RS59580B1 - Ekspresija rekombinantnih proteina kod lutaka trichoplusia ni - Google Patents

Description

Opis

PODRUČJE OVOG PRONALASKA

[0001] Ovaj pronalazak može biti obuhvaćen područjem biotehnologije i podrazumeva sredstva i postupke za povećanje efikasnosti ekspresije rekombinantnog proteina, naročito za industrijsku proizvodnju rekombinantnih proteina kod lutaka insekata, naročito kod lutaka Trichoplusia ni (T. ni), uključujući njenu optimizaciju. Štaviše, ovaj pronalazak je takođe usmeren na same lutke koje obuhvataju bakulovirus, lutke koje su zaražene, transformisane, prenesene ili transfektovane sa bakulovirusima ili bakmidima.

STANJE TEHNIKE

[0002] Sistem vektora ekspresije bakulovirusa (BEVS) je dobro utvrđen postupak za proizvodnju rekombinantnih proteina, na primer proteina koji se koriste kao vakcine, terapeutski molekuli ili dijagnostički reagensi. Sa njegovim potencijalom za prekomernu ekspresiju i brzi razvoj, BEVS predstavlja jedan od najatraktivnijih izvora za proizvodnju rekombinantnih proteina za bilo koju namenu. Najuposleniji vektor bakulovirusa koji se koristi u industriji za ekspresiju rekombinantnog proteina je baziran na Autographa californica virusu multinuklearne polihedroze (AcMNPV)

sa Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) ili 21 (Sf21) ćelijama insekata kao pogodnim domaćinima ekspresije (Nettleship, J.E., Assenberg, R., Diprose, J.M., Rahman-Huq, N., Owens, R.J. Recent advances in the production of proteins in insect and mammalian cells for structural biology. J. Struct. Biol.2010, 172, 55-65), kao i na Trichoplusia ni (T. ni) larvama insekata kao živim biološkim fabrikama (Gomez-Casado E, Gomez-Sebastian S, Núñez MC, Lasa-Covarrubias R, Martínez-Pulgarín S, Escribano JM. Insect larvae biofactories as a platform for influenza vaccine production. Protein Expr Purif.79: 35-43.2011). Budući da je BEVS razvijen 80-ih godina (Smith, G.E., M.D. Summers, and M.J. Fraser.1983. Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Mol. Cell. Biol.3: 2156-2165), stotine rekombinantnih proteina, od citosolnih enzima do proteina vezanih membranom, se uspešno proizvode u ćelijama insekata zaraženih bakulovirusom.

[0003] U novije vreme su opisani novi vektori bakulovirusa. Na primer, WO 2012/168493 i WO 2012168492 daju opis elemenata rekombinantne DNK za ekspresiju rekombinantnih proteina kod insekata i ćelija insekata.

[0004] Širom sveta se na godišnjem nivou se proizvede oko 70,000 tona svile postupkom koji pretvara supstrat niske vrednosti, listove drveta duda, u proizvod visoke vrednosti baziran na proteinu: svilu. Insekti su izuzetno efikasni proizvođači proteina zbog svog ubrzanog metabolizma.

[0005] Leptiri kao što je Bombyx mori (B. mori, svileni crv) ili T.ni (kupusar), su dva insekta koja se najviše koriste u biotehnologiji. Oni narastu do veličine od oko 5000 puta za manje od 2 nedelje i proizvedu više od kilometar svile po B. mori insektu. Dok ćelija iz svilene žlezde može da proizvede oko 80 µg proteina/ćelija/dan, najbolji sistemi ćelijske strukture proizvode samo oko 50 pg protein/ćelija/dan.

[0006] Samim tim, insekti kao žive biološke fabrike stvaraju obećavajuću alternativu za ćelije insekata, konvencionalne tehnologije fermentacije, takođe i za proteine koji se dobijaju iz biljaka zbog mnogostranosti proizvodnje, mogućnosti prenosa na različite proizvodne nivoe, mogućnosti automatizacije, efikasnosti i brzine razvoja. Na primer, insekti kao žive biološke fabrike zaobilaze neophodne biološke reaktore za ekspresiju proteina kod, npr., ćelija insekata. Biološki reaktori predstavljaju tehnološku i ekonomsku barijeru za proizvodnju novih i postojećih rekombinantnih proteina, budući da su neefikasni, skupi, tehnološki složeni (potrebno je nekoliko godina da se izgrade, teški su za validaciju, zahtevaju visoko kvalifikovano osoblje za njihovo rukovanje, skloni su kontaminacijama i nisu pouzdani). Pored toga, suočavaju se sa problemom ograničene mogućnosti prenosa na druge proizvodne nivoe.

[0007] Larve B. mori su u širokoj upotrebi kao žive biološke fabrike za ekspresiju rekombinantnih proteina upotrebom Sistema vektora ekspresije bakulovirusa (Wang, DN; Liu, JW; Yang, GZ; Zhang, WJ; Wu, XF.2002. Cloning of anti-LPS factor cDNA from Tachypleus tridentatus, expression in Bombyx mori larvae and its biological activity in vitro. Molecular Biotechnology, 21(1), 1-7; Wu, XF; Kamei, K; Sato, H; Sato, S; Takano, R; Ichida, M; Mori, H; Hara, S.2001. High-level expression of human acidic fibroblast growth factor and basic fibroblast growth factor in silkworm (Bombyx mori L.) using recombinant baculovirus. Protein Expression And Purification, 21(1), 192-200; Kulakosky, PC; Hughes, PR; Wood, HA.

1998. N-linked glycosylation of a baculovirus-expressed recombinant glycoprotein in insect larvae and tissue culture cells. Glycobiology, 8(7), 741-745; Suzuki, T; Kanaya, T; Okazaki, H; Ogawa, K; Usami, A; Watanabe, H; KadonoOkuda, K; Yamakawa, M; Sato, H; Mori, H; Takahashi, S; Oda, K.1997. Efficient protein production using a Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus lacking the cysteine proteinase gene. Journal Of General Virology, 78, 3073-3080; Sumathy, S; Palhan, VB; Gopinathan, KP.1996.

Expression of human growth hormone in silkworm larvae through recombinant Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus. Protein Expression And Purification, 7(3), 262-268; U. Reis, B. Blum, B.U. von Specht, H. Domdey, J. Collins, Antibody production in silkworm cells and silkworm larvae infected with a dual recombinant Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus, Biotechnology (NY) 10 (1992) 910-912).

[0008] Larve T. ni se takođe upotrebljavaju za ekspresiju rekombinantnih proteina (Perez-Martin, E., Gomez-Sebastian, S., Argilaguet, J.M., Sibila, M., Fort, M., Nofrarias, M., Kurtz, S., Escribano, J.M., Segales, J., Rodriguez, F., 2010. Immunity conferred by an experimental vaccine based on the recombinant PCV2 Cap protein expressed in Trichoplusia ni-larvae. Vaccine 28 (11), 2340-2349); Gomez-Casado E, Gomez-Sebastian S, Núñez MC, Lasa-Covarrubias R, Martínez-Pulgarín S, Escribano JM. Insect larvae biofactories as a platform for influenza vaccine production, Protein Expr. Purif.2011, 79: 35-43; Medin, JA; Hunt, L; Gathy, K; Evans, RK; Coleman, MS.1990. Efficient, low-cost protein factories -expression of human adenosine-deaminase in baculovirus-infected insect larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 87(7), 2760-2764; Shafer, AL; Katz, JB; Eernisse, KA.1998. Development and validation of a competitive enzyme-linked immunosorbent assay for detection of type A influenza antibodies in avian sera. Avian Diseases, 42(1), 28-34; Cha, HJ; Pham, MQ; Rao, G; Bentley, WE.1997. Expression of green fluorescent protein in insect larvae and its application for heterologous protein production. Biotechnology and Bioengineering, 56(3), 239-247; Burden, JP; Hails, RS; Windass, JD; Suner, MM; Cory, JS.2000. Infectivity, speed of kill, and productivity of a baculovirus expressing the itch mite toxin txp-1 in second and fourth instar larvae of Trichoplusia ni. Journal of Invertebrate Pathology, 75(3), 226-236; Perez-Filgueira, D. M.; Resino-Talavan, P.; Cubillos, C.; Angulo, I.; Barderas, M. G.; Barcena, J.; Escribano, J. M..2007. Development of a low-cost, insect larvae-derived recombinant subunit vaccine against RHDV. Virology, 364(2), 422-430; Perez-Filgueira, D. A.; Gonzalez-Camacho, F.; Gallardo, C.; Resino-Talavan, P.; Blanco, E.; Gomez-Casado, E.; Alonso, C.; Escribano, J. M..2006. Optimization and validation of recombinant serological tests for African swine fever diagnosis based on detection of the p30 protein produced in Trichoplusia ni larvae. Journal of Clinical Microbiology, 44(9), 3114-3121; Hellers, M; Gunne, H; Steiner, H.1991.

Expression and posttranslational processing of preprocecropin-a using a baculovirus vector. European Journal of Biochemistry, 199(2), 435-439).

[0009] Kod svilenih crva, uporedna ispitivanja su pokazala da su, za većinu proteina, najveći prinosi ekspresije dobijeni kod larvi a ne kod lutaka (Akihiro Usami et al (Akihiro Usami, Seiji Ishiyama, Chiaki Enomoto, Hironobu Okazaki, Keiko Higuchi, Mashahiro Ikeda, Takeshi Yamamoto, Mutsumi Sugai, Yukiko Ishikawa, Yumiko Hosaka, Teruyuki Koyama, Yoneko Tobita, Syoko Ebihara, Toshiko Mochizuki, Yoshimi Asano and Hidekazu Nagaya, Comparison of recombinant protein expression in a baculovirus system in insect cells (Sf9) and silkworm, J. Biochem.2011;149(2):219-227; Chazarra S, Aznar-Cervantes S, Sánchez-del-Campo L, Cabezas-Herrera J, Xiaofeng W, Cenis JL, Rodriguez-López JN, Purification and kinetic properties of human recombinant dihydrofolate reductase produced in Bombyx mori chrysalides, Appl Biochem Biotechnol.2010 Nov;162(7):1834-46). Takođe, opisano je i smanjenje osetljivosti lutaka na infekciju bakulovirusom kod svilenih crva u odnosu na starost (Journal of General Virology (1992), 73, 3195-320). Pored toga, kod larvi, infekcija bakulovirusa se generalno izvodi oralnim putem, umesto inokulacijom (injekcijom) radi povećanja proizvodnje. Lutke ne mogu biti zaražene oralnim putem, tako da moraju da se ubrizgaju ručno, što je zamorno i oduzima vreme. Pored toga, lutke svilenih crva su prekrivene debelom larvom koja mora (ručno) da se ukloni pre inokulacije virusa, što je generalno zamoran proces.

[0010] Zajedno sa generalnim niskim prinosom ekspresije proteina kod lutke svilenih crva, i poteškoće sa rukovanjem istih, su dovele do opšte prednosti za upotrebu larvi za proizvodnju rekombinantnih proteina.

[0011] Slične mane mogu da se pronađu i u drugim sistemima, kao što su Hyalophora cecropilutke. Ekspresija određenih proteina kod lutaka H. cecropia je niža nego kod T. ni larvi (Hellers, M. and Steiner, H.; Insect Biochem. Molec. Biol., Vol 22, Bo.1, pp.35-39, 1992). Pored toga, Hyalophora cecropia moljci su teški za uzgajanje, i striktno su univoltni (daju samo jednu generaciju godišnje), daju veoma male količine jaja po ciklusu i poseduju larvu velike debljine (pri čemu ta debela larva mora (ručno) da se ukloni pre inokulacije virusa, što je generalno zamoran postupak). Sve ove mane čine lutke Hyalophora cecropia slabim sistemom za ekspresiju rekombinantnih proteina, naročito slabo efikasnim, sa malom mogućnošću prenosa na drugi proizvodni nivo i automatskim sistemom za ekspresiju rekombinantnih proteina.

[0012] Postoji potreba za efikasnijim i sistemima koji su laki za automatizovanje (prenos na drugi proizvodni nivo) sistema za ekspresiju rekombinantnih proteina kod insekata upotebom BEVS, naročito za industrijsku ekspresiju rekombinantnih proteina kod insekata upotrebom BEVS.

[0013] Nakon intenzivnog istraživanja, pronalazači ovog pronalaska su našli rešenje za gore pomenuti problem, naime sistem ekspresije proteina kod lutaka koje pripadaju rodu Trichoplusia, koji je efikasniji od ekspresije larvi i štaviše omogućava gotovo potpunu automatizaciju (prenos na drugi proizvodni nivo), što povećava efikasnost i smanjuje troškove povezane sa ekspresijom rekombinantnog proteina, naročito na inustrijskom nivou.

[0014] Ovaj pronalazak je stoga usmeren na upotrebu lutaka (hrizalisa), roda Trichoplusia, u kombinaciji sa vektorima bakulovirusa dobijenim od Autographa californica multicapsid

nucleopolyhedrovirus (AcMNPV), kako bi se proizveli rekombinantni proteini za upotrebu u dijagnostici, vakcinama i terapeutskim lečenjima. Upotreba lutaka (hrizalisa) vrste Trichoplusia ni za ekspresiju rekombinantnog proteina, naročito industrijska upotreba lutaka (hrizalisa) vrste Trichoplusia ni za ekspresiju rekombinantnog proteina još uvek nije prijavljena.

KRATAK SADRŽAJ OVOG PRONALASKA

[0015] Pronalazak na koji se ova specifikacija odnosi je utvrđen u zahtevima koji se nalaze u dodatku ovog opisa.

[0016] Ovaj pronalazak obezbeđuje lutku koja obuhvata rekombinantni bakulovirus i/ili vektor/bakmid transfera dobijen od Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus (AcMNPV).

[0017] Pored toga, ovaj pronalazak obezbeđuje lutku koja obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja omogućava ekspresiju iznad endogenih nivoa proteina IE-1, IE-0 i/ili njihovih fragmenata koji funkcionišu kao transkripcioni regulatori iznad endogenih nivoa proteina dobijenih tokom infekcije bakulovirusom i rekombinantni homologni region (hr) operativno povezan sa bilo kojim promoterom koji je pogodan za upravljanje ekspresije rekombinantnog proteina.

[0018] Pronalazak se takođe odnosi na upotrebu lutke prema ovom pronalasku za ekspresiju rekombinantnih proteina.

[0019] Dalje, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za proizvodnju najmanje jednog rekombinantnog proteina koji obuhvata faze:

(a) Dobijanje lutke;

(b) Inokulisanje lutke iz faze (a) sa rekombinantnim bakulovirusom dobijenim od Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus (AcMNPV);

(c) Inkubiranje inokulisane lutke iz faze (b) za vremenski period dovoljan za najmanje jedan rekombinantni protein koji bi trebalo da se eksprimira;

(d) Dobijanje lutaka koje obuhvataju najmanje jedan rekombinantni protein;

(e) Opciono, sakupljanje najmanje jednog rekombinantnog proteina; i

(f) Opciono, prečišćavanje najmanje jednog rekombinantnog proteina.

[0020] Pored toga, u ovom opisu je dat postupak koji može biti automatizovan kako bi se smanjilo manipulisanje za proizvodnju lutke koja ne sadrži svilu koja pripada redu Lepidoptera koji obuhvata faze:

(a) Dobijanje lutke koja se nalazi u larvi;

(b) Lečenje lutke koja se nalazi u larvi, poželjno pomoću specijalno dizajniranog uređaja, rastvorom soli hipohloraste kiseline, poželjno natrijumhipohlorita; i

(c) Dobijanje lutke koja ne sadrži svilu (i, opciono, suštinski spolja dezinfikovane).

[0021] Postupak za proizvodnju rekombinantnog bakulovirusa koji obuhvata faze:

(a) Dobijanje lutke;

(b) Transfekcija lutke iz faze (a) sa vektorom/bakmidom transfera prikladnim za proizvodnju rekombinantnog bakulovirusa dobijenog od Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus (AcMNPV);

(c) Inkubiranje inokulisane lutke iz faze (b) za vremenski period dovoljan da se proizvede rekombinantni bakulovirus;

(d) Dobijanje lutaka koje obuhvataju rekombinantni bakulovirus;

(e) Opciono, sakupljanje rekombinantnog bakulovirusa; i

(f) Opciono, prečišćavanje rekombinantnog bakulovirusa.

