Deprecated: The each() function is deprecated. This message will be suppressed on further calls in /home/zhenxiangba/zhenxiangba.com/public_html/phproxy-improved-master/index.php on line 456
RS59541B1 - Metodi lečenja kancera - Google Patents
[go: Go Back, main page]

RS59541B1 - Metodi lečenja kancera - Google Patents

Metodi lečenja kancera

Info

Publication number
RS59541B1
RS59541B1 RS20191374A RSP20191374A RS59541B1 RS 59541 B1 RS59541 B1 RS 59541B1 RS 20191374 A RS20191374 A RS 20191374A RS P20191374 A RSP20191374 A RS P20191374A RS 59541 B1 RS59541 B1 RS 59541B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
compound
subject
cells
cancer
tumor
Prior art date
Application number
RS20191374A
Other languages
English (en)
Inventor
Sarah K Knutson
Natalie Warholic
Heike Keilhack
Original Assignee
Epizyme Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Epizyme Inc filed Critical Epizyme Inc
Publication of RS59541B1 publication Critical patent/RS59541B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/14—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing three or more hetero rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4412—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/4523—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4545—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems containing a six-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pipamperone, anabasine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A61K31/5377—1,4-Oxazines, e.g. morpholine not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. timolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D211/00—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings
    • C07D211/04—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D211/80—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D211/84—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms, with at the most one bond to halogen directly attached to ring carbon atoms
    • C07D211/86—Oxygen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
    • C07D405/12—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Diabetes (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Predmetni pronalazak odnosi se uopšteno na oblast lečenja kancera i, posebno, lečenje kancera udruženog sa SWI/SNF kompleksom (tj., SWI/SNF-posredovani kancer). Tačnije, predmetni pronalazak obezbeđuje metode i kompozicije koji leče, preveniraju, smanjuju ili na drugi način ublažavaju simptome kancera udruženog sa SWI/SNF kompleksom.
OSNOV PRONALASKA
[0002] Enzimi koji modifikuju hromatin (npr., EZH2) udruženi sa bolešću, imaju ulogu u oboljenjima kao što su proliferativni poremećaji i poremećaji krvi. Prema tome, postoji potreba za razvijanjem malih molekula koji mogu da modulišu aktivnost EZH2.
KRATAK OPIS PRONALASKA
[0003] Predmetni pronalazak obezbeđuje inhibitor EZH2 za upotrebu u lečenju epiteloidnog sarkoma, kako je navedeno u patentnim zahtevima. Na primer, SWI/SNF-udruženi kancer karakteriše se smanjenom ekspresijom i/ili gubitkom funkcije SWI/SNF kompleksa, ili jedne ili više komponenti SWI/SNF kompleksa.
[0004] Na primer, jedna ili više komponenti biraju se iz grupe koja se sastoji od SNF5, ATRX, i ARID1A.
[0005] Na primer, gubitak funkcije prouzrokovan je mutacijom gubitka funkcije, koja je rezultat tačkaste mutacije, delecije i/ili insercije.
[0006] Na primer, subjekat ima deleciju SNF5.
[0007] U ovom tekstu opisan je subjekt koji ima mutaciju ATRX odabranu iz grupe koja se sastoji od supstitucije rezidue divljeg tipa, lizina (K), na aminokiselinskoj poziciji 688 SEQ ID NO: 5 asparaginom (N) (K688N), i supstitucije rezidue divljeg tipa, metionima (M) na aminokiselinskoj poziciji 366 SEQ ID NO: 5 izoleucinom (I) (M366I).
[0008] U ovom tekstu opisan je subjekt koji ima mutaciju ARID1A ATRX odabranu iz grupe koja se sastoji od besmislene mutacije umesto rezidue divljeg tipa, cisteina (C) na aminokiselinskoj poziciji 884 SEQ ID NO: 11 (C884*), supstitucije rezidue divljeg tipa, glutaminske kiseline (E) lizinom (K) na aminokiselinskoj poziciji 966 (E966K), besmislene mutacije umesto rezidue divljeg tipa, glutamina (Q) na aminokiselinskoj poziciji 1411 SEQ ID NO: 11 (Q1411*), mutacije pomaka u ramu čitanja umesto rezidue divljeg tipa, fenilalanina (F) na aminokiselinskoj poziciji 1720 SEQ ID NO: 11 (F1720fs), mutacije pomaka u ramu čitanja posle rezidue divljeg tipa, glicina (G) na aminokiselinskoj poziciji 1847 SEQ ID NO: 11 (G1847fs), mutacije pomaka u ramu čitanja na mestu rezidue divljeg tipa, cisteina (C) na aminokiselinskoj poziciji 1874 SEQ ID NO: 11 (C1874fs), supstituciji rezidue divljeg tipa, asparaginske kiseline (D) na aminokiselinskoj poziciji 1957 glutaminskom kiselinom (E) (D1957E), besmislene mutacije umesto rezidue divljeg tipa, glutamina (Q) na aminokiselinskoj poziciji 1430 SEQ ID NO: 11 (Q1430*), mutacije pomaka u ramu čitanja na mestu rezidue divljeg tipa, arginina (R) na aminokiselinskoj poziciji 1721 SEQ ID NO: 11 (R1721fs), supstituciji rezidue divljeg tipa, glicina (G) na aminokiselinskoj poziciji 1255 glutaminskom kiselinom (E) (G1255E), mutacije pomaka u ramu čitanja na mestu rezidue divljeg tipa, glicina (G) na aminokiselinskoj poziciji 284 SEQ ID NO: 11 (G284fs), besmislene mutaciji umesto rezidue divljeg tipa, arginina (R), na aminokiselinskoj poziciji 1722 SEQ ID NO: 11 (R1722*), mutacije pomaka u ramu čitanja na mestu rezidue divljeg tipa, metionina (M) na aminokiselinskoj poziciji 274 SEQ ID NO: 11 (M274fs), mutacije pomaka u ramu čitanja na mestu rezidue divljeg tipa, glicina (G) na aminokiselinskoj poziciji 1847 SEQ ID NO: 11 (G1847fs), mutacije pomaka u ramu čitanja na mestu rezidue divljeg tipa, P na aminokiselinskoj poziciji 559 SEQ ID NO: 11 (P559fs), besmislene mutacije umesto rezidue divljeg tipa, arginina (R), na aminokiselinskoj poziciji 1276 SEQ ID NO: 11 (R1276*), mutacije pomaka u ramu čitanja na mestu rezidue divljeg tipa, glutamina (G) na aminokiselinskoj poziciji 2176 SEQ ID NO: 11 (Q2176fs), mutacije pomaka u ramu čitanja na mestu rezidue divljeg tipa, histidina (H) na aminokiselinskoj poziciji 203 SEQ ID NO: 11 (H203fs), mutacije pomaka u ramu čitanja na mestu rezidue divljeg tipa, alanina (A) na aminokiselinskoj poziciji 591 SEQ ID NO: 11 (A591fs), besmislene mutacije umesto rezidue divljeg tipa, glutamina (Q) na aminokiselinskoj poziciji 1322 SEQ ID NO: 11 (Q1322*), besmislene mutacije umesto rezidue divljeg tipa, serina (S) na aminokiselinskoj poziciji 2264 SEQ ID NO: 11 (S2264*), besmislene mutacije umesto rezidue divljeg tipa, glutamina (Q) na aminokiselinskoj poziciji 586 SEQ ID NO: 11 (Q586*), mutacije pomaka u ramu čitanja na mestu rezidue divljeg tipa, glutamina (Q) na aminokiselinskoj poziciji 548 SEQ ID NO: 11 (Q548fs), i mutacije pomaka u ramu čitanja na mestu rezidue divljeg tipa, asparagina (N) na aminokiselinskoj poziciji 756 SEQ ID NO: 11 (N756fs).
[0009] U ovom tekstu objavljen je metod lečenja ili ublažavanja simptoma kancera udruženog sa SWI/SNF kod subjekta kojem je to potrebno (a) određivanjem nivoa ekspresije najmanje jednog gena odabranog iz grupe koja se sastoji od gena neuronske diferencijacije, gena inhibicije ćelijskog ciklusa i tumor-supresorskih gena u uzorku dobijenom od subjekta; (b) selektovanjem subjekta sa smanjenim nivoom ekspresije najmanje jednog gena u koraku a; i (c) primenom, kod subjekta odabranog u koraku b, efikasne količine EZH2 inhibitora, čime se leče ili ublažavaju simptomi kancera kod subjekta.
[0010] U ovom tekstu objavljen je metod lečenja ili ublažavanja simptoma kancera udruženog sa SWI/SNF, kod subjekta kojem je to potrebno, (a) određivanjem nivoa ekspresije najmanje jednog gena odabranog iz grupe koja se sastoji od gena hedgehog puta, myc puta i gena za histon metiltransferazu u uzorku dobijenom od subjekta; (b) selektovanjem subjekta sa povećanim nivoom ekspresije najmanje jednog gena u koraku a; i (c) primenom, kod subjekta odabranog u koraku b, efikasne količine EZH2 inhibitora, čime se kod subjekta leče ili ublažavaju simptomi kancera.
[0011] Na primer, gen neuronske diferencijacije je CD133, DOCK4, ili PTPRK.
[0012] Na primer, gen inhibicije ćelijskog ciklusa je CKDN1A ili CDKN2A.
[0013] Na primer, tumor-supresorski gen je BIN1.
[0014] Na primer, gen hedgehog puta je GLI1 ili PTCH1.
[0015] Na primer, gen myc puta je MYC.
[0016] Na primer, gen za histon metiltransferazu je EZH2.
[0017] U ovom tekstu objavljen je metod indukovanja neuronske diferencijacije, inhibicije ćelijskog ciklusa ili supresije tumora dovođenjem u kontakt ćelije sa EZH2 inhibitorom. Količina EZH2 inhibitora može biti dovoljna da se poveća ekspresija najmanje jednog gena odabranog iz grupe koja se sastoji od CD133, DOCK4, PTPRK, CKDN1A, CDKN2A i BIN1.
[0018] U ovom tekstu objavljen je metod inhibiranja hedgehog signalizacije dovođenjem u kontakt ćelije sa EZH2 inhibitorom. Količina EZH2 inhibitora može biti dovoljna za smanjenje ekspresije GLI1 i/ili PTCH1.
[0019] U ovom tekstu objavljen je metod indukovanja ekspresije gena dovođenjem u kontakt ćelije sa EZH2 inhibitorom. Količina EZH2 inhibitora može biti dovoljna da indukuje diferencijaciju neurona, inhibiciju ćelijskog ciklusa i/ili supresiju tumora. Na primer, gen može biti CD133, DOCK4, PTPRK, CKDN1A, CKDN2A ili BIN1.
[0020] U ovom tekstu objavljen je metod inhibiranja genske ekspresije dovođenjem u kontakt ćelije sa EZH2 inhibitorom. Količina EZH2 inhibitora dovoljna je za inhibiranje hedgehog signalizacije. Na primer, gen može biti GLI1 ili PTCH1.
[0021] Na primer, ćelija može imati gubitak funkcije SNF5, ARID1A, ATRX, i/ili komponente SWI/SNF kompleksa.
[0022] Na primer, gubitak funkcije izazvan je delecijom SNF5.
[0023] EZH2 inhibitor je Jedinjenje A koje ima sledeću formulu:
njegovi stereoizomeri ili farmaceutski prihvatljive soli ili solvati istog.
[0024] Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni izrazi upotrebljeni u ovom tekstu imaju ono značenje koje razume stručnjak prosečno obučen u oblasti kojoj pronalazak pripada. U specifikaciji, izrazi u jednini uključuju i množinu, ukoliko kontekst jasno ne nalaže drugačije. Iako se u izvođenju ili testiranju predmetnog pronalaska mogu koristiti metodi i materijali slični ili ekvivalentni opisanima u ovom tekstu, pogodni metodi i materijali opisani su u nastavku ovog teksta. Reference navedene u ovom tekstu nisu priložene da bi predstavljale stanje tehnike zahtevanog pronalaska. U slučaju konflikta, važiće predmetna specifikacija, uključujući definicije. Pored toga, materijali, metodi i primeri dati su samo kao ilustracija i nisu namenjeni ograničavanju pronalaska.
[0025] Druge osobine i prednosti pronalaska biće očigledne na osnovu detaljnog opisa i patentnih zahteva koji slede.
KRATAK OPIS SLIKA
[0026]
Slike 1A i 1B predstavljaju niz Western blot analiza ćelijskih linija sa divljim tipom (RD i SJCRH30) i mutantnim SNF5.
Slike 2A-2E predstavljaju niz grafikona koji prikazuju da SNF5 mutantne ćelijske linije A204 (C), G401 (D) i G402 (E) selektivno odgovaraju na EZH2 jedinjenje (Jedinjenje E) u poređenju sa ćelijskim linijama divljeg tipa RD (A) i SJCRH30 (B).
Slike 3A-3D predstavljaju niz grafikona sa stubićima, koji pokazuju da G401 SNF mutantna ćelijska linija odgovara na Jedinjenje E posle 7 dana na suvom agaru, u poređenjuu sa ćelijama divljeg tipa RD. A prikazuje ćelijsku liniju RD (5.000 ćelija/bunarčiću). B prikazuje G401 ćelije (5.000 ćelija/bunarčiću). C prikazuje G401 ćelije u 2D rastu. D prikazuje G401 ćelije (10.000 ćelija/bunarčiću).
Slike 4A-4D predstavljaju četiri grafikona koji prikazuju da su G401 SNF5 mutantne ćelijske linije osetljive na Jedinjenje A in vitro. Ćelijska linija divljeg tipa SJCRH30 (A) i RD (C) i SNF5 mutantna ćelijska linija G401 (B) i A204 (D) prethodno su tretirane tokom 7 dana navedenim koncentracijama Jedinjenja A i ponovo zasejane na dan 0. Vijabilnost ćelija određivana je CellTiter-Glo® testom vijabilnosti ćelija baziranim na luminiscenciji.
Slike 5A-5D predstavljaju niz grafikona koji pokazuju trajnu regresiju u G401 ksenograftima (model malignog rabdoidnog tumora) uz tretman Jedinjenjem A. (A) Regresija tumora indukovana Jedinjenjem A u naznačenim dozama. (B) Regresija tumora indukovana primenom, dva puta dnevno, Jedinjenja A u naznačenim dozama. Podaci prikazuju srednje vrednosti ± SEM (n=8). Primena jedinjenja prekida se na dan 28. (C) EZH2 cilja inhibiciju u G401 ksenograftskom tumorskom tkivu sakupljenom iz paralelnog kohorta miševa na dan 21. Svaka tačka prikazuje odnos H3K27Me3 prema ukupnom H3. Horizontalne linije predstavljaju srednje vrednosti za grupu. BLLQ = ispod donje granice kvantifikacije. (D, E) Imunohistohemijsko bojenje metilacije tumorskog histona iz uzoraka tumora miševa tretiranih prenosnikom (D) i miševa tretiranih Jedinjenjem A (E) (u dozi od 125 mg/kg).
Slika 6 predstavlja grafikon koji prikazuje lokacije ATRX mutacija identifikovanih u SCLC ćelijskim linijama.
Slika 7A predstavlja grafikon koji prikazuje da LNCAP ćelije kancera prostate ispoljavaju dozno zavisnu inhibiciju ćelijskog rasta uz tretman Jedinjenjem E in vitro.
Slika 7B predstavlja grafikon koji priazuje IC50vrednost Jedinjenja E na dan 11 i dan 14, za ćelije WSU-DLCL2 i LNCAP.
Slike 8A-8C predstavljaju tri grafikona koja potvrđuju da ATRX mutantne SCLC linije NCI-H446 (A), SW1271 (B) i NCIH841 (C) odgovaraju na Jedinjenje E.
Slike 9A-9C predstavljaju tri slike sa mikroskopa koje prikazuju da SCLC linija NCI-H841 menja morfologiju posle tretmana prenosnikom ili (A) ili Jedinjenjem E u koncentraciji od 4.1E-02 uM (B) ili 3.3 uM (C).
Slike 10A-10C predstavljaju niz grafikona koji prikazuju efekte Jedinjenja A na ćelijsku globalnu metilaciju histona i vijabilnost ćelija. (A) Hemijska struktura Jedinjenja A. (B) Koncentraciono zavisna inhibicija ćelijskih nivoa H3K27Me3 u G401 i RD ćelijama. (C) Selektivna inhibicija proliferacije SMARCB1-deletovanih G401 ćelija Jedinjenjem A in vitro (mereno preko sadržaja ATP). G401 (paneli a i b) i RD ćelija (paneli c i d) su ponovo zasejane pri originalnoj gustini zassejavanja na dan 7. Svaka tačka predstavlja srednju vrednost za određenu koncentraciju (n=3).
Slike 11A i 11B predstavljaju niz grafikona koji prikazuju biohemijske studije mehanizma dejstva. IC50vrednost Jedinjenja A raste sa porastom koncentracije SAM (A) i na nju minimalno utiče porast koncentracije oligonukleozoma (B), što ukazuje na SAM-kompetitivan i nukleozom-nekompetitivan mehanizam dejstva.
Slike 12A i 12B predstavljaju niz panela kojima se verifikuje ekspresija SMARCB 1 i EZH2 u ćelijskim linijama, kao i specifičnost Jedinjenja A u inhibiciji ćelijske metilacije histona. (A) Lizati ćelija analizirani su imunoblotom uz korišćenje antitela specifičnih za SMARCB 1, EZH2 i aktin (kontrola količine nanetih proteina). (B) Selektivna inhibicija ćelijske metilacije H3K27 u G401 i RD ćelijama. Ćelije su inkubirane sa Jedinjenjem A tokom 4 dana, i kiselinom ekstrahovani histoni analizirani su imunoblotom.
Slike 13A i 13B predstavljaju niz grafikona sa stubićima koji prikazuju da Jedinjenje A indukuje zastoj u G1 fazi i apoptozu SMARCB1-deletovanih MRT ćelija. Analiza ćelijskog ciklusa (protočnom citometrijom) i određivanje apoptoze (TUNEL testom) u RD (panel A) ili G401 ćelijama (panel B) tokom inkubacije sa prenosnikom ili 1 μM Jedinjenja A u trajanju od 14 dana. Zastoj u G1 fazi zapažen je 7. dana, a apoptoza je indukovana 11. dana. Podaci su prikazani kao srednje vrednosti ± SEM (n=2). Prikazane vrednosti DMSO kontrole predstavljjau srednju vrednost ± SEM u svakoj tački vremena. Ćelije se razdvoje i ponovo zaseju na dane 4, 7 i 11 pri originalnoj gustini zasejavanja.
Slike 14A-14B predstavljaju niz grafikona koji prikazuju da Jedinjenje A indukuje promene ekspresije SMARCB 1 regulisanih gena i ćelijske morfologije. (A) Bazalna ekspresija SMARCB 1 regulisanih gena u G401 SMARCB1-deletovanim ćelijama, u odnosu na kontrolne RD ćelije (mereno korišćenjem qPCR, n=2). (B) G401 i RD ćelije inkubirane su sa DMSO ili sa 1 μM Jedinjenja A, tokom 2, 4 i 7 dana. Ekspresija gena određena je pomoću qPCR (n=2) i izražena je relativno u odnosu na DMSO kontrolu za svaku tačku vremena. Paneli a-j odgovaraju genima GLI1, PTCh1, DOCK4, CD133, PTPRK, BIN1, CDKN1A, CDKN2A, EZH2, odnosno MYC. (C) G402 ćelije inkubirane su sa DMSO (levi panel) ili sa 1 μM Jedinjenja A (desni panel) tokom 14 dana. Ćelije su razdvojene i ponovo zasejane pri originalnoj gustini zasejavanja, na dan 7.
Slike 15A-15D predstavljaju niz grafikona koji prikazuju telesne težine, regresiju tumora i nivoe u plazmi, kod miševa koji nose G401 ksenograft, i koji su tretirani Jedinjenjem A. (A) Telesna težina je merena dva puta nedeljeno, za životinje tretirane Jedinjenjem A, po rasporedu BID, tokom 28 dana. Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SEM (n=16 do dana 21, n=8 od dana 22 do 60). (B) Regresija tumora indukovana primenom Jedinjenja A dva puta dnevno tokom 21 dana, u navedenim dozama (srednje vrednosti ± SEM, n=16). * p <0.05, ** p < 0.01, ANOVA za ponavljana merenja, Dunnettov post-test vs. prenosnik. (C) Težine tumora 8 miševa eutanaziranih na dan 21. **** p < 0.0001, Fisherov test tačne verovatnoće. (D) Plazma je sakupljena 5 min pre i 3 h posle doziranja Jedinjenja A na dan 21, i nivoi jedinjenja mereni su korišćenjem LC-MS/MS. Životinje su eutanazirane, i tumori su uzeti 3 h posle doziranja na dan 21. Napravljeni su homogenati tumora i podvrgnuti LC-MS/MS analizi da bi se odredile koncentracije Jedinjenja A. Treba primetiti da nivoi jedinjenja u tumoru nisu mogli da se odrede za sve životinje posebno u grupama tretiranim višim dozama jer su ksenografti bili premali na dan 21. Tačke predstavljaju vrednosti za pojedinačne životinje; horizontalne linije predstavljaju srednje vrednosti za grupe.
Slike 16A-16C predstavljaju niz grafikona koji prikazuju da Jedinjenje A iskorenjuje SMARCB1-deletovane MRT ksenografte kod SCID miševa. (A) Regresija tumora indukovana primenom Jedinjenja A dva puta dnevno (BID) tokom 28 dana u navedenim dozama. Primena jedinjenja prekinuta je na dan 28 i ostavljeno je da tumori ponovo počnu da rastu do dostizanja 2000 mm3 (podaci su prikazani kao srednje vrednosti ± SEM, n=8). (B) EZH2 ciljana inhibicija u G401 ksenograftskom tumorskom tkivu sakupljenom od miševa eutanaziranih na dan 21. Svaka tačka prokazuje odnos H3K27Me3 prema ukupnom H3, mereno korišćenjem ELISA. Horizontalne linije predstavljaju srednje vrednosti za grupe; sivi simboli su vrednosti izvan standardne krive ELISA. (C) Promena u ekspresiji gena u G401 ksenograftskom tumorskom tkivu sakupljenom od miševa tretiranih Jedinjenjem A tokom 21 dana. Paneli a-d odgovaraju genima CD133, PTPRK, DOCK4, odnosno GLI. Podaci prikazuju koliko puta je vrednost promenjena u poređenju sa prenosnikom ± SEM (n=6, n=4 za 500 mg/kg grupi). * p < 0.05, ** p < 0.01, **** p < 0.0001, vs. prenosnik, Fisherov test tačne verovatnoće.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0027] Predmetni pronalazak delom se zasniva na otkriću da EZH2 inhibitori mogu efikasno da leče SWI/SNF-udružene kancere koji se karakterišu izmenjenom ekspresijom i/ili gubitkom funkcije određenih biomarkera ili gena. Specifično, tumori ili tumorske ćelije, koji imaju izmenjenu ekspresiju i/ili gubitak funkcije odabranih biomarkera ili gena osetljivi su na EZH2 inhibitore predmetnog pronalaska. Prema tome, predmetni pronalazak obezbeđuje EZH2 inhibitor za upotrebu u lečenju epiteloidnog sarkoma, kako je definisano u patentnim zahtevima. U ovom tekstu objavljeni su metodi lečenja ili ublažavanja simptoma kancera kod subjekta, primenom terapijski efikasne količine EZH2 inhibitora kod subjekta, posebno lečenja kancera udruženih sa izmenjenom ekspresijom i/ili gubitkom funkcije određenih biomarkera ili gena. Na primer, biomarker je jedna komponenta SWI/SNF kompleksa. Na primer, gen se bira iz grupe koja se sastoji od gena neuronske diferencijacije, gena koji inhibiraju ćelijski ciklus, tumor-supresorskih gena, gena hedgehog puta, gena myc puta i gena za histon metilatransferazu.
[0028] SWI/SNF kompleks kod ljudi uključuje evoluciono konzervirane sržne podjedinice i varijantne podjedinice. Evoluciono konzervirane sržne podjedinice uključuju SNF5 (nazvanu i SMARCB1, INI1 i BAF47), SMARCA4 (poznatu i kao BRM/SWI2-srodan gen 1, BRG1), BAF155, i BAF170. Varijantne subjedinice uključuju BAF53 (A ili B), BAF60 (A, B ili C), BAF 57, BAF45 (A, B, C, ili D). Druge podjedinice uključuju ARIDI1A (poznatu i kao SMARCF1), ARID1B, SMARCA2 (poznatu i kao brahma homolog, BRM), ATRX, BAF200, BAF180 (poznatu i kao PBRM1), i bromodomen-sadržavajući 7 (bromodomaincontaining 7, BRD7). Najmanje jedna komponenta SWI/SNF kompleksa može biti bilo koja komponenta kompleksa, na primer, komponenta/podjedinica opisana u ovom tekstu ili poznata u struci.
[0029] U svakom od metoda prikazanih u ovom tekstu, gen diferencijacije nurona može biti, ali se ne ograničava na CD133 (nazvan i PROM1), DOCK4, PTPRK, PROM2, LHX1, LHX6, LHX9, PAX6, PAX7, VEFGA, FZD3B, FYN, HIF1A, HTRA2, EVX1, CCDC64, ili GFAP.
[0030] U svakom od metoda prikazanih u ovom tekstu, gen za inhibiciju ćelijskog ciklusa može biti, ali se ne ograničava na CKDN1A, CDKN2A, MEN1, CHEK1, IRF6, ALOX15B, CYP27B1, DBC1, NME6, GMNN, HEXIM1, LATS1, MYC, HRAS, TGFB1, IFNG, WNT1, TP53, THBS1, INHBA, IL8, IRF1, TPR, BMP2, BMP4, ETS1, HPGD, BMP7, GATA3, NR2F2, APC, PTPN3, CALR, IL12A, IL12B, PML, CDKN2B, CDKN2C, CDKN1B, SOX2, TAF6, DNA2, PLK1, TERF1, GAS1, CDKN2D, MLF1, PTEN, TGFB2, SMAD3, FOXO4, CDK6, TFAP4, MAP2K1, NOTCH2, FOXC1, DLG1, MAD2L1, ATM, NAE1, DGKZ, FHL1, SCRIB, BTG3, PTPRK, RPS6KA2, STK11, CDKN3, TBRG1, CDC73, THAP5, CRLF3, DCUN1D3, MYOCD, PAF1, LILRB1, UHMK1, PNPT1, USP47, HEXIM2, CDK5RAP1, NKX3-1, TIPIN, PCBP4, USP44, RBM38, CDT1, RGCC, RNF167, CLSPN, CHMP1A, WDR6, TCF7L2, LATS2, RASSF1, MLTK, MAD2L2, FBXO5, ING4, ili TRIM35.
[0031] U svakom od metoda prikazanih u ovom tekstu, tumor-supresorski gen može biti, ali se ne ograničava na BIN1. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "tumor-supresorski gen" ima značenje koje je uobičajeno u struci, tj., gen čija ekspresija i normalna funkcija suprimiraju neoplastični fenotip ili indukuju apoptozu, ili oba. U nekim primerima izvođenja, tumorsupresorski geni uključuju gene koji inhibiraju ćelijski ciklus. Primeri kategorija tumorsupresora baziranih na njihovoj funkciji uključuju, ali se ne ograničavju na:
(1) gene koji inhibiraju ćelijski ciklus;
(2) gene koji koji povezuju ćelijski ciklus sa oštećenjem DNK. Kada u ćeliji postoji oštećenje DNK, ćelija ne bi trebalo da se deli. Ako oštećenje može da se reparira, ćelijski ciklus može da se nastavi. Ako oštećenje ne može da se reparira, ćelija bi trebalo da inicira apoptozu (programiranu ćelijsku smrt);
(3) geni koji preveniraju rasejavanje tumorskih ćelija, blokiraju gubitak kontaktne inhibicije i inhibiraju metastaziranje. Ovi geni i proteini koje oni kodiraju poznati su i kao supresori metastaza; i
(4) proteini za reparaciju DNK. Mutacije u ovim genima povećavaju rizik za kancer.
[0032] U svakom od metoda prikazanih u ovom tekstu, gen hedgehog signalnog puta može biti, ali se ne ograničava na GLI1, PTCH1, SUFU, KIF7, GLI2, BMP4, MAP3K10, SHH, TCTN3, DYRK2, PTCHD1, ili SMO.
[0033] U svakom od metoda prikazanih u ovom tekstu, gen myc puta može biti, ali se ne ograničava na MYC NMI, NFYC, NFYB, ciklin T1, RuvB-like 1, GTF2I, BRCA1, T-ćelijski limfom-invazija i metastaza-indukujući protein 1, ACTL6A, PCAF, MYCBP2, MAPK8, Bcl-2, protein inicijacije transkripcije SPT3-homolog, SAP130, DNMT3A, mothers against decapentaplegic homolog 3, MAX, mothers against decapentaplegic homolog 2, MYCBP, HTATIP, ZBTB17, transformacija/transkripcija domen-udruženi protein, TADA2L, PFDN5, MAPK1, TFAP2A, P73, TAF9, YY1, SMARCB1, SMARCA4, MLH1, EP400 ili let-7.
[0034] U svakom od metoda prikazanih u ovom tekstu, gen za histon metiltransferazu može biti, ali se ne ograničava na EZH2.
[0035] Jedinjenja objavljena u ovom tekstu inhibiraju histon metiltransferaznu aktivnost EZH2 ili njegovog mutanta i, prema tome, jedinjenja objavljena u ovom tekstu su kandidati za lečenje ili prevenciju određenih stanja i oboljenja. U ovom tekstu objavljeni su metodi lečenja, prevencije ili ublažavanja simptoma kancera ili prekanceroznog stanja. Metod uključuje primenu, kod subjekta kojem je to potrebno, terapijski efikasne količine jedinjenja objavljenog u ovom tekstu, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, polimorfa, solvata, ili stereoizomera. Primeri kancera koji se mogu lečiti uključuju epiteloidni sarkom. Alternativno, kanceri koji će se lečiti jedinjenjima su ne-NHL kanceri.
[0036] U ovom tekstu opisana je upotreba ovde objavljenog jedinjenja, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, polimorfa ili solvata, za lečenje kancera ili prekancera, ili za pripremanje medikamenta korisnog za lečenje takvog kancera ili prekancera. Primeri kancera koji se mogu lečiti uključuju epiteloidni sarkom.
[0037] Jedinjenja objavljena u ovom tekstu mogu se koristit za modulisanje metilacije proteina (npr., histona), npr., za modilisanje histon metiltransferazne ili histon demetilazne enzimske aktivnosti. Jedinjenja objavljena u ovom tekstu mogu se koristit in vivo ili in vitro za modulisanje metilacije proteina. Na osnovu iznenađujućeg otkrića da je regulacija metilacije putem EZH2 uključena u formiranje tumora, posebno tumora koji nose izmenjenu ekspresiju i/ili gubitak funkcije odabranih biomarkera/gena, jedinjenja opisana u ovom tekstu pogodna su kandidati za lečenje ovih oboljenja, tj., za smanjenje metilacije ili vraćanje nivoa metilacije na približno isti nivo kakav je u odgovarajućim normalnim ćelijama.
[0038] Jedinjenja objavljena u ovom tekstu mogu selektivno inhibirati proliferaciju tumora ili tumorskih ćelija udruženu sa SWI/SNF kompleksom (kao što je pokazano na Slikama 1-9). Prema tome, u ovom tekstu objavljeni su metodi lečenja, prevencije ili ublažavanja simptoma kancera ili prekanceroznog stanja udruženog sa SWI/SNF kompleksom, jedinjenjem objavljenim u ovom tekstu, ili njegovom farmaceutski prihvatljivom solju, polimorfom ili solvatom. U ovom tekstu objavljena je upotreba jedinjenja ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, polimorfa ili solvata za lečenje kancera udruženih sa SWI/SNF kompleksom ili za pripremanje medikamenta korisnog za lečenje takvog kancera.
[0039] U ovom tekstu objavljeni su metodi određivanja odgovora subjekta koji ima kancer na EZH2 inhibitor. Metod uključuje korake dobijanja uzorka (uzorak nukleinske kiseline ili uzorak proteina) od subjekta i detektovanje smanjene ekspresije, haploinsuficijencije i/ili gubitka funkcije najmanje jedne komponente SWI/SNF kompleksa, detektovanje ekspresije i/ili funkcije ove komponente, i prisustvo takve smanjene ekspresije, haploinsuficijencije i/ili gubitka funkcije ukazuje na to da subjekt odgovara na inhibitor EZH2. Izraz "uzorak" označava svaki biološki uzorak poreklom iz subjekta, i uključuje, ali se ne ograničava na ćelije, uzorke tkiva, telesne tečnosti (uključujući ali ne ograničavajući se na mukus, krv, plazmu, serum, urin, salivu i semenu tečnost), tumorske ćelije i tumorska tkiva. Uzorci se mogu dobiti od subjekta koji se leči ili testira. Alternativno uzorke može dobiti lekar, u skladu sa uobičajenom praksom u struci
[0040] U ovom tekstu objavljeni su metodi određivanja predispozicije subjekta za kancer ili prekancerozno stanje dobijanjem uzorka od subjekta i detektovanjem smanjene ekspresije haploinsuficijencije i/ili gubitka funkcije najmanje jedne komponente SWI/SNF kompleksa i prisustvo takve smanjene ekspresije, haploinsuficijencije i/ili gubitka funkcije ukazuje na to da je subjekt predisponiran (tj., ima veći rizik) da razvije kancer ili prekancerozno stanje u poređenju sa subjektom koji nema takav gubitak funkcije najmanje jedne komponente SWI/SNF kompleksa.
[0041] Izraz "predisponiran" kako se koristi u ovom tekstu u vezi sa kancerom ili prekanceroznim stanjem treba razumeti da označava povećanu verovatnoću (npr., najmanje 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, veći porast verovatnoće) da subjekt sa smanjenom ekspresijom, haploinsuficijencijom i/ili gubitkom funkcije najmanje jedne komponente SWI/SNF kompleksa oboli od kancera ili prekanceroznog stanja, u poređenju sa verovatnoćom da će drugi subjekt koji nema smanjenu ekspresiju, haploinsuficijenciju i/ili gubitak funkcije najmanje jedne komponente SWI/SNF kompleksa oboleti od kancera ili prekanceroznog stanja, pod uslovima u kojima su drugi faktori rizika (npr., hemijski/sredinski, ishrana pušenje) za kancer ili prekancerozno stanje, za dva subjekta, isti.
[0042] "Rizik" u kontekstu predmetne objave, odnosi se na verovatnoću da će se događaj desiti u okviru specifičnog vremenskog perioda i može označavati subjektov "apsolutni" rizik ili "relativni" rizik. Apsolutni rizik može se meriti pozivajući se na kohort koji se zaista posmatra posle merenja, tokom relevantnog vremena, ili pozivajući se na indeksne vrednosti razvijene na osnovu statistički validnih istorijskih kohorta koji su bili praćeni tokom relevantnog vremenskog perioda. Relativni rizik odnosi se na odnos apsolutnog rizika subjekta u poređenju sa apsolutnim rizikom kohorta sa malim rizikom ili prosečnim populacionim rizikom, koji može varirati zavisno od toga kako se procenjuju klinički faktori rizika. Nejednaka verovatnoća, proporcija pozitivnih događaja prema negativnim događajima za dati testni rezultat, takođe se obično koriste (verovatnoće su prema formuli p/(1-p), gde je p verovatnoća događaja i (1- p) je verovatnoća da do događaja neće doći) za nekonverziju.
[0043] Prema tome, u ovom tekstu objavljuju se personalizovana medicina, lečenje i/ili kontrola kancera kod subjekta genetičkim skriningom smanjene ekspresije, haploinsuficijencije i/ili gubitka funkcije najmanje jedne komponente SWI/SNF kompleksa kod subjekta. Na primer, u ovom tekstu objavljuju se metodi lečenja, prevencije ili ublažavanja simptoma kancera ili prekanceroznog stanja određivanje odgovora subjekta na EZH2 inhibitor i, kada subjekt odgovara na EZH2 inhibitor, primene kod subjekta terapijski efikasne količine EZH2 inhibitora, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata ili stereoizomera. Odgovor se određuje dobijanjem uzorka od subjekta i detektovanjem smanjene ekspresije, haploinsuficijencije i/ili gubitka funkcije najmanje jedne komponente SWI/SNF kompleksa (na primer SNF5, ARID1A ili ATRX), i prisustvo takvog gubitka funkcije ukazuje na to da subjekt odgovara na EZH2 inhibitor.
[0044] U drugom primeru, u ovom tekstu su objavljeni metodi upravljanja kancerom kod subjekta, periodičnim određivanjem predispozicije subjekta za kancer ili prekancerozno stanje. Metodi uključuju korake dobijanja uzorka od subjekta i detektovanja smanjene ekspresije, haploinsuficijencije i/ili gubitka funkcije najmanje jedne komponente SWI/SNF kompleksa, i prisustvo takve smanjene ekspresije, haploinsuficijencije i/ili gubitka funkcije ukazuje na to da je subjekt predisponiran da razvije kancer ili prekancerozno stanje u poređenju sa subjektom bez takve smanjene ekspresije, haploinsuficijencije i/ili gubitka funkcije najmanje jedne komponente SWI/SNF kompleksa.
[0045] U svrhu ilustrovanja, metodi lečenja prikazani u ovom tekstu uključuju korake (a) prikupljanja uzorka nukleinske kiseline ili uzorka proteina iz biološkog uzorka dobijenog od subjekta, (b) merenja nivoa ekspresije ili nivoa funkcije komponente SWI/SNF kompleksa u uzorku, (c) merenja nivoa ekspresije ili nivoa funkcije komponente SWI/SNF kompleksa u kontrolnom uzorku; (d) upoređivanja nivoa ekspresije ili nivoa funkcije komponente, merene u koraku (b) u testiranom uzorku sa nivoom ekspresije ili nivoom funkcije komponente, merene u koraku (c) u kontrolnom uzorku (ili referentnom vrednošću); (e) identifikovanja subjekta kao kandidata za lečenje kada je nivo ekspresije ili nivo funkcije komponente, meren u koraku (b) smanjen ili izgubljen (npr., haploinsuficijencija ili gubitak funkcije) u poređenju sa nivoom ekspresije ili nivoom funkcije funkcije komponente merenim u koraku (c); i (f) primene terapijski efikasne količine EZH2 inhibitora kod subjekta identifikovanog u koraku (e) ili odabira režima lečenja subjekt identifikovanog u koraku (e). Nivo ekspresije ili nivo funkcije komponente u subjektovom uzorku smanjen je, na primer, 10%, 25%, 50% ili 1-, 2-, 5- ili više puta u poređenju sa sa nivoom ekspresije ili nivoom funkcije komponente u kontrolnom uzorku. Svaki pogodan metod poznat u struci može se upotrebiti za merenje nivoa ekspresije ili nivoa funkcije komponente SWI/SNF kompleksa. U nekim primerima izvođenja, komponeta je SNF5, ARID1A ili ATRX.
[0046] Na primer, identifikovani subjekt može se lečiti standardnim merama lečenja kako je opisano u najnovijem vodiču National Comprehensive Cancer Network (NCCN).
[0047] Na primer, kontrolni uzorak se dobija od zdravog, normalnog subjekta. Alternativno kontrolni uzorak se dobija od subjekta koji nije oboleo, kojem nije dijagnostikova niti je pod rizikom da razvije kancer udružen sa SWI/SNF kompleksom.
[0048] U ovom tekstu objavljen je metod lečenja ili ublažavanja simptoma kancera kod subjekta određivanjem odgovora subjekta na EZH2 inhibitor i primenom kod subjekta terapijski efikasne količine EZH2 inhibitora ako subjekt odgovara na EZH2 inhibitor i subjekt ima kancer odabran iz grupe koja se sastoji od kancera mozga i CNS, kancera bubrega, kancera ovarijuma, kancera pankreasa, leukemije, limfoma, mijeloma i/ili sarkoma. Takav odgovor se određuje dobijanjem uzorka od subjekta i detektovanjem smanjene ekspresije, haploinsuficijencije i/ili gubitka funkcije SNF5, ARID1A, i/ili ATRX, i prisustvo smanjene ekspresije, haploinsuficijencije i/ili gubitka funkcije ukazuje da subjekt odgovara na EZH2 inhibitor.
[0049] Bez želje za teorijskim ograničavanjem, jedinjenje objavljeno u ovom tekstu specifično inhibira ćelijsku H3K27 metilaciju dovodeći do selektivnog apoptotskog ubijanja SMARCB1 mutantnih MRT ćelija. Na primer, in vitro tretman SMARCB1-deletovanih MRT ćelijskih linija Jedinjenjem A indukuje snažne antiproliferativne efekte sa IC50vrednostima nM opsegu; dok je uticaj na kontrolne (divlji tip) ćelijske linije minimalan (Slika 10C i tabela 6). Pored toga, jedinjenje objavljeno u ovom tekstu indukuje gene neuronske diferencijacije, inhibicije ćelijskog ciklusa i supresije tumora, dok suprimira ekspresiju gena hedgehog puta, MYC i EZH2. Na primer, tretman Jedinjenjem A treatment G401 SMARCB1-deletovanih ćelija u trajanju od najviše 7 dana snažno indukuje ekspresiju CD133, DOCK4 i PTPRK i pozitivno reguliše inhibitore ćelijskog ciklusa CDKN1A i CDKN2A i tumor-supresor BIN1, sve na način zavisan od vremena (Slika 14B). U isto vreme, ekspresija gena hedgehog puta, MYC i EZH2 bile su smanjene. Važno je reći da, G402 SMARCB1-deletovane ćelije izložene Jedinjenju A u trajanju od 14 dana simuliraju morfologiju sličnu neuronima (Slika 14C).
[0050] Prema tome, u ovom tekstu objavljeni su metodi lečenja ili ublažavanja simptoma kancera kod subjekta kojem je to potrebno (a) određivanjem nivoa ekspresije najmanje jednog gena odabranog iz grupe koja se sastoji od gena diferencijacije neurona, gena inhibicije ćelijskog ciklusa i tumor-supresorskih gena u uzorku dobijenom od subjekta; (b) selektovanjem subjekta sa smanjenim nivoom ekspresije najmanje jednog gena u koraku a; i (c) primenom kod subjekta odabranog u koraku (b) efikasne količine jedinjenja objavljenog u ovom tekstu, čime se leče ili ublažavaju simptomi kancera kod subjekta.
[0051] U ovom tekstu objavljeni su metodi lečenja ili ublažavanja simptoma kancera kod subjekta kojem je to potrebno (a) određivanjem nivoa ekspresije najmanje jednog gena odabranog iz grupe koja se sastoji od gena hedgehog puta, gena myc puta i histon metiltransferaznih gena u uzorku dobijenom od subjekta; (b) selektovanjem subjekta sa smanjenim nivoom ekspresije najmanje jednog gena u koraku a; i (c) primenom kod subjekta odabranog u koraku (b) efikasne količine jedinjenja objavljenog u ovom tekstu, čime se leče ili ublažavaju simptomi kancera kod subjekta.
[0052] U ovom tekstu obezbeđeni su i metodi odabira terapije za kancer kod subjekta kojem je to potrebno (a) određivanjem nivoa ekspresije najmanje jednog gena odabranog iz grupe koja se sastoji od gena neuronske diferencijacije, gena inhibicije ćelijskog ciklusa i tumorsupresorskih gena u uzorku dobijenom od subjekta; i (b) selektovanjem terapije protiv kancera kada subjekat ima smanjenu nivo ekspresije najmanje jednog gena u koraku (a), pri čemu terapija za kancer uključuje primenu efikasne količine jedinjenja objavljenog u ovom tekstu, kod subjekta.
[0053] U ovom tekstu objavljeni su metodi odabira terapije protiv kancera za subjekta kojem je to potrebno (a) određivanjem nivoa ekspresije najmanje jednog gena odabranog iz grupe koja se sastoji od gena hedgehog puta, gena myc puta i histon metiltransferaznih gena u uzorku dobijenom od subjekta i (b) selektovanjem terapije protiv kancera kada subjekat ima povišeni nivo ekspresije najmanje jednog gena u koraku (a), pri čemu terapija protiv kancera uključuje primenu efikasne količine jedinjenja objavljenog u ovom tekstu, kod subjekta.
[0054] U isključivo ilustrativnim primerima, metodi prikazani u ovom tekstu mogu uključivati korake (a) prikupljanja uzorka nukleinske kiseline ili uzorka proteina iz biološkog uzorka dobijenog od subjekta, (b) merenja nivoa ekspresije najmanje jednog gena odabranog iz grupe koja se sastoji od gena diferencijacije neurona, gena inhibicije ćelijskog ciklusa i tumor-supresorskih gena u uzorku, (c) merenja nivoa ekspresije istog/istih gena u kontrolnom uzorku; (d) upoređivanja nivoa ekspresije gena merenih u koraku (b) u testnom uzorku sa nivoom ekspresije gena merenih u koraku (c) u kontrolnom uzorku (ili referentnom vrednošću); (e) identifikovanja subjekta kao kandidata za lečenje kad aje nivo ekspresije komponente merene u koraku (b) smanjen u poređenju sa nivoom ekspresije gena merenog u koraku (c); i (f) primene terapijski efikasne količine EZH2 inhibitora kod subjekta identifikovanog u koraku (e) ili selektovanja režima lečenja za subjekta identifikovanog u koraku (e). Nivo ekspresije gena u testiranom subjektu je smanjen, na primer, 10%, 25%, 50% ili 1-, 2-, 5- ili više puta u poređenju sa nivoom ekspresije gena u kontrolnom uzorku.
