RS59756B1 - Kombinovana farmaceutska kompozicija - Google Patents

Description

Opis

Područje ovog pronalaska

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na novu „kombinovanu farmaceutsku kompoziciju“, i određenije na kombinaciju za lečenje kancera specifičnog IL-15 superagonista i antitela koje antagonistički deluje na imuni put umešan u inhibiciju aktivacije T ćelije kako je definisano u zahtevima.

Pozadina

[0002] Adaptivni imuni odgovor podrazumeva aktivaciju, odabir, i klonalnu proliferaciju dve glavne klase limfocita koje se nazivaju T ćelije i B ćelije. Nakon susreta sa antigenom, T ćelije se proliferišu i diferenciraju u antigen-specifične ćelije efektora, dok se B ćelije proliferišu i diferenciraju u ćelije koje izlučuju antitela.

[0003] Aktivacija T ćelija predstavlja postupak od više faza koji zahteva nekoliko događaja signaliziranja između T ćelije i ćelije koja predstavlja antigen (APC). Da bi došlo do aktivacije T ćelije, dva tipa signala moraju biti isporučena T ćeliji u mirovanju.

[0004] Prvi tip je posredovan antigen-specifičnim receptorom T ćelije (TcR), i daje specifičnost imunom odgovoru.

[0005] Drugi, kostimulativni, tip reguliše jačinu odgovora i isporučuje se putem pomoćnih receptora na T ćeliji. Ovi receptori obuhvataju imunosupresivne receptore (npr. CTL-A4, PD-1, ili Inhibitorni KIRs) i kostimulativne receptore (npr. CD40, 4-1BB, OX-40 ili TNFR-povezan protein indukovan glukokortikoidom (GITR)).

[0006] Terapeutske strategije su razvijene na inhibiciji imunosupresivnih receptora ili na aktivaciji kostimulativnih receptora tako da se potencira antitumorski odgovor imunog sistema.

[0007] U WO 2012/175222 je dat opis imunocitokina koji obuhvata (a) konjugat, i (b) antitelo ili njegov fragment direktno ili indirektno povezan putem kovalentnosti za pomenuti konjugat, pri čemu pomenuti konjugat obuhvata (i) polipeptid koji obuhvata sekvencu aminokiseline interleukina 15 ili njegovih derivata, i polipeptid koji obuhvata sekvencu aminokiseline sushi domena IL-15Ra ili njegovih derivata. Xu et al. (Cancer Research, vol.73, no.10, pages 3075-3086, 2013) opisuju kako jedna doza kompleksa interleukin (IL)-15 superagonist mutanta i dimernog IL-15 receptora αSu/Fc fuzionog proteina, ali ne samog IL-15 , eliminiše 5T33P i MOPC-315P ćelije mijeloma u koštanoj srži miševa sa tumorom.

[0008] Kombinovane strategije se takođe stvarno predviđaju. Sada, rezultati su veoma opasni u zavisnosti od ispitivanih jedinjenja.

Kratak sadržaj ovog pronalaska

[0009] Sada, pronalazači pokazuju da kombinacija njihovog specifičnog jedinjenja, pod nazivom RLI, sa antitelom koje antagonistički deluje na imuni put umešan u inhibiciju aktivacije T ćelije daje veoma visok procenat remisije tumora, dok se takva remisija ne može predvideti u smislu remisije tumora dobijene sa RLI ili antagonistima samih imunosupresivnih receptora.

[0010] Štaviše, ovo sinergičko delovanje je takođe dobijeno sa kombinacijom niske doze u kojoj se niska doza RLI kombinuje sa niskom dozom anti-PD1. Iznenađujuće, i u poređenju sa prethodnom kombinacijom, ova kombinacija obezbeđuje jaku i sinergičku inhibiciju rasta tumora.

[0011] Ova jaka sinergija omogućava nove terapije.

[0012] Prema tome, ovaj pronalazak se odnosi na kombinovanu farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata:

1) konjugat koji obuhvata (i) polipeptid koji obuhvata sekvencu aminokiseline interleukina 15 ili njegovih derivata sa najmanje 10% aktivnosti humanog IL-15 u indukciji proliferacije ćelijske linije kit225, i ii) polipeptid koji obuhvata sekvencu aminokiseline sushi domena IL-15Rα ili njegovih derivata sa najmanje 10% aktivnosti vezivanja sushi domena humanog IL-15Rα za humani IL-15; samim tim polinukleotid koji kodira, ili vektor koji obuhvata takav polinukleotid; i

2) antitelo koje antagonistički deluje na imuni put umešan u inhibiciju aktivacije T ćelije, ili njegov fragment koji može da reaguje sa istim antigenom kao i njegov kontradeo antitela, samim tim sa polinukleotidom koji kodira, ili vektorom koji obuhvata takav polinukleotid,

pri čemu pomenuto antitelo predstavlja PD-1/PD-L1/PD-L2 antagonist, pri čemu pomenuto antitelo antagonistički deluje ili vezivanjem PD-1 receptora ili vezivanjem PD-L1 ili PD-L2 liganda, pri čemu pomenuti konjugat i antitelo ili njegov fragment nisu povezani.

[0013] U drugom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju za upotrebu u lečenju kancera kod subjekta koja obuhvata

(A) konjugat koji obuhvata (i) polipeptid koji obuhvata sekvencu aminokiseline interleukina 15 ili njegovih derivata sa najmanje 10% aktivnosti humanog IL-15 u indukciji proliferacije ćelijske linije kit225, i (ii) polipeptid koji obuhvata sekvencu aminokiseline sushi domena IL-15Rα ili njegovih derivata sa najmanje 10% aktivnosti vezivanja sushi domena humanog IL-15Rα, za humani IL-15, samim tim polinukleotid koji kodira, ili vektor koji obuhvata takav polinukleotid, pri čemu upotreba obuhvata istovremeno, odvojeno, ili uzastopno davanje (a) pomenute farmaceutske kompozicije i (b) antitela koje antagonistički deluje na imuni put umešan u inhibiciju aktivacija T ćelija, ili njegov fragment koji može da reaguje sa istim antigenom kao i njegov kontradeo antitela, samim tim polinukleotid koji kodira, ili vektorom koji obuhvata takav polinukleotid, ili

(B) antitelo koje antagonistički deluje na imuni put umešan u inhibiciju aktivacije T ćelija, ili njegov fragment koji može da reaguje sa istim antigenom kao i njegov kontradeo antitela, samim tim polinukleotidom koji kodira, ili vektorom koji obuhvata takav polinukleotid,

pri čemu upotreba obuhvata istovremeno, odvojeno, ili uzastopno davanje (a) pomenute farmaceutske kompozicije i (b) konjugata koji obuhvata (i) polipeptid koji obuhvata sekvencu aminokiseline interleukina 15 ili njegovih derivata, sa najmanje 10% aktivnosti humanog IL-15 u indukciji proliferacije ćelijske linije kit225, i ii) polipeptid koji obuhvata sekvencu aminokiseline sushi domena IL-15Rα ili njegovih derivata sa najmanje 10% aktivnosti vezivanja sushi domena humanog IL-15Rα za humani IL-15, samim tim polinukleotida koji kodira, ili vektora koji obuhvata takav polinukleotid, i

pri čemu je pomenuto antitelo PD-1/PD-L1/PD-L2 antagonist,

pri čemu pomenuto antitelo antagonistički deluje ili vezivanjem PD-1 receptora ili vezivanjem PD-L1 ili PD-L2 liganda.

[0014] Farmaceutska kompozicija za upotrebu u lečenju kancera ili kombinovana farmaceutska kompozicija ovog pronalaska, su poželjno prilagođene za istovremeno, odvojeno ili uzastopno davanje za upotrebu u lečenju kancera kod subjekta.

Kratak opis crteža

[0015]

Na FIG.1 je dat prikaz protokola davanja injekcije koji se koristi kod modela miša sa kancerom sa BIOXELL anti-PD1

Na FIG.2 je dat prikaz prisustva TILs kod CT26 modela.

Na FIG.3 je dat prikaz Anti-PD1 (RPMI1-14) i RLI kombinovane terapije kod miševa.

Na FIG.4 je dat prikaz preživljavanja miševa za Anti-PD1 / RLI kombinovano tretiranje.

Na FIG.5 je dat prikaz protokola za davanje injekcija kod modele miša sa kancerom.

Na FIG.6 je dat prikaz anti-PD1 (mBAT) i RLI kombinovane terapije kod miševa.

Detaljan opis

Konjugat

[0016] Pojam "interleukin 15" u svom opštem značenju u tehnici i odnosi se na citokin koji je po svojoj strukturi sličan sa IL-2 (GRABSTEIN et al., Science, vol.264(5161), p:965-968, 1994). Ovaj citokin je takođe poznat kao IL-15, IL15 ili MGC9721. Ovaj citokin i IL-2 dele mnoge biološke aktivnosti i zaključeno je da se vezuju za zajedničke podjedinice hematopoietinskog receptora. Stoga, mogu da stupe u kompetenciju za isti receptor, negativno regulišući međusobnu aktivnost. Ustanovljeno je da IL-15 reguliše aktivaciju i proliferaciju T i prirodnih ćelija ubica, i pokazalo se da se broj CD8+ -memorijske ćelije kontroliše ravnotežom između ovog citokina i IL2. Aktivnost IL-15 se može meriti određivanjem njegove indukcije proliferacije na ćelijskoj liniji kit225 (HORI et al., Blood, vol.70(4), p:1069-72, 1987), kako je opisano u primerima.

[0017] Pomenuti IL-15 ili njegovi derivati sa najmanje 10% aktivnosti humanog interleukina-15 u indukciji proliferacije ćelijske linije kit225, poželjno najmanje 25% i poželjnije najmanje 50%.

[0018] Pomenuti interleukin 15 predstavlja interleukin 15 sisara, poželjno interleukin 15 primata, i poželjnije humani interleukin 15.

[0019] Stručnjak može jednostavno da identifikuje interleukin 15 sisara. Kao primer, može se navesti interleukin 15 iz Sus scrofa (pristupni broj ABF82250), iz Rattus norvegicus (pristupni broj NP_037261), iz Mus musculus (pristupni broj NP_032383), iz Bos Taurus (pristupni broj NP _776515), iz Oryctolagus cuniculus (pristupni broj NP_001075685), iz Ovies aries (pristupni broj NP_001009734), iz Felis catus (pristupni broj NP_001009207), iz Macaca fascicularis (pristupni broj BAA19149), iz Homo sapiens (pristupni broj NP_000576), iz Macaca Mulatta (pristupni broj NP_001038196), iz Cavia porcellus (pristupni broj NP_001166300), ili iz Chlorocebus sabaeus (pristupni broj ACI289).

[0020] Kako se ovde upotrebljava, pojam "interleukin 15 sisara" se odnosi na konsenzus sekvencu SEQ ID n°1.

