RS59605B1

RS59605B1 - Kombinacija anti-cd19 antitela i inhibitora brutonove tirozin kinaze i njene upotrebe

Info

Publication number: RS59605B1
Application number: RS20191485A
Authority: RS
Inventors: Jan Endell; Rainer Boxhammer; Mark Winderlich
Original assignee: Morphosys Ag
Priority date: 2015-05-26
Filing date: 2016-05-25
Publication date: 2020-01-31
Also published as: KR20180004286A; JP2021152029A; ZA201707867B; HK1251152B; JP6916741B2; US20180153892A1; AU2024201029A1; CY1122298T1; JP2025016532A; EP3302550B1; US10617691B2; SMT201900647T1; JP2018516905A; PT3302550T; ES2754431T3; EP3302550A1; AU2022202796A1; CA2986175A1; LT3302550T; IL287433A

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Predmetni prikaz se odnosi na farmaceutsku kombinaciju anti-CD19 antitela i inhibitora Brutonove tirozin kinaze (BTK) za lečenje ne-Hočkinovog limfoma, hronične limfocitne leukemije i/ili akutne limfoblastne leukemije.

Osnov pronalaska

[0002] B ćelije su limfociti koji igraju veliku ulogu u humoralnom imunom odgovoru. Proizvode se u koštanoj srži većine sisara i predstavljaju 5-15% ukupnog broja limfoidnih ćelija u cirkulaciji. Glavna funkcija B ćelija je proizvodnja antitela protiv različitih antigena, i one predstavljaju komponentu adaptivnog imunog sistema od suštinskog značaja.

[0003] Zbog odlučujuće uloge B ćelija u regulaciji imunog sistema, gubitak njihove regulacije je povezan sa nizom poremećaja, kao što su limfomi i leukemije. Ovi poremećaji uključuju ne-Hočkinov limfom (NHL), hroničnu limfocitnu leukemiju (CLL) i akutnu limfoblastnu leukemiju (ALL).

[0004] NHL je heterogena maligna bolest poreklom od limfocita. U Sjedinjenim Državama (SAD), učestalost je procenjena na 65,000/godini sa smrtnošću od približno 20,000 (Američko društvo za rak, 2006; i Pregled statistike kancera SEER programa). Bolest može da se pojavi u svim životnim dobima, uobičajeno otpočinje kod odraslih osoba starijih od 40 godina, pri čemu se učestalost povećava sa starošću. NHL se odlikuje klonalnom proliferacijom limfocita koji se nagomilavaju u limfnim čvorovima, krvi, koštanoj srži i slezini, premda mogu da budu uključeni svi važniji organi. Sistem klasifikacije koji trenutno koriste patolozi i klinički lekari je Klasifikacija tumora po Svetskoj zdravstvenoj organizaciji (WHO), koja NHL svrstava u neoplazme prekursorskih i zrelih B-ćelija ili T-ćelija. Prema PDQ, za svrhe uključivanja u klinička ispitivanja, NHL se trenutno dele na neinvazivne i agresivne. Grupa neinvazivnih NHL primarno je sačinjena od folikularnih podtipova, limfoma malih limfocita, MALT (limfoidnih tkiva u vezi sa sluzokožom ) i marginalne zone; neinvazivni obuhvataju približno 50% pacijenata kod kojih je prvi put dijagnostifikovan NHL B-ćelija. Agresivni NHL uključuje pacijente sa histološkim dijagnozama primarno difuznih velikih B ćelija (DLBL, DLBCL ili DLCL) (40% svih pacijenata sa prvi put postavljenom dijagnozom imaju difuzne velike ćelije), Burkitovih i mantle ćelija. Klinički tok NHL je veoma raznolik. Glavni faktor koji određuje klinički tok je histološki podtip. Smatra se da većina neinvazivnih tipova NHL predstavljaju neizlečive bolesti. Inicijalno pacijenti odgovaraju na hemioterapiju ili terapiju antitelima, ali kod većine dolazi do recidiva. Do sada studije nisu pokazale da rana intervencija dovodi do poboljšanog preživljavanja. Kod pacijenata bez simptoma, prihvatljivo je "posmatranje i čekanje" sve dok se simptomi kod pacijenata ne jave ili dok se razvoj bolesti naizgled ne ubrza. Bolest tokom vremena može da se transformiše u agresivniju histološku sliku. Srednje preživljavanje iznosi 8 do 10 godina, a pacijenti sa neinvazivnom bolešću često prime 3 ili više tretmana tokom faze lečenja bolesti. Inicijalni tretman za NHL pacijente sa neinvazivnim simptomima tradicionalno je predstavljen kombinovanom hemioterapijom. Agensi koji se najčešće koriste uključuju: ciklofosfamid, vinkristin i prednizon (CVP); ili ciklofosfamid, adriamicin, vinkristin, prednizon (CHOP). Približno 70% do 80% pacijenata odgovoriće na svoju inicijalnu hemioterapiju, pri čemu remisije traju 2-3 godine. Na kraju se kod većine pacijenata javlja recidiv. Otkriće i klinička upotreba anti-CD20 antitela, rituksimaba, obezbedila je značajna poboljšanja odgovora i stope preživljavanja. Trenutni standard za lečenje većine pacijenata je rituksimab CHOP (R-CHOP) ili rituksimab CVP (R-CVP). Za inicijalni tretman NHL odobren je interferon u kombinaciji sa alkilirajućim agensima, ali u SAD ima ograničenu upotrebu. Pokazano je da je terapija rituksimabom efikasna kod nekoliko tipova NHL, i trenutno je odobrena kao tretman za prvu liniju lečenja i za neinvazivne (folikularni limfom) i za agresivne NHL (difuzni limfom velikih B ćelija). Postoje, međutim, značajna ograničenja anti CD20 monoklonskog antitela (mAb), uključujući primarnu rezistenciju (50% odgovora kod pacijenata sa neinvazivnim oblikom u relapsu), stečenu rezistenciju (stopa odgovora od 50% pri ponovljenom tretmanu), retkost potpunog odgovora (stopa potpunog odgovora 2% kod populacije u relapsu) i obrazac produženog ralapsa. Na kraju, mnoge B ćelije ne eksprimiraju CD20, i stoga mnogi poremećaji B-ćelija ne mogu da se leče pomoću terapije anti-CD20 antitelom.

[0005] Pored NHL postoji još nekoliko tipova leukemija koje nastaju usled poremećene regulacije B ćelija. Hronična limfocitna leukemija (poznata takođe i kao "hronična limfoidna leukemija" ili "CLL"), je tip adultne leukemije koju izaziva nenormalno nagomilavanje B limfocita. Kod CLL, maligni limfociti mogu da izgledaj normalno i zrelo, ali nisu u stanju da se efikasno bore sa infekcijom. CLL je najčešći oblik leukemije kod odraslih. CLL će se dvostruko verovatnije razviti kod muškaraca nego kod žena. Međutim, ključni faktor rizika je starost. Preko 75% novih slučajeva dijagnostifikuje se kod pacijenata starijih od 50 godina. Svake godine se dijagnostifikuje 10,000 slučajeva, a smrtnost iznosi skoro 5,000 godišnje (Američko društvo za rak, 2006; i Pregled statistike kancera SEER programa). CLL je neizlečiva bolest ali u većini slučajeva napreduje sporo. Mnogi ljudi oboleli od CLL vode normalan i aktivan život tokom velikog broja godina. Zbog svog sporog početka, CLL u ranim stadijumima se u principu ne leči, pošto se veruje da rana intervencija kod CLL-a ne poboljšava vreme preživljavanja ili kvalitet života. Umesto toga, stanje se tokom vremena prati. Inicijalni tretmani za CLL razlikuju se u zavisnosti od tačne dijagnoze i napredovanja bolesti. Postoji na desetine agenasa koji se koriste za terapiju CLL. Režimi kombinovane hemioterapije kao što je FCR (fludarabin, ciklofosfamid i rituksimab) i BR (ibrutinib i rituksimab), efikasni su kako kod prvi put postavljenih dijagnoza tako i kod relapsa CLL. Transplantacija alogene koštane srži (matičnih ćelija) retko se koristi kao tretman za prvu liniju lečenja CLL zbog rizika koje nosi.

