Deprecated: The each() function is deprecated. This message will be suppressed on further calls in /home/zhenxiangba/zhenxiangba.com/public_html/phproxy-improved-master/index.php on line 456
RS59343B1 - Antitela koja se vezuju za humani cgrp receptor - Google Patents
[go: Go Back, main page]

RS59343B1 - Antitela koja se vezuju za humani cgrp receptor - Google Patents

Antitela koja se vezuju za humani cgrp receptor

Info

Publication number
RS59343B1
RS59343B1 RSP20191122A RS59343B1 RS 59343 B1 RS59343 B1 RS 59343B1 RS P20191122 A RSP20191122 A RS P20191122A RS 59343 B1 RS59343 B1 RS 59343B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antigen
group
seq
amino acid
sequence
Prior art date
Application number
Other languages
English (en)
Inventor
Thomas Charles Boone
David W Brankow
Colin V Gegg Jr
Shaw-Fen Sylvia Hu
Chadwick T King
Hsieng Sen Lu
Licheng Shi
Cen Xu
Original Assignee
Amgen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amgen Inc filed Critical Amgen Inc
Publication of RS59343B1 publication Critical patent/RS59343B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/06—Antimigraine agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2869—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against hormone receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/32—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency specific for a neo-epitope on a complex, e.g. antibody-antigen or ligand-receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cardiology (AREA)