[0021] Stručnjak može jednostavno da identifikuje interleukin 15 primata. Kao primer, može se navesti interleukin 15 iz Sus scrofa (pristupni broj ABF82250), iz Oryctolagus cuniculus (pristupni broj NP_001075685), iz Macaca fascicularis (pristupni broj BAA19149), iz Homo sapiens (pristupni broj NP_000576), iz Macaca Mulatta (pristupni broj NP_001038196), ili iz Chlorocebus sabaeus (pristupni broj ACI289).

[0022] Kako se ovde upotrebljava, pojam "interleukin 15 primata" se odnosi na konsenzus sekvencu SEQ ID n°2.

[0023] Stručnjak može jednostavno da identifikuje humani interleukin 15 i odnosi se na sekvencu aminokiselina SEQ ID n° 3.

[0024] Kako se ovde upotrebljava, pojam "derivati interleukina 15" se odnosi na sekvencu aminokiseline sa procentom identiteta od najmanje 92.5 % (tj. što odgovara oko 10 aminokiselinskih supstitucija) sa sekvencom aminokiseline odabranom iz grupe koju čine SEQ ID n°: 1, SEQ ID n°2 i SEQ ID n°3, poželjno od najmanje 96 % (tj. što odgovara oko 5 aminokiselinskih supstitucija), i poželjnije od najmanje 98.5% (tj. što odgovara oko 2 aminokiselinske supstitucije) ili od najmanje 99% tj. što odgovara oko 1 aminokiselinskoj supstituciji). Stručnjak može jednostavno da identifikuje takve derivate imajući u vidu sopstveno lično znanje i učenje iz prijave ovog patenta. Kao primer takvih derivata, mogu se navesti oni opisani u International Patent Application PCT WO 2009/135031. Takođe se smatra da se prirodne kiseline mogu zameniti hemijski modifikovanim aminokiselinama. Uobičajeno je da, takve hemijski modifikovane aminokiseline povećavaju poluživot polipeptida.

[0025] Kako se ovde upotrebljava, "procenat identiteta" između dve sekvence aminokiselina, označava procenat identičnih aminokiselina, između dve sekvence koje se porede, dobijen sa najboljim poravnanjem pomenutih sekvenci, pri čemu je ovaj procenat čisto statistički, a razlike između ove dve sekvence nasumično pokrivaju sekvence aminokiselina. Kako se ovde upotrebljava, "najbolje poravnanje" ili "optimalno poravnanje", označava ono poravnanje za koje je određeni procenat identiteta (videti u nastavku) najviši. Poređenje sekvenci između dve sekvence aminokiselina se obično sprovodi poređenjem ovih sekvenci koje su prethodno poravnane u skladu sa najboljim poravnanjem; ovo poređenje se sprovodi po segmentima poređenja kako bi se identifikovali i poredili lokalni regioni sličnosti. Najbolje poravnanje sekvenci, u cilju izvođenja poređenja, se može realizovati, pored ručnog načina realizovanja, i upotrebom algoritma globalne homologije koji je razvijen pomoću SMITH i WATERMAN (Ad. App. Math., vol.2, p:482, 1981), upotrebom algoritma lokalne homologije razvijenim pomoću NEDDLEMAN i WUNSCH (J. Mol. Biol., vol.48, p:443, 1970), upotrebom postupka sličnosti razvijenim pomoću PEARSON i LIPMAN (Proc. Natl. Acd. Sci. USA, vol.85, p:2444, 1988), upotrebom računarskog softvera koji koristi takve algoritme (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA, TFASTA kod Wisconsin Genetics software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI USA), upotrebom MUSCLE algoritama višestrukog poravnanja (Edgar, Robert C., Nucleic Acids Research, vol.

32, p: 1792, 2004). Da bi se dobilo najbolje lokalno poravnanje, poželjno je da se koristi BLAST softver sa BLOSUM 62 matricom. Procenat identiteta između dve sekvence aminokiseline se određuje poređenjem ove dve optimalno poravnane sekvence, pri čemu te sekvence aminokiselina imaju mogućnost da obuhvate dodavanja ili brisanja u odnosu na referentnu sekvencu kako bi se dobilo optimalno poravnanje između te dve sekvence. Procenat identiteta se računa određivanjem broja identičnih pozicija između ove dve sekvence, i deljenjem ovog broja sa ukupnim brojem upoređenih pozicija, i množenjem rezultata sa 100 kako bi se dobio procenat identiteta između ove dve sekvence.

[0026] Poželjno, derivati interleukina 15 su IL-15 agonist ili superagonist. Stručnjak može jednostavno da identifikuje IL-15-agonist ili -superagonist. Kao primer IL-15-agonista ili -superagonista, mogu se navesti oni koji su opisani u International patent application WO 2005/085282 ili u ZHU et al. (J. Immunol., vol.

183(6), p:3598-607, 2009).

[0027] I dalje poželjno, pomenuti IL-15 agonist ili superagonist je odabran iz grupe koja obuhvata/se sastoji od L45D, L45E, S51D, L52D, N72D, N72E, N72A, N72S, N72Y i N72P (u odnosu na sekvencu humanog IL-15, SEQ ID n°3).

[0028] Kako se ovde upotrebljava pojam "sushi domen IL-15Rα" ima svoje opšte značenje u tehnici i odnosi se na domen koji počinje na prvom ostatku cisteina (C1) nakon signalnog peptida IL-15Rα, a završava se na četvrtom ostatku cisteina (C4) nakon pomenutog signalnog peptida. Pomenuti sushi domen koji odgovara delu ekstracelularnog regiona IL-15Rα je neophodan radi sopstvenog vezivanja za IL-15 (WEI et al., J. Immunol., vol.167(1), p:277-282, 2001).

[0029] Pomenuti sushi domen IL-15Rα ili njegovi derivati sa najmanje 10% aktivnosti vezivanja sushi domena humanog IL-15Rα za humani interleukin-15, poželjno najmanje 25% i poželjnije najmanje 50%. Pomenuta aktivnost vezivanja može jednostavno da se odredi postupkom opisanim u WEI et al. (gore pomenutim, 2001).

[0030] Pomenuti sushi domen IL-15Rα predstavlja sushi domen IL-15Rα sisara, poželjno sushi domen IL-15Rα primata i poželjnije sushi domen humanog IL-15Rα.

[0031] Stručnjak može jednostavno da identifikuje sushi domen IL-15Rα sisara. Kao primer, može se navesti sushi domen IL-15Rα iz Rattus norvegicus (pristupni broj XP_002728555), iz Mus musculus (pristupni broj EDL08026), iz Bos Taurus (pristupni broj XP_002692113), iz Oryctolagus cuniculus (pristupni broj XP_002723298), iz Macaca fascicularis (pristupni broj ACI42785), iz Macaca nemestrina (pristupni broj ACI42783), iz Homo sapiens (pristupni broj Q13261.1), iz Macaca Mulatta (pristupni broj NP_001166315), Pongo abelii (pristupni broj XP_002820541), Cercocebus torquatus (pristupni broj ACI42784), Callithrix jacchus (pristupni broj XP_002750073), ili iz Cavia porcellus (pristupni broj NP_001166314).

[0032] Kako se ovde upotrebljava, pojam "sushi domen IL-15Rα sisara" odnosi se na konsenzus sekvencu SEQ ID n°4.

[0033] Poželjno, polipeptid koji obuhvata sekvencu aminokiseline sushi domena IL-15Rα sisara odnosi se na taj konsenzus sekvence SEQ ID n°5.

[0034] Stručnjak može jednostavno da identifikuje sushi domen IL-15Rα primata . Kao primer, mogu se navesti sushi domeni IL-15Rα iz Oryctolagus cuniculus, iz Macaca fascicularis, iz Macaca nemestrina, iz Homo sapiens, iz Macaca Mulatta, Pongo abelii, Cercocebus torquatus, ili Callithrix jacchus.

[0035] Kako se ovde upotrebljava, pojam "sushi domen IL-15Rα primata " se odnosi na konsenzus sekvencu SEQ ID n°6.

[0036] Poželjno, polipeptid koji obuhvata sekvencu aminokiseline sushi domena IL-15Rα primata se odnosi na konsenzus sekvencu SEQ ID n°7.

[0037] Stručnjak može jednostavno da identifikuje sushi domen humanog IL-15Rα i odnosi se na sekvencu aminokiselina SEQ ID n° 8.

[0038] Poželjno, polipeptid koji obuhvata sekvencu aminokiseline sushi domena humanog IL-15Rα se odnosi na SEQ ID n° 9.

[0039] Kako se ovde upotrebljava, pojam "derivati sushi domena IL-15Rα" se odnosi na sekvencu aminokiseline koja ima procenat identiteta od najmanje 92 % (tj. što odgovara oko 5 aminokiselinskih supstitucija) sa sekvencom aminokiseline odabranom iz grupe koju čine SEQ ID n°: 4, SEQ ID n°5, SEQ ID n°6, SEQ ID n°: 7, SEQ ID n°8, i SEQ ID n°9, poželjno od najmanje 96 % (tj. što odgovara oko 2 aminokiselinske supstitucije), i poželjnije od najmanje 98% (tj. što odgovara oko 1 aminokiselinskoj supstituciju). Takvi derivati obuhvataju četiri ostatka cisteina sushi domena L-15Rα i stručnjak ih može jednostavno identifikovati u pogledu njegovog/njenog opšteg znanja i učenja iz prijave ovog patenta. Takođe se smatra da prirodne aminokiseline mogu da se zamene hemijski modifikovanim aminokiselinama. Obično, takve hemijski modifikovane aminokiseline mogu da povećaju poluživot polipeptida.

[0040] Prema poželjnom načinu ostvarivanja, konjugat obuhvata (ii) polipeptid koji obuhvata sekvencu aminokiseline sushi i spojnih domena IL-15Rα ili njegovih derivata.

[0041] IL-15Rα spojni domen se definiše kao sekvenca aminokiseline koja počinje na prvom amino ostatku nakon sushi domena i koja se završava na poslednjem ostatku aminokiseline pre prvog potencijalnog mesta glikosilacije. Kod humanog IL-15Rα, sekvenca aminokiseline spojnog regiona se sastoji od četrnaest aminokiselina koje su pozicionirane nakon sushi domena ovog IL- 15Ralfa, na poziciji C-terminala u odnosu na pomenuti sushi domen, odnosno, pomenuti IL- 15Ralfa spojni region počinje na prvoj aminokiselini nakon pomenutog (C4) ostatka cisteina, i završava se na četrnaestoj aminokiselini (prema standardnoj orijentaciji "od N- terminala do C-terminala").

[0042] Pomenuti sushi i spojni domeni IL-15Rα predstavljaju sushi i spojne domene IL-15Rα sisara, poželjno sushi i spojne domene IL-15Rα primata i poželjnije sushi i spojne domene humanog IL-15Rα.

[0043] Stručnjak može jednostavno da identifikuje sekvencu aminokiseline sushi i spojnog domena IL-15Rα sisara. Kako se ovde upotrebljava, pojam "sushi i spojni domeni IL-15Rα sisara" se odnosi na konsenzus sekvencu SEQ ID n°10.