[0006] Drugi tip leukemije je akutna limfoblastna leukemija (ALL), poznata takođe i kao akutna limfocitna leukemija. ALL se odlikuje preteranom proizvodnjom i kontinuiranim umnožavanjem malignih i nezrelih leukocita (poznatih takođe i kao limfoblasti) u koštanoj srži. ’Akutna’ se odnosi na nediferencirano, nezrelo stanje limfocita u cirkulaciji ("blasti"), i na to da bolest napreduje rapidno sa očekivanim preživljavanjem koje može da traje nedeljama do mesecima, ukoliko se stanje ne leči. ALL je najčešća u detinjstvu sa najvećom vrednošću incidence u starosnoj dobi od 4-5 godina. Deca starosti 12- 16 godina od nje umiru više od drugih pacijenata. Trenutno se najmanje 80% ALL dečijeg doba smatra izlečivim. Svake godine se dijagnostifikuje manje od 4,000 slučajeva, a smrtnost iznosi skoro 1,500 godišnje (Američko društvo za rak, 2006; i Pregled statistike kancera SEER programa).

[0007] Humani molekul CD 19 je strukturno osoben površinski receptor eksprimiran na površini humanih B ćelija, uključujući, ali ne i ograničeno na, pre-B ćelije, B ćelije tokom ranog razvoja {tj., nezrele B ćelije), zrele B ćelije sve do terminalne diferencijacije u plazma ćelije, i maligne B ćelije. CD 19 je eksprimiran kod većine pre-B akutnih limfoblastnih leukemija (ALL), ne-Hočkinovih limfoma, B ćelijskih hroničnih limfocitnih leukemija (CLL), pro-limfocitnih leukemija, leukemija vlasastih ćelija, običnih akutnih limfocitnih leukemija, i nekih akutnih nulllimfoblastnih leukemija (Nadler et al, J. Immunol., 131 :244-250 (1983), Loken et al, Blood, 70:1316-1324 (1987), Uckun et al, Blood, 71 :13- 29 (1988), Anderson et al, 1984. Blood, 63:1424-1433 (1984), Scheuermann, Leuk. Lymphoma, 18:385-397(1995)). Ekspresija CD 19 na plazma ćelijama dodatno ukazuje na to da bi ovaj molekul mogao da bude eksprimiran na diferenciranim tumorima B ćelija kao što su multipli mijelom, plazmocitomi, Valdenstromovi tumori (Grossbard et al., Br. J. Haematol, 102:509- 15(1998); Treon et al, Semin. Oncol, 30:248-52(2003)).

[0008] Stoga je antigen CD 19 ciljni molekul za imunoterapiju u lečenju ne-Hočkinovog limfoma (uključujući svaki od ovde opisanih podtipova), hronične limfocitne leukemije i/ili akutne limfoblastne leukemije.

[0009] Neke CD19 terapije su već prikazane. T ćelije koje eksprimiraju anti-CD19 himerni receptor za antigen (CAR) uključujući i CD3-ζ i 4-BBkostimulatorni domen primenjene su kod tri pacijenta sa uznapredovalim CLL (Kalos et al., T cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia, Science Translational Medicine, vol.3, no. 95 ,10 August 2011). Publikacija Sadelain et al., The promise and potential pitfalls of chimeric antigen receptors, Current Opinion in Immunology, Elsevier, vol. 21, no.2, 2 April 2009, takođe opisuje anti-CD19 himerne receptore za antigen (CARs). Međutim, ni Kalos et al. niti Sadelain et al., ne opisuju antitelo specifično za CD19 u kombinaciji sa inhibitorom Brutonove tirozin kinaze (BTK), kao što je ovde prikazano.

[0010] Upotreba CD19 antitela u nespecifičnim limfomima B ćelija razmatra se u WO2007076950 (US2007154473) zajedno sa usputnim pominjanjem ibrutiniba u okviru dugačke liste potencijalnih partnera za kombinovanje, ali propušta bilo da predstavi ovde prikazano antitelo, bilo da nagovesti sinergističko delovanje kombinacije u lečenju ne-Hočkinovog limfoma, hronične limfocitne leukemije i/ili akutne limfoblastne leukemije, kao što je ovde prikazano.

[0011] Upotreba CD19 antitela kod CLL, NHL i ALL opisana je kod Scheuermann et al., CD19 Antigen in Leukemia and Lymphoma Diagnosis and Immunotherapy, Leukemia and Lymphoma, Vol. 18, 385-397 (1995), ali propušta da nagovesti kombinaciju koja je ovde prikazana.

[0012] Dodatna antitela specifična za CD19 opisana su u WO2005012493, WO2010053716 (kompanija Immunomedics); WO2007002223 (kompanija Medarex); WO2008022152 i WO2008150494 (kompanija Xencor), WO2008031056 (kompanija Medimmune); WO 2007076950 (kompanija Merck Patent GmbH); WO 2009/052431 (kompanija Seattle Genetics); i WO2010095031 (kompanija Glenmark Pharmaceuticals), WO2012010562 i WO2012010561 (kompanija International Drug Development), WO2011147834 (kompanija Roche Glycart), i WO 2012/156455 (kompanija Sanofi).

[0013] Kombinacije antitela specifičnih za CD19 i drugih agenasa, opisane su u WO2010151341 (Fajnštajnov institut); US5686072 (Univerzitet u Teksasu) i WO2002022212 (kompanija IDEC Pharmaceuticals), WO2013/024097 (kompanija MorphoSys AG) i WO2013/024095 (kompanija MorphoSys AG).

[0014] Neki inhibitori Brutonove tirozin kinaze su komercijalno dostupni. Ibrutinib, takođe poznat i kao PCI-32765, koji se nalazi na tržištu pod imenom Imbruvica predstavlja antikancerski lek koji ciljano deluje na maligne bolesti B-ćelija. Ibrutinib je opisan u SAD Patentima br.7,514,444; 8,008,309; 8,697,711; 8,735,403; 8,957,079; i 8,754,090.

[0015] Ibrutinib je testiran u kombinaciji sa rituksimabom (koji predstavlja anti-CD20 antitelo). Burger et al., Lancet Oncol., 2014 September, 15(19): 1090-1099. Ibrutinib potencijalno aktivira ADCC delovanje nekih CD20 antitela in vitro. Duong et al., mAbs, Jan/Feb 2015, 192-198 i Kohrt et al., Blood, 2014, 123:1957-1960.

[0016] Publikacija autora Wu et al. (Journal of Hematology & Oncology 2013, 6:36) obezbeđuje pregled jedinjenja koja su dostupna za lečenje hronične limfocitne leukemije i sumira kliničke rezultate. Između ostalog, tu se razmatraju ibrutinib i XmAb5574 (=MOR00208).

[0017] Jasno je da uprkos skorašnjem napretku u otkrivanju i razvijanju anti-kancerskih sredstava, mnogi oblici raka sa tumorima koji eksprimiraju CD19 i dalje imaju slabu prognozu. Dakle, postoji potreba za poboljšanim postupcima za lečenje ovih oblika raka.

Kratak opis pronalaska

[0018] U prethodnom stanju tehnike se ne nagoveštava sinergističko delovanje, niti pojedinačno, niti u kombinacijama, koje pokazuje kombinacija ovde predstavljenog antitela i ibrutiniba u lečenju ne-Hočkinovog limfoma, hronične limfocitne leukemije i/ili akutne limfoblastne leukemije.

[0019] U jednom aspektu, predmetni prikaz se odnosi na sinergističku kombinaciju antitela specifičnog za CD19 i inhibitora Brutonove tirozin kinaze (BTK). Ove kombinacije su korisne u lečenju malignih bolesti B ćelija, kao što su ne-Hočkinov limfom, hronična limfocitna leukemija i/ili akutna limfoblastna leukemija.

[0020] Smatra se da in vitro modeli ukazuju na to kako bi se neko jedinjenje ili kombinacija jedinjenja ponašalo kod ljudi.

[0021] MEC-1 ćelije u ovom in vitro modelu ukazuju na to kako će kombinacija funkcionisati prilikom lečenja hronične limfoidne leukemije (CLL) kod ljudi. Ramos ćelije u ovom in vitro modelu ukazuju na to kako će kombinacija funkcionisati prilikom lečenja ne-Hočkinovog limfoma (NHL) kod ljudi. MEC-1 ćelije (DSMZ# ACC497) predstavljaju ćelijsku liniju hronične B-ćelijske leukemije. Ramos ćelije (ATCC broj CRL-1596) su humane ćelije Burkitovog limfoma.

[0022] Osim toga, kada se jedinjenja kombinuju in vitro, očekuje se da kombinacija pokazuje samo aditivni efekat. Iznenađujuće, ovi pronalazači su pokazali da je kombinacija određenog antitela specifičnog za CD19 i ibrutiniba posredovala u sinergističkom nivou specifičnog ubijanja ćelija in vitro ako se poredi sa delovanjem antitela i ibrutiniba pojedinačno. Konkretno, pronalazači su našli da je kombinacija MOR00208 i ibrutiniba posredovala u sinergističkom nivou specifičnog ubijanja ćelija in vitro kod MEC-1 ćelija, u poređenju sa antitelom i ibrutinibom kada su sami.