[0022] Ovaj opis se takođe odnosi na uređaj koji obuhvata preciznu pumpu, pokretnu mehaničku ruku i (pokretljivu) iglu/e prikladnu za ubrizgavanje tečnosti u lutku koja pripada redu Lepidoptera, poželjno rodovima Trichoplusia, Rachiplusia, Spodoptera, Heliothis, Manduca, Helicoverpa,

Ascalapha ili Samia, poželjnije rodu Trichoplusia, Rachiplusia, Spodoptera, Heliothis ili Helicoverpa, čak poželjnije vrstama Trichoplusia, ni, Rachiplusia nu, Spodoptera frugiperda, Heliothis virescens, Helicoverpa armigera, Helicoverpa Zea, Manduca sexta, Ascalapha odorata ili Sanda cynthia.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0023]

FIG.1: Masivni modul za jednokratnu upotrebu namenjen za uzgajanje T. ni insekata. Peti stadijum razvoja larvi koje rastu u modulu za uzgajanje insekata.

FIG.2: Poređenje larvi (levi deo slike) i lutaka koje ne sadrže svilu (desni deo slike) koje formiraju leptiri Bombyx mori i Trichoplusia ni Lepidoptera.

FIG.3: Poluautomatski uređaj za uklanjanje svile iz T. ni larvi. Šematski prikaz mašine koja sadrži dva suda i mehaničku ruku u kojoj je smešten modul za jednokratnu upotrebu namenjen za uzgajanje. Prvi sud sadrži hipohlorastu kiselinu i sistem za izbacivanje tečnosti kroz module za uzgajanje koji sadrže larve (pomaže u efikasnijem rastvaranju svile koja okružuje lutku). Drugi sud služi za pranje lutaka, i on prska vodu iznad hirizalisa. Na vrhu ovog suda postoji sistem koji distribuira vazduh do suvih lutaka. Na kraju postupka, lutke ne sadrže svilu i spremne su za upotrebu kod infekcije i da se čuvaju u frižideru do upotrebe.

FIG.4: Ekspresione kasete bakulovirusa koje se upotrebljavaju za proizvodnju zelenog flourescentnog proteina (GFP). A) Konvencionalna ekspresiona kaseta bakulovirusa koja koristi promoter polihedrina (npr., SEQ ID NO.: 23). B) TB ekspresiona kaseta koja obuhvata Ac-ie-01 cDNK koji kodira za transaktivatore IE1 i IE0 eksprimovane pod kontrolom promotera polihedrina; pojačivač sekvence hr1 i himerni promoter p6.9-p10 koji upravlja ekspresiju GFP (npr., SEQ ID NO.:17 i sekvenca nukleinske kiseline koja kodira GFP, npr., SEQ ID NO.: 38).

FIG.5: Automatska inokulacija lutaka T. ni tako što robot ubrizgava rekombinantni bakulovirus. A) Šematski prikaz robota za inokulaciju. B) Šematski prikaz matrice alveola gde su lutke insekata smeštene. Ove alveole koje sadrže lutke imaju perforiran gornji deo i složive su i na taj način olakšavaju transport lutaka do proizvodne laboratorije i kompatibilne su sa robotom za inokulaciju. Na istom panelu je i prava fotografija alveola koje sadrže lutke i sa gornjim delom. C) Šematski prikaz inokulacije lutaka sa iglom povezanom sa robotskom rukom.

FIG.6: Uporedna analiza prinosa ekspresije GFP proteina kod zaraženih lutaka upotrebom konvencionalnog bakulovirusa TB(-) (promoter polihedrina, npr., SEQ ID NO.: 23) ili TB-modifikovanog bakulovirusa TB(+). A) Plava Coomassie boja SDS-PAGE koja rastvara proteinske ekstrakte iz zaraženih lutaka sa TB(-) ili TB(+) bakulovirusima. (-) odgovara ekstraktu iz nezaražene kontrolne lutke. B) Kvantifikacija GFP proizvodnih prinosa dobijenih kod lutaka zaraženih svakim bakulovirusom koji je analiziran i izražen u mg po g biomase lutaka.

FIG.7: Ekspresiona kaseta bakulovirusa koja se upotrebljava da bi se proizveo kapsidni protein od svinjskog cirkovirusa tipa 2 (Cap) (npr., SEQ ID NO.: 26) ili hemaglutinin (HA) iz virusa gripa (npr., SEQ ID NO.: 30). A) Konvencionalna ekspresiona kaseta bakulovirusa koja koristi promoter polihedrina. B) TB ekspresiona kaseta koja obuhvata Ae-ie-01 cDNK koji kodira za transaktivatore IE1 i IE0 eksprimirane pod kontrolom promotera polihedrina; pojačivač sekvence hr1 i himerni promoter p6.9-p10 koji upravljaju ekspresiju gore pomenutih proteina.

FIG.8: Uporedna analiza prinosa ekspresije Cap proteina (npr., SEQ ID NO.: 26) kod zaraženih lutaka upotrebom konvencionalnog bakulovirusa TB(-) (promoter polihedrina, SEQ ID NO.: 10, SEQ ID NO.: 28) ili TB-modifikovanog bakulovirusa TB(+) (npr., SEQ ID NO.: 27 ili 29). A) Bojenje plavom Coomassie bojom SDS-PAGEektrakata rastvarajućih proteina iz zaraženih lutaka sa TB(-) ili TB(+) bakulovirusima. (-) odgovara ekstraktu iz nezaražene kontrolne lutke. B) Kvantifikacija Cap proizvodnih prinosa dobijenih kod lutaka zaraženih svakim bakulovirusom koji je analiziran, izražena u mg po g biomase lutaka.

FIG.9: Uporedna analiza prinosa ekspresije HA proteina (SEQ ID NO.: 30) kod zaraženih lutaka upotrebom konvencionalnog bakulovirusa TB(-) (promoter polihedrina, SEQ ID NO.: 10) ili TB-modifikovanog bakulovirusa TB(+) (npr., SEQ ID NO.: 31). A) Bojenje Coomassie plavom bojom SDS-PAGE ekstrakta rastvarajućeg proteina iz zaraženih lutaka sa TB(-) ili TB(+) bakulovirusima. (-) odgovara ekstraktu iz nezaražene kontrolne lutke. B) Kvantifikacija HA proizvodnih prinosa dobijenih kod lutaka zaraženih svakim bakulovirusom koji je analiziran, izražena u mg po g biomase lutaka.

FIG.10: Ekspresiona kaseta bakulovirusa koja se koristi za proizvodnju GFP, Cap (SEQ ID NO.: 26), HA (SEQ ID NO.: 30) i VP60 proteina iz virusa hemoragijske bolesti zečeva (RHDV, SEQ ID NO.:32 ili 33) kod T. ni larvi i lutaka. Šematski prikaz TB ekspresione kasete koja obuhvata Ac-ie-01 cDNK koji kodira za transaktivatore IE1 i IE0 eksprimirane pod kontrolom promotera polihedrina; pojačivač sekvence hr1 i himerni promoter p6.9-p10 koji upravljaju ekspresiju gore pomenutih proteina. FIG.11: Uporedna analiza prinosa ekspresije GFP proteina kod zaraženih lutaka i larvi. A) Bojenje Coomassie plavom bojom SDS-PAGE ekstrakta rastvarajućeg proteina iz zaraženih lutaka (P) ili zaraženih larvi (L) sa TB(+) bakulovirusom. (-) odgovara ekstraktu iz nezaražene kontrolne lutke. B) Kvantifikacija GFP proizvodnih prinosa dobijenih kod zaraženih lutaka ili larvi i izražena u mg po g biomase insekta.

FIG.12: Uporedna analiza prinosa ekspresije Cap proteina kod zaraženih lutaka i larvi. A) Bojenje Coomassie plavom bojom SDS-PAGE ekstrakta rastvarajućeg proteina iz zaraženih lutaka (P) ili zaraženih larvi (L) sa TB(+) bakulovirusom. (-) odgovara ekstraktu iz nezaražene kontrolne lutke. B) Kvantifikacija Cap proizvodnih prinosa dobijenih kod zaraženih lutaka ili larvi i izražena u mg po g biomase insekta.

FIG.13: Uporedna analiza prinosa ekspresije HA proteina kod zaraženih lutaka i larvi. A) Bojenje Coomassie plavom bojom SDS-PAGE ekstrakta rastvarajućeg proteina iz zaraženih lutaka (P) ili zaraženih larvi (L) sa TB(+) bakulovirusom. (-) odgovara ekstraktu iz nezaražene kontrolne lutke. B) Kvantifikacija HA proizvodnih prinosa dobijenih kod zaraženih lutaka ili larvi i izražena u mg po g biomase insekta.

FIG.14: Uporedna analiza prinosa ekspresije RHDV kapsidnih VP60 proteina (G1 i RHDVb) kod zaraženih lutaka i larvi. A) Bojenje Coomassie plavom bojom SDS-PAGE ekstrakta rastvarajućeg proteina iz zaraženih lutaka (P) ili zaraženih larvi (L) sa TB(+) bakulovirusom. (-) odgovara ekstraktu iz nezaražene kontrolne lutke. B) Kvantifikacija RHDV kapsidnih proteina proizvodnih prinosa dobijenih kod zaraženih lutaka ili larvi i izražena u mg po g biomase insekata (L) sa TB(+) bakulovirusom. (-) odgovara ekstraktu iz nezaražene kontrolne lutke. B) Kvantifikacija RHDV kapsidnih proteina proizvodnih prinosa dobijenih kod zaraženih lutaka ili larvi i izražena u mg po g biomase insekta.

FIG.15: VLP-ovi formirani nakon infekcije T. ni lutaka TB (+) bakulovirusom koji eksprimira VP60 protein iz RHDV G1 i RHDVb. Ekstrakti iz zaraženih lutaka u vreme optimalne proizvodnje sa svakim virusom su obrađeni za VLP prečišćavanje. Uzorci se prate elektronskim mikroskopom upotrebom negativne boje. Na crtežu su prikazani dva puta uvećani VLP-ovi. VLP-ovi dobijeni sa dva bakulovirusa predstavljaju identične veličine i oblike. Mikrografi predstavljaju analizirana područja.

FIG.16: Šematski primer postupka za dobijanje virusnog inokuluma iz zaraženih lutaka u odsustvu ćelijskih kultura insekata.

FIG.17: Šematski primer postupka uzvodne i nizvodne obrade da bi se dobio prečišćeni rekombinantni protein iz zaraženih lutaka u tri faze. A) Proizvodnja T. ni hrizalisa, njihovo rukovanje i opciono otpremanje na konačnu adresu (npr., farmaceutsku kompaniju) za proizvodnju rekombinantnog proteina. B) Čuvanje lutke, robotska inokulacija sa rekombinantnim bakulovirusom upotrebom uređaja ovog pronalaska, inkubacija i zamrznuta biomasa insekata, koje mogu da se čuvaju mesecima pre in situ obrađivanja, ili koji mogu lako da se otpreme na druge lokacije radi nastavka nizvodne obrade. C) Nizvodna obrada konvencionalnim sredstvima zamrznute biomase, uključujući homogenizaciju, tangencijalnu filtraciju protoka i prečišćavanje proteina.

FIG.18: Poređenje prinosa ekspresije Cap proteina svinjskog cirkovirusa u ćelijama insekata upotrebom konvencionalnog bakulovirusa i bakulovirusa modifikovanog od strane TopBac u ćelijama insekata i u lutkama insekata.

FIG.19: Šematski primer postupka za dobijanje virusnog inokuluma iz zaraženih lutaka.

FIG.20: Šematski primer postupka nizvodne obrade kako bi se dobio prečišćeni rekombinantni protein iz zaraženih lutaka.

DETALJAN OPIS OVOG PRONALASKA

Definicije

[0024] Kako se ovde upotrebljava, "lutka" se odnosi na životni stadijum nekih insekata kada se transformišu. Stadijum lutke je prisutan kod insekata koji prolaze kompletnu metamorfozu (holometaboluzni insekti). Ovi insekti prolaze kroz četiri životna stadijuma: embrion, larva, lutka i imago. Lutka leptira se takođe naziva hrizalisa. Insekti mogu da zaštite lutku tako što је prekrivaju larvom, koja predstavlja navlaku od svilene pređe koja štite lutku od mnogih insekata.

[0025] Kako se ovde upotrebljava, "bakulovirus" se odnosi na porodicu infektivnih virusa za beskičmenjake, kojima se uglavnom zaraze insekti i zglavkari. "Rekombinantni bakulovirus" dalje uvodi rekombinantnu DNK putem, na primer, homologne rekombinacije ili transpozicije. Rekombinantni bakulovirus može da vodi poreklo od Autographa californica multicapsid

nucleopolyhedrovirus (AcMNPV).

[0026] Kako se ovde upotrebljava, "ekspresiona kaseta" obuhvata elemente rekombinantne DNK koji su uključeni u ekspresiju određenog gena, kao što je sam gen i/ili elementi koji kontrolišu ekspresiju ovog gena (npr. promotera). Na primer, ekspresiona kaseta koja je korisna u ovom pronalasku obuhvata sledeće elemente rekombinantne DNK:

1. sekvencu nukleinske kiseline koja omogućava ekspresiju rekombinantnog proteina, kao što su rekombinantni proteini opisani u nastavku ove specifikacije, i poželjno sekvence nukleinske kiseline koje kontrolišu sopstvenu ekspresiju (najmanje promotera); i

2. sekvencu nukleinske kiseline koja omogućava ekspresiju transkripcionih regulatora bakulovirusa, kao što su IE-1 i IE-0, iznad normalnih, tj. endogenih, nivoa pomenutih regulatora koji su dobijeni tokom infekcije bakulovirusom ćelija insekta ili insekta.

[0027] Kod nekih načina izvođenja, ekspresiona kaseta dalje obuhvata pojačivač homolognog regiona (hr), kao što je hr1, operativno povezan sa promoterom pomenute sekvence koja kodira rekombinantni protein. Elementi rekombinantne DNK koji formiraju deo ekspresione kasete ovog pronalaska mogu biti prisutni u jednom molekulu nukleinske kiseline. Elementi rekombinantne DNK koji formiraju deo ekspresione kasete mogu biti prisutni u različitim molekulima nukleinske kiseline.

Poželjno, različiti molekuli nukleinske kiseline su prisutni unutar same ćelije.

[0028] Kako se ovde upotrebljava, "rekombinantna DNK" se odnosi na oblik veštačke DNK koji je konstruisan kombinovanjem ili umetanjem jednog ili više lanaca DNK, što znači takvim kombinovanjem DNK koje se normalno ne bi desilo.

[0029] Kako se ovde upotrebljava, "element rekombinantne DNK" se odnosi na funkcionalni element unutar rekombinantne DNK, kao što je promoter, pojačivač ili gen.

[0030] Kako se ovde upotrebljava, "transkripcioni regulator" se odnosi na regulatorni protein koji ima mogućnost da moduliše transkripciju specifičnih gena, na primer, vezivanjem za regione pojačivača ili represora regiona i/ili regrutovanjem dalje proteina koji su uključeni u transkripciju. IE-1 i njegova varijanta IE-0 nastala cepanjem, predstavljaju transkripcione regulatore koji su endogeno eksprimirani tokom infekcije bakulovirusom. Nivo ekspresije proteina IE-1, IE-0 i/ili njihovih fragmenata može da se

1

odredi na nivou mRNK i proteinskom nivou postupcima koji su konvencionalno poznati stručnjaku, kao što je kvantitativna PCR i Western Blot analiza.

[0031] Prema ovom pronalasku, IE-1, IE-0 i/ili njihovi fragmenati mogu biti rekombinantno eksprimirani kako bi se povećao ukupni nivo ovih proteina iznad nivoa proteina tokom infekcije bakulovirusom. Ovo može da se postigne, na primer, uvođenjem dalje kopija enodenog gena ili manipulisanjem ekspresije promotera endogenog gena. Dalje kopije endogenih gena mogu da se uvedu kao transgeni pod kontrolom prikladnog promotera kao što je polh ili pB29.

[0032] IE-1, IE-0 i njihove fragmente mogu da kodiraju nukleinske kiseline SEQ ID NO: 1 (takođe označene kao Ae-ie-01) do SEQ ID NO: 5. SEQ ID NO: 1 predstavlja Ae-ie-01 cDNK koja kodira i IE-1 i IE-0, SEQ ID NO: 2 predstavlja kodirajuću sekvencu (CDS) IE-1, a SEQ ID NO: 3 predstavlja CDS IE-0. SEQ ID NO: 4 i 5 predstavljaju CDS-ove domena N-terminala IE-1 i IE-0 koji zadržavaju katalizatorsku transkripcionu aktivnost regulatora. Proteini koje kodira SEQ ID NOs: 2-5 predstavlja SEQ ID NOs: 6-9.

[0033] Nukleinske i aminokiselinske sekvence naznačene u ovom pronalasku se razlikuju od drugih nukleinskih i aminokiselinskih sekvenci po njihovom stepenu identitičnosti ili sličnosti sekvence u odnosu na to kako su određene upotrebom EMBOSS Igle sa fabričkim parametrima (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/). Postupci za generisanje takvih varijanti uključuju nasumične ili mutageneze usmerene na mesto, mutageneze mesta-zasićenja, sklop fragmenta baziran na PCR, mešanje DNK, homolognu rekombinaciju in vitro ili in vivo, i postupke sinteze gena.