[0044] Stručnjak može jednostavno da identifikuje sekvencu aminokiseline sushi i spojnog domena IL-15Rα primata. Kako se ovde upotrebljava, pojam "sushi i spojni domeni IL-15Rα primata " se odnosi na konsenzus sekvencu SEQ ID n°11.

[0045] Stručnjak jednostavno može da identifikuje sekvencu aminokiseline sushi i spojnog domena humanog IL-15Rα. Kako se ovde upotrebljava, pojam "sushi i spojni domeni humanog IL-15Rα" se odnose na konsenzus sekvencu SEQ ID n°12.

[0046] Kako se ovde upotrebljava, pojam "derivati sushi i spojnog domena IL-15Rα" odnosi se na sekvencu aminokiseline koja ima procenat identiteta od najmanje 93 % (tj. što odgovara oko 5 aminokiselinskih supstitucija) sa sekvencom aminokiseline odabranom iz grupe koju čine SEQ ID n°: 10, SEQ ID n°11, i SEQ ID n°12, poželjno od najmanje 97 % (tj. što odgovara oko 2 aminokiselinske supstitucije), i poželjnije od najmanje 98% (tj. što odgovara oko 1 aminokiselinskoj supstituciji). Takvi derivati obuhvataju četiri ostatka cisteina sushi domena L-15Rα i stručnjak jednostavno može da ih identifikuje u pogledu svog opšteg znanja i učenja iz ove patentne prijave. Takođe se smatra da prirodne aminokiseline mogu da se zamene hemijski modifikovanim aminokiselinama. Obično, takve hemijski modifikovane aminokiseline mogu da povećaju poluživot polipeptida.

[0047] I polipeptidi i) i ii) od konjugata mogu biti povezani ne-kovalentno kao u kompleksu opisanom u Patent US 8,124,084 B2. Pomenuti konjugat ili kompleks se može jednostavno dobiti dobijanjem prikladne količine polipeptida i), dobijanjem prikladne količine polipeptida ii), mešanjem oba polipeptida u odgovarajućim pH i jonskim uslovima u trajanju dovoljno da se dozvoli formiranje kompleksa (odnosno konjugata), i opciono koncentrovanjem ili prečišćavanjem pomenutog kompleksa. Polipeptidi kompleksa (odnosno konjugata) mogu da se formiraju, na primer, upotrebom sintetizatora peptida prema standardnim postupcima; eksprimiranjem svakog polipeptida odvojeno u ćeliji ili ekstraktu ćelije, zatim izolovanjem i prečišćavanjem polipeptida. Opciono, terapeutski kompleks polipeptida ovog pronalaska može da se formira eksprimiranjem oba polipeptida i) i ii) u istoj ćeliji ili ćelijskom ekstraktu, zatim izolovanjem i prečišćavanjem kompleksa, na primer, upotrebom hromatografskih tehnika, kao što su hromatografija afinitet sa antitelima prema delu limfokina, delu receptora limfokina, ili kompleksa.

[0048] I polipeptidi i) i ii) od konjugata mogu takođe biti kovalentno povezani upotrebom dvofunkcionalnih proteinskih sredstava za kuplovanje ili u fuzionom proteinu.

[0049] Dvofunkcionalna proteinska sredstva za kuplovanje su dobro poznata stručnjaku kao postupci u kojima se koriste, i u njih spadaju, primera radi, N-sukcinimidil (2-piridilditio) propionat (SPDP), sukcinimidil (N-maleimidometil) cikloheksan-1-karboksilat, iminotiolan (IT), dvofunkcionalni derivati imidoestra (kao što je dimetil adipimidat HCL), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao što su glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis (p-azidobenzoil) heksanediamin), derivati bis-diazonijuma (kao što je bis-(p-diazoniumbenzoil)-etilenediamin), diizocijanati (kao što je tolien 2,6-diizocijanat), i bis-aktivna jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen).

[0050] Pojam "fuzioni protein" odnosi se na protein kreiran putem spajanja dva ili više gena koji su originalno kodirani za odvojene proteine. Takođe je poznat i kao himerni protein. Prevođenje ovog fuzionog gena dovodi do jednog polipeptida sa funkcionalnim svojstvima koja potiču od svakog od originalnih proteina. Rekombinantni fuzioni proteini su veštački stvoreni rekombinantnom DNK tehnologijom za upotrebu u biološkom istraživanju ili u terapeutske svrhe. Rekombinantni fuzioni protein je protein stvoren genetskim inženjeringom fuzionog gena. Ovo obično podrazumeva uklanjanje stop-kodona iz cDNK sekvence koja kodira za prvi protein, zatim dodavanje cDNK sekvence drugog proteina u okvir putem ligacije ili preklapanja PCR produžetka. Ta DNK sekvenca se zatim eksprimira ćelijom ili jednim proteinom. Taj protein se može konstruisati tako da obuhvati punu sekvencu oba originalna proteina, ili samo deo od nekog od njih.

[0051] U poželjnom načinu ostvarivanja, konjugat je fuzioni protein.

[0052] Sekvenca aminokiseline interleukina 15 ili njegovih derivata može biti na poziciji C-terminala ili N-terminala u odnosu na sekvencu aminokiseline sushi domena IL-15Rα ili njegovih derivata. Poželjno, sekvenca aminokiseline interleukina 15 ili njegovih derivata je na poziciji C-terminala u odnosu na sekvencu aminokiseline sushi domena IL-15Rα ili njegovih derivata.

[0053] Sekvenca aminokiseline interleukina 15 ili njegovih derivata i sekvenca aminokiseline sushi domena IL-15Rα ili njegovih derivata može biti razdvojena prvim "veznikom" sekvence aminokiseline.

Pomenuti prvi "veznik" sekvence aminokiseline može biti dugačak dovoljno da obezbedi da fuzioni protein formira ispravne sekundarne i tercijarne strukture.

[0054] Dužina prvog veznika sekvence aminokiseline može da varira a da ne utiče značajno na biološku aktivnost fuzionog proteina. Obično, prvi veznik sekvence aminokiseline obuhvata najmanje jednu, ali manje od 30 aminokiselina npr., veznik od 2-30 aminokiselina, poželjno od 10-30 aminokiselina, poželjnije od 15-30 aminokiselina, i dalje poželjnije od 15-25 aminokiselina, najpoželjnije od 18-22 aminokiselina.

[0055] Poželjne sekvence aminokiselina sa veznikom su one koje omogućavaju konjugatu da usvoji pravilnu konformaciju (odnosno, konformaciju koja omogućava pravilnu aktivnost prenosa signala putem IL-15Rbeta/gama signalizirajućeg puta).

[0056] Najprikladniji sekvence aminokiseline prvog veznika (1) usvajaju fleksibilnu produženu konformaciju, (2) ne pokazuje sklonost ka razvijanju uređene sekundarne strukture koja može da stupi u interakciju sa funkcionalnim domenima fuzionih proteina, i (3) ima minimalni hidrofobni ili naelektrisan karakter koji može da promoviše interakciju sa funkcionalnim domenima proteina.

[0057] Poželjno, sekvenca aminokiseline prvog veznika obuhvata bliske neutralne aminokiseline odabrane iz grupe koja obuhvata Gly (G), Asn (N), Ser (S), Thr (T), Ala (A), Leu (L), i Gln (Q), najpoželjnije iz grupe koja obuhvata Gly (G), Asn (N), i Ser (S).

[0058] Primeri sekvenci veznika su opisani u U.S. Pat. Nos.5,073,627 i 5,108,910.

[0059] Ilustrativni fleksibilni veznici koji su određenije prikladni za ovaj pronalazak obuhvataju one koje kodiraju sekvence SEQ ID NO: 13 (SGGSGGGGSGGGSGGGGSLQ), SEQ ID n°14 (SGGSGGGGSGGGSGGGGSGG) ili SEQ ID n°15 (SGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQ).

[0060] I dalje poželjno, konjugat predstavlja fuzioni protein sa sekvencom SEQ ID n°16 ili SEQ ID n°17.

Antitelo kao antagonist receptora za imunosupresive

[0061] Pojam "antitelo" se odnosi na molekul imunoglobulina koji odgovara tetrameru koji obuhvata četiri polipeptidna lanca, dva identična teška (H) lanca (oko 50-70 kDa kada je u punoj dužini) i dva identična laka (L) lanca (oko 25 kDa kada je u punoj dužini) međusobno povezana disulfidnim vezama. Laki lanci se klasifikuju kao kapa i lambda. Teški lanci se klasifikuju kao gama, mu, alfa, delta, ili ipsilon, i definišu izotip antitela kao, redom, IgG, IgM, IgA, IgD, i IgE. Svaki teški lanac obuhvata varijabilni region teškog lanca N-terminala (skraćeno kao HCVR) i konstantni region teškog lanca. Konstantni region teškog lanca obuhvata tri domena (CH1, CH2, i CH3) za IgG, IgD, i IgA; i 4 domena (CHI, CH2, CH3, i CH4) za IgM i IgE. Svaki laki lanac obuhvata varijabilni region lakog lanca N-terminala (skraćeno kao LCVR) i konstantni region lakog lanca. Taj konstantni region lakog lanca obuhvata jedan domen, CL. HCVR i LCVR regioni mogu dalje da se podele u regione hipervarijabilnosti, koji se nazivaju regioni koji određuju komplementarnost (CDR-ovi), rasuti sa regionima koji su zatvoreniji, koji se nazivaju okvirni regioni (FR). Svaki HCVR i LCVR se sastoji od tri CDR-a i četiri FR-a, raspoređenih od amino-terminusa do karboksi-

1

terminusa po sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Dodeljivanje aminokiseline svakom domenu je u skladu sa dobro poznatim konvencijama. Funkcionalna mogućnost antitela da se vezuje za određeni antigen zavisi od varijabilnih regiona svakog para lakog/teškog lanca, i u velikoj meri je određena CDR-ovima.

[0062] Pojam "antitelo", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na monoklonalno antitelo per se. Monoklonalno antitelo može biti humano antitelo, himerno antitelo i/ili humanizovano antitelo.

[0063] Korisno, pojam antitelo odnosi se na an IgG, kao što je IgG1, IgG2 (IgG2a ili IgG2b), IgG3 i IgG4. Poželjno, pojam antitelo se odnosi na IgG1 ili IgG2, i poželjnije na IgG2a.

[0064] "Himerno antitelo" označava antitelo koje je sastavljeno od varijabilnih regiona od mišjeg imunoglobulina i konstantnih regiona humanog imunoglobulina. Ova promena se sastoji jednostavno od supstituisanja konstantnog regiona humanog antitela sa mišjim konstantnim regionom, što dovodi do humane/mišje himere koja može da ima dovoljno nisku imunogenost da bi bila prihvatljiva za farmaceutsku upotrebu. Broj postupaka za proizvodnju takvih himernih antitela još nije prijavljen, tako da predstavljaju deo opšteg znanja stručnjaka (videti, npr., U.S. Pat. br.5,225,539).