[0023] Pored toga, i takođe neočekivano, pronalazači su pokazali da je kombinacija određenog antitela specifičnog za CD19 i ibrutiniba imala izvesna funkcionalna svojstva, ako se poredi sa antitelom i ibrutinibom kada su sami.

[0024] Ukratko, kombinacija prikazanog anti-CD19 antitela i ibrutiniba pokazala je sinergističko ponašanje u modelima koji su od značaja za CLL. Kako CLL predstavlja poremećaj povezan sa B ćelijama, a CD19 je u velikoj meri eksprimiran na B-ćelijama, ovde prikazana kombinacija bi imala isti mehanizam delovanja i takođe bi trebalo da pokazuje sinergističko ponašanje prilikom lečenja drugih poremećaja povezanih sa B-ćelijama, npr. ALL i NHL.

[0025] Dakle, kombinacija prikazanog antitela specifičnog za CD19 i ibrutiniba bi trebalo da bude efikasna u lečenju ljudi od ne-Hočkinovog limfoma, hronične limfocitne leukemije i/ili akutne limfoblastne leukemije. Očekivana efikasnost kombinacije prikazanog antitela specifičnog za CD19 i ibrutiniba biće potvrđena u kliničkim ispitivanjima.

[0026] Pošto su mehanizmi delovanja ibrutiniba i drugih inhibitora Brutonove tirozin kinaze (BTK) slični, jer svi funkcionišu tako što inhibiraju tirozin proteinsku kinazu, enzim BTK, koja igra ključnu ulogu u razvoju B-ćelija, veruje se da bi trebalo da se uočava sinergija i kada se ljudi koji imaju ne-Hočkinov limfom, hroničnu limfocitnu leukemiju i/ili akutnu limfoblastnu leukemiju leče kombinacijom anti-CD19 antitela navedenog kao primer i drugih inhibitora Brutonove tirozin kinaze (BTK) osim ibrutiniba.

[0027] Pošto se anti-CD19 antitelo navedeno kao primer i druga anti-CD19 antitela vezuju za CD19, veruje se da bi trebalo da se sinergija uočava i kada se ljudi koji imaju ne-Hočkinov limfom, hroničnu limfocitnu leukemiju i/ili akutnu limfoblastnu leukemiju, leče kombinacijom bilo kog anti-CD19 antitela i inhibitora Brutonove tirozin kinaze (BTK), npr., ibrutiniba.

[0028] Jedan aspekt prema predmetnom pronalasku obuhvata sinergističku kombinaciju kod koje antitelo specifično za CD19 sadrži HCDR1 region sa sekvencom SYVMH (SEQ ID NO: 1), HCDR2 region sekvence NPYNDG (SEQ ID NO: 2), HCDR3 region sa sekvencom GTYYYGTRVFDY (SEQ ID NO: 3), LCDR1 region sa sekvencom RSSKSLQNVNGNTYLY (SEQ ID NO: 4), LCDR2 region sa sekvencom RMSNLNS (SEQ ID NO: 5), i LCDR3 region sa sekvencom MQHLEYPIT (SEQ ID NO: 6) i ibrutinib. U poželjnim aspektima, kombinacija se koristi za lečenje ne-Hočkinovog limfoma, hronične limfocitne leukemije i/ili akutne limfoblastne leukemije.

Opis crteža

[0029]

Slika 1 prikazuje citotoksično delovanje MOR00208 i ibrutiniba na Ramos ćelije, pojedinačno i u kombinaciji. Ramos ćelije su prethodno tretirane sa 40mM ibrutinibom tokom 24 sata.

Slika 2 prikazuje citotoksično delovanje MOR00208 i ibrutiniba na MEC-1 ćelije, pojedinačno i u kombinaciji. MEC-1 ćelije su prethodno tretirane sa 30mM ibrutinibom tokom 24 sata.

Slika 3 prikazuje citotoksično delovanje MOR00208 i ibrutiniba na MEC-1 ćelije, pojedinačno i u kombinaciji. MEC-1 ćelije su prethodno tretirane sa 30mM ibrutinibom tokom 24 sata.

Slika 4 prikazuje aminokiselinski sekvencu varijabilnih domena MOR00208.

Slika 5 prikazuje aminokiselinsku sekvencu Fc regiona MOR00208.

Slike 6-8 prikazuju citotoksičnost MOR00208 i ibrutiniba na MEC-1 ćelijsku liniju, pojedinačno i u kombinaciji.

Slike 9-11 prikazuju krive za indeks kombinovanja po Chou-Talay-u za MOR00208 i ibrutinib u kombinaciji, kod MEC-1 ćelijske linije.

Slike 12-20 prikazuju izračunavanje sinergije prema Clarke et al. za MOR00208 i ibrutinib u kombinaciji, kod MEC-1 ćelijske linije.

Detaljan opis pronalaska

[0030] "Sinergija", "sinergizam" ili "sinergistički" podrazumeva više od očekivanog aditivnog efekta neke kombinacije. "Sinergija", "sinergizam" ili "sinergistički" efekat kombinacije je ovde određen postupcima prema Chou et al., Clarke et al. i/ili Webb et al. Videti Ting-Chao Chou, Theoretical Basis, Experimental Design, and Computerized Simulation of Synergism and Antagonism in Drug Combination Studies, Pharmacol Rev 58:621-681 (2006). Videti takođe Clarke et al., Issues in experimental design and endpoint analysis in the study of experimental cytotoxic agents in vivo in breast cancer and other models, Breast Cancer Research and Treatment 46:255 278 (1997). Videti takođe Webb, J. L. (1963) Enzyme and Metabolic Inhibitors, Academic Press, New York.

[0031] Izraz "antitelo" podrazumeva monoklonska antitela, uključujući bilo koji izotop, kao recimo IgG, IgM, IgA, IgD i IgE. IgG antitelo je sačinjeno od dva identična teška lanca i dva identična laka lanca koji su povezani disulfidnim vezama. Svaki teški i laki lanac sadrži konstantni region i varijabilni region. Svaki varijabilni region sadrži tri segmenta koji su označeni kao "regioni koji određuju komplementarnost" ("CDR") ili "hipervarijabilni regioni", koji su primarno odgovorni za vezivanje za epitop antigena. Oni se označavaju kao CDR1, CDR2 i CDR3, a brojevima se obeležavaju redom počev od N-terminusa. Konzervativniji delovi varijabilnih regiona izvan CDR regiona zovu se "’okvirni’ regioni". "Fragment antitela" podrazumeva Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab’ F(ab’)2 fragment, ili neki drugi fragment, koji sadrži najmanje jedan varijabilan teški ili varijabilan laki lanac, od kojih svaki sadrži CDR regione i okvirne regione.

[0032] "Inhibitor Brutonove tirozin kinaze (BTK)" je klasa lekova koji funkcionišu putem inhibicije tirozinske protein-kinaze, enzima BTK, koji igra važnu ulogu u razvoju B-ćelija. Konkretno, BTK sadrži PH domen koji vezuje fosfatidilinozitol (3,4,5) trisfosfat (PIP3).

Vezivanje PIP3 dovodi do toga da Btk fosforiliše fosfolipazu C, koja zatim hidrolizuje PIP2, fosfatidilinozitol, na dva sekundarna glasnika, inozitol trifosfat (IP3) i diacilglicerol (DAG), koji, sa svoje strane, moduliraju aktivnost nizvodnih proteina u signalnom putu B-ćelija.

[0033] Inhibitori Brutonove tirozin kinaze (BTK) uključuju ibrutinib. Ibrutinib prodaju kompanije Pharmacyclics, Inc i Johnson & Johnson’s Janssen Pharmaceutical (registrovano ime Imbruvica, takođe označen i kao PCI-32765). Ibrutinib je trenutno markiran kao lek za lečenje pacijenata sa limfomom mantle ćelija (MCL) koji su prethodno primili najmanje jednu terapiju, hroničnom limfocitnom leukemijom (CLL), koji su prethodno primili najmanje jednu terapiju, hroničnom limfocitnom leukemijom sa delecijom 17p i Valdenstromovom makroglobulinemijom. Formula ibrutiniba je 1-[(3R)-3-[4-amino-3-(4-fenoksifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il]-1-piperidinil]-2 propen-1-on i ima sledeću strukturu:

[0034] Ibrutinib je inhibitor BTK čiji je molekul mali. Ibrutinib formira kovalentnu vezu sa cisteinskim ostatkom u aktivnom mestu BTK, što dovodi do inhibicije enzimske aktivnosti BTK. BTK je signalni molekul u signalnim putevima B-ćelijskog receptora za antigen (BCR) i receptora za citokine. Uloga BTK u signalnom putu koji se odvija preko receptora na površini B-ćelija, dovodi do aktivacije puteva koji su neophodni za cirkulaciju, hemotaksiju i adheziju B-ćelija. Nekliničke studije pokazuju da ibrutinib inhibira proliferaciju i preživljavanje malignih B-ćelija in vivo kao i migraciju ćelija i adheziju za supstrat in vitro.