[0034] Kako se ovde upotrebljava, "varijante" predstavljaju nukelinske ili aminokiseline čije se nukleinske ili aminokiselinske sekvence razlikuju u jednoj ili više pozicija od roditeljskih nukleinskih ili aminokiselinskih kiselina, pri čemu razlike mogu predstavljati dodavanja, brisanja i/ili supstitucije ostataka nukleinskih ili aminokiselina.

[0035] Kako se ovde upotrebljava, "homologni regioni", (hr), obuhvataju ponovljene jedinice od oko 70-bp sa nesavršenim 30-bp palindromom blizu centra. Na primer, homologni regioni se ponavljaju na osam lokacija u AcMNPV genomu sa 2 do 8 ponavljanja na svakoj strani. Homologni regioni su označeni i kao transkripcioni pojačivači, kao i porekla DNK replikacije bakulovirusa.

[0036] Kako se ovde upotrebljava, "pojačivač regiona" se odnosi na kontrolnu sekvencu, čije vezivanje za transkripcione regulatore povećava nivo transkripcije pridruženih gena.

[0037] Kako se ovde upotrebljava, "rekombinantni protein" se odnosi na protein koji potiče od rekombinantne DNK. Takvi proteini mogu da se koriste radi ljudske i životinjske koristi i mogu imati industrijsku, komercijalnu ili terapeutsku primenu.

[0038] Kako se ovde upotrebljava, "operativno povezan" se odnosi na dve sekvence nukleinske kiseline koje su povezane tako da jedna utiče na drugu u smislu, na primer, transkripcione regulacije.

[0039] Kako se ovde upotrebljava, "promoter" se odnosi na sekvencu DNK za koju može da se veže RNK polimeraza kako bi došlo do transkripcije. Ta sekvenca dalje može da sadrži mesta za vezivanje za razne proteine koji regulišu transkripciju, kao što su faktori transkripcije. Sekvenca promotera može da se sastoji od različitih fragmenata promotera (ili različitih ili istih fragmenata) koji se nalaze blizu sekvence DNK i mogu se razdvojiti veznicima ili spejserom. Takvi promoteri su naznačeni kao himerni promoteri.

[0040] Kako se ovde upotrebljava, "vektor transfera" predstavlja vektor (naime molekul DNK koji se koristi kao nosač da bi se prenosio genetski materijal) koji dozvoljava umetanje genetskih informacija u genom bakulovirusa.

[0041] Kako se ovde upotrebljava, "bakmid" se odnosi na konstrukt plazmida koji sadrži sekvecnu DNK koja je dovoljna za generisanje bakulovirusa kada se transfektuje u ćeliju ili insekt.

[0042] Kako se ovde upotrebljava, "vektor kloniranja" se odnosi na bilo koji vektor koji je prikladan za kloniranje, koji generalno uključuje prisustvo restriktivnih mesta, poreklo replikacije za bakterijsku propagaciju i odabirljivi marker.

[0043] Vektor kloniranja koji može da se koristi u kontekstu ovog pronalaska poželjno dodatno sadrži (i) sekvencu za ekspresiju iznad nivoa proteina IE-0, IE-1 i/ili njihovih fragmenata, (ii) rekombinantni homologni region (hr) povezan sa (iii) prikladnim promoterom koji upravlja ekspresiju rekombinantnog proteina. Na primer, vektor kloniranja može da obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja kodira rekombinantni protein (takođe označen kao "vektor donora", naime vektor kloniranja koji obuhvata ekspresionu kasetu). Alternativno, vektoru kloniranja nedostaje takva sekvenca.

[0044] Kako se ovde upotrebljava, "vakcina" može biti definisana kao biološki preparat, poželjno koji obuhvata rekombinantni protein koji obezbeđuje aktivni stečeni imunitet na određenu bolest.

[0045] Kako se ovde upotrebljava, pojam "oko" označava naznačenu vrednost ± 1 % njegove vrednosti, ili pojam "oko" označava naznačenu vrednost ± 2% njegove vrednosti, ili pojam "oko" označava naznačenu vrednost ± 5% njegove vrednosti, pojam "oko" označava naznačenu vrednost ± 10% njegove vrednosti, ili pojam "oko" označava naznačenu vrednost ± 20% njegove vrednosti, ili pojam "oko" označava naznačenu vrednost ± 30% njegove vrednosti; poželjno pojam "oko" označava tačno naznačenu vrednost (± 0%).

Detaljan opis

[0046] Ovaj opis obezbeđuje lutku koja obuhvata rekombinantni bakulovirus i/ili vektor transfera/bakmid. Ovaj opis iznenađujuće pokazuje da uvođenje rekombinantnih bakulovirusa u lutke insekata, a naročito sekvenci koje izazivaju ekspresiju transkripcionih regulatora bakulovirusa iznad nivoa proteina i opciono uvođenje sekvence pojačivača homolognog regiona (hr), promotera ili kombinacije promotera, može da poveće proizvodnju rekombinantnog proteina do do tada neviđenih nivoa. Ovo ukazuje na korist ovog sistema za ekspresiju rekombinantnih proteina in vivo, naročito za industrijsku proizvodnju rekombinantnih proteina in vivo.

[0047] Ovaj opis obezbeđuje lutku koja obuhvata rekombinantni bakulovirus i/ili vektor transfera i/ili bakmid. Rekombinantni bakulovirus i/ili vektor transfera i/ili bakmid je poželjno dobijen od Autographa californica multicapsid micleopolyhedrovirus (AcMNPV). Poželjno, lutka pripada

redu Lepidoptera, poželjno rodu Trichoplusia, Rachiplusia, Spodoptera, Heliothis, Manduca, Helicoverpa, Ascalapha ili Samia, poželjno rodu Trichoplusia, Rachiplusia, Spodoptera, Heliothis ili Helicoverpa, poželjnije vrsti Trichoplusia ni, Rachiplusia nu, Spodoptera frugiperda, Heliothis virescens, Helicoverpa armigera, Helicoverpa Zea, Manduca sexta, Ascalapha odorata ili Samia cynthia. Čak poželjnije, lutka pripada vrsti Trichoplusia ni. U poželjnom aspektu, lutka prema ovom opisu ne pripada vrsti Bombyx mori. U poželjnom aspektu, lutka prema ovom opisu ne pripada vrsti Hyalophora cecropia.

[0048] Lutka prema ovom pronalasku predstavlja lutku koja pripada rodovima Trichoplusia, poželjno vrsti Trichoplusia ni, koja obuhvata rekombinantni bakulovirus i/ili vektor transfera/bakmid dobijen od Autographa californica multicapsid micleopolyhedrovirus (AcMNPV).

[0049] Lutke prema ovom pronalasku, i određenije lutke T. ni, nude nekoliko prednosti za ekspresiju rekombinantnih proteina, određenije u automatizovanim i procesima sa mogućnošću prenosa na drugi proizvodni nivo. Na primer, par moljca T. ni može da dâ oko 1.000 jaja po ciklusu. Pored toga, larva koju proizvode T. ni lutke nije tako tvrda kao larva koja pokriva lutke drugih vrsta (kao što je, na primer, Bombyx mori ili Hyalophora cecropia), koja čini lutke T. ni posebno pogodnim za njihovu upotrebu u automatizovanim i postupcima proizvodnje koju je moguće preneti na drugi nivo (industrijska proizvodnja rekombinantnih proteina). S tim u vezi, lutke T. ni zaražene rekombinantnim bakulovirusom i/ili vektorom transfera i/ili bakmidom poželjno dobijenim od Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) obezbeđuju efikasan, i lako automatizovani sistem za proizvodnju rekombinantnih proteina sa mogućnošću prenosa na drugi proizvodni nivo. Dalje prednosti ovog sistema su njegova visoka produktivnost (do 20 puta je produktivniji od bioloških reaktora), činjenica da je tehnički jednostavan, lak za primenu i validaciju, njegovi smanjeni troškovi (> 90% smanjenje kod fiksnih investicija u pogledu upotrebe bioloških reaktora), niži trošak robe, kratko vreme razvoja (sistem bakulovirusa), njegova velika efikasnost kod proteina koji su teški za proizvodnju, i visoki kvalitet i bezbednost proizvedenih proizvoda.

[0050] Istraživači ove prijave su iznenađujuće pronašli da je ekspresija rekombinantnih proteina kod lutaka, naročito kod lutaka koje pripadaju redu Lepidoptera, poželjno rodu Trichoplusia, Rachiplusia, Spodoptera, Heliothis, Manduca, Helicoverpa, Ascalapha ili Samia, poželjno rodu Trichoplusia, Rachiplusia, Spodoptera, Heliothis ili Helicoverpa, poželjnije vrsti Trichoplusia ni, Rachiplusia nu, Spodoptera frugiperda, Heliothis virescens, Helicoverpa armigera, Helicoverpa Zea, Manduca sexta, Ascalapha odorata ili Samia Cynthia, uporediva čak i viša nego kod ekspresije u larvama.

[0051] Patentna prijava objavljena kao WO 2012/168492 daje opis rekombinantnog bakulovirusa i vektora transfera i bakmida koje može da obuhvata lutka prema ovom pronalasku.

[0052] Rekombinantni bakulovirus i/ili vektor transfera i/ili bakmid koji obuhvata lutka prema ovom pronalasku može poželjno da obuhvati rekombinantnu DNK. Na primer, rekombinantni bakulovirus i/ili vektor transfera i/ili bakmid koje obuhvata lutka prema ovom pronalasku obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja kodira rekombinantni protein, pri čemu rekombinantni protein je poželjno odabran iz

1

grupe koju čine podjedinična jednostruka vakcina, podjedinična višestruka vakcina, čestica poput virusa, terapeutski protein, antitelo, enzim, citokin, faktor zgrušavanja krvi, antikoagulans, receptor, hormon, dijagnostički proteinski reagensi i zeleni fluorescentni protein (GFP), i/ili pri čemu rekombinantni protein poželjno ne predstavlja protein koji lutke endogeno proizvode, što će biti opisano u nastavku. Na primer, rekombinantni bakulovirus i/ili vektor transfera i/ili bakmid koji obuhvata lutka prema ovom pronalasku obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja omogućava ekspresiju iznad nivoa proteina IE-1, IE-0 i/ili njihovih fragmenata koji funkcionišu kao transkripcioni regulatori iznad nivoa proteina dobijenih tokom infekcije bakulovirusom (na primer, ekspresija iznad nivoa proteina se može dobiti prisustvom, u rekombinantnom virusu, dodatne kopije sekvence nukleinske kiseline koja omogućava ekspresiju proteina IE-1, IE-0 i/ili njihovih fragmenata). Poželjno, rekombinantni bakulovirus i/ili vektor transfera i/ili bakmid koji obuhvata lutka prema ovom pronalasku dalje obuhvata rekombinantni homologni region (hr) operativno povezan sa bilo kojim promoterom prikladnim za upravljane ekspresije rekombinantnog proteina.

[0053] Vektor transfera koji može da obuhvati lutku ovog pronalaska poželjno dodatno sadrži (i) sekvencu za ekspresiju iznad nivoa proteina IE-0, IE-1 i/ili njihovih fragmenata, (ii) rekombinantni homologni region (hr) povezan sa (iii) prikladnim promoterom za upravljanje ekspresije rekombinantnog proteina. U jednom poželjnom aspektu, vektor transfera obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja kodira pomenuti rekombinantni protein, dok u drugom poželjnom načinu ostvarivanja, vektoru transfera nedostaje takva sekvenca. U poželjnom načinu ostvarivanja, vektor transfera je bakmid.

[0054] Vektor transfera i/ili bakmid može biti dobijen od bilo kog komercijalno dostupnog sistema za ekspresiju bakulovirusa "Bac-to-Bac®" (invitrogen™), "BacPAK™" (Clontech™), "FlashBAC™" (Oxford Expression Technologies™), "BacuVance™" (GenScript™), "Bac-N-BlueDNK™" (invitrogen™), "BaculoDirect™" (invitrogen™), "BacVector®" 1000, 2000, 3000 (Novagen®), "DiamondBac™" (Sigma-Aldrich®) ili "BaculoGold™" (BD biosciences™).

[0055] Lutka prema ovom opisu (koja poželjno pripada redu Lepidoptera, poželjno rodu Trichoplusia, Rachiplusia, Spodoptera, Heliothis, Manduca, Helicoverpa, Ascalapha ili Samia, poželjno

rodu Trichoplusia, Rachiplusia, Spodoptera, Heliothis ili Helicoverpa, poželjnije vrsti Trichoplusia ni, Rachiplusia nu, Spodoptera frugiperda, Heliothis virescens, Helicoverpa armigera, Helicoverpa Zea, Manduca sexta, Ascatapha odorata ili Samia cynthia, ili bilo koji drugi leptir Lepidoptera osetljiv na AcMNPV infekciju, čak poželjnije rodu Trichoplusia i vrsti Trichoplusia ni) može da obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja omogućava ekspresiju iznad nivoa proteina IE-1, IE-0 i/ili njihovih fragmenata koji funkcionišu kao transkripcioni regulatori iznad nivoa proteina dobijenih tokom infekcije bakulovirusom. Gore opisani elementi rekombinantne DNK se poželjno uvode u lutku putem rekombinantnog bakulovirusa.

[0056] Sekvenca nukleinske kiseline koja omogućava ekspresiju proteina IE-1, IE-0 i/ili njihovih fragmenata koji funkcionišu kao transkripcioni regulatori iznad nivoa proteina dobijenih tokom infekcije bakulovirusom prema ovom pronalasku je poželjno odabrana iz grupe koju čine:

(a) nukleinska kiselina koja sadrži nukleotidnu sekvencu naznačenu u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 1-5; (b) sekvenca nukleinske kiseline koja je najmanje 70% identična, poželjno najmanje 75%, poželjnije najmanje 80%, poželjnije najmanje 85%, poželjnije najmanje 90% i najpoželjnije najmanje 95% sa nukleotidnom sekvencom naznačenom u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 1-5 i koja kodira protein koji može da funkcioniše kao transkripcioni regulator u rekombinantnom bakulovirusu;

(c) sekvenca nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu naznačenu u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 6-9; i

(d) sekvenca nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70% slična, poželjno najmanje 75%, poželjnije najmanje 80%, poželjnije najmanje 85%, poželjnije najmanje 90% i najpoželjnije najmanje 95% sa aminokiselinskom sekvencom naznačenom u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 6-9 i koja može da funkcioniše kao transkripcioni regulator u rekombinantnom bakulovirusu.

[0057] Sekvenca varijanti SEQ ID NOs: 1-5 je najmanje 70%, poželjno najmanje 75%, poželjnije najmanje 80%, poželjnije najmanje 85%, poželjnije najmanje 90% i najpoželjnije najmanje 95% identična sekvencama SEQ ID NOs: 1-5.

[0058] Sekvenca varijante SEQ ID NOs: 6-9 je najmanje 70%, poželjno najmanje 75%, poželjnije najmanje 80%, poželjnije najmanje 85%, poželjnije najmanje 90% i najpoželjnije najmanje 95% slična sekvencama SEQ ID NOs: 6-9.

[0059] Lutka prema ovom pronalasku dalje može da obuhvati sekvencu nukleinske kiseline i/ili rekombinantni bakulovirus i/ili vektor transfera i/ili bakmid koji dalje obuhvata rekombinantni homologni region (hr) operativno povezan sa bilo kojim promoterom koji je pogodan za upravljanje ekspresije rekombinantnog proteina.

[0060] Rekombinantni homologni region (hr) predstavlja poželjno sekvencu naznačenu u SEQ ID NO: 21 (hr1).

[0061] Promoter koji upravlja ekspresiju pomenutog rekombinantnog proteina je poželjno odabran iz grupe nukleinskih kiselina koja obuhvata:

(a) nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu naznačenu u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 10-14, poželjno naznačenu u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 11-13; i

(b) sekvencu nukleinske kiseline koja može da funkcioniše kao promoter u rekombinantnom bakulovirusu i koja je najmanje 70% identična, poželjno najmanje 75%, poželjnije najmanje 80%, poželjnije najmanje 85%, poželjnije najmanje 90% i najpoželjnije najmanje 95% sa nukleotidnom sekvencom naznačenom u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 10-14, poželjno naznačenom u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 11-13.

[0062] U poželjnom načinu ostvarivanja, sekvenca nukleinske kiseline koja obuhvata kombinacije rekombinantnih promotera, sekvence koje kodiraju transkripcione regulatore i pojačivači regiona

1

(sekvence nukleinske kiseline koje obuhvataju lutku prema ovom pronalasku) su odabrani iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 15-20.

