RS59740B1 - Benzoksazepin oksazolidinonska jedinjenja i postupci upotrebe - Google Patents

Description

OPIS

UNAKRSNA REFERENCA ZA SRODNE PRIMENE

Ova privremena primena podnesena je pod 37 CFR § 1.53(b), zahteva naknadu prema 35 USC § 119(e) US privremene primene serijski br.62/188,029, podnesenu 2. jula 2015., koja je u celini uključena referencom.

OBLAST PRONALASKA

Pronalazak se uglavnom odnosi na jedinjenja benzoksazepin oksazolidinona sa aktivnostima protiv hiperproliferativnih poremećaja kao što je kancer. Pronalazak se takođe odnosi na postupke upotrebe jedinjenja za in vitro, in situ i in vivo dijagnostiku ili lečenje ćelija sisara, ili povezana patološka stanja.

OSNOVA PRONALASKA

Uzlazna regulacija signalnog puta fosfoinozitidne-3 kinaze (PI3K)/Akt je uobičajena karakteristika kod većine kancera (Yuan i Cantley (2008) Oncogene 27:5497-510). Genetska odstupanja na putu su otkrivena kod mnogih kancera kod ljudi (Osaka i sar. (2004) Apoptosis 9:667-76) i deluju prvenstveno na podsticanje proliferacije ćelija, migracije i preživljavanja. Aktivacija puta se događa nakon aktiviranja mutacija tačaka ili pojačanja PIK3CA gena koji kodira p110α (alfa) PI3K izoforme (Hennessy i sar. (2005) Nat. Rev. Drug Discov. 4:988-1004). Genetska izbacivanja ili gubitak funkcije mutacija unutar tumorskog supresora PTEN, fosfataza sa suprotnom funkcijom PI3K, takođe povećava PI3K signalizaciju puta (Zhang i Yu (2010) Clin. Cancer Res.16:4325-30). Ove aberacije dovode do povećane odlazne signalizacije kroz kinaze kao što su Akt i mTOR, a povećana aktivnost PI3K puta je predložena kao znak otpornosti na lečenje kancera (Opel i sar. (2007) Cancer Res. 67:735-45; Razis i sar. (2011) Breast Cancer Res. Treat.128:447-56).

Fosfatidilinozitol 3-kinaza (PI3K) je glavni signalni čvor za ključne signale preživljavanja i rasta limfoma i suprotan je aktivnosti fosfataze PTEN. Signalni put fosfoinozitidne 3-zavisne kinaze (PI3K) je najviše negulisan put kod kancera dojke pozitivnog hormonskog receptora (HR+BC). PI3K put je takođe neregulisan u agresivnim oblicima limfoma (Abubaker (2007) Leukemia 21:2368-2370). Osam procenata DLBCL (difuznog velikog B-ćelijskog limfoma) ima mutaciju PI3CA (fosfatidilinozitol-3 kinaza katalitička podjedinica alfa), a 37% je negativno na PTEN imunohistohemijskim testom.

Fosfatidilinozitol je jedan u nizu fosfolipida koji se nalaze u ćelijskim membranama i koji učestvuju u intraćelijskoj transdukciji signala. Ćelijska signalizacija putem 3'fosforilisanih fosfoinozitida je uključena u različite ćelijske procese, npr. malignu transformaciju, signalizaciju faktora rasta, upalu i imunitet (Rameh i sar. (1999) J. Biol Chem. 274:8347-8350). Enzim odgovoran za stvaranje ovih fosforilisanih signalnih produkata, fosfatidilinozitol 3-kinaza (koja se takođe naziva PI 3-kinaza ili PI3K), prvobitno je identifikovan kao aktivnost povezana sa viralnim onkoproteinima i receptorima faktora rasta tirozin kinaza koji fosforilišu fosfatidilinozitol (PI) i njegove fosforilisane derivate u 3'-hidroksilu inozitolskog prstena (Panayotou i sar. (1992) Trends Cell Biol 2:358-60). Fosfoinozitidne-3-kinaze (PI3K) su lipidne kinaze koje fosforilišu lipide u 3-hidroksilnom ostatku inozitolskog prstena (Whitman i sar. (1988) Nature, 332:664). 3-fosforilisani fosfolipidi (PIP3) generisani PI3-kinazama deluju kao drugi kuriri koji regrutuju kinaze sa domenima vezivanja lipida (uključujući regione plekstrin homologije (PH)), kao što su Akt i PDK1, kinaza-1, zavisna od fosfoinozitida (Vivanco i sar. (2002) Nature Rev. Cancer 2:489; Phillips i sar. (1998) Cancer 83:41).

Familija PI3 kinaza sadrži najmanje 15 različitih enzima podkategorisanih po strukturnoj homologiji i podeljeni su u 3 klase na osnovu homologije sekvence i proizvoda koji je formiran enzimskom katalizom. Kinaze klase I PI3 se sastoje od 2 podjedinice: katalitička podjedinica 110 kd i regulatorna podjedinica 85 kd. Regulatorne podjedinice sadrže SH2 domene i vezuju se za ostatke tirozina fosforilisane receptorima faktora rasta sa aktivnošću tirozin kinaze ili onkogenim proizvodima, na taj način indukujući PI3K aktivnost katalitičke podjedinice p110 koja fosforiliše njegov lipidni supstrat. Kinaze klase I PI3 su uključene u važne događaje transdukcije odlaznih signala od citokina, integina, faktora rasta i imunoreceptora, što sugeriše da kontrola ovog puta može dovesti do važnih terapeutskih efekata kao što su modulacija proliferacije ćelija i karcinogeneza. PI3K klase I mogu fosforilisati fosfatidilinozitol (PI), fosfatidilinozitol-4-fosfat i fosfatidilinozitol-4,5-bifosfat (PIP2), da bi proizveli fosfatidilinozitol-3-fosfat (PIP), fosfatidilinozitol-3,4-bifosfat i fosfatidilinozitol 3,4,5-trifosfat. PI3K klase II fosforilišu PI i fosfatidilinozitol-4-fosfat. PI3K klase III mogu samo fosforilisati PI. Ključni izoform PI3-kinaze u kanceru je PI3-kinaza klase I, p110α kako je naznačeno ponavljajućim onkogenim mutacijama u p110α (Samuels i sar. (2004) Science 304:554; US 5824492; US 5846824; US 6274327). Drugi izoformi mogu biti važni u kanceru, i takođe su uključeni u kardiovaskularnu i imuno-upalnu bolest (Workman P (2004) Biochem Soc Trans 32:393-396; Patel i sar. (2004) Proc. Am. Assoc. Of Cancer Res. (Abstract LB-247) 95th Annual Meeting, March 27-31, Orlando, Florida, SAD; Ahmadi K i Waterfield MD (2004) „Phosphoinositide 3-Kinase: Function and Mechanisms” Encyclopedia of Biological Chemistry (Lennarz WJ, Lane MD eds) Elsevier / Academic Press), onkogene mutacije p110α (alfa) su nađene na značajnoj frekvenciji u čvrstim tumorima debelog creva, dojke, mozga, jetre, jajnika, želuca, pluća, glave i vrata. Oko 35-40% tumora kancera dojke pozitivnih na hormonske receptore (HR+) ima mutaciju PIK3CA. Abnormalnosti PTEN-a nalaze se kod kancera glioblastoma, melanoma, prostate, endometrija, jajnika, dojke, pluća, glave i vrata, hepatocelularnog i štitnjače.

PI3 kinaza (PI3K) je heterodimer koji se sastoji od p85 i p110 podjedinice (Otsu i sar. (1991) Cell 65:91-104; Hiles i sar. (1992) Cell 70:419-29). Identifikovane su četiri različite klase I PI3K , označene kao PI3K α (alfa), β (beta), δ (delta) i γ (gama), od kojih svaka sadrži posebnu katalitičku podjedinicu od 110 kDa i regulatornu podjedinicu. Tri katalitičke podjedinice, tj. p110 alfa, p110 beta i p110 delta, svaka u interakciji sa istom regulatornom podjedinicom, p85; dok p110 gama deluje u interakciji sa različitom regulatornom podjedinicom, p101. Obrasci ekspresije svakog od ovih PI3K u ljudskim ćelijama i tkivima su različiti. U svakom od PI3K podtipova alfa, beta i delta, podjedinica p85 deluje na lokalizaciju PI3 kinaze u plazma membrani interakcijom njegovog SH2 domena sa fosforiliranim ostacima tirozina (prisutnim u odgovarajućem kontekstu sekvence) u ciljnim proteinima (Rameh i sar. (1995) Cell, 83:821-30; Volinia i sar. (1992) Oncogene, 7:789-93).

Put PI3 kinaze / Akt / PTEN je atraktivan cilj za razvoj lekova protiv kancera jer bi se očekivalo da takvi agensi inhibiraju ćelijsku proliferaciju, potiskuju signale iz stromalnih ćelija koje omogućavaju preživljavanje i hemorezistenciju ćelija kancera, da zaustave potiskivanje apoptoze i nadvladavaju unutrašnju otpornost ćelija kancera na citotoksične agense. PI3K se aktivira signalizacijom receptora tirozin kinaze, kao i aktiviranjem mutacija u p110 katalitičkoj podjedinici PI3K, gubitkom tumorskog supresorskog PTEN-a ili putem retkih aktivirajućih mutacija u AKT-u.

Taselisib (GDC-0032, Roche RG7604, CAS Reg. br. 1282512-48-4, Genentech Inc.), imenovan kao 2-(4-(2-(1-izopropil-3-metil-1H-1,2,4-triazol-5-il)-5,6-dihidrobenzo[f]imidazo[1,2-d][1,4]oksazepin-9-il)-1H-pirazol-l-il)-2-metilpropanamid, ima potentnu PI3K aktivnost (Ndubaku, C. O. i sar. (2013) J. Med. Chem. 56:4597-4610; WO 2011/036280; US 8242104; US 8343955) i proučava se kod pacijenata sa lokalno uznapredovalim ili metastatskim čvrstim tumorima. Taselisib (GDC-0032) je inhibitor koji štedi beta-izoformu katalitičke podjedinice PI3K, 31 puta selektivniji za alfa podjedinicu u odnosu na beta. Taselisib pokazuje veću selektivnost za mutirane PI3Kα izoforme od divljeg tipa PI3Kα (Olivero AG i sar., AACR 2013. Abstract DDT02-01). Taselisib se trenutno razvija za lečenje pacijenata sa estrogenim receptorima (ER)-pozitivnim, HER2-negativnim metastatskim kancerom dojke (mBC) i mikrocelularnim kancerom pluća (NSCLC). U ispitivanju faze la sa jednim agensom taselisiba, primećeni su delimični odgovori (PR) kod 6/34 upisanih pacijenata. Svih 6 odgovora primećeno je kod pacijenata sa PIK3CA mutiranim tumorima (Juric D. i sar. AACR 2013), što ukazuje na potrebu da se odredi PIK3CA mutacioni status kod pacijenata lečenih taselisibom.

Nedavni klinički podaci sa PI3K inhibitorima su podrazumevali delta aktivnost PI3K kao izvora gastrointestinalnih toksičnosti („Akinleye et al Phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) inhibitors as cancer therapeutics” Journal of Hematology & Oncology 2013, 6:88-104; C. Saura i sar. „Phase Ib Study of the PI3K Inhibitor Taselisib (GDC-0032) in Combination with Letrozole in Patients with Hormone Receptor-Positive Advanced Breast Cancer“ San Antonio Breast Cancer Symposium - December 12, 2014, PD5-2; Lopez i sar. „Taselisib, a selective inhibitor of PIK3CA, is highly effective on PIK3CA-mutated and HER2/neu amplified uterine serous carcinoma in vitro and in vivo” (2014) Gynecologic Oncology).

Idelalisib (GS-1101, CAL-101, ZYDELIG®, Gilead Sciences Inc., CAS Reg. br.

870281-82-6, 5-fluoro-3-fenil-2-[(1S)-1-(7H-purin-6-ilamino)propil]-4(3H)-hinazolinon) je selektivni PI3Kδ (delta) inhibitor i odobren za lečenje hronične limfoidne leukemije, CLL (Somoza, J.R. i sar. (2015) J. Biol. Chem. 290:8439-8446; US 6800620; US 6949535; US 8138195; US 8492389; US 8637533; US 8865730; US 8980901; RE44599; RE44638). Proliv i kolitis su jedan od najčešćih neželjenih pojava koje su prijavljene nakon lečenja idelalisibom (Brown i sar.. „Idelalisib, an inhibitor of phosphatidylinositol 3-kinase p110d, for relapsed/refractory chronic lymphocytic leukemia“ (2014), Blood 123(22):3390-3397 Zydelig® Prescribing Information 2014; Zydelig® REMS Fact Sheet). Značajne GI toksičnosti koje su primećene posle lečenja idelalisibom su u skladu sa hipotezom da je inhibicija PI3Kδ (delta) izvor gastrointestinalnih toksičnosti. Dodatne ozbiljne neželjene pojave primećene su u kliničkim ispitivanjima idelalisiba (Zydelig®) u kombinaciji sa drugim terapijama. Neželjeni događaji, uključujući smrtne slučajeve, su vezani za infekcije poput upale pluća. U martu 2016. godine Odbor za procenu rizika od farmakovigilanse EMA-e (PRAC) je izdao privremeno upozorenje i preporuku da pacijenti primaju lečenje antibioticima i da se rutinski prate pojave infekcije tokom uzimanja Zydeliga (idelalisiba). U martu 2016. godine američka Uprava za hranu i lekove je izdala upozorenje da je „šest kliničkih ispitivanja koja istražuju idelalisib (Zydelig®) u kombinaciji sa drugim terapijama zaustavljeno zbog izveštaja o povećanom broju neželjenih pojava, uključujući smrt“.

US-B2-8,242,104 otkriva inhibitore PI3K na osnovu supstituisanih 5,6-dihidrobenzo[f]imidazo[1,2-d][1,4]oksazepina. Potrebni su dodatni modulatori PI3Kα koji su korisni u lečenju kancera, posebno inhibitora PI3Kα koji je selektivan za mutantni PI3Kα koji eksprimira tumore u odnosu na ne-mutirajuće ćelije koje eksprimiraju PI3Kα. Posebno postoji potreba za takvim agensom koji selektivno inhibira izoform PI3Kα u odnosu na izoforme PI3Kβ, PI3Kδ i PI3Kγ, za koje se može očekivati da će rezultovati poboljšanim terapeutskim vremenskim okvirom.

SAŽETAK PRONALASKA

Pronalazak se uglavnom odnosi na jedinjenja benzoksazepin oksazolidinona sa selektivnom aktivnošću u modulaciji mutantnih oblika PI3Kα (alfa) izoforme, koji imaju strukturu Formule I:

i njihove stereoizomeri, geometrijske izomere, tautomere i njihove farmaceutski prihvatljive soli. Ovde su definisani različiti supstituenti.

Još jedan aspekt ovog pronalaska je farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje benzoksazepin oksazolidinone formule I i farmaceutski prihvatljiv nosač, glidans, razblaživač ili ekscipijens.

Još jedan aspekt ovog pronalaska je jedinjenje formule 1 za upotrebu u postupku lečenja kancera kod pacijenta koji ima kancer, a koji obuhvata davanje pomenutom pacijentu terapeutski efikasne količine jedinjenja benzoksazepin oksazolidinona formule I.

Još jedan aspekt ovog pronalaska je komplet za terapeutsko lečenje kancera dojke, koji sadrži:

a) jedinjenje benzoksazepin oksazolidinona formule I; i

b) uputstva za upotrebu u terapeutskom tretmanu kancera dojke

KRATAK OPIS SLIKA

Na slici 1 su prikazane rendgenske ko-kristalne strukture PI3Kα sa: A) taselisibom (GDC-0032), B) jedinjenjem 529 US 8242104, C) jedinjenjem 101 i D) jedinjenjem 103.

Na slici 2 su prikazane rendgenske ko-kristalne strukture PI3Kα sa: A) taselisibom (GDC-0032) i B) jedinjenjem 101.

Na slici 3A su prikazani Western-blot podaci koji prikazuju nivoe p110α (p110a, P110 alfa) nakon 24 sata tretmana sa jedinjenjem 101, jedinjenjem 103 i jedinjenjem 436 iz US 8242104 u ćelijama HCC-1954 (PI3Kα mutant H1047R).

Na slici 3B su prikazani Western-blot podaci koji prikazuju nivoe p110α (p110a, P110 alfa) nakon 24 sata tretmana sa jedinjenjem 101, jedinjenjem 103 i jedinjenjem 436 iz US 8242104 u HDQ-P1 ćelijama (PI3Kα divljeg tipa).

DETALJAN OPIS PRIMERA OTELOTVORENJA

Sada će biti detaljno reči o nekim otelotvorenjima iz pronalaska, čiji primeri su ilustrovani pratećim strukturama i formulama. Mada će pronalazak biti opisan u vezi sa nabrojanim otelotvorenjima, treba razumeti da to ne predstavlja ograničavanje pronalaska na ta otelotvorenja. Naprotiv, pronalazak pokriva sve alternative, modifikacije i ekvivalente koji mogu biti uključeni u oblast predmetnog pronalaska, kako je definisano patentnim zahtevima. Stručnjaci u ovoj oblasti će prepoznati brojne postupke i materijale slične, ili ekvivalentne ovima ovde opisanim, koji se mogu koristiti u praksi za predmetni pronalazak. Predmetni pronalazak ni na koji način nije ograničen na postupke i materijale koji su opisani. U slučaju da se jedna ili više upotrebljenih literatura, patenata i sličnih materijala razlikuje ili protivreči ovoj primeni, uključujući, ali ne ograničavajući se na definisane pojmove, upotrebu termina, opisane tehnike ili slično, ova primena je primarna. Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni izrazi koji se ovde koriste imaju isto značenje kao što je obično poznato stručnjaku u oblasti kojoj pripada ovaj pronalazak. Iako se postupci i materijali slični ili ekvivalentni onima opisanim ovde mogu koristiti u praksi ili testiranju ovog pronalaska, pogodni postupci i materijali su opisani u nastavku. Sve publikacije, patentne primene, patenti i ostale reference koje su ovde pomenute uključene su referencom u celosti. Nomenklatura koja se koristi u ovoj primeni zasnovana je na IUPAC sistematskoj nomenklaturi, osim ako nije drugačije naznačeno.

DEFINICIJE

Kada označava broj supstituenata, termin „jedan ili više” odnosi se na opseg od jednog supstituenta do najvećeg mogućeg broja supstitucija, tj. od zamene jednog vodonika do zamene svih vodonika supstituentima. Izraz „supstituent” opisuje atom ili grupu atoma koja zamenjuje atom vodonika u matičnom molekulu. Izraz „supstituisani” označava da određena grupa ima jedan ili više supstituenata. Kada bilo koja grupa može imati više supstituenata i obezbeđen je niz mogućih supstituenata, supstituenti su nezavisno odabrani i ne moraju biti isti. Termin „nesupstituisan” znači da specifična grupa ne sadrži supstituente.

Izraz „opciono supstituisan” znači da je navedena grupa nesupstituisana ili supstituisana sa jednim ili više supstituenata, nezavisno odabranih iz grupe mogućih supstituenata. Kada označava broj supstituenata, termin „jedan ili više” znači od jednog supstituenta do najvećeg mogućeg broja supstitucija, tj. od zamene jednog vodonika do zamene svih vodonika supstituentima.

Izraz „alkil” koji se ovde koristi odnosi se na zasićeni monovalentni ugljikovodikov radikal sa ravnim ili razgranatim lancem od jednog do dvanaest atoma ugljenika (C1-C12), pri čemu alkil radikal može opciono biti nezavisno supstituisan sa jednim ili više supstituenata kako je opisano u nastavku. U drugom otelotvorenju, alkil radikal je jedan do osam atoma ugljenika (C1-C8), ili jedan do šest atoma ugljika (C1-C6). Primeri alkilnih grupa uključuju, ali nisu ograničeni na, metil (Me, −CH3), etil (Et, −CH2CH3), 1-propil (n-Pr, npropil, −CH2CH2CH3), 2-propil (i-Pr, i-propil, −CH(CH3)2), 1-butil (n-Bu, n-butil, −CH2CH2CH2CH3), 2-metil-1-propil (i-Bu, i-butil, −CH2CH(CH3)2), 2-butil (s-Bu, s-butil, −CH(CH3)CH2CH3), 2-metil-2-propil (t-Bu, t-butil, −C(CH3)3), 1-pentil (n-pentil, −CH2CH2CH2CH2CH3), 2-pentil (-CH(CH3)CH2CH2CH3), 3-pentil (-CH(CH2CH3)2), 2-metil-2-butil (-C(CH3)2CH2CH3), 3-metil-2-butil (-CH(CH3)CH(CH3)2), 3-metil-1-butil (-CH2CH2CH(CH3)2), 2-metil-1-butil (-CH2CH(CH3)CH2CH3), 1-heksil (-CH2CH2CH2CH2CH2CH3), 2-heksil (-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3), 3-heksil (-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3)), 2-metil-2-pentil (-C(CH3)2CH2CH2CH3), 3-metil-2-pentil (-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3), 4-metil-2-pentil (-CH(CH3)CH2CH(CH3)2), 3-metil-3-pentil (-C(CH3)(CH2CH3)2), 2-metil-3-pentil (-CH(CH2CH3)CH(CH3)2), 2,3-dimetil-2-butil (-C(CH3)2CH(CH3)2), 3,3-dimetil-2-butil (-CH(CH3)C(CH3)3, 1-heptil, 1-octil, i slične.

Izrazi „karbocikl“, „ karbociklil“, „ karbociklični prsten“ i „cikloalkil” se odnose na monovalentni, nearomatični, zasićeni ili delimično nezasićeni prsten sa 3 do 12 atoma ugljenika (C3−C12) kao i monociklični prsten ili 7 do 12 atoma ugljenika kao biciklični prsten. Biciklični karbocikli sa 7 do 12 atoma mogu biti raspoređeni, na primer, u obliku biciklo [4,5], [5,5], [5,6] ili [6,6] sistema, i biciklični karbocikli sa 9 ili 10 atoma u prstenu, mogu biti raspoređeni kao biciklo [5,6] ili [6,6] sistem, ili kao premošćeni sistemi, kao što su biciklo[2.2.1]heptan, biciklo[2.2.2]oktan i biciklo[3.2.2]nonan. Spiro karbociklilni ostaci su također uključeni u područje ove definicije. Primeri spiro karbociklilnih ostataka uključuju [2.2]pentanil, [2.3]heksanil i [2.4]heptanil. Primeri monocikličnih karbocikala uključuju, ali nisu ograničeni na, ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, 1-ciklopennt-1-enil, 1-ciklopennt-2-enil, 1-ciklopennt-3-enil, cikloheksil, 1-cikloheks-1- enil, 1-cikloheks-2-enil, 1-cikloheks-3-enil, cikloheksadienil, cikloheptil, ciklooktil, ciklononil, ciklodecil, cikloundecil, ciklododecil, i slične. Karbociklilne grupe su opciono nezavisno supstituisane jednim ili više ovde opisanih supstituenata.

„Aril” označava monovalentni aromatični ugljovodonični radikal od 6-20 atoma ugljenika (C6−C20) koji se dobija uklanjanjem jednog atoma vodonika iz jednog atoma ugljenika matičnog aromatičnog prstenastog sistema. Neke arilne grupe predstavljene su u oglednim strukturama kao „Ar“. Aril uključuje biciklične radikale koji sadrže aromatični prsten spojen sa zasićenim, delimično nezasićenim prstenom ili aromatičnim karbocikličnim prstenom. Tipične arilne grupe uključuju, ali nisu ograničene na, radikale izvedene iz benzena (fenil), supstituisane benzene, naftalen, antracen, bifenil, indenil, indanil, 1,2-dihidronaftalen, 1,2,3,4-tetrahidronaftil i slične. Arilne grupe su opciono nezavisno supstituisane jednim ili više ovde opisanih supstituenata.

Izrazi „heterocikl”, „heterociklil” i „heterociklični prsten” ovde su korišćeni naizmenično i odnose se na zasićeni ili delimično nezasićeni (tj. koji ima jednu ili više dvostrukih i/ili trostrukih veza unutar prstena) karbociklični radikal od 3 do oko 20 atoma u prstenu u kojima je najmanje jedan atom prstena heteroatom odabran između azota, kiseonika, fosfora i sumpora, a preostali atomi prstena su C, pri čemu je jedan ili više atoma u prstenu opciono supstituisano jednim ili više supstituenata opisanih u nastavku. Heterocikl može biti monocikl koji sadrži 3 do 7 članova prstena (2 do 6 atoma ugljenika i 1 do 4 heteroatoma odabranih između N, O, P i S) ili biciklični sa 7 do 10 članova prstena (4 do 9 atoma ugljenika i 1 do 6 heteroatoma izabranih između N, O, P i S), na primer: biciklo [4,5], [5,5], [5,6] ili [6,6] sistema. Heterocikli su opisani u Paquette, Leo A.; „Principles of Modem Heterocyclic Chemistry“ (W.A. Benjamin, New York, 1968), posebno poglavlja 1, 3, 4, 6, 7 i 9; „The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs“ (John Wiley & Sons, New York, 1950 do danas), posebno sveske 13, 14, 16, 19 i 28; i J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566. „Heterociklil” takođe uključuje radikale gde su heterocikl radikali spojeni sa zasićenim, delimično nezasićenim prstenom, ili aromatičnim karbocikličnim ili heterocikličnim prstenom. Primeri heterocikličnih prstenova uključuju, ali nisu ograničeni na, morfolin-4-il, piperidin-1-il, piperazinil, piperazin-4-il-2-on, piperazin-4-il-3-on, pirolidin-1- il, tiomorfolin-4-il, S-dioksotiomorfolin-4-il, azokan-1-il, azetidin-1-il, oktahidropirido[1,2-a]pirazin-2-il, [1,4]diazepan-1-yl, pirolidinil, tetrahidrofuranil, dihidrofuranil, tetrahidrothienil, tetrahidropiranil, dihidropiranil, tetrahidrotiopiranil, piperidin, morfolino, tiomorfolino, tioksanil, piperazinil, homopiperazinil, azetidinil, oksetanil, tietanil, homopiperidinil, oksepanil, tiepanil, oksazepinil, diazepinil, tiazepinil, 2-pirolinil , 3-pirolinil, indolinil, 2H-piranil, 4H-piranil, dioksanil, 1,3-dioksolanil, pirazolinil, ditianil, ditiolanil, dihidropiranil, dihidrotienil, dihidrofuranil, pirazolidinilimidazolinil, imidazolidinil, 3-azabiciklo[3.1.0]heksanil, 3-azabiciklo[4.1.0]heptanil, azabiciklo[2.2.2]heksanil, 3H-indolil kinolizinil i N-piridil ureje. U područje ove definicije su takođe uključeni spiro heterociklilni delovi. Prieri spiro heterociklilnih ostataka uključuju azaspiro[2.5]oktanil i azaspiro[2.4]heptanil. Prieri heterociklične grupe u kojoj su 2 atoma prstena supstituisana sa okso (=O) ostacima pirimidinonila i 1,1-diokso-tiomorfolinila.

Izraz „heteroaril” se odnosi na monovalentni aromatski radikal sa 5-, 6- ili 7-članim prstenovima i uključuje fuzionisane prstenaste sisteme (od kojih je najmanje jedan aromatičan) od 5-20 atoma, koji sadrže jedan ili više heteroatoma nezavisno izabranih između azota, kiseonika i sumpora. Prieri za heteroaril grupe uključuju, ali nisu ograničeni na piridinil (uključujući, na primer, 2-hidroksipiridinil), imidazolil, imidazopiridinil, pirimidinil (uključujući, na primer, 4-hidroksipirimidinil), pirazolil, triazolil, pirazinil, tetrazolil, furil, tienil, izoksazolil, tiazolil, oksadiazolil, oksazolil, izotiazolil, pirolil, hinolinil, izohinolinil, tetrahidroizohinolinil, indolil, benzimidazolil, benzofuranil, cinolinil, indazolil, indolizinil, ftalazinil, piridazinil, triazinil, izoindolil, pteridinil, purinil, oksadiazolil, triazolil, tiadiazolil, furazanil, benzofurazanil, benzotiofenil, benzotiazolil, benzoksazolil, hinazolinil, hinoksalinil, naftiridinil i furopiridinil.

