RS59761B1 - Antigen vezujući molekuli, koji vezuju egfr, vektori koji kodiraju iste, i njihova upotreba - Google Patents

Description

Opis

OSNOVA PRONALASKA OBLAST PRONALASKA

[0001] Dati pronalazak odnosi se na humanizovana anti-EGFR antitela koja se specifično vezuju za humani EGFR, gde pomenuta antitela obuhvataju: (a) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO: 15; i (b) varijabilni region lakog lanca koji obuhvata sekvencu od SEQ ID NO: 45; i gde pomenuto antitelo obuhvata human Fc region izmenjen glikoinženjerstvom, koji ima smanjeni broj ostataka fukoze u poredjenju sa antitelom u obliku neizmenjenom glikoinženjerstvom. Dato otkriće se generalno odnosi na antigen vezujuće molekule (ABMs). U posebnim izvodjenjima, dati pronalazak se odnosi na rekombinantna monoklonska antitela, uključujući himerna, primatizovana ili humanizovana antitela koja su specifična za receptor humanog epidermalnog faktora rasta (EGFR). Osim toga, dati pronalazak odnosi se na molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju takve ABM (molekule koji vezuju antigen), i vektore i ćelije domaćina koje obuhvataju takve molekule nukleinskih kiselina. Pronalazak se dalje odnosi na postupke za proizvodnju ABM koji su opisani u ovom tekstu, i na postupke za korišćenje tih molekula koji vezuju antigen-ABM u lečenju oboljenja. Osim toga, dati pronalazak se odnosi na ABM sa modifikovanom glikozilacijom koji imaju poboljšana terapijska svojstva, uključujući antitela sa povećanim vezivanjem za Fc receptor i pojačanom efektorskom funkcijom.

Stanje tehnike

EGFR i Anti-EGFR Antitela

[0002] Receptori za humani epidermalni faktor rasta (takodje poznat i kao HER-1 ili Erb-B1, i koji se u tekstu ovde naziva "EGFR") predstavlja transmembranski receptor od 170 kDa koji se kodira pomoću cerbB protoonkogena, i koji pokazuje unutrašnju aktivnost tirozin kinaze (Modjtahedi et al., Br. J. Cancer 73:228-235 (1996); Herbst and Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002)). Baza podataka SwissProt sa ulaznim brojem P00533 obezbedjuje sekvencu za EGFR. Postoje takodje izoforme i varijante EGFR (na primer, alternativni transkripti RNK, skraćene verzije, polimorfizmi, itd.) koji uključuju, ali nisu ograničeni na one koje su identifikovani u bazi podataka Swissprot pomoću ulaznih brojeva P00533-1, P00533-2, P00533-3, i P00533-4. Poznato je da EGFR vezuje ligande koji uključuju epidermalni faktor rasta (EGF), transformišući faktor-α rasta (TGf-α), amfiregulin, EGF koji vezuje heparin (hb-EGF), betacelulin, i epiregulin (Herbst and Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002); Mendelsohn and Baselga, Oncogene 19:6550-6565 (2000)). EGFR reguliše brojne ćelijske procese putem prenosa signala posredovanog tirozin-kinazom koji uključuje, ali se ne ograničava na aktivaciju prenosa signalnih puteva koji kontrolišu ćelijsku proliferaciju, diferencijaciju, opstanak ćelije, apoptozu, angiogenezu, mitogenezu, i metastazu (Atalay et al., Ann. Oncology 14:1346-1363 (2003); Tsao and Herbst, Signal 4:4-9 (2003); Herbst and Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002); Modjtahedi et al., Br. J. Cancer 73:228-235 (1996)).

[0003] Zabeležena je prekomerna ekspresija EGFR kod brojnih malignih stanja kod ljudi, uključujući kancere bešike, mozga, glave i vrata, pankreasa, pluća, dojke, jajnika, debelog creva, prostate i bubrega. (Atalay et al., Ann. Oncology 14:1346-1363 (2003); Herbst and Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002) Modjtahedi et al., Br. J. Cancer 73:228-235 (1996)). U mnogim od tih stanja, prekomerna ekspresija EGFR nalazi se u uzajamnoj vezi ili je povezana sa lošom prognozom za oporavak pacijenata. (Herbst and Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002) Modjtahedi et al., Br. J. Cancer 73:228-235 (1996)). EGFR se takodje eksprimira u ćelijama normalnog tkiva, posebno u epitelnim tkivima kože, jetre, i gastrointestinalnog trakta, iako na generalno nižim nivoima nego što je to slučaj u malignim ćelijama (Herbst and Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002)).