[0063] Rekombinantni promoteri, sekvence koje kodiraju transkripcione regulatore i pojačivači regiona ovog pronalaska ne moraju da formiraju deo, jednog molekula, umesto toga, ove sekvence mogu da formiraju deo različitih molekula sve dok su operativno povezane, tj. dok su unutar istih ćelija unutar lutke.

[0064] Lutka prema ovom pronalasku i/ili rekombinantni bakulovirus i/ili vektor transfera i/ili bakmid dalje mogu da obuhvate sekvencu nukleinske kiseline koja kodira rekombinantni protein. Ova sekvenca nukleinske kiseline je poželjno operativno povezana sa sekvencom nukleinske kiseline koja omogućava ekspresiju iznad nivoa proteina IE-1, IE-0 i/ili njihovih fragmenata, i opciono sa homologni region (hr), pri čemu su ove sekvence opisane iznad.

[0065] Poželjno, rekombinantni protein odabran iz grupe koju čine podjedinična jednostruka vakcina, podjedinična višestruka vakcina, čestica poput virusa, terapeutski protein, antitelo, enzim, citokin, faktor zgrušavanja krvi, antikoagulans, receptor, hormon, dijagnostički proteinski reagensi i zeleni fluorescentni protein (GFP).

[0066] U poželjnom načinu ostvarivanja, rekombinantni protein predstavlja česticu proteina poput virusa, koji je poželjno odabran iz grupe koju čine:

(a) Kapsidni protein svinjskog cikrovirusa, poželjno od svinjskog cirkovirusa tipa 2 (npr., SEQ ID NO.: 26),

(b) VP1, VP3 ili VP0 protein virusa bolesti stopala i usta,

(c) VP1 i VP2 proteini psećeg pravovirusa,

(d) VP1 i VP2 proteini svinjskog parvovirusa,

(e) Kapsidni protein humanog norovirusa (genogrupa I ili II),

(f) Kapsidni protein kalcivirusa,

(g) L1 protein humanog papiloma virusa, poželjno od humanog papiloma virusa 16,

(h) Protein E2 hepatitisa E,

(i) VP1, VP2 i VP3 proteini virusa infektivne burzalne bolesti,

(j) ORF2-kodirani proteini astrovirusa,

(k) NA i M1 proteini, virus gripa HA (npr., SEQ ID NO.: 30),

(l) Antigeni jezgra i površine hepatitisa B,

(m) VP60 protein zečjeg kalcivirusa, poželjno od virusa hemoragijske bolesti zečeva RHDVb i RHDVG1 (npr., SEQ ID NOs.: 32 i 33).

(n) VP1 i VP2 proteini humanog parvovirusa

[0067] Na primer, rekombinantni protein može biti:

1

Kapsidni protein svinjskog cikrovirusa, poželjno od svinjskog cirkovirusa tipa 2, koji je, na primer, prikazan aminokiselinskom sekvencom od SEQ ID NO: 26 ili kog kodira sekvenca nukleinske kiseline od SEQ ID NO: 25.

VP1, VP3 i VP0 protein virusa bolesti stopala i usta (FMDV), pri čemu je njegova sekvenca naznačena ili se može dobiti, na primer od sledećih sekvenci:

- Kompletni genom serotipa O FMDV: GenBank JX570650.1

- Kompletni genom serotipa A FMDV: GenBank HQ832592.1

- Kompletni genom serotipa C FMDV: GenBank AY593810.1

- Kompletni genom serotipa SAT 1 FMDV: GenBank AY593846.1

- Kompletni genom serotipa SAT 2 FMDV: GenBank JX014256.1

- Kompletni genom serotipa ASIA 1 FMDV: GenBank HQ631363.1.

VP1 i VP2 protein psećeg pravovirusa, čija je sekvenca naznačena ili može da se dobije, na primer, iz sledećih sekvenci:

- VP1 gen psećeg pravovirusa za kapsidni protein VP1, delimična cds, lanac: 1887/f/3. GenBank: AB437434.1.

- VP1 gen psećeg pravovirusa za kapsidni protein VP1, delimična cds, lanac: 1887/M/2. GenBank: AB437433.1.

- VP2 gen psećeg pravovirusa, kompletna cds, lanac: HNI-2-13. GenBank: AB120724.1.

- VP2 gen psećeg pravovirusa, kompletna cds, lanac: HNI-3-4. GenBank: AB120725.1.

- VP2 gen psećeg pravovirusa, kompletna cds, lanac: HNI-3-11, GenBank: AB 120726.1.

- VP2 gen psećeg pravovirusa, kompletna cds, lanac: HNI-4-1. GenBank: AB120727.1.

- VP2 gen psećeg pravovirusa, kompletna cds, lanac: HNI-1-18. GenBank: AB120728.1.

- (VP2) gen VP2 proteina psećeg pravovirusa, kompletna cds. GenBank: DQ354068.1.

- VP2 gen psećeg pravovirusa, kompletna cds, lanac: HCM-6. GenBank: AB120720.1.

- Taichung VP2 gen izolata psećeg pravovirusa, kompletna cds. GenBank: AY869724.1.

- VP2 gen psećeg pravovirusa, kompletna cds, lanac: HCM-8. GenBank: AB120721.1.

- Proteini VP1 i VP2 psećeg pravovirusa tipa 1: GenBank AB518883.1

- VP1 i VP2 psećeg pravovirusa tipa 2a. GenBank: M24003.1

- VP2 psećeg pravovirusa tipa 2b: GenBank FJ005265.1

- VP2 psećeg pravovirusa tipa 2C: GenBank FJ005248.1

VP1 i VP2 protein svinjskog parvovirusa, čija je sekvenca naznačena ili može da se dobije, na primer, iz sledećih sekvenci:

- Svinjski parvovirus, lanac 693a. GenBank: JN400519.1

- Svinjski parvovirus, lanac 8a. GenBank: JN400517.1

VP1 i VP2 protein humanog pravovirusa, čija je sekvenca naznačena ili može da se dobije, na primer, iz sledećih sekvenci:

1

- Humani B19 parvovirus, VP1, kompletna cds. GenBank: AF264149.1

- Izolat humanog B19 parvovirusa, Vn115 NS1 (NS1), 7.5 kDa protein (NS1), VP1 (VP1), 9.5 kDa protein (VP1), i VP2 (VP2) gena, kompletna cds. GenBank: DQ357065.1

- Izolat B19 virusa FoBe VP1 (VP1) i VP2 (VP2) gena, kompletna cds. GenBank: AY768535.1 - Izolat B19 virusa Br543 NS1 (NS1), VP1 (VP1), i VP2 (VP2) gena, kompletna cds. GenBank:

AY647977.1

- Izolat humanog 4 pravovirusa VES065CSF NS1, VP1, i VP2 gena, kompletna cds. GenBank:

HQ593532.1

- Izolat humanog 4 pravovirusa VES085CSF NS1 gena, delimična cds; i VP1 i VP2 gena, kompletna cds. GenBank: HQ593531.1

- Lanac humanog B19 pravovirusa BB-2 NS1, VP1, i VP2 gena, kompletna cds. GenBank:

KF724387.1

Kapsidni protein humanog norovirusa (genogrupa I ili II), čija je sekvenca naznačena ili može da se dobije, na primer, iz sledećih sekvenci:

- Norwalk virus: GenBank M87661, NP056821

- Southampton virus: GenBank L07418

- Mexico virus: GenBank U22498

- Seto virus: GenBank AB031013

- Chiba virus: GenBank AB042808

- Lordsdale virus: GenBank X86557

- Snow Mountain virus: GenBank U70059

- Hawaii virus: GenBank U07611

VP60 protein virusa hemoragijske bolesti zečeva, čija je sekvenca naznačena ili može da se dobije, na primer, iz sledeće sekvence:

- RHDV AST/89 kompletni genom: GenBank: Z49271.2

- RHDV N11 kompletni genom: GenBank: KM878681.1

- RHDV CBVal16 kompletni genom; GenBank: KM979445.1

- SEQ ID NO.: 32

- SEQ ID NO.: 33

L1 protein humanog papiloma virusa, čija je sekvenca naznačena ili može da se dobije, na primer, iz sledećih sekvenci:

- HPV 6: GenBank: JN252323.1

- HPV 11: GenBank : JQ773411.1

- HPV 16: GenBank DQ155283.1

- HPV 18: GenBank FJ528600.1

1

E2 protein virusa hepatitisa E, čija je sekvenca naznačena ili može da se dobije, na primer, iz sledećih sekvenci:

- Virus hepatitisa E, kompletni genom NCBI referentna sekvenca: NC_001434.1

- Gen ITFAEll kapsidnog proteina izolata virusa svinjskog hepatitisa E . GenBank: JN861806.1 VP1, VP2 i VP3 proteini virusa infektivne burzalne bolesti, čija je sekvenca naznačena ili može da se dobije, na primer, iz sledećih sekvenci:

- Infektivna burzalna bolest, virus VP1 (VP1) gena, kompletna cds. GenBank: AY099457.1 - Infektivna burzalna bolest, izolat virusa PT VP1 gena, kompletna cds. GenBank: DQ679814.1 - Infektivna burzalna bolest, izolat virusa OE/G2 VP1 gena, kompletna cds. GenBank: DQ679813.1 - Infektivna burzalna bolest, izolat virusa OA/G1 VP1 gena, kompletna cds. GenBank: DQ679812.1 - Infektivna burzalna bolest, izolat virusa HOL VP1 gena, kompletna cds. GenBank: DQ679811.1 - Infektivna burzalna bolest, virus, lanac TL2004 VP1 gena, kompletna cds. GenBank: DQ118374.1 - Infektivna burzalna bolest, izolat virusa CA-K785 VP1 gena, kompletna cds. GenBank: JF907705.1 - Infektivna burzalna bolest, izolat virusa D495 VP1 gena, kompletna cds. GenBank: JF907704.1 - Infektivna burzalna bolest, virus, lanac A-BH83 VP1 mRNK, kompletna cds. GenBank:

EU544149.1

- Infektivna burzalna bolest, virus lanac Cro-Pa/98 VP1 gena, kompletna cds. GenBank:

EU184690.1

- Infektivna burzalna bolest, virus VP2 mRNK, kompletna cds. GenBank: AY321509.1

- Infektivna burzalna bolest, virus VP2, VP3, VP4 gena, kompletna cds. GenBank: M97346.1 - Infektivna burzalna bolest, virus VP2 gena, kompletna cds. GenBank: AF508177.1 Kapsidni protein kalcivirusa, čija je sekvenca naznačena ili može da se dobije, na primer, iz sledećih sekvenci:

- Gen kapsidnog proteina mačjeg kalcivirusa, kompletna cds. GenBank: L09719.1

- Gen kapsidnog proteina mačjeg kalcivirusa, kompletna cds. GenBank: L09718.1

- Humani kalicivirus HU/NLV/Wortley/90/UK RNK za kapsidni protein (ORF2), lanac HU/NLV/Wortley/90/UK. GenBank: AJ277618.1

- Humani kalcivirus HU/NLV/Thistlehall/90/UK RNK za kapsidni protein (ORF2), lanac HU/NLV/Thistlehall/90/UK. GenBank: AJ277621.1

- Humani kalcivirus HU/NLV/Valetta/95/Malta RNK za kapsidni protein (ORF2), lanac HU/NLV/Valetta/95/Malta. GenBank: AJ277616.1

- Gen kapsidnog proteina humanog kalcivirusa NLV/Stav/95/Nor, kompletna cds. GenBank: AF145709.1

- Gen kapsidnog proteina goveđegcrevni kalcivirusa, lanac Bo/CV500-OH/2002/US, kompletna cds. GenBank: AY549155.1

1

- Gen kapsidnog proteina humanog kalcivirusa NLV/Mora/97/SE, kompletna cds. GenBank: AY081134.1

- Gen kapsidnog proteina humanog kalcivirusa NLV/Potsdam 196/2000/DE, kompletna cds. GenBank: AF439267.1

- Gen kapsidnog proteina humanog kalcivirusa NLV/1581-01/SWE, kompletna cds. GenBank: AY247442.1

- Gen kapsidnog proteina humanog kalcivirusa Hu/NLV/GII/MD134-10/1987/US, kompletna cds. GenBank: AY030313.1

ORF2-kodirani proteini astrovirusa, čija je sekvenca naznačena ili može da se dobije, na primer, iz sledećih sekvenci:

- Svinjski astrovirus 4, ORF1b gen, delimična cds; i ORF2 gen, kompletna cds. GenBank:

JX684071.1

- Astrovirus MLB1, HK05kompletni genom. NCBI Referentna sekvenca: NC_014320.1

- Astrovirus divljeg vepra/WBAstV-1/2011/HUN, kompletni genom. NCBI referentna sekvenca: NC_016896.1

- Humani astrovirus BF34, kompletni genom. NCBI referentna sekvenca: NC_024472.1

- Astrovirus MLB1 lanac Hu/ITA/2007/PR326/MLB1 RNK-zavisna RNK polimeraza (ORF1b) gen, delimična cds; I gen kapsidnog proteina (ORF2), kompletna cds. GenBank: KF417713.1 - Humani astrovirus 5 lanac Hu/Budapest/HUN5186/2012/HUN geni nestrukturnog proteina (ORF1a) i nestrukturnog proteina (ORF1b), delimična cds; i gen kapsidnog proteina (ORF2), kompletna cds. GenBank: KF157967.1.

- Izolat humanog astrovirusa 1, gen Shanghai kapsidnog proteina (ORF2), kompletna cds.

GenBank: FJ792842.1

- Humani astrovirus tipa 8 orf2 gena za kapsidni protein. GenBank: Z66541.1

HA, NA i M1 proteini virusa gripa, čija je sekvenca naznačena ili može da se dobije, na primer, iz sledećih sekvenci:

- SEQ ID NO.: 30

- Virusa gripa A (A/patka/Chiba/25-51-14/2013(H7N1)) HA gen za hemaglutinin, kompletna cds. GenBank: AB813060.1

- Sintetički konstrukt hemaglutinina (HA) mRNK, kompletna cds. GenBank: DQ868374.1

- Virus gripa A (A/svinja/Shandong/2/03(H5N1)) gen hemaglutinina (HA), kompletna cds.

GenBank: AY646424.1

- cDNK koja kodira HA gripa tipa A. GenBank: E01133.1

- Virus gripa A (A/svinja/Korea/S452/2004(H9N2)) NA gen, kompletna cds. GenBank: AY790307.1 - Virus gripa A (A/Thailand/2(SP-33)/2004(H5N1)) neuraminidaza (NA) gen, kompletna cds. GenBank: AY555152.3

2

- Virus gripa A (A/svinja/Binh Doung/02-16/2010(H1N2)) NA gen za neuraminidaze, kompletna cds. GenBank: AB628082.1

- Virus gripa A (A/pile/Jalgaon/8824/2006(H5N1)) neuraminidaza (NA) gen, kompletna cds.

GenBank: DQ887063.1

- Virus gripa A SC35M M2 i M1 geni, kompletna cds. GenBank: DQ266100.1

- Virus gripa tipa /Leningrad/134/47/57 (H2N2) M1 i M2 RNK, kompletna od cds-a. GenBank: M81582.1

- Virus gripa A SC35M M2 i M1 geni, kompletna cds. GenBank: DQ266100.1

- Virus gripa A (A/Tochigi/2/2010(H1N1)) M2, M1 geni za matricu proteina 2, matricu proteina 1, kompletna cds. GenBank: AB704481.1

● Antigeni jezgra i površine hepatitisa B, čija je sekvenca naznačena ili može da se dobije, na primer, iz sledećih sekvenci:

- Virus hepatitisa B, lanac HBV248 geni predjezgra i jezgra proteina, kompletna cds. GenBank: KP857118.1

- Virus hepatitisa B, lanac HBV401 geni predjezgra i jezgra proteina, kompletna cds. GenBank: KP857113.1

- Virus hepatitisa B, lanac HBV403 geni predjezgra i jezgra proteina, kompletna cds. GenBank: KP857068.1

- Virus hepatitisa B, S gen za antigen površine hepatitisa B, delimična cds, izolat: B0503327(PTK). GenBank: AB466596.1

[0068] Poželjno, rekombinantni protein nije protein koji lutke endogeno proizvode. Na primer, rekombinantni protein nije protein koji lutke endogeno proizvode kao što su lutke vrste Hyalophora cecropia. Na primer, rekombinantni protein nije cekropin A ili atacin.

