Deprecated: The each() function is deprecated. This message will be suppressed on further calls in /home/zhenxiangba/zhenxiangba.com/public_html/phproxy-improved-master/index.php on line 456
RS59182B1 - Kompozicije i postupci za modulaciju ekspresije faktora b komplementa - Google Patents
[go: Go Back, main page]

RS59182B1 - Kompozicije i postupci za modulaciju ekspresije faktora b komplementa - Google Patents

Kompozicije i postupci za modulaciju ekspresije faktora b komplementa

Info

Publication number
RS59182B1
RS59182B1 RSP20191141A RS59182B1 RS 59182 B1 RS59182 B1 RS 59182B1 RS P20191141 A RSP20191141 A RS P20191141A RS 59182 B1 RS59182 B1 RS 59182B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
certain embodiments
modified
compound
antisense
oligonucleotide
Prior art date
Application number
Other languages
English (en)
Inventor
Thazha P Prakash
Punit P Seth
Eric E Swayze
Tamar R Grossman
Michael L Mccaleb
Andrew T Watt
Susan M Freier
Original Assignee
Ionis Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ionis Pharmaceuticals Inc filed Critical Ionis Pharmaceuticals Inc
Publication of RS59182B1 publication Critical patent/RS59182B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/555—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound pre-targeting systems involving an organic compound, other than a peptide, protein or antibody, for targeting specific cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21047—Alternative-complement-pathway C3/C5 convertase (3.4.21.47), i.e. properdin factor B
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/334—Modified C
    • C12N2310/3341—5-Methylcytosine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/341—Gapmers, i.e. of the type ===---===
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3525—MOE, methoxyethoxy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
Oblast
[0001] Prikazani pronalazak se odnosni na postupke, jedinjenja i kompozicije za lečenje prevenciju, ili ublažavanje bolesti u vezi sa disregulacijom alternativnog puta komplementa davanjem specifičnog inhibitora faktora B komplementa (engl. Complement Factor BCFB) subjektu.
Stanje tehnike
[0002] Sistem komplemenata je deo urođenog imunog sistema domaćina uključenog u liziranje stranih ćelija, pospešivanje fagocitoze antigena, grupisanje sredstava koji nose antigen, i privlačenje makrofaga i neutrofila. Sistem komplementa je podeljen u tri inicijalna puta, klasični, lecitinski i alternativni putevi koji konvergiraju ka komponenti C3 da bi se stvorio enzimski kompleks poznat kao C3 konvertaza, koja cepa C3 u C3a i C3b. C3b se vezuje sa C3 konvertazom pomoću CFB i dovodi do stvaranja C5 konvertaze, koja seče C5 u C5a i C5b, što inicira put membranskog napada koji dovodi di obrazovanja kompleksa membranskog napada (engl. membrane attack complex -MAC) koji sadrži komponente C5b, C6, C7, C8, i C9. Kompleks membranskog napada (MAC) obrazuje transmembranske kanale i remeti fosfolipidni dvosloj ciljnih ćelija, vodeći do ćelijske lize.
[0003] U homeostatskom stanju, alternativni put je kontinualno aktiviran pri niskim nivoima "preživljavnja" kao rezultat aktivacije alternativnog puta spontanom hidrolizom C3 i proizvodnjom C3b, što stvara C5 konvertazu.
[0004] US7696344 B2 odnosi se na maksimiziranje stvaranja efikasnog reagensa za utišavanje gena biranjem posebne siRNKs racionalnim dizajnom, kao i postupcima za utišavanje gena.
[0005] US2004/249178 A1 odnosi se na konjugate, degradabilne vezujuće grupe, kompozicije, postupke sinteze i njihove primene, uključujući holersterol, folat, galaktozu, galaktozamin, N-acetil galaktozamin, PEG, fosfolipid, peptidni i humani albumin seruma (HSA) koji potiče iz konjugata biološki aktivnih jedinjenja.
[0006] WO2012/177947 A2 odnosi se na dvostruku ribonukleinsku kiselinu (dsRNK) sa ciljanjem APOC3 gena, i postupke za korišćenje dsRNM da se inhibira ekspresija APOC3.
[0007] WO2013/166121 A1 odnosi se na tetraGalNAc koji sadrži konjugate i postupke za davaje oligonukleotida.
[0008] M. Maier et al. (2003) odnosi se na višestruke ugljenohidratne motive za prepoznavanje za asialoglikoproteinski receptor, napravljene za specifično tkivno i ćelijsko davanje antisens lekova u parenhimalne čelije jetre.
Suština pronalaska
[0009] Prikazani pronalazak obezbeđuje jedinjenje koje sadrži modifikovane oligonukleotide i konjugovane grupe, gde modifikovani oligonukleotidi se sastoje od 20 do 30 vezanih nukleozida i imaju sekvencu nukleobaza koja se sastoji od SEQ ID NO: 440 i gde konjugovana grupa sadrži:
[0010] Prikazani pronalazak se takođe odnosi na kompoziciju koja sadrži jedinjenje prema pronalasku ili njegovu so i bar jedan farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač.
[0011] Prikazani pronalazak takođe obezbeđuje jedinjenje ili kompoziciju za upotrebu u lečenju, sprečavanju ili ublažavanju bolesti u vezi sa disregulacijom alternativnog puta komplementa kod subjekta.
Kratak prikaz opisa
[0012] Sistem komplementa posreduje u urođenom imunom sistemu i igra važnu ulogu u normalnom inflamatornom odgovoru na povrede, ali njegova disregulacija može izazvati ozbiljne povrede. Aktivacija alternativnog puta komplementa preko njegovog konstitutivnog nivoa "preživljavanja" može voditi do neograničene hiperaktivnosti i dovesti do bolesti disregulacije komplementa.
[0013] Izvesna izvođenja prema opisu odnose se na postupke lečenje, prevencije ili ublažavanja bolesti u vezi sa disregulacijom alternativnom puta komplementa kod subjekta davanjem specifičnog inhibitra faktora B komplementa (CFB). Nekoliko izvođenja opisa se odnose na postupak inhibicije ekspresije CFB kod subjekta koji ima, ili koji je u riziku da dobije, bolest koja je u vezi sa disregulacijom alternativnog puta komplementa, davanjem specifičnog inhibitora CFB subjektu. U izvesnim izvođenjima opisa, postupak smanjenja ili inhibicije akumulacije C3 depozita u oku subjekta koji ima, ili je je u riziku od, bolesti u vezi sa disregulacijom alternativnog puta komplementa obuhvata davanje specifičnog inhibitora subjektu. U nekoliko izvođenja ovog opsa, postupak smanjenja ili inhibicije akumulacije C3 depozita u bubregu subjekta koji ima, ili koji je u riziku od bolesti u vezi sa disregulacijom alternativnog puta komplementa koji obuhvata davanje specifičnog inhibitora CFB subjektu.
Detaljan opis pronalaska
[0014] Razume se da oba gronja opšta opisa i detalji koji slede su dati samo kao primeri i isključivo kao primeri i ne ograničavaju pronalazak za koji je zatražena zaštita. Ovde upotreba jednine uključuje i množenu osim ukoliko nije specifično navedeno drugačije. Kako je ovde navedeno, upotreba "ili" označava "i/ili" osim ukoliko nije drugačije navedeno. Pored toga, upotreba izraza "uključuje" kao i drugih oblika, kao što su "obuhvata" i "uključeno", nije ograničavajuća. Takođe izrazi kao "element" ili "komponenta" obuhvataju oba elemente i komponente koje se sastoje od jedne jedinice i elemete i i komponente koji sadrže više od jedne podjedinice, osim ako posebno nije navedeno drugačije.
[0015] Nazivi odeljaka koji su ovde korišćeni su samo za svrhe organizacije i nisu napravljeni da ograničavaju opisani predmet.
[0016] Osim ako nisu date posebne definicije, nomeklatura koja je krišćena u vezi sa ovde opisanim postupcima i tehnikama analitičke hemije, sintetske organske hemije, i medicinske i farmaceutske hemije je ona dobro poznata i uobičajeno korišćena u ovoj oblasti tehnike. Standardne tehnike mogu biti korišćene za hemijske sinteze i hemijske analize. Izvesne takve tehnike i postupci mogu biti nađeni na primer u "Carbohydrate Modifications in Antisense Research" Edited by Sangvi and Cook, American Chemical Society , Washington D.C., 1994; "Remington’s Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, Pa., 21st edition, 2005; i "Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications" Edited by Stanley T. Crooke, CRC Press, Boca Raton, Florida; i Sambrook et al., "Molecular Cloning, A laboratory Manual," 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
[0017] Osim ako nije drugačije navedeno, sledeći izrazi imaju sledeća značenja:
"2’-F nukleozid" odnosi se na nukleozid koji sadrži šećer koji sadrži fluor u položaju 2’. Osim ako nije drugačije navedeno, fluor u 2’-F nukleozidu je u ribo položaju (menja OH u prirodnoj ribozi).
[0018] "2’-O-metoksietil" (takođe 2’-MOE i 2’-O(CH2)2-OCH3) odnosi se na O-metoksi-etil modifikaciju u položaju 2’ furanoznog prstena.2’-O-metoksietil modifikovan šećer je modifikovan šećer.
[0019] "2’-MOE nukleozid" (takođe 2’-O-metoksietil nukleozid) označava nukleozid koji sadrži 2’-MOE modifikovani šećerni deo.
[0020] "2’-supstituisani nukleozid" označava nukleozid koji sadrži supstituent u položaju 2’-furanozil prstena koji je drugačiji od H ili OH. U izvesnim izvođenjima, 2’ supstituisani nukleozidi obuhvataju nukleozide sa bicikličnim šećernim modifikacijama.
[0021] "3’ cijljno mesto" odnosi se na nukleotid ciljne nukleinske kiseline koja je komplementarna većinom sa 3’ nukleotidom posebnog antisens jednjenja.
[0022] "5’ ciljno mesto" odnosi se na nukleotid ciljne nukleinske kiseline koja je komplementarna većinom sa 5’ nukleotidom posebnog antisens jedinjenja.
[0023] "5-metilcitozin" označava citozin modifikovan sa metil grupom vezanom u položaju 5. 5-metilcitozin je modifikovana nukelobaza.
[0024] "Oko" označava oko ±10% vrednosti. Na primer, ukoliko je navedeno, "jedinjenja su postigla bar oko 70% inhibicije CFB", podrazumeva se da nivoi CFB su inhibirani u okviru opsega od 60% i 80%.
[0025] "Davati" ili "davanje" odnosi se na načine davanja antisens jedinjenja obezbeđenih subjektu da bi se izvela njegova nameravana funkcija. Primer načina davanja koji može biti korišćen obuhvata, ali nije ograničen na parenteralno davanje, kao što je subkutanozno, intravencko ili intramuskulatno ili infuzijom.
[0026] "Alkil," kako je ovde korišćeno, označava zasićeni prav ili razgranat ugljovodonični radikal koji sadrži do dvadeset četiri ugljenikovih atoma. Primeri alkil groupa uključuju bez ograničenja, metil, etil, propil, butil, izopropil, n-heksil, oktil, decil, dodecil i slično. Alkil frupe tipično uključuju od 1 do oko 24 ugljenikovih atoma, tipičnije od 1 do oko 12 ugljenikovih atoma (C1-C12 alkil) sa od 1 do oko 6 ugljenikovih atoma koji je poželjniji.
[0027] Kako je ovde korišćeno, "alkenil," označava prav ili razgranat ugljovodonični lančani radikal koji sadrži do dvadeset četiri ugljenikova atoma i ima bar jednu ugljenik-ugljenik dvostruku vezu. Primeri alkenil grupa uključuju bez ograničenja, etenil, propenil, butenil, 1-metil-2-buten-1-il, dien kao što je 1,3-butadien i slično. Alkenil grupe tipično sadrže od 2 do oko 24 ugljenikovih atoma, tipičnije od 2 do oko 12 ugljenikovih atoma, poželjnije su od 2 do oko 6 ugljenikovih atoma. Alkenil grupe kako je ovde korišćeno mogu opciono uključivati jednu ili više supstitucionih grupa.
[0028] Kako je ovde korišćeno, "alkinil," označava prav ili razgranati ugljovodonični radikal koji sadrži do dvadeset četiri ugljenikova atoma i ima bar jednu ugljenik-ugljenik trostruku vezu. Primeri alkinil grupe uključuju, bez ograničenja, etinil, 1-propinil, 1-butinil, i slično. Alkinil grupe tipično sadrže od 2 do oko 24 ugljenikovih atoma, tipičnije od 2 do oko 12 ugljenikovih atoma, poželjnije su od 2 do oko 6 ugljenikovih atoma. Alkinil grupe kako je ovde korišćeno mogu opciono uključivati jednu ili više supstituicionih grupa.
[0029] Kako je ovde korišćeno, "acil," označava radikal obrzovan uklanjanjem hidroksilne grupe iz organske kiseline i ima opštu formulu -C(O)-X, gde je X tipično alifatik, aliciklik ili aromatik . Primeri uključuju alifatične karbonile, aromatične karbonile, alifatične sulfonile, aromatične sulfinile, alifatične sulfinile, aromatične fosfate, alifatične fosfate i slično. Acil grupe kako je ovde korišćeno mogu opciono uključivati druge supstitucione grupe.
[0030] Kako je ovde korišćeno, "aliciklični" označava sistem cikličnih prstena, gde je prsten alifatičan. Sistem prstena sadrži jedan ili više prstena u kojima je bar jedan prsten alifatičan. Poželjni aliciklici uključuju prsten koji ima od oko 5 do oko 9 ugljenikovih atoma u prstenu. Aliciklik kako je ovde korišćeno može opciono uključivati drugu grupu supstituenta.
[0031] Kako je ovde korišćeno, "alifatični" označava prav ili razgranat ugljovodononični radikal koji sadrži do dvadeset četiri ugljenikova atoma u kojima je zasićenje između bilo koja dva ugljenikova atoma jednostruka, dvostruka ili trostruka veza .Alifatična grupa poželjno sadrži od 1 do oko 24 ugljenikovih atoma, tipičnije od 1 do oko 12 ugljenikovih atoma sa, poželjnije je od 1 do oko 6 ugljenikovih atoma. Pravii ili razgranati lanac alifatične grupe može biti prekinut sa jednim ili više heteroatoma koju uključuju azot, kiseonik, sumpto i fosfor. Takve alifatične grupe prekinute heteroatomima uključuju bez ograničenja, polialkoksile, kao što su polialkilen glikoli, poliamini, i poliimini. Alifatične grupe kako je ovde korišćeno mogu opciono uključivati dalje supstitucione grupe.
[0032] Kako je ovde korišćeno, "alkoksi" označava radikal obrazovan između alkil grupe i atoma kiseonika, gde je atom kiseonika korišćen da se veže za alkoksi grupu osnovnog molekula. Primeri alkoksi grupe uključuju bez ograničenja, metoksi, etoksi, propoksi, izopropoksi, n-butoksi, sekbutoksi, terc-butoksi, n-pentoksi, neopentoksi, n-heksoksi i slično. Alkoksi grupe kako je ovde korišćeno mogu opciono uključivati druge supstitucione grupe.
[0033] Kako je ovde korišćeno, "aminoalkil" označavan amino supstituisani C1-C12 alkil radikal. Alkil deo radikala obrazuje kovalentnu vezu sa osnovim molekulom. Amino grupa može biti locirana u bilo kom položaju i amino alkil grupa može biti supstituisana sa drugom supstitucionom grupom u alkil i/ili amino delu.
[0034] Kako je ovde korišćeno, "aralkil" i "arilalkil" označavaju aromatičnu grupu koja je kovalento vezana za C1-C12 alkil radikal. Deo alkil radikala dobijenog aralkila (ili arilalkil) grupe obrazuje kovalentnu vezu sa osnovnim molekulom. Primeri uključuju bez ograničenja, benzil, fenetil i slično. Aralkil grupe kako je ovde korišćeno mogu opciono uključivati dalje supstitucione grupe vezane za alkil, aril ili obe grupe koje obrazuju radikalsku grupu.
[0035] Kako je ovde korišćeno, "aril" i "aromatični" označava radikale mono- ili policikličnih karbocikličnih prstena koji imaju jedan ili više aromatičnih prstenova. Primeri aril grupe uključuju bez ograničenja fenil, anftil, tetrahidronaftil, indanil, idenil i slično. Poželjni prstenasti aril sistemi imaju od oko 5 do oko 20 ugljenikovih atoma u jednom ili više prstena. Aril grupe kako je ovde korišćeno mogu opciono uključivati druge supstituicione grupe.
[0036] "Ublažavanje" se odnosi na smanjenje bar jednog indikatora, znaka, ili simptoma u vezi sa bolesti, poremećajem ili stanjem. U izvesnim izvođenjima, ublažavanje uključuje odlaganje ili usporavanje u napredovanju jednog ili više indikatora stanja ili bolesti. Ozbiljnost indikatora može biti određena subjektivnim ili objektivnim merama, koje su poznate osobama iz struke.
[0037] "Životinja" odnosi se na humanu ili nehumanu životinju, uključujući, ali bez ograničenja, miša, pacova, zečeva, pasa, mačaka, svinja, i nehumanih primata, uključujući, ali bez ograničenja, majmune i šimpaze.
[0038] "Antisens aktivnost" označava bilo koju detektabilnu ili merljivu aktivnost koja se može pripisati hibridizaciji antisens jedinjenje za njegov ciljnu nukleinsku kiselinu. U izvesnim izvođenjima, antisens aktivnost je pad u količini ili ekspresiji ciljne nukelinske kiseline ili proteina kodiranog sa ciljnom nukleinskom kiselinom.
[0039] "Antisens jedinjenje" označava oligomerno jedinjenja koje je u stanju da podeleže hibridizaciji sa ciljnom nukleinskom kiselinom preko vezivanja vodonika. Primeri antisensnih jedinjenja uključuju jednolančana i dvolančana jedinjenja, kao što su, antisensni oligonukleotidi, siRNAs, shRNAs, ssRNAs, i jedinjenja zasnovanih na popunjenosti.
[0040] "Antisensna inhibicija" označava redukciju nivoa ciljne nukleinske kiseline u prisustvu antisens jedinjenja komplementarnog sa ciljnom nukleinskom kiselinom u poređenju sa nivoima ciljne nukleinske kiseline bez prisustva antisens jedinjenja.
[0041] "Antisens mehanizmi" su oni mehanizmi koji uključuju hibridizaciju jedinjenja sa ciljnom nuklenskom kiselom, gde ishod ili efekat hibridizacije je ili ciljna degradacija ili ciljna zauzetost sa istovremenim zaustavljanjem ćelijske mašinerije koja uključuje, na primer transkripciju ili obradu.
[0042] "Antisens oligonukleotid" označava jednolančani oligonukleotid koji ima sekvencu nukeobaze koja dozvoljava hibridizaciju za odgovarajućim regionom ili segmentom ciljne nukleinske kiseline.
[0043] "Komplementarnost baza" odnosi se na kapacitet za precizno bazno sparivanje nukleobaza antisens nukleotida sa odgovarajućim nukeobazama u ciljnoj nukleinskoj kiselini (tj. hibridizacija), i posredovano je sa Watson- Crick-ovim, Hoogsteen ili reverznim Hoogsteen vodoničnim vezivanjem između odgovarajućih nukleobaza.
[0044] "Biciklični šećerni deo " označava modifikovani šećerni deo koji sadrži 4 do 7 člani prsten (uključujući ali bez ograničenja furanozil) koji sadrži premošćena dva atoma sa 4 do 7 članim prstenom da bi se obrazovao drugi prsten, dajući bicikličnu strukturu. U izvesnim izvođenjima, 4 do 7 člani prsten je šećerni prsten. U izvesnim izvođenjima, 4 do 7 člani prsten je furanozil. U izvesnim takvim izvođenjima, prsten povezuje 2’-ugljenik i 4’- ugljenik furanozila.
[0045] "Biciklična nukelinska kiselina" ili " BNA" iil "BNA nukleozidi" označavaju nukleinske kiselinske monomere koji imaju most koji povezuje dva ugljenikova atoma između položaja 4’ i 2’ nukleozidne šećerne jedinice, na taj način obrzujući biciklični šećer. Primeri takvih bicikličnih šećera uključuju, ali bez ograničenja A) α-L-Metileneoksi (4’-CH2-O-2’) LNA , (B) β-D-Metileneoksi (4’-CH2-O-2’) LNA , (C) Etilenoksi (4’-(CH2)2-O-2’) LNA, (D) Aminooksi (4’-CH2-O-N(R)-2’) LNA i (E) Oksiamino (4’-CH2-N(R)-O-2’) LNA, kao što je dole prikazano.
[0046] Kako je ovde korišćeno, LNA jedinjenja uključuju, ali bez ograničenja, jedinjenja koja imaju bar jedan most između položaja 4’ i 2’ šećera gde svaki od mostova nezavisno sadrži 1 ili od 2 do 4 vezane grupe nezavisno izabrane između -[C(R1)(R2)]n-, -C(R1)=C(R2)-, -C(R1)=N-, -C(=NR1)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(R1)2-, -S(=O)x- i -N(R1)-; gde: x je 0, 1, ili 2; n je 1, 2, 3, ili 4; svaki R1i R2je, nezavisno, H, zaštitna grupa, hidroksil, C1-C12alkil, supstituisani C1-C12alkil, C2-C12alkenil, supstituisani C2-C12alkenil, C2-C12alkinil, supstituisani C2-C12alkinil, C5-C20aril, supstituisani C5-C20aril, heterociklični radikal, supstituisani heterociklični radikal, heteroaril, supstituisani heteroaril, C5-C7aliciklični radikal, supstituisani C5-C7aliciklični radikal, halogen, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, acil (C(=O)-H), supstituisani acil, CN, sulfonil (S(=O)2-J1), ili sulfoksil (S(=O)-J1); i svaki J1i J2je, nezavisno, H, C1-C12alkil, supstituisani C1-C12alkil, C2-C12alkenil, supstituisani C2-C12alkenil, C2-C12alkinil, supstituisani C2-C12alkinil, C5-C20aril, supstituisani C5-C20aril, acil (C(=O)-H), supstituisani acil, heterociklični radikal, supstituisani heterociklični radikal, C1-C12aminoalkil, supstituisani C1-C12aminoalkil ili zaštitna grupa.
[0047] Primeri 4’- 2’ premošćavajuće grupe obuhvaćeno u okviru definicije LNA uključuju ali bez ograničenja na jednu formulu: -[C(R1)(R2)]n-, -[C(R1)(R2)]n-O, -C(R1R2)-N(R1)-O- ili -C(R1R2)-O-N(R1)-. Pored toga, druge premošćavajuće grupe obuhvaćene definicijom LNA su 4’-CH2-2’, 4’-(CH2)2-2’, 4’-(CH2)3-2’, 4’-CH2-O-2’, 4’-(CH2)2-O-2’, 4’-CH2-O-N(R1)-2’ i 4’-CH2-N(R1)-O-2’-mostovi, gde svaka R1i R2je, nezavisno, H, zaštitna grupa ili C1-C12alkil.
[0048] Takođe uključeni u okviru definicije LNA prema pronalasku su LNAs u kojoj 2’-hidroksil grupa ribozil šećernog prstena je vezana za 4’ ugljenikov atom šećernog prstena, na taj način obrazujući metilenoksi 2’) most da bi se obrazovao biciklični šećerni deo. Most može takođe biti metilenska (-CH2-) grupa koja povezuje 2’ kiseonikvo atom i 4’ ugljenikov atom, za koji izraz metilenoksi LNA je korišćen. Pore toga; u slučaju bicikličnog šećernog dela koji ima etilensku premošćavajuću grupu u ovom položaju, izaz etilenoksi (4’-CH2CH2-O-2’) LNA je korišćen. α -L- metilenoksi (4’-CH2-O-2’), izmer metilenoksi (4’-CH2-O-2’) LNA je takođe obuhvaćen u okviru definicije LNA, kako je ovde korišćeno.
[0049] "Struktura kape" ili"terminalni deo kape" označava hemijsku modifikaciju, koja je ugrađena u kraj antisens jedinjenja.
[0050] "Ugljenihidrat" označava ugljenihidrat koji se javlja u prirodi, modifikovani ugljenihidrat ili derivat uljenoghidrata<.>
[0051] "Klaster ugljenihhidrata" označava jedinjenje koje ima jedan ili više ugljenohidratnih ostataka vezanih za strukturu ili vezujuću grupu (engl. linker) (videti npr., Maier et al., "Synthesis of Antisense Oligonukleotids Conjugated to a Multivalent Carbohydrate Cluster for Cellular Targeting," Bioconjugate Hemija, 2003, (14): 18-29, ili Rensen et al., "Design and Synthesis of Novel N-Acetylgalactosamine-Terminated Glycolipids for Targeting of Lipoproteins to the Hepatic Asiaglikoprotein Re-ceptor," J. Med. Chem. 2004, (47): 5798-5808, na primere ugljenohidratnih konjugovanih klastera).
[0052] "Ugljenohidratni derivati" označavaju jedinjenje koja može biti sintetizovano pomoću ugljenihidrata kao polaznog materijala ili intermedijera.
[0053] "cEt" ili "premošćeni etil" označava biciklični šećerni deo koji sadrži most koji povezuje 4’-ugljenik i 2’-ugljenik, gde most ima formulu: 4’-CH(CH3)-O-2’.
[0054] "Hemijska modifikacija" označava hemijsku razliku u jedinjenju kada se poredi sa onim koji se javlja u prirodi. Hemijske modifikacije oligonukleotida uključuju nukleozidne modifikacije (uključujući modifikacije šećernog dela i modifikacije nukleobaza) i modifikacije internukleozidne veze. Pozivanjem na oligonukleotid hemijske modifikacije ne uključuju razlike samo u sekvenci nukleobaza.
[0055] "Veza koja se cepa" označava bilo koju hemijsku vezu koja je u stanju da se pocepa. U izvesnim izvođenjima, veza koja se cepa je izabrana između: amidne, poliamidne, estrske, etarske, jedne ili obe estarske fosfodiestra, estra fosfata, karbamata, di-sulfida, ili peptida.
[0056] "Grupa koja se cepa" označava vezu ili grupu koja je u stanju sa se pocepa pod fiziološkim uslovima. U izvesnim izvođenjima, grupa koja se cepa se cepa u ćeliji ili subćelijskom delu, kao što je lizozom. U izvesnim izvođenjima, grupa koja se cepa se cepa endogenim enzimima kao što su nukelaze. U izvesnim izvođenjima, grupa koja se cepa sadrži grupu atoma koji imaju jednu, dve, tri, četiri, ili više od četiri veze koje se cepaju.
[0057] "Konjugat" ili "konjugovana grupa" označavan atom ili grupu atoma vezane za oligonukleotid ili oligomerno jedinjenje. Generalno, konjugovana grupa modifikuje jednu ili više osobina jedinjenja za koje je vezana, uključujuči ali bez ograničenja farmakodinamičke, farmakokinetičke, vezujuće, apsorpcione osobine, ćelijsku raspoređenost, ćelijsko preuzimanje, naelektrisanje i/ili klirens .
[0058] "Konjugovana vezujuća grupa" ili "vezujuća grupa" u kontekstu konjugovane grupe označačava deo konjugovane grupe koji sadrži atom ili grupu atoma i koji kovalentno vezuje (1) oligonukleotid za drugi deo konjugove grupe ili (2) dva ili više delova konjugovane grupe.
[0059] Konjugovane grupe su ovde pokazane kao radikali, obezbeđujući vezu za obrazovanje konvaletnog vezivanja za oligomerno jedinjenje kao što antisens oligonukleotid. U izvesnim izvođenjima, tačka vezivanja oligomernog jedinjenja je 3’-kiseonikov atom 3’-hidroksil grupe 3’ terminalnog nukleozida oligomernog jedinjenja. U izvesnim izvođenjima tačka vezivanja oligomernog jedinjenja je 5’-kiseonikov atom 5’-hidroksil grupe 5’ terminalnog nukelozida oligomernog jedinjanja. U izvesnim izvođenjima, veza za obrazovanje veze za oligomerno jedinjenje je veza koja se cepa. U izvesnim izvođenjima, tavka veza koja se cepa čini sve ili deo dela koji se cepa .
[0060] U izvesnim izvođenjima, konjugovana grupa sadrži deo koji se cepa (npr., vezu koja se cepa ili nukleozid koji se cepa) i ugljenohidrati deo klastera, kao što je GalNAc deo klastera. Takav ugljenohidratni deo klastera sadrži: ciljajući deo i opciono, konjugovani vezujući deo. U izvesnim izvođenjima, uljenohidratni klaster deo je identifikovan sa brojem i identitetom liganda . Na primer, i izvesnim izvođenjima, ugljenohidratni deo klastera sadrži 3 GalNAc grupe i označen je kao "GalNAc3". U izvesnim izvođenjima, ugljenohidratni deo klastera sadrži 4 GalNAc grupe i označen je kao "GalNAc4". Specifični ugljenohidratni klaster delovi (koji imaju specifične privezane, razgrante i konjugovane vezujuće grupe) su ovde opisani i označeni sa rimskim brojevima sa subskriptom "a". Prema tome "GalNac3-1a" odnosi se na specifične ugljenohidratni deo klastera konjugovane grupe koja ima 3 GalNac grupe i specifično identifikovane vezane, razgranate i vezujuće grupe. Takvi ugljenohidratni fragment klastera je povezan za oligomernim jedinjenjem pomoću delova koji se cepaju, kao što je veza koja se cepa ili nukleozid koji se cepa.
[0061] "Konjugovano jedinjenje" označavany atome, grupe atoma, ili grupe vezane za atome pogodne za upotrebu kao konjugovana grupa. U izvesnim izvođenjima, konjugovana jedinjenja mogu posedovati ili imati jednu ili više osobina, uključujuči , ali bez ograničenja farmakodinamičke, farmakokinetičke, vezujuće, apsorpcione osobine, ćelijsku raspoređenost, ćelijsko preuzimanje, naelektrisanje i/ili klirens .
[0062] "Ograničeni etil nukleozid" (takođe cEt nukleozid) označava nukleozid koji sadrži biciklični šećerni deo koji sadrži 4’-CH(CH3)-O-2’ most.
[0063] "Faktor B kompelmenta (CFB)" označava nukleinsku kiselinu ili protein CFB. "CFB nukleinska kiselina" označava bilo koju nukleinsku kiselinu koja kodira CFB. Na primer, u izvesnim izvođenjima, CFB nukeinska kiselina obuhvata DNK sekvencu koja kodira CFB, RNK sekvencu koja transkribuje DNK koji kodira CFB (uključujući genomsku DNK koja sadrži introne i egzone), uključujući neprotensku kodirajuću (tj. nekodirajuću) RNK sekvencu, i iRNK sekvencu koja kodira CFB. "CFB iRNK" označava iRNK koja kodiraCFB protein.
[0064] "CFB specifični inhibitor" odnosi se na bilo koje sredstvo koje je u stanju sa specifično inhibira CFB RNK i/ili ekspresiju CFB proteina ili aktivnost na molekulskom nivou. Na primer, CFB specifični inhibitori uključuju nukleinske kiseline (uključujući antisens jedinjenja), peptide, antitela, male molekule, i ostala sredstva koja su u stanju da inhibiraju ekspresiju CFB RNK i/ili CFB proteina.
[0065] "Hemijski različit region" odnosi se na region antisens jedinjenja koje je na neki način hemijski različito od ostalog regiona istog antisens jedinjenja. Na primer, region koji ima 2’-O-metoksietil nukleotide je hemijski različit od regiona koji ima nukleotide bez 2’-O-metoksietil modifikacija.
[0066] "Himerna antisens jedinjenja" označava antisens jedinjenja koja imaju bar 2 hemijski različita regiona, gde svaki položaj ima mnošto podjedinica.
[0067] "Komplementarnost" označava kapacite za sparivanje između nuklobaza prve nukleinske kiseline i druge nukleinske kiseline.
[0068] "Sadrži," "sastoji se" i "obuhvata" se razume da se odnose na uključivanje navedenih koraka ili elemenata ili grupa koraka ili elemenata ali ne isključuje bilo koji drugi korak ili element ili grupu koraka ili elemanata.
[0069] "Susedne nuklobaze" označava nukleobaze koje su neporsedno jedna pored druge.
[0070] "Dezoksinukleozid" označava nukleozid koji sadrži 2’-H furanozil šećerni deo, kako se nalazi u prirodi z dezoksirubonukeozidima (DNK). U izvesnim izvođenjima, 2’-dezoksinukleozid može sadržati modifikovane nukeobaze ili može sadržati RNK nukleobazu (npr., uracil).
[0071] "Dezoksiribonukleotid" označava nukleotid koji ima vodonik u položaju 2’ šećernog dela nukleotida. Dezoksiribonukleotidi mogu biti modifikovani sa bilo kojim različitim supstituentima.
[0072] "Konstruisanje" ili"konstruisano prema" odnosi se na postupak konstruisanja oligomernog jedinjenja koje specifično hibiridizuje sa izabranim molekulom nukleinske kiseline.
[0073] "Različito modifikovani" označava hemijske modifikacije ili hemijske supstituente koji su različiti jedan od drugog, uključujući odsustvo modifikacija. Prema tome, na primer, MOE nukleozid i nemodifikovani DNK nukleozid su "različito modifikovani," mada DNK nukleozid je nemodifikovan. Slično, DNK i RNK su "različito modifikovani," i ako su oba nemodifikovana nukelozida koji se javljau u prirodi. Nukleozidi koji su isti, ali koji sadrže različite nukleobaze nisu različito modifikovani. Na primer, nukleozid koji sadrži 2’-OMe modifikovani šećer i nemodifikovanu adenin nukleobazu i nukleozid koji sadrži 2’-OMe modifikovani šećer i nemodifikovanu timin nukleobazu nisu različito modifikovani.
[0074] "Dvolančane" odnosi se na dva odvojena oligomerna jedinjanja koja su hibridzovana jedna sa drugim . Takva dvolančana jedinjenja mogu imati jedan ili više nehibridiizujućih nukleozida na jednom ili oba kraja jednog ili oba lanca (visećih) i/ili jedna ili više nehibiridzujućig nukleozida (pogrešno sparenih) uz uslov da ima dovoljno komplementarnost da se održi hibridizacija pod fiziološki relevantim uslovima.
[0075] "Efikasna količina" označava količinu aktivnog sredstva dovoljnog da ostvari željeni farmaceutski ishod kod pojedinca kome je potrebno sredstvo. Efikasna količina može varirati duž pojedinaca u zavisnsoti od zdravnja i fizičkih uslova pojedinca koji se leči, taksonomske grupe pojedinaca koji se leče formulacije kompozicije, procene medicinskog stanja pojedinaca i drugih relevantih faktora.
[0076] "Efikasnost"označava sposobnost da se proizvede željeni efekat.
[0077] "Ekspresija" uključuje sve funkcije kojima se informacija kodirana genom pretvara u strukture prisutne i rade u ćeliji. Takve strukture uključuju, ali bez ograničenja proizvode transkripcije i translacije.
[0078] "Potpuna komplementarnost" ili "100% komplemenatarnost" označava da svaka nukleobaza prve nukleinske kiseline ima komplementarnu bazu druge nuklinske kiseline. U izvesnim izvođenjima, prva nukleinska kiselina je antisens jedinjenje i ciljna nukleinska kiselina je druga nukleinska kiselina.
[0079] "Furanozil" označava strukturu koja sadrži 5 –člani prsten koji sadrži četiri ugljenikova atoma i jedan kiseonikov atom.
[0080] "Gapmer" označava himerne antisens jedinjenje u kome unutrašnji region ima mnoštvo nukleozida koji podržavaju cepanja RNaze H smeštena između spoljašnjih regiona koji imaju jedan ili više nukleozida, gde nukleozidi koji sadrže unutrašnji region su hemijski različiti od nukleozida ili nukleozida koji sadrže spoljašnje regione. Unutrašnji region može biti nazvan kao "razmak" (engl.gap) i spoljašnji regioni mogu biti nazvani "krila." (engl.wings)
[0081] "Halo" i "halogen," označavaju atom izabran između fluora, hlora, broma i joda.
[0082] "Heteroaril," i "heteroaromatični," označava radikal koji sadrži mono- ili policiklični aromatični prsten, sistem prstena ili spojeni sistem prstena u kome bar jedan od prstena je
1
aromatičan i uključuje jedan ili više heteroatoma. Heteroaril takođe označava da uključuje spojedni sistem prstenova u kome jedan ili više spojenih prstena ne sadrže heteroatome. Heteroaril grupe tipično uključuju jedan atomski prsten izabran između sumpora, azota ili kiseonika. Primeri heteroaril grupe uključuju bez ograničenja, piridinil, pirazinil, pirimidinil, pirolil, pirazolil, imidazolil, tiazolil, oksazoil, izooksazolil, tiadiazolil, oksadiazolil, tiofenil, furanil, hinolinil, izohinolinil, benzimidazolil, benzooksazolil, hinoksalinil i slično. Heteroaril radikal može biti vezan sa osnovnim molekulom direktno ili preko dela koji vezuje kao što je alifatična grupa ili heteroatom. Heteroaril grupe kako je ovde korišćeno mogu opciono uključivati druge supstituicione grupe.
[0083] "Hibridizacija" označava sparivanje komplementarnih molekula nukleinske kiseline. U izvesnim izvođenjima, komplementarni molekuli nukleinskih kiselina uključuju, ali bez ograničenja, antisens jedinjenje i ciljnu nukleinsku kiselinu. U izvesnim izvođenjima, komplementarni molekuli nukleinske kiseline uključuju, ali bez ograničenja antisens oligonukleotid i ciljnu nukelinsku kiselinu.
[0084] "Identifikovanje životinje koja ima, ili je u riziku da ima, bolest, poremećaj i/ili stanje" označava identifikovanje životinje kod koje je dijagnozirana bolest, poremećaj i/ili stanje ili identifikovanje životinje koja ima predispoziciju da se razvije bolest, poremećaj i/ili stanje. Takva identifikacija može se postići bilo kojim postupkom za procenu medicinske istorije pojedinca i stanardnih kliničkih testova ili procena.
[0085] "Odmah susedni" označava da ne postoje dodatni elementi između odmah susednih elemenata.
[0086] "Pojedinac" označava humanu ili nehumanu životinju izabranu za lečenje ili terapiju.
[0087] "Inhibiranje ekspresione aktivnost" odnosi se na redukcuju, blokadu eskpresije ili aktivnosti i neophodno ne ukazuje na ukupnu eliminaciju ekspresione aktivnosti.
[0088] "Internukleozidna veza"odnosi se na hemijsku vezu između nukelozida .
[0089] "Internukleozidna neutrana vezujuća grupa " označava neutralnu vezujuću grupu koja direktno veže dva nukleozida .
[0090] "Internukleozida fosforna vezujuća grupa" označava fosfornu vezujuću grupu koja se direktno veže za dva nukleozida.
[0091] "Produženi" antisens oligonukleotidi su oni koji imaju jedan ili više dodatnih nukleozida u odnosu na ovde opisani antisens oligonukleotid.
[0092] "Motiv povezivanja’ označava uzorak modifikacije veze u oligonukleotidu ili njegovom regionu. Nukleozidi takvog oligonukleotida mogu biti modifikovani ili nemodifikvoani. Osim ako nije drugačije navedeno, motivi ovde koji opisuju samo veze namera je da budu motivi povezivanja. Prema tome, u takvim slučajevima nukleozidi nisu ograničeni.
[0093] "Vezani dezoksinukleozid" označava bazu nukleinske kiseline (A, G, C, T, U) supstituisanu sa dezoksiribozom povezanom sa fosfatnim estrom da bi se obazovao nukleotid.
[0094] "Vezani nukleozidi" označavaju susedne nukleozide vezane zajedno sa internukleozidnom vezom.
[0095] "Zaključani nukleozid nukleinske kiseline" ili "LNA" označava nukleozid koji sadrži šećerni deo koji sadrži most 4’-CH2-O-2’.
[0096] "Pogrešno sparivanje" ili "nekomplementarne nukleobaze " odnosi se na slučaj kada nukleobaza prve nukleinske ksieline nije u stanju da se spari sa odgovarajućom nukleobazom druge ciljne nukleinske kiseline.
[0097] "Modifikovana internukleozidna veza" odnosi se na susptituciju ili bilo koju drugi promenu u odnosu na intenukleozidne veze koji se javlja u prirodi (tj fosfodiestarska internukleozidna veza).
[0098] "Modifikovana nukleobaza" označava bilo koju nuklobazu koja je drugačija od adenina, citozina, gvanina, timidina, ili uracila. "Nemodifikovana nukleobaza" označava purininske baze adenin (A) i gvanin (G), i piridmidinske baze timidin (T), citozin (C) i uracil (U).
[0099] "Modifikovni nukleozid" označava nukleozid koji ima nezavisno, modifikovani šećenrni deo i/ili modifikovanu nukleobazu.
[0100] "Modifikovani nukleotid" označava nukleotid koji ima, nezavisno modifikovani šećerni deo, modifikovanu internukleozidnu vezu ili modifikovanu nukleobazu.
[0101] "Modifikovani oligonukleotid" označavan oligonukleotid koji sadrži bar jednu modifikovanu internukleozidnu vezu, modifikovani šećer, i/ili modifikovanu nukleobazu.
[0102] "Modifikovani šećer" označava supstituciju i/ili bilo koju promenu iz prirodnog šećernog dela.
[0103]"Modulovanje" odnosi se na promenu ili prilagođavanje karakteristike u ćeliji, tkviu , organu ili organizmu. Na primer, modulacija CFB iRNK može značiti da se poveća ili smanji nivo CFB iRNK i/ili CFB proteina u ćeliji, tkivu, organu ili organizmu. "Modulator" utiče na promenu u ćeliji, tkivu, organu ili organizmu. Na primer, CFB antisens jedinjenje može biti modulator koji smanjuje količinu CFB iRNK i/ili CFB proteina u ćeliji, tkivu, organu ili organizmu.
[0104] "Monomer" odnosi se na pojedinačnu jedinicu oligomera. Monomeri uključuju , ali bez ograničenja, nukleozide i nukleotide, bilo da se prirodno javljaju ili su modifikovani.
[0105] "Mono ili polisistemi cikličnih prstena" se misli da uključuju sistem prstena izabran iz pojedinačnog ili policikličnog radikalnskog sistema prstena u kojima su prsteni spojeni ili povezani i smatra se da uključuju pojedinačene i mešovite sisteme prstena pojedinačno izabrane između alifatičnih, alicikličnih, aril, heteroaril, aralkil, arilalkil, heterociklil, heteroaril, heteroaromatičnih i heteroarilalkil. Takve mono i policiklične strukture mogu sadržati prstenove od kojih svaki ima isti nivo zasićena ili svaki, nezavisno, ima različiti stepen zasićenja uključujući potpuno zasićene ili potpnuno nezasićene. Svaki prsten može sadržati atome u prstenu izabrane između C, N, O i S da se stvore heterociklični prstenovi kao i prstenovi koji sadrže samo C atome u prstenu koji mogu biti prisutni u mešovitim motivima kao što su na primer benzimidazol gde jedan prsten ima samo uljenikove atome u prstenu i spojeni prsten ima dva azotova atoma . Mono il poli ciklični sistem prstena može biti dalje supstituisan sa grupama supstituenata kao što su na primer ftalimid koji ima dve =0 grupe vezane za jedan od prstena. Mono ili policiklični sistem prstena može biti vezan za osnovne molekule pomoću različitih strategija kao što je direktno preko atoma prstena, spojeni preko višestrukih atoma prstena, preko grupe supstituenata ili preko bifunkcionalnih delova za vezivanje.
[0106] "Motiv" označva uzorak ne modifikovanih i modifikovanhi nukleozida u antisens jedinjenju.
[0107] "Prirodni šećerni deo" označava šećerni deo koji se nalazi u DNK (2’-H) ili RNK (2’-OH).
[0108] "Internukleozidna veza koja se javlja u prirodi" označava 3’ do 5’ fosfodiestarsku vezu.
[0109] "Neutralna vezujuća grupa" označava vezujuću grupu koja nije naelektrisana. Neutralna vezujuća grupa uključuje bez ograničenja fosfotriestre, metilfosfonate, MMI (-CH2-N(CH3)-O-), amid-3 -CH2-C(=O)-N(H)-), amid-4 (-CH2- N(H)-C(=O)-), formacetal (-O-CH2-O-), i tioformacetal (-S-CH2-O-). Dalje neutralne vezujuće grupe uključuju nejonske veze koje sadrže siloksan (dialkilsiloksan), karboksilatni estar, karboksamid, sulfid, sulfonatni estar i amide (Videti na primer: Carbohydrate Modifications in Antisense Research; Y.S. Sanghvi and P.D. Cook Eds. ACS Symposium Series 580; Chapters 3 and 4, (pp.40-65)). Druge neutralne vezujuće grupe uključuju nejonske veze koje sadrže mešovite komponente N, O, S i CH2 kao delove.
[0110] "Nekomplementarna nukleobaza" odnosi se na par nukleobaza koji ne obrazuje vodonične veze sa jedna sa drugom ili na drugi način podržavaju hibridizaciju.
[0111] "Neinternukleozidna neutralna vezujuća grupa " označava neutralnu vezujuću grupu koja direkrno ne veže dva nukleozida . U izvesnim izvođenjima, neinternukleozidna neutralna vezujuća grupa vezuje nukleozid za grupu koja je drugačija od nukleozida. U izvesnim izvođenjima, neinternukleozidna neutralna vezujuća grupa vezuje dve grupe, od kojih nijedna nije nukleozid.
[0112] "Neinternukleozidna fosforna vezujuća grupa" označava fosfornu vezujuću grupu koja ne vezuje direkno dva nukleozida. U izvesnim izvođenjima, nenternukleozidna fosforna vezujuća grupa vezuje nukleozid za grupu koja je drugačija od nukleozida. U izvesnim izvođenjima, neinternukleozidna fosforna vezujuća grupa vezuje dve grupe, od kojih ni jedna nije nukleozid.
[0113] "Nukleinska kiselina" odnosi se na molekule koji su sastavljeni od monomernih nukleotida. Nukleinska kiselina uključuje, ali bez ograničenja samo na njih, ribonukleinske kiseline (RNK), dezoksiribonukleinske kiseline (DNK), jednolančane nukleinske kiseline, i dvolančane nukleinske kiseline.
[0114] "Nukleobaza" označava heterociklični deo koji je u stanju da se sparuje sa bazom druge nukleinske kiseline.
[0115] "Nukleobazana komplementarnost " odnosi se na nukleobazu koja je u stanju da se spari sa drugom nukleobazom. Na primer, i DNK, adenin (A) je komplementaran sa timidinom (T). Na primer, u RNK, adenin (A) je komplementaran sa uracilom (U). U izvesnim izvođenjima, komplementarna nukleobaza odnosi se na nukleobazu antisens jedinjenja koja je u stanju da se bazno spari sa nukleobazom ciljne nukleinske kiseline. Na primer, ukoliko nukleobaza u izvesnom položaju antisens jedinjenja je u stanju da se vodonično veže sa nukleobazom u izvesnom položaju ciljne nukleinske kiseline, tada se položaj vodoničnog vezivanja između oligonukleotida i ciljne nukleinske kiseline se smatra da je komplemataran za nukleobazni par.
[0116] "Nukleobazani modifikacioni motiv’ označava uzorak modifikacija nuklobaza duž oligonukleotida. Osim ako nije drugačije navedeno, nukleobazni modifikacioni motiv je nezavisan od nukleobazne sekvence.
[0117] "Nukleobazna sekvenca" označava redosred susednih nukleobaza nezavisnih od bilo kog šećera, veze, i/ili nukleobazne modifikacije.
[0118] "Nukleozid" označava nukleobazu vezanu za šećer.
[0119] "Nukleozidni mimetik" obuhvata one strukture koje se koriste za zamenu šećera ili šećera i baze, a ne nužno i vezu na jednom ili više položaja oligomernog jedinjenja, kao što su nukleozidni mimetici koji sadrže morfolino, cikloheksenil, cikloheksil, tetrahidropiranil, biciklo ili triciklošećerni mimetik, npr. , šećerne jedinice bez furanoze. Nukleotidni mimetik uključuje one strukture koje se koriste za zamenu nukleozida i povezivanje na jednom ili više položaja oligomernog jedinjenja, kao što su na primer peptidna nukleinska kiselina ili morfolinosi (morfolini povezani sa -N (H) -C (= O) -O- ili drugom nefosfodiestarskom vezom). Surogat šećera preklapa se sa nešto širim pojmom nukleozidnog mimetika, ali je namenjen samo da ukaže na zamenu jedinice šećera (furanoznog prstena). Ovde su predstavljeni tetrahidropiranilni prstenovi kao ilustrativni primeri
1
surogata šećera gde je furanozna šećerna grupa zamenjena sa tetrahidropiranilnim prstenastim sistemom. "Mimetik" se odnosi na grupe koje su zamena za šećer, nukleobazu i / ili internukleozidnu vezu. Generalno, mimetik se koristi umesto šećera ili kombinacije šećerainternukleozida, a nukleobaza ostaje za hibridizaciju na odabrani cilj.
[0120] "Nukleozidni motiv’ označava uzorak nukleozidnih modifikacija u oligonukleotidu ili njihovom regionu. Veze takvih oligonukleotida mogu biti modifikovane ili nemodifikovane. Osim ako nije drugačije navedeno, motivi koji se ovde opisuju samo nukleozide smatraju se nukleozidnim motivima. Prema tome, u takvim slučajevima, veze nisu ogrničene.
[0121] "Nukleotid" označava nukleozid koji ima fosfatnu grupu kovalento vezanu za šećerni deo nukleozida<.>
[0122] "Oligomerno jedinjenje " označava polimer vezanih monomernih podjedinica koje su u stanju da hibridizuju sa bar jednim regionom molekula nukleinske kiseline.
[0123] "Oligonukleozid" označavan oligonukleotid u kome internukleozidne veze ne sadrže fosforni atom .
[0124] "Oligonukleotid" označava polimer povezanih nukleozida od kojih svaki može biti modifikovan ili nemodifikovani, nezavisno jedan od drugog.
[0125] "Parenteralno davanje" označava davanje preko injekcije ili infuzije. Parenteralno davanje uključuje subkutanozno davanje, intravensko davanje, intramuskularno davanje, intraarterijsko davanje, intraperitonealno davanje ili intrakranijalno davanje, npr. intratekalno ili intracerebroventrikularno davanje.
[0126] "Farmaceutska kompozicija" označava smešu supstanci pogodnih za davanje pojedincu. Na primer, farmaceutska kompozicija može sadržati jedan ili više farmaceutski aktivnih sredstava i sterilni vodeni rastvor.
[0127] "Farmaceutski prihvatljive soli" označava fiziološki i farmaceutski prihvatljive soli antisens jedinjenja, tj., soli koje zadržavaju željenu biološku aktivnost osnovnog oligonukleotida i ne doprinose njihovim neželjenem toksikološkim efektima.
[0128] "Fosforotioatna veza" označava vezu između nukleozida gde fosfodiestarska veza je modifikovana zamenom jednog nepremošćenog atoma kiseonika sa sumpornim atomom. Fosforotioatna veza je modifikovana internukleozidna veza .
[0129] "Fosforna vezujuća grupa" označava vezujuću grupu koja sadrži fosforov atom. Fosforne vezujuće grupe uključuju bez ograničenja grupe koje imaju formulu:
gde:
Rai Rdsu svaki, nezavisno, O, S, CH2, NH, ili NJ1gde je J1C1-C6alkil ili supstituisani C1-C6alkil;
Rbje O ili S;
Rcje OH, SH, C1-C6alkil, supstituisani C1-C6alkil, C1-C6alkoksi, supstituisani C1-C6alkoksi, amino ili supstituisani amino; i
J1je Rbje O ili S.
Fosforne vezujuće vezujuće grupe uključuju bez ograničenja, fosfodiestar, fosforotioat, fosforoditioat, fosfonat, fosforamidat, fosforotioamidat, tionoalkilfosfonat, fosfotriestre, tionoalkilfosfotriestar i boranofosfat.
[0130] "Deo" označava definisani broj susednih (tj., vezanih) nukleobaza nukleinske kiseline. U izvesnim izvođenjima, deo je definisani broj uzastopnih nukleobaza ciljne nukleinske kiseline. U izvesnim izvođenjima, deo je definisani broj susednih nukleobaza antisens jedinjenja.
[0131] "Sprečava" odnosi se na odlaganje ili ometanje početka, razvoja ili napredovanja bolesti,poremećaja ili stanja za vremenski period od nekoliko minuta do beskonačnosti. Sprečava takođe označava smanjenje rizika od razvijanja bolesti,poremećaja ili stanja.
[0132] "Prolek" označava neaktivan ili manje aktivan oblik jedinjenja koje, kada se daje subjektu metabolisan je da bi se obrazovao aktivni oblik, ili aktivnije, jedinjenje (npr., lek).
[0133] "Profilaktički efikasna količina " odnosi se na količinu farmaceutskog sredstva koje obezbeđuje profilaktičku ili preventivnu korist životinji.
[0134] "Zaštitna grupa" označava bilo koje jedinjenje ili zaštitnu grupu poznatu osobama iz struke. Neograničavajući primeri zaštitne grupe mogu biti nađeni u "Protective Grupe in Organic Hemija", T. W. Greene, P. G. M. Wuts,<35>ISBN 0-471-62301-6, John Wiley & Sons, Inc, New York.
[0135] "Region" je definisan kao deo ciljne nukleinske kiseline koja ima bar jednu prepoznatljivu strukturu, funkciju, ili karakteristiku.
[0136] "Ribonukleotid" označava nukleotid koji ima hidroksi u položaju 2’ šećera nukleotida. Ribonukleotidi mogu biti modifikovani sa bilo kojim različitim supstituentom.
[0137] "RISC zasnovano antisens jedinjenje" označavan antisens jedinjenje u kome se bar nešto antisens aktivnosti antisens jedinjenja pripisuje RNK indukovani utišavajući kompleks (RISC).
[0138] " Antisens jedinjenje zasnovano na RNazi H " označavan antisens jedinjenje u kome bar nešto antisens aktivnosti antisens jedinjenja je pripisano hibridizaciji antisens jedinjenja sa ciljnom nukleinskom kiselinomi i naknadnom cepanju ciljne nukleinske kiseline sa RNazom H.
[0139] "Segmenti" su definisani kao manje ili subprocije regiona u okviru ciljne nukleinske kiseline.
[0140] "Odvojeni regioni" označavaju delove oligonukleotida u kojima hemijske modifikacije ili motiv hemijske modifkacije bilo kojih susednih delova uključuje bar jednu razliku da bi se omogućilo odvajanje regiona da se razlikuje jedno od drugih.
[0141] "Motiv sekvence’ označava uzorak nukleobaza podešen duž oligonukleotida ili njegovog dela. Osim ako nije drugačije navedeno, motiv sekvence je nezavisan od hemijskih modifikacija i prema tome može imati bilo koju kombinaciju hemijskih modifikacija, uključujući bez hemijskih modifikacija.
[0142] "Sporedni efekti" označavaju fiziološku bolest i/ili stanja koja se pripisuju tretmanu koji je drugačiji od željenih efekata. U izvesnim izvođenjima, sporedni efekti uključuju reakcije na mestu injekcije, abnormalnsosti ćelija jetre, abnormalnosti funkcije bubrega, toksičnost jetre, renalna toksičnost, abnormalnosti centralnog nervnog sistema, miopatije, i slabost. Na primer,<povećani nivoi>aminotransferaze u serumu mogu ukazivati na toksičnost jere ili abnormalnosti funkcije jetre. Naprimer, povećani bilirubin može ukazivati na toksičnost jetre ili abnormalnost funkcije jetre.
[0143] "Mesta," kako je ovde korišćeno, su definisanoa kao jedinstveni nukleobazni položaji u okviru ciljne nukleinske kiseline.
1
[0144] "Sporo napredovanje" označava pad u razvou pomenute bolesti .
[0145] "Specifično hibridizabilan " odnosi se na antisens jedinjenje koje ima dovoljan stepen komplementarnosti između antisens oligonukleotida i ciljne nukleinske kiseline da bi se indukovao željeni efekat, dok prikazuje minimalan ili je bez efekta na neciljne nukleinske kiseline pod uslovima u kojima je specifično vezovanje poželjno, tj., pod fiziološkim uslovima u slučaju in vivo testova i terapeutskih lečenja . "Strogi hibridizacioni uslovi" ili "strogi uslovi" odnose se na stanja ukojima oligomerno jedninje je hibridizabilno sa njegovom ciljnom sekvencom, ali sa minimalnim brojem drugih sekvenci.
[0146] "Subjekt" označava humanu ili nehumanu životinju izabranu za lečenje ili terapiju.
[0147] "Supstituent" i "supstituciona grupa," označava atom ili grupu koja zamenjuje atom ili grupu navedenog osnovnog jedinjenja. Na primer supstituent modifikovanog nukleozida je bilo koji atom ili grupa koji se razlikuje od atoma ili grupe nađene u nukelozidu koji se javlja u prirodi (npr., modifikovani 2’-supstituent na bilo kom atomu ili grupi u položaju 2’- nukleozida koji je drugačii od H ili OH). Supstitucione grupe mogu biti zaštićene ili nezaštićene. U izvesnim izvođenjima, jedinjenja prema prikazanom pronalasku imaju supstituente u jednom ili više položaja osnovnog jedinjenja. Supstituenti mogu biti dalje supstituisani sa drugim supstitucionim grupama i mogu biti vezani direktno ili preko vezujuće grupe kao što je alkil ili hidrokarbil grupa za osnovno jedinjenje.
[0148] Slično, kako je ovde korišćeno, "supstituent" u vezi sa hemijskom funkcionalnom grupom označava atom ili grupu atoma koji su različiti od atoma ili grupe atoma normalno prisutne u imenovanoj funkcionalnoj grupi . U izvesnim izvođenjima, supstituent zamenjuje vodonikov atom funkcionalne grupe (npr., u izvesnim izvođenjima, supstituent supstituisane metil grupe je atom ili grupa koja je drugačija od vodonika koji j zamenjuje jedan od vodonikovih atoma nesusptituisane metil grupe). Osim ako nije drugačije navedeno, grupe pogodne za upotrebu kao supstituneti uključuju bez ograničenja , halogen, hidroksil, alkil, alkenil, alkinil, acil (-C¬(O)¬Raa), karboksil (-C(O)O-Raa), alifatične grupe, aliciklične grupe, alkoksi, supstituisani oksi (-O-Raa), aril, aralkil, heterociklični radikal, heteroaril, heteroarilalkil, amino (N(Rbb)¬(Rcc)), imino(=NRbb), amido (C(O)N¬(Rbb)(Rcc) ili N(Rbb)C(O)Raa), azido (-N3), nitro (NO2), cijano (-CN), karbamido (OC(O)N(Rbb)(Rcc) ili N(Rbb)¬C(O)¬ORaa), ureido (N(Rbb)C(O)¬N(Rbb)(Rcc)), tioureido(N(Rbb)C¬¬¬(S)N(Rbb)¬(Rcc)), gvanidinil (N(Rbb)¬C(=NRbb)-N(Rbb)(Rcc)), amidinil (C(=NRbb)¬¬N(Rbb)(Rcc) ili N(Rbb)C(=NRbb)(Raa)), thiol (-SRbb), sulfinil (S(O)Rbb), sulfonil (-S(O)2Rbb) i sulfonamidil (-S(O)2N(Rbb)(Rcc) ili N(Rbb)¬S¬¬(O)2Rbb). Gde svaki Raa, Rbb i Rcc je, nezavisno, H, opciono vezana hemijska funkcionalna grupa ili druga supstituciona grupa sa poželjnom listom koja uključuje bez ograničenja, alkil, alkenil, alkinil, alifatik, alkoksi, acil, aril, aralkil, heteroaril, aliciklik, heterociklik i hetero¬aril¬alkil. Odabrani supstituenti u okviru jedinjenja ovde opisani su prisutni do rekurzivnog stepena.
[0149] "Supstituisani šećerni deo" označava furanozil koji je šećer koji se ne javlja u prirodi. Supstituisani šećerni deo uključuje, ali bez ograničenja furanozil koji sadrži supstituente u položaju 2’-, položaju 3’-, položaju 5’- i/ili položaju 4’. Izvesni supstituisani šećerni delovi su biciklični šećerni delovi.
[0150] "Šećerni delovi" označavju šečerni deo koji se javlja u prirodi ili modifikovani šećerni deo nukleozida.
[0151] "Šećerni deo’ označava uzorak šećerne modifikacije oligonukleotida ili njegovog regiona.
1
[0152] "Surogat šećera" označava strukturu koja ne sadrži furanozol i koja je u stanju da zameni šećeri deo nukelozida koji se javlja u prirodi, tako da dobijene nukleozidne podjedinice su u stanju da se zajedno povežu i/ili povežu za druge nukleozide da bi se obrazaovala oligomerna jedinjenja koje je u stanju da hibridizuju sa komplementarnim oligomernim jedinjenjem. Takve strukture uključuju prstenove koji sadrže različite brojeve atoma u odnosu na furanozil (npr., 4, 6, ili 7-člani prstenovi); zamena kiseonika furanozila sa nekisonikovim atomom (npr., ulgljenikom, sumporom, ili azotom); ili oboje promena u broju atoma i zamena kiseonika. Takve strukture mogu takođe sadržati supstitucije koje odgovaraju onim opisanim za supstituisane šećerne delove (npr., 6-člani karbocilični biciklični šećerni surogati opciono sadrže dodatne supstituente). Šećerni surogati takođe uključuju kompleksnije zamene šećerne (npr., neprstenaste sisteme peptide nukleinske kiseline). Šećerni surogati uključuju bez ograničenja morfoline, cikloheksenile i cikloheksitole.
[0153] "Cilj" se odnosi na protein, modulaciju koja je poželjna.
[0154] "Ciljni gen" odnosi se na gen koji kodira cilj.
