RS58856B1

RS58856B1 - Nova stabilna formulacija

Info

Publication number: RS58856B1
Application number: RS20190692A
Authority: RS
Inventors: Carsten Olbrich; Thomas Trill
Original assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 2013-10-25
Filing date: 2014-10-21
Publication date: 2019-07-31
Also published as: HRP20191053T1; ES2735645T3; LT3060256T; CY1121791T1; JP2016534062A; EP3060256A1; HUE045020T2; PL3060256T3; EP3060256B1; DK3060256T3; JP6813355B2; US20190240345A1; WO2015059147A1; SI3060256T1; TR201909034T4; US20160250349A1; PT3060256T

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na stabilnu formulaciju kako je definisana patentnim zahtevima, posebno pogodnu za anti-mezotelin imunokonjugat MF-T-SPDB-DM4. Opisana stabilna vodena formulacija koja sadrži MF-T-SPDB-DM4 je direktno pogodna za terapeutske primene i za naknadnu liofilizaciju. Liofilizovan prah može biti rekonstituisan sa vodom kako bi se dobio rekonstituisani rastvor koji je ponovo pogodan za terapeutske primene. Dalji cilj je da se pruži stabilna formulacija rekonstituisanih proteina koja je pogodna za terapeutske primene.

STANJE TEHNIKE

[0002] Terapija zasnovana na antitelima se pokazala kao veoma efikasna u tretmanu različitih vrsta raka, uključujući čvrste tumore. Važna za razvoj uspešne terapije zasnovane na antitelima je izolacija antitela protiv proteina ćelijske površine za koje se pokazalo da su preferencijalno eksprimirani na tumorskim ćelijama. Mezotelinski prekursorski polipeptid je glikozilirani protein na površini glikofosfatidilinozitola (GPI) koji je proteolitički razdvojen na 30 kDa N-terminalni izlučeni polipeptid i 40 kDa, C-terminalni polipeptid, koji se pretežno javlja u membrani, GPI-usidren oblik (Chang, K. and I. Pastan, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, (1996) 93(1):136), i koji se ovde naziva mezotelin. Mezotelin se prvenstveno eksprimira određenim tumorskim ćelijama, posebno mezotelioma ćelijama, ćelijama tumora pankreasa i ćelijama raka jajnika, dok je njegovo eksprimiranje ograničeno u normalnom tkivu, što je čini atraktivnim ciljem za razvoj terapije tumora (Argani, P. i dr., Clin. Cancer Res. (2001) 7(12): 3862; Hassan, R., i dr., Clin. Cancer Res. (2004) 10(12 Pt 1):3937).

[0003] Anti-mezotelin antitela uključujući MF-T, fragmente antitela koji vezuju antigen i varijante ovih antitela su opisani u WO2009/068204. Opisana antitela imaju posebne osobine što ih čini veoma pogodnim za upotrebu kao imunokonjugati. Imunokonjugat je sastavljen od antitela koje specifično prepoznaje antigen ciljane ćelije, kao što je antigen ćelije tumora, i jedan ili nekoliko kovalentno vezanih molekula leka, posebno citotoksičnog leka kao što je majtanzinoid. Imunokonjugati sastavljeni od anti-mezotelin antitela, fragmenata antitela i varijanti ovih antitela i fragmenata povezanih sa hemoterapeutskim agensom, npr. majtanzinoidi, ili njihovi derivati su opisani u WO2010/124797. Posebno poželjno otelotvorenje anti-mezotelin imunokonjugata je MF-T-SPDB-DM4 detaljno opisan u WO2010/124797.

[0004] Za razliku od tradicionalnih organskih i neorganskih lekova, lekovi bazirani na antitelima su veći i složeniji. Ovo otežava razvoj formulacija koje čuvaju lekove bazirane na antitelima u svom biološki aktivnom obliku i sprečavaju degradaciju. Degradacija se može desiti usled hemijske nestabilnosti (koja dovodi do novog hemijskog entiteta) ili fizičke nestabilnosti. Konjugacija lekova, posebno citotoksičnih lekova, koji su često hidrofobni, mali molekuli, do hidrofilnih monoklonskih antitela, uvodi dodatnu nestabilnost imunokonjugatima. Formiranje čestica u farmaceutskim proizvodima proteina, naročito, može destabilizovati farmaceutsko jedinjenje, čime se formulacija čini manje potentnom ili čak štetnom za kliničku upotrebu. Na primer, čestice u injekcionim farmaceutskim formulacijama mogu izazvati značajne povrede kod pacijenata. Pored toga, formiranje agregata je glavni put degradacije farmaceutskih proizvoda proteina (Chari i dr., Pharm Res.

20, 1325-1336 (2003)), i može dovesti do neželjenih efekata kao što je imunogenost.

Hemijska nestabilnost imunokonjugata može dovesti do stvaranja slobodnih citotoksičnih lekova, što može dovesti do toksičnih sporednih efekata.

[0005] Pogodna formulacija za imunokonjugat sprečava hemijsku i fizičku nestabilnost tokom dugačkog vremenskog perioda. Pogodne stabilne tečne ili liofilizovane formulacije za imunokonjugate koji sadrže majtanzinoid su opisane, na primer, u WO2004/004639, WO2004/110498, i WO2007/019232. WO2007/019232 opisuje tečnu formulaciju imunokonjugata koja sadrži nekoliko ekscipijenata, gde je formulacija puferisani vodeni rastvor. WO2004/110498 daje tečan i liofilizovan sastav koji sadrži antitelo hemijski vezano za majtanzinoid. WO2004/004639 opisuje pogodne formulacije za imunokonjugat huC242-DM1.