[0069] Lutka prema ovom pronalasku može biti lutka koja ne sadrži svilu, ili može biti unutar svilene larve. Ukoliko lutka nije lutka koja ne sadrži svilu, stručnjak je svestan postupaka uklanjanja svile iz larve. Na primer, svila iz larve može da se rastvori, poželjno rastvorom soli, poželjno soli hipohloraste kiseline (HClO), poželjno natrijumhipohlorita (NaClO) (koji je u ovom opisu takođe označen kao "rastvor za rastvaranje"). Postupak može da se automatizuje pomoću specifično dizajniranog uređaja, kako je prikazano na FIG.3.

Upotreba lutke prema ovom pronalasku za ekspresiju rekombinantnih proteina

[0070] Lutka prema ovom pronalasku, u bilo kojoj svojoj varijanti, može da se koristi za ekspresiju rekombinantnih proteina. S tim u vezi, ovaj pronalazak obezbeđuje upotrebu lutaka ovog pronalaska za ekspresiju rekombinantnih proteina, poželjno rekombinantnih proteina detaljno opisanih u ovoj specifikaciji.

Postupci za proizvodnju rekombinantnih proteina ovog pronalaska

[0071] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje postupke za proizvodnju rekombinantnih proteina (koji, kako je već gore opisano, poželjno ne predstavljaju proteine koje endogeno proizvode lutke). Na primer, postupak za obezbeđivanje najmanje jednog rekombinantnog proteina prema ovom pronalasku obuhvata, ili, alternativno, sastoji se od, sledećih faza:

(a) Dobijanje lutke;

(b) Inokulisanje lutke iz faze (a) sa rekombinantnim bakulovirusom dobijenim od Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus (AcMNPV);

(c) Inkubiranje inokulisane lutke iz faze (b) za vremenski period dovoljan za najmanje jedan rekombinantni protein koji bi trebalo da se eksprimira;

(d) Dobijanje lutaka koje obuhvataju najmanje jedan rekombinantni protein;

(e) Opciono, sakupljanje najmanje jednog rekombinantnog proteina; i

(f) Opciono, prečišćavanje najmanje jednog rekombinantnog proteina.

[0072] Lutka iz faze (a) iz gore navedenog postupka utoliko budući da se ovaj pronalazak bavi lutkom prema ovom pronalasku, kako je gore detaljno opisano. Lutka iz faze (a) generalno poželjnije pripada redu Lepidoptera, poželjno, lutka pripada redu Lepidoptera, poželjno rodu Trichoplusia, Rachiplusia, Spodoptera, Heliothis, Manduca, Helicoverpa, Ascalapha ili Samia, poželjno rodu Trichoplusia, Rachiplusia, Spodoptera, Heliothis ili Helicoverpa, poželjnije vrsti Trichoplusia ni, Rachiplusia nu, Spodoptera frugiperda, Heliothis virescens, Helicoverpa armigera, Helicoverpa Zea, Manduca sexta, Ascalapha odorata ili Samia cynthia, čak poželjnije vrsti Trichoplusia ni. Kako je gore već opisano, lutka može da obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja omogućava ekspresiju rekombinantnog proteina. Kako je gore već opisano, lutka može da obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja omogućava ekspresiju iznad nivoa proteina IE-1, IE-0 i/ili njihovih fragmenata koji funkcionišu kao transkripcioni regulatori iznad nivoa proteina dobijenih tokom infekcije bakulovirusom.

[0073] Lutka iz faze (a) gore može da se razvije iz jajeta. Na primer, lutka iz faze a) gore može da se razvije iz jajeta u lutku za 15-18 dana, npr., u posebno dizajniranim kutijama za jednokratnu upotrebu namenjenim za uzgajanje. Lutka iz faze a) takođe može već da bude u obliku lutke.

[0074] Ukoliko je lutka iz faze (a) gore unutar larve, postupak za proizvodnju rekombinantnih proteina ovog pronalaska dalje može da obuhvati fazu uklanjanja svile larve iz lutke. Na primer, svila iz lutke može da se rastvori, poželjno rastvorom soli koji poželjno obuhvata hipohlorastu kiselinu (HClO), poželjno natrijumhipohlorita (NaClO), na primer u koncentracijama od 0.1 do 5 mas.%, kao što je 0.1, 0.2, 0.5, 1, 3 ili 5 mas.%. Na primer, lutke mogu da se urone u, ili da se prskaju rastvorom natrijumhipohlorita u koncentraciji od 0.1 do mas.5%. Rastvaranje svile iz larve može da traje od nekoliko sekundi do nekoliko minuta. Uklanjanje svile larve iz lutke iz faze (a), kada je lutka unutar larve, se poželjno izvodi u poluautomatskom ili automatskom obliku (robotizovano uklanjanje svile). U ovom smislu, činjenica da larva nekih vrsta kao što je Hyalophora cecropia ili Bombyx mori predstavlja tvrdu larvu je mana u odnosu na druge rodove ili vrste (kao što je rod Trichoplusia, naročito vrsta Trichoplusia ni). Lutke vrste Trichoplusia, naročito vrste Trichoplusia ni, imaju larvu koja sadrži svilu manje tvrdoće, i može lako da se rastvori. Ovo predstavlja prednost, budući da se ceo postupak izvodi u automatskom ili poluautomatskom obliku, povećanjem efikasnosti i smanjenjem celokupnih troškova.

[0075] Larva može biti uklonjena u poluautomatskoj mašini koja može da obuhvati primaoca sa rastvorom za rastvaranje koji bi trebalo primeniti na larvu, poželjno sa vazdušnim turbulencijama pod pritiskom, kako bi se smanjilo vreme koje je potrebno za rastvaranje svilene larve. Lutke koje ne sadrže svilu mogu zatim da budu oprane u posudi za pranje kako bi se uklonili tragovi rastvora za rastvaranje, a zatim se suše na vazduhu.

[0076] U skladu sa tim, lutke koja ne sadrže svilu su poželjne, pošto je onda, fazu (b) lakše izvesti. U skladu sa tim, lutke sa veoma gustom larvom su manje poželjne. Na primer, lutke Bombyx mori imaju veoma tvrdu, čvrstu i kompaktnu larvu, koja ne može lako da se ukloni rastvaranjem upotebom rastvora soli za nekoliko minuta, kako je gore opisano. Isto važi i za lutke Hyalophora cecropia. Larvu Bombyx mori i/ili lutke Hyalophora cecropi bi trebalo ukloniti ručno.

[0077] Nasuprot njih, lutke druge vrste kao što je T. ni obuhvataju larvu čija je svila manje tvrda, i mogu lako da se rastvore kao što je opisano gore. Ove lutke su samim tim poželjne za postupak proizvodnje rekombinantnih proteina ovog pronalaska, budući da njihova larva može da se ukloni automatskim ili poluautomatskim postupcima, na taj način olakšavajući mogućnost prenosa na drugi proizvodni nivo za dobijanje lutaka koje su spremne da se ubrizgaju sa rekombinantnim bakulovirusom (faza (b)).

[0078] Nakon uklanjanja svile iz larve, poželjno je lutke oprati sa vodom, kako bi se uklonili tragovi slanog rastvora (npr., natrijumhipohlorita). Lutke koja ne sadrže svilu mogu naknadno da se suše i čuvaju na niskoj temperaturi (npr., 4°C) pre sprovođenja faze (b). Na primer, lutke koje ne sadrže svilu mogu da se čuvaju do 1 meseca na niskoj temperaturi (npr., 4°C) pre sprovođenja faze (b).

[0079] Ovaj opis obezbeđuje postupak za proizvodnju lutke koja ne sadrži svilu (poželjno lutke koja ne sadrži svilu koja pripada rodu Lepidoptera, poželjno lutke prema ovom pronalasku), koja obuhvata faze:

(a) Dobijanje lutke (poželjno lutke prema ovom pronalasku kako je gore opisano) koja se nalazi u larvi;

(b) Tretiranje lutke koja se nalazi u larvi rastvorom soli, poželjno rastvorom soli hipohloraste kiseline, poželjno natrijumhipohlorita, kako je gore detaljno opisano; i

(c) Dobijanja lutke koja ne sadrži svilu (i poželjno suštinski dezinfikovane).

[0080] Ovaj pronalazak samim tim takođe obezbeđuje lutku prema ovom pronalasku koja suštinski ne sadrži svilu (naime, bez larve). Lutka koja suštinski ne sadrži svilu prema ovom opisu poželjno ne pripada vrsti Bombyx mori. U poželjnom aspektu lutka koja suštinski ne sadrži svilu prema ovom opisu ne pripada vrsti Hyalophora cecropia. U poželjnom aspektu lutka koja suštinski ne sadrži svilu prema ovom opisu pripada rodu Trichoplusia, Rachiplusia, Spodoptera, Heliothis, Manduca, Helicoverpa, Ascalapha ili Samia, poželjno rodu Trichoplusia, Rachiplusia, Spodoptera, Heliothis ili Helicoverpa. U

2

poželjnom aspektu lutka koja suštinski ne sadrži svilu prema ovom opisu pripada vrsti Trichoplusia ni, Rachiplusia nu, Spodoptera frugiperda, Heliothis virescens, Helicoverpa armigera, Helicoverpa Zea, Manduca sexta, Ascalapha odorata ili Samia cynthia, čak poželjnije vrsti Trichoplusia ni.

[0081] Faza (b) postupka ovog pronalaska je usmerena na inokulaciju lutke iz faze (a) sa rekombinantnim bakulovirusom dobijenim od Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus (AcMNPV). Rekombinantni bakulovirus koji može da obuhvati lutku prema ovom pronalasku je gore detaljno opisan, u šemi koja je, primera radi, takođe prikazana na FIG.4B. U skladu sa tim, poželjno, u fazi (b), lutka prema ovom pronalasku je inokulisana sa rekombinantnim bakulovirusom, kako bi se obezbedila lutka prema ovom pronalasku, koja obuhvata rekombinantni bakulovirus, kako je gore opisano. Patentna prijava objavljena kao WO2012/168492 daje opis rekombinantnog bakulovirusa koji može biti inokulisan u lutku prema ovom pronalasku u fazi (b) postupka za proizvodnju rekombinantnih proteina ovog pronalaska. Rekombinantni bakulovirus obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja kodira rekombinantni protein, poželjno rekombinantni protein odabran iz grupe kako je gore definisano u specifikaciji (ekspresiona kaseta).

[0082] Lutke koje ne sadrže svilu su poželjne, pošto je u tom slučaju inokulacija sa rekombinantnim bakulovirusom lakša, i može da se izvede automatski ili poluautomatski, na taj način olakšavajući prenos na drugi proizvodni nivo i reproduktivnost postupka.

[0083] Inokulacija rekombinantnog bakulovirusa prema fazi (b) može da se izvede postupcima poznatim u tehnici i stručnjaku. Kako je ovde definisano, "inokulacija" se odnosi na uvođenje supstance u telo, u ovom slučaju, uvođenje rekombinantnog bakulovirusa u lutke. Inokulacija takođe može da bude naznačena kao i "injekcija". Pošto su ove larve inokulisane sa bakulovirusom, ovaj postupak takođe u ovom opisu može biti naznačen kao "infekcija larvi sa bakulovirusom".

[0084] Poželjno, inokulacija se izvodi ubrizgavanjem lutke u specifičnu količinu rastvora koja obuhvata obuhvata najmanje jedan bakulovirus. Ubrizgavanje se poželjno obavlja sa iglom, koja perforira lutku i raspodeljuje specifičnu količinu rastvora koji obuhvata bakulovirus unutar tela lutke. Ova faza takođe može biti automatska; lutke mogu biti položene, npr., u matrici ili poljima alveola, a uređaj za inokulaciju ili robot (opisani u nastavku) mogu automatski da raspodele bakulovirus unutar lutaka. Na primer, lutka može da bude položena u alveoli matrice (ili polju), pri čemu matrica obuhvata gornji deo sa rupom u centru, tako da uređaj za inokulaciju ili robot (koji obuhvata iglu, npr., na robotskoj ruci) automatski postavlja iglu na alveole, i igla prilazi lutkama kroz tu rupu na gornjem delu. Igla prodire u telo lutke, npr., oko 1-5 millimetara, poželjno oko 3 mm (to takođe može biti automatski) i raspodeljuje rastvor koji obuhvata bakulovirus unutar lutke. Uređaj ili robot može da obuhvati preciznu pumpu koja može da raspodeli tačnu količinu bakulovirusa (npr., količine od oko 0.5-10 mikrolitara rastvora koji obuhvata bakulovirus, poželjno oko 5 µl) u lutke. Robot može da obuhvati ruku koja obuhvata jednu ili više igli koje mogu da ubrizgaju bakulovirus u lutke na preciznim pozicijama. Kada se ovo izvede, robot ostavlja alveole, i zahvaljujući gornjem delu matrice gde su lutke položene, lutka se lako ostavlja na alveolama matrice, i odatle se ne uklanja kada ruka robota ukloni iglu iz lutke, pošto je rupa na gornjem delu matrice manja od lutke, tako da samo igla može da prođe kroz nju, tako da se i igla uklanja iz lutke i iz matrice alveola i tako unutra ostaje samo lutka. Sa ovakvim poželjnim rasporedom, postupak inokulacije je automatski, brz, efikasan i izuzetno reproduktivan (svaka lutka prima istu količinu rastvora koji obuhvata bakulovirus, sa istim postupkom). Robot može da ima nekoliko igli za inokulaciju (naime, igle koje mogu da inokulišu ili ubrizgaju bakulovirus u lutke na preciznim položajima) koje mogu da se uklone, i koje mogu da inokulišu bakulovirus u lutke pri brzini između oko 3.000 i oko 10.000 lutaka na sat.

[0085] Na primer, količina od više od oko 50 jedinica formiranja plaka (PFU-ova) bakulovirusa se inokuliše u svaku lutku. Na primer, oko 50, oko 100, oko 500, oko 1,000, oko 5,000, oko 10,000, oko 15,000, oko 20,000, oko 25,000, oko 30,000, oko 40,000, oko 50,000, oko 60,000, oko 75,000 ili više PFU-ova (čak oko 1,000,000) se inokuliše u svaku lutku. Na primer, kako je već gore pomenuto, rastvor obuhvata virus, tako da se određena količina rastvora koja obuhvata bakulovirus ubrizgava u lutke. Na primer, rastvor može da predstavlja medijume ćelijskih kultura koji obuhvataju bakulovirus. Na primer, rastvor može da predstavlja puferovan rastvor koji obuhvata bakulovirus, kao što je rastvor PBS 1x pH 7.4, 1 mM PMSF (inhibitor proteaza) i 5mM DTT koji obuhvata bakulovirus. Na primer, lutke mogu da se inokulišu sa količinom od oko 0.5 - 10 µl rastvora koji obuhvata bakulovirus, kao što je oko 0,5 µl, kao što je oko 1-10 µl, kao što je oko 1, oko 2, oko 3, oko 5, oko 7 ili oko 10 µl. Na primer, svaka lutka prima 0.5 - 10 µl rastvora koji obuhvata između 50 do 1,000,000 PFU-ova.

[0086] Zahvaljujući automatizaciji inokulacije, robot može da inokuliše oko 3,000 lutaka po satu ili više, kao što je između oko 3.000 i oko 10.000 lutaka po satu. Robot je prikladan za isporuku tečnosti u lutke koje se nalaze u polju matrice.

[0087] Faza (c) postupka ovog pronalaska obuhvata inkubiranje inokulisane lutke iz faze (b) za vremenski period dovoljan za najmanje jedan rekombinantni protein koji bi trebalo da se eksprimira. Ova faza inokulacije se poželjno izvodi u trajanju od najmanje 72 h, kao što je oko 72h, oko 96h, oko 100h, oko 125h, oko 150h, oko 168h ili više (nakon inokulacije). Poželjno, vreme inkubacije je oko 96-168h nakon inokulacije ili oko 72-168h nakon inokulacije. Faza inokulacije se može poželjno izvoditi na temperaturi od oko 22-28 °C, poželjno u inkubatoru bez bilo kakve potrebe za kontrolom svetlosti ili vlažnosti.

[0088] Inokulisane lutke (poželjno položene u alveolama matrice) mogu da se ostave na alveolama matrice za vreme gore pomenutog perioda (inkubacije). U drugom načinu ostvarivanja, lutke se uklone iz matrice i stave se bilo gde za vreme inkubacije, kao što su vreće ili bilo koji primalac koji omogućava transpiraciju (inkubaciju bi poželjno trebalo izvoditi u posudi gde postoji razmena gasova, ne u potpuno zatvorenoj posudi).

2

[0089] Stručnjak računa potrebno vreme inkubacije i uslove za inkubaciju za svaku lutku i svaki rekombinantni protein na osnovu prethodnih eksperimenata, u zavisnosti od proteina koji bi trebalo da se eksprimira.

