RS58839B1 - Muteini lipokalina u suzama koji vezuju il-4 r alfa - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Predmetni pronalazak odnosi se na muteine humanog lipokalina u suzama koji vezuje IL-4 alfa receptor. Pronalazak se takođe odnosi na odgovarajuće molekule nukleinske kiseline koji kodiraju takav mutein. Konačno, pronalazak je usmeren na farmaceutski sastav koji uključuje takav mutein lipokalina.

Pozadina

[0002] Proteini koji se selektivno vezuju za odabrane ciljeve putem nekovalentne interakcije igraju ključnu ulogu kao reagensi u biotehnologiji, medicini, bioanalitici kao i u biološkim i životnim naukama uopšte. Antitela, tj. imunoglobulini, su istaknuti primer ove klase proteina. Uprkos višestrukim potrebama za takvim proteinima u vezi sa prepoznavanjem, vezivanjem i/ili razdvajanjem liganda/ciljeva, trenutno se koriste isključivo imunoglobulini. Primena drugih proteina sa definisanim karakteristikama vezivanja liganda, na primer lektini, ostala je ograničena na posebne slučajeve.

[0003] Dodatni proteinski vezujući molekuli koji imaju antitelo slične funkcije su članovi porodice lipokalina, koji su prirodno evoluirali da vežu ligande. Lipokalini se javljaju u mnogim organizmima, uključujući kičmenjake, insekte, biljke i bakterije. Članovi familije proteina lipokalina (Pervaiz, S., & Brew, K. (1987) FASEB J.1, 209-214) su obično mali, sekretni proteini i imaju jedan polipeptidni lanac. Karakterišu ih različita svojstva molekularnog prepoznavanja: sposobnost vezivanja različitih, uglavnom hidrofobnih molekula (kao što su retinoidi, masne kiseline, holesterol, prostaglandini, biliverdini, feromoni, ukusi i mirisi), njihovo vezivanje za specifične ćelijske površine i njihovo formiranje makromolekularnih kompleksa. Iako su u prošlosti bili klasifikovani prvenstveno kao transportni proteini, sada je jasno da lipokalini ispunjavaju različite fiziološke funkcije. To uključuje uloge u transportu retinola, olfakciju, feromonsku signalizaciju i sintezu prostaglandina. Lipokalini su takođe uključeni u regulaciju imunog odgovora i posredovanje u ćelijskoj homeostazi. Flower, D.R. (1996) Biochem. J.318, 1-14 i Flower, D.R. i dr. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1482, 9-24).

[0004] Lipokalini imaju neuobičajeno niske nivoe ukupne konzervacije sekvenci, često sa identičnostima sekvence manje od 20%. U velikom kontrastu, njihov ukupan oblik presavijanja je veoma očuvan. Centralni deo lipokalinske strukture sastoji se od jednog osmostrukog anti-paralelnog β-sloja zatvorenog na sebi da formira β-bure koje je kontinuirano vezano vodonikom. Ovo β-bure formira centralnu šupljinu. Jedan kraj cevi je sterično blokiran N-terminalnim segmentom peptida koji se proteže preko njegovog dna, kao i tri peptidne petlje koje povezuju β-burad. Drugi kraj β-bureta je otvoren za rastvarač i obuhvata mesto za vezivanje cilja, koje je formirano sa četiri fleksibilne peptidne petlje.

Upravo ta raznolikost petlji u inače krutom lipokalinskom skeletu dovodi do različitih načina vezivanja, svaki sposoban da prihvati ciljeve različite veličine, oblika i hemijskog karaktera (pregledano, npr. u Flower, D.R. (1996), iznad; Flower, D.R. i dr. (2000), iznad, ili Skerra, A. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1482, 337-350).

[0005] Međunarodna patentna prijava WO 99/16873 obelodanjuje polipeptide familije lipokalina sa mutiranim položajima aminokiselina u regionu četiri peptidne petlje, koji su raspoređeni na kraju cilindrične strukture β-bureta koja obuhvata džep za vezivanje i koji odgovaraju onim segmentima u linearnoj polipeptidnoj sekvenci koja uključuje aminokiselinske položaje 28 do 45, 58 do 69, 86 do 99, i 114 do 129 bilin-vezujućeg proteina Pieris brassicae. Prijavljeno je da su članovi familije lipokalina post-translacijski modifikovani, npr. fosforilacija i glikozilacija lipokalina u suzama (npr. You, J., i dr. (2010) Electrophoresis 31, 1853-1861). Ipak, nije potrebna post-translacijska modifikacija za njihova svojstva molekularnog prepoznavanja.

[0006] Međunarodna patentna prijava WO 00/75308 obelodanjuje muteine bilin-vezujućeg proteina, koji se specifično vezuju za digoksigenin, dok međunarodne patentne prijave WO 03/029463 i WO 03/029471 odnose se na muteine humanog neutrofilnog želatinastog lipokalina (hNGAL) i apolipoproteina D, respektivno. U cilju daljeg poboljšanja i finog podešavanja afiniteta liganda, specifičnosti i stabilnosti savijanja lipokalinske varijante predloženi su različiti pristupi koji koriste različite članove familije lipokalina. (Skerra, A. (2001) Rev. Mol. Biotechnol.74, 257-275; Schlehuber, S., i Skerra, A. (2002) Biophys.

Chem. 96, 213-228), kao što je zamena dodatnih aminokiselinskih ostataka. PCT prijava WO 2006/56464 obelodanjuje muteine lipokalina sa humanim neutrofilnim želatinazama sa afinitetom vezivanja za CTLA-4 u niskom nanomolarnom opsegu.

[0007] Međunarodna patentna prijava WO 2005/19256 obelodanjuje muteine lipokalina suza sa najmanje jednim veznim mestom za različite ili iste ciljne ligande i obezbeđuje postupak za dobijanje takvih muteina humanog lipokalina u suzama. Prema ovoj PCT prijavi, određene aminokiseline se protežu unutar primarne sekvence lipokalina u suzama, posebno regioni petlje koje uključuju aminokiseline 7-14, 24-36, 41-49, 53-66, 69-77, 79-84 , 87-98 i 103-110 zrelog humanog lipokalina suza, podvrgnuti su mutagenezi da bi se generisali muteini sa afinitetima vezivanja. Dobijeni muteini imaju afinitete vezivanja za izabrani ligand (KD) u nanomolarnom opsegu, u većini slučajeva > 100 nM. Međunarodna patentna prijava WO 2008/015239 obelodanjuje muteine lipokalina u suzama koji vezuje dati neprirodni ligand, uključujući IL-4 alfa receptor. Afiniteti vezivanja su nanomolarnog opsega, dostizanje skoro 1 x 10<-10>M u eksperimentima površinske plazmonske rezonance.

[0008] Humani lipokalin u suzama (TLPC ili Tic), koji se takođe naziva lipokalin-1 suza prealbumin ili protein fon Ebnerove žlezde, je prvobitno opisan kao glavni humani protein suzne tečnosti (približno jedna trećina ukupnog sadržaja proteina), ali je takođe bio identifikovane u nekoliko drugih sekretornih tkiva, uključujući prostatu, nadbubrežnu žlezdu, timus, mlečnu žlezdu, testise, nosnu sluznicu i mukozu dušnika, kao i kortikotrofe hipofize. Homologni proteini su nađeni u rezus majmunima, šimpanzama, pacovima, miševima, svinjama, hrčcima, kravama, psima i konjima. Lipokalin suza je neobičan lipokalinski član po tome što pokazuje neuobičajeno široku specifičnost liganda, u poređenju sa drugim lipokalinima, i po svojoj visokoj promiskuitetnosti za relativno nerastvorljive lipide (videti Redl, B. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1482, 241-248). Ova osobina lipokalina suza pripisana je funkciji proteina u inhibiranju rasta bakterija i gljivica na rožnjači. Izuzetan broj lipofilnih jedinjenja različitih hemijskih klasa kao što su masne kiseline, masni alkoholi, fosfolipidi, glikolipidi i holesterol su endogeni ligandi ovog proteina. Zanimljivo je da, za razliku od drugih lipokalina, jačina vezivanja liganda (cilj) je u vezi sa dužinom ugljovodoničnog repa i za alkil amide i masne kiseline. Stoga, suzni lipokalina najjače vezuje najmanje rastvorljive lipide (Glasgow, B.J. i dr. (1995) Curr. Eye Res.14, 363-372; Gasymov, O.K. i dr. (1999) Biochim. Biophys. Acta 1433, 307-320).1.8-Å kristalna struktura lipokalina suza otkrila je neuobičajeno veliku šupljinu unutar njenog β-bureta (Breustedt, D.A. i dr. (2005) J. Biol. Chem.280, 1, 484-493). WO 2008/015239 obelodanjuje mutante humanog lipokalina koji se vezuju za IL-4 alfa receptor, uključujući mutant S191.4 B24, kao i postupke za generisanje i selekciju pomenutih mutanata.

[0009] Uprkos ovom napretku, još uvek bi bilo poželjno imati humani lipokalinski mutein koji ima poboljšana svojstva vezivanja za IL-4 alfa receptor, naročito veći afinitet vezivanja, jednostavno iz razloga da se dodatno poboljša pogodnost muteina humanih lipokalina u suzama u dijagnostičke i terapeutske primene.

Rezime pronalaska

[0010] Prema tome, cilj ovog pronalaska je da obezbedi još jedan mutein humanog lipokalina u suzama sa visokim afinitetom vezivanja za IL4 alfa receptor.

[0011] Ovaj cilj se ostvaruje muteinom humanog lipokalina suza sa karakteristikama navedenim u patentnim zahtevima, posebno u patentnom zahtevu 1.

[0012] U prvom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje mutein humanog lipokalina suza. Mutein se vezuje za IL4 alfa receptor. Mutein uključuje mutirani aminokiselinski ostatak na bilo kojoj ili više pozicija sekvenci 27, 28, 30, 31, 33, 53, 57, 61, 64, 66, 80, 83, 104-106 i 108 linearnog polipeptida sekvenca zrelog humanog lipokalina suza. Mutein dalje uključuje mutirani aminokiselinski ostatak na bilo koja dva ili više od sekvencijskih položaja 26, 32, 34, 55, 56, 58 i 63 linearne polipeptidne sekvence zrelog humanog lipokalina suza.

Aminokiselinska sekvenca muteina humanog lipokalina suza uključuje jednu od sledećih kombinacija aminokiselina: (1) Ser 26, Glu 34, Leu 55, Lys 58, (2) Ser 26, Asn 34, Ala 55, Lys 58, (3) Ser 26, Val 34, (4) Pro 26, Ser 34 (5) Pro 26, Ala 55, (6) Leu 26, Trp 34, Ala 55, (7) Leu 26, Trp 34, Ile 58, (8) Asn 26, Asp 34, (9) Asn 26, Ala 55, (10) Tyr 26, His 34, Ala 55, (11) Tyr 26, His 34, Ala 58, (12) Lys 26, Arg 34, Ala 55, (13) Lys 26, Arg 34, Asn 58, (14) Glu 26, Gly 34, Ala 55 i (15) Glu 26, Gly 34, Leu 58.

[0013] Termin "položaj" kada se koristi u skladu sa pronalaskom označava poziciju bilo aminokiseline u okviru ovde prikazane aminokiselinske sekvence ili položaja nukleotida unutar sekvence nukleinske kiseline koja je ovde prikazana. Termin "odgovarajući", kako se ovde koristi, takođe uključuje da položaj nije određen samo brojem prethodnih nukleotida/aminokiselina. Shodno tome, položaj date aminokiseline u skladu sa pronalaskom koji može biti supstituisan može varirati usled brisanja ili dodavanja aminokiselina negde drugde u (mutantnom ili divljem tipu) lipokalinu. Slično tome, položaj datog nukleotida u skladu sa ovim pronalaskom koji može biti supstituisan može da varira zbog delecija ili dodatnih nukleotida na drugim mestima u muteinu ili divljem tipu lipokalina 5'-netranslatovanog regiona (UTR) uključujući promoter i/ili bilo koja druga regulatorna sekvenca ili gen (uključujući egzone i introne).

[0014] Prema tome, pod "odgovarajućom pozicijom" u skladu sa pronalaskom poželjno je razumeti da se nukleotidi/aminokiseline mogu razlikovati u navedenom broju, ali mogu imati slične susedne nukleotide/aminokiseline. Navedeni nukleotidi/aminokiseline, koji se mogu razmenjivati, brisati ili dodavati, takođe su obuhvaćeni terminom "odgovarajuća pozicija".

[0015] Specifično, da bi se odredilo da li nukleotidni ostatak ili aminokiselinski ostatak aminokiselinske sekvence lipokalina različit od Tlc lipokalinskog muteina iz opisa odgovara određenom položaju u nukleotidnoj sekvenci ili aminokiselinskoj sekvenci Tic lipokalin muteina kako je opisano, naročito bilo koji iz SEQ ID NOs: 2-11 ili ona koja ima jednu ili više supstitucija aminokiselina na položaju 27, 28, 30, 31, 33, 53, 57, 61, 64, 66, 80, 83, 104-106 i 108 linearne polipeptidne sekvence Tlc (SEQ ID NO:20), iskusni stručnjak može koristiti sredstva i postupke koji su dobro poznati u tehnici, npr. poravnanja, bilo ručno ili pomoću kompjuterskih programa kao što je BLAST2.0, što znači Basic Local Alignment Search Tool ili ClustalW ili bilo koji drugi pogodan program koji je pogodan za generisanje poravnanja sekvenci. Prema tome, lipokalinski mutein bilo koje od SEQ ID Nos: 2-11 ili ona koja ima jednu ili više supstitucija aminokiselina na položaju 27, 28, 30, 31, 33, 53, 57, 61, 64, 66, 80, 83, 104-106 i 108 linearne polipeptidne sekvence Tic (SEQ ID NO:20) može poslužiti kao "predmetna sekvenca", dok aminokiselinska sekvenca lipokalina različita od Tlc služi kao "sekvenca upita".

[0016] Ovdašnje obelodanjivanje je postupak stvaranja muteina humanog lipokalina suza. Mutein se vezuje za IL4 alfa receptor. Postupak uključuje podvrgavanje molekula nukleinske kiseline koja kodira humani suzni lipokalin mutagenezi na bilo kojoj ili više pozicija sekvence aminokiselina 27, 28, 30, 31, 33, 53, 57, 61, 64, 66, 80, 83, 104-106 i 108 linearne polipeptidne sekvence zrelog humanog lipokalina suza. Dalje, postupak uključuje podvrgavanje molekula nukleinske kiseline koji kodira humani lipokalin suza mutagenezi kod bilo koje dve ili više pozicija sekvenci aminokiselina 26, 32, 34, 55, 56, 58 i 63 linearne polipeptidne sekvence zrelog humanog lipokalina suza. Najmanje jedan od dva ili više položaja aminokiselinske sekvence 26, 32, 34, 55, 56, 58 i 63 linearne polipeptidne sekvence zrelog humanog lipokalina suza. Kao rezultat dobije se jedna ili više nukleinskih kiselina koje kodiraju mutein humanog lipokalina suza. Aminokiselinska sekvenca kodiranog muteina uključuje jedno od sledeći kompleta aminokiselinskih kombinacija: (1) Ser 26, Glu 34, Leu 55, Lys 58, (2) Ser 26, Asn 34, Ala 55, Lys 58, (3) Ser 26, Val 34, (4) Pro 26, Ser 34, (5) Pro 26, Ala 55, (6) Leu 26, Trp 34, Ala 55, (7) Leu 26, Trp 34, lie 58, (8) Asn 26, Asp 34, (9) Asn 26, Ala 55, (10) Tyr 26, His 34, Ala 55, (11) Tyr 26, His 34, Ala 58, (12) Lys 26, Arg 34, Ala 55, (13) Lys 26, Arg 34, Asn 58, (14) Glu 26, Gly 34, Ala 55 i (15) Glu 26, Gly 34, Leu 58. Postupak takođe obuhvata ispoljavanje jednog ili više molekula mutein kodirajuće nukleinske kiseline tako dobijenih u sistemu ispoljavanja. Postupak stoga obuhvata jedan ili više muteina. Dalje, postupak uključuje obogaćivanje jednog ili više tako dobijenih muteina koji se vezuju za IL 4 alfa receptor selekcijom i/ili izolacijom.

[0017] Predmetni pronalazak obezbeđuje molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 6. Molekul nukleinske kiseline uključuje nukleotidnu sekvencu koja kodira mutein prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4.

[0018] Predmetni pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina prema patentnom zahtevu 7. Ćelija domaćina sadrži molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 6.

[0019] Predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 8. Farmaceutski sastav uključuje mutein humanog lipokalina u suzama prema patentnim zahtevima 1-4. Farmaceutski sastav dalje obuhvata farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.

[0020] Pronalazak će biti bolje razumljiv u odnosu na detaljan opis kada se razmatra zajedno sa neograničavajućim primerima i pratećim crtežima.