Description

Opis
OSNOVA PRONALASKA
[0001] Superfamilija kalcitoninskih peptida uključuje najmanje pet poznatih članova: kalcitonin, amilin, adrenomedulin, i dva peptida kodirana genom za kalcitonin ("CGRP"), CGRP1 (takođe poznat kao ctCGRP, ili CGRP) i CGRP2 (takođe poznat kao βCGRP). CGRP je vazoaktivni neuropeptid od 37 aminokiselina koji se eksprimira u centralnom i u perifernom nervnom sistemu, i pokazao se kao snažan vazodilator na periferiji, gde su neuroni koji sadrže CGRP blisko povezani sa krvnim sudovima. Vazodilatacija posredovana peptidom CGRP takođe je povezana sa neurogenom inflamacijom, kao deo niza događaja koji rezultuju u izlivu plazme i vazodilataciji mikrovaskulature, i prisutna je kod migrene. Amilin takođe ima specifična vezivna mesta u CNS, i smatra se da reguliše pražnjenje želuca i da ima ulogu u metabolizmu ugljenih hidrata. Adrenomedulin je snažan vazodilatator. Adrenomedulin ima specifične receptore na astrocitima i njegova informaciona RNK je ushodno regulisana u tkivima CNS koja podležu ishemiji. (Zimmermann, et al., Identification of adrenomedullin receptors in cultured rat astrocytes and in neuroblastoma glioma hybrid cells (NG108-15), Brain Res., 724:238-245 (1996); Wang et al., Discovery of adrenomedullin in rat ischemic cortex and evidence for its role in exacerbating focal brain ischemic damage, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:11480-11484 (1995)).
[0002] Kalcitonin je uključen u kontrolu metabolizma kosti i aktivan je i u centralnom nervnom sistemu (CNS). Biološke aktivnosti CGRP uključuju regulaciju nervno-mišićnih spojeva, prezentovanje antigena u imunskom sistemu, vaskularni tonus i senzornu neurotransmisiju. (Poyner, D. R., Calcitonin gene-related peptide: multiple actions, multiple receptors, Pharmacol. Ther., 56:23-51 (1992); Muff et al., Calcitonin, calcitonin gene related peptide, adrenomedullin and amylin: homologous peptides, separate receptors and overlapping biological actions, Eur. J. Endocrinol., 133: 17-20 (1995)). Tri peptida koja stimulišu kalcitoninski receptor (CRSP) su takođe identifikovana kod brojnih vrsta sisara; peptidi CRSP mogu da obrazuju novu potfamiliju CGRP familije. (Katafuchi, T and Minamino, N, Structure and biological properties of three calcitonin receptor-stimulating peptides, novel members of the calcitonin gene-related peptide family, Peptides, 25(11):2039-2045 (2004)).
[0003] Kalcitoninska superfamilija peptida deluje preko receptora sa sedam transmembranskih domena spojenog sa G-proteinom (GPCR). Kalcitoninski receptor ("CT", "CTR" ili "CT receptor") i receptori za CGRP su tip II ("familija B") receptora GPCR, ova familija uključuje druge receptore GPCR koji prepoznaju regulatorne peptide kao što su sekretin, glukagon i vazoaktivni intestinalni polipeptid (VIP). Najbolje okarakterisane varijante nastale iskrajanjem introna humanog kalcitoninskog receptora razlikuju se u zavisnosti od prisustva (ranije CTRII+ili CTR1, sada poznatog kao CT(b)) ili odsustva (glavna varijanta iskrajanja introna, ranije CTRII-ili CTR2, sada poznatog kao CT(a)) 16 aminokiselina u prvoj intracelularnoj petlji. (Gorn et al., Expression of two human skeletal calcitonin receptor isoforms cloned from a giant cell tumor of bone: the first intracellular domain modulates ligand binding and signal transduction, J. Clin. Invest., 95:2680-2691 (1995); Hay et al., Amylin receptors: molecular composition and pharmacology, Biochem. Soc. Trans., 32:865-867 (2004); Poyner et al., 2002). Predpostavka o postojanju bar dva subtipa CGRP receptora proizašla je iz različitih afiniteta antagonista i potencijala agonista u različitim in vivo i in vitro biološkim testovima. (Dennis et al., CGRP8-37, A calcitonin gene-related peptide antagonist revealing calcitonin generelated peptide receptor heterogeneity in brain and periphery, J. Pharmacol. Exp. Ther., 254:123-128 (1990); Dennis et al., Structure-activity profile of calcitonin gene-related peptide in peripheral and brain tissues. Evidence for multiplicity, J. Pharmacol. Exp. Ther., 251:718-725 (1989); Dumont et al., A potent and selective CGRP2 agonist, [Cys(Et)2,7]hCGRP: comparison in prototypical CGRP1 and CGRP2 in vitro assays, Can. J. Physiol. Pharmacol., 75:671-676 (1997)).
[0004] Nađeno je da je CGRP1podtip receptora osetljiv na fragment antagonista CGRP(8-37). (Chiba et al., Calcitonin gene-related peptide receptor antagonist human CGRP-(8-37), Am. J. Physiol., 256:E331-E335 (1989); Dennis et al. (1990); Mimeault et al., Comparative affinities and antagonistic potencies of various human calcitonin gene-related peptide fragments on calcitonin gene-related peptide receptors in brain and periphery, J. Pharmacol. Exp. Ther., 258:1084-1090 (1991)). Nasuprot tome, CGRP2receptor je bio osetljiv na linearne analoge humanog CGRP (hCGRP), u kojima su cisteinski ostaci na pozicijama 2 i 7 derivatizovani (npr., acetoaminometilom [Cys(ACM)<2,7>] ili etilamidom [Cys(Et)<2,7>]) ali CGRP2receptor je bio neosetljiv na fragment CGRP(8-37). (Dennis et al. (1989); Dennis et al. (1990); Dumont et al. (1997)).
[0005] Specifičnost za ligand kalcitoninskog receptora i kalcitoninu-sličnog receptora ("CL", "CLR" ili "CRLR") zavisi od koekspresije članova familije dodatnih proteina nazvanih proteini koji modifikuju aktivnost receptora (RAMP). Familija RAMP uključuje tri polipeptida (RAMP1, RAMP2 i RAMP3) koji deluju kao modulatori receptora koji određuju specifičnost za ligand članova familije receptora za kalcitonin. Proteini RAMP su transmembranski proteini tipa I koji dele oko 30% identičnosti aminokiselinske sekvence i opštu predviđenu topologiju, sa kratkim citoplazmatskim C-krajevima, jednim transmembranskim domenom i velikim vanćelijskim N-krajevima koji su odgovorni za specifičnost. (McLatchie et al., (1998) RAMPs regulate the transport and ligand specificity of the calcitonin-receptor-like receptor, Nature, 393:333-339; Fraser et al., (1999) The amino terminus of receptor activity modifying proteins is a critical determinant of glycosylation state and ligand binding of calcitonin receptor-like receptor, Molecular Pharmacology, 55:1054-1059).
[0006] Godine 1998, receptor CGRP1je identifikovan kao heterodimer koji se sastoji od novog dodatnog proteina sa jednim transmembranskim domenom, proteina 1 koji modifikuje aktivnost receptora (RAMP1), i CRLR. (McLatchie et al., supra). Eksperimenti obrazovanja unakrsnih veza su sugerisali da CGRP receptor sastoji od CRLR i RAMP1 u stehiometrijskom uređenju 1:1 (Hilairet et al. JBC 276, 42182-42190 (2001)), novija ispitivanja koja koriste nekoliko metodologija kao što su BRET i BiFC otkrila su da funkcionalni CGRP receptorski kompleks može biti sastavljen od asimetričnog homo-oligomera CRLR i monomera RAMP1 (Heroux et al. JBC 282, 31610-31620 (2007)).
[0007] Pokazano je da se prečišćeni CRLR N-terminalni domen specifično vezuje za<125>I-CGRP (Chauhan et al. Biochemistry 44, 782 (2005)), potvrđujući važnu i neposrednu interakciju CRLR sa CGRP ligandom. Posebno, smatra se da Leu 24 i Leu 34 u CRLR obrazuju mesto uklapanja C-terminalnog Phe37 iz CGRP (Banerjee et al. BMC Pharmacol.6, 9 (2006)). Dodatno, Koller et al. (FEBS Lett.531, 464-468 (2002)) su pribavili dokaz da 18 N-terminalnih aminokiselinskih ostataka CRLR doprinosi selektivnoj interakciji sa CGRP ili adrenomedulinom, a Ittner et al (Biochemistry 44, 5749- 5754 (2005)) su sugerisali da N-terminalni aminokiselinski ostaci 23- 60 u CRLR posreduju u udruživanju sa RAMP1.
[0008] Ispitivanja strukture i funkcije RAMP1 su identifikovala ostatke 91-103, koji su u korelaciji sa "spiralom 3" (Simms et al. Biophys. J. 91, 662 - 669 (2006)), kao potencijalno značajne u interakciji sa CRLR, i ostatke Trp74 i Phe92 kao one koji potencijalno interaguju sa ligandom CGRP u vezi sa njegovim vezivanjem za CGRP receptorski kompleks. Ispitivanja vezivanja liganda korišćenjem himernog humanog/pacovskog RAMP1 sugerišu da je vezujuće mesto za određene niskomolekulske inhibitore CGRP R (npr., BIBN4096BS), smešteno u regionu koji uključuje aminokiseline 66-102 u RAMP1 (Mallee et al. JBC 277, 14294 - 14298 (2002)).
[0009] CRLR ima 55% identičnosti ukupne aminokiselinske sekvence sa CTR, mada su transmembranski domeni skoro 80% identični. (McLatchie et al. (1998); Poyner et al., International union of pharmacology. XXXII. The mammalian calcitonin gene-related peptides, adrenomedullin, amylin and calcitonin receptors, Pharmacol. Rev., 54:233-246 (2002)).
[0010] Pokazano je da CRLR obrazuje receptor visokog afiniteta za CGRP, kada je udružen sa RAMP1, ili, da se pretežno vezuje za adrenomedulin kada je udružen sa RAMP2 ili RAMP3. (McLatchie et al. (1998); Sexton et al., Receptor activity modifying proteins, Cellular Signaling, 13:73-83 (2001); Conner et al., Interaction of calcitonin-gene-related peptide with its receptors, Biochemical Society Transactions 30(Part 4): 451-454 (2002)). Stanje glikozilacije CRLR je povezano sa njegovom farmakologijom. RAMP 1, 2, i 3 prenose CRLR do plazma membrane sličnom efikasnošću, međutim RAMP1 predstavlja CRLR kao terminalno glikozilovani, zreli glikoprotein i CGRP receptor, dok RAMP 2 i 3 predstavljaju CRLR kao nezreli, osnovno glikozilovani adrenomedulinski receptor ("AM" ili "AMR" ili "AM receptor". (Fraser et al. (1999)). Karakterizacija CRLR/RAMP2 i CRLR/RAMP3 receptora u ćelijama HEK293T vezivanjem radioliganda (<125>I-adrenomedulin kao radioligand), funkcionalnim ispitivanjem (merenje cAMP), ili biohemijskom analizom (elektroforeza na SDS-poliakrilamidnom gelu) pokazalo je da se oni ne mogu razlikovati, mada RAMP 2 i 3 dele samo 30% identičnosti aminokiselinske sekvence. (Fraser et al. 1999)). Međutim, razlike su primećene u farmakologiji kod CRLR eksprimiranog sa RAMP 2 u odnosu na RAMP 3. I CGRP i CGRP8-37, kao i adrenomedulin i peptid izveden iz adrenomedulina AM 22-52, aktivni su prema RAMP 3 heterodimeru, ukazujući na to da ovaj kompleks može da deluje i kao CGRP i AM receptor. (Howitt et al., British Journal of Pharmacology, 140:477-486 (2003); Muff et al., Hypertens. Res., 26:S3-S8 (2003)). Koekspresija humanog CRLR sa pacovskim RAMP1, i obrnuto, sugeriše da vrsta RAMP1 određuje farmakološka svojstva kompleksa CRLR/RAMP1 u odnosu na nekoliko ispitanih niskomolekulskih antagonista CGRP receptora. (Mallee et al., Receptor Activity-Modifying Protein 1 determines the species selectivity of nonpeptide CGRP receptor antagonists, J. Biol. Chem., 277(16):14294-14298 (2002)). Osim ako nije udružen sa RAMP, nije poznato da se CRLR vezuje za bilo koji endogeni ligand; to je trenutno jedini GPCR za koji se smatra da se ponaša na ovaj način. (Conner et al., A key role for transmembrane prolines in calcitonin receptor-like agonist binding and signaling: implications for family B G-protein-coupled receptors, Molec. Pharmacol., 67(1):20-31 (2005)).
[0011] Pokazano je takođe da kalcitoninski receptor (CT) obrazuje heterodimerne komplekse sa RAMP, koji su poznati kao amilinski receptori ("AMY", "AMY R" ili "AMY receptor"). Uopšteno, CT/RAMP1 receptori (označeni kao "AMY1" ili "AMY1") pokazuju visoki afinitet prema kalcitoninu lososa, amilinu i CGRP, i niži afinitet prema sisarskim kalcitoninima. Kod CT/RAMP2 receptora ("AMY2" ili "AMY2") i CT/RAMP3 receptora ("AMY3" ili "AMY3"), primećuje se principijelno sličan obrazac, mada je afinitet prema CGRP niži i može da ne bude značajan pri fiziološki relevantnnim koncentracijama liganda. Precizni fenotip receptora zavisi od tipa ćelije i varijante isecanja introna CTR (CT(a)il CT(b)), naročito za amilinske receptore obrazovane učešćem RAMP2. Na primer, objavljeno je da čista populacija ćelija sličnih osteoklastu eksprimira RAMP2, CTR, i CRLR, ali ne i RAMP1 ili RAMP3. (Hay et al. (2004); Christopoulos et al., Multiple amylin receptors arise from receptor activity-modifying protein interaction with the calcitonin receptor gene product, Molecular Pharmacology, 56:235-242 (1999); Muff et al., An amylin receptor is revealed following co-transfection of a calcitonin receptor with receptor activity modifying proteins-1 or -3, Endocrinology, 140:2924-2927 (1999); Sexton et al. (2001); Leuthauser et al., Receptor-activity-modifying protein 1 forms heterodimers with two G-protein-coupled receptors to define ligand recognition, Biochem. J., 351:347-351 (2000); Tilakaratne et al., Amylin receptor phenotypes derived from human calcitonin receptor/RAMP co-expression exhibit pharmacological differences dependent on receptor isoform and host cell environment, J. Pharmacol. Exp. Ther., 294:61-72 (2000); Nakamura et al., Osteoclast-like cells express receptor activity modifying protein 2: application of laser capture microdissection, J. Molec. Endocrinol., 34:257-261 (2005)).
[0012] Tabela 1, u nastavku, sažeto prikazuje odnos komponenti receptora koje su prethodno diskutovane.
[0013] Predložene su terapijske upotrebe antagonista CGRP. Noda et al. su opisali upotrebu CGRP ili derivata CGRP za inhibiciju agregacije trombocita i za lečenje ili prevenciju arterioskleroze ili tromboze. (EP 0385712 B1). Liu et al. su opisali terapeutska sredstva koja moduliraju aktivnost CTR, uključujući peptide konjugovane sa vehikulumom kao što je kalcitonin i humani αCGRP. (WO 01/83526 A2; US 2002/0090646 A1). Vazoaktivni peptidni antagonisti CGRP i njihova upotreba u postupku za inhibiciju vezivanja CGRP za CGRP receptore su opisani kod Smith et al.; za takve peptidne antagoniste CGRP je pokazano da inhibiraju vezivanje CGRP za membrane koronarne arterije i da opuštaju koronarne arterije svinje obrađene kapsaicinom. (SAD pat. br.6,268,474 B1; i SAD pat. br.6,756,205 B2). Rist et al. su opisali peptidne analoge sa aktivnošću antagonista za CGRP receptor i njihovu upotrebu u leku za lečenje i profilaksi brojnih poremećaja. (DE 19732944 A1).
[0014] CGRP je snažan vazodilator koji je uključen u patologiju brojnih vazomotornih simptoma, kao što su svi oblici vaskularne glavobolje, uključujući migrene (sa ili bez aure) i klaster glavobolju. Durham, N. Engl. J. Med. 350:1073-1 075, 2004. Patofiziologija migrene uključuje aktivaciju trigeminalne ganglije, gde je CGRP lokalizovan, i nivoi CGRP značajno rastu tokom napada migrene. Ovo zauzvrat pospešuje dilataciju kranijalnih krvnih sudova i neurogenu inflamaciju i sensitizaciju. (Doods, H., Curr. Opin. Investig. Drugs, 2:1261-1268 (2001)). Dalje, serumski nivoi CGRP u spoljnoj jugularnoj veni su povišeni kod pacijenata tokom migrenske glavobolje. Goadsby et al., Ann. Neurol. 28:183-7, 1990. Intravenska primena humanog ci-CGRP je indukovala glavobolju i migrenu kod pacijenata koji pate od migrene bez aure, podržavajući gledište da CGRP ima uzročnu ulogu kog migrene (Lassen et al, Cephalalgia 22:54-61, 2002).
[0015] Migrena je kompleksno, često neurološko stanje koje se odlikuje ozbiljnim, epizodnim napadima glavobolje i povezanim pojavama, koje mogu da uključuju mučninu, povraćanje, osetljivost na svetlost, zvuk ili pokret. Kod nekih pacijenata, glavobolji prethodi ili je prati aura. Bol kod glavobolje može da bude ozbiljan i može takođe da bude jednostran kod određenih pacijenata. Napadi migrene narušavaju dnevne aktivnosti. U SAD i Zapadnoj Evropi, ukupna zastupljenost ljudi koji pate od migrene je 11% opšte populacije (6% muškaraca; 15-18% žena). Dalje, srednja učestalost napada kod pojedinca je 1.5/mesec dana. Mada su brojni tretmani za ublažavanje ili smanjenje simptoma dostupni, preventivna terapija se preporučuje za one pacijente koji imaju više od 3-4 napada migrene mesečno. Goadsby, et al. New Engl. J. Med. 346(4): 257-275, 2002. Neki pacijenti koji pate od migrene su lečeni topiramatom, antikonvulzivnim sredstvom koje blokira voltažno-zavisne natrijumove kanale i određene receptore za glutamat (AMPA-kainat), pojačava aktivnost GABA-A receptora, i blokira karbonsku anhidrazu. Relativno nedavni uspeh serotonina 5HTI B/ID i/ili agonista 5HT-1 receptora, kao što je sumatriptan, kod nekih pacijenata naveo je istraživače da predpostave serotonergičku etiologiju poremećaja. Nažalost, dok neki pacijenti dobro odgovaraju na ovo lečenje, drugi su relativno otporni na njegovo dejstvo.
[0016] Moguće učešće CGRP u migreni bilo je osnova za razvoj i ispitivanje brojnih jedinjenja koja inhibiraju oslobađanje CGRP (npr., sumatriptan), antagonizuju CGRP receptor (npr., dipeptidni derivat BIBN4096BS (Boehringer Ingelheim); CGRP(8-37)), ili interaguju sa jednim ili više proteina povezanih sa receptorom, kao što je, RAMP1. Brain, S. et al., Trends in Pharmacological Sciences 23:51-53, 2002. Podtipovi alfa-2 adrenoceptora i adenozinski receptori A1 takođe kontrolišu (inhibiraju) oslobađanje CGRP i trigeminalnu aktivaciju (Goadsby et al., Brain 125:1392- 401, 2002). Sa druge strane, izgleda da je lečenje jedinjenjima koja isključivo inhibiraju neurogenu inflamaciju (npr., antagonisti receptora tahikinina NKI) ili trigeminalnu aktivaciju (npr., agonisti receptora 5HT10) relativno neefikasno u vidu akutnih tretmanta za migrenu, dovodeći u pitanje inhibiciju oslobađanja CGRP kao osnovu za efikasne antimigrenske tretmane. Arulmani et al., Eur. J. Pharmacol.500:315-330, 2004.
[0017] Iako precizna patofiziologija migrene još uvek nije dobro poznata, terapeutska upotreba antagonista CGRP i aptamera koji ciljno deluju na CGRP predložena je za lečenje migrene i drugih poremećaja. (Npr., Olesen et al., Calcitonin gene-related peptide receptor antagonist BIBN 4096 BS for the acute treatment of migraine, New Engl. J. Med., 350:1104-1110 (2004); Perspective: CGRP-receptor antagonists - a fresh approach to migraine, New Engl. J. Med., 350:1075 (2004); Vater et al., Short bioactive Spiegelmers to migraine-associated calcitonin gene-related peptide rapidly identified by a novel approach: tailored-SELEX, Nuc. Acids Res., 31(21 e130):1-7 (2003); WO 96/03993). Dalje, pokazano je da snažni niskomolekularni antagonist CGRP olakšava umerene do ozbiljne napade migrene, uključujući migrenski bol i simptome povezane sa migrenom, u nedavnom kliničkom ispitivanju faze III (Connor, et al. Efficacy and Safety of telcagepant (MK-0974), a Novel Oral CGRP Receptor Antagonist, for Acute Migraine Attacks. Poster, European Headache and Migraine Trust International Congress, London, England, September 2008).
[0018] CGRP može takođe da bude uključen u sindrome hroničnog bola koji nisu migrena. Kod glodara, intratekalno dostavljeni CGRP indukuje ozbiljan bol, i nivoi CGRP su povišeni u brojnim modelima za ispitivanje bola. Pored toga, antagonisti CGRP delimično blokiraju nocicepciju kod akutnog pankreatitisa kod glodara (Wick, et al., (2006) Surgery, Volume 139, Issue 2, Pages 197-201). Zajedno uzevši, ova zapažanja impliciraju da snažan i selektivan antagonist CGRP receptora može da bude efikasno terapeutsko sredstvo za lečenje hroničnog bola, uključujući migrenu. McLatchie et al., Nature (1998), 333-339, otkriva rekombinantnu ekspresiju RAMP1 i CRLR na ćelijama HEK293. Ćelije se dalje koriste za ispitivanja vezanja koja uključuju CGRP peptide, aminlin i kalcitonin i RAMP1+CRLR, (tj. CGRP-R) homodimer.
[0019] Durham et al, New England Journal of Medicine, Massachusetts Medical Society, Boston, MA, US, 350, 2004, 1073-1075 opisuje antagoniste CGRP receptora i njihovu potencijalnu upotrebu u terapiji migrene.
[0020] Chauhan et al, Biology of Reproduction, 2004, 70, 1658-1663 opisuje proizvodnju antagonističkih anti-pacovskih, CRLR poliklonskih antitela pacova.
REZIME
[0021] Ovde su opisana izolovana antitela, njihovi antigen-vezujući fragmenti i drugi izolovani antigen-vezujući protein kao što se zahteva (tj. monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen) koji se vezuje za CGRP R, posebno CGRP R primata, npr., humani CGRP R.
Takvo monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kao što se zahteva mogu selektivno da inhibiraju CGRP R primata (u poređenju sa AM1, AM2, CT ili amilinskim receptorima primata) i mogu da se vežu i za CRLR i za RAMP1 komponente CGRP R. Nađeno je da proteini koji se vezuju za CGRP R inhibiraju, interferiraju sa, ili moduliraju bar jedan od bioloških odgovora vezanih za CGRP R, i da su kao takvi, korisni za ublažavanje efekata bolesti ili poremećaja povezanih sa CGRP R. Vezivanje određenih antigen-vezujućih proteina za CGRP R može, prema tome, da proizvede jednu ili više od sledećih aktivnosti: inhibiciju, interferiranje sa, ili moduliranje CGRP R, inhibiciju vazodilatacije, smanjenje neurogene inflamacije, i ublažavanje, poboljšanje, lečenje, sprečavanje ili smanjenje simptoma hroničnog bola ili migrene.
Primeri izvođenja pronalaska su:
[0022]
1. Monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji vezuje humani CGRP receptor, pri čemu navedeni humani CGRP receptor sadrži humani CRLR polipeptid i humani RAMP1 polipeptid,
pri čemu se monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment veže na epitop formiran od aminokiselinskih ostataka i iz oba CRLR i RAMP1 polipeptida, i pri čemu se monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment nadmeću za vezivanje za humani CGRP receptor sa referentnim antitelom, pri čemu pomenuto referentno antitelo sadrži (i) varijabilnu regiju teškog lanca koja sadrži sekvencu odabranu iz grupe koja sadrži SEQ ID NO: 161, 163164, 166 i 168; i (ii) varijabilnu regiju lakog lanca koja sadrži sekvencu odabranu iz grupe koja sadrži SEQ ID NO: 140, 143, 146, 148 i 150.
2. Monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema primeru izvođenja 1, pri čemu se monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment specifično vezuje za humani CGRP receptor sa KD≤ 100 nM kako je određeno korišćenjem FACS testa vezivanja.
3. Monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema primeru izvođenja 1, pri čemu referentno antitelo sadrži teški i laki lanac definisan sa jednim od sledećih parova sekvenci:
SEQ ID NO: 32 i SEQ ID NO: 15:
SEQ ID NO: 34 i SEQ ID NO: 18;
SEQ ID NO: 35 i SEQ ID NO: 21;
SEQ ID NO: 37 i SEQ ID NO: 23; i
SEQ ID NO: 39 i SEQ ID NO: 25.
4. Monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema primeru izvođenja 1, pri čemu monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment selektivno inhibira humani CGRP receptor u poređenju sa ljudskim AM1, AM2 i AMY1 receptorima sa omjerom selektivnosti od 100 ili više, što je određeno testom inhibicije cAMP.
5. Monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kojem primeru izvođenja 1 do 4, pri čemu je monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment potpuno humano antitelo, humanizovano antitelo, himerno antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment.
6. Monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kojem primeru izvođenja 1 do 4, pri čemu je monoklonsko antitelo tipa IgG1-, IgG2-, IgG3- ili IgG4.
7. Monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kojem primeru izvođenja 1 do 6, pri čemu antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment inhibira vezivanje CGRP na humani CGRP receptor.
8. Monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kojem primeru izvođenja 4 ili 7 za upotrebu u inhibiciji vazodilatacije kod pacijenta kom je to potrebno.
9. Monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kojem primeru izvođenja 4 ili 7 za upotrebu u lečenju stanja povezanog sa CGRP receptorom, pri čemu je stanje glavobolja.
10. Monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kojem primeru izvođenja 4 ili 7 za upotrebu u lečenju stanja povezanog sa CGRP receptorom, pri čemu je stanje migrena.
11. Monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kojem primeru izvođenja 4 ili 7 za upotrebu u lečenju stanja povezanog sa CGRP receptorom, pri čemu je stanje klaster glavobolja.
[0023] Monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment za koje se traži zaštita mogu selektivno da inhibiraju humani CGRP receptor (u poređenju sa humanim AM1, AM2 ili amilinskim receptorima). U nekim primerima izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment za koje se traži zaštita može selektivno da inhibira humani CGRP receptor sa odnosom selektivnosti od 50 ili više, 75 ili više, 100 ili više, 150 ili više, 200 ili više, 250 ili više, 300 ili više, 400 ili više, 500 ili više, 750 ili više ili 1000 ili više. Stepen selektivne inhibicije može da se odredi upotrebom bilo kog pogodnog postupka, npr., upotrebom cAMP testa kao što je ovde opisano u primerima. U nekim primerima izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment za koje se traži zaštita se specifično vezuje i za humani CRLR i za humani RAMP1, i ne vezuje se specifično za humani AM1, humani AM2 ili humani amilinski receptor (npr., AMY1 ili AMY2). Na primer, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može specifično da se vezuje za humani CGRP R sa KD≤1 µM, ≤100 nM, ≤10 nM, ili ≤5 nM. U nekim primerima izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment za koje se traži zaštita se specifično vezuje za humani CGRP R sa KD≤100 nM, ≤10 nM, ili ≤5 nM kako je određeno korišćenjem FACS testa vezivanja i analizirano, na primer, korišćenjem postupaka opisanih kod Rathanaswami, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 334 (2005) 1004-1013. U nekim primerima izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment za koje se traži zaštita ima Ki od ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.5 nM ili ≤0.1 nM u testu kompetitivnog vezivanja CGRP. U nekim primerima izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigenvezujući fragment za koje se traži zaštita ima Ki od ≤100 nM, ≤50 nM, ≤20 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.5 nM ili ≤0.1 nM u testu kompetitivnog vezivanja korišćenjem radioaktivno obeleženog<125>I-CGRP za membrane ćelija koje eksprimiraju humani CGRP R, na primer, u testu koji je ovde opisan u primeru 5.
[0024] U drugom aspektu primera, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment za koji se traži zaštita stupa u kompeticiju za vezivanje za humani CGRP R, npr., vanćelijski deo CGRP R, sa referentnim antitelom koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 161, 163, 164, 166 i 168 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO140, 143, 146, 148 i 150. U nekim primerima izvođenja, kompeticija za vezivanje se procenjuje korišćenjem kvantitativnih merenja stepena vezivanja, npr., korišćenjem Biacore testa, na primer, kao što je ovde opisano u primeru 7. U nekim primerima izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment za koji se traži zaštita stupa u kompeticiju za vezivanje za humani CGRP R sa referentnim antitelom, pri čemu referentno antitelo sadrži (i) varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 161, 163, 164, 166 i 168; i (ii) varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 140, 143, 146, 148 i 150. U određenim primerima izvođenja, referentno antitelo sadrži (i) teški lanac definisan sekvencom odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs:32, 34, 35, 37 i 39; i (ii) laki lanac definisan sekvencom odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 15, 18, 21, 23 i 25. U specifičnijim primerima izvođenja, referentno antitelo sadrži teški lanac i laki lanac definisane jednim od sledećih parova sekvenci: (i) SEQ ID NO: 32 i SEQ ID NO: 15; (ii) SEQ ID NO: 34 i SEQ ID NO: 18; (iii) SEQ ID NO: 35 i SEQ ID NO: 21; (iv) SEQ ID NO: 37 i SEQ ID NO: 23; i (v) SEQ ID NO: 39 i SEQ ID NO: 25. U jednom takvom primeru izvođenja, referentno antitelo sadrži teški lanac koji sadrži SEQ ID NO: 32 i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 15. U drugom takvom primeru izvođenja, referentno antitelo sadrži teški lanac koji sadrži SEQ ID NO: 34 i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 18. U drugom takvom primeru izvođenja, referentno antitelo sadrži teški lanac koji sadrži SEQ ID NO: 35 i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 21. U drugom takvom primeru izvođenja, referentno antitelo sadrži teški lanac koji sadrži SEQ ID NO: 37 i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 23. U drugom takvom primeru izvođenja, referentno antitelo sadrži teški lanac koji sadrži SEQ ID NO: 39 i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 25.
[0025] U određenim primerima izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment za koje se traži zaštita koji stupaju u kompeticiju za humani CGRP R mogu takođe selektivno da inhibiraju humani CGRP receptor, npr., sa odnosom selektivnosti od 100 ili više, 250 ili više, 500 ili više, 750 ili više, 1000 ili više, 2500 ili više, 5000 ili više, ili 10000 ili više, i takva selektivnost može da se odredi, npr., korišćenjem cAMP testa kao što je ovde opisano u primerima. U povezanim poželjnim primerima izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment za koje se traži zaštita koji stupaju u kompeticiju za vezivanje za humani CGRP R specifično se veže za humani CGRP R sa KD≤100 nM, ≤10 nM, ili ≤5 nM, npr., kako je određeno korišćenjem FACS testa za vezivanje i analizirano, na primer, korišćenjem postupaka opisanih kod Rathanaswami, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 334 (2005) 1004-1013. U povezanim primerima izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment za koje se traži zaštita koje stupa u kompeticiju za vezivanje za humani CGRP R mogu da imaju Ki od ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.5 nM ili ≤0.1 nM u testu kompetitivnog vezivanja korišćenjem radioaktivno obeleženog<125>I-CGRP za membrane ćelija koje eksprimiraju humani CGRP R, na primer, testu koji je ovde opisan u primeru 5.
[0026] U bilo kom od prethodno pomenutih primera izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koje stupa u kompeticiju za vezivanje za humani CGRP R može, na primer, da bude rekombinantno antitelo, humano (npr., potpuno humano) antitelo, humanizovano antitelo, himerno antitelo, multispecifično antitelo, ili njihov antigen-vezujući fragment. Dalje, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koje stupa u kompeticiju za vezivanje za humani CGRP R može da bude Fab fragment, i Fab’ fragment, F(ab’)2fragment, Fv fragment, di-antitelo ili molekul jednolančanog antitela; i može da bude, na primer, humano monoklonsko antitelo, npr., IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4 tipa antitela. U određenim primerima izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koje stupa u kompeticiju za vezivanje za humani CGRP R mogu da budu neutrališući antigenvezujući proteini.
[0027] U određenim primerima za koje se traži zaštita, monoklonska antitela ili njihovi fragmenti mogu da sadrže (A) jedan ili više regiona koji određuju komplementarnost teškog lanca (CDRH) izabranih iz grupe koja se sastoji od: (i) CDRH1 koji ima SEQ ID NO: 134; (ii) CDRH2 koji ima SEQ ID NO: 135; (iii) CDRH3 koji ima SEQ ID NO: 136; i opciono (iv) CDRH od (i), (ii) i (iii) koja sadrži jednu ili više supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecije ili insercije koje ukupno ne sadrže više od četiri aminokiseline; (B) jedan ili više regiona koji određuju komplementarnost lakog lanca (CDRL) izabranih iz grupe koja se sastoji od: (i) CDRL1 izabranog iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 107, 111 i 118; (ii) CDRL2 izabranog iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 108, 112 i 119; (iii) CDRL3 izabranog iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 109, 113 i 120; i opciono (iv) CDRL od (i), (ii) i (iii) koji sadrži jednu ili više, npr. jednu, dve, tri, četiri ili više supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecije ili insercije koje ukupno ne sadrže više od četiri aminokiseline; ili (C) jedan ili više CDRH-ova teškog lanca od (A) i jedan ili više CDRL-ova lakog lanca od (B).
[0028] U nekim primerima izvođenja za koje se traži zaštita, CDRH-ovi mogu biti dalje izabrani iz grupe koja se sastoji od: (i) CDRH1 koji ima SEQ ID NO: 131; (ii) CDRH2 koji ima SEQ ID NO: 132; (iii) CDRH3 koji ima SEQ ID NO: 133; i opciono (iv) CDRH od (i), (ii) i (iii) koji sadrži jednu ili više, npr. jednu, dve, tri, četiri ili više supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecije ili insercije koje ukupno ne sadrže više od tri aminokiseline. U srodnim ostvarenjima, CDRH-ovi su dalje izabrani iz grupe koja se sastoji od: (i) CDRH1 izabranog iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 76, 88, 100, 121, 125 i 128; (ii) CDRH2 izabranog iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 89, 101, 122, 124, 126 i 129; (iii) CDRH3 izabranog iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 78, 90, 102, 123, 127 i 130; i opciono (iv) CDRH od (i), (ii) i (iii) koji sadrži jednu ili više, npr. jednu, dve, tri, četiri ili više supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecije ili insercije koje ukupno ne sadrže više od dve aminokiseline. U drugim srodnim ostvarenjima, CDRH su dalje izabrani iz grupe koja se sastoji od: (i) CDRH1 izabranog iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 73, 76, 79, 82, 85, 88, 92, 97 i 100; (ii) CDRH2 izabranog iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 74, 77, 80, 83, 86, 89, 91, 93, 95, 98, 101 i 129; (iii) CDRH3 izabranog iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 75, 78, 81, 84, 87, 90, 96, 99, 102 i 123; i opciono (iv) CDRH od (i), (ii) i (iii) koji sadrži jednu ili više, npr. jednu, dve, tri, četiri ili više supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecije ili insercije koje ukupno ne sadrže više od dve aminokiseline.
[0029] U nekim realizacijama kako se zahteva, CDRL-ovi su dalje izabrani iz grupe koja se sastoji od: (i) CDRL1 izabranog iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 107, 111 i 115; (ii) CDRL2 izabranog iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 108, 112 i 116; (iii) CDRL3 izabranog iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 109, 113 i 117; i opciono (iv) CDRL od (i), (ii) i (iii) koji sadrži jednu ili više, npr. jednu, dve, tri, četiri ili više supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecije ili insercije. U nekim realizacijama, supstitucije aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecije ili insercije ukupno ne sadrže više od tri aminokiseline po CDRL. U nekim realizacijama, supstitucije aminokiselina, delecije ili insercije ukupno ne sadrže više od dve aminokiseline po CDRL. U srodnim ostvarenjima, CDRL su dalje izabrani iz grupe koja se sastoji od: (i) CDRL1 izabranog iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 42, 45, 51, 57, 62, 69, 103, 110; (ii) CDRL2 izabranog iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 43, 52, 55, 58, 63, 70, 104, 108 i 114; (iii) CDRL3 izabranog iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 44, 47, 53, 56, 59, 64, 105 i 106; i opciono (iv) CDRL od (i), (ii) i (iii) koji sadrži jednu ili više, npr. jednu, dve, tri, četiri ili više supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecije ili insercije koje ukupno ne sadrže više od dve aminokiseline. U dodatnim povezanim rešenjima, CDRL su dalje izabrani iz grupe koja se sastoji od: (i) CDRL1 izabranog iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 42, 45, 48, 51, 54, 57, 62, 65, 66, i 69; (ii) CDRL2 izabranog iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 63, 67 i 70; (iii) CDRL3 izabranog iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 44, 47, 50, 53, 56, 59, 64, 68, 71 i 72; i opciono (iv) CDRL od (i), (ii) i (iii) koji sadrži jednu ili više npr. jednu, dve, tri, četiri ili više supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecije ili insercije. U jednoj realizaciji, ukupan broj supstitucija, delecija ili insercija aminokiselina nije veći od dve aminokiseline po CDR. U drugoj realizaciji, supstitucije aminokiselina su konzervativne supstitucije.
[0030] U drugoj realizaciji, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment za koje se traži zaštita, sadrži najmanje jedan ili dva CDRH bilo kog od gore pomenutog (A) i najmanje jedan ili dva CDRL bilo kog od gore pomenutog (B). U još jednoj realizaciji, monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji za antigen, za koje se traži zaštita, sadrži (i) najmanje tri CDRH bilo kog od gore pomenutog (A), gde tri CDRH uključuju CDRH1, CDRH2 i CDRH3, i (ii) najmanje tri CDRL bilo kog od gore pomenutog (B), gde tri CDRL uključuju CDRL1, CDRL2 i CDRL3. U dodatnim realizacijama, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment za koje se traži zaštita kako je opisano, sadrže prvu sekvencu aminokiseline koja sadrži najmanje jedan CDRH i drugu sekvencu aminokiseline koja sadrži najmanje jedan CDRL. U jednoj realizaciji, prva i druga sekvenca aminokiseline su kovalentno vezane jedna sa drugom.
[0031] U drugom aspektu, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment za koje se traži zaštita, uključuje CDRH1, CDRH2 i CDRH3. U jednoj realizaciji, CDRH1 sadrži SEQ ID NO: 73, CDRH2 sadrži SEQ ID NO: 74, CDRH3 sadrži SEQ ID NO: 75. U drugoj realizaciji, CDRH1 sadrži SEQ ID NO: 76, CDRH2 sadrži SEQ ID NO: 77, i CDRH3 sadrži SEQ ID NO: 78. U drugoj realizaciji, CDRH1 sadrži SEQ ID NO: 79, CDRH2 sadrži SEQ ID NO: 80, a CDRH3 sadrži SEQ ID NO: 81. U drugoj realizaciji, CDRH1 sadrži SEQ ID NO: 82, CDRH2 sadrži SEQ ID NO: 83, i CDRH3 sadrži SEQ ID NO: 84. U drugoj realizaciji, CDRH1 sadrži SEQ ID NO: 85, CDRH2 sadrži SEQ ID NO: 86, i CDRH3 sadrži SEQ ID NO: 87. U drugoj realizaciji, CDRH1 sadrži SEQ ID NO: 88, CDRH2 sadrži SEQ ID NO: 89, i CDRH3 sadrži SEQ ID NO: 90. U drugoj realizaciji, CDRH1 sadrži SEQ ID NO: 76, CDRH2 sadrži SEQ ID NO: 91, a CDRH3 sadrži SEQ ID NO: 78. U drugoj realizaciji, CDRH1 sadrži SEQ ID NO: 92, CDRH2 sadrži SEQ ID NO: 93, i CDRH3 sadrži SEQ ID NO: 94. U drugoj realizaciji, CDRH1 sadrži SEQ ID NO: 76, CDRH2 sadrži SEQ ID NO: 95, a CDRH3 sadrži SEQ ID NO: 78. U drugoj realizaciji, CDRH1 sadrži SEQ ID NO: 73, CDRH2 sadrži SEQ ID NO: 74, a CDRH3 sadrži SEQ ID NO: 96. U drugoj realizaciji, CDRH1 sadrži SEQ ID NO: 97, CDRH2 sadrži SEQ ID NO: 98, a CDRH3 sadrži SEQ ID NO: 99. U drugoj realizaciji, CDRH1 sadrži SEQ ID NO: 100, CDRH2 sadrži SEQ ID NO: 101, i CDRH3 sadrži SEQ ID NO: 102.
[0032] U drugom aspektu, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment za koje se traži zaštita uključuje CDRL1 sekvencu, CDRL2 sekvencu i CDRL3 sekvencu. U jednoj realizaciji, CDRL1 sadrži SEQ ID NO: 42, CDRL2 sadrži SEQ ID NO: 43, i CDRL3 sadrži SEQ ID NO: 44. U drugoj realizaciji, CDRL1 sadrži SEQ ID NO: 45, CDRL2 sadrži SEQ ID NO: 46, i CDRL3 sadrži SEQ ID NO: 47. U drugoj realizaciji, CDRL1 sadrži SEQ ID NO: 48, CDRL2 sadrži SEQ ID NO: 49, i CDRL3 sadrži SEQ ID NO: 50. U drugoj realizaciji, CDRL1 sadrži SEQ ID NO: 51, CDRL2 sadrži SEQ ID NO: 52, i CDRL3 sadrži SEQ ID NO: 53. U drugoj realizaciji, CDRL1 sadrži SEQ ID NO: 54, CDRL2 sadrži SEQ ID NO: 55, i CDRL3 sadrži SEQ ID NO: 56. U drugoj realizaciji, CDRL1 sadrži SEQ ID NO: 57, CDRL2 sadrži SEQ ID NO: 58, i CDRL3 sadrži SEQ ID NO: 59. U drugoj realizaciji, CDRL1 sadrži SEQ ID NO: 60, CDRL2 sadrži SEQ ID NO: 55, i CDRL3 sadrži SEQ ID NO: 56. U drugoj realizaciji, CDRL1 sadrži SEQ ID NO: 45, CDRL2 sadrži SEQ ID NO: 61, i CDRL3 sadrži SEQ ID NO: 47. U drugoj realizaciji, CDRL1 sadrži SEQ ID NO: 62, CDRL2 sadrži SEQ ID NO: 63, i CDRL3 sadrži SEQ ID NO: 64. U drugoj realizaciji, CDRL1 sadrži SEQ ID NO: 65, CDRL2 sadrži SEQ ID NO: 55, i CDRL3 sadrži SEQ ID NO: 56. U drugoj realizaciji, CDRL1 sadrži SEQ ID NO: 66, CDRL2 sadrži SEQ ID NO: 67, i CDRL3 sadrži SEQ ID NO: 68. U drugoj realizaciji, CDRL1 sadrži SEQ ID NO: 69, CDRL2 sadrži SEQ ID NO: 70, i CDRL3 sadrži SEQ ID NO: 71. U drugoj realizaciji, CDRL1 sadrži SEQ ID NO: 69, CDRL2 sadrži SEQ ID NO: 70, i CDRL3 sadrži SEQ ID NO: 72.
[0033] U drugom aspektu, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment za koje se traži zaštita, uključuje CDRL1 sekvencu, CDRL2 sekvencu, CDRL3 sekvencu, CDRH1 sekvencu, CDRH2 sekvencu i CDRH3 sekvencu. U jednoj realizaciji, CDRL1 sadrži SEQ ID NO: 42, CDRL2 sadrži SEQ ID NO: 43, CDRL3 sadrži SEQ ID NO: 44, CDRH1 sadrži SEQ ID NO: 73, CDRH2 sadrži SEQ ID NO: 74, a CDRH3 sadrži SEQ ID NO: 75. U drugoj realizaciji, CDRL1 sadrži SEQ ID NO: 45, CDRL2 sadrži SEQ ID NO: 46, CDRL3 sadrži SEQ ID NO: 47, CDRH1 sadrži SEQ ID NO: 76, CDRH2 sadrži SEQ ID NO: 77, a CDRH3 sadrži SEQ ID NO: 78. U drugoj realizaciji, CDRL1 sadrži SEQ ID NO: 48, CDRL2 sadrži SEQ ID NO: 49, CDRL3 sadrži SEQ ID NO: 50, CDRH1 sadrži SEQ ID NO: 79, CDRH2 sadrži SEQ ID NO: 80, a CDRH3 sadrži SEQ ID NO: 81. U drugoj realizaciji, CDRL1 sadrži SEQ ID NO: 51, CDRL2 sadrži SEQ ID NO: 52, CDRL3 sadrži SEQ ID NO: 53, CDRH1 sadrži SEQ ID NO: 82, CDRH2 sadrži SEQ ID NO: 83 i CDRH3 sadrži SEQ ID NO: 84. U drugoj realizaciji, CDRL1 sadrži SEQ ID NO: 54, CDRL2 sadrži SEQ ID NO: 55, CDRL3 sadrži SEQ ID NO: 56, CDRH1 sadrži SEQ ID NO: 85, CDRH2 sadrži SEQ ID NO: 86, a CDRH3 sadrži SEQ ID NO: 87. U drugoj realizaciji, CDRL1 sadrži SEQ ID NO: 57, CDRL2 sadrži SEQ ID NO: 58, CDRL3 sadrži SEQ ID NO: 59, CDRH1 sadrži SEQ ID NO: 88, CDRH2 sadrži SEQ ID NO: 89, a CDRH3 sadrži SEQ ID NO: 90 U drugoj realizaciji, CDRL1 sadrži SEQ ID NO: 60, CDRL2 sadrži SEQ ID NO: 55, CDRL3 sadrži SEQ ID NO: 56, CDRH1 sadrži SEQ ID NO: 85, CDRH2 sadrži SEQ ID NO: 86, a CDRH3 sadrži SEQ ID NO: 87. U drugoj realizaciji, CDRL1 sadrži SEQ ID NO: 45, CDRL2 sadrži SEQ ID NO: 61, CDRL3 sadrži SEQ ID NO: 47, CDRH1 sadrži SEQ ID NO: 76, CDRH2 sadrži SEQ ID NO: 91, a CDRH3 sadrži SEQ ID NO: 78. U drugoj realizaciji, CDRL1 sadrži SEQ ID NO: 62, CDRL2 sadrži SEQ ID NO: 63, CDRL3 sadrži SEQ ID NO: 64, CDRH1 sadrži SEQ ID NO: 92, CDRH2 sadrži SEQ ID NO: 93, a CDRH3 sadrži SEQ ID NO: 9394. U drugoj realizaciji, CDRL1 sadrži SEQ ID NO: 45, CDRL2 sadrži SEQ ID NO: 61, CDRL3 sadrži SEQ ID NO: 47, CDRH1 sadrži SEQ ID NO: 76, CDRH2 sadrži SEQ ID NO: 95, a CDRH3 sadrži SEQ ID NO: 78. U drugoj realizaciji, CDRL1 sadrži SEQ ID NO: 65, CDRL2 sadrži SEQ ID NO: 55, CDRL3 sadrži SEQ ID NO: 56, CDRH1 sadrži SEQ ID NO: 85, CDRH2 sadrži SEQ ID NO: 86, a CDRH3 sadrži SEQ ID NO: 87. U drugoj realizaciji, CDRL1 sadrži SEQ ID NO: 42, CDRL2 sadrži SEQ ID NO: 43, CDRL3 sadrži SEQ ID NO: 44, CDRH1 sadrži SEQ ID NO: 73, CDRH2 sadrži SEQ ID NO: 74, a CDRH3 sadrži SEQ ID NO: 7496. U drugoj realizaciji, CDRL1 sadrži SEQ ID NO: 66, CDRL2 sadrži SEQ ID NO: 67, CDRL3 sadrži SEQ ID NO: 68, CDRH1 sadrži SEQ ID NO: 97, CDRH2 sadrži SEQ ID NO: 98, a CDRH3 sadrži SEQ ID NO: 99. U drugoj realizaciji, CDRL1 sadrži SEQ ID NO: 69, CDRL2 sadrži SEQ ID NO: 70, CDRL3 sadrži SEQ ID NO: 71, CDRH1 sadrži SEQ ID NO: 100, CDRH2 sadrži SEQ ID NO: 101, a CDRH3 sadrži SEQ ID NO: 102. U drugoj realizaciji, CDRL1 sadrži SEQ ID NO: 69, CDRL2 sadrži SEQ ID NO: 70, CDRL3 sadrži SEQ ID NO: 72, CDRH1 sadrži SEQ ID NO: 100, CDRH2 sadrži SEQ ID NO: 101, a CDRH3 sadrži SEQ ID NO: 102.
[0034] U bilo kom od gore pomenutih primera izvođenja definisanih sekvencom, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako je zatraženo može da bude, na primer rekombinantno antitelo, humano (npr., potpuno humano) antitelo, humanizovano antitelo, himerno antitelo, multispecifično antitelo, ili njihov antigen-vezujući fragment. Dalje, fragment monoklonskog antitela ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva može da bude Fab fragment, i Fab’ fragment, F(ab’)2fragment, Fv fragment, diatelo ili molekul jednolančanog antitela. Na primer, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako je zatraženo može da bude humano monoklonsko antitelo, i može da bude, npr., tip antitela IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4. Dalje, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako je zatraženo mogu da budu neutrališući antigen-vezujući proteini.
[0035] U bilo kom od prethodno pomenutih primera izvođenja definisanih sekvencom, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva može specifično da se vezuje i za humani CRLR i za humani RAMP1, a ne vezuje se specifično za AM1, AM2 ili humani amilinski receptor (npr., AMY1), na primer, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva može specifično da se veže za humani CGRP R sa KD≤1 µM, ≤100 nM, ≤10 nM, ili ≤5 nM, npr., kao što je određeno korišćenjem FACS testa za vezivanje i analizirano, na primer, korišćenjem postupaka opisanih kod Rathanaswami, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 334 (2005) 1004-1013. U bilo kom od prethodno pomenutih primera izvođenja koji definišu sekvencu, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva može selektivno da inhibira humani CGRP R, u odnosu na humane receptore AM1, AM2 ili AMY1, npr., sa odnosom selektivnosti od 100 ili više, 250 ili više, 500 ili više, 750 ili više, 1000 ili više, 2500 ili više, 5000 ili više, ili 10 000 ili više, gde stepen selektivne inhibicije može da se odredi korišćenjem bilo kog pogodnog postupka, npr., korišćenjem cAMP testa kao što je ovde opisano u primerima. U bilo kom od prethodno pomenutih primera izvođenja koji definišu sekvencu, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva može da ima Ki od ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.5 nM ili ≤0.1 nM u testu kompetitivnog vezivanja korišćenjem radioaktivno obeleženog<125>I-CGRP za membrane ćelija koje eksprimiraju humani CGRP R, na primer, testu koji je ovde opisan u primeru 5.
[0036] Druga grupa realizacija uključuje monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, koji uključuju jedan ili kombinaciju CDR-ova koji imaju konsenzusne sekvence opisane u daljem tekstu, i vežu humani CGRP R. Konsenzusne sekvence su izvedene iz filogenetski srodnih CDR sekvenci. U jednom aspektu, CDR iz različitih grupa mogu se mešati i podudarati sa bilo kojim određenim monoklonskim antitelom ili njegovim fragmentom koji veže antigen kako se zahteva koje vezuje humani CGRP R. U drugom aspektu, protein koji veže za antigen sadrži CDR-ove teškog i lakog lanca koji su dobiveni iz iste filogenetski povezane grupe klonova antitela. Ovde su prikazani primeri primeri CDR konsenzusnih sekvenci kako sledi:
Konsenzus sekvenca K1
[0037] CDR1 RASQGIRX1DLG (SEQ ID NO:103), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od N i K.
[0038] CDR2 X1ASSLQS (SEQ ID NO:104), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od A i G.
[0039] CDR3 LQYNX1X2PWT (SEQ ID NO:105), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od I i S, i X2je odabran iz grupe koja se sastoji od Y i F.
Konsenzus sekvenca K4
[0040] CDR3 QQYGNSLX1R (SEQ ID NO:106), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od S i C.
Konsenzus sekvenca K1,4
[0041] CDR1 RASQX1X2X3X4GX5LX6(SEQ ID NO:107), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od S i G, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od V i I, X3je odabran iz grupe koja se sastoji od S i R, X4je odabran iz grupe koja se sastoji od S, N i K, X5je odabran iz grupe koja se sastoji od Y i D, i X6je odabran iz grupe koja se sastoji od T i G.
[0042] CDR2 X1ASSX2X3X4(SEQ ID NO: 108), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od G i A, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od R i L, X3je odabran iz grupe koja se sastoji od A i Q, i X4je odabran iz grupe koja se sastoji od T i S.
[0043] CDR3 X1QYX2X3X4X5X6X7(SEQ ID NO:109), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od Q i L, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od G i N, X3je odabran iz grupe koja se sastoji od N i T, X4je odabran iz grupe koja se sastoji od S, Y i F, X5je odabran iz grupe koja se sastoji od L i P, X6je odabran iz grupe koja se sastoji od C, W i S, i X7je odabran iz grupe koja se sastoji od R i T.
Konsenzus sekvenca K3
[0044] CDR1 KSSQSLLHSX1GX2X3YLY (SEQ ID NO:110), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od D i A, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od R i K, i X3je odabran iz grupe koja se sastoji od N i T.
Konsenzus sekvenca K2,3
[0045] CDR1 X1SSQSLLHSX2GX3X4YLX5(SEQ ID NO:111), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od R i K, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od F, D i A, X3je odabran iz grupe koja se sastoji od Y, R i K, X4je odabran iz grupe koja se sastoji od N i T, i X5je odabran iz grupe koja se sastoji od D i Y.
[0046] CDR2 X1X2SNRX3S (SEQ ID NO:112), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od L i E, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od G i V, i X3je odabran iz grupe koja se sastoji od A i F.
[0047] CDR3 MQX1X2X3X4PX5T (SEQ ID NO:113), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od A i S, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od L i F, X3je odabran iz grupe koja se sastoji od Q i P, X4je odabran iz grupe koja se sastoji od T i L, i X5je odabran iz grupe koja se sastoji od F i L.
Konsenzus sekvenca Lm3
[0048] CDR2 RX1NQRPS (SEQ ID NO:114), gde je X1je odabran iz grupe koja se sastoji od N i S.
Konsenzus sekvenca Lm1,2,3
[0049] CDR1 SGSSSNIGX1NX2VX3(SEQ ID NO:115), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od N i S, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od Y i T, i X3je odabran iz grupe koja se sastoji od S, N i Y.
[0050] CDR2 X1X2NX3RPS (SEQ ID NO:116), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od D, T i R, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od N i S, i X3je odabran iz grupe koja se sastoji od K i Q.
[0051] CDR3 X1X2X3DX4X5LX6X7VV (SEQ ID NO:117), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od G i A, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od T i A, X3je odabran iz grupe koja se sastoji od W i R, X4je odabran iz grupe koja se sastoji od S i D, X5je odabran iz grupe koja se sastoji od R i S, X6je odabran iz grupe koja se sastoji od S i N, i X7je odabran iz grupe koja se sastoji od A i G.
Konsenzus sekvenca LmAll
[0052] CDR1 X1GX2X3SX4X5X6X7X8X9X10X11(SEQ ID NO:118), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od S i Q, X2is present ili absent, i if present, is S, X3je odabran iz grupe koja se sastoji od S i D, X4is present ili absent, i if present, is N, X5je odabran iz grupe koja se sastoji od I i L, X6je odabran iz grupe koja se sastoji od G i R, X7je odabran iz grupe koja se sastoji od N i S, X8je odabran iz grupe koja se sastoji od N i F, X9je odabran iz grupe koja se sastoji od Y i T, X10je odabran iz grupe koja se sastoji od V i A, i X11je odabran iz grupe koja se sastoji od S, N i Y.
[0053] CDR2 X1X2NX3RPS (SEQ ID NO:119), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od D, G, T, i R, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od N, K i S, i X3je odabran iz grupe koja se sastoji od K, N i Q.
[0054] CDR3 X1X2X3DX4X5X6X7X8X9V (SEQ ID NO:120), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od G, N i A, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od T, S i A, X3je odabran iz grupe koja se sastoji od W i R, X4je odabran iz grupe koja se sastoji od S i D, X5je odabran iz grupe koja se sastoji od R i S, X6je odabran iz grupe koja se sastoji od L i V, X7je odabran iz grupe koja se sastoji od S, Y i N, X8je odabran iz grupe koja se sastoji od A, H i G, i X9je odabran iz grupe koja se sastoji od V i L.
Konsenzus sekvenca HC1
[0055] CDR1 X1YYMX2(SEQ ID NO:121), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od G i D, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od H i Y.
[0056] CDR2 WIX1PNSGGTNYAQKFQG (SEQ ID NO:122), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od N i S.
[0057] CDR3 X1X2X3SX4X5X6X7X8GX9X10X11X12YYX13GMDV (SEQ ID NO:123), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od D i G, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od Q i G, X3je odabran iz grupe koja se sastoji od M i Y, X4je odabran iz grupe koja se sastoji od I i G, X5je odabran iz grupe koja se sastoji od I i Y, X6je odabran iz grupe koja se sastoji od M i A, X7je prisutan ili odsutan, i ako je prisutan, predstavlja L, X8je prisutan ili odsutan, i ako je prisutan, predstavlja R, X9je odabran iz grupe koja se sastoji od V i L, X10je odabran iz grupe koja se sastoji od F i Y, X11je odabran iz grupe koja se sastoji od P i S, X12je odabran iz grupe koja se sastoji od P i H, i X13je prisutan ili odsutan, i ako je prisutan, predstavlja Y.
Konsenzus sekvenca HC2
[0058] CDR2 RIKSX1TDGGTTDYX2APVKG (SEQ ID NO:124), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od K i T, i X2je odabran iz grupe koja se sastoji od T i A.
Konsenzus sekvenca HC3
[0059] CDR1 X1YX2MX3(SEQ ID NO:125), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od T i S, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od S i A, i X3je odabran iz grupe koja se sastoji od N i S.
[0060] CDR2 X1ISX2SX3X4X5X6YYADSVKG (SEQ ID NO:126), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od S i A, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od S i G, X3je odabran iz grupe koja se sastoji od S i G, X4je odabran iz grupe koja se sastoji od S i G, X5je odabran iz grupe koja se sastoji od Y i R, i X6je odabran iz grupe koja se sastoji od R i T.
[0061] CDR3 X1X2X3X4X5X6X7PYSX8X9WYDYYYGMDV (SEQ ID NO:127), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od E i D, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od G i Q, X3je odabran iz grupe koja se sastoji od V i R, X4je odabran iz grupe koja se sastoji od S i E, X5je odabran iz grupe koja se sastoji od G i V, X6je odabran iz grupe koja se sastoji od S i G, X7je prisutan ili odsutan, i ako je prisutan, predstavlja S, X8je odabran iz grupe koja se sastoji od I i S, i X9je odabran iz grupe koja se sastoji od S i G.
Konsenzus sekvenca HC4
[0062] CDR1 SX1GMH (SEQ ID NO:128), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od F i Y.
[0063] CDR2 VISX1DGSX2KYX3X4DSVKG (SEQ ID NO:129), gde je X1je odabran iz grupe koja se sastoji od F i Y, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od I i H, X3je odabran iz grupe koja se sastoji od S i Y, i X4je odabran iz grupe koja se sastoji od V i A.
[0064] CDR3 X1RX2X3X4X5X6SX7X8YYX9X10X11YYGX12X13V (SEQ ID NO:130), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od D i E, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od L i K, X3je odabran iz grupe koja se sastoji od N i R, X4je odabran iz grupe koja se sastoji od Y i V, X5je odabran iz grupe koja se sastoji od Y i T, X6je odabran iz grupe koja se sastoji od D i M, X7je odabran iz grupe koja se sastoji od S i T, X8je odabran iz grupe koja se sastoji od G i L, X9je odabran iz grupe koja se sastoji od H i Y, X10je prisutan ili odsutan, i ako je prisutan, predstavlja Y, X11je odabran iz grupe koja se sastoji od K i F, X12je odabran iz grupe koja se sastoji od M i L, i X13je odabran iz grupe koja se sastoji od A i D.
Konsenzus sekvenca HCA
[0065] CDR1 X1X2X3MX4(SEQ ID NO:131), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od N i S, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od A, Y i F, X3je odabran iz grupe koja se sastoji od W, A i G, i X4je odabran iz grupe koja se sastoji od S i H.
[0066] CDR2 X1IX2X3X4X5X6GX7X8X9X10X11X12X13X14VKG (SEQ ID NO:132), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od R, A i V, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od K, S i W, X3je odabran iz grupe koja se sastoji od S, G, F i Y, X4je prisutan ili odsutan, i ako je prisutan, odabran je iz grupe koja se sastoji od K i T, X5je prisutan ili odsutan, i ako je prisutan, predstavlja T, X6je odabran iz grupe koja se sastoji od D i S, X7je odabran iz grupe koja se sastoji od G i S, X8je odabran iz grupe koja se sastoji od T, R, I, N i H, X9je odabran iz grupe koja se sastoji od T i K, X10je odabran iz grupe koja se sastoji od D i Y, X11je odabran iz grupe koja se sastoji od Y i S, X12je odabran iz grupe koja se sastoji od T, A i V, X13je odabran iz grupe koja se sastoji od A i D, i X14je odabran iz grupe koja se sastoji od P i S.
[0067] CDR3 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17GX18X19V (SEQ ID NO:133), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od D, A i E, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od R, Q i G, X3je odabran iz grupe koja se sastoji od T, R, L, G i K, X4je odabran iz grupe koja se sastoji od G, E, N, I i R, X5je odabran iz grupe koja se sastoji od Y, V i A, X6je odabran iz grupe koja se sastoji od S, G, Y, A i T, X7je odabran iz grupe koja se sastoji od I, P, D, A i M, X8je prisutan ili odsutan, i ako je prisutan, odabran je iz grupe koja se sastoji od S i Y, X9je prisutan ili odsutan, i ako je prisutan, odabran je iz grupe koja se sastoji od W, S i T, X10je odabran iz grupe koja se sastoji od S, G i L, X11je odabran iz grupe koja se sastoji od S, G, L i Y, X12je prisutan ili odsutan, i ako je prisutan, odabran je iz grupe koja se sastoji od W i Y, X13je odabran iz grupe koja se sastoji od Y i H, X14je prisutan ili odsutan, i ako je prisutan, odabran je iz grupe koja se sastoji od Y i D, X15je odabran iz grupe koja se sastoji od Y, K i F, X16je prisutan ili odsutan, i ako je prisutan, predstavlja Y, X17je prisutan ili odsutan, i ako je prisutan, predstavlja Y, X18je odabran iz grupe koja se sastoji od M i L, i X19je odabran iz grupe koja se sastoji od D i A.
Konsenzus sekvenca HCB
[0068] CDR1 X1X2X3X4X5(SEQ ID NO:134), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od N, G, D, S i A, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od A, F i Y, X3je odabran iz grupe koja se sastoji od W, Y, A i G, X4je odabran iz grupe koja se sastoji od M i L, i X5je odabran iz grupe koja se sastoji od S i H.
[0069] CDR2 X1IX2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17G (SEQ ID NO:135), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od R, W, A, V, S i F, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od K, N, S, W i R, X3je odabran iz grupe koja se sastoji od S, P, G, F i Y, X4je prisutan ili odsutan, i ako je prisutan, odabran je iz grupe koja se sastoji od K, T i R, X5je prisutan ili odsutan, i ako je prisutan, odabran je iz grupe koja se sastoji od T i A, X6je odabran iz grupe koja se sastoji od D, N, H, S i Y, X7je odabran iz grupe koja se sastoji od G i S, X8je odabran iz grupe koja se sastoji od G i S, X9je odabran iz grupe koja se sastoji od T, G, R, I, N, H i Y, X10je odabran iz grupe koja se sastoji od T, K, R i P, X11je odabran iz grupe koja se sastoji od D, N, Y i E, X12je odabran iz grupe koja se sastoji od Y i S, X13je odabran iz grupe koja se sastoji od T, A i V, X14je odabran iz grupe koja se sastoji od A, Q i D, X15je odabran iz grupe koja se sastoji od P, K i S, X16je odabran iz grupe koja se sastoji od V i F, i X17je odabran iz grupe koja se sastoji od K i Q.
[0070] CDR3 X1X2X3X4X5SX6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16GX17X18V (SEQ ID NO:136), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od D, G, A i E, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od R, G i Q, X3je odabran iz grupe koja se sastoji od T, M, Y, R, L, G i K, X4je odabran iz grupe koja se sastoji od G, S, E, N, I i R, X5je odabran iz grupe koja se sastoji od Y, I, G, V i A, X6je odabran iz grupe koja se sastoji od S, I, Y, G, A i T, X7je odabran iz grupe koja se sastoji od I, M, A, P i D, X8je prisutan ili odsutan, i ako je prisutan, odabran je iz grupe koja se sastoji od S, L i Y, X9je prisutan ili odsutan, i ako je prisutan, odabran je iz grupe koja se sastoji od W, R, S i T, X10je odabran iz grupe koja se sastoji od S, G i L, X11je odabran iz grupe koja se sastoji od S, V, L, G i Y, X12je prisutan ili odsutan, i ako je prisutan, odabran je iz grupe koja se sastoji od F, Y i W, X13je odabran iz grupe koja se sastoji od Y, P, S i H, X14je prisutan ili odsutan, i ako je prisutan, odabran je iz grupe koja se sastoji od Y, P, D i H, X15je odabran iz grupe koja se sastoji od Y, K i F, X16je prisutan ili odsutan, i ako je prisutan, predstavlja Y, X17je prisutan ili odsutan, i ako je prisutan, predstavlja Y i X18je odabran iz grupe koja se sastoji od M i L.
[0071] U bilo kom od prethodno pomenutih primera izvođenja definisanih konsenzus sekvencom, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se ovde zahteva može da bude, na primer, rekombinantno antitelo, humano (npr., potpuno humano) antitelo, humanizovano antitelo, himerno antitelo, multispecifično antitelo, ili njihov antigen-vezujući fragment. Dalje, fragment antitela monoklonskog antitela ili njegov antigen-vezujući fragment kako se ovde zahteva može da bude Fab fragment, i Fab’ fragment, F(ab’)2fragment, Fv fragment, di-antitelo, ili jednolančani molekul antitela. Na primer, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se ovde zahteva može da bude humano monoklonsko antitelo, i može da bude, npr., IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4 tip antitela. Dalje, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se ovde zahteva mogu da budu neutrališući antigen-vezujući proteini.
[0072] U bilo kom od prethodno pomenutih primera izvođenja definisanih konsenzus sekvencom, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se ovde zahteva može specifično da se veže za humani CRLR i za humani RAMP1, a ne vezuje se specifično za AM1, AM2 ili humani amilinski receptor (npr., AMY1), na primer, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se ovde zahteva može specifično da se veže za humani CGRP R sa KD≤1 µM, ≤100 nM, ≤10 nM, ili ≤5 nM, npr., kao što je određeno korišćenjem FACS testa za vezivanje i analizirano, na primer, korišćenjem postupaka opisanih kod Rathanaswami, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 334 (2005) 1004-1013. U bilo kom od prethodno pomenutih primera izvođenja definisanih konsenzus sekvencom, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se ovde zahteva može selektivno da inhibira humani CGRP R, u odnosu na humane AM1, AM2 ili AMY1 receptore, npr., sa odnosom selektivnosti od 100 ili više, 250 ili više, 500 ili više, 750 ili više, 1 000 ili više, 2500 ili više, 5000 ili više, ili 10000 ili više, gde stepen selektivne inhibicije može da se odredi korišćenjem bilo kog pogodnog postupka, npr., korišćenjem cAMP testa kao što je ovde opisano u primerima. U bilo kom od prethodno pomenutih primera izvođenja definisanih konsenzus sekvencom, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se ovde zahteva može da ima Ki od ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.5 nM ili ≤0.1 nM u testu kompetitivnog vezivanja, korišćenjem radioaktivno obeleženog<125>I-CGRP, za membrane ćelija koje eksprimiraju humani CGRP R, na primer, testu koji je ovde opisan u primeru 5.
[0073] Neka od monoklonskih antitela ili njihov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, kako je opisano sadrže sekvencu varijabilne regije teškog lanca (VH) koja ima najmanje 80%, 85%, i 90% ili 95% identičnosti sekvence sa sekvencom aminokiseline odabranom iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 158-170. Neka od monoklonskih antitela ili njihov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, kako je opisano sadrže sekvencu varijabilne regije lakog lanca (VL) koja ima najmanje 80%, 85%, i 90% ili 95% identičnosti sekvence sa sekvencom aminokiseline odabranom iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 137-153. Neka od monoklonskih antitela ili njihov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, kako je opisano sadrže VHsekvencu koja ima najmanje 80%, 85%, 90% ili 95% identičnosti sekvence sa sekvencom aminokiseline odabranom iz grupe koju čine SEQ ID NOs:158-170, i VLsekvencu koja ima najmanje 80%, 85%, 90% ili 95% identičnosti sekvence sa sekvencom aminokiseline odabranom iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 137-153. U nekim primerima izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži (A) varijabilnu regiju teškog lanca (VH) koja sadrži sekvencu (i) odabranu iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 158-170, ili (ii) kako je definisano u (i) i sadrži jednu ili više (npr., pet, deset, petnaest ili dvadeset) supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija; (B) VLkoja sadrži sekvencu (iii) odabranu iz grupe koju čine SEQ ID NOs:137-153, ili (iv) kako je definisano u (iii) sadrži jednu ili više (npr., pet, deset, petnaest ili dvadeset) supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija; ili (C) VHod (A) i VLod (B). U nekim primerima izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigenvezujući fragment kako se zahteva, sadrži varijabilnu regiju teškog lanca (VH) koji obuhvata sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 158-170 i VLkoji obuhvata sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NOs:137-153.
[0074] U jednom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži varijabilnu regiju teškog lanca (VH) koja sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO: 158, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija. U drugom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži VHkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:159, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija. U drugom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigenvezujući fragment kako se zahteva, sadrži VHkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:160, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija. U drugom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži VHkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:161, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija. U drugom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži VHkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO: 162, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija. U drugom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži VHkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO: 163, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija. U drugom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži VHkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO: 164, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija. U drugom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži VHkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO: 165, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija. U drugom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži VHkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO: 166, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija. U drugom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži VHkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:167; (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija. U drugom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži VHkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO: 168, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija. U drugom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži VHkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:169, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija. U drugom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigenvezujući fragment kako se zahteva, sadrži VHkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:170, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija.
[0075] U jednom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži varijabilnu regiju lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO: 137, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija. U drugom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži VLkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO: 138, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija. U drugom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigenvezujući fragment kako se zahteva, sadrži VLkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:139, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija. U drugom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži VLkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:140, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija. U drugom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži VLkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:141, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija. U drugom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži VLkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:142, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija. U drugom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži VLkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:143, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija. U drugom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži VLkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:144, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija. U drugom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigenvezujući fragment kako se zahteva, sadrži VLkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:145, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija. U drugom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži VLkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO: 146, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija. U drugom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži VLkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO: 147, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija. U drugom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži VLkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO: 148, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija. U drugom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži VLkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:149, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija. U drugom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži VLkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO: 150, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija. U drugom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži VLkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:151, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija. U drugom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigenvezujući fragment kako se zahteva, sadrži VLkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO: 152, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija. U drugom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži VLkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:153, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija.