[0035] Dodatni inhibitori Brutonove tirozin kinaze (BTK) uključuju:

ACP-196 (kompanije Acerta Pharma BV), koji je opisan u WO 2012170976, WO 2013010380 i WO 2014113932 ;

BGB-3111 (kompanije BeiGene, Co., Ltd.), i CC-292, iz publikacije Evans et al.2013

[0036] "VH" se odnosi na varijabilni region imunoglobulinskog teškog lanca antitela ili fragmenta antitela. "VL" se odnosi na varijabilni region imunoglobulinskog lakog lanca antitela ili fragmenta antitela.

[0037] Izraz "CD19" se odnosi na protein poznat kao CD19, koji ima sledeće sinonime: B4, antigen B-limfocita CD19, površinski antigen B-limfocita B4, CVID3, antigen diferencijacije CD19, MGC12802 i površinski antigen T-ćelija, Leu-12.

[0038] Humani CD19 ima aminokiselinsku sekvencu:

[0039] "MOR00208" je anti-CD19 antitelo. Aminokiselinska sekvenca varijabilnih domena je obezbeđena na slici 4. Aminokiselinska sekvenca Fc regiona teškog i lakog lanca MOR00208 obezbeđena je na slici 5. "MOR00208" i "XmAb 5574" koriste se kao sinonimi koji opisuju antitelo prikazano na slikama 4 i 5. Antitelo MOR00208 je opisano u SAD patentu 8,524,867.

[0040] U US 8,524,867 se na sledeći način opisuje antitelo označeno kao 4G7 H1.52 hibrid S239D/I332E / 4G7 L1.155 (kasnije nazvano MOR00208):

>4G7 H1.52 hibrid S239D/I332E

> 4G7 L1.155

[0041] "Fc region" podrazumeva konstantan region antitela, koji kod ljudi može da pripada potklasama IgG1, 2, 3, 4 ili nekoj drugoj. Sekvence humanih Fc regiona dostupne su na internet

1

stranici IMGT, Human IGH C-REGIONs, http://www.imgt.org/IM-GTrepertoire/Proteins /protein/human/IGH/IGHC/Hu_IGHCallgenes.html (preuzeto 16. maja 2011.).

[0042] "RefmAb33" je antitelo sa sledećom aminokiselinskom sekvencom:

Teški lanac, uključujući Fc region:

Laki lanac, uključujući Fc region:

[0043] RefmAb33 je specifično za RSV i koristi se kao kontrola izotipa, pošto ima isti Fc region kao i MOR00208.

[0044] "Kombinacija" podrazumeva više od jedne kategorije, npr. jedinjenje kao što je antitelo i ibrutinib.

[0045] Predmetni prikaz odnosi se takođe na kombinacije, farmaceutike i farmaceutske kompozicije koje sadrže opisane kombinacije. Dve komponente sinergističke kombinacije prema predmetnom pronalasku, npr. antitelo specifično za CD19 i ibrutinib, mogu da se primenjuju zajedno, istovremeno, odvojeno i jedna posle druge, bilo fizički ili vremenski.

[0046] Ibrutinib se za sada uzima oralno i dozira jednom na dan. MOR00208 se za sada primenjuje intravenski i trenutno se dozira ili jednom nedeljno ili jednom u dve nedelje.

[0047] Poželjno, primena oba leka omogućava da oba budu aktivna u pacijentu u isto vreme. Na primer, ako se MOR208 dozira nedeljno a ibrutinib dnevno, onda je aktivna supstanca oba leka prisutna u pacijentu u isto vreme. U jednom primeru izvođenja, ibrutinib se primenjuje pre i/ili odvojeno od, primene antitela specifičnog za CD19, npr. MOR00208.

[0048] Istovremeno podrazumeva da su dve komponente primenjene u isto vreme, pri čemu su obe komponente (lekovi) aktivne u pacijentu u isto vreme. Izraz "sinergizam" implicira da su oba leka aktivna u pacijentu u isto vreme.

[0049] Primenjene zajedno može da znači primenjene u isto vreme.

[0050] Dve komponente mogu da budu formulisane u različitim farmaceutskim kompozicijama. Farmaceutska kompozicija uključuje aktivni agens, npr., antitelo za terapeutsku upotrebu kod ljudi. Farmaceutska kompozicija može da uključuje prihvatljive nosače ili ekscipijense.

[0051] "Primenjen" ili "primena" uključuje, ali nije ograničeno na, dostavu u obliku za ubrizgavanje, kao što je, na primer, intravenska, intramuskularna, intradermalna ili potkožna ruta ili mukozna ruta, na primer, u vidu nazalnog spreja ili aerosola za inhalaciju, ili u vidu rastvora, kapsule ili tablete koja može da se proguta.

[0052] "Terapeutski efikasna količina" jedinjenja ili kombinacije odnosi se na količinu dovoljnu da izleči, ublaži ili delimično zaustavi kliničko ispoljavanje date bolesti ili poremećaja i njihove komplikacije. Količina koja je efikasna za određenu terapeutsku svrhu zavisiće od ozbiljnosti bolesti ili povrede kao i od težine i opšteg stanja subjekta. Smatraće se da određivanje odgovarajuće doze može da se postigne putem rutinskog eksperimentisanja, tako što se konstruiše matrica sa vrednostima i testiraju različite tačke matrice, što sve spada u domen uobičajenih veština iskusnog lekara ili kliničkog naučnika.

[0053] "CDR" je ovde definisano ili publikacijom Chothia et al ili Kabat et al. Videti Chothia C, Lesk AM. (1987) Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins. J Mol Biol., 196(4):901-17. Videti Kabat E.A, Wu T.T., Perry H.M., Gottesman K.S. and Foeller C. (1991). Sequences of Proteins of Immunological Interest.5th edit., NIH Publication no.91-3242, US Dept. of Health and Human Services, Washington, DC.

[0054] „Učestvuje u unakrsnoj kompeticiji“ podrazumeva sposobnost antitela ili nekog drugog vezujućeg agensa da ometa vezivanje drugih antitela ili vezujućih agenasa za CD19 u nekom od standardnih testova kompetitivnog vezivanja. Sposobnost ili stepen u kome antitelo ili drugi vezujući agens može da ometa vezivanje drugog antitela ili vezujućeg molekula za CD19, i, stoga, da li se može reći da učestvuje u unakrsnoj kompeticiji prema pronalasku, može da se odredi upotrebom standardnih kompetitivnih testova za vezivanje. Jedan pogodan test uključuje upotrebu Biacore tehnologije (npr. koristeći instrument BIAcore 3000 (kompanija Biacore, Upsala, Švedska)), koja može da meri stepen interakcija koristeći tehnologiju površinske plazmonske rezonance. Drugi test za merenje unakrsne kompeticije koristi pristup koji se bazira na ELISA tehnologiji. Postupak za karakterizaciju antitela velikog kapaciteta obrade, označen kao binovanje epitopa, koji se bazira na njihovoj unakrsnoj kompeticiji, opisan je u internacionalnoj patentnoj prijavi br. WO 2003/48731

[0055] Izraz "epitop" uključuje bilo koju proteinsku determinantu koja može da se veže za antitelo ili na drugi način interaguje sa nekim molekulom. Epitopske determinante se u principu sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupa na molekulima kao što su aminokiseline ili ugljeni hidrati ili bočni lanci šećera i mogu da imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifična naelektrisanja. Epitop može da bude "linearan" ili "konformacioni". Izraz "linearni epitop" odnosi se na epitop kod koga su sve tačke interakcije između proteina i interagujućeg molekula (kao što je antitelo) smeštene linearno duž primarne aminokiselinske sekvence proteina (u kontnuitetu). Izraz " konformacioni epitop" odnosi se na epitop kod koga aminokiseline nisu kontinuirane ali se međusobno približavaju u trodimenzionalnoj konformaciji. U konformacionom epitopu, tačke interakcije prostiru se preko aminokiselinskih ostataka na proteinu koji su međusobno odvojeni.