[0006] Ipak, opšta poruka iz svih ovih publikacija je da je svaki imunokonjugat, ovde MF-T-SPDB-DM4, specijalna kombinacija antitela, veznika i citotoksičnog leka. Ova kombinacija dovodi do određenih fizičko-hemijskih osobina koje zahtevaju nepredvidivi rastvor za pogodnu formulaciju koja je data u ovom pronalasku.

KRATAK PREGLED PRONALASKA

[0007] Pronalazak pruža formulaciju/sastav pogodne za terapeutske primene, koji sadrže formulaciju imunokonjugata koja sadrži: a.5 mg/ml MF-T-SPDB-DM4, b.10mM L-histidina, c.130mM Glicina, d.5% saharoze, i e.0,01% polisorbata 80, gde je formulacija puferisani vodeni rastvor koji ima pH 5,5.

[0008] Pronalazak takođe pruža liofilizovan sastav koji sadrži formulaciju imunokonjugata koja sadrži: a.5 mg/ml MF-T-SPDB-DM4, b.10mM L-histidina, c.130mM Glicina, d.5% saharoze, i e.0,01% polisorbata 80, gde sastav ima pH 5,5 kada se rekonstituiše sa vodom. Rekonstituisani rastvor ovog liofilizovanog sastava je pogodan za terapeutske primene. DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0009] Predmetni pronalazak se odnosi na farmaceutski pogodnu formulaciju imunokonjugata MF-T-SPDB-DM4, gde formulacija sadrži: a.5 mg/ml MF-T-SPDB-DM4, b. 10mM L-histidina, c.130mM Glicina, d.5% saharoze, i e.0,01% polisorbata 80, gde je formulacija puferisani vodeni rastvor koji ima pH 5,5. Pronalazak se takođe odnosi na liofilizovan sastav koji sadrži formulaciju imunokonjugata koja sadrži: a.5 mg/ml MF-T-SPDB-DM4, b.10mM L-histidina, c.130mM Glicina, d.5% saharoze, i e.0,01% polisorbata 80, gde sastav ima pH 5,5 kada se rekonstituiše sa vodom.

[0010] Imunokonjugat MF-T-SPDB-DM4 je poznat u struci (WO2010/124797). MF-T-SPDB-DM4 je imunokonjugat koji sadrži antitelo MF-T hemijski vezano za majtanzinoid (opisano u WO2009/068204).

[0011] Degradacija imunokonjugata, ovde MF-T-SPDB-DM4, je neželjeni efekat za farmaceutske primene. Efikasnost ili dostupnost leka može se dramatično promeniti.

Degradacija se može desiti usled hemijske nestabilnosti (koja dovodi do novog hemijskog entiteta) ili fizičke nestabilnosti. Hemijska nestabilnost može biti rezultat npr. deamidacije, hidrolize, oksidacije ili disulfidne razmene. Fizička nestabilnost može biti rezultat npr. agregacije ili adsorpcije. Konjugacija lekova, posebno citotoksičnih lekova, koji su često hidrofobni, mali molekuli, do hidrofilnih monoklonskih antitela, uvodi dodatnu nestabilnost imunokonjugatima. Formiranje čestica u farmaceutskim proizvodima proteina, naročito, može destabilizovati farmaceutsko jedinjenje, čime se formulacija čini manje potentnom ili čak štetnom za kliničku upotrebu. Na primer, čestice u injekcionim farmaceutskim formulacijama mogu izazvati značajne povrede kod pacijenata. Pored toga, formiranje agregata je glavni put degradacije proteina i može dovesti do neželjenih efekata kao što je imunogenost.

[0012] Prema tome, cilj ovog pronalaska je da pruži farmaceutski pogodne formulacije imunokonjugata MF-T-SPDB-DM4 koje sprečavaju formiranje „agregata visoke molekulske mase“. Izraz „agregati visoke molekulske mase“ ili „HMV“, kako se ovde koristi, odnosi se na agregate koji sadrže dva ili više molekula imunokonjugata.

[0013] Dalji cilj ovog pronalaska je da pruži farmaceutski pogodne formulacije imunokonjugata MF-T-SPDB-DM4 koje sprečavaju hemijsku nestabilnost. Hemijska nestabilnost imunokonjugata može da dovede do stvaranja slobodnih citotoksičnih lekova (ovde slobodne vrste DM4 majtanzinoida), što može dovesti do toksičnih sporednih efekata. Tako da, dodatno, prisustvo ili generisanje bilo kog tipa fragmenata „niske molekulske mase“ (LMW) treba minimizovati ili izbegavati.

[0014] Predmetni pronalazak se zasniva na otkriću da je postignut sastav koji sadrži MF-T-SPDB-DM4, koji omogućava dugačak rok trajanja u obliku tečne formulacije, kao i liofilizovanog sastava. Ova formulacija omogućava dugotrajno skladištenje kao liofilizovan sastav (dugačak rok trajanja) i nakon rekonstitucije za mogućnost skladištenja neiskorišćenog dela tokom dugačkog vremenskog perioda kao vodeni rastvor.

[0015] Tipičan rok trajanja imunokonjugatnih sastava predmetnog pronalaska je oko 1 do 5 godina, poželjno 1 do 4 godine, poželjnije 2 do 4 godine, na 4°C.