Izrazi „lečiti“ i „lečenje“ se odnose na terapeutsko lečenje, gde je cilj da se uspori (umanji) neželjena fiziološka promena ili poremećaj, kao što je razvoj ili širenje artritisa ili kancera. U svrhu ovog pronalaska, korisni ili željeni klinički rezultati uključuju, ali nisu ograničeni na ublažavanje simptoma, smanjenje obima bolesti, stabilizovano (tj. koje se ne pogoršava) stanje bolesti, odlaganje ili usporavanje progresije bolesti, poboljšanje ili ublažavanje stanja bolesti i remisiju (delimičnu ili totalnu), bilo da može ili ne može da se detektuje. „Lečenje“ može takođe da znači produžavanje preživljavanja u poređenju sa očekivanim preživljavanjem bez lečenja. Oni kojima je potrebno lečenje uključuju one sa stanjem ili poremećajem.

Izraz „terapeutski efikasna količina” označava količinu jedinjenja predmetnog pronalaska koja (i) leči određenu bolest, stanje ili poremećaj, (ii) ublažava, poboljšava ili eliminiše jedan ili više simptoma određene bolesti, stanja ili poremećaja ili (iii) sprečava ili odlaže pojavu jednog ili više simptoma ovde opisane određene bolesti, stanja ili poremećaja. U slučaju kancera, terapeutski efektivna količina leka može redukovati broj ćelija kancera; smanjiti veličinu tumora; inhibirati (tj. usporiti do izvesnog stepena i poželjno zaustaviti) infiltraciju ćelija kancera u periferne organe; sprečiti (tj. usporiti do izvesnog stepena i poželjno zaustaviti) metastaze tumora; inhibirati, do određenog stepena, tumorski rast; i/ili

1

ublažiti do izvesnog stepena jedan ili više simptoma kancera. Prema stepenu do koga lek može sprečiti rast i/ili uništiti postojeće ćelije kancera, on može biti citostatični i/ili citotoksični lek. Za terapiju kancera, efikasnost se može meriti, na primer, procenom vremena do progresije bolesti (TTP) i/ili određivanjem stope odgovora (RR).

Izraz „kancer“ odnosi se na fiziološko stanje sisara koje se tipično karakteriše neregulisanim rastom ćelija. „Tumor“ sadrži jednu ili više ćelija kancera. Primeri za kancer uključuju, ali nisu ograničeni na, kancer, limfom, blastom, sarkom, i leukemiju ili limfoidne malignitete. Konkretniji primeri za takve kancere uključuju , kancer skvamoznih ćelija (npr., kancer skvamoznih ćelija epitela), kancer pluća, uključujući mikrocelularni kancer pluća, nemikrocelularni kancer pluća („NSCLC“), adenokancer pluća i skvamozni kancer pluća, kancer peritoneuma, hepatocelularni kancer, gastrični kancer ili kancer želuca, uključujući gastrointestinalni kancer, kancer pankreasa, glioblastom, kancer cerviksa, kancer jajnika, kancer jetre, kancer bešike, hepatom, kancer dojke, kancer kolona, kancer rektuma, kolorektalni kancer, kancer endometrijuma ili materice, kancer pljuvačnih žlezda, kancer bubrega ili renalni kancer, kancer prostate, kancer vulve, tiroidni kancer, kancer jetre, analni kancer, kancer penisa, kao i kancer glave i vrata.

„Hematološki maligniteti” (britanski pravopis „Haematological” maligniteti) su vrste kancera koji utiču na krv, koštanu srž i limfne čvorove. Pošto su sve tri prisno povezane preko imunološkog sistema, bolest koja utiče na jednu od njih često će zahvatiti i ostale: iako je limfom bolest limfnih čvorova, ona se često širi u koštanu srž, utičući na krv. Hematološki maligniteti su maligne neoplazme („kancer“), i uglavnom ih leče specijalisti hematologije i/ili onkologije. U nekim centrima „Hematologija / onkologija” je jedna podvrsta interne medicine, dok se u drugim smatraju posebnim odeljenjima (postoje i hirurški i onkolozi za zračenje). Nisu svi hematološki poremećaji maligni („kancerogeni”); ovim drugim krvnim stanjima takođe može upravljati hematolog. Hematološki maligniteti mogu proizaći iz bilo koje od dve glavne linije krvnih ćelija: mijeloidne i limfoidne ćelijske linije. Mijeloidna ćelijska linija obično proizvodi granulocite, eritrocite, trombocite, makrofage i mastocite; limfoidna ćelijska linija proizvodi B, T, NK i plazma ćelije. Limfomi, limfocitne leukemije i mijelom nastaju iz limfoidne linije, dok su akutna i hronična mijeloična leukemija, mijelodisplastični sindromi i mijeloproliferativne bolesti mijeloidnog porekla. Leukemije uključuju akutnu limfoblastičnu leukemiju (ALL), akutnu mijelogenu leukemiju (AML), hroničnu limfocitnu leukemiju (CLL), hroničnu mijelogenu leukemiju (CML), akutnu monocitnu leukemiju (AMOL) i mali limfocitni limfom (SLL). Limfomi uključuju Hodžkinove limfome (sva četiri podtipa) i ne-Hodžkinove limfome (NHL, svi podtipovi).

„Hemioterapeutski agens“ je hemijsko jedinjenje koje je od koristi u lečenju kancera, nezavisno od mehanizma dejstva. Klase hemioterapeutskih agenasa uključuju, ali se ne ograničavaju na alkilujuće agense, antimetabolite, biljne aklaloide koji sprečavaju formiranje deobnog vretena, citotoksične/antitumorske antibiotike, inhibitore topoizomeraze, antitela, fotosenzitizatore i inhibitore kinaze. Hemioterapeutski agensi uključuju jedinjenja koja se koriste u „ciljanoj terapiji“ i konvencionalnoj hemoterapiji. Primeri hemioterapeutskih agenasa uključuju: ibrutinib (IMBRUVICA™, APCI-32765, Pharmacyclics Inc./Janssen Biotech Inc.; CAS Reg. br. 936563-96-1, US 7514444), idelalisib (ranije CAL-101, GS 1101, GS-1101, Gilead Sciences Inc.; CAS Reg. br.

1146702-54-6), erlotinib (TARCEVA®, Genentech/OSI Pharm.), docetaksel (TAXOTERE®, Sanofi-Aventis), 5-FU (fluorouracil, 5-fluorouracil, CAS Reg. br. 51-21-8), gemcitabin (GEMZAR®, Lilly), PD-0325901 (CAS br.391210-10-9, Pfizer), cisplatin (Platinol®, (SP-4-2)-diaminedihloroplatinum(II), cis-diamin, dihloroplatinum(II), CAS br.

15663-27-1), carboplatin (CAS br. 41575-94-4), paclitaksel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), trastuzumab (HERCEPTIN®, Genentech), temozolomid (4-metil-5-okso- 2,3,4,6,8-pentazabiciklo [4.3.0] nona-2,7,9-triene- 9-carboksamid, CAS br.

85622-93-1, TEMODAR®, TEMODAL®, Schering Plough), tamoksifen ((Z)-2-[4-(1,2-difenilbut-1-enil)fenoksi]-N,N-dimetiletanamin, NOLVADEX®, ISTUBAL®, VALODEX®) i doksorubicin (ADRIAMYCIN®, CAS br.23214-92-8), Akti-1/2, HPPD, i rapamicin.

Hemioterapeutski agensi uključuju inhibitore B-ćelijskih ciljeva receptora kao što su BTK, Bcl-2 i JAK inhibitori.

Dodatni primeri za hemioterapeutske agense uključuju: oksaliplatin (ELOXATIN®, Sanofi), bortezomib (VELCADE®, Millennium Pharm.), sutent (SUNITINIB®, SU11248, Pfizer), letrozol (FEMARA®, Novartis), imatinib mezilat (GLEEVEC®, Novartis), XL-518 (Mek inhibitor, Exelixis, WO 2007/044515), ARRY-886 (Mek inhibitor, AZD6244, Array BioPharma, Astra Zeneca), SF-1126 (PI3K inhibitor, Semafore Pharmaceuticals), BEZ-235 (PI3K inhibitor, Novartis), XL-147 (PI3K inhibitor, Exelixis), PTK787/ZK 222584 (Novartis), fulvestrant (FASLODEX®, AstraZeneca), leukovorin (folinska kiselina), rapamicin (sirolimus, RAPAMUNE®, Wyeth), lapatinib (TYKERB®, GSK572016, Glaxo Smith Kline), lonafarnib (SARASAR™, SCH 66336, Schering Plough), sorafenib (NEXAVAR®, BAY43-9006, Bayer Labs), gefitinib (IRESSA®, AstraZeneca), irinotekan (CAMPTOSAR®, CPT-11, Pfizer), tipifarnib (ZARNESTRA™, Johnson & Johnson), ABRAXANE™ (bez kremofora), formulacije sa nanočesticama paklitaksela konstruisane sa albuminom (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, II), vandetanib (rINN, ZD6474, ZACTIMA®, AstraZeneca), hlorambucil, AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen), temsirolimus (TORISEL®, Wyeth), pazopanib (GlaxoSmithKline), kanfosfamid (TELCYTA®, Telik), tiotepa i ciklosfosfamid (CYTOXAN®, NEOSAR®); alkil sulfonate, kao što je busulfan, improsulfan i piposulfan; aziridine kao što je benzodopa, karbokvon, meturedopa, i uredopa; etilenimine i metilamelamine, uključujući altretamin, trietilenemelamin, trietilenfosforamid, trietilentiofosforamid i trimetilomelamin; acetogenine (posebno bulatacin i bulatacinon); kamptotecin (uključujući sintetički analog topotekan); briostatin; kalistatin; CC-1065 (uključujući njegove sintetičke analoge adozelesin, karzelesin i bizelesin); kriptoficine (posebno kriptoficin 1 i kriptoficin 8); dolastatin; duokarmicin (uključujući sintetičke analoge, KW-2189 i CB1-TM1); eleuterobin; pankratistatin; sarkodiktin; spongistatin; azotne iperite, kao što su hlorambucil, hlornafazin, hlorfosfamid, estramustin, ifosfamid, mehloretamin, mehloretamin oksid hidrohlorid, melfalan, novembicin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, uracil iperit; nitrozouree, kao što su karmustin, hlorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin i ranimnustin; antibiotike, kao što su endiinski antibiotici (npr. kaliheamicin, kaliheamicin gama1I, kaliheamicin omegaI1 (Angew Chem. Intl. Ed. Engl. (1994) 33:183-186); dinemicin, dinemicin A; bisfosfonate, kao što je klodronat; esperamicin; kao i neokarzinostatin hromofor i povezani hromoproteinski hromofori endiinskih antibiotika), aklacinomisine, aktinomicin, autramicin, azaserin, bleomicine, kaktinomicin, karabicin, karminomicin, karzinofilin, hromomicine, daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleucin, morfolino-doksorubicin, cijanomorfolino-doksorubicin, 2-pirolino-doksorubicin i deoksidoksorubicin), epirubicin, esorubicin, idarubicin, nemorubicin, marcelomicin, mitomicine, kao što je mitomicin C, mikofenolna kiselina, nogalamicin, olivomicini, peplomicin, porfiromicin, puromicin, kvelamicin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimeks, zinostatin, zorubicin; anti-metabolite, kao što je metotreksat i 5-fluorouracil (5-FU); analoge folne kiseline, kao što je denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat; analoge purina, kao što je fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin; analoge pirimidina, kao što je ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, citarabin, dideoksiuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin; androgene, kao što je kalusteron, dromostanolon propionat, epitiostanol, mepitiostan, testolakton; anti-adrenale, kao što je aminoglutetimid, mitotan, trilostan; sredstva za dopunu folne kiseline, kao što je folinska kiselina; aceglaton; aldofosfamid glikozid;

1

aminolevulinsku kiselinu; eniluracil; amsakrin; bestrabucil; bisantren; edatraksat; defofamin; demekolcin; diazikvon; elfornitin; eliptinijum acetat; epotilon; etoglucid; galijum nitrat; hidroksiureu; lentinan; lonidainin; majtansinoide, kao što su majtansin i ansamitocini; mitoguazon; mitoksantron; mopidanmol; nitraerin; pentostatin; fenamet; pirarubicin; losoksantron; podofillinsku kiselinu; 2-etilhidrazid; prokarbazin; PSK® kompleks polisaharida (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoksan; rizoksin; sizofiran; spirogermanijum; tenuazonsku kiselinu; triazikvon; 2,2',2”-trihlortrietilamin; trihotecene (posebno T-2 toksin, verakurin A, roridin A i anguidin); uretan; vindezin; dakarbazin; manomustin; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gacitozin; arabinozid (Ara-C); ciklofosfamid; tiotepu; 6-tioguanin; merkaptopurin; metotreksat; analoge platine, kao što je cisplatin i karboplatin; vinblastin; etopozid (VP-16); ifosfamid; mitoksantron; vinkristin; vinorelbin (NAVELBINE®); novantron; tenipozid; edatreksat; daunomicin; aminopterin; kapecitabin (XELODA®, Roche); ibandronat; CPT-11; inhibitor topoizomeraze RFS 2000; difluormetilornitin (DMFO); retinoide, kao što je retinoinska kiselina; i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline i derivate bilo kog gorepomenutog jedinjenja.

Uključeni u definiciju „hemioterapeutski agens” su i: (i) antihormonski agensi koji deluju na regulisanje ili inhibiciju delovanja hormona na tumore kao što su antiestrogeni i selektivni modulatori receptora estrogena (SERM), uključujući, na primer, tamoksifen (uključujući NOLVADEX®; tamoksifen citrat), raloksifen, droloksifen, 4-hidroksitamoksifen, trioksifen, keoksifen, LY117018, onapriston i FARESTON® (toremifin citrat) i selektivni modulatori receptora estrogena (SERD), kao što su fulvestrant (FASLODEX®, Astra Zeneca); (ii) inhibitori aromataze koji inhibiraju enzim aromatazu, koji reguliše proizvodnju estrogena u nadbubrežnoj žlezdi, kao što su, na primer, 4(5)-imidazoli, aminoglutetimid, MEGASE® (megestrol acetat), AROMASIN® (eksemestan; Pfizer), formestani, fadrozol, RIVISOR® (vorozol), FEMARA® (letrozol; Novartis) i ARIMIDEX® (anastrozol; AstraZeneca); (iii) anti-androgeni kao što su flutamid, nilutamid, bikalutamid, leuprolid i goserelin; kao i troksacitabin (1,3-dioksolan analog nukleozida citozina); (iv) inhibitori protein kinaze, kao što su inhibitori MEK, kao što je kobimetinib (WO 2007/044515); (v) inhibitori lipidne kinaze, kao što je taselisiba (GDC-0032, Genentech Inc.); (vi) antisens oligonukleotidi, naročito oni koji inhibiraju ekspresiju gena u signalnim putevima koji su uključeni u ablerantnu proliferaciju ćelija, na primer, PKC-alfa, Raf i H-Ras, kao što je oblimersen (GENASENSE®, Genta Inc.); (vii) ribozimi kao što su inhibitori ekspresije VEGF (npr. ANGIOZYME®) i inhibitori ekspresije HER2; (viii) vakcine kao što je vakcina za gensku terapiju, na primer, ALLOVECTIN®, LEUVECTIN® i VAXID®; PROLEUKIN® rIL-2; inhibitori topoizomeraze 1, kao što je LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; (ix) anti-angiogeni agensi kao što je bevacizumaba (AVASTIN®, Genentech); i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline i derivati bilo čega od gore navedenog.

Uključeni u definiciju „hemioterapeutski agens” su i: terapeutska antitela kao što su alemtuzumab (Campath), bevacizumab (AVASTIN®, Genentech); cetuksimab (ERBITUX®, Imclone); panitumumab (VECTIBIX®, Amgen), rituksimab (RITUXAN®, Genentech / Biogen Idec), pertuzumab (PERJETA™, 2C4, Genentech), trastuzumab (HERCEPTIN®, Genentech), trastuzumab emtansin (KADCYLA®, Genentech Inc.) i tositumomab (BEXXAR, Corixia).

„Metabolit” je proizvod koji nastaje metabolizmom određenog jedinjenja ili njegove soli u organizmu. Metaboliti jedinjenja se mogu identifikovati korišćenjem rutinskih tehnika poznatih u struci i njihovim aktivnostima određenim upotrebom testova kao što su oni opisani ovde. Takvi proizvodi mogu da nastanu, na primer, oksidacijom, redukcijom, hidrolizom, amidacijom, deamidacijom, esterifikacijom, deesterifikacijom, enzimatskim odvajanjem i slično, primenjenog jedinjenja. Prema tome, pronalazak uključuje metabolite jedinjenja ovog pronalaska, uključujući jedinjenja dobijena postupkom koji uključuje dovođenje u vezu jedinjenja Formule I ovog pronalaska sa sisarom tokom perioda koji je dovoljan da se dobije njegov metabolički produkt.

Termin „uputstvo za lek“ koristi se da se ukaže na uputstvo koje se uobičajeno nalazi u komercijalnim pakovanjima terapeutskog proizvoda, koje sadrži informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, primeni, kontraindikacijama i/ili upozorenjima u vezi sa upotrebom takvog terapeutskog proizvoda.

Termin „hiralni” se odnosi na molekule koji imaju svojstvo nemogućnosti preklapanja sa odrazom u ogledalu partnera, dok se termin „ahiralni” se odnosi na molekule koji mogu da se preklope sa svojim odrazom na partnera.

Izraz „stereoizomeri” se odnosi na jedinjenja koja imaju identičan hemijski sastav, ali se razlikuju sa obzirom na raspored atoma ili grupa u prostoru.

„Dijastereomer“ se odnosi na stereoizomer sa dva ili više hiralnih centara i čiji molekuli uzajamno nisu kao likovi u ogledalu. Dijastereomeri imaju različita fizička svojstva, npr. tačke topljenja, tačke ključanja, spektralne osobine i reaktivnosti. Smeše dijastereomera se mogu odvojiti pod analitičkim postupcima visoke rezolucije, kao što su elektroforeza i hromatografija.

„Enantiomeri“ se odnose na dva stereoizomera jedinjenja koji nisu međusobno

1

preklopivi kao likovi u ogledalu.

Ovde korišćene stereohemijske definicije i konvencije uopšteno slede S. P. Parker, izd., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(1984) McGraw-Hill Book Company, New York; i Eliel, E. i Wilen, S., “Stereochemistry of Organic Compounds”, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1994. Jedinjenja ovog pronalaska mogu da sadrže asimetrične ili hiralne centre, i zbog toga postoje u različitim stereoizomernim oblicima. Namera je da svi stereoizomerni oblici jedinjenja ovog pronalaska, uključujući, ali ne ograničavajući se na dijastereomere, enantiomere i atropisomere, kao i njihove smeše, poput racemskih smeša, čine deo predmetnog pronalaska. Mnoga organska jedinjenja postoje u optički aktivnim oblicima, tj. imaju sposobnost rotacije ravni svjetlosti polarizovane u ravni. Kod opisivanja optički aktivnog jedinjenja, prefiksi D i L ili R i S, koriste se za označavanje apsolutne konfiguracije molekula oko njegovog hiralnog centra (ili centara). Prefiksi d i l ili (+) i (-) koriste se da označe znak rotacije u ravni polarizovane svetlosti od strane jedinjenja, pri čemu (-) ili l koji označavaju da je jedinjenje levorotatorno. Jedinjenje sa prefiksom (+) ili d je desnorotatorno. Za datu hemijsku strukturu, ovi stereoizomeri su identični osim što su likovi u ogledalu jedan drugog. Specifični stereoizomer se takođe može nazvati enantiomerom, a smeša takvih izomera često se naziva enantiomerna smeša. Smeša enantiomera od 50:50 naziva se racemska smeša ili racemat, a može se pojaviti tamo gde nije bilo stereoselekcije ili stereospecifičnosti u hemijskoj reakciji ili procesu. Izrazi „racemska smeša“ i „racemat“ se odnose na ekvimolarnu smešu dve enantiomerne vrste lišene optičke aktivnosti. Enantiomeri se mogu odvojiti od racemske smeše kiralnim postupkom odvajanja, poput superkritične fluidne hromatografije (SFC). Dodeljivanje konfiguracije u kiralnim centrima, u odvojenim enantiomerima, može biti uslovno i prikazane su u Tabeli 1 strukture u ilustrativne svrhe, dok je stereohemija definitivno uspostavljena, kao što je u rendgenskim kristalografskim podacima.

Termin „tautomer“ ili „tautomerni oblik“ odnose se na strukturne izomere različitih energija koji mogu da prelaze jedni u druge putem niske energetske barijere. Na primer, protonski tautomeri (takođe poznati i kao prototropni tautomeri) uključuju interkonverzije preko migracije protona, kao što su keto-enolne i imin-enamin izomerizacije. Valentni tautomeri uključuju interkonverzije preko reorganizacije nekih od vezujućih elektrona.

Termin „farmaceutski prihvatljive soli” označava soli koje nisu biološki ili na drugi način nepoželjne. Farmaceutski prihvatljive soli uključuju kisele i bazne adicione soli. Izraz „farmaceutski prihvatljiv” označava da supstanca ili kompozicija moraju biti hemijski i/ili toksikološki kompatibilni sa ostalim sastojcima koji sadrže formulaciju i/ili sisara koji se sa

1

njom tretira.

Termin „farmaceutski prihvatljiva kisela adiciona so” označava one farmaceutski prihvatljive soli formirane sa neorganskim kiselinama, kao što su hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, sumporna kiselina, azotna kiselina, ugljena kiselina, fosforna kiselina, i organskim kiselinama odabranim od alifatičnih, cikloalifatičnih, aromatičnih, arali-alifatičnih, heterocikličnih, karboksilnih i sulfonskih organskih kiselina, kao što su mravlja kiselina, sirćetna kiselina, propionska kiselina, glikolna kiselina, glukonska kiselina, mlečna kiselina, piruvinska kiselina, oksalna kiselina, jabučna kiselina, maleinska kiselina, malonska kiselina, ćilibarna kiselina, fumarna kiselina, vinska kiselina, limunska kiselina, asparaginska kiselina, askorbinska kiselina, glutaminska kiselina, antranilna kiselina, benzojeva kiselina, cimetna kiselina, bademova kiselina, embonska kiselina, fenilsirćetna kiselina, metansulfonska kiselina „mezilat”, etansulfonska kiselina, p-toluensulfonska kiselina i salicilna kiselina.

Termin „farmaceutski prihvatljiva bazna adiciona so” označava one farmaceutski prihvatljive soli formirane sa organskom ili neorganskom bazom. Primeri za prihvatljive neorganske baze uključuju soli natrijuma, kalijuma, amonijaka, kalcijuma, magnezijuma, gvožđa, cinka, bakra, mangana i aluminijuma. Soli izvedene iz farmaceutski prihvatljivih organskih netoksičnih baza obuhvataju soli primarnih, sekundarnih i tercijarnih amina, supstituisanih amina, uključujući i supstituisane amine koji se nalaze u prirodi, cikličnih amina i baznih jonoizmenjivačkih smola, kao što su izopropilamin, trimetilamin, dietilamin, trietilamin, tripropilamin, etanolamin, 2-dietiaminoetanol, trimetamin, dicikloheksilamin, lizin, arginin, histidin, kafein, prokain, hidrabamin, holin, betain, etilendiamin, glukozamin, metilglukamin, teobromin, purini, piperazin, piperidin, N-etilpiperidin, piperidin i poliaminskih smola.

„Solvat” se odnosi na udruživanje ili kompleks jednog ili više molekula rastvarača i jedinjenje ovog pronalaska. Primeri rastvarača koji formiraju solvate uključuju, ali nisu ograničeni na vodu, izopropanol, etanol, metanol, DMSO, etilacetat, sirćetnu kiselinu i etanolamin.

Izraz „(EC50)” je polovina maksimalne efektivne koncentracije i predstavlja koncentraciju određenog jedinjenja u plazmi potrebnu za dostizanje 50% maksimuma određenog dejstva in vivo.

Izraz „Ki” je konstanta inhibicije i predstavlja apsolutni afinitet vezivanje pojedinog inhibitora za receptor. Meri se pomoću testova za kompetitivno vezivanje i jednaka je koncentraciji na mestu gde bi određeni inhibitor zauzeo 50% receptora, ako nije prisutan

1

kompetitivni ligand (npr. radioobeleženi ligand). Vrednosti Ki se mogu logaritamski konvertovati u vrednosti Pki (-log Ki), prema kojima više vrednosti ukazuju na eksponencijalnu veću potentnost.

Izraz je polovina koncentracije maksimalnog inhibitorskog dejstva i predstavlja koncentraciju određenog jedinjenja potrebnu za dostizanje 50% inhibicije biološkog procesa in vitro. Vrednosti IC50mogu se logaritamski konvertovati u vrednosti pIC50(-log IC50), prema kojima više vrednosti ukazuju na eksponencijalnu veću potentnost. IC50vrednost nije apsolutna vrednost, ali zavisi od eksperimentalnih uslova, npr. koncentracije koja se koristi, a može se pretvoriti u apsolutnu konstantu inhibicije (Ki) korišćenjem Čeng-Prusof-ove jednačine (Biochem Pharmacol. (1973) 22:3099). Mogu se izračunati i drugi procentualni parametri inhibicije, kao što su IC70, IC90, itd.

Izrazi „jedinjenje ovog pronalaska“ i „jedinjenja predmetnog pronalaska“ i „jedinjenja formule I” uključuju jedinjenja formule I i stereoizomere, geometrijske izomere, tautomere, solvate, metabolite i njihove farmaceutski prihvatljive soli i prolekove.

Svaka ovde navedena formula ili struktura, uključujući jedinjenja Formule I, takođe trebaju da predstavljaju hidrate, solvate i polimorfe takvih jedinjenja i njihove smeše. Bilo koja formula ili struktura koja je ovde data, uključujući jedinjenja Formule I, takođe namerava da predstavi neobeležene forme, kao i izotopski obeležene forme jedinjenja. Izotopski obeležena jedinjenja imaju strukture opisane ovde datim formulama, osim što je jedan ili više atoma zamenjen atomom koji ima odabranu atomsku masu ili maseni broj. Primeri izotopa koji se mogu ugraditi u jedinjenja pronalaska uključuju izotope vodonika, ugljenika, azota, kiseonika, fosfora, fluora i hlora, kao što su, ali ne ograničavajući se na 2H (deuterij, D), 3H (tritijum), 11C, 13C, 14C, 15N, 18F, 31P, 32P, 35S, 36Cl, i 125I. Različita izotopno obeležena jedinjenja predmetnog pronalaska, na primer, ona u koja su ugrađeni radioaktivni izotopi poput 3H, 13C i 14C. Takva izotopno obeležena jedinjenja mogu biti korisna u metaboličkim studijama, studijama reakcione kinetike, tehnikama detekcije ili snimanja, kao što je pozitronska emisiona tomografija (PET) ili jednofotonska emisiona računarska tomografija (SPECT), uključujući analize distribucije lekova ili supstrata u tkivu, ili u radioaktivnim lečenjima pacijenata. Terapeutska jedinjenja obeležena ili supstituisana deuterijumom prema ovom pronalasku mogu da imaju poboljšana svojstva DMPK (metabolizam leka i farmakokinetika), koja se odnose na distribuciju, metabolizam i izlučivanje (ADME). Zamena sa težim izotopima kao što je deuterijum, može pružiti određene terapeutske prednosti usled veće metaboličke stabilnosti, na primer, povećan in vivo poluživot ili manje potrebne doze. Jedinjenje obeleženo sa 18F može biti korisno za

1

PET ili SPECT studije. Izotopski obeležena jedinjenja ovog pronalaska i prolekovi se mogu generalno pripremiti postupkom opisanim u šemama, ili u primerima i preparatima koji su opisani u daljem tekstu, tako što se neizotopski označeni reagens zamenjuje lako dostupnim izotopski označenim reagensom. Dalje, supstitucija težim izotopima, posebno deuterijuma (tj. 2H ili D), može pružiti određene terapeutske prednosti koje proističu iz veće metaboličke stabilnosti, npr. povećan poluživot in vivo, ili smanjenje potrebne doze ili poboljšanje terapeutskog indeksa. Razume se da se deuterijum u ovom kontekstu smatra supstituentom u jedinjenju formule (I). Koncentracija tako težeg izotopa, konkretno deuterijuma, može se definisati izotopskim faktorom obogaćivanja. U jedinjenjima ovog pronalaska, svaki atom koji nije posebno označen kao određeni izotop treba da predstavlja bilo koji stabilan izotop tog atoma. Ako nije drugačije navedeno, kada je položaj posebno označen kao „H” ili „vodonik”, podrazumeva se da taj položaj vodonik ima u svom izotopskom sastavu u kom je rasprostranjen u prirodi. Prema tome, u jedinjenjima ovog pronalaska svaki atom posebno označen kao deuterijum (D) treba da predstavlja deuterijum.

