RS59361B1 - Antisens nukleinske kiseline - Google Patents

Description

Opis

OBLAST TEHNIKE

[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na antisens oligomer koji izaziva preskakanje eksona 53 u genu humanog distrofina, i farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata taj oligomer.

STANJE TEHNIKE

[0002] Dišenova mišićna distrofija (DMD) predstavlja najčešći oblik nasledne progresivne mišićne distrofije koja pogađa jednog na oko 3500 novorođenih dečaka. Iako se motorne funkcije retko razlikuju kod zdravih ljudi po rođenju i u detinjstvu, mišićna slabost primećuje se kod dece od oko 4 do 5 godina. Nakon toga, mišićna slabost napreduje do gubitka sposobnosti hodanja do oko 12 godina i smrti usled srčane i respiratorne insuficijencije u dvadesetim godinama. DMD je kao takav težak poremećaj.

Trenutno, ne postoji dostupna efektivna terapija za DMD, i postoji veoma snažnapotreba za razvojem novog terapeutskog agensa.

[0003] Poznato je da se DMD izaziva mutacijom u genu distrofina. Gen distrofina je smešten na X hromozomu i predstavlja veliki gen koji se sastoji od 2.2 miliona DNK nukleotidnih parova. DNK se transkribuje u mRNK prekursorima, a introni se uklanjaju splajsovanjem radi sintetizovanja mRNK u kojoj je međusobno spojeno 79 eksona. mRNK se translatuje na 3685 aminokiselina radi proizvodnje distrofin proteina. Distrofin protein je povezan sa održavanjem membranske stabilnosti u mišićnim ćelijama i neophodan kako bi se mišićne ćelije bile manje lomljive. Gen distrofina od pacijenata sa DMD sadrži mutaciju, te je prema tome, distrofin protein, koji je funkcionalan u mišićnim ćelijama, retko ekprimiran. Prema tome, struktura mišićnih ćelija ne može se održavati u telu pacijenata sa DMD, što dovodi do velikog utoka jona kalcijuma u mišićnim ćelijama. Kao posledica, dolazi do odgovora nalik zapaljenu čime se promoviše fibroza tako da se mišićne ćelije mogu regenerisati samo uz poteškoće.

[0004] Becker-ova mišićna distrofija (BMD) takođe je izazvana mutacijom u genu distrofina. Simptomi uključuju mišićnu slabost praćenu atrofijom mišića, ali su često blagi i spori u napredovanju mišićne slabosti, u poređenju sa DMD. U mnogim slučajevima, javlja se u odraslom dobu. Smatra se da se razlike u kliničkim simptomima između DMD i BMD ogledaju u tome da li je okvir čitanja za aminokiseline na translaciji distrofin mRNK u distrofin protein prekinut mutacijom ili nije (Nepatentni dokument 1).

Određenije, u DMD, prisustvo mutacije pomera okvir čitanja aminokiselina tako da se ekspresija funkcionalnog distrofin proteina poništava, dok se u BMD distrofin proteinu koji funkcioniše, premda nesavršeno, proizvodi budući da je okvir čitanja aminokiselina sačuvan, dok je deo eksona obrisan mutacijom.

[0005] Očekuje se da preskakanje eksona služi kao postupak za lečenje DMD. Ovaj postupak uključuje modifikujuće splajsovanje da bi se povratio okvir čitanja aminokiselina distrofin mRNK i indukovala ekspresija distrofin proteina sa funkcijom delimično povraćenom (Nepatentni dokument 2).

Aminokiselinski sekvencioni deo, koji je meta za preskakanje eksona, se gubi. Zbog toga, distrofin protein eksprimiran ovim tretmanom postaje kraći od uobičajenog, ali kako je očivan okvir čitanja aminokiselina, funkcija da se stabilišu mišićnim ćelijama delimično je zadržana. Kao posledica, očekuje se da preskakanje eksona dovodi DMD do sličnih simptoma poput onih kod BMD koji je blaži. Pristup preskakanje eksona prošao je testiranje na životinjama korišćenjem miševa ili pasa i sada se trenutno procenjuje u kliničkim ispitivanjima na humanim DMD pacijentima.

[0006] Preskakanje eksona može se indukovati vezivanjem antisens nukleinskih kiselina koje ciljaju ili 5' ili 3' mesto splajsovanja ili oba mesta, ili ekson-internalna mesta. Ekson će biti uključen samo u mRNK kada su njegova oba mesta splajsovanja prepoznata od strane kompleksa splajsozoma. Na taj način, preskakanje eksona može biti ndukovano ciljanjem mesta splajsovanja sa antisens nukleinskim kiselinama. Dodatno, vezivanje SR proteina sa pojačivačem eksonskog splajsovanja (ESE) smatra se potrebnim za prepoznavanje eksona od strane mehanizma za splajsovanje. Saglasno tome, preskakanje eksona takođe se može indukovati ciljanjem ESE.

[0007] Kako mutacija gena distrofina može da varira zavisno od DMD pacijenata, antisens nukleinske kiseline moraju biti konstruisane na bazi mesta ili vrste respektivne genetske mutacije. U prošlosti, antisens nukleinske kiseline koje indukuju preskakanje eksona za svih 79 eksona, proizvedene su od strane Steve Wilton, et al., University of Western Australia (Nepatentni dokument 3), a antisens nukleinske kiseline koje indukuju preskakanje eksona za 39 eksona, proizvedene su od strane Annemieke Aartsma-Rus, et al., Netherlands (Nepatentni dokument 4).

[0008] Smatra se da približno 8% svih DMD pacijenata može biti tretirano preskakanjem 53. eksona (u nastavku označen kao "ekson 53"). U skorijim godinama, veći broj istraživačkih organizacija prijavilo je ispitivanja u kojima je ekson 53 u genu distrofina ciljan za preskakanje eksona (Patentni dokumenti 1 do 4;

Nepatentni dokument 5). Međutim, tehnika za preskakanje eksona 53 sa velikom efikasnošću još uvek nije utvrđena.

Patentni dokument 1: Međunarodna objava WO 2006/000057

Patentni dokument 2: Međunarodna objava WO 2004/048570

Patentni dokument 3: US 2010/0168212

Patentni dokument 4: Međunarodna objava WO 2010/048586

Nepatentni dokument 1: Monaco A. P. et al., Genomics 1988; 2: p.90-95

Nepatentni dokument 2: Matsuo M., Brain Dev 1996; 18: p.167-172

Nepatentni dokument 3: Wilton S. D., e t al., Molecular Therapy 2007: 15: p.1288-96

Nepatentni dokument 4: Annemieke Aartsma-Rus et al., (2002) Neuromuskularno Disorders 12: S71-S77

Nepatentni dokument 5: Linda J. Popplewell et al., (2010) Neuromuskularno Disorders , vol.20, br. 2, p.102-10

OPIS PRONALASKA

[0009] Pod gore navedenim okolnostima, potrebni su antisens oligomeri koji snažno indukuju preskakanje eksona 53 u genu distrofina i terapeutici za mišićnu distrofiju koji obuhvataju njegove oligomere.

[0010] Kaso rezultat detaljnih ispitivanja struktura gena distrofina, pronalazači su pronašli da preskakanje eksona 53 može biti indukovano sa velikom efikasnošću ciljanjem sekvence koja se sastoji od 32. do 56. nukleotida iz 5’ kraja eksona 53 u mRNK prekursoru (u nastavku označena kao "premRNK") u genu distrofina sa antisens oligomerima. Na osnovu ovog otkrića, pronalazači su izveli ovaj pronalazak.

[0011] To jest, ovaj pronalazak je kako sledi.

[1] Antisens oligomer koji izaziva preskakanje 53. eksona u genu humanog distrofina, koji se sastoji od nukleotidne sekvence komplementarne sa 36. do 60. nukleotidom iz 5’ kraja 53. eksona u genu humanog distrofina.

[2] Antisens oligomer u skladu sa [1] iznad, koji je oligonukleotid.

[3] Antisens oligomer u skladu sa [2] iznad, pri čemu su šećerna grupa i/ili fosfat-vezujući region najmanje jednog nukleotida koji sačinjavaju oligonukleotid modifikovani.

[4] Antisens oligomer u skladu sa [3] iznad, pri čemu šećerna grupa najmanje jednog nukleotida koji sačinjavaju oligonukleotid predstavlja ribozu u kojoj je 2'-OH grupa zamenjena je bilo kojom odabranom iz grupe koju čine OR, R, R'OR, SH, SR, NH2, NHR, NR2, N3, CN, F, Cl, Br i I, pri čemu R je alkil ili aril, a R' je alkilen.

[0012] Antisens oligomer ovog pronalaska može da indukuje preskakanje eksona 53 u genu humanog distrofina sa velikom efikasnošću. Dodatno, simptomi Dišenove mišićne distrofije mogu se efikasno ublažiti davanjem farmaceutske kompozicije ovog pronalaska.

[0013] Ovde su takođe opisani:

[1] Antisens oligomer koji izaziva preskakanje 53. eksona u genu humanog distrofina, koji se sastoji od nukleotidne sekvence komplementarne bilo kojoj od sekvenci koje se sastoje od 31. do 53., 31. do 54., 31. do 55., 31. do 56., 31. do 57., 31. do 58., 32. do 53., 32. do 54., 32. do 55., 32. do 56., 32. do 57., 32. do 58., 33. do 53., 33. do 54., 33. do 55., 33. do 56., 33. do 57., 33. do 58., 34. do 53., 34. do 54., 34. do 55., 34. do 56., 34. do 57., 34. do 58., 35. do 53., 35. do 54., 35. do 55., 35. do 56., 35.

do 57., 35. do 58., 36. do 53., 36. do 54., 36. do 55., 36. do 56., 36. do 57., ili 36. do 58. nukleotida, iz 5’ kraja 53. eksona u genu humanog distrofina.

[2] Antisens oligomer u skladu sa [1] iznad, koji je oligonukleotid.

[3] Antisens oligomer u skladu sa [2] iznad, pri čemu su šećerna grupa i/ili fosfat-vezujući region najmanje jednog nukleotida koji sačinjavaju oligonukleotid modifikovani.

[4] Antisens oligomer u skladu sa [3] iznad, pri čemu šećerna grupa najmanje jednog nukleotida koji sačinjavaju oligonukleotid je riboza u kojoj je 2'-OH grupa zamenjena bilo kojom odabranom iz grupe koju čine OR, R, R'OR, SH, SR, NH2, NHR, NR2, N3, CN, F, Cl, Br i I (pri čemu R je alkil ili aril, a R' je alkilen).

[5] Antisens oligomer u skladu sa [3] ili [4] iznad, pri čemu je fosfat-vezujući region najmanje jednog nukleotida koji sačinjavaju oligonukleotid bilo koji odabran iz grupe koju čine fosforotioatna veza, fosforoditioatna veza, alkilfosfonatna veza, fosforamidatna veza i boranofosfatna veza.

[6] Antisens oligomer u skladu sa [1] iznad, koji je morfolino oligomer.

[7] Antisens oligomer u skladu sa [6] iznad, koji je fosforodiamidat morfolino oligomer.

[8] Antisens oligomer u skladu sa bilo kojim iz [1] do [7] iznad, pri čemu je 5’ kraj bilo koji iz grupe hemijskih formula (1) do (3) ispod:

[9] Antisens oligomer u skladu sa bilo kojim iz [1] do [8] iznad, koji se sastoji od nukleotidne sekvence komplementarne sekvencama koje se sastoje od 32. do 56. ili 36. do 56. nukleotida iz 5’ kraja 53. eksona u genu humanog distrofina.

[10] Antisens oligomer u skladu sa bilo kojim iz [1] do [8] iznad, koji se sastoji od nukleotidne sekvence prikazane bilo kojom odabranom iz grupe koju čine SEQ ID NO: 2 do 37.

[11] Antisens oligomer u skladu sa bilo kojim iz [1] do [8] iznad, koji se sastoji od nukleotidne sekvence prikazane bilo kojom odabranom iz grupe koju čine SEQ ID NO: 11, 17, 23, 29 i 35.

[12] Antisens oligomer u skladu sa bilo kojim iz [1] do [8] iznad, koji se sastoji od nukleotidne sekvence prikazane putem SEQ ID NO: 11 ili 35.

[13] Farmaceutska kompozicija za lečenje mišićne distrofije, koja obuhvata kao aktivni sastojak antisens oligomer u skladu sa bilo kojim iz [1] do [12] iznad, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili hidrat.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0014]

FIG.1 prikazuje efikasnost preskakanja eksona 53 u genu humanog distrofina u humanoj Rabdomiosarkom ćelijskoj liniji (RD ćelije).

FIG.2 prikazuje efikasnost preskakanja eksona 53 u genu humanog distrofina u ćelijama u kojima se humani myoD gen uvodi u humane iz normalnog tkiva izvedene fibroblaste (TIG-119 ćelije) radi indukovanja diferencijacije u mišićnim ćelijama.

FIG.3 prikazuje efikasnost preskakanja eksona 53 u genu humanog distrofina u ćelijama u kojima se humani myoD gen uvodi u humane iz DMD pacijenata izvedene fibroblaste (5017 ćelije) radi indukovanja diferencijacije u mišićnim ćelijama.

FIG.4 prikazuje efikasnost preskakanja eksona 53 u genu humanog distrofina u ćelijama u kojima se humani myoD gen uvodi u fibroblaste iz humanog DMD pacijenta (sa brisanjem eksona 45-52) radi indukovanja diferencijacije u mišićnim ćelijama.

FIG.5 prikazuje efikasnost preskakanja eksona 53 u genu humanog distrofina u ćelijama u kojima se humani myoD gen uvodi u fibroblaste iz humanog DMD pacijenta (sa brisanjem eksona 48-52) radi indukovanja diferencijacije u mišićnim ćelijama.

FIG.6 prikazuje efikasnost preskakanja eksona 53 u genu humanog distrofina u ćelijama u kojima se humani myoD gen uvodi u fibroblaste iz humanog DMD pacijenta (sa brisanjem eksona 48-52) radi indukovanja diferencijacije u mišićnim ćelijama.

FIG.7 prikazuje efikasnost preskakanja eksona 53 u genu humanog distrofina u ćelijama u kojima se humani myoD gen uvodi u fibroblaste iz humanog DMD pacijenta (sa brisanjem eksona 45-52 ili brisanjem eksona 48-52) radi indukovanja diferencijacije u mišićnim ćelijama. FIG.8 prikazuje efikasnost preskakanja eksona 53 u genu humanog distrofina u ćelijama u kojima se humani myoD gen uvodi u fibroblaste iz humanog DMD pacijenta (sa brisanjem eksona 45-52) radi indukovanja diferencijacije u mišićnim ćelijama.

FIG.9 prikazuje efikasnost preskakanja eksona 53 (2'-OMe-S-RNK) u genu humanog distrofina u humanim ćelijama Rabdomiosarkoma (RD ćelije).

FIG.10 prikazuje efikasnost preskakanja eksona 53 (2'-OMe-S-RNK) u genu humanog distrofina u humanim ćelijama Rabdomiosarkoma (RD ćelije).

FIG.11 prikazuje efikasnost preskakanja eksona 53 (2'-OMe-S-RNK) u genu humanog distrofina u humanim ćelijama Rabdomiosarkoma (RD ćelije).

FIG.12 prikazuje efikasnost preskakanja eksona 53 (2'-OMe-S-RNK) u genu humanog distrofina u humanim ćelijama Rabdomiosarkoma (RD ćelije).

FIG.13 prikazuje efikasnost preskakanja eksona 53 (2'-OMe-S-RNK) u genu humanog distrofina u humanim ćelijama Rabdomiosarkoma (RD ćelije).

FIG.14 prikazuje efikasnost preskakanja eksona 53 (2'-OMe-S-RNK) u genu humanog distrofina u humanim ćelijama Rabdomiosarkoma (RD ćelije).

FIG.15 prikazuje efikasnost preskakanja eksona 53 (2'-OMe-S-RNK) u genu humanog distrofina u humanim ćelijama Rabdomiosarkoma (RD ćelije).

FIG.16 prikazuje efikasnost preskakanja eksona 53 (2'-OMe-S-RNK) u genu humanog distrofina u humanim ćelijama Rabdomiosarkoma (RD ćelije).

FIG.17 prikazuje efikasnost preskakanja eksona 53 (2'-OMe-S-RNK) u genu humanog distrofina u humanim ćelijama Rabdomiosarkoma (RD ćelije).

FIG.18 prikazuje efikasnost preskakanja eksona 53 u genu humanog distrofina u humanim ćelijama Rabdomiosarkoma (RD ćelije) pri respektivnim koncenteracijama oligomera.

FIG.19 prikazuje efikasnost preskakanja eksona 53 u genu humanog distrofina u humanim ćelijama Rabdomiosarkoma (RD ćelije) pri respektivnim koncenteracijama oligomera.

NAJBOLJI NAČIN ZA IZVOĐENJE OVOG PRONALASKA

[0015] U nastavku, ovaj pronalazak je detaljno opisan. Primeri izvođenja koji su opisani u nastavku datio su samo kao primer tek da opišu ovaj pronalazak, ali ne i da ga ograniče samo na te primere izvođenja. Ovaj pronalazak može se implementirati na razne načine bez udaljavanja od obima ovog pronalaska.

[0016] Sve objave, objavljene patentne prijave, patenti i druge patentni dokumenti koji su navedeni u ovoj specifikaciji inkorporirani su u njoj u svojoj celosti. Specifikacija tako inkorporira uz pozivanje sadržaje specifikacije i crteža Japanske Patentne Prijave (br.2010-196032) podnete Septembra 1, 2010, na koju se poziva prioritetom.

1. Antisens oligomer

[0017] Ovaj pronalazak obezbeđuje antisens oligomer (u nastavku označen kao "oligomer ovog pronalaska") koji izaziva preskakanje 53. eksona u genu humanog distrofina, koji se sastoji od nukleotidne sekvence komplementarne bilo kojoj od sekvenci (u nastavku takođe označene kao "ciljne sekvence") koji se sastoji od 36. do 60. nukleotida iz 5’ kraja 53. eksona u genu humanog distrofina.

[0018] Ovde je takođe opisan antisens oligomer koji izaziva preskakanje 53. eksona u genu humanog distrofina, koji se sastoji od nukleotidne sekvence komplementarne bilo kojoj od sekvenci (u nastavku takođe označene kao "ciljne sekvence") koji se sastoji od 31. do 53., 31. do 54., 31. do 55., 31. do 56., 31. do 57., 31. do 58., 32. do 53., 32. do 54., 32. do 55., 32. do 56., 32. do 57., 32. do 58., 33. do 53., 33. do 54., 33. do 55., 33. do 56., 33. do 57., 33. do 58., 34. do 53., 34. do 54., 34. do 55., 34. do 56., 34. do 57., 34. do 58., 35. do 53., 35. do 54., 35. do 55., 35. do 56., 35. do 57., 35. do 58., 36. do 53., 36. do 54., 36. do 55., 36. do 56., 36. do 57., ili 36. do 58. nukleotida, iz 5’ kraja 53. eksona u genu humanog distrofina.

[Ekson 53 u genu humanog distrofina]

[0019] U ovom pronalasku, pojam "gen" namenjen je da označi genomski gen i takođe uključuje cDNK, mRNK prekursor i mRNK. Poželjno, taj gen je mRNK prekursor, tj., pre-mRNK.

[0020] U humanom genomu, gen humanog distrofina lociran je na lokusu Xp21.2. Gen humanog distrofina ima veličinu od 3.0 Mbp i najveći je gen među poznatim humanim genima. Međutim, kodirajući regioni gena humanog distrofina su samo 14 kb, distribuirani kao 79 eksona kroz gen humanog distrofina (Roberts, RG., et al., Genomics, 16: 536-538 (1993)). pre-mRNK, koji je transkript gena humanog distrofina, prolazi kroz splajsovanje radi generisanja zrele mRNK od 14 kb. Nukleotidna sekvenca humanog gena distrofina divljeg tipa je poznata (GenBank pristupni br. NM_004006).

[0021] Nukleotidna sekvenca eksona 53 u humanom genu distrofina divljeg tipa predstavljena je putem SEQ ID NO: 1.

[0022] Oligomer ovog pronalaska konstruisan je da izazove preskakanje eksona 53 u genu humanog distrofina, čime modifikuje protein enkodiran DMD vrstom gena distrofina u BMD vrstu distrofin proteina. U skladu sa tim, ekson 53 u genu distrofina koji je meta preskakanja eksona od strane oligomera ovog pronalaska uključuje i divlje i mutant vrste.

[0023] Određenije, ekson 53 mutanti gena humanog distrofina uključuju polinukleotidi definisan u (a) ili (b) ispod.

(a) Polinukleotid koji hibridizuje pod strogim uslovima u polinukleotid koji se sastoji od nukleotidne sekvence komplementarne nukleotidnoj sekvenci iz SEQ ID NO: 1; i,

(b) Polinukleotid koji se sastoji od nukleotidne sekvence sa najmanje 90% identiteta sa nukleotidnom sekvencom iz SEQ ID NO: 1.

[0024] Kako se ovde koristi, pojam "polinukleotid" namenjen je da označi DNK ili RNK.

[0025] Kako se ovde koristi, pojam "polinukleotid koji hibridizuje pod strogim uslovima" odnosi se na, na primer, polinukleotid dobijen hibridizacijom kolonije, hibridizacijom plaka, Southern hibridizacijom ili slično, koristeći kao sondu ceo ili deo polinukleotida koji se sastoji od nukleotidne sekvence komplementarne nukleotidnoj sekvenci iz, npr., SEQ ID NO: 1. Postupak hibridizacije koji se može primeniti uključuje postupke opisane u, na primer, "Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol.3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001," "Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997," itd.

[0026] Kako se ovde koristi, pojam "komplementarna nukleotidna sekvenca" nije ograničena samo na nukleotidne sekvence koje formiraju Watson-Crick parove sa ciljnim nukleotidnim sekvencama, već je takođe namenjen da uključuje nukleotidne sekvence koje formiraju Wobble bazni par. Kako se ovde koristi, pojam Watson-Crick par odnosi se na par nukleobaza u kojem su vodonične veze formirane između adenin-timina, adenin-uracila ili gvanin-citozina, a pojam Wobble bazni par odnosi se na par nukleobaza u kojem su vodonične veze formirane između gvanin-uracila, indozin-uracila, indozinadenina ili indozin-citozina. Kako se ovde koristi, pojam "komplementarna nukleotidna sekvenca" ne samo da se odnosi na nukleotidnu sekvencu 100% komplementarnu ciljnoj nukleotidnoj sekvenci već se takođe odnosi na komplementarnu nukleotidnu sekvencu koja može da sadrži, na primer, 1 do 3, 1 ili 2, ili jedan nukleotid ne-komplementaran ciljnoj nukleotidnoj sekvenci.

[0027] Kako se ovde koristi, pojam "strogi uslovi" mogu biti bilo koji od slabo strogi uslovi, umereno strogi uslovi ili veoma strogi uslovi. Pojam "slabo strogi uslovi" su, na primer, 5x SSC, 5x Denhardt-ov rastvor, 0.5% SDS, 50% formamid na 32°C. Pojam "umereno strogi uslovi" su, na primer, 5x SSC, 5x Denhardt-ov rastvor, 0.5% SDS, 50% formamid na 42°C, ili 5x SSC, 1% SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50% formamid na 42°C. Pojam "veoma strogi uslovi" su, na primer, 5x SSC, 5x Denhardt-ov rastvor, 0.5% SDS, 50% formamid na 50°C ili 0.2 x SSC, 0.1% SDS at 65°C. Pod ovim uslovima, očekuje se da se polinukleotidi sa većom homologijom dobijaju efikasno pri višim temperaturama, iako je upleteno više faktora u strogost hibridizacije koji uključuju temperaturu, koncentracija sonde, dužina sonde, jačina jona, vreme, koncentracija soli i drugo, a stručnjaci iz ove oblasti lako mogu da odaberu ove faktore radi postizanja slične strogosti.

[0028] Kada se komercijalno dostupni kompleti koriste za hibridizaciju, na primer, Alkphos Direct Labeling and Detection System (GE Healthcare) mogu da se koriste. U ovom slučaju, u skladu sa priloženim protokolom, nakon uzgajanja sa obeleženom sondom preko noći, membrana je oprana primarnim puferom za pranje koji sadrži 0.1% (w/v) SDS na 55°C, čime se detektuju hibridizovani polinukleotidi. Alternativno, u proizvodnji sonde na bazi cele ili dela nukleotidne sekvence komplementarne nukleotidnoj sekvenci iz SEQ ID NO: 1, hibridizacija može biti detektovana sa DIG Nucleic acid Detection Kit (Roche Diagnostics) kada je sonda obeležena digoksigeninom (DIG) primenom a komercijalno dostupnog reagens (npr., PCR Labeling Mix (Roche Diagnostics), itd.).

[0029] Pored polinukleotidi ovde opisanih, drugi polinukleotidi koji mogu biti hibridizovani uključuju polinukleotide sa 90% ili više, 91% ili više, 92% ili više, 93% ili više, 94% ili više, 95% ili više, 96% ili više, 97% ili više, 98% ili više, 99% ili više, 99.1% ili više, 99.2% ili više, 99.3% ili više, 99.4% ili više, 99.5% ili više, 99.6% ili više, 99.7% ili više, 99.8% ili više ili 99.9% ili više identiteta sa polinukleotidom iz SEQ ID NO: 1, kako je izračunato softverom za pretraživanje homologije BLAST primenom uobičajenih parametara.

[0030] Identitet između nukleotidnih sekvenci može se odrediti primenom algoritma BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) od Karlin i Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873, 1993). Programi koji se nazivaju BLASTN i BLASTX na bazi BLAST algoritma su razvijeni (Altschul SF, et al: J. Mol. Biol.215: 403, 1990). Kada je nukleotidna sekvenca sekvencirana primenom BLASTN, parametri su, na primer, ocena = 100 i dužinareči = 12. Kada se korister BLAST i Gapped BLAST programi, koriste se uobičajeni parametri za svaki program.

[0031] Primeri nukleotidnih sekvenci komplementarnih sekvencama koje se sastoje od 31. do 53., 31. do 54., 31. do 55., 31. do 56., 31. do 57., 31. do 58., 32. do 53., 32. do 54., 32. do 55., 32. do 56., 32. do 57., 32. do 58., 33. do 53., 33. do 54., 33. do 55., 33. do 56., 33. do 57., 33. do 58., 34. do 53., 34. do 54., 34. do 55., 34. do 56., 34. do 57., 34. do 58., 35. do 53., 35. do 54., 35. do 55., 35. do 56., 35. do 57., 35. do 58., 36. do 53., 36. do 54., 36. do 55., 36. do 56., 36. do 57. i 36. do 58. nukleotida, iz 5’ kraja eksona 53.

TABELA 1

[0032] Poželjno je da se oligomer ovog pronalaska sastoji od nukleotidne sekvence komplementarne bilo kojoj od sekvenci koje se sastoje od 36. do 60. nukleotida (npr., SEQ ID NO: 57), iz 5’ kraja 53. eksona u genu humanog distrofina.

[0033] Ovde je takođe opisan oligomer koji se sastoji od nukleotidne sekvence komplementarne bilo kojoj od sekvenci koje se sastoje od 32. do 56., 33. do 56., 34. do 56., 35. do 56. ili 36. do 56. nukleotida (npr., SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 29 ili SEQ ID NO: 35), iz 5’ kraja 53. eksona u genu humanog distrofina.

[0034] Ovde je takođe opisan oligomer koji se sastoji od nukleotidne sekvence komplementarne bilo kojoj od sekvenci koje se sastoje od 32. do 56. ili 36. do 56. nukleotida (npr., SEQ ID NO: 11 ili SEQ ID NO: 35), iz 5’ kraja 53. eksona u genu humanog distrofina.

[0035] Pojam "izaziva preskakanje 53. eksona u genu humanog distrofina" namenjen je da označi da je vezivanjem oligomera ovog pronalaska za mesto koje odgovara eksonu 53 transkripta (npr., pre-mRNK) gena humanog distrofina, na primer, nukleotidna sekvenca koja odgovara 5’ kraju eksona 54 splajsovana na 3' strani nukleotidne sekvence koja odgovara 3' kraju eksona 51 kod DMD pacijenata sa brisanjem, eksona 52 kada transkript prolazi kroz splajsovanje, čime rezultuje formiranje zrele mRNK koja je bez pomeranja kodonskog okvira.

[0036] U skladu sa tim, nije potrebno da oligomer ovog pronalaska ima nukleotidnu sekvencu 100% komplementarnu ciljnoj sekvenci, dokle god izaziva preskakanje eksona 53 u genu humanog distrofina. Oligomer ovog pronalaska može da uključuje, na primer, 1 do 3, 1 ili 2, ili jedan nukleotid nekomplementaran ciljnoj sekvenci.

[0037] Ovde opisan pojam "vezivanje" namenjen je da označi da kada se oligomer ovog pronalaska izmešan sa transkriptom gena humanog distrofina, oba se hibridizuju pod fiziološkim uslovima radi formiranja dvolančane nukleinske kiseline. Pojam "pod fiziološkim uslovima" odnosi se na uslove podešene da imitiraju in vivo okolinu u smislu pH, kompozicije soli i temperature. Ti uslovi su, na primer, 25 do 40°C, poželjno 37°C, pH 5 do 8, poželjno pH 7.4 i 150 mM koncentracije natrijum hlorida.

[0038] Da li je preskakanje eksona 53 u genu humanog distrofina izazvano ili ne, može se potvrditi uvođenjem oligomera ovog pronalaska u distrofin ekspresionoj ćeliji (npr., humane ćelije Rabdomiosarkoma), amplifikovanjem regiona koji okružuje ekson 53 mRNK gena humanog distrofina od ukupne RNK distrofin ekspresione ćelije putem RT-PCR i izvođenjem grupisanog PCR ili sekvencione analize na PCR amplifikovanom proizvodu.

[0039] Efikasnost preskakanja može se odrediti kako sledi. mRNK za gen humanog distrofina sakuplja se iz test ćelije; u mRNK, mere se polinukleotidni nivo "A" trake na kojoj je ekson 53 preskočen i polinukleotidni nivo "B" trake na kojoj ekson 53 nije preskočen. Primenom ovih vrednosti merenja "A" i "B," efikasnost se izračunava sledećom jednačinom:

[0040] Oligomer ovog pronalaska uključuje, na primer, oligonukleotid, morfolino oligomer ili peptidna nukleinska kiselina (PNK), sa dužinom od 18 do 28 nukleotida. Dužina je poželjno od 21 do 25 nukleotida, a morfolino oligomeri su poželjni.

[0041] Oligonukleotid ovde opisan (u nastavku označen kao "oligonukleotid ovog pronalaska") je oligomer ovog pronalaska sastavljen od nukleotida kao sastavnij jedinica. Takvi nukleotidi mogu biti bilo koji od ribonukleotida, deoksiribonukleotida i modifikovanih nukleotida.

[0042] Modifikovani nukleotid odnosi se na oan jsa potpuno ili delimično modifikovanom nukleobazom, šećernim grupama i/ili fosfat-vezujućim regionima, koji konstituišu ribonukleotid ili deoksiribonukleotid.

[0043] Nukleobaza uključuje, na primer, adenin, gvanin, hipoksantin, citozin, timin, uracil, i njihove modifikovane baze. Primeri takvih modifikovanih nukleobaza uključuju, ali se ne ograničavaju na, pseudouracil, 3-metiluracil, dihidrouracil, 5-alkilcitozine (npr., 5-metilcitozin), 5-alkiluracile (npr., 5-etiluracil), 5-halouracile (5-bromouracil), 6-azapirmidin, 6-alkilpirmidini (6-metiluracil), 2-tiouracil, 4-tiouracil, 4-acetilcitozin, 5-(karboksihidroksimetil) uracil, 5'-karboksimetilaminometil-2-tiouracil, 5karboksimetilaminometiluracil, 1-metiladenin, 1-metilhipoksantin, 2,2-dimetilgvanin, 3-metilcitozin, 2-metiladenin, 2-metilgvanin, N6-metiladenin, 7-metilgvanin, 5-metoksiaminometil-2-tiouracil, 5-metilaminometiluracil, 5-metilkarbonilmetiluracil, 5-metiloksiuracil, 5-metil-2-tiouracil, 2-metiltio-N6-izopenteniladenin, uracil-5- oksiacetnu kiselinu, 2-tiocitozin, purin, 2,6-diaminopurin, 2-aminopurin, izogvanin, indol, imidazol, ksantin, itd.

[0044] Modifikacija šećerne grupe može da uključuje, na primer, modifikacije na 2'-položaju riboze i modifikacije drugih položaja šećera. Modifikacija na 2'-položaju riboze uključuje zamenu 2'-OH riboze sa OR, R, R'OR, SH, SR, NH2, NHR, NR2, N3, CN, F, Cl, Br ili 1, pri čemu R predstavlja alkil ili aril, a R' predstavlja alkilen.

[0045] Modifikacija za druge položaje šećera uključuje, na primer, zamenu O na 4' položaj riboze ili deoksiriboze sa S, dovođenjem između 2' i 4' položaja šećera, npr., LNK (zabravljena nukleinska kiselina) ili ENK (2'-O,4'-C-etilen-premošćene nukleinske kiseline), ali se ne ograničava na njih.

[0046] Modifikacija fosfat-vezujućef regiona uključuje, na primer, modifikaciju zamene fosfodiestarske veze sa fosforotioatnom vezom, fosforoditioatnom vezom, alkil fosfonatnom vezom, fosforoamidatnom vezom ili boranofosfatnom vezom (Enya et al: Bioorganic & Medicinal Chemistry ,2008, 18, 9154-9160) (cf., npr., Japan Domestic Re-Publications of PCT Application Br.2006/129594 i 2006/038608).

[0047] Alkil je poželjno linearni ili razgranati alkil sa 1 do 6 atoma ugljenika. Specifični primeri uključuju metil, etil, n-propil, izopropil, n-butil, izobutil, sec-butil, tert-butil, n-pentil, izopentil, neopentil, tertpentil, n-heksil i izoheksil. Alkil može opciono biti supstituisan. Primeri takvih supstituenata su halogen, alkoksi, cijano i nitro. Alkil može biti supstituisan sa 1 do 3 supstituenta.

[0048] Cikloalkil je poželjno cikloalkil sa 5 do 12 atoma ugljenika. Specifični primeri uključuju ciklopentil, cikloheksil, cikloheptil, ciklooktil, ciklodecil i ciklododecil.

[0049] Halogen uključuje fluor, hlor, brom i jod.

[0050] Alkoksi je linearni ili razgranati alkoksi sa 1 do 6 atoma ugljenika kao što je metoksi, etoksi, npropoksi, izopropoksi, n-butoksi, izobutoksi, sec-butoksi, tert-butoksi, n-pentiloksi, izopentiloksi, nheksiloksi, izoheksiloksi, itd. Između ostalog, alkoksi sa 1 do 3 atoma ugljenika je poželjan.

[0051] Aril je poželjno aril sa 6 do 10 atoma ugljenika. Specifični primeri uključuju fenil, α-naftil i β-naftil. Između ostalog, fenil je poželjan. Aril može opciono biti supstituisan. Primeri takvih supstituenata su alkil, halogen, alkoksi, cijano i nitro. Aril može biti supstituisan sa jednim do tri takvih supstituenata.

[0052] Alkilen je poželjno linearni ili razgranati alkilen sa 1 do 6 atoma ugljenika. Specifični primeri uključuju metilen, etilen, trimetilen, tetrametilen, pentametilen, heksametilen, 2-(etil) trimetilen i 1-(metil) tetrametilen.

[0053] Acil uključuje linearni ili razgranati alkanoil ili aroil. Primeri alkanoila uključuju formil, acetil, 2-metilacetil, 2,2-dimetilacetil, propionil, butiril, izobutiril, pentanoil, 2,2-dimetilpropionil, heksanoil, itd.

Primeri aroila uključuju benzoil, toluoil i naftoil. Aroil može opciono biti supstituisan na supstituišuće položaje i može biti supstituisan alkilom(ima).

[0054] Poželjno, oligonukleotid ovog pronalaska je oligomer ovog pronalaska koji sadrži sastavnu jedinicu predstavljenu opštom formulom koja sledi pri čemu je -OH grupa na položaju 2' riboze supstituisana sa metoksi, a fosfat-vezujući region je fosforotioatna veza:

u kojoj Baza predstavlja nukleobazu.

[0055] Oligonukleotid ovog pronalaska može biti lako sintetizovan primenom raznih automatizovanih sintetizatora (npr., AKTA oligopilot plus 10/100 (GE Healthcare)). Alternativno, sinteza takođe može biti poverena potpuno trećoj organizaciji (npr., Promega Inc., ili Takara Co.), itd.

[0056] Morfolino oligomer ovog pronalaska je oligomer ovog pronalaska koji obuhvata sastavnu jedinicu predstavljenu opštom formulom koja sledi:

u kojoj Baza ima isto značenje kakvo je prethodno definisano, a,

W predstavlja grupu prikazanu bilo kojom od sledećih grupa:

pri čemu X predstavlja -CH2R<1>, -O-CH2R<1>, -S-CH2R<1>, -NR2R<3>ili F;

R<1>predstavlja H ili alkil;

R<2>i R<3>, koji mogu biti isti ili različiti, gde svaki predstavlja H, alkil, cikloalkil ili aril;

Y1predstavlja O, S, CH2ili NR<1>;

Y2predstavlja O, S ili NR<1>;

Z predstavlja O ili S.

[0057] Poželjno, morfolino oligomer je oligomer koji obuhvata sastavnu jedinicu predstavljenu opštom formulom koja sledi (fosforodiamidat morfolino oligomer (u nastavku označen kao "PMO")).

u kojoj Baza, R<2>i R<3>imaju isto značenje kakvo je prethodno definisano.

[0058] Morfolino oligomer može biti proizveden u skladu sa, npr., WO 1991/009033 ili WO 2009/064471. Određenije, PMO može biti proizveden postupkom opisanim u WO 2009/064471 ili proizveden postupkom prikazanim u nastavku.

[Postupak za proizvodnju PMO]

[0059] Jedan primer izvođenja PMO je, na primer, jedinjenje predstavljeno opštom formulom (I) ispod (u nastavku PMO (I)).

u kojoj Baza, R<2>i R<3>imaju isto značenje kakvo je prethodno definisano; i,

n je dati ceo broj od 1 do 99, poželjno dati ceo broj od 18 do 28.

[0060] PMO (I) može biti proizveden u skladu sa poznatim postupkom, na primer, može biti proizveden izvođenjem postupaka u sledećim fazama.

[0061] Jedinjenja i reagensi koji se koriste u Fazima ispod nisu naročito ograničeni dokle god se uobičajeno koriste za pripremu PMO.

[0062] Takođe, sledeće faze sve mogu biti izvedene postupkom tečne faze ili postupkom čvrste faze (primenom uputstava ili komercijalno dostupnih automatizovanih sintetizatora čvrste faze). U proizvodnji PMO postupkom čvrste faze, poželjno je primeniti automatizovane sintetizatore u pogledu jednostavnih radnih procedura i precizne sinteze.

(1) Faza A:

[0063] Jedinjenje predstavljeno opštom formulom (II) ispod (u nastavku označeno kao Jedinjenje (II)) reagovano je sa nekom kiselinom radi pripreme jedinjenja predstavljenog opštom formulom (III) ispod (u nastavku označeno kao Jedinjenje (III)):

pri čemu n, R<2>i R<3>imaju isto značenje kakvo je prethodno definisano;

svako B<P>nezavisno predstavlja nukleobazu koja opciono može biti zaštićena;

T predstavlja tritil, monometoksitritil ili dimetoksitritil; i,

L predstavlja vodonik, acil ili grupu predstavljenu opštom formulom (IV) ispod (u nastavku označena kao grupa (IV)).

[0064] "Nukleobaza" za B<P>uključuje istu "nukleobazu" kao u Bazi, pod uslovom da amino ili hidroksi grupa u nukleobazi prikazana sa B<P>može biti zaštićena.

[0065] Takva zaštitna grupa za amino nije naročito ograničena dokle god je upotrebljena kao zaštitna grupa za nukleinske kiseline. Specifični primeri uključuju benzoil, 4-metoksibenzoil, acetil, propionil, butiril, izobutiril, fenilacetil, fenoksiacetil, 4-tert-butilfenoksiacetil, 4-izopropilfenoksiacetil i (dimetilamino)metilen. Specifični primeri zaštitne grupe za hidroksi grupu uključuju 2-cijanoetil, 4-nitrofenetil, fenilsulfoniletil, metilsulfoniletil i trimetilsililetil, i fenil, koji može biti supstituisan sa 1 do 5 elektron-povlačeće grupe na opciono supstituišućim položajima, difenilkarbamoil, dimetilkarbamoil, dietilkarbamoil, metilfenilkarbamoil, 1-pirolidinilkarbamoil, morfolinokarbamoil, 4-(tert-butilkarboksi) benzil, 4-[(dimetilamino)karboksi]benzil i 4-(fenilkarboksi)benzil, (cf., npr., WO 2009/064471).

[0066] "Čvrst nosač" nije naročito ograničen dokle god je to neki nosač koji se može primeniti za reakciju čvrste faze nukleinskih kiselina. Poželjno je da čvrst nosač ima sledeće osobine: npr., (i) umereno je rastvorljiv u reagensima koji se mogu primeniti za sintezu derivata morfolino nukleinske kiseline (npr., dihlorometan, acetonitril, tetrazol, N-metilimidazol, pirdin, anhidrid sirćetne kiseline, lutidin, trifluorosirćetna kiselina); (ii) hemijski je stabilan u reagensima koji se mogu primeniti za sintezu derivata morfolino nukleinske kiseline; (iii) može biti hemijski modifikovan; (iv) može biti naelektrisan poželjnim derivatima morfolino nukleinske kiseline; (v) dovoljno je snažan da izdrži visok pritisak tokom tretiranja; i (vi) poseduje uniforman opseg prečnika čestica i distribuciju. Određenije, bubreći polistiren (npr., aminometil polistirenska smola 1% dibenzilbenzen umrežena (200-400 mreža) (2.4-3.0 mmol/g) (proizvedena od strane Tokyo Chemical Industry), Aminometilisana Polistirenska Smola·HCl [dibenzilbenzen 1%, 100-200 mreža] (proizvedena od strane Peptide Institute, Inc.)), ne-bubreći polistiren (npr., Prajmer Podloga (proizvedena od strane GE Healthcare)), sa PEG lancem vezan polistiren (npr., NH2-PEG smola (proizvedena od strane Watanabe Chemical Co.), TentaGel smola), staklo sa kontrolisanim porama (staklo sa kontrolisanim porama; CPG) (proizvedeno od

strane, npr., CPG), oksalil-staklo sa kontrolisanim porama (cf., npr., Alul et al., Nucleic Acids Research, Vol.19, 1527 (1991)), TentaGel podloga-aminopolietilen glikol-derivatizovana podloga (npr., Wright et al., cf., Tetrahedron Letters, Vol.34, 3373 (1993)), i kopolimer Porozni-polistiren/divinilbenzen.

[0067] "Veznik" koji se može pimeniti je poznat veznik koji se generalno primenjuje za povezivanje nukleinskih kiselina ili derivata morfolino nukleinskih kiselina. Primeri uključuju 3-aminopropil, sukcinil, 2,2'-dietanolsulfonil i alkil amino dugog lanca (LCAA).

[0068] Ova faza može se izvesti reagovanjem Jedinjenja (II) sa nekom kiselinom.

[0069] "Kiselina" koja se može upotrebiti u ovoj fazi uključuje, na primer, trifluorosirćetnu kiselinu, dihlorosirćetnu kiselinu i trihlorosirćetnu kiselinu. Kiselina koja se primenjuje poželjno je u opsegu od, na primer, 0.1 mol ekvivalenta do 1000 mol ekvivalenata na bazi 1 mol Jedinjenja (II), poželjno u opsegu od 1 mol ekvivalenta do 100 mol ekvivalenata na bazi 1 mol Jedinjenja (II).

[0070] Organski amin može se primeniti u kombinaciji sa ovde opisanom kiselinom. Organski amin nije naročito ograničen i uključuje, na primer, trietilamin. Količina organskog amina koja se primenjuje poželjno je u opsegu od, npr., 0.01 mol ekvivalenta do 10 mol ekvivalenata, i poželjno u opsegu od 0.1 mol ekvivalenta do 2 mol ekvivalenata, na bazi 1 mol kiseline.

[0071] Kada se so ili mešavina kiseline i organski amin koriste u ovoj fazi, ta so ili mešavina uključuje, na primer, so ili mešavinu trifluorosirćetne kiseline i trietilamina, i određenije, mešavinu 1 ekvivalenta trietilamina i 2 ekvivalenata trifluorosirćetne kiseline.

[0072] Kiselina koja se može upotrebiti u ovoj fazi takođe može biti upotrebljena u obliku razblaženja sa pogodnim rastvaračem u koncentraciji od 0.1% do 30%. Taj rastvarač nije naročito ograničen dokle god je inertan u odnosu na reakciju, i uključuje, na primer, dihlorometan, acetonitril, alkohol (etanol, izopropanol, trifluoroetanol, itd.), vodu, ili njihovu mešavinu.

[0073] Temperatura reakcije u ovde opisanoj reakciji poželjno u opsegu od, npr., 10°C do 50°C, poželjnije, u opsegu od 20°C do 40°C, i najpoželjnije, u opsegu od 25°C do 35°C.

[0074] Vreme reakcije može da varira zavisno od vrste kiseline koja je upotrebljena i temperature reakcije, i pogodno je u opsegu od 0.1 minuta do 24 sata generalno, i poželjno u opsegu od 1 minuta do 5 sati.

[0075] Po završetku ove faze, može se dodati baza, ukoliko je potrebno, da bi se neutralizovala kiselina koja ostaje u sistemu. "Baza" nije naročito ograničena i uključuje, na primer, diizopropilamin. Baza takođe može biti upotrebljena u obliku razblaženja sa pogodnim rastvaračem u koncentraciji od 0.1% (zapreminskih) do 30% (zapreminskih).

[0076] Taj rastvarač koji se koristi u ovoj fazi nije naročito ograničen dokle god je inertan u odnosu na reakciju, i uključuje dihlorometan, acetonitril, alkohol (etanol, izopropanol, trifluoroetanol, itd.), vodu, i njihovu mešavinu. Temperatura reakcije je poželjno u opsegu od, npr., 10°C do 50°C, poželjnije, u opsegu od 20°C do 40°C, i najpoželjnije, u opsegu od 25°C do 35°C.

[0077] Vreme reakcije može da varira zavisno od vrste baze koja je upotrebljena i temperature reakcije, i pogodno je u opsegu od 0.1 minuta do 24 sata generalno, i poželjno u opsegu od 1 minuta do 5 sati.

[0078] U Jedinjenju (II), jedinjenje opšte formule (IIa) ispod (u nastavku Jedinjenje (IIa)), u kojem n je 1 i L je grupa (IV), može biti proizvedeno sledećim postupkom.

u kojoj B<P>, T, veznik i čvrst nosač imaju isto značenje kakvo je prethodno definisano.

Faza 1:

[0079] Jedinjenje predstavljeno opštom formulom (V) ispod reagovano je sa agensom za aciliranje radi pripreme jedinjenja predstavljenog opštom formulom (VI) ispod (u nastavku označeno kao Jedinjenje (VI)).

u kojoj B<P>, T i veznik imaju isto značenje kakvo je prethodno definisano; i,

R<4>predstavlja hidroksi, halogen ili amino.

[0080] Ova faza može biti izvedena poznatim postupcima za uvođenje veznika, primenom Jedinjenja (V) kao početnog materijala.

[0081] Određenije, jedinjenje predstavljeno opštom formulom (VIa) ispod može biti proizvedeno izvođenjem postupka poznatog kao esterifikacija, primenom Jedinjenja (V) i anhidrida ćilibarne kiseline.

u kojoj B<P>i T imaju isto značenje kakvo je prethodno definisano.

Faza 2:

[0082] Jedinjenje (VI) reagovano je sa čvrstim nosačem pomoću agensa za kondenzovanje radi pripreme jedinjenja (IIa).

u kojoj B<P>, R<4>, T, veznik i čvrst nosač imaju isto značenje kakvo je prethodno definisano.

[0083] Ova faza može se izvesti primenom Jedinjenja (VI) i čvrstog nosača u skladu sa postupkom poznatim kao reakcija kondenzacije.

[0084] U Jedinjenju (II), jedinjenje predstavljeno opštom formulom (IIa2) ispod u kojoj n je 2 do 99, a L je grupa predstavljena opštom formulom (IV), može biti proizvedeno primenom Jedinjenja (IIa) kao početnog materijala i ponavljanjem faza A i faza B PMO proizvodnog postupka opisanog u ovoj specifikaciji onoliko puta koliko je poželjno.

u kojoj B<P>, R<2>, R<3>, T, veznik i čvrst nosač imaju isto značenje kakvo je prethodno definisano; i, n' predstavlja 1 do 98.

[0085] U Jedinjenju (II), jedinjenje opšte formule (IIb) ispod u kojoj n je 1, a L je vodonik, može biti proizvedeno postupkom opisanim u, npr., WO 1991/009033.

u kojoj B<P>i T imaju isto značenje kakvo je prethodno definisano.

[0086] U Jedinjenju (II), jedinjenje predstavljeno opštom formulom (IIb2) ispod u kojoj n je 2 do 99,a L je vodonik, može biti proizvedeno primenom Jedinjenja (IIb) kao početnog materijala i ponavljanjem faza A i faza B PMO proizvodnog postupka opisanog u ovoj specifikaciji onoliko puta koliko je poželjno.

u kojoj B<P>, n', R<2>, R<3>i T imaju isto značenje kakvo je prethodno definisano.

[0087] U Jedinjenju (II), jedinjenje predstavljeno opštom formulom (IIc) ispod u kojoj n je 1 , a L je acil, može biti proizvedeno izvođenjem postupka poznatog kao reakcija acilovanja, primenom Jedinjenja (IIb).

u kojoj B<P>i T imaju isto značenje kakvo je prethodno definisano; i,

R<5>predstavlja acil.

[0088] U Jedinjenju (II), jedinjenje predstavljeno opštom formulom (IIc2) ispod u kojoj n je 2 do 99 , a L je acil, može biti proizvedeno primenom Jedinjenja (IIc) kao početnog materijala i ponavljanjem faza A i faza B PMO proizvodnog postupka opisanog u ovoj specifikaciji onoliko puta koliko je poželjno.

u kojoj B<P>, n', R<2>, R<3>, R<5>i T imaju isto značenje kakvo je prethodno definisano.

(2) Faza B

[0089] Jedinjenje (III) reagovano je sa jedinjenjem morfolino monomera u prisustvu baze radi pripreme jedinjenja predstavljenog opštom formulom (VII) ispod (u nastavku označeno kao Jedinjenje (VII)):

u kojoj B<P>, L, n, R<2>, R<3>i T imaju isto značenje kakvo je prethodno definisano.

[0090] Ova faza može se izvesti reagovanjem Jedinjenja (III) sa jedinjenjem morfolino monomera u prisustvu baze.

[0091] Jedinjenje morfolino monomera uključuje, na primer, jedinjenja predstavljena opštom formulom (VIII) ispod:

u kojoj B<P>, R<2>, R<3>i T imaju isto značenje kakvo je prethodno definisano.

[0092] "Baza" koja se može upotrebiti u ovoj fazi uključuje, na primer, diizopropilamin, trietilamin i N-etilmorfolin. Količina baze koja se primenjuje poželjno je u opsegu od 1 mol ekvivalenta do 1000 mol ekvivalenata na bazi 1 mol Jedinjenja (III), poželjno, 10 mol ekvivalenata do 100 mol ekvivalenata na bazi 1 mol Jedinjenja (III).

[0093] Jedinjenje morfolino monomera i baza koja se može upotrebiti u ovoj fazi takođe se može primeniti kao razblaženje sa pogodnim rastvaračem u koncentraciji od 0.1% do 30%. Taj rastvarač nije naročito ograničen dokle god je inertan u odnosu na reakciju, i uključuje, na primer, N,N-dimetilimidazolidon, N-metilpiperidon, DMF, dihlorometan, acetonitril, tetrahidrofuran, ili njihovu mešavinu.

[0094] Temperatura reakcije je poželjno u opsegu od, npr., 0°C do 100°C, a poželjnije, u opsegu od 10°C do 50°C.

[0095] Vreme reakcije može da varira zavisno od vrste baze koja je upotrebljena i temperature reakcije, i pogodno je u opsegu od 1 minuta do 48 sati generalno, i poželjno u opsegu od 30 minuta do 24 sata.

[0096] Pored toga, po završetku ove faze, može se dodati agens za aciliranje, ukoliko je potrebno. "Agens za aciliranje" uključuje, na primer, anhidrid sirćetne kiseline, acetil hlorid i fenoksianhidrid sirćetne kiseline. Agens za aciliranje takođe se može primeniti kao razblaženje sa pogodnim rastvaračem u koncentraciji od 0.1% do 30%. Taj rastvarač nije naročito ograničen dokle god je inertan u odnosu na reakciju, i uključuje, na primer, dihlorometan, acetonitril, alkohol(e) (etanol, izopropanol, trifluoroetanol, itd.), vodu, ili njihovu mešavinu.

[0097] Ukoliko je potrebno, baza kao što je piridin, lutidin, kolidin, trietilamin, diizopropiletilamin, N-etilmorfolin, itd. takođe može biti upotrebljena u kombinaciji sa agensom za aciliranje. Količina agensa za aciliranje pogodno je u opsegu od 0.1 mol ekvivalenta do 10000 mol ekvivalenata, a poželjno u opsegu od 1 mol ekvivalenta do 1000 mol ekvivalenata. Količina baze pogodno je u opsegu od, npr., 0.1 mol ekvivalenta do 100 mol ekvivalenata, a poželjno u opsegu od 1 mol ekvivalenta do 10 mol ekvivalenata, na bazi 1 mol agensa za aciliranje.

[0098] Temperatura reakcije u ovoj reakciji je poželjno u opsegu od 10°C do 50°C, poželjnije, u opsegu od 10°C do 50°C, još poželjnije, u opsegu od 20°C do 40°C, i najpoželjnije, u opsegu od 25°C do 35°C. Vreme reakcije može da varira zavisno od vrste agensa za aciliranje koja je upotrebljena i temperature reakcije, i pogodno je u opsegu od 0.1 minuta do 24 sata generalno, i poželjno u opsegu od 1 minuta do 5 sati.

(3) Faza C:

[0099] U Jedinjenju (VII) proizvedenom u Fazi B, zaštitna grupa uklanja se primenom agens za skidanje zaštite radi pripreme jedinjenja predstavljenog opštom formulom (IX).

u kojoj Baza, B<P>, L, n, R<2>, R<3>i T imaju isto značenje kakvo je prethodno definisano.

[0100] Ova faza može se izvesti reagovanjem Jedinjenja (VII) sa agensom za skidanje zaštite.

[0101] "Agens za skidanje zaštite" uključuje, npr., konc. amonijačnu vodu i metilamin. "Agens za skidanje zaštite" koji se koristi u ovoj fazi takođe se može primeniti kao razblaženje sa, npr., vodom, metanolom, etanolom, izopropil alkoholom, acetonitrilom, tetrahidrofuranom, DMF, N,N-dimetilimidazolidonom, N-metilpiperidonom, ili mešavinom ovih rastvarača. Između ostalog, etanol je poželjan. Količina agensa za skidanje zaštite koja se primenjuje poželjno je u opsegu od, npr., 1 mol ekvivalenta do 100000 mol ekvivalenata, i poželjno u opsegu od 10 mol ekvivalenata do 1000 mol ekvivalenata, na bazi 1 mol Jedinjenja (VII).

[0102] Temperatura reakcije pogodno je u opsegu od 15°C do 75°C, poželjno, u opsegu od 40°C do 70°C, i poželjnije, u opsegu od 50°C do 60°C. Vreme reakcije za skidanje zaštite može da varira zavisno od vrste Jedinjenja (VII), temperature reakcije, itd., i pogodno je u opsegu od 10 minuta do 30 sati, poželjno 30 minuta do 24 sata, i poželjnije u opsegu od 5 sati do 20 sati.

(4) Faza D:

[0103] PMO (I) je proizveden reagovanjem Jedinjenja (IX) proizvedenog u Fazi C sa nekom kiselinom:

u kojoj Baza, n, R<2>, R<3>i T imaju isto značenje kakvo je prethodno definisano.

[0104] Ova faza može se izvesti dodavanjem neke kiseline Jedinjenju (IX).

[0105] "Kiselina" koja se može upotrebiti u ovoj fazi uključuje, na primer, trihlorosirćetnu kiselinu, dihlorosirćetnu kiselinu, sirćetnu kiselinu, fosfornu kiselinu, hlorovodoničnu kiselinu, itd. Kiselina koja se koristi pogodno se koristi da omogući da rastvor bud u opsegu pH od 0.1 do 4.0, i poželjnije, u opsegu od pH 1.0 do 3.0. Taj rastvarač nije naročito ograničen dokle god je inertan u odnosu na reakciju, i uključuje, na primer, acetonitril, vodu, ili mešavinu ovih rastvarača.

[0106] Temperatura reakcije pogodno je u opsegu od 10°C do 50°C, poželjno, u opsegu od 20°C do 40°C, i poželjnije, u opsegu od 25°C do 35°C. Vreme reakcije za skidanje zaštite može da varira zavisno od vrste Jedinjenja (IX), temperatura reakcije, itd., i pogodno je u opsegu od 0.1 minuta do 5 sati, poželjno 1 minuta do 1 sata, i poželjnije u opsegu od 1 minuta do 30 minuta.

[0107] PMO (I) može biti dobijen podvrgavanjem reakcione mešavine dobijene u ovoj fazi koncvencionalnim sredstvima odvajanja i prečišćavanja kao što je ekstrahovanje, koncentrovanje, neutralizacija, filtracija, centrifugalno odvajanje, rekristalizacija, reverzno fazna hromatografija na koloni C8do C18, katjon izmenjivačka hromatografija na koloni, anjon izmenjivačka hromatografija na koloni, gel filtraciona hromatografija na koloni, tečna hromatografija visokih performansi, dijaliza, ultrafiltracija, itd., primenjenim samih ili u međusobnoj kombinaciji. Tako, poželjan PMO (I) može se izolovati i prečistiti (cf., npr., WO 1991/09033).

[0108] Kod prečišćavanja PMO (I) primenom reverzno fazne hromatografije, npr., mešavina rastvora 20 mM trietilamin/acetat pufera i acetonitrila može se primeniti kao elucioni rastvarač.

[0109] Kod prečišćavanja PMO (I) primenom jono izmenjivačke hromatografije, npr., mešavina rastvora 1 M slanog rastvora i 10 mM vodeni rastvor natrijum hidroksida može se primeniti kao elucioni rastvarač.

[0110] Peptidna nukleinska kiselina je oligomer ovog pronalaska sa grupom predstavljenom opštom formulom kao sastavna jedinica:

u kojoj Baza ima isto značenje kakvo je prethodno definisano.

[0111] Peptidne nukleinske kiseline mogu se pripremiti pozivanjem na, npr., sledeću literaturu.

1) P. E. Nielsen, M. Egholm, R. H. Berg, O. Buchardt, Science, 254, 1497 (1991)

2) M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, R. H. Berg, Jacs., 114, 1895 (1992)

3) K. L. Dueholm, M. Egholm, C. Behrens, L. Christensen, H. F. Hansen, T. Vulpius, K. H. Petersen, R. H. Berg, P. E. Nielsen, O. Buchardt, J. Org. Chem., 59, 5767 (1994)

4) L. Christensen, R. Fitzpatrick, B. Gildea, K. H. Petersen, H. F. Hansen, T. Koch, M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, J. Coull, R. H. Berg, J. Pept. Sci., 1, 175 (1995)

5) T. Koch, H. F. Hansen, P. Andersen, T. Larsen, H. G. Batz, K. Otteson, H. Orum, J. Pept. Res., 49, 80 (1997)

[0112] Kod oligomera ovog pronalaska, 5’ kraj može biti bilo koji od hemijskih struktura (1) do (3) ispod, a poželjno je (3)-OH.

[0113] U nastavku, grupe prikazane pomoću (1), (2) i (3) označene su kao "Grupa (1)," "Grupa (2)" i "Grupa (3)," respectively.

2. Farmaceutska kompozicija

[0114] Oligomer ovog pronalaska izaziva preskakanje eksona 53 sa više efikasnosti u poređenju sa antisens oligomerima iz stanja tehnike. Tako se očekuje da stanja mišićne distrofije mogu biti olakšana sa velikom efikasnošću davanjem farmaceutske kompozicije koja obuhvata oligomer ovog pronalaska DMD pacijentima. Na primer, kada se koristi farmaceutska kompozicija koja obuhvata oligomer ovog pronalaska, mogu se postići isti terapeutski efekti čak i pri manjoj dozi od one u kojoj se daju oligomeri iz stanja tehnike. U skladu sa tim, sporedni efekti mogu biti ublaženi, a čak i ekonomski.

[0115] U drugom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju za lečenje mišićne distrofije, koja obuhvata kao aktivni sastojak oligomer ovog pronalaska, njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili hidrat (u nastavku označena kao "kompozicija ovog pronalaska").

[0116] Primeri farmaceutski prihvatljive soli oligomera ovog pronalaska sadržan u kompoziciji ovog pronalaska su soli alkalnih metala kao što su soli natrijuma, kalijuma i litijuma; soli zemno alkalnih metala kao što su soli kalcijuma i magnezijuma; soli metala kao što su soli aluminuma, železa, cinka, bakra, nikla, kobalt, itd.; amonijumove soli; organske aminske soli kao što su soli t-oktilamina, dibenzilamina, morfolina, glukozamina, fenilglicin alkil estra, etilendiamina, N-metilglukamina, gvanidina, dietilamina, trietilamina, dicikloheksilamina, N, N' -dibenziletilendiamina, hloroprokaina, prokaina, dietanolamina, N-benzilfenetilamina, piperazina, tetrametilamonijuma, tris(hidroksimetil)aminometana; hidrohalidne soli kao što su soli hidrofluorata, hidrohloridi, hidrobromidi i hidrojodidi; soli neorganskih kiselina kao što su nitrati, perhlorati, sulfati, fosfati, itd.; niži alkanski sulfonati kao što su metansulfonati, trifluorometansulfonati i etansulfonati; arilsulfonati kao što su benzensulfonati i p-toluensulfonati; soli organskih kiselina kao što su acetati, malati, fumarati, sukcinati, citrati, tartarati, oksalati, maleati, itd.; i, aminokiselinske soli kao što su soli glicina, lizina, arginina, ornitina, glutaminske kiseline i asparaginske kiseline. Ove soli mogu biti proizvedene poznatim postupcima. Alternativno, oligomer ovog pronalaska sadržan u kompoziciji ovog pronalaska može biti u obliku njegovog hidrata.

[0117] Put davanja za kompoziciju ovog pronalaska nije naročito ograničen dokle god je farmaceutski prihvatljiv put za davanje, i može se odabrati zavisno od postupka lečenja. U pogledu lakoće dostave u mišićna tkiva, poželjno je intravenozno davanje, intraarterijalno davanje, intramuskularno davanje, subkutano davanje, oralno davanje, tkivno davanje, transdermalno davanje, itd. Takođe, dozni oblici koji su dostupni za kompoziciju ovog pronalaska nisu naročito ograničeni, i uključuju, na primer, razne injekcije, oralne agense, kapi, inhalacije, masti, losione, itd.

[0118] Kod davanja oligomera ovog pronalaska pacijentima sa mišićnom distrofijom, kompozicija ovog pronalaska poželjno sadrži nosač za promovisanje dostave oligomera do mišičnih tkiva. Takav nosač nije naročito ograničen dokle god je farmaceutski prihvatljiv, i primeri uključuju katjonske nosače kao što su katjonski lipozomi, katjonski polimeri, itd., ili nosači koji koriste virusnu opnu. Katjonski lipozomi su, na primer, lipozomi sastavljeni od 2-O-(2-dietilaminoetil)karabamoil-1,3-O-dioleoilglicerola i fosfolipida kao suštinskih sastavnih delova (u nastavku označen kao "lipozom A"), Oligofectamin (registrovana trgovinska marka) (proizveden od strane Invitrogen Corp.), Lipofectin (registrovana trgovinska marka) (proizveden od strane Invitrogen Corp.), Lipofectamin (registrovana trgovinska marka) (proizveden od strane Invitrogen Corp.), Lipofectamin 2000 (registrovana trgovinska marka) (proizveden od strane Invitrogen Corp.), DMRIE-C (registrovana trgovinska marka) (proizveden od strane Invitrogen Corp.), GeneSilencer (registrovana trgovinska marka) (proizveden od strane Gene Therapy Systems), TransMessenger (registrovana trgovinska marka) (proizveden od strane QIAGEN, Inc.), TransIT TKO (registrovana trgovinska marka) (proizveden od strane Mirus) i Nucleofector II (Lonza). Između ostalog, lipozom A je poželjan. Primeri katjonskih polimera su JetSI (registrovana trgovinska marka) (proizveden od strane Qbiogene, Inc.) i Jet-PEI (registrovana trgovinska marka) (polietilenimin, proizveden od strane Qbiogene, Inc.). Primer nosača koji koriste virusne opne su GenomeOne (registrovana trgovinska marka) (HVJ-E lipozom, proizveden od strane Ishihara Sangyo). Alternativno, medicinski uređaji opisanu u Japanskom Patentu br.2924179 i katjonski nosači opisani Japanskoj domaćim ponovno objavljenim PCT Br.2006/129594 i 2008/096690 takođe se mogu primeniti.

[0119] Koncentracija oligomera ovog pronalaska sadržana u kompoziciji ovog pronalaska može da varira zavisno od vrste nosača, itd., i pogodno je u opsegu od 0.1 nM do 100 µM, poželjno u opsegu od 1 nM do 10 µM, i poželjnije u opsegu od 10 nM do 1 µM. Maseni odnos oligomera ovog pronalaska sadržan u kompoziciji ovog pronalaska i nosača (nosač/oligomer ovog pronalaska) može da varira zavisno od svojstva oligomera, vrste nosača, itd., i pogodno je u opsegu od 0.1 do 100, poželjno u opsegu od 1 do 50, i poželjnije u opsegu od 10 do 20.

[0120] Pored oligomera ovog pronalaska i nosača koji su ovde opisani, farmaceutski prihvatljivi aditivi takođe se opciono mogu formulisati u kompoziciji ovog pronalaska. Primeri takvih aditivi su sredstva za potpomaganje emulzifikovanja (npr., masne kiseline sa 6 do 22 atoma ugljenika i njihove farmaceutski prihvatljive soli, albumin i dekstran), stabilizatori (npr., holesterol i fosfatidinska kiselina), agensi za pospešivanje izotoničnosti (npr., natrijum hlorid, glukoza, maltoza, laktora, saharoza, trehaloza), i agensi za kontrolisanje pH (npr., hlorovodonična kiselina, sumporna kiselina, fosforna kiselina, sirćetna kiselina, natrijum hidroksid, kalijum hidroksid i trietanolamin). Može se primeniti jedan ili više od ovih aditiva. Sadržaj aditiva u kompoziciji ovog pronalaska pogodno je 90 mas.% ili manje, poželjno 70 mas.% ili manje i poželjnije, 50 mas.% ili manje.

[0121] Kompozicija ovog pronalaska može se pripremiti dodavanjem oligomera ovog pronalaska disperziji nosača i adekvatnim umešavanjem te mešavine. Aditivi se mogu dodati u pogodnoj fazi ili pre ili posle dodavanja oligomera ovog pronalaska. Vodeni rastvarač koji se može primeniti u dodavanju oligomera ovog pronalaska nije naročito ograničen dokle god je farmaceutski prihvatljiv, a primeri su injektabilna voda ili injektabilna destilovana voda, elektrolitni fluid kao što je fiziološki slani rastvor, itd., i šećerni fluid kao što je glukozni fluid, maltozni fluid, itd. Stručnjak pogodno može odabrati uslove za pH i temperaturu u ovakvoj stvari.

[0122] Kompozicija ovog pronalaska može se pripremiti u, npr., tečnom obliku i svom liofilizovanom preparatu. Liofilizovani preparat može se pripremiti liofilizovanjem kompozicije ovog pronalaska u tečnom obliku na konvencionalni način. Liofilizacija može se izvesti, na primer, pogodnim sterilisanjem kompozicije ovog pronalaska u tečnom obliku, dispergovanjem alikvota u bočasti kontejner, izvođenjem preliminarnog zamrzavanja tokom 2 sata pod uslovima od oko -40 do -20°C, izvođenjem primarnog sušenja na 0 do 10°C pod sniženim pritiskom, i zatim izvođenjem drugog sušenja na oko 15 do 25°C pod sniženim pritiskom. Generalno, liofilizovani preparat kompozicije ovog pronalaska može biti dobijen zamenom sadržaja bočice sa gasom azota i zatvaranjem.

[0123] Liofilizovani preparat kompozicije ovog pronalaska može se primeniti generalno nakon rekonstruisanja dodavanjem opciono pogodnog rastvora (rekonstituciona tečnost) i ponovnim rastvaranjem preparata. Takva rekonstruisana tečnost uključuje injektabilnu vodu, fiziološki slani rastvor i druge infuzione tečnosti. Zapremina rekonstruisane tečnosti može da varira zavisno namenjene upotrebe, itd., nije naročito ograničena, i pogodno je 0.5 do 2-puta veća od zapremine pre liofilizacije ili ne veća od 500 mL.

[0124] Poželjno je kontroliasti dozu kompozicije ovog pronalaska koja se daje, uzimajući u obzir sledeće faktore: vrstu i dozni oblik sadržanog oligomera ovog pronalaska; stanje pacijenata uključujući starost, telesnu masu, itd.; put davanja; i karakteristike i meru bolesti. Dnevna doza izračunata kao količina oligomera ovog pronalaska generalno je u opsegu od 0.1 mg do 10 g/čoveku, i poželjno 1 mg do 1 g/čoveku. Ovaj numerički opseg može povremeno da varira zavisno od vrste ciljane bolesti, puta davanja i ciljanog molekula. Prema tome, doza niža od opsega može biti dovoljna u nekim slučajevima i obrnuto, doza koja je viša od opsega može biti povremeno potrebna. Kompozicija se može davati od jednom do nekoliko puta na dan ili u intervalima od jednog dana do nekoliko dana.

[0125] U još jednom primeru izvođenja kompozicije ovog pronalaska, obezbeđena je farmaceutska kompozicija koja obuhvata vektor sposoban da eksprimira oligonukleotid ovog pronalaska i nosač koji ovde opisan. Takav ekspresioni vekor može da eksprimira više oligonukleotida ovog pronalaska.

Kompozicija može biti formulisana sa farmaceutski prihvatljivim aditivima kao što je to u slučaju sa kompozicijom ovog pronalaska koja sadrži oligomer ovog pronalaska. Koncentracija ekspresionog vektora sadržana u kompoziciji može da varira zavisno od vrste nosača, itd., i pogodno je u opsegu od 0.1 nM do 100 µM, poželjno u opsegu od 1 nM do 10 µM, a poželjnije u opsegu od 10 nM do 1 µM. Maseni odnos ekspresionog vektora sadržanog u kompoziciji i nosača (nosač/ekspresioni vektor) može da varira zavisno od svojstva ekspresionog vektora, vrste nosača, itd., i pogodno je u opsegu od 0.1 do 100, poželjno u opsegu od 1 do 50, i poželjnije u opsegu od 10 do 20. Sadržaj nosača sadržanog u kompoziciji je isti kao i u slučaju sa kompozicijom ovog pronalaska koja sadrži oligomer ovog pronalaska, a i postupak za proizvodnju je isti kao u slučaju sa kompozicijom ovog pronalaska.

[0126] U nastavku, ovaj pronalazak biće opisan detaljnije uz pozivanje na PRIMERE i TEST PRIMERE koji slede, ali nije namenjen da se njima ograniči.

[PRIMERI]

[REFERENTNI PRIMER 1]

4-{[(2S,6R)-6-(4-Benzamido-2-oksopirmidin-1-il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoksi} -4-oksobutanoična kiselina uvedena na aminometil polistirensku smolu

Faza 1: Proizvodnja

4-{[(2S,6R)-6-(4-benzamido-2-oksopirmidin-l(2H)-il)-4-tritilmorfolin-2-il]met oksi}-4-oksobutanoične kiseline

[0127] Pod atmosferom argona, 22.0 g N-{1-[(2R,6S)-6-(hidroksimetil)-4-tritilmorfolin-2-il]-2-okso-1,2-dihidropirmid in-4-il}benzamida i 7.04 g 4-dimetilaminopiridina (4-DMAP) suspendovano je u 269 mL dihlorometana, i 5.76 g anhidrida ćilibarne kiseline dodato je suspenziji, praćeno mešanjem na sobnoj temperaturi tokom 3 sata. U reakcioni rastvor dodato je 40 mL metanola, i mešavina je koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je ekstraktovan primenom etil acetata i 0.5M vodenog rastvora kalijum dihidrogenfosfata. Dobijeni organski sloj opran je sekvencijalno sa 0.5M vodenim rastvorom kalijum dihidrogenfosfata, vodom i fiziološkim rastvorom u navedenom redosledu. Dobijeni organski sloj osušen je preko natrijum sulfata i koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobilo 25.9 g proizvoda.

Faza 2: Proizvodnja

4-{[(2S,6R)-6-(4-benzamido-2-oksopirmidin-1-il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoksi} -4-oksobutanoična kiselina uvedena na aminometil polistirensku smolu

[0128] Nakon što je 23.5 g 4-{[(2S,6R)-6-(4-benzamido-2-oksopirmidin-1(2H)-il)-4-tritilmorfolin-2-il]met oksi}-4-oksobutanoična kiselina rastvorena u 336 mL piridina (dehidriran), 4.28 g 4-DMAP i 40.3 g 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid hidrohlorida dodato je u rastvor. Zatim, 25.0 g Aminometil Polistirenske Smole umrežene sa 1% DVB (proizveden od strane Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., A 1543) i 24 mL trietilamina dodato je mešavini, praćeno protresanjem na sobnoj temperaturi tokom 4 dana. Po završetku reakcije, smola je izvađena filtracijom. Dobijena smola oprana je sekvencijalno piridinom, metanolom i dihlorometanom u navedenom redosledu, i osušena pod sniženim pritiskom. Dobijenoj smoli dodato je 150 mL tetrahidrofurana (dehidrat), 15 mL anhidrida sirćetne kiseline i 15 mL 2,6-lutidina, i mešavina je protresana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Smola je izvađena filtracijom, oprana sekvencijalno piridinom, metanolom i dihlorometanom u navedenom redosledu, i osušena pod sniženim pritiskom da bi se dobilo 33.7 g proizvoda.

[0129] Količina uvođenja proizvoda određena je merenjem UV absorbance na 409 nm molarne količine tritila po g smole, primenom poznatog postupka. Količina uvođenja smole bila je 397.4 µmol/g.

Uslovi UV merenja

[0130]

Uređaj: U-2910 (Hitachi, Ltd.)

Rastvarač: metansulfonska kiselina

Talasna dužina: 265 nm

ε Vrednost: 45000

[REFERENTNI PRIMER 2]

4-Okso-4-1[(2S,6R)-6-(6-okso-2-[2-fenoksiacetamido]-1H-purin-9-il)-4-tritilmorfo lin-2-il]metoksi}butanoična kiselina uvedena na 2-aminometilpolistiren smola

Faza 1: Proizvodnja N<2>-(fenoksiacetil)gvanozina

[0131] Gvanozin, 100 g, osušen je na 80°C pod sniženim pritiskom tokom 24 sata. Nakon što je 500 mL piridina (anhidrous) i 500 mL dihlorometana (anhidrous) dodato u njega, 401 mL hlorotrimetilsilana ukapavanjem je dodato mešavini pod atmosferom argona na 0°C, praćeno mešanjem na sobnoj temperaturi tokom 3 sata. Mešavina je ponovo ohlađena ledom i 66.3 g fenoksiacetil hlorida ukapavanjem je dodato. Pod ledenim hlađenjem, mešavina je umešavana tokom dodatna 3 sata. U reakcioni rastvor dodato je 500 mL metanola, i mešavina je umešavana na sobnoj temperaturi preko noći. Taj rastvarač zatim je uklonjen destilovanjem pod sniženim pritiskom. U ostatak dodato je 500 mL metanola, i koncentrovanje pod sniženim pritiskom izvedeno je 3 puta. U ostatak je dodato 4L vode, i mešavina je umešavana tokom jednog sata pod ledenim hlađenjem. Talozi koji su se formirali izvađeni su filtracijom, oprani sekvencijalno vodom i hladnim metanolom i zatim osušeni da bi se dobilo 150.2 g predmetnog jedinjenja (prinos: 102%) (cf. :Org. Lett. (2004), Vol.6, br.15, 2555-2557).

Faza 2:

N-{9-[(2R,6S)-6-(hidroksimetil)-4-morfolin-2-il]-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-2-il}-2-fenoksiacetamid ptoluensulfonat

[0132] U 480 mL metanola suspendovano je 30 g Jedinjenja dobijenog u Fazi 1, i 130 mL 2N hlorovodonične kiseline dodato je suspenziji pod ledenim hlađenjem. Naknadno, 56.8 g amonijum tetraborat tetrahidrata i 16.2 g natrijum perjodata dodato je mešavini u navedenom redosledu i umešavano na sobnoj temperaturi tokom 3 sata. Reakcioni rastvor ohlađen je ledom i nerasvorive materije uklonjen su filtracijom, praćeno pranjem sa 100 mL metanola. Fitrat i tečnost za pranje su ukombinovani, a mešavina je ohlađen ledom. Mešavini je dodato 11.52 g 2-pikolin boran. Nakon umešavanja tokom 20 minuta, 54.6 g monohidrata p-toluensulfonske kiseline polako je dodato mešavini, praćeno mešanjem na 4°C preko noći. Talozi su izvađeni filtracijom i oprani sa 500 mL hladnog metanola i osušeni da bi se dobilo 17.7 g predmetnog jedinjenja (prinos: 43.3%).

<1>H NMR (δ, DMSO-d6): 9.9-9.2 (2H, br), 8.35 (1H, s), 7.55 (2H, m), 7.35 (2H, m), 7.10 (2H, d, J = 7.82Hz), 7.00 (3H, m), 5.95 (1H, dd, J = 10.64, 2.42Hz), 4.85 (2H, s), 4.00 (1H, m), 3.90-3.60 (2H, m), 3.50-3.20 (5H, m), 2.90 (1H, m), 2.25 (3H, s)

Faza 3: Proizvodnja

N-{9-[(2R,6S)-6-(hidroksimetil)-4-tritilmorfolin-2-il]-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-2-il}-2-fenoksiacetamida

[0133] U 30 mL dihlorometana suspendovano je 2.0 g Jedinjenja dobijenog u Fazi 2, i 13.9 g trietilamina i 18.3 g tritil hlorida dodato suspenziji pod ledenim hlađenjem. Mešavina je umešavana na sobnoj temperaturi tokom sata. Reakcioni rastvor opran je zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata, a zatim vodom, i osušen. Organski sloj je koncentrovan pod sniženim pritiskom. U ostatak je dodato 40 mL 0.2M natrijum citratnog pufera (pH 3)/metanola (1:4 (zapreminskih)), i mešavina je umešavana. Naknadno, 40 mL vode dodato je i mešavina je umešavana tokom jednog sata pod ledenim hlađenjem. Mešavina je izvađena filtracijom, oprana hladnim metanolom i osušena da bi se dobilo 1.84 g predmetnog jedinjenja (prinos: 82.0%).

Faza 4: Proizvodnja

4-okso-4-{[(2S,6R)-6-(6-okso-2-[2-fenoksiacetamido]-1H-purin-9-il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoksi}butanoične kiseline uvedene na aminometil polistirensku smolu

[0134] Naslovno jedinjenje proizvedeno je na način sličan REFERENTNOM PRIMERU 1, osim što je N-{9-[(2R,6S)-6-(hidroksimetil)-4-tritilmorfolin-2-il]-6-okso-6,9-dihidro-1H-purin-2-il}-2-fenoksiacetamid upotrebljen u ovoj fazi, umesto N-{1-[(2R,6S)-6-(hidroksimetil)-4-tritilmorfolin-2-il]-2-okso-1,2-dihidropirmidin-4-il}benzamida upotrebljenog u Fazi 1 REFERENTNOG PRIMERA 1.

[REFERENTNI PRIMER 3]

4-{[(2S,6R)-6-(5-Metil-2,4-diokso-3,4-dihidropirmidin-1-il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoksi}-4-oksobutanoična kiselina uvedena na aminometil polistirensku smolu

[0135] Naslovno jedinjenje proizvedeno je na način sličan REFERENTNOM PRIMERU 1, osim što je 1-[(2R,6S)-6-(hidroksimetil)-4-tritilmorfolin-2-il]-5-metilpirmidin-2,4 (1H,3H)-dion upotrebljen u ovoj fazi, umesto N-{1-[(2R,6S)-6-(hidroksimetil)-4-tritilmorfolin-2-il]-2-okso-1,2-dihidropirmidin-4-il}benzamida upotrebljenog u Fazi 1 REFERENTNOG PRIMERA 1.

[REFERENTNI PRIMER 4]

1,12-Diokso-1-(4-tritilpiperazin-1-il)-2,5,8,11-tetraoksa-15-pentadekanoična kiselina uvedena na aminometil polistirensku smolu

[0136] Naslovno jedinjenje proizvedeno je na način sličan REFERENTNOM PRIMERU 1, osim što je 2-[2-(2-hidroksietoksi)etoksi]etil 4-tritilpiperazin-1-karboksilna kiselina (jedinjenje opisano u WO 2009/064471) upotrebljena u ovoj fazi, umesto N-{1-[(2R,6S)-6-(hidroksimetil)-4-tritilmorfolin-2-il]-2-okso-1,2-dihidropirmidin-4-il}benzamida.

[0137] U skladu sa opisima i PRIMERIMA 1 do 12 i REFERENTNIM PRIMERIMA 1 do 3 ispod, sintetizovane su razne vrste PMO prikazane pomoću PMO Br.1-11 i 13-16 U TABELI 2. PMO koji je sintetizovan rastvoren je u injektabilnoj vodi (proizveden od strane Otsukfarmaceutska Factory, Inc.). PMO br.12 kupljen je od Gene Tools, LLC.

TABELA 2

[PRIMER 1]

PMO br.8

[0138] 4-{[(2S,6R)-6-(4-Benzamido-2-oksopirmidin-1(2H)-il)-4-tritilmorfolin-2 -il]metoksi}-4-oksobutanoična kiselina, uvedena na aminometil polistirenskoj smoli (REFERENTNI PRIMER 1), 2 g (800 µmol) prebačena je u reakcioni sud, i 30 mL dihlorometana dodato je u njega. Mešavina je ostavljena tokom 30 minuta. Nakon što je mešavina dodatno oprana dva puta sa 30 mL dihlorometana, tzapočet je sledeći sintezioni ciklus. Poželjno jedinjenje morfolino monomera dodato je u svaki ciklus da bi se dobila nukleotidna sekvenca naslovnog jedinjenja.

TABELA 3

[0139] Upotrebljeni deblokirajući rastvor bio je rastvor dobijen rastvaranjem mešavine trifluorosirćetne kiseline (2 ekvivalenata) i trietilamina (1 ekvivalent) u rastvoru dihlorometana koji sadrži 1% (zapreminskih) etanola i 10% (zapreminskih) 2,2,2-trifluoroetanola da bi bio 3% (w/v). Upotrebljeni neutrališući rastvor bio je rastvor dobijen rastvaranjem N,N-diizopropiletilamina u rastvoru dihlorometana koji sadrži 25% (zapreminskih) 2-propanola da bi bio 5% (zapreminskih). Upotrebljeni kuplujući rastvor A bio je rastvor dobijen rastvaranjem jedinjenje morfolino monomera u 1,3-dimetil-2-imidazolidinonu koji sadrži 10% (zapreminskih) N,N-diizopropiletilamina da bi bio 0.15M. Upotrebljeni kuplujući rastvor B bio je rastvor dobijen rastvaranjem N,N-diizopropiletilamina u 1,3-dimetil-2-imidazolidinonu da bi bio 10% (zapreminskih). Upotrebljeni zatvarajući rastvor bio je rastvor dobijen rastvaranjem 20% (zapreminskih) anhidrida sirćetne kiseline i 30% (zapreminskih) 2, 6-lutidina u dihlorometanu.

[0140] Aminometil polistiren smola uvedena sa PMO sintetizovanim kako je gore objašnjeno, izdvojena je iz reakcionog suda i osušena na sobnoj temperaturi tokom najmanje 2 sata pod sniženim pritiskom. Osušeni PMO uveden na aminometil polistirensku smolu uveden je u reakcioni sud, i 200 mL 28% amonijačne vode-etanola (1/4) dodato je u njega. Mešavina je umešavana na 55°C tokom 15 sati.

Aminometil polistiren smola je odvojena filtracijom i oprana sa 50 mL vode-etanola (1/4). Dobijeni filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Dobijen ostatk rastvoren je u 100 mL mešavine rastvarača 20 mM sirćetne kiseline - trietilamin pufera (TEAA pufer) i acetonitrila (4/1) i filtrirana kroz membranski filter. Dobijeni fitrat prečišćen je reverzno faznom HPLC. Upotrebljeni uslovi bili su kako sledi.

TABELA 4

[0141] Svaka frakcija je analizirana i proizvod izdvojen u 100 mL acetonitril-vode (1/1), u koju je dodato 200 mL etanola. Mešavina je koncentrovana pod sniženim pritiskom. Dalje sušenje pod sniženim pritiskom dalo je belu čvrstu materiju. U dobijenu čvrstu materiju dodato je 300 mL 10 mM vodenog rastvora fosforne kiseline da bi se suspendovala čvrsta materija. Suspenziji je dodato 10 mL 2M vodenog rastvora fosforne kiseline, i mešavina je umešavana tokom 15 minuta. Pored toga, 15 mL 2M vodenog rastvora natrijum hidrata dodato je za neutralizaciju. Zatim, 15 mL 2M vodenog rastvora natrijum hidroksida, dodato je da bi mešavina postala alkalna, praćeno filtracijom kroz membranski filtrat (0.45µm). Mešavina je temeljno oprana sa 100 mL 10 mM vodenog rastvora natrijum hidroksida da bi se dobio proizvod kao vodeni rastvor.

[0142] Dobijen vodeni rastvor koji sadrži proizvod prečišćen je na koloni sa anjon izmenjivačkom smolom. Primenjeni uslovi bili su kako sledi.

TABELA 5

[0143] Svaka frakcija je analizirana (na HPLC) i proizvod je dobijen kao vodeni rastvor. U dobijen vodeni rastvor dodato je 225 mL 0.1 M fosfatnog pufera (pH 6.0) radi neutralizacije. Mešavina je filtrirana kroz membranski filter (0.45 µm). Zatim, ultrafiltracija je izvedena pod dole opisanim uslovima.

TABELA 6

[0144] Fitrat je koncentrovan da bi se dobilo približno 250 mL vodenog rastvora. Dobijen vodeni rastvor je filtriran kroz membranski filter (0.45 µm). Dobijeni vodeni rastvor osušen je zamrzavanjem da bi se dobilo 1.5 g predmetnog jedinjenja kao bela pamučasta čvrsta materija.

ESI-TOF-MS Izrač.: 6924.82

Otkriveno: 6923.54

[PRIMER 2]

PMO. br.1

[0145] Naslovno jedinjenje proizvedeno je u skladu sa postupkom PRIMERA 1.

MALDI-TOF-MS Izrač.: 8291.96

Otkriveno: 8296.24

[PRIMER 3]

PMO. br.2

[0146] Naslovno jedinjenje proizvedeno je u skladu sa postupkom PRIMERA 1.

ESI-TOF-MS Izrač.: 7310.13

Otkriveno: 7309.23

[PRIMER 4]

PMO. br.3

[0147] Naslovno jedinjenje proizvedeno je u skladu sa postupkom PRIMERA 1.

ESI-TOF-MS Izrač.: 8270.94

Otkriveno: 8270.55

[PRIMER 5]

PMO. br.4

[0148] Naslovno jedinjenje proizvedeno je u skladu sa postupkom PRIMERA 1, osim što je 4-(((2S,6R)-6-(5-metil-2,4-diokso-3,4-dihidropirmidin-1(2H)-il)-4-tritilmorfoli n-2-il)metoksi)-4-oksobutanoična kiselina (REFERENTNI PRIMER 3) uvedena na aminometil polistirensku smolu upotrebljena kao početni materijal. ESI-TOF-MS Izrač.: 7310.13

Otkriveno: 7310.17

[PRIMER 6]

PMO. br.5

[0149] Naslovno jedinjenje proizvedeno je u skladu sa postupkom PRIMERA 1, osim što je 4-(((2S,6R)-6-(5-metil-2,4-diokso-3,4-dihidropirmidin-1(2H)-il)-4-tritilmorfoli n-2-il)metoksi)-4-oksobutanoična kiselina uvedena na aminometil polistirensku smolu (REFERENTNI PRIMER 3) upotrebljena kao početni materijal. ESI-TOF-MS Izrač.: 8270.94

Otkriveno: 8270.20

[PRIMER 7]

PMO. br.6

[0150] Naslovno jedinjenje proizvedeno je u skladu sa postupkom PRIMERA 1.

ESI-TOF-MS Izrač.: 5964.01

Otkriveno: 5963.68

[PRIMER 8]

PMO. br.7

[0151] Naslovno jedinjenje proizvedeno je u skladu sa postupkom PRIMERA 1.

ESI-TOF-MS Izrač.: 6609.55

Otkriveno: 6608.85

[PRIMER 9]

PMO. br.9

[0152] Naslovno jedinjenje proizvedeno je u skladu sa postupkom PRIMERA 1, osim što je 4-okso-4-(((2S,6R)-6-(6-okso-2-(2-fenoksiacetamido)-1H-purin-9 (6H)-il)-4-tritilmorfolin-2-il)metoksi)butanoična kiselina uvedena na aminometil polistirensku smolu (REFERENTNI PRIMER 2) upotrebljena kao početni materijal.

ESI-TOF-MS Izrač.: 7280.11

Otkriveno: 7279.42

[PRIMER 10]

PMO. br.10

[0153] Naslovno jedinjenje proizvedeno je u skladu sa postupkom PRIMERA 1, osim što je 4-okso-4-(((2S,6R)-6-(6-okso-2-(2-fenoksiacetamido)-1H-purin-9 (6H)-il)-4-tritilmorfolin-2-il)metoksi)butanoična kiselina uvedena na aminometil polistirensku smolu (REFERENTNI PRIMER 2) upotrebljena kao početni materijal.

ESI-TOF-MS Izrač.: 8295.95

Otkriveno: 8295.91

[PRIMER 11]

PMO. br.13

[0154] Naslovno jedinjenje proizvedeno je u skladu sa postupkom PRIMERA 1, osim što je

1,12-diokso-1-(4-tritilpiperazin-1-il)-2,5,8,11-tetraoksa-15-pentadekanoična kiselina uvedena na aminometil polistirensku smolu (REFERENTNI PRIMER 4) upotrebljena kao početni materijal.

ESI-TOF-MS Izrač.: 7276.15

Otkriveno: 7276.69

[PRIMER 12]

PMO. br.14

[0155] Naslovno jedinjenje proizvedeno je u skladu sa postupkom PRIMERA 1, osim što je 1,12-diokso-1-(4-tritilpiperazin-1-il)-2,5,8,11-tetraoksa-15-pentadekanoična kiselina uvedena na aminometil polistirensku smolu (REFEENCE PRIMER 4) upotrebljena kao početni materijal.

ESI-TOF-MS Izrač.: 8622.27

Otkriveno: 8622.29

[UPOREDNI PRIMER 1]

PMO. br.11

[0156] Naslovno jedinjenje proizvedeno je u skladu sa postupkom PRIMERA 1.

ESI-TOF-MS Izrač.: 10274.63

Otkriveno: 10273.71

[UPOREDNI PRIMER 2]

PMO.br.15

[0157] Naslovno jedinjenje proizvedeno je u skladu sa postupkom PRIMERA 1.

ESI-TOF-MS Izrač.: 9941.33

Otkriveno: 9940.77

[UPOREDNI PRIMER 3]

PMO.br.16

[0158] Naslovno jedinjenje proizvedeno je u skladu sa postupkom PRIMERA 1.

ESI-TOF-MS Izrač.: 8238.94

Otkriveno: 8238.69

[TEST PRIMER 1]

In vitro ogled

[0159] Primenom Amaxa Cell Line Nucleofector Kit L on Nucleofector II (Lonza), 10 µM oligomeri PMO Br.1 do 8 ovog pronalaska i antisens oligomer PMO br.11 transfektovani su sa 4x 10<5>RD ćelija (humana Rabdomiosarkom ćelijska linija). Upotrebljen je Program T-030.

[0160] Nakon transfekcije, ćelije su uzgajane preko noći u 2 mL Eagle-ovog minimalnog esencijalnog medijuma (EMEM) (proizveden od strane Sigma, u nastavku isti) koji sadrži 10% fetalni goveđi serum (FCS) (proizveden od strane Invitrogen) pod uslovima od 37°C i 5% CO2. Ćelije su oprane dva puta sa PBS (proizveden od strane Nissui, u nastavku isti) i 500 µl ISOGEN-a (proizveden od strane Nippon Gene) dodato je ćelijama. Nakon što su ćelije ostavljene na sobnoj temperaturi tokom nekoliko minuta radi liziranja ćelija, lizati su sakupljeni u Eppendorf-ovu epruvetu. Ukupna RNK je ekstraktovana u skladu sa protokolom prikačenim uz ISOGEN. Koncentracija ukupne RNK koja je ekstraktovana određena je primenom NanoDrop ND-1000 (proizveden od strane LMS).

[0161] Jedno-Fazna RT-PCR izvedena je sa 400 ng ekstraktovane ukupne RNK primenom Titan One Tube RT-PCR Kit (proizveden od strane Roche). Reakcioni rastvor pripremljen je u skladu sa protokolom prikačenim uz komplet. PTC-100 (proizveden od strane MJ Research) upotrebljen je kao termički cikler. Upotrebljeni RT-PCR program je kako sledi.

50°C, 30 min: reverzna transkripcija

94°C, 2 min: termičko denaturisanje

[94°C, 10 sekundi; 58°C, 30 sekundi; 68 °C, 45 sekundi] x 30 ciklusa: PCR amplifikacija 68°C, 7 min: krajnje produžavanje

[0162] Nukleotidne sekvence direktnog prajmera i reverznog prajmera upotrebljene za RT-PCR date su u nastavku.

Direktni prajmer: 5'-AGGATTTGGAACAGAGGCGTC-3' (SEQ ID NO: 40)

Reverzni prajmer: 5'-GTCTGCCACTGGCGGAGGTC-3' (SEQ ID NO: 41)

[0163] Zatim, umetnuta PCR izvedena je sa proizvodom amplifikovanim putem RT-PCR primenom Taq DNK Polimeraze (proizvedene od strane Roche). Upotrebljeni PCR program bio je kako sledi.

94°C, 2 min: termičko denaturisanje

[94°C, 15 sekundi; 58°C, 30 sekundi; 68 °C, 45 sekundi] x 30 ciklusa: PCR amplifikacija 68°C, 7 min: krajnje produžavanje

[0164] Nukleotidne sekvence direktnog prajmera i reverznog prajmera koje su upotrebljene za gornju umetnutu PCR, date su u nastavku.

Direktni prajmer: 5'-CATCAAGCAGAAGGCAACAA-3' (SEQ ID NO: 42)

Reverzni prajmer: 5'-GAAGTTTCAGGGCCAAGTCA-3' (SEQ ID NO: 43)

[0165] Prozvod reakcije, 1 µl, pomenute umetnute PCR analiziran je primenom Bioanalyzer (proizveden od strane Agilent Technologies, Inc.).

[0166] Polinukleotidni nivo "A" trake sa preskakanjem eksona 53 i polinukleotidni nivo "B" trake bez preskakanja eksona 53 su izmereni. Na bazi ovih vrednosti merenja “A” i “B,” efikasnost preskakanja određena je sledećom jednačinom:

Eksperimentalni rezultati

[0167] Rezultati su prikazani na FIG.1. Ovaj eksperiment otkriva da oligomeri PMO Br.1 do 8 ovog pronalaska izazivaju preskakanje eksona 53 sa izrazito velikom efikasnošću u poređenju sa antisens oligomerom PMO br.11. Određenije, oligomeri PMO Br.3 i 8 ovog pronalaska eksprimiraju više od četiri puta veću efikasnost preskakanja eksona od one od antisen oligomera PMO br.11.

[TEST PRIMER 2]

In vitro ogled primenom humanih fibroblasta

[0168] Humani myoD gen (SEQ ID NO: 44) uveden je u TIG-119 ćelije (humani iz normalnog tkiva izvedeni fibroblasti, National Institute of Biomedical Innovation) ili 5017 ćelije (humani iz DMD pacijenata izvedeni fibroblasti, Coriell Institute for Medical Research) primenom ZsGreen1 koeskpresionog retrovirusnog vektora.

[0169] Nakon inkubacije tokom 4 do 5 dana, ZsGreen-pozitivni MyoD-transformisani fibroblasti sakupljeni su pomoću FACS i zasejani pri 5x 10<4>/cm<2>na ploču sa 12 bazenčića. Kao podloga za uzgajanje, upotrebljen je 1 mL Dulbecco-ov Modifikovani Eagle-ov medijum: Mešavina nutrijenata F-12 (DMEM.F-12) (Invitrogen Corp.) koja sadrži 10% FCS i 1% Penicilin/Streptomicin (P/S) (Sigma-Aldrich, Inc.).

[0170] Podloga je zamenjena 24 sata kasnije sa podlogom za diferencijaciju (DMEM/F-12 koji sadrži 2% konjski serum (Invitrogen Corp.), 1% P/S i ITS Tečnu suplemenu podlogu (Sigma, Inc.)). Podloga je zamenjena svaka 2 do 3 dana i inkubacija nastavljena tokom 12 do 14 dana radi diferencijacije na miocevčice.

[0171] Naknadno, podloga za diferencijaciju zamenjena je podlogom za diferencijaciju koja sadrži 6 µM Endo-Porter (Gene Tools), i morfolino oligomer dodat u nju u konačnoj koncentraciji od 10 µM. Nakon inkubacije tokom 48 sati, ukupna RNK je ekstraktovana iz ćelija primenom TRIzol (proizveden od strane Invitrogen Corp.). RT-PCR je izvedena sa 50 ng ekstraktovane ukupne RNK primenom QIAGEN OneFaza RT-PCR Kit. Reakcioni rastvor pripremljen je u skladu sa protokolom prikačenim uz komplet. An iCycler (proizveden od strane Bio-Rad) upotrebljen je kao termički cikler. Upotrebljeni RT-PCR program je kako sledi.

50°C, 30 min: reverzna transkripcija

95°C, 15 min: termičko denaturisanje

[94°C, 1 min; 60°C, 1 min; 72 °C, 1 min] x 35 ciklusa: PCR amplifikacija

72°C, 7 min: krajnje produžavanje

[0172] Upotrebljeni prajmeri bili su hEX51F i hEX55R.

hEX51F: 5'-CGGGCTTGGACAGAACTTAC-3' (SEQ ID NO: 45)

hEx55R: 5'-TCCTTACGGGTAGCATCCTG-3' (SEQ ID NO: 46)

[0173] Prozvod reakcije gornje RT-PCR odvojen je pomoću 2% elektroforeze na gelu agaroze i slike gela zabeležene su sa GeneFlash (Syngene). Polinukleotidni nivo "A" trake sa preskakanjem eksona 53 i polinukleotidni nivo "B" trake bez preskakanja eksona 53 izmereni su primenom Image J (proizveden od strane National Institutes of Health). Na bazi ovih vrednosti merenja “A” i “B,” efikasnost preskakanja određena je sledećom jednačinom.

Eksperimentalni rezultati

[0174] Rezultati su prikazani na FIG.2 i 3. Ovaj eksperiment otkriva da su u TIG-119 ćelijama, oligomeri PMO Br.3, 8 i 9 ovog pronalaska (FIG.2) svi izazvali preskakanje eksona 53 sa više efikasnosti od antisens oligomera PMO br.12 (FIG.2). Određenije, oligomeri PMO Br.3 i 8 ovog pronalaska eksprimiraju više od dva puta veću efikasnost preskakanja eksona od one od antisen oligomera PMO br.

12 (FIG.2).

[0175] Pored toga, ovaj eksperiment otkriva da su oligomeri PMO Br.3 i 8 do 10 ovog pronalaska (FIG.

3) svi izazvali preskakanje eksona 53 sa više efikasnosti od antisens oligomera PMO br.12 (FIG.3). Određenije, oligomeri PMO Br.3 i 8 ovog pronalaska eksprimiraju više od sedam puta veću efikasnost preskakanja eksona od one od antisen oligomera PMO br.12 (FIG.3).

[TEST PRIMER 3]

In vitro ogled primenom humanih fibroblasta

[0176] Ćelijska linija kožnih fibroblasta (fibroblasti iz humanog DMD pacijenta (eksoni 45-52 ili eksoni 48-52)) utvrđena je biopsijom iz srednje leve nadlaktice DMD pacijenta sa brisanjem eksona 45-52 ili DMD pacijenta sa brisanjem eksona 48-52. Humani myoD gen (SEQ ID NO: 44) uveden je u fibroblast ćelije primenom ZsGreen 1 koeskpresionog retrovirusnog vektora.

[0177] Nakon inkubacije tokom 4 do 5 dana, ZsGreen-pozitivni MyoD-transformisani fibroblasti sakupljeni su pomoću FACS i zasejani pri 5x 10<4>/cm<2>na ploču sa 12 bazenčića. Kao podloga za uzgajanje, upotrebljen je 1 mL Dulbecco-ov Modifikovani Eagle-ov medijum: Mešavina nutrijenata F-12 (DMEM/F-12) (Invitrogen Corp.) koji sadrži 10% FCS i 1% Penicilin/Streptomicin (P/S) (Sigma-Aldrich, Inc.).

[0178] Podloga je zamenjena 24 sata kasnije sa podlogom za diferencijaciju (DMEM/F-12 koji sadrži 2% konjski serum (Invitrogen Corp.), 1% P/S i ITS Tečnu suplemenu podlogu (Sigma, Inc.)). Podloga je zamenjena svaka 2 do 3 dana, a inkubacija nastavljena tokom 12, 14 ili 20 dana radi diferencijacije na miocevčice.

[0179] Naknadno, podloga za diferencijaciju zamenjena je podlogom za diferencijaciju koja sadrži 6 µM Endo-Porter (Gene Tools), a morfolino oligomer dodat je u njega pri konačnog koncentraciji od 10 µM. Nakon inkubacije tokom 48 sati, ukupna RNK je ekstraktovana iz ćelija primenom TRIzol (proizveden od strane Invitrogen Corp.). RT-PCR je izvedena sa 50 ng ekstraktovane ukupne RNK primenom QIAGEN OneFaza RT-PCR Kit. Reakcioni rastvor pripremljen je u skladu sa protokolom prikačenim uz komplet. iCycler (proizveden od strane Bio-Rad) upotrebljen je kao termički cikler. Upotrebljeni RT-PCR program je kako sledi.

50°C, 30 min: reverzna transkripcija

95°C, 15 min: termičko denaturisanje

[94°C, 1 min; 60°C, 1 min; 72 °C, 1 min] x 35 ciklusa: PCR amplifikacija

72°C, 7 min: krajnje produžavanje

[0180] Upotrebljeni prajmeri bili su hEx44F i h55R.

hEx44F: 5'- TGTTGAGAAATGGCGGCGT-3' (SEQ ID NO: 48)

hEx55R: 5'- TCCTTACGGGTAGCATCCTG-3' (SEQ ID NO: 46)

[0181] Prozvod reakcije gornje RT-PCR odvojen je pomoću 2% elektroforeze na gelu agaroze i slike gela zabeležene su sa GeneFlash (Syngene). Polinukleotidni nivo "A" trake sa preskakanjem eksona 53 i polinukleotidni nivo "B" trake bez preskakanja eksona 53 izmereni su primenom Image J (proizveden od strane National Institutes of Health). Na bazi ovih vrednosti merenja “A” i “B,” efikasnost preskakanja određena je sledećom jednačinom.

Eksperimentalni rezultati

[0182] Rezultati su prikazani na FIG.4 i 5. Ovaj eksperiment otkriva da oligomeri PMO Br.3 i 8 ovog pronalaska izazivaju preskakanje eksona 53 sa efikasnošću od više od 80% u ćelijama od DMD pacijenta sa brisanjem eksona 45-52 (FIG.4) ili brisanjem eksona 48-52 (FIG.5). Takođe, otkriveno je da oligomeri PMO Br.3 i 8 ovog pronalaska izazivaju preskakanje eksona 53 sa više efikasnosti od one od antisen oligomera PMO br.15 u ćelijama od DMD pacijenta sa brisanjem eksona 45-52 (FIG.4).

[TEST PRIMER 4]

Western blot analiza

[0183] Oligomer PMO br.8 ovog pronalaska dodat je ćelijama pri koncentraciji od 10 µM, a proteini su ekstraktovani iz ćelija nakon 72 sata primenom RIPA pufera (proizveden od strane Thermo Fisher Scientific) koji sadrži Complete Mini (proizveden od strane Roche Applied Science) i kvantifikovani primenom BCA protein assay kit (proizveden od strane Thermo Fisher Scientific). Proteini su electroforezovani u NuPAGE Novex Tris-Acetat Gel 3-8% (proizveden od strane Invitrogen) na 150V tokom 75 minuta i transferovani na PVDF membranu (proizvedena od strane Millipore) primenom polusuvog blotera. PVDF membrana blokirana je sa 5% ECL agensom za blokiranje (proizveden od strane GE Healthcare), a membrana je zatim inkubisana u rastvoru anti-distrofin antitela (proizvedeno od strane NCL-Dys1, Novocastra). Nakon dalje inkubacije u rastvoru peroksidaza-konjugovano kozje-antimišje IgG (Model br.170-6516, Bio-Rad), membrana je obojena sa ECL Plus Western blotting sistemom (proizveden od strane GE Healthcare).

Imunobojenje

[0184] Oligomer PMO br.3 ili 8 ovog pronalaska dodat je ćelijama. Ćelije su nakon 72 sata fiksirane u 3% paraformaldehidu tokom 10 minuta, praćeno inkubacijom na 10% Triton-X tokom 10 minuta. Nakon blokiranja u 10% koziji serum-sadržavajućem PBS, membrana je inkubisana u rastvoru anti-distrofin antitela (NCL-Dys1, Novocastra). Membrana je dalje inkubisana u rastvoru anti-mišjeg IgG antitela (proizvedeno od strane Invitrogen). Ta membrana dopunjena je Pro Long Gold Antifade reagensom (proizveden od strane Invitrogen) i posmatrana je fluorescencionim mikroskopom.

Eksperimentalni rezultati

[0185] Rezultati su prikazani na FIG.6 i 7. U ovom eksperimentu potvrđeno je western blot analizom (FIG.6) i imunobojenjem (FIG.7) da oligomeri PMO Br.3 i 8 ovog pronalaska indukuju ekspresiju distrofin proteina.

[TEST PRIMER 5]

In vitro ogled primenom humanih fibroblasta

[0186] Eksperiment je izveden kao i u TEST PRIMERU 3.

Eksperimentalni rezultati

[0187] Rezultati su prikazani na FIG.8. Ovaj eksperiment otkriva da su u ćelijama od DMD pacijenata sa brisanjem eksona 45-52, oligomeri PMO Br.3 do 8 ovog pronalaska izazvali preskakanje eksona 53 sa više efikasnosti od oligomera PMO Br.13 i 14 ovog pronalaska (FIG.8).

[TEST PRIMER 6]

In vitro ogled

[0188] Eksperimenti su izvedeni primenom antisens oligomera 2'-O-metoksi-fosforotioata (2'-OMe-S-RNK) prikazani putem SEQ ID NO: 49 do SEQ ID NO: 123. Razni antisens oligomeri primenjeni za ovaj ogled, kupljeni su od Japan Bio Services. Sekvence raznih antisens oligomera date su u nastavku.

TABELA 7

[0189] RD ćelije (humana Rabdomiosarkom ćelijska linija) zasejane su pri 3x 10<5>u ploču sa 6 bazenčića i uzgajani u 2 mL Eagle-ovog minimalnog esencijalnog medijuma (EMEM) (proizveden od strane Sigma, Inc., u nastavku isti) koji sadrži 10% fetalni goveđi serum (FCS) (proizveden od strane Invitrogen Corp.) pod uslovima od 37°C i 5% CO2preko noći. Kompleksi raznih antisens oligomera (Japan Bio Services) (1 µM) za preskakanje eksona 53 i Lipofectamin 2000 (proizveden od strane Invitrogen Corp.) pripremljeni su i 200 µl dodato je RD ćelijama u kojima je 1.8 mL podloge zamenjeno, da bi se dostigla konačna koncentracija od 100 nM.

[0190] Po završetku dodavanja, ćelije su uzgajane preko noći. Ćelije su oprane dva puta sa PBS (proizveden od strane Nissui, u nastavku isti), a zatim je 500 µl ISOGEN (proizveden od strane Nippon Gene) dodato ćelijama. Nakon što su ćelije ostavljene na sobnoj temperaturi tokom nekoliko minuta radi lizije ćelija, lizati su sakupljeni u Eppendorf-ovu epruvetu. Ukupna RNK je ekstraktovan u skladu sa protokolom prikačenim uz ISOGEN. Koncentracija ukupne ekstraktovane RNK određena je primenom NanoDrop ND-1000 (proizveden od strane LMS).

[0191] Jedno-Fazna RT-PCR izvedena je sa 400 ng ekstraktovane ukupne RNK primenom Titan One Tube RT-PCR Kit (proizveden od strane Roche). Reakcioni rastvor pripremljen je u skladu sa protokolom prikačenim uz komplet. PTC-100 (proizveden od strane MJ Research) upotrebljen je kao termički cikler. Upotrebljeni RT-PCR program je kako sledi.

50°C, 30 min: reverzna transkripcija

94°C, 2 min: termičko denaturisanje

[94°C, 10 sekundi; 58°C, 30 sekundi; 68 °C, 45 sekundi] x 30 ciklusa: PCR amplifikacija 68°C, 7 min: krajnje produžavanje

[0192] Nukleotidne sekvence direktnog prajmera i reverznog prajmera upotrebljene za RT-PCR date su u nastavku.

Direktni prajmer: 5'-CATCAAGCAGAAGGCAACAA-3' (SEQ ID NO: 42)

Reverzni prajmer: 5'-GAAGTTTCAGGGCCAAGTCA-3' (SEQ ID NO: 43)

[0193] Naknadno, umetnuta PCR je izvedena sa amplifikovanim proizvodom RT-PCR primenom Taq DNK Polimeraze (proizvedena od strane Roche). Upotrebljeni PCR program bio je kako sledi.

94°C, 2 min: termičko denaturisanje

[94°C, 15 sekundi; 58°C, 30 sekundi; 68 °C, 45 sekundi] x 30 ciklusa: PCR amplifikacija 68°C, 7 min: krajnje produžavanje

[0194] Nukleotidne sekvence direktnog prajmera i reverznog prajmera koje su upotrebljene za gornju umetnutu PCR, date su u nastavku.

Direktni prajmer: 5'-AGGATTTGGAACAGAGGCGTC-3' (SEQ ID NO: 40)

Reverzni prajmer: 5'-GTCTGCCACTGGCGGAGGTC-3' (SEQ ID NO: 41)

[0195] Prozvod reakcije, 1 µl, pomenute umetnute PCR analiziran je primenom Bioanalyzer (proizveden od strane Agilent Technologies, Inc.).

[0196] Polinukleotidni nivo "A" trake sa preskakanjem eksona 53 i polinukleotidni nivo "B" trake bez preskakanja eksona 53 su izmereni. Na bazi ovih vrednosti merenja “A” i “B,” efikasnost preskakanja određena je sledećom jednačinom:

Eksperimentalni rezultati

[0197] Rezultati su prikazani na FIG.9 do 17. Ovi eksperimenti otkrivaju da, kada su antisens oligomeri konstruisani na položajima 31-61 iz 5’ kraja eksona 53 u genu humanog distrofina, preskakanje eksona 53 izaziva se sa velikom efikasnošću.

[TEST PRIMER 7]

[0198] Primenom Amaxa Cell Line Nucleofector Kit L on Nucleofector II (Lonza), 0.3 to 30 µM antisens oligomera transfektovano je sa 3.5x 10<5>RD ćelijama (humana Rabdomiosarkom ćelijska linija).

Upotrebljen je Program T-030.

[0199] Nakon transfekcije, ćelije su uzgajane preko noći u 2 mL Eagle-ovog minimalnog esencijalnog medijuma (EMEM) (proizveden od strane Sigma, Inc., u nastavku isti) koji sadrži 10% fetalni goveđi serum (FCS) (proizveden od strane Invitrogen Corp.) pod uslovima od 37°C i 5% CO2. Ćelije su oprane dva puta sa PBS (proizveden od strane Nissui, u nastavku isti) i 500 µl ISOGEN (proizveden od strane Nippon Gene) zatim je dodat ćelijama. Nakon što su ćelije ostavljene na sobnoj temperaturi tokom nekoliko minuta radi liziranja ćelija, lizati su sakupljeni u Eppendorf-ovu epruvetu. Ukupna RNK je ekstraktovan u skladu sa protokolom prikačenim uz ISOGEN. Koncentracija ukupne ekstraktovane RNK određena je primenom NanoDrop ND-1000 (proizveden od strane LMS).

[0200] Jedno-Fazna RT-PCR izvedena je sa 400 ng ekstraktovane ukupne RNK primenom QIAGEN OneFaza RT-PCR Kit (proizveden od strane Qiagen, Inc.). Reakcioni rastvor pripremljen je u skladu sa protokolom prikačenim uz komplet. Upotrebljeni termički cikler bio je PTC-100 (proizveden od strane MJ Research). Upotrebljeni RT-PCR program je kako sledi..

50°C, 30 min: reverzna transkripcija

95°C, 15 min: termičko denaturisanje

[94°C, 30 sekundi; 60°C, 30 sekundi; 72 °C, 1 min] x 35 ciklusa: PCR amplifikacija

72°C, 10 min: krajnje produžavanje

[0201] Nukleotidne sekvence direktnog prajmera i reverznog prajmera upotrebljene za RT-PCR date su u nastavku.

Direktni prajmer: 5'-CATCAAGCAGAAGGCAACAA-3' (SEQ ID NO: 42)

Reverzni prajmer: 5'-GAAGTTTCAGGGCCAAGTCA-3' (SEQ ID NO: 43)

[0202] Prozvod reakcije, 1 µl, gornje PCR analiziran je primenom Bioanalyzer (proizveden od strane Agilent Technologies, Inc.).

[0203] Polinukleotidni nivo "A" trake sa preskakanjem eksona 53 i polinukleotidni nivo "B" trake bez preskakanja eksona 53 su izmereni. Na bazi ovih vrednosti merenja “A” i “B,” efikasnost preskakanja određena je sledećom jednačinom:

Eksperimentalni rezultati

[0204] Rezultati su prikazani na FIG.18 i 19. Ovi eksperimenti otkrivaju da oligomer PMO br.8 ovog pronalaska izaziva preskakanje eksona 53 sa izrazito velikom efikasnošću u poređenju sa antisens oligomerima PMO Br.15 i 16 (FIG.18). Takođe je otkriveno da oligomeri PMO Br.3 i 8 ovog pronalaska izazivaju preskakanje eksona 53 sa izrazito velikom efikasnošću u poređenju sa oligomerima PMO Br.13 i 14 ovog pronalaska (FIG.19). Ovi rezultati pokazuju da sekvence sa -OH grupom na 5’ kraju obezbeđuju efikasnija preskakanja čak i u istim sekvencama.

INDUSTRIJSKA PRIMENJIVOST

[0205] Eksperimentalni rezultati U TEST PRIMERIMA pokazuju da su svi oligomeri ovog pronalaska (PMO Br.1 do 10) izazvali preskakanje eksona 53 sa izrazito velikom efikasnošću pod svim ćelijskim okolnostima, u poređenju sa oligomerima (PMO Br.11, 12, 15 i 16) prema stanju tehnike.5017 ćelije koje su upotrebljene u TEST PRIMERU 2 su ćelije izolovane od DMD pacijenata, a fibroblasti primenjeni u TEST PRIMERIMA 3 i 5 su ciljane ćelije za preskakanje eksona 53 od DMD pacijenata. Naročito u TEST PRIMERIMA 3 i 5, oligomeri ovog pronalaska pokazuju efikasnost preskakanja eksona 53 od 90% ili više u ćelijama od DMD pacijenata koje su ciljane za preskakanje eksona 53. Kao posledica, oligomeri ovog pronalaska mogu da indukuju preskakanje eksona 53 sa velikom efikasnošću, kada se daju DMD pacijentima.

[0206] Prema tome, oligomeri ovog pronalaska su izuzetno korisni u lečenju DMD.

Slobodan tekst liste sekvenci

[0207]

SEQ ID NO: 2: sintetička nukleinska kiselina

SEQ ID NO: 3: sintetička nukleinska kiselina

SEQ ID NO: 4: sintetička nukleinska kiselina

SEQ ID NO: 5: sintetička nukleinska kiselina

SEQ ID NO: 6: sintetička nukleinska kiselina

SEQ ID NO: 7: sintetička nukleinska kiselina

SEQ ID NO: 8: sintetička nukleinska kiselina

SEQ ID NO: 9: sintetička nukleinska kiselina

SEQ ID NO: 10: sintetička nukleinska kiselina

SEQ ID NO: 11: sintetička nukleinska kiselina

SEQ ID NO: 12: sintetička nukleinska kiselina

SEQ ID NO: 13: sintetička nukleinska kiselina

SEQ ID NO: 14: sintetička nukleinska kiselina

SEQ ID NO: 15: sintetička nukleinska kiselina

SEQ ID NO: 16: sintetička nukleinska kiselina

SEQ ID NO: 17: sintetička nukleinska kiselina

SEQ ID NO: 18: sintetička nukleinska kiselina

SEQ ID NO: 19: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 20: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 21: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 22: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 23: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 24: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 25: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 26: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 27: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 28: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 29: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 30: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 31: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 32: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 33: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 34: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 35: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 36: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 37: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 38: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 39: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 40: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 41: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 42: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 43: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 45: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 46: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 47: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 48: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 49: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 50: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 51: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 52: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 53: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 54: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 55: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 56: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 57: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 58: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 59: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 60: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 61: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 62: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 63: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 64: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 65: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 66: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 67: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 68: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 69: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 70: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 71: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 72: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 73: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 74: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 75: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 76: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 77: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 78: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 79: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 80: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 81: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 82: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 83: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 84: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 85: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 86: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 87: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 88: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 89: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 90: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 91: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 92: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 93: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 94: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 95: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 96: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 97: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 98: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 99: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 100: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 101: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 102: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 103: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 104: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 105: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 106: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 107: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 108: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 109: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 110: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 111: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 112: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 113: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 114: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 115: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 116: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 117: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 118: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 119: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 120: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 121: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 122: sintetička nukleinska kiselina SEQ ID NO: 123: sintetička nukleinska kiselina

Claims (4)

Patentni zahtevi

1. Antisens oligomer koji izaziva preskakanje 53. eksona u genu humanog distrofina, koji se sastoji od nukleotidne sekvence komplementarne sa 36. do 60. nukleotidom iz 5’ kraja 53. eksona u genu humanog distrofina.

2. Antisens oligomer prema zahtevu 1, koji je oligonukleotid.

3. Antisens oligomer prema zahtevu 2, u kojem su šećerna grupa i/ili fosfat-vezujući region najmanje jednog nukleotida koji sačinjavaju oligonukleotid modifikovani.

4. Antisens oligomer prema zahtevu 3, u kojem šećerna grupa najmanje jednog nukleotida koja sačinjava oligonukleotid predstavlja ribozu u kojoj je 2'-OH grupa zamenjena bilo kojom odabranom iz grupe koju čine: OR, R, R'OR, SH, SR, NH2, NHR, NR2, N3, CN, F, Cl, Br, i I, pri čemu R je alkil ili aril, a R' je alkilen.