[0016] Ova vrsta formulacija može se postići uključivanjem ekscipijenata koji inhibiraju ili redukuju agregaciju i formiranje čestica. Formulacije za stabilizaciju imunokonjugata su poznate u struci. Pogodne stabilne tečne ili liofilizovane formulacije za imunokonjugate koji sadrže majtanzinoid su opisane, na primer, u WO2004/004639, WO2004/110498, i WO2007/019232. WO2007/019232 opisuje formulaciju tečnog imunokonjugata koja sadrži: imunokonjugat i jedan ili više ekscipijenata izabranih iz grupe koju čine: saharoza, polisorbat 20, polisorbat 80, ciklodekstrin, dekstroza, glicerol, polietilen glikol, manitol, natrijum hlorid i amino kiselina, gde je formulacija puferisani vodeni rastvor koji ima pH od 4,5 do 7,6. WO2004/110498 pruža tečan i liofilizovan sastav koji sadrži antitelo hemijski vezano za majtanzinoid. WO2004/004639 opisuje pogodne formulacije za imunokonjugat huC242-DM1. Ali, takođe je dobro poznato da je svaki imunokonjugat, ovde MF-T-SPDB-DM4, specijalna kombinacija antitela, veznika i citotoksičnog leka, što rezultuje problemima nepredvidive formulacije.

[0017] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na primenu farmaceutskih sastava. Takva primena se vrši oralno ili parenteralno. Za imunokonjugate su poželjniji parenteralni putevi primene. Postupci parenteralne primene uključuju lokalnu, intra-arterijsku (direktno u tumor), intramuskularnu, subkutanu, intramedularnu, intratekalnu, intraventrikularnu, intravensku, intraperitonealnu ili intranazalnu primenu. Pored aktivnih sastojaka, ovi farmaceutski sastavi mogu da sadrže pogodne farmaceutski prihvatljive nosače koji sadrže ekscipijente i pomoćna sredstva koja olakšavaju preradu aktivnih jedinjenja u preparate koji se mogu koristiti farmaceutski. Dalji detalji o tehnikama formulacije i primene mogu se naći u najnovijem izdanju Remington's Pharmaceutical Sciences (Ed. Maack Publishing Co, Easton, Pa.).

[0018] Formulacije prema pronalasku mogu biti primenjene upotrebom injektora, pumpe, šprica ili bilo kog drugog uređaja poznatog u struci, kao i gravitacijom. Igla ili kateter se mogu koristiti za uvođenje formulacija iz ovog pronalaska u telo pacijenta preko određenih parenteralnih puteva.

[0019] Farmaceutski sastavi pogodni za upotrebu u ovom pronalasku obuhvataju sastave u kojima su aktivni sastojci sadržani u efikasnoj količini kako bi se postigla željena svrha, tj. tretman određene bolesti. Određivanje efikasne doze je u okviru sposobnosti stručnjaka.

[0020] Za bilo koje jedinjenje, terapeutski efikasna doza može biti procenjena na početku bilo analizama ćelijske kulture, npr., neoplastičnim ćelijama, bilo životinjskim modelima, obično miševima, zečevima, psima, svinjama ili majmunima. Životinjski model se takođe koristi za postizanje poželjnog raspona koncentracije i načina primene. Takve informacije se zatim mogu koristiti za određivanje korisnih doza i načina primene kod ljudi.

[0021] Sastavi ovog pronalaska su formulisani da budu prihvatljivi u terapeutskoj primeni. „Terapeutska primena“ se odnosi na tretmane koji uključuju primenu pacijentu, koji ima potrebu za tretmanom, terapeutski efikasne količine imunokonjugata MF-T-SPDB-DM4. „Terapeutski efikasna količina“ je definisana kao količina imunokonjugata MF-T-SPDBDM4 koja je dovoljna da se smanji proliferaciju mezotelin pozitivnih ćelija ili da se smanji veličinu tumora koji eksprimira mezotelin u tretiranoj oblasti pacijenta - ili kao pojedinačna doza ili u skladu sa režimom višestruke doze, sama ili u kombinaciji sa drugim agensima, što dovodi do ublažavanja neželjenih stanja, i ta količina je toksikološki podnošljiva. Pacijent može biti čovek ili životinja koja nije čovek (npr. zec, pacov, miš, pas, majmun ili drugi niži primat).

[0022] Tačnu dozu bira individualni lekar u pogledu pacijenta koji se tretira. Doziranje i primena su prilagođeni da pruže dovoljne nivoe aktivne grupe ili da održe željeni efekat. Dodatni faktori koji se mogu uzeti u obzir uključuju ozbiljnost stanja bolesti, npr. veličinu i lokaciju tumora; godine, težinu i pol pacijenta; ishranu, vreme i učestalost primene, kombinaciju lekova, osetljivost reakcije i tolerancija/odgovor na terapiju. Farmaceutski sastavi dugačkog dejstva mogu se primenjivati, na primer, svaka 3 do 4 dana, svake nedelje, jednom svake dve nedelje, ili jednom svake tri nedelje, u zavisnosti od polu-života i brzine klirensa određene formulacije.

[0023] Izraz „farmaceutska formulacija“ ili „formulacija“ se odnosi na preparat koji je u takvom obliku da dozvoljava da biološka aktivnost aktivnog sastojka sadržanog u njemu bude efikasna, i koji ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za pacijenta kom bi se formulacija davala.

[0024] Predmetni pronalazak takođe pruža liofilizovan prah tečne formulacije. „Liofilizovan“ znači da je sastav sušen zamrzavanjem pod vakuumom. Tokom liofilizacije tečna formulacija je zamrznuta i rastvorene materije su odvojene od rastvarača. Rastvarač je uklonjen sublimacijom (tj. primarno sušenje) i zatim desorpcijom (tj. sekundarnim sušenjem).

Liofilizacija rezultuje kolačem ili praškom koji se mogu skladištiti tokom dugačkog vremenskog perioda. Pre primene, liofilizovan sastav se rekonstituiše u rastvaraču, prvenstveno sterilnoj vodi za injekcije. Izraz „rekonstituisana formulacija“, kako se ovde koristi, odnosi se na takav liofilizovan sastav posle rastvaranja.