Opis slika

[0021]

Slika 1 prikazuje polipeptidnu sekvencu S191.4-B24, mutein humanog lipokalina suza koji poseduje afinitet vezivanja za IL-4 alfa receptor.

Slika 2 prikazuje polipeptidne sekvence primernih muteina sa visokim afinitetom za IL-4 alfa receptor (SEQ ID NOs:2-11).

Slika 3 prikazuje inhibiciju TF-1 ćelijske proliferacije povećavanjem količine muteina pronalaska u prisustvu IL-4 (A) i IL-13 (B).

Slika 4 oslikava IC50vrednosti sa Slike 3 i podatke Biacore merenja vezivanja humanih lipokalinskih muteina suza iz pronalaska za IL-4 alfa receptor, kao što je humani IL-4 alfa receptor.

Detaljni opis

[0022] Predmetni pronalazak obezbeđuje humani lipokalin u suzama koji posebno ima visoki afinitet IL-4 alfa receptora . IL-4 alfa receptor kao meta muteina ovog pronalaska je tipično protein sisara, kao što je humani protein. In vivo Alfa receptorski IL-4 može vezati interleukin 4 i interleukin 13 za regulaciju proizvodnje IgE antitela u B ćelijama.

[0023] Afiniteti vezivanja muteina prema pronalasku imaju KDispod 0.1 nM, a u nekim otelotvorenjima oko 1 pikomolar (pM) (videti Sliku 4). Lipokalinski muteini iz ovog pronalaska su u skladu sa tim sposobni da vezuju IL-4 alfa receptor sa detektabilnim afinitetom, tj. sa konstantom disocijacije od najmanje oko 0.1 nM, oko 10 pM ili čak manje. Afinitet vezivanja muteina na odabranu metu, u ovom slučaju IL-4 alfa receptor, može se izmeriti i na taj način se KDvrednosti mutein-ligand kompleksa mogu odrediti mnoštvom metoda poznatih stručnjacima. Takvi postupci uključuju, ali nisu ograničeni na, titraciju fluorescencije, kompetetivnu ELISA, kalorimetrijske metode, kao što je izotermalna titraciona kalorimetrija (ITC) i površinska plazmonska rezonanca (BIAcore). Primeri takvih postupaka su detaljno opisani u nastavku (videti npr. Primer 2).

[0024] Alfa lanac humanog interleukina-4 receptora može imati aminokiselinsku sekvencu SWISS PROT baze podataka pristupa br. P24394 (SEQ ID NO:18) ili njihovih fragmenata. Ilustrativni primer fragmenta alfa lanca humanog interleukina-4 receptora obuhvata aminokiseline od 26 do 232 alfa receptora IL-4. Aminokiselinska sekvenca humanog IL-13 alfa receptora 1 je prikazana u SEQ ID NO:19.

[0025] Uopšteno, termin "fragment", kako se ovde koristi, u vezi sa proteinskim ligandima muteina lipokalina suza iz pronalaska, odnosi se na N-terminalno i/ili C-terminalno skraćene proteinske ili peptidne ligande, koji zadržavaju sposobnost punog liganda dužine koji se prepoznaje i/ili vezuje muteinom prema pronalasku.

[0026] Mutein humanog lipokalina suza koji vezuje IL-4 alfa receptor može da deluje kao IL-4 antagonist i/ili IL-13 antagonist ili kao inverzni IL-4 agonist i/ili inverzni IL-13 agonist. Inverzni agonist se vezuje za isto mesto vezivanja kao agonist za određeni receptor i vraća konstitutivnu aktivnost odgovarajućeg receptora . Za sada, za IL-4 receptore nije zabeleženo da poseduju intrinzičnu aktivnost kinaze, tako da mutein pronalaska može tipično da deluje kao IL-4 antagonist i/ili IL-13 antagonist. U jednom otelotvorenju, muteini humanog lipokalina suza deluje kao antagonist humanog IL-4 i/ili humanog IL-13. U nekim otelotvorenju mutein je unakrsno reaktivan sa makaki IL-4 alfa receptorom i kao takav deluje kao antagonist makaki liganda kao što je IL-4 i/ili IL-13. U nekim otelotvorenju mutein je unakrsno reaktivan sa marmozet IL-4 alfa receptorom i kao takav deluje kao antagonist marmozet liganda kao što je IL-4 i/ili IL-13.

[0027] IL-4 alfa receptor može se uzeti za definisanje neprirodnog liganda humanog lipokalina suza. Termin "neprirodni ligand" se odnosi na jedinjenje, koje se ne vezuje za prirodni zreli humani lipokalin suza pod fiziološkim uslovima. Termin "humani lipokalin suza", kako je ovde korišćen, odnosi se na zreli lipokalin humanih suza koji odgovara proteinu SWISS-PROT broja pristupne banke broj P31025. Zreli humani lipokalin suza ne uključuje N-terminalni signalni peptid koji je uključen u sekvencu SWISS-PROT pristupnog broja P31025 (videti Sliku 2).

[0028] Aminokiselinska sekvenca muteina ovog pronalaska ima visok identitet sekvence za sazrevanje lipokalina humanih suza kada se uporedi sa identitetom sekvence sa drugim lipokalinima (iznad). U ovom opštem kontekstu aminokiselinska sekvenca muteina iz ovog pronalaska je barem suštinski slična sekvenci aminokiselina zrelog humanog lipokalina suza. Odgovarajuća sekvenca muteina ovog pronalaska, koja je suštinski slična sekvenci zrelog humanog lipokalina suza, ima najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 82%, najmanje 85%, najmanje 87%, najmanje 90% identiteta, uključujući najmanje 95% identičnosti sa sekvencom zrelog lipokalina humanih suza, uz uslov da je izmenjena pozicija ili sekvenca zadržana, pri čemu je sekvenca zrelog humanog lipokalina suza

[0029] Pod "identitetom" se podrazumeva svojstvo sekvenci koje meri njihovu sličnost ili odnos. Identitet se meri deljenjem broja identičnih ostataka sa ukupnim brojem ostataka i množenjem proizvoda sa 100.

[0030] "Praznine" su prostori u poravnanju koji su rezultat dodavanja ili brisanja aminokiselina. Prema tome, dve kopije tačno iste sekvence imaju 100% identiteta, ali sekvence koje su manje visoko konzervirane i imaju delecije, dodatke ili zamene, mogu imati niži stepen identiteta. Stručnjaci iz oblasti će prepoznati da je nekoliko kompjuterskih programa dostupno za određivanje identiteta sekvence koristeći standardne parametre, na primer Blast (Altschul, i dr. (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402), Blast2 (Altschul, i dr. (1990) J. Mol. Biol.215, 403-410) i Smith-Waterman (Smith, i dr. (1981) J. Mol. Biol.147, 195-197).

[0031] Termin "mutirani" ili "mutant" u odnosu na nukleinsku kiselinu ili polipeptid se odnosi na razmenu, deleciju ili ubacivanje jednog ili više nukleotida ili aminokiselina, u odnosu na nukleinsku kiselinu ili polipeptid koji se javlja u prirodi.

[0032] U nekim otelotvorenjima mutein prema pronalasku uključuje aminokiselinsku supstituciju izvornog cisteinskog ostatka na položajima 61 i/ili 153 sa serinskim ostatkom. U ovom kontekstu, primećeno je da je otkriveno da uklanjanje strukturne disulfidne veze (na nivou odgovarajuće naivne biblioteke nukleinskih kiselina) divljeg tipa lipokalina suza koji se formira od cisteinskih ostataka 61 i 153 (videti Breustedt, i dr., 2005, iznad) daje lipokalin suza koje nije samo stabilno presavijen, nego je dodatno sposoban da veže dati neprirodni ligand sa visokim afinitetom. Bez želje da se vezuje teorija, takođe se veruje da eliminacija strukturne disulfidne veze obezbeđuje dalju prednost omogućavanja (spontane) generacije ili namernog uvođenja neprirodnih veštačkih disulfidnih veza u muteine pronalaska (videti primere), čime se na primer povećava stabilnost muteina. U nekim otelotvorenjima mutein prema pronalasku uključuje aminokiselinsku supstituciju izvornog cisteinskog ostatka na

1

položajima 101 sa serinskim ostatkom. Dalje, u nekim otelotvorenjima mutein prema pronalasku uključuje aminokiselinsku supstituciju izvornog cisteinskog ostatka na položajima 111 sa prolinskim ostatkom. U nekim otelotvorenjima mutein prema pronalasku uključuje aminokiselinsku supstituciju izvornog cisteinskog ostatka na položajima 114 sa triptofanskim ostatkom.

[0033] Mutein lipokalina humanih suza prema pronalasku tipično ima jedan asparagin, glutaminsku kiselinu, prolin, lizin, serin i tirozin na položaju koji odgovara položaju aminokiseline 26 zrelog lipokalina humanih suza.

[0034] U nekim otelotvorenjima mutein pronalaska ima sekvencu koja obuhvata aminokiselinske supstitucije Arg 26 → Pro i Glu 34 → Ser. U nekim otelotvorenjima mutein pronalaska ima sekvencu koja obuhvata aminokiselinske supstitucije Arg 26 → Pro i Met 55 → Ala. U nekim otelotvorenjima mutein pronalaska ima sekvencu koja obuhvata aminokiselinske supstitucije Arg 26 → Ser i Glu 34 → Val. U nekim otelotvorenjima mutein pronalaska ima sekvencu koja obuhvata aminokiselinske supstitucije Arg 26 → Ser, Glu 34 → Asn, Met 55 → Ala i Ser 58 → Lys. U nekim otelotvorenjima mutein pronalaska ima sekvencu koja obuhvata aminokiselinske supstitucije Arg 26 → Asn i Glu 34 → Asp. U nekim otelotvorenjima mutein pronalaska ima sekvencu koja obuhvata aminokiselinske supstitucije Arg 26 → Asn i Met 55 → Ala. U nekim otelotvorenjima mutein pronalaska ima sekvencu koja obuhvata aminokiselinske supstitucije Arg 26 → Tyr, Glu 34 → His i Met 55 → Ala. U nekim otelotvorenjima mutein pronalaska ima sekvencu koja obuhvata aminokiselinske supstitucije Arg 26 → Tyr, Glu 34 → His i Ser 58 → Ala. U nekim otelotvorenjima mutein pronalaska ima sekvencu koja obuhvata aminokiselinske supstitucije Arg 26 → Lys, Glu 34 → Arg i Met 55 → Ala. U nekim otelotvorenjima mutein pronalaska ima sekvencu koja obuhvata aminokiselinske supstitucije Arg 26 → Lys, Glu 34 → Arg i Ser 58 → Asn.

[0035] U nekim otelotvorenjima lipokalinski mutein iz pronalaska ima mutirani aminokiselinski ostatak na položaju 26 koji je jedan od asparagina, prolina, lizina, serina i tirozina. U nekim otelotvorenjima lipokalinski mutein iz pronalaska ima mutirani aminokiselinski ostatak na položaju 32 koji je jedan od histidina, lizina, tirozina i valina. U nekim otelotvorenjima lipokalinski mutein iz pronalaska ima mutirani aminokiselinski ostatak na položaju 34 koji je jedan od arginina, asparaginove kiseline, histidina, serina i valina. Mutein lipokalina iz pronalaska ima mutirani aminokiselinski ostatak na položaju 55 koji je alanin. Lipokalinski mutein iz pronalaska ima mutirani aminokiselinski ostatak na položaju 56 koji je jedan od alanina, glutamina, histidina, metionina i lizina. U nekim otelotvorenjima lipokalinski mutein pronalaska ima mutirani aminokiselinski ostatak na poziciji 58 koji je jedan od alanina, arginina, asparagina, izoleucina i lizina. U nekim otelotvorenjima lipokalinski mutein iz pronalaska ima mutirani aminokiselinski ostatak na poziciji 63 koji je jedan od glutamina, lizina, prolina i serina.

[0036] U nekim otelotvorenjima, mutein prema pronalasku obuhvata supstitucije Met 31 → Ala, Leu 33 → Tyr, Cys 61 → Trp, Asp 80 → Ser, Glu 104 → Leu, His 106 → Pro i Lys 108 → Gln. U nekim otelotvorenjima mutein prema pronalasku obuhvata supstituciju Val 53 → Phe. Mutirani aminokiselinski ostatak može takođe obuhvatati supstituciju Val 64 → Tyr. Takođe može obuhvatati supstituciju Ala 66 → Leu ili Ala 66 → Asp.

[0037] Ovde je takođe opisan mutein humanog lipokalina suza koji uključuje supstituisanu aminokiselinu najmanje cisteinskog ostatka koji se nalazi na poziciji 61 i 153 drugom aminokiselinom i mutacijom aminokiselinskog ostatka na položajima sekvence 26-28, 30-34 , 53, 55-58, 63, 64, 66, 80, 83, 104-106 i 108 linearne polipeptidne sekvence zrelog humanog lipokalina suza. Položaji 26-28 i 30-34 su uključeni u AB petlju, pozicije 53 i 55 se nalaze na samom kraju beta-lista i sledeće pozicije 56-58 su uključene u CD petlju. Iznenađujuće, pozicije 63, 64 i 66 su uključene unutar beta-lista (βD) i pozicija 80 je locirana u α-spiralnom regionu. Pozicija 83 je aminokiselina koja definiše jednu petlju između ovog α-spiralnog regiona i beta-lista (βF). Položaji 104-106 i 108 su uključeni u GH petlju u mestu vezivanja na otvorenom kraju strukture β-bureta lipokalina suze. Definicija ovih regiona se ovde koristi u skladu sa Flower (Flower, 1996, iznad, Flower, i dr., 2000, iznad) i Breustedt i dr. (2005, iznad). U nekim otelotvorenjima mutein obuhvata aminokiselinske ostatke Cys 61 → Trp i Cys 153 → Ser ili Ala. Takva supstitucija se pokazala korisnom u sprečavanju formiranja prirodnog disulfidnog mosta koji povezuje Cys 61 i Cys 153, i na taj način olakšava rukovanje muteinom.

[0038] U nekim otelotvorenjima mutein uključuje najmanje jednu dodatnu aminokiselinsku supstituciju, izabranu iz Arg 111 → Pro i Lys 114 → Trp. Mutein iz ovog pronalaska može dalje da uključi cistein na poziciji 101 sekvence izvornog zrelog humanog lipokalina suza koji je supstituisan sa drugom amino kiselinom. Ova supstitucija može, na primer, biti mutacija Cys 101 → Ser ili Cys 101 → Thr. U nekim otelotvorenjima, mutein ima mutirani aminokiselinski ostatak na svakoj od sekvenci 27, 28, 30, 31, 33, 53, 57, 61, 64, 66, 80, 83, 104-106 i 108 linearnog sekvenca polipeptida zrelog humanog lipokalina suza.

[0039] U nekim otelotvorenjima, mutein ima mutirani aminokiselinski ostatak na svakoj od sekvenci 27, 28, 30, 31, 33, 53, 57, 61, 64, 66, 80, 83, 104-106 i 108 linearnog sekvenca polipeptida zrelog humanog lipokalina suza. U nekim otelotvorenjima, lipokalinski mutein u skladu sa pronalaskom može takođe da nosi jednu ili više aminokiselinskih mutacija na položaju/poziciji sekvence sve dok takva mutacija, bar suštinski, ne ometa ili ne ometa aktivnost vezivanja i preklapanje mutein. Takve mutacije se mogu vrlo lako postići na nivou DNK koristeći standardne metode. Ilustrativni primeri promena aminokiselinske sekvence su ubacivanja ili delecije kao i aminokiselinske supstitucije. Takve supstitucije mogu biti konzervativne, tj. aminokiselinski ostatak je zamenjen sa aminokiselinskim ostatkom hemijski sličnih populacija, naročito s obzirom na polarnost kao i veličinu. Primeri konzervativnih supstitucija su zamene među članovima sledećih grupa: 1) alanin, serin i treonin; 2) asparaginova kiselina i glutaminska kiselina; 3) asparagin i glutamin; 4) arginin i lizin; 5) izoleucin, leucin, metionin i valin; i 6) fenilalanin, tirozin i triptofan. Sa druge strane, takođe je moguće uvesti nekonzervativne promene u aminokiselinskoj sekvenci. Pored toga, umesto zamene pojedinačnih aminokiselinskih ostataka, moguće je ili ubaciti ili izbrisati jednu ili više neprekidnih aminokiselina primarne strukture lipokalina suza sve dok te delecije ili ubacivanja dovode do stabilnog presavijenog/funkcionalnog muteina (videti na primer, eksperimentalna sekcija u kojoj su generisani muteini sa skraćenim N- i C-terminusom).