[0155] "Ciljanje" označava postupak projektovanjai i odabira antisens jedinjenja koja će se specifično hibridizovati za ciljnu nukleinsku kiselinu i izazvati željeni efekat.
[0156] "Ciljna nukleinska kiselina," "ciljna RNK," "ciljni RNK transkript" i "ciljna nukleinska kiselina " svi označavaju nukleinsku kiselinu koju cilja antisens jedinjenje.
[0157] "Ciljni region" označava deo ciljne nukleinske kiseline za koju jedan ili više antisens jedinjenja je ciljano.
[0158] "Ciljni segment" označava sekvencu nukleotida ciljne nukleinske kiseline koju antisens jedinjenje cilja. "5’ ciljno mesto" odnosi se na većinom 5’ nukleotid ciljnog segmenta. "3’ ciljno mesto" odnosi se na većinom 3’ nukleotid ciljnog segmenta.
[0159] "Terminalna grupa" označava jedan ili više atoma vezanih za bilo koji ili oba 3’ kraj ili 5’ kraj oligonukleotida. U izvesnim izvođenjima krajnja grupa je konjugovanat grupa. U izvesnim izvođenjima, krajnja grupa sadrži jednu ili više krajnjih grupa nukelozida.
[0160] "Terminalna internukleozidna veza" označava vezu između zadnja dva nukelozida oligonukleotida ili njegovog definisanog regiona.
[0161] "Terapeutski efikasna količina" označava količinu farmaceutskog sredstva koje obezbeđuje terapeutsku korist za pojedinca.
[0162] "Tretiranje" odnosi se na davanje farmaceutske kompozicije za životinju u cilju da bi se postigla promena ili poboljšanje bolesti,poremećaja ili stanja kod životinje. U izvesnim izvođenjima, jedan ili više farmaceutskih kompozcija može biti davano životinji.
[0163] "Nemodifikovane" nukleobaze označavaju purinske baze adenin (A) i gvanin (G), ipirimidinske baze timidin (T), citozin (C) i uracil (U).
[0164] "Nemodifikovani nukleotid" označava nukleotid sastavljen od nukelobaza, šećernih delova i inernukleozidnih veza koje se javljaju u prirodi. U izvesnim izvođenjima, nemodikfovani nukleotid je RNK nukleotid (tj. α-D-ribonukleozidi) ili DNK nukleotid (tj. β-D-dezoksiribonukleozid).
Izvesna izvođenja
[0165] U izvesnim izvođenjima, jedinjenje sadrži modifikovani oligonukleotid i konjugovanu grupu, gde modifikovani oligonukleotid se sastoji od 10 do 30 povezanih nukleozida koji imaju sekvencu nukleobaza koja čini SEQ ID NO:440.
[0166] U izvesnim izvođenjima, jedinjenje sadrži modifikovani oligonukleotid i konjugovanu
1
grupu, gde modifikovani oligonukleotid ima sekvencu nukleobaza koja čini SEQ ID NO:440.
[0167] U izvesnim izvođenjima, bilo koje od gore navedenih jedinjenja ili oligonukleotida može sadržati bar jednu modifikovanu internukleozidnu vezu, bar jedan modifikovani šećer, i/ili bar jednu modifikovanu nukleobazu.
[0168] U izvesnim aspektima, bilo koje od gore navednih jedinjenja ili oligonukleotida može sadržati bar jedan modifikovani šećer. U izvesnim aspektima, bar jedan modifikovani šećer sadrži 2’-O-metoksietil grupu. U izvesnim aspektima, bar jedan modifikovani šećer je biciklični šećer, kao što je 4’-CH(CH3)-O-2’ grupa, 4’-CH2-O-2’ grupa, ili 4’-(CH2)2-O-2’grupa.
[0169] U izvesnim aspektima, modifikovani oligonukleotid sadrži bar jednu modifikovanu internukleozidnu vezi, kao što je fosforotioatna internukleozidna veza.
[0170] U izvesnim izvođenjima, modifikovani oligonukleotid sadrži bar 1, 2, 3, 4, 5, 6, ili 7 fosfodiestarskih internukleozidnih veza.
[0171] U izvesnim izvođenjima, svaka internukleozidna veza modifikovanog oligonukleotida je izabrana od fosfodiestarske internukleozidne veze i fosforotioatne internukleozidne veze.
[0172] U izvesnim izvođenjima, svaka internukleozidna veza modifikovanog oligonukleotida je fosforotioatna veza.
[0173] U izvesnim izvođenjima, bilo koje od navedenihjedinjenja ili oligonukleotida sadrži bar jednu modifikovanu nukleobazu, kao štoje 5-metilcitozin.
[0174] U izvesnim izvođenjima, jedinjenje sadrži konjugovanu grupu i modifikovani oligonukleotid koji sadrži:
segment razmaka se sastoji od povezanih dezoksinukleozida;
5’ segment "krila" koji se sastoji od povezanih nukleozida; i
3’ segment „krila“ koji se sastoji od povezanih nukleozida;
gde segment razmaka je smešten između 5’ segmenta "krila" i 3’ segmenta "krila" i gde svaki nukelozid svakog segmenta "krila"sadrži modifikovani šećer.
[0175] U izvesnim izvođenjima, modifikovani oligonukleotid ima nukleobaznu sekvencu koja sadrži ili se sastoji od sekvence koje navedena u SEQ ID NO: 440, gde modifikovani oligonukleotid sadrži:
segment razmaka koji se sastoji od dest vezanih dezoksinukleozida;
5’ segment „krila“ koji se sastoji od pet povezanih nukleozida; i
3’ segment „krila“ koji se sastoji od pet povezanih nukleozida;
gde segment razmaka je smešten između 5’ segmenta "krila" i 3’ segmenta "krila", gde svaki nukleozid svakog segmenta "krila" sadrži 2’-O-metoksietil šećer; gde svaka internukleozidna veza je fosforotioatna veza i gde svaki citozin je 5-metilcitozin.
[0176] U izvesnim izvođenjima, jedinjenje sadrži ili se sastoji jednolančanog modifikovanog oligonukleotida i konjugovane grupe, gde modifikovani oligonukleotid se sastoji od 20 vezanih nukleozida koji imaju nukleobazne sekvence koje se sastoje od sekvence navedene u SEQ ID NO: 440, gde oligonukleotid se sastoji od:
segmenta razmaka koji se sastoji od deset povezanih dezoksinukleozida;
5’ segmenta "krila"koji se sastojiod pet povezanih nukleozida; i
3’ segmenta "krila" koji se sastoji od pet povezanih nukleozida;
gde segment razmaka je smešten između 5’ segmenta "krila" i 3’ segmenta "krila", gde svaki nukleozid svakog segmenta "krila" sadrži 2’-O-metoksietil šećere; gde svaka internukleozida veza
1
je fosforotioatna veza; i gde svaki citozin je 5 -metilcitozin.
[0177] U izvesnim izvođenjima, jedinjenje sadrži ili se sastoji ISIS 588540 i konjugovanu grupu. U izvesnim izvođenjima, ISIS 588540 ima sledeću hemijsku strukturu:
[0178] U bilo kom od gore navedenih izvođenja, jedinjenje il oligonukleotid može biti bar 85%, bar 90%, bar 95%, bar 98%, bar 99%, ili 100% komplementaran sa nukleinskom kiselinom koja kodira CFB.
[0179] U bilo kom od gore navedenih izvođenja, jedinjenje ili oligonukleotid može biti jednolančani.
[0180] U izvesnim izvođenjima, konjugovana grupa je vezana za modifikovani oligonukleotid na 5’ kraju modifikovanog oligonukleotida. U izvesnim izvođenjima, konjugovana grupa je vezana za modifikovani oligonukleotid na 3’ kraju modifikovanog oligonukleotida. Konjugovana grupa sadrži tri N-acetilgalaktozamina (GalNAcs).
[0181] U izvesnim izvođenjima, jedinjenje koje ima sledeću hemijsku strukturu sadrži ili se sastoji od ISIS 588540 sa 5’-X, gde X je konjugovana grupa koja sadrži GalNAc kao što je definisano u patentnim zahtevima:
1
[0182] U izvesnim izvođenjima, jedinjenje sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO: 440, 5’-GalNAc, i hemijskih modifikacija kako je prikazano na sledećoj hemijskoj strukturi :
2
gde ili R<1>je -OCH2CH2OCH3(MOE) i R<2>je H; ili R<1>i R<2>zajedno obrazuju most, gde R<1>je -O- i R<2>je -CH2-, -CH(CH3)-, ili -CH2CH2-, i R<1>i R<2>su direktno povezani tako da je dobijeni most izabran između: -O-CH2-, -O-CH(CH3)-, i -O-CH2CH2-;
i svaki od R<3>i R<4>na istom prstenu, nezavisno za svaki prsten: ili R<3>je izabran od H i -OCH2CH2OCH3i R<4>je H; ili R<3>i R<4>zajedno obrazuju most, gde R<3>je -O-, i R<4>je -CH2-, - CH(CH3)-, ili -CH2CH2-i R<3>i R<4>su direkno vezani tako da dobijeni most je izabran između: - O-CH2-, -O-CH(CH3)-, i -O-CH2CH2-;
i R<5>je izabran između H i -CH3;
i Z je izabran između S<->i O-.
[0183] U izvesnim izvođenjima, jedinjenje sadrži ISIS 696844. U izvesnim izvođenjima, jedinjenje sadrži ISIS 696844. U izvesnim izvođenjima, ISIS 696844 ima sledeću hemijsku strukturu:
[0184] U izvesnim izvođenjima, jedinjenje sadrži ISIS 696845. U izvesnim izvođenjima, jedinjenje se sastoji od ISIS 696845. U izvesnim izvođenjima, ISIS 696845 ima sledeću hemijsku strukturu:
[0185] U izvesnim izvođenjima, jedinjenje sadrži ISIS 698969. U izvesnim izvođenjima, jedinjenje se sastoji od ISIS 698969. U izvesnim izvođenjima, ISIS 698969 ima sledeću strukturu:
2
[0186]U izvesnim izvođenjima, jedinjenje sadrži ISIS 698970. U izvesnim izvođenjima, jedinjenje se sastoji ISIS 698970. U izvesnim izvođenjima, ISIS 698970 ima sledeću hemijsku strukturu:
[0187] Izvesna izvođenja uključuju kompozicije koje sadrže bilo koje od jedinjenja koje sadrži ili se sastoji od modifikovanih oligonukleotida koji ciljaju CFB ili njegove soli i konjugovane grupu, i bar jednog od farmaceutski prihvatljivih nosača ili razblaživača.
[0188] U izvesnim izvođenjima, jedinjenja ili kompozicije kao što je ovde opisano su efkasne zahvaljujući tome što imaju bar jedan in vitro IC50manji od 250 nM, manji od 200 nM, manji od 150 nM, manji od 100 nM, manji od 90 nM, manji od 80 nM, manji od 70 nM, manji od 65 nM, manji od 60 nM, manji od 55 nM, manji od 50 nM, manji od 45 nM, manji od 40 nM, manji od 35 nM, manji od 30 nM, manji od 25 nM, ili manji od 20 nM.
[0189] U izvesnim izvođenjima, jedinjenja ili kompozicije koji su ovde opisane su visoko ponošljive što je pokazano sa bar jednim povećanom ALT ili AST vrednošću ne više od 4 puta, 3 puta, ili 2 puta u odnosu na životinje tretirane fiziološkim rastvorom ili porast u masi jetre, slezine ili bubrega ne veći od 30%, 20%, 15%, 12%, 10%, 5%, ili 2%. U izvesnim izvođenjima, jedinjenja ili kompozicije ovde opisane su visoko podnošljive što je pokazano time što ne pokazuju porast u ALT ili AST u odnosu
2
na životinje tretirane sa fiziološkim rastvorom. U izvesnim izvođenjima, jedinjenja ili kompozicije koji su ovde opisani su visoko tolerabilne kao što je pokazano time što nemaju porast u masi jetre, slezine ili bubrega u odnosu na životinje tretirane fiziološkim rastvorom.
[0190] Izvesna izvođenja opisuju kompoziciju koja sadrži jedinjenje prema bilo kom od gore pomenutih izvođenja ili njegovu so i bar jedan farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač. U izvesnim aspektima, kompozicija ima viskoznost manju od oko 40 centipoza (cP), manju od oko 30 centipoza (cP), manju od oko 20 centipoza (cP), manju od okot 15 centipozae (cP), ili manju od oko 10 centipoza (cP). U izvesnim aspektima kompozicija ima bilo koji od gore pomenutih viskoziteta koji ima jedinjenje ovde opisano pri koncentraciji od oko 100 mg/mL, oko 125 mg/mL, oko 150 mg/mL, oko 175 mg/mL, oko 200 mg/mL, oko 225 mg/mL, oko 250 mg/mL, oko 275 mg/mL, ili oko 300 mg/mL. U izvesnim aspektima, kompozicija koja ima bilo koji od gore pomenutih viskoziteta i/ili koncentracija jedinjenja na sobnoj temperaturi ili oko 20°C, oko 21°C, oko 22°C, oko 23°C, oko 24°C, oko 25°C, oko 26°C, oko 27°C, oko 28°C, oko 29°C, ili oko 30°C.
[0191] U izvesnim izvođenjima opisa, postupak lečenja, prevencije ili ublažavanja boelsti u vezi sa disregulacijom alternativnog puta komplemena kod subjekta koji obuhvata davanje subjektu jedinjenja ili kompozicije koja je ovde opisana, na taj način lečenjem , sprečavanjem ili ublažavanjem bolesti. U izvesnim aspektima, alternativni put komplementa je aktiviran više od normalnog. U izvesnim izvođenjima opisa, postupak lečenja, sprečavanja, ili ublažavanja bolesti u vezi sa disregulacom alternativnog puta komplementa kod subjekta obuhvata davanje subjektu jedinjenja koje sadrži ili se sastoji od 10 do 30 vezanih nukleozida i ima nukleobazu sekvencu koja sadrži nukelobaznu sekvencu prema bilo kojoj od SEQ ID NOs: 6-808. U izvesnim izvođenjima opisa, postupak lečenja, sprečavanja, ili ublaživanja bolesti je u vezi sa disregulacijom alternativnog puta komplementa kod subjekta koji obuhvata davanje subjektu jedinjenja koje sadrži ili se sastoji modifikovanog oligonukleotida i konjugovane grupe, gde modifikovani oligonukleotid se sastoji od 10 do 30 vezanih nukleozida koji imaju nukleobaznu sekvencu koja sadrži bilo koju od SEQ ID NOs: 198, 228, 237, 440, 444, 448, 450, 453, 455, 549, i 598. U izvesnim izvođenjima opisa, postupak lečenje, sprečavanja ili ublažavanja bolesti u vezi sa disregulacijom alternativnog puta komplementa kod subjekta obuhvata davanje subjektu jedinjenja koje sadrži ili se sastoji od ISIS 696844, ISIS 696845, ISIS 698969, ili ISIS 698970.
[0192] U izvesnim izvođenjima opisa, postupak lečenja, prevencije ili ublažavanja makularne degeneracije, kao što je senilna makularna degeneracija (AMD) kod subjekta obuhvata davanje subjektu ovde opisanog jedinjenja ili kompozicije, tako lečei, sprečava ili ublažava AMD. U izvesnim aspektima, alternativni put komplementa je aktiviran više nego normalno. U izvesnim aspektima, AMD je vlažna AMD. U izvesnim aspektima, AMD je suva AMD, kao što je geografska atrofija. U izvesnim izvođenjima opisa, postupak lečenja, prevencije ili ublažavanja makularne degeneracije kod subjekta, kao što je makularna degeneracija u vezi sa godinama (AMD), vlažna AMD, suvaAMD, ili geografska atrofija obuhvataju davanje subjektu jedinjenja koje obuhvata ili se sastoji od modifikovanog oligonukleotida i konjugovane grupe, gde modifikovani oligonukleotid se sastoji od 10 do 30 vezanih nukleozida i ima nukleobaznu sekvencu koja sadrži nukleobaznu sekvencu prem bilo kojoj od SEQ ID NOs: 6-808. Uizvesnim izvođenjima opisa, postupak lečenja, prevencije ili ublažavanja makularne degeneracije, kao što je senilna makularna degeneracija (AMD), vlažna AMD, suva AMD, ili geografska atrofija kod subjekta obuhvata davanje subjektu obuhvata davanje subjektu jedinjenja koje obuhvata ili se sastoji od modifikovanog
2
oligonukleotida i konjugovane grupe, gde modifikovani oligonukleotid se sastoji od 10 do 30 vezanih nukleozida koji imaju nukleobaznu sekvencu koja sadrži bilo koju od SEQ ID NOs: 198, 228, 237, 440, 444, 448, 450, 453, 455, 549, i 598. U izvesnim izvođenjima opisa, postupak lečenja, prevencije ili ublažavanja makularne degeneracije, kao što je senilna makularna degeneracija (AMD), vlažna AMD, suva AMD, ili geografska atrofija kod subjekta obuhvata davanje subjektu jedinjenja koje sadrži ili se sastoji od ISIS 696844, ISIS 696845, ISIS 698969, ili ISIS 698970. U izvesnim aspektima, jedinjenje ili kompozicija je davano subjektu parenteralno .
[0193] U izvesnim izvođenjima opisa, postupak lečenja, prevencije ili ublažavanja bolesti bubrega u vezi sa disregulacijom alternativnog puta komplementa kod subjekta obuhvata davanje subjektu ovde opisanog jedinjenja ili kompozicije, na taj način lečenje, sprečavanje ili ublažavanje bolesti bubrega. U izvesnim izvođenjima opisa, postupak lečenja, prevencije ili ublažavanja bolesti bubrega je u vezi sa disregulacijom alternativnog puta komplementa kod subjekta obuhvata davanje subjektu jedinjenja koje se sadrži ili sastoji od modifikovanog oligonukleotida i konjugovane grupe, gde modifikovani oligonukleotid se sastoji od 10 do 30 vezanih nukleozida i ima nukleobaznu sekvencu koja se sastoji od nukleobazne sekvence prema bilo kojoj od SEQ ID NOs: 6-808. U izvesnim izvođenjima opisa, postupak lečenja, prevencije ili ublažavanja bolesti bubrega u vezi sa disregulacijom alternativnog puta komplementa kod subjekta obuhvata davanje subjektu jedinjenja koje sadrži ili se sastoji od modifikovanog oligonukleotida i konjugovane grupe, gde modifikovani oligonukleotid se sastoji od 10 do 30 vezanih nukleozida koji imaju nukleobaznu sekvencu koja sadrži bilo koji od SEQ ID NOs: 198, 228, 237, 440, 444, 448, 450, 453, 455, 549, i 598. U izvesnim izvođenjima opisa, postupak lečenja, prevencije ili ublažavanja bolesti bubrega u vezi sa disregulacijom alternativnog puta komplementa kod subjekta obuhvata davanje subjektu jedinjenja koje sadrži ili se sastoji od ISIS 696844, ISIS 696845, ISIS 698969, ili ISIS 698970. U izvesnim aspektima, alternativni put komplementa je aktiviran više nego normalan. U izvesnim aspektima, bolest bubrega je lupus nefritis, sistemski eritemski lupus (SLE), bolest gustih depozita (engl. dense deposit disease-DDD), C3 glomerulonefritis (C3GN), CFHR5 nefropatija, ili atipični hemolitički uremični sindrom (aHUS), ili bilo koja njihova kombinacija. U izvesnim aspektima, bolest bubrega je u vezi C3 depozitima, kao što su C3 depozitit kod glomerula. U izvesnim aspektima, bolest bubrega je u vezi sa nižim od normalnih nivoa C3 u krvi, kao što su nivoi seruma ili plazme C3. U izvesnim aspektima, davanje jedinjenje ili kompozicije smanjuje ili inhibira nagomilacanje C3 nivoa u očima, kao što su C3 proteinski nivoi. U izvesnim aspektima, davanje jedinjenja ili kompozicije smanjuje nivo C3 naslaga u oku ili inhibira nagomilavanje C3 deposita. U izvesnim aspektima, jedinjenje ili kompozicija se daje subjektu parenteralno. U izvesnim aspektima, davanje jedinjenja ili kompozicije smanjuje ili inhibira akumulaciju C3 nivoa u bubregu, kao što su C3 proteinski nivoi. U izvesnim aspektima, davanje jedinjenja ili kompozicije smanjuje nivo C3 deposita u bubregu ili inhibira akumulaciju C3 deposita u bubregu, kao što su C3 nivoi kod glomerula. U izvesnim aspektima, subjekt je identifikovan da ima ili da je u riziku da dobije bolest u vezi sa disregulacijom alternativnog puta komplementa, na primer detektvanjem nivoa komplementa ili nivoa kompleksa membranskog napada u krvi kod subjekta i/ili izvođenje genetskog testa za genske mutacije faktroa komplemanta u vezi sa bolešću.
[0194] U izvesnim izvođenjima opisa, postupak inhibiranja ekspresije faktora B komplementa (CFB) kod subjekta koji ima, ili je u riziku da dobije bolest u vezi sa disregulacijom alternativnog puta komplementa obuhvata davanje ovde opisanog jedinjenja ili kompozicije subjektu, tako
2
inhibirajući ekspresiju CFB kod subjekta. U izvesnim izvođenjima opisa, postupak inhibicije ekspresije faktora B komlementa B (CFB) kod subjekta koji ima, ili je u riziku da dobije, bolest u vezi sa disregulacijom alternativnog puta komplementa obuhvata davanje subjektu jedinjenja koje obuhvata ili se sastoji od modifikovanogi oligonukleotida i konjugovane grupe, gde modifikovani oligonukleotid se sastoji od 10 do 30 vezanih nukleozida i ima nukleobaznu sekvencu koja sadrži nukleobaznu sekvencu prema bilo kojoj od SEQ ID NOs: 6-808. U izvesnim izvođenjima opisa, postupak inhibiranja ekspresije faktora B komplementa (CFB) kod subjekta koji ima, ili je u riziku od toga da dobije bolest u vezi sa disregulacijom alternativnog puta komplementa obuhvata davanje subjektu jedinjenja koje sadrži ili se sastoji od modifikovanog oligonukleotida i konjugovane grupe, gde modifikovani oligonukleotid se sastoji od 10 do 30 povezanih nukleozida koji imaju nukleobazne sekvence koje sadrže bilo koju od SEQ ID NOs: 198, 228, 237, 440, 444, 448, 450, 453, 455, 549, i 598. U izvesnim izvođenjima opisa, postupak inhibiranja ekspresije faktora B komplementa (CFB) kod subjekta koji ima, ili je u riziku da dobije bolest, u vezi sa disregulacijom alternativnog puta komplementa koji obuhvata davanje subjektu jedinjenja koje sadržalo ili se sastoji od ISIS 696844, ISIS 696845, ISIS 698969, ili ISIS 698970. U izvesnim aspektima, davanje jedinjenja ili kompozicija koje inhibiraju ekspresiju CFB u oku. U izvesnim aspektima, subjekt ima, ili je u riziku da dobije senilnu makularnu degradaciju (AMD), kao što je vlažna AMD i suva AMD. U izvesnim aspektima, suva AMD može biti geografska atrofija. Geografska atrofija je se smatra uznapredovanim oblikom suve AMD uključujući degeneraciju retine. U izvesnim aspektima, davanje jedinjenja ili kompozicije inhibira ekspresiju CFB u bubregu, kao što je glomerula. U izvesnim aspektima, subjekt ima, ili je u riziku od toga da dobije lupus nefritis, sistemski eritemski lupus (SLE), bolest gustih depozita (DDD), C3 glomerulonefhritis (C3GN), CFHR5 nefopatija, ili atipični hemolitički uremični sindrom (aHUS), ili bilo koja njihova kombinacija.
[0195] U izvesnim izvođenjima opisa, postupak za smanjenje ili inhibiranje akumulacije C3 deposita u oku subjekta koji ima, ili je u riziku da dobije bolest u vezi sa disregulacijom alternativnog puta komplementa koji obuhvata davanje ovde opisanog jedinjenja ili kompozicije subjektu, tako smanjujući ili inhibirajuči akumulaciju C3 depozita u oku subjekta. U izvesnim izvođenjima opisa, postupak smanjenja ili inhibiranja akumulacije C3 depozita u oku subjekta koji ima, ili koji je u riziku da dobije bolest u vezi sa disregulacijom alternativnog puta komplementa koji obuhvata davanje subjektu jedinjenja koje sadrži ili se sastoji od modifikovanog oligonukleotida i konjugovane grupe, gde modifikovani oligonukleotid se sastoi od 10 do 30 vezanih nukleozida i ima nukleobaznu sekvencu koja sadrži nukleobaznu sekvencu prema bilo kojoj od SEQ ID NOs: 6-808. Uizvesnim izođenjima opisa, postupak smanjenja ili inhibiranja akumulacije C3 depozita u oku subjekta koji ima ili je u riziku da dobije bolest u vezi sa disregulacijom alternativnog puta komplementa koja obuhvata davanje subjektu jedinjenja koje sadrži ili se sastoji od modifikovanog oligonukleotida i konjugovane grupe, gde modifikovani oligonukleotid se sastoji od 10 do 30 vezanih nukleozida koji imaju nukleobaznu sekvencu koja sadrži bilo koju od SEQ ID NOs: 198, 228, 237, 440, 444, 448, 450, 453, 455, 549, i 598. U izvesnim izođenjima opisa, postupak smanjenja ili inhibicije akumulacije C3 depozita u oku subjekta koji ima, ili koji je u riziku da dobije bolesti u vezi sa disregulacijom alternativnog puta komplementa koji obuhvata davanje subjektu jedinjenja koje sadrži ili se sastoji od ISIS 696844, ISIS 696845, ISIS 698969, ili ISIS 698970. U izvesnim aspektima, subjekat ima, ili je u riziku da dobije, senilnu
2
makularnu degeneraciju (AMD), kao što je vlažna AMD i suva AMD. U izvesnim aspektima, suva AMD može biti geografska atrofija. U izvesnim aspektima, jedinjenje ili kompozicija se daje subjektu parenteralno.
[0196] U izvesnim izvođenjima opisa, postupak smanjenja ili inhibicije akumulacije C3 depozita u bubregu subjekta koji ima, ili koji je u riziku od bolesti u vezi sa disregulacijom alternativnog puta komplementa pbuhvata davanje ovde opisanog jedinjenja ili kompozicije subjektu, tako smanjujući ili inhibirajući akumulaciju C3 deposita bubrega subjekta. U izvesnim izvođenjima opisa, postupak smanjenja ili inhibiranja akumulacije C3 depozita u bubregu subjekta koji ima, ili je u riziku od bolesti u vezi sa disregulacijom alternativnog puta komplementa koji obuhvata davanje subjektu jedinjenja koje sadrži ili se sastoji od modifikovani oligonukleotid i konjugovanu grupu, gde modifikovani oligonukleotid se sastoji od 10 do 30 vezanih nukleozida i ima nukleobazne sekvence koje sadrže nukleobazna sekvenca prema bilo kojoj od SEQ ID NOs: 6-808. U izvesnim izvođenjima opisa, postupak smanjenja ili inhibiranja akumulacije C3 deposita u bubregu subjekta koji ima, ili je u riziku da dobije bolesti u vezi sa disregulacijom alternativnog puta komplementa koji obuhvata davanje subjektu jedinjenja koje sadrži ili se sastoji od modifikovani oligonukleotida i konjugovane grupe, gde se modifikovani oligonukleotid sadrži od 10 do 30 vezanih nukelozida koji imaju nukleobaznu sekvencu koja sadrži bilo koju od SEQ ID NOs: 198, 228, 237, 440, 444, 448, 450, 453, 455, 549, i 598. U izvesnim izvođenjima opisa, postupak smanjenja ili inhibicije akumulacije C3 depozita u bubregu subjekta koji ima, ili je u riziku da dobije bolest u vezi sa disregulacijom alternativnog puta komplementa koji obuhvata davanje subjektu jedinjenja koje sadrži ili se sastoji od ISIS 696844, ISIS 696845, ISIS 698969, ili ISIS 698970. U izvesnim aspektima, subjekt ima, ili je u riziku da dobije lupus nefritis, sistemski eritemski lupus (SLE), bolest gustih depozita (DDD), C3 glomerulonefritis (C3GN), CFHR5 nefropatiju, ili atipični hemolitični uremični sindrom (aHUS), ili bilo koju njihovu kombinaciju. U izvesnim aspektima, jedinjenje ili kompozicija se daje subjektu parenteralno.
[0197] Izvesna izvođenja opisa se odnose na upotrebu ovde opsianog jedinjenja ili kompozicije za lečenje bolesti u vezi sa disregulacijom alternativnog puta komplementa. Izvesna izvođenja opisa se odnose na upotebu jedinjenja koje sadrži ili se sastoji od modifikovani oligonukleotida i konjugovane grupe, gde modifikovani oligonukleotid se sastoji od 10 do 30 vezanih nukleozida i ima nukleobaznu sekvencu koju čini nukleobazna sekvenca bilo koja od SEQ ID NOs: 6-808, za lečenje bolesti u vezi sa disregulacijom alternativnog puta komplementa. Izvesna izvođenja opisa se odnose na upotrebu jedinjenja koje sadrži ili se sastoji od modifikovanog oligonukleotida i konjugovane grupe, gde modifikovani oligonukleotid se sastoji od 10 to 30 vezanih nukleozida koji imaju nukleobaznu sekvencu koja se sadrži bilo koju od SEQ ID NOs: 198, 228, 237, 440, 444, 448, 450, 453, 455, 549, i 598, za lečenje bolesti u vezi sa disregulacijom alternativnog puta komplementa. Izvesna izvođenja se odnose na upotrebu jedinjenja koje sadrži ili se sastoji od ISIS 696844, ISIS 696845, ISIS 698969, ili ISIS 698970 za lečenje bolesti u vezi sa disregulacijom alternativnog puta komplementa. U izvesnim aspektima, alternativni put komplementa je aktiviran više nego što je normalno. U izvesnim aspektima, bolest je makularna degeneracija, kao što je senilna makularna degeneracija (AMD), koja može biti vlažna AMD ili suva AMD. U izvesnim aspektima, suva AMD može biti geografska atropija. U izvesnim aspektima, bolest je bolest bubrega kao što je lupus nefritis, sistemski eritemski lupus (SLE), bolest gustih depozita (DDD), C3 glomerulonefritis (C3GN), CFHR5 nefropatija, ili atipični hemolitični uremični sindrom (aHUS), ili
2
bilo koja njihova kombinacija. U izvesnim aspektima, jedinjenje ili kompozicija je davano subjektu parenteralno.
[0198] U izvesnim izvođenjima, ovde opisano jedinjnje ili kompozicija su davani parenteralno . Na primer, u izvesnim izvođenjima jedinjenje ili kompozicija mogu biti davani injekcijom ili infuzijom. Parenteralno davanje uključuje subkutanozno davanje, intravensko davanje, intramuskularno davanje, intraarterijski davanje, intraperitonealno davanje ili intrakranialno davanje, npr. intratekalno ili intracerebroventrikularno davanje.
Antisens jedinjenja
[0199] Oligomerna jedinjenja uključuju, ali nisu ograničena samo na njih, oligonukleotide, oligonukleozide, oligonukleotidne analoge, oligonukleotidne mimetike, antisens jedinjenja, antisens oligonukleotide, i siRNAs. Oligomerno jedinjenje može biti "antisens" za ciljnu nukleinsku kiselinu, što znali da je u stanju da se podlegne hidridizaciji sa ciljnom nukleinskom kiselinom preko vodoničnog vezivanja.
[0200] U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenje ima nukleobaznu sekvencu koja, kada je napisana u 5’ do 3’smeru, sadrži reverzni komplement ciljnog segmenta ciljne nukleinske kiseline koja je ciljana.
[0201] U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenje je 10 do 30 podjedinica u dužini. U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenje je dugo 12 do 30 podjedinica. U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenje je dugo 12 do 22 podjedinice. U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenje jedugo 14 do 30 podjedinica. U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenje je dugo 14 do 20 podjedinica. U izvesnim izvođenjima, antisense jedinjenje je dugo 15 do 30 podjedinica. U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenje je dugo 15 do 20 odjedinica. U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenje je dugo 16 do 30 podjedinica. U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenje je dugo 16 do 20 podjedinica. U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenje je dugo 17 do 30 podjedinica. U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenje je dugo 17 do 20 podjedinica. U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenje je dugo 18 do 30 podjedinica. U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenje je dugo 18 do 21 podjedinica. U izvesnim izvođenjima, anantisens jedinjenje je dugo 18 do 20 podjedinica. U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenje je dugo 20 do 30 podjedinica. Drugim rečima, takva antisens jedinjenja su od 12 do 30 vezanih podjedinica, 14 do 30 vezanih podjedinica, 14 do 20 podjedinica, 15 do 30 podjedinica, 15 do 20 podjedinica, 16 do 30 podjedinica, 16 do 20 podjedinica, 17 do 30 podjedinica, 17 do 20 podjedinica, 18 do 30 podjedinica, 18 do 20 podjedinica, 18 do 21 podjedinica, 20 do 30 podjedinica, ili 12 do 22 vezanih podjedinica, respektivno. U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenje je dugo 14 podjedinica. U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenje je dugo 16 podjedinica. U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenje je dugo 17 podjedinica. U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenje je dugo 18 podjedinica. U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenje je dugo 19 podjedinica. U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenje je dugo 20 podjedinica. U drugim izvođenjima, antisens jedinjenje je 8 do 80, 12 do 50, 13 do 30, 13 do 50, 14 do 30, 14 do 50, 15 do 30, 15 do 50, 16 do 30, 16 do 50, 17 do 30, 17 do 50, 18 do 22, 18 do 24, 18 do 30, 18 do 50, 19 do 22, 19 do 30, 19 do 50, ili 20 do 30 vezanih podjedinica. U izvesnim takvim izvođenjima, antisens jedinjenja su 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27,28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58,59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, ili 80 vezanih podjedinica u dužini, ili opseg definisan sa bilo koje dve gornje vrednosti. U nekim izvođenjima antisens jedinjenje je antisens oligonukleotid, i vezane podjedinice sue nukleotidi.
[0202] U izvesnim izvođenjima antisens oligonukleotidi mogu biti smanjeni ili skraćeni. Na primer, pojedinačna podjedinica može biti izbrisana sa 5’ kraja (5’ skraćenje), ili alternativno sa 3’ kraja (3’ skraćena). Smanjenje ili skraćenje antisens jedinjenja koja ciljaju CFB nukleinsku kiselinu mogu imati dve podjedinice izbrisane sa 5’ kraja, ili alternativno mogu imati dve podjedinice izbrisane sa 3’ kraja, antisens jedinjenja. Alternativno, izbrisani nukleozidi mogu biti rasuti kroz antisens jedinjenje, na primer, u antisens jedinjenju koje ima jedan nukleozid izbrisan sa 5’ kraja i jedan nukleozid izbrisan sa 3’ kraja.
[0203] Kada je pojedinačna dodana podjedinica prisutna u produženom antisens jedinjenju, dodatna podjedinica može biti locirana na 5’ ili 3’ kraju antisens jedinjenja. Kada dve ili više dodatne podjedinice su prisutne, dodata podjedinica može biti susedna jedna drugoj, na primer, u antisens jedinjenju koje ima dve podjedinice dodate u 5’ kraj (5’ adicija), ili alternativno u 3’ kraj (3’ adicija), antisens jedinjenja. Alternativno, dodata podjedinica može biti rasuta kroz antisens jedinjenje, na primer, u antisens jedinjenju koje ima jednu podjedinicu dodatu u 5’ kraj i jednu podjedinicu dodatu u 3’ kraj.
[0204] Moguće je povećati ili smanjiti antisens jedinjenje, kao što je antisens oligonukleotid,i/ili uvesti baze koje se ne sparuju bez eliminisanja aktivnosti. Na primer, u Woolf et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7309, 1992), serija antisens oligonukleotida 13-25 nukleobaza u dužini su testriane na njihovu sposobnost da izazovu cepanje ciljne RNK na modelu injekcije oocita. Antisens oligonukleotidi 25 nukleobaze u dužini sa 8 ili 11 nesparenih baza blizu kraja antisens oligonukleotida su u stanju sa usmere specifično cepanje ciljne iRNK, ali u manjem obimu u odnosu na antisens oligonukleotide koji ne sadrže nesparene. Silično, ciljno specifično cepanje je postignuto pomoću 13 nukleobaza antisens oligonukleotida, uključujući one sa 1 ili 3 nesparena.
[0205] Gautschi et al. (J. Natl. Cancer Inst. 93:463-471, March 2001) pokazuju sposobnost oligonukleotida koji ima 100% komplementarnost za bcl-2 iRNK i koji ima 3 nesparena za bcl-xL iRNK da smanjuje ekspresiju oba bcl-2 i bcl-xL in vitro i in vivo. Pored toga, ovaj oligonukleotid pokazuje jaku anti-tumorsku aktivnost in vivo<.>
[0206] Maher and Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358,1988) testirali su serije tandem 14 nukleobaza antisens oligonukleotida, i 28 i 42 nukleobaza antisens oligonukleotida koje čine sekvencu od dva ili tri tandem antisens oligonukleotida, respektivno, na njihovu sposobnost da zaustave translaciju humanog DHFR u testu retikulocita zeca. Svaki od tri14 nukleobazna antisens oligonukleotida pojedinačno je u stanju da inhibira translaciju, iako na skromnijem nivou nego antisens oligonukleotidi sa 28 ili 42 nukleobaza.
Motivi i mehanizmi izvesnih antisens jedinjenja
[0207] U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenja imaju hemijski modifikovane podjedinice smeštene u uzorke ili motive, da čine osobine antisens jedinjenja takvim da poboljšavaju inhibitornu aktivnost, povećaju afinitet vezivanja za ciljnu nukleinsku kiselinu, ili otpornost na degradaciju sa in vivo nukleazama.
1
[0208] Himerna antisens jedinjenja tipično sadrže bar jedan modifikovani region tako da doprinose povećanoj otpornosti na degradaciju nukleazama, povećanom preuzimanju od strane ćelija, povežćanom afinitetu vezivanja za ciljnu nukleinsku kiselinu, i/ili povećanu inhibitornu aktivnost. Drugi region himernog antisens jedinjenja može doprineti drugim željnim osobinama npr., služiti kao supstrat za ćelijske endonukelazne RNaze H, koje seku RNK lanac RNK:DNK dupleksa.
[0209] Antisens aktivnost može biti posledica bilo kog mehanizma koji uključuje hibridizaciju antisens jedinjenja (npr., oligonukleotida) sa ciljnom nukleinskom kiselinom, gde hibridizacija konačno ne dovodi do bioloških efekata. U izvesnim izvođenjima, količina i/ili aktivnost ciljne nukleinske kiseline je modulirana. U izvesnim izvođenjima, količina i/ili aktivnost ciljne nukleinske kiseline je smanjena. U izvesnim izvođenjima, hibirizacija antisens jedinjenja sa ciljnom nukleinskom kiselinom obavezno dovodi do degradacije ciljne nukleinske kiseline. U izvesnim izvođenjima, hibridizacija antisens jedinjenja sa ciljnom nukleinskom kiselinom ne dovodi do degradacije nukleinske kiseline. U izvesnim izvođenjima, prisustvo antisens jedinjenja hibridizovanog sa ciljnom nukleinskom kiselinom (popunjenost) dovodi do modulacije antisens aktivnosti. U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenja koja imaju posebne hemijske motive ili uroke hemijskih modifikacija su naročito pogodni eksploatisanje jednog ili više mehanizama. U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenja funkcionišu preko više od jednog mehanizma i/ili preko mehanizama koji nisu rasvetljeni . Prema tome, ovde opisana antisens jedinjenja nisu ograničena posebnim mehanizmom .
[0210] Antisens mehanizmi uključuju, ali bez ograničenja, antisens posredovan RNazom H; RNKi mehanizme, koji koriste RISC put i uključuju, ali bez ograniečenja, siRNK, ssRNK i microRNK mehanizme; i mehanizme zasnovane na popunjenosti. Izvesna antisens jedinjenja mogu delovati preko više takvih mehanizama i/ili preko dodatnih mehanizama.
Antisens posredovan RNazom H
[0211] U izvesnim izvođenjima, antisens aktivnost dolazi bar delom od degradacije ciljne RNK sa RNazom H. RNaza H je ćelijska endonukelaza koja seče RNK lanac u RNK:DNK dupleksu. Poznato je u stanju tehnike da jednolačana antisens jedinjenja koja su "slična DNK" izazivaju aktivnost RNaze H u ćelijama sisara. Prema tome, antisens jedinjenja koja sadrže bar deo DNK ili DNK-sličnih nukleozida mogu aktivirati RNazu H, dovodeći do cepanje ciljne nukleinska kiselina. U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenja koja koriste RNazu H sadrže jedan ili više modifikovanih nukleozida. U izvesnim izvođenjima, takva antisens jedinjenja sadrže bar jedan blok 1-8 modifikovanih nukleozida. U izvesnim takvim izvođenjima, modifikovani nukleozidi ne podržavju aktivnost RNaze H. U izvesnim izvođenjima, takva antisens jedinjenja su gapmeri, kao štoje ovde opisano. U izvesnim takvim izvođenjima, razmak gapmera sadrži DNK nukleozide. U izvesnim takvim izvođenjima, razmak gapmera sadrže nukleozide slične DNK. U izvesnim takvim izvođenjima, razmak gapmersa sadrži DNK nukleozide i nukleozide sličine DNK.
[0212] Izvesna antisens jedinjenja koja imaju motiv gapmera se smatraju himernim antisens jedinjenjima. U gapmeru unutrašnji region koji ima višestruke nukleotide koji podržavaju cepanje RNazeH je smešten između spoljašnjih regiona koji imaju višestruke nukleotide koji su hemijski različiti od nukleozida unutrašnjeg regiona.U slučaju antisens oligonukleotida koji ima motiv
2
gapmera, segment razmaka generalno služi kao supstrat za cepanje endonukleazama, dok segement "krila" sadrži modifikovane nukleozide. U izvesnim izvođenjima, regioni gapmera se razlikuju po tipovima šećernih delova koji sadrže svaki različiti region. Tipovi šećernih delova koji se koriste za razlikovanje regiona gapmera mogu u nekim izvođenjima uključivati β-D-ribonukleozide, β-D- dezoksiribonukleozide, 2’-modifikovane nukleozide (kao što su 2’-modifikovani nukleozidi mogu uključivati 2’-MOE i 2’-O-CH3, između drugih), i bicikličine šećerne modifikovane nukleozide (takvi bičiklični šećerni modifikovani nukleozidi mogu uključivati one koji imaju neprirodan etil). U izvesnim izvođenjima, nukleozidi u "krilima" mogu uključivati nekoliko modifikovanih šećernih delova, uključujući, na primer 2’-MOE i biciklične šećerne delove kao što su ograničeni etili ili LNA. U izvesnim izvođenjima, "krila" mogu uključivati nekoliko modifikovanih i nemodifikovanih šećernih delova. U izvesnim izvođenjima, "krila" mogu uključivati različite kombinacije 2’-MOE nukleozida, bicikličnih šećernih delova kao što su ograničeni etil nukleozidi ili LNA nukleozidi, i 2’-dezoksinukleozidi.
[0213] Svaki različit region može sadržati jednoobrazne šećerne delove, varijantu ili ponavljajuće šećerne delove. Motiv "krilo"- razmak-"krilo" je često opisan "X-Y-Z", gde "X" predstavlja dužinu 5’ "krila", "Y" predstavlja dužinu razmaka, i "Z" predstavlja dužinu 3’-"krila". "X" i "Z" mogu sadržati jednoobrazne, varijantne, ili ponavljajuće šećerne motive. U izvesnim izvođenjima, "X" i "Y" mogu sadržati jedan ili više 2’-dezoksinukleozida."Y" mogu sadržati 2’-dezoksinukleozide. Kako je ovde korišćeno, gapmer ovde opisan kao "X-Y-Z" ima konfiguraciju takvu da je razmak smešten neposredno pored svakog 5’-"krila" i 3’ "krila". Prema tome, ne postoje interventni nukleotidi između 5’-"krila" i razmaka, ili razmaka i 3’-"krila". Bilo koje od ovde opisanog antisens jedinjenja može imati gapmer motiv. U izvesnim izvođenjima, "X" i "Z" su isti; u drugim izvođenjima oni su različiti. U izvesnim izvođenjima, "Y" je između 8 i 15 nukleozida. X, Y, ili Z mogu biti bilo koji od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 ili više nukleozida.
[0214] U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenje koje cilja CFB nukleinske kiselinu ima gapmer motiv u kome razmak se sastoji od 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, ili 16 vezanih nukleozida.
[0215] U izvesnim izvođenjima, antisens oligonukleotid ima šećerni motiv opisan formulom A kao što sledi:
(J)m-(B)n-(J)p-(B)r-(A)t-(D)g-(A)v-(B)w-(J)x-(B)y-(J)z
gde:
svaki A je nezavisno 2’-supstituisani nukleozid;
svaki B je nezavisno biciklični nukleozid;
svaki J je nezavisno ili 2’-supstituisani nukleozid ili 2’-dezoksinukleozid;
svaki D je 2’-dezoksinukleozid;
m je 0-4; n je 0-2; p je 0-2; r je 0-2; t je 0-2; v je 0-2; w je 0-4; x je 0-2; y je 0-2; z je 0-4; g je 6-14;
uz uslov da:
bar jedan od m, n, i r je drugačiji od 0; bar jedan od w i y je drugačiji od 0;
zbir m, n, p, r, i t je od 2 do 5; i zbir v, w, x, y, i z je od 2 do 5.
Jedinjenja RNK
[0216] U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenja su ometajuća RNK jedinjenja (RNAi), koja uključuju dvolančana RNK jedinjenja (na koja se takođe odnosi kao na kratko ometajuća RNK ili siRNK) i jednoklančana RNK jedinjenja (ili ssRNA). Takva jedinjenja rade bar delom preko RISC puta da degradiraju i/ili odvoje ciljnu nukleinsku kiselinu (ovo, uključuje jedinjenja mikroRNK/mikroRNK-mimika). U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenja sadrže modifikacije koje ih čine naročito pogodnim za takve mehanizme .
<i.>Jedinjenja ssRNK
[0217] U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenja uključuju ona naročito pogodna za upotrebu kao jednolančana RNKi jedinjenja (ssRNK) koja sadrže modifikovani 5’-terminalni kraj. U izvesnim takvim izvođenjima, 5 ’-terminalni kraj sadrži modifikovani fosfatni deo. U izvesnim izvođenjima, takav modifikovani fosfat je stabilizovan (npr., otporan na degradaciju/cepanje u poređenju sa nemodifikovanim 5’-fosfatom). U izvesnim izvođenjima, takvi 5’-terminalni nukleozidi stabilizuju 5’-fosforni deo. Izvesni modifikovani 5’-terminalni nukleozidi mogu biti nađeni u stanju tehnike, na primer u WO/2011/139702.
[0218] U izvesnim izvođenjima, 5’-nukleozid ssRNK jedinjenja ima Formulu IIc:
gde:
T1je opciono zaštićeni fosforni deo;
T2je internukleozidna vezujuća grupa koja povezuje jedinjenje formule IIc sa oligomernim jedinjenjem;
A ima jednu od formula:
ili
Q1i Q2su svaki, nezavisno, H, halogen, C1-C6alkil, supstituisani C1-
supstituisani C1-C6alkoksi, C2-C6alkenil, supstituisani C2-C6alkenil, C2-C6alkinil, supstituisani C2-C6alkinil ili N(R3)(R4);
Q3je O, S, N(R5) ili C(R6)(R7);
svaki R3, R4R5, R6i R7je, nezavisno, H, C1-C6alkil, supstituisani C1-C6alkil ili C1-C6alkoksi; M3je O, S, NR14, C(R15)(R16), C(R15)(R16)C(R17)(R18), C(R15)=C(R17), OC(R15)(R16) ili OC(R15)(Bx2);
4
R14je H, C1-C6alkil, supstituisani C1-C6alkil, C1-C6alkoksi, supstituisani C1-C6alkoksi, C2-C6alkenil, supstituisani C2-C6alkenil, C2-C6alkinil ili supstituisani C2-C6alkinil;
R15, R16, R17i R18su svaki, nezavisno, H, halogen, C1-C6alkil, supstituisani C1-C6alkil, C1-C6alkoksi, supstituisani C1-C6alkoksi, C2-C6alkenil, supstituisani C2-C6alkenil, C2-C6alkinil ili supstituisani C2-C6alkinil;
Bx1je heterociklični bazni deo;
Ili ako Bx2je prisutan tada Bx2je heterociklični bazni deo i Bx1je H, halogen, C1-C6alkil, supstituisani C1-C6alkil, C1-C6alkoksi, supstituisani C1-C6alkoksi, C2-C6alkenil, supstituisani C2-C6alkenil, C2-C6alkinil ili supstituisani C2-C6alkinil;
J4, J5, J6i J7su svaki, nezavisno, H, halogen, C1-C6alkil, supstituisani C1-C6alkil, C1-C6alkoksi, supstituisani C1-C6alkoksi, C2-C6alkenil, supstituisani C2-C6alkenil, C2-C6alkinil ili supstituisani C2-C6alkinil;
ili J4obrazuje most sa jednim od J5ili J7gde pomenuti most sadrži od 1 do 3 vezanih biradikalnih grupa izabranih između O, S, NR19, C(R20)(R21), C(R20)=C(R21), C[=C(R20)(R21)] i C(=O) druge dve J5, J6i J7su svaka, nezavisno, H, vodnik, C1-C6alkil, supstituisani C1-C6alkil, C1-C6alkoksi, supstituisani C1-C6alkoksi, C2-C6alkenil, supstituisani C2-C6alkenil, C2-C6alkinil ili supstituisani C2-C6alkinil;
svaki R19, R20i R21je, nezavisno, H, C1-C6alkil, supstituisani C1-C6alkil, C1-C6alkoksi, supstituisani C1-C6alkoksi, C2-C6alkenil, supstituisani C2-C6alkenil, C2-C6alkinil ili supstituisani C2-C6alkinil;
G je H, OH, halogen ili O-[C(R8)(R9)]n-[(C=O)m-X1]j-Z;
svaki R8i R9je, nezavisno, H, halogen, C1-C6alkil ili supstituisani C1-C6alkil;
X1je O, S ili N(E1);
Z je H, halogen, C1-C6alkil, supstituisani C1-C6alkil, C2-C6alkenil, supstituisani C2-C6alkenil, C2-C6alkinil, supstituisani C2-C6alkinil ili N(E2)(E3);
E1, E2i E3su svaki, nezavisno, H, C1-C6alkil ili supstituisani C1-C6alkil;
n je od 1 do oko 6;
m je 0 ili 1;
j je 0 ili 1;
svaka supstituciona grupa sadrži jednu ili više opciono zaštićenih supstitucionih grupa nezavisno izabranih od halogena, OJ1, N(J1)(J2), =NJ1, SJ1, N3, CN, OC(=X2)J1, OC(=X2)N(J1)(J2) i C(=X2)N(J1)(J2);
X2je O, S ili NJ3;
svaki J1, J2i J3je, nezavisno, H ili C1-C6alkil;
gde j je 1 zatim Z je drugačiji od halogena ili N(E2)(E3); i
gde pomenuto oligomerno jedinjenje sadrži od 8 do 40 monomernih podjedinica i hibridizuje sa bar delom ciljne nukleinske kiseline.
[0219] U izvesnim izvođenjima, M3je O, CH=CH, OCH2ili OC(H)(Bx2). U izvesnim izvođenjima, M3je O.
[0220] U izvesnim izvođenjima, J4, J5, J6id J7su svaki H. U izvesnim izvođenjima, J4obrazuje most sa jednim od J5ili J7.
[0221] U izvesnim izvođenjima, A ima jednu od formula:
gde:
Q1i Q2su svaki, nezavisno, H, halogen, C1-C6alkil, supstituisani C1-C6alkil, C1-C6alkoksi ili supstituisani C1-C6alkoksi. U izvesnim izvođenjima, Q1i Q2su svaki H. U izvesnim izvođenjima, Q1i Q2su svaki, nezavisno, H ili halogen. U izvesnim izvođenjima, Q1i Q2je H i drugi od Q1i Q2je F, CH3ili OCH3.
[0222] U izvesnim izvođenjima, T1ima formulu:
gde:
Rai Rcsu svaki, nezavisno, zaštićeni hidroksil, zaštićeni tiol, C1-C6alkil, supstituisani C1-C6alkil, C1-C6alkoksi, supstituisani C1-C6alkoksi, zaštićeni amino ili supstituisani amino; i
Rbje O ILI S. U izvesnim izvođenjima, Rbje O i Rai Rcsu svaki, nezavisno, OCH3, OCH2CH3ili CH(CH3)2.
[0223] U izvesnim izvođenjima, G je halogen, OCH3, OCH2F, OCHF2, OCF3, OCH2CH3, O(CH2)2F, OCH2CHF2, OCH2CF3, OCH2-CH=CH2, O(CH2)2-OCH3, O(CH2)2-SCH3, O(CH2)2-OCF3, O(CH2)3-N(R10)(R11), O(CH2)2-ON(R10)(R11), O(CH2)2-O(CH2)2-N(R10)(R11), OCH2C(=O)-N(R10)(R11), OCH2C(=O)-N(R12)-(CH2)2-N(R10)(R11) ili O(CH2)2-N(R12)-C(=NR13)[N(R10)(R11)] gde R10, R11, R12i R13su svaki, nezavisno, H ili C1-C6alkil. U izvesnim izvođenjima, G je halogen, OCH3, OCF3, OCH2CH3, OCH2CF3, OCH2-CH=CH2, O(CH2)2-OCH3, O(CH2)2-O(CH2)2-N(CH3)2, OCH2C(=O)-N(H)CH3, OCH2C(=O)-N(H)-(CH2)2-N(CH3)2ili OCH2-N(H)-C(=NH)NH2. U izvesnim izvođenjima, G je F, OCH3ili O(CH2)2-OCH3. U izvesnim izvođenjima, G je O(CH2)2-OCH3.
[0224] U izvesnim izvođenjima, 5’-terminalni nukleozid ima Formulu IIe:
[0225] U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenja, uključuju one naročito pogodna za ssRNK koja sadrže jedan ili više tipova modifikovanih šećernih deolva i/ili šećernih delova koji se javljaju u prirodi raspoređenih duž oligonukleotida ili njegovih regiona u definisanom uzorku ili motivu modifikacije šećera. Takvi motivi mogu uključivati bilo koju od modifikacija šećera koja je ovde diskutovana i/ili druge opoznate modifikacije šećera.
[0226] U izvesnim izvođenjima, oligonukleotidi sadrže ili se sastoje od regiona koji ima jednoorazne šećerne modifikacije. U izvesnim takvim izvođenjima, svaki nukleozid regiona sadrži iste modifikacije slične RNK. U izvesnim izvođenjima, takav nukleozid regiona je 2’-F nukleozid. U izvesnim izvođenjima, svaki nukleozid regiona je 2’-OMe nukleozid. U izvesnim izvođenjima, svaki nukleozid regiona je 2’-MOE nukleozid. U izvesnim izvođenjima, svaki nukleozid region je cEt nukleozid. U izvesnim izvođenjima, svaki nukleozid regiona je LNA nukleozid. U izvesnim izvođenjima, jednoobrazni region čine svi ili suštinski svi oligonukleotidi. U izvesnim izvođenjima, region čine celokupni oligonukleotid osim 1-4 terminalnih nukleozida.
[0227] U izvesnim izvođenjima, oligonukleotidi sadrže jedan ili više regiona naizmeničnih šećernih modifikacija, gde nukleozidi se naizmenično smenjuju između nukleotida koji imaju šećernu modifikaciju prvog tipa i nukleotida koji imaju šećerni deo drugog tipa. U izvesnim izvođenjima, nukleozidi oba tipa su nukleozidi slični RNK. U izvesnim izvođenjima nukleozidi koji se smenjuju su izabrani između: 2’-OMe, 2’-F, 2’-MOE, LNA, i cEt. U izvesnim izvođenjima, modifikacije koje se menjau su 2’-F i 2’-OMe. Takvi regioni mogu biti kontinualni ili mogu biti prekinuti sa različito modifikovanim nukleozidima ili konjugovanim nukleozidima.
[0228] U izvesnim izvođenjima, naizmenični region neizmeničnih modifikacija svaki se sastoji od jednog nukleozida (tj., uzorak je (AB)xAygde A je nukleozid kojiima šećernu modifikaciju prvog tipa i B je nukleozid koji ima šećernu modifkiaciju drugog tipa; x je 1-20 i y je 0 ili 1). U izvesnim izvođenjima, jedan ili više naizmeničnih regiona u naizmeničnim motivima obuhvata više od jednog tipa nukleozida. Na primer, oligonukleotidi mogu uključivati jedan ili više regiona prema bilo kom od sledećih motiva nukleozida:
AABBAA;
ABBABB;
AABAAB;
ABBABAABB;
ABABAA;
AABABAB;
ABABAA;
ABBAABBABABAA;
BABBAABBABABAA; ili
ABABBAABBABABAA;
gde A je nukleozid prvog tipa i B je nukleozid drugog tipa. U izvesnim izvođenjima, A i B su svaki izabran između 2’-F, 2’-OMe, BNA, i MOE.
[0229] U izvesnim izvođenjima, oligonukleotidi koji imaju naizmenične motive takođe sadrže modifikovani 5’ terminalni nukleozid, kao što su oni formule IIc ili IIe.
[0230] U izvesnim izvođenjima, oligonukleotidi sadrži region koji ima 2-2-3 motiv. Takvi regioni sadrže sledeći motiv:
-(A)2-(B)x-(A)2-(C)y-(A)3-
gde: A je prvi tip modifikovanog nukleozida;
B i C, su nukleozidi koji su različito modifikovani od A, međutim, B i C mogu imati iste ili različite modifikacije kao jedan od drugog;
x i y su od 1 do 15.
[0231] U izvesnim izvođenjima, A je 2’-OMe modifikovani nukleozid. U izvesnim izvođenjima, B i C su oba 2’-F modifikovani nukleozidi. U izvesnim izvođenjima, A je 2’-OMe modifikovani nukleozid i B i C su oba 2’-F modifikovani nukleozidi.
[0232] U izvesnim izvođenjima, oligonukleozidi imaju sledeći šećerni motiv:
5’- (Q)- (AB)xAy-(D)z
gde:
Q je nukleozid koji ima stabilizovani fosfatni deo. U izvesnim izvođenjima, Q je nukleozid koji ima Formule IIc ili IIe;
A je prvi tip modifikovanog nukleozida;
B je drugi tip modifikovanog nukleozida;
D je modifikovani nukleozid koji sadrži modifikacije različite od susednog nukleozida. Prema tome, ukoliko y je 0, tada D mora biri različito modifikovan u odnosu na B i ukoliko y je 1, tada D mora biti različito modifikovan u odnosu na A. U izvesnim izvođenjima, D se razlikuje od A i B.
X je 5-15;
Y is 0 ili 1;
Z je 0-4.
[0233] U izvesnim izvođenjima, oligonukleozidi imaju sledeći šećerni motiv:
5’- (Q)- (A)x-(D)z
gde:
Q je nukleozid koji sadrži stabilizovani fosfatni deo. U izvesnim izvođenjima, Q je nukleozid koji ima Formulu IIc ili IIe;
A je prvi tip modifikovanog nukleozida;
D je modifikovani nukleozid koji sadrži modifikacije različite od A.
X je 11-30;
Z je 0-4.
[0234] U izvesnim izvođenjima A, B, C, i D u gornjim motivima su izabrani između: 2’-OMe, 2’-F, 2’-MOE, LNA, i cEt. U izvesnim izvođenjima, D predstavlja krajnje nukleozide. U izvesnim izvođenjima, takvi terminalni nukleozidi nisu dizajnirani da hibridizuju sa ciljnom nukleinskom kiselinom (mada jedna ili više mogu hibridizovati slučajno). U izvesnim izvođenjima, nukleobaza svakog D nukleozida je adenin, bez obzira na identitet nukleobaze u odgovarajućem položaju ciljne nukleinske kiseline. U izvesnim izvođenjima nukleobaza svakog D nukleozida je timidin.
[0235] U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenja, uključujući ona naročito pogodna za upotrebu kao ssRNK sadrže modifikovane internukleozidne veze raspoređene duž oligonukleotida ili njegovog regiona u definisanom uzorku ili motivu modifikovane internukleozidne veze. U izvesnim izvođenjima, oligonukleotidi sadrže region koji ima naizmenični motiv internukleozidne veze. U izvesnim izvođenjima, oligonukleotidi sadrže region jednoobrznih modifikovanih internukleozidnih veza. U izvesnim takvim izvođenjima, oligonukleotid sadrži region koji je jednoobrazno povezan sa fosforotioatnim internukleozidnim vezama. U izvesnim izvođenjima, oligonukleotid je jednoobrazno povezan sa fosforotioatnim internukleozidnim vezama. U izvesnim izvođenjima, svaka internukleozidna veza oligonukleotida je izabrana između fosfodiestra i fosforotioata. U izvesnim izvođenjima, svaka internukleozidna veza oligonukleotida je izabrana između fosfodiestra i fosforotioata i bar jedne internukleozidne veze je fosforotioat.
[0236] U izvesnim izvođenjima, oligonukleotid čini bar 6 fosforotioatnih internukleozidnih veza. U izvesnim izvođenjima, oligonukleotid sadrži 8 fosforotioatne internukleozidne veze. U izvesnim izvođenjima, oligonukleotid sadrži bar 10 fosforotioatnih internukleozidnih veza. U izvesnim izvođenjima, oligonukleotid sadrži bar jedan blok bar 6 konsekutivnih fosforotioatnih internukleozidnih veza. U izvesnim izvođenjima, oligonukleotid sadrži bar jedan blok od bar 8 konsekutivnih fosforotioatnih internukleozidnih veza. U izvesnim izvođenjima, oligonukleotid sadrži bar jedan blok od bar 10 konsekutivnih fosforotioatnih internukleozidnih veza. U izvesnim izvođenjima, oligonukleotid sadrži bar jedan blok od bar 12 konsekutivnih fosforotioatnih internukleozidnih veza. U izvesnim takvim izvođenjima, bar jedan takav blok je smešten na 3’ kraju oligonukleotids. U izvesnim takvim izvođenjima, bar jedan takva blok je smešten u okviru 3 nukleozida 3’ kraj oligonukleotida.
[0237] Oligonukleotidi koji imaju bilo koje od različitih motiva šećera ovde opisanih, mogu imati bilo koji motiv. Na primer, oligonukleotidi, uključujući ali bez ograničenja na one ovde opisane, mogu imati motiv veze izabran iz donje neograničavajuće tabele:
ii. siRNK jedinjenja
[0238] U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenja su dvolančana RNKi jedinjenja (siRNK). U takvim izvođenjima, jedan ili oba lanca mogu sadržati bilo koju motiv modifikacije gore opisan za ssRNK. U izvesnim izvođenjima, ssRNK jedinjenja mogu biti nemodifikovani RNK. U izvesnim izvođenjima, siRNA jedinjenja mogu sadržati nemodifikovane RNK nukleozide, ali modifikovane internukleozidne veze.
[0239] Nekoliko izvođenja se odnosi na dvolančane kompozicije u kojima svaki lanac sadrži motiv koji je definisan smeštanjem jednog ili više modifikovanih ili nemodifikovanih nukleozida. U izvesnim izvođenjima, obezbeđene su kompozicije koje sadrže prvo i drugo oligomerno jedinjenje koja su potpuno ili bar delimično hidrbidizovana da obrazuju region dupleksa i dalje sadrže region koji je komplementaran ili hibridizuje sa nukleinskom kiselinom. Pogodno je da takva kompozicija sadrži prvo oligomerno jedinjenja koje je antisens lanac koji ima punu ili parcijalnu komplementarnost sa ciljnom nukleinskom kiselinom i drugo oligomerno jedinjenja koji je osetljiv lanac kojiima jedan ili više regiona komplementarnosti sa i obrazuje bar jedan region dupleksa sa prvim oligomernim jedinjenjem.