[0004] Nekonjugovana monoklonska antitela (mAbs) mogu biti korisni lekovi za lečenje kancera, kao što je pokazano sa davanjem dozvole za Trastuzumab od strane Američke administracije za hranu i lekove (Herceptin™; Genentech Inc,) za lečenje uznapredovalog kancera dojke (Grillo-Lopez, A.-J., et al., Semin. Oncol.26:66-73 (1999); Goldenberg, M. M., Clin. Ther.21:309-18 (1999)), Rituximab (Rituxan™; IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA, and Genentech Inc., San Francisco, CA), za lečenje CD20 pozitivne B-ćelije, niskog gradusa ili folikularnog ne-Hočkinovog limfoma, Gemtuzumab (Mylotarg™, Celltech/Wyeth-Ayerst) za lečenje remisije akutne mijeloidne leukemije, i Alemtuzumab (CAMPATH ™, Millenium Pharmaceuticals/Schering AG) za lečenje B ćelijske hronične limphocitne leukemije. Uspeh ovih proizvoda oslanja se na samo na njihovu efikasnost već i na njihove istaknute sigurnosne profile (Grillo-Lopez, A.J., et al., Semin. Oncol. 26:66-73 (1999); Goldenberg, M. M., Clin. Ther. 21:309-18 (1999)). Uprkos dometima ovih lekova, trenutno postoji veliko zanimanje za dobijanje specifičnih antitela sa višim nivoom aktivnosti od onoga koji se obično dobija terapijom nekonjugovanim mAb.

[0005] Rezultati odredjenog broja studija navode da mehanizmi koji su zavisni od Fc-receptora značajno doprinose dejstvu citotoksičnih antitela protiv tumora i ukazuju da bi se najpogodnije antitelo protiv tumora preferencijalno vezalo za aktivacione Fc receptore i minimalno za inhibitorni partner FcγRIIB. (Clynes, R. A., et al., Nature Medicine 6(4):443-446 (2000); Kalergis, A.M., and Ravetch, J. V., J. Exp. Med.

195(12):1653-1659 (June 2002). Na primer, rezultati najmanje jedne studije sugerišu da je polimorfizam u FcγRIIIa receptoru, posebno snažno povezan sa efikasnošću terapije antitelom. (Cartron, G., et al., Blood 99(3):754-757 (February 2002)). Ova studija je pokazala da pacijenti homozigotni za FcyRIIIa imaju bolji odgovor na Rituksimab od heterozigotnih pacijenata. Autori su zaključili da je bolji odgovor posledica boljeg in vivo vezivanja antitela za FcyRIIIa, što za rezultat ima bolje dejstvo ADCC protiv ćelija limfoma.

(Cartron, G., et al., Blood 99(3):754-757 (February 2002)).

[0006] Prijavljene su različite strategije za targetiranje EGFR i blokiranje signalnih puteva EGFR. Inhibitori malih molekula tirozin kinaze poput gefitiniba, erlotiniba, i CI-1033 blokiraju autofosforilaciju EGFR u unutarćelijskom regionu tirozin kinaze, i na taj način inhibirajući nishodne signalne puteve (Tsao and Herbst, Signal 4: 4-9 (2003)). Monoklonska antitela, sa druge strane, targetiraju ekstracelularni deo EGFR, što kao rezultat ima blokiranje vezivanja liganda i na taj način inhibiraju nishodne puteve poput ćelijske proliferacije (Tsao and Herbst, Signal 4: 4-9 (2003)).