[0076] U bilo kojoj od gore pomenutih realizacija definisanih sekvenci VLi VH, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, može da bude, na primer, rekombinantno antitelo, humano (npr., potpuno humano) antitelo, humanizovano antitelo, himerno antitelo, multi-specifično antitelo, ili njihov antigen-vezujući fragment. Dalje, fragment antitela od monoklonskog antitela ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, može da bude Fab fragment, i Fab' fragment, F(ab')2fragment, Fv fragment, diatelo, ili molekul antitela sa jednim lancem. Na primer, monoklonsko antitelo ili njegov antigenvezujući fragment kako se zahteva, može da bude humano monoklonsko antitelo, i može da bude, npr., IgG1-, IgG2-, IgG3-, ili IgG4-tip antitela. Dalje, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, mogu da budu neutralizujući proteini koji vezuju antigen.
[0077] U bilo kom od prethodno pomenutih primera izvođenja definisanih VLi VHsekvencom, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, kako je zahtevano, može specifično da se veže za humani CRLR i humani RAMP1, a ne vezuje se specifično za AM1, AM2 ili humani amilinski receptor (npr., AMY1), na primer, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, kako je zahtevano može specifično da se veže za humani CGRP R sa KD≤1 µM, ≤100 nM, ≤10 nM, ili ≤5 nM, npr., kao što je određeno korišćenjem FACS testa za vezivanje i analizirano, na primer, korišćenjem postupaka opisanih kod Rathanaswami, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 334 (2005) 1004-1013. U bilo kom od prethodno pomenutih primera izvođenja definisanih VLi VHsekvencom, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, kako je zahtevano može selektivno da inhibira humani CGRP R, u odnosu na humane AM1, AM2 ili AMY1 receptore, npr., sa odnosom selektivnosti od 100 ili više, 250 ili više, 500 ili više, 750 ili više, 1000 ili više, 2500 ili više, 5 000 ili više, ili 10000 ili više, gde stepen selektivne inhibicije može da se odredi korišćenjem bilo kog pogodnog postupka, npr., korišćenjem cAMP testa kao što je ovde opisano u primerima. U bilo kom od prethodno pomenutih primera izvođenja definisanih VLi VHsekvencom, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, kako je zahtevano, može da ima Ki od ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.5 nM ili ≤0.1 nM u testu kompetitivnog vezivanja, korišćenjem radioaktivno obeleženog<125>I-CGRP, za membrane ćelija koje eksprimiraju humani CGRP R, na primer, testu koji je ovde opisan u primeru 5.
[0078] U jednom aspektu, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži sekvencu teškog lanca koja ima najmanje 80%, 85%, 90% ili 95% identičnosti sekvence sa sekvencom aminokiseline odabranom iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 29-41. Neka od monoklonskih antitela ili njihov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, kako je opisano sadrže sekvencu lakog lanca koja ima najmanje 80%, 85%, 90% ili 95% identičnosti sekvence sa sekvencom aminokiseline odabranom iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 12-28. Neka od monoklonskih antitela ili njihov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži sekvencu teškog lanca koja ima najmanje 80%, 85%, 90% ili 95% identičnosti sekvence sa sekvencom aminokiseline odabranom iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 29-41, i sekvencu lakog lanca koja ima najmanje 80%, 85%, 90% ili 95% identičnosti sekvence sa sekvencom aminokiseline odabranom iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 12-28. U nekim primerima izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži (A) teški lanac koji sadrži sekvencu (i) odabranu iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 29-41, ili (ii) kako je definisano u (i) i sadrži jednu ili više (npr., pet, deset, petnaest ili dvadeset) supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija; (B) laki lanac koji sadrži sekvencu (iii) odabranu iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 12-28, ili (iv) kako je definisano u (iii) sadrži jednu ili više (npr., pet, deset, petnaest ili dvadeset) supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija; ili (C) teški lanac od (A) i laki lanac od (B). U nekim primerima izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži teški lanac koji obuhvata sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 29-41 i laki lanac koji obuhvata sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 12-28.
[0079] U jednom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži (A) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:29, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija; i (B) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:12, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija.
[0080] U drugom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži (A) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:30, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija; i (B) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:13, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija.
[0081] U drugom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži (A) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:31, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija; i (B) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:14, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija.
[0082] U drugom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži (A) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:32, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija; i (B) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO: 15, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija.
[0083] U drugom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži (A) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:33, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija; i (B) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:16, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija.
[0084] U drugom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži (A) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:29, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija; i (B) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:17, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija.
[0085] U drugom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži (A) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:34, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija; i (B) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:18, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija.
[0086] U drugom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži (A) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:33, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija; i (B) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:19, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija.
[0087] U drugom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži (A) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:29, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija; i (B) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:20, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija.
[0088] U drugom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži (A) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:35, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija; i (B) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:21, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija.
[0089] U drugom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži (A) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:36, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija; i (B) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:22, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija.
[0090] U drugom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži (A) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:37, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija; i (B) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:23, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija.
[0091] U drugom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži (A) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:38, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija; i (B) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:23, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija.
[0092] U drugom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži (A) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:33, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija; i (B) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:24, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija.
[0093] U drugom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži (A) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:39, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija; i (B) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:25, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija.
[0094] U drugom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži (A) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:40, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija; i (B) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:26, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija.
[0095] U drugom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži (A) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:41, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija; i (B) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:27, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija.
[0096] U drugom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako se zahteva, sadrži (A) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:41, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija; i (B) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (i) SEQ ID NO:28, (ii) sekvenca koja je najmanje 90% ili 95% identična sa sekvencom definisanom sa (i), i (iii) sekvenca definisana sa (i) koja sadržava do deset supstitucija aminokiselina (npr. konzervativne supstitucije aminokiselina), delecija ili insercija.
[0097] U bilo kojem od gore pomenutih primera izvođenja definisanih lakim i teškim lancem, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako je zahtevano može da sadrži naznačenu sekvencu teškog i/ili lakog lanca, ali sa drugačijim signalnim peptidom ili bez signalnog peptida. U bilo kom od prethodno pomenutih primera izvođenja definisanih sekvencom lakog i teškog lanca, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, kako se ovde zahteva, može da bude, na primer, rekombinantno antitelo, humano (npr., potpuno humano) antitelo, humanizovano antitelo, himerno antitelo, multispecifično antitelo, ili njihov antigen-vezujući fragment. Dalje, fragment antitela monoklonskog antitela ili njegovog fragmenta koji veže antigen, kako se ovde zahteva može da bude Fab fragment, i Fab’ fragment, F(ab’)2fragment, Fv fragment, di-antitelo, ili jednolančani molekul antitela. Na primer, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, kako se ovde zahteva može da bude humano monoklonsko antitelo, te može da bude, npr., IgG1-, IgG2-, IgG3-, ili IgG4-tip antitela. Dalje, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, kako se ovde zahteva može da bude neutrališući antigen-vezujući proteini.
[0098] U bilo kom od prethodno pomenutih primera izvođenja definisanih sekvencom lakog i teškog lanca, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, kako se ovde zahteva može specifično da se veže za humani CRLR i humani RAMP1, a ne vezuje se specifično za AM1, AM2 ili humani amilinski receptor (npr., AMY1), na primer, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, kako se ovde zahteva može specifično da se veže za humani CGRP R sa KD≤1 µM, ≤100 nM, ≤10 nM, ili ≤5 nM, npr., kao što je određeno korišćenjem FACS testa za vezivanje i analizirano, na primer, korišćenjem postupaka opisanih kod Rathanaswami, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 334 (2005) 1004-1013. U bilo kom od prethodno pomenutih primera izvođenja definisanih sekvencom lakog i teškog lanca, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, kako se ovde zahteva može selektivno da inhibira humani CGRP R, u odnosu na humane AM1, AM2 ili AMY1 receptore, npr., sa odnosom selektivnosti od 100 ili više, 250 ili više, 500 ili više, 750 ili više, 1000 ili više, 2 500 ili više, 5000 ili više, ili 10 000 ili više, gde stepen selektivne inhibicije može da se odredi korišćenjem bilo kog pogodnog postupka, npr., korišćenjem cAMP testa kao što je ovde opisano u primerima. U bilo kom od prethodno pomenutih primera izvođenja definisanih sekvencom lakog i teškog lanca, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, kako se ovde zahteva može da ima Ki od ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.5 nM ili ≤0.1 nM u testu kompetitivnog vezivanja, korišćenjem radioaktivno obeleženog<125>I-CGRP, za membrane ćelija koje eksprimiraju humani CGRP R, na primer, testu koji je ovde opisan u primeru 5.
[0099] U sledećem aspektu, takođe su obezbeđeni izolovani polinukleotidi nukleinske kiseline koji kodiraju bilo koji od CGRP R antigen-vezujućih proteina kako se ovde zahteva. U nekim slučajevima, izolovani molekuli nukleinske kiseline su operativno vezani za kontrolnu sekvencu. U povezanim primerima izvođenja, izolovani polinukleotidi su ugrađeni u ekspresioni vektor.
[0100] Takođe su uključene ćelijske linije transformisane ekspresionim vektorima koji sadrže izolovane polinukleotide kao što je prethodno opisano. U povezanim aspektima, takođe su obezbeđeni ekspresioni vektori i ćelije-domaćini transformisane ili transficirane ekspresionim vektorima koji sadrže prethodno pomenute izolovane molekule nukleinske kiseline koji kodiraju prethodno opisane antigen-vezujuće proteine za CGRP R.
[0101] U drugom aspektu, obezbeđen je takođe postupak za pripremu monoklonskog antitela ili njegovog fragmenta koji veže antigen, kako se ovde zahteva koji uključuje korak pripreme antigen-vezujućeg proteina iz ćelije-domaćina koja sekretuje antigen-vezujući protein. U nekim primerima izvođenja, antigen-vezujući protein se proizvodi korišćenjem imunogena koji sadrži rastvorni CGRP receptor. U nekim primerima izvođenja, takav rastvorni CGRP receptor se dobija pomoću koekspresije i prečišćavanja N-terminalnog vanćelijskog domena (ECD) humanog CRLR i ECD humanog RAMP1, npr., ECD humanog CRLR koji sadrži SEQ ID NO: 6 i ECD RAMP1 koji sadrži SEQ ID NO: 8, na primer, kao što je ovde opisano u primerima 1 i 2.
[0102] U još jednom aspektu, obezbeđena je farmaceutska kompozicija koja sadrži bar jedan od monoklonskog antitela ili njegovog fragmenta koji veže antigen, kako se ovde zahteva koji su prethodno sumarno prikazani i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens. U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija može da sadrži dodatno aktivno sredstvo koje je odabrano iz grupe koja se sastoji od radioizotopa, radionuklida, toksina, ili terapeutske i hemoterapeutske grupe.
[0103] U jednom aspektu, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, kako se ovde zahteva je efikasno u inhibiciji vazodilatacije i/ili smanjuje neurogenu inflamaciju kada se primeni kod pacijenta. U jednom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, kako se ovde zahteva je efikasno u smanjenju učestalosti i/ili ozbiljnosti glavobolja, na primer, migrenskih glavobolja. Na primer, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, kako se ovde zahteva može da se koristi za akutno lečenje migrene, i/ili za profilaktičko lečenje da spreči ili smanji učestalost i/ili ozbiljnost simptoma, posebno simptoma bola, povezanih sa napadom migrene.
[0104] Ilustrovani su postupci za lečenje ili prevenciju stanja povezanog sa CGRP R kod pacijenta, koji obuhvataju primenu kod pacijenta efikasne količine najmanje jednog monoklonskog antitela ili njegovog fragmenta koji veže antigen, kako se ovde zahteva, koji je prethodno opisan. Stanje može da bude glavobolja, na primer, migrenska glavobolja ili klaster glavobolja ili druga vrsta bola, npr., hronični bol; u drugom primeru izvođenja stanje predstavlja dijabetes melitus (tipa II); alternativno, stanje predstavlja inflamaciju, naročito neurogenu inflamaciju; alternativno, stanje predstavlja kardiovaskularni poremećaj; alternativno, stanje predstavlja hemodinamski poremećaj povezan sa endotoksemijom i sepsom; alternativno, stanje predstavlja vazodilataciju.
[0105] Takođe je ilustrovan postupak za inhibiciju vezivanja CGRP za humani CGRP R, npr., za ekstraćelijski deo CGRP R, kod pacijenta, koji obuhvata primenu efikasne količine najmanje jednog antigen-vezujućeg proteina koji je ovde obezbeđen i/ili prethodno opisan.
[0106] Ovi i drugi aspekti će ovde biti detaljnije opisani. Svaki od obezbeđenih aspekata može da obuhvati različite primere izvođenja koji su ovde obezbeđeni. Zbog toga se očekuje da svaki od primera izvođenja koji uključuje jedan element ili kombinacije elemenata može da bude uključen u svaki opisani aspekt, i sve takve kombinacije prethodnih aspekata i primeri izvođenja se izričito razmatraju. Druge karakteristike, ciljevi, i prednosti pronalaska su očigledni iz detaljnog opisa koji sledi.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0107]
Sl. 1 prikazuje poravnanje RAMP-1 sekvenci čoveka, cinomolgus majmuna i pacova. Sl. 2 prikazuje poravnanje CRLR sekvenci čoveka, cinomolgus majmuna i pacova.
Sl. 3A i 3B prikazuju filogenetski zasnovana poravnanja sekvenci CDR lakog lanca iz naznačenih klonova antitela protiv CGRP receptora koja imaju kapa lake lanace, i određene odgovarajuće konsenzus sekvence.
Sl. 4 prikazuje filogenetski zasnovana poravnanja sekvenci CDR lakog lanca iz naznačenih klonova antitela protiv CGRP receptora koja imaju lambda lake lanace, i određene odgovarajuće konsenzus sekvence.
Sl. 5A, 5B, 5C, 5D i 5E prikazuju filogenetski zasnovana poravnanja sekvenci CDR teškog lanca iz naznačenih klonova antitela protiv CGRP receptora, i određene odgovarajuće konsenzus sekvence.
Sl. 5F prikazuje konsenzus sekvence tipičnog CDR teškog lanca antitela protiv CGRP receptora, ovde opisanog.
Sl. 6 predstavlja grafik sa podacima iz dva eksperimenta koji prikazuju procenat inhibicije obeleženog liganda koji se vezuje za CGRP R pomoću 1092 supernatanta hibridoma sa anti-CGRP R antitelima (rombovi) i 68 supernatanta negativnih kontrola (kvadratići).
Sl. 7A-D prikazuju podatke o IC50 iz tipičnog testa cAMP iz ćelija koje eksprimiraju hCGRP receptor (Sl.7A), hAM1 (Sl.7B), hAM2 (Sl.7C) i humane amilinske receptore (Sl. 7D) za tri naznačena anti-CGRP R mAb.
Sl. 8 prikazuje primer podataka o vezivanju<125>I-CGRP kakvi mogu da se koriste za određivanje Ki mAb protiv humanog CGRP receptora.
Sl. 9A-D prikazuju podatke o kompeticiji u Biacore testu za odabrana ovde opisana antitela.
Sl. 10 prikazuje određivanje Kd mAb 12G8 pomoću FACS.
Sl. 11 prikazuje poravnanje RAMP1 sekvenci cinomolgus majmuna, čoveka, humanih himera, pacova i rezus majmuna.
Sl. 12A-B prikazuju poravnanje CRLR sekvenci čoveka, cinomolgus majmuna, rezus majmuna, pacova, humanih himera i konsenzus CRLR sekvenci.
Sl. 13A-13C prikazuju reprezentativne podatke dobijene pomoću FACS različitih himernih CGRP receptora koji se vezuju za anti-CGRP R antitela.
Sl. 14 prikazuje peptidne mape dobijene digestijom samog CGRP R delovanjem AspN (hromatogram A) i digestijom kontrolnog uzorka koji sadrži monoklonsko antitelo 12G8 protiv CGRP R (hromatogram B).
Sl. 15 prikazuje digestije CGRP R pomoću AspN u prisustvu različitih koncentracija neutrališućeg antitela protiv CGRP R.
Sl. 16 prikazuje digestije CGRP R pomoću AspN u prisustvu različitih koncentracija neutrališućeg antitela 4E4 protiv CGRP R.
Sl. 17 prikazuje intenzitet imunohistohemijskog bojenja ćelija koje eksprimiraju različite komponente receptora antitelom 32H7.
DETALJNI OPIS
[0108] Naslovi poglavlja koji se ovde koriste su samo u svrhu organizacije i ne treba ih smatrati ograničavajućim za opisanu temu pronalaska.
[0109] Osim ako ovde nije drugačije definisano, naučni i tehnički termini korišćeni u vezi sa predmetnom prijavom imaće značenja koja obično podrazumevaju osobe za uobičajenim znanjem u oblasti. Dalje, osim ako kontekst ne nalaže drugačije, termini u jednini će uključivati množinu i termini u množini će uključivati jedninu.
[0110] Uopšteno, nomenklature korišćene u vezi sa, i tehnike, kulture ćelija i tkiva, molekularne biologije, imunologije, mikrobiologije, genetike i hemije proteina i nukleinskih kiselina i hibridizacije koje su ovde opisane su one koje su dobro poznate i uobičajeno korišćene u ovoj oblasti. Postupci i tehnike predmetne prijave se uopšteno izvode prema uobičajenim postupcima dobro poznatim u stanju tehnike i kao što je opisano u raznim opštim i specifičnijim referencama koje su citirane i diskutovane u predmetnoj specifikaciji osim ako nije drugačije naznačeno. Videti, npr., Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), i Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990). Enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja se izvode prema specifikacijama proizvođača, kao što se uobičajeno radi u ovoj oblasti, ili kako je ovde opisano. Terminologija korišćena u vezi sa, i laboratorijski postupci i tehnike analitičke hemije, sintetske organske hemije, i medicinske i farmaceutske hemije koje su ovde opisane su one koje su dobro poznate i uobičajeno korišćene u ovoj oblasti. Standardne tehnike mogu da se koriste za hemijske sinteze, hemijske analize, farmaceutske pripreme, formulaciju, i dostavu, i lečenje pacijenata.
[0111] Treba razumeti da ovaj pronalazak nije ograničen na određenu metodologiju, protokole i reagense, itd., koji su ovde opisani i kao takav može da varira. Ovde korišćena terminologija je samo u svrhu opisivanja određenih primera izvođenja, i nije namenjena da bude ograničavajuća za obim predmetnog pronalaska, koji je definisan samo patentnim zahtevima.
[0112] Osim u operativnim primerima, ili gde je drugačije naznačeno, sve brojeve koji označavaju količine sastojaka ili reakcione uslove koji su ovde korišćeni, treba shvatiti kao modifikovane u svim slučajevima izrazom "oko". Termin "oko" kada se koristi u vezi sa procentima označava ±1%.
Definicije
[0113] Termin "polinukleotid" ili "nukleinska kiselina" uključuje i jednolančane i dvolančane nukleotidne polimere. Nukleotidi koji sačinjavaju polinukleotid mogu da budu ribonukleotidi ili dezoksiribonukleotidi ili modifikovani oblik bilo kog od ovih tipova nukleotida. Pomenute modifikacije uključuju modifikacije baza kao što su derivati bromouridina i inozina, modifikacije riboze kao što je 2’,3’-didezoksiriboza, i modifikacije internukleotidnih veza kao što je fosforotioat, fosforoditioat, fosforoselenoat, fosforodiselenoat, fosforoanilotioat, fosforaniladat i fosforoamidat.
[0114] Termin "oligonukleotid" označava polinukleotid koji sadrži 200 ili manje nukleotida. U nekim primerima izvođenja, oligonukleotidi su dugi 10 do 60 baza. U drugim primerima izvođenja, oligonukleotidi su dugi 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili 20 do 40 nukleotida. Oligonukleotidi mogu da budu jednolančani ili dvolančani, npr., za upotrebu u konstruisanju mutantnog gena. Oligonukleotidi mogu da budu sens ili antisens oligonukleotidi. Oligonukleotid može da uključuje oznaku za testove detekcije, uključujući radioaktivnu oznaku, fluorescentnu oznaku, hapten ili antigenu oznaku. Oligonukleotidi mogu da se koriste, na primer, kao prajmeri za PCR reakcije, prajmeri za kloniranje ili hibridizacione probe.
[0115] "Molekul izolovane nukleinske kiseline" označava DNK ili RNK genomskog, iRNK, cDNK, ili sintetskog porekla, ili neku njihovu kombinaciju, koja nije povezana sa celim ili delom polinukleotida u kome se izolovani polinukleotid nalazi u prirodi, ili je vezana za polinukleotid za koji nije vezana u prirodi. U svrhu ovog opisa, treba razumeti da "molekul nukleinske kiseline koji sadrži" određenu nukleotidnu sekvencu ne obuhvata intaktne hromozome. Molekuli izolovane nukleinske kiseline "koji sadrže" navedene sekvence nukleinske kiseline mogu da uključuju, pored navedenih sekvenci, kodirajuće sekvence za do deset ili čak do dvadeset drugih proteina ili njihovih delova, ili mogu da uključuju operativno vezane regulatorne sekvence koje kontrolišu ekspresiju kodirajućeg regiona nabrojanih sekvenci nukleinske kiseline, i/ili mogu da uključuju vektorske sekvence.
[0116] Osim ako nije drugačije naznačeno, levi kraj bilo koje jednolančane polinukleotidne sekvence koja je ovde opisana predstavlja 5’ kraj; smer ulevo dvolančane polinukleotidne sekvence je označen kao 5’ smer. Smer 5’ ka 3’ dodavanja nascentnih RNK transkripata je označen kao smer transkripcije; regioni sekvence na lancu DNK koji imaju istu sekvencu kao RNK transkript koji su 5’ u odnosu na 5’ kraj RNK transkripta označeni su kao "ushodne sekvence;" regioni sekvence na lancu DNK koji imaju istu sekvencu kao RNK transkript koji su 3’ u odnosu na 3’ kraj RNK transkripta označeni su kao "nishodne sekvence."
[0117] Termin "kontrolna sekvenca" odnosi se na polinukleotidnu sekvencu koja može da utiče na ekspresiju i obradu kodirajućih sekvenci sa kojima je spojena. Priroda takvih kontrolnih sekvenci može da zavisi od organizma domaćina. U konkretnim primerima izvođenja, kontrolne sekvence za prokariote mogu da uključuju promotor, vezujuće mesto za ribozom i sekvencu za završetak transkripcije. Na primer, kontrolne sekvence za eukariote mogu da uključuju promotore koji sadrže jedno ili više mesta prepoznavanja za transkripcione faktore, sekvence za pojačavanje transkripcije i sekvencu za završetak transkripcije. "Kontrolne sekvence" mogu da uključuju lider sekvence i/ili fuzione partnerske sekvence.
[0118] Termin "vektor" označava bilo koji molekul ili entitet (npr., nukleinsku kiselinu, plazmid, bakteriofag ili virus) korišćen za prenos informacije koja kodira protein u ćelijudomaćina.
[0119] Termin "ekspresioni vektor" ili "ekspresioni konstrukt" se odnosi na vektor koji je pogodan za transformaciju ćelije-domaćina i sadrži sekvence nukleinske kiseline koje usmeravaju i/ili kontrolišu (u sadejstvu sa ćelijom-domaćinom) ekspresiju jednog ili više heterolognih kodirajućih regiona koji su operativno vezani za njih. Ekspresioni konstrukt može da uključuje, ali bez ograničenja, sekvence koje utiču na ili kontrolišu transkripciju, translaciju, i, ako su prisutni introni, utiču na obradu RNK kodirajućeg regiona koji je operativno vezan za njih.
[0120] Kako se ovde koristi, "operativno vezan" znači da su komponente na koje se primenjuje termin u odnosu koji im omogućava da sprovedu svoje svojstvene funkcije pod pogodnim uslovima. Na primer, kontrolna sekvenca u vektoru koja je "operativno vezana" za sekvencu koja kodira protein je vezana za nju na taj način da se ekspresija sekvence koja kodira protein postiže pod uslovima koji su kompatibilni sa transkripcionom aktivnošću kontrolnih sekvenci.
[0121] Termin "ćelija-domaćin" označava ćeliju koja je transformisana, ili je sposobna da bude transformisana, sekvencom nukleinske kiseline, i da na taj način eksprimira gen od interesa. Termin uključuje potomstvo roditeljske ćelije, bilo da je, ili ne, potomstvo identične morfologije ili genetskog sastava kao originalna roditeljska ćelija, sve dok je gen od interesa prisutan.
[0122] Termin "transdukcija" označava transfer gena iz jedne bakterije u drugu, obično pomoću bakteriofaga. "Transdukcija" se takođe odnosi na dobijanje i transfer sekvenci eukariotske ćelije pomoću replikativno defektnih retrovirusa.
[0123] Termin "transfekcija" označava unos strane ili egzogene DNK u ćeliju, i ćelija je "transficirana" kada je egzogena DNK uvedena unutar ćelijske membrane. Brojne tehnike transfekcije su dobro poznate u ovoj oblasti i ovde su opisane. Videti, npr., Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra; Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al., 1981, Gene 13:197. Takve tehnike mogu da se koriste za uvođenje jednog ili više egzogenih DNK fragmenata u pogodne ćelije-domaćine.
[0124] Termin "transformacija" se odnosi na promenu u genetskim svojstvima ćelije, i ćelija je transformisana kada je modifikovana tako da sadrži novu DNK ili RNK. Na primer, ćelija je transformisana kada je genetski modifikovana iz svog nativnog stanja uvođenjem novog genetskog materijala putem transfekcije, transdukcije, ili drugih tehnika. Nakon transfekcije ili transdukcije, transformišuća DNK može da rekombinuje sa DNK ćelije pomoću fizičke ugradnje u hromozom ćelije, ili može da bude prolazno održavana kao epizomalni element a da se ne replikuje, ili može da se replikuje nezavisno kao plazmid. Ćelija se smatra "stabilno transformisanom" kada se transformišuća DNK replikuje sa podelom ćelije.
[0125] Termini "polipeptid" ili "protein" se ovde koriste međusobno zamenljivo da označe polimer aminokiselinskih ostataka. Termini se takođe odnose na aminokiselinske polimere u kojima je jedan ili više aminokiselinskih ostataka analog ili mimetik odgovarajuće prirodne aminokiseline, kao i na prirodne polimere aminokiselina. Termini mogu da obuhvataju i polimere aminokiselina koji su modifikovani, npr., dodatkom ugljovodoničnih ostataka da bi se obrazovali glikoproteini, ili fosforilisani. Polipeptidi i proteini mogu da budu proizvedeni u prirodno postojećoj i nerekombinantnoj ćeliji; ili se proizvode u genetski modifikovanoj ili rekombinantnoj ćeliji, i sadrže molekule koji imaju aminokiselinsku sekvencu nativnog proteina, ili molekule koji imaju delecije, adicije, i/ili supstitucije jedne ili više aminokiselina u odnosu na nativnu sekvencu. Termini "polipeptid" i "protein" specifično obuhvataju antigenvezujuće proteine, npr., CGRP R antigen-vezujuće proteine, CGRP R vezujuće proteine, antitela, ili sekvence koje imaju delecije, adicije, i/ili supstitucije jedne ili više aminokiselina u odnosu na antigen-vezujući protein. Termin "polipeptidni fragment" se odnosi na polipeptid koji ima amino-terminalnu deleciju, karboksi-terminalnu deleciju, i/ili unutrašnju deleciju u poređenju sa proteinom celokupne dužine. Takvi fragmenti mogu takođe da sadrže modifikovane aminokiseline u poređenju sa proteinom celokupne dužine. U određenim primerima izvođenja, fragmenti su dužine oko pet do 500 aminokiselina. Na primer, fragmenti mogu da budu najmanje 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400, ili 450 aminokiselina dugi. Korisni polipeptidni fragmenti uključuju imunološki funkcionalne fragmente antitela, uključujući vezujuće domene. U slučaju CGRP R-vezujućeg antitela, korisni fragmenti uključuju, ali nisu ograničeni na CDR region, varijabilni domen teškog ili lakog lanca, deo lanca antitela ili samo njegov varijabilni domen uključujući dva CDR, i slično. Podrazumeva se da "CGRP receptor", ili "CGRP R", obuhvata RAMP1 i CRLR.
[0126] Termin "izolovani protein" (npr., izolovani antigen-vezujući protein), "izolovani polipeptid" ili "izolovano antitelo" označava da je predmetni protein, polipeptid ili antitelo (1) lišeno bar nekih drugih proteina sa kojima bi se normalno nalazilo, (2) suštinski lišeno drugih proteina iz istog izvora, npr., iz iste vrste, (3) eksprimira se u ćeliji druge vrste, (4) odvojeno je od najmanje oko 50 procenata polinukleotida, lipida, ugljenih hidrata, ili drugih materijala sa kojima je povezano u prirodi, (5) operativno je povezano (kovalentnom ili nekovalentnom interakcijom) sa polipeptidom sa kojim nije povezano u prirodi, ili (6) se ne javlja u prirodi. Tipično, "izolovani protein", "izolovani polipeptid" ili "izolovano antitelo" čini najmanje oko 5%, najmanje oko 10%, najmanje oko 25%, ili najmanje oko 50% datog uzorka. Genomska DNK, cDNK, iRNK ili druge RNK sintetskog porekla, ili bilo koja njihova kombinacija može da kodira takav izolovani protein. Poželjno, izolovani protein, polipeptid ili antitelo je suštinski bez drugih proteina, ili drugih polipeptida, ili drugih kontaminanata koje se nalaze u njegovom prirodnom okruženju koje bi interferirale sa njegovom terapeutskom, dijagnostičkom, profilaktičkom, istraživačkom ili drugom upotrebom.
[0127] "Varijanta" polipeptida (npr., antigen-vezujući protein, ili antitelo) sadrži aminokiselinsku sekvencu gde je jedan ili više aminokiselinskih ostataka insertovan, deletiran i/ili supstituisan u aminokiselinskoj sekvenci, u odnosu na drugu polipeptidnu sekvencu. Varijante uključuju fuzione proteine.
[0128] "Derivat" polipeptida je polipeptid (npr., antigen-vezujući protein, ili antitelo) koji je hemijski modifikovan na neki način drugačiji od insercionih, delecionih, ili supstitucionih varijanti, npr., putem konjugacije sa drugim hemijskim fragmentom.
[0129] Termin "prirodni", kako se koristi u specifikaciji u vezi sa biološkim materijalima kao što su polipeptidi, nukleinske kiseline, ćelije-domaćini, i slično, odnosi se na materijale koji se nalaze u prirodi.
[0130] "Antigen-vezujući protein", kako se ovde koristi, označava protein koji se specifično vezuje za naznačeni ciljni antigen, kao što je CGRP R, naročito primata, npr., humani CGRP R. CGRP R antigen-vezujući protein se specifično vezuje za humani CGRP receptor.
[0131] Za antigen-vezujući protein se kaže da se "specifično vezuje" za ciljni molekul kada je konstanta disocijacije (KD) ≤10<-6>M. Antitelo se specifično vezuje za ciljni antigen sa "visokim afinitetom" kada je KD≤1x 10<-8>M. U jednom primeru izvođenja, antitela će se vezati za CGRP R, ili humani CGRP R sa KD≤5x 10<-7>; u drugom primeru izvođenja antitela će se vezati sa KD≤1x 10<-7>; u drugom primeru izvođenja antitela će se vezati sa KD≤5x 10<-8>; u drugom primeru izvođenja antitela će se vezati sa KD≤1x 10<-8>; u drugom primeru izvođenja antitela će se vezati sa KD≤5x 10<-9>; u drugom primeru izvođenja antitela će se vezati sa KD≤1x 10<-9>; u drugom primeru izvođenja antitela će se vezati sa KD≤5x 10<-10>; u drugom primeru izvođenja antitela će se vezati sa KD≤1x 10<-10>.
[0132] Antitelo, njegov antigen-vezujući fragment ili antigen-vezujući protein "selektivno inhibira" specifični receptor u odnosu na druge receptore kada je vrednost IC50 antitela, njegovog antigen-vezujućeg fragmenta ili antigen-vezujućeg proteina u testu inhibicije za specifični receptor najmanje 50 puta niža od vrednosti IC50 u testu inhibicije za drugi "referentni" receptor. "Odnos selektivnosti" predstavlja vrednost IC50 za referentni receptor podeljenu vrednošću IC50 za specifični receptor. Antitelo, njegov antigen-vezujući fragment ili antigen-vezujući protein selektivno inhibira humani CGRP receptor ako je IC50 antitela, njegovog antigen-vezujućeg fragmenta ili antigen-vezujućeg proteina u testu cAMP, npr., cAMP testu inhibicije, kao što je ovde opisano u primeru 4, najmanje 50 puta niža od IC50 istog antitela, njegovog antigen-vezujućeg fragmenta ili antigen-vezujućeg proteina u testu inhibicije za humani AM1, AM2 ili amilinski receptor (npr., AMY1). U smislu neograničavajućeg primera, ako je IC50 specifičnog anti-CGRP R antitela u testu cAMP za hCGRP R, npr., između 0.1 nM i 20 nM, i IC50 istog antitela u testu cAMP za hAM1, hAM2 ili humani AMY1 receptor 1000 nM ili više, tada antitelo selektivno inhibira hCGRP receptor. Takođe se razume da je antigen-vezujući protein koji selektivno inhibira specifični receptor neutrališući antigen-vezujući protein u odnosu na taj receptor.
[0133] "Antigen-vezujući region" označava protein, ili deo proteina, koji se specifično vezuje za naznačeni antigen. Na primer, taj deo antigen-vezujućeg proteina koji sadrži aminokiselinske ostatke koji interaguju sa antigenom i dodeljuju antigen-vezujućem proteinu njegovu specifičnost i afinitet za antigen označen je kao "antigen-vezujući region." Antigenvezujući region tipično uključuje jedan ili više "komplementarno vezujućih regiona" ("CDR"). Određeni antigen-vezujući regioni takođe uključuju jedan ili više "okvirnih" regiona. "CDR" je aminokiselinska sekvenca koja doprinosi antigen-vezujućoj specifičnosti i afinitetu. "Okvirni" regioni mogu da pomognu u održavanju ispravne konformacije CDR regiona doprinoseći vezivanju između antigen-vezujućeg regiona i antigena.
[0134] U određenim aspektima, obezbeđeni su rekombinantni antigen-vezujući proteini koji se vezuju za CGRP R protein, ili humani CGRP R. U tom kontekstu, "rekombinantni protein" je protein napravljen korišćenjem rekombinantnih tehnika, tj., putem ekspresije rekombinantne nukleinske kiseline kao što je ovde opisano. Postupci i tehnike za proizvosdnju rekombinantnih proteina su dobro poznati u stanju tehnike.
[0135] Termin "antitelo" se odnosi na intaktni imunoglobulin bilo kog izotipa, ili na njegov antigen-vezujući fragment koji može da stupi u kompeticiju sa intaktnim antitelom za specifično vezivanje za ciljni antigen, i uključuje, na primer, himerna, humanizovana, potpuno humana, i bispecifična antitela. "Antitelo" kao takvo je vrsta antigen-vezujućeg proteina. Intaktno antitelo će uopšteno sadržati najmanje dva teška lanca celokupne dužine i dva laka lanca celokupne dužine, ali u nekim slučajevima može da uključuje manje lanaca, kao antitela koja se prirodno javljaju kod kamelida, koja mogu da sadrže samo teške lance. Antitela mogu da budu dobijena samo iz jednog izvora, ili mogu da budu "himerna," što znači da različiti delovi antitela mogu da potiču od dva različita antitela, kao što je opisano u nastavku. Antigenvezujući proteini, antitela, ili vezujući fragmenti mogu da budu proizvedeni u hibridomima, pomoću tehnika rekombinantne DNK, ili enzimskim ili hemijskim sečenjem intaktnih antitela. Osim ako nije drugačije naznačeno, termin "antitelo" uključuje, pored antitela koja sadrže dva teška lanca celokupne dužine i dva laka lanca celokupne dužine, derivate, varijante, fragmente, i njihove mutacije, za koje su primeri opisani u nastavku teksta.
[0136] Termin "laki lanac" uključuje laki lanac celokupne dužine i njegove fragmente koji imaju dovoljno sekvence varijabilnog regiona da obezbede specifičnost vezivanja. Laki lanac celokupne dužine uključuje domen varijabilnog regiona, VL, i domen konstantnog regiona, CL. Domen varijabilnog regiona lakog lanca se nalazi na amino-terminusu polipeptida. Laki lanaci uključuju kapa lance i lambda lance.
[0137] Termin "teški lanac" uključuje teški lanac celokupne dužine i njegove fragmente koji imaju dovoljno sekvence varijabilnog regiona da obezbede specifičnost vezivanja. Teški lanac celokupne dužine uključuje domen varijabilnog regiona, VH, i tri domena konstantnog regiona, CH1, CH2, i CH3. VHdomen se nalazi na amino-terminusu polipeptida, a CHdomeni na karboksi-terminusu, sa CH3 koji je najbliži karboksi-terminusu polipeptida. Teški lanci mogu da budu bilo kog izotipa, uključujući IgG (uključujući IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4 podtipove), IgA (uključujući IgA1 i IgA2 podtipove), IgM i IgE.
[0138] Termin "signalna sekvenca", "lider sekvenca" ili "signalni peptid" odnosi se na kratki (3-60 aminokiselina dug) peptidni lanac koji upravlja transportom proteina. Signalni peptidi mogu takođe da se nazivaju signalima ciljnog delovanja, signalnim sekvencama, tranzitnim peptidima, ili lokalizacionim signalima. Neki signalni peptidi se isecaju iz proteina pomoću signalne peptidaze nakon što se proteini transportuju, tako da biološki aktivni oblik proteina (npr., antigen-vezujući protein kao što je ovde opisano) ima isečeni, kraći oblik. Prema tome, podrazumeva se da termini kao što su "antitelo koje sadrži teški lanac...", "antitelo koje sadrži laki lanac...", itd., gde se antitelo karakteriše time što ima teški i/ili laki lanac sa određenom identifikovanom sekvencom, uključuju antitela koja imaju specifične identifikovane sekvence, antitela koja imaju specifične identifikovane sekvence osim što su signalne sekvence zamenjene drugim signalnim sekvencama, kao i antitela koja imaju identifikovane sekvence, bez bilo kojih signalnih sekvenci.
[0139] Termin "antigen-vezujući fragment" (ili jednostavno "fragment") antitela ili imunoglobulinskog lanca (teškog ili lakog lanca), kako se ovde koristi, sadrži deo (bez obzira na to kako je deo dobijen ili sintetisan) antitela kome nedostaje bar neka od aminokiselina prisutnih u lancu celokupne dužine, ali koji je sposoban da se specifično veže za antigen. Takvi fragmenti su biološki aktivni po tome što se specifično vezuju za ciljni antigen i mogu da stupe u kompeticiju sa drugim antigen-vezujućim proteinima, uključujući intaktna antitela, za specifično vezivanje za dati epitop. U jednom aspektu, takav fragment će zadržati najmanje jedan CDR prisutan u lakom ili teškom lancu pune dužine, i u nekim primerima izvođenja će sadržati jedan teški lanac i/ili laki lanac ili njihov deo. Ovi biološki aktivni fragmenti mogu da budu proizvedeni pomoću tehnika rekombinantne DNK, ili mogu da budu proizvedeni enzimskim ili hemijskim isecanjem antigen-vezujućih proteina, uključujući intaktna antitela. Imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragmenti uključuju, ali bez ograničenja, Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, domenska antitela i jednolančana antitela, i mogu da potiču iz bilo kog sisarskog izvora, uključujući, ali bez ograničenja čoveka, miša, pacova, kamelide ili zeca. Podrazumeva se dalje da funkcionalni deo antigen-vezujućih proteina koji su ovde opisani, na primer, jedan ili više CDR, može da bude kovalentno vezan za drugi protein ili za mali molekul da bi nastalo terapeutsko sredstvo usmereno na određeni cilj u telu, koje poseduje bifunkcionalna terapeutska svojstva, ili koje ima produženi polu-život u serumu.
[0140] "Fab fragment" je sačinjen od jednog lakog lanca, i CH1 i varijabilnih regiona jednog teškog lanca. Teški lanac Fab molekula ne može da obrazuje disulfidnu vezu sa drugim molekulom teškog lanca.
[0141] "Fc" region sadrži dva fragmenta teškog lanca koji sadrže CH1 i CH2 domene antitela. Dva fragmenta teškog lanca se drže zajedno pomoću dve ili više disulfidnih veza i pomoću hidrofobnih interakcija CH3 domena.
[0142] "Fab’ fragment" sadrži jedan laki lanac i deo jednog teškog lanca koji sadrži VHdomen i CH1 domen i takođe region između CH1 i CH2 domena, tako da disulfidna veza između lanaca može da se obrazuje između dva teška lanca dva Fab’ fragmenta tako da obrazuje F(ab’)2molekul.
[0143] "F(ab’)2fragment" sadrži dva laka lanca i dva teška lanca koja sadrže deo konstantnog regiona između CH1 i CH2 domena, tako da se međulančana disulfidna veza obrazuje između dva teška lanca. F(ab’)2fragment se prema tome sastoji od dva Fab’ fragmenta koja zajedno drži disulfidna veza između dva teška lanca.
[0144] "Fv region" sadrži varijabilne regione iz teških i lakih lanaca, ali mu nedostaju konstantni regioni.
[0145] "Jednolančana antitela" su Fv molekuli u kojima su varijabilni regioni teškog i lakog lanca spojeni fleksibilnim linkerom tako da obrazuju jedan polipeptidni lanac, koji obrazuje antigen-vezujući region. Jednolančana antitela su detaljno opisana u objavljenoj međunarodnoj patentnoj prijavi br. WO 88/01649 i SAD patentu br.4,946,778 i br.5,260,203.
[0146] "Domensko antitelo" je imunološki funkcionalan imunoglobulinski fragment koji sadrži samo varijabilni region teškog lanca ili varijabilni region lakog lanca. U nekim slučajevima, dva ili više VHregiona su kovalentno spojena peptidnim linkerom tako da stvaraju bivalentno domensko antitelo. Dva VHregiona bivalentnog domenskog antitela mogu da ciljno deluju na iste ili različite antigene.
[0147] "Bivalentni antigen-vezujući protein" ili "bivalentno antitelo" sadrži dva antigenvezujuća mesta. U nekim slučajevima, dva vezivna mesta imaju istu antigenu specifičnost. Bivalentni antigen-vezujući proteini i bivalentna antitela mogu da budu bispecifična, videti, infra.
[0148] "Multispecifični antigen-vezujući protein" ili "multispecifično antitelo" je ono koje ciljno deluje na više od jednog antigena ili epitopa.
[0149] "Bispecifični," "dvojno-specifični" ili "bifunkcionalni" antigen-vezujući protein ili antitelo je hibridni antigen-vezujući protein ili antitelo, redom, koje ima dva različita antigenvezujuća mesta. Bispecifični antigen-vezujući proteini i antitela su vrste multispecifičnog antigen-vezujućeg proteina ili multispecifičnog antitela i mogu da budu proizvedeni različitim postupcima uključujući, ali bez ograničenja, fuziju hibridoma ili spajanje Fab’ fragmenata. Videti, npr., Songsivilai and Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553. Dva vezivna mesta bispecifičnog antigen-vezujućeg proteina ili antitela će se vezati za dva različita epitopa, koji mogu da se nalaze na istim ili različitim ciljnim molekulima proteina.
[0150] Termin "neutrališući antigen-vezujući protein" ili "neutrališuće antitelo" se odnosi na antigen-vezujući protein ili antitelo, redom, koje se vezuje za ligand, sprečava vezivanje liganda za njegovog partnera u vezivanju i prekida biolološki odgovor koji bi inače rezultovao iz vezivanja liganda za njegovog partnera u vezivanju. U proceni vezivanja i specifičnosti antigen-vezujućeg proteina, npr., antitela ili njegovog imunološki funkcionalnog antigenvezujućeg fragmenta, antitelo ili fragment će suštinski inhibirati vezivanje liganda za njegovog partnera u vezivanju kada višak antitela smanji količinu partnera u vezivanju vezanog za ligand za najmanje oko 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ili više (mereno in vitro kompetitivnim testom vezivanja). U slučaju vezujućeg proteina za CGRP R, takav neutrališući molekul će smanjiti sposobnost CGRP R da se veže za CGRP.
[0151] Termin "stupa u kompeticiju", kada se koristi u kontekstu antigen-vezujućih proteina koji mogu da se vežu za isti region na ciljnom antigenu, označava kompeticiju između antigenvezujućih proteina određenu testom u kome antigen-vezujući protein (npr., antitelo ili njegov imunološki funkcionalni antigen-vezujući fragment) u testu sprečava ili inhibira specifično vezivanje referentnog antigen-vezujućeg proteina (npr., liganda, ili referentnog antitela) za zajednički antigen (npr., CGRP R ili njegov antigen-vezujući fragment). Može da se koristi bilo koji od brojnih testova kompetitivnog vezivanja, na primer: direktni ili indirektni radioimunoesej (RIA) u čvrstoj fazi, direktni ili indirektni enzimski imunoesej (EIA) u čvrstoj fazi, „sendvič“ analiza kompetitivnog vezivanja (videti, npr., Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9:242-253); direktni biotin-avidin EIA test u čvrstoj fazi (videti, npr., Kirkland et al., 1986, J. Immunol.137:3614-3619) direktno obeleženi test u čvrstoj fazi, direktno obeleženi „sendvič“ test u čvrstoj fazi (videti, npr., Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press); direktno obeleženi RIA test koji koristi oznaku I-125 u čvrstoj fazi (videti, npr., Morel et al., 1988, Molec. Immunol.25:7-15); direktni biotin-avidin EIA test u čvrstoj fazi (videti, npr., Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552); i direktno obeleženi RIA (Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82). Takav test može da uključuje upotrebu prečišćenog antigena vezanog za čvrstu površinu ili ćelije koje nose bilo neobeleženi ispitivani antigen- vezujući protein ili obeleženi referentni antigen-vezujući protein. Kompetitivna inhibicija može da se meri određivanjem količine oznake vezane za čvrstu površinu ili ćelije u prisustvu ispitivanog antigen-vezujućeg proteina. Antigen-vezujući proteini identifikovani testom kompeticije (kompetitivni antigen-vezujući proteini) uključuju antigen-vezujuće proteine koji se vezuju za isti epitop kao referentni antigen-vezujući proteini i antigen-vezujuće proteine koji se vezuju za susedni epitop koji se nalazi dovoljno blizu epitopa vezanog za referentni antigen-vezujući protein da bi došlo do prostornog ometanja. Obično, kada je kompetitivni antigen-vezujući protein prisutan u višku, on će inhibirati specifično vezivanje referentnog antigen-vezujućeg proteina za zajednički antigen za najmanje 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% ili 75%. U nekim slučajevima, vezivanje je inhibirano za najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, ili 97% ili više. Kompetitivna inhibicija može takođe da se meri imobilizacijom referentnog antigen-vezujućeg proteina za substrat, npr., "senzorski čip", koji zarobljava antigen na substratu preko vezivanja za referentno antitelo, i ispituje da li drugačiji antigen-vezujući protein (kompetitivni antigen-vezujući protein) može dodatno da se veže za antigen. Primer ove druge analize kompetitivnog vezivanja uključuje Biacore analizu, i ovde je opisan u primeru 7.
[0152] Termin "antigen" ili "imunogen" se odnosi na molekul ili deo molekula koji može da bude vezan selektivno vezujućim sredstvom, kao što je antigen-vezujući protein (uključujući, npr., antitelo ili njegov imunološki funkcionalni antigen-vezujući fragment), i koji pored toga može da bude upotrebljen u životinji za proizvodnju antitela sposobnih da se vežu za taj antigen. Antigen može da ima jedan ili više epitopa koji mogu da međusobno reaguju sa različitim antigen-vezujućim proteinima, npr., antiteloma.
[0153] Termin "epitop" označava deo molekula koji je vezan antigen-vezujućim proteinom (na primer, antitelom). Termin uključuje bilo koju determinantu sposobnu za specifično vezivanje za antigen-vezujući protein, kao što je antitelo ili za T-ćelijski receptor. Epitop može da bude kontinuiranog ili diskontinuiranog tipa (npr., (i) u jednolančanom polipeptidu, aminokiselinski ostaci koji nisu susedni jedan drugom u polipeptidnoj sekvenci, ali koji su u kontekstu molekula vezani antigen-vezujućim proteinom, ili (ii) u multimernom receptoru, npr., CGRP R, koji sadrži dve ili više pojedinačnih komponenti, npr., RAMP1 i CRLR, aminokiselinski ostaci prisutni na dve ili više pojedinačnih komponenti, ali koji su u kontekstu multimernog receptora vezani antigen-vezujućim proteinom). U određenim primerima izvođenja, epitopi mogu da budu mimetici po tome što sadrže trodimenzionalnu strukturu sličnu epitopu korišćenom za stvaranje antigen-vezujućeg proteina, mada ne sadrže ili sadrže samo neke od aminokiselinskih ostataka nađenih u tom epitopu korišćenom za stvaranje antigen-vezujućeg proteina. Češće, epitopi se nalaze na proteinima, ali u nekim slučajevima mogu da se nalaze na drugoj vrsti molekula, kao što su nukleinske kiseline. Epitopske determinante mogu da uključuju hemijski aktivne površinske grupe molekula kao što su aminokiseline, bočni lanci šećera, fosforil ili sulfonil grupe, i mogu da imaju specifične trodimenzionalne strukturne osobine, i/ili specifične osobine naelektrisanja. Uopšteno, antitela specifična za određeni ciljni antigen će pretežno prepoznavati epitop na ciljnom antigenu u složenoj smeši proteina i/ili makromolekula.
[0154] Termin "identičnost" se odnosi na odnos između sekvenci dva ili više polipeptidnih molekula ili dva ili više molekula nukleinske kiseline, određen poravnanjem i poređenjem sekvenci. "Procenat identičnosti" označava procenat identičnih ostataka među aminokiselinama ili nukleotidima u molekulima koji se porede i računa se na osnovu veličine najmanjeg od molekula koji se porede. Za ova izračunavanja, praznine u poravnanjima (ako ih ima) moraju da se obrade određenim matematičkim modelom ili kompjuterskim programom (tj., "algoritmom"). Postupci koji mogu da se koriste za izračunavanje identičnosti upoređenih nukleinskih kiselina ili polipeptida uključuju one opisane u Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M., ed.), 1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press; i Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math.48:1073.
[0155] U izračunavanju procenta identičnosti, sekvence koje se porede se poravnavaju na način koji daje najveće poklapanje između sekvenci. Kompjuterski program koji se koristi za izračunavanje procenta identičnosti je programski paket GCG, koji uključuje GAP (Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI). Kompjuterski algoritam GAP se koristi za poravnanje dva polipeptida ili polinukleotida za koje procenat identičnosti sekvence treba da se odredi. Sekvence se poravnavaju za optimalno poklapanje odgovarajućih aminokiselina ili nukleotida ("upareni raspon", kako je određeno algoritmom). Negativni poeni za praznine (koji se računaju kao 3x prosečna dijagonala, gde je "prosečna dijagonala" prosek dijagonale matrice poređenja koja se koristi; "dijagonala" je rezultat ili broj dodeljen svakom savršenom poklapanju aminokiselina u određenoj matrici poređenja) i negativni poeni za produženje praznine (koji obično predstavljaju 1/10 puta negativni poeni za prazninu), kao i matrica poređenja kao što je PAM 250 ili BLOSUM 62, koriste se zajedno sa algoritmom. U određenim primerima izvođenja, algoritam takođe koristi standardnu matricu poređenja (videti, Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 za PAM 250 matricu poređenja; Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.89:10915-10919 za BLOSUM 62 matricu poređenja).
[0156] Preporučeni parameteri za određivanje procenta identičnosti za polipeptidne ili nukleotidne sekvence korišćenjem programa GAP su sledeći:
Algoritam: Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol.48:443-453;
Matrica poređenja: BLOSUM 62 prema Henikoff et al., 1992, supra;
Negativni poeni za prazninu: 12 (ali bez negativnih poena za krajnje praznine) Negativni poeni za dužinu praznine: 4
Prag sličnosti: 0
[0157] Određene šeme poravnanja za poravnanje dve aminokiselinske sekvence mogu da rezultuju u poklapanju samo kratkog regiona dve sekvence, i ovi mali regioni poravnanja mogu da imaju vrlo visoku identičnost sekvence mada nema značajne veze između celokupnih dužina dve sekvence. Prema tome, odabrani postupak za poravnanje (GAP program) može po želji da se prilagodi tako da rezultuje u poravnanju koje se prostire na bar 50 susednih aminokiselina ciljnog polipeptida.
[0158] Kako se ovde koristi, "suštinski čisto" označava da je opisana vrsta molekula pretežno prisutna vrsta, što znači, da je na molarnoj osnovi zastupljenija od bilo koje druge pojedinačne vrste u istoj smeši. U određenim primerima izvođenja, suštinski čist molekul je kompozicija u kojoj predmetna vrsta sadrži najmanje 50% (na molarnoj osnovi) svih prisutnih vrsta makromolekula. U drugim primerima izvođenja, suštinski čista kompozicija će sadržati najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, ili 99% svih makromolekulskih vrsta prisutnih u kompoziciji. U drugim primerima izvođenja, predmetna vrsta je prečišćena do esencijalne homogenosti pri čemu kontaminirajuće vrste ne mogu da se detektuju u kompoziciji uobičajenim postupcima za detekciju, i na taj način se kompozicija sastoji od samo jedne detektabilne makromolekulske vrste.
[0159] Termin "lečenje" se odnosi na bilo kakvu indiciju uspeha u lečenju ili poboljšanju povrede, patologije ili stanja, uključujući bilo koji objektivni ili subjektivni parametar kao što je ublažavanje; remisija; smanjenje simptoma ili postizanje da povreda, patologija ili stanje bude podnošljivije za pacijenta; usporavanje brzine ili nazadovanje degeneracije; čime se poslednja tačka degeneracije čini manje iznurujućom; poboljšanje pacijentovog psihičkog ili mentalnog stanja. Lečenje ili poboljšanje simptoma može da bude zasnovano na objektivnim ili subjektivnim parametrima; uključujući rezultate lekarskog pregleda, neuropsihijatrijska ispitivanja, i/ili psihijatrijsku procenu. Na primer, određeni postupci koji su ovde prikazani uspešno leče migrenske glavobolje, ili profilaktički, ili u vidu akutnog lečenja, smanjenjem učestalosti migrenskih glavobolja, smanjenjem ozbiljnosti migrenskih glavobolja, i/ili poboljšavanjem simptoma povezanih sa migrenskim glavoboljama.
[0160] "Efikasna količina" je uopšteno količina dovoljna da smanji ozbiljnost i/ili učestalost simptoma, ukloni simptome i/ili osnovni uzrok, spreči pojavu simptoma i/ili njihovog osnovnog uzroka, i/ili poboljša ili popravi štetu koja rezultuje iz, ili je povezana sa migrenskom glavoboljom. U nekim primerima izvođenja, efikasna količina je terapeutski efikasna količina ili profilaktički efikasna količina. "Terapeutski efikasna količina" je količina dovoljna da otkloni stanje bolesti (npr. migrensku glavobolju) ili simptome, posebno stanje ili simptome povezane sa stanjem bolesti, ili drugačije spreči, ometa, zadrži ili preokrene progresiju stanja bolesti ili bilo koji drugi nepoželjni simptom povezan sa bolešću na bilo koji način. "Profilaktički efikasna količina" je količina farmaceutske kompozicije koja će, kada se primeni kod subjekta, imati namenjeni profilaktički efekat, npr., sprečavanje ili odlaganje početka (ili recidiva) migrenske glavobolje, ili smanjenje verovatnoće pojave (ili recidiva) migrenske glavobolje ili simptoma migrenske glavobolje. Potpuno terapeutsko ili profilaktičko dejstvo ne nastupa neophodno nakon primene jedne doze, i može da nastupi tek nakon primene serije doza. Na taj način, a terapeutski ili profilaktički efikasna količina može da bude primenjena u jednoj ili više primena.
[0161] "Aminokiselina" uključuje svoje uobičajeno značenje u stanju tehnike. Dvadeset prirodnih aminokiselina i njihove skraćenice se koriste prema uobičajenoj upotrebi. Videti, Immunology-A Synthesis, 2nd Edition, (E. S. Golub and D. R. Green, eds.), Sinauer Associates: Sunderland, Mass. (1991). Stereoizomeri (npr., D-aminokiseline) dvadeset uobičajenih aminokiselina, neprirodne aminokiseline kao što su α-,α-disupstituisane aminokiseline, N-alkil aminokiseline, i druge neuobičajene aminokiseline mogu takođe da budu pogodne komponente za polipeptide i uključene su u termin "aminokiselina." Primeri neuobičajenih aminokiselina uključuju: 4-hidroksiprolin, γ-karboksiglutamat, ε-N,N,N-trimetillizin, ε-N-acetillizin, O-fosfoserin, N-acetilserin, N-formilmetionin, 3-metilhistidin, 5-hidroksilizin, σ-N-metilarginin i druge slične aminokiseline i imino kiseline (npr., 4-hidroksiprolin). U ovde korišćenom označavanju polipeptida, levi kraj predstavlja aminoterminalni kraj i desni kraj predstavlja karboksi-terminalni kraj, u skladu sa standardnom upotrebom i konvencijom.
Opšti pregled
[0162] Ovde su obezbeđeni antigen-vezujući proteini koji se vezuju za CGRP R protein, uključujući humani CGRP R (hCGRP R) protein. Obezbeđeni antigen-vezujući proteini su polipeptidi u kojima su jedan ili više regiona za određivanje komplementnosti (CDR), kao što je ovde opisano, ugrađeni i/ili spojeni. Kod nekih antigen-vezujućih proteina, CDR regioni su ugrađeni u "okvirni" region, koji orijentiše CDR region(e) tako da ispravna antigen-vezujuća svojstva CDR regiona budu uspostavljena. Uopšteno, antigen-vezujući proteini koji su obezbeđeni mogu da interferiraju sa, blokiraju, smanje, ili modulišu interakciju između CGRP i CGRP R.
[0163] Određeni ovde opisani antigen-vezujući proteini su antitela ili su izvedeni iz antitela. U određenim primerima izvođenja, polipeptidna struktura antigen-vezujućih proteina se zasniva na antitelima, uključujući, ali bez ograničenja, monoklonska antitela, bispecifična antitela, mini-antitela, domenska antitela, sintetska antitela (ponekad ovde označena kao "mimetici antitela"), himerna antitela, humanizovana antitela, humana antitela, fuzije antitela (ponekad ovde označene kao "konjugovana antitela"), i njihove fragmente. Različite strukture su ovde opisane u nastavku teksta.
[0164] Pokazano je da se ovde obezbeđeni antigen-vezujući proteini vezuju za CGRP R, naročito humani CGRP R. Kao što je dalje opisano u primerima u nastavku teksta, određeni antigen-vezujući proteini su ispitivani i nađeno je da se vezuju za epitope drugačije od onih za koje se vezuju brojna druga antitela usmerena protiv jedne ili druge komponente CGRP R. Obezbeđeni antigen-vezujući proteini stupaju u kompeticiju sa CGRP i tako sprečavaju CGRP da se veže za svoj receptor. Kao posledica toga, antigen-vezujući proteini koji su ovde obezbeđeni su sposobni da inhibiraju aktivnost CGRP R. Posebno, antigen-vezujući proteini koji se vezuju za ove epitope mogu da imaju jednu ili više od sledećih aktivnosti: inhibicije, između ostalog indukcije CGRP R puteva prenosa signala, inhibicije vazodilatacije, izazivanje vazokonstrikcije, smanjenje inflamacije, npr., neurogene inflamacije, i druga fizioliška dejstva indukovana sa CGRP R nakon vezivanja CGRP.
[0165] Ovde obezbeđeni antigen-vezujući proteini imaju različite upotrebe. Neki od antigenvezujućih proteina su, na primer, korisni u analizama specifičnog vezivanja, afinitetnog prečišćavanja CGRP R, naročito hCGRP R ili njegovih liganda, i u skriningu za identifikovanje drugih antagonista aktivnosti CGRP R. Neki od antigen-vezujućih proteina su korisni za inhibiciju vezivanja CGRP za CGRP R.
[0166] Antigen-vezujući proteini mogu da imaju različite primene u lečenju, kao što je ovde objašnjeno. Na primer, određeni CGRP R antigen-vezujući proteini su korisni za lečenje stanja povezanih sa prenosom signala posredovanim CGRP R, kao što je smanjenje, ublažavanje, ili lečenje učestalosti i/ili ozbiljnosti migrenske glavobolje, smanjenje, ublažavanje, ili lečenje klaster glavobolje, smanjenje, ublažavanje, ili lečenje hroničnog bola, ublažavanje, ili lečenje dijabetes melitusa (tipa II), smanjenje, ublažavanje, ili lečenje kardiovaskularnih poremećaja, i smanjenje, ublažavanje, ili lečenje hemodinamskih poremećaja povezanih sa endotoksemijom i sepsom kod pacijenta. Druge upotrebe antigen-vezujućih proteina uključuju, na primer, dijagnostiku bolesti ili stanja povezanih sa CGRP R i skrining analize za određivanje prisustva ili odsustva CGRP R. Neki od ovde opisanih antigen-vezujućih proteina su korisni u lečenju posledica, simptoma, i/ili patologije povezane sa aktivnošču CGRP R. One uključuju, ali bez ograničenja, različite tipove migrenskih glavobolja.
CGRP receptor
[0167] Ovde opisani antigen-vezujući proteini se vezuju za CGRP R, naročito humani CGRP R. CGRP R je multimer koji uključuje CRLR i RAMP1. Nukleotidna sekvenca humanog CRLR je ovde obezbeđena kao SEQ ID NO:1. Aminokiselina sekvenca humanog CRLR je ovde obezbeđena kao SEQ ID NO:2. Nukleotidna sekvenca humanog RAMP1 je ovde obezbeđena kao SEQ ID NO:3. Aminokiselinska sekvenca humanog RAMP1 je ovde obezbeđena kao SEQ ID NO:4. Ovde opisani antigen-vezujući proteini se vezuju za vanćelijski deo CGRP R, koji sadrži vanćelijske delove CRLR i RAMP1. Tipičan vanćelijski domen ("ECD") humanog CRLR je kodiran nukleotidnom sekvencom predstavljenom kao SEQ ID NO:5, i ima aminokiselinsku sekvencu predstavljenu kao SEQ ID NO:6. Ova sekvenca uključuje signalni peptid; tipični zreli (bez signalnog peptida) ECD CRLR ima aminokiselinsku sekvencu predstavljenu kao SEQ ID NO:10. Tipičan ECD humanog RAMP1 je kodiran nukleotidnom sekvencom predstavljenom kao SEQ ID NO:7, i ima aminokiselinsku sekvencu predstavljenu kao SEQ ID NO:8. Ova sekvenca uključuje signalni peptid; tipičan zreli (bez signalnog peptida) ECD RAMP1 ima aminokiselinsku sekvencu predstavljenu kao SEQ ID NO:11. Kao što je opisano u nastavku, CGRP R proteini mogu takođe da uključuju fragmente. Kako se ovde koristi, termini se koriste međusobno zamenljivo da označe receptor, naročito, ako nije drugačije naznačeno, humani receptor koji se specifično vezuje za CGRP.
[0168] Termin CGRP R takođe uključuje post-translacione modifikacije aminokiseline sekvence CGRP R, na primer, moguća N-vezana mesta glikozilacije. Na taj način, antigenvezujući proteini mogu da se vežu za, ili da nastanu iz proteina koji su glikozilovani na jednoj ili više pozicija.
CGRP receptor-vezujući proteini
[0169] Obezbeđena su različita sredstva koja se selektivno vezuju, korisna za regulaciju aktivnosti CGRP R. Ova sredstva uključuju, na primer, antigen-vezujuće proteine koji sadrže antigen-vezujući domen (npr., jednolančana antitela, domenska antitela, imunoadhezini, i polipeptidi sa antigen-vezujućim regionom) i specifično se vezuju za CGRP R, naročito humani CGRP R. Neka od srestava, na primer, korisna su za inhibiciju vezivanja CGRP za CGRP R, i mogu tako da se koriste u inhibiciji, interferenciji sa, ili modulaciji jedne ili više aktivnosti povezanih sa prenosom signala putem CGRP R.
[0170] Uopšteno, antigen-vezujući proteini koji su obezbeđeni tipično sadrže jedan ili više CDR regiona kao što je ovde opisano (npr., 1, 2, 3, 4, 5 ili 6). U nekim slučajevima, antigenvezujući protein sadrži (a) polipeptidnu strukturu i (b) jedan ili više CDR regiona koji su ubačeni u, i/ili vezani za polipeptidnu strukturu. Polipeptidna struktura može da ima različite oblike. Na primer, to može da bude, ili da sadrži, okvirni region prirodnog antitela, ili fragment ili njegova varijanta, ili može da bude u potpunpsti sintetske prirode. Primeri različitih polipeptidnih struktura su dalje opisani u nastavku.
[0171] U određenim primerima izvođenja, polipeptidna struktura antigen-vezujućih proteina je antitelo ili je izvedena iz antitela, uključujući, ali bez ograničenja, monoklonska antitela, bispecifična antitela, mini-antitela, domenska antitela, sintetska antitela (ponekad ovde označena kao "mimetici antitela"), himerna antitela, humanizovana antitela, fuzije antitela (ponekad ovde označene kao "konjugovana antitela"), delove ili fragmente svakog od njih, redom. U nekim slučajevima, antigen-vezujući protein je imunološki fragment antitela (npr., Fab, Fab’, F(ab’)2, ili scFv). Različite strukture su ovde dodatno opisane i definisane.
[0172] Određeni ovde obezbeđeni antigen-vezujući proteini specifično se vezuju za humani CGRP R. U specifičnom primeru izvođenja, antigen-vezujući protein specifično se vezuje za humani CGRP R protein koji sadrži humani CRLR koji ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao SEQ ID NO:2 i humani RAMP1 koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4.
[0173] U primerima izvođenja u kojima se antigen-vezujući protein koristi za terapeutske primene, antigen-vezujući protein može da inhibira, interferira sa, ili modulira jednu ili više bioloških aktivnosti CGRP R. U tom slučaju, antigen-vezujući protein se specifično vezuje i/ili suštinski inhibira vezivanje humanog CGRP R za CGRP kada višak antitela smanjuje količinu humanog CGRP R vezanog za CGRP, ili obrnuto, za najmanje oko 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ili više (na primer merenjem vezivanja in vitro testom kompetitivnog vezivanja).
Struktura prirodnog antitela
[0174] Neki od obezbeđenih antigen-vezujućih proteina imaju strukturu tipično povezanu sa prirodnim antitelima. Strukturne jedinice ovih antitela tipično sadrže jedan ili više tetramera, od kojih se svaki sastoji od dva identična para polipeptidnih lanaca, iako neke vrste sisara takođe proizvode antitela koja imaju samo pojedinačni teški lanac. U tipičnom antitelu, svaki par ili kuplet uključuje jedan "laki" lanac pune dužine (u određenim primerima izvođenja, oko 25 kDa) i jedan "teški" lanac pune dužine (u određenim primerima izvođenja, oko 50-70 kDa). Svaki pojedinačni imunoglobulinski lanac se sastoji od nekoliko "imunoglobulinskih domena", od kojih se svaki sastoji od približno 90 do 110 aminokiselina i ispoljava svojstveni obrazac savijanja. Ovi domeni su osnovne jedinice od kojih se sastoje polipeptidi antitela. Aminoterminalni deo svakog lanca tipično uključuje varijabilni domen koji je odgovoran za prepoznavanje antigena. Karboksi-terminalni deo je evolutivno očuvaniji nego drugi kraj lanca i označen je kao "konstantni region" ili "C region". Humani laki lanci se uopšteno klasifikuju kao kapa i lambda laki lanci, i svaki od njih sadrži jedan varijabilni domen i jedan konstantni domen. Teški lanci su tipično klasifikovani kao mu, delta, gama, alfa, ili epsilon lanci, i oni definišu izotip antitela kao IgM, IgD, IgG, IgA, i IgE, redom. IgG ima nekoliko podtipova, uključujući, ali bez ograničenja, IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4. IgM podtipovi uključuju IgM, i IgM2. IgA podtipovi uključuju IgA1 i IgA2. Kod ljudi, izotipovi IgA i IgD sadrže četiri teška lanca i četiri laka lanca; izotipovi IgG i IgE sadrže dva teška lanca i dva laka lanca; i izotip IgM sadrži pet teških lanaca i pet lakih lanaca. C region teškog lanca tipično sadrži jedan ili više domena koji mogu da budu odgovorni za efektorsku funkciju. Broj domena konstantnog regiona teškog lanca će zavisiti od izotipa. Svaki od teških lanaca IgG, na primer, sadrži tri domena C regiona poznata kao CH1, CH2 i CH3. Antitela koja su obezbeđena mogu da budu bilo kog od ovih tipova i izotipova. U određenim primerima izvođenja, antitelo protiv CGRP R predstavlja podtip IgG1, IgG2, ili IgG4.
[0175] U lakim i teškim lancima pune dužine, varijabilni i konstantni regioni su spojeni pomoću "J" regiona od oko dvanaest ili više aminokiselina, sa teškim lancem koji takođe uključuje "D" region od oko deset dodatnih aminokiselina. Videti, npr., Fundamental Immunology, 2nd ed., Ch.7 (Paul, W., ed.) 1989, New York: Raven Press. Varijabilni regioni svakog para laki/teški lanac tipično obrazuju antigen-vezujuće mesto.