JEDINJENJA BENZOKSAZEPIN OKSAZOLIDINONA

Predmetni pronalazak obezbeđuje benzoksazepin oksazolidinonska jedinjenja i njihove farmaceutske formulacije, koji su potencijalno korisne u lečenju kancera, a imaju sledeću strukturu:

i stereoizomere, geometrijske izomere, tautomere i njihove farmaceutski prihvatljive soli, pri čemu:

R<1>je izabran od -CH3,, -CH2CH3,, ciklopropila, i ciklobutila;

R<2>je izabran od -CH3,, -CHF2,, -CH2F i -CF3..

Primeri otelotvorenja jedinjenja Formule I uključuju ona u kojima jeR<1>ciklopropil. Primeri otelotvorenja jedinjenja Formule I uključuju ona u kojima je R<1>CH3ili ciklopropil.

Primeri otelotvorenja jedinjenja Formule I uključuju ona u kojima je R<1>CH3.

Primeri otelotvorenja jedinjenja Formule I uključuju ona u kojima je R<2>−CHF2. Primeri otelotvorenja jedinjenja Formule I uključuju ona u kojima je R<2>-CH2F.

1

Primeri otelotvorenja jedinjenja Formule I uključuju ona u kojima je R<1>ciklopropil i R<2>je -CHF2.

Primeri otelotvorenja jedinjenja Formule I uključuju ona u kojima je R<1>ciklopropil i R<2>je -CHF2F.

Primeri otelotvorenja jedinjenja Formule I uključuju ona u kojima je R<1>CH3i R2je -CHF2

Primeri otelotvorenja jedinjenja Formule I uključuju jedinjenja u Tabeli 1.

Jedinjenja formule I ovog pronalaska mogu da sadrže asimetrične ili hiralne centre, i zbog toga postoje u različitim stereoizomernim oblicima. Namera je da svi stereoizomerni oblici jedinjenja ovog pronalaska, uključujući, ali ne ograničavajući se na dijastereomere, enantiomere i atropisomere, kao i njihove smeše, poput racemskih smeša, čine deo predmetnog pronalaska. U nekim slučajevima stereohemija nije određena ili je privremeno dodeljena.

Pored toga, predmetni pronalazak obuhvata sve dijastereomere, uključujući cis-trans (geometrijske) i konformacione izomere. Na primer, ako jedinjenje formule I sadrži dvostruku vezu ili fuzionisani prsten, cis- i trans- forme, kao i njihove smeše, obuhvaćeni su obimom ovog pronalaska.

U strukturama koje su ovde prikazane, gde stereohemija bilo kog određenog hiralnog atoma nije navedena, tada se svi stereoizomeri razmatraju i uključuju kao jedinjenja ovog pronalaska. Ako je stereohemija određena čvrstim klinom ili isprekidanom linijom koja predstavlja određenu konfiguraciju, tada je taj stereoizomer tako određen i definiran.

Jedinjenja predmetnog pronalaska mogu postojati u nesolvatnim kao i u solvatnim oblicima sa farmaceutski prihvatljivim rastvaračima, kao što su voda, etanol, i slično, i predviđeno je da pronalazak obuhvata i solvatne i nesolvatne oblike.

Jedinjenja predmetnog pronalaska mogu takođe postojati u različitim tautomernim oblicima, i svi takvi oblici su obuhvaćeni obimom pronalaska. Termin „tautomer“ ili „tautomerni oblik“ odnose se na strukturne izomere različitih energija koji mogu da prelaze jedni u druge putem niske energetske barijere. Na primer, protonski tautomeri (takođe poznati i kao prototropni tautomeri) uključuju interkonverzije preko migracije protona, kao što su keto-enolne i imin-enamin izomerizacije. Valentni tautomeri uključuju interkonverzije preko reorganizacije nekih od vezujućih elektrona.

BIOLOŠKA OCENA

Relativna efikasnost jedinjenja Formule I kao inhibitora enzimske aktivnosti (ili druge biološke aktivnosti) se može utvrditi određivanjem koncentracija kod kojih svako

2

jedinjejne inhibira aktivnost na unapred definiranom nivou, a zatim upoređivanjem rezultata. Tipično, poželjno određivanje je koncentracija koja inhibira 50% aktivnosti u biohemijskom testu, odnosno 50% inhibitorske koncentracije ili Određivanje IC50vrednosti se može postići korišćenjem konvencionalnih tehnika poznatih u struci. Generalno, IC50se može odrediti merenjem aktivnosti datog enzima u prisustvu opsega koncentracija ispitivanog inhibitora. Eksperimentalno dobijene vrednosti aktivnosti enzima se zatim postavljaju u odnosu na korišćene koncentracije inhibitora. Koncentracija inhibitora koja pokazuje 50% aktivnosti enzima (u poređenju sa aktivnošću u odsustvu bilo kog inhibitora) se uzima kao IC50vrednost. Analogno tome, druge inhibitorske koncentracije se mogu definisati odgovarajućim određivanjem aktivnosti. Na primer, u nekim podešavanjima može biti poželjno uspostaviti inhibitorsku koncentraciju od 90%, tj. IC90, itd.

Primer jedinjenja Formule I u Tabeli 1 su napravljeni, okarakterisani i testirani na vezivanje na različite izoforme i mutirane oblike PI3K prema postupcima ovog pronalaska i imaju sledeće strukture, odgovarajuća imena (ChemBioDraw, Verzija 12.0.2, CambridgeSoft Corp., Cambridge MA) i biološku aktivnost. Ako je više jedinjenja povezano sa jedinjenjem formule I ili intermedijatom, hemijska struktura će definisati jedinjenja.

Tabela 1. Jedinjenja formule I

TASELISIB

Jedinjenje poznato kao taselisib, GDC-0032 i Roche RG7604 (CAS br.1282512-484, Genentech Inc.) ima IUPAC naziv: 2-(4-(2-(1-izopropil-3-metil-1H-1,2,4-triazol-5-il)-5,6-dihidrobenzo[f]imidazo[1,2-d][1,4]oksazepin-9-il)-lH-pirazol-l-il)-2-metilpropanamid, i strukturu:

taselisib

uključujući stereoizomere, geometrijske izomere, tautomere i njihove farmaceutski prihvatljive soli.

Taselesib se može pripremiti i okarakterisati kako je opisano u WO 2011/036280, US 8242104 i US 8343955.

PIKTILISIB

Jedinjenje poznato kao piktilisib, GDC-0941, Roche, RG-7321 i piktrelisib (CAS br.

957054-30-7, Genentech Inc.,) je moćan višeciljni inhibitor klase I PI3K izoforma. GDC-0941 se trenutno nalazi u fazi II kliničkih ispitivanja za lečenje uznapredovalih čvrstih tumora. GDC-0941 je nazvan 4-(2-(1H-indazol-4-il)-6-((4- (metilsulfonil)piperazin-1-il)metil)tieno[3,2-d]pirimidin-4-il)morfolin (US 7781433; US 7750002; Folkes i sar. (2008) Jour, of Med. Chem. 51(18):5522-5532), i ima strukturu:

piktilisib

uključujući stereoizomere, geometrijske izomere, tautomere i njihove farmaceutski prihvatljive soli.

ALPELISIB

Jedinjenje poznato kao alpelisib (BYL719, Novartis, CAS#: 1217486-61-7) je oralni, selektivni inhibitor PI3K alfa izoforme i nalazi se u kliničkim ispitivanjima za potencijalno lečenje različitih vrsta tumora, uključujući fazu III ispitivanja u kombinaciji sa fulvestrantom za hormonski pozitivne receptore druge linije, HER2 - napredni metastatički kancer dojke

2

(Furet, P. i sar. (2013) Bioorg. Med. Chem. Lett.23: 3741-3748; US 8227462; US 8476268; US 8710085). Alpelisib je nazvan kao (S)-N1-(4-metil-5-(2-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)piridin-4-il)tiazol-2-il)pirolidin-1,2-dikarboksamid) i ima strukturu:

alpelisib

BIOHEMIJSKA INHIBICIJA PI3K IZOFORME

Sposobnost jedinjenja prema ovom pronalasku da deluje kao inhibitor PI3Kα sa selektivnošću u odnosu na PI3Kβ, PI3Kδ i PI3Kγ je određena korišćenjem postupaka iz primera 901. Ki vrednosti prikazane u tabelama 2A i 2B predstavljaju geometrijsku sredinu od najmanje tri nezavisna eksperimenta, osim ako nije drugačije navedeno.

Tabela 2A prikazuje biohemijsku inhibiciju četiri PI3K izoforme prema jedinjenjima formule I iz tabele 1. Pored toga su, kao klinički komparatori, uključena dva klinički testirana PI3K jedinjenja, taselisib i piktilisib. Reprezentativna jedinjenja ovog pronalaska pokazuju jaku aktivnost u odnosu na PI3Kα i pokazuju značajno pojačanu selektivnost u odnosu na ostale izoforme PI3Kβ, PI3Kδ i PI3Kγ u poređenju sa taselisibom (GDC-0032) i piktilisibom (GDC-0941). Konkretno, odnosi selektivnosti u drugom iz desnog stupca tabele 2A pokazuju da svako jedinjenje formule I 101-107 ima odnos selektivnosti PI3K alfa i delta daleko veći od taselisiba ili piktilisiba. U stvari, i taselisib i piktilisib imaju jaču aktivnost prema delti PI3K nego u odnosu na PI3K alfa, odnosno, njihovi odnosi selektivnosti su manji od 1. Koeficijenti selektivnosti jedinjenja formule I 101-107 se kreću u opsegu od 301 do 634 puta.

Tabela 2B prikazuje biohemijsku inhibiciju dve PI3K izoforme, alfa i delta i PI3K odnos selektivnosti alfa i delta za određena komparativna jedinjenja US 8242104, i jedinjenja koje nosi dimetiloksazolidin-2-on grupa iz US 8263633 (jedinjenje 356, kolona 149). Komparativna jedinjenja prikazana ovde u Tabeli 2B su primeri iz širokih genusa opisanih u US 8242104 i US 8263633. Ni US 8242104 ni US 8263633 ne otkrivaju jedinjenje u obimu jedinjenja formule I prema ovom pronalazku. Dok reprezentativni primeri komparatora US 8242104, kao što je opisano u tabeli 2B, pokazuju odnose selektivnosti PI3Kα (alfa) u odnosu na PI3Kδ (delta) >1, maksimalni posmatrani odnos selektivnosti je 46,9 puta. Zbog toga jedinjenja formule I 101-107 postižu značajno veće odnose selektivnosti u odnosu na primere US 8242104. Nema smernica za US 8242104, ni za US 8263633, da se vrši izbor strukturnih elemenata jedinjenja formule I da bi se postiglo svojstvo visoke PI3K alfa selektivnosti u odnosu na deltu PI3K. Ovo neočekivano svojstvo veće od 300 puta PI3K alfa selektivnosti je sačuvano u celom spektru jedinjenja prikazanih u tabeli 1.

Trenutni inhibitori PI3K u kliničkim ispitivanjima, poput taselisiba (WO 2011/036280; US 8242104; US 8343955), i drugih reprezentativnih primera US 8242104 pokazuju značajnu aktivnost u odnosu na izoformu PI3Kδ (delta). Ovaj nedostatak selektivnosti prema PI3Kδ (delta) je u skladu sa uočenom GI toksičnošću u klinici za taselisib. Postoji potreba za inhibitorima PI3Kα (alfa) koji sadrže povoljne karakteristike koje su reprezentativne za primere US 8242104 koji istovremeno nemaju aktivnost u odnosu na PI3Kδ (delta). Sadašnji pronalazak obezbeđuje jedinjenja koja ispunjavaju ovu aktivnost i profil selektivnosti.

Neočekivano svojstvo PI3K alfa selektivnosti je pogodno za uklanjanje gastrointestinalne toksičnosti primećene kod kandidata kliničkih inhibitora PI3K. Nedavni klinički podaci sa PI3K inhibitorima podrazumevali su delta aktivnost PI3K kao izvora gastrointestinalnih toksičnosti (Akinleye i sar., „Phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) inhibitors as cancer therapeutics“. Journal of Hematology & Oncology 2013, 6:88-104). Pogledajte tabelu 2 PI3K inhibitora u kliničkim ispitivanjima, taselisiba i pictilisiba.

Sa značajno većom selektivnošću za inhibiciju PI3Kα (alfa) u odnosu na inhibiciju PI3Kδ (delta), zbog toga je bilo očekivano da jedinjenja formule I 101-107 postignu veću granicu između kliničke aktivnosti podstaknute inhibicijom PI3Kα (alfa) u odnosu na toksičnosti koje izazivaju PI3Kδ (delta) inhibicije, u poređenju sa klinički testiranim taselisibom i piktilisibom, ili bilo kojim od primera iz US 8242104 ili US 8263633. Prema tome, jedinjenja formule I prema ovom pronalasku mogu biti korisni kao terapeutski agensi sa smanjenim profilom toksičnosti u odnosu na agense koji pokazuju veću inhibiciju normalnih funkcija PI3Kβ, PI3Kδ ili PI3Kγ.

2

Tabela 2A. Biohemijska inhibicija PI3K izoformi jedinjenja formule I i komparativna jedinjenja taselisib i piktilisib

Tabela 2B. Biohemijska inhibicija PI3K izoformi sa komparativnim jedinjenjima

2

2

2

* Ki vrednost predstavlja prosek dva eksperimenta, ** Ki vrednost predstavlja jedan eksperiment

INTERAKCIJE JEDINJENJA SA PI3K

Racionalna osnova za PI3Kα selektivnost jedinjenja formule I može se nalaziti u određenim interakcijama vezanja.

Sposobnost jedinjenja prema ovom pronalasku da posebno deluje na PI3Kα određena je rešavanjem rendgenske ko-kristalne strukture reprezentativnih jedinjenja sa PI3Kα (alfa) korišćenjem postupaka iz primera 908. Optimizovani strukturni dizajn PI3K inhibitora sa selektivnošću za PI3Kα izoformu u odnosu na ostale izoforme može uključivati precizno pozicioniranje i raspored atoma i funkcionalnih grupa za interakciju sa ostacima specifičnim za izoformu na mestu vezivanja. Naročito, supstitucija u položaju 9 i na položaju 2 5,6-dihidrobenzo[f]imidazo[1,2-d][1,4]oksazepinskog prstenastog sistema ima kritične uticaje na specifičnu aktivnost jedinjenja u odnosu na PI3Kα.

Slike 1A-D prikazuju rendgenske ko-kristalne strukture taselisiba (GDC-0032), referentno jedinjenje 529 (US 8242104) i dva reprezentativna jedinjenja ovog pronalaska sa PI3Kα. Kao što je prikazano na slici 1A, taselisib (GDC-0032) sadrži primarnu amidnu funkcionalnu grupu koja je pozicionirana u bliskom kontaktu i Gln859 i Ser854, izgleda da nudi mogućnost interakcije vezanja vodika. Ostatak Gln859 specifičan je za PI3Kα izoformu, sa različitim ostatkom koji zauzima ovaj položaj u ostalim izoformama (PI3Kβ = Asp, PI3Kδ = Asn, PI3Kγ = Lys). Međutim, uprkos ovom bliskom kontaktu sa ostatkom specifičnim za PI3Kα, merenim u biohemijskom testu, GDC-0032 ima jednaku aktivnost u odnosu na izoforme PI3Kα i PI3Kδ, i samo blago smanjenu aktivnost u odnosu na izoformu PI3Kγ (vidi tabelu 2A).

Kao što je prikazano na slici 1B, referentno jedinjenje 529 (US 8242104) sadrži primarnu amidnu funkcionalnu grupu koja je na sličnom položaju kao taselisib. Ova je funkcionalnost unutar odgovarajuće udaljenosti i odgovarajuće geometrije Ser854 i Gln859 da bi se ostvarile interakcije vezane vodonikom. Odnos selektivnosti od 46,9 puta za PI3Kα u odnosu na PI3Kδ (vidi tabelu 2B) može se racionalizovati u svetlu ovih interakcija, a saznanje da PI3Kδ ne sadrži Gln ostatak na položaju 859, i zbog toga bi te interakcije trebale

2

biti specifične za PI3Kα.

Slike 1C i ID pokazuju da primarni amid (S)-2-aminopropanamidne grupe jedinjenja 101 i (S)-2-amino-2-ciklopropilacetamidne grupe jedinjenja 103 svaki zauzima vrlo slično mesto na mestu vezivanja za primarne amide GDC-0032 i referentno jedinjenje 529 (US 8242104). Ova primarna funkcionalnost amida kod svakog predstavnika pronalaska nalazi se na odgovarajućoj udaljenosti i odgovarajućoj geometriji Ser854 i Gln859 da bi se napravile idealne interakcije vezivanja vodonika. Uprkos očiglednim sličnostima u smeštanju i orijentaciji funkcionalne grupe, reprezentativni primeri prikazani na slikama 1C i 1D, kao i druga jedinjenja ovog pronalaska sa sličnim supstituentima i funkcionalnošću, poboljšavaju se u interakcijama primarnog amida, taselisiba i referentnog jedinjenja 529 (US 8242104), tako da se primećuje da jedinjenja ovog pronalaska imaju značajno povećanu selektivnost za PI3Kα u odnosu na PI3Kδ, mereno u biohemijskom testu. Jedinjenje 101 je selektovano 361 put, a jedinjenje 103 je selektovano 634 puta, što je značajno povećanje u odnosu na referentno jedinjenje 529 (US 8242104) koje je selektovano samo 46,9 puta. U svetlu sličnosti položaja primarne amidne funkcionalnosti između taselisiba i drugih jedinjenja US 8242104 (kao što je prikazano referentnim jedinjenjem 529), povećana selektivnost za PI3Kα u odnosu na PI3Kδ, što je pokazano jedinjenjima ovog pronalaska, neočekivano je svojstvo. U US 8242104 nema smernica da se vrši izbor strukturnih elemenata jedinjenja formule I da bi se postiglo svojstvo visoke (> 300 puta) PI3Kα selektivnosti. Jedinjenja formule I prema ovom pronalasku poboljšavaju se u interakcijama primarnog amida GDC-0032 tako da se opaža da jedinjenja ovog pronalaska imaju značajno povećanu selektivnost za PI3Kα u odnosu na PI3Kδ, mereno u biohemijskom testu, u odnosu na komparativna jedinjenja (vidi tabelu 2A i 2B)

Slika 2A prikazuje strukturu rendgenskih zraka taselisiba vezanog na aktivnom mestu PI3Kα (alfa). Atom N2 triazolnog prstena nije u mogućnosti da direktno komunicira ni sa bočnim lancem Tyr836 (udaljenost 4,04 A) ili Ser774 (udaljenost 2,74 i 2,82 A, nema komplementarne polarnosti između liganda i ostatka). Slika 2B prikazuje rendgensku strukturu jedinjenja 101 vezanog na aktivnom mestu PI3Kα i pokazuje da je oksazolidinonski prsten u stanju da ostvari višestruke poboljšane interakcije sa proteinom u odnosu na triazolni prsten. Karbonilna funkcionalnost je bliska bočnom lancu Tyr836 (2,67 Å) i sposobna je da izvrši povoljnu polarnu interakciju. Atom fluora oksazolidinononskog supstituenta je u bliskom kontaktu (2,21 A) sa hidroksilnom grupom Ser774 i u skladu je sa polarnom interakcijom ili ne-klasičnom vodoničnom vezom, povoljnom interakcijom omogućenom polarizacijom veze ugljenik-fluor (Böhm i sar.., Fluorine in Medicinal Chemistry, (2004) ChemBioChem, 5:637-643; Zhou i sar., „Fluorine Bonding - How Does it Work In Protein-Ligand Interactions”, (2009) J. Chem., inf. Model., 49:2344-2355).

Sva jedinjenja ovog pronalaska sadrže oksazolidinonski prsten i sposobna su da poboljšaju interakciju sa Tyr836 od PI3Kα (alfa). Neki primeri ovog pronalaska takođe sadrže fluorisani supstituent na oksazolidinonskom prstenu i sposobni su da poboljšaju interakciju sa Ser774 od PI3Kα. Obe ove interakcije vezivanja mogu doprineti povećanoj selektivnosti za PI3Kα primećenim u primerima ovog pronalaska u odnosu na primere US 8242104. Kao što je prikazano u Tabelama 2A i 2B, jedinjenja koja sadrže oksazolidinonski prsten imaju veću selektivnost izoforme od uporedivih jedinjenja koji sadrže triazolni prsten. Ostaci Ser774 i Tyr836 nisu jedinstveni za PI3Kα izoformu, PI3Kδ sadrži te iste ostatke na istim pozicijama, a povećana selektivnost izoforme inhibitora oksazolidinona ne predviđa ove kristalne strukture. Suptilne razlike u položaju i orijentaciji istog ostatka identiteta između različitih izoforma mogu biti rezultat suptilnih promena u sekundarnoj i tercijarnoj strukturi proteina. Te razlike je teško predvideti i interpretirati čak i pored rendgenskih zraka kristalnih struktura obe proteinske izoforme. Iznenađujuća i neočekivana svojstva poboljšanih molekularnih interakcija i poboljšane izoformne selektivnosti inhibitora oksazolidinona sačuvana su u celom spektru jedinjenja prikazanih u Tabeli 1.

Oksazolidinon se strukturno razlikuje od triazola po tome što oksazolidinon ima karbonil, polarniji je i nema aromatičan karakter. Triazol nema karbonilnu grupu, manje je polarni i ima aromatičan karakter.

Oksazolidinonski prsten obezbeđuje dalju korist u odnosu na triazolni prsten u smislu pojačanog sp3 karaktera i smanjenog broja aromatičnih prstenova. U literaturi je opšte prihvaćeno da je povećan broj aromatičnih prstenova povezan sa povećanim rizikom od promiskuitetnog vezivanja. Suprotno tome, povećanje frakcije sp3 ugljenika (# sp3 ugljenici / # ukupno ugljenika) povezano je sa poboljšanim fizičko-hemijskim svojstvima i smanjenim promiskuitetnim vezivanjem, smanjujući rizik od neciljane toksikologije. Ovi koncepti su opisani u referencama Lovering i sar., „Escape From Flatland“, (2009) J. Med. Chem., 52:6752-6756 i Ritchie and Macdonald, “Physicochemical Descriptors of Aromatic Character and Their Use in Drug Discovery”, (2014) J. Med. Chem., 57:7206-7215. Zamena aromatičnog prstena triazola, kao što su to pokazali predstavnici US 8242104, zasićenim heterocikličnim prstenom, oksazolidinonom sadržanim u svakom primeru ovog pronalaska, predstavlja povoljno smanjenje rizika od neciljane toksikologije. Kompletna prikazana jedinjenja u US 8242104 su pretežno popunjena jedinjenjima sa aromatičnim prstenovima na ovom položaju, 4 primera funkcionalne grupe karboksamida koja zamenjuje aromatični

1

prsten i nema primera zasićenih cikličnih ili heterocikličnih sistema. Zbog znatno različitih interakcija vezivanja i sternih potreba za aromatičnim i zasićenim heterociklima, oni obično nisu zamenjivi. Bez primera zasićenih heterocikličnih sistema u položaju 2 5,6-dihidrobenzo[f]imidazo[1,2- d][1,4]oksazepinskog prstena, US 8242104 ne obezbeđuje uputstva o načinu zamene aromatičnog prstena sa zasićenim heterociklom zadržavajući aktivnost u odnosu na PI3Kα.

Prema tome, jedinjenja ovog pronalaska sadrže optimizovane supstituente i funkcionalnost i u 5,6-dihidrobenzo[f]imidazo[1,2-d][1,4]oksazepinu u 9 i 2 položaju. Ova optimizovana jedinjenja daju značajnu i do sada nepoznatu korist u pogledu poboljšanih molekularnih interakcija i povećanu selektivnu aktivnost u odnosu na PI3Kα, uz smanjenu aktivnost u odnosu na PI3Kδ. Jedinjenja ovog pronalaska mogu biti korisna kao terapeutski agensi sa poboljšanim terapeutskim vremenskim okvirom u odnosu na srodne agense kao što je taselisiba (GDC-0032).

SEFEKTIVNA INHIBICIJA MUTANTNOG PI3Kα (ALFA)

Sposobnost jedinjenja prema ovom pronalasku da deluje preferencijalno na ćelije koje sadrže mutirani PI3Kα određena je merenjem inhibicije PI3K putanje u SW48 izogenim ćelijskim linijama: PI3Kα divljeg tipa (roditeljski), mutirani spiralni domen E545K i mutant H1047R domena kinaze, kao što je opisano u postupcima iz primera 902.

Statistička analiza: EC50 vrednosti predstavljaju geometrijsku sredinu od najmanje 4 nezavisna eksperimenta, osim ako nije drugačije navedeno. Sve statistike su izvedene korišćenjem KaleidaGraph softvera (verzija 4.1.3). Studentov t-test je izvršen korišćenjem nesparenih podataka sa jednakom varijacijom za poređenje aktivnosti u odnosu na mutirane ćelije i ćelije divljeg tipa. P < 0,05 se smatra značajnim.

Tabela 3A prikazuje inhibiciju P-PRAS40 u izogenim ćelijama SW48 prema jedinjenjima formule I iz tabele 1. Sva ova jedinjenja pokazuju povećanu aktivnost prema mutiranim PI3Kα ćelijama u odnosu na divlji tip PI3Kα ćelija. Jedinjenja ovog pronalaska pokazuju sličnu aktivnost kao taselisib u mutirajućim PI3Kα ćelijama SW48, sa jednakom ili većom selektivnošću od taselisiba u odnosu na aktivnost u PI3Kα ćelijama dibljeg tipa (vidi tabelu 3B).

Tabela 3B prikazuje inhibiciju P-PRAS40 u izogenim ćelijama SW48 određenim komparativnim jedinjenjima US 8242104, jedinjenjem koje sadrži dimetiloksazolidin-2-on iz US 8263633 (jedinjenje 356, kolona 149) i piktilisib. Komparativna jedinjenja prikazana ovde u Tabeli 3B su primeri iz širokih genusa opisanih u US 8242104 i US 8263633. Ni US 8242104 ni US 8263633 ne otkrivaju jedinjenje u obimu jedinjenja formule I prema ovom

2

pronalazku. Komparativna jedinjenja sadrže primere koji nemaju značajno povećanu aktivnost za mutirajuće PI3Kα ćelije u odnosu na divlji tip PI3Kα ćelija (vidi komparativna jedinjenja 436 i 549, p > 0,05). Ova jedinjenja su veoma strukturno slična komparativnim jedinjenjima koja pokazuju značajno povećanu aktivnost za mutirajuće PI3Kα ćelije u odnosu na divlji tip PI3Kα ćelije (vidi komparativno jedinjenje 529). Ne postoji zajednički strukturni element u komparatornim jedinjenjima koji obezbeđuje smernice za selektivnu inhibiciju mutiranih PI3Kα (alfa) ćelija. U širem smislu, ne postoje smernice u US 8242104 ni u US 8263633 da se vrši izbor strukturnih elemenata jedinjenja formule I da bi se postigla povećana ili ekvivalentna aktivnost prema mutiranim PI3Kα ćelijama u odnosu na divlje vrste PI3Kα ćelija. Ovo neočekivano svojstvo je sačuvano u celom spektru jedinjenja prikazanih u tabeli 1.