[0007] Proizvedeno je nekoliko monoklonskih antitela iz životinje koja pripada glodarima koja mogu da ostvare takvu blokadu in vitro, a koja su procenjena na osnovu osobine da deluju na rast tumora u mišijim modelima ksentografa/ ksenokalema (Masui, et al., Cancer Res.46:5592-5598 (1986); Masui, et al., Cancer Res. 44:1002-1007 (1984); Goldstein, et al.,Clin. Cancer Res. 1 :1311-1318 (1995)). Na primer, EMD 55900 (EMD Pharmaceuticals) predstavlja mišije anti-EGFR monoklonsko antitelo koje je uzgajano naspram A431 ćelijskih linija epidermalnog karcinoma i koje je testirano u kliničkim studijama pacijenata sa uznapredovalim karcinomom skvamoznih ćelija larinksa ili hipolarinksa (Bier et al., Eur. Arch. Otorhinolaryngol. 252:433-9 (1995)). Osim toga, pokazano je da su monoklonska antitela pacova ICR16, ICR62, i ICR80, koja se vezuju za ekstracelularni domen EGFR, efikasna u inhibiciji vezivanja EGF i TGF-α receptora. (Modjtahedi et al., Int. J. Cancer 75:310-316 (1998)). Monoklonsko antitelo životinje iz grupe glodara 425 predstavlja još jedan MAb koji se uzgaja protiv humane ćelijske linije karcinoma A431 i nadjeno je da se vezuje za polipeptidni epitop na spoljnom domenu za receptor humanog epidermalnog faktora rasta. (Murthy et al., Arch. Biochem. Biophys. 252(2):549-560 (1987). Potencijalni problem sa upotrebom antitela iz životinje iz grupe glodara u terapijskim tretmanima je taj što ne-humana monoklonska antitela mogu biti prepoznata od humanog domaćina kao strani protein; stoga, ponovljena ubrzigavanja tih stranih antitela mogu dovesti do indukcije imunih odgovora što može dovesti do štetnih hipersenitivnih reakcija. Za monoklonska antitela iz životinje koja pripada glodarima, ovo je često označeno kao odgovor humanog anti-mišijeg antitela, ili "HAMA" odgovor, ili Humanog Anti-pacovskog Antitela, ili "HARA" odgovor. Pored toga, ova "strana" antitela mogu biti napadnuta od strane imunog Sistema domaćina tako da se ona u stvari neutralizuju pre nego što dostignu stvoje ciljno mesto. Štaviše, ne-humana monoklonska antitela (na primer, monoklonska antitela iz životinje koja pripada glodarima) uglavnom ne poseduju efektorsku funkciju kod čoveka, tj., ona ne mogu da ostvare, izmedju ostalog, komplement zavisno liziranje, niti liziranje humanih ciljnih ćelija posredstvom mehanizma antitelo zavisne ćelijske toksičnosti, niti Fcreceptorom posredovane fagocitoze.

[0008] Himerna antitela koja obuhvataju delove antitela iz dve ili više različitih vrsta (na primer, miša ili čoveka) razvijena su kao alternativa "konjugovanim" antitelima. Na primer, američki Patent br.5,891,996 (Mateo de Acosta del Rio et al.) razmatra mišija/humana himerna antitela, R3, usmerena protiv EGFR, i američki patent br. 5,558,864 razmatra generaciju himernih i humanizovanih oblika iz anti-EGFR MAb 425 iz životinje koja pripada redu glodara. Takodje, IMC-C225 (Erbitux®; ImClone) predstavlja anti-EGFR monoklonsko antitelo himernog miša/čoveka (bazirano na mišijem M225 monoklonskom antitelu, što je rezultiralo HAMA odgovorima u humanim kliničkim ispitivanjima) za koje je prijavljeno da pokazuje antitumorsku efikasnost u različitim humanim ksentografnim modelima. (Herbst and Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002)). Efikasnost IMC-C225 pripisana je većem broju mehanizama, uključujući inhibiciju ćelijskih dogadjaja koji su regulisani EGFR signalnim putevima, i moguće povećanoj ćelijskoj toksičnosti zavisnoj od antitela (ADCC) (Herbst and Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002)). IMC-C225 je takodje korišćen u kliničkim ispitivanjima, uključujući u kombinaciji sa radioterapijom i hemoterapijom (Herbst and Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002)). Nedavno je kompanija Abgenix, Inc. (Fremont, CA) razvila ABX-EGF za terapiju kancera. ABX-EGF predstavlja u potpunosti humano anti-EGFR monoklonsko antitelo. (Yang et al., Crit. Rev. Oncol./Hematol.38: 17-23 (2001)).

[0009] Objavljena patentna prijava br. WO2004/065540 opisuje anti-EGFR antitela koja su dizajnirana za povećanje terapijskog potencijala. Objavljena prijava br. WO95/20045 opisuje pacovsko anti-EGFR antitelo ICR62 i njegovu upotrebu u fazi I ogleda kod ljudi.

Glikozilacija antitela

[0010] Oligosaharidna komponenta može značajno da utiče na svojstva/osobine relevantne za efikasnost terapijskog glikoproteina, uključujući fizičku stabilnost, otpornost na proteaazu, interakcije sa imunim sistemom, farmakokinetiku, i specifičnu biološku aktivnost. Takve osobine mogu da zavise ne samo od prisustva ili odsustva, već takodje od prisustva specifičnih struktura, oligosaharida. Može da se napravi izvesna generalizacija izmedju oligosaharidne strukture i glikoproteinske funkcije. Na primer, odredjene oligosaharidne strukture posreduju u brzom klirensu glikoproteina iz krvotoka preko interakcija sa specifičnim proteinima koji se vezuju za ugljene hidrate, dok druge mogu vezati antitela i pokrenuti neželjne imune reakcije. (Jenkins et al., Nature Biotechnol.14:975-81 (1996)).