[0240] Kompozicije prema nekoliko izvođenja muduliraju ekspresiju gena hibridizacjom sa ciljnom nukleinskom kiselinom koja dovodi do gubitka njegove normalne funkcije. U nekim izvođenjima, ciljana nukleinska kiselina je CFB. U izvesnim izvođenjima, degradacija ciljanog CFB je olakšana sa aktiviranim RISC kompleksom koji je obrazovan sa kompozicijma prema proanalasku.
[0241] Nekoliko izvođenja se odnosi na dvolančanue kompozicije u kojima jedan od lanaca je korisan u, na primer, uticanju preferencijalnog opterećenja suprotnog lanca u RISC (ili cepanju) kompleksa. Kompozicije su korisne za ciljanje odabranih molekula nukleinske kiseline i modulaciju ekspresije jednog ili više gena. U nekim izvođenjima, kompozicije prema prikazanom pronalasku hibridizuju sa delom ciljne RNK dovodeći do gubitka normalne funkcije ciljne RNK.
[0242] Izvesna izvođenja se odnose na dvolančane kompozicije u kojima oba lanca sadrže himerne motive, potpuno modifikovani motiv, poziciono modifikovani motiv ili naizmenične motive. Svaki lanac kompozicije prema prikazanom pronalasku može biti modifikovan da ispuni naročitu ulogu na primer siRNA puta. Korišćenjem različitih motiva u lancu ili istih motiva sa različitih hemijskim modifikacijama u svakom lancu dozovljava ciljanje antisens lanca za RISC kompleks dok inhibira inkorporaciju u sens lanac. U okviru ovog modela, svaki lanac može biti nezavisno modifikovan tako da pospešuje njegovu posebnu ulogu. Antisens lanac može biti modifikovan na 5’-kraju da se pospeši njegova uloga u jednom regionu RISC dok 3’-kraj može biti modifikovan raličito da se pospeši njegova uloga u različitim regionima RISC.
[0243] Dvolančani oligonukleotidni molekuli mogu biti dvolančani polinukleotidni molekul koji sadrže samokomplementarne sens i antisens regione, u kojima antisens region sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementara sa nukleotidnom sekvencom u molekulu ciljne nukleinske kiseline ili njegovog dela i sens region koji ima nukleotidnu sekvencu koja odgovara ciljanoj sekvenci nukleinske kiseline ili njenom delu. Dvolančani oligonukleotidni molekuli mogu biti sklopljeni od dva odvojena oligonukleotida, gde je jedan lanac sens lanac a drugi je antisens lanac, gde su antisens i sens lanac samokomplementarni (tj. svaki lanac sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sa nukleotidnom sekvencom drugog lanca; kao što su antisens lanac i sens lanac iz dupleksa ili dvolančane strukture, na primer gde dvolančani region je oko 15 do oko 30, npr., oko 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ili 30 parova baza; antisens lanac sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sa nukleotidnom sekvencom u ciljnom molekulu nukleinske kiseline ili njenom delu i sens lanac sadrži nukleotidnu sekvencu koja odgovara ciljanoj sekvenci nukleinske kiseline ili njenom delu (npr., oko 15 do oko 25 ili više nukleotida dvolančanog oligonukleotidnog molekule je kompatibilno sa ciljnom nukleinskom kiselinom ili njenim delom). Alternativno, dvolančani oligonukleotid je sklopljen sa pojedninačnim oligonukleotidom, gde samo-komplementarni sens i antisens regioni siRNK su vezani sa vezujućom grupom(ama) na bazi nukleinske kiseline ili koji nisu na bazi nukleinske kiseline.
[0244] Dvolančani oligonukleotid može biti polinukleotid sa dupleksom, asimetričnim dupleksom, sekundarne strukture ukosnice ili asimetrične ukosnice, koja ima samokomplementarne sens i antisens regione, gde antisens region sadrži nukleotidne sekvence koje su komplementarne sa nukelotidnim sekvencama u odgovojenom molekulu ciljne nukleinske kiseline ili njenog dela i sense region koji ima nukleotidne sekvence koje odgovaraju ciljnoj sekvenci nukleinske kiseline ili njenog dela. Dvolančani oligonukleotid može biti kružni jednolančani polinukleotid koji ima dve ili
4
više strukture petlje i osnovu koju čine samokomplementarni sens i antisens regioni, gde antisens region sadrži nukelotidne sekvencu koja je komplementarna sa nukleotidnom sekvencom molekula ciljne nukleinske kiseline ili njegog dela i sens region koji ima nukleotidnu sekvencu koja odgovara sekvenci ciljne nukleinske kiseline ili njenog dela, i gde kružni polinukleotid može biti obrađen ili in vivo ili in vitro da stvori aktivni siRNA molekul u stanju da posreduje RNKi.
[0245] U izvesnim izvođenjima, dvolančani oligonukleotid sadrži odvojene sens i antisens sekvence ili regione, u kojima sens i antisens regionu su kovalentno vezani sa molekulima nukleotidnih ili ne-nukleotidnih vezujućih grupa kao što je poznato u stanju tehnike, ili su naizmenično nekovalento vezani sa jonskim interakcijama, vodoničnom vezom, van der valsovim interakcijama, hidrofonim interakcijama, i/ili interakcijama nagomilavanja. U izvesnim izvođenjima, dvolančani oligonukleotid sadrži nukleotidne sekvence koje su komplementarne sa nukelotidnom sekvencom ciljnog gena. U drugom izvođenju, dvolančani oligonukleotid reaguje sa nukleotidnom sekvencom ciljnog gena na način koji izaziva inhibiciju ekspresije ciljanog gena.
[0246] Kako je ovde korišćeno, dvolančani oligonukleotidi treba da su ograničeni na one molekule koji sadrže samo RNK, ali dalje obuhvataju hemijski modifikovane nukelotide i nenukleotide. U izvesnim izvođenjima, kratkom molekulu ometajuće nukleinske kiseline nedostaju nukleotidi koji sadrže 2’-hidroksi U izvesnim izvođenjima kratke ometajuće nukleinske kiseline opciono ne obuhvataju bilo koje ribonukleotide(npr., nukleotide koji imaju 2’-OH group). Takvi dvolančani oligonukleotidi ne zahtevaju prisustvo ribonukleotida u okviru molekula da podrži RNKi može međutim imati vezanu vezjuću grupu ili vezujuće grupe ili druge vezane ili pridružene grupe, delove ili lance koji sadrže jedan ili više nukelotida sa 2’-OH grupe. Opciono, dvolančani oligonukleotidi mogu sadržati ribonukleotide u oko 5, 10, 20, 30, 40, ili 50% nukleotidnih položaja. Kako je ovde korišćeno, izraz siRNKse smatra da je ekvivalenat sa ostalim izrazima korišćenim da se opišu molekuli nukleinske kiseline koji su u stanju da posreduju sa RNKi sa specifičnim sekvencama, na primer kratke ometajuće RNK (siRNK), dvolančane RNK (dsRNK), mikro-RNK (miRNK), RNK u vidu kratke ukosnice (shRNK), kratki ometajući oligonukleotid, kratka ometajuća nukleinska kiselina, kratki ometajući modifikovani oligonukleotid, hemijski modifikovani siRNK, post-transkripciono genetsko utišavanje RNK (ptgsRNK), i ostale. Pored toga, kako je ovde korišćeno, izraz RNKi se smatra da je ekvivalentan sa ostalim izrazima korišćenim da se opišu ometanju sekvence specifičnim RNK, kao što je postranskripciono utišavanje gena, translaciona inhibicija, ili epigenetici. Na primer, dvolančani oligonukleotidi mogu biti korišćeni za epigenetsko utišavanje gena na oba prostranskipciona nivou i predtranskripcionom nivou. U neograničavajućem primeru, epigentska regulacija ekspresije od strane molekula siRNK prema pronalasku može biti posledica siRNK posredovane modifikacije hromatinske strukture ili metilacionog uzorka da bi se izmenila ekspresija gena (videti, na primer, Verdel et al., 2004, Science, 303, 672-676; Pal-Bhadra et al., 2004, Science, 303, 669-672; Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819; Volpe et al., 2002, Science, 297, 1833-1837; Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218; and Hall et al., 2002, Science, 297, 2232-2237).
[0247] Smatra se da jedinjenja i kompozicije prema nekoliko izvođena ovde obezbeđenih mogu ciljati CFB b sa dsRNK-posredovanim utišavanjem gena ili RNKi mehanizmom, uključujući, npr., "ukosnicu" ili osnova-petlja dvolančane RNK molekule efektora u kojima jedan RNK kanac sa samokomplementarnim sekvencama je u stanju da pretpostavi dolančanu konformaciju ili dupleks dsRNK molekula efektora koji sadrže dva odvojena lanca RNK. U različitim izvođenjima, dsRNK se sastoji u celini od ribonukleotida ili se sastoji od smeše ribonukleotida i dezoksinukleotida, kao što su opisani RNK/DNK hibridi, na primer, u WO 00/63364, podnetoj Apr.
19, 2000, ili U.S. Ser. No.60/130,377, podnetoj Apr.21, 1999. dsRNK ili dsRNK molekul efketor može biti jedan molekul sa regionom samokomplementarnim tako da nukleotidi u jednom segmentu molekula baze se sparuju sa nukleotidima u drugom segmentu molekula. U različitim izvođenjima, dsRNK koji se sastoji od pojedinačnog molekula se sastoji u potpunosti od ribonukleotida ili uključuje region ribonukleotida koji je komplementaran sa regionom dezoksiribonukleotida. Alternativno, dsRNA može uključivati dva raličita lanca koja imaju region komplementaran jedan sa drugim.
[0248] U različitim izvođenjima, oba lanca se sastoje u potpunosti od ribonukleotida, jedan lanac se sastoji potpuno od ribonukleotida i jedan lanac se sastoji potpuno od dezoksiribonukleotida, ili jedan ili oba lanca sadrže smešu ribonukleotida i dezoksiribonukleotida. U izvesnim izvođenjima, regioni komplementarnosti su bar 70, 80, 90, 95, 98, ili 100% komplementarni jedan sa drugim i sa ciljnom sekvencom nukleinske kiseline. U izvesnim izvođenjima, region dsRNK koji je prisutan u dvolančanoj konformaciji uključuje bar 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 50, 75,100, 200, 500, 1000, 2000 ili 5000 nukleotida ili uključuje sve nukelotide u cDNA ili druge ciljne sekvence nukleinske kiseline koja je predstavljana u dsRNK. U nekim izvođenjima, dsRNK ne sadrži bilo koje jednolančane regione, kao što su jednolančani krajevi ili dsRNK je ukosnica. U drugim izvođenjima, dsRNA ima jednu ili više jednolančanih regiona ili ispusta. U izvesnim izvođenjima, RNK/DNK hibridi uključuju DNK lanac ili region koji je antisens lanac ili reion (npr, ima bar 70, 80, 90, 95, 98, ili 100% komplementarnosti sa ciljnom nukleinskom kiselinom) i RNK lanac ili region koji je sens lanac ili region (npr, ima bar 70, 80, 90, 95, 98, ili 100% identičnosti sa ciljnom nukleinskom kiselinom), i vice versa.
[0249] U različitim izvođenjima, RNK/DNK hibrid je napravljen in vitro pomoću enzimskih i hemijskih sintetskih metoda kao što su one ovde ili one opisane u WO 00/63364, podnetoj Apr.
19, 2000, ili U.S. Ser. No.60/130,377, podnetoj Apr.21, 1999. U ostalim izvođenjima, DNK lanac sintetisan in vitro je kompleksiran sa RNK lancem napravljenim in vivo ili in vitro pre, posle, ili konkurentno sa transformacijom DNK lanca u ćeliju . U još jednom izvođenju, dsRNK je kružna nukleinska kiselina koja sadrži sens i antisens region, ili dsRNK uključuje cikličnu nukleinsku kiselinu i ili drugu cikličnu nukleinsku kiselinu ili linearnu nukleinsku kiselinu (videti, na primer, WO 00/63364, podnetu Apr. 19, 2000, ili U.S. Ser. No. 60/130,377, filed Apr. 21, 1999.) Primeri cirkularnih nukleinskih kiselina uključuju ’laso’ strukture u kojima slobodna 5’ fosforil grupa nukleotida postaje vezana za 2’ hidroksilnu grupu drugog nukleotida na način vraćanja petlje.
[0250] U drugim izvođenjima, dsRNK uključuje jedan ili više modifikovanih nukleotida u kojima položaj 2’ u šećeru sadrži halogen (kao što je grupa fluora) ili sadrži alkoksi grupu (kao što je metoksi grupa) koja povećava poluživot dsRNK in vitro ili in vivo u poređenju sa odgovarajućom dsRNK u kojoj odgovarajući položaj 2’ sadrži vodonik ili hidroksilnu grupu. U drugim izvođenjima, dsRNK uključuje jednu ili više veza između susednih nukeotida koje su drugačije od fosfodiestarskih veza koje se javljaju u prirodi. Primeri takvih veza uključuju fosforamid, fosforotioat, i fosforoditioatne veze. dsRNKs mogu takođe biti hemijski modifikovani molekuli nukleinske kiseline kao što je u U.S. Pat. No.6,673,661. U drugim izvođenjima, dsRNK jedan ili dva lanca sa kapama (engl. capped) kao što je opisano u, na primer, kod WO 00/63364, podneto Apr.19, 2000, ili U.S. Ser. No.60/130,377, podneto Apr.21, 1999.
[0251] U ostalim izvođenjima, dsRNK može biti bilo koja od bar delom dsRNK molekula opisanih u WO 00/63364, kao i bilo koji od dsRNK molekula opisanih u U.S. privremenoj prijavi 60/399,998; i U.S. privremenoj prijavi 60/419,532, i PCT/US2003/033466. Bilo koji od dsRNKs može biti eksprimovan in vitro ili in vivo ukorišćenjem postupaka ovde opisanih ili standardnih postupaka, kao što su oni opisani u WO 00/63364.
Zauzetost
[0252] U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenja se ne očekuje da dovode od cepanja ili ciljne nukleinske kiseline pomoću RNaze H ili da dovode do cepanja ili sekvestracije kroz RISC put. U izvesnim takvim izvođenjima, antisens aktivnost može biti rezutat zauzetosti, gde prisustvo hibridizovanih antisens jedinjenja ometa aktivnost ciljne nukleinske kiseline. U izvesnim takvim izvođenjima, antisens jedinjenje može biti jednoobrazno modifikovano ili može zadržati mešovite modifikacije i/ili modifikovane i nemodifikovane nukleozide.
Ciljne nukleinske kiseline, ciljni regioni i nukleotidne sekvence
[0253] Nukleotidne sekvence koji kodiraju faktor B komplementa (CFB) uključuju, bez ograničenja, sledeće: GEN- BANK pristupni broj. NM_001710.5 (uključen ovde kao SEQ ID NO: 1), GENBANK pristupni broj. NT_007592.15 skraćeni od nukleotida 31852000 do 31861000 (ovde uključenih kao SEQ ID NO: 2), GENBANK pristupni broj NW_001116486.1 skraćeni od nukleotida 536000 do 545000 (uključeni ovde kao SEQ ID NO: 3), GENBANK pristupni broj. XM_001113553.2 (uključeni ovde kao SEQ ID NO: 4), ili GENBANK pristupni broj. NM_008198.2 (uključeni ovde kao SEQ ID NO: 5).
Hibridizacija
[0254] U nekim izvođenjima, hibridizacija se javlja između antisens jedinjenja ovde opisanih i CFB nukleinske kiseline. Najuobičajeni mehanizam hibridizacije uključuje vodonično vezivanje (npr., Watson-Crick-ovo, Hoogsteen-ovo ili reverzno Hoogsteen-ovo vodonično vezivanje) između komplementarnih nukleobaza molekula nukleinske kiseline.
[0255] Hibridizacija se može javiti pod različitim uslovima. Strogi uslovi su zavisni od sekvence i određeni su prirodom i sastavom molekula nukleinske kiseline koja se hibridizuje.
[0256] Postupci određivanja da li je sekvenca specifično hibridizabilna za ciljnu nukleinsku kiselinu su dobropoznati u ovoj oblasti. U izvesnim izvođenjima, obezbeđena antisens jedinjenja ovde su specifično hibirizabilna sa CFB nukleinskom kiselinom.
Komplementarnost
[0257] Antisens jedinjenje i ciljna nukleinska kiselina su komplemenatrni jedan sa drugim kada je dovoljan broj nukleobaza antisens jedinjenja se može vodoničnom vezom vezati sa odgovarajućim nukleobazama ciljne nukleinske kiseline, tako da će se željeni efekti javiti (npr., antisens inhibicija ciljne nukleinska kiseline, kao što je CFB nukleinska kiselina).
[0258] Nekomplementarne nukleobaze između antisens jedinjenja CFB nukleinske kiseline mogu
4
biti tolerisane uz uslov da antisens jedinjenje ostaje u stanju da se specifično hibridizuje sa ciljnom nukleinskom kiselinom. Pored toga, antisens jedinjenje može hibridizovati preko jednog ili više sgemenata CFB nukleinske kiseline tako da interventni ili susedni segmenti nisu uključeni u hibridizacioni događaj (npr., struktura petlje, nepoklapanje ili struktura ukosnice).
[0259] U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenja ovde obezbeđena , ili njihovi specifični delovi su ili bar, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% komplementarni sa CFB nukleinskom kiselinom, ciljnim regionom, ciljnim segmentom ili specifičnim njihovim delom. Procenat komplemenatarnosti antisens jedinjenja sa ciljnom nukleinskom kiselinom može biti određen korišćenjem rutinskih postupaka.
[0260] Na primer, antisens jedinjenje u kome 18 od 20 nukleobaza antisens jedinjenja je komplementarno sa ciljnim regionom, i prema tome će specifično hibridizovati, će predstavljati 90 percenta komplementarnosti. U ovom primeru, preostale nekomplemantarne nukleobaze mogubiti grupisane ili rasute sa komplementarnim nukleobazama i ne treba da budu susedne jedna sa drugom ili sa komplemantarnim nukleobazama. Kao takvo, antisens jedinjenje koje je dugo 18 nukleobaza ima četiri nekomplementarne nukleobaze koje su obično od dva regiona koji su potpuno komplementarni sa ciljnom nukleinskom kiselina će imati 77.8% celokupne komplementarnosti sa ciljnom nukleinskom kiselinom. Percenat komplementarnosti antisens jedinjenja sa regionom ciljne nukleinske kiseline može biti određen rutinski korišćenjem BLAST programa (engl.basic local alignment search tools) i PowerBLAST programa poznatih u ovoj oblasti (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656). Procenat homologije, identičnost sekvence ili komplemantarnosti, može biti određen, na primer, Gap programom (Wisconsin Sekvenca Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), korišćenjem podrazumevajućih podešavanja, koja koriste algoritam Smith and Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482489).
[0261] U izvesnim izvođenjima, ovde obezbeđena antisens jedinjenja, ili njihove specifični delovi, su potpuno komplementarni (tj. 100% komplementarni) sa ciljnom nukleinskom kiselinom, ili njenim specifičnim delovima. Na primer, antisens jedinjenje može biti potpuno komplemantarno sa CFB nukleinskom kiselinom, ili ciljnim regionom, ili ciljnim segmentom ili njenom ciljnom sekvencom. Kako je ovde korišćeno, "potpuno komplementaran" označava svaku nukleobazu antisens jedinjenja koja je u stanju sa se precizno spari sa bazom odgovarajućih nukleobaza ciljne nukleinske kiseline. Na primer, 20 nukleobaza antisens jedinjenja su potpuno komplementarne sa ciljnom sekvencom koja je dugačka 400 nukleobaza, tako duga kao deo odgovarajućih 20 nukleobaza ciljne nukleinske kiseline koji je potpuno komplementaran sa antisens jedinjenjem. Potpuno komplementaran može takođe biti korišćen pozivanjem na specifični deo prve i /ili druge nukleinske kiseline. Na primer, deo od 20 nukleobaza antisens jedinjenja od 30 nukleobaza može biti "potpuno komplementaran" sa ciljnom sekvencom koja je dugačka 400 nukleobaza. Deo od 20 nukleobaza od oligonukleotida 30 nukleobaza je potpuno komplementaran sa ciljnom sekvencom ukoliko ciljna sekvenca ima deo odgovarajućih 20 nukleobaza gde svaka nukleobaza je komplementarna sa delom 20 nukleobaza antisens jedinjenja. U isto vreme, celokupno antisens jedinjenje od 30 nukleobaza može ili ne može biti potpuno komplementarno sa ciljnom sekvencom, u zavisnosti od toga da li preostalih 10 nukleobaza antisens jedinjenja je takođe komplementarno sa ciljnom sekvencom.
[0262] Položaj nekomplementarne nukleobaze može biti na 5’ kraju ili 3’ kraju antisens jedinjenja.
Alternativno, nekomplementarna nukleobaza ili nukleobaze mogu biti u unutrašnjem položaju antisens jedinjenja. Kada su dve ili više nekomplementarne nukleobaze prisutne, one mogu biti susedne (tj. povezane) ili nesusedne. U jednom izvođenju, nekomplementarna nukleobaza je smeštena u segment „krila“ gapmer antisens oligonukleotida.
[0263] U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenja koja su dužine, ili su do 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili 20 nukleobaza sadrže ne više od 4, ne više od 3, ne više od 2, ili ne više od 1 nekomplementarne(ih) nukleobaze(a) u odnosu na ciljnu nukleinsku kiselinu, kao što je CFB nukleinska kiselina, ili specifičninjen deo.
[0264] U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenja koja su dužine ili su do 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ili 30 nukleobaze sadrže ne više od 6, ne više od 5, ne više od 4, ne više od 3, ne više od 2, ili ne više od 1 nekomplementarne(ih) nukleobaze(a) u odnosu na ciljnu nukleinsku kiselinu, kao što je CFB nukleinska kiselina, ili njen specifični deo.
[0265] Antisens jedinjenja ovde takođe uključuju ona koja su komplementarna sa delom ciljne nukleinske kiseline. Kako je ovde korišćeno, "deo" odnosi se na definisani broj susednih (tj. povezanih) nukleobaza u okiru regiona ili segmenta ciljne nukleinske kiseline. "Deo" može se takođe odnositi na definisani broj susednih nukleobaza antisens jedinjenja. U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenja, su komplementarna sa bar delom od 8 nukleobaza ciljanog segmenta. U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenja su komplementarna sa bar delom od 9 nukleobaza ciljnog segmenta. U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenja su komplementarna sa bar delom od 10 nukleobaza ciljnog segmenta. U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenja su komplementarna sa bar delom od 11 ciljnog segmenta . U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenja su komplementarna sa bar delom od 12 nukleobaza ciljnog segmenta. U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenja su komplementarna sa delom od bar 13 nukleobaza ciljnog segmenta. U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenja su komplementarna sa delom od bar 14 nukleobaza ciljnog segmenta. U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenja su komplementarna sa delom od bar 15 nukleobaza ciljnog segmenta. Takođe su razmatrana antisens jedinjenja koja su komplementarna sa delom od bar 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ili više nukleobaza ciljnog segmenta, ili opsegom definisanim sa bilo koje dve od ovih vrednosti .
Identitčnost
[0266] Antisens jedinjenja ovde mogu takođe imati definisani procenat identičnosti sa određenom nukleotidnom sekvencom , SEQ ID NO, ili jedinjenjem predstavljenim sa specifičnim Isis brojem, ili njegovim delom. Kako je ovde korišćeno, antisens jedinjenje je identično sa ovde opisanom sekvencom ukoliko ima istu sposobnost sparivanja nukleobaza. Na primer, RNK koja sadrži uracil na mestu timidina u opisanoj DNK sekvenci će se smatrati identičnom sa DNK sekvencom jer oba uracil i timidin sparuju se sa adeninom. Skraćene i produžene verzije ovde opisanih antisens jedinjenja kao i jedinjenja koja imaju neidentične baze u odnosu na antisens jedinjenja su takođe ovde razmatrane. Neidentične baze mogu biti susedne jedna sa drugom ili rasute kroz antisens jedinjenje. Procenat identičnosti antisens jedinjenja je izračunat prema broju baza koje imaju identično bazno sparivanje prema sekvecni za koju se porede.
[0267] U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenje, ili njihovi delovi, su bar 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identični sa jednim ili više antisens jedinjenja ili SEQ ID
4
NOs, ili njihovim delom, ovde opisanim.
[0268] U izvesnim izvođenjima, deo antisens jedinjenja se poredi sa delom jednake dužine ciljne nukleinske kiseline. U izvesnim izvođenjima, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ili 25 nukleobaznih delova se poredi sa delovima jednake dužine ciljne nukleinske kiseline.
[0269] U izvesnim izvođenjima, deo antisens oligonukleotida je poređen sa delom jednake dužine ciljne nukleinske kiseline. U izvesnim izvođenjima, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ili 25 nukleobazni deo se poredi da delom jednake dužine ciljne nukleinske kiseline.
Modifikacije
[0270] Nukleozid je kombinacija baza-šećer. Nukleobazni (takođe poznat kao bazni) deo nukleozida je normalni heterociklični bazni deo. Nukleotidi su nukleozidi koji dalje uključuju fosfatnu grupu kovalento vezanu sa šećernim delom nukleozida. Za one nukelotide koji uključuju pentofuranozil kao šećer, fosfatna grupa može biti vezana za 2’, 3’ ili 5’ hidroksilni deo šećera. Oligonukleotidi su obrazovani kroz kovalentnu vezu susednih nukleozida jednog sa drugim da bi se obrazovao linearni polimerni oligonukleotid. U okviru oligonukleotidne strukture, fosfatne grupe se uobičajeno nazivaju kako obrazuju internukleozidne veze oligonukleotida.
[0271] Modifikacije antisens jedinjenja obuhvataju supstitucije ili izmene u internukleozidnim vezama, šećernim delovima, ili nukleobazama. Modifikovana antisens jedinjenja su često poželjna u odnosu na prirodne oblike jer željene ososbine kao što su, na primer, poboljšano ćelijsko preuzimanje, povećani afinitet za ciljnu nukleinsku kiselinu, povećana stabilnost u prisustvu nukleaza, ili povećane inhibitorne aktivnosti.
[0272] Hemijski modifikovani nukeozidi mogu takođe biti korišćeni da povećaju afinitet vezivanja smanjenih ili skraćenih antisens oligonukleotida za ciljnu nukleinsku kiselinu. Posledično, uporedivi rezultati mogu često biti dobijeni sa kratkim antisens jedinjenjima koja imaju takve hemijski modifikovane nukleozide.
Modifikovane internukleozidne veze
[0273] Internukleozidna veza koja se javlja u prirodi RNK i DNK je 3’ do 5’ fosfodiestarska veza. Antisens jedinjenja imaju jednu ili više modifikovanih internukleozidnih veza tj. koje se ne javljaju u prirodi, i često su izabrane u odnosu na antisens jedinjenja koja imaju internukleozidne veze koje je javljaju u prirodi, zbog željenih osobine kao što su, na primer, pospešeno ćelijsko preuzimanje, pojačani ćelijski afinitet za ciljne nukleinske kiseline, i povećana stabilnost u prisustvu nukleaza.
[0274] Oligonukleotidi koji imaju modifikovane internukleozidne veze uključuju internukleozidne veze koje zadržavaju fosforni atom kao i internkleozidne veza koje nemaju fosforne atome. Reprezentativne internukleozidne veze koje sadrže fosfor uključuju, ali bez organičenja, fosfodiestar, fosfotriestar, metilfosfonat, fosforamidat, i fosforotioat. Postupci dobijanja veza koje sadrže fosfor i ne sadrže su dobro poznati.
[0275] U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenja cilaju CFB nukleinsku kiselinu koja sadrži jednu ili više modifikovanih internukleozidnih veza. U izvesnim izvođenjima, modifikovane internukleozide veze su fosforotioatne veze. U izvesnim izvođenjima, svaka internukleozidna veza
4
antisens jedinjenja je fosforotioatna internukleozidna veza.
[0276] U izvesnim izvođenjima, oligonukleotidi sadrže modifikovane internukleozidne veze raspoređene duž oligonukleotida ili njegovih regiona u definisanom uzorku ili modifikovanom motvu internukleozidnih veza. U izvesnim izvođenjima, internukleozidne veze su raspoređene u motiv razmaka. U takvim izvođenjima, internukleozidne veze u svakom od dva regiona "krila" su različite od internukleozidnih veza u regionu razmaka. U izvesnim izvođenjima internukleotidne veze u "krilima" su fosfodiestarske i internukleozidne veze u razmaku su fosforotioatne. Nukleozidni motiv je nezavisno odabran, tako da takvi oligonukleotidi imaju motiv segmenta sa razmakom (engl.gapped) internukleozidne veze i mogu ili ne moraju imati nukleozidni motiv sa razmakom (engl. gapped ) i ako imaju nukleozid motiv segmenta sa razmakom (engl.gapped), dužine "krila" i razmaka mogu ali ne moraju biti iste.
[0277] U izvesnim izvođenjima, oligonukleotidi sadrže region koji ima naizmenični motiv naizmenične internukleozidne veze. U izvesnim izvođenjima, oligonukleotidi prema prikazanom pronalasku sadrže region jednoobrazno modifikovanih internukleozidnih veza. U izvesnim takvim izvođenjima, oligonukleotid sadrži region koji se jednoobrazno veže sa fosforotioatnim internukleozidnim vezama. U izvesnim izvođenjima, oligonukleotid je jednoobrazno vezan sa fosforotioatom. U izvesnim izvođenjima, svaka internukleozidna veza oligonukleotida je izabrana od fosfodiestra i fosforotioata. U izvesnim izvođenjima, svaka internukleozidna veza oligonukleotida je izabrana iz fosfodiestra fosforotioat i bar jedna internukleozidna veza je fosforotioat.
[0278] U izvesnim izvođenjima, oligonukleotid sadrži bar 6 fosforotioatnih internukleozidnih veza. U izvesnim izvođenjima, oligonukleotid sadži bar 8 fosforotioatnih internukleozidnih veza. U izvesnim izvođenjima, oligonukleotid sadrži bar 10 fosforotioatnih internuklelozidnih veza. U izvesnim izvođenjima, oligonukleotid sadrži bar jedan blok bar 6 uzastopnih fosforotioatnih internukleozidnih veza. U izvesnim izvođenjima, oligonukleotid sadrži bar jedan blok od bar 8 konsekutivnih fosforotioatnih internukleozidnih veza. U izvesnim izvođenjima, oligonukleotid sadrži bar jedan blok od bar 10 uzastopnih fosforotioatnih internukleozidnih veza. U izvesnim izvođenjima, oligonukleotid sadrži bar blok od bar jedno 12 uzastopnih fosforotioatnih internukleozidnih veza. U izvesnim takvim izvođenjima, bar jedan takav bolok je smešten na 3’ kraj oligonukleotida. U izvesnim takvim izvođenjima, bar jedan blok je smešten u okviru 3 nukleozida 3’ kraja oligonukleotida.
[0279] U izvesnim izvođenjima, oligonukleotidi sadrže jedan ili više metilfosfonatnih veza. U izvesnim izvođenjima, oligonukleotidi koji imaju nukleozidni gapmer motiv sadrže motiv veza koji sadrži sve fosforotioatne veze osim jedne ili dve metilfosfonatne veze. U izvesnim izvođenjima, jedna metilfosfonatna veza je u centralnom razmaku oligonukleotida koji ima nukleozidni motiv gapmera.
[0280] U izvesnim izvođenjima, poželjno je da se rasporedi fosforotioatnih internukleozidnih veza i fosfodiestarskih internukleozidnih veza da se održi nukleazna otpornost. U izvesnim izvođenjima, poželjno je rasporediti broj i položaj fosforotioatnih internukleozidnih veza i broj i položaj fosforodiestarskih internukleozidnih veza da bi se održala nukelazna otpornost. U izvesnim izvođenjima, broj fosforotioatnih internukleozidnih veza može biti smanjen i broj fosfodiestarskih internukleozidnih veza može biti povećan. U izvesnim izvođenjima, broj fosforotioatnih internukleozidnih veza može biti smanjen i broj fosfodiestarskih internukleozidnih veza može biti
4
povećan dok još uvek se održava nukleazana otpornost . U izvesnim izvođenjima poželjno je smanjiti broj fosforotioatnih internukleozidnih veza dok se zadržava nukleazna otpornost. U izvesnim izvođenjima poželjno je povećati broj fosfodiestarskih veza dok se zadržava nukelazana otpornost.
Modifikovani šećerni delovi
[0281] Antisens jedinjenja mogu opciono sadržati jedan ili više nukleozida u kojima šećerna grupa je bila modifikovana. Takvi šećerno modifikovani nukleozidi mogu davati poboljšanu nukelaznu stabilnost, povećani afinitet vezivanja , ili neke druge korisne biološke osobine antisens jedinjenja. U izvesnim izvođenjima, nukleozidi sadrže hemijski modifikovane ribofuranozne prstenaste delove. Primeri hemijski modifikovanih ribofuranoznih prstena uključuju ali bez obraničenja, dodavanje grupe supstituenata (uključujući 5’ i 2’ grupe supstituenata, premošćavanje negeminalnih atoma prstena da bi se obrazovale biciklične nukleinske kiseline (BNA), zamena kiseonikovag atoma u ribozil prstenu sa S, N(R), ili C(R1)(R2) (R, R1i R2su svaki nezavisno H, C1-C12alkil ili zaštitna grupa) i njihova kombinacija. Primeri hemijski modifikovanih šećerna uključuju 2’-F-5’-metil supstituisani nukleozid (videti PCT međunarodnu prijavu WO 2008/101157 objavljenu 8/21/08za druge opisane 5’,2’-bis supstituisane nukleozide) ili zamenu kiseonikvog atoma ribozil prstena sa sa daljom supstitucijom na položaju 2’- (videti objavljenu U.S. Patentnu prijavu US2005-0130923, objavljenu Juna 16, 2005) ili alternativno 5’-supstituciju BNA (videti PCT međunarodnu prijavu WO 2007/134181 objavljenu 11/22/07 gde LNA je supstituisan sa na primer 5’-metil ili 5’-vinil grupom).
[0282] Primeri nukleozida imaju modifkovane šećerne delove koji uključuju bez ograničenja nukleozide koji sadrže 5’-vinil, 5’-metil (R ili S), 4’-S, 2’-F, 2’-OCH3, 2’-OCH2CH3, 2’-OCH2CH2F i 2’-O(CH2)2OCH3grupe supstituenata. Supstituent u položaju 2’ može takođe biti izabran iz alil, amino, azido, tio, O-alil, O-C1-C10alkil, OCF3, OCH2F, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), i O-CH2-C(=O)-N(R1)-(CH2)2-N(Rm)(Rn), gde svaki R1, Rmi Rnje, nezavisno, H ili supstituisani ili nesupstituisani C1-C10alkil.
[0283] Kako je ovde korišćeno, "biciklični nukleozidi" odnose se na modifikovani nukleozide koji sadrže biciklični šećerni deo. Primeri bicikličnih nukleozida sadrže bez ograničenja nukelozide koji sadrže most između 4’ i 2’ atoma ribozil prstena. U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenja koja su ovde obezbeđena uključuu jedan ili više bicikličnih nukleozida koji sadrže 4’ do 2’ mosta. Primeri takvih 4’ do 2’ premošćenih bicikličnih nukleozida, uključuju ali bez ograničenja na jednog formula: 4’-(CH2)-O-2’ (LNA); 4’-(CH2)-S-2’; 4’-(CH2)2-O-2’ (ENA); 4’-CH(CH3)-O-2’ (takođe se naziva ograničeni etil ili cEt) i 4’-CH(CH2OCH3)-O-2’ (i njegove analoge videti U.S. Patent 7,399,845, izdat July 15, 2008); 4’- C(CH3)(CH3)-O-2’ (i njegovi analozi videti objavljenu međunarodnu prijavu WO 2009/006478, objavljenu January 8, 2009); 4’-CH2-N(OCH3)-2’ (i njegove analoge videti obajvljenu međunarodnu prijavu WO/2008/150729, objavljenu December 11, 2008); 4’-CH2-O-N(CH3)-2’ (videti objavljenu U.S. Patentnu prijavu US2004-0171570, objavljenu Septembra 2, 2004); 4’izdat Septemba 23, 2008); 4’-CH2-C(H)(CH3)-2’ (videti Zhou et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); i 4’-CH2-C(=CH2)- 2’ (i njegovi analozi videti obajavljenu međunarodnu prijavu WO 2008/154401,
4
objavljenu Decembra8, 2008).
[0284] Dalji izveštaji koji se odnose na biciklične nukleozidi mogu biti nađeni u objavljenoj literaturi (videti na primer: Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26) 8362-8379; Elayadi et al., Curr. Opinion Invest. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; i Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; U.S. Patent Nos. 6,268,490; 6,525,191; 6,670,461; 6,770,748; 6,794,499;7,034,133; 7,053,207; 7,399,845; 7,547,684; 8,530,640; i7,696,345; U.S. patentna objava br. US2008-0039618; US2009-0012281; U.S. Patenti serijski broj.
61/026,995 i 61/097,787; Objavljene PCT međunarodne prijave; WO 2009/067647; WO 2011/017521; WO 2010/036698 WO 1999/014226; WO 2004/106356; WO 2005/021570; WO 2007/134181; WO 2008/150729; WO 2008/154401; i WO 2009/006478. Svaki od gore navedenih bicikličnih nukelozida mogu biti pripremljeni sa šećerima koji imaju jednu ili više sterohemijskih konfiguracija uključujući na primer α-L-ribofuranozu i β-D-ribofuranozu (videti PCT međunarodnu prijavu PCT/DK98/00393, objavljenu marta 25, 1999 kao WO 99/14226).
[0285] U izvesnim izvođenjima, biciklični šećerni delovi BNA nukleozida uključuju ali bez ograničenja, jedinjenja koja imaju bar jedan most između položaja 4’ i 2’ pentofuranozil šećera gde takvi mostovi nezavisno sadrže 1 ili od 2 do 4 vezane grupe nezavisno izabrane između -[C(Ra)(Rb)]n-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=O)-, -C(=NRa)-, -C(=S)-, -O-, -Si(Ra)2-, -S(=O)x-, i -N(Ra)-;
gde:
x je 0, 1, ili 2;
n je 1, 2, 3, ili 4;
svaki Rai Rbje, nezavisno, H, zaštitna grupa, hidroksil, C1-C12alkil, supstituisani C1-C12alkil, C2-C12alkenil, supstituisani C2-C12alkenil, C2-C12alkinil, supstituisani C2-C12alkinil, C5-C20aril, supstituisani C5-C20aril, heterociklični radikal, supstituisani heterociklični radikal, heteroaril, supstituisani heteroaril, C5-C7aliciklični radikal, supstituisani C5-C7aliciklični radikal, halogen, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, acil (C(=O)-H), supstituisani acil, CN, sulfonil (S(=O)2-J1), ili sulfoksil (S(=O)-J1); i
svaki J1i J2je, nezavisno, H, C1-C12alkil, supstituisani C1-C12alkil, C2-C12alkenil, supstituisani C2-C12alkenil, C2-C12alkinil, supstituisani C2-C12alkinil, C5-C20aril, supstituisani C5-C20aril, acil (C(=O)-H), supstituisani acil, heterociklični radikal, supstituisani heterociklični radikal, C1-C12aminoalkil, supstituisani C1-C12aminoalkil ili zaštitna grupa.
[0286] U izvesnim izvođenjima, most bicikličnog šećernog dela je -[C(Ra)(Rb)]n-, -[C(Ra)(Rb)]n-O-, -C(RaRb)-N(R)-O- ili -C(RaRb)-O-N(R)-. U izvesnim izvođenjima, most je 4’-CH2-2’, 4’-(CH2)2-2’, 4’-(CH2)3-2’, 4’-CH2-O-2’, 4’-(CH2)2-O-2’, 4’-CH2-O-N(R)-2’ i 4’-CH2-N(R)-O-2’- gde svaki R je, nezavisno, H, zaštitna grupa ili C1-C12alkil.
[0287] U izvesnim izvođenjima, biciklični nukleozidi su dalje definisani sa izomernom konfiguracijom. Na primer, nukleozid sadrži 4’-2’ metilen-oksi most, može biti u α -L konfiguraciji
4
ili u β-D konfiguraciji. Ranije, α-L-metilenoksi BNA’s je ugrađen u antisens oligonukleotidr koji pokazuju antisens aktivnost (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372).
[0288] U izvesnim izvođenjima, biciklični nukleozidi uključuju, ali bez ograničenja, (A) α-L-metilenoksi (4’-CH2-O- 2’) BNA, (B) β-D-metilenoksi (4’-CH2-O-2’) BNA, (C) etilenoksi (4’-(CH2)2-O-2’) BNA , (D) aminooksi (4’-CH2-O-N(R)-2’) BNA, (E) oksiamino (4’-CH2-N(R)-O-2’) BNA, i (F) metil(metilenoksi) (4’-CH(CH3)-O-2’) BNA, (G) metilen-tio (4’-CH2-S-2’) BNA, (H) metilen-amino (4’-CH2-N(R)-2’) BNA, (I) metil karbociklik (4’-CH2-CH(CH3)-2’) BNA, (J) propilen karbociklik (4’-(CH2)3-2’) BNA i (K) vinil BNA kao što je dole prikazano:
gde Bx je bazni deo i R je nezavisno H, zaštitna grupa, C1-C12alkil ili C1-C12alkoksi.
[0289] U izvesnim izvođenjima, obezbeđeni su biciklični nukleozidi koji imaju formulu I:
gde:
Bx je heterociklični bazni deo;
-Qa-Qb-Qc- je -CH2-N(Rc)-CH2-, -C(=O)-N(Rc)-CH2-, -CH2-O-N(Rc)-, -CH2-N(Rc)-O- ili -N(Rc)-O-CH2;
Rcje C1-C12alkil ili amino zaštitna grupa; i
Tai Tbsu svaki, nezavisno H, hidroksilna zaštitna grupa, konjugovana grupa, reaktivna fosforna grupa, fosforni deo ili kovalentna veza za medijum nosača.
[0290] U izvesnim izvođenjima, obezbeđeni su biciklični nukleozidi koji imaju formulu II:
gde:
Bx je heterociklični bazni deo;
Tai Tbsu svaki, nezavisno H, hidroksil zaštitna grupa, konjugovana grupa, reaktivna fosforna grupa,
fosforni deo ili kovalentna veza za medijumnosača;
Zaje C1-C6alkil, C2-C6alkenil, C2-C6alkinil, supstituisani C1-C6alkil, supstituisani C2-C6alkenil, supstituisani C2-C6alkinil, acil, supstituisani acil, supstituisani amide, tiol ili supstituisani tio.
[0291] U jednom izvođenju, svaka od supstituisanih grupa je, nezavisno, mono ili poli supstituisana sa supstitucionim grupama nezavisno izabranim od halogena, okso, hidroksil, OJc, NJcJd, SJc, N3, OC(=X)Jc, i NJeC(=X)NJcJd, gde svaki Jc, Jdi Jeje, nezavisno, H, C1-C6alkil, ili supstituisani C1-C6alkil i X je O ili NJc.
[0292] U izvesnim izvođenjima, obezbeđeni su biciklični nukleozidi koji imaju formulu III:
gde:
Bx je heterociklični bazni deo;
Tai Tbsu svaki, nezavisno H, hidroksilna zaštitna grupa, konjugovana grupa, reaktivna fosforna grupa,
fosforni deo ili kovalentna veza za medijum nosača;
Zbje C1-C6alkil, C2-C6alkenil, C2-C6alkinil, supstituisani C1-C6alkil, supstituisani C2-C6alkenil, supstituisani C2-C6alkinil ili supstituisani acil (C(=O)-).
[0293]U izvesnim izvođenjima, obezbeđeni su biciklični nukleozidi formule IV:
1
gde:
Bx je heterociklični bazni deo;
Tai Tbsu svaki, nezavisno H, hidroksilna zaštitna grupa, konjugovana grupa, reaktivna fosforna grupa, fosforni deo ili kovalentna veza za medijum nosača;
Rdje C1-C6alkil, supstituisani C1-C6alkil, C2-C6alkenil, supstituisani C2-C6alkenil, C2-C6alkinil ili supstituisani C2-C6alkinil;
svaki qa, qb, qci qdje, nezavisno, H, halogen, C1-C6alkil, supstituisani C1-C6alkil, C2-C6alkenil, supstituisani C2-C6alkenil, C2-C6alkinil ili supstituisani C2-C6alkinil, C1-C6alkoksil, supstituisani C1-C6alkoksil, acil, supstituisani acil, C1-C6aminoalkil ili supstituisani C1-C6aminoalkil;
[0294] U izvesnim izvođenjima, obezbeđeni su biciklični nukleozidi formule V:
gde:
Bx je heterociklični bazni deo;
Tai Tbsu zajedno, nezavisno H, hidroksilna zaštitna grupa, konjugovana grupa, reaktivna fosforna grupa,fosforni deo ili kovalentna veza za medijum nosača;
qa, qb, qei qfsu svaki, nezavisno, vodonik, halogen, C1-C12alkil, supstituisani C1-C12alkil, C2-C12alkenil, supstituisani C2-C12alkenil, C2-C12alkinil, supstituisani C2-C12alkinil, C1-C12alkoksi, supstituisani C1-C12alkoksi, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJkili N(H)C(=S)NJjJk; ili qei qfzajedno su =C(qg)(qh);
qgi qha svaki, nezavisno, H, halogen, C1-C12alkil ili supstituisani C1-C12alkil.
[0295] Sinteza i dobijanje metilenoksi (4’-CH2-O-2’) BNA monomera adenina, citozina, gvanina, 5-metil-citozina, timidina i uracila, zajedno sa njihovom oligomerizacijom, i osobinama prepoznavanja nukleinske kiseline su opisani (Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). BNAs i njihovo dobijanje je takođe opisano u WO 98/39352 i WO 99/14226.
[0296] Analozi metilenoksi (4’-CH2-O-2’) BNA i 2’-tio-BNAs, su takođe pripremljeni (Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). Dobijanje zaključanih nukleozidnih analoga obuhvata oligodezoksiribonukleotidne duplekse kao supstrate za polimeraze nukleinskih kiselina su takođe
2
opisani (Wengel et al., WO 99/14226). Pored toga, sinteza 2’-amino-BNA, novog konformaciono ograničeng analoga oligonukleotida visokog afiniteta je opisana u stanju tehnike (Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). Pored toga, 2’-amino- i 2’-metilamino-BNA su pripremljeni i termalna stabinost njihovih dupleksa sa komplementarnim lancima RNK i DNK je ranije zabaležena.
[0297] U izvesnim izvođenjima, obezbeđeni su biciklični nukleozidi koji imaju formulu VI:
gde:
Bx je heterociklični bazni deo;
Tai Tbsu svaki, nezavisno H, hidroksilna zaštitna grupa, konjugovana grupa, reaktivna fosforna grupa, fosforni deo ili kovalentna veza za medijum nosača;
svaki qi, qj, qki qlje, nezavisno, H, halogen, C1-C12alkil, supstituisani C1-C12alkil, C2-C12alkenil, supstituisani C2-C12alkenil, C2-C12alkinil, supstituisani C2-C12alkinil, C1-C12alkoksil, supstituisani C1-C12alkoksil, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJkili N(H)C(=S)NJjJk; i qii qjili qli qkzajendo su =C(qg)(qh), gde qgi qhsu svaki, nezavisno, H, halogen, C1-C12alkil ili supstituisani<C>1<-C>12alkil<.>
[0298] Opisani su jedan karbociklični biciklični nukleozid koji ima 4’-(CH2)3-2’ most i alkenil analog mosta 4’-CH=CH-CH2- 2’ (Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443 i Albaek et al., J. Org. Chem.,2006, 71, 7731-7740). Sinteza i dobijanje karbicikličnog bicikličnog nukleozida zajdno sa njihovom oligomerizacijom i biohemijskim ispitivanje je takođe opisano (Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007,129(26), 8362-8379).
[0299] Kako je ovde korišćeno, "4’-2’ biciklični nukleozid" ili "4’ do 2’ biciklični nukleozid" odnosi se na biciklični nukleozid koji sadrži furanozni prsten koji povezuje 2’ ugljenikvoa atoma i 4’ ugljenikov atom šećernog prstena.
[0300] Kako je ovde korišćeno, "monociklični nukleozidi" se odnosi na nukleozide koji sadrže modifikovane šećerne delove koji nisu biciklični šećerni delovi. U izvesnim izvođenjima, šećerni deo, ili analog šćernog dela, nukleozida može biti modifikovan ili supstituisan u bilo kom položaju.
[0301] Kako je ovde korišćeno, "2’-modifikovani šećer" označava modifikovani furanozil šećer u položaju 2’. U izvesnim izvođenjima, takve modifikacije uključuju supstutente izabrane između: halogenida, uključujući, ali bez ograničenja supstituisani i nesupstituisani alkoksi, supstituisani i nesupstituisani tioalkil, supstituisani i nesupstituisani amino alkil, supstituisani i nesupstituisani alkil, supstituisani i nesupstituisani alil, i supstituisani i nesupstituisani alkinil. U izvesnim izvođenjima, 2’ modifikacije su izabrane između supstiuenata koji uključuju ali bez ograničenja: O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nF, O(CH2)nONH2, OCH2C(=O)N(H)CH3, i O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2, gde n i m su od 1 do oko 10. Ostale 2’-supstitucione grupe mogu takođe biti izabrane između: C1-C12alkil, supstituisani alkil, alkenil, alkinil, alkaril, aralkil, O-alkaril ili O-aralkil, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, F, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocikloalkil, heterocikloalkaril, aminoalkilamino, polialkilamino, supstituisani silil, RNK cepajuće grupe, reporterske grupe, interkalatora, grupa za poboljšanje farmakokinetičkih osobina, ili grupa za poljšanje farmakodinamičkih osobina antisens jedinjenja, i drugi supstituenti koji imaju slične osobine. U izvesnim izvođenjima, modifikovani nukleozidi sadrže 2’-MOE bočni lanac (Baker et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 11944-12000). Takve 2’-MOE supstitucije je opisano da imaju poboljšane osobine vezivanja za nemodifikovane nukleozide i za ostale modifikovane nukleozide, kao što su 2’- O-metil, O-propil, i O-aminopropil. Oligonukleotidi koji imaju 2’-MOE supstituent je takođe pokazano da su antisens inhibitori ekspresije gena sa obećavajućim karakteristikama za in vivo upotrebu (Martin, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann et al., Biochem. Soc. Trans.,<25>1996, 24, 630-637; i Altmann et al., Nukleozids Nukleotids, 1997, 16, 917-926).
[0302] Kako je ovde korišćeno, "modifikovani tetrahidropiranski nukleozid" ili "modifikovani THP nukleozid" označava nukleozid koji ima šest članova tetrahidropirana "šećera" supstituisanih sa pentofuranozilnim ostatakom u normalnim nukleozidima (šećerni surogat). Modifikovani THP nukleozidi obuhvataju, ali bez ograničenja, na šta se pozvaju u stanju tehnike kao na heksitolnu nukleinsku kiselinu (HNA), anitol nukleinsku kiselinu (ANA), manitol nukleinsku kiselinu (MNA) (videti Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854) ili fluoro HNA (F-HNA) koji ima tetrahidropiranski sitem prstena kao što je dole prikazano:
[0303] U izvesnim izvođenjima, šećerni surogati su izabrani iz Formule VII:
gde nezavisno za svaki od pomenutog bar jednog tetrahidropiranskog nukleozidnog analoga Formule VII:
Bx je heterociklični bazni deo;
Tai Tbsu svaki, nezavisno, internukleozidna vezujuća grupa koja vezuje tetrahidropiranski nukleozidni analog za antisens jedinjenje ili jedan od Tai Tbje internukleozidna vezujuća grupa koja vezuje tetrahidropiranski nukleozidni analog za antisens jedinjenje i druge Tai Tbje H, hidroksilna zaštitna grupa, vezana konjugovana grupa ili 5’ ili 3’-terminalna grupa; q1, q2, q3, q4, q5, q6i q7su svaki nezavisno, H, C1-C6alkil, supstituisani C1-C6alkil, C2-C6
4
alkenil, supstituisani C2-C6alkenil, C2-C6alkinil ili supstituisani C2-C6alkinil; i svaki od R1i R2je izabran između vodonika, hidroksila, halogena, supstituisanog ili nesupstituisanog alkoksi, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2i CN, gde X je O, S ili NJ1i svaki J1, J2i J3je, nezavisno, H ili C1-C6alkil.
[0304] U izvesnim izvođenjima, modifikovani THP nukleozidi formule VII su obezbeđen gde iq1, q2, q3, q4, q5, q6i q7su svaki H. U izvesnim izvođenjima, bar jedan od q1, q2, q3, q4, q5, q6i q7je drugačiji od H. U izvesnim izvođenjima, bar jedan od q1, q2, q3, q4, q5, q6i q7je metil. U izvesnim izvođenjima, THP nukleozidi formula VII su obezbeđeni gde jedan od R1i R2je fluoro. U izvesnim izvođenjima, R1je fluoro i R2je H; R1je metoksi i R2je H, i R1je metoksietoksi i R2je H.
[0305] U izvesnim izvođenjima, šećerni surogati sadrže prstenove koji imaju više od 5 atoma i više od jednog heteroatoma. Na primer nukleozidi sadrže morfolino šećerne delove i njihova upotreba u oligomernm jedinjenjima je zabeležena (videti na primer: Braasch et al., BioHemija, 2002, 41, 4503-4510; i U.S. Patenti 5,698,685; 5,166,315; 5,185,444; i 5,034,506). Kako je ovde korišćeno, izraz "morfolino" označava šećerni surogat koji ima sledeću formulu :
U izvesnim izvođenjima, morfolino može biti modifikovani, na primer dodavanjem ili menjanjem različitih suptitucionih grupa iz gornje morfolino strukture. Takvi šećerni surogati se nazivaju ovde kao "modifikovani morfolinosi."
[0306] Kombinacije modifikacija su takođe obezbeđene bez ograničenja, kao što su 2’-F-5’-metil supstituisani nukleozidi (videti PCT međunarodnu prijavu WO 2008/101157 objavljenu 8/21/08 za druge opisane 5’, 2’-bis supstituisane nukleozide) i zamenu kiseonikovog atoma u ribozil prstenu sa S i dalju susptituciju u položaju 2’- (videti objavljenu U.S. Patent prijavu US2005-0130923, objavljenu juna 16, 2005) ili alternativno 5’-supstituciju biciklične nukleinska kiseline (videti PCT međunarodnu prijavu WO 2007/134181, objavljenu 11/22/07 gde 4’-CH2-O- 2’ biciklični nukleozid je dalje supstituisani u položaju 5’ sa 5’-metil ili 5’-vinil grupom). Sinteza i priprema karboksilnih bicikličnih nukleozida zajedno sa njihovom oligomerizaccijom i biohemijskim ispitivanjem je takođe opisana (videti, npr., Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc. 2007, 129(26), 8362-8379).
[0307] U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenja sadrže jedan ili više modifikovanih cikloheksenil nukleozida, pri čemu je nukleozid koji ima šestočlani ciklohekenil umesto pentofuranozilnog ostatka u nukleozidima koji se javljaju u prirodi. Modifikovani cikloheksenil nukleozidi uključuju, ali nisu ograničeni na one opisane u stanju tehnike (videti na primer obično vlasništvo, objavljene PCT prijave WO 2010/036696, objavljene aprila 10, 2010, Robeyns et al., J. Am. Chem. Soc., 2008, 130(6), 1979-1984; Horváth et al., Tetrahedron Letters, 2007, 48, 3621-3623; Nauwelaerts et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(30), 9340-9348; Gu et al.,, Nukleozids, Nukleotids & Nucleic Acids, 2005, 24(5-7), 993-998; Nauwelaerts et al., Nucleic Acids Research, 2005, 33(8), 2452-2463; Robeyns et al., Acta Crystallographica, Section F: Structural Biology and Crystallization Communications, 2005, F61(6), 585-586; Gu et al., Tetrahedron, 2004, 60(9), 2111-2123; Gu et al., Oligonukleotids, 2003, 13(6), 479-489; Wang et al., J. Org. Chem., 2003, 68, 4499-4505; Verbeure et al., Nucleic Acids Research, 2001, 29(24), 4941-4947; Wang et al., J. Org. Chem., 2001, 66, 8478-82; Wang et al., Nukleozids, Nukleotids & Nucleic Acids, 2001, 20(4-7), 785-788; Wang et al., J. Am. Chem., 2000, 122, 8595-8602; objavljene PCT prijave, WO 06/047842; i obajvljene PCT prijave WO 01/049687). Izvesni modifikovani cikloheksenil nukleozidi imaju Formulu X.
gde nezavisno za svaki od pomenutih bar jednog cikloheksenil nukleozidnog analoga formule X:
Bx je heterociklični bazni deo;
T3i T4su svaki, nezavisno, internukleozidna vezujuća grupa koja vezuje cikloheksenilni nukleozidni analog za antisens jedinjenje ili jedan od T3i T4je internukleozidna vezujuća grupa koja vezuje tetrahidropiranski nukleozidni analog sa antisens jedinjenjem i drugi T3i T4je H, hidroksilna zaštitna grupa, vezana konjugovana grupa, ili 5’-ili 3’-terminalna grupa; i
q1, q2, q3, q4, q5, q6, q7, q8i q9su svaki, nezavisno, H, C1-C6alkil, supstituisani C1-C6alkil, C2-C6alkenil, supstituisani C2-C6alkenil, C2-C6alkinil, supstituisani C2-C6alkinil supstituentna grupa šećera.
[0308] Kako je ovde korišćeno, "2’-modifikovani" ili "2’-supstituisani" odnosi se na nukleozid koji sadrži šećer koji sadrži supstituenat u položaju 2’ koji je drugačiji od H ili OH. 2’-modifikovani nukleozidi, uključuju, ali bez ograničenja, biciklične nukleozide gde most koji povezuje dva ugljenikova atoma prstena šećera povezuje 2’ ugljenik i drugi ugljenik šećernog prstena; i nukleozide sa nepremošćenim 2’supstituentima, kao što su alil, amino, azido, tio, O-alil, O-C1-C10alkil,-OCF3, O-(CH2)2-O-CH3, 2’-O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), ili O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), gde svaki Rmi Rnje, nezavisno, H ili supstituisani ili nesupstituisani C1-C10alkil.2’-modifikovani nukleozidi mogu dalje sadržati druge modifikvacije, na primer u drugim položajima šećera i/ili u nukleobaze.
[0309] Kako je ovde korišćeno, "2’-F" odnosi se na nukleozid koji sadrži šećer koji sadrži fluoro grupu u položaju 2’ prstena šećera.
[0310] Kako je ovde korišćeno, "2’-OMe" ili "2’-OCH3" ili "2’-O-metil" svako se odnosi na nukleozid koji sadrži šećer koji sadrži -OCH3grupu u položaju 2’ šećernog prstena.
[0311] Kako je ovde korišćeno, "MOE" ili "2’-MOE" ili "2’-OCH2CH2OCH3" ili "2’-O-metoksietil" svaki odnosi se na nukleozid koji sadrži šećer koji sadrži -OCH2CH2OCH3grupu u položaju 2’ šećernog prstena.
[0312] Kako je ovde korišćeno, "oligonukleotid" odnosi se na jedinjenje koje sadrži mnoštvo vezanih nukleozida. U izvesnim izvođenjima, jedan ili više nukleotida je modifikovano. U izvesnim izvođenjima, oligonukleotid sadrži jedan ili više ribonukleozida (RNK) i/ili dezoksiribonukleozida (DNK).
[0313] Mnogo drugih biciklo i triciklo prstenastih sistemi šećernih surogata takođe poznati u stanju tehnike može biti korišćeno da se modifikuju nukleozidi za ugrađivanje u antisens jedinjenja (videti na primer revijalni članak: Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854). Takvi sistemi prstena mogu podleći različitim dodatnim supstitucijama da bi se pospešila aktivnost.
[0314] Postupci za pripremanje modifikovanih šećera su dobro poznati osobama iz struke. Neki reprezentativni U.S. patenti koji opisuju dobijanje takvih modifikovanih šećera uključuju ali bez ograničenja, U.S.: 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,670,633; 5,700,920; 5,792,847 i 6,600,032 i međunarodnu prijavu PCT/US2005/019219, podnetu juna 2, 2005 i obajavljenu kao WO 2005/121371 decembra 22, 2005.
[0315] U nukleotidima koji imaju modifikovane šećerne delove, nukleobazni delovi (prirodni, modifikovani ili njihova kombinacija) su održavani za hidrodizaciju sa odgovarajućom ciljnom nukleinskom kiselinom.