Tabela 3A. Inhibicija P-PRAS40 u SW48 izogenim ćelijama jedinjenja formule I

Tabela 3B. Inhibicija P-PRAS40 u izogenim ćelijama SW48 komparativnih jedinjenja

* EC50 predstavlja jedan eksperiment

ANTIPROLIFERATIVNA AKTIVNOST U PI3K MUTANTNIM TUMORNIM

ĆELIJAMA

Sposobnost jedinjenja prema ovom pronalasku da deluje na PI3K mutirajuće ćelije tumora je određena merenjem ćelijske vitalnosti EC50 u ćelijama HCC1954 (PI3Kα mutant H1047R) i MCF7 ćelije (PI3Kα mutant E545K) korišćenjem postupaka iz primera 903. Tabela 4 pokazuje da su reprezentativna jedinjenja formule I 101 i 103 ovog pronalaska sposobna da inhibiraju put PI3K i inhibiraju proliferaciju u ćelijama HCC1954 i MCF7 sa sličnim nivoom potencijala kao komparativna jedinjenja taselisib (jedinjenje 196, US 8242104), piktilisib i jedinjenje 436 (US 8242104).

Tabela 4. Anti-proliferativna aktivnost PI3K jedinjenja u mutiranim ćelijama tumora PI3K-alfa

EFIKASNOST IN VIVO

Tabele 5-8 prikazuju podatke iz in vivo ispitivanja inhibicije rasta tumora (TGI) sa PI3K jedinjenjima. Promena volumena tumora je merena tokom20 ili više dana u kohortama

4

imunokompromitovanih miševa koji nose ksenografte sa kancerom dojke, koji se svakodnevno doziraju PO (oralno) primenom nosača i PI3K jedinjenjima (Primer 904).

Tabela 5 pokazuje da su kod maksimalnih tolerisanih doza (MTD), GDC-0032 (taselisib), jedinjenje 103 i jedinjenje 101 efikasniji od alpelisiba (BYL-719) u modelu tumora sa mutiranim PI3K.

Tabela 6 pokazuje da je u dozama manjim od maksimalno tolerisane doze (tj. 25 mg/kg), jedinjenje 101 efikasnije od GDC-0032 u modelu tumora sa mutiranim PI3K. Postoji potencijal za veći terapeutski indeks (TI) sa jedinjenjem 101, jer je postignuta maksimalna efikasnost pre maksimalne podnošljivosti.

Tabela 7 pokazuje da se pri jedinjenju 101 u poređenju sa GDC-0032 u modelu tumora sa mutiranim PI3K vide povećani odgovori (PR i CR). Takođe, u maksimalno tolerisanim dozama, GDC-0032 i BYL-719 su podjednako efikasni.

Tabela 8 pokazuje da su u maksimalno tolerisanim dozama GDC-0032 i jedinjenje 101 efikasniji od BYL-719, a jedinjenje 101 je otprilike efikasno kao GDC-0032 u modelu tumora sa mutiranim PI3K.

Tabela 5. Poređenje maksimalno tolerisanih doza (MTD) PI3K jedinjenja u HCC-1954x1 (ER-, PI3K<H1047R>) modelu ksenografta dojke

Tabela 6. Studija o opsegu doze jedinjenja 101 u HCC-1954x1 (ER-, PI3K<H1047R>) modelu ksenografta dojke

Tabela 7. Studija o opsegu doze jedinjenja 101 u KPL-4 (ER-, PI3K<H1047R>) model ksenografa dojke

Tabela 8. Poređenje GDC-0032, jedinjenja 101 i BYL-719 u HCI-003 (ER+, PI3K<H1047R>) model PDX ksenografta dojke

INHIBICIJA PUTA U IZOLIRANIM B-ĆELIJAMA

Sposobnost jedinjenja prema ovom pronalasku da inhibira put PI3K u B-ćelijama je procenjena uticajem jedinjenja na nivoima CD69 posle agonističkog a-IgM tretmana korišćenjem postupaka iz primera 906. Veruje se da ekspresija CD69 u B-ćelijama koja je rezultat a-IgM tretmana podstaknuta signalizacijom kroz PI3Kδ (delta). Tabela 9 prikazuje reprezentativna jedinjenja formule 1 koji su selektivniji inhibitori putne signalizacije u PI3K-mutantnoj liniji (SW48 (H1047R)) u odnosu na B-ćelije (kolona 3) u poređenju sa taselisibom, piktilisibom, alpelisibom, jedinjenjem-436 (US US8242104) i idelalisibom.

Tabela 9. Inhibicija ekspresije CD69 u B-ćelijama odabirom jedinjenja.

*CD69 ekspresija IC50 izmerena u celokupnoj ljudskoj krvi i ispravljena množenjem sa merenim ljudskim fuiz eksperimenta vezivanja proteina u plazmi.

INHIBICIJA PUTA U PI3K MUTANTU I ĆELIJAMA TUMORA DIVLJEG TIPA

Sposobnost jedinjenja prema ovom pronalasku da inhibira signalizaciju PI3K-puta u ćelijama tumora je procenjena merenjem nivoa p-PRAS40 u linijama HCC1954 (PI3Kα mutant H1047R) i HDQ-P1 linija (PI3Kα divljeg tipa), korišćenjem postupaka iz primera 907. Tabela 10 prikazuje reprezentativna jedinjenja formule 1101, 103 i 105 koja su u stanju da selektivno inhibiraju put PI3K u PI3Kα mutantu (HCC1954, PI3Kα mutant H1047R) u odnosu na PI3Kα ćelije tumora divljeg tipa (HDQ-P1, PI3Kα divljeg tipa). Jedinjenja 101, 103 i 105 imaju veći mutant u odnosu na selektivnost divljeg tipa u poređenju sa komparativnim jedinjenjima taselisiba, piktilisiba, alpelisiba i jedinjenja-436 (US8242104).

Tabela 10. Inhibicija p-PRAS40 u HCC1954 i HDQ-P1 linija odabirom jedinjenja.

p110α DEGRADACIJA U PI3K MUTANTNIM ĆELIJAMA TUMORA

Sposobnost jedinjenja prema ovom pronalasku da smanji nivo p110a je određena u eksperimentima sa HCC1954 (PI3Kα mutant H1047R) i HDQ-P1 linija (PI3Kα divlji tip), korišćenjem postupaka iz primera 905. Slike 3A i 3B prikazuju reprezentativna jedinjenja formule 1, 101 i 103, koji mogu da promovišu redukciju nivoa p110a selektivno u PI3K mutantu (HCC1954, PI3Kα mutant H1047R) u odnosu na PI3Kα divlji tip (HDQ-P1, PI3Kα divlji tip) ćelija tumora na način koji zavisi od koncentracije. Na slici 3A su prikazani Western-blot podaci koji prikazuju nivoe p110a (p110a, P110 alfa) nakon 24 sata tretmana sa jedinjenjem 101, jedinjenjem 103 i jedinjenjem 436 iz US 8242104 u ćelijama HCC-1954 (PI3Kα mutant H1047R). Na slici 3B su prikazani Western-blot podaci koji prikazuju nivoe p110a (p110a, P110 alfa) nakon 24 sata tretmana sa jedinjenjem 101, jedinjenjem 103 i jedinjenjem 436 iz US 8242104 u HDQ-P1 ćelijama (PI3Kα divljeg tipa). Jedinjenja 101 i 103 snažnije utiču na nivo p110α u odnosu na jedinjenje-436 (US8242104).

VIŠEDNEVNO ORALNO DOZIRANJE PASA

Sposobnost jedinjenja prema ovom pronalasku da promoviše gastrointestinalne i/ili sistemske upale ili da izaziva iscrpljivanje limfoida procenjena je kliničkom i anatomskom procenom patologije nakon višednevnog doziranja pasa rase Bigl(7-14 dana). Jedinjenja formule 1101 i 103 pri >5-ostrukom slobodnom izlaganju više puta preko TGI60 (inhibicija rasta tumora 60% u studiji ksenografta PI3K-mutant) ne promovišu pro-upalni potpis kako je određeno kliničkom patologijom ili anatomskom procenom patologije (Tabela 11a , 11b). Slično tome, jedinjenja 101 i 103 proizvode samo manje količine iscrpljivanja limfoida kod višestruke izloženosti. Suprotno tome, eksperimenti sa komparativnim jedinjenjem taselisib pokazuju značajne pro-upalne efekte i iscrpljivanje limfoida pri <0,3 puta slobodnoj izloženosti preko TGI60 (Tabela 11c). Komparativna jedinjenja alpelisib (BYL-719) i jedinjenje 436 (US8242104) takođe izazivaju upalu i iscrpljivanje limfoida kod višestrukog nižeg izlaganja, u poređenju sa jedinjenjima 101 i 103 formule 1 (Tabela 11d, 11e). Stepen i ozbiljnost nalaza je u skladu sa povećanom inhibicijom PI3Kδ (delta) pri višestrukoj izloženosti preko CD69 IC50za jedinjenja komparatora.

Tabela 11. Višednevno doziranje formule 1 i komparativna jedinjenja kod pasa. (a)

Fupas = 0,692; Fumiš = 0,252 (Fu= nevezana frakcija u plazmi vrsta)

* Višestruka izloženost pomoću TGI60 iz 21-dnevne KPL4 studije ksenografta; TGI60 @ 2 mg/kg, 1,04 µM h ukupno, 0,26 µM h slobodno

**a-IgM stimulisana CD69 ekspresija (cele-krv) IC50= 67 nM

<+>Nalazi vezani za upalu i limfoidne organe

(b)

Fupas = 0,507; Fumiš = 0,03 (Fu= nevezana frakcija u plazmi vrsta)

* Višestruka izloženost pomoću TGI60 iz 21-dnevne studije HCC1954 TGI; TGI60 @ 3 mg/kg, ukupno 1,13 µM h, 0,03 µM h slobodno

**a-IgM stimulisana CD69 ekspresija (cele-krv) IC50= 142 nM<+>Nalazi vezani za upalu i limfoidne organe

(c)

4

Fupas = 0,28; Fumiš = 0,10 (Fu= nevezana frakcija u plazmi vrsta)

* Višestruka izloženost pomoću TGI60 iz 21-dnevne KPL4 studije ksenografta; TGI60 @ 4,3 uM h (ukupno) ili 0,44 uM h slobodno

**a-IgM stimulisana CD69 ekspresija (cele-krv) IC50= 3,1 nM

<+>Nalazi vezani za upalu i limfoidne organe

(d)

Fupas = 0,68; Fumiš = 0,36 (Fu= nevezana frakcija u plazmi vrsta)

* Višestruka izloženost pomoću TGI60 iz 21-dnevne KPL4 studije ksenografta; TGI60 @ 2,8 uM h ukupno, 1,0 uM h slobodno

**a-IgM stimulisana CD69 ekspresija (cele-krv) IC50= 45 nM

<+>Nalazi vezani za upalu i limfoidne organe

(e)

Fupas = 0,072; Fumiš = 0,082 (Fu= nevezana frakcija u plazmi vrsta)

* Višestruka izloženost pomoću TGI60 iz 21-dnevne KPL4 studije ksenografta; TGI60 @ 72 uM h (ukupno), 5,9 uM h (slobodno)

**a-IgM stimulisana CD69 ekspresija (cele-krv) IC50= 613 nM

<+>Nalazi vezani za upalu i limfoidne organe

PRIMENA JEDINJENJA FORMULE I

Jedinjenja ovog pronalaska mogu se primeniti na bilo kojim način pogodan stanju koji se tretira. Pogodni putevi uključuju oralni, parenteralni (uključujući potkožno, intramuskularno, intravenski, intraarterijski, intradermalni, intratekalni i epiduralni), transdermalni, rektalni, nazalni, topički (uključujući bukalni i sublingvalni), vaginalni, intraperitonealni, intrapulmonalni i intranazalni. Za lokalni imunosupresivni tretman,

4

jedinjenja se mogu primenjivati intralezionalnom primenom, uključujući perfuziju ili kontakt na neki drugi način sa inhibitorom pre transplantacije. Podrazumeva se da poželjna ruta može varirati u zavisnosti od, na primer, stanja primaoca. Ako se jedinjenje primenjuje oralno, može se formulisati u obliku pilula, kapsula, tableta itd. sa farmaceutski prihvatljivim nosačem ili ekscipijentom. Ako se jedinjenje primenjuje parenteralno, može se formulisati sa farmaceutski prihvatljivim parenteralnim nosačem i u obliku jedinične doze za injekciju, kao što je detaljno opisano u nastavku.

Doza za lečenje ljudskih pacijenata može biti u opsegu od oko 1 mg do oko 1000 mg jedinjenja Formule I. Tipična doza može biti od oko 10 mg do oko 300 mg jedinjenja. Doza se može primenjivati jednom dnevno (QID), dva puta dnevno (BID) ili češće, u zavisnosti od farmakokinetičkih i farmakodinamičkih svojstvava, uključujući apsorpciju, distribuciju, metabolizam i izlučivanje određenog jedinjenja. Osim toga, faktori toksičnosti mogu uticati na režim doziranja i primene. Ako se primenjuje oralno, pilula, kapsula ili tableta mogu se uzimati svakodnevno ili ređe tokom određenog vremenskog perioda. Režim se može ponavljati tokom više ciklusa terapije.

POSTUPCI LEČENJA SA JEDINJENJIMA FORMULE I

Jedinjenja Formule I predmetnog pronalaska su korisna u lečenju ljudskog ili životinjskog pacijenta koji pati od bolesti ili poremećaja koji proizilaze iz abnormalnog rasta ćelije, funkcije ili ponašanja povezanog sa PI3K, kao što je kancer, pa se mogu tretirati postupkom koji sadrži primenu jedinjenja predmetnog pronalaska kao što je gore definisano. Ljudski ili životinjski pacijent koji boluje od kancera može se takođe tretirati postupkom koji sadrži primenu jedinjenja predmetnog pronalaska kao što je gore definisano. Stanje pacijenta se na taj način može poboljšati ili popraviti.

Postupci ovog pronalaska takođe uključuju lečenje kancera dojke, jajnika, grlića maternice, prostate, testisa, genitourinarnog trakta, jednjaka, grkljana, glioblastoma, neuroblastoma, želuca, kože, keratoakantoma, pluća, epidermoidnog kancera, kancera velikih ćelija, nemikrocelularnog kancera pluća (NSCLC), kancera malih ćelija, adenokancera pluća, kosti, debelog creva, adenoma, gušterače, adenokancera, kancera štitne žlezde, folikularnog kancera, nediferenciranog kancera, papilarnog kancera, seminoma, melanoma, sarkoma, kancera mokraćne bešike, kancera jetre i žučnih puteva, kancera bubrega , pankreasa, mijeloidnog poremećaja, limfoma, dlakastih ćelija, bukalne šupljine, nazo-faringe, ždrela, usne, jezika, usta, tankog creva, debelog creva, rektuma, mozga i centralnog nervnog sistema, Hodžkinove bolesti, leukemije, bronhija, štitne žlijezde, jetre i intrahepatičnog žučnog kanala, hepatocelularnog, želudačnog, glioma / glioblastoma, endometrije, melanoma, bubrega i bubrežne karlice, mokraćne bešike, korpusa maternice, grlića maternice, multipli mjeloma, akutne mijeloične leukemije, hronične mijeloične leukemije, limfocitne leukemije, hronične limfatične leukemije (CLL), mijelocitne leukemije, usne šupljine i ždrijela, ne-Hodžkinovog limfoma, melanoma i vilioznog adenoma debelog creva.

Na osnovu analize ekspresije, imunohistohemijske analize i profiliranja ćelijskih linija, maligniteti debelog crijeva, dojke, grlića maternice, želuca, pluća i multipli mijelom najverovatnije reaguju na PI3K modulatore ili inhibitore.

Pronalazak se odnosi na jedinjenje kao što je prethodno opisano za upotrebu u lečenju kancera kod pacijenta.

Pronalazak se odnosi na upotrebu jedinjenja kao što je prethodno opisano za proizvodnju leka za lečenje kancera kod pacijenta.

Pronalazak se odnosi na jedinjenje kao što je prethodno opisano za upotrebu u lečenju kancera kod pacijenta.

Pronalazak se odnosi na jedinjenje kao što je prethodno opisano za upotrebu u lečenju kancera kod pacijenta gde je kancer izabran između kancera dojke i mikrocelularnog kancera pluća.

Pronalazak se odnosi na upotrebu jedinjenja kao što je prethodno opisano za proizvodnju leka za lečenje kancera kod pacijenta gde je kancer odabran od kancera dojke i mikrocelularnog kancera pluća.

Pronalazak se odnosi na jedinjenje kao što je prethodno opisano za upotrebu u lečenju kancera kod pacijenta gde je kancer odabran između kancera dojke i mikrocelularnog kancera pluća.

FARMACEUTSKE FORMULACIJE

Da bi se jedinjenje ovog pronalaska koristilo za terapeutski tretman sisara, uključujući ljude, obično se formuliše u skladu sa standardnom farmaceutskom praksom kao farmaceutska kompozicija. Prema ovom aspektu pronalaska, predviđena je farmaceutska kompozicija koji sadrži jedinjenje ovog pronalaska u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim razblaživačem ili nosačem.

Tipična formulacija se priprema mešanjem jedinjenja iz predmetnog pronalaska i nosača, razblaživača ili ekscipijensa. Pogodni nosači, razblaživači i ekscipijensi su dobro poznati stručnjacima, i uključuju materijale kao što su ugljeni hidrati, voskovi, vodorastvorljivi i/ili bubreći polimeri, hidrofilni ili hidrofobni materijali, želatin, ulja, rastvarači, voda, i slično. Određeni nosač, razblaživač ili ekscipijens koji će se koristiti zavisi

4

od načina i svrhe za koju se primenjuje jedinjenje iz predmetnog pronalaska. Rastvarači se generalno biraju na osnovu rastvarača koje stručnjaci iz struke prepoznaju kao sigurne (GRAS) za davanje sisarima. Uopšteno, sigurni rastvarači su netoksični vodeni rastvarači, kao što su voda i drugi netoksični rastvarači koji su rastvorljivi ili se mešaju u vodi. Pogodni vodeni rastvarači uključuju vodu, etanol, propilen-glikol, polietilen-glikole (npr. PEG 400, PEG 300), itd. i njihove smeše. Formulacije mogu takođe sadržati jedan ili više pufera, stabilizatora, surfaktanata, agenasa za vlaženje, lubrikanata, emulgatora, agenasa za suspendovanje, konzervanasa, antioksidanasa, agenasa za zamućivanje, glidanasa, agenasa za preradu, boja, zaslađivača, mirisa, aroma i drugih poznatih aditiva koji obezbeđuju elegantnu prezentaciju lijeka (tj. jedinjenja iz predmetnog pronalaska ili njegove farmaceutske kompozicije), ili pomažu u proizvodnji farmaceutskog proizvoda (tj. lijeka).

Formulacije se mogu pripremiti pomoću klasičnih postupaka rastvaranja i mešanja. Na primer, supstanca leka u rasutom stanju (tj. jedinjenje iz predmetnog pronalaska ili stabilizovani oblik jedinjenja (npr. kompleks sa derivatom ciklodekstrina ili drugim poznatim kompleksirajućim agensom) se rastvori u pogodnom rastvaraču u prisustvu jednog ili više gore opisanih ekscipijenasa. Jedinjenje predmetnog pronalaska je tipično formulisano u farmaceutske dozne oblike da se obezbedi lako kontrolisano doziranje leka, i da se omogući komplijansa pacijenta sa propisanim režimom.

Farmaceutska kompozicija (ili formulacija) za primenu može biti spakovana na razne načine, u zavisnosti od postupka primene leka. Generalno, artikal za distribuciju uključuje posudu u kojoj se nalazi farmaceutska formulacija u odgovarajućoj formi. Pogodne posude su dobro poznate stručnjacima, i uključuju materijale kao što su boce (plastične i staklene), kesice, ampule, plastične kese, metalne cilindre, i slično. Posuda može takođe da sadrži neprobojnu zaštitu da se spreči neželjeni pristup sadržaju pakovanja. Pored toga, posuda ima na sebi etiketu koja opisuje sadržaj posude. Etiketa može takođe da sadrži odgovarajuća upozorenja.

Farmaceutske formulacije jedinjenja predmetnog pronalaska se mogu se pripremiti za različite načine i vrste primene. Na primer, jedinjenje formule I koje ima željeni stepen čistoće može po izboru da se pomeša sa farmaceutski prihvatljivim razblaživačima, nosačima, ekscipijensima ili stabilizatorima (Remington's Pharmaceutical Sciences (1980), 16. izdanje, Osol, A. Ed.), u obliku liofilizovane formulacije, samleven u prah ili vodeni rastvor. Formulacija se može izvesti mešanjem na sobnoj temperaturi na odgovarajućem pH, i sa željenim stepenom čistoće, sa fiziološki prihvatljivim nosačima, tj. nosačima koji su netoksični za primaoca u primenjenim dozama i koncentracijama. pH formulacije zavise

4

uglavnom od konkretne upotrebe i koncentracije jedinjenja, ali može biti u opsegu od oko 3 do oko 8. Pogodna realizacija otelotvorenja je formulacija u acetatnom puferu na pH 5.

Jedinjenje se obično može čuvati kao čvrsta kompozicija, liofilizovana formulacija ili vodeni rastvor.

Farmaceutske kompozicije pronalaska biće formulisane, dozirane i primenjene na način, tj. količine, koncentracije, raspored, tok, vehikulum i put primene, u skladu sa dobrom medicinskom praksom. Faktori za razmatranje u ovom kontekstu uključuju konkretni poremećaj koji se leči, konkretnog sisara koji se leči, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto isporuke agensa, postupak primene, raspored primene i druge faktore poznate lekarima. „Terapeutski efikasna količina“ jedinjenja koje će se primenjivati biće vođena takvim razmatranjima i to je minimalna količina potrebna da se poboljša ili leči hiperproliferativni poremećaj.

Kao opšta pretpostavka, početna farmaceutski efikasna količina inhibitora koji se primenjuje parenteralno po dozi, biće u opsegu od oko 0,01-100 mg/kg, alternativno oko 0,1 do 20 mg/kg telesne težine pacijenta dnevno, sa tipičnim početnim opsegom upotrebljenog jedinjenja od 0,3 do 15 mg/kg/dan.

Prihvatljivi razblaživači, nosači, ekscipijensi i stabilizatori su netoksični za primaoca u primenjenim dozama i koncentracijama, i uključuju pufere, kao što je fosfatni, citratni i puferi drugih organskih kiselina; antioksidanse, uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što je oktadecildimetilbenzil amonijum-hlorid; heksametonijum-hlorid; benzalkonijum-hlorid, benzetonijum-hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabene, kao što je metil ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i mkrezol); polipeptide male molekulske mase (manje od 10 ostataka); proteine, kao što je serum albumin, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere, kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline, kao što je glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatne agense, kao što je EDTA; šećere, kao što je saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontra-jone koji grade soli, kao što je natrijum; metalne komplekse (npr. kompleksi Zn-protein); i/ili nejonske surfaktante, kao što je TWEEN™, PLURONICS™ ili polietilen glikol (PEG). Aktivni farmaceutski sastojci mogu takođe da se nalaze u mikrokapsulama pripremljenim, na primer, tehnikama koacervacije ili interfacijalne polimerizacije, na primer, mikrokapsule od hidroksimetilceluloze, odnosno želatinske mikrokapsule i mikrokapsule od poli-(metilmetakrilata), u koloidnim sistemima za isporuku leka (na primer, lipozomi, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule), ili u makroemulzijama.

4

Takve tehnike su objavljene u Remington's Pharmaceutical Sciences 16. izdanje, Osol A. (izd.) (1980).

Mogu se pripremiti preparati sa produženim oslobađanjem jedinjenja Formule I. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju polupropusne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koji sadrže jedinjenje formule I ili njegovu realizaciju, čije su matrice u formi oblikovanih proizvoda, npr. filmova ili mikrokapsula. Primeri matrica sa produženim oslobađanjem uključuju poliestre, hidrogele (na primer, poli(2-hidroksietilmetakrilat) ili poli(vinil alkohol)), polilaktide (US 3773919), kopolimere L-glutaminske kiseline i gama-etil-L-glutamat, nerazgradivi etilen-vinil acetat, razgradive kopolimere mlečne kiseline i glikolne kiseline, kao što su LUPRON DEPOT™ (injektirajuće mikrosfere sastavljene od kopolimera mlečne kiseline, glikolne kiseline i leuprolid acetata) i poli-D-(-)-3-hidroksibutirnu kiselinu.

Formulacije uključuju one koje su pogodne za ovde opisane puteve primene. Formulacije mogu pogodno biti predstavljene u jediničnom doznom obliku, i mogu se dobiti bilo kojim postupkom dobro poznatom u farmaciji. Tehnike i formulacije generalno se nalaze u Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, PA). Takvi postupci uključuju korak povezivanja aktivne supstance sa nosačem koji čini jedan ili više pomoćnih supstanci. Generalno, formulacije se pripremaju jednobraznim i bliskim dovođenjem u vezu aktivnog jedinjenja sa tečnim nosačima, ili fino raspoređenim čvrstim nosačima, ili oba, a zatim, po potrebi, oblikovanjem proizvoda.

Formulacije jedinjenja formule I pogodne za oralnu primenu se mogu pripremiti kao diskretne jedinice, kao što su pilule, kapsule, kesice ili tablete, a svaka sadrži unapred određenu količinu jedinjenja formule I. Komprimovane tablete se mogu pripremiti komprimovanjem u pogodnoj mašini, aktivni sastojak u slobodno tečnom obliku kao što su prah ili granule, opcionalno pomešan sa vezivom, mazivom, inertnim razblaživačem, konzervansom, površinski aktivnim ili disperzivnim agensom. Oblikovane tablete se mogu napraviti pomoću kalupa odgovarajuće mašine i smeše aktivnog sastojka u prahu navlaženog inertnim tečnim razblaživačem. Tablete se mogu opciono obložiti ili zarezati i opciono su formulisane tako da omogućavaju sporo ili kontrolisano oslobađanje aktivnog sastojka. Tablete, pastile, lozenge, vodene ili uljane suspenzije, disperzivni praškovi ili granule, emulzije, tvrde ili meke kapsule, npr. želatinske kapsule, sirupi ili eliksiri mogu se pripremiti za oralnu upotrebu. Formulacije jedinjenja formule I, namenjene za oralnu upotrebu, se mogu pripremiti prema bilo kom postupku koji je poznat u struci za proizvodnju farmaceutskih kompozicija i takve kompozicije mogu da sadrže jedan ili više agenasa,

4

uključujući agense za zaslađivanje, agense za poboljšanje ukusa, agense za bojenje i agense za očuvanje, kako bi se obezbedio ukusan preparat. Prihvatljive su tablete koje sadrže aktivni sastojak u smeši sa netoksičnim farmaceutski prihvatljivim ekscipijentom koji je pogodan za proizvodnju tableta. Ovi ekscipijenti mogu biti, na primer, inertni razblaživači, kao što su kalcijum ili natrijum-karbonat, laktoza, kalcijum ili natrijum-fosfat; agensi za granuliranje i dezintegraciju, kao što je kukuruzni skrob, ili alginska kiselina; agensi za vezivanje, kao što su skrob, želatin ili akacija; i agensi za podmazivanje, kao što su magnezijum-stearat, stearinska kiselina ili talk. Tablete mogu biti neobložene ili obložene poznatim tehnikama, uključujući mikroinkapsuliranje da bi se odložila dezintegracija i adsorpcija u gastrointestinalnom traktu i time osiguralo kontinuirano delovanje tokom dužeg perioda. Na primer, može se koristiti materijal za odloženo razlaganje, kao što je gliceril-monostearat ili gliceril-distearat, sam ili sa voskom.