[0040] Takve modifikacije aminokiselinske sekvence uključuju usmerenu mutagenezu položaja pojedinačnih aminokiselina kako bi se pojednostavilo pod-kloniranje mutiranog gena lipokalina ili njegovih delova inkorporiranjem mesta za odvajanje za određene restrikcione enzime. Pored toga, ove mutacije se takođe mogu ugraditi da bi se dodatno poboljšao afinitet lipokalinskog muteina za dati cilj. Osim toga, mutacije se mogu uvesti da bi se modulirale određene karakteristike muteina, kao što je poboljšanje stabilnosti preklapanja, stabilnosti seruma, otpornosti proteina ili rastvorljivosti u vodi ili da se smanji sklonost agregacije, ako je neophodno. Na primer, prirodni cisteinski ostaci mogu biti mutirani u druge aminokiseline da

1

bi se sprečilo formiranje disulfidnog mosta. Takođe je moguće da se namerno mutira druga pozicija aminokiselinske sekvence do cisteina da bi se uvele nove reaktivne grupe, na primer za konjugaciju sa drugim jedinjenjima, kao što su polietilen glikol (PEG), hidroksietil skrob (HES), biotin, peptidi ili proteini ili za formiranje neprirodnih disulfidnih veza. Primeri mogućnosti takve mutacije za uvođenje ostatka cisteina u aminokiselinsku sekvencu humanog lipokalina suza muteina uključuju supstitucije Thr 40 → Cys, Glu 73 → Cys, Arg 90 → Cys, Asp 95 → Cys, i Glu 131 → Cys . Stvorena tiolna grupa na strani bilo koje od aminokiselinskih pozicija 40, 73, 90, 95 i/ili 131 može se koristiti za PEGilaciju ili HESilat muteina, na primer, da bi se povećao polu-raspad seruma odgovarajućeg muteina lipokalina suza.

[0041] Ovaj pronalazak takođe obuhvata muteine kao što je gore definisano, u kojima prva četiri N-terminalna aminokiselinska ostatka sekvence zrelog humanog lipokalina suza (His-His-Leu-Leu; pozicije 1-4) i/ili poslednja dva C-terminalna aminokiselinska ostatka (Ser-Asp; pozicije 157-158) sekvence zrelog humanog lipokalina suza su izbrisane (videti takođe primere i priložene liste sekvenci). Još jedna moguća mutacija sekvence divljeg tipa je da se promeni aminokiselinska sekvenca na pozicijama sekvence 5 do 7 (Ala Ser Asp) na Gly Asp kao što je opisano u PCT prijavi WO 2005/019256.

[0042] Mutein lipokalina suza prema pronalasku ima sledeće aminokiselinske supstitucije u poređenju sa zrelim humanim lipokalinom suza: Glu 27 → Arg; Phe 28 → Cys; Glu 30 → Arg; Met 31 → Ala; Leu 33 → Tyr; Ile 57 → Arg; Cys 61 → Trp; Asp 80 → Ser; Lys 83 → Arg; Glu 104 → Leu; Leu 105 → Cys; His 106 → Pro; Lys 108 → Gln.

[0043] U nekim otelotvorenjima mutein dalje uključuje skup aminokiselinskih supstitucija Val 53 → Phe, Val 64 → Tyr, Ala 66 → Leu.

[0044] U nekim otelotvorenjima mutein lipokalina u suzama prema pronalasku uključuje kombinaciju supstitucija aminokiselina Arg 26 → Pro; Asn 32 → Tyr; Glu 34 → Ser; Met 55 → Ala; Leu 56 → Gln; Glu 63 → Lys u odnosu na zreli humani lipokalin u suzama. U nekim otelotvorenjima mutein lipokalina u suzama prema pronalasku uključuje kombinaciju supstitucija aminokiselina Arg 26 → Ser; Asn 32 → Tyr; Glu 34 → Val; Met 55 → Ala; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Ile; Glu 63 → Ser u odnosu na zreli humani lipokalin u suzama. U nekim otelotvorenjima mutein lipokalina u suzama prema pronalasku uključuje kombinaciju supstitucija aminokiselina Arg 26 → Ser; Asn 32 → Val; Glu 34 → Asn; Met 55 → Ala; Leu 56 → Gin; Ser 58 → Lys; Glu 63 → Lys u odnosu na zreli humani lipokalin u suzama. U nekim otelotvorenjima mutein lipokalina u suzama prema pronalasku uključuje kombinaciju supstitucija aminokiselina Arg 26 → Tyr; Asn 32 → Tyr; Glu 34 → His; Met 55 → Ala; Leu 56 → His; Ser 58 → Ala; Glu 63 → Lys u odnosu na zreli humani lipokalin u suzama. U nekim otelotvorenjima mutein lipokalina u suzama prema pronalasku uključuje kombinaciju supstitucija aminokiselina Arg 26 → Lys; Asn 32 → Tyr; Glu 34 → Arg; Met 55 → Ala; Leu 56 → Lys; Ser 58 → Asn; Glu 63 → Pro u odnosu na zreli humani lipokalin u suzama. U nekim otelotvorenjima mutein lipokalina u suzama prema pronalasku uključuje kombinaciju supstitucija aminokiselina Arg 26 → Glu; Asn 32 → His; Glu 34 → Gly; Met 55 → Ala; Leu 56 → Met; Ser 58 → Leu; Glu 63 → Lys u odnosu na zreli humani lipokalin u suzama.

[0045] Mutein humanog lipokalina suza prema pronalasku može uključivati, sastojati se u suštini ili se sastojati od bilo koje od aminokiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NOs: 4 i 6-11 ili njegov fragment ili varijanta. Termin "fragment" kako se ovde koristi u vezi sa muteinima pronalaska se odnosi na proteine ili peptide koji potiču od zrelog humanog lipokalina suza u punoj dužini koji su N-terminalno i/ili C-terminalno skraćeni, tj. N-terminalne i/ili C-terminalne aminokiseline. Takvi fragmenti mogu uključivati najmanje 10, više kao što su 20 ili 30 ili više uzastopnih aminokiselina primarne sekvence zrelog humanog lipokalina suza i obično se mogu detektovati u imunotestu zrelog humanog lipokalina suza.

[0046] Termin "varijanta" kako se koristi u ovom pronalasku odnosi se na derivate proteina ili peptida koji uključuju modifikacije aminokiselinske sekvence, na primer supstitucijom, delecijom, ubacivanjem ili hemijskom modifikacijom. Takve modifikacije u nekim otelotvorenjima ne smanjuju funkcionalnost proteina ili peptida. Takve varijante obuhvataju proteine, pri čemu su jedna ili više aminokiselina zamenjene njihovim odgovarajućim D-stereoizomerima ili aminokiselinama koje nisu prirodnih 20 aminokiselina, kao što su, na primer, ornitin, hidroksiprolin, citrulin, homoserin, hidroksirolin, citrulin, homoserin, hidroksilcin, norvalin. Međutim, takve supstitucije mogu takođe biti konzervativne, tj. aminokiselinski ostatak je zamenjen hemijski sličnim aminokiselinskim ostatkom. Primeri konzervativnih supstitucija su zamene među članovima sledećih grupa: 1) alanin, serin i

1

treonin; 2) asparaginova kiselina i glutaminska kiselina; 3) asparagin i glutamin; 4) arginin i lizin; 5) izoleucin, leucin, metionin i valin; i 6) fenilalanin, tirozin i triptofan.

[0047] Mutein lipokalina suze iz pronalaska može postojati kao monomerni protein. U nekim otelotvorenjima lipokalinski mutein prema pronalasku može spontano dimerizovati ili oligomerizovati. Upotreba lipokalinskih muteina koji formiraju stabilne monomerne može biti korisna u nekim primenama, npr. zbog brže difuzije i bolje penetracije tkiva. U drugim otelotvorenjima, upotreba lipokalina muteina koji spontano formira stabilne homodimere ili multimere može biti povoljna, jer takvi multimeri mogu da obezbede (dalje) povećani afinitet i/ili avidnost prema datom cilju. Pored toga, oligomerni oblici lipokalina muteina mogu imati sporije brzine disocijacije ili produženi polu-raspad seruma. Ako je poželjna dimerizacija ili multimerizacija muteina koji formiraju stabilne monomere, to se može postići, na primer, spajanjem odgovarajućih domena oligomerizacije kao što su jun-fos domeni ili leucinski zatvarači na muteine pronalaska ili upotrebom "Duocalins" (videti takođe ispod).

[0048] Lipokalinski mutein prema predstavljenom pronalasku može se dobiti mutagenezom prirodnog oblika humanog lipokalina suza. Termin "mutageneza" kako se ovde koristi znači da su eksperimentalni uslovi izabrani tako da aminokiselina koja se prirodno pojavljuje u datoj poziciji sekvence humanog lipokalina suza (Swiss-Prot baza podataka P31025) može biti supstituisana sa najmanje jednom aminokiselinom koja nije prisutan u ovoj specifičnoj poziciji u odgovarajućoj prirodnoj polipeptidnoj sekvenci. Termin "mutageneza" takođe uključuje (dodatnu) modifikaciju dužine segmenata sekvence uklanjanjem ili umetanjem jedne ili više aminokiselina. Prema tome, unutar obima pronalaska je, na primer, da jedna aminokiselina u izabranoj poziciji sekvence bude zamenjena delom od tri slučajne mutacije, što dovodi do umetanja dva aminokiselinska ostatka u poređenju sa dužinom odgovarajućeg segmenta divljeg tipa proteina. Takvo ubacivanje delecije može se uvesti nezavisno jedan od drugog u bilo kojem od peptidnih segmenata koji mogu biti podvrgnuti mutagenezi u pronalasku. U jednom primernom otelotvorenju predmetnog pronalaska, umetanje nekoliko mutacija može biti uvedeno u petlju AB odabrane lipokalinske skele (videti Međunarodnu patentnu prijavu WO 2005/019256). Termin "nasumična mutageneza" označava da nijedna unapred određena pojedinačna aminokiselina (mutacija) nije prisutna u određenoj poziciji sekvence, ali da najmanje dve aminokiseline mogu biti inkorporirane sa određenom verovatnoćom na unapred definisanoj poziciji sekvence tokom mutageneze.

1

[0049] Kodirajuća sekvenca humanog lipokalina suza (Redl, B. i dr. (1992) J. Biol. Chem. 267, 20282-20287) je korišćena kao početna tačka mutageneze peptidnih segmenata odabranih u predmetnom pronalasku. Za mutagenezu pozicija navedenih aminokiselina, stručnjak u ovoj oblasti ima na raspolaganju različite standardne metode za mutagenezu usmerenu prema mestu. Uobičajena tehnika je uvođenje mutacija pomoću PCR (polimeraza lančana reakcija) korišćenjem smeša sintetskih oligonukleotida, koji nose degenerisani bazni sastav na željenim pozicijama sekvence. Na primer, upotreba kodona NNK ili NNS (gde je N = adenin, gvanin ili citozin ili timin; K = guanin ili timin; S = adenin ili citozin dozvoljava inkorporaciju svih 20 aminokiselina plus ćuti stop kodon tokom mutageneze, dok kodon WS ograničava broj moguće ugrađenih aminokiselina na 12, pošto isključuje aminokiseline Cys, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr, Val se uključuju u odabranu poziciju polipeptidne sekvence; upotreba kodona NMS (gde je M = adenin ili citozin), na primer, ograničava broj mogućih aminokiselina na 11 na odabranoj poziciji sekvence jer isključuje aminokiseline Arg, Cys, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Val nije uključen u izabranu poziciju sekvence. U tom smislu, primećeno je da kodoni za druge aminokiseline (od redovnih 20 prirodno nastalih aminokiselina) kao što su selenocistein ili pirolizin mogu takođe biti inkorporirani u nukleinsku kiselinu muteina. Takođe je moguće, kao što je opisano od strane Wang, L., i dr. (2001) Science 292, 498-500, ili Wang, L., and Schultz, P.G. (2002) Chem. Comm. 1, 1-11, da se koriste "veštački" kodoni kao što je UAG koji se obično prepoznaju kao zaustavni kodoni da bi se ubacili druge neuobičajene aminokiseline, na primer o-metil-L-tirozin ili paminofenilalanin.

[0050] Upotreba nukleotidnih gradivnih blokova sa redukovanom specifičnošću baznih parova, kao na primer inozin, 8-okso-2'deoksigvanozin ili 6 (2-deoksi-2-D-ribofuranozil)-3,4-dihidro-8H-pirimindo-1, 2-oksazin-7-on (Zaccolo i dr. (1996) J. Mol. Biol.255, 589-603), je druga opcija za uvođenje mutacija u odabrani segment sekvence.

[0051] Dodatna mogućnost je takozvana trostruka mutageneza. Ovaj metod koristi smeše različitih nukleotidnih tripleta, od kojih svaki kodira jednu aminokiselinu, za inkorporaciju u kodirajuću sekvencu (Virnekäs B, i dr., 1994 Nucleic Acids Res 22, 5600-5607).

1

[0052] Jedna moguća strategija za uvođenje mutacija u odabranim regionima odgovarajućih polipeptida zasniva se na upotrebi četiri oligonukleotida, od kojih je svaki delimično izveden iz jedne od odgovarajućih sekvenci koje treba mutirati. Kada se sintetizuju ovi oligonukleotidi, stručnjak iz date oblasti tehnike može da koristi smeše blokova za izgradnju nukleinskih kiselina za sintezu onih nukleotidnih trojki koje odgovaraju položajima aminokiselina koje treba mutirati, tako da se pojavljuju kodoni koji kodiraju sve prirodne aminokiseline, a koje konačno nastaju rezultira u generisanju biblioteke lipokalin peptida. Na primer, prvi oligonukleotid odgovara svojoj sekvenci-osim mutiranih pozicija-kodirajućem lancu za peptidni segment koji treba mutirati na većini N-terminalnog položaja lipokalinskog polipeptida. Prema tome, drugi oligonukleotid odgovara nekodirajućem lancu za drugi segment sekvence koji sledi u polipeptidnoj sekvenci. Treći oligonukleotid odgovara redom kodirajućem lancu za odgovarajući treći segment sekvence. Konačno, četvrti oligonukleotid odgovara nekodirajućem lancu za četvrti segment sekvence. Lančana reakcija polimeraze može se izvesti sa odgovarajućim prvim i drugim oligonukleotidom i odvojeno, ako je potrebno, sa odgovarajućim trećim i četvrtim oligonukleotidom.

[0053] Produkti amplifikacije obe ove reakcije mogu se kombinovati različitim poznatim metodama u jednu nukleinsku kiselinu koja uključuje sekvencu od prvog do četvrtog segmenta sekvence, u kojoj su mutacije uvedene na odabranim položajima. U tu svrhu, oba proizvoda mogu, na primer, da se podvrgnu novoj lančanoj reakciji polimeraze koristeći bočne oligonukleotide kao i jedan ili više molekula nukleinske kiseline posrednika, koji doprinose sekvencu između drugog i trećeg segmenta sekvence. U izboru broja i rasporeda unutar sekvence oligonukleotida koji se koriste za mutagenezu, stručnjak u ovoj oblasti ima na raspolaganju brojne alternative.

[0054] Gore definisani molekuli nukleinske kiseline mogu biti povezani ligacijom sa nedostajućim 5'- i 3'-sekvencama nukleinske kiseline koja kodira lipokalinski polipeptid i/ili vektor, i može se klonirati u poznatom organizmu domaćinu. Dostupno je mnoštvo procedura za ligaciju i kloniranje. Na primer, sekvence prepoznavanja za restrikcione endonukleaze koje su takođe prisutne u sekvenci klonirajućeg vektora mogu se projektovati u sekvencu sintetskih oligonukleotida. Tako, nakon amplifikacije odgovarajućeg PCR proizvoda i enzimskog cepanja, dobijeni fragment se može lako klonirati koristeći odgovarajuće sekvence prepoznavanja.

1

[0055] Duži segmenti sekvence unutar gena koji kodiraju za protein izabran za mutagenezu mogu takođe biti podvrgnuti slučajnoj mutagenezi preko poznatih metoda, na primer upotrebom lančane reakcije polimeraze u uslovima povećane stope grešaka, hemijskom mutagenezom ili upotrebom bakterijskih mutatora. Takvi postupci se takođe mogu koristiti za dalju optimizaciju ciljnog afiniteta ili specifičnosti lipokalinskog muteina. Mutacije koje se mogu pojaviti izvan segmenata eksperimentalne mutageneze se često tolerišu ili se čak mogu pokazati kao korisne, na primer, ako doprinose poboljšanoj efikasnosti savijanja ili stabilnosti savijanja lipokalinskog muteina.

[0056] U postupku prema obelodanjivanju, molekul nukleinske kiseline koji kodira humani lipokalin suza prvo se podvrgava mutagenezi na jednoj ili više pozicija sekvence aminokiselina 27, 28, 30, 31, 33, 53, 57, 61, 64, 66 , 80, 83, 104-106 i 108 linearne polipeptidne sekvence zrelog humanog lipokalina suza. Drugo, molekul nukleinske kiseline koji kodira humani lipokalin suza je takođe podvrgnut mutagenezi na dve ili više pozicija sekvenci aminokiselina 26, 32, 34, 55, 56, 58 i 63 linearne polipeptidne sekvence zrelog humanog lipokalina suza. Od ovih poslednjih aminokiselinskih sekvenci pozicionira se najmanje jedna pozicija koju treba mutirati izabrana od pozicije aminokiselinske sekvence 58 i položaja sekvence aminokiseline 63.