[0055] U isključivo ilustrativnim primerima, metodi prikazani u ovom tekstu mogu uključivati korake (a) prikupljanja uzorka nukleinske kiseline ili uzorka proteina iz biološkog uzorka dobijenog od subjekta, (b) merenja nivoa ekspresije najmanje jednog gena odabranog iz grupe koja se sastoji od gena hedgehog puta, gena myc puta i histon metiltransferaznih gena u uzorku, (c) merenja nivoa ekspresije istog/istih gena u kontrolnom uzorku; (d) upoređivanja nivoa ekspresije gena merenih u koraku (b) u testnom uzorku sa nivoom ekspresije gena merenih u koraku (c) u kontrolnom uzorku (ili referentnom vrednošću); (e) identifikovanja subjekta kao kandidata za lečenje kada je nivo ekspresije komponente merene u koraku (b) povišen u poređenju sa nivoom ekspresije gena merenog u koraku (c); i (f) primene terapijski efikasne količine EZH2 inhibitora kod subjekta identifikovanog u koraku (e) ili selektovanja režima lečenja za subjekta identifikovanog u koraku (e). Nivo ekspresije gena u testiranom subjektu je povišen, na primer, 10%, 25%, 50% ili 1-, 2-, 5- ili više puta u poređenju sa nivoom ekspresije gena u kontrolnom uzorku.
[0056] Izraz "nivo ekspresije" odnosi se na nivo proteina, RNK, ili mRNK određenog gena od interesa. Svaki od metoda poznatih u struci može se upotrebiti za određivanje nivoa ekspresije određenog gena od interesa. Primeri uključuju, ali se ne ograničavaju na testove reverzne transkripcije i amplifikacije (kao što su PCR, ligaciona RT-PCR ili kvantitativna RTPCT), testove hibridizacije, Northern blotting, dot blotting, in situ hibridizaciju, elektroforezu na gelu, kapilarnu elektroforezu, hromatografiju na koloni, Western blotting, imunohistohemiju, imunobojenje, ili maseni spektrometriju. Testovi se mogu izvesti direktno na biološkim uzorcima ili na proteinu/nukleinskoj kiselini izolovanim iz uzoraka. Izvođenje ovih testova predstavlja rutinsku praksu u struci. Na primer, korak merenja u bilo kojem metodu opisanom u ovom tekstu uključuje dovođenje u kontakt uzorka nukleinske kiseline iz biološkog uzorka dobijenog od subjekta, sa jednim ili više prajmera koji se specifično hibridizuju sa genom od interesa predstavljenim u ovom tekstu. korak merenja u bilo kojem metodu opisanom u ovom tekstu uključuje dovođenje u kontakt uzorka proteina iz biološkog uzorka dobijenog od subjekta, sa jednim ili više antitela koja se vezuju za biomarker od interesa prikazan u ovom tekstu.
[0057] Smanjeni nivo ekspresije određenog gena označava smanjenje njegovog nivoa ekspresije za najmanje 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%,1000%, 1500%, ili više u poređenju sa referentnom vrednošću ili nivoom ekspresije ovog gena merenim u različitom (ili prethodnom) uzorku dobijenom od istog subjekta.
[0058] Povišeni nivo ekspresije određenog gena označava porast njegovog nivoa ekspresije za najmanje 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%,1000%, 1500%, ili više u poređenju sa referentnom vrednošću ili nivoom ekspresije ovog gena merenim u različitom (ili prethodnom) uzorku dobijenom od istog subjekta.
[0059] "Referentni ili bazalni nivo/vrednost", kako se koristi u ovom tekstu mogu se upotrebljavati naizmenično i treba da bude relativan u odnosu na broj ili vrednost izvedenim iz populacionih studija, uključujući, bez ograničavanja, subjekte sličnog opsega starosti, stanja bolesti (npr., stadijum), subjekte iz iste ili slične etničke grupe, ili relativan u odnosu na početni uzorak subjekta koji je podvrgnut lečenju kancera. Takve referentne vrednosti mogu se izvesti iz statističkih analiza i/ili podataka o predikciji rizika za populacije, dobijenih matematičkim algoritmima i izračunatim indeksima kancera. Isto tako, referentni indeksi mogu da se konstruišu i koriste upotrebom algoritama i drugih metoda statističke i strukturne klasifikacije.
[0060] U ovom tekstu je objavljeno da referentna ili bazalna vrednost može biti nivo ekspresije određenog gena od interesa u kontrolnom uzorku poreklom iz jednog ili više zdravih subjekata ili subjekata kojima nije dijagnostikovana nijedna vrsta kancera.
[0061] U ovom tekstu je objavljeno da referentna ili bazalna vrednost može biti nivo ekspresije određenog gena od interesa u uzorku dobijenom od istog subjekta pre bilo kojeg načina lečenja kancera. U ovom tekstu je objavljeno da referentna ili bazalna vrednost može biti nivo ekspresije određenog gena od interesa u uzorku dobijenom od istog subjekta tokom lečenja kancera. Alternativno, referentna ili bazalna vrednost je prethodno merenje nivo ekspresije određenog gena od interesa u ranije dobijenom uzorku iz istog subjekta ili iz subjekta koji je slične starosti, stanja bolesti (npr., stadijum) sa testiranim subjektom.
[0062] U ovom tekstu je objavljeno da efikasna količina može označavati količinu koja je dovoljna da poveća nivo ekspresije najmanje jednog gena koji je smanjen kod subjekta pre lečenja ili količinu koja je dovoljna da ublaži jedan ili više simptoma kancera. Na primer, efikasna količina je količina dovoljna da poveća nivo ekspresije najmanje jednog gena odabranog iz grupe koja se sastoji od gena neuronske diferencijacije, gena inhibicije ćelijskog ciklusa i tumor-supresorskih gena za najmanje 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%,1000%, 1500%, ili više u poređenju sa referentnom vrednošću ili nivoom ekspresije bez lečenja nekim jedinjenjem.
[0063] U ovom tekstu je objavljeno da efikasna količina može označavati količinu koja je dovoljna da smanji nivo ekspresije najmanje jednog gena koji je povišen kod subjekta pre lečenja ili količinu koja je dovoljna da ublaži jedan ili više simptoma kancera. Na primer, efikasna količina je količina dovoljna da smanji nivo ekspresije najmanje jednog gena odabranog iz grupe koja se sastoji od gena hedgehog puta, MYC i EZH2 za najmanje 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%,1000%, 1500%, ili više u poređenju sa referentnom vrednošću ili nivoom ekspresije bez lečenja nekim jedinjenjem.
[0064] Tačna efikasna količina za subjekta zavisiće od telesne težine, veličine i zdravstvenog stanja subjekta; prirode i obima stanja; i terapijskog sredstva odabranog za primenu. Efikasna količina u datoj situaciji može se odrediti rutinskim eksperimentisanjem koje je u okvirima obučenosti i procene kliničara.
[0065] U ovom tekstu objavljen je metod određivanja efikasnosti tretmana protiv kancera kod subjekta kojem je to potrebno (a) merenjem nivoa ekspresije najmanje jednog gena odabranog iz grupe koja se sastoji od gena neuronske diferencijacije, gena inhibicije ćelijskog ciklusa i tumor-supresorskih gena u uzorku dobijenom od subjekta (b) upoređivanjem nivoa ekspresije najmanje jednog gena u koraku (a) sa referentnom vrednošću ili prethodnim merenjem, i (c) određivanjem efikasnosti tretmana protiv kancera na osnovu koraka upoređivanja. Primer lečenja kancera je primena jedinjenja pronalaska kod testiranog subjekta.
[0066] Lečenje je efikasno kada testirani subjekt ima povišenu ekspresiju najmanje jednog gena odabranog iz grupe koja se sastoji od gena diferencijacije neurona, gena inhibicije ćelijskog ciklusa i tumor-supresorskih gena 1) u poređenju sa referentnom vrednošću ili pre merenja; ili 2) tokom perioda vremena kada se prati, na primer 1, 2, 3, 4, 5, 6, ili 7 dana, ili 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 nedelja, ili 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 meseci ili duže. Kada postojeći tretman nije efikasan, za testiranog subjekta je potrebno potražiti novi tretman ili povećanu dozu postojećeg tretmana (na primer povećanu dozu jedinjenja datog subjektu).
[0067] U ovom tekstu objavljen je metod određivanja efikasnosti lečenja kancera kod subjekta kojem je to potrebno (a) merenjem nivoa ekspresije najmanje jednog gena odabranog iz grupe koja se sastoji od gena hedgehog puta, gena myc puta i histon metiltransferaznih gena u uzorku dobijenom od subjekta, (b) upoređivanjem nivoa ekspresije najmanje jednog gena u koraku (a) sa referentnom vrednošću ili prethodnim merenjem, i (c) određivanjem efikasnosti lečenja kancera na osnovu koraka upoređivanja. Primer lečenja kancera je primena EZH2 inhibitora pronalaska kod testiranog subjekta.
[0068] Na primer, lečenje je efikasno kada testirani subjekt ima smanjenu ekspresiju najmanje jednog gena izabranog iz grupe koja se sastoji od gena hedgehog puta, gena myc puta i histon metiltransferaznih gena genes 1) u poređenju sa referentnom vrednošću ili prethodnim merenjem; ili 2) tokom perioda vremena kada je praćen, na primer 1, 2, 3, 4, 5, 6, ili 7 dana, ili 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 nedelja, ili 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 meseci ili duže. Kada postojeći tretman nije efikasan, za testiranog subjekta je potrebno potražiti novi tretman ili povećanu dozu postojećeg tretmana (na primer povećanu dozu jedinjenja datog subjektu).
[0069] U svim metodima predstavljenim u ovom tekstu, kancer je epiteloidni sarkom.
[0070] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "odgovaranje" koristi se naizmenično sa izrazima "koji odgovara", "osetljiv/senzitivan" i "osetljivost/senzitivnost", i znači da subjekt pokazuje terapijske odgovore kada mu se daje EZH inhibitor, npr., tumorske ćelije ili tumorska tkiva subjekta podležu apoptozi i/ili nekrozi, i/ili ispoljavaju smanjen rast, deobe ili proliferaciju. Ovaj izraz takođe znači da će subjekt pokazati ili da će sa većom verovatnoćom u odnosu na opštu populaciju pokazati terapijske odgovore na primenu EZH inhibitora, npr., tumorske ćelije ili tumorska tkiva subjekta podležu apoptozi i/ili nekrozi, i/ili ispoljavaju smanjen rast, deobe ili proliferaciju.
[0071] Kako se koristi u ovom tekstu, "subjekt" se koristi naizmenično sa "subjekt kojem je to potrebno", a oba izraza se odnose na subjekta koji ima poremećaj u kojem ulogu ima EZH2-posredovana metilacija proteina, ili subjekt ima povećan rizik da razvije takav poremećaj u odnosu na opštu populaciju. Subjekt kojem je to potrebno može biti subjekt koji ima poremećaj udružen sa SWI/SNF kompleksom. Subjekt kojem je to potrebno može imati prekancerozno stanje. Poželjno, subjekt kojem je to potrebno ima kancer. Subjekt kojem je to potrebno može imati kancer udružen sa SWI/SNF kompleksom. Subjekt kojem je to potrebno može može imati kancer udružen sa gubitkom funkcije najmanje jedne komponente SWI/SNF kompleksa. U poželjnom aspektu, subjekt kojem je to potrebno ima jedan ili više kancera odabrana iz grupe koja se sastoji od epiteloidnog sarkoma.
[0072] Kako se koristi u ovom tekstu,"subjekt" uključuje sisara. Sisar može biti, npr., ćovek ili drugi odgovarajući sisar kao što je primat, miš, pacov, pas, mačka, krava, konj, koza, kamila, ovca ili svinja. Subjekt može biti i ptica ili živina. U jednom primeru izvođenja, sisar je čovek. Subjekt može biti muškog ili ženskog pola.
[0073] Subjekt kojem je to potrebno može biti onaj kojem ranije nije postavljena dijagnoza ili koji nije ranije bio identifikovan da ima kancer ili prekancerozno stanje. Subjekt kojem je to potrebno može biti onaj kojem je ranije postavljena dijagnoza ili koji je ranije bio identifikovan da ima kancer ili prekancerozno stanje. Subjekt kojem je to potrebno može biti i onaj ko ima (pati od) kancera ili prekanceroznog stanja. Alternativno, subjekt kojem je to potrebno može biti onaj koji ima rizik da razvije takav poremećaj relativno u odnosu na opštu populaciju (tj., subjekt koji ima predispoziciju da razvije takav poremećaj u odnodu na opštu populaciju).
[0074] Opciono, subjekt kojem je to potrebno već je podvrgnut, trenutno je podvrgnut ili će biti podvrgnut, bar jednoj terapijskoj intervenciji protiv kancera ili prekanceroznog stanja.
[0075] Subjekt kojem je to potrebno može imati kancer refraktoran na najskoriju terapiju. "Refraktorni kancer" označava kancer koji ne odgovara na lečenje. Kancer može biti rezistentan na lečenje ili može postati rezistentan tokom lečenja. Refraktorni kancer se naziva i rezistentni kancer. U nekim primerima izvođenja, subjekt kojem je to potrebno ima rekurenciju kancera posle remisije na najskorijoj terapiji. U nekim primerima izvođenja, subjekt kojem je to potrebno primao je i nije odgovarao ni na jednu poznatu efikasnu terapiju za lečenje kancera. U nekim primerima izvođenja, subjekt kojem je to potrebno primao je najmanje jednu raniju terapiju.
[0076] Subjekt je onaj koji je imao, ima ili je predisponiran da razvije epiteloidni sarkom.
[0077] U ovom tekstu, objavljeno je da subjekt kojem je to potrebno može imati smanjeni nivo ekspresije najmanje jednog gena odabranog iz grupe koja se sastoji od gena neuronske diferencijacije, gena inhibicije ćelijskog ciklusa i tumor-supresorskih gena.
[0078] U ovom tekstu, objavljeno je da subjekt kojem je to potrebno može imati povišen nivo ekspresije najmanje jednog gena odabranog iz grupe koja se sastoji od gena hedgehog puta, gena myc puta i histon metiltransferaznih gena.
[0079] U ovom tekstu, objavljeno je da subjekt kojem je to potrebno može imati gubitak funkcije najmanje jedne komponente/podjedinice SWI/SNF kompelksa. Alternativno, subjekt kojem je to potrebno ima smanjenu ekspresiju ili haploinsuficijenciju najmanje jedne komponente/subjedinice SWI/SNF kompleksa. U određenim primerima izvođenja, subjekt kojem je to potrebno ima gubitak funkcije SNF5 podjedinice.
[0080] U bilo kojem metodu objavljenom u ovom tekstu, subjekt kojem je to potrebno može imati sniženu ekspresiju, haploinsuficijenciju ili gubitak funkcije najmanje jedne signalne komponente nishodno od of SWI/SNF kompleksa. Takva nishodna komponenta uključuje ali se ne ograničava na polycomb kompleks (PcG) i njegove ciljeve.
[0081] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "gubitak funkcije" odnosi se na smanjenje ili gubitak funkcije genskog proizvoda/proteina u poređenju sa divljim tipom. Gubitak funkcije komponete SWI/SNF kompleksa znači da komponenta/podjedinica ili ceo SWI/SNF kompleks imaju manju ili nemaju biološku funkciju u poređenju sa divljim tipom komponente/podjedinice ili čitavog SWI/SNF kompleksa, respektivno. Gubitak funkcije može biti izazvan transkripcionim, posttranskripcionim ili posttranslacionim mehanizmima. Na primer, gubitak funkcije je izazvan mutacijom gubitka funkcijekoaj je rezultat tačkaste mutacije (npr., supstitucije, mutacije pogrešnog smisla ili besmislene mutacije), insercije, i/ili delecije u polipeptidu komponente SWI/SNF kompleksa ili sekvenci nukelinske kiseline koja kodira polipeptid komponente SWI/SNF kompleksa. Mutacije pomenute u ovom tekstu su somatske mutacije. Izraz "somatske mutacije" odnosi se na štetne promenenajmanje jednog genskog alela koji se ne nalazi u svim ćelijama u telu, nego se nalazi samo u izolovanim ćelijama.. Karakteristika somatkih mutacija, kako se koristi u ovom tekstu, je ta što su ograničene na određena tkiva ili čak delove tkiva ili ćelije u tkivu i nisu prisutne u celom organizmu koji nosi ta tkiva ili ćelije. Izraz "divlji tip" odnosi se na gen ili genski porizvod koji iam karakteristike tog gena ili genskog proizvoda kada se izoluje iz izvora u kojem se prirodno nalazi. Divlji tip gena je onaj koji se najčešće sreće u populaciji i arbitrarno se označava kao "normalni" ili "divlji tip" forme gena.
[0082] Prema tome, mutacija gubitka funkcije ili smanjene ekspresije može se detektovati korišćenjem bilo kojeg metoda raspoloživog u struci. Na primer, mutacija gubitka funkcije može se detektovati merenjem biološke funkcije genskog proizvoda, kao što je aktivnost SWI/SNF kompleksa u ATP-zavisnom remodeliranju hromatina. Alternativno, mutacija gubitka funkcije može se odrediti detektovanjem izmene u sekvenci nukleinske kiseline koja kodira komponentu SWI/SNF kompleksa. Na primer, sekvenci nukleinske kiseline koja kodira komponentu SWI/SNF kompleksa, koja ima mutaciju gubitka funkcije može se detektovati resekvenciranjem celog genoma ili resekvenciranjem ciljnog regiona (ovo drugo poznato je i kao ciljno resekvenciranje) korišćenjem pogodnog izvora DNK i prajmera za lančanu reakciju polimeraze (polymerase chain reaction, PCR) u skladu sa metodima koji su dobro poznati u struci. Metod tipično i uopšteno zahteva korake prečišćavanja genomske DNK, PCR amplifikacije da bi se amplifikovao region od interesa, ciklično sekvenciranje, pročišćavanje reakcije sekvenciranja, kapilarne elektroforeze i/ili analize podataka. Alternativno ili dodatno, metod može uključivati upotrebu imobilisanja i/ili sekvenciranja ciljnog regiona genomske DNK baziranu na upotrebi mikročipa. Kitovi, reagensi i metodi za izbor odgovarajućih PCR prajmera i izvođenje resekvenciranja mogu se komercijalno nabaviti, na primer od Applied Biosystems, Agilent, i NimbleGen (Roche Diagnostics GmbH). Alternativno ili dodatno, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira SWI/SNF polipeptid sa mutacijom gubitka funkcije može se detektovati korišćenjem Southern blota u skladu sa metodima dobro poznatim u struci. Opciono, mutacija gubitka funkcije može se detektovati merenjem odsustva ekspresije polipeptidne komponente ili merenjem ekspresije mutantne polipeptidne komponente. Detektovanje ekspresije (mutantnog) polipeptida može se obaviti bilo kojim pogodnim imunotestom poznatim u struci, na primer Western blot analizom.
[0083] Sekvenca nukleinske kiseline i proteinska sekvenca koomponenti humanog SWI/SNF kompleksa ranije su opisane. Vidi, npr., GenBank pristupni br. NP_003064.2, NM_003073.3, NP_001007469.1, i NM_001007468.1 za SNF5, GenBank pristupni br. NM_000489.3, NP_000480.2, NM_138270.2, i NP_612114.1 za ATRX, GenBank pristupni br. NP_006006.3, NM_006015.4, NP_624361.1, i NM_139135.2 za ARID1A.
[0084] Spektar hSNF5 somatskih mutacija kod ljudi opisan je i u Sevenet et al., Human Molecular Genetics, 8: 2359-2368, 1999.
[0085] Subjekt kojem je to potrebno, može imati smanjenu ekspresiju, haplinsuficijenciju i/ili gubitak funkcije SNF5. Na primer, subjekt može imati deleciju SNF5 u SNF5 polipeptidnoj sekvenci ili u sekvenci nukelinske kiseline koja kodira SNF5 polipeptid.
[0086] Subjekt kojem je to potrebno može imati smanjenu ekspresiju, haploinsuficijenciju i/ili gubitak funkcije ATRX. Na primer, subjekt može imati mutaciju odabranu iz grupe koja se sastoji od supstitucije asparaginom (N) rezidue divljeg tipa, lizina (K), na aminokiselinskoj poziciji 688 SEQ ID NO: 5 (K688N), i supstituciju izoleucinom (I) rezidue divljeg tipa metionina (M) na aminokiselinskoj poziciji 366 SEQ ID NO: 5 (M366I).
[0087] Subjekt kojem je to potrebno može imati smanjenu ekspresiju, haploinsuficijenciju i/ili gubitak funkcije ARID1A. Na primer, subjekt može uključivati mutaciju odabranu iz grupe koja se sastoji od besmislene mutacije umesto rezidue divljeg tipa, cisteina (C) na aminokiselinskoj poziciji 884 SEQ ID NO: 11 (C884*), supstitucije rezidue divljeg tipa, glutaminske kiseline (E) lizinom (K) na aminokiselinskoj poziciji 966 (E966K), besmislene mutacije umesto rezidue divljeg tipa, glutamina (Q) na aminokiselinskoj poziciji 1411 SEQ ID NO: 11 (Q1411*), mutacije pomaka u ramu čitanja umesto rezidue divljeg tipa, fenilalanina (F) na aminokiselinskoj poziciji 1720 SEQ ID NO: 11 (F1720fs), mutacije pomaka u ramu čitanja posle rezidue divljeg tipa, glicina (G) na aminokiselinskoj poziciji 1847 SEQ ID NO: 11 (G1847fs), mutacije pomaka u ramu čitanjana mestu rezidue divljeg tipa, cisteina (C) na aminokiselinskoj poziciji 1874 SEQ ID NO: 11 (C1874fs), supstitucije rezidue divljeg tipa asparaginske kiseline (D) na aminokiselinskoj poziciji 1957 glutaminskom kiselinom (E) (D1957E), besmislene mutacije umesto rezidue divljeg tipa, glutamina (Q) na aminokiselinskoj poziciji 1430 SEQ ID NO: 11 (Q1430*), mutacije pomaka u ramu čitanja na mestu rezidue divljeg tipa, arginina (R) na aminokiselinskoj poziciji 1721 SEQ ID NO: 11 (R1721fs), supstituciji rezidue divljeg tipa, glicina (G) na aminokiselinskoj poziciji 1255 glutaminskom kiselinim (E) (G1255E), mutacije pomaka u ramu čitanja na mestu rezidue divljeg tipa, glicina (G) na aminokiselinskoj poziciji 284 SEQ ID NO: 11 (G284fs), besmislene mutaciji umesto rezidue divljeg tipa, arginina (R), na aminokiselinskoj poziciji 1722 SEQ ID NO: 11 (R1722*), mutacije pomaka u ramu čitanja na mestu rezidue divljeg tipa, metionina (M) na aminokiselinskoj poziciji 274 SEQ ID NO: 11 (M274fs), mutacije pomaka u ramu čitanja na mestu rezidue divljeg tipa, glicina (G) na aminokiselinskoj poziciji 1847 SEQ ID NO: 11 (G1847fs), mutacije pomaka u ramu čitanja na mestu rezidue divljeg tipa, P na aminokiselinskoj poziciji 559 SEQ ID NO: 11 (P559fs), besmislene mutacije umesto rezidue divljeg tipa, arginina (R), na aminokiselinskoj poziciji 1276 SEQ ID NO: 11 (R1276*), mutacije pomaka u ramu čitanja na mestu rezidue divljeg tipa, glutamina (G) na aminokiselinskoj poziciji 2176 SEQ ID NO: 11 (Q2176fs), mutacije pomaka u ramu čitanja na mestu rezidue divljeg tipa, histidina (H) na aminokiselinskoj poziciji 203 SEQ ID NO: 11 (H203fs), mutacije pomaka u ramu čitanja na mestu rezidue divljeg tipa, alanina (A) na aminokiselinskoj poziciji 591 SEQ ID NO: 11 (A591fs), besmislene mutacije umesto rezidue divljeg tipa, glutamina (Q) na aminokiselinskoj poziciji 1322 SEQ ID NO: 11 (Q1322*), besmislene mutacije umesto rezidue divljeg tipa, serina (S) na aminokiselinskoj poziciji 2264 SEQ ID NO: 11 (S2264*), besmislene mutacije umesto rezidue divljeg tipa, glutamina (Q) na aminokiselinskoj poziciji 586 SEQ ID NO: 11 (Q586*), mutacije pomaka u ramu čitanja na mestu rezidue divljeg tipa, glutamina (Q) na aminokiselinskoj poziciji 548 SEQ ID NO: 11 (Q548fs), i mutacije pomaka u ramu čitanja na mestu rezidue divljeg tipa, asparagina (N) na aminokiselinskoj poziciji 756 SEQ ID NO: 11 (N756fs)."*" upotrebljava se ovde da označi stop kodon. "fs" upotrebljava se ovde da označi pomak u ramu čitanja.
[0088] U ovom tekstu objavljeni su metodi indukovanja neuronske diferencijacije dovođenjem u kontakt ćelije sa jedinjenjem (tj., EZH2 inhibitorom) pronalaska. Na primer, jedinjenje je u količini koja je dovoljna da poveća ekspresiju najmanje jednog gena odabranog iz grupe koja se sastoji od CD133 (nazvan još i PROM1), DOCK4, PTPRK, PROM2, LHX1, LHX6, LHX9, PAX6, PAX7, VEFGA, FZD3B, FYN, HIF1A, HTRA2, EVX1, CCDC64 i GFAP.
[0089] Izraz "indukovanje diferencijacije neurona" upotrebljen u ovom tekstu odnosi se na izazivanje ćelije da se razvije u ćeliju neuronske linije, kao rezultat direktnog ili namernog uticaja na ćeliju.
[0090] U ovom tekstu objavljeni su metodi indukovanja inhibicije ćelijskog ciklusa dovođenjem u kontakt ćelije sa jedinjenjem pronalaska. Na primer, jedinjenje je u količini koja je dovoljna da poveća ekspresiju najmanje jednog gena odabranog iz grupe koja se sastoji od CKDN1A, CDKN2A, MEN1, CHEK1, IRF6, ALOX15B, CYP27B1, DBC1, NME6, GMNN, HEXIM1, LATS1, MYC, HRAS, TGFB1, IFNG, WNT1, TP53, THBS1, INHBA, IL8, IRF1, TPR, BMP2, BMP4, ETS1, HPGD, BMP7, GATA3, NR2F2, APC, PTPN3, CALR, IL12A, IL12B, PML, CDKN2B, CDKN2C, CDKN1B, SOX2, TAF6, DNA2, PLK1, TERF1, GAS1, CDKN2D, MLF1, PTEN, TGFB2, SMAD3, FOXO4, CDK6, TFAP4, MAP2K1, NOTCH2, FOXC1, DLG1, MAD2L1, ATM, NAE1, DGKZ, FHL1, SCRIB, BTG3, PTPRK, RPS6KA2, STK11, CDKN3, TBRG1, CDC73, THAP5, CRLF3, DCUN1D3, MYOCD, PAF1, LILRB1, UHMK1, PNPT1, USP47, HEXIM2, CDK5RAP1, NKX3-1, TIPIN, PCBP4, USP44, RBM38, CDT1, RGCC, RNF167, CLSPN, CHMP1A, WDR6, TCF7L2, LATS2, RASSF1, MLTK, MAD2L2, FBXO5, ING4 i TRIM35.
[0091] Izraz "indukovanje inhibicije ćelijskog ciklusa" upotrebljen u ovom tekstu odnosi se na izazivanje akumulacije ili zaustavljanja u bilo kojoj fazi tokom ćelijske deobe i/ili duplikacije.
[0092] U ovom tekstu objavljeni su metodi indukovanja supresije tumora dovođenjem u kontakt ćelije sa jedinjenjem pronalaska. Na primer, jedinjenje je u količini dovoljnoj da poveća ekspresiju BIN1 ili bilo kojeg tumorskog supresora.
[0093] Izraz "indukovanje supresije tumora" može uključivati, ali se ne ograničava na smanjenje veličine tumora, smanjenje zapremine tumora, smanjenje broja tumora, smanjenje broja metastatskih lezija u drugim tkivima ili organima udaljenim od mesta primarnog tumora, porast prosečnog vremena preživljavanja populacije tretiranih subjekata u poređenju sa populacijom koja je primala samo nosač, porast prosečnog vremena preživljavanja populacije tretiranih subjekata u poređenju sa populacijom netretiranih subjekata, porast prosečnog vremena preživljavanja populacije tretiranih subjekata u poređenju sa populacijom koja je primala monoterapiju lekom koji nije jedinjenje predmetnog pronalaska, smanjenje stope mortaliteta populacije tretiranih subjekata u poređenju sa populacijom koja je primala samo nosač, smanjenje stope rasta tumora ili smanjenje stope ponovnog rasta tumora.
[0094] U ovom tekstu objavljeni su metodi inhibiranja hedgehog signalizacije dovođenjem u kontakt ćelije sa jedinjenjem pronalaska. Na primer, jedinjenje je u količini dovoljnoj da smanji ekspresiju najmanje jednog gena odabranog iz grupe koja se sastoji od GLI1, PTCH1, SUFU, KIF7, GLI2, BMP4, MAP3K10, SHH, TCTN3, DYRK2, PTCHD1 i SMO.
[0095] Izraz "inhibiranja hedgehog signalizacije" znači da je jačina hedgehog signalizacije (intenzitet) uz tretman jedinjenjem smanjena za najmanje 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%,1000%, 1500%, ili više u poređenju sa jačinom (intenzitetom) hedgehog signalizacije bez ikakvog tretmana jedinjenjem.
[0096] U ovom tekstu objavljeni su metodi indukovanja genske ekspresije dovođenjem u kontakt ćelije sa jedinjenjem pronalaska. Na primer, jedinjenje je u količini dovoljnoj da indukuje neuronsku diferencijaciju, inhibiciju ćelijskog ciklusa i/ili supresiju tumora. Takav gen se bira iz grupe koja se sastoji od CD133 (nazvan još i PROM1), DOCK4, PTPRK, PROM2, LHX1, LHX6, LHX9, PAX6, PAX7, VEFGA, FZD3B, FYN, HIF1A, HTRA2, EVX1, CCDC64, GFAP, CKDN1A, CDKN2A, MEN1, CHEK1, IRF6, ALOX15B, CYP27B1, DBC1, NME6, GMNN, HEXIM1, LATS1, MYC, HRAS, TGFB1, IFNG, WNT1, TP53, THBS1, INHBA, IL8, IRF1, TPR, BMP2, BMP4, ETS1, HPGD, BMP7, GATA3, NR2F2, APC, PTPN3, CALR, IL12A, IL12B, PML, CDKN2B, CDKN2C, CDKN1B, SOX2, TAF6, DNA2, PLK1, TERF1, GAS1, CDKN2D, MLF1, PTEN, TGFB2, SMAD3, FOXO4, CDK6, TFAP4, MAP2K1, NOTCH2, FOXC1, DLG1, MAD2L1, ATM, NAE1, DGKZ, FHL1, SCRIB, BTG3, PTPRK, RPS6KA2, STK11, CDKN3, TBRG1, CDC73, THAP5, CRLF3, DCUN1D3, MYOCD, PAF1, LILRB1, UHMK1, PNPT1, USP47, HEXIM2, CDK5RAP1, NKX3-1, TIPIN, PCBP4, USP44, RBM38, CDT1, RGCC, RNF167, CLSPN, CHMP1A, WDR6, TCF7L2, LATS2, RASSF1, MLTK, MAD2L2, FBXO5, ING4, TRIM35, BIN1 i svaki tumorski supresor.
[0097] Izraz "indukovanje genske ekspresije" označava da je nivo ekspresije određenog gena od interesa povećan za najmanje 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%,1000%, 1500%, ili više u poređenju sa nivoom ekspresije ovog gena bez ikakvog tretmana jedinjenjem.
[0098] U ovom tekstu objavljeni su metodi inhibiranja genske ekspresije koji uključuju dovođenje u kontakt ćelije sa jedinjenjem pronalaska. Na primer, jedinjenje je u količini dovoljnoj da inhibira hedgehog signalizaciju. Takav gen je GLI1, PTCH1, SUFU, KIF7, GLI2, BMP4, MAP3K10, SHH, TCTN3, DYRK2, PTCHD1, ili SMO.
[0099] Izraz "inhibiranje genske ekspresije" znači da je nivo ekspresij određenog gena od interesa smanjen za najmanje 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%,1000%, 1500%, ili više u poređenju sa nivoom ekspresije ovog gena bez ikakvog tretmana jedinjenjem.
[0100] Neuronska diferencijacija, inhibicija ćelijskog ciklusa, tumorska supresija i inhibicija hedgehog signalizacije mogu se odrediti bilo kojim od metoda poznatih u struci.
[0101] Kako se koristi u ovom tekstu, ćelija se odnosi na bilo koju ćeliju koja se može doboti korišćenjem metoda opisanih u ovom tekstu. Na primer, ćelija se može dobiti iz ćelijske kulture. Alternativno, ćelija se može izolovati iz subjekta. Ćelija mže da se odnosi i na ćeliju subjekta.
[0102] Ćelija može imati gubitak funkcije SNF5, ARID1A, ATRX, i/ili komponente SWI/SNF kompleksa. Poželjno, ćelija može imati deleciju SNF5.
[0103] Ćelija može biti kancerska ćelija, pri čemu je kancer epiteloidni sarkom.
[0104] Kancer koji treba da se leči može da se gradira prema klasifikacionom sistemu American Joint Committee on Cancer (AJCC) TNM, gde se tumoru (T) pripisuje stadijum TX, T1, T1mic, T1a, T1b, T1c, T2, T3, T4, T4a, T4b, T4c, ili T4d; i gde se regionalnim limfnim čvorovima (N) pripisuje stadijum NX, N0, N1, N2, N2a, N2b, N3, N3a, N3b, ili N3c; i gde se udaljenim metastazama (M) može pripisati stadijum MX, M0, ili M1. Kancer koji se leči može biti gradiran prema klasifikaciji American Joint Committee on Cancer (AJCC) kao stadijum I, stadijum IIA, stadijum IIB, stadijum IIIA, stadijum IIIB, stadijum IIIC, ili stadijum IV. U skladu sa klasifikacijom AJCC, kanceru koji se leči može biti pripisan stadijum 1, stadijum 2, stadijum 3 ili stadijum 4. Kancer koji se leči može biti gradiran prema patološkoj klasifikaciji AJCC (pN) kao pNX, pN0, PN0 (I-), PN0 (I+), PN0 (mol-), PN0 (mol+), PN1, PN1(mi), PN1a, PN1b, PN1c, pN2, pN2a, pN2b, pN3, pN3a, pN3b, ili pN3c.
[0105] Kancer koji treba da se leči može se evaluirati DNK citometrijom, protočnom citometrijom ili citometrijom sa dobijanjem slike. Kancer koji treba da se leči može da se tipizira kao da ima 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ili 90% ćelija u sintetskom stadijumu ćelijske deobe (npr., u S fazi ćelijske deobe). Kancer koji treba da se leči može da se tipizira kao da ima nisku frakciju S faze ili visoku frakciju S faze.
[0106] Kako se koristi u ovom tekstu, "normalna ćelija" je ćelija koja ne može da se klasifikuje kao deo "ćelijskog proliferativnog poremećaja". Normalna ćelija nema neregulisani ili abnormalni rast, ili oba, što bi moglo dovesti do razvoja neželjenog stanja ili bolesti. Poželjno, normalna ćelija poseduje normalno funkcionišuće mehanizme kontrole tačaka provere ćelijskog ciklusa.
[0107] Kako se koristi u ovom tekstu, "kontakt sa ćelijom" odnosi se na stanje u kojem je jedinjenje ili druga kompozicija od interesa u direktnom kontaktu sa ćelijom ili je dovoljno blizu da indukuje željeni biološki efekat u ćeliji.
[0108] Kako se koristi u ovom tekstu, "monoterapija" se odnosi na primenu jednog aktivnog ili terapijskog jedinjenja kod subjekta kojem je to potrebno. Poželjno, monoterapija će uključiti primenu terapijski efikasne količine aktivnog jedinjenja. Na primer, kancerska monoterapija jednim od jedinjenja predmetnog pronalaska, ili njegovom farmaceutski prihvatljivom solju, polimorfom, solvatom, analogom ili derivatom, kod subjekta kojem je potrebno lečenje kancera. Monoterapija može biti u suprotnosti sa kombinacionom terapijom u kojoj se primenjuje kombinacija više aktivnih jedinjenja, poželjno svaka komponenta kombinacije je prisutna u terapijski efikasnoj količini. U jednom aspektu, monoterapija jedinjenjem predmetnog pronalaska, ili njegovom farmaceutski prihvatljivom solju, polimorfom ili solvatom, efikasnija je nego kombinaciona terapija u indukovanju željenog biološkog efekta.
[0109] Kako se koristi u ovom tekstu, "lečiti" ili "leči" opisuje upravljanje i brigu o pacijentu sa ciljem borbe protiv bolesti, stanja ili poremećaja i uključuje primenu jedinjenja predmetnog pronalaska ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, polimorfa ili solvata, za ublažavanje jednog ili više simptoma ili komplikacija bolesti, stanja ili poremećaja. Izraz "leči/tretira" može uključivati i tretman ćelija in vitro ili životinjski model.
[0110] Jedinjenje objavljeno u ovom tekstu ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, polimorf ili solvat, mogu se koristiti i za prevenciju oboljenja, stanja ili poremećaja, ili se mogu koristiti za identifikovanje pogodnih kandidata za tu namenu. Kako se koristi u ovom tekstu, "preveniranje" ili "prevencija" opisuju smanjenje ili eliminisanje pojave simptoma ili komplikacija bolesti, stanja ili poremećaja.
[0111] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "ublažiti" opisuje proces kojim se jačina znaka ili simptoma poremećaja smanjuje. Važno je napomenuti da znak ili simptom može biti ublažen, a da se ne otkloni. U poželjnom primeru izvođenja, primena farmaceutskih kompozicija pronalaska dovodi do eliminacije znaka ili simptoma, međutim, eliminacija nije obavezna. Očekuje se da efikasne doze smanje jačinu znaka ili simptoma. Na primer, znak ili simptom poremećaja kao što je kancer koji se može naći na više lokacija, ublažen je ako se jačina kancera smanji na bar jednoj od više lokacija.
[0112] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "jačina" opisuje potencijal kancera da se transformiše od prekanceroznog ili benignog stanja u maligno stanje. Alternativno, ili dodatno, jačina treba da opiše stadijum kancera, na primer prema TNM sistemu (prihvaćen od strane International Union Against Cancer (UICC) i American Joint Committee on Cancer (AJCC)) ili drugim metodima poznatim u struci. Stadijum kancera odnosi se na obim ili jačinu kancera, na osnovu faktora kao što su lokacija primarnog tumora, veličina tumora, broj tumora i zahvaćenost limfnih čvorova (širenje kancera u limfne čvorove). Alternativno ili dodatno, jačina opisuje gradus tumora prema metodima poznatim u struci (vidi, National Cancer Institute, www.cancer.gov). Gradacija tumora predstavlja sistem koji se koristi za klasifikovanje kancera u pogledu toga koliko abnormalno izgledaju pod mikroskopom i koliko brzo će tumor verovatno rasti i širiti se. Mnogi faktori se razmatraju kada se određuje gradus tumora, uključujući strukturu i obrazac rasta ćelija. Specifični faktori upotrebljeni za determinisanje gradusa tumora variraju u zavisnosti od tipa kancera. Jačina opisuje i histološki gradus, nazvan još i diferencijacija, što se odnosi na to koliko tumorske ćelije liče na normalne ćelije istog tipa tkiva (vidi, National Cancer Institute, www.cancer.gov). Pored toga, jačina opisuje nukleusni gradus, koji se odnosi na veličinu i oblik nukleusa u tumorskim ćelijama i procenat tumorskih ćelija koje se dele (vidi, National Cancer Institute, www.cancer.gov).
[0113] U ovom tekstu se objavljuje da jačina opisuje stepen do kojeg tumor ima sekretovane faktore, degradira vanćelijski matriks, postaje vaskularizovan, gubi adheziju sa jukstapozicioniranim tkivima, ili metastazira. Pored toga, jačina opisuje broj lokacija na koje je primarni tumor metastazirao. Konačno, jačina uključuje teškoće u lečenju tumora različitih tipova i lokacija. Na primer, inoperabilni tumori, oni kanceri koji imaju bolji pristup većem broju telesnih sistema (hematološki i imunološki tumori), i oni koji su najrezistentniji na tradicionalne načine lečenja, smatraju se za najjače. U ovim situacijama, produžavanje očekivane dužine života subjekta i/ili smanjenje bolasmanjenje proporcije kanceroznih ćelija ili suzbijanje ćelija na jedan sistem, i poboljšanje kancerskog stadijuma, gradusa tumora/histološkog gradusa/nukleusnog gradusa smatraju se za ublažavanje znaka ili simptoma kancera.
[0114] Kako se koristi u ovom tekstu izraz "simptom" definiše se kao indikacija oboljenja, bolesti, povrede ili toga da nešto nije kako treba u telu. Simptomi se osećaju ili primećuju od strane osobe koja oseća simptom, ali drugi ih ne mogu lako zapaziti. Drugi se definišu kao osobe koje nisu profesionalni zdravstveni radnici.
[0115] Kako se koristi u ovom tekstu izraz "znak" takođe se definiše kao indikacija da nešto nije kako treba u telu. Međutim, znaci se definišu kao ono što mogu videti lekar, sestra ili drugi profesionalni zdravstveni radnici.
[0116] Kancer predstavlja grupu oboljenja koja mogu izazvati gotovo svaki znak ili simptom. Znaci i simptomiće zavisiti od od toga gde se kancer nalazi, koja je veličina kancera, i koliko on utiče na susedne organe ili strukture. Ako se kancer širi (metastazira), onda se simprtomi mogu pojaviti u različitim delovima tela.
[0117] Lečenje kancera za rezultat može imati smanjenje veličine tumora. Smanjenje veličine tumora može se označiti i kao "regresija tumora". Poželjno, posle lečenja, veličina tumora smanjena je za 5% ili više u odnosu na njegovu veličinu pre lečenja; poželjnije, veličina tumora smanjena je za 10% ili više; poželjnije, smanjena je za 20% ili više; poželjnije, smanjena je za 30% ili više; poželjnije, smanjena je za 40% ili više; još poželjnije, smanjena je za 50% ili više; i najpoželjnije smanjena je za više od 75% ili više. Veličina tumora može se meriti bilo kojim reproducibilnim načinom merenja. Veličina tumora može se meriti kao prečnik tumora.
[0118] Lečenje kancera za rezultat može imati smanjenje zapremine tumora. Poželjno, posle lečenja zapremina tumora redukovana je za 5% ili više u odnosu na njegovu veličinu pre lečenja; poželjnije, zapremina tumora redukovana je za 10% ili više; poželjnije, smanjena je za 20% ili više; poželjnije, smanjena je za 30% ili više; poželjnije smanjena je za 40% ili više; još poželjnije, smanjena je za 50% ili više; i najpoželjnije smanjena je za više od 75% ili više. Zapremina tumora može se meriti bilo kojim reproducibilnim načinom merenja.
[0119] Lečenje kancera za rezultat ima smanjenje broja tumora. Poželjno, posle lečenja, broj tumora se redukuje za 5% ili više u odnosu na broj pre lečenja; poželjnije, broj tumora se redukuje za 10% ili više; poželjnije, smanjen je za 20% ili više; poželjnije, smanjen je za 30% ili više; poželjnije smanjen je za 40% ili više; još poželjnije smanjen je za 50% ili više; i najpoželjnije smanjen je za više od 75%. Broj tumora može se meriti bilo kojim reproducibilnim načinom merenja. Broj tumora može se meriti brojanjem tumora vidljivih golim okom ili pri specifikovanom uveličanju. Poželjno, specifikovano uveličanje iznosi 2x, 3x, 4x, 5x, 10x, ili 50x.
[0120] Tretiranje kancera za rezultat može imati smanjenje broja metastatskih lezija u drugim tkivima ili organima udaljenim od mesta primarnog tumora. Poželjno, posle lečenja, broj metastatskih lezija smanjen je za 5% ili više u odnosu na broj pre tretmana; poželjnije, broj metastatskih lezija smanjen je za 10% ili više; poželjnije, smanjen je za 20% ili više; poželjnije, smanjen je za 30% ili više; poželjnije, smanjen je za 40% ili više; još poželjnije, smanjen je za 50% ili više; i najpoželjnije, smanjen je za više od 75%. Broj metastatskih lezija može se meriti bilo kojim reproducibilnim načinom merenja. Broj metastatskih lezija može se meriti brojanjem metastatskih lezija vidljivih golim okom ili pri specifikovanom uveličanju. Poželjno, specifikovano uveličanje iznosi 2x, 3x, 4x, 5x, 10x, ili 50x..
[0121] Tretiranje kancera za rezultat može imati porast prosečnog vremena preživljavanja populacije tretiranih subjekata u poređenju sa populacijom koja je primala samo nosač. Poželjno, prosečno vreme preživljavanja povećano je za više od 30 dana; poželjnije, za više od 60 dana; poželjnije, za više od 90 dana; i najpoželjnije, za više od 120 dana. Porast prosečnog vremena preživljavanja populacije može se meriti bilo kojim reproducibilnim načinom merenja. Porast prosečnog vremena preživljavanja populacije može se meriti, na primer, izračunavanjem prosečne dužine preživljavanja za populaciju posle početka tretmana aktivnim jedinjenjem. Porast prosečnog vremena preživljavanja populacije može se meriti, na primer, i izračunavanjem prosečne dužine preživljavanja za populaciju posle završetka prvog ciklusa tretmana aktivnim jedinjenjem.