[0056] "Vezuje se za isti epitop kao i" podrazumeva sposobnost antitela ili drugog vezujućeg agensa da se veže za CD19 i da ima isti epitop kao i prikazano antitelo. Epitopi prikazanog antitela i drugih antitela na CD19 mogu da se odrede upotrebom standardnih tehnika za mapiranje epitopa. Tehnike za mapiranje epitopa, dobro poznate u oblasti, uključuju protokole za mapiranje epitopa iz publikacije Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E.Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey. Na primer, linearni epitopi mogu da se odrede tako što se, npr. istovremeno sintetiše veliki broj peptida na čvrstim podlogama, pri čemu peptidi odgovaraju delovima proteinskog molekula, i zatim izlože reakciji sa antitelima dok su još vezani za podlogu. Ove tehnike su poznate u oblasti i opisane su u, npr., SAD patentu br.

4,708,871 ; Geysen et al, (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:3998-4002; Geysen et al, (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:78-182; Geysen et al, (1986) Mol. Immunol. 23 :709-715. Na sličan način se konformacioni epitopi lako identifikuju tako što se odredi prostorna konformacija aminokiselina, npr. izmenom vodonik/deuterijum, rendgenskom kristalografijom i dvodimenzionalnom nuklearnom magnetnom rezonancom. Videti, npr., Protokole za mapiranje epitopa iz publikacije prethodno navedene u tekstu. Antigeni regioni proteina mogu takođe da se identifikuju upotrebom standardnih grafika antigenosti i hidropatije, kao što su grafici koji se izračunavaju, npr., pomoću softverskog programa Omiga verzija 1.0 koji može da se dobije od Oksfordske molekularne grupe. Ovaj kompjuterski program koristi metod po Hopp/Woods-u, Hopp et al, (1981) Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:3824-3828; za određivanje profila antigenosti i tehniku po Kyte-Doolittle-u, Kyte et al, (1982) J.Mol. Biol.157: 105-132; za grafike hidropatije.

Primeri izvođenja

[0057] Jedan aspekt predmetnog prikaza je kombinacija koja sadrži antitelo specifično za CD19 i inhibitor Brutonove tirozin kinaze (BTK) za upotrebu u lečenju ne-Hočkinovog limfoma, hronične limfocitne leukemije i/ili akutne limfoblastne leukemije.

[0058] Ovde su kombinacije prikazanog anti-CD19 antitela i ibrutiniba pokazale sinergističko ponašanje u in vitro modelima koji su od značaja za CLL. Kako CLL predstavlja poremećaj povezan sa B ćelijama, a CD19 je u velikoj meri eksprimiran na B-ćelijama, ovde prikazana

1

kombinacija bi trebalo da ima isti mehanizam delovanja i takođe bi trebalo da pokazuje sinergističko ponašanje prilikom lečenja drugih poremećaja povezanih sa B-ćelijama, npr. ALL i NHL. Dakle, kombinacija prikazanog antitela specifičnog za CD19 i ibrutiniba bi trebalo da bude efikasna u lečenju ljudi od ne-Hočkinovog limfoma, hronične limfocitne leukemije i/ili akutne limfoblastne leukemije. Očekivana efikasnost kombinacije prikazanog antitela specifičnog za CD19 i ibrutiniba biće potvrđena u kliničkim ispitivanjima.

[0059] MEC-1 ćelije (DSMZ# ACC497), koje pripadaju ćelijskoj liniji hronične B-ćelijske leukemije, su testirane. MEC-1 ćelije u ovom in vitro modelu ukazuju na to kako će kombinacija funkcionisati u lečenju hronične limfoidne leukemije (CLL) kod ljudi. Vrednosti indeksa po Chou-u jasno ukazuju na sinergizam kombinacije MOR00208 i ibrutiniba prilikom specifičnog ubijanja MEC- 1 ćelija, kada se poredi sa samim MOR00208 i samim ibrutinibom.

[0060] Ocenjene su i dodatne ćelijske linije: Ramos ćelije (ATCC broj CRL-1596), humane ćelije Burkitovog limfoma. HG-3 (DSMZ#ACC765) i CII (DSMZ#ACC773) su ćelijske linije hronične limfocitne leukemije. Su-DHL 6 (DSMZ#ACC572), U2932 (DSMZ#ACC633) i OCI-LY7 (DSMZ#ACC688) su ćelijske linije difuznih limfoma velikih B-ćelija (DLBCL). JVM-2 (ATCC® CRL-3002) je ćelijska linija limfoma mantle ćelija. BALL-1 (DSMZ#ACC742) je ćelijska linija akutne limfoblastne leukemije.

[0061] Ramos ćelije u ovom in vitro modelu ukazuju na to kako će kombinacija funkcionisati prilikom lečenja ne-Hočkinovog limfoma (NHL) kod ljudi. HG-3 i CII ćelije u ovom in vitro modelu ukazuju na to kako će kombinacija funkcionisati prilikom lečenja hronične limfoidne leukemije (CLL) kod ljudi. Su-DHL 6, U2932 i OCI-LY7 ćelije u ovom in vitro modelu ukazuju na to kako će kombinacija funkcionisati prilikom lečenja ne-Hočkinovog limfoma kod ljudi. JVM-2 ćelije u ovom in vitro modelu ukazuju na to kako će kombinacija funkcionisati prilikom lečenju ne-Hočkinovog limfoma kod ljudi. BALL-1 ćelije u ovom in vitro modelu ukazuju na to kako će kombinacija funkcionisati prilikom lečenja akutne limfoblastne leukemije kod ljudi.

[0062] Ukratko, kombinacija prikazanog anti-CD19 antitela i ibrutiniba pokazala je sinergističko ponašanje u modelima koji su od značaja za CLL.

[0063] Dakle, kombinacija prikazanog antitela specifičnog za CD19 i ibrutiniba bi trebalo da bude efikasna prilikom lečenja ljudi od ne-Hočkinovog limfoma, hronične limfocitne leukemije i/ili akutne limfoblastne leukemije.

[0064] Pošto je mehanizam delovanja ibrutiniba i drugih inhibitora Brutonove tirozin kinaze (BTK) sličan, budući da svi funkcionišu tako što inhibiraju tirozinsku protein kinazu, enzim BTK, koji igra centralnu ulogu pri razvoju B-ćelija, veruje se da bi sinergija trebalo da se uočava i prilikom lečenja ljudi koji imaju ne-Hočkinov limfom, hroničnu limfocitnu leukemiju i/ili akutnu limfoblastnu leukemiju, kombinacijom prikazanog anti-CD19 antitela i inhibitora Brutonove tirozin kinaze (BTK) koji nije ibrutinib.

[0065] Pošto se prikazano anti-CD19 antitelo i druga anti-CD19 antitela vezuju za CD19, veruje se da bi trebalo da se sinergija takođe uočava i kada se ljudi koji imaju ne-Hočkinov limfom, hroničnu limfocitnu leukemiju i/ili akutnu limfoblastnu leukemiju, leče kombinacijom bilo kog anti-CD19 antitela i inhibitora Brutonove tirozin kinaze (BTK), pri čemu je anti-CD19 antitelo, na primer, opisano u SAD patentnoj prijavi pod serijskim brojem 12/377,251 (kompanija Xencor), WO2005012493, WO2010053716 (kompanija Immunomedics); WO2007002223 (kompanija Medarex); WO2008022152 (kompanija Xencor); WO2008031056 (kompanija Medimmune); WO 2007/076950 (kompanija Merck Patent GmbH); WO 2009/052431 (kompanija Seattle Genetics); i WO2010095031 (kompanija Glenmark Pharmaceuticals).

[0066] U nekim aspektima predmetnog prikaza, antitelo specifično za CD19 sadrži antitelo koje stupa u unakrsnu kompeticiju sa antitelom koje sadrži HCDR1 region sa sekvencom SYVMH (SEQ ID NO: 1), HCDR2 region sa sekvencom NPYNDG (SEQ ID NO: 2), HCDR3 region sa sekvencom GTYYYGTRVFDY (SEQ ID NO: 3), LCDR1 region sa sekvencom RSSKSLQNVNGNTYLY (SEQ ID NO: 4), LCDR2 region sa sekvencom RMSNLNS (SEQ ID NO: 5), i LCDR3 region sa sekvencom MQHLEYPIT (SEQ ID NO: 6).