[0057] U jednom otelotvorenju obelodanjivanja, postupak za generisanje muteina humanog lipokalina suza uključuje mutiranje najmanje 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 15, 16 ili 17 kodona od bilo koja od sekvenci aminokiselinskih sekvenci 26-28, 30-34, 53, 55-58, 63, 64, 66, 80, 83, 104-106 i 108 linearne polipeptidne sekvence zrelog humanog lipokalina suza. U nekim otelotvorenjima, mutein ima mutirani aminokiselinski ostatak na svakoj od sekvenci 32, 33, 34, 53, 55, 56, 57, 63, 64, 66, 80, 83, 104106 i 108 linearnog sekvenca polipeptida zrelog humanog lipokalina suza.

[0058] U jednom otelotvorenju gore pomenutog postupka, dodatno najmanje 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14 ili 15 kodona bilo koje od sekvenci aminokiselinskih sekvenci 26-28, 30- 34, 53, 55-58, 63, 64, 66, 80, 83, 104-106 i 108 linearne polipeptidne sekvence zrelog humanog lipokalina suza su mutirani.

1

[0059] U sledećem otelotvorenju obelodanjivanja, postupci obuhvataju mutaciju oba kodona koji kodiraju cistein na položajima 61 i 153 u linearnoj polipeptidnoj sekvenci zrelog humanog lipokalina suza. U jednom otelotvorenju, pozicija 61 je mutirana da kodira alanin, fenilalanin, lizin, arginin, treonin, asparagin, tirozin, metionin, serin, prolin ili ostatak triptofana, da navedemo samo nekoliko mogućnosti. U otelotvorenjima gde je pozicija 153 mutirana, aminokiselina kao što je serin ili alanin može biti uvedena na poziciju 153.

[0060] U sledećem otelotvorenju ovde opisanog obelodanjivanja, kodoni koji kodiraju pozicije sekvence aminokiselina 111 i/ili 114 linearne polipeptidne sekvence zrelog humanog lipokalina suza su mutirani da kodiraju na primer arginin na položaju 111 i triptofan na poziciji 114.

[0061] Sledeće otelotvorenje postupaka iz opisa uključuje mutagenezu kodona koji kodira cistein na poziciji 101 linearne polipeptidne sekvence zrelog humanog lipokalina suza, tako da ovaj kodon kodira bilo koju drugu aminokiselinu. U jednom otelotvorenju, položaj 101 kodiranog mutiranog kodona kodira serin. Prema tome, u nekim otelotvorenjima ili dva ili sva tri cisteinska kodona na pozicijama 61, 101 i 153 zamenjeni su kodonom druge aminokiseline.

[0062] U skladu sa metodom, mutein se dobija polazeći od nukleinske kiseline koja kodira humani lipokalin suza. Takva nukleinska kiselina je podvrgnuta mutagenezi i uvedena u pogodan bakterijski ili eukariotski organizam domaćina pomoću tehnologije rekombinantne DNK. Dobijanje biblioteke nukleinske kiseline lipokalina suza može se izvesti upotrebom bilo koje pogodne tehnike koja je poznata u struci za dobijanje lipokalinskih muteina sa svojstvima sličnim antitelima, tj. muteini koji imaju afinitet prema datoj meti. Primeri takvih kombinatornih metoda detaljno su opisani u međunarodnim patentnim prijavama WO 99/16873, WO 00/75308, WO 03/029471, WO 03/029462, WO 03/029463, WO 2005/019254, WO 2005/019255, WO 2005/019256 ili WO 2006/56464 na primer. Posle ekspresije sekvenci nukleinskih kiselina koje su bile podvrgnute mutagenezi u odgovarajućem domaćinu, klonovi koji nose genetičku informaciju za mnoštvo odgovarajućih lipokalinskih muteina, koji vezuju određeni cilj mogu biti izabrani iz dobijene biblioteke. Dobro poznate tehnike mogu se koristiti za selekciju ovih klonova, kao što je prikaz faga (pregledano u Kay, B.K. i dr. (1996) iznad; Lowman, H.B. (1997) iznad ili Rodi, D.J., i Makowski, L. (1999) iznad), skrining kolonije (pregledano u Pini, A. i dr. (2002) Comb. Chem. High Throughput

2

Screen. 5, 503-510), prikaz ribozoma (pregledan u Amstutz, P. i dr. (2001) Curr. Opin.

Biotechnol. 12, 400-405) ili mRNK prikaz kao što je objavljeno u Wilson, D.S. i dr. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 3750-3755 ili metode naročito opisane u WO 99/16873, WO 00/75308, WO 03/029471, WO 03/029462, WO 03/029463, WO 2005/019254, WO 2005/019255, WO 2005/019256 ili WO 2006/56464.

[0063] Molekul nukleinske kiseline koji kodira mutein se eksprimira korišćenjem bilo kog pogodnog ekspresionog sistema. Dobijeni mutein ili muteini su obogaćeni selekcijom i/ili izolacijom. Izbor se može izvršiti, na primer, pod konkurentnim uslovima. Konkurentni uslovi koji se ovde koriste znači da selekcija muteina obuhvata najmanje jedan korak u kome se muteini i dati ne-prirodni ligand humanog lipokalina suza, tj. IL4 alfa receptor, dovode u kontakt u prisustvu dodatnog liganda, koji se takmiče sa vezivanjem muteina za IL4 alfa receptor. Ovaj dodatni ligand može biti fiziološki ligand meta, npr. IL4, višak samog cilja ili bilo koje druge ne-fiziološke ligande meta koji veže barem jedan epitop koji se preklapa sa epitopom koji prepoznaju muteini pronalaska i na taj način interferira sa ciljnim vezivanjem muteina. Alternativno, dodatni ligand se takmiči sa vezivanjem muteina kompleksiranjem epitopa koji se razlikuje od mesta vezivanja muteina do cilja alosteričnim efektima.

[0064] Otelotvorenje tehnike fagnog prikazivanja (prikazano u Kay, B.K. i dr. (1996), iznad; Lowman, H. B. (1997) iznad ili Rodi, D.J., & Makowski, L. (1999), iznad) korišćenjem temperent M13 faga je dat kao primer metode selekcije koja se može koristiti u ovom opisu. Drugo otelotvorenje tehnologije prikazivanja faga koja se može koristiti za izbor muteina iz obelodanjivanja je tehnologija faga hiperfagije kao što je opisano u Broders i dr. (Broders i dr. (2003) "Hyperphage. Improving antibody presentation in phage display." Methods Mol. Biol.

205:295-302). Mogu se koristiti i druge fazne fage kao što je f1 ili litički fag kao što je T7. Za primer selektivnog postupka, proizvedeni su M13 fagemidi koji dozvoljavaju ekspresiju mutirane sekvence nukleinske kiseline lipokalina kao fuzioni protein sa signalnom sekvencom na N-terminusu, kao što je OmpA-signalna sekvenca, i sa pilulom kapsidnog proteina fag M13 ili njegovi fragmenti koji se mogu inkorporirati u kapsid faga na C-završetku. C-terminalni fragment ΔpIII proteinskog kapsida koji uključuje aminokiseline 217 do 406 divljeg tipa može se koristiti za proizvodnju fuzionih proteina. U jednom otelotvorenju koristi se C-terminalni fragment pilule, u kome nedostaje cisteinski ostatak na poziciji 201 ili je zamenjen drugom aminokiselinom.

[0065] Prema tome, dalje otelotvorenje postupaka iz opisa uključuje operativno spajanje nukleinske kiseline koja kodira jedan ili više muteina humanog lipokalina suza i koja je rezultat mutageneze na 3' kraju sa genom koji kodira za pilulu proteina omotača filamentoznog bakteriofaga porodice M13 ili fragment ovog proteina omotača, da bi se izabrao najmanje jedan mutein za vezivanje datog liganda.

[0066] Fuzioni protein može da sadrži dodatne komponente kao što je afinitetna oznaka, koja omogućava imobilizaciju, detekciju i/ili prečišćavanje fuzionog proteina ili njegovih delova. Pored toga, stop kodon može biti lociran između sekvencijskih regiona koji kodiraju lipokalin ili njegove muteine i fagni kapsidni gen ili njegovi fragmenti, pri čemu je stop kodon, kao što je amber stop kodon, bar delimično preveden u aminokiselinu tokom translacije u pogodnom supresorskom soju.

[0067] Na primer, fazmidni vektor pTLPC27, koji se sada takođe naziva pTlc27 koji je ovde opisan, može se koristiti za pripremu fagemidne biblioteke koja kodira muteine humanih lipokalina suza. Inventivni molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju muteine lipokalina suza su ubačeni u vektor koristeći dva BstXI restrikciona mesta. Posle ligacije, odgovarajući soj domaćina, kao što je E. coli XL1-Blue, transformiše se dobijenom smešom nukleinske kiseline da bi se dobio veliki broj nezavisnih klonova. Odgovarajući vektor se može generisati za pripremu hiperfagemidne biblioteke, ako se želi.

[0068] Dobijena biblioteka je zatim superinficirana u tečnoj kulturi sa odgovarajućim M13-pomoćnim fagom ili hiperfagom da bi se proizveli funkcionalni fagemidi. Rekombinantni fagemid prikazuje lipokalinski mutein na svojoj površini kao fuziju sa pilulom proteina omotača ili njenim fragmentom, dok se N-terminalna signalna sekvenca fuzionog proteina normalno odvaja. S druge strane, on takođe nosi jednu ili više kopija izvornog kapsidnog proteina pIII obezbeđenog fagom pomagača i na taj način je sposoban da zarazi primaoca, generalno bakterijski soj koji nosi F- ili F'-plazmid. U slučaju hiperfagmida, hiperfagemidi prikazuju lipokalinske muteine na svojoj površini kao fuziju sa infektivnim proteinom pIII pIII, ali bez prirodnog kapsidnog proteina. Tokom ili posle infekcije sa fagom pomagača ili hiperfagom, može se indukovati ekspresija gena fuzionog proteina između lipokalinskog muteina i pilule kapsidnog proteina, na primer dodavanjem anhidrotetraciklina. Uslovi indukcije se biraju tako da značajna frakcija dobijenih fagemida prikazuje najmanje jedan lipokalinski mutein na njihovoj površini. U slučaju hiperfagnog prikaza, indukcioni uslovi rezultiraju populacijom hiperfagemida koji nose između tri i pet fuzionih proteina koji se sastoje od muteina lipokalina i pilule kapsidnog proteina. Poznati su različiti postupci za izolovanje fagemida, kao što je taloženje sa polietilen glikolom. Izolacija se obično javlja nakon perioda inkubacije od 6-8 sati.

[0069] Izolovani fazmidi se zatim mogu podvrgnuti selekciji inkubacijom sa željenim ciljem, pri čemu je meta predstavljena u formi koja omogućava najmanje privremenu imobilizaciju onih fagemida koji nose muteine sa željenom aktivnošću vezivanja kao fuzioni proteini u njihovom omotaču. Među različitim ostvarenjima poznatim stručnjaku u ovoj oblasti, cilj može, na primer, biti konjugovan sa proteinom nosača kao što je serumski albumin i biti vezan preko ovog nosećeg proteina na površinu za vezivanje proteina, na primer polistiren. Mikrotitarske ploče pogodne za ELISA tehnike ili takozvani "imuno-štapići" mogu se, na primer, koristiti za takvu imobilizaciju cilja. Alternativno, mogu se koristiti konjugati mete sa drugim vezujućim grupama, kao što je biotin. Meta zatim može biti imobilisana na površini koja selektivno vezuje ovu grupu, na primer mikrotitarske ploče ili paramagnetne čestice obložene streptavidinom, neutravidinom ili avidinom. Ako je meta fuzionisana sa Fc delom imunoglobulina, imobilizacija se takođe može postići sa površinama, na primer mikrotitarskim pločama ili paramagnetnim česticama, koje su obložene proteinom A ili proteinom G.

[0070] Ne-specifična fagemid-vezujuća mesta prisutna na površinama mogu biti zasićena rastvorima za blokiranje kao što su poznata za ELISA metode. Fagemidi se zatim tipično dovode u kontakt sa metom imobilizovanim na površini u prisustvu fiziološkog pufera.

Nevezani fagemidi se uklanjaju višestrukim ispiranjem. Fagemidne čestice koje ostaju na površini se zatim eluiraju. Za eluiranje je moguće nekoliko metoda. Na primer, fagemidi se mogu eluirati dodavanjem proteaza ili u prisustvu kiselina, baza, deterdženata ili haotropnih soli ili pod umereno denaturacionim uslovima. Jedan takav postupak je eluiranje korišćenjem pufera pH 2.2, gde se eluat zatim neutrališe. Alternativno, može se dodati rastvor slobodnog cilja da bi konkurisao sa imobilizovanim ciljem za vezivanje za fagemide ili ciljno-specifični fagemidi mogu da se eluiraju konkurencijom sa imunoglobulinima ili prirodnim ligandnim proteinima koji se specifično vezuju za ciljnu grupu.

2

[0071] Nakon toga, ćelije E. coli su inficirane eluiranim fagemidima. Alternativno, nukleinske kiseline se mogu ekstrahovati iz eluiranih fagemida i koristite za analizu sekvenci, amplifikaciju ili transformaciju ćelija na drugi način. Polazeći od klonova E. coli koji su dobijeni na ovaj način, sveži fagemidi ili hiperfagemidi se ponovo proizvode superinfekcijom sa M13 pomoćnim fagama ili hiperfagom prema iznad opisanom postupku i fagemidi pojačani na ovaj način ponovo podvrgavaju selekciji na imobilizovanim cilj. Višestruki ciklusi selekcije su često neophodni da bi se dobili fagemidi sa muteinima pronalaska u dovoljno obogaćenom obliku. Broj ciklusa selekcije je u nekim otelotvorenjima izabran na takav način da u kasnijoj funkcionalnoj analizi najmanje 0.1% ispitivanih klonova proizvodi muteine sa detektabilnim afinitetom za dati cilj. U zavisnosti od veličine, tj. složenosti korišćene biblioteke, obično je potrebno 2 do 8 ciklusa.

[0072] Za funkcionalnu analizu odabranih muteina, soj E. coli je inficiran sa fagemidima dobijenim iz selekcionih ciklusa i izolovana je odgovarajuća dvolančana fazmidna DNK. Polazeći od ove fazmidne DNK, ili isto tako iz jednolančane DNK ekstrahovane iz fagemida, sekvence nukleinskih kiselina odabranih muteina iz pronalaska mogu se odrediti postupcima poznatim u struci i iz toga se može izvesti sekvenca aminokiselina. Mutirana oblast ili sekvenca celokupnog lipokalina muteina suza može se podklonirati na drugi ekspresioni vektor i eksprimirati u pogodnom organizmu domaćina. Na primer, vektor pTLPC26 koji se sada takođe naziva pTlc26 može da se koristi za ekspresiju u sojevima E. coli kao što je E.coli TG1. Tako proizvedeni muteini lipokalina suza mogu se prečistiti različitim biohemijskim metodama. Proizvedeni mutein lipokalina suze, na primer sa pTlc26, može da nosi afinitetni peptid, takozvani afinitetni tag, na primer na svom C-kraju i može se stoga prečistiti afinitetnom hromatografijom. Primeri afinitetnih oznaka uključuju, ali nisu ograničeni na biotin, Strep-oznaka, Strep-oznaka II (Schmidt i dr., Iznad), oligohistidin, polihistidin, domen imunoglobulina, protein za vezivanje maltoze, glutation-S-transferaza (GST) ili vezujući peptid kalmodulina (CBP).

[0073] Neke afinitetne oznake su hapteni, na primer ali bez ograničenja, dinitrofenol i digoksigenin. Neke oznake afiniteta su oznake epitopa, kao što su FLAG®-peptid (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Gly), T7 epitop (Ala-Ser-Met-Thr-Gly-Gly-Gln-Gln-Met-Gly), protein za vezivanje maltoze (MBP), HSV epitop sekvence Gln-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-GluAsp-Pro-Glu-Asp glikoproteina D herpes simpleks virusa, epitopa hemaglutinina (HA) sekvence Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala, the VSV-G epitop virusnog glikoproteina vezikularnog stomatitisa (Cys-Tyr-The-Asp-Ile-Glu-Met-Asn-Arg-Leu-Lys), E epitop oznaka sekvence Gly-Ala-Pro-Val-Pro-Tyr-Pro-Asp-Pro-Leu-Glu-Pro-Arg, E2 epitop oznaka sekvence Gly-Val-Ser-Ser-Thr-Ser-Ser-Asp-Phe-Arg-Asp-Arg, Tag-100 epitop oznaka C-krajeva sisara MAPK/ERK kinaza sekvence Glu-Glu-Thr-Ala-Arg-Phe-Gln-Pro-Gly-Tyr-Arg-Ser, S-oznaka sekvence Lys-Glu-Thr-Ala-Ala-Ala-Lys-Phe-Glu-Arg-Gln-His-Met-Asp-Ser, "myc" epitop transkripcijskog faktora c-myc sekvence Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu i mali V5 epitop prisutni su na P i V proteinima paramiksovirusa Simian virusa 5 (Gly-Lys-Pro-Ile-Pro-Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-Asp-Ser-Thr). Pored toga, ali generalno ne kao pojedinačna oznaka, može se koristiti oznaka za povećanje rastvorljivosti kao što je NusA, tioredoksin (TRX), mali modifikator sličan ubikvitinu (SUMO) i ubikvitin (Ub). Hapteni i epitopne oznake se mogu koristiti u kombinaciji sa odgovarajućim antitelom ili antitelom kao proteinski molekul kao partner za vezivanje. Epitop S-peptida sekvence Lys-Glu-Thr-Ala-Ala-Ala-Lys-Phe-Glu-Arg-Gln-His-Met-Asp-Ser može se koristiti kao epitopna oznaka u vezi sa odgovarajućim antitelom ili u kombinaciji sa S-proteinom kao vezujućim partnerom (Hackbarth, JS, i dr., BioTechniques (2004) 37, 5, 835-839).