[0011] Ćelije sisara su poželjni domaćini za proizvodnju terapeutskih glikoproteina, usled njihove sposobnosti da glikoziluju proteine u najkompatibilnijem obliku za humanu primenu. (Cumming et al., Glycobiology 1:115-30 (1991); Jenkins et al., Nature Biotechnol.14:975-81 (1996)). Bakterije veoma retko glikoziluju proteine, i kao i ostale vrste zajedničkih domaćina, kao što su kvasci, filamentozne gljive, ćelije insekata i biljaka, proizvode obrasce glikozilacije povezane sa brzim uklanjanjem iz cirkulacije (krvotoka), neželjenim imunim reakcijama, i u nekim specifičnim slučajevima, sniženom biološkom aktivnošću. Medju ćelijama sisara, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) su najčešće korišćene tokom poslednje dve decenije. Pored toga što daju odgovarajuće obrasce glikozilacije, ove ćelije omogućavaju konzistentno stvaranje genetski stabilnih, visoko produktivnih kloniranih ćelijskih linija. One se mogu kultivisati dok ne postignu veliku gustinu u običnom bioreaktorima u medijumu bez seruma, i omogućavaju razvoj bezbednih i obnovljivih bio-procesa. Ostale obično korišćene životinje uključuju ćelije bubrega mladunčeta hrčka (BHK), NS0- i SP2/0-mišije ćelije mijeloma. U novije vreme, testirana je i proizvodnja iz transgenih životinja. (Jenkins et al., Nature Biotechnol.14:975-81 (1996)).

[0012] Sva antitela sadrže ugljenohidratne strukture na sačuvanim položajima u konstantnim regionima teškog lanca, pri ćemu svaki izotip poseduje poseban niz N-vezanih ugljenohidratnih struktura, koje promenjivo utiču na molekul proteina sa višim nivoima strukture, na sekrekciju ili funkcionalnu aktivnost. (Wright, A., and Morrison, S. L., Trends Biotech. 15:26-32 (1997)). Struktura spojenog N-vezanog ugljenog hidrata značajno varira, u zavisnosti od stepena obrade, i može da obuhvata više manozne, višestruko razgranate kao i oligosaharidne komplekse u obliku dve grane. (Wright, A., and Morrison, S. L., Trends Biotech. 15:26-32 (1997)). Postoji heterogena obrada oligosahardinih struktura jezgra vezanih na odredjenim mestima za glikozilaciju tako da čak i monoklonska antitela postoje kao višestruke glikoforme. Slično, pokazano je da se glavne razlike u glikozilaciji antitela javljaju izmedju ćelijskih linija, i čak se manje razlike vide za datu ćelijsku liniju koja je uzgajana pod različitim uslovima za kulture. (Lifely, M. R. et al., Glycobiology 5(8):813-22 (1995)).

[0013] Jedan način za postizanje velikih povećanja potencije, uz održavanje jednostavnog proizvodnog postupka i potencijalnog izbegavanja značajnih, neželjenih sporednih efekata, je u pojačanju prirodne, ćelijski-posredovane efektorne funkcije monoklonskih antitela putem inženjeringa njihovih oligosaharidnih komponenti kako je opisano u Umaña, P. et al., Nature Biotechnol.17:176-180 (1999) i američkom patentu br 6,602,684. Antitela tipa IgG1, najčešće korišćena antitiela u imunoterapiji kancera, predstavljaju glikoproteine koje imaju sačuvano mesto N-glikozilacije na Asn297 u svakom CH2 domenu. Dva složena oligosaharidna kompleksa u obliku dve grane koji su spojeni na Asn297 su uronjena izmedju CH2 domena, formirajući široke kontakte sa osnovnim polipeptidnim lancem, i njegovo prisustvo je osnovno da bi antitelo posredovalo efektorne funkcije kao ćelijska citotoksičnost zavisna od aintitela (ADCC) (Lifely, M. R., et al., Glycobiology 5:813-822 (1995); Jefferis, R., et al., Immunol Rev. 163:59-76 (1998); Wright, A. and Morrison, S. L., Trends Biotechnol.15:26-32 (1997)).