[0090] Faza (d) postupka ovog pronalaska obuhvata dobijanje lutaka koje obuhvataju najmanje jedan rekombinantni protein koji se eksprimira tokom faze inkubacije (c). Lutke koje obuhvatajuju najmanje jedan rekombinantni protein mogu da se sakupe iz matrice/polja (ili mesta inkubacije). Ove lutke koje obuhvataju najmanje jedan rekombinantni protein mogu da se čuvaju (zamrznute ili liofilizirane) radi naknadne obrade. Na primer, lutke koje obuhvataju najmanje jedan rekombinantni protein mogu biti spakovane u pakovanje (poželjno vakuumirano pakovanje). Pakovanje koje obuhvata lutke može da se čuva, prevozi i/ili dalje obrađuje.

[0091] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje pakovanje koje obuhvata lutke ovog pronalaska, pri čemu poželjno, lutke obuhvataju najmanje jedan rekombinantni protein. Poželjno, lutke se pakuju u vakuum pakovanje, tako da pakovanje ovog pronalaska obuhvata vakuumirane lutke, koje su npr., zamrznute ili liofilizirane, da bi se izbegla oksidacija. Ovim je omogućeno lakše rukovanje i duži periodi čuvanja.

[0092] Lutke dobijene prema fazi (d) iz gore navedenog postupka takođe mogu da se zamrznu i čuvaju radi dalje obrade. Na primer, lutke mogu da se zamrznu neposredno nakon sakupljanja na oko -20°C, ili na oko -80°C, dok se dalje ne obrade. Na primer, lutke koje obuhvataju najmanje jedan rekombinantni protein mogu da se zamrznu na temperaturi od, na primer, između oko -20°C i -70°C, do ekstrahovanja rekombinantnog proteina. Lutke koje obuhvataju rekombinantni protein mogu da se čuvaju zamrznute duži vremenski period, kao što je, na primer, više od 1 godine.

[0093] (Opciona) faza (e) postupka ovog pronalaska obuhvata, opciono, sakupljanje najmanje jednog rekombinantnog proteina. Stručnjak je svestan postupaka i protokola za sakupljanje najmanje jednog rekombinantnog proteina koji obuhvata lutke dobijene u fazi (d). Naravno, ovi postupci i/ili protokoli mogu da zavise od prirode rekombinantnog proteina koji je eksprimiran.

[0094] Na primer, protein mogu da ekstrahuju homogenizirane lutke (npr., u mašini za homogenizaciju ili mešaču homogenizatoru, kao što je mikser homogenizator ili rotor-stator homogenizator, najmanje nekoliko sekundi/minuta), poželjno u prisustvu pufera neutralne pH, pri čemu pufer poželjno obuhvata anti-oksidanse (sredstva za redukciju), inhibitore proteaze i odgovarajuće deterdžente. Na primer, pufer obuhvata oko 1-25 mM sredstva za redukciju i oko 0.01-2 mas.% proizvoda deterdženta. Poželjno, pufer dalje obuhvata kompoziciju inhibitora proteaze.

[0095] Nakon homogenizacije ekstrakti mogu da se sonicuju i/ili centrifugiraju (npr., 15,000-20,000 G) kako bi se uklonili ostaci insekta, i filtriraju.

[0096] Na primer, sredstva za ekstrakciju (postupci i protokoli za sakupljanje najmanje jednog rekombinantnog proteina koji obuhvata lutke) obuhvataju fizički razgrađene lutke, centrifuge, faze tangencijalne filtracije protoka, sonikaciju, hromatografske postupke i/ili filtracije za sterilisanje.

2

[0097] U poželjnom načinu ostvarivanja, viskozitet homogenata se može smanjiti njegovom inkubacijom (filtracijom) sa dijatomatejskom zemljom (npr., Celite). Faza taloženja proteina može biti uključena.

[0098] Ekstrakt može postati jasniji putem tangencijalne filtracije protoka, upotrebom filtera koji stručnjak može da izabere u zavisnosti od prirode rekombinantnog proteina. Pufer može da se promeni postupkom diafiltracije (npr., u istom uređaju za tangencijalnu filtraciju).

[0099] (Opciona) faza (f) postupka ovog pronalaska obuhvata, opciono, prečišćavanje najmanje jednog rekombinantnog proteina. Stručnjak je svestan tehnika za prečišćavanje proteina. Na primer prečišćavanje može da se postigne hromatografijom prečišćavanjem, filtracijom ili ultracentrifugiranjem.

[0100] Prečišćeni rekombinantni protein se tako može dobiti. Šema jednog načina ostvarivanja ovog postupka je prikazana na FIG.17.

[0101] Rekombinantni protein koji može da se dobije postupkom prema ovom pronalasku poseduje visoki stepen čistoće, i može se upotrebljavati u vakcinama, dijagnozi, kozmetici ili u terapiji.

Postupak za proizvodnju rekombinantnog bakulovirusa

[0102] Ovaj opis dalje obezbeđuje postupak za proizvodnju rekombinantnog bakulovirusa koji obuhvata faze:

(a) Dobijanje lutke,

(b) Transfekcija lutke iz faze (a) sa vektorom bakamida prikladnim za proizvodnju rekombinantnog bakulovirusa dobijenog od Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus (AcMNPV); (c) Inkubiranje inokulisane lutke iz faze (b) za vremenski period dovoljan da se proizvede rekombinantni bakulovirus;

(d) Dobijanje lutaka koje obuhvataju rekombinantni bakulovirus;

(e) Opciono, sakupljanje rekombinantnog bakulovirusa; i

(f) Opciono, prečišćavanje rekombinantnog bakulovirusa.

[0103] Poželjno, lutka dobijena u fazi (a) predstavlja lutku koja ne sadrži svilu kako je gore definisano. Lutka poželjno pripada rodu Trichoplusia, Rachiplusia, Spodoptera, Heliothis, Manduca, Helicoverpa, Ascalapha ili Samia, poželjno rodu Trichoplusia, Rachiplusia, Spodoptera,

Heliothis ili Helicoverpa, poželjnije vrsti Trichoplusia ni, Rachiplusia nu, Spodoptera frugiperda, Heliothis virescens, Helicoverpa armigera, Helicoverpa Zea, Manduca sexta, Ascalapha odorata ili Samia cynthia, čak poželjnije vrsti Trichoplusia ni.

[0104] U fazi (b), lutka iz faze (a) se transfektuje sa vektorom bakmida prikladnim za proizvodnju rekombinantnog bakulovirusa dobijenog od Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus (AcMNPV).

[0105] Ova faza (b) takođe može biti označena kao "faza inokulacije", budući da može da se izvede na sličan način kao faza (b) gore opisanog postupka za proizvodnju rekombinantnog proteina (samo što se

2

umesto bakulovirusa, inokuliše vektor bakmida), naime na automatski ili poluautomatski način, upotrebom uređaja prema ovom pronalasku (takođe opisanog u nastavku). Uređaj može da inokuliše u lutku (koja se poželjno nalazi u alveolama matrice, koje obuhvataju slavine sa rupama) specifičnu količinu rastvora koji obuhvata vektor transfera i/ili bakmida koji je potrebno inokulisati u lutku, ubrizgavanjem iglom, kako je gore opisano.

[0106] Vektor bakmida može da nastane primenom postupaka poznatih stručnjaku, na primer, sekvencijalnim generisanjem vektora kloniranja, vektora donora, vektora transfera i, konačno, vektora bakmida. Na primer, generisanje vektora bakmida je opisano u patentnoj pirjavi objavljenoj kao WO 2014/086981.

[0107] U poželjnom načinu ostvarivanja, ovaj vektor transfera i/ili bakmida obuhvata ili se alternativno, sastoji od, sekvence nukleinske kiseline koja omogućava ekspresiju iznad nivoa proteina IE-1, IE-0 i/ili njihovih fragmenata koji funkcionišu kao transkripcioni regulatori iznad nivoa proteina dobijenih tokom infekcije bakulovirusom, i rekombinantni homologni region (hr) operativno povezan sa bilo kojim promoterom koji je pogodan za upravljanje ekspresije rekombinantnog proteina. Ove sekvence nukleinske kiseline su već gore opisane. Na primer, sekvenca nukleinske nukleinske kiseline koja omogućava ekspresiju proteina IE-1, IE-0 i/ili njihovih fragmenata je poželjno odabrana iz grupe koju čine:

(a) nukleinska kiselina koja sadrži nukleotidnu sekvencu naznačenu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 1-5; (b) sekvenca nukleinske kiseline koja je najmanje 70% identična, poželjno najmanje 75%, poželjnije najmanje 80%, poželjnije najmanje 85%, poželjnije najmanje 90% i najpoželjnije najmanje 95% sa nukleotidnom sekvencom naznačenom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 1-5 i koja kodira protein koji može da funkcioniše kao transkripcioni regulator u rekombinantnom bakulovirusu;

(c) sekvenca nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu naznačenu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 6-9; i

(d) sekvenca nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70% slična, poželjno najmanje 75%, poželjnije najmanje 80%, poželjnije najmanje 85%, poželjnije najmanje 90% i najpoželjnije najmanje 95% sa aminokiselinskom sekvencom naznačenom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 6-9 i koja može da funkcioniše kao transkripcioni regulator u rekombinantnom bakulovirusu.

[0108] Pored toga, promoter koji upravlja ekspresiju pomenutog rekombinantnog proteina je poželjno odabran iz grupe nukleinskih kiselina koja obuhvata:

(a) nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu naznačenu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 10-14, poželjno naznačenu u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 11-13; i

(b) sekvencu nukleinske kiseline koja može da funkcioniše kao promoter u rekombinantnom bakulovirusu i koja je najmanje 70%, poželjno najmanje 75%, poželjnije najmanje 80%, poželjnije najmanje 85%, poželjnije najmanje 90% i najpoželjnije najmanje 95% identična sa nukleotidnom

2

sekvencom naznačenom u bilo kojoj od SEQ ID NO: 10-14, poželjno naznačenu u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 11-13.

[0109] Rekombinantni homologni region (hr) je poželjno sekvenca naznačena u SEQ ID NO: 21 (hr1). Sekvenca nukleinske kiseline koja obuhvata kombinacije rekombinantnog promotera, sekvence koje kodiraju transkripcione regulatore, a pojačivači regiona su poželjno odabrani iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 15-20.

[0110] Poželjno, vektor koji se inokuliše u lutke je bakmid.

[0111] Faza (c) se odnosi na inkubaciju inokulisane lutke iz faze (b) za vremenski period dovoljan da se proizvede rekombinantni bakulovirus. Na primer, ovaj vremsnki period za lutku T. ni može biti od oko 72h do oko 7 dana, u zavisnosti od virusa i temperature. Stručnjak može da izračuna vremenski period koji je dovoljan za proizvodnju rekombinantnog bakulovirusa.

[0112] Zatim, lutke koje obuhvataju rekombinantni bakulovirus dobijen u (fazi (d)). Lutke koje obuhvataju rekombinantni bakulovirus mogu da se čuvaju radi dalje obrade. Na primer, mogu da budu upakovane u vakuum pakovanje, kako bi se smanjio proces oksidacije i kako bi se olakšalo njihovo manipulisanje i kako bi se povećalo vreme bezbednog čuvanja. Na primer, lutke koje obuhvataju rekombinantni bakulovirus mogu da se zalede (npr., na -20°C do -80°C) pre njihove dalje obrade. Na primer, lutke koje obuhvataju rekombinantni bakulovirus mogu biti liofilizovane pre dalje obrade.

[0113] Opciono, rekombinantni bakulovirus može da se sakupi i prečisti (faze (e) i (f)).

Uređaj prema ovom opisu

[0114] Ovaj opis takođe obezbeđuje uređaj (koji je u ovom opisu označen i kao robot) koji obuhvata preciznu pumpu, pokretnu mehaničku ruku i iglu (koja može da se ukloni) prikladnu za ubrizgavanje tečnosti (poželjno rastvora koji obuhvata bakulovirus ili vektore bakmida) u lutku (poželjno lutku prema ovom pronalasku, koja poželjno predstavlja lutku koja ne sadrži svilu i koja poželjno pripada

redu Lepidoptera, poželjno rodu Trichoplusia. Rachiplusia, Spodoptera, Heliothis, Manduca, Helicoverpa, Ascalapha ili Samia, poželjno rodu Trichoplusia, Rachiplusia, Spodoptera,

Heliothis ili Helicoverpa, poželjnije vrsti Trichoplusia ni, Rachiplusia nu, Spodoptera frugiperda, Heliothis virescens, Helicoverpa armigera, Helicoverpa Zea, Manduca sexta, Ascalapha odorata ili Samia cynthia.

[0115] Kako je gore detaljno opisano, lutka može poželjno da bude dobijena iz matrice (ili polja), naime lutka je položena u alveolama matrice, tako da uređaj lako može da locira lutku na automatski način. Poželjno, matrica obuhvata slavine, sa rupama koje su manje od lutke (naime lutke ne mogu da prođu kroz rupe).

[0116] Uređaj dalje može obuhvatati računarskii program za definisanje položaja igle (i/ili položaja mehaničke ruke) i/ili za izračunavanje udaljenosti od vrha (kraja) igle do lutke i/ili udaljenosti prodiranja igle u lutku i/ili zapremine tečnosti (poželjno rastvora koji obuhvata bakulovirus ili vektore bakmida) koju bi trebalo inokulisati u lutku. Pored toga, uređaj prema ovom opisu dalje može da obuhvata

2

računarski program za izračunavanje vremena inokulacije i/ili vremena između različitih inokulacija u lutke. Uređaj dalje može obuhvatati kameru za definisanje položaja igle.

[0117] U poželjnom aspektu tečnost koju uređaj ubrizgava prema ovom opisu obuhvata rekombinantni bakulovirus. U drugom aspektu, tečnost koju ubrizgava uređaj ovog pronalaska obuhvata vektor bakmida prikladan za proizvodnju rekombinantnog bakulovirusa dobijenog od AcMNPV, kako je gore opisano u opisu.

[0118] Uređaj prema ovom opisu je prikladan za izvođenje faze (b) postupka za proizvodnju rekombinantnog proteina ovog pronalaska i faze (b) postupka dobijanja rekombinantnog bakulovirusa ovog pronalaska.

[0119] Na primer, uređaj prema ovom opisu je prikladan za ubrizgavanje (inokulisanje) u lutku količine tečnosti koja je u opsegu od oko 0,5 do oko 10,0 µL, kao što je oko 0,5 µl, kao što je oko 1-10 µl, kao što je oko 1, oko 2, oko 3, oko 5, oko 7 ili oko 10 µL.

[0120] Na primer, igla koja je deo uređaja prema ovom opisu može da prodre u lutku na razdaljini od oko 1 to oko 4,5 mm, poželjno oko 3 mm.

[0121] Na primer, uređaj prema ovom opisu obuhvata nekoliko igli koje mogu da se uklone, i mogu da inokulišu tečnost (poželjno rastvor koji obuhvata bakulovirus ili vektore bakmida) pri brzinama od između oko 3.000 i 10.000 lutaka po satu.

[0122] Na primer, tečnost koja je ubrizgana uređajem prema ovom opisu obuhvata bakulovirus, poželjno u količini od 50 do 10<6>PFU-ova/doza ubrizganih u svaku lutku. Na primer, uređaj prema ovom opisu ubrizgava (inokuliše) u svaku lutku količinu od više od oko 50, ili više od oko 100, ili više od oko 500 jedinica za formiranje plaka (PFU-ova) bakulovirusa. Na primer, oko 50, oko 100, oko 300, oko 500, oko 1,000, oko 5,000, oko 10,000, oko 15,000, oko 20,000, oko 25,000, oko 30,000, oko 40,000, oko 50,000, oko 100,000, oko 500,000 ili više PFU-ova je inokulisano u svaku lutku, kao što je oko 1,000,000 PFU-ova.

[0123] Uređaj prema ovom opisu poželjno obuhvata visoko precizne pumpe koje omogućavaju uređaju da sa velikom preciznošću inokuliše željenu zapreminu tečnosti (poželjno rastvora koji obuhvata bakulovirus ili vektore bakmida) u lutke.

[0124] Uređaj prema ovom opisu je prikladan da isporuči tečnost u lutke koje se nalaze u matrici ili polju.

[0125] Poželjno, uređaj prema ovom opisu dalje obuhvata računarski program za izračunavanje vremena inokulacije/ili vremena između inokulacija u lutke, koje bi trebalo da bude dovoljno za raspodelu tečnosti koja sadrži bakulovirus u svaku lutku.

[0126] Poželjno, uređaj prema ovom opisu dalje obuhvata kameru za definisanje položaja igle.

[0127] Ovaj opis dalje obezbeđuje uređaj za uklanjanje svile (uređaj za uklanjanje svile). Šematski prikaz primera uređaja za uklanjanje svile je prikazan na FIG.3 (poluautomatski uređaj za uklanjanje svile iz T. ni larvi).