[0122] Tretiranje kancera za rezultat može imati porast prosečnog vremena preživljavanja populacije tretiranih subjekata u poređenju sa populacijom netretiranih subjekata. Poželjno, prosečno vreme preživljavanja povećano je za više od 30 dana; poželjnije, za više od 60 dana; poželjnije, za više od 90 dana; i najpoželjnije, za više od 120 dana. Porast prosečnog vremena preživljavanja populacije može se meriti bilo kojim reproducibilnim načinom merenja. Porast prosečnog vremena preživljavanja populacije može se meriti, na primer, izračunavanjem prosečne dužine preživljavanja za populaciju posle početka tretmana aktivnim jedinjenjem.
Porast prosečnog vremena preživljavanja populacije može se meriti, na primer, i izračunavanjem prosečne dužine preživljavanja za populaciju posle završetka prvog ciklusa tretmana aktivnim jedinjenjem.
[0123] Tretiranje kancera za rezultat može imati porast prosečnog vremena preživljavanja populacije tretiranih subjekata u poređenju sa populacijom koja prima monoterapiju lekom koji nije jedinjenje predmetnog pronalaska ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, polimorf, solvat, analog ili derivat. Poželjno, prosečno vreme preživljavanja povećano je za više od 30 dana; poželjnije, za više od 60 dana; poželjnije, za više od 90 dana; i najpoželjnije, za više od 120 dana. Porast prosečnog vremena preživljavanja populacije može se meriti bilo kojim reproducibilnim načinom merenja. Porast prosečnog vremena preživljavanja populacije može se meriti, na primer, izračunavanjem prosečne dužine preživljavanja za populaciju posle početka tretmana aktivnim jedinjenjem. Porast prosečnog vremena preživljavanja populacije može se meriti, na primer, i izračunavanjem prosečne dužine preživljavanja za populaciju posle završetka prvog ciklusa tretmana aktivnim jedinjenjem.
[0124] Tretiranje kancera za rezultat može imati smanjenje stope mortaliteta populacije tretiranih subjekata u poređenju sa populacijom koja je primala samo nosač. Tretiranje kancera za rezultat može imati smanjenje stope mortaliteta populacije tretiranih subjekata u poređenju sa netretiranom populacijom. Tretiranje kancera za rezultat može imati smanjenje stope mortaliteta populacije tretiranih subjekata u poređenju sa populacijom koja prima monoterapiju lekom koji nije jedinjenje predmetnog pronalaska ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, polimorf ili solvat. Poželjno, stopa mortaliteta smanjena je za više od 2%; poželjnije za više od 5%; poželjnije za više od 10%; i najpoželjnije za više od 25%. Smanjenje stope mortaliteta populacije tretiranih subjekata bilo kojim reproducibilnim načinom merenja. Smanjenje stope mortaliteta populacije može se meriti, na primer, izračunavanjem prosečnog broja smrtnih slučajeva vezanih za oboljenje, za populaciju, po jedinici vremena, posle početka tretmana aktivnim jedinjenjem. Smanjenje stope mortaliteta populacije može se meriti, na primer, i izračunavanjem prosečnog broja smrtnih slučajeva vezanih za oboljenje, za populaciju, po jedinici vremena posle završetka prvog ciklusa tretmana aktivnim jedinjenjem.
[0125] Tretiranje kancera za rezultat može imati smanjenje stope rasta tumora. Poželjno, posle tretmana, stopa rasta tumora smanjena je za najmanje 5% u odnosu na broj pre tretmana; poželjnije, stopa rasta tumora smanjena je za najmanje 10%; poželjnije, smanjena je za najmanje 20%; poželjnije, smanjena je za najmanje 30%; poželjnije, smanjena je za najmanje 40%; poželjnije, smanjena je za najmanje 50%; još poželjnije smanjena je za najmanje 50%; i najpoželjnije, smanjena je za najmanje 75%. Stopa rasta tumora može se meriti bilo kojim reproducibilnim načinom merenja. Stopa rasta tumora može se meriti kao promena dijametra tumora po jedinici vremena.
[0126] Tretiranje kancera za rezultat može imati smanjenje ponovnog rasta tumora. Poželjno, posle tretmana, ponovni rast tumora manji je za 5%; poželjnije, ponovni rast tumora manji je za 10%; poželjnije manji je za 20%; poželjnije manji je za 30%; poželjnije manji je za 40%; poželjnije manji je za 50%; još poželjnije manji je za 50%; i najpoželjnije, manji je za 75%. Ponovni rast tumora može se meriti bilo kojim reproducibilnim načinom merenja. Ponovni rast tumora može se meriti, na primer, merenjem porasta dijametra tumora posle prethodnog smanjivanja tumora usled tretmana. Smanjenje ponovnog rasta tumora manifestuje se izostankom ponovnog pojavljivanja tumora posle prestanka tretmana.
[0127] Lečenje kancera za rezultat može imati smanjenje stope ćelijske proliferacije. Poželjno, posle lečenja, stopa ćelijske proliferacije smanjena je za najmanje 5%; poželjnije za najmanje 10%; poželjnije za najmanje 20%; poželjnije za najmanje 30%; poželjnije za najmanje 40%; poželjnije za najmanje 50%; još poželjnije za najmanje 50%; i najpoželjnije za najmanje 75%. Stopa ćelijske proliferacije može se meriti bilo kojim reproducibilnim načinom merenja. Stopa ćelijske proliferacije može se meriti, na primer, merenjem broja ćelija u deobi u uzorku tkiva, po jedinici vremena.
[0128] Lečenje kancera za rezultat može imati smanjenje proporcije proliferišućih ćelija. Poželjno, posle lečenja, proporcija proliferišućih ćelija smanjena je za najmanje 5%; poželjnije za najmanje 10%; poželjnije za najmanje 20%; poželjnije za najmanje 30%; poželjnije za najmanje 40%; poželjnije za najmanje 50%; još poželjnije za najmanje 50%; i najpoželjnije za najmanje 75%. Proporcija proliferišućih ćelija može se meriti bilo kojim reproducibilnim načinom merenja. Poželjno, proporcija proliferišućih ćelija meri se, na primer, kvantifikovanjem broja ćelija u deobi u odnosu na broj ćelija koje se ne dele u uzorku tkiva. Proporcija proliferišućih ćelija može biti ekvivalentna mitotičkom indeksu.
[0129] Lečenje kancera za rezultat može imati smanjenje veličine područja ili zone ćelijske proliferacije. Poželjno, posle lečenja veličina područja ili zone ćelijske proliferacije smanjena je za najmanje 5% u odnosu na veličinu pre lečenja; poželjnije, smanjena je za najmanje 10%; poželjnije, smanjena je za najmanje 20%; poželjnije, smanjena je za najmanje 30%; poželjnije, smanjena je za najmanje 40%; poželjnije, smanjena je za najmanje 50%; još poželjnije, smanjena je za najmanje 50%; i najpoželjnije, smanjena je za najmanje 75%. Veličina područja ili zone ćelijske proliferacije može se meriti bilo kojim reproducibilnim načinom merenja. Veličina područja ili zone ćelijske proliferacije može se meriti kao dijametar ili širina područja ili zone ćelijske proliferacije.
[0130] Lečenje kancera za rezultat može imati smanjenje broja ili proporcije ćelija koje imaju abnormalan izgled ili morfologiju. Poželjno, posle lečenja, broj ćelija koje imaju abnormalnu morfologiju smanjen je za najmanje 5% u odnosu na veličinu pre lečenja; poželjnije, smanjen je za najmanje 10%; poželjnije, smanjen je za najmanje 20%; poželjnije, smanjen je za najmanje 30%; poželjnije, smanjen je za najmanje 40%; poželjnije, smanjen je za najmanje 50%; još poželjnije, smanjen je za najmanje 50%; i najpoželjnije, smanjen je za najmanje 75%. Abnormalni izgled ili morfologija ćelija mogu se meriti bilo kojim reproducibilnim načinom merenja. Abnormalna ćelijska morfologija može se meriti mikroskopijom, npr., korišćenjem inverzionog mikroskopa za kulturu tkiva. Abnormalna ćelijska morfologija može zadobiti formu nukleusnog pleomorfizma.
[0131] Lečenje kancera za rezultat može imati ćelijsku smrt, i poželjno, ćelijska smrt rezultuje smanjenjem od najmanje 10% u broju ćelija u populaciji. Poželjnije, ćelijska smrt znači smanjenje od najmanje 20%; poželjnije, smanjenje od najmanje 30%; poželjnije, smanjenje od najmanje 40%; poželjnije, smanjenje od najmanje 50%; najpoželjnije, smanjenje od najmanje 75%. Broj ćelija u populaciji može se meriti bilo kojim reproducibilnim načinom merenja. Broj ćelija u populaciji može se meriti sortiranjem ćelija aktiviranih fluorescencijom (fluorescence activated cell sorting, FACS), imunofluorescentnom mikroskopijom i svetlosnom mikroskopijom. Metodi merenja ćelijske smrti su kao što je prikazano u Li et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 100(5): 2674-8, 2003. U aspektu, ćelijska smrt se odvija apoptozom.
[0132] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "selektivno" označava težnju češćeg pojavljivanja u jednoj populaciji nego u drugoj populaciji. Populacije koje se upoređuju mogu biti populacije ćelija. Poželjno, jedinjenje predmetnog pronalaska, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, polimorf ili solvat, deluju selektivno na kancersku ili prekancersku ćeliju, ali ne na normalnu ćeliju. Poželjno, jedinjenje predmetnog pronalaska, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, polimorf ili solvat, deluje selektivno modulišući jedan molekulski cilj (npr., ciljni protein metiltransferaza), ali ne moduliše u značajnoj meri drugi molekulski cilj (npr, neciljni protein metiltransferaza). Pronalazak takođe obezbeđuje metod selektivnog inhibiranja aktivnosti enzima, kao što je proteinska metiltransferaza. Poželjno, događaj se dešava selektivno u populaciji A u odnosu na populaciju B ako se događa dva puta češće u populaciji A u poređenju sa populacijom B. Događaj se dešava selektivno ako se dešava više od pet puta češće u populaciji A. Događaj se dešava selektivno ako se dešava više od deset puta češće u populaciji A; poželjnije, više od pedeset puta; još poželjnije više od 100 puta; i najpoželjnije, više od 1000 puta češće u populaciji A u poređenju sa populacijom B. Na primer, za ćelijsku smrt se kaže da se dešava selektivno u kancerskim ćelijama ako se dešava više od dva puta češće u kancerskim ćelijama nego u normalnim ćelijama.
[0133] Jedinjenje objavljeno u ovom tekstu, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, polimorf ili solvat, može modilisati aktivnost molekulskog cilja (npr., ciljni protein metiltransferaza). Modulacija se odnosi na stimulisanje ili inhibiranje aktivnosti molekulskog cilja. Na primer, jedinjenje objavljeno u ovom tekstu, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, polimorf ili solvat, moduliše aktivnost molekulskog cilja ako stimuliše ili inhibira aktivnost molekulskog cilja najmanje 2 puta u odnosu na aktivnost molekulskog cilja pod istim uslovima, ali bez prisustva pomenutog jedinjenja. Na primer, jedinjenje objavljeno u ovom tekstu, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, polimorf ili solvat, moduliše aktivnost molekulskog cilja ako stimuliše ili inhibira aktivnost molekulskog cilja za najmanje 5 puta, najmanje 10 puta, najmanje 20 puta, najmanje 50 puta, najmanje 100 puta u odnosu na aktivnost molekulskog cilja pod istim uslovima, ali bez prisustva pomenutog jedinjenja. Aktivnost molekulskog cilja može se meriti bilo kojim reproducibilnim načinom merenja. Aktivnost molekulskog cilja može se meriti in vitro ili in vivo. Na primer, aktivnost molekulskog cilja može se meriti in vitro testom enzimske aktivnosti ili testom vezivanja DNK, ili se aktivnost molekulskog cilja može meriti in vivo testiranjem ekspresije reporter-gena.
[0134] Jedinjenje objavljeno u ovom tekstu, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, polimorf ili solvat, ne moduliše bitno aktivnost molekulskog cilja ako dodavanje jedinjenja ne stimuliše ili inhibira aktivnost molekulskog cilja za više od 10% u odnsou na aktivnost molekulskog cilja pod istim uslovima, samo bez prisustva pomenutog jedinjenja
[0135] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "izozimski selektivno" označava preferencijalnu inhibiciju ili stimulaciju prve izoforme enzima u poređenju sa drugom izoformom enzima (npr., preferencijalna inhibicija ili stimulacija protein metiltransferaznog izozima alfa u poređenju sa protein metiltransferaznim izozimom beta). Poželjno, jedinjenje predmetnog pronalaska, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, polimorf ili solvat, pokazuju najmanje četvorostruku razliku, poželjno desetostruku razliku, poželjnije pedesetostruku razliku u dozi potrebnoj za postizanje biološkog efekta. Poželjno, jedinjenje predmetnog pronalaska, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, polimorf ili solvat, pokazuju ovu razliku duž opsega inhibicije i razlika se izražava kao IC50, tj., 50% inhibicija, za molekulski cilj od interesa.
[0136] Primena jedinjenja objavljenog u ovom tekstu, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, polimorfa ili solvata, na ćeliju ili kod subjekta kojem je to potrebno, može rezultovati modulacijom (tj., stimulacijom ili inhibicijom) aktivnosti proteinske metiltransferaze od interesa.
[0137] Detekcija metilacije H3-K27, formiranje trimetilisanog H3-K27, konverzija monometilisanog H3-K27 u dimetilisani H3-K27, ili konverzija dimetilisanog H3-K27 u trimetilisani H3-K27 mogu se obaviti korišćenjem bilo kojeg pogodnog metoda. Primeri metoda mogu se naći u US20120071418.
[0138] Primena jedinjenja objavljenog u ovom tekstu, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, polimorfa ili solvata, na ćeliju ili kod subjekta kojem je to potrebno, za rezultat ima modulaciju (tj., stimulaciju ili inhibiciju) aktivnosti unutarćelijskog cilja (npr., supstrat). Nekoliko unutarćelijskih ciljeva može se modulisati jedinjenjima predmetnog pronalaska, uključujući, ali ne ograničavajući se na proteinsku metiltransferazu.
[0139] Na primer, efikasna količina jedinjenja objavljenog u ovom tekstu, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, polimorfa ili solvata, nije u značajnoj meri citotoksična za normalne ćelije. Terapisjki efikasna količina jedinjenja nije značajno citotoksična za normalne ćelije ako primena jedinjenja u terapijski efikasnim količinama ne indukuje ćelijsku smrt u više od 10% normalnih ćelija. Terapijski efikasna količina jedinjenja ne utiče u zanačajnoj meri na vijabilnost normalnih ćelija ako primena jedinjenja u terapijski efikasnoj količini ne indukuje ćelijsku smrt u više od 10% normalnih ćelija. U aspektu, ćelijska smrt se odvija apoptozom.
[0140] Dovođenje u kontakt ćelije sa jedinjenjem objavljenim u ovom tekstu ili njegovom farmaceutski prihvatljivom solju, polimorfom ili solvatom, može indukovati ćelijsku smrt selektivno u kancerskim ćelijama. Primena kod subjekta kojem je to potrebno jedinjenja objavljenog u ovom tekstu, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, polimorfa ili solvata može indukovati ili aktivirati ćelijsku smrt selektivno u kancerskim ćelijama Dovođenje u kontakt ćelije sa jedinjenjem objavljenim u ovom tekstu ili njegovom farmaceutski prihvatljivom solju, polimorfom ili solvatom, može indukovati ćelijsku smrt selektivno u jednoj ili više ćelija koje imaju poremećaj ćelijske proliferacije. Poželjno, primena kod subjekta kojem je to potrebno jedinjenja objavljenog u ovom tekstu, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, polimorfa ili solvata indukuje ćelijsku smrt selektivno u jednoj ili više ćelija koje imaju poremećaj ćelijske proliferacije.
[0141] Stručnjak u oblasti može se uputiti na opšte referentne tekstove za detalje opise poznatih tehnika pomenutih u ovom tekstu ili ekvivalentnih tehnika. Ovi tekstovi obuhvataju Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (2005); Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2000); Coligan et al., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, N.Y.; Enna et al., Current Protocols in Pharmacology, John Wiley & Sons, N.Y.; Fingl et al., The Pharmacological Basis of Therapeutics (1975), Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 18th edition (1990). Na ove tekstove se naravno može pozvati prilikom pravljenja ili korišćenja aspekta pronalaska.
[0142] Jedinjenje koje se može koristiti u bilo kojem od metoda prikazanih u ovom tekstu je:
njegovi stereoizomeri ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili solvat.
[0143] Jedinjenja opisana u ovom tekstu mogu se sintetisati u skladu sa bilo kojim metodom poznatim u struci. Na primer, jedinjenja koja imaju Formulu (VII) mogu se sintetisati u skladu sa metodom opisanim u WO 2011/140325; WO 2011/140324; i WO 2012/005805.
[0144] Kako se koristi u ovom tekstu, "alkil", "C1, C2, C3, C4, C5ili C6alkil" ili "C1-C6alkil" treba da uključi C1, C2, C3, C4, C5ili C6zasićene alifatične ugljovodonične grupe pravog lanca (linearnog lanca) i C3, C4, C5ili C6granate zasićene alifatične ugljovodonične grupe. Na primer, C1-C6alkil treba da uključi C1, C2, C3, C4, C5i C6alkil grupe. Primeri alkila uključuju kompoenente koje imaju jedan do šest ugljenikovih atoma, kao što su, bez ograničavanja, metil, etil, n-propil, ipropil, n-butil, s-butil, t-butil, n-pentil, s-pentil ili n-heksil.
[0145] U određenim primerima izvođenja, ravnolančani ili granati lanac ima šest ili manje ugljenikovih atoma (npr., C1-C6za pravi lanac, C3-C6za granati lanac), i u drugom primeru izvođenja, ravnolančani ili granati alkil ima četiri ili manje ugljenikovih atoma.
[0146] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "cikloalkil" odnosi se na zasićeni ili nezasićeni nearomatični ugljovodonični mono- ili multiprstenasti (npr., fuzionisani, premošćeni, ili spiro prstenovi) sistem sa 3 do 30 ugljenikovih atoma (npr., C3-C10). Primeri cikloalkila uključuju, ali se ne ograničavaju na ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, cikloheksil, cikloheptil, ciklooktil, ciklopentenil, cikloheksenil, cikloheptenil, i adamantil. Izraz "heterocikloalkil" odnosi se na zasićeni ili nezasićeni nearomatični 3-8-člani monociklični, 7-12-člani biciklični (fuzionisani, premošćeni, ili spiro prstenovi), ili 11-14-člani triciklični prstenasti sistem (fuzionisani, premošćeni, ili spiro prstenovi) sa jednim ili više heteroatoma (kao što su O, N, S, ili Se), ukoliko nije drugačije specifikovano. Primeri heterocikloalkil grupa uključuju, ali se ne ograničavaju na piperidinil, piperazinil, pirolidinil, dioksanil, tetrahidrofuranil, izoindolinil, indolinil, imidazolidinil, pirazolidinil, oksazolidinil, izoksazolidinil, triazolidinil, tetrahidrofuranil, oksiranil, azetidinil, oksetanil, tietanil, 1,2,3,6-tetrahidropiridinil, tetrahidropiranil, dihidropiranil, piranil, morfolinil, 1,4-diazepanil, 1,4-oksazepanil, 2-oksa-5-azabiciklo[2.2.1]heptanil, 2,5-diazabiciklo[2.2.1]heptanil, 2-oksa-6-azaspiro[3.3]heptanil, 2,6-diazaspiro[3.3]heptanil, 1,4-dioksa-8-azaspiro[4.5]dekanil i slično.
[0147] Izraz "opciono supstituisani alkil" odnosi se na nesupstituisani alkil ili alkil sa naznačenim supstituentima koji zamenjuju jedan ili više vodonikovih atoma na jednom ili više ugljenikovih atoma ugljovodonične osovine. Takvi supstituenti mogu uključivati, na primer, alkil, alkenil, alkinil, halogen, hidroksil, alkilkarboniloksi, arilkarboniloksi, alkoksikarboniloksi, ariloksikarboniloksi, karboksilat, alkilkarbonil, arilkarbonil, alkoksikarbonil, aminokarbonil, alkilaminokarbonil, dialkilaminokarbonil, alkiltiokarbonil, alkoksil, fosfat, fosfonato, fosfinato, amino (uključujući alkilamino, dialkilamino, arilamino, diarilamino i alkilarilamino), acilamino (uključujući alkilkarbonilamino, arilkarbonilamino, karbamoil i ureido), amidino, imino, sulfhidril, alkiltio, ariltio, tiokarboksilat, sulfate, alkilsulfinil, sulfonato, sulfamoil, sulfonamido, nitro, trifluorometil, cijano, azido, heterociklil, alkilaril, ili aromatičnu ili heteroaromatičnu komponentu.
[0148] "Arilalkil" ili "aralkil" komponenta je alkil supstituisan arilom (npr., fenilmetil (benzil)). "Alkilaril" komponenta je aril supstituisan alkilom (npr., metilfenil).
[0149] Kako se koristi u ovom tekstu, "alkil linker" treba da uključi C1, C2, C3, C4, C5or C6zasićene dvovalentne alifatične grupe pravog lanca (linearnog) i C3, C4, C5ili C6granate zasićene alifatične ugljovodonične grupe. Na primer, C1-C6alkil linker treba da uključi C1, C2, C3, C4, C5i C6alkil linkerske grupe. Primeri alkil linkera uključuju komponente koje imaju od jednog do šest ugljenikovih atoma, kao na primer, bez ograničavanja, metil (-CH2-), etil (-CH2CH2-), n-propil (-CH2CH2CH2-), i-propil (-CHCH3CH2-), n-butil (-CH2CH2CH2CH2-), s-butil (-CHCH3CH2CH2-), i-butil (-C(CH3)2CH2-), n-pentil (-CH2CH2CH2CH2CH2-), s-pentil (-CHCH3CH2CH2CH2-) ili n-heksil (-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-).
[0150] "Alkenil" uključuje nezasićene alifatične grupe analogne po dužini i mogućoj supstituciji sa gore opisanim alkilima, ali koje sadrže najmanje jednu dvostruku vezu. Na primer, izraz "alkenil" uključuje alkenil grupe pravog lanca (npr., etenil, propenil, butenil, pentenil, heksenil, heptenil, oktenil, nonenil, decenil), i granate alkenil grupe. U određenim primerima izvođenja, alkenil grupa ravnog lanca ili granata alkenil grupa ima šest ili manje ugljenikovih atoma u svojoj osovini (npr., C2-C6za pravi lanac, C3-C6za granati lanac). Izraz "C2-C6" uključuje alkenil grupe koje sadrže dva do šest ugljenikovih atoma. Izraz "C3-C6" uključuje alkenil grupe koje sadrže tri do šest ugljenikovih atoma.
[0151] Izraz "opciono supstituisani alkenil" odnosi se na nesupstituisani alkenil ili alkenil sa naznačenim supstituentima koji zamenjuju jedna ili više vodonikovih atoma na jednom ili više ugljenikovih atoma ugljovodonične osovine. Takvi supstituenti mogu uključivati, na primer, alkil, alkenil, alkinil, halogen, hidroksil, alkilkarboniloksi, arilkarboniloksi, alkoksikarboniloksi, ariloksikarboniloksi, karboksilat, alkilkarbonil, arilkarbonil, alkoksikarbonil, aminokarbonil, alkilaminokarbonil, dialkilaminokarbonil, alkiltiokarbonil, alkoksil, fosfat, fosfonato, fosfinato, amino (uključujući alkilamino, dialkilamino, arilamino, diarilamino i alkilarilamino), acilamino (uključujući alkilkarbonilamino, arilkarbonilamino, karbamoil i ureido), amidino, imino, sulfhidril, alkiltio, ariltio, tiokarboksilat, sulfate, alkilsulfinil, sulfonato, sulfamoil, sulfonamido, nitro, trifluorometil, cijano, heterociklil, alkilaril, ili aromatičnu ili heteroaromatičnu komponentu.
[0152] "Alkinil" uključuje nezasićene alifatične grupe analogne po analogne po dužini i mogućoj supstituciji sa gore opisanim alkilima, ali koje sadrže najmanje jednu trostruku vezu. Na primer, "alkinil" uključuje alkinil grupe pravog lanca (npr., etinil, propinil, butinil, pentinil, heksinil, heptinil, oktinil, noninil, decinil), i granate alkinil grupe. U određenim primerima izvođenja, alkinil grupa pravog lanca ili granata alkinil grupa ima šest ili manje ugljenikovih atoma u svojoj osovini (npr., C2-C6za pravi lanac, C3-C6za granati lanac). Izraz "C2-C6" uključuje alkinil grupe koje sadrže dva do šest ugljenikovih atoma. Izraz "C3-C6" uključuje alkinil grupe koje sadrže tri do šest ugljenikovih atoma.
[0153] Izraz "opciono supstituisani alkinil" odnosi se na nesupstituisani alkinil ili alkinil sa naznačenim supstituentima koji zamenjuju jedan ili više vodonikovih atoma na jednom ili više ugljenikovih atoma ugljovodonične osovine. Takvi supstituenti mogu uključivati, na primeralkil, alkenil, alkinil, halogen, hidroksil, alkilkarboniloksi, arilkarboniloksi, alkoksikarboniloksi, ariloksikarboniloksi, karboksilat, alkilkarbonil, arilkarbonil, alkoksikarbonil, aminokarbonil, alkilaminokarbonil, dialkilaminokarbonil, alkiltiokarbonil, alkoksil, fosfat, fosfonato, fosfinato, amino (uključujući alkilamino, dialkilamino, arilamino, diarilamino i alkilarilamino), acilamino (uključujući alkilkarbonilamino, arilkarbonilamino, karbamoil i ureido), amidino, imino, sulfhidril, alkiltio, ariltio, tiokarboksilat, sulfate, alkilsulfinil, sulfonato, sulfamoil, sulfonamido, nitro, trifluorometil, cijano, azido, heterociklil, alkilaril, ili aromatičnu ili heteroaromatičnu komponentu.
[0154] Druge opciono supstituisane komponenete (kao što su opciono supstituisani cikloalkil, heterocikloalkil, aril, ili heteroaril) uključuju nesupstituisane komponente i komponente sa jednim ili više naznačenih supstituenata. Na primer, supstituisani heterocikloalkil uključuje one supstituisane jednom ili većim brojem alkil grupa, kao 2,2,6,6-tetrametil-piperidinil i 2,2,6,6-tetrametil-1,2,3,6-tetrahidropiridinil.
[0155] "Aril" uključuje grupe sa aromatičnošću, uključujući "konjugovane" ili multiciklične sisteme sa najmanje jednim aromatičnim prstenom i koji ne sadrže nijedan heteroatom u prstenastoj strukturi. Primeri uključuju fenil, benzil, 1,2,3,4-tetrahidronaftalenil, itd..
[0156] "Heteroaril" grupe su aril grupe, kako je gore definisano, osim što imaju od jednog do četiri heteroatoma u prstenastoj strukturi, i mogu se takođe označiti kao "aril heterocikli" ili "heteroaromatici". Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "heteroaril" treba da uključi stabilni 5-, 6-, ili 7-člani monociklični ili 7-, 8-, 9-, 10-, 11- ili 12-člani biciklični aromatični heterociklični prsten koji se sastoji od ugljenikovih atoma i jednog ili više heteroatoma, npr., 1 ili 1-2 ili 1-3 ili 1-4 ili 1-5 ili 1-6 heteroatoma, ili npr., 1, 2, 3, 4, 5, ili 6 heteroatoma, nezavisno odabrana iz grupe koja se sastoji od azota, kiseonika i sumpora. Atom azota može biti supstituisan ili nesupstituisan (tj., N ili NR pri čemu je R H ili drugi supstituent, kako je definisano). Heteroatomi azota i sumpora mogu opciono biti oksidisani (tj., N→O i S(O)p, gde p = 1 ili 2). Treba napomenuti da ukupan broj S i O atoma u aromatičnom heterociklu nije veći od 1.
[0157] Primeri heteroaril grupa uključuju pirol, furan, tiofen, tiazol, izotiazol, imidazol, triazol, tetrazol, pirazol, oksazol, izoksazol, piridin, pirazin, piridazin, pirimidin, i slično.
[0158] Pored toga, izrazi "aril" i "heteroaril" uključuju multiciklične aril i heteroaril grupe, npr., triciciklične, biciklične, npr., naftalen, benzoksazol, benzodioksazol, benzotiazol, benzoimidazol, benzotiofen, metilendioksifenil, hinolin, izohinolin, naftirdin, indol, benzofuran, purin, benzofuran, deazapurin, indolizin.
[0159] U slučaju multicikličnih aromatičnih prstenova, samo jedan od prstenova treba da bude aromatičan (npr., 2,3-dihidroindol), mada svi prstenovi mogu da budu aromatični (npr., hinolin). Drugi prsten takođe može da bude fuzionisan ili premošćen.
[0160] Cikloalkil, heterocikloalkil, aril, ili heteroaril prsten može biti supstituisan na jednoj ili više pozicija u prstenu (npr., prsten-formirajući ugljenik ili heteroatom kao N) supstituentima kao što je gore opisano, na primer, alkil, alkenil, alkinil, halogen, hidroksil, alkoksi, alkilkarboniloksi, arilkarboniloksi, alkoksikarboniloksi, ariloksikarboniloksi, karboksilat, alkilkarbonil, alkilaminokarbonil, aralkilaminokarbonil, alkenilaminokarbonil, alkilkarbonil, arilkarbonil, aralkilkarbonil, alkenilkarbonil, alkoksikarbonil, aminokarbonil, alkiltiokarbonil, fosfat, fosfonato, fosfinato, amino (uključujući alkilamino, dialkilamino, arilamino, diarilamino i alkilarilamino), acilamino (uključujući alkilkarbonilamino, arilkarbonilamino, karbamoil i ureido), amidino, imino, sulfhidril, alkiltio, ariltio, tiokarboksilat, sulfate, alkilsulfinil, sulfonato, sulfamoil, sulfonamido, nitro, trifluorometil, cijano, azido, heterociklil, alkilaril, ili aromatičnu ili heteroaromatičnu komponentu. Aril i heteroaril grupe mogu biti i fuzionisane ili premošćene alicikličnim ili heterocikličnim prstenovima koji nisu aromatični tako da formiraju multiciklični sistem (npr., tetralin, metilendioksifenil).
[0161] Kako se koristi u ovom tekstu, "karbocikl" ili "karbociklični prsten" treba da uključi svaki stabilan monociklični, biciklični ili triciklični prsten koji ima naznačeni broj ugljenika, od kojih svaki može biti zasićen, nezasićen ili aromatičan. Karbocikl uključuje cikloalkil i aril. Na primer, C3-C14karbocikl treba da uključi monociklični, biciklični ili triciklični prsten sa 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ili 14 ugljenikovih atoma. Primeri karbocikla uključuju, ali se ne ograničavaju na, ciklopropil, ciklobutil, ciklobutenil, ciklopentil, ciklopentenil, cikloheksil, cikloheptenil, cikloheptil, cikloheptenil, adamantil, ciklooktil, ciklooktenil, ciklooktadienil, fluorenil, fenil, naftil, indanil, adamantil i tetrahidronaftil. Premošćeni prstenovi takođe su uključeni u definiciju karbocikla, uključujući, na primer, [3.3.0]biciklooktan, [4.3.0]biciklononan, [4.4.0]biciklodekan i [2.2.2]biciklooktan. Premošćeni prstenovi sreću se kada jedan ili više ugljenikovih atoma povezuju dva nesusedna ugljenikova atoma. U jednom primeru izvođenja, premošćeni prstenovi su jedan ili dva ugljenikova atoma. Napominje se da most uvek konvertuje monociklični prsten u triciklični prsten. Kada je prsten premošćen, supstituenti navedeni za prsten mogu biti prisutni i u mostu. Fuzionisani (npr., naftil, tetrahidronaftil) i spiro prstenovi takođe su uključeni.
[0162] Kako se koristi u ovom tekstu, "heterocikl" ili "heterociklična grupa" uključuje svaku prstenastu strukturu (zasićenu, nezasićenu ili aromatičnu) wkoja sadrži najmanje jedan heteroatom u prstenu (npr., N, O ili S). Heterocikl uključuje heterocikloalkil i heteroaril. Primeri heterocikala uključuju, ali se ne ograničavaju na morfolin, pirolidin, tetrahidrotiofen, piperidin, piperazin, oksetan, piran, tetrahidropiran, azetidin, i tetrahidrofuran.
[0163] Primeri heterocikličnih grupa uključuju, ali se ne ograničavaju na akridinil, azocinil, benzimidazolil, benzofuranil, benzotiofuranil, benzotiofenil, benzoksazolil, benzoksazolinil, benztiazolil, benztriazolil, benztetrazolil, benzizoksazolil, benzizotiazolil, benzimidazolinil, karbazolil, 4aH-karbazolil, karbolinil, hromanil, hromenil, cinolinil, dekahidrohinolinil, 2H,6H-1,5,2-ditiazinil, dihidrofuro[2,3-b]tetrahidrofuran, furanil, furazanil, imidazolidinil, imidazolinil, imidazolil, 1H-indazolil, indolenil, indolinil, indolizinil, indolil, 3H-indolil, izatinoil, izobenzofuranil, izohromanil, izoindazolil, izoindolinil, izoindolil, izohinolinil, izotiazolil, izoksazolil, metilendioksifenil, morfolinil, naftiridinil, oktahidroizohinolinil, oksadiazolil, 1,2,3-oksadiazolil, 1,2,4-oksadiazolil, 1,2,5-oksadiazolil, 1,3,4-oksadiazolil, 1,2,4-oksadiazol5(4H)-on, oksazolidinil, oksazolil, oksindolil, pirimidinil, fenantridinil, fenantrolinil, fenazinil, fenotiazinil, fenoksatinil, fenoksazinil, ftalazinil, piperazinil, piperidinil, piperidonil, 4-piperidonil, piperonil, pteridinil, purinil, piranil, pirazinil, pirazolidinil, pirazolinil, pirazolil, piridazinil, piridooksazol, piridoimidazol, piridotiazol, piridinil, piridil, pirimidinil, pirolidinil, pirolinil, 2H-pirolil, pirolil, hinazolinil, hinolinil, 4H-hinolizinil, hinoksalinil, hinuklidinil, tetrahidrofuranil, tetrahidroizohinolinil, tetrahidrohinolinil, tetrazolil, 6H-1,2,5-tiadiazinil, 1,2,3-tiadiazolil, 1,2,4-tiadiazolil, 1,2,5-tiadiazolil, 1,3,4-tiadiazolil, tiantrenil, tiazolil, tienil, tienotiazolil, tienooksazolil, tienoimidazolil, tiofenil, triazinil, 1,2,3-triazolil, 1,2,4-triazolil, 1,2,5-triazolil, 1,3,4-triazolil i ksantrenil.
[0164] Izraz "supstituisan" kako se koristi u ovom tekstu, znači da je bilo koji ili veći broj vodonikovih atoma na naznačenom atomu zamenjeno izborom iz navedenih grupa, uz uslov da normalna valenca naznačenog atoma ne bude prevaziđena, i da susptitucija za rezultat ima stabilno jedinjenje. Kada je supstituent okso ili keto (tj., =O), onda su 2 vodonikova atoma na atomu zamnjena. Keto supstituenti nisu prisutni na aromatičnim komponentama. Dvostruke veze prstena, kako se koristi u ovom tekstu, su dvostruke veze koje se formiraju između dva susedna atoma prstena (npr., C=C, C=N ili N=N). "Stabilno jedinjenje" i "stabilna struktura" treba da označe jedinjenje koje je dovoljno robusno da prođe izolaciju do korisnog stepena čistoće iz reakcione mešavine i formulaciju u efikasno terapijsko sredstvo.
[0165] Kada je pokazano da veza sa supstituentom ukršta sa vezom koja povezuje dva atoma u prstenu, takav supstituent može biti povezan sa bilo kojim atomom u prstenu. Kada se supstituent navodi bez naznačavanja atoma preko kojeg je takav supstituent povezan sa ostatkom jedinjenja date formule, onda takav supstituent može biti povezan preko bilo kojeg atoma u takvoj formuli. Kombinacije supstituenata i/ili varijabli su permisibilne, ali samo ako takve kombinacije za rezultat imaju stabilna jedinjenja.
[0166] Kada se neka varijabla (npr., R1) sreće više od jednom u nekom konstituentu ili formuli za jedinjenje njena definicija pri svakom pojavljivanju je nezavisna od definicije u bilo kojem drugom pojavljivanju. Prema tome na primer, ako je pokazano da je grupa supstituisana sa 0-2 R1komponente, onda grupa opciono može biti supstituisana sa do dve R1komponente i R1pri svakom pojavljivanju bira se nezavisno od definicije R1. Isto tako, kombinacije supstituenata i/ili varijabli su permisibilne, ali samo ako takve kombinacije za rezultat imaju stabilna jedinjenja.
[0167] Izraz "hidroksi" ili "hidroksil" uključuje grupe sa -OH ili -O-.
[0168] Kako se koristi u ovom tekstu, "halo" ili "halogen" odnosi se na fluoro, hloro, bromo i jodo. Izraz "perhalogenisan" uopšteno označava komponentu u kojoj su svi vodonikovi atomi zamenjeni atomima halogena. Izraz "haloalkil" ili "haloalkoksil" označava alkil ili alkoksil supstituisan jednim ili većim brojem atoma halogena.
[0169] Izraz "karbonil" uključuje jedinjenja i komponente koji sadrže ugljenik spojen dvostrukom vezom za atom kiseonika. Primeri komponenti koje sadrže karbonil uključuju, ali se ne ograničavaju na aldehide, ketone, karboksilne kiseline, amide, estre, anhidride, itd.
[0170] Izraz "karboksil" odnosi se na -COOH ili njen C1-C6alkil estar.
[0171] "Acil" uključuje komponente koje sadrže acil radikal (R-C(O)-) ili karbonil grupu. "Supstituisani acil" uključuje acil grupe u kojima su jedan ili više vodonikovih atoma zamenjeni na primer, alkil grupama, alkinil grupama, halogenom, hydroksil, alkilkarboniloksi, arilkarboniloksi, alkoksikarboniloksi, ariloksikarboniloksi, karboksilat, alkilkarbonil, arilkarbonil, alkoksikarbonil, aminokarbonil, alkilaminokarbonil, dialkilaminokarbonil, alkiltiokarbonil, alkoksil, fosfat, fosfonato, fosfinato, amino (uključujući alkilamino, dialkilamino, arilamino, diarilamino i alkilarilamino), acilamino (uključujući alkilkarbonilamino, arilkarbonilamino, karbamoil i ureido), amidino, imino, sulfhidril, alkiltio, arilthio, tiokarboksilat, sulfate, alkilsulfinil, sulfonato, sulfamoil, sulfonamido, nitro, trifluorometil, cijano, azido, heterociklil, alkilaril, ili aromatičnu ili heteroaromatičnu komponentu.
[0172] "Aroil" uključuje komponente sa aril ili heteroaromatičnom komponentom vezanom za karbonil grupu. Primeri aroil grupa uključuju fenilkarboksi, naftil karboksi, itd.
[0173] "Alkoksialkil", "alkilaminoalkil" i "tioalkoksialkil" uključuju alkil grupe, kako je gore opisano, gde atomi kiseonika, azota ili sumpora zamenjuju jedan ili više ugljenikovih atoma ugljovodonične osovine.
[0174] Izraz "alkoksi" ili "alkoksil" uključuje supstituisani i nesupstituisani alkil, alkenil i alkinil grupe kovalentno vezane sa atomom kiseonika. Primeri alkoksi grupa ili alkoksil radikala uključuju, ali se ne ograničavaju na metoksi, etoksi, izopropiloksi, propoksi, butoksi i pentoksi grupe. Primeri supstituisanih akoksi grupa uključuju halogenisane alkoksi grupe. Alkoksi grupe mogu biti supstituisane grupama kao što su alkenil, alknil, halogen, hidroksil, alkilkarboniloksi, arilkarboniloksi, alkoksikarboniloksi, ariloksikarboniloksi, karboksilat, alkilkarbonil, arilkarbonil, alkoksikarbonil, aminokarbonil, alkilaminokarbonil, dialkilaminokarbonil, alkiltiokarbonil, alkoksil, fosfat, fosfonato, fosfinato, amino (uključujući alkilamino, dialkilamino, arilamino, diarilamino, i alkilarilamino), acilamino (uključujući alkilkarbonilamino, arilkarbonilamino, karbamoil i ureido), amidino, imino, sulfhidril, alkiltio, ariltio, tiokarboksilat, sulfate, alkilsulfinil, sulfonato, sulfamoil, sulfonamido, nitro, trifluorometil, cijano, azido, heterociklil, alkilaril, ili aromatične ili heterosromatične komponente. Primeri halogenom supstituisanih alkoksi grupa uključuju, ali se ne ograničavaju na fluorometoksi, difluorometoksi, trifluorometoksi, hlorometoksi, dihlorometoksi i trihlorometoksi.
[0175] Izraz "etar" ili "alkoksi" uključuje jedinjenja ili komponente koje sadrže kiseonik vezan za dva ugljenikova atoma ili heteroatoma. Na primer, izraz uključuje "alkoksialkil" što se odnosi na alkil, alkenil, ili alkinil grupu kovalentno vezanu za kiseonikov atom koji je kovalentno vezan za alkil grupu.
[0176] Izraz "estar" uključuje jedinjenja ili komponente koje sadrže ugljenik ili heteroatom vezan za atom kiseonika koji je vezan za ugljenik karbonilne grupe. Izraz "estar" uključuje alkoksikarboksi grupe kao što su metoksikarbonil, etoksikarbonil, propoksikarbonil, butoksikarbonil, pentoksikarbonil, itd.
[0177] Izraz "tioalkil" uključuje jedinjenja ili komponente koje sadrže alkil grupu povezanu sa atomom sumpora. Tioalkil grupe mogu biti supstituisane grupama kao što su alkil, alkenil, alkinil, halogen, hidroksil, alkilkarboniloksi, arilkarboniloksi, alkoksikarboniloksi, ariloksikarboniloksi, karboksilat, karboksi kiselina, alkilkarbonil, arilkarbonil, alkoksikarbonil, aminokarbonil, alkilaminokarbonil, dialkilaminokarbonil, alkiltiokarbonil, alkoksil, amino uključujući alkilamino, dialkilamino, arilamino, diarilamino, i alkilarilamino), acilamino (uključujući alkilkarbonilamino, arilkarbonilamino, karbamoil i ureido), amidino, imino, sulfhidril, alkiltio, ariltio, tiokarboksilat, sulfate, alkilsulfinil, sulfonato, sulfamoil, sulfonamido, nitro, trifluorometil, cijano, azido, heterociklil, alkilaril, ili aromatične ili heterosromatične komponente.
[0178] Izraz "tiokarbonil" ili "tiokarboksi" uključuje jedinjenja i komponente koje sadrže ugljenik povezan dvostrukom vezom sa atomom sumpora.
[0179] Izraz "tioetar" uključuje komponente koje sadrže atom sumpora vezan za dva atoma ugljenika ili heteroatoma. Primeri tioetara uključuju, ali se ne ograničavaju na alktioalkile, alktioalkenile, i alktioalkinile. Izraz "alktioalkili" uključuje komponente sa alkil, alkenil, ili alkinil grupom vezanom za atom sumpora koji je vezan za alkil grupu. Slično tome, izraz "alktioalkenili" odnosi se na komponente u kojima je alkil, alkenil, ili alkinil grupa vezana za atom sumpora koji je kovalentno vezan za alkenil grupu; i "alktioalkinili" dnosi se na komponente u kojima je alkil, alkenil, ili alkinil grupa vezana za atom sumpora koji je kovalentno vezan za alkinil grupu.