[0065] "Humanizovano antitelo" označava antitelo koje se delimično sastoji ili u potpunosti od sekvenci aminokiselina dobijenih od zametne linije humanog antitela izmenom sekvence antitela koje ima nehumane regione za određivanje komplementarnosti (CDR). Ova humanizacija varijabilnog regiona antitela i vremenom CDR se prave tehnikama koje su do sada dobro poznate u tehnici. Kao primer, Britanska patentna prijava GB 2188638A i US broj patenta 5,585,089 daju opise postupaka pri čemu se rekombinantna antitela proizvode tamo gde je samo jedan deo antitela supstituisan regionom za određivanje komplementarnosti, ili "CDR". Tehnika ugrađivanja CDR se koristi kako bi se stvorila antitela koja se sastoje od mišjih CDR-ova, i humanog varijabilnog okvirnog regiona i konstantnih regiona (viedti npr., RIECHMANN et al., Nature , vol.332, p: 323-327, 1988). Ova antitela zadržavaju humane konstantne regione koji su neophodni za funkciju Fc zavisnog efektora, ali je manje verovatno da će dovesti do imunog odgovora na to antitelo. Kao primer, okvirni regioni varijabilnih regiona su supstituisani odgovarajućim humanim okvirnim regionima ostavljajući ne-humani CDR suštinski netaknutim, ili čak zamenom CDR-ova sa sekvencom dobijenom od humanog genoma. U potpunosti humana antitela se proizvode kod genetski modifikovanih miševa čiji su imuni sistemi izmenjeni tako da odgovaraju humanim imunim sistemima. Kako je u prethodnom delu teksta pomenuto, dovoljno je za upotrebu u postupcima ovog pronalaska, da se uposli imunološki specifični fragment antitela, uključujući fragmente koji predstavljaju oblike jednog lanca.

[0066] Humanizovano antitelo se ponovo odnosi na antitelo koje obuhvata humani okvir, najmanje jedan CDR od ne-humanog antitela, i u kojem je bilo koji konstanti region suštinski identičan humanom imunoglobulinskom konstantnom regionu, odnosno, najmanje oko 85 ili 90%, poželjno najmanje 95% identičan. Stoga, svi delovi humanizovanog antitela, izuzev mogućih CDR-ova, su suštinski identični odgovarajućim delovima jednog ili više nativnih humanih imunoglobulinskih sekvenci. Na primer, humanizovani imunoglobulin obično ne obuhvata antitelo himernog mišjeg varijabilnog regiona/humanog konstantnog regiona. Kao primer, koncept humanizovanih imunoglobulina može da se sprovede na sledeći način: kada se aminokiselina nađe u sledećoj kategoriji, okvirna aminokiselina humanog imunoglobulina koji se koristi (primalac imunoglobulina) se zameni okvirnom aminokiselinom iz ne-humanog imunoglobulina koji obezbeđuje CDR (davalac imunoglobulina): (a) aminokiselina u humanom okvirnom regionu primaoca imunoglobulina nije karakteristična za humani imunoglobulin na toj poziciji, dok je odgovarajuća aminokiselina kod davaoca imunoglobulina karakteristična za humani imunoglobulin na toj poziciji; (b) pozicija aminokiseline je neposredno uz jedan od CDR-ova ; ili (c) bilo koji atom iz bočnog lanca okvirne aminokiseline je unutar oko 5-6angstroma (centar-do-centra) bilo kog atoma CDR-ova aminokiseline u trodimenzionalnom modelu imunoglobulina (CO M. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.88, p:2869, 1991). Kada je svaka od aminokiselina kod humanog okvirnog regiona primaoca imunoglobulina i odgovarajuća aminokiselina davaoca imunoglobulina nekarakteristična za humani imunoglobulin na toj poziciji, takva aminokiselina se zameni sa aminokiselinom karakterističnom za humani imunoglobulin na toj poziciji.

[0067] Pojam "fragment antitela" kako se ovde upotrebljava se odnosi na fragment antitela koji može da reaguje sa istim antigenom kao i njegov kontradeo antitela. Stručnjak može jednostavno da identifikuje ovakve fragmente i oni obuhvataju, kao primer, Fabfragment (npr., digestijom papaina), Fab' fragment (npr., digestijom pepsina i delimičnom redukcijom), F(ab')2fragment (npr., digestijom pepsina), Facb(npr., digestijom plazmina), Fd(npr., digestijom pepsina, delimičnom redukcijom i reagregacijom), i takođe scFv(jedan lanac Fv; npr., tehnikama molekulske biologije) fragment su obuhvaćeni ovim pronalaskom.

[0068] Takvi fragmenti mogu da nastanu cepanjem enzima, sintetičkim ili rekombinantnim tehnikama, kako je poznato u tehnici i/ili kako je opisano ovde. Antitela takođe mogu da nastanu u raznim skraćenim oblicima upotrebom gena antitela u koji se uvodi jedan ili više stop-kodona uzlazno od prirodnog zaustavnog mesta. Na primer, kombinacija gena koji kodira F(ab')2deo teškog lanca može biti napravljena tako da uključuje sekvencu DNK koja kodira CH1domen i/ili spojni region teškog lanca. Razni delovi antitela mogu biti združeni zajedno hemijski, konvencionalnim tehnikama, ili se mogu pripremiti kao bliski protein upotrebom tehnika genetskog inženjeringa.

[0069] Poželjno, pomenuti fragment antitela predstavlja scFv fragment.

[0070] Pojam "antitelo koje antagonistički deluje na imuni put umešan u inhibiciju aktivacije T ćelija" se odnosi na antitelo koje antagonistički deluje na receptor PD-1 imunosupresiva ili vezivanjem ovog receptora ili vezivanjem njegovog liganda, koje na taj način promoviše imunu aktivaciju sprečavanjem silazno regulisanih signala. Dalje je opisano da drugo "antitelo koje antagonistički deluje na imuni put umešan u inhibiciju aktivacije T ćelija" predstavlja antitelo koje antagonistički deluje na receptor CTL-A4 imunosupresiva ili inhibitorne KIRs ili vezivanjem ovog receptora ili vezivanjem njegovog liganda, koje na taj način promoviše imunu aktivaciju sprečavanjem silazno regulisanih signala. Kao primer antitela kao antagonista receptora za imunosupresive, mogu se navesti antitela koja odgovaraju CTL-A4, PD-1/PD-L1, PD-1/PD-L2, inhibitornim KIRs, CD276, VTCN1, BTLA/HVEM, LAG3, HAVCR2 i ADORA2A antagonistu, poželjno PD-1/PD-L1 antitela.

CTL-A4 (antigen povezan sa citoksičnim limfocitom, takođe označen i sa CD 152) je otkriven 1987. godine (BRUNET et al., Nature, vol.328, p:267-270, 1987). Uloga CTL-A4 je prvenstveno da inhibira aktivaciju T ćelija i ovo je pokazano kod miševa sa deficitom CTL-A4 koji imaju masivnu limfoproliferaciju (CHAMBERS et al., Immunity, vol.7, p:8855-8959, 1997). Sada, pokazalo se da blokada CTL-A4 pojačava odgovore T ćelije in vitro (WALUNAS et al., Immunity, vol.1, p:405-413, 1994) i in vivo (KEARNEY, J. Immunol, vol.155, p:1032-1036, 1995) i takođe povećava antitumorski imunitet (LEACH, Science, vol.271, p:1734-1736, 1996). Kao primer antitela koje odgovara CTL-A4 antagonistima, može se navesti ipilimumab (takođe označen i kao MDX-010 i 10D1, koji je dostupan od MEDAREX, i na tržištu se nalazi pod nazivom YERVOY™ proizvođača BRISTOL-MYERS SQUIBB COMPANY) opisan u WO 01/14424, ticilimumab (takođe poznat kao 11.2.1 i CP-675,206) opisan u WO 00/37504, i takođe CTL-A4 antitela opisan u Međunarodnim patentnim prijavama WO 98/42752, WO 01/14424, WO 2004/035607, i WO 2012/120125, u EP 1212422 i EP 1262193, u U.S. pat. br. US 5,811,097, US 5,855,887, US 5,977,318, US 6,051,227, US 6,207,156, US 6,682,736, US 6,984,720, US 7, 109,003, i US 7,132,281.

[0071] Programirana ćelijska smrt 1 takođe poznata kao PD-1 (takođe označena i kao PDCD1 ili CD279) predstavlja ∼55kD tip I membranskog glikoproteina. PD-1 predstavlja receptor CD28 kostimulatorne familije gena, koji je umereno eksprimiran na naivnim T, B i NK ćelijama i uzlazno regulisan receptorima T/B ćelija koje signaliziraju na limfocitima, monocitima i mijeloidnim ćelijama. PD-1 ima dva poznata liganda sa različitim profilima eksprimiranja, PD-L1 (B7-H1), koji je široko eksprimiran –tj. na naivnim limfocitima na aktiviranim B i T ćelijama, monocitima i dendritičnim ćelijama -, i PD-L2 (B7-DC), čije eksprimiranje je ograničeno – tj. na aktiviranim dendritičkim ćelijama, makrofazima i monocitima i na vaskularnim endotelijalnim ćelijama-. Kod nekoliko mišjih modela singenskog tumora, blokada ili PD-1 ili PD-L1 značajno inhibira rast tumora ili dovodi do potpune regresije. Stoga, PD-1 je prepoznat kao važan igrač u imunoj regulaciji i održavanju periferne tolerancije. Kao primer antitela koja odgovaraju PD-1/PD-L1 /PD-L2 antagonistima, može se navesti nivolumab (takođe poznat kao BMS-936558 ili MDX1106; anti-PD-1 antitelo, BRISTOL-MYERS SQUIBB) opisan u WO 2006/121168, Merck 3745 (takođe poznat kao MK-3475 ili SCH-900475, predstavlja anti-PD- 1 antitelo) opisan u WO 2009/114335, CT-011 (takođe poznat kao hBAT ili HBAT-1, anti-PD-1 antitelo) opisan u WO 2009/101611, lambrolizumab opisan u WO2008/156712, AMP514 koji je opisan

u WO2010/027423, WO2010/027827, WO2010/027828, i WO2010/098788, i takođe antitela opisana u International patent applications WO 2004/056875, WO 2006/056875, WO 2008/083174, WO 2010/029434, WO 2010/029435, WO 2010/036959, WO 2010/089411, WO 2011/110604, WO 2012/135408, i WO 2012/145493. Pomenuti PD-1 antagonist može da odgovara anti-PD-L1 antitelu kao što je MDX- 1105 (takođe poznat kao BMS-936559, anti-PD-L1 antitelo) opisan u WO 2007/005874, ili

1

YW243.55.S70 (takođe poznat kao MPDL3280A ili RG7446; anti-PD-L1 antitelo) opisan u WO 2010/077634.

[0072] Receptori-ćelija-ubica koji podsećaju na imunoglobulin (KIRs), predstavljaju familiju proteina na ćelijskoj površini koja se nalazi na važnim ćelijama imunog sistema koje se nazivaju prirodne ćelije ubice (NK). Oni regulišu funkciju ubijanja ovih ćelija stupanjem u interakciju sa MHC klasom i molekulima, koji se eksprimiraju na svim tipovima ćelija. Ova interakcija im dozvoljava da detektuju virusom zaražene ćelije ili ćelije tumora koje imaju karakterističan niski nivo klase I MHC na njihovoj površini. Većina KIRs su inhibitorne, što znači da njihovo prepoznavanje MHC suprimira citotoksičnu aktivnost njihovih NK ćelija. Samo ograničen broj KIRs ima mogućnost da aktivira ćeliju.