[0067] U nekim aspektima predmetnog prikaza, antitelo specifično za CD19 sadrži antitelo koje se vezuje za isti epitop kao i antitelo koje sadrži HCDR1 region sa sekvencom SYVMH (SEQ ID NO: 1), HCDR2 region sa sekvencom NPYNDG (SEQ ID NO: 2), HCDR3 region sa sekvencom GTYYYGTRVFDY (SEQ ID NO: 3), LCDR1 region sa sekvencom RSSKSLQNVNGNTYLY (SEQ ID NO: 4), LCDR2 region sa sekvencom RMSNLNS (SEQ ID NO: 5), i LCDR3 region sa sekvencom MQHLEYPIT (SEQ ID NO: 6)

[0068] U primerima izvođenja, antitelo specifično za CD19 sadrži HCDR1 region sa sekvencom SYVMH (SEQ ID NO: 1), HCDR2 region sa sekvencom NPYNDG (SEQ ID NO: 2), HCDR3 region sa sekvencom GTYYYGTRVFDY (SEQ ID NO: 3), LCDR1 region sa sekvencom RSSKSLQNVNGNTYLY (SEQ ID NO: 4), LCDR2 region sa sekvencom RMSNLNS (SEQ ID NO: 5), i LCDR3 region sa sekvencom MQHLEYPIT (SEQ ID NO: 6).

[0069] U primerima izvođenja, antitelo specifično za CD19 sadrži varijabilni teški lanac sa sekvencom EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGYTFTSYVMHWVRQAPGKGLEWIGYINPY NDGTKYNEKFQGRVTISSDKSISTAYMELSSLRSEDTAMYYCARGTYYYGTRVFDYWG QGTLVTVSS (SEQ ID NO: 10) i varijabilan laki lanac sa sekvencom

1

[0070] U nekim primerima izvođenja pomenuto antitelo sadrži konstantan domen teškog lanca sa sekvencom

[0071] U primerima izvođenja, antitelo specifično za CD19 sadrži konstantan domen lakog lanca sa sekvencom

[0072] U primerima izvođenja, inhibitor Brutonove tirozin kinaze (BTK) je ibrutinib.

[0073] U primerima izvođenja, komponente kombinacije, antitelo specifično za CD19 i ibrutinib, se primenjuju odvojeno. U jednom primeru izvođenja, ibrutinib se primenjuje pre primene antitela specifičnog za CD19.

[0074] U primerima izvođenja se komponente kombinacije primenjuju u isto vreme, pri čemu su obe komponente (oba leka) aktivne u pacijentu u isto vreme. Izraz "sinergizam" ukazuje na to da su oba leka aktivna u pacijentu u isto vreme. U primerima izvođenja, komponente kombinacije se primenjuju zajedno, istovremeno, odvojeno i jedna posle druge, bilo fizički ili vremenski. U primerima izvođenja, komponente kombinacije se primenjuju istovremeno.

[0075] U primerima izvođenja kombinacija je farmaceutska kompozicija. U primerima izvođenja kompozicija sadrži prihvatljivi nosač. U primerima izvođenja, kombinacija se primenjuje u efikasnoj količini.

[0076] U drugom aspektu, sinergistička kombinacija antitela specifičnog za CD19 koje sadrži HCDR1 region sa sekvencom SYVMH (SEQ ID NO: 1), HCDR2 region sa sekvencom NPYNDG (SEQ ID NO: 2), HCDR3 region sa sekvencom GTYYYGTRVFDY (SEQ ID NO: 3), LCDR1 region sa sekvencom RSSKSLQNVNGNTYLY (SEQ ID NO: 4), LCDR2 region sa sekvencom RMSNLNS (SEQ ID NO: 5), i LCDR3 region sa sekvencom MQHLEYPIT (SEQ ID NO: 6) i ibrutinib, mogu da posreduju u ubijanju MEC-1 ćelija putem ADCC u prisustvu

1

izolovanih humanih PBMC ćelija, sa najmanje dvostruko, trostruko, četvorostruko ili petostruko boljom efikasnošću nego sam ibrutinib.

[0077] Jedan aspekt predmetnog prikaza sadrži sinergističku kombinaciju antitela specifičnog za CD19 koje sadrži HCDR1 region sa sekvencom SYVMH (SEQ ID NO: 1), HCDR2 region sa sekvencom NPYNDG (SEQ ID NO: 2), HCDR3 region sa sekvencom GTYYYGTRVFDY (SEQ ID NO: 3), LCDR1 region sa sekvencom RSSKSLQNVNGNTYLY (SEQ ID NO: 4), LCDR2 region sa sekvencom RMSNLNS (SEQ ID NO: 5), i LCDR3 region sa sekvencom MQHLEYPIT (SEQ ID NO: 6) i ibrutiniba, za lečenje ne-Hočkinovog limfoma, hronične limfocitne leukemije i/ili akutne limfoblastne leukemije. U primerima izvođenja, ne-Hočkinov limfom je odabran iz grupe koja se sastoji od folikularnog limfoma, limfoma malih limfocita, limfoidnog tkiva povezanog sa mukozom, marginalne zone, difuznih velikih B ćelija, Burkita, i mantle ćelija.

[0078] U primerima izvođenja, ne-Hočkinov limfom je folikularni limfom. U primerima izvođenja, ne-Hočkinov limfom je limfom malih limfocita. U primerima izvođenja, ne-Hočkinov limfom je limfoidno tkivo povezano sa mukozom. U primerima izvođenja, ne-Hočkinov limfom je limfom marginalne zone. U primerima izvođenja, ne-Hočkinov limfom je difuzni limfom velikih B ćelija. U primerima izvođenja, ne-Hočkinov limfom je Burkitov limfom. U primerima izvođenja, ne-Hočkinov limfom je limfom mantle ćelija.

[0079] U primerima izvođenja, kombinacija je za lečenje hronične limfocitne leukemije. U primerima izvođenja, kombinacija je za lečenje akutne limfoblastne leukemije.

[0080] Drugi aspekt sadrži postupak za lečenje ne-Hočkinovog limfoma, hronične limfocitne leukemije i/ili akutne limfoblastne leukemije kod pojedinca kome je lečenje potrebno, pri čemu postupak sadrži primenu antitela specifičnog za CD19 i inhibitora Brutonove tirozin kinaze (BTK). U drugim aspektima postupka, antitelo specifično za CD19 sadrži HCDR1 region sa sekvencom SYVMH (SEQ ID NO: 1), HCDR2 region sa sekvencom NPYNDG (SEQ ID NO: 2), HCDR3 region sa sekvencom GTYYYGTRVFDY (SEQ ID NO: 3), LCDR1 region sa sekvencom RSSKSLQNVNGNTYLY (SEQ ID NO: 4), LCDR2 region sa sekvencom RMSNLNS (SEQ ID NO: 5), i LCDR3 region sa sekvencom MQHLEYPIT (SEQ ID NO: 6). U drugim aspektima postupka, antitelo sadrži prikazano antitelo, specifično za CD19. U drugim aspektima postupka, inhibitor Brutonove tirozin kinaze (BTK) je ibrutinib.

[0081] Drugi aspekt uključuje upotrebu antitela specifičnog za CD19 pri čemu pomenuto antitelo antitelo sadrži HCDR1 region sa sekvencom SYVMH (SEQ ID NO: 1), HCDR2 region sa sekvencom NPYNDG (SEQ ID NO: 2), HCDR3 region sa sekvencom GTYYYGTRVFDY (SEQ ID NO: 3), LCDR1 region sa sekvencom RSSKSLQNVNGNTYLY (SEQ ID NO: 4), LCDR2 region sa sekvencom RMSNLNS (SEQ ID NO: 5), i LCDR3 region sa sekvencom

1

MQHLEYPIT (SEQ ID NO: 6), u proizvodnji medikamenta za lečenje ne-Hočkinovog limfoma, hronične limfocitne leukemije i/ili akutne limfoblastne leukemije, u sinergističkoj kombinaciji sa ibrutinibom.

Primeri

Primer 1: Citotoksičnost kod MEC-1 ćelije kada se koriste MOR00208 i ibrutinib pojedinačno i u kombinaciji

Materijali

[0082] Testirane ćelijske linije: MEC-1 ćelije (DSMZ# ACC497). Testirane su ćelijske linije: ćelijska linija hronične B-ćelijske leukemije; JVM-2 (ATCC® CRL-3002) ćelijska linija limfoma mantle ćelija; Ramos ćelije (ATCC broj CRL-1596), humane ćelije Burkitovog limfoma; HG-3 (DSMZ#ACC765) i CII (DSMZ#ACC773) su ćelijske linije hronične limfocitne leukemije; Su-DHL 6 (DSMZ#ACC572), U2932 (DSMZ#ACC633) i OCI-LY7 (DSMZ#ACC688) su ćelijske linije difuznih limfoma velikih B-ćelija (DLBCL); JVM-2 (ATCC® CRL-3002) je ćelijska linija limfoma mantle ćelija; i BALL-1 (DSMZ#ACC742) je ćelijska linija akutne limfoblastne leukemije.