[0176] Jedan primer konstantnog domena teškog lanca IgG2 tipičnog monoklonskog antitela protiv CGRP R ima aminokiselinsku sekvencu:
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAP PVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQV YTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (poslednjih 326 ostataka sekvence prikazano je kao SEQ. ID NO:29).
[0177] Jedan primer konstantnog domena kapa lakog lanca tipičnog monoklonskog antitela protiv CGRP R ima aminokiselinsku sekvencu:
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(poslednjih 107 ostataka sekvence prikazano je kao SEQ ID NO:14).
[0178] Varijabilni regioni imunoglobulinskih lanaca uopšteno imaju istu opštu strukturu, koja sadrži relativno očuvane okvirne regione (FR) spojene pomoću tri hipervarijabilna regiona, češće nazvana "regioni za određivanje komplementnosti" ili CDR. Regioni CDR iz dva lanca svakog prethodno pomenutog para teški lanac/laki lanac, tipično su poravnati pomoću okvirnih regiona tako da obrazuju strukturu koja se specifično vezuje za specifični epitop na ciljnom proteinu (npr., CGRP R). Od N-terminalnog ka C-terminalnom kraju, varijabilni regioni prirodnog lakog i teškog lanca obično su poređani u skladu sa sledećim redosledom elemenata: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Razvijen je sistem numerisanja za dodeljivanje brojeva aminokiselinama koje zauzimaju određene položaje u svakom od ovih domena. Ovaj sistem numerisanja je definisan kod Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1987 i 1991, NIH, Bethesda, MD), ili Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342:878-883.
[0179] Različiti varijabilni regioni teškog lanca i lakog lanca koji su ovde obezbeđeni prikazani su u tabeli 3. Svaki od ovih varijabilnih regiona može da bude povezan sa gore pomenutim konstantnim regionima teškog i lakog lanca, tako da obrazuje potpuni teški i laki lanac antitela, redom. Dalje, svaka od tako dobijenih sekvenci teškog i lakog lanca može da bude kombinovana tako da obrazuje potpunu strukturu antitela. Jasno je da ovde obezbeđeni varijabilni regioni teškog lanca i lakog lanca mogu takođe da se spoje sa drugim konstantnim domenima koji imaju različite sekvence u odnosu na sekvence prethodno navedene kao primer.
[0180] Specifični primeri celokupne dužine nekih od lakih i teških lanaca antitela koji su ilustrovani, i njihove odgovarajuće aminokiselinske sekvence su prikazane u tabelama 2A i 2B. Tabela 2A prikazuje tipične sekvence lakog lanca, a tabela 2B prikazuje tipične sekvence teškog lanca.
[0181] Prve 22 aminokiseline svake od sekvenci lakog lanca u tabeli 2A, osim 32H7 i 32H7 CS, predstavljaju signalnu sekvencu. U slučaju 32H7 i 32H7 CS, signalna sekvenca predstavlja 20 aminokiselina. Slično, prve 22 aminokiseline svake od sekvenci teškog lanca u tabeli 2B predstavljaju signalnu sekvencu. Signalni peptidi mogu da budu izmenjeni u signalne peptide sa drugačijim sekvencama, npr., za optimalniju ekspresiju u određenim ćelijama-domaćinima. Podrazumeva se da pronalazak takođe uključuje antitela koja imaju sekvence lakog i/ili teškog lanca kao što je naznačeno u tabelama 2A i 2B, ali sa drugim signalnim sekvencama.
[0182] Ponovo, svaki od primera teških lanaca (H1, H2, H3 itd.) navedenih u tabeli 2B može da se kombinuje sa bilo kojim primerom lakih lanaca prikazanih u tabeli 2A da bi se obrazovalo antitelo. Primeri takvih kombinacija uključuju H1 kombinovan sa bilo kojim od L1 do L17; H2 kombinovan sa bilo kojim od L1 do L17; H3 kombinovan sa bilo kojim od L1 do L17, i tako dalje. U nekim slučajevima, antitela uključuju bar jedan teški lanac i jedan laki lanac od onih navedenih u tabelama 2A i 2B. U nekim slučajevima, antitela sadrže dva različita teška lanca i dva različita laka lanca navedena u tabelama 2A i 2B. U drugim slučajevima, antitela sadrže dva ista laka lanca i dva ista teška lanca. Kao primer, antitelo ili imunološki funkcionalni fragment može da uključuje dva H1 teška lanca i dva L1 laka lanca, ili dva H2 teška lanca i dva L2 laka lanca, ili dva H3 teška lanca i dva L3 laka lanca i druge slične kombinacije parova lakih lanaca i parova teških lanaca kao što je navedeno u tabelama 2A i 2B.
[0183] Drugi antigen-vezujući proteini koji su ilustrovani su varijante antitela obrazovanih kombinovanjem teških i lakih lanaca prikazanih u tabelama 2A i 2B i sadrže lake i/ili teške lance od kojih svaki ima bar 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ili 99% identičnosti sa aminokiselinskim sekvencama ovih lanaca. U nekim slučajevima, takva antitela uključuju bar jedan teški lanac i jedan laki lanac, dok u drugim slučajevima varijante oblika sadrže dva identična laka lanca i dva identična teška lanca.
Varijabilni domeni antitela
[0184] Takođe su ilustrovani antigen-vezujući proteini koji sadrže varijabilni region teškog lanca antitela odabran iz grupe koja se sastoji od VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, i VH13, i/ili varijabilni region lakog lanca antitela odabran iz grupe koja se sastoji od VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, i VL17, kao što je prikazano u tabeli 3 ispod, i imunološki funkcionalne fragmente, derivate, muteine i varijante ovih varijabilnih regiona lakog lanca i teškog lanca.
[0185] Poravnanja sekvenci različitih varijabilnih regiona teškog i lakog lanca, redom, obezbeđena su na sl.1A i 1B.
[0186] Antigen-vezujući proteini ovog tipa mogu uopšteno da se označe formulom " VHx/ VLy," gde "x" odgovara broju varijabilnih regiona teškog lanca i "y" odgovara broju varijabilnih regiona lakog lanca.
Tabela 3: Primeri aminokiselinskih sekvenci VH i VL lanaca
[0187] Svaki od varijabilnih regiona teškog lanca navedenih u tabeli 3 može da bude kombinovan sa bilo kojim od varijabilnih regiona lakog lanca prikazanih u tabeli 3 da bi se obrazovao antigenvezujući protein. Primeri takvih kombinacija uključuju VH1 kombinovan sa bilo kojim od VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, ili VL17; VH2 kombinovan sa bilo kojim od VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, ili VL17; VH3 kombinovan sa bilo kojim od VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, ili VL17; i tako dalje.
[0188] U nekim slučajevima, antigen-vezujući protein uključuje bar jedan varijabilni region teškog lanca i/ili jedan varijabilni region lakog lanca od ovih navedenih u tabeli 3. U nekim slučajevima, antigen-vezujući protein uključuje najmanje dva različita varijabilna regiona teškog lanca i/ili varijabilna regiona lakog lanca od onih koji su navedeni u tabeli 3. Primer takvog antigenvezujućeg proteina sadrži (a) jedan VH1, i (b) jedan od VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, ili VH13. Drugi primer sadrži (a) jedan VH2, i (b) jedan od VH1, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, ili VH13. Još jedan primer sadrži (a) jedan VH3, i (b) jedan od VH1, VH2, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, ili VH13, itd. Još jedan primer takvog antigen-vezujućeg proteina sadrži (a) jedan VL1, i (b) jedan od VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, ili VL17, VL18, VL19, VL20, ili VL21. Još jedan primer takvog antigen-vezujućeg proteina sadrži (a) jedan VL2, i (b) jedan od VL1, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, VL17, VL18, VL19, VL20, ili VL21. Još jedan primer takvog antigen-vezujućeg proteina sadrži (a) jedan VL3, i (b) jedan od VL1, VL2, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, VL17, VL18, VL19, VL20, ili VL21, itd.
[0189] Različite kombinacije varijabilnih regiona teškog lanca mogu da budu kombinovane sa bilo kojom od različitih kombinacija varijabilnih regiona lakog lanca kao što je očigledno stručnjaku u oblasti.
[0190] U drugim slučajevima, antigen-vezujući protein sadrži dva identična varijabilna regiona lakog lanca i/ili dva identična varijabilna regiona teškog lanca. Na primer, antigen-vezujući protein može da bude antitelo ili imunološki funkcionalni fragment koji uključuje dva varijabilna regiona lakog lanca i dva varijabilna regiona teškog lanca u kombinacijama parova varijabilnih regiona lakog lanca i parova varijabilnih regiona teškog lanca kao što je navedeno u tabeli 3.
[0191] Neki antigen-vezujući proteini koji su ilustrovani sadrže varijabilni domen teškog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina koja se razlikuje od sekvence varijabilnog domena teškog lanca odabrane od VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, i VH13 u samo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 aminokiselinskih ostataka, gde je svaka takva razlika u sekvenci nezavisno delecija, insercija ili supstitucija jedne aminokiseline, sa delecijama, insercijama i/ili supstitucijama koje rezultuju u ne više od 15 aminokiselinskih izmena u odnosu na gore navedene sekvence varijabilnog domena. Varijabilni region teškog lanca u nekim antigenvezujućim proteinima sadrži sekvencu aminokiselina koja ima najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ili 99% identičnosti sekvence sa aminokiselinskim sekvencama varijabilnog regiona teškog lanca sekvence VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, i VH13.
[0192] Određeni antigen-vezujući proteini sadrže varijabilni domen lakog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina koja se razlikuje od sekvence varijabilnog domena lakog lanca odabrane od VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, ili VL17 u samo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 aminokiselinskih ostataka, gde je svaka takva razlika u sekvenci nezavisno delecija, insercija ili supstitucija jedne aminokiseline, sa delecijama, insercijama i/ili supstitucijama koje rezultuju u ne više od 15 aminokiselinskih izmena u odnosu na gore navedene sekvence varijabilnog domena. Varijabilni region lakog lanca u nekim antigen-vezujućim proteinima sadrži sekvencu aminokiselina koja ima najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ili 99% identičnosti sekvence sa aminokiselinskim sekvencama varijabilnog regiona lakog lanca sekvence VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, ili VL17.
[0193] U dodatnim slučajevima, antigen-vezujući proteini sadrže sledeće parove varijabilnih domena lakog lanca i teškog lanca: VL1 sa VH1, VL2 sa VH2, VL3 sa VH3, VL4 sa VH4, VL5 sa VH5, VL6 sa VH1, VL7 sa VH6, VL8 sa VH5, VL9 sa VH1, VL10 sa VH7, VL11 sa VH8, VL12 sa VH9, VL12 sa VH10, VL13 sa VH5, VL14 sa VH11, VL15 sa VH12, VL16 sa VH13, i VL17 sa VH13. U nekim slučajevima, antigen-vezujući proteini u prethodno navedenim parovima mogu da sadrže aminokiselinske sekvence koje imaju 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ili 99% identičnosti sekvence sa navedenim varijabilnim domenima.
[0194] Drugi antigen-vezujući proteini, npr., antitela ili imunološki funkcionalni fragmenti, uključuju varijantne oblike varijante teškog lanca i varijante lakog lanca kao što je upravo opisano.
CDR regioni
[0195] Ovde opisani antigen-vezujući proteini su polipeptidi u kojima je nakalemljen, ubačen i/ili spojen jedan ili više CDR regiona. Antigen-vezujući protein može da ima 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 CDR regiona. Antigen-vezujući protein tako može da ima, na primer, jedan teški lanac CDR1 ("CDRH1"), i/ili jedan teški lanac CDR2 ("CDRH2"), i/ili jedan teški lanac CDR3 ("CDRH3"), i/ili jedan laki lanac CDR1 ("CDRL1"), i/ili jedan laki lanac CDR2 ("CDRL2"), i/ili jedan laki lanac CDR3 ("CDRL3"). Neki antigen-vezujući proteini uključuju i CDRH3 i CDRL3. Specifični CDR regioni teškog i lakog lanca su identifikovani u tabelama 4A i 4B, redom.
[0196] Regioni za određivanje komplementarnosti (CDR) i okvirni regioni (FR) datog antitela mogu da budu identifikovani korišćenjem sistema opisanog kod Kabat et al. u Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242, 1991. Izvesna antitela koja su ovde opisana sadrže jednu ili više aminokiselinskih sekvenci koje su identične ili su suštinski identične sekvence sa aminokiselinskim sekvencama jednog ili više CDR regiona prikazanih u tabeli 4A (CDRH) i tabeli 4B (CDRL).
Tabela 4A: Primeri aminokiselinskih sekvenci CDR teško lanca
Tabela 4B: Primeri aminokiselinskih sekvenci CDR lakog lanca
[0197] Struktura i svojstva CDR regiona u prirodnom antitelu su opisana, supra. Ukratko, u uobičajenom antitelu, CDR regioni su ugrađeni u okvirne regione u varijabilnom regionu teškog i lakog lanca gde čine regione odgovorne za vezivanje za antigen i prepoznavanje antigena. Varijabilni region sadrži najmanje tri CDR regiona teškog ili lakog lanca, videti, supra (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD; videti takođe Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-883), u okvirnom regionu (označeni okvirni regioni 1-4, FR1, FR2, FR3, i FR4, prema Kabat et al., 1991, supra; videti takođe Chothia and Lesk, 1987, supra). Ovde obezbeđeni CDR regioni, međutim, ne samo da mogu da se upotrebe za definisanje antigenvezujućeg domena uobičajene strukture antitela, već mogu da budu ugrađeni u brojne druge polipeptidne strukture, kao što je ovde opisano.
[0198] U jednom aspektu obezbeđeni CDR regioni su (a) CDRH odabran iz grupe koja se sastoji od (i) CDRH1 odabranog iz grupe koja se sastoji od sekvenci označenih kao SEQ ID NO:73, 76, 79, 82, 85, 88, 92, 97, i 100; (ii) CDRH2 odabranog iz grupe koja se sastoji od sekvenci označenih kao SEQ ID NO:74, 77, 80, 83, 86, 89, 91, 93, 95, 98, 101, i 129; (iii) CDRH3 odabranog iz grupe koja se sastoji od sekvenci označenih kao SEQ ID NO:75, 78, 81, 84, 87, 90, 96, 99, 102, i 123; i (iv) CDRH iz (i), (ii) i (iii) koji sadrži jednu ili više, npr., jednu, dve, tri, četiri ili više aminokiselinskih supstitucija (npr., konzervativnih aminokiselinskih supstitucija), delecija ili insercija ne više od pet, četiri, tri, dve, ili jedne aminokiseline; (B) CDRL odabran iz grupe koja se sastoji od (i) CDRL1 odabranog iz grupe koja se sastoji od sekvenci označenih kao SEQ ID NO:42, 45, 48, 51, 54, 57, 62, 65, 66, i 69; (ii) CDRL2 odabranog iz grupe koja se sastoji od sekvenci označenih kao SEQ ID NO:43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 63, 67, i 70; (iii) CDRL3 odabranog iz grupe koja se sastoji od sekvenci označenih kao SEQ ID NO:44, 47, 50, 53, 56, 59, 64, 68, 71, i 72; i (iv) CDRL iz (i), (ii) i (iii) koji sadrži jednu ili više, npr., jednu, dve, tri, četiri ili više aminokiselinskih supstitucija (npr., konzervativnih aminokiselinskih supstitucija), delecija ili insercija ne više od pet, četiri, tri, dve, ili jedne aminokiseline.
[0199] U drugom aspektu antigen-vezujući protein uključuje 1, 2, 3,4, 5, ili 6 varijanti oblika CDR regiona navedenih u tabelama 4A i 4B, od kojih svaki ima najmanje 80%, 85%, 90% ili 95% identičnosti sekvence sa CDR sekvencom navedenom u tabelama 4A i 4B. Neki antigen-vezujući proteini uključuju 1, 2, 3, 4, 5, ili 6 CDR regiona navedenih u tabelama 4A i 4B, od kojih se svaki razlikuje u ne više od 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselina od CDR regiona navedenih u ovim tabelama.
[0200] Ovde obezbeđeni CDR regioni uključuju konsenzus sekvence izvedene iz grupa srodnih monoklonskih antitela. Kao što je ovde opisano, "konsenzus sekvenca" se odnosi na aminokiselinske sekvence koje imaju očuvane aminokiseline zajedničke za brojne sekvence i varijabilne aminokiseline koje variraju u datim aminokiselinskim sekvencama. Obezbeđene CDR konsenzus sekvence uključuju CDR regione koji odgovaraju svakom od CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 i CDRL3 regiona.
[0201] Antigen-vezujući protein može da uključuje sledeće kombinacije CDRL1, CDRL2 i CDRL3: SEQ ID NOs: 42, 43, i 44; SEQ ID NOs: 45, 46, i 47; SEQ ID NOs: 48, 49, i 50; SEQ ID NOs: 51, 52, i 53; SEQ ID NOs: 54, 55, i 56; SEQ ID NOs: 57, 58, i 59; SEQ ID NOs: 60, 55, i 56; SEQ ID NOs: 45, 61, i 47; SEQ ID NOs: 62, 63, i 64; SEQ ID NOs: 65, 55, i 56; SEQ ID NOs: 66, 67, i 68; SEQ ID NOs: 69, 70, i 71; i SEQ ID NOs: 69, 70, i 72.
[0202] Antigen-vezujući protein može da uključuje sledeće kombinacije CDRH1, CDRH2 i CDRH3: SEQ ID NOs: 73, 74, i 75; SEQ ID NOs: 76, 77, i 78; SEQ ID NOs: 79, 80, i 81; SEQ ID NOs: 82, 83, i 84; SEQ ID NOs: 85, 86, i 87; SEQ ID NOs: 88, 89, i 90; SEQ ID NOs: 76, 91, i 78; SEQ ID NOs: 92, 93, i 94; SEQ ID NOs: 76, 95, i 78; SEQ ID NOs: 73, 74, i 96; SEQ ID NOs: 97, 98, i 99; i SEQ ID NOs: 100, 101, i 102.
[0203] Antigen-vezujući protein može da uključuje sledeće kombinacije CDRL1, CDRL2 i CDRL3 sa CDRH1, CDRH2 i CDRH3: SEQ ID NOs: 42, 43, i 44 sa SEQ ID NOs: 73, 74, i 75; SEQ ID NOs: 45,46, i 47 sa SEQ ID NOs: 76, 77, i 78; SEQ ID NOs: 48,49, i 50 sa SEQ ID NOs: 79, 80, i 81; SEQ ID NOs: 51, 52, i 53 sa SEQ ID NOs: 82, 83, i 84; SEQ ID NOs: 54, 55, i 56 sa SEQ ID NOs: 85, 86, i 87; SEQ ID NOs: 57, 58, i 59 sa SEQ ID NOs: 88, 89, i 90; SEQ ID NOs: 60, 55, i 56 sa SEQ ID NOs: 85, 86, i 87; SEQ ID NOs: 45, 61, i 47 sa SEQ ID NOs: 76, 91, i 78; SEQ ID NOs: 62, 63, i 64 sa SEQ ID NOs: 92,93, i 94; SEQ ID NOs: 45, 61, i 47 sa SEQ ID NOs: 76, 95, i 78; SEQ ID NOs: 65, 55, i 56 sa SEQ ID NOs: 85, 86, i 87; SEQ ID NOs: 42, 43, i 44 sa SEQ ID NOs: 73, 74, i 96; SEQ ID NOs: 66, 67, i 68 sa SEQ ID NOs: 97, 98, i 99; SEQ ID NOs: 69, 70, i 71 sa SEQ ID NOs: 100, 101, i 102; i SEQ ID NOs: 69, 70, i 72 sa SEQ ID NOs: 100, 101, i 102.
[0204] Konsenzus sekvence su određene korišćenjem standardnih filogenetskih ispitivanja CDR regiona koji odgovaraju VHi VLanti-CGRP R antitela. Konsenzus sekvence su određene zadržavanjem susednih CDR regiona u okviru iste sekvence koja odgovara VHili VL.
[0205] Kao što je prikazano na slikama 3A, 3B, 4, 5A, 5B, 5C, 5D i 5E, ispitivanje linije različitih antigen-vezujućih proteina koji su ovde dati je rezultovalo sa grupama srodnih sekvenci, označenih kao grupe CDR lakog lanca K1, K2, K3, i K4 (sl.3A i 3B), grupe CDR lakog lanca L1, L2, L3, i L4 (sl.4), i grupe CDR teškog lanca HC1 (sl.5A), HC2 (sl.5B), HC3 (sl.5C), HC4 (sl.5C), HC5 (sl. 5D) i HC6 (sl.5E). Neke od prethodnih grupa su korišćene za obrazovanje dodatnih konsenzus sekvenci, kao što je pokazano na sl. 3A, 3B, 4, i 5F, da bi se dobile grupe CDR lakog lanca K1,4 (sl. 3A), K2,3 (sl.3B), L1,2,3 (sl.4), i LA11 (sl. 4), i grupe CDR teškog lanca HCA i HCB (sl.
5F).
[0206] Konsenzus sekvence različitih grupa CDR regiona su obezbeđene u nastavku:
Konsenzus sekvenca K1
[0207] CDR1 RASQGIRX1DLG (SEQ ID NO:103), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od N i K.
[0208] CDR2 X1ASSLQS (SEQ ID NO:104), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od A i G.
[0209] CDR3 LQYNX1X2PWT (SEQ ID NO: 105), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od I i S, i X2je odabran iz grupe koja se sastoji od Y i F.
Konsenzus sekvenca K4
[0210] CDR3 QQYGNSLX1R (SEQ ID NO:106), gde je X1je odabran iz grupe koja se sastoji od S i C.
Konsenzus sekvenca K1,4
[0211] CDR1 RASQX1X2X3X4GX5LX6(SEQ ID NO:107), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od S i G, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od V i I, X3je odabran iz grupe koja se sastoji od S i R, X4je odabran iz grupe koja se sastoji od S, N i K, X5je odabran iz grupe koja se sastoji od Y i D, i X6je odabran iz grupe koja se sastoji od T i G.
[0212] CDR2 X1ASSX2X3X4(SEQ ID NO:108), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od G i A, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od R i L, X3je odabran iz grupe koja se sastoji od A i Q, i X4je odabran iz grupe koja se sastoji od T i S.
[0213] CDR3 X1QYX2X3X4X5X6X7(SEQ ID NO:109), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od Q i L, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od G i N, X3je odabran iz grupe koja se sastoji od N i T, X4je odabran iz grupe koja se sastoji od S, Y i F, X5je odabran iz grupe koja se sastoji od L i P, X6je odabran iz grupe koja se sastoji od C, W i S, i X7je odabran iz grupe koja se sastoji od R i T.
Konsenzus sekvenca K3
[0214] CDR1 KSSQSLLHSX1GX2X3YLY (SEQ ID NO:110), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od D i A, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od R i K, i X3je odabran iz grupe koja se sastoji od N i T.
Konsenzus sekvenca K2,3
[0215] CDR1 X1SSQSLLHSX2GX3X4YLX5(SEQ ID NO:111), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od R i K, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od F, D i A, X3je odabran iz grupe koja se sastoji od Y, R i K, X4je odabran iz grupe koja se sastoji od N i T, i X5je odabran iz grupe koja se sastoji od D i Y.
[0216] CDR2 X1X2SNRX3S (SEQ ID NO:112), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od L i E, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od G i V, i X3je odabran iz grupe koja se sastoji od A i F.
[0217] CDR3 MQX1X2X3X4PX5T (SEQ ID NO:113), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od A i S, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od L i F, X3je odabran iz grupe koja se sastoji od Q i P, X4je odabran iz grupe koja se sastoji od T i L, i X5je odabran iz grupe koja se sastoji od F i L.
Konsenzus sekvenca Lm3
[0218] CDR2 RX1NQRPS (SEQ ID NO:114), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od N i S.
Konsenzus sekvenca Lm1,2,3
[0219] CDR1 SGSSSNIGX1NX2VX3(SEQ ID NO:115), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od N i S, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od Y i T, i X3je odabran iz grupe koja se sastoji od S, N i Y.
[0220] CDR2 X1X2NX3RPS (SEQ ID NO:116), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od D, T i R, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od N i S, i X3je odabran iz grupe koja se sastoji od K i Q.
[0221] CDR3 X1X2X3DX4X5LX6X7VV (SEQ ID NO:117), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od G i A, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od T i A, X3je odabran iz grupe koja se sastoji od W i R, X4je odabran iz grupe koja se sastoji od S i D, X5je odabran iz grupe koja se sastoji od R i S, X6je odabran iz grupe koja se sastoji od S i N, i X7je odabran iz grupe koja se sastoji od A i G.
Konsenzus sekvenca LA11
[0222] CDR1 X1GX2X3SX4X5X6X7X8X9X10X11(SEQ ID NO:118), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od S i Q, X2je prisutan ili odsutan, a ako je prisutan predstavlja S, X3je odabran iz grupe koja se sastoji od S i D, X4je prisutan ili odsutan, a ako je prisutan predstavlja N, X5je odabran iz grupe koja se sastoji od I i L, X6je odabran iz grupe koja se sastoji od G i R, X7je odabran iz grupe koja se sastoji od N i S, X8je odabran iz grupe koja se sastoji od N i F, X9je odabran iz grupe koja se sastoji od Y i T, X10je odabran iz grupe koja se sastoji od V i A, i X11je odabran iz grupe koja se sastoji od S, N i Y.
[0223] CDR2 X1X2NX3RPS (SEQ ID NO:119), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od D, G, T, i R, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od N, K i S, i X3je odabran iz grupe koja se sastoji od K, N i Q.
[0224] CDR3 X1X2X3DX4X5X6X7X8X9V (SEQ ID NO:120), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od G, N i A, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od T, S i A, X3je odabran iz grupe koja se sastoji od W i R, X4je odabran iz grupe koja se sastoji od S i D, X5je odabran iz grupe koja se sastoji od R i S, X6je odabran iz grupe koja se sastoji od L i V, X7je odabran iz grupe koja se sastoji od S, Y i N, X8je odabran iz grupe koja se sastoji od A, H i G, i X9je odabran iz grupe koja se sastoji od V i L.
Konsenzus sekvenca HC1
[0225] CDR1 X1YYMX2(SEQ ID NO:121), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od G i D, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od H i Y.
[0226] CDR2 WIX1PNSGGTNYAQKFQG (SEQ ID NO:122), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od N i S.
[0227] CDR3 X1X2X3SX4X5X6X7X8GX9X10X11X12YYX13GMDV (SEQ ID NO:123), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od D i G, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od Q i G, X3je odabran iz grupe koja se sastoji od M i Y, X4je odabran iz grupe koja se sastoji od I i G, X5je odabran iz grupe koja se sastoji od I i Y, X6je odabran iz grupe koja se sastoji od M i A, X7je prisutan ili odsutan, a ako je prisutan predstavlja L, X8je prisutan ili odsutan, a ako je prisutan predstavlja R, X9je odabran iz grupe koja se sastoji od V i L, X10je odabran iz grupe koja se sastoji od F i Y, X11je odabran iz grupe koja se sastoji od P i S, X12je odabran iz grupe koja se sastoji od P i H, i X13je prisutan ili odsutan, a ako je prisutan predstavlja Y.
Konsenzus sekvenca HC2
[0228] CDR2 RIKSX1TDGGTTDYX2APVKG (SEQ ID NO:124), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od K i T, i X2je odabran iz grupe koja se sastoji od T i A.
Konsenzus sekvenca HC3
[0229] CDR1 X1YX2MX3(SEQ ID NO:125), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od T i S, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od S i A, i X3je odabran iz grupe koja se sastoji od N i S.
[0230] CDR2 X1ISX2SX3X4X5X6YYADSVKG (SEQ ID NO:126), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od S i A, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od S i G, X3je odabran iz grupe koja se sastoji od S i G, X4je odabran iz grupe koja se sastoji od S i G, X5je odabran iz grupe koja se sastoji od Y i R, i X6je odabran iz grupe koja se sastoji od R i T.
[0231] CDR3 X1X2X3X4X5X6X7PYSX8X9WYDYYYGMDV (SEQ ID NO:127), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od E i D, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od G i Q, X3je odabran iz grupe koja se sastoji od V i R, X4je odabran iz grupe koja se sastoji od S i E, X5je odabran iz grupe koja se sastoji od G i V, X6je odabran iz grupe koja se sastoji od S i G, X7je prisutan ili odsutan, a ako je prisutan predstavlja S, X8je odabran iz grupe koja se sastoji od I i S, i X9je odabran iz grupe koja se sastoji od S i G.
Konsenzus sekvenca HC4
[0232] CDR1 SX1GMH (SEQ ID NO:128), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od F i Y.
[0233] CDR2 VISX1DGSX2KYX3X4DSVKG (SEQ ID NO:129), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od F i Y, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od I i H, X3je odabran iz grupe koja se sastoji od S i Y, i X4je odabran iz grupe koja se sastoji od V i A.
[0234] CDR3 X1RX2X3X4X5X6SX7X8YYX9X10X11YYGX12X13V (SEQ ID NO:130), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od D i E, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od L i K, X3je odabran iz grupe koja se sastoji od N i R, X4je odabran iz grupe koja se sastoji od Y i V, X5je odabran iz grupe koja se sastoji od Y i T, X6je odabran iz grupe koja se sastoji od D i M, X7je odabran iz grupe koja se sastoji od S i T, X8je odabran iz grupe koja se sastoji od G i L, X9je odabran iz grupe koja se sastoji od H i Y, X10je prisutan ili odsutan, a ako je prisutan predstavlja Y, X11je odabran iz grupe koja se sastoji od K i F, X12je odabran iz grupe koja se sastoji od M i L, i X13je odabran iz grupe koja se sastoji od A i D.
Konsenzus sekvenca HCA
[0235] CDR1 X1X2X3MX4(SEQ ID NO:131), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od N i S, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od A, Y i F, X3je odabran iz grupe koja se sastoji od W, A i G, i X4je odabran iz grupe koja se sastoji od S i H.
[0236] CDR2 X1IX2X3X4X5X6GX7X8X9X10X11X12X13X14VKG (SEQ ID NO:132), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od R, A i V, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od K, S i W, X3je odabran iz grupe koja se sastoji od S, G, F i Y, X4je prisutan ili odsutan, a ako je prisutan, odabran je iz grupe koja se sastoji od K i T, X5je prisutan ili odsutan, a ako je prisutan predstavlja T, X6je odabran iz grupe koja se sastoji od D i S, X7je odabran iz grupe koja se sastoji od G i S, X8je odabran iz grupe koja se sastoji od T, R, I, N i H, X9je odabran iz grupe koja se sastoji od T i K, X10je odabran iz grupe koja se sastoji od D i Y, X11je odabran iz grupe koja se sastoji od Y i S, X12je odabran iz grupe koja se sastoji od T, A i V, X13je odabran iz grupe koja se sastoji od A i D, i X14je odabran iz grupe koja se sastoji od P i S.
[0237] CDR3 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17GX18X19V (SEQ ID NO:133), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od D, A i E, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od R, Q i G, X3je odabran iz grupe koja se sastoji od T, R, L, G i K, X4je odabran iz grupe koja se sastoji od G, E, N, I i R, X5je odabran iz grupe koja se sastoji od Y, V i A, X6je odabran iz grupe koja se sastoji od S, G, Y, A i T, X7je odabran iz grupe koja se sastoji od I, P, D, A i M, X8je prisutan ili odsutan, a ako je prisutan, odabran je iz grupe koja se sastoji od S i Y, X9je prisutan ili odsutan, a ako je prisutan, odabran je iz grupe koja se sastoji od W, S i T, X10je odabran iz grupe koja se sastoji od S, G i L, X11je odabran iz grupe koja se sastoji od S, G, L i Y, X12je prisutan ili odsutan, a ako je prisutan, odabran je iz grupe koja se sastoji od W i Y, X13je odabran iz grupe koja se sastoji od Y i H, X14je prisutan ili odsutan, a ako je prisutan, odabran je iz grupe koja se sastoji od Y i D, X15je odabran iz grupe koja se sastoji od Y, K i F, X16je prisutan ili odsutan, a ako je prisutan predstavlja Y, X17je prisutan ili odsutan, a ako je prisutan predstavlja Y, X18je odabran iz grupe koja se sastoji od M i L, i X19je odabran iz grupe koja se sastoji od D i A.
Konsenzus sekvenca HCB
[0238] CDR1 X1X2X3X4X5(SEQ ID NO:134), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od N, G, D, S i A, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od A, F i Y, X3je odabran iz grupe koja se sastoji od W, Y, A i G, X4je odabran iz grupe koja se sastoji od M i L, i X5je odabran iz grupe koja se sastoji od S i H.
[0239] CDR2 X1IX2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17G (SEQ ID NO:135), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od R, W, A, V, S i F, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od K, N, S, W i R, X3je odabran iz grupe koja se sastoji od S, P, G, F i Y, X4je prisutan ili odsutan, a ako je prisutan, odabran je iz grupe koja se sastoji od K, T i R, X5je prisutan ili odsutan, a ako je prisutan, odabran je iz grupe koja se sastoji od T i A, X6je odabran iz grupe koja se sastoji od D, N, H, S i Y, X7je odabran iz grupe koja se sastoji od G i S, X8je odabran iz grupe koja se sastoji od G i S, X9je odabran iz grupe koja se sastoji od T, G, R, I, N, H i Y, X10je odabran iz grupe koja se sastoji od T, K, R i P, X11je odabran iz grupe koja se sastoji od D, N, Y i E, X12je odabran iz grupe koja se sastoji od Y i S, X13je odabran iz grupe koja se sastoji od T, A i V, X14je odabran iz grupe koja se sastoji od A, Q i D, X15je odabran iz grupe koja se sastoji od P, K i S, X16je odabran iz grupe koja se sastoji od V i F, i X17je odabran iz grupe koja se sastoji od K i Q.
[0240] CDR3 X1X2X3X4X5SX6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16GX17X18V (SEQ ID NO:136), gde je X1odabran iz grupe koja se sastoji od D, G, A i E, X2je odabran iz grupe koja se sastoji od R, G i Q, X3je odabran iz grupe koja se sastoji od T, M, Y, R, L, G i K, X4je odabran iz grupe koja se sastoji od G, S, E, N, I i R, X5je odabran iz grupe koja se sastoji od Y, I, G, V i A, X6je odabran iz grupe koja se sastoji od S, I, Y, G, A i T, X7je odabran iz grupe koja se sastoji od I, M, A, P i D, X8je prisutan ili odsutan, a ako je prisutan, odabran je iz grupe koja se sastoji od S, L i Y, X9je prisutan ili odsutan, a ako je prisutan, odabran je iz grupe koja se sastoji od W, R, S i T, X10je odabran iz grupe koja se sastoji od S, G i L, X11je odabran iz grupe koja se sastoji od S, V, L, G i Y, X12je prisutan ili odsutan, a ako je prisutan, odabran je iz grupe koja se sastoji od F, Y i W, X13je odabran iz grupe koja se sastoji od Y, P, S i H, X14je prisutan ili odsutan, a ako je prisutan, odabran je iz grupe koja se sastoji od Y, P, D i H, X15je odabran iz grupe koja se sastoji od Y, K i F, X16je prisutan ili odsutan, a ako je prisutan predstavlja Y, X17je prisutan ili odsutan, a ako je prisutan predstavlja Y, i X18je odabran iz grupe koja se sastoji od M i L.
[0241] U nekim slučajevima antigen-vezujući protein sadrži bar jedan CDR1, CDR2, ili CDR3 teškog lanca, koji ima jednu od gore navedenih konsenzus sekvenci. U nekim slučajevima antigenvezujući protein sadrži bar jedan CDR1, CDR2, ili CDR3 lakog lanca, koji ima jednu od gore navedenih konsenzus sekvenci. U drugim slučajevima, antigen-vezujući protein sadrži najmanje dva CDR regiona teškog lanca prema gore navedenim konsenzus sekvencama, i/ili najmanje dva CDR regiona lakog lanca prema gore navedenim konsenzus sekvencama. U drugim slučajevima, antigen-vezujući protein sadrži najmanje tri CDR regiona teškog lanca prema gore navedenim konsenzus sekvencama, i/ili najmanje tri CDR regiona lakog lanca prema gore navedenim konsenzus sekvencama.
Primeri antigen-vezujućih proteina
[0242] Ilustrovano je monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, kao što se zahteva, koji se vezuje za CGRP R koji sadrži (A) jedan ili više regiona za određivanje komplementarnosti (CDRH) teškog lanca odabranih iz grupe koja se sastoji od: (i) CDRH1 odabranog iz grupe koja se sastoji od sekvenci označenih kao SEQ ID NO:73, 76, 79, 82, 85, 88, 92, 97, i 100; (ii) CDRH2 odabranog iz grupe koja se sastoji od sekvenci označenih kao SEQ ID NO:74, 77, 80, 83, 86, 89, 91, 93, 95, 98, 101, i 129; (iii) CDRH3 odabranog iz grupe koja se sastoji od sekvenci označenih kao SEQ ID NO:75, 78, 81, 84, 87, 90, 96, 99, 102, i 123; i (iv) CDRH iz (i), (ii) i (iii) koji sadrži jednu ili više, npr., jednu, dve, tri, četiri ili više aminokiselinskih supstitucija, delecija ili insercija ne više od pet, četiri, tri, četiri, dve, ili jedne aminokiseline; (B) jedan ili više regiona za određivanje komplementarnosti (CDRL) lakog lanca odabranIH iz grupe koja se sastoji od: (i) CDRL1 odabranog iz grupe koja se sastoji od sekvenci označenih kao SEQ ID NO:42, 45, 48, 51, 54, 57, 62, 65, 66, i 69; (ii) CDRL2 odabranog iz grupe koja se sastoji od sekvenci označenih kao SEQ ID NO:43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 63, 67, i 70; (iii) CDRL3 odabranog iz grupe koja se sastoji od sekvenci označenih kao SEQ ID NO:44, 47, 50, 53, 56, 59, 64, 68, 71, i 72; i (iv) CDRL iz (i), (ii) i (iii) koji sadrži jednu ili više, npr., jednu, dve, tri, četiri ili više aminokiselinskih supstitucija, delecija ili insercija ne više od pet, četiri, tri, četiri, dve, ili jedne aminokiseline; ili (C) jedan ili više CDRH regiona teškog lanca iz (A) i jedan ili više CDRL regiona lakog lanca iz (B).
[0243] Monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, kao što se zahteva, može da sadrži (A) CDRH odabran iz grupe koja se sastoji od (i) CDRH1 odabranog iz grupe koja se sastoji od sekvenci označenih kao SEQ ID NO:73, 76, 79, 82, 85, 88, 92, 97, i 100; (ii) CDRH2 odabranog iz grupe koja se sastoji od sekvenci označenih kao SEQ ID NO:74, 77, 80, 83, 86, 89, 91, 93, 95, 98, 101, i 129; i (iii) CDRH3 odabranog iz grupe koja se sastoji od sekvenci označenih kao SEQ ID NO:75, 78, 81, 84, 87, 90, 96, 99, 102, i 123; (B) CDRL odabran iz grupe koja se sastoji od (i) CDRL1 odabranog iz grupe koja se sastoji od sekvenci označenih kao SEQ ID NO:42, 45, 48, 51, 54, 57, 62, 65, 66, i 69; (ii) CDRL2 odabranog iz grupe koja se sastoji od sekvenci označenih kao SEQ ID NO:43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 63, 67, i 70; i (iii) CDRL3 odabranog iz grupe koja se sastoji od sekvenci označenih kao SEQ ID NO:44, 47, 50, 53, 56, 59, 64, 68, 71, i 72; ili (C) jedan ili više CDRH regiona teškog lanca iz (A) i jedan ili više CDRL rediona lakog lanca iz (B). U jednom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, kao što se zahteva, može da uključuje (A) CDRH1 sekvence SEQ ID NO:73, 76, 79, 82, 85, 88, 92, 97, i 100, CDRH2 sekvence SEQ ID NO:74, 77, 80, 83, 86, 89, 91, 93, 95, 98, 101, i 129, i CDRH3 sekvence SEQ ID NO:75, 78, 81, 84, 87, 90, 96, 99, 102, i 123, i (B) CDRL1 sekvence SEQ ID NO:42, 45, 48, 51, 54, 57, 62, 65, 66, i 69, CDRL2 sekvence SEQ ID NO:43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 63, 67, i 70, i CDRL3 sekvence SEQ ID NO:44, 47, 50, 53, 56, 59, 64, 68, 71, i 72.
[0244] U drugoj realizaciji varijabilna regija teškog lanca (VH) ima najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ili 99% identičnosti sekvence sa sekvencom aminokiseline odabranom iz grupe koja sadrži SEQ ID NO: 158-170, i/ili VLima najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ili 99% identičnosti sekvence sa sekvencom aminokiseline odabranom iz grupe koja sadrži SEQ ID NO: 137-153. U sledećoj realizaciji, VHje izabran iz grupe koja sadrži SEQ ID NO: 158-170, i/ili VL je izabran iz grupe koja sadrži SEQ ID NO: 137-153.
[0245] Takođe je obezbeđeno monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, kao što se zahteva koji se specifično vezuje za epitop formiran od aminokiselinskih ostataka i iz komponente CRLR i komponente RAMP1 iz CGRP R.
[0246] U još jednom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji se veže antigen, kao što se zahteva, kako je gore opisano, sadrži prvu sekvencu aminokiseline koja sadrži najmanje jednu od ovde opisanih CDRH konsenzus sekvenci i drugu sekvencu amino kiselina koja sadrži najmanje jednu od ovde opisanih CDRL konsenzus sekvenci. U jednom aspektu, prva sekvenca aminokiseline sadrži najmanje dve CDRH konsenzus sekvence, i/ili druga sekvenca aminokiseline sadrži najmanje dve CDRL konsenzus sekvence.
[0247] U nekim realizacijama, prva i druga sekvenca aminokiselina su kovalentno povezane jedna sa drugom.
[0248] U sledećoj realizaciji, prva aminokiselinska sekvenca monoklonskog antitela ili njegovog fragmenta koji veže antigen, kao što se zahteva, može da obuhvata CDRH3 sekvence SEQ ID NO:75, 78, 81, 84, 87, 90, 96, 99, 102, i 123, CDRH2 sekvence SEQ ID NO:74, 77, 80, 83, 86, 89, 91, 93, 95, 98, 101, i 129, i CDRH1 sekvence SEQ ID NO:73, 76, 79, 82, 85, 88, 92, 97, i 100, i/ili druga aminokiselinska sekvenca monoklonskog antitela ili njegovog fragmenta koji veže antigen, kao što se zahteva može da sadrži CDRL3 sekvence SEQ ID NO:44, 47, 50, 53, 56, 59, 64, 68, 71, i 72, CDRL2 sekvence SEQ ID NO:43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 63, 67, i 70, i CDRL1 sekvence SEQ ID NO:42, 45, 48, 51, 54, 57, 62, 65, 66, i 69.
[0249] Antigen-vezujući protein može da sadrži najmanje dve CDRH sekvence od sekvenci teškog lanca H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, ili H13, kao što je prikazano u tabeli 5A. Takođe, antigen-vezujući protein može da sadrži najmanje dve CDRL sekvence od sekvenci lakog lanca L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L9, L10, L11, L12, L13, L14, L15, L16, ili L17, kao što je prikazano u tabeli 5B. Takođe, antigen-vezujući protein može da sadrži najmanje dve CDRH sekvence od sekvenci teškog lanca H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, ili H13, kao što je prikazano u tabeli 5A, i najmanje dve CDRL sekvence od sekvenci lakog lanca L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L9, L10, L11, L12, L13, L14, L15, L16, ili L17, kao što je prikazano u tabeli 5B.
[0250] Takođe, antigen-vezujući protein može da sadrži CDRH1, CDRH2, i CDRH3 sekvence od sekvenci teškog lanca H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, ili H13, kao što je prikazano u tabeli 5A. Takođe, antigen-vezujući protein može da sadrži CDRL1, CDRL2, i CDRL3 sekvence od sekvenci lakog lanca L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L9, L10, L11, L12, L13, L14, L15, L16, ili L17, kao što je prikazano u tabeli 5B.
[0251] Takođe, antigen-vezujući protein može da sadrži svih šest CDR regiona od L1 i H1, ili L2 i H2, ili L3 i H3, ili L4 i H4, ili L5 i H5, ili L6 i H1, ili L7 i H6, ili L8 i H5, ili L9 i H1, ili L10 i H7, ili L11 i H8, ili L12 i H9, ili L12 i H10, ili L13 i H5, ili L14 i H11, ili L15 i H12, ili L16 i H13, ili L17 i H13, kao što je prikazano u tabelama 5A i 5B.
[0252] U jednom aspektu, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako je zatraženo u zahtevima koji su ovde obezbeđeni mogu da budu rekombinantno antitelo, humano antitelo, humanizovano antitelo, himerno antitelo, multispecifično antitelo, ili antigen-vezujući fragment antitela.
[0253] U drugom primeru izvođenja, antigen-vezujući fragment kako je ovde opisano može da bude Fab fragment, Fab’ fragment, F(ab’)2fragment, Fv fragment, di-antitelo, ili molekul jednolančanog antitela.
[0254] U drugom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako je zatraženo u zahtevima koji je ovde obezbeđen predstavlja humano antitelo i može da bude tipa IgG1, IgG2 IgG3 ili IgG4.
[0255] U drugom primeru izvođenja, antigen-vezujući protein se sastoji samo od lakog ili teškog polipeptidnog lanca kao što je naznačeno u tabelama 5A-5B. U nekim primerima izvođenja, antigen-vezujući protein se sastoji samo od varijabilnog domena lakog lanca ili varijabilnog domena teškog lanca kao što su oni navedeni u tabelama 5A-5B. Takvi antigen-vezujući proteini mogu da budu pegilovani sa jednim ili više PEG molekula.
[0256] U još jednom aspektu, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako je zatraženo u zahtevima koji je ovde obezbeđen može da bude spojen sa grupom za obeležavanje i može da stupi u kompeticiju za vezivanje za vanćelijski deo humanog CGRP R sa antigenvezujućim proteinom, jednim od ovde obezbeđenog monoklonskog antitela ili njegovim antigenvezujućim fragmentom kako je zatraženo u zahtevima. U jednom primeru izvođenja, monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kako je zatraženo u zahtevima koji je ovde obezbeđen može da smanji hemotaksis monocita, inhibira migraciju monocita u tumore ili inhibira nakupljanje i funkciju makrofaga povezanih sa tumorom u tumoru kada se primeni kod pacijenta.
[0257] Kao što će biti jasno stručnjacima u oblasti, za bilo koji antigen-vezujući protein koji ima više od jednog CDR iz prikazanih sekvenci, bilo koja kombinacija CDR regiona nezavisno odabranih od prikazanih sekvenci je korisna. Prema tome, mogu da se proizvedu antigen-vezujući proteini sa jednim, dva, tri, četiri, pet ili šest nezavisno odabranih CDR regiona. Međutim, kao što će biti jasno stručnjacima u oblasti, specifični primeri izvođenja uopšteno koriste kombinacije CDR regiona koje se ne ponavljaju, npr., antigen-vezujući proteini se uopšteno ne proizvode sa dva CDRH2 regiona, itd.
[0258] Neki od obezbeđenih antigen-vezujućih proteina se detaljnije razmatraju u nastavku teksta.
Antigen-vezujući proteini i vezujući epitopi i vezujući domeni za koji se traži zaštita
[0259] Kada se kaže da se antigen-vezujući protein vezuje za epitop, kao što je jedna ili obe komponente CGRP R, ili vanćelijski domen CGRP R, na primer, misli se na to da se antigenvezujući protein specifično vezuje za naznačeni deo CGRP R, koji može da bude na CRLR, RAMP 1, ili deo sekvence oba, i CRLR i RAMP 1. U slučajevima kada se antigen-vezujući protein vezuje samo za CRLR (a ne i za RAMP1), ne očekuje se da se antigen-vezujući protein selektivno vezuje za CGRP R budući da je CRLR zajednički, između ostalog, za AM1 i AM1 receptore. Slično, u slučaju kada se antigen-vezujući protein vezuje samo za RAMP1 (a ne i za CRLR), ne očekuje se da se antigen-vezujući protein selektivno vezuje za CGRP R, budući da je RAMP1 zajednički, između ostalog, za AMY1 receptor. U slučajevima kada antigen-vezujući protein interaguje i sa CRLR i sa RAMP1, očekuje se da se antigen-vezujući protein vezuje za ostatke ili sekvence ostataka, ili regione i u CRLR i u RAMP1. Ni u jednom od gore pomenutih primera izvođenja ne očekuje se da antigen-vezujući protein stupi u kontakt sa svakim ostatkom u CRLR ili RAMP1. Slično, ne očekuje se da svaka supstitucija ili delecija u CRLR, RAMP1 ili njihovim vanćelijskim domenima značajno utiče na afinitet za vezivanje.
[0260] Postupci koji su detaljno prikazani, npr., u primeru 10, mogu da se koriste za procenu toga koji regioni multimernih receptora, kao što je CGRP R, mogu da budu uključeni u vezivanje za odabrane antigen-vezujuće proteine.
Antigen-vezujući proteini koji stupaju u kompeticiju za koje se traži zaštita
[0261] U drugom aspektu, obezbeđeni su antigen-vezujući proteini koji stupaju u kompeticiju sa jednim od tipičnih, ili "referentnih" antitela ili funkcionalnih fragmenata koji se vezuju za gore opisani epitop, za specifično vezivanje za CGRP R. Takvi antigen-vezujući proteini mogu takođe da se vežu za isti epitop kao jedan od antigen-vezujućih proteina koji su ovde dati kao primer, ili za epitop koji se preklapa. Očekuje se da antigen-vezujući proteini i fragmenti koji kompetiraju sa, ili se vezuju za isti epitop kao antigen-vezujući proteini dati kao primer, ili referentni antigenvezujući proteini, pokažu slična funkcionala svojstva. Primeri antigen-vezujućih proteina i fragmenata uključuju one sa teškim i lakim lancima, domenima varijabilnog regiona VL1- VL17 i VH1- VH13, i CDR regionima uključenim u tabele 2A, 2B, 3, 4A, 4B, 5A i 5B. Tako, kao specifični primer, antigen-vezujući proteini koji su obezbeđeni uključuju one koji kompetiraju sa antitelom koje ima: (a) svih 6 od CDR regiona nabrojanih za antitelo u tabelama 5A i 5B; (b) VHi VLodabrane od VL1- VL17 i VH1- VH13 i nabrojanih za antitelo u tabelama 5A i 5B; ili (c) dva laka lanca i dva teška lanca kao što je naznačeno za antitelo u tabelama 5A i 5B. Drugi primeri pogodnih referentnih antitela uključuju ona koja imaju varijabilni region teškog lanca koji ima sekvencu koja odgovara bilo kojoj od sekvenci identifikovanih kao SEQ ID NO:158-170 i varijabilni region lakog lanca koji ima sekvencu koja odgovara bilo kojoj od sekvenci identifikovanih kao SEQ ID NO:137-153.
[0262] Kompeticija za vezivanje može da se oceni, na primer, pomoću analize kvantitativnog merenja stepena vezivanja, kao što je test Biacore opisan u primeru 7, u nastavku teksta. U tom primeru, 19 antitela koja su ovde opisana su ispitana protiv svakog od 6 "referentnih" antitela - pet neutrališućih antitela (11D11, 3B6, 4H6, 12G8, i 9F5) i jednog antitela koje nije neutrališuće (34E3). Rezultati testa, prikazani u tabeli 13, ukazuju na to da se sva ispitivana neutrališuća antitela (1E11,1H7,2E7,3B6,3C8,4E4,4H6,5F5,9D4,9F5,10E4,11D11,11H9,12E8,12G8,13H2 i 32H7) vezuju za suštinski isti region CGRP R, koji se razlikuje od regiona CGRP R za koji se vezuju ispitivana antitela koja nisu neutrališuća (32H8, 33B5, 33E4 i 34E3). Na osnovu ovih podataka, bilo koje od neutrališućih antitela bi činilo primere referentnih antigen-vezujućih proteina u kompetitivnom testu, posebno bilo koje od neutrališućih antitela koja su bila imobilisana u testu opisanom u primeru 7 --- 11D11, 3B6, 4H6, 12G8, i 9F5.
Monoklonska antitela
[0263] Antigen-vezujući proteini koji su obezbeđeni uključuju monoklonska antitela koja se vezuju za CGRP R. Monoklonska antitela mogu da se proizvedu korišćenjem bilo koje tehnike poznate u struci, npr., pomoću imortalizacije ćelija slezine sakupljenih iz transgene životinje nakon završetka imunizacionog rasporeda. Ćelije slezine mogu da se imortalizuju korišćenjem bilo koje tehnike poznate u struci, npr., njihovom fuzijom sa ćelijama mijeloma da bi se proizveli hibridomi. Ćelije mijeloma za upotrebu u postupcima fuzije za proizvodnju mijeloma poželjno ne proizvode antitelo, imaju visoku efikasnost fuzije, i pokazuju nedostatke enzima što ih čini nesposobnim za rast u određenim selektivnim medijumima koji podržavaju samo rast željenih fuzionisanih ćelija (hibridoma). Primeri pogodnih ćelijskih linija za upotrebu u fuzijama mišjih ćelija uključuju Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63- Ag8.653, NS1/1.Ag 41, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 i S194/5XXO Bul; primeri ćelijskih linija koje se koriste u fuzijama pacovskih ćelija uključuju R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F i 4B210. Druge ćelijske linije korisne za ćelijske fuzije su U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 i UC729-6. Primer postupka za pripremu monoklonskih antitela je opisan u primeru 2, u nastavku teksta.
[0264] U nekim slučajevima, ćelijska linija hibridoma se proizvodi imunizacijom životinje (npr., transgene životinje koja ima humane imunoglobulinske sekvence) imunogenom CGRP R; sakupljanjem ćelija slezine iz imunizovane životinje; fuzijom sakupljenih ćelija slezine sa ćelijskom linijom mijeloma, čime nastaju ćelije hibridoma; uspostavljanjem ćelijske linije hibridoma iz ćelija hibridoma, i identifikacijom ćelijske linije hibridoma koja proizvodi antitelo koje se vezuje za CGRP R (npr., kao što je opisano u primerima 1-3, u nastavku). Takve ćelijske linije hibridoma, i anti-CGRP R monoklonska antitela koja one proizvode, predstavljaju aspekte predmetne prijave.
[0265] Monoklonska antitela koja sekretuje ćelijska linija hibridoma mogu da se prečiste korišćenjem bilo koje tehnike poznate u struci. Hibridomi ili mAb antitela mogu dodatno da se provere da bi se identifikovala mAb antitela sa određenim svojstvima, kao što je sposobnost vezivanja za ćelije koje eksprimiraju CGRP, sposobnosti da blokiraju ili interferiraju sa vezivanjem CGRP liganda ili CGRP8-37peptida, ili sposobnosti da funkcionalno blokiraju receptor, npr., korišćenjem cAMP testa, npr., kao što je opisano u nastavku.
Himerna i humanizovana antitela
[0266] Himerna i humanizovana antitela koja se zasnivaju na gore pomenutim sekvencama su takođe obezbeđena. Monoklonska antitela za upotrebu kao terapeutska sredstva mogu da budu modifikovana na različite načine pre upotrebe. Jedan primer je himerno antitelo, koje predstavlja antitelo koje se sastoji od proteinskih segmenata iz različitih antitela koji su kovalentno vezani da bi stvorili funkcionalne imunoglobulinske lake ili teške lance ili njihove imunološki funkcionalne delove. Uopšteno, deo teškog lanca i/ili lakog lanca je identičan sa, ili homologan odgovarajućoj sekvenci u antitelima izvedenim iz određene vrste, ili koja pripadaju određenoj klasi ili podklasi antitela, dok ostatak lan(a)ca je/su identični sa, ili homologni odgovarajućoj sekvenci u antitelu izvedenom iz druge vrste, ili koje pripada drugoj klasi ili podklasi antitela. Za postupke koji se odonse na himerna antitela, videti, na primer, SAD patent br.4,816,567; i Morrison et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855. Kalemljenje CDR je opisano, na primer, u SAD patentu br. 6,180,370, br.5,693,762, br.5,693,761, br.5,585,089, i br.5,530,101.
[0267] Uopšteno, cilj pravljenja himernog antitela je stvaranje himere u kojoj je broj aminokiselina iz vrste kojoj pripada predviđeni pacijent maksimalan. Jedan primer je "CDR-kalemljeno" antitelo, u kome antitelo sadrži jedan ili više regiona za određivanje komplementarnosti (CDR regioni) iz određene vrste, ili koji pripadaju određenoj klasi ili podklasi antitela, dok je ostatak lan(a)ca antitela identičan sa, ili homologan odgovarajućoj sekvenci u antitelima izvedenim iz druge vrste, ili koja pripadaju drugoj klasi ili podklasi antitela. Za upotrebu kod ljudi, varijabilni region ili odabrani CDR regioni iz antitela glodara obično su kalemljeni na humano antitelo, zamenjujući prirodne varijabilne regione ili CDR regione humanog antitela.
[0268] Jedan koristan tip himernog antitela je "humanizovano" antitelo. Uopšteno, humanizovano antitelo se proizvodi iz monoklonskog antitela prvobitno nastalog u životinji koja nije čovek. Određeni aminokiselinski ostaci u ovom monoklonskom antitelu, tipično iz dela antitela koji nije zadužen za prepoznavanje antigena, se modifikuju da bi bili homologni sa odgovarajućim ostacima u humanom antitelu odgovarajućeg izotipa. Humanizacija može da se izvede, na primer, korišćenjem različitih postupaka supstitucijom najmanje dela glodarskog varijabilnog regiona odgovarajućim regionima humanog antitela (videti, npr., SAD patent br. 5,585,089, i br.
5,693,762; Jjedans et al., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-27; Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536),
[0269] U jednom aspektu, CDR regioni varijabilnih regiona lakog i teškog lanca antitela koji su ovde obezbeđeni (videti, tabelu 4) su kalemljeni u okvirne regione (FR) iz antitela iste, ili druge, filogenetske vrste. Na primer, CDR regioni varijabilnih regiona lakog i teškog lanca VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, i VH13, i/ili VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, i VL17 mogu da se nakaleme na humane konsenzus FR regione. Za stvaranje humanih konsenzus FR regiona, FR regioni iz nekoliko aminokiselinskih sekvenci humanog teškog lanca ili lakog lanca mogu da budu poravnati da bi se identifikovala konsenzus aminokiselinska sekvenca. U drugim primerima izvođenja, FR regioni teškog lanca ili lakog lanca koji su ovde opisani, zamenjeni su FR regionima iz drugog teškog lanca ili lakog lanca. U jednom aspektu, retke aminokiseline u FR regionima teškog i lakog lanca anti-CGRP R antitela nisu zamenjene, dok je ostatak FR aminokiselina zamenjen. "Retka aminokiselina" je specifična aminokiselina koja se nalazi na poziciji na kojoj se ta određena aminokiselina obično ne nalazi u FR. Alternativno, kalemljeni varijabilni regioni iz jednog teškog ili lakog lanca mogu da se koriste sa konstantnim regionom koji je drugačiji od konstantnog regiona tog određenog teškog ili lakog lanca kao što je ovde opisano. U drugim primerima izvođenja, kalemljeni varijabilni regioni su deo jednolančanog Fv antitela.
[0270] U određenim primerima izvođenja, konstantni regioni vrsta koje nisu humane mogu da se koriste zajedno sa humanim varijabilnim regionom(ima) za proizvodnju hibridnog antitela.
Potpuno humana antitela
[0271] Takođe su obezbeđena antitela koja su u potpunosti humana. Postupci za pravljenje potpuno humanih antitela specifičnih za dati antigen bez izlaganja ljudi antigenu ("potpuno humana antitela") su dostupni. Jedan specifični način obezbeđen za implementaciju proizvodnje potpuno humanih antitela je "humanizacija" mišjeg humoralnog imunskog sistema. Uvođenje lokusa humanog imunoglobulina (Ig) u miševe kod kojih su geni za endogeni Ig inaktivisani predstavlja jedan način proizvodnje potpuno humanog monoklonskog antitela (mAb) u mišu, životinji koja može da se imunizuje bilo kojim željenim antigenom. Korišćenje potpuno humanog antitela može da smanji imunogene i alergijske odgovore koji mogu ponekad da budu izazvani primenom kod ljudi mišjih ili mAb antitela dobijenih iz miša kao terapeutskih sredstava.
[0272] Potpuno humana antitela mogu da se proizvedu imunizacijom transgenih životinja (obično miševa) koje su sposobne da proizvedu repertoar humanih antitela u odsustvu endogene proizvodnje imunoglobulina. Antigeni za ovu primenu obično imaju šest ili više susednih aminokiselina, i izborno su konjugovani sa nosačem, kao što je hapten. Videti, npr., Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-2555; Jakobovits et al., 1993, Nature 362:255-258; i Bruggermann et al., 1993, Year in Immunol.7:33. U jednom primeru takvog postupka, transgene životinje se proizvode onesposobljavanjem endogenih mišjih imunoglobulinskih lokusa koji kodiraju mišje teške i lake imunoglobulinske lance u njima, i ubacivanjem u genom miša velikih fragmenata humane genomske DNK koja sadrži lokuse koji kodiraju proteine humanog teškog i lakog lanca. Delimično modifikovane životinje, koje imaju manje od celog komplementa humanih imunoglobulinskih lokusa se zatim ukrštaju da bi se dobila životinja koja ima sve željene modifikacije imunskog sistema. Kada se primeni imunogen, ove transgene životinje proizvode antitela koja su imunospecifična za imunogen, ali imaju humane radije nego mišje aminokiselinske sekvence, uključujući varijabilne regione. Za dodatne detalje takvih postupaka, videti, na primer, WO96/33735 i WO94/02602. Dodatni postupci koji se odnose na transgene miševe za dobijanje humanih antitela su opisani u SAD patentu br. 5,545,807; br. 6,713,610; br. 6,673,986; br.
6,162,963; br.5,545,807; br.6,300,129; br.6,255,458; br.5,877,397; br.5,874,299 i br.5,545,806; u PCT publikacijama WO91/10741, WO90/04036, i u EP 546073B1 i EP 546073A1.
[0273] Transgeni miševi koji su prethdno opisani, ovde su označeni kao "HuMab" miševi, sadrže minilokus gena humanog imunoglobulina koji kodira nerearanžirane imunoglobulinske sekvence humanog teškog ([mu] i [gama]) i [kapa] lakog lanca, zajedno sa ciljnim mutacijama koje inaktivišu endogene lokuse [mu] i [kapa] lanaca (Lonberg et al., 1994, Nature 368:856-859). Prema tome, miševi ispoljavaju smanjenu ekspresiju mišjeg IgM ili [kapa], i kao odgovor na imunizaciju, uvedeni humani transgeni za teški i laki lanac podležu promeni klase i somatskoj mutaciji da bi nastala humana IgG [kapa] monoklonska antitela visokog afiniteta (Lonberg et al., supra.; Lonberg and Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol.13: 65-93; Harding and Lonberg, 1995, Ann. N.YAcad. Sci.764:536-546). Priprema HuMab miševa je detaljno opisana kod Taylor et al., 1992, Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen et al., 1993, International Immunology 5:647-656; Tuaillon et al., 1994, J. Immunol.152:2912-2920; Lonberg et al., 1994, Nature 368:856-859; Lonberg, 1994, Handbook of Exp. Pharmacology 113:49-101; Taylor et al., 1994, International Immunology 6:579-591; Lonberg and Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol.13:65-93; Harding and Lonberg, 1995, Ann. N.Y Acad. Sci. 764:536-546; Fishwild et al., 1996, Nature Biotechnology 14:845-851. Videti, dodatno SAD patent br.5,545,806; br.5,569,825; br.5,625,126; br.5,633,425; br. 5,789,650; br. 5,877,397; br. 5,661,016; br. 5,814,318; br. 5,874,299; i br. 5,770,429; kao i SAD patent br. 5,545,807; međunarodne publikacije br. WO 93/1227; WO 92/22646; i WO 92/03918. Tehnologije korišćene za proizvodnju humanih antitela u ovim transgenim miševima opisane su takođe u WO 98/24893, i kod Mendez et al., 1997, Nature Genetics 15:146-156. Na primer, sojevi transgenih miševa HCo7 i HCo12 mogu da se koriste za proizvodnju anti-CGRP R antitela. Dodatni detalji u vezi sa proizvodnjom humanih antitela korišćenjem transgenih miševa obezbeđeni su u primerima u nastavku teksta.
[0274] Korišćenjem tehnologije hibridoma, antigen-specifična humana mAb antitela sa željenom specifičnošću mogu da budu proizvedena i selektovana u transgenim miševima kao što je prethodno opisano. Takva antitela mogu da budu klonirana i eksprimirana korišćenjem pogodnog vektora i ćelije-domaćina, ili antitela mogu da se sakupe iz gajenih ćelija hibridoma.
[0275] Potpuno humana antitela mogu takođe da potiču iz biblioteka prikaza na fagu (kao što je opisano kod Hoogenboom et al., 1991, J. Mol. Biol.227:381; i Marks et al., 1991, J. Mol. Biol.
222:581). Tehnike fagnog prikaza imitiraju imunsku selekciju putem prikaza repertoara antitela na površini filamentoznog bakteriofaga, i naknadne selekcije faga prema njihovom vezivanju za izabrani antigen. Jedna takva tehnika je opisana u PCT publikaciji br. WO 99/10494, koja opisuje izdvajanje visokoafinitetnih i funkcionalnih agonističkih antitela za MPL- i msk-receptore korišćenjem ovakvog pristupa.
Bispecifični ili bifunkcionalni antigen-vezujući proteini
[0276] Obezbeđeni antigen-vezujući proteini takođe uključuju bispecifična i bifunkcionalna antitela koja uključuju jedan ili više CDR regiona ili jedan ili više varijabilnih regiona kao što je ovde opisano. Bispecifično ili bifunkcionalno antitelo u nekim slučajevima je veštačko hibridno antitelo koje ima dva različita para teškog/lakog lanca i dva različita vezivna mesta. Bispecifična antitela mogu da budu proizvedena različitim postupcima uključujući, ali bez ograničenja, fuziju hibridoma ili spajanje Fab’ fragmenata. Videti, npr., Songsivilai and Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553.
Različiti drugi oblici
[0277] Neki od obezbeđenih antigen-vezujućih proteina su varijante oblika antigen-vezujućih proteina koji su prethodno opisani (npr., onih koji imaju sekvence navedene u tabelama 2-5). Na primer, neki od antigen-vezujućih proteina imaju jednu ili više konzervativnih aminokiselinskih supstitucija u jednom ili više teških ili lakih lanaca, varijabilnih regiona ili CDR regiona navedenih u tabelama 2-5.
[0278] Prirodne aminokiseline mogu da mogu da se podele u klase na osnovu zajedničkih odlika bočnog lanca:
1) hidrofobne: norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
2) neutralne hidrofilne: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
3) kisele: Asp, Glu;
4) bazne: His, Lys, Arg;
5) sa ostacima koji utiču na orijentaciju lanca: Gly, Pro; i
6) aromatične: Trp, Tyr, Phe.
[0279] Konzervativne aminokiselinske supstitucije mogu da uključuju zamenu člana jedne od ovih klasa drugim članom iste klase. Konzervativne aminokiselinske supstitucije mogu da obuhvataju aminokiselinske ostatke koji se ne javljaju u prirodi, koji su tipično ugrađeni hemijskom sintezom peptida, a ne sintezom u biološkim sistemima. Oni uključuju peptidomimetike i druge obrnute ili invertovane oblike aminokiselinskih fragmenata.
[0280] Nekonzervativne supstitucije mogu da uključuju zamenu člana jedne od gore navedenih klasa članom druge klase. Takvi supstituisani ostaci mogu da se uvedu u regione antitela koji su homologni sa humanim antitelima, ili u nehomologne regione molekula.
[0281] Pri izvođenju ovakvih zamena, prema određenim primerima izvođenja, treba imati u vidu hidropatski indeks aminokiselina. Hidropatski profil proteina se izračunava dodeljivanjem svakoj aminokiselini numeričke vrednosti ("hidropatski indeks") i zatim ponovljenim određivanjem proseka ovih vrednosti duž peptidnog lanca. Svakoj aminokiselini dodeljen je hidropatski indeks na osnovu njene hidrofobnosti i osobina naelektrisanja. To su: izoleucin (+4.5); valin (+4.2); leucin (+3.8); fenilalanin (+2.8); cistein/cistin (+2.5); metionin (+1.9); alanin (+1.8); glicin (-0.4); treonin (-0.7); serin (-0.8); triptofan (-0.9); tirozin (-1.3); prolin (-1.6); histidin (-3.2); glutamat (-3.5); glutamin (-3.5); aspartat (-3.5); asparagin (-3.5); lizin (-3.9); i arginin (-4.5).
[0282] Značaj hidropatskog profila u doprinosu interaktivnoj biološkoj funkciji proteina je prepoznat u ovoj oblasti (videti, npr., Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol.157:105-131). Poznato je da određene aminokiseline mogu da budu supstituisane drugim aminokiselinama koje imaju saličan hidropatski indeks ili rezultat i da i dalje zadrže sličnu biološku aktivnost. U uvođenje zamena na osnovu hidropatskog indeksa, u određenim primerima izvođenja, uključena je supstitucija aminokiselina čiji su hidropatski indeksi u okviru vrednosti ±2. U nekim aspektima, uključene su one koje su u okviru vrednosti ±1, i u drugim aspektima, uključene su one koje su u okviru vrednosti ±0.5.
[0283] Takođe je poznato u stanju tehnike da supstitucija sličnih aminokiselina može da se efikasno izvede na osnovu hidrofilnosti, posebno tamo gde je predviđeno da se tako nastali biološki funkcionalni protein ili peptid koristi u imunološkim primerima izvođenja, kao u ovom slučaju. U određenim primerima izvođenja, najveća lokalna prosečna hidrofilnost proteina, kao rezultat hidrofilnosti njegovih susednih aminokiselina, u korelaciji je sa njegovom imunogenošću i vezivanjem za antigen ili imunogenošću, to jest, sa biološkim svojstvom proteina.
[0284] Sledeće vrednosti hidrofilnosti su dodeljene ovim aminokiselinskim ostacima: arginin (+3.0); lizin (+3.0); aspartat (+3.061); glutamat (+3.061); serin (+0.3); asparagin (+0.2); glutamin (+0.2); glicin (0); treonin (-0.4); prolin (-0.561); alanin (-0.5); histidin (-0.5); cistein (-1.0); metionin (-1.3); valin (-1.5); leucin (-1.8); izoleucin (-1.8); tirozin (-2.3); fenilalanin (-2.5) i triptofan (-3.4). U uvođenje zamena na osnovu sličnih vrednosti hidrofilnosti, u određenim primerima izvođenja, uključena je supstitucija aminokiselina čije vrednosti hidrofilnosti su u okviru ±2, u drugim primerima izvođenja, uključene su one koje su u okviru vrednosti ±1, i u još drugim primerima izvođenja, uključene su one koje su u okviru vrednosti ±0.5. U nekim slučajevima, moguće je identifikovati epitope iz primarnih aminokiselinskih sekvenci na osnovu hidrofilnosti. Ovi regioni se takođe označavaju kao "osnovni regioni epitopa."
[0285] Primeri konzervativnih aminokiselinskih supstitucija su naznačeni u tabeli 6.
Tabela 6: Konzervativne aminokiselinske supstitucije
[0286] Iskusni stručnjak će moći da odredi pogodne varijante polipeptida kako je ovde navedeno korišćenjem dobro poznatih tehnika. Stručnjak u oblasti može da odredi pogodne oblasti molekula koje mogu da budu promenjene bez narušavanja aktivnosti ciljanjem regiona za koje se smatra da nisu značajni za aktivnost. Iskusni stručnjak će takođe moći da identifikuje ostatke i delove molekula koji su očuvani među sličnim polipeptidima. U sledećim primerima izvođenja, čak i oblasti koje su značajne za biološku aktivnost ili za strukturu mogu da se podvrgnu supstitucijama konzervativnim aminokiselinama, bez narušavanja biološke aktivnosti ili bez negativnog uticaja na polipeptidnu strukturu.
[0287] Dodatno, stručnjak u oblasti može da razmotri ispitivanja veze struktura-funkcija koja identifikuju ostatke u sličnim polipeptidima koji su značajni za aktivnost ili strukturu. U svetlu takvog poređenja, može se predvideti značaj aminokiselinskih ostataka u proteinu koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima značajnim za aktivnost ili strukturu u sličnim proteinima. Stručnjak u oblasti može da se opredeli za supstitucije hemijski sličnim aminokiselinama za ovakve aminokiselinske ostatke za koje se predviđa da su značajni.
[0288] Stručnjak u oblasti može takođe da analizira trodimenzionalnu strukturu i aminokiselinsku sekvencu povezanu sa tom strukturom u sličnim polipeptidima. U svetlu takve informacije, stručnjak u oblasti može da predvidi poravnanje aminokiselinskih ostataka u antitelu u odnosu na njegovu trodimenzionalnu strukturu. Stručnjak u oblasti može da odluči da ne izvrši radikalne promene aminokiselinskih ostataka za koje se predviđa da će biti na površini proteina, budući da takvi ostaci mogu da budu uključeni u važne interakcije sa drugim molekulima. Osim toga, stručnjak u oblasti može da stvori probne varijante koje sadrže jednu aminokiselinsku supstituciju na svakom željenom aminokiselinskom ostatku. Ove varijante mogu da budu ispitane korišćenjem testova za neutrališuću aktivnost za CGRP R, (videti primere u nastavku) dobijajući tako informaciju u vezi sa aminokiselinama koje mogu da se zamene i koje ne smeju da se zamene. Drugim rečima, na osnovu informacija dobijenih takvim rutinskim eksperimentima, stručnjak u oblasti može lako da odredi pozicije aminokiselina na kojima dalje supstitucije treba da budu izbegnute, bilo same ili u kombinaciji sa drugim mutacijama.
[0289] Brojne naučne publikacije su posvećene predviđanju sekundarne strukture. Videti, Moult, 1996, Curr. Op. in Biotech.7:422-427; Chou et al., 1974, Biochem.13:222-245; Chou et al., 1974, Biochemistry 113:211-222; Chou et al., 1978, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol.47:45-148; Chou et al., 1979, Ann. Rev. Biochem. 47:251-276; i Chou et al., 1979, Biophys. J.26:367-384. Osim toga, sada su dostupni kompjuterski programi za pomoć u predviđanju sekundarne strukture.
Jedan postupak za predviđanje sekundarne strukture se zasniva na modelovanju homologije. Na primer, dva polipeptida ili proteina koja imaju identičnost sekvence veću od 30%, ili sličnost veću od 40% mogu da imaju slične strukturne topologije. Nedavni porast baze podataka proteinske strukture (PDB) obezbedio je povećanu predvidivost sekundarne strukture, uključujući potencijalni broj prevoja u strukturi polipeptida ili proteina. Videti, Holm et al., 1999, Nucl. Acid. Res. 27:244-247. Predloženo je (Brenner et al., 1997, Curr. Op. Struct. Biol.7:369-376) da postoji ograničeni broj prevoja u datom polipeptidu ili proteinu i da, kada se kritičan broj struktura razjasni, predviđanje strukture postaje značajno pouzdanije.
[0290] Dodatni postupci za predviđanje sekundarne strukture uključuju "nizanje" (Jones, 1997, Curr. Opin. Struct. Biol.7:377-387; Sippl et al., 1996, Structure 4:15-19), "analizu profila" (Bowie et al., 1991, Science 253:164-170; Gribskov et al., 1990, Meth. Enzym. 183:146-159; Gribskov et al., 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. 84:4355-4358), i "evolutivno povezivanje" (Videti, Holm, 1999, supra; i Brenner, 1997, supra).
[0291] U nekim primerima izvođenja, uvedene su aminokiselinske supstitucije koje: (1) smanjuju podložnost proteolizi, (2) smanjuju podložnost oksidaciji, (3) menjaju afinitet vezivanja za obrazovanje proteinskih kompleksa, (4) menjaju afinitete za vezivanje liganda ili antigena, i/ili (4) dodeljuju ili modifikuju druga fizičkohemijska ili funkcionalna svojstva takvim polipeptidima. Na primer, pojedinačne ili višestruke aminokiselinske supstitucije (u određenim primerima izvođenja, konzervativne aminokiselinske supstitucije) mogu da se izvedu u prirodnoj sekvenci. Supstitucije mogu da se uvedu u delu antitela koji leži van domena koji obrazuju međumolekulske kontakte). U takvim primerima izvođenja, mogu da se koriste konzervativne aminokiselinske supstitucije koje ne menjaju suštinski strukturna svojstva roditeljske sekvence (npr., jedna ili više zamena aminokiselina koje ne remete sekundarnu strukturu koja karakteriše roditeljski ili nativni antigenvezujući protein). Primeri sekundarnih i tercijarnih struktura polipeptida poznati u stanju tehnike opisani su u Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed.), 1984, W. H. New York: Freeman and Company; Introduction to Protein Structure (Branden and Tooze, eds.), 1991, New York: Garland Publishing; i Thornton et al., 1991, Nature 354:105.