[0073] Inhibitorne KIRs imaju dug citoplazmatski zadnji deo koji sadrži inhibitorni motiv baziran na tirozinu imunoreceptora (ITIM), koji prenosi inhibitorne signale do NK ćelije nakon angažovanja njegovih liganda klase I MHC. U poznate inhibitorne KIRs spadaju članovi KIR2DL i KIR3DL podfamilije koje obuhvataju KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B,KIR3DL1, KIR3DL2, i KIR3DL3. Kao primer antitela koja odgovaraju inhibitornim antagonistima KIRs, može se navesti antitelo 1-7F9 opisano u WO 2006/003179.

[0074] Članovi B7 familije liganda su poznati da imaju jaku imunoregulatornu aktivnost koju im obezbeđuju imune ćelije i u novije vreme ćelije tumora, pri čemu ova familija obuhvata CD276 i VTCN1.

[0075] CD276 (grozd diferencijacije 276) (takođe poznat kao B7H3, B7-H3; B7RP-2; 4Ig-B7-H3) je tip transmembranskog proteina iz familije B7 liganda, koji je prvo identifikovan kod dendritičkih ćelija i aktiviranih T-ćelija. CD276 se eksprimira putem nekih čvrstih tumora i smatra se da učestvuje u regulaciji imunog odgovora posredovanog T-ćelijama. Određenije, čini se da CD276 silazno reguliše imuni odgovor T-pomoćnika i suprimira imunitet (SUH W. K. et al., 2003. Nat Immunol 4(9): 899-906). Kao primer CD276 antagonista, može se navesti antitelo 8H9 opisano u patentnoj prijavi US 2005/0169932 i WO 2008/116219, a druga antitela kao što je MGA271 su opisana u WO 2011/109400.

[0076] VTCN1 (V-set domen-koji sadrži inhibitor 1 aktivacije T-ćelije), takođe poznat kao B7X; B7H4; B7S1; B7-H4, je takođe član familije B7. Smatra se da VTCN1 ima ulogu u inhibitornoj regulaciji odgovora T ćelija i studije su pokazale da su visoki nivoi ovog proteina međusobno povezani sa napredovanjem tumora. Kao primer VTCN1 antagonista, mogu se navesti antitela opisana u WO 2009/073533.

[0077] BTLA (atenuator B- i T-limfocita), takođe poznat kao CD272, se indukuje tokom aktivacije T ćelija, i ostaje eksprimiran na Th1 ćelijama ali ne na Th2 ćelijama. BTLA pokazuje inhbiciciju T-ćelija putem interakcije sa faktorom nekroze tumora (receptor), član 14 (TNFRSF14), takođe poznat kao posrednik ulaza virusa herpesa (HVEM), TR2; ATAR; HVEA; CD270; LIGHTR. TNFRSF14 je identifikovan kao ćelijski posrednik ulaza virusa herpesa simpleksa (HSV). Citoplazmični region ovog receptora se vezuje za nekoliko članova familije TRAF, koji može da posreduje u prenosu signala koji aktivira imuni odgovor. Konačno, BTLA/HVEM kompleksi negativno regulišu imune odgovore T-ćelija. Kao primer BTLA/HVEM antagonista, mogu se navesti antitela opisana u WO 2008/076560, WO 2010/106051, i WO 2011/014438.

[0078] LAG3 (gen 3 aktivacije limfocita, takođe poznat kao CD223) pripada superfamiliji imunoglobulina (Ig) i sadrži 4 ekstracelularna domena koja podsećaju na Ig. Kao primer LAG3 antagonista, mogu se navesti antitela opisana u WO 2010/019570.

[0079] HAVCR2 (celularni receptor 2 virusa hepatitisa A , takođe poznat kao Tim-3, KIM-3; TIMD3; Tim-3; iTIMD-3) je Th1-specifični protein ćelijske površine koji pripada superfamiliji imunoglobulina. HAVCR2 reguliše aktivaciju makrofaga i inhibira Th1-posredovane auto- i aloimune odgovore, i na taj način promoviše imunološku toleranciju. Kao primer HAVCR2 antagonista, mogu se navesti antitela opisana u WO 2013/006490A.

[0080] ADORA2A (receptor adenozina A2A, takođe poznat kao A2aR, RDC8; ili ADORA2) pripada superfamiliji gvanin nukleotid-vezujućeg proteina (G protein)-kuplovanog receptora (GPCR), koja se deli na klase i podtipove. Ovaj protein igra važnu ulogu u mnogim biološkim funkcijama, kao što su srčani ritam i cirkulacija, cerebralni i renalni protok krvi, imuna funkcija, regulacija bola, i sna. Deo je i patofizioloških stanja kao što su zapaljenske bolesti i neurodegenerativni poremećaji.

[0081] Pomenuto antitelo ili njegov fragment i pomenuti konjugat nisu povezani.

Nukleinske kiseline i vektori

[0082] Kako se ovde upotrebljava, pojam "polinukleotid " se odnosi na RNK ili DNK, poželjno na DNK.

[0083] Poželjno, takav "polinukleotid" je operativno povezan sa sekvencom eksprimiranja gena, koji usmerava eksprimiranje nukleinske kiseline unutar prokarotične ili eukariotične ćelije, poželjno unutar eukariotične ćelije. "Sekvenca eksprimiranja gena" predstavlja bilo koju regultaornu nukleotidnu sekvencu, kao što je sekvenca promotera ili kombinacija promoter-pojačavač, koja olakšava efikasnu transkripciju i translaciju nukleinske kiseline imunocitokina za koju se operativno vezuje. Sekvenca eksprimiranja gena može, na primer, da bude od sisara ili virusni promoter, kao što je konstitutivni ili inducibilan promoter.

[0084] Konstitutivni promoteri sisara uključuju, ali bez ograničenja na, promotere za sledeće gene: hipoksantin fosforibozil transferazu (HPTR), adenozin deaminazu, piruvat kinazu, beta.-aktin promoter, promoter mišićne kreatin kinaze, promoter humanog faktora elongacije i druge konstitutivne promotere. Primeri virusnih promotera koji funkcionišu konstitutivno u eukariotičnim ćelijama uključuju, na primer, promotere od virusa simiana (npr., SV40), papiloma virusa, adenovirusa, virusa humane imunodeficijencije (HIV), citomegalovirusa (CMV), Rous sarkoma virusa (RSV), virusa hepatitisa B (HBV), ponvaljanja dugih terminala (LTR) Molonijevog virusa leukemije i druge retroviruse, i promotere timidin kinaze virusa herpes simpleksa. Drugi konstitutivni promoteri su poznati običnom stručnjaku.

1

[0085] Promoteri korisni kao sekvence eksprimiranja gena takođe uključuju inducibilne promotere. Inducibilni promoteri se eksprimiraju u prisustvu sredstva za indukovanje. Na primer, metalotion kod promotera se indukuje kako bi se promovisala transkripcija i translacija u prisustvu određenih metalnih jona. Drugi inducibilni promoteri su poznati stručnjacima.

[0086] Uopšteno, sekvenca eksprimiranja gena uključuje, po potrebi, 5' ne-transkribujući i 5' netranslacione sekvence koje učestvuju u inicijaciji transkripcije i transalcije, kao što su TATA kutija, zatvarajuća sekvenca, CAAT sekvenca, i njima slične. Posebno, takve 5' ne-ton-transkribujuće sekvence uključuju region promotera koji uključuje sekvencu promotera za transkriptivnu kontrolu operativno pridružene nukleinske kiseline. Sekvenca eksprimiranja gena opciono uključuje sekvencu pojačavača ili su poželjne sekvence uzlaznog aktivatora. Kako se ovde upotrebljava, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira imunocitokin ovog pronalaska i sekvenca eksprimiranja gena su pomenute da su "operativno povezane" kada su kovalentno povezane na takav način da eksprimiranje ili transkripciju i/ili transalciju imunocitokina ovog pronalaska koji kodira sekvencu stave pod uticaj ili kontrolu sekvence eksprimiranja gena.

[0087] Pomenuto je da su dve DNK sekvence operativno povezane ukoliko indukcija promotera u 5' sekvenci eksprimiranja gena dovodi do transkripcije imunocitokina ovog pronalaska i ukoliko priroda veze između dve DNK sekvence ne (1) dovodi do uvođenja mutacije pomeranja okvira čitanja, (2) utiče na mogućnost regiona promotera da usmerava transkripciju imunocitokina ovog pronalaska, ili (3) utiče na mogućnost odgovarajućeg transkripta RNK da se translatuje u protein. Stoga, sekvenca eksprimiranja gena je operativno povezana sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira imunocitokin ovog pronalaska ukoliko sekvenca eksprimiranja gena ima mogućnost uticanja na transkripciju sekvence nukleinske kiseline tako da se dobijeni transkript translatuje u željeni polipeptid.

[0088] Kao prednost, pomenuta sekvenca nukleinske kiseline obuhvata intron, budući da se pre-mRNK molekuli često pokažu da poboljšavaju proizvodnju prinosa rekombinantnih molekula. Bilo koja sekvenca introna se može koristiti, i kao primer, mogu se navesti one opisane u ZAGO et al. (Biotechnol. Appl. Biochem., vol.52(Pt 3), p:191-8, 2009) i u CAMPOS-DA-PAZ et al. (Mol. Biotechnol., vol.39(2), p: 155-8, 2008).

[0089] Polinukleotid koji kodira za T konjugat ili za imunomodulatorno antitelo može da se isporuči samo in vivo ili zajedno sa vektorom.

[0090] U svom širem smislu, "vektor" predstavlja bilo koji nosač koji može da olakša prenos nukleinske kiseline koja kodira za imunocitokin ovog pronalaska do ćelija. Poželjno, vektor prenosi nukleinsku kiselinu do ćelija sa smanjenom degradacijom u odnosu na veličinu degradacije koja dovodi do odsustva vektora. Uopšteno, korisni vektori za ovaj pronalazak uključuju, ali bez ograničenja na, plazmide, kozmide, fagmide, epizome, veštačke hromozome, viruse i druge nosače dobijene od virusnih ili bakterijskih izvora koji su izmanipulisani umetanjem ili inkorporisanjem sekvence imunocitokina nukleinske kiseline.

1

[0091] Vektori plazmida predstavljaju poželjan tip vektora i u velikoj meri se opisuju u tehnici i dobro su poznati stručnjacima. Videti npr., SANBROOK et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Second Edition, Cold Spring Harbili Laboratory Press, 1989. Neograničavajući primeri plazmida uključuju pBR322, pUC18, pUC19, pRC/CMV, SV40, i pBlueScript, i druge plazmide dobro poznate stručnjacima. Pored toga, plazmidi mogu biti napravljeni prema potrebama upotrebom enzima ograničenja i reakcija ligacije kako bi se uklonili ili dodali specifični fragmenti DNK.