[0083] Uslovi gajenja korišćenih ćelijskih linija su u skladu sa informacijama dobijenim od snabdevača.

[0084] Ćelijski medijum: Modifikovani Dulbekov medijum po Iscove-u (IMDM), Invitrogen, kat.br.: 31980-048; RPMI1640, Invitrogen, kat.br.: 31870-074; GlutaMAX, Invitrogen, KAT. br.: 35050-38 br. serije: 1504647; FCS: Sigma KAT br.: F7524 br. serije: 111M3396.

[0085] NK ćelije: RPMI1640, sa GlutaMAXTM, Invitrogen, kat br.: 31870-074, 10% FCS; Biocoll: Biochrome AG KAT br.: L6115 br. serije: 0034D; MACS Kit za izolaciju NK ćelija: Miltenyi Biotec KAT. br.: 130-092-657 br. serije: 5150130115; ibrutinib : Selleck Chem br. serije: S2680; FCS: Sigma KAT. br.: F7524 br. serije: 111M3396; i RefmAb33 (anti-RSV) sa istim Fc regionom kao MOR00208.

Metode

[0086] Citotoksičnost MOR00208 i ibrutiniba kada su sami, i u kombinaciji, testirana je pomoću ćelijske linije MEC-1 (CLL). Citotoksičnost MOR00208 i ibrutiniba kada su sami, i u kombinaciji, testirana je u sledećim ćelijskim linijama: JVM-2, Ramos, HG-3, CII, Su-DHL 6, U2932, OCI-LY7, JVM-2 i BALL-1.

[0087] Ibrutinib je kovalentni inhibitor Brutonove tirozin kinaze i trebalo bi da sprečava proliferaciju u ciljanim ćelijskim linijama. MOR00208 ciljano deluje na CD19 i posreduje u

1

ubijanju ciljnih ćelija putem ADCC. Ubijanje ciljnih ćelija se meri upotrebom sledećih parametara: ibrutinib u opsegu koncentracija između 0.033 i 33 µM, konkretno pri 0.3 µM, 1.0 µM i 3.0 µM; MOR00208 u opsegu koncentracija od 0.001 - 10 nM, konkretno pri 0.01 nM, 0.1 nM i 10nM, i kombinacija MOR00208 i ibrutiniba. Kao kontrola se koriste: RefmAb33 ili NK ćelije, pojedinačno. U grupi sa ibrutinibom kao i u grupi sa kombinacijom MOR00208+ibrutinib, ciljne ćelije su prethodno tretirane ibrutinibom, tokom 7 dana pre merenja ADCC testom. Ciljne ćelije su prebrojane i obojene pomoću CFSE u finalnoj koncentraciji od 1µg/ml. Za ciljne ćelije tretirane sa DMSO, odabran je odnos efektorske: ciljne (E:T) od 2:1, što odgovara gustini ćelija od 5x105/ml. Proliferativni efekat na ciljne ćelije do koga dovodi tretman ibrutinibom uključen je tako što je podešen E:T odnos za ćelije tretirane inhibitorom. NK ćelije su prebrojane i podešene na gustinu od 1x106/ml. Testovi ubijanja ciljnih ćelija su izvedeni na sledeći način: korišćene su ploče sa 96 bunarčića, u svaki bunarčić je dodato 100µl suspenzije ciljnih ćelija, a nakon toga i 100 µl suspenzije NK ćelija u svaki bunarčić, sa rezultujućim E:T odnosom od 2:1. Antitela su razblažena medijumom u opsegu od 10 - 0.001 nM. Ćelije su centrifugirane i peleti koji sadrže ciljne ćelije:efektorske ćelije resuspendovani su u 100 µl medijuma sa antitelom ili odgovarajućeg kontrolnog rastvora. Esej je inkubiran tokom 4h u inkubatoru sa CO2na 37°C. Posle 10 min inkubacije na ledu, 50 µl rastvora DAPI dodato je u svaki bunarčić (finalna koncentracija 1 µg/ml) i inkubirano na ledu tokom 10 min. Merenja ćelijskog ubijanja su obavljena pomoću FACS-Verse instrumenta. Mrtve ciljne ćelije su bile DAPI pozitivne.

[0088] Prethodni eksperimenti prema postupcima koji su u tekstu do sada opisani, obavljeni su i sa MEC-1 ćelijama i sa RAMOS ćelijama. Slike 1-3 prikazuje rezultate tih prethodnih eksperimenata.

Podaci

[0089] Ukupno su izvedena tri eksperimenta, kako bi se odredilo posredovanje ADCC na MEC-1 ćelije kombinacijom MOR00208 i ibrutiniba. Krive ADCC zavisnosti odgovora od doze za eksperimente 1-3 prikazane su na slikama 6-8.

[0090] Procenat (%) mrtvih ćelija (sirovi podaci) za eksperimente 1-3 prikazan je na tabelama 1-9 koje slede.

Eksperiment 1:

[0091]

Tabela 1, ibrutinib pri 3 uM

1

Tabela 2, ibrutinib pri 1 uM

Tabela 3, ibrutinib pri 0,3 µM

Eksperiment 2:

[0092]

Tabela 4, ibrutinib pri 3 µM

Tabela 5, ibrutinib pri 1 µM

2

Tabela 6, ibrutinib pri 0,3 µM

Eksperiment 3:

[0093]

Tabela 7, ibrutinib pri 3 µM

Tabela 8, ibrutinib pri 1 µM

Tabela 9, ibrutinib pri 0,3 µM

Izračunavanje sinergizma

[0094] Sirovi podaci (% mrtvih ćelija) su analizirani na sledeći način: 1) od sirovih podataka (% mrtvih ćelija), oduzete su pozadinske vrednosti (kontrole), čime je dobijeno specifično ubijanje za svaku grupu tretiranu na određeni način; zatim su 2) vrednosti za specifično ubijanje normalizovane tako što je kombinacija MOR00208 ibrutinib definisana kao 1.

[0095] Izračunavanja indeksa kombinacije (CI) su obavljena kako bi se odredila sinergija kombinacije prikazanog anti-CD19 antitela i ibrutiniba u poređenju sa MOR00208 i ibrutinibom, pojedinačno. Ova izračunavanja su opisana u publikacijama Ting-Chao Chou, Theoretical Basis, Experimental Design, and Computerized Simulation of Synergism and Antagonism in Drug Combination Studies, Pharmacol Rev 58:621-681 (2006) i Chou TC, Talalay P, Quantitative analysis of dose-effect relationships: the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors. Adv Enzyme Regul 22: 27-55 (1984). Postupci prema Chou-Talalay-u izvedeni su upotrebom CI-izobolografske metode.

Jednačina za medijanu efekta

[0096] Jednačina za medijanu efekta modeluje efekat nekog inhibitora (kao što je lek) izrazom Fa/Fu =(D/D50)^m, gde je D doza, Fa i Fu su frakcije sistema na koje doza D utiče, odnosno ne utiče (Fa Fu = 1); D50 je doza koja proizvodi efekat sa vrednošću medijane (npr. IC50, ED50, LD50). Konstanta m određuje oblik krive doza-efekat. Mi koristimo GraphPad Prism za izvođenje izračunavanja nelinearne regresije kojom se procenjuju parametri m i D50.

CI izobolografska metoda

[0097] CI-izobolografska metoda obezbeđuje kvantitativnu procenu sinergizma između lekova. Indeks kombinacije (CI) se procenjuje na osnovu podataka o doznom efektu tretmana pojedinačnim ili kombinovanim lekovima. Vrednost CI manja od 1 ukazuje na sinergizam; CI = 1 ukazuje na aditivni efekat; i CI > 1 ukazuje na antagonizam. Interakcija lekova (sinergizam ili antagonizam) je utoliko izraženija ukoliko je CI vrednost dalja od 1.

[0098] Formalno, indeks kombinacije (CI) za kombinovani tretman lekom, definiše se kao

CI=D1/Dx1+ D2/Dx2

[0099] Ovde su D1 i D2 doze leka 1 i leka 2 u kombinaciji, redom; a Dx1 i Dx2 su doze za tretman samo lekom 1 i lekom 2 koje bi dale isti efekat kao i kombinacija. Neophodno je da doze Dx1 i Dx2 budu procenjene na osnovu podataka o odnosu doze i efekta za tretmane pojedinačnim lekovima. U suštini, jednačina za medijanu efekta se fituje u podatke za svaki lek. Na osnovu jednačine za medijanu efekta nekog leka, možemo da procenimo dozu (tj. D) koja je neophodna da bi proizvela efekat (tj. Fa, Fu). Što se tačka nalazi dalje od linije adicije, to je veća razlika između 1 i njenog CI, dakle, utoliko jači (sinergistički ili antagonistički) efekat.