[0014] Umaña et al. su prethodno pokazali da prekomerna ekspresija u ćelijama jajnika kineskog hrčka (CHO) β(1,4)-N-aceilglukozaminiltransferaze III ("GnTIII"), glikoziltransferaze koja katalizuje formiranje oligosaharida podeljenih na dva jednaka dela, značajno povećava in vitro ADCC aktivnost antineuroblastoma himernog monoklonskog antitela (chCE7) proizvedenog pomoću CHO ćeija dobijenih inženjeringom. (Videti Umaña, P. et al., Nature Biotechnol.17:176-180 (1999); i medjunarodnu objavljenu prijavu patenta br. WO 99/54342). Antitelo chCE7 pripada velikoj klasi nekonjugovanih mAbs koja imaju visoki afinitet i specifičnost za tumor, ali imaju premalu potenciju da bi klinički bili korisni kada se proizvode u standardnim industrijskim ćelijskim linijama kojima nedostaje GnTIII enzim (Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999)). Ova studija je bila prva koja je trebala da pokaže da se velika povećanja aktivnosti ADCC mogu dobiti inženjeringom ćelija koje proizvode antitelo tako da eksprimiraju GnTIII, što takodje dovodi do povećanja u proporciji razdvojenih oligosaharida povezanih sa konstantnim regionom (Fc), uključujući razdvojene, nefukozilovane oligosaharide, iznad nivoa koji se nalaze u prirodnim antitelima.

[0015] Ostaje potreba za poboljšanim terapijskim pristupima koji ciljno deluju na EGFR za lečenje poremećaja ćelijske proliferacije kod primata, uključujući, ali bez ograničenja na ljude, gde se takvi poremećaji karakterišu ekspresijom EGFR, naročito abnormlnom ekspresijom (prekomerna ekspresija) koji uključuju, ali nisu ograničeni na, kancere bešike, mozga, glave i vrata, pankreasa, pluća, grudi, jajnika, debelog creva, prostate, i bubrega.

KRATAK REZIME PRONALASKA

[0016] Prepoznajući ogroman terapijski potencijal molekula koji vezuju antigen (ABMs) koji imaju specifičnost vezivanja mišijeg ICR62 antitela (na primer, vezuju isti epitop) i koji su dobijeni glikoinženjeringom da bi se povećao afinitet vezivanja za Fc receptor i efektorna funkcija, razvijen je postupak za proizvodnju ABMs. Izmedju ostalog, ovaj postupak obuhvata proizvodnju rekombinantnih, himernih antitela ili njihovih himernih fragmenata. Efikasnost ovih ABM molekula je dalje poboljšana putem inženjeringa glikozilacionog profila antitela Fc regiona.

[0017] Prema tome, u jednom aspektu, otkriće je usmereno na izolovani polinukleotid koji sadrži: (a) sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od: SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:122, I SEQ ID NO:124; (b) sekvence koja je odabrana iz grupe koju čine: SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:106, i SEQ ID NO:126; i (c) SEQ ID NO:108. U narednom aspektu, otkriće je usmereno na izolovani polinukleotid koji sadrži (a) sekvencu koja je odabrana iz grupe koja se sastoji SEQ ID NO:112 i SEQ ID NO:114; (b) sekvencu koja je odabrana iz grupe koju čine SEQ ID NO:116 i SEQ ID NO:118; i (c) SEQ ID NO:119. U jednom izvodjenju, bilo koji od tih polinukleotida kodira fuzioni polipeptid.

[0018] U daljem aspektu, otkriće je usmereno na izolovani polinukleotid koji sadrži sekvencu koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID No:2; SEQ ID No:4; SEQ ID No:6; SEQ ID No:8; SEQ ID No:10; SEQ ID No:12; SEQ ID No:14; SEQ ID No:16; SEQ ID No:18; SEQ ID No:20; SEQ ID No:22; SEQ ID No:24; SEQ ID No:26; SEQ ID No:28; SEQ ID No:30; SEQ ID No32; SEQ ID No:34; SEQ ID No:36; SEQ ID No:38; SEQ ID No:40 i SEQ ID No:120. U daljem aspektu, otkriće je usmereno na izolovani polinukleotid koji sadrži sekvencu koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID No:44; SEQ ID No:46; SEQ ID No:50; i SEQ ID No.:52. U jednom izvodjenju, ti polinukleotidi kodiraju fuzione polipeptide.