[0025] Postupci liofilizacije su dobro poznati u struci (npr. Wang, W., Int. J . Pharm., 203, 1-60 (2000)). Liofilizovan sastav pronalaska je postignut sa dva različita protokola liofilizacije kao što je detaljno opisano u primerima.

[0026] Kako bi se sprečila degradacija tokom procesa liofilizacije, tečni sastav prema pronalasku sadrži krioprotektant. Izraz „krioprotektant“, kako se ovde koristi, odnosi se na ekscipijent koji štiti nestabilne molekule tokom zamrzavanja. Tečna sastav pre liofilizacije sadrži 5% saharoze.

[0027] Liofilizovan sastav može dalje da sadrži agens za povećanje mase, poželjno kristalizujući agens za povećanje mase. Agensi za povećanje mase tipično se koriste u struci da pruže strukturu i težinu „kolača“ proizvedenog kao rezultat liofilizacije. Bilo koji pogodan agens za povećanje mase koji je poznat u struci može se koristiti u vezi sa liofilizovanim sastavom pronalaska. Pogodni agensi za povećanje mase uključuju, na primer, manitol, dekstran i glicin.

[0028] Sastav prema pronalasku sadrži surfäktant. Surfäktant je polisorbat 80 u koncentraciji od 0,01%.

[0029] Izraz „pufer“, kako se ovde koristi odnosi se na puferisani rastvor, čiji pH se menja samo marginalno nakon dodavanja kiselih ili baznih supstanci. „Puferski sistem“ obuhvata 10 mM L-histidina i 130 mM glicina.

[0030] Otelotvorenje pronalaska je formulacija imunokonjugata koja sadrži MF-T-SPDB-DM4, kao što je definisano patentnim zahtevima, gde sastav ima pH 5,5.

[0031] Pronalazak je formulacija imunokonjugata koja sadrži 5 mg/ml MF-T-SPDB-DM4, kao što je definisano patentnim zahtevima.

[0032] Pronalazak je formulacija imunokonjugata koja sadrži MF-T-SPDB-DM4 i sistem za puferisanje koji sadrži 10 mM L-histidina i 130 mM glicina, kao što je definisano patentnim zahtevima.

[0033] Pronalazak je formulacija imunokonjugata koja sadrži MF-T-SPDB-DM4, sistem za puferisanje i krioprotektant, koji je 5% saharoze u tečnom sastavu ili tečnom sastavu pre liofilizacije, kao što je definisano patentnim zahtevima.

[0034] Otelotvorenje pronalaska je formulacija imunokonjugata koja sadrži MF-T-SPDBDM4, sistem za puferisanje, krioprotektant, kako je definisano u patentnim zahtevima, i surfäktant koji je 0,01% polisorbata 80.

[0035] Pronalazak je formulacija imunokonjugata koja sadrži 5 mg/ml MF-T-SPDB-DM4, 10 mM L-histidina, 130 mM glicina, 5% saharoze i 0,01% polisorbata 80, pri pH 5,5.

[0036] Otelotvorenje pronalaska je liofilizovan sastav dobijen liofilizacijom tečne formulacije imunokonjugata prema ovom pronalasku, ili se može dobiti liofilizacijom tečne formulacije imunokonjugata prema ovom pronalasku.

[0037] Poželjno otelotvorenje pronalaska je liofilizovana smeša dobijena sušenjem zamrzavanjem tečne formulacije imunokonjugata prema ovom pronalasku.

[0038] Poželjno otelotvorenje ovog pronalaska je liofilizovan sastav dobijena sušenjem zamrzavanjem formulacije tečnog imunokonjugata prema ovom pronalasku primenom postupaka objašnjenih u primeru 6.

[0039] Veoma poželjno otelotvorenje ovog pronalaska je liofilizovan sastav dobijena sušenjem zamrzavanjem tečne formulacije imunokonjugata koja sadrži 5 mg/ml MF-T-SPDB-DM4, 10 mM L-histidina, 130 mM glicina, 5% saharoze i 0,01% polisorbata 80, pri pH 5,5, ili je dobijen sušenjem zamrzavanjem tečne formulacije imunokonjugata koja sadrži 5 mg/ml MF-T-SPDB-DM4, 10 mM L-histidina, 130 mM glicina, 5% saharoze i 0,01% polisorbata 80 pri pH 5,5.

[0040] Otelotvorenje ovog pronalaska je tečna formulacija imunokonjugata dobijena rekonstitucijom liofilizovanog preparata prema ovom pronalasku (naziva se rekonstituisana formulacija). U poželjnom otelotvorenju ovog pronalaska liofilizovan sastav se rekonstituiše u vodi, prvenstveno u sterilnoj vodi za injekcije.

[0041] Prema tome, u skladu sa pronalaskom, sadržaj liofilizovanog sastava koji treba da se rekonstituiše da sadrži 5 mg/ml MF-T-SPDB-DM4 sadrži 0,31 mg L-histidina, 1,95 mg glicina, 9,99 mg saharoze i 0,02 mg polisorbata 80 po mg imunokonjugata MF-T-SPDB-DM4. Kada se rekonstituiše sa vodom, takav liofilizovan sastav ima pH od oko 5,5.

[0042] Ako nije drugačije navedeno, sve vrednosti u ovom slučaju su % težine po zapremini.

[0043] Predmetni pronalazak je dalje opisan sledećim primerima, koji su ilustrativni za postupak i ne treba ih tumačiti kao ograničenje pronalaska. Procesni parametri navedeni u daljem tekstu mogu biti usvojeni i prilagođeni od strane stručne osobe kako bi odgovarali određenoj potrebi.