Rezultati

[0100] Krive za indekse po Chou-u prikazane su na slikama 9-11. Podaci iz tri eksperimenta (pri istim koncentracijama) spojeni su u po jednu krivu za svaku koncentraciju ibrutniba.

[0101] Vrednosti indeksa prema Chou-u jasno ukazuju na sinergizam kombinacije MOR00208 i ibrutiniba prilikom specifičnog ubijanja MEC-1 ćelija, u poređenju sa MOR00208 i ibrutinib pojedinačno.

[0102] Dakle, kombinacija MOR00208 i ibrutiniba takođe će se ponašati sinergistički prilikom lečenja ne-Hočkinovog limfoma (NHL), hronične limfoidne leukemije (CLL) i akutne limfoblastne leukemije (ALL) kod ljudi.

[0103] Drugi pristup za izračunavanje i poređenje efekata pojedinačnih agenasa kasa se koriste u kombinaciji je koncept frakcionog proizvoda koji je prvi opisao Webb J.L. u "Enzymes and metabolic inhibitors",1963. godine . Ovaj postupak analize uzima u obzir da efekti nekoliko lekova mogu da budu usmereni protiv iste frakcije ćelija, sve dok ti efekti nisu međusobno isključivi, što je slučaj kod MOR00208 i ibrutiniba, i stoga će izmereni efekat kombinacije biti manji od teorijske sume pojedinačnih efekata. Koncept frakcionog proizvoda tvrdi da, kad god dva leka ubijaju 50% frakcije ciljnih ćelija, efekat u kombinaciji će iznositi samo 75% (primenjena jednačina: 1 - (1 - 0.5) 3 (1 - 0.5) = 0.75) a ne očekivanih 100%, usled toga što je 50% ciljnih ćelija i dalje vijabilno i podložno jednom od dva leka.

[0104] Drugi pristup za izračunavanje i poređenje efekata pojedinačnih agenasa kada se koriste u kombinaciji je pristup prema Clarke et al., Issues in experimental design and endpoint analysis in the study of experimental cytotoxic agents in vivo in breast cancer and other models, Breast Cancer Research and Treatment 46:255-278 (1997).

[0105] % mrtvih ćelija (sirovi podaci) iz tabela 1-16 analizirani su na sledeći način:

Antagonistički (AB)/C < (A/C) x (B/C)

Aditivan (AB)/C = (A/C) x (B/C)

Sinergistički (AB)/C > (A/C) x (B/C)

2

Gde je A tretman samo MOR00208 antitelom; B je tretman samo ibrutinibom; C je odgovor na kontrolu DMSO RefMab33; AB je kombinacija tretmana A i B.

Eksperiment 1

[0106]

Tabela 10: Analiza po Clarke-u podataka prikazanih u tabeli 1

[0107] Ova analiza po Clarke-u podataka prikazanih u tabeli 1 takođe je grafički predstavljena na slici 12.

Tabela 11: Analiza po Clarke-u podataka prikazanih u tabeli 2

[0108] Ova analiza po Clarke-u podataka prikazanih u tabeli 2 takođe je grafički predstavljena na slici 13.

Tabela 12: Analiza po Clarke-u podataka prikazanih u tabeli 3

[0109] Ova analiza po Clarke-u, podataka prikazanih u tabeli 3 takođe je grafički predstavljena na slici 14.

Eksperiment 2

[0110]

Tabela 13: Analiza po Clarke-u podataka prikazanih u tabeli 4

[0111] Ova analiza po Clarke-u, podataka prikazanih u tabeli 4 takođe je grafički predstavljena na slici 15.

Tabela 14: Analiza po Clarke-u podataka prikazanih u tabeli 5

[0112] Ova analiza po Clarke-u, podataka prikazanih u tabeli 5 takođe je grafički predstavljena na slici 16.

Tabela 15: Analiza po Clarke-u podataka prikazanih u tabeli 6

[0113] Ova analiza po Clarke-u, podataka prikazanih u tabeli 6 takođe je grafički predstavljena na slici 17.

Eksperiment 3

[0114]

Tabela 16: Analiza po Clarke-u podatakaprikazanih u tabeli 7

[0115] Ova analiza po Clarke-u, podataka prikazanih u tabeli 7 takođe je grafički predstavljena na slici 18.

Tabela 17: Analiza po Clarke-u podataka prikazanih u tabeli 8

2

[0116] Ova analiza po Clarke-u, podataka prikazanih u tabeli 8, takođe je grafički predstavljena na slici 19.

Tabela 18: Analiza po Clarke-u podataka prikazanih u tabeli 9

[0117] Ova analiza po Clarke-u, podataka prikazanih u tabeli 9, takođe je grafički predstavljena na slici 20.

Rezultati po Clarke-u

[0118] Eksperimenti 1-3 za svaku od koncentracija, pokazali su jasnu sinergiju kombinacije MOR00208 ibrutiniba, upotrebom postupala po autorima Clarke et al. Postupci autora Clarke et al., pokazuju, međutim, sinergizam osim u nekoliko eksperimenata u kojima je aktivnost ibrutiniba bila manja od aktivnosti kontrole.

2

1

2

4

Claims

Patentni zahtevi 1. Sinergistička kombinacija koja sadrži antitelo specifično za CD19 naznačena time što pomenuto antitelo sadrži HCDR1 region sa sekvencom SYVMH (SEQ ID NO: 1), HCDR2 region sa sekvencom NPYNDG (SEQ ID NO: 2), HCDR3 region sa sekvencom GTYYYGTRVFDY (SEQ ID NO: 3), LCDR1 region sa sekvencom RSSKSLQNVNGNTYLY (SEQ ID NO: 4), LCDR2 region sa sekvencom RMSNLNS (SEQ ID NO: 5) i LCDR3 region sa sekvencom MQHLEYPIT (SEQ ID NO: 6) i ibrutinib, za upotrebu u lečenju ne-Hočkinovog limfoma, hronične limfocitne leukemije i/ili akutne limfoblastne leukemije.
2. Sinergistička kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačena time što antitelo sadrži varijabilan teški lanac sa sekvencom EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGYTFTSYVMHWVRQAPGKGLEWIGYINPY NDGTKYNEKFQGRVTISSDKSISTAYMELSSLRSEDTAMYYCARGTYYYGTRVFDYWG QGTLVTVSS (SEQ ID NO: 10) i varijabilan laki lanac sa sekvencom
3. Sinergistička kombinacija za upotrebu prema patentnim zahtevima 1 ili 2, naznačena time što antitelo sadrži konstantan domen teškog lanca sa sekvencom
4. Sinergistička kombinacija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time što antitelo sadrži konstantan domen lakog lanca sa sekvencom
5. Sinergistička kombinacija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time što se navedeno antitelo specifično za CD19 i ibrutinib primenjuju odvojeno.
6. Sinergistička kombinacija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time što se ibrutinib primenjuje pre primene antitela specifičnog za CD19.
7. Sinergistička kombinacija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time što se navedeno antitelo specifično za CD19 i ibrutinib primenjuju istovremeno.
8. Sinergistička kombinacija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time što se navedeno antitelo specifično za CD19 i ibrutinib primenjuju u isto vreme, pri čemu su oba leka aktivna u pacijentu u isto vreme.
9. Sinergistička kombinacija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, za upotrebu u lečenju hronične limfocitne leukemije.
10. Sinergistička kombinacija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, za upotrebu u lečenju akutne limfoblastne leukemije.
11. Sinergistička kombinacija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, za upotrebu u lečenju ne-Hočkinovog limfoma, pri čemu je ne-Hočkinov limfom odabran iz grupe koja se sastoji od folikularnog limfoma, limfoma malih limfocita, limfoidnog tkiva povezanog sa mukozom, marginalne zone, difuznih velikih B ćelija, Burkita, i mantle ćelija.
12. Sinergistička kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, naznačena time što je ne-Hočkinov limfom folikularni limfom.
13. Sinergistička kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, naznačena time što je ne-Hočkinov limfom difuzni limfom velikih B ćelija.
14. Sinergistička kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, naznačena time što je ne-Hočkinov limfom Burkitov limfom.
15. Sinergistička kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, naznačena time što je ne-Hočkinov limfom limfom mantle ćelija. 4