[0316] U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenja sadrže jedan ili više nukleotida koji imaju modifikovane šećerne delove. U izvesnim izvođenjima, modifikovani šećerni deo je 2’-MOE. U izvesnim izvođenjima, 2’-MOE modifikovani nukleozidi su raspoređeni u motiv gapmera. U izvesnim izvođenjima, modifikovani šećerni motiv je biciklični nukleozid koji ima (4’-CH(CH3)-O-2’) premšćavajuću grupu. U izvesnim izvođenjima, (4’-CH(CH3)-O-2’) modifikovani nukleozidi su raspoređeni preko "krila" motiva gapmera.
Modifikovane nukleobaze
[0317] Modifikacija nukleobaza (ili baze) ili supstitucija su strukturno različite od, funkcionalno zamenjive sa, nemodifikovanim nukleobazama koje se javljaju u prirodi ili sintetičkim. Obe prirodne ili modifikovane nukleobaze su u stanju da učestvuju u vodoničnom vezivanju. Takve modifikacije nukleobaza mogu doprineti nukleaznoj stabilnosti, afinitetu vezivanja ili nekim drugim korisnim biološkim osobinama antisens jedinjenja. Modifikovane nukleobaze uključuju sintetičke i prirodne nukleobaze kao što su, na primer, 5-metilcitozin (5-me-C). Izvesne nukleobazne supstitucije, uključujući 5-metilcitozin supstitucije, naročito su korisne za povećanje afiniteta vezivanja antisens jedinjenja za ciljnu nukleinsku kiselinu. Na primer, 5-metilcitozin supstitucije je pokazano da povećavaju stabilnost dupleksa nukleinske kiseline za 0.6-1.2°C (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp.276-278).
[0318] Dodatne modifikovane nukleobazee uključuju 5-hidroksimetil citozin, ksantin, hipoksantin, 2-aminoadenin, 6-metil i ostale alkil derivate adenina i gvanina, 2-propil i ostale alkil derivate adenina i gvanina, 2-tiouracil, 2-tiotimidin i 2-tiocitozin, 5-halouracil i citozin, 5-propinil (-C ≡C-CH3) uracil i citozin i drugi alkinil derivativi pirimidinskih baza, 6-azo uracil, citozin i timidin, 5-uracil (pseudouracil), 4-tiouracil, 8- halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalkil, 8-hidroksil i drugi 8-supstituisani adenini i gvanini, 5-halo naročito 5-bromo, 5-trifluorometil i ostali 5-supstituisani uracili i citozini, 7-metilgvanin i 7-metiladenin, 2-F-adenin, 2- amino-adenin, 8-azagvanin i 8-azaadenin, 7-deazagvanin i 7-deazaadenin i 3-deazagvanin i 3-deazaadenin.
[0319] Heterociklični bazni delovi mogu takođe uključivati one u kojima purinska ili pirimidinska baza je zamenjena sa drugim heterociklima, na primer 7-deaza-adenin, 7-deazagvanozin, 2-aminopiridin i 2-piridon. Nukleobaze koje su naročito korisne za povećavanje afiniteta vezivanja antisens jedinjenja uključuju 5-supstituisane pirimidine, 6-aza-pirimidine i N-2, N-6 i 0-6 supstituisane purine, uključujući 2 aminopropiladenin, 5-propiniluracil i 5-propinilcitozin.
[0320] U izvesnim izvođenjima, antisens jedinjenja ciljaju CFB nukleinsku kiselinu koja sadrži jednu ili više modifikovanih nukleobaza. U izvesnim izvođenjima, skraćeni ili antisens oligonukleotidi sa proširenim razmakom koji ciljaju CFB nukleinsku kiselinu sadrže jedan ili više modifikovanih nukleobaza. U izvesnim izvođenjima, modifikovane nukleobaza je 5-metilcitozin. U izvesnim izvođenjima, svaki citozin je 5-metilcitozin.
Konjugovana antisens jedinjenja
[0321] U izvesnim izvođenjima, prikazani opis obezbeđuje konjugovana antisens jedinjenja. U izvesnim izvođenjima, prikazani opis obezbeđuje konjugovana antisens jedinjenja koja sadrže antisens oligonukleotid komplemantaran sa transkriptom nukleinske kiseline. U izvesnim izvođenjima, prikazani opis obezbeđuje postupke koji obuhvataju dovođenje u kontakt ćelije sa konjugovanim antisens jedinjenjem koje se sastoji od antisens oligonukleotida komplementarnog sa transkriptom nukleinske kiseline. U izvesnim izvođenjima, prikazani opis obezbeđuje postupke koji obuhvataju dovođenje ćelije u kontakt sa konjugovanim antisens jedinjenjem koje sadrži antisens oligonukleotid i smanjenjem količine ili aktivnosti transkripta nukleinske kiseline u ćeliji.
[0322] Asialoglikoproteinski receptor (ASGP-R) je ranije opisan. Videti npr., Park et al., PNAS vol.
102, No. 47, pp 17125-17129 (2005). Takvi receptori su eksprimovani u ćelijama jetre, posebno hepatocitama. Dalje, pokazano je da jedinjenja koja sadrže klastere tri N-acetilgalaktozaminskih (GalNAc) liganada su u stanju da se vežu za ASGP-R, što dovodi do preuzimanja jedinjenja u ćeliju. Videti npr., Khorev et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry, 16, 9, pp 5216-5231 (May 2008). Prema tome, konjugati koji sadrže takve GalNAc klastere su bili korišćeni za olakšavanje preuzinmanja izvesnih jedinjenja u ćelije jetre, naročito hepatocite. Na primer pokazano je da izvesni konjugati koji sadrže GalNAc-povećavaju aktivnost dupleksa siRNK jedinjenja u ćelijama jetre in vivo. U takvim slučajevima, konjugat koji sadrži GalNAc je tipično vezan –za sens lanac siRNK dupleksa. S obzirom da je sens lanac odbačen pre nego što antisens lanac konačno hibridizuje sa ciljnom nukleinskom kiselinom, postoji malo zabrinutosti da će konjugat ometati takvu aktivnost. Tipično, konjugat je vezan za 3’ kraj sense lanca siRNK. Videti npr., U.S. Patent 8,106,022. Izvesne konjugatne grupe koje su ovde opisane su aktivnije i/ili lakše da se sintetizuju od ranije opisanih konjugovanih grupa.
[0323] U izvesnim izvođenjima prema prikazanom pronalasku, konjugati su vezani za jednolačna antisens jedinjenja, uključujući ali bez ograničenja antisens jedinjenja na bazi RNaze H i antisens jedinjenja koja menjaju obradu pre-iRNK ciljne nukleinske kiseline. U takvim izođenjim, konjugat treba da ostave vezan za antisens jedinjenje dovoljno dugo da obezbedi korist (poboljšano preuzimanje u ćelije ) ali zatim treba da ili bude otcepljen ili na drugi način onemogućen da ometa naknadnim koracima neophodnim za aktivnost, kao što je hibridizacija sa ciljnom nukleinskom kiselinom i interakcija sa RNazom H ili enzimima u vezi sa obradom ili modulacijom obrade. Ova ravnoteža osobina je važnija u podešavanju jednolančanih antisens jedinjenja nego u siRNK jedinjenjima, gde konjugat može jednostavno biti vezan za sens lanac. Ovde su opisana konjugovana jednolančana antisens jedinjenja koja imaju poboljšano dejstvo u ćelijama jetre in vivo u poređenju sa istim antisens jedinjenjem kojem nedostaje konjugat. Iznenađujuća je da potrebna ravnotežu osobina za ova jedinjenja tako pojačava njihovo dejstvo.
[0324] U izvesnim izvođenjima, konjugovana grupa ovde sadrži deo koji se cepa. Kako je napomenuto, bez namere da se ograniči mehanizam, logično je da konjugat treba da ostane na jedinjenju dovoljno dugo da obezbedi poboljšanje preuzimanja, ali posle toga, poželjno je neke delove ili, idealno, da svi konjugati budi otcepljeni, oslobađajući osnovno jedinjenje (npr., antisens jedinjenje) u najaktivnijem obliku. U izvesnim izvođenjima, deo koji se cepa je nukleozid koji se cepa. Takva izvođenja koriste prednost endogenih nukleaza u ćeliji vezivanjem ostatka konjugata (klastera) za antisens oligonukleotid kroz nukleozid preko jedne ili više veza koje se cepaju, kao što su one fosfodiestarske veze. U izvesnim izvođenjima, klaster je vezan za nukleozid koji se cepa preko fosfodiestarske veze. U izvesnim izvođenjima, nukleozid koji se cepa je vezan za antisens oligonukleotid (antisens jedinjenje) fosfodiestarskom vezom. U izvesnim izvođenjima, konjugovana grupa može da sadrži sva ili tri nuklozida koji se cepaju. U takvim izvođenjima, takvi nukleozidi koji se cepaju su povezani jedan sa drugim, za antisens jedinjenje i/ili za klaster preko veza koje se cepaju (kao što je fosfodiestarska veza). Izvesni konjugati ovde ne sadrže nukleozid koji se cepa i umesto toga sadrže vezu koja se cepa. Prikazano je da dovoljno cepanje konjugata iz oligonukleotisa je obezbeđeno sa bar jednom vezom koja je osetljiva na cepanje u ćeliji (veza koja se cepa).
[0325] U izvesnim izvođenjima, konjugovana antisens jedinjenja su prolekovi. Takvi prolekovi su davani životinjama i na kraju su metabolizovani u aktivnij oblik . Na primer, konjugovana antisens jedinjenja se cepaju da se uklone svi ili deo konjugata koji dovodi do aktivnog (ili aktivnijeg) oblika antisens jedinjenja kome nedostaju svi ili neki konjugati.
[0326] U izvesnim izvođenjima, konjugati su vezani na 5’ kraj oligonukleotida. Izvesni takvi 5’-konjugati se cepaju efikasnije od suprotnih delova koji imaju sličnu konjugovanu grupu vezanu za 3’ kraj. U izvesnim izvođenjima, poboljšana aktivnost može biti u korelaciji sa poboljšanim cepanjem. U izvesnim izvođenjima, oligonukleotidi sadrže konjugat na 5’ kraju imaju veću efikasnost od oligonukleotida koji sadrže konjugat u 3’ kraju (videti, na primer, Primere 56, 81, 83, i 84). Dalje, 5’-vezani omogućavaju lakšu oligonukleotidnu sintezu. Tipično, oligonukleotidi su sinteizovani na čvrstom nosaču u smeru 3’ do 5’ . Da bi se dobio 3’-konjugovani oligonukleotid, tipično se vezuje pre -konjugovani 3’ nukleozid za čvrsti nosač i zatim gradi oligonukleotid kao obično. Međutim, vezivanje tog konjugovanog nukleozida za čvrsti nosač dodaje komplikacije u sintezu. Pored toga, korišćenjem tog prilaza, konjugat je zatim prisutan u toku cele sinteze oligonukleotida i može biti degradiran u toku naknadnih koraka ili može ograničiti vrste reakcije i reganesa koje se mogu koristiti. Korišćenjem struktura tehnika ovde opisanih za 5’-konjugovane oligonukleotide, neko može sintetizovati oligonukleotid pomoću standardnih automatizovanih tehnika i uvesti konjugat u krajnji (većinom 5’) nukleozid ili pošto je oligonukleotid ocepljen sa čvrstog nosača.
[0327] U odnosu na stanje tehnike i prikazani opis, osoba iz struke može lako napraviti bilo koji od ovih konjugata i konjugovanih oligonukleotida. Pore toga, sinteza izvesnih takvih konjugata i konjugovanih ovde opisanih oligonukleotida je lakša i/ili zahteva nekoliko koraka, i prema tome je manje skupa nego ona ranije opisanih konjugata, dajući prednosti pri proizvodnji . Na primer, sinteza izvesne konjugovane grupe se sastoji od nekoliko sintetičkih koraka, koje dovode do porasta prinosa, u odnosu na ranije opisanu konjugovanu grupu. Konjugovana grupa kao što je GalNAc3-10 u primeru 46 i GalNAc3-7 U primeru 48 su mnogo jednostavnije nego prethodno opisani konjugati kao što su oni u U.S. 8,106,022 ili U.S. 7,262,177 koji zahtevaju sklapanje više hemijskih intermedijera. Prema tome, ovi i ostali konjugati ovde opisani imaju prednosti u odnosu na ranije opisana jedinjenja za upotrebu sa bilo kojim oligonukleotidom, uključujući jednolančane oligonukleotide i jednolančane ili višelančane oligonukleotide (npr., siRNK).
[0328] Slično, ovde su opisana konjugovane grupe koje imaju samo jedan ili više GalNAc liganada. Kao što je prikazano, takve konjugovane grupe poboljšavaju aktivnost antisens jedinjenja. Takva jedinjenja su mnogo lakša za pripremanje konjugata koji sadrže tri GalNAc liganda. Konjugovane grupe sadrže jedan ili dva GalNAc liganada koji mogu biti vezana za bilo koje antisens jedinjenje, uključujući jednolančane oligonukleotide i lanac dvolačanih oligonukleotida (npr., siRNK).
[0329] U izvesnim izvođenjima, konjugati ovde suštinski ne menjaju izvesne mere tolerabilnosti. Na primer, pokazano je da konjugovana antisens jedinjenja nisu više imunogena u odnosu na nekonjugovana osnovna jeidnjenja. S obzirom da je dejstvo potvrđeno, izvođenja u kojima ostaje tolerabilnost ista (ili zaista ista čak ukoliko je tolerabilnost pogoršana samo malo u odnosu na dobitke u desjtvu) ima poboljšane osobine za terapiju.
[0330] U izvesnim izvođenjima, konjugovanje dozvoljava da se menjaju antisens jedinjenja na način koji ima manje atraktivne posledice nego nepostojanje konjugata. Na primer, u izvesnim izvođenjima, zamena jedne ili više fosforotioatnih veza potpunog fosforotioatnog antisens jedinjenja sa fosfodiestarskim vezama dovodi do poboljšanja u nekim merama tolerabilnosti. Na primer, u izvesnim slučajevima, takva antisens jedinjenja imaju jedan ili više fosfodiestara koja imaju jedan ili više fosfodiestara su manje imunogena nego ista jedinjenja u kojima je svaka veza fosforotioat. Međutim, u izvesnim slučajevima, kao što je prikazano primeru 26, da ista zamena jedne ili više fosforotioatnih veza sa fosfodiestarskim vezama takođe dovodi do smanjenja ćelijskog preuzimanja i/ili gubitka dejstva. U izvesnim izvođenjima, konjugovana antisens jedinjenja ovde opisana tolerišu takvu promenu u vezama sa malim ili bez gubitka u preuzimanju i dejstvu kada se porede sa konjugovanim potpuno fosforotioatnim delovaima. U stvari, u izvesnim izvođenjima, na primer, u primerima 44, 57, 59, i 86, oligonukleotidi sadrže konjugat i bar jednu fosfodiestarsku internukleozidnu veza koja u stvari pokazuje povećano dejstvo in vivo čak relativno u odnosu na potpuni fosforotioatni suprotni deo koji takođe sadrži isti konjugat. Pored toga, s obzirom da konjugacija dovodi do suštinskog porasta u preuzimanju/dejstvu mali gubitak u suštinskoj koristi može biti prihvatljiv da bi se postigla pobošana tolerabilnost. Prema tome, u izvesnim izvođenjima, konjugovana antisens jedinjenja sadrže bar jednu fosfodiestarsku vezu.
[0331] U izvesnim izvođenjima, konjugovanja antisens jedinjenja ovde dovodi do povećanog davanja, preuzimanja i aktivnosti u hepatocitama. Prema tome, više jedinjenja je davano u tkivo jetre. Međutim, u izvesnim izvođenjima, koja povećavaju samo davanje ne objašnjavaju celokupno povećanje aktivnosti. U izvesnim takvim izvođenjima, više jedinjenja ulazi u hematocite. U izvesnim izvođenjima, čak povećani unos u hepatocite ne objšnjava celokupni porast u aktivnosti. U takvim izvođenjima, povećano je produktivno preuzimanje konjugovanog jedinjenja. Na primer, kao što je prikazano na primeru 102, izvesna izvođenja konjugata koji sadrže GalNAc-povećava obogaćivanje antisens oligonukleotida u hepatocitima naspram ne-parenhimalnih ćelija. Ovo obogaćivanje je prednost za oligonukleotide koji ciljaju gene koji se ekpsrimuju u hepatocitima.
[0332] U izvesnim izvođenjima, konjugovana antisens jedinjenja ovde dovode do smanjene izloženost bubrezima. Na primer, kao što je pokazano u primeru 20, koncentracije antisens oligonukleotida sadrži izvesna izvođenja konjugata koji sadrži GalNAc su niži u bubregu nego oni antisens oligonukleotidi kojima nedostaje konjugat koji sadrži GalNAc. Ovo ima nekoliko korisnih terapeutskih implikacija. Za terapeutskie indikacije gde je aktivnost u bubrezima viđena, izloženost bubrega riziku toksičnosti bubrega bez odgovarajuće koristi. Pore toga, visoka koncentracija u bugregu tipično dovodi do gubitka jedinjenja u urinu dovodeći do bržeg klirensa. Prema nebubrežnim metama, akumulaciju u bubregu nije poželjna. U izvesnim izvođenjima, obezbeđena su konjugovana antisens jedinjenja koja imaju strukturu:
Deo koji cilja ćeliju 10
i. Izvesni delovi koji se cepaju
[0333] U izvesnim izvođenjima, deo koji se cepa je veza koja se cepa. U izvesnim izvođenjima, deo koji se cepa sadrži vezu koja se cepa. U izvesnim izvođenjima, konjugovana grupa sadrži deo koji se cepa. U izvesnim takvim izvođenjima, deo koji se cepa je povezan sa antisens oligonukleotidom. U izvesnim takvim izvođenjima, deo koji se cepa vezan je direktno za deo koji cilja u ćeliju. U izvesnim takvim izvođenjima, deo koji se cepa je vezan za konjugovani vezujuću grupu. U izvesnim izvođenjima, deo koji se cepa sadrži fosfat ili fosfodiestar. U izvesnim izvođenjima, deo koji se cepa je nukleozid ili nukleozidni analog koji se cepa. U izvesnim izvođenjima, nukleozid ili nukleozidni analog sadrži opciono zaštićenu heterocikličnu bazu izabranu između purina, supstituisanog purina, pirimidina ili supstituisanog pirimidina. U izvesnim izvođenjima, deo koji se cepa je nukleozid koji sadrži opciono zaštićenu heterocikličnu bazu izabranu između uracila, timidina, citozina, 4-N-benzoilcitozina, 5-metilcitozina, 4-N-benzoil-5-metilcitozina, adenina, 6-N-benzoiladenina, gvanina i 2-N-izobutirilgvanina. U izvesnim izvođenjima, deo koji se cepa je 2’-dezoksinukleozid koji je vezan za položaj 3’ antisens oligonukleotida sa fosfodiestarskom vezom i
1
vezan je za vezujuću grupu sa fosfodiestarskom ili fosforotioatnom vezom. U izvesnim izvođenjima, deo koji se cepa je 2’-dezoksi adenozin koji je vezan za 3’ položaj antisens oligonukleotida sa fosfodiestarskom vezom i vezan je za vezujuću grupu sa fosfodiestarskom ili fosforotioatnom vezom. U izvesnim izvođenjima, deo koji se cepa je 2’-dezoksi adenozin koji je vezan za položaj 3’ antisens oligonukleotida sa fosfodiestarskom vezom i vezan za vezujuću grupu sa fosfodiestarskom vezom.
[0334] U izvesnim izvođenjima, deo koji se vepa je vezan za položaj 3’ antisens oligonukleotida. U izvesnim izvođenjima, deo koji se cepa je vezan za 5’ položaj antisens oligonukleotida. U izvesnim izvođenjima, deo koji se cepa je vezan za položaj 2’ antisens oligonukleotida. U izvesnim izvođenjima, deo koji se cepa je vezan za antisens oligonukleotid fosfodiestarskom vezom. U izvesnim izvođenjima, deo koji se seče je povezan vezujućom grupom sa ili fosfodiestarskom ili fosforotioatnom vezom. U izvesnim izvođenjima, veza koja se seče je vezana za vezujuću grupu sa fosfodiestarskom vezom. U izvesnim izvođenjima, konjugovana grupa ne uključuje deo koji se cepa.
ii. U izvesnim izvođenjima, deo koji se cepa je se cepa pošto je kompleks dat životinji samo pošto je bio dat životinji samo pošto je bio internalizovan od strane ciljne ćelije. Unutar ćelije deo koji se cepa je cepan tako što oslobađa aktivni antisens oligonukleotid. Bez namere da bude ograničen teorijom veruje se da motiv koji se cepa se cepa sa jednom ili više nukelaza u okviru ćelije. U izvesnim izvođenjima, jedna ili više nukelaza cepaju fosfodiestarsku vezu između dela koji se cepa i vezjujuće grupe.
Izvesne vezujuće grupe
[0335] Konjugovana grupa jedinjenja prema pronalasku sadrži vezujuću grupu. U izvesnim takvim izvođenjima, vezujuća grupa je kovalentno vezana za deo koji se cepa. U izvesnim takvim izvođenjima, vezujuća grupa je kovelentno vezana za antisens oligonukleotid. Vezujuća grupa je kovelentno vezana za deo koji cilja ćeliju.
[0336] Vezujuća grupa je linearna grupa koja sadrži alkilnu, amidnu i etarsku grupu. U izvesnim izvođenjima, linearna grupa je kovelentno vezana za deo koji cilja ćeliju i deo koji se cepa. U izvesnim izvođenjima, linearna grupa je kovelentno vezana za deo koji cilja ćeliju i antisens oligonukleotid.
[0337] Konjugovana vezujuća grupa jedinjenja prema pronalasku ima strukturu:
iii. Izvesni delovi koji ciljaju ćeliju
[0338] Konjugovana grupa jedinjenja prema pronalasku sadrži delove koje ciljaju ćelije. Izvesni takvi delovi koji ciljaju ćeliju povećavaju ćelijsko preuzimanje antisens jedinjenja. Delovi koji ciljaju ćeliju sadrže grupu za granjanje, tri premošćujuće grupe (engl.tethers), i tri liganda.
2
Izvesne grupe za granjanje
[0339] Konjugovana grupa jedinjenja prema pronalasku obuhvata ciljajući deo koji sadrži grupu koja se grana i tri premošćena liganda. Grupa koja se grana je vezana za konjugvanu vezujuću grupu. Grupa koja se grana je kovalentno vezana za vezujuću grupu i svaki od premošćenih liganda. Grupa za granjanje jedinjenja prema pronalasku ima sledeću strukturu:
Izvesne premošćujuće grupe
[0340] Konjugovana grupa jedinjenja prema pronalasku sadrži tri premošćujuće grupe kovalentno vezane za grupu za granjanje. Premošćujuća grupa je vezana za grupu za granjanje preko etarske grupe. Premošćujuća grupa je vezana za ligand preko etarske grupe.
[0341] Premošćujuća grupa jedinjenja prema pronalasku ima strukturu:
3. Određeni ligandi
[0342] Svaki ligand jedinjenja prema pronalasku je vezan za premošćujuću grupu. U izvesnim izvođenjima, svaki ligand je izabran da ima afinitet za bar jedan tip receptora ciljne ćelije. U izvesnim izvođenjima, ligandi su odabrani da imaju afinitet za bar jedan tip na površini ćelija jetre sisara U izvesnim izvođenjima, ligandi su izabrani koji imaju isti afinitet za hepatički asialoglikoproteinski receptor (ASGP-R). U izvesnim izvođenjima opisa, svaki ligand je ugljeni hridrat. Svaki igand jedinjenja prema pronalsku je N-acetil galaktozamin (GalNAc). U izvesnim izvođenjima opisa, ciljajući deo sadrži 3 liganda. Ciljajući deo jedinjenja prema pronalasku sadrži 3 N-acetil galaktozaminske ligande.
[0343] U izvesnim izvođenjima, "GalNac" ili "Gal-NAc" odnosi se na 2-(Acetilamino)-2-dezoksi-D-galaktopiranozu, koja se uobičajeno naziva u literaturi N-acetil galaktozamin. U izvesnim izvođenjima, "N-acetil galaktozamin" odnosi se na 2-(Acetilamino)-2-dezoksi-D-galaktopiranozu. "GalNac" ili "Gal-NAc" jedinjenja prema pronalasku se odnosi na 2-(Acetilamino)-2-dezoksi-D-galaktopiranozu, koja je β-oblik: 2-(Acetilamino)-2-dezoksi-β-D-galaktopiranoza. Pored prikazanog pronalaska, ovde je opisan α-oblik: 2-(Acetilamino)-2-dezoksi-D-galaktopiranozu, koji je prikazan za donju referencu .
2-(Acetilamino)-2-dezoksi-D-galaktopiranoza
2-(Acetilamino)-2-dezoksi- β-D-galaktopiranoza
2-(Acetilamino)-2-dezoksi- β-D-galaktopiranoza
Izvesni konjugati
[0344] U izvesnim izvođenjima, konjugovane grupe sadrži gornje strukturne karakteristike koje su konzistentne sa priloženim zahtevima.
[0345] U izvesnim takvim izvođenjima, konjugovana grupa će imati sledeću strukturu:
4
[0346] U izvesnim takvim izvođenjima, konjugovana grupa će imati sledeću strukturu:
a Izvesna konjugovana antisens jedinjenja
[0347] U izvesnim izvođenjima, konjugati su vezani za nukleozid antisens oligonukleotida u položaju 2’, 3’, 5’ nukleozida. Konjugovano antisens jedinjenje može imati sledeću strukturu:
A-B-C-D(E-F)q
gde
A je antisens oligonukleotid;
B je deo koji se cepa
C je konjugovana vezujuća grupa
D je grupa za granjanje;
svaki E je premošćujuća grupa;
svaki F je ligand; i
q je ceo broj između 1 i 5.
U izvesnim izvođenjima opisa, konjugovano antisens jedinjenje ima sledeću strukturu:
A-C-D(E-F)q
gde
A je antisens oligonukleotid;
C je konjugovana vezujuća grupa
D je grupa za granjanje
svaki E je premošćujuća grupa;
svaki je ligand; i
q je ceo broj između 1 i 5.
[0348] U izvesnim takvim izvođenjima, konjugovana vezujuća grupa sadrži bar jednu vezu koja se cepa.
[0349] U izvesnim takvim izvođenjima, grupa za granjanje sadrži bar jednu vezu koja se cepa.
[0350] U izvesnim izvođenjima svaka premošćujuća grupa sadrži bar jednu vezu koja se cepa.
[0351] U izvesnim izvođenjima, konjugati su vezani za nukleozid antisens oligonukleotida u položajima 2’, 3’, 5’ nukleozida.
[0352] U izvesnim izvođenjima opisa, konjugovano antisens jedinjenje ima sledeću strukturu:
A-B-C(E-F)q
gde
A je antisens oligonukleotid;
B deo koji se cepa
C je konjugovana vezujuća grupa
svaki E je premošćujuća grupa;
svaki F je ligand; i
q je celi broj između 1 i 5.
[0353] U izvesnim izvođenjima, konjugati su vezani za nukleozid antisens oligonukleotida u 2’, 3’, od 5’ položaju nukleozida. U izvesnim izvođenjima opisa, konjugovano antisens jedinjenje ima sledeću strukturu:
A-C(E-F)q
gde
A je antisens oligonukleotid;
C je konjugovana vezujuća grupa
svaki E je premošćujuća grupa;
svaki F je ligand; i
q je ceo broj između 1 i 5.
[0354] U izvesnim izvođenjima opisa, konjugovano antisens jedinjenje ima sledeću strukturu:
A-B-D(E-F)q
gde
A je antisens oligonukleotid;
B je deo koji se cepa
D je grupa za granjanje
svaki E je premošćujuća grupa;
svaki F je ligand; i
q je ceo broj između 1 i5.
[0355] U izvesnim izvođenjima opisa, konjugovano antisens jedinjenje ima sledeću strukturu: A-D(E-F)q
gde
A je antisens oligonukleotid;
D je grupa za granjanje
svaki E je premošćujuća grupa;
svaki F je ligand; i
q je celi broj između 1 i 5.
[0356] Primeri US patenta, objava US patentih prijava, i objava međunarodna patentna prijava koja opisuje pripremanje izvesnih gore navedenih konjugata, konjugati antisens jedinjenja, premošćujuće grupe, vezujuće grupe, grupe za granjanje, ligande, delovi koji se cepaju kao druge modifikacije uključuju bez ograničenja, US 5,994,517, US 6,300,319, US 6,660,720, US 6,906,182, US 7,262,177, US 7,491,805, US 8,106,022, US 7,723,509, US 2006/0148740, US 2011/0123520, WO 2013/033230 i WO 2012/037254.
[0357] Reprezentatvne objave koje opisuju dobijanje izvesnih gore navedenih konjugata, konjugovanih antisens jedinjenja, premošćujućih grupa, vezujućih grupa, grupa za granjanje, liganda, grupa koje se cepaju kao i ostalih modifikacija uključuju bez ograničenja, BIESSEN et al., "The Cholestarol Derivative of a Triantennary Galactoside with High Affinity for the Hepatic Asialoglikoprotein Receptor: a Potent Cholestarol Lowering Agent" J. Med. Chem. (1995) 38:1846-1852, BIESSEN et al., "Synthesis of Cluster Galactosides with High Affinity for the Hepatic Asialoglikoprotein Receptor" J. Med. Chem. (1995) 38:1538-1546, LEE et al., "New and more efficient multivalent glyco-ligands for asialoglikoprotein receptor of mammalian hepatocytes" Bioorganic & Medicinal Hemija (2011) 19:2494-2500, RENSEN et al., "Deter- mination of the Upper Size Limit for Uptake and Processing of Ligands by the Asialoglikoprotein Receptor on Hepatocytes in Vitro and in Vivo" J. Biol. Chem. (2001) 276(40):37577-37584, RENSEN et al., "Design and Synthesis of Novel N- Acetylgalactosamine-Terminated Glycolipids for Targeting of Lipoproteins to the Hepatic Asialoglikoprotein Receptor" J. Med. Chem. (2004) 47:5798-5808, SLIEDREGT et al., "Design and Synthesis of Novel Amphiphilic Dendritic Galac- tosides for Selective Targeting of Liposomes to the Hepatic Asialoglikoprotein Receptor" J. Med. Chem. (1999) 42:609-618, i Valentijn et al., "Solid-phase synthesis of lysine-based cluster galactosides with high affinity for the Asialoglikoprotein Receptor" Tetrahedron, 1997, 53(2), 759-770.
[0358] U izvesnim izvođenjima, konjugovana antisens jedinjenja sadrže oligonukleotid na osnovu RNaze H (kao što je gapmer) ili obrađeni modulirajući oligonukleotid (kao što je potpuno modifikovani oligonukleotid) i bilo koja konjugovana grupa koja sadrži bar jednu, dve ili tri GalNAc grupe. U izvesnim izvođenjima konjugovano antisens jedinjenje koje sadrži bilo koju grupu koja je nađena u bilo kojoj sledećoj referenci: Lee, Carbohydr Res, 1978, 67, 509-514; Connolly et al., J Biol Chem, 1982, 257, 939-945; Pavia et al., Int J Pep Protein Res, 1983, 22, 539-548; Lee et al., Biochem, 1984, 23, 4255-4261; Lee et al., Glycoconjugate J, 1987, 4, 317-328; Toyokuni et al., Tetrahedron Lett, 1990, 31, 2673-2676; Biessen et al., J Med Chem, 1995, 38, 1538-1546; Valentijn et al., Tetrahedron, 1997, 53, 759-770; Kim et al., Tetrahedron Lett, 1997, 38, 3487-3490; Lee et al., Bioconjug Chem, 1997, 8, 762-765; Kato et al., Glycobiol, 2001, 11, 821-829; Rensen et al., J Biol Chem, 2001, 276, 37577-37584; Lee et al., Methods Enzymol, 2003, 362, 38-43; Westarlind et al., Glycoconj J, 2004, 21, 227-241; Lee et al., Bioorg Med Chem Lett, 2006, 16(19), 5132-5135; Maierhofer et al., Bioorg Med Chem, 2007, 15, 7661-7676; Khorev et al., Bioorg Med Chem, 2008, 16, 5216-5231; Lee et al., Bioorg Med Chem, 2011, 19, 2494-2500; Kornilova et al., Analyt Biochem, 2012, 425, 43-46; Pujol et al., Angew Chemie Int Ed Engl, 2012, 51, 7445-7448; Biessen et al., J Med Chem, 1995, 38, 1846-1852; Sliedregt et al., J Med Chem, 1999, 42, 609-618; Rensen et al., J Med Chem, 2004, 47, 5798-5808; Rensen et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2006, 26, 169-175; van Rossenberg et al., Gene Ther, 2004, 11, 457-464; Sato et al., J Am Chem Soc, 2004, 126, 14013-14022; Lee et al., J Org Chem, 2012, 77, 7564-7571; Biessen et al., FASEB J, 2000, 14, 1784-1792; Rajur et al., Bioconjug Chem, 1997, 8, 935-940; Duff et al., Methods Enzymol, 2000, 313, 297-321; Maier et al., Bioconjug Chem, 2003, 14, 18-29; Jayaprakash et al., Org Lett, 2010, 12, 5410-5413; Manoharan, Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 2002, 12, 103-128; Merwin et al., Bioconjug Chem, 1994, 5, 612-620; Tomiya et al., Bioorg Med Chem, 2013, 21, 5275-5281; International applications WO1998/013381; WO2011/038356; WO1997/046098; WO2008/098788; WO2004/101619; WO2012/037254; WO2011/120053; WO2011/100131; WO2011/163121; WO2012/177947; WO2013/033230; WO2013/075035; WO2012/083185; WO2012/083046; WO2009/082607; WO2009/134487; WO2010/144740; WO2010/148013; WO1997/020563; WO2010/088537; WO2002/043771; WO2010/129709; WO2012/068187; WO2009/126933; WO2004/024757; WO2010/054406; WO2012/089352; WO2012/089602; WO2013/166121;WO2013/165816; U.S. Patents 4,751,219; 8,552,163; 6,908,903; 7,262,177; 5,994,517; 6,300,319; 8,106,022; 7,491,805; 7,491,805; 7,582,744; 8,137,695; 6,383,812; 6,525,031; 6,660,720; 7,723,509; 8,541,548; 8,344,125; 8,313,772; 8,349,308; 8,450,467; 8,501,930; 8,158,601; 7,262,177; 6,906,182; 6,620,916; 8,435,491; 8,404,862; 7,851,615; objavljena U.S. Patentna prijava US2011/0097264; US2011/0097265; US2013/0004427; US2005/0164235; US2006/0148740; US2008/0281044; US2010/0240730; US2003/0119724; US2006/0183886; US2008/0206869; US2011/0269814; US2009/0286973; US2011/0207799; US2012/0136042; US2012/0165393; US2008/0281041; US2009/0203135; US2012/0035115; US2012/0095075; US2012/0101148; US2012/0128760; US2012/0157509; US2012/0230938; US2013/0109817; US2013/0121954; US2013/0178512; US2013/0236968; US2011/0123520; US2003/0077829; US2008/0108801; i US2009/0203132.
In vitro testiranje antisens oligonukleotida
[0359] Ovde opisani postupci za lečenje ćelija sa antisens oligonukleotidima, koji mogu biti modifikovani odgovarajuće za lečenje sa drugim antisens jedinjenja.
[0360] Ćelije mogu biti tretirane sa antisens oligonukleotidima u kojima ćelije dosežu približno 60-80% konfluentnosti u kulturi.
[0361] Jedan regens uobičajeno korišćen za uvođenje antisens oligonukleotida u kultivisanim ćelijama uključuju karjonski lipidni transfekcioni reagens LIPOFECTIN (Invitrogen, Carlsbad, CA). Antisens oligonukleotidi mogu biti pomešani sa LIPOFECTIN-om u OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) da se postigne željena krajnja koncentracija antisens oligonukleotida i LIPOFECTIN koncentracija da može biti u opsegu od 2 do 12 ug/mL po 100 nM antisens oligonukleotida.
[0362] Još jedan reagens korišen da se uvedu antisens oligonukleotidi u kultivisane ćelije uključuje LIPOFECTAMINE (Invitrogen, Carlsbad, CA). Antisens oligonukleotid je pomešan sa LIPOFECTAMINE u OPTI-MEM 1 redukovanom serumskom medijumu (Invitrogen, Carlsbad, CA) da bi se postigla željena koncentracija antisens oligonukleotida i koncentracija LIPOFECTAMINE koja može biti u opsegu od 2 do 12 ug/mL po 100 nM antisens oligonukleotida.
[0363] Još jedna tehnika korišćena za uvođenje antisens oligonukleotida u kultivisane ćelije uključuje elektorporaciju.
[0364] Još jedna tehnika korišćena za uvođenje antisens oligonukleotida u kultivisane ćelije uključuju slobodno preuzimanje oligonukleotida od strane ćelija.
[0365] Ćelija je tretirana sa antisens oligonukleotidima rutinskim postupcima. Ćelije mogu biti sakupljene 16-24 sata tretmana sa antisens oligonukleotidom, za koje vreme su nivoi RNK ili proteina ciljne nukleinske kiseline mereni postupcima poznatim u ovoj oblasti i ovde opisanim. Generalno, kada je izveden tretman u višestrukim replikatima, podaci su prikazani kao srednja vrednost tretmana replikata.
[0366] Koncentracija antisens oligonukleotida korišćenih razlikuje se od ćelijske linije do ćelijske linije. Postupci za određivanje optimalnih antisens oligonukleotidne koncentracije za posebnu ćelijsku liniju su dobro poznate u stanju tehnike. Antisens oligonukleotidi su naročito korišćeni kao koncentracioni opsezi od 1 nM to 300 nM kada su transfektovani sa LIPOFECTAMINE. Antisens oligonukleotidi su korišćeni kao viši koncentracioni opsezi od 625 do 20,000 nM kada su transfektovani korišćenjem elektroporacije.
RNK izolovanje
[0367] RNK analiza može biti izvedena u ukupnoj ćelijskoj RNK ili poli(A)+ iRNK. Postupci RNK izolovanja su dobro poznati u stanju tehnike. RNK je pripremljen pomoću postupaka dobro poznatih u ovoj oblasti, na primer, pomoću TRIZOL Reagensa (Invitrogen, Carlsbad, CA) prema protokolima preporučenim od proizvođača.
Izvesne indikacije
[0368] Izvesna izvođenja opisa odnose se na postupke lečenja, sprečavanja ili ublažavanja bolesti u vezi sa disregulacijom alternativnog puta komplementa kod subjekta davanjem CFB specifičnog inhibitora, kao što je antisens jedinjenje koje je ciljalo CFB.
[0369] Primeri bolesti bubrega u vezi sa disregulacijom alternativnog puta komplementa je lečen, sprečavan, i/ili ublažavan sa ovde opisanim postupcima obuhvata C3 glomerulopatiju, atipični hemolitički uremički sindrom (aHUS), bolest gustog depozita (DDD; takođe poznat kao MPGN Tip II ili C3Neph), i CFHR5 nefropatiju.
[0370] Dodatne bubrežne bolesti u vezi sa disregulacijom alternativnog puta komplementa lečene, sprečavane, i/ili ublažene sa postupcima ovde opisanim uključuju IgA nefopatiju; mesangiokapalarni (membranoproliferativni) glomerulonefritis (MPGN); autoimune poremećaje uključujući lupus nefritis i sistemski eritemski lupus (SLE); infekcijom izazvani glomerulonefritis (takođe poznat kao post infektivni glomerulonefritis); i ishemijsko-reperfuziono oštećenje bubrega, na primer post-transplantacionalna ishemijsko reperfuziono oštećene bubrega.
[0371] Primeri nerenalnih poremećaja u vezi sa disregulacijom alternativnog puta komplementa koji se leče i/ili sprečavaju sa postupcima ovde opisanim uključuju očne boelsti kao što su makularna degeneracija, na primer senilna makularna degeneracija (AMD), uključujući vlažnu AMD i suvu AMD, kao što je geografska atrofija; neuromijelitis optika; bolest rožnjače, kao što je zapaljenje rožnjače; autoimuni uveitis; i dijabetička retinopatija. Zabeleženo je da sistem komplemenata je uključen u očne bolesti. Jha P, et al., Mol Immunol (2007) 44(16): 3901-3908. Dodazni primer nebubrežnih poremećaja u vezi sa disregulacijom alternativnog puta komplementa koji se leče i/ili sprečavaju sa postupcima ovde opsianim uključuju vaskulitis u vezi sa ANCA, antifosfolipidni sindrom (takođe poznat kao antifosfolipidni sindrom (APS)), astmu, reumatoidni artritis, mijastenija gravis, i multipla sklerozu<.>
[0372] Izvesna opisana izvođenja odnose se na postupke lečenja, sprečavanje ili ublažavanja bubrežne bolesti u vezi sa disregulacijom alternativnog puta komplementa kod subjekta davanjem CFB specifičnog inhibitora, kao što je antisens jedinjenje koje cilja CFB. U izvesnim aspektima, bubrežna bolest je lupus nefritis, sistemski eritemski lupus (SLE), bolest gustog depozita (DDD), C3 glomerulonefritis (C3GN), CFHR5 nefropatija, ili atipičnil hemolitički uremični sindrom (aHUS), ili bilo koja njihova kombinacija.
[0373] Izvesna izvođenja opisa odnose se na postupke lečenja, sprečavanja ili ublažavanja makularne degeneracije, kao što je senilna makularna degeneracija (AMD), kod subjekta davanjem CFB specifičnog inhibitora, kao što je antisens jedinjenje koje cilja CFB. U izvesnim aspektima, AMD je vlažna AMD ili suva AMD. U izvesnim aspektima, suva AMD može biti geografska atrofija. Ispitivanja su pokazala povezanost disregulacije alternativnog puta komplementa i AMD. Komponente komplementa su uobičajeni konstituenti okularne drusen, ekstracelularnog materija koji se akumulira u makuli AMD pacijenata. Pored toga, zabeleženo je da CFH i CFB varijane čine blizu 75% AMD slučajeva u Severnoj Evropi i Južnoj Americi. Takođe je ustanovljeno da specifični CFB polimorfizam doprinosi zaštiti naspram AMD. Patel, N. et al., Eye (2008) 22(6):768-76. Dodatno, CFB homozigotni miševi sa inaktiviranim genom (engl.null mice ) su imali nižu aktivnost puta komplementa, pokazivale su manje okularne lezije horoidalnu neovaskularizaciju (CNV) posle laserske fotokoagulacije. Rohrer, B. et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. (2009) 50(7):3056-64. Pored toga CFB siRNA lečenje štiti miševe od laserski indukovane CNV. Bora, NS et al., J Immunol. (2006) 177(3):1872-8. Ispitivanja su takođe pokazala da bubreg i oko dele razvojne puteve i strukturne karakteristike uključujući sastav i prokrvljenost promotera bazne membrane kolagena IV. Savige et al., J Am Soc Nephrol. (2011) 22(8):1403-15. Postoji dokaz da put komplementa je uključen u bubrežne i očne bolesti. Na primer, nasleđena deficijencija regulatornog proteina puta komplementa izaziva predispozicije za atipični hemolitički uremijski sindrom i AMD. Richards A et al., Adv Immunol. (2007) 96:141-77. Dodatno, hronična bolest bubrega je u vezi sa AMD. Nitsch, D. et al., Ophthalmic Epidemiol. (2009) 16(3):181-6; Choi, J. et al, Ophthalmic Epidemiol. (2011) 18(6):259-63. Bolest gustih depozita (DDD), bolest bubrega u vezi sa disregulacijom alternativnog puta komplementa, je karakterisana sa akutnim nefritičkim sindormom i očnim drusenom. Cruz and Smith, GeneReviews (2007) Jul 20. Pored toga, miševi koji su podvrgnuti genetskoj deleciji komponente alternativnog puta komplementa imaju istovremeno fenotipove bubrežne i očne bolesti. Zabeleženo je da CFH homozigotni miševi sa inaktiviranim genom razvijaju DDD i imaju bubrežne abnormalnosti i vizuelnu disfukcije. Pickering et al., Nat Genet. (2002) 31(4):424-8. Mišji modeli bubrežnih boelsti u vezi sa disregulacijom alternativnog puta komplementa su takođe prihvaćeni kao modeli AMD. Pennesi ME et al., Mol Aspects Med (2012) 33:487-509. CFH miševi sa inaktiviranim genom, na primer, su prihvačeni model za bubrežne bolesti kao što su DDD, i AMD. Pored toga, takođe je zabeleženo da AMD je u vezi sa sistemskim izvorom faktora komplementa, koji je akumuliran lokalno u oko da pokrene aktivaciju alternativnog puta kompelenta. Loyet et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. (2012) 53(10):6628-37.
PRIMERI
[0374] Sledeći primeri prikazuju izvesna izvođenja prikazanog opsa i nisu ograničavajuća. Pored toga, gde su obezbeđena specifična izvođenja, pronalazači su razmatrali generičku primenu ovih specifičnih izvođenja. Na primer, opis oligonukleotida koji ima naročiti motiv obezbeđuje racionalnu osnovu za dodatne oligonukleotide koji imaju isti ili sličan motiv. I, na primer, gde posebano velika modifikacija afiniteta se javlja na posebnom položaju, ostale mofifikacije visokog afintieta u istom položaju se smatraju pogodnim, osim ako nije drugačije navedeno.
Primeri 1: Opšti postupak za dobijanje fosforamidita, Jedinjenja 1, 1a i 2
[0375]
[0376] Bx je heterociklična baza;
Jedinjenja 1, 1a i 2 su dobijena prema postupcima dobro pozantim u ovoj oblasti kako je opisano ovde u opisu (videti Seth et al., Bioorg. Med. Chem., 2011, 21(4), 1122-1125, J. Org. Chem., 2010, 75(5), 1569-1581, Nucleic Acids Symposium Series, 2008, 52(1), 553-554); i takođe videti objavljenu PCT Imeđunarodne prijave (WO 2011/115818, WO 2010/077578, WO2010/036698, WO2009/143369, WO 2009/006478, i WO 2007/090071), i US patent 7,569,686).
Primer 2: Dobijanje jedinjenja 7
[0377]
[0378] Jedinjenje 3 (2-acetamido-1,3,4,6-tetra-O-acetil-2-dezoksi- β-Dgalaktopiranoza ili galaktozamin penta acetat) je komercijalno dostupan. Jedinjenje 5 je pripremljeno prema
1
objavljenim postupcima (Weber et al., J. Med. Chem., 1991, 34, 2692).
Primer 3: Dobijanje jedinjenja 11
[0379]
[0380] Jedinjenja 8 i 9 su komercijalno dostupna.
Primer 4: Dobijanje jedinjenja 18
2
[0382] Jedinjenje 11 je dobijeno prema postupcima prikazanim u primeru 3. Jedinjenje 14 je komercijalno dostupno. Jedinjenje 17 je dobijeno korišćenjem sličnih postupaka zabeleženih kod Rensen et al., J. Med. Chem., 2004, 47, 5798-5808.
Primer 39: Opšti postupak dobijanja oligomernog jedinjenja 83h koje sadži GalNAc3-3 konjugat na 5’ kraju (GalNAc3-1 modifikovani za vezivanje na 5’ kraju) na čvrstom nosaču
[0383]
4
[0384] Jedinjenje 18 je dobijeno prema postupcima prikazanim u primeru 4. Jedinjenja 83a i 83b su komercijalno dostupna. Oligomerno jedinjenje 83e koji sadrži fosfodiestarski vezani heksilamin je dobijen korišćenjem standardnih oligonukleotidnih sintetskih postupaka. Tretiranje zaštitćenih oligomernih jedinjenja sa vodenim amonijakom obezbedilo je 5’-GalNAc3-3 konjugovano oligomerno jedinjenje (83h).
[0385] Gde GalNAc3-3 ima strukturu:
[0386] GalNAc3grupisani deo konjugovane grupe GalNAc3-3 (GalNAc3-3a) može biti kombinovan sa bilo kojim delom koji se cepa da bi se obezbedille raznovrsne konjugovane grupe. Gde GalNAc3-3aima formulu:
Primer 44: Efekat PO/PS veza na antisens inhibiciju ASOs koji sadrži GalNAc3-1 konjugat (videti Primer 9) na 3’ kraju ciljajući SRB-1
[0387] ISIS 655861 i 655862 koji sadrže GalNAc3-1 konjugat na 3’ kraju svaki ciljajući SRB-1 su testirani u ispitivanju jednog davanja na njihovu sposobnost da inhibiraju mišji SRB-1. Osnovno nekonjugovano jedinjenje, ISIS 353382 je uključeno u ispitvanje upoređivanja.
[0388] ASOs su 5-10-5 MOE gapmeri, gde region razmaka sadrži deset 2’-dezoksiribonukleozida i svaki region "krila" sadrži pet 2’-MOE modifikovanih nukleozida. ASOs su pripremljeni pomoću sličnih postupaka kao što je ranije prikazano u primeru 19 i opisani su dole u tabeli 36,.
Tabela36
[0389] Supskripti: "e" označava 2’-MOE modifikovani nukleozid; "d" označava β-D-2’-dezoksiribonukleozid; "s" označava fosforotioatne internukleozidne veze (PS); "o" označava fosfodiestarske internukleozidne veze (PO); i "o"’ označava -O-P(=O)(OH)-. Superskript "m" označava 5-metilcitozine. Struktura "GalNAc3-1" je prikazana u primeru 9.
Postupak
[0390] Muškim miševima Balb/c starim šest nedelja (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) je jednom injektovana subkutanozna doza dole prikazana ISIS 353382, 655861, 655862 ili PBS tretirana kontrola. Svaka tretirana grupa se sastojala od 4 životinje. Pre lečenja kao i posle poslednje doze, uzeta je krv od svakog miša i analizirani su uzorci plazme. Miševi su žrtvovani 72 sata posle poslednjeg davanja da bi se odredili nivoi SRB-1 iRNK u jetri pomoću PCR u realnom vremenu i RIBOGREEN® RNK kvantifikacioni regans (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) prema standardnim protokolima. SRB-1 iRNK nivoi su određeni relativno prema ukupnoj RNK (korišćenjem Ribogreen), pre normalizacije prema PBS-tretiranoj kontroli. Donji rezultati su prikazani kao srednja vrednost procenta nivoa SRB-1 iRNK za svaku tretiranu grupu, normalizovanih prema PBS-tretiranoj kontroli je označan kao "% PBS". ED50s je meren korišćenjem sličnih postupaka kao što je ranije opisano i zabeleženo dole.
[0391] Kao što je prikazano u tabelali 37, lečenje sa antisens oligonukleotidima smanjilo je nivoe SRB-1 iRNK na zavisan način poređenjem sa PBS tretiranom kontrolom. Zaista, antisens oligonukleotidi koji sadrže GalNAc3- 1 konjugat na 3’ kraju (ISIS 655861 i 655862) prikazali su suštinsko poboljšanje u dejstvo u poređenju sa nekonjugovanim antisens oligonukleotida (ISIS 353382). Dalje, ISIS 655862 sa mešovitim PS/PO vezama pokazao je poboljšanje u dejstvu u odnosu na potpun PS (ISIS 655861).
Tabela 37
[0392] Nivoi transaminaze u jetri, alanin aminotransferaze (ALT) i aspartat aminotransferaze (AST), u serumu su mereni realativno prema rastvoru soli injektovanom miševima prema standarnim protokolima. Rezultati su pokazali da ne postoji povećanje u nivoima transaminaza (Tabela 38) ili masama organa (podaci nisu prikazani) primećenim kod miševa tretiranih sa ASOs u poređenju sa PBS kontrolom. Dalje ASO sa mešovitim PS/PO vezama (ISIS 655862) su pokazali sličene nivoe transaminaza prema potpunom (ISIS 655861).
Tabela 38
(nastavak)
Primer 45: Dobijanje PFP Estra, Jedinjenje 110a
[0393]
[0394] Jedinjenje 4 (9.5g, 28.8 mmola) je tretirano sa jedinjenjem 103a ili 103b (38 mmola), pojedinačno, i TMSOTf (0.5 eq.) i molekulskim sitima u dihlorometanu (200 mL), i mešani su u toku 16 sati na sobnoj temperaturi. U to vreme, organski sloj je proceđen kroz celit, zatim ispran sa natrijum bikarbonatom, vodom i fiziološkim rastvorom. Organski sloj je zatim odvojen i osušen iznad natrijum sulfata, proceđen i redukovan pod sniženim pritiskom. Dobijeno ulje je prečišćeno pomoću hromatografije na silikagelu (2%-->10% metanol/dihlorometan) da bi se dobilo jedinjenje 104a i 104b u prinosu >80%. LCMS i protonska NMR su bili konzistentni sa strukturom.
[0395] Jedinjenja 104a i 104b su bila tretirana do istih uslova kao za jedinjenja 100a-d (primer 47), da bi se dobila jedinjenja 105a i105b u prinosu >90%. LCMS i protonska NMR su bili konzistentni sa strukturom.
[0396] Jedinjenja 105a i 105b su tretirana, pjedinačno sa jedinjenjem 90 pod istim uslovima kao za jedinjenja 901a-d, da bi se dobilo jedinjenje 106a (80%) i 106b (20%). LCMS i protonska NMR su bile konzistentne sa strukturom<.>
[0397] Jedinjenja 106a i 106b su tretirana u istim uslovima kao za jedinjenja 96a-d (Primer 47), da bi se dobio 107a (60%) i 107b (20%). LCMS i protonska NMR su bili konzistentni sa strukturom.
[0398] Jedinjenja 107a i 107b su tretirana u istim uslovima kao za jedinjenja 97a-d (Primer 47), da bi se dobila jedinjenja 108a i 108b u prinosu 40-60%. LCMS i protonska NMR su bila konzistentna sa strukturom.
[0399] Jedinjenja 108a (60%) i 108b (40%) su tretirana do istih uslova kao za jedinjenja 100a-d (Primer 47), da bi se dobila jedinjenja 109a i 109b u prinosu >80% . LCMS i protonska NMR su bili konzistentni sa strukturom.
[0400] Jedinjenje 109a je tretirano u istim uslovima kao za jedinjenja 101a-d (Primer 47), da bi se dobilo jedinjenje 110a u prinosu 30-60%. LCMS i protonski NMR je bio konszistentan sa strukturom. Alternativno, jedinjenje 110b može biti pripremljeno na sličan način polazeći od jedinjenja 109b.
Primer 48: Dobijanje oligonukleotida 119 koji sadrži GalNAc3-7
[0401]
1
[0402] Jedinjenje 112 je sintetizovano pomoću postupka opisanog u literaturi (J. Med. Chem.
2004, 47, 5798-5808).
[0403] Jedinjenje 112 (5 g, 8.6 mmol) je rastvoreno u 1:1 metanol/etil acetat (22 mL/22 mL). Dodat je paladijum hidroksid na ugljeniku (0.5 g). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temepraturi pod vodonikom u toku 12 h. The Reakciona smeša je proceđena kroz sloj celita i sloj je ispran sa 1:1 metanol/etil acetat. Filtrat i delovi posle ispiranja su spojeni i koncentrovani do suvog da bi se dobilo Jedinjenje 105a (kvantitativno). Struktura je potvrđena sa LCMS.
[0404] Jedinjenje 113 (1.25 g, 2.7 mmol), HBTU (3.2 g, 8.4 mmol) i DIEA (2.8 mL, 16.2 mmol) su rastvoreni u anhidroavnom DMF (17 mL) i reakciona smeša je mešana na sobnoj temepraturi u toku 5 min. U ovo je dodat rastvor jedinjenja 105a (3.77 g, 8.4 mmol) u anhidrovanom DMF (20 mL). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi u toku 6 h. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom da bi se dobilo ulje. Ostatak je rastvoren u CH2Cl2(100 mL) i ispran sa vodenim zasićenim NaHCO3rastvorom (100 mL) i rastvrom soli (100 mL). Organska faza je odvojena, osušena (Na2SO4), proceđena i uparena. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni od silikagela eluiranoj sa 10 so 20 % MeOH u dihlorometanu da bi se dobilo Jedinjenje 114 (1.45 g, 30%). Strukltura je potvrđena sa LCMS i<1>H NMR analizama.
[0405] Jedinjenje 114 (1.43 g, 0.8 mmol) je rastvoreno u 1:1 metanol/etil acetat (4 mL/4 mL). Paladijum na ugljeniku (vlažan, 0.14 g) je dodat. Reakciona smeša je isprana sa vodonikom i mešana na sobnoj temepraturi pod vodonikom u toku 12 h. Reakciona smeša je proceđena kroz sloj celita.
2
Sloj celita je ispran sa metanol/etil acetatom (1:1). Filtrat i ostaci od ispiranja su spojeni zajedno i upareni pod sniženim pritiskom da bi se dobilo Jedinjenje 115 (kvantitativno). Struktura je potvrđena sa LCMS i<1>H NMR analizama.
[0406] Jedinjenje 83a (0.17 g, 0.75 mmol), HBTU (0.31 g, 0.83 mmol) i DIEA (0.26 mL, 1.5 mmol) su rastvoreni u anhidrovanom DMF (5 mL) i reakciona smše je mešana na sobnoj temperaturi u toku 5 min. U ovo je dodat rastvor jedinjenja 115 (1.22 g, 0.75 mmol) u anhidrovanom DMF i reakcija je mešana na sobnoj temperaturi u toku 6 h. Rastvarač je uklonjen pod sniženim prirskom i ostatak je rastvoren u CH2Cl2. Organski sloj je ispran sa vodenim zasićenim rastvorom NaHCO3i rastvorom soli i osušen iznad anhidrovanog Na2SO4i proceđen. Organski sloj je koncentrovan do suvog i dobijen ostatak prečišćen hromatografijom na silikagelu i eluiran sa 3 do 15 % MeOH u dihlorometanu da bi se dobilo jedinjenje 116 (0.84 g, 61%). Struktura je potvrđena sa LC MS i<1>H NMR analizama.
[0407] Jedinjenje 116 (0.74 g, 0.4 mmol) je rastvoreno u 1:1 metanol/etil acetatu (5 mL/5 mL). Paladijum na ugljeniku (vlažan, 0.074 g) je dodat. Reakcione smeše su isprane sa vodonikom i mešane na sobnoj temepraturi pod vodonikom u toku 12 h. Reakciona smeša je proceđena kroz sloj celita. Sloj celita je ispran sa metanol/etil acetatom (1:1). Filtrat i ostaci od ispiranja su spojeni zajedno i upareni pod sniženim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje 117 (0.73 g, 98%). Struktura je potvrđena sa LCMS i<1>H NMR analizama.
[0408] Jedinjenje 117 (0.63 g, 0.36 mmol) je rastvoreno u anhidrovanom DMF (3 mL). U ovoj su dodati rastvor N,N-Diizopropiletilamina (70 µL, 0.4 mmol) i pentafluorofenil trifluoroacetata (72 µL, 0.42 mmol). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi u toku 12 h i sipana na vodeni zasićeni rastvor NaHCO3. Smeša je ekstrahovana sa dihlorometanom, isprana sa rastvorom soli i osušena iznad anhidrovnog Na2SO4. Rastvor dihlorometana je koncentrovan do suvog i prečišćen pomoću hromatografije na koloni silikagela i eluiran sa 5 do 10 % MeOH u dihlorometanu da se dobije jedinjenje 118 (0.51 g, 79%). Struktura je potvrđena sa LCMS i<1>H i<1>H i<19>F NMR.
2.vodeni amonijak,s
5
[0409] Oligomerno Jedinjenje 119, koje sadrži GalNAc3-7 konjugovanu grupu, je dobijeno pomoću opštih postupaka prikazanih u primeru 46. GalNAc3grupisani deo konjugovane grupe GalNAc3-7 (GalNAc3-7a) može biti kombinovan sa bilo kojim delom koji se može otceptiti da bi se dobile različite konjugovane grupe. U izvesnim izvođenjima, grupa koja se cepa je -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-.
[0410] Struktura GalNAc3-7 (GalNAc3-7a-CM-) je dole prikazana:
Primer 51: Dobijanje oligonukleotida 155 koji sadrži GalNAc3-6
[0411]
4
[0412] Jedinjenje 146 je sintetizovana kao što je opisano u literaturi (Analytical BioHemija 1995, 229, 54-60).
[0413] Jedinjenje 4 (15 g, 45.55 mmol) i jedinjenje 35b (14.3 grama, 57 mmol) su rastvoreni u CH2Cl2(200 ml). Dodata su aktivirana molekulska sita (4 Å. 2 g, sprašena), i reakcija je omogućeno da se meša u toku 30 minuta u atmosferi azota. TMS-OTf je dodat (4.1 ml, 22.77 mmol) i reakcija je omogućeno da se meša na sobnoj temperaturi u toku noći. Pošto je završena reakcija je zaustavljena sipanjem u rastvor zasićenog vodenog NaHCO3(500 ml) i smrvljenog leda ( ~ 150 g). Organski sloj je odvojen, ispran sa rastvorom soli, osušen iznad MgSO4, proceđen, i koncentrovan je do narandžastog ulja pod sniženim pritiskom. Sirovi materijal je prečišćen hromatografijom na koloni od silikagela i eluiran sa 2-10 % MeOH u CH2Cl2da bi se dobilo Jedinjenje 112 (16.53 g, 63 %). LCMS i<1>H NMR su bili konzistentni sa očekivanim jedinjenjem.
[0414] Jedinjenje 112 (4.27 g, 7.35 mmol) je rastvoreno u 1:1 MeOH/EtOAc (40 ml). Reakciona smeša je prečišćena uvođenjem u mehurićima struje argona kroz rastvor u toku 15 minuta. Pearlman-ov katalizator (paladijum hidrksid na ugljeniku, 400 mg) je dodat, i uvođen je gas vodonika u mehurićima u rastvor u toku 30 minuta. Posle završetka (TLC 10% MeOH u CH2Cl2, i LCMS), katalizator je uklonjen ceđenjem kroz sloj celita. Filtrat je koncentrovan na rotacionom uparivaču i osušen je kratko pod vakuumom da bi se dobilo jedinjenje 105a (3.28 g). LCMS i 1H NMR su bili konzistentni sa željenim proizvodom.
[0415] Jedinjenje 147 (2.31 g, 11 mmol) je rastvoreno u anhidrovanom DMF (100 mL). Dodat je N,N-Diizopropiletilamin (DIEA, 3.9 mL, 22 mmol), a zatim HBTU (4 g, 10.5 mmol). Reakciona smeša je omogućeno da se meša ~ 15 minuta pod azotom. Ovome je dodat rastvor jedinjenja 105a (3.3 g, 7.4 mmol) u suvom DMF i mešan u toku 2 h u atmosferi azota. Reakcija je razblažena sa EtOAc i isprana sa zasićenim vodenim NaHCO3i rastvorom soli. Organska faza je odvojena, osušena (MgSO4), proceđena i koncentrovan da bi se dobio narandžasti sirup. Sirovi materijal je prečišćen hromatografijomna koloni 2-5 % MeOH u CH2Cl2da bi se dobilo Jedinjenje 148 (3.44 g, 73 %). LCMS i<1>H NMR su bili konzistentni sa očekivanim proizvodom.
[0416] Jedinjenje 148 (3.3 g, 5.2 mmol) je rastvoreno u 1:1 MeOH/EtOAc (75 ml). Reakciona smeša je prečišćena uvođenjem mehurića struje kroz rastvor u toku 15 minuta. Pearlman-ov katalizator (paladijum hidroksid na ugljeniku) je dodat (350 mg). Gas vodonika je uvođen u mehurićima kroz rastvor u toku 30 minuta. Pošto je završeno (TLC 10% MeOH u DCM, i LCMS), katalizator je uklonjen ceđenjem kroz sloj celita. Filtrat je koncentrovan na rotacionom uparivaču, i osušen je brzo pod visokim vakumom da bi se dobilo Jedinjenje 149 (2.6 g). LCMS je bio konzistentan sa željenim proizvodom. Ostatak je rastvoren u suvom DMF (10 ml) korišćen je odmah u sledećem koraku.
[0417] Jedinjenje 146 (0.68 g, 1.73 mmol) je rastvoreno u suvom DMF (20 ml). U ovo DIEA (450 μL, 2.6 mmol, 1.5 eq.) i HBTU (1.96 g, 0.5.2 mmol) su dodati. Reakciona smeša je omogućeno da se meša u toku 15 minuta na sobnoj temperaturi pod azotom. Rastvor jedinjenja 149 (2.6 g) u anhidrovanom DMF (10 mL) je dodat. pH reakcije je prilagođen na pH = 9-10 dodavanjem DIEA (ukoliko je potrebno). Omogućeno je da se reakcija meša na sobnoj temperaturi pod azotom u toku 2 h. Posle završetka reakcija je razblaženA sa EtOAc (100 mL), i isprana sa vodenim zasićenim rastvorom NaHCO3, a zatim zasićenim rastvorom soli. Organska faza je odvojena, osušena iznad MgSO4, proceđena i koncentrovana. Ostatak je prečišćen sa hromatografijom na koloni silikagela i eluiran sa 2-10 % MeOH u CH2Cl2da bi se dobilo Jedinjenje 150 (0.62 g, 20 %). LCMS i<1>H NMR su konzistentni sa željenim proizvodom.