[0128] Uređaj za uklanjanje svile prema ovom opisu (takođe označen kao "mašina za uklanjanje svile") obuhvata najmanje jednu posudu koja sadrži rastvor za rastvranje svile, kako je gore objašnjeno. Na primer, posuda obuhvata hipohlorastu kiselinu. Prva posuda može poželjno takođe da obuhvati sistem za izbacivanje tečnosti kroz module za uzgajanje koji sadrže larve (pomaže u efikasnijem rastvaranju svile kojom je lutka okružena). Rastvor za rastvaranje se poželjno nanosi na larvu sa vazdušnim turbulencijama pod pritiskom, kako bi se smanjilo vreme potrebno za rastvaranje larve.

[0129] Poželjno, uređaj za uklanjanje svile prema ovom opisu dalje obuhvata drugu posudu, koja predstavlja posudu za pranje i obuhvata i/ili disperguje rastvor prikladan za uklanjanje tragova svile i rastvora za rastvaranje svile sa lutaka, kao što je voda. Rastvor (poželjno voda) se poželjno prska iznad hrizalisa (lutaka). Poželjno, na gornjem delu posude, nalazi se sistem koji distribuira vazduh do suvih lutaka. U skladu sa tim, nakon pranja lutaka, poželjno se suše na vazduhu. Na kraju ovog postupka, lutke ne sadrže svilu i spremne su da budu zaražene ili da se čuvaju (u frižideru) do upotrebe.

Sažetak sekvenci

1

2 PRIMERI

Primer 1. Proizvodnja T. ni lutaka

[0130] Larve insekata se uzgajaju u kutijama za višekratnu illi jednokratnu upotrebu koje sadrže nekoliko stotina larvi kojima je omogućeno da se u roku od 15-18 dana razviju iz jajeta u lutku (FIG.1). Zatim, se sve kutije za uzgajanje ili sakupljene lutke urone u ili poprskaju rastvorom natrijumhipohlorita u koncentracijama od 0.1 do 5 mas.% kako bi se rastvorila svilena vlakna larvi. Svila se rastvori za par minuta i lutke se zatim operu sa vodom kako bi se uklonili tragovi hipohlorita. Lutke se naknadno osuše i čuvaju na 4°C do inokulacije bakulovirusa. Postupak je jednostavniji u pogledu istog postupka sa larvama Bombyx mori zbog niže gustine svile koja se tretira od T. ni leptira, kao što se može i videti na FIG.

2. Bombyx mori larve zahtevaju ručno intervenisanje kako bi se lutke oslobodile, dok se T. ni svila lako rastvara i uklanja automatskim ili poluautomatskim postupcima, olakšavajući tako prenos na drugi proizvodni nivo dobijanja lutaka koje su spremne da budu ubrizgane sa rekombinantnim bakulovirusom za proizvodnju rekombinantnog proteina.

Primer 2. Dvostruki rekombinantni bakulovirusi koji sadrže pojačivač sekvence (hr1) operativno povezan sa himernim promoterom (p6.6 i p10), a prekomerno eksprimirani IE-1 i IE-0 transaktivacioni faktori su visoko efikasni u proizvodnji rekombinantnih proteina u lutkama insekata

[0131] Ekspresija rekombinantnog proteina kojim se upravlja pod kontrolom himernih promotera pojačanih homolognom ponovljenom sekvencom bakulovirusa hr1 i koje trans-aktiviraju prekomerno eksprimirani IE-1 i IE0 faktori se poredi kod lutke insekta (T. ni) sa dobijenom upotrebom konvencionalnog bakulovirusa. Gen koji kodira za rekombinantni zeleni fluorescentni protein (GFP) se klonira kod konvencionalnog AcMNPV bakulovirusa pod kontrolom promotera polihedrina konvencionalnim sredstvima (FIG.4A). Drugi AcMNPV bakulovirus modifikovan kasetom koja sadrži gore pomenute regulatorne elemente (TB ekspresionom kasetom) je takođe generisan sa GFP genom koji kodira (FIG.4B). Lutke su zaražene sa 50,000 PFU-ova svakog bakulovirusa pomoću robota za inokulaciju (FIG.5A), koji obuhvata preciznu pumpu koja može da raspodeli mikrolitarske količine virusnog inokuluma i robotsku ruku koja može da ubrizga virus u precizne položaje. Lutke su smeštene u alveolama matrice sa gornjim delom sa rupom u centru svake alveole (FIG.5B). Igla za inokulaciju (koja može da se ukloni) dolazi do lutaka kroz rupu i prodire u lutke nekoliko mililitara kako bi se ubrizgao bakulovirus (FIG.5C). Rekombinantni virus koji je sadržan u 0.5 do 10 mikrolitara (µl) se raspodeli u lutke i tokom uvlačenja igle lutke ostaju u alveoli zbog gornjeg dela. Ovaj robot za inokulaciju je pokazao brzinu inokulacije od najmanje 3,000 lutaka po satu, najmanje 6 puta veću brzinu od brzine ručne inokulacije koju izvodi stručnjak.

[0132] Nakon perioda inkubacije nakon inokulacije od 96-168h, lutke se sakupe a protein se ekstrahuje u homogenizator mašini u prisustvu pufera neutralne pH vrednosti koji sadrži anti-oksidanse, inhibitora proteaza i nejonskih deterdženata (npr., PBS1X pH 7,4 5mM Dithiothreitol (DTT) 1mM fenilmelilsulfonil fluorid (PMSF) 0,1% Brij 35 0,5% Sarkosyl. Ekstrakti se centrifugiraju na 15,000-20,000 g i filtriraju. Ekstrakti se analiziraju SDS-PAGE elektroforezom, a gelovi se boje plavom Coomassie bojom (FIG.6A). Proizvodni prinosi (izraženi kao miligrami po jedinici biomase) GFP proteina proizvedenih od strane svakog bakulovirusa u zaraženim lutakama se izračunavaju densitometrijom upotrebom krive goveđeg serumskog albumina (BSA). Ova analiza daje porast od oko 5.6 puta GFP produktivnosti kod lutaka dobijenih genetski modifikovanim bakulovirusom sa TB kasetom u odnosu na one dobijene sa konvencionalnim bakulovirusom (naime bakulovirusom koji obuhvata, npr., promoter polihedrina bez bilo kog drugog regulatornog elementa u ekspresionoj kaseti) (FIG.6B).

Primer 3. Ekspresija različitih proteina putem TB-modifikovanih bakulovirusa kod T. ni lutaka [0133] Da bi se analizirala korist od upotrebe TB (TopBac) ekspresione kasete (SEQ ID NO.: 17) za dalju ekspresiju proteina, kloniraju se dva gena u TB kaseti i dobijaju se odgovarajući rekombinantni bakulovirusi, kao i konvencionalni bakulovirusi koji eksprimiraju gene pod kontrolom promotera polihedrina (polh) (FIG.7). Ta dva gena koja se koriste za dobijanje rekombinantnih bakulovirusa predstavljaju one koji kodiraju za proteine Cap od svinjskog cirkovirusa tipa 2 dobijenog iz PCV2a GER3 lanca (SEQ IS NOs: 25 i 27) i hemaglutinina iz virusa gripa (H1) dobijenog iz lanca virusa A/PR/8/34 (SEQ ID NOs: 30 i 31). Dobijeni TB(-) (naime konvencionalni bakulovirus koji uključuje promotera polihedrina radi eksprimiranja proteina u ekspresionoj kaseti ali koji nije modifikovan od strane TopBac (TB) ekspresione kasete) i TB(+) bakulovirusi se porede radi njihove produktivnosti u T. ni lutkama upoterbom iste infekcije i protokola za ekstrakciju proteina kao što su oni koji se koriste i koji su opisani u primeru 2.

[0134] Poređenje proizvodnih prinosa (izraženih kao miligrami po jedinici biomase) kod zaraženih lutaka posredovani konvencionalnim (TB(-)) ili TB-modifikovanim (TB(+)) bakulovirusima pokazuje da je za oba proteina TB ekspresiona kaseta povećala proizvodni prinos. U slučaju svinjskog circovirusa Cap proteina, povećanje od 2.79 puta u proizvodnji proteina kada je lutka zaražena sa TB-modifikovanim bakulovirusom u poređenju sa lutkom zaraženom sa konvencionalnom bakulovirusom (FIG.8). Za HA protein iz virusa gripa, ovo povećanje je iznosilo 2.04 puta (FIG.9). Ovi rezultati potvrđuju da TB kaseta značajno povećava proizvodnju rekombinantnih proteina kod T. ni lutaka.

Primer 4. Proizvodnja rekombinantnih proteina u bakoulovirusu zaraženog T. ni lutkama je efikasnije nego sa larvama

[0135] Sprovedena je uporedna ekspresija pet rekombinantnih proteina kod TB(+) bakulovirusa u T. ni lutkama i larvama. Eksprimirani proteini su sledeći: GFP (SEQ ID NO.: 23), Cap (SEQ ID NO.: 25), HA (SEQ ID NO.: 30) i VP60 (kapsidni protein) iz lanaca dva zečja hemoragijska kalicivirusa (RHDV genogrupa 1 i RHDVb; SEQ ID NOs: 32 i 33) (FIG.10). Lutke i larve su zaražene sa 50,000 PFU-ova odgovarajućih

4

TB(+) bakulovirusa. Zaraženi insekti (larva i lutka) se sakupe 96h nakon infekcije. Rastvorljivi ekstrakti proteina se analiziraju SDS-PAGE elektroforezom obojenom sa plavom Coomassie bojom (FIG.11A, 12A, 13A i 14A). Rekombinantni proteini se kvantifikuju densitometrijom upotrebom BSA krive a proizvodni prinosi se izražavaju kao miligrami po jedinici biomase (FIG.11B, 12B, 13B i 14B). U svim slučajevima, lutke eksprimiraju veće količine rekombinantnog proteina nego larva, sa rastućim odnosima od 1.06 do 3.64.

Primer 5. Proizvodnja rekombinantnih čestica poput virusa (VLP-ova) u lutkama T. ni

[0136] Kako bi se demonstrirala proizvodnja VLP-ova kod zaraženih lutaka, ekstrakti proteina iz zaraženih lutaka sa TB(+) bakulovirusima koji ekpsrimiraju VP60 protein iz dva lanca zečjeg kalcivirusa koji su analizirani u primeru 4 se obrađuju radi prečišćavanja. VLP-ovi se ekstrahuju iz zaraženih lutaka na 96 h nakon infekcije centrifugiranjem u prisustvu deterdženata (2% sarkozil (Sigma) i 5 mM EDTA (Sigma) u PBS-u (0.2 M natrijumfosfat, 0.1 M NaCl, pH 6.0) i inhibitora proteaza (Complete®, Roche) i inkubiraju se preko noći na 4°C. Zatim se tretiraju sa DNKse i (Roche Diagnostics) 1 h na 37°C. Nakon dodatnog centrifugiranja (2,000 x g, 5 min), supernatanti se ultracentrifugiraju (131,453 x g; 2.5 h). Sedimenti se ekstrahuju dva puta u Vertrel (Sigma) i predaju se radi drugog ultracentrifugiranja (131,453 x g; 2.5 h). Konačno, sedimenti se ponovo suspenduju u PBS 1X i čuvaju se na 4°C do analize.

[0137] Sedimenti se analiziraju prenosnom elektronskom mikroskopijom koja se izvodi pomoću konvencionalnih sredstava. Ukratko, prečišćeni VLP-ovi (približno 5 µl) se nanose na rešetke sa tinjavim pražnjenjem koje su obložene ugljenikom za 2 minuta. Uzorci su negativno obojeni sa 2 mas.% vodenim uranilacetatom. Snime se mikrografi sa EM 2000 Ex mikroskopom (JEOL, Japan). Kako je prikazano na FIG.14, VLP-ovi očekivane veličine i oblika koji odgovaraju RHDV se posmatraju, pokazujući da se ispravno presavijanje i samosklapanje sprovodi u tkivima lutaka zaraženih bakulovirusom (FIG.15).

Primer 6. Proizvodnja virusnog inokuluma u zaraženim T. ni lutkama

[0138] Spodoptera frugiperda (Sf21 i Sf9) ćelijske linije se kultivišu na 27°C u TNMFH medijumu (PAN Biotech GmbH, Nemačka) sa 10% toplotno neaktivnim fetalnim goveđim serumom (PAN Biotech GmbH) i gentamicinom (50 µg/ml) (PAN Biotech GmbH). Gustina ćelije i vijabilnost se ocenjuju bojenjem Trypan plavom bojom. Ćelijska vijabilnost se računa na osnovu procenta živih ćelija u odnosu na ukupan broj ćelija u raznim vremenskim tačkama nakon infekcije.

[0139] Sf9 ćelije, koje su kultivisane u suspenziji, su zaražene u tikvicama sa mešalicama (80 ml medijuma kulture) pri gustini ćelije od 2x10<6>ćelije/ml. Ćelijska vijabilnost u vreme infekcije iznosi >99% u suspenziji. Sf9 ćelije su zaražene in vitro sa rekombinantnim bakulovirusima pri višestrukosti infekcije (MOI) od 0.01 do 0.1.72-96 h nakon infekcije, inokulum virusa se oporavlja od supernatanta nakon centrifugiranja. Titer virusa se računa ispitivanjem jedinica za formiranje plaka (pfu), pri čemu se dobijaju titeri virusa između 10<7>do 10<8>virusa po ml.

[0140] Virusi se koriste da bi se zarazile T. ni lutke sa dozama koje su u opsegu od 5 x 10<2>do 10<4>pfu. Nakon 3-7 dana, lutke se homogenizuju kako bi se sakupili zarazni virusi u medijima ćelijske kulture ili u specifičnom PBS puferu koji sadrži DTT i inhibitor proteaze PMSF. Homogenati lutaka se centrifugiraju kako bi se eliminisali ostaci na 5,000 x g tokom 30 minuta. Zatim se supernatant koji sadrži virus filtrira sekvencijalno kroz filter od 0.45 i 0.22 mikrona i dobijeni virusni preparat se čuva mešanjem glicerola a zatim može biti zamrznut ili liofiliziran. Zalihe virusa se titriraju u T. ni kod larvi petog stadijuma upotrebom Karber postupka konkretno, LID50 (infektivna doza za larve 50). Statističko značenje infektivne doze računato na ovaj način predstavlja populaciju larvi zaraženih sa ID50 pokazuje 50% individualno zaraženih. Larve se posmatraju najmanje 96 h kako bi se detektovali klinički znaci i kako bi se ispratio njihov razvoj u lutku. Tipični titeri virusa su između 10<6>do 10<8>pfu/ml pripreme virusa. Pored toga, inokulum bakulovirusa može da se dobije bez prethodne generacije vektora bakulovirusa u ćelijskim kulturama. Lutke mogu da se transfektuju sa bakamidom dobijenim u bakterijama primenom postupka transpozicije. FIG.16 predstavlja opšti postupak za dobijanje zalihe virusa u lutki putem sistema bez ćelija.

Primer 7. Ćelijske kulture i virusi

[0141] Spodoptera frugiperda Sf21 ili Sf9 ćelijske linije se kultivišu u pločama kulture tkiva sa 6 bunarčića (1x10<6>ćelije/bunarčić) u TNM-FH medijumu insekta (Pan Biotech™, Nemačka) koji sadrži 10 % toplotno neaktivnog fetalnog goveđeg seruma (Pan Biotech™, Nemačka) na 27°C. AcMNPV rekombinantni bakulovirusi se dobijaju "Bac-to-Bac®" Sistemom za ekspresiju virusa (invitrogen™, SAD). Različiti TB(+) transferi vektora koje sadrže elemente rekombinantne DNK se generišu upotrebom pFastBac™-DUAL plazmida (invitrogen™). Ovi transferi vektora se koriste za transfekciju Sf21 ćelija sa Cellfectin® (invitrogen™, SAD). Dobijeni rekombinantni bakulovirusi od injekcije od Sf21 ćelija zatim prolaze dva puta u ćelijama i titriraju se postukom ispitivanja plaka. Dobijeni konstrukti gena TB (+) ekspresione kasete bakulovirusa su šematski su prikazani na FIG.4, 7 i 10, prikazujući kombinacije genetskih regulatornih elemenata uključenih u ekspresiju gena (polhAc-ie-01/hr1p6.9p10, SEQ ID NO.: 17, plus sekvenca gena koji kodira za željeni protein, npr., SEQ ID NOs: 26, 30, 32 i 33). Rezličite ekspresione kasete se koriste da bi se generisali rekombinantni bakulovirusi koji se upotrebljavaju u primerima prikazanim na FIG.6, 8, 9, 11, 12, 13, i 14.