Za tretman oka ili drugih spoljnih tkiva, npr. usta i kože, formulacije se poželjno primenjuju kao topikalna mast ili krema koja sadrži aktivni sastojak (aktivne sastojke) u količini od, na primer, 0,075 % w/w – 20% w/w. Kada se formuliše u obliku masti, aktivni sastojci mogu da se koriste sa parafinskom bazom ili bazom koja se meša sa vodom. Alternativno, aktivni sastojci mogu biti formulisani u kremu sa bazom kreme ulje-u-vodi. Po želji, vodena faza baze kreme može sadržati polihidrični alkohol, tj. alkohol koji ima dve ili više hidroksilnih grupa, kao što su propilen-glikol, butan 1,3-diol, manitol, sorbitol, glicerol i polietilen-glikol (uključujući PEG 400) i njihove smeše. Topikalne formulacije mogu poželjno sadržati jedinjenje koje poboljšava apsorpciju ili penetraciju aktivnog sastojka kroz kožu ili druga zahvaćena područja. Primeri takvih pojačivača dermalne penetracije uključuju dimetil-sulfoksid i srodne analoge. Uljana faza emulzija ovog pronalaska se može sastojati od poznatih sastojaka na poznati način. Iako faza može da sadrži samo emulgator, ona poželjno sadrži smešu najmanje jednog emulgatora sa masti ili uljem, ili sa masti i uljem. Poželjno je da hidrofilni emulgator bude uključen zajedno sa lipofilnim emulgatorom koji deluje kao stabilizator. Takođe je poželjno da uključuje i ulje i masti. Zajedno, emulgator(i), sa ili bez stabilizatora, čine takozvani vosak za emulgiranje, a vosak zajedno sa uljem i mastima čini takozvanu emulgatorsku podlogu za mastikoja formira uljno dispergovanu fazu kreme formulacije. Emulgatori i stabilizatori emulzije pogodni za upotrebu u formulaciji ovog pronalaska uključuju Tween® 60, Span® 80, cetostearil alkohol, benzil alkohol, miristil alkohol, gliceril mono-stearat i natrijum lauril sulfat.

Vodene suspenzije jedinjenja formule I sadrže aktivne materije u smeši sa

4

ekscipijensima pogodnim za proizvodnju vodenih suspenzija. Takvi pomoćni sastojci uključuju agens za suspendovanje, kao što je natrijum karboksimetilceluloza, kroskarmeloza, povidon, metilceluloza, hidroksipropil metilceluloza, natrijum alginat, polivinilpirolidon, tragakant gume i guma akacije, te agensi za disperziju ili vlaženje, kao što je prirodni fosfatid (npr. lecitin), produkt kondenzacije alkilen oksida sa masnom kiselinom (npr. polioksietilen stearat), produkt kondenzacije etilen oksida sa alifatskim alkoholom dugog lanca (npr. heptadekaetilenoksicetanol), produkt kondenzacije etilen oksida sa delimičnim esterom dobijenim iz masne kiseline i anhidrid heksitola (npr. polioksietilen sorbitan monooleat). Vodena suspenzija takođe može da sadrži jedan ili više konzervansa, kao što su etil ili n-propil p-hidroksibenzoat, jedno ili više sredstava za bojenje, jednu ili više aroma, i jedan ili više zaslađivača, poput saharoze ili saharina.

Farmaceutske kompozicije jedinjenja Formule I mogu biti u obliku sterilnog injekcijskog preparata, kao što je sterilna vodena ili uljasta suspenzija za ubrizgavanje. Ova suspenzija se može formulisati prema poznatoj upotrebi u struci, uz upotrebu odgovarajućih agenasa za suspendovanje ili vlaženje, i agenasa za suspendovanje koji su gore pomenuti. Sterilni preparat za injektiranje takođe može biti sterilni rastvor za injektiranje ili suspenzija u netoksičnom parenteralno prihvatljivom razblaživaču ili rastvaraču, kao što je rastvor u 1,3-butandiolu ili pripremljen kao liofilizovani prah. Među prihvatljivim nosačima i rastvaračima koji se mogu koristiti su voda, Ringerov rastvor i izotonični rastvor natrijumhlorida. Pored toga, sterilna fiksirana ulja se mogu uobičajeno koristiti kao rastvarač ili suspendirajući medij. U tu svrhu se može koristiti bilo koje blago masno ulje, uključujući sintetičke mono- ili digliceride. Pored toga, masne kiseline kao što je oleinska kiselina mogu se takođe koristiti u pripremi injekcija.

Količina aktivnog sastojka koji se može kombinovati sa nosećom supstancom radi proizvodnje pojedinačnog doznog oblika variraće u zavisnosti od domaćina koji se leči i konkretnog načina primene. Na primer, formulacija sa vremenskim oslobađanjem namenjena oralnoj primeni na ljudima može da sadrži otprilike od 1 do 1000 mg aktivnog materijala pomešanog sa odgovarajućom i pogodnom količinom nosača materijala koji može varirati od oko 5 do oko 95% ukupne kompozicije (težina:težina). Farmaceutski kompozicija može se pripremiti tako da obezbedi lako merljive količine za primenu. Na primer, vodeni rastvor namenjen za intravensku infuziju može da sadrži od oko 3 do 500 µg aktivnog sastojka po mililitru rastvora, tako da može doći do infuzije pogodne zapremine brzinom od oko 30 mL/h.

Formulacije pogodne za parenteralnu primenu uključuju vodene i nevodene sterilne rastvore za ubrizgavanje koji mogu da sadrže anti-oksidante, pufere, bakteriostate i rastvore koji formulaciju čine izotoničnom sa krvlju predviđenog primaoca; i vodene i nevodene sterilne suspenzije koje mogu da sadrže agense za suspendovanje i zgušnjavanje.

Formulacije pogodne za lokalnu primenu u oko takođe uključuju kapi za oči u kojima je aktivni sastojak rastvoren ili suspendovan u pogodnom nosaču, posebno vodenom rastvaraču za aktivni sastojak. Aktivni sastojak je poželjno prisutan u takvim formulacijama u koncentraciji od oko 0,5 do 20% w/w, na primer oko 0,5 do 10% w/w, na primer oko 1,5% w/w.

Formulacije pogodne za lokalnu primenu u ustima uključuju pastile koji sadrže aktivni sastojak u aromatizovanoj osnovi, obično saharozu i akaciju ili tragakant; pastile koji sadrže aktivni sastojak u inertnoj osnovi, kao što su želatina i glicerin, ili saharoza i akacija; i sredstva za ispiranje usta koja sadrže aktivni sastojak u odgovarajućem tečnom nosaču.

Formulacije za rektalnu primenu mogu biti predstavljena kao supozitorije sa pogodnom bazom koja sadrži, na primer, kakao maslac ili salicilat.

Formulacije pogodne za intrapulmonalnu ili nazalnu primenu imaju veličinu čestica, na primer u opsegu od 0,1 do 500 mikrona (uključujući veličine čestica u opsegu između 0,1 i 500 mikrona sa povećanjem mikrona kao što je 0,5, 1, 30 mikrona, 35 mikrona itd.), koja se primenjuje brzim udisanjem kroz nazalni prolaz ili udisanjem kroz usta, tako da se dođe do alveolarnih vrećica. Pogodne formulacije uključuju vodene ili uljne rastvore aktivnog sastojka. Formulacije pogodne za primenu aerosola ili suvog praha mogu se pripremiti u skladu sa konvencionalnim postupcima i mogu se isporučiti sa drugim terapeutskim agensima, kao što su jedinjenja do sada korišćena u lečenju ili poremećajima profilakcije, kako je opisano u daljem tekstu.

Formulacije pogodne za vaginalnu primenu mogu se predstaviti kao pesari, tamponi, kreme, gelovi, paste, pene ili formulacije u spreju koji pored aktivnog sastojka sadrže i one nosače za koje je poznato u struci da su prikladni.

Formulacije mogu da se pakuju u jediničnim dozama ili više doznim kontejnerima, na primer, u zapečaćenim ampulama i bočicama i mogu se skladištiti u suvo smrznutom (liofilizovanom) stanju, koje zahteva samo dodavanje sterilnog tečnog nosača, na primer, vode, za ubrizgavanje neposredno pre upotrebe. Nepripremljeni rastvori za injekcije i suspenzije se pripremaju iz sterilnih prašaka, granula i tableta prethodno opisane vrste. Poželjne formulacije jedinične doze su one koje sadrže dnevnu dozu ili jediničnu dnevnu subdozu, kao što je prethodno navedeno, ili odgovarajuću frakciju aktivnog sastojka.

Pronalazak dalje obezbeđuje veterinarske kompozicije koje sadrže najmanje jedan

1

aktivni sastojak kako je gore definirano zajedno sa veterinarskim nosačem. Veterinarski nosači su materijali korisni za primjenu kompozicije i mogu biti čvrsti, tečni ili gasoviti materijali, koji su inače inertni ili prihvatljivi u veterinarskoj struci i kompatibilni su sa aktivnom supstancom. Ove veterinarske kompozicije se mogu primeniti parenteralno, oralno ili bilo kojim drugim željenim putem.

KOMBINOVANA TERAPIJA

Jedinjenja formule I se mogu koristiti samostalno ili u kombinaciji sa dodatnim terapeutskim agensima za lečenje ovde opisanih bolesti ili poremećaja, kao što je upala ili hiperproliferativni poremećaj (npr. kancer). U nekim otelotvorenjima, jedinjenje formule I se kombinuje u farmaceutskoj kombinovanoj formulaciji, ili režimu doziranja kao kombinirana terapija, sa dodatnim, drugim terapeutskim jedinjenjem koje ima protivupalna ili antihiperproliferativna svojstva ili je korisno za lečenje upale, poremećaja imunološkog odgovora ili hiperproliferativnog poremećaja (npr. kancera). Dodatna terapija može biti inhibitor Bcl-2, JAK inhibitor, protivupalni agens, imunomodulatorni agens, hemioterapeutski agens, pojačivač apoptoze, neurotropni faktor, agens za lečenje kardiovaskularnih bolesti, agens za lečenje bolesti jetre, antivirusni agens, agens za lečenje krvnih smetnji, agens za lečenje dijabetesa i agens za lečenje poremećaja imunodeficijencije. Drugi terapeutski agens može biti NSAID protivupalni agens. Drugi terapeutski agens može biti hemioterapeutski agens. Drugo jedinjenje farmaceutski kombinovane formulacije ili režima doziranja poželjno ima komplementarne aktivnosti jedinjenja formule I, tako da ne štetno deluju jedni na druge. Takvi molekuli su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za nameravane svrhe. U jednom otelotvorenju, kompozicija ovog pronalaska sadrži jedinjenje formule I, ili njegov stereoizomer, tautomer, solvat, metabolit ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili prolek, u kombinaciji sa terapeutskim agensom kao što je NSAID.

Kombinovana terapija se može primeniti kao simultani ili sekvencijalni režim. Kada se primenjuje sekvencijalno, kombinacija se može primenjivati u dve ili više primena. Kombinovana primena obuhvata istovremenu primenu, koristeći posebne formulacije ili jednu farmaceutsku formulaciju, ili sekvencijalnu primenu u bilo kom redosledu, pri čemu je poželjno da postoji vremenski period dok oba (ili sva) aktivna agensa istovremeno vrše svoje biološke aktivnosti.

Pogodne doze za bilo koje od gore primenjenih agenasa su one koje se trenutno koriste i mogu se smanjiti zahvaljujući kombinovanom delovanju (sinergiji) novootkrivenog agensa i drugih terapeutskih agenasa ili tretmana.

2

Kombinovana terapija može da obezbedi „sinergiju“ i da se pokaže kao „sinergijska“, tj. efekat postignut kada se aktivni sastojci zajedno koriste je veći od zbira efekata koji se dobijaju od odvojene primene komponenata. Sinergijski efekat se može postići kada su aktivni sastojci: (1) koformulisani i primenjeni ili isporučeni istovremeno u kombinovanoj, jediničnoj doznoj formulaciji; (2) isporučeni naizmenično ili paralelno kao odvojene formulacije; ili (3) primenjeni nekim drugim režimom. Kada se isporučuju kao naizmenična terapija, sinergijski efekat se može postići kada se komponente primenjuju ili isporučuju sekvencijalno, npr. različitim injekcijama u odvojenim špricevima, odvojenim pilulama ili kapsulama, ili odvojenim infuzijama. Generalno, tokom naizmenične terapije, efikasna doza svakog aktivnog sastojka se primenjuje sekvencijalno, tj. serijski, dok se kod kombinovane terapije efikasne doze dva ili više aktivnih sastojaka primenjuju zajedno.

U posebnom otelotvorenju terapije, jedinjenje formule I, ili njegov stereoizomer, tautomer, solvat, metabolit ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili prolek mogu da se kombinuju sa drugim terapeutskim, hormonskim ili agensima antitela kao što je ovde opisano, kao i u kombinaciji sa hirurškom terapijom i radioterapijom. Kombinovane terapije prema predmetnom pronalasku tako obuhvataju davanje najmanje jednog jedinjenja formule I, ili njegovog stereoizomera, tautomera, solvata, metabolita, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili proleka, i upotrebu bar još jednog postupaka lečenja kancera. Količine jedinjenja (a) formule I i drugog farmaceutski aktivnog(ih) terapeutskog(ih) agensa (a) i relativno vreme primene biće odabrane da bi se postigao željeni kombinovani terapeutski efekat.

Dodatni terapeutski agensi koji se koriste u kombinaciji sa jedinjenjem formule I uključuju 5-FU, docetaksel, eribulin, gemcitabin, kobimetinib, ipatasertib, paklitaksel, tamoksifen, fulvestrant, GDC-0810, deksametazon, palbociklib, bevacizumab, pertuzumabtu, pertuzumab, trastuzumab, emtansin i letrozol.

PROIZVODI

U drugom otelotvorenju predmetnog pronalaska, obezbeđen je proizvod, ili „komplet”, koji sadrži materijale korisne za lečenje gore opisanih bolesti i poremećaja. U jednoj otelotvorenju, komplet sadrži ambalažu koja sadrži jedinjenje formule I, ili njegov stereoizomer, tautomer, solvat, metabolit ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili prolek. Komplet može dalje da sadrži etiketu ili uputstvo u pakovanju, na ambalaži ili povezano sa njom. Termin „uputstvo za lek“ koristi se da se ukaže na uputstvo koje se uobičajeno nalazi u komercijalnim pakovanjima terapeutskog proizvoda, koje sadrži informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, primeni, kontraindikacijama i/ili upozorenjima u vezi sa upotrebom takvog terapeutskog proizvoda. Pogodna ambalaža uključuje, na primer, boce, bočice, špriceve, blister pakovanje, itd. Ambalaža može biti izrađena od različitih materijala, kao što je staklo ili plastika. Ambalaža može da sadrži jedinjenje formule I ili njegovu formulaciju koja je efikasna za lečenje stanjai može imati sterilan priključak za pristup (na primer, ambalaža može da bude vrećica za intravenski rastvor ili bočica koja ima čep koji se može probiti pomoću potkožne injekcione igle). Najmanje jedan aktivni agens u kompoziciji je jedinjenje formule I. Etiketa ili uputstvo u pakovanju ukazuje da se kompozicija koristi za lečenje odabranog stanja, poput kancera. Pored toga, etiketa ili uputstvo u pakovanju može značiti da pacijent koji se leči je onaj koji ima poremećaj kao što je hiperproliferativni poremećaj, neurodegeneracija, srčana hipertrofija, bol, migrena ili neurotraumatska bolest ili događaj. U jednom otelotvorenju, etiketa ili uputstvo u pakovanju pokazuje da se kompozicija koji sadrži jedinjenje formule I može da se koristiti za lečenje poremećaja koji je posledica abnormalnog rasta ćelija. Etiketa ili uputstvo u pakovanju takođe može ukazivati da se kompozicija može koristiti za lečenje drugih poremećaja. Umesto toga, ili pored toga, proizvod može dalje da sadrži drugu ambalažu koja sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Može dalje da obuhvati druge materijale poželjne sa komercijalnog i aspekta upotrebe, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.

Komplet može dalje da sadrži uputstva za primenu jedinjenja formule I i, ako postoji, drugu farmaceutsku formulaciju. Na primer, ako komplet sadrži prvu kompoziciju koja sadrži jedinjenje formule I i drugu farmaceutsku kompoziciju, komplet može dalje da sadrži uputstva za istovremenu, sekvencijalnu ili odvojenu primenu prve i druge farmaceutske kompozicije pacijentu kome je potreban.

U drugom otelotvorenju, kompleti su pogodni za isporuku čvrstih oralnih oblika jedinjenja formule I, poput tableta ili kapsula. Takav komplet poželjno uključuje određeni broj jediničnih doza. Takvi kompleti mogu da sadrže karticu sa doziranjem orijentisanim redosledom njihove namene. Primer takvog kompleta je „blister pakovanje”. Blister pakovanja su dobro poznata u industriji ambalaže i naširoko se koriste za pakovanje farmaceutskih jediničnih oblika doziranja. Po želji, može se obezbediti pomoć za pamćenje, na primer u obliku brojeva, slova ili drugih oznaka ili sa umetkom kalendara, koji označava dane u rasporedu lečenja u kojima se mogu primeniti doziranja.

Prema jednom otelotvorenju, komplet može da sadrži (a) prvu ambalažu sa jedinjenjem Formule I koji se tamo nalazi; i opciono (b) drugu ambalažu sa drugom

4

farmaceutskom formulacijom koja se u njemu nalazi, pri čemu druga farmaceutska formulacija sadrži drugo jedinjenje sa antihiperproliferativnim učinkom. Umesto toga, ili pored toga, komplet može dalje da sadrži treću ambalažu koja sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Može dalje da obuhvati druge materijale poželjne sa komercijalnog i aspekta upotrebe, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.

U nekim drugim otelotvorenjima gde komplet sadrži kompoziciju Formule I i drugi terapeutski agens, komplet može da sadrži ambalažu za odvojene kompozicije kao što je podeljena boca ili deljeni paket folije, međutim, odvojene kompozicije takođe mogu da budu sadržane unutar jedne, nepodeljene ambalaže. Uobičajeno, komplet sadrži uputstva za primenu odvojenih komponenti. Oblik kompleta je naročito pogodan kada se odvojene komponente poželjno primjenjuju u različitim doznim oblicima (npr. oralni i parenteralni), primenjuju se u različitim intervalima doziranja ili kada je lekar koji je propisao želi titrirati pojedinačne komponente kombinacije.

PRIPREMA JEDINJENJA FORMULE I

Jedinjenja formule I mogu da se sintetišu sintetskim putevima koji uključuju procese analogne onima koji su dobro poznati u hemijskoj struci, naročito u svetlu ovde sadržanih opisa, i one za drue heterocikle opisane u: Comprehensive Heterocyclic Chemistry II, Urednici Katritzky i Rees, Elsevier, 1997, npr. Volume 3; Liebigs Annalen der Chemie, (9):1910-16, (1985); Helvetica Chimica Acta, 41:1052-60, (1958); Arzneimittel-Forschung, 40(12):1328-31, (1990), od kojih su svi izričito uključeni referencom. Početni materijali su obično dostupni iz komercijalnih izvora kao što je Aldrich Chemicals (Milwaukee, WI) ili su lako pripremljeni koristeći postupake dobro poznate stručnjacima (npr. pripremljeni postupcima uopšteno opisanim u Louis F. Fieser i Mary Fieser, Reagents for Organic Synthesis , v. 1-23, Wiley, N.Y. (1967-2006, ed.), Ili Beilsteins Handbuch der organischen Chemie , 4, Aufl. ed. Springer-Verlag, Berlin, uključujući dodatke (dostupne i preko Beilstein online baze podataka).

Transformacije sintetske hemije i zaštitne metodologije grupe (zaštita i uklanjanje zaštite) korisne u sintetizovanju jedinjenja formule I i potrebnih reagensa i intermedijara su poznati u struci i uključuju, na primer, one opisane u R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989) ; TW Greene i P. G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3<će>izdanje, John Wiley and Sons (1999); i L. Paquette, izd., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995) i njihova naredna izdanja.

Primeri daju primere postupaka za dobijanje jedinjenja Formule I. Osobe sa znanjem u struci će razumeti da se drugi sintetički putevi mogu koristiti za sintezu jedinjenja formule I. Iako se ovde opisuju i diskutuju, na slikama i primerima, specifični polazni materijali i reagensi, drugi polazni materijali i reagensi se lako mogu zameniti, kako bi se obezbedili razni derivati i/ili reakcioni uslovi. Pored toga, mnogi od primera jedinjenja koja su pripremljena opisanim postupcima mogu se dalje modifikovati u svetlu ovog otkrića, koristeći konvencionalnu hemiju dobro poznatu stručnjacima za ovu oblast.

U pripremi jedinjenja Formule I, može biti potrebna zaštita daljinske funkcionalnosti (npr. primarnog ili sekundarnog amina) intermedijara. Potreba za takvom zaštitom variraće u zavisnosti od prirode udaljene funkcionalnosti i uslova postupaka pripreme. Pogodne amino-zaštitne grupe uključuju acetil, trifluoroacetil, t-butoksikarbonil (BOC), benziloksikarbonil (CBz) i 9-fluorenilmetilenoksikarbonil (Fmoc). Stručnjak u ovoj oblasti lako utvrđuje potrebu za takvom zaštitom. Za opšti opis zaštitnih grupa i njihovu upotrebu, vidi T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991.

U postupcima pripreme jedinjenja Formule I, može biti korisno odvajanje produkata reakcije jedan od drugog i/ili od polaznih materijala. Željeni proizvodi svakog koraka ili niza koraka se odvajaju i/ili prečišćavaju do željenog stepena homogenosti pomoću tehnika uobičajenih u struci. Tipično, takva razdvajanja uključuju višefaznu ekstrakciju, kristalizaciju iz rastvarača ili smeše rastvarača, destilaciju, sublimaciju ili hromatografiju. Hromatografija može uključivati bilo koji broj postupaka, uključujući, na primer, postupake i aparate za reversno faznu i normalno faznu; ekskluzionu; jonoizmenjivačku; kao i hromatografiju pod visokim, srednjim i niskim pritiskom; analizu malog uzorka; simulirani pokretni sloj (SMB) i preparativnu hromatografiju na tankom ili debelom sloju, kao i tehnike tankoslojne hromatografije na malom uzorku i fleš hromatografije.

Druga klasa postupaka razdvajanja uključuje tretiranje smeše sa reagensom odabranim da se veže ili na drugi način odvoji željeni proizvod, nereagirani polazni materijal, reakcija proizvoda ili slično. Takvi reagensi uključuju adsorbense ili apsorbente kao što su aktivni ugalj, molekularna sita, mediji za izmenu jona ili slično. Alternativno, reagensi mogu biti kiseline u slučaju osnovnog materijala, baze u slučaju kiselog materijala, vezujući reagensi kao što su antitela, vezivni proteini, selektivni helatori kao što su krunski eteri, tečni / tečni ioni reagensi za ekstrakciju (LIX), ili slično. Izbor odgovarajućih postupaka odvajanja zavisi od prirode materijala koji su uključeni, kao što su tačka ključanja i molekulska masa prilikom destilacije i sublimacije, prisustvo ili odsustvo polarnih funkcionalnih grupa u hromatografiji, stabilnosti materijala u kiselim i bazičnim medijumima u višefaznoj ekstrakciji, i slično.

Dijastereomerne smeše se mogu razdvojiti na pojedinačne dijastereomere na osnovu njihovih fizičkohemijskih razlika, postupcima koji su dobro poznati stručnjacima za ovu oblast, kao što je hromatografija i/ili frakciona kristalizacija. Enantiomeri se mogu razdvojiti pretvaranjem enantiomerne smeše u dijastereomernu smešu reakcijom sa odgovarajućim optički aktivnim jedinjenjem (npr. hiralnim pomoćnim sredstvima, kao što su hiralni alkohol ili Mošerovog kiseli hlorid), razdvajanjem dijastereomera i pretvaranjem (npr. hidrolizovanjem) pojedinih dijastereoizomera odgovarajućim čistim enantiomerima. Takođe, neka jedinjenja iz predmetnog pronalaska mogu biti atropisomeri (npr. supstituisani biarili) i smatraju se delom ovog pronalaska. Enantiomeri se takođe mogu razdvojiti upotrebom hiralne HPLC kolone.

Pojedinačni stereoizomer, npr. enantiomer, u osnovi bez njegovog stereoizomera, može se dobiti razblaživanjem racemske smeše korišćenjem postupka kao što je formiranje dijastereomera korišćenjem optički aktivnih razdvajajućih sredstava (Eliel, E. i Wilen, S. „Stereochemistry of Organic Compounds “John Wiley & Sons, Inc., New York, 1994; Lochmuller, C.H., (1975) J. Chromatogr., 113(3):283-302). Racemske smeše hiralnih jedinjenja ovog pronalaska mogu se odvojiti i izolovati bilo kojim pogodnim postupkom, uključujući: (1) formiranje jonskih, dijastereomernih soli sa hiralnim jedinjenjima i odvajanje frakcionom kristalizacijom ili drugim postupcima, (2) formiranje dijastereomernih jedinjenja sa hiralnim derivatima reagensa, odvajanjem dijastereomera i pretvaranjem u čiste stereoizomere, i (3) odvajanjem uglavnom čistih ili obogaćenih stereoizomera direktno pod hiralnim uslovima. Vidi: „Drug Stereochemistry, Analytical Methods and Pharmacology”, Irving W. Wainer, Ed., Marcel Dekker, Inc., New York (1993).

Prema postupku (1), dijastereomerne soli mogu da se formiraju reakcijom enantiomernih čistih kiralnih baza kao što su brucin, kinin, efedrin, strihin, α-metil-βfeniletilamin (amfetamin) i slično sa asimetričnim jedinjenjima koja nose kiselu funkcionalnost, kao što su karboksilna kiselina i sulfonska kiselina. Dijastereomerne soli mogu biti indukovane da se razdvoje frakcionom kristalizacijom ili jonskom hromatografijom. Za odvajanje optičkih izomera amino jedinjenja, dodavanje kiralne karboksilne ili sulfonske kiseline, poput kamforsulfonske kiseline, vinske kiseline, mandelne kiseline ili mlečne kiseline može rezultovati stvaranjem dijastereomernih soli.

Alternativno, postupkom (2), supstrat koji treba da se rastvara reaguje sa jednim enantiomerom kiralnog jedinjenja, da bi se stvorio dijastereomerni par (E. i Wilen, S. „Stereochemistry of Organic Compounds“, John Wiley & Sons, Inc., 1994, str. 322). Dijastereomerna jedinjenja se mogu formirati reakcijom asimetričnih jedinjenja sa enantiomerno čistim hiralnim derivatima reagensa, kao što su mentil derivati, zatim razdvajanjem dijastereomera i hidrolizom da bi se dobio čisti ili obogaćeni enantiomer. Postupak za određivanje optičke čistoće uključuje izradu kiralnih estera, poput mentil-estera, npr. (-) mentil-hloroformat u prisustvu baze ili Mošerovog estera, α-metoksi-α-(trifluorometil)fenil acetat(Jacob III. J. Org. Chem. (1982), 47:4165), od racemske smeše, i analizu<1>H NMR spektra na prisustvo dva atropisomerna enantiomera ili dijastereoizomera. Stabilni dijastereomeri atropisomernih jedinjenja se mogu odvojiti i izolovati normalnom i reverznom faznom hromatografijom sledećim postupcima za odvajanje atropisomernih naftil-izokinolina (WO 96/15111). Postupkom (3), racemska smeša dva enantiomera se može odvojiti hromatografijom upotrebom hiralne stacionarne faze („Chiral Liquid Chromatography“ (1989) W.J. Lough, Ed., Chapman and Hall, New York; Okamoto, J. Chromatogr., (1990) 513:375-378). Obogaćeni ili prečišćeni enantiomeri se mogu razlikovati po postupcima koje se koriste za razlikovanje drugih hiralnih molekula sa asimetričnim atomima ugljenika, kao što je optička rotacija i cirkularni dihroizam.

Jedinjenja pronalaska su pripremljena kao što je prikazano u opštim šemama 1 i 2. Šema 1.

a) MgCl2,trietilamin, paraformaldehid, acetonitril, toplota; b) oksaldehid, amonijum hidroksid, toplota; c) cezijum karbonat, 1,2-dibromoetan, DMF, toplota; d) N-jodosukcinimid, DMF, toplota; e) i. EtMgBr, THF, -20 °C, ii. vodeni amonijum-hlorid Kao što je prikazano u šemi 1, 4-bromo-2-hidroksibenzaldehid 2 može se dobiti formiranjem komercijalno dostupnog 3-bromofenola. Zagrevanje 2 oksaldehidom i amonijum hidroksidom daje 3. Oksazepinski prsten može se formirati zagrevanjem 3 sa 1,2-dibromoetanom. Jodiranje bisom može se indukovati reakcijom sa N-jodsukcinimidom, a 3-jodna grupa selektivno se uklanja tretmanom etil-magnezijum bromidom na sniženoj temperaturi, dajući 6.