[0092] Poželjno, vektor može da uključi markere koji se mogu odabrati i koji su aktivni i u ćelijama bakterija i kod sisara.

Farmaceutske kompozicije i medicinske upotrebe

[0093] Kako se ovde upotrebljava, pojam "subjekat" označava sisara, kao što je glodar, mačka, pas ili primat, a najpoželjnije čovek.

[0094] Farmaceutska kompozicija ovog pronalaska može da obuhvata jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača.

[0095] Izraz "farmaceutski prihvatljiv" se odnosi se na molekulska tela koja su fiziološki tolerantna i obično ne dovode do alergijskih ili sličnih neželjenih reakcija, kao što su uznemiren stomak, vrtoglavica, i njima slične prilikom davanja čoveku. Poželjno, kako se ovde upotrebljava, izraz "farmaceutski prihvatljiv" znači da ga odobrava regulatorna agencija federalne ili državne vlade ili da je naveden u U.S. Pharmacopeia ili u drugoj generalno priznatoj farmakopeji, za upotrebu kod životinja, i određenije kod ljudi.

[0096] Pojam "nosač" se odnosi na rastvarač, adjuvans, ekscipijens, ili nosač sa kojim se jedinjenje daje. Takvi farmaceutski nosači mogu biti sterilne tečnosti, kao što su voda i ulja, uključujući i petrolejska, životinjska, biljna ili ulja sintetičkog porekla, kao što su ulje kikirikija, sojino ulje, mineralno ulje, susamovo ulje i njima slična.

[0097] U kontekstu ovog pronalaska, pojam "lečiti" ili "lečenje", kako se ovde upotrebljava, označava promenu smera, olakšavanje, inhibiranje napretka, ili sprečavanje poremećaja ili stanja na koji se taj pojam odnosi, ili jedan ili više simptoma takvog poremećaja ili stanja. Izraz "lečenje kancera" kako se ovde upotrebljava označava inhibiciju rasta ćelija kancera. Poželjno takvo lečenje takođe dovodi do regresije rasta tumora, odnosno smanjenja veličine tumora koji se može izmeriti. Najpoželjnije, takvo lečenje dovodi do potpune regresije tumora.

[0098] Izraz "terapeutski efektivna količina" se odnosi na količinu koja je dovoljna da se inhibira rast ćelija kancera, poželjno dovoljna da se izazove regresija rasta tumora. Primenjene doze se mogu podesiti kao funkcija raznih parametara, određenije kao funkcija režima davanja koji se koristi, relevantne patologije, ili alternativno željenog trajanja lečenja. Prirodno, oblik farmaceutske kompozicije, način davanja, doziranje i režim prirodno zavise od stanja koje se leči, ozbiljnosti bolesti, starosnog doba, mase, i pola subjekta itd. Opsezi efektivnih doza koji su dati u nastavku nemaju za cilj da

1

ograniče ovaj pronalazak i predstavljaju poželjne dozne opsege. Međutim, poželjna doza se može prilagoditi individualno prema subjektu, što jedan stručnjak razume i može da odredi, bez bespotrebnog eksperimentisanja.

[0099] U smislu označene efikasnosti kombinacije ovog pronalaska, stručnjak može da isplanira da koristi veoma male doze oba individualna jedinjenja za lečenje subjekta.

[0100] Kao neograničavajući primer, antitelo kao antagonist receptora za imunosupresive ovog pronalaska se može davati injekcijom u dozi od 500 µg/kg ili manje, poželjno u dozi od 100 µg/kg ili manje, i najpoželjnije u dozi od 50 µg/kg ili manje.

[0101] Poželjno, pomenuto antitelo kao antagonist receptora za imunosupresive može da se daje injekcijom u dozi od najmanje 1 µg/kg subjekta, poželjno od najmanje 5 µg/kg subjekta, i najpoželjnije u dozi od najmanje 10 µg/kg subjekta.

[0102] Kao neograničavajući primer, konjugat ovog pronalaska može da se daje injekcijom u dozi od 60 µg/kg ili manje, poželjno u dozi od 10 µg/kg ili manje, i najpoželjnije u dozi od 5 µg/kg ili manje.

[0103] Poželjno, pomenuti konjugat može da se daje injekcijom u dozi od najmanje 0.5 µg/kg subjekta, poželjno od najmanje 0.7 µg/kg subjekta, i najpoželjnije u dozi od najmanje 0.8 µg/kg subjekta.

[0104] Kao primer, faze davanja mogu da odgovaraju topikalnoj, oralnoj, intranazalnoj, intraokularnoj, intravenskoj, intramuskularnoj, intratumoralnoj ili supkutanoj primeni i njima sličnim. Poželjno, ove faze davanja odgovaraju injekciji. Stoga, konjugat, imunomodulatorno antitelo ili njegov fragment, polinukleotid koji kodira takve polipeptide, ili vektori koji obuhvataju takve polinukleotide su povezani sa nosačima koji su farmaceutski prihvatljivi za formulaciju koja bi trebalo da se ubrizga. To mogu biti naročito izotonični, sterilni, slani rastvori (mono-natrijum ili dinatrijum fosfat, natrijum, kalijum, kalcijum ili magnezijum hlorid i njima slični ili kompozicije takvih soli), ili suve, naročito zamrznuto-suve kompozicije koje po dodavanju, u zavisnosti od slučaja, sterilisane vode ili fiziološkog rastvora, dopuštaju upotrebu rastvora koji mogu da se ubrizgavaju. Prikladni farmaceutski nosači su opisani u " Remington’s Pharmaceutical Sciences" od E.W. Martin.

[0105] Konjugat, imunomodulatorno antitelo ili njegov fragment, polinukleotid koji kodira takve polipeptide, ili vektori koji obuhvataju takve polinukleotide mogu da se rastvore u puferu ili vodi ili da se inkorporišu u emulzije, mikroemulzzije, hidrogelove (npr. PLGA-PEG-PLGA hidrogelovi bazirani na kopolimerima tri bloka), u mikrosfere, u nanosfere, u mikročestice, u nanočestice (npr. poli(laktik-koglikolinska kiselina) mikročestice (npr. poli mlečna kiselina (PLA); poli (laktid-ko-glikolinska kiselina) (PLGA) ; mikrosfere, nanosfere, mikročestice ili nanočestoce poliglutamata), u lipozomima, ili drugim galenskim formulacijama. U svim slučajevima, formulacija mora biti sterilna i tečna u meri koja je prihvatljiva za davanje špricom. Mora biti stabilna u uslovima proizvodnje i čuvanja i mora se čuvati od zagađujućeg delovanja mikroorganizama, kao što su bakterije i gljivice.

[0106] Rastvori aktivnih jedinjenja kao slobodna baza ili farmakološki prihvatljive soli mogu da se pripreme u vodi prikladno pomešani sa surfaktantom, kao što je hidroksipropilceluloza.

1

[0107] Disperzije takođe mogu da se naprave u glicerolu, tečnim polietilenskim glikolima, i njihovim kompozicijama i u uljima. U regularnim uslovima čuvanja i upotrebe, ovi preparati sadrže konzervans kako bi se sprečio rast mikroorganizama.

[0108] Konjugat, antitelo kao antagonist receptora za imunosupresive ili njegov fragment, polinukleotid koji kodira takve polipeptide, ili vektori koji obuhvataju takav pronalazak polinukleotida mogu biti formulisani u kompozicije u neutralnom ili slanom obliku. Farmaceutski prihvatljive soli uključuju kisele adicione soli (nastale sa slobodnim amino grupama proteina) koje su nastale sa neorganskim kiselinama kao što su, na primer, hlorovodonične ili fosforne kiseline, ili takve organske kiseline kao što je sirćetna, oksalna, tartarska, mandelska i njima slične kiseline. Soli nastale sa slobodnim karboksilnim grupama takođe mogu da se dobiju od neorganskih baza kao što je, na primer, natrijum, kalijum, amonijak, kalcijum ili hidroksidi železa, kao što su organske baze kao izopropilamin, trimetilamin, histidin, prokain i njima slični.

[0109] Nosač takođe može da bude i rastvarač ili medijum disperzije koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol, i tečni polietilenski glikol, i njima slične), njihove prikladne kompozicije i biljna ulja. Polipeptidi takođe mogu da se modifikuju, pegilacijom kao primer, tako da se poveća njihova biodisponibilnost.

[0110] Odgovarajuća fluidnost može da se održava, na primer, upotrebom obloge, kao što je lecitin, održavanjem tražene veličine čestice u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. Sprečavanje dejstva mikroorganizama može da dovede do raznih antibakterijskih i antigljivičnih sredstava, na primer, parabena, hlorobutanola, fenola, sorbinske kiseline, timerozala i njima sličnih. U mnogim slučajevima, poželjno je obuhvatiti izotonična sredstva, na primer, šećere ili natrijum hlorid.

[0111] Do produžene apsorpcije kompozicija koje se ubrizgavaju može doći upotrebom kompozicija sredstava koja odlažu apsorpciju, na primer, aluminijum monostearata, želatina, poli oblika, i kovalentnih i nekovalentnih formulacija koje pojačavaju poluživot.

[0112] Postoje brojni uzroci za nestabilnost peptida ili degradaciju, uključujući hidrolizu i denaturaciju. Hidrofobna interakcija može da izazove gomilanje molekula zajedno (odnosno agregacije). Stabilizatori mogu da se dodaju kako bi se smanjili ili sprečili takvi problemi.

[0113] U stabilizatore spadaju ciklodekstrin i njegovi derivati (videti U.S. Pat. br.5,730,969). Prikladni konzervansi kao što su saharoza, manitol, sorbitol, trehaloza, dekstran i glicerin takođe mogu da se dodaju kako bi se stabilizovala konačna formulacija. Stabilizator, odabran između jonskih i nejonskih surfaktanata, D-glukoze, D-galaktoze, D-ksiloze, D-galakturonske kiseline, trehaloze, dekstrana, hidroksietil skrobova i njihovih kompozicija, može da se doda formulaciji. Dodavanje alkalne metalne soli ili magnezijum hlorida može da stabilizuje peptid. Peptid može takođe da se stabilizuje u kontaktu sa saharidom odabranim iz grupe koju čine dekstran, hondroitin sumporna kiselina, skrob, glikogen, dekstrin, i kisela so algina. U ostale šećere koji mogu da se dodaju, spadaju monosaharidi, disaharidi, šećerni alkoholi, i njihove kompozicije (npr., glukoza, manoza, galktoza, fruktoza, saharoza, maltoza,

1

laktoza, manitol, ksilitol). Poli oblici mogu da stabilizuju peptid, i mogu da se mešaju u vodi ili su rastvorljivi u vodi. Prikladni poli oblici mogu biti polihidroksni alkoholi, monosaharidi i disaharidi uključujući manitol, glicerol, etilen glikol, propilen glikol, trimetil glikol, vinil pirolidon, glukoza, fruktoza, arabinoza, manoza, maltose, saharoza i njihovi polimeri. Razni ekscipijensi takođe mogu da stabilizuju peptide, uključujući albuminski serum, aminokiseline, heparin, masne kiseline i fosfolipide, surfaktante, metale, poli oblike, sredstva za redukciju, metalna helatna sredstva, polivinil pirolidon, hidrolizovani želatin, i amonijum sulfat.