PRIMER 1

[0044] Ovaj primer pokazuje kako su proizvedene različiti tečni sastavi koje sadrže MF-T-SPDB-DM4. Ovi sastavi su naknadno analizirane kao što je opisano u sledećim primerima.

[0045] Imunokonjugat MF-T-SPDB-DM4 je pripremljen kao što je opisano u WO2010/124797. Za proučavanje nekoliko sastava formulacija rastvor koji sadrži imunokonjugat MF-T-SPDB-DM4 mora biti promenjen na definisan način. Rastvori koji sadrže MF-T-SPDB-DM4 su injektirani u preparativnu kolonu za isključivanje veličine koja je napunjena sa Sephadex G25 spojenim na ÄKTA ekplorer (GE Healthcare). Primenjeni rastvori su eluirani sa konačnim puferskim rastvorom od interesa. Veličina kolone omogućila je potpunu zamenu pufera tako da se sakupljeni fragment eluiranja sastojao od MF-T-SPDB-DM4 u puferskom rastvoru od interesa. Koncentracija proteina je podešena ultrafiltracijom pomoću Vivapore Cell (10/20, 7500 MWCO; Sartorius).

PRIMER 2

[0046] Ovaj primer (koji ne spada u opseg patentnih zahteva) pokazuje efekat nekoliko sistema pufera na agregaciju procenjenu vizuelnim izgledom, kao i dinamičkim rasipanjem svetlosti (DLS) i stabilnost imunokonjugata izmerenu pomoću diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC) za MF- T-SPDB-DM4.

[0047] Sastojci pufera kao i pH imaju jak uticaj da inhibiraju ili smanje formiranje vidljivih i sub-vidljivih čestica. Vidljive čestice se mogu posmatrati vizuelnim pregledom. Sub-vidljiva agregacija se može detektovati putem dinamičkog rasipanja svetlosti (DLS).

[0048] Viša temperatura topljenja Tmmereno sa DSC je jaka indikacija za povećanu stabilnost imunokonjugata.

[0049] Konjugat MF-T-SPDB-DM4 je formulisan na približno 5,0 mg/ml u:

1. (1) 100 mM kalijum fosfata pH 7,5

1

2. (2) 10 mM L-histidina, 130 mM glicina, pH 7,3

3. (3) 20 mM natrijum citrata, 10% trehaloze, pH 6,6

4. (4) 10 mM L-histidina, 130 mM glicina, pH 5,5

5. (5) 0,9% NaCl

Tabela 1: Uticaj nekoliko sistema pufera na agregaciono ponašanje i stabilnost

[0050] Sistem puferisanja ima snažan uticaj na stabilnost imunokonjugata, što je naznačeno temperaturom topljenja Tm1, dok formiranje i agregacija čestica nisu bili pogođeni. Za MF-T-SPDB-DM4, kao što je prikazano u Tabeli 1, poželjni su sistemi pufera koji sadrže L-histidin i glicin koji pokazuju povećan Tm1od približno 3°C.

PRIMER 3

[0051] Ovaj primer (koji ne spada u opseg patentnih zahteva) pokazuje efekat nekoliko sistema pufera na agregaciju procenjenu vizuelnim izgledom, dinamičkim rasipanjem svetlosti (DLS) i hromatografijom isključenja veličine (SEC) u sledeća tri eksperimenta: a. Eksperiment skladištenja 48 sati na 20°C

b. Test opterećenja mućkanja tokom 24 sata na 20°C

c. Inverzni test opterećenja mućkanja sa kontaktom sa čepom tokom 24 sata na 20°C [0052] Ovi eksperimenti pokušavaju da procene stabilnost imunokonjugata u uslovima koji nisu optimalni za tretman (skladištenje).

[0053] Konjugat MF-T-SPDB-DM4 je formulisan na približno 5,0 mg/ml u:

(1) 100 mM kalijum fosfata pH 7,5

(2) 10 mM L-histidina, 130 mM glicina, pH 7,3

(3) 20 mM natrijum citrata, 10% trehaloze, pH 6,6

(4) 10 mM L-histidina, 130 mM glicina, pH 5,5

(5) 0,9% NaCl

Tabela 2: Uticaj nekoliko sistema pufera na agregaciono ponašanje u neoptimalnim uslovima tretmana.

[0054] Uslovi puferisanja imaju snažan efekat na ponašanje agregacije kod ne optimalnih uslova tretmana (skladištenja), što nije očigledno u primeru 2. U primeru 2 može se samo primetiti da sistemi pufera koji sadrže L-histidin i glicin pokazuju povećan Tm1što ukazuje na veću stabilnost imunokonjugata.

[0055] Kao što je prikazano u Tabeli 2, sastav 1 i sastav 5 imaju snažno ponašanje da formiraju agregate. Za sastav 1 tendencija agregacije je bila očigledna već vizuelnim pregledom u testu mućkanja, kao i u invertovanom eksperimentu mućkanja. Rezultati za hromatografiju (SEC) za sastav 5 pokazuju dramatičan pad imunokonjugatnog monomera koji ukazuje na agregaciju. Sastav 3 pokazuje povećanje formiranja dimera imunokonjugata i stoga otkriva tendenciju agregacije.

[0056] Iznenađujuće, sastav 2 koja sadrži L-histidin i glicin pri pH 7,3 pokazuje gubitak koncentracije proteina u invertovanim eksperimentu mućkanja (kontakt sa čepom). Odnos koncentracije proteina pre i posle eksperimenta mućkanja (cAb [%]) je samo 92% u poređenju sa 99,6% pri pH 5,5. Ovaj gubitak proteina može biti posledica povećane adsorpcije na čep pri pH 7,3 u poređenju sa pH 5,5. Ovo je još više iznenađujuće, jer se smanjenje imunokonjugatne stabilnosti oslabljene DSC i povećano agregaciono ponašanje ne mogu primetiti.