Šema 2.

f) 4-supstituisani oksazolidin-2-on, Cu(OAc)2, trans-N,N'-dimetilcikloheksan-1,2-diamin, kalijum karbonat, dioksan, toplota; g) HN(R<2>)CH(R<1>)CO2H, Cul, K3PO4,DMSO, toplota; h) amonijum-hlorid, trietilamin, HATU (1-[bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridin 3-oksid heksafluorofosfat)

Kao što je prikazano u šemi 2, 6 se može povezati sa odgovarajuće supstituisanim oksazolidin-2-onom korišćenjem bakarne katalize za dobijanje 7. Bromo intermedijer 7 može biti povezan sa odgovarajuće supstituisanim aminokiselinama pod bakarnom katalizom, nakon čega sledi HATU posredovano spajanje amida sa amonijum hloridom da bi se dobila jedinjenja 8.

PRIMERI

Skraćenice

DMSO Dimetil sulfoksid

ESI Elektrosprej jonizacija

HPLC Tečna hromatografija visokih performansi

LCMS Masena spektrometrija sa tečnom hromatografijom

min Minuta

N Normalno

NMR Nuklearna magnetna rezonanca

RTRetenciono vreme:

LCMS postupak A: Eksperimenti izvedeni na kvadrupolnom masenom spektrometru Waters Micromass ZQ2000 povezanim sa Waters Acquity UPLC sistemom sa PDA UV detektorom. Spektrometar imaj izvor elektrospreja koji radi u pozitivnom i negativnom jonskom režimu. Ovaj sistem koristi Acquity BEH C181,7 um 100 x 2,1 mm kolonu, koja se održava na 40 °C ili Acquity BEH štit RP181,7 µm 100 x 2,1 mm kolona, koji se održava na 40 °C i 0,4 ml / minutni protok. Početni sistem rastvarača je bio 95% vode koja sadrži 0,1% mravlje kiseline (rastvarač A) i 5% acetonitrila koji sadrži 0,1% mravlje kiseline (rastvarač B) prvih 0,4 minuta, a zatim gradijent do 5% rastvarača A i 95% rastvarača B tokom narednih 5,6 minuta. To se održavalo 0,8 minuta pre vraćanja u 95% rastvarača A i 5% rastvarača B tokom narednih 0,2 minuta. Ukupno vreme trajanja je bilo 8 minuta.

LCMS postupak B: Eksperimenti izvedeni na Agilent 1100 HPLC u kombinaciji sa Agilent MSD masenim spektrometrom koristeći ESI kao izvor jonizacije. Za razdvajanje LC-a je korišćen Phenomenex XB-C18, 1,7 mm, 50 × 2,1 mm kolona sa protokom od 0,4 ml / minutu. Rastvarač A je voda sa 0,1% mravlje kiseline, a rastvarač B je acetonitril sa 0,1% mravlje kiseline. Gradijent se sastojao od 2 - 98% rastvarača B tokom 7 minuta i držao je 97% B tokom 1,5 minuta nakon ravnoteže tokom 1,5 minuta. Temperatura LC kolone je 40 °C. Apsorbancija UV zračenja je sakupljana na 220 nm i 254 nm, a za sve eksperimente primenjena je potpuna analiza masenog spektra.

Primer 101 (S)-2 -((2-((S)-4-(difluorometil) -2-oksoksazolidin-3-il)-5,6-dihidrobenzo[f]imidazo[1,2-d][1,4]oksazepin-9-il)amino)propanamid 101

Korak 1: 4-bromo-2-hidrobenzaldehid.

U balon sa okruglim dnom od 20 L, sa 4 vrata,, pročišćen i održavan sa inertnom atmosferom azota, stavljen je 3-bromofenol (1300 g, 7,51 mol), dihloromagnezijum (1078 g, 11,3 mol), trietilamin (3034 g, 30,0 mol) i acetonitril (7,8 L). Smeša se meša 30 minuta na 40 °C. U smešu je dodat paraformaldehid (676 g, 22.6 mol) na 80 °C. Dobijeni rastvor je mešan tokom 6 sati na 76 °C. Ova se reakcija ponovila 5 puta. Kombinovane reakcione smeše su ugašene dodavanjem 12 L razvodnjenog hlorovodonika (4 N). pH vrednost rastvora je podešena na 5 koncentrovanim razvodnjenim hlorovodonikom. Dobijeni rastvor je ekstrahovan sa 1 x 20 L etil acetata. Organski ekstrakti su ispareni in vacuo. Ostatak je pročišćen putem fleš hromatografije na silika gelu (eluirano: 15% etil acetata u petrolej etru) da bi se dobio sirovi proizvod koji je ispran sa 2,4 L metil terc-butil etra: heksana (1:4). Dobijene čvrste supstance su sakupljene filtracijom da bi se dobilo 7,0 kg (78%) naslovnog jedinjenja u obliku žute čvrste supstance.

Korak 2: 5-bromo-2-(1H-imidazol-2-il)fenol

U balon sa okruglim dnom od 20 L, sa 4 vrata, postavljen je rastvor 4-bromo-2-hidroksibenzaldehida (700 g, 3,50 mola) u metanolu (7,0 L) i oksaldehida (40%) (2540 g, 17,5 mol) dodavanjem kap po kap tokom 4 sata vodenog amonijaka (25-28%, 3500 g) uz mešanje i održavanje temperature ispod 40 °C. Dobijeni rastvor je mešan 15 sati na 30-35 °C. Ova reakcija je ponovljena 9 puta. Kombinovane 9 reakcione smeše su isparene in vacuo održavajući temperaturu ispod 45 °C. Ostatak je razblažen sa 100 L etil acetata uz mešanje tokom 30 minuta. Čvrste supstance su filtrirane i dobijeni rastvor je razblažen vodom. Vodena faza je ekstrahovana sa 35 L etil acetata. Organski ekstrakti su isparili u vakuumu, a ostatak je pročišćen putem fleš kromatografije na silika gelu (gradijent rastvarača: 5-75% etil acetata u petrolej etru) da bi se dobilo 2,4 kg (29%) naslovnog jedinjenja u obliku žute čvrste supstance.

Korak 3: 9-bromo-5,6-dihidrobenzo[f]imidazo [1,2-d][1,4]oksazepin

U balon sa okruglim dnom od 20 L, sa 4 vrata, postavljen je rastvor 5-bromo-2-(1H-imidazol-2-il)fenola (1,4 kg, 5,86 mol) u N,,N-dimetilformamida (14 L) i cezijum karbonat (7,2 kg, 22,1 mol). Smješa je mešana 20 minuta. U reakcionu smešu je dodn 1,2-dibromoetana (4,1 kg, 21,8 mol). Dobijeni rastvor je mešan 4-12 sati na 85-90 °C, ohlađen na 15 °C i filtriran. Filterski kolač je ispran sa 3,0 L etil acetata. Filtrat je razblažen sa 14 L etil acetata. Kombinovani organski ekstrakti su isprani slanim rastvorom (4 x 14 L), osušeni iznad bezvodnog natrijum sulfata, filtrirani i ispareni in vacuo da bi se dobilo 1,1 kg (71%) naslovnog jedinjenja u obliku svetlo žute čvrste supstance.. LCMS (ESI): [M+H]<+>=265;<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,32 (d, J = 8,4, 1H), 7,35-7,24 (m, 3H), 7,06 (s, 1H), 4,47-4,42 (m, 4H).

Korak 4: 9-bromo-2,3-dijodo-5,6-dihidrobenzo[f]imidazo[1,2-d][1,4]oksazepin

1

U balon sa okruglim dnom od 20 L, sa 4 vrata, postavljen je 9-bromo-5,6-dihidrobenzo[f]imidazo[1,2-d][1,4]oksazepin (2,5 kg, 9,43 mol) i N,N-dimetilformamid (12,5 L) nakon čega sledi dodavanje N-jodosukcinimida (6,0 kg, 26,7 mol) u nekoliko serija uz mešanje. Dobijeni rastvor je mešan tokom 12 sati na 60 °C, ohlađen do 15 °C sa kupkom vode/ leda, razblažen sa 12,5 L vode / leda i filtriran. Filtrirane čvrste supstance su rekristalizovane iz petrolejskog etra da bi se dobilo 4,0 kg (82%) naslovnog jedinjenja u obliku žute čvrste supstance.

Korak 5: 9-bromo-2-jod-5,6-dihidrobenzo[f]imidazo[1,2-d][1,4]oksazepin

U balon sa okruglim dnom od 20 L, sa 4 vrata, pročišćen i održavan inertnom atmosferom azota, stavljen je 9-bromo-2,3-dijodo-5,6-dihidrobenzo[f]imidazo[1,2-d][1,4]oksazepin (800 g, 1,55 mola) i tetrahidrofuran (2,4 L) praćen dodavanjem u kapima etil magnezijum bromida (1 N rastvor u etru, 1,7 L) uz mešanje na -20 °C, tokom 3,5 sata. Reakciona smeša je mešana tokom 3 sata održavanjem temperature na -15 °C korišćenjem kupke od leda / soli. Reakciona smeša je ugašena dodavanjem 3,0 L zasićenog vodenog amonijum hlorida i ekstrahovana etil acetatom (2 x 8,0 L). Kombinovani organski ekstrakti su isprani slanim rastvorom (2x10 L), osušeni preko bezvodnog natrijum-sulfata, filtrirani i upareni in vacuo. Sirovi ostatak je trituriran sa 8,0 L etil acetata: petrolej etar (1:5), filtriran i ispran petrolej etrom da bi se dobilo 501 g (83%) naslovnog jedinjenja u obliku smeđe čvrste supstance. LCMS (ESI): [M+H]<+>= 391;<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,22 (d, J = 8,7, 1H), 7,55 (s, 1H), 7,30-7,25 (m, 2H), 4,45-4,41 (m, 4H).

Korak 6: (R)-2,2-dimetil-[1,3]dioksolan-4-karbaldehid

Natrijum-perjodat (57,0 g, 270 mmol) je rastvoren u vrućoj vodi (115 ml) i dodata je

2

silika mreža (200 g, 60 Å 220-440, veličina čestica 35-75 µm). Smeša je snažno mešana sve dok nije dobijen slobodno tečni prah. Ovo je dodato u rastvor 1,2:5,6-bis-0-(1-metiletiliden)-D-manitola (50 g, 190 mmol) u dihlorometanu (1,0 L) i reakcija je mešana na sobnoj temperaturi 1 sat. Reakciona smeša je filtrirana kroz sloj od Na2SO4a čvrste supstance su temeljno oprane dihlormetanom. Kombinovani organski ekstrakti su ispareni in vacuo da bi se dobilo 37,2 g (75%) naslovnog jedinjenja u obliku bezbojnog ulja.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9,73 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 4,38 (ddd, J =7,4, 4,7, 1,9 Hz, 1H), 4,18 (dd, J = 8,8, 7,4 Hz, 1H), 4,10 (dd, J = 8,8, 4,7 Hz, 1H), 1,49 (s, 3H), 1,43 (s, 3H).

Korak 7: (R)-4-difluormetil-2,2-dimetil-[1,3]dioksolan

U rastvor (R)-2,2-dimetil-[1,3]dioksolana-4-karbaldehida (7,08 g, 54 mmol) u diklorometanu (50 ml) ohlađenom u vodenoj kupki dodat je, kap po kap, dietilaminosulfur trifluorid (8,4 mL, 62,6 mmol) i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 3 sata. Reakciona smeša je dodavana, kap po kap, u brzo mešani, ledeni zasićeni vodeni rastvor natrijum bikarbonata. Smeša je dalje ekstrahovana dihlorometanom. Kombinovani organski ekstrakti su isprani slanim rastvorom, osušeni preko magnezijum sulfata, filtrirani i upareni in vacuo da bi se dobilo 6,58 g (79%) sirovog naslovnog jedinjenja u obliku narandžastog ulja.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3)δ 5,69 (td, J = 55,8, 4,9 Hz, 1H), 4,27 - 4,17 (m, 1H), 4,16-4,03 (m, 2H), 1.46 (s, 3H), 1,38 (s, 3H).

Korak 8: (R)-3-(terc-butildimetilsilaniloksi)-1,1-difluoropropan-2-ol

HCl u dioksanu (4 N, 10,8 ml, 43,2 mmol) je dodat u rastvor (R)-4-difluorometil-2,2-dimetil[1,3]dioksolana (6,58 g, 43,2 mmol) u metanolu (40 ml), a reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 30 minuta. Reakciona smeša je isparena in vacuo i azeotropirana acetonitrilom. Ostatak je rastvoren u N,N-dimetilformamidu (10 mL) i dodat je terc-butildimetilsilil-hlorid (6,53 g, 43,2 mmol), trietilamin (9,0 mL, 64,9 mmol) i 4-(dimetilamino)piridin (katalitički). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 1 sat. Reakciona smeša je isprana vodom, a zatim ekstrahovana diklormetanom. Kombinovani organski ekstrakti su isprani slanim rastvorom, osušeni preko magnezijum-sulfata, filtrirani i upareni in vacuo. Reakcioni sirovi ostatak je pročišćen putem fleš hromatografije na silika gelu (gradijent rastvarača: 0-30% etil acetat u cikloheksanu) da bi se dobilo 3,43 g (35%) naslovnog jedinjenja u obliku žutog ulja.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3)δ 5,66 (td, J = 56,4, 4,6 Hz, 1H), 3,76 - 3,60 (m, 2H), 2,46 (d, J = 6,4 Hz, 1H), 0,81 (e, 9H), 0,00 (s, 6H).

Korak 9: ((S)-2-azido-3,3-difluoropropoksi)-terc-butildimetilsilan

Trifluorometansulfonski anhidrid (2,9 mL, 17,4 mmol) dodat je kap po kap rastvoru (R)-3-(tercbutil-dimetilsilaniloksi)-1,1-difluoropropan-2-ola (3,43 g, 15,1 mmol) i piridina (2,0 mL, 24,2 mmol) u diklorometanu (50 ml) na -20 °C i reakciona smeša je mešana na -20 °C 20 minuta, a zatim 1 sat na 0 °C. Reakciona smeša je razblažena sa 0,5 N vodenog HCl i ekstrahovana dihlormetanom. Kombinovani organski ekstrakti su osušeni iznad magnezijum-sulfata i koncentrovani in vacuo. Sirovi ostatak je rastvoren u N,N-dimetilformamidu (10 ml) natrijum-azida (2,96 g, 45,5 mmol) i dodata je reakciona smeša 2 sata mešana na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je razblažena vodom i ekstrahovana etil acetatom. Kombinovani organski ekstrakti su isprani slanim rastvorom, osušeni preko magnezijum sulfata, filtrirani i upareni in vacuo da bi se dobilo 4,50 g sirovog naslovnog jedinjenja.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5,74 (td J = 55,4, 4,4 Hz, 1H), 3,81-3,71 (m, 2H), 3,58-3,47 (m, 1H), 0,81 (s, 9H), 0,00 (s 6H).

Korak 10: (S)-1-(terc-butildimetilsilaniloksimetil)-2,2-difluoroetilamin

Paladijum hidroksid na ugljeniku (200 mg, 20%) je dodat rastvor ((R)-2-azido-3,3-difluoropropoksi)-terc-butildimetilsilana (4,50 g, sirov, pretpostavimo ~15,1 mmol) u etil acetatu (20 mL) i metanola (2.0 mL) i reakcija je mešana pod balonom vodonika 16 sati. Reakcija je filtrirana, dodat je sveži paladijum hidroksid na ugljeniku (400 mg, 20%) i reakciona smeša je mešana pod balonom vodonika 16 sati. Reakciona smeša je filtrirana i filtrat je uparen in vacuo da bi se dobilo 3,08 g (90%) sirovog naslovnog proizvoda u obliku bezbojnog ulja.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5,66 (td, J = 57,0, 4,7 Hz, 1H), 3,71 - 3,57 (m, 2H), 3,00 - 2,89 (m, 1H), 1,42 (br s, 2H), 0,82 (s, 9H), 0,00 (s, 6H).

4

Korak 11: (S)-4-difluorometiloksazolidin-2-on

HCl u dioksanu (4 N, 5,0 mL, 20 mmol) je dodat u rastvor (R)-1-(terc-butildimetilsilaniloksimetil)-2,2-difluoroetilamina (Org. Lett., Vol. 9, br. 1, 2007, 41-44) (2,30 g, 10,3 mmol) u metanolu (5,0 ml) i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 2 sata. Smeša je uparena in vacuo i rezultujuće ulje je triturirano dietil eterom da bi se dobila čvrsta supstanca koja je osušena in vacuo. Čvrsta supstanca je rastvorena u smeši toluena (20 ml) i KOH (2,50 g, 44,6 mmol u 20 ml vode) na 0 °C. Fosgen je dodat kap po kap (16,3 ml, 20% u toluenu), uklonjena je kupka za hlađenje i reakciona smeša je mešana tokom 1 sata. Smeša je uparena in vacuo, reakcioni ostatak je ekstrahovan vrućim industrijskim denaturalizovanim alkoholom, i čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom. Filtrat je uparen in vacuo i reakcioni ostatak je pročišćen putem fleš hromatografije na silika gelu (gradijent rastvarača: 0-100% etil acetata u cikloheksanu) da bi se dobilo 830 mg (68%) naslovnog jedinjenja u obliku prljavo bele čvrste supstance, [α]D= 10,1 (c = 2,37, CHCl3).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5,96 (br s, 1H), 5,78 (td, J = 55,3, 4,8 Hz, 1H), 4,54 (t, J = 9,2 Hz, 1H), 4,42 (dd, J = 9,6, 4,4 Hz, 1H), 4,17 - 4,06 (m, 1H).

Korak 12: (S)-3-(9-bromo-5,6-dihidrobenzo[f]imidazo[1,2-d][1,4]oksazepin-2-il)-4-(difluorometil)oksazolidin-2-on

Smeša 9-bromo-2-jod-5,6-dihidrobenzo[f]imidazo[1,2-d][1,4]oksazepina (250 mg, 0,64 mmol), (S)-4-difluorometiloksazolidin-2-on (88 mg, 0,64 mmol), trans-N,N,-dimetil-1,2-cikloheksan diamin (36 mg, 0,26 mmol), bakar(I)-jodid (24 mg, 0,13 mmol) i kalijum karbonat (177 mg, 1,28) mmol) u dioksanu (3,0 mL) degasira se argonom pod ultrazvukom. Reakciona smeša je zagrevana na 100 °C tokom 5h, a zatim je ostavljena da se ohladi do sobne temperature. Reakciona smeša je razblažena sa 15% vodenim amonijakom i ekstrahovana etil acetatom. Kombinovani organski ekstrakti su isprani slanim rastvorom, osušeni preko magnezijum-sulfata, filtrirani i upareni in vacuo. Reakcioni ostatak je trituriran metanolom, a zatim je prečišćen pomoću preparativne HPLC [C18, 60% acetonitrila (0,1% mravlje kiseline) u vodi (0,1% mravlje kiseline), 20 minuta niz] da bi se dobilo 20 mg (8%) naslovnog jedinjenja kao bela čvrsta supstanca. LCMS (ESI): [M+H]<+>= 400/402.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8,19 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,29 (s, 1H), 7,24 - 7,19 (m, 2H), 6,65 (ddd, J = 57,8, 54,5, 1,0 Hz, 1H), 4,87 (ddd, J = 24,0, 9,2, 4,0 Hz, 1H), 4,73 (dd, J = 9,5, 4,2 Hz, 1H), 4,53 (t, J = 9,2 Hz, 1H), 4,48 - 4,43 (m, 2H), 4,38 - 4,33 (m, 2H).

Korak 13: (S)-2-((2-((S)-4-(difluorometil)-2-oksoksazolidin-3-il)-5,6-dihidrobenzo[f]imidazo[1,2-d][1,4]oksazepin-9-il)amino)propanamid

(S)-3-(9-bromo-5,6-dihidrobenzo[f]imidazo[1,2-d][1,4]oksazepin-2-il)-4-(difluorometil)oksazolidin-2-on (600 mg, 1,50 mmol), L-alanin (267 mg, 3,00 mmol), bakar(I)-jodid (57 mg, 0,30 mmol) i tribazni kalijum fosfat (637 mg, 3,00 mmol) suspendovani su u dimetil sulfoksidu (6,0 ml). Reakciona smeša je zagrevana na 100 °C tokom 2 sata. Nakon što se ohladi na sobnu temperaturu, dodati su dimetil sulfoksid (4,0 mL), amonijum-hlorid (480 mg, 9,00 mmol) i trietilamin (3,1 mL, 22,5 mmol). Reakcionoj mešanoj suspenziji je dodat 1-[bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinijum3-oksid heksafluorofosfat (5,10 g, 13,5 mmol), u porcijama preko 5 minuta. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 sata, a zatim je filtrirana kroz Celite®, ispiranje etil acetatom. Organski ekstrakti su isprani zasićenim vodenim natrijum bikarbonatom, a vodena faza je ekstrahovana etil acetatom. Kombinovani organski ekstrakti su isprani slanim rastvorom, osušeni preko natrijum sulfata, filtrirani i upareni in vacuo. Sirovi ostatak je prečišćen putem fleš hromatografije na silika gelu (gradijent rastvarača: 0-5% metanola u dihlorometanu) i zatim hiralnom superkritičnom tečnom hromatografijom da bi se dobillo 294 mg (46%) od 101 u obliku prljavo bele čvrste supstance. LCMS (ESI): RT(min) = 2,89 [M+H]<+>= 408, Postupak = A;<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,00 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 7,38 (br s, 1H), 7,18 (s, 1H), 7,00 (br s, 1H), 6,71 (t, J = 55,9 Hz, 1H), 6,41 (dd, J = 8,8, 2,3 Hz, 1H), 6,16 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 6,09 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 5,02 - 4,89 (m, 1H), 4,63 - 4,52 (m, 2H), 4,39 - 4,30 (m, 4H), 3,76 (quintet, J = 7,0 Hz, 1H), 1,30 (d, J = 7,1 Hz, 3H).

Primer 102 (S)-2-ciklobutil-2-((2-((R)-4-metil-2-oksoksazolidin-3-il)-5,6-dihidrobenzo[f]imidazo[1,2-d][1,4]oksazepin-9-il)amino)acetamid 102

Korak 1: (R)-4-metiloksazolidin-2-on

Smeši D-alaninola (8,65 g, 0,12 mmol) u toluenu i vodenom KOH-u (124 ml, 12,5% vod., 0,28 mmol) na 0 °C dodat je fosgen (72,7 ml, 20% u toluenu, 0,14 mmol) tako da je unutrašnja temperatura ostala <5 °C. Reakciona smeša je mešana na 0 °C dodatnih 40 minuta, a zatim je uparena do suvog. Sirovi ostatak je ekstrahovan industrijskim metilatima, suspenzija je filtrirana i filtrat je uparen in vacuo. Reakcioni ostatak je pročišćen putem fleš hromatografije na silika gelu (gradijent rastvarača: 40-100% etil acetata u cikloheksanu) da bi se dobilo 10,4 g (90%) naslovnog jedinjenja u obliku bele čvrste supstance.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6,00 (br s, 1H), 4,50 (t, J = 6,5 Hz, 1H), 4,07 - 3,97 (m, 1H), 3,95 (dd, J = 7,8, 6,2 Hz, 1H), 1,30 (d, J = 6,1 Hz, 3H).

Korak 2: (R)-3-(9-bromo-5,6-dihidrobenzo[f]imidazo[1,2-d][1,4]oksazepin-2-il)-4-metiloksazolidin-2-on i (R)-3-(9-jod-5,6-dihidrobenzo[f]imidazo[1,2-d][1,4]oksazepin-2-il)-4-metiloksazolidin-2-on

Smeša 9-bromo-2-jod-5,6-dihidrobenzo[f]imidazo[1,2-d][1,4]oksazepina (30,0 g, 76,7 mmol), (R)-4-metiloksazolidin-2-on (7,70 g, 76,7 mmol), bakar(I)-jodid (1,61 g, 8,40 mmol), trans-N,N'-dimetil-1,2-cikloheksan diamin (2,7 ml, 16,9 mmol) i kalijum karbonat (14,9 g, 107 mmol) je suspendovana u 1,4-dioksanu (200 mL), a reakciona smeša je degazirana sa argonom pod ultrazvukom. Reakciona smeša je zagrevana 16 h na 100 °C. Reakciona smeša je razblažena vodenim rastvorom amonijaka (~16%) i ekstrahovana etil acetatom. Kombinovani organski ekstrakti su isprani slanim rastvorom, osušeni preko magnezijum-sulfata, filtrirani i upareni in vacuo. Reakcioni ostatak je pročišćen putem fleš hromatografije na silika gelu (gradijent rastvarača: 0-100% etil acetata u cikloheksanu) da bi se dobilo 13,4g (~42%) naslovnih jedinjenja (~2:1 smeše 9-Br: 9-I proizvoda),<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8,28 (d, J = 7,6 Hz, 0,33H), 8,11 (d, J = 6,9 Hz, 0,66H), 7,42 - 7,38 (m, 1H), 7,28 - 7,24 (m, 1,33H), 7,23 - 7,18 (m, 0,66H), 4,77 - 4,68 (m, 1H), 4,58 (t, J = 8,3 Hz, 1H), 4,49 - 4,39 (m, 2H), 4,37 - 4,30 (m, 2H), 4,08 (dd, J = 8,4, 4,5 Hz, 1H), 1,57 - 1,50 (m, 3H).

Korak 3: (R)-3-(9-bromo-5,6-dihidroimidazo[1,2-d][1,4]benzoksazepin-2-il)-4-metil-oksazolidin-2-on

80 mg smješe (R)-3-(9-bromo-5,6-dihidrobenzo[f]imidazo[1,2-d][1,4]oksazepin-2-il)-4-metiloksazolidin-2-on i (R)-3-(9-jod-5,6-dihidrobenzo[f]imidazo[1,2-d][1,4]oksazepin-2-il)-4-metiloksazolidin-2-on je odvojen preko hiralne SFC, da bi se dobilo 27,6 mg naslovnog jedinjenja. LCMS (ESI): [M+H]<+>= 364,0/366,0/367,2;<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,22 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 7,35 (s, 1H), 7,31 (dd, J = 8,7, 2,1 Hz, 1H), 7,25 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 4,65 - 4,54 (m, 2H), 4,49 - 4,43 (m, 4H), 4,09 - 4,06 (m, 1H), 1,42 (d, J = 6,0 Hz).

Korak 4: Metil (S)-2-ciklobutil-2-((2-((R)-4-metil-2-oksoksazolidin-3-il)-5,6-dihidrobenzo[f]imidazo[1,2-d][1,4]oksazepin-9-il)amino)acetat

Smeša (4R)-3-(9-bromo-5,6-dihydroimidazo[1,2-d][1,4]benzoxazepin-2-il)-4-metil-oxazolidin-2-on (0,2746 mmol, 100 mg), bakar(I)-jodid (0,084 mmol, 16 mg), (2S)-2-amino-2-ciklobutil-sirćetna kiselina (1,10 mmol, 142 mg) i kalijum fosfat tribazni (1,37 mmol, 297 mg) u dimetil sulfoksidu (3 mL) zagrejano je pod mikrotalasnim zračenjem na 120 °C 2 sata, Reakcija je ohlađena do sobne temperature, dodat je jodometan (1,4 mmol, 0,086 mL) i reakcija je ekstrahovana dihlorometanom i vodom. Kombinovani organski ekstrakti su isprani slanim rastvorom, osušeni preko natrijum-sulfata, filtrirani i upareni in vacuo. Sirovi proizvod je pročišćen putem fleš hromatografije na silika gelu (24 g silika, gradijent rastvarača: 5-40% 3:1 izopropil acetat: metanol u dihlormetanu) da bi se dobilo 100 mg (85%) naslovnog jedinjenja.

