RS59373B1 - Vezujući molekuli za bcma i cd3 - Google Patents

Description

Opis

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na vezujući molekul koji je barem bispecifičan i sadrži prvi i drugi vezujući domen, gde je prvi vezujući domen sposoban da se vezuje za klaster epitopa 3 od BCMA, i drugi vezujući domen je sposoban da se vezuje za CD3. Štaviše, pronalazak pruža sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vezujući molekul, vektor koji sadrži navedenu sekvencu nukleinskih kiselina i ćeliju domaćina transformisanu ili transfektovanu navedenim vektorom. Dalje, pronalazak pruža postupak za proizvodnju vezujućeg molekula predmetnog pronalaska, medicinsku upotrebu navedenog vezujućeg molekula i komplet koji sadrži navedeni vezujući molekul.

[0002] BCMA (antigen za sazrevanje B-ćelija, TNFRSF17, CD269) je transmembranski protein koji pripada super porodici TNF receptora. BCMA se prvobitno navodi kao integralni protein membrane u Goldžijevom aparatu ljudskih zrelih B limfocita, tj. kao unutarćelijski protein (Gras i dr., (1995) International Immunol 7(7):1093-1105) što pokazuje da se čini da BCMA ima važnu ulogu tokom razvoja B-ćelija i homeostaze. Otkriće od strane Grasa i dr. može biti povezano sa činjenicom da je BCMA protein koji je opisan u Gras i dr. je, zbog hromozomske translokacije, fuzioni protein između BCMA i IL-2. Međutim, u međuvremenu je za BCMA ustanovljeno da predstavlja marker B-ćelija koji je neophodan za razvoj B-ćelija i homeostazu (Schliemann i dr., (2001) Science 293 (5537):2111-2114) zbog pretpostavljene suštinske interakcije sa svojim ligandima BAFF (faktor aktiviranja B ćelije), koji su takođe označeni kao TALL-1 ili TNFSF13B, i APRIL (ligand koji indukuje proliferaciju).

[0003] Eksprimiranje BCMA je ograničeno na B-ćelijsku liniju i uglavnom je prisutno na ćelijama plazme i plazmablastima i donekle na memorijskim B ćelijama, ali praktično je odsutno na perifernim i naivnim B ćelijama. BCMA se takođe eksprimira u ćelijama multiplog mijeloma (MM). Zajedno sa članovima porodice, transmembranskim aktivatorom i interaktorom ciklofilinskog liganda (TACI) i B ćelijskim faktorom aktivacije receptora TNF porodice (BAFF-R), BCMA reguliše različite aspekte humoralnog imuniteta, razvoj B-ćelija i homeostazu. Eksprimiranje BCMA se pojavljuje prilično kasno u diferencijaciji B-ćelija i doprinosi dugoročnom preživljavanju plazmablasta i plazma ćelija u koštanoj srži. Ciljano brisanje BCMA gena kod miševa ne utiče na stvaranje zrelih B ćelija, na kvalitet i veličinu humoralnih imunih odgovora, formiranje germinalnog centra i stvaranje kratkotrajnih plazma ćelija. Međutim, takvi miševi su značajno smanjili broj dugovečnih plazma ćelija u koštanoj srži, što ukazuje na važnost BCMA za njihov opstanak (O'Connor i dr., 2004).

[0004] U skladu sa ovim otkrićem, BCMA takođe podržava rast i preživljavanje ćelija multiplog mijeloma (MM). Novak i dr. otkrili su da MM ćelijske linije i sveže izolovane MM ćelije eksprimiraju BCMA i TACI protein na svojim ćelijskim površinama i da imaju varijabilno eksprimiranje BAFF-R proteina na svojoj ćelijskoj površini (Novak i dr., (2004) Blood 103(2):689-694).

[0005] Multipli mijelom (MM) drugi je najčešći hematološki maligni oblik i čini 2% svih smrtnih slučajeva od raka. MM je heterogena bolest i uzrokovana je uglavnom translokacijama hromozoma inter alia t(11;14),t(4;14),t(8;14),del(13),del(17) (Drach i dr., (1998) Blood 92(3):802-809; Gertz i dr., (2005) Blood 106(8):2837-2840; Facon i dr., (2001) Blood 97(6):1566-1571). Pacijenti koji su pogođeni sa MM mogu da dožive razne simptome povezane sa bolešću usled infiltracije koštane srži, uništavanja kostiju, otkazivanja bubrega, imunodeficijencije i psihosocijalnog opterećenja dijagnoze karcinoma. Od 2006. godine, 5-godišnja relativna stopa preživljavanja za MM iznosila je otprilike 34% što naglašava da je MM bolest teška za tretiranje, gde trenutno nema mogućnosti izlečenja.

[0006] Obećavajuće nove terapije, kao što su hemoterapija i transplantacija matičnih ćelija, postaju dostupne i poboljšavaju stope preživljavanja, ali često donose neželjene nuspojave, pa MM ostaje i dalje neizlečiv (Lee i dr., (2004) J Natl Compr Canc Netw 8 (4): 379-383) Do danas, dve najčešće korišćene mogućnosti tretmana za pacijente sa multiplim mijelomom su kombinacije steroida, talidomida, lenalidomida, bortezomiba ili različitih citotoksičnih agenasa, i za mlađe pacijente koncepti hemoterapije u visokim dozama sa autolognom transplantacijom matičnih ćelija.

Većina transplantacija je autolognog tipa, tj. koristi pacijentove sopstvene ćelije. Pokazalo se da takve transplantacije, iako ne mogu da izleče, produžavaju život odabranim pacijentima.

Mogu se primeniti kao početna terapija kod novo dijagnostikovanih pacijenata ili u vreme recidiva. Ponekad se kod odabranih pacijenata može preporučiti više od jedne transplantacije kako bi se adekvatno kontrolisala bolest.

[0007] Hemoterapijski agensi koji se koriste za tretman bolesti su ciklofosfamid, doksorubicin, vinkristin i melfalan, kombinovana terapija sa imunomodulatornim agensima kao što su talidomid (Thalomid®), lenalidomid (Revlimid®), bortezomib (Velcade®) i kortikosteroidi (npr. Deksametazon), javili su se kao važne mogućnosti za tretman mijeloma, kako kod novo dijagnostikovanih pacijenata, tako i kod pacijenata sa uznapredovalom bolešću kod kojih hemoterapija ili transplantacija nisu uspeli.

[0008] Trenutno korišćene terapije obično ne omogućuju izlečenje. Transplantacija matičnih ćelija možda nije opcija mnogim pacijentima zbog starijeg uzrasta, prisustva drugih ozbiljnih bolesti ili drugih fizičkih ograničenja. Hemoterapija samo delimično kontroliše multipli mijelom, i retko dovodi do potpune remisije. Stoga postoji hitna potreba za novim, inovativnim tretmanima.

[0009] Bellucci i dr. (Blood, 2005; 105(10) su identifikovali antitela specifična za BCMA kod pacijenata sa multiplim mijelomom nakon što su primili infuziju donorskih limfocita (DLI). Serum ovih pacijenata bio je sposoban da posreduje BCMA-specifičnu ćelijsku lizu putem ADCC i CDC, i detektovan je isključivo kod pacijenata sa antitumorskim odgovorima (4/9), ali ne i kod pacijenata bez odgovora (0/6). Autori nagađaju da indukcija antitela specifičnih za BCMA doprinosi eliminaciji ćelija mijeloma i dugoročnoj remisiji pacijenata.

[0010] Ryan i dr. (Mol. Cancer Ther. 2007; 6(11) su prijavili stvaranje antagonističkog BCMA specifičnog antitela koje sprečava NF-κB aktivaciju koja je povezana sa potentnim signalnim putem koji podržava preživljavanje u normalnim i malignim B ćelijama. Pored toga, antitelo je in vitro dodalo snažnu ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela(ADCC) ćelijskim linijama multiplog mijeloma in vitro što je značajno poboljšano Fc inženjeringom.

[0011] WO 2009/132058 pruža dijagnostički test za merenje nivoa BCMA na površini B ćelija. Takođe ima reči o bispecifičnim antitelima usmerenim protiv B ćelijskih markera i T ćelijskih receptora.

[0012] Ostali pristupi u borbi protiv krvnih tumora ili autoimunih poremećaja usredsređeni su na interakciju između BAFF i APRIL, tj. Ligandi iz TNF ligand super porodice i njihovih receptora TACI, BAFF-R i BCMA koji aktiviraju BAFF i/ili APRIL. Na primer, spajanjem Fc domena ljudskog imunoglobulina sa TACI, Zymogenetics, Inc. su generisali Atacicept (TACI-Ig) kako bi neutralisao oba ova liganda i spreči aktivaciju receptora. Atacicept se trenutno nalazi u kliničkim ispitivanjima za tretman sistemskog eritematološkog lupusa (SLE, faza III), multiple skleroze (MS, faza II) i reumatoidnog artritisa (RA, faza II), kao i u kliničkoj fazi ispitivanja tretmana maligniteta B-ćelija hronične limfocitne leukemije (CLL), ne-Hodgkins-ovog limfom (NHL) i MM. U pred-kliničkim studijama atacicept smanjuje rast i opstanak primarnih MM ćelija i MM ćelijskih linija in vitro (Moreaux i dr, Blood, 2004, 103) i in vivo (Yaccoby i dr, Leukemia, 2008, 22, 406-13), pokazujući važnost TACI liganda za MM ćelije. Pošto većina MM ćelija i izvedenih ćelijskih linija eksprimiraju BCMA i TACI, oba receptora mogu doprineti rastu i preživljavanju posredovanom ligandom. Ovi podaci sugeriraju da antagonizovanje i BCMA i TACI može biti korisno u tretmanu poremećaja plazma ćelija.

[0013] Pored toga, opisana su BCMA specifična antitela koja unakrsno reaguju sa TACI (WO 02/066516).

[0014] Human Genome Sciences i GlaxoSmithKline su razvili antitelo koje cilja BAFF koje se zove belimumab. Belimumab blokira vezivanje rastvorljivog BAFF za svoje receptore BAFF-R, BCMA i TACI na B ćelijama. Belimumab ne vezuje B ćelije direktno, već vezanjem BAFF, belimumab inhibira opstanak B ćelija, uključujući autoreaktivne B ćelije, i smanjuje diferencijaciju B ćelija u plazma ćelije koje proizvode imunoglobulin.

[0015] Ipak, uprkos činjenici da je BCMA; BAFF-R i TACI, tj. B ćelijski receptori koji pripadaju super porodici TNF receptora i njihovi ligandi BAFF i APRIL podležu terapiji u borbi protiv raka i/ili autoimunih poremećaja, još uvek postoji potreba za dodatnim opcijama za tretman takvih zdravstvenih stanja.

[0016] Prema tome, ovde su dati načini i postupci za rešavanje ovog problema u obliku vezujućeg molekula koji je barem bispecifičan sa jednim vezujućim domenom za citotoksične ćelije, tj. citotoksične T ćelije i sa drugim vezujućim domenom za BCMA.

[0017] Prema tome, u prvom aspektu, predmetni pronalazak pruža vezujući molekul koji je barem bispecifičan i sadrži prvi i drugi vezujući domen, gde

(a) prvi vezujući domen je sposoban da se vezuje za klaster epitopa 3 od BCMA (CQLRCSSNTPPLTCQRYC) (SEQ ID NO:1016); i

(b) drugi vezujući domen je sposoban da se vezuje za CD3; i

gde klaster epitopa 3 od BCMA odgovara ostacima aminokiselina 24 do 41 iz sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 1002.

[0018] Mora se napomenuti da, kako se ovde koristi, oblici jednine uključuju i oblike množine, osim ako kontekst jasno ne naznačuje drugačije. Tako, na primer, pozivanje na „reagens“ uključuje jedan ili više takvih različitih reagensa, i pozivanje na „postupak“ uključuje pozivanje na ekvivalentne korake i postupke poznate onima koji imaju uobičajene veštine u struci, i koji bi mogli biti modifikovani ili zamenjeni za ovde opisane postupke.

[0019] Ako nije drugačije naznačeno, podrazumeva se da se izraz „barem“ koji prethodi nizu elemenata odnosi na svaki element u nizu. Stručnjaci u oblasti će prepoznati, ili će moći da utvrde koristeći ne više od rutinskog eksperimentisanja, mnogo ekvivalenta ovde opisanim specifičnim otelotvorenjima pronalaska. Predviđeno je da takvi ekvivalenti budu obuhvaćeni predmetnim pronalaskom.

[0020] Izraz „i/ili“ gde god se ovde koristi uključuje značenje „i“, „ili“ i „sve ili bilo koje druge kombinacije elemenata povezanih navedenim izrazom“.

[0021] Izraz „približno“ ili „otprilike“, kako se ovde koristi, znači unutar ± 20%, poželjno unutar ± 15%, poželjnije unutar ± 10%, i najpoželjnije unutar ± 5% date vrednosti ili raspona.

[0022] Kroz ovu specifikaciju i prateće patentne zahteve, osim ako kontekst ne zahteva drugačije, reč „sadrži“, i varijacije poput „sadrže“ i „sadržati“ podrazumevaju obuhvatanje navedenog celog broja ili koraka ili grupe celih brojeva ili koraka, ali ne i isključivanje bilo kog drugog celog broja ili koraka ili grupe celih brojeva ili koraka. Kako se ovde koristi, izraz „sadrži“ može biti supstituisan izrazom „koji sadrži“ ili „uključuje“ ili ponekad kako se ovde koristi izrazom „ima“.

[0023] Kako se ovde koristi, „koji se sastoji od“ isključuje bilo koji element, korak ili sastojak koji nije naveden u elementu patentnom zahteva. Kako se ovde koristi, „u osnovi se sastoji od“ ne isključuje materijale ili korake koji ne utiču materijalno na osnovne i nove karakteristike zahteva.

[0024] U svakom slučaju ovde, bilo koji od izraza „sadrži“, „uglavnom se sastoji od“ i „sastoji se od“ može biti zamenjen bilo kojim od druga dva izraza.

[0025] Različiti aspekti i otelotvorenja predmetnog pronalaska su opisani u nastavku.

[0026] Predmetni pronalazak se odnosi na vezujući molekul koji je barem bispecifičan i sadrži prvi i drugi vezujući domen, gde

(a) prvi vezujući domen je sposoban da se vezuje za klaster epitopa 3 od BCMA (CQLRCSSNTPPLTCQRYC); i

(b) drugi vezujući domen je sposoban da se vezuje za CD3; i

gde klaster epitopa 3 od BCMA odgovara aminokiselinskim ostacima 24 do 41 sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 1002, i gde je navedeni vezujući molekul polipeptid.

[0027] Dalje, predmetni pronalazak se odnosi na vezujući molekul iznad, gde je prvi vezujući domen dalje spojen na klaster epitopa 3 makaki BCMA (CQLRCSSTPPLTCQRYC).

[0028] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na gore navedeni vezujući molekul, gde je drugi vezujući domen sposoban da se vezuje za CD3 epsilon.

[0029] Pored toga, predmetni pronalazak se odnosi na gore navedeni vezujući molekul, gde prvi i/ili drugi vezujući domen sadrže CDR antitela.

[0030] Dalje, predmetni pronalazak se odnosi na gore navedeni vezujući molekul, gde prvi i drugi domen formiraju molekul koji je izabran iz grupe koju čine (scFv)2, (jednodomensko mAb)2, scFv-jednodomensko mAb, dijatelo ili njihovi oligomeri.

[0031] Predmetni pronalazak se dodatno odnosi na gore navedene vezujuće molekule, gde prvi vezujući domen sadrži VH region koji sadrži CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3i VL region koji sadrži CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 odabrane iz grupe koju čine:

(1) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 1, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 2, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 3, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 4, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 5 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 6; (2) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 11, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 12, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 13, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 14, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 15 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 16;

(3) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 21, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 22, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 23, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 24, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 25 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 26;

(4) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 31, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 32, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 33, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 34, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 35 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 36;

(5) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 41, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 42, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 43, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 44, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 45 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 46;

(6) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 51, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 52, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 53, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 54, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 55 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 56;

(7) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 61, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 62, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 63, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 64, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 65 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 66;

(8) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 71, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 72, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 73, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 74, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 75 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 76;

(9) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 161, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 162, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 163, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 164, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 165 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: (10) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 171, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 172, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 173, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 174, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 175 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 176;

(11) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 181, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 182, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 183, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 184, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 185 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 186;

(12) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 191, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 192, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 193, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 194, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 195 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 196;

(13) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 201, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 202, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 203, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 204, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 205 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 206;

(14) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 211, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 212, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 213, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO:214, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 215 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 216;

(15) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 221, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 222, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 223, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 224, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 225 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 226;

(16) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 311, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 312, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 313, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 314, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 315 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 316;

(17) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 321, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 322, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 323, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 324, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 325 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 326;

(18) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 331, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 332, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 333, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 334, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 335 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 336;

(19) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 341, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 342, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 343, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 344, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 345 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 346;

(20) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 351, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 352, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 353, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 354, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 355 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 356;

(21) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 361, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 362, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 363, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 364, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 365 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 366;

(22) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 371, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 372, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 373, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 374, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 375 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 376;

(23) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 381, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 382, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 383, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 384, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 385 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 386;

(24) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 581, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 582, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 583, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 584, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 585 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 586;

(25) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 591, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 592, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 593, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 594, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 595 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 596;

(26) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 601, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 602, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 603, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 604, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 605 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: (27) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 611, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 612, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 613, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 614, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO:615 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 616;

(28) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 621, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 622, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 623, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 624, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 625 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 626;

(29) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 631, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 632, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 633, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 634, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 635 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 636;

(30) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 641, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 642, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 643, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 644, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 645 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 646;

(31) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 651, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 652, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 653, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 654, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 655 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 656;

(32) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 661, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 662, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 663, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 664, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 665 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 666;

(33) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 671, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 672, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 673, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 674, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 675 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 676;

(34) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 681, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 682, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 683, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 684, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 685 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 686;

(35) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 691, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 692, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 693, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 694, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 695 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 696;

(36) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 701, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 702, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 703, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 704, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 705 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 706;

(37) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 711, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 712, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 713, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 714, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 715 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 716;

(38) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 721, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 722, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 723, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 724, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 725 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 726;

(39) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 731, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 732, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 733, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 734, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 735 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 736;

(40) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 741, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 742, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 743, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 744, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 745 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 746;

(41) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 751, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 752, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 753, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 754, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 755 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 756;

(42) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 761, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 762, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 763, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 764, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 765 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 766;

(43) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 771, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 772, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 773, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 774, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 775 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: (44) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 781, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 782, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 783, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 784, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 785 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 786;

(45) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 791, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 792, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 793, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 794, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 795 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 796;

(46) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 801, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 802, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 803, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 804, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 805 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 806;

(47) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 811, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 812, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 813, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 814, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 815 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 816;

(48) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 821, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 822, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 823, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 824, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 825 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 826;

(49) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 831, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 832, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 833, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 834, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 835 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 836;

(50) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 961, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 962, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 963, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 964, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 965 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 966;

(51) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 971, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 972, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 973, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 974, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 975 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 976;

(52) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 981, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 982, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 983, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 984, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 985 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 986; i

(53) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 991, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 992, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 993, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 994, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 995 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 996.

[0032] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na gore navedeni vezujući molekul, gde prvi vezujući domen sadrži VH region odabran iz grupe koju čine VH regioni kako su prikazani u SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 317, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 337, SEQ ID NO: 347, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 377, SEQ ID NO: 387, SEQ ID NO: 587, SEQ ID NO: 597, SEQ ID NO: 607, SEQ ID NO: 617, SEQ ID NO: 627, SEQ ID NO: 637, SEQ ID NO: 647, SEQ ID NO: 657, SEQ ID NO: 667, SEQ ID NO: 677, SEQ ID NO: 687, SEQ ID NO: 697, SEQ ID NO: 707, SEQ ID NO: 717, SEQ ID NO: 727, SEQ ID NO: 737, SEQ ID NO: 747, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 767, SEQ ID NO: 777, SEQ ID NO: 787, SEQ ID NO: 797, SEQ ID NO: 807, SEQ ID NO: 817, SEQ ID NO: 827, SEQ ID NO: 837, SEQ ID NO: 967, SEQ ID NO: 977, SEQ ID NO: 987, i SEQ ID NO: 997.

[0033] Dalje, predmetni pronalazak se takođe odnosi na vezujući molekul kako je naveden iznad, gde prvi vezujući domen sadrži VL region odabran iz grupe koju čine VL regioni kako su prikazani u SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 318, SEQ ID NO: 328, SEQ ID NO: 338, SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 358, SEQ ID NO: 368, SEQ ID NO: 378, SEQ ID NO: 388, SEQ ID NO: 588, SEQ ID NO: 598, SEQ ID NO: 608, SEQ ID NO: 618, SEQ ID NO: 628, SEQ ID NO: 638, SEQ ID NO: 648, SEQ ID NO: 658, SEQ ID NO: 668, SEQ ID NO: 678, SEQ ID NO: 688, SEQ ID NO: 698, SEQ ID NO: 708, SEQ ID NO: 718, SEQ ID NO: 728, SEQ ID NO: 738, SEQ ID NO: 748, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 768, SEQ ID NO: 778, SEQ ID NO: 788, SEQ ID NO: 798, SEQ ID NO: 808, SEQ ID NO: 818, SEQ ID NO: 828, SEQ ID NO: 838, SEQ ID NO: 968, SEQ ID NO: 978, SEQ ID NO: 988, i SEQ ID NO: 998.

[0034] Dodatno, predmetni pronalazak se takođe odnosi na gore navedeni vezujući molekul, gde prvi vezujući domen sadrži VH region i VL region odabran iz grupe koju čine:

(1) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 7, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 8;

(2) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 17, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 18;

(3) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 27, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 28;

(4) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 37, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 38;

(5) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 47, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 48;

(6) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 57, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 58;

(7) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 67, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 68;

(8) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 77, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 78;

(9) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 167, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 168;

(10) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 177, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 178;

(11) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 187, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 188;

(12) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 197, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 198;

(13) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 207, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 208;

(14) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 217, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 218;

(15) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 227, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 228;

(16) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 317, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 318;

(17) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 327, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 328;

(18) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 337, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 338;

(19) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 347, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 348;

(20) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 357, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 358;

(21) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 367, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 368;

(22) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 377, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 378;

(23) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 387, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 388;

(24) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 587, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 588;

(25) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 597, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 598;

(26) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 607, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 608;

(27) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 617, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 618;

(28) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 627, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 628;

(29) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 637, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 638;

(30) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 647, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 648;

(31) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 657, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 658;

(32) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 667, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 668;

(33) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 677, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 678;

(34) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 687, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 688;

(35) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 697, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 698;

(36) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 707, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 708;

(37) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 717, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 718;

(38) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 727, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 728;

(39) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 737, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 738;

(40) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 747, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 748;

(41) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 757, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 758;

(42) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 767, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 768;

(43) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 777, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 778;

(44) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 787, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 788;

(45) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 797, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 798;

(46) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 807, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 808;

(47) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 817, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 818;

(48) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 827, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 828;

(49) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 837, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 838;

(50) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 967, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 968;

(51) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 977, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 978;

(52) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 987, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 988; i

(53) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 997, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 998.

[0035] Dalje, predmetni pronalazak se takođe odnosi na gore navedeni vezujući molekul, koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 340 ili SEQ ID NO: 980.

[0036] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na gore navedeni vezujući molekul koji karakteriše EC50 (pg/ml) od 350 ili manje, poželjno 320 ili manje.

[0037] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na gore navedeni vezujući molekul koji karakteriše EC50 (pg/ml), što je ekvivalentno EC50 (pg/ml) bilo kog od BCMA/CD3 bispecifičnih vezujućih molekula, kao što je navedeno u SEQ ID NO:829xCD3, SEQ ID NO:619xCD3 SEQ ID NO:49xCD3, SEQ ID NO:979xCD3, SEQ ID NO:709xCD3, SEQ ID NO:339xCD3, SEQ ID NO:739xCD3 ili SEQ ID NO:199xCD3.

[0038] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na sekvencu nukleinskih kiselina koja kodira vezujući molekul kako je definisano iznad.

[0039] Dalje, predmetni pronalazak se takođe odnosi na vektor koji sadrži sekvencu nukleinskih kiselina kako je definisano iznad.

[0040] Pored toga, predmetni pronalazak se takođe odnosi na ćeliju domaćina transformisanu ili transfektovanu sekvencom nukleinske kiseline kako je definisano iznad ili vektorom kako je definisano iznad.

[0041] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na postupak za proizvodnju vezujućeg molekula kako je definisano iznad, gde navedeni postupak uključuje kultivisanje ćelije domaćini kako je ovde definisano pod uslovima koji omogućavaju eksprimiranje vezujućeg molekula kako je ovde definisano i vraćanje proizvedene vezujuće molekule iz kulture.

[0042] Pored toga, predmetni pronalazak se odnosi na farmaceutski sastav koji sadrži vezujući molekul kako je ovde definisano, ili proizveden u skladu sa gore definisanim postupkom.

[0043] Dalje, predmetni pronalazak se odnosi na vezujući molekul kao što je gore navedeno, ili proizveden u skladu sa definisanim postupkom za upotrebu u prevenciji, tretmanu ili ublažavanju bolesti izabrane iz grupe koja se sastoji od poremećaja ćelije plazme, drugih poremećaja B ćelija koji su u korelaciji sa BCMA eksprimiranjem i autoimunih bolesti.

[0044] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na komplet koji sadrži vezujući molekul kako je definisano iznad, molekul nukleinske kiseline kako je ovde definisano, vektor kako je definisano iznad, i/ili ćeliju domaćina kako je definisano iznad.

[0045] Dalje, predmetni pronalazak se odnosi na molekul za vezivanje kao što je gore navedeno, gde je navedeni drugi vezujući domen sposoban da se vezuje za ljudski CD3 i makaki CD3.

[0046] Pored toga, predmetni pronalazak se odnosi na vezujući molekul kao što je gore navedeno, gde su navedeni vezujući domeni izvedeni iz antitela, lipokalina ili antikalina.

[0047] Dalje, predmetni pronalazak se odnosi na vezujući molekul kao što je gore navedeno, gde je prvi i/ili drugi vezujući domen antitelo.

[0048] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na vezujući molekul kao što je gore navedeno, gde navedeno antitelo uključuje monoklonska, himerna, jednolančana, humanizovana i ljudska antitela.

[0049] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na vezujući molekul kao što je gore navedeno, gde navedeno antitelo uključuje Fab fragmente, F(ab')2, Fv, scFv fragmente, antitela sa jednim domenom, nano antitela, antitela, DART antitela, jednolančana dijatela, tandem antitela, mini antitela, Fc DART antitela, IgG DART antitela i multitela.

[0050] Pored toga, predmetni pronalazak se odnosi na vezujući molekul kao što je gore navedeno, gde je navedeno antitelo afinitetni zrelo antitelo.

[0051] Dalje, predmetni pronalazak se odnosi na vezujući molekul kao što je gore navedeno, gde se vezivanje na klaster epitopa 3 od BCMA testira razmenom sa odgovarajućim klasterom epitopa ne-ljudskog BCMA antigena ili skeniranjem alanina.

[0052] Klaster epitopa 3 sastoji se od vanćelijskog domena od BCMA. „BCMA vanćelijski domen“ ili „BCMA ECD“ odnosi se na oblik BCMA koji je u suštini bez transmembranskih i citoplazmatičnih domena od BCMA. Stručnjak će razumeti da je transmembranski domen identifikovan za BCMA polipeptid predmetnog pronalaska identifikovan u skladu sa kriterijumima koji se rutinski koriste u struci za identifikaciju te vrste hidrofobnog domena. Tačne granice transmembranskog domena mogu varirati, ali najverovatnije ne više od oko 5 aminokiselina na bilo kom kraju domena koji je ovde posebno naveden. Poželjni BCMA ECD je prikazan u SEQ ID NO: 1007.

[0053] CD3 je proteinski kompleks i sastoji se od četiri različita lanca. Kod sisara kompleks sadrži CD3γ lanac, CD3δ lanac i dva CD3ε (epsilon) lanca. Ovi lanci se udružuju sa molekulom poznatim kao T ćelijski receptor (TCR) i ζ lancem kako bi stvorili signal aktivacije u T limfocitima.

[0054] Preusmerena liza ciljanih ćelija preko regrutovanja T ćelija bispecifičnim molekulima uključuje stvaranje citolitičke sinapse i isporuku perforina i granzima. Uključene T ćelije su sposobne za serijsku liziju ciljane ćelije, i na njih ne utiču mehanizmi imunog izbacivanja koji interferišu sa obradom i prezentacijom peptidnih antigena, ili kolnskom diferencijacijom T ćelija; pogledati, na primer, WO 2007/042261.

[0055] Izraz „vezujući molekul“ u smislu predmetnog obelodanjenja označava bilo koji molekul koji je sposoban da se(specifično) vezuje za, interaguje sa ili prepozna ciljane molekula BCMA i CD3. Prema predmetnom pronalasku, vezujući molekuli su specifično polipeptidi. Takvi polipeptidi mogu da obuhvataju proteinske delove i ne-proteinske delove (npr. Hemijski veznici ili hemijski agensi za umrežavanje poput glutaraldehida).

Vezujući molekul, takoreći, pruža skelu za navedeni jedan ili više domena koji se vezuju tako da navedeni vezujući domeni mogu da se vezuju/interaguju sa ciljanim molekulima BCMA i CD3. Na primer, takva skela može da se pruži od strane proteina A, naročito njegovog Zdomena (afilije), ImmE7 (proteini imuniteta), BPTI/APPI (Kunitz domeni), Ras-vezujućeg proteina AF-6 (PDZ-domeni), haribdotoksina (škorpijski toksin), CTLA-4, minut-23 (knotini), lipokalina (antikalini), neokarzinostatina, domena fibronektina, ankinin konsenzus ponovljenog domena ili tioredoksina (Skerra, Curr. Opin. Biotechnol. 18, 295-304 (2005); Hosse i dr., Protein Sci.15, 14-27 (2006); Nicaise i dr., Protein Sci.13, 1882-1891 (2004) ; Nygren and Uhlen, Curr. Opin. Struc. Biol.7, 463-469 (1997)). Poželjni vezujući molekul je antitelo.

Predviđeno je da se vezujući molekul proizvede (ili da se može dobiti) postupcima prikaza faga ili skrininga biblioteka, pre nego graftovanjem CDR sekvence iz prethodno postojećeg (monoklonskog) antitela u skele, na primer, skele kao što je ovde obelodanjeno.

[0056] Izraz „bispecifičan“, kako se ovde koristi, odnosi se na vezujući molekul koji sadrži najmanje prvi i drugi vezujući domen, gde je prvi vezujući domen sposoban da se vezuje za jedan antigen ili cilj, i drugi vezujući domen je sposoban da se vezuje za drugi antigen ili cilj. „Vezujući molekul“ predmetnog pronalaska takođe sadrže multispecifične vezujuće molekule, npr. trispecifične vezujućih molekula, i kasniji uključuju tri vezujuća domena.

[0057] Takođe je predviđeno da vezujući molekul predmetnog pronalaska ima, pored svoje funkcije da se vezuje za ciljane molekule BCMA i CD3, dalju funkciju. U ovom obliku, vezujući molekul je tri ili višenamenski vezujući molekul ciljanjem plazma ćelija vezanjem na BCMA, posredujući citotoksičnu T ćelijsku aktivnost putem vezivanja CD3 i pružajući dalju funkciju, kao što je potpuno funkconalna Fc konstantnim domenom posredovana ćeliska citotoksičnost zavisna od antitela, kroz regrutovanje efektorskih ćelija poput NK ćelija, oznake (fluorescentna itd.), terapeutskog agensa poput npr. toksina ili radionuklida i/ili agensa za povećanje polu-života u serumu itd.

[0058] Izraz „vezujući domen“ karakteriše, u vezi sa predstavljenim pronalaskom, domen koji je sposoban specifično da se vezuje za interakciju sa datim ciljanim epitopom ili određenim ciljanim mestom na ciljanim molekulima BCMA i CD3.

Vezujući domeni mogu se izvesti od donora vezujućeg domena, kao što su, na primer, antitelo, protein A, ImmE7 (proteini imuniteta), BPTI/APPI (Kunitz domeni), Ras-vezujući protein AF-6 (PDZ-domeni), haribdotoksin (škorpijski toksin), CTLA-4, minut-23 (knottini), lipokalini (antikalini), neokarzinostatin, domen fibronektina, ankinin konsenzus ponovljeni domen ili tioredoksin (Skerra, Curr. Opin. Biotechnol.18, 295-304 (2005); Hosse i dr., Protein Sci.15, 14-27 (2006); Nicaise i dr., Protein Sci.13, 1882-1891 (2004) ; Nygren and Uhlen, Curr. Opin. Struc. Biol.7, 463-469 (1997)). Poželjni vezujući domen je izveden iz antitela. Predviđeno je da vezujući domen predloženog pronalaska sadrži barem navedeni deo bilo kog od gore navedenih vezujućih domena koji je potreban za vezivanje/interakciju sa datim ciljanim epitopom ili određenim ciljanim mestom na ciljanim molekulima BCMA i CD3.

[0059] Predviđeno je da je vezujući domen gore navedenih donora vezujućeg domena karakterisan onim delom ovih donora koji je odgovoran za vezivanje odgovarajućeg cilja, tj. kada se taj deo ukloni od donora vezujućeg domena, navedeni donor gubi sposobnost vezivanja. „Gubitak“ znači smanjenje za najmanje 50% sposobnosti vezivanja u poređenju sa vezujućim donorom. Postupci za mapiranje ovih mesta vezivanja su dobro poznati u struci -stoga je u okviru uobičajenog znanja stručnjaka da locira/preslika mesto vezivanja donora vezujućeg domena i na taj način „izvuče“ navedeni vezujući domen iz odgovarajućeg donora vezujućeg domena.

[0060] Izraz „epitop“ odnosi se na mesto na antigenu na koje se specifično vezuje vezujući domen, kao što je antitelo ili imunoglobulin ili derivat ili fragment antitela ili imunoglobulina. „Epitop“ je antigenski i zato se izraz epitop ponekad takođe naziva „antigena struktura“ ili „antigena determinanta“. Dakle, vezujući domen je „mesto interakcije antigena“. Takođe se podrazumeva da navedeno vezivanje/interakcija definiše „specifično prepoznavanje“. U jednom primeru, navedeni vezujući domen koji se (specifično) vezuje za/interakciju sa datim ciljanim epitopom ili određenim ciljanim mestom na ciljanim molekulima BCMA i CD3 je antitelo ili imunoglobulin, i navedeni vezujući domen je VH i/ili VL region antitela ili imunoglobulina.

„Epitopi“ mogu da se formiraju bilo neprekidnim aminokiselinama ili ne-neprekidnim aminokiselinama koje su postavljene jedne uz druge tercijarnim savijanjem proteina.

„Linearni epitop“ je epitop gde primarna sekvenca aminokiseline sadrži prepoznati epitop. Linearni epitop tipično uključuje najmanje 3 ili najmanje 4, i obično, najmanje 5 ili najmanje 6 ili najmanje 7, na primer, oko 8 do oko 10 aminokiselina u jedinstvenoj sekvenci.

„Konformacioni epitop“, za razliku od linearnog epitopa, je epitop gde primarna sekvenca aminokiselina koja sadrži epitop nije jedina određujuća komponenta prepoznatog epitopa (npr. epitop gde je primarna sekvenca aminokiselina nije nužno prepoznat od strane vezujućeg domena). Tipično konformacioni epitop sadrži povećan broj aminokiselina u odnosu na linearni epitop. Što se tiče prepoznavanja konformacionih epitopa, vezujući domen prepoznaje trodimenzionalnu strukturu antigena, poželjno peptida ili proteina ili njegovog fragmenta (u kontekstu predmetnog pronalaska, antigen za jedan od vezujućih domena se nalazi u okviru BCMA proteina). Na primer, kada se molekul proteina savije da formira trodimenzionalnu strukturu, određene aminokiseline i/ili kičma polipeptida koji formiraju konformacioni epitop postaju međusobno suprotstavljeni što omogućava antitelu da prepozna epitop. Postupci za određivanje konformacije epitopa uključuju, ali nisu ograničeni na, rendgensku kristalografiju, dvodimenzionalnu nuklearno magnetnu rezonancu (2D-NMR) spektroskopiju i lokalno usmereno spinovanje i spektroskopiju elektronske paramagnetnu rezonancu (EPR). Štaviše, navedeni primeri opisuju dalji postupak za testiranje da li se neki vezujući domen vezuje za jedan ili više klastera epitopa određenog proteina, naročito BCMA.

[0061] U jednom aspektu, prvi vezujući domen predmetnog pronalaska sposoban je da se vezuje za klaster epitopa 3 ljudskog BCMA, poželjno ECD BCMA ECD. Shodno tome, kada se odgovarajući klaster epitopa u ljudskom BCMA proteinu razmenjuje sa odgovarajućim klasterom epitopa mišjeg BCMA antigena (što rezultuje konstruktom koji sadrži ljudski BCMA, gde je ljudski klaster epitopa 3 zamenjen mišjim klasterom epitopa 3; pogledati SEQ ID NO: 1011) doći će do smanjenja vezivanja vezujuća domena. Navedeno smanjenje je poželjno najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%; poželjnije najmanje 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ili čak 100% u poređenju sa odgovarajućim klasterom epitopa u ljudskom BCMA proteinu, gde se vezivanje na odgovarajući klaster epitopa u ljudskom BCMA proteinu postavlja na 100%. Predviđeno je da se navedene ljudski BCMA/mišji BCMA himere eksprimiraju u CHO ćelijama. Takođe je predviđeno da su ljudski BCMA/mišji BCMA himere spojeni sa transmembranskim domenom i/ili citoplazmatičnim domenom različitog proteina vezanog za membranu, kao što je EpCAM; pogledati Sliku 2a.

Postupak za testiranje ovog gubitka vezivanja usled razmene sa odgovarajućim klasterom epitopa ne-ljudskog (npr. mišjeg) BCMA antigena opisan je u priloženim primerima, naročito u Primerima 1-3. Dalji postupak za određivanje doprinosa određenog ostatka ciljanog antigena prepoznavanju datog vezujućeg molekula ili vezujućeg domena je alaninsko skeniranje (pogledati npr. Morrison KL & Weiss GA. Cur Opin Chem Biol. 2001 Jun;5(3):302-7), gde je svaki ostatak koji se analizira zamenjen alaninom, npr. putem mutageneze usmerene na mesto. Alanin se koristi zbog svoje neprobojne, hemijski inertne, metil funkcionalne grupe koja uprkos tome oponaša reference sekundarne strukture koje poseduju mnoge druge aminokiseline. Ponekad se glomazne aminokiseline poput valina ili leucina mogu koristiti u slučajevima kada se želi sačuvati veličina mutiranih ostataka.

Alaninsko skeniranje je zrela tehnologija koja se koristi duži vremenski period.

Kako se ovde koristi, izraz „klaster epitopa“ označava celokupnost epitopa koji leže u definisanom neprekidnom delu antigena. Klaster epitopa može da sadrži jedan, dva ili više epitopa. Klasteri epitopa koji su definisani - u kontekstu predmetnog pronalaska - u vanćelijskom domenu BCMA, su opisani iznad i prikazani na Slici 1.

[0062] Izrazi „(sposobni) da se vezuju za“, „specifično prepoznaju“, „usmereni na“ i „reaguju sa“ znače, u skladu sa predmetnim pronalaskom, da vezujući domen može specifično da deluje u interakciji sa jednim ili više, poželjno najmanje dva, poželjnije najmanje tri i najpoželjnije najmanje četiri aminokiseline epitopa.

[0063] Kako se ovde koristio, izrazi „specifično u interakciji“, „specifično vezivanje“ ili „specifično vezuje“ znače da vezujući domen pokazuje značajan afinitet za određeni protein ili antigen i, generalno, ne pokazuje značajnu reaktivnost sa proteinima ili antigenima osim BCMA ili CD3. „Uočljiv afinitet“ uključuje vezivanje sa afinitetom od oko 10<-6>M (KD) ili višim. Poželjno, vezivanje se smatra specifičnim kada je afinitet vezivanja oko 10<-12>do 10<-8>M, 10<-12>do 10<-9>M, 10<-12>do 10<-10>M, 10<-11>do 10<-8>M, poželjno oko 10<-11>do 10<-9>M. Da li vezujući domen posebno reaguje ili se vezuje za cilj može se lako ispitati, inter alia, upoređivanjem reakcije navedenog vezujućeg domena sa ciljanim proteinom ili antigenom sa reakcijom navedenog vezujućeg domena sa proteinima ili antigenima koji nisu BCMA ili CD3. Poželjno, vezujući domen predmetnog pronalaska se u suštini ne vezuje ili nije sposoban da se vezuje za proteine ili antigene koji nisu BCMA ili CD3 (tj. prvi vezujući domen nije sposoban da se vezuje za proteine koji nisu BCMA, i drugi vezujući domen nije sposoban da se vezuje za proteine koji nisu CD3).

Izraz „u suštini ne vezuje“ ili „nije sposoban za vezivanje“ znači da vezujući domen predmetnog pronalaska ne vezuje drugi protein ili antigen koji nije BCMA ili CD3, tj. ne pokazuje reaktivnost veću od 30%, poželjno ne veću od 20%, poželjnije ne veću od 10%, posebno poželjno ne veću od 9%, 8%, 7%, 6% ili 5% sa proteinima ili antigenima, osim BCMA ili CD3, gde se vezivanje za BCMA ili CD3, respektivno, postavlja se na 100%. Smatra se da se specifično vezivanje vrši pomoću specifičnih motiva u aminokiselinskoj sekvenci vezujućeg domena i antigena. Stoga se vezivanje postiže kao rezultat njihove primarne, sekundarne i/ili tercijarne strukture kao i posledica sekundarnih modifikacija navedenih struktura. Specifična interakcija mesta interakcije antigena sa njegovim specifičnim antigenom može rezultovati jednostavnim vezivanjem navedenog mesta na antigen. Štaviše, specifična interakcija mesta interakcije antigena sa svojim specifičnim antigenom može alternativno ili dodatno rezultovati pokretanjem signala, npr. usled indukcije promene konformacije antigena, oligomerizacije antigena itd.

[0064] U jednom aspektu, prvi vezujući domen predmetnog pronalaska se vezuje za klaster epitopa 3 ljudskog BCMA i dalje je sposoban da se vezuje za klaster epitopa 3 makaki BCMA, kao što je BCMA od Macaca mulatta (SEQ ID NO: 1017) ili Macaca fascicularis (SEQ ID NO: 1017). Predviđeno je da se prvi vezujući domen vezuje ili ne vezuje za mišji BCMA.

[0065] Shodno tome, u jednom otelotvorenju, vezujući domen koji se vezuje za ljudski BCMA, posebno za klaster epitopa 3 vanćelijskog proteinskog domena od BCMA formiran aminokiselinskim ostacima 24 do 41 ljudske sekvence, kako je prikazano u SEQ ID NO: 1002, takođe se vezuje na makaki BCMA, posebno na klaster epitopa 3 vanćelijskog proteinskog domena od BCMA formiranog aminokiselinskim ostacima 24 do 41 od makaki BCMA sekvence, kako je prikazano u SEQ ID NO: 1006.

[0066] U jednom otelotvorenju, prvi vezujući domen vezujućeg molekula sposoban je da se vezuje za klaster epitopa 3 od BCMA, gde klaster epitopa 3 od BCMA odgovara aminokiselinskim ostacima 24 do 41 u sekvenci kao što je prikazano u SEQ ID NO: 1002 (ljudski BCMA celog dužine polipeptida) ili SEQ ID NO: 1007 (ljudski BCMA vanćelijski domen: aminokiseline 1-54 od SEQ ID NO: 1002).

[0067] U jednom aspektu predmetnog pronalaska, prvi vezujući domen vezujućeg molekula je dodatno ili alternativno sposoban da se vezuje na klaster epitopa 3 od Callithrix jacchus, Saguinus oedipus i/ili Saimiri sciureus BCMA.

[0068] Proteini (uključujući njihove fragmente, poželjno biološki aktivni fragmenti, i peptidi, koji obično imaju manje od 30 aminokiselina) sadrže jednu ili više aminokiselina povezanih međusobno preko kovalentne peptidne veze (što rezultuje lancem aminokiselina). Izraz „polipeptid“, kako se ovde koristi, opisuje grupu molekula, koja se sastoje od više od 30 aminokiselina. Polipeptidi mogu dalje formirati multimere poput dimera, trimera i viših oligomera, tj. koji se sastoje od više polipeptidnih molekula. Polipeptidni molekuli koji formiraju takve dimere, trimere itd. mogu biti identični ili neidentični. Odgovarajuće strukture višeg reda takvih multimera su, prema tome, nazvane homo- ili heterodimeri, homo- ili heterotrimeri itd. Primer za hereteromultimer je molekul antitela, koji se u svom prirodnom obliku sastoji od dva identična polipeptidna laka lanca i dva identična polipeptidna teška lanca. izrazi „polipeptid“ i „protein“ se takođe odnose na prirodno modifikovane polipeptide/proteine gde je modifikacija izvedena, npr. post-translacijskim modifikacijama poput glikozilacije, acetilacije, fosforilacije i slično. „Polipeptid“, kako se ovde navodi, takođe može biti hemijski modifikovan, poput pegiliranog. Takve modifikacije su dobro poznate u struci.

U narednom aspektu predmetnog pronalaska, drugi vezujući domen može se vezivati za CD3 epsilon. U još jednom aspektu predmetnog pronalaska, drugi vezujući domen može se vezivati za ljudski CD3 i makaki CD3, poželjno za ljudski CD3 epsilon i makaki CD3 epsilon. Dodatno ili alternativno, drugi vezujući domen je sposoban da se vezuje Callithrix jacchus, Saguinus oedipus i/ili Saimiri sciureus CD3 epsilon. Prema ovim otelotvorenjima, jedan ili oba vezujuća domena vezujućeg molekula predmetnog pronalaska su poželjno specifično unakrsni među vrstama za članove sisarskog reda primata. Na primer, CD3 domeni vezivanja specifično unakrsni među vrstama su, na primer, opisani u WO 2008/119567.

[0069] Za vezujući molekul predmetnog pronalaska je naročito poželjno da drugi vezujući domen koji se može vezati za CD3 sadrži VL region koji sadrži CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 odabran od:

(a) CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 27 u WO 2008/119567, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 28 u WO 2008/119567 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 29 u WO 2008/119567;

(b) CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 117 u WO 2008/119567, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 118 u WO 2008/119567 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 119 u WO 2008/119567; i

(c) CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 153 u WO 2008/119567, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 154 u WO 2008/119567 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 155 u WO 2008/119567.

U alternativno poželjnom otelotvorenja vezujućeg molekula predmetnog pronalaska, drugi vezujući domen koji se može vezati za CD3 sadrži VH region koji sadrži CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 odabran od:

(a) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 12 u WO 2008/119567, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 13 u WO 2008/119567 i CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 14 u WO 2008/119567;

(b) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 30 u WO 2008/119567, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 31 u WO 2008/119567 i CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 32 u WO 2008/119567;

(c) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 48 u WO 2008/119567, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 49 u WO 2008/119567 i CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 50 u WO 2008/119567;

(d) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 66 u WO 2008/119567, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 67 u WO 2008/119567 i CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 68 u WO 2008/119567;

(e) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 84 u WO 2008/119567, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 85 u WO 2008/119567 i CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 86 u WO 2008/119567;

(f) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 102 u WO 2008/119567, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 103 u WO 2008/119567 i CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 104 u WO 2008/119567;

(g) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 120 u WO 2008/119567, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 121 u WO 2008/119567 i CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 122 u WO 2008/119567;

(h) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 138 u WO 2008/119567, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 139 u WO 2008/119567 i CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 140 u WO 2008/119567;

(i) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 156 u WO 2008/119567, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 157 u WO 2008/119567 i CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 158 u WO 2008/119567; i

(j) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 174 u WO 2008/119567, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 175 u WO 2008/119567 i CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 176 u WO 2008/119567.

[0070] Dalje je za vezujući molekul predmetnog pronalaska poželjno da drugi vezujući domen koji se može vezati za CD3 sadrži VL region izabran iz grupe koja se sastoji od VL regiona kako je prikazano u SEQ ID NO: 35, 39, 125, 129, 161 ili 165 u WO 2008/119567.

[0071] Alternativno je poželjno da drugi vezujući domen koji se može vezati za CD3 sadrži VH region izabran iz grupe koja se sastoji od VH regiona kako je prikazano u SEQ ID NO: 15, 19, 33, 37, 51, 55, 69, 73, 87, 91, 105, 109, 123, 127, 141, 145, 159, 163, 177 ili 181 WO 2008/119567.

[0072] Poželjnije, molekul za vezivanje predmetnog pronalaska karakteriše drugi vezujući domen koji se može vezati za CD3 koji sadrži VL region i VH region izabran iz grupe koju čine:

(a) VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 17 ili 21 u WO 2008/119567 i VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 15 ili 19 u WO 2008/119567;

(b) VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 35 ili 39 u WO 2008/119567 i VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 33 ili 37 u WO 2008/119567;

(c) VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 53 ili 57 u WO 2008/119567 i VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 51 ili 55 u WO 2008/119567;

(d) VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 71 ili 75 u WO 2008/119567 i VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 69 ili 73 u WO 2008/119567;

(e) VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 89 ili 93 u WO 2008/119567 i VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 87 ili 91 u WO 2008/119567;

(f) VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 107 ili 111 u WO 2008/119567 i VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 105 ili 109 u WO 2008/119567;

(g) VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 125 ili 129 u WO 2008/119567 i VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 123 ili 127 u WO 2008/119567;

(h) VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 143 ili 147 u WO 2008/119567 i VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 141 ili 145 u WO 2008/119567;

(i) VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 161 ili 165 u WO 2008/119567 i VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 159 ili 163 u WO 2008/119567; i

(j) VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 179 ili 183 u WO 2008/119567 i VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 177 ili 181 u WO 2008/119567.

[0073] Prema poželjnom otelotvorenju vezivajućeg molekula predmetnog pronalaska, posebno drugog vezujućeg domena koji se može vezati za CD3, parovi VH-regiona i VL-regiona su u obliku jednolančana antitela (scFv). VH i VL regioni su raspoređeni redom VH-VL ili VL-VH. Poželjno je da VH-region bude postavljen N-terminalno prema veznik sekvenci . VL-region je postavljen C-terminalno prema veznik sekvenci.

[0074] Poželjno otelotvorenje gore opisanog vezujućeg molekula predmetnog pronalaska karakteriše drugi vezujući domen koji se može vezati za CD3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja sadrži SEQ ID NO: 23, 25, 41, 43, 59, 61, 77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 ili 187 WO 2008/119567.

[0075] Afinitet prvog vezujućeg domena za ljudski BCMA poželjno je ≤15 nM, poželjnije ≤10 nM, još poželjnije ≤5 nM, još poželjnije ≤1 nM, još poželjnije <0,5 nM, još poželjnije <0,1 nM, i najpoželjnije je 0,05 nM. Afinitet prvog vezujućeg domena za makaki BCMA poželjno je ≤15 nM, još poželjnije <10 nM, još poželjnije ≤5 nM, još poželjnije ≤1 nM, još poželjnije ≤0 nm, još poželjnije ≤0 nm, i najpoželjnije ≤ 0,05 nM ili čak ≤ 0,01 nM. Afinitet se može meriti na primer u Biacore testu ili u Scatchard testu, npr. kao što je opisano u Primerima. Jačina afiniteta za vezivanje za makaki BCMA nasuprot ljudskom BCMA poželjno je [1:10-1:5] ili [5:1-10:1], poželjnije [1:5-5:1], i najpoželjnije [1:2-3:1] ili čak [1:1-3:1]. Ostali postupci za određivanje afiniteta su dobro poznate stručnjaku.

[0076] Citotoksičnost posredovana BCMA/CD3 bispecifičnim vezujućim molekulima može se meriti na različite načine. Efektorske ćelije mogu biti npr. stimulisane obogaćene (ljudske) CD8 pozitivne T ćelije ili nestimulisane (ljudske) mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC). Ako su ciljane ćelije makaki porekla ili su eksprimirane ili transfektovane od strane makaki BCMA, efektorske ćelije takođe treba da budu makaki porekla, kao što je makaki T ćelijska linija, npr.4119LnPx. Ciljane ćelije treba da eksprimiraju (barem vanćelijski domen) BCMA, npr. Ljudskog ili makaki BCMA. Ciljane ćelije mogu biti ćelijska linija (kao što je CHO) koja je stabilno ili prolazno transfektovana sa BCMA, npr. Ljudskim ili makaki BCMA. Alternativno, ciljane ćelije mogu biti BCMA pozitivne prirodne eksprimirajuće ćelijske linije, kao što je ćelijska linija sa multiplim mijelomom L363 ili NCI-H929. Obično se očekuje da vrednosti EC50 budu niže sa ciljanim ćelijskim linijama koje eksprimiraju više nivoe BCMA na ćelijskoj površini. Odnos efektorske-ciljane ćelije (E:T) je obično oko 10:1, ali takođe može varirati. Citotoksična aktivnost BCMA/CD3 bispecifičnih vezivnih molekula može se meriti u testu oslobađanja 51-hroma (vreme inkubacije oko 18 sati) ili u FACS testu citotoksičnosti (vreme inkubacije oko 48 sati). Takođe su moguće modifikacije vremena inkubacije ispitivanja (citotoksična reakcija). Ostali postupci merenja citotoksičnosti su dobro poznati stručnjaku i sadrže MTT ili MTS testove, ATP-bazirane testove uključujući bioluminescentne testove, sulforhodamin B (SRB) test, WST test, klonogeni test i ECIS tehnologiju.

[0077] Citotoksična aktivnost posredovana BCMA/CD3 bispecifičnim vezujućim molekulima predmetnog pronalaska je poželjno merena u ispitivanju citotoksičnosti zasnovane na ćeliji. Predstavljena je sa EC50vrednosti, koja odgovara polovini maksimalne efektivne koncentracije (koncentracija vezujućeg molekula koja indukuje citotoksični odgovor na pola puta između osnovice i maksimuma). Poželjno, EC50vrednost BCMA/CD3 bispecifičnih molekula za vezivanje je ≤20.000 pg/ml, još poželjnije ≤ 5000 pg/ml, još poželjnije ≤ 1000 pg/ml, još poželjnije ≤500 pg/ml, još poželjnije ≤350 pg/ml, još poželjnije ≤320 pg/ml, još poželjnije ≤250 pg/ml, još poželjnije ≤100 pg/ml, još poželjnije ≤50 pg/ml, još poželjnije ≤10 pg/ml, i najpoželjnije ≤ 5 pg/ml

[0078] Bilo koje od gore datih EC50vrednosti se mogu kombinovati sa bilo kojim od naznačenih scenarija ispitivanja citotoksičnosti zasnovanom na ćeliji. Na primer, kada se (ljudske) CD8 pozitivne T ćelije ili makaki T ćelijska linija koriste kao efektorske ćelije, EC50vrednost BCMA/CD3 bispecifičnog vezujućeg molekula je poželjno ≤1000 pg/ml, poželjnije ≤500 pg/ml, još poželjnije ≤250 pg/ml, još poželjnije ≤100 pg/ml, još poželjnije ≤50 pg/ml ml, još poželjnije ≤10 pg/ml, i najpoželjnije ≤5 pg/ml. Ako su u ovom testu ciljane ćelije (ljudske ili makaki) BCMA transfektovane ćelije, kao što su CHO ćelije, EC50vrednost BCMA/CD3 bispecifičnog molekula za vezivanje je poželjno ≤150 pg/ml, još poželjnije ≤100 pg/ml, još poželjnije ≤50 pg/ml, još poželjnije ≤30 pg/ml, još poželjnije ≤10 pg/ml ml, i najpoželjnije ≤5 pg/ml.

Ako su ciljane ćelije BCMA pozitivna prirodna ekspresiona ćelijska linija, tada je EC50vrednost je poželjno ≤350 pg/ml, poželjnije ≤320 pg/ml, još poželjnije ≤250 pg/ml, još poželjnije ≤200 pg/ml, još poželjnije ≤100 pg/ml, još poželjnije ≤150 pg/ml, još poželjnije ≤100 pg/ml, i najpoželjnije ≤50 pg/ml, ili niže.

Kada se (ljudski) PBMC koriste kao efektorske ćelije, EC50vrednost BCMA/CD3 bispecifičnog vezujućeg molekula je poželjno ≤1000 pg/ml, poželjnije ≤750 pg/ml, poželjnije ≤500 pg/ml, još poželjnije ≤350 pg/ml, još poželjnije ≤320 pg/ml, još poželjnije ≤250 pg/ml, još poželjnije ≤100 pg/ml, i najpoželjnije ≤50 pg/ml, ili niže.

U posebno poželjnom otelotvorenju, BCMA/CD3 bispecifičnh vezujućih molekula predmetnog pronalaska karakteriše EC50od ≤350 pg/ml ili manje, poželjnije ≤320 pg/ml ili manje. U tom otelotvorenju ciljane ćelije su L363 ćelije, i efektorske ćelije su nestimulisane ljudske PBMC. Stručnjak zna kako da izmeri vrednost EC50bez dodatnog istraživanja.

Štaviše, specifikacija navodi specifična uputstva kako izmeriti vrednost EC50; pogledati, na primer, Primer 8.3 u nastavku. Pogodan protokol je sledeći:

a) Pripremiti mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) centrifugiranjem Ficoll gradijentom gustine iz obogaćenih preparata limfocita

b) Opciono oprati sa Dulbecco-ovim PBS (Gibco)

c) Ukloniti preostale eritrocite iz PBMC putem inkubacije sa puferom za liziranje eritrocita (155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 100 µM EDTA)

c) Ukloniti trombocite preko supernatanta nakon centrifugiranja PBMC pri 100 x g d) Potrošiti CD14+ ćelije i NK ćelije

e) Izolovati CD14/CD56 negativne ćelije koristeći npr. LS Columns (Miltenyi Biotec, #130-042-401)

f) Kultivisati PBMC bez CD14+/CD56+ ćelija, npr. u RPMI kompletnom medijumu, tj. RPMI1640 (Biochrom AG, #FG1215) sa dodatkom 10% FBS (Biochrom AG, #S0115), 1x neesencijalne aminokiseline (Biochrom AG, #K0293), 10 mM Hepes pufer (Biochrom AG, #L1613), 1 mM natrijum-piruvata (Biochrom AG, #L0473) i 100 U/mL penicilina/streptomicina (Biochrom AG, #A2213) na 37°C u inkubatoru koliko je potrebno. g) Označi ciljane ćelije

h) Mešati efektorske i ciljane ćelije, po mogućstvu u jednakim zapreminama, tako da ima odnos E:T od 10:1

i) Dodati vezujući molekul, po mogućstvu u serijskom razblaženju

j) Nastaviti tokom 48 sati u 7% CO2vlažnom inkubatoru

k) Nadgledati integritet ciljane ćelijske membrane, npr. dodavanjem propidijum-jodida (PI) u konačnoj koncentraciji od 1 µg/mL, na primer, protočnom citometrijom

l) Izračunati EC50, npr., prema sledećoj formuli:

nmrtve ciljanećelije

Citotoksičnost [% ]= ×100

nciljanećelije

n = broj događaja

[0079] Koristeći softver GraphPad Prism 5 (Graph Pad Software, San Diego), procenat citotoksičnosti je napravljen prema odgovarajućim koncentracijama bispecifičnih antitela. Krive doziranja mogu se analizirati pomoću četiri parametrična modela logističke regresije za procenu sigmoidnih krivih odgovora na doziranje sa fiksnim nagibom brda, i izračunate su EC50 vrednosti.

[0080] S obzirom na gore navedeno, poželjno je da vezujući molekul predmetnog pronalaska karakteriše EC50 (pg/ml) od 350 ili manje, poželjno 320 ili manje.

[0081] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na molekule koji su ovde opisani i koje karakteriše EC50 (pg/ml) koji je ekvivalentan EC50 (pg/ml) bilo kog od BCMA/CD3 bispecifičnih vezujućih molekula BCMA-83 x CD3, BCMA-62 x CD3, BCMA-5 x CD3, BCMA-98 x CD3, BCMA-71 x CD3, BCMA-34 x CD3, BCMA-74 x CD3, BCMA-20 x CD3. kako bi se utvrdilo da li je EC50 vezujućeg molekula, kako je opisano ovde, ekvivalentan sa EC50 bilo kog od BCMA-83 x CD3, BCMA-62 x CD3, BCMA-5 x CD3, BCMA-98 x CD3, BCMA-71 x CD3, BCMA-34 x CD3, BCMA-74 x CD3, BCMA-20 x CD3, predviđeno je da se za određivanje vrednosti EC50 koristi isti test. Izraz „ekvivalentan“ obuhvata odstupanje od /- 10%, poželjno /- 7.5%, poželjnije /- 5%, još poželjnije /- 2.5% odgovarajuće EC50 vrednosti.

BCMA/CD3 bispecifični vezujući molekuli BCMA-83 x CD3, BCMA-62 x CD3, BCMA-5 x CD3, BCMA-98 x CD3, BCMA-71 x CD3, BCMA-34 x CD3, BCMA-74 x CD3, BCMA-20 x CD3 koji služe kao „referentni“ vezujući molekuli u gore opisanom ispitivanju su poželjno proizvedeni u CHO ćelijama.

[0082] Razlika u citotoksičnoj aktivnosti između monomernog i dimernog izoforma pojedinih BCMA/CD3 bispecifičnih vezujućih molekula (poput antitela) naziva se „jaz potencija“. Taj jaz potencija može da se izračuna npr. kao odnos između EC50vrednosti monomernog i dimernog oblika molekula. Jazovi potencijala BCMA/CD3 bispecifičnih vezujućih molekula predmetnog pronalaska su poželjno ≤5, poželjnije ≤4, još poželjnije ≤3, još poželjnije ≤2, i najpoželjnije ≤1.

[0083] Poželjno, BCMA/CD3 bispecifični vezujući molekuli predmetnog pronalaska se ne vezuju, interaguju sa, prepoznaju ili unakrsno reaguju sa ljudskim BAFF-R i/ili ljudskim TACI. Postupci za detektovanje unakrsne reaktivnosti sa ljudskim BAFF-R i/ili ljudskim TACI su opisani u Primeru 9.

[0084] Takođe je poželjno da se BCMA/CD3 bispecifični vezujući molekuli predmetnog pronalaska nalaze sa vrlo niskom konverzijom dimera nakon niza ciklusa zamrzavanja/odmrzavanja. Poželjno, procenti dimera su ≤5%, poželjnije ≤4%, još poželjnije ≤3%, još poželjnije ≤2,5%, još poželjnije ≤2%, još poželjnije ≤1%, i najpoželjnije ≤1%, na primer nakon tri ciklusa zamrzavanja/odmrzavanja. Ciklus zamrzavanja-odmrzavanja i određivanje procenta dimera može se obaviti u skladu sa Primerom 16.

[0085] BCMA/CD3 bispecifični vezujući molekuli (kao što su antitela) predmetnog pronalaska poželjno pokazuju povoljnu termostabilnost sa temperaturama topljenja iznad 60°C.

[0086] Kako bi se odredila potencijalna interakcija BCMA/CD3 bispecifičnih molekula koji se vezuju (kao što su antitela) sa ljudskim proteinima plazme, može se obaviti test interferencije u plazmi (pogledati npr. Primer 18). U poželjnom otelotvorenju, ne postoji značajno smanjenje ciljanog vezivanja BCMA/CD3 bispecifičnih molekula koji se vezuju posredovani proteinima plazme. Relativna vrednost interferencije u plazmi je poželjno ≤2.

[0087] Dalje je predviđeno da BCMA/CD3 bispecifični vezujući molekuli predmetnog pronalaska mogu da pokazuju terapijsku efikasnost ili anti-tumorsku aktivnost. To se može proceniti npr. u studiji kao što je otkriveno u Primeru 19 (model ksenografta ljudskog tumora u naprednom stadijumu). Stručnjak zna kako da modifikuje ili prilagodi određene parametre ove studije, kao što su broj ubrizganih ćelija tumora, mesto ubrizgavanja, broj presađenih ljudskih T ćelija, količina BCMA/CD3 bispecifičnih vezujućih molekula, i vremenski okviri, tako da svaki put postigne smislen i ponovljiv rezultat. Poželjno, inhibicija rasta tumora T/C [%] je 70 ili 60 ili niža, poželjnije 50 ili 40 ili niža, još poželjnije najmanje 30 ili 20 ili niža i najpoželjnije 10 ili niža, 5 ili niža ili čak 2,5 ili niža.

[0088] Poželjno, BCMA/CD3 bispecifični vezujući molekuli predmetnog pronalaska ne indukuju/posreduju lizu ili u suštini ne indukuju/posreduju lizu BCMA negativnih ćelija kao što su HL60, MES-SA i SNU-16. Izraz „ne indukuje lizu“, „u suštini ne indukuje lizu“, „ne posreduju lizu“ ili „u suštini ne posreduje lizu“ znače da vezujući molekul iz predmetnog pronalaska ne indukuje ili ne posreduje lizu više od 30 %, poželjno ne više od 20%, poželjnije ne više od 10%, naročito poželjno ne više od 9%, 8%, 7%, 6% ili 5% BCMA negativnih ćelija, gde je liza BCMA pozitivne ćelijske linije, kao što su NCI-H929, L-363 ili OPM-2, postavljena na 100%. Ovo se odnosi na koncentracije vezujućeg molekula od barem do 500 nM. Stručnjak zna kako da izmeri lizu ćelija bez dodatnih koraka. Štaviše, specifikacija podučava određeno uputstvo kako da izmeri lizu ćelije; pogledati npr. Primer 20 u nastavku.

[0089] U jednom otelotvorenju, prvi ili drugi vezujući domen je antitelo ili je izveden iz antitela. U drugom otelotvorenju, oba vezujuća domena su ili su izvedena iz antitela.

[0090] Definicija izraza „antitelo“ uključuje otelotvorenja kao što su monoklonska, himerna, jednolančana, humanizovana i ljudska antitela. Pored antitela pune dužine, definicija takođe uključuje derivate antitela i fragmente antitela, kao što su inter alia, Fab fragmenti. Fragmenti ili derivati antitela dalje sadrže F(ab')2, Fv, scFv fragmente ili antitela sa jednim domenom, kao što su domenska antitela ili nanotela, antitela sa jednim varijabilnim domenom ili imunoglobulini sa jednim varijabilnim domenom koji sadrže samo jedan varijabilni domen, koji može biti VHH, VH ili VL, i koji specifično vezuju antigen ili epitop nezavisno od drugih V regiona ili domena; pogledati, na primer, Harlow i Lane (1988) i (1999), loc. cit.; Kontermann i Dübel, Antibody Engineering, Springer, 2nd ed.2010 i Little, Recombinant Antibodies for Immunotherapy, Cambridge University Press 2009. Navedeni izraz takođe uključuje dijatela ili Dual-Affinity Re-Targeting (DART) antitela. Dalje se predviđaju (bispecifična) jednolančana dijatela, tandemska dijatela (Tandab-ova), „minitela“, koja su prikazana strukturom koja je sledeća: (VH-VL-CH3)2, (scFv-CH3)2or (scFv-CH3-scFv)2, „Fc DART“ antitela i „IgG DART“ antitela, i multitela kao što su trijatela. Pojedinačni varijabilni domeni imunoglobulina obuhvataju ne samo izolovani polipeptid antitela sa jednim varijabilnim domenom, već i veće polipeptide koji sadrže jedan ili više monomera antitela sa jednim varijabilnim domenom polipeptidne sekvence.

[0091] U oblasti su poznati razni postupci i mogu se koristiti za proizvodnju takvih antitela i/ili fragmenata. Stoga se derivati (antitela) mogu proizvesti peptidomimeticima. Dalje, opisane tehnike za proizvodnju jednolančanih antitela (pogledati, inter alia, US Patent 4,946,778, Kontermann and Dübel (2010), loc. cit. i Little (2009), loc. cit.) mogu se prilagoditi tako da proizvode jednolančana antitela specifična za izabrane polipeptide.

Takođe, transgene životinje se mogu koristiti za eksprimiranje humanizovanih antitela specifičnih za polipeptide i fuzione proteine predmetnog pronalaska. Za dobijanje monoklonskih antitela može se koristiti bilo koja tehnika koja pruža antitela proizvedena kontinuiranim kulturama ćelijskih linija. Primeri za takve tehnike uključuju tehniku hibridoma (Kohler and Milstein Nature 256 (1975), 495-497), tehniku trioma, tehniku hibridoma ljudskih B ćelija (Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72) i tehniku EBV hibridoma za proizvodnju ljudskih monoklonskih antitela (Cole i dr., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96). Površinska plazmonska rezonanca koja se koristi u BIAcore sistemu može se koristiti za povećanje efikasnosti antitela faga koja se vezuju za epitop ciljanog polipeptida, kao što je CD3 epsilon (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). Takođe je predviđeno u kontekstu predmetnog pronalaska da izraz „antitelo“ sadrži konstrukte antitela, koji se mogu eksprimirati u domaćinu kao što je ovde opisano u daljem tekstu, npr. konstrukte antitela koji mogu biti transfektovani i/ili transdukovani, inter alia, virusima ili plazmidnim vektorima.

[0092] Dalje, izraz „antitelo“, kako se ovde koristi, takođe se odnosi na derivate ili varijante ovde opisanih antitela koja pokazuju istu specifičnost kao i opisana antitela. Primeri „varijanti antitela“ uključuju humanizovane varijante ne-ljudskih antitela, „afinitetno zrela“ antitela (pogledati, npr. Hawkins i dr. J. Mol. Biol.254, 889-896 (1992) and Lowman i dr., Biochemistry 30, 10832- 10837 (1991)) i mutante antitela sa izmenjenim efektorskim funkcijama (pogledati, npr., US Patent 5, 648, 260, Kontermann i Dübel (2010), loc. cit. i Little(2009), loc. cit.).

[0093] Izrazi „antigen-vezujući domen“, „antigen-vezujući fragment“ i „vezujući region antitela“ kako se ovde koriste odnose se na deo molekula antitela koji sadrži aminokiseline odgovorne za specifično vezivanje između antitela i antigena. Deo antigena koji je specifično prepoznat i vezan antitelom naziva se „epitop“ kako je gore opisano. Kao što je gore navedeno, antigen-vezujući domen obično može da sadrži varijabilni region lakog lanca antitela (VL) i varijabilni region teškog lanca antitela (VH); međutim, ne mora da sadrži i jedan i drugi. Fd fragmenti, na primer, imaju dva VH regiona i često zadržavaju neku funkciju vezivanja antigena netaknutog domena koji vezuje antigen. Primeri fragmenata koji vezuju antigen antitela uključuju (1) Fab fragment, monovalentni fragment koji ima VL, VH, CL i CH1 domene; (2) F(ab')2 fragment, bivalentni fragment koji ima dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom u zglobnom regionu; (3) Fd fragment koji ima dva VH i CH1 domena; (4) Fv fragment koji ima VL i VH domene jednog kraka antitela, (5) dAb fragment (Ward i dr., (1989) Nature 341 :544-546) koji ima VH domen; (6) izolovani region koji određuje komplementarnost (CDR), i (7) jednolančani Fv (scFv), gde je poslednji poželjan (na primer, dobijen iz biblioteke scFV). Iako su dva domena Fv fragmenta, VL i VH kodirani odvojenim genima, mogu se spojiti, rekombinantnim postupcima, sintetičkim veznikom koji omogućava njihovo stvaranje kao jedinstveni proteinski lanac u kome su VL i VH regioni spojeni kako bi formirali monovalentne molekule (poznate kao jednolančani Fv (scFv); pogledati npr. Huston i dr. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:5879-5883). Ovi fragmenti antitela su dobijeni korišćenjem konvencionalnih tehnika poznatih stručnjacima u oblasti, i fragmenti se procenjuju za funkciju na isti način kao netaknuta antitela.

[0094] Izraz „monoklonsko antitelo“, kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela koja obuhvataju populaciju su identična osim mogućih post-translacionih mutacija i/ili modifikacija (npr. izomerizacije, amidacije) koje mogu biti prisutne u manjim količinama.

[0095] Monoklonska antitela su visoko specifična i usmerena su ka jednom antigenom mestu. Pored toga, za razliku od konvencionalnih (polikolnskih) preparata antitela koji obično uključuju različita antitela usmerena protiv različitih determinanti (epitopi), svako monoklonsko antitelo je usmereno protiv pojedinačne determinante na antigenu. Pored svoje specifičnosti, monoklonska antitela su pogodna po tome što ih sintetiše kultura hibridoma, nekontaminirana drugim imunoglobulinama. Modifikator „monoklonski“ označava karakter antitela koje je dobijeno iz uglavnom homogene populacije antitela i ne treba ga tumačiti kao da zahteva proizvodnju antitela bilo kojim određenim postupkom. Na primer, monoklonska antitela koja će se koristiti u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu se načiniti postupkom hibridoma koji je najpre opisan kod Kohler i dr., Nature, 256: 495 (1975), ili se može napraviti rekombinantnim DNK postupcima (pogledati npr. U. S. Patent No.4,816,567). „monoklonska antitela“ se takođe mogu izolovati iz biblioteke faga antitela koristeći tehnike opisane kod Clackson i dr., Nature, 352: 624-628 (1991) i Marks i dr., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), na primer.

[0096] Monoklonska antitela predmetnog pronalaska posebno uključuju „himerna“ antitela (imunoglobulini) u kojima je deo teškog i/ili lakog lanca identičan ili homologan sa odgovarajućim sekvencama u antitelima dobijenim od određene vrste ili pripadaju određenoj klasi ili pod-klasi antitela, dok su ostaci lanaca identični ili homologni odgovarajućim sekvencama antitela izvedenih iz druge vrste ili pripadaju drugoj klasi ili pod-klasi antitela, kao i fragmenti takvih antitela, sve dok ispoljavaju željenu biološku aktivnost (U. S. Patent No. 4,816, 567; Morrison i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Himerna antitela koja su ovde od interesa uključuju „primatizovana“ antitela koja sadrže sekvence antigena koji vezuju varijabilne domene izvedene iz primata koji nije čovek (npr. majmuni starog sveta, bezrepi majmuni itd.) i ljudske sekvence konstantnog regiona.

„Humanizovani“ oblici ne-ljudskih (npr., mišjih) antitela su himerni imunoglobulini, imunoglobulinski lanci ili njihovi fragmenti (kao što su Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ili druge antigen-vezujuće pod-sekvence antitela) ljudske sekvence, koji sadrže minimalnu sekvencu koja je izvedena iz ne-ljudskog imunoglobulina. U većini slučajeva, humanizovana antitela su ljudski imunoglobulini (antitelo primalac) u kojima se ostaci iz hipervarijabilnog regiona (takođe CDR) primaoca zamenjuju ostacima iz hipervarijabilnog regiona ne-ljudske vrste (antitelo donora), poput miša, pacova ili zec koji imaju željenu specifičnost, afinitet i kapacitet. U nekim slučajevima, ostaci Fv okvirnog regiona (FR) ljudskog imunoglobulina zamenjuju se odgovarajućim ne-ljudskim ostacima. Dalje, „humanizovana antitela“ kako se ovde koristi, mogu takođe da sadrže ostatke koji se ne nalaze ni u antitelu primaocu, ni u antitelu donoru. Ove modifikacije su napravljene da poboljšaju i optimizuju performanse antitela. Optimizovano humanizovano antitelo će takođe sadržati bar deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), obično onog ljudskog imunoglobulina. Za dalje detalje pogledati Jones i dr., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann i dr., Nature, 332: 323-329 (1988); i Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992).

[0097] Izraz „ljudsko antitelo“ uključuje antitela koja imaju varijabilne i konstantne regione koji značajno odgovaraju ljudskim sekvencama imunoglobulina poznatih u struci, uključujući, na primer, ona koja su opisana kod Kabat i dr. (See Kabat i dr. (1991) loc. cit.). Ljudska antitela predmetnog pronalaska mogu da sadrže aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani ljudskim germlinijskim sekvencama imunoglobulina (npr. mutacije uvedene nasumičnim mutagenezama ili mutagenezama specifičnim za mesto) in vitro ili somatskom mutacijom in vivo), na primer u CDR, i posebno CDR3. Ljudsko antitelo može imati najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet, ili više položaja zamenjenih aminokiselinskim ostatkom koji nije kodiran ljudskom germlinijskom sekvencom imunoglobulina.

[0098] Kako se ovde koristi, „in vitro generisano antitelo“ odnosi se na antitelo gde se ceo ili deo varijabilnog regiona (npr. najmanje jedan CDR) generiše u neimunoj selekciji ćelija (npr. in vitro prikaz faga, protein čip ili bilo koji drugi postupak u kom se kandidat sekvence mogu testirati za svoju sposobnost da se vezuju na antigen). Ovaj izraz na taj način poželjno isključuje sekvence koje nastaju genomskim preuređivanjem u imunoj ćeliji.

[0099] „Bispecifično“ ili „bifunkcionalno“ antitelo ili imunoglobulin je veštačko hibridno antitelo ili imunoglobulin koji ima dva različita para teškog/lakog lanca i dva različita mesta vezivanja. Bispecifična antitela se mogu proizvesti različitim postupcima, uključujući fuziju hibridoma ili povezivanje Fab' fragmenata. Pogledati npr. Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990). Brojni postupci poznati stručnjacima su dostupni za dobijanje antitela ili njihovih fragmenata koji vezuju antigen. Na primer, antitela se mogu proizvesti korišćenjem postupaka rekombinantne DNK (U.S. Patent No.4,816,567).

Monoklonska antitela se takođe mogu proizvesti stvaranjem hibridoma (pogledati npr. Kohler i Milstein (1975) Nature, 256: 495-499) u skladu sa poznatim postupcima. Hibridomi formirani na ovaj način se zatim pretražuju standardnim postupcima, kao što su ispitivanje imunosorbentom vezanim za enzim (ELISA) i površinska plazmonska rezonanca (BIACORE™), kako bi se identifikovao jedan ili više hibridoma koji proizvode antitelo koje se specifično vezuje za određeni antigen. Bilo koji oblik navedenog antigena može se upotrebiti kao imunogen, npr. rekombinantni antigen, prirodni oblici, bilo koje njegove varijante ili fragmenti, kao i njegov antigeni peptid.“

[0100] Jedan primerena postupak pravljenja antitela uključuje skrining biblioteke eksprimiranja proteina, npr., biblioteke faga ili ribozoma. Prikaz faga je opisan, na primer, kod Ladner i dr., U.S. Patent No.5,223,409; Smith (1985) Science 228:1315-1317; Clackson i dr. (1991) Nature, 352: 624-628.

Pored upotrebe biblioteka za prikaz, navedeni antigen se može koristiti za imunizaciju životinje koja nije čovek, npr. glodara, npr. miša, hrčka ili pacova. U jednom aspektu, neljudska životinja uključuje bar deo ljudskog imunoglobulinskog gena. Na primer, moguće je konstruisati mišje linije deficitarne u proizvodnji mišjih antitela sa velikim fragmentima ljudskog Ig lokusa. Pomoću tehnologije hibridoma mogu se proizvesti i izabrati monoklonska antitela specifična za antigene izvedena iz gena sa željenom specifičnošću. Pogledati npr. XENOMOUSE™, Green i dr. (1994) Nature Genetics 7:13-21, US 2003- 0070185, WO 96/34096, i WO96/33735.

[0101] monoklonsko antitelo se može dobiti od životinje koja nije čovek, i zatim se modifikuje, npr., humanizovano, deimunizovano, himerno, može se proizvesti korišćenjem rekombinantnih DNK tehnika poznatih u struci. Opisani su različiti pristupi za pravljenje himernih antitela. Pogledati npr. Morrison i dr., Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A. 81:6851, 1985; Takeda i dr., Nature 314:452, 1985, Cabilly i dr., U.S. Patent No.4,816,567; Boss i dr., U.S. Patent No.4,816,397; Tanaguchi i dr., EP 0171496; EP 0173494, GB 2177096.

Humanizovana antitela se takođe mogu proizvesti, na primer, korišćenjem transgenih miševa koji eksprimiraju ljudske gene teškog i lakog lanca, ali nisu u stanju da eksprimiraju gene teškog i lakog lanca imunoglobulina endogenog miša. Winter opisuje primer primena CDR-graftovanja koja se mogu koristiti za pripremu humanizovanih antitela opisanih ovde (U.S. Patent No.5,225,539). Svi CDR određenog ljudskog antitela mogu biti zamenjeni sa najmanje delom CDR koji nije ljudski, ili se samo neki CDR mogu zameniti sa CDR koji nisu ljudski. Potrebno je samo zameniti broj CDR potrebnih za vezivanje humanizovanog antitela na unapred određeni antigen.

[0102] Humanizovana antitela ili njihovi fragmenti mogu se generisati zamenom sekvenci Fv varijabilnog domena koji nisu direktno uključeni u vezivanje antigena ekvivalentnim sekvencama iz ljudskih Fv varijabilnih domena. Primeri za generisanje humanizovanih antitela ili njihovih fragmenata prikazani su kod Morrison (1985) Science 229:1202-1207; od strane Oi i dr. (1986) BioTechniques 4:214; i od strane US 5,585,089; US 5,693,761; US 5,693,762; US 5,859,205; i US 6,407,213. Ti postupci uključuju izolovanje, manipulisanje i eksprimiranje sekvenci nukleinskih kiselinskih koje kodiraju sve ili deo imunoglobulin Fv varijabilnih domena iz najmanje jednog teškog ili lakog lanca. Takve nukleinske kiseline mogu se dobiti od hibridoma koji proizvodi antitelo protiv unapred definisanog cilja, kao što je gore opisano, kao i iz drugih izvora. Rekombinantna DNK koja kodira humanizovani molekul antitela može se zatim klonirati u odgovarajući vektor eksprimiranja.

[0103] Humanizovano antitelo se može optimizovati uvođenjem konzervativnih supstitucija, supstitucijom konsenzusnih sekvenci, germlinijskim supstitucijama i/ili mutacijama u nazad. Ovako izmenjeni molekuli imunoglobulina mogu se proizvesti bilo kojom od nekoliko tehnika poznatih u struci, (npr. Teng i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 7308-7312, 1983; Kozbor i dr., Immunology Today, 4: 7279, 1983; Olsson i dr., Meth. Enzymol., 92: 3-16, 1982), i može se izraditi u skladu sa navodima u EP 239400.

Antitelo ili njegov fragment takođe se može modifikovati specifičnim brisanjem epitopa ljudskih T ćelija ili „deimmunizacijom“ postupcima obelodanjenim u WO 98/52976 i WO 00/34317. Ukratko, varijabilni domeni antitela teškog i lakog lanca mogu se analizirati na peptide koji se vezuju za MHC klasu II; ovi peptidi predstavljaju potencijalne T ćelijske epitope (definisanu u WO 98/52976 i WO 00/34317). Za detekciju potencijalnih epitopa T ćelija, može se primeniti kompjuterski modeliran pristup nazvan „nanošenje peptida“, i kao dodatak bazi podataka ljudskih vezujućih peptida MHC klase II, za pretragu motiva prisutnih u VH i VL sekvenci, kako je opisano u WO 98/52976 i WO 00/34317. Ovi motivi se vezuju za bilo koji od 18 glavnih DR alotipa MHC klase II i tako čine potencijalne epitope T ćelija. Detektovani potencijalni epitopi T-ćelija mogu se eliminisati supstitucijom malog broja aminokiselinskih ostataka u varijabilnim domenima, ili poželjno, jedinstvenim supstitucijama aminokiselina. Obično se rade konzervativne supstitucije. Često, ali ne isključivo, može se koristiti aminokiselina zajednička položaju u sekvenci ljudskog germlinijskog antitela.

Ljudske germlinijske sekvence obelodanjene su, npr. kod Tomlinson, i dr. (1992) J. Mol. Biol. 227:776-798; Cook, G.P. i dr. (1995) Immunol. Today Vol.16 (5): 237-242; i Tomlinson i dr. (1995) EMBO J.14: 14:4628-4638. V BASE direktorijum pruža sveobuhvatan direktorijum sekvenci varijabilnih regiona ljudskog imunoglobulina (sastavljen od strane Tomlinson, LA. i dr. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK). Ove sekvence se mogu koristiti kao izvor ljudske sekvence, npr. za okvirne regione i CDR.

Konsenzusni ljudski okvirni regioni takođe se mogu koristiti, npr. kako je opisano u US Patent No.6,300,064.

[0104] Spajanje zajedno VH i VL formira jedinstveno antigen-vezujuće mesto. CH domen najbliži VH označen je kao CH1. Svaki L lanac povezan je sa H lancem jednom kovalentnom disulfidnom vezom, dok su dva H lanca međusobno povezana jednom ili više disulfidnih veza u zavisnosti od izotipa H lanca. VH i VL domeni sastoje se od četiri regiona relativno očuvanih sekvenci koje se zovu okvirni regioni (FR1, FR2, FR3 i FR4), koje formiraju skele za tri regiona hipervarijabilnih sekvenci (regioni koji određuju komplementarnost, CDR). CDR sadrže većinu ostataka odgovornih za specifične interakcije antitela sa antigenom. CDR se nazivaju CDR 1, CDR2 i CDR3. Prema tome, činioci CDR na teškom lancu se nazivaju H1, H2 i H3, dok se činioci CDR na lakom lancu nazivaju L1, L2 i L3.

Izraz „varijabilno“ odnosi se na delove domena imunoglobulina koji pokazuju varijabilnost u svojoj sekvenci i koji su uključeni u određivanje specifičnosti i afiniteta vezivanja određenog antitela (tj., „varijabilni domeni“). Varijabilnost nije ravnomerno raspoređena u varijabilnim domenima antitela; koncentrisana je u pod-domenima svakog od varijabilnih regiona teškog i lakog lanca. Ovi pod-domeni nazivaju se „hipervarijabilnim“ regionima ili „regionima koji određuju komplementarnost“ (CDR). Očuvaniji (tj., ne-hipervarijabilni) delovi varijabilnih domena nazivaju se „okvirni“ regioni (FRM). Varijabilni domeni teških i lakih lanaca koji se javljaju prirodno sadrže četiri FRM regiona, uglavnom usvajajući β-list konfiguraciju, povezana sa tri hipervarijabilna regiona, koji formiraju petlje koje povezuju, i u nekim slučajevima čine i deo strukture β-lista. Hipervarijabilni regioni u svakom lancu drže se zajedno u neposrednoj blizini FRM, i hipervarijabilni regioni iz drugog lanca doprinose formiranju mesta za vezivanje antigena (pogledati Kabat i dr., loc. cit.). Stalni domeni nisu direktno uključeni u vezivanje antigena, ali pokazuju različite efektorske funkcije, kao što su, na primer, ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela i aktivacija komplementa.

[0105] Takođe je za vezujući molekul predmetnog pronalaska poželjno da prvi i drugi domen formiraju molekul koji je izabran iz grupe koju čine (scFv)2, (jednodomensko mAb)2, scFvjednodomensko mAb, dijatelo ili njihovi oligomeri.

[0106] Izraz „CDR“ i svi njegovi oblici odnosi se na region koji određuje komplementarnost (CDR), od kojih tri čine vezujući karakter varijabilnog regiona lakog lanca (CDRL1, CDRL2 i CDRL3), i tri čine vezujući karakter varijabilnog regiona teškog lanca (CDRH1, CDRH2 i CDRH3). CDR doprinose funkcionalnoj aktivnosti molekula antitela i razdvajaju se aminokiselinskim sekvencama koje sadrže skele ili okvirne regiona. Tačne definitivne CDR granice i dužine podležu različitim sistemima klasifikacije i numerisanja. CDR se stoga mogu imenovati pomoću Kabat, Chothia, dodir ili bilo koje druge granične definicije, uključujući ovde opisani sistem numerisanja. Uprkos različitim granicama, svaki od ovih sistema ima određeni stepen preklapanja u onome što čini takozvane „hipervarijabilne regione“ unutar varijabilnih sekvenci. Definicije CDR prema ovim sistemima mogu se, dakle, razlikovati po dužini i graničnim oblastima u odnosu na susedni okvirni region. Pogledati na primer Kabat, Chothia i/ili MacCallum (Kabat i dr., loc. cit.; Chothia i dr., J. Mol. Biol, 1987, 196: 901; i MacCallum i dr., J. Mol. Biol, 1996, 262: 732). Međutim, poželjno je numerisanje u skladu sa takozvanim Kabat sistemom.

[0107] Izraz „aminokiselina“ ili „aminokiselinski ostatak“ obično se odnosi na aminokiselinu koja ima poznatu definiciju, kao što je aminokiselina odabrana iz grupe koju čine: alanin (Ala ili A); arginin (Arg ili R); asparagin (Asn ili N); asparagniska kiselina (Asp ili D); cistein (Cys ili C); glutamin (Gln ili K); glutaminska kiselina (Glu ili E); glicin (Gly ili G); histidin (His ili H); izoleucin (He ili I): leucin (Leu ili L); lizin (Lys ili K); metionin (Met ili M); fenilalanin (Phe ili F); prolin (Pro ili P); serin (Ser ili S); treonin (Thr ili T); triptofan (Trp ili W); tirozin (Tyr ili Y); i valin (Val ili V), iako se modifikovane, sintetičke ili retke aminokiseline mogu koristiti po želji. Generalno, aminokiseline se mogu grupisati kao da imaju nepolarni bočni lanac (npr. Ala, Cys, He, Leu, Met, Phe, Pro, Val); negativno nenaelektrisan bočni lanac (npr. Asp, Glu); pozitivno nenaelektrisan bočni lanac (npr. Arg, His, Lys); ili nenaelektrisan polarni bočni lanac (npr. Asn, Cys, Gln, Gly, His, Met, Phe, Ser, Thr, Trp i Tyr).

[0108] Izraz „hipervarijabilni region“ (takođe poznat kao „region koji određuje komplementarnost“ ili CDR) kako se ovde koristi odnosi se na aminokiselinske ostatke antitela koji su (obično tri ili četiri kratka regiona ekstremne varijabilnosti sekvenci) unutar domena V regiona imunoglobulina koji formiraju mesto vezivanja antigena i glavne su odrednice specifičnosti antigena. Postoje najmanje dva postupka za identifikaciju CDR ostataka: (1) Pristup zasnovan na varijabilnosti sekvenci među vrstama (npr., Kabat i dr., loc. cit.); i (2) Pristup zasnovan na kristalografskim studijama antigen-antitelo kompleksa (Chothia, C. i dr., J. Mol. Biol.196: 901-917 (1987)). Međutim, u meri u kojoj dve tehnike identifikacije ostataka definišu regiona preklapanja, ali ne identičnih regiona, one se mogu kombinovati za definisanje hibridnog CDR. Međutim, generalno, ostaci CDR se poželjno identifikuju u skladu sa takozvanim Kabat sistemom (numerisanja).

[0109] Izraz „okvirni region“ odnosi se na u struci prepoznate delove varijabilnog regiona antitela koji postoje između više divergentnih (tj., hipervarijabilnih) CDR. Takvi okvirni regioni se obično nazivaju okviri 1 do 4 (FR1, FR2, FR3 i FR4) i pružaju skele za predstavljanje šest CDR (tri iz teškog lanca i tri iz lakog lanca) u trodimenzionalnom prostoru, kako bi se formirala površina koja vezuje antigen.

[0110] Obično CDR formiraju strukturu petlje koja se može klasifikovati kao kanonska struktura. Izraz „kanonska struktura“ odnosi se na konformaciju glavnog lanca koja je usvojena od strane petlji vezivanja antigena (CDR). Iz uporednih strukturnih studija, ustanovljeno je da pet od šest petlji vezivanja antigena ima samo ograničen repertoar dostupnih konformacija. Svaku kanonsku strukturu mogu da karakterišu torzioni uglovi polipeptidne kičme. Zbog toga odgovarajuće petlje između antitela mogu imati veoma slične trodimenzionalne strukture, uprkos velikoj varijabilnosti sekvenci aminokiselina u većem delu petlje (Chothia i Lesk, J. Mol. Biol., 1987, 196: 901; Chothia i dr., Nature, 1989, 342: 877; Martin i Thornton, J. Mol. Biol, 1996, 263: 800). Dalje, postoji odnos između usvojene strukture petlje i aminokiselinskih sekvenci koje je okružuju. Konformacija određene kanonske klase određena je dužinom petlje i aminokiselinskih ostataka koji se nalaze na ključnim položajima unutar petlje, kao i unutar sačuvanog okvira (tj., izvan petlje). Dodela određenoj kanonskoj klasi može se, dakle, izvršiti na osnovu prisustva ovih ključnih aminokiselinskih ostataka. Izraz „kanonska struktura“ takođe može obuhvatati razmatranja u vezi sa linearnom sekvencom antitela, na primer, kao što je katalogirano od strane Kabat (Kabat i dr., loc. cit.). Kabat (sistem) šema numerisanja je široko usvojen standard za numerisanje aminokiselinskih ostataka varijabilnog domena antitela na dosledan način i predstavlja poželjnu šemu primenjenu u predmetnom pronalasku, kao što je takođe navedeno drugde u ovom tekstu. Dodatna strukturalna razmatranja takođe se mogu koristiti za određivanje kanonske strukture antitela. Na primer, one razlike koje nisu u potpunosti odražene Kabat numerisanjem mogu se opisati sistemom numerisanja od strane Chothia i dr i/ili pokazati drugim tehnikama, na primer, kristalografijom i dvodimenzionalnim ili trodimenzionalnim računarskim modeliranjem. Shodno tome, data sekvenca antitela može se svrstati u kanonsku klasu koja omogućava, inter alia, identifikovanje odgovarajućih sekvenci šasije (npr. na osnovu želje za uključivanjem različitih kanonskih struktura u biblioteku). Kabat numerisanje aminokiselinskih sekvenci antitela i strukturalna razmatranja kao što je opisano kod Chothia i dr., loc. cit. i njihove implikacije na konstruisanje kanonskih aspekata strukture antitela, opisani su u literaturi.

[0111] CDR3 je tipično najveći izvor molekularne raznolikosti unutar mesta za vezivanje antitela. H3, na primer, može biti dugačak samo dva aminokiselinska ostatka ili duži od 26 aminokiselina. Strukture podjedinica i trodimenzionalne konfiguracije različitih klasa imunoglobulina su dobro poznate u struci. Za pregled strukture antitela, pogledati Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow i dr., 1988. Stručnjak u oblasti će prepoznati da svaka struktura podjedinice, na primer, CH, VH, CL, VL, CDR, FR struktura, sadrži aktivne fragmente, npr. deo VH, VL ili CDR podjedinice se vezuje za antigen, tj. antigen-vezujući fragment, ili, na primer, deo CH-podjedinice koji se vezuje za i/ili aktivira, npr., Fc receptor i/ili komplement. CDR se obično odnosi na Kabat CDR, kako je opisano u Sequences of Proteins of immunological Interest, US Department of Health and Human Services (1991), eds. Kabat i dr. Drugi standard za karakterizaciju mesta vezivanja antigena je upućivanje na hipervarijabilne petlje kao što je opisano od strane Chothia.

Pogledati npr. Chothia, i dr. (1987; J. Mol. Biol.227:799-817); i Tomlinson i dr. (1995) EMBO J.14: 4628-4638. Još jedan standard je definicija AbM koju koristi softver za modeliranje antitela AbM od kompanije Oxford Molecular. Pogledati, uopšteno, npr. Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg).

Otelotvorenja opisane u odnosu na Kabat CDR mogu se alternativno primeniti koristeći slične opisane odnose u odnosu na Chothia hipervarijabilne petlje ili na AbM-određene petlje.

[0112] Sekvenca gena antitela posle sklapanja i somatske mutacije je veoma raznolika, i procenjuje se da ovi različiti geni kodiraju 10<10>različitih molekula antitela (Immunoglobulin Genes, 2nd ed., eds. Jonio i dr., Academic Press, San Diego, CA, 1995). Prema tome, imuni sistem pruža repertoar imunoglobulina. Izraz „repertoar“ odnosi se na najmanje jednu nukleotidnu sekvencu izvedenu u potpunosti ili delimično iz najmanje jedne sekvence koja kodira najmanje jedan imunoglobulin. Sekvence mogu biti generisane preuređivanjem V, D i J segmenata teških lanaca i V i J segmenata lakih lanaca. Alternativno, sekvence mogu biti generisane iz ćelije kao odgovor na to koje preuređivanje se događa, npr. in vitro stimulacija. Alternativno, delovi ili čitave sekvence mogu se dobiti spajanjem DNK, nukleotidnom sintezom, mutagenezom i drugim postupcima, pogledati, npr. U.S. Patent 5,565,332.

Repertoar može obuhvatati samo jednu sekvencu ili može uključiti mnoštvo sekvenci, uključujući one u genetski raznovrsnoj kolekciji.

[0113] U jednom otelotvorenju, prvi vezujući domen vezujućeg molekula pronalaska sadrži VH region koji sadrži CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3i VL region koji sadrži CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 odabrane iz grupe koju čine:

(1) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 1, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 2, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 3, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 4, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 5 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 6; (2) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 11, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 12, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 13, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 14, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 15 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 16;

(3) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 21, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 22, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 23, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 24, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 25 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 26;

(4) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 31, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 32, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 33, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 34, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 35 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 36;

(5) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 41, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 42, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 43, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 44, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 45 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 46;

(6) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 51, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 52, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 53, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 54, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 55 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 56;

(7) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 61, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 62, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 63, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 64, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 65 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 66;

(8) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 71, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 72, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 73, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 74, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 75 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 76;

(9) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 161, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 162, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 163, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 164, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 165 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 166;

(10) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 171, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 172, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 173, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 174, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 175 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 176;

(11) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 181, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 182, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 183, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 184, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 185 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 186;

(12) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 191, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 192, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 193, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 194, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 195 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 196;

(13) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 201, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 202, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 203, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 204, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 205 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 206;

(14) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 211, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 212, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 213, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO:214, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 215 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 216;

(15) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 221, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 222, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 223, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 224, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 225 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 226;

(16) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 311, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 312, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 313, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 314, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 315 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 316;

(17) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 321, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 322, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 323, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 324, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 325 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 326;

(18) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 331, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 332, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 333, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 334, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 335 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 336;

(19) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 341, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 342, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 343, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 344, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 345 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 346;

(20) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 351, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 352, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 353, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 354, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 355 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 356;

(21) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 361, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 362, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 363, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 364, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 365 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 366;

(22) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 371, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 372, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 373, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 374, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 375 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 376;

(23) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 381, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 382, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 383, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 384, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 385 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 386;

(24) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 581, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 582, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 583, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 584, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 585 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 586;

(25) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 591, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 592, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 593, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 594, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 595 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 596;

(26) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 601, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 602, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 603, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 604, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 605 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 606;

(27) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 611, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 612, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 613, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 614, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 615 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 616;

(28) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 621, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 622, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 623, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 624, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 625 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 626;

(29) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 631, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 632, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 633, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 634, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 635 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 636;

(30) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 641, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 642, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 643, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 644, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 645 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: (31) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 651, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 652, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 653, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 654, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 655 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 656;

(32) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 661, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 662, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 663, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 664, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 665 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 666;

(33) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 671, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 672, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 673, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 674, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 675 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 676;

(34) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 681, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 682, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 683, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 684, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 685 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 686;

(35) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 691, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 692, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 693, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 694, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 695 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 696;

(36) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 701, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 702, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 703, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 704, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 705 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 706;

(37) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 711, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 712, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 713, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 714, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 715 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 716;

(38) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 721, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 722, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 723, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 724, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 725 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 726;

(39) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 731, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 732, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 733, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 734, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 735 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 736;

(40) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 741, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 742, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 743, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 744, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 745 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 746;

(41) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 751, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 752, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 753, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 754, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 755 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 756;

(42) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 761, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 762, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 763, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 764, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 765 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 766;

(43) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 771, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 772, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 773, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 774, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 775 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 776;

(44) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 781, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 782, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 783, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 784, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 785 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 786;

(45) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 791, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 792, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 793, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 794, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 795 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 796;

(46) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 801, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 802, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 803, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 804, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 805 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 806;

(47) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 811, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 812, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 813, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 814, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 815 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 816;

(48) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 821, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 822, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 823, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 824, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 825 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 826;

(49) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 831, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 832, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 833, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 834, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 835 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 836;

(50) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 961, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 962, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 963, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 964, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 965 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 966;

(51) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 971, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 972, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 973, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 974, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 975 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 976;

(52) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 981, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 982, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 983, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 984, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 985 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 986; i

(53) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 991, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 992, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 993, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 994, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 995 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 996.

[0114] U drugom otelotvorenju, prvi vezujući domen vezujućeg molekula sadrži VH region odabran iz grupe koju čine VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 317, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 337, SEQ ID NO: 347, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 377, SEQ ID NO: 387, SEQ ID NO: 587, SEQ ID NO: 597, SEQ ID NO: 607, SEQ ID NO: 617, SEQ ID NO: 627, SEQ ID NO: 637, SEQ ID NO: 647, SEQ ID NO: 657, SEQ ID NO: 667, SEQ ID NO: 677, SEQ ID NO: 687, SEQ ID NO: 697, SEQ ID NO: 707, SEQ ID NO: 717, SEQ ID NO: 727, SEQ ID NO: 737, SEQ ID NO: 747, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 767, SEQ ID NO: 777, SEQ ID NO: 787, SEQ ID NO: 797, SEQ ID NO: 807, SEQ ID NO: 817, SEQ ID NO: 827, SEQ ID NO: 837, SEQ ID NO: 967, SEQ ID NO: 977, SEQ ID NO: 987, i SEQ ID NO: 997.

[0115] U drugom otelotvorenju, prvi vezujući domen vezujućeg molekula sadrži VL region odabran iz grupe koju čine VL region kako je prikazan u SEQ ID u SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 318, SEQ ID NO: 328, SEQ ID NO: 338, SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 358, SEQ ID NO: 368, SEQ ID NO: 378, SEQ ID NO: 388, SEQ ID NO: 588, SEQ ID NO: 598, SEQ ID NO: 608, SEQ ID NO: 618, SEQ ID NO: 628, SEQ ID NO: 638, SEQ ID NO: 648, SEQ ID NO: 658, SEQ ID NO: 668, SEQ ID NO: 678, SEQ ID NO: 688, SEQ ID NO: 698, SEQ ID NO: 708, SEQ ID NO: 718, SEQ ID NO: 728, SEQ ID NO: 738, SEQ ID NO: 748, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 768, SEQ ID NO: 778, SEQ ID NO: 788, SEQ ID NO: 798, SEQ ID NO: 808, SEQ ID NO: 818, SEQ ID NO: 828, SEQ ID NO: 838, SEQ ID NO: 968, SEQ ID NO: 978, SEQ ID NO: 988, i SEQ ID NO: 998.

[0116] U jednom otelotvorenju, prvi vezujući domen vezujućeg molekula sadrži VH region i VL region odabran iz grupe koju čine:

(1) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 7, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 8;

(2) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 17, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 18;

(3) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 27, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 28;

(4) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 37, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 38;

(5) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 47, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 48;

(6) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 57, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 58;

(7) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 67, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 68;

(8) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 77, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 78;

(9) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 167, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 168;

(10) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 177, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 178;

(11) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 187, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 188;

(12) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 197, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 198;

(13) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 207, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 208;

(14) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 217, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 218;

(15) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 227, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 228;

(16) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 317, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 318;

(17) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 327, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 328;

(18) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 337, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 338;

(19) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 347, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 348;

(20) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 357, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 358;

(21) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 367, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 368;

(22) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 377, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 378;

(23) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 387, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 388;

(24) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 587, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 588;

(25) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 597, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 598;

(26) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 607, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 608;

(27) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 617, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 618;

(28) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 627, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 628;

(29) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 637, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 638;

(30) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 647, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 648;

(31) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 657, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 658;

(32) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 667, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 668;

(33) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 677, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 678;

(34) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 687, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 688;

(35) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 697, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 698;

(36) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 707, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 708;

(37) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 717, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 718;

(38) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 727, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 728;

(39) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 737, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 738;

(40) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 747, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 748;

(41) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 757, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 758;

(42) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 767, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 768;

(43) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 777, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 778;

(44) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 787, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 788;

(45) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 797, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 798;

(46) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 807, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 808;

(47) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 817, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 818;

(48) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 827, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 828;

(49) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 837, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 838;

(50) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 967, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 968;

(51) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 977, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 978;

(52) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 987, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 988; i

(53) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 997, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 998.

[0117] U jednom primeru, prvi vezujući domen sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 319, SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 349, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO: 379, SEQ ID NO: 389, SEQ ID NO: 589, SEQ ID NO: 599, SEQ ID NO: 609, SEQ ID NO: 619, SEQ ID NO: 629, SEQ ID NO: 639, SEQ ID NO: 649, SEQ ID NO: 659, SEQ ID NO: 669, SEQ ID NO: 679, SEQ ID NO: 689, SEQ ID NO: 699, SEQ ID NO: 709, SEQ ID NO: 719, SEQ ID NO: 729, SEQ ID NO: 739, SEQ ID NO: 749, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NO: 769, SEQ ID NO: 779, SEQ ID NO: 789, SEQ ID NO: 799, SEQ ID NO: 809, SEQ ID NO: 819, SEQ ID NO: 829, SEQ ID NO: 839, SEQ ID NO: 969, SEQ ID NO: 979, SEQ ID NO: 989, i SEQ ID NO: 999.

[0118] Poželjno je da vezujući molekul predmetnog pronalaska ima CDR-H3 region sa dužinom od 12 aminokiselina, gde je tirozin (Y) ostatak prisutan na položaju 3, 4 i 12.

Poželjan CDR-H3 je prikazan u SEQ ID NO: 43, 193, 333, 613, 703, 733, 823 ili 973. Prema tome, vezujući molekul predmetnog pronalaska ima u poželjnom otelotvorenju CDR-H3 prikazan u SEQ ID NO: 43, 193, 333, 613, 703, 733, 823 ili 973.

[0119] Poželjan je vezujući molekul sa sekvencom aminokiselina prikazanom u SEQ ID NO: 340. Takođe je poželjan vezujući molekul sa sekvencom aminokiselina prikazanom u ili SEQ ID NO: 980.

Vezujući molekul predmetnog pronalaska je pogodno „izolovan“ vezujući molekul.

„Izolovan“ kada se ovde koristi za opisivanje vezanog molekula, označava vezujući molekul koji je identifikovan, izdvojen i/ili obnovljen iz komponente svog proizvodnog okruženja. Poželjno, izolovan vezujući molekul nije povezan sa svim ostalim komponentama svog proizvodnog okruženja. Kontaminirajuće komponente njegovog proizvodnog okruženja, poput one koja je rezultat iz rekombinantnih transfektovanih ćelija, su materijali koji obično ometaju dijagnostičku ili terapijsku upotrebu polipeptida, i mogu uključivati enzime, hormone i druge proteinske ili ne-proteinske rastvarače. U poželjnim otelotvorenjima, vezujući molekul će biti prečišćen (1) do stepena dovoljnog da se dobije najmanje 15 ostataka N-terminalne ili unutrašnje aminokiselinske sekvence korišćenjem okretnog sekventatora ili (2) do homogenosti pomoću SDS-PAGE pod redukcionim ili ne-redukcionim uslovima koristeći Coomassie plavo ili, poželjno, srebrno bojenje. Međutim, obično, izolovano antitelo će se pripremiti bar jednim korakom prečišćavanja.

[0120] Razmotrene su modifikacije sekvenci amino kiselina ovde vezanih molekula. Na primer, može biti poželjno da se poboljšaju afinitet vezivanja i/ili druga biološka svojstva antitela. Varijante aminokiselinskih sekvenci vezujućih molekula se pripremaju uvođenjem odgovarajućih nukleotidnih promena u nukleinsku kiselinu koja se vezuje na molekule ili sintezom peptida.

[0121] Takve modifikacije uključuju, na primer, brisanja iz i/ili ubacivanja u i/ili supstitucije ostataka unutar aminokiselinskih sekvenci vezujućih molekula. Svaka kombinacija brisanja, umetanja i supstitucije vrši se kako bi se dobio konačni konstrukt, pod uslovom da konačni konstrukt poseduje željene karakteristike. Promene aminokiselina takođe mogu izmeniti procese translacionih molekula vezivanja, kao što je promena broja ili položaja mesta glikozilacije. Poželjno je da 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 aminokiselina mogu biti supstituisane u CDR, dok 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ili 25 aminokiselina mogu biti supstituisane u okvirnim regionima (FR). Supstitucije su po mogućnosti konzervativne supstitucije kao što je ovde opisano. Dodatno ili alternativno, 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 aminokiselina mogu biti ubačene ili izbrisane u svaki od CDR (naravno, u zavisnosti od njihove dužine), dok 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili 25 aminokiselina mogu biti ubačene ili izbrisane u svaki od FR.

[0122] Koristan postupak za identifikaciju određenih ostataka ili regiona vezujućih molekula koji su poželjna mesta za mutagenezu naziva se „alanin skenirajuća mutageneza“, kako je opisano kod Cunningham i Wells u Science, 244: 1081-1085 (1989). Ovde se identifikuju ostatak ili grupa ciljanih ostataka unutar vezujućeg molekula (npr. naelektrisani ostaci kao što su arg, asp, his, lys i glu) i zamenjuje ih neutralna ili negativno naelektrisana aminokiselina (najpoželjnije alanin ili polialanin) kako bi se uticalo na interakciju aminokiselina i epitopa.

[0123] One lokacije aminokiselina koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na supstitucije zatim se rafiniraju uvođenjem daljih ili drugih varijanti na, ili za, mesta supstitucije. Prema tome, dok je mesto za uvođenje varijacije aminokiselinskih sekvenci unapred određeno, prirodu mutacije per se ne treba unapred određivati. Na primer, za analizu performansi mutacije na datom mestu, ala skeniranje ili slučajna mutageneza se vrše na ciljanom kodonu ili regionu, i eksprimirane varijante vezujućeg molekula se pretražuju za željenu aktivnost.

[0124] Poželjno, umetci aminokiselinskih sekvenci uključuju amino- i/ili karboksil-terminalne fuzije, u rasponu od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 ostataka, sa polipeptidima koji sadrže sto ili više ostataka, kao i umetanje pojedinačnih ili višestrukih aminokiselinskih ostataka. Umetna varijanta vezujućeg molekula uključuje fuziju N- ili C-terminusa antitela na enzim ili fuziju sa polipeptidom što povećava polu-život seruma antitela.

[0125] Druga vrsta varijante je varijanta supstitucije aminokiselina. Ove varijante imaju pogodno najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 aminokiselinskih ostataka u vezujućem molekuli koji su zamenjeni drugačijim ostatkom. Mesta od najvećeg interesovanja za supstitucionu mutagenezu uključuju CDR teškog i/ili lakog lanca, posebno hipervarijabilne regione, ali se razmatraju i promene FR u teškom i/ili lakom lancu.

[0126] Na primer, ako CDR sekvenca obuhvata 6 aminokiselina, predviđa se da jedna, dve ili tri ove aminokiseline budu supstituisane. Slično tome, ako CDR sekvenca obuhvata 15 aminokiselina, predviđa se da jedna, dve, tri, četiri, pet ili šest ovih aminokiselina budu supstituisane.

[0127] Generalno, ako su aminokiseline supstituisane u jednom ili više ili svim CDR teškog i/ili lakog lanca, poželjno je da tada dobijena „supstituisana“ sekvenca bude najmanje 60%, poželjnije 65%, čak i više poželjno 70%, posebno poželjno 75%, naročito poželjno 80% identična „originalnoj“ sekvenci CDR. To znači da od dužine CDR zavisi u kojoj je meri identična „supstituisanoj“ sekvenci. Na primer, CDR koji sadrži 5 aminokiselina je poželjno 80% identičan svojoj supstituisanoj sekvenci kako bi imao najmanje jednu aminokiselinu supstituisanu. Prema tome, CDR vezujućeg molekula može imati različit stepen identičnosti sa supstituisanim sekvencama, npr. CDRL1 može imati 80%, dok CDRL3 može imati 90%.

[0128] Poželjne supstitucije (ili zamene) su konzervativne supstitucije. Međutim, svaka supstitucija (uključujući nekonzervativnu supstituciju ili jednu ili više iz „primernih supstitucija“ navedenih u Tabeli 1, u nastavku) je predviđena sve dok vezujući molekul zadržava svoju sposobnost da se vezuje za BCMA preko prvog vezujućeg domena i za CD3 epsilon preko drugog vezujućeg domena i/ili njegovi CDR imaju identičnost sa tada supstituisanom sekvencom (barem 60%, poželjnije 65%, još poželjnije 70%, naročito poželjno 75%, naročito poželjnije 80% identičnosti sa „originalnom“ CDR sekvencom).

[0129] Konzervativne supstitucije prikazane su u Tabeli 1 pod naslovom „Poželjne supstitucije“. Ako takve supstitucije rezultuju promenom biološke aktivnosti, tada se mogu uvesti značajnije promene, označene kao „primerne supstitucije“ u Tabeli 1, ili kao što je dalje opisano u vezi sa klasama aminokiselina, i proizvodi se pregledaju za željenu karakteristiku.

Tabela 1: Supstitucije aminokiselina

[0130] Značajne modifikacije u biološkim svojstvima vezujućeg molekula predmetnog pronalaska su izvedene odabirom supstitucija koje se značajno razlikuju po svom efektu na održavanje (a) strukture polipeptidne kičme u području supstitucije, na primer, u obliku lista ili spiralne konformacija, (b) naelekstrisanje ili hidrofobnost molekula na ciljanom mestu, ili (c) najveći deo bočnog lanca. Ostaci koji se javljaju prirodno su podeljeni u grupe na osnovu zajedničkih svojstava bočnih lanaca: (1) hidrofobni: norleucin, met, ala, val, leu, ile; (2) neutralni hidrofilni: cys, ser, thr; (3) kiseli: asp, glu; (4) bazni: asn, gin, his, lys, arg; (5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: gly, pro; i (6) aromatični: trp, tyr, phe.

[0131] Nekonzervativne supstitucije podrazumevaće razmenu člana jedne od ovih klasa za drugu klasu. Bilo koji ostatak cisteina koji nije uključen u održavanje odgovarajuće konformacije vezujućeg molekula može biti supstituisan, uglavnom sa serinom, kako bi se poboljšala oksidaciona stabilnost molekula i sprečilo aberantno umrežavanje. Suprotno tome, cisteinska veza može se dodati antitelu kako bi se poboljšala njegova stabilnost (naročito gde je antitelo fragment antitela, kao što je Fv fragment).

[0132] Posebno poželjna vrsta supstitucione varijante uključuje supstituciju jednog ili više hipervarijabilnih ostataka matičnog antitela (npr. humanizovanog ili ljudskog antitela).

Generalno, rezultujuće varijante odabrane za dalji razvoj imaće poboljšana biološka svojstva u odnosu na matično antitelo iz koga su generisane. Pogodan način za generisanje takvih supstitucionih varijanti uključuje sazrevanje afiniteta pomoću prikaza faga. Ukratko, nekoliko mesta hipervarijabilnih regiona (npr.6-7 mesta) se mutiraju kako bi se stvorile sve moguće supstitucije aminokiselina na svakom mestu. Tako dobijene varijante antitela prikazane su na monovalentan način od čestica filamentnih faga kao fuzije za gena III proizvoda M13 koji je pakovan unutar svake čestice. Fagno prikazane varijante su zatim ispitane za svoju biološku aktivnost (npr. afinitet vezivanja) kao što je ovde obelodanjeno. Kako bi se identifikovala mesta hipervarijabilnog regiona za modifikaciju, može se izvesti mutageneza skeniranja alanina radi identifikacije ostataka hipervarijabilnih regiona koji značajno doprinose vezivanju antigena. Alternativno, ili dodatno, može biti korisno analizirati kristalnu strukturu antigen-antitelo kompleksa kako bi se identifikovale tačke dodira između vezujućeg domena i, na primer, ljudskog BCMA. Takvi dodirni ostaci i susedni ostaci su kandidati za supstituciju prema ovde opisanim tehnikama. Jednom kada se generišu takve varijante, panel varijanti je podvrgnut skriningu kao što je ovde opisano, i antitela sa superiornim svojstvima u jednom ili više relevantnih ispitivanja mogu biti odabrana za dalji razvoj.

[0133] Ovde su razmatrane druge modifikacije vezivajućeg molekula. Na primer, vezujući molekul može da bude povezan sa jednim od različitih ne-proteinskih masnih polimera, na primer, polietilen glikol, polipropilen glikol, polioksialkileni ili kopolimeri polietilen glikola i polipropilen glikola. Vezujući molekul se takođe može ugraditi u mikrokapsule pripremljene, na primer, tehnikama koacervaracije ili interfacijalnom polimerizacijom (na primer, hidroksimetilcelulozom ili želatin-mikrokapsulama, poli-metilmetacilatnim mikrokapsulama, respektivno), u koloidnim sistemima za dostavu lekova (na primer, lipozomi, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su obelodanjene u Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980).

[0134] Ovde obelodanjeni vezujući molekuli mogu se takođe formulisati kao imuno-lipozomi. „Lipozom“ je mala vezikula sastavljena od različitih vrsta lipida, fosfolipida i/ili surfaktanata koja je korisna za isporuku leka sisaru. Komponente lipozoma obično su raspoređene u dvoslojnoj formaciji, slično lipidnom rasporedu bioloških membrana. Lipozomi koji sadrže antitelo su pripremljeni postupcima poznatim u struci, kao što je opisano kod Epstein i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang i dr., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); US Pat. Nos.4,485,045 i 4,544,545; i WO 97/38731 objavljenom 23. oktobra 1997. Lipozomi sa povećanim vremenom cirkulacije obelodanjeni su u US Patent No.5,013, 556. Posebno korisni lipozomi mogu se proizvesti postupkom isparavanja iz reverzne faze sa lipidnim sastavom koji sadrži fosfatidilholin, holesterol i PEG-derivatizovani fosfatidiletanolamin (PEG-PE). Lipozomi se ekstrudiraju pomoću filtera definisane veličine pora kako bi se dobili lipozomi sa željenim prečnikom. Fab' fragmenti antitela predmetnog pronalaska mogu se konjugovati sa lipozomima kako je opisano kod Martin i dr. J. Biol.

Chem. 257: 286-288 (1982) reakcijom razmene disulfida. Hemoterapeutski agens je opciono sadržan u lipozomu. Pogledati Gabizon i dr. J. National Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989).

[0135] Kada se koriste rekombinantne tehnike, molekul za vezivanje može se proizvesti unutar ćelije, u periplazmatskom prostoru, ili direktno izlučiti u medijum. Ako se vezujući molekul proizvodi unutarćelijski, kao prvi korak, ostaci čestica, bilo ćelije domaćini ili lizirani fragmenti, uklanjaju se, na primer, centrifugiranjem ili ultrafiltracijom. Carter i dr., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) opisuju postupak za izolovanje antitela koja se izlučuju u periplazmatski prostor od E. Coli

[0136] Sastav vezujućeg molekula pripremljen iz ćelija može se prečistiti korišćenjem, na primer, hidroksilapatitske hromatografije, elektroforeze gela, dijalize i afinitetne hromatografije, gde je afinitetna hromatografija poželjna tehnika prečišćavanja.

[0137] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na sekvencu nukleinskih kiselina koja kodira vezujući molekul predmetnog pronalaska. Izraz „nukleinska kiselina“ dobro je poznat stručnjaku i obuhvata DNK (kao što je cDNK) i RNK (kao što je mRNK). Nukleinska kiselina može biti dvolančana, jednolančana, linearna i kružna. Navedeni molekul nukleinske kiseline poželjno nalazi u vektoru koji je poželjno sadržan u ćeliji domaćinu. Navedena ćelija domaćina je, npr. posle transformacije ili transfekcije sekvencom nukleinske kiseline predmetnog pronalaska, sposobna da eksprimira vezujući molekul. U tu svrhu, molekul nukleinske kiseline je operativno povezan sa kontrolnim sekvencama.

[0138] Vektor predmetnog pronalaska je molekul nukleinske kiseline koji se koristi kao nosač za prenos (stranog) genetskog materijala u ćeliju. Izraz „vektor“ obuhvata - ali nije ograničen na - plazmide, viruse, kosmide i veštačke hromozome. Generalno, konstruisani vektori sadrže poreklo replikacije, mesto multikloniranja i selektabilni marker. Sam vektor je generalno nukleotidna sekvenca, obično DNK sekvenca koja sadrži umetak (transgen) i veća sekvenca koja služi kao „kičma“ vektora. Savremeni vektori mogu da obuhvate i dodatne karakteristike pored umetka transgena i kičme: promotor, genetski marker, rezistencija na antibiotike, reporterski gen, ciljana sekvenca, oznaka za prečišćavanje proteina. Vektori koji se nazivaju vektori eksprimiranja (konstrukti eksprimiranja) specifični su za eksprimiranje transgena u ciljanoj ćeliji i obično imaju kontrolne sekvence kao što je promoterska sekvenca koja pokreće eksprimiranje transgena. Umetanje vektora u ciljanu ćeliju obično se naziva „transformacija“ za bakterijske ćelije, „transfekcija“ za eukariotske ćelije, mada se ubacivanje virusnog vektora takođe naziva „transdukcija“.

[0139] Kako se ovde koristi, izraz „ćelija domaćin“ predmetnog pronalaska treba da se odnosi na ćeliju u koju se nukleinska kiselina koja kodira vezujući molekul predmetnog pronalaska uvodi putem transformacije, transfekcije i slično. Treba shvatiti da se takvi pojmovi ne odnose samo na određenu predmetnu ćeliju već i na potomstvo ili potencijalno potomstvo takve ćelije. Budući da se u narednim generacijama mogu dogoditi određene modifikacije ili zbog mutacija ili uticaja okoline, takvo potomstvo zapravo ne mora biti identično kao matična ćelija, ali je i dalje uključeno u obim izraza koji se ovde koristi.

[0140] Kako se ovde koristi, izraz „eksprimiranje“ uključuje bilo koji korak uključen u proizvodnju vezujućeg molekula predmetnog pronalaska, uključujući, ali ne ograničavajući se na, transkripciju, post-transkripcionu modifikaciju, prevođenje, post-translacione modifikacije i sekreciju.

[0141] Izraz „kontrolne sekvence“ odnosi se na DNK sekvence neophodne za eksprimiranje operativno povezane kodirajuće sekvence u određenom organizmu domaćina. Kontrolne sekvence koje su pogodne za prokariote, na primer, uključuju promotor, opciono operativnu sekvencu i vezujuće mesto za ribozome. Poznato je da se eukariotske ćelije koriste promotorima, signalima poliadenilacije i pojačivačima.

[0142] Nukleinska kiselina je „operativno povezana“ kada je stavljena u funkcionalni odnos sa drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, DNK za predsekvencu ili sekretorni lider je operativno povezan sa DNK za polipeptid ako je eksprimiran kao preprotein koji učestvuje u izlučivanju polipeptida; promotor ili pojačivač je operativno povezan sa kodirajućom sekvencom ako utiče na transkripciju sekvence; ili je mesto vezivanja ribozoma operativno povezano sa kodirajućom sekvencom ako je postavljeno tako da olakša translaciju. Generalno, „operativno povezan“ znači da su DNK sekvence koje se povezuju neprekidno i, u slučaju sekretornog lidera, susedne i u fazi čitanja. Međutim, pojačivači ne moraju da budu neprekidni. Povezivanje se ostvaruje ligacijom na pogodnim restrikcionim mestima. Ako takva mesta ne postoje, koriste se sintetički oligonukleotidni adapteri ili povezivači u skladu sa uobičajenom praksom.

[0143] Izrazi „ćelija domaćin“, „ciljana ćelija“ ili „ćelija primalac“ imaju nameru da uključe bilo koju pojedinačnu ćeliju ili ćelijsku kulturu koja može biti ili je bila primala vektora ili ugradnje egzogenih molekula nukleinske kiseline, polinukleotide i/ili proteina. Takođe je predviđeno da uključi potomstvo jedne ćelije, gde potomstvo ne mora nužno biti potpuno identično (po morfologiji ili u genomskom ili ukupnom komplementu DNK) sa originalnom matičnom ćelijom zbog prirodne, slučajne ili namerne mutacije. Ćelije mogu biti prokariotske ili eukariotske i uključuju, ali nisu ograničene na bakterijske ćelije, ćelije kvasca, životinjske ćelije i ćelije sisara, na primer, mišje, pacovske, makaki ili ljudske.

[0144] Pogodne ćelije domaćini uključuju prokariotske i eukariotske ćelije domaćine uključujući kvasce, gljive, ćelije insekata i ćelije sisara.

Vezujući molekuli predmetnog pronalaska mogu se proizvesti u bakterijama. Posle eksprimiranja, vezujući molekul predmetnog pronalaska, poželjno vezujući molekul je izolovan iz E. Coli ćelijske paste u rastvorljivom fragmentu i može se prečistiti, na primer, afinitetnom hromatografijom i/ili hromatografijom isključenja veličine. Konačno prečišćavanje se može izvesti slično procesu prečišćavanja antitela eksprimiranog npr., u CHO ćelijama.

[0145] Pored prokariota, eukariotski mikrobi poput vlaknastih gljiva ili kvasaca su pogodni domaćini za kloniranje ili eksprimiranje za vezujući molekul predmetnog pronalaska.

Saccharomyces cerevisiae, ili uobičajeni pekarski kvasac, najčešće se koristi od nižih eukariotskih mikroorganizmima domaćina. Međutim, mnogi drugi rodovi, vrste i sojevi su ovde dostupni i korisni, kao što su Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces domaćini, npr. K. Lactis, K. fragilis (ATCC 12424), K. bulgaricus (ATCC 16045), K. wickeramii (ATCC 24178), K. waltii (ATCC 56500), K. drosophilarum (ATCC 36906), K. thermotolerans, i K. marxianus; yarrowia (EP 402226); Pichia pastoris (EP 183070);

Candida; Trichoderma reesia (EP 244234); Neurospora crassa; Schwanniomyces kao što su Schwanniomyces occidentalis; i vlaknaste gljive kao što su, na primer, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium i Aspergillus domaćini, kao što su A. nidulans i A. niger.

[0146] Pogodne ćelije domaćini za eksprimiranje glikoziliranog vezujućeg molekula pronalaska, poželjno vezujućeg molekula izvedenog iz antitela, su izvedeni iz višećelijskih organizama. Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata. Mnogobrojni bakuloviralni sojevi i varijante i odgovarajuće dozvoljene ćelije domaćini insekata, od domaćina kao što su Spodoptera frugiperda (gusenica), Aedes aegypti (komarac), Aedes albopictus (komarac), Drosophila melanogaster (voćna muha) i Bombyx mori su identifikovani. Raznovrsni virusni sojevi za transfekciju su javno dostupni, npr. g., L-1 varijanta Autographa californica NPV i Bm-5 soj Bombyx mori NPV i takvi virusi se mogu koristiti kao virus ovde prema predmetnom pronalasku, naročito za transfekciju Spodoptera frugiperda ćelija.

[0147] Biljne kulture pamuka, kukuruza, krompira, soje, petunije, paradajza, Arabidopsis i duvana mogu se takođe koristiti kao domaćini. S tručnjacima su poznati vektori kloniranja i eksprimiranja korisni u proizvodnji proteina u biljnoj kulturi ćelija. Pogledati npr. Hiatt i dr., Nature (1989) 342: 76-78, Owen i dr. (1992) Bio/Technology 10: 790-794, Artsaenko i dr.(1995) The Plant J 8: 745-750, i Fecker i dr. (1996) Plant Mol Biol 32: 979-986.

Međutim, interesovanje je bilo najveće za ćelije kičmenjaka, i razmnožavanje ćelija kičmenjaka u kulturi (kultura tkiva) postala je rutinska procedura. Primeri korisnih ćelijskih linija domaćina sisara su CV1 linija bubrega majmuna transformisana sa SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); ljudska embrionalna linija bubrega (293 ili 293 ćelije subklonirane za rast kulture suspenzije, Graham i dr. , J. Gen Virol.36 : 59 (1977)); ćelije bubrega beba hrčaka (BHK, ATCC CCL 10); jajne ćelije kineskog hrčka/-DHFR (CHO, Urlaub i dr. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); mišje sertoli ćelije (TM4, Mather, Biol. Reprod.23: 243-251 (1980)); ćelije bubrega majmuna (CVI ATCC CCL 70); ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76, ATCC CRL1587); ćelije ljudskog karcinoma grlića materice (HELA, ATCC CCL 2); ćelije bubrega psa (MDCK, ATCC CCL 34); ćelije jetre buffalo pacova (BRL 3A, ATCC CRL 1442); ljudske ćelije pluća (V138, ATCC CCL 75); ljudske ćelije jetre (Hep G2,1413 8065); mišji tumor dojke (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI ćelije (Mather i dr., Annals N. Y Acad. Sci.383 : 44-68 (1982)) MRC 5 ćelije; FS4 ćelije; i ljudska hepatoma linija (Hep G2).

[0148] Kada se koriste rekombinantne tehnike, vezujući molekul predmetnog pronalaska može se proizvesti unutar ćelije, u periplazmatskom prostoru, ili direktno izlučiti u medijum. Ako se vezujući molekul proizvodi unutarćelijski, kao prvi korak, ostaci čestica, bilo ćelije domaćini ili lizni fragmenti, uklanjaju se, na primer, centrifugiranjem ili ultrafiltracijom. Carter i dr., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) opisuju postupak za izolovanje antitela koja se izlučuju u periplazmatski prostor E. Coli. Ukratko, ćelijska pasta se odmrzava u prisustvu natrijum acetata (pH 3,5), EDTA i fenilmetilsulfonilfluorida (PMSF) tokom oko 30 minut. Ćelijski ostaci se mogu ukloniti centrifugiranjem. Kada se antitelo izlučuje u medijum, supernatanti iz takvih sistema eksprimiranja se obično prvo koncentrišu pomoću komercijalno dostupnog filtra za koncentraciju proteina, na primer, jedinice za ultrafiltraciju Amicon ili Millipore Pellicon. Inhibitor proteaze kao što je PMSF može biti uključen u bilo koji od prethodnih koraka za inhibiciju proteolize i antibiotici mogu biti uključeni da spreče rast slučajnih kontaminanata.

[0149] Vezujući molekul predmetnog pronalaska pripremljen iz ćelija domaćina može da se prečisti korišćenjem, na primer, hidroksilapatitske hromatografije, elektroforeze gela, dijalize i afinitetne hromatografije, gde je afinitetna hromatografija poželjna tehnika prečišćavanja.

[0150] Matrica na koju se vezuje afinitetni ligand najčešće je agaroza, ali dostupne su i druge matrice. Mehanički stabilne matrice kao što su kontrolisano porozno staklo ili poli (stirenedivinil) benzen omogućavaju brži protok i kraća vremena obrade nego što se to može postići sa agarozom. Tamo gde vezujući molekul predmetnog pronalaska sadrži domen CH3, Bakerbond ABXMresin (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) je koristan za prečišćavanje. Ostale tehnike za prečišćavanje proteina, kao što su fragmentisanje na koloni za jonsku razmenu, taloženje etanola, HPLC reverzne faze, hromatografija na silicijum dioksidu, hromatografija na heparin SEPHAROSE™, hromatografiji na smoli za razmenu anjona ili katjona (kao što je kolona poliaspartinske kiseline), hromato-fokusiranje, SDS-PAGE i taloženje amonijum sulfata su takođe dostupni u zavisnosti od antitela koje se mora izvući.

[0151] U sledećem aspektu predmetnog pronalaska, pruženi su procesi za proizvodnju vezujućih molekula predmetnog pronalaska, gde navedeni procesi uključuju kultivaciju ćelije domaćina definisanu ovde pod uslovima koji omogućavaju eksprimiranje vezujućeg molekula i izvlače proizvedene vezujuće molekule iz kulture.

[0152] Izraz „kultivacija“ odnosi se na in vitro održavanje, diferencijaciju, rast, proliferaciju i/ili razmnožavanje ćelija pod pogodnim uslovima u medijumu.

[0153] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na sastave koji sadrže vezujući molekul predmetnog pronalaska, ili su proizvedeni u skladu sa postupkom pronalaska. Tačnije, navedeni sastav je farmaceutski sastav.

[0154] Kako se ovde koristi, izraz „farmaceutski sastav“ odnosi se na sastav za primenu pacijentu, poželjno ljudskom pacijentu. Posebno poželjan farmaceutski sastav predmetnog pronalaska obuhvata vezujući molekul predmetnog pronalaska. Poželjno, farmaceutski sastav sadrži pogodne formulacije nosača, stabilizatora i/ili ekscipijenata. U poželjnom otelotvorenju, farmaceutski sastav sadrži sastav za parenteralnu, transdermalnu, intraluminalnu, intraarterijsku, intratekalnu i/ili intranazalnu primenu ili direktnom injekcijom u tkivo. Posebno je predviđeno da se navedeni sastav primenjuje pacijentu putem infuzije ili injekcije. primenu pogodnih sastava može se izvršiti na različite načine, npr., intravenskim, intraperitonealnim, potkožnim, intramuskularnim, lokalnim ili intradermalnim primenjivanjem. Posebno, predmetni pronalazak pruža neprekidnu primenu pogodnog sastava. Kao neograničavajući primer, neprekidna, tj. kontinuirana primena može se ostvariti sistemom malih pumpi koji pacijent nosi, za merenje priliva terapeutskog agensa u telo pacijenta. Farmaceutski sastav koja sadrži vezujući molekul predmetnog pronalaska može se primeniti korišćenjem navedenih sistema pumpi. Takvi sistemi pumpi su opšte poznati u struci i obično se oslanjaju na periodičnu razmenu patrona koje sadrže terapeutski agens koji se treba infuzirati. Kada se zamenjuje uložak u takvom sistemu pumpi, može doći do privremenog prekida inače neprekidnog protoka terapeutskog agensa u telo pacijenta. U takvom slučaju, faza primene pre zamene patrona i faza primene posle zamene patrona će se i dalje smatrati u okviru značenja farmaceutskih sredstava i postupaka predmetnog pronalaska koji zajedno čine jednu „neprekidnu primenu“ takvog terapeutskog agensa.

[0155] Kontinuirana ili neprekidna primena ovih vezujućih molekula predmetnog pronalaska može biti intravenska ili subkutana pomoću uređaja za dovod tečnosti ili sistema malih pumpi, uključujući mehanizam za pokretanje tečnosti za izvlačenje tečnosti iz rezervoara i mehanizam za aktiviranje pokretačkog mehanizma. Sistemi pumpi za potkožno primenu mogu sadržati iglu ili kanilu za prodiranje u kožu pacijenta i dovođenje odgovarajućeg sastava u pacijentovo telo. Navedeni sistemi pumpi mogu se direktno fiksirati ili pričvrstiti na kožu pacijenta nezavisno od vene, arterije ili krvnih žila, omogućavajući tako direktan dodir između sistema pumpi i kože pacijenta. Sistem pumpi može da se pričvrsti na kožu pacijenta tokom 24 sata do nekoliko dana. Sistem pumpi može biti malih dimenzija sa rezervoarima za male zapremine. Kao neograničavajući primer, zapremina rezervoara za odgovarajući farmaceutski sastav koji se primenjuje mogu biti između 0,1 i 50 ml.

[0156] Kontinuirana primena može biti transdermalna pomoću flastera koji se nosi na koži i zamenjuje u intervalima. Stručnjak u oblasti je svestan sistema flastera za isporuku lekova koji su pogodni za ovu svrhu. Treba primetiti da je transdermalna primena posebno podložna neprekidnoj primeni, jer se zamena prvog iscrpljenog flastera može pogodno izvršiti istovremeno sa postavljanjem novog, drugog flastera, na primer na površini kože odmah pored prvog iscrpljenog flaster i neposredno pre uklanjanja prvog iscrpljenog flastera. Ne dolazi do problema sa prekidom protoka ili kvara napajanja.

[0157] Sastavi pronalaska mogu dalje da sadrže farmaceutski prihvatljiv nosač. Primeri pogodnih farmaceutskih nosača su dobro poznati u struci i uključuju rastvore, npr. fiziološke rastvore puferisane fosfatima, voda, emulzije, kao što su emulzije ulja/vode, razne vrste ovlaživača, sterilni rastvori, lipozomi itd. Sastavi koji sadrže takve nosače mogu se formulisati dobro poznatim konvencionalnim postupcima. Formulacije mogu da sadrže ugljene hidrate, puferske rastvore, aminokiseline i/ili surfaktante. Karbohidrati mogu biti neredukujući šećeri, po mogućnosti trehaloza, saharoza, oktasulfat, sorbitol ili ksilitol.

Uglavnom, kako se ovde koristi, „farmaceutski prihvatljiv nosač“ označava bilo koji i sve rastvarače, disperzijske medijume, obloge, antibakterijske i antifungalne agense, izotonične i agensa za odlaganje apsorpcije, kompatibilne sa farmaceutskom primenom. Upotreba takvih medijuma i agenasa za farmaceutski aktivne supstance je dobro poznata u struci. Prihvatljivi nosači, ekscipijenti ili stabilizatori nisu toksični za primaoce u korišćenim dozama i koncentracijama i uključuju: dodatne puferske agense; konzervanse; ko-rastvarače; antioksidante, uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; helatorske agensi kao što je EDTA; metalne komplekse (npr., Zn-protein kompleksi); biorazgradive polimeri, poput poliestera; kontra-jone koji stvaraju so, kao što su natrijum, viševodonični šećerni alkoholi; aminokiseline kao što su alanin, glicin, asparagin, 2-fenilalanin i treonin; šećeri ili šećerni alkoholi, poput trehaloze, saharoze, oktasulfata, sorbitola ili ksilitola stahize, manoze, sorboze, ksiloze, riboze, mioinisitoze, galaktoze, laktitola, ribitola, mioinisitola, galaktolita, glicerola, ciklota (npr., ikolitit, npr., inositit), polieten glikoga; redukcione agense koji sadrže sumpor, kao što su glutation, tioktična kiselina, natrijum tioglikolat, tioglicerol, [alfa]-monotioglicerol i natrijum-tio sulfat; proteini male molekulske težine, kao što su albumin ljudskog seruma, goveđi serumski albumin, želatin ili drugi imunoglobulini; i hidrofilni polimeri, poput polivinilpirolidona. Takve formulacije se mogu koristiti za kontinuiranu primenu koja može biti intravenska ili subkutana sa i/ili bez sistema pumpi. Aminokiseline mogu biti naelektrisane aminokiseline, poželjno lizin, lizin acetat, arginin, glutamat i/ili histidin. Surfaktanti mogu biti deterdženti, poželjno sa molekulskom masom od >1,2 KD i/ili polieter, poželjno sa molekulskom masom >3 KD. Neograničavajući primeri poželjnih deterdženata su Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80 ili Tween 85. Neograničavajući primeri poželjnih polietera su PEG 3000, PEG 3350, PEG 4000 ili PEG 5000. Sistemi pufera korišćeni u predmetnom pronalasku mogu da imaju željeni pH od 5-9 i mogu da sadrže citrat, sukcinat, fosfat, histidin i acetat.

[0158] Sastavi predmetnog pronalaska mogu se primeniti pacijentu u odgovarajućoj dozi koja se može odrediti npr. studijama eskalacije doze primenom rastućih doza polipeptida predmetnog pronalaska koji pokazuju ovde opisanu specifičnost između vrsta za primate koji nisu šimpanze, na primer makaki. Kao što je gore izneto, vezujući molekul predmetnog pronalaska koji pokazuje ovde opisanu specifičnost između vrsta , može se povoljno koristiti u identičnom obliku u pred-kliničkim ispitivanjima na primatima koji nisu šimpanze, i kao lek kod ljudi. Ovi sastavi se takođe mogu primenjivati u kombinaciji sa drugim proteinima i neproteinima. Ovi lekovi se mogu primenjivati istovremeno sa sastavom koja sadrži polipeptid predmetnog pronalaska kako je ovde definisano, ili odvojeno pre ili posle primene navedenog polipeptida u blagovremeno definisanim intervalima i dozama. Režim doziranja će odrediti lekar i klinički faktori. Kao što je dobro poznato u medicinskoj struci, doziranje za jednog pacijenta zavisi od mnogih faktora, uključujući veličinu pacijenta, površinu tela, starost, određeno jedinjenje koje se treba primenjivati, pol, vreme i put primene, opšte zdravstveno stanje i druge lekovi koji se primenjuju istovremeno.

Preparati za parenteralnu primenu uključuju sterilne vodene ili nevodene rastvore, suspenzije i emulzije. Primeri nevodenih rastvarača su propilen glikol, polietilen glikol, biljna ulja poput maslinovog ulja i organski estri koji se mogu injektirati, kao što je etil oleat. Vodeni nosači uključuju vodu, alkoholne/vodene rastvore, emulzije ili suspenzije, uključujući fiziološki rastvor i puferisane medijume. Parenteralni nosači uključuju rastvor natrijum-hlorida, Ringerovu dekstrozu, dekstrozu i natrijum-hlorid, laktatirana Ringer-ova ulja, ili fiksirana ulja. Intravenski nosači uključuju obnavljivače tečnosti i hranljivih materija, obnavljače elektrolita (poput onih zasnovanih na Ringer-ovoj dekstrozi) i slično. Konzervansi i drugi aditivi takođe mogu biti prisutni, na primer, antimikrobni lekovi, antioksidanti, helatni agensi, inertni gasovi i slično. Pored toga, sastav predmetnog pronalaska može da sadrži proteinske nosače, kao što su, na primer, albumin u serumu ili imunoglobulin, poželjno ljudskog porekla. Predviđeno je da sastav predmetnog pronalaska može, pored polipeptida pronalaska koji je ovde definisan, sadržati i druge biološki aktivne agense, u zavisnosti od namera upotrebe. Takvi agensi mogu biti lekovi koji deluju na gastrointestinalni sistem, lekovi koji deluju kao citostatici, lekovi koji sprečavaju hiperurikemiju, lekovi koji inhibiraju imunoreakcije (npr. kortikosteroidi), lekovi koji moduliraju upalni odgovor, lekovi koji deluju na cirkulatorni sistem i/ili agensi poput citokina poznati u struci. Takođe je predviđeno da se vezujući molekul predmetnog pronalaska primenjuje u toku terapije, tj. u kombinaciji sa drugim lekom protiv raka.

[0159] Biološka aktivnost ovde definisanog farmaceutskog sastava može se utvrditi, na primer, ispitivanjem citotoksičnosti, kao što je opisano u pratećim primerima, u WO 99/54440 ili id strane Schlereth i dr. (Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1-12). „Efikasnost“ ili „in vivo efikasnost“, kako se ovde koristi, odnosi se na odgovor na terapiju farmaceutskim sastavom predmetnog pronalaska, korišćenjem npr. standardizovanih kriterijuma NCI odgovora. Uspeh ili in vivo efikasnost terapije korišćenja farmaceutskog sastava predmetnog pronalaska odnosi se na efikasnost sastava u odnosu na njegovu predviđenu nameni, tj. na sposobnost sastava da izazove svoj željeni efekat, tj. iscrpljivanje patoloških ćelija, npr. ćelija tumora. In vivo efikasnost se može pratiti utvrđenim standardnim postupcima za odgovarajuće entitete bolesti, uključujući, ali ne ograničavajući se na broj, razlike belih krvnih zrnaca, sortiranje ćelija aktivirano fluorescencijom i aspiraciju koštane srži. Pored toga, mogu se koristiti različiti parametri za kliničku hemiju specifične za bolest i druge utvrđene standardne postupke. Dalje, mogu se koristiti kompjuterski potpomognuta tomografija, rendgenski snimak, tomografija nuklearne magnetne rezonance (npr. za procenu odgovora na osnovu National Cancer Institute kriterijuma [Cheson BD, Horning SJ, Coiffier B, Shipp MA, Fisher RI, Connors JM, Lister TA, Vose J, Grillo-Lopez A, Hagenbeek A, Cabanillas F, Klippensten D, Hiddemann W, Castellino R, Harris NL, Armitage JO, Carter W, Hoppe R, Canellos GP. Report of an international workshop to standardize response criteria for non-Hodgkin's lymphomas. NCI Sponsored International Working Group. J Clin Oncol.1999 Apr;17(4):1244]), pozitronsko-emisijska tomografija, broj, razlike belih krvnih zrnaca, sortiranje ćelija aktivirano fluorescencijom i aspiraciju koštane srži, biopsije/histologije limfnih čvorova i različiti klinički hemijski parametri specifični za limfom (npr. laktat dehidrogenaza) i drugi utvrđeni standardni postupci.

[0160] Drugi glavni izazov u razvoju lekova kao što je farmaceutski sastav predmetnog pronalaska je predvidiva modulacija farmakokinetičkih svojstava. U tu svrhu se može uspostaviti farmakokinetički profil kandidata za lek, tj. profil farmakokinetičkih parametara koji utiču na sposobnost određenog leka da tretira određeno stanje. Farmakokinetički parametri leka koji utiču na sposobnost leka za tretman određenog entiteta bolesti uključuju, ali nisu ograničeni na: polu-život, količinu distribucije, metabolizam jetre u prvom prolazu i stepen vezivanja krvnog seruma. Na efikasnost datog leka može da utiče svaki od gore navedenih parametara.

[0161] „Polu-život“ znači vreme u kome se 50% primenjenog leka eliminiše putem bioloških procesa, npr. metabolizmom, izlučivanjem itd.

[0162] Pod „hepatičkim metabolizmom prvog prolaza“ podrazumeva se sklonost leka koji se metabolizuje pri prvom dodiru sa jetrom, tj. tokom prvog prolaska kroz jetru.

[0163] „Količina distribucije“ označava stepen zadržavanja leka u različitim delovima tela, kao što su npr. unutarćelijski i vanćelijski prostori, tkiva i organi itd. i distribucija leka unutar ovih odeljaka.

[0164] „Stepen vezivanja za serum u krvi“ označava sklonost leka da u interakciji sa proteinima u serumu u krvi, kao što je albumin, dovede do smanjenja ili gubitka biološke aktivnosti leka.

Farmakokinetički parametri takođe uključuju bioraspoloživost, vreme kašnjenja (Tlag), Tmax, stope apsorpcije, više naleta i/ili Cmax za određenu količinu primenjenog leka.

„Bioraspoloživost“ znači količina leka u odeljku krvi. „Vreme kašnjenja“ znači vremensko odlaganje između davanja leka i njegovog otkrivanja i merljivosti u krvi ili plazmi.

[0165] „Tmax“ je vreme posle kog se dostiže maksimalna koncentracija leka u krvi, i „Cmax“ je maksimalno dobijena koncentracija u krvi sa datim lekom. Na vreme postizanja koncentracije leka u krvi ili tkivu koje je potrebno za njegovo biološko dejstvo utiču svi parametri. Farmakokinetički parametri bispecifičnih jednolančanih antitela koja pokazuju unakrsnu specifičnost, koja se može odrediti pred-kliničkim ispitivanjima na životinjama na primatima koji nisu šimpanze, takođe su navedeni, npr. u publikaciji od Schlereth i dr.

(Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1-12).

[0166] Izraz „toksičnost“, kako se ovde koristi, odnosi se na toksične efekte leka koji se manifestuju u neželjenim događajima ili teškim neželjenim događajima. Ovi sporedni događaji mogu se odnositi na nedostatak podnošljivosti leka uopšte i/ili na nedostatak lokalne tolerancije posle primene. Toksičnost takođe može da uključi teratogene ili kancerogene efekte izazvane lekom.

[0167] Izraz „sigurnost“, „in vivo sigurnost“ ili „podnošljivost“ kako se ovde koristi definiše primenu leka bez izazivanja teških neželjenih događaja direktno posle primene (lokalna tolerancija) i tokom dužeg perioda primene leka. „Bezbednost“, „in vivo bezbednost“ ili „podnošljivost“ može se proceniti npr. u redovnim intervalima tokom perioda tretmana i praćenja. Merenja uključuju kliničku procenu, npr. manifestacije organa i skrining laboratorijskih abnormalnosti. Klinička procena se može izvršiti i odstupanja od normalnih nalaza evidentirati/kodirani prema NCI-CTC i/ili MedDRA standardima. Manifestacije organa mogu uključivati kriterijume kao što su alergija/imunologija, krv/koštana srž, srčana aritmija, koagulacija i slično, kao što je navedeno npr. u Common Terminology Criteria za neželjene događaje v3.0 (CTCAE). Laboratorijski parametri koji se mogu testirati uključuju na primer hematologiju, kliničku hemiju, profil koagulacije i analizu urina i ispitivanje drugih telesnih tečnosti kao što su serum, plazma, limfoidna ili kičmena tečnost, likvor i sl.

Bezbednost može biti tako procenjena npr. fizičkim pregledom, tehnikama snimanja (tj. ultrazvukom, rendgenom, CT skeniranjem, magnetnom rezonancom (MRI), drugim merama sa tehničkim uređajima (tj. elektrokardiogram), vitalnih znakova, merenjem laboratorijskih parametara i beleženjem štetnih događaja. Na primer, neželjeni događaji kod primata koji nisu šimpanze u upotrebama i postupcima prema pronalasku mogu se ispitati histopatološkim i/ili histohemijskim postupcima.

Izraz „efikasna doza“ ili „efektivna doza“ je definisan kao količina dovoljna da se postigne ili bar delimično postigne željeni efekat. Izraz „terapeutski efikasna doza“ je definisan kao količina dovoljna da izleči ili bar delimično zaustavi bolest i njene komplikacije kod pacijenta koji već pati od bolesti. Količine koje su efikasne za ovu upotrebu zavise od težine infekcije i opšteg stanja imunog sistema pacijenta. Izraz „pacijent“ uključuje ljude i druge sisare koji su primali ili profilaktički ili terapeutski tretman.

[0168] Izraz „efikasna i netoksična doza“, kako se ovde koristi, odnosi se na podnošljivu dozu vezujućeg molekula pronalaska koja je dovoljno visoka da izazove iscrpljivanje patoloških ćelija, eliminaciju tumora, smanjenje tumora ili stabilizaciju bolesti bez ili u suštini bez većih toksičnih efekata. Takve efikasne i netoksične doze mogu se odrediti, npr. prema studijama eskalacije doze opisanim u struci i treba da budu ispod doze koja izaziva teške neželjene efekte (toksičnost koja ograničava dozu, DLT).

[0169] Gore navedeni izrazi se takođe koriste npr. u Preclinical safety evaluation of biotechnology-derived pharmaceuticals S6; ICH Harmonised Tripartite Guideline; ICH Steering Committee sastanak 16. jula 1997.

[0170] Odgovarajuća doza, ili terapeutski efikasna količina vezujućeg molekula prema pronalasku zavisiće od stanja koje se tretira, težine stanja, prethodne terapije i kliničke anamneze pacijenta i odgovora na terapijski agens. Odgovarajuća doza može se prilagoditi prema proceni lekara tako da se pacijentu može primenjivati jednokratno ili tokom niza primena. Farmaceutski sastav se može primeniti kao jedini terapeutik ili u kombinaciji sa dodatnim terapijama, kao što su terapije protiv raka, po potrebi.

[0171] Farmaceutski sastavi predmetnog pronalaska su naročito korisni za parenteralnu primenu, tj. subkutano, intramuskularno, intravenski, intraartikularno i/ili intra-sinovijalno. Parenteralna primena može biti bolusnom injekcijom ili kontinuiranom infuzijom.

[0172] Ako je farmaceutski sastav liofilizovan, liofilizovani materijal se prvo rekonstituiše u odgovarajućoj tečnosti pre primene. Liofilizirani materijal može biti rekonstituisan u, na primer, bakteriostatskoj vodi za ubrizgavanje (BWFI), fiziološkom rastvoru soli, fiziološkom rastvoru puferisanom fosfatima (PBS) ili istoj formulaciji u kojoj je protein bio pre liofilizacije. Poželjno, vezujući molekul predmetnog pronalaska ili proizveden postupkom predmetnog pronalaska koristi se u prevenciji, tretmanu ili poboljšanju bolesti odabrane od proliferativne bolesti, tumorske bolesti ili imunog poremećaja.

[0173] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na postupak za prevenciju, tretman ili poboljšanje bolesti odabrane od proliferativne bolesti, tumorske bolesti ili imunog poremećaja koji sadrži korak primene pacijentu kome je potreban vezujući molekul predmetnog pronalaska, ili proizveden postupkom predmetnog pronalaska.

[0174] Ovde opisane formulacije su korisne kao farmaceutski sastavi za tretman, poboljšanje i/ili sprečavanje patološkog medicinskog stanja kao što je ovde opisano kod pacijenta kome je to potrebno. Izraz „tretman“ odnosi se i na terapeutski tretman i na profilaktičke ili preventivne mere. Tretman uključuje upotrebu ili primenu formulacije u telo, izolovano tkivo ili ćeliju pacijenta koji ima bolest/poremećaj, simptom bolesti/poremećaja ili predispoziciju za bolest/poremećaj, sa ciljem da tretira, izleči, ublažava, olakša, menja, obnovi, poboljšava, popravi ili utiče na bolest, simptom bolesti ili predispoziciju za bolest.

[0175] Oni „kojima je potreban tretman“ uključuju one koji već imaju poremećaj, kao i one kod kojih će poremećaj biti sprečen. Izraz „bolest“ je svako stanje koje bi imalo koristi od tretmana ovde opisanom proteinskom formulacijom. Ovo uključuje hronične i akutne poremećaje ili bolesti, uključujući ona patološka stanja koja predisponiraju sisara za predmetnu bolest. Neograničavajući primeri bolesti/poremećaja koji će se ovde lečiti uključuju proliferativnu bolest, tumorsku bolest ili imuni poremećaj.

[0176] Poželjno, vezujući molekul predmetnog pronalaska je za upotrebu u prevenciji, tretmanu ili poboljšanju poremećaja B ćelija koji su u korelaciji sa BCMA (prekomernim) eksprimiranjem, poput poremećaja plazma ćelija i/ili autoimunih bolesti. Autoimuna bolest je, na primer, sistemski eritemod lupusa ili reumatoidni artritis.

[0177] Predmetni pronalazak takođe pruža postupak za tretman ili poboljšanje poremećaja B ćelija koji su u korelaciji sa BCMA (prekomernim) eksprimiranjem, kao što su poremećaji u plazma ćelijama, i/ili autoimunim bolestima, koji obuhvataju korak primene pacijentu kome je potreban molekul za vezivanje predmetnog pronalaska. Autoimuna bolest je, na primer, sistemski lupus eritematodes ili reumatoidni artritis.

Kod poremećaja u plazma ćelijama jedan klon plazma ćelija se nekontrolisano umnožava. Kao rezultat toga, ovaj klon stvara ogromne količine jednog (monoklonskog) antitela poznatog kao M-protein. U nekim slučajevima, kao što je slučaj sa monoklonskim gamopatijama, dobijeno antitelo je nepotpuno, sastoji se od samo lakih ili teških lanaca. Ove nenormalne ćelije plazme i antitela koja proizvode su obično ograničene na jednu vrstu. Poželjno, poremećaj plazma ćelija je izabran iz grupe koju čine multipli mijelom, plazmacitom, leukemija plazma ćelija, makroglobulinemije, amiloidoza, Waldenstrom-ova makroglobulinemija, solitarni plazmocitom kostiju, ekstramedularni plazmocitom, osteosklerotični mijelom, bolesti teškog lanca, monoklonska gamopatija neodređenog značaja i tinjajući multipli mijelom.

Predmetni pronalazak se takođe odnosi na komplete koji sadrže vezujući molekul predmetnog pronalaska, molekul nukleinske kiseline predmetnog pronalaska, vektor pronalaska ili ćeliju domaćina pronalaska. Komplet može da sadrži jednu ili više bočica koje sadrže vezujući molekul i uputstva za upotrebu. Komplet takođe može da sadrži agens za primenu vezujućeg molekula predmetnog pronalaska, kao što su špric, pumpa, infuzer ili slično, agensa za rekonstituciju vezujućeg molekula predmetnog pronalaska i/ili agensa za razblaživanje vezujućeg molekula predmetnog pronalaska.

[0178] Dalje, predmetno obelodanjenje se odnosi na upotrebu klastera epitopa 3 od BCMA, poželjno ljudskog BCMA, za stvaranje vezujućeg molekula, poželjno antitela koje se može vezati za BCMA, poželjno ljudsko BCMA. Klaster epitopa 3 od BCMA pogodno odgovara aminokiselinskim ostacima 24 do 41 iz sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 1002.

[0179] Pored toga, predmetno obelodanjenje pruža postupak za stvaranje antitela, poželjno bispecifičnog vezujućeg molekula, koji je sposoban da se vezuje za BCMA, poželjno ljudski BCMA, koji sadrži

(a) imunizaciju životinje polipeptidom koji sadrži klaster epitopa 3 od BCMA, poželjno ljudskog BCMA, gde klaster epitopa 3 od BCMA odgovara aminokiselinskim ostacima 24 do 41 u sekvenci kao što je prikazano u SEQ ID NO: 1002,

(b) dobijanje navedenog antitela i

(c) opciono pretvaranje navedenog antitela u bispecifični vezujući molekul koji se može vezati za ljudski BCMA i poželjno za CD3.

Poželjno, korak (b) uključuje da se dobijeno antitelo testira na sledeći način:

kada se odgovarajući klaster epitopa u ljudskom BCMA proteinu razmenjuje sa odgovarajućim klasterom epitopa mišjeg BCMA antigena (što rezultuje konstruktom koji sadrži ljudski BCMA, gde je ljudski klaster epitopa 3 zamenjen mišjim klasterom epitopa 3; pogledati SEQ ID NO: 1011) doći će do smanjenja vezivanja antitela. Navedeno smanjenje je poželjno najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%; poželjnije najmanje 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ili čak 100% u poređenju sa odgovarajućim klasterom epitopa u ljudskom BCMA proteinu, gde se vezivanje na odgovarajući klaster epitopa u ljudskom BCMA proteinu postavlja na 100%. Predviđeno je da se navedene ljudski BCMA/mišji BCMA himere eksprimiraju u CHO ćelijama. Takođe je predviđeno da su ljudski BCMA/mišji BCMA himere spojeni sa transmembranskim domenom i/ili citoplazmatičnim domenom različitog proteina vezanog za membranu, kao što je EpCAM; pogledati Sliku 2a.

Postupak za testiranje ovog gubitka vezivanja usled razmene sa odgovarajućim klasterom epitopa BCMA antigena ne-ljudskog (npr. mišjeg) BCMA je opisan u priloženim primerima, naročito u Primerima 1-3.

[0180] Postupak može dalje uključivati testiranje da li se antitelo vezuje na klaster epitopa 3 od ljudskog BCMA i da li je dalje sposobno da se vezuje za klaster epitopa 3 makaki BCMA, kao što je BCMA od Macaca mulatta (SEQ ID NO: 1017) ili Macaca fascicularis (SEQ ID NO: 1017).

[0181] Dalje su pruženi vezujući molekuli koji sadrže bilo koju od sekvenci aminokiselina prikazanih u SEQ ID NO: 1-1000 i 1022-1093.

Poželjno, vezujući molekul sadrži tri VH CDR sekvence (nazvane „VH CDR1“, „VH CDR2“, „VH CDR3“, pogledati četvrtu kolonu priložene Tabele sekvenci) iz molekula koji se vezuje pod nazivom „BCMA-(X)“, gde X jeste 1-100 (pogledati drugu kolonu priložene Tabele sekvence) i/ili tri VL CDR sekvence (nazvane „VL CDR1“, „VH CDR2“, „VH CDR3“, pogledati četvrtu kolonu priložene Tabele sekvenci) iz izraza BCMA-X koji se vezuje za molekulu, gde je X 1-100 (pogledati drugu kolonu priložene Tabele sekvence).

Poželjno, vezujući molekul sadrži VH i/ili VL sekvencu kako je dato u priloženoj Tabeli sekvenci (pogledati četvrtu kolonu priložene Tabele sekvence: „VH“ i „VL").

Poželjno, vezujući molekul sadrži scFV sekvencu kako je dato u priloženoj Tabeli sekvenci (pogledati četvrtu kolonu priložene Tabele sekvence: „scFv").

Poželjno, vezujući molekul sadrži bispecifičnu sekvencu molekula kako je data u priloženoj Tabeli sekvenci (pogledati četvrtu kolonu priložene Tabele sekvence: „bispecifični molekul").

[0182] Ovde je takođe obelodanjen bispecifičan vezujući agens koji sadrži najmanje dva vezujuća domena, koji sadrže prvi vezujući domen i drugi vezujući domen, gde se navedeni prvi vezujući domen vezuje na antigen BCMA za sazrevanje B ćelija i gde se navedeni drugi vezujući domen vezuje na CD3 (stavka 1) takođe uključujući sledeće stavke :

Stavka 2. Bispecifični vezujući agens iz stavke 1, gde se navedeni vezujući domen vezuje na vanćelijski domen BCMA, i navedeni drugi vezujući domen se vezuje na ε lanac od CD3. Stavka 3. Bispecifični vezujući agens iz stavke 1 ili 2, koje je u obliku antitela pune dužine ili fragmenta antitela.

Stavka 4. Bispecifični vezujući agens iz stavke 3 u obliku antitela pune dužine, gde je navedeni prvi BCMA domen izveden iz mišjeg i gde je drugi domen koji vezuje CD3 izveden iz pacova.

Stavka 5. Bispecifični vezujući agens iz stavke 3, koje je u obliku fragmenta antitela u obliku dijatela koje sadrži varijabilni domen teškog lanca povezan na varijabilni domen lakog lanca na istom polipeptidnom lancu tako da se dve domene ne spajaju.

Stavka 6. Bispecifični vezujući agens iz stavke 1 ili 2, koji je u obliku bispecifičnog jednolančanog antitela koje se sastoji od dva scFv molekula povezana preko veznik peptida ili molekula ljudskog serumskog albumina.

Stavka 7. Bispecifični vezujući agens iz stavke 6, regioni teškog lanca (VH) i odgovarajući varijabilni regiona lakog lanca (VL) su raspoređeni, od N-terminusa do C-terminusa, redosledom

VH(BCMA)-VL(BCMA) -VH(CD3)-VL(CD3),

VH(CD3)-VL(CD3) -VH(BCMA)-VL(BCMA) ili

VH CD3)-VL(CD3)-VL(BCMA)-VH(BCMA).

Stavka 8. Bispecifični vezujući agens iz stavke 1 ili 2, koje je u obliku domena jednodomenskog imunoglobulina odabranog između VHH ili VH.

Stavka 9. Bispecifični vezujući agens iz stavke 1 ili 2, koje je u obliku Fv molekula koji ima četiri varijabilna domena antitela sa najmanje dva vezujuća domena, gde je najmanje jedan vezujući domen specifičan za ljudski BCMA i najmanje jedan vezujući domen je specifičan za ljudski CD3.

Stavka 10. Bispecifični vezujući agens iz stavke 1 ili 2, koje je u obliku jednolančanog vezujućeg molekula koji se sastoji od prvog vezujućeg domena specifičnog za BCMA, konstantnog pod-regiona koji je smešten C-terminalno u odnosu na navedeni prvo vezujući domena, škorpijski veznik smešten C-terminalno u odnosu na konstantni pod-region i drugi vezujući domen specifičan za CD3, koji se nalazi C-terminalno u odnosu na navedeni konstantni pod-region.

Stavka 11. Bispecifični vezujući agens iz stavke 1 ili 2, koje je u obliku molekula sličnog antitelu koje se vezuje za BCMA preko dva teška lanac/laki lanac Fv antitela ili fragmenta antitela i koje se vezuje za CD3 preko vezujućeg domen koji je konstruisan u ne-CDR petljama teškog lanca ili lakog lanac navedenog antitela ili fragmenta antitela.

Stavka 12. Bispecifični vezujući agens iz stavke 1, koji je u obliku bispecifičnog molekula ankirin ponavljanja.

Stavka 13. Bispecifični vezujući agens iz stavke 1, gde navedeni prvi vezujući domen ima oblik izabran od oblika definisanih u bilo kojoj od stavki 3 do 12 i gde navedeni drugi vezujući domen ima drugačiji oblik odabran od oblika definisanih u bilo kojoj stavci 3 do 12. Stavka 14. Bispecifični vezujući agens iz stavke 1, koje je biciklički peptid.

Stavka 15. Farmaceutski sastav koji sadrži najmanje jedan bispecifični vezujući agens iz bilo koje od stavki 1 do 14.

Stavka 16. Bispecifični vezujući agens prema bilo kojoj od stavki 1 do 14 ili farmaceutski sastav iz stavke 14 za tretman poremećaja plazma ćelija ili drugih poremećaja B ćelija koji su u korelaciji sa eksprimiranjem BCMA i za tretman autoimunih bolesti.

Stavka 17. Bispecifični vezujući agens prema bilo kojoj od stavki 1 do 14 ili farmaceutski sastav iz stavke 15 za tretman poremećaja plazma ćelija izabran od plazmacitoma, leukemije plazma ćelija, multiplog mijeloma, makroglobulinemije, amiloidoze, Waldenstrom-ove makroglobulinemije, solitarnog plazmacitoma kostiju, ekstramedularnog plazmacitoma, osteosklerotičnog mijeloma, bolesti teškog lanca, monoklonske gamopatija neodređenog značaja, tinjajućeg multiplog mijeloma.

Varijacije gornjih stavki mogu se izvesti iz EP 10191 418.2 koji su takođe ovde obelodanjeni.

Slike prikazuju:

[0183]

Slika 1:

Usklađivanje rasporeda vanćelijskog domena (BCD) ljudskog BCMA (aminokiselinski ostaci 1-54 proteina cele dužine) i mišjeg BCMA (aminokiselinski ostaci 1-49 proteina cele dužine). Istaknuti su regioni (domeni ili aminokiselinski ostaci) koji su razmenjeni u himernim konstruktima, kako je određeno za grupisanje epitopa. Cisteini su prikazane crnim okvirima. Označene su disulfidne veze.

Slika 2:

Mapiranje epitopa BCMA konstrukata. Ljudski i mišji BCMA (slika 2a) kao i sedam himernih BCMA konstrukata od ljudi i miševa (slika 2b) eksprimirani na površini CHO ćelija kao što je prikazano protočnom citometrijom. Eksprimiranje ljudskog BCMA na CHO detektovano je monoklonskim anti-ljudskim BCMA antitelom. Eksprimiranje mišjeg BCMA detektovano je monoklonskim anti-mišjim BCMA antitelom. Vezano monoklonsko antitelo detektovano je anti-pacovskim IgG-Fc-gama-specifičnim antitelom konjugovanim sa fikoeritrinom.

Slika 3:

Primeri vezujućih molekula specifičnih za klaster epitopa E3, kako je detektovano mapiranjem epitopa himernih BCMA konstrukata (pogledati primer 3).

Slika 4:

Određivanje konstante vezivanja bispecifičnih vezujućih molekula (anti BCMA x anti CD3) na ljudskom i makaki BCMA pomoću Biacore sistema. Antigen je imobilisan u CM5 čipu sa niskom do srednjom gustinom (100 RU). Razblaženja veznika su puštena iznad površine čipa i vezivanje određeno pomoću BiaEval softvera. Odgovarajuće off-stope i konstanta vezivanja (KD) odgovarajućih veznika prikazani su ispod svakog grafika.

Slika 5:

Citotoksična aktivnost BCMA bispecifičnih antitela izmerena za 18-časovnom testu oslobađanja<51>hroma. Efektorske ćelije : stimulisane obogaćene ljudske CD8 T ćelije. Ciljane ćelije: Ljudskim BCMA transfektovane CHO ćelije (leva slika) i makaki BCMA transfektovane CHO ćelije (desna slika). Odnos efektorske-ciljane ćelije (E:T): 10:1.

Slika 6:

Određivanje konstanta vezivanja BCMA/CD3 bispecifičnih antitela klastera epitopa E3 na ljudskom i makaki BCMA, i na ljudskom i makaki CD pomoću Biacore sistema. Antigen je imobilisan u CM5 čipu sa niskom do srednjom gustinom (100-200 RU). Razblaženja bispecifičnih antitela su puštena po po površini čipa i vezivanje je određeno pomoću BiaEval softvera. Respektivne on- i off-stope i rezultujuća konstanta vezivanja (KD) odgovarajućih bispecifičnih antitela prikazani su ispod svakog grafika.

Slika 7:

FACS analiza BCMA/CD3 bispecifičnih antitela klastera epitopa E3 na naznačenim ćelijskim linijama: 1) ljudskim BCMA transfektovane CHO ćelije, 2) ljudskim CD3 pozitivna ljudska T ćelijska linije HBP-ALL, 3) makaki BCMA transfektovane CHO ćelije, 4) makaki T ćelijska linija 4119 LnPx, 5) BCMA-pozitivna ljudska multipla mijelomijska ćelijska linija NCI-H929 i 6) netrafikovane CHO ćelije. Negativne kontrole [1) do 6]]: antitela za detektovanje bez prethodnih BCMA/CD3 bispecifičnih antitela.

Figura 8:

Scatchard analiza BCMA/CD3 bispecifičnih antitela na ćelijama koje eksprimiraju BCMA. Ćelije su inkubirane sa povećanjem koncentracije monomernih antitela do zasićenja. Antitela su detektovana protočnom citometrijom. Vrednosti trostrukih merenja prikazane su kao hiperboličke krive i kao sigmoidne krive kako bi se prikazao korišćeni raspon koncentracija. Maksimalno vezivanje određeno je korišćenjem Scatchard procene i izračunate su odgovarajuće vrednosti KD.

Slika 9:

Citotoksična aktivnost BCMA/CD3 bispecifičnih antitela klastera epitopa E3, izmerena u 18-časovnom testu oslobađanja 51-hroma na CHO ćelije transfektovane sa ljudskim BCMA. efektorske ćelije: stimulisane obogaćene ljudske CD8 T ćelije. Odnos efektorske-ciljane ćelije (E:T): 10:1.

Slika 10:

Citotoksična aktivnost BCMA/CD3 bispecifičnih antitela klastera epitopa E3 izmerena u 48-časovnom FACS testu citotoksičnosti. Efektorske ćelije: nestimulisani ljudski PBMC. Ciljane ćelije: CHO ćelije koje su transfektovane ljudskim BCMA. Odnos efektorske-ciljane ćelije (E:T): 10:1.

Slika 11:

FACS analiza BCMA/CD3 bispecifičnih antitela klastera epitopa E3 na BAFF-R i TACI transfektovanim CHO ćelijama. Ćelijske linije: 1) ljudske BAFF-R transfektovane CHO ćelije, 2) ljudske TACI transfektovane CHO ćelije 3) ćelijska linija multiplog mijeloma L363; negativne kontrole: detektovanje antitela bez prethodnog BCMA/CD3 bispecifičnog antitela. Pozitivne kontrole: detektovanje BAFF-R: kozji anti-ljudski BAFF-R (R&D AF1162; 1:20) detektovan anti-kozjim antitelom-PE (Jackson 705-116-147; 1:50) TACI-detektovanje: zečje anti TACI antitelo (abcam AB 79023; 1:100) detektovano od strane kozjeg anti-zečjeg antitela PE (Sigma P9757; 1:20).

Slika 12:

Citotoksična aktivnost BCMA/CD3 bispecifičnih antitela izmerena u 18-časovnom testu oslobađanja 51-hroma. Efektorske ćelije: stimulisane obogaćene ljudske CD8 T ćelije. Ciljane ćelije: BCMA-pozitivna ćelijska linija ljudskog multiplog mijeloma L363 (tj. prirodno ekspresor). Odnos efektorske-ciljane ćelije (E:T): 10:1.

Slika 13:

Citotoksična aktivnost BCMA/CD3 bispecifičnih antitela izmerena u ispitivanju citotoksičnosti zasnovanom na FACS tokom 48 sati. Efektorske ćelije: nestimulisani ljudski PBMC. Ciljane ćelije: ljudska ćelija multiplog mijeloma L363 (prirodni BCMA ekspresor). Odnos efektorske-ciljane ćelije (E:T): 10:1.

Slika 14:

Citotoksična aktivnost BCMA/CD3 bispecifičnih antitela izmerena u ispitivanju citotoksičnosti zasnovanom na FACS tokom 48 sati. Efektorske ćelije: nestimulisani ljudski PBMC. Ciljane ćelije: BCMA-pozitivna ćelijska linija ljudskog multiplog mijeloma NCI-H929. Odnos efektorske-ciljane ćelije (E:T): 10:1.

Slika 15:

Citotoksična aktivnost BCMA/CD3 bispecifičnih antitela izmerena u ispitivanju citotoksičnosti zasnovanom na FACS tokom 48 sati. Efektorske ćelije: makaki T ćelijska linija 4119LnPx. Ciljane ćelije: CHO ćelije transfektovane sa makaki BCMA. Odnos efektorske-ciljane ćelije (E:T): 10:1.

Slika 16:

Anti-tumorska aktivnost BCMA/CD3 bispecifičnih antitela klastera epitopa E3 u modelu ksenografta napredne faze NCI-H929 (pogledati Primer 16).

Slika 17:

Analiza citotoksičnosti zasnovana na FACS korišćenjem ljudskih ćelijskih linija multiplog mijeloma NCI-H929, L-363 i OPM-2 kao ciljane ćelije i ljudskim PBMC kao efektorske ćelija (48 sati; E:T = 10:1). Na slici su prikazani nivoi citokina [pg/ml] koji su određeni za II2, IL-6, IL-10, TNF i IFN-gama pri povećanim koncentracijama BCMA/CD3 bispecifičnih antitela klastera epitopa E3 (pogledati Primer 22).

Primeri:

[0184] Naredni primeri ilustruju pronalazak. Ove primere ne treba tumačiti kao ograničavanje opsega predmetnog pronalaska. Primeri su uključeni radi ilustracije, i predmetni pronalazak je ograničen samo patentnim zahtevima.

Primer 1

Generisanje CHO ćelija koje eksprimiraju himerni BCMA

[0185] Za konstrukciju molekula himernog epitopa za mapiranje, aminokiselinska sekvenca odgovarajućih domena epitopa ili pojedinačni aminokiselinski ostatak ljudskog BCMA su promenjeni u mišju sekvencu. Konstruisani su sledeći molekuli:

• Ljudski BCMA ECD / E1 mišji (SEQ ID NO: 1009)

Himerni vanćelijski BCMA domen: Ljudski vanćelijski BCMA domen gde je klaster epitopa 1 (aminokiselinski ostaci 1-7 od SEQ ID NO: 1002 ili 1007) zamenjen odgovarajućim mišjim klasterom (aminokiselinski ostaci 1-4 od SEQ ID NO: 1004 ili 1008)

→ brisanje aminokiselinskih ostataka 1-3 i G6Q mutacija u SEQ ID NO: 1002 ili 1007

• Ljudski BCMA ECD / E2 mišji (SEQ ID NO: 1010)

Himerni vanćelijski BCMA domen: Ljudski vanćelijski BCMA domen gde je klaster epitopa 2 (aminokiselinski ostaci 8-21 od SEQ ID NO: 1002 ili 1007) zamenjen odgovarajućim mišjim klasterom (aminokiselinski ostaci 5-18 od SEQ ID NO: 1004 ili 1008)

→ S9F, Q10H, i N11S mutacije u SEQ ID NO: 1002 ili 1007

• Ljudski BCMA ECD/E3 mišji (SEQ ID NO: 1011)

Himerni vanćelijski BCMA domen: Ljudski vanćelijski BCMA domen gde je klaster epitopa 3 (aminokiselinski ostaci 24-41 od SEQ ID NO: 1002 ili 1007) zamenjen odgovarajućim mišjim klasterom (aminokiselinski ostaci 21-36 od SEQ ID NO: 1004 ili 1008)

→ brisanje aminokiselinskih ostataka 31 i 32 i Q25H, S30N, L35A, i R39P mutacija u SEQ ID NO: 1002 ili 1007

• Ljudski BCMA ECD / E4 mišji (SEQ ID NO: 1012)

Himerni vanćelijski BCMA domen: Ljudski vanćelijski BCMA domen gde je klaster epitopa 4 (aminokiselinski ostaci 42-54 od SEQ ID NO: 1002 ili 1007) zamenjen odgovarajućim mišjim klasterom (aminokiselinski ostaci 37-49 od SEQ ID NO: 1004 ili 1008)

→ N42D, A43P, N47S, N53Y i A54T mutacije u SEQ ID NO: 1002 ili 1007

• Ljudski BCMA ECD / E5 mišji (SEQ ID NO: 1013)

Himerni vanćelijski BCMA domen: Ljudski vanćelijski BCMA domen gde je aminokiselinski ostatak na položaju 22 od SEQ ID NO: 1002 ili 1007 (izoleucin) zamenjen svojim odgovarajućim mišjim aminokiselinskim ostatkom od SEQ ID NO: 1004 ili 1008 (lizin, položaj 19)

→ I22K mutacija u SEQ ID NO: 1002 ili 1007

• Ljudski BCMA ECD / E6 mišji (SEQ ID NO: 1014)

Himerni vanćelijski BCMA domen: Ljudski vanćelijski BCMA domen gde je aminokiselinski ostatak na položaju 25 od SEQ ID NO: 1002 ili 1007 (glutamin) zamenjen svojim odgovarajućim mišjim aminokiselinskim ostatkom od SEQ ID NO: 1004 ili 1008 (histidin, položaj 22)

→ Q25H mutacija u SEQ ID NO: 1002 ili 1007

• Ljudski BCMA ECD / E7 mišji (SEQ ID NO: 1015)

Himerni vanćelijski BCMA domen: Ljudski vanćelijski BCMA domen gde je aminokiselinski ostatak na položaju 39 od SEQ ID NO: 1002 ili 1007 (arginin) zamenjen svojim odgovarajućim mišjim aminokiselinskim ostatkom od SEQ ID NO: 1004 ili 1008 (prolin, položaj 34)

→ R39P mutacija u SEQ ID NO: 1002 ili 1007

A) cDNK konstrukti su klonirani u pEF-DHFR sisarski vektor eksprimiranja i stabilno se transfektuju u CHO ćelije. Eksprimiranje ljudskog BCMA na CHO ćelijama je verifikovano u FACS testu korišćenjem monoklonskog anti-ljudskog BCMA antitela. Eksprimiranje mišjeg BCMA je demonstrirano monoklonskim anti-mišjim BCMA antitelom. Korišćena koncentracija BCMA antitela je bila 10 µg/ml inPBS/2% FCS. Vezana monoklonska antitela su detektovana sa anti-pacovski-IgG-Fci-PE (1:100 u PBS/2% FCS; Jackson-Immuno-Research #112-116-071). Kao negativna kontrola, ćelije su inkubirane sa PBS/2% FCS umesto prvog antitela. Uzorci su mereni protočnom citometrijom na FACSCanto II instrumentu(Becton Dickinson) i analizirani FlowJo softverom(Verzija 7.6). Površinsko eksprimiranje ljudskih i mišjih BCMA himera, transfektovane CHO ćelije su analizirane i potvrđeno je testom protočne citometrije sa različitim anti-BCMA antitelima (Slika 2).

B) Za generisanje CHO ćelija koje eksprimiraju ljudski, makaki, mišji i ljudsko/mišji himerni transmembranski BCMA, kodirajuće sekvence ljudskih, makaki, mišjih BCMA i ljudskomišjih BCMA humera (BCMA sekvence objavljene u GenBank, pristupni brojevi NM_001192 [ljudski]; NM_011608 [mišji] i XM_001106892 [makaki]) dobijeni su sintezom gena u skladu sa standardnim protokolima. Fragmenti sinteze gena su dizajnirani tako da sadrže prvo Kozak mesto za eukariotsko eksprimiranje konstrukata i kodirajuću sekvencu 19 aminokiselinskih imunoglobulinskih lider peptida, praćeno u okviru kodirajućom sekvencom BCMA proteina, respektivno, u slučaju himera sa odgovarajućim domenima epitopa ljudske sekvence izmenjene za mišju sekvencu.

[0186] Osim za ljudski BCMA ECD/E4 mišji i ljudski BCMA konstrukt, kodirajuća sekvenca vanćelijskog domena BCMA proteina praćena je u okviru kodirajućom sekvencom veštačkog Ser1-Gly4-Ser1-veznika posle čega sledi intracelularni domen ljudskog EpCAM (aminokiseline 226-314; sekvenca kao što je objavljeno u GenBank pod pristupnim brojem NM_002354).

[0187] Sve sekvence kodiranja pratio je zaustavni kodon. Fragmenti sinteze gena su takođe dizajnirani tako da uvode pogodna mesta restrikcije. Fragmenti sinteze gena su klonirani u plazmid sa pEF-DHFR (pEF-DHFR je opisan u Raum i dr. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) Svi gore navedeni postupci sprovedeni su u skladu sa standardnim protokolima (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (2001)). Za svaki antigen klon, sekvencno-verifikovana nukleotidna sekvenca je transfektovana u CHO ćelije sa nedostatkom DHFR radi eukariotskog eksprimiranja konstrukata. Eukariotsko eksprimiranje proteina u CHO ćelijama sa nedostatkom DHFR je izvedeno kao što je opisano od strane Kaufman R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Genska amplifikacija konstrukata je indukovana povećanjem koncentracije metotreksata (MTX) do krajnje koncentracije do 20 nM MTX.

Primer 2

2.1 Transientno eksprimiranje u ćelijama HEK 293

[0188] Klonovi plazmida eksprimiranja sa nukleotidnim sekvencama proverenim sekvencama korišćeni su za transfekciju i eksprimiranje proteina u FreeStile 293 ekspresijskom sistemu (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Nemačka) prema protokolu proizvođača. Dobijeni su supernatanti koji sadrže izražene proteine, ćelije su uklonjene centrifugiranjem i supernatanti su smešteni na -20°C.

2.2 Stabilna eksprimiranje u CHO ćelijama

[0189] Klonovi plazmida eksprimiranja sa sekvencno-verifikovanim nukleotidnim sekvencama transfektovani su u CHO ćelije sa nedostatkom DHFR radi eukariotskog eksprimiranja konstrukata. Eukariotsko eksprimiranje proteina u CHO ćelijama sa nedostatkom DHFR je izvedeno kao što je opisano u Kaufman R.J. (1990) Methods Enzymol.

185, 537-566. Gensko pojačavanje konstrukata je indukovano povećanjem koncentracija metotreksata (MTX) do krajnje koncentracije od 20 nM MTX. Posle dva prolaza stacionarne kulture, ćelije su uzgajane u valjkastim bocama sa HyQ PF CHO medijumom tečne soje bez nukleozida (sa 4,0 mM L-glutamina sa 0,1% Pluronic F - 68; HyClone) 7 dana pre prikupljanja. Ćelije su uklonjene centrifugiranjem i supernatant koji sadrži izraženi protein je smešten na -20°C.

2.3 Prečišćavanje proteina

[0190] Prečišćavanje rastvorljivih BCMA proteina je izvršeno na sledeći način: Äkta® Explorer System (GE Healthcare) i Unicorn® Software korišćeni su za hromatografiju.

Imobilizovana metalna afinitetna hromatografija („IMAC") izvedena je korišćenjem Fractogel EMD chelate® (Merck) koji je napunjen sa ZnCl2 prema protokolu koji je dao proizvođač. Kolona je izbalansirana sa puferom A (20 mM natrijum-fosfatnim puferom pH 7,2, 0,1 M NaCl) i filtrirani (0,2 µm) supernatant ćelijske kulture nanesen je na kolonu (10 ml) sa brzinom protoka od 3 ml/minut. Kolona je isprana puferom A kako bi se uklonio nevezani uzorak. Vezani protein je eluiran korišćenjem dvostepenog gradijenta pufera B (20 mM natrijum-fosfatnog pufera pH 7,2, 0,1 M NaCl, 0,5 M imidazola) u skladu sa sledećim postupkom:

Korak 1:10% pufer B u zapremini 6 kolona

Korak 2: 100% pufer B u količini 6 kolona

[0191] Eluirani proteinski fragmenti iz koraka 2 su sakupljene radi daljeg prečišćavanja. Sve hemikalije bile su istraživačke klase i nabavljene su od Sigma (Deisenhofen) ili Merck (Darmstadt).

[0192] Gel filtraciona hromatografija izvedena je na HiLoad 16/60 Superdex 200 koloni za pripremu (GE/Amersham), uravnoteženoj Equi-puferom (10 mM citrat, 25 mM lizin-HCl, pH 7,2 za proteine eksprimirane u HEK ćelijama i PBS pH 7,4 za proteine eksprimirane u CHO ćelijama). Eluirani uzorci proteina (protok 1 ml/minut) podvrgnuti su standardnom SDS-PAGE i Western Blot u radi detektovanja. Koncentracije proteina su određene pomoću OD280 nm.

[0193] Proteini dobijeni transientnim eksprimiranjem u ćelijama HEK 293 korišćeni su za imunizaciju. Proteini dobijeni stabilnim eksprimiranjem u CHO ćelijama korišćeni su za selekciju veznika i za merenje vezivanja.

Primer 3

Klasiranje epitopa mišjih scFv-fragmenata

[0194] Ćelije koje su transfektovane ljudskim ili mišjim BCMA ili himernim BCMA molekulima obojene su sirovim, nerazređenim periplazmatskim ekstraktom koji sadrži scFv vezivanje za ljudski/makaki BCMA. Vezani scFv detektovani su sa 1 µg/ml anti-FLAG antitela (Sigma F1804) i R-PE obeleženim anti-mišjim Fc gama specifičnim antitelom (1:100; Dianova #115-116-071). Sva antitela su razblažena u PBS sa 2% FCS. Kao negativna kontrola, ćelije su inkubirane sa PBS/2% FCS umesto periplazmatskog ekstrakta. Uzorci su mereni protočnom citometrijom na FACSCanto II instrumentu (Becton Dickinson) i analizirani FlowJo softverom (Verzija 7.6); pogledati Sliku 3.

Primer 4

Nabavka različitih rekombinantnih oblika rastvorljivih ljudskih i makaki BCMA [0195]

A) Kodirajuće sekvence ljudskog i rezus BCMA (kao što je objavljeno u GenBank, pristupni brojevi NM_001192 [ljudski], XM_001106892 [rezus]) kodirajuće sekvence ljudskog albumina, ljudskog Fcγ1 i mišjeg albumina korišćene su za izgradnju veštačkih sekvenci cDNK koje kodiraju rastvorljive fuzione proteine ljudskog i makaki BCMA, respektivno, i ljudskog albumina, ljudskog IgG1 Fc i mišjeg albumina, respektivno, kao i rastvorljivi proteini koji sadrže samo vanćelijske domene BCMA. Kako bi se stvorili konstrukti za eksprimiranje rastvorljivih proteina ljudskog i makaki BCMA, cDNK fragmenti su dobijeni PCR mutagenezom od BCMA cDNK cele dužine kako je gore opisano i molekularnim kloniranjem u skladu sa standardnim protokolima.

Za fuzije sa ljudskim albuminom, modifikovani cDNK fragmenti su dizajnirani tako da sadrže prvo Kozak mesto za eukariotsko eksprimiranje konstrukata, praćeno kodirajućom sekvencom ljudskih i i rezus (ili Macaca mulatta) BCMA proteina, respektivno, koja sadrži aminokiseline 1 do 54 i 1 do 53, koje odgovaraju vanćelijskom domenu ljudskog i rezus BCMA, praćeno u okviru kodirajućom sekvencom veštačkog Serl-Gly4-Serl-veznika, praćeno u okviru kodiranom sekvencomo ljudskog serumskog albumina, praćeno u okviru kodirajućom sekvencom Flag oznake, praćeno u okviru kodirajućom sekvencom modifikovane histidinske oznake (SGHHGGHHGGGHH) i zaustavnim kodonom.

Za fuzije sa mišjim IgGl, modifikovani cDNK fragmenti su dizajnirani tako da sadrže prvo Kozak mesto za eukariotsko eksprimiranje konstrukata, praćeno kodirajućom sekvencom ljudskih i makaki BCMA proteina, koji sadrže aminokiseline 1 do 54 i 1 do 53 što odgovara vanćelijskom domenu ljudskog i rezus BCMA, praćeno u okviru kodirajućom sekvencom veštačkog Ser1-Gly4-Ser1-veznika, praćeno u okviru kodirajućom sekvencom zglobnog i Fc gama dela ljudskog IgG1, praćeno u okviru kodirajućom sekvencom heksahistidin oznake i zaustavnim kodonom.

Za fuzije sa mišjim albuminom, modifikovani cDNK fragmenti su dizajnirani tako da sadrže prvo Kozak mesto za eukariotsko eksprimiranje konstrukata, praćeno kodirajućom sekvencom ljudskih i makaki BCMA proteina, koji sadrže aminokiseline 1 do 54 i 1 do 53 što odgovara vanćelijskom domenu ljudskog i rezus BCMA, praćeno u okviru kodirajućom sekvencom veštačkog Serl-Gly4-Serl-veznika, praćeno u okviru kodirajućom sekvencom mišjeg serumskog albumina, praćeno u okviru kodirajućom sekvencom Flag oznake, praćeno u okviru kodirajućom sekvencom modifikovane histidinske oznake (SGHHGGHHGGHH) i zaustavnim kodonom.

Za rastvorljive konstrukte vanćelijskih domena, modifikovani cDNK fragmenti su dizajnirani tako da sadrže prvo Kozak mesto za eukariotsko eksprimiranje konstrukata, praćeno kodirajućom sekvencom ljudskih i makaki BCMA proteina, koji sadrže aminokiseline 1 do 54 i 1 do 53 što odgovara vanćelijskom domenu ljudskog i rezus BCMA, praćeno u okviru kodirajućom sekvencom veštačkog Ser1-Gli1-veznika, praćeno u okviru kodirajućom sekvencom Flag oznake, praćeno u okviru kodirajućom sekvencom modifikovane histidinske oznake (SGHHGGHHGGHH) i zaustavnim kodonom.

cDNK fragmenti su takođe dizajnirani tako da uvode mesta restrikcije na početku i na kraju fragmenata. Uvedena mesta restrikcije, EcoRI na 5' kraju i Jedro na 3' kraju, korišćena su u narednim procedurama kloniranja. cDNK fragmenti su klonirani preko EcoRI i Jedra u plazmid označen kao pEF-DHFR (pEF-DHFR je opisan kod Raum i dr. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Svi gore navedeni postupci sprovedeni su u skladu sa standardnim protokolima (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (2001)).

B) Kodirajuće sekvence ljudskog i makaki BCMA kao što je prethodno opisano i kodirajuće sekvence ljudskog albumina, ljudskog Fcγ1, mišjeg Fcγ1, mišjeg Fcγ2a, mišjeg albumina, pacovskog albumina, pacovskog Fcγ1 i pacovskog Fcγ2b korišćene su za izgradnju veštačkih sekvenci cDNK koje kodiraju rastvorljive fuzione proteine ljudskog i makaki BCMA, odnosno ljudskog albumina, ljudskog IgG1 Fc, mišjeg IgG1 Fc, mišjeg IgG2a Fc, mišjeg albumina, pacovskog IgG1 Fc, pacovskog IgG2b i pacovskog albumina, kao i rastvorljive proteine koji sadrže samo vanćelijske domene BCMA. Kako bi se generisali konstrukti za eksprimiranje rastvorljivih ljudskih i makaki BCMA proteina, cDNK fragmenati su dobijeni PCR mutagenezom od cDNK pune dužine od BCMA opisane iznad i molekularnim kloniranjem prema standardnim protokolima.

[0196] Za fuzije sa albuminima, modifikovani cDNK fragmenti su dizajnirani tako da sadrže prvo Kozak mesto za eukariotsko eksprimiranje konstrukata i kodirajuću sekvencu 19 aminokiselinskih imunoglobulinskih lider peptida, praćeno u okviru kodirajućom sekvencom vanćelijskog domena odgovarajućeg BCMA proteina, praćeno u okviru kodirajućom sekvencom veštačkog Ser1-Gly4-Ser1-veznika, praćeno u okviru kodirajućom sekvencom odgovarajućeg serumskog albumina, praćeno u okviru kodirajućom sekvencom Flag oznake, praćeno u okviru kodirajućom sekvencom modifikovane histidinske oznake (SGHHGGHHGGHHH) i zaustavni kodon.

[0197] Za fuzije sa IgG Fc, modifikovani cDNK fragmenti su dizajnirani tako da sadrže prvo Kozak mesto za eukariotsko eksprimiranje konstrukata i kodirajuću sekvencu 19 aminokiselinskih imunoglobulinskih lider peptida, praćeno u okviru kodirajućom sekvencom vanćelijskog domena odgovarajućeg BCMA proteina, praćeno u okviru kodirajućom sekvencom veštačkog Serl-Gly4-Ser1-veznika, osim ljudskog IgG1 Fc gde je korišćen veštački Ser1-Gli1-veznik, praćeno u okviru kodirajućom sekvencom zglobnim i Fc gama delom odgovarajućeg IgG, praćeno u okviru kodirajućom sekvencom Flag oznake, praćeno u okviru kodirajućom sekvencom modifikovane histidinske oznake (SGHHGGHHGGHH) i zaustavnim kodonom.

[0198] Za konstrukte rastvorljivih vanćelijskih domena, modifikovani cDNK fragmenti su dizajnirani tako da sadrže prvo Kozak mesto za eukariotsko eksprimiranje konstrukata i kodirajuću sekvencu 19 aminokiselinskih imunoglobulinskih lider peptida, praćeno u okviru kodirajućom sekvencom vanćelijskog domena odgovarajućeg BCMA proteina, praćeno u okviru kodirajućom sekvencom veštačkog Ser1-Gli1-veznika, praćeno u okviru kodirajućom sekvencom Flag oznake, praćeno u okviru kodirajućom sekvencom modifikovane histidinske oznake (SGHHGGHHGGHH) i zaustavnim kodonom.

[0199] Za kloniranje konstrukata uvedena su pogodna restrikciona mesta. cDNK fragmenti su klonirani u plazmid označen kkao pEF-DHFR (pEF-DHFR je opisan kod Raum i dr.2001). Svi gore navedeni postupci sprovedeni su u skladu sa standardnim protokolima (Sambrook, 2001).

[0200] Naredni konstrukti su dizajnirani da omoguće usmereno pomicanje na različite epitope. Kodirajuća sekvenca mišje-ljudskih BCMA himera i mišje-makaki BCMA (mišje, ljudske i makaki BCMA sekvence kao što je gore opisano) i kodirajuće sekvence mišjeg albumina i mišjeg Fcγ1 korišćeni su za izgradnju veštačkih sekvenci cDNK koje kodiraju rastvorljive fuzione proteine mišje-ljudskih i mišje-makaki BCMA himera, i mišji IgG1 Fc i mišji albumin. Kako bi se generisali konstrukti za eksprimiranje rastvorljivih mišje-ljudskih i mišje-makaki BCMA himera, cDNK fragmenati mišjeg BCMA (aminokiselina 1-49) sa pripadajućim domenima epitopa mutiranim u ljudsku i makaki sekvencu, respektivno,, dobijeni su sintezom gena u skladu sa standardnim protokolima. Kloniranje konstrukata izvršeno je kao što je gore opisano i prema standardnim protokolima (Sambrook, 2001).

[0201] Konstruisani su naredni molekuli:

• aminokiselina 1-4 ljudski, mišji IgG1 Fc

• aminokiselina 1-4 ljudski, mišji albumin

• aminokiselina 1-4 rezus, mišji IgG1 Fc

• aminokiselina 1-4 rezus, mišji albumin

• aminokiselina 5-18 ljudski, mišji IgG1 Fc

• aminokiselina 5-18 ljudski, mišji albumin

• aminokiselina 5-18 rezus, mišji IgG1 Fc

• aminokiselina 5-18 rezus, mišji albumin

• aminokiselina 37-49 ljudski, mišji IgG1 Fc

• aminokiselina 37-49 ljudski, mišji albumin

• aminokiselina 37-49 rezus, mišji IgG1 Fc

• aminokiselina 37-49 rezus, mišji albumin

Primer 5

5.1 Biacore određivanje afiniteta bispecifičnih antitela prema ljudskom i makaki BCMA i CD3

[0202] Eksperimenti Biacore analize izvedeni su koristeći rekombinantne BCMA fuzione proteine sa albuminom ljudskog seruma (ALB) kako bi se odredilo vezivanje BCMA za ciljeve. Za merenja afiniteta CD3 korišćeni su rekombinantni fuzione proteine sa N-terminalnim 27 aminokiselinama CD3 epsilona (CD3e) fuzionisanih sa Fc delom ljudskog antitela. Ovaj rekombinantni protein postoji u ljudskoj CD3e1-27 verziji i u cinomolgog CD3e verziji, od kojih oba nose epitop CD3 veznika u bispecifičnim antitelima.

[0203] Detaljno, CM5 Sensor Chips (GE Healthcare) su imobilizovani sa oko 100 do 150 RU odgovarajućeg rekombinantnog antigena korišćenjem acetatnog pufera pH 4,5 u skladu sa uputstvima proizvođača. Uzorci bispecifičnih antitela se učitavaju u pet koncentracija: 50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,25 nM i 3,13 nM razblaženi u HBS-EP tekućem puferu (GE Healthcare). Brzina protoka je bila 30 do 35 µl/minut tokom 3 minuta, i zatim je HBS-EP tekući pufer ponovo nanošen tokom 8 minuta pri brzini protoka od 30 do 35 µl/ml. Regeneracija čipa izvedena je korišćenjem 10 mM glicina 0,5 M NaCl pH 2,45. Skupovi podataka analizirani su pomoću BiaEval softvera (pogledati

[0204] Slika 4). Generalno su izvedena dva nezavisna eksperimenta.

5.2 Afinitet vezivanja za ljudski i makaki BCMA

[0205] Afiniteti vezivanja BCMA/CD3 bispecifičnih antitela za ljudski i makaki BCMA su određeni Biacore analizom koristeći rekombinantne BCMA fuzione proteine sa mišjim albuminom (ALB).

[0206] Detaljno, CM5 Sensor Chips (GE Healthcare) su imobilizovani sa oko 150 do 200 RU odgovarajućeg rekombinantnog antigena korišćenjem acetatnog pufera pH 4,5, prema uputstvu proizvođača. Uzorci bispecifičnih antitela se učitavaju u pet koncentracija: 50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,25 nM i 3,13 nM razblaženi u HBS-EP tekućem puferu (GE Healthcare). Za određivanje afiniteta BCMA, brzina protoka je bila 35 µl/minut tokom 3 minuta, zatim je HBS-EP tekući pufer ponovo nanošen 10, 30 ili 60 minuta, sa brzinom protoka od 35 µl/ml. Regeneracija čipa izvedena je korišćenjem pufera koji se sastojao od 1:1 smeše 10 mM glicina 0,5 M NaCl pH 1,5 i 6 M rastvora gvanidin hlorida. Skupovi podataka analizirani su pomoću BiaEval softvera (pogledati Sliku 6). Generalno su izvedena dva nezavisna eksperimenta.

[0207] Potvrdno vezivanje ljudskog i makaki CD3 epsilona izvedeno je u pojedinačnim eksperimentima koristeći iste koncentracije kao i za BCMA vezivanje; određivanje odstupanja izvršeno je tokom 10 minuta vremena disocijacije.

[0208] Sva BCMA/CD3 bispecifična antitela klastera epitopa E3 pokazala su visok afinitet prema ljudskom BCMA u sub-nanomolarnom rasponu do jednocifrenog pikomolarnog raspona. Vezivanje za makaki BCMA je uravnoteženo, pokazujući takođe afinitete u jednocifrenom nanomolarnom rasponu do subnanomolarnog raspona. Afiniteti i jazovi afiniteta BCMA/CD3 bispecifičnih antitela prikazane su u Tabeli 2.

Tabela 2: Afiniteti BCMA/CD3 bispecifičnih antitela klastera epitopa E3 za ljudski i makaki BCMA, kako je utvrđeno Biacore analizom, i izračunate razlike u afinitetu (ma BCMA: hu BCMA).

5.3 Biacore određivanje afiniteta bispecifičnih antitela za ljudski i makaki BCMA [0209] Afiniteti BCMA/CD3 bispecifičnih antitela za rekombinantni rastvorljivi BCMA na CM5 čipovima u Biacore merenjima su ponovljeni za potvrđivanje KD, i naročito off-stopa korišćenjem dužih perioda disocijacije (60 minuta umesto 10 minuta kao što je korišćeno u prethodnom eksperimentu). Sva testirana BCMA/CD3 bispecifična antitela prošla su dva nezavisna merenja afiniteta sa po pet različitih koncentracija.

[0210] Afiniteti BCMA/CD3 bispecifičnih antitela klastera epitopa E3 bili su očigledno subnanomolarni sve do jednocifrenog pikomomola, pogledati primere u Tabeli 3.

Tabela 3:Afiniteti (KD) BCMA/CD3 bispecifičnih antitela klastera epitopa E3 iz Biacore eksperimenata korišćenjem produženog vremena disocijacije (svaki po dva nezavisna eksperimenta).

Primer 6

Bispecifično vezivanje i unakrsna reaktivnost između vrsta

[0211] Za potvrdu vezivanja za ljudski i makaki BCMA i CD3, bispecifična antitela su testirana protočnom citometrijom pomoću CHO ćelija transfektovanih sa ljudskim i makaki BCMA, respektivnom, NCI-H929 ćelijskom linijom ljudskog multiplog mijeloma koja eksprimira prirodni ljudski BCMA, HPB-ALL ljudskom ćelijskom linijom T ćelija leukemija koja eksprimira CD3 HPB-ALL (DSMZ, Braunschweig, ACC483) i 4119LnPx makaki linija T ćelija koja eksprimira CD3 (Knappe A, i dr., Blood, 2000, 95, 3256-3261). Štaviše, netransfektovane CHO ćelije korišćene su kao negativna kontrola.

[0212] Za protočnu citometriju, 200,000 ćelija odgovarajućih ćelijskih linija inkubirano je tokom 30 minuta na ledu sa 50 µl pročišćenog bispecifičnog antitela u koncentraciji od 5 µg/ml. Ćelije su isprane dva puta sa PBS/2% FCS i vezivanje konstrukata detektovano je mišjim PentaHis antitelom (Qiagen; razblaženo 1:20 u 50 µl PBS/2% FCS). Posle pranja, detektovana vezana PentaHis antitela su detektovana sa Fc gama specifičnim antitelom (Dianova) konjugovanim na fikoetrinom, razblaženo 1:100 u PBS/2% FCS. Uzorci su mereni protočnom citometrijom na instrumentu FACSCanto II i analizirani FACSDiva softverom (oba od Becton Dickinson).

[0213] BCMA/CD3 bispecifična antitela klastera epitopa E3 obojila su CHO ćelijama transfektovanim sa ljudskom i makaki BCMA, NCI-H929 ćelijskom linijom ljudskog multiplog mijeloma koja eksprimira ljudski BCMA, kao i ljudskim i makaki T ćelijama. Štaviše, nije bilo bojenja netransfekovanih CHO ćelija (pogledati Sliku 7).

Primer 7

Scatchard određivanje afiniteta bispecifičnog antitela za ljudski i makaki BCMA [0214] Za Scatchard analizu, eksperimenti vezivanja zasićenja se izvode koristeći monovalentni sistem detektovanja razvijen od strane Micromet (anti-His Fab/Alexa 488) kako bi se precizno utvrdilo monovalentno vezivanje bispecifičnih antitela za odgovarajuću ćelijsku liniju.

[0215] 2 x 10<4>ćelije odgovarajuće ćelijske linije (rekombinantna CHO ćelijska linija koja eksprimira ljudski BCMA, rekombinantno CHO ćelijska linija koja eksprimira makaki BCMA) inkubiraju se sa po 50 µl tripletne serije razblaženja (osam razblaženja pri 1:2) odgovarajućeg BCMA specifičnog antitela počevši od 100 nM nakon čega sledi 16 sati inkubacija pri 4°C uz mešanje i jedan preostali korak ispiranja. Zatim, ćelije se inkubiraju tokom dodatnih 30 minuta sa 30 µl anti-His Fab/Alexa488 rastvora (Micromet; 30 µl/ml). Posle jednog koraka pranja, ćelije se ponovo suspenduju u 150 µl FACS pufera koji sadrži 3,5% formaldehida, inkubira se narednih 15 minuta, centrifugira, ponovo suspenduje u FACS puferu i analizira pomoću FACS Cantoll mašine i FACS Diva softvera. Podaci se generišu iz dve nezavisne grupe eksperimenata. Vrednosti su prikazane kao hiperboličke krive vezivanja. Odgovarajuća Scatchard analiza izračunava se za ekstrapolaciju maksimalnog vezivanja (Bmax). Koncentracije bispecifičnih antitela pri polu-maksimalnom vezivanju određuju se tako da odražavaju odgovarajuće KD. Vrednosti trostrukih merenja prikazane su u obliku hiperboličke krive. Maksimalno vezivanje se utvrđuje pomoću Scatchard procene i izračunavaju se odgovarajući KD.

[0216] Afiniteti BCMA/CD3 bispecifičnih antitela za CHO ćelije koje su transfektovane ljudskim ili makaki BCMA utvrđene su Scatchard analizom kao najpouzdaniji postupak za merenje potencijalnih razlika u afinitetu između ljudskog i makaki BCMA.

[0217] Ćelije koje eksprimiraju BCMA antigen se inkubiraju sa povećanim koncentracijama odgovarajućeg monomernog BCMA/CD3 bispecifičnog antitela dok se ne postigne zasićenost (16 sati). Vezano bispecifično antitelo detektovano je protočnom citometrijom. Koncentracije BCMA/CD3 bispecifičnih antitela pri polu-maksimalnom vezivanju određene su odražavajući odgovarajuće KD.

[0218] Vrednosti trostrukih merenja prikazane su kao hiperboličke krive i kao krive u obliku S slova kako bi se pokazala pravilna koncentracija u rasponu od minimalnog do optimalnog vezivanja. Maksimalno vezivanje (Bmax) je određeno (Slika 8) korišćenjem Scatchard procene i izračunati su odgovarajući KD. Vrednosti prikazane u Tabeli 4 izvedene su iz dva nezavisna eksperimenta po BCMA/CD3 bispecifičnom antitelu.

[0219] Scatchard analiza na ćelijama potvrdila je da su BCMA/CD3 bispecifična antitela klastera epitopa E3 subnanomolarna po afinitetu za ljudski BCMA i prisutna su sa malim jazom afiniteta, ispod pet, za BCMA među vrstama.

Tabela 4: Afiniteti (KD) BCMA/CD3 bispecifičnih antitela klastera epitopa E3 iz Scatchard analize na ćelijama (svaki po dva nezavisna eksperimenta) sa izračunatim jazom afiniteta KD makaki BCMA/KD ljudski BCMA.

Primer 8

Citotoksična aktivnost

8.1 Test oslobađanja hroma sa stimulisanim ljudskim T ćelijama

[0220] Stimulisane T ćelije obogaćene za CD8+ T ćelije su dobijene kao što je opisano u daljem tekstu.

[0221] Petrijev sud (prečnika 145 mm, Greiner bio-one GmbH, Kremsmunster) obložena je komercijalno dostupnim CD3-specifičnim antitelom (OKT3, Orthoclone) u konačnoj koncentraciji od 1 µg/ml tokom 1 sata na 37°C. Nevezani protein je uklonjen jednim korakom pranja sa PBS.3 - 5 x 107 ljudski PBMC je dodat u prethodno obložen petrijev sud pri 120 ml od RPMI 1640 sa stabilizovanim glutaminom/10% FCS/IL-220 U/ml (Proleukin®, Chiron) i stimulisan je tokom 2 dana. Trećeg dana, ćelije su sakupljene i isprane jednom sa RPMI 1640. IL-2 je dodat u konačnoj koncentraciji od 20 U/ml i ćelije su ponovo kultivisane jedan dan u istom medijumu ćelijske kulture kao iznad.

[0222] CD8<+>citotoksični T limfociti (CTL) su obogaćeni iscrpljivanjem CD4<+>T ćelija i CD56<+>NK ćelija koje koriste Dynal-Beads prema protokolu proizvođača.

[0223] CHO ciljane ćelije transfekovane makaki ili ljudskim BCMA isprane su dva puta PBS i označene sa 11,1 MBq<51>Cr u konačnoj zapremini od 100 µl RPMI sa 50% FCS tokom 60 minuta na 37°C. Nakon toga, obeležene ciljane ćelije su isprane 3 puta sa 5 ml RPMI i zatim korišćene u testu citotoksičnosti. Ispitivanje je izvedeno na pločici sa 96 komorici u ukupnoj zapremini od 200 µl dopunjenih RPMI sa odnosom E:T od 10:1. Korišćena je početna koncentracija od 0,01 - 1 µg/ml prečišćenog bispecifičnog antitela i trostruko razblaženje istog. Vreme inkubacije za test je bilo 18 sati. Citotoksičnost je određena kao relativne vrednosti oslobođenog hroma u supernatantu u odnosu na razliku maksimalne lize (dodavanje Triton-X) i spontane lize (bez efektorskih ćelija). Sva merenja su izvršena četiri puta. Merenje aktivnosti hroma u supernatantima izvršeno je u Wizard 3" gama brojaču (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Köln, Germany). Analiza rezultata izvršena je pomoću Prism 5 za Windows (verzija 5.0, GraphPad Software Inc., San Diego, California, USA). EC50 vrednosti izračunate programom analize iz sigmoidnih krivi odgovora na dozu korišćene su za poređenje citotoksične aktivnosti (pogledati Sliku 5).

8.2 Potencija preusmeravanja stimulisanih ljudskih efektorskih T ćelija protiv CHO ćelija transfekovanih sa ljudskim BCMA

[0224] Citotoksična aktivnost BCMA/CD3 bispecifičnih antitela analizirana je u testu citotoksičnosti oslobađanja 51-hroma (<51>Cr) koristeći CHO ćelije koje su transfektovane ljudskim BCMA kao ciljanim ćelijama i stimulisanim obogaćenim ljudskim CD8 T ćelijama kao efektorskim ćelijama. Eksperiment je izveden kao što je opisano u Primeru 8.1.

[0225] Sva BCMA/CD3 bispecifična antitela klastera epitopa E3 pokazala su vrlo snažnu citotoksičnu aktivnost protiv ljudskih BCMA transfektovanih CHO ćelija sa EC50 vrednostima u rasponu od jednocifrenog pg/ml ili čak niže (Slika 9 i Tabela 5). Dakle, klastera epitopa E3 predstavlja vrlo povoljan odnos epitopske aktivnosti koji podržava citotoksičnu aktivnost posredovanu bispecifičnim antitelom.

Tabela 5: EC50 vrednosti [pg/ml] BCMA/CD3 bispecifičnih antitela klastera epitopa E3 analizirane su u testu citotoksičnosti oslobađanja 51-hroma (<51>Cr) koristeći CHO ćelije koje su transfektovane ljudskim BCMA kao ciljanim ćelijama i stimulisanim obogaćenim ljudskim CD8 T ćelijama kao efektorskim ćelijama.

8.3 FACS test citotoksičnosti sa izolacijom efektorskih ćelija nestimulisanim ljudskim PBMC

[0226] Mononuklearne ćelije ljudske periferne krvi (PBMC) pripremljene su centrifugiranjem Ficoll gradijenta gustine iz obogaćenih preparata limfocita (puferski slojevi), sporednog produkta krvnih banaka koje skupljaju krv za transfuzije. Puferske slojeve je pružila lokalna banka krvi i PBMC je pripremljen istog dana kad i uzimanja krvi. Posle centrifugiranja Ficoll gustine i opsežnog ispiranja sa Dulbecco-vim PBS (Gibco), preostali eritrociti su uklonjeni iz PBMC putem inkubacije sa puferom za liziranje eritrocita (155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 100 uM EDTA). Trombociti su uklonjeni preko supernatanta centrifugiranjem PBMC pri 100 x g. Preostali limfociti uglavnom obuhvataju B i T limfocite, NK ćelije i monocite. PBMC su čuvani u kulturi pri 37°C/5% CO2u RPMI medijumu (Gibco) sa 10% FCS (Gibco).

Iscrpljivanje CD14<+>i CD56<+>ćelija

[0227] Za iscrpljivanje CD14<+>ćelija, ljudski CD14 MicroBeads (Milteny Biotec, MACS, #130-050-201) korišćeni su za iscrpljivanje NK ćelija ljudskih CD56 MicroBeads (MACS, #130-050-401). PBMC se broji i centrifugira tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi sa 300 x g. Supernatant je odbačen i ćelijski pelet je resuspendovan u MACS izolacionom puferu [80 µL/10<7>ćelije; PBS (Invitrogen, #20012-043), 0,5% (v/v) FBS (Gibco, #10270-106), 2 mM EDTA (Sigma-Aldrich, #E-6511)]. CD14 MicroBeads i CD56 MicroBeads (20 µL /10<7>ćelije) dodavane su i inkubirane tokom 15 minuta na 4 - 8°C. Ćelije su isprane MACS izolacionim puferom (1 - 2 mL/10<7>ćelija). Posle centrifugiranja (pogledati gore), supernatant je odbačen i ćelije su ponovo suspendovane u MACS izolacionom puferu (500 µL/10<8>ćelija). CD14/CD56 negativne ćelije su zatim izolovane korišćenjem LS kolona (Miltenyi Biotec, #130-042-401). PBMC bez CD14<+>/CD56<+>ćelija kultivisan je u kompletnom medijumu RPMI, tj. RPMI1640 (Biochrom AG, #FG1215) sa dodatkom 10% FBS (Biochrom AG, #S0115), 1x nebitne aminokiseline (Biochrom AG, #K0293), 10 mM Hepes pufera (Biochrom AG, #L1613), 1 mM natrijum-piruvata (Biochrom AG, #L0473) i 100 U/mL penicilina/streptomicina (Biochrom AG, #A2213) na 37°C u inkubatoru dok postoj potreba.

Označavanje ciljane ćelije

[0228] Za analizu ćelijske lize u testovima protočne citometrije, fluorescentna membranska boja DiOC18(DiO) (Molekularne sonde, #V22886) je korišćen da označi ljudskim BCMA- ili makaki BCMA transfektovane CHO ćelije kao ciljane ćelije i da ih razlikuje od efektorskih ćelija. Ukratko, ćelije su sakupljene, jednom isprane sa PBS i podešene na 10<6>ćelija/mL u PBS koji sadrži 2% (v/v) FBS i membransku boju DiO (5 µL/10<6>ćelija). Posle inkubacije tokom 3 minuta na 37°C, ćelije su isprane dva puta u kompletnom RPMI medijumu i broj ćelija je podešen na 1,25 x 10<5>ćelija/mL. Vitalnost ćelija je određena korišćenjem 0,5% (v/v) izotoničnog EosinG rastvora (Roth, #45380).

Analiza zasnovana na protočnoj citometriji

[0229] Ovaj test je dizajniran da kvantifikuje lizu makaki ili ljudskim BCMA-transfekovanih CHO ćelija u prisustvu serijskih razblaženja BCMA bispecifičnih antitela.

[0230] Jednake količine DiO-označenih ciljanih ćelija i efektorskih ćelija (tj. PBMC bez CD14<+>ćelija) su pomešane, što je rezultovalo odnosom E:T ćelija od 10:1.160 µL ove suspenzije preneseno je u svaku komoricu ploče sa 96 komorica. Dodato je 40 µL serijskih razblaženja BCMA bispecifičnih antitela i negativna kontrolna bispecifičnog (CD3-zasnovano bispecifično antitelo koje prepoznaje irelevantni ciljani antigen) ili RPMI kompletnog medijuma kao dodatna negativna kontrola. Citotoksična reakcija posredovana bispecifičnim antitelom odvijala se tokom 48 sati u 7% CO2vlažnom inkubatoru. Zatim su ćelije prebačene na novu ploču sa 96 komorica i gubitak integriteta ciljane membrane praćen je dodavanjem propidijum-jodida (PI) u konačnoj koncentraciji od 1 µg/mL. PI je membranska nepropusna boja koja se obično isključuje iz održivih ćelija, dok je mrtve ćelije uzimaju i postaju prepoznatljive fluorescentnom emisijom.

[0231] Uzorci su mereni protočnom citometrijom na instrumentu FACSCanto II i analizirani FACSDiva softverom (oba od Becton Dickinson).

[0232] Ciljane ćelije su identifikovane kao DiO-pozitivne ćelije. PI-negativne ciljane ćelije klasifikovane su kao žive ciljane ćelije. Procenat citotoksičnosti je izračunat po sledećoj formuli:

n

Citotoksičnost [% ]=mrtve ciljanećelije×100

nciljanećelije

n = broj događaja

[0233] Koristeći GraphPad Prism 5 softver (Graph Pad Software, San Diego), procenat citotoksičnosti je napravljen prema odgovarajućim koncentracijama bispecifičnih antitela. Krive odgovora na dozu analizirane su sa četiri parametrična modela logističke regresije za procenu sigmoidnih krivih odgovora na dozu sa fiksnim nagibom i izračunate su EC50 vrednosti.

8.4 Nestimulisani ljudski PBMC protiv ciljanih ćelija transfekovanih ljudskim BCMA [0234] Citotoksična aktivnost BCMA/CD3 bispecifičnih antitela analizirana je u FACS testu citotoksičnosti korišćenjem CHO ćelija transfektovanih ljudskim BCMA kao ciljanim ćelijama i nestimulisanim ljudskim PBMC kao efektorskim ćelijama. Ispitivanje je izvedeno kao što je opisano iznad (Primer 8.3).

[0235] Rezultati FACS ispitivanja citotoksičnosti sa nestimulisanim ljudskim PBMC kao efektorskim ćelijama i CHO ćelijama transfekovanim ljudskim BCMA kao ciljevima prikazani su na Slici 10 i Tabeli 6.

Tabela 6: EC50 vrednosti [pg/ml] BCMA/CD3 bispecifičnih antitela klastera epitopa E3 izmerene u 48-časovnom FACS testu citotoksičnosti sa nestimulisanim ljudskim PBMC kao efektorskim ćelijama i CHO ćelijama transfektovanim ljudskim BCMA kao ciljanim ćelijama.

Primer 9

9.1 Isključivanje unakrsne reaktivnosti sa BAFF receptorom

[0236] Za protočnu citometriju, 200,000 ćelija odgovarajućih ćelijskih linija inkubirano je tokom 30 minuta na ledu sa 50 µl prečišćenih bispecifičnih molekula u koncentraciji od 5 µg/ml. Ćelije su isprane dva puta u PBS sa 2% FCS i vezivanje konstrukata je otkriveno mišjim PentaHis antitelom (Qiagen; razblažen 1:20 u 50 µl PBS sa 2% FCS). Nakon pranja, detektovana vezana PentaHis antitela su pronađena sa Fc gama specifičnim antitelom (Dianova) konjugovanim na fikoetrin, razblažen 1:100 u PBS sa 2% FCS. Uzorci su mereni protočnom citometrijom na instrumentu FACSCanto II i analizirani FACSDiva softverom (oba od Becton Dickinson). Pokazano je da bispecifični veznici nisu unakrsno reaktivni sa BAFF receptorima.

9.2 Isključenje unakrsne reaktivnosti BCMA/CD3 bispecifičnog antitela sa ljudskim BAFF-receptorom (BAFF-R) i TACI

[0237] Kako bi se isključilo vezivanje za ljudski BAFF-R i TACI, BCMA/CD3 bispecifična antitela su testirana protočnom citometrijom primenom CHO ćelija transfekovanih ljudskim BAFF-R i TACI. Štaviše, L363 ćelije multiplog mijeloma korišćene su kao pozitivna kontrola za vezivanje na ljudski BCMA. Eksprimiranje BAFF-R i TACI antigena na CHO ćelijama potvrđeno je sa dva pozitivna kontrolna antitela. Protočna citometrija izveden je kao što je opisano u prethodnom primeru.

[0238] Analiza protočne citometrije potvrdila je da nijedno BCMA/CD3 bispecifično antitelo klastera epitopa E3 ne reaguje na ljudski BAFF-R ili ljudski TACI (pogledati Sliku 11).

Primer 10

Citotoksična aktivnost

[0239] Potencija ljudskih BCMA bispecifičnih antitela u preusmeravanju efektorskih T ćelija na ciljane ćelije koje eksprimiraju BCMA analizirana je u pet dodatnih in vitro ispitivanja citotoksičnosti:

1. Potencija BCMA bispecifičnih antitela u preusmeravanju stimulisanih ljudskih efektorskih T ćelija protiv BCMA-pozitivnih (ljudskih) ćelijskih linija tumora meri se testom oslobađanja 51-hroma.

2. Potencija BCMA bispecifičnih antitela u preusmeravanju T ćelija u nestimulisanom ljudskom PBMC protiv CHO ćelija transfekovanih ljudskim BCMA, meri se FACS testom citotoksičnosti.

3. Potencija BCMA bispecifičnih antitela u preusmeravanju T ćelija u nestimulisanom ljudskom PBMC protiv BCMA-pozitivnih (ljudskih) ćelijskih linija tumora meri se FACS testom citotoksičnosti.

4. Kako bi se potvrdilo da su unakrsno reaktivna BCMA bispecifična antitela sposobna da preusmera makaki T ćelije protiv CHO ćelije transfekovanih makaki BCMA, FACS test citotoksičnosti se izvodi sa makaki T ćelijskom linijom kao efektorskim T ćelijama.

5. Jaz potencija između monomernih i dimernih oblika BCMA bispecifičnih antitela određuje se u testu oslobađanja 51-hroma korišćenjem CHO ćelija transfekovanih ljudskim BCMA kao ciljanih ćelija i stimulisanih ljudskih T ćelija kao efektorskih ćelija.

Primer 11

Stimulisane ljudske T ćelije protiv BCMA-pozitivne ljudske ćelijske linije multiplog mijeloma L363

[0240] Citotoksična aktivnost BCMA/CD3 bispecifičnih antitela analizirana je u testu citotoksičnosti oslobađanja 51-hroma (<51>Cr) koristeći BCMA-pozitivnu ćelijsku liniju multiplog mijeloma L363 (DSMZ No. ACC49) kao izvor ciljanih ćelija i stimulisanih obogaćenih ljudske CD8 T ćelija kao efektorske ćelije. Ispitivanje je izvedeno kao što je opisano u Primeru 8.1.

[0241] U skladu sa rezultatima ispitivanja oslobađanja 51-hroma sa stimulisanim obogaćenim ljudskim CD8 T limfocitima kao efektorskim ćelijama i CHO ćelijama transfekovanih ljudskim BCMA kao ciljevima, BCMA/CD3 bispecifična antitela klastera epitopa E3 vrlo su potentna u citotoksičnoj aktivnosti (Slika 12 i Tabela 7).

[0242] Druga grupa antitela je identifikovana tokom grupisanja epitopa (pogledati Primere 1 i 3), koja se može vezati za klastere epitopa 1 i 4 od BCMA („E1/E4"). Neočekivano, BCMA/CD3 bispecifična antitela klastera epitopa E1/E4 - iako su potentna u citotoksičnoj aktivnosti protiv CHO ćelije transfektovane ljudskim BCMA - pokazalo se da je prilično slabo citotoksična protiv ćelijske linije ljudskog multiplog mijeloma L363 koja eksprimira prirodni BCMA pri niskoj gustini na površini ćelije (Slika 12 i Tabela 7). Bez želje da se vezuju teorijom, pronalazači veruju da bi E1/E4 epitop ljudskog BCMA mogao biti manje dostupan na prirodnim BCMA ekspresorima nego na BCMA-transfekovanim ćelijama.

Tabela 7: EC50 vrednosti [pg/ml] BCMA/CD3 bispecifičnih antitela epitopskih klastera E1/E4 (redovi 1 i 2) i E3 (redovi 3 do 8) analizirane u testu citotoksičnosti oslobađanja 51-hroma (<51>Cr) koristeći BCMA-pozitivnu ćelijsku liniju multiplog mijeloma L363 kao izvor ciljanih ćelija i stimulisanih obogaćenih ljudske CD8 T ćelija kao efektorske ćelije.

Primer 12

Nestimulisani ljudski PBMC protiv BCMA-pozitivne ćelijske linije multiplog mijeloma L363

[0243] Citotoksična aktivnost BCMA/CD3 bispecifičnih antitela je dalje analizirana u FACS testu citotoksičnosti korišćenjem BCMA-pozitivne ljudske ćelijske linije multiplog mijeloma L363 (DSMZ, ACC49) - pokazujući najslabije površinsko eksprimiranje prirodnih BCMA svih testiranih ciljanih T ćelijskih linija - kao izvor ciljanih ćelija i nestimulisan ljudski PBMC kao efektorske ćelije. Ispitivanje je izvedeno kao što je opisano iznad (Primer 8.3).

[0244] Kao što je primećeno u testu oslobađanja 51-hroma sa stimulisanim obogaćenim ljudskim CD8 T limfocitima protiv ljudske ćelijske linije multiplog mijeloma L363, BCMA/CD3 bispecifična antitela klastera epitopa E1/E4 - za razliku od njihove potentne citotoksične aktivnosti protiv CHO ćelija transfektovanih ljudskim BCMA – ponovo su se pokazala manje potentna u preusmeravanju citotoksične aktivnosti nestimulisanog PBMC protiv ljudske ćelijske linije multiplog mijeloma L363 eksprimirajući prirodni BCMA pri niskoj gustini na ćelijskoj površini. To je u skladu sa gore navedenom teorijom, tj. E1/E4 epitop ljudskog BCMA može biti manje dostupan na prirodnim BCMA ekspresorima nego na ćelijama transfektovanim BCMA. BCMA/CD3 bispecifična antitela klastera epitopa E3 predstavljena sa u ovom testu sa trocifrenim vrednostima pg/ml EC50 (pogledati Sliku 13 i Tabelu 8).

Tabela 8: EC50 vrednosti [pg/ml] BCMA/CD3 bispecifičnih antitela epitopskih klastera E1/E4 (redovi 1 i 2) i E3 (redovi 3 do 8) izmerene u 48-časovnom FACS testu citotoksičnosti sa nestimulisanim ljudskim PBMC kao efektorskim ćelijam i ljudskom ćelijskom linijom multiplog mijeloma L363 kao izvorom ciljanih ćelija.

[0245] Očekivano, EC50 vrednosti bile su veće u ispitivanjima citotoksičnosti sa nestimulisanim PBMC kao efektorskim ćelijama nego u testovima citotoksičnosti koristeći obogaćene stimulisane ljudske CD8 T ćelije.

Primer 13

Nestimulisani ljudski PBMC protiv BCMA-pozitivne ćelijske liniji multiplog mijeloma NCI-H929

[0246] Citotoksična aktivnost BCMA/CD3 bispecifičnih antitela analizirana je u FACS testu citotoksičnosti koristeći BCMA-pozitivnu ljudsku ćelijsku liniju multiplog mieloma NCI-H929 (ATCC CRL-9068) kao izvor ciljanih ćelija i nestimulisani ljudski PBMC kao efektorske ćelije. Ispitivanje je izvedeno kao što je opisano iznad (Primer 8.3).

[0247] Rezultati ovog testa sa drugom ljudskom ćelijskom linijom multiplog mijeloma (tj. NCI-H929) koja eksprimira prirodnu BCMA na ćelijskoj površini potvrđuju one dobijene sa ćelijskom linijom ljudskog multiplog mijeloma L363. Opet, BCMA/CD3 bispecifična antitela klastera epitopa E1/E4 - za razliku od njihove potentne citotoksične aktivnosti protiv CHO ćelije transfekovane ljudskim BCMA - pokazala se manje potentnom u preusmeravanju citotoksične aktivnosti nestimulisanog PBMC protiv ljudskih ćelija multiplog mijeloma što potvrđuje teoriju da je epitop E1/E4 ljudskog BCMA možda manje dostupan na prirodnim ekspresorima BCMA nego na ćelijama koje su BCMA-transfekovane. Takav jaz između aktivnosti BCMA-transfektovanih ciljanih ćelija i prirodnih ekspresora kao što se vidi za veznike za E1/E4 nije otkriven za E3. BCMA/CD3 bispecifična antitela klastera epitopa E3 predstavljena su sa dvoficrenim do trocifrenim vrednostima pg/ml EC50 i prema tome preusmeravaju nestimulisani PBMC protiv NCI-H929 ciljanih ćelija sa vrlo dobrim EC50 vrednostima (pogledati Sliku 14 i Tabelu 9).

Tabela 9: EC50 vrednosti [pg/ml] BCMA/CD3 bispecifičnih antitela epitopskih klastera E1/E4 (redovi 1 i 2) i E3 (redovi 3 do 8) izmerene u 48-časovnom FACS testu citotoksičnosti sa nestimulisanim ljudskim PBMC kao efektorskih ćelijama i ljudskom ćelijskom linijom multiplog mijeloma NCI-H929 kao izvor ciljanih ćelija.

[0248] Kao što se očekivalo, vrednosti EC50 bile su niže sa ćelijskom linijom ljudskog multiplog mijeloma NCI-H929, koja eksprimira više nivoe BCMA na ćelijskoj površini u poređenju s L363.

Primer 14

Makaki T ćelije protiv ciljanih ćelija koje eksprimiraju BCMA

[0249] Konačno, citotoksična aktivnost BCMA/CD3 bispecifičnih antitela je analizirana u FACS testu citotoksičnosti koristeći CHO ćelije transfektovane makaki BCMA kao ciljane ćelije i makaki T ćelijsku liniju kao izvor efektorskih ćelija.

[0250] Makaki T ćelijska linija 4119LnPx (Knappe i dr. Blood 95:3256-61 (2000)) korišćena je kao izvor efektorskih ćelija. Označavanje ciljane ćelije CHO ćelija transfektovanih sa makaki BCMA i analiza citotoksične aktivnosti zasnovana na protočnoj citometriji izvedene su kao što je gore opisano.

[0251] Makaki T ćelije iz ćelijske linije 4119LnPx su indukovane da efikasno ubiju CHO ćelije transfekovane sa makaki BCMA, BCMA/CD3 bispecifičnim antitelom klastera epitopa E3. Antitela su u ovom testu predstavljena su vrlo potentna sa jednocifrenim do niskim dvocifrenim pg/ml EC50 vrednostima, što potvrđuje da su ova antitela veoma aktivna u makaki sistemu. S druge strane, BCMA/CD3 bispecifična antitela klastera epitopa E1/E4 pokazala su značajno slabiju potenciju sa EC50 vrednostima u dvocifrenom do trocifrenog pg/ml raspona (pogledati Sliku 15 i Tabelu 10). Antitela specifična za E3 su stoga oko 3 do gotovo 100 puta jača u makaki sistemu.

Tabela 10: EC50 vrednosti [pg/ml] BCMA/CD3 bispecifičnih antitela epitopskih klastera E1/E4 (redovi 1 i 2) i E3 (redovi 3 do 8) izmerene u 48-časovnom FACS testu citotoksičnosti sa makaki T ćelijskom linijom 4119LnPx kao efektorskim ćelijama i CHO ćelijama transfektovanim sa makaki BCMA kao ciljanim ćelijama.

Primer 15

Jaz potencija između monomera i dimera BCMA/CD3 bispecifičnih antitela

[0252] Kako bi se utvrdila razlika u citotoksičnoj aktivnosti između monomernog i dimernog izoforma pojedinačnih BCMA/CD3 bispecifičnih antitela (što se naziva jaz potencija), sproveden je test citotoksičnosti oslobađanja 51-hroma, kao što je prethodno opisano (Primer 8.1) sa prečišćenim monomerom i dimerom BCMA/CD3 bispecifičnog antitela. Jaz potencija je izračunata kao odnos između EC50 vrednosti monomera i dimera bispecifičnog antitela. Praznine potencijala testiranih BCMA/CD3 bispecifičnih antitela klastera epitopa E3 bile su između 0,03 i 1,2. Stoga nema značajno aktivnijeg dimera u poređenju sa njegovim monomerom.

Primer 16

Konverzija monomera u dimer nakon tri ciklusa zamrzavanja/odmrzavanja

[0253] Bispecifični monomer antitela BCMA/CD3 podvrgnut je tri ciklusa zamrzavanja/odmrzavanja praćen visokim performansama SEC kako bi se odredio procenat početno monomernih antitela, koja su pretvorena u dimer antitela.

[0254] 15 | jg monomernih antitela je podešeno na koncentraciju od 250 µg/ml generičkim puferom, i zatim zamrznuto na -80°C tokom 30 minuta, i zatim odleđivano tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon tri ciklusa zamrzavanja/odmrzavanja, sadržaj dimera je određen sa HP-SEC. U tu svrhu, sledi 15 µg alikvota monomernih izoforma antitela i odmrzava se do koncentracije od 250 µg/ml u originalnom SEC puferu (10 mM limunska kiselina - 75 mM lizin HCl - 4% trehaloza - pH 7,2). inkubacijom na 37°C tokom 7 dana. TSK Gel G3000 SWXL kolona visoke rezolucije (Tosoh, Tokio-Japan) spojena je sa Äkta Purifier 10 FPLC (GE opremljen sa A905 Autosampler. Uravnotežavanje kolona i tekući pufer sastojali su se od 100 mM KH2PO4 - 200 mM Na2SO4 podešen na pH 6,6. Nakon 7 dana inkubacije, rastvor antitela (15 µg proteina) je nanesen na izbalansiranu kolonu i eluiranje je sprovedeno pri protoku od 0,75 ml/minut, pri maksimalnom pritisku od 7 MPa. Ceo rad je praćen na 280, 254 i 210 nm optičkoj apsorbanciji. Analiza je rađena vršnom integracijom 210 nm signala zabeleženog na listi za ocenjivanje softverskog programa Äkta Unicorn. Sadržaj dimera izračunat je deljenjem vršne površine dimera na ukupnu površinu monomera plus dimera.

[0255] BCMA/CD3 bispecifična antitela klastera epitopa E3 predstavljena su procentom dimera od 0,7 do 1,1% nakon tri ciklusa zamrzavanja/odmrzavanja, što se smatra dobrim. Međutim, stopa konverzije dimera BCMA/CD3 bispecifičnih antitela klastera epitopa E1/E4 dostigla je nepovoljno visoke vrednosti, prelazeći prag do nepovoljnih vrednosti dimera od ≥2,5% (4,7% i 3,8%, respektivno), pogledati Tabelu 11.

Tabela 11:Procenat monomernih nasuprot dimernih BCMA/CD3 bispecifičnih antitela epitopskih klastera E1/E4 (redovi 1 i 2) i E3 (redovi 3 do 8) nakon tri ciklusa zamrzavanja/odmrzavanja, kao što je utvrđeno hromatografijom visokih performansi isključivanja veličine (HP-SEC).

Primer 17

Termostabilnost

[0256] Krive temperature topljenja određene su diferencijalnom skenirajućom kalorimetrijom (DSC) kako bi se odredila svojstvena biofizička proteinska stabilnost BCMA/CD3 bispecifičnih antitela. Ovi eksperimenti su izvedeni korišćenjem MicroCal LLC (Northampton, MA, U.S.A) VP-DSC uređaja. Zabeležen je energetski unos uzorka koji sadrži BCMA/CD3 bispecifično antitelo od 20 do 90°C u poređenju sa uzorkom koji je samo sadržao pufer za formulaciju antitela.

[0257] Detaljno, BCMA/CD3 bispecifična antitela su podešena na konačnu koncentraciju od 250 µg/ml u puferu za skladištenje.300 µl pripremljenih proteinskih rastvora prebačeno je u ploču sa dubokim komoricima i stavljeno u ohlađeni položaj autosampler stalka u DSC uređaju. Dodatni otvori su ispunjeni SEC tekućim puferom kao referentnim materijalom za merenje. Za postupak merenja, rastvor proteina je prebačen autosamplerom u kapilar. Dodatni kapilar bio je ispunjen s SEC tekućim puferom. Za sve uzorke urađeno je zagrevanje i snimanje potrebne grejne energije za zagrevanje oba kapilare na jednakoj temperaturi u rasponu od 20 do 90°C.

[0258] Za snimanje odgovarajuće krive topljenja, ukupna temperatura uzorka je povećana postupno. Za svaku temperaturu T unosa energije uzorka i formulacije, zabeležen je referentni pufer. Razlika unosa energije Cp (kcal/mol/°C) uzorka umanjena za referentnu temperaturu je upoređena sa odgovarajućom temperaturom. Temperatura topljenja se definiše kao temperatura pri prvom maksimumu utroška energije.

[0259] Sva testirana BCMA/CD3 bispecifična antitela klastera epitopa E3 pokazala su povoljnu termostabilnost sa temperaturama topljenja iznad 60°C, tačnije između 61,62°C i 63,05°C.

Primer 18

Isključivanje interferencije plazme protočnom citometrijom

[0260] Kako bi se utvrdila potencijalna interakcija BCMA/CD3 bispecifičnih antitela sa proteinima ljudske plazme, utvrđen je test interferencije plazme. U tu svrhu, 10 µg/ml odgovarajućih BCMA/CD3 bispecifičnih antitela se inkubira jedan sat na 37°C u 90% ljudskoj plazmi. Nakon toga, vezivanje za CHO ćelije koje eksprimiraju ljudski BCMA određeno je protočnom citometrijom.

[0261] Za protočnu citometriju, 200,000 ćelija odgovarajućih ćelijskih linija inkubirano je tokom 30 minuta na ledu sa 50 µl pročišćenog antitela u koncentraciji od 5 µg/ml. Ćelije su isprane dva puta sa PBS/2% FCS i vezivanje konstrukata detektovano je mišjim PentaHis antitelom (Qiagen; razblažen 1:20 u 50 µl PBS/2% FCS). Posle pranja, vezana PentaHis antitela su detektovana sa Fc gama specifičnim antitelom (Dianova) konjugovanim na fikoetrin, razblažen 1:100 u PBS/2% FCS. Uzorci su mereni protočnom citometrijom na instrumentu FACSCanto II i analizirani FACSDiva softverom (oba od Becton Dickinson).

[0262] Dobijeni podaci upoređeni su sa kontrolnim testom koristeći PBS umesto ljudske plazme. Relativno vezivanje je izračunato na sledeći način:

(signalni PBS uzorak/signal bez agensa za detektovanje)/(signalni uzorak plazme/signal bez agensa za detektovanje).

[0263] U ovom eksperimentu postalo je očigledno da nije došlo do značajnog smanjenja ciljanog vezivanja odgovarajućih BCMA/CD3 bispecifičnih antitela klastera epitopa E3 posredovanih proteinima plazme. Relativna vrednost interferencije u plazmi bila je ispod vrednosti 2 u svim slučajevima, tačnije između 1,29 ± 0,25 i 1,70 ± 0,26 (gde se vrednost „2“ smatra donjim pragom za interferencijske signale).

Primer 19

Terapijska efikasnost BCMA/CD3 bispecifičnih antitela u ksenograft modelima ljudskog tumora

[0264] Dana 1 studije, 5x10<6>ćelija ljudske ćelijske linije raka NCI-H929 subkutano su ubrizgane u desni leđni bok ženki NOD/SCID miševa.

[0265] Dana 9, kada je srednja zapremina tumora dostigla oko 100 mm<3>, in vitro proširene ljudske CD3<+>T ćelije su transplantirane u miševe ubrizgavanjem oko 2x10<7>ćelije u peritonealnu šupljinu životinja. Miševi kontrolne grupe 1 (n=5) nosača nisu dobili efektorske ćelije i korišćeni su kao netransplantirana kontrola za poređenje sa kontrolnom grupom 2 (n=10, koje primaju efektorske ćelije) kako bi nadgledali uticaj T ćelija na rast tumora.

[0266] Tretman antitelom je počeo dana 13, kada je srednja zapremina tumora dostigla oko 200 mm<3>. Srednja veličina tumora svake grupe za tretman na dan početka tretmana nije se statistički razlikovala od bilo koje druge grupe (analiza varijance). Miševi su tretirani sa 0,5 mg/kg/dan BCMA/CD3 bispecifičnih antitela BCMA-98 x CD3 (grupa 3, n=7) ili BCMA-34 x CD3 (grupa 4, n=6) intravenskom bolus injekcijom tokom 17 dana.

[0267] Tumori su mereni šestarom tokom studije i napredak je procenjen među-grupnim poređenjem zapremina tumora (TV). Inhibicija rasta tumora T/C [%] određena je izračunavanjem TV kao T/C% = 100 x (srednja TV analizirane grupe)/(srednja TV kontrolne grupe 2). Rezultati su prikazani u Tabeli 12 i na Slici 16.

Tabela 12: Srednja zapremina tumora (TV) i inhibicija rasta tumora (T/C) na dane 13 do 30.

Primer 20

Isključivanje lize ciljanih negativnih ćelija

[0268] In vitro test lize je izveden korišćenjem BCMA-pozitivne ljudske ćelije linije multiplog mijeloma NCI-H929 i pročišćenim T ćelijama pri odnosu na efektorskih i ciljanih ćelije od 5:1 i sa vremenom inkubacije 24 sata. BCMA/CD3 bispecifična antitela klastera epitopa E3 (BCMA-34 i BCMA-98) pokazala su visoku potenciju i efikasnost u lizi NCI-H929. Međutim, nije otkrivena liza kod BCMA-negativnih ćelijskim linijama HL60 (AML/mijeloblastna morfologija), MES-SA (sarkom materice, morfologija fibroblasta) i SNU-16 (rak želuca, morfologija epitela) za do 500 nM odgovarajućeg antitelo.

Primer 21

Indukcija T ćelijske aktivacije različitih PBMC podskupova

[0269] Ispitivanje citotoksičnosti zasnovane na FACS (48h; E:T = 10:1) izvedeno je korišćenjem ljudskih ćelijskih linija multiplog mijeloma NCI-H929, L-363 i OPM-2 kao ciljanih ćelija i različitih podvrsta ljudskog PBMC (CD4<+>/ CD8<+>/ CD25<+>/ CD69<+>) kao efektorskih ćelija. Rezultati (pogledati Tabelu 13) pokazuju da je stepen aktivacije, meren EC50 vrednosti, u osnovi u istom rasponu za različite analizirane podgrupe PBMC.

Tabela 13: EC50 vrednosti [ng/ml] BCMA/CD3 bispecifičnih antitela klastera epitopa E3 izmerene u 48-časovnom FACS testu citotoksičnosti sa različitim podvrstama ljudskih PBMC kao efektorskih ćelija i različitim ljudskim ćelijskim linijama multiplog mijeloma kao ciljanih ćelija.

Primer 22

Indukcija oslobađanja citokina

[0270] FACS ispitivanje citotoksičnosti (48 sati; E:T = 10:1) izvedeno je korišćenjem ljudskih ćelijskih linija multiplog mijelomska NCI-H929, L-363 i OPM-2 kao ciljanih ćelija i ljudskog PBMC kao efektorskih ćelija. Nivoi oslobađanja citokina [pg/ml] određeni su povećanim koncentracijama BCMA/CD3 bispecifičnih antitela klastera epitopa E3. Analizirani su sledeći citokini: II-2, IL-6, IL-10, TNF i IFN-gama. Rezultati su prikazani u Tabeli 1 i na Slici 17.

Tabela 14: Oslobađanje IL-2, IL-6, IL-10, TNF i IFN-gama [pg/ml] indukovanog 2,5 µg/ml BCMA/CD3 bispecifičnim antitelima klastera epitopa E3 (BCMA-98 i BCMA-34) u 48-očasovnom FACS testu citotoksičnosti sa ljudskim PBMC kao efektorskim ćelijama i različitim ljudskim ćelijskim linijama multiplog mijeloma kao ciljanim ćelijama (E:T = 10:1).

Claims (26)

Patentni zahtevi

1. Vezujući molekul koji je barem bispecifičan koji sadrži prvi i drugi vezujući domen, gde (a) prvi vezujući domen je sposoban da se vezuje za klaster epitopa 3 od BCMA (CQLRCSSNTPPLTCQRYC); i

(b) drugi vezujući domen je sposoban da se vezuje za CD3; i

gde klaster epitopa 3 od BCMA odgovara aminokiselinskim ostacima 24 do 41 sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 1002,

i gde je navedeni molekul za vezivanje polipeptid.

2. Vezujući molekul prema patentnom zahtevu 1, gde je prvi vezujući domen is dalje sposoban da se vezuje za klaster epitopa 3 od makaki BCMA (CQLRCSSTPPLTCQRYC).

3. Vezujući molekul prema patentnom zahtevu 1 ili 2, gde drugi vezujući domen je sposoban da se vezuje za CD3 epsilon.

4. Vezujući molekul prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde prvi i/ili drugi vezujući domen obuhvataju CDR od antitela.

5. Vezujući molekul prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde prvi i drugi domen formiraju molekul koji je izabran iz grupe koju čine (scFv)2, (jednodomenski mAb)2, scFv-jednodomenski mAb, dijatelo ili njihovi oligomeri.

6. Vezujući molekul prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde prvi vezujući domen sadrži VH region koji sadrži CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3i VL region koji sadrži CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 odabrane iz grupe koju čine:

(1) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 1, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 2, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 3, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 4, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 5 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 6;

(2) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 11, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 12, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 13, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 14, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 15 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 16;

(3) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 21, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 22, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 23, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 24, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 25 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 26;

(4) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 31, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 32, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 33, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 34, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 35 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 36;

(5) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 41, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 42, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 43, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 44, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 45 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 46;

(6) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 51, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 52, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 53, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 54, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 55 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 56;

(7) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 61, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 62, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 63, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 64, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 65 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 66;

(8) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 71, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 72, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 73, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 74, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 75 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 76;

(9) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 161, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 162, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 163, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 164, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 165 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 166;

(10) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 171, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 172, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 173, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 174, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 175 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 176;

(11) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 181, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 182, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 183, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 184, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 185 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 186;

(12) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 191, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 192, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 193, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 194, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 195 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 196;

(13) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 201, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 202, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 203, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 204, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 205 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 206;

(14) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 211, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 212, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 213, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO:214, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 215 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 216;

(15) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 221, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 222, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 223, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 224, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 225 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 226;

(16) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 311, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 312, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 313, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 314, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 315 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 316;

(17) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 321, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 322, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 323, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 324, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 325 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 326;

(18) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 331, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 332, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 333, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 334, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 335 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 336;

(19) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 341, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 342, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 343, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 344, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 345 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 346;

(20) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 351, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 352, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 353, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 354, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 355 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 356;

(21) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 361, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 362, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 363, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 364, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 365 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 366;

(22) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 371, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 372, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 373, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 374, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 375 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 376;

(23) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 381, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 382, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 383, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 384, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 385 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 386;

(24) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 581, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 582, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 583, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 584, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 585 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 586;

(25) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 591, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 592, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 593, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 594, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 595 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 596;

(26) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 601, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 602, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 603, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 604, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 605 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 606;

(27) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 611, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 612, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 613, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 614, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 615 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 616;

(28) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 621, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 622, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 623, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 624, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 625 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 626;

(29) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 631, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 632, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 633, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 634, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 635 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 636;

(30) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 641, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 642, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 643, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 644, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 645 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 646;

(31) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 651, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 652, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 653, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 654, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 655 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 656;

(32) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 661, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 662, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 663, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 664, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 665 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 666;

(33) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 671, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 672, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 673, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 674, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 675 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 676;

(34) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 681, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 682, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 683, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 684, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 685 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 686;

(35) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 691, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 692, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 693, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 694, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 695 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 696;

(36) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 701, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 702, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 703, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 704, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 705 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 706;

(37) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 711, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 712, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 713, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 714, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 715 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 716;

(38) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 721, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 722, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 723, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 724, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 725 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 726;

(39) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 731, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 732, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 733, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 734, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 735 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 736;

(40) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 741, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 742, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 743, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 744, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 745 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 746;

(41) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 751, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 752, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 753, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 754, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 755 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 756;

(42) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 761, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 762, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 763, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 764, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 765 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 766;

(43) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 771, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 772, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 773, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 774, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 775 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 776;

(44) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 781, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 782, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 783, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 784, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 785 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 786;

(45) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 791, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 792, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 793, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 794, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 795 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 796;

(46) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 801, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 802, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 803, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 804, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 805 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 806;

(47) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 811, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 812, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 813, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 814, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 815 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 816;

(48) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 821, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 822, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 823, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 824, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 825 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 826;

(49) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 831, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 832, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 833, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 834, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 835 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 836;

(50) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 961, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 962, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 963, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 964, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 965 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 966;

(51) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 971, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 972, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 973, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 974, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 975 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 976;

(52) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 981, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 982, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 983, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 984, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 985 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 986; i

(53) CDR-H1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 991, CDR-H2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 992, CDR-H3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 993, CDR-L1 kako je prikazan u SEQ ID NO: 994, CDR-L2 kako je prikazan u SEQ ID NO: 995 i CDR-L3 kako je prikazan u SEQ ID NO: 996.

7. Vezujući molekul prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde prvi vezujući domen sadrži VH region odabran iz grupe koju čine VH regioni kako su prikazani u SEQ

ID NO: 7, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 47, SEQ ID

NO: 57, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 177, SEQ ID

NO: 187, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 227, SEQ

ID NO: 317, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 337, SEQ ID NO: 347, SEQ ID NO: 357,

SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 377, SEQ ID NO: 387, SEQ ID NO: 587, SEQ ID NO:

597, SEQ ID NO: 607, SEQ ID NO: 617, SEQ ID NO: 627, SEQ ID NO: 637, SEQ ID

NO: 647, SEQ ID NO: 657, SEQ ID NO: 667, SEQ ID NO: 677, SEQ ID NO: 687, SEQ

ID NO: 697, SEQ ID NO: 707, SEQ ID NO: 717, SEQ ID NO: 727, SEQ ID NO: 737,

SEQ ID NO: 747, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 767, SEQ ID NO: 777, SEQ ID NO:

787, SEQ ID NO: 797, SEQ ID NO: 807, SEQ ID NO: 817, SEQ ID NO: 827, SEQ ID

NO: 837, SEQ ID NO: 967, SEQ ID NO: 977, SEQ ID NO: 987, i SEQ ID NO: 997.

8. Vezujući molekul prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde prvi vezujući domen sadrži VL region odabran iz grupe koju čine VL regioni kako su prikazani u SEQ

ID NO: 8, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 48, SEQ ID

NO: 58, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 178, SEQ ID

NO: 188, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 228, SEQ

ID NO: 318, SEQ ID NO: 328, SEQ ID NO: 338, SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 358,

SEQ ID NO: 368, SEQ ID NO: 378, SEQ ID NO: 388, SEQ ID NO: 588, SEQ ID NO:

598, SEQ ID NO: 608, SEQ ID NO: 618, SEQ ID NO: 628, SEQ ID NO: 638, SEQ ID

NO: 648, SEQ ID NO: 658, SEQ ID NO: 668, SEQ ID NO: 678, SEQ ID NO: 688, SEQ

ID NO: 698, SEQ ID NO: 708, SEQ ID NO: 718, SEQ ID NO: 728, SEQ ID NO: 738,

SEQ ID NO: 748, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 768, SEQ ID NO: 778, SEQ ID NO:

788, SEQ ID NO: 798, SEQ ID NO: 808, SEQ ID NO: 818, SEQ ID NO: 828, SEQ ID

NO: 838, SEQ ID NO: 968, SEQ ID NO: 978, SEQ ID NO: 988, i SEQ ID NO: 998.

9. Vezujući molekul prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde prvi vezujući domen sadrži VH region i VL region odabran iz grupe koju čine:

(1) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 7, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 8;

(2) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 17, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 18;

(3) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 27, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 28;

(4) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 37, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 38;

(5) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 47, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 48;

(6) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 57, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 58;

(7) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 67, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 68;

(8) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 77, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 78;

(9) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 167, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 168;

(10) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 177, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 178;

(11) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 187, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 188;

(12) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 197, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 198;

(13) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 207, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 208;

(14) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 217, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 218;

(15) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 227, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 228;

(16) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 317, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 318;

(17) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 327, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 328;

(18) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 337, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 338;

(19) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 347, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 348;

(20) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 357, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 358;

(21) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 367, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 368;

(22) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 377, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 378;

(23) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 387, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 388;

(24) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 587, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 588;

(25) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 597, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 598;

(26) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 607, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 608;

(27) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 617, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 618;

(28) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 627, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 628;

(29) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 637, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 638;

(30) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 647, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 648;

(31) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 657, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 658;

(32) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 667, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 668;

(33) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 677, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 678;

(34) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 687, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 688;

(35) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 697, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 698;

(36) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 707, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 708;

(37) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 717, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 718;

(38) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 727, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 728;

(39) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 737, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 738;

(40) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 747, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 748;

(41) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 757, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 758;

(42) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 767, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 768;

(43) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 777, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 778;

(44) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 787, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 788;

(45) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 797, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 798;

(46) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 807, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 808;

(47) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 817, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 818;

(48) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 827, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 828;

(49) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 837, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 838;

(50) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 967, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 968;

(51) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 977, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 978;

(52) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 987, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 988; i

(53) VH region kako je prikazan u SEQ ID NO: 997, i VL region kako je prikazan u SEQ ID NO: 998.

10. Vezujući molekul prema bilo kom patentnom zahtevu 1-5 koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 340 ili SEQ ID NO: 980.

11. Vezujući molekul prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što ima EC50 (pg/ml) od 350 ili manje, poželjno 320 ili manje.

12. Vezujući molekul prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što ima EC50 (pg/ml) što je ekvivalentno EC50 (pg/ml) bilo kog od BCMA/CD3 bispecifičnih vezujućih molekula kako je dato u SEQ ID NO:829xCD3, SEQ ID NO:619xCD3 SEQ ID NO:49xCD3, SEQ ID NO:979xCD3, SEQ ID NO:709xCD3, SEQ ID NO:339xCD3, SEQ ID NO:739xCD3 ili SEQ ID NO:199xCD3.

13. Sekvenca nukleinske kiselina koja kodira vezujući molekul kako je definisano u bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 12.

14. Vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline kako je definisano u patentnom zahtevu 13.

15. Ćelija domaćina transformisana ili transfektovana sekvencom nukleinske kiseline kako je definisano u patentnom zahtevu 15 ili vektorom kako je definisano u patentnom zahtevu 14.

16. Proces proizvodnje vezujućeg molekula prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 12, gde navedeni postupak sadrži kultivisanje ćelije domaćini kako je definisano u patentnom zahtevu 15, pod uslovima koji omogućavaju eksprimiranje vezujućeg molekula kako je definisano u bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 12 i pribavljanje proizvedenog vezujućeg molekula iz kulture.

17. Farmaceutski sastav koja sadrži vezujući molekul prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 12, ili proizveden u skladu sa postupkom prema patentnom zahtevu 16.

18. Vezujući molekul prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 12, ili proizveden u skladu sa postupkom prema patentnom zahtevu 16, za upotrebu u prevenciji, tretmanu ili ublažavanju bolesti izabrane iz grupe koja se sastoji od poremećaja ćelija plazme, drugih poremećaja B ćelija koji su u korelaciji sa BCMA eksprimiranjem, i autoimune bolesti.

19. Komplet koji sadrži vezujući molekul definisan u bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 12, molekul nukleinske kiseline definisan u patentnom zahtevu 13, vektor definisan u patentnom zahtevu 14, i/ili ćeliju domaćina definisanu u patentnom zahtevu 15.

20. Vezujući molekul prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 3, gde je navedeni drugi vezujući domen sposoban da se vezuje za ljudski CD3 i za makaki CD3.

21. Vezujući molekul patentnog zahteva 1, gde su navedeni vezujući domeni izvedeni iz antitela, lipokalina ili antikalina.

22. Vezujući molekul patentnog zahteva 1, gde je prvi i/ili drugi vezujući domen antitelo.

23. Vezujući molekul patentnog zahteva 21 ili 22, gde navedeno antitelo uključuje monoklonska, himerna, jednolančana, humanizovana i ljudska antitela.

24. Vezujući molekul od bilo kom patentnom zahtevu od 21 do 23, gde navedeno antitelo uključuje Fab fragmente, F(ab')2, Fv, scFv fragmente, jednodomenska antitela, nano antitela, dijatela, DART antitela, jednolančana dijatela, tandemska antitela, minitela, Fc DART antitela, IgG DART antitela i više multitela.

25. Vezujući molekul od bilo kom patentnom zahtevu od 21 do 24, gde je navedeno antitelo afinitetno zrelo antitelo.

26. Vezujući molekul patentnog zahteva 1, gde se navedeno vezivanje za klaster epitopa 3 od BCMA testira razmenom sa odgovarajućim klasterom epitopa od ne-ljudskog BCMA antigena alaninskim skeniranjem.