[0180] Kako se koristi u ovom tekstu, "amin" ili "amino" odnosi se na nesupstituisani ili supstituisani -NH2. "Alkilamino" uključuje grupe jedinjenja u kojima je azot iz -NH2vezan za najmanje jednu alkil grupu. Primeri alkilamino grupa uključuju benzilamino, metilamino, etilamino, fenetilamino, itd. "Dialkilamino" uključuje grupe u kojima je azot iz -NH2vezan za najmanje još dve alkil grupe. Primeri dialkilamino grupa uključuju,a li se ne ograničavaju na dimetilamino i dietilamino. "Arilamino" i "diarilamino" uključuju grupe u kojima je azot vezan za najmanje jednu, odnosno dve aril grupe. "Aminoaril" i "aminoariloksi" odnosi se na aril i ariloksi supstituisan sa amino. "Alkilarilamino", "alkilaminoaril" ili "arilaminoalkil" odnosi se na amino grupu koja je vezana za najmanje jednu alkil grupu i najmanje jednu aril grupu. "Alkaminoalkil" odnsoi se na alkil, alkenil, ili alkinil grupu vezanu za atom azota koji je vezan i za alkil grupu. "Acilamino" uključuje grupe u kojima je azot vezan za acil grupu. Primeri acilamino uključuju, ali se ne ograničavaju na alkilkarbonilamino, arilkarbonilamino, karbamoil i ureido grupe.
[0181] Izraz "amid" ili "aminokarboksi" uključuje jedinjenja ili komponente koje sadrže atom azota vezan za ugljenik karbonil ili tiokarbonil grupe. Izraz obuhvata "alkaminokarboksi" grupe koje uključuju alkil, alkenil, ili alkinil grupe vezane za amino grupu koja je vezana za ugljenik karbonil ili tiokarbonil grupe. Uključuje i "arilaminokarboksi" grupe koje uključuju aril ili heteroaril komponente vezane za amino grupu koja je vezana za ugljenik karbonil ili tiokarbonil grupe. Izrazi "alkilaminokarboksi", "alkenilaminokarboksi", "alkinilaminokarboksi" i "arilaminokarboksi" uključuju komponente u kojima su alkil, alkenil, alkinil i aril komponente, respektivno, vezane za atom azota koji je sa druge strane vezan za ugljenik karbonilne grupe. Amidi mogu biti supstituisani supstituentima kao što je alkil pravog lanca, granati lakil, cikloalkil, aril, heteroaril ili heterocikl. Supstituenti na amidnim grumapa mogu biti dodatno supstituisani.
[0182] U predmetnoj specifikaciji, strukturna formula jedinjenja predstavlja određeni izomer radi pogodnosti u nekim slučajevima, ali predmetna objava uključuje sve izomere, kao što su geometrujski izomeri, optički izomeri bazirani na asimetričnom ugljeniku, stereoizomeri, tautomeri i slično, i razume se da ne mogu svi izomeri imati isti nivo aktivnosti. Pored toga, kristalni polimorfizam može biti prisutan kod jedinjenja predstavljenih formulom. Napominje se da je svaka kristalna forma, mešavina kristalnih formi, ili njihov anhidrid ili hidrat uključeni u okvir predmetnog pronalaska. Pored toga, takozvani metabolit koji se proizvodi degradacijom predmetnog jedinjenja in vivo obuhvaćen je okvirom predmetnog pronalaska.
[0183] "Izomerizam" označava jedinjenja koja imaju identične molekulske formule ali se razlikuju u sekvenci vezivanja svojih atoma ili u aranžmanu svojih atoma u prostoru. Izomeri koji se razlikuju aranžmanu svojih atoma u prostoru nazivaju se "stereoizomeri". Stereoizomeri koji jedan drugome nisu slika u ogledalu nazivaju se "dijastereoizomeri" i stereoizomeri koji su nepreklapajuće slike u ogledalu jedan drugome označavaju se kao "enantiomeri" ili poneka, optički izomeri. Mešavina koja sadrži jednake količine pojedinačnih enantiomernih formi suprotne hiralnosti označava se kao "racemska mešavina".
[0184] Ugljenikov atom vezan za četiri neidentična supstituenta označava se kao "hiralni centar."
[0185] "Hiralni izomer" označava jedinjenje sa najmanje jednim hirlanim centrom. Jedinjenja sa više od jednog hiralnog centra mogu postojati kao pojedinačni dijastereomeri ili kao mešavina dijastereomera, označena kao "dijastereomerna mešavina". Kada je prisutan jedan hiralni centar, stereoizomer se može karakterisati apsolutnom konfiguracijom (R ili S) tog hiralnog centra. Apsolutna konfiguracija odnosi se na aranžman u prostoru supstituenata prikačenih za hiralni centar. Supstituenti prikačeni za hiralni centar o kojem je reč rangirani su prema Pravilu redosleda, Cahna, Ingolda i Preloga. (Cahn et al., Angew. Chem. Inter. Edit.
1966, 5, 385; errata 511; Cahn et al., Angew. Chem. 1966, 78, 413; Cahn and Ingold, J. Chem. Soc. 1951 (London), 612; Cahn et al., Experientia 1956, 12, 81; Cahn, J. Chem. Educ.
1964, 41, 116).
[0186] "Geometrijski izomer" označava dijastereomere koji svoje postojanje duguju ometenoj rotaciji oko dvostrukih veza ili cikloalkilnom linkeru (npr., 1,3-ciklobutil). Ove konfiguracije se razlikuju u imenima po prefiksima cis i trans, ili Z i E, koji ukazuju da su grupe na istoj ili na suprotnim stranama dvostruke veze u molekulu u skladu sa Cahn-Ingold-Prelogovim pravilima.
[0187] Treba razumeti da jedinjenja objavljena u ovom tekstu mogu da se prikažu kao različiti hiralni izomeri ili geometrijski izomeri. Treba razumeti i to da kada jedinjenja imaju hiralne izomerne ili geometrijske izomerne forme, sve izomerne forme treba da budu uključene u okvir predmetnog pronalaska, i nazivi jedinjenja ne isključuju nijednu izomernu formu, i razume se da svi izomeri ne mogu imati isti nivo aktivnosti.
[0188] Pored toga, strukture i druga jedinjenja o kojima je reč u ovom pronalasku uključuju sve njihove atropske izomere, i razume se da svi atropski izomeri ne mogu imati isti nivo aktivnosti. "Atropski izomeri" su tip stereoizomera u kojima su atomi dva izomera aranžirani različito u prostoru. Atropski izomeri svoje postojanje duguju ograničenoj rotaciji uzrokovanoj ometenošću rotacije velikih grupa oko centralne veze. Takvi atropski izomeri tipično postoje kao mešavina, međutim, kao rezultat nedavnih dostignuća u tehnikama hromatografije, moguće je izvršiti razdvajanje mešavine dva atropska izomera u odabranim slučajevima.
[0189] "Tautomer" je jedan od dva ili više strukturnih izomera koji postoje u ravnoteži i lako se konvertuju iz jedne izomerne forme u drugu. Rezultat ove konverzije je formalna migracija vodonikovih atoma, praćena "prekopčavanjem" susednih konjugovanih dvostrukih veza. Tautomeri postoje kao mešavina tautomernog seta u rastvoru. U rastvorima gde je tautomerizacija moguća, dostići će se hemijska ravnoteža tautomera. Tačan odnos tautomera zavisi od nekoliko faktora, uključujući temperaturu, rastvarač i pH. Koncept tautomera koji su interkonvertibilni tautomerizacijom naziva se tautomerizam.
[0190] Od različitih tipova tautomerizma koji su mogući, dva se obično sreću. U ketoenolnom tautomerizmu dešava se istovremeno pomeranje elektrona i vodonikovog atoma. Tautomerizam prsten-lanac nastaje kao rezultat reakcije aldehidne grupe (-CHO) u molekulu šećernog lanca sa jednom od hidroksi grupa (-OH) u istom molekulu da bi se dobila ciklična (prstenasta) forma, prikazana glukozom.
[0191] Česti tautomerni parovi su: keton-enol, amid-nitril, laktam-laktim, amid-imidinska kiselina tautomerizam u heterocikličnim prstenovima (npr., u nukleobazama kao što su guanin, timin i citozin), imin-enamin i enamin-enamin. Primer keto-enolne ravnoteže je između piridin-2(1H)-ona i odgovarajućih piridin-2-ola, kao što je pokazano dole.
[0192] Treba razumeti da jedinjenja objavljena u ovom tekstu mogu da se opišu kao različiti tautomeri. Treba razumeti i to da kada jedinjenja imaju tautomerne forme, sve tautomerne forme treba da budu uključene u okvir predmetnog pronalaska, i imenovanje jedinjenja ne isključuje nijednu tautomernu formu. Treba razumeti da određeni tautomeri mogu imati viši nivo aktivnosti od drugih.
[0193] Izraz "kristalni polimorfi", "polimorfi" ili "kristalne forme" označavaju kristalne strukture u kojima jedinjenje (ili njegova so ili solvat) mogu da se kristalizuju u različitim kristalnim pakujućim aranžmanima, od kojih svi imaju isti hemijski sastav. Različite kristalne forme obično imaju različite obrasce difrakcije X-zraka, infracrvene spektre, tačke topljenja, gustinsku tvrdoću, oblik kristala, optičke i električne osobine, stabilnost i rastvorljivost.
Rekristalizacioni rastvarač, stopa kristalizacije, temperatura skladištenja, i drugi faktori mogu dovesti do toga da dominira jedna kristalna forma. Kristalni polimorfi jedinjenja mogu se pripremiti kristalizacijom pod različitim uslovima.
[0194] Jedinjenja bilo koje od Formula objavljenih u ovom tekstu uključuju sama jedinjenja, kao i njihove soli ili njihove solvate, ako je primenljivo. So, na primer, može da se formira između anjona i pozitivno naelektrisane grupe (npr., amino) na aril- ili heteroarilsupstituisanom benzenskom jedinjenju. Pogodni anjoni uključuju hlorid, bromid, jodid, sulfat, bisulfat, sulfamat, nitrat, fosfat, citrat, metansulfonat, trifluoroacetat, glutamat, glukuronat, glutarat, malat, maleat, sukcinat, fumarat, tartrat, tozilat, salicilat, laktat, naftalensulfonat i acetat (npr., trifluoroacetat). Izraz "farmaceutski prihvatljivi anjon" odnosi se na anjon pogodan za formiranje farmaceutski prihvatljive soli. Slično tome, so se može formirati i između katjona i negativno naelektrisane grupe (npr., karboksilat) na aril- ili heteroarilsupstituisanom benzenskom jedinjenju. Pogodni katjoni uključuju natrijumov jon, kalijumov jon, magnezijumov jon, kalcijumov jon i amonijumov katjon kao što je tetrametilamonijumov jon. Aril- ili heteroaril-supstituisana benzenova jedinjenja uključuju i one soli koje sadrže kvaternarne atome azota.
[0195] Pored toga, jedinjenja objavljena u ovom tekstu, na primer, soli jedinjenja, mogu postojati u hidratisanom ili nehidratisanom (anhidrovanom) can exist in either hydrated or unhydrated (the anhydrous) obliku ili kao solvati sa molekulima rastvarača. Neograničavajući primeri hidrata uključuju monohidrate, dihidrate, itd. Neograničavajući primeri solvata uključuju etanolske solvate, acetonske solvate, itd.
[0196] "Solvat" označava solvent-adicione forme koje sadrže stehiometrijske ili nestehiometrijske količine solventa (rastvarača). Neka jedinjenja imaju tendenciju da zadrže fiksirani molarni odnos molekula solventa u kristalnom čvrstom stanju, formirajući tako solvat. Ako je solvent voda, formirani solvat je hidrat; a ako je solvent alkohol, formirani solvat je alkoholat. Hidrati se formiraju kombinacijom jednog ili više molekula vode sa jednim molekulom supstance pri čemu voda zadržava svoje molekulsko stanje kao H2O.
[0197] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "analog" odnosi se na hemijsko jedinjenje koje je strukturno slično drugom ali se blago razlikuje u sastavu (na primer zameni jednog atoma drugim različitog elementa ili po prisustvu određene funkcionalne grupe, ili zameni jedne funkcionalne grupe drugom funkcionalnom grupom). Analog je, dakle, jedinjenje slično ili uporedivo u funkciji i izgledu, ali ne i po strukturi ili poreklu, sa referentnim jedinjenjem.
[0198] Kako se definiše u ovom tekstu, izraz "derivat" odnosi se na jedinjenja koja imaju zajedničku osnosvnu strukturu, a supstituisana su različitim grupama kao što je opisano u ovom tekstu. Na primer, sva jedinjenja predstavljena Formulom (I) su aril- ili heteroarilsupstituisana benzenska jedinjenja i imaju Formulu (I) kao zajedničku osnovu.
[0199] Izraz "bioizoster" odnosi se na jedinjenje koje je rezultat razmene atoma ili grupe atoma sa drugim, u širem smislu sličnim atomom ili grupom atoma. Cilj bioizosterne zamene je stvaranje novog jedinjenja sa sličnim biološkim osobinama kao matično jedinjenje. Bioizosterna zamena može biti fizičko-hemijski ili topološki bazirana. Primeri bioizostera karboksilnih kiselina uključuju, ali se ne ograničavaju na acil sulfonimide, tetrazole, sulfonate i fosfonate. Vidi, npr., Patani and LaVoie, Chem. Rev. 96, 3147-3176, 1996.
[0200] Predmetna objava treba da uključi sve izotope atoma koji se sreću u predmetnim jedinjenjima. Izotopi uključuju one atome koji imaju isti atomski broj, ali različite masene brojeve. Kao opšti primer i bez ograničavanja, izotopi vodonika uključuju tricijum i deuterjium, a izotopi ugljenika ukljućuju C-13 i C-14.
[0201] U ovom tekstu objavljeni su metodi sinteze jedinjenja svake Formule objavljene u ovom tekstu. U ovom tekstu objavljeni su i detaljni metodi sinteze različitih objavljenih jedinjenja u skladu sa šemama koje slede, kao što je prikazano u Primerima.
[0202] U ovom opisu, kada se opisuje da kompozicije imaju, uključuju ili sadrže specifične komponente, misli se na to da se kompozicije sastoje suštinski od navedenih komponenti. Slično tome, kada se opisuje da metodi ili procesi imaju, uključuju ili sadrže specifične procesne korake, procesi se sastoje suštinski ili se sastoje od navedenih procesnih koraka. Pored toga, treba razumeti da redosled koraka ili redosled izvođenja određenih aktivnosti nije značajan sve dok pronalazak ostaje operabilan. Štaviše, dva ili više koraka ili aktivnosti mogu se izvoditi istovremeno.
[0203] Procesi sinteze objavljeni u ovom tekstu mogu tolerisati veliki broj različitih funkcionalnih grupa, tako da se mogu koristiti različiti supstituisani polazni materijali. Procesi uopšteno daju željeno finalno jedinjenje na kraju ili pri kraju čitavog procesa, mada u nekim slučajevima može biti poželjno da se izvede dodatna konverzija jedinjenja u njegovu farmaceutski prihvatljivu so, polimorf ili solvat.
[0204] Jedinjenja objavljena u ovom tekstu mogu se pripremiti na različite načine korišćenjem komercijalno dostupnih polaznih materijala, jedinjenja poznatih iz literature, ili iz intermedijara koji se lako pripremaju, korišćenjem standardnih metoda i postupaka sinteze poznatih stručnjaku u oblasti ili koji će biti jasni obučenom stručnjaku u svetlu uputstava datih u ovom tekstu. Standardni sintetski metodi i postupci pripremanja organskih molekula i transformacije i manipulacije funkcionalnih grupa mogu se dobiti iz relevantne naučne literature ili iz standardnih udžbenika iz oblasti. Bez ograničavanja na bilo koji ili nekoliko izvora, klasični tekstovi kao što su Smith, M. B., March, J., March’s Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 5th edition, John Wiley & Sons: New York, 2001; Greene, T.W., Wuts, P.G. M., Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd edition, John Wiley & Sons: New York, 1999; R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994); and L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995), korisni su i poznati referentni udžbenici organske sinteze poznati stručnjacima u oblasti. Opisi metoda sinteze, koji slede izdvojeni su da bi ilustrovali, a ne da bi ograničili opšte postupke pripremanja jedinjenja objavljenih u ovom tekstu.
[0205] Jedinjenja objavljena u ovom tekstu mogu se pogodno pripremiti različitim metodima koji su bliski stručnjacima u oblasti. Jedinjenja objavljena u ovom tekstu sa bilo kojom Formulom ovde objavljenom mogu se pripremiti prema postupcima ilustrovanim na Šemama 1-10, u nastavku, od komercijalno dostupnih polaznih materijala koji se mogu pripremiti korišćenjem postupaka iz literature. Z i R grupe (kao R2, R3, R4, R6, R7, R8, and R12) na Šemama 1-10 su kako je definisano u bilo kojoj od Formula objavljenih u ovom tekstu, ako nije drugačije specifikovano.
[0206] Prosečno obučen stručnjak u oblasti primetiće da duž niza reakcija i sintetskih šema opisanih u ovom tekstu, redosled određenih koraka može da se promeni, na primer uvođenje i uklanjanje protektivnih grupa.
[0207] Prosečno obučen stručnjak u oblasti prepoznaće da određene grupe mogu zahtevati zaštitu od reakcionih uslova upotrebom protektivnih grupa. Protektivne grupe mogu da se koriste i za diferenciranje sličnih funkcionalnih grupa u molekulima. Spisak protektivnih grupa i kako se ove grupe uvode i uklanjaju, može se naći u Greene, T.W., Wuts, P.G. M., Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd edition, John Wiley & Sons: New York, 1999.
[0208] Poželjne protektivne grupe uključuju, ali se ne ograničavaju na:
Za hidroksilnu komponentu: TBS, benzil, THP, Ac
Za karboksilne kiseline: benzil estar, metil estar, etil estar, alil estar
Za amine: Cbz, BOC, DMB
Za diole: Ac (x2) TBS (x2), ili kada se uzmu zajedno acetonidi
Za tiole: Ac
Za benzimidazole: SEM, benzil, PMB, DMB
Za aldehide: dialkil acetali kao dimetoksi acetal ili dietil acetil.
[0209] U reakcionim šemama opisanim u ovom tekstu, može se proizvesti veći broj stereoizomera. Kada nije posebno naznačen nijedan stereoizomer, podrazumeva se da to označava sve moguće stereoizomere koji se u reakciji mogu proizvesti. Osoba prosečno obučena u struci prepoznaće da reakcije mogu da se optimizuju da bi preferencijalno dale jedan izomer, ili se mogu osmisliti nove šeme da bi se proizveo jedan izomer. Ako se proizvedu mešavine, za razdvajanje izomera mogu se koristiti tehnike kao što su preparativna tankoslojna hromatografija, preparativna HPLC, preparativna hiralna HPLC, ili preparativna SFC.
[0210] Sledeće skraćenice koriste se u specifikaciji i definisane su u nastavku:
Ac acetil
AcOH sirćetna kiselina
aq. vodeni
BID ili b.i.d. bis in die (dva puta dnevno)
BOC tert-butoksi karbonil
Cbz benziloksi karbonil
CDCl3deuterisani hloroform
CH2Cl2dihlorometan
DCM dihlorometan
DMB 2,4 dimetoksi benzil
DMF N,N-dimetilformamid
DMSO dimetil sulfoksid
EA ili EtOAc etil acetat
EDC ili EDCI N-(3-dimetilaminopropil)-N’-etilkarbodiimid
ESI- elektrosprej negativni modalitet
ESI+ elektrosprej pozitivni modalitet
EtOH etanol
h sati
H2O voda
HOBt 1-hidroksibenzotriazol
HCl hidrogen hlorid ili hlorovodonična kiselina
HPLC tečna hromatografija visokih performansi
K2CO3kalijum karbonat
LC/MS ili LC-MS tečna hromatografija-maseni spektar
M molarni
MeCN acetonitril
min minuti
Na2CO3natrijum karbonat
Na2SO4natrijum sulfat
NaHCO3natrijum bikarbonat
NaHMDs natrijum heksametildisilazid
NaOH natrijum hidroksid
NaHCO3natrijum bikarbonat
Na2SO4natrijum sulfat
NMR nuklearna magnetna rezonanca
Pd(OH)2paladijum dihidroksid
PMB para metoksibenzil
p.o. per os (oralna primena)
ppm delova na milion (parts per million)
prep HPLC preparativna tečna hromatografija visokih performansi PYBOP (benzotriazol-1-iloksi)tripirolidinofosfonijum heksafluorofosfat Rt ili RT sobna temperatura (room temperature)
TBME tert-butil metil etar
TFA trifluorosirćetna kiselina
THF tetrahidrofuran
THP tetrahidropiran
[0211] U ovom tekstu objavljene su farmaceutske kompozicije koje sadrže jedinjenja bilo koje Formule objavljene u ovom tekstu u kombinaciji sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim ekscipijentom ili nosačem.
[0212] "Farmaceutska kompozicija" je formulacija koja sadrži jedinjenja predmetnog pronalaska u formi pogodnoj za primenu kod subjekta. U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija je u većoj količini ili u jediničnoj doznoj formi. Jedinična dozna forma je bilo koja od različitih formi, uključujući, na primer, kapsulu, IV vrećicu, tabletu, pojedinačnu pumpu na aerosolnom inhalatoru ili fiolu. Količina aktivnog sastojka (npr., formulacija objavljenog jedinjenja ili njegove soli, hidrata, solvata ili izomera) u jediničnoj dozi kompozicije je efikasna količina i varira u skladu sa određenim tretmanom o kojem je reć. Stručnjak u oblasti će razumeti da je ponekad neophodno izvoditi rutinske varijacije doze zavisno od starosti i stanja pacijenta. Doza će zavisiti i od puta primene. U vidu se imaju različiti putevi primene, uključujući oralni, pulmonalni, rektalni, parenteralni, transdermalni, subkutani, intravenski, intramuskularni, intraperitonealni, inhalacioni, bukalni, sublingvalni, intrapleuralni, intratekalni, intranazalni i slično. Dozne forme površinsku ili transdermalnu primenu jedinjenja ovog pronalaska uključuju praškove, sprejove, masti, paste, kremove, losione, gelove, rastvore, flastere i inhalante. U jednom primeru izvođenja, aktivno jedinjenje se meša pod sterilnim uslovima sa farmaceutski prihvatljivim nosačem i sa nekim prezervansima, puferima ili propelantima koji su potrebni.
[0213] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "farmaceutski prihvatljiv" odnosi se na ona jedinjenja, anjone, katjone, materijale, kompozicije, nosače i/ili dozne forme koji su u okviru zvanične medicinske procene pogodni za upotrebu u kontaktu sa tkivima ljudi i životinja, bez izazivanja preterane toksičnosti, iritacije, alergijskog odgovora ili nekog drugog problema ili komplikacije, u skladu sa razumnim odnosom koristi i rizika.
[0214] "Farmaceutski prihvatljiv ekscipijent" označava ekscipijent koji je koristan za pripremanje farmaceutske kompozicije koji je uopšteno bezbedan, netoskičan i nije biološki ni na drugi način nepoželjan, i uključuje ekscipijent koji je prihvatljiv za upotrebu u veterini kao i za humanu farmaceutsku upotrebu. "Farmaceutski prihvatljiv ekscipijent" kako se koristi u specifikaciji i patentnim zahtevima uključuje jedan i više od jednog takvog ekscipijenta.
[0215] Farmaceutska kompozicija objavljena u ovom tekstu formulisana je tako da bude kompatibilna sa nameravanim putem primene. Primeri puteva primene uključuju parenteralnu, npr., intravensku, intradermalnu, subkutanu, oralnu (npr., inhalacionu), transdermalnu (površinsku) i transmukoznu primenu. Rastvori ili suspenzije koji se koriste za parenteralnu, intradermalnu ili subkutanu primenu mogu uključivati sledeće komponente: sterilni razblaživač kao što je voda za injekcije, slani rastvor, fiksirana ulja, polietilen glikoli, glicerin, propilen glikol ili drugi sintetski rastvarači; antibakterijska sredstva kao što su benzil alkohol ili metil parabeni; antioksidante kao što su askorbinska kiselina ili natrijum bisulfit; helirajuća sredstva kao što je etilendiamin tetrasirćetna kiselina; pufere kao što su acetati, citrati ili fosfati, i sredstva za podešavanje toničnosti kao što su natrijum hlorid ili dekstroza. pH se može podesiti kiselinama ili bazama, kao što su hlorovodonična kiselina ili natrijum hidroksid. PŠreparat za parenteralnu primenu može biti zatvoren u ampule, jednokratne špriceve ili fiole sa većim brojem doza mapravljene od stakla ili plastike.
[0216] Jedinjenje ili farmaceutska kompozicija objavljeni u ovom tekstu mogu se primeniti kod subjekta velikim brojem dobro poznatih metoda koje se trenutno koriste za hemioterapijsko lečenje. Na primer, za lečenje kancera, jedinjenje pronalaska može da s einjektira direktno u tumore, može da se injektira u krvotok ili telesne duplje ili da se uzme oralno ili nanese kroz kožu pomoću flastera. Odabrana doza treba da bude dovoljna da predstavlja efikasan tretman, ali ne toliko visoka da dovede do neprihvatljivih štetnih sporednih efekata. Stanje oboljenja (npr., kancer, prekancer, i slično) i zdravlje pacijenta treba pažljivo pratiti tokom lečenja kao i razuman period vremena posle lečenja.
[0217] Izraz "terapijski efikasna količina", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na količinu farmaceutskog sredstva za kečenje, ublažavanje ili prevenciju identifikovane bolesti ili stanja, ili za ispoljavanje detektabilnog terapijskog ili inhibitornog efekta. Efekat se može detektovati bilo kojim testnim metodom poznatim u struci. Precizna efikasna količina za subjekta zavisiće od njegove telesne težine, veličine i zdravlja; prirode i obima stanja; i terapijskog sredstva ili kombinacije terapijskih sredstava odabranih za primenu. Terapijski efikasna količina za datu situaciju može se odrediti rutinskim eksperimenatcijama koje su u okvirima osposobljenosti i procene kliničara. U poželjnom aspektu, bolest ili stanje koje se leči je kancer. U drugom aspektu, bolest ili stanje koje se leči je ćelijski proliferativni poremećaj.
[0218] Za neko jedinjenje, terapijski efikasna količina može se proceniti inicijalno u testovima na ćelijama u kulturi, npr., neoplastičnih ćelija, ili u animalnim modelima uz korišćenje obično pacova, miševa, zečeva, pasa ili svinja. Životinjski modeli mogu da se koriste i za određivanje odgovarajućeg koncentracionog opsega i puta primene. Te informacije zatim mogu da se koriste za utvrđivanje korisnih doza i puteva za primenu kod ljudi. Terapijska/profilaktička efikasnost i toksičnost mogu se odrediti standardnim farmaceutskim postupcima u ćelijskim kulturama ili eksperimentalnim životinjama, npr., ED50(doza koja je terapijski efikasna kod 50% populacije) i LD50(doza koja je letalna za 50% populacije). Dozni odnos između toksičnih i terapijskih efekata je terapijski indeks i on se može izraziti kao odnos LD50/ED50. Poželjne su farmaceutske kompozicije koje pokazuju visoke terapijske indekse. Doza može varirati unutar ovog opsega u zavisnosti od upotrebljene dozne forme, osetljivosti pacijenta i puta primene.
[0219] Doza i primena podešavaju se tako da obezbede dovoljne nivoe aktivnog sredstva/sredstava ili da održe željeni efekat. Faktori koji se mogu uzeti u obzir uključuju jačinu bolesti, opšte stanje zdravlja subjekta, starost, težinu i pol subjekta, način ishrane vreme i učestalost primene, kombinacije lekova, reakcije osetljivosti i toleranciju/odgovor na terapiju. Dugodejstvujuće farmaceutske formulacije mogu se davati svaka 3 do 4 dana, svake nedelje, ili jednom svake dve nedelje u zavisnosti od poluživota i stope klirensa određene formulacije.
[0220] Farmaceutske kompozicije koje sadrže aktivna jedinjenja predmetnog pronalaska mogu se napraviti na način koji je opšte poznat, npr., uobičajenim postupcima mešanja, rastvaranja, granulisanja, pravljenja dražeja, levigacijem, emulgovanja, inkapsuliranja, uklapanja ili liofilizacije. Farmaceutske kompozicije mogu da se formulišu na konvencionalan način korišćenjem jednog ili više farmaceutski prihvatljivih nosača koji uključuju ekscipijente i/ili pomoćna sredstva koja olakšavaju procesovanje aktivnih jedinjenja u preparate koji olakšavaju procesovanje aktivnih jedinjenja u preparate koji mogu da se koriste farmaceutski. Naravno, odgovarajuća formulacija zavisi od odabranog puta primene.
[0221] Farmaceutske kompozicije pogodne za injektabilnu upotrebu uključuju sterilne vodene rastvore (kada je vodorastvona) ili disperzije i sterilne praškove za pripremanje sterilnih injektabilnih rastvora ili disperzije neposredno pre primene. Za intravensku primenu, pogodni nosači uključuju fiziološki slani rastvor, bakteriostatsku vodu, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.) ili fosfatom puferisani slani rastvor (phosphate buffered saline, PBS). U svim slučajevima, kompozicija mora biti sterilna i treba da bude fluidna u meri da se lako ubrizgava. Mora biti stabilna pod uslovima proizvodnje i skladištenja i mora biti očuvana od kontaminirajućeg dejstva mikroorganizama kao što su bakterije i gljivice. Nosač može biti solvent ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol, i tečni polietilen glikol, i slično), i njihove pogodne mešavine. Dobra fluidnost može se održati, na primer, upotrebom obloga kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. Prevencija delovanja mikroorganizama može se postići različitim antibakterijskim i antigljivičnim sredstvima, na primer, parabenima,
hlorobutanolom, fenolom, askorbinskom kiselinom, timerosalom i slično. U mnogo slučajeva, poželjno će biti uključivanje izotoničnih sredstava, na primer, šećera polialkohola kao što su manitol i sorbitol, i natrijum hlorida u kompoziciju. Produžena apsorpcija injektabilnih kompozicija može se postići uključivanjem u kompoziciju sredstva koje odlaže apsorpciju, na primer, aluminijum monostearata i želatina.
[0222] Sterilni injektabilni rastvori mogu da se pripreme inkorporisanjem aktivnog jedinjenja u potrebnoj količini u odgovarajući solvent, sa jednim ili kombinacijom gore navedenih sastojaka, po potrebi, i zatim sterilizacijom filtriranjem. Uopšteno, disperzije se pripremaju inkorporisanjem aktivnog jedinjenja u sterilni prenosnik koji sadrži bazični disperzioni medijum i druge potrebne sastojke od gore navedenih. U slučaju sterilnih praškova za pripremanje sterilnih injektabilnih rastvora, metodi pripremanja su sušenje u vakuumu i sušenje zamrzavanjem čime se dobija prah aktivnog sastojka i svi dodatni željeni sastojci iz prethodno sterilno filtriranog rastvora istog.
[0223] Oralne kompozicije uopšteno uključuju inertni razblaživač ili jestivi farmaceutski prihvatljivi nosač. One mogu biti zatvorene u želatinske kapsule ili komprimovane u tablete. U svrhu oralne primene terapijskog sredstva, aktivno jedinjenje može se inkorporisati sa ekscipijentima i koristiti u vidu tableta, troheja ili kapsula. Oralne kompozicije mogu i da se pripreme korišćenjem tečnog nosača za upotrebu u vidu vodice za ispiranje usta, pri čemu se jedinjenje u tečnom nosaču primenjuje oralno i promućka i izbaci ili proguta. Farmaceutski kompatibilna vezujuća sredstva i/ili adjuvansni materijali mogu se uključiti kao deo kompozicije. Tablete, pilule, kapsule, troheje i slično mogusadržati bilo koji od sledećih sastojaka ili jedinjenja slične prirode: povezivač kao mikrokristalna celuloza, tragantova guma ili želatin; ekscipijent kao skrob ili laktoza, dezintegrišuće sredstvo kao alginska kiselina, Primogel, ili kukuruzni skrob; lubrikantkao magnezijum stearat ili Sterotes; glidans kao koloidni silicijum dioksid; zaslađivač kao saharoza ili saharin; ili sredstvo za poboljšanje ukusa kao nana, metil salicilat ili ukus pomorandže.
[0224] Za primenu inhalacijom, jedinjenja se dostavljaju u vidu aerosolnog spreja iz kontejnera pod pritiskom ili dispenzera koji sadrži pogodni propelant, npr., gas kao ugljen dioksid, ili iz nebulizera.
[0225] Sistemska primena može biti i transmukozna ili transdermalna. Za transmukoznu ili transdermalnu primenu, u formulaciji se koriste penetranti pogodni za permeaciju barijere. Takvi penetranti poznati su u struci i uključuju, na primer, za transmukoznu primenu, deterdžente, žučne soli i derivate fuzidinske kiseline. Transmukozna primena može se obaviti upotrebom nazalnih sprejova ili supozitorija. Za transdermalnu primenu aktivna jedinjenja se formulišu u masti, meleme, gelove ili kremove kao što je opštepoznato u struci.
[0226] Aktivna jedinjenja mogu se pripremiti sa farmaceutski prihvatljivim nosačima koji će zaštiti jedinjenje od brze eliminacije iz tela, kao što je formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implante i mikroinkapsulirane dostavne sisteme. Biodegradabilni, biokompatibilni polimeri mogu da se koriste, na primer, etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri i polilaktična kiselina. Metodi pripreme takvih formulacija biće očigledni stručnjacima u oblasti. Materijali mogu da se nabave i komercijalno od Alza Corporation i Nova Pharmaceuticals, Inc. Lipozomske suspenzije (uključujući lipozome usmerene ka inficiranim ćelijama monoklonskim antitelima na virusne antigene) takođe mogu da se koriste kao farmaceutski prihvatljivi nosači. Mogu se pripremiti prema metodima poznatim stručnjacima u oblasti, na primer, kao što je opisano u U.S. pat. br.
4,522,811.
[0227] Posebno je povoljno formulisati oralne ili parenteralne kompozicijeu jediničnoj doznoj formi za laku primenu i uniformnost doziranja. Jedinična dozna forma kako se koristi u ovom tekstu odnosi se na fizički zasebne jedinice podešene da budu jedinične doze za subjekta koji se leči; svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog jedinjenja za koju je izračunato da proizvodi željeni terapijski efekat u asocijacijisa potrebnim farmceutskim nosačem. Specifikacija jediničnih doznih formi pronalaska diktirana je i direktno zavisna od jedinstvenih karakteristika aktivnog jedinjenja i posebnog terapijskog efekta koji treba da se postigne.
[0228] U terapijskim primenama, doze farmaceutskih kompozicija upotrebljene u skladu sa pronalaskom variraju u zavisnosti od sredstva, starosti, težine i kliničkog stanja pacijenta primaoca, i iskustva i procene kliničara ili praktičara koji daje terapiju, pored ostalih faktora koji utiču na izabrano doziranje. Generalno, doza treba da bude dovoljna da rezultuje usporavanjem i poželjno regresijom rasta tumora i da takođe, poželjno, dovede do potpune regresije kancera. Doze mogu biti u opsegu od oko 0.01 mg/kg na dan do oko 5000 mg/kg na dan. U poželjnim aspektima, doze mogu biti u opsegu od oko 1 mg/kg na dan do oko 1000 mg/kg na dan. U aspektu, doza će biti u opsegu od oko 0.1 mg/dan do oko 50 g/dan; oko 0.1 mg/dan do oko 25 g/dan; oko 0.1 mg/dan do oko 10 g/dan; oko 0.1 mg do oko 3 g/dan; ili oko 0.1 mg do oko 1 g/dan, u pojedinačnim, podeljenim ili kontinuiranim dozama (koje se mogu podesiti prema pacijentovoj težini u kg, površini tela u m<2>, i starosti u godinama). Efikasna količina farmaceutskog sredstvaje ona koja obezbeđujepoboljšanje koje objektivno može utvrditi kliničar ili drugi kvalifikovani posmatrač. Na primer, regresija tumora kod pacijenta se može meriti u odnosu na dijametar tumora. Smanjenje dijametra tumora ukazuje na regresiju. Na regresiju ukazuje i nemogućnost tumora da se ponovo pojavi posle prestanka tretmana. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "dozno efikasan način" odnosi se na količinu aktivnog jedinjenja za proizvodnju željenog biološkog efekta kod subjekta ili u ćeliji.
[0229] Farmaceutske kompozicije mogu se nalaziti u kontejneru, pakovanju ili dispenzeru, zajedno sa uputstvima z aprimenu.
[0230] Jedinjenja objavljena u ovom tekstu mogu da formiraju soli. Sve ove forme takođe se razmatraju u okviru zahtevanog pronalaska.
[0231] Kako se koristi u ovom tekstu, "farmaceutski prihvatljive soli" odnosi se na derivate jedinjenja objavljenih u ovom tekstu pri čemu je matično jedinjenje modifikovano pravljenjem njegove kisele ili bazne soli. Primeri farmaceutski prihvatljivih soli uključuju, ali se ne ograničavaju na soli mineralnih ili organskih kiselina baznih rezidua kao što su amini, alkalne ili organske soli kiselih rezidua kao karboksilne kiseline i slično. Farmaceutski prihvatljive soli uključuju konvencionalne netoksične soli ili kvaternarne amonijum soli matičnog jedinjenja formirane, na primer, od netoksičnih neorganskih ili organskih kiselina. Na primer, takve konvencionalne netoksične soli uključuju, ali se ne ograničavaju na one koje su izvedene iz neorganskih i organskih kiselina odabranih između 2-acetoksibenzoeve, 2-hidroksietan sulfonske, sirćetne, askorbinske, benzen sulfonske, benzoeve, bikarbonske, karbonske, limunske, edetinske, etan disulfonske, 1,2-etan sulfonske, fumarne, glukoheptonske, glukonske, glutaminske, glikolne, glikoliarsanilne, heksilrezorcinske, hidrabamske, bromovodonične, hlorovodonične, jodovodonične, hidroksimaleinske, hidroksinaftoične, izetionske, mlečne, laktobionske, lauril sulfonske, maleinske, jabučne, mandelične, metan sulfonske, napsilične, azotne, oksalne, pamoične, pantotenske, fenilsirćetne, fosforne, poligalakturonske, propionske, salicilne, stearinske, subsirćetnea, sukcinske, sulfamske, sulfanilne, sumporne, taninske, tartaratne, toluen sulfonske, i uobičajenih amino-kiselina, npr., glicina, alanina, fenilalanina, arginina, itd.
[0232] Drugi primeri farmaceutski prihvatljivih soli uključuju heksansku kiselinu, ciklopentan propionsku kiselinu, piruvičnu kiselinu, malonsku kiselinu, 3-(4-hidroksibenzoil)benzoevu kiselinu, cinaminsku kiselinu, 4-hlorobenzensulfonsku kiselinu, 2-naftalensulfonsku kiselinu, 4-toluensulfonsku kiselinu, kamforsulfonsku kiselinu, 4-metilbiciklo-[2.2.2]-okt-2-en-1-karboksilnu kiselinu, 3-fenilpropionsku kiselinu, trimetilsirćetnu kiselinu, terciajrnu butilsirćetnu kiselinu, mukonsku kiselinu i slično. Predmetni pronalazak obuhavata i soli koje se formiraju kada je kiselinski proton prisutan u matičnom jedinjenju zameni metalnim jonom, npr., jonom alkalnog metala, jonom zemno-alkalnog metala ili jonom aluminijuma; ili koordiniše sa organskom bazom kao što su etanolamin, dietanolamin, trietanolamin, trometamin, N-metilglukamin, i slično. U formi soli, razume se da odnos jedinjenja prema katjonu ili anjonu soli može biti 1:1, ili bilo koji odnos različit od 1:1, npr., 3:1, 2:1, 1:2, ili 1:3.
[0233] Treba razumeti da sva pozivanja na farmaceutski prihvatljive soli uključuju adicione forme solventa (solvate) ili kristalne forme (polimorfe) kako je definisano u ovom tekstu, iste soli.
[0234] Jedinjenja objavljena u ovom tekstu mogu se pripremiti i kao estri, na primer farmaceutski prihvatljivi estri. Na primer, funkcionalna grupa karboksilne kiseline u jedinjenju može da se konvertuje u odgovarajući estar, npr., metil, etil ili drugi estar. Isto tako, alkoholna grupa u jedinjenju može da se konvertuje u odgovarajući estar, npr., acetatni, propionatni ili drugi estar.
[0235] Jedinjenja, ili njihove farmaceutski prihvatljive soli ili solvati, primenjuju se oralno, nazalno, transdermalno, pulmonalno, inhalacijom, bukalno, sublingvalno, intraperintonealno, subkutano, intramuskularno, intravenski, rektalno, intrapleuralno, intratekalno i parenteralno. U jednom primeru izvođenja, jedninjenje se primenjuje oralno. Stručnjak u oblasti će prepoznati prednosti određenih puteva primene.
[0236] Režim doziranja u kojem se koriste jedinjenja bira se u skladu sa različitim faktorima uklučujući tip, vrstu, starost, težinu, pol i medicinsko stanje pacijenta; jačinu stanja koje treba lečiti; put primene; funkciju bubrega i jetre pacijenta; i određeno jedinjenje ili njegovu so koja se koristi. Uobičajeno obučeni leka ili veterinar može lako odrediti i prepisati efikasnu količinu leka potrebnu za preveniranje, suprotstavljanje ili prestanak napredovanja stanja.
[0237] Tehnike formulisanja i primene objavljenih jedinjenja pronalaska mogu se naći u Remington: the Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, Mack Publishing Co., Easton, PA (1995). U primeru izvođenja, jedinjenja opisana u ovom tekstu i njihove farmaceutski prihvatljive soli koriste se u farmaceutskim preparatima u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem ili razblaživačem. Pogodni farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju inertna čvrsta potporna sredstva ili razblaživače i sterilne vodene ili organske rastvore. Jedinjenja će biti prisutna u takvim farmaceutskim kompozicijama u količini dovoljnoj da se obezbedi željena dozna količina u opsegu opisanom u ovom tekstu.
[0238] Svi procenti i opsezi upotrebljeni u ovom tekstu, ako nije drugačije naznačeno, su po težini. Druge osobine i prednosti predmetnog pronalaska očigledni su iz različitih primera. Dati primeri ilustruju različite komponente i metodologiju korisnu za izvođenje predmetnog pronalaska. Primeri ne ograničavaju zahtevani pronalazak. Na osnovu predmetne objave obučen stručnjak će identifikovati i upotrebiti druge komponente i metodologiju korisne za izvođenje predmetnog pronalaska.
[0239] U šemama sinteze opisanim u ovom tekstu, jedinjenja mogu biti nacrtana u jednoj određenoj konfiguraciji, radi pojednostavljenja. Takve određene konfiguracije ne treba razumeti kao da ograničavaju pronalazak na jedan ili drugi izomer, tautomer, regioizomer ili stereoizomer, niti da isključuju mešavine izomera, tautomera, regioizomera ili stereoizomera; međutim, razume se da dati izomer, tautomer, regioizomer ili stereoizomer može imati viši nivo aktivnosti nego drugi izomer, tautomer, regioizomer ili stereoizomer.