[0074] Izbor se može izvršiti i pomoću drugih metoda. Mnogi odgovarajući oblici su poznati stručnjacima ili su opisani u literaturi. Štaviše, može se primeniti kombinacija postupaka. Na primer, klonovi koji su izabrani ili barem obogaćeni "fagnim prikazom" mogu dodatno biti podvrgnuti "skriningu kolonija". Ova procedura ima prednost da se pojedinačni klonovi mogu direktno izolovati u odnosu na proizvodnju muteina lipokalina suza sa detektabilnim afinitetom vezivanja za cilj.

[0075] Pored upotrebe E. coli kao organizma domaćina u tehnici "fagnog prikazivanja" ili u metodi "skrininga kolonija", za ovu svrhu mogu se koristiti drugi bakterijski sojevi, kvasci ili takođe ćelije insekata ili ćelije sisara. Pored selekcije muteina suze lipokalina iz slučajne biblioteke kao što je gore opisano, evolutivne metode, uključujući ograničenu mutagenezu, mogu se takođe primeniti da bi se optimizovao mutein koji već poseduje neku aktivnost vezivanja za cilj u odnosu na afinitet ili specifičnost za ciljni posle ponovljenih ciklusa skrininga.

2

[0076] Lako je očigledno za stručnu osobu da formiranje kompleksa zavisi od mnogih faktora kao što su koncentracija partnera za vezivanje, prisustvo konkurenata, jonska snaga pufer sistema itd. Izbor i obogaćivanje se generalno obavlja u uslovima koji omogućavaju izolaciju lipokalina muteini koji u kompleksu sa željenim ciljem imaju konstantu disocijacije od najmanje 200 nM. Međutim, koraci za ispiranje i eluiranje mogu se izvesti pod različitom strogošću. Moguća je i selekcija u odnosu na kinetičke karakteristike. Na primer, selekcija se može izvesti pod uslovima koji pogoduju kompleksnom formiranju cilja sa muteinima koji pokazuju sporo disocijaciju od cilja, ili drugim rečima nisku stopu kOff. Alternativno, selekcija se može vršiti pod uslovima koji pogoduju brzom formiranju kompleksa između muteina i meta, ili drugim rečima visoke stope kOn. Kao dodatna ilustrativna alternativa, skrining se može izvesti pod uslovima koji se odabiru za poboljšanu termostabilnost muteina (u poređenju sa bilo kojim tipom lipokalina suza divljeg tipa ili muteinom koji već ima afinitet prema prethodno odabranoj meti).

[0077] Jednom kada je odabran mutein sa afinitetom prema datom cilju, dodatno je moguće da se takav mutein podvrgne drugoj mutagenezi da bi se potom selektovale varijante još višeg afiniteta ili varijante sa poboljšanim svojstvima, kao što je veća termostabilnost, poboljšana stabilnost seruma, termodinamička stabilnost, poboljšana rastvorljivost, poboljšano monomerno ponašanje, poboljšana otpornost na toplotnu denaturaciju, hemijsku denaturaciju, proteolizu ili deterdžente itd. Ova dodatna mutageneza, koja se u slučaju cilja na viši afinitet može smatrati in vitro "afinitetnim sazrevanjem", može se postići specifičnom mutacijom na lokaciji zasnovanoj na racionalnom dizajnu ili slučajnoj mutaciji. Drugi mogući pristup za dobijanje višeg afiniteta ili poboljšanih svojstava je upotreba PCR-a koja je sklon grešci, što rezultira točkastim mutacijama preko izabranog opsega položaja sekvence lipokalina muteina. PCR koji je sklon grešci može se izvesti u skladu sa bilo kojim poznatim protokolom kao što je onaj opisan u Zaccolo i dr. J. Mol. Biol.255, 589-603. Druge metode slučajne mutageneze koje su pogodne za takve svrhe uključuju mutagenezu slučajnog umetanja/brisanja (RID) kao što je opisano u Murakami, H i dr. (2002) Nat.Biotechnol.20, 76-81 ili nehomolognu nasumičnu rekombinaciju (NRR) kao što je opisano u Bittker, J. A i dr. (2002) Nat.

Biotechnol. 20,1024-1029. Ako se želi, sazrevanje afiniteta se takođe može izvesti prema postupku opisanom u WO 00/75308 ili Schlehuber, S. i dr., (2000) J. Mol. Biol.297, 1105-1120, gde su dobijeni muteini bilin-vezujućeg proteina koji imaju visok afinitet za digoksigenin.

2

[0078] Mutein lipokalina suze iz ovog pronalaska može da se koristi za formiranje kompleksa sa alfa receptorom IL4. Mutein može takođe biti u stanju da vezuje imunogeni fragment IL4 alfa receptora . Imunogeni fragment IL-4 alfa receptora je fragment koji ima jedan ili više epitopa, mimotopa ili drugih antigenskih determinanti, i prema tome je sposoban da indukuje imuni odgovor ili protiv koga se može podići antitelo. Imunogeni fragment može uključivati jedan epitop ili može imati veći broj epitopa. Od antigen-prezentujućeg sistema, npr. protein nosača, može se koristiti za obezbeđivanje veličine koja je potrebna za prepoznavanje od strane imunog sistema, bez određenog ograničenja veličine za imunogeni fragment. Prema tome, imunogeni fragment može takođe biti "hapten", tj. fragment koji ne mora biti antigenski sam od sebe ili može imati nisku imunogenost, naročito zbog svoje male molekulske težine i shodno tome veličine. Tipično imunogeni fragment može, sam ili kada je predstavljen na nosaču, biti vezan imunoglobulinom ili T staničnim receptorom (TCR) ako je predstavljen sa MHC molekulima. Imunogeni fragment je tipično, sam ili kada je predstavljen u obliku sistema za predstavljanje antigena, sposoban da indukuje humoralni imuni odgovor i/ili ćelijski imuni odgovor koji vodi, na primer, do aktivacije B- i/ili T-limfocita.

[0079] Cilj muteina iz ovog pronalaska je alfa lanac receptora interleukina-4, transmembranski protein, koji sadrži vanćelijski domen od 207 aminokiselina. Postoji sekretni oblik ekstracelularnog domena, sIL-4R alfa, koji je takođe poznat kao CD124 i koji može da blokira aktivnosti IL-4. Mutein iz ovog pronalaska može da se veže za sIL-4 alfa receptor kao i bilo koji deo ekstracelularnog domena IL4 alfa receptora .

[0080] U ovom kontekstu takođe je primećeno da na formiranje kompleksa između odgovarajućeg muteina i njegovog liganda utiču mnogi različiti faktori kao što su koncentracije odgovarajućih veznih partnera, prisustvo konkurenata, pH i jonska snaga korišćenog puferskog sistema, i eksperimentalna metoda koja se koristi za određivanje konstante disocijacije KD(na primer fluorescentna titracija, kompetetivna ELISA ili površinska plazmonska rezonanca, da samo navedemo nekoliko) ili čak matematički algoritam koji se koristi za procenu eksperimentalnih podataka.

[0081] Prema tome, stručnjaku je takođe jasno da KDvrednosti (konstanta disocijacije kompleksa formiranog između odgovarajućeg muteina i njegovog liganda) mogu da variraju u

2

okviru određenog eksperimentalnog opsega, u zavisnosti od metode i eksperimentalne postavke koja se koristi za određivanje afiniteta određenog lipokalinskog muteina za dati ligand. To znači da može postojati neznatno odstupanje u izmerenim KDvrednostima ili opsegu tolerancije u zavisnosti, na primer, od toga da li je vrednost KDodređena površinskom plazmonskom rezonancom (Biacore) ili kompetetivnim ELISA.

[0082] U opseg ovog pronalaska uključeni su i oblici gore navedenih muteina, u kojima je odgovarajući mutein izmenjen ili modifikovan u odnosu na njegovu potencijalnu imunogenost.

[0083] Citotoksične T-ćelije prepoznaju peptidne antigene na ćelijskoj površini antigenprezentujuće ćelije u vezi sa molekulom velikog histokompatibilnosti klase I (MHC).

Sposobnost peptida da se vežu za MHC molekule je specifičan alel i u vezi je sa njihovom imunogeničnošću. Da bi se smanjila imunogenost datog proteina, sposobnost da se predvidi koji peptidi u proteinu imaju potencijal da se vežu za dati molekul MHC je od velike vrednosti. Prethodno su opisani pristupi koji koriste kompjuterski pristup za identifikaciju potencijalnih epitopa za T-ćelije da bi se predvidelo vezivanje date peptidne sekvence za MHC molekule klase I (Altuvia i dr. (1995) J. Mol. Biol.249, 244-250).

[0084] Takav pristup se takođe može koristiti za identifikaciju potencijalnih epitopa za T-ćelije u muteinima ovog pronalaska i da se u zavisnosti od njegove namene koristi selekcija specifičnog muteina na osnovu njegove predviđene imunogenosti. Dalje je moguće da se peptidni regioni za koje se predviđa da sadrže epitope T-ćelija podvrgnu dodatnoj mutagenezi da bi se smanjili ili eliminisali ti epitopi T-ćelija i na taj način smanjili imunogenost. Opisano je uklanjanje amfipatskih epitopa iz genetički modifikovanih antitela (Mateo i dr. (2000) Hybridoma 19, 6, 463-471) i mogu biti prilagođeni muteinima predmetnog pronalaska.

[0085] Tako dobijeni muteini mogu imati minimiziranu imunogenost, koja je poželjna za njihovu upotrebu u terapeutskim i dijagnostičkim primenama, kao što su one opisane ispod.

[0086] Za neke primene, takođe je korisno da se koriste muteini pronalaska u obeleženom obliku. Prema tome, pronalazak je takođe usmeren na lipokalinske muteine koji su konjugovani na etiketu izabranu iz grupe koja se sastoji od enzimskih oznaka, radioaktivnih

2

oznaka, obojenih etiketa, fluorescentnih etiketa, hromogenih etiketa, luminiscentnih etiketa, haptena, digoksigenina, biotina, metalnih kompleksa, metala , i koloidno zlato. Mutein se takođe može konjugovati sa organskim jedinjenjem male molekulske težine. Termin "organsko jedinjenje male molekulske težine", kako se ovde koristi, označava monomerno jedinjenje na bazi ugljenika, koje može imati alifatske, aliciklične i/ili aromatične ostatke. U tipičnim otelotvorenjima, organsko jedinjenje male molekulske težine je organsko jedinjenje koje ima glavni lanac od najmanje dva atoma ugljenika, au nekim realizacijama ne više od 7 ili 12 rotirajućih ugljeničnih veza. Takvo jedinjenje ima molekulsku masu u opsegu od oko 100 do oko 2000 Daltona, kao što je od oko 100 do oko 1000 Daltona. Opciono može da sadrži jedan ili dva atoma metala.

[0087] Uopšteno, lipokalin mutein je moguće obeležiti bilo kojom odgovarajućom hemijskom supstancom ili enzimom, koji direktno ili indirektno generiše detektabilno jedinjenje ili signal u hemijskoj, fizičkoj, optičkoj ili enzimatskoj reakciji. Primer za fizičku reakciju i istovremeno optičku reakciju/marker je emisija fluorescencije nakon zračenja ili emisije X zraka kada se koristi radioaktivna oznaka. Alkalna fosfataza, peroksidaza hrena ili βgalaktozidaza su primeri enzimskih oznaka (i istovremeno optičkih oznaka) koje katalizuju formiranje hromogenih reakcionih proizvoda. Uopšteno, sve oznake koje se obično koriste za antitela (osim onih koje se isključivo koriste sa šećernim ostatkom u Fc delu imunoglobulina) mogu se takođe koristiti za konjugaciju sa muteinima ovog pronalaska. Muteini pronalaska mogu takođe biti konjugovani sa bilo kojim pogodnim terapeutski aktivnim sredstvom, npr., za ciljanu isporuku takvih agenasa u datu ćeliju, tkivo ili organ ili za selektivno ciljanje ćelija, npr., tumorskih ćelija bez uticaja na okruženje normalne ćelije. Primeri takvih terapeutski aktivnih sredstava uključuju radionuklide, toksine, male organske molekule i terapeutske peptide (kao što su peptidi koji deluju kao agonisti/antagonisti receptora na površini ćelije ili peptidi koji se bore za mesto vezivanja proteina na datoj ćelijskoj meti). Međutim, muteinski lipokalini iz ovog pronalaska mogu takođe biti konjugovani sa terapeutski aktivnim nukleinskim kiselinama kao što su antisens molekuli nukleinske kiseline, male interferirajuće RNK, mikro RNK ili ribozomi. Takvi konjugati mogu biti proizvedeni postupcima dobro poznatim u tehnici.

[0088] U jednom otelotvorenju, muteini iz ovog pronalaska mogu takođe biti pridruženi sa ciljnim ostatkom koji cilja na specifičnu oblast tela da bi se isporučili inventivni muteini u

2

željeni region ili područje unutar tela. Jedan primer gde takva modifikacija može biti poželjna je prelazak krvno-moždane barijere. Da bi se prešlo krvno-moždanu barijeru, muteini iz ovog pronalaska se mogu povezati sa delovima koji olakšavaju aktivni transport preko ove barijere (videti Gaillard PJ, i dr., Difterijaa-toksinski receptor-ciljani isporuka lekova za mozak.

International Congress Series, 20051277, 185-198 ili Gaillard PJ, i dr. Ciljana isporuka preko krvno-moždane barijere. Expert Opin Drug Deliv.2005 2, 2, 299-309. Takve grupe su, na primer, dostupne pod trgovačkim imenom 2B-Trans™ (do-BBB tehnologije BV, Leiden, NL)).

[0089] Kao što je iznad naznačeno, mutein pronalaska može u nekim realizacijama biti konjugovan sa ostatkom koji produžava polu-raspad seruma muteina (u ovom pogledu videti takođe PCT prijava WO 2006/56464 gde su takve strategije konjugacije opisane sa referencama na muteine humanog neutrofilnog želatinastog lipokalina sa afinitetom vezivanja za CTLA-4). Grupa koja produžava polu-raspad seruma može biti molekul polialkilen glikola, hidroksietil skrob, molekuli masne kiseline, kao što je palmitinska kiselina. (Vajo & Duckworth 2000, Pharmacol. Rev.52, 1-9), Fc deo imunoglobulina, CH3 domen imunoglobulina, CH4 domen imunoglobulina, albumin ili njegov fragment, peptid koji vezuje albumin, ili protein koji vezuje albumin, transferin da navedemo samo neke. Protein koji vezuje albumin može biti bakterijski albumin koji veže protein, antitelo, fragment antitela uključujući domenska antitela (vidi US patent 6,696,245, na primer), ili lipokalin muteina sa vezujućim aktivnostima za albumin. U skladu sa tim, pogodni partneri za konjugaciju za produženje polu-raspada lipokalinskog muteina iz pronalaska uključuju albumin (Osborn, B.L. i dr., 2002, J. Pharmacol. Exp. Ther. 303, 540-548) ili protein za vezivanje albumina, na primer, bakterijski albumin vezujući domen, kao što je streptokokni protein G (König, T., & Skerra, A. (1998) J. Immunol. Methods 218, 73-83). Drugi primeri peptida koji vezuju albumin koji se mogu koristiti kao partneri za konjugaciju su, na primer, oni koji imaju a Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys konsenzus sekvenca, pri čemu Xaa1je Asp, Asn, Ser, Thr ili Trp; Xaa2je Asn, Gin, His, lie, Leu ili Lys; Xaa3je Ala, Asp, Phe, Trp ili Tyr; i Xaa4je Asp, Gly, Leu, Phe, Ser ili Thr kao što je opisano u patentnoj prijavi SAD 2003/0069395 ili Dennis i dr. (Dennis, M. S., Zhang, M., Meng, Y. G., Kadkhodayan, M., Kirchhofer, D., Combs, D. & Damico, L. A. (2002) J Biol Chem 277, 35035-35043).