[0019] Otkriće je dalje usmereno na izolovani polinukleotid koji sadrži sekvencu koja ima najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, ili 99% identičnosti sa sekvencom koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID No:2; SEQ ID No:4; SEQ ID No:6; SEQ ID No:8; SEQ ID No:10; SEQ ID No:12; SEQ ID No:14; SEQ ID No:16; SEQ ID No:18; SEQ ID No:20; SEQ ID No:22; SEQ ID No:24; SEQ ID No:26; SEQ ID No:28; SEQ ID No:30; SEQ ID No32; SEQ ID No:34; SEQ ID No:36; SEQ ID No:38; SEQ ID No:40 i SEQ ID No:120, gde pomenuti izolovani polinukleotid kodira fuzioni polipeptid. U dodatnom aspektu, otkriće je usmereno na izolovani polinukleotid koji sadrži sekvencu koja ima najmanje 80% identičnosti sa sekvencom koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID No:44; SEQ ID No:46; SEQ ID No:50; i SEQ ID No.:52, gde pomenuti izolovani polinukleotid kodira fuzioni polipeptid.

[0020] Otkriće je dalje usmereno na izolovani polinukleotid koji kodira himerni polipetid koji sadrži sekvencu SEQ ID No.:1. U jednom izvodjenju, polinukleotid obuhvata sekvencu koja kodira polipeptid koji ima sekvencu SEQ ID No.:1; i sekvencu koja kodira polipeptid koji ima sekvencu antitela Fc regiona, ili njegov fragment, od vrste koja nije pacov. Otkriće je dalje usmereno na izolovani polinukleotid koji kodira himerni polipetid koji sadrži sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID No:3; SEQ ID No:5; SEQ ID No:7; SEQ ID No:9; SEQ ID No:11; SEQ ID No:13; SEQ ID No:15; SEQ ID No:17; SEQ ID No:19; SEQ ID No:21; SEQ ID No:23; SEQ ID No:25; SEQ ID No:27; SEQ ID No:29; SEQ ID No:31; SEQ ID No33; SEQ ID No:35; SEQ ID No:37; SEQ ID No:39; i SEQ ID No:121. U jednom izvodjenju, polinukleotid obuhvata sekvencu koja kodira polipeptid sa sekvencom koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID No:3; SEQ ID No:5; SEQ ID No:7; SEQ ID No:9; SEQ ID No:11; SEQ ID No:13; SEQ ID No:15; SEQ ID No:17; SEQ ID No:19; SEQ ID No:21; SEQ ID No:23; SEQ ID No:25; SEQ ID No:27; SEQ ID No:29; SEQ ID No:31; SEQ ID No33; SEQ ID No:35; SEQ ID No:37; SEQ ID No:39; i SEQ ID No:121; i sekvencu koja kodira polipeptid sa sekvencom antitela Fc regiona, ili njegovog fragmenta, iz vrste koja je različita od pacova.

[0021] U još jednom aspektu, otkriće je usmereno na izolovani polinukleotid koji kodira himerni polipetid sa sekvencom SEQ ID No.:43. U jednom izvodjenju, polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira polipeptid sa sekvencom SEQ ID No.:43; i sekvencom koja kodira polipeptid sa sekvencom antitela Fc regiona, ili njegovog fragmenta, iz vrste koja nije pacov. U još jednom aspektu, otkriće je dalje usmereno na izolovani polinukleotid koji kodira himerni polipetid koji sadrži sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID No:45; SEQ ID No:49; i SEQ ID No.:51. U jednom izvodjenju, polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira polipeptid sa sekvencom koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID No:45; SEQ ID No:49; i SEQ ID No.:51, i sekvence koja kodira polipeptid sa sekvencom antitela lakog lanca konstantnog regiona (CL), ili njegovog fragmenta, od vrste koja je drugačija od pacova.

[0022] Otkriće je takodje usmereno na izolovani polinukleotid koji sadrži sekvencu koja kodira polipetid sa VH regionom ICR62 antitela, ili njihove funkcionalne varijante, i sekvence koja kodira polipeptid sa sekvencom antitela Fc regiona, ili njegovog fragmenta, iz vrste koja nije pacov. U narednom aspektu, otkriće je usmereno na izolovani polinukleotid koji sadrži sekvencu koja kodira polipetid sa VL regionom ICR62 antitela, ili njegovih funkcionalnih varijanti, i sekvencu koja kodira polipeptid sa sekvencom antitela CL regiona, ili njegovog fragmenta, iz vrste koja nije pacov.

[0023] Otkriće je takodje usmereno na vektor ekspresije koji obuhvata bilo koji od izolovanih polinukleotida koji su opisani u prethodnom delu teksta, i na ćeliju domaćina koja obuhvata taj vektor ekspresije. U daljem aspektu, otkriće je usmereno na ćeliju domaćina koja obuhvata bilo koji od izolovanih polinukleotida koji su opisani u prethodnom delu teksta.