[0240] Jedinjenja dizajnirana, selektovana i/ili optimizovana metodima opisanim gore, kada se proizvedu, mogu da se karakterišu korišćenjem različitih testova poznatih stručnjaku u oblasti da bi se odredilo da li jedinjenja imaju biološku aktivnost. Na primer, molekuli mogu da se okarakterišu uobičajenim testovima, uključujući, ali ne ograničavajući se na testove opisane u nastavku, da bi se odredilo da li imaju prediktivnu aktivnost, vezujuću aktivnost i/ili vezujuću specifičnost.
[0241] Pored toga, visokopropusni skrining može da se upotrebi za ubrzanje analize korišćenjem takvih testova. Kao rezultat, moguće je brzo pretražiti molekule opisane u ovom tekstu u pogledu aktivnosti, korišćenjem tehnika poznatih u struci. Opšta metodologija izvođenja visokopropusnog skrininga opisana je na primer u Devlin (1998) High Throughput Screening, Marcel Dekker; i U.S. patent br.. 5,763,263. Visokopropusni testovi mogu da koriste jednu ili više različitih testnih tehnika uključujući, ali ne ograničavajući se na opisane u nastavku..
[0242] EZH2 inhibitor objavljen u ovom tekstu može, po želji, biti prisutan u kitu (npr., pakovanje ili dispenzer) koji može sadržati jednu ili više jediničnih doznih formi koje sadrže EZH2 inhibitor. Pakovanje može na primer sadržati metalnu ili plastičnu foliju, na primer blister pakovanje. Pakovanju ili dispenzeru mogu biti pridružena uputstva za primenu. Kompozicije koje uključuju EZH2 inhibitor objavljen u ovom tekstu formulisan u kompatibilnom farmaceutskom nosaču mogu se pripremiti, staviti u odgovarajući kontejner i obeležiti za lečenje naznačenog stanja. Mogu se obezbediti i uputstva za upotrebu.
[0243] U ovom tekstu obezbeđeni su i kitovi koji sadrže veći broj reagenasa za detektovanje metilacije, koji detektuju metilisani H3-K27. Na primer, kit uključuje detekcione reagense za monometilisani H3-K27, dimetilisani H3-K27 i trimetilisani H3-K27. Deteksioni reagensi su na primer antitela ili njihovi fragmenti, polipeptid ili aptameri.
[0244] Kit može uključivati i reagense za detektovanje gubitka funkcije najmanje jedne komponente SWI/SNF kompleksa, npr, nukleinske kiseline koje specifično identifikuju mutantnu komponentnu nukleinskokiselinsku sekvencu pomoću posedovanja homologih nukleinskokiselinskih sekvenci, kao što su oligonukleotidne sekvence komplementarne sa delom mutantne komponentne nukleinskokiselinske sekvence ili antitela na proteine kodirane divljim tipom i/ili mutantnom komponentnom nukleinskom kiselinom, pakovane zajedno u vidu kita. Oligonukleotidi mogu biti fragmenti komponentnog gena. Na primer, oligonukleotidi mogu biti dugi 200, 150, 100, 50, 25, 10 ili manje nuukleotida. Kit može sadržati u zasebnim kontejnerima aptamer ili antitelo, kontrolne formulacije (pozitivnu i/ili negativnu), i/ili detektabilni obeleživač kao fluorescein, zeleni fluorescentni protein, rodamin, cijaninske boje, Alexa boje, luciferazu, radioobeleživače, između ostalih. Pored toga, reagensi za detektovanje biološke aktivnosti SWI/SNF kompleksa (kao što je aktivnost u remodeliranju hromatina) mogu biti uključene u kit.
[0245] Uputstva (npr., pisana, snimljena, VCR, CD-ROM, itd.) za izvođenje testa mogu biti uključena u kit. Test može biti na primer u formi Western blot analize, imunohistohemije (immunohistochemistry, IHC), imunofluorescencije (immunofluorescence, IF), sekvenciranja i masene spektrometrije (mass spectrometry, MS), kako je poznato u struci.
Primer 1: Trajna regresija tumora u genetički izmenjenim limfomima i malignim rabdoidnim tumorima inhibicijom EZH2
[0246] Jedinjenje A je snažan i selektivan inhibitor EZH2: Biohemijski testovi bez ćelija koji uključuju radioobeležene SAM i oligonukleozome pilećih eritrocita ili peptide koji odgovaraju H3K27 kao supstrat, pokazali su da Jedinjenje A selektivno inhibira aktivnost humanog PRC2 koji sadrži divlji tip EZH2 sa vrednošću konstante inhibicije (Ki) od 2.5 ± 0.5 nmol/L i IC50vrednostima od 11 ± 5 nM (nukleozomski test) ili 16 ± 12 nM (peptidni test). IC50vrednosti su slične za humani i pacovski EZH2 enzim kao i za EZH2 proteine koji nose sve poznate mutacije promene funkcije koje se javljaju u limfomu. IC50vrednost Jedinjenja A raste sa porastom koncentracije SAM, ali je minimalno afektovana porastom količine oligonukleozoma što je konzistentno sa SAM-kompetitivnim i nukleozom-nekompetitivnim modalitetom inhibicije. da bi se demonstrirala selektivnost HMT, procenjivana je inhibicija Jedinjenjem A u odnosu na panel HMT različitih od EZH2 koji obuhvataju lizinske i argininske HMT. Jedinjenje A pokazalo je 35-struku selektivnost prema EZH1 i više od 4500-struku selektivnost u odnosu na drugih 14 testiranih.
[0247] Jedinjenje A specifično inhibira metilaciju ćelijskog H3K27 u ćelijama: Kada se WSU-DLCL2 EZH2 Y641F mutantne ćelije limfoma inkubiraju sa Jedinjenjem A 4 dana, zapaža se koncentraciono zavisno smanjenje globalnih H3K27Me3 nivoa, sa prosečnom IC50vrednošću od 0.26 μM (H3K27Me3 nivoi određivani pomoću ELISA). Kada se izučava kinetika inhibicije metilacije, poluživot H3K27Me3 je približno 1 dan jer se 90% inhibicije postiže posle 3 do 4 dana inkubacije. Kada se OCI-LY19 EZH2 limfoma ćelije divljeg tipa inkubiraju sa 2.7 μM Jedinjenja A 4 dana, jedini afektovani metil markeri bili su H3K27Me1, H3K27Me2 i H3K27Me3, tri poznata proizvoda PRC2 katalize. Inkubacija sa Jedinjenjem A takođe rezultuje poratsom H3K27 acetilacije.Sposobnost Jedinjenja A da redukuje globalne nivoe H3 K27 trimetilacije dodatno je testirana na nekoliko drugih ćeloijskih linija humanog limfoma uključujući linije koje eksprimiraju divlji tip ili mutantni EZH2. Jedinjenje A smanjuje H3K27Me3 sa sličnom snagom u svim ćelijskim linijama nezavisno od EZH2 statusa (Tabela 1).
[0248] Jedinjenje A dovodi do selektivnog ubijanja ćelijskih linija limfoma koje nose EZH2 tačkaste mutacije: Inkubacija WSU-DLCL2 EZH2 Y641F mutantnih ćelija sa Jedinjenjem A dovodi do antiproliferativnih efekata sa prosečnom IC50vrednošću od 0.28 ± 0.14 μM u šestodnevnom proliferacionom testu. Kinetika efekta Jedinjenja A na broj vijabilnih ćelija dodatno je testirana tokom produženog vremenskog perioda od 11 dana. Antiproliferativni efekat Jedinjenja A bio je vidljiv posle izlaganja WSUDLCL2 ćelija jedinjenju duže od 4 dana, što je konzistentno sa kinetikom inhibicije ćelijske H3K27 metilacije posredovane Jedinjenjem A. IC50vrednost za inhibiciju proliferacije WSU-DLCL2 ćelija Jedinjenjem A u 11-dnevnom testu (0.0086 μM, Tabela 1) bila je niža u poređenju sa rezultatima dobijenim u 6-dnevnom proliferacionom testu, što sugeriše povećanu senzitivnost sa produženim periodima inkubacije. Nasuprot WSU-DLCL2 ćelijama, rast OCILY19 ćelija humanog limfoma (EZH2 divlji tip za reziduu Y641) tokom 11 dana nije značajno afektovan, uprkos uporedivim IC50vrednostima za H3K27Me3 inhibiciju za obe ćelijske linije (Tabela 1). Da bi se identifikovala koncentracija pri kojoj ćelije prestaju da proliferišu imajući u vidu čitav period inkubacije od 11 dana, izračunavana je najniža citotoksična koncentracija (LCC) za određenu ćelijsku liniju. LCC vrednost za WSU-DLCL2 EZH2 Y641F mutantne humane limfoma ćelije bila je značajno niža u poređenju sa OCI-LY19 ćelijama koje su divlji tip za EZH2 (Tabela 1). Ovaj kontekst specifičnog ubijanja ćelija dodatno je podržan rezultatima iz 11-dnevnih testova proliferacije sa proširenim panelom ćelijskih linija limfoma. Sve ćelijske linije koje nose EZH2 mutaciju, osim RL ćelijske linije (EZH2 Y641N), bile su senzitivnije na antiproliferativne efekte Jedinjenja A u poređenju sa ćelijskim linijama sa divljim tipom EZH2 (Tabela 1). Pfeiffer ćelijska linija (EZH2 A677G) pokazala je 20- do 300-struki porast osetljivosti na Jedinjenje A, kako je izmereno IC50vrednošću i LCC, respektivno, nad Y641 mutantnim ćelijskim linijama. Zatim, minimalno vreme izlaganja jedinjenju, potrebno za trajno ubijanje ćelija ispitivano je eksperimentima ispiranja. LCC vrednosti na dan 11 ili 14 za WSU-DLCL2 ćelije koje su bile inkubirane sa Jedinjenjem A 7 dana (praćeno sa 7 dana ispiranja jedinjenja) ili kontinuirano 14 dana bile su slične (Tabela 2).Izlaganje leku u trajanju od samo 4 dana, međutim, nije bilo dovoljno da indukuje LCC vrednosti slične kontinuiranoj inkubaciji.
[0249] Jedinjenje A indukuje zastoj u G1 fazi i apoptozu u EZH2 mutantnim limfoma ćelijama: Zatim, procenjivani su efekti inkubacije sa Jedinjenjem A (1 μM) u trajanju od 7 dana na progresiju ćelijskog ciklusa i apoptozu u WSU-DLCL2 ćelijama. Porast procenta ćelija u G1 fazi i smanjenje procenta ćelija u S fazi i G2/M fazi bio je vidljiv posle 2 dana inkubacije sa Jedinjenjem A. Maksimalan efekat dostignut je posle 4 dana. Nije bilo vidljivog porasta sub-G1 frakcije što sugeriše da apoptoza nije indukovana inkubacijom sa Jedinjenjem A tokom 7 dana. Ovo je u saglasnosti sa krivama rasta WSU-DLCL2 ćelija u prisustvu Jedinjenja A što ukazuje da su citotoksični efekti zapaženi samo posle 7 dana inkubacije. Posle inkubacije WSU-DLCL2 ćelija sa Jedinjenjem A tokom do 14 dana, frakcija apoptotskih ćelija određena TUNEL testom bila je značajno povećana na dan 14 u poređenju sa prenosnikom, što ukazuje da se ćelijska smrt posredovana Jedinjenjem A dešava preko indukcije apoptoze.
[0250] Oralna primena Jedinjenja A dovodi do EZH2 ciljne inhibicije u EZH2 mutantnim ksenograftskim modelima kod miševa: Ispitivan je efekat oralnog doziranja Jedinjenja A na sistemsko izlaganje jedinjenju i in vivo ciljnu inhibiciju kod miševa koji nose EZH2 mutantne limfoma-ksenografte. Prvo, SCID miševi kojima su implantirani subkutano WSUDLCL2 ksenografti oralno su dozirani Jedinjenjem A tokom 4 ili 7 dana. Merenjem nivoa Jedinjenja A u plazmi 5 minuta pre ili 3 sata posle poslednje doze pokazuje jasan dozno zavisan porast izloženosti. Samo životinje dozirane sa 160 mg/kg TID ili 213 mg/kg BID zadržale su srednje nivoe jedinjenja u plazmi iznad LCC za WSU-DLCL2 ćelije tokom celog ciklusa doziranja (1652 ng/mL, uz razmatranje vezivanja za proteine plazme miša). Određivanje jedinjenja u homogenatima tumora sakupljenih 3 sata posle poslednje doze pokazalo je da su samo za najviše dozne grupe nivoi jedinjenja u 2 kompartmenta bili slični. Kada su analizirani nivoi H3K27Me3 u tumorima, dozno zavisna EZH2 ciljna inhibicija je bila zapažena. H3K27Me3 inhibicija bila je manja u tumorima iz miševa doziranih sa 213 mg/kg QD, što sugeriše da je održavanje koncentracije u plazmi iznad LCC tokom ciklusa doziranja potrebno za optimalnu ciljnu inhibiciju. Doziranje u trajanju od 4 dana, sa 160 mg/kg TID rezultovalo je blago sniženom ciljnom inhibicijom nego doziranje u trajanju od 7 dana istom dozom i po istom rasporedu, što ukazuje da produženo doziranje povećava stepen ciljne inhibicije u WSU-DLCL2 tumorima. Izvedena je slična 7-dnevna studija sa "nude" miševima kojima su subkutano implantirani ksenografti KARAPS-422 i procenjivani BID i QD rasporedi doziranja. Jedinjenje A indukovalo je dozno zavisno smanjenje nivoa tumora H3K27Me3 pri oba režima.
[0251] Jedinjenje A indukuje značajne antitumorske efekte u ksenograftima nekoliko EZH2 mutantnih limfoma: Kada su SCID miševi koji nose WSU-DLCL2 EZH2 Y641F mutantni ksenograftski tumor bili tretirani Jedinjenjem A 28 dana, zapažena je dozno zavisna inhibicija rasta tumora, 58% pri najvišoj dozi od 150 mg/kg TID. Samo životinje kod kojih je primenjena najviša doza zadržale su nivoe Jedinjenja A u plazmi iznad LCC za WSU-DLCL2 ćelije tokom čitavog ciklusa doziranja. Doziranje Jedinjenja A tokom 28 dana dovelo je do relativne akumulacije jedinjenja u tumorskom tkivu u poređenju sa plazmom, što je suprotno od zapaženog tokom 7-dnevnog doziranja. ELISA analiza histona iz tumora prikupljenih na dan 28 pokazala je dozno zavisnu ciljnu inhibiciju. H3K27Me3 nivoi u WSU-DLCL2 ksenograftima bili su niži kod miševa doziranih tokom 28 dana u poređenju sa 7 dana što ukazuje na to da produžena primena Jedinjenja A povećava stepen ciljne inhibicije. U KARPAS-422 EZH2 Y461N mutantnim ksenograftima, 28-dnevno doziranje Jedinjenja A prema BID rasporedu imalo je mnogo izraženije efekte. Inhibicija rasta tumora zapažena je pri niskim dozama od 80.5 mg/kg BID, ali više doze iskorenile su ksenografte i nije zapažen ponovni rast do 90. dana posle prekida doziranja. Kada je ispitivan intermitentni raspored doziranja u miševima koji nose KARPAS-422 ksenograft, Jedinjenje A je ponovo pokazalo značajne dozno zavisne antitumorske efekte uz dva ciklusa uz raspored od 7 dana doziranja/7 dana bez doziranja i 21 dan doziranja/7 dana bez doziranja. Za sve rasporede doziranja, inhibicija rasta tumora i potpuna regresija zapažene su pri 90 i 361 mg/kg BID, respektivno. Pfeiffer EZH2 A677G mutantni ksenograftski model bio je najosetljiviji model tumora, kako je sugerisano snažnim antiproliferativnim efektima Jedinjenja A na ovu ćelijsku liniju in vitro. Sve dozne grupe Jedinjenja A (QD raspored) osim najniže (30 mg/kg QD) pokazale su potpunu regresiju tumora kod svih životinja. Ponovo, nije zapažen ponovni rast tumora do kraja studije (36 dana posle prestanka primene Jedinjenja A). Iako je ponovni rast tumora zapažen pri 30 mg/kg QD, ova veoma niska doza indukovala je stazu tumora tokom perioda primene. Usled pitanja tolerabilnosti doziranje je prekinuto na dan 12 za miševe koji su dozirani sa 1140 mg/kg QD; ipak, trajna potpuna regresija zapažena je u ovoj grupi koja je izlagana Jedinjenju A tokom samo 12 dana.
[0252] Jedinjenje A selektivno ubija SMARCB1 mutantne MRT ćelije in vitro i in vivo:
Ispitivano je da li EZH2 inhibicija ima ikakve efekte na rast i preživljavanje SMARCB 1-deletovanih MRT ćelija. Inkubacija SMARCB1- deletovanih MRT ćelijskih linija G401 i A204 sa Jedinjenjem A u 14-dnevnom proliferacionom testu in vitro indukovala je snažne antiproliferativne efekte sa IC50vrednostima u nM opsegu dok je uticaj na kontrolne ćelijske linije RD i SJCRH30 koje eksprimiraju SMARCB 1 bio minimalan (Tabela 3). Doziranje SCID miševa koji nose subkutane G401 ksenografte, Jedinjenjem A pri dozama od 266 ili 532 mg/kg BID tokom 28 dana eliminisalo je ove izuzetno brzorastuće tumore. Slično modelima KARPAS-422 i Pfeiffer EZH2 mutantnim NHL ksenograftima, ponovni rast nije zapažen na kraju studije, 32 dana posle prestanka doziranja. Jedinjenje A u dozi od 133 mg/kg indukovalo je stazu tokom perioda primene, i proizvelo je značajno odlaganje rasta tumora u poređenju sa prenosnikom, posle prestanka doziranja. Tumori koji su bili izolovani iz podgrupe miševa iz svake grupe, na dan 21, pokazali su jaku ciljnu inhibiciju EZH2 pri svim dozama.
[0253] Jedinjenje A inhibira H3K27 metilaciju u netumorskim tkivima na dozno zavisan način: Gore opisani podaci pokazuju da Jedinjenje A predstavlja novi modalitet lečenja kancera pokrenutih SWI/SNF i MRT. Merenjem modulacije farmakodinamičkih biomarkera posle doziranja često se obavlja u ranim kliničkim studijama da bi se procenio stepen ciljne inhibicije za koju je predviđeno da proizvodi odgovor na osnovu podataka iz prekliničkih modela. Pošto prikupljanje biopsija tumora posle doziranja obično nije moguće, umesto toga se često prikupljaju lakše dostupna surogatska tkiva kao što su mononuklearne ćelije periferne krvi (peripheral blood mononuclear cells, PBMC), koža ili kostna srž. Da bi se testirala EZH2 ciljna inhibicija u surogatskim tkivima, mužjacima i ženkama Sprague Dawley pacova oralno su davane doze od 100, 300, ili 1000 mg/kg Jedinjenja A tokom 28 dana, i uzorci PBMC, kostne srži i kože sakupljeni su na kraju studije. Nivoi Jedinjenja A u plazmi dozno zavisno su povišeni kod mužjaka i kod ženki pacova, a nivoi u plazmi uopšteno bili su viši kod ženki u poređenju sa onim kod mužjaka. Zbog pitanja tolerabilnosti, ženke u grupi od 1000 mg/kg morale su da budu eutanazirane na dan 23. Dozno zavisna ciljna inhibicija zapažena je u PBMC i kostnoj srži pacova doziranihJedinjenjem A, kako je mereno korišćenjem ELISA. Stepen ciljne inhibicije bio je manje izražen za PBMC iz ženki koje su dozirane 22 dana u poređenju sa mužjacima koji su dozirani 28 dana (ista doza od 1000 mg/kg). Dozno zavisno smanjenje H3K27Me3 pozitivnih ćelija zapažena je u epidermu kože pacova doziranih Jedinjenjem A, kako je procenjeno IHC testom. Maksimalan efekat zapažen je pri najvišoj dozi, i bio je evidentan već posle 22 dana primene Jedinjenja A.
[0254] Jedinjenje A pokazalo je slične osobine kao drugi EZH2 inhibitori in vitro, na primer veoma visoka specifičnost za EZH2 u biohemijskim testovima u poređenju sa drugim HMT i specifična inhibicija ćelijske H3K27 metilacije koja dovodi do za kontekst specifičnog ubijanja EZH2 mutiranih NHL ćelijskih linija. Međutim, ovo jedinjenje dostiglo je približno 10-struko povećanje potencije, reflektovano smanjenjem Ki i IC50vrednosti, određenih u biohemijskim testovima i testovima funkcije ćelija. Pored toga, Jedinjenje A pokazalo je odličnu oralnu bioraspoloživost kada je primenjeno kod glodara što je dovelo do dozno zavisne EZH2 ciljne inhibicije u ksenograftskim tumorima i netumorskim tkivima. Što je važno, doziranje Jedinjenja A indukovalo je značajne antitumorske efekte kod miševa koji nose EZH2 mutantne limfoma ksenografte. Odgovori su bili u rasponu od iskorenjivanja tumora (bez ponovnog rasta posle prestanka doziranja) do dozno zavisne inhibicije rasta tumora. Odložena pojava antitumorske aktivnosti (posle 4 do 7 dana) bila je konzistentna sa kinetikom inhibicije metilacije i antiproliferativnom aktivnošću indukovanom inkubacijom ćelija sa Jedinjenjem A in vitro. Održavanje nivoa Jedinjenja A u plazmi iznad LCC tokom ciklusa doziranja bilo je neophodno za WSU-DLCL2 ksenograftski model da bi se indukovala maksimalna ciljna inhibicija i antitumorski odgovor. Druga dva ksenograftska modela limfoma (KARPAS-422 i Pfeiffer), međutim, bila su izuzetno osetljiva na primenu Jedinjenja A i održavanje nivoa u plazmi iznad LCC nije bilo neophodno. Pfeiffer EZH2 A677G mutantni ksenograftski tumori trajno su se izgubili uz veoma niske doze i kratke periode doziranja, što sugeriše da bi se kod pacijenata sa ovim tipom genetički definisanog NHL ostvario zanačajan efekat lečenja Jedinjenjem A.
[0255] MRT su izuzetno agresivni pedijatrijski kanceri mozga, bubrega i mekih tkiva koji su visoko maligni, lokalno inavazivni, često metastaziraju i posebno su letalni, ali su tipično diploidni i nemaju genomske aberacije. Oni se, međutim, karakterišu gotovo potpunom penetrancijom gubitka ekspresije SMARCB 1, središnje komponente SWI/SNF kompleksa za remodeliranje hromatina. Bialelska inaktivacija SMARCB 1, na primer indukovana mutacijama, u suštini je usamljen genetički događaj u MRT što sugeriše ulogu pokretača za ovu genetičku aberaciju. U genetičkim studijama sugerisano je da PRC2 i SWI/SNF antagonistički regulišu gensku ekspresiju oko RB, Ciklin D1 i MYC puteva. Ovde su pokazani farmakološkom inhibicijom EZH2 indukovani antiproliferativni efekti u SMARCB1 deletovanim MRT ćelijskim linijama i trajno iskorenjeni MRT ksenografti u miševima. Ovo potvrđuje zavisnost takvih kancera u kojima sam EZH2 nije genetički izmenjen, od PRC2 aktivnosti.
[0256] Jedinjenje A predstavlja novi modalitet lečenja genetički definisane podgrupe NHL MRT. Sposobnost merenja dozno zavisnih promena u nivoima H3K27Me3 u koži, PBMC i kostnoj srži predviđa upotrebu signala iz ovih surogatskih tkiva kao neinvazivnog farmakodinamičkog biomarkera u kliničkim ispitivanjima na ljudima.
Tabela 1: IC50vrednosti za metilaciju i proliferaciju kao i LCC vrednosti za Jedinjenje A u ćelijskim linijama humanog limfoma
Tabela 2: LCC vrednosti za Jedinjenje A za WSU-DLCL2 ćelije humanog limfoma dozirane kontinuirano ili posle ispiranja Jedinjenja
Tabela 3: IC50vrednosti za Jedinjenje A za SMARCB1 negativne MRT ćelijske linije i SMARCB1 pozitivne kontrolne ćelijske linije
Primer 2: Trajna regresija tumora kod genetički izmenjenih malignih rabdoidnih tumora, inhibicijom EZH2
[0257] Jedinjenje A je snažni i selektivni inhibitor EZH2: Jedinjenje A razvijeno je iterativnom medicinskom hemijom (Slika 10A). Jedinjenje A inhibira aktovnost humanog PRC2 koji sadrži divlji tip EZH2 uz vrednost konstante inhibicije (Ki) od 2.5 ± 0.5 nM, i slična potencija je zapažena za EZH2 proteine koji nose sve poznate mutacije promene funkcije za limfome (Tabela 5). Studijama kinetike ravnotežnog stanja nađeno je da je jedinjenje SAM-kompetitivno i nukleozom-nekompetitivno (Slika 11). Inhibicija Jedinjenjem A panela HMT različitih od EZH2 koji obuhvataju lizin i arginin HMT takođe je procenjivana. Jedinjenje A pokazalo je 35-struku selektivnost prema EZH1 i > 4500-struku selektivnost u odnosu na 14 drugih testiranih HMT (Tabela 5).
Tabela 4: Inhibicija histonmetiltransferaze Jedinjenjem A
[0258] Jedinjenje A specifično inhibira ćelijsku metilaciju H3K27 dovodeći do selektivnog apoptotskog ubijanja SMARCB1 mutantnih MRT ćelija: Panel SMARCB1 deficijentnih MRT ćelija i SMARCB1 divlji tip kontrolnih ćelija (potvrđeno imunoblotom, Slika 12A) tretiran je Jedinjenjem A u trajanju od 4 dana, što je rezultovalo koncentraciono zavisnim smanjenjima globalnih nivoa H3K27Me3 (Slika 10B i tabela 6). Tretman divljeg tipa ćelija ili mutantnih ćelija rezultovao je smanjenjem samo metil markera na H3K27, bez uticaja na druge metil markere histona (Slika 12B). In vitro tretman SMARCB1-deletovanih MRT ćelijskih linija Jedinjenjem A indukovala je snažne antiproliferativne efekte, uz IC50vrednosti u nM rasponu; dok su kontrolne (divlji tip) ćelijske linije bile minimalno afektovane (Slika 10C i tabela 6). Antiproliferativni efekti bili su vidljivi kod SMARCB1-deletovanih MRT ćelija posle 7 dana izlaganja jedinjenju, ali je za maksimalnu aktivnost bilo potrebno izlaganje od 14 dana. Efekti inkubacije sa Jedinjenjem A (1 μM) u trajanju od 14 dana na progresiju ćelijskog ciklusa i apoptozu u G401 i RD ćelijama takođe su procenjivani. Inkubacija Jedinjenja A sa RD SMARCB1 divlji tip ćelijama pokazala je izostanak promena u ćelijskom ciklusu ili apoptozi u poređenju sa DMSO kontrolom (Slika 13A). Nasuprot tome, G401 SMARCB1-deletovane ćelije pokazale su porast procenta ćelija u G1 fazi i prateće smanjenje u S fazi i G2/M fazi posle 7 dana (Slika 13B). Nije bilo vidljivog porasta sub-G1 frakcije do dana7, što sugeriše da do tog vremena apoptoza još nije bila indukovana. Ovo koincidira sa krivama rasta G401 ćelija u prisustvu Jedinjenja A koje pokazuju citotoksičnost samo posle 7 dana inkubacije (Slika 10C). Posle tretmana G401 ćelija Jedinjenjem A u trajanju do 14 dana, frakcija ćelija u sub-G1 kao i apoptotskih ćelija određenih TUNEL testom raste na način zavisan od vremena do dana 11 i 14, ukazujući da se Jedinjenjem A posredovana ćelijska smrt dešava indukcijom apoptoze (Slika 13B).
Tabela 6
[0259] Jedinjenje A indukuje gene neuronske diferencijacije i inhibicije ćelijskog ciklusa, dok suprimira ekspresiju gena hedgehog puta, MYC i EZH2: Sugerisano je da gubitak SMARCB 1 pokreće formiranje kancera preko simultane epigenetske perturbacije ključnih kancerskih puteva. Sadašnji podaci potvrđuju ranije opisanu smanjenu ekspresiju gena važnih za neuronslu diferencijaciju (CD133, DOCK4, PTPRK), inhibiciju ćelijskog ciklusa (CDKN2A) i supresiju tumora (BIN1), kao i porast ekspresije gena hedgehog puta GLI1 u SMARCB1-deletovanim G401 ćelijama u poređenju sa kontrolnim ćelijama (Slika 14A). Tretman Jedinjenjem A G401 ćelija u trajanju do 7 dana snažno indukuje ekspresiju CD133, DOCK4 i PTPRK i pozitivno reguliše inhibitore ćelijskog ciklusa CDKN1A i CDKN2A i tumor supresor BIN1, sve na način zavisan od vremena (Slika 14B). Istovremeno, ekspresija gena hedgehog puta, MYC i EZH2 je smanjena. Posebno, G402 SMARCB1-deletovane ćelije izložene Jedinjenju A u trajanju od 14 dana simulirale su morfologiju sličnu neuronima (Slika 14C). Nasuprot tome, inkubacija RD kontrolnih ćelija sa Jedinjenjem A imala je minimalne efekte na ekspresiju gore pomenutih gena.
[0260] Jedinjenje A iskorenjuje SMARCB1 mutantne MRT ksenografte: Oralno doziranje Jedinjenja A dovodi do sistemske izloženosti jedinjenju, in vivo ciljne inhibicije i antitumorske aktivnosti kod miševa koji nose SMARCB1-deletovane MRT ksenografte. Izvedena je studija na SCID miševima koji nose subkutane G401 ksenografte u kojoj su životinje bile 21 dan dozirane Jedinjenjem A. Polovina miševa po grupi eutanazirana je na dan 21 da bi se prikupili uzorci krvi i tkiva, dok su ostale životinje tretirane još 7 dana, a zatim ostavljene bez doziranja sledeća 32 dana. Jedinjenje A dobro je tolerisano u svim dozama sa minimalnim efektom na telesnu težinu (Slika 15A). Doziranje korišćenjem 250 ili 500 mg/kg dva puta dnevno (BID) tokom 21 do 28 dana praktično je eliminisalo brzorastuće G401 tumore (Slike 15B, 14C i 16A). Ponovni rast nije zapažen tokom 32 dana posle prestanka doziranja. Jedinjenje A u dozi od 125 mg/kg indukovalo je stazu tumora tokom perioda primene, i proizvelo je značajno odlaganje rasta tumora u poređenju sa prenosnikom tokom perioda doziranja. Merenje nivoa Jedinjenja A u plazmi 5 min pre ili 3 h posle doziranja na dan 21 pokazalo je jasan dozno zavisni porast sistemskog izlaganja (Slika 15D). Tumori koji su izolovani iz podgrupe miševa iz svake grupe na dan 21 pokazali su jaku inhibiciju H3K27me3, koja je u korelaciji sa antitumorskom aktivnošću (mamaksimalni efekat je dostignut na 250 mg/kg, Slika 16B). Pored toga, dozno zavisne promene ekspresije CD133, PTPRK, DOCK4 i GLI1 detektovane su u G401 ksenograftskim tumorima (Slika 16C).
[0261] Ovi podaci pokazuju da farmakološka inhibicija EZH2 indukuje antiproliferativne efekte specifično u SMARCB1-deletovanim MRT ćelijskim linijama i trajno iskorenjuje MRT ksenografte u miševima. Ovo potvrđuje zavisnost takvih kancera od aktivnosti PRC2, uprkos činjenici da sam EZH2 nije genetički izmenjen u ovom kontekstu. Podaci prikazani u ovom tekstu pokazuju da u kontekstu SMARCB1-deletovanog MRT, inhibicija EZH2 funkcioniše kao SMARCB 1 surogat i derepresuje gene neuronske diferencijacije, inhibitore ćelijskog ciklusa i tumorske supresore dok redukuje GLI1, PTCH1, MYC i EZH2. Zbir efekata Jedinjenja Compound A posredovanih EZH2 inhibicijom na nekoliko kancerskih puteva razlog je dramatične i trajne antitumorske aktivnosti zašažene u antitumorskim MRT modelima. Prema tome, Jedinjenje A predstavlja novi modalitet lečenja ovih letalnih tumora dečjeg doba.
[0262] Pored toga, pošto je nekoliko članova SWI/SNF kompleksa genetički izmenjeno u drugim tipovima kancera pored besides MRT, verovatno je da EZH2 ima ulogu i u održavanju tumora i preživljavanju u spektru tipova kancera. U kombinaciji sa nedavnim saopštenjima koja pokazuju efikasnost EZH2 inhibitora u selektivnom ubijanju EZH2 mutanta koji nosi ne-Hodgkinove limfome, ovi podaci pokazuju da je inhibicija EZH2 bazirana na malim molekulima efikasan mehanizam terapijske intervencije za različite hematološke i solidne tumore kojima genetičke promene - bilo da su usmerene ka cilju ili indirektne - daju proliferativnu zavisnost od enzimske aktivnosti EZH2.
Primer 3: Materijal i metodi
[0263] Ćelijska kultura: Ćelijske linije 293T, RD, SJCRH30, A204, G401, G402 i KYM-1.
293T (CRL-11268), RD (CRL-136), SJCRH30 (CRL-2061), A204 (HTB-82), G401 (CRL-1441) i G402 (CRL-1440) dobijene su od ATCC. KYM-1 (JCRB0627) dobijena je od JCRB.
293T i RD ćelije kultivisane su u DMEM+10% FBS. SJCRH30 ćelije kultivisane su u RPMI+10% FBS. A204, G401, i G402 ćelije kultivisane su u McCoyevom medijumu 5a+10% FBS. KYM-1 ćelije kultivisane su u DMEM/Hamovom medijumu F12+10% FBS.
[0264] Western blot analiza: Histoni su ekstrahovani kiselinom kako je ranije opisano (Daigle et al., Blood.2013 Aug 8;122(6): 1017-25). Western blotovi za histone ekstrahovane kiselinom izvedeni su kako je ranije opisano (Knutson et al., Proc Natl Acad Sci U S A.2013 May 7;110(19):7922-7). Lizati celih ćelija (whole cell lysates, WCL) pripremljeni su korišćenjem modifikovanog RIPA pufera (10x RIPA litički pufer (Millipore #20-188), 0.1% SDS (Invitrogen AM9823), proteazna mini-tableta (Roche #1836153)). Ćelije se peletiraju, isperu ledenim PBS, resuspenduju u ledenom RIPA puferu i inkubirajuna ledu 5 minuta. Lizati se sonifikuju 3x po 10 sekundi na 50% snage, zatim inkubiraju na ledu 10 minuta. Lizati se zatim centrifugiraju na maksimalnoj brzini 15 minuta na 4 stepena u stonoj centrifugi. Izbistreni lizati se alikvotiraju u nove epruvete i određuje se koncentracija proteina za WCL, BCA testom (Pierce). Deset mikrograma svakog lizata frakcioniše se na 10-20% Tris-glicin gelu (Biorad), prenese korišćenjem iBlot (7 minuta na programu 3, uz korišćenje nitroceluloznih "paketa" membrana za transfer), i ispita sledećim antitelima u Odyssey blokirajućem puferu: SNF5 (CST #8745), EZH2 (CST #5246), i beta-aktin (CST #3700).
[0265] In vitro ćelijski testovi: Za testove proliferacije adherentnih ćelijskih linija (sve ćelijske linije osim KYM-1, koje su analiziranje kako je prethodno opisano za suspenzione ćelijske linije (Daigle et al., Blood. 2013 Aug 8;122(6):1017-25), gustina zasejavanja za svaku ćelijsku liniju određivana je na osnovu krivih rasta (mereno vijabilnošću ATP) i gustina tokom sedmodnevnog vremenskog perioda. Na dan pre tretmana jedinjenjem, ćelije su zasejane na ploče sa 96 bunarčića u triplikatu (za vremenski period od dana 0 do 7) ili na ploče sa 6 bunarčića (za ponovno zasejavanje na dan 7 za ostatak vremenskog perioda). Na dan 0, ćelije su ostavljene bez tretmana, tretirane DMSO, ili tretirane Jedinjenjem A počevši sa 10 uM i smanjujući koncentraciju 3-strukim ili 4-strukim razblaženjima. Ploče su očitavane na dan 0, dan 4 i dan 7 korišćenjem CellTiter-Glo® (Promega), uz dopunjavanje jedinjenjem/medijumom na dan 4. Na dan 7, ploče sa 6 bunarčića tripsinizovane su, centrifugirane i resuspendovane u svežem medijumu za uz korišćenje Vi-Cell. Ćelije iz svakog tretmana ponovo su zasejane u originalnoj gustini na ploče sa 96 bunarčića u triplikatu. Ćelije su ostavljene preko noći da adheriraju za ploču, i ćelije su tretirane na dan 0. Na dan 7, 11 i 14, ploče su očitavane korišćenjem CellTiter-Glo®, uz dopunjavanje jedinjenjem/medijumom na dan 11. Prosečne vrednosti triplikata upotrebljene su za unošenje proliferacije tokom vremena, i izračunate su IC50vrednosti. Za ćelijski ciklus i apoptozu, G401 i RD ćelije zasejane su u posude od 15 cm u duplikatu, pri gustini od 1x10<6>ćelija po ploči. Ćelije su inkubirane sa Jedinjenjem A pri 1 uM, u ukupno 25 mL, tokom 14 dana, uz razdvajanje ćelija ponovo na originalnu gustinu zasejavanja na dan 4, 7 i 11. Analiza ćelijskog ciklusa i TUNEL test izvedeni su korišćenjem Guava® protočnog citometra, prema protokolu proizvođača.
[0266] Analiza genske ekspresije: G401 i RD ćelije zasejane su u T-75 flakone, pri 175.000 ćelija/flakonu odnosno 117.000 ćelija/flakonu i ostavljene preko noći da adheriraju. Na dan 0, ćelije su tretirane u duplikatima sa DMSO ili 1 uM Jedinjenja A. Ćelije su sakupljene i peletirane na dan 2, 4 i 7 uz dopunjavanje jedinjenja i medijuma na dan 4. Tumorsko tkivo iz životinja sa G401 ksenograftom, doziranih 21 dan (prenosnik, 125 mg/kg, i 250 mg/kg (6 životinja svaka) i 500 mg/kg (4 životinje) Jedinjenja A doznim grupama) upotrebljeno je za analizu genske ekspresije. Ukupna mRNK ekstrahovana je iz ćelijskih peleta i tumorskog tkiva korišćenjem RNeasy Mini kita (Qiagen #74106) i reverzno transkribovana korišćenjem High Capacity cDNA Reverse Transcription kita (Applied Biosystems (AB) #4368813). RT-PCR izvedena je pomoću ViiA™ 7 Real-Time PCR sistema (AB) korišćenjem TaqMan Fast Advanced Master miksa (AB #4444964) i TaqMan prajmer/proba setova u tabeli, dole. Genska ekspresija normalizovana je na 18S (AB #Hs99999901_s1) i izračunato je koliko puta je promena iznosila, korišćenjem ΔΔCt metoda. Za in vivo uzorke, prosečna Ct vrednost +/SD određena je za svaku doznu grupu i broj puta promene u poređenju sa grupom doziranom prenosnikom izračunat je korišćenjem ΔΔCt metoda.
[0267] ELISA: Histoni su izolovani iz tumora kako je ranije opisano (Daigle et al) i pripremljeni u ekvivalentnim koncentracijama (0.5 ng/ul za H3 i 4 ng/ul za H3K27Me3) u oblažućem puferu (PBS sa 0.05% BSA). Uzorak ili standard (100 μL) dodaju se u duplikatu u dve ELISA ploče sa 96 bunarčićas (Thermo Labsystems, Immulon 4HBX #3885). Histoni izolovani iz G401 ćelija tretirani sa DMSO ili 10 mmol/L Jedinjenja A tokom 4 dana dodati su u kontrolne bunarčiće u istoj koncentraciji histona kao uzorci tumorskih histona. Ploče su zatvorene i inkubirane preko noći na 4°C. Sledećeg dana, ploče su isprane 3 puta sa 300 μL/bunarčiću PBST (PBS sa 0.05% Tween 20; 10x PBST, KPL #51-14-02) na Bio Tek ispiraču ploča. Ploče su blokirane sa 300 μL/bunarčiću razblaživača (PBS 2% BSA 0.05% Tween 20), inkubirane na sobnoj temperaturi 2 sata i isprane 3 puta sa PBST. Sva antitela razblažena su u razblaživaču. 100 uL/bunarčiću anti-H3K27Me3 (CST #9733, 50% glicerol stok 1:1000) ili anti-ukupni H3 (Abcam #ab1791, 50% glicerol stok 1:10,000) doda se na svaku ploču. Ploče su inkubirane 90 minuta na sobnoj temperaturi i isprane 3 puta sa PBST. 100 μL/bunarčiću anti-Rb-IgG-HRP (Cell Signaling Technology, 7074) doda se 1:2000 na H3K27Me3 ploču i 1:6000 na H3 ploču i inkubira 90 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče se isperu 4 puta sa PBST. Za detekciju, 100 μL/bunarčiću TMB supstrata (BioFx Laboratories, #TMBS) doda se i ploče se inkubiraju u mraku na sobnoj temperaturi 5 minuta. Reakcija se zaustavlja sa 100 μL/bunarčiću IN H2SO4. Apsorbanca na 450 nm očitana je na SpectraMax M5 čitaču mikroploča.
[0268] Studija sa ksenograftima: Sve procedure u vezi sa radom sa životinjama, brigom i tretmanom u ovoj studiji, obavljni su u skladu sa uputstvima odobrenim od strane Odbora za institucionalnu zaštitu i upotrebu životinja (Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC), Shanghai Chemparner, prema smernicama Udruženja za procenu i akreditaciju brige o laboratorijskim životinjama (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care, AAALAC). Za in vivo studiju, miševi su inokulisani subkutano u desni bok G-401 tumorskim ćelijama (5x10<6>/mišu) u 0.2 ml mešavine osnovnog medijuma i matrigela (McCoy 5A : matrigel=1:1) da bi se razvio tumor. Tretmani su otpočeti kada je veličina tumora dostigla približno 157 mm<3>, za studije efikasnosti na tumoru (n=16 miševa po grupi). Jedinjenje A ili prenosnik (0.5% NaCMC+0.1% Tween-80 u vodi) primenjeni su oralno, BID u doznoj zapremini od 10 μL/g, tokom 21 ili 28 dana. Telesna težina životinja merena je svakog dana tokom prve nedelje, zatim dva puta nedeljno do kraja studije. Veličina tumora merena je dva puta nedeljno u dve dimenzije korišćenjem nonijusa i zapremina je izražavana u mm<3>.Za PK/PD analizu, 8 miševa sa najvećim opterećenjem tumorom eutanazirano je posle 21 dana doziranja, za uzimanje uzoraka tumora i krvi. Doziranje preostalih miševa nastavljeno je još nedelju dana i od dana 29 tretman je prekinut i miševi su uključeni u studiju odloženog rasta tumora. Miševi su praćeni pojedinačno dok tumori nisu dostigli završnu tačku težine tumora (2000 mm<3>) ili do dana 60 (do čega je od ta dva prvo došlo).
[0269] Farmakokinetičke analize: Deksametazon je upotrebljen kao unutrašnji standard. Alikvotu od 30 μL uzorka plazme dodato je 30 μL IS (deksametazon, 1000 ng/mL) i 150 μL ACN. Mešavina se vorteksuje 5 min i centrifugira na 14000 rpm, 5 min. Alikvot od 2 μL supernatanta injektira se za LC-MS/MS analizu (Q-trap 3200). Za 10-struko razblažene uzorke plazme, alikvotu od 3 μL uzorka plazme doda se 27 μL "blank" plazme, dilucioni faktor bio je 10, zatim se doda 30 μL IS (deksametazon, 1000 ng/mL) i 150 μL ACN. Mešavina se vorteksuje 5 min i centrifugira na 14000 rpm 5 min. Alikvot od 2 μL supernatanta injektira se za LC-MS/MS analizu. Uzorci tumora se homogenizuju na Beadbeater®, 30 sekundi, sa 3 x PBS (tež./zapr,) da se dobije homogenat tumora. Alikvotu od 30 μL uzorka tumorskog homogenata dodaju se 30 μL IS (deksametazon, 1000 ng/mL) i 150 μL ACN. Mešavina se vorteksuje 5 min i centrifugira na 14000 rpm 5 min. Alikvot od 2 μL supernatanta injektira se za LC-MS/MS analizu.
Primer 4: Opšte eksperimentalne procedure
NMR
[0270] 1H-NMR spektri se dobijaju korišćenjem CDCl3, ako nije drugačije naznačeno i registruju na 400 ili 500 MHz korišćenjem Varian ili Oxford instruments magnetnih (500 MHz) instrumenata. Navedeni multipliciteti su s=singlet, d = dublet, t = triplet, q = kvartet, quint = qvintet, sxt = sekstet, m = multiplet, dd =dublet dubleta, dt = dublet tripleta; br označava široki signal.
LCMS i HPLC
[0271] Shimadzu LC-Q, Shimadzu LCMS-2010EV ili Waters Acquity Ultra Performance LC. HPLC: Proizvodi su analizirani uz korišćenje Shimadzu SPD-20A sa 150 x 4.5 mm YMC ODS-M80 kolonom ili 150 x 4.6 mm YMC-Pack Pro C18 kolonom pri 1.0 ml/min.
[0272] Mobilna faza je MeCN:H2O=3:2 (sadrži 0.3% SDS i 0.05% H3PO4), 0.05% TFA u vodi, 0.05% TFA u acetonitrilu (gradijent početno 20 %, zatim 0.05%TFA/MeCN do konc. do 95% za 3 min. zadržavanje 0.5 min. pri 3.51 do 4.50 min zatim 0.05%TFA/MeCN konc.
20 %).
[0273] Alternativno LCMS, 2 različitia metoda su korišćena; jedan koji najčešće upotrebljavamo je visoki pH (METCR1600) a drugi je za standardnija jedinjenja (METCR1416).
[0274] 0.1% mravlja kiselina u vodi - mobilna faza "A" 0.1% mravlja kiselina u acetonitrilu -mobilna faza "B" uz korišćenje Waters Atlantis dC18, 2.1 mm x 100 mm, 3 μm kolona, uz stopu protoka = 0.6 ml/min temperatura kolone = 40 °C; vreme (min) %B 0.00 min 5% B.5.0 min 100% B, 5.4 min 100% B i .42 min 5%B
3.5 minutni metod se odnosi na Atlantis dC18, 2.1 mm x 50 mm, 3 μm kolona, stopa protoka 1 ml/min na 40 C. Mobilna faza A mravlja kiselina (aq.) 0.1% mobilna faza B mravlja kiselina (MeCN) 0.1%, injekcija 3 μL, gradijent 0 mins (5% organsko), 2.5 min (100 % organsko), 2.7 min (100 % organsko), 2.71 min (5% organsko), 3.5 min (5% organsko) 7.0 minutni metod se odnosi na Atlantis dC18, 2.1 mm x 100 mm, 3 μm kolona, stopa protoka 0.6 ml/min na 40 C. Mobilna faza A mravlja kiselina (aq.) 0.1% mobilna faza B mravlja kiselina (MeCN) 0.1%, injekcija 3 μL, gradijent 0 mins (5% organsko), 5 min (100 % organsko), 5.4 min (100% organsko), 5.42 min (5% organsko), 7 min (5% organsko). Metodi od 3.5 i 7 minuta se oba izvode na MS18 Shimadzu LCMS-2010EV ili MS19 Shimadzu LCMS-2010EV sistemu koji koristi LC-20AB pumpe i SPD-M20A PDA detektore.
[0275] Proizvodi se prečišćavaju HPLC/MS uz korišćenje Waters AutoPurification sistema sa 3100 Mass Detector.