[0090] U drugim otelotvorenjima, sam albumin ili biološki aktivni fragment albumina mogu se koristiti kao partneri za konjugaciju lipokalina muteina pronalaska. Termin "albumin" uključuje sve albumine sisara kao što je humani serumski albumin ili goveđi serum albumin ili albumin pacova. Albumin ili njegov fragment se može rekombinantno proizvesti kao što je opisano u patent SAD 5,728,553 ili Evropske patentne prijave EP 0330 451 i EP 0361 991. Rekombinantni humani albumin (Recombumin®) Novozymes Delta Ltd. (Nottingham, UK) može biti konjugovan ili spojen sa lipokalinom muteina da bi se produžio polu-raspad muteina.

[0091] Ako je protein koji vezuje albumin fragment antitela, on može biti antitelo domena. Antitela domena (dAbs) su konstruisana da omoguće preciznu kontrolu nad biofizičkim svojstvima i polu-životom in vivo da bi se stvorio optimalni profil proizvoda za bezbednost i efikasnost. Antitela domena su na primer komercijalno dostupna od Domantis Ltd.

(Cambridge, UK i MA, SAD).

[0092] Koristeći transferin kao deo za produženje polu-raspada seruma muteina iz ovog pronalaska, muteini mogu biti genetički fuzionisani sa N ili C terminalom, ili oba, neglikozilovanog transferina. Ne-glikozilovani transferin ima polu-raspad od 14-17 dana, a fuzioni protein transferina će slično imati produženi polu-raspad. Nosač transferina takođe obezbeđuje visoku bioraspoloživost, biodistribuciju i stabilnost cirkulacije. Ova tehnologija je komercijalno dostupna od BioRexis (BioRexis Pharmaceutical Corporation, PA, SAD).

Rekombinantni humani transferin (DeltaFerrin ™) za upotrebu kao stabilizator proteina/partner za produženje polu-raspada je takođe komercijalno dostupan od Novozymes Delta Ltd. (Nottingham, UK).

[0093] Ako se Fc deo imunoglobulina koristi u svrhu produženja polu-života seruma muteina pronalaska, može se koristiti SynFusion™ tehnologija, komercijalno dostupna od Syntonix Pharmaceuticals, Inc (MA, SAD). Upotreba ove Fc-fuzione tehnologije omogućava stvaranje biofarmaceutika dužeg dejstva i može se, na primer, sastojati od dve kopije muteina vezanog za Fc region antitela za poboljšanje farmakokinetike, rastvorljivosti i efikasnosti proizvodnje.

[0094] Još jedna alternativa za produženje polu-života muteina iz pronalaska je fuzija sa N- ili C-terminusom muteina pronalaska dugih, nestrukturiranih, fleksibilnih sekvenci bogatih

1

glicinom (na primer poli-glicin sa oko 20 do 80 uzastopnih ostataka glicina). Ovaj pristup je obelodanjen u WO2007/038619 na primer, ima takođe termin "rPEG" (rekombinantni PEG).

[0095] Ako se polialkilen glikol koristi kao partner za konjugaciju, polialkilen glikol može biti supstituisan, nesupstituisan, linearan ili razgranat. Takođe može biti aktivirani polialkilenski derivat. Primeri pogodnih jedinjenja su molekuli polietilen glikola (PEG) kao što je opisano u WO 99/64016 u patentu SAD 6,177,074 ili u Patentu SAD 6,403,564 in u vezi sa interferonom, ili kao što je opisano za druge proteine kao što su PEG-modifikovana asparaginaza, PEG-adenozin deaminaza (PEG-ADA) ili PEG-superoksid dismutaza (videti na primer, Fuertges i dr. (1990) The Clinical Efficacy of Poly(Ethylene Glycol)-Modified Proteins J. Control. Release 11, 139-148). Molekulska težina takvog polimera, kao što je polietilen glikol, može biti u opsegu od oko 300 do oko 70.000 Daltona, uključujući, na primer, polietilen glikol sa molekulskom težinom od oko 10.000, od oko 20.000, od oko 30.000 ili od oko 40.000 Daltona. Čak šta više, kao što je npr. opisano u patentima SAD 6,500,930 ili 6,620,413, ugljenohidrati oligo- i polimeri kao što su skrob ili hidroksietil škrob (HES) mogu biti konjugovani sa muteinom ovog pronalaska u svrhu produženja polu-raspada u serumu.

[0096] Ako je jedna od gornjih grupa konjugovana sa humanim muteinom lipokalina suza iz pronalaska, konjugacija na bočni lanac aminokiseline može biti povoljna. Pogodni aminokiselinski bočni lanci mogu se prirodno pojaviti u aminokiselinskoj sekvenci humanog lipokalina suze ili mogu biti uvedeni mutagenezom. U slučaju da je pogodno mesto vezivanja uvedeno preko mutageneze, jedna mogućnost je zamena aminokiseline na odgovarajućem položaju sa cisteinskim ostatkom. U jednom otelotvorenju, takve mutacije uključuju barem jednu od Thr 40→ Cys, Glu 73→ Cys, Arg 90→ Cys, Asp 95→ Cys ili Glu 131→ Cys supstitucija. Novo-stvoreni cisteinski ostatak na bilo kom od ovih položaja može se u sledećem koristiti za konjugiranje muteina sa ostatkom koji produžava polu-raspad seruma muteina, kao što je PEG ili njegov aktivirani derivat.

[0097] U još jednom otelotvorenju, da bi se obezbedili odgovarajući bočni lanci aminokiselina za konjugovane jedne od gornjih grupa sa muteinima ovog pronalaska, veštačke aminokiseline mogu biti uvedene mutagenezom. Generalno, takve veštačke aminokiseline su dizajnirane da budu reaktivnije i na taj način olakšavaju konjugaciju sa

2

željenom grupom. Jedan primer takve umetne aminokiseline koja se može uvesti putem veštačke tRNK je para-acetil-fenilalanin.

[0098] Za nekoliko primena ovde opisanih muteina može biti korisno da se koriste u obliku fuzionih proteina. U nekim otelotvorenju, inventivni mutein humanog lipokalina suza je fuzionisan na svom N-kraju ili njegovom C-kraju sa proteinom, proteinskim domenom ili peptidom kao što je signalna sekvenca i/ili afinitetna oznaka.

[0099] Za farmaceutske primene, mutein iz ovog pronalaska može biti fuzionisan sa fuzionim partnerom koji produžava in vivo serumski polu-raspad muteina (videti ponovo PCT objava WO 2006/56464 gde su opisani pogodni fuzioni partneri sa referencama na muteine humanog neutrofilnog želatinastog lipokalina sa afinitetom vezivanja za CTLA-4). Slično konjugatima opisanim iznad, fuzioni partner može biti Fc deo imunoglobulina, CH3 domen imunoglobulina, CH4 domen imunoglobulina, albumin, peptid koji vezuje albumin ili protein koji vezuje albumin, da navedemo samo nekoliko. Opet, protein vezujući albumin može biti bakterijski albumin koji veže protein ili lipokalinski mutein sa aktivnostima vezivanja za albumin. Shodno tome, pogodni fuzioni partneri za produženje polu-raspada muteina lipokalina iz pronalaska uključuju albumin (Osborn, B.L. i dr. (2002) iznad J. Pharmacol. Exp. Ther.303, 540-548) ili protein za vezivanje albumina, na primer, bakterijski albumin vezujući domen, kao što je streptokokni protein G (Konig, T., & Skerra, A. (1998) J.

Immunol. Methods 218, 73-83). Peptidi vezivanja albumina opisani u Dennis i dr, iznad (2002) ili patentnoj prijavi SAD 2003/0069395 koji imaju Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys konsenzusne sekvence, gde Xaa1je Asp, Asn, Ser, Thr ili Trp; Xaa2je Asn, Gln, His, lie, Leu ili Lys; Xaa3je Ala, Asp, Phe, Trp ili Tyr; i Xaa4is Asp, Gly, Leu, Phe, Ser je Thr mogu takođe biti upotrebljeni kao fuzioni partneri. Takođe je moguće koristiti sam albumin ili biološki aktivni fragment albumina kao fuzionog partnera lipokalina muteina pronalaska. Termin "albumin" uključuje sve albumine sisara kao što je humani serumski albumin ili goveđi serumski albumin ili pacovski serumski albumin. Rekombinantna proizvodnja albumina ili njihovih fragmenata je dobro poznata u tehnici i na primer opisana u patentu SAD 5,728,553, Evropskoj patentnoj prijavi EP 0330 451 ili EP 0361 991.

[0100] Fuzioni partner može dati nove karakteristike inventivnom lipokalinu muteina, kao što je enzimska aktivnost ili afinitet vezivanja za druge molekule. Primeri pogodnih fuzionih proteina su alkalna fosfataza, peroksidaza hrena, glutation-S-transferaza, domen za vezivanje albumina proteina G, protein A, fragmenti antitela, oligomerizacioni domeni, muteini lipokalina iste ili različite specifičnosti vezivanja (što rezultira formacijom "Duocalins", videti Schlehuber, S., i Skerra, A. (2001), Duocalins, projektovani ligand-vezujući proteini sa dvostrukom specifičnošću izvedeni iz lipokalinskog nabora. Biol. Chem. 382, 1335-1342) ili toksini.

[0101] Posebno, moguće je spojiti lipokalinski mutein iz ovog pronalaska sa odvojenim aktivnim mestom enzima tako da obe "komponente" rezultujućeg fuzionog proteina zajedno deluju na datu terapeutsku metu. Vezujući domen muteina lipokalini se veže na cilj koji izaziva bolest, dozvoljavajući domenu enzima da ukine biološku funkciju cilja.

[0102] Oznake afiniteta kao što su Strep-oznaka® ili Strep-oznaka® II (Schmidt, T.G.M. i dr. J. Mol. Biol.255, 753-766), myc-oznaka, FLAG-oznaka, His6-oznaka ili HA-oznaka ili proteini kao što je glutation-S-transferaza takođe omogućavaju lako detektovanje i/ili prečišćavanje rekombinantnih proteina su dodatni primeri pogodnih fuzionih partnera.

Konačno, proteini sa hromogenim ili fluorescentnim svojstvima kao što su zeleni fluorescentni protein (GFP) ili žuti fluorescentni protein (IFP) su pogodni fuzioni partneri za lipokalinski mutein pronalaska.

[0103] Termin "fuzioni protein", kako se ovde koristi, takođe uključuje lipokalinske muteine prema pronalasku koji sadrže signalnu sekvencu. Signalne sekvence na N-terminusu polipeptida usmeravaju ovaj polipeptid u specifični ćelijski deo, na primer, periplazu E. coli ili endoplazmatski retikulum eukariotskih ćelija. U struci je poznat veliki broj signalnih sekvenci. Ilustrativna signalna sekvenca za sekreciju polipeptida u periplazmi E. coli je OmpA-signalna sekvenca.

[0104] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na molekule nukleinske kiseline (DNK i RNK) koji uključuju nukleotidne sekvence koje kodiraju za muteine kao što je ovde opisano. Pošto degeneracija genetskog koda dozvoljava supstitucije određenih kodona drugim kodonima koji specificiraju istu aminokiselinu, pronalazak nije ograničen na specifični molekul nukleinske kiseline koji kodira mutein pronalaska, već obuhvata sve molekule nukleinske kiseline koje uključuju nukleotidne sekvence koje kodiraju funkcionalni mutein.

4

[0105] Prema tome, predmetni pronalazak takođe obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mutein prema pronalasku.

[0106] Pronalazak koji je ovde opisan takođe uključuje molekule nukleinske kiseline koji kodiraju muteine lipokalina suza, koji uključuju dodatne mutacije izvan naznačenih pozicija sekvenci eksperimentalne mutageneze. Takve mutacije se često tolerišu ili se čak mogu pokazati kao korisne, na primer ako doprinose poboljšanoj efikasnosti savijanja, stabilnosti seruma, termičkoj stabilnosti ili afinitetu muteina za vezivanje liganda.

[0107] Molekul nukleinske kiseline opisan u ovoj prijavi može biti "operativno vezan" za regulatornu sekvencu (ili regulatorne sekvence) da omogući ekspresiju ovog molekula nukleinske kiseline.

[0108] Molekul nukleinske kiseline, kao što je DNK, naziva se "sposoban da eksprimira molekul nukleinske kiseline" ili je sposoban "da omogući ekspresiju nukleotidne sekvence" ako uključuje elemente sekvence koji sadrže informacije koje se odnose na transkripcionu i/ili translacionu regulaciju, i takve sekvence su "operativno povezane" sa nukleotidnom sekvencom koja kodira polipeptid. Operativna veza je veza u kojoj su elementi regulatorne sekvence i sekvenca koja se eksprimira povezani na način koji omogućava ekspresiju gena. Precizna priroda regulatornih regiona neophodnih za ekspresiju gena može varirati među vrstama, ali generalno ovi regioni uključuju promotor koji, u prokariotama, sadrži i promotor, tj. DNK elemente koji usmeravaju inicijaciju transkripcije, kao i DNK elemente koji, kada se transkribuje u RNK, signalizira pokretanje prevođenja. Takve promoterske regije normalno uključuju 5' nekodirajuće sekvence uključene u inicijaciju transkripcije i translacije, kao što su - 35/-10 kutije i Shine-Dalgarno element u prokariotama ili TATA kutiji, CAAT sekvencama i 5'-pokrovnim elementima kod eukariota. Ovi regioni mogu takođe uključiti elemente pojačivača ili represora, kao i prevedene signale i vođinske sekvence za ciljanje izvornog polipeptida u specifični deo ćelije domaćina.

[0109] Pored toga, 3' nekodirajuće sekvence mogu da sadrže regulatorne elemente koji su uključeni u terminaciju transkripcije, poliadenilaciju ili slično. Ako, međutim, ove terminalne sekvence nisu zadovoljavajuće funkcionalne u određenoj ćeliji domaćinu, tada one mogu biti supstituisane sa signalima koji su funkcionalni u toj ćeliji.

[0110] Prema tome, molekul nukleinske kiseline iz pronalaska može da sadrži regulatornu sekvencu, kao što je promoterska sekvenca. U nekim otelotvorenjima molekul nukleinske kiseline iz pronalaska uključuje promotersku sekvencu i transkripcionu završnu sekvencu. Pogodni prokariotski promotori su, na primer, tet promotor, promotor lacUV5 ili promotor T7. Primeri promotora korisnih za ekspresiju u eukariotskim ćelijama su SV40 promotor ili CMV promotor.

[0111] Molekuli nukleinske kiseline iz pronalaska mogu takođe biti deo vektora ili bilo koje druge vrste klonirajućeg nosača, kao što je plazmid, fagemid, fag, bakulovirus, kosmid ili veštački hromozom.

[0112] U jednom otelotvorenju, molekul nukleinske kiseline je uključen u fazmid. Fazmidni vektor označava vektor koji kodira intergenski region temperatnog faga, kao što je M13 ili f1, ili njegov funkcionalni deo spojen na cDNK od interesa. Posle superinfekcije bakterijskih ćelija domaćina sa takvim fagemidnim vektorom i odgovarajućim pomagačkim fagima (npr. M13K07, VCS-M13 ili R408) proizvode se netaknute fagne čestice, čime se omogućava fizičko povezivanje kodirane heterologne cDNK sa odgovarajućim polipeptidom prikazanim na fagu površine (videti npr. Lowman, H.B. (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct.26, 401-424, ili Rodi, D.J., and Makowski, L. (1999) Curr. Opin. Biotechnol.10, 87-93).

[0113] Takva sredstva za kloniranje mogu, osim regulatornih sekvenci opisanih iznad, i sekvence nukleinske kiseline koja kodira lipokalinski mutein iz pronalaska, da repliciraju i kontrolišu sekvence izvedene od vrste koja je kompatibilna sa ćelijom domaćinom koja se koristi za ekspresiju kao i selekcione markere selektivni fenotip na transformisanim ili transfektovanim ćelijama. Veliki broj pogodnih vektora za kloniranje je poznat u struci i komercijalno su dostupni.

[0114] DNK molekul koji kodira lipokalinske muteine iz pronalaska, a naročito vektor kloniranja koji sadrži kodirajuću sekvencu takvog lipokalinskog muteina može se transformisati u ćeliju domaćina sposobnu za ekspresiju gena. Transformacija se može izvesti standardnim tehnikama. Prema tome, pronalazak je takođe usmeren na ćeliju domaćina koja sadrži molekul nukleinske kiseline kao što je ovde opisano.

[0115] Transformisane ćelije domaćini se kultivišu u uslovima koji su pogodni za ekspresiju nukleotidne sekvence koja kodira fuzioni protein iz pronalaska. Pogodne ćelije domaćini mogu biti prokariotske, kao što su Escherichia coli (E. coli) ili Bacillus subtilis, ili eukariotske, kao što su Saccharomices cerevisiae, Pichia pastoris, SF9 ili High5 ćelije insekata, imortalizovane ćelijske linije sisara (npr. HeLa ćelije ili CHO ćelije) ili primarnih ćelija sisara.