[0418] Jedinjenje 150 (0.62 g) je rastvoreno u 1:1 MeOH/ EtOAc (5 L). Reakciona smeša je prečišćena uvođenjem mehurića struje argona u rastvor u toku 15 minuta. Pearlman-ov katalizator (paladijum hidroksid na ugljeniku) je dodat (60 mg). Gas vodonika je uvođen kao mehurići u rastvor u toku 30 minuta. Posle završetka (TLC 10% MeOH u DCM, i LCMS), katalizator je uklonjen ceđenjem (Teflon filter sa injekcionim vrhom, 0.45 µm). Filtrat je koncentrovan na rotacionom uparivaču, i osušen je brzo pod visokim vakumom da bi se dobilo Jedinjenje 151 (0.57 g). LCMS je bila konzistentna sa željenim proizvodom. Proizvod je rastvoren u 4 mL suvog DMF i korišćen je neposredno u sledećem koraku.
[0419] Jedinjenje 83a (0.11 g, 0.33 mmol) je rastvoreno u anhidrovanom DMF (5 mL) i dodati su N,N-Diizopropiletilamin (75 µL, 1 mmol) i PFP-TFA (90 µL, 0.76 mmol). Reakciona smeša se pretvorila u purpurno crvenu posle kontakta i postepeno postala narandžasta u toku sledećih 30 minuta. Napredovanje reakcije je praćeno sa TLC i LCMS. Posle završetka (obrazovanje PFP estra), dodat je rastvor jedinjenje 151 (0.57 g, 0.33 mmol) u DMF. pH reakcije je prilagođen na pH = 9-10 dodavanjem N,N-Diizopropiletilamina (ukoliko je neophodno). Reakciona smeša je mešana pod azotom u toku ~ 30 min. Posle završteka, veći deo rastvarača je uklonjen pod sniženim pritiskom. Ostatak je razblažen sa CH2Cl2i ispran sa vodenim zasićenim NaHCO3, a zatim sa rastvorom soli. Organska faza je odvojena, osušena iznad MgSO4, proceđena, i koncentrovana do narandžastog sirupa. Ostatak je prečišćen sa hromatografijom na koloni sa silikagelom (2-10 % MeOH u CH2Cl2) da bi se dobilo jedinjenje 152 (0.35 g, 55 %). LCMS i<1>H NMR su konzistentni sa željenim proizvodom.
[0420] Jedinjenje 152 (0.35 g, 0.182 mmol) je rastvoreno u 1:1 MeOH/EtOAc (10 mL). Reakciona smeša je prečišćena uvođenjem mehurića struje argona kroz rastvor u toku 15 minuta. Dodat je Pearlman-ov katalizator (paladijum hidroksid na ugljeniku) (35 mg). Gas vodonika je uvođen u mehurićima kroz rastvor u toku 30 minuta. Pošto je završeno (TLC 10% MeOH u DCM, i LCMS), katalizator je uklonjen ceđenjem (Teflonski filter sa vrhom kao špric, 0.45 μm). Filtrat je koncentrovan sa rotacionim uparivačem, i kratko je osušen pod visokim vakumom da bi se dobilo jedinjenje 153 (0.33 g, kvantitativno). LCMS je konzistentan sa željenim proizvodom.
[0421] Jedinjenje 153 (0.33 g, 0.18 mmol) je rastvoreno u anhidrovanom DMF (5 mL) uz mešanje pod azotom. U ovo su dodati N,N-Diizopropiletilamin (65 µL, 0.37 mmol) i PFP-TFA (35 µL, 0.28 mmol). Reakciona smeša je mešana pod azotom u toku ~30 min. Reakciona smeša je tamno purpurna posle kontakta i postepeno je posatala naradžasta. pH reakcione smeše je odražavan na pH = 9-10 dodavanjem više N,-Diizopropiletilamina. Napredovanje reakcije je praćeno sa TLC i LCMS. Posle završetka, veliki deo rastvarača je uklonjenj pod sniženim pritiskom. Ostatak je razblažen sa CH2Cl2(50 mL), i ispran sa zasićenim vodenim NaHCO3, a zatim sa rastvorom soli. Organski sloj je osušen izand MgSO4, proceđen, i koncentrovan do narandžastog sirupa. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni i eluiran sa 2-10 % MeOH u CH2Cl2da bi se dobilo jedinjenje 154 (0.29 g, 79 %). LCMS i<1>H NMR su bili konzistentni za željeni proizvod.
[0422] Oligomerno jedinjenje 155, koje sadrži GalNAc3-6 konjugovanu grupu, je dobijeno pomoću opštih postupaka prikazanih u primeru 46. GalNAc3grupisani deo konjugovane grupe GalNAc3-6 (GalNAc3-6a) može biti kombinovana sa bilo kojim delom koji se da bi se dobile različite konjugovane grupe. U izvesnim izvođenjima, deo koji se cepa je -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-.
[0423] Struktura GalNAc3-6 (GalNAc3-6a-CM-) je prikazana dole:
Primer 56: Dozno-zavisno ispitivanje oligonukleotida koji sadrže ili 3’ ili 5’-konjugovanu grupu (upoređivanje GalNAc3-1, 2, 3, 5, 6, 7 i 10) koje ciljaju SRB-1 in vivo
[0424] Oligonukleotidi dole dati u listi su testirani u ispitivanju dozne-zavisnosti za antisens inhibiciju SRB-1 na miševima. Nekonjugovani ISIS 353382 je uključen kao standard. Svaka od različitih GalNAc3konjugovanih grupa je vezana za 5’ kraj odgovarajućeg oligonukleotida sa fosfodiestarski povezanim 2’-dezoksiadenozin nukleozidom (deo koji se cepa) osim za ISIS 655861 koji je imao GalNAc3konjugovanu grupu povezanu za 3’ kraj.
Tabela 42
(nastavak)
[0425] Velika slova označavaju nukleobazu za svaki nukleozid i<m>C označava na 5-metil citozin. Supskripti: "e" označava na 2’-MOE modifikovani nukleozid; "d" označava β-D-2’-dezoksiribonukleozid; "s" označava fosforotioatnu internukleozidnu vezu (PS); "o" označava fosfodiestarsku internukleozidnu vezu (PO); i "o"’ označava -O- P(=O)(OH)-. Konjugovana grupa je napisana masnim slovima.
[0426] Struktura GalNAc3-1aje prikazana ranije u primeru 9. Struktura GalNAc3-2aje prikazana ranije u primeru 37. Struktura GalNAc3-3aje prikazana ranije u primeru 39. Struktura GalNAc3-5aje prikazana ranije u primeru 49. Struktura GalNAc3-6aje ranije prikazana u primeru 51. Struktura GalNAc3-7aje ranije prikazana u prrimeru 48. Struktura GalNAc3-10aje prikazana ranije u primeru 46.
Postupak
[0427] Šest nedelja starim muškim Balb/c miševa (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) su subkutanozno jednom injektovani u dozama dole prikazanim sa ISIS 353382, 655861, 664507, 661161, 666224, 666961, 666981, 666881 ili fiziološkim rastvorom. Svaka tretirana grupa se sastojala od 4 životinje. Miševi su žrtvovani 72 sati posle poslednjeg davanja da bi se odredili nivoi SRB-1 iRNK u jetri pomoću PCR u realnom vremenu i RIBOGREEN® RNK kvantifikacionog reagensa (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) prema standarnim protokolima. Donji rezultati su prikazani kao srednja vrednost procenata nivoa SRB-1 iRNK za svaku tretiranu grupu, normalizovanih sa kontrolom rastvora soli .
[0428] Kao što je prikazano u tabeli 43, lečenje sa antisens oligonukleotidima je snizilo nivoe SRB-1 iRNK na dozno-zavisan način. Zaista, konjugovani antisens oligonukleotidi su pokazali suštinsko poboljšanje u dejstvu u poređenju sa nekonjugovanim antisens oligonukleotidom (ISIS 353382).
5’ konjugovani antisens oligonukleotid pokazali su blagi porast u dejstvu u odnosu na 3’ konjugovani antisens oligonukleotid.
Tabela 43
[0429] Nivoi transaminaze jetre, alanin aminotransferaza (ALT) i aspartat aminotransferaza (AST), u serumu su mereni relativno u odnosu na injektovani fiziološki rastvor miševima pomoću standardnog protokola. Ukupni bilirubin i BUN su takođe procenjivani. Promena u masi tela je procenjena bez značajne promene u odnosu na grupu sa fiziološkim rastvorom. ALTs, ASTs, ukupni bilirubin i BUN vrednosti su prikazane dole u tabeli 44.
1
Tabela 44
Primer 80: Antisens inhibicija in vivo sa oligonukleotidima koji ciljaju Alfa-1 Antitripsin (A1AT) koji sadrži GalNAc3konjugat
[0430] Oligonukleotidi izlistani dole u tabeli 72 su testirani u ispitivanju na dozno-zavisnu inhibiciju A1AT kod miševa<.>
2
Tabela 72
Struktura GalNAc3-1aje ranije prikazana u primeru 9, GalNAc3-3aprikazana u primeru 39, GalNAc3-7aje prikazana u primeru 48, GalNAc3-10aje prikazana u primeru 46, i GalNAc3-13aje prikazana u primeru 62.
Postupak
[0431] Svakom od šest nedelja starih muških C57BL/6 miševa (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) subkutanozno su injektovane jednom nedeljno dole prikazane doze, ukupno tri doze sa oligonukleotidima izlistanim u tabeli 72 ili sa PBS. Svaka tretirana grupa se sastojala od 4 životinje. Miševi su žrtvovani 72 sata posle poslednjeg davanja. Nivoi A1AT iRNK u jetri su određeni pomoću PCR u realnom vremenu i RIBOGREEN® RNK kvantifikacionom reagensom (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) prema standarnim protokolima. Nivoi A1AT proteina u plazmi su određeni pomoću Mišjeg Alfa 1-Antitripsin ELISA (katalog # 41-A1AMS-E01, Alpco, Salem, NH). Donji rezultati su prikazani kao srednja vrednost procenta A1AT iRNK jetre i nivoa proteina u plazmi za svaku tretiranu grupu, normalizovane prema PBS kontroli.
[0432] Kao što je prikazano u tabeli 73, lečenje sa antisens oligonukleotidima snižava A1AT iRNK jetre i nivoe A1AT proteina u plazmi na dozno-zavistan način. Oligonukleotidi koji sadrže GalNAc konjugat su bili značajno višeg dejstva nego osnovni (ISIS 476366).
Tabela 73
(nastavak)
[0433] Transaminaze jetre i BUN nivoi u plazmi su mereni u vreme žrtvovanja korišćenjem standardnih protokola. Telesna masa i mase organa su takođe merene. Rezultati su prikazanu dole u tabeli 74. Telesna masa je prikazana kao % u odnosu na osnovnu liniju. Mase organa su prikazane kao % telesne mase u odnosu na PBS kontrolnu grupu.
4
Tabela 74
(nastavak)
Primer 81: Trajanje dejstva in vivo oligonukleotida koji ciljaju A1AT koji sadrže GalNAc3klaster [0434] Oligonukleotidi izlistani u tabeli 72 su testirana u ispitivanju jedne doze na trajanje dejstva kod miševa.
Postupak
[0435] Svakom od šest nedelja starih muških C57BL/6 miševa je jednom subkutanozno injektovan ligonukleotid izlistanin u tabeli 72 ili sa PBS. Svaka tretirana grupa se sastojala od 4 životinje. Uzeta je krv jedan dan pre doziranja da bi se odredila osnovna linija i 5, 12, 19, i 25 dana posle doziranja. Nivoi A1AT proteina u plazmi su mereni pomoću ELISA (videti primer 80). Rezultati dole prestavljaju srednju vrenost procenta nivoa A1AT proteina u plazmi za svaki tretiranu grupu, normalizovane prema nivoima osnovne linije. Rezultati prikazuju da oligonukleotidi koji sadrže GalNAc konjugat su imali jače dejstvo i duže trajanje dejstva u odnosu na osnovni kome fali GalNAc konjugat (ISIS 476366). Pored toga, oligonukleotidi koji sadrže 5’-GalNAc konjugat (ISIS 678381, 678382, 678383, i 678384) su generalno bili jačeg dejstva i čak sa dužim trajanjem nego oligonukleotid koji sadrži 3’-GalNAc konjugat (ISIS 656326).
Tabela 75
(nastavak)
Primer 82: Antisens inhibicija in vitro sa oligonukleotidima koji ciljaju SRB-1 koji sadrži GalNAc3konjugat
[0436] Primarno mišji hepatociti jetre su zasejani na ploče sa 96 bunarčića po 15,000 ćelija/bunarčiću 2 sata pre tretmana. Oligonukleoitidi izlistani u tabeli 76 su dodati 2, 10, 50, ili 250 nM u Williams E medijum i ćelije su inkubirane u toku noći na 37 °C u 5% CO2. Ćelije su lizirane 16 sati posle dodavanja oligonukleotida, i ukupna RNK je prečišćena korišćenjem RNeaze 3000 BioRobot (Qiagen). Nivoi SRB-1 iRNK su određeni pomoću PCR u realnom vremenu i RIBOGREEN® RNK kvantifikacionog regensa (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) prema standardnim protokolima. IC50vrednosti su određene korišćenjem Prism 4 softvera(GraphPad). Rezultati pokazuju da oligonukleotidi koji sadrže raznovrsne različite GalNAc konjugovane grupe i raznovrsne različite delove su značajno jačeg dejstva u in vitro eksperimentu slobodnog preuzimanja u odnosu na osnovne oligonukleotide kojima nedostaje GalNAc konjugovana grupa (ISIS 353382 i 666841).
67 ela ab
)vaksta(na
k)va sta(na
)kavaast (n
Struktura GalNAc3-1aje ranije prikazana u primeru 9, GalNAc3-3aje prikazana u primeru 39, GalNAc3-5aje prikazana u primeru 49, GalNAc3-6aje prikazana u primeru 51, GalNAc3-7aje prikazana u primeru 48, GalNAc3-8aje prikazana u primeru 47, GalNAc3-9aje prikazana u primeru 52, GalNAc3-10akao što je prikazana u primeru 46, GalNAc3- 12aje prikazana u primeru 61, GalNAc3-13aje prikazana u primeru 62, GalNAc3-14aje prikazana u primeru 63, GalNAc3-15aje prikazana u primeru 64, GalNAc3-17aje prikazana u primeru 68, GalNAc3-18aje prikazaan u primeru 69, GalNAc3-19aje prikazana u primeru 70, GalNAc3-20aje prikazana u primeru 71, i GalNAc3-23aje prikazana u primeru 76.
Primer 83: Antisens inhibicija in vivo oligonukleotidima koji ciljaju faktor XI koji sadrže grupisani GalNAc3
[0437] Oligonukleoitidi izlistani dole u tabeli 77 su testirani u ispitivanju na dozno-zavisnu inhibiciju faktora XI kod miševa.
Tabela 77
Struktura GalNAc3-1aje prikazana up rimeru 9, GalNAc3-3aje prikazana u primeru 39, GalNAc3-7aje prikazana u primeru 48, GalNAc3-10aje prikazana u primeru 46, i GalNAc3-13aje prikazana u primeru 62.
Postupak
[0438] Šest do osam nedelja stari miševi su svaki bili injektovani subkutanozno jednom nedeljnom
1 2
u dozi prikazanoj dole, za ukupno tri doze, sa ologonukleotidima dole izlistanim ili sa PBS. Svaka tretirana grupa se sastojala od 4 životinje. Miševi su žrtvovani 72 sata posle krajnje doze. Nivoi Faktora XI iRNK jetre su mereni pomoću PCR u realnom vremenu i normalizovani prema ciklofilinu prema standardnim protokolima. Jetrena transaminaza, BUN, i bilirubin su bili takođe mereni. Donji rezultati su prikazani kao srednja vrednost procenta za svaku tretiranu grupu, normalizovani prema PBS kontroli.
[0439] Kao što je prikazano u Tabeli 78, tretiranje sa antisens oligonukleotidima je smanjilo iRNK faktora XI jetre na dozno-zavistan način. Rezultati pokazuju da oligonukleotidi koji sadrže GalNAc konjugat su jačeg dejstva nego osnovni kojima nedostaje GalNAc konjugat (ISIS 404071). Pored toga, oligonukleotidi koji sadrže 5’-GalNAc konjugat (ISIS 663086, 678347, 678348, i 678349) su čak jačeg dejstva nego oligonukleotidi koji sadrže 3’- GalNAc konjugat (ISIS 656173).
Tabela 78
Primer 84: Trajanje dejstva in vivo oligonukleotida koji ciljaju faktor XI koji sadrži GalNAc3konjugat
[0440] Oligonukleoitidi izlistani u tabeli 77 su testirani u jednoj dozi na trajanje dejstva na miševima.
1
Postupak
[0441] Svaki od šest do osam nedelja starih miševa je injektovan jednom subkutanozno sa oligonukleotidom izlistanim u tabelali 77 ili sa PBS. Svaka grupa za tretiranje se sastojala od 4 životinje. Krv je uzeta iz repa dan pre doziranja da bi se odredila osnovna linija i 3, 10, i 17 dana posle doze. Nivoi proteina faktora XI u plazmi su mereni sa ELISA korišćenjem antitela koja vezuju Faktor XI i biotinilovanim detekcionim antitelima od R & D Systems, Minneapolis, MN (catalog # AF2460 i # BAF2460, respektivno) i OptEIA Reagensa Set B (katalog # 550534, BD Biosciences, San Jose,CA). Donji rezultati su prikazani kao srednja vrednost procenta nivoa proteina faktora XI u plazmi za svaku tretirnanu grupu normalizovanu prema nivoima osnovne linije. Rezultati pokazuju da oligonukleotidi koji sadrže GalNAc konjugat su jačeg dejstva sa družim trajanjem od osnovnog kome nedostaje GalNAc konjugat (ISIS 404071). Pored toga, oligonukleotidi koji sadrže 5’-GalNAc konjugat (ISIS 663086, 678347, 678348, i 678349) čak su bili jačeg dejstva sa čak sa dužim trajanjem od oligonukleotida koji sadrže 3’-GalNAc konjugat (ISIS 656173).
Tabela 79
1 4
Primer 93: Antisens inhibicija in vivo sa nukleotidima koji ciljaju SRB-1 koji sadrže mešovita "krila" i 5’-GalNAc3konjugat
[0442] Oligonukleoitidi izlistani u tabeli 100 su testirani pri ispitivanju dozno zavisnosti za antisens inhibiciju SRB- 1 kod miševa.
Tabela 100
(nastavak)
Struktura GalNAc3-3aje ranije prikazana u primeru 39, i struktura GalNAc3-7aje ranije prikazana u Primer 48. Supskripti: "e" ukazuje na 2’-MOE modifikovani nukleozid; "d" ukazuje na β-D-2’-dezoksiribonukleozid; "k" ukazuje na 6’-(S)-CH3biciklični nukleozid (cEt); "s" ukazuje na fosforotioatne internukleozidne veze (PS); "o" označava fosfodiestarske internukleozidne veze (PO). Supersript "m" označava 5-metilcitozine.
Postupak
[0443] Šest do osam nedelja starim C57BL/6 miševima (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) su jednom subkutanozno injektovana doza dole prikazana sa oligonukleotidima izlistanim u Tabeli 100 ili fiziološki rastvor. Svaka grupa za tretiranje se sastojala od 4 životinje. Miševi su žrtvovani 72 sata posle poslednjeg. Nivoi SRB-1 iRNK u jetri su mereni pomoću PCR u realnom vremenu. SRB-1 iRNK nivoi su normalizovani prema nivoima iRNK ciklofilina prema standardnim protokolima. Rezultat su prikazani kao srednja vrednost procentna nivoa SRB-1 iRNK za svaku tretiranu grupu u odnosu na kontrolu grupu tretiranu fiziološkim rastvorom. Kao što je prikazano u tabeli 101,
1
tretiranje sa antisens oligonukleotidima je snizilo nivoe SRB-1 iRNK na dozno-zavistan način, i gapmer oligonukleotidi koji sadrže GalNAc konjugat i imaju "krila" koja su ili sva cEt ili mešovite šećerne modifikacije su bili zančanojno jačeg dejstva u odnosu na osnvni oligonukleotid kome nedostaje konjugat i sadrži sva cEt modifikovana "krila".
[0444] Telesne mase, transaminaze, ukupni bilirubin, i BUN su bili takođe mereni i srednje vrednosti za svaku tretiranu grupu su prikazane u tabeli 101. Telesna masa je prikazana kao srednja vrednost procenta telesne mase u odnosu na osnovnu liniju telesne mase (% BL) merene upravo pre oligonukleotidne doze.
Tabela 101
(nastavak)
1
Primer 95: Antisens inhibicije in vivo sa oligonukleotidima koji ciljaju SRB-1 koji sadrži biciklični nukleozide i 5’-GalNAc3konjugate
[0445] Oligonukleoitidi izlistani u tabeli 104 su testirani u ispitivanju dozno-zavisnosti za antisens inhibiciju SRB- 1 kod miševa.
Tabela 104
Supskript "g" označava fluoro-HNA nukleozid, supskript "1" označava zaključani nukleozid koji sadrži 2’-O-CH2-4’ most. Videti primer 74 legendu tabela za druge skraćenice. Struktura GalNAc3-1aje ranije prikazana u primeru 9, struktura GalNAc3-3aje prikazana u primeru 39, i struktura GalNAc3-7a je prikazana u primeru 48.
Postupak
[0446] Ispitivanje je završeno korišćenjem protokola opisanog u primeru 93. Rezultati su prikazani dole u tabeli 105 i pokazuju da oligonukleotidi koji sadrže GalNAc konjugat i različite modifikacije bicikličnog nukleozida su značajno jačeg dejstva od osnovnog oligonukleotida kome nedostaje konjugat i koji sadrži modifikacije bicikličnog nukleozida. Pored toga, oligonukleotid koji sadrži GalNAc konjugat i fluoro-HNA modifikacije je bio značajno jačeg dejstva od osnovnog kome nedostaje konjugat i koji sadrži fluoro-HNA modifikacije. Rezultati telesne mase, transaminaza jetre, ukupnog bilirubina i BUN merenja ukazuju da su jedinjenja sva dobro tolerisana.
1
Tabela 105
Primer 96: Vezivanje proteina plazme antisens oligonukleotida koji sadrže GalNAc3konjugovanu grupu
[0447] Oligonukleotidi izlisati u tabelama 70 koji ciljaju ApoC-III i oligonukleotidi u tabeli 106 koji ciljaju Apo(a) su testirani testom ultra-filtracije u cilju procene vezivanja proteina plazme.
Tabela 106
1
Videti primer 74 za legendu tabele. Struktura GalNAc3-7a je prikazana ranije u primeru 48.
[0448] Ultrafree-MC ultrafiltracione jedinice (30,000 NMWL, regenerisane celulozne membrane sa niskim vezivanjem, Millipore, Bed ford, MA) su prethodno tretirane sa 300 µL 0.5% Tween 80 i centrifugirane na 2000 g u toku 10 minuta, zatim sa 300µL rastvora 300 µg/mL kontrolnog oligonukleotida u H2O i centrifugirane na 2000 g u toku 16 minuta. U cilju procene nespecifičnog vezivanja za filtere svakog testiranog oligonukleotida iz tabela 70 i 106 za korišćenje u ispitivanjima, 300 0518µL 250 ng/mL rastvora oligonukleotida u H2O na pH 7.4 je smešteno u filtere prethodno tretirane i centrifugirane na 2000 g u toku 16 minuta. Nefiltrirani i filtrirani uzorci su analizirani sa ELISA testom da bi se odredile oligonukleotidne konentracije. Tri replikata su korićena da bi se dobila srednja koncentracija svakog uzorka. Srednja koncentracija proceđenog uzorka u odnosu na nefiltriranei uzorak je korisšćena da se odredi procenat oligonukleotida koji je regenerisan preko filtera bez prisustva plazme (% regeneracije).
[0449] Zamrznuti uzorci cele plazme su sakupljeni u K3-EDTA od normalnih, humanih dobrovoljaca koji ne uzimaju lekove, cinomolgus majmuna, i CD-1 miševa, koji su nabavljeni kod Bioreclamation LLC (Westbury, NY). Testirani oligonukleotidi su dodati u 1.2 mL alikvota plazme u dve koncentracije (5 i 150 µg/mL). Alikvot (300 µL) svakog obogaćenog uzorka plazme je smešten u prethodno tretirane jedinice za filtriranje i inkubiran na 37°C u toku 30 minuta, neposredno zatim centrifugoran na 2000 g u toku 16 minuta. Alikvoti proceđenih i neproceđenih obogaćenih uzoraka plazme su analizrani sa ELISA da se odrede koncentracije oligonukleotida u svakom uzorku. Tri replike po koncentraciji su korišćene da se odredi srednja vrednost procenta vezivanje i nevezivanja oligonukleotida u svakom uzorku. Srednja koncentracija proceđenog uzorka u odnosu na koncentraciju neproceđenog uzorka je korišćena da se odredi procenat oligonukleotida u plazmi koji nije vezan za proteine u plazmi (% nevezivanja). Krajnje vrednosti nevezanog oligonukleotida su korigovae za nespecifično vezivanje deljenjem % nevezenog sa % regenerisanog za svaki oligonukleotid. Krajnji % vrednosti vezanog oligonukleotida su određene sa oduzimanjem krajnjeg % nevezanih vrednosti od 100. Rezultati su prikazani u tabeli 107 za dve koncentracije testiranih oligonukleotida (5 i 150 µg/mL) u svakoj vrsti plazme. Rezultati pokazuju da GalNAc konjugovana grupa nema značajan uticaj na vezivanje proteina plazme. Pored toga, oligonukleotidi sa svim PS internukleozidnim vezama i mešvovitim PO/PS vezama oba vezuju proteine plazme, a oni sa svim PS vezma vezuju proteine u većem procentu od onih sa mešovitim PO/PS vezama.
1
Tabela 107
Primer 98: Procena pro-inflamatornih efekata oligonukleotida koji sadrže GalNAc konjugat u hPMBC testu
[0450] Oligonukleoitidi izlistani u tabeli 109 i testirani su na pro-inflamatorne efekte u hPMBC testu kao što su opisani u primerima 23 i 24. (videti tabele 30, 83, 95, i 108 za opis oligonukleotida.) ISIS 353512 je visoko odzivno jedinjenje koje je korišćeno kao pozitivna kontrola i ostali oligonukleotidi su opisani u tabelama 83, 95, i 108. Rezultati prikazani u tabeli 109 su dobijeni korišćenjem krvi iz jednog volonetra donora. Rezultati pokazuju da oligo nukleotid i koji sadrže mešovite PO/PS internukleozidne veze proizvode značajno manji pro-inflamatorni odgovor u poređenju sa istim oligonukleotidima koji imaju sve PS veze. Pored toga, GalNAc konjugovana grupa nema značajan efekat na ovaj test.
Tabela 109
Primer 99: Afiniteti vezivanja oligonukleotida koji sadrže GalNAc konjugat za asialoglikoproteinski receptor
[0451] Afiniteti vezivanja oligonukleoitida izlistani u tabeli 110 (videti tabelu 76 za opis oligonukleotida) za asialoglikoproteinski receptor testtirani su u kompetativnom testu vezivanja za receptor. Kometitivni ligand, α1-kiselinski glikoprotein (AGP), je inkubiran u 50 mM pufera natrijum acetata (pH 5) sa 1 U neuraminidaznom-agarozom u toku 16 sati na 37°C, i > 90% desijalilacija je potvrđena sa ili testom za sijalinsku kiselinu ili ekskluzionom hromatografijom prema veličini (engl.size exclusion chromatography-SEC). Jod monohlorid je korišćen za jodovanje AGP prema postupku Atsma et al. (videti J Lipid Res.1991 Jan; 32(1):173-81.) U ovom postupku,
11
desijalilovani α1-kiseli glikoprotein (de-AGP) je dodat u 10 mM jod hlorid, Na<125>I, i 1 M glicin u 0.25 M NaOH. Posle inkubacije u toku 10 minuta na sobnoj temperaturi,<125>I -obeleženi de-AGP je odvojen iz slobodnog<125>I koncentrovanjem smeše dva puta korišćenjem 3 KDMWCO spin kolone. Protein je testiran za efikasnost obeležavanja i čistoću na HPLC sistemu snabdevenom sa Agilent SEC-3 kolonom (7.8x300mm) i β-RAM brojačem. Kompeticioni eksperimenti u kojima je korišćen<125>I -obeležen de-AGP i različite GalNAc-klastere koji sadrže ASOs su izvedeni kao što sledi. Humane HepG2 ćelije (10<6>ćelija/ml) je zasejano na ploče sa 6-bunarčića u 2 ml odgovarajućeg medijum za rast. MEM medijum obogaćen sa 10% fetalnim goveđim serumom (FBS), 2 mM L-Glutaminom i 10mM HEPES je korišćen. Ćelije su inkubirane 16-20 sati @ 37°C sa 5% i 10% CO2respektivno. Ćelije su isprane sa medijumom sa FBS pre eksperimenta. Ćelije su inkubirane u toku 30 min @37°C sa 1ml kompeticione smeše koja sadrži odgovarajući medijum za rast sa 2% FBS, 10<-8>M<125>I - obeleženi de-AGP i GalNAc-grupisanja koji sadrže containing ASOs u koncentracionim opsezima od 10<-11>do 10<-5>M. Nespecifično vezivanje je određeno uprisutvu 10<-2>M GalNAc šećera. Ćelije su isprane dva puta sa medijumom bez FBS da se ukloni nevezani<125>I -obeleženi de-AGP i kompetitor GalNAc ASO. Ćelije su lizirane pomoću Qiagen’s RLT pufera koji sadrži 1% βmerkaptoetanol. Lizati su premešteni u epruvete sa okruglim dnom posle kratkog 10 min ciklusa smrzavanja/otapanja i testirana na γ-brojaču. Nespecifčno vezivanje je oduzeto pre deljenja<125>I proteinske vrednosti sa vrednošću najniže intenziteta konventracije GalNAc-ASO. Inhibicione krive su uklapane prema jednačini vezivanja za jedno mesto kompeticije pomoću algoritma nelinearne regresije da bi se izračunali afiniteti vezivanja (KD’s).
[0452] Rezultati u tabelama 110 su dobijeni iz eksperimenta izvedenih u pet različitih dana . Rezultati za oligonukleotide su obeleženi sa superskriptom "a" su srednja vrednost eksperimenata izvedenih dva različita dana. Rezultati pokazuju da oligonukleotidi koji sadrže GalNAc konjugovanu grupu na 5’-kraju vežu asialoglikoproteinski receptor na humanim HepG2 ćelijama sa 1.5 do 16-puta većim afinitetom od oligonukleotida koji sadrže GalNAc konjugovanu grupu na 3’-kraju.
Tabela 110
Primer 101: Antisens inhibicija sa oligonukleotidima koji sadrže GalNAc klastere pomoću stabilnog dela
[0453] Oligonukleoitidi izlistani u tabeli 112 su testirani na inhibiciju mišje APOC-III ekspresije in vivo. Svakom od C57B1/6 miševa je subkutanozno jednom injektovan oligonukleotid izlistan u Tabeli 112 ili PBS. Svaka grupa za tretiranje se sastojala od 4 životinje. Svaki miš tretiran sa ISIS 440670 primio je dozu 2, 6, 20, ili 60 mg/kg. Svaki miš tretiran sa ISIS 680772 ili 696847 je primio 0.6, 2, 6, ili 20 mg/kg. GalNAc konjugovana grupa ISIS 696847 je vezana pomoću stabilnog dela, fosforotioatnom vezom umesto vezom koja sadrži fosfodiestarsku koja se lako cepa. Životinje su žrtvovane 72 sata posle doze. Nivoi APOC-III iRNK u jetri su mereni korišćenjem PCR u realnom remenu. APOC-III iRNK nivoi su normalizovanai prema nivoima iRNK ciklofilina prema standardnim protokolima. Rezultati su prikazani u tabeli 112 kao srednja vrednost procenta nivoa APOC-III iRNK za svaku tretiranu grupu u odnosi na kontrolu grupu sa fiziološkim rastvorom. Rezultati pokazuju da oligonukleotidi koji sadrže GalNAc konjugovanu grupu su značajno jačeg dejstva nego oligonukleotidi kojima nedostaje konjugovana grupa. Pored toga, oligonukleotid sadrži GalNAc konjugovanu grupu koja je vezana za oligonukleotid pomoću dela koji se cepa (ISIS 680772) koji ima čak još više dejstvo nego oligonukleotid koji sadrži GalNAc konjugovanu grupu vezanu za stabilni deo (ISIS 696847).
Tabela 112
Struktura GalNAc3-7aje prikazana u primeur 48.
Primer 113: Antisens inhibicija in vivo sa oligonukleotidima koji ciljaju CFB
[0454] Oligonukleoitidi izlistani u tabeli 121 su testirani u dozno-zavisnom ispitivanju antisens inhibicije humanog faktora B komplementa (CFB) kod miševa.
Tabela 121
Struktura GalNAc3-3aje prikazana ranije u primeru 39.
Postupak
[0455] Transgenim miševima koji eksprimuju humani CFB (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) je subkutanozno injektovano jednom nedeljno u toku 3 nedelje (ukupno 4 doze) oligonukleotida izlistanih u Tabeli 122 ili fiziološkog rastvora. Četiri tretirane grupe koje su primile ISIS br.588540 dato im je 6, 12, 25, ili 50 mg/kg po dozi. Četiri tretirane grupe koje su primile ISIS br.687301 dato im je 0.25, 0.5, 2, ili 6 mg/kg po dozi. Svaka grupa za tretiranje se sastojala od 4 životinje. Miševi su žrtvovani 2 dana posle poslednjeg davanja da bi se odredili nivoi humanog CFB jetre i bubrega i nivoi iRNK ciklofilina korišćenjem PCR-u realnom vremenu prema standardnim protokolima. Nivoi CFB iRNK su normalizovani prema nivoima ciklofilina i prosečene vrednosti svake tretirane grupe su korišćene za određivanje doza koja postiže 50% inhibicije humane CFB transcripcione ekspresije (ED50). Rezultati su srednja vrednost četiri eksperimenta završena sa dva različita seta proba prajmera i prikazani su u tabeli 122.
Tabela 122
[0456] Nivoi transaminaza jetre, alanin aminotransferaze (ALT) i aspartat aminotransferaze (AST), u serumu su merene u odnosu na miševe kojima je injektovan fiziološki rastvor pomoću standarnih protokola. Ukupni bilirubin, BUN, i telesne mase su takođe procenjivane. Rezultati pokazuju da ne postoji zančajni promena u bilo kojoj tretiranoj grupu u odnosu grupu koja je tretirana fiziološkim rastvorom (podaci nisu pokazani), ukazujući da su oba nukleotida veoma dobro tolerisana.
Primer 114: Antisens inhibicija in vivo sa oligonukleotidima koji ciljaju CFB
[0457] Oligonukleoitidi izlistani u tabeli 123 su testirani u dozni-zavisnom ispitivanju antisens inhibicije humanog CFB kod miševa.
11
Postupak
[0458] Transgenim miševima koji eksprimuju humani CFB (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) je subkutanozno injektovano jednom 0.6, 1, 6, ili18 mg/kg oligonukleotida izlistanih u tabeli 123 ili fiziološki rastvor. Svaka tretirana grupa se sastojala od 4 ili 5 životinjas. Miševi su žrtvovani 72 sata posle doze da se odrede nivoi humanog CFB jetre i iRNK ciklofilina pomoću PCR u realnom vremenu prema standardnim protokolima. Nivoi CFB iRNK su normalizovi prema nivoima ciklofilina, i srednje vrednosti za svaku tretiranu grupu su korišćene da se odredi doza koja postiže 50% inhibicije humane CFB transkripcione ekspresije (ED50). Rezultati su prikazani u tabeli 123.
Tabela 123
Struktura GalNAc3-7aje ranije prikazana u primeru 48.
Primer 115: Antisens inhibicija humanog faktora B komplementa (CFB) u HepG2 ćelijama sa MOE gapmera
[0459] Antisens oligonukleotidi su napravljeni da ciljaju nukleinsku kiselinu humanog faktora B komplementa (CFB) i testirani su na njihovo dejstvo na CFB iRNK in vitro. Antisens oligonukleotidi su testirani u serijama eksperimenta koji imaju sličene uslove za kulture. Rezultati za svaki eksperimet su prikazani u odvojeni tablema koje su dole prikazane. Kultivisane HepG2 ćelije pri gustini od 20,000 ćelija po bunarčiću su transfektovane pomoću elektroporacije sa 4,500 nM antisens oligonukleotidom. Posle perioda tretiranja približno 24 sata, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi CFB iRNK su mereni sa kvantitativnom PCR u realnom vremenu. Set probe humanog prajmera RTS3459 (napredna sekvenca AGTCTCT-GTGGCATGGTTTGG, označena ovde kao SEQ ID NO: 810; reverzna sekvenca GGGCGAATGACTGAGATCTTG, označena ovde kao SEQ ID NO: 811; sekvenca probe TACCGATTACCACAAGCAACCATGGCA, označena ovde kao SEQ ID NO: 812) je korišćena za merenje nivoa iRNK. Nivoi CFB iRNK su prilagođeni prema ukupnom RNK sadržaju, kako je mereno sa RIBOGREEN®. Rezultati su prikazani kao procentna inhibicija CFB, relativno na netretirane kontrolne ćelije<.>
[0460] Novodizajnirani himerni antisens oligonukleotidi dole u tabelama su bili napravljeni kao 5-10-5 MOE gapmeri.5-10-5 MOE gapmeri su dužine 20 nukleozida, gde centralni segment razmaka sadrži deset 2’-dezoksinukleozida i okružen je segmentima"krila" u 5’ smeru i 3’ smeru koji sadrže pet nukleozida svaki. Svaki nukleozid u 5’ segmentu "krila"i svaki nukleozid u 3’ segmentu "krila" ima 2’-MOE modifickaciju. Internukleozidne veza kroz svaki gapmer su fosforotioatne (P=S) veze. Svi citozinski ostaci kroz gapmer su 5-metilcitozini. "Start mesto" označava većinom 5’ nukleozid za koji gapmer cilja u humanoj sekvenci gena. "Stop mesto" označava većinom 3’ nukleozid za koji gapmer je ciljao humanoj sekvenci gena. Svaki gapmer izlistan dole u tabelama je ciljao u ili humanu CFB iRNK, označenu ovde kao SEQ ID NO: 1 (GENBANK pristupni br. NM _001710.5) ili humanu CFB genomsku sekvencu, označenu ovde kao SEQ ID NO: 2 (GENBANK pristupn br. NT_007592.15 skraćenu od nukleotida 31852000 so 31861000),ili oba. ’n/a’ označava da antisens oligonukleotid ne cilja određenu sekvencu gena sa 100% komplementarnošću.
Tabela 124
(nastavak)
11
(nastavak)
11
(nastavak)
11
Tabela 125
(nastavak)
11
11
12
(nastavak)
Tabela 126
(nastavak)
(nastavak)
12
(nastavak)
Tabela 127
(nastavak)
12
(nastavak)
12
(nastavak)
12
(nastavak)
12
(nastavak)
12 Tabela 128
(nastavak)
1
(nastavak)
11
(nastavak)
12
1
Primer 116: Antisens inhibicija humanog faktora B komplementa (CFB) u HepG2 ćelijama sa MOE gapmerima
[0461] Dodatni antisens oligonukleotidi su napravljeni za ciljanje nukleinske kiseline humanog faktora B komplementa (CFB) i testriani na njihovu efikasnonst za CFB iRNK in vitro. Kultivisane HepG2 ćelije pri gustini 20,000 ćelija po bunarčiću su transfektovane pomoću elektroporacije sa 4,500 nM antisens oligonukleotidom. Posle perioda tertiranja od približno 24 sata, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi CFB iRNK su mereni kvativativnom PCR u realnom vremenu. Set humanih
1 4
prajmer proba RTS3460_MGB (napredna sekvecna CGAAGCAGCTCAATGAAATCAA, označena ovde kao SEQ ID NO: 813; reverzna sekvenca TGCCTGGAGGGCCTTCTT, označena ovde kao SEQ ID NO: 814; sekvenca probe AGACCACAAGTTGAAGTC, označena ovde kao SEQ ID NO: 815) je korišćena za merenje nivoa iRNK. Nivoi CFB iRNK su prilagođeni prema ukupnom sadržaju RNK, merenom sa RIBOGREEN®. Rezultati su prikazani kao procentna inhibicija CFB, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0462] Novonapravljeni himerni antisens oligonukleotidi u donjim tabelama su označeni kao 5-10-5 MOE gapmeri.5-10-5 MOE gapmeri su dugi 20 nukleozida, gde centralni segment razmaka sadrži deset 2’-dezoksinukleozida i okružen je segmentima "krila" u 5’ smeru i 3’ smeru koji sadrži svaki pet nukleozida. Svaki nukleozid u 5’ segmentu"krila" i svaki nukleozid u 3’ segmentu "krila" ima 2’-MOE modifikacije. Internukleozidne veze kroz svaki gapmer su fosforotioatne (P=S) veze. Svi ostaci citozina kroz svaki gapmer su 5-metilcitozini. "Start mesto" označava većinom 5’ nukleozid koji gapmer cilja u humanog genskoj sekvenci. "Stop mesto" označava većinom 3’ koji gapmer cilja u humanoj genskoj sekvenci. Svaki gapmer izlistan u donjim tabelama cilja ili humanu CFB iRNK, označenu ovde kao SEQ ID NO: 1 (GENBANK pristupni No. NM_001710.5) ili humanu CFB genomsku sekvencu, označenu ovde kao SEQ ID NO: 2 (GENBANK pristupni broj. NT_007592.15 skraćenu od nukleotida 31852000 do 31861000), ili oba. ’n/a’ ukazuje da antisens oligonukleotid ne cilja tu posebnu gensku sekvencu sa 100% komplementarnošću.
Tabela 129
1
(nastavak)
1 (nastavak)
1
Primer 117: Antisens inhibicija humananog faktora B komplementa (CFB) u HepG2 ćelijama sa MOE gapmerima
[0463] Dodatni antisens oligonukleotidi su napravljeni da ciljaju nukleinsku kiselinu humanog faktora B komplemnta (CFB) i testirani su na njihovo dejstvo na CFB iRNK in vitro. Antisens oligonukleotidi su testirani u serijama eksperimenata koji imaju slične uslove za kulture. Rezultati za svaki eksperiment su prikazani dole na odvojenim tabelama. Kultivisane HepG2 ćelije pri gustini od 20,000 ćelija po bunarčiću su transfektovene pomoću elektroporacije sa 5,000 nM antisens oligonukleotidom. Posle perioda tretiranja od približno 24 sata, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi CFB iRNK su mereni sa kvantitativnom PCR u realnom vremenu. Set humanih prajmer proba RTS3459 je korišćen za merenje nivoa iRNK. CFB iRNK nivoi su prilagođeni prema ukupnom sadržaju RNK, kako je mereno sa RIBOGREEN®. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije CFB, relativno u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0464] Novo dizajnirani himerni antisens oligonukleotidi u donjim tabelama su označeni kao 5-10-5 MOE gapmeri. Gapmeri su dugački 20 nukleozida, gde centralni segment razmaka sadrži deset 2’-dezoksinukleozida i okružen je segmentima "krila" u 5’ smeru i 3’ smeru koji sadrže svaki pet nukleozida. Svaki nukleozid u 5’ segmentu "krila" i svaki nukleozid u 3’ segmentu "krila" ima 2’-MOE modifikacije. Inter-nukleozidne veze kroz svaki gapmer su fosforotioatne (P=S) veze. Svi ostaci citozina kroz svaki gapmer su 5-metilcitozini. "Start mesto" označava većinom 5’ nukleozid koji gapmer cilja u humanoj genskoj sekvenci. "Stop mesto" označava većinom 3’ nukleozid koji gapmer cilja u humanoj genskoj sekvenci. Svaki gapmer izlistan dole u tabelama cilja ili humanu CFB iRNK, označenu ovde kao SEQ ID NO: 1 (GENBANK pristupni br. NM_001710.5) ili humanu CFB genomsku sekvencu, označenu ovde kao SEQ ID NO: 2 (GENBANK pristupni br. NT_007592.15 skraćeni nukleotidi 31852000 do 31861000), ili oba. ’n/a’ ukazuje da antisens oligonukleotid ne cilja tu posebnu gensku sekvencu sa 100% komplementarnošću. U slučaju da poravnanje sekvence za ciljni gen u određenoj tabeli nije prikazano, i razume sa da ni jedan od prikazanih oligonukleotida u toj tabeli nije poravnat sa 100% komplementarnošću sa ciljnim genom.
1
Tabela 130
1
14
Tabela 131
14
(nastavak)
Primer 118: Antisens inhibicija humanog faktora B komplementa (CFB) u HepG2 ćelijama sa MOE gapmerima
[0465] Antisens oligonukleotidi su napravljeni da ciljaju nukleinsku kiselinu humanog faktora B komplemenata (CFB) i testirani su na njihova dejstva na CFB iRNK in vitro. Antisens oligonukleotidi su testirani u serijama eksperimenata koji imaju sliče uslove za kulture. Rezultati za svaki eksperiment su dole prikazani u odvojenim tabelama. Kultivisane HepG2 ćelije sa gustinom od 20,000 ćelija po bunarčiću su transfektovane pomoću elektroporacije sa 3,000 nM antisens oligonukleotidom. Posle perioda tretiranja od približno 24 sata, RNK je izolovan iz ćelija i CFB iRNK su mereni sa kvantitativnom PCR u realnom vremenu. Setovi humanih prajmera proba RTS3459 su korišćeni za merenje nivoa iRNK. Nivoi CFB iRNK su prilagođeni prema ukupnom sadržaju RNK, kao što je mereno RIBOGREEN®. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije CFB, relativno u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0466] Novonapravljeni himerni antisens oligonukleotidi dole u tabelama su označeni kao 4-8-5 MOE, 5-9-5 MOE, 5-10-5 MOE, 3-10-4 MOE, 3-10-7 MOE, 6-7-6- MOE, 6-8-6 MOE, ili 5-7-5 MOE gapmeri, ili kao dezoksi, MOE, i (S)-cEt oligonukleotidi.
[0467] 4-8-5 MOE gapmeri su dugački 17 nukleozida, gde centralni segment razmaka sadrži osam 2’- dezoksinukleozida i okružen je segmentima "krila" u 5’ smeru i 3’ smeru koji sadrže četiri i pet nukleozida respektivno. 5-9-5 MOE gapmeri su dugački 19 nukleozida, gde centralni segment razmaka sadrži devet 2’-dezoksinukleozida i okružen je segmentima "krila" u 5’ smeru i 3’ smeru gde svaki sadrži pet nukleozida.5-10-5 MOE gapmeri su dugi 20 nukleozida, gde centralni segment razmaka sadrži deset 2’-dezoksinukleozida i okružen je segmentima "krila" u 5’ smeru i 3’ smeru gde svaki sadrži pet nukleozida. 5-7-5 MOE gapmeri su dužine 17 nukleozida, gde centralni segment razmaka sadrži sedam 2’-dezoksinukleozida i okružen je segmentima "krila" u 5’ smeru i 3’ smeru gde svaki sadrži pet nukleozida.3-10-4 MOE gapmeri su dugi 17 nukleozida, gde centralni segment razmaka sadrži deset 2’-dezoksinukleozida i okružen je segmentima "krila" u 5’ smeru i 3’ smeru koji sadrže tri i četiri nukleozida respektivno. 3-10-7 MOE gapmeri su dužine 20 nukleozida, gde centralni segment razmaka sadrži deset 2’-dezoksinukleozida i okružen je segmentima "krila" u 5’ smeru i 3’ smeru koji sadrže tri i sedam nukleozida respektivno.6-7-6 MOE gapmeri su dužine 19 nukleozida, gde centralni segment razmaka sadrži sedam 2’-dezoksinukleozida i okružen je segmentima "krila" u 5’ smeru i 3’ smeru gde svaki sadrži šest nukleozida. 6-8-6 MOE gapmeri su dužine 20 nukleozida, gde centralni segment razmaka sadrži osam 2’-dezoksinukleozida i okružen je segmentima "krila" u 5’ smeru i 3’ smeru gde svaki sadrži šest nukleozida. Internukleozidne veze kroz svaki gapmer su fosforotioatne (P=S) veze. Svi ostaci citozina kroz svaki gapmer su 5-metilcitozini.
[0468] Dezoksi, MOE i (S)-cEt oligonukleotidi su dužine 16 nukleozida gde nukleozid ima ili MOE šećerni deo, (S)-cEt šećernu modifikaciju ili modifikaciju. Kolona ’Hemija’ opisuje modifikacije šećra svakog oligonukleotida. ’k’ označava (S)-cEt šećernu modifikaciju; ’d’ ukazuje na dezoksiribozu; i ’e’ označava MOE modifikaciju.
[0469] "Start mesto" označava većinom 5’ nukleozid za koji gapmer cilja u humanoj genskoj sekvenci. "Stop mesto" označava većinom 3’ nukleozid na koji gapmer cilja u humanoj genskoj sekvenci. Svaki gapmer izlistan dole u tabelama cilja ili humanu CFB iRNK, označenu ovde kao SEQ ID NO: 1 (GENBANK pristupni br. NM_001710.5) ili humanu CFB genomsku sekvencu, označenu ovde kao SEQ ID NO: 2 (GENBANK pristupni br. NT_007592.15 skraćeno od nukletida 31852000 do 31861000), ili obe. ’n/a’ označava da antisens oligonukleotid ne cilja određenu gensku sekvencu sa 100% komplementarnošću.
14
Tabela 133
1
11
12
1
134la be Ta
5 13la be Ta
136
la
eb
Ta
81
37
1la be
Ta
Primer 119: Antisens inhibicija humanog faktora B komplementa (CFB) u HepG2 ćelijama sa MOE gapmerima
[0470] Dodatni antisens oligonukleotidi su bili napravljeni da ciljaju nukleinsku kiselinu humanog faktora B komplementa (CFB) i testirani su na njihovo dejstvo na CFB iRNK in vitro. Antisens oligonukleotidi su testirani u serijama eksperimenata koji imaju slične uslove za kulture. Rezultati svakog od eksperimenata su predstavljei dole u različitim tabelama. Kultivisane HepG2 ćelije pri gustini od 20,000 ćelija po bunarčiću su transfektovane pomoću elektroporacije sa 2,000 nM antisens oligonukleotidom. Posle perioda tretiranja od približno 24 sata, RNK je izolovna iz ćelija i nivoi CFB iRNK su mereni sa kvantitativnom PCR u realnom vremenu. Set humanih prajmer proba RTS3459 je korišćen za merenje nivoa iRNK nivoa. Nivoi CFB iRNK su prilagođeni prema ukupnom sadržaju RNK, kako je mereno sa RIBOGREEN®. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije CFB, relativno u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0471] Novonapravljeni himerni antisens oligonukleotidi dole u tabelama su označeni kao 4-8-5 MOE, 5-8-5 MOE, 5-9-5 MOE, 5-10-5 MOE, 6-7-6- MOE, 3-10-5 MOE, ili 6-8-6 MOE gapmeri.
[0472] 4-8-5 MOE gapmeri su dugački 17 nukleozida, gde centralni segment razmaka sadrži osam 2’- dezoksinukleozida i okružen je segmentima "krila" u 5’ smeru i 3’ smeru koji sadrže četiri i pet nukleozida respektivno. 5-8-5 MOE gapmeri su dugački 18 nukleozida, gde centralni segment razmaka sadrži osam 2’-dezoksinukleozida i okružen je segmentima "krila" u 5’ smeru i 3’ smeru gde sadrži svaki pet nukleozida. 5-9-5 MOE gapmeri su dužine 19 nukleozida, gde centralni segment razmaka sadrži devet 2’-dezoksinukleozida i okružen je segmentima "krila" u 5’ smeru i 3’ smeru gde svaki sadrži pet nukleozida. 5-10-5 MOE gapmeri su dužine 20 nukleozida, gde centralni segment razmaka sadrži često 2’-dezoksinukleozide i okružen je segmentima "krila" u 5’ smeru i 3’ smeru gde svaki sadrži pet nukleozida. 3-10-5 MOE gapmeri su dužine 18 nukleozida, gde centralni segment razmaka sadrži često 2’-dezoksinukleozide i okružen je segmentima "krila" u 5’ smeru i 3’ smeru koji sadrže tri i pet nukleozida, respektivno. 6-7-6 MOE gapmeri su dužine 19 nukleozida, gde centralni centralni segment razmaka sadrži sedam 2’-dezoksinukleozida i okružen je segmentima "krila" u 5’ smeru i 3’ smeru gde svaki sadrži nukleozide. 6-8-6 MOE gapmeri su dužine 20 nukleozida, gde centralni segment razmaka sadrži osam 2’-dezoksinukleozida i okružen je segmentima "krila" u 5’ smeru i 3’ smeru gde svaki sadrži šest nukleozida. Svaki nukleozid u 5’ krilnom segmentiu i svaki nukleozid u 3’ segmentu "krila" ima 2’-MOE modifikacije. Internukleozidne veza kroz svaki gapmer su fosforotioatne (P=S) veze. Svi ostaci citozina kroz svaki gapmer su 5-metilcitozini.
[0473] "Start mesto" označava većinom 5’ nukleozid koji gapmer cilja u humanoj genskoj sekvenci. "Stop mesto" označava većinom 3’ nukleozid koji cilja humanu gensku sekvencu. Svaki gapmer izlistan u donjim tabelama cilja ili humani CFB iRNK, označen ovde kao SEQ ID NO: 1 (GENBANK pristupni broj. NM _001710.5) ili humanu CFB genomsku sekvencu, označenu ovde kao SEQ ID NO: 2 (GENBANK pristupni broj. NT_007592.15 skraćeni nukleotidi 31852000 do 31861000), ili oba. ’n/a’ označava da antisens oligonukleotid ne cilja određenu gensku sekvencu sa 100% komplementarnošću.
1
8 13la be Ta
139la be Ta
140 ela ab T
Primer 120: Antisens inhibicija humanog faktora B komplementa (CFB) u HepG2 ćelijama sa MOE gapmerima
[0474] Dodatni antisens oligonukleotidi su napravljeni da ciljaju nukleinsku kiselinu humanog faktora B komplementa (CFB) i testirani su na njihovo dejstvo na CFB iRNK in vitro. Kultivisane HepG2 ćelije pri gustini od 20,000 ćelija po bunarčiću su transfektovane pomoću elektroporacije sa 1,000 nM antisens oligonukleotidom. Posle perioda tretiranja od 24 sata, RNK je izolovan iz ćelija i nivoi CFB iRNK su mereni sa kvantitativnom PCR u realnom vremenu. Set humanih prajmer proba RTS3459 je korišćen za merenje nivoa iRNK. Nivoi CFB iRNK su prilagođeni prema ukupnom sadržaju RNK , kako je mereno sa RIBOGREEN®. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije CFB, relativno u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0475] Novonapravljeni himerni antisens oligonukleotidi u donjim tablema su označeni kao dezoksi, MOE i (S)-cEt oligonukleotidi. Dezoksi, MOE i (S)-cEt oligonukleotidi su dužine 16 nukleozida gde nukleozid ima ili MOE modifikaciju šećera, (S)-cEt modifikaciju šećera, ili modifikacija dezoksi. Kolona ’Hemija’ odnosi se na modifikacije šećera svakog oligonukleotida. ’k’ označava (S)-cEt modifikaciju šećera; ’d’ označava dezoksiribozu; i ’e’ označava MOE modifikacije.
[0476] "Start mesto" označava većinom 5’ nukleozida koji gapmer cilja u humanoj genskoj sekvenci. "Stop mesto" označava većinom 3’ nukleozid koji gapmer cilja u humanoj genskoj sekvenci. Svaki od gapmer je izlistan dole u tabelama cilja ili humanu CFB iRNK, označenu ovde kao SEQ ID NO: 1 (GENBANK pristupni br. NM_001710.5) ili humanu CFB genomsku Sekvencu, označenu ovde kao SEQ ID NO: 2 (GENBANK pristupni br. NT_007592.15 skraćeni nukleotidi 31852000 do 31861000), ili oba. ’n/a’ ukazuje da antisens oligonukleotid ne cilja onu određenu gensku sekvencu sa 100% komplementarnošću.
1
1 14 ela ab
Primer 121: Antisens inhibicija humanog faktora B komplementa(CFB) u HepG2 ćelijama sa MOE gapmerima
[0477] Dodatni antisens oligonukleotidi su napravljeni da ciljaju nukleinske kiseline humanog faktora B komplementa (CFB) i testirani su na njihovo dejstvo na CFB iRNK in vitro. Antisens oligonukleotidi su testirani u serijama eksperimenata koji imaju slične uslove za kulture. Rezultati za svaki eksperiment su prikazani dole u odvojenim tabelama. Kultivisane HepG2 ćelije pri gustini 20,000 ćelija po bunarčiću su transfektovane pomoću elektroporacije sa 500 nM antisens oligonukleotidom. Posle perioda tretiranja približno 24 sata, RNK su izolovani iz ćelija i nivoi CFB iRNK su mereni sa kvantitativnom PCR u realnom vremenu. Set humanih prajmer proba RTS3459 je korišćen za merenje nivoa iRNK. Nivoi CFB iRNK su prilagođene prema ukupno sadržaju RNK, kao što je mereno RIBOGREEN®. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije CFB, relativno u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0478] Novonapravljeni himerni antisens oligonukleotidi dole u tabelama su označeni kao dezoksi, MOE i (S)-cEt oligonukleotidi, ili 5-8-5 MOE, 5-9-5 MOE, 5-10-5 MOE, 6-7-6- MOE, 3-10-5 MOE, ili 6-8-6 MOE gapmeri.
[0479] Dezoksi, MOE i (S)-cEt oligonukleotidi su dugi 16 nukleozida, gde nukleozid ima ili MOE modifikaciju šećera, (S)-cEt modifikaciju šećera, ili dezoksi modifikaciju. Kolona ’Hemija’ opisuje šećerne modifikacije svakog oligonukleotida. ’k’ označavan (S)-cEt šećernu modifikaciju; ’d’ označava dezoksiribozu; i ’e’ označava MOE modifikaciju.
[0480] 5-8-5 MOE gapmeri su dugački 18 nukleozida, gde centralni segment razmaka sadrži osam 2’- dezoksinukleozida i okružen je segmentima „krila“ u 5’ smeru i 3’ smeru koji sadrži svaki pet nukleozida. 5-9-5 MOE gapmeri su dugi 19 nukleozida, gde centralni segment razmaka sadrži devet 2’- dezoksinukleozida i okružen je segmentima „krila“ u 5’ smeru i 3’ smeru koji sadrži svaki pet nukleozida. 5-10-5 MOE gapmeri su dužine 20 nukleozida, gde centralni segment razmaka sadrži deset 2’- dezoksinukleozida i okružen je segmentima „krila“ u 5’ smeru i 3’ smeru koji sadrži svaki pet nukleozida. 3-10-5 MOE gapmeri su dužine 18 nukleozida, gde centralni segment razmaka sadrži deset 2’- dezoksinukleozida i okružen je segmentima „krila“ u 5’ smeru i 3’ smeru koji sadrže tri i pet nukleozida respektivno. 6-7-6 MOE gapmeri su dugački 19 nukleozida, gde centralni segment razmaka sadrži sedam 2’-dezoksinukleozida i okružen je segmentima „krila“ u 5’ smeru i 3’ smeru koji sadrže svaki šest nukleozida.6-8-6 MOE gapmeri su dugi 20 nukleozida, gde centralni segment razmaka sadrži osam 2’-dezoksinukleozida i okružen je segmentima „krila“ u 5’ smeru i 3’ smeru gde svaki sadrži šest nukleozida. Svaki od nukleozida u 5’ krilnom segmentu i svaki nukleozid u 3’ krilnom segmentu ima 2’- MOE modifikacije. Internukleozidne veze kroz svaki gapmer su fosforotioatne (P=S) veze. Svi ostaci citozina tkroz svaki gapmer su 5-metilcitozini.
[0481] "Start mesto" označava većinom 5’ nukleozid koji gapmer cilja u humanoj genskoj sekvenci. "Stop mesto" označava većinom 3’ nukleozid koju gapmer cilja u humanoj genskoj sekvenci. Svaki gapmer izlistan dole u tabelama je cilja ili CFB iRNK, označenu ovde kao SEQ ID NO: 1 (GENBANK pristupni br. NM_001710.5) ili humanu CFB genomsku sekvencu, označenu ovde kao SEQ ID NO: 2 (GENBANK pristupni br. NT_007592.15 skraćeni od nukleotida 31852000 o 31861000), ili obe. ’n/a’ ukazuje da antisens oligonukleotid ne cilja tu posebnu gensku sekvencu sa 100% komplementarnošću.
2 2
2 14 ela Tab
3 14 ela b Ta
4 14la be a T
145 ela Tab
146la be Ta
Tabela 147
22
(nastavak)
2
(nastavak)
21
Primer 122: Dozno-zavisna antisens inhibicija humanog CFB u HepG2 ćelijama sa 5-10-5 MOE gapmerima
[0482] Gapmeri iz gore opisanih ispitivanja koji pokazuju in vitro inhibiciju CFB iRNK su odabrani i testiirani u različitim dozama na HepG2 ćelijama. Ćelije su zasejane na ploči pri gustini od 20,000 ćelija po bunarčiću i transfektovane pomoću elektroporacija sa koncentracijama 0.313 µM, 0.625 µM, 1.25 µM, 2.50 µM, 5.00 µM, ili 10.00 µM antisens oligonukleotida, kako je navedeno dole u tabeli. Posle perioda tretmana od približno 16 sati, RNK je izolovan iz ćelija i nivoi CFB iRNK su mereni sa kvantitativnom PCR u realnom vremenu. Set humanih prajmer proba RTS3459 je korišćen za merenje nivoa iRNK. Nivoi CFB iRNK su prilagođeni prema ukupnom RNK, kako je mereno sa RIBOGREEN®.Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije CFB, relativno u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0483] Polovnina maskimalne inhibitorne koncentracije (IC50) svakog oligonukleotida je takođe prikazana. Nivoi CFB iRNK su smanjeni na dozno-zavistan način u ćelijama tretiranim sa antisens oligonukleotidima.
Tabela 148
2 2
Primer 123: Dozno-zavisna antisens inhibicija humanog CFB u HepG2 ćelijama
[0484] Gapmeri iz ispitivanja gore opisanih koji pokazuju in vitro inhibiciju CFB iRNK su izabrani i testriani pri različitim dozama HepG2 ćelijama. Antisens oligonukleotidi su testirani u brojnim eksperimentima sa sličnim uslovima gajenja. Rezultati svakog od eksperimenta su prikazani dole u odvojenim tabelama. Ćelije su zasejane na ploči pri gustini od 20,000 ćelija po bunarčiću i transfektovane pomoću elektroporacije sa koncentracijma 0.08<µ>M, 0.25<µ>M, 0.74<µ>M, 2.22<µ>M, 6.67<µ>M, i 20.00<µ>M antisens oligonukleotida, kao što je navedeno dole u Tabeli. Posle perioda tretiranja od približno 16 sati, RNK je izolovan iz ćelija i nivoi CFB iRNK su mereni kvantitativno sa PCR u realnom vremenu. Set humanih prajmer proba RTS3459 je korišćen za merenje nivoa iRNK. Nivoi CFB iRNK su prilagođeni prema ukupnom sadržaju RNK, kako je mereno RIBOGREEN®. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije CFB, relativno u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0485] Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) svakog oligonukleotida je takođe prikazana. Nivoi CFB iRNK su smanjeni na dozno-zavistan način u ćelijama tretiranim antisens oligonukleotidnim.
Tabela 149
2
Tabela 150
Tabela 151
24 Tabela 152
Tabela 153
Tabela 154
2
Primer 124: Dozno-zavisna antisens inhibicija humanog CFB u HepG2 ćelijama
[0486] Gapmeri iz gore opisanih ispitivanja koji pokazuju in vitro inhibiciju CFB iRNK su izabrani i testirani u različitim dozana u HepG2 ćelijama. Antisens oligonukleotidi su testirani u brojnim eksperimentima sa sličnim uslovima kultivisanja. Rezultati svakog eksperimenta su prikazani dole u odvojenim tabelema. Ćelije su zasejane na ploči pri gustini od 20,000 ćelija po bunarčiću i transfektovane pomoću elektroporacije sa koncentracijama 0.06 µM, 0.25 µM, 1.00 µM, i 4.00 µM antisens oligonukleotida, kao što je navedeno dole u Tabeli. Posle perioda tretiranja od približno 16 sati, RNK je izolovan iz ćelija i nivoi CFB iRNK su mereni sa kvantitativnom PCR u realnom vremenu. Set humanih prajmer proba RTS3459 je korišćen za merenje iRNK nivoa. Nivoi CFB iRNK su prilagođeni ukupnom sadržaju RNK, kako je mereno sa RIBOGREEN®. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije CFB, relativno u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0487] Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) svakog oligonukleotid je takođe prikazana. Nivoi CFB iRNK su takođe smanjeni na dozno-zavistan način u ćelijama tretiranim sa antisens oligonukleotidom.