[0292] Dodatne poželjne varijante antitela uključuju varijante cisteina gde je jedan ili više cisteinskih ostataka u roditeljskoj ili nativnoj aminokiselinskoj sekvenci deletiran ili supstituisan drugom aminokiselinom (npr., serinom). Cisteinske varijante su korisne, između ostalog kada antitela moraju ponovo da se uviju u biološki aktivnu konformaciju. Cisteinske varijante mogu da imaju manje cisteinskih ostataka od nativnog antitela, i tipično imaju paran broj da bi se smanjile interakcije koje rezultuju iz nesparenih cisteina.
[0293] Teški i laki lanci, domeni varijabilnih regiona i CDR regioni koji su opisani mogu da se koriste za pripremu polipeptida koji sadrže antigen-vezujući region koji može da se specifično veže za CGRP R. Na primer, jedan ili više CDR regiona navedenih u tabelama 4 i 5 može da se ugradi u molekul (npr., polipeptid) kovalentno ili nekovalentno da bi se postigla imunoadhezija. Imunoadhezija može da uključuje CDR region(e) kao deo većeg polipeptidnog lanca, može kovalentno da veže CDR region(e) za drugi polipeptidni lanac, ili može da ugradi CDR region(e) nekovalentno. CDR region(i) omogućavaju imunoadheziju dovodeći do specifičnog vezivanja za konkretni antigen od interesa (npr., CGRP R ili njegov epitop).
[0294] Mimetici (npr., "peptidni mimetici" ili "peptidomimetici") koji se zasnivaju na domenima varijabilnog regiona i CDR regionima koji su ovde opisani su takođe obezbeđeni. Ovi analozi mogu da budu peptidni, nepeptidni ili kombinacije peptidnih i nepeptidnih regiona. Fauchere, 1986, Adv. Drug Res. 15:29; Veber and Freidinger, 1985, TINS p. 392; i Evans et al., 1987, J. Med. Chem. 30:1229. Peptidni mimetici koji su strukturno slični terapeutski korisnim peptidima mogu da se koriste za izazivanje sličnog terapeutskog ili profilaktičkog dejstva. Takva jedinjenja se obično razvijaju uz pomoć komputerizovanog molekulskog modelovanja. Uopšteno, peptidomimetici su proteini koji su strukturno slični antitelu koji ispoljavaju željenu biološku aktivnost, kao što je ovde sposobnost da se specifično veže za CGRP R, ali imaju jednu ili više peptidnih veza izborno zamenjenih vezom odabranom od: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH-CH-(cis i trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2-, i -CH2SO-, postupcima koji su dobro poznati u stanju tehnike. Sistematska supstitucija jedne ili više aminokiselina konsenzus sekvence D-aminokiselinom istog tipa (npr., D-lizin umesto L-lizina) može da bude korišćena u određenim primerima izvođenja za stvaranje stabilnijih proteina. Dodatno, ograničeni peptidi koji sadrže konsenzus sekvencu, ili suštinski identičnu varijantu konsenzus sekvence, mogu da budu napravljeni postupcima poznatim u stanju tehnike (Rizo and Gierasch, 1992, Ann. Rev. Biochem.
61:387)), na primer, dodavanjem unutrašnjih cisteinskih ostataka sposobnih da obrazuju unutarmolekulske disulfidne mostove koji ciklizuju peptid.
[0295] Derivati antigen-vezujućih proteina koji su ovde opisani su takođe obezbeđeni. Derivatizovani antigen-vezujući proteini mogu da sadrže bilo koji molekul ili supstancu koja daje željeno svojstvo antitelu ili fragmentu, kao što je povećani polu-život u konkretnoj upotrebi. Derivatizovani antigen-vezujući protein može da sadrži, na primer, detektabilan (ili obeležavajući) fragment (npr., radioaktivni, kolorimetrijski, antigeni ili enzimski molekul, detektabilnu perlu (kao što je perla velike magnetske ili elektronske gustine (npr., zlatna)), ili molekul koji se vezuje za drugi molekul (npr., biotin ili streptavidin)), fragment sa terapeutskim ili dijagnostičkim dejstvom (npr., radioaktivni, citotoksični, ili farmaceutski aktivni), ili molekul koji povećava pogodnost antigen-vezujućeg proteina za određenu upotrebu (npr., primena kod subjekta, kao što je humani subjekt, ili druge in vivo ili in vitro upotrebe). Primeri molekula koji mogu da se koriste za derivatizaciju antigen-vezujućeg proteina uključuju albumin (npr., humani serum albumin) i polietilen glikol (PEG). Derivati vezani za albumin i PEG-ilovani derivati antigen-vezujućih proteina mogu da se pripreme korišćenjem tehnika koje su dobro poznate u ovoj oblasti. Određeni antigen-vezujući proteini uključuju pegilovani jednolančani polipeptid kao što je ovde opisano. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući protein je konjugovan ili drugačije vezan za transtiretin (TTR) ili varijantu TTR. TTR ili varijanta TTR može da bude hemijski modifikovana, na primer, hemikalijom odabranom iz grupe koja se sastoji od dekstrana, poli(n-vinil pirolidona), polietilen glikola, propropilen glikol homopolimera, polipropilen oksid/etilen oksid ko-polimera, polioksietilovanih poliola i polivinil alkohola.
[0296] Drugi derivati uključuju kovalentne ili agregirane konjugate CGRP R-vezujućih proteina sa drugim proteinima ili polipeptidima, na primer pri ekspresiji rekombinantno fuzionisanih proteina koji sadrže heterologe polipeptide fuzionisane za N-kraj ili C-kraj CGRP R-vezujućeg proteina. Na primer, konjugovani peptid može da bude heterologni signalni (ili lider) polipeptid, npr., alfa-faktor lider kvasca, ili peptid kao što je tag oznaka epitopa. Fuzioni proteini koji sadrže CGRP antigen-vezujući protein mogu da sadrže peptide dodate da bi se olakšalo prečišćavanje ili identifikacija CGRP R-vezujućeg proteina (npr., poli-His). CGRP R-vezujući protein može takođe da bude povezan sa FLAG peptidom kao što je opisano kod Hopp et al., 1988, Biol/Technology 6:1204; i u SAD patentu br. 5,011,912. FLAG peptid je visoko antigen i obezbeđuje epitop koji reverzibilno vezuje specifično monoklonsko antitelo (mAb), omogućavajući brzo ispitivanje i lako prečišćavanje eksprimiranog rekombinantnog proteina. Reagensi korisni za pripremu fuzionih proteina u kojima je FLAG peptid fuzionisan za dati polipeptid su komercijalno dostupni (Sigma, St. Louis, MO).
[0297] Oligomeri koji sadrže jedan ili više CGRP R-vezujućih proteina mogu da budu korišćeni kao CGRP R antagonisti. Oligomeri mogu da budu u obliku kovalentno-vezanih ili nekovalentnovezanih dimera, trimera, ili viših oligomera. Za upotrebu su predviđeni oligomeri koji sadrže dva ili više CGRP R-vezujućih proteina, pri čemu jedan primer predstavlja homodimer. Drugi oligomeri uključuju heterodimere, homotrimere, heterotrimere, homotetramere, heterotetramere, itd.
[0298] Jedan primer izvođenja je usmeren na oligomere koji sadrže višestruke CGRP R-vezujuće polipeptide spojene putem kovalentnih ili nekovalentnih interakcija između peptidnih fragmenata fuzionisanih sa CGRP R-vezujućim proteinima. Takvi peptidi mogu da budu peptidni linkeri (spejseri), ili peptidi koji imaju osobinu pospešivanja oligomerizacije. Leucinski zatvarač i određeni polipeptidi izvedeni iz antitela su među peptidima koji mogu da pospeše oligomerizaciju CGRP R-vezujućih proteina povezanih sa njima, kao što je detaljnije opisano u nastavku.
[0299] U određenim primerima izvođenja, oligomeri sadrže od dva do četiri CGRP R-vezujuća proteina. Fragmenti CGRP R-vezujućeg proteina u oligomeru mogu da budu u bilo kom od prethodno opisanih oblika, npr., varijante ili fragmenti. Poželjno, oligomeri sadrže CGRP R-vezujuće proteine koji poseduju aktivnost vezivanja CGRP R.
[0300] U jednom primeru izvođenja, oligomer se priprema korišćenjem polipeptida izvedenih iz imunoglobulina. Priprema fuzionih proteina koji sadrže određene heterologe polipeptide fuzionisane sa različitim delovima polipeptida izvedenih iz antitela (uključujući Fc domen) je opisana, npr., kod Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535; Byrn et al., 1990, Nature 344:677; i Hollenbaugh et al., 1992 "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", u Current Protocols in Immunology, Suppl.4, pages 10.19.1-10.19.11.
[0301] Jedan primer izvođenja je usmeren na dimer koji sadrži dva fuziona proteina nastala fuzijom CGRP R-vezujućeg proteina sa Fc regionom antitela. Dimer može da se napravi, na primer, insercijom genske fuzije koja kodira fuzioni protein u odgovarajući ekspresioni vektor, koji eksprimira gensku fuziju u ćelijama-domaćinima transformisanim rekombinantnim ekspresionim vektorom, i omogućava eksprimiranom fuzionom proteinu da se sklopi vrlo slično molekulima antitela, posle čega se međulančane disulfidne veze obrazuju između Fc fragmenata da bi se dobio dimer.
[0302] Termin "Fc polipeptid", kako se ovde koristi, uključuje nativne i muteinske oblike polipeptida izvedene iz Fc regiona antitela. Skraćeni oblici takvih polipeptida koji sadrže region zgloba koji pospešuje dimerizaciju su takođe uključeni. Fuzioni proteini koji sadrže Fc fragmente (i oligomeri obrazovani od njih) imaju prednost lakog prečišćavanja afinitetnom hromatografijom preko kolona sa proteinom A ili proteinom G.
[0303] Jedan pogodan Fc polipeptid, opisan u PCT prijavi WO 93/10151 i SAD patentu br.
5,426,048 i br. 5,262,522, je jednolančani polipeptid koji se pruža od N-terminalnog regiona zgloba do nativnog C-kraja Fc regiona humanog IgG1 antitela. Drugi koristan Fc polipeptid je Fc mutein opisan u SAD patentu br. 5,457,035, i kod Baum et al., 1994, EMBO J. 13:3992-4001. Aminokiselinska sekvenca ovog muteina je identična onoj u nativnoj sekvenci Fc predstavljenoj u WO 93/10151, osim što je aminokiselina 19 izmenjena iz Leu u Ala, aminokiselina 20 je izmenjena iz Leu u Glu, i aminokiselina 22 je izmenjena iz Gly u Ala. Mutein ispoljava smanjeni afinitet za Fc receptore.
[0304] U drugim primerima izvođenja, varijabilni deo teških i/ili lakih lanaca CGRP R-vezujućeg proteina, kao što je ovde opisano, može da bude supstituisan varijabilnim delom teškog i/ili lakog lanca antitela.
[0305] Alternativno, oligomer je fuzioni protein koji sadrži višestruke CGRP R-vezujuće proteine, sa ili bez peptidnih linkera (spejser peptida). Među pogodnim peptidnim linkerima su oni opisani u SAD patentu br.4,751,180 i br.4,935,233.
[0306] Drugi postupak za pripremu oligomernih derivata CGRP R-vezujućih proteina uključuje upotrebu leucinskog zatvarača. Domeni leucinskog zatvarača su peptidi koji promovišu oligomerizaciju proteina u kojima se nalaze. Leucinski zatvarači su originalno identifikovani u nekoliko DNK-vezujućih proteina (Landschulz et al., 1988, Science 240:1759), i od tada su pronađeni u raznim različitim proteinama. Među poznatim leucinskim zatvaračima su prirodni peptidi i njihovi derivati koji dimerizuju ili trimerizuju. Primeri domena leucinskog zatvarača pogodni za proizvodnju rastvornih oligomernih proteina su opisani u PCT prijavi WO 94/10308, i leucinski zatvarač izveden iz surfaktantnog proteina D pluća (SPD) je opisan kod Hoppe et al., 1994, FEBS Letters 344:191. Upotreba modifikovanog leucinskog zatvarača koji omogućava stabilnu trimerizaciju heterolognog proteina fuzionisanog sa njim opisana je kod Fanslow et al., 1994, Semin. Immunol. 6:267-278. U jednom pristupu, rekombinantni fuzioni proteini koji sadrže fragment ili derivat CGRP R-vezujućeg proteina fuzionisan sa peptidom leucinskog zatvarača su eksprimirani u pogodnim ćelijama-domaćinima, i rastvorni oligomerni fragmenti ili derivati CGRP R-vezujućeg proteina koji se obrazuju, izdvajaju se iz supernatanta kulture.
[0307] U određenim primerima izvođenja, antigen-vezujući protein ima KD(ravnotežni afinitet vezivanja) manji od 1 pM, 10 pM, 100 pM, 1 nM, 2 nM, 5 nM, 10 nM, 25 nM ili 50 nM.
[0308] Drugi aspekt obezbeđuje antigen-vezujući protein koji ima polu-život od bar jedan dan in vitro ili in vivo (npr., kada se primeni kod humanog subjekta). U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući protein ima polu-život od najmanje tri dana. U drugom primeru izvođenja, antitelo ili njegov deo ima polu-život od četiri dana ili duže. U drugom primeru izvođenja, antitelo ili njegov deo ima polu-život od osam dana ili duže. U drugom primeru izvođenja, antitelo ili njegov antigen-vezujući deo je derivatizovan ili modifikovan tako da ima duži polu-život u poređenju sa nederivatizovanim ili nemodifikovanim antitelom. U drugom primeru izvođenja, antigen-vezujući protein sadrži tačkaste mutacije da bi mu se povećao polu-život u serumu, kao što je opisano u WO 00/09560, objavljenom 24.02.2000.
Glikozilacija
[0309] Antigen-vezujući protein može da ima šablon glikozilacije koji je drugačiji ili izmenjen u odnosu na onaj nađen kod nativne vrste. Kao što je poznato u stanju tehnike, šabloni glikozilacije mogu da zavise i od sekvence proteina (npr., prisustva ili odsustva određenih glikozilacionih aminokiselinskih ostataka, diskutovanih u nastavku), ili ćelije-domaćina ili organizma u kome se protein proizvodi. Konkretni ekspresioni sistemi su razmatrani u nastavku.
[0310] Glikozilacija polipeptida je tipično ili N-vezana ili O-vezana. N-vezana glikolizacija se odnosi na dodavanje ugljovodoničnog fragmenta na bočni lanac asparaginskog ostatka. Tripeptidne sekvence asparagin-X-serin i asparagin-X-treonin, gde je X bilo koja aminokiselina osim prolina, čine sekvence za prepoznavanje za enzimsko dodavanje ugljovodoničnog fragmenta na asparaginski bočni lanac. Na taj način, prisustvo bilo koje od ovih tripeptidnih sekvenci u polipeptidu stvara potencijalno mesto glikozilacije. O-vezana glikozilacija se odnosi na dodavanje jednog od šećera N-acetilgalaktozamina, galaktoze, ili ksiloze, na hidroksiaminokiselinu, najčešće serin ili treonin, mada mogu da se koriste i 5-hidroksiprolin ili 5-hidroksilizin.
[0311] Dodavanje glikozilacionih mesta u antigen-vezujući protein se pogodno postiže menjanjem aminokiselinske sekvence tako da sadrži jednu ili više prethodno opisanih tripeptidnih sekvenci (za mesto N-vezane glikozilacije). Izmena se takođe može izvršiti dodavanjem ili supstitucijom, jednog ili više serinskih ili treoninskih ostataka u startnoj sekvenci (za mesto O-vezane glikozilacije). Zbog jednostavnosti, aminokiselina sekvenca antigen-vezujućeg proteina može da bude izmenjena putem izmena na nivou DNK, naročito mutiranjem DNK koja kodira ciljni polipeptid na unapred određenoj bazi, tako da nastanu kodoni koji se translatiraju u željene aminokiseline.
[0312] Drugi način povećanja broja ugljovodoničnih fragmenata na antigen-vezujućem proteinu je pomoću hemijskog ili enzimskog spajanja glikozida sa proteinom. Ovi postupci su pogodni jer ne zahtevaju proizvodnju proteina u ćeliji-domaćinu koja ima sposobnost N- i O-vezane glikozilacije. U zavisnosti od korišćenog načina spajanja, šećer(i) mogu da budu vezani za (a) arginin i histidin, (b) slobodne karboksilne grupe, (c) slobodne sulfhidrilne grupe kao što su one u cisteinu, (d) slobodne hidroksilne grupe kao što su one u serinu, treoninu, ili hidroksiprolinu, (e) aromatične ostatke kao što su oni u fenilalaninu, tirozinu, ili triptofanu, ili (f) amidnu grupu u glutaminu. Ovi postupci su opisani u WO 87/05330 objavljenoj 11.09.1987, i kod Aplin and Wriston, 1981, CRC Crit. Rev, Biochem., pp.259-306.
[0313] Ukljanjanje ugljovodoničnih fragmenata prisutnih na polaznom antigen-vezujućem proteinu može da se postigne hemijski ili enzimski. Hemijska deglikozilacija zahteva izlaganje proteina jedinjenju trifluorometansulfonskoj kiselini, ili ekvivalentnom jedinjenju. Ova obrada rezultuje u isecanju većine ili svih šećera osim povezujućih šećera (N-acetilglukozamin ili N-acetilgalaktozamin), dok polipeptid ostaje nedirnut. Hemijska deglikozilacija je opisana kod Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 i kod Edge et al., 1981, Anal. Biochem.
118:131. Enzimsko isecanje ugljovodoničnih fragmenata sa polipeptida može da se postigne upotrebom različitih endo- i egzo-glikozidaza kao što je opisano kod Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138:350. Glikozilacija na potencijalnim mestima glikozilacije može da bude sprečena upotrebom jedinjenja tunikamicin kao što je opisano kod Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem.
257:3105. Tunikamicin blokira obrazovanje protein-N-glikozidnih veza.
[0314] Prema tome, aspekti uključuju glikozilacione varijante antigen-vezujućih proteina gde je broj i/ili tip mesta glikozilacije izmenjen u poređenju sa aminokiselinskim sekvencama roditeljskog polipeptida. U određenim primerima izvođenja, varijante proteina antitela sadrže veći ili manji broj mesta N-vezane glikozilacije nego nativno antitelo. Mesto N-vezane glikozilacije se odlikuje sekvencom: Asn-X-Ser ili Asn-X-Thr, gde aminokiselinski ostatak označen kao X može da bude bilo koji aminokiselinski ostatak osim prolina. Supstitucija aminokiselinskih ostataka kojom se obrazuju ove sekvence obezbeđuje potencijalno novo mesto za dodavanje N-vezanog ugljovodoničnog lanca. Alternativno, supstitucije koje uklanjaju ili menjaju ovu sekvencu će sprečiti dodavanje N-vezanog ugljovodoničnog lanca prisutnog u nativnom polipeptidu. Na primer, glikozilacija može da se smanji delecijom Asn ili supstitucijom Asn drugom aminokiselinom. U drugim primerima izvođenja, obrazovano je jedno ili više novih mesta za N-vezanu glikolizaciju. Antitela tipično imaju mesto za N-vezanu glikozilaciju u Fc regionu.
Oznake i efektorske grupe
[0315] U nekim primerima izvođenja, antigen-vezujući protein sadrži jednu ili više oznaka. Termin "grupa za obeležavanje" ili "oznaka" označava bilo koju detektabilnu oznaku. Primeri pogodnih grupa za obeležavanje uključuju, ali bez ograničenja, sledeće: radioizotope ili radionuklide (npr.,<3>H,<14>C,<15>N,<35>S,<90>Y,<99>Tc,<111>In,<125>I,<131>I), fluorescentne grupe (npr., FITC, rodamin, lantanid fosfore), enzimske grupe (npr., peroksidazu rena, β-galaktozidazu, luciferazu, alkalnu fosfatazu), hemiluminescentne grupe, biotinil grupe, ili unapred određene polipeptidne epitope koje prepoznaje sekundarni reporter (npr., par sekvenci leucinskog zatvarača, vezivna mesta za sekundarna antitela, metal-vezujuće domene, tag oznake epitopa). U nekim primerima izvođenja, grupa za obeležavanje je spojena sa antigen-vezujućim proteinom preko ručica spejsera različitih dužina da bi se smanjilo potencijalno sterno ometanje. Različiti postupci za obeležavanje proteina su poznati u stanju tehnike i mogu da se koriste po potrebi.
[0316] Termin "efektorska grupa" označava bilo koju grupu spojenu sa antigen-vezujućim proteinom koja deluje kao citotoksično sredstvo. Primeri pogodnih efektorskih grupa su radioizotopi ili radionuklidi (npr.,<3>H,<14>C,<15>N,<35>S,<90>Y,<99>Tc,<111>In,<125>I,<131>I). Druge pogodne grupe uključuju toksine, terapeutske grupe, ili hemoterapeutske grupe. Primeri pogodnih grupa uključuju kaliheamicin, auristatine, geldanamicin i maitansin. U nekim primerima izvođenja, efektorska grupa je spojena sa antigen-vezujućim proteinom preko ručica spejsera različitih dužina da bi se smanjilo potencijalno sterno ometanje.
[0317] Uopšteno, oznake pripadaju različitim klasama, u zavisnosti od testa u kome se detektuju: a) izotopske oznake, koje mogu da budu radioaktivni ili teški izotopi; b) magnetne oznake (npr., magnetne čestice); c) redoks-aktivni fragmenti; d) optičke boje; enzimske grupe (npr. peroksidaza rena, β-galaktozidaza, luciferaza, alkalna fosfataza); e) biotinilisane grupe; i f) unapred određeni epitopi polipeptida koje prepoznaje sekundarni reporter (npr., par sekvenci leucinskog zatvarača, vezivna mesta za sekundarna antitela, metal-vezujući domeni, oznake epitopa, itd.). U nekim primerima izvođenja, grupa za obeležavanje je spojena sa antigen-vezujućim proteinom preko ručica spejsera različitih dužina da bi se smanjilo potencijalno sterno ometanje. Različiti postupci za obeležavanje proteina su poznati u stanju tehnike.
[0318] Specifične oznake uključuju optičke boje, uključujući, ali bez ograničenja, hromofore, fosfore i fluorofore, sa poslednjima koji su specifični u mnogim slučajevima. Fluorofori mogu da budu "niskomolekularni" fluorofori, ili proteinski fluorofori.
[0319] Pod "fluorescentna oznaka" misli se na bilo koji molekul koji može da bude detektovan preko njegovih inherentnih fluorescentnih svojstava. Pogodne fluorescentne oznake uključuju, ali bez ograničenja, fluorescein, rodamin, tetrametilrodamin, eozin, eritrozin, kumarin, metilkumarine, piren, Malahit zelenu, stilben, Lucifer Yellow, Cascade BlueJ, Texas Red, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC Red 640, Cy 5, Cy 5.5, LC Red 705, Oregon green, Alexa-Fluor boje (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), Cascade Blue, Cascade Yellow i R-fikoeritrin (PE) (Molecular Probes, Eugene, ILI), FITC, Rodamin, i Texas Red (Pierce, Rockford, IL), Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA). Pogodne optičke boje, uključujući fluorofore, opisane su u MOLECULAR PROBES HANDBOOK autora Richard P. Haugland.
[0320] Pogodne proteinske fluorescentne oznake uključuju, ali bez ograničenja, zeleni fluorescentni protein, uključujući Renilla, Ptilosarcus, ili Aequorea vrste GFP (Chalfie et al., 1994, Science 263:802-805), EGFP (Clontech Labs., Inc., Genbank pristupni broj U55762), plavi fluorescentni protein (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc., Quebec, Canada; Stauber, 1998, Biotechniques 24:462-471; Heim et al., 1996, Curr. Biol.6:178-182), pojačani žuti fluorescentni protein (EYFP, Clontech Labs., Inc.), luciferazu (Ichiki et al., 1993, J. Immunol.150:5408-5417), β galaktozidazu (Nolan et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2603-2607) i Renilla (WO92/15673, WO95/07463, WO98/14605, WO98/26277, WO99/49019, SAD patent br.
5292658, br. 5418155, br. 5683888, br. 5741668, br. 5777079, br. 5804387, br. 5874304, br.
5876995, br.5925558).
Sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju CGRP antigen-vezujuće proteine
[0321] Nukleinske kiseline koje kodiraju antigen-vezujuće proteine koji su ovde opisani, ili njihovi delovi, takođe su obezbeđeni, uključujući nukleinske kiseline koje kodiraju jedan ili oba lanca antitela, ili fragment, derivat, mutein, ili njihove varijante, polinukleotide koji kodiraju varijabilne regione teškog lanca ili samo CDR regione, polinukleotide adekvatne za upotrebu kao hibridizacione probe, PCR prajmeri ili sekvencioni prajmeri, za identifikaciju, ispitivanje, mutiranje ili amplifikaciju polinukleotida koji kodira polipeptid, anti-sens nukleinske kiseline za inhibiciju ekspresije polinukleotida, i komplementarne sekvence gore pomenutog. Nukleinske kiseline mogu da budu bilo koje dužine. Mogu da budu, na primer, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1 000, 1 500 ili više nukleotida duge, i/ili mogu da sadrže jednu ili više dodatnih sekvenci, na primer, regulatorne sekvence, i/ili da budu deo veće nukleinske kiseline, na primer, vektora. Nukleinske kiseline mogu da budu jednolančane ili dvolančane i mogu da sadrže RNK i/ili DNK nukleotide, i njihove veštačke varijante (npr., peptidne nukleinske kiseline).
[0322] Tabela 7 prikazuje primere sekvenci nukleinske kiseline koje kodiraju konstantni region teškog lanca IgG2, konstantni region kapa lakog lanca i konstantni region lambda hCL-1 lakog lanca. Bilo koji varijabilni region koji je ovde obezbeđen može da bude povezan sa ovim konstantnim regionima da bi se obrazovale sekvence celokupnog teškog i lakog lanca. Međutim, treba razumeti da su ove sekvence konstantnih regiona obezbeđene samo kao specifični primeri – stručnjak u oblasti može da upotrebi druge konstantne regione, uključujući konstantni region teškog lanca IgG1, konstantne regione teškog lanca IgG3 ili IgG4, bilo koji od sedam konstantnih regiona lambda lakog lanca, uključujući hCL-1, hCL-2, hCL-3 i hCL-7; konstantne regione koji su modifikovani zbog poboljšanja stabilnosti, ekspresije, proizvodnje ili drugih željenih svojstava, i slično. U nekim primerima izvođenja, sekvence varijabilnog regiona su spojene sa drugim sekvencama konstantnog regiona poznatim u stanju tehnike.
Primeri sekvenci nukleinske kiseline koje kodiraju varijabilne regione teškog i lakog lanca obezbeđeni su u tabeli 8.
Tabela 7: Primeri sekvenci nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog i lakog lanca
[0323] Tabela 8 prikazuje tipične sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju varijabilne regione teškog lanca i lakog lanca, u koje su uključene različite sekvence CDRL1, CDRL2 i CDRL3, ili CDRH1, CDRH2 i CDRH3.
Tabela 8: Primeri sekvenci nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog i lakog lanca
212
[0324] Tabela 9 prikazuje brojeve sekvenci tipičnih sekvenci nukleinske kiseline koje kodiraju potpuni teški i laki lanac, kao i varijabilne regione teškog i lakog lanca, primera izolovanih antigenvezujućih proteina, naročito hCGRP R-vezujućih proteina koji su ovde opisani.
Tabela 9 – Primeri sekvence nukleinske kiseline SEQ ID NOs HC, LC, VH i VL
[0325] Nukleinske kiseline koje kodiraju određene antigen-vezujuće proteine, ili njihove delove (npr., celokupno antitelo, teški ili laki lanac, varijabilni domen, ili CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, ili CDRL3) mogu da budu izolovane iz B ćelija miša koji je imunizovan sa CGRP R ili njegovim imunogenim komponentama, npr., imunizacijom sa CGRP R pune dužine (koji sadrži i CRLR i RAMP1), vanćelijskim domenom CGRP R (koji sadrži vanćelijske domene CRLR i RAMP1), celim ćelijama koje eksprimiraju CGRP R, membranama pripremljenim iz ćelija koje eksprimiraju CGRP R, fuzionim proteinima, npr., Fc fuzijama, koje sadrže CRLR, RAMP1 (ili njihove vanćelijske domene) fuzionisanim sa Fc, i drugim postupcima poznatim u stanju tehnike, na primer, kao što je ovde opisano u primerima 1-3. Nukleinska kiselina može da bude izolovana uobičajenim postupcima kao što je lančana reakcija polimeraze (PCR). Prikaz na fagu je drugi primer poznate tehnike kojom mogu da budu pripremljeni derivati antitela i drugi antigen-vezujući proteini. U jednom pristupu, polipeptidi koji su komponente antigen-vezujućeg proteina od interesa se eksprimiraju u bilo kom pogodnom rekombinantnom ekspresionom sistemu, i eksprimirani polipeptidi se ostavljaju da se sklope tako da obrazuju molekule antigenvezujućeg proteina.
[0326] Nukleinske kiseline obezbeđene u tabeli 7-9 su date samo kao primer. Zbog degeneracije genetskog koda, svaka od polipeptidnih sekvenci navedenih u tabelama 2-5, ili ovde drugačije prikazanih, takođe je kodirana velikim brojem drugih sekvenci nukleinske kiseline, pored ovih koje su obezbeđene. Stručnjak sa uobičajenim znanjem u oblasti će shvatiti da predmetna prijava prema tome obezbeđuje odgovarajući pisani opis i potpunost otkrivanja za svaku degenerativnu nukleotidnu sekvencu koja kodira svaki antigen-vezujući protein.
[0327] Aspekt dodatno obezbeđuje nukleinske kiseline koje hibridizuju sa drugim nukleinskim kiselinama (npr., nukleinske kiseline koje sadrže nukleotidnu sekvencu prikazanu u tabeli 7, tabeli 8, tabeli 9 i/ili SEQ ID NOs:224-258) pod određenim uslovima hibridizacije. Postupci za hibridizaciju nukleinskih kiselina su dobro poznati u stanju tehnike. Videti, npr., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Kao što je ovde definisano, umereno striktni uslovi hibridizacije uključuju rastvor za prethodno pranje koji sadrži 5x natrijum hlorid/natrijum citrat (SSC), 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0), hibridizacioni pufer od oko 50% formamida, 6x SSC, i temperaturu hibridizacije od 55°C (ili druge slične hibridizacione rastvore, kao što je onaj koji sadrži oko 50% formamida, sa temperaturom hibridizacije od 42°C), i uslovima pranja od 60°C, u 0.5x SSC, 0.1% SDS. Strogi uslovi hibridizacije podrazumevaju hibridizaciju u 6x SSC na 45°C, praćenu sa jednim ili više pranja u 0.1x SSC, 0.2% SDS na 68°C. Dalje, stručnjak u oblasti može da podešava uslove hibridizacije i/ili pranja tako da poveća ili smanji strogost uslova hibridizacije, tako da nukleinske kiseline koje sadrže nukleotidne sekvence koje su najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ili 99% identične jedna drugoj, tipično ostaju hibridizovane jedna sa drugom.
[0328] Osnovni parametri koji utiču na izbor uslova hibridizacije i uputstva za postavljanje pogodnih uslova naznačena su kod, na primer, Sambrook, Fritsch, and Maniatis (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., supra; i Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., sections 2.10 i 6.3-6.4), i mogu lako da se odrede od strane onih sa uobičajenim znanjem u oblasti na osnovu, npr., dužine i/ili osnovnog sastava nukleinske kiseline.
[0329] Mutacijom mogu da se uvedu izmene u nukleinsku kiselinu, što vodi izmenama u aminokiselinskoj sekvenci polipeptida (npr., antitela ili derivata antitela) koje ona kodira. Mutacije mogu da se uvedu korišćenjem bilo kojih postupaka poznatih u stanju tehnike. U jednom primeru izvođenja, jedan ili više određenih aminokiselinskih ostataka su izmenjeni korišćenjem, na primer, protokola za mesto-specifičnu mutagenezu. U drugom primeru izvođenja, jedan ili više nasumično odabranih ostataka je izmenjen korišćenjem, na primer, protokola za nasumičnu mutagenezu. Bez obzira na to kako je napravljen, mutantni polipeptid može da se eksprimira i ispita da li poseduje željeno svojstvo.
[0330] Mutacije mogu da budu uvedene u nukleinsku kiselinu bez značajne izmene biološke aktivnosti polipeptida koji ona kodira. Na primer, mogu da se uvedu nukleotidne supstitucije koje vode do aminokiselinskih supstitucija na neesencijalnim aminokiselinskim ostacima. Alternativno, u nukleinsku kiselinu može da se uvede jedna ili više mutacija koje selektivno menjaju biološku aktivnost polipeptida koji ona kodira. Na primer, mutacija može kvantitativno ili kvalitativno da izmeni biološku aktivnost. Primeri kvantitativnih izmena uključuju povećanje, smanjenje ili uklidanje aktivnosti. Primeri kvalitativnih izmena uključuju promenu antigene specifičnosti antitela. U jednom primeru izvođenja, nukleinska kiselina koja kodira bilo koji antigen-vezujući protein koji je ovde opisan može da bude mutirana tako da izmeni aminokiselinsku sekvencu korišćenjem tehnika molekularne biologije koje su dobro poznate u struci.
[0331] Još jedan aspekt obezbeđuje molekule nukleinske kiseline koji su pogodni za upotrebu kao prajmeri ili hibridizacione probe za detekciju sekvence nukleinskih kiselina. Molekul nukleinske kiseline može da sadrži samo deo sekvence nukleinske kiseline koja kodira polipeptid pune dužine, na primer, fragment koji može da se koristi kao proba ili prajmer ili fragment koji kodira aktivni deo (npr., deo za vezivanje za CGRP R) polipeptida.
[0332] Probe koje se zasnivaju na sekvenci nukleinske kiseline mogu da se koriste za detekciju nukleinske kiseline ili sličnih nukleinskih kiselina, na primer, transkripata koji kodiraju polipeptid. Proba može da sadrži grupu za obeležavanje, npr., radioizotop, fluorescentno jedinjenje, enzim, ili enzimski kofaktor. Takve probe mogu da se koriste za identifikovanje ćelije koja eksprimira polipeptid.
[0333] Drugi aspekt obezbeđuje vektore koji sadrže nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid ili njegov deo (npr., fragment koji sadrži jedan ili više CDR regiona ili jedan ili više domena varijabilnog regiona). Primeri vektora uključuju, ali bez ograničenja, plazmide, viralne vektore, neepizomalne sisarske vektore i ekspresione vektore, na primer, rekombinantne ekspresione vektore. Rekombinantni ekspresioni vektori mogu da sadrže nukleinsku kiselinu u obliku pogodnom za ekspresiju nukleinske kiseline u ćeliji-domaćinu. Rekombinantni ekspresioni vektori uključuju jednu ili više regulatornih sekvenci, odabranu na osnovu ćelija-domaćina koje će se koristiti za ekspresiju, koja je operativno povezana sa sekvencom nukleinske kiseline koja treba da se eksprimira. Regulatorne sekvence uključuju one koje usmeravaju konstitutivnu ekspresiju nukleotidne sekvence u mnogim tipovima ćelija-domaćina (npr., pojačivač ranog gena SV40, promotor Rous sarkoma virusa i citomegalovirusni promotor), one koje usmeravaju ekspresiju nukleotidne sekvence samo u određenim ćelijama-domaćinima (npr., tkivno-specifične regulatorne sekvence, videti, Voss et al., 1986, Trends Biochem. Sci.11:287, Maniatis et al., 1987, Science 236:1237), i one koje usmeravaju inducibilnu ekspresiju nukleotidne sekvence kao odgovor na određeni tretman ili stanje (npr., metalotioninski promotor u sisarskim ćelijama i tetresponsivni i/ili streptomicin responsivni promotor u prokariotskim i eukariotskim sistemima (videti, id.)). Stručnjacima u oblasti će biti jasno da dizajn ekspresionog vektora može da zavisi od takvih faktora kao što je izbor ćelije-domaćina koji treba da se transformiše, željenog nivoa ekspresije proteina, itd. Ekspresioni vektori mogu da budu uvedeni u ćelije-domaćine da tu proizvode proteine ili peptide, uključujući fuzione proteine ili peptide, kodirane nukleinskim kiselinama kao što je ovde opisano.
[0334] Drugi aspekt obezbeđuje ćelije-domaćine u koje je rekombinantni ekspresioni vektor uveden. Ćelija-domaćin može da bude bilo koja prokariotska ćelija (na primer, E. coli) ili eukariotska ćelija (na primer, kvasac, insekt, ili sisarske ćelije (npr., CHO ćelije)). Vektorska DNK može da se uvede u prokariotske ili eukariotske ćelije putem uobičajenih tehnika transformacije ili transfekcije. Kada je u pitanju stabilna transfekcija sisarskih ćelija, poznato je da, u zavisnosti od ekspresionog vektora i korišćene tehnike transfekcije, samo mali deo ćelija može da integriše stranu DNK u svoj genom. U cilju identifikovanja i odabira ovih ćelija, gen koji kodira selektabilni marker (npr., za otpornost na antibiotike) se uopšteno uvodi u ćelije-domaćine zajedno sa genom od interesa. Poželjni selektabilni markeri uključuju one koji stvaraju otpornost na lekove, kao što su G418, higromicin i metotreksat. Ćelije koje su stabilno transficirane uvedenom nukleinskom kiselinom mogu da budu identifikovane selekcijom pomoću leka (npr., ćelije koje su ugradile selektabilni marker gen će preživeti, dok će ostale ćelije umreti), između ostalih postupaka.
Priprema antigen-vezujućih proteina
[0335] Nehumana antitela koja su obezbeđena mogu da, na primer, potiču iz bilo koje životinje koja proizvodi antitelo, kao što je miš, pacov, zec, koza, magarac, ili nehumani primat (kao što je majmun (npr., cinomolgus ili rezus majmun) ili čovekoliki majmun (npr., šimpanza)). Nehumana antitela mogu da se koriste, na primer, u in vitro ćelijskoj kulturi i primenama zasnovanim na ćelijskoj kulturi, ili u bilo kojoj drugoj primeni u kojoj ne dolazi do imunskog odgovora na antitelo, ili je on beznačajan, može da se spreči, ne razmatra se, ili je poželjan. U određenim primerima izvođenja, antitela mogu da budu proizvedena imunizacijom životinja korišćenjem postupaka poznatih u stanju tehnike, kao što je prethodno opisano i/ili je opisano u primerima 1-3 u nastavku teksta. Primeri opisuju stvaranje CGRP R antitela korišćenjem tri različita imunogena preparata -(i) celih ćelija koje eksprimiraju verzije pune dužine dve glavne komponente CGRP R - RAMP1 i CRLR; (ii) membranskih ekstrakata iz takvih ćelija; i (iii) rastvornog CGRP R dobijenog koekspresijom i prečišćavanjem N-terminalnih vanćelijskih domena CRLR i RAMP1. Antitela mogu da budu poliklonska, monoklonska, ili mogu da budu sintetisana u ćelijama-domaćinima ekspresijom rekombinantne DNK. Potpuno humana antitela mogu da budu pripremljena kao što je prethodno opisano imunizacijom transgenih životinja koje sadrže humane imunoglobulinske lokuse ili izborom biblioteke prikaza na fagu koja eksprimira repertoar humanih antitela.
[0336] Monoklonska antitela (mAb) mogu da se proizvedu različitim tehnikama, uključujući uobičajenu metodologiju za monoklonsko antitelo, npr., standardnom tehnikom hibridizacije somatskih ćelija prema Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495. Alternativno, druge tehnike za proizvodnju monoklonskih antitela mogu da se koriste, na primer, viralna ili onkogena transformacija B-limfocita. Jedan od pogodnih životinjskih sistema za pripremu hibridoma je mišji sistem, što predstavlja dobro poznati postupak. Protokoli imunizacije i tehnike izolacije imunizovanih splenocita za fuziju su poznati u stanju tehnike i ilustrativni pristupi su opisani u primerima u nastavku teksta. U takvim postupcima, B ćelije iz imunizovanih miševa se tipično fuzionišu sa pogodnim imortalizovanim fuzionim partnerom, kao što je mišja ćelijska linija mijeloma. Po želji, pacovi ili drugi sisari mogu da se imunizuju umesto miševa i B ćelije iz takvih životinja mogu da se fuzionišu sa mišjom ćelijskom linijom mijeloma da bi se obrazovali hibridomi. Alternativno, može da se koristi ćelijska linija mijeloma koja potiče iz izvora koji nije miš. Postupci fuzije za pravljenje hibridoma su takođe dobro poznati.
[0337] Jednolančana antitela koja su obezbeđena mogu da budu obrazovana povezivanjem fragmenata varijabilnog domena teškog i lakog lanca (Fv region) preko aminokiselinskog mosta (kratki peptidni linker), čime nastaje pojedinačani polipeptidni lanac. Takvi jednolančani fragmenti Fv (scFv) mogu da se pripreme fuzionisanjem DNK koja kodira peptidni linker između DNK koje kodiraju dva varijabilna domena polipeptida (VLi VH). Rezultujući polipeptidi mogu da se sklope sami tako da obrazuju antigen-vezujuće monomere, ili mogu da obrazuju multimere (npr., dimere, trimere, ili tetramere), u zavisnosti od dužine fleksibilnog linkera između dva varijabilna domena (Kortt et al., 1997, Prot. Eng.10:423; Kortt et al., 2001, Biomol. Eng.18:95-108). Kombinovanjem polipeptida koji sadrže različite VLi VH, mogu da se obrazuju multimerni scFv koji se vezuju za različite epitope (Kriangkum et al., 2001, Biomol. Eng. 18:31-40). Tehnike razvijene za proizvodnju jednolančanih antitela uključuju one opisane u SAD pat. br.4,946,778; Bird, 1988, Science 242:423; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.85:5879; Ward et al., 1989, Nature 334:544, de Graaf et al., 2002, Methods Mol Biol. 178:379-387. Jednolančana antitela izvedena iz antitela koja su ovde obezbeđena uključuju, ali bez ograničenja, scFv koji sadrže kombinacije varijabilnog domena varijabilnih regiona teškog i lakog lanca prikazanih u tabeli 3, ili kombinacije varijabilnih domena lakog i teškog lanca koje uključuju CDR regione prikazane u tabelama 4A i 4B.
[0338] Ovde obezbeđena antitela, koja pripadaju jednoj potklasi, mogu da se izmene u antitela druge potklase korišćenjem postupaka za promenu potklase. Tako, IgG antitela mogu, na primer, da budu izvedena iz IgM antitela i obrnuto. Takve tehnike omogućavaju pripemu novih antitela koja imaju antigen-vezujuća svojstva datog antitela (roditeljskog antitela), ali takođe ispoljavaju biološka svojstva povezana sa izotipom antitela ili potklasom drugačijom od roditeljskog antitela. Mogu da se korste tehnike rekombinantne DNK. Klonirana DNK koja kodira polipeptide određenog antitela može da bude uključena u takve postupke, npr., DNK koja kodira konstantni domen antitela željenog izotipa. Videti, npr., Lantto et al., 2002, Methods Mol. Biol.178:303-316.
[0339] U skladu sa tim, antitela koja su obezbeđena uključuju ona koja sadrže, na primer, opisane kombinacije varijabilnog domena, supra., koje imaju željeni izotip (na primer, IgA, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, i IgD) kao i njihove Fab ili F(ab’)2fragmente. Osim toga, ako je poželjan IgG4, može takođe da bude poželjno uvođenje tačkaste mutacije (CPSCP->CPPCP) u region zgloba kao što je opisano kod Bloom et al., 1997, Protein Science 6:407 da bi se ublažila sklonost ka obrazovanju disulfidnih veza unutar H lanca koje mogu da dovodu do heterogenosti IgG4 antitela.
[0340] Osim toga, poznate su i tehnike za izvođenje antitela koja imaju drugačija svojstva (tj., različite afinitete za antigen za koji se vezuju). Jedna takva tehnika, nazvana mešanje lanaca, uključuje prikazivanje repertoara gena za imunoglobulinski varijabilni domen na površini filamentoznog bakteriofaga, često označeno kao prikaz na fagu. Mešanje lanaca je korišćeno za pripremu visokoafinitetnih antitela na hapten 2-feniloksazol-5-on, kao što je opisano kod Marks et al., 1992, BioTechnology 10:779.
[0341] Konzervativne modifikacije mogu da se izvedu na varijabilnim regionima teškog i lakog lanca opisanim u tabeli 3, ili CDR regionima opisanim u tabelama 4A i 4B (i odgovarajuće modifikacije u kodirajućim nukleinskim kiselinama) da bi se proizveo CGRP R-vezujući protein koji ima određena poželjna funkcionalna i biohemijska svojstva. Postupci za postizanje takvih modifikacija su prethodno opisani.
[0342] CGRP antigen-vezujući proteini mogu da budu dodatno modifikovani na razne načine. Na primer, ako treba da se koriste u terapeutske svrhe, mogu da budu konjugovani sa polietilen glikolom (pegilovani) da bi se produžio serumski polu-život ili da bi se poboljšala dostava proteina. Alternativno, V region predmetnih antitela ili njihovih fragmenata može da bude fuzionisan sa Fc regionom drugog molekula antitela. Fc region koji se koristi u ovu svrhu može da bude modifikovan tako da ne vezuje komplement, smanjujući tako verovatnoću indukovanja lize ćelija kod pacijenta kada se fuzioni protein koristi kao terapeutsko sredstvo. Osim toga, predmetna antitela ili njihovi funkcionalni fragmenti mogu da budu konjugovani sa humanim serum albuminom da bi se poboljšao serumski polu-život antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta. Još jedan koristan fuzioni partner za antigen-vezujuće proteine ili njihove fragmente je transtiretin (TTR). TTR ima kapacitet da obrazuje tetramer, tako da fuzioni protein antitelo-TTR može da obrazuje multivalentno antitelo koje može da poveća njegov aviditet vezivanja.
[0343] Alternativno, suštinske modifikacije funkcionalnih i/ili biohemijskih svojstava antigenvezujućih proteina koji su ovde opisani mogu da se postignu uvođenjem supstitucija u aminokiselinsku sekvencu teškog i lakog lanca koje se značajno razlikuju po svom dejstvu na uspostavljanje (a) strukture molekularnog skeleta u oblasti supstitucije, na primer, kao što je konformacija naborane ploče ili spirale, (b) naelektrisanja ili hidrofobnosti molekula na ciljnom mestu, ili (c) obimnosti bočnog lanca. "Konzervativna supstitucija aminokiseline" može da uključuje supstituciju nativnog aminokiselinskog ostatka ostatkom koji nije nativan, koja ima malo, ili nema efekta na polarnost ili naelektrisanje aminokiselinskog ostatka na tom položaju. Videti, tabelu 4, supra. Dalje, bilo koji nativni ostatak u polipeptidu može takođe da bude supstituisan alaninom, kao što je prethodno opisano za alanin-skenirajuću mutagenezu.
[0344] Stručnjaci u oblasti mogu da implementiraju aminokiselinske supstitucije predmetnog antitela (bilo konzervativne ili nekonzervativne) primenom rutinskih tehnika. Aminokiselinske supstitucije mogu da se koriste za identifikovanje značajnih ostataka ovde obezbeđenih antitela, ili za povećanje ili smanjenje afiniteta ovih antitela za humani CGRP R, ili za modifikovanje afiniteta vezivanja drugih ovde opisanih antigen-vezujućih proteina.
Postupci za eksprimiranje antigen-vezujućih proteina
[0345] Ovde su takođe obezbeđeni ekspresioni sistemi i konstrukti u obliku plazmida, ekspresionih vektora, transkripcionih ili ekspresionih kaseta koje sadrže bar jedan gore opisani polinukleotid, kao i ćelije-domaćini koje sadrže takve ekspresione sisteme ili konstrukte.
[0346] Antigen-vezujući proteini koji su ovde obezbeđeni mogu da budu pripremljeni bilo kojom od brojnih uobičajenih tehnika. Na primer, CGRP R antigen-vezujući proteini mogu da budu proizvedeni u rekombinantnim ekspresionim sistemima, korišćenjem bilo kog postupka poznatog u stanju tehnike. Videti, npr., Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.) Plenum Press, New York (1980); i Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988).
[0347] Antigen-vezujući proteini mogu da budu eksprimirani u ćelijskim linijama hibridoma (npr., naročito antitela mogu da budu eksprimirana u hibridomima) ili u ćelijskim linijama koje nisu hibridomi. Ekspresioni konstrukti koji kodiraju antitela mogu da se koriste da transformišu sisarsku, insekatsku ili mikrobijalnu ćeliju-domaćina. Transformacija može da se izvede korišćenjem bilo kog poznatog postupka za uvođenje polinukleotida u ćeliju-domaćina, uključujući, na primer pakovanje polinukleotida u virus ili bakteriofag i transdukciju ćelijedomaćina konstruktom transfekcionim postupcima poznatim u stanju tehnike, kao što je prikazano primerima u SAD patentu br. 4,399,216; br. 4,912,040; br. 4,740,461; br. 4,959,455. Optimalni postupak koji se koristi za transformaciju će zavisiti od toga koji tip ćelije-domaćina se transformiše. Postupci za uvođenje heterologih polinukleotida u sisarske ćelije su dobro poznati u stanju tehnike i uključuju, ali bez ograničenja, transfekciju posredovanu dekstranom, taloženje kalcijum fosfatom, transfekciju posredovanu polibrenom, fuziju protoplasta, elektroporaciju, inkapsulaciju polinukleotida u lipozome, mešanje nukleinske kiseline sa pozitivno-naelektrisanim lipidima i direktnu mikroinjekciju DNK u jedra.
[0348] Rekombinantni ekspresioni konstrukti tipično sadrže molekul nukleinske kiseline koja kodira polipeptid koji sadrži jedan ili više od sledećeg: jedan ili više CDR regiona koji su ovde obezbeđeni; konstantni region lakog lanca; varijabilni region lakog lanca; konstantni region teškog lanca (npr., CH1, CH2 i/ili CH3); i/ili drugi noseći deo CGRP R antigen-vezujućeg proteina. Ove sekvence nukleinske kiseline su ubačene u odgovarajući ekspresioni vektor korišćenjem standardnih tehnika ligacije. U jednom primeru izvođenja, konstantni region teškog ili lakog lanca je dodat C-kraju anti-CGRP R-specifičnog varijabilnog regiona teškog ili lakog lanca i ligiran u ekspresioni vektor. Vektor je tipično odabran tako da bude funkcionalan u konkretnoj ćelijidomaćinu koja se koristi tj., vektor je kompatibilan sa mehanizmima ćelije-domaćina, omogućavajući odvijanje amplifikacije i/ili ekspresije gena). U nekim primerima izvođenja, upotrebljavaju se vektori koji koriste testove komplementacije protein-fragment korišćenjem proteina-reportera, kao što je dihidrofolat reduktaza (videti, na primer, SAD pat. br. 6,270,964). Pogodni ekspresioni vektori mogu da se nabave, na primer, od Invitrogen Life Technologies ili BD Biosciences (ranije "Clontech"). Drugi korisni vektori za kloniranje i ekspresiju antitela i fragmenata uključuju one opisane kod Bianchi and McGrew, 2003, Biotech. Biotechnol. Bioeng.
84:439-44. Dodatni pogodni ekspresioni vektori su diskutovani, na primer, u Methods Enzymol., vol. 185 (D. V. Goeddel, ed.), 1990, New York: Academic Press.
[0349] Tipično, ekspresioni vektori korišćeni u bilo kojim ćelijama-domaćinima, sadržavaće sekvence za održavanje plazmida i za kloniranje i ekspresiju egzogenih nukleotidnih sekvenci. Takve sekvence, pod zajedničkim nazivom "granične sekvence" u određenim primerima izvođenja će tipično uključivati jednu ili više od sledećih nukleotidnih sekvenci: promotor, jednu ili više sekvenci za pojačavanje, oridžin replikacije, transkripcionu terminacionu sekvencu, potpunu intronsku sekvencu koja sadrži donorsko i akceptorsko mesto za isecanje introna, sekvencu koja kodira lider sekvencu za sekreciju polipeptida, mesto vezivanja ribozoma, poliadenilacionu sekvencu, region polilinkera za insertovanje nukleinske kiseline koja kodira polipeptid koji treba da se eksprimira, i element selektabilnog markera. Svaka od ovih sekvenci se razmatra u nastavku teksta.
[0350] Izborno, vektor može da sadrži sekvencu koja kodira "oznaku", tj., oligonukleotidni molekul smešten na 5’ ili 3’ kraju sekvence koja kodira CGRP R-vezujući protein; oligonukleotidnu sekvencu koja kodira polyHis (kao što je hexaHis), ili drugu oznaku kao što je FLAG®, HA (hemaglutinin influenca virusa), ili myc, za koji postoje komercijalno dostuna antitela. Ova oznaka je tipično fuzionisana sa polipeptidom nakon ekspresije polipeptida, i može da služi kao sredstvo za afinitetno prečišćavanje ili detekciju CGRP R-vezujućeg proteina u ćelijidomaćinu. Afinitetno prečišćavanje može da se postigne, na primer, hromatografijom na koloni korišćenjem antitela protiv oznake kao afinitetne matrice. Izborno, oznaka može zatim da se ukloni sa prečišćenog CGRP R-vezujućeg proteina različitim sredstvima kao što je korišćenje određenih peptidaza za isecanje.
[0351] Granične sekvence mogu da budu homologe (tj., iz iste vrste i/ili soja kao ćelija-domaćin), heterologe (tj., iz vrste drugačije nego što je vrsta ili soj ćelije-domaćina), hibridne (tj., kombinacija graničnih sekvenci iz više od jednog izvora), sintetske ili nativne. Tako, izvor granične sekvence može da bude bilo koji prokariotski ili eukariotski organizam, bilo koji organizam vertebrata ili invertebrata, ili bilo koja biljka, pod uslovom da je granična sekvenca funkcionalna u njemu, i da može da se aktivira mehanizmima ćelije-domaćina.
[0352] Granične sekvence korisne u vektorima mogu da se dobiju bilo kojim od nekoliko postupaka dobro poznatih u stanju tehnike. Tipično, granične sekvence koje su ovde korisne će prethodno biti identifikovane mapiranjem i/ili digestijom restrikcionom endonukleazom, i mogu prema tome da budu izolovane iz odgvarajućeg izvora tkiva korišćenjem odgovarajućih restrikcionih endonukleaza. U nekim slučajevima, može da bude poznata potpuna nukleotidna sekvenca granične sekvence. Ovde, granična sekvenca može da se sintetiše korišćenjem ovde opisanih postupaka za sintezu ili kloniranje nukleinske kiseline.
[0353] Bilo da je poznata cela, ili samo deo granične sekvence, ona može da se dobije korišćenjem lančane reakcije polimeraze (PCR) i/ili pregledom genomske biblioteke pogodnom probom kao što je oligonukleotid i/ili fragment granične sekvence iz iste ili druge vrste. Tamo gde granična sekvenca nije poznata, fragment DNK koji sadrži graničnu sekvencu može da bude izolovan iz većeg dela DNK koji može da sadrži, na primer, kodirajuću sekvencu ili čak drugi gen ili gene. Izdvajanje može da se postigne digestijom restrikcionom endonukleazom da bi se dobio pogodan DNK fragment, praćenom izdvajanjem korišćenjem prečišćavanja na agaroznom gelu, hromatografije na koloni Qiagen® (Chatsworth, CA), ili drugih postupaka poznatih stručnjaku u oblasti. Izbor pogodnih enzima za ovu svrhu će biti sasvim očigledan stručnjaku u oblasti.
[0354] Oridžin replikacije je tipično deo onih prokariotskih ekspresionih vektora koji se komercijalno nabavljaju, i oridžin pomaže u amplifikaciji vektora u ćeliji-domaćinu. Ako izabrani vektor ne sadrži oridžin replikacije, on može da bude hemijski sintetisan na osnovu poznate sekvence, i ligiran u vektor. Na primer, oridžin replikacije iz plazmida pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA) je pogodan za većinu gram-negativnih bakterija, a različiti virusni oridžini (npr., SV40 virusa, polioma virusa, adenovirusa, virusa vezikularnog stomatitisa (VSV), ili papilomavirusa kao što su HPV ili BPV) su korisni za kloniranje vektora u sisarske ćelije. Uopšteno, komponenta oridžina replikacije nije potrebna za sisarske ekspresione vektore (na primer, oridžin SV40 se često koristi samo zato što sadrži i virusni rani promotor).
[0355] Transkripciona terminaciona sekvenca je tipično smeštena 3’ u odnosu na kraj kodirajućeg regiona za polipeptid i služi da završi transkripciju. Obično, transkripciona terminaciona sekvenca u prokariotskim ćelijama predstavlja fragment bogat G-C parovima praćen poly-T sekvencom. Dok se sekvenca lako klonira iz biblioteke ili čak nabavlja komercijalno kao deo vektora, ona takođe može lako da se sintetiše korišćenjem postupaka za sintezu nukleinske kiseline kao što su oni koji su ovde opisani.
[0356] Gen za selektabilni marker kodira protein neophodan za preživljavanje i rast ćelijedomaćina gajene u selektivnom medijumu za kulturu. Tipični geni za selekcioni marker kodiraju proteine koji (a) stvaraju otpornost na antibiotike ili druge toksine, npr., ampicilin, tetraciklin, ili kanamicin za prokariotske ćelije-domaćine; (b) komplementiraju auksotrofne nedostatke ćelije; ili (c) obezbeđuju kritične hranljive supstance koje nisu dostupne u složenom ili definisanom medijumu. Specifični selektabilni markeri su gen za otpornost na kanamicin, gen za otpornost na ampicilin, i gen za otpornost na tetraciklin. Pogodno, gen za otpornost na neomicin može takođe da se koristi za selekciju i kod prokariotskih i kod eukariotskih ćelija-domaćina.
[0357] Drugi selektabilni geni mogu da se koriste za umnožavanje gena koji će biti eksprimiran. Amplifikacija je postupak u kome se geni koji su potrebni za proizvodnju proteina kritičnog za rast ili preživljavanje ćelije ponavljaju u tandemu u hromozomima sukcesivnih generacija rekombinantnih ćelija. Primeri pogodnih selektabilnih markera za sisarske ćelije uključuju dihidrofolat reduktazu (DHFR) i gene za timidin kinazu bez promotora. Transformisane sisarske ćelije se izlažu selektivnom pritisku pod kojim su samo transformisane ćelije jedinstveno prilagođene da prežive pomoću selektabilnih gena prisutnih u vektoru. Selektivni pritisak je nametnut gajenjem transformisanih ćelija pod uslovima u kojima se sukcesivno povećava koncentracija selektivnog sredstva u medijumu, što dovodi do amplifikacije i selektabilnog gena i DNK koja kodira drugi gen, kao što je gen za antigen-vezujući protein koji se vezuje za CGRP R. Kao rezultat, sintetišu se povećane količine polipeptida kao što je antigen-vezujući protein sa umnožene DNK.
[0358] Mesto vezivanja za ribozom je obično neophodno za započinjanje translacije iRNK i odlikuje se Shine-Dalgarno sekvencom (prokarioti) ili Kozak sekvencom (eukarioti). Element je tipično smešten 3’ u odnosu na promotor i 5’ u odnosu na kodirajuću sekvencu polipeptida koji treba da se eksprimira.
[0359] U nekim slučajevima, kao kada je glikozilacija poželjna u ekspresionom sistemu sa eukariotskom ćelijom-domaćinom, mogu da se umnože različite pre- ili pro-sekvence da bi se poboljšala glikozilacija ili prinos. Na primer, može da se izmeni mesto isecanja peptidazom određenog signalnog peptida, ili da se dodaju prosekvence, koje takođe mogu da utiču na glikozilaciju. Finalni proteinski proizvod može da ima, na položaju -1 (u odnosu na prvu aminokiselinu zrelog proteina), jednu ili više dodatnih aminokiselina dodatih tokom ekspresije, koje mogu da ne budu u potpunosti uklonjene. Na primer, finalni proteinski proizvod može da ima jedan ili dva aminokiselinska ostatka koji se nalaze na mestu isecanja peptidazom, dodatih na amino-kraju. Alternativno, upotreba nekih mesta isecanja enzimima može da rezultuje u blago skraćenom obliku željenog polipeptida, ako je mesto isecanja enzimom u zrelom polipeptidu.
[0360] Ekspresija i kloniranje će tipično uključivati promotor koji prepoznaje organizam domaćina i koji je operativno spojen sa molekulom koja kodira CGRP R-vezujući protein. Promotori su sekvence koje se ne prepisuju, smeštene ushodno (tj., 5’) od start kodona strukturnog gena (uopšteno unutar oko 100 do 1000 bp) koje kontrolišu transkripciju strukturnog gena. Promotori su dogovorno grupisani u jednu od dve klase: inducibilni promotori i konstitutivni promotori. Inducibilni promotori iniciraju povišene nivoe transkripcije sa DNK pod njihovom kontrolom kao odgovor na neku promenu u kultivacionim uslovima, kao što je prisustvo ili odsustvo hranljivog sastojka ili promena temperature. Konstitutivni promotori, sa druge strane, ravnomerno prepisuju gen za koji su operativno vezani, što znači, sa malo ili nimalo kontrole nad ekspresijom gena. Veliki broj promotora, koje prepoznaju različite potencijalne ćelije-domaćini, su dobro poznati. Pogodni promotor se operativno vezuje za DNK koja kodira teški lanac ili laki lanac koji obrazuje CGRP R-vezujući protein, uklanjanjem promotora iz izvorne DNK digestjom restrikcionim enzimom i ubacivanjem željene promotorske sekvence u vektor.
[0361] Pogodni promotori za upotrebu sa kvascem kao domaćinom su takođe dobro poznati u stanju tehnike. Sekvence za pojačavanje kvasca se pogodno koriste sa promotorima kvasca. Pogodni promotori za upotrebu sa sisarskim ćelijama-domaćinima su dobro poznati i uključuju, ali bez ograničenja, one dobijene iz genoma virusa kao što je polioma virus, virus kokošjih boginja, adenovirus (kao što je adenovirus 2), papiloma virus goveda, ptičji sarkoma virus, citomegalovirus, retrovirusi, virus hepatitisa-B, i Simian Virus 40 (SV40). Drugi pogodni sisarski promotori uključuju heterologne sisarske promotore, na primer, promotore toplotnog šoka i aktinski promotor.
[0362] Dodatni promotori koji mogu da budu od interesa uključuju, ali bez ograničenja: rani promotor SV40 (Benoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310); promotor CMV (Thornsen et al., 1984, Proc. Natl. Acad. U.S.A. 81:659-663); promotor sadržan u 3’ dugom terminalnom ponovku Rous sarkoma virusa (Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797); promotor timidin kinaze herpesa (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.78:1444-1445); promotor i regulatorne sekvence iz gena za metalotionin (Prinster et al., 1982, Nature 296:39-42); i prokariotske promotore kao što je promotor beta-laktamaze (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731); ili tac promotor (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.80:21-25). Takođe su od interesa sledeći regioni koji kontrolišu transkripciju životinjskog porekla, koji ispoljavaju tkivnu specifičnost i korišćeni su u transgenim životinjama: kontrolni region gena za elastazu I koji je aktivan u acinarnim ćelijama pankreasa (Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); kontrolni region insulinskog gena koji je aktivan u beta ćelijama pankreasa (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122); kontrolni region imunoglobulinskog gena koji je aktivan u limfoidnim ćelijama (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444); kontrolni region mišjeg virusa tumora mlečne žlezde koji je aktivan u testikularnim, ćelijama dojke, limfoidnim i mast ćelijama (Leder et al., 1986, Cell 45:485-495); kontrolni region za albuminski gen koji je aktivan u jetri (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel.1 :268-276); kontrolni region gena za alfafeto-protein koji je aktivan u jetri (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 253:53-58); kontrolni region alfa 1-antitripsinskog gena koji je aktivan u jetri (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel.1:161-171); kontrolni region beta-globinskog gena koji je aktivan u mijeloidnim ćelijama (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94); kontrolni region gena za osnovni protein mijelina koji je aktivan u oligodendrocitnim ćelijama mozga (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712); kontrolni region gena za miozinski laki lanac-2 koji je aktivan u skeletnom mišiću (Sani, 1985, Nature 314:283-286); i kontrolni region gena za gonadotropni oslobađajući hormon koji je aktivan u hipotalamusu (Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378).
[0363] Sekvenca za pojačavanje može da bude ubačena u vektor da bi povećala transkripciju DNK koja kodira laki lanac ili teški lanac, koji obrazuje humani CGRP R-vezujući protein kod viših eukariota. Pojačivači su cis-delujući elementi DNK, dugi obično oko 10-300 bp, koji deluju na promotor povećavajući transkripciju. Pojačivači ne zavise od relativne orijentacije i položaja, nađeni su i na 5’ i na 3’ položaju u odnosu na transkripcionu jedinicu. Poznato je nekoliko sekvenci za pojačavanje dostupnih u sisarskim genima (npr., genima za globin, elastazu, albumin, alfa-fetoprotein i insulin). Tipično se, međutim, koristi pojačivač iz virusa. Primeri elemenata za pojačavanje za aktivaciju eukariotskih promotora, poznati u stanju tehnike su pojačivač SV40, pojačivač ranog promotora citomegalovirusa, pojačivač polioma virusa, i adenovirusni pojačivači. Iako pojačivač može da bude smešten u vektoru ili 5’ ili 3’ u odnosu na kodirajuću sekvencu, tipično je smešten 5’ u odnosu na promotor. Sekvenca koja kodira odgovarajuću nativnu ili heterolognu signalnu sekvencu (lider sekvencu ili signalni peptid) može da se ugradi u ekspresioni vektor, da bi pospešivala vanćelijsku sekreciju antitela. Izbor signalnog peptida ili lidera zavisi od vrste ćelija-domaćina u kojima će antitelo biti proizvedeno, i heterologna signalna sekvenca može da zameni nativnu signalnu sekvencu. Primeri signalnih peptida koji su funkcionalni u sisarskim ćelijama-domaćinima uključuju sledeće: signalnu sekvencu za interleukin-7 (IL-7) opisanu u SAD patentu br.4,965,195; signalnu sekvencu za receptor za interleukin-2 opisanu kod Cosman et al., 1984, Nature 312:768; signalni peptid za receptor za interleukin-4 opisan u EP patentu br. 0367 566; signalni peptid za receptor tipa I za interleukin-1 opisan u SAD patentu br.4,968,607; signalni peptid za receptor tipa II za interleukin-1 opisan u EP patentu br.0 460 846.
[0364] Ekspresioni vektori koja su obezbeđeni mogu da budu konstruisani od polaznog vektora kao što je komercijalno dostupni vektor. Takvi vektori mogu, ali ne moraju da sadrže sve željene granične sekvence. Kada jedna ili više graničnih sekvenci koje su ovde opisane nije već prisutna u vektoru, one mogu da budu pojedinačno dobijene i ligirane u vektor. Postupci koji se koriste za dobijanje svake od graničnih sekvenci su dobro poznati stručnjaku u oblasti.
[0365] Nakon konstruisanja vektora i insertovanja molekula nukleinske kiseline koja kodira laki lanac, teški lanac, ili laki lanac i teški lanac koji obrazuju CGRP R antigen-vezujuću sekvencu, na odgovarajuće mesto u vektoru, kompletni vektor može da budu ubačen u odgovarajuću ćelijudomaćina za amplifikaciju i/ili ekspresiju polipeptida. Transformacija odabrane ćelije-domaćina ekspresionim vektorom za antigen-vezujući protein može da se postigne dobro poznatim postupcima uključujući transfekciju, infekciju, koprecipitaciju kalcijum fosfatom, elektroporaciju, mikroinjektovanje, lipofekciju, transfekciju posredovanu DEAE-dekstranom, ili druge poznate tehnike. Odabrani postupak će delom zavisiti od ćelije-domaćina koja će se koristiti. Ovi postupci i drugi pogodni postupci su dobro poznati iskusnom stručnjaku, i prikazani su, na primer, kod Sambrook et al., 2001, supra.
[0366] Ćelija-domaćin, kada se gaji u odgovarajućim uslovima, sintetiše antigen-vezujući protein koji zatim može da se sakupi iz medijuma kulture (ako ga ćelija-domaćin sekretuje u medijum) ili direktno iz ćelije-domaćina koja ga proizvodi (ako se ne sekretuje). Izbor odgovarajuće ćelijedomaćina će zavisiti od različitih faktora, kao što su željeni nivoi ekspresije, modifikacija polipeptida koje su poželjne ili neophodne za aktivnost (kao što je glikozilacija ili fosforilacija) i lakoća sklapanja u biološki aktivni molekul.
[0367] Sisarske ćelijske linije koje su dostupne kao domaćini za ekspresiju su dobro poznate u stanju tehnike i uključuju, ali bez ograničenja, imortalizovane ćelijske linije dostupne iz kolekcije American Type Culture Collection (ATCC), uključujući, ali bez ograničenja ćelije ovarijuma kineskog hrčka (CHO), HeLa ćelije, ćelije bubrega bebe hrčka (BHK), ćelije majmunskog bubrega (COS), ćelije humanog hepatocelularnog karcinoma (npr., Hep G2), i brojne druge ćelijske linije. U određenim primerima izvođenja, ćelijske linije mogu da budu odabrane kroz određivanje ćelijskih linija koje imaju visoke nivoe ekspresije i konstitutivno proizvode antigen-vezujuće proteine sa svojstvima vezivanja za CGRP R. U drugom primeru izvođenja, može da se odabere ćelijska linija iz B ćelijske linije koja ne sintetiše sopstveno antitelo, ali ima kapacitet da proizvede i sekretuje heterologno antitelo.
Upotreba humanih CGRP antigen-vezujućih proteina u dijagnostičke i terapeutske svrhe
[0368] Antigen-vezujući proteini su korisni za detekciju CGRP R u biološkim uzorcima i identifikaciju ćelija ili tkiva koja proizvode CGRP R. Na primer, CGRP R antigen-vezujući proteini mogu da se koriste u dijagnostičkim testovima, npr., testovima vezivanja, za detekciju i/ili kvantifikaciju CGRP R eksprimiranog u tkivu ili ćeliji. Antigen-vezujući proteini koji se specifično vezuju za CGRP R mogu takođe da se koriste u lečenju bolesti povezanih sa CGRP R kod pacijenta kome je to potrebno. Osim toga, CGRP R antigen-vezujući proteini mogu da se koriste za inhibiciju obrazovanja kompleksa CGRP R sa njegovim ligandom CGRP, modulišući na taj način biološku aktivnost CGRP R u ćeliji ili tkivu. Primeri aktivnosti koje mogu da se modulišu uključuju, ali bez ograničenja, inhibiciju vazodilatacije i/ili smanjenje neurogene inflamacije. Antigen-vezujući proteini koji se vezuju za CGRP R na taj način mogu da modulišu i/ili blokiraju interakciju sa drugim jedinjenjima koja se vezuju i kao takva mogu da imaju terapeutsku upotrebu ublažavanju bolesti povezanih sa CGRP R.
Indikacije
[0369] Bolest ili stanje povezano sa humanim CGRP R uključuje bilo koju bolest ili stanje čija pojava kod pacijenta je izazvana, bar delimično, interakcijom CGRP R sa njegovim ligandom, CGRP. Ozbiljnost bolesti ili stanja može takođe da se poveća ili smanji interakcijom CGRP R sa CGRP. Primeri bolesti i stanja koja mogu da se leče antigen-vezujućim proteinima koji su ovde opisani uključuju glavobolje, kao što su klaster glavobolje, migrenu, uključujući migrenske glavobolje, hronični bol, dijabetes melitus tipa II, inflamaciju, npr., neurogenu inflamaciju, kardiovaskularne poremećaje, i hemodinamski poremećaj povezan sa endotoksemijom i sepsom.
[0370] Naročito, antigen-vezujući proteini koji su ovde opisani mogu da se koriste za lečenje migrene, ili u vidu akutnog tretmana koji počinje nakon što je migrenski napad započeo, i/ili kao profilaktički tretman primenjen, npr., dnevno, nedeljno, dvonedeljno, mesečno, dvomesečno, na dve godine, itd.) da bi se sprečila pojava ili smanjila učestalost i/ili ozbiljnost simptoma, npr., simptoma bola, povezanog sa napadima migrene.
Dijagnostički postupci
[0371] Antigen-vezujući proteini koji su ovde opisani mogu da se koriste u dijagnostičke svrhe za detekciju, dijagnozu, ili praćenje bolesti i/ili stanja povezanih sa CGRP R. Takođe su obezbeđeni postupci za detekciju prisustva CGRP R u uzorku korišćenjem klasičnih imunohistoloških postupaka poznatih stručnjacima u oblasti (npr., Tijssen, 1993, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Vol 15 (Eds R.H. Burdon i P.H. van Knippenberg, Elsevier, Amsterdam); Zola, 1987, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc.); Jalkanen et al., 1985, J. Cell. Biol. 101:976-985; Jalkanen et al., 1987, J. Cell Biol. 105:3087-3096). Detekcija CGRP R može da se izvede in vivo ili in vitro.
[0372] Dijagnostičke primene koje su ovde obezbeđene uključuju upotrebu antigen-vezujućih proteina za detekciju ekspresije CGRP R i vezivanje liganda za CGRP R. Primeri postupaka korisnih za detekciju prisustva CGRP R uključuju imunoeseje, kao što je enzimski vezani imunosorbentni test (ELISA) i radioimunoesej (RIA).
[0373] Za dijagnostičke primene, antigen-vezujući protein će tipično biti obeležen detektabilnom grupom za obeležavanje. Pogodne grupe za obeležavanje uključuju, ali bez ograničenja, sledeće: radioizotope ili radionuklide (npr.,<3>H,<14>C,<15>N,<35>S,<90>Y,<99>Tc,<111>In,<125>I,<131>I), fluorescentne grupe (npr., FITC, rodamin, lantanid fosfore), enzimske grupe (npr., peroksidazu rena, β-galaktozidazu, luciferazu, alkalnu fosfatazu), hemiluminescentne grupe, biotinil grupe, ili unapred određene polipeptidne epitope koje prepoznaje sekundarni reporter (npr., sekvence leucinskih zatvarača, vezivna mesta za sekundarna antitela, metal-vezujući domeni, oznake epitopa). U nekim primerima izvođenja, grupa za obeležavanje je spojena sa antigen-vezujućim proteinom preko ručica spejsera različitih dužina da bi se smanjilo potencijalno sterno ometanje. Različiti postupci za obeležavanje proteina su poznati u stanju tehnike i mogu da se koriste po potrebi.
[0374] U drugom aspektu, antigen-vezujući protein može da se koristi za identifikovanje ćelije ili ćelija koje eksprimiraju CGRP R. U specifičnom primeru izvođenja, antigen-vezujući protein je obeležen grupom za obeležavanje, i detektuje se vezivanje obeleženog antigen-vezujućeg proteina za CGRP R. U sledećem specifičnom primeru izvođenja, vezivanje antigen-vezujućeg proteina za CGRP R se detektuje in vivo. U sledećem specifičnom primeru izvođenja, CGRP R antigenvezujući protein se izoluje i meri korišćenjem postupaka poznatih u stanju tehnike. Videti, na primer, Harlow and Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor (ed. 1991 and periodic supplements); John E. Coligan, ed., 1993, Current Protocols In Immunology New York: John Wiley & Sons.
[0375] Drugi aspect obezbeđuje detekciju prisustva ispitivanog molekula koji kompetira za vezivanje za CGRP R sa obezbeđenim antigen-vezujućim proteinima. Primer jednog takvog ispitivanja bi uključivao detekciju količine slobodnog antigen-vezujućeg proteina u rastvoru koji sadrži određenu količinu CGRP R u prisustvu ili odsustvu ispitivanog molekula. Povećanje količine slobodnog antigen-vezujućeg proteina (tj., antigen-vezujućeg proteina koji nije vezan za CGRP R) bi ukazivalo na to da je ispitivani molekul sposoban da stupa u kompeticiju za vezivanje za CGRP R sa antigen-vezujućim proteinom. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući protein je obeležen grupom za obeležavanje. Alternativno, obeležava se ispitivani molekul, i količina slobodnog ispitivanog molekula se prati u prisustvu i odsustvu antigen-vezujućeg proteina.
Postupci za lečenje: farmaceutske formulacije, putevi primene
[0376] Postupci za korišćenje antigen-vezujućih proteina su takođe ilustrovani. U nekim postupcima, antigen-vezujući protein je obezbeđen pacijentu. Antigen-vezujući protein inhibira vezivanje CGRP za humani CGRP R.
[0377] Farmaceutske kompozicije koje sadrže terapeutski efikasnu količinu jednog ili više antigenvezujućih proteina i farmaceutski prihvatljiv razblaživač, nosač, sredstvo za poboljšanje rastvaranja, emulzifikator, konzervans, i/ili adjuvans su takođe obezbeđene. Dodatno, postupci za lečenje pacijenta, npr., od migrene, primenom takve farmaceutske kompozicije su uključeni. Termin "pacijent" uključuje humane pacijente.
[0378] Prihvatljive komponente formulacije su netoksične za primaoca u dozama i koncentracijama u kojima su primenjene. U specifičnim primerima izvođenja, obezbeđene su farmaceutske kompozicije koje sadrže terapeutski efikasnu količinu humanih CGRP R antigenvezujućih proteina.
[0379] U određenim primerima izvođenja, prihvatljive komponente formulacije poželjno su netoksične za primaoca u dozama i koncentracijama u kojima su primenjene. U određenim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija može da sadrži materijale formulacije za modifikovanje, održavanje ili konzervisanje, na primer, pH, osmolarnosti, viskoznosti, bistrine, boje, izotoničnosti, mirisa, sterilnosti, stabilnosti, brzine rastvaranja ili otpuštanja, adsorpcije ili prodiranja kompozicije. U takvim primerima izvođenja, pogodne komponente formulacije uključuju, ali bez ograničenja, aminokiseline (kao glicin, glutamin, asparagin, arginin ili lizin); antimikrobne supstance; antioksidanse (kao askorbicnska kiselina, natrijum sulfit ili natrijum hidrogen-sulfit); pufere (kao borat, bikarbonat, Tris-HCl, citrat, fosfat ili druge organske kiseline); sredstva za povećanje zapremine (kao manitol ili glicin); helirajuća sredstva (kao etilendiamin tetrasirćetna kiselina (EDTA)); sredstva za kompleksiranje (kao kofein, polivinilpirolidin, betaciklodekstrin ili hidroksipropil-beta-ciklodekstrin); punioce; monosaharide; disaharide; i druge ugljene hidrate (kao glukoza, manoza ili dekstrini); proteine (kao serum albumin, želatin ili imunoglobuline); sredstva za bojenje, davanje arome i razblaživanje; emulzifikatore; hidrofilne polimere (kao polivinilpirolidin); polipeptide male molekulske težine; protiv-jone koji obrazuju soli (kao natrijum); konzervanse (kao benzalkonijum hlorid, benzojeva kiselina, salicilna kiselina, timerosal, fenetil alkohol, metilparaben, propilparaben, hlorheksidin, sorbinska kiselina ili vodonik peroksid); rastvarače (kao glicerin, propilen glikol ili polietilen glikol); šećerne alkohole (kao manitol ili sorbitol); sredstva za suspendovanje; surfaktante ili sredstva za kvašenje (kao pluronici, PEG, sorbitan estri, polisorbati kao polisorbat 20, polisorbat, triton, trometamin, lecitin, holesterol, tiloksapal); sredstva za povećanje stabilnosti (kao saharoza ili sorbitol); sredstva za povećanje toničnosti (kao halidi alkalnih metala, poželjno natrijum ili kalijum hlorid, manitol sorbitol); vehikulume za dostavu; razblaživače; ekscipijense i/ili farmaceutske adjuvanse. Videti, REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18" Edition, (A.R. Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Company.
[0380] U određenim primerima izvođenja, iskusni stručnjak će odrediti optimalnu farmaceutsku kompoziciju u zavisnosti od, na primer, nameravanog puta primene, načina dostave i željenog doziranja. Videti, na primer, REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra. U određenim primerima izvođenja, takve kompozicije mogu da utiču na fizičko stanje, stabilnost, brzinu oslobađanja in vivo i klirens in vivo antigen-vezujućih proteina koji su opisani. U određenim primerima izvođenja, primarni vehikulum ili nosač u farmaceutskoj kompoziciji mogu da budu na vodenoj ili nevodenoj bazi. Na primer, pogodni vehikulum ili nosač mogu da budu voda za injekcije, fiziološki slani rastvor ili veštački cerebrospinalni fluid, koji može da bude obogaćen drugim supstancama uobičajenim u kompozicijama za parenteralnu primenu. Neutralni puferisani slani rastvor ili slani rastvor pomešan sa serum albuminom su sledeći primeri vehikuluma. U specifičnim primerima izvođenja, farmaceutske kompozicije sadrže Tris pufer od oko pH 7.0-8.5, ili acetatni pufer od oko pH 4.0-5.5, i mogu dodatno da uključuju sorbitol ili pogodnu zamenu. U određenim primerima izvođenja, kompozicije sa humanim CGRP R antigen-vezujućim proteinom mogu da budu pripremljene za skladištenje mešanjem odabrane kompozicije koja ima željeni stepen čistoće sa izbornim sredstvima za formulisanje (REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra) u obliku liofilizovanog kolača ili vodenog rastvora. Dalje, u određenim primerima izvođenja, humani CGRP R antigen-vezujući protein može da bude formulisan kao liofilizat korišćenjem odgovarajućih ekscipijenasa kao što je saharoza.
[0381] Farmaceutske kompozicije mogu da budu izabrane za parenteralnu dostavu. Alternativno, kompozicije mogu da budu izabrane za inhalaciju ili za dostavu putem digestivnog trakta, kao oralnim putem. Priprema takvih farmaceutski prihvatljivih kompozicija je u okviru stanja tehnike.
[0382] Komponente formulacije su prisutne poželjno u koncentracijama koje su prihvatljive na mestu primene. U određenim primerima izvođenja, koriste se puferi za održavanje kompozicije na fiziološkom pH ili na malo nižem pH, tipično u opsegu pH od oko 5 do oko 8.
[0383] Kada je predviđena parenteralna primena, terapeutske kompozicije mogu da budu obezbeđene u obliku parenteralno prihvatljivog vodenog rastvora bez pirogena, koji sadrži željeni humani CGRP R-vezujući protein u farmaceutski prihvatljivom vehikulumu. Posebno pogodan vehikulum za parenteralnu injekciju je sterilna destilovana voda u kojoj je humani CGRP R antigen-vezujući protein formulisan kao sterilni, izotonični rastvor, ispravno konzervisan. U određenim primerima izvođenja, priprema može da uključuje formulaciju željenog molekula sa sredstvom, kao što su injektabilne mikrokuglice, bioerodibilne čestice, polimerna jedinjenja (kao polilaktična kiselina ili poliglikolna kiselina), perle ili lipozomi, koje može da obezbedi kontrolisano ili neprekidno oslobađanje proizvoda koji može da se dostavi putem depo-injekcije. U određenim primerima izvođenja, hijaluronska kiselina, koja ima dejstvo pospešivanja neprekidnog održavanja u cirkulaciji, može takođe da se koristi. U određenim primerima izvođenja, mogu da se koriste implantabilni uređaji za dostavu leka za uvođenje željenog antigenvezujućeg proteina.
[0384] Određene farmaceutske kompozicije su formulisane za inhalaciju. U nekim primerima izvođenja, humani CGRP R antigen-vezujući proteini su formulisani kao suvi, inhalabilni prah. U specifičnim primerima izvođenja, inhalacioni rastvori humanog CGRP R antigen-vezujućeg proteina mogu takođe da budu formulisani sa propelantom za dostavu putem aerosola. U određenim primerima izvođenja, rastvori mogu da budu nebulizovani. Neke formulacije mogu da se primene oralno. Humani CGRP R antigen-vezujući proteini koji se primenjuju na ovaj način mogu da budu formulisani sa ili bez nosača koji se obično koriste u sastavljanju čvrstih doznih oblika kao što su tablete i kapsule. U određenim primerima izvođenja, kapsule mogu da budu dizajnirane tako da oslobađaju aktivni deo formulacije na onom mestu u gastrointestinalnom traktu gde je bioraspoloživost najveća, a presistemska degradacija najmanja. Mogu da budu uključena dodatna sredstva kako bi se olakšala apsorpcija humanog CGRP R antigen-vezujućeg proteina. Razblaživači, sredstva za davanje arome, voskovi sa niskom tačkom topljenja, biljna ulja, lubrikanti, sredstva za suspendovanje, sredstva za raspadanje tableta, i vezivna sredstva mogu takođe da budu uključena.
[0385] Neke farmaceutske kompozicije sadrže efikasnu količinu jednog ili više humanih CGRP R antigen-vezujućih proteina u smeši sa netoksičnim ekscipijensima koji su pogodni za proizvodnju tableta. Rastvaranjem tableta u sterilnoj vodi, ili drugom odgovarajućem vehikulumu, rastvori mogu da budu pripremljeni u jednodoznom obliku. Pogodni ekscipijensi uključuju, ali bez ograničenja, inertne razblaživače, kao kalcijum karbonat, natrijum karbonat ili bikarbonat, laktoza, ili kalcijum fosfat; ili vezivna sredstva, kao skrob, želatin, ili akacija; ili sredstva za podmazivanje kao magnezijum stearat, stearinska kiselina, ili talk.
[0386] Dodatne farmaceutske kompozicije će biti vidljive stručnjacima u oblasti, uključujući formulacije koje uključuju humane CGRP R antigen-vezujuće proteine u formulacijama sa neprekidnom ili kontrolisanom dostavom. Tehnike za formulisanje brojnih drugih sredstava za neprekidnu ili kontrolisanu dostavu, kao što su lipozomski nosači, bioerodiblne mikročestice ili porozne perle i depo-injekcije, su takođe poznate stručnjacima u oblasti. Videti, na primer, međunarodnu patentnu prijavu br. PCT/US93/00829, koja opisuje kontrolisano oslobađanje poroznih polimernih mikročestica za dostavu farmaceutske kompozicije. Preparati sa produženim oslobađanjem mogu da uključuju polupropustljive polimerne matrice u obliku uobličenih artikala, npr., filmova, ili mikrokapsula. Matrice za produženo oslobađanje mogu da uključuju poliestre, hidrogelove, polilaktide (kao što je opisano u SAD patentu br.3,773,919 i objavi evropske prijave patenta br. EP 058481), kopolimere L-glutaminske kiseline i gama etil-L-glutamata (Sidman et al., 1983, Biopolymers 2:547-556), poli (2-hidroksietil-metakrilat) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res.15:167-277 i Langer, 1982, Chem. Tech.12:98-105), etilen vinil acetat (Langer et al., 1981, supra) ili poli-D(-)-3-hidroksibutirnu kiselinu (objava evropske prijave patenta br. EP 133,988). Kompozicije sa produženim oslobađanjem mogu takođe da uključuju lipozome koji mogu da se pripreme prema bilo kom od nekoliko postupaka poznatih u stanju tehnike. Videti, npr., Eppstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:3688-3692; objava evropske prijave patenta br. EP 036,676; EP 088,046 i EP 143,949.
[0387] Farmaceutske kompozicije koje se koriste za in vivo primenu su tipično obezbeđene kao sterilni preparati. Sterilizacija može da se postigne filtracijom kroz sterilne filtracione membrane. Kada je kompozicija liofilizovana, sterilizacija korišćenjem ovog postupka može da se izvede ili pre ili nakon liofilizacije i rekonstitucije. Kompozicije za parenteralnu primenu mogu da se skladište u liofilizovanom obliku ili u rastvoru. Parenteralne kompozicije uopšteno se smeštaju u kontejner koji ima sterilni pristupni port, na primer, kesu sa intravenskim rastvorom ili bočicu koja ima zatvarač kroz koji može da prođe hipodermalna injekciona igla.
[0388] U određenim primerima izvođenja, ćelije koje eksprimiraju rekombinantni antigenvezujući protein kao što je ovde opisano su inkapsulirane za dostavu (videti, Invest. Ophthalmol Vis Sci 43:3292-3298, 2002 i Proc. Natl. Acad. Sciences 103:3896-3901, 2006).
[0389] U određenim formulacijama, antigen-vezujući protein ima koncentraciju od najmanje 10 mg/ml, 20 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml, 100 mg/ml ili 150 mg/ml. Neke formulacije sadrže pufer, saharozu i polisorbat. Primer formulacije sadrži 50-100 mg/ml antigen-vezujućeg proteina, 5-20 mM natrijum acetata, 5-10% tež./zapr. saharoze, i 0.002 - 0.008% tež./zapr. polisorbata. Određene formulacije, na primer, sadrže 65-75 mg/ml antigen-vezujućeg proteina u natrijum acetatnom puferu koncentracije 9-11 mM, sa 8-10% tež./zapr. saharoze i 0.005-0.006% tež./zapr. polisorbata. pH vrednost pojedinih takvih formulacija je u opsegu od 4.5-6. Druge formulacije imaju pH od 5.0-5.5 (npr., pH od 5.0, 5.2 ili 5.4).
[0390] Kada je farmaceutska kompozicija formulisana, može da se skladišti u sterilnim bočicama kao rastvor, suspenzija, gel, emulzija, u čvrstom obliku, u kristalnom obliku, ili kao dehidratisani ili liofilizovani prah. Takve formulacije mogu da budu skladištene ili u obliku spremnom za upotrebu ili u obliku (npr., liofilizovane) koji se rekonstituiše pre primene. Kitovi za proizvodnju jedinice za primenu pojedinačne doze su takođe obezbeđeni. Određeni kitovi sadrže prvi kontejner koji ima suvi protein i drugi kontejner koji ima formulaciju na bazi vode. U određenim primerima izvođenja, obezbeđeni su kitovi koji sadrže prethodno napunjene špriceve sa jednom ili više komora (npr., špricevi sa tečnošću i špricevi sa liofilizatom). Terapeutski efikasna količina farmaceutske kompozicije koja sadrži humani CGRP R antigen-vezujući protein koja će se upotrebiti zavisi od, na primer, terapeutskog konteksta i ciljeva. Iskusni stručnjak će shvatiti da će odgovarajući nivoi doziranja za lečenje varirati u zavisnosti, delom, od molekula koji se dostavlja, indikacije za koju se koristi humani CGRP R antigen-vezujući protein, puta primene, i veličine (telesna težina, površina tela ili veličina organa) i/ili stanja (starosti i opšteg zdravlja) pacijenta. U određenim primerima izvođenja, kliničar može da titrira dozu i modifikuje put primene da bi dobio optimalno terapeutsko dejstvo.
[0391] Tipična doza može da varira od oko 1 µg/kg do oko 30 mg/kg ili više, u zavisnosti od gorepomenutih faktora. U specifičnim primerima izvođenja, doza može da varira od 10 µg/kg do oko 30 mg/kg, izborno od 0.1 mg/kg do oko 30 mg/kg, alternativno od 0.3 mg/kg do oko 20 mg/kg. U nekim primenama, doza je od 0.5 mg/kg do 20 mg/kg. U nekim slučajevima, antigen-vezujući protein je doziran sa 0.3 mg/kg, 0.5mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 10 mg/kg, ili 20 mg/kg. Raspored doziranja u nekim režimima lečenja je pri dozi od 0.3 mg/kg jednom nedeljno, 0.5mg/kg jednom nedeljno, 1 mg/kg jednom nedeljno, 3 mg/kg jednom nedeljno, 10 mg/kg jednom nedeljno, ili 20 mg/kg jednom nedeljno.
[0392] Učestalost doziranja će zavisiti od farmakokinetičkih parametara određenog humanog CGRP R antigen-vezujućeg proteina korišćenog u formulaciji. Tipično, kliničar primenjuje kompoziciju dok se ne dostigne doza koja koja postiže željeno dejstvo. Kompozicija može prema tome da se primeni kao jedna doza, ili kao dve ili više doza (koje mogu ali ne moraju da sadrže istu količinu željenog molekula) tokom vremena, ili kao kontinuirana infuzija putem implantacionog uređaja ili katetera. Odgovarajuće doze mogu da budu utvrđene korišćenjem odgovarajućih podataka o odnosu doza-odgovor. U određenim primerima izvođenja, antigenvezujući proteini mogu da se primene kod pacijenata tokom produženog perioda vremena. Hronična primena antigen-vezujućeg proteina smanjuje negativni imunski ili alergijski odgovor koji je uobičajeno povezan sa antigen-vezujućim proteinima koji nisu u potpunosti humani, na primer antitelom razvijenim protiv humanog antigena u nehumanoj životinji, na primer, nepotpuno humano antitelo ili nehumano antitelo proizvedeno u nehumanoj vrsti.
[0393] Put primene farmaceutske kompozicije je u skladu sa poznatim postupcima, npr., oralno, putem injekcije, intravenskim, intraperitonealnim, intracerebralnim (intraparenhimalnim), intracerebroventrikularnim, intramuskularnim, intraokularnim, intraarterijalnim, intraportalnim, ili intralezionalnim putevima; sistemima za produženo oslobađanje ili implantacionim uređajima. U određenim primerima izvođenja, kompozicije mogu da budu primenjene bolus injekcijom ili kontinuirano infuzijom, ili implantacionim uređajem.
[0394] Kompozicije takođe mogu da budu primenjene lokalno putem implantacije membrane, sunđera ili drugog odgovarajućeg materijala kojim je željeni molekul apsorbovan ili inkapsuliran. U određenim primerima izvođenja, kada se koristi implantacioni uređaj, uređaj može da bude implantiran u bilo koje pogodno tkivo ili organ, i dostava željenog molekula može da bude putem difuzije, bolusa sa vremenskim oslobađanjem, ili kontinuiranom primenom.
[0395] Takođe može da bude poželjno koristiti farmaceutske kompozicije humanog CGRP R antigen-vezujućeg proteina ex vivo. U takvim slučajevima, ćelije, tkiva ili organi koji su uzeti od pacijenta izloženi su farmaceutskim kompozicijama humanog CGRP R antigen-vezujućeg proteina nakon čega se ćelije, tkiva i/ili organi implantiraju natrag u pacijenta.
[0396] Naročito, humani CGRP R antigen-vezujući proteini mogu da se dostave pomoću implantacije određenih ćelija koje su genetski modifikovane, korišćenjem postupaka kao što su oni koji su ovde opisani, za ekspresiju i sekreciju polipeptida. U određenim primerima izvođenja, takve ćelije mogu da budu životinjske ili humane ćelije, i mogu da budu autologne, heterologne, ili ksenogene. U određenim primerima izvođenja, ćelije mogu da budu imortalizovane. U drugim primerima izvođenja, u cilju smanjenja mogućnosti imunološkog odgovora, ćelije mogu da budu inkapsulirane da bi se izbegla infiltracija okolnih tkiva. U sledećim primerima izvođenja, materijali za inkapsulaciju su tipično biokompatibilni, polupropustljivi polimerni omotači ili membrane koje omogućavaju oslobađanje proteinskog(ih) proizvoda, ali sprečavaju uništavanje ćelija pacijentovim imunskim sistemom ili drugim detrimentalnim faktorima iz okolnih tkiva.
PRIMER 1
PROIZVODNJA CGRP RECEPTORA KAO ANTIGENA
A. Molekularno kloniranje humanog CRLR i RAMP1
[0397] Humana cDNK CRLR (GenBank Pristupni br. U17473; SEQ ID NO:1) i cDNK RAMP1 (GenBank Pristupni br. AJ001014; SEQ ID NO:3) su klonirane u ekspresione vektore sisarske ćelije pcDNA3.1-Zeo i pcDNA3.1-Hyg (Invitrogen, Carlsbad, CA), redom, za transfekciju ćelija HEK 293EBNA (Invitrogen) kao što je opisano u nastavku teksta. cDNK hCRLR i cDNK hRAMP1 su takođe klonirane u vektor pDSRα24 (Kim, H. Y. et al. J. Inv. Derm. Symp. Proc. (2007) 12: 48-49) za transfekciju ćelija AM-1 CHO (SAD patent br.6,210,924).
B. Stabilno-transficirane ćelijske linije
1. Stabilna ekspresija humanog CGRP R u ćelijama 293EBNA
[0398] Ćelije HEK 293EBNA (dostupne kod ATCC ili Invitrogen) su zasejane pri gustini od 1.5x10<6>ćelija po posudi od 100 mm. Nakon 24 časa, ćelije su kotransficirane sa 6 µg linearizovanih DNK huRAMP1/pcDNA3.1-Hyg i huCRLR/pcDNA3.1-Zeo sa FuGene6 (Invitrogen, Carlsbad, CA) prateći uputstva koja je dao Invitrogen. Nakon dva dana, ćelije su tripsinizirane i supkultivisane u medijumu za rast koji sadrži 400 µg/ml higromicina 250 µg/ml zeocina. Nakon dve nedelje, rezultujuće kolonije otporne na lek su tripsinizirane i kombinovane u pulove. Pulovi su podvrgnuti FACS sortiranju u četiri ciklusa sa peptidnim analogom CGRP8-37obeleženim bojom Alexa 647 (opisano u nastavku). U svakom ciklusu je sakupljeno 5% ćelija sa najvišom ekspresijom.
2. Stabilna ekspresija humanog CGRP R u AM-1 CHO ćelijama
[0399] Ćelije AM-1 CHO (varijanta adaptirana na medijum za rast bez seruma iz CHO DHFR-deficijentne ćelijske linije opisane kod Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci.77, 4216 (1980), su zasejane pri gustini od 1.5x10<6>ćelija po posudi od 100 mm. Nakon 24 časa, ćelije su kotransficirane sa po 4 µg linearizovane DNK pDSRα24/huRAMP1 i pDSRα24/huCRLR sa FuGene6 (Invitrogen, Carlsbad, CA) prateći uputstva koja je dao Invitrogen. Transficirane ćelije su tripsinizirane 2 dana nakon transfekcije i posejane u CHO DHFR selektivni medijum za rast koji sadrži 10% dijalizovanog FBS i ne sadrži dodatak hipoksantina/timidina. Nakon 2 nedelje, rezultujuće transficirane kolonije su tripsinizirane i pulirane. Pulovi su podvrgnuti ispitivanju pomoću FACS sortiranja.
3. Stabilna ekspresija humanog adrenomedulina (AM1) u ćelijama HEK 293EBNA
[0400] Ćelije 293EBNA su zasejane u posude od 100 mm pri gustini od 1.5x10<6>ćelija/posudi u DMEM (sa visokim sadržajem glukoze) 5% FBS 1% MEM sa neesencijalnim aminokiselinama 1% natrijum piruvata. Sledećeg dana, ćelije su kotransficirane korišćenjem reagensa za transfekciju FuGENE 6 (Roche) sa pcDNA3.1/zeocin/huCRLR plus pcDNA3.1/higromicin/huRAMP2. Oba DNK konstrukta su linearizovana sa FspI. Nakon 48 časova ćelije su supkultivisane u sudovima od 100 mm u 3 gustine ćelija (8x10<5>, 3.2x10<5>, i 8x10<4>ćelija/posudi) u medijumu za rast koji sadrži 200 µg/ml zeocina. Medijum je menjan dva puta nedeljno. Nakon jedne nedelje u ploče je dodat medijum koji sadrži 200 µg/ml higromicina 200 µg/ml zeocina. Nakon dve nedelje, izolovano je 96 kolonija pomoću prstenova za kloniranje. Preostale kolonije su sakupljene u jedan pul kulture. Ispitan je odgovor na stimulaciju agonistom receptora ili forskolinom kod kolonija i pulova. Nekoliko kolonija je pokazalo dobar odgovor, i jedna je odabrana za upotrebu u narednim eksperimentima.
4. Stabilna ekspresija cino CGRP R u HEK ćelijama 293EBNA
[0401] Ćelije 293EBNA su zasejane u posude od 100 mm pri gustini od 1.5x10<6>ćelija/posudi u DMEM (sa visokim sadržajem glukoze) 5% FBS 1% MEM sa neesencijalnim aminokiselinama 1% natrijum piruvata. Sledećeg dana, ćelije su kotransficirane korišćenjem FuGENE 6 sa pcDNA3.1/zeocin/cinoCRLR plus pcDNA3.1/higromicin/cinoRAMP1. Oba konstrukta su linearizovana sa FspI. Nakon 48 časova ćelije su supkultivisane u medijumu za rast koji sadrži 200 µg/ml zeocina 400 µg/ml higromicina u razblaženjima od 1:20, 1:40, 1:100, i 1:200. Medijum je menjan dva puta nedeljno. Nakon dve nedelje, izolovano je 96 kolonija pomoću prstenova za kloniranje. Ispitan je odgovor na stimulaciju CGRP ligandom kod kolonija. Nekoliko kolonija je pokazalo slične visoke nivoe odgovora, i jedna je odabrana za upotrebu u narednim eksperimentima.
C. Izdvajanje ćelija sa visokom ekspresijom CGRP receptora
[0402] Sintetisan je peptidni analog CGRP8-37(Midwest Bio-Tech Inc. Fishers, IN) sa sekvencom datom u nastavku:
Ac-WVTHRLAGLLSRSGGVVRCNFVPTDVGPFAF-NH2(SEQ ID NO:9)
[0403] Peptid je bio obeležen bojom Alexa 647-NHS prema uputstvima proizvođača (Molecular Probes, Inc. Cat A 2006). CGRP8-37obeležen sa Alexa 647 je pokazao specifično bojenje ćelija transficiranih CGRP receptorom i izostanak bojenja netransficiranih roditeljskih ćelija i korišćen je kao reagens za ispitivanje pomoću FACS.
[0404] Pulovi ćelija 293EBNA i AM-1 CHO transficiranih huCGRP receptorom (proizvedeni kao što je gore opisano) bili su ponavljano sortirani do četiri puta korišćenjem CGRP8-37peptida obeleženog sa Alexa 647. Visokoeksprimirajuće ćelije su sakupljane pri svakom sortiranju, umnožavane i posle završnog sortiranja zamrznute u bočicama. AM-1 CHO/huCGRP R ćelije su korišćene za imunizaciju kao što je opisano u nastavku, i 293EBNA/huCGRP R ćelije su korišćene za titriranje mišjeg seruma nakon imunizacije i u ispitivanju vezivanja supernatanta hibridoma.
D. Proizvodnja rastvornog CGRP receptora
[0405] Polipeptidi rastvornog CGRP receptora koji sadrže N-terminalne vanćelijske domene (ECD) humanog CRLR (SEQ ID NO:6) i humanog RAMP1 (SEQ ID NO:8) su proizvedeni prolaznom kotransfekcijom ćelija 293 6E (Durocher, et al., Nucleic Acids Res. 30:E9 (2002)) sa vektorima koji sadrže odgovarajuće cDNK (SEQ ID NO:5 ili SEQ ID NO:7) kao što je opisano u nastavku. Uključene su običajeno korišćene oznake (polyHis, Flag, HA i/ili Fc) da bi se olakšala sekrecija i/ili naknadno prečišćavanje.
[0406] Rastvorni heterodimerni CGRP R ECD fuzionisan sa Fc je pripremljen pomoću PCR kloniranja sa odgovarajućim prajmerima u privremeni ekspresioni vektor pTT5 (Durocher, et al., supra). N-terminalni ECD-Fc CRLR se sastojao od N-terminalnog vanćelijskog domena CRLR (SEQ ID NO:6) fuzionisanog sa humanim IgG1 Fc. ECD-Fc RAMP1 sadrži vanćelijski domen RAMP1 (SEQ ID NO:8) fuzionisan sa humanim IgG1 Fc. U oba slučaja, postojao je linker koji se sastoji od pet uzastopnih glicina između ECD domena i Fc.
[0407] Rastvorni heterodimerni CGRP receptor je bio eksprimiran kotransfekcijom dva konstrukta kao što sledi. Ćelije 293-6E pri gustini od 1x10<6>ćelija/ml u bocama koje se mućkaju transficirane su sa 0.5 mg/L DNK (hCRLR N-ter ECD-Fc/pTT5 i huRAMP1 ECD-Fc/pTT5) sa 3 ml PEI/mg DNK u medijumu FreeStyle 293 (Invitrogen). Ćelije su rasle u suspenziji u ekspresionom medijumu FreeStyle 293 obogaćenom sa 0.1% pluronika F68 i 50 µg/ml geneticina tokom 7 dana i sakupljene su za prečišćavanje.
[0408] Prečišćavanje iz kondicioniranog medijuma ("CM") je izvedeno puferisanjem CM dodatkom 50 mM Tris, 400 mM natrijum citrata, i podešavanjem pH do 8.5. Puferisani CM je zatim propušten kroz afinitetnu kolonu Protein A ekvilibrisanu u 50 mM Tris sa 400 mM natrijum citratom i pH podešenim do pH 8.5. Kolona Protein A je oprana sa PBS i Fc fuzioni protein je eluiran sa 0.1 N HOAc. Pik elucije je sadržao i CRLR i RAMP1 komponente kada je ispitan pomoću western blot testa korišćenjem pojedinačnih antitela specifičnih za CRLR ili RAMP1. Dodatna LC-MS i N-terminalno sekvenciranje potvrdilo je prisustvo i CRLR:RAMP1 heterodimera i CRLR:CRLR homodimera u približnom odnosu od 2:3. Pokazano je da ovaj "rastvorni CGRP receptor" kompetira u vezivanju za CGRP8-37obeležen sa Alexa647 sa CGRP receptorom, eksprimiranim na rekombinantnim ćelijama, u testu FMAT, mada se nije vezivao za ligand CGRP kao što je pokazano u testu Biacore. Materijal je korišćen kao imunogen kao što je opisano u primeru, uprkos, između ostalog, njegovoj heterogenosti i nedostatku vezivanja za ligand CGRP.
E. Proizvodnja membranskih ekstrakata iz rekombinantnih ćelija koje eksprimiraju CGRP receptor
[0409] Membranski ekstrakti su pripremljeni iz ćelija koje eksprimiraju CGRP receptor korišćenjem postupka opisanog kod Bossé, R. et al., (Journal of Biomolecular Screening, 3(4): 285-292 (1998)). Ukratko, približno 5 grama ćelijske paste je staloženo u 50 ml PBS na 3000 obr/min tokom 10 minuta na 4°C i resuspendovano u 30 ml hladnog pufera za lizu (25 mM HEPES, pH 7.4, 3 mM MgCl2i jedna tableta smeše inhibitora proteaze Roche/ 50mL). Lizat je homogenizovan sa Glas-Col (homogenizator teflon-staklo) sa ∼20 udaraca na 5 000 obr/min i podvrgnut obradi u rotoru JA21 na 20000 obr/min tokom 15 minuta na 4°C. Ovaj postupak je ponovljen još jednom i finalni talog je resuspendovan u ∼1-5 ml pufera „za finalni talog“ (25 mM HEPES, pH 7.4, 3 mM MgCl2, 10 % (tež./zapr.) saharoze i jedna tableta smeše inhibitora proteaze Roche / 50mL). Membranski ekstrakti su usitnjeni propuštanjem kroz igle od 16 G i 25 G, 2-3 puta. Ukupna koncentracija membranskog proteina je određena pomoću analize Microplate BCA Protein Assay (Pierce).
PRIMER 2
PROIZVODNJA ANTITELA PROTIV CGRP RECEPTORA
A. Imunizacija
[0410] Imunizacije su izvedene korišćenjem sledećih oblika antigena CGRP receptora, pripremljenih kao što je opisano u u primeru 1:
(i) transfektanti AM-1 CHO koji eksprimiraju punu dužinu humanog CRLR i RAMP1 na površini ćelije, dobijeni kotransfekcijom CHO ćelija humanom cDNK CRLR pune dužine (SEQ ID NO:1) koja kodira polipeptid sekvence SEQ ID NO:2, i cDNK RAMP1 (SEQ ID NO:3) koja kodira polipeptid sekvence SEQ ID NO:4
(ii) membranski ekstrakt iz ćelija opisanih u tački (i) gore; i
(iii) rastvorni CGRP receptor dobijen koekspresijom i prečišćavanjem N-terminalnog ECD CRLR (SEQ ID NO:6) i vanćelijskog domena (ECD) RAMP1 (SEQ ID NO:8) kao što je opisano u primeru 1.
[0411] Životinje linije XENOMOUSE su imunizovane prečišćenim rastvornim proteinom CGRP receptora i prečišćenim membranama sa CGRP R pripremljenim iz ćelija AM-1 CHO koje stablno eksprimiraju CGRP R, na isti način, korišćenjem doza od 10 µg/mišu i 150 µg/mišu redom. CGRP-membrane su pripremljene korišćenjem gore opisanih postupaka.
[0412] Naredne buster-doze su primenjene u dozama od deset µg/mišu rastvornog CGRP R ili 75 µg prečišćenih CGRP R membrana. Životinje linije XENOMOUSE su takođe imunizovane ćelijama koje eksprimiraju CGRP receptor korišćenjem doza od 3.4 x 10<6>ćelija transficiranih sa CGRP R /mišu i naredne buster-doze su bile 1.7 x 10<6>ćelija transficiranih sa CGRP R /mišu. Primenjene injekcije su predstavljale kombinacije subkutane injekcije u osnovi repa i intraperitonealne injekcije. Imunizacije su izvedene prema postupcima opisanim u SAD patentu br. 7,064,244, podnetom 19.02.2002. Adjuvansi TiterMax Gold (Sigma; cat. # T2684), Alum (E.M. Sergent Pulp and Chemical Co., Clifton, NJ, cat. # 1452-250) su pripremljeni prema uputstvima proizvođača i pomešani u odnosu emulzije adjuvansa prema rastvoru antigena od 1:1.
[0413] Serumi su sakupljeni 4 - 6 nedelja nakon prve injekcije i specifični titrovi su određeni pomoću FACs bojenja rekombinantnih ćelija 293EBNA koje eksprimiraju CGRP receptor.
[0414] Miševi su imunizovani ili ćelijama/membranama koje eksprimiraju CGRP R pune dužine ili vanćelijskim domenom rastvornog CGRP R, opsegom od 11 - 17 imunizacija tokom perioda od približno jednog to tri ipo meseca. Miševi sa najvišim serumskim titrom su identifikovani i pripremljeni za proizvodnju hibridoma. Imunizacije su izvedene u grupama od više miševa, tipično deset. Poplitealni i ingvinalni limfni čvorovi i tkivo slezine su tipično sakupljeni iz svake grupe za proizvodnju fuzija.
B. Priprema monoklonskih antitela
[0415] Životinje koje ispoljavaju odgovarajuće titrove su identifikovane, i dobijeni su limfociti dreniranjem limfnih čvorova i, ako je neophodno, pulirani za svaku kohortu. Limfociti su razdvojeni od limfnog tkiva u pogodnom medijumu (na primer, Dulbecco-ov modifikovani Eagle medijum; DMEM; dobijen od Invitrogen, Carlsbad, CA) da bi se ćelije oslobodile od tkiva, i suspendovani u DMEM. B ćelije su odabrane i/ili umnožene korišćenjem pogodnog postupka, i fuzionisane sa pogodnim fuzionim partnerom, na primer, nesekretornim ćelijama mijeloma P3X63Ag8.653 (American Type Culture Collection CRL 1580; Kearney et al, J. Immunol. 123, 1979, 1548-1550).
[0416] Limfociti su pomešani sa ćelijama koje predstavljaju fuzionog partnera u odnosu od 1:4. Mešavina ćelija je pažljivo staložena centrifugiranjem na 400 x g tokom 4 minuta, supernatant je odliven, i smeša ćelija pažljivo izmešana korišćenjem pipete od 1 ml. Fuzija je indukovana sa PEG/DMSO (polietilen glikol/dimetil sulfoksid; dobijenim od Sigma-Aldrich, St. Louis MO; 1 ml na milion limfocita). PEG/DMSO je polako dodat uz pažljivo mućkanje tokom jednog minuta praćeno jednim minutom mešanja. Zatim je dodavan IDMEM (DMEM bez glutamina; 2 ml na milion B ćelija), tokom 2 minuta uz pažljivo mućkanje, praćeno dodatkom IDMEM (8 ml na milion B-ćelija) koji je dodavan tokom 3 minuta.
[0417] Fuzionisane ćelije su pažljivo staložene (400 x g, 6 minuta) i resuspendovane u 20 ml medijuma Selection (na primer, DMEM koji sadrži azaserin i hipoksantin [HA] i druge suplemente ako je potrebno) na milion B ćelija. Ćelije su inkubirane 20-30 minuta na 37°C i zatim resuspendovane u 200 ml medijuma Selection i gajene tri do četiri dana u bocama T175 pre zasejavanja u ploču sa 96 bunarčića.
[0418] Ćelije su raspoređene u ploče sa 96 bunarčića korišćenjem standardnih postupaka za povećanje klonalnosti rezultujućih kolonija. Nakon nekoliko dana gajenja, supernatanti hibridoma su sakupljeni i podvrgnuti skrining testovima kao što je detaljno prikazano u primerima u nastavku, uključujući potvrđivanje vezivanja za humani CGRP receptor, identifikaciju blokirajućih antitela testom za kompetitivno vezivanje liganda i procenom unakrsne reaktivnosti sa drugim receptorima srodnim sa CGRP receptorom (na primer, humanim adrenomedulinskim receptorom). Pozitivne ćelije su dalje odabrane i podvrgnute standardnim postupcima za kloniranje i supkloniranje. Klonalne linije su umnožene in vitro, i dobijena su sekretovana humana antitela za ispitivanje.
C. Analiza sekvence odabranih monoklonskih antitela
[0419] Odabrana supklonirana monoklonska antitela su sekvencirana korišćenjem standardnih postupaka RT-PCR. Tabela 2A prikazuje aminokiselinske sekvence lakih lanaca ovde opisanih primera antitela. Tabela 2B prikazuje aminokiselinske sekvence teških lanaca ovde opisanih primera antitela.
[0420] Aminokiseline sekvence koje odgovaraju CDR regionima sekvenciranih antitela su poravnate i poravnanja su korišćena za grupisanje klonova prema sličnosti.
[0421] Poravnanja sekvenci CDR regiona lakog lanca iz klonova koji imaju kapa lake lance, i određene odgovarajuće konsenzus sekvence, prikazane su na sl.3A i 3B.
[0422] Poravnanja sekvenci CDR regiona lakog lanca iz klonova koji imaju lambda lake lance, i određene odgovarajuće konsenzus sekvence, prikazane su na sl.4.
[0423] Poravnanja sekvenci CDR regiona teškog lanca ovde opisanih primera antitela, i određene odgovarajuće konsenzus sekvence, prikazane su na sl. 5A, 5B, 5C, 5D i 5E.
[0424] Određene konsenzus sekvence ovde opisanih primera CDR regiona teškog lanca prikazani su na sl.5F.
PRIMER 3
IDENTIFIKACIJA ANTITELA SPECIFIČNIH ZA CGRP RECEPTOR
A. Selekcija antitela koja se specifično vezuju za CGRP receptor pomoću FMAT
[0425] Nakon 14 dana gajenja, supernatanti hibridoma su ispitani na monoklonska antitela specifična prema CGRP R pomoću tehnologije fluorometrijske analize u mikrozapremini (FMAT) (Applied Biosystems, Foster City, CA). Supernatanti su ispitani na ćelije AM-1 CHO huCGRP R ili rekombinantne ćelije HEK 293 koje su transficirane humanim CGRP R i podvrgnute protivskriningu protiv ćelija roditeljske linije HEK293 (pripremljenih kao što je opisano u primeru 1).
[0426] Ukratko, ćelije u medijumu Freestyle (Invitrogen, Carlsbad, CA) su zasejane u ploče FMAT sa 384 bunarčića u zapremini od 50 µL/bunarčiću pri gustini od približno 4000 ćelija/bunarčiću za stabilne transfektante, i pri gustini od približno 16 000 ćelija/bunarčiću za roditeljske ćelije, i ćelije su inkubirane preko noći na 37°C. Zatim je dodato 10 µL/bunarčiću supernatanta, i ploče su inkubirane približno jedan čas na 4°C, nakon čega je dodato 10 µL/bunarčiću antihumanog IgG-Cy5 sekundarnog antitela (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) u koncentraciji od 2.8 µg/ml (400 ng/ml finalne koncentracije). Ploče su zatim inkubirane jedan čas na 4°C, i fluorescencija je očitana korišćenjem makrokonfokalnog skenera FMAT (Applied Biosystems, Foster City, CA).
[0427] Za protiv-skrining, ćelije roditeljske linije AM-1 CHO ili HEK 293 su zasejane na sličan način i urađeno je paralelno ispitivanje supernatanta pomoću FMAT ovih ćelija, da bi se razlikovali i eliminisali hibridomi koji se vezuju za ćelijske proteine, ali ne i za CGRP receptor.
B. Identifikacija blokirajućih antitela testom za kompetitivno vezivanje liganda pomoću FMAT
[0428] Test za kompetitivno vezivanje za ligand je razvijen da bi se identifikovala antitela (u supernatantima hibridoma) koja se vezuju za CGRP receptor i blokiraju vezivanje liganda CGRP. Ploče sa 384 bunarčića (Corning Costar, Cat:#3712) su pripremljene sa 5 000 ćelija AM-1 huCGRP R pula 2 i 20000 netransficiranih ćelija CHO-S u svakom bunarčiću. U svaki bunarčić je dodato 20 µl anti-CGRP R supernatanta hibridoma, i ploče su inkubirane 1 čas na sobnoj temperaturi. U svaki bunarčić je zatim dodato 10 µl Alexa 647-CGRP8-37peptida koncentracije 2.8 µg/ml i ploče su zatim inkubirane dodatna 3 časa na sobnoj temperaturi. Količina Alexa 647-CGRP8-37koji je vezan za ćelije je ispitana pomoću sistema za detekciju ćelija FMAT 8200 (Applied Biosystems). Izlazni podaci su dobijeni u vidu numeričke vrednosti FL1 intenziteta signala (više vrednosti FL1 ukazuju na viši intenzitet signala), kao i snimka ćelija.
[0429] Eksperimenti su uključivali negativnu kontrolu supernatanta hibridoma. Prosečna vrednost FL1 primećena u ovim eksperimentima sa negativnom kontrolom je postavljena kao maksimalni mogući signal u testu. Eksperimentalni supernatanti su upoređeni sa ovim maksimalnim signalom i procenat inhibicije je izračunat za svaki bunarčić (% Inhibicije = (1-(FL1 za anti-CGRP R supernatant hibridoma /maksimalni sinal FL1)).
[0430] Pregled rezultata je prikazan na sl.6. U ovom eksperimentu, ispitana su 1092 supernatanta sa anti-CGRP R antitelima korišćenjem receptor-ligand testa. Podaci su bili rangirani korišćenjem prosečnog procenta inhibicije. Devedeset supernatanta je ispoljilo srednju vrednost inhibicije >25%, 31 od ovih je ispoljilo >50% i 7 je ispoljilo srednju vrednost inhibicije >70%.
[0431] Skraćeni prikaz podataka je dat u tabeli 10, dole. Uzorci ID br. 1-5 ilustruju primere anti-CGRP R supernatanta hibridoma koji inhibiraju vezivanje Alexa 647-CGRP8-37peptida za CGRP receptor i uzorci ID br.536 - 540 ilustruju primere anti-CGRP R supernatanta hibridoma koji ne inhibiraju vezivanje Alexa 647-CGRP8-37peptida za CGRP receptor.
Tabela 10 – Tipični podaci dobijeni testom za kompetitivno vezivanje liganda FMAT
[0432] Na osnovu testova kompetitivnog vezivanja, približno 30 supernatanata je odabrano za dalju karakterizaciju.
PRIMER 4
AKTIVNOST BLOKIRAJUĆIH MONOKLONSKIH ANTITELA SPECIFIČNIH ZA CGRP RECEPTOR U FUNKCIONALNOM TESTU cAMP
A. Aktivnost antitela protiv CGRP receptora.
[0433] Odabrana antitela protiv CGRP receptora su ispitana u in vitro CGRP receptorposredovanom cAMP testu za određivanje njima svojstvene aktivnosti. In vitro cAMP test je uključivao humanu ćelijsku liniju izvedenu iz neuroblastoma (SK-N-MC; Spengler, et al., (1973) In Vitro 8: 410) dobijenu od ATCC (ATCC broj HTB-10; "HTB-10 cells"). HTB-10 ćelije eksprimiraju CRLR i RAMP1, koji obrazuju CGRP receptor (L. M. McLatchie et al, 1998). Ćelijska linija 293EBNA koja eksprimira rekombinantni CGRP R cinomolgus majmuna je proizvedena kao što je opisano u primeru 1, a pacovska ćelijska linija L6 koja eksprimira pacovski CGRP receptor je dobijena od ATCC (CRL-1458).
[0434] Za ispitivanje je korišćen kit za test LANCE cAMP (PerkinElmer, Boston, MA). Ispitivanja su izvedena u belim pločama sa 96 bunarčića u ukupnoj zapremini od 60 µL. Ukratko, na dan izvođenja testa, zamrznute ćelije HTB-10 su odmrznute na 37°C, ćelije su oprane jednom puferom za test, i 12 µL ćelijske suspenzije sa 10000 ćelija, pomešane sa anti-cAMP antitelom obeleženim bojom Alexa, dodato je u bele ploče sa 96 bunarčića sa pola zapremine. Nakon dodavanja 12 µL antitela na CGRP receptor, smeša je inkubirana 30 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim je dodato 12 µL humanog α-CGRP agonista CGRP receptora (1 nM finalne koncentracije) i dodatno inkubirano 15 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon stimulacije humanim α-CGRP, dodato je 24 µL smeše za detekciju i inkubirano 60 minuta na sobnoj temperaturi i ploče su očitane pomoću instrumenta EnVision (PerkinElmer, Boston, MA) na Em665nM. Podaci su obrađeni i analizirani programom Prizm (GraphPad Software Inc.) ili ActivityBase (IDBS).
[0435] Sl. 7A prikazuje primer podataka dobijenih kao što je gore opisano korišćenjem ćelijske linije HTB-10 koja eksprimira hCGRP receptor za tri antitela - 3C8, 13H2 i 1E11. Podaci su grafički prikazani kao procenat od kontrole ("POC") u funkciji koncentracije antitela (3C8, 13H2 ili 1E11), i prilagođeni standardnim nelinearnim regresionim krivama da bi se dobile IC50 vrednosti prikazane pri dnu slike.
B. Nedostatak aktivnosti antitela na srodnim receptorima.
[0436] Ćelije koje eksprimiraju srodne receptore AM1 (ćelije HEK 293 koje eksprimiraju hCRLR+hRAMP2; D. R. Poyner, et al, Pharmacological review, 54:233-246, 2002), AM2 (ćelije CHO koje eksprimiraju hCRLR+hRAMP3; D. R. Poyner, et al, Pharmacological review, 54:233-246, 2002) ili humani amilinski AMY1 receptor (ćelije MCF-7 hCTR+hRAMP1; Wen-Ji Chen, et al, Molecular pharmacology, 52: 1164-1175, 1997) korišćene su za određivanje selektivnosti ispitivanih antitela. Ćelijska linija HEK 293 koja eksprimira AM1 je proizvedena kao što je opisano u primeru 1, gore u tekstu. Ćelijska linija CHO koja eksprimira AM2 je nabavljena od EuroScreen (sada PerkinElmer, Inc.); i ćelijska linija MCF-7 koja eksprimira humani amilinski AMY1 receptor (Zimmermann, et al, Journal of Endocrinology, 423-431, 1997), dobijena je iz ATCC (HTB-22). Primeri rezultata, grafički prikazani kao što je gore opisano, prikazani su na sl.
7B (ćelije hAM1-HEK), 7C (ćelije hAM2-CHO) i 7D (ćelije hAMY-MCF-7). Treba zapaziti da njedno od ispitivanih antitela ne pokazuje značajnu inhibitornu aktivnost protiv receptora hAM1, hAM2 ili hAMY1 u ispitivanom opsegu.
[0437] Slični eksperimenti su izvedeni korišćenjem rekombinantnih ćelija HEK koje eksprimiraju CGRP receptore cinomolgus majmuna i pacovskih ćelija L6 koje eksprimiraju pacovski CGRP receptor (ATCC). Podaci iz ovih ispitivanja, kao i dodatni IC50 podaci dobijeni kao što je opisano u delu A ovog primera, prikazani su u koloni "cAMP" u tabeli 11, u nastavku. Treba primetiti da su IC50 vrednosti protiv humanih i cino CGRP receptora u nanomolarnom opsegu, dok su aktivnosti protiv CGRP receptora pacova, i humanih receptora AM1, AM2 i AMY1, kao i ćelija MCF7 koje eksprimiraju kalcitonin (podaci nisu prikazani) sve veće od 1 mikromola. Razlika u IC50 između humanog CGRP receptora i humanih receptora AM1, AM2, amilinskog i kalcitoninskog receptora ilustruje visoku selektivnost ovih antitela za CGRP receptor u odnosu na srodne receptore koji su delimično obrazovani od istih receptorskih komponenti. IC50 dobijen korišćenjem CGRP receptora čoveka i cinomolgus majmuna su bili slični, dok ispitivana antitela izgleda da ne pokazuju unakrsnu reaktivnost sa CGRP receptorom pacova.
Tabela 11
PRIMER 5
TEST VEZIVANJA RADIOLIGANDA ZA CGRP ZA ODREĐIVANJE Ki ANTITELA KOJA BLOKIRAJU RECEPTOR
[0438] CGRP obeležen sa<125>I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) i ćelijske membrane ćelija HTB-10 (PerkinElmer Inc., Waltham, Massachusetts) korišćene su za eksperiment vezivanja radioliganda u prisustvu različitih koncentracija ispitivanih antitela za određivanje odgovarajućih vrednosti Ki. Test za vezivanje za CGRP je postavljen na sobnoj temperaturi u pločama sa 96 bunarčića koje sadrže: 110 µl pufera za vezivanje (20 mM Tris-HCl, pH7.5, 5.0 mM MgSO4, 0.2% BSA (Sigma), 1 tabletu CompleteTM/50 ml pufera (inhibitor proteaze)); 20 ispitivanih jedinjenja (10X); 20 µl<125>I-hαCGRP (Amersham Biosciences; 10X); i 50 µl suspenzije membrana ćelija humanog neuroblastoma (HTB-10) (10 µg po bunarčiću, PerkinElmer). Ploče su inkubirane na sobnoj temperaturi 2 čsasa uz mućkanje na 60 obr/min, a zatim su sadržaji svakog bunarčića filtrirani nad filter pločama GF/C sa 96 bunarčića obrađenim sa 0.5%-tnim polietileniminom (PEI) (tokom bar jednog časa). Filter ploče GF/C su oprane šest puta sa ledeno hladnim 50 mM Tris, pH 7.5 i osušene u pećnici na 55°C tokom 1 časa. Dna GF/C ploča su zatim zatvorena. U svaki bunarčić je dodato 40 µl Microscint™ 20, vrhovi GF/C ploča su zatvoreni pomoću TopSeal™-A (adhezivni zaptivni film koji se učvršćuje pritiskanjem), i GF/C ploče su očitane pomoću TopCount NXT (Packard). Podaci su analizirani korišćenjem programa Prizm (GraphPad Software Inc.)
[0439] Primeri podataka i vrednosti Ki dobijene korišćenjem antitela 3C8, 12H2 i 1E11 su prikazane na sl. 8.
[0440] Krajnja desna kolona u tabeli 11, gore, prikazuje vrednosti Ki naznačenih mAb u radioaktivno obeleženom testu kompetitivnog vezivanja<125>I-CGRP za ćelijske membrane HTB-10. Podaci pokazuju da su antitela na CGRP receptor bila visoko kompetitivna (sva u subnanomolarnom opsegu) u odnosu na vezivanje CGRP.
PRIMER 6
TEST VEZIVANJA FACS ZA ODREĐIVANJE KD ANTITELA KOJA BLOKIRAJU CGRP RECEPTOR
[0441] Afiniteti anti-CGRP R mAb za CGRP receptore eksprimirane na ćelijama su određeni korišćenjem postupka FACS. Ukratko, ćelije CHO koje eksprimiraju AM-1 huCGRP R, pripremljene kao što je gore opisano, zasejane su u ploče sa 96 bunarčića pri gustinama od 16000 ili 160 000 ćelija po bunarčiću u medijumu DMEM koji sadrži 10% FBS, NEAA, PS, L glut, NaPyr i 0.05% natrijum azida. Antitela protiv CGRP receptora su titrirana u istom medijumu od 50 nM do 1 pM i inkubirana sa ćelijama. Nakon inkubacije preko noći na 4°C u ukupnoj zapremini od 120 µl, na šejkeru za ploče, ćelije su oprane 2X sa PBS+2% FBS, centrifugirane i supernatant je svaki put odbacivan. Zatim je dodato 100 µl/bunarčiću G anti-Hu Fc Cy5 (5 µg/mL; Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA) koja sadrže 7AAD (5 µl/bunarčiću) i inkubirano na 4°C tokom 40 minuta. Ćelije su oprane 2X sa PBS+2% FBS, centrifugirane i supernatant je svaki put odbacivan. Zatim je dodato 100 µl PBS+2% FBS pufera i analizirano pomoću FACS da bi se odredila geometrijska srednja vrednost vezivanja. Kd vrednost je izračunata korišćenjem programa KinExA, uzimanjem negativne geometrijske srednje vrednosti na svakoj koncentraciji antitela kao količine prisutnog slobodnog At (Rathanaswami, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 334 (2005) 1004-1013). Podaci dobijeni na dve različite koncentracije ćelija su analizirani analizom n-krive da bi se odredila Kd i 95%-tni interval poverenja kao što je opisano kod Rathanaswami, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 334 (2005) 1004-1013.
[0442] Primeri podataka sa odgovarajućim prilagođavanjem krive prikazani su na sl.10 za antitelo 12G8.2. Podaci o osam blokirajućih antitela generisani u prilog predmetnom opisu prikazani su u tabeli 12. Jedno od antitela (3B6) je analizirano u dva različita dana. Odnos od 0.9 dobijen za eksperiment sa ćelijama 16K ukazuje na to da koncentracija antigena može da se predvidi kao 0.9X Kd i stoga kriva dobijena ovim eksperimentom predstavlja Kd kontrolisanu krivu. Može se zapaziti da su vrednosti Kd dobijene na ovaj način bile u niskom jednocifrenom nanomolarnom opsegu za sva ispitivana antitela.
Tabela 12
PRIMER 7
KVANTITATIVNO MERENJE STEPENA VEZIVANJA ANTITELA KOJA BLOKIRAJU CGRP RECEPTOR POMOĆU KOMPETITIVNOG VEZIVANJA BIACORE
[0443] Ispitivanja Biacore (Karlsson, R. et al., Methods; A Companion to Methods in Enzymology, 6: 99-110 (1994) su izvedena kao što sledi. Imobilizacija anti-CGRP receptorantitela na površini senzorskog čipa CM5 izvedena je prema uputstvima proizvođača, korišćenjem kontinuiranog protoka 10 mM HEPES, 0.15M NaCl, 3.4mM EDTA, 0.005% P-20, pH 7.4 (HBS-EP pufer). Karboksilne grupe na površinama senzorskog čipa su aktivirane injektovanjem 60 µL smeše koja sadrži 0.2 M N-etil-N’ (dimetilaminopropil)karbodiimid (EDC) i 0.05 M N-hidroksisukcinimid (NHS). Specifične površine su dobijene injektovanjem 180 µl anti-CGRP receptor-antitela razblaženog u 10 mM acetatu, pH 4.0 pri koncentraciji od 30 µg/mL. Višak reaktivnih grupa na površinama je deaktiviran injektovanjem 60 µL 1 M etanolamina. Finalni nivoi imobilisanih pojedinačnih antitela bili su kao što sledi:
Antitelo Rezonantne jedinice (RU)
11D11 ∼5 900
3B6 ∼7200
12G8 ∼7 800
9F5 ∼6 600
34E3 ∼3700
Slepa proba, lažno-vezana referentna površina takođe je pripremljena na senzorskom čipu. Rastvorni huCGRP receptor u koncentraciji od 100 nM učvršćen je na senzorskom čipu koji ima jedno od gore navedenih šest imobilisanih antitela (11D11, 3B6, 4H6, 12G8, 9F5 ili 34E3). Svako od 20 ispitivanih anti-CGRP R antitela jer zatim injektovano preko učvršćenog huCGRP receptora. Ako je injektovano antitelo prepoznalo posebni epitop u odnosu na onaj koji je prepoznalo imobilisano antitelo, bio bi primećen drugi događaj vezivanja. Ako antitela prepoznaju iste ili vrlo slične epitope, bilo bi primećeno samo vezivanje huCGRP receptora.
[0444] Primeri podataka dobijenih korišćenjem senzorskog čipa obloženog imobilisanim antitelom 3B6 prikazani su na sl. 9A. Četiri krive su podaci dobijeni korišćenjem antitela 1E11, 4E4, 2E7 i 12G8 u injektovanom rastvoru. Događaji tokom eksperimenta su predstavljeni slovima, gde "A" odgovara injektovanju huCGRP R-Fc, "B" odgovara završetku injektovanja huCGRP R-Fc, "C" odgovara injektovanju drugog mAb, i "D" odgovara završetku drugog injektovanja mAb i početku pranja puferom. Treba primetiti da nema naznake bilo kakvog signala vezivanja od bilo kog od injektovanih antitela na površini imobilisanog antitela, što ukazuje na to da četiri injektovana antitela očigledno prepoznaju isti ili veoma sličan epitop(e) kao imobilisano antitelo. Suštinski isti rezultati su dobijeni sa svim ispitivanim blokirajućim antitelima prelivenim preko površina svakog od pet imobilisanih neutrališućih antitela, što pokazuje da sva ispitivana blokirajuća anti-huCGRP receptor-antitela prepoznaju iste ili veoma slične i snažno preklapajuće epitop(e).
[0445] Nasuprot tome, kao što je delimično prikazano na sl. 9B, 9C i 9D, četiri ispitivana neblokirajuća, CGRP receptor-specifična antitela 32H8, 33B5, 33E4 i 34E3 nisu stupala u kompeticiju sa 11D11 (podaci nisu prikazani), 3B6 (sl. 9B), 12G8 (sl. 9C) i 9F5 (podaci nisu prikazani) iako je 34E3 bio u stanju da kompetira sa 4H6 (sl. 9D) i slabo da kompetira sa 32H7 (podaci nisu prikazani).32H8 nije stupao u kompeticiju sa 3B6, 4H6, 12G8, 9F5 ili neblokirajućim antitelom 34E3, ali 33B5 i 33E4 su mogli da kompetiraju sa neblokirajućim antitelom 34E3. Podaci za sva blokirajuća i neblokirajuća antitela su prikazani u tabeli 13, ispod. "NB" označava da nema vezivanja; "+" označava značajno vezivanje; i "slabo" označava slabo vezivanje.
Tabela 13
[0446] Kao što se može videti iz podataka, sva ispitivana blokirajuća ili neutrališuća antitela vezuju se za isti region kao pet imobilisanih blokirajućih antitela; tj., sva ispitivana neutrališuća antitela vezuju se za isti region molekula CGRP R. Sa druge strane, neblokirajuća antitela uopšteno nisu kompetirala sa imobilisanim blokirajućim antitelima, ukazujući na to da se neblokirajuća antitela primarno vezuju za drugačiji region CGRP R.
PRIMER 8
VEZIVANJE ANTITELA PROTIV CGRP RECEPTORA ZA RASTVORNI CGRP RECEPTOR U TESTU WESTERN BLOT
[0447] Tri reprezentativna blokirajuća antitela protiv CGRP receptora ispitivana su korišćenjem testova Western blot za vezivanje za rastvorni fuzioni protein CGRP receptor-muFc.
[04488] 100 ng prečišćenog CGRP R-muFc (proizveden i prečišćen kao što je gore opisano za CGRP R-huFc, osim što je korišćen mišji Fc i linker između ECD RAMP1 ili CRLR i muFc je izmenjen u "GGGGGVDGGGGGV" (SEQ ID NO:213)) razblaženo je u PBS sa puferom za uzorak PAGE sa (redukovani) ili bez (neredukovani) beta-merkaptoetanola (βME) u koncentraciji od 13.3%. Uzorak koji sadrži βME je zatim kuvan 4 minuta. Redukovni i neredukovani uzorci su naneti na odvojene Tris-glicin gelove od 4-20% (Invitrogen) sa naizmeničnim trakama CGRP R-Fc proteina i markera molekulske težine (Invitrogen). Gelovi su preneti pomoću struje na 0.2 µm nitrocelulozne filtere (Invitrogen). Blotovi su oprani Tris-puferisanim slanim rastvorom 1% Tween 20 (TBST) i zatim blokirani pomoću TBST 5% mleka u prahu tokom 30 minuta. Blotovi su isečeni na trake duž linija markera za molekulsku težinu. Po jedna traka sa redukovanim i neredukovanim CGRP R-muFc je inkubirana sa prečišćenim antitelima na huCGRP R, 4E4, 9F5, ili 3B6 (1:500 razblaženje u TBST 5% mleka), kozjim anti-huRAMP1 antitelima N-20 (1:500; Santa Cruz Biotechnology, Inc), zečjim anti-mišjim IgG-Fc-HRP antitelima (1:10 000) (Pierce), ili kozjim anti-humanim IgG-Fc-HRP antitelima (1:10 000) (Pierce). Blotovi su inkubirani sa antitelima jedan čas nakon čega su oprani 3 puta po 10 minuta smešom TBST 1 % mleka. Blotovi obrađeni sa huCGRP R antitelima su zatim inkubirani sa kozjim anti-mišjim IgG-Fc-HRP antitelima (1:10000 u TBST 1% mleka), a blotovi obrađeni sa anti-huRAMP1 antitelima (N-20 anti-RAMP1 kozje poliklonsko antitelo, Santa Cruz Biotech, CA) su inkubirani sa zečjim antikozjim IgG-Fc-HRP antitelima (1:10000) tokom 20 minuta. Blotovi su oprani 3 puta po 15 minuta sa TBST. Blotovi sa huCGRP R i anti-huRAMP1 antitelima su obrađeni reagensom za detekciju Pierce Supersignal West Pico, a blotovi sa anti-mišjim i anti-humanim IgG-Fc-HRP antitelima su obrađeni standardnim reagensom za detekciju Pierce (1 min.). Blotovi su zatim obrađeni pomoću rendgenografskog filma Kodak Biomax MS.
[0449] Sva tri antitela protiv CGRP receptora, 4E4, 9F5 i 3B6 bila su u stanju da detektuju rastvorni CGRP R-muFc (koji sadrži ECD RAMP1 i ECD CRLR) pod neredukujućim uslovima, ali ne i pod redukujućim uslovima, što ukazuje na to da je vezujući epitop ovih antitela protiv CGRP R bio konformacioni i osetljiv na disulfidne veze (3 para u RAMP1-ECD i 3 para u CRLR N-ter ECD). Nasuprot tome, komercijalno anti-RAMP1 antitelo N-20 (Santa Cruz Biotech) se vezuje za RAMP1 i pod redukujućim i pod neredukujućim uslovima što ukazuje na to da je vezivno mesto za N-20 antitelo primarno linearno i nije osetljivo na disulfidne veze.
PRIMER 9
VEZIVANJE BLOKIRAJUĆIH ANTITELA ZA CGRP RECEPTOR ZA HIMERNE RECEPTORE
[0450] CGRP receptori obrazovani ili od nativnog RAMP1 sa himernim CRLR, ili nativnog CRLR sa himernim RAMP1, korišćeni su za identifikovanje sekvenci CGRP receptora uključenih u vezivanje antitela. Budući da nijedno ispitivano blokirajuće antitelo za humani CGRP receptor nije pokazalo funkcionalnu aktivnost prema CGRP receptoru pacova, himerne komponente su sadržale regione sekvence pacova u okruženju od humanih sekvenci. Sledeće himere su stvorene za ispitvanje vezivanja pomoću FACS:
RAMP1 himera#1 (Q28 do A34): SEQ ID NO:217
[0451] Aminokiselinski ostaci Q28 do A34 u humanom RAMP1 su zamenjeni odgovarajućim sekvencama iz RAMP1 pacova. Ovaj niz je uključivao pet aminokiselinskih ostataka koji se razlikuju između RAMP1 čoveka i pacova.
RAMP1 himera#2 (Q43 do E53): SEQ ID NO:218
[0452] Aminokiselinski ostaci Q43 do E53 u humanom RAMP1 su zamenjeni odgovarajućim sekvencama iz RAMP1 pacova. Ovaj niz je uključivao šest aminokiselinskih ostataka koji se razlikuju između RAMP 1 čoveka i pacova.
RAMP1 himera#3 (R67 do E78): SEQ ID NO:219
[0453] Aminokiselinski ostaci R67 do E78 u humanom RAMP su zamenjeni odgovarajućim sekvencama iz RAMP1 pacova. Ovaj niz je uključivao sedam aminokiselinskih ostataka koji se razlikuju između RAMP1 čoveka i pacova.
CRLR himera#1 (L24 do Q33); SEQ ID NO:223
[0454] Aminokiselinski ostaci L24 do Q33 u humanom CRLR su zamenjeni odgovarajućim sekvencama iz CRLR pacova. Ovaj niz je uključivao osam aminokiselinskih ostataka koji se razlikuju između CRLR čoveka i pacova.
[0455] Sl. 11 prikazuje poravnanje aminokiselinskih sekvenci RAMP1 cinomolgus majmuna (SEQ ID NO:215), čoveka (SEQ ID NO:4), pacova (SEQ ID NO:214) i rezus majmuna (SEQ ID NO:216), zajedno sa sekvencama RAMP1 himere #1 (SEQ ID NO:217), himere #2 (SEQ ID NO:218) i himere #3 (SEQ ID NO:219). Sl. 12A i 12B prikazuju poravnanje aminokiselinske sekvence CRLR čoveka (SEQ ID NO:2), cinomolgus majmuna (SEQ ID NO:221), rezus majmuna (SEQ ID NO:222), pacova (SEQ ID NO:220), kao i aminokiselinsku sekvencu CRLR himere #1 (SEQ ID NO:223).
[0456] Ćelije 293-6E su prolazno transficirane sa himernim DNK konstruktima CGRP R (CRLR wt RAMP1 Q28-A34; CRLR wt RAMP1 Q43-E53; CRLR wt RAMP1 R67-E78; CRLR L24-Q33 RAMP wt; CRLR wt RAMP1 wt; pTT5 kontrola vektora). Ćelije su sakupljene posle 72 časa, oprane sa PBS 0.5% BSA, i izbrojane. Svaka transficirana ćelijska linija je resuspendovana pri razblaženju od 5x10<5>ćelija na 100 µl PBS/BSA. Po 100 µl ćelijske suspenzije je ravnomerno raspoređeno po bunarčiću u ploči sa okruglim dnom sa 96 bunarčića (Falcon). Ćelije su staložene na 1200 obr/min tokom 5 minuta. Supernatant je uklonjen i zamenjen sa novih 100 µl koji sadrže 0.5 µg prečišćenih huCGRP R antitela 1H7, 2E7, 3B6, 9F5, 4H6, 12G8, 3C8, 10E4, 11D11, 32H8, ili 33B5. Kontrolni bunarčići su obrađeni sa anti-DNP huIgG2 antitelom (0.5 µg), peptidom Alexa 647-CGRP (0.5 µg), ili samo sa PBS/BSA. Ćelije su inkubirane na ledu tokom 1 časa, a zatim dva puta oprane sa PBS/BSA. Ćelije su resuspendovane u 100 µl/bunarčiću PBS/BSA koji sadrži anti-hug-Fc-FITC antitelo (0.5 µg) (osim za ćelije obrađene sa Alexa647CGRP). Ćelije su inkubirane na ledu u mraku tokom 1 časa, a zatim dva puta oprane sa PBS/BSA. Ćelije su resuspendovane u 200 µl PBS/BSA i analizirane korišćenjem aparata FACS Calibur.
[0457] Ispitivano je deset reprezentativnih blokirajućih antitela (3B6, 9F5, 4H6, 12G8, 3C8, 10E4, 32H7, 4E4, 11D11 i 1H7) i dva neblokirajuća antitela (32H8 i 33B5). Reprezentativni podaci (antitelo 9F5) su prikazani na sl.13A, 13B i 13C. Sl.13A prikazuje vezivanje za CGRP receptor divljeg tipa; sl.13B prikazuje vezivanje za CGRP receptore koji sadrže CRLR L24-Q33 himeru, i sl. 13C prikazuje vezivanje za CGRP receptore koji sadrže RAMP1 Q28-A34 himeru. Ispitivanja pomoću FACS pokazala su da se svih 12 antitela vezuje za kontrolni humani CGRP receptor divljeg tipa, kao što je očekivano. Svih 12 antitela pokazalo je značajno smanjeno vezivanje za bilo koju od tri RAMP1 himere, RAMP1 (Q28-A34), (Q43- E53) i (R67 - E78). Ovo je moglo da rezultuje iz sledećeg: (1) nivo ekspresije himernog receptora je bio znatno niži, (2) RAMP1 himera je bila nepodesna za sklapanje sa humanim CRLR i izmenila konformaciju receptorskog kompleksa, i/ili (3) ova tri odabrana regiona u RAMP1 su neposredno uključena u vezivanje ovih antitela za CGRP receptor.
[0458] Kada je ispitivanje pomoću FACS bilo podešeno tako da uključuje samo veoma male "eksprimirajuće" ćelijske populacije, neblokirajuća antitela 33B5 i 32H8 izgleda da su se dosledno vezivala u manjem stepenu (niže geometrijske srednje vrednosti) za himeru RAMP1 Q43-E53 u poređenju sa blokirajućim antitelima, sugerišući da vezivanje za region RAMP1 Q43-E53 može da bude značajnije za neblokirajuća antitela. Sa druge strane, 33B5 i 32H8 su se dosledno vezivala u većem stepenu za himeru RAMP1 R67-E78 nego blokirajuća antitela, sugerišući da sekvenca R67-E78 u RAMP1 može da bude važnija za blokirajuća antitela.
[0459] Sva ispitivana antitela protiv CGRP receptora su se vezivala u prihvatljivom stepenu za himeru CRLR (L24-Q33), sugerišući da ovo mesto nije od suštinskog značaja za vezivanje blokirajućih antitela.
[0460] Ukratko, podaci pokazuju da bi tri diskontinuirana regiona u RAMP1 -- (Q28-A34), (Q43 - E53) i (R67-E78) – mogla da budu uključena u vezivanje antitela za CGRP receptor, sa regionom (R67-E78) koji je važniji za blokirajuća antitela. N-terminalne sekvence (L24-Q33) CRLR izgleda da nisu kritično uključene u vezivanje antitela za CGRP receptor, kako je pokazao ovaj metod. Ovaj pristup ne isključuje dodatna vezivna mesta koja dele identične ili slične sekvence između CGRP receptora čoveka i pacova, koja nisu bila ispitana tokom ove analize.
PRIMER 10
IDENTIFIKACIJA EPITOPA HUMANOG CGRP R ZA ANTI-CGRP R NEUTRALIŠUĆA ANTITELA POMOĆU TESTA ZAŠTITE OD DELOVANJA PROTEAZE
[0461] Fragment CRLR u zrelom obliku fuzionog molekula CRLR-Fc (sa uklonjenim signalnim peptidom; ovde opisan kao SEQ ID NO:10) sadrži 116 aminokiselina (koje prethode glicinskom linkeru) i ima tri velike strukture u obliku petlje stvorene obrazovanjem tri disulfidne veze. Tri disulfidne veze u CRLR čine Cys1 na položaju 26 u sekvenci (svi položaji u sekvenci CRLR navedeni u ovom odeljku se odnose na zrelu sekvencu predstavljenu kao SEQ ID NO:10) povezan sa Cys3 na položaju 52 u sekvenci (označena kao CRLR C1-C3), Cys2 na položaju 43 u sekvenci povezan sa Cys5 na položaju 83 u sekvenci (označena kao CRLR C2-C5), Cys4 na položaju 66 u sekvenci povezan sa Cys6 na položaju 105 u sekvenci (označena kao CRLR C4-C6). Fragment RAMP1 u zrelom obliku fuzionog molekula RAMP1-Fc sadrži 91 aminokiselinu (SEQ ID NO:11) koje prethode glicinskom linkeru, koje takođe obrazuju tri unutarmolekulske disulfidne veze. Tri disulfidne veze u RAMP1 predstavljaju Cys1 na položaju 1 u sekvenci (svi položaji u sekvenci RAMP1 navedeni u ovom odeljku se odnose na zrelu sekvencu predstavljenu kao SEQ ID NO:11) povezan sa Cys5 na položaju 56 u sekvenci (označena kao RAMP1 C1-C5), Cys2 na položaju 14 u sekvenci povezan sa Cys4 na položaju 46 u sekvenci (označena kao RAMP1 C2-C4), Cys3 na položaju 31 u sekvenci povezan sa Cys6 na položaju 78 u sekvenci (označena kao RAMP1 C3-C6).
[0462] Regioni humanog CGRP receptorskog proteina vezani anti-CGRP neutrališućim monoklonskim antitelima identifikovani su fragmentacijom h CGRP R na peptide specifičnim proteazama, i određivanjem sekvence rezultujućih h CGRP R peptida (tj., peptidnih fragmenata CRLR i RAMP1 koji sadrže disulfid i koji ne sadrže disulfid). Test zaštite od proteaze je zatim izveden da bi se odredila proteolitička digestja hCGRP R u prisustvu vezujućih monoklonskih antitela. Opšti princip ovog testa zasniva se na činjenici da vezivanje mAb za CGRP R može da rezultuje u zaštiti određenih specifičnih mesta sečenja proteazom i ova informacija može da se koristi za određivanje regiona ili dela CGRP R za koji se vezuje mAb.
[0463] Ukratko, peptidni proizvodi digestije su podvrgnuti testu mapiranja peptida pomoću HPLC; sakupljeni su pojedinačni pikovi, i peptidi identifikovani i mapirani pomoću interaktivne analize jonizacije elektrosprejem LC-MS (ESI-LC-MS) i/ili pomoću N-terminalnog sekvenciranja. Sve HPLC analize za ova ispitivanja su izvedene korišćenjem mikro-pakovane reverzno-fazne C18 kolone (2.1 mm u.p. x 15 cm dužine; Zorbax 300SB, 5 µm, Agilent Technologies) za analizu u autonomnom režimu, i korišćenjem kapilarne reverzno fazne C18 kolone (0.5mm u.p. x 25 cm Vydac C18 MS, 5 µm; The Separation Group) za LC-MS. Mapiranje peptida pomoću HPLC je izvedeno sa linearnim gradijentom od 0.05% trifluorosirćetne kiseline (mobilna faza A) do 90% acetonitrila u 0.05% trifluorosirćetnoj kiselini. Kolone su razvijane 90 minuta pri protoku od 0.25 ml/min za mikro-pakovanu HPLC, za autonomne ili interaktivne LC-MS analize, i 0.018 ml/min za kapilarnu HPLC za interaktivne LC-MS analize.
[0464] Zreli oblik humanog CGRP R je digestiran sa AspN (koja seče posle ostataka asparaginske kiseline i nekih ostataka glutaminske kiseline na amino kraju) inkubacijom 100 µg CGRP R u koncentraciji od 1.0 mg/ml u 0.1M natrijum fosfata (pH 6.5), tokom 20 časova na 37°C sa 2 µg AspN.
[0465] HPLC hromatografija proizvoda digestije sa AspN dala je profil peptida kao što je prikazano na sl.14 (injektovano je 30 µg svakog uzorka), hromatogramu obeležen sa A predstavlja sam CGRP R (koncentracija 1 mg/ml), dok kontrolna digestija sa sličnom količinom neutrališućeg antitela protiv CGRP R, klon 12G8, pokazuje da je antitelo suštinski otporno na AspN endoproteinazu (hromatogram obeležen sa B; odnos CGRP R:antitelu, 100:2; 100:7; 100:20, tež./tež., redom). Ispitivanja sekvence su izvedena pomoću interaktivne LC-MS/MS analize i pomoću sekvenciranja po Edmanu peptidnih pikova dobijenih pomoću HPLC. Interaktivne ESI LC-MS analize peptida nastalih digestijom su izvedene da bi se odredila precizna masa i sekvenca peptida koji su razdvojeni pomoću HPLC. Identiteti nekoliko peptida prisutnih u pikovima peptida nastalih digestijom sa AspN su na taj način određeni (pikovi označeni brojevima na sl.14). Tabela 14, dole, prikazuje lokaciju ovih peptidnih sekvenci u odgovarajućoj komponenti (CRLR ili RAMP1) u hCGRP R. Veliko slovo C praćeno brojem ili X predstavlja peptid identifikovan kao CRLR peptid; veliko slovo R praćeno brojem ili X predstavlja RAMP1 peptid i "Fc" predstavlja veliki Fc fragment koji nije digestiran oslobođen iz fuzionih molekula CRLR-Fc i RAMP1-Fc.
[0466] Sl.15 prikazuje poređenje eksperimenta AspN digestije (injektovano 30 µg svakog uzorka) samog CGRP R (hromatogram obeležen sa A), sa onim izvedenim u prisustvu neutrališućeg antitela 12G8 (hromatogram obeležen sa B). Težinski odnos CGRP R:antitelu bio je 1:1. Nekoliko pikova (C5, C6, i C7) pokazuje smanjenje visine pika u hromatogramu B u odnosu na hromatogram A, dok druga dva pika (C-X i R-X) pokazuju povećanje visine pika u hromatogramu B u odonsu na hromatogram A. Sličan obrazac peptidne mape takođe je primećen kada je drugo neutrališuće anti-CGRP R antitelo (10E4, 3B6, 3C8 ili 4E4) bilo prisutno u sličnoj količini u digestionom uzorku kao što se vidi na hromatogramu obeleženom sa C. Oba peptida, C6 i C7, su vezana disulfidnim vezama i obuhvataju veći deo molekula CRLR, dok C5 predstavlja CRLR peptid koji ne sadrži disulfid, nalazi se na N-terminalnom kraju molekula i prethodi disulfidnom peptidu C7. Pik C-X sadrži tri disulfidne veze CRLR sa multiplim sekvencama, što ukazuje na to da su najmanje dva do tri peptida međusobno povezana disulfidnim vezama. Činjenica da pik C-X ima povećanu visinu u CGRP R digestiranom u prisustvu neutrališućeg antitela protiv CGRP ukazuje na to da je antitelo zaštitilo CGRP R od digestije enzimom AspN na nekoliko mesta sečenja povezanih sa Glu25 i Asp55. Antitelo izgleda da nema značajno zaštitno dejstvo na Asp33 i Asp72 budući da intenzitet pika za peptide C2 i C4 nije uopšte opao. Prema tome, izgleda da se antitelo vezuje za region CRLR koji uključuje CRLR C1-C3 i CRLR C4-C6 disulfidni region zajedno sa regionom petlje između Cys53 i Cys66.
[0467] Mapiranje hCGRP R pomoću AspN takođe je identifikovalo peptid RAMP1 sa disulfidnim vezama (R2) i peptid RAMP1 bez disulfidnih veza (R1) (videti tabelu 14 i sl.14). U prisustvu bilo kog od gorepomenutih neutrališućih antitela (12G8, 10E4, 4E4, 3B6 ili 3C8), peptid R-X je izdvojen pri značajno većem intenzitetu pika, nego onom koji je dobijen digestijom bez antitela u uzorku. Ispitivanja mase i sekvence su pokazala da R-x sadrži jedan polipeptidni lanac koji odgovara sekvenci RAMP1 između Cys1 i Arg86. Ovi eksperimenti ukazuju da neutrališuće antitelo protiv CGRP R može da zaštiti značajan region RAMP1 od proteolitičke digestije sa AspN.
[0468] Da bi se procenilo da li je zaštitno dejstvo od proteolize CGRP R sa AspN specifično za CGRP R-neutrališuća (blokirajuća) antitela (u poređenju sa anti-CGRP R antitelima koja nisu neutrališuća), digestija CGRP R sa AspN je izvedena u prisustvu nesrodnog kontrolnog monoklonskog antitela koje ne neutrališe aktivnost CGRP R. Rezultati su prikazani na sl. 15 na hromatogramu D. Antitelo koje nije neutrališuće ne pokazuje nikakvo značajno blokirajuće dejstvo na proteolizu CGRP R sa AspN; zaista, profil peptidne mape (hromatogram D) je gotovo nerazdvojiv u bitnim aspektima od profila dobijenog digestijom samog CGRP R (hromatogram A).
[0469] Dejstvo zaštite od proteolize je zavisilo od koncentracije dodate uzorku za digestiju. Kao što se vidi na sl. 16, za Aspen proteolizu je korišćena fiksirana količina CGRP R u uzorku (100 µg) sa varijabilnim količinama anti-CGRP R neutrališućeg antitela 4E4 (odnos CGRP R: antitelo u mikrogramima, 100:2; 100:7; 100:20, tež./tež., redom). Moguće je uočiti profil zaštite, koja je zavisna od koncentracije antitela.
[0470] Zajedno uzevši, ovi podaci pokazuju da ovde opisana blokirajuća ili neutrališuća anti-CGRP R antitela mogu da blokiraju proteolizu CGRP R (na obe komponente, i CRLR i RAMP1) sa AspN, sugerišući da se, pri vezivanju ovih antitela za CGRP receptor, blokirajuća antitela vezuju i za CRLR i za RAMP1. Dalje, zaštitno dejstvo je zavisno od koncentracije antitela. Ovi rezultati takođe ukazuju na to da se CGRP R neutrališuća antitela vezuju za zajedničke regione na humanom CGRP R koji su blizu mesta sečenja sa Asp N.
PRIMER 11
KOMERCIJALNO DOSTUPNA ANTI-RAMP1 I ANTI-CRLR ANTITELA U FUNKCIONALNOM TESTU cAMP
[0471] Komercijalno dostupna antitela usmerena protiv jedne ili druge komponente (RAMP 1 ili CRLR) humanog CGRP receptora su ispitana u testu cAMP posredovanom CGRP receptorom korišćenjem ćelija HTB-10 kao što je opisano u primeru 4, gore, da bi se odredilo da li antitela imaju biološku aktivnost. Podaci su predstavljeni u tabeli 15, dole. Antitela ili nisu imala detektabilnu ("ND"), ili imaju veoma slabu ("VW") ili slabu ("W") biološku aktivnost u opsegu koncentracija u kome ovde opisani primeri antitela imaju izrazitu biološku aktivnost.
Tabela 15 Aktivnost komercijalno dostupnih antitela
PRIMER 12
Imunohistohemijsko bojenje ćelija koje eksprimiraju različite komponente receptora
[0472] Na kolagensku membranu CollaPlug (Integra LifeSciences Co., Plainsboro, NJ) injektovano je 2-4 x 10<6>ćelija. Membrane su uronjene u medijum OCT (Sakura Finetek Inc., Torrance, CA), smrznute na -20°C i isečene na odsečke od 20 µm korišćenjem kriostata. Odsečci su fiksirani 4% paraformaldehidom tokom 1 časa na sobnoj temperaturi (RT) i zatim oprani u fosfatno-puferisanom slanom rastvoru (PBS). Endogena peroksidaza je blokirana sa 3% H2O2/PBS tokom 15 minuta i odsečci su inkubirani u rastvoru za blokiranje (PBS sa 3% normalnim kozjim serumom (Vector Labs, Burlingame, CA) i 0.3% triton X-100) tokom 1 časa. Nakon toga, odsečci su inkubirani u humanom primarnom antitelu protiv CGRP receptora (32H7, 0.03-0.1 µg/ml) na 4°C preko noći, oprani u PBS i inkubirani u sekundarnom antitelu (biotinilatisani Fc fragment kozjeg anti-humanog IgG, 1:800, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) u 1% normalnom kozjem serumu/PBS tokom 1 časa na RT. Imunoreaktivnost je amplifikovana korišćenjem kita Vector Elite prema uputstvima proizvođača (Vector Labs, Burlingame, CA) i bojenje je izvedeno korišćenjem 3,3’-diaminobenzidin-nikla kao hromogena (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Isečci su očišćeni ksilenom i pokriveni pokrovnom ljuspom sa medijumom Permount (Fisher Chemicals, Fair Lawn, NJ). Imunoreaktivnost je analizirana korišćenjem mikroskopa Nikon E-800 i pripadajućeg programa (Nikon, Melville, NY).
[0473] Podaci dobijeni iz ćelija koje eksprimiraju različite receptorske komponente (kao što je dole identifikovano), korišćenjem antitela 32H7 kao što je gore opisano, otkrili su izrazito bojenje CHO ćelija koje eksprimiraju rekombinantni humani CGRP receptor (CRLR+RAMP1; "CHO/CGRP R ćelije") i slabije bojenje ćelija SK-N-MC koje endogeno eksprimiraju CGRP receptore (zahvaljujući mnogo manjoj gustini receptora). Bojenje nije primećeno u roditeljskoj ćelijskoj liniji CHO, ćelijama CHO koje eksprimiraju nesrodni rekombinantni protein (TRPM8), ćelijama CHO/CGRP R nakon preapsorpcije sa odgovarajućim antigenom 32H7, ćelijama CHO koje eksprimiraju rekombinantni humani adrenomedulinski receptor 2 (CRLR+RAMP3), ćelijama MCF-7 koje eksprimiraju endogene amilinske receptore, ćelijama HEK koje eksprimiraju rekombinantni humani adrenomedulinski receptor 1 (CRLR+RAMP2), ili ćelijama roditeljske HEK. Podaci iz ovih eksperimenata su sumirani u tabeli 16, dole.
Tabela 16 Intenzitet imunohistohemijskog bojenja naznačenih ćelija

Claims (11)

Patentni zahtevi
1. Monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji vezuje humani CGRP receptor, navedeni humani CGRP receptor sadrži humani CRLR polipeptid i humani RAMP1 polipeptid,
naznačeno time što se monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment vezuje na epitop formiran od aminokiselinskih ostataka oba CRLR i RAMP1 polipeptida, i
gde se monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment takmiči se za vezivanje za humani CGRP receptor sa referentnim antitelom, pomenuto referentno antitelo obuhvata (i) varijabilnu regiju teškog lanca koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 161, 163, 164, 166, i 168; i (ii) varijabilnu regiju lakog lanca koji obuhvata sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 140, 143, 146, 148, i 150.
2. Monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema zahtevu 1, naznačeno time što se monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment specifično vezuje na humani CGRP receptor sa KD≤100 nM kako je utvrđeno sa testom FACS vezivanja.
3. Monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema zahtevu 1, naznačeno time što referentno antitelo sadrži teški lanac i laki lanac definisan jednim od sledećih parova sekvenci:
SEQ ID NO: 32 i SEQ ID NO: 15;
SEQ ID NO: 34 i SEQ ID NO: 18;
SEQ ID NO: 35 i SEQ ID NO: 21;
SEQ ID NO: 37 i SEQ ID NO: 23; i
SEQ ID NO: 39 i SEQ ID NO: 25.
4. Monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema zahtevu 1, naznačeno time što monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment selektivno inhibira humani CGRP receptor u poređenju sa humanim AM1, AM2, i AMY1 receptorima sa odnosom selektivnosti od 100 ili više kako je utvrđeno sa testom cAMP inhibicije.
5. Monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1 do 4, naznačeno time što monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment je potpuno humano antitelo, humanizovano antitelo, himerno antitelo, ili njihov antigen-vezujući fragment.
6. Monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1 do 4, naznačeno time što monoklonsko antitelo je IgG1-, IgG2-, IgG3-, ili IgG4-tip antitela.
7. Monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1 do 6, naznačeno time što antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment inhibira vezivanje CGRP na humani CGRP receptor.
8. Monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 4 ili 7 naznačeno time što se koristi u inhibiciji vazodilatacije kod pacijenta kome je to potrebno.
9. Monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 4 ili 7 naznačeno time što se koristi u lečenje stanja povezanog sa CGRP receptorom, pri čemu stanje je glavobolja.
10. Monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 4 ili 7 naznačeno time što se koristi u lečenje stanja povezanog sa CGRP receptorom, pri čemu stanje je migrena.
11. Monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 4 ili 7 naznačeno time što se koristi u lečenje stanja povezanog sa CGRP receptorom, pri čemu stanje je klaster glavobolja.
RSP20191122 2008-12-23 2009-12-18 Antitela koja se vezuju za humani cgrp receptor RS59343B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US20356908P 2008-12-23 2008-12-23
US26462209P 2009-11-25 2009-11-25
EP16199717.6A EP3184546B8 (en) 2008-12-23 2009-12-18 Human cgrp receptor binding antibodies

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS59343B1 true RS59343B1 (sr) 2019-10-31

Family

ID=41718325

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RSP20191122 RS59343B1 (sr) 2008-12-23 2009-12-18 Antitela koja se vezuju za humani cgrp receptor
RS20250696A RS67071B1 (sr) 2008-12-23 2009-12-18 Antitela koja se vezuju za humani cgrp receptor
RS20171121A RS56567B1 (sr) 2008-12-23 2009-12-18 Antitela koja se vezuju za humani cgrp receptor

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20250696A RS67071B1 (sr) 2008-12-23 2009-12-18 Antitela koja se vezuju za humani cgrp receptor
RS20171121A RS56567B1 (sr) 2008-12-23 2009-12-18 Antitela koja se vezuju za humani cgrp receptor

Country Status (42)

Country Link
US (7) US9102731B2 (sr)
EP (4) EP3184546B8 (sr)
JP (6) JP5761805B2 (sr)
KR (4) KR20180043850A (sr)
CN (2) CN102348722B (sr)
AR (1) AR074857A1 (sr)
AU (2) AU2009330175C1 (sr)
BR (2) BRPI0922505B1 (sr)
CA (1) CA2746858C (sr)
CL (1) CL2011001578A1 (sr)
CO (1) CO6400232A2 (sr)
CR (1) CR20110400A (sr)
CY (3) CY1119465T1 (sr)
DK (3) DK3569620T3 (sr)
EA (2) EA201891500A3 (sr)
ES (3) ES2643835T3 (sr)
FI (1) FI3569620T3 (sr)
HR (3) HRP20171690T1 (sr)
HU (4) HUE034506T2 (sr)
IL (2) IL213429A (sr)
JO (2) JO3382B1 (sr)
LT (4) LT3184546T (sr)
LU (1) LUC00095I2 (sr)
MA (1) MA32982B1 (sr)
ME (1) ME03601B (sr)
MX (1) MX2011006804A (sr)
MY (1) MY180564A (sr)
NL (1) NL300961I2 (sr)
NO (2) NO2379594T3 (sr)
NZ (2) NZ623541A (sr)
PE (1) PE20120427A1 (sr)
PL (3) PL3569620T3 (sr)
PT (3) PT3184546T (sr)
RS (3) RS59343B1 (sr)
SG (2) SG10201401879TA (sr)
SI (3) SI2379594T1 (sr)
SM (1) SMT201700504T1 (sr)
TN (1) TN2011000283A1 (sr)
TW (4) TW202241950A (sr)
UA (1) UA108066C2 (sr)
WO (1) WO2010075238A1 (sr)
ZA (1) ZA201105418B (sr)

Families Citing this family (121)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3069731A1 (en) 2005-11-14 2016-09-21 Labrys Biologics Inc. Antagonist antibodies directed against calcitonin gene-related peptide and methods using same
AU2008330125B2 (en) * 2007-11-21 2012-11-22 Amgen Inc. Wise binding antibodies and epitopes
RU2522493C2 (ru) 2008-03-04 2014-07-20 Пфайзер Лимитед Способы лечения хронической боли
JO3382B1 (ar) * 2008-12-23 2019-03-13 Amgen Inc أجسام مضادة ترتبط مع مستقبل cgrp بشري
CN102740884A (zh) 2009-08-28 2012-10-17 瑞纳神经科学公司 通过施用针对降钙素基因相关肽的拮抗性抗体来治疗内脏痛的方法
PE20141787A1 (es) 2011-05-20 2014-12-07 Alderbio Holdings Llc Composiciones anti-cgrp y uso de las mismas
TWI705825B (zh) 2011-05-20 2020-10-01 美商艾爾德生物控股有限責任公司 抗降血鈣素基因相關胜肽（ａｎｔｉ－ｃｇｒｐ）或抗降血鈣素基因相關胜肽受器（ａｎｔｉ－ｃｇｒｐ－ｒ）抗體或抗體片段治療或預防慢性及急性型腹瀉之用途
CN107827982B (zh) * 2011-05-20 2021-07-06 H.伦德贝克公司 抗cgrp抗体和抗体片段用于在有需要的受试者中预防或抑制畏光或厌光的用途
EP2970483A2 (en) * 2013-03-15 2016-01-20 Amgen Inc. Methods and compositions relating to anti-ccr7 antigen binding proteins
CA2906737C (en) 2013-03-15 2023-08-15 Amgen Inc. Human pac1 antibodies
US20170114122A1 (en) 2015-10-23 2017-04-27 Alderbio Holdings Llc Regulation of glucose metabolism using anti-cgrp antibodies
SG11201600853UA (en) 2013-08-05 2016-03-30 Twist Bioscience Corp De novo synthesized gene libraries
CA3168888A1 (en) 2013-10-24 2015-04-30 Amgen Inc. Drug delivery system with temperature-sensitive control
SG11201602876WA (en) 2013-10-24 2016-05-30 Amgen Inc Injector and method of assembly
US10994112B2 (en) 2014-02-05 2021-05-04 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
AU2015230933B2 (en) 2014-03-21 2020-08-13 Teva Pharmaceuticals International Gmbh Antagonist antibodies directed against calcitonin gene-related peptide and methods using same
US10556945B2 (en) 2014-03-21 2020-02-11 Teva Pharmaceuticals International Gmbh Antagonist antibodies directed against calcitonin gene-related peptide and methods using same
AU2015256082C1 (en) 2014-05-07 2020-09-10 Amgen Inc. Autoinjector with shock reducing elements
CN111840696B (zh) 2014-06-03 2022-12-20 安姆根有限公司 可控制药物递送系统和使用方法
WO2016044224A1 (en) 2014-09-15 2016-03-24 Amgen Inc. Bi-specific anti-cgrp receptor/pac1 receptor antigen binding proteins and uses thereof
EP3206739B1 (en) 2014-10-14 2021-12-01 Amgen Inc. Drug injection device with visual and audio indicators
US11357916B2 (en) 2014-12-19 2022-06-14 Amgen Inc. Drug delivery device with live button or user interface field
EP3848072A1 (en) 2014-12-19 2021-07-14 Amgen Inc. Drug delivery device with proximity sensor
ES2818103T3 (es) 2015-01-16 2021-04-09 Juno Therapeutics Inc Anticuerpos y receptores de antígenos quiméricos específicos para ROR1
US10669304B2 (en) 2015-02-04 2020-06-02 Twist Bioscience Corporation Methods and devices for de novo oligonucleic acid assembly
JP6484345B2 (ja) 2015-02-17 2019-03-20 アムジエン・インコーポレーテツド 固定及び／または戻りが真空によって支援された薬物送達装置
WO2016138434A1 (en) 2015-02-27 2016-09-01 Amgen Inc. Drug delivery device having a needle guard mechanism with a tunable threshold of resistance to needle guard movement
US9981239B2 (en) 2015-04-21 2018-05-29 Twist Bioscience Corporation Devices and methods for oligonucleic acid library synthesis
TWI799849B (zh) * 2015-04-24 2023-04-21 美商安美基公司 治療或預防偏頭痛之方法
WO2016183479A1 (en) * 2015-05-13 2016-11-17 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Variants of adrenomedullin and calcitonin gene-related peptide and methods of use
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
EP3350314A4 (en) 2015-09-18 2019-02-06 Twist Bioscience Corporation OLIGONUCLEIC ACID VARIANT LIBRARIES VARIANT AND SYNTHESIS THEREOF
KR102794025B1 (ko) 2015-09-22 2025-04-09 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 핵산 합성을 위한 가요성 기판
JP7082568B2 (ja) 2015-12-09 2022-06-08 アムジエン・インコーポレーテツド 信号伝達キャップ付き自動注射器
US11154661B2 (en) 2016-01-06 2021-10-26 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
EP4006056A1 (en) 2016-02-02 2022-06-01 Fred Hutchinson Cancer Research Center Anti-ror1 antibodies and uses thereof
DK3429663T3 (da) 2016-03-15 2020-09-28 Amgen Inc Reduktion af sandsynligheden for glasbrud i anordninger til indgivelse af lægemidler
KR102444717B1 (ko) 2016-04-15 2022-09-16 하. 룬드벡 아크티에셀스카브 인간화 항-pacap 항체 및 그의 용도
WO2017189089A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
US11389588B2 (en) 2016-05-02 2022-07-19 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
AU2017263558B2 (en) 2016-05-13 2022-12-22 Amgen Inc. Vial sleeve assembly
WO2017200989A1 (en) 2016-05-16 2017-11-23 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
US11541176B2 (en) 2016-06-03 2023-01-03 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
EP3478342B1 (en) 2016-07-01 2025-03-12 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
WO2018034784A1 (en) 2016-08-17 2018-02-22 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
US10417457B2 (en) 2016-09-21 2019-09-17 Twist Bioscience Corporation Nucleic acid based data storage
EA201990548A1 (ru) 2016-09-23 2019-09-30 Тева Фармасьютикалз Интернэшнл Гмбх Лечение кластерной головной боли
CN109952314A (zh) 2016-09-23 2019-06-28 泰瓦制药国际有限公司 治疗难治性偏头痛
US20200261643A1 (en) 2016-10-25 2020-08-20 Amgen Inc. On-body injector
US11993645B2 (en) 2017-01-11 2024-05-28 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions comprising R-Spondin (RSPO) surrogate molecules
AU2018210301A1 (en) 2017-01-17 2019-08-01 Amgen Inc. Injection devices and related methods of use and assembly
WO2018140821A1 (en) 2017-01-26 2018-08-02 Surrozen, Inc. Tissue-specific wnt signal enhancing molecules and uses thereof
WO2018151890A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Amgen Inc. Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly
CA3052204A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
EP4556433A3 (en) 2017-02-22 2025-08-06 Twist Bioscience Corporation Nucleic acid based data storage
RU2770066C2 (ru) 2017-03-02 2022-04-14 Бет Изрейэл Диконисс Медикал Сентер, Инк. Отбор пациентов с головной болью, восприимчивых к антителам, направленным против кальцитонин ген-родственного пептида
EP3592403B1 (en) 2017-03-06 2025-08-20 Amgen Inc. Drug delivery device with activation prevention feature
US11571511B2 (en) 2017-03-07 2023-02-07 Amgen Inc. Insertion mechanism and method of inserting a needle of a drug delivery device
AU2018230486B2 (en) 2017-03-09 2023-05-11 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
ES3023742T3 (en) 2017-03-28 2025-06-03 Amgen Inc Plunger rod and syringe assembly system
US11590294B2 (en) 2017-06-08 2023-02-28 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
JP7200134B2 (ja) 2017-06-08 2023-01-06 アムジエン・インコーポレーテツド トルク駆動式薬物送達デバイス
JP7195276B2 (ja) 2017-06-22 2022-12-23 アムジエン・インコーポレーテツド デバイス起動による衝突／衝撃の低減
WO2018237225A1 (en) 2017-06-23 2018-12-27 Amgen Inc. Electronic drug delivery device comprising a cap activated by a switch assembly
IL270784B2 (en) 2017-07-14 2023-11-01 Amgen Inc Needle insertion-extraction system with a double torsion spring system
JP7649105B2 (ja) 2017-07-21 2025-03-19 アムジエン・インコーポレーテツド 薬物容器のためのガス透過性シーリング部材及び組立方法
MA49676A (fr) 2017-07-25 2020-06-03 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament doté d'un système d'accès à un récipient et procédé d'assemblage associé
US11617837B2 (en) 2017-07-25 2023-04-04 Amgen Inc. Drug delivery device with gear module and related method of assembly
MA49838A (fr) 2017-08-09 2020-06-17 Amgen Inc Systèm de administration de médicaments avec pression hydraulique-pneumatique de chambre
EP3668567B1 (en) 2017-08-18 2026-02-18 Amgen Inc. Wearable injector with sterile adhesive patch
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
WO2019070472A1 (en) 2017-10-04 2019-04-11 Amgen Inc. FLOW ADAPTER FOR MEDICATION DELIVERY DEVICE
ES2971450T3 (es) 2017-10-06 2024-06-05 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármacos con conjunto de enclavamiento y procedimiento de montaje correspondiente
US11464903B2 (en) 2017-10-09 2022-10-11 Amgen Inc. Drug delivery device with drive assembly and related method of assembly
CN111565834B (zh) 2017-10-20 2022-08-26 特韦斯特生物科学公司 用于多核苷酸合成的加热的纳米孔
IL273582B2 (en) 2017-11-03 2024-12-01 Amgen Inc Systems and approaches for sterilizing a drug delivery device
EP3707075A1 (en) 2017-11-06 2020-09-16 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
EP3706830B1 (en) 2017-11-06 2024-08-07 Amgen Inc. Drug delivery device with placement and flow sensing
MA50557A (fr) 2017-11-10 2020-09-16 Amgen Inc Pistons pour dispositifs d'administration de médicament
JP7370969B2 (ja) 2017-11-16 2023-10-30 アムジエン・インコーポレーテツド 薬物送達デバイスの扉ラッチ機構
SG11202006610YA (en) 2018-01-12 2020-08-28 Amgen Inc Pac1 antibodies and uses thereof
JP7840636B2 (ja) 2018-04-02 2026-04-06 アムジェン インコーポレイテッド エレヌマブ組成物及びその使用
MX2020010724A (es) 2018-04-12 2020-11-06 Amgen Inc Metodos para preparar composiciones proteicas estables.
CA3100739A1 (en) 2018-05-18 2019-11-21 Twist Bioscience Corporation Polynucleotides, reagents, and methods for nucleic acid hybridization
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
CA3104868A1 (en) 2018-07-09 2020-01-16 Surrozen, Inc. Tissue-specific wnt signal enhancing molecules and uses thereof
CA3103681A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
US12303677B2 (en) 2018-07-24 2025-05-20 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with optional grip portion and related method of preparation
MA53375A (fr) 2018-07-24 2021-06-02 Amgen Inc Dispositifs d'administration pour l'administration de médicaments
WO2020023336A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
CA3103105A1 (en) 2018-07-31 2020-02-06 Amgen Inc. Fluid path assembly for a drug delivery device
US20210346601A1 (en) 2018-09-24 2021-11-11 Amgen Inc. Interventional dosing systems and methods
CA3110371A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 Amgen Inc. Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
EP3860685A1 (en) 2018-10-02 2021-08-11 Amgen Inc. Injection systems for drug delivery with internal force transmission
US12151089B2 (en) 2018-10-05 2024-11-26 Amgen Inc. Drug delivery device having dose indicator
TW202541859A (zh) 2018-10-15 2025-11-01 美商安進公司 具有阻尼機構之藥物遞送裝置及自動注射器
WO2020081480A1 (en) 2018-10-15 2020-04-23 Amgen Inc. Platform assembly process for drug delivery device
TWI831847B (zh) 2018-11-01 2024-02-11 美商安進公司 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法
MA54048A (fr) 2018-11-01 2022-02-09 Amgen Inc Dispositifs d'administration de médicament avec rétraction partielle de l'organe d'administration de médicament
EP3873563A1 (en) 2018-11-01 2021-09-08 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
WO2020139871A1 (en) 2018-12-26 2020-07-02 Twist Bioscience Corporation Highly accurate de novo polynucleotide synthesis
WO2020146527A1 (en) * 2019-01-08 2020-07-16 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Acute treatment and rapid treatment of headache using anti-cgrp antibodies
JP2022522668A (ja) 2019-02-26 2022-04-20 ツイスト バイオサイエンス コーポレーション 抗体を最適化するための変異体核酸ライブラリ
CN113766930B (zh) 2019-02-26 2025-07-22 特韦斯特生物科学公司 Glp1受体的变异核酸文库
AU2020263289B2 (en) 2019-04-24 2025-05-22 Amgen Inc. Syringe sterilization verification assemblies and methods
CN114127110B (zh) * 2019-05-30 2022-07-01 山东博安生物技术股份有限公司 抗cgrp抗体及其应用
US20220363770A1 (en) 2019-06-28 2022-11-17 Amgen Inc. Anti-cgrp receptor/anti-pac1 receptor bispecific antigen binding proteins
WO2021041067A2 (en) 2019-08-23 2021-03-04 Amgen Inc. Drug delivery device with configurable needle shield engagement components and related methods
JP2022548783A (ja) 2019-09-23 2022-11-21 ツイスト バイオサイエンス コーポレーション 単一ドメイン抗体のバリアント核酸ライブラリー
EP4034566A4 (en) 2019-09-23 2024-01-24 Twist Bioscience Corporation VARIANT NUCLEIC ACID BANKS FOR CRTH2
CA3077973A1 (en) 2020-04-06 2021-10-06 H. Lundbeck A/S Treatment of most bothersome symptom (mbs) associated with migraine using anti-cgrp antibodies
JP2023549854A (ja) 2020-11-16 2023-11-29 スロゼン オペレーティング， インコーポレイテッド 肝臓特異的Ｗｎｔシグナル増強分子およびその使用
JP2024509165A (ja) 2021-03-02 2024-02-29 シージーアールピー ダイアグノスティクス ゲーエムベーハー 片頭痛の治療及び／又は発生の低減
JP2024523779A (ja) 2021-05-21 2024-07-02 アムジェン インコーポレイテッド 薬物容器用の充填レシピを最適化する方法
US20250109188A1 (en) 2021-08-24 2025-04-03 Cgrp Diagnostics Gmbh Preventative treatment of migraine
JP2025515038A (ja) * 2022-05-05 2025-05-13 アムジェン インコーポレイテッド Ｄｌｌ３及びｃｄ３に結合するヘテロ多量体
TW202432600A (zh) 2022-11-07 2024-08-16 美商安進公司 用於治療肥胖症之方法
WO2025226754A1 (en) 2024-04-23 2025-10-30 Amgen Inc. Method for predicting osmolality of protein solutions
CN118459595A (zh) * 2024-05-21 2024-08-09 杭州百懿生物药业有限公司 特异性结合cgrp受体的抗体分子及其用途
WO2026030152A1 (en) 2024-07-29 2026-02-05 Amgen Inc. System and method for assessing transferability of a fill recipe

Family Cites Families (107)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
DE3374837D1 (en) 1982-02-17 1988-01-21 Ciba Geigy Ag Lipids in the aqueous phase
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
DE3474511D1 (en) 1983-11-01 1988-11-17 Terumo Corp Pharmaceutical composition containing urokinase
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US4751180A (en) 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
WO1987005330A1 (en) 1986-03-07 1987-09-11 Michel Louis Eugene Bergh Method for enhancing glycoprotein stability
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
EP0281604B1 (en) 1986-09-02 1993-03-31 Enzon Labs Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
US5011912A (en) 1986-12-19 1991-04-30 Immunex Corporation Hybridoma and monoclonal antibody for use in an immunoaffinity purification system
US4965195A (en) 1987-10-26 1990-10-23 Immunex Corp. Interleukin-7
US4968607A (en) 1987-11-25 1990-11-06 Immunex Corporation Interleukin-1 receptors
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
AU643427B2 (en) 1988-10-31 1993-11-18 Immunex Corporation Interleukin-4 receptors
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
JPH02229119A (ja) 1989-02-28 1990-09-11 Toyo Jozo Co Ltd 動脈硬化予防および治療剤
US5683888A (en) 1989-07-22 1997-11-04 University Of Wales College Of Medicine Modified bioluminescent proteins and their use
US5292658A (en) 1989-12-29 1994-03-08 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Boyd Graduate Studies Research Center Cloning and expressions of Renilla luciferase
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
WO1996033735A1 (en) 1995-04-27 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
DE69120146T2 (de) 1990-01-12 1996-12-12 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
US6713610B1 (en) 1990-01-12 2004-03-30 Raju Kucherlapati Human antibodies derived from immunized xenomice
WO1991018982A1 (en) 1990-06-05 1991-12-12 Immunex Corporation Type ii interleukin-1 receptors
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
ES2142801T3 (es) 1991-03-11 2000-05-01 Univ Georgia Res Found Clonacion y expresion de luciferasa de renilla.
EP0590076A4 (en) 1991-06-14 1997-02-12 Dnx Corp Production of human hemoglobin in transgenic pigs
CA2113113A1 (en) 1991-07-08 1993-01-21 Simon W. Kantor Thermotropic liquid crystal segmented block copolymer
US5262522A (en) 1991-11-22 1993-11-16 Immunex Corporation Receptor for oncostatin M and leukemia inhibitory factor
ES2131107T3 (es) * 1992-03-17 1999-07-16 Novartis Ag Anticuerpos obtenidos mediante ingenieria genetica.
ES2301158T3 (es) 1992-07-24 2008-06-16 Amgen Fremont Inc. Produccion de anticuerpos xenogenicos.
PT672141E (pt) 1992-10-23 2003-09-30 Immunex Corp Metodos de preparacao de proteinas oligomericas soluveis
US5766880A (en) 1992-10-27 1998-06-16 Queen's University At Kingston Isolated nucleic acid molecules encoding multidrug resistance proteins
US5457035A (en) 1993-07-23 1995-10-10 Immunex Corporation Cytokine which is a ligand for OX40
EP0759170B1 (en) 1993-09-10 2008-07-09 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Uses of green fluorescent protein
WO1995021191A1 (en) 1994-02-04 1995-08-10 William Ward Bioluminescent indicator based upon the expression of a gene for a modified green-fluorescent protein
WO1996003993A2 (en) 1994-08-05 1996-02-15 The Rockefeller University Modulation of thymocyte and t cell functional activity
EP0777684B1 (en) 1994-08-16 2004-04-28 Human Genome Sciences, Inc. Calcitonin receptor
US5777079A (en) 1994-11-10 1998-07-07 The Regents Of The University Of California Modified green fluorescent proteins
US5874304A (en) 1996-01-18 1999-02-23 University Of Florida Research Foundation, Inc. Humanized green fluorescent protein genes and methods
US5804387A (en) 1996-02-01 1998-09-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP)
US5876995A (en) 1996-02-06 1999-03-02 Bryan; Bruce Bioluminescent novelty items
US5925558A (en) 1996-07-16 1999-07-20 The Regents Of The University Of California Assays for protein kinases using fluorescent protein substrates
AU6596096A (en) 1996-07-23 1998-02-10 Smithkline Beecham Corporation Calcitonin gene-related peptide receptor component factor (houdc44)
US5976796A (en) 1996-10-04 1999-11-02 Loma Linda University Construction and expression of renilla luciferase and green fluorescent protein fusion genes
US6255455B1 (en) * 1996-10-11 2001-07-03 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Rh(D)-binding proteins and magnetically activated cell sorting method for production thereof
CA2722378C (en) 1996-12-03 2015-02-03 Amgen Fremont Inc. Human antibodies that bind tnf.alpha.
IL129767A0 (en) 1996-12-12 2000-02-29 Prolume Ltd Apparatus and method for detecting and identifying infectious agents
CA2196496A1 (en) 1997-01-31 1998-07-31 Stephen William Watson Michnick Protein fragment complementation assay for the detection of protein-protein interactions
DE19732944A1 (de) 1997-07-31 1999-02-04 Thomae Gmbh Dr K Peptidische CGRP-Antagonisten
US6342220B1 (en) 1997-08-25 2002-01-29 Genentech, Inc. Agonist antibodies
JP2002507410A (ja) 1998-03-27 2002-03-12 プロルーム・リミテッド ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼおよび蛍光タンパク質をコードする核酸および、診断、高処理スクリーニングおよび新規アイテムにおけるその使用
US6268474B1 (en) 1998-04-30 2001-07-31 Creighton University Peptide antagonists of CGRP-receptor superfamily and methods of use
US6210924B1 (en) 1998-08-11 2001-04-03 Amgen Inc. Overexpressing cyclin D 1 in a eukaryotic cell line
EP1105427A2 (en) 1998-08-17 2001-06-13 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
EP1234174A1 (en) * 1999-12-02 2002-08-28 Myriad Genetics, Inc. Protein-protein interactions
US20020090646A1 (en) 2000-05-03 2002-07-11 Amgen Inc. Calcitonin-related molecules
FR2821080B1 (fr) 2001-02-20 2003-12-19 Sanofi Synthelabo Anticorps specifique de l'adrenomedulline humaine, composition pharmaceutique le contenant, ses applications therapeutiques
CA2450793A1 (en) 2001-06-20 2002-12-27 Prochon Biotech Ltd. Antibodies that block receptor protein tyrosine kinase activation, methods of screening for and uses thereof
CA2461917C (en) * 2001-09-27 2012-01-17 Merck & Co., Inc. Isolated dna molecules encoding humanized calcitonin gene-related peptide receptor, related non-human transgenic animals and assay methods
US7658924B2 (en) 2001-10-11 2010-02-09 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
AR039067A1 (es) 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
EP2840089A1 (en) * 2002-01-18 2015-02-25 ZymoGenetics, Inc. Cytokine receptor zcytor17 multimers
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US20040110170A1 (en) 2002-05-18 2004-06-10 The Regents Of The University Of California Cloning and characterization of calcitonin gene related peptide receptors
US20070071744A1 (en) 2002-06-07 2007-03-29 Gotz Munch Agents which bind to epitopes of glycoprotein VI
EA008744B1 (ru) * 2002-08-12 2007-08-31 Актавис Груп Хф. Применение соединений антагонистов кальцитонин генсвязанного пептида (cgrp) для лечения псориаза
US20040176577A1 (en) * 2002-09-10 2004-09-09 Eva Rojer Immunoassays for specific determination of SCCA isoforms
WO2004097421A2 (en) 2003-04-29 2004-11-11 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with calcitonin receptor-like receptor (calcrl)
NZ579621A (en) 2004-02-11 2011-03-31 Amylin Pharmaceuticals Inc Hybrid polypeptides with selectable properties
US7423128B2 (en) 2004-11-03 2008-09-09 Amgen Fremont Inc. Anti-properdin antibodies, and methods for making and using same
ZA200705695B (en) * 2004-12-21 2009-02-25 Astrazeneca Ab Antibodies directed to angiopoietin-2 and uses thereof
EP1900374B1 (en) 2005-06-16 2014-03-12 Takayuki Shindo Angiogenetic agent containing adrenomedulin as the active ingredient
GB0521139D0 (en) * 2005-10-18 2005-11-23 Univ Sheffield Therapeutic agent
US8168592B2 (en) 2005-10-21 2012-05-01 Amgen Inc. CGRP peptide antagonists and conjugates
EP3069731A1 (en) 2005-11-14 2016-09-21 Labrys Biologics Inc. Antagonist antibodies directed against calcitonin gene-related peptide and methods using same
WO2007076336A1 (en) * 2005-12-22 2007-07-05 Eli Lilly And Company Treatment of migraine with anti-cgrp antibodies
EP2064244B1 (en) * 2006-08-03 2019-06-05 MedImmune Limited ANTIBODIES DIRECTED TO alphaVbeta6 AND USES THEREOF
GB0708002D0 (en) 2007-04-25 2007-06-06 Univ Sheffield Antibodies
WO2009109908A1 (en) 2008-03-04 2009-09-11 Pfizer Limited Methods of treating inflammatory pain
FR2934597B1 (fr) * 2008-07-31 2013-04-19 Univ Aix Marseille Ii Anticorps se liant aux recepteurs de l'adrenomedulline et leurs utilisations comme medicament.
JO3382B1 (ar) 2008-12-23 2019-03-13 Amgen Inc أجسام مضادة ترتبط مع مستقبل cgrp بشري
CN102740884A (zh) 2009-08-28 2012-10-17 瑞纳神经科学公司 通过施用针对降钙素基因相关肽的拮抗性抗体来治疗内脏痛的方法
WO2013180295A1 (ja) 2012-06-01 2013-12-05 日本電信電話株式会社 パケット転送処理方法およびパケット転送処理装置
US9300829B2 (en) 2014-04-04 2016-03-29 Canon Kabushiki Kaisha Image reading apparatus and correction method thereof
WO2016044224A1 (en) * 2014-09-15 2016-03-24 Amgen Inc. Bi-specific anti-cgrp receptor/pac1 receptor antigen binding proteins and uses thereof
TWI799849B (zh) * 2015-04-24 2023-04-21 美商安美基公司 治療或預防偏頭痛之方法
US11385238B2 (en) * 2017-06-30 2022-07-12 Amgen Inc. Methods of protein clips recovery
JP7840636B2 (ja) * 2018-04-02 2026-04-06 アムジェン インコーポレイテッド エレヌマブ組成物及びその使用

Also Published As

Publication number Publication date
IL213429A0 (en) 2011-07-31
IL213429A (en) 2016-02-29
JO3382B1 (ar) 2019-03-13
CY2018032I1 (el) 2019-07-10
US20150376286A1 (en) 2015-12-31
EP3184546B8 (en) 2019-10-30
AU2009330175A1 (en) 2011-06-23
CR20110400A (es) 2011-10-12
EP4585264A2 (en) 2025-07-16
LT2379594T (lt) 2017-11-27
EP3569620B1 (en) 2025-05-07
FI3569620T3 (fi) 2025-07-15
DK2379594T3 (en) 2017-10-30
JP2016026224A (ja) 2016-02-12
EP3184546A1 (en) 2017-06-28
LTPA2018017I1 (lt) 2019-01-10
HRP20171690T1 (hr) 2017-12-15
US20100172895A1 (en) 2010-07-08
EA201891500A3 (ru) 2019-03-29
HRP20250807T1 (hr) 2025-09-12
NZ623541A (en) 2015-12-24
AU2009330175C1 (en) 2018-10-04
EP4585264A3 (en) 2025-10-29
TW202241950A (zh) 2022-11-01
SMT201700504T1 (it) 2018-01-11
MA32982B1 (fr) 2012-01-02
CL2011001578A1 (es) 2012-01-20
AU2013205271A1 (en) 2013-05-02
PT3569620T (pt) 2025-07-21
PT2379594T (pt) 2017-11-16
NZ606090A (en) 2014-08-29
KR20190054181A (ko) 2019-05-21
CN106084045B (zh) 2020-02-11
CN106084045A (zh) 2016-11-09
JP2023116783A (ja) 2023-08-22
US9862771B2 (en) 2018-01-09
PT3184546T (pt) 2019-09-16
SG10201401879TA (en) 2014-06-27
KR20180043850A (ko) 2018-04-30
CY2018032I2 (el) 2019-07-10
JP5761805B2 (ja) 2015-08-12
ES3036151T3 (en) 2025-09-15
KR101740615B1 (ko) 2017-05-26
CY1122658T1 (el) 2021-03-12
ES2746571T3 (es) 2020-03-06
PL3184546T3 (pl) 2019-12-31
KR101853393B1 (ko) 2018-05-02
PE20120427A1 (es) 2012-05-13
PL3569620T3 (pl) 2025-10-20
HUE034506T2 (en) 2018-02-28
JP2021036912A (ja) 2021-03-11
JP2012513214A (ja) 2012-06-14
TN2011000283A1 (en) 2012-12-17
SG172307A1 (en) 2011-07-28
UA108066C2 (uk) 2015-03-25
CA2746858C (en) 2017-10-03
SI2379594T1 (sl) 2017-12-29
HUE045966T2 (hu) 2020-01-28
MY180564A (en) 2020-12-02
EA201891500A2 (ru) 2018-11-30
LUC00095I2 (sr) 2019-12-24
US9102731B2 (en) 2015-08-11
MX2011006804A (es) 2011-09-27
JOP20190017B1 (ar) 2023-03-28
IL243784A0 (en) 2016-04-21
CN102348722B (zh) 2016-06-08
TWI754176B (zh) 2022-02-01
US20130071410A1 (en) 2013-03-21
NL300961I2 (nl) 2019-01-15
AU2009330175B2 (en) 2014-01-16
EP3569620A1 (en) 2019-11-20
BR122020010360B1 (pt) 2022-08-16
HRP20191341T1 (hr) 2019-10-18
ME03601B (me) 2020-07-20
NO2018042I1 (no) 2018-12-17
EP3184546B1 (en) 2019-07-17
AR074857A1 (es) 2011-02-16
SI3184546T1 (sl) 2019-09-30
US20180142029A1 (en) 2018-05-24
TW201032823A (en) 2010-09-16
CY1119465T1 (el) 2018-03-07
JP2014210815A (ja) 2014-11-13
CN102348722A (zh) 2012-02-08
HUE072123T2 (hu) 2025-10-28
AU2013205271B2 (en) 2016-07-14
TWI574697B (zh) 2017-03-21
LUC00095I1 (sr) 2018-12-28
CA2746858A1 (en) 2010-07-01
JP7584577B2 (ja) 2024-11-15
US20210179723A1 (en) 2021-06-17
JP2019062907A (ja) 2019-04-25
JOP20190017A1 (ar) 2017-06-16
EP2379594B1 (en) 2017-08-09
BRPI0922505B1 (pt) 2021-08-03
CO6400232A2 (es) 2012-03-15
US20210179722A1 (en) 2021-06-17
HRP20191341T8 (hr) 2020-02-07
KR20110106409A (ko) 2011-09-28
JP6261132B2 (ja) 2018-01-17
TWI688403B (zh) 2020-03-21
ES2643835T3 (es) 2017-11-24
ZA201105418B (en) 2012-02-29
PL2379594T3 (pl) 2018-01-31
TW202026312A (zh) 2020-07-16
US12122841B2 (en) 2024-10-22
DK3569620T3 (da) 2025-08-04
LT3184546T (lt) 2019-09-10
EA201100892A1 (ru) 2012-01-30
US20250129172A1 (en) 2025-04-24
EA031320B1 (ru) 2018-12-28
RS56567B1 (sr) 2018-02-28
HRP20250807T8 (hr) 2026-02-27
HUS1800047I1 (hu) 2018-12-28
EP2379594B8 (en) 2020-12-30
WO2010075238A1 (en) 2010-07-01
LT3569620T (lt) 2025-07-25
EP2379594A1 (en) 2011-10-26
NO2379594T3 (sr) 2018-01-06
RS67071B1 (sr) 2025-08-29
LTC2379594I2 (lt) 2020-04-10
TW201703796A (zh) 2017-02-01
BRPI0922505A2 (pt) 2016-07-05
SI3569620T1 (sl) 2025-08-29
US12134652B2 (en) 2024-11-05
AU2013205271C1 (en) 2018-10-04
KR20170061182A (ko) 2017-06-02
IL243784A (en) 2016-11-30
DK3184546T3 (da) 2019-09-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7584577B2 (ja) ヒトｃｇｒｐ受容体結合タンパク質
HK1230633A1 (en) Human cgrp receptor binding proteins
HK1163699B (en) Human cgrp receptor binding antibodies
HK1163699A (en) Human cgrp receptor binding antibodies
HK1167147A (en) Human cgrp receptor binding proteins