[0114] U nastavku, ovaj pronalazak je detaljnije opisan sa pozivanjem na sekvence aminokiselina, sekvence nukleinske kiseline i u primerima. Međutim, detaljan prikaz ovih primera nema nameru da ograniči ovaj pronalazak.

PRIMERI

1) PD1/PD-L1 model kancera

[0115] BALB/C miševima se supkutano ubrizgavaju u desni bok CT26 ćelije tumora (2.10<5>/miš).9. dana, kada tumori dostignu veličinu od 20-30 mm<2>, miševi se tretiraju sa 250 µg/miš anti-PD1 (BIOXCELL, klon RPM1-14, #BE0146) samog, ili kontrolom izotipa (pacov IgG2a; BIOXCELL, klon 2A3, #BE0089). Anti-PD1 (α-PD1) ili kontrola izotipa (2A3) se ubrizgavaju 9., 12. i 15. dana. Od 13. do 37. dana, miševi se dva puta nedeljno tretiraju sa 2 µg RLI CHO (1004-14p) ili PBS u kontrolnim grupama. Tumori se mere tri puta nedeljno sa kaliperom, a površina tumora se računa na sledeći način: dužina x širina. Miševi se žrtvuju kada tumor dostigne veličinu od 300 mm<2>ili ulcerišu.

[0116] Protokol je predstavljen na FIG.1. Miševi sa tumorom CT26 su primali 3 doze (250 µg/doza) anti-PD1 ili kontrole izotipa od 9. do 15. dana. RLI (2µg/doza) se ubrizgava od 13. dana do 37. dana dva puta nedeljno.

[0117] Model CT26 tumora eksprimira PD-L1 (ligand za PD1; (DURAISWAMY et al., Kancer Res., Jun 5, 2013) i filtrira se od strane T ćelija koje izuzetno eksprimiraju PD1 receptor. Na FIG.2 je prikazana visoka učestalost filtriranja tumora u CD8+ T ćelije koje zajedno eksprimiraju PD-1 i Tim-3 u CT26 modelu. Disocirana slezina i tumor od miša koji ima CT26 tumor se oboje i analiziraju protočnom citometrijom. Zajedničko eksprimiranje Tim-3 i PD-1 na CD3+ CD8+ T ćelijama je prikazano u slezini (levi panel) i u tumoru (desni panel).

[0118] Na FIG.3 je prikazana evolucija veličine tumora kod miševa koji imaju CT26 tumor sa anti-PD1 (aPD1) ili kontrolom (2A3), RLI ili kontrolom (PBS) ili kombinovanje oba tretiranja (aPD1 RLI) prema prethodno opisanom protokolu. (A) Rast tumora u svakoj grupi (n=5 miševi/grupa) (B) kao pod A. ali od drugog eksperimenta. C. Procenat miševa sa potpunom regresijom tumora u svakoj grupi. (D-G). Rast tumora kod svakog miša (izvučenog iz eksperimenta 1 i 2, n=10) za kontrolnu tretiranu grupu (D); za

2

grupu tretiranu samostalno (F); za aPD1 grupu tretiranu samostalno (F) i za aPD1 grupu tretiranu sa RLI (F). Statistički testovi su određeni upotrebom dvosmerne ANOVA. * p<0.05; *** p<0,001.

[0119] Na FIG.4 je prikazano da kombinacija anti-PD1 / RLI tretiranja povećava ukupno preživljavanje kod miševa. A. Ukupno preživljavanje kod svake tretirane grupe (n=10 po grupi).

[0120] Stoga, rezultati pokazuju da kombinacija anti-PD1+RLI tretiranja pojačava antitumorski efekat u poređenju sa grupama tretiranim samostalno. Određenije, RLI/aPD1 tretiranje povećava broj miševa sa potpunom regresijom tumora i ukupnim preživljavanjem (FIG.3C i 4). Iznenađujuće, nijedan od miševa sa tumorom tretiran sa kombinacijom RLI i anti-PD1 koji je ponovo tretiran 145. dana nakon potpune remisije sa CT26 tumorima, nije pokazao bilo kakav rast tumora koji ukazuje na perzistenciju zaštitnog antitumorskog imuniteta (podaci nisu prikazani). Ovi rezultati su potvrđeni u drugoj seriji eksperimenata koji utvrđuju da i) samostalno, RLI nema efekta na rast tumora kada se tretiranje započine od D10 nakon inokulacije tumora, ii) u to vreme, anti-PD1 pojačava preživljavanje ali retko izaziva potpunu regresiju (5.9%). Kombinacija anti-PD1 i RLI povećava preživljavanje i potpunu remisiju (30,4%), koje su bile remisije koje su dugo trajale. Ova kombinacija izaziva efektivni antitumorski memorijski imuni odgovor budući da su miševi i dalje bez tumora 145 dana nakon ukupne regresije i ponovno tretiranje izlečenih miševa nikada nije pokazalo otkrivanje tumora (podaci nisu prikazani).

[0121] BALB/C miševima se supkutano ubrizgavaju u desni bok CT26 ćelije tumora (2.10<5>/miš). Miševi su primili i.p. nisku dozu anti-PD1 (klon mBAT, 12 µg/miš) ili kontrolu, 2µg RLI CHO (1004-15p) ili kontrolu ili kombinaciju oba tretmana 10. dana. Nedelju dana kasnije (17. dana) miševi su primili drugu injekciju anti-PD1, RLI ili kontrolu. Tumori se izmere svaka dva dana sa kaliperom, a površina tumora se izračuna na sledeći način: dužina x širina. Miševi se žrtvuju kada tumor dostigne veličinu od 300 mm<2>ili ulcerišu. Ovaj protokol je prikazan na FIG.5.

[0122] Na FIG.6 prikazan je rast tumora CT26 kod miševa sa tumorom CT26 tretiranih sa dve i.p. injekcije anti-PD1 u niskoj koncentraciji u kombinaciji sa RLI. Statistički testovi se određuju upotrebom dvosmerne ANOVA. *** p<0,001.

[0123] Rezultati pokazuju da niska doza anti-PD1 ili RLI samog nije u mogućnosti da podrži inhibiciju primarnog supkutanog rasta tumora. Međutim, kombinovanje niske doze anti-PD1 sa RLI omogućava inhibiciju rasta tumora. Ovaj eksperiment potvrđuje da RLI može da sinerguje sa strategijama anti-PD1 u borbi protiv rasta tumora čak i sa suboptimalnom dozom anti-PD1 tretiranja.

[0124] Konačno, čini se da kombinacije niskih doza dovode do obeležene sinergije koja kao posledicu ima jaku inhibiciju rasta tumora.

2) Melanom sa metastazama

[0125] B16F10 tumori se implantiraju injekcijom 3 × 10<4>B16F10 ćelija u bok C57BL/6 miševa, i.d. nultog dana. Miševi se tretiraju i.p. sa anti-CTLA-4 (klon: UC10-4F10-11100 ili klonom: 9D9) ili sa anti-PD-1 (klon RPM1-14, #BE0146) ili sa anti-PD-L1 mAb (klon: 10F.9G2) u kombinaciji ili bez RLI CHO (2 µg/miš) i.p. koja se ubrizgava od 7. dana do 25. dva puta nedeljno sa 2 µg RLI CHO. Doziranje anti-CTLA-4 ili Anti-PD-1 ili Anti-PD-L1 antitela po injekciji iznosi 200 µg 3. dana plus 100 µg 6. i 9. dana. Kontrolne grupe primaju odgovarajuću dozu izotipa antitela. Veličina tumora i incidenca se prate tokom vremena fizičkim ispitivanjem.

3) Uznapredovali kancer pluća

[0126] Tumorska ćelijska linija, TC-1 je dobijena od primarnih plućnih epitelijalnih ćelija C57BL/6 miševa i predstavlja humani papiloma virus 16 (HPV-16) E6/E7, a c-Ha-Ras je zajednički transformisan.10<5>TC-1 ćelije kancera pluća se ubrizgavaju s.c. u gornji dermis zadnjeg dela C57BL/6 miševa. Tretiranje je započeto 10. dana nakon inokulacije tumora što odgovara vremenu kada tumori postaju jasno vidljivi i opipljivi pri veličini od ≈ 15-20 mm2. Anti-CTLA-4 mAb (100 µg/miš, klon: UC10-4F10-11100 ili klon: 9D9) ili anti-PD-1 (250 µg/miš, klon RPM1-14, #BE0146) ili anti-PD-L1 mAb (100 µg/miš, klon: 10F.9G2) se daje u tri pojedinačna vremenska perioda (10., 14., 17. dana), a RLI (2 µg/miš) se daje 10., 13. i 18. dana. Tretiranje sa jednim sredstvom nasuprot duplih kombinacija svakog antitela sa RLI se poredi, korišćenjem rasta tumora merenog dva puta nedeljno kao krajnje tačke. Kontrolne grupe primaju odgovarajuću dozu izotipa antitela.

4) Uznapredovali kancer bešike

[0127] Ćelijska linija MB49 tumora potiče od tumora bešike epitelijalnog porekla od C57BL/6 mužjaka miševa izazvanog kancerom.10<6>MB49 ćelije kancera bešike se ubrizgavaju s.c. u gornji dermis u zadnjem delu C57BL/6 miševi. Tretiranje je započeto 6. dana nakon inokulacije tumora što odgovara vremenu kada tumori postaju jasno vidljivi i opipljivi pri veličini od ≈ 15 mm2. Anti-CTLA-4 mAb (100 µg/miš, klon: UC10-4F10-11100 ili klon: 9D9) ili anti-PD-1 (100 µg/miš, klon RPM1-14, #BE0146) ili anti-PD-L1 mAb (100 µg/miš, klon: 10F.9G2) se daje u četiri pojedinačna vremenska perioda (6., 9., 12. dana), a RLI (2 µg/miš) se daje 7., 8., 10., 11., 13., 14., i 16., 17. dana. Tretiranje sa jednim sredstvom nasuprot duplih kombinacija svakog antitela sa RLI se poredi. Kontrolne grupe primaju odgovarajuću dozu izotipa antitela. Tumori se mere tri pura nedeljno sa kaliperom, a površina tumora se računa na sledeći način: dužina x širina. Miševi se žrtvuju kada tumor dostigne veličinu od 300 mm<2>ili ulcerišu.