[0024] U jednom aspektu, otkriće je usmereno na izolovani polipeptid koji obuhvata: (a) sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od: SEQ ID NO:53 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:123, i SEQ ID NO:125;

(b) sekvence koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od: SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:105, i SEQ ID NO:127; i (c) SEQ ID NO:107. gde pomenuti polipeptid predstavlja fuzioni polipeptid. U narednom aspektu, otkriće je usmereno na izolovani polipeptid koji sadrži (a) sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:111 i SEQ ID NO:113; (b)

SEQ ID NO:115; i (c) SEQ ID NO:117, gde pomenuti polipeptid predstavlja fuzioni polipeptid.

[0025] Otkriće je usmereno na himerni polipeptid koji sadrži sekvencu SEQ ID NO.:1 ili njenu varijantu. Otkriće je dalje usmereno na himerni polipeptid koji obuhvata sekvencu SEQ ID NO.:43 ili njenu varijantu. U jednom izvodjenju, bilo koji od tih polipeptida dalje obuhvata humani Fc region i/ili humani CL region. Otkriće je usmereno i na himerni polipeptid koji obuhvata sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID No:3; SEQ ID No:5; SEQ ID No:7; SEQ ID No:9; SEQ ID No:11; SEQ ID No:13; SEQ ID No:15; SEQ ID No:17; SEQ ID No:19; SEQ ID No:21; SEQ ID No:23; SEQ ID No:25; SEQ ID No:27; SEQ ID No:29; SEQ ID No:31; SEQ ID No33; SEQ ID No:35; SEQ ID No:37; SEQ ID No:39; i SEQ ID No:121, ili njihovu varijantu. Otkriće je dalje usmereno na himerni polipeptid koji obuhvata sekvencu odbranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID No:45; SEQ ID No:49; i SEQ ID No.:51, ili njihovu varijantu. U jednom izvodjenju, bilo koji od tih polipeptida dalje sadrži human Fc region i/ili humani CL region. U jednom izvodjenju, humani Fc region sadrži IgG1.

[0026] U narednom aspektu pronalazak se odnosi na polipeptid koji sadrži sekvencu koja je izvedena iz ICR62 antitela i sekvencu koja je izvedena iz heterolognog polipeptida i antigen-vezujućeg molekula koji sadrži takav polipeptid. U jednom izvodjenju antigen-vezujući molekul predstavlja antitelo. U poželjnom izvodjenju, antitelo je himerno. U narednom poželjnom izvodjenju, antitelo je humanizovano ili primatizovano.

[0027] U narednom aspektu, otkriće je usmereno na ABM, koji je sposoban da se takmiči sa pacovskim ICR62 antitelom za vezivanje na EGFR i koje je himerno. U jednom izvodjenju, ABM predstavlja antitelo ili njegov fragment. U narednom izvodjenju, ABM predstavlja rekombinantno antitelo koje sadrži VH region sa aminokiselinskom sekvencom koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO.: 1; SEQ ID No:3; SEQ ID No:5; SEQ ID No:7; SEQ ID No:9; SEQ ID No:11; SEQ ID No:13; SEQ ID No:15; SEQ ID No:17; SEQ ID No:19; SEQ ID No:21; SEQ ID No:23; SEQ ID No:25; SEQ ID No:27; SEQ ID No:29; SEQ ID No:31; SEQ ID No33; SEQ ID No:35; SEQ ID No:37; SEQ ID No:39; i SEQ ID No:121. U narednom izvodjenju, ABM predstavlja rekombinantno antitelo koje sadrži VL region sa aminokiselinskom sekvencom odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:43, SEQ ID No:45; SEQ ID No:49; i SEQ ID No.:51. U daljem izvodjenju ABM predstavlja rekombinantno antitelo koje je primatizovano. U daljem izvodjenju ABM je rekombinantno antitelo koje je humanizovano. U još jednom izvodjenju ABM predstavlja rekombinantno antitelo koje sadrži human Fc region. U daljem izvodjenju, bilo koji od prethodno razmatranih ABM može biti konjugovan sa grupom kao što je toksin ili radioaktivni obeleživač (marker).

[0028] Otkriće dalje upućuje na ABM iz datog pronalaska, gde pomenuti ABM ima modifikovane oligosaharide. U jednom izvodjenju modifikovani oligosaharidi imaju smanjenu fukozilaciju u poredjenju sa ne-modifikovanim oligosaharidima. U drugim izvodjenjima, modifikovani oligosaharidi su hibridni ili u formi kompleksa. U daljem izvodjenju, ABM povećani udeo ne-fukolizovanih oligosaharida ili podeljenih na dva jednaka dela, ne-fukolizovanih oligosaharida u Fc region pomenutog molekula. U jednom izvodjenju, razdvojeni, ne-fukolizovani oligosaharidi su hibridni. U narednom izvodjenju, razdvojeni, nefukolizovani oligosaharidi predstavljaju kompleks. U jednom izvodjenju, najmanje 20% oligosaharida u Fc region pomenutog polipeptida su ne-fukolizovani ili razdvojeni, ne-fukolizovani. U poželjnim izvodjenjima, najmanje 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% ili 75% ili više oligosaharida su ne-fukolizovani ili razdvojeni, ne-fukolizovani.