[0276] HPLC analize mogu da se izvode i na Shimdazu LC-2010CHT uz korišćenje YMC ODS-A, C18, (150x4.6 x5 μm) kolone na ambijentalnoj temperaturi, uz stopu protoka 1.4 ml/min. Koristi se injekciona zapremina od 10 μl i detekcija se odvija pomoću UV/PDA. Mobilna faza A je 0.05 % TFA u vodi i mobilna faza B je 0.05 % TFA u acetonitrilu uz gradijentni program: početno 5% B do 95% B za 8 min, zadržavanje 1.5 min, na 9.51 do 12 min B. konc.0.5%. Razblaživač je mobilna faza.
Drugo
[0277] Automatizovana "flash" hromatografija na koloni izvodi se na Biotage Isolera version 4. 10 g SNAP kertridž koji radi na 12 ml/min ili 25g SNAP kertridž koji radi na 25 ml/min i detektovanje na 254 nm i 280 nm.
[0278] Odabrane nitrilne redukcije mogu se izvoditi na ThalesNano H-Cube® u skladu sa uslovima opisanim u eksperimentalnom postupku.
[0279] Drugi srodni opšti postupci mogu se naći i u PCT publikaciji br. WO12/118812, PCT prijavi br. PCT/US2012/033648 i PCT prijavi br. PCT/US2012/033662, od kojih je svaka u celini uključena u ovaj tekst kao referenca.
Primer 5: Sinteza N-((4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil (tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3-karboksamida
[0280]
Korak 1: Sinteza 5-bromo-2-metil-3-nitrobenzoeve kiseline
[0281]
[0282] U mešani rastvor 2-metil-3-nitrobenzoeve kiseline (100 g, 552 mmol) u konc. H2SO4(400 mL), doda se 1,3-dibromo-5,5-dimetil-2,4-imidazolidindion (88 g, 308 mmol)u porcijama na sobnoj temperaturi i reakciona mešavina se zatim meša na sobnoj temperaturi 5 h. Reakciona mešavina se izlije na ledenu vodu, precipitirana čvrsta supstanca se isfiltrira, ispere vodom i suši pod vakuumom da se dobije željeno jedinjenje u vidu čvrste supstance (140 g, 98%). Izolovano jedinjenje se direktno koristi u sledećm koraku.<1>H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 8.31 (s, 1H), 8.17 (s, 1H), 2.43 (s, 3H).
Korak 2: Sinteza metil 5-bromo-2-metil-3-nitrobenzoata
[0283]
[0284] U mešani rastvor 5-bromo-2-metil-3-nitrobenzoeve kiseline (285 g, 1105 mmol) u DMF (2.8 L) na sobnoj temperaturi doda se natrijum karbonat (468 g, 4415 mmol) zatim metil jodid (626.6 g, 4415 mmol). Dobijena reakciona mešavina se greje na 60 °C 8 h. Po završetku (praćeno pomoću TLC), reakciona mešavina se filtrira (da se ukloni natrijum karbonat) i ispere etil acetatom (1 L X 3). Kombinovani filtrat se ispere vodom (3 L X 5) i vodena faza se ekstrahuje etil acetatom (1L X 3). Kombinovani organski slojevi se suše preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtriraju i koncentruju pod sniženim pritiskom da se dobije jedinjenje iz naslova u vidu čvrste supstance (290 g, 97% prinos). Izolovano jedinjenje se koristi direktno u sledećm koraku.<1>H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.17 (s, 1H), 7.91 (s, 1H), 3.96 (s, 3H), 2.59 (s, 3H).
Korak 3: Sinteza metil 3-amino-5-bromo-2-metilbenzoata
[0285]
[0286] U mešani rastvor metil 5-bromo-2-metil-3-nitrobenzoata (290 g, 1058 mmol) u etanolu (1.5 L) doda se vodeni rastvor amonijum hlorida (283 g, 5290 mmol rastvoreno u 1.5 L vode). Dobijena mešavina se meša na 80°C, u nju se doda gvožđe u prahu (472 g, 8451 mmol), u porcijama. Dobijena reakciona mešavina se greje na 80 °C 12 h. Po završetku, što se određuje pomoću TLC, reakciona mešavina se toplo filtrira preko celite® i celitno jastuče se ispere metanolom (5 L) što je praćeno ispiranjem pomoću 30% MeOH u DCM (5 L). Kombinovani filtrat se koncentruje u vakuumu, dobijena rezidua se razblaži vodenim rastvorom natrijum bikarbonata (2 L) i ekstrahuje etil acetatom (5 L X 3). Kombinovani organski slojevi se suše preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtriraju i koncentruju pod sniženim pritiskom da se dobije jedinjenje iz naslova u vidu čvrste supstance (220 g, 85%). Jedinjenje se koristi direktno u sledećm koraku.<1>H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 7.37 (s, 1H), 6.92 (s, 1H), 3.94 (s, 3H), 3.80 (bs, 2H), 2.31 (s, 3H).
Korak 4: Sinteza metil 5-bromo-2-metil-3-((tetrahidro-2H-piran-4-il) amino) benzoata
[0287]
[0288] U mešani rastvor metil 3-amino-5-bromo-2-metilbenzoata (15 g, 61.5 mmol) i dihidro-2H-piran-4(3)-ona (9.2 g, 92 mmol) u dihloroetanu (300 mL) doda se sirćetna kiselina (22 g, 369 mmol) i reakciona mešavina se meša na sobnoj temperaturi 15 minuta, zatim se reakciona mešavina ohladi na 0 °C i doda se natrijum triacetoksiborohidrid (39 g, 184 mmol). Reakciona mešavina se meša preko noći na sobnoj temperaturi. Posle završetka reakcije što se određuje korišćenjem TLC, u reakcionu mešavinu se dodaje vodeni rastvor natrijum bikarbonata dok se ne dostigne pH od 7-8. Organska faza se izdvoji i vodena faza se ekstrahuje etil acetatom. Kombinovani organski slojevi se suše preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtriraju i koncentruju pod sniženim pritiskom. Sirovo jedinjenje se prečisti hromatografijom na koloni (silika gel, vel. zrna 100-200) eluira etil acetatom: heksanom da se dobije željeno jedinjenje u vidu čvrste supstance (14 g, 69%).<1>H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 7.01 (s, 1H), 6.98 (s, 1H), 5.00 (d, 1H, J=7.6 Hz), 3.84-3.87 (m, 2H), 3.79 (s, 3H), 3.54-3.56 (m, 1H), 3.43 (t, 2H, J=12 Hz), 2.14 (s, 3H), 1.81-1.84 (m, 2H), 1.47-1.55 (m, 2H).
Korak 5: Sinteza metil 5-bromo-3-(etil (tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-2-metilbenzoata
[0289]
[0290] U mešani rastvor metil 5-bromo-2-metil-3-((tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)benzoata (14 g, 42.7 mmol) u dihloroetanu (150 mL) dodaju se acetaldehid (3.75 g, 85.2 mmol) i sirćetna kiselina (15.3 g, 256 mmol). Rezultujuća reakciona mešavina se meša na sobnoj temperaturi 15 minuta. Mešavina se ohladi na 0 °C i doda se natrijum triacetoksiborohidrid (27 g, 128 mmol). Reakciona mešavina se meša na sobnoj temperaturi 3 sata. Posle završetka reakcije, što se određuje korišćenjem TLC, dodaje se vodeni rastvor natrijum bikarbonata u reakcionu mešavinu dok se ne dostigne pH od 7-8, organska faza se izdvoji i vodena faza se ekstrahuje etil acetatom. Kombinovani organski slojevi se suše preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtriraju i koncentruju pod sniženim pritiskom. Sirovo jedinjenje se prečisti hromatografijom na koloni (silika gel, vel. zrna 100-200) eluira etil acetatom: heksanom da se dobije željeno jedinjenje u vidu viskozne tečnosti (14 g, 93%).<1>H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 7.62 (s, 1H), 7.52 (s, 1H), 3.80 (bs, 5H), 3.31 (t, 2H), 2.97-3.05 (m, 2H), 2.87-2.96 (m, 1H), 2.38 (s, 3H), 1.52-1.61 (m, 2H), 1.37-1.50 (m, 2H), 0.87 (t, 3H, J=6.8 Hz).
Korak 6: Sinteza 5-bromo-N-((4, 6-dimetil-2-okso-1, 2-dihidropiridin-3-il)metil)-3-(etil (tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-2-metilbenzamida
[0291]
[0292] U mešani rastvor of 5-bromo-3-(etil (tetrahidro-2H-piran-4-il) amino)-2-metilbenzoata (14 g, 39.4 mmol) i etanolu (100 mL) doda se vodeni rastvor NaOH (2.36 g, 59.2 mmol u 25 mL vode) i dobijena mešavina se meša na 60 °C 1 h.. Posle završetka reakcije što se određuje korišćenjem TLC, rastvarač se ukloni pod sniženim pritiskom i dobijena rezidua se acidifikuje korišćenjem 1N HCl dok se ne dostigne pH 7, a zatim se doda vodeni rastvor limunske kiseline dok se ne dostigne pH 5-6. Vodeni sloj se ekstrahuje 10% MeOH u DCM (200 mL X 3), kombinovani organski slojevi se suše preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtriraju i koncentruju pod sniženim pritiskom dajući odgovarajuću kiselinu (14 g, 100%).
[0293] Gornja kiselina (14 g, 40.9 mmol) se zatim rastvori u DMSO (70 mL) i doda se 3-(amino metil)-4, 6-dimetilpiridin-2(1H)-on (12.4 g, 81.9 mmol). Reakciona mešavina se meša na sobnoj temperaturi 15 minuta, zatim se doda PYBOP (31.9 g, 61.4 mmol) i mešanje se nastavi preko noći na sobnoj temperaturi. Posle završetka reakcije, što se određuje korišćenjem TLC, reakciona mešavina se izlije u ledenu vodu (700 mL), meša 30 minuta i precipitirana čvrsta supstanca se sakupi filtracijom, ispere vodom (500 mL) i osuši na vazduhu. Dobijena čvrsta supstanca se meša sa acetonitrilom (75 mL X 2), filtrira i suši na vazduhu. Dobijena čvrsta supstanca se ponovo meša sa 5% MeOH u DCM (100 mL), filtrira i potpuno osuši pod vakuumom da se dobije jedinjenje iz naslova u vidu čvrste supstance (14 g, 74 %). 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 11.47 (s, 1H), 8.23 (t, 1H), 7.30 (s, 1H), 7.08 (s, 1H), 5.85 (s, 1H), 4.23 (d, 2H, J=4.4 Hz), 3.81 (d, 2H, J=10.4 Hz), 3.20-3.26 (m, 2H), 3.00-3.07 (m, 1H), 2.91-2.96 (m, 2H), 2.18 (s, 3H), 2.14 (s, 3H), 2.10 (s, 3H), 1.58-1.60 (m, 2H), 1.45-1.50 (m, 2H), 0.78 (t, 3H, J=6.8 Hz).
Korak 7: Sinteza N-((4, 6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il) metil)-5-(etil (tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3-karboksamida
[0294]
[0295] U mešani rastvor 5-bromo-N-((4, 6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-3-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-2-metilbenzamida (14 g, 29.5 mmol) u mešavini dioksan/voda (70 mL/14 mL) doda se 4-(4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il) benzil) morfolin (13.4 g, 44.2 mmol) što je praćeno dodavanjem Na2CO3(11.2 g, 106.1 mmol). Rastvor se prečišćava argonom 15 minuta i zatim se doda Pd(PPh3)4(3.40 g, 2.94 mmol) i rastvor se ponovo prečišćava argonom još 10 min. Reakciona mešavina se greje na 100°C 4 h. Posle završetka reakcije (praćeno pomoću TLC), reakciona mešavina se razblaži vodom i ekstrahuje korišćenjem 10% MeOH/DCM. Kombinovani organski slojevi se suše preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtriraju i koncentruju pod sniženim pritiskom. Sirovo jedinjenje se prečisti hromatografijom na koloni (silika gel, veličina zrna 100-200) i eluira metanolom:DCM do jedinjenja iz naslova u vidu čvrste supstance (12 g, 71%). Analitički podaci: LCMS: 573.35 (M 1)+; HPLC: 99.5% (@ 254 nm) (Rt;3.999; Metod: Kolona: YMC ODS-A 150 mm x 4.6 mm x 5 μ; Mobilna faza: A; 0.05% TFA u vodi/B; 0.05% TFA u acetonitrilu; Inj. zapr.10 μL, Temp. kol.: 30 °C; Stopa protoka: 1.4 mL/min.; Gradijent: 5% B do 95% B za 8 min, zadržavanje 1.5 min, 9.51-12 min 5% B);<1>H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 11.46 (s, 1H), 8.19 (t, 1H), 7.57 (d, 2H, J=7.2 Hz), 7.36-7.39 (m, 3H), 7.21 (s, 1H), 5.85 (s, 1H), 4.28 (d, 2H, J=2.8 Hz), 3.82 (d, 2H, J=9.6 Hz), 3.57 (bs, 4H), 3.48 (s, 2H), 3.24 (t, 2H, J=10.8Hz), 3.07-3.09 (m, 2H), 3.01 (m, 1H), 2.36 (m, 4H), 2.24 (s, 3H), 2.20 (s, 3H), 2.10 (s, 3H), 1.64-1.67 (m, 2H), 1.51-1.53 (m, 2H), 0.83 (t, 3H, J=6.4 Hz).
Korak 8: Sinteza N-((4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3-karboksamid trihidrohlorida
[0296]
[0297] N-((4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il) amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3-karboksamid (12 g, 21.0 mmol) rastvori se u metanolnoj HCl (200 mL) i meša na sobnoj temperaturi 3 h. Posle tri sata mešanja, reakciona mešavina se koncentruje pod sniženim pritiskom. Dobijena čvrsta supstanca meša se sa etrom (100 mL X 2) da se dobije željena so u vidu čvrste supstance (11 g, 77 %).
Analitički podaci za tri-HCl so: LCMS: 573.40 (M 1)<+>; HPLC: 99.1% (@ 254 nm) (Rt;3.961; Metod: Kolona: YMC ODS-A 150 mm x 4.6 mm x 5 μ; mobilna faza: A; 0.05% TFA u vodi /B; 0.05% TFA u acetonitrilu; inj. zapr: 10 μL, temp. kol.: 30 °C; stopa protoka: 1.4 mL/min.; gradijent: 5% B do 95% B za 8 min, zadržavanje 1.5 min, 9.51-12 min 5% B); 1H NMR (D2O 400 MHz) δ 7.92 (bs, 1H,) 7.80 (s, 1H), 7.77 (d, 2H, J=8 Hz), 7.63 (s, 1H), 7.61 (s, 1H), 6.30 (s, 1H), 4.48 (s, 2H), 4.42 (s, 2H), 4.09-4.11 (m, 4H), 3.95-3.97 (m, 2H), 3.77 (t, 3H, J=10.4 Hz), 3.44-3.47 (m, 3H), 3.24-3.32 (m, 3H), 2.42 (s, 3H), 2.35 (s, 3H), 2.26 (s, 3H), 2.01 (m, 2H), 1.76 (m, 2H), 1.04 (t, 3H, J=6.8 Hz).
Referentni primer 6: N-((4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(((1r,4r)-4-(dimetilamino)cikloheksil)(etil)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3-karboksamid
[0298]
Korak 1: 5-bromo-2-metil-3-nitrobenzoeva kiselina
[0299] U mešani rastvor 2-metil-3-nitrobenzoeve kiseline (100 g, 552.48 mmol) u konc. H2SO4(400 mL), doda se 1,3-dibromo-5,5-dimetil-2,4-imidazolidindion (87.98 g, 307.70 mmol) u porcijama, na sobnoj temperaturi. Reakciona mešavina se zatim meša na sobnoj temperaturi 5 h. Reakciona mešavina se izlije u ledenu vodu, precipitirana čvrsta supstanca se sakupi filtracijom, ispere vodom i suši pod vakuumom da se dobije željena 5-bromo-2-metil-3-nitrobenzoeva kiselina kao beličasta čvrsta supstanca (140 g, 97.90% yield).<1>H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 8.31 (s, 1H), 8.17 (s, 1H), 2.43 (s, 3H).
Korak 2: metil 5-bromo-2-metil-3-nitrobenzoat
[0300] U mešani rastvor 5-bromo-2-metil-3-nitrobenzoeve kiseline (285 g, 1104.65 mmol) u DMF (2.8 L) doda se natrijum karbonat (468 g, 4415.09 mmol) što je praćeno dodavanjem metil jodida (626.63 g, 4415 mmol) na sobnoj temperaturi. Dobijena reakciona mešavina se meša na 60 °C 8 h. Reakciona mešavina se zatim filtrira da se uklone suspendovane čvrste supstance koje se dobro isperu etil acetatom (3 x 1 L). Kombinovani filtrati se dobro isperu vodom (5 x 3 L) i vodena faza se ekstrahuje etil acetatom (3 x 1 L). Kombinovni organski ekstrakti se suše preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtriraju i koncentruju pod sniženim pritiskom da se dobije metil 5-bromo-2-metil-3-nitrobenzoat kao beličasta čvrsta supstanca (290 g, prinos 97%). 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.17 (s, 1H), 7.91 (s, 1H), 3.96 (s, 3H), 2.59 (s, 3H).
Korak 3: metil 3-amino-5-bromo-2-metilbenzoat
[0301] U mešani rastvor metil 5-bromo-2-metil-3-nitrobenzoata (290 g, 1058.39 mmol) u etanolu (1.5 L) doda se vodeni rastvor amonijum hlorida (283 g, 5290 mmol rastvoreno u 1.5 L vode). Dobijena mešavina se meša i greje na 80 °C što je praćeno dodavanjem gvožđa u prahu (472 g, 8451 mmol) u porcijama na 80 °C. Dobijena reakciona mešavina se greje na 80 °C 12 h. Reakciona mešavina se zatim toplo filtrira kroz Celite® i Celite® jastuče se dobro ispere metanolom (5 L) i zatim 30% MeOH u DCM (5 L). Kombinovani filtrati se koncentruju u vakuumu i dobijena rezidua se razblaži vodenim rastvorom bikarbonata (2 L) i ekstrahuje etil acetatom (3 x 5 L). Kombinovni organski ekstrakti se suše preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtriraju i koncentruju pod sniženim pritiskom da se dobije metil 3-amino-5-bromo-2-metilbenzoat u vidu braon čvrste supstance (220 g, prinos 89.41%).
[0302] Deo proizvoda (5 g) rastvori se u vrućem etanolu (20 mL), nerastvorljiva rezidua se isfiltrira i matična tečnost koncentruje da se dobije metil 3-amino-5-bromo-2-metilbenzoat (3.5 g, prinos 70%) uz HPLC čistoću od 93.81% u vidu svetlobraon čvrste supstance.<1>H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 7.37 (s, 1H), 6.92 (s, 1H), 3.94 (s, 3H), 3.80 (bs, 2H), 2.31 (s, 3H).
Korak 4: metil 5-bromo-3-(((1r,4r)-4-((tert-butoksikarbonil)amino)cikloheksil)amino)-2-metilbenzoat
[0303] U mešani rastvor metil 3-amino-5-bromo-2-metilbenzoata (5 g, 20.5 mmol) i tert-butil (4-oksocikloheksil) karbamata (5.69 g, 26.7 mmol) u dihloroetanu (50 mL), doda se sirćetna kiselina (7.4 g, 123 mmol) i reakcija se meša na sobnoj temperaturi 10 minuta. Zatim se doda natrijumtriacetoksiborohidrid (13.1 g, 61.7 mmol) na 0 °C i reakcija se meša na sobnoj temperaturi 16 sati. Reakcija se gasi vodenim rastvorom natrijum bikarbonata, organska faza se izdvoji i vodena faza se ekstrahuje dihlorometanom. Kombinovani organski slojevi se suše preko anhidrovanog natrijum sulfata i koncentruju u vakuumu. Sirovi proizvod se prečisti hromatografijom na koloni od silika gela (veličina zrna 100-200) uz eluiranje 10% etil acetatom u heksanu da se dobije 3.5 g polarnijeg (trans) izomera, metil 5-bromo-3-(((1r,4r)-4-((tert-butoksikarbonil)amino)cikloheksil)amino)-2-metilbenzoata, u vidu čvrste supstance (38.46%). 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 7.21 (s, 1H), 6.80 (s, 1H), 4.41 (bs, 1H), 3.85 (s, 3H), 3.60 (m, 1H), 3.45 (m, 1H), 3.20 (m, 1H), 2.22 (s, 3H), 2.15 (bs, 2H), 2.05 (bs, 2H), 1.45 (s, 9H), 1.30 (m, 4H).
Korak 5: metil 5-bromo-3-(((1r,4r)-4-((tert-butoksikarbonil)amino)cikloheksil)-(etil)amino)-2-metilbenzoat
[0304] U mešani rastvor metil 5-bromo-3-(((1r,4r)-4-((tert-butoksikarbonil)amino)-cikloheksil)(etil)amino)-2-metilbenzoata (55 g, 0.124 mol) i acetaldehida (11 g, 0.25 mol) u dihloroetanu (550 mL), doda se sirćetna kiselina (44.64 g, 0.744 mol) i reakciona mešavina se meša na sobnoj temperaturi 10 minuta. Zatim se doda natrijum triacetoksiborohidrid (79 g, 0.372 mol) na 0 °C i reakciona mešavina se meša na sobnoj temperaturi 16 sati. Reakcija se gasi vodenim rastvorom natrijum bikarbonata, organska faza se izdvoji i vodena faza se ekstrahuje dihlorometanom. Kombinovani ekstrakti se suše preko anhidrovanog natrijum sulfata i koncentruju u vakuumu. Sirovo jedinjenje se prečisti hromatografijom na koloni od silika gela (veličina zrna 100-200) uz eluiranje 10% etil acetatom u heksanu da se dobije 44 g metil 5-bromo-3-(((1r,4r)-4-((tert-butoksikarbonil)amino)cikloheksil)-(etil)amino)-2-metilbenzoata (75.2%) u vidu čvrste supstance.<1>H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 7.55 (s, 1H), 7.45 (s, 1H), 6.65 (d, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.15 (bs, 1H), 3.05 (q, 2H), 2.60 (m, 1H), 2.30 (s, 3H), 1.75 (m, 4H), 1.40 (m, 2H), 1.35 (s, 9H), 1.10 (m, 2H), 0.80 (t, 3H).
Korak 6: tert-butil ((1r,4r)-4-((5-bromo-3-(((4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)karbamoil)-2-metilfenil)(etil)amino)cikloheksil)karbamat
[0305] Vodeni NaOH (3.5 g, 0.08 mol u 10 mL H2O) doda se u rastvor metil 5-bromo-3-(((1r,4r)-4-((tertbutoksikarbonil)amino)cikloheksil)-(etil)amino)-2-metilbenzoata (25 g, 0.053 mol) u EtOH (100 mL) i meša na 60 °C 1 h. Etanol se zatim ukloni pod sniženim pritiskom i izvrši se acidifikacija do pH 8 razblaženom HCl i do pH 6 limunskom kiselinom. Mešavina se ekstrahuje 10% metanolom u DCM (3 x 200 mL). Kombinovani organski slojevi se suše i koncentruju dajući odgovarajuću kiselinu (24.2 g, 99.0%).<1>H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 13.13 (s, 1H), 7.54 (s, 1H), 7.43 (s, 1H), 6.68 (d, 1H), 3.14 (bs, 1H), 3.03 (q, 2H), 2.56 (m, 1H), 2.33 (s, 3H), 1.80-1.65 (m, 4H), 1.40 (m, 2H), 1.35 (s, 9H), 1.10 (m, 2H), 0.77 (t, 3H).
[0306] Kiselina (24 g, 0.053 mol) se rastvori u DMSO (100 mL) i dodaju se 3-(aminometil)-4,6-dimetilpiridin-2(1H)-on (16 g, 0.106 mol) i trietilamin (5.3 g, 0.053 mol). Reakciona mešavina se meša na sobnoj temperaturi 15 min pre nego što joj se doda PyBop (41 g, 0.079 mmol) i mešanje se zatim nastavi preko noći na sobnoj temperaturi. Reakciona mešavina se sipa u ledenu vodu (1L). Nastali precipitat se sakupi filtracijom, dobro ispere vodom (2 x 1 L) i suši. Dobijeni proizvod se dodatno prečisti ispiranjem acetonitrilom (3 x 200 mL) i DCM (100 mL) da se dobijet tert-butil ((1r,4r)-4-((5-bromo-3-(((4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)karbamoil)-2-metilfenil)(etil)amino)cikloheksil)-karbamat (24 g, 77%). 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 11.47 (s, 1H), 8.24 (t, 1H), 7.25 (s, 1H), 7.04 (s, 1H), 6.67 (d, 1H), 5.85 (s, 1H), 4.24 (d, 2H), 3.13 (bs, 1H), 3.01 (q, 2H), 2.53 (m, 1H), 2.18 (s, 3H), 2.10 (s, 6H), 1.80-1.65 (m, 4H), 1.40 (m, 2H), 1.35 (s, 9H), 1.10 (m, 2H), 0.77 (t, 3H).
Korak 7: tert-butil ((1r,4r)-4-((5-(((4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)karbamoil)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3-il)(etil)amino)cikloheksil) karbamat
[0307] U mešani rastvor tert-butil ((1r,4r)-4-((5-bromo-3-(((4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)karbamoil)-2-metilfenil)(etil)amino)cikloheksil)-karbamata (24 g, 0.041 mol) i 4-(4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)benzil)morfolina (18 g, 0.061 mol) u mešavini dioksan/voda (160 mL 40 mL), doda se Na2CO3(15 g, 0.15 mol) i rastvor se prečišćava argonom 15 min. Zatim se doda Pd(PPh3)4(4.7 g, 0.041 mol) i reakciona mešavina se ponovo prečišćava argonom 10 min. Reakciona mešavina se greje na 100 °C 4 h. Reakciona mešavina se razblaži 10% MeOH/DCM (500 mL) i filtrira. Filtrat se koncentruje, razblaži vodom (500 mL) i ekstrahuje 10% MeOH u DCM (3 x 500 mL). Kombinovani organski ekstrakti se suše preko Na2SO4i rastvarač se ukloni pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod se prečisti hromatografijom na koloni od silika gela (100-200 veličina zrna) uz eluiranje 7% MeOH u DCM da se dobije tert-butil ((1r,4r)-4-((5-(((4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)karbamoil)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3-il)(etil) amino)cikloheksil)karbamat (20 g, 71.43%).1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 11.46 (s, 1H), 8.20 (t, 1H), 7.56 (d, 2H), 7.36 (m, 3H), 7.17 (s, 1H), 6.66 (d, 1H), 5.85 (s, 1H), 4.28 (d, 2H), 3.57 (bs, 4H), 3.48 (s, 2H), 3.20-3.05 (m, 3H), 2.62 (m, 1H), 2.36 (bs, 4H), 2.20 (s, 6H), 2.10 (s, 3H), 1.75 (m, 4H), 1.42 (m, 2H), 1.35 (s, 9H), 1.10 (m, 2H), 0.82 (t, 3H).
Korak 8: 5-(((1r,4r)-4-aminocikloheksil)(etil)amino)-N-((4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3-karboksamid
[0308] U mešani rastvor tert-butil ((1r,4r)-4-((5-(((4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)karbamoil)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3-il)(etil)amino)cikloheksil) karbamata (20 g, 0.03 mol) u DCM (200 mL) na 0 °C, doda se TFA (75 mL) i reakcija se meša 2 h na sobnoj temperaturi. Reakciona mešavina se zatim koncentruje do suvog i rezidua se bazifikuje vodenim zasićenim rastvorom bikarbonata (300 mL) do pH 8. Mešavina se ekstrahuje 20% metanolom u DCM (4 x 200 m). Kombinovani ekstrakti se suše preko Na2SO4i rastvarač se ukloni pod sniženim pritiskom da se dobije 5-(((1r,4r)-4-aminocikloheksil)(etil)amino)-N-((4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3-karboksamid (15.5 g, 91%) koji se kao takav koristi u sledećoj reakciji.<1>H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 8.18 (bs, 1H), 7.57 (d, 2H), 7.38 (m, 3H), 7.20 (s, 1H), 5.85 (s, 1H), 4.29 (d, 2H), 3.57 (bs, 4H), 3.48 (s, 2H), 3.31 (bs, 2H), 3.10 (m, 2H), 2.91 (m, 1H), 2.67 (m, 1H), 2.36 (bs, 4H), 2.21 (s, 3H), 2.20 (s, 3H), 2.10 (s, 3H), 1.90 (m, 2H), 1.83 (m, 2H), 1.45 (m, 2H), 1.23 (m, 2H), 0.83 (t, 3H).
Korak 9: N-((4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(((1r,4r)-4-(dimetilamino)cikloheksil)(etil)amino)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3-karboksamid
[0309] U mešani rastvor 5-(((1r,4r)-4-aminocikloheksil)(etil)amino)-N-((4,6-dimetil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-4-metil-4’-(morfolinometil)-[1,1’-bifenil]-3-karboksamida (14 g, 0.023 mol) u dihlorometanu (150 mL) doda se 35% vodeni rastvor formaldehida (2.4 g, 0.080 mol) na 0° C. Posle 20 min mešanja, doda se Na(OAc)3BH (12.2 g, 0.057 mol) i mešanje se nastavi 2 h na 0° C. Zatim se u reakcionu mešavinu doda voda (100 mL) i mešavina se ekstrahuje 20% metanolom u DCM (3 x 200 mL). Kombinovani ekstrakti se suše preko Na2SO4i rastvarač se ukloni pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod se prečisti hromatografijom na koloni od baznog aluminijum oksida uz eluiranje 6-7% MeOH u DCM da se dobije jedinjenje iz naslova (10 g, 63.6%). LCMS: 614.65 (M 1)+; HPLC: 98.88% (@ 210-370 nm) (Rt;3.724; Metod: kolona: YMC ODS-A 150 mm x 4.6 mm x 5 μ; mobilna faza: A; 0.05% TFA u vodi/B; 0.05% TFA u acetonitrili; inj. zapr: 10 mL, temp. kol.: 30 °C; stopa protoka: 1.4 mL/min.; gradijent: 5% B do 95% B za 8 min, zadržavanje 1.5 min, 9.51-12 min 5% B); 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 11.45 (s, 1H), 8.17 (t, 1H), 7.56 (d, 2H, J=8 Hz), 7.36 (m, 3H), 7.17 (s, 1H), 5.85 (s, 1H), 4.29 (d, 2H, J=4.4 Hz), 3.57 (bs, 4H), 3.48 (s, 2H), 3.09 (q, 2H), 2.66 (m, 1H), 2.36 (bs, 4H), 2.21 (s, 3H), 2.20 (s, 3H), 2.11 (s, 9H), 1.79 (m, 4H), 1.36 (m, 2H), 1.11 (m, 2H), 0.82 (t, 3H, J=6.4&6.8 Hz).
Primer 7: Protokol biotesta i opšti metodi
Protokol za enzimske testove PRC2 divljeg tipa i mutante
[0310] Opšti materijali. S-adenozilmetionin (S-adenosylmethionine, SAM), S-adenozilhomocistein (S-adenosylhomocysteine, SAH), bicin, KCl, Tween20, dimetilsulfoksid (DMSO) i želatin iz kože goveda (bovine skin gelatin, BSG), sa najvećim mogućim stepenom čistoće nabavljeni su od Sigma-Aldrich. Ditiotreitol (dithiothreitol, DTT) nabavljen je od EMD. 3H-SAM nabavljen je od American Radiolabeled Chemicals sa specifičnom aktivnošću od 80 Ci/mmol. Streptavidinom obložene flash-ploče sa 384 bunarčića nabavljene su od PerkinElmer.
[0311] Supstrati. Reprezentativni peptidi rezidua 21-44 humanog histona H3 koji sadrže nemodifikovani lizin 27 (H3K27me0) ili dimetilisani lizin 27 (H3K27me2) sintetisani su sa C-terminalnim G(K-biotin) linker-afinitetnim marker-motivom i C-terminalnom amidnom "kapom", od strane 21st Century Biochemicals. Peptidi su prečišćeni tečnom hromatografijom visokih performansi (HPLC) do čistoće od preko 95% i potvrđeni su tečnom hromatografijom -masenom spektrometrijom (LC-MS). Sekvence su navedene u nastavku.
H3K27me0: ATKAARKSAPATGGVKKPHRYRPGGK(biotin)-amid (SEQ ID NO: 13)
H3K27me2: ATKAARK(me2)SAPATGGVKKPHRYRPGGK(biotin)-amid (SEQ ID NO: 14)
[0312] Oligonukleozomi pilećih eritrocita prečišćeni su iz pileće krvi prema uspostavljenim postupcima.
[0313] Rekombinantni PRC2 kompleksi. Humani PRC2 kompleksi prečišćeni su kao 4-komponentni enzimski kompleksi koeksprimirani u ćelijama Spodoptera frugiperda (sf9) uz korišćenje bakulovirusnog ekspresionog sistema. Eksprimirane subjedinice bile su divlji tip EZH2 (NM_004456) ili EZH2 Y641F, N, H, S ili C mutanti stvoreni iz konstrukta divljeg tipa EZH2, EED (NM_003797), Suz12 (NM_015355) i RbAp48 (NM_005610). EED subjedinica sadržala se N-terminalni FLAG marker koji je korišćen za prečišćavanje celog 4-komponentnog kompleksa iz sf9 ćelijskih lizata. Čistoća kompleksa bila je 95% ili više, kako je određivano korišćenjem SDS-PAGE i Agilent Bioanalyzer analize. Koncentracije enzimskih stok rastvora (obično 0.3-1.0 mg/mL) određivane su korišćenjem Bradford testa, u odnsou na goveđi serum albumin (BSA) kao standard.
[0314] Opšti postupci za PRC2 enzimske testove na peptidnim supstratima. Svi testovi izvedeni su u puferu koji se sastojao od 20 mM bicina (pH = 7.6), 0.5 mM DTT, 0.005% BSG i 0.002% Tween20, pripremljenog na dan korišćenja. Jedinjenja u 100% DMSO (1 μL) naneta su na polipropilenske ploče sa 384 bunarčića sa V-dnom (Greiner) uz korišćenje Platemate 2 X 3 opremljenom 384-kanalskom glavom pipete (Thermo). DMSO (1 μL) se doda u kolone 11, 12, 23, 24, redove A-H za kontrolu maksimalnog signala, i SAH, poznati proizvod i inhibitor PRC2 (1 μL) doda se u kolone 11,12, 23, 24, redove I-P za kontrolu minimalnog signala. Koktel (40 μL) koji sadrži divlji tip PRC2 enzima i H3K27me0 peptid ili neki od Y641 mutantnih enzima i H3K27me2 peptid dodaju se pomoću Multidrop Combi (Thermo). Jedinjenja se inkubiraju sa PRC2 30 min na 25 °C, zatim se doda koktel (10 μL) koji sadrži mešavinu neardoaktivnog i H-SAM da se inicira reakcija (finalna zapremina = 51 μL). U svim slučajevima, finalne koncentracije bile su sledeće: divlji tip ili mutantni PRC2 enzim 4 nM, SAH u bunarčićima za kontrolu minimalnog signala 1 mM DMSO koncentracija bila je 1%. Finalne koncentracije ostalih komponenti navedne su u Tabeli 7, u nastavku. Testovi su zaustavljani dodavanjem neradioaktivnog SAM (10 μL) do finalne koncentracije od 600 μM, što razblažuje<3>H-SAM do nivoa na kojem njegova inkorporacija u peptidni supstrat nije više detektabilna. 50 μL reakcije na polipropilenskoj ploči sa 384 bunarčića zatim se prenese na Flashplate sa 384 bunarčića i ostavi se da se biotinizovani peptidi vežu za streptavidinsku površinu, tokom najmanje 1 h pre ispiranja, tri puta, 0.1% Tween20 u Biotek ELx405 ispiraču ploča. Ploče se zatim očitavaju u PerkinElmer TopCount čitaču ploča da se izmeri količina 3H-obeleženog peptida vezanog za površinu Flashplate, merena kao dezintegracija po minutu (disintegrations per minute, dpm) ili alternativno, označena kao broj po minutu (counts per minute, cpm).
Tabela 7: Finalne koncentracije komponenti za svaku varijaciju testa na bazi identiteta EZH2 (divlji tip ili Y641 mutantni EZH2)
[0315] Opšti postupci enzimskih testova divljeg tipa PRC2 na oligonukleozomskom supstratu. Testovi su izvedeni u puferu koji se sastoji od 20 mM bicina (pH = 7.6), 0.5 mM DTT, 0.005% BSG, 100 mM KCl i 0.002% Tween20, pripremljenom na dan korišćenja. Jedinjenja u 100% DMSO (1 μL) naneta su na polipropilenske ploče sa 384 bunarčića sa V-dnom (Greiner) uz korišćenje Platemate 2 X 3 opremljenom 384-kanalskom glavom pipete (Thermo). DMSO (1 μL) se doda u kolone 11, 12, 23, 24, redove A-H za kontrolu maksimalnog signala, i SAH, poznati proizvod i inhibitor PRC2 (1 μL) doda se u kolone 11,12, 23, 24, redove I-P za kontrolu minimalnog signala. Koktel (40 μL) koji sadrži divlji tip PRC2 enzima i oligonukleozome pilećih eritrocita dodaju se pomoću Multidrop Combi (Thermo). Jedinjenja se inkubiraju sa PRC230 min na 25 °C, zatim se doda koktel (10 μL) koji sadrži mešavinu neardoaktivnog i<3>H-SAM da se inicira reakcija (finalna zapremina = 51 μL). Finalne koncentracije bile su sledeće: divlji tip PRC2 enzima 4 nM, neradioaktivni SAM 430 nm, H-SAM 120 nM, oligonukleozom pilećeg eritrocita 120 nM, SAH u bunarčićima za kontrolu minimalnog signala 1 mM i DMSO koncentracija bila je 1%. Testje zaustavljen ovi su zaustavljani dodavanjem neradioaktivnog SAM (10 μL) do finalne koncentracije od 600 μM, što razblažuje<3>H-SAM do nivoa na kojem njegova inkorporacija u oligonukleozom eritrocita pileta kao supstrat prestane da bude detektabilna. 50 μL reakcije na polipropilenskoj ploči sa 384 bunarčića zatim se prenese na Flashplate sa 384 bunarčića i nukleozomipilećih eritrocita imobilišu se na površini ploče koaj se zatim ispira tri puta, 0.1% Tween20 u Biotek ELx405 ispiraču ploča. Ploče se zatim očitavaju u PerkinElmer TopCount čitaču ploča da se izmeri količina<3>H-obeleženog oligonukleozoma pilećih eritrocita vezanog za površinu Flashplate, merena kao dezintegracija po minutu (disintegrations per minute, dpm) ili alternativno, označenog kao broj po minutu (counts per minute, cpm).
Izračunavanje % inhibicije
[0316]
[0317] Gde je dpm = dezintegracija po minutu, cmpd = signal u testnom bunarčiću, i min i max su kontrole minimalnog odnosno maksimalnog signala.
Četvoroparametarsko IC50podešavanjet
[0318]
[0319] Kada su vrh i dno normalno ostavljeni kao "plutajući" ali mogu biti fiksirani na 100, odnosno 0 u 3-parametarskom podešavanju. Hillov koeficijent normalno dopušta fluktuiranje ali može biti i fiksiran na 1 u 3-parametarskom podešavanju. Y je % inhibicije i X je koncentracija jedinjenja.
[0320] IC50vrednosti za PRC2 enzimske testove na peptidnim supstratima (npr., EZH2 divlji tip iY641F) predstavljeni su u Tabeli 8, dole.
Test WSU-DLCL2 metilacije
[0321] WSU-DLCL2 suspenzija ćelija nabavljena je od DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Germany). RPMI/Glutamax medijum, penicilin-streptomicin, toplotom inaktivirnai fetalni goveđi serum, i D-PBS nabavljeni su od Life Technologies, Grand Island, NY, USA. Ekstrakcioni pufer i neutralizacioni pufer (5X) nabavljeni su od Active Motif, Carlsbad, CA, USA. Zečje anti-histon H3 antitelo nabavljeno je od Abcam, Cambridge, MA, USA. Zečje anti-H3K27me3 i HRP-konjugovani antizečji-IgG nabavljeni su od Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA. TMB "Super Sensitive" supstrat je iz BioFX Laboratories, Owings Mills, MD, USA. Goveđi serum albumin bez IgG nabavljen je od Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA. PBS sa Tween (10X PBST) nabavljen je od KPL, Gaithersburg, MD, USA. Sumporna kiselina nabavljena je od Ricca Chemical, Arlington, TX, USA. Immulon ELISA ploče nabavljene su od Thermo, Rochester, NY, USA. ploče za kulturu ćelija sa V-dnom nabavljene su od Corning Inc., Corning, NY, USA. Poliproliplenske ploče sa V-dnom nabavljene su od Greiner Bio-One, Monroe, NC, USA.
[0322] WSU-DLCL2 suspenzione ćelije održavane su u medijumu za rast (RPMI 1640 dopunjen 10% zapr./zapr. toplotom inaktiviranim fetalnim goveđim serumom i 100 jedinica/mL penicilina-streptomicina) i kultivisane na 37 °C pod 5% CO2. U uslovima testa, ćelije su inkubirane u testnom medijumu (RPMI 1640 dopunjen 20% zapr./zapr. toplotom inaktiviranim fetalnim goveđim serumom i 100 jedinica/mL penicilina-streptomicina) na 37 °C pod 5% CO2na šejkeru za ploče.
[0323] WSU-DLCL2 ćelije zasejane su u testnom medijumu u koncentraciji od 50.000 ćelija po mL na pločama za kulturu ćelija sa 96 bunarčića s aV-dnom, 200 μL po bunarčiću. Jedinjenje (1 μL) iz izvornih ploča sa 96 bunarčića doda se direktno u ćelijsu ploču sa V-dnom. Ploče se inkubirajuna šejkeru za titarske ploče na 37°C, 5% CO296 sati. Posle četir dana inkubacije, ploče se centrifugiraju na 241 x g pet minuta i medijum se nežno aspirira iz svakog bunarčića a da se ne uznemiri ćelijski pelet. Pelet se resuspenduje u 200 μL DPBS i ploče se ponovo centrifugiraju na 241 x g pet minuta. Supernatant se aspirira i hladni (4°C) ekstrakcioni pufer (100 μL) se doda u svaki bunarčić. Ploče se inkubiraju na 4°C na orbitalnom šejkeru dva sata. Ploče se centrifugiraju na 3427 x g x 10 minuta. Supernatant (80 μL po bunarčiću) se prenese u odgovarajuće bunarčiće na polipropilenskoj ploči sa 96 bunarčića sa V-dnom. Neutralizacioni pufer 5X (20 μL po bunarčiću) doda se na polipropilensku ploču sa V-dnom koja sadrži supernatant. Polipropilenske ploče sa V-dnom koje sadrže sirovi histonski preparat (crude histone preparation, CHP) inkubiraju se na orbitalnom šejkeru x pet minuta. Sirovi histonski preparati se dodaju (2 μL po bunarčiću) u svaki respektivni bunarčić i duplikatnim ELISA pločama sa 96 bunarčića sa 100 μL oblažućeg pufera (IX PBS BSA 0.05% tež./zapr.). Ploče se zatvore i inkubiraju preko noći na 4°C. Sledećeg dana, ploče se isperu tri puta sa 300 μL po bunarčiću IX PBST. Bunarčići se blokiraju dva sata sa 300 μL po bunarčiću ELISA razblaživača ((PBS (IX) BSA (2% tež./zapr) i Tween20 (0.05% zapr/zapr)). Ploče se isperu tri puta sa IX PBST. Za histon H3 detekcione ploče, doda se 100 μL po bunarčiću anti-histon-H3 antitela (Abcam, ab1791) u razblaženju 1:10,000 u ELISA razblaživaču. Za deteksione ploče H3K27 trimetilacije, doda se 100 μL po bunarčiću anti-H3K27me3 u razblaženju 1:2000 u ELISA razblaživaču. Ploče s einkubiraju 90 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče s eisperu tri puta sa 300 μL IX PBST po bunarčiću. Za detekciju histona H3, 100 μL of HRP-konjugovanog anti-zečjeg IgG antitela u razblaženju 1:6000 u ELISA razblaživaču doda se u svaki bunarčić. Za H3K27me3 detekciju, 100 μL HRP konjugovanog anti-zečjeg IgG antitela u razblaženju 1:4000 u ELISA razblaživaču doda se u svaki bunarčić. Ploče s einkubiraju na sobnoj temperatur 90 minuta. Ploče se isperu četir puta sa IX PBST 300 μL po bunarčiću. TMB supstrat100 μL doda se u svaki bunarčić. Histon H3-ploče se inkubiraju pet minuta na sobnoj temperaturi. H3K27me3-ploče se inkubiraju 10 minuta na sobnoj temperaturi. Reakcija se zaustavlja sumpornom kiselinom IN (100 mL po bunarčiću). Apsorbanca za svaku ploču očitava se na 450 nm.
[0324] Prvo odnos za svaki bunarčić se određuje pomoću:
[0325] Svaka ploča uključuje osam kontrolnih bunarčića tretmana samo korišćenjem DMSO (minimalna inhibicija) kao i osam kontrolnih bunarčića za maksimalnu inhibiciju (pozadinski bunarčići).
[0326] Prosek odnosa vrednosti za svaki kontrolni tip izračunat je i upotrebljen za određivanje procenta inhibicije za svaki testni bunarčić na ploči. Testno jedinjenje je serijski razblaženo trostruko u DMSO u ukupno deset testnih koncentracija, počevši od 25 μM. Određen je procenat inhibicije i IC50krive su generisane korišćenjem duplikatnih bunarčića za koncentracije jedinjenja. IC50vrednosti za ovaj test prikazane su u Tabeli 8 dole.
Analiza ćelijske proliferacije
[0327] WSU-DLCL2 ćelije za suspenziju nabavljene su od DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Germany). RPMI/Glutamax medijum, penicilin-streptomicin, toplotom inaktivirnai fetalni goveđi serum, nabavljeni su od Life Technologies, Grand Island, NY, USA. Poliproliplenske ploče sa V-dnom sa 384 bunarčića nabavljene su od Greiner Bio-One, Monroe, NC, USA. Ploče za ćelijsku kulturu sa 384 bunarčića, bele neprozirne, nabavljene su od Perkin Elmer, Waltham, MA, USA. Cell-Titer Glo® nabavljen je od Promega Corporation, Madison, WI, USA. SpectraMax M5 čitač ploča nabavljen je od Molecular Devices LLC, Sunnyvale, CA, USA.
[0328] WSU-DLCL2 ćelije za suspenziju održavane su u medijumu za rast (RPMI 1640 dopunjen sa 10% zapr./zapr. toplotom inaktivirnaim fetalnim goveđim serumom i kultivisane na 37 °C pod 5% CO2. Pod uslovima testa, ćelije su inkubirane u testnom medijumu (RPMI 1640 dopunjen sa 20% zapr./zapr toplotom inaktivirnaim fetalnim goveđim serumom i 100 jedinica/mL penicilina/streptomicina) na 37 °C pod 5% CO2.
[0329] Za procenu efekta jedinjenja na proliferaciju WSU-DLCL2 ćelijske linije, ćelije u eksponencijalnom rastu zasejane su na neprozirne ploče sa 384 bunarčića u gustini od 1250 ćel/ml u finalnoj zapremini od 50 μl testnog medijuma. Ploče sa izvornim jedinjenjem pripremljena je izvođenjem triplikatnih trostrukih serijskih razblaženja u devet tačaka, u DMSO, počevši od 10 mM (finalna gornja koncentracija jedinjenja u testu bila je 20 μM i DMSO je bio 0.2%). 100 nLski alikvot iz ploče sa stok jedinjenjem dodat je u odgovarajuće bunarčiće na ploči za ćelije. 100% inhibiciona kontrola sastojala se od ćelija tretiranih sa finalnom koncentracijom od 200 nM staurosporina i 0% inhibiciona kontrola sastojala se od ćelija tretiranih sa. Posle dodavanja jedinjenja, testne ploče su inkubirane 6 dana na 37°C, 5% CO2, relativna vlažnost > 90% 6 dana. Vijabilnost ćelija merena je kvantifikovanjem ATP prisutnog u ćelijskim kulturama, dodavanjem 35 μl CellTiter-Glo®® reagensa na ćelijske ploče. Luminiscencija je očitavana na SpectraMax M5. Koncentracija koja je inhibirala vijabilnost ćelija za 50% određena je korišćenjem 4-parametrijskog podešavanja normalizovanih krivih doznog odgovora.
[0330] Navođenje publikacija i patentnih dokumenata nije zamišljeno kao priznanje da je nešto od toga primereno stanju tehnike niti da predstavlja priznanje o sadržaju ili datumu istog. Pronalazak je sada opisan pisanim putem, stručnjak u oblasti će prepoznati da pronalazak može da se primeni različitim primerima izvođenja i da gornji opis i primeri služe samo kao ilustracije, a ne kao ograničenja patentnih zahteva koji slede.
EKVIVALENTI
[0331] Pronalazak može biti ostvaren u drugim specifičnim formama bez odstupanja od suštinskih karakteristika. Gornje primere izvođenja dakle treba smatrati u svakom pogledu ilustrativnim, a ne ograničavajućim u odnosu na pronalazak opisan u ovom tekstu. Okvir pronalaska je prema tome naznačen priloženim patentnim zahtevima, a ne gornjim opisom.