[0116] Obelodanjivanje se takođe odnosi na postupak za proizvodnju muteina iz ovog pronalaska, pri čemu se mutein, fragment muteina ili fuzioni protein muteina i drugi polipeptid proizvode polaženjem od nukleinske kiseline koja kodira za mutein pomoću metode genetskog inženjeringa. Postupak se može izvesti in vivo, mutein može, na primer, biti proizveden u bakterijskom ili eukariotskom organizmu domaćina i zatim izolovan iz tog organizma domaćina ili njegove kulture. Takođe je moguće proizvesti protein in vitro, na primer upotrebom in vitro sistema za translaciju.

[0117] Kada se proizvodi mutein in vivo, nukleinska kiselina koja kodira mutein iz ovog pronalaska se uvodi u pogodan bakterijski ili eukariotski organizam domaćina pomoću tehnologije rekombinantne DNK (kao što je već iznad navedeno). U tu svrhu, ćelija domaćina se prvo transformiše sa klonirajućim vektorom koji uključuje molekul nukleinske kiseline koji kodira mutein pronalaska upotrebom standardnih metoda. Ćelija domaćin se zatim kultiviše pod uslovima, koji omogućavaju ekspresiju heterologne DNK i time sintezu odgovarajućeg polipeptida. Nakon toga, polipeptid se regeneriše ili iz ćelije ili iz medijuma za kultivaciju.

[0118] U muteinima lipokalina suza ovog pronalaska, prirodna disulfidna veza između Cys 61 i Cys 153 je uklonjena. Prema tome, takvi muteini (ili bilo koji drugi mutein lipokalina suza koji ne uključuje intramolekularnu disulfidnu vezu) mogu biti proizvedeni u ćelijskom odeljku koji ima redukciono redoks milje, na primer, u citoplazmi Gram-negativnih bakterija. U slučaju da lipokalinski mutein iz pronalaska uključuje intramolekularne disulfidne veze, može biti poželjno da se nascentni polipeptid usmeri u ćelijski deo koji ima oksidirajući redoks sredinu, koristeći odgovarajući signalni niz. Takva oksidaciona sredina može biti obezbeđena periplazmom Gram-negativnih bakterija kao što je E. coli, u ekstracelularnom miljeu Gram-pozitivnih bakterija ili u lumenu endoplazmatskog retikuluma eukariotskih ćelija i obično favorizuje formiranje strukturnih disulfidnih veza.. Međutim, takođe je moguće proizvesti mutein ovog pronalaska u citosolu ćelije domaćina, kao što je E. coli. U ovom slučaju, polipeptid se može ili direktno dobiti u rastvornom i presavijenom stanju ili se može dobiti u obliku inkluzionih tela, nakon čega sledi renaturacija in vitro. Dalja opcija je upotreba specifičnih sojeva domaćina koji imaju oksidirajuće intracelularno okruženje, što može omogućiti formiranje disulfidnih veza u citosolu (Venturi M, i dr. (2002) J. MoL Biol.315, 1-8).

[0119] Međutim, mutein ovog pronalaska ne mora nužno da se generiše ili proizvodi samo korišćenjem genetičkog inženjeringa. Umesto toga, mutein lipokalina se takođe može dobiti hemijskom sintezom, kao što je Merrifield sinteza polipeptida u čvrstoj fazi ili pomoću in vitro transkripcije i translacije. Na primer, moguće je da se obećavajuće mutacije identifikuju korišćenjem molekularnog modeliranja, a zatim da se sintetizuje željeni (dizajnirani) polipeptid in vitro i istraži aktivnost vezivanja za dati cilj. Metode za sintezu proteina u čvrstoj fazi i/ili fazi rastvora dobro su poznate u tehnici (videti npr. Bruckdorfer, T. i dr.

(2004) Curr. Pharm. Biotechnol. 5, 29-43).

[0120] U još jednom otelotvorenju, muteini pronalaska mogu biti proizvedeni in vitro transkripcijom/translacijom koristeći dobro poznate metode poznate stručnjacima.

[0121] Pronalazak se takođe odnosi na farmaceutski sastav, koja uključuje najmanje jedan inventivni muteinskog humanog lipokalina suza ili fuzioni protein ili njegov konjugat i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.

[0122] Muteini lipokalina prema pronalasku mogu se primenjivati bilo kojim parenteralnim ili ne-parenteralnim (enteralnim) putem koji je terapeutski efikasan za lekove koji sadrže proteine. Muteini iz ovog pronalaska se mogu administrirati sistemski ili lokalno u formulacijama koje sadrže konvencionalne ne-toksične farmaceutski prihvatljive ekscipijente ili nosače, aditive i nosače po želji.

[0123] U jednom otelotvorenju ovog pronalaska lek se administrira parenteralno sisaru, a posebno ljudima. Farmaceutski sastav može biti vodeni rastvor, emulzija ulja u vodi ili emulzija voda u ulju.

[0124] U tom smislu, napominje se da tehnologije transdermalne isporuke, npr. jontoforeza, sonoforeza ili dostava pojačana mikroiglom, kao što je opisano u Meidan VM i Michniak BB (2004) Am. J. Ther.11, 4, 312-316, može takođe biti upotrebljen za transdermalnu isporuku muteina opisanih ovde. Muteini iz ovog pronalaska se mogu administrirati sistemski ili lokalno u formulacijama koje sadrže različite konvencionalne ne-toksične farmaceutski prihvatljive ekscipijente ili nosače, aditive i nosače.

[0125] Doza primenjenog muteina može da varira u širokim granicama da bi se postigao željeni preventivni efekat ili terapeutski odgovor. Ona će, na primer, zavisiti od afiniteta jedinjenja za izabrani ligand, kao i od polu-života kompleksa između muteina i liganda in vivo. Dalje, optimalna doza će zavisiti od biodistribucije muteina ili njegovog fuzionog proteina ili njegovog konjugata, načina primene, ozbiljnosti bolesti/poremećaja koji se leči, kao i medicinskog stanja pacijenta. Na primer, kada se koristi u mastima za lokalnu primenu, može se koristiti visoka koncentracija muteina lipokalina suza. Međutim, ako se želi, mutein se takođe može dati u formulaciji sa neprekidnim oslobađanjem, na primer lipozomskim disperzijama ili polimernim mikrosferama na bazi hidrogela kao što je PolyActive™ ili OctoDEX™ (videti Bos i dr., Business Briefing: Pharmatech 2003, 1-6). Druge dostupne formulacije sa produženim oslobađanjem su na primer polimeri na bazi PLGA (PR farmaceutici), hidrogelovi na bazi PLA-PEG (Medincell) i polimeri na bazi PEA (Medivas).

[0126] Shodno tome, muteini iz ovog pronalaska mogu biti formulisani u sastave koristeći farmaceutski prihvatljive sastojke, kao i ustanovljene postupke dobijanja. Farmaceutski sastav može takođe da sadrži aditive, kao što su, na primer, punioci, veziva, sredstva za kvašenje, glidanti, stabilizatori, konzervansi, emulgatori, i još rastvarače ili solubilizatori ili sredstva za postizanje efekta skladištenja. Ovo poslednje je da fuzioni proteini mogu biti inkorporirani u sisteme sporog ili uzdržanog oslobađanja ili ciljane isporuke, kao što su lipozomi i mikrokapsule.

[0127] Formulacije se mogu sterilisati brojnim sredstvima, uključujući filtraciju kroz filter koji zadržava bakterije, ili ugradnjom sterilizirajućih sredstava u obliku sterilnih čvrstih sastava koji se mogu rastvoriti ili dispergovati u sterilnoj vodi ili drugoj sterilnoj podlozi neposredno pre upotrebe.

[0128] Ovde opisani lipokalinski mutein može biti primenjen na organizam, uključujući čovekovog pacijenta, ili u farmaceutskom sastavu gde može uključiti ili biti pomešan sa farmaceutski aktivnim sastojcima ili pogodnim nosačima ili ekscipijensima. Tehnike za formulaciju i davanje odgovarajuće lipokalinske muteinske sastave slične ili su identične onima sa jedinjenjima male molekulske težine dobro ustanovljenim u tehnici. Primeri puteva uključuju, ali nisu ograničeni na, oralno, transdermalno i parenteralno davanje.

[0129] Sastav koji uključuje lipokalinski mutein iz ovog pronalaska može se, na primer, naneti na kožu ili na ranu. U nekim otelotvorenima može se primeniti lipokalinski mutein ili odgovarajući sastav na lokalni, a ne sistemski način, na primer, putem injekcije.

[0130] Farmaceutski sastav koji uključuju lipokalinski mutein iz ovog pronalaska mogu biti proizvedene na način koji je sam po sebi poznat, npr. pomoću konvencionalnih postupaka mešanja, rastvaranja, granulacije, dražeja, levigacije, emulgiranja, inkapsuliranja, hvatanja ili liofilizacije. Farmaceutski sastav za upotrebu u skladu sa ovim pronalaskom tako se može formulisati na konvencionalan način upotrebom jednog ili više fiziološki prihvatljivih nosača, uključujući ekscipijense i pomoćna sredstva koja olakšavaju obradu hidrogela i/ili peptida/peptoida u preparate koji se mogu koristiti farmaceutski. Pravilna formulacija zavisi od izabranog načina davanja.

[0131] Za injekcije, mutein lipokalin ili odgovarajući sastav može biti formulisana u vodenim rastvorima, na primer u fiziološki kompatibilnim puferima kao što je Henksov rastvor, Ringerov rastvor ili fiziološki slan pufer. Za transmukozalno davanje, u formulaciji se koriste penetranti koji odgovaraju barijeri koja se propušta. Takvi penetranti su generalno poznati u struci.

[0132] Za oralno davanje, lipokalinski mutein ili odgovarajući sastav može se lako formulisati kombinovanjem sa farmaceutski prihvatljivim nosačima koji su dobro poznati u tehnici. Takvi

4

nosači omogućavaju da se muteinski lipokalin ili odgovarajući sastav, kao i farmaceutski aktivno jedinjenje, tamo gde je prisutno, formuliše kao tablete, pilule, dražeje, kapsule, tečnosti, gelovi, sirupi, suspenzije, i slično, za oralno uzimanje pacijenta koji se leči.

Farmaceutski preparati za oralnu upotrebu mogu se dobiti dodavanjem čvrstog ekscipijensa, opciono mlevenjem dobijene smeše, i obradom mešavine granula, nakon dodavanja pogodnih pomoćnih sredstava, ako se želi, da bi se dobile tablete ili jezgra dražeja. Pogodni ekscipijensi su, naročito, punioci kao što su šećeri, uključujući laktozu, saharozu, manitol ili sorbitol; preparati od celuloze kao što su, na primer, kukuruzni skrob, pšenični skrob, rižin skrob, krompirov skrob, želatina, guma tragakant, metil celuloza, hidroksipropilmetil-celuloza, natrijum karboksimetilceluloza i/ili polivinilpirolidon (PVP). Ako se želi, mogu se dodati sredstva za dezintegraciju, kao što je umreženi polivinil pirolidon, agar, ili alginska kiselina ili njena so, kao što je natrijum alginat.

[0133] Jezgra dražeja je obezbeđena odgovarajućim premazima. U tu svrhu mogu se koristiti koncentrovani rastvori šećera, koji mogu opciono da sadrže gumi arabik, talk, polivinil pirolidon, karbopol gel, polietilen glikol, i/ili titan dioksid, rastvore za lakove, i pogodne organske rastvarače ili smeše rastvarača. Boje ili pigmenti mogu biti dodani tabletama ili prevlakama dražeja za identifikaciju ili za karakterizaciju različitih kombinacija doza aktivnog jedinjenja.

[0134] Farmaceutski preparati koji se mogu upotrebiti oralno uključuju puš-fit kapsule napravljene od želatina, kao i meke, zapečaćene kapsule napravljene od želatina i plastifikatora, kao što su glicerol ili sorbitol. Puš-fit kapsule mogu da sadrže aktivne sastojke u smeši sa puniocem kao što je laktoza, vezivima kao što su skrobovi, i/ili lubrikanti kao što su talk ili magnezijum stearat i, opciono, stabilizatori. U mekim kapsulama, peptidi/peptoidi mogu biti suspendovani u pogodnim tečnostima, kao što su masna ulja, tečni parafin, ili tečni polietilen glikoli. Pored toga, mogu se dodati stabilizatori. Sve formulacije za oralnu primenu treba da budu u dozama koje su pogodne za takvu primenu.

[0135] Lipokalinski mutein može biti formulisan za parenteralno davanje injekcijom, npr. Intramuskularnim injekcijama ili bolus injekcijom ili kontinuiranom infuzijom. Formulacije za injekcije mogu biti predstavljene u obliku jedinične doze, npr. u ampulama ili u višedoznim kontejnerima, sa dodatim konzervansom. Odgovarajući sastavi mogu biti u obliku suspenzija, rastvora ili emulzija u uljanim ili vodenim nosačima, i mogu da sadrže formulaciona sredstva kao što su sredstva za suspendovanje, stabilizaciju i/ili disperziju.

[0136] Ispitanik kome je potreban takav tretman može biti sisar, kao što je čovek, pas, miš, pacov, svinja, majmun, kao cimologni, da navede samo nekoliko ilustrativnih primera. Mutein ovog pronalaska se može koristiti za lečenje bilo koje bolesti ili poremećaja koji uključuje IL-4 alfa receptor, u razvoju takvog oboljenja ili poremećaja koji može biti prikazan produktu ekspresije biblioteke nukleinske kiseline ovog otkrića ili prikazan na inače dobijeni muteini lipokalina suza.

[0137] U ovom kontekstu, primećeno je da različite ćelije tumora izražavaju veći broj IL-4 receptora visokog afiniteta od normalnih ćelija. Takve ćelije obuhvataju čvrsti humani tumor kao što je melanom, rak dojke, karcinom jajnika, mezoteliom, glioblastom, astrocitom, karcinom bubrežnih ćelija, karcinom glave i vrata, Kaposijev sarkom povezan sa AIDS-om = AIDS KS, hormonski zavisne i nezavisne ćelije karcinoma prostate i primarne kulture od tumora prostate, na primer (videti Garland, L, i dr., (2005) Journal of Immunotherapy 28, 4, 376-381, Rand, RW, i dr. Clinical Cancer Research. (2000) 6, 2157-2165; Husain SR, i dr. (1999) Nature Medicine 5, 817-822; Puri RK, i dr. Cancer Research (1996) 56, 5631-5637; Debinski W, i dr, or Husain SR, i dr. Cancer Research (1998) 58, 3649-3653, Kawakami K, i dr. (2000) Cancer Research, 60, 2981-2987; ili Strome SE, i dr. Clinical Cancer Research (2002) 8, 281-286, for example). Specifični primeri ćelija koji dokumentuju prekomernu ekspresiju IL-4 receptora uključuju, ali nisu ograničeni na, Burkitt limfomske ćelijske linije Jijoye (B-ćelijski limfom), karcinom prostate (LNCaP, DU145), karcinom glave i vrata (SCC, KCCT873), Pranzatički kancer (PANC-1 ćelijska linija), SCC-25: 13.000 (+/- 500) h ćelijske linije kancera glave i vrata (ATCC). AL4 lanac IL4R igra glavnu ulogu u internalizaciji IL4. Prema tome, kada su fuzionisani ili konjugovani sa toksinom, vezni lipokalinski muteini koji se vezuju za alfa lanac receptora IL-4 mogu se stoga takođe koristiti za lečenje tumora (kancera). Primeri pogodnih toksina su Pseudomonas egzotoksin, pertusis-toksin, difterijski toksin, ricin, saporin, pseudomonazni egzotoksin, kalicheamicin ili njegov derivat, taksoid, majtanzinoid, tubulizin i analog dolastatina. Primeri dolastatin analoga uključuju, ali nisu ograničeni na, auristatin E, monometiluristatin E, auristatin PYE i auristatin PHE.

[0138] Za lečenje kancera, takođe je moguće konjugovati muteine koji se vezuju za alfa lanac IL-4 receptora za cistostatsko sredstvo. Primeri takvih cistostatičnih sredstava su Cisplatin, Carboplatin, Oksaliplatin, 5-Fluorouracil, Takotere (Docetaksel), Paclitakel, Antraciklin (Dokorubicin), Metotreksat, Vinblastin, Vincristin, Vindesin, Vinorelbin, Dakarbazin, Ciklofosfamid, Etopozid 4-srodna jedinjenja, sulfonamidi, oksadiazolini, benzo [b] tiofenizintetski spiroketalni pirani, monotetrahidrofuran jedinjenja, derivati kuracina i kuracina, derivati metoksiestradiola i Leukovorin.

[0139] Kao što je očigledno iz iznad navedenog obelodanjivanja, mutein iz ovog pronalaska ili njegov fuzioni protein ili konjugat mogu se koristiti u mnogim primenama. Uopšteno, takav mutein se može koristiti u svim primenjenim antitelima, osim onih koji se specifično oslanjaju na glikozilaciju Fc dela.

[0140] Prema tome, u drugom aspektu obelodanjivanja, izumljeni muteini humanog lipokalina suza se koriste za detekciju datog neprirodnog liganda humanog lipokalina suze. Takva upotreba može uključivati korake kontaktiranja muteina sa uzorkom za koji se sumnja da sadrži dati ligand pod pogodnim uslovima, čime se omogućava formiranje kompleksa između muteina i datog liganda i detektovanje kompleksiranog muteina pomoću odgovarajućeg signala.

[0141] Signal koji se može detektovati može biti uzrokovan oznakom, kao što je objašnjeno gore, ili promenom fizičkih svojstava usled vezivanja, tj. Jedan primer je plazmonska površinska rezonanca, čija se vrednost menja tokom vezivanja partnera za vezivanje iz kojih je jedan imobilizovan na površini kao što je zlatna folija.

[0142] Muteini humanog lipokalina suza koji su ovde opisani mogu se takođe koristiti za odvajanje datog neprirodnog liganda humanog lipokalina suza. Takva upotreba može uključivati korake kontakta muteina sa uzorkom koji treba da sadrži navedeni ligand pod pogodnim uslovima, čime se omogućava formiranje kompleksa između muteina i datog liganda, i odvajanje kompleksa muteina/liganda iz uzorka.

[0143] U oba slučaja upotreba muteina za detekciju datog neprirodnog liganda kao i odvajanje datog liganda, mutein i/ili meta mogu biti imobilizovani na pogodnoj čvrstoj fazi.

4

[0144] Muteini humanih suza lipokalina iz pronalaska mogu se takođe koristiti za ciljanje jedinjenja na prethodno izabrano mesto. U tu svrhu, mutein se dovodi u kontakt sa jedinjenjem od interesa kako bi se omogućilo formiranje kompleksa. Onda kompleks koji uključuje mutein i jedinjenje od interesa se dostavljaju na prethodno izabrano mesto. Ova primena je naročito pogodna, ali nije ograničena na, za isporuku leka (selektivno) na prethodno izabrano mesto u organizmu, kao što je zaraženi deo tela, tkivo ili organ koji treba da se tretira sa lekom. Pored formiranja kompleksa između muteina i jedinjenja od interesa, mutein može takođe reagovati sa datim jedinjenjem da bi se dobio konjugat muteina i jedinjenja. Slično gore navedenom kompleksu, takav konjugat može biti pogodan da isporuči jedinjenje na prethodno izabrano ciljno mesto. Takav konjugat muteina i jedinjenja može takođe da sadrži veznik koji kovalentno povezuje mutein i jedinjenje jedni sa drugima.

Opciono, takav veznik je stabilan u krvotoku, ali se može odvojiti u ćelijskoj okolini.

[0145] Ovde opisani muteini i njegovi derivati mogu se stoga koristiti u mnogim poljima sličnim antitelima ili njihovim fragmentima. Pored njihove upotrebe za vezivanje za nosač, koji dozvoljava da se meta datog muteina ili konjugata ili fuzionog proteina ovog cilja imobilizira ili razdvoji, muteini se mogu koristiti za obeležavanje enzimom, antitelom, radioaktivnim supstanca ili bilo koja druga grupa koja ima biohemijsku aktivnost ili definisane karakteristike vezivanja. Na taj način, njihove odgovarajuće mete ili konjugati ili njihovi fuzioni proteini se mogu detektovati ili dovesti u kontakt sa njima. Na primer, muteini iz pronalaska mogu da služe za detekciju hemijskih struktura pomoću utvrđenih analitičkih metoda (npr. ELISA ili Zapadno blotovanje) ili pomoću mikroskopije ili imunosenzorike. Ovde, signal detekcije može biti generisan direktno upotrebom pogodnog mutein konjugata ili fuzionog proteina ili indirektno imunohemijskom detekcijom vezanog muteina preko antitela.

[0146] U medicini postoje brojne mogućnosti primene muteina inventivnog tipa. Pored njihove upotrebe u dijagnostici i unošenju leka, može se generisati mutantni polipeptid prema pronalasku, koji se, na primer, vezuje za ćelijske površinske molekule specifične za tkivo ili tumor. Takav mutein može, na primer, biti upotrebljen u konjugovanoj formi ili kao fuzioni protein za "tumorsko snimanje" ili direktno za terapiju kancera. Shodno tome, ovaj pronalazak obezbeđuje dijagnostičku kompoziciju koja sadrži mutein iz ovog pronalaska i sredstva za dijagnozu, kao što su ekscipijenti, puferi, etikete (koje se mogu koristiti za obeležavanje muteina).

[0147] Prema tome, ovaj pronalazak takođe uključuje upotrebu humanih muteina lipokalina iz ovog pronalaska za formiranje kompleksa sa datim ne-prirodnim ligandom.

[0148] Sledeća srodna upotreba ovde opisanog muteina je validacija cilja, tj. analiza da li je polipeptid za koji se pretpostavlja da je uključen u razvoj ili napredovanje bolesti ili poremećaja zaista nekako uzročnik te bolesti ili poremećaja. Ova upotreba za validaciju proteina kao farmakološkog cilja leka ima prednost od sposobnosti muteina ovog pronalaska da specifično prepozna površinsku površinu proteina u njegovoj prirodnoj konformaciji, tj. da se veže za prirodni epitop. U tom smislu, treba napomenuti da je ova sposobnost prijavljena samo za ograničeni broj rekombinantnih antitela. Međutim, upotreba inventivnog muteina za validaciju cilja leka nije ograničena na detekciju proteina kao ciljeva, već takođe uključuje detekciju proteinskih domena, peptida, molekula nukleinskih kiselina, organskih molekula ili kompleksa metala.

Primerno otelotvorenje pronalaska

[0149] Slika 1 prikazuje primarnu strukturu ranije opisanog muteina humanog lipokalina suza (S191.4-B24) koji pokazuje afinitet vezivanja za IL-4 alfa receptor. Prvih 21 ostatka (podvučeni) čine signalnu sekvencu, koja se cepa pri periplazmatskoj ekspresiji. N-terminalni T7-tag (kurziv) i C-terminalni Strep-oznaka II (podebljano) su deo karakterizovanog proteina. Slika 1 takođe pokazuje da se u ovom muteinu brišu 4 N-terminalna aminokiselinska ostatka (His1 His2 Leu3 Ala4) kao i dva poslednja C-terminalna aminokiselinska ostatka (Ser157 i Asp158) divljeg tipa lipokalina suza.

[0150] Slika 2 prikazuje polipeptidne sekvence primernih muteina sa visokim afinitetom za IL-4 alfa receptor (SEQ ID Nos: 2-11). Brojevi označeni sa "SwissProt P31025" pokazuju odgovarajuće numerisanje aminokiselinske pozicije neobrađene prekursorske sekvence unosa SwissProt baze podataka. Wt TLc26 u suštini odgovara sekvenci lipokalina suza divljeg tipa u vektoru pTLc26. Međutim, wt TLc26 ne uključuje disulfidnu vezu, jer su ostaci cisteina na položajima 61 i 153 zrelog proteina zamenjeni sa serinskim ostacima. Slično tome, serinski ostatak na položajima 101 zrelog proteina je zamenjen sa serinskim ostatkom. Pored toga, na poziciji 111 zrelog proteina argininski ostatak je zamenjen prolinom, a na položaju 114 zrelog

4

proteina ostatak lizina je zamenjen triptofanom. Dalje, dve C-terminalne aminokiseline uključene u sekvencu SwissProt unosa P31025 nisu uključene u sekvencu. AB4004 je nasumična biblioteka obelodanjena u međunarodnoj patentnoj prijavi WO 2008/015239, u kojoj su mutirane pozicije ukazane podebljano. Nasumične sekvence su identične sa J14 sa izuzetkom položaja 53 i 55. M3-B24 (PSM) označava vruće tačke iz PSM B24.

[0151] Slika 3 prikazuje rezultate TF-1 ćelijske proliferacije. TF-1 ćelije su inkubirane 1 sat na 37 °C sa ukazanim muteinima pronalaska (S276.2 K04, S308.5 F08, S308.5 N01, S308.5 L20, S308.5 L04, S308.5 N20, S308.3010, S191.4 B24 [SEQ ID Nos:2-11]) u razblaženim serijama pre dodavanja 0.8 ng/ml IL-4 (A) ili 12 ng/ml IL-13 (B) na 72 h. Proliferacija je izmerena pomoću<3>H-timidine inkorporacije.

[0152] Slika 4 prikazuje vrednosti IC50iz slike 3 i rezultate Biacore merenja muteina humanog lipokalina suza sa afinitetom za IL-4 alfa receptor. Približno 400 RU IL-4 alfa receptora -Fc je uhvaćeno na CM-5 čipu, koji je prethodno obložen sa anti human-Fc monoklonskim antitelom. Nakon toga, mutein u jednoj koncentraciji od 25 nM je propušten preko protočne ćelije i zabeležene su promene u rezonantnim jedinicama. Referentni signali iz protočne ćelije koja je podjednako tretirana odvojeno od toga da nemaju IL-4 alfa receptor-Fc je oduzeta i dobijeni podaci su prilagođeni 1:1 Langmuir modelu koristeći BIAevaluacija softver. Zbog spore kinetike disocijacije dvostrukog referenciranja korišćeno je oduzimanje signala iz protočne ćelije koja je podjednako tretirana osim da nema bilo koji IL-4 alfa receptor-Fc i oduzimanje signala iz eksperimenta gde je ubrizgan samo uzorak pufera.

Dobijeni podaci su ugrađeni u 1:1 Langmuir model sa ograničenjem masovnog transporta korišćenjem BIAevaluacija softvera.

[0153] Ukoliko nije drugačije naznačeno, primenjene su poznate metode u tehnici rekombinantnog gena.

Primeri

Primer 1: Afinitetno sazrevanje muteina S191.4-B24 korišćenjem nasumično usmerenog pristupa

[0154] Biblioteka varijanti na osnovu muteina S191.4-B24 (SEQ ID NO:2) koja je opisana u PCT prijavi WO 2008/015239 je dizajniran iz nasumičnih položaja 26, 32, 34, 55, 56, 58 i 63

4

kako bi se omogućilo da svih 20 aminokiselina na ovim položajima. Biblioteka je konstruisana u suštini kao što je opisano u Primeru 1 WO 2008/015239.

[0155] Fagemidna selekcija je izvedena kao što je opisano u Primeru 2 WO 2008/015239 korišćenjem ograničene ciljne koncentracije (0.5 nM i 0.1 nM IL-4 alfa receptora , Peprotech) u kombinaciji sa produženim vremenom pranja zajedno sa konkurentnim monoklonskim antitelom protiv IL-4 alfa receptora (MAB230, R&D Systems; 1 sat pranja) ili kratko vreme inkubacije (10 minuta). Izvršena su tri ili četiri kruga selekcije.

[0156] Preparativna proizvodnja IL-4 alfa receptora -specifičnih muteina je izvedena korišćenjem E. coli K12 soja JM83 koji je držao odgovarajući mutein kodiran na ekspresionom vektoru pTLPC10 (SEQ ID NO:1) ili, gde su potrebne veće količine proteina, E. coli soj W3110 koji nose odgovarajući vektor ekspresije kao što je opisano u WO 2008/015239.

Primer 2: Merenje afiniteta koristeći Biacore

[0157] Merenja afiniteta su izvedena u suštini kao što je opisano u Primeru 9 WO 2006/56464 sa modifikacijama koje su imobilisane približno 400 RU IL-4 alfa receptora -Fc (R&D Sistems) (umesto 2000 RU humanog CTLA-4 ili mišjeg CTLA-4-Fc korišćenog kao ciljna u WO 2006/56464) i 100 µl muteina je ubrizgano u koncentraciji od 25 nM (umesto 40 µl uzorka prečišćenih lipokalinskih muteina u koncentracijama od 5 - 0.3 µM kako se koristi u WO 2006/56464).

Primer 3: Testovi TF-1 ćelijske proliferacije

[0158] IL-4 i IL-13-stimulisani TF-1 testovi proliferacije ćelija su izvedeni u suštini kao što je opisano u Lefort i dr. (Lefort S., i dr., (1995) FEBS Lett.366, 2-3, 122-126) i kao što je opisano u Primeru 10 PCT prijave WO 2008/015239. TF-1 ćelije su inkubirane 1 sat na 37 °C sa ukazanim muteinima pronalaska (S276.2 K04, S308.5 F08, S308.5 N01, S308.5 L20, S308.5 L04, S308.5 N20, S308.3 O10, S191.4 B24 [SEQ ID Nos: 3-11]) u razblaženim serijama pre dodavanja 0.8 ng/ml IL-4 (a) ili 12 ng/ml IL-13 (b) na 72 h. Proliferacija je izmerena pomoću<3>H-timidine inkorporacije. Rezultati testa proliferacije TF-1 prikazani su na slici i pokazuju da su varijante visokog afiniteta S276.2 K04, S308.5 F08, S308.5 N01,

4

S308.5 L20, S308.5 L04, S308.5 N20, i S308.3O10 su jaki antagonisti IL-4 kao i IL-13 indukovani.

[0159] Pronalazak je ovde široko i uopšteno opisan. Svaka od užih vrsta i podgeneričkih grupacija koje spadaju u opšti opis takođe čine deo pronalaska. Ovo uključuje opšti opis pronalaska sa ograničenjem ili negativnim ograničenjem uklanjanja bilo kojeg predmeta iz roda, bez obzira da li je ili nije izrezan materijal specifično ovde naveden.

[0160] Druga otelotvorenja su unutar sledećih patentnih zahteva. Pored toga, tamo gde su karakteristike ili aspekti pronalaska opisani u terminima Markuš grupa, oni koji su verzirani u stanje tehnike će prepoznati da je pronalazak takođe opisan u terminima bilo kog pojedinačnog člana ili podgrupe članova Markuš grupe.

4

�

1

2

4

1

�

4

Claims (8)

1. Patentni zahtevi 1. Mutein humanog lipokalina suza, gde mutein sadrži: (i) sledeće aminokiselinske supstitucije Glu 27 → Arg, Phe 28 → Cys, Glu 30 → Arg, Met 31 → Ala, Leu 33 → Tyr, Ile 57 → Arg, Cys 61 → Trp, Asp 80 → Ser, Lys 83 → Arg, Glu 104 → Leu, Leu 105 → Cys, His 106 → Pro, Lys 108 → Gin; i (ii) jedan od sledećih kompleta aminokiselinskih supstitucija (1) Arg 26 → Pro, Asn 32 → Tyr, Glu 34 → Ser, Met 55 → Ala, Leu 56 → Gin, Glu 63 → Lys; (2) Arg 26 → Ser, Asn 32 → Tyr, Glu 34 → Val, Met 55 → Ala, Leu 56 → Ala, Ser 58 → lie, Glu 63 → Ser; (3) Arg 26 → Ser, Asn 32 → Val, Glu 34 → Asn, Met 55 → Ala, Leu 56 → Gln, Ser 58 → Lys, Glu 63 → Lys; (4) Arg 26 → Asn, Asn 32 → Lys, Glu 34 → Asp, Met 55 → Ala, Leu 56 → His, Ser 58 → Arg, Glu 63 → Gln; (5) Arg 26 → Tyr, Asn 32 → Tyr, Glu 34 → His, Met 55 → Ala, Leu 56 → His, Ser 58 → Ala, Glu 63 → Lys; (6) Arg 26 → Lys, Asn 32 → Tyr, Glu 34 → Arg, Met 55 → Ala, Leu 56 → Lys, Ser 58 → Asn, Glu 63 → Pro; ili (7) Arg 26 → Glu, Asn 32 → His, Glu 34 → Gly, Met 55 → Ala, Leu 56 → Met, Ser 58 → Leu, Glu 63 → Lys; i (iii) najmanje 75% identiteta sa sekvencom zrelog humanog lipokalina suza, pri čemu je sekvenca zrelog humanog lipokalina suza

   i gde se mutein vezuje za humani IL-4 alfa receptor sa konstantom disocijacije (KD) ispod 0.1 nM.
2. 2. Mutein prema patentnom zahtevu 1, koji dalje sadrži sledeći skup aminokiselinskih supstitucija: (1) Val 53 → Phe, Val 64 → Tyr, Ala 66 → Leu.
3. 3. Mutein prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde su prva četiri N-terminalna aminokiselinska ostatka sekvence zrelog humanog lipokalina suza i/ili poslednja dva C-terminalna aminokiselinska ostatka sekvence zrelog humanog lipokalina izbrisana.
4. 4. Mutein prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde mutein ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID NO:4 i 6-11.
5. 5. Fuzioni protein koji sadrži mutein prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4.
6. 6. Molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira mutein prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4 ili fuzioni protein iz patentnog zahteva 5.
7. 7. Ćelija domaćin koja sadrži molekul nukleinske kiseline iz patentnog zahteva 6.
8. 8. Farmaceutski ili dijagnostički sastav koji sadrži mutein prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4 ili fuzioni protein iz patentnog zahteva 5.