[0029] Otkriće je dalje usmereno na polinukleotid koji kodira bilo koji od prethodno razmatranih ABM, i na ekspresione vektore i ćelije koje sadrže polinukleotid.

[0030] Pronalazak je dalje povezan sa postupkom za proizvodnju ABM, koji je sposoban da bude u kompeticiji sa pacovskim antitelom ICR62 za vezivanje za EGFR i gde je pomenuti ABM himeran; gde pomenuti postupak obuhvata: (a) kultivisanje ćelije domaćina koja sadrži polinukleotid koji kodira ABM iz datog pronalaska u podlozi (medijumu) pod uslovima koji dozvoljavaju ekspresiju pomenutog polinukleotida koji kodira pomenuti ABM; i (b) ponovno dobijanje ABM iz rezultujuće kulture.

[0031] U narednom aspektu, otkriće se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata ABM iz pronalaska. Podrazumeva se da farmaceutska kompozicija može dalje da sadrži farmaceutski prihvatljivi nosač, adjuvans ili njihovu kombinaciju.

[0032] U daljem aspektu, otkriće se odnosi na postupak za tretman oboljenja koji se karakteriše ekspresijom EGFR (na primer, abnormalnom ili preteranom ekspresijom EGFR). Postupak obuhvata davanje terapijski efikasne količine ABM iz datog pronalaska ispitaniku, poželjno sisaru, a poželjnije ljudima kojima je to potrebno. U poželjnom izvodjenju, oboljenje se tretira davanjem ABM koje je himerno (na primer, humanizovano) antitelo, ili himerni fragment antitela. U jednom izvodjenju, ABM se daje u količini od oko 1.0 mg/kg do oko 15.0 mg/kg. U drugom izvodjenju, ABM se daje u količini od oko 1.5 mg/kg do oko 12.0 mg/kg. U narednom izvodjenju, ABM se daje u količini od oko 1.5 mg/kg do oko 4.5 mg/kg.U drugom izvodjenju, ABM se daje u količini od oko 4.5 mg/kg do oko 12.0 mg/kg. U daljem izvodjenju, ABM se daje u količini odabranoj iz grupe koja se sastoji od oko 1.5, oko 4.5, i oko 12.0 mg/kg.

[0033] U još jednom aspektu pronalaska, pronalazak se odnosi na ćeliju domaćina konstruisanu da eksprimuje barem jednu nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid sa GnTIII aktivnošću u količini koja je dovoljna za modifikaciju/ izmenu oligosaharida u Fc regionu ABM proizvedene od strane ćelije domaćina, gde je ABM sposoban da se takmiči sa pacovskim antitelom ICR62 za vezivanje na EGFR i gde je ABM himeran. U jednom izvodjenju, polipeptid koji ima GnTIII aktivnost predstavlja fuzioni polipeptid. U drugom izvodjenju, ABM proizveden od strane ćelije domaćina predstavlja antitelo ili fragment antitela. U daljem izvodjenju, antitelo ili fragment antitela je humanizovan. U daljem izvodjenju, ABM obuhvata region koji je ekvivalentan Fc regionu humanog IgG.

[0034] Pronalazak takodje upućuje i na izolovani polinukleotid koji obuhvata barem jedan (na primer, jedan, dva, tri, četiri, pet, ili šest) region koji odredjuje komplementarnost pacovskog ICR62 antitela, ili varijantu ili njegov skraćeni oblik koji sadrži najmanje ostatke koji odredjuju specifičnost za navedeni region koji odredjuje komplementarnost, pri čemu izolovani polinukleotid kodira fuzioni polipeptid. Poželjno, takvi izolovani polinukleotidi kodiraju fuzioni polipeptid koji predstavlja antigen vezujući molekul. U jednom izvodjenju, polinukleotid sadrži tri regiona koji odredjuju komplementarnost regiona pacovskog ICR62 antitela, ili varijante ili njegove skraćene oblike koji sadrže najmanje ostatke koji odredjuju specifičnost za svaki od pomenuta tri navedena regiona koji odredjuje komplementarnost. U narednom izvodjenju, polