Deprecated: The each() function is deprecated. This message will be suppressed on further calls in /home/zhenxiangba/zhenxiangba.com/public_html/phproxy-improved-master/index.php on line 456
RS59471B1 - Nova imunoterapija za lečenje nekoliko tumora krvi, kao što je akutna mijeloidna leukemija (aml) - Google Patents
[go: Go Back, main page]

RS59471B1 - Nova imunoterapija za lečenje nekoliko tumora krvi, kao što je akutna mijeloidna leukemija (aml) - Google Patents

Nova imunoterapija za lečenje nekoliko tumora krvi, kao što je akutna mijeloidna leukemija (aml)

Info

Publication number
RS59471B1
RS59471B1 RS20191183A RSP20191183A RS59471B1 RS 59471 B1 RS59471 B1 RS 59471B1 RS 20191183 A RS20191183 A RS 20191183A RS P20191183 A RSP20191183 A RS P20191183A RS 59471 B1 RS59471 B1 RS 59471B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
peptide
adenocarcinoma
cell
tumor
cells
Prior art date
Application number
RS20191183A
Other languages
English (en)
Inventor
Juliane Walz
Daniel Kowalewski
Claudia Berlin
Hans-Georg Rammensee
Stefan Stevanovic
Original Assignee
Immatics Biotechnologies Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Immatics Biotechnologies Gmbh filed Critical Immatics Biotechnologies Gmbh
Publication of RS59471B1 publication Critical patent/RS59471B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/02—Linear peptides containing at least one abnormal peptide link
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0638—Cytotoxic T lymphocytes [CTL] or lymphokine activated killer cells [LAK]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01048—Histone acetyltransferase (2.3.1.48)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y306/00—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6)
    • C12Y306/04—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6) acting on acid anhydrides; involved in cellular and subcellular movement (3.6.4)
    • C12Y306/04004—Plus-end-directed kinesin ATPase (3.6.4.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y599/00—Other isomerases (5.99)
    • C12Y599/01—Other isomerases (5.99.1)
    • C12Y599/01002—DNA topoisomerase (5.99.1.2)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G01N33/505—Cells of the immune system involving T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)

Description

Predmetni pronalazak odnosi se na peptide, nukleinske kiseline i ćelije za upotrebu u imunoterapijskim metodama. Predmetni pronalazak se konkretno odnosi na imunoterapiju raka. Pored toga, predmetni pronalazak odnosi se na peptidne epitope tumor-asocirane citotoksične T ćelije (CTL), samostalno ili u kombinaciji sa drugim tumor-asociranim peptidima koji predstavljaju aktivne farmaceutske sastojke smeša za vakcinu koji stimulišu antitumorske imunske odgovore. Predmetni pronalazak odnosi se na nekoliko novih peptidnih sekvenci i njihove varijante dobijene iz HLA molekula klase I humanih tumorskih ćelija koje mogu da se koriste u smešama za vakcinu za izazivanje antitumorskih imunskih odgovora.
Osnovne informacije o pronalasku
Akutna mijeloidna leukemija (AML), takođe poznata i kao akutna mijelogena leukemija ili akutna nelimfocitna leukemija (ANLL), je malignitet mijeloidne loze krvnih ćelija koji karakteriše brzi rast abnormalnih belih krvnih ćelija koje se akumuliraju u kostnoj srži i ometaju proizvodnju normalnih ćelija krvi. AML je najčešća akutna leukemija kod odraslih a njena incidencija se povećava sa godinama starosti. Iako je AML relativno retka bolest, koja je odgovorna za približno 1,2% smrtnih ishoda usled malignih bolesti u Sjedinjenim Američkim Državama, očekuje se da će se zbog sve starije populacije njena incidencija povećati.
Simptomi AML posledica su zamene normalne kostne srži leukemičnim ćelijama što dovodi do smanjenja broja crvenih krvnih ćelija, trombocita i normalnih belih krvnih ćelija. Ovi simptomi obuhvataju malaksalost, otežano disanje, lako stvaranje modrica i krvarenje i povećan rizik za nastanak infekcija. Identifikovano je nekoliko faktora rizika i hromozomske anomalije ali specifičan uzrok nije jasan. Budući da je akutna leukemija, AML brzo progredira i tipično se završava smrtnim ishodom u roku od nekoliko nedelja ili meseci ako se ne leči.
Postoji nekoliko podvrsta AML; terapija i prognoza se razlikuju u zavisnosti od podvrste. Petogodišnje preživljavanje se kreće u rasponu od 15% do 70%, a procenat relapsa u rasponu od 33% do 78%, u zavisnosti od podvrste. AML se inicijalno leči hemioterapijom koja ima za cilj da indukuje remisiju; pacijenti mogu da nastave da primaju dodatnu hemioterapiju ili da im se izvrši transplantacija hematopoetskih matičnih ćelija.
Patent US 2005/0261190 A1 predstavlja fragmente polipeptida faktora 1 povezanog sa Fas, koji se vezuju za Hsc70/Hsp70, ubikvitinisani protein ili protein koji sadrži valozin. Neki od fragmenata obuhvataju ID BR. SEKV: 5 kako je izloženo u ovom dokumentu.
Slično tome, dokument KR100692416 iznosi da fragment FAF-1 (faktor 1 povezan sa Fas) ima inhibitorne efekte na angiogenezu i ćelijsku proliferaciju. Zbog toga je on predložen kao antitumorski agens, npr. agens koji inhibira metastazu tumora. Frakcija koja ima inhibitorni efekat na metastazu tumora sastavljena je od 290-345 aminokiselina FAF1.
Hassan i sar. (The human leukocyte antigen-presented ligandome of B lymphocytes. Mol Cell Proteomics. 2013 Jul;12(7):1829-43) iznose identifikaciju i relativnu kvantifikaciju 14.500 peptidnih liganada koji čine HLA ligandom B ćelija kao početnu tačku za rešavanje mnoštva specifičnih imunoloških pitanja.
Kowalewski i sar. (Mapping The HLA Ligandome Of Chronic Lymphocytic Leukemia – Towards Peptide Based Immunotherapy Blood 2013; 122(21):4123) opisuju metod za analiziranje HLA klasa I peptidoma 25 pacijenata sa HLL i 35 zdravih kontrola.
Patent US 2011/287442 A1 identifikuje peptide dobijene iz Top2αC koji se potencijalno vezuju za H-2K<b >koji su bili ispitani pomoću sistema za bodovanje peptidnog motiva (BIMAS). Bez obzira na to, predmetni peptid nije bio identifikovan a samo jedan od pet peptida u US 2011/287442 A1 je uopšte bio imunogen (slika 9).
Veeraraghavan, S. (u radu: „Mapping of the immunodominant T cell epitopes of the protein topoisomerase I“, Annals of the Rheumatic Diseaes, vol.63, br.8, 2004, strane 982-987) takođe predviđa epitope pomoću softvera i pored toga odnosi se na autoantitela u autoimunskim bolestima. Pored posredovanja MHC klasom II, Veeraraghavan nije mogao da ustanovi ATA sa specifičnim peptidima (diskusija) te stoga ne motiviše stručnu osobu da traži MHC peptide klase I koji su povezani sa rakom.
I pored gore navedenog, ostaje potreba za novom efikasnom i bezbednom terapijskom opcijom za maligne tumore kao što je malignitet krvi, konkretno akutnu mijeloidnu leukemiju (AML) i druge maligne tumore krvi različitih fenotipova, a koja poboljšava blagostanje pacijenata bez korišćenja prekomernih hemioterapijskih agenasa ili drugih agenasa koji mogu imati teška neželjena dejstva.
Predmetni pronalazak koristi peptide koji stimulišu imunski sistem pacijenta i deluju kao antitumorski agensi na neinvazivan način.
Kratak pregled pronalaska
U prvom aspektu predmetnog pronalaska, predmetni pronalazak odnosi se na peptid dužine između 9 i 30 aminokiselina, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu KLQEQLAQL u skladu sa ID BR. SEKV: 266, ili njenu farmaceutski prihvatljivu so.
U sledećim tabelama prikazani su ovde predstavljeni peptidi, njihovi odgovarajući ID BR. SEKV i prospektivni izvorni protein(i) za ove peptide. Svi peptidi u tabeli 1 vezuju se za HLA A, HLA B ili HLA C alele, peptidi u tabeli 2 identifikovani su kao izvedeni iz antigena povezanih sa AML, a peptidi u tabeli 3 se vezuju za HLA-DR (MHC klasa II) alele. Peptidi klase II u tabeli 3 su dalje korisni u dijagnostikovanju i/ili lečenju AML, hronične limfocitne leukemije (HLL) i drugih hematoloških maligniteta, koji podrazumevaju prekomernu ekspresiju ili prekomernu prezentaciju dotičnog osnovnog polipeptida.
Predmetni pronalazak se konkretno odnosi na peptid predmetnog pronalaska koji sadrži sekvencu u skladu sa ID BR. SEKV: 266.
Tabela 1: Peptidi u skladu sa predmetnim pronalaskom, osnovni polipeptidi prikazani su podebljanim slovima. ID BR. SEKV: 266 je u skladu sa pronalaskom.
Tabela prikazuje tumor-asocirane antigene dobijene iz HLA klasa I ligandoma (LiTAAs) sa učestalostima reprezentacije ≥20% kod pacijenata sa AML (n=15) i predstavlja HLA ligande (LiTAPs) zabeležene sa odnosnom HLA restrikcijom. Skraćenice: rep. reprezentacija; n.d. nije dodeljeno
Tabela 2: Dodatni peptidi prema predmetnom pronalasku povezani sa osnovnim antigenima opisanim da su u vezi sa AML
WT1 Wilms-ov tumor 1 10[33,3] / 0[0,0] 3[20,0]
384 AFTVHFSGQF 0/0 2 A*23
385 GVFRGIQDV 0/0 1 A*02:01
386 QRNMTKLQL 1/0 0 n.d.
Tabela prikazuje prezentovane HLA ligande dobijene iz ustanovljenih AML-asociranih antigena zabeležene sa izvornim uzorkom, učestalostima reprezentacije u različitom tkivu (15 uzoraka AML, 30 uzoraka PBMC i 5 uzoraka BMNC) i odgovarajućom HLA restrikcijom. Skraćenice: rep. reprezentacija; n.d. nije dodeljeno
Peptidi u sledećoj tabeli 3 su dalje korisni u dijagnostikovanju i/ili lečenju hematoloških maligniteta, AML i/ili ćelija hronične limfocitne leukemije (HLL), ali poželjno AML.
Tabela 3: Predstavljeni peptidi MHC klase II
Tabela prikazuje tumor-asocirane antigene dobijene iz HLA klasa II ligandoma (LiTAAs) sa
učestalostima reprezentacije >20% kod pacijenata sa AML (n=12) i predstavlja HLA ligande
(LiTAPs). Skraćenice: rep. reprezentacija.
Peptidi u sledećoj tabeli 4 su korisni i u dijagnostikovanju i/ili lečenju AML i/ili HLL, a
poželjno AML.
Tabela 4: Peptidi u skladu sa predmetnim pronalaskom koji se mogu koristiti i u lečenju AML
i HLL
ID BR.
SEKV: Sekvenca
448 APVELILSDETLPAPE
520 DDNIKTYSDHPEK
471 EKGVRTLTAAAVSGAQ
472 EKGVRTLTAAAVSGAQP
439 ELTLGEFLK
353 FLDPRPLTV
522 GDKVYVHLKNLASRPY
318 GLDPNKPPEL
178 HEIDRYTAI
68 IGVEHVVVY
201 IPVVHASI
474 KGVRTLTAAAVSGAQ
381 KLDNQVSKV
323 KLYELHVFTF
46 KLYPTLVIR
241 KTIAFLLPMF
450 LAPLEGARFALVRED
357 LEKQLIEL
491 LNSLTYQVLDVQRYP
492 LPQLVGVSTPLQG
493 LPQLVGVSTPLQGG
494 LPQLVGVSTPLQGGS
441 LTLGEFLK
442 LTLGEFLKL
498 RKSRQGSLAMEELK
495 RLPQLVGVSTPLQGGS
354 SAFADRPAF
45 SEETFRFEL
382 SENVKLFSA
445 SQLTTLSFY
443 TLGEFLKL
202 TVADQVLVGSY
179 VFTLKPLEF
296 VIYNEQMASK
383 VQKLQNII
525 VYVHLKNLASRPY
325 YLNKEIEEA
180 YWVPRNAL
Tako, naročito je poželjan najmanje jedan peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom izabran
iz grupe koja se sastoji od ID BR. SEKV: 448, 520, 471, 472, 439, 353, 522, 318, 178, 68, 201,
474, 381, 323, 46, 241, 450, 357, 491, 492, 493, 494, 441, 442, 498, 495, 354, 45, 382, 445,
443, 202, 179, 296, 383, 525, 325 i 180, i njihova upotrebu u lečenju AML i/ili HLL kako je
opisano u ovom dokumentu.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptide u skladu sa predmetnim pronalaskom za
upotrebu u lečenju proliferativnih bolesti osim AML, kao što je na primer HLL. Bez obzira na
navedeno, kako je prikazano u sledećoj tabeli 5, mnogi od peptida u skladu sa predmetnim
pronalaskom mogu takođe da se koriste i u drugim indikacijama.
Tabela 5: Predstavljeni peptidi i njihove specifične primene u drugim proliferativnim
oboljenjima, opciono u drugim organima. ID BR. SEKV 266 u skladu sa pronalaskom.
ID Sekvenca Proliferativno oboljenje i njegova lokacija sekv.
1 AEQFRLEQI kolon ili rektum, pluća, sitnoćelijski karcinom 2 FTAEFSSRY kolon ili rektum, pluća, sitnoćelijski karcinom 3 HHDESVLTNVF kolon ili rektum, pluća, sitnoćelijski karcinom 4 REQDEAYRL kolon ili rektum, pluća, sitnoćelijski karcinom 5 RPVMPSRQI kolon ili rektum, pluća, sitnoćelijski karcinom 6 VQREYNLNF kolon ili rektum, pluća, sitnoćelijski karcinom 7 GQLPITIQV bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, kost, neosificirajući fibrom
8 RAYADEVAV bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, kost, neosificirajući fibrom
9 REDKPPLAV bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, kost, neosificirajući fibrom
10 RVKDLDTEKY bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, kost, neosificirajući fibrom
11 SEQEMNAHL bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, kost, neosificirajući fibrom
12 YVLPLVHSL bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, kost, neosificirajući fibrom
13 LPLRFWVNI jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor, pankreas, adenokarcinom
14 EVAEHVQYM kolon ili rektum, prostata, benigna nodularna hiperplazija
15 YMAELIERL kolon ili rektum, prostata, benigna nodularna hiperplazija
16 ALASLIRSV štitasta žlezda, nodularna hiperplazija
17 TVAEITGSKY štitasta žlezda, nodularna hiperplazija
18 EIIGKRGIIGY kolon ili rektum, bubreg, karcinom
19 NLVEKTPAL kolon ili rektum, bubreg, karcinom
20 IEDKAQILL maligni fibrozni histiocitom
21 SIYDDSYLGY maligni fibrozni histiocitom
22 TTNHPINPK maligni fibrozni histiocitom
23 NAAILKKV mozak, glioblastom, štitasta žlezda, nodularna hiperplazija
24 NYLDIKGLL mozak, glioblastom, štitasta žlezda, nodularna hiperplazija
25 YLDIKGLLDV mozak, glioblastom, štitasta žlezda, nodularna hiperplazija
26 EEVGDFIQRY pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća,
27 EVGDFIQRY pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća,
28 MKDLSLGGVL pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća,
29 DEFITVHSM želudac, koža, bazocelularni karcinom
30 EFITVHSML želudac, koža, bazocelularni karcinom
31 GQLDVRELI želudac, koža, bazocelularni karcinom
32 TQYIIHNY želudac, koža, bazocelularni karcinom EVVDVTWRY kolon ili rektum, limfni čvor, non-Hodžkinov limfom
KEALLRDTI kolon ili rektum, limfni čvor, non-Hodžkinov limfom
HGYENPTYK pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća, bubreg, karcinom
SLLYKVPYV pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća, bubreg, karcinom
AEIPLRMV želudac, metastatski, adenokarcinom EVVYRFTAR želudac, metastatski, adenokarcinom FPGLAIKI želudac, metastatski, adenokarcinom IYNGKLFDL želudac, metastatski, adenokarcinom IYNGKLFDLL želudac, metastatski, adenokarcinom KEIDVISI želudac, metastatski, adenokarcinom LEEQASRQI želudac, metastatski, adenokarcinom TRMSTVSEL želudac, metastatski, adenokarcinom SEETFRFEL želudac, adenokarcinom, endometrijum, adenokarcinom
KLYPTLVIR želudac, adenokarcinom, endometrijum, adenokarcinom
ALRNQATMVQK želudac, adenokarcinom, non-Hodžkinov limfom, mycosis fungoides LLDHAPPEI želudac, adenokarcinom, non-Hodžkinov limfom, mycosis fungoides GVLGTVVHGK kolon ili rektum, jetra, fokalna nodularna hiperplazija
VQFIGRESKY kolon ili rektum, jetra, fokalna nodularna hiperplazija
GQSLIHVI paraštitasta žlezda, adenom VHSPAGMAL paraštitasta žlezda, adenom VLYEGIKVGK paraštitasta žlezda, adenom AVIEAEKIAQV jajnik, tumor granuloznih ćelija, DRIEVVNML jajnik, tumor granuloznih ćelija, IEAEKIAQV jajnik, tumor granuloznih ćelija, IEDLKAQIL grlić materice, skvamocelularni karcinom, YLLESVNKL grlić materice, skvamocelularni karcinom, HRIYVPLML želudac, adenokarcinom difuznog podtipa, pankreas, adenokarcinom
KEYIPPLIW želudac, adenokarcinom, pankreas,
adenokarcinom
MDKLVVEY želudac, adenokarcinom, pankreas,
adenokarcinom
ALLGHILLH bubreg, karcinom bubrežnih ćelija,
nesvetloćelijski tip
ALLPHLYTL bubreg, karcinom bubrežnih ćelija,
nesvetloćelijski tip
HVAGETVAR bubreg, karcinom bubrežnih ćelija,
nesvetloćelijski tip
KVWPGSTAF bubreg, karcinom bubrežnih ćelija,
nesvetloćelijski tip
ETAVAILRF metastatski infiltrišući lobularni karcinom dojke
RVYNTDPLKEK endometrijum, adenokarcinom, IGVEHVVVY mozak, maligni tumor, bubreg, onkocitom RQIGVEHVV mozak, maligni tumor, bubreg, onkocitom DVFERPSAKK bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, sinovijalni sarkom
EEFQFIKKA bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, sinovijalni sarkom THLVDQDTTSF bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, sinovijalni sarkom
ESADLIQHY pankreas, adenokarcinom, bubreg, karcinom bubrežnih ćelija
EIIKEISIM pankreas, adenokarcinom, limfni čvor,
Hodžkinova bolest
SVSDIIRLR pankreas, adenokarcinom, limfni čvor,
Hodžkinova bolest
AVSLIREEW želudac, adenokarcinom, bele krvne ćelije, hronična limfocitna leukemija GEKSESISV želudac, adenokarcinom, bele krvne ćelije, hronična limfocitna leukemija FLTILPEEL pankreas, adenokarcinom, pluća,
adenokarcinom
ILWETVPSM kolon ili rektum, metastatski karcinom bubrežnih ćelija
LPVRTLSI kolon ili rektum, metastatski karcinom bubrežnih ćelija
RESEYKQVY kolon ili rektum, metastatski karcinom bubrežnih ćelija
SESLPVRTL kolon ili rektum, metastatski karcinom bubrežnih ćelija
RLLESVVVL pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća, slezina, hronična mijeloidna leukemija RPEEGKESL pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća, slezina, hronična mijeloidna leukemija THGKLVILF pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća, slezina, hronična mijeloidna leukemija KELEHLSHI želudac, adenokarcinom, REMENYEKI želudac, adenokarcinom,
VLLSTIHEL želudac, adenokarcinom, KTYTKSSHLK želudac, adenokarcinom, mozak, meningeom, EIIEKNFDY želudac, adenokarcinom, GTEEAPKVFK želudac, adenokarcinom,
KLMAIPLVF želudac, adenokarcinom,
DIKRGIPN želudac, adenokarcinom, pluća, sitnoćelijski karcinom
DIKRGIPNY želudac, adenokarcinom, pluća, sitnoćelijski karcinom
FLDITNPKA želudac, adenokarcinom diferenciranog podtipa, pluća, sitnoćelijski karcinom ALYSVYRQK bubreg, angiomiolipom
KVLALVFGF bubreg, angiomiolipom
SFTDVIGHY bubreg, angiomiolipom ASAAASGGLLK kolon ili rektum, slezina, ekstramedularna hematopoeza
ALLGVTGAPK kolon ili rektum, slezina, ekstramedularna hematopoeza
DEIKTLQRY želudac, adenokarcinom, jetra, karcinoidni tumor, metastatski
EAYVQKMV želudac, adenokarcinom, jetra, karcinoidni tumor, metastatski
VLHQDSGLGY želudac, adenokarcinom, jetra, karcinoidni tumor, metastatski
YLQNHFVGL želudac, adenokarcinom, jetra, karcinoidni tumor, metastatski
AEIEDIRVL želudac, metastatski, dvanaestopalačno crevo, adenokarcinom
GQSRLIFTY želudac, metastatski, dvanaestopalačno crevo, adenokarcinom
READFKETL želudac, metastatski, dvanaestopalačno crevo, adenokarcinom
DTMGPSQHVY pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća, slezina, ekstramedularna hematopoeza ESRGPALTR pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća, slezina, ekstramedularna hematopoeza FQLPGLGTPPIT pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća, slezina, ekstramedularna hematopoeza RIQGYVVSW pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća, slezina, ekstramedularna hematopoeza LLDPSVFHV želudac, adenokarcinom, testis, seminom RFFHLADLF želudac, adenokarcinom, testis, seminom DSISGNLQR želudac, metastatski, kost, neosificirajući fibrom
ETEQTIQKL želudac, metastatski, kost, neosificirajući fibrom
FLYPFLSHL želudac, metastatski, kost, neosificirajući fibrom
TLDQKIERV želudac, metastatski, kost, neosificirajući fibrom
DADSRAATV jetra, hepatocelularni karcinom, bubreg,
karcinom bubrežnih ćelija DHEGFGFVL jetra, hepatocelularni karcinom, bubreg,
karcinom bubrežnih ćelija GEAVKVLSI jetra, hepatocelularni karcinom, bubreg,
karcinom bubrežnih ćelija NATDLLKVL jetra, hepatocelularni karcinom, bubreg,
karcinom bubrežnih ćelija
KEITEGKTV želudac, metastatski, rektum, adenokarcinom YRQKQVVIL želudac, metastatski, rektum, adenokarcinom VAINLIVQH želudac, metastatski, rektum, adenokarcinom DAIKVFVRI želudac, adenokarcinom, bubreg, Wilms-ov tumor
LEKAFSEI želudac, adenokarcinom, bubreg, Wilms-ov tumor
MEKSDKNQ želudac, adenokarcinom, bubreg, Wilms-ov tumor
GQTGSGKTF želudac, adenokarcinom, rektum,
adenokarcinom
DTSPDLSSR pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća, testis, seminom
KLNEVIVNK pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća, testis, seminom
FAQIISVALI želudac, adenokarcinom, paraštitasta žlezda, adenom
IIFDRPLLY želudac, adenokarcinom, paraštitasta žlezda, adenom
DAVNQNTKLL jajnik, adenokarcinom, svetloćelijski tip, HHILADVSL jajnik, adenokarcinom, svetloćelijski tip, YPSEKRGEL jajnik, adenokarcinom, svetloćelijski tip, SVVDLINHY mozak, glioblastom, kost, neosificirajući fibrom
EIIEKDTKY želudac, metastatski, pluća, krupnoćelijski karcinom
ENEEKLKEL želudac, metastatski, pluća, krupnoćelijski karcinom
ILGGPGTVQGV jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor, vulva, skvamocelularni karcinom ESAALIHHY jetra, hepatocelularni karcinom, fibromatoza YQRETPQV jetra, hepatocelularni karcinom, fibromatoza ARIEIGLHY jetra, fokalna nodularna hiperplazija IPYPRPIHL jetra, fokalna nodularna hiperplazija DVSGKTALNQ bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, želudac, gastrointestinalni stromalni tumor (GIST)
TEFRSLVI bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, želudac, gastrointestinalni stromalni tumor (GIST)
TLKSGDGITF bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, želudac, gastrointestinalni stromalni tumor (GIST)
HEADKTYML želudac, adenokarcinom, KFFEEVLLF želudac, adenokarcinom, RVMPSSFFL želudac, adenokarcinom, YELDLREPAL pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća, pluća, adenokarcinom
GAYGKVFLV jetra, hepatocelularni karcinom, bubreg, angiomiolipom
DHDLLKNF bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, bubreg, policistična bolest bubrega EELQLIRQA bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, bubreg, policistična bolest bubrega AAELLKHPF prostata, adenokarcinom GRVKLSDFGF prostata, adenokarcinom
KSNSIIVSPR mozak, glioblastom, mozak, meningeom ETLERLQEL jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor, parotidna žlezda, pleomorfni adenom KDDELSRQ jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor, parotidna žlezda, pleomorfni adenom LQQTNSEKI bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, parotidna žlezda, pleomorfni adenom GEFGKPYFI kolon ili rektum, testis, seminom KDVKVVIL kolon ili rektum, testis, seminom RPVPPPPSL kolon ili rektum, testis, seminom KEDIPGRHSY želudac, adenokarcinom, slezina, hronična mijeloidna leukemija
KETKAVTNF želudac, adenokarcinom, slezina, hronična mijeloidna leukemija
YEILIHDL želudac, adenokarcinom, slezina, hronična mijeloidna leukemija
FPRFVNVTV slezina, hronična mijeloidna leukemija QVAGWGSQR slezina, hronična mijeloidna leukemija WIDGVLNNPGPG slezina, hronična mijeloidna leukemija SFMTHPEF želudac, adenokarcinom, miometrijum, lejomiom
HYTIVFNTF kolon ili rektum, miometrijum, lejomiom GTNDGPALKK kolon ili rektum, jetra, hepatocelularni karcinom
IEDPVRPEV kolon ili rektum, jetra, hepatocelularni karcinom
NTASGGMTR mozak, glioblastom, koža, skvamocelularni karcinom
EVIETEKTLY kolon ili rektum, dojka, mucinozni karcinom MKILNHPNI kolon ili rektum, pluća, skvamocelularni karcinom
HEIDRYTAI bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, non-Hodžkinov limfom VFTLKPLEF bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, non-Hodžkinov limfom YWVPRNAL bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, non-Hodžkinov limfom EVSPNLVRY želudac, metastatski, pankreas,
adenokarcinom
LSEIAGMTLP želudac, metastatski, pankreas,
adenokarcinom
FLSFMNTEL pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća, želudac, adenokarcinom KAVPSQKRT pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća, želudac, adenokarcinom LKAVPSQKRT pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća, želudac, adenokarcinom
SLIAVFQKY pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća, želudac, adenokarcinom
IIKEKTVVY jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor, jetra, hepatocelularni karcinom LLEQKVWEV jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor, jetra, hepatocelularni karcinom SEIAESHRF jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor, jetra, hepatocelularni karcinom YLAIGIHEL jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor, jetra, hepatocelularni karcinom IHDELQQSF kolon ili rektum, slezina, hronična mijeloidna leukemija
AHVIDKFLL bubreg, karcinom bubrežnih ćelija, KAGGEFLLRY bubreg, karcinom bubrežnih ćelija, FEVKDLLSL bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, mozak, meningeom FSKAKPSVL jetra, hepatocelularni karcinom, dojka,
infiltrišući lobularni karcinom EAIKALEV želudac, metastatski, pluća, neuroendokrini karcinom
EVASAKQSVKY želudac, metastatski, pluća, neuroendokrini karcinom
IEFTYTAKL želudac, metastatski, pluća, neuroendokrini karcinom
LLADITSKY želudac, metastatski, pluća, neuroendokrini karcinom
VLVDRTIYI jetra, hepatocelularni karcinom, jetra, fokalna nodularna hiperplazija
IPVVHASI želudac, adenokarcinom, kolon,
adenokarcinom
TVADQVLVGSY želudac, adenokarcinom, kolon,
adenokarcinom
VALVHPDL želudac, adenokarcinom, kolon,
adenokarcinom
LPDDKVTAL želudac, metastatski, želudac, adenokarcinom KIAKQIVQK pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća, pluća, neuroendokrini karcinom
VEKILLSVV pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća, pluća, neuroendokrini karcinom APAGARGGPA kolon ili rektum, rektum, adenokarcinom EHLRKLEAE kolon ili rektum, rektum, adenokarcinom RFIPELINF kolon ili rektum, rektum, adenokarcinom TEKIAQLF želudac, adenokarcinom, jajnik,
adenokarcinom
KLHDETLTY želudac, adenokarcinom, jajnik,
adenokarcinom
LHDETLTYL želudac, adenokarcinom, jajnik,
adenokarcinom
GPQEGNGPSLF kolon ili rektum, sinovijalni sarkom YLLQRAVEV kolon ili rektum, sinovijalni sarkom FAALHGPAL skvamocelularni karcinom, RMANLMGIEF skvamocelularni karcinom, DTFPGPYAVL liposarkom
DTMPQTYKR liposarkom
IEHVFVTDV kolon ili rektum, limfni čvor, infiltrišući duktalni karcinom dojke
KESPTSVGF kolon ili rektum, limfni čvor, infiltrišući duktalni karcinom dojke
EAITAIMKY bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, slezina, non-Hodžkinov limfom KEKPAENTL bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, slezina, non-Hodžkinov limfom NEFQSQQNI bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, slezina, non-Hodžkinov limfom NVIDYGHASKY bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, slezina, non-Hodžkinov limfom FAKSQSKTF atipični lipom
LPFSLAHL atipični lipom
APNYRLKSL želudac, adenokarcinom, metastatski karcinom bubrežnih ćelija ILKDMGITEY želudac, adenokarcinom, metastatski karcinom bubrežnih ćelija AHDDGRWSL želudac, metastatski, pluća, skvamocelularni karcinom
KYLTAEAFGF želudac, metastatski, pluća, skvamocelularni karcinom
ESAALIHHY jetra, hepatocelularni karcinom, fibromatoza YQRETPQV jetra, hepatocelularni karcinom, fibromatoza EELQRNISL bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, jajnik, adenokarcinom RPAALFLTL bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, jajnik, adenokarcinom SEELQRNISL bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, jajnik, adenokarcinom ETIDSRVQEY kolon ili rektum, jajnik, teratom EVSEQILHM želudac, metastatski, limfni čvor, non-Hodžkinov limfom
GTLSGGILSSGK želudac, adenokarcinom diferenciranog podtipa, grlić materice, skvamocelularni karcinom
GVPIMLAY mozak, glioblastom, grlić materice,
skvamocelularni karcinom EEVKEEVKKF pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća, timus, timom
KTIAFLLPMF pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća, timus, timom
EVTTNIPKM jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor, adenoidni cistični karcinom IHGDTVQNQL kolon ili rektum, nadbubrežna žlezda,
adrenokortikalni karcinom RTMVKTLEY kolon ili rektum, nadbubrežna žlezda,
adrenokortikalni karcinom ETVRTLNNLY mozak, glioblastom, omentum,
lejomiosarkom, metastatski HSIDKVTSR kolon ili rektum, paraštitasta žlezda, adenom VSNPKSFEY kolon ili rektum, paraštitasta žlezda, adenom GLGPTFKL pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća,
želudac, adenokarcinom
NKGISDIIKV pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća,
želudac, adenokarcinom
TSTTRPVL pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća,
želudac, adenokarcinom VLGGKAFLEHL želudac, endometrijum, adenokarcinom YEFERTTSI želudac, endometrijum, adenokarcinom YLDFTNPKV jetra, hepatocelularni karcinom, grlić materice, skvamocelularni karcinom IPAVARTTTL pankreas, adenokarcinom, miometrijum, lejomiom
KQQLELDSI pankreas, adenokarcinom, miometrijum, lejomiom
KTTDTVSSF pankreas, adenokarcinom, miometrijum, lejomiom
DYLDGVHTVF kolon ili rektum, fibromatoza YLDGVHTVF kolon ili rektum, fibromatoza TYVSGMLRF mozak, glioblastom, dojka, karcinom DAIDGKQAR mozak, glioblastom, jetra, fokalna nodularna hiperplazija
DPMAPGVQGSLL pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća, grlić materice, skvamocelularni karcinom GLDPSQRPK pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća, grlić materice, skvamocelularni karcinom IEDSRVYEL želudac, metastatski, non-Hodžkinov limfom YVHSFLSSGY tanko crevo, gastrointestinalni stromalni tumor
HEYTTKEVF jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor, kolon, adenokarcinom KLQEQLAQL jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor, kolon, adenokarcinom SIAAKILSY jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor, kolon, adenokarcinom KELLAVKL pankreas, adenokarcinom, pluća,
adenokarcinom
KLKQTTSALEK pankreas, adenokarcinom, pluća,
adenokarcinom
EVGPREAGLR bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, bubreg, karcinom prelaznog epitela SEAQEGLQKF bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, bubreg, karcinom prelaznog epitela DEAVLFVQV pankreas, adenokarcinom, jajnik, mucinozni cistadenokarcinom
EVAKFLSFY bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, bubreg, angiomiolipom KLDQKLPEL bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, bubreg, angiomiolipom SVFEKSVGY bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, bubreg, angiomiolipom NEGQTALHY kolon ili rektum, endometrijum, mešoviti Milerov tumor
VEFPHSPEI kolon ili rektum, endometrijum, mešoviti Milerov tumor
RLQGELQAV bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, bubreg, karcinom bubrežnih ćelija KELRELLSI kolon ili rektum, fibromatoza SLVDQSAAL kolon ili rektum, fibromatoza LELIMSKY kolon ili rektum, jajnik, tekom-fibrom DIKPYIAEY pankreas, adenokarcinom, timus, timom KLMAMFLEY pluća, adenokarcinom, YTVEKREGY pluća, adenokarcinom,
FEFDIHQVI želudac, metastatski, dojka, karcinom SENPSKHDSF želudac, metastatski, dojka, karcinom NFLRINTI kolon ili rektum, želudac, adenokarcinom YSGPTSVSR kolon ili rektum, želudac, adenokarcinom DIYGGDYERF kolon ili rektum, nadbubrežna žlezda, adrenokortikalni karcinom SARLEKLGY želudac, metastatski, prostata, benigna nodularna hiperplazija
YVFPGVTRL želudac, metastatski, prostata, benigna nodularna hiperplazija
YYLNEIQSF želudac, metastatski, prostata, benigna nodularna hiperplazija
YHSQDRYEF želudac, metastatski, non-Hodžkinov limfom FPPGRQVVM mozak, maligni tumor, limfni čvor, maligni melanom
ILDEAHERTI mozak, maligni tumor, limfni čvor, maligni melanom
VIYNEQMASK jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor, jetra, fokalna nodularna hiperplazija EATSIKRVR kolon ili rektum, adenokarcinom LPEDKPRLI kolon ili rektum, adenokarcinom KYPLNLYLL bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, lipom
VHESPALILLF bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, lipom
EVTGHSKGY želudac, adenokarcinom, rektum,
adenokarcinom
RDSEELLQI želudac, adenokarcinom, rektum,
adenokarcinom
SPASKTTL želudac, adenokarcinom, rektum,
adenokarcinom
DAKTVNVI kolon ili rektum, testis, seminom DSNATAAKM kolon ili rektum, testis, seminom RTLNPQMLQK kolon ili rektum, testis, seminom RTLNPQMLQKK kolon ili rektum, testis, seminom LMAEMGVHSV želudac, metastatski, dojka, karcinom RLLPPVGTGR želudac, metastatski, dojka, karcinom VRIGTILIQTNQ želudac, metastatski, dojka, karcinom KELSVLSLI želudac, metastatski, pluća, neuroendokrini karcinom
TQPHPNTVY želudac, metastatski, pluća, neuroendokrini karcinom
ALEEQLLKY želudac, adenokarcinom, maligni fibrozni histiocitom
DHFTGAIEKL želudac, metastatski, dojka, karcinom KILDLETEL želudac, metastatski, dojka, karcinom AEDIPSLKL dojka, karcinom
DIPSLKLAL dojka, karcinom
GLDPNKPPEL dojka, karcinom
FLRDPAEAL dojka, karcinom
GYGSQGYKY dojka, karcinom
KLLAEVTLK dojka, karcinom
SAADGPRVF dojka, karcinom
KLYELHVFTF kolon, adenom
YELHVFTF kolon, adenom
YLNKEIEEA kolon, adenom
DENEHQLSL želudac, adenokarcinom, kolon, non-Hodžkinov limfom
EITPPVVLR želudac, adenokarcinom, kolon, non-Hodžkinov limfom
GFEITPPVVLR želudac, adenokarcinom, kolon, non-Hodžkinov limfom
HQLSLRTV želudac, adenokarcinom, kolon, non-Hodžkinov limfom
MSVQPTVSL želudac, adenokarcinom, limfni čvor, non-Hodžkinov limfom
SIRDTPAKN želudac, adenokarcinom, limfni čvor, non-Hodžkinov limfom
SIRDTPAKNAQK želudac, adenokarcinom, limfni čvor, non-Hodžkinov limfom
SPIKVTLATL želudac, adenokarcinom, limfni čvor, non-Hodžkinov limfom
TPPVVLRL želudac, adenokarcinom, kolon, non-Hodžkinov limfom
VEAKFINY želudac, adenokarcinom, kolon, non-Hodžkinov limfom
YEGSPIKV želudac, adenokarcinom, kolon, non-Hodžkinov limfom
YEGSPIKVTL želudac, adenokarcinom, kolon, non-Hodžkinov limfom
SELKMMTQL limfni čvor, non-Hodžkinov limfom EKDPQPQQL pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća, švanom GYVPRTAL pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća, švanom KEKDPQPQQL pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća, švanom LPKKPSKLEL pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća, švanom RPSAASIDL pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća, švanom SRHPLSPGF pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća, švanom TPRSPQPEL pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća, švanom GRIVAFFEF bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, štitasta žlezda, nodularna hiperplazija HTPHPAASR bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, štitasta žlezda, nodularna hiperplazija NPDELKTTV pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća, testis, seminom
PSKQLPDQI pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća, testis, seminom
VYVERAEVL pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća, testis, seminom
DPFIIIHSI kolon ili rektum, grlić materice,
skvamocelularni karcinom EHSIATLLL kolon ili rektum, grlić materice,
skvamocelularni karcinom FLDPRPLTV pankreas, adenokarcinom, miometrijum, lejomiom
SAFADRPAF pankreas, adenokarcinom, miometrijum, lejomiom
DTTLPASAR želudac, adenokarcinom, rektum,
adenokarcinom
KLLEYIEEI želudac, adenokarcinom, rektum,
adenokarcinom
LEKQLIEL želudac, adenokarcinom, rektum,
adenokarcinom
LMSVYVVEL jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor
ESITDVLVR pankreas, adenokarcinom, želudac,
adenokarcinom
ETAFQGMLR pankreas, adenokarcinom, želudac,
adenokarcinom,
EVPDVTATPARL pankreas, adenokarcinom, želudac,
adenokarcinom,
GRIVTLISF pankreas, adenokarcinom, želudac,
adenokarcinom,
HVFSDGVTNW pankreas, adenokarcinom, želudac,
adenokarcinom,
REIGGGEAGAVI pankreas, adenokarcinom, želudac,
adenokarcinom,
RGWDGFVEF pankreas, adenokarcinom, želudac,
adenokarcinom,
RPAVLPLL pankreas, adenokarcinom, želudac,
adenokarcinom,
VEFFHVEDL pankreas, adenokarcinom, želudac,
adenokarcinom,
VQRNHETAF pankreas, adenokarcinom, želudac,
adenokarcinom,
AELEAARL pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća, testis, seminom
ATQTPVSNK kolon ili rektum, rektum, adenokarcinom ESIDQYIER kolon ili rektum, rektum, adenokarcinom FEEHNSMNEL kolon ili rektum, rektum, adenokarcinom SVASTPISQR kolon ili rektum, rektum, adenokarcinom VASTPISQR kolon ili rektum, rektum, adenokarcinom AEIVGGHEA slezina, ekstramedularna hematopoeza RPPSPALASV slezina, ekstramedularna hematopoeza SVAQVFLNNY slezina, ekstramedularna hematopoeza TQEPTQQHF slezina, ekstramedularna hematopoeza KDITMKNLV bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, kolon, non-Hodžkinov limfom MAEKAKQIY bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, kolon, non-Hodžkinov limfom KLDNQVSKV kolon ili rektum, prostata, benigna nodularna hiperplazija
SENVKLFSA kolon ili rektum, prostata, benigna nodularna hiperplazija
VQKLQNII kolon ili rektum, prostata, benigna nodularna hiperplazija
AFTVHFSGQF omentum, adenokarcinom GVFRGIQDV omentum, adenokarcinom QRNMTKLQL omentum, adenokarcinom RMFPNAPYL omentum, adenokarcinom EAAAEAKAR limfni čvor, karcinom dojke IIKEYTDVY limfni čvor, karcinom dojke KEIDKNDHL limfni čvor, karcinom dojke KVSKASGVSK limfni čvor, karcinom dojke MPATETKKV limfni čvor, karcinom dojke NADPQAVTM limfni čvor, karcinom dojke RSDMLKDII limfni čvor, karcinom dojke SESGAGLTRF limfni čvor, karcinom dojke SMMQTLLTV limfni čvor, karcinom dojke TEVSKTPEA limfni čvor, karcinom dojke VEVPETPKA limfni čvor, karcinom dojke DVYPEIIER mozak, glioblastom, limfni čvor, karcinom dojke
REVEIQSHL želudac, adenokarcinom, želudac,
adenokarcinom
EPPAVLLL pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća,
omentum, adenokarcinom LEADPFLKY pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća,
omentum, adenokarcinom TTQGQDVTLA želudac, adenokarcinom, pluća,
adenokarcinom
AEYEDGFSIP pankreas, adenokarcinom, kost, osteosarkom AQISLPRI slezina, hronična mijeloidna leukemija DFTPEPAAR slezina, hronična mijeloidna leukemija DNTGITTVSK slezina, hronična mijeloidna leukemija EEAKQLVDKAY slezina, hronična mijeloidna leukemija ERRESIKQ slezina, hronična mijeloidna leukemija ETVGQLGTVLR slezina, hronična mijeloidna leukemija FEQVMRIGL slezina, hronična mijeloidna leukemija FSMQQRQAL slezina, hronična mijeloidna leukemija GVPFFSSLR slezina, hronična mijeloidna leukemija IVRFPTDQL slezina, hronična mijeloidna leukemija KQPVAATRTAV slezina, hronična mijeloidna leukemija LGASNRAFV slezina, hronična mijeloidna leukemija NPRWDGERL slezina, hronična mijeloidna leukemija NVFTNAFRY slezina, hronična mijeloidna leukemija QPMEPNPRVPL slezina, hronična mijeloidna leukemija QPVAATRTAV slezina, hronična mijeloidna leukemija RLFEQVMRI slezina, hronična mijeloidna leukemija SEEPLARNL slezina, hronična mijeloidna leukemija TIRNQINAL slezina, hronična mijeloidna leukemija VLGPTAMRK slezina, hronična mijeloidna leukemija AELRNATAA pankreas, adenokarcinom, dojka, karcinom DVPDGTLVTVM pankreas, adenokarcinom, dojka, karcinom LPIAFKVV pankreas, adenokarcinom, dojka, karcinom SAMGSATRY pankreas, adenokarcinom, dojka, karcinom AEKQGHQW želudac, metastatski, jajnik, tumor granuloznih ćelija
GEQKPTGTF želudac, metastatski, jajnik, tumor granuloznih ćelija
GQFSKPFSF želudac, metastatski, jajnik, tumor granuloznih ćelija
IAFFDVRTF želudac, metastatski, jajnik, tumor granuloznih ćelija
LSAGKTSFSF želudac, metastatski, jajnik, tumor granuloznih ćelija
VSNKYGLVF želudac, metastatski, jajnik, tumor granuloznih ćelija
GEVDVEQHTL kolon ili rektum, kolon, adenokarcinom VDVEQHTL kolon ili rektum, kolon, adenokarcinom DAADELSVGRY bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, kolon, adenom
LSEADVRA želudac, adenokarcinom, pluća,
adenokarcinom
ELTLGEFLK želudac, metastatski, jajnik, mešoviti Milerov tumor
ELTLGEFLKL želudac, metastatski, jajnik, mešoviti Milerov tumor
LTLGEFLK želudac, metastatski, jajnik, mešoviti Milerov tumor
LTLGEFLKL želudac, metastatski, jajnik, mešoviti Milerov tumor
TLGEFLKL želudac, metastatski, jajnik, mešoviti Milerov tumor
KTYTKSSHLK želudac, adenokarcinom, mozak, meningeom SQLTTLSFY pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća,
omentum, adenokarcinom KMQEKKKLQ jetra, hepatocelularni karcinom, pluća,
krupnoćelijski karcinom
LLGHLPAEI jetra, hepatocelularni karcinom, pluća, krupnoćelijski karcinom APVELILSDETLPAPE jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor
ETPDFQLFKNGVAQEPV jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor
LAPLEGARFALVRED jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor
SPDRIFFHLNAVALGD jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor
SPDRIFFHLNAVALGDG jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor
EEMRKLQATVQELQKR limfni čvor, non-Hodžkinov limfom EEPLSLQELDTSSG limfni čvor, non-Hodžkinov limfom EMRKLQATVQELQKR limfni čvor, non-Hodžkinov limfom HLEEPLSLQELDTSSG limfni čvor, non-Hodžkinov limfom LEEPLSLQELDTSSG limfni čvor, non-Hodžkinov limfom GVVHSFSHNVGPGDK jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor, pluća, adenokarcinom GVVHSFSHNVGPGDKY jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor, pluća, adenokarcinom GVVHSFSHNVGPGDKYT jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor, pluća, adenokarcinom KTEEFEVTKTAVAHRP jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor, pluća, adenokarcinom KTEEFEVTKTAVAHRPG jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor, pluća, adenokarcinom VRPGGVVHSFSHNVGPGDK jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor, pluća, adenokarcinom VRPGGVVHSFSHNVGPGDKYT jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor, pluća, adenokarcinom AEKGVRTLTAAAVSGAQ pankreas, adenokarcinom, kost,
gigantocelularni tumor kosti AQPILSKLEPQIASASE pankreas, adenokarcinom, kost,
gigantocelularni tumor kosti EKGVRTLTAAAVSGAQ pankreas, adenokarcinom, kost,
gigantocelularni tumor kosti EKGVRTLTAAAVSGAQP pankreas, adenokarcinom, kost,
gigantocelularni tumor kosti GVRTLTAAAVSGAQ pankreas, adenokarcinom, kost,
gigantocelularni tumor kosti KGVRTLTAAAVSGAQ pankreas, adenokarcinom, kost,
gigantocelularni tumor kosti DVNEYAPVFKEKSYK mozak, glioblastom, parotidna žlezda, pleomorfni adenom HRSFVDLSGHNLA mozak, glioblastom, parotidna žlezda, pleomorfni adenom HRSFVDLSGHNLANPH mozak, glioblastom, parotidna žlezda, pleomorfni adenom HRSFVDLSGHNLANPHP mozak, glioblastom, parotidna žlezda, pleomorfni adenom ALPEFDGKRFQNVAKEG jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor, štitasta žlezda, nodularna hiperplazija DSNEFSVIADPRG jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor, štitasta žlezda, nodularna hiperplazija DSNEFSVIADPRGN jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor, štitasta žlezda, nodularna hiperplazija DSNEFSVIADPRGNT jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor, štitasta žlezda, nodularna hiperplazija DSNEFSVIADPRGNTL jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor, štitasta žlezda, nodularna hiperplazija DSNEFSVIADPRGNTLG jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor, štitasta žlezda, nodularna hiperplazija PEFDGKRFQNVAK jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor, štitasta žlezda, nodularna hiperplazija SDSNEFSVIADPRGNTLG jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor, štitasta žlezda, nodularna hiperplazija SQKKTFEINPRHPLIR jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor, štitasta žlezda, nodularna hiperplazija ALPEFDGKRFQNVAKEG jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor, štitasta žlezda, nodularna hiperplazija PEFDGKRFQNVAK jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor, štitasta žlezda, nodularna hiperplazija PEFDGKRFQNVAKE jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor, štitasta žlezda, nodularna hiperplazija LNSLTYQVLDVQRYP bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, endometrijum, adenokarcinom LPQLVGVSTPLQG bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, endometrijum, adenokarcinom LPQLVGVSTPLQGG bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, endometrijum, adenokarcinom LPQLVGVSTPLQGGS bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, endometrijum, adenokarcinom RLPQLVGVSTPLQGGS bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, endometrijum, adenokarcinom SDVDLIPMNDHNAYR bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, endometrijum, adenokarcinom GRRKSRQGSLAMEELK rektum, adenokarcinom RKSRQGSLAMEELK rektum, adenokarcinom SGPSLKGEEEPLVASEDGAVD rektum, adenokarcinom SGSGPSLKGEEEPLVASEDGAVD rektum, adenokarcinom IKPGVTTEEIDHAVH endometrijum, adenokarcinom KPGVTTEEIDHAVH endometrijum, adenokarcinom DGVLRIQNLDQS pankreas, adenokarcinom, miometrijum, lejomiom
GAYFHDDGFLAFPG pankreas, adenokarcinom, miometrijum, lejomiom
TPYSFLPLPTIKDAYR pankreas, adenokarcinom, miometrijum, lejomiom
YPTPDISWSKLDGSLPP pankreas, adenokarcinom, miometrijum, lejomiom
YPTPDISWSKLDGSLPPD pankreas, adenokarcinom, miometrijum, lejomiom
ASHFEQMAAASMHR metastatski karcinom bubrežnih ćelija GGQVIVAIPKLQTQQ paraštitasta žlezda, adenom GQVIVAIPKLQTQ paraštitasta žlezda, adenom GQVIVAIPKLQTQQ paraštitasta žlezda, adenom IESTFDVVSSKPVG paraštitasta žlezda, adenom DWGALATISTLEAVRG pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća, jetra, hepatocelularni karcinom GRPFADVLSLSDGPPG pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća, jetra, hepatocelularni karcinom WGALATISTLEAVR pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća, jetra, hepatocelularni karcinom WGALATISTLEAVRG pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća, jetra, hepatocelularni karcinom ADELALVDVIEDK bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, bubreg, karcinom bubrežnih ćelija GVSLKTLHPDLGTDK bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, bubreg, karcinom bubrežnih ćelija IVSGKDYNVTANSKL bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, bubreg, karcinom bubrežnih ćelija DDNIKTYSDHPEK bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, jetra, hepatocelularni karcinom DKVYVHLKNLASRPY bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, jetra, hepatocelularni karcinom GDKVYVHLKNLASRPY bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, jetra, hepatocelularni karcinom LDDNIKTYSDHPEK bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, jetra, hepatocelularni karcinom TGDKVYVHLKNLASRPY bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, jetra, hepatocelularni karcinom VYVHLKNLASRPY bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, jetra, hepatocelularni karcinom KTSRLPIIDVAPLDVGAPD pankreas, adenokarcinom, hondrosarkom KTSRLPIIDVAPLDVGAPDQE pankreas, adenokarcinom, hondrosarkom LPIIDVAPLDVGAPD pankreas, adenokarcinom, hondrosarkom RLPIIDVAPLDVGAPD pankreas, adenokarcinom, hondrosarkom RLPIIDVAPLDVGAPDQE pankreas, adenokarcinom, hondrosarkom SRLPIIDVAPLDVGAPD pankreas, adenokarcinom, hondrosarkom SRLPIIDVAPLDVGAPDQE pankreas, adenokarcinom, hondrosarkom TSRLPIIDVAPLDVGAPD pankreas, adenokarcinom, hondrosarkom TSRLPIIDVAPLDVGAPDQE pankreas, adenokarcinom, hondrosarkom DTSYVSLKAPLT jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor
DTSYVSLKAPLTKP jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor
DTSYVSLKAPLTKPL jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor
ESDTSYVSLKAPLT jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor
ESDTSYVSLKAPLTKPL jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor
SDTSYVSLKAPLT jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor
SDTSYVSLKAPLTKP jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor
SDTSYVSLKAPLTKPL jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor
DPASFRAAIGLLARH bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, kolon, adenokarcinom TEGQFVDLTGNRLTYT jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor, jetra, fokalna nodularna hiperplazija ALDFFGNGPPVNYK pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća, ALDFFGNGPPVNYKTG pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća, kost, neosificirajući fibrom DFFGNGPPVNYKTG pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća, kost, neosificirajući fibrom LDFFGNGPPVNYK pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća, kost, neosificirajući fibrom LDFFGNGPPVNYKTG pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća, kost, neosificirajući fibrom QALDFFGNGPPVNYKTG pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća, kost, neosificirajući fibrom AISDYVFNTASLVYH jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor
AISDYVFNTASLVYHEE jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor
ISDYVFNTASLVYH jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor
ISDYVFNTASLVYHEE jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor
YVFNTASLVYHEE jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor
IVIALSGNKADLA mozak, glioblastom, endometrijum,
adenokarcinom
SPNIVIALSGNKADL mozak, glioblastom, endometrijum,
adenokarcinom SPNIVIALSGNKADLA mozak, glioblastom, endometrijum,
adenokarcinom
TPPRLVAPRFLEVE želudac, metastatski, non-Hodžkinov limfom TPPRLVAPRFLEVET želudac, metastatski, non-Hodžkinov limfom TPPRLVAPRFLEVETS želudac, metastatski, non-Hodžkinov limfom EIQRDILLEKKKVAQDQ želudac, metastatski, jetra, hepatocelularni adenom
FGAIFFLPDSSK želudac, metastatski, jetra, hepatocelularni adenom
IQRDILLEKKKVAQ želudac, metastatski, jetra, hepatocelularni adenom
IQRDILLEKKKVAQD želudac, metastatski, jetra, hepatocelularni adenom
IQRDILLEKKKVAQDQ želudac, metastatski, jetra, hepatocelularni adenom
LSGVLFHSSPALQPA želudac, metastatski, jetra, hepatocelularni adenom
RDILLEKKKVAQDQ želudac, metastatski, jetra, hepatocelularni adenom
SSKLLSGVLFHSSPA želudac, metastatski, jetra, hepatocelularni adenom
SSPALQPAADHKPGPG želudac, metastatski, jetra, hepatocelularni adenom
APPTRGPPPSYGGS kolon ili rektum, timus, timom, GNSRSAPPTRGPPPSYGGSSRY kolon ili rektum, timus, timom, RDYGHSSSRDDYPS kolon ili rektum, timus, timom, SPRDDGYSTKDSY kolon ili rektum, timus, timom, GGSAAAAAAAAASGG jetra, hepatocelularni karcinom, miometrijum, lejomiom
DNMLLAEGVSGPEK jetra, hepatocelularni karcinom, nadbubrežna žlezda, adrenokortikalni adenom ADSLYVEKIDVGEAEPR jednjak, adenokarcinom RIQLVEEELDRAQER pankreas, adenokarcinom, intramuskularni lipom
RRIQLVEEELDRAQER pankreas, adenokarcinom, intramuskularni lipom
HQPHKVTQYKKGKDSLY liposarkom
RKKAKTTKKIVL liposarkom
DVFRQYASLTGTQALPP jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor, tanko crevo, gastrointestinalni stromalni tumor
GTAQGELFLDDGHT jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor, tanko crevo, gastrointestinalni stromalni tumor VFRQYASLTGTQALPP jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor, tanko crevo, gastrointestinalni stromalni tumor
PEFDGKRFQNVAK jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor, štitasta žlezda, nodularna hiperplazija PEFDGKRFQNVAKE jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor, štitasta žlezda, nodularna hiperplazija ALPEFDGKRFQNVAKEG jetra, hepatocelularni karcinom, maligni tumor, štitasta žlezda, nodularna hiperplazija ASPSESEARFRIDSVSEGNAGPY pankreas, adenokarcinom, lipom EARFRIDSVSEGNAGP pankreas, adenokarcinom, lipom ESEARFRIDSVSEGNAGP pankreas, adenokarcinom, lipom ESEARFRIDSVSEGNAGPY pankreas, adenokarcinom, lipom FRIDSVSEGNAGP pankreas, adenokarcinom, lipom FRIDSVSEGNAGPY pankreas, adenokarcinom, lipom SEARFRIDSVSEGNAGPY pankreas, adenokarcinom, lipom SPSESEARFRIDSVSEGNAGPY pankreas, adenokarcinom, lipom GNQLFRINEANQL želudac, adenokarcinom, prostata,
adenokarcinom
597 GNQLFRINEANQLMQ želudac, adenokarcinom, prostata, adenokarcinom
598 SPAMAGGLFAIERE želudac, adenokarcinom, prostata,
adenokarcinom
599 FIGNIAVNHAPVSPR želudac, adenokarcinom, metastatski karcinom dojke
600 FIGNIAVNHAPVSPRPG želudac, adenokarcinom, metastatski karcinom dojke
601 IGNIAVNHAPVSPRP želudac, adenokarcinom, metastatski karcinom dojke
602 IGNIAVNHAPVSPRPG želudac, adenokarcinom, metastatski karcinom dojke
603 FEGQFSINKVPGNFH bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, prostata, adenokarcinom
604 FEGQFSINKVPGNFHVS bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, prostata, adenokarcinom
605 RFEGQFSINKVPGNFH bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, prostata, adenokarcinom
Tako se drugi aspekt predmetnog pronalaska odnosi na upotrebu peptida u skladu sa predmetnim pronalaskom za – poželjno kombinovano – lečenje proliferativne bolesti izabrane iz grupe koju čine
atipični lipom;
maligni tumor mozga i proliferativna bolest izabrana od sledećeg: onkocitom bubrega i maligni melanom limfnog čvora; glioblastom i proliferativna bolest izabrana od sledećeg: neosificirajući fibrom kosti, meningeom, karcinom dojke, endometrijalni adenokarcinom, lejomiosarkom omentuma, pleomorfni adenom parotidne žlezde, skvamocelularni karcinom kože, nodularna hiperplazija štitaste žlezde i skvamocelularni karcinom grlića materice; lobularni karcinom dojke;
intraduktalni karcinom dojke;
karcinom kolona ili rektuma i proliferativna bolest izabrana od sledećeg: adenokarcinom, adrenokortikalni karcinom, mucinozni karcinom dojke, adenokarcinom, mešoviti Milerov tumor endometrijuma, fibromatoza, karcinom bubrega, fokalna nodularna hiperplazija jetre, hepatocelularni karcinom jetre, sitnoćelijski karcinom pluća, skvamocelularni karcinom pluća, karcinom dojke, non-Hodžkinov limfom limfnog čvora, metastatski karcinom bubrežnih ćelija, lejomiom miometrijuma, teratom jajnika, tekom-fibrom jajnika, adenom paraštitaste žlezde, benigna nodularna hiperplazija prostate, adenokarcinom rektuma, hronična mijeloidna leukemija slezine, ekstramedularna hematopoeza slezine, adenokarcinom želuca, sinovijalni sarkom, seminom testisa, timom timusa i skvamocelularni karcinom grlića materice; adenom kolona;
adenokarcinom endometrijuma;
adenokarcinom jednjaka;
angiomiolipom bubrega;
bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija i proliferativna bolest izabrana od sledećeg: neosificirajući fibrom kosti, meningeom mozga, adenokarcinom kolona, adenom kolona, non-Hodžkinov limfom kolona;
bubreg, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija i proliferativna bolest izabrana od sledećeg: adenokarcinom endometrijuma, angiomiolipom bubrega, policistična bolest bubrega, karcinom prelaznog epitela bubrega, lipom, non-Hodžkinov limfom, adenokarcinom jajnika, pleomorfni adenom parotidne žlezde, adenokarcinom prostate, non-Hodžkinov limfom slezine, gastrointestinalni stromalni tumor (GIST) želuca, sinovijalni sarkom i nodularna hiperplazija štitaste žlezde;
bubreg, karcinom bubrežnih ćelija, npr. nesvetloćelijski tip;
liposarkom;
fokalna nodularna hiperplazija jetre;
jetra, hepatocelularni karcinom i proliferativna bolest izabrana od sledećeg: adrenokortikalni adenom nadbubrežne žlezde, karcinom dojke, adenoidni cistični karcinom, adenokarcinom kolona, fokalna nodularna hiperplazija jetre, hepatocelularni karcinom jetre, adenokarcinom pluća, adenokarcinom pankreasa, pleomorfni adenom parotidne žlezde, gastrointestinalni stromalni tumor tankog creva, nodularna hiperplazija štitaste žlezde, fibromatoza, angiomiolipom bubrega, karcinom bubrežnih ćelija bubrega, fokalna nodularna hiperplazija jetre, krupnoćelijski karcinom pluća, lejomiom miometrijuma i skvamocelularni karcinom grlića materice; adenokarcinom pluća;
pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća i proliferativna bolest izabrana od sledećeg: neosificirajući fibrom kosti, karcinom bubrega, hepatocelularni karcinom jetre, adenokarcinom pluća, neuroendokrini karcinom pluća, adenokarcinom omentuma, švanom, hronična mijeloidna leukemija slezine, ekstramedularna hematopoeza u slezini, adenokarcinom želuca, seminom testisa, timom timusa i skvamocelularni karcinom grlića materice;
infiltrišući karcinom dojke u limfnom čvoru;
non-Hodžkinov limfom u limfnom čvoru;
maligni fibrozni histiocitom;
metastatski infiltrišući karcinom dojke;
metastatski karcinom bubrežnih ćelija;
adenokarcinom omentuma;
adenokarcinom jajnika, svetloćelijski tip;
tumor granuloznih ćelija jajnika;
adenokarcinom pankreasa i proliferativna bolest izabrana od sledećeg: gigantocelularni tumor kosti, osteosarkom kosti, karcinom dojke, hondrosarkom, intramuskularni lipom, lipom, adenokarcinom pluća, Hodžkinova bolest u limfnom čvoru, lejomiom miometrijuma, mucinozni cistadenokarcinom jajnika, adenokarcinom želuca i timom timusa;
adenom paraštitaste žlezde;
adenokarcinom prostate;
adenokarcinom rektuma;
gastrointestinalni stromalni tumor tankog creva;
hronična mijeloidna leukemija slezine;
ekstramedularna hematopoeza u slezini;
skvamocelularni karcinom;
adenokarcinom želuca i proliferativna bolest izabrana od sledećeg: meningeom mozga, metastatski karcinoidni tumor jetre, adenokarcinom prostate i hronična mijeloidna leukemija slezine;
adenokarcinom želuca diferenciranog podtipa i proliferativna bolest izabrana od sledećeg: adenokarcinom kolona, non-Hodžkinov limfom kolona, adenokarcinom endometrijuma, Wilms-ov tumor bubrega, adenokarcinom pluća, sitnoćelijski karcinom pluća, non-Hodžkinov limfom limfnog čvora, maligni fibrozni histiocitom, metastatski infiltrišući lobularni karcinom dojke, adenom paraštitaste žlezde, adenokarcinom rektuma, adenokarcinom želuca, seminom testisa i skvamocelularni karcinom grlića materice;
adenokarcinom želuca i proliferativna bolest izabrana od sledećeg: adenokarcinom pluća, metastatski karcinom bubrežnih ćelija, lejomiom miometrijuma, non-Hodžkinov limfom, mycosis fungoides, adenokarcinom jajnika, adenokarcinom pankreasa i hronična limfocitna leukemija belih krvnih ćelija;
želudac, endometrijum, adenokarcinom;
metastatski karcinom želuca i proliferativna bolest izabrana od sledećeg: adenokarcinom, neosificirajući fibrom kosti, karcinom dojke, adenokarcinom dvanaestopalačnog creva, hepatocelularni adenom jetre, krupnoćelijski karcinom pluća, neuroendokrini karcinom pluća, skvamocelularni karcinom pluća, non-Hodžkinov limfom limfnog čvora, tumor granuloznih ćelija jajnika, mešoviti Milerov tumor jajnika, adenokarcinom pankreasa, benigna nodularna hiperplazija prostate, adenokarcinom rektuma i bazocelularni karcinom;
nodularna hiperplazija štitaste žlezde;
i skvamocelularni karcinom grlića materice.
Predmetni pronalazak se pored toga odnosi na peptide u skladu sa predmetnim pronalaskom koji imaju sposobnost da se vežu za molekul klase I humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC).
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptide u skladu sa predmetnim pronalaskom naznačene time što navedeni peptidi sadrže aminokiselinsku sekvencu prema ID BR. SEKV: 266.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptide u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačene time što je navedeni peptid modifikovan i/ili sadrži nepeptidne veze.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na fuzioni protein, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa patentnim zahtevom 1 fuziran na N-terminalne aminokiseline 1-80 HLA-DR antigen-asociranog nepromenljivog lanca (Ii) ili fuziran na ili u sekvencu antitela, kao, na primer, antitela koje je specifično za dendritične ćelije.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira peptide u skladu sa predmetnim pronalaskom.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom koja je DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihova kombinacija.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na vektor ekspresije koji eksprimira nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom, nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom ili vektor ekspresije u skladu sa predmetnim pronalaskom za upotrebu u medicini.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na antitela u skladu sa predmetnim pronalaskom, kao i metode njihove proizvodnje.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na T-ćelijske receptore (TCR), konkretno solubilne TCR (sTCR), u skladu sa predmetnim pronalaskom, kao i metode njihove proizvodnje.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ćeliju domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom ili vektor ekspresije kako je ranije opisan.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ćeliju domaćina u skladu sa predmetnim pronalaskom koja je antigen-prezentujuća ćelija.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ćeliju domaćina u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačeno time što je antigen-prezentujuća ćelija dendritična ćelija.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod proizvodnje peptida u skladu sa predmetnim pronalaskom, pri čemu se metod sastoji od kultivisanja ćelije domaćina u skladu sa predmetnim pronalaskom i izolovanja peptida iz ćelije domaćina ili njenog medijuma za kultivaciju.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na in vitro metod za proizvodnju aktiviranih citotoksičnih T limfocita (CTL), pri čemu se metod sastoji od dovođenja u kontakt in vitro CTL sa humanim MHC molekulima klase I sa ubačenim antigenom eksprimiranim na površini prikladne antigenprezentujuće ćelije u toku vremenskog perioda koji je dovoljan da se navedeni CTL aktiviraju na antigen-specifičan način, naznačeno time što je navedeni antigen bilo koji peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačeno time što se antigen postavlja na MHC molekule klase I eksprimirane na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije tako što se dovoljna količina antigena dovodi u kontakt sa antigen-prezentujućom ćelijom.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačeno time što antigen-prezentujuća ćelija sadrži vektor ekspresije koji eksprimira navedeni peptid koji sadrži ID BR. SEKV: 266.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na aktivirane citotoksične T limfocite (CTL), proizvedene pomoću metoda u skladu sa predmetnim pronalaskom, koji selektivno prepoznaju ćeliju koja aberantno eksprimira polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa predmetnim pronalaskom.
Predmetni pronalazak dalje predstavlja metod ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži bilo koju aminokiselinsku sekvencu u skladu sa predmetnim pronalaskom, pri čemu metod obuhvata davanje pacijentu efikasnog broja citotoksičnih T limfocita (CTL) u skladu sa predmetnim pronalaskom.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na opisani peptid, nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom, vektor ekspresije u skladu sa predmetnim pronalaskom, ćeliju u skladu sa predmetnim pronalaskom, ili aktivirani citotoksični T limfocit u skladu sa predmetnim pronalaskom za primenu u lečenju malignog tumora.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačeno time što je navedeni lek vakcina.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačeno time što je navedeni maligni tumor akutna mijeloidna leukemija i/ili hronična limfocitna leukemija, maligni tumor jetre ili maligni tumor kolona.
Stimulacija imunskog odgovora zavisi od prisustva antigena koje imunski sistem domaćina prepoznaje kao strane. Otkriće postojanja tumor-asociranih antigena otvorilo je mogućnost primene imunskog sistema domaćina za intervenciju u rastu tumora. Trenutno se istražuju različiti mehanizmi za iskorišćavanje kako humoralnog tako i ćelijskog dela imunskog sistema za imunoterapiju raka.
Specifični elementi ćelijskog imunskog odgovora su u stanju da specifično prepoznaju i unište ćelije tumora. Izolacija citotoksičnih T ćelija (CTL) iz ćelijskih populacija koje infiltriraju tumor ili iz periferne krvi navodi na to da takve ćelije imaju značajnu ulogu u prirodnim imunskim odbranama protiv raka. U ovom odgovoru naročito važnu ulogu imaju CD8-pozitivne T ćelije, koje prepoznaju peptide koji nose molekule klase I glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) i koji obično imaju 8 do 10 aminokiselinskih ostataka i dobijeni su iz proteina ili defektnih proizvoda ribozoma (DRIP-ovi) koji se nalaze u citosolu. MHC molekuli ljudi se takođe nazivaju humani leukocitni antigeni (HLA).
Postoje dve klase MHC molekula: MHC molekuli klase I koji se nalaze na većini ćelija koje sadrže jedro. MHC molekuli su sastavljeni od alfa teškog lanca i beta-2 mikroglobulina (MHC klasa I receptori) odnosno alfa i beta lanca (MHC klasa II receptori). Njihova trodimenzionalna konformacija rezultuje stvaranjem udubljenja za vezivanje, koje se koristi za nekovalentnu interakciju sa peptidima. MHC klase I prezentuju peptide koji nastaju kao posledica proteolitičkog cepanja predominantno endogenih proteina, DRIP-ova i većih peptida. MHC molekuli klase II predominantno se nalaze na profesionalnim antigen-prezentujućim ćelijama (APĆ), i primarno prezentuju peptide egzogenih ili transmembranskih proteina koje APĆ preuzimaju u toku procesa endocitoze, i nakon toga obrađuju. Komplekse peptida i MHC molekula klase I prepoznaju CD8-pozitivni citotoksični T limfociti koji nose odgovarajući TCR (T-ćelijski receptor), dok komplekse peptida i MHC molekula klase II prepoznaju CD4-pozitivne pomoćničke T ćelije koje nose odgovarajući TCR. Dobro je poznato da su TCR, peptid i MHC pritom prisutni u stehiometrijskom odnosu od 1:1:1.
CD4-pozitivne pomoćničke T ćelije imaju važnu ulogu u indukovanju i održavanju efikasnih odgovora od strane CD8-pozitivnih citotoksičnih T ćelija. Identifikacija CD4-pozitivnih T-ćelijskih epitopa dobijenih iz tumor-asociranih antigena (TAA) je od velikog značaja za razvoj farmaceutskih proizvoda za izazivanje antitumorskih imunskih odgovora; Gnjatic S, et al. Survey of naturally occurring CD4+ T cell responses against NY-ESO-1 in cancer patients: correlation with antibody responses. Proc Natl Acad Sci U S A.2003 Jul 22;100(15):8862-7). Na mestu tumora T-pomoćničke ćelije podržavaju citokinski milje koji je povoljan za CTL (Mortara L, et al. CIITA-induced MHC class II expression in mammary adenocarcinoma leads to a Th1 polarization of the tumor microenvironment, tumor rejection, and specific antitumor memory. Clin Cancer Res. 2006 Jun 1;12(11 Pt 1):3435-43) i privlače efektorske ćelije, npr. CTL, NK ćelije, makrofage, granulocite (Hwang ML, et al. Cognate memory CD4+ T cells generated with dendritic cell priming influence the expansion, trafficking, and differentiation of secondary CD8+ T cells and enhance tumor control. J Immunol. 2007 Nov 1;179(9):5829-38).
U odsustvu zapaljenja, ekspresija MHC molekula klase II je uglavnom ograničena na ćelije imunskog sistema, naročito profesionalne antigen-prezentujuće ćelije (APĆ), npr. monocite, ćelije izvedene iz monocita, makrofage, dendritične ćelije. Kod pacijenata koji boluju od raka, neočekivano je otkriveno da ćelije tumora eksprimiraju MHC molekule klase II (Dengjel J, et al. Unexpected abundance of HLA class II presented peptides in primary renal cell carcinomas. Clin Cancer Res. 2006 Jul 15;12(14 Pt 1):4163-70).
Na životinjskim modelima na sisarima, npr. miševi, dokazano je da su čak i u odsustvu CTL efektorskih ćelija (tj. CD8-pozitivnih T limfocita), CD4-pozitivne T ćelije dovoljne za inhibiranje manifestacija tumora putem inhibicije angiogeneze pomoću sekrecije interferonagama (IFNγ).
Dodatno, pokazano je da CD4-pozitivne T ćelije koje prepoznaju peptide iz tumor-asociranih antigena prezentovanih od strane HLA molekula klase II mogu da se suprotstave progresiji tumora pomoću indukcije odgovora antitelima (At).
Za razliku od tumor-asociranih peptida koji se vezuju za HLA molekule klase I, do danas je opisan samo mali broj liganda klase II tumor-asociranih antigena (TAA).
Budući da je konstitutivna ekspresija HLA molekula klase II obično ograničena na ćelije imunskog sistema, mogućnost izolovanja peptida klase II direktno iz primarnih tumora nije se smatrala mogućom. Međutim, Dengjel i saradnici uspešno su identifikovali određeni broj epitopa MHC klase II direktno iz tumora (WO 2007/028574, EP 1760 088 B1; (Dengjel et al., 2006).
Antigeni koje prepoznaju tumor-specifični citotoksični T limfociti, to jest, njihovi epitopi, mogu biti molekuli dobijeni iz svih klasa proteina, kao što su enzimi, receptori, faktori transkripcije, itd. koji se eksprimiraju i, u poređenju sa neizmenjenim ćelijama istog porekla, ushodno regulišu u ćelijama datog tumora.
Budući da obe vrste odgovora, CD8 i CD4-zavisan, zajednički i sinergistički doprinose antitumorskom efektu, identifikacija i karakterizacija tumor-asociranih antigena prepoznatih pomoću ili CD8+ CTL (ligand: MHC molekul klase I peptidni epitop) ili pomoću CD4-pozitivnih T pomoćničkih ćelija (ligand: MHC molekul klase II peptidni epitop) je važna u razvoju tumorskih vakcina.
Dužinske varijante su uopšteno N- i/ili C-terminalno produženi (između 1 i 5, poželjno 1 do 10 aminokiselina) ili N- i/ili C-terminalno skraćeni (između 1 i 5 aminokiselina) peptidi, koji i dalje mogu da se vežu za MHC, i izazovu ćelijski imunski odgovor kako je opisano u ovom dokumentu. Kao što je trenutno poznato u predmetnoj oblasti, peptidi koji se vezuju za proteine klase II nisu ograničeni u pogledu veličine i mogu varirati od 11 do 30 aminokiselina u dužini. Udubljenje za vezivanje peptida u MHC molekulima klase II je otvoreno na oba kraja što omogućava vezivanje peptida sa relativnom većom dužinom. Iako „jezgreni“ segment dug devet ostataka najviše doprinosi prepoznavanju peptida, bočni regioni su takođe važni za specifičnost peptida prema alelu klase II (vidite, na primer, Meydan C, et al., Prediction of peptides binding to MHC class I and II alleles by temporal motif mining. BMC Bioinformatics.
2013; 14 Suppl 2: S13). Upotrebom mnogih dostupnih softverskih alatki (npr. kako je opisano ranije) osoba stručna u predmetnoj oblasti će moći da identifikuje vezujući motiv te samim tim identifikuje mogućnosti za ekstenzije i/ili delecije MHC klasa II peptida u skladu sa tabelom 3, u cilju kreiranja dužinskih varijanti.
Da bi peptid pokrenuo (izazvao) ćelijski imunski odgovor, on mora da se veže za MHC molekul. Ovaj proces zavisi od alela MHC molekula i specifičnih polimorfizama aminokiselinske sekvence peptida. Peptidi koji vezuju MHC klasa I su obično dužine 8-12 aminokiselinskih ostataka i obično sadrže dva konzervirana ostatka („sidra“) u svojoj sekvenci koji interaguju sa odgovarajućim udubljenjem za vezivanje MHC molekula. Na ovaj način, svaki MHC alel ima „vezujući motiv“ koji određuje koji peptidi mogu specifično da se vežu za udubljenje za vezivanje.
U MHC klasa I-zavisnoj imunskoj reakciji, peptidi ne samo da moraju da budu sposobni da se vežu za određene MHC molekule klase I koje eksprimiraju tumorske ćelije, već njih takođe moraju da prepoznaju T ćelije koje nose specifične T-ćelijske receptore (TCR).
Antigeni koje prepoznaju tumor-specifični citotoksični T limfociti, to jest, njihovi epitopi, mogu biti molekuli dobijeni iz svih klasa proteina, kao što su enzimi, receptori, faktori transkripcije, itd. koji se eksprimiraju i, u poređenju sa neizmenjenim ćelijama istog porekla, ushodno regulišu u ćelijama datog tumora.
Trenutno važeća klasifikacija tumor-asociranih antigena sadrži sledeće velike grupe:
a) Karcinom-testis antigeni: Prvi tumor-asocirani antigeni (TAA) koji su ikad identifikovani koje mogu da prepoznaju T ćelije pripadaju ovoj klasi, koja je originalno nazvana karcinomtestis (CT) antigeni zbog ekspresije njenih članova u histološki različitim humanim tumorima i, među normalnim tkivima, samo u spermatocitima/spermatogonijama testisa i, povremeno, u placenti. Budući da ćelije testisa ne eksprimiraju HLA molekule klase I i II, ove antigene ne mogu da prepoznaju T ćelije u normalnim tkivima te se stoga mogu smatrati imunološki tumorspecifičnim. Dobro poznati primeri za CT antigene su pripadnici MAGE familije ili NY-ESO-1.
b) Antigeni diferencijacije: Ove TAA dele tumori i normalno tkivo iz kojeg je tumor nastao; većina njih nalazi se u melanomima i normalnim melanocitima. Mnogi od ovih proteina povezanih sa melanocitnom linijom uključeni su u biosintezu melanina te stoga nisu tumorspecifični, ali bez obzira na to naširoko se koriste za imunoterapiju raka. Primeri uključuju, ali nisu i ograničeni na, tirozinazu i Melan-A/MART-1 za melanom ili PSA za karcinom prostate. c) Prekomerno eksprimirani TAA: Geni koji kodiraju naširoko eksprimirane TAA detektovani su u histološki različitim tipovima tumora kao i u mnogim normalnim tkivima, generalno sa nižim nivoima ekspresije. Moguće je da su mnogi od epitopa koje normalna tkiva obrađuju i potencijalno prezentuju ispod nivoa praga za prepoznavanje od strane T ćelija, dok njihova prekomerna ekspresija u ćelijama tumora može da pokrene antitumorski odgovor probijanjem prethodno uspostavljene tolerancije. Istaknuti primeri za ovu klasu TAA su Her-2/neu, survivin, telomeraza ili WT1.
d) Tumor-specifični antigeni: Ovi jedinstveni TAA nastaju iz mutacija normalnih gena (kao što je β-katenin, CDK4, itd). Neke od ovih molekularnih promena su u vezi sa neoplastičnom transformacijom i/ili progresijom. Tumor-specifični antigeni su generalno u stanju da indukuju jake imunske odgovore a da pritom ne nose rizik od autoimunskih reakcija protiv normalnih tkiva. S druge strane, ovi TAA su u većini slučajeva relevantni samo za određeni tumor na kojem su identifikovani i obično ih ne deli mnogo individualnih tumora.
e) TAA koji nastaju iz abnormalnih posttranslacionih modifikacija: Takvi TAA mogu nastati iz proteina koji su niti specifični niti prekomerno eksprimirani u tumorima, ali bez obzira na to postaju tumor-asocirani pomoću posttranslacionih procesa koji su primarno aktivni u tumorima. Primeri za ovu klasu nastaju iz izmenjenih obrazaca glikozilacije koji dovode do novih epitopa u tumorima kao za MUC1 ili događaja poput spajanja proteina u toku degradacije, koji mogu i ne moraju biti tumor-specifični.
f) Onkovirusni proteini: Ovi TAA su virusni proteini koji mogu imati kritičnu ulogu u procesu onkogeneze i, zbog toga što su stranog (a ne humanog) porekla, oni mogu pokrenuti T-ćelijski odgovor. Primeri takvih proteina su proteini humanog papiloma virusa tip 16, E6 i E7, koji se eksprimiraju u karcinomu grlića materice.
Da bi proteini mogli da budu prepoznati od strane citotoksičnih T limfocita kao tumorspecifični ili tumor-asocirani antigeni, i da bi mogli da se koriste u terapiji, moraju da budu ispunjeni određeni preduslovi. Antigen bi trebalo da bude uglavnom eksprimiran od strane ćelija tumora a ne uopšte ili samo u uporedivo malim količinama od strane normalnih zdravih tkiva ili u drugom poželjnom otelotvorenju peptid bi trebalo da bude prekomerno prezentovan od strane ćelija tumora u poređenju sa normalnim zdravim tkivima. Nadalje je poželjno da dati antigen ne bude samo prisutan u određenoj vrsti tumora, već takođe i u visokim koncentracijama (tj. broj kopija datog peptida po ćeliji). Tumor-specifični i tumor-asocirani antigeni se često dobijaju od proteina koji su direktno uključeni u transformaciju normalne ćelije u tumorsku ćeliju zbog funkcije npr. u kontroli ćelijskog ciklusa ili supresiji apoptoze. Pored toga, nishodni ciljevi proteina koji su direktno odgovorni za transformaciju mogu biti ushodno regulisani i tako mogu indirektno biti tumor-asocirani. Takvi indirektni tumorasocirani antigeni mogu takođe biti ciljevi vakcinalnog pristupa (Singh-Jasuja et al. The Tübingen approach: identification, selection, and validation of tumor-associated HLA peptides for cancer therapy. Cancer Immunol Immunother. 2004 Mar;53(3):187-95). U oba slučaja, esencijalno je da epitopi budu prisutni u aminokiselinskoj sekvenci antigena, budući da takav peptid („imunogeni peptid“) koji je dobijen iz tumor-asociranog antigena treba da dovede do in vitro ili in vivo T-ćelijskog odgovora.
U osnovi, svaki peptid koji je u stanju da veže MHC molekul može funkcionisati kao T-ćelijski epitop. Preduslov za indukciju in vitro ili in vivo T-ćelijskog odgovora je prisustvo T ćelije sa odgovarajućim TCR i odsustvo imunološke tolerancije za ovaj konkretni epitop.
Zato su TAA početna tačka za razvoj tumorske vakcine. Metodi za identifikaciju i karakterizaciju TAA zasnovani su na upotrebi CTL koji mogu biti izolovani iz pacijenata ili zdravih ispitanika, ili se oni zasnivaju na stvaranju diferencijalnih profila transkripcije ili diferencijalnih obrazaca ekspresije peptida između tumora i normalnih tkiva.
Ipak, identifikacija gena koji su prekomerno eksprimirani u tumorskim tkivima ili humanim tumorskim ćelijskim linijama, ili selektivno eksprimirani u takvim tkivima ili ćelijskim linijama, ne obezbeđuje precizne informacije o upotrebi antigena koji se transkribuju iz ovih gena u imunskoj terapiji. Ovo je iz razloga što je samo pojedinačna potpopulacija epitopa ovih antigena prikladna za takvu primenu budući da mora da bude prisutna T ćelija sa odgovarajućim TCR i da imunološka tolerancija za ovaj naročit epitop bude odsutna ili minimalna. U veoma poželjnom otelotvorenju pronalaska je zato važno da se odaberu samo oni prekomerno ili selektivno prezentovani peptidi protiv kojih se može naći funkcionalna i/ili proliferišuća T ćelija. Takva funkcionalna T ćelija je definisana kao T ćelija koja nakon stimulacije sa specifičnim antigenom može klonalno da se proširi i koja je sposobna da izvrši efektorske funkcije („efektorska T ćelija“).
U slučaju TCR i antitela u skladu sa pronalaskom, imunogenost osnovnih peptida je sekundarna. Za TCR i antitela u skladu sa pronalaskom prezentacija je određujući faktor.
T-pomoćničke ćelije imaju važnu ulogu u orkestriranju efektorske funkcije CTL u antitumorskoj imunosti. T-pomoćnički ćelijski epitopi koji izazivaju T-pomoćnički ćelijski odgovor TH1tipa podržavaju efektorske funkcije CD8-pozitivnih T ćelija ubica, koje obuhvataju citotoksične funkcije usmerene protiv tumorskih ćelija koje prikazuju komplekse tumor-asocirani peptid/MHC na površini ćelije. Na ovaj način tumor-asocirani peptidni epitopi T-pomoćničke ćelije, samostalno ili u kombinaciji sa drugim tumor-asociranim peptidima, mogu da služe kao aktivni farmaceutski sastojci smeša za vakcinu koje stimulišu antitumorske imunske odgovore.
Primene protiv dodatnih malignih tumora predstavljene su u sledećem detaljnijem opisu peptida u skladu sa pronalaskom.
Detaljan opis pronalaska
Na način kako su korišćeni u ovom tekstu, i sem ako nije naznačeno drugačije, svi termini su definisani kako je navedeno u nastavku.
Termin „peptid“ je korišćen u ovom tekstu da označi seriju aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Peptidi su poželjno dužine 9 aminokiselina, ali mogu biti i kraći sa dužinom od 8 aminokiselina, ili duži sa dužinom od 10, 11, 12, 13 ili 14, a u slučaju peptida MHC klase II oni mogu biti dužine od 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 aminokiselina.
Pored toga, termin „peptid“ će obuhvatati soli serija aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Poželjno, soli su farmaceutski prihvatljive soli peptida, kao što su, na primer, hloridne ili acetatne (trifluoroacetat) soli.
Termin „peptid“ će obuhvatati „oligopeptid“. Termin „oligopeptid“ je korišćen u ovom tekstu da označi seriju aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Dužina oligopeptida nije presudna za pronalazak, sve dok je u njemu zadržan ispravni epitop ili epitopi. Oligopeptidi su tipično dužine manje od oko 30 aminokiselinskih ostataka, a duži od oko 15 aminokiselina.
Termin „peptidi predmetnog pronalaska“ će obuhvatati peptide koji se sastoje od ili sadrže peptid kako je definisan ranije u skladu sa ID BR. SEKV: 266.
Termin „polipeptid“ označava seriju aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Dužina polipeptida nije presudna za pronalazak, sve dok su u njemu zadržani ispravni epitopi. Suprotno terminima peptid ili oligopeptid, termin polipeptid je namenjen da označi molekule koji sadrže više od oko 30 aminokiselinskih ostataka.
Peptid, oligopeptid, protein ili polinukleotidni kod za takav molekul je „imunogen“ (pa je zato „imunogen“ u okviru predmetnog pronalaska), ako je sposoban da indukuje imunski odgovor. U slučaju predmetnog pronalaska, imunogenost je specifičnije definisana kao sposobnost indukovanja T-ćelijskog odgovora. Tako bi „imunogen“ bio molekul koji je u stanju da indukuje imunski odgovor, a u slučaju predmetnog pronalaska, molekul koji je u stanju da indukuje T-ćelijski odgovor. U drugom aspektu, imunogen može biti peptid, kompleks peptida sa MHC, oligopeptid i/ili protein koji se koristi za pokretanje specifičnih antitela ili TCR protiv njega.
T-ćelijski „epitop“ klase I zahteva kratak peptid koji je vezan za MHC receptor klase I, obrazujući trojni kompleks (alfa lanac MHC klase I, beta-2-mikroglobulin i peptid), koji može da prepozna T ćelija koja nosi podudarni T-ćelijski receptor koji se vezuje za kompleks MHC/peptid sa odgovarajućim afinitetom. Peptidi koji se vezuju za MHC molekule klase I su tipično dužine 8-14 aminokiselina, a najčešće su dugački 9 aminokiselina.
Kod ljudi postoje tri različita genska lokusa koji kodiraju MHC molekule klase I (MHC molekuli ljudi se takođe nazivaju humani leukocitni antigeni (HLA)): HLA-A, HLA-B i HLA-C. HLA-A*01, HLA-A*02 i HLA-B*07 su primeri različitih alela MHC klase I koji mogu biti eksprimirani od ovih lokusa.
Tabela 6: Učestalosti ekspresije F HLA*A02 i najučestaliji serotipovi HLA-DR. Učestalosti su izvedene iz učestalosti haplotipova Gfunutar američke populacije adaptirane iz rada Mori i sar. (Mori M, et al. HLA gene and haplotype frequencies in the North American population: the National Marrow Donor Program Donor Registry. Transplantation. 1997 Oct 15;64(7):1017-27) primenom Hardi-Vajnberg formule F=1-(1-Gf)². Kombinacije A*02 sa određenim HLA-DR alelima mogu biti obogaćene ili manje učestale nego što je očekivano u odnosu na njihove pojedinačne učestalosti usled neravnoteže povezivanja. Za detalje pogledajte rad Chanock et al. (S.J. Chanock, et al (2004) HLA-A, -B, -Cw, -DQA1 and DRB1 in an African American population from Bethesda, USA Human Immunology, 65: 1223-1235).
Stoga, za terapijske i dijagnostičke svrhe, veoma je poželjan peptid koji se vezuje sa odgovarajućim afinitetom za nekoliko različitih receptora HLA klase II. Peptid koji se vezuje za nekoliko različitih HLA molekula klase II naziva se slobodan vezivač.
Na način kako je korišćeno u ovom dokumentu, upućivanje na DNK sekvencu obuhvata i jednolančanu i dvolančanu DNK. Tako, specifična sekvenca, sem ako kontekst ne ukazuje drugačije, odnosi se na jednolančanu DNK takve sekvence, dupleks takve sekvence sa njenim komplementarnim delom (dvolančana DNK) i komplementarni deo takve sekvence. Termin „kodirajući region“ odnosi se na onaj deo gena koji ili prirodno ili normalno kodira proizvod ekspresije datog gena u njegovoj prirodnoj genomskoj sredini, tj. region koji in vivo kodira proizvod prirodne ekspresije tog gena.
Kodirajući region može biti iz nemutiranog („normalnog“), mutiranog ili izmenjenog gena, ili čak iz DNK sekvence, ili gena, koji su u potpunosti sintetizovani u laboratoriji pomoću metoda koji su dobro poznati stručnjacima iz oblasti sinteze DNK.
Termin „nukleotidna sekvenca“ odnosi se na heteropolimer deoksiribonukleotida.
Nukleotidna sekvenca koja kodira određeni peptid, oligopeptid ili polipeptid može biti prirodno postojeća ili mogu biti sintetički napravljene. Uopšteno, DNK segmenti koji kodiraju peptide, polipeptide i proteine ovog pronalaska sastavljaju se iz cDNK fragmenata i kratkih oligonukleotidnih povezivača, ili iz serije oligonukleotida, kako bi se obezbedio sintetički gen koji je u stanju da bude eksprimiran u rekombinantnoj transkripcionoj jedinici koja sadrži regulatorne elemente dobijene iz mikrobnog ili virusnog operona.
Na način kako je korišćen u ovom dokumentu termin „nukleotidni kod za peptid“ (ili koji kodira) odnosi se na nukleotidnu sekvencu koja kodira peptid uključujući veštačke (napravljene od strane ljudi) start i stop kodone kompatibilne za biološki sistem koji će eksprimirati sekvencu.
Termin „proizvod ekspresije“ označava polipeptid ili protein koji je prirodni proizvod translacije gena i bilo koje sekvence nukleinskih kiselina koja kodira ekvivalente koji nastaju iz degeneracije genetskog koda i tako kodiraju istu aminokiselinu(e).
Termin „fragment“, kada se odnosi na kodirajuću sekvencu, označava deo DNK koji sadrži manje od kompletnog kodirajućeg regiona, čiji proizvod ekspresije esencijalno zadržava istu biološku funkciju ili aktivnost kao i proizvod ekspresije kompletnog kodirajućeg regiona.
Termin „DNK segment“ odnosi se na DNK polimer, u obliku zasebnog fragmenta ili kao komponenta većeg DNK konstrukta, koji je dobijen iz DNK koja je izolovana najmanje jednom u suštinski čistom obliku, tj. ne sadrži kontaminirajuće endogene materijale i u količini ili koncentraciji koja omogućava identifikaciju, manipulaciju i ponovno dobijanje segmenta i njegovih komponentnih nukleotidnih sekvenci pomoću standardnih biohemijskih metoda, na primer upotrebom vektora za kloniranje. Takvi segmenti se obezbeđuju u obliku otvorenog okvira čitanja koji nije prekinut unutrašnjim netranslatornim sekvencama, ili intronima, koji su tipično prisutni u eukariotskim genima. Sekvence netranslatorne DNK mogu biti prisutne nishodno od otvorenog okvira čitanja, gde iste ne ometaju manipulaciju ili ekspresiju kodirajućih regiona.
Termin „prajmer“ označava kratku sekvencu nukleinskih kiselina koja može biti uparena sa jednim lancem DNK i obezbeđuje slobodan 3'-OH kraj na kojem DNK polimeraza započinje sintezu deoksiribonukleotidnog lanca.
Termin „promoter“ označava region DNK koji je uključen u vezivanje RNK polimeraze kako bi se inicirala transkripcija.
Termin „izolovan“ označava da je materijal uklonjen iz njegove originalne sredine (npr. prirodne sredine ako se on prirodno javlja). Na primer, prirodno postojeći polinukleotid ili polipeptid prisutan u živoj životinji nije izolovan, ali isti polinukleotid ili polipeptid, izdvojen iz nekog ili svih koegzistirajućih materijala u prirodnom sistemu, jeste izolovan. Takvi polinukleotidi mogu biti deo vektora i/ili takvi polinukleotidi ili polipeptidi mogu biti deo smeše, a da i dalje budu izolovani tako što takav vektor ili smeša nije deo njegove prirodne sredine.
Polinukleotidi, i rekombinantni ili imunogeni polipeptidi, predstavljeni u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu takođe biti u „prečišćenom“ obliku. Termin „prečišćen“ ne zahteva apsolutnu čistoću; on je pre namenjen kao relativna definicija, i može obuhvatati preparate koji su visoko prečišćeni ili preparate koji su samo delimično prečišćeni, jer se ti termini podrazumevaju od strane stručnjaka u relevantnoj oblasti. Na primer, pojedinačni klonovi izolovani iz biblioteke cDNK su dogovorno prečišćeni do elektroforetske homogenosti. Prečišćavanje početnog materijala ili prirodnog materijala do najmanje jednog reda veličine, poželjno dva ili tri reda, i još poželjnije četiri ili pet redova veličine se izričito razmatra. Pored toga, polipeptid patentnog zahteva koji ima čistoću od poželjno 99,999%, ili najmanje 99,99% ili 99,9%; i čak poželjno 99% po težini ili veću izričito se razmatra.
Nukleinske kiseline i proizvodi ekspresije polipeptida predstavljeni u skladu sa predmetnim pronalaskom, kao i vektori ekspresije koji sadrže takve nukleinske kiseline i/ili takve polipeptide, mogu biti u „obogaćenom obliku“. Na način kako je korišćen u ovom dokumentu, termin „obogaćen“ znači da je koncentracija materijala najmanje oko 2, 5, 10, 100 ili 1000 puta veća od njegove prirodne koncentracije (na primer), pri čemu prednost ima 0,01% po težini, poželjno najmanje oko 0,1% po težini. Obogaćeni preparati od oko 0,5%, 1%, 5%, 10% i 20% po težini takođe se razmatraju. Sekvence, konstrukti, vektori, klonovi i drugi materijali koji sačinjavaju predmetni pronalazak mogu pogodno biti u obogaćenom ili izolovanom obliku.
Termin „aktivni fragment“ označava fragment koji izaziva imunski odgovor (tj. ima imunogenu aktivnost) kada se primeni, samostalno ili opciono sa prikladnim adjuvansom, na životinji, kao što je sisar, na primer, zec ili miš, i takođe uključujući ljude, pri čemu takav imunski odgovor po obliku stimuliše T-ćelijski odgovor unutar životinje primaoca, kao što je čovek. Alternativno, „aktivni fragment“ može takođe da se koristi za indukciju T-ćelijskog odgovora in vitro.
Na način kako su korišćeni ovde, termini „deo“, „segment“ i „fragment“, kada se koriste u vezi sa polipeptidima, odnose se na kontinuiranu sekvencu ostataka, kao što su aminokiselinski ostaci, čija sekvenca obrazuje podskup veće sekvence. Na primer, ako je polipeptid bio podvrgnut tretmanu sa bilo kojom od uobičajenih endopeptidaza, kao što su tripsin ili himotripsin, oligopeptidi nastali kao posledica takvog tretmana bi predstavljali delove, segmente ili fragmente početnog polipeptida. Kada se koriste u vezi sa polinukleotidima, ovi termini se odnose na proizvode koji se dobijaju tretiranjem navedenih polinukleotida sa bilo kojom od endonukleaza.
U skladu sa predmetnim pronalaskom, termin „procenat identičnosti“ ili „procentualno identičan“, kada se odnosi na sekvencu, znači da je sekvenca upoređena sa traženom ili opisanom sekvencom nakon poravnanja sekvence koja se upoređuje („upoređena sekvenca“) sa opisanom ili traženom sekvencom („referentna sekvenca“). Procenat identičnosti se zatim utvrđuje prema sledećoj formuli:
Procenat identičnosti = 100 [1 -(C/R)]
gde je C broj razlika između referentne sekvence i upoređene sekvence u okviru dužine poravnanja između referentne sekvence i upoređene sekvence, naznačeno time što
(i) svaka baza ili aminokiselina u referentnoj sekvenci koja nema odgovarajuću poravnatu bazu ili aminokiselinu u upoređenoj sekvenci, i
(ii) svaka praznina u referentnoj sekvenci, i
(iii) svaka poravnata baza ili aminokiselina u referentnoj sekvenci koja se razlikuje od poravnate baze ili aminokiseline u upoređenoj sekvenci, predstavlja razliku, i
(iiii) poravnanje mora da počne na poziciji 1 poravnatih sekvenci;
a R je broj baza ili aminokiselina u referentnoj sekvenci u okviru dužine poravnanja sa upoređenom sekvencom, pri čemu se svaka praznina u referentnoj sekvenci takođe broji kao baza ili aminokiselina.
Ako između upoređene sekvence i referentne sekvence postoji poravnanje za koje je procenat identičnosti izračunat pomoću gore navedene formule skoro jednak ili veći od određenog minimalnog procenta identičnosti, onda upoređena sekvenca ima određeni minimalni procenat identičnosti sa referentom sekvencom iako mogu postojati poravnanja u kojima je ovde naveden i ranije izračunat procenat identičnosti manji od određenog procenta identičnosti.
Originalni (nemodifikovani) peptidi kako su ovde predstavljeni mogu biti modifikovani supstitucijom jednog ili više ostataka na različitim, poželjno selektivnim, položajima unutar peptidnog lanca, ako nije navedeno drugačije. Poželjno, ove supstitucije nalaze se na kraju aminokiselinskog lanca. Takve supstitucije mogu biti konzervativne prirode, na primer, kada se jedna aminokiselina zamenjuje aminokiselinom slične strukture i sličnih karakteristika, kao kada se hidrofobna aminokiselina zamenjuje drugom hidrofobnom aminokiselinom. Još konzervativnija bi bila zamena aminokiselina iste ili slične veličine i hemijske prirode, kao kada se leucin zamenjuje izoleucinom. U studijama varijacija sekvenci u familijama prirodno javljajućih homolognih proteina, određene supstitucije aminokiselina se češće tolerišu od drugih, i one često pokazuju korelaciju sa sličnostima u veličini, naelektrisanju, polaritetu i hidrofobnosti između originalne aminokiseline i njene zamene, i kao takve predstavljaju osnovu za definisanje „konzervativnih supstitucija“.
Konzervativne supstitucije su ovde definisane kao zamena u okviru jedne od sledećih pet grupa: Grupa 1 – mali alifatični, nepolarni ili malo polarni ostaci (Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); Grupa 2 – polarni, negativno naelektrisani ostaci i njihovi amidi (Asp, Asn, Glu, Gln); Grupa 3 – polarni, pozitivno naelektrisani ostaci (His, Arg, Lys); Grupa 4 – veliki, alifatični, nepolarni ostaci (Met, Leu, Ile, Val, Cys); i Grupa 5 – veliki aromatični ostaci (Phe, Tyr, Trp).
Manje konzervativne supstitucije bi mogle da uključuju zamenu jedne aminokiseline drugom koja ima slične karakteristike ali je malo drugačije veličine, kao što je zamena alaninskog ostatka izoleucinskim ostatkom. Veoma nekonzervativne zamene bi mogle da uključuju supstituisanje kisele aminokiseline polarnom, ili čak i aminokiselinom baznog karaktera. Takve „radikalne“ supstitucije ne mogu, ipak, da se odbace kao potencijalno neefikasne jer hemijski efekti nisu potpuno predvidivi a radikalne supstitucije bi mogle da dovedu do srećnih slučajnih otkrića koja inače ne bi mogla da se predvide iz jednostavnih hemijskih principa.
Naravno, takve supstitucije mogu uključivati strukture koje nisu uobičajene L-aminokiseline. Tako, D-aminokiseline bi mogle da supstituišu L-aminokiseline koje se uobičajeno nalaze u antigenim peptidima pronalaska a da i dalje budu obuhvaćene onim što je ovde objavljeno. Pored toga, aminokiseline koje poseduju nestandardne R grupe (tj. R grupe koje se ne nalaze u uobičajenih 20 aminokiselina prirodnih proteina) takođe se mogu koristiti u svrhe supstituisanja da bi se proizveli imunogeni i imunogeni polipeptidi u skladu sa predmetnim pronalaskom.
Ako se utvrdi da supstitucije na više od jednog položaja rezultuju peptidom sa značajnom jednakom ili većom antigenom aktivnošću kako je definisano u nastavku, onda će kombinacije tih supstitucija biti testirane kako bi se utvrdilo da li kombinovane supstitucije rezultuju aditivnim ili sinergističkim efektima na antigenost peptida. Najviše, u okviru peptida neće biti istovremeno supstituisano više od četiri položaja.
Peptidi pronalaska mogu biti produženi za najviše četiri aminokiseline, to jest mogu da se dodaju 1, 2, 3 ili 4 aminokiseline na bilo koji kraj u bilo kojoj kombinaciji između 4:0 i 0:4.
Kombinacije elongacija u skladu sa pronalaskom mogu se videti iz sledeće tabele 7:
Aminokiseline za elongaciju mogu biti peptidi originalne sekvence proteina ili bilo koja druga aminokiselina. Elongacija može da se koristi za poboljšavanje stabilnosti ili rastvorljivosti peptida.
Termin „T-ćelijski odgovor“ označava specifičnu proliferaciju i aktivaciju efektorskih funkcija indukovanih peptidom in vitro ili in vivo. Za MHC klasa I restrikovane CTL, efektorske funkcije mogu biti liza ciljnih ćelija pulsiranih peptidom, pulsiranih prekursorom peptida ili ciljnih ćelija koje prirodno prezentuju peptid, sekrecija citokina, poželjno interferon-gama, TNF-alfa ili IL-2, indukovana peptidom, sekrecija efektorskih molekula, poželjno granzima ili perforina, indukovana peptidom, ili degranulacija.
Poželjno, kada se CTL specifični za peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom testiraju na supstituisane peptide, koncentracija peptida pri kojoj supstituisani peptidi dostižu polovinu maksimalnog povećanja lize u odnosu na pozadinu nije veća od oko 1 mmol/l, poželjno nije veća od oko 1 µmol/l, poželjnije nije veća od oko 1 nmol/l, a još poželjnije nije veća od oko 100 pmol/l, i najpoželjnije nije veća od oko 10 pmol/l. Takođe je poželjno da supstituisani peptid bude prepoznat od strane CTL dobijenih od više od jedne osobe, najmanje dve, a još poželjnije tri osobe.
Stimulacija imunskog odgovora zavisi od prisustva antigena koje imunski sistem domaćina prepoznaje kao strane. Otkriće postojanja tumor-asociranih antigena sada je otvorilo mogućnost primene imunskog sistema domaćina za intervenciju u rastu tumora. Trenutno se istražuju različiti mehanizmi za iskorišćavanje kako humoralnog tako i ćelijskog dela imunskog sistema za imunoterapiju raka.
Specifični elementi ćelijskog imunskog odgovora su u stanju da specifično prepoznaju i unište ćelije tumora. Izolacija citotoksičnih T ćelija (CTL) iz ćelijskih populacija koje infiltriraju tumor ili iz periferne krvi navodi na to da takve ćelije imaju značajnu ulogu u prirodnim imunskim odbranama protiv raka. U ovom odgovoru naročito važnu ulogu imaju CD8-pozitivne T ćelije, koje prepoznaju molekule klase I glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) koji nose peptide od obično 8 do 12 ostataka dobijene iz proteina ili defektnih proizvoda ribozoma (DRIP-ovi) koji se nalaze u citosolu. MHC molekuli ljudi se takođe nazivaju humani leukocitni antigeni (HLA).
MHC molekuli klase I se mogu naći na većini ćelija koje sadrže jedro koje prezentuju peptide koji nastaju kao posledica proteolitičkog cepanja uglavnom endogenih proteina, proteina citosola ili jedra, DRIP-ova i većih peptida. Međutim na MHC molekulima klase I se često nalaze i peptidi dobijeni iz endozoma ili egzogenih izvora. Ovaj neklasičan način prezentacije klase I se u literaturi naziva unakrsna prezentacija.
Budući da obe vrste odgovora, CD8 i CD4-zavisan, zajednički i sinergistički doprinose antitumorskom efektu, identifikacija i karakterizacija tumor-asociranih antigena prepoznatih pomoću ili CD8-pozitivnih CTL (MHC molekul klase I) ili pomoću CD4-pozitivnih CTL (MHC molekul klase II) važna je u razvoju tumorskih vakcina. Zato je cilj predmetnog pronalaska, da obezbedi smeše peptida koje sadrže peptide koji se vezuju za MHC komplekse bilo koje od ove dve klase.
Imajući u vidu ozbiljna neželjena dejstva i troškove u vezi sa lečenjem raka preko su potrebni bolji metodi prognoze i dijagnostikovanja. Zato, postoji potreba da se identifikuju drugi faktori koji predstavljaju biomarkere za karcinom uopšte i konkretno za karcinom pluća. Pored toga, postoji potreba da se identifikuju faktori koji mogu da se koriste u lečenju raka uopšte i konkretno AML.
Predmetni pronalazak obezbeđuje peptide koji su korisni u lečenju raka / tumora, poželjno malignih tumora pluća, još poželjnije AML i drugih malignih tumora (pogledajte tabelu 5) koji prekomerno ili isključivo prezentuju peptide pronalaska. Za ove peptide je pokazano masenom spektrometrijom da ih prirodno prezentuju HLA molekuli na primarnim humanim uzorcima AML.
Dokazano je da su izvorni gen/protein (koji se takođe naziva „protein kompletne dužine“ ili „osnovni protein“) iz kojih su dobijeni peptidi visoko prekomerno eksprimirani u tumorskom tkivu u poređenju sa normalnim tkivima (pogledajte primer 1 i sliku 2 za AML), što pokazuje visok stepen tumorske asocijacije izvornih gena. Štaviše, sami peptidi su jako prekomerno prezentovani na tumorskom tkivu ali ne na normalnim tkivima (pogledajte primer 1 i sliku 3).
HLA-vezani peptidi mogu da budu prepoznati od strane imunskog sistema, specifično T limfocita/T ćelija. T ćelije mogu da unište ćelije koje prezentuju prepoznati kompleks HLA/peptid, npr. ćelije karcinoma pluća koje prezentuju dobijene peptide.
Za peptide predmetnog pronalaska je dokazano da su sposobni da stimulišu T-ćelijske odgovore i/ili da su prekomerno prezentovani i da samim tim mogu da se koriste za proizvodnju antitela i/ili TCR, konkretno sTCR, u skladu sa predmetnim pronalaskom (pogledajte primer 1 i sliku 4). Pored toga, peptidi, kada su u kompleksu sa odgovarajućim MHC, mogu takođe da se koriste za proizvodnju antitela i/ili TCR, konkretno sTCR, u skladu sa predmetnim pronalaskom. Odgovarajući metodi dobro su poznati osobi stručnoj u ovoj oblasti i mogu se naći i u odgovarajućoj literaturi. Tako su peptidi predmetnog pronalaska korisni za generisanje imunskog odgovora kod pacijenta pomoću kojeg mogu da se unište tumorske ćelije. Imunski odgovor kod pacijenta može da se indukuje direktnim davanjem opisanih peptida ili prikladnih prekursorskih supstanci (npr. produženi peptidi, proteini, ili nukleinske kiseline koje kodiraju ove peptide) pacijentu, idealno u kombinaciji sa agensom koji pojačava imunogenost (tj. adjuvansom). Može se očekivati da imunski odgovor koji potiče od takve terapeutske vakcinacije bude visoko specifičan protiv tumorskih ćelija zato što ciljni peptidi predmetnog pronalaska nisu prezentovani na normalnim tkivima u uporedivom broju kopija, čime se sprečava rizik od neželjenih autoimunskih reakcija protiv normalnih ćelija kod pacijenta.
Farmaceutske smeše sadrže peptide ili u slobodnom obliku ili u obliku farmaceutski prihvatljive soli (pogledajte ranije u tekstu). Na način kako je korišćen u ovom tekstu, termin „farmaceutski prihvatljiva so“ odnosi se na derivat opisanih peptida, naznačeno time što je peptid modifikovan pravljenjem kiselih ili baznih soli agensa. Na primer, kisele soli se dobijaju od slobodne baze (tipično naznačeno time što neutralni oblik leka ima neutralnu –NH2grupu) što uključuje reakciju sa pogodnom kiselinom. Pogodne kiseline za dobijanje kiselih soli uključuju i organske kiseline, npr. sirćetna kiselina, propionska kiselina, glikolna kiselina, piruvična kiselina, oksalna kiselina, jabučna kiselina, malonska kiselina, ćilibarna kiselina, maleinska kiselina, fumarna kiselina, vinska kiselina, limunska kiselina, benzoeva kiselina, cimetna kiselina, bademova kiselina, metansulfonska kiselina, etansulfonska kiselina, p-toluensulfonska kiselina, salicilna kiselina i slične, kao i neorganske kiseline, npr. hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, sumporna kiselina, azotna kiselina, fosforna kiselina i slične. Obratno, preparati baznih soli iz kiselih delova koji mogu biti prisutni na peptidu dobijaju se upotrebom farmaceutski prihvatljive baze kao što je natrijum hidroksid, kalijum hidroksid, amonijum hidroksid, kalcijum hidroksid, trimetilamin, ili slične.
U jednom posebno poželjnom otelotvorenju, farmaceutske smeše sadrže peptide u vidu soli sirćetne kiseline (acetati), trifluoro acetata ili hlorovodonične kiseline (hloridi).
Peptidi predmetnog pronalaska mogu da se koriste za stvaranje i razvoj specifičnih antitela protiv kompleksa MHC/peptid. Ona se mogu koristiti za terapiju, tako što će ciljno dovoditi toksine ili radioaktivne supstance u obolelo tkivo. Druga primena ovih antitela može biti ciljno dovođenje radionuklida u obolelo tkivo u svrhe imidžinga kao što je PET. Ova primena može pomoći da se detektuju male metastaze ili utvrdi veličina i precizna lokacija obolelih tkiva.
Predstavljen je metod za proizvodnju rekombinantnog antitela koje se specifično vezuje za humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I koji je u kompleksu sa HLA-restrikovanim antigenom, pri čemu se metod sastoji od: imunizacije genetičkim inžinjeringom napravljenog nehumanog sisara koji sadrži ćelije koje eksprimiraju navedeni humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I sa solubilnim oblikom MHC molekula klase I koji je u kompleksu sa navedenim HLA-restrikovanim antigenom; izolacije molekula mRNK iz ćelija navedenog sisara koji nije čovek koje proizvode antitela; proizvodnje biblioteke prikaza faga koja prikazuje molekule proteina kodiranih navedenim molekulima mRNK; i izolacije najmanje jednog faga iz navedene biblioteke prikaza faga, pri čemu taj navedeni najmanje jedan fag prikazuje navedeno antitelo koje se specifično vezuje za navedeni humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I koji je u kompleksu sa navedenim HLA-restrikovanim antigenom.
Dalji je aspekt pronalaska da se obezbedi antitelo koje se specifično vezuje za humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I koji je u kompleksu sa peptidom u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačeno time što je antitelo poželjno poliklonalno antitelo, monoklonalno antitelo, bispecifično antitelo i/ili himerno antitelo.
Predstavljen je metod za proizvodnju navedenog antitela koje se specifično vezuje za humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I koji je u kompleksu sa HLA-restrikovanim antigenom, pri čemu se metod sastoji od: imunizacije genetičkim inžinjeringom napravljenog nehumanog sisara koji sadrži ćelije koje eksprimiraju navedeni humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I sa solubilnim oblikom MHC molekula klase I koji je u kompleksu sa navedenim HLA-restrikovanim antigenom; izolacije molekula mRNK iz ćelija navedenog sisara koji nije čovek koje proizvode antitela; proizvodnje biblioteke prikaza faga koja prikazuje molekule proteina kodiranih navedenim molekulima mRNK; i izolacije najmanje jednog faga iz navedene biblioteke prikaza faga, pri čemu taj navedeni najmanje jedan fag prikazuje navedeno antitelo koje je u stanju da se specifično veže za navedeni humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I ili II koji je u kompleksu sa navedenim HLA-restrikovanim antigenom. Odgovarajući metodi za proizvodnju takvih antitela i jednolančanih glavnih kompleksa gena tkivne podudarnosti klase I, kao i ostali alati za proizvodnju ovih antitela izneti su u patentima WO 03/068201, WO 2004/084798, WO 01/72768, WO 03/070752, kao i radovima Cohen CJ, et al. Recombinant antibodies with MHC-restricted, peptide-specific, T-cell receptor-like specificity: new tools to study antigen presentation and TCR-peptide-MHC interactions. J Mol Recognit. 2003 Sep-Oct;16(5):324-32.; Denkberg G, et al. Selective targeting of melanoma and APCs using a recombinant antibody with TCR-like specificity directed toward a melanoma differentiation antigen. J Immunol. 2003 Sep 1;171(5):2197-207; i Cohen CJ, et al. Direct phenotypic analysis of human MHC class I antigen presentation: visualization, quantitation, and in situ detection of human viral epitopes using peptide-specific, MHC-restricted human recombinant antibodies. J Immunol. 2003 Apr 15; 170(8):4349-61.
Poželjno, antitelo se vezuje za kompleks sa afinitetom vezivanja manjim od 20 nanomol/l, poželjno ispod 10 nanomol/l, što se u kontekstu predmetnog pronalaska smatra „specifičnim“.
Predstavljen je metod za proizvodnju rastvorljivog T-ćelijskog receptora koji prepoznaje specifični kompleks peptid-MHC. Takvi rastvorljivi T-ćelijski receptori mogu da se naprave od specifičnih T-ćelijskih klonova, a njihov afinitet može da se poveća pomoću mutageneze koja cilja komplementarne determinišuće regione. U svrhe odabira T-ćelijskog receptora, može se koristiti prikaz faga (US 2010/0113300, Liddy N, et al. Monoclonal TCR-redirected tumor cell killing. Nat Med 2012 Jun;18(6):980-987). U svrhu stabilizacije T-ćelijskih receptora u toku prikaza faga i u slučaju praktične primene u vidu leka, alfa i beta lanac mogu da se povežu, npr. neprirodnim disulfidnim vezama, bilo kovalentnim vezama (jednolančani T-ćelijski receptor) ili pomoću domena dimerizacije (vidite rad Boulter JM, et al. Stable, soluble T-cell receptor molecules for crystallization and therapeutics. Protein Eng 2003 Sep;16(9):707-711.; Card KF, et al. A soluble single-chain T-cell receptor IL-2 fusion protein retains MHC-restricted peptide specificity and IL-2 bioactivity. Cancer Immunol Immunother 2004 Apr;53(4):345-357; and Willcox BE, et al. Production of soluble alphabeta T-cell receptor heterodimers suitable for biophysical analysis of ligand binding. Protein Sci 1999 Nov; 8 (11):2418-2423). T-ćelijski receptor može biti povezan sa toksinima, lekovima, citokinima (vidite patent US 2013/0115191), domenima koji regrutuju efektorske ćelije kao što je anti-CD3 domen, itd. kako bi se izvršile određene funkcije na ciljnim ćelijama. Pored toga, on može biti eksprimiran u T ćelijama koje se koriste za adoptivni transfer.
Dalje informacije se mogu naći u patentima WO 2004/033685A1 i WO 2004/074322A1. Kombinacija sTCR opisana je u WO 2012/056407A1. Dalji metodi za proizvodnju izneti su u WO 2013/057586A1.
Pored toga, ona mogu da se koriste za verifikaciju dijagnoze malignog tumora patologa postavljene na osnovu uzorka biopsije.
Za selekciju prekomerno prezentovanih peptida, izračunava se profil prezentacije koji pokazuje srednju prezentaciju uzorka kao i varijaciju replikata. Profil postavlja jedno uz drugo uzorke tumora od interesovanja sa polaznim vrednostima uzoraka normalnog tkiva. Svaki od ovih profila može zatim da se konsoliduje u rezultat prekomerne prezentacije pomoću izračunavanja p-vrednosti modela linearnih mešovitih efekata (J. Pinheiro, et al. The nlme Package: Linear and Nonlinear Mixed Effects Models.2007) uz prilagođavanje za višestruko testiranje pomoću stope lažnog otkrivanja (Y. Benjamini and Y. Hochberg. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological), Vol.57 (No.1):289-300, 1995).
Radi identifikacije i relativne kvantifikacije HLA liganada pomoću masene spektrometrije, HLA molekuli iz uzoraka tkiva zamrznutih brzim zamrzavanjem su prečišćeni a HLA-asocirani peptidi su izolovani. Izolovani peptidi su razdvojeni a sekvence su identifikovane pomoću onlajn eksperimenata nano-elektrosprej-jonizacije (nanoESI) tečne hromatografije-masene spektrometrije (LC-MS). Tako dobijene peptidne sekvence su potvrđene poređenjem obrasca fragmentacije prirodnih TUMAP zabeleženog iz uzoraka AML sa obrascima fragmentacije odgovarajućih sintetičkih referentnih peptida identičnih sekvenci. Budući da su peptidi direktno identifikovani kao ligandi HLA molekula primarnih tumora, ovi rezultati daju direktan dokaz za prirodnu obradu i prezentaciju identifikovanih peptida na tkivu primarnog tumora dobijenog od pacijenata sa AML.
Linija korišćena u otkriću XPRESIDENT® v2.1 (vidite na primer US 2013-0096016) omogućava identifikaciju i selekciju relevantnih prekomerno prezentovanih peptida kandidata za vakcinu na osnovu direktne relativne kvantifikacije nivoa HLA-restrikovanog peptida na malignim tkivima u poređenju sa nekoliko različitih nemalignih tkiva i organa. Ovo je postignuto razvojem diferencijalne kvantifikacije bez obeležavanja primenom podataka dobijenih pomoću LC-MS koji su obrađeni vlasničkom linijom za analizu podataka, kombinovanjem algoritama za identifikaciju sekvence, grupisanje spektra, brojanje jona, poravnanje vremena zadržavanja, slabljenje naelektrisanog stanja i normalizaciju.
Ustanovljeni su nivoi prezentacije uključujući procene greške za svaki peptid i uzorak. Identifikovani su peptidi koji su isključivo prezentovani na tumorskom tkivu i peptidi koji su prekomerno prezentovani u tumorskim u poređenju sa nemalignim tkivima i organima.
U kontekstu predmetnog pronalaska, kompleksi HLA-peptid iz 50 uzoraka tumorskog tkiva AML zamrznutih brzim zamrzavanjem su prečišćeni a HLA-asocirani peptidi su izolovani i analizirani pomoću LC-MS (vidite primere). Svi TUMAP koji su sadržani u predmetnoj aplikaciji ovim pristupom su identifikovani na uzorcima tumora primarne AML čime je potvrđena njihova prezentacija na primarnoj AML.
TUMAP identifikovani na multiplim AML tumorskim i normalnim tkivima kvantifikovani su pomoću brojanja jona LC-MS podataka bez obeležavanja. Metod pretpostavlja da oblasti LC-MS signala peptida koreliraju sa njegovom obilnošću u uzorku. Svi kvantitativni signali peptida u raznim LC-MS eksperimentima su normalizovani na osnovu centralne tendencije, uprosečene po uzorku i sjedinjeni u stubičasti dijagram, koji se naziva profil prezentacije. Profil prezentacije objedinjuje različite metode analize kao što su pretraživanje baze podataka proteina, grupisanje spektra, slabljenje naelektrisanog stanja (gubitak naelektrisanja) i poravnanje vremena zadržavanja i normalizaciju.
Predmetni pronalazak se stoga odnosi na peptid dužine između 9 i 30 aminokiselina, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu KLQEQLAQL u skladu sa ID BR. SEKV: 266, ili njenu farmaceutski prihvatljivu so.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptide u skladu sa pronalaskom koji imaju sposobnost da se vežu za molekul klase I humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC).
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptide u skladu sa pronalaskom naznačene time što peptid sadrži aminokiselinsku sekvencu prema ID BR. SEKV: 266.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptide u skladu sa pronalaskom, naznačene time što je peptid (hemijski) modifikovan i/ili sadrži nepeptidne veze.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptide u skladu sa pronalaskom, naznačeno time što je peptid fuzioni protein, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa patentnim zahtevom 1 fuziran na N-terminalne aminokiseline 1-80 HLA-DR antigen-asociranog nepromenljivog lanca (Ii) ili fuziran na ili u sekvencu antitela, kao, na primer, antitela koje je specifično za dendritične ćelije.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira peptide u skladu sa pronalaskom.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu u skladu sa pronalaskom koja je DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihova kombinacija.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na vektor ekspresije koji eksprimira nukleinsku kiselinu u skladu sa pronalaskom.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid u skladu sa pronalaskom, nukleinsku kiselinu u skladu sa pronalaskom ili vektor ekspresije u skladu sa pronalaskom za upotrebu u medicini.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ćeliju domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu u skladu sa pronalaskom ili vektor ekspresije u skladu sa pronalaskom.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ćeliju domaćina u skladu sa pronalaskom koja je antigen-prezentujuća ćelija.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ćeliju domaćina u skladu sa pronalaskom, naznačeno time što je antigen-prezentujuća ćelija dendritična ćelija.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod proizvodnje peptida u skladu sa pronalaskom, pri čemu se metod sastoji od kultivisanja opisane ćelije domaćina i izolovanja peptida iz ćelije domaćina ili njenog medijuma za kultivaciju.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na in vitro metod za proizvodnju aktiviranih citotoksičnih T limfocita (CTL), pri čemu se metod sastoji od dovođenja u kontakt in vitro CTL sa humanim MHC molekulima klase I sa ubačenim antigenom eksprimiranim na površini prikladne antigenprezentujuće ćelije u toku vremenskog perioda koji je dovoljan da se navedeni CTL aktiviraju na antigen-specifičan način, naznačeno time što je navedeni antigen bilo koji peptid u skladu sa pronalaskom.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod kako je opisan, naznačeno time što se navedeni antigen postavlja na MHC molekule klase I eksprimirane na površini prikladne antigenprezentujuće ćelije tako što se dovoljna količina antigena dovodi u kontakt sa antigenprezentujućom ćelijom.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod u skladu sa pronalaskom, naznačeno time što antigen-prezentujuća ćelija sadrži vektor ekspresije koji eksprimira navedeni peptid koji sadrži ID BR. SEKV: 266.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na aktivirane citotoksične T limfocite (CTL), proizvedene pomoću metoda u skladu sa pronalaskom, koji selektivno prepoznaju ćeliju koja aberantno eksprimira polipeptid koji sadrži opisanu aminokiselinsku sekvencu.
Predstavljen je metod ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži bilo koju aminokiselinsku sekvencu u skladu sa pronalaskom, pri čemu metod obuhvata davanje pacijentu efikasnog broja citotoksičnih T limfocita (CTL) u skladu sa pronalaskom.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid u skladu sa pronalaskom, nukleinsku kiselinu u skladu sa pronalaskom, vektor ekspresije u skladu sa pronalaskom, ćeliju u skladu sa pronalaskom, ili aktivirani citotoksični T limfocit u skladu sa pronalaskom za primenu u lečenju malignog tumora.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu u skladu sa pronalaskom, naznačeno time što je lek vakcina.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu u skladu sa pronalaskom, naznačeno time što je navedeni maligni tumor akutna mijeloidna leukemija i/ili hronična limfocitna leukemija, maligni tumor jetre ili maligni tumor kolona.
Termin „antitelo“ ili „antitela“ je u ovom dokumentu korišćen u širokom smislu i uključuje kako poliklonalna tako i monoklonalna antitela. Pored intaktnih ili „kompletnih“ molekula imunoglobulina, pod terminom „antitela“ su takođe obuhvaćeni i fragmenti ili polimeri tih molekula imunoglobulina i humanizovane verzije molekula imunoglobulina, ukoliko oni ispoljavaju bilo koje od željenih svojstava (npr. specifično vezivanje markerskog polipeptida karcinoma pluća, isporučivanje toksina ćeliji karcinoma pluća koja eksprimira markerski gen za karcinom pluća u povećanom stepenu, i/ili inhibicija aktivnosti markerskog polipeptida karcinoma pluća) u skladu sa pronalaskom.
Kad god je to moguće, antitela pronalaska mogu da se nabave iz komercijalnih izvora. Antitela pronalaska mogu takođe biti napravljena pomoću dobro poznatih metoda. Osobi stručnoj u predmetnoj oblasti će biti poznato da za stvaranje antitela pronalaska mogu da se koriste ili markerski polipeptidi za karcinom pluća kompletne dužine ili njihovi fragmenti. Polipeptid koji će se koristiti za stvaranje antitela pronalaska može biti parcijalno ili kompletno prečišćen iz prirodnog izvora, ili može biti proizveden pomoću tehnika rekombinantne DNK.
Na primer, cDNK koja kodira peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom, kao što je peptid u skladu sa ID BR. SEKV: 266 ili njegov fragment, može biti eksprimirana u prokariotskim ćelijama (npr. bakterije) ili eukariotskim ćelijama (npr. kvasnice, insekti ili ćelije sisara), nakon čega rekombinantni protein može da se prečisti i koristi za stvaranje preparata monoklonalnog ili poliklonalnog antitela koje se specifično vezuje za markerski polipeptid za karcinom pluća koji se koristi za stvaranje antitela u skladu sa pronalaskom.
Osoba stručna u predmetnoj oblasti će shvatiti da stvaranje dva ili više različitih skupova monoklonalnih ili poliklonalnih antitela maksimizira verovatnoću dobijanja antitela sa specifičnošću i afinitetom neophodnim za njegovu namenu (npr. ELISA, imunohistohemija, in vivo imidžing, terapija imunotoksinima). Antitela se testiraju za njihovu željenu aktivnost pomoću poznatih metoda, u skladu sa svrhom za koju će se antitela koristiti (npr. ELISA, imunohistohemija, imunoterapija, itd; za dalje smernice o stvaranju i testiranju antitela pogledajte, npr. Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988, novo 2. izdanje 2013). Na primer, antitela mogu da se testiraju u ELISA testovima, Western blot testovima, imunohistohemijskim bojenjem uzoraka karcinoma pluća fiksiranih u formalinu ili zamrznutih isečaka tkiva. Nakon njihove inicijalne in vitro karakterizacije, antitela namenjena za terapeutsku ili in vivo dijagnostičku upotrebu testiraju se u skladu sa poznatim metodama kliničkog testiranja.
Termin „monoklonalno antitelo“ na način na koji je korišćen u ovom dokumentu odnosi se na antitelo dobijeno iz značajno homogene populacije antitela, to jest, pojedinačna antitela koja sačinjavaju populaciju su identična izuzev za moguće prirodno javljajuće mutacije koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Monoklonalna antitela opisana u ovom dokumentu specifično obuhvataju „himerna“ antitela u kojima je deo teškog i/ili lakog lanca identičan sa ili homologan sa korespondentnim sekvencama u antitelima dobijenim iz određenih vrsta ili koja pripadaju određenoj klasi ili potklasi antitela, dok je preostali deo lanca (lanaca) identičan sa ili homologan sa korespondentnim sekvencama u antitelima dobijenim iz drugih vrsta ili koja pripadaju drugoj klasi ili potklasi antitela, kao i fragmente takvih antitela, sve dok oni ispoljavaju željenu antagonističku aktivnost (patent registrovan u SAD pod brojem 4,816,567).
Monoklonalna antitela pronalaska mogu da se pripreme pomoću metoda hibridoma. U metodu hibridoma, miš ili druga odgovarajuća životinja domaćin se obično imunizuje sa sredstvom za imunizaciju kako bi se izazvali limfociti koji proizvode ili su u stanju da proizvode antitela koja će specifično da se vezuju za sredstvo za imunizaciju. Alternativno, imunizacija limfocita može da se izvrši in vitro.
Monoklonalna antitela mogu takođe da se naprave pomoću metoda rekombinantne DNK, kao što su one koje su opisane u patentu registrovanom u SAD pod brojem 4,816,567. DNK koja kodira monoklonalna antitela pronalaska može lako da se izoluje i sekvencionira pomoću konvencionalnih procedura (npr. primenom oligonukleotidnih proba koje su sposobne da se specifično vežu za gene koji kodiraju teške i lake lance mišjih antitela).
Za pripremanje monovalentnih antitela takođe su pogodne i in vitro metode. Digestija antitela u cilju proizvodnje njihovih fragmenata, konkretno, Fab fragmenata, može da se izvrši pomoću rutinskih tehnika poznatih u predmetnoj oblasti. Na primer, digestija može da se izvrši pomoću papaina. Primeri papainske digestije opisani su u dokumentu WO 94/29348 i patentu registrovanom u SAD pod brojem 4,342,566. Papainska digestija antitela tipično proizvodi dva identična fragmenta koja vezuju antigen, koji se nazivaju Fab fragmenti, i svaki sadrži jedno mesto za vezivanje antigena i rezidualni Fc fragment. Tretiranje pepsinom proizvodi F(ab')2 fragment i pFc' fragment.
Fragmenti antitela, bilo da su povezani sa drugim sekvencama ili ne, mogu takođe uključivati insercije, delecije, supstitucije, ili druge izabrane modifikacije konkretnih regiona ili specifičnih aminokiselinskih ostataka, pod uslovom da aktivnost fragmenta nije značajno izmenjena ili narušena u poređenju sa nemodifikovanim antitelom ili fragmentom antitela. Ove modifikacije mogu obezbediti neka dodatna svojstva, kao što je uklanjanje/dodavanje aminokiselina sposobnih za disuflidno vezivanje, povećanje njegove biološke dugovečnosti, menjanje njegovih sekretornih karakteristika itd. U svakom slučaju, fragment antitela mora da poseduje bioaktivno svojstvo, kao što je aktivnost vezivanja, regulacija vezivanja na domenu za vezivanje, itd. Funkcionalni ili aktivni regioni antitela mogu biti identifikovani pomoću mutageneze specifičnog regiona proteina, nakon čega sledi ekspresija i testiranje eksprimiranog polipeptida. Takvi metodi su očigledni osobi stručnoj u predmetnoj oblasti i mogu uključivati mutagenezu specifičnu za mesto nukleinske kiseline koja kodira fragment antitela.
Antitela pronalaska mogu dalje da sadrže humanizovana antitela ili humana antitela. Humanizovani oblici nehumanih (npr. mišjih) antitela su himerni imunoglobulini, imunoglobulinski lanci ili njihovi fragmenti (poput Fv, Fab, Fab' ili druge podsekvence antitela koje vezuju antigen) koji sadrže najmanju sekvencu dobijenu iz nehumanog imunoglobulina. Humanizovana antitela uključuju humane imunoglobuline (recipijentno antitelo) u kojim su ostaci iz komplementarnog determinišućeg regiona (CDR) recipijenta zamenjeni ostacima iz CDR nehumanih vrsta (donorsko antitelo) kao što je miš, pacov ili zec koji imaju željenu specifičnost, afinitet i kapacitet. U nekim slučajevima, ostaci okvira Fv (FR) humanog imunoglobulina se zamenjuju odgovarajućim nehumanim ostacima. Humanizovana antitela mogu takođe da sadrže ostatke koji se ne nalaze niti u recipijentnom antitelu niti u uvezenim sekvencama CDR ili okvira. Uopšteno, humanizovano antitelo će u značajnoj meri da sadrži sve od najmanje jednog, i tipično dva, varijabilna domena, u kojem svi ili značajno svi CDR regioni odgovaraju regionima nehumanog imunoglobulina i svi ili značajno svi FR regioni su regioni konsenzus sekvence humanog imunoglobulina. Humanizovano antitelo će takođe optimalno sadržati najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično iz humanog imunoglobulina.
Metodi humanizacije nehumanih antitela dobro su poznati u predmetnoj oblasti. Uopšteno, humanizovano antitelo ima jedan ili više aminokiselinskih ostataka uvedenih u njega iz izvora koji nije ljudski. Ovi nehumani aminokiselinski ostaci se često nazivaju „uvozni“ ostaci, koji se tipično uzimaju iz „uvoznog“ varijabilnog domena. Humanizacija se u suštini može izvršiti supstitucijom glodarskih CDR ili CDR sekvenci za korespondentne sekvence humanog antitela. U skladu sa tim, takva „humanizovana“ antitela su himerna antitela (patent registrovan u SAD pod brojem 4,816,567), naznačeno time što je značajno manje od intaktnog humanog varijabilnog domena supstituisano odgovarajućim sekvencama iz nehumanih vrsta. U praksi, humanizovana antitela su tipično humana antitela u kojima su neki CDR ostaci, a moguće i neki FR ostaci, supstituisani ostacima sa analognih mesta u antitelima glodara.
U ovu svrhu mogu da se upotrebe transgenske životinje (npr. miševi) koji su sposobni da nakon imunizacije proizvedu kompletan repertoar humanih antitela u odsustvu endogene proizvodnje imunoglobulina. Na primer, opisano je da homozigotna delecija gena koji kodira region spajanja teškog lanca antitela kod miševa sa himernom i gametskom mutacijom rezultira kompletnom inhibicijom endogene proizvodnje antitela. Transfer humanog gametskog niza gena za imunoglobuline u takve miševe sa gametskom mutacijom rezultovaće proizvodnjom humanih antitela nakon izazivanja od strane antigena. Humana antitela mogu takođe da se proizvedu u bibliotekama prikaza faga.
Antitela pronalaska se poželjno daju ispitaniku u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Tipično, koristi se odgovarajuća količina farmaceutski prihvatljive soli za pravljenje formulacije kako bi se napravila izotona formulacija. Primeri farmaceutski prihvatljivog nosača uključuju fiziološki rastvor, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. pH rastvora je poželjno od oko 5 do oko 8, još poželjnije od oko 7 do oko 7,5. Dalji nosači obuhvataju preparate sa održivim oslobađanjem, kao što su polupropustljive matrice solidnih hidrofobnih polimera koji sadrže antitelo, pri čemu su matrice u obliku oblikovanih proizvoda, npr. filmovi, lipozomi ili mikročestice. Osobama stručnim u predmetnoj oblasti će biti očigledno da određeni nosači mogu biti poželjniji u zavisnosti od, na primer, načina primene i koncentracije antitela koje se primenjuje.
Antitela se mogu dati ispitaniku, pacijentu ili ćeliji pomoću injekcije (npr. intravenska, intraperitonealna, potkožna, intramuskularna) ili pomoću drugih metoda kao što je infuzija, koje osiguravaju isporučivanje u cirkulaciju u efikasnom obliku. Antitela mogu takođe da se primene intratumorskim ili peritumorskim putevima, kako bi ispoljila lokalne kao i sistemske terapijske efekte. Preferira se lokalna ili intravenska injekcija.
Efikasne doze i režimi primene antitela mogu da se utvrde empirijski a takva određivanja spadaju u okvir veštine predmetne oblasti. Osobe stručne u predmetnoj oblasti će razumeti da će doza antitela, koja mora da se primeni, zavisiti od, na primer, ispitanika koji će dobiti antitelo, načina primene, konkretne vrste korišćenog antitela i drugih lekova koji se primenjuju. Tipična dnevna doza antitela koje se koristi samostalno može se kretati od oko 1 µg/kg do 100 mg/kg telesne težine ili više dnevno, u zavisnosti od gorepomenutih faktora. Nakon primene antitela za tretiranje karcinoma pluća efikasnost terapijskog antitela može da se proceni na različite načine koji su dobro poznati osobi stručnoj u predmetnoj oblasti. Na primer, veličina, broj i/ili distribucija karcinoma pluća kod ispitanika koji prima terapiju, može da se prati pomoću standardnih tehnika za imidžing tumora. Antitelo koje se primenjuje u terapijske svrhe, koje zaustavlja rast tumora, rezultuje smanjivanjem veličine tumora i/ili sprečava nastanak novih tumora u poređenju sa tokom bolesti koji bi nastao u odsustvu primene antitela, jeste efikasno antitelo za lečenje karcinoma pluća.
Budući da su peptidi navedeni u tabelama 2 i 5 (posebno oni udruženi sa AML) pronalaska a samim tim i njihovi osnovni polipeptidi visoko eksprimirani u AML, a eksprimirani su u prilično ili izuzetno niskim nivoima u normalnim ćelijama, inhibicija ekspresije ABCA13 i/ili MMP12 ili aktivnosti polipeptida može biti poželjno integrisana u terapijsku strategiju za lečenje ili prevenciju AML.
Princip antisens terapije bazira se na hipotezi da sekvencno-specifična supresija ekspresije gena (preko transkripcije ili translacije) može da se postigne unutarćelijskom hibridizacijom između genomske DNK ili mRNK i komplementarnih antisens vrsta. Obrazovanje takvog dupleksa hibridne nukleinske kiseline ometa transkripciju ciljne genomske DNK koja kodira tumorski antigen, ili obradu/transport/translaciju i/ili stabilnost ciljne mRNK tumorskog antigena.
Antisens nukleinske kiseline mogu da se isporuče raznovrsnim pristupima. Na primer, antisens oligonukleotidi ili antisens RNK može da se direktno da ispitaniku (npr. intravenskom injekcijom) u obliku koji omogućava preuzimanje u ćelije tumora. Alternativno, u ćelije in vivo, mogu da se uvedu virusni ili plazmidni vektori koji kodiraju antisens RNK (ili fragmente RNK). Antisens efekti mogu takođe da se indukuju sens sekvencama; međutim, stepen fenotipskih promena je veoma varijabilan. Fenotipske promene indukovane efikasnom antisens terapijom se procenjuju u skladu sa promenama u, npr. nivoima ciljne mRNK, nivoima ciljnog proteina i/ili nivoima aktivnosti ciljnog proteina.
U specifičnom primeru, inhibicija funkcije tumorskog markera pluća pomoću antisens genske terapije može da se postigne direktnim davanjem antisens RNK tumorskog markera karcinoma pluća ispitaniku. Antisens RNK tumorskog markera može da se proizvede i izoluje pomoću bilo koje standardne tehnike, ali se najčešće proizvodi in vitro transkripcijom pomoću antisens cDNK tumorskog markera pod kontrolom visoko efikasnog promotera (npr. T7 promoter). Unošenje antisens RNK tumorskog markera u ćelije može se izvršiti bilo kojom od metoda za direktno unošenje nukleinskih kiselina koje su opisane u nastavku.
Alternativna strategija za inhibiranje funkcije ABCA13 i MMP12 pomoću genske terapije podrazumeva unutarćelijsku ekspresiju anti-ABCA13, anti-MMP12 antitela ili dela anti-ABCA13, anti-MMP12 antitela. Na primer, gen (ili fragment gena) koji kodira monoklonalno antitelo koje se specifično vezuje za ABCA13, MMP12 polipeptid i inhibira njegovu biološku aktivnost, postavlja se pod transkripcionu kontrolu specifične (npr. tkivno- ili tumor-specifične) genske regulatorne sekvence, unutar vektora ekspresije nukleinske kiseline. Vektor se zatim daje ispitaniku tako da ga preuzimaju ćelije karcinoma pluća ili druge ćelije, koje zatim sekretuju anti-ABCA13, anti-MMP12 antitelo i tako blokiraju biološku aktivnost ABCA13, MMP12 polipeptida. Poželjno, ABCA13, MMP12 polipeptidi su prisutni na ekstraćelijskoj površini AML malignih ćelija.
U metodama opisanim ranije u tekstu, koje obuhvataju unošenje i preuzimanje egzogene DNK u ćelije ispitanika (tj. transdukciju ili transfekciju gena), nukleinske kiseline predmetnog pronalaska mogu biti u obliku ogoljene DNK ili nukleinske kiseline mogu biti u vektoru za dostavljanje nukleinskih kiselina ćelijama u cilju inhibicije ekspresije proteina tumorskog markera AML. Vektor može biti komercijalno dostupan preparat, kao što je adenovirusni vektor (Quantum Biotechnologies, Inc. (Laval, Quebec, Kanada). Dostavljanje nukleinskih kiselina ili vektora ćelijama može biti putem različitih mehanizama. U jednom primeru, dostavljanje je moguće putem lipozoma, primenom komercijalno dostupnih preparata lipozoma kao što su LIPOFECTIN, LIPOFECTAMINE (GIBCO-25 BRL, Inc, Gaithersburg, Merilend), SUPERFECT (Qiagen, Inc. Hilden, Nemačka) i TRANSFECTAM (Promega Biotec, Inc, Madison, Viskonsin, SAD), kao i drugih lipozoma koji su razvijeni u skladu sa standardnim procedurama u predmetnoj oblasti. Pored toga, nukleinska kiselina ili vektor ovog pronalaska mogu da se dostavljaju in vivo pomoću elektroporacije, tehnologije koja je dostupna kod kompanije Genetronics, Inc. (San Diego, SAD) kao i pomoću aparata SONOPORATION (ImaRx Pharmaceutical Corp, Tucson, Arizona, SAD).
U jednom primeru, dostavljanje vektora može biti putem virusnog sistema, kao što je sistem retrovirusnog vektora u koji se može upakovati rekombinantni retrovirusni genom. Rekombinantni retrovirus potom može da se koristi za inficiranje i samim tim dostavljanje antisens nukleinske kiseline inficiranim ćelijama koja inhibira ekspresiju ABCA13 i/ili MMP12. Naravno, tačan metod uvođenja izmenjene nukleinske kiseline u ćelije sisara nije ograničen na primenu retrovirusnih vektora. Za ovu proceduru široko su dostupne i druge tehnike, uključujući primenu adenovirusnih vektora, adeno-asociranih virusnih (AAV) vektora, lentivirusnih vektora, pseudotipiziranih retrovirusnih vektora. Takođe mogu da se koriste fizičke tehnike transdukcije, kao što je dostavljanje lipozomom i receptorom-posredovana endocitoza i drugi mehanizmi endocitoze. Ovaj pronalazak može da se koristi zajedno sa bilo kojim od ovih ili drugim često korišćenim metodima za transfer gena.
Antitela se takođe mogu koristiti za in vivo dijagnostičke eseje. Uopšteno, antitelo se obeležava radionuklidom (kao što je<111>In,<99>Tc,<14>C,<131>I,<3>H,<32>P ili<35>S) tako da se tumor može lokalizovati upotrebom imunoscintigrafije. U jednom otelotvorenju, antitela ili njihovi fragmenti se vezuju za ekstraćelijske domene dva ili više ABCA13 i MMP12 ciljeva, a vrednost afiniteta (Kd) je manja od 1x10 µmol/l.
Antitela za dijagnostičku primenu mogu biti obeležena probama koje su prikladne za detekciju različitim imidžing metodama. Metode za detekciju proba uključuju, ali nisu i ograničene na, fluorescenciju, svetlosnu, konfokalnu i elektronsku mikroskopiju; imidžing magnetnom rezonancom i spektroskopiju; fluoroskopiju, kompjuterizovanu tomografiju i pozitronsku emisionu tomografiju. Prikladne probe uključuju, ali nisu i ograničene na, fluorescein, rodamin, eozin i druge fluorofore, radioizotope, zlato, gadolinijum i druge lantanide, paramagnetsko gvožđe, fluorin-18 i druge radionuklide koji emituju pozitrone. Pored toga, probe mogu biti biili multi-funkcionalne i mogu se detektovati pomoću više od jednog od navedenih metoda. Ova antitela mogu biti direktno ili indirektno obeležena navedenim probama. Vezivanje proba za antitela uključuje kovalentno vezivanje probe, inkorporaciju probe u antitelo, i kovalentno vezivanje helirajućeg jedinjenja za vezivanje probe, među ostalima koji su dobro poznati u predmetnoj oblasti. Za imunohistohemiju, uzorak obolelog tkiva može biti svež ili zamrznut ili može biti ukalupljen u parafin i fiksiran konzervansom kao što je formalin. Fiksirani ili ukalupljeni isečci koji sadrže uzorak dovode se u kontakt sa obeleženim primarnim antitelom i sekundarnim antitelom, naznačeno time što se antitelo koristi za detekciju ekspresije ABCA13 i/ili MMP12 proteina in situ.
Predmetni pronalazak tako obezbeđuje peptid koji sadrži sekvencu koja se sastoji od ID BR. SEKV: 266 koji će indukovati T ćelije koje unakrsno reaguju sa navedenim peptidom.
Peptidi pronalaska imaju sposobnost da se vezuju za molekul humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I.
U predmetnom pronalasku, termin „homologno“ odnosi se na stepen identiteta (vidite Procenat identičnosti ranije) između sekvenci dveju aminokiselinskih sekvenci, tj. peptidnih ili polipeptidnih sekvenci. Gore pomenuta „homologija“ utvrđena je upoređivanjem dve sekvence koje su poravnate pod optimalnim uslovima preko sekvenci koje se upoređuju. Takva homologija sekvence može da se izračuna kreiranjem poravnanja pomoću, na primer, ClustalW algoritma. Opšte dostupni softver za analizu sekvence, specifičnije, Vector NTI, GENETYX ili druge alatke za analizu dostupne su u javnim bazama podataka.
Osoba stručna u predmetnoj oblasti će moći da proceni da li će T ćelije koje su indukovane varijantom specifičnog peptida biti sposobne da unakrsno reaguju sa samim peptidom (Fong L, et al. Altered peptide ligand vaccination with Flt3 ligand expanded dendritic cells for tumor immunotherapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Jul 17;98(15):8809-14; Zaremba S, et al. Identification of an enhancer agonist cytotoxic T lymphocyte peptide from human carcinoembryonic antigen. Cancer Res.1997 Oct 15;57(20):4570-7; Colombetti S, et al. Impact of orthologous melan-A peptide immunizations on the anti-self melan-A/HLA-A2 T cell crossreactivity. J Immunol. 2006 Jun 1;176(11):6560-7; Appay V, et al. Decreased specific CD8+ T cell cross-reactivity of antigen recognition following vaccination with Melan-A peptide. Eur J Immunol. 2006 Jul;36(7):1805-14).
CTL mogu naknadno da unakrsno reaguju sa ćelijama i ubijaju ćelije koje eksprimiraju polipeptid koji sadrži prirodnu aminokiselinsku sekvencu srodnog peptida kako je definisan u aspektima pronalaska. Kako se može izvesti iz naučne literature (Godkin A, et al. Use of eluted peptide sequence data to identify the binding characteristics of peptides to the insulin-dependent diabetes susceptibility allele HLA-DQ8 (DQ 3.2). Int Immunol. 1997 Jun;9(6):905-11) i baza podataka (Rammensee H. et al. SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs. Immunogenetics. 1999 Nov;50(3-4):213-9), određene pozicije peptida koji vezuju HLA su tipično sidreni ostaci koji obrazuju jezgrenu sekvencu koja se uklapa u vezujući motiv HLA receptora, koji je definisan polarnim, elektrofizičkim, hidrofobnim i prostornim svojstvima polipeptidnih lanaca koji čine udubljenje za vezivanje.
Oni aminokiselinski ostaci koji ne doprinose značajno interakcijama sa T-ćelijskim receptorom mogu da se modifikuju zamenom sa drugom aminokiselinom čija inkorporacija ne utiče značajno na T-ćelijsku reaktivnost i ne eliminiše vezivanje za relevantni MHC. Stoga, nezavisno od navedenog uslova, peptid pronalaska može biti bilo koji peptid (a pod ovim terminom pronalazači podrazumevaju i oligopeptid ili polipeptid), koji obuhvata aminokiselinske sekvence kako je naznačeno.
Takođe, mogu biti prikladni i duži peptidi. Takođe je moguće da se obradom peptida iz dužih peptida ili proteina koji sadrže sam epitop, stvore epitopi MHC klase I, mada su oni obično dužine između 8 i 11 aminokiselina. Poželjno je da ostaci koji su bočni na aktuelni epitop budu ostaci koji ne ometaju u značajnoj meri proteolitičko cepanje koje je neophodno da bi se aktuelni epitop eksponirao tokom obrade.
Naravno, peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom će imati sposobnost da se veže za molekul humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I. Vezivanje peptida ili varijante za MHC kompleks može da se testira pomoću metoda poznatih u predmetnoj oblasti.
U naročito preferiranom otelotvorenju pronalaska peptid se sastoji od aminokiselinske sekvence u skladu sa ID BR. SEKV: 266.
U jednom otelotvorenju predmetnog pronalaska, peptid je fuzioni protein koji sadrži 80 N-terminalnih aminokiselina HLA-DR antigen-asociranog nepromenljivog lanca (p33, u nastavku koji je dobijen od američkog Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (NCBI), GenBank pristupni broj X00497. U drugim fuzijama, peptidi predmetnog pronalaska mogu biti fuzirani na antitelo kako je opisano u ovom dokumentu, ili na njegov funkcionalni deo, naročito u sekvencu antitela, tako da budu specifično ciljani od strane navedenog antitela, ili, na primer, na ili u antitelo koje je specifično za dendritične ćelije.
Pored toga, peptid može biti dalje modifikovan da bi se poboljšala stabilnost i/ili vezivanje za MHC molekule kako bi se izazvao jači imunski odgovor. Metodi za takvu optimizaciju peptidne sekvence su dobro poznati u predmetnoj oblasti i uključuju, na primer, uvođenje reverznih peptidnih veza ili nepeptidnih veza.
U reverznoj peptidnoj vezi, aminokiselinski ostaci nisu povezani peptidnim (-CO-NH-) vezama već je peptidna veza obrnuta. Takvi retro-inverzni peptidomimetici mogu biti napravljeni pomoću metoda poznatih u predmetnoj oblasti, na primer poput onih opisanih u radu Meziere et al (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237. Ovaj pristup obuhvata pravljenje pseudopeptida koji sadrže izmene koje uključuju kostur, a ne orijentaciju bočnih lanaca. Meziere i saradnici (1997) pokazuju da su ovi pseudopeptidi korisni za vezivanje MHC i T-pomoćničke ćelijske odgovore. Retro-inverzni peptidi, koji sadrže NH-CO veze umesto CO-NH peptidnih veza, mnogo su otporniji na proteolizu.
Nepeptidna veza je, na primer, -CH2-NH, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH-, -COCH2-, -CH(OH)CH2- i -CH2SO-. Patent registrovan u Sjedinjenim Američkim Državama pod brojem 4,897,445 obezbeđuje metod za sintezu nepeptidnih veza (-CH2-NH) u solidnoj fazi u polipeptidnim lancima koji uključuje polipeptide sintetisane pomoću standardnih postupaka i nepeptidnu vezu sintetisanu reakcijom amino-aldehida i aminokiseline u prisustvu NaCNBH3.
Peptidi koji sadrže sekvence opisane ranije mogu biti sintetisani tako da na svojim amino i/ili karboksi krajevima sadrže dodatne hemijske grupe, kako bi se pojačala stabilnost, bioraspoloživost i/ili afinitet peptida. Na primer, na amino krajevima peptida mogu da se dodaju hidrofobne grupe kao što su karbobenzoksil, dansil ili t-butiloksikarbonil grupa. Isto tako, na amino krajeve peptida mogu biti postavljene acetilna grupa ili 9-fluorenilmetoksi-karbonilna grupa. Pored toga, na karboksi krajeve peptida mogu da se dodaju hidrofobna grupa, tbutiloksikarbonil, ili amido grupa.
Slično tome, peptid pronalaska može da se modifikuje hemijski, reakcijom sa specifičnim aminokiselinama bilo pre ili nakon sinteze peptida. Primeri za takve modifikacije dobro su poznati u predmetnoj oblasti i sažeto predstavljeni, na primer, u radu R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3. izdanje, CRC Press, 2005. Hemijska modifikacija aminokiselina uključuje, ali nije i ograničeno na, modifikaciju pomoću acilacije, amidacije, piridoksilacije lizina, redukcione alkilacije, trinitrobenzilacije amino grupa sa 2,4,6-trinitrobenzen sulfonskom kiselinom (TNBS), amidne modifikacije karboksil grupa i sulfidrilne modifikacije vršenjem kisele oksidacije cisteina do cisteinske kiseline, obrazovanja živinih derivata, obrazovanja mešovitih disulfida sa drugim tiolnim jedinjenjima, reakcije sa maleimidom, karboksimetilacije sa jodosirćetnom kiselinom ili jodoacetamidom i karbamilacije sa cijanatom u alkalnoj pH sredini, iako bez ograničenja na ovde navedeno. U ovom pogledu, osoba stručna u predmetnoj oblasti se upućuje na poglavlje 15 Trenutno važećih protokola u nauci o proteinima, izdanja Coligan et al. (John Wiley and Sons NY 1995-2000) za opsežniju metodologiju u vezi sa hemijskim modifikacijama proteina.
Ukratko, modifikacija, na primer, arginilskih ostataka u proteinima često se bazira na reakciji vicinalnih dikarbonilnih jedinjenja kao što su fenilglioksal, 2,3-butandion i 1,2-cikloheksandion kako bi se obrazovao adukt. Drugi primer je reakcija metilglioksala sa argininskim ostacima. Cistein može da se modifikuje bez istovremene modifikacije drugih nukleofilnih mesta kao što su lizin i histidin. Kao rezultat, dostupan je veliki broj reagenasa za modifikaciju cisteina. Veb stranice kompanija kao što je Sigma-Aldrich (http://www.sigma-aldrich.com) pružaju informacije o specifičnim reagensima.
Selektivna redukcija disulfidnih veza u proteinima je takođe uobičajena. Disulfidne veze mogu da se formiraju i oksidiraju u toku tretiranja biofarmaceutika toplotom.
Woodward-ov reagens K može da se koristi za modifikaciju specifičnih ostataka glutaminske kiseline. N-(3-(dimetilamino)propil)-N’-etilkarbodiimid može da se koristi za obrazovanje intramolekularnih unakrsnih veza između lizinskog ostatka i ostatka glutaminske kiseline.
Na primer, dietilpirokarbonat je reagens za modifikaciju histidilskih ostataka u proteinima. Histidin može takođe da se modifikuje pomoću 4-hidroksi-2-nonenala.
Reakcija lizinskih ostataka i drugih α-amino grupa je, na primer, korisna u vezivanju peptida za površine ili unakrsno povezivanje proteina/peptida. Lizin je mesto vezivanja poli(etilen)glikola i glavno mesto modifikacije u glikozilaciji proteina.
Metioninski ostaci u proteinima mogu da se modifikuju pomoću npr. jodoacetamida, bromoetilamina i hloramina T.
Tetranitrometan i N-acetilimidazol mogu da se koriste za modifikaciju tirozilskih ostataka. Unakrsno povezivanje pomoću obrazovanja ditirozina može da se postigne vodonik peroksidom/jonima bakra.
U nedavnim studijama o modifikaciji triptofana korišćeni su N-bromosukcinimid, 2-hidroksi-5-nitrobenzil bromid ili 3-bromo-3-metil-2-(2-nitrofenilmerkapto)-3H-indol (BPNS-skatol).
Uspešna modifikacija terapeutskih proteina i peptida sa PEG je često udružena sa produžavanjem poluživota u cirkulaciji dok se unakrsno povezivanje proteina sa glutaraldehidom, polietilen glikol diakrilatom i formaldehidom koristi za pripremanje hidrogelova. Hemijska modifikacija alergena za imunoterapiju se često postiže karbamilacijom sa kalijum cijanatom.
Peptid naznačen time što je peptid modifikovan ili sadrži nepeptidne veze je poželjno otelotvorenje pronalaska. Uopšteno, peptidi (najmanje oni koji sadrže peptidne veze između aminokiselinskih ostataka) mogu da se sintetišu pomoću Fmoc-poliamid režima sinteze peptida u solidnoj fazi kako je izloženo u radu Lukas et al. (Solid-phase peptide synthesis under continuous-flow conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. May 1981; 78(5): 2791–2795) i referencama u istom. Privremenu zaštitu N-amino grupe obezbeđuje 9-fluorenilmetiloksikarbonil (Fmoc) grupa. Ponovljeno cepanje ove zaštitne grupe koja je veoma labilna u bazama vrši se pomoću 20% piperidina u N,N-dimetilformamidu. Funkcionalnosti bočnog lanca mogu da se zaštite u obliku njihovih butil etara (u slučaju serina, treonina i tirozina), butil estara (u slučaju glutaminske kiseline i asparaginske kiseline), butiloksikarbonil derivata (u slučaju lizina i histidina), tritil derivata (u slučaju cisteina) i 4-metoksi-2,3,6-trimetilbenzensulfonil derivata (u slučaju arginina). Kada su glutamin ili asparagin C-terminalni ostaci, za zaštitu amido funkcionalnosti bočnog lanca koristi se 4,4'-dimetoksibenzhidril grupa. Potpora solidne faze zasniva se na polidimetil-akrilamid polimeru koji se sastoji od tri monomera dimetilakrilamida (monomer kostura), bisakriloiletilen diamina (unakrsni povezivač) i akriloilsarkozin metil estra (agens za funkcionalizaciju). Peptid-smola odvojivi vezani agens koji se koristi je derivat 4-hidroksimetil-fenoksisirćetne kiseline koji je labilan u kiselinama. Svi derivati aminokiselina se dodaju u obliku njihovih preformiranih simetričnih anhidridnih derivata sa izuzetkom asparagina i glutamina, koji se dodaju pomoću procedure reverznog spajanja posredovane N, N-dicikloheksil-karbodiimid/hidroksibenzotriazolom. Sve reakcije spajanja i deprotekcije se prate pomoću ninhidrin, trinitrobenzen sulfonska kiselina ili izotin test procedura. Nakon završetka sinteze, peptidi se odvajaju od potpore od smole sa istovremenim uklanjanjem zaštitnih grupa bočnog lanca tretiranjem sa 95% trifluorosirćetnom kiselinom koja sadrži 50% smešu čistača. Čistači koji se uobičajeno koriste obuhvataju etanditiol, fenol, anizol i vodu, pri čemu tačan izbor zavisi od konstituentnih aminokiselina peptida koji se sintetizuje. Takođe je moguća kombinacija metodologija za solidnu fazu i fazu rastvora za sintezu peptida (pogledajte, na primer, rad Bruckdorfer T, et al. From production of peptides in milligram amounts for research to multi-tons quantities for drugs of the future. Curr Pharm Biotechnol. 2004 Feb;5(1):29-43. Pregled, i reference koje su tamo citirane).
Trifluorosirćetna kiselina se uklanja evaporacijom in vacuo, sa naknadnom trituracijom sa dietil etrom što obezbeđuje sirovi peptid. Svi prisutni čistači se uklanjaju jednostavnim postupkom ekstrakcije koji po liofilizaciji vodene faze obezbeđuje sirovi peptid bez čistača. Reagensi za sintezu peptida su generalno dostupni kod npr. kompanije Calbiochem-Novabiochem (UK) Ltd, Nottingham NG7 2QJ, UK.
Prečišćavanje može da se vrši pomoću bilo koje tehnike, ili kombinacije tehnika kao što su rekristalizacija, ekskluziona hromatografija, jonoizmenjivačka hromatografija, hidrofobna hromatografija i (obično) reverzno-fazna tečna hromatografija visokih performansi upotrebom npr. acetonitril/voda gradijenta separacije.
Analiza peptida može da se sprovede upotrebom hromatografije na tankom sloju, elektroforeze, konkretno kapilarne elektroforeze, ekstrakcije iz čvrste faze (CSPE), reverzno-fazne tečne hromatografije visokih performansi, analizom aminokiselina nakon kisele hidrolize i pomoću maseno spektrometrijske analize korišćenjem bombardovanja brzim atomima (FAB), kao i MALDI i ESI-Q-TOF maseno spektrometrijske analize.
Dalji aspekt pronalaska obezbeđuje nukleinsku kiselinu (na primer polinukleotid) koja kodira peptid pronalaska. Polinukleotid može biti, na primer, DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihove kombinacije, bilo jedno- i/ili dvolančana, ili nativni ili stabilizovani oblici polinukleotida, kao što su, na primer, polinukleotidi sa fosforotioatnim kosturom i oni mogu i ne moraju sadržati introne sve dok kodiraju peptid. Naravno, polinukleotid može da kodira isključivo peptide koji sadrže prirodno postojeće aminokiselinske ostatke spojene prirodnim peptidnim vezama. Još jedan aspekt pronalaska obezbeđuje vektor ekspresije koji eksprimira polipeptid u skladu sa pronalaskom.
Razvijeni su raznovrsni metodi za povezivanje polinukleotida, naročito DNK, sa vektorima, na primer, preko komplementarno kohezivnih terminusa. Na primer, komplementarni homopolimerni traktovi mogu da se dodaju na DNK segment koji se umeće u vektorsku DNK. Vektor i DNK segment se zatim spajaju vodoničnom vezom između komplementarnih homopolimernih repova kako bi se obrazovali molekuli rekombinantne DNK.
Sintetički povezivači koji sadrže jedno ili više restrikcionih mesta obezbeđuju alternativni metod za spajanje DNK segmenta sa vektorima. Sintetički povezivači koji sadrže raznovrsna restrikciona endonukleazna mesta komercijalno su dostupni iz velikog broja izvora, uključujući International Biotechnologies Inc., New Haven, CN, SAD.
Poželjan metod modifikovanja DNK koja kodira polipeptid pronalaska koristi lančanu reakciju polimeraze koja je izneta od strane Saiki RK, et al. (Diagnosis of sickle cell anemia and betathalassemia with enzymatically amplified DNA and nonradioactive allele-specific oligonucleotide probes. N Engl J Med. 1988 Sep 1;319(9):537-41). Ovaj metod može da se koristi za uvođenje DNK u pogodan vektor, na primer, ugradnjom u prikladna restrikciona mesta, ili se može koristiti za modifikaciju DNK na druge korisne načine koji su poznati u predmetnoj oblasti. Ako se koriste virusni vektori, poželjni su poks- ili adenovirus vektori.
DNK (ili u slučaju retrovirusnih vektora, RNK) može zatim da se eksprimira u prikladnom domaćinu kako bi proizvodio polipeptid koji sadrži peptid ili varijantu pronalaska. Tako, DNK koja kodira peptid pronalaska može da se koristi u skladu sa poznatim tehnikama, odgovarajuće modifikovanih u smislu ovde sadržanih učenja, da se konstruiše vektor ekspresije, koji se zatim koristi da se odgovarajuća ćelija domaćin transformiše za ekspresiju i proizvodnju polipeptida pronalaska. Takve tehnike uključuju one izložene u patentima registrovanim u SAD pod br.
4,440,859, 4,530,901, 4,582,800, 4,677,063, 4,678,751, 4,704,362, 4,710,463, 4,757,006, 4,766,075 i 4,810,648.
DNK (ili u slučaju retrovirusnih vektora, RNK) koja kodira polipeptid koji sačinjava jedinjenje pronalaska može da se spoji sa širokim spektrom drugih DNK sekvenci za uvođenje u odgovarajućeg domaćina. Pridružena DNK će zavisiti od prirode domaćina, načina uvođenja DNK u domaćina, i od toga da li se želi epizomalno održavanje ili integracija.
Uopšteno, DNK se umeće u vektor ekspresije, kao što je plazmid, u pravilnoj orijentaciji i pravom okviru čitanja za ekspresiju. Ako je neophodno, DNK može da se poveže sa odgovarajućim regulatornim kontrolnim nukleotidnim sekvencama za transkripciju i translaciju koje prepoznaje željeni domaćin, iako su takve kontrole generalno dostupne u vektoru ekspresije. Vektor se zatim standardnim tehnikama uvodi u domaćina. Uopšteno, vektor neće transformisati sve domaćine. Zato će biti neophodno da se izaberu transformisane ćelije domaćini. Jedna tehnika selekcije obuhvata inkorporiranje DNK sekvence u vektor ekspresije, sa svim neophodnim kontrolnim elementima, koja kodira osobinu po izboru u transformisanoj ćeliji, kao što je otpornost na antibiotike.
Alternativno, gen za takvu osobinu po izboru može biti na drugom vektoru, koji se koristi za kotransformaciju željene ćelije domaćina.
Ćelije domaćini koje su transformisane pomoću rekombinantne DNK pronalaska se zatim kultiviraju dovoljno dugo i u odgovarajućim uslovima koji su poznati osobama stručnim u predmetnoj oblasti, uzimajući u obzir učenja izneta u ovom dokumentu, kako bi se omogućila ekspresija polipeptida, koji nakon toga može da se prikupi.
Poznati su mnogi sistemi za ekspresiju, uključujući bakterije (na primer E. coli i Bacillus subtilis), kvasnice (na primer Saccharomyces cerevisiae), filamentozne gljivice (na primer Aspergillus spec.), biljne ćelije, životinjske ćelije i ćelije insekata. Poželjno, sistem mogu biti ćelije sisara kao što su CHO ćelije dostupne iz ATCC kolekcije biologije ćelija.
Tipični plazmidni vektor ćelije sisara za konstitutivnu ekspresiju sadrži CMV ili SV40 promoter sa prikladnim poli A repom i markerom rezistencije, kao što je neomicin. Jedan primer je pSVL koji je dostupan kod kompanije Pharmacia, Piscataway, NJ, SAD. Primer inducibilnog sisarskog vektora ekspresije je pMSG, koji je takođe dostupan kod kompanije Pharmacia. Korisni kvasnički plazmidni vektori su pRS403-406 i pRS413-416 koji su generalno dostupni kod kompanije Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, SAD. Plazmidi pRS403, pRS404, pRS405 i pRS406 su integrišući plazmidi kvasnice (YIps) i inkorporiraju selektivne markere kvasnica HIS3, TRP1, LEU2 i URA3. Plazmidi pRS413-416 su centromerni plazmidi kvasnice (Ycps). Vektori zasnovani na CMV promoteru (na primer, kompanije Sigma-Aldrich) obezbeđuju prolaznu ili stabilnu ekspresiju, citoplazmatsku ekspresiju ili sekreciju, i N-terminalno ili C-terminalno označavanje u različitim kombinacijama FLAG, 3xFLAG, c-myc ili MAT. Ovi fuzioni proteini omogućavaju detekciju, prečišćavanje i analizu rekombinantnog proteina. Dvostruko označene fuzije obezbeđuju fleksibilnost prilikom detekcije.
Snažni regulatorni region, humani citomegalovirus (CMV) promoter dovodi nivoe ekspresije konstitutivnog proteina čak i do 1 mg/l u COS ćelijama. Za manje potentne ćelijske linije, nivoi proteina su tipično ~0,1 mg/l. Prisustvo izvora SV40 replikacije će rezultovati visokim nivoima DNK replikacije u COS ćelijama koje dozvoljavaju replikaciju SV40. CMV vektori, na primer, mogu sadržati izvor pMB1 (derivat pBR322) za replikaciju u bakterijskim ćelijama, gen za blaktamazu za izbor rezistencije na ampicilin u bakterijama, hGH poliA i izvor f1. Vektori koji sadrže preprotripsin (PPT) vodeću sekvencu mogu usmeriti sekreciju FLAG fuzionih proteina u medijum za kultivaciju za prečišćavanje pomoću ANTI-FLAG antitela, smola i pločica. Drugi vektori i sistemi za ekspresiju su dobro poznati u predmetnoj oblasti za upotrebu sa raznim ćelijama domaćinima.
U drugom otelotvorenju dva ili više peptida pronalaska su kodirani i samim tim eksprimirani po sukcesivnom redosledu (slično konstruktima „brojanica“). Pritom, peptidi ili varijante peptida mogu biti povezani ili spojeni zajedno pomoću regija povezujućih aminokiselina, kao što je na primer LLLLLL, ili mogu biti povezani bez bilo kakvih dodatnih peptida između njih.
Predmetni pronalazak se takođe odnosi na ćeliju domaćina koja je transformisana sa konstruktom vektora polinukleotida predmetnog pronalaska. Ćelija domaćin može biti prokariotska ili eukariotska. Bakterijske ćelije mogu biti preferirane prokariotske ćelije domaćini u nekim okolnostima i tipično su soj E. coli kao što su, na primer, sojevi E. coli DH5 dostupan kod kompanije Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, SAD, i RR1 dostupan kod organizacije American Type Culture Collection (ATCC) iz mesta Rockville, MD, SAD (Br. ATCC 31343). Preferirane eukariotske ćelije domaćini obuhvataju kvasnice, ćelije insekata i sisara, poželjno ćelije kičmenjaka kao što su ćelije miševa, pacova, majmuna ili humane fibroblastne ćelijske linije i ćelijske linije kolona. Ćelije domaćini kvasnica uključuju YPH499, YPH500 i YPH501, koje su generalno dostupne kod kompanije Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, SAD. Preferirane ćelije domaćini sisara uključuju ovarijalne ćelije kineskog hrčka (CHO) dostupne kod organizacije ATCC kao CCL61, NIH embrionske ćelije švajcarskog miša NIH/3T3 dostupne kod organizacije ATCC kao CRL 1658, COS-1 ćelije dobijene iz bubrega majmuna dostupne kod organizacije ATCC kao CRL 1650 i 293 ćelije koje su humane embrionske ćelije bubrega. Preferirane ćelije insekata su Sf9 ćelije koje mogu da se transfektuju sa bakulovirusnim vektorima ekspresije. Kratak pregled izbora pogodnih ćelija domaćina za ekspresiju može se naći u, na primer, udžbeniku autora Paulina Balbás i Argelia Lorence „Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols“, deo jedan, drugo izdanje, ISBN 978-1-58829-262-9, i drugoj literaturi poznatoj stručnoj osobi.
Transformacija odgovarajućih ćelija domaćina sa DNK konstruktom predmetnog pronalaska postiže se dobro poznatim metodama koje tipično zavise od vrste korišćenog vektora. U pogledu transformacije prokariotskih ćelija domaćina, pogledajte, na primer, Cohen et al (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110, i Sambrook et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. Transformacija ćelija kvasnica opisana je u radu Sherman et al. (1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY. Metod koji je izložio Beggs (1978) Nature 275,104-109 takođe je koristan. U pogledu ćelija kičmenjaka, reagensi koji su korisni za transfekciju takvih ćelija, na primer kalcijum fosfat i DEAE-dekstran ili formulacije lipozoma, dostupni su kod kompanije Stratagene Cloning Systems, ili Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, SAD. Elektroporacija je takođe korisna za transformaciju i/ili transfekciju ćelija i dobro je poznata u predmetnoj oblasti za transformaciju ćelija kvasnica, bakterijskih ćelija, ćelija insekata i ćelija kičmenjaka.
Uspešno transformirane ćelije, tj. ćelije koje sadrže DNK konstrukt predmetnog pronalaska, mogu da se identifikuju pomoću dobro poznatih tehnika kao što je PCR. Alternativno, prisustvo proteina u supernatantu može da se detektuje pomoću antitela.
Podrazumeva se da su određene ćelije domaćini pronalaska korisne za pripremanje peptida pronalaska, na primer, bakterijske, ćelije kvasnica i insekata. Međutim, u određenim terapeutskim metodama mogu biti korisne druge ćelije domaćini. Na primer, antigenprezentujuće ćelije, kao što su dendritične ćelije, mogu korisno da se upotrebe za ekspresiju peptida pronalaska tako da oni mogu da se ubace u odgovarajuće MHC molekule. Tako, prikazani pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina koja se sastoji od nukleinske kiseline ili vektora ekspresije u skladu sa pronalaskom.
U jednom poželjnom otelotvorenju ćelija domaćin je antigen-prezentujuća ćelija, konkretno dendritična ćelija ili antigen-prezentujuća ćelija. APĆ u koje je postavljen rekombinantni fuzioni protein koje sadrže prostatičnu kiselu fosfatazu (PAP) odobrene su od strane Američke uprave za hranu i lekove (FDA) 29. aprila 2010. godine za lečenje asimptomatskog ili minimalno simptomatskog metastatskog karcinoma prostate refraktornog na hormone – HRPC (Sipuleucel-T) (Small EJ, et al. Placebo-controlled phase III trial of immunologic therapy with sipuleucel-T (APC8015) in patients with metastatic, asymptomatic hormone refractory prostate cancer. J Clin Oncol.2006 Jul 1;24(19):3089-94. Rini et al. Combination immunotherapy with prostatic acid phosphatase pulsed antigen-presenting cells (provenge) plus bevacizumab in patients with serologic progression of prostate cancer after definitive local therapy. Cancer.
2006 Jul 1;107(1):67-74).
Dalji aspekt pronalaska zatim obezbeđuje metod za proizvodnju peptida, pri čemu metod obuhvata kultivisanje ćelije domaćina i izolaciju peptida iz ćelije domaćina ili njegovog medijuma za kultivaciju.
U drugom otelotvorenju, peptid, nukleinska kiselina ili vektor ekspresije pronalaska koriste se u medicini. Na primer, peptid može biti pripremljen za intravensku (i.v.) injekciju, potkožnu (s.c.) injekciju, intradermalnu (i.d.) injekciju, intraperitonealnu (i.p.) injekciju, intramuskularnu (i.m.) injekciju. Poželjni načini primene injekcije peptida obuhvataju s.c., i.d., i.p., i.m. i i.v. Poželjni načini primene injekcije DNK obuhvataju i.d., i.m., s.c., i.p. i i.v. Mogu se dati doze od npr. između 50 µg i 1,5 mg, poželjno 125 µg do 500 µg, peptida ili DNK i one će zavisiti od datog peptida ili DNK. Doze u ovom opsegu su uspešno korišćene u ranijim ispitivanjima (Walter et al., Nature Medicine 18, 1254–1261 (2012)).
Drugi aspekt predmetnog pronalaska uključuje in vitro metod za proizvodnju aktiviranih T ćelija, pri čemu se metod sastoji od dovođenja u kontakt in vitro T ćelija sa humanim MHC molekulima sa ubačenim antigenom eksprimiranim na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije u toku vremenskog perioda koji je dovoljan da se navedena T ćelija aktivira na antigenspecifičan način, naznačeno time što je antigen peptid u skladu sa pronalaskom. Poželjno, sa antigen-prezentujućom ćelijom se koristi dovoljna količina antigena.
Poželjno, ćelija sisara ne poseduje ili ima smanjen nivo ili funkciju TAP peptidnog transportera. Pogodne ćelije kojima nedostaje TAP peptidni transporter obuhvataju T2, RMA-S i ćelije vinske mušice. TAP je transporter koji je u vezi sa obradom antigena.
Ćelijska linija T2 koja je deficijentna za ubacivanje humanih peptida dostupna je kod organizacije American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, SAD pod kataloškim brojem CRL 1992; ćelijska linija vinske mušice Schneider 2 dostupna je kod organizacije ATCC pod kataloškim brojem CRL 19863; mišja RMA-S ćelijska linija opisana je u radu Karre et al 1985 (Ljunggren, H.-G., and K. Karre.1985. J. Exp. Med.
162:1745).
Poželjno, ćelija domaćin pre transfekcije značajno ne eksprimira MHC molekule klase I. Takođe je poželjno da stimulatorna ćelija eksprimira molekul koji je važan za obezbeđivanje ko-stimulatornog signala za T ćelije, kao što su bilo koji od B7.1, B7.2, ICAM-1 i LFA 3. Sekvence nukleinskih kiselina brojnih MHC molekula klase I i ko-stimulatornih molekula javno su dostupne iz GenBank i EMBL baza podataka.
U slučaju epitopa MHC klase I koji se koristi kao antigen, T ćelije su CD8-pozitivni CTL.
Ako se antigen-prezentujuća ćelija transficira da eksprimira takav epitop, ćelija se poželjno sastoji od vektora ekspresije koji eksprimira peptid koji sadrži ID BR. SEKV: 266.
Brojne druge metode mogu da se koriste za generisanje CTL in vitro. Na primer, za generisanje CTL mogu da se koriste autologni tumor-infiltrišući limfociti. Plebanski i saradnici (1995) (Induction of peptide-specific primary cytotoxic T lymphocyte responses from human peripheral blood. Eur J Immunol. 1995 Jun;25(6):1783-7) upotrebljavaju autologne limfocite iz periferne krvi (PLB) za pripremanje CTL. Pored toga, moguća je proizvodnja autolognih CTL pulsiranjem dendritičnih ćelija sa peptidom ili polipeptidom, ili putem infekcije sa rekombinantnim virusom. Takođe, za proizvodnju autolognih CTL mogu da se koriste B ćelije. Pored toga, makrofagi pulsirani sa peptidom ili polipeptidom, ili inficirani sa rekombinantnim virusom, mogu da se koriste za pripremu autolognih CTL. S. Walter i saradnici 2003 (Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres. J Immunol. 2003 Nov 15;171(10):4974-8) opisuju in vitro prajming T ćelija upotrebom veštačkih antigen-prezentujućih ćelija (aAPĆ), što je takođe prikladan način za generisanje T ćelija protiv peptida izbora. U predmetnom pronalasku, aAPĆ su generisane spajanjem preformiranih kompleksa MHC:peptid za površinu polistirenskih čestica (mikroperle) pomoću biohemije biotin:streptavidin. Ovaj sistem dozvoljava egzaktnu kontrolu gustine MHC na aAPĆ, što omogućava da se selektivno izazovu visoko- ili nisko-aviditetni antigen-specifični T-ćelijski odgovori sa visokom efikasnošću iz uzoraka krvi. Pored ovih kompleksa MHC:peptid, aAPĆ bi trebalo da nose druge proteine sa ko-stimulatornom aktivnošću poput anti-CD28 antitela spojenih za njihovu površinu. Osim toga takvi sistemi zasnovani na aAPĆ često iziskuju dodavanje odgovarajućih solubilnih faktora, npr. citokina, kao što je interleukin-12.
Alogene ćelije mogu takođe da se koriste u pripremanju T ćelija a metod je detaljno opisan u patentu WO 97/26328. Na primer, pored ćelija vinske mušice i T2 ćelija, mogu da se koriste druge ćelije za prezentovanje antigena kao što su CHO ćelije, ćelije insekata inficirane bakulovirusom, bakterije, kvasnice, ciljne ćelije inficirane vakcinijom. Pored toga mogu da se koriste i virusi biljaka (pogledajte, na primer, Porta et al (1994) Development of cowpea mosaic virus as a high-yielding system for the presentation of foreign peptides. Virology. 1994 Aug 1;202(2):949-55) koji opisuje razvoj mozaičkog virusa crnog pasulja kao sistem sa visokim prinosom za prezentaciju stranih peptida.
Aktivirane T ćelije koje su usmerene protiv peptida pronalaska korisne su u terapiji. Tako, dalji aspekt pronalaska obezbeđuje aktivirane T ćelije koje se mogu dobiti prethodno navedenim metodima pronalaska.
Aktivirane T ćelije, koje su proizvedene pomoću gore navedenog metoda, će selektivno prepoznati ćeliju koja aberantno eksprimira polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa ID BR. SEKV: 266.
Poželjno, T ćelija prepoznaje ćeliju pomoću interakcije kroz njen TCR sa kompleksom HLA/peptid (na primer, vezivanje). T ćelije su korisne u metodu ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu pronalaska, naznačeno time što se pacijentu daje efikasan broj aktiviranih T ćelija. T ćelije koje se daju pacijentu mogu biti dobijene od pacijenta i aktivirane na način opisan ranije (tj. one su autologne T ćelije). Alternativno, T ćelije nisu od dotičnog pacijenta već od druge osobe. Naravno da je poželjno da osoba bude zdrava osoba. Pod „zdravom osobom“ pronalazači podrazumevaju da osoba bude uopšteno dobrog zdravlja, poželjno da ima kompetentan imunski sistem i, još poželjnije, da ne boluje ni od jedne bolesti za koju se mogu izvršiti testovi i koja se može detektovati.
In vivo, ciljne ćelije za CD8-pozitivne T ćelije u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu biti ćelije tumora (koje ponekad eksprimiraju MHC klase II) i/ili ćelije strome koje okružuju tumor (tumorske ćelije) (koje ponekad takođe eksprimiraju MHC klase II; (Dengjel et al., 2006)).
T ćelije predmetnog pronalaska mogu da se koriste kao aktivni sastojci terapeutske smeše. Na taj način, pronalazak takođe obezbeđuje metod ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu pronalaska, pri čemu metod obuhvata davanje efikasnog broja T ćelija pacijentu kako je definisano ranije.
Pod pojmom „aberantno eksprimiran“ pronalazači takođe podrazumevaju da je polipeptid prekomerno eksprimiran u poređenju sa normalnim nivoima ekspresije ili da je gen neaktivan u tkivu iz kojeg je tumor nastao ali da je eksprimiran u tumoru. Pod pojmom „prekomerno eksprimiran“ pronalazači podrazumevaju da je polipeptid prisutan u nivou koji je najmanje 1,2 puta veći od nivoa prisutnog u normalnom tkivu; poželjno je najmanje 2 puta veći, a još poželjnije najmanje 5 puta ili 10 puta veći od nivoa prisutnog u normalnom tkivu.
T ćelije mogu da se dobiju pomoću metoda poznatih u predmetnoj oblasti, npr. ranije opisanih.
Protokoli za ovaj takozvani adoptivni transfer T ćelija dobro su poznati u predmetnoj oblasti. Pregledi se mogu naći u: Gattinoni L, et al. Adoptive immunotherapy for cancer: building on success. Nat Rev Immunol. 2006 May;6(5):383-93. Pregled, i Morgan RA, et al. Cancer regression in patients after transfer of genetically engineered lymphocytes. Science. 2006 Oct 6;314(5796):126-9).
Svaki molekul pronalaska, tj. peptid, nukleinska kiselina, antitelo, vektor ekspresije, ćelija, aktivirani CTL, T-ćelijski receptor ili nukleinska kiselina koja ga kodira koristan je za lečenje poremećaja, koji karakterišu ćelije koje izbegavaju imunski odgovor. Zato svaki molekul predmetnog pronalaska može da se koristi kao lek ili u proizvodnji leka. Molekul može da se koristi samostalno ili u kombinaciji sa drugim molekulom(ima) pronalaska ili poznatim molekulom(ima).
Poželjno, lek predmetnog pronalaska je vakcina. Ona se može dati direktno pacijentu, primeniti u zahvaćeni organ ili sistemski i.d., i.m., s.c., i.p. i i.v., ili primeniti ex vivo u ćelije dobijene od pacijenta ili humane ćelijske linije koje se nakon toga daju pacijentu, ili koristiti in vitro za odabir potpopulacije imunskih ćelija dobijenih od pacijenta, koje se zatim ponovo daju pacijentu. Ako se nukleinska kiselina primenjuje u ćelije in vitro, može biti od koristi da ćelije budu transfektovane tako da ko-eksprimiraju imunostimulišuće citokine, kao što je interleukin-2. Peptid može biti značajno prečišćen, ili kombinovan sa imunostimulišućim adjuvansom (pogledajte u nastavku), ili da se koristi u kombinaciji sa imunostimulatornim citokinima, ili da se primenjuje sa pogodnim dostavnim sistemom, kao na primer lipozomima. Peptid može takođe da bude konjugovan sa prikladnim nosačem kao što je hemocijanin iz puža Megathura crenulata (keyhole limpet haemocyanin – KLH) ili manan (pogledajte WO 95/18145 i Longenecker, 1993). Peptid takođe može biti obeležen, može biti fuzioni protein, ili može biti hibridni molekul. Od peptida čija je sekvenca data u predmetnom pronalasku se očekuje da stimulišu CD4 ili CD8 T ćelije. Ipak, stimulacija CD8 CTL je efikasnija u prisustvu pomoći koju pružaju CD4 T-pomoćničke ćelije. Tako, za epitope MHC klase I koji stimulišu CD8 CTL, fuzioni partner ili delovi hibridnog molekula prikladno obezbeđuju epitope koji stimulišu CD4-pozitivne T ćelije. CD4- i CD8-stimulišući epitopi su dobro poznati u predmetnoj oblasti i uključuju one identifikovane u predmetnom pronalasku.
U jednom aspektu, vakcina sadrži najmanje jedan peptid koji ima aminokiselinsku sekvencu navedenu u ID BR. SEKV: 266 i najmanje jedan dodatni peptid, poželjno dva do 50, poželjnije dva do 25, još poželjnije dva do 20 i najpoželjnije dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest, četrnaest, petnaest, šesnaest, sedamnaest ili osamnaest peptida. Peptid(i) može biti dobijen od jednog ili više specifičnih TAA i može se vezivati za MHC molekule klase I.
U drugom aspektu, vakcina sadrži najmanje jedan peptid koji ima aminokiselinsku sekvencu navedenu u ID BR. SEKV: 266 i najmanje jedan dodatni peptid, poželjno dva do 50, poželjnije dva do 25, još poželjnije dva do 20 i najpoželjnije dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest, četrnaest, petnaest, šesnaest, sedamnaest ili osamnaest peptida. Peptid(i) može biti dobijen od jednog ili više specifičnih TAA i može se vezivati za MHC molekule klase I.
Polinukleotid može biti značajno prečišćen ili sadržan u pogodnom vektoru ili sistemu za dostavljanje. Nukleinska kiselina može biti DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihova kombinacija. Metodi za dizajniranje i uvođenje takve nukleinske kiseline su dobro poznati u predmetnoj oblasti. Kratak pregled je dat od strane npr. (Pascolo et al., 2005 Human peripheral blood mononuclear cells transfected with messenger RNA stimulate antigen-specific cytotoxic T-lymphocytes in vitro. Cell Mol Life Sci.2005 Aug;62(15):1755-62). Polinukleotidne vakcine se lako pripremaju, ali način delovanja ovih vektora u indukovanju imunskog odgovora nije u potpunosti jasan. Prikladni vektori i sistemi za dostavljanje uključuju virusnu DNK i/ili RNK, kao što su sistemi zasnovani na adenovirusu, virusu vakcinije, retrovirusima, herpes virusu, adeno-asociranom virusu ili hibridima koji sadrže elemente više od jednog virusa. Nevirusni sistemi za dostavljanje uključuju katjonske lipide i katjonske polimere i dobro su poznati u oblasti dostavljanja DNK. Fizičko dostavljanje, kao što je preko „genskog pištolja“, može takođe da se koristi. Peptid ili peptidi koje kodira nukleinska kiselina mogu biti fuzioni protein, na primer sa epitopom koji stimuliše T ćelije za dati suprotni CDR kako je navedeno ranije.
Medikament pronalaska može takođe da sadrži jedan ili više adjuvanasa. Adjuvansi su supstance koje nespecifično pojačavaju ili potenciraju imunski odgovor (npr. imunske odgovore posredovane CTL i pomoćničkim T (TH) ćelijama na antigen, i na taj način se smatraju korisnim u leku predmetnog pronalaska. Pogodni adjuvansi uključuju, ali nisu i ograničeni na, 1018 ISS, soli aluminijuma, AMPLIVAX<®>, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, flagelin ili TLR5 ligande dobijene od flagelina, FLT3 ligand, GM-CSF, IC30, IC31, imikvimod (ALDARA<®>), rezikvimod, ImuFact IMP321, interleukine poput IL-2, IL-13, IL-21, interferon-alfa ili -beta, ili njihove pegilovane derivate, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, ISCOMs, JuvImmune<®>, LipoVac, MALP2, MF59, monofosforil lipid A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, emulzije voda u ulju i ulje u vodi, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, OspA, PepTel® vektorski sistem, poli(laktid ko-glikolid) [PLG]-zasnovane i mikročestice dekstrana, talaktoferin, SRL172, virozome i druge virusu slične partikule, YF-17D, VEGF klopku, R848, beta-glukan, Pam3Cys, QS21 stimulon kompanije Aquila, koji je dobijen od saponina, mikobakterijske ekstrakte i sintetičke mimetike bakterijskog ćelijskog zida i druge zaštićene adjuvanse kao što su Ribi-jev Detox, Quil ili Superfos. Preferirani su adjuvansi kao što je Freund-ov ili GM-CSF. Nekoliko imunoloških adjuvanasa (npr. MF59) specifičnih za dendritične ćelije i njihova priprema opisani su ranije (Allison and Krummel, 1995 The Yin and Yang of T cell costimulation. Science. 1995 Nov 10;270(5238):932-3. Review). Takođe, mogu se koristiti citokini. Nekoliko citokina je direktno dovedeno u vezu sa uticajem na migraciju dendritičnih ćelija u limfna tkiva (npr. TNF-), ubrzavanjem sazrevanja dendritičnih ćelija u efikasne antigen-prezentujuće ćelije za T limfocite (npr. GM-CSF, IL-1 i IL-4) (patent registrovan u SAD pod brojem 5,849,589) i delovanjem kao imunoadjuvansi (npr. IL-12, IL-15, IL-23, IL-7, IFN-alfa, IFN-beta) (Gabrilovich, 1996 Production of vascular endothelial growth factor by human tumors inhibits the functional maturation of dendritic cells Nat Med.
1996 Oct;2(10):1096-103).
Takođe, objavljeno je da CpG imunostimulatorni oligonukleotidi poboljšavaju efekte adjuvanasa u sastavu vakcine. Bez ograničavanja postojećom teorijom, CpG oligonukleotidi deluju aktiviranjem urođenog (neadaptivnog) imunskog sistema preko Toll-like receptora (TLR), uglavnom TLR9. Aktivacija TLR9 pokrenuta CpG-om pojačava antigen-specifične humoralne i ćelijske odgovore na širok spektar antigena, uključujući peptidne ili proteinske antigene, žive ili mrtve viruse, vakcine dendritičnim ćelijama, autologne ćelijske vakcine i polisaharidne konjugate kako u profilaktičkim tako i terapijskim vakcinama. Što je važnije, on poboljšava sazrevanje i diferencijaciju dendritičnih ćelija, što dovodi do pojačane aktivacije TH1ćelija i snažnog stvaranja citotoksičnih T limfocita (CTL), čak i u odsustvu pomoći CD4 T ćelija. Predominacija TH1indukovana pomoću TLR9 stimulacije se održava čak i u prisustvu adjuvanasa u vakcini kao što je aluminijum ili nekompletni Freund-ov adjuvans (IFA) koji normalno promovišu predominaciju TH2. CpG oligonukleotidi pokazuju još veću adjuvansnu aktivnost kada se formulišu ili istovremeno primenjuju sa drugim adjuvansima ili u formulacijama kao što su mikročestice, nanočestice, lipidne emulzije ili slične formulacije, koje su naročito neophodne za indukovanje snažnog odgovora kada je antigen relativno slab. Oni takođe ubrzavaju imunski odgovor i omogućavaju da se doze antigena smanje za približno dva reda veličine, sa uporedivim odgovorima antitelima na punu dozu vakcine bez CpG u pojedinim eksperimentima (Krieg, 2006). Patent registrovan u SAD pod br. 6,406,705 B1 opisuje kombinovanu upotrebu CpG oligonukleotida, adjuvanasa u obliku nenukleinskih kiselina i antigena za indukovanje antigen-specifičnog imunskog odgovora. Antagonist CpG TLR9 je dSLIM (double Stem Loop Immunomodulator) kompanije Mologen (Berlin, Nemačka) koji je preferirana komponenta farmaceutske smeše predmetnog pronalaska. Takođe, mogu se koristiti i drugi molekuli koji vezuju TLR kao što su RNK koja vezuje TLR 7, TLR 8 i/ili TLR 9.
Drugi primeri korisnih adjuvanasa uključuju, ali nisu i ograničeni na, hemijski modifikovane CpG-jeve (npr. CpR, Idera), analoge dsRNK kao što su Poly(I:C) i njegovi derivati (npr. AmpliGen®, Hiltonol®, poli-(ICLC), poli(IC-R), poli(I:C12U), ne-CpG bakterijska DNK ili RNK kao i imunoaktivne male molekule i antitela poput ciklofosfamida, sunitiniba, Bevacizumab®-a, celebreksa, NCX-4016, sildenafila, tadalafila, vardenafila, sorafeniba, temozolomida, temsirolimusa, XL-999, CP-547632, pazopaniba, VEGF klopke, ZD2171, AZD2171, anti-CTLA4, druga antitela koja ciljaju ključne strukture imunskog sistema (npr. anti-CD40, anti-TGFbeta, anti-TNFalfa receptor) i SC58175, koji mogu delovati terapijski i/ili kao adjuvans. Količine i koncentracije adjuvanasa i aditiva korisnih u kontekstu predmetnog pronalaska, stručnjak iz ove oblasti može lako da utvrdi bez izvođenja suvišnih eksperimenata.
Poželjni adjuvansi su imikvimod, rezikvimod, GM-CSF, ciklofosfamid, sunitinib, bevacizumab, interferon-alfa, CpG oligonukleotidi i derivati, poli-(I:C) i derivati, RNK, sildenafil i formulacije čestica sa PLG ili virozomima.
U poželjnom otelotvorenju, farmaceutskoj smeši u skladu sa pronalaskom adjuvans je izabran iz grupe koja se sastoji od faktora stimulacije kolonija, kao što je faktor stimulacije granulocitno-makrofagne kolonije (GM-CSF, sargramostim), ciklofosfamida, imikvimoda, rezikvimoda i interferona alfa.
U poželjnom otelotvorenju, farmaceutskoj smeši u skladu sa pronalaskom adjuvans je izabran iz grupe koja se sastoji od faktora stimulacije kolonija, kao što je faktor stimulacije granulocitno-makrofagne kolonije (GM-CSF, sargramostim), ciklofosfamida, imikvimoda i rezikvimoda.
U poželjnom otelotvorenju farmaceutske smeše u skladu sa pronalaskom, adjuvans je ciklofosfamid, imikvimod ili rezikvimod.
Još poželjniji adjuvansi su Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, poli-ICLC (Hiltonol®) i anti-CD40 mAT ili njihove kombinacije.
Ova smeša se koristi za parenteralnu primenu, kao što je subkutana, intradermalna, intramuskularna ili oralnu primenu. Za navedeno, peptidi i opciono drugi molekuli se rastvaraju ili suspenduju u farmaceutski prihvatljivom, poželjno, vodenom nosaču. Pored toga, smeša može sadržati pomoćne materije, poput pufera, vezujućih agenasa, raspršivača, rastvarača, aroma, lubrikanata itd. Peptidi takođe mogu biti primenjeni zajedno sa imunostimulišućim supstancama kao što su citokini. Opsežna lista pomoćnih materija koje se mogu koristiti u navedenom sastavu može, na primer, biti preuzeta od A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3<rd>Ed., 2000, American Pharmaceutical Association and pharmaceutical press. Smeša se može koristiti za prevenciju, profilaksu i/ili terapiju adenomatoznih ili malignih oboljenja. Primerne formulacije se mogu naći u, na primer, patentu EP2113253.
Bez obzira na to, u zavisnosti od broja i fizičko-hemijskih karakteristika peptida pronalaska, potrebno je dalje istraživanje kako bi se obezbedile formulacije za specifične kombinacije peptida, posebno kombinacije sa više od 20 peptida koje su stabilne duže od 12 do 18 meseci.
Predmetni pronalazak obezbeđuje lek koji je koristan u lečenju raka, posebno AML, hronične limfocitne leukemije (HLL) i drugih hematoloških maligniteta.
Predstavljen je komplet koji se sastoji od:
(a) posude koja sadrži farmaceutsku smešu kako je opisana iznad, u obliku rastvora ili u liofiliziranom obliku;
(b) opciono druge posude koja sadrži rastvarač ili rastvor za rekonstituciju za liofiliziranu formulaciju; i
(c) opciono, uputstva za (i) upotrebu rastvora ili (ii) rekonstituciju i/ili upotrebu liofilizirane formulacije.
Komplet dalje može da se sastoji od jednog ili više od navedenih (iii) pufer, (iv) rastvarač, (v) filter, (vi) igla ili (v) brizgalica. Posuda je preferirano boca, bočica, brizgalica ili epruveta; i ona može biti višekratna posuda. Farmaceutska smeša je preferirano liofilizirana.
Predstavljeni kompleti se poželjno sastoje od liofilizirane formulacije predmetnog pronalaska u pogodnoj posudi i uputstava za njenu rekonstituciju i/ili upotrebu. Pogodne posude uključuju, na primer, boce, bočice (npr. bočice sa dve šupljine), brizgalice (kao što su brizgalice sa dve šupljine) i epruvete. Posuda može biti izrađena od različitih materijala kao što su staklo ili plastika. Poželjno, komplet i/ili posuda sadrži/e uputstva o ili u vezi sa posudom koja navode uputstva za rekonstituciju i/ili upotrebu. Na primer, na nalepnici može biti navedeno da liofilizirana formulacija treba da se rekonstituiše do koncentracija peptida kako je opisano ranije. Na nalepnici može dalje da bude naznačeno da je formulacija korisna ili namenjena za potkožnu primenu.
Posuda u kojoj se nalazi formulacija može da bude višekratna bočica, što omogućava ponavljane primene (npr. 2-6 primena) rekonstituisane formulacije. Komplet može dalje da sadrži i drugu posudu u kojoj se nalazi pogodni rastvarač (npr. rastvor natrijum bikarbonata).
Nakon mešanja rastvarača i liofilizirane formulacije, konačna koncentracija peptida u rekonstituisanoj formulaciji je poželjno najmanje 0,15 mg/ml/peptida (=75µg) a poželjno ne više od 3 mg/ml/peptida (=1500µg). Komplet može dalje da uključuje druge materijale poželjne sa komercijalne ili korisničke tačke gledišta, uključujući druge pufere, rastvarače, filtere, igle, brizgalice i uputstva za upotrebu uz pakovanje.
Predstavljeni kompleti mogu da imaju jednu posudu koja sadrži formulaciju farmaceutskih smeša u skladu sa predmetnim pronalaskom sa ili bez drugih komponenti (npr. druga jedinjenja ili farmaceutske smeše ovih drugih jedinjenja) ili mogu da imaju zasebnu posudu za svaku komponentu.
Poželjno, predstavljeni kompleti obuhvataju formulaciju pronalaska upakovanu za upotrebu u kombinaciji sa istovremenom primenom drugog jedinjenja (kao što su adjuvansi (npr. GM-CSF), hemioterapijski agens, prirodni proizvod, hormon ili antagonist, antiangiogeni agens ili inhibitor, agens koji indukuje apoptozu ili helirajući agens) ili njegove farmaceutske smeše.
Komponente kompleta mogu biti u vidu prethodno napravljenog kompleksa ili svaka komponenta može biti u odvojenoj zasebnoj posudi pre primene kod pacijenta. Komponente kompleta mogu biti obezbeđene u jednom ili više tečnih rastvora, poželjno, vodenom rastvoru, poželjnije sterilnom vodenom rastvoru. Komponente kompleta mogu takođe biti obezbeđene kao čvrste materije, koje se mogu pretvoriti u tečnosti dodavanjem pogodnih rastvarača, koji su preferirano obezbeđeni u drugoj zasebnoj posudi.
Posuda terapeutskog kompleta može biti bočica, epruveta, pljosnata boca, boca, brizgalica ili neka druga posuda za čuvanje čvrstih supstanci ili tečnosti. Obično, kada postoji više od jedne komponente, komplet će sadržati drugu bočicu ili drugu posudu, koja omogućava zasebno doziranje. Komplet takođe može sadržati drugu posudu za farmaceutski prihvatljivu tečnost. Poželjno, terapeutski komplet će sadržati pribor (npr. jednu ili više igala, brizgalice, kapaljke, pipete itd) koji omogućava primenu agenasa pronalaska koji su komponente prikazanog kompleta.
Prikazana formulacija je ona koja je pogodna za primenu peptida na bilo koji prihvatljiv način primene kao što je oralni (enteralni), nazalni, očni, supkutani, intradermalni, intramuskularni, intravenski ili transdermalni. Poželjno, primena je s.c., a najpoželjnije i.d. Primena može biti i pomoću infuzione pumpe.
Budući da su peptidi pronalaska izolovani iz tumorskog tkiva u vezi sa AML, lek pronalaska se poželjno koristi za lečenje AML.
U jednom aspektu, peptidi se biraju za uključivanje u vakcinu na osnovu njihove prikladnosti za pojedinačnog pacijenta na osnovu metoda kako je opisan i kako sledi.
HLA fenotip, transkriptomični i peptidomični podaci će biti prikupljeni iz tumorskog materijala pacijenta i uzoraka krvi kako bi se identifikovali najprikladniji peptidi za svakog pacijenta koji sadrže uskladištene (u bazi podataka) i jedinstvene za pacijenta (tj. mutirane) TUMAP. Biće izabrani oni peptidi koji su selektivno ili prekomerno eksprimirani u tumoru pacijenta i, gde je to moguće, koji su pokazali snažnu in vitro imunogenost ako su testirani sa individualnim PBMC pacijenta.
Poželjno, peptidi uključeni u vakcinu identifikovani su pomoću metoda koji se sastoji od: (a) identifikacije tumor-asociranih peptida (TUMAP) koje prezentuje uzorak tumora od pojedinačnog pacijenta; (b) upoređivanja peptida identifikovanih u tački (a) sa skladištem (bazom podataka) peptida kako je opisano ranije; i (c) biranja najmanje jednog peptida iz skladišta (baze podataka) koji korelira sa tumor-asociranim peptidom identifikovanim kod pacijenta. Na primer, TUMAP koje prezentuje uzorak tumora identifikuju se pomoću: (a1) upoređivanja podataka o ekspresiji iz uzorka tumora sa podacima o ekspresiji iz uzorka normalnog tkiva koje odgovara vrsti tkiva uzorka tumora kako bi se identifikovali proteini koji su prekomerno eksprimirani ili aberantno eksprimirani u uzorku tumora; i (a2) koreliranja podataka o ekspresiji sa sekvencama MHC liganada vezanih za MHC klasa I i/ili klasa II molekule u uzorku tumora kako bi se identifikovali MHC ligandi dobijeni iz proteina koje tumor prekomerno eksprimira ili aberantno eksprimira. Poželjno, sekvence MHC liganada se identifikuju eluiranjem vezanih peptida sa MHC molekula izolovanih iz uzorka tumora, i sekvenciranjem eluiranih liganada. Poželjno, uzorak tumora i normalno tkivo se dobijaju od istog pacijenta.
U dodatku, ili kao alternativa, biranju peptida pomoću modela skladišta, TUMAP mogu da se identifikuju kod pacijenta de novo a zatim da se uključe u vakcinu. Kao jedan primer, kandidati za TUMAP mogu da se identifikuju kod pacijenta pomoću (a1) upoređivanja podataka o ekspresiji iz uzorka tumora sa podacima o ekspresiji iz uzorka normalnog tkiva koje odgovara vrsti tkiva uzorka tumora kako bi se identifikovali proteini koji su prekomerno eksprimirani ili aberantno eksprimirani u uzorku tumora; i (a2) koreliranja podataka o ekspresiji sa sekvencama MHC liganada vezanih za MHC klasa I i/ili klasa II molekule u uzorku tumora kako bi se identifikovali MHC ligandi dobijeni iz proteina koje tumor prekomerno eksprimira ili aberantno eksprimira. Kao drugi primer, mogu biti identifikovani proteini koji sadrže mutacije koje su jedinstvene za uzorak tumora u odnosu na normalno istovetno tkivo od pojedinačnog pacijenta, te mogu biti identifikovani TUMAP koji specifično ciljaju mutaciju. Na primer, genom tumora i istovetnog normalnog tkiva može da se sekvencira pomoću sekvenciranja celog genoma: Za otkrivanje nesinonimnih mutacija u regionima gena koji kodiraju protein, iz tumorskih tkiva se ekstrahuju genomska DNK i RNK a normalna nemutirana genomska germinativna DNK se ekstrahuje iz mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC). Primenjeni NGS pristup ograničen je na resekvenciranje regiona koji kodiraju protein (resekvenciranje egzoma). U ovu svrhu, egzonska DNK iz uzoraka ljudskog porekla se sakuplja pomoću kompleta za obogaćivanje cilja koje dostavlja dobavljač, nakon čega sledi sekvenciranje pomoću npr. HiSeq2000 (Illumina). Dodatno, tumorska mRNK se sekvencira radi direktne kvantifikacije genske ekspresije i potvrde da su mutirani geni eksprimirani u tumorima pacijenta. Nastali milioni očitanih sekvenci se obrađuju kroz algoritme softvera. Izlazna lista sadrži ekspresiju mutacija i gena. Tumor-specifične somatske mutacije se utvrđuju upoređivanjem sa germinativnim varijacijama dobijenim iz PBMC i daje im se prioritet. De novo identifikovani peptidi zatim mogu da se testiraju u pogledu imunogenosti kako je opisano ranije za skladište (bazu podataka), a kandidati za TUMAP koji poseduju prikladnu imunogenost se odabiru za uključivanje u vakcinu.
U jednom primernom otelotvorenju, peptidi koji su uključeni u vakcinu se identifikuju pomoću: (a) identifikacije tumor-asociranih peptida (TUMAP) koje prezentuje uzorak tumora od pojedinačnog pacijenta pomoću ranije opisanih metoda; (b) upoređivanja peptida identifikovanih u tački a) sa skladištem (bazom podataka) peptida koji su prethodno skrinirani za imunogenost i prekomernu prezentaciju u tumorima u poređenju sa korespodentnim normalnim tkivom; (c) biranja najmanje jednog peptida iz skladišta (baze podataka) koji korelira sa tumor-asociranim peptidom identifikovanim kod pacijenta; i (d) opciono, biranja najmanje jednog peptida identifikovanog de novo u tački (a) i potvrđivanja njegove imunogenosti.
U jednom primernom otelotvorenju, peptidi koji su uključeni u vakcinu se identifikuju pomoću: (a) identifikacije tumor-asociranih peptida (TUMAP) koje prezentuje uzorak tumora od pojedinačnog pacijenta; i (b) biranja najmanje jednog peptida identifikovanog de novo u tački (a) i potvrđivanja njegove imunogenosti.
Kada se peptidi izaberu, proizvodi se vakcina.
Vakcina je poželjno tečna formulacija koja se sastoji od pojedinačnih peptida rastvorenih u 33% DMSO.
Svaki peptid koji će biti uključen u proizvod se rastvara u DMSO. Koncentracija rastvora pojedinačnih peptida treba da se izabere u zavisnosti od broja peptida koji će biti uključeni u proizvod. Rastvori pojedinačan peptid-DMSO se mešaju u jednakim delovima kako bi se dobio rastvor koji sadrži sve peptide koji treba da budu uključeni u proizvod sa koncentracijom od ~2,5 mg/ml po peptidu. Pomešani rastvor se zatim razblažuje u odnosu 1:3 sa vodom za injekcije kako bi se dobila koncentracija od 0,826 mg/ml po peptidu u 33% DMSO. Razblaženi rastvor se filtrira kroz sterilni filter veličine 0,22 µm. Dobijen je konačan ukupni rastvor.
Konačni ukupni rastvor se puni u bočice i čuva na -20 °C do upotrebe. Jedna bočica sadrži 700 µl rastvora koji sadrži 0,578 mg svakog peptida. Od toga će 500 µl (pribl.400 μg po peptidu) biti primenjeno za intradermalnu injekciju.
Predmetni pronalazak će sada biti opisan u sledećim primerima sa referencom na pripadajuće slike koje opisuju njegova poželjna otelotvorenja, ali to neće biti ograničeno na ovde navedeno.
Kratak opis crteža
Slika 1 prikazuje površinsku ekspresiju HLA primarnih AML uzoraka i HSC zdravih donora. Kvantifikacija je izvršena ex vivo pomoću QIFIKIT (Dako). (a) HLA klasa I (W6/32 mAt) ekspresija CD34<+>AML blasta u poređenju sa autolognim CD15<+>normalnim monocitima. (b) HLA-DR (L243 mAt) ekspresija CD34<+>AML blasta u poređenju sa autolognim CD15<+>normalnim monocitima. (c) HLA klasa I (W6/32 mAt) ekspresija CD34<+>AML blasta (n=5) i CD34<+>CD38<->hematopoetskih stem ćelija (n=5) dobijenih od zdravih donora. (d) HLA-DR (L243 mAt) ekspresija CD34<+>AML blasta (n=5) i CD34<+>CD38<->hematopoetskih stem ćelija (n=5) dobijenih od zdravih donora. * P<0,05, *** P< 0,001, neuparen t test. Skraćenice: UPN, uniformni broj pacijenta
Slika 2 prikazuje broj identifikacija HLA liganda i izvornog proteina iz primarnih uzoraka AML. Jedinstveni ID-jevi (peptidne sekvence i odgovarajući izvorni proteini) identifikovani pomoću LC-MS/MS za HLA klasa I (W6/32 mAt, n=15) i HLA klasa II (Tü39 mAt, n=12) u primarnim uzorcima AML. Samo uzorci koji ispunjavanju prag od ≥500 (HLA klasa I) i ≥100 (HLA klasa II) jedinstvenih identifikacija liganada po uzorku su bili uključeni u ovu studiju. Skraćenice: ID, identifikacija; UPN, uniformni broj pacijenta
Slika 3 prikazuje identifikaciju ciljeva peptidne vakcine na osnovu karakterizacije HLA klasa I ligandoma/izvornih proteoma AML (n=15), PBMC (n=30) i BMNC (n=5) (a) Preklapanja izvornih proteina HLA klasa I liganada za AML, PBMC i BMNC. (b) Komparativno profiliranje izvornih proteina HLA klasa I liganada na osnovu učestalosti HLA-restrikovane reprezentacije u AML, PBMC i BMNC. Apsolutni brojevi pacijenata/donora pozitivnih za HLA-restrikovanu prezentaciju dotičnog izvornog proteina (x osa) navedeni su na y osi. Isprekidane linije pokazuju 100% reprezentaciju za svaku dotičnu kohortu. Kockica sa leve strane ističe podskup izvornih proteina koji pokazuju AML-ekskluzivnu reprezentaciju sa učestalostima >20% (LiTAA: tumor-asocirani antigeni dobijeni iz ligandoma). (c) Analiza reprezentacije objavljenih AML-asociranih antigena u HLA klasa I ligandomima. Stupci pokazuju relativnu reprezentaciju dotičnih antigena od strane HLA klasa I liganada u AML, PBMC i BMNC. (d) Podskup-specifična analiza FLT3-ITD mutiranih (n=8) naspram FLT3-WT (n=7) AML HLA klasa I ligandoma. Analiza preklapanja AML-ekskluzivnih izvornih proteina (kako je definisano u (b)) za FLT3-ITD i FLT3-WT AML. (e) Komparativno profiliranje AML-ekskluzivnih izvornih proteina HLA klasa I liganada na osnovu učestalosti HLA-restrikovane reprezentacije u FLT3-ITD i FLT3-WT AML. Kockica u sredini ističe podskup zajedničkih izvornih proteina, što obuhvata 91,3% ovde definisanih LiTAA.
Slika 4 prikazuje funkcionalnu karakterizaciju HLA klasa I AML-LiTAPova. (a) IFN-γ ELISPOT esej PBMC od pacijenta sa AML nakon stimulacije sa 2 različita A*03-restrikovana AML LiTAP (tumor-asocirani peptid dobijen iz ligandoma) pula (P<I>1i PI2). PHA služila je kao pozitivna kontrola, stimulacija sa HIV GAG18-26A*03 peptidom kao negativna kontrola. Za PI 1 i P<I>2zabeležena je značajna proizvodnja IFN-γ. (b) Unutarćelijsko bojenje za IFN-γ i TNF-α PBMC od pacijenta sa AML stimulisanih sa P<I>1i PI2(isto kao i u (a)). PHA/jonomicin služio je kao pozitivna kontrola, HIV GAG18-26A*03 peptid kao negativna kontrola. (c) IFN-γ ELISPOT esej za unakrsnu proveru PBMC zdravih donora nakon stimulacije sa A*03-restrikovanim AML LiTAP pulovima P<I>1i PI2, nije otkrio značajnu proizvodnju IFN-γ.
Slika 5 prikazuje identifikaciju dodatnih/sinergističkih ciljeva peptidne vakcine na osnovu karakterizacije AML HLA klasa II ligandoma. (a) Analiza preklapanja izvornih proteoma HLA klasa II liganada iz AML (n=12), PBMC (n=13) i BMNC (n=2). (b) Komparativno profiliranje izvornih proteina HLA klasa II liganada na osnovu učestalosti HLA-restrikovane reprezentacije u AML, PBMC i BMNC. Apsolutni brojevi pacijenata/donora pozitivnih za HLA-restrikovanu prezentaciju dotičnog izvornog proteina (x osa) navedeni su na y osi. Isprekidane linije pokazuju 100% reprezentaciju za svaku dotičnu kohortu. Kockica sa leve strane ističe podskup izvornih proteina koji pokazuju AML-ekskluzivnu reprezentaciju sa učestalostima >20%. (c) Analiza preklapanja HLA klasa I i HLA klasa II AML-ekskluzivnih izvornih proteina. (d) Od 43 zajedničkih AML-ekskluzivnih izvornih proteina, identifikovan je podskup od 3 koji sadrži kompletne HLA klasa I ligande ugrađene u HLA klasa II peptide. Ugrađene sekvence predstavljene su podebljano. (e) IFN-γ ELISPOT esej PBMC od pacijenta sa AML nakon stimulacije sa različitim HLA klasa II AML LiTAP (P<II>1, PI<II>2i PI<II>3). PHA služila je kao pozitivna kontrola, stimulacija sa FLNA1669-1683HLA-DR peptidom kao negativna kontrola. Za P<II>1, PIII2i PIII3kod više pacijenata zabeleženo je značajno povećanje proizvodnje IFN-γ. Skraćenice: UPN, uniformni broj pacijenta.
Slika 6 prikazuje rezultate eksperimenta u cilju evaluacije unutrašnje heterogenosti HLA klasa I ligandoma u FLT3-ITD (n=8) naspram FLT3-WT (n=7) podskupovima. Pronalazači su izvršili semi-kvantitativno indeksiranje sličnosti. Kako bi omogućili poređenje ligandoma različitih HLA tipova, pronalazači su sproveli analizu na nivou izvornih proteina HLA liganada. Semi-kvantitativne informacije dobijene su iz analiziranja brojanja spektara (PSM) prikazanih HLA liganada. Euklidske distance su analizirane kao mera za sličnost/različitost uzorak-par, pri čemu niske vrednosti ukazuju na visoke sličnosti a visoke vrednosti ukazuju na visoke različitosti. Euklidske distance su izračunate za svaki mogući par uzoraka u okviru svakog podskupa primenom interne Python skipte (Python v3.3.3, Python Software Foundation). Ukratko, ukupni brojevi PSM u svakom paru uzoraka normalizovani su do odnosnog višeg računajućeg uzorka. Liste izvornih proteina su kombinovane a apsolutne vrednosti razlika u brojevima PSM koji predstavljaju dotične izvorne proteine su sumirane kako bi se dobila Euklidska distanca. *** P< 0,001, neuparen t test.
PRIMERI
PRIMER 1:
Identifikacija i kvantifikacija tumor-asociranih peptida prezentovanih na površini ćelije
Uzorci tkiva
Uzorci tumora pacijenata dobijeni su od Univerziteta u Tubingenu, Tübingen, Nemačka. Od svih pacijenata pribavljeni su pisani informisani pristanci. Uzorci su zamrznuti brzim zamrzavanjem u tečnom azotu neposredno nakon operacije i uskladišteni na -80 °C do izolacije TUMAP. Za analizu ligandoma, pomoću centrifugiranja u gradijentu gustine izolovani su PBMC od pacijenata sa AML u vreme postavljanja dijagnoze ili relapsa pre terapije (>80% AML blasta u krvi), kao i PBMC i BMNC od zdravih donora.
Izolacija HLA peptida iz uzoraka tkiva
HLA molekuli klase I i II izolovani su primenom standardnog imunoafinitetnog prečišćavanja kako je ranije opisano. Ukratko, brzo zamrznuti peleti ćelija su lizirani u 10 mmol/l CHAPS/PBS (AppliChem, St. Louis, MO, SAD/Gibco, Carlsbad, CA, SAD) koji je sadržao 1x proteazni inhibitor (Complete, Roche, Basel, Švajcarska). HLA molekuli prečišćeni su u jednom koraku pomoću pan-HLA klasa I-specifičnog mAt W6/32 odnosno pan-HLA klasa II-specifičnog mAt Tü39, kovalentno vezanog za CNBr-aktiviranu sefarozu (GE Healthcare, Chalfont St Giles, Ujedinjeno Kraljevstvo). Kompleksi HLA:peptid su eluirani ponovljenim dodavanjem 0,2% trifluorosirćetne kiseline (TFA, Merck, Whitehouse Station, NJ, SAD). Elucione frakcije E1-E8 su pulirane a slobodni HLA ligandi su izolovani pomoću ultrafiltracije primenom centrifugalnih filterskih jedinica (Amicon, Millipore, Billerica, MA, SAD). HLA ligandi su ekstrahovani i desalinizovani iz filtrata primenom ZipTip C18 vrhova za pipete (Millipore). Ekstrahovani peptidi su eluirani u 35 µl 80% acetonitrila (ACN, Merck)/0,2% TFA, centrifugirani do potpune suvoće i resuspendovani u 25 µl 1% ACN/0,05% TFA. Uzorci su uskladišteni na -20 °C do analize pomoću LC-MS/MS.
Analiza HLA liganda pomoću LC-MS/MS
Uzorci peptida razdvojeni su pomoću reverzno-fazne tečne hromatografije (nanoUHPLC, UltiMate 3000 RSLCnano, ThermoFisher, Waltham, MA, SAD) te naknadno analizirani u onlajn spregnutom LTQ Orbitrap XL hibridnom masenom spektrometru (ThermoFisher). Uzorci su analizirani u 5 tehničkih replikata. Zapremine uzoraka od 5 µl (udeo uzorka od 20%) ubrizgavane su na 75 µm x 2 cm kolonu za hvatanje (Acclaim PepMap RSLC, ThermoFisher) pri 4 µl/min tokom 5,75 min. Separacija peptida naknadno je izvršena na 50 °C sa brzinom protoka od 175 nl/min na 50 µm x 50 cm koloni za separaciju (Acclaim PepMap RSLC, ThermoFisher) primenom gradijenta u rasponu od 2,4 do 32,0% ACN u toku 140 min. Eluirani peptidi su jonizovani pomoću nanosprej jonizacije i analizirani u masenom spektrometru koji koristi prvih 5 CID (disocijacija indukovana kolizijom) metod koji generiše spektre fragmenata za 5 najobilnijih prekursorskih jona u istražnim skenovima. Rezolucija je bila podešena na 60.000. Za HLA klasa I ligande, opseg za masu ograničen je na 400-650 m/z pri čemu su stanja naelektrisanja 2 i 3 bila dozvoljena za fragmentaciju. Za HLA klasu II analiziran je maseni opseg od 300-1.500 m/z sa stanjima naelektrisanja ≥2 dozvoljenim za fragmentaciju.
Profili prezentacije primernih prekomerno prezentovanih peptida prikazani su na slici 3.
Amplifikacija peptid-specifičnih T ćelija
PBMC od pacijenata sa AML i zdravih dobrovoljaca su kultivisane u RPMI1640 medijumu (Gibco) u koji su dodati 10% pulirani ljudski serum (PHS, proizveden interno), 100 mmol/l βmerkaptoetanol (Roth, Karlsruhe, Nemačka) i 1% penicilin/streptomicin (GE). Za stimulaciju CD8<+>T ćelija, PBMC su odmrznute te pulsirane sa 1 µg/ml po peptidu. PBMC pulsirane peptidom (5-6 x 10<6>ćelija/ml) su kultivisane na 37 °C i 5% CO2tokom 12 dana. U medijum za kultivaciju je 0. dana i 1. dana dodato 5 ng/ml IL-4 (R&D Systems, Minneapolis, MN, SAD) i 5 ng/ml IL-7 (Promokine, Heidelberg, Nemačka). Trećeg, 5, 7. i 9. dana u medijum za kultivaciju dodato je 2 ng/ml IL-2 (R&D Systems). Peptidom-stimulisane PBMC su funkcionalno okarakterisane pomoću ELISPOT eseja 12. dana odnosno pomoću bojenja unutarćelijskih citokina 13. dana. Za stimulaciju CD4<+>T ćelija, kultivisanje je izvršeno kao što je opisano za CD8<+>T ćelije sa 2 modifikacije: pulsiranje je izvršeno sa 10 µg/ml HLA klasa II peptidom i nisu dodati IL-4 i IL-7.
IFN-γ ELISPOT esej
IFN-γ ELISPOT eseji su sprovedeni kako je ranije opisano (Widenmeyer M, Griesemann H, Stevanovic S, Feyerabend S, Klein R, Attig S, et al. Promiscuous survivin peptide induces robust CD4+ T-cell responses in the majority of vaccinated cancer patients. Int J Cancer.2012 Jul 1;131(1):140-9). Ukratko, nitrocelulozne pločice sa 96 mesta (Millipore) obložene su sa 1 mg/ml IFN-γ mAt (Mabtech, Cincinnati, OH, SAD) i inkubirane preko noći na 4 °C. Pločice su blokirane sa 10% PHS tokom 2h na 37 °C. 5 x 10<5>ćelija/mestu prethodno stimulisanih PBMC je pulsirano sa 1 µg/ml (HLA klasa I) ili 2,5 µg/ml (HLA klasa II) peptidom i inkubirano 24-26 h. Očitavanja su izvršena prema uputstvima proizvođača. Tačke su brojane pomoću ImmunoSpot S5 analizatora (CTL, Shaker Heights, OH, SAD). Odgovori T ćelija smatrali su se pozitivnim kada je izbrojano >15 tačaka/mestu a srednji broj tačaka po mestu je bio najmanje 3 puta veći od srednjeg broja tačaka u mestima sa negativnom kontrolom (u skladu sa smernicama programa za imunovođenje u malignim tumorima (CIP)).
Bojenje unutraćelijskog IFN-γ i TNF-α
Učestalost i funkcionalnost peptid-specifičnih CD8<+>T ćelija analizirani su pomoću bojenja unutraćelijskih IFN-γ i TNF-α. PBMC su pulsirane sa 1 µg/ml pojedinačnog peptida i inkubirane u prisustvu 10 µg/ml Brefeldin A (Sigma, St. Louis, MO, SAD) i 10 µg/ml GolgiStop (BD) tokom 6-8 h. Ćelije su obeležene primenom Cytofix/Cytoperm (BD), CD8-PECy7 (Beckman Coulter, Fullerton, CA, SAD), CD4-APC (BD Bioscience), TNF-α-PE (Beckman Coulter) i IFN-γ-FITC (BD). Uzorci su analizirani na FACS Canto II.
Kvantifikacija površinske ekspresije HLA
Da bi se omogućilo poređenje sa zdravim monocitima, izvršena je kvantifikacija površinske ekspresije HLA u dodatnim uzorcima pacijenata koji su sadržali CD15<->AML blaste i najmanje 5% normalnih CD15<+>monocita kako je definisano imunofenotipizacijom. Površinska ekspresija HLA analizirana je pomoću QIFIKIT® kompleta za kvantitativnu protočnu citometriju (Dako, Glostrup, Danska) prema uputstvima proizvođača. Ukratko, triplikati svakog uzorka su obojeni sa pan-HLA klasa I-specifičnim monoklonalnim antitelom (mAt) W6/32, HLA-DR-specifičnim mAt L243 (oba proizvedena interno) odnosno kontrolom IgG izotip (BioLegend, San Diego, CA, SAD). Sekundarno bojenje sa FITC-konjugovanim zečjim-antimišjim F(ab’)2fragmentima (Dako) je naknadno izvršeno na PBMC, BMNC kao i QIFIKIT® perlama za kvantifikaciju. Bojenje površinskih markera sprovedeno je sa direktno obeleženim CD34 (BD, Franklin Lakes, NJ, SAD), CD15 (BD), CD45 (BD) i CD38 (BD). 7AAD (BioLegend) je dodat kao marker vijabilnosti neposredno pre analize protočnom citometrijom na LSR Fortessa analizatoru ćelija (BD).
Rezultati
Primarni AML uzorci pokazuju da nema gubitka niti nishodne regulacije ekspresije HLA u poređenju sa autolognim benignim leukocitima
Utvrđeni su nivoi ekspresije HLA na AML blastima u poređenju sa odgovarajućim benignim leukocitima. Za ovo, površinski nivoi HLA su kvantifikovani protočnom citometrijom u panelu od 5 pacijenata sa CD15<->AML i 5 zdravih donora BMNC. AML blasti su gejtovani kao CD34<+>, CD45<med>vijabilne ćelije, a njihova ekspresija HLA je upoređena sa autolognim CD15<+>normalnim granulocitima i monocitima. Pronađeno je da su nivoi HLA heterogeni sa ukupnim brojem HLA klasa I molekula u rasponu od 45.189-261.647 molekula/ćeliji na AML blastima i 75.344-239.496 molekula/ćeliji na CD15<+>ćelijama. Analiza površinske ekspresije HLA u triplikatu kod pojedinačnih pacijenata otkrila je malu, ali značajnu prekomernu ekspresiju kod 3/5 pacijenata (neupareni t test, P≤0,001). Ekspresija HLA-DR kretala se u rasponu od 1.476 do 45.150 molekula/ćeliji na AML blastima i 0-3.252 na CD15<+>ćelijama i bila je značajno veća na AML blastima kod svih analiziranih pacijenata (P≤0,001). Radi reference, analizirani su brojevi HLA površinskih molekula na hematopoetskim stem ćelijama (HSC, CD34<+>CD38-) 5 zdravih donora BMNC. Sveobuhvatna statistička analiza površinske ekspresije HLA na AML u poređenju sa normalnim monocitima nije otkrila značajne razlike u srednjoj ekspresiji HLA klasa I i II. Pronađeno je da je srednji broj HLA klasa I na normalnim HSC (248.587±35.351 molekula/ćeliji) značajno veći od istog na AML blastima (116.445±37.855 molekula/ćeliji, P=0,034, sl.1c). Srednji broj HLA klasa II na normalnim HSC (38.373±5.159 molekula/ćeliji) nije pokazao značajno povećan nivo u poređenju sa AML blastima (17.103±7.604 molekula/ćeliji, P=0,053).
LC-MS/MS identifikuje široki dijapazon prirodno prezentovanih HLA klasa I i II liganada
Mapiranjem HLA klasa I ligandoma 15 pacijenata sa AML (tabela 1) identifikovano je ukupno 13.238 različitih peptida koji predstavljaju 6.104 izvorna proteina. Broj identifikovanih (tumorskih) jedinstvenih peptida po pacijentu kretao se u rasponu od 563 do 2.733 (srednja vrednost 1.299 peptida). U zdravoj kohorti (30 donora PBMC, 5 donora BMNC) identifikovano je ukupno 17.940 jedinstvenih peptida (17.322 peptida/7.207 izvornih proteina na PBMC; 1.738 peptida/1.384 izvorna proteina na BMNC, dodatno). Analizom HLA klasa II ligandoma kod 12 pacijenata sa AML dobijeno je ukupno 2.816 jedinstvenih peptida (raspon 104-753 peptida/pacijentu, srednja vrednost 332 peptida) koji predstavljaju 885 izvornih proteina. HLA klasa II zdrava kontrolna kohorta (13 donora PBMC, 2 donora BMNC) proizvela je 2.202 različita peptida (2.046 peptida/756 izvornih proteina na PBMC; 317 peptida/164 izvorna proteina na BMNC). Nije pronađena korelacija analiziranih brojeva ćelija i broja identifikacija peptida ni za HLA klasu I (Spirman r=0,27, P=0,33), ni za HLA klasu II (r=0,31, P=0,33).
Komparativno profiliranje HLA klasa I ligandoma otkriva mnoštvo AML-asociranih antigena
Da bi se identifikovali novi ciljevi za peptidnu vakcinaciju u AML, komparativno su mapirani izvorni proteini HLA liganada iz kohorti AML, PBMC i BMNC. Analiza preklapanja HLA izvornih proteina otkrila je da je 1.435 proteina (23,6% mapiranog AML izvornog proteoma) ekskluzivno reprezentovano u HLA ligandomima pacijenata sa AML. Pronađeno je da AML deli 75,5% (4.588 proteina) svojih HLA izvornih proteina sa PBMC i 19,3% (1.173 proteina) sa BMNC. Izvorni proteini HLA liganada BMNC pokazali su preklapanje od 89,9% (1.173 proteina) sa izvornim proteomom PBMC. Naš cilj je bio da iz ovog širokog dijapazona potencijalnih ciljeva izaberemo najrelevantnije i široko primenjive kandidate za dizajn komercijalne vakcine. U skladu sa tim, definisali smo AML-ekskluzivnost i visoku učestalost reprezentacije u AML ligandomima kao vrhovne kriterijume za izbor antigena na našoj platformi. Rangiranje izvornih proteina HLA liganada u skladu sa ovim kriterijumima identifikovalo je podskup od 132 proteina (2,2% AML izvornog proteoma) koji su ekskluzivno reprezentovani kod ≥20% AML ligandoma. U okviru ovih LiTAA (tumor-asocirani antigeni dobijeni iz ligandoma) definisanih pomoću ova dva kriterijuma, identifikovali smo faktor 1 povezan sa FAS (FAF1) kao najviše rangiran, koji je bio detektovan u 8/15 (53,3%) ligandoma poreklom od pacijenata i reprezentovan od strane 6 različitih HLA liganada (AEQFRLEQI (ID BR. SEKV: 1) (B*44), FTAEFSSRY (ID BR. SEKV: 2) (A*03), HHDESVLTNVF (ID BR. SEKV: 3) (B*38:01), REQDEAYRL (ID BR. SEKV: 4) (B*44:25), RPVMPSRQI (ID BR. SEKV: 5) (B*07), VQREYNLNF (ID BR. SEKV: 6) (B*15). Pregled najbolje rangiranih 15 LiTAA koji su pokazali reprezentaciju kod ≥33% AML ligandoma prikazan je u tabeli 2. U sažetku, glavna 132 najčešća LiTAA samostalno obezbeđuju panel od 341 različitog prirodno prezentovanog HLA liganda (LiTAP, tumor-asocirani peptidi dobijeni iz ligandoma) od više od 25 različitih HLA restrikcija, pogodnih za razvoj široko primenjivih AML-specifičnih peptidnih vakcina. Pored toga, dodatnih 1.389 AML-ekskluzivnih izvornih proteina sa učestalostima reprezentacije <20% reprezentovanih od strane 1.727 različitih HLA liganada mogu služiti kao skladišta za dizajn individualizovanijih vakcina.
Identifikacija prirodno prezentovanih HLA klasa I liganada dobijenih iz ustanovljenih AML-asociranih antigena
Drugi pristup eksploatacije podataka bio je fokusiran na identifikaciju i rangiranje ustanovljenih AML-asociranih antigena (kako je sumirano u radu Anguille S, Van Tendeloo VF, Berneman ZN. Leukemia-associated antigens and their relevance to the immunotherapy of acute myeloid leukemia. Leukemia. 2012 Oct;26(10):2186-96) u bazi podataka prirodno prezentovanih HLA liganada. Identifikovana su 122 različita HLA liganda koji predstavljaju 29 od ovih objavljenih antigena. Upečatljivo, pronađeno je da je >80% (24/29) ovih antigena takođe reprezentovano na benignim PBMC i/ili BMNC te samim tim nisu AML-specifični.
AML-ekskluzivnost u pogledu HLA prezentacije pronađena je za FLT3 (SELKMMTQL, B*40) (ID BR. SEKV: 338), PASD1 (LLGHLPAEI, C*01:02) (ID BR. SEKV: 447), HOXA9 (DAADELSVGRY, A*26:01) (ID BR. SEKV: 437), AURKA (REVEIQSHL, B*49:01) (ID BR. SEKV: 400) i CCNA1 (LEADPFLKY, B*18:01 (ID BR. SEKV: 402); EPPAVLLL, B*51:01 (ID BR. SEKV: 401)). Za mijeloperoksidazu (MPO), identifikovano je ukupno 19 različitih HLA liganada, a reprezentacija je detektovana u 6/15 (40%) AML i 0/30 PBMC ligandoma. Ipak, analiza normalnih BMNC otkrila je reprezentaciju kod 3/5 (60%) ligandoma što ističe važnost upotrebe i PBMC i BMNC za identifikaciju cilja. U sažetku, naša analiza je pokazala da veliki deo ustanovljenih AML-asociranih antigena ne ispunjava uslove tumorekskluzivne HLA-restrikovane reprezentacije.
Podskup-specifična analiza FLT3-ITD-mutiranih naspram FLT3-WT AML HLA klasa I ligandoma identifikuje zajedničke LiTAA uprkos značajnoj različitosti ligandoma Da bi se procenila primenjivost naših novih ciljeva u različitim podskupovima AML, okarakterisana je reprezentacija LiTAA u podskupovima pacijenata sa FMS-sličnom tirozin kinaza 3 internom tandem duplikacijom (FLT3-ITD, n=8) i FLT3 divljim tipom (FLT3-WT, n=7). Indeksiranje sličnosti HLA klasa I ligandoma otkrilo je da je FLT3-WT podskup prikazao značajno nižu unutrašnju heterogenost (srednja vrednost 916,2±70,6, n=21) od podskupa FLT3-TID (srednja vrednost 1687,0±156,5, n=21, P< 0,0001, slika 6). Analiza preklapanja AML-ekskluzivnih HLA izvornih proteina (FLT3-WT: 748 proteina, FLT3-ITD: 926 proteina) otkrila je preklapanja od 32,0% (FLT3-WT/FLT3-ITD) odnosno 25,6% (FLT3-ITD/FLT3-WT) (sl.
3d). Treba pomenuti da je za 42/46 (91,3%) visoko rangiranih LiTAA utvrđeno da su reprezentovani u oba podskupa (sl. 3e). Tri izvorna proteina HLA liganada SKP1 (5/8), C16orf13 (5/8) i ERLIN1 (4/8), koji su bili identifikovani isključivo u podskupu FLT3-ITD, dostigla su učestalosti reprezentacije ≥50%. FLT3-WT-specifični LiTAA MUL1 bio je reprezentovan kod 4/7 (57,1%) FLT3-WT ligandoma. Kada se sagledaju zajedno, ovi podaci govore u prilog osmišljenoj strategiji analiziranja HLA ligandoma sa kohortama za biranje ciljeva dok istovremeno ističu malu frakciju visoko učestalih, podskup-specifičnih ciljeva.
Funkcionalna karakterizacija LiTAP otkriva AML-asociranu imunoreaktivnost Da bi se izvršila procena imunogenosti i specifičnosti naših HLA-A*03 LiTAP, istraživači su zatim sproveli 12-dnevne IFN-γ ELISPOT eseje podsećanja. PBMC dobijene od 6 pacijenata sa AML kao i 8 zdravih osoba stimulisane su sa različitim pulovima (P<I>1i P<I>2) najbolje rangiranih HLA-A*03 LiTAP. Zabeležena je značajna sekrecija IFN-γ sa oba primenjena peptidna pula u 2/6 uzoraka AML (sl.4a). Da bi se potvrdili ovi nalazi, sprovedeni su bojenje unutraćelijskih citokina i protočna citometrija za IFN-γ i TNF-α primenom 12-dnevno prethodno stimulisanih PBMC (sl.4b). Potvrđeno je da su P<I>1i P<I>2-specifični CD8<+>T ćelijski odgovori funkcionalno okarakterisani pomoću sekrecije IFN-γ (P<I>1: 1,6%, P<I>2: 1,7% CD8<+>T ćelija) i TNF-α (P<I>1: 2,6%, P<I>2: 2,4% CD8<+>T ćelija). ELISPOT eseji za unakrsnu proveru primenom PBMC od A*03-pozitivnog zdravog donora stimulisanih sa P<I>1i PI2nisu pokazali značajnu sekreciju IFN-γ (0/8, sl. 4c). Ove inicijalne karakterizacije pokazuju da ovde definisani LiTAP mogu potencijalno da funkcionišu kao AML-specifični T-ćelijski epitopi.
Analiza HLA klasa II ligandoma obezbeđuje dodatne ciljeve i tačno ukazuje na potencijalno sinergističke ugrađene ligande
Analiza preklapanja HLA klasa II izvornih proteoma identifikovala je da je 396 proteina (44,7%) reprezentovanih od strane 1.079 različitih HLA liganada ekskluzivno reprezentovano u HLA ligandomu AML. Utvrđeno je da AML deli 53,3% (472 proteina) odnosno 15,1% (134 proteina) svog izvornog proteoma sa PBMC odnosno BMNC. BMNC su pokazale preklapanje izvornog proteoma od 88,2% (127 proteina) sa PBMC. Sprovođenjem komparativnog profiliranja HLA izvornog proteoma kako je opisano iznad za HLA klasu I, istraživači su bili u stanju da identifikuju 36 LiTAA (reprezentovanih od strane 152 različita HLA klasa II liganda) sa učestalostima reprezentacije ≥20%. Najviše rangirani klasa II LiTAA (A1BG) je identifikovan na 6/12 (50%) pacijenata reprezentovan od strane 5 različitih liganada. Da bi identifikovali LiTAA prezentovani u oba, HLA klasa I i klasa II ligandomima, istraživači su naknadno uporedili odgovarajuće AML-ekskluzivne izvorne proteome. Ovo je otkrilo panel od samo 43 zajednička izvorna proteina (3,0% HLA klasa I odnosno 10,4% HLA klasa II izvornog proteoma). Mapiranje odgovarajućih klasa I naspram klasa II liganada identifikovalo je 3 HLA klasa II peptida koji sadrže kompletne ugrađene HLA klasa I ligande.
Da bi funkcionalno okarakterisali HLA klasa II LiTAP istraživači su sproveli 12-dnevne IFN-γ ELISPOT eseje podsećanja. Za 3/7 najviše rangiranih LiTAP detektovana je značajna sekrecija IFN-γ kod pacijenata sa AML. T-ćelijski odgovori detektovani su za peptid P<II>1(CLSTN1836-852) kod 4/15 (26,7%), za PII2(LAB5A123-138) kod 3/15 (20,0%) i za PII3(MBL2191-
206) kod 2/15 (13,3%) pacijenata sa AML. Na sl.5e prikazan je primer učestalosti specifičnih T ćelija za peptide P<II>1, P<II>2i P<II>3kod jednog pacijenta sa AML. ELISPOT eseji za unakrsnu proveru primenom PBMC od zdravog donora stimulisanih sa P<II>1, PII2i PII3nisu pokazali značajnu sekreciju IFN-γ (0/8). Tako, ovde definisani AML-specifični HLA klasa II epitopi imaju potencijal da dopune HLA klasa I peptidnu vakcinu.
PRIMER 2
Profiliranje ekspresije gena koji kodiraju peptide pronalaska
Nisu svi AML peptidi koji su identifikovani kao da su prezentovani na površini tumorskih ćelija od strane MHC molekula pogodni za imunoterapiju, zato što je većina ovih peptida dobijena iz normalnih ćelijskih proteina koje eksprimiraju mnoge vrste ćelija. Samo nekoliko ovih peptida je tumor-asocirano i verovatno je da su sposobni da indukuju T ćelije sa velikom specifičnošću prepoznavanja za tumor iz kojeg su dobijeni. Da bi identifikovali takve peptide i sveli rizik od autoimunosti indukovane vakcinacijom na minimum, pronalazači su se fokusirali na one peptide koji su dobijeni od proteina koji su prekomerno eksprimirani na tumorskim ćelijama u poređenju sa većinom normalnih tkiva.
Idealni peptid će biti izveden iz proteina koji je jedinstven za tumor i nije prisutan u bilo kom drugom tkivu. Da bi se identifikovali peptidi koji su dobijeni iz gena sa profilom ekspresije sličnim idealnom, identifikovani peptidi su dodeljeni proteinima, odnosno genima, iz kojih su dobijeni i generisani su profili ekspresije ovih gena.
RNK izvori i priprema
Hirurški odstranjeni uzorci tkiva obezbeđeni su od strane Univerziteta u Hajdelbergu, Heidelberg, Nemačka (pogledajte primer 1) nakon što je od svakog pacijenta pribavljen pisani informisani pristanak. Uzorci tumorskog tkiva su zamrznuti brzim zamrzavanjem u tečnom azotu neposredno nakon operacije i kasnije homogenizovani avanom i tučkom u prisustvu tečnog azota. Ukupna RNK je pripremljena iz ovih uzoraka pomoću TRI reagensa (Ambion, Darmstadt, Nemačka) nakon čega je sledilo čišćenje sa RNeasy (QIAGEN, Hilden, Nemačka); oba metoda su izvedena u skladu sa protokolom proizvođača.
Ukupna RNK iz zdravih humanih tkiva dobijena je komercijalno (Ambion, Huntingdon, UK; Clontech, Heidelberg, Nemačka; Stratagene, Amsterdam, Holandija; BioChain, Hayward, CA, SAD). RNK od nekoliko pojedinaca (između 2 i 123 osobe) izmešana je tako da je RNK od svakog pojedinca bila težinski podjednaka.
Kvalitet i kvantitet svih uzoraka RNK procenjen je na Agilent 2100 bioanalizatoru (Agilent, Waldbronn, Nemačka) upotrebom RNA 6000 Pico LabChip kompleta (Agilent).
Eksperimenti na mikročipu
Analiza genske ekspresije svih uzoraka RNK iz tumorskih i normalnih tkiva izvršena je pomoću Affymetrix Human Genome (HG) U133A ili HG-U133 Plus 2.0 oligonukleotidnih mikročipova (Affymetrix, Santa Clara, CA, SAD). Svi koraci su izvršeni u skladu sa priručnikom za Affymetrix. Ukratko, sintetisana je dvolančana cDNK iz 5–8 µg ukupne RNK, primenom SuperScript RTII (Invitrogen) i oligo-dT-T7 prajmera (MWG Biotech, Ebersberg, Nemačka) kako je opisano u priručniku. In vitro transkripcija je izvršena sa kompletom BioArray High Yield RNA Transcript Labelling Kit (ENZO Diagnostics, Inc., Farmingdale, NY, SAD) za U133A čipove ili sa kompletom GeneChip IVT Labelling Kit (Affymetrix) za U133 Plus 2.0 čipove, nakon čega je sledila fragmentacija, hibridizacija i bojenje cRNK sa streptavidinfikoeritrin i biotiniliranim anti-streptavidin antitelom (Molecular Probes, Leiden, Holandija). Slike su skenirane skenerom Agilent 2500A GeneArray Scanner (U133A) ili Affymetrix Gene-Chip Scanner 3000 (U133 Plus 2.0), a podaci su analizirani pomoću GCOS softvera (Affymetrix), upotrebom podrazumevanih podešavanja za sve parametre. Za normalizaciju je korišćeno 100 konstitutivnih gena obezbeđenih od strane kompanije Affymetrix. Vrednosti relativne ekspresije izračunate su iz logaritamskih odnosa signala datih od strane softvera a normalni uzorak bubrega je arbitrarno podešen na 1,0.
Primerni profili ekspresije izvornih gena predmetnog pronalaska koji su veoma prekomerno eksprimirani ili isključivo eksprimirani u AML prikazani su na slici 3.
PRIMER 3
In vitro imunogenost za AML MHC klasa I-prezentovane peptide
Da bi se dobile informacije u pogledu imunogenosti TUMAP predmetnog pronalaska, istraživači su sproveli ispitivanja pomoću eseja za in vitro prajming T ćelija zasnovanog na ponovljenim stimulacijama CD8+ T ćelija sa veštačkim antigen-prezentujućim ćelijama (aAPĆ) napunjenim kompleksima peptid/MHC i anti-CD28 antitelom. Na ovaj način istraživači su mogli da pokažu imunogenost za 9 HLA-A*0201-restrikovanih TUMAP koji su do sada predstavljeni, dokazujući da su ovi peptidi T-ćelijski epitopi protiv kojih kod ljudi postoje CD8+ prekursorske T ćelije.
In vitro priprema CD8+ T ćelija
Da bi izvršili in vitro stimulacije pomoću veštačkih antigen-prezentujućih ćelija napunjenih kompleksom peptid-MHC (pMHC) i anti-CD28 antitelom, istraživači su prvo izolovali CD8+ T ćelije iz svežih proizvoda leukafereze HLA-A*02 putem pozitivne selekcije primenom CD8 mikroperli (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Nemačka) zdravih donora dobijenih iz Zavoda za transfuziju u Tubingenu, Nemačka, nakon pribavljanja informisanog pristanka.
Izolovani CD8+ limfociti ili PBMC su inkubirani do primene u T-ćelijskom medijumu (TCM) koji je sadržao RPMI-Glutamax (Invitrogen, Karlsruhe, Nemačka) u koji je dodat 10% humani toplotom inaktiviran AB serum (PAN-Biotech, Aidenbach, Nemačka), 100 U/ml penicilina / 100 µg/ml streptomicina (Cambrex, Cologne, Nemačka), 1 mmol/l natrijum piruvata (CC Pro, Oberdorla, Nemačka), 20 µg/ml gentamicina (Cambrex). U ovom koraku u TCM je takođe dodato 2,5 ng/ml IL-7 (Promo Cell, Heidelberg, Nemačka) i 10 U/ml IL-2 (Novartis Pharma, Nürnberg, Nemačka).
Stvaranje perli obloženih sa pMHC/anti-CD28, stimulacije T ćelija i očitavanje su izvršeni u visoko definisanom in vitro sistemu primenom četiri različita pMHC molekula po uslovu stimulacije i 8 različitih pMHC molekula po uslovu očitavanja.
Svi kompleksi pMHC korišćeni za punjenje aAPĆ i citometrijsko očitavanje dobijeni su iz UV-indukovane izmene MHC liganda (Rodenko B, et al. Generation of peptide-MHC class I complexes through UV-mediated ligand exchange. Nat Protoc.2006;1(3):1120-32) sa manjim modifikacijama. Da bi odredili količinu pMHC monomera dobijenog izmenom, istraživači su sproveli sendvič ELISA testove zasnovane na streptavidinu prema Rodenko B, et al., 2006.
Prečišćeno ko-stimulatorno mišje IgG2a anti humano CD28 At 9.3 (Jung G, et al. Induction of cytotoxicity in resting human T lymphocytes bound to tumor cells by antibody heteroconjugates. Proc Natl Acad Sci USA.1987 Jul;84(13):4611-5) je hemijski biotinilirano pomoću sulfo-N-hidroksisukcinimidobiotina kako je preporučeno od strane proizvođača (Perbio, Bonn, Nemačka). Korišćene perle bile su polistirenske čestice obložene streptavidinom prečnika 5,6 µm (Bangs Laboratories, Illinois, SAD).
pMHC korišćeni za stimulacije pozitivne i negativne kontrole bili su A*0201/MLA-001 (peptid ELAGIGILTV (ID BR. SEKV: 606) iz modifikovanog Melan-A/MART-1) odnosno A*0201/DDX5-001 (YLLPAIVHI iz DDX5 (ID BR. SEKV: 607)).
800.000 perli / 200 µl je bilo obloženo u pločicama sa 96 mesta u prisustvu 4 x 12,5 ng različitih biotin-pMHC, isprano i naknadno je dodato 600 ng biotin anti-CD28 u zapremini od 200 µl. Stimulacije su bile pokrenute u pločicama sa 96 mesta istovremenim inkubiranjem 1x10<6>CD8+ T ćelija sa 2x10<5>ispranih obloženih perli u 200 µl TCM u koji je dodato 5 ng/ml IL-12 (PromoCell) u toku 3-4 dana na 37 °C. Polovina medijuma je zatim zamenjena sa svežim TCM u koji je dodato 80 U/ml IL-2 i inkubacija je nastavljena u toku 3-4 dana na 37 °C. Ovaj ciklus stimulacije je izvršen ukupno tri puta. Za očitavanje pMHC multimera pomoću 8 različitih pMHC molekula po uslovu, korišćen je pristup dvodimenzionalnog kombinatornog kodiranja kako je ranije opisano (Andersen et al., 2012 Parallel detection of antigen-specific T cell responses by combinatorial encoding of MHC multimers. Nat Protoc. 2012 Apr 12;7(5):891-902.) sa manjim modifikacijama koje obuhvataju spajanje sa 5 različitih fluorohroma. Na kraju, analize multimera su izvršene bojenjem ćelija sa bojom Live/dead near IR dye (Invitrogen, Karlsruhe, Nemačka), klonom CD8-FITC antitela SK1 (BD, Heidelberg, Nemačka) i fluorescentnim pMHC multimerima. Za analizu je korišćen BD LSRII SORP citometar opremljen odgovarajućim laserima i filterima. Peptid-specifične ćelije izračunate su kao procenat ukupnih CD8+ ćelija. Evaluacija analize multimera izvršena je primenom FlowJo softvera (Tree Star, Oregon, SAD). In vitro prajming specifičnih multimer+ CD8+ limfocita detektovan je upoređivanjem sa stimulacijama negativne kontrole. Imunogenost datog antigena detektovana je ako je pronađeno da najmanje jedno procenjivo in vitro stimulisano mesto jednog zdravog donora sadrži specifičnu CD8+ T-ćelijsku liniju nakon in vitro stimulacije (tj. ovo mesto je sadržalo najmanje 1% specifičnih multimer+ među CD8+ T ćelijama a procenat specifičnih multimer+ ćelija je bio najmanje 10x veći od srednje vrednosti stimulacija negativne kontrole).
In vitro imunogenost za AML peptide
Za testirane HLA klasa I peptide, in vitro imunogenost može da se pokaže stvaranjem peptidspecifičnih T-ćelijskih linija. Primerni rezultati protočne citometrije nakon TUMAP-specifičnog bojenja multimera za dva peptida pronalaska prikazani su na slici 4 zajedno sa odgovarajućim negativnim kontrolama.
PRIMER 4
Sinteza peptida
Svi peptidi su sintetisani pomoću standardne i dobro ustanovljene sinteze peptida u čvrstoj fazi primenom strategije Fmoc. Nakon prečišćavanja pomoću preparativne RP-HPLC, sprovedena je jonoizmenjivačka procedura da bi se inkorporirali fiziološki kompatibilni kontra joni (na primer, trifluoro-acetat, acetat, amonijum ili hlorid).
Identitet i prečišćenost svakog pojedinačnog peptida utvrđeni su masenom spektrometrijom i analitičkom RP-HPLC. Nakon jonoizmenjivačke procedure peptidi su dobijeni kao beli do prljavo-beli liofilizati u čistoćama 90% do 99,7%.
Svi TUMAP se poželjno primenjuju u obliku trifluoro-acetatnih soli ili acetatnih soli, mogući su i drugi prikladni oblici soli. Za merenja u primeru 3 korišćene su trifluoro-acetatne soli peptida.
PRIMER 5
Eseji za vezivanje MHC – MHC klasa I
Peptidi kandidati za terapije zasnovane na T ćelijama u skladu sa predmetnim pronalaskom su dalje testirani u pogledu njihovog kapaciteta vezivanja MHC (afinitet). Pojedinačni kompleksi peptid-MHC proizvedeni su zamenom sa peptidom od interesa kako je analiziran. Samo peptidi kandidati koji mogu efikasno da vežu i stabilizuju peptid-receptivne MHC molekule sprečavaju disocijaciju MHC kompleksa. Da bi se utvrdio prinos reakcije zamene, sprovedena je ELISA zasnovana na detekciji lakog lanca (β2m) stabilizovanih MHC kompleksa. Esej je sproveden kako je uopšteno opisano u radu Rodenko i sar. (Rodenko, B. et al., Nat Protoc.1 (2006): 1120-1132).
MAXISorp pločice sa 96 mesta (NUNC) obložene su preko noći sa 2 ug/ml streptavidina u PBS na sobnoj temperaturi, isprane 4 puta i blokirane tokom 1 h na 37 °C u 2% BSA koji sadrži pufer za blokiranje. Ponovo presavijeni HLA-A*0201/MLA-001 monomeri služili su kao standardi, pokrivajući opseg od 15-500 ng/ml. Monomeri peptid-MHC iz UV-izmenjivačke reakcije razblaženi su 100 puta u puferu za blokiranje. Uzorci su inkubirani tokom 1 h na 37 °C, isprani četiri puta, inkubirani sa 2 µg/ml HRP konjugovanog anti-β2m tokom 1 h na 37 °C, isprani ponovo i detektovani sa rastvorom TMB koji je zaustavljen sa NH2SO4. Apsorpcija je izmerena na 450 nm. Peptidi kandidati koji pokazuju visok prinos izmene (poželjno veći od 50%, najpoželjnije veći od 75%) se generalno preferiraju za generisanje i proizvodnju antitela ili njihovih fragmenata, i/ili T-ćelijskih receptora ili njihovih fragmenata, jer oni pokazuju dovoljan aviditet prema MHC molekulima i sprečavaju disocijaciju MHC kompleksa.
Rezultati vezivanja MHC klasa I za testirane peptide bili su; <20% = ; 20%–49% = +; 50%– 75%= ++; >= 75% = +++
PRIMER 6
Eseji za vezivanje MHC – MHC klasa II
Proteini HLA klase II podeljeni su u tri velika izotipa HLA-DR, -DP, DQ koje kodiraju brojni haplotipovi. Kombinacija različitih α- i β- lanaca povećava raznovrsnost HLA klasa II proteina koji se nalaze u proizvoljnoj populaciji. Tako, izabrani HLA klasa II TUMAP-ovi moraju da se vezuju za nekoliko različitih HLA-DR molekula (tj. da pokazuju sposobnost promiskuitetnog vezivanja) da bi mogli da doprinesu efikasnom T-ćelijskom odgovoru kod značajnog procenta pacijenata.
Promiskuitetno vezivanje GALNT7-001 i ERGIC1-001 za različite HLA-DR haplotipove i stabilnost formiranih kompleksa procenjena je u in vitro eseju vezivanja.
Testirani peptidi su bili:
Sedam ispitivanih HLA-DR haplotipova izabrani su prema njihovim učestalostima u HLA-A*02- i HLA-A*24- pozitivnoj severnoameričkoj populaciji. Podaci su dobijeni iz analize 1,35 miliona HLA-tipiziranih dobrovoljaca registrovanih u Nacionalnom programu doniranja kostne srži (Mori M, Beatty PG, Graves M, Boucher KM, Milford EL (1997). HLA gene and haplotype frequencies in the North American population: the National Marrow Donor Program Donor Registry. Transplantation 64, 1017-1027). Analizirana populacija je dodatno podeljena u sledeće etničke grupe: Evropeidni Amerikanci (N=997.193), Afroamerikanci (N=110.057), Azijski Amerikanci (N=81.139), Latinoamerikanci (N=100.128) i Indijanci (N=19.203).
Esej za vezivanje MHC-peptid koji je korišćen je utvrdio sposobnost svakog peptida kandidata da se veže za izabrani haplotip HLA klase II i stabilizuje kompleks HLA-peptid. U tu svrhu, peptidi kandidati su spojeni in vitro sa konkretnim proteinom HLA klase II.
Kapacitet vezivanja peptida kandidata za određeni HLA molekul se upoređuje sa referentnim peptidom sa poznatim veoma jakim svojstvima vezivanja (pozitivna kontrola) za svaki HLA haplotip. Eksperimentalne standardne greške potiču iz eksperimenata vezivanja pozitivnih kontrola u triplikatu.
Pored afiniteta peptida za određeni HLA molekul, postojana stabilnost obrazovanog kompleksa HLA-peptid je presudna za javljanje imunskog odgovora. Iz toga razloga, prisustvo obrazovanog kompleksa HLA-peptid se meri nakon njegove inkubacije tokom 24 h na 37 °C. Stabilnost obrazovanog kompleksa MHC-peptid se izračunava kao odnos rezultata vezivanja nakon 24 h i rezultata vezivanja dobijenih odmah nakon ponovnog presavijanja (saglasno u vremenu 0) u procentima.
Analiza GALNT7-001 i ERGIC1-001 u REVEAL<®>eseju vezivanja MHC-peptid pokazala je da se oba peptida vezuju za različite HLA haplotipove. Pokazano je da oba peptida obrazuju kompleks sa pet od sedam ispitivanih HLA haplotipova (HLA-DR1, -DR2, -DR4, -DR5 i – DR7)Error! Reference source not found.. Detektovani rezultati vezivanja bili su u rasponu od 0,02 do oko 78,5% u poređenju sa pozitivnom kontrolom i evidentno iznad rezultata peptida koji se ne vezuju. GALNT7-001 je pokazao promiskuitetno jako vezivanje (tj. sa rezultatom vezivanja preko 15%, vrednost za koju se na osnovu iskustva dobavljača usluge smatra da odražava jako vezivanje) za četiri od sedam ispitivanih HLA haplotipova (HLA-DR1, -DR2, -DR4, -DR7). Za ERGIC-001, rezultati vezivanja dva ispitivana HLA haplotipa bili su oko ili iznad 15% (HLA-DR4, -DR5). Oba peptida se nisu vezivala za HLA-DR3 i HLA-DR6.
Analiza stabilnosti obrazovanih HLA- GALNT7-001 i HLA- ERGIC1-001 kompleksa otkrila je da su 4 od 7 ispitivanih HLA-peptid kompleksa stabilni nakon 24 h na 37 °C (HLA-DR1, -DR4, -DR5, -DR7).
Analiza kapaciteta vezivanja GALNT7-001 i ERGIC1-001 za najučestalije HLA-DR haplotipove primenom eseja in vitro vezivanja otkrila je sposobnost promiskuitetnog vezivanja za oba peptida. Oba peptida su obrazovala komplekse sa 5 od 7 ispitivanih HLA-DR haplotipova. Stoga, analiza je pokazala značajan kapacitet vezivanja GALNT7-001 za najmanje 4 a ERGIC1-001 za najmanje 2 HLA-DR haplotipa. Pored toga, 4 od 5 obrazovanih kompleksa HLA-peptid za svaki ispitivani peptid bili su stabilni najmanje 24 h. Tako, analiza je pokazala da bi oba peptida trebalo da budu sposobni da doprinesu efikasnom T-ćelijskom odgovoru kod značajnog procenta pacijenata.
Lista referenci
Babbio, F. et al., Cell Cycle 3 (2004): 486-490
Bidkhori, G. et al., PLoS.One.8 (2013): e67552
Enesa, K. et al., Adv.Exp.Med.Biol. 809 (2014): 33-48
Greiner, J. et al., Int.J Cancer 106 (2003): 224-231
Huang, A. et al., Cancer Res.65 (2005): 5607-5619
Isaksson, H. S. et al., Oncotarget.5 (2014): 4040-4049
Kuznetsova, E. B. et al., Mol.Biol.(Mosk) 41 (2007): 624-633
Liu, D. et al., Int.J Oncol.45 (2014): 1232-1240
McLellan, J. et al., Mol.Biol.Cell 20 (2009): 5306-5313
Oh, Y. et al., J Biol.Chem 287 (2012): 17517-17529
Price, J. C. et al., PLoS.One.8 (2014): e63313
Rao, W. et al., Carcinogenesis 35 (2014a): 1573-1581 Rao, W. et al., PLoS.One.9 (2014b): e85705
RefSeq, The NCBI handbook [Internet], Chapter 18 (2002) Sand, M. et al., Mol.Carcinog.51 (2012): 916-922
Scanlan, M. J. et al., Cancer Immun. 1 (2001): 4
Soupene, E. et al., J Lipid Res.49 (2008): 1103-1112
Tian, Y. et al., Int.J Oncol.43 (2013): 2082-2090 Uchiyama, K. et al., J Cell Biol.159 (2002): 855-866 Vanneste, D. et al., Curr.Biol.19 (2009): 1712-1717
Yotov, W. V. et al., Genes Chromosomes.Cancer 26 (1999): 62-69 Zhang, J. et al., J Allergy Clin.Immunol.115 (2005): 548-554 Zhou, B. et al., Cancer Biol.Ther 13 (2012a): 871-879 Zhou, B. et al., Cancer Lett.322 (2012b): 195-203

Claims (15)

Patentni zahtevi
1. Peptid dužine između 9 i 30 aminokiselina, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu KLQEQLAQL u skladu sa ID BR. SEKV: 266, ili njenu farmaceutski prihvatljivu so.
2. Peptid u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačen time što je navedeni peptid modifikovan i/ili sadrži nepeptidne veze.
3. T-ćelijski receptor koji je reaktivan sa HLA ligandom koji ima najmanje 80% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom u skladu sa ID BR. SEKV: 266.
4. Fuzioni protein, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa patentnim zahtevom 1 fuziran na N-terminalne aminokiseline 1-80 HLA-DR antigen-asociranog nepromenljivog lanca (Ii) ili fuziran na ili u sekvencu antitela, kao, na primer, antitela koje je specifično za dendritične ćelije.
5. Antitelo koje se specifično vezuje za humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I koji je u kompleksu sa peptidom u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 2.
6. Nukleinska kiselina koja kodira peptid u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 2, T-ćelijski receptor u skladu sa patentnim zahtevom 3, fuzioni protein u skladu sa patentnim zahtevom 4 ili antitelo u skladu sa patentnim zahtevom 5.
7. Vektor ekspresije koji eksprimira nukleinsku kiselinu u skladu sa patentnim zahtevom 6.
8. Ćelija domaćin koja sadrži nukleinsku kiselinu u skladu sa patentnim zahtevom 6 ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 7, naznačeno time što je navedena ćelija domaćin poželjno antigen-prezentujuća ćelija, na primer dendritična ćelija.
9. Metod za proizvodnju peptida u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 2, T-ćelijskog receptora u skladu sa patentnim zahtevom 3, fuzionog proteina u skladu sa patentnim zahtevom 4, ili antitela u skladu sa patentnim zahtevom 5, pri čemu se navedeni metod sastoji od kultivisanja ćelije domaćina u skladu sa patentnim zahtevom 8, i izolacije navedenog peptida, navedenog T-ćelijskog receptora, navedenog fuzionog proteina ili navedenog antitela iz navedene ćelije domaćina i/ili njenog medijuma za kultivaciju.
10. In vitro metod za proizvodnju aktiviranih citotoksičnih T limfocita (CTL), pri čemu se metod sastoji od dovođenja u kontakt in vitro CTL sa humanim MHC molekulima klase I sa ubačenim antigenom eksprimiranim na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije u toku vremenskog perioda koji je dovoljan da se navedeni CTL aktiviraju na antigen-specifičan način, naznačeno time što je navedeni antigen navedeni peptid u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 2.
11. Aktivirani citotoksični T limfocit (CTL), proizveden metodom u skladu sa patentnim zahtevom 10, koji je specifičan za peptid iz patentnog zahteva 1 ili 2.
12. Farmaceutska smeša, koja sadrži peptid u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 2, T-ćelijski receptor u skladu sa patentnim zahtevom 3, fuzioni protein u skladu sa patentnim zahtevom 4, antitelo u skladu sa patentnim zahtevom 5, nukleinsku kiselinu u skladu sa patentnim zahtevom 6 ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 7, ćeliju domaćina u skladu sa patentnim zahtevom 8 ili aktivirani citotoksični T limfocit u skladu sa patentnim zahtevom 11 i farmaceutski prihvatljiv nosač, naznačeno time što je navedena farmaceutska smeša poželjno vakcina.
13. Peptid u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 2, T-ćelijski receptor u skladu sa patentnim zahtevom 3, fuzioni protein u skladu sa patentnim zahtevom 4, antitelo u skladu sa patentnim zahtevom 5, nukleinska kiselina u skladu sa patentnim zahtevom 6, vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 7, ćelija domaćin u skladu sa patentnim zahtevom 8, aktivirani citotoksični T limfocit u skladu sa patentnim zahtevom 11 ili farmaceutska smeša u skladu sa patentnim zahtevom 12 za upotrebu u medicini.
14. Peptid u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 2, T-ćelijski receptor u skladu sa patentnim zahtevom 3, fuzioni protein u skladu sa patentnim zahtevom 4, antitelo u skladu sa patentnim zahtevom 5, nukleinska kiselina u skladu sa patentnim zahtevom 6, vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 7, ćelija domaćin u skladu sa patentnim zahtevom 8, aktivirani citotoksični T limfocit u skladu sa patentnim zahtevom 11 ili farmaceutska smeša u skladu sa patentnim zahtevom 12 za upotrebu u lečenju raka.
15. Upotreba u skladu sa patentnim zahtevom 14, naznačena time što je navedeni maligni tumor akutna mijeloidna leukemija i/ili hronična limfocitna leukemija, maligni tumor jetre ili maligni tumor kolona.
RS20191183A 2014-05-09 2015-05-08 Nova imunoterapija za lečenje nekoliko tumora krvi, kao što je akutna mijeloidna leukemija (aml) RS59471B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461990980P 2014-05-09 2014-05-09
GBGB1408255.6A GB201408255D0 (en) 2014-05-09 2014-05-09 Novel immunotherapy against several tumours of the blood, such as acute myeloid leukemia (AML)
PCT/EP2015/060168 WO2015169945A2 (en) 2014-05-09 2015-05-08 Novel immunotherapy against several tumors of the blood, such as acute myeloid leukemia (aml)
EP15732544.0A EP3140319B1 (en) 2014-05-09 2015-05-08 Novel immunotherapy against several tumors of the blood, such as acute myeloid leukemia (aml)

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS59471B1 true RS59471B1 (sr) 2019-12-31

Family

ID=51032516

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20191183A RS59471B1 (sr) 2014-05-09 2015-05-08 Nova imunoterapija za lečenje nekoliko tumora krvi, kao što je akutna mijeloidna leukemija (aml)

Country Status (25)

Country Link
US (2) US10064924B2 (sr)
EP (3) EP3140319B1 (sr)
JP (1) JP6659582B2 (sr)
KR (1) KR20170003976A (sr)
CN (1) CN106459167A (sr)
AU (2) AU2015257652B2 (sr)
BR (1) BR112016025035A2 (sr)
CA (1) CA2946349A1 (sr)
CR (1) CR20160531A (sr)
DK (1) DK3140319T3 (sr)
EA (2) EA035456B1 (sr)
ES (1) ES2747734T3 (sr)
GB (1) GB201408255D0 (sr)
HU (1) HUE045177T2 (sr)
LT (1) LT3140319T (sr)
MA (3) MA39907B1 (sr)
ME (1) ME03565B (sr)
MX (1) MX2016014711A (sr)
PL (1) PL3140319T3 (sr)
PT (1) PT3140319T (sr)
RS (1) RS59471B1 (sr)
SG (1) SG11201608332SA (sr)
SI (1) SI3140319T1 (sr)
TW (2) TWI668230B (sr)
WO (1) WO2015169945A2 (sr)

Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10704021B2 (en) 2012-03-15 2020-07-07 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic perfusion devices
HRP20200967T1 (hr) * 2014-06-20 2020-10-16 Immatics Biotechnologies Gmbh Nova imunoterapija protiv nekoliko tumora krvi, posebice kronične limfoidne leukemije (cll)
US11708572B2 (en) 2015-04-29 2023-07-25 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic cell separation techniques and processes
EA201792501A1 (ru) 2015-05-13 2018-10-31 Эйдженус Инк. Вакцины для лечения и профилактики рака
GB201521746D0 (en) 2015-12-10 2016-01-27 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against CLL and other cancers
GB201521894D0 (en) * 2015-12-11 2016-01-27 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against various cancers
ES2970865T3 (es) 2015-12-16 2024-05-31 Gritstone Bio Inc Identificación, fabricación y uso de neoantígenos
HRP20210698T1 (hr) 2015-12-22 2021-09-17 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptidi i kombinacija peptida za uporabu u imunoterapiji protiv karcinoma dojke i drugih karcinoma
GB201603987D0 (en) 2016-03-08 2016-04-20 Immatics Biotechnologies Gmbh Uterine cancer treatments
GB201604458D0 (en) 2016-03-16 2016-04-27 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against cancers
CN109071605A (zh) * 2016-04-06 2018-12-21 伊玛提克斯生物技术有限公司 用于aml和其他癌症免疫治疗的新型肽和肽组合物
WO2017174645A1 (en) * 2016-04-06 2017-10-12 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against aml and other cancers
CN109563130A (zh) * 2016-04-07 2019-04-02 卡斯西部储备大学 用于治疗神经退行性疾病的tdp-43线粒体定位抑制剂
US11214789B2 (en) 2016-05-03 2022-01-04 Flodesign Sonics, Inc. Concentration and washing of particles with acoustics
JP7075125B2 (ja) * 2016-05-25 2022-05-25 イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー 標的としてのおよび胆嚢がんおよび胆管がんおよびその他のがんに対する免疫療法で使用するための新規ペプチド、ペプチド組み合わせ
EP3475706B1 (en) * 2016-06-27 2021-08-11 Juno Therapeutics, Inc. Mhc-e restricted epitopes, binding molecules and related methods and uses
EP3504230A1 (en) * 2016-08-23 2019-07-03 GlaxoSmithKline Biologicals SA Fusion peptides with antigens linked to short fragments of invariant chain (cd74)
TWI796299B (zh) * 2016-08-26 2023-03-21 德商英麥提克生物技術股份有限公司 用於頭頸鱗狀細胞癌和其他癌症免疫治療的新型肽和支架
KR102379955B1 (ko) 2016-12-08 2022-03-29 이매틱스 바이오테크놀로지스 게엠베하 짝짓기가 향상된 t 세포 수용체
DE102016123893A1 (de) 2016-12-08 2018-06-14 Immatics Biotechnologies Gmbh T-Zellrezeptoren mit verbesserter Bindung
EA201992416A1 (ru) 2017-04-10 2020-02-25 Имматикс Байотекнолоджиз Гмбх Пептиды и комбинации пептидов для применения в иммунотерапии лейкозов и других видов рака
WO2018189661A2 (en) * 2017-04-10 2018-10-18 Palti Yoram Prof Methods and compounds for treating diabetes
SG11201909058WA (en) 2017-04-10 2019-10-30 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against leukemias and other cancers
EP4576103A3 (en) 2017-10-10 2025-08-27 Gritstone bio, Inc. Neoantigen identification using hotspots
US11696938B2 (en) 2017-11-21 2023-07-11 Naofumi Miwa Human cancer cell metastasis inhibitory agent and human cancer cell determination agent
CN111630602A (zh) 2017-11-22 2020-09-04 磨石肿瘤生物技术公司 减少新抗原的接合表位呈递
MA52363A (fr) 2018-04-26 2021-03-03 Agenus Inc Compositions peptidiques de liaison à une protéine de choc thermique (hsp) et leurs méthodes d'utilisation
CN108707666B (zh) * 2018-05-28 2021-04-09 陕西中医药大学第二附属医院 Dgkz基因作为白血病检测的生物标志物的应用
CN109663128A (zh) * 2018-11-21 2019-04-23 中国农业大学 一种肺动脉高压标志物及其作为治疗靶点的应用
EP3930755A4 (en) * 2019-03-01 2023-03-22 Flow Pharma Inc. DESIGN, MANUFACTURE AND USE OF PERSONALIZED CANCER VACCINES
CN112409449B (zh) * 2019-08-19 2023-12-15 辽宁中健医药科技有限公司 Hla-a0201限定性kif15特异性抗肿瘤ctl优势表位肽及应用
CA3173666A1 (en) * 2020-04-14 2021-10-21 Claude Perreault Novel tumor-specific antigens for acute myeloid leukemia (aml) and uses thereof
CN112980955A (zh) * 2021-03-05 2021-06-18 南昌大学第二附属医院 Emilin2作为胶质瘤替莫唑胺耐药检测、治疗及预后分子靶点的应用
CN113130001B (zh) * 2021-03-31 2023-07-18 甘肃中医药大学 一种天然化合物与抗肿瘤化合物配伍的筛选方法
EP4334332A4 (en) * 2021-05-04 2025-11-12 California Inst Of Techn VAA RECOMMENDANTS FOR ADMINISTRATION TO THE CENTRAL NERVOUS SYSTEM AND CEREBRAL VASCULATURE
JP2024534825A (ja) * 2021-08-24 2024-09-26 イマティクス ユーエス，アイエヌシー． 条件付きリガンド交換により産生されたペプチドｍｈｃ複合体を使用する免疫細胞の選択
CN114703274B (zh) * 2022-04-01 2023-08-15 中国人民解放军总医院 Phpt1在预警和/或治疗高原病中的应用
CN117586344B (zh) * 2022-08-12 2025-07-25 上海交通大学医学院附属瑞金医院 靶向flt3-d835突变的抗原肽及其在肿瘤免疫治疗中的应用
AU2024287610A1 (en) * 2023-07-12 2026-01-29 Anda Biology Medicine Development (Shenzhen) Co., Ltd Novel markers for tumor neoantigen vaccines

Family Cites Families (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4440859A (en) 1977-05-27 1984-04-03 The Regents Of The University Of California Method for producing recombinant bacterial plasmids containing the coding sequences of higher organisms
US4704362A (en) 1977-11-08 1987-11-03 Genentech, Inc. Recombinant cloning vehicle microbial polypeptide expression
LU88258I2 (sr) 1978-12-22 1994-02-03
US4530901A (en) 1980-01-08 1985-07-23 Biogen N.V. Recombinant DNA molecules and their use in producing human interferon-like polypeptides
US4342566A (en) 1980-02-22 1982-08-03 Scripps Clinic & Research Foundation Solid phase anti-C3 assay for detection of immune complexes
US4678751A (en) 1981-09-25 1987-07-07 Genentech, Inc. Hybrid human leukocyte interferons
US4766075A (en) 1982-07-14 1988-08-23 Genentech, Inc. Human tissue plasminogen activator
US4582800A (en) 1982-07-12 1986-04-15 Hoffmann-La Roche Inc. Novel vectors and method for controlling interferon expression
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4757006A (en) 1983-10-28 1988-07-12 Genetics Institute, Inc. Human factor VIII:C gene and recombinant methods for production
US4677063A (en) 1985-05-02 1987-06-30 Cetus Corporation Human tumor necrosis factor
US4810648A (en) 1986-01-08 1989-03-07 Rhone Poulenc Agrochimie Haloarylnitrile degrading gene, its use, and cells containing the gene
US4897445A (en) 1986-06-27 1990-01-30 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Method for synthesizing a peptide containing a non-peptide bond
ATE183513T1 (de) 1993-06-03 1999-09-15 Therapeutic Antibodies Inc Herstellung von antikörperfragmenten
AUPM322393A0 (en) 1993-12-24 1994-01-27 Austin Research Institute, The Mucin carbohydrate compounds and their use in immunotherapy
CA2243235C (en) 1996-01-17 2010-08-10 Imperial College Innovations Limited Immunotherapy using cytotoxic t lymphocytes (ctl)
US5849589A (en) 1996-03-11 1998-12-15 Duke University Culturing monocytes with IL-4, TNF-α and GM-CSF TO induce differentiation to dendric cells
US6406705B1 (en) 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
WO2001016174A2 (en) * 1999-08-30 2001-03-08 Rolf Kiessling Induction of cytotoxic t lymphocyte response by hla class ia restricted epitopes of mycobacterial heat shock protein 65
DE69941703D1 (de) * 1999-10-11 2010-01-07 Pasteur Institut Lentivirale Vektoren für die Herstellung von immunotherapeutischen Zusammensetzungen
EP1239866A4 (en) * 1999-12-10 2005-02-09 Epimmune Inc INDUCTION OF HER2 / NEU CELLULAR IMMUNE RESPONSES USING PEPTIDE AND NUCLEIC ACID-CONTAINING COMPOSITIONS
CA2404260A1 (en) * 2000-03-21 2001-09-27 Elitra Pharmaceuticals, Inc. Identification of essential genes in prokaryotes
IL151860A0 (en) 2000-03-27 2003-04-10 Technion Res & Dev Foundation Single chain class i major histocompatibility complexes, constructs encoding same and methods of generating same
US20040191260A1 (en) 2003-03-26 2004-09-30 Technion Research & Development Foundation Ltd. Compositions capable of specifically binding particular human antigen presenting molecule/pathogen-derived antigen complexes and uses thereof
US7834146B2 (en) * 2000-05-08 2010-11-16 Monsanto Technology Llc Recombinant polypeptides associated with plants
AU7524601A (en) 2000-06-05 2001-12-17 Sunol Molecular Corp T cell receptor fusions and conjugates and methods of use thereof
AU2002365187A1 (en) * 2001-11-07 2003-07-24 Mannkind Corporation Epitope synchronization in antigen presenting cells
US6992176B2 (en) 2002-02-13 2006-01-31 Technion Research & Development Foundation Ltd. Antibody having a T-cell receptor-like specificity, yet higher affinity, and the use of same in the detection and treatment of cancer, viral infection and autoimmune disease
AU2003216341A1 (en) 2002-02-20 2003-09-09 Dyax Corporation Mhc-peptide complex binding ligands
CA2501870C (en) 2002-10-09 2013-07-02 Avidex Limited Single chain recombinant t cell receptors
PT1558643E (pt) 2002-11-09 2009-08-24 Immunocore Ltd Apresentação de um receptor das células t
GB0304068D0 (en) 2003-02-22 2003-03-26 Avidex Ltd Substances
KR100692416B1 (ko) 2003-05-26 2007-03-09 학교법인 배재학당 Ｆａｆ1 단편 및 그를 함유하는 종양 전이 억제제
US20050261190A1 (en) 2004-04-29 2005-11-24 Sk Corp. Fas associated factor 1
US7314630B2 (en) * 2005-01-07 2008-01-01 Yao-Xiong Hu Compounds and methods of early diagnosis of cervical cancer and genital condyloma with HPV, CHSP60 tumor suppressor H-Ras, K-Ras and PTEN derived peptides modified
SI1806358T1 (sl) 2005-09-05 2010-06-30 Immatics Biotechnologies Gmbh S tumorjem povezani peptidi ki se promiskuitetnovežejo na molekule humanega levkocitnega antigena HLA razreda II
CN103864893B (zh) * 2007-07-27 2017-01-04 伊玛提克斯生物技术有限公司 免疫疗法的免疫抗原表位
EP2113253B1 (en) 2008-04-30 2010-03-31 Immatics Biotechnologies GmbH Novel formulations of tumour-associated peptides binding to human leukocyte antigen (HLA) class I or II molecules for vaccines
GB201004551D0 (en) * 2010-03-19 2010-05-05 Immatics Biotechnologies Gmbh NOvel immunotherapy against several tumors including gastrointestinal and gastric cancer
GB201006360D0 (en) 2010-04-16 2010-06-02 Immatics Biotechnologies Gmbh Method for differentially quantifying naturally processed HLA-restricted peptides for cancer, autoimmune and infectious diseases immunotherapy development
KR101224466B1 (ko) * 2010-05-20 2013-01-22 가톨릭대학교 산학협력단 토포아이소머라아제 2 알파 유래의 종양항원 단백질, 유전자, 또는 펩타이드
EP2632955A1 (en) 2010-10-26 2013-09-04 Technion Research & Development Foundation Ltd. Antibodies which bind soluble t-cell receptor ligands
WO2013057586A1 (en) 2011-10-19 2013-04-25 Oslo Universitetssykehus Hf Compositions and methods for producing soluble t - cell receptors
GB201411037D0 (en) * 2014-06-20 2014-08-06 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel immunotherapy against several tumors of the blood, in particular chronic lymphoid leukemai (CLL)

Also Published As

Publication number Publication date
PL3140319T3 (pl) 2020-02-28
EA202090751A3 (ru) 2020-10-30
JP2017524337A (ja) 2017-08-31
US20180311330A1 (en) 2018-11-01
PT3140319T (pt) 2019-10-15
CA2946349A1 (en) 2015-11-12
SI3140319T1 (sl) 2019-11-29
EA202090751A2 (ru) 2020-07-31
ES2747734T3 (es) 2020-03-11
HUE045177T2 (hu) 2019-12-30
US10286052B2 (en) 2019-05-14
EP3604327A1 (en) 2020-02-05
KR20170003976A (ko) 2017-01-10
TWI668230B (zh) 2019-08-11
EA201692103A1 (ru) 2017-04-28
CR20160531A (es) 2017-04-27
EP3140319B1 (en) 2019-07-10
JP6659582B2 (ja) 2020-03-04
US20150320848A1 (en) 2015-11-12
GB201408255D0 (en) 2014-06-25
TW201920246A (zh) 2019-06-01
AU2020200066A1 (en) 2020-01-30
BR112016025035A2 (pt) 2017-10-24
EA035456B1 (ru) 2020-06-18
WO2015169945A3 (en) 2016-02-04
WO2015169945A2 (en) 2015-11-12
AU2015257652B2 (en) 2019-10-10
AU2015257652A1 (en) 2016-09-29
US10064924B2 (en) 2018-09-04
CN106459167A (zh) 2017-02-22
EP3140319A2 (en) 2017-03-15
ME03565B (me) 2020-07-20
MA49287A (fr) 2020-02-05
EP3449937A1 (en) 2019-03-06
MA39907B1 (fr) 2019-09-30
LT3140319T (lt) 2019-09-25
MA39907A (fr) 2017-03-15
SG11201608332SA (en) 2016-11-29
MA49280A (fr) 2019-03-06
DK3140319T3 (en) 2019-09-23
TW201625676A (zh) 2016-07-16
MX2016014711A (es) 2017-10-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10875892B2 (en) Immunotherapy against several tumors of the blood, in particular chronic lymphoid leukemia (CLL)
US10286052B2 (en) Immunotherapy against several tumors of the blood, such as acute myeloid leukemia (AML)
EP3157549B1 (en) Novel immunotherapy against several tumors of the blood, in particular chronic lymphoid leukemia (cll)
US10898562B1 (en) Immunotherapy against several tumors of the blood, such as acute myeloid leukemia (AML)
HK40023054A (en) Novel immunotherapy against several tumors of the blood, such as acute myeloid leukemia (aml)
HK40005505A (en) Novel immunotherapy against several tumors of the blood, such as acute myeloid leukemia (aml)
HK1232240B (en) Novel immunotherapy against several tumors of the blood, such as acute myeloid leukemia (aml)
HK1236424A1 (en) Novel immunotherapy against several tumors of the blood, in particular chronic lymphoid leukemia (cll)
HK1236424B (en) Novel immunotherapy against several tumors of the blood, in particular chronic lymphoid leukemia (cll)