Tabela 155
2
Tabela 156
Tabela 157
2
Tabela 158
2 Tabela 159
Primer 125: Dozno-zavisna antisens Inhibicija humanog CFB u HepG2 ćelijama
[0488] Gapmeri iz gore opisanih ispitivanja in vitro inhibicije CFB iRNK su izabrani i testirani na u različitim dozama u HepG2 ćelijama. Dodatno, a dezoksi, MOE i (S)-cEt oligonukleotid, ISIS 594430, je označen sa sekvencom (CTCCTTCCGAGTCAGC, SEQ ID NO: 549) i ciljni region (ciljano start mesto 2195 SEQ ID NO: 1 i ciljano start mesto 6983 SED ID NO: 2) kao ISIS 588870, još jedan dezoksi, MOE, i (S)-cEt oligonukleotid. ISIS 594430 je 3-10-3 (S)-cEt gapmer.
[0489] Ćelije su zasejane na ploči pri gustini od 20,000 po bunarčima i transfektovani pomoću elektropolacije sa 0.01 µM, 0.04 µM,0.12 mM, 0.37 µM, 1.11 µM, 3.33 µM, i 10.00 µM koncentracijama antisens oligonukleotida, kao što je navedeno dole u tabeli. Posle perioda tretiranja od približno 16 sati, RNK je izolovan iz ćelija i nivoi CFB iRNK su mereni sa kvantitativnom PCR u realnom vremenu. Set humanih prajmer proba RTS3459 je korišćen za merenje nivoa iRNK. Nivoi CFB iRNK su prilagođeni prema ukupnom sadržaju RNK, kako je mereno sa RIBOGREEN®. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije CFB, relativno u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0490] Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) svakog oligonukleotida je takođe prikazana. Nivoi CFB iRNK su smanjeni na dozno-zavistan način u ćelijama tretiranim sa antisens oligonukleotidima.
2
Tabela 160
Primer 126: Tolerabilnost MOE gapmerima koji ciljaju human CFB u CD1 miševima
[0491] CD1® miševi (Charles River, MA) su višenamenski model miša, često korišćen za testiranje sigurnosti i efikasnosti. Miševi su tretirani sa ISIS antisens oligonukleotidima izabranim iz gore opisanih studija i procenjivani na promene u nivoima različitih hemijskih markera iz plazme.
Ispitivanje 1 (sa 5-10-5 MOE gapmerima)
[0492] Grupama sedam nedelja starim muških CD1 miševima subkutanozno je injektovano jednom nedeljno u toku 6 nedelja 100 mg/kg ISIS oligonukleotida. Grupi muških CD1 miševa subkutanozno je injektovano jednom nedeljno u toku 6 nedelja PBS. Jednoj grupi miševa subkutanozno je injektovano jednom nedeljno u toku 6 nedelja 100 mg/kg kontrolnog oligonukleotida ISIS 141923 (CCTTCCCTGAAGGTTCCTCC, označenog ovde kao SEQ ID NO: 809, 5-10-5 MOE gapmer bez poznate mišje mete). Miševi su eutanazirani 48 sati posle poslednje doze, i organi i plazma su sakupljani za dalje analize.
Hemijski markeri plazme
[0493] Da bi se porcenio efekat ISIS oligonukleotida na funkciju jetre i bubrega, mereni su nivoi transaminaza u plazmi a, i BUN korišćenjem automatizovanog analizatora kliničke hemije (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Rezultati su prikazani dole u tabeli. ISIS oligonukleotidi koji izazivaju promene u nivoima bilo kog markera van očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni iz daljeg ispitivanja.
24
Tabela 161
Mase
[0494] Telesne mase miševa su merene dana 40 pre žrtvovanja miševa. Mase organe, jetre, bubrega, i slezine su takođe merene nakon žrtvovanja miševa. Rezultat su prikazani dole u tabeli. ISIS oligonukleotidi koji izazivaju promene u masama van očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni iz daljeg isptivanja .
Tabela 162
Ispitivanje 2 (sa 5-10-5 MOE gapmerima)
[0495] Grupama od šest do osam nedelja starih muških CD1 miševa subkutanozno je injektovano jednom nedeljno u toku 6 nedelja 100 mg/kg ISIS oligonukleotida. Dvema grupama CD1 miševa subkutanozno je injektovano jednom nedeljno u toku 6 nedelja PBS. Jednoj grupi miševa subkutanozno je injektovano jednom nedeljno u toku 6 nedelja 100 mg/kg kontrolnog oligonukleotida ISIS 141923. Miševi su eutanazirani 48 posle poslednje doze, i organi i plazma su sakupljani za druge analize.
Hemijski markeri plazme
[0496] Da bi se procenio efekat ISIS oligonukleotida na funkciju jetre i bubrega, mereni su nivoi transaminaza u plazmi, albumina i BUN pomoću automatizovanog analizatora za kliničku hemiju (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Rezultati su prikazani dole u tabeli . ISIS oligonukleotidi koji izazivaju promene u nivoima bilo kog markera funkcije jetre ili bubrega van očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni u daljim ispitivanjima.
Tabela 163
Mase
[0497] Telesne mase miševa su merene dana 42. Mase organa, jetre, bubrega i slezine su takođe merne pošto su miševi žrtvovani dana 45. Rezultati su prikani dole u tabeli. ISIS oligonukleotidi koji izazivaju promene u masi van očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni iz daljih ispitivanja.
Tabela 164
Ispitivanje 3 (sa 5-10-5 MOE gapmerima)
[0498] Grupama od šet do osam nedelja starih muških CD1 miševa je subkutanozno injektovano jednom nedeljno toku 6 nedelja 100 mg/kg ISIS oligonukleotida. Dvema grupama muških CD1 miševa subkutanozno je injektovano jednom nedeljno u toku 6 nedelja PBS. Miševi su eutanazirani 48 sati posle poslednje doze, i sakupljeni su organi i plazma za dalje analize.
24
Hemijski markeri plazme
[0499] Da bi se procenili efekti ISIS oligonukleotida na funkciju bubrega i jetre, mereni su nivoi transaminaza u plazmi, albumin, i BUN pomoću automatizovanog analizatora za kliniču hemiju (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Rezultati su prikazani dole u tabelama. ISIS oligonukleotidi koji izazivaju promene u nivoima markera funkcionisanja jetre ili bubrega van očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni iz daljih ispitivanja .
Tabela 165
Mase
[0500] Telesne mase miševa su merene dana 42. Mase organa, jetre, bugrega i slezine su takođe merene pošto su miševi žrtvovani dana 42. Rezultati su prikazani dole u tabeli. ISIS oligonukleotidi koji su izazivali promene u masama van očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni iz daljeg ispitivanja.
Tabela 166
Ispitivanja 4 (sa (S) cEt gapmerima i dezoksi, MOE i (S)-cEt oligonukleotidima)
[0501] Grupama od deset nedelja starih muških CD1 miševa subkutanozno je injektovano jednom nedeljno u toku 6 nedelja 50 mg/kg ISIS oligonukleotida iz gore opisnih ispitivanja. Pored toga, dva oligonukleotida, ISIS 594431 i ISIS 594432, koji su označeni kao 3-10-3 (S)-cEt gapmeri i takođe su testirani u ovom ispitivanju. ISIS 594431(ACCTCCTTCCGAGTCA, SEQ ID NO: 550) cilja isti region kao ISIS 588871, dezoksi, MOE i (S)-cEt gapmer (ciljaju start mesto 2197 f SEQ ID NO: 1 i ciljaju start mesto 6985 SEQ ID NO: 2). ISIS 594432 (TGGTCACATTCCCTTC, SEQ ID NO: 542) cilja isti region kao ISIS 588872 dezoksi, MOE i (S)-cEt gapmer (ciljaju start mesto 154 SEQ ID NO: 1 i ciljajut start mesto 1875 SEQ ID NO: 2).
[0502] Dvema grupama muških CD1 miševa je subkutanozno injektovano jednom nedeljno u toku 6 nedelja PBS. Miševi su eutanazirani 48 sati posle poslednje doze i sakupljeni su organi i plazma u toku daljih analiza .
Hemijski markeri plazme
[0503] Da bi se procenio uticaj ISIS oligonukleotida na funkciju jetre i bubrega, mereni su nivoi transaminaza u plazmi, albumin, kreatinin, i BUN korišćenjem automatizovanog analizatora za kliničku hemiju (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Rezultati su prikazani dole u tabeli. ISIS oligonukleotidi koji izazivaju promene u nivoima markera funkcija jetre i bubrega van očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni iz daljeg ispitivanja.
24
Tabela 167
Mase
[0504] Telesne mase miševa su merene dana 39. Mase organa, jetre, bubrega i slezine su takođe merene nakon što su miševi žrtvovani dana 42. Rezultati su prikazani dole u tabeli. ISIS oligonukleotidi koji su izazivali promene u masama van očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni iz daljeg ispitivanja
24
Tabela 168
Ispitivanje 5 (sa MOE gapmerima. (S) cEt gapmeri i dezoksi, MOE i (S)-cEt oligonukleotidi)
[0505] Grupama osam do devet nedelja starih muških CD1 miševa subkutanozno je injektovano jednom nedeljno u toku 6 nedelja 50 mg/kg ISIS oligonukleotida. Dvema grupama muških CD1 miševa subkutanozno je injektovano jednom nedeljno u toku 6 nedelja PBS. Miševi su eutanazirani 48 sati posle poslednje doze i sakupljeni su organi i plazma za dalje analize.
Hemijski markeri plazme
[0506] Da bi se procenio uticaj ISIS oligonukleotida na funkcije jetre i bubrega, mereni su nivoi u plazmi transaminaza, albumina, kreatinina i BUN pomoću automatizovanog analizatora za kliničku hemiju (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Rezultati su prikazani dole u tabeli. ISIS oligonukleotidi koji izazivaju promene u nivoima markera funkcije jetre ili bubrega van očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni iz daljeg ispitivanja
24
Tabela 169
24 Mase
[0507] Telesne mase miševa su merene dana 40. Mase organa, jetre, bubrega i slezine su takođe merene pošto su miševi žrtvovani dana 42. Rezultati su prikazani dole u tabeli. ISIS oligonukleotidi koji su izazivali promene u masama van očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni iz daljeg ispitivanja
Tabela 170
Ispitivanje 6 (sa dezoksi, MOE i (S)-cEt oligonukleotidima)
[0508] Grupama muških CD1 miševa starih osam do devet nedelja subkutanozno je injektovano jednom nedeljno u toku 6 nedelja 50 mg/kg dezoksi, MOE, i (S)-cEt oligonukleotida. Dvema grupama muških CD1 miševa subkutanozno je injektovano jednom nedeljno u toku 6 nedelja PBS. Miševi su eutanazirani 48 sati posle poslednje doze i organi i plazma su sakupljeni za dalje analize.
24
Hemijski markeri plazme
[0509] Da bi se procenio uticaj ISIS oligonukleotida na funkcije jetre i bubrega , nivoi u plazmi transaminaza, albumina, kreatinine, bilirubine, i BUN su mereni automatizovanim analizatorom za kliničku hemiju (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Rezultati su prikazani dole u tabeli. ISIS oligonukleotidi koji izazivaju promene u nivoima bilo kog od markera funkcije jetre ili bubrega van očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni iz daljeg ispitivanja.
Tabela 171
Mase
[0510] Telesne mase miševa su merene dana 40. Mase organa, jetre, bubrega i slezine su takođe merene pošto su miševi žrtvovani dana 45. Rezultati su prikazani dole u tabeli. ISIS oligonukleotidi koji su izazivali promene u masama van očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni iz daljeg ispitivanja
2
Tabela 172
(nastavak)
Ispitivanje 7 (sa MOE gapmerima i dezoksi, MOE i (S)-cEt oligonukleotidima)
[0511] Grupama osam do devet nedelja starih muških CD1 miševa subkutanozno je injektovano jednom nedeljno u toku 6 nedelja 100 mg/kg ISIS oligonukleotida. Jednoj grupi CD1 miševa subkutanozno je injektovano jednom nedeljno u toku 6 nedelja PBS. Miševi su eutanazirani 48 sati posle poslednje doze i sakupljeni su organi i plazma za dalje analize.
Hemijski markeri plazme
[0512] Da bi se procenio uticaj ISIS oligonukleotida na funkcije jetre i bubrega mereni su nivoi u plazmi transaminaza, albumina, kreatinina i BUN pomoću automatizovanog analizatora za kliničku hemiju (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Rezultati su prikazani dole u tabeli. ISIS oligonukleotidi koji su izazvali promene u nivoima markera funkcionisanja jetre ili bubrega van očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni iz daljeg ispitivanja
2 1
Tabela 173
Mase
[0513] Telesne mase miševa su merene dana 44. Mase organa, jetre, bubrega i slezine su takođe merene pošto su miševi žrtvovani dana 49. Rezultati su prikazani dole u tabeli. ISIS oligonukleotidi koji su izazivali promene u masama van očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni iz daljih ispivanja<.>
2 2
Tabela 174
Ispitivanje 8 (sa MOE gapmerima, dezoksi, MOE i (S)-cEt oligonukleotida, i (S)-cEt gapmeri)
[0514] Grupama osam do devet nedelja starih muških CD1 miševa subkutanozno je injektovano jednom nedeljno u toku 6 nedelja 100 mg/kg MOE gapmera, ili 50 mg/kg dezoksi, MOE i (S)-cEt oligonukleotida ili (S)-cEt gapmera. Jednoj grupi muških CD1 miševa subkutanozno je injektovano jednom nedeljno u toku 6 nedelja PBS. Miševi su eutanazirani 48 sati posle poslednje doze i sakupljeni su organi i plazma za druge analize.
Hemijski markeri plazme
[0515] Da bi se procenio uticaj ISIS oligonukleotida na funkcije jetre i bubrega mereni su nivoi u plazmi transaminaza, albumina, kreatinina i BUN pomoću automatizovanog analizatora za kliničku hemiju (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Rezultati su prikazani dole u tabeli.
2
Tabela 175
Mase
[0516] Telesne mase miševa su merene dana 36. Mase organa, jetre, bubrega i slezine su takođe merene pošto su miševi žrtvovani dana 43. Rezultati mase organa su izraženi kao odnos prema telesnoj masi i normalizovani prema odnosu PBS kontrole.
Tabela 176
2 4
Testovi citokina
[0517] Krv dobijena iz svih grupa miševa je poslata u Antech Diagnostics radi merenja različitih nivoa citokina, kao što su IL-6, MDC, MIP1 β, IP-10, MCP1, MIP-1 α, i RANTES. Rezultati su prikazani u tabeli 54.
Tabela 177
Hematološki testovi
[0518] Krv dobijena iz svih grupa miševa je poslata u Antech Diagnostics za merenje hematokrita (HCT), kao i različitih ćelija krvi, kao što je sadržaj WBC, RBC, i krvnih pločica, i ukupnog hemoglobina (Hb). Rezultati su prikazani u tabeli 55.
2
Tabela 178
Primer 127: Tolerabilnost antisens oligonukleotida koji ciljaju humani CFB kod Sprague-Dawley pacova
[0519] Sprague-Dawley pacovi su višenamenski model koji se koristi pri procenama sigurnosti i efikasnosti. Pacovi su tretirani sa ISIS antisens oligonukleotidima iz gore opisanih ispitivanja u primerima i procenjivani na promene u nivoima različitih hemijskih markera plazme.
Ispitivanje 1 (sa 5-10-5 MOE gapmerima)
[0520] Muški Sprague-Dawley pacovi, stari sedam do osam nedelja, su održavani u režimu 12-sati svetlo/mrak i hranjeni ad libitum sa hranom za pacove Purina normal, ishrana 5001. Grupama od 4 Sprague-Dawley pacova je subkutanozn injektovan jednom nedeljno u toku 6 nedelja 100 mg/kg 5-10-5 MOE gapmerima. Jednoj kontrolnoj grupi od 6 pacova je injektovano subkutanozno jednom nedeljo u toku 6 nedelja PBS. Četrdeset osam sati posle poslednje doze, pacovi su eutanazirano i sakupljeni su organi i plazma za dalje analize.
Funkcija jetre
[0521] Da bi se procenio efekat ISIS oligonukleotida na funkciju jetre, mereni su nivoi transaminaza u plazmi pomoću automatizovanog analizatora za kliničku hemiju (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Nivoi u plazmi ALT (alanin transaminaze) i AST (aspartat transaminaze) su mereni i dole prikazani rezultati u tabeli izraženi su u IU/L. ISIS oligonukleotidi koji izazivaju promene u nivoima bilo kojih markera funkcije jetre van očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni iz daljeg ispitivanja
2
Tabela 179
Funkcija bubrega
[0522] Da bi se procenio efekat ISIS oligonukleotida na funkciju bubrega, mereni su nivoi u plazmi azota iz uree u krvi (engl. blood urea nitrogen - BUN) i kreatinina automatizovanim analizatorom za kliničku hemiju (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Rezultati su prikazani dole u tabeli, izraženi u mg/dL. ISIS oligonukleotidi koji su izabrani promene u nivoima bilo kojih markera funkcije bubrega van očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni iz daljeg ispitivanja
Tabela 180
2
Mase
[0523] Merenja telesne mase su obavljena dana 39. Mase jetre, srca, slezine i bubrega su merena na kraju ispitivanja dana 42, i prikazane su dole u tabelama. ISIS oligonukleotidi koji izazivaju bilo koje promene u masi organa van očekivanih za antisens oligonukleotide su isključeni iz drugih ispitivanja.
Tabela 181
Ispitivanje 2 (sa dezoksi, MOE i (S)-cEt oligonukleotidima)
[0524] Muški Sprague-Dawley pacovi, devet do deset nedelja stari, su održavani u režimu 12-sati svetlo/mrak i hranjeni su ad libitum sa hranom za pacove Purina normal, ishrana 5001. Grupama od 4 Sprague-Dawley pacova subkutanozno je dato jednom nedeljno u toku 6 nedelja 100 mg/kg dezoksi, MOE, i (S)-cEt oligonukleotida. Dvema kontrolnim grupama od 3 pacova subkutanozno je injektovan jednom nedeljno u toku 6 nedelja PBS. Četrdeset osam sati posle poslednje doze, pacovi su eutanazirani i sakupljeni su organi i plazma za druge analize.
Funkcija jetre
[0525] Da bi se procenio efekat ISIS oligonukleotida na funkciju jetre, nivoi transaminaza u plazmi su mereni dana 42 pomoću automatizovanog analizatora za kliničku hemiju (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Nivoi ALT (alanin transaminaze) i AST (aspartat transaminaze) u plazmi, i albumina su mereni i rezultati su dole prikazani u tabeli. ISIS oligonukleotidi koji izazivaju promene u nivoima bilo kog markera funkcije jetre van očekivanog opsega antisens oligonukleotida su isključeni iz daljeg ispitivanja.
2
Tabela 182
Funkcija bubrega
[0526] Za procenjivanje efekata ISIS oligonukleotida na funkciju bubrega, mereni su nivoi u plazmi azota iz uree u krvi (BUN) i kreatinin automatizovanim analizatorom za kliničku hemiju (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Rezultati su prikazani dole u tabeli, izraženi u mg/dL. ISIS oligonukleotidi koji uzrokuju promene u nivoima bilo kog od markera funkcije bubrega van očekivanog opsaga za antisens oligonukleotide su isključeni iz daljih ispitivanja<.>
Tabela 183
2
Mase
[0527] Merenja telesne mase su sakupljena dana 39. Mase jetre, srca, slezine i bubrega su merene na kraju ispitivanja dana 42, i prikazane su dole u tabeli. ISIS oligonukleotidi koji izazivaju bilo koje promene u masi organa van očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni iz daljih ispitivanja
Tabela 184
Ispitivanje 3 (sa MOE gapmerima)
[0528] Muški Sprague-Dawley pacovi, devet do deset nedelja stari, su održavani u režimu 12-sati svetlo/mrak i hranjeni su ad libitum sa hranom za pacove Purina normal, ishrana 5001. Svakoj od grupa od 4 Sprague-Dawley pacova subkutanozno je injektovano jednom nedeljno u toku 6 nedelja 100 mg/kg MOE gapmera. Jednoj kontrolnoj grupi od 6 pacova subkutanozno je injektovano jednom nedeljno u toku 6 nedelja PBS. Četrdeset osam sati posle poslednje doze, pacovi su eutanazirani i sakupljeni su organi i plazma za druge analize.
Funkcija jetre
[0529] Radi procenjivanja efekta ISIS oligonukleotida na funkciju jetre, mereni su nivoi transaminaza u plazni dana 43 pomoću automatizovanog analizatora za kliničku hemiju (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Mereni su nivoi u plazmi ALT (alanin transaminaze) i AST (aspartat transaminaze) i rezultati su dole prikazani u tabeli izraženi u IU/L. ISIS oligonukleotidi koji izazivaju promene u nivoima bilo kog od markera funkcije jetre van oočekivanog opsega antisens oligonukleotida su isključeni iz daljeg ispitivanja
2
Tabela 185
Funkcija bubrega
[0530] Da bi se procenio efekat ISIS nukleotida na funkciju bubrega, mereni su nivoi u plazmi azota iz uree u krvi (BUN) i kreatinina automatizovanim analizatorom za kliničku hemiju (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Rezultati su prikazani dole u tabeli, izraženi u mg/dL. ISIS oligonukleotidi koji izazivaju promene u nivoima bilo kog pod markera funkcije bubrega van očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni iz daljeg ispitivanja
Tabela 186
2 1
Mase
[0531] Merenja telesne mase su sakupljena dana 39. Merene su mase jetre, srca, slezine i bubrega na kraju ispitivanja dana 42, i prikazane su dole u tabeli. ISIS oligonukleotidi koji izazivaju bilo koje promene u masi organa van očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni iz daljih ispitivanja.
Tabela 187
Ispitivanje 4 (sa MOE gapmerima)
[0532] Muški Sprague-Dawley pacovi, devet do deset nedelja stari, su održavani na režimu 12-sati svetlo/mrak i hranjeni su ad libitum sa hranom za pacove Purina normal, ishrana 5001. Svakoj grupi od 4 Sprague-Dawley pacova subkutanozno je injektovano jednom nedeljno u toku 6 nedelja 100 mg/kg MOE gapmera. Jednoj kontrolnoj grupi od 6 pacova subkutanozno je injektovano jednom nedeljno u toku 6 nedelja PBS. Četrdeset osam sati posle poslednje doze, pacovi su eutanazirani i sakupljeni su organi i plazma za druge analize.
Funkcija jetre
[0533] Radi procenjivanja efekta ISIS oligonukleotida na funkciju jetre, mereni su nivoi u plazmi transaminaza dana 42 pomoću automatizovanog analizatora za kliničku hemiju (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Mereni su nivoi u plazmi ALT (alanin transaminaze) i AST (aspartat transaminaze) i rezultati su prikazani dole u tabeli izraženi u IU/L. ISIS oligonukleotidi koji izazivaju promene u nivoima bilo kog od markera funkcije jetre van očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni iz daljeg ispitivanja.
2 2
Tabela 188
Funkcija bubrega
[0534] Da bi se procenio efekat ISIS nukleotida na funkciju bubrega, mereni su nivoi u plazmi azota iz uree u krvi (BUN) i kreatinina automatizovanim analizatorom za kliničku hemiju (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Rezultati su prikazani dole u tabeli, izraženi u mg/dL. ISIS oligonukleotidi koji izazivaju promene u nivoima bilo kog od markera funkcije bubrega van očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni iz daljeg ispitivanja
Tabela 189
Mase
[0535] Merenja telesne mase su sakupljena dana 39. Merene su mase jetre, srca, slezine i bubrega na kraju ispitivanja dana 42, i prikazane su dole u tabeli. ISIS oligonukleotidi koji izazivaju bilo koje promene u masi organa van očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni iz daljih
2
ispitivanja.
Tabela 190
Ispitivanje 5 (sa MOE gapmerima i dezoksi. MOE i (S)-cEt oligonukleotidima)
[0536] Muški Sprague-Dawley pacovi, devet do deset nedelja stari, su održavani u režimu 12-sati svetlo/mrak i hranjeni su ad libitum sa hranom za pacove Purina normal, ishrana 5001. Svakoj od grupa od 4 Sprague-Dawley subkutanozno je injektovano jednom nedeljno u toku 6 nedelja 100 mg/kg of MOE gapmera ili 50 mg/kg dezoksi, MOE i (S)-cEt oligonukleotida. Jednoj kontrolnoj grupi od 4 pacova subkutanozno je injektovan jednom nedeljno u toku 6 nedelja PBS. Četrdeset osam sati posle poslednje doze, pacovi su eutanazirani i sakupljeni su organi i plazma za druge analize.
Funkcija jetre
[0537] Radi procenjivanja efekta ISIS oligonukleotida na funkciju jetre, mereni su nivoi u plazmi transaminaza dana 42 pomoću automatizovanog analizatora za kliničku hemiju (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Mereni su nivoi u plazmi ALT (alanin transaminaze) i AST (aspartat transaminaze) i rezultati su prikazani dole u tabeli izraženi u IU/L. ISIS oligonukleotidi koji izazivaju promene u nivoima bilo kog od markera funkcije jetre van očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni iz daljeg ispitivanja.
2 4
Tabela 191
Funkcija bubrega
[0538] Da bi se procenio efekat ISIS nukleotida na funkcija bubrega, mereni su nivoi u plazmi i urinu azota iz uree u krvi (BUN) i kreatinina automatizovanim analizatorom za kliničku hemiju (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Rezultati su prikazani dole u tabelama, izraženi u mg/dL. ISIS oligonukleotidi koji izazivaju promene u nivoima bilo kog od markera funkcije bubrega van očekivanog opsega za antisens ologonukleotide su isključeni iz daljih ispitivanja.
Tabela 192
Tabela 193
2
Mase
[0539] Merenja telesne mase su sakupljena dana 39. Merene su mase jetre, srca, slezine i bubrega na kraju ispitivanja dana 42, i prikazane su dole u tabeli. ISIS oligonukleotidi koji izazivaju bilo koje promene u masi organa van očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni iz daljih ispitivanja.
Tabela 194
Ispitivanja 6 (sa MOE gapmerima, dezoksi, MOE i (S)-cEt oligonukleotidi, i (S)-cEt gapmeri)
[0540] Muški pacovi su održavani u režimu 12-sati svetlo/mrak i hranjeni su ad libitum sa hranom za pacove Purina normal, ishrana 5001. Svakoj od grupa od 4 pacova subkutanozno je injektovano jednom nedeljno u toku 6 nedelja 100 mg/kg of MOE gapmera ili 50 mg/kg dezoksi, MOE i (S)-cEt oligonukleotida ili (S)-cEt gapmera. Jednoj kontrolnoj grupi od 4 pacova subkutanozno je injektovan jednom nedeljno u toku 6 nedelja PBS. Četrdeset osam sati posle poslednje doze, pacovi su eutanazirani i sakupljeni su organi i plazma za druge analize
Funkcija jetre
[0541] Radi procenjivanja efekta ISIS oligonukleotida na funkciju jetre, mereni su nivoi u plazmi transaminaza dana 42 pomoću automatizovanog analizatora za kliničku hemiju (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Mereni su nivoi u plazmi ALT (alanin transaminaze) i AST (aspartat transaminaze) su merene i rezultati su prikazani dole u tabeli izraženi u IU/L.
2
Tabela 195
Funkcija bubrega
[0542] Da bi se procenio efekat ISIS nukleotida na funkcija bubrega, mereni su nivoi u urinu ukupnih proteina i kreatinina automatizovanim analizatorom za kliničku hemiju (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Rezultati su prikazani dole u tabeli. ISIS oligonukleotidi koji izazivaju promene u nivoima bilo kog od markera funkcije bubrega van očekivanog opsega za antisens oligonukleotide su isključeni iz daljeg ispitivanja
Tabela 196
2
Mase
[0543] Merenja telesne mase su sakupljena dana 39. Merene su mase jetre, srca, slezine i bubrega na kraju ispitivanja dana 42, i prikazane su dole u tabeli. Rezultati za mese ogana su izraženi kao odnos prema telesnoj masi i normalizovane prema odnosu PBS kontrole.
Tabela 197
Primer 128: Efikasnost antisens oligonukleotida naspram CFB iRNK kod hCFB miševa
[0544] Izabrana jedinjenja su testirana na efikasnost na humanom CFB transgenom mišu, osnivačka linija #6 Humani CFB gen je smešten na hromozom 6: položaja 31913721- 31919861. CFB Sekvenca koja sadrži fozmid (ABC14-50933200C23) je odabrana da se napravi transgeni miš koji eksprimuje humani CFB gen. Cla I (31926612) i Age I (31926815) restrikcioni enzimi su korišeni da se stvori fragment od 22,127 bp koji sadrži CFB gen za pronuklearnu injekciju. DNK je potvrđen analizom sa restrikcionim enzimima pomoću Pvu I. Fragment DNK sa 22,127 bp je injektovan u C57BL/6NTac embrion.6 pozitivnih osnivača je uzgajano. Osnivač #6 eksprimuje humani CFB iRNK jetre i unakrsno je ukrštan sa 3-ćom generacijom. Potomstvo od 3-će generacije miševa je korišeno da proceni humani CFB ASOs za redukciju humanog CFB iRNK.
Postupak
[0545] Svaka od grupa od 3 miša je injektovano subkutanozno dva puta nedeljno u toku prve nedelje 50 mg/kg ISIS oligonukleotida, praćeno sa jednonedeljnim doziranjem 50 mg/kg ISIS oligonukleotida još dodatne tri nedelje. Jedna kontrolna grupa od 4 miša je subkutanozno injektovana dva puta nedeljno 2 nedelje u toku prve nedelje sa PBS u toku prve nedelje za dodatne tri nedelje. Četrdeset osam sati posle poslednje doze, miševi su eutanazirani i sakupljeni su organi i plazma za dalje analize.
2
RNK Analiza
[0546] Na kraju perioda doziranja, RNK je ekstrahovana iz jetre i bubrega za PCR analizu u realnom vremenu nivoa CFB iRNK. Nivoi humane CFB iRNK su mereni pomoću seta humanih proba prajmera RTS3459. Nivoi CFB iRNK su normalizovani prema RIBOGREEN®, i takođe prema domaćem genu, ciklofilinu. Rezultati su izračunati kao procenat inhibicije ekspresije CFB iRNK u poređenju sa kontrolom. Svi antisens oligonukleotidi su postigli inhibiciju nivoa humanog CFB iRNK u jetri.
Tabela 198
2
Primer 129: In vivo antisens inhibicija mišjeg CFB
[0547] Nekoliko antisens oligonukleotida je napravljeno da ciljaju mišji CFB iRNK (GENBANK pristupni broj. NM_008198.2, uključen ovde kao SEQ ID NO: 5). Ciljna start mesta i sekvence svakog oligonukleotida su opisani dole u tabeli. Himerni antisens oligonukleotidi dole u tabeli su označeni kao 5-10-5 MOE gapmeri. Gapmeri su dugački 20 nukleozida, gde centralni segment razmaka se sastoji od 102’-dezoksinukleozida i okružen je sa obe strane (u 5’ i 3’ smerovima) sa "krilima" gde svakoi sadrži 5 nukleozida. Svaki nukleozid u 5’ segmentu "krila" i svaki nukleozid u 3’ segmentu "krila" imaju 2’-MOE modifikacije. Internukleozidne veze kroz svaki gapmer su fosforotioatne (P=S) veze. Svi ostaci citozina kroz svaki gapmer su 5-metilcitozini.
Tabela 199
Postupak
[0548] Svakoj od grupa od 4 C57BL/6 miša je injektovano 50 mg/kg ISIS 516269, ISIS 516272, ISIS 516323, ISIS 516330, ili ISIS 516341 koji su davani nedeljno u toku 3 nedelje. Kontrolna grupa miševa je injektovana sa rastvorom soli puferisanim fosfatima (PBS) davanim nedeljno u toku 3 nedelje.
CFB RNK Analiza
[0549] Na kraju ispitivanja, RNK je ekstrahovan iz tkiva jetre za PCR analizu u realnom vremenu CFB, pomoću seta proba prajmera RTS3430 (napredna sekvenca GGGCAAACAGCAATTTGTGA, označena ovde kao SEQ ID NO: 816; reverzna sekvenca TGGCTACCCACCTTCCTTGT, označena ovde kao SEQ ID NO: 817; sekvenca probe CTGGATACTGTC- CCAATCCCGGTATTCCX, označena ovde kao SEQ ID NO: 818). Nivoi iRNK nivoa su normalizovani pomoću RI-BOGREEN®. Kako je prikazano dole u tabeli, neki od antisens oligonukleotida postigli su smenjenje u mišjem CFB u odnosu na PBS kontrolu. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije CFB, u odnosu na kontrolu.
2
Tabela 200
Analiza proteina
[0550] Nivoi CFB proteina su mereni u bubregu, jetri, plazmi, i u oku sa zapadnim Blot-om u kome je korišćeno kozje anti- CFB antitelo (Sigma Aldrich). Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije CFB, u odnosu na PBS kontrolu. ’n/a’ označava da merenja nisu bila uzeta za taj uzorak. Kao što je prikazano dole u tabeli, antisens inhibicija CFB sa ISIS oligonukleotidima dovela je do smanjenja CFB proteina u različitim tkivima. Kao što je prikazano dole u tabeli, istemsko davanje ISIS oligonukleotida je bilo efikasno u smanjenju CFB nivoa u oku.
Tabela 201
Primer 130: Dozno-zavisna antisens inhibicija mišjeg CFB
[0551] Svakoj grupi od četiri C57BL/6 miša je injektovano 25 mg/kg, 50 mg/kg, ili 100 mg/kg ISIS 516272, i ISIS 516323 nedeljno u toku 6 nedelja. Još dvema grupama injektovano je 100 mg/kg ISIS 516330 ili ISIS 516341 nedeljno u toku 6 nedelja. Dvema kontrolnim grupama je injektovan rastvor soli sa fosatnim puferom (PBS) nedeljno u toku 6 nedelja.
CFB RNK Analiza
[0552] RNK je ekstrahovan iz tkiva jetre i bubrega za PCR analizu u realnom vremenu CFB, pomoću seta proba prajmera RTS3430. Nivoi iRNK su normalizovani pomoću RIBOGREEN®. Kao što je prikazano dole u tabeli, antisens oligo- nukleotidi su postigli dozno-zavisn smanjenje mišjeg CFB u odnosu na PBS kontrolu. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije CFB, u odnosu na kontrolu.
2 1
Tabela 202
Analiza proteina
[0553] Nivoi CFB proteina su mereni u plazmi sa zapadnim Blotom pomoću kozjeg anti-CFB antitela (Sigma Aldrich). Kao što je prikazano dole u tabeli, antisens inhibicija CFB sa ISIS oligonukleotidima dovodi do smanjenja CFB proteina. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije CFB, u odnosu na PBS kontrolu. ’n/a’ označava da nisu uzeta merenja za taj uzorak.
[0554] Nivoi CFB proteina su takođe mereni u oku sa Westarn Blot. Sve tretirane grupe su pokazale inhibiciju CFB od 95%, dok su merenja za neke uzorke bila ispod detekcionih nivoa testa.
Tabela 203
Primer 131: Efekti antisens inhibicija CFB na modelu NZB/W F1 miša
[0555] NZB/W F1 je najstariji klasični model lupusa, gde su kod miševa razvijeni ozbiljni fenotipovi slični lupusu koji se mogu upoređivati sa onima pacijenata sa lupusom (Theofilopoulos, A.N. and Dixon, F.J. Advances in Immunology, vol. 37, pp. 269-390, 1985). Ovi fenotipovi slični lupusu
2 2
uključuju limfadenopatiju, splenomegaliju, povećana antinuklearna autoantitela u serumu (ANA) uključujući anti-dsDNK IgG, od kojih su većina IgG2a i IgG3, i glomerulonefritis posredovan imunim kompelskom (GN) koji postaje očigledan pri starosti od 5-6 meseci, i vodi do otkazivanja bubrega i smrti pri starosti 0-12 meseci.
Ispitivanje 1
[0556] Ispitivanje je izvedeno da pokaže da tretman sa antisens oligonukleotidima koji ciljaju CFB bi poboljšao renalnu patologiju na modelu miša. Ženski NZB/W F1 miševi, stari 17 nedelja, su nabavljeni od Jackson Laboratories. Grupe od 16 miševa su primali doze od 100 µg/kg/nedelji ISIS 516272 ili ISIS 516323 u toku 20 nedelja. Još jedna grupa od 16 miševa je primala doze od 100 µg/kg/nedelji kontrolnog oligonukleotida ISIS 141923 u toku 20 nedelja. Još jedna grupa od 10 miševa je primala doze PBS u toku 20 nedelja i služila je kao grupa sa kojom su sve ostale grupe poređene. Završne krajnje tačke su sakupljene u toku 48 sati posle injektovanja poslednje doze.
CFB RNK Analiza
[0557] RNK je ekstrahovan iz tkiva jetre i bubrega sa PCR analizom u realnom vremenu CFB, pomoću seta proba prajmera RTS3430. Nivoi iRNK su normalizovani pomoću RIBOGREEN®. Kao što je prikazano dole u tabeli, neki od antisens oligonukleotida su postigli smanjenje mišjeg CFB u odnosu na PBS kontorlu. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije CFB, u odnosu na kontrolu.
Tabela 204
Proteinurija
[0558] Proteinurija se očekuje kod 60% životinja na modelu miša. Kumulativna učestalost javljanje ozbiljne proteinurije je merena izračunavanjem ukupnih proteina prema odnosu kreatinina koji se koristi u kliničkom analizatoru. Rezultati su prikazani dole u tabeli i pokazuju da tretman sa antisens oligonukleotidima koji ciljaju CFB postiže smanjenje proteinurije kod miševa u poređenju sa kontrolom i miševima tretiranim sa kontolnim oligonukleotidom.
2
Tabela 205
Preživljavanje
[0559] Preživljavanje miševa je praćeno održavanjem broja miševa na početku tretmana i zatim ponovo 20. nedelje. Rezultati su prikazani dole u tabeli i pokazuju da treatman sa antisens oligonukleotidima koji ciljau CFB povećava preživljavanje kod miševa u poređenju sa PBS kontrolom i miševima tretiranim sa kontrolnim oligonukleotidom.
Tabela 206
Glomerulane naslage
[0560] Količina C3 naslaga, kao i IgG naslaga, u glomeruli bubrega je merena imunohistohemijski sa anti-C3 antitelom. Rezultati su prikazani dole u tabeli i pokazuju da lečenje sa antisens oligonukleotidima koji ciljaju CFB postižu smanjenje obe vrste C3 i IgG naslaga u glomeruli bubrega u poređenju sa PBS kontrolom i miševima tretiranim sa kontrolnim oligonukleotidima.
Tabela 207
Ispitivanje 2
[0561] Ženski NZB/W F1 miševi, 16 nedelja stari, su nabavljeni u Jackson Laboratories. Grupa od 10 miševa je primaila doze od 100 μg/kg/nedelji ISIS 516323 u toku 12 nedelja. Još jedna grupa od 10
2 4
miševa je primila doze od 100 μg/kg/nedelji kontrolnog oligonukleotida ISIS 141923 u toku 12 nedelja. Još jedna grupa od 10 miševa je primila doze PBS za 12 nedelja i služila je kao kontrolna grupa sa kojom su sve ostale grupe poređene. Završne krajnje tačke su sakupljene 48 sati posle injektovanja poslednje doze.
CFB RNK analiza
[0562] RNK je ekstrahovan iz tkiva jetre i bubrega za PCR analizu u realnom vremenu CFB, pomoću seta proba prajmera RTS3430. Kao što je prikazano dole u tabeli, tretman sa ISIS 516323 je postigao smanjenje mišjeg CFB u odnosu na PBS kontrolu. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije CFB, u odnosu na kontrolu.
Tabela 208
Proteinurija
[0563] Kumulativno javljanje ozbiljne proteinurije je procenjeno merenjem ukupnog proteina u urinu u odnosu na odnos kreatinina, kao i mernjem ukupnih nivo mikroalbumina. Rezultati su prikazani dole u tabelama i pokazuju da tretiranje sa antisens oligonukleotidima koji ciljaju CFB smanjuje proteinuriju kod miševa u proeđenju sa PBS kontrolom i sa miševima tretiranim sa kontrolnim oligonukleotidom.
Tabela 209
Tabela 210
Preživljavanje
[0564] Preživljavanje miševa je praćeno održavanjem broja miševa na početku tretmana i na kraju tretmana i zatim ponovo 12. nedelje. Rezultati su prikazani dole u tabeli i pokazuju da tretiranje sa antisens oligonukleotidima koji ciljaju CFB povećava preživljavanje kod miševa u odnosu na PBS kontrolu i miševe tretirane sa kontolim oligonukleotidom.
2
Tabela 211
Primer 132: Efekat antisens inhibicije CFB na modelu MRL miša
[0565] Model MRL/lpr lupus nefritisa na miševima razvija fenotip sličan SLE-karakterisan sa limfadenopatijom usled akumulacije dvostruko negativnih (CD4<->CD8-) i B220<+>T-ćelija. Ovi miševi pokazuju ubrzanu stopu smrtnosti. Pore toga, miševi imaju visoke koncentracije cirkulišućih imunoglobulina, koji uključuju povećane nivoe autoantitela kao što su ANA, anti-ssDNK, antidsDNK, anti-Sm, i reumatoidni faktori, koji dovode do povećanih količina imunih kompleksa (Andrews, B. et al., J. Exp. Med.148: 1198-1215, 1978).
Postupci
[0566] Ispitivanje je izvedeno da se ispita da li tretman sa antisens oligonukleotidima koji ciljaju CFB bi preokreno renalnu patologiju na modelu miša. Ženski MRL/lpr miševi, stari 14 nedelja, su nabavljeni iz Jackson Laboratories. Grupa od 10 miševa je primila doze od 50 μ/kg/nedelji ISIS 516323 u toku 7 nedelja. Još jedna grupa od 10 miševa je primila doze od 50 μg/kg/nedelji kontrolnog oligonukleotida ISIS 141923 u toku 7 nedelja. Još jedna grupa od 10 miševa koja je primila doze PBS u toku 7 nedelja i služila je kao kontrolna grupa sa kojom se sve ostale grupe porede. Završne krajanje tačke su sakupljene u toku 48 sati posle poslenje injektovane doze.
CFB RNK Analiza
[0567] RNK je ekstrahovan iz tkiva jetre PCR analizom u realnom vremenu CFB, pomoću seta proba prajmera RTS3430. Kao što je prikazano dole u tabeli, ISIS 516323 smanjuje CFB u odnosu na PBS kontrolu. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije CFB, u odnosu na kontrolu.
Tabela 212
Renalna patologija
[0568] Renalna patologija je procenjivana sa dva postupka. Histološki delovi bubrega su bojeni sa Haematoksilin &Eozinom. PBS kontrola je pokazala prisustvo multiglomelularni srpastih cevastih segmenata, koji su simptomi glomeruloskleroze. Nasuprot tome, delovi iz miševa tretiranih sa ISIS 516323 su pokazali odsustvo srpastih cevastih segmenata sa minimalim fibrotičnim promenama bavmanove kapsule, umerenom do ozbiljnom ekspanzijom mezangijalnih ćelija i zadebljanjem osnovne membrane glomerula.
2
[0569] Akumulacija C3 u bubregu je takođe procenjena sa imunohistohemijom sa anti-C3 antitelima. Bodovanje intenziteta celo bubrežne C3 imunohistohemije je izračunato prema sistemu bodovanja intenziteta, koje je bilo kompjuterizovano snimanjem 10 glomerula po bubregu i izračuvanje intenziteta pozitivnog C3 bojenja. Rezultati su prikazani dole u tabeli i pokazuju da tretiranje sa ISIS 516323 smanjuje bubrežnu C3 akumulaciju u odnosu na kontrolu grupu.
Tabela 213
Nivoi C3 u plazmi
[0570] Smanjenje CFB inhibira aktivaciju alternativnog puta komplemenata, sprečavajući C3 korišćenje i vodi do očiglednog povećanja nivoa C3 u plazmi. Nivoi C3 u plazmi iz krajnjeg krvarenja su mereni kliničkim analizatorom. Rezultati su prikazani dole u tabeli i pokazuju da tretiranje sa ISIS 516323 povećava nivoe C3 (p<0.001) u plazmi u poređenju sa kontrolnom grupom.
Tabela 214
Rezultati ukazuju da tretman sa antisens oligonukleotidima koji cilju CFB preokreće bubrežnu patologiju na modelu lupusa miša.
Primer 133: Efekat antisens inhibicije CFB na modelu CFH Het miša
[0571] Model CFH heterozigotnih (CFH Het, CFH<+/->) miševa koji eksprimuju mutantni protein faktora H u kombinaciji sa mišjim proteinom pune dužine (Pickering, M.C. et al., J. Exp. Med. 2007.
204: 1249-56). Renalna histologija ostaje normalna kod ovih miševa starosti od šeset meseci.
Ispitivanje 1
[0572] Svaka grupa od 8 CFH<+/->miševa, starih 6 nedelja, je primala doze od 75 mg/kg/nedelji ISIS 516323 ili ISIS 516341 u toku 6 nedelja. Još jedna grupa od 8 miševa koja je primala doze od 75 mg/kg/nedelji kontrolnog oligonukleotida ISIS 141923 u toku 6 nedelja. Još jedna grupa od 8 miševa primala je doze PBS u toku 6 nedelja i služila je kao kontrolna grupa sa kojom su ostale grupe poređene. Završne krajne tačke su sakupljene 48 sati posle injektovanja posledenje doze.
2
CFB RNK analize
[0573] RNK je ekstrahovana iz tkiva jetre i bubrega za PCR analizu u realnom vremenu CFB, pomoću seta proba prajmera RTS3430. Kao što je prikazano dole u tabeli, antisens oligonukleotidi su smanjili CFB u odnosu na PBS kontrolu. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije CFB, relativno u odnosu na kontrolu.
Tabela 215
Nivoi C3 u plazmi
[0574] Smanjenje CFB inhibira aktiviranje alternativnog puta komplementa, sprečavajući korišćenje C3 i vodi kao očiglednom povećanju nivoa C3 u plazmi. Nivoi C3 u plazmi iz poslednjeg sakupljanja plazme su mereni sa kliničkim analizatorom. Rezultati su prikazani dole u tabeli i pokazali su da tretman sa ISIS 516323 povećava C3 do normalnih nivoa u plazmi.
Tabela 216
Ispitivanje 2
[0575] Grupa od 5 CFH<+/->miševa je primila doze 12.5 mg/kg/nedelji, 25 mg/kg/nedelji, 50 mg/kg/nedelji, 75 mg/kg/nedelji, ili 100 mg/kg/nedelji ISIS 516323 ili ISIS 516341 za 6 nedelja. Još jedna grupa od 5 miševa je primala doze 75 µg/kg/nedelji kontrolnog oligonukleotida ISIS 141923 u toku 6 nedelja. Još jedna grupa od 5 miševa je primala doze PBS u toku 6 nedelja i služila je kao kontrolna grupa sa kojom su sve ostale grupe poređene. Završne krajnje tačke su sakupljene 48 sati posle injektovanja poslednje doze.
CFB RNK Analiza
[0576] RNK je ekstrahovan iz tkiva jetre i bubrega PCR analizom u realnom vremenu CFB, pomoću seta proba prajmera RTS3430. Kao što je prikazano dole u tabeli, antisens oligonukleotidi smanjuju CFB u odnosu na kontrolu PBS na dozno zavistan način. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije CFB, u odnosu na kontrolu.
2
Tabela 217
Nivoi C3 u plazmi
[0577] Redukcija CFB inhibira aktivaciju alternativnog puta komplementa, sprečavajući trošenje C3 i vodeći do očiglenog povećanja nivoa C3 u plazmi. Nivoi C3 u plazmi za krajnje sakupljenu plaze su mereni kliničkim analiztorom. Rezultati su prikazani dole u tabeli i pokazuju da tretman sa ISIS oligonukleotidima koji cilja CFB povećava C3 nivoe u plazmi.
Tabela 218
2
Primer 134: Efekat ISIS antisens oligonukleotida koji ciljaju humani CFB kod cinomolgus majmuna
[0578] Cinomolgus majmuni su tretirani sa ISIS antisens oligonukleotidima izabranim u ispitivanjima opisanim gore u primerima. Procenjivane su efikasnost antisens oligonukleotida i toleribilnost, kao i njihov farmakokinetički profil u jetri i bubregu,.
[0579] U vreme kada je ispitivanje izvođeno, genomska sekvenca cinomolgus majmuna nije bila dostupna u bazi podataka National Center for Biotechnology Information (NCBI); zbog toga unakrsna reaktivnost sa genskom sekvencom cinomolgus majmuma ne može biti potvrđena. Umesto toga, sekvence ISIS antisens oligonukleotida korišćene kod cinomolgus majmuna su bile poređene na homologiju sa sekvencom rezus majmuna. Očekuje se da ISIS oligonukleotidi sa homologijom sa sekvencom rezus majmuna su potpuno unakrno reaktivni takođe sa sekvencom cinomolgus majmuna. Testirani humani antisens oligonukleotidi su unakrsno reaktivni sa gensomskom sekvencom rezusa (GENBANK pristupni br. NW_001116486.1 skraćenoj od nukleotida 536000 do 545000, ovde označenom kao SEQ ID NO: 3). Što je veča komplementarnost između sekvenca humanih oligonukleotida i rezus majmuna, verovatnije je da će humana oligonukleotidna sekvenca unakrsno reagovati sa sekvencom rezus majmuna. Start i stop mesta svakog oligonukleotida koji cilja SEQ ID NO: 3 su prikazana dole u tabeli. "Start mesto" označava većinom 5’ nukleotid koji gapmer cilja u genskoj sekvenci rezus majmuna. ’Nepoklapanje’ označava broj nukleobaza u humanom oligonukleotidu koje se ne poklapaju sa genomskom sekvencom rezusa.
Tabela 219
Postupak
[0580] Pre ispitivanja, majmuni su čuvani u karantinu u toku bar perioda od 30 dana, u toku kog su životinje posmatrane dnevno radi opšeg zdravnja. Majmuni su bili 2-4 godine stari i imali težinu
2
između 2 i 4 kg. Svakoj od jedanaest grupa 4-6 nasumično dodeljenih muških cinomolgus majmuna subkutanozno je injektovan ISIS oligonukleotid ili PBS na četiri mesta na leđima sa rotacijom u smeru sata (tj. levo, vrh, desno, i dole), jedno mesto po dozi. Majmunima su date četiri pune doze PBS ili 40 mg/kg ISIS 532800, ISIS 532809, ISIS 588540, ISIS 588544, ISIS 588548, ISIS 588550, ISIS 588553, ISIS 588555, ISIS 588848, ili ISIS 594430 u toku prve nedelje (dani 1, 3, 5, i 7), i naknadno je doziran jednom nedeljno u toku 12 nedelja (dana 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77, i 84) PBS ili 40 mg/kg ISIS oligonukleotida. ISIS 532770 je testiran u odvojeni ispitivanjima sa sličnim uslovima sa dva muška i dva ženska cinomolgus majmuna u grupi.
Hepatičko ciljano smanjenje
RNK analiza
[0581] Dana 86, uzoci jetre i bubrega su sakupljeni u duplikatu (približno 250 mg svaki) za CFB iRNK analizu. Uzorci su brzo smrznuti u tečnom azotu pri nekroskopiji u okviru približno 10 minuta posle žrtvovanja.
[0582] RNK je ekstrahovan iz jetre i bubrega PCR analizom u realnom vremenu merenjem iRNK ekspresije CFB. Rezultati su prikazani kao procentna promena iRNK, u odnosu na PBS kontrolu, normalizovani sa RIBOGREEN®. RNK nivoi su takođe normalizovani sa genom iz kuće, ciklofilina A. RNK nivoi su mereni sa setovima roba prajmera RTS3459, gore opisanim, ili RTS4445_MGB (napredna sekvenca CGAAGAAGCTCAGTGAAATCAA, ovde označena kao SEQ ID NO: 819; reverzna sekvenca TGCCTGGAGGGCCCTCTT, ovde označena kao SEQ ID NO: 820; sekvenca probe AGACCACAAGTTGAAGTC, označena ovde kao SEQ ID NO: 815).
[0583] Kako je pokazano dole na tabelama, tretman ISIS antisens oligonukleotidima rezultovao je smanjenju CFB iRNK u poređenju sa PBS kontrolom. Analiza nivoa CFB iRNK je otkrila da nekoliko ISIS oligonukleotida smanjuje CFB nivoe u jetri i/ili bubregu. Ovde ’0’ označava da nivoi ekspresije nisu bili inhibirani. ’*’ označava da je oligonukleotid testiran u odvojenom ispitivanju u sličnim uslovima.
Tabela 220
2 1
Tabela 221
[0584] Približno 1 mL krvi je sakupljen od svih dostupnih životinja dana 85 i smešten je u epruvete koje sadrže kalijumovu so EDTA. Uzorci krvi su smešteni odmah u vlažni led ili Kryorack, i centrifugirani (3000 oum u toku 10 min na 4°C) da bi se dobila plazma (približno 0.4 mL) u okviru 60 minuta sakupljanja. Nivoi CFB u plazmi su mereni u plazmi sa radijalnom imunodifuzijom (RID), pomoću poliklonalnih antitela anti-faktora B. Rezultati su prikazani dole u tabeli. ISIS 532770 je testiran u odvojenom ispitivanji i nivoi proteina u plazmi su mereni dana 91 ili 92 u toj grupi.
[0585] Analiza CFB u plazmi je otkrila da nekoliko ISIS oligonukleotida smanjuje nivoe proteina na odloženi način. ISIS 532770, koji je testiran u odvojenom ispitivanju, smanjuje nivoe CFB proteina dana 91/92 za 50% u poređenju sa vrednostima osnovne linije. Redukcija u vrednostima nivoa CFB proteina u plazmi su u dobroj korelacji sa smanjenjem nivoa CFB iRNK jetre u odgovarajućoj grupi životinja.
2 2
Tabela 222
Ispitivanja tolerabilnosti
Merenja telesne mase
[0586] Da bi se procenio efekat ISIS nukleotida na celokupno zdravlje životinja, mase tela i organa su merene i prikazane dole u tabeli. ’*’ označava da su oligonukleotidi testirani u odvojenim ispitivanjima u sličnim uslovima i to je srednja vrednost merenja muških i ženskih majmuna. Rezultati ukazuju da efekat tretiranja sa antisens oligonukleotidima na masu tela i organa je bitno u okviru očekivanog opsega za antisens oligonukleotide.
Tabela 223
2
Tabela 224
Funkcija jetre
[0587] Radi procenjivanja efekta ISIS oligonukleotida na funkciju jetre, sakupljeni su uzorci krvi iz svih ispitivanih grupa. Uzorci krvi su sakupljeni iz vene glave, safene ili butne vene, 48 sati posle doziranja. Majmuni su izgladnjivani u toku noći pre sakupljanja krvi. Krv (1.5 mL) je sakupljena u epruvete bez antikoagulatna za odvajanje seruma. Epruvete su držane na sobnoj temperaturi u toku minimalno 90 minuta i zatim su centrifugirane (približno 3,000 opm u toku 10 min) da bi se dobio serum. Nivoi različitih markera funkcije jetre su mereni pomoću Toshiba 200FR NEO hemijskog analizatora (Toshiba Co., Japan).
[0588] Nivoi u plazmi ALT i AST su mereni i rezultati su prikazani dole u tabeli, izraženi u IU/L. Bilirubin, marker funkcije jetre, je slično meren i prikazan je dole u tabeli izraženi u mg/dL. ’*’ označava da je oligonukleotid bio testiran u odvojenom ispitivanju sa sličnim uslovima i srednja je vrednost merenja za muške i ženske majmune. Rezultati ukazuju da većina antisens oligonukleotida nema uticaj na funkciju jetre van očekivanog opsega za antisens oligonukleotide.
Tabela 225
2 4
Funkcija bubrega
[0589] Da bi se procenio efekat ISIS nukleotida na funkcija bubrega, uzorci krvi su sakupljeni iz svih ispitivanjih grupa. Uzorci krvi su sakupljani iz vena glave, safene ili butne vene, 48 sati posle doziranja. Majmuni su izgladnjivani u toku noći pre sakuplajnja krvi. Krv je sakupljena u epruvetama bez antikoagulanta za odvajanje seruma. Epruvete su držane na sobnoj temperaturi u toku minimalno 90 minuta i zatim su centrifugirane (približno 3,000 oum u toku 10 min) da bi se dobio serum. Nivoi BUN i kreatinina su mereni pomoću Toshiba 200FR NEO hemijskog analizatora (Toshiba Co., Japan). Rezultati su prikazani dole u tabeli, izraženi u mg/dL. ’*’ označava da je oligonukleotid testiran u odvojenom ispitivanju u sličnim uslovima i srednja je vrednost merenja za muške i ženske majmune.
[0590] Za analizu urina, svež urin od svih životinja je sakupljen ujutru pomoću čistog dna kaveza koji je hlađen na vlažnom ledu .Hrana je uklonjena u toku noći jedan dan pre sakupljanja urina ali je nastavljeno snabdevanje vodom. Uzorci urina (približno 1 mL) su analizirani na odnos proteina prema kreatininu (P/C) pomoću Toshiba 200FR NEO automatskog hemijskog analizatora (Toshiba Co., Japan). ’n.d.’ označava da je nivo proteina u urinu bio ispod detekcione granice analizatora.
[0591] Hemijski podaci iz plazme i urina ukazuju da većina ISIS oligonukleotida nema bilo kakav efekat na funkciju bubrega van očekivanog opsega za antisens oligonukleotide.
Tabela 226
2
Tabela 227
Hematologija
[0592] Za procenjivanje efekta ISIS oligonukleotida na hematološke parametere cinomolgus majmune, sakupljeni su uzorci krvi približno 0.5 mL krvi i044z svakog dostupnog ispitivanja životinja u epruvetama koje sadrže K2-EDTA. Uzorci su analizirani na broj crvenih krvnih zrnaca (RBC), broj belih krvnih zrnaca (WBC), broj pojedinalnih belih krvnih zrnaca kao što su monocite, neutrofili, limfociti, kao i broj trombocita, sadržaj hemoglobina i hematokrita, pomoću ADVIA120 hematološkog analizatora (Bayer, USA). Podaci su prikazani dole u tabelama. ’*’ označava da je oligonukleotid testiran u odvojenom ispitivanju pri sličnim uslovima i srednja je vrednost merenja za muške i ženske majmune.
[0593] Podaci ukazuju da oligonukleotidi ne izazivaju bilo kakve promene u hematološkim parametrima van očekivanog opsega za antisens oligonukleotide pri ovoj dozi.
Tabela 228
2
Tabela 229
Merenje koncentracije oligonukleotida
[0594] Koncentracija oligonukleotida pune dužine je merena u tkivima bubrega i jetre. Korišćen postupak je modifikacija ranije objavljenih postupaka (Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999) koja se sastoji od ekstrakcije fenol-hloroform (tečno-tečno) praćene ekstrakcijom sa čvrstom fazom. Koncentracje uzoraka tkiva su izračunavane pomoću kalibracionih kriva, sa nižom granicom kvantifikacije (LLOQ) od približno 1.14 µg/g. Rezultati su prikazani dole u tabeli, izraženi kao µg/g tkiva jetre ili bubrega.
2
Tabela 230
Primer 135: 6-nedeljno ispitivanje efikasnosti nekonjugovanog i 5’-THA-GalNAc3 konjugovanih antisens oligonukleotida koji ciljaju humani CFB u transgenom mišu
[0595] Dva antisens oligonukleotida koji imaju istu nukleobaznu sekvencu: nekonjugovani antisens oligonukeotid ISIS 588540 i 5’-THA-GalNAc3-konjugovani antisens oligonukleotid ISIS 696844, su testirani u humanim CFB transgenim miševima (hCFB-Tg miševi).
[0596] Miševima je dat subkutanozno ISIS 696844 u dozama 0.1, 1.25, 0.5, 2.0, 6.0, ili 12.0 mg/kg/nedelji ili ISIS 588540 u dozama 2, 6, 12, 25, ili 50 mg/kg/nedelji u toku 6 nedelja. Kontrolnoj grupi miševa je davan subkutanozno PBS u toku 6 nedelja. Miševi su žrtvovani 48 sati posle poslednje doze. Nivoi iRNK u jetri su analizirani sa qRT-PCR.
Ispitivanje 1
[0597] Rezultati su prikazani dole u tabeli i pokazuju da 5’-THA-GalNAc3-konjugovani antisens oligonukleotid koji cilja CFB ima jače dejstvo od nekonjugovanog antisens oligonukleotida sa istom sekvencom.
Tabela 231
Ispitivanje 2
[0598] Nivoi iRNK u jetri su mereni sa dva različita seta proba prajemera koji ciljaju različite regone iRNK i normalizovani su prema ili RIBOGREEN® (RGB) ili ciklofilinu. Setovi proba prajmera su bili RTS3459, gore opisan, i RTS3460 (napredna sekvenca CGAAGCAGCTCAATGAAATCAA, označena ovde kao SEQ ID NO: 813; reverzna sekvenca TGCCTGGAGGGCCTTCTT, označena ovde kao SEQ ID NO: 814; sekvenca probe AGACCACAAGTT-GAAGTC, označena ovde kao SEQ ID NO: 815). Rezultati koji su prikazani dole u tabeli i pokazuju da 5’-THA-GalNAc3-konjugovani antisens oligonukleotid koji cilja CFB je jačeg dejstva od nekonjugovanog antisens oligonukleotida sa istom sekvencom, bez obzira na korišćeni set probe prajmera.
2
231la be
Ta
2
21
22
�
��
�
�
�
2
�
�
�
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
1
2
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
41
41
41
41
41
41
41
42
42
42
42
42
42
42
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
44
44
44
44
44
44
44
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
4
41