Korak 5: (S)-2-ciklobutil-2-((2-((R)-4-metil-2-oksoksazolidin-3-il)-5,6-dihidrobenzo[f]imidazo[1,2-d][1,4]oksazepin-9-il)amino)acetamid

U rastvor metil (2S)-2-ciklobutil-2-[[2-[(4R)-4-metil-2-okso-oxazolidin-3-il]-5,6-dihydroimidazo[1,2-d][1,4]benzoksazepin-9-il]amino]acetat (0,234 mmol, 100 mg) u tetrahidrofuranu (5 ml) dodata je voda (0,45 ml) i litijum hidroksid monohidrat (0,357 mmol, 15 mg). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 6h. Reakciona smeša je uparena in vacuo. Rastvoru rezultirajućeg ostatka u N,N--dimetilformamidu (3 ml) je dodat 1-[bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-]piridin-3-oksid heksafluorofosfat (0.353 mmol, 137 mg), amonijum hlorid (0,71 mmol, 38 mg) i N,N-diizopropiletilamin (0,705 mmol, 0,123 mL) i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 1 sat. Reakciona smeša je uparena in vacuo i reakcioni ostatak je obrađen vodom i zatim ekstrahovan dihlormetanom. Kombinovani organski ekstrakti su isprani slanim rastvorom, osušeni preko magnezijum sulfata i upareni in vacuo. Sirovi produkt je prečišćen pomoću HPLC reverzne faze, a zatim SFC i liofilizovan da bi se dobilo 15,0 mg (15%) od 102. LCMS (ESI): RT(min) = 3,03, [M+H]<+>= 412,2, method = D;<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,96 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,39 - 7,36 (brs, 1H), 7,13 (s, 1H), 7,00 - 6,97 (brs, 1H), 6,44 (dd, J = 8,9, 2,3 Hz, 1H), 6,14 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 5,96 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 4,62 - 4,49 (m, 2H), 4,38 - 4,28 (m, 4H), 4,06-4,03 (m, 1H), 3,70 - 3,61 (m, 1H), 2,06 - 1,75 (m, 6H), 1,42 - 1,34 (m, 3H).

Primer 103 (S)-2-ciklopropil-2-((2-((S)-4-(difluorometil)-2-oksoksazolidin-3-il)-5,6-dihidrobenzo[f]imidazo[1,2-d][1,4]oksazepin-9-il)amino)acetamid 103

Smeša (S)-3-(9-bromo-5,6-dihidrobenzo[f]imidazo[1,2-d][1,4]oksazepin-2-il)-4-(difluorometil)oksazolidin-2-on iz primera 101, korak 12 (400 mg, 1,00 mmol), L--ciklopropilglicin (230 mg, 2,00 mmol), bakar(I)-jodid (38 mg, 0,20 mmol) i tribazni kalijum fosfat (424 mg, 2,00 mmol) u dimetil sulfoksidu (2,0 mL) degazirani su argonom pod ultrazvukom. Smeša je zagrevana na 100 °C tokom 5 sati, a zatim je ohlađena do sobne temperature. Reakciona smeša je razblažena dimetil sulfoksidom (5,0 ml) i dodati su amonijum hlorid (320 mg, 6,00 mmol) i trietilamin (1,4 ml, 10,0 mmol). U mešanu suspenziju je zatim dodat 1-[bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinijum 3-oksid heksafluorofosfat (2,28 g, 6,0 mmol), u porcijama, a reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 10 minuta. Reakciona smeša je razblažena sa 15% vodenim rastvorom amonijaka i ekstrahovana etil acetatom. Kombinovani organski ekstrakti su isprani slanim rastvorom, osušeni preko magnezijum-sulfata, filtrirani i upareni in vacuo. Sirovi ostatak je prečišćen putem fleš hromatografije na silika gelu (gradijent rastvarača: 0-7% metanola u etil acetatu). Ostatak je rastvoren u najmanje acetonitrila. Zatim je dodata voda da se istaloži čvrsta supstanca koja je sakupljena filtracijom i sušena in vacuo da bi se dobilo 324 mg (75%) od 103 u obliku prljavo bele čvrste supstance. LCMS (ESI): RT(min) = 3,21, [M+H]<+>= 434, Postupak = A;<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,98 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 7,40 (br s, 1H), 7,17 (s, 1H), 7,03 (br s, 1H), 6,71 (t, J = 56,0 Hz, 1H), 6,42 (dd, J =8,9, 2,4 Hz, 1H), 6,24 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 6,09 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 5,01 - 4,89 (m, 1H), 4,63-4,51 (m, 2H), 4,38-4,29 (m, 4H), 3,15 (t, J = 7,7 Hz, 1H), 1,16-1,05 (m, 1H), 0,56 - 0,44 (m, 3H), 0,33 -0,25 (m, 1H).

Primer 104 (S)-2-ciklopropil-2-((2-((R)-4-metil-2-oksoksazolidin-3-il)-5,6-dihidrobenzo[f]imidazo[1,2-d][1,4]oksazepin-9-il)amino)acetamid 104

Smeša (R)-3-(9-bromo-5,6-dihidroimidazo[1,2-d][1,4]benzoksazepin-2-il)-4-metiloksazolidin-2-on (Primer 102, korak 3) (1,098 mmol, 400 mg), bakar(I)-jodid (0,330 mmol, 62,8 mg), (2S)-2-amino-2-ciklopropil-sirćetna kiselina (3,295 mmol, 379,3 mg) i kalijumfosfat tribazni (4,393 mmol, 951,5 mg) u dimetil sulfoksidu (35 mmol, 2,5 ml) je zagrevano na 110 °C 2 sata pod mikrotalasnim zračenjem. Reakcija je ohlađena do sobne temperature. Reakcionoj smeši je dodat 1-[bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridin-3-oksid heksafluorofosfat (12,08 mmol, 4260 mg), amonijum-hlorid (12,08 mmol, 646 mg) i trietilamin (1,53 mL, 11,0 mmol). Nakon 20 minuta na sobnoj temperaturi, reakciona smeša je tretirana vodom, a zatim ekstrahovana dihlormetanom. Kombinovani organski ekstrakti su isprani slanim rastvorom, osušeni preko magnezijum-sulfata, filtrirani i upareni in vacuo. Sirovi proizvod je prečišćen pomoću HPLC reverzne faze i liofilizovan da bi se dobilo 110 mg (25% tokom 2 koraka) od 104. LCMS (ESI): RT(min) = 2,588, [M+H]<+>= 398,2, postupak = B;<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,96 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,39 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 7,13 (s, 1H), 7,02 (d, J =2,3 Hz, 1H), 6,42 (dd, J = 8,9, 2,4 Hz, 1H), 6,20 (d, J = 7,1 Hz, 1H), 6,09 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 4,61 - 4,49 (m, 2H), 4,40 - 4,27 (m, 4H), 4,10 - 3,99 (m, 1H), 3,22 - 3,09 (m, 1H), 1,42 - 1,36 (m, 3H), 1,16 - 1,04 (m, 1H), 0,56 - 0,42 (m, 3H), 0,32 - 0,27 (m, 1H).

Primer 105 (S)-2-ciklopropil-2-((2-((S)-4-(fluormetil)-2-oksoksazolidin-3-il)-5,6-dihidrobenzo[f]imidazo[1,2-d][1,4]oksazepin-9-il)amino)acetamid 105

Korak 1: (R)-1-(terc-butildimetilsilaniloksi)-3-fluoropropan-2-ol

terc-butildimetilsilil hlorid (1,60 g, 10,63 mmol) je dodat u rastvor (R)-3-fluoropropan-1,2-diola (1,00 g, 10,6 mmol), trietilamin (1,93 ml, 13,8 mmol) i katalitički 4-(dimetilamino)piridin u diklorometanu na 0 °C i reakciona smeša je ostavljena da se zagreje do sobne temperature i mešana je na sobnoj temperaturi 16 sati. Reakciona smeša je razblažena vodom i ekstrahovana dihlorometanom. Kombinovane organske frakcije su isprane slanim rastvorom, osušene preko magnezijum-sulfata, filtrirane i uparene in vacuo.

Reakcioni sirovi ostatak je pročišćen putem fleš hromatografije na silika gelu (gradijent rastvarača: 0-40% etil acetata u cikloheksanu) da bi se dobilo 1,80 g (81%) naslovnog jedinjenja u obliku bezbojnog ulja.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4,45 - 4,36 (m, 1H), 4,34 - 4,25 (m, 1H), 3,87 - 3,73 (m, 1H), 3,66 - 3,56 (m, 2H), 2,30 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 0,82 (s, 9H), 0,00 (s, 6H).

Korak 2: (S)-2-azido-3-fluoropropoksi)-terc-butildimetilsilan

Trifluorometansulfonski anhidrid (1,67 mL, 9,93 mmol) dodat je kap po kap rastvoru (R)-1-(terc-butildimetilsilaniloksi)-3-fluoropropan-2-ola (1,80 g, 8,60 mmol) i piridina (1,2 mL, 13,8 mmol) u dihlorometanu na -20 °C i reakciona smeša je mešana na -20 °C tokom 20 minuta, a zatim na 0 °C tokom 30 minuta. Reakciona smeša je razblažena sa 0,5 N vodenog rastvora HCl i ekstrahovana dihlorometanom. Kombinovana organski ekstrakti su osušeni iznad magnezijum-sulfata, filtrirani i upareni in vacuo. Ostatak je rastvoren u N,N-dimetilformamidu (5,0 mL) i dodat je natrijum azid (1,68 g, 25,9 mmol). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 2h. Reakciona smeša je razblažena vodom i ekstrahovana etil acetatom. Kombinovani organski ekstrakti su isprani slanim rastvorom, osušeni preko magnezijum sulfata, filtrirani i upareni in vacuo da bi se dobilo sirovo naslovno jedinjenje koji je prenošeno dalje bez prečišćavanja.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4,58 - 4,26 (m, 2H), 3,75 - 3,63 (m, 2H), 3,62 - 3,46 (m, 1H), 0,80 (s, 9H), 0,00 (s, 6H).

Korak 3: (S)-1-(tercbutildimetilsilaniloksimetil)-2-fluoroetilamin

Paladijum hidroksid (400 mg, 20% na ugljenik) je dodat rastvoru ((S)-2-azido-3-fluoropropoksi)-terc-butildimetilsilana (sirovi, pretpostaviti 8,60 mmol) u etil acetatu (15 ml) i metanolu (5,0 mL) i reakciona smeša je mešana pod balonom vodonika 16 sati. Reakciona smeša je filtrirana, dodat je sveži paladijum hidroksid (400 mg, 20% ugljika) i reakcija je mešana pod balonom vodonika dodatnih 16 sati. Reakciona smeša je filtrirana i filtrat je uparen in vacuo da bi se dobilo naslovno jedinjenje u obliku smeše proizvoda: polaznog materijala ~2:1, koja je prenesena dalje bez prečišćavanja.

Korak 4: (S)-4-fluorometiloksazolidin-2-on

1

HCl u dioksanu (4 N, 2,0 ml, 8,00 mmol) je dodat u rastvor (S)-1-(tercbutildimetilsilaniloksimetil)-2-fluoroetilamina (sirov, pretpostavimo 8,60 mmol) u metanolu (3,0 ml) i dobijena smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Reakciona smeša je uparena in vacuo. Reakcioni ostatak je rastvoren u smeši toluena (20 ml) i KOH (2,89 g, 51,6 mmol, 12,5% vod.) na 0 °C. U ovu smešu je dodavan, kap po kap, fosgen (13,6 ml, 20% u toluenu), uklonjena je kupka za hlađenje i reakciona smeša je mešana tokom 1 sata. Reakciona smeša je uparena in vacuo i reakcioni ostatak je ekstrahovan vrućim industrijskim denaturalizovanim alkoholom. Filtrat je uparen in vacuo i reakcioni ostatak je pročišćen putem fleš hromatografije na silika gelu (gradijent rastvarača: 50-100% etil acetata u cikloheksanu) da bi se dobilo 450 mg (44%, 3 koraka) naslovnog jedinjenja u obliku prljavo bele čvrste supstance.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5,69 (br s, 1H), 4,59 - 4,42 (m, 2H), 4,42 - 4,32 (m, 1H), 4,25 - 4,08 (m, 2H).

Korak 5: (S)-3-(9-bromo-5,6-dihidrobenzo[f]imidazo[1,2-d][1,4]oksazepin-2-il)-4-(fluorometil)oksazolidin-2-on i (S)-3-(9-jod-5,6-dihidrobenzo[f]imidazo[1,2-d][1,4]oksazepin-2-il)-4-(fluorometil)oksazolidin-2-on

Smeša 9-bromo-2-jod-5,6-dihidrobenzo[f]imidazo[1,2-d][1,4]oksazepina (722 mg, 1,85 mmol), (S)-4-fluorometiloksazolidin-2-on (220 mg, 1,85 mmol), 3,4,7,8-tetrametil-1,10-fenantrolin (131 mg, 0,55 mmol), Cu(OAc)2.H2O (74 mg, 0,37 mmol), kalijum karbonat (510 mg, 3,70 mmol) i dioksan (6,0 ml) su zapečaćeni u epruvetu, a smeša je degazirana argonom pod ultrazvukom. Reakciona smeša je zagrevana na 100 °C tokom 72 sata. Rezultujuća reakciona smeša je razblažena sa 15% vodenim amonijakom i ekstrahovana etil acetatom. Kombinovani organski ekstrakti su isprani slanim rastvorom, osušeni preko magnezijum-sulfata, filtrirani i upareni in vacuo. Sirovi ostatak je prečišćen putem fleš hromatografije na silika gelu (gradijent rastvarača: 0-100% etil acetata u cikloheksanu) da bi se dobilo 390 mg (53%) naslovnih jedinjenja (približno 2:1 smeša proizvoda 9-Br i 9-I). LCMS (ESI): [M+H]<+>= 382/384/430;<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ

2

8,22 (d, J = 9,3 Hz, 0,7H), 8,05 (d, J = 8,8 Hz, 0,3H), 7,43 - 7,37 (m, 0,6H), 7,29 (s, 1,2H), 7,23 - 7,18 (m, 1,2H), 5,03 - 4,66 (m, 3H), 4,60 (t, J = 8,5 Hz, 1H), 4,54 (dd, J = 8,6, 4,3 Hz, 1H), 4,47 - 4,43 (m, 2H), 4,37 - 4,33 (m, 2H).

Korak 6: (S)-2-ciklopropil-2-((2-((S)-4-(fluorometil)-2-oksoksazolidin-3-il)-5,6-dihidrobenzo[f]imidazo[1,2-d][1,4]oksazepin-9-il)amino)acetamid

Smeša (S)-3-(9-bromo-5,6-dihidrobenzo[f]imidazo[1,2-d][1,4]oksazepin-2-il)-4-(fluorometil)oksazolidin-2-on i (S)-3-(9-jod-5,6-dihidrobenzo[f]imidazo[1,2-d][1,4]oksazepin-2-il)-4-(fluorometil)oksazolidin-2-on (195 mg, ~2:1, smeša Br:I, ~0,49 mmol), L-ciklopropilglicin (104 mg, 0,90 mmol), bakar(I)-jodid (17 mg, 0,09 mmol) i kalijum fosfat tribazni (190 mg, 0,90 mmol) u dimetil sulfoksidu (1,5 ml) se degasira argonom pod ultrazvukom. Reakciona smeša je zagrevana na 100 °C tokom 16 sati, a zatim je ohlađena do sobne temperature. Reakciona smješa je razblažena dimetil sulfoksidom (1,0 ml) i dodati su amonijum hlorid (144 mg, 2,70 mmol) i trietilamin (950 uL, 6,75 mmol). Ovoj mešavini je zatim dodat 1-[bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridin-3-oksida heksafluorofosfat (1,54 g, 4,05 mmol), u porcijama, a reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Dobijena smeša je razblažena zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata i ekstrahovana etil acetatom. Kombinovani organski ekstrakti su isprani slanim rastvorom, osušeni preko magnezijum-sulfata, filtrirani i upareni in vacuo. Reakcioni sirovi ostatak je pročišćen putem fleš hromatografije na silika gelu (gradijent rastvarača: 0-5% metanola u dihlorometanu) i zatim dalje pročišćeno fleš hromatografijom na silika gelu (gradijent rastvarača: 0-100% metil acetata u cikloheksanu) da bi se dobilo 90 mg (48%) od 105 u obliku prljavo bele čvrste supstance. LCMS (ESI): RT(min) = 2,76 [M+H]<+>= 416, Postupak = A;<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,94 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,40 (br s, 1H), 7,17 (s, 1H), 7,03 (br s, 1H), 6,41 (dd, J = 8,8, 2,3 Hz, 1H), 6,22 (d, J = 7,1 Hz, 1H), 6,09 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 4,99 (ddd, J = 48,3, 9,8, 2,5 Hz, 1H), 4,81 - 4,56 (m, 3H), 4,40 (dd, J = 8,6, 3,9 Hz, 1H), 4,37 - 4,29 (m, 4H), 3,15 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 1,16-1,05 (m, 1H), 0,54 - 0,43 (m, 3H), 0,33 - 0,25 (m, 1H).

Primer 106 (S)-2-((2-((S)-4-(fluorometil)-2-oksoksazolidin-3-il)-5,6-dihidrobenzo[f]imidazo[1,2-d][1,4]oksazepin-9-il)amino)propanamid 106

Smeša (S)-3-(9-bromo-5,6-dihidrobenzo[f]imidazo[1,2-d][1,4]oksazepin-2-il)-4-(fluorometil)oksazolidin-2-on i (S)-3-(9-jod-5,6-dihidrobenzo[f]imidazo[1,2-d][1,4]oksazepin-2-il)-4-(fluorometil)oksazolidin-2-on (Primer 105, korak 5) (195 mg, približno 2:1 smeša 9-Br: 9-I, otprilike 0,49 mmol), L-alanin (87 mg, 0,98 mmol), bakar(I)-jodid (17 mg, 0,09 mmol) i kalijum fosfat tribazni (208 mg, 0,98 mmol) u dimetil sulfoksidu (3,0 ml) degazirani su argon pod ultrazvukom. Reakciona smeša je zagrevana na 100 °C tokom 4 sati, a zatim je ohlađena do sobne temperature. Reakciona smeša je razblažena sadimetil sulfoksidom (3,0 ml) i dodati su amonijum hlorid (157 mg, 2,94 mmol) i trietilamin (683 µL, 4,8 mmol). Ovoj smeši je zatim dodat 1-[bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridin-3-oksid heksafluorofosfat (1,10 g, 2,94 mmol), u porcijama, a reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. Dobijena smeša je razblažena zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata i ekstrahovana etil acetatom. Kombinovani organski ekstrakti su isprani slanim rastvorom, osušeni preko magnezijumsulfata, filtrirani i upareni in vacuo. Reakcioni ostatak je pročišćen putem fleš hromatografije na silika gelu (gradijent rastvarača: 0-5% metanola u dihlorometanu) i zatim dalje prečišćeno hiralnom superkritičnom tečnom hromatografijom da bi se dobilo 36 mg (19%) od 106 u obliku prljavo bele čvrste supstance. LCMS (ESI): RT(min) = 2,43 [M+H]<+>= 390, Postupak = A;<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,96 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,37 (br s, 1H), 7,17 (s, 1H), 7,00 (br s, 1H), 6,39 (dd, J = 8,6, 1,6 Hz, 1H), 6,15 (d, J = 7,0 Hz, 1H), 6,09 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 5,08 - 4,55 (m, 5H), 4,42 - 4,28 (m, 4H), 3,76 (quintet, J = 7,2 Hz, 1H), 1,30 (d, J = 7,2 Hz, 3H).

Primer 107 (S)-2-((2-((S)-4-(difluorometil)-2-oksoksazolidin-3-il)-5,6-dihidrobenzo[f]imidazo[1,2-d][1,4]oksazepin-9-il)amino)butanamid 107

Smeša (S)-3-(9-bromo-5,6-dihidrobenzo[f]imidazo[1,2-d][1,4]oksazepin-2-il)-4-(difluorometil)oksazolidin-2-on (Primer 101, korak 12) (240 mg, 0,60 mmol), (S)-2-aminobutirna kiselina (124 mg, 1,19 mmol), bakar(I)-jodid (22,8 mg, 0,119 mmol), kalijum fosfat tribazni (255 mg, 1,19) mmol) i dimetil sulfoksid (6,0 mL) su mešani pod argonom na 100 °C tokom 6 sati. Reakciona smeša je ostavljena da se ohladi do sobne temperature, a zatim su dodati amonijum-hlorid (188 mg, 3,52 mmol) i trietilamin (1,2 ml, 8,80 mmol). U mešanu suspenziju je dodat 1-[bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinijum 3-oksid heksafluorofosfat (2,01 g, 5,28 mmol), u porcijama, a reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Reakciona smješa je razblažena etil acetatom, isprana zasićenim amonijum-hloridom, osušena iznad magnezijum sulfata, filtrirana i uparena in vacuo. Sirovi proizvod je prečišćen putem fleš hromatografije na silika gelu (gradijent rastvarača: 0-10% metanola u etil acetatu), dalje prečišćen pomoću HPLC reverzne faze, zatim hiralnom superkritičnom tečnaom hromatografijom da bi se dobilo 73,6 mg (30%) od 107 u obliku bele čvrste supstance. LCMS (ESI): RT(min) = 3,13, [M+H]<+>= 422, Postupak = A;<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,99 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,40 (s, 1H), 7,17 (s, 1H), 7,03 (s, 1H), 6,71 (t, J =56,0 Hz, 1H), 6,44 (dd, J = 8,8, 2,2 Hz, 1H), 6,13 (d, J

4

=2,2 Hz, 1H), 6,09 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 5,02 - 4,89 (m, 1H), 4,62 - 4,53 (m, 2H), 4,41 - 4,27 (m, 4H), 3,65 - 3,60 (m, 1H), 1,72 - 1,59 (m, 2H), 0,94 (t, J = 7,3 Hz, 3H).

Primer 901 p110α (alfa) PI3K test vezanja

PI3K analiza vezivanja namenjena je određivanju biohemijskih potencijala inhibitora malih molekula PI3K. Reakcija lipidne kinaze PI3K se izvodi u prisustvu lipidnog supstrata PIP2:3PS (Promega # V1792) i ATP. Nakon prestanka ako je kinazna reakcija, otkrivanje prometa ATP ka ADP fosforilacijom lipidnog supstrata otkriveno je korišćenjem Promega ADP-Glo™ (Promega #V1792) testa. Reakcije su izvedene korišćenjem sledećih uslova za svaku izoformu PI3K kao u Tabeli 5.

Tabela 5.

Posle 120 minuta reakcionog vremena, kinazna reakcija se prekida. Bilo koji ATP koji ostane nakon reakcije je potrošen, ostavljajući samo ADP. Zatim se dodaje reagens za detekciju kinaze za pretvaranje ADP u ATP, koji se koristi u povezanoj reakciji luciferin / luciferaza. Meri se luminescentni izlaz povezan je sa aktivnošću kinaze.

Sve reakcije su izvedene na sobnoj temperaturi. Za svaki PI3K izoform 3 µl smeše (1:1) enzima / lipidnog supstrata se dodaje na belu ploču za ispitivanje sa 384 bunarčića (Perkin Elmer #6007299) koja sadrži 50 nl ispitivanog jedinjenja ili DMSO samo za neobrađene kontrole. Reakcija je započeta dodavanjem 2 μl ATP/MgCl2.Reakcijski pufer kinaze sadrži 50 mM HEPES, 50 mM NaCl, 3mm MgCl2, 0,01% BSA, 1% DMSO i koncentracije enzima i supstrata kao što je navedeno u gornjoj tabeli. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 10 µL ADP-Glo reagensa. Ploče se čitaju u sistemu Perkin Elmer Envision koristeći režim luminiscencije. Krive odziva doziranja od 10 tačaka se stvaraju za svako ispitivano jedinjenje. Ki vrednosti za svako jedinjenje su određene pomoću Morrison Equation.

Testovi vezivanja: Početni eksperimenti za polarizaciju su izvedeni na Analyst HT 96-384 (Molecular Devices Corp, Sunnyvale, CA.). Uzorci za merenje afiniteta za polarizaciju fluorescencije su pripremljeni dodavanjem 1:3 serijskih razblaženja p110alpha PI3K (Upstate Cell Signaling Solutions, Charlottesville, VA) počevši sa krajnjom koncentracijom od 20 ug/mL u polarizacijskom puferu (10 mM Tris pH 7,5, 50 mM NaCl, 4 mM MgCl2, 0,05% Chaps i 1 mM DTT) do 10 mM PIP2(Echelon-Inc., Salt Lake City, UT) krajnja koncentracija. Posle vremena inkubacije od 30 minuta na sobnoj temperaturi, reakcije su zaustavljene dodavanjem GRP-1 i PIP3-TAMRA sonde (Echelon-Inc., Salt Lake City, UT) Krajnja koncentracija 100 nM i 5 nM. Pročitajte sa standardnim prekidačkim filterima za rodamin fluorofor (λex = 530 nm; λem = 590 nm) u crnoprozirnim sa 384 bunarčića Proxiplates® (PerkinElmer, Wellesley, MA). Vrednosti fluorescentne polarizacije su prikazane kao funkcija koncentracije proteina. Vrednosti EC50su dobijene prilagođavanjem podataka četvoroparametarskoj jednačini korišćenjem softvera KaleidaGraph® (Synergy softver, Reading, PA). Ovaj eksperimenttakođe uspostavlja odgovarajuću koncentraciju proteina koja će se koristiti u narednim oglednim eksperimentima sa inhibitorima.

IC50vrednosti inhibitora su određene dodavanjem 0,04mg/mL p110alpha PI3K (konačna koncentracija) u kombinaciji sa PIP2(10mM konačna koncentracija) do bunarčića koji sadrži 1:3 serijska razblaženja antagonista u krajnjoj koncentraciji 25mM ATP (Cell signalizacije Technology, Inc., Danvers, MA) u polarizacijskom puferu. Posle vremena inkubacije od 30 minuta na sobnoj temperaturi, reakcije su zaustavljene dodavanjem GRP-1 i PIP3-TAMRA sonde (Echelon-Inc., Salt Lake City, UT) Krajnja koncentracija 100nM i 5nM. Pročitajte sa standardnim prekidačkim filterima za rodamin fluorofor (λex = 530 nm; λem = 590 nm) u crnoprozirnim sa 384 bunarčića Proxiplates® (PerkinElmer, Wellesley, MA). Vrednosti fluorescentne polarizacije su prikazane kao funkcija koncentracije antagonista, a vrednosti IC50dobijene su prilagođavanjem podataka jednačini sa 4-parametra u softveru Assay Explorer (MDL, San Ramon, CA.).

Alternativno, inhibicija PI3K je određena u radiometrijskom testu koristeći pročišćeni, rekombinantni enzim i ATP u koncentraciji od 1 µM (mikromolaran). Jedinjenje je serijski razblaženo u 100% DMSO. Reakcija kinaze se inkubiratokom 1 sata na sobnoj temperaturi, a reakcija se prekida dodavanjem PBS. IC50vrednosti su naknadno određene pomoću sigmoidne krive doza-odgovor fit (promenljivi nagib).

Primer 902 Selektivna inhibicija mutantnog PI3Kα (alfa)

Sposobnost jedinjenja prema ovom pronalasku da deluje preferencijalno na ćelije koje sadrže mutirani PI3Kα (alfa) određena je merenjem inhibicije PI3K putanje u SW48 izogenim ćelijskim linijama: PI3Kα divljeg tipa (roditeljski), mutirani helikazni domen E545K i mutant H1047R domena kinaze. Sledeći testovi su namenjeni određivanju ćelijske potencije i mutantne selektivnosti inhibitora PI3Kα malih molekula. Analiza koristi izogene ćelijske linije koje izražavaju PI3Kα WT, PI3Kα mutant E545K/+ (Horizon Discovery 103-001) ili PI3Kα mutant H1047R/+ (Horizon Discovery 103-005). Potencijalnost inhibicije pPRAS40 od strane PI3Kα u svakoj ćelijskoj liniji meri se nakon 24 sata tretmana jedinjenjem. Mutantna selektivnost PI3Kα inhibitora je određena odnosima EC50potencijala u WT protiv E545K staničnim linijama i WT u odnosu na H1047R ćelijske linije.