5) Kancer dojke

[0128] BALB/c miševi su inokulisani sa 5 × 10<4>4T1 ćelijama kancera dojke u mlečnu žlezdu nultog dana. Tretiranje je započeto 10. dana nakon inokulacije tumora što odgovara vremenu kada tumori postaju jasno vidljivi i opipljivi pri veličini od ≈ 15-20 mm2. Anti-CTLA-4 mAb (100 µg/miš, klon: UC10-4F10-11 100 ili klon: 9D9) ili anti-PD-1 (250 µg/miš, klon RPM1-14, #BE0146) ili anti-PD-L1 mAb (200 µg/miš, klon: 10F.9G2) se daje u četiri pojedinačna vremenska perioda (10., 13., 16. dana), a RLI (2 µg/miš) se daje 10., 11., 13., 14., 16., 17., i 19., 20. dana. Tretiranje sa jednim sredstvom nasuprot duplih

kombinacija svakog antitela sa RLI se poredi. Kontrolne grupe primaju odgovarajuću dozu izotipa antitela. Tumori se mere tri puta nedeljno sa kaliperom, a površina tumora se računa na sledeći način: dužina x širina. Miševi se žrtvuju 27. dana. Metastatički plućni noduli se broje pod binokularnim mikroskopom.

6) Kancer jajnika

[0129] ID8-VEGF ćelijska linija kancera jajnika se prethodno razvija od epitelijalne papilarne serozne ćelijske linije adenokarcinoma jajnika miša. Kod C57BL/6 miševa se supkutano u desni bok implantiraju ili 5 × 10<6>ID8 ćelije tumora. Tretiranje je započeto 10. dana nakon inokulacije tumora što odgovara vremenu kada tumori postaju jasno vidljivi i opipljivi pri veličini od ≈ 15-20 mm2. Anti-CTLA-4 mAb (100 µg/miš, klon: UC10-4F10-11100 ili klon: 9D9) ili anti-PD-1 (250 µg/miš, klon RPM1-14, #BE0146) ili anti-PD-L1 mAb (200 µg/miš, klon: 10F.9G2) se daje u četiri pojedinačna vremenska perioda (10., 13., 16. dana), a RLI (2 µg/miš) se daje 10., 11., 13., 14., 16., 17., i 19., 20. dana. Tretiranje sa jednim sredstvom nasuprot duplih kombinacija svakog antitela sa RLI se poredi, korišćenjem rasta tumora merenog dva puta nedeljno kao krajnje tačke. Kontrolne grupe primaju odgovarajuću dozu izotipa antitela. Tumori se mere tri puta nedeljno sa kaliperom, a površina tumora se računa na sledeći način: dužina x širina. Miševi se žrtvuju kada tumor dostigne veličinu od 300 mm<2>ili ulcerišu.

7) Kancer prostate: RM-1

[0130] Ženke miševa C57BL/6 su inokulisane supkutano sa 2 × 10<5>RM-1 ćelijama mišjeg kancera prostate. Tretiranje je započeto 3. dana nakon inokulacije tumora što odgovara vremenu kada tumori postaju jasno vidljivi i opipljivi pri veličini od ≈ 15-20 mm2. Anti-CTLA-4 mAb (100 µg/miš, klon: UC10-4F10-11100 ili klon: 9D9) ili anti-PD-1 (250 µg/miš, klon RPM1-14, #BE0146) ili anti-PD-L1 mAb (200 µg/miš, klon: 10F.9G2) se daje u tri pojedinačna vremenska perioda (dan 3, 6, 9), a RLI (2 µg/miš) se daje 6., 7., 9., 10., 12., 13., 15., 16. i 18., 19. dana. Tretiranje sa jednim sredstvom nasuprot duplih kombinacija svakog antitela sa RLI se poredi, korišćenjem rasta tumora merenog dva puta nedeljno kao krajnje tačke. Kontrolne grupe primaju odgovarajuću dozu izotipa antitela. Tumori se mere tri puta nedeljno sa kaliperom, a površina tumora se računa na sledeći način: dužina x širina. Miševi se žrtvuju kada tumor dostigne veličinu od 300 mm<2>ili ulcerišu.

2

2

2

2

2

2

1

2

4

4

4

4

4

4

4

4

Claims (12)

Patentni zahtevi

1. Kombinovana farmaceutska kompozicija koja obuhvata:

a) konjugat koji obuhvata (i) polipeptid koji obuhvata sekvencu aminokiseline interleukina 15 ili njegovih derivata, sa najmanje 10% aktivnosti humanog IL-15 u indukciji proliferacije ćelijske linije kit225, i (ii) polipeptid koji obuhvata sekvencu aminokiseline sushi domena IL-15Rα ili njegovih derivata, sa najmanje 10% aktivnosti vezivanja sushi domena humanog IL-15Rα za humani IL-15, samim tim polinukleotida koji kodira, ili vektora koji obuhvata takav polinukleotid; i

b) antitelo koje antagonistički deluje na imuni put umešan u inhibiciju aktivacije T ćelija, ili njegov fragment koji može da reaguje sa istim antigenom kao i njegov kontradeo antitela, samim tim sa polinukleotidom koji kodira, ili vektorom koji obuhvata takav polinukleotid, pri čemu pomenuto antitelo predstavlja PD-1/PD-L1/PD-L2 antagonist,

pri čemu pomenuto antitelo antagonistički deluje ili vezivanjem PD-1 receptora ili vezivanjem PD-L1 ili PD-L2 liganda;

pri čemu pomenuti konjugat i antitelo ili njegov fragment nisu povezani.

2. Farmaceutska kompozicija za upotrebu u lečenju kancera kod subjekta koja obuhvata

(A) konjugat koji obuhvata (i) polipeptid koji obuhvata sekvencu aminokiseline interleukina 15 ili njegovih derivata, sa najmanje 10% aktivnosti humanog IL-15 u indukciji proliferacije ćelijske linije kit225, i (ii) polipeptid koji obuhvata sekvencu aminokiseline sushi domena IL-15Rα ili njegovih derivata sa najmanje 10% aktivnosti vezivanja sushi domena humanog IL-15Rα za humani IL-15, samim tim polinukleotid koji kodira, ili vektora koji obuhvata takav polinukleotid, pri čemu ta upotreba obuhvata istovremeno, odvojeno, ili uzastopno davanje (a) pomenute farmaceutske kompozicije i (b) antitela koje antagonistički deluje na imuni put umešan u inhibiciju aktivacija T ćelija, ili njegov fragment koji može da reaguje sa istim antigenom kao i njegov kontradeo antitela, samim tim polinukleotidom koji kodira, ili vektorom koji obuhvata takav polinukleotid, ili

(B) antitelo koje antagonistički deluje na imuni put umešan u inhibiciju aktivacije T ćelija, ili njegov fragment koji može da reaguje sa istim antigenom kao i njegov kontradeo antitela, samim tim polinukleotidom koji kodira, ili vektorom koji obuhvata takav polinukleotid, pri čemu ta upotreba obuhvata istovremeno, odvojeno, ili uzastopno davanje (a) pomenute farmaceutske kompozicije i (b) konjugata koji obuhvata (i) polipeptid koji obuhvata sekvencu aminokiseline interleukina 15 ili njegovih derivata, sa najmanje 10% aktivnosti humanog IL-15 u indukciji proliferacije ćelijske linije kit225, i (ii) polipeptid koji obuhvata sekvencu aminokiseline sushi domena IL-15Rα ili njegovih derivata sa najmanje 10% aktivnosti vezivanja sushi domena

2

humanog IL-15Rα za humani IL-15, samim tim polinukleotida koji kodira, ili vektora koji obuhvata takav polinukleotid, i

pri čemu je pomenuto antitelo PD-1/PD-L1/PD-L2 antagonist,

pri čemu pomenuto antitelo antagonistički deluje ili vezivanjem PD-1 receptora ili vezivanjem PD-L1 ili PD-L2 liganda.

3. Farmaceutska kompozicija za upotrebu u lečenju kancera prema zahtevu 2 ili kombinovana farmaceutska kompozicija prema zahtevu 1, prilagođena za istovremeno, odvojeno ili uzastopno davanje za upotrebu u lečenju kancera kod subjekta.

4. Farmaceutska kompozicija za upotrebu u lečenju kancera ili kombinovana farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 3, pri čemu:

a) konjugat se daje injekcijom u dozi od 60 µg/kg ili manje, poželjno u dozi od 10 µg/kg ili manje i najpoželjnije u dozi od 5 µg/kg ili manje; i

b) antitelo koje antagonistički deluje na imuni put umešan u inhibiciju aktivacije T ćelija, ili njegov fragment se daje injekcijom u dozi od 500 µg/kg ili manje, poželjno u dozi od 100 µg/kg ili manje i najpoželjnije u dozi od 50 µg/kg ili manje.

5. Farmaceutska kompozicija za upotrebu u lečenju kancera ili kombinovana farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 4, pri čemu pomenuto antitelo predstavlja PD-1/PD-L1 antagonist.

6. Farmaceutska kompozicija za upotrebu u lečenju kancera ili kombinovana farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 5, pri čemu pomenuti derivat interleukina 15 ima najmanje 25% aktivnosti humanog interleukina-15 u indukciji proliferacije ćelijske linije kit225, poželjnije najmanje 50%, ili

ima sekvencu aminokiseline koja ima procenat identiteta od najmanje 92.5%, pri čemu je ta sekvenca aminokiseline odabrana iz grupe koju čine SEQ ID n°: 1, SEQ ID n°: 2 i SEQ ID n°: 3, poželjno od najmanje 96 %, i poželjnije od najmanje 98.5% ili od najmanje 99%.

7. Farmaceutska kompozicija ili kombinovana farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 6, pri čemu pomenuti derivat sushi domena IL-15Rα ima najmanje 25%, poželjnije najmanje 50% aktivnosti vezivanja sushi domena humanog IL-15Rα, ili

ima sekvencu aminokiseline koja ima procenat identiteta od najmanje 92%, pri čemu je sekvenca aminokiseline odabrana iz grupe koju čine SEQ ID n°: 4, SEQ ID n°: 5, SEQ ID n°: 6, SEQ ID n°: 7, SEQ ID n°: 8, i SEQ ID n°: 9, poželjno od najmanje 96 %, i poželjnije od najmanje 98%.

8. Farmaceutska kompozicija za upotrebu u lečenju kancera ili kombinovana farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 7, pri čemu je pomenuto antitelo odabrano između PD-1/PD-L1 i PD-1/PD-L2 antagonista, poželjno nivolumaba, Merck 3745, CT-011, lambrolizumaba, AMP514, MDX- 1105 ili YW243.55.S70.

9. Farmaceutska kompozicija za upotrebu u lečenju kancera ili kombinovana farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 8, pri čemu su ti polipeptidi (i) i (ii) konjugata kovalentno povezani u fuzioni protein.

10. Farmaceutska kompozicija za upotrebu u lečenju kancera ili kombinovana farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 9, pri čemu pomenuti interleukin 15 ima sekvencu aminokiseline SEQ ID n°: 1.

11. Farmaceutska kompozicija za upotrebu u lečenju kancera ili kombinovana farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 10, pri čemu sushi domen IL-15Rα ima sekvencu aminokiseline SEQ ID n°: 4.

12. Farmaceutska kompozicija za upotrebu u lečenju kancera ili kombinovana farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 11, pri čemu konjugat ima sekvencu SEQ ID n°: 16 ili SEQ ID n°: 17.

4