Claims (6)

  1. PATENTNI ZAHTEVI 1. EZH2 inhibitor za upotrebu u lečenju epiteloidnog sarkoma, pri čemu je EZH2 inhibitor:
    ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
  2. 2. EZH2 inhibitor za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, za lečenje ili olakšavanje simptoma kancera udruženog sa SWI/SNF kompleksom kod subjekta, naznačen time, što subjekt ima epiteloidni sarkom, pri čemu je identifikovano da subjekt ima izmenjenu ekspresiju i/ili gubitak funkcije SWI/SNF kompleksa ili jedne ili više komponenti SWI/SNF kompleksa.
  3. 3. EZH2 inhibitor za upotrebu prema patentnom zahtevu 2, naznačen time, što se kancer udružen sa SWI/SNF kompleksom karakteriše smanjenom ekspresijom ili gubitkom funkcije SWI/SNF kompleksa ili jedne ili više komponenti SWI/SNF kompleksa.
  4. 4. EZH2 inhibitor za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, naznačen time, što se jedna ili više komponenti biraju iz grupe koja se sastoji od SNF5, ATRX i ARID1A.
  5. 5. EZH2 inhibitor za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, naznačen time, što je gubitak funkcije prouzrokovan mutacijom gubitka funkcije, što je rezultat tačkaste mutacije, delecije i/ili insercije.
  6. 6. EZH2 inhibitor za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što subjekt ima deleciju SNF5.
RS20191374A 2012-10-15 2013-10-15 Metodi lečenja kancera RS59541B1 (sr)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261714145P 2012-10-15 2012-10-15
US201261714140P 2012-10-15 2012-10-15
US201261714045P 2012-10-15 2012-10-15
US201361758972P 2013-01-31 2013-01-31
US201361780703P 2013-03-13 2013-03-13
US201361786277P 2013-03-14 2013-03-14
PCT/US2013/065112 WO2014062720A2 (en) 2012-10-15 2013-10-15 Methods of treating cancer
EP13786351.0A EP2908823B1 (en) 2012-10-15 2013-10-15 Methods of treating cancer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS59541B1 true RS59541B1 (sr) 2019-12-31