[0057] Ovaj eksperiment pokazuje da su sastavi za MF-T-SPDB-DM4 koje sadrže L-histidin i glicin poželjni i sastavi za MF-T-SPDB-DM4 koje sadrže L-histidin i glicin pri pH 5,5 su veoma poželjni.

PRIMER 4

[0058] Ovaj primer pokazuje efekat polisorbata 80 na agregaciju proteina procenjenu vizuelnom kontrolom i DLS.

[0059] Konjugat MF-T-SPDB-DM4 je formulisan na približno 5,0 mg/ml u:

10 mM L-histidina, 130 mM glicina pH 5,5, koji sadrži 0,0 do 0,1% polisorbata 80 (samo

1

0,01% spada u opseg patentnih zahteva)

Tabela 3: Uticaj polisorbata 80 na agregaciju proteina

[0060] Dodatak polisorbata 80 nema nikakav negativan efekat u poželjnom sistemu pufera do koncentracije od 0,1% (pogledati Tabelu 3). Dodavanje deterdženta je generalno poželjno kako bi se izbegla nekontrolisana adsorpcija tokom skladištenja i primene. Poželjna je koncentracija polisorbata 80 od oko 0,01%.

PRIMER 5

[0061] Ovaj primer pokazuje stabilnost poželjnih tečnih formulacija tokom perioda od 14 dana. Pored toga, proveravane su dve koncentracije saharoze za agregaciju proteina procenjene vizuelnim pregledom, DLS i hromatografijom isključivanja veličine (SEC).

[0062] Saharoza je veoma moćna i jedna je od najčešće korišćenih lioprotektanata. Za formulaciju pogodnu za skladištenje tečnosti, kao i liofilizaciju, procenjen je uticaj saharoze na imunokonjugat MF-T-SPDB-DM4.

[0063] Konjugat MF-T-SPDB-DM4 je formulisan na približno 5,0 mg/ml u:

(1) 10% saharoze, 0,01% polisorbata 80, 10 mM L-histidina, 130 mM glicina, pH 5,5 (nije u skladu sa pronalaskom)

(2) 5% saharoze, 0,01% polisorbata 80, 10 mM L-histidina, 130 mM glicina, pH 5,5

[0064] Tokom perioda od 14 dana, sastavi koje sadrže imunokonjugat MF-T-SPDB-DM4 su stabilne. Ovo su sastavi koji su pogodni za liofilizaciju, kao što je prikazano u primeru 6 i primeru 8. Nije moguće posmatrati agregaciju vizuelnim pregledom, DLS i SEC. Sadržaj monomera je veoma stabilan. Čak i na povišenim temperaturama od 40°C, tečna formulacija ne pokazuje agregaciju tokom perioda od 14 dana.

[0065] Sastavi koji sadrže 5 do 10% saharoze su poželjne formulacije. Sastavi koji sadrže 5% saharoze su veoma poželjne zbog niže toničnosti.

[0066] Ovaj eksperiment takođe pokazuje da rekonstituisani rastvor posle liofilizacije može biti uskladišten tokom dugačkog vremenskog perioda bez agregacije.

PRIMER 6

[0067] Ovaj primer pokazuje robusnost liofilizacije i pogodnost tečnog sastava za liofilizaciju. Dodatno, rezultati postignuti nakon rekonstitucije liofilizovanh uzoraka jasno pokazuju da sastav dodatno dozvoljava liofilizovanu formulaciju.

[0068] Konjugat MF-T-SPDB-DM4 je formulisan pri 5,0 mg/ml u veoma poželjnom otelotvorenju:

10 mM L-histidina, 130 mM glicina, 5% saharoze, 0,01% polisorbata 80, pH 5,5

[0069] Korišćena su dva postupka liofilizacije: uslovi 1: prilično oštar postupak koji traje

1

ukupno 62,5 sati; uslovi 2: blaži postupak koji traje ukupno 95,5 sati. Detalji ciklusa liofilizacije prikazani su u Tabeli 5.

[0070] Gore opisani postupci liofilizacije rezultuju belim kolačem ili praškom, koji se može brzo rekonstituisati (oko 1 min) u vodi. Ako se rekonstituiše u istoj koncentraciji proteina kao pre liofilizacije (5 mg/ml), primećuje se bistri rastvor bez čestica. Nisu otkrivene agregacije niti naznake agregacije (pogledati Tabelu 6). Sadržaj SEC monomera je u istom opsegu kao bez liofilizacije (pogledati Tabelu 4 za poređenje).

[0071] U dubinskoj analizi rekonstituisanog rastvora uključena je detekcija nevidljivih čestica putem HIAC postupka, uz osetljiviji MFI (mikro protok slike) postupak koji je primenjen. Čestice/kontejner (zapremina 12,5 ml) su u okviru opšteprihvaćenih kriterijuma. Ovo je važan zahtev za pogodnost kao farmaceutski proizvod.

[0072] U Tabeli 6 su sumirane osobine uzoraka nakon rekonstitucije sa vodom za injekcije.

Tabela 6: Karakterizacija liofilizovanih serija nakon rekonstitucije sa vodom [konačna

1

zapremina 12,5 ml/kontejner]

PRIMER 7

[0073] Ovaj primer pokazuje hemijsku stabilnost imunokonjugata MF-T-SPDB-DM4 u nekoliko poželjnih tečnih formulacija tokom perioda od 14 dana. Korišćene su dve različite koncentracije saharoze.