Primer 8. Stvaranje vektora kloniranja

[0142] Vektor kloniranja predstavlja mali deo DNK koji sadrži TB(+) ekspresionu kasetu bakulovirusa u koju se može umetnuti segment strane DNK tretiranjem nosača i strane DNK sa restriktivnim enzimom koja kreira isti ispust, zatim vezuje fragmente zajedno. Suštinske karakteristike vektora kloniranja su da on mora da uključi sintetičko višestruko mesto kloniranja (MCS) kako bi se olakšalo umetanje stranih gena odgovarajuće usmerenih, selektabilnog markera, kao što je antibiotska otpornost koja omogućava odabir pozitivno transformisanih ćelija i funkcionalnog porekla replikacije (ORI) radi propagacije u bakterijama

Primer 9. Stvaranje vektora donora koji sadrži ekspresionu kasetu bakulovirusa ovog pronalaska [0143] Vektor donora sastoji od vektora kloniranja, na primer pUC57 plazmida, koji sadrži ekspresionu kasetu bakulovirusa, u kom se strani gen klonira upotrebom odgovarajućih restriktivnih enzima. TB(+) ekspresiona kaseta bakulovirusa koja se koristi, se sintetiše vezivanjem sledećih DNK sekvenci: (i) transkripcioni regulator bakulovirusa kodira sekvencu Ac-ie-01 (npr., SEQ ID NOs: 1-5) nizvodno od sekvence promotera, kao što je polh promoter (npr., SEQ ID NO.: 10), i uzvodno od HSV TK signala poliadenilacije i (ii) u drugom lokusu sekvence pojačivača, na primer, homologni region hr1, uzvodno od (iii) sekvence promotera, na primer, p6.9p10 (npr., SEQ ID NO.: 13), nakon čega sledi mesto višestrukog kloniranja (MCS) radi kloniranja gena od značaja a signal poliadenilacije p10 nizvodno od MCS (FIG. 4, 7 i 10). Ekspresiona kaseta bakulovirusa je praćena specifičnim restriktivnim mestima (na primer BglII i BstZ171 na kraju 5'-terminala i Bgl II i Sgf I na kraju 3'-terminala) kako bi se olakšalo podkloniranje u vektor transfera komercijalnog sistema za generisanje virusa (na osnovu transpozicije, na primer "Bacto-Bac®" sistema (invitrogen™), ili na osnovu homologne rekombinacije, na primer "flashBAC™" (Oxford Expression Technologies™), "Baculogold™" (BD Biosciences™), "BacPAK6™" (Clontech™). "Bac-N-BlueDNK™" (invitrogen™).

[0144] Strani geni koji kodiraju se kloniraju u MCS vektor kloniranja upotrebom Nco I i Spe i restriktivnih mesta, stvarajući vektore plazmida donora.

Primer 10. Generisanje vektora transfera koji sadrži ekspresionu kasetu bakulovirusa ovog pronalaska [0145] Vektor transfera se generiše varenjem vektora donora sa BstZ1715'-susednog mesta i sa Xba I i kloniranjem istog u vektor transfera pFastBac™1 koji se takođe vari sa istim enzimima. U ovom slučaju, kao rezultat podkloniranja, SV40 signal poliadenilacije ekspresione kasete bakulovirusa se razmenjuje p10 signalom poliadenlacije iz vektora transfera. Pored ovoga, svi elementi ekspresione kasete su uključeni u pFastBac vektor transfera, supstituisanjem polh promotera i MCS originalnog komercijalnog vektora transfera.

Primer 11. Generisanje vektora ekspresije bakulovirusa koji sadrži ekspresionu kasetu bakulovirusa ovog pronalaska upotrebom "Bac-to-Bac®" sistema

[0146] Modifikovani vektor transfera pFastBac™1 i TB(+) ekspresiona kaseta bakulovirusa se upotrebljavaju za generisanje rekombinantnog bakulovirusa upotrebom "Bac-to-Bac®" Sistema za ekspresiju bakulovirusa. Određenije, modifikovani vektor transfera se koristi radi transformisanja E. coli lanca domaćina DH10Bac™ koji sadrži prenosni vektor bakulovirusa (bakmida) i pomoćnik plazmida, i omogućava generisanje rekombinantnog bakmida nakon transpozicije ekspresione kasete. DNK rekombinantnog bakmida sadrži TB(+) ekspresionu kasetu bakulovirusa ovog pronalaska i različiti strane geni koji kodiraju se zatim koriste da bi se transfektovale ćelije insekata, na primer, Sf21 ćelije, upotrebom Cellfectin®. Bakmid se takođe upotrebljava za transfekciju lutaka insekta. Lutke Trichoplusia ni (kupusar) starosti od 1 do 5 dana se koriste za ovaj eksperiment.72 sata nakon transfekcije, ćeije ili lutke se sakupe ili obrađuju i dobija se prva generacija rekombinantnog bakulovirusa. Ovaj rekombinantni bakulovirus može zatim dalje da se pojačava i/ili titrira u skladu sa konvencionalnim protokolima. Slični postupci mogu da se koriste kako bi se dobili rekombinantni bakulovirusi sa drugim vektorima transfera koje obezbeđuju komercijalni BEVS-ovi.

Primer 12. Infekcija lutaka insekata

[0147] Trichoplusia ni (kupusar) lutke starosti 1 do 5 dana se koriste za sve eksperimente. Standardna masa svake lutke je približno 200-300 mg i lutke se ručno ubrizgavaju, ili pomoću specifično dizajniranog robota sa 1 do 10 µl rekombinantnih bakulovirusa rastvorenih u medijumima ćelijskih kultura ili PBS IX kako bi se dosegao broj jedinica formiranja plaka (PFU) po odabranoj dozi. Lutke se sakupljaju 72-168 h nakon infekcije. Sakupljene lutke se zamrzavaju odmah kako bi se čuvale na -20°C ili -80°C do njihove obrade radi kvantifikacije rekombinantnog proteina. Ukupni rastvorljivi, nedenaturisani proteini (TSNDP-ovi) iz zamrznutih T. ni lutaka zaraženih bakulovirusima se dobijaju homogenizacijom u prisustvu pufera za ekstrakciju upotrebom mešalice ili homogenizator mešalice u trajanju od nekoliko minuta.

Primer 13. Nizvodna obrada lutaka insekata

[0148] Zamrznute lutke se razgrađuju u homogenizatoru kako bi se dobio sirovi ekstrakt koji sadrži sredstvo za redukciju u koncentraciji od 1-25mM, deterdžent u koncentraciji od 0,01%-2% i kompoziciju inhibitora proteaze. Viskozitet sirovog ekstrakta se smanjuje njegovom inkubacijom sa dijatomejskom zemljom za određeni vremenski period a zatim se centrifugira da bi se uklonili ostaci insekata i filtrira kako bi se uklonila dijatomejska zemlja. Zatim, ekstrakt postaje bistriji putem tangencijalne filtracije protoka upotrebom odgovarajućeg filtera u zavisnosti od prirode rekombinantnog proteina. Na kraju, postupak diafiltracije se izvodi na istom uređaju za tangencijalnu filtraciju kako bi se promenio pufer pre daljeg prečišćavanja hromatografijom. Na FIG.17 je prikazan opšti postupak kako se dobija rastvorljivi ekstrakt rekombinantnog proteina iz lutaka zaraženih bakulovirusom.

4

4

4

�

4

4

1

2

4

�

2

4

�

2

�

�

2

4

�

2

4

Claims (15)

Patentni zahtevi

1. Lutka koja obuhvata rekombinantni bakulovirus i/ili bakmid dobijen od Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus (AcMNPV), pri čemu lutka pripada rodu Trichoplusia.

2. Lutka prema zahtevu 1, pri čemu rekombinantni bakulovirus i/ili bakmid obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja kodira rekombinantni protein.

3. Lutka prema bilo kom od zahteva 1 ili 2, pri čemu bakulovirus i/ili bakmid obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja omogućava ekspresiju iznad endogenih nivoa proteina IE-1, IE-0 i/ili njihovih fragmenata koji funkiconišu kao transkripcioni regulatori iznad endogenih nivoa dobijenih tokom infekcije bakulovirusom, i rekombinantni homologni region (hr) operativno povezan sa bilo kojim promoterom koji je pogodan za upravljanje ekspresije rekombinantnog proteina,

pri čemu je sekvenca nukleinske kiseline koja omogućava ekspresiju proteina IE-1, IE-0 i/ili njihovih fragmenata odabrana iz grupe koju čine:

(a) nukleinska kiselina koja sadrži nukleotidnu sekvencu naznačenu u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 1-5;

(b) sekvenca nukleinske kiseline koja je najmanje 70% identična sa nukleotidnom sekvencom naznačenom u bilo kojoj od SEQ Nos: 1-5 i koja kodira protein koji može da funkcioniše kao transkripcioni regulator u rekombinantnom bakulovirusu;

(c) sekvenca nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu naznačenu u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 6-9; i

(d) sekvenca nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu čija je sekvenca najmanje 70% slična sa aminokiselinskom sekvencom naznačenom u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 6-9 i koja može da funkcioniše kao transkripcioni regulator u rekombinantnom bakulovirusu.

4. Lutka koja obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja omogućava ekspresiju iznad endogenih nivoa proteina IE-1, IE-0 i/ili njihovih fragmenata koji funkcionišu kao transkripcioni regulatori iznad endogenih nivoa proteina dobijenih tokom infekcije bakulovirusom, i rekombinantni homologni region (hr) operativno povezan sa bilo kojim promoterom koji je pogodan za upravljanje ekspresije rekombinantnog proteina, pri čemu lutka pripada rodu Trichoplusia,

pri čemu je sekvenca nukleinske kiseline koja omogućava ekspresiju proteina IE-1, IE-0 i/ili njihovih fragmenata odabrana iz grupe koju čine:

(a) nukleinska kiselina koja sadrži nukleotidnu sekvencu naznačenu u bilo kojoj od SEQ ID NOs: (b) sekvenca nukleinske kiseline koja je najmanje 70% identična sa nukleotidnom sekvencom naznačenom u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 1-5 i koja kodira protein koji može da funkcioniše kao transkripcioni regulator u rekombinantnom virusu;

(c) sekvenca nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu naznačenu u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 6-9; i

(d) sekvenca nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70% slična sa aminokiselinskom sekvencom naznačenom u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 6-9 i koja može da funkcioniše kao transkripcioni regulator u rekombinantnom virusu.

5. Lutka prema bilo kom od zahteva 2 do 4, pri čemu je promoter koji upravlja ekspresiju pomenutog rekombinantnog proteina, odabran iz grupe nukleinskih kiselina koja obuhvata:

(a) nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu naznačenu u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 10-14; i

(b) sekvencu nukleinske kiseline koja može da funkcioniše kao promoter u rekombinantnom bakulovirusu i koja je najmanje 70% identična sa nukleotidnom sekvencom naznačenom u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 10-14; i/ili

pri čemu taj rekombinantni homologni region (hr) predstavlja sekvencu naznačenu u SEQ ID NO: 21 (hr1).

6. Lutka prema bilo kom od zahteva 2 do 5, pri čemu su sekvenca nukleinske kiseline koja obuhvata kombinacije rekombinantnih promotera, sekvence koje kodiraju transkripcione regulatore i pojačivači regiona odabrani iz grupe koja obuhvata SEQ ID NOs: 15-20.

7. Lutka prema bilo kom od zahteva 3 do 6, pri čemu lutka dalje obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja kodira rekombinantni protein.

8. Upotreba lutke kako je definisano u bilo kom od zahteva 1 do 7 za ekspresiju rekombinantnih proteina.

9. Postupak za proizvodnju najmanje jednog rekombinantnog proteina koji obuhvata faze:

(a) Dobijanje lutke;

(b) Inokulisanje lutke iz faze (a) sa rekombinantnim bakulovirusom dobijenim od Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus (AcMNPV);

(c) Inkubiranje inokulisane lutke iz faze (b) za vremenski period dovoljan za najmanje jedan rekombinantni protein koji bi trebalo da se eksprimira; i

(d) Dobijanje lutaka koje obuhvataju najmanje jedan rekombinantni protein,

pri čemu lutka pripada rodu Trichoplusia.

10. Postupak prema zahtevu 9, pri čemu rekombinantni bakulovirus obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja omogućava ekspresiju iznad endogenih nivoa proteina IE-1, IE-0 i/ili njihovih fragmenata koji funkcionišu kao transkripcioni regulatori iznad endogenih nivoa proteina dobijenih tokom infekcije bakulovirusom, i rekombinantni homologni region (hr) operativno povezan sa bilo kojim promoterom koji je pogodan za upravljanje ekspresije rekombinantnog proteina, pri čemu su, sekvenca nukleinske kiseline koja omogućava ekspresiju iznad endogenih nivoa proteina IE-1, IE-0 i/ili njihovih fragmenata koji funkcionišu kao transkripcioni regulatori iznad endogenih nivoa proteina dobijenih tokom infekcije bakulovirusom, i rekombinantni homologni region (hr) operativno povezan sa bilo kojim promoterom koji je pogodan za upravljanje ekspresije rekombinantnog proteina, onakvi kako je definisano u zahtevima 3 i/ili 4;

pri čemu su, opciono, sekvenca nukleinske kiseline koja obuhvata kombinacije rekombinantnih promotera, sekvence koje kodiraju transkripcione regulatore i pojačivači regiona, odabrani iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 15-20.

11. Postupak prema bilo kom od zahteva 9 do 10, pri čemu lutka dalje obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja kodira rekombinantni protein.

12. Postupak prema zahtevu 9, pri čemu lutka iz faze (a) predstavlja lutku koja ne sadrži svilu;

pri čemu se, opciono, ta lutka koja ne sadrži svilu dobija ili se može dobiti postupkom za proizvodnju lutke koja ne sadrži svilu, koji obuhvata faze:

(a) Dobijanje lutke koja se nalazi u svilenoj larvi;

(b) Tretiranje svilene larve koja sadrži lutku rastvorom soli hipohloraste kiseline; i

(c) Dobijanje lutke koja ne sadrži svilu i koja je spolja dezinfikovana.

13. Postupak za proizvodnju rekombinantnog bakulovirusa koji obuhvata faze:

(a) Dobijanje lutke koja ne sadrži svilu koja pripada rodu Trichoplusia;

(b) Transfekcija lutke iz faze (a) sa bakamidom prikladnim za proizvodnju rekombinantnog bakulovirusa dobijenog od Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus (AcMNPV); (c) Inkubiranje inokulisane lutke iz faze (b) za vremenski period dovoljan da se proizvede rekombinantni bakulovirus; i

(d) Dobijanje lutaka koje obuhvataju rekombinantni bakulovirus.

14. Postupak prema zahtevu 13, pri čemu bakmid pogodan za proizvodnju rekombinantnog bakulovirusa dobijenog od Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus (AcMNPV)

1

obuhvata ili se alternativno, sastoji od, sekvence nukleinske kiseline koja omogućava ekspresiju iznad endogenih nivoa proteina IE-1, IE-0 i/ili njihovih fragmenata koji funkcionišu kao transkripcioni regulatori iznad endogenih nivoa proteina dobijenih tokom infekcije bakulovirusom, i rekombinantni homologni region (hr) operativno povezan sa bilo kojim promoterom koji je pogodan za upravljanje ekspresije rekombinantnog proteina, pri čemu su, sekvenca nukleinske kiseline koja omogućava ekspresiju iznad endogenih nivoa proteina IE-1, IE-0 i/ili njihovih fragmenata koji funkcionišu kao transkripcioni regulatori iznad endogenih nivoa proteina dobijenih tokom infekcije bakulovirusom, i rekombinantni homologni region (hr) operativno povezan sa bilo kojim promoterom koji je pogodan za upravljanje ekspresije rekombinantnog proteina, onakvi kako je definisano u zahtevima 3 i/ili 4; pri čemu su, opciono, sekvenca nukleinske kiseline koja obuhvata kombinacije rekombinantnih promotera, sekvence koje kodiraju transkripcione regulatore i pojačivači regiona odabrani iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 15-20.

15. Upotreba uređaja koji obuhvata preciznu pumpu, pokretnu mehaničku ruku i iglu pogodnu za ubrizgavanje tečnosti u lutku

za inokulisanje lutke koja pripada rodu Trichoplusia sa rekombinantnim bakulovirusom dobijenim od Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus (AcMNPV);

pri čemu, opciono, taj uređaj dalje obuhvata računarski program za definisanje položaja igle i/ili za izračunavanje udaljenosti igle od lutke i/ili udaljenosti prodiranja igle u lutku i/ili zapremine tečnosti koju je potrebno inokulisati u lutku.

1 1