Claims (14)

  1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje koje sadrži modifikovani oligonukleotid i konjugovanu grupu, gde modifikovani oligonukleotid se sastoji od 20 do 30 vezanih nukelozida i ima nukleobaznu sekvencu SEQ ID NO: 440, gde je oligonukleotid bar 80% komplementaran sa SEQ ID NO: 1 ili 2 i gde konjugovana grupa obuhvata :
  2. 2. Jedinjenje prema zahtevu 1, gde modifikovani oligonukleotid sadrži bar jednu modifikovanu internukleozidnu vezu, bar jedan modifikovani šećer, ili bar jednu modifikovanu nukleobazu, opciono gde modifikovana internukleozidna veza je fosforotioatna internukleozidna veza.
  3. 3. Jedinjenje prema zahtevu 2, gde modifikovani oligonukleotid sadrži: a) bar 1 fosforodiestarsku internukleozidnu vezu; b) bar 2 fosforodiestarske internukleozidne veze; c) bar 3 fosforodiestarske internukleozidne veze; d) bar 4 fosforodiestarske internukleozidne veze; e) bar 5 fosforodiestarskih internukleozidnih veza; f) bar 6 fosforodiestarskih internukleozidnih veza; g) bar 7 fosforodiestarskih internukleozidnih veza, opciono gde: i) svaka internukleozina veza modifikovanog oligonukleotida je izabrana iz fosforodiestarske internukleozidne veze i fosforotioatne internukleozidne veze; ili ii) svaka internukleozidna veza modifikovanog oligonukleotida sadrži fosforotiatnu internukleozidnu vezu.
  4. 4. Jedinjenje prema zahtevu 2 ili 3, gde: a) modifikovani šećer je biciklični šećer, opciono gde je biciklični šećer izabran iz grupe koju čine: 4’-(CH2)-O-2’ (LNA); 4’-(CH2)2-O-2’ (ENA); i 4’-CH(CH3)-O-2’ (cEt); ili b) modifikovani šećer je 2’-O-metoksietil; i/ili 4 2 c) modifikovana nukleobaza je 5-metilcitozin.
  5. 5. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1-4, gde modifikovani oligonukleotid sadrži: (a) segment razmaka koji se sastoji od povezanih dezoksinukleozida; (b) 5’ segment „krila“ koji se sastoji od povezanih nukleozida; i (c) 3’ segment „krila“ koji se sastoji od povezanih nukleozida; gde segment razmaka je smešten odmah pored i između 5’ segmenta „krila“ i 3’ segmenta „krila“ i gde svaki nukleozid svakog segmenta „krila“ sadrži modifikovani šećer.
  6. 6. Jedinjenje prema zahtevu 5, gde modifikovani oligonukleotid se sastoji od 20 povezanih nukleotida koji imaju nukleobaznu sekvencu koja se sastoji od sekvence navedene u SEQ ID NO: 440, gde modifikovani oligonukleotid sadrži segment razmaka koji se sastoji od deset povezanih dezoksinukleozida; 5’ segment "krila" koji se sastoji od pet povezanih nukleozida; i 3’ segment „krila“ koji se sastoji od pet povezanih nukleozida; gde segment razmaka je smešten između 5’ segment „krila“a i 3’ segment „krila“a, gde svaki nukleozid svakog segment „krila“ se sastoji od 2’-O-metoksietil šećera; gde svaka internukleozidna veza je fosforotioatna veza i gde svaki citozin je 5-metilcitozin.
  7. 7. Jedinjenje prema bilo kom od zahteve 1-5, gde je oligonukleotid bar 85%, 90%, 95% ili 100% komplementaran sa SEQ ID NO: 1 ili 2.
  8. 8. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1-7, gde: a) jedinjenje je jednolančano; ili b) jedinjenje je dvolančano; i/ili c) jedinjenje sadrži: i) ribonukleotide; ili ii) deozoksibonukleotide.
  9. 9. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1-8, gde konjugovana grupa je povezana sa modifikovanim oligonukleotidom: i) na 5’ kraju modifikovanog oligonukleotida; ili ii) na 3’ kraju modifikovanog oligonukleotida.
  10. 10. Jedinjenje prema zahtevu 1 koje ima formulu: a) 4
    gde ili R<1>je -OCH2CH2OCH3(MOE) i R<2>je H; ili R<1>i R<2>zajedno obrazuju most, gde R<1>je -O- i R<2>je -CH2-, -CH(CH3)-, ili -CH2CH2-, i R<1>i R<2>su direktno vezani tako da je takav dobijeni most izabran između : -O-CH2-, -O-CH(CH3)-, i -O-CH2CH2-; i za svaki par R<3>i R<4>na istom prstenu, nazavisno od svakog prstena : ili R<3>je izabran između H i -OCH2CH2OCH3i R<4>je H; ili R<3>i R<4>zajedno obrazuju most, gde R<3>je -O-, i R<4>je-CH2-, -CH(CH3)-, ili -CH2CH2-i R<3>i R<4>su direkno povezani tako da je dobijeni most izabran između : -O-CH2-, -O-CH(CH3)-, i -O-CH2CH2-; i R<5>je izabran između H i -CH3; i Z je izabran između S- i O-; b) 4 4
    ili d) 4
  11. 11. Jedinjenje prema zahtevu 1 koje ima formulu : 4
  12. 12. Kompozicija koja sadrži jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1-11 ili njegova so i bar jedan farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač.
  13. 13. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1-11 ili kompozicija prema zahtevu 12 za upotrebu u lečenju, sprečavanju ili ublažavanju bolesti u vezi sa disregulacijom alternativnog puta komplementa kod subjekta.
  14. 14. Jedinejnje ili kompozicija za upotrebu prema zahtevu 13, gde je bolest: a) makularna degeneracija, starosna makularna degeneracija (AMD), vlažna AMD, suva AMD ili geografska atrofija; 4 b) bolest bubrega, opciono gde je bolest lupus nefritis, sistemski eritemski lupus (SLE), bolest gustih depozita (DDD), C3 glomerulonefitis (C3GN), CFHR5 nefropatija ili atipični hemolitički uremički sindrom (aHUS). Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5 4
RSP20191141 2014-05-01 2015-05-01 Kompozicije i postupci za modulaciju ekspresije faktora b komplementa RS59182B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461987471P 2014-05-01 2014-05-01
US201462076273P 2014-11-06 2014-11-06
PCT/US2015/028916 WO2015168635A2 (en) 2014-05-01 2015-05-01 Compositions and methods for modulating complement factor b expression
EP15786214.5A EP3137596B1 (en) 2014-05-01 2015-05-01 Compositions and methods for modulating complement factor b expression

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS59182B1 true RS59182B1 (sr) 2019-10-31

Family

ID=54359510

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RSP20191141 RS59182B1 (sr) 2014-05-01 2015-05-01 Kompozicije i postupci za modulaciju ekspresije faktora b komplementa

Country Status (29)

Country Link
US (5) US10280423B2 (sr)
EP (3) EP4219718A3 (sr)
JP (2) JP6637442B2 (sr)
KR (1) KR102369736B1 (sr)
CN (2) CN110724687B (sr)
AU (1) AU2015252858C1 (sr)
BR (1) BR112016022593B1 (sr)
CA (2) CA2943894C (sr)
CL (2) CL2016002764A1 (sr)
CR (2) CR20200228A (sr)
DK (1) DK3137596T3 (sr)
DO (1) DOP2016000291A (sr)
EA (1) EA036496B1 (sr)
ES (2) ES2941742T3 (sr)
HR (1) HRP20191664T1 (sr)
HU (1) HUE046272T2 (sr)
IL (2) IL247883B (sr)
LT (1) LT3137596T (sr)
MX (1) MX380866B (sr)
PE (2) PE20190626A1 (sr)
PH (1) PH12016502062B1 (sr)
PL (2) PL3608406T3 (sr)
PT (1) PT3137596T (sr)
RS (1) RS59182B1 (sr)
RU (1) RU2701645C2 (sr)
SG (2) SG10201809953QA (sr)
SI (1) SI3137596T1 (sr)
UA (1) UA121656C2 (sr)
WO (1) WO2015168635A2 (sr)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013159108A2 (en) * 2012-04-20 2013-10-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising bicyclic nucleotides and uses thereof
DK2992098T3 (da) 2013-05-01 2019-06-17 Ionis Pharmaceuticals Inc Sammensætninger og fremgangsmåder til modulering af hbv- og ttr-ekspression
MY181251A (en) * 2013-09-13 2020-12-21 Ionis Pharmaceuticals Inc Modulators of complement factor b
EA036496B1 (ru) 2014-05-01 2020-11-17 Ионис Фармасьютикалз, Инк. Конъюгированные олигонуклеотиды для модулирования экспрессии фактора комплемента b
BR112016022742B1 (pt) 2014-05-01 2022-06-14 Ionis Pharmaceuticals, Inc Composto químico, composição compreendendo o composto e uso dos mesmos
CN106795200B (zh) 2014-10-10 2020-06-19 豪夫迈·罗氏有限公司 Galnac亚磷酰胺、其核酸缀合物及其用途
KR20250078597A (ko) 2015-11-06 2025-06-02 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 아포리포프로테인 (a) 발현 조정
US10781175B2 (en) 2016-07-15 2020-09-22 Am Chemicals Llc Solid supports and phosphoramidite building blocks for oligonucleotide conjugates
JOP20190215A1 (ar) * 2017-03-24 2019-09-19 Ionis Pharmaceuticals Inc مُعدّلات التعبير الوراثي عن pcsk9
WO2020109343A1 (en) 2018-11-29 2020-06-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy for treatment of macular degeneration
JP7720788B2 (ja) * 2019-06-25 2025-08-08 アムジエン・インコーポレーテツド 炭水化物に連結されたオリゴヌクレオチドのための精製方法
JP7672394B2 (ja) 2019-09-03 2025-05-07 アークトゥラス・セラピューティクス・インコーポレイテッド 治療的に活性な複合体のアシアロ糖タンパク質受容体媒介送達
WO2021081026A1 (en) 2019-10-22 2021-04-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c3 irna compositions and methods of use thereof
BR112022010742A2 (pt) 2019-12-26 2022-08-16 Eisai R&D Man Co Ltd Composição farmacêutica contendo ácido ribonucleico de fita dupla que inibe a expressão de c5 complementar
JP2023523790A (ja) * 2020-04-30 2023-06-07 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 補体因子Ｂ（ＣＦＢ）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法
EP4373940A4 (en) * 2021-07-17 2025-10-01 Sirnaomics Inc PRODUCTS AND COMPOSITIONS
WO2023031359A1 (en) 2021-09-02 2023-03-09 Silence Therapeutics Gmbh Nucleic acids for inhibiting expression of complement factor b (cfb) in a cell
CN118302525A (zh) 2021-10-29 2024-07-05 阿尔尼拉姆医药品有限公司 补体因子B（CFB）iRNA组合物及其使用方法
AU2022396536A1 (en) 2021-11-24 2024-06-06 Adarx Pharmaceuticals, Inc. Complement factor b-modulating compositions and methods of use thereof
WO2024097861A1 (en) * 2022-11-02 2024-05-10 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods for modulating complement factor b expression
WO2024137590A2 (en) * 2022-12-19 2024-06-27 Sanegene Bio Usa Inc. Small interfering rna targeting cfb and uses thereof
EP4684015A2 (en) * 2023-03-21 2026-01-28 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Rnai agents for inhibiting expression of complement factor b (cfb), pharmaceutical compositions thereof, and methods of use
TW202513799A (zh) * 2023-06-02 2025-04-01 大陸商維亞臻生物技術（蘇州）有限公司 用於免疫類疾病的雙鏈核苷酸化合物及其用途
WO2025002401A1 (zh) * 2023-06-28 2025-01-02 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 一种cfb基因修饰的非人动物
CN121532510A (zh) * 2023-07-28 2026-02-13 苏州炫景生物科技有限公司 Cfb抑制剂组合物及其应用
WO2025151250A2 (en) * 2024-01-09 2025-07-17 Adarx Pharmaceuticals, Inc. Complement factor b-modulating compositions and methods of use thereof
WO2026046277A1 (zh) * 2024-08-28 2026-03-05 倍臻生物技术（苏州）有限公司 用于抑制补体因子b(cfb)基因表达的双链核糖核酸及其缀合体

Family Cites Families (297)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2699508A (en) 1951-12-21 1955-01-11 Selectronics Inc Method of mounting and construction of mounting for low frequency piezoelectric crystals
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4500707A (en) 1980-02-29 1985-02-19 University Patents, Inc. Nucleosides useful in the preparation of polynucleotides
US5132418A (en) 1980-02-29 1992-07-21 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US4973679A (en) 1981-03-27 1990-11-27 University Patents, Inc. Process for oligonucleo tide synthesis using phosphormidite intermediates
US4668777A (en) 1981-03-27 1987-05-26 University Patents, Inc. Phosphoramidite nucleoside compounds
US4415732A (en) 1981-03-27 1983-11-15 University Patents, Inc. Phosphoramidite compounds and processes
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
DE3329892A1 (de) 1983-08-18 1985-03-07 Köster, Hubert, Prof. Dr., 2000 Hamburg Verfahren zur herstellung von oligonucleotiden
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
USRE34036E (en) 1984-06-06 1992-08-18 National Research Development Corporation Data transmission using a transparent tone-in band system
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US4751219A (en) 1985-02-05 1988-06-14 Nederlandse Centrale Organisatie Voor Toegepast-Natuur-Wetenschappelijk Onderzoek Synthetic glycolipides, a process for the preparation thereof and several uses for these synthetic glycolipides
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5506337A (en) 1985-03-15 1996-04-09 Antivirals Inc. Morpholino-subunit combinatorial library and method
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
EP0260032B1 (en) 1986-09-08 1994-01-26 Ajinomoto Co., Inc. Compounds for the cleavage at a specific position of RNA, oligomers employed for the formation of said compounds, and starting materials for the synthesis of said oligomers
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
EP0366685B1 (en) 1987-06-24 1994-10-19 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Nucleoside derivatives
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
ATE151467T1 (de) 1987-11-30 1997-04-15 Univ Iowa Res Found Durch modifikationen an der 3'-terminalen phosphodiesterbindung stabilisierte dna moleküle, ihre verwendung als nukleinsäuresonden sowie als therapeutische mittel zur hemmung der expression spezifischer zielgene
US5403711A (en) 1987-11-30 1995-04-04 University Of Iowa Research Foundation Nucleic acid hybridization and amplification method for detection of specific sequences in which a complementary labeled nucleic acid probe is cleaved
JPH03503894A (ja) 1988-03-25 1991-08-29 ユニバーシィティ　オブ　バージニア　アランミ　パテンツ　ファウンデイション オリゴヌクレオチド　ｎ‐アルキルホスホラミデート
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5194599A (en) 1988-09-23 1993-03-16 Gilead Sciences, Inc. Hydrogen phosphonodithioate compositions
US5256775A (en) 1989-06-05 1993-10-26 Gilead Sciences, Inc. Exonuclease-resistant oligonucleotides
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
US5721218A (en) 1989-10-23 1998-02-24 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides with inverted polarity
US5264562A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
DE69034150T2 (de) 1989-10-24 2005-08-25 Isis Pharmaceuticals, Inc., Carlsbad 2'-Modifizierte Oligonukleotide
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
US5130302A (en) 1989-12-20 1992-07-14 Boron Bilogicals, Inc. Boronated nucleoside, nucleotide and oligonucleotide compounds, compositions and methods for using same
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5623065A (en) 1990-08-13 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped 2' modified oligonucleotides
US7101993B1 (en) 1990-01-11 2006-09-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides containing 2′-O-modified purines
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5457191A (en) 1990-01-11 1995-10-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5859221A (en) 1990-01-11 1999-01-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-modified oligonucleotides
US6005087A (en) 1995-06-06 1999-12-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-modified oligonucleotides
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5149797A (en) 1990-02-15 1992-09-22 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of rna and production of encoded polypeptides
US5220007A (en) 1990-02-15 1993-06-15 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of RNA and production of encoded polypeptides
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
ES2116977T3 (es) 1990-05-11 1998-08-01 Microprobe Corp Soportes solidos para ensayos de hibridacion de acidos nucleicos y metodos para inmovilizar oligonucleotidos de modo covalente.
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5386023A (en) 1990-07-27 1995-01-31 Isis Pharmaceuticals Backbone modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through reductive coupling
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
JPH0874B2 (ja) 1990-07-27 1996-01-10 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド 遺伝子発現を検出および変調するヌクレアーゼ耐性、ピリミジン修飾オリゴヌクレオチド
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5378825A (en) 1990-07-27 1995-01-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5223618A (en) 1990-08-13 1993-06-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
MY107332A (en) 1990-08-03 1995-11-30 Sterling Drug Inc Compounds and methods for inhibiting gene expression.
US5177196A (en) 1990-08-16 1993-01-05 Microprobe Corporation Oligo (α-arabinofuranosyl nucleotides) and α-arabinofuranosyl precursors thereof
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
JPH06505704A (ja) 1990-09-20 1994-06-30 ギリアド　サイエンシズ，インコーポレイテッド 改変ヌクレオシド間結合
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
US6582908B2 (en) 1990-12-06 2003-06-24 Affymetrix, Inc. Oligonucleotides
US5948903A (en) 1991-01-11 1999-09-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Synthesis of 3-deazapurines
US5672697A (en) 1991-02-08 1997-09-30 Gilead Sciences, Inc. Nucleoside 5'-methylene phosphonates
US7015315B1 (en) 1991-12-24 2006-03-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligonucleotides
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
EP0538194B1 (de) 1991-10-17 1997-06-04 Novartis AG Bicyclische Nukleoside, Oligonukleotide, Verfahren zu deren Herstellung und Zwischenprodukte
US5594121A (en) 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
AU3222793A (en) 1991-11-26 1993-06-28 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
TW393513B (en) 1991-11-26 2000-06-11 Isis Pharmaceuticals Inc Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
US5792608A (en) 1991-12-12 1998-08-11 Gilead Sciences, Inc. Nuclease stable and binding competent oligomers and methods for their use
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
JP3131222B2 (ja) * 1991-12-24 2001-01-31 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド ギャップを有する２′修飾オリゴヌクレオチド
US5700922A (en) 1991-12-24 1997-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
US20030206887A1 (en) * 1992-05-14 2003-11-06 David Morrissey RNA interference mediated inhibition of hepatitis B virus (HBV) using short interfering nucleic acid (siNA)
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
US5652355A (en) 1992-07-23 1997-07-29 Worcester Foundation For Experimental Biology Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
ATE162198T1 (de) 1992-07-27 1998-01-15 Hybridon Inc Oligonukleotid alkylphosphonothiate
ATE138384T1 (de) 1993-01-25 1996-06-15 Hybridon Inc Olionukleotidalkylphosphonate und - phosphonothioate
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
GB9304620D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Compounds
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
CA2159631A1 (en) 1993-03-30 1994-10-13 Sanofi Acyclic nucleoside analogs and oligonucleotide sequences containing them
HU9501974D0 (en) 1993-03-31 1995-09-28 Sterling Winthrop Inc Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
US5801154A (en) 1993-10-18 1998-09-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of multidrug resistance-associated protein
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
DE733059T1 (de) 1993-12-09 1997-08-28 Univ Jefferson Verbindungen und verfahren zur ortsspezifischen mutation in eukaryotischen zellen
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US5646269A (en) 1994-04-28 1997-07-08 Gilead Sciences, Inc. Method for oligonucleotide analog synthesis
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5597909A (en) 1994-08-25 1997-01-28 Chiron Corporation Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use
US5681940A (en) * 1994-11-02 1997-10-28 Icn Pharmaceuticals Sugar modified nucleosides and oligonucleotides
US6172045B1 (en) 1994-12-07 2001-01-09 Neorx Corporation Cluster clearing agents
US6908903B1 (en) 1994-12-07 2005-06-21 Aletheon Pharmaceuticals, Inc. Cluster clearing agents
US5652356A (en) 1995-08-17 1997-07-29 Hybridon, Inc. Inverted chimeric and hybrid oligonucleotides
CN1120707C (zh) 1995-11-22 2003-09-10 约翰斯·霍普金斯大学 增强生物分子的细胞摄取的配体
US20030119724A1 (en) 1995-11-22 2003-06-26 Ts`O Paul O.P. Ligands to enhance cellular uptake of biomolecules
US5998203A (en) 1996-04-16 1999-12-07 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Enzymatic nucleic acids containing 5'-and/or 3'-cap structures
US20080119427A1 (en) 1996-06-06 2008-05-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double Strand Compositions Comprising Differentially Modified Strands for Use in Gene Modulation
CN1231675A (zh) 1996-09-26 1999-10-13 味之素株式会社 修饰的生理活性蛋白及含有该蛋白的药物组合物
US6770748B2 (en) 1997-03-07 2004-08-03 Takeshi Imanishi Bicyclonucleoside and oligonucleotide analogue
USRE44779E1 (en) 1997-03-07 2014-02-25 Santaris Pharma A/S Bicyclonucleoside and oligonucleotide analogues
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US7572582B2 (en) 1997-09-12 2009-08-11 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
JP4236812B2 (ja) 1997-09-12 2009-03-11 エクシコン エ／エス オリゴヌクレオチド類似体
US20030228597A1 (en) 1998-04-13 2003-12-11 Cowsert Lex M. Identification of genetic targets for modulation by oligonucleotides and generation of oligonucleotides for gene modulation
US6300319B1 (en) 1998-06-16 2001-10-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Targeted oligonucleotide conjugates
US6043352A (en) 1998-08-07 2000-03-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-Dimethylaminoethyloxyethyl-modified oligonucleotides
US6166239A (en) 1998-09-04 2000-12-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide protecting groups
AU1705100A (en) 1998-10-09 2000-05-01 Musc Foundation For Research Development Blocking factor b to treat complement-mediated immune disease
US20030064944A1 (en) * 2001-06-21 2003-04-03 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of transforming growth factor beta receptor II expression
ES2234563T5 (es) 1999-02-12 2018-01-17 Daiichi Sankyo Company, Limited Nuevos análogos de nucleósidos y oligonucleótidos
US20030170249A1 (en) 1999-02-19 2003-09-11 Hakomori Sen-Itiroh Vaccines directed to cancer-associated carbohydrate antigens
US7084125B2 (en) 1999-03-18 2006-08-01 Exiqon A/S Xylo-LNA analogues
KR20070118315A (ko) 1999-04-21 2007-12-14 와이어쓰 폴리뉴클레오티드 서열의 기능을 억제하기 위한 조성물
US7053207B2 (en) 1999-05-04 2006-05-30 Exiqon A/S L-ribo-LNA analogues
US6525191B1 (en) 1999-05-11 2003-02-25 Kanda S. Ramasamy Conformationally constrained L-nucleosides
US6383812B1 (en) 1999-05-28 2002-05-07 Academia Sinica Anti liver disease drug R-YEEE and method of synthesizing branched galactose-terminal glycoproteins
US20080281041A1 (en) 1999-06-07 2008-11-13 Rozema David B Reversibly Masked Polymers
US8541548B2 (en) 1999-06-07 2013-09-24 Arrowhead Madison Inc. Compounds and methods for reversible modification of biologically active molecules
JP4151751B2 (ja) 1999-07-22 2008-09-17 第一三共株式会社 新規ビシクロヌクレオシド類縁体
DE19935303A1 (de) * 1999-07-28 2001-02-08 Aventis Pharma Gmbh Oligonukleotide zur Inhibierung der Expression von humanem eg5
US20020082227A1 (en) * 1999-09-30 2002-06-27 Scott Henry Use of oligonucleotides for inhibition of complement activation
EP1244667B1 (en) 1999-12-30 2006-04-05 K.U. Leuven Research & Development Cyclohexene nucleic acids
US7491805B2 (en) * 2001-05-18 2009-02-17 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
US7833992B2 (en) 2001-05-18 2010-11-16 Merck Sharpe & Dohme Conjugates and compositions for cellular delivery
US7053199B2 (en) 2000-08-29 2006-05-30 Takeshi Imanishi Nucleoside analogs and oligonucleotide derivatives containing these analogs
US6426220B1 (en) 2000-10-30 2002-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of calreticulin expression
CN100406065C (zh) 2000-12-01 2008-07-30 细胞工厂治疗公司 糖基化/半乳糖基化肽、双官能接头和核苷酸单体/多聚体的缀合物以及相关的组合物和使用方法
WO2002087541A1 (en) 2001-04-30 2002-11-07 Protiva Biotherapeutics Inc. Lipid-based formulations for gene transfer
CA2452458A1 (en) 2001-07-03 2003-01-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant chimeric oligonucleotides
US20030158403A1 (en) 2001-07-03 2003-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant chimeric oligonucleotides
US20030175906A1 (en) 2001-07-03 2003-09-18 Muthiah Manoharan Nuclease resistant chimeric oligonucleotides
US6964950B2 (en) 2001-07-25 2005-11-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of C-reactive protein expression
US20030073623A1 (en) * 2001-07-30 2003-04-17 Drmanac Radoje T. Novel nucleic acid sequences obtained from various cDNA libraries
CA2459347C (en) 2001-09-04 2012-10-09 Exiqon A/S Locked nucleic acid (lna) compositions and uses thereof
US7439043B2 (en) 2001-10-10 2008-10-21 Neose Technologies, Inc. Galactosyl nucleotide sugars
US20100240730A1 (en) 2002-02-20 2010-09-23 Merck Sharp And Dohme Corp. RNA Interference Mediated Inhibition of Gene Expression Using Chemically Modified Short Interfering Nucleic Acid (siNA)
EP1540004A4 (en) 2002-07-31 2007-10-03 Nucleonics Inc DOUBLE-STRING RNA STRUCTURES AND CONSTRUCTS AND METHOD FOR THE PRODUCTION AND USE THEREOF
AU2003261449A1 (en) * 2002-08-07 2004-02-25 Compositions for rna interference and methods of use thereof
CA2498772A1 (en) 2002-09-11 2004-03-25 Santaris Pharma A/S Modified pna molecules
CA2502649A1 (en) 2002-10-18 2004-04-29 Nucleonics Inc. Double-stranded rna structures and constructs, and methods for generating and using the same
WO2004041889A2 (en) 2002-11-05 2004-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
AU2003291755A1 (en) 2002-11-05 2004-06-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomers comprising modified bases for binding cytosine and uracil or thymine and their use
AU2003295600A1 (en) 2002-11-14 2004-06-15 Dharmacon, Inc. Functional and hyperfunctional sirna
US6673661B1 (en) 2002-12-20 2004-01-06 Taiwan Semiconductor Manufacturing Co., Ltd. Self-aligned method for forming dual gate thin film transistor (TFT) device
US20070015927A1 (en) 2003-01-09 2007-01-18 Kim Byeang H New phosphoramidite compounds
CA2518475C (en) 2003-03-07 2014-12-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Irna agents comprising asymmetrical modifications
US7851615B2 (en) 2003-04-17 2010-12-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipophilic conjugated iRNA agents
ES2702942T3 (es) 2003-04-17 2019-03-06 Alnylam Pharmaceuticals Inc Agentes de ARNi modificados
US7723509B2 (en) 2003-04-17 2010-05-25 Alnylam Pharmaceuticals IRNA agents with biocleavable tethers
US20070123466A1 (en) 2003-05-13 2007-05-31 New York Society For The Ruptured And Crippled Maintaining The Hospital For Special Surgery Method of treating recurrent miscarriages
WO2004101619A1 (ja) 2003-05-15 2004-11-25 Shionogi Co., Ltd. 機能的糖ペプチドの合理的設計および合成
WO2004106356A1 (en) 2003-05-27 2004-12-09 Syddansk Universitet Functionalized nucleotide derivatives
EP1661905B9 (en) 2003-08-28 2012-12-19 IMANISHI, Takeshi Novel artificial nucleic acids of n-o bond crosslinkage type
JP2007505605A (ja) * 2003-09-16 2007-03-15 サーナ・セラピューティクス・インコーポレイテッド 低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を使用したＲＮＡ干渉により媒介される血管内皮増殖因子遺伝子発現および血管内皮増殖因子遺伝子受容体遺伝子発現のＲＮＡ干渉媒介性抑制
CA2538252C (en) 2003-09-18 2014-02-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. 4'-thionucleosides and oligomeric compounds
US7959919B2 (en) 2003-11-19 2011-06-14 Novelmed Therapeutics, Inc. Method of inhibiting factor B-mediated complement activation
US20060019941A1 (en) 2003-12-23 2006-01-26 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Analogs of benzoquinone-containing ansamycins and methods of use thereof
JPWO2005061707A1 (ja) 2003-12-24 2007-07-12 協和醗酵工業株式会社 癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性を判定する方法
US20050244851A1 (en) 2004-01-13 2005-11-03 Affymetrix, Inc. Methods of analysis of alternative splicing in human
PL1713503T3 (pl) 2004-02-10 2014-02-28 Univ Colorado Regents Hamowanie czynnika B, alternatywny szlak dopełniacza i związane z tym sposoby
US20050244869A1 (en) 2004-04-05 2005-11-03 Brown-Driver Vickie L Modulation of transthyretin expression
JPWO2005097155A1 (ja) 2004-04-08 2008-02-28 タカラバイオ株式会社 神経突起伸長誘導剤
EP1791567B1 (en) 2004-08-10 2015-07-29 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Chemically modified oligonucleotides
US20090203132A1 (en) 2004-09-09 2009-08-13 Swayze Eric E Pyrrolidinyl groups for attaching conjugates to oligomeric compounds
US7919472B2 (en) 2004-09-17 2011-04-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Enhanced antisense oligonucleotides
WO2006047842A2 (en) 2004-11-08 2006-05-11 K.U. Leuven Research And Development Modified nucleosides for rna interference
US20060148740A1 (en) 2005-01-05 2006-07-06 Prosensa B.V. Mannose-6-phosphate receptor mediated gene transfer into muscle cells
US20080206869A1 (en) 2005-01-24 2008-08-28 Avaris Ab Nucleic Acid Complex
KR20080065617A (ko) 2005-09-19 2008-07-14 존슨 앤드 존슨 파머슈티컬 리서치 앤드 디벨로프먼트 엘엘씨 글루코코티코이드 수용체 발현의 조절
WO2007056111A1 (en) * 2005-11-02 2007-05-18 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Method evolved for recognition and testing of age related macular degeneration (mert-armd)
WO2007090071A2 (en) 2006-01-27 2007-08-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-modified bicyclic nucleic acid analogs
US7569686B1 (en) 2006-01-27 2009-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for synthesis of bicyclic nucleic acid analogs
JP2009536222A (ja) * 2006-05-05 2009-10-08 アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド Ｐｃｓｋ９の発現を調節するための化合物および方法
US7666854B2 (en) 2006-05-11 2010-02-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bis-modified bicyclic nucleic acid analogs
AU2007249349B2 (en) 2006-05-11 2012-03-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5'-Modified bicyclic nucleic acid analogs
US8658211B2 (en) 2006-08-18 2014-02-25 Arrowhead Madison Inc. Polyconjugates for in vivo delivery of polynucleotides
CN101500548A (zh) 2006-08-18 2009-08-05 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 用于体内递送多核苷酸的多缀合物
AU2007299705B2 (en) 2006-09-22 2012-09-06 Dharmacon, Inc. Duplex oligonucleotide complexes and methods for gene silencing by RNA interference
ES2526295T5 (es) 2006-10-18 2021-05-04 Ionis Pharmaceuticals Inc Compuestos antisentido
WO2008101157A1 (en) 2007-02-15 2008-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5'-substituted-2'-f modified nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
US9216228B2 (en) 2007-02-16 2015-12-22 KTB Tumorforschungsgesellschaft MBM Receptor and antigen targeted prodrug
JP5332064B2 (ja) 2007-03-01 2013-11-06 ウェルスタット イムノセラピューティクス， エルエルシー 炎症により特徴付けられる疾患の治療
US20100055782A1 (en) * 2007-03-02 2010-03-04 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting myc gene expression and uses thereof
CA2685127C (en) 2007-04-23 2019-01-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Glycoconjugates of rna interference agents
CA2688321A1 (en) 2007-05-30 2008-12-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs
DK2173760T4 (en) 2007-06-08 2016-02-08 Isis Pharmaceuticals Inc Carbocyclic bicyclic nukleinsyreanaloge
US20090004140A1 (en) 2007-06-26 2009-01-01 Yao-Ling Qiu 4-substituted pyrrolidine as anti-infectives
AU2008272918B2 (en) 2007-07-05 2012-09-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-disubstituted bicyclic nucleic acid analogs
KR101654007B1 (ko) 2007-08-15 2016-09-05 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 테트라하이드로피란 핵산 유사체
US20090123928A1 (en) 2007-10-11 2009-05-14 The Johns Hopkins University Genomic Landscapes of Human Breast and Colorectal Cancers
WO2009067647A1 (en) 2007-11-21 2009-05-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbocyclic alpha-l-bicyclic nucleic acid analogs
WO2009073809A2 (en) 2007-12-04 2009-06-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Carbohydrate conjugates as delivery agents for oligonucleotides
CA2713379A1 (en) 2008-01-31 2009-11-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Optimized methods for delivery of dsrna targeting the pcsk9 gene
WO2009100320A2 (en) 2008-02-07 2009-08-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic cyclohexitol nucleic acid analogs
US20110130440A1 (en) 2008-03-26 2011-06-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Non-natural ribonucleotides, and methods of use thereof
CA2721183C (en) 2008-04-11 2019-07-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Site-specific delivery of nucleic acids by combining targeting ligands with endosomolytic components
WO2009143369A2 (en) 2008-05-22 2009-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Method of preparing nucleosides and analogs thereof without using chromatography
NZ591057A (en) 2008-07-10 2012-11-30 Az Univ Amsterdam Complement antagonists and uses thereof
EP2323667A4 (en) 2008-08-07 2012-07-25 Isis Pharmaceuticals Inc MODULATION OF TRANSTHYRETIN EXPRESSION BY TREATMENT OF CNS DISEASES
AU2009298802A1 (en) 2008-09-23 2010-04-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Chemical modifications of monomers and oligonucleotides with cycloaddition
DK2356129T3 (da) 2008-09-24 2013-05-13 Isis Pharmaceuticals Inc Substituerede alpha-L-bicykliske nukleosider
DK2361256T3 (da) 2008-09-24 2013-07-01 Isis Pharmaceuticals Inc Cyclohexenyl-nukleinsyreanaloger
MX360460B (es) 2008-10-20 2018-11-05 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composiciones y metodos para inhibir la expresion de transtiretina.
US20120059045A1 (en) 2008-10-24 2012-03-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of using oligomeric compounds comprising 2'-substituted nucleosides
EP2447274B1 (en) 2008-10-24 2017-10-04 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and methods
CN111808084A (zh) 2008-11-10 2020-10-23 阿布特斯生物制药公司 用于递送治疗剂的新型脂质和组合物
EP3243504A1 (en) 2009-01-29 2017-11-15 Arbutus Biopharma Corporation Improved lipid formulation
AU2010221419B2 (en) 2009-03-02 2015-10-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid chemical modifications
FR2943060B1 (fr) 2009-03-13 2013-01-04 Commissariat Energie Atomique Agents chelatants d'ions metalliques, leurs procedes de preparation et leurs applications
SG10201911942UA (en) 2009-05-05 2020-02-27 Muthiah Manoharan Lipid compositions
KR101766408B1 (ko) 2009-06-10 2017-08-10 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 향상된 지질 조성물
JP5894913B2 (ja) 2009-06-15 2016-03-30 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． Ｐｃｓｋ９遺伝子を標的とする、脂質で製剤化されたｄｓｒｎａ
US9512164B2 (en) 2009-07-07 2016-12-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide end caps
WO2011005860A2 (en) 2009-07-07 2011-01-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 5' phosphate mimics
US9012421B2 (en) 2009-08-06 2015-04-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic cyclohexose nucleic acid analogs
TWI458493B (zh) 2009-09-25 2014-11-01 Iner Aec Executive Yuan 新穎肝標靶藥劑與合成方法
BR112012008865A2 (pt) 2009-10-16 2019-09-24 Glaxo Group Ltd inibidores de hbv anti-sentido.
TWI391144B (zh) 2009-10-26 2013-04-01 Iner Aec Executive Yuan 一種定量肝殘餘功能的檢驗方法與其新穎肝受體造影檢驗藥劑
TWI388338B (zh) 2009-10-26 2013-03-11 Iner Aec Executive Yuan 對聚合醣鏈進行放射標誌以作為肝受體造影劑之方法
WO2011072290A2 (en) 2009-12-11 2011-06-16 The Regents Of The University Of Michigan Targeted dendrimer-drug conjugates
US9198972B2 (en) 2010-01-28 2015-12-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Monomers and oligonucleotides comprising cycloaddition adduct(s)
SI2539451T1 (sl) 2010-02-24 2016-04-29 Arrowhead Research Corporation Sestavki za ciljano dostavo sirna
US9193752B2 (en) 2010-03-17 2015-11-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5′-substituted bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
EP2553019A1 (en) 2010-03-26 2013-02-06 Mersana Therapeutics, Inc. Modified polymers for delivery of polynucleotides, method of manufacture, and methods of use thereof
US20130109817A1 (en) 2010-03-26 2013-05-02 Mersana Therapeutics, Inc. Modified Polymers for Delivery of Polynucleotides, Method of Manufacture, and Methods of Use Thereof
US9102938B2 (en) 2010-04-01 2015-08-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 2′ and 5′ modified monomers and oligonucleotides
WO2011133871A2 (en) 2010-04-22 2011-10-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 5'-end derivatives
US10913767B2 (en) 2010-04-22 2021-02-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising acyclic and abasic nucleosides and analogs
EP2601204B1 (en) 2010-04-28 2016-09-07 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modified nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
PL2563920T3 (pl) 2010-04-29 2017-08-31 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulacja ekspresji transtyretyny
US20130236968A1 (en) 2010-06-21 2013-09-12 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Multifunctional copolymers for nucleic acid delivery
CA2812046A1 (en) 2010-09-15 2012-03-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified irna agents
WO2012068187A1 (en) 2010-11-19 2012-05-24 Merck Sharp & Dohme Corp. Poly(amide) polymers for the delivery of oligonucleotides
AU2011343664B2 (en) 2010-12-17 2015-10-08 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Galactose cluster-pharmacokinetic modulator targeting moiety for siRNA
US8501930B2 (en) 2010-12-17 2013-08-06 Arrowhead Madison Inc. Peptide-based in vivo siRNA delivery system
CA3131967A1 (en) 2010-12-29 2012-07-05 F. Hoffman-La Roche Ag Small molecule conjugates for intracellular delivery of nucleic acids
EP2673361B1 (en) 2011-02-08 2016-04-13 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising bicyclic nucleotides and uses thereof
CN103562215B (zh) 2011-04-01 2017-04-26 埃西斯药品公司 信号转导及转录激活蛋白3(stat3)表达的调节
WO2012145674A1 (en) 2011-04-21 2012-10-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hepatitis b virus (hbv) expression
RS61447B1 (sr) 2011-04-21 2021-03-31 Glaxo Group Ltd Modulacija ekspresije virusa hepatitisa b (hbv)
MX390699B (es) 2011-06-21 2025-03-21 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composiciones y metodos para inhibicion de genes para apolipoproteina c-iii (apoc3).
EP2723758B1 (en) 2011-06-21 2018-06-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Angiopoietin-like 3 (angptl3) irna compostions and methods of use thereof
WO2013032829A1 (en) 2011-08-26 2013-03-07 Arrowhead Research Corporation Poly(vinyl ester) polymers for in vivo nucleic acid delivery
WO2013033230A1 (en) 2011-08-29 2013-03-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomer-conjugate complexes and their use
EP3730618A1 (en) * 2011-11-18 2020-10-28 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Rnai agents, compositions and methods of use thereof for treating transthyretin (ttr) associated diseases
WO2013119979A1 (en) 2012-02-08 2013-08-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for modulating factor vii expression
WO2013159108A2 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising bicyclic nucleotides and uses thereof
US20150299696A1 (en) 2012-05-02 2015-10-22 Sirna Therapeutics, Inc. SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA) COMPOSITIONS
TW201808342A (zh) 2012-05-02 2018-03-16 喜納製藥公司 包含四ｇａｌｎａｃ之新穎結合物及傳送寡核苷酸之方法
US20160002624A1 (en) 2012-05-17 2016-01-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide compositions
US9695418B2 (en) 2012-10-11 2017-07-04 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising bicyclic nucleosides and uses thereof
CN104837996A (zh) 2012-11-15 2015-08-12 罗氏创新中心哥本哈根有限公司 抗apob反义缀合物化合物
WO2014118272A1 (en) 2013-01-30 2014-08-07 Santaris Pharma A/S Antimir-122 oligonucleotide carbohydrate conjugates
AU2014211406B2 (en) 2013-01-30 2019-07-18 Roche Innovation Center Copenhagen A/S LNA oligonucleotide carbohydrate conjugates
IL288931B2 (en) * 2013-03-14 2025-05-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc Compositions comprising a complementary portion of C5 IRNA and methods of using them
DK2992098T3 (da) 2013-05-01 2019-06-17 Ionis Pharmaceuticals Inc Sammensætninger og fremgangsmåder til modulering af hbv- og ttr-ekspression
EP3564374A1 (en) 2013-06-21 2019-11-06 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulation of target nucleic acids
HUE048738T2 (hu) 2013-06-27 2020-08-28 Roche Innovation Ct Copenhagen As Antiszensz oligomerek és konjugátumok, amelyek a PCK9-t célozzák meg
DE102013106985A1 (de) * 2013-07-03 2015-01-22 Osram Oled Gmbh Optoelektronische Bauelementevorrichtung und Verfahren zum Herstellen einer optoelektronischen Bauelementevorrichtung
WO2015006740A2 (en) * 2013-07-11 2015-01-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide-ligand conjugates and process for their preparation
MY181251A (en) * 2013-09-13 2020-12-21 Ionis Pharmaceuticals Inc Modulators of complement factor b
SG10201804960RA (en) * 2013-12-12 2018-07-30 Alnylam Pharmaceuticals Inc Complement component irna compositions and methods of use thereof
EA036496B1 (ru) 2014-05-01 2020-11-17 Ионис Фармасьютикалз, Инк. Конъюгированные олигонуклеотиды для модулирования экспрессии фактора комплемента b

Also Published As

Publication number Publication date
IL271659A (en) 2020-02-27
KR20160147892A (ko) 2016-12-23
IL247883A0 (en) 2016-11-30
PL3137596T3 (pl) 2019-11-29
CL2018001996A1 (es) 2019-03-08
CA3289039A1 (en) 2026-03-02
NZ724366A (en) 2023-10-27
DK3137596T3 (da) 2019-09-02
ES2941742T3 (es) 2023-05-25
PE20170010A1 (es) 2017-03-04
EP4219718A3 (en) 2024-01-10
CR20160554A (es) 2017-03-07
CN106232804B (zh) 2019-10-25
HUE046272T2 (hu) 2020-02-28
BR112016022593A2 (pt) 2017-10-10
SG10201809953QA (en) 2018-12-28
WO2015168635A3 (en) 2016-01-07
CN110724687A (zh) 2020-01-24
DOP2016000291A (es) 2017-02-15
MX2016014294A (es) 2017-02-02
EP3608406A1 (en) 2020-02-12
RU2016147047A (ru) 2018-06-01
IL247883B (en) 2021-03-25
JP2017514489A (ja) 2017-06-08
PE20190626A1 (es) 2019-04-26
EA036496B1 (ru) 2020-11-17
EP3137596A2 (en) 2017-03-08
PH12016502062A1 (en) 2016-12-19
KR102369736B1 (ko) 2022-03-02
AU2015252858B2 (en) 2020-12-10
NZ763982A (en) 2023-11-24
US10280423B2 (en) 2019-05-07
ES2745825T3 (es) 2020-03-03
LT3137596T (lt) 2019-09-10
RU2016147047A3 (sr) 2018-10-26
MX380866B (es) 2025-03-12
EP4219718A2 (en) 2023-08-02
US20170159055A1 (en) 2017-06-08
PT3137596T (pt) 2019-09-27
US20260022382A1 (en) 2026-01-22
US20230357776A1 (en) 2023-11-09
JP7001663B2 (ja) 2022-02-04
EP3137596A4 (en) 2017-09-20
SI3137596T1 (sl) 2019-08-30
UA121656C2 (uk) 2020-07-10
EP3137596B1 (en) 2019-07-10
EA201692204A1 (ru) 2017-04-28
CR20200228A (es) 2020-07-09
AU2015252858A1 (en) 2016-10-06
CN106232804A (zh) 2016-12-14
SG11201608502TA (en) 2016-11-29
JP6637442B2 (ja) 2020-01-29
RU2701645C2 (ru) 2019-09-30
HRP20191664T1 (hr) 2019-12-13
PH12016502062B1 (en) 2023-01-27
CA2943894A1 (en) 2015-11-05
CL2016002764A1 (es) 2017-12-29
CA2943894C (en) 2026-03-03
EP3608406B1 (en) 2023-02-15
US11732265B2 (en) 2023-08-22
US20230057718A1 (en) 2023-02-23
CN110724687B (zh) 2023-10-13
PL3608406T3 (pl) 2023-05-22
US20200048638A1 (en) 2020-02-13
BR112016022593B1 (pt) 2022-04-26
WO2015168635A2 (en) 2015-11-05
AU2015252858C1 (en) 2021-09-16
JP2020058368A (ja) 2020-04-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11732265B2 (en) Compositions and methods for modulating complement factor B expression
JP7297112B2 (ja) 補体ｂ因子の調節薬
US11312964B2 (en) Compositions and methods for modulating growth hormone receptor expression
AU2015252917A1 (en) Compositions and methods for modulating PKK expression
HK40022441A (en) Compositions and methods for modulating complement factor b expression
HK1234433A1 (en) Compositions and methods for modulating complement factor b expression
HK1234433B (en) Compositions and methods for modulating complement factor b expression
HK1234434B (en) Compositions and methods for modulating growth hormone receptor expression
HK1234434A1 (en) Compositions and methods for modulating growth hormone receptor expression