Ćelijska kultura: Ćelijske linije su održavane u inkubatoru ćelijske kulture na 37 °C i 5% CO2u mediju ćelijske kulture koji sadrži RPMI1640 (pripremljen u Genentech-u), 10% FBS (Gibco 16140-071), 2 mM L-glutamina (pripremljen u Genentech-u), i 10 mM HEPES pH 7,2 (pripremljen u Genentech-u). Ćelije su podeljene na svakih 72 sata u odnosu 1:8 koristeći 0,25% Trypsin-EDTA (Gibco 25200).

Procedure testova: Ćelije su sakupljene i posejane u ploče za ispitivanje sa 384 bunarčića tretirane kulture tkiva (Greiner cat #781091) i inkubirane preko noći na 37 °C na 5% CO2. Tri ćelijske linije (WT, E545K i H1047R) paralelno su postavljene i analizirane. Sledećeg dana, testirana jedinjenja su serijski razređena u dimetil sulfoksidu (DMSO) i dodata ćelijama (krajnja koncentracija DMSO 0,5%). Ćelije su zatim inkubirane tokom 24 sata na 37 °C i 5% CO2. Nakon 24 sata, ćelije su lizirane i vrednosti pPRAS40 su merene korišćenjem Meso-Scale prilagođene opreme za ispitivanje pPRAS40 384b (Meso Scale Discovery, cat # L21CA-1). Ćelijski lizati su dodani u ploče za testiranje prethodno obloženim antitelima protiv fosforiliranog PRAS40. Pušteno je da se fosforilirani PRAS40 u uzorcima veže za hvatanje antitela preko noći na 4 °C. Antitelo za otkrivanje (anti-total PRAS40, obeleženo elektrohemiluminescentnim SULFO-TAG) je dodato u vezani lizat i inkubirano tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. MSD čitač punjenja se dodaje tako da, kada se napon primeni na ploče elektroda, nalepnice vezane na površinu elektrode emituju svetlost. MSD sektorski instrument meri intenzitet svetlosti i kvantitativno meri količinu fosfora-PRAS40 u uzorku. Procentualna inhibicija fosforilacije PRAS40 promenljivim koncentracijama ispitnih jedinjenja izračunava se u odnosu na netretirane kontrole. EC50vrednosti su izračunate korišćenjem četveroparametrijskog logističkog nelinearnog regresijskog modela doza-odgovor.

Statistička analiza: EC50vrednosti predstavljaju geometrijsku sredinu od najmanje 4 nezavisna eksperimenta. Sve statistike su izvedene korišćenjem KaleidaGraph softvera (verzija 4.1.3). Studentov t-test je izvršen korišćenjem nesparenih podataka sa jednakom varijacijom za poređenje aktivnosti u odnosu na mutirane ćelije i ćelije divljeg tipa. P < 0,05 se smatra značajnim.

Primer 903 In vitro ćelije putem ispitivanja bilitnosti

Ćelije su zasejane (1,500 po bunarčiću) u ploče sa 384 bunarčića tokom16 sati. Drugog dana je napravljeno devet serijskih 1:3 rastvaranja jedinjenja u DMSO u ploči sa 96 bunarčića. Zatim su jedinjenja razblažena u medijumu za rast pomoću robota Rapidplate (Zymark Corp.). Razblažena jedinjenja su zatim dodata u četvorostruke bunarčiće na pločamasa 384 bunarčića i inkubirana na 37 °C i 5% CO2. Nakon 4 d, relativni broj održivih ćelija izmeren je luminiscencijom korišćenjem Cell Titer-Glo (Promega) prema uputstvima proizvođača i očitan na Wallac Multilabel Reader-u (Perkin-Elmer). EC50 vrednosti su izračunate korišćenjem softvera Prism 6.0 (GraphPad).

Primer 904 In Vivo Efikasnost tumora miš a kod ksenografta

Miševi: Ženski teški kombinovani imunodeficijencijski miševi (CB-17 SCID.bg Charles River Labs, San Diego), NOD.SCID (Charles River Labs, Hollister) ili NCR.nude miševi (Taconic) stari su od 8 do 9 tjedana i imali su opseg BW od 18-26 grama na dan 0 ispitivanja. Životinje su dobile vodu ad libitum i dijetu 5010 laboratorijske autoklavalne prehrane glodara (LabDiet St. Louis, MO). Miševi su smješteni u mikroizolatore na 12-satnom svetlosnom ciklusu. Kompanija „Genetech“ se posebno pridržava preporuka Vodiča za negu i upotrebu laboratorijskih životinja u pogledu zadržavanja, uzgoja, hirurških postupaka, regulacije hrane i tečnosti i veterinarske nege. Program nege i upotrebe životinja u "Genentech"-u akreditovan je od strane Udruženja za procenu i akreditaciju laboratorijskih životinja za zaštitu životinja (AAALAC), što obezbeđuje poštovanje prihvaćenih standarda za negu i upotrebu laboratorijskih životinja. Miševi su smešteni u prostorijama kompanije „Genetech“ u standardnim kavezima mikroizolatora glodavaca i aklimatizovani su da proučavaju uslove najmanje 3 dana pre implantacije tumorskih stanica. Za ispitivanje su korišćene samo životinje koje su izgledale zdrave i koje nisu imale očigledne deformacije Implantacija tumora: Ksenografti su započeti ili sa ćelijama kancera (HCC1954x1 ili KPL4) ili sa tumorima prolaza (HCI-003). Ćelije su kultivirane u mediju RPMI 1640 sa dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma, 2 mM glutamina, 100 jedinica / ml penicilina, 100 µg / mL (mikrograma po ml) streptomicin sulfata i 25 µg / mL gentamicina, sabranih u rastu faze evidentiranja i resuspendovano u 50% -tnom Matrigelu bez fenola (Becton Dickinson Bioscience; San Jose, Kalifornija) i Henkovom balansiranom solnom rastvoru u koncentraciji 3 x 106 ili 5 x 106 ćelija / ml, u zavisnosti od vremena udvostručenja ćelijske linije. Za model HCI-003 pacijenta izvedeni, 30 mg pčelinjeg voska peleta sadrži otprilike 1 mg 17 β (beta) -estradiol su implantiran potkožno 3 dana pre implantacije tumora fragmenata. Tumorske ćelije ili fragmenti implantirani su u 2/3 mliječne masne ćelije, a rast tumora je praćen kako se prosječna veličina približavala ciljanom opsegu od 100 do 250 mm3. Nakon što je većina tumora dostigla ciljani opseg, miševi su raspoređeni u grupe od 7-10 miševa na osnovu volumena tumora.

Terapeutska agensi : PI3K jedinjenja su isporučena kao besplatna baza u suvom prahu i čuvani na sobnoj temperaturi zaštićeni od svetlosti. Nosač za taselisib (GDC-0032) i BYL719 bilo je 0,5% metilceluloze: 0,2% Tween 80 (MCT) u dejonizovanoj vodi. Kontrola nosača za jedinjenje 101 bila je 0,5% metilceluloza / 0,2% nanosuspenzija Tween-80 (MCT). MCT nanosuspenzija se priprema tako da se prvobitno pripremi MCT suspenzija. Nakon pripreme, staklene kuglice od 1 mm i retka zemljana magnetska mešalica se koriste za mlevenje MCT suspenzije oko 24 sata u finu nanosuspenziju. Analizator veličine čestica korišćen je za proveru konačne veličine čestica. Doze leka se pripremaju nedeljno i čuvaju se na 4C.

Tretman: Miševima su davani (nosač) ili navedena mg / kg doziranja PI3K jedinjenja (izraženo kao ekvivalent slobodne baze), PO dnevno odmeravanjem tokom 21-28 dana u količini od 100 uL, mikrolitara (5 mL / kg).

Krajnja tačka: Zapremina tumora izmerena je u dve dimenzije (dužina i širina), koristeći Ultra Cal IV instrumentima za merenje (Model 54 10 111; Fred V. Fowler Company), kako sledi: volumen tumora (mm<3>) = (dužina x širina<2>) x 0,5 i analizirano pomoću Excel verzije 11.2 (Microsoft Corporation). Za modeliranje ponovljenog merenja volumena tumora istih životinja tokom vremena korišćen je linearni mešoviti efekat (LME) (Pinheiro J i dr. Nlme: linearni i nelinearni modeli mešanih učinaka, 2009; R verzija 3.2.5. Ovaj pristup se odnosi na ponovljena merenja i skromne prekide zbog bilo koje smrti životinja koje nisu povezane sa lečenjem pre završetka studije. Kubična regresijska krila korišćena je za prilagođavanje nelinearnog profila vremenskim tokovima volumena log2 tumora na svakom nivou doze. Ovi nelinearni profili su tada bili povezani sa dozom unutar mešovitog modela. Inhibicija rasta tumora kao postotak kontrole nosača (% TGI) izračunata je kao postotak površine ispod nameštene krivulje (AUC) za dotičnu grupu doza dnevno u odnosu na vozilo, koristeći sledeću formulu: % TGI = 100 x (1 - AUCdose/ AUCveh). Koristeći ovu formulu, vrednost TGI od 100% ukazuje na zastoj tumora, vrednost TGI veća od (>) 1%, ali manja od (<) 100% označava kašnjenje rasta tumora i vrednost TGI više od (>) 100% ukazuje na regresiju tumora. Delimični odgovor (PR) za životinju definisan je kao regresija tumora veća od (>) 50%, ali manja od (<) 100% početnog volumena tumora. Kompletan odgovor (CR) je definisan kao 100% regresija tumora (tj. bez merljivog tumora) bilo kojeg dana tokom studije.

Toksičnost : Životinje su vagane svakodnevno tokom prvih pet dana studije i dva puta nakon toga. Težina životinja izmerena je pomoću Adventurer Pro® AV812 skale (Ohaus Corporation). Promena procentne težine je izračunata na sledeći način: promena telesne težine (%) = [(dantežinenovi-dantežine0) /dantežine0] x 100. Miševi su često praćeni zbog otvorenih znakova bilo kakvih neželjenih, nuspojava povezanih sa tretmanom, i kada su primećeni klinički znakovi toksičnosti. Prihvatljiva toksičnost je definisana kao grupni gubitak telesne težine (BW) manji od 20% tokom ispitivanja i ne više od jedne smrti povezane sa lečenjem (TR) među deset lečenih životinja. Bilo koji režim doziranja koji rezultira većom toksičnošću smatra se iznad maksimalne tolerisane doze (MTD). Smrt se klasifikuje kao TR ako se može pripisati nuspojavama tretmana što dokazuju klinički znakovi i/ili nekropsija, ili se takođe može klasifikovati kao TR ako zbog nepoznatih uzroka tokom razdoblja doziranja ili u roku od 10 dana od poslednje doze. Smrt je klasifikovana kao NTR ako nema dokaza da je smrt bila povezana sa nuspojavama tretmana.

Primer 905. Eksperimenti sa ćelijskom kulturom i in vitro inhibitorom

Ćelijske linije su uzgajane u standardnim uslovima kulture tkiva u RPMI medijumu sa 10% fetalnim goveđim serumom, 100 U / mL penicilina i 100 µg / mL streptomicina. HCC-1954 i HDQ-P1 su ćelijske linije kancera dojke (American Type Culture Collection; Manassas, VA. HCC-1954 i HDQ-P1 ćelije su postavljene u svaki zid 6-zidnoj pločici sa kulturom tkiva na 800,00 ćelija / zidu i inkubirane preko noći na 37 °C. Ćelije se inkubiraju sa naznačenim koncentracijama svakog jedinjenja tokom 24 sata. Nakon inkubacije, ćelije su jednom isprane fiziološkom otopinom hladnog fosfata (PBS) i lizirane u Biosource™ ćelijskom ekstrakcijskom puferu (Invitrogen; Carlsbad, CA) sa dodatkom inhibitora proteaze (F. Hoffman-LaRoche; Mannheim, Nemačka), 1 mM fenilmetilsulfonil kokteli 1 i 2 fluorida i inhibitora fosfataze (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO). Koncentracije proteina određene su upotrebom kompleta za ispitivanje proteina Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific; Rockford, IL).

Proteinski testovi

Koncentracija proteina je određena upotrebom kompleta za ispitivanje proteina Pierce BCA (Rockford, IL). Za imunoblotove jednake količine proteina razdvojene su elektroforezom kroz NuPage Bis-Tris 4-12% gradijentne gelove (Invitrogen; Carlsbad, CA); proteini su preneseni na nitrocelulozne membrane pomoću IBlot sistema i protokola iz InVitrogen-a. Antitela na p110alpha i fosfo-Akt (Ser473) dobijena su iz ćelijske signalizacije (Danvers, MA). Antitela na β-aktin i GAPDH bila su iz Sigme.

Primer 906 Ekspresija B-ćelija CD69, Analiza ljudske cele krvi za ekspresiju CD69 u CD19<+>CD27<->B ćelijama

Ćelijska kultura: Ljudska puna krv je raspodeljena u pločice sa 96 dubokim bunarčićima µl po bunarčiću. jedinjenja su razblaženi u DMSO da se dobiju željene koncentracije, a zatim se dalje razblaže u PBS do željene radne koncentracije i doda u zapremini od 5,5 µl po bunarčiću. Uzorci su potom inkubirani 1 sat na 37 °C ispod 5% CO

2pre toga od 5 g (10 μl po bunarčiću) koza anti IgM F (ab') 2 (Southern Biotech, AL), i inkubirani 18 sati na 37 °C pod 5% CO2. Svi tretmani su testirani u duplikatu.

Postupci izolacije i bojenja ćelija: Nakon inkubacije određen je nivo ekspresije CD69 na CD19<+>CD27<->ćelijama bojenjem uzoraka cele krvi koktelom CD27; 10 µl/bunarčiću (klon L128; BD Biosciences, NJ) CD19; 7,5 µl / jamici (klon SJ25C1; BD Biosciences, NJ) i CD69; 10 µl (klon FN50; BD Biosciences, NJ). Pored toga, ljudska puna krv iz svakog davaoca obojena je fluorescentnim kontrolnim antitelima podudarnih izotopa. Nakon dodavanja odgovarajućeg koktela antitela, uzorci pune krvi obojeni su 30 minuta u mraku i potom lizirani pomoću BD Pharm Lysis (BD Bioscience, NJ). Rezultirajući uzorci su isprani sa FACS puferom (fosfatno puferirana fiziološki rastvor (bez Ca/Mg++), ImM EDTA, 25mM HEPES pH 7,0, 1% fetalnim goveđim serumom (deaktivirano toplotom) i fiksirani u FACS puferu sa dodatkom 0,1% formalmaldehida (Polysciences Inc, PA) i 0,1% Pluronic F-68 (Sigma, MO). Podaci su dobiveni pomoću BD LSR-II (BD Biosciences) s BD FACSDiva softverom.

CD69 Izraz CD19<+>CD27<->B ćelije. Ćelije su procenjene protočnom citometrijom za nivoe CD 19, CD27 i CD69 korišćenjem BD FACSDiva Software i utvrđena je vrednost CD69 MFI-Srednja populacija CD19<+>CD27<->limfocita. Koncentracija jedinjenje rezultira 50% inhibicije CD69 MFI-Mean (IC50)određen je pomoću Genedata softvera (Genedata Screener, MA).

Primer 907 HCC1954 i HDQP1 pPRAS40 EC50

Ćelije se razmnožavaju u testnim pločicama sa 384 kultura sa dobro udubljenim tkivima i inkubiraju preko noći. Sledećeg dana ćelije su tretirane jedinjenjima i inkubirane tokom 24 sata. Nakon 24 sata, ćelije se liziraju i mere se pPRAS40 pomoću Meso-Scale analize. Ove ćelijske linije su prilično korisne za karakterizaciju selektivnosti PI3Ka inhibitora za mutirani PI3Ka. HCC1954 ćelijska linija izražava mutirani PI3Ka (E545K) prema WT u HDQP1.

Princip ispitivanja: MSD platforma obezbeđuje postupak za merenje nivoa fosforiliranog pPRAS40 u jednom uzorku. Ćelijski lizati se dodaju testnim pločama prethodno obloženim antitelima protiv ukupnog PRAS40. Nakon lize ćelija, PRAS40 u

1

uzorcima ima mogućnost da se veže na hvatačka antitela. Detekcijsko antitelo (antifosfo PRAS40), obeleženo elektrokemiluminescentnim jedinjenjem MSD SULFO-TAG, dodaje se vezanom lizatu. MSD čitač punjenja se dodaje tako da, kada se napon primeni na ploče elektroda, nalepnice vezane na površinu elektrode emituju svetlost. MSD Sektorski instrument meri intenzitet svetla i kvantitativno meri količinu fosfora_EGFR u uzorku (Meso skala Analiza načela).

Materijali:

Postupak:

• Jedinjenja pripremljeni u koncentraciji od 2 mM u DMSO. Pripremite pločicu za titraciju DMSO jedinjenja, 1:3 u urednom DMSO.

• DMSO matična ploča sadrži 72 µl 13 jedinjenja.

• Mutant selektivno kontrolno jedinjenje: Dodajte 72 µl 2 mM kontrolnog jedinjenja u bunarčić B2 na svakoj ploči za ispitivanje. Ovo kontrolno jedinjenje pokazuje otprilike 20 puta veću potenciju u HCC1954 ćelijskoj liniji u odnosu na liniju HDQP1.

• Koristite višekanalnu pipetu, prenesite 36 µl iz svakog jedinjenja u bunarčić direktno ispod (primer B2 do C2) da biste postavili duplikate krivulje doza-odgovor.

• Upotrebite Biomek Fx postupak pod nazivom „SLS_serial razređivanje / 1 ploča_384_3_13_3x“ da biste napravili serijska razređenja jedinjenja u matičnoj ploči.

• Zatvorite i držite obe ploče DMSO majka i kćer toplotnim zaptivačem kada se ne koriste.

1. dan: Ćelijske pločice

1. Seme 12500 ćelija u mediju od 45 µl za svaku ćelijsku liniju. Pustite ćelije da se

2

slegnu/pričvrstite na ploču 15-20 min na sobnoj temperaturi.

2. Inkubirajte ćelije preko noći u inkubatoru sa vlagom od 37 °C i CO2.

2. dan: Priprema složenih ploča i tretman sa jedinjenjem

1. Za ploču sa 10X srednjim razređivanjem: dodajte 95 µl medija bez seruma u standardnu polipropilensku ploču od 384 bunarčića.

2. Koristite biomek Fx protokol za intermedijarno razređivanje jedinjenja u medijuma i dodatak ćelijama: „SLS Intermed Dil dodao 5 µl u ćelije 13. jula 2012.“ Ovaj Biomek protokol prenosi 5 µl sa ploče kćeri DMSO na intermedijarnu pločicu za razređivanje koja sadrži 95 µl medija i meša medije i jedinjenja. Postupak se zatim prenosi 5 µl sa ploče za razređivanje na odgovarajuću ćelijsku ploču.

3. Inkubirajte tretirane ćelije na 37 stepeni tokom 24 sata u inkubatoru sa vlagom 5% CO2.

3. dan: Lisika ćelija i dodatak na MSP ploče

Blokirajte MSD ploču za ispitivanje s 50 µl 3% Blocker A / 1X MSD puferom za pranje 1-2 sata na sobnoj temperaturi. Ovaj rastvor se može čuvati na 4 °C do mesec dana. Blokiranje pufera A sadrži 1X MSD pufer za pranje.20 ml 1X Tris pufer za pranje i 600 mg Blocker A.

Pripremite pufer za lizu:

Aspirirajte medije i lizirajte ćelije

1. Lizirajte ćelije u 50 µl puferu za liziranje. Lizirajte na sobnoj temperaturi 10-20 minuta na mućkalici pločica.

2. Dok ćelije liziraju, operite blokirane ploče 1x MSD puferom za pranje.

3. Prenesite 42 µl lizata (21 21 uL) na blokiranu ploču za ispitivanje MSD pPRAS40.

4. Zatvorite MSD ploče i inkubirajte na 4 °C mućkanjem preko noći.

4. dan: MSD test/detekcija

8. Napravite rasstvor od 1% Blocker A u 1X MSD puferu za pranje. (20 mL 1X Tris pufer za pranje i 200 mg Blocker A (1% w / v). Ovaj rastvor se može čuvati na 4 °C do mesec dana.

9. Operite MSD ploče sa 1x MSD puferom za pranje.

10. Na ploče dodajte 10 µl razređenog antitela za otkrivanje SULFO-TAG. Inkubirajte 1 sat uz mućkanje na sobnoj temperaturi.

11. Operite ploče 4X sa 1X MSD puferom za pranje.

12. Dodajte 35 µl 1X pufer za čitanje s obrnutim pipetiranjem kako biste izbegli mehuriće.

13. Pročitajte ploču odmah na instrumentu MSD SECTOR.

Primer 908 Kokristalografija s p110α (alfa)

N-krajnje skraćeni p110α (alfa) proizveden je prema Chen i sar. i Nacht i sur. (Chen, P., YL Deng, S. Bergqvist, MD Falk, W. Liu, S. Timofeevski i A. Brooun „Inženjering izolovane podjedinice p110alpha PI3Kalpha omogućava kristalizaciju i obezbeđuje platformu za dizajn lijekova zasnovanih na strukturi.” (2014) Protein Sci 23 (10): 1332-1340; Nacht, M. i sur. (2013) „Otkrivanje snažnog i izoformno selektivnog ciljanog kovalentnog inhibitora lipidne kinaze PI3Kalpha,” J. Med. Chem. 56 (3): 712-721).

Za proizvodnju kristala primenjeni su standardni protokoli u prisustvu projektnih jedinjenja. Sakupljeni kristali sačuvani su za prikupljanje difrakcijskih podataka uranjanjem u tečni azot i montirani na sintrotronsku zraku koja proizvodi jednobojne rendgenske zrake. Podaci o difrakciji prikupljani su, smanjeni i spojeni koristeći standardne protokole. Kristalografske jedinice ćelije i prostorna grupa bile su izomorfne onima prethodno prijavljenim (Nacht, 2013; Chen, 2014). Postavljanje projektnih jedinjenja u mape gustoće elektrona i kristalografsko preciziranje do granica rezolucije između 2,36 i 2,56 A izvedeni su korišćenjem standardnih protokola.

4

U ovoj primeni jedinice ul, uMol itd. Znače µl, µMol, itd.

Iako je pronalazak koji prethodi opisan prilično detaljno pomoću ilustracija i Primera za lakše razumevanje, opise i Primere ne treba tumačiti kao ograničenja za opseg primene pronalaska. Otkrivanja celokupne citirane patentne i naučne literature izričito su u potpunosti uključena referencom.

Claims (23)

1. PATENTNI ZAHTEVI 1. Jedinjenje, odabrano iz Formule I:

   i stereoizomere, geometrijske izomere, tautomere i njihove farmaceutski prihvatljive soli, pri čemu: R<1>je izabran od -CH3,, -CH2CH3,, ciklopropila, i ciklobutila; R<2>je izabran od -CH3,, -CHF2,, -CH2F i -CF3..
2. 2. Jedinjenje prema zahtevu 1 pri čemu R<1>je CH3ili ciklopropil.
3. 3. Jedinjenje prema zahtevu 1 ili 2 pri čemu R<2>je – CHF2.
4. 4. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1-3, pri čemu je Formula I: (S) -2-((2-((S)-4-(difluorometil) -2-oksoksazolidin-3-il) -5,6-dihidrobenzo [ f ] imidazo [1,2- d ] [1,4 ] oksazepin-9-il) amino) propanamid koji ima strukturu

   ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli.
5. 5. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1-3, pri čemu je Formula I: (S)-2-ciklobutil-2-((2-((R)-4-metil-2-oksoksazolidin-3-il) -5,6-dihidrobenzo [ f ] imidazo [1,2- d ] [1 , 4] oksazepin-9-il) amino) acetamid koji ima strukturu

   ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli.
6. 6. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1-3, pri čemu je Formula I: (S)-2-ciklopropil-2 -((2-((S)-4-(difluorometil) -2-oksoksazolidin-3-il) -5,6-dihidrobenzo [ f ] imidazo [1,2- d ] [1,4] oksazepin-9-il) amino) acetamid koji ima strukturu

   ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli.
7. 7. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1-3, pri čemu je Formula I: (S)-2-ciklopropil-2-((2-((R)-4-metil-2-oksoksazolidin-3-il) -5,6-dihidrobenzo [ f ] imidazo [1,2- d ] [1 , 4] oksazepin-9-il) amino) acetamid koji ima strukturu

   ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli.
8. 8. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1-3, pri čemu je Formula I: (S)-2-ciklopropil-2 -((2-((S)-4- (fluormetil) -2-oksoksazolidin-3-il) -5,6-dihidrobenzo [ f ] imidazo [1,2- d ] [1,4] oksazepin-9-il) amino) acetamid koji ima strukturu

   ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli.
9. 9. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1-3, pri čemu, je Formula I: (S)-2-ciklopropil-2 -((2-((S)-4-(fluorometil) -2-oksoksazolidin-3-il) -5,6-dihidrobenzo [ f ] imidazo [1,2- d ] [1,4 ] oksazepin-9-il) amino) propanamid koji ima strukturu

   ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli.
10. 10. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1-3, pri čemu je Formula I: (S)-2-((2-((S)-4-(difluorometil) -2-oksoksazolidin-3-il) -5,6-dihidrobenzo [ f ] imidazo [1,2- d ] [1,4 ] oksazepin-9-il) amino) butanamid koji ima strukturu

    ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli.
11. 11. Farmaceutska kompozicija koja se sastoji od jedinjenja prema bilo kojem od zahteva 1-10 i farmaceutski prihvatljivog nosača, kliznog sredstva, razblaživača ili ekscipijenta
12. 12. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 11, pri čemu farmaceutski prihvatljiv nosač, agens za klizanje, razblaživač ili ekscipijent izabran od silicijum dioksida, celuloze u prahu, mikrokristalne celuloze, metalnih stearata, natrijum aluminosilikata, natrijum benzoata, kalcijumovog karbonata, kalcijumovog silikata, kukuruznog škroba, magnezijum karbonata, talk bez azbesta, stearowet C, skrob, skrob 1500, magnezijev lauril sulfat, magnezijev oksid, i njihove kombinacije.
13. 13. Postupak za proizvodnju farmaceutske kompozicije koji uključuje kombinovanje jedinjenja prema bilo kojem od zahteva 1-10 sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, glidantom, razblaživačem ili ekscipijentom.
14. 14. Jedinjenje prema bilo kojem od zahteva 1-10, za upotrebu za lečenje kancera kod pacijenta pri čemu je kancer odabran između kancera dojke i mikrocelularnog kancera pluća.
15. 15. Jedinjenje za upotrebu u skladu sa zahtevom 14, dodatno uključuje davanje pacijentu dodatnog terapeutskog agensa izabrano između 5-FU, docetaksela, eribulina, gemcitabina, kobimetiniba, ipatasertiba, paklitaksela, tamoksifena, fulvestranta, GDC-0810, deksametazona, palbocikliba, bevacizumab, pertuzumab, trastuzumab emtansin, trastuzumab i letrozol.
16. 16. Jedinjenje za upotrebu u skladu sa zahtevom 14, pri čemu kancer je kancer dojke.
17. 17. Jedinjenje za upotrebu u skladu sa zahtevom 16, pri čemu kancer dojke je pozitivan na estrogenski receptor (ER ) kancer dojke.
18. 18. Jedinjenje za upotrebu prema zahtevu 16, pri čemu podtip kancera dojke je Basal ili Luminal.
19. 19. Jedinjenje za upotrebu u skladu sa zahtevom 14, pri čemu kancer izražava PIK3CA mutant odabran između E542K, E545K, Q546R, H1047L i H1047R.
20. 20. Jedinjenje za upotrebu prema zahtevu 14, naznačen time što kancer izražava PTEN mutant.
21. 21. Jedinjenje za upotrebu prema zahtevu 16, pri čemu je kancer, HER2 pozitivni kancer.
22. 22. Jedinjenje za upotrebu prema zahtevu 16, pri čemu pacijent je negativan na HER2, na ER (estrogenski receptor) i na PR (progesteronski receptor).
23. 23. Komplet za terapeutski tretman kancera dojke, koji sadrži: a) farmaceutski kompozicija prema zahtevima 11 ili 12; i b) uputstva za upotrebu u terapeutskom tretmanu kancera dojke.