1

[0074] Konjugat MF-T-SPDB-DM4 je formulisan na približno 5,0 mg/ml u:

[0075] MF-T-SPDB-DM4 je stabilan pri različitim uslovima skladištenja u periodu od 14 dana (pogledati Tabelu 7). Čak i na povišenim temperaturama od 25°C ili 40°C mogu se detektovati samo male količine slobodnih vrsta toksofora (slobodni DM4-linker, slobodni DM4). Prema tome, poželjni sastavi su fizički i hemijski stabilne

PRIMER 8

[0076] Ovaj primer pokazuje dugoročnu stabilnost imunokonjugata MF-T-SPDB-DM4 u poželjnom liofilizovanom sastavu.

[0077] Konjugat MF-T-SPDB-DM4 je formulisan u približno 5,0 mg/ml u 10 mM L-histidina, 130 mM glicina, 5% saharoze, 0,01% polisorbata 80, pH 5,5. Tečna formulacija je liofilizovana kao što je opisano u primeru 6. Liofilizovan sastav koji se rekonstituiše tako da sadrži 5 mg/ml MF-T-SPDB-DM4 obuhvata, prema tome, 0,31 mg L-histidina, 1,95 mg glicina, 9,99 mg saharoze i 0,02 mg polisorbata 80 po mg imunokonjugata MF-T-SPDB-DM4. Kada se rekonstituiše sa vodom, takav liofilizovan sastav ima pH od oko 5,5.

1

[0078] Liofilizovan sastav je čuvan tokom perioda od 24 meseca na 2 do 8°C. U određenim vremenskim tačkama (3, 6, 9, 12, 18 i 24 meseca) uzorci su rekonstituisani sa sterilnom vodom.

[0079] Posle rekonstitucije (konačna zapremina 12,5 ml/bočica) tečni sastav je analiziran za upotrebljivost u farmaceutskim primenama. Pored gore opisanih testova koji analiziraju fizičku stabilnost (agregaciju, formiranje čestica, itd.) i hemijsku stabilnost (slobodne DM4 vrste; odnos DM4/antitelo), analizirana je i sposobnost imunokonjugata u biološkom testu baziranom na ćelijama.

[0080] Kao što je prikazano u tabeli 8, svi relevantni parametri su stabilni za period od 24 meseca. Svi mereni parametri, uključujući biološku snagu imunokonjugata, pokazuju da poželjne formulacije omogućavaju dug život na polici.

Tabela 8: Dugoročna stabilnost (do 24 meseca) imunokonjugata MF-T-SPDB-DM4 u poželjnoj liofilizovanoj formulaciji. Rezultati testa nakon rekonstitucije sa sterilnom vodom.

KORIŠĆENI POSTUPCI

1

Određivanje koncentracije proteina i određivanje odnosa majtanzinoida/antitela (DM4/Ab odnos)

[0081] Koncentracije proteina i odnos majtanzinoida/antitela (DM4/Ab odnos) određivani su merenjem apsorpcije na dve talasne dužine (280 nm i 252 nm) korišćenjem Nanodrop 2000 (Thermo Scientific). Svaki rastvor je merena dva puta na tri nezavisna uzorka.

[0082] Uzorci su razblaženi formulacijom pufera kako bi se dobila UV-apsorpcija na 280 nm u rasponu od 0,6 do 1,2. Uzorak je meren na 252 nm i 280 nm korišćenjem formulacije pufera kao prazan uzorak. Proračuni su prikazani u nastavku.

Calculations:

[0083]

A252

= Ekstinkcija 252 nm

DF

= faktor razblaživanja

A280

= Ekstinkcija 280 nm

ABε252/ε280

= Odnos koeficijenata ekstinkcije antitela 0,35

ABε252

= 68614 [M<-1>(cm)<-1>]

ABε280

= 195413 [M<-1>(cm)<-1>]

DM4ε280

= 5323 [M<-1>(cm)<-1>]

DM4ε252

= 26010 [M<-1>(cm)<-1>]

DM4ε252/ε280

= Odnos koeficijenata ekstinkcije od DM4 (4,89)

2

DM4ε280

= 5323 [M<-1>(cm)<-1>]

ABε280

= 195413 [M<-1>(cm)<-1>]

[AB]

= Molarna koncentracija antitela

MWAB

= 146278 g/mol

Vizuelni pregled

[0084] Za vizuelni izgled testirani su rastvori koji sadrže MF-T-SPDB-DM4 na tamnoj pozadini za čestice ili zamućenost. Bistar rastvor posle razmene pufera ili testa opterećenja je znak malog prisustva ili odsustva formiranja dimera i/ili oligomera, dok je vidljiva zamućenost rastvora u korelaciji sa visokim sadržajem dimera i oligomera.

Dinamičko rasipanje svetlosti (DLS)

[0085] Dinamičko rasipanje svetlosti je postupak za analizu rasute svetlosti generisane laserom. Svetlost koja se rasipa pomoću rastvorene ili suspendovane sonde može se koristiti za izračunavanje hidrodinamičkog poluprečnika (dH[nm]). Povećanje hidrodinamičkog poluprečnika je indikacija za agregaciju imunokonjugata. Hidrodinamički poluprečnik preko DLS je određen korišćenjem Horiba LB 550 (Retsch Technology). Izmeren dHveći od 25nm smatran je kritičnim. dHvrednosti između 16 nm i 25 nm ukazuju na dobro ponašanje imunokonjugata.

Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija, (DSC)

[0086] Stabilnost proteina može se meriti određivanjem temperature topljenja. Sa diferencijalnom skenirajućom kalorimetrijom (DSC) izmerena je temperatura topljenja (Tm) od MF-T-SPDB-DM4 u nekoliko rastvora. Uzorci su zagrevani od 20°C do 105°C i temperature topljenja (Tm) je određena pomoću VP-DSC kalorimetra (GE Healthcare).

Test opterećenja mućkanja

[0087] Imunokonjugati kao što su MF-T-SPDB-DM4 su veoma osetljivi na mehaničku agitaciju, koja se dešava tokom proizvodnje, punjenja ili transporta. Nakon određenog intenziteta pokreta, imunokonjugati počinju da se agregiraju i denaturišu. Tokom testa opterećenja mućkanja tečni sastavi koji sadrže MF-T-SPDB-DM4 analizirani su za agregaciju i denaturaciju u kontrolisanim uslovima.

[0088] Uzorci koji sadrže MF-T-SPDB-DM4 bili su naglašeni na laboratorijskom mikseru (IKA, HS 260) u komori sa kontrolisanom temperaturom (MMM, FrioCell 200). Agregacija parametara kritičnog kvaliteta (vizuelnom kontrolom i DLS) je izmerena nakon 24 sata na 20°C i 300 rpm.

Hromatografija isključivanja po veličini, SEC

[0089] Za određivanje sadržaja monomera i dimera, kao i sadržaja fragmenata male molekulske mase (LMW) i visoke molekulske mase (HMV) izvršena je hromatografija isključivanja po veličini (SEC) korišćenjem HPLC sistema. MF-T-SPDB-DM4 je detektovan upotrebom detektora fluorescencije i kvantifikovan korišćenjem postupka procenta površine. Korišćene su standardne HPLC SEC kolone za proteine, npr. Tosoh Biosep TSK gel G3000 G3000 5 µm, 300mm, dužina x 7,8mm i.D.

Detekcija nevidljivih čestica HIAC i MFI

[0090] Za detekciju i brojanje nevidljivih čestica primenjeni su HIAC i MFI postupci. Za MFI (Micro Flow Imaging) merenja Micro-Flow Imaging™ DPA 4200 sistem (Brightwell Technologies Inc.) je korišćen u skladu sa uputstvima dobavljača. HIAC merenja su izvršena pomoću HIAC 9703+ Liquid Particle Counter (HACH Lange) u kombinaciji sa HRLD-150 13-150 µm senzorom u skladu sa uputstvima dobavljača.

Detekcija slobodnog majtanzinoida sa HPLC

[0091] Slobodni majtanzinoid je određen korišćenjem HPLC postupka. Supelcosil LC-HISEP, 50 mm x 4,6 mm, 5 µm (Sigma-Aldrich) ili ekvivalentna kolona je korišćena u kombinaciji sa Zorbax Eclipse XDB-C18, 50 x k 2,1 mm, 3,5 µm (Agilent) ili ekvivalentna kolona. Kolone su korišćene sa Agilent HPLC sistemom. Slobodni majtanzinoid je odvojen od proteina HISEP hromatografijom i zatim kvantifikovan uz pomoć reverzno fazne hromatografije visokih performansi (RP-HPLC). Kolone su korišćene na 35°C. Kao rastvarači korišćene su mobilna faza A (0,1% TFA u vodi) i mobilna faza B (0,08% TFA u acetonitrilu). Majtanzinoid (DM4) i svi ostali sastavni delovi su izračunati pomoću Empower calc. rutine korišćenjem linearne regresione analize krive kalibracije rutin hidrata u µg/mL. Kako bi se korigovali različiti faktori korelacije rutin hidrata i DM4, rezultati DM4 i svih ostalih komponenti moraju se pomnožiti sa faktorom 1,05497.

Test potencije baziran na ćelijama (biotest)

[0092] Biološka aktivnost imunokonjugata MF-T-SPDB-DM4 je testirana korišćenjem testa potencije baziranog na ćelijama kao što je detaljno opisano u WO2010/124797. Ukratko, transfektovane HT29-ćelije mezotelina su posejane u ploče sa 96 komorica i inkubirane sa serijskim razblaživanjem MF-T-SPDB-DM4 tokom 4 sata. Posle ove inkubacije sa imunokonjugatom, ćelije su pažljivo isprane sa medijumom i inkubirane dodatnih 68 do 96 sati. Posle ovog vremena ćelijska proliferacija je kvantifikovana korišćenjem standardnog postupka (npr. WST-1 reagens ćelijske proliferacije, Roche). Procenjuje se i izveštava odnos aktivnosti u odnosu na standardnu vrednost.

2

Claims

Patentni zahtevi

1. Formulacija imunokonjugata koja sadrži:

a. 5 mg/ml MF-T-SPDB-DM4, anti-mezotelin imunokonjugat majtanzinoida,

b. 10 mM L-histidina,

c. 130 mM glicina

d. 5% (w/v) saharoze, i

e. 0,01% (w/v) polisorbata 80

gde je formulacija puferisani vodeni rastvor koji ima pH 5,5.

2. Liofilizovana smeša dobijena sušenjem zamrzavanjem tečne formulacije imunokonjugata prema patentnom zahtevu 1.

3. Formulacija imunokonjugata dobijena rekonstitucijom liofilizovanog sastava prema patentnom zahtevu 2 u rastvoru.

4. Formulacija imunokonjugata dobijena rekonstitucijom liofilizovanog sastava prema patentnom zahtevu 2 u vodi.

5. Liofilizovan sastav prema patentnom zahtevu 2, koji se rekonstituiše tako da sadrži 5 mg/ml MF-T-SPDB-DM4, koji obuhvata 0,31 mg L-histidina, 1,95 mg glicina, 9,99 mg saharoze i 0,02 mg polisorbata 80 po mg imunokonjugata MF-T-SPDB-DM4. Kada se rekonstituiše sa vodom, takav liofilizovan sastav ima pH od oko 5,5.

6. Formulacija imunokonjugata prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva za upotrebu u terapeutskoj primeni.

Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5