Family

ID=49519104

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20191374A RS59541B1 (sr) 2012-10-15 2013-10-15 Metodi lečenja kancera

Country Status (23)

Country Link
US (7) US9688665B2 (sr)
EP (2) EP3659606A1 (sr)
JP (5) JP6351182B2 (sr)
KR (3) KR102021642B1 (sr)
CN (2) CN110898067A (sr)
AU (4) AU2013331368A1 (sr)
BR (1) BR112015008447A2 (sr)
CA (2) CA2887243C (sr)
CY (1) CY1122186T1 (sr)
ES (1) ES2750199T3 (sr)
HR (1) HRP20191814T1 (sr)
HU (1) HUE046790T2 (sr)
IL (4) IL308613A (sr)
LT (1) LT2908823T (sr)
MX (2) MX376008B (sr)
NZ (2) NZ746054A (sr)
PL (1) PL2908823T3 (sr)
PT (1) PT2908823T (sr)
RS (1) RS59541B1 (sr)
RU (2) RU2677276C2 (sr)
SI (1) SI2908823T1 (sr)
SM (1) SMT201900593T1 (sr)
WO (1) WO2014062720A2 (sr)

Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011160206A1 (en) 2010-06-23 2011-12-29 Morin Ryan D Biomarkers for non-hodgkin lymphomas and uses thereof
JO3363B1 (ar) 2011-04-13 2019-03-13 Epizyme Inc مركبات بنزين مستبدلة بأريل أو أريل غير متجانس
US9051269B2 (en) 2011-11-18 2015-06-09 Constellation Pharmaceuticals, Inc. Modulators of methyl modifying enzymes, compositions and uses thereof
JP5989805B2 (ja) 2012-02-10 2016-09-07 コンステレーション・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＣｏｎｓｔｅｌｌａｔｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ． メチル基変更酵素の調節物質、組成物及びその使用
US9394283B2 (en) 2012-04-13 2016-07-19 Epizyme, Inc. Salt form of a human histone methyltransferase EZH2 inhibitor
CA2887243C (en) 2012-10-15 2024-04-09 Epizyme, Inc. Methods of treating cancer
PE20150887A1 (es) 2012-10-15 2015-06-04 Epizyme Inc Compuestos de benceno sustituidos
DK2935222T3 (en) 2012-12-21 2019-01-07 Epizyme Inc PRMT5 INHIBITORS AND APPLICATIONS THEREOF
US9745305B2 (en) 2013-03-15 2017-08-29 Constellation Pharmaceuticals, Inc. Modulators of methyl modifying enzymes, compositions and uses thereof
US9969716B2 (en) 2013-08-15 2018-05-15 Constellation Pharmaceuticals, Inc. Indole derivatives as modulators of methyl modifying enzymes, compositions and uses thereof
KR102142177B1 (ko) 2013-10-16 2020-08-07 에피자임, 인코포레이티드 Ezh2 억제용 하이드로클로라이드 염 형태
EP3057594A4 (en) * 2013-10-18 2017-06-07 Epizyme, Inc. Method of treating cancer
CA2931263A1 (en) 2013-12-06 2015-06-11 Epizyme, Inc. Combination therapy for treating cancer
IL285201B2 (en) * 2014-06-17 2024-05-01 Epizyme Inc EZH2 inhibitors for the treatment of lymphoma
EP3158086B1 (en) 2014-06-19 2021-03-24 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Biomarkers for response to ezh2 inhibitors
IL310279A (en) * 2014-10-16 2024-03-01 Epizyme Inc Method for treating cancer
HUE062159T2 (hu) * 2014-11-17 2023-10-28 Epizyme Inc Módszer a rák kezelésére N-((4,6-dimetil-2-oxo-l,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H -pirán-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinmetil)-[1,1'-bifenil]-3-karboxamiddal
AR102767A1 (es) 2014-12-05 2017-03-22 Lilly Co Eli Inhibidores de ezh2
EP3236962A2 (en) 2014-12-23 2017-11-01 University of Copenhagen Treatment of cancer by inhibiting ezh2 activity
CN108135908A (zh) 2015-04-20 2018-06-08 Epizyme股份有限公司 用于治疗癌症的组合疗法
EP3307713A4 (en) 2015-06-10 2019-01-23 Epizyme, Inc. EZH2 INHIBITOR FOR THE TREATMENT OF LYMPHOMA
KR20180042356A (ko) 2015-08-24 2018-04-25 에피자임, 인코포레이티드 암 치료 방법
TW201718598A (zh) 2015-08-27 2017-06-01 美國禮來大藥廠 Ｅｚｈ２抑制劑
US10577350B2 (en) 2015-08-28 2020-03-03 Constellation Pharmaceuticals, Inc. Crystalline forms of (R)-N-((4-methoxy-6-methyl-2-oxo-1,2-dihydropyridin-3-yl)methyl)-2-methyl-1-(1-(1-(2,2,2-trifluoroethyl)piperidin-4-yl)ethyl)-1H-indole-3-carboxamide
JP7013369B2 (ja) * 2015-09-25 2022-02-15 エピザイム，インコーポレイティド Ｅｚｈ２阻害剤により卵巣の悪性ラブドイド腫瘍（ｍｒｔｏ）／高カルシウム血症型の卵巣の小細胞癌（ｓｃｃｏｈｔ）を処置するための方法
MX394355B (es) * 2015-10-06 2025-03-24 Epizyme Inc Método de tratamiento de meduloblastoma con un inhibidor de ezh2.
WO2017079757A1 (en) * 2015-11-06 2017-05-11 Epizyme, Inc. Pediatric dosing for treatment of cancer with an ezh2 inhibitor
CN105440023A (zh) * 2015-12-10 2016-03-30 江苏理工学院 Epz-6438的合成方法
WO2017132518A1 (en) 2016-01-29 2017-08-03 Epizyme, Inc. Combination therapy for treating cancer
JP2019508406A (ja) * 2016-02-08 2019-03-28 エピザイム，インコーポレイティド 癌を処置する方法
WO2017201585A1 (en) * 2016-05-26 2017-11-30 Genea Ip Holdings Pty Ltd Modulators of dux4 for regulation of muscle function
WO2017210395A1 (en) 2016-06-01 2017-12-07 Epizyme, Inc. Use of ezh2 inhibitors for treating cancer
US20200129519A1 (en) * 2016-06-08 2020-04-30 Genentech, Inc. Diagnostic and therapeutic methods for cancer
EP3471830A4 (en) 2016-06-17 2020-02-26 Epizyme Inc EZH2 INHIBITORS TO TREAT CANCER
US20190192521A1 (en) * 2016-08-15 2019-06-27 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods of Treating Arid1A-Mutated Cancers With HDAC6 Inhibitors and EZH2 Inhibitors
WO2018049000A1 (en) * 2016-09-08 2018-03-15 The General Hospital Corporation Treatment of cancers having alterations within the swi/snf chromatin remodeling complex
CN109843870A (zh) 2016-10-19 2019-06-04 星座制药公司 Ezh2抑制剂的合成
AU2017351638A1 (en) 2016-10-26 2019-06-13 Genea Biocells USA (Holdings), Inc. Improved generation of muscle lineage cells and therapeutic uses thereof
CN108314677B (zh) 2017-01-17 2020-06-30 安徽中科拓苒药物科学研究有限公司 一种ezh2抑制剂及其用途
JP7324144B2 (ja) * 2017-02-02 2023-08-09 エピザイム，インコーポレイティド 癌処置様式
US10266542B2 (en) 2017-03-15 2019-04-23 Mirati Therapeutics, Inc. EZH2 inhibitors
US11642346B2 (en) 2017-03-31 2023-05-09 Epizyme, Inc. Combination therapy for treating cancer
EP3630080A4 (en) 2017-06-02 2021-03-10 Epizyme, Inc. USE OF EZH2 INHIBITORS TO TREAT CANCER
US12178854B2 (en) 2017-07-19 2024-12-31 Children's Medical Center Corporation Compositions and methods for treating diseases associated with an imprinting defect
MX2020001875A (es) 2017-08-18 2020-07-29 Tragara Pharmaceuticals Inc Forma polimorfica de tg02.
WO2019050924A1 (en) 2017-09-05 2019-03-14 Epizyme, Inc. POLY THERAPY FOR THE TREATMENT OF CANCER
BR112020008325A2 (pt) 2017-11-14 2020-10-20 Pfizer Inc. terapias de combinação com o inibidor de ezh2
MX2020007974A (es) 2018-01-31 2020-09-07 Mirati Therapeutics Inc Inhibidores de complejo represivo polycomb 2 (prc2).
EP3823671B1 (en) * 2018-07-09 2024-02-07 Fondation Asile Des Aveugles Inhibition of prc2 subunits to treat eye disorders
TWI798532B (zh) * 2019-03-25 2023-04-11 大陸商深圳微芯生物科技股份有限公司 Ｋｄｍ５ａ基因和ａｔｒｘ基因的應用
US20220154295A1 (en) * 2019-03-27 2022-05-19 The Johns Hopkins University Methods and materials for assessing and treating cancer
US12421228B2 (en) 2019-04-22 2025-09-23 Mirati Therapeutics, Inc. Naphthyridine derivatives as PRC2 inhibitors
EP3958854B1 (en) 2019-04-22 2025-06-04 University of Pittsburgh - of The Commonwealth System of Higher Education Tg02 for use in treating gliomas in pediatric subjects
EP3976044A4 (en) * 2019-06-03 2024-08-07 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Compounds and methods for inhibiting cancers via rest inhibition
EP3980422A1 (en) 2019-06-05 2022-04-13 Mirati Therapeutics, Inc. Imidazo[1,2-c]pyrimidine derivatives as prc2 inhibitors for treating cancer
JP2022539556A (ja) 2019-06-28 2022-09-12 エイエルエス・セラピー・デベロップメント・インスティテュート ジペプチドリピートタンパク質の阻害
US20230181543A1 (en) * 2020-02-28 2023-06-15 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Treatment of carm1-overexpressing and/or arid1a mutant cancers with ire-1/xbp-1 inhibitors
AU2021293943A1 (en) * 2020-06-18 2023-02-23 Epizyme, Inc. SMARCA4 inhibition for the treatment of cancer
CN111773387A (zh) * 2020-07-08 2020-10-16 北京大学 一种通过改变bin1剪切体比例改善心脏横管结构的方法
EP4392034A1 (en) 2021-08-25 2024-07-03 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Use of ezh2 inhibitors for the treatment of aortic valve stenosis
CN116019916A (zh) * 2021-10-27 2023-04-28 蚌埠医学院第一附属医院 非小细胞肺癌靶点arid1a及其抑制剂在制备肺癌治疗药物中的用途

Family Cites Families (81)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US5455044A (en) 1993-05-14 1995-10-03 Depotech Corporation Method for treating neurological disorders
US5763263A (en) 1995-11-27 1998-06-09 Dehlinger; Peter J. Method and apparatus for producing position addressable combinatorial libraries
US7229774B2 (en) 2001-08-02 2007-06-12 Regents Of The University Of Michigan Expression profile of prostate cancer
SI2238982T1 (sl) 2003-06-27 2013-01-31 Astellas Pharma Inc. Terapevtsko sredstvo za mehkotkivni sarkom
WO2009006577A2 (en) * 2007-07-03 2009-01-08 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for inhibiting ezh2
US20120114670A1 (en) * 2007-10-02 2012-05-10 University Of Rochester Methods and compositions related to synergistic responses to oncogenic mutations
US20110064664A1 (en) * 2007-10-08 2011-03-17 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Methods and compositions involving chitosan nanoparticles
US20110251216A1 (en) * 2010-02-19 2011-10-13 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for inhibiting ezh2
EA023788B1 (ru) 2010-05-07 2016-07-29 ГЛЭКСОСМИТКЛАЙН ЭлЭлСи Производные индола и фармацевтические композиции на их основе
WO2012005805A1 (en) 2010-05-07 2012-01-12 Glaxosmithkline Llc Azaindazoles
JP5864546B2 (ja) 2010-05-07 2016-02-17 グラクソスミスクライン・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ ＬＬＣ インダゾール
WO2012071096A2 (en) * 2010-09-03 2012-05-31 The Johns Hopkins University Arid1a and ppp2r1a mutations in cancer
US9175331B2 (en) 2010-09-10 2015-11-03 Epizyme, Inc. Inhibitors of human EZH2, and methods of use thereof
BR112013005806B1 (pt) 2010-09-10 2022-05-10 Epizyme, Inc Métodos para detectar se um indivíduo é um candidato para o tratamento com ou responsivo a um inibidor de ezh2 e usos terapêuticos do dito inibidor de ezh2
US20130310379A1 (en) * 2010-11-19 2013-11-21 Constellation Pharmaceuticals Modulators of methyl modifying enzymes, compositions and uses thereof
EP2646020B1 (en) 2010-12-01 2016-09-21 Glaxosmithkline LLC Indoles
WO2012118812A2 (en) 2011-02-28 2012-09-07 Epizyme, Inc. Substituted 6,5-fused bicyclic heteroaryl compounds
US20140296248A1 (en) 2011-04-04 2014-10-02 Stichting het Nederlands Kanker Instiuut-Antoni van Leeuwenhoek ziekenhuis Methods and compositions for predicting resistance to anticancer treatment
TW201733984A (zh) * 2011-04-13 2017-10-01 雅酶股份有限公司 經取代之苯化合物
JO3363B1 (ar) 2011-04-13 2019-03-13 Epizyme Inc مركبات بنزين مستبدلة بأريل أو أريل غير متجانس
KR20140033384A (ko) 2011-05-16 2014-03-18 울리커 누베르 신규한 암 치료제 및 방법
EP2755962B1 (en) 2011-09-13 2017-03-01 Glaxosmithkline LLC Azaindazoles
CA2850570A1 (en) * 2011-09-30 2013-04-04 Glaxosmithkline Llc Methods of treating cancer
WO2013059944A1 (en) 2011-10-28 2013-05-02 British Columbia Cancer Agency Branch Epigenetic regulators and uses thereof
JP5989805B2 (ja) 2012-02-10 2016-09-07 コンステレーション・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＣｏｎｓｔｅｌｌａｔｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ． メチル基変更酵素の調節物質、組成物及びその使用
RU2704445C2 (ru) 2012-03-12 2019-10-28 Эпизайм, Инк. Ингибиторы ezh2 человека и способы их применения
AU2013237226A1 (en) * 2012-03-19 2014-10-09 Emory University Quinazoline compounds and their use in therapy
SG10201608579UA (en) 2012-04-13 2016-12-29 Epizyme Inc Combination therapy for treating cancer
US9394283B2 (en) 2012-04-13 2016-07-19 Epizyme, Inc. Salt form of a human histone methyltransferase EZH2 inhibitor
US9562041B2 (en) 2012-05-16 2017-02-07 Glaxosmithkline Llc Enhancer of zeste homolog 2 inhibitors
CA2887243C (en) 2012-10-15 2024-04-09 Epizyme, Inc. Methods of treating cancer
PE20150887A1 (es) 2012-10-15 2015-06-04 Epizyme Inc Compuestos de benceno sustituidos
US20140120083A1 (en) 2012-11-01 2014-05-01 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Treatment of cancers using pi3 kinase isoform modulators
WO2014092905A1 (en) 2012-12-10 2014-06-19 Children's Medical Center Corporation Methods and assays for combination treatment of cancer
CA2894222A1 (en) 2012-12-21 2014-06-26 Epizyme, Inc. 1,4-pyridone bicyclic heteroaryl compounds
WO2014100646A1 (en) 2012-12-21 2014-06-26 Epizyme, Inc. 1,4-pyridone compounds
MA38341B1 (fr) 2013-02-11 2018-11-30 Constellation Pharmaceuticals Inc Modulateurs d'enzymes de modification par méthylation, compositions et utilisations associées
CA2903572A1 (en) 2013-03-15 2014-10-23 Epizyme, Inc. Substituted benzene compounds
US9776996B2 (en) 2013-03-15 2017-10-03 Epizyme, Inc. Substituted 6,5-fused bicyclic heteroaryl compounds
US9243001B2 (en) 2013-03-15 2016-01-26 Epizyme, Inc. Substituted benzene compounds
US9045477B2 (en) 2013-03-15 2015-06-02 Epizyme, Inc. Substituted 6,5-fused bicyclic heteroaryl compounds
WO2014176047A1 (en) 2013-04-25 2014-10-30 Novartis Ag Markers for ezh2 inhibitors
WO2014177982A1 (en) 2013-04-30 2014-11-06 Glaxosmithkline Intellectual Property (No.2) Limited Enhancer of zeste homolog 2 inhibitors
EP3004096A1 (en) 2013-06-06 2016-04-13 Glaxosmithkline Intellectual Property (No. 2) Limited Enhancer of zeste homolog 2 inhibitors
AU2014288839B2 (en) 2013-07-10 2017-02-02 Glaxosmithkline Intellectual Property (No.2) Limited Enhancer of Zeste Homolog 2 inhibitors
EP3022195A2 (en) 2013-07-19 2016-05-25 Epizyme, Inc. Substituted 6,5-fused bicyclic heteroaryl compounds
WO2015010049A1 (en) 2013-07-19 2015-01-22 Epizyme, Inc. Substituted benzene compounds
KR102142177B1 (ko) 2013-10-16 2020-08-07 에피자임, 인코포레이티드 Ezh2 억제용 하이드로클로라이드 염 형태
EP3057594A4 (en) 2013-10-18 2017-06-07 Epizyme, Inc. Method of treating cancer
CA2931263A1 (en) 2013-12-06 2015-06-11 Epizyme, Inc. Combination therapy for treating cancer
WO2015103431A1 (en) 2013-12-31 2015-07-09 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Compositions and methods for the diagnosis and treatment of ovarian cancers that are associated with reduced smarca4 gene expression or protein function
US20160361309A1 (en) 2014-02-26 2016-12-15 Glaxosmithkline Intellectual Property (No.2) Limited Methods of treating cancer patients responding to ezh2 inhibitor gsk126
EP3114125A1 (en) 2014-03-07 2017-01-11 Glaxosmithkline Intellectual Property (No. 2) Limited Enhancer of zeste homolog 2 inhibitors
MX382033B (es) 2014-03-19 2025-03-13 Infinity Pharmaceuticals Inc Compuestos heterocíclicos para utilizarlos en el tratamiento de trastornos mediados por pi3k-gamma.
WO2015193768A1 (en) 2014-06-17 2015-12-23 Pfizer Inc. Aryl fused lactams as ezh2 modulators
IL285201B2 (en) 2014-06-17 2024-05-01 Epizyme Inc EZH2 inhibitors for the treatment of lymphoma
EP3158086B1 (en) 2014-06-19 2021-03-24 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Biomarkers for response to ezh2 inhibitors
US20170217941A1 (en) 2014-06-25 2017-08-03 Epizyme, Inc. Substituted benzene and 6,5-fused bicyclic heteroaryl compounds
SG11201701704XA (en) 2014-09-05 2017-04-27 Arqule Inc Compositions and methods for treating proliferation disorders
IL310279A (en) 2014-10-16 2024-03-01 Epizyme Inc Method for treating cancer
HUE062159T2 (hu) 2014-11-17 2023-10-28 Epizyme Inc Módszer a rák kezelésére N-((4,6-dimetil-2-oxo-l,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H -pirán-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinmetil)-[1,1'-bifenil]-3-karboxamiddal
CN108135908A (zh) 2015-04-20 2018-06-08 Epizyme股份有限公司 用于治疗癌症的组合疗法
EP3307713A4 (en) 2015-06-10 2019-01-23 Epizyme, Inc. EZH2 INHIBITOR FOR THE TREATMENT OF LYMPHOMA
KR20180042356A (ko) 2015-08-24 2018-04-25 에피자임, 인코포레이티드 암 치료 방법
JP7013369B2 (ja) 2015-09-25 2022-02-15 エピザイム，インコーポレイティド Ｅｚｈ２阻害剤により卵巣の悪性ラブドイド腫瘍（ｍｒｔｏ）／高カルシウム血症型の卵巣の小細胞癌（ｓｃｃｏｈｔ）を処置するための方法
MX394355B (es) 2015-10-06 2025-03-24 Epizyme Inc Método de tratamiento de meduloblastoma con un inhibidor de ezh2.
WO2017079757A1 (en) 2015-11-06 2017-05-11 Epizyme, Inc. Pediatric dosing for treatment of cancer with an ezh2 inhibitor
EP3386513A2 (en) 2015-12-07 2018-10-17 Epizyme Inc Inhibitors of ezh2 and methods of use thereof
WO2017132518A1 (en) 2016-01-29 2017-08-03 Epizyme, Inc. Combination therapy for treating cancer
JP2019508406A (ja) 2016-02-08 2019-03-28 エピザイム，インコーポレイティド 癌を処置する方法
WO2017210395A1 (en) 2016-06-01 2017-12-07 Epizyme, Inc. Use of ezh2 inhibitors for treating cancer
US20200129519A1 (en) 2016-06-08 2020-04-30 Genentech, Inc. Diagnostic and therapeutic methods for cancer
EP3471830A4 (en) 2016-06-17 2020-02-26 Epizyme Inc EZH2 INHIBITORS TO TREAT CANCER
JP7324144B2 (ja) 2017-02-02 2023-08-09 エピザイム，インコーポレイティド 癌処置様式
US11642346B2 (en) 2017-03-31 2023-05-09 Epizyme, Inc. Combination therapy for treating cancer
EP3630080A4 (en) 2017-06-02 2021-03-10 Epizyme, Inc. USE OF EZH2 INHIBITORS TO TREAT CANCER
US20230201212A1 (en) 2017-06-13 2023-06-29 Epizyme, Inc. Inhibitors of ezh2 and methods of use thereof
WO2019050924A1 (en) 2017-09-05 2019-03-14 Epizyme, Inc. POLY THERAPY FOR THE TREATMENT OF CANCER
KR20220130698A (ko) 2019-12-20 2022-09-27 에피자임, 인코포레이티드 Ezh2 억제제의 결정질 하이드로브로마이드 염, 이의 제조 및 암의 치료에 유용한 약학적 조성물
AU2021280314A1 (en) 2020-05-28 2022-12-08 Epizyme, Inc. Use of EZH2 inhibitors for treating cancer

Also Published As

Publication number Publication date
SMT201900593T1 (it) 2019-11-13
JP2018062535A (ja) 2018-04-19
JP2024029066A (ja) 2024-03-05
JP2021120420A (ja) 2021-08-19
CN105142642B (zh) 2019-10-18
RU2015118144A (ru) 2016-12-10
KR20230156450A (ko) 2023-11-14
CN105142642A (zh) 2015-12-09
US20250163033A1 (en) 2025-05-22
WO2014062720A3 (en) 2014-06-19
JP6351182B2 (ja) 2018-07-04
KR20150086264A (ko) 2015-07-27
RU2018145311A (ru) 2019-02-18
LT2908823T (lt) 2019-10-25
JP2020011971A (ja) 2020-01-23
CA3177498A1 (en) 2014-04-24
US20140128393A1 (en) 2014-05-08
MX2015004771A (es) 2016-01-08
HUE046790T2 (hu) 2020-03-30
CN110898067A (zh) 2020-03-24
BR112015008447A2 (pt) 2017-07-04
EP2908823B1 (en) 2019-09-25
US20190100514A1 (en) 2019-04-04
IL238254B (en) 2020-04-30
HK1213771A1 (en) 2016-07-15
EP2908823A2 (en) 2015-08-26
KR20190105669A (ko) 2019-09-17
AU2020205261A1 (en) 2020-08-06
AU2018233004B2 (en) 2020-04-16
AU2020205261B2 (en) 2023-09-14
RU2677276C2 (ru) 2019-01-16
PL2908823T3 (pl) 2020-03-31
IL238254A0 (en) 2015-06-30
US20200262823A1 (en) 2020-08-20
US20170305889A1 (en) 2017-10-26
MX376008B (es) 2025-03-07
KR102021642B1 (ko) 2019-09-16
AU2018233004A1 (en) 2018-10-11
IL288181B1 (en) 2023-12-01
JP2015536308A (ja) 2015-12-21
PT2908823T (pt) 2019-11-04
IL273517A (en) 2020-05-31
SI2908823T1 (sl) 2019-11-29
US20220315566A1 (en) 2022-10-06
CA2887243A1 (en) 2014-04-24
MX2020010535A (es) 2020-11-06
IL288181B2 (en) 2024-04-01
AU2013331368A1 (en) 2015-04-30
NZ746054A (en) 2020-07-31
US12162865B2 (en) 2024-12-10
CA2887243C (en) 2024-04-09
AU2023282217A1 (en) 2024-01-04
ES2750199T3 (es) 2020-03-25
IL288181A (en) 2022-01-01
HRP20191814T1 (hr) 2019-12-27
US20170305890A1 (en) 2017-10-26
NZ706836A (en) 2019-02-22
EP3659606A1 (en) 2020-06-03
WO2014062720A2 (en) 2014-04-24
US9688665B2 (en) 2017-06-27
CY1122186T1 (el) 2020-11-25
IL308613A (en) 2024-01-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RS59541B1 (sr) Metodi lečenja kancera
JP2015536308A5 (sr)
US9334527B2 (en) Inhibitors of human EZH2, and methods of use thereof
US20210267990A1 (en) Method for treating cancer
US20200330472A1 (en) Method of treating cancer
US20190038633A1 (en) Methods of treating cancer
TW201906825A (zh) 化合物及其使用方法
HK40031444A (en) Methods of treating cancer
HK1213771B (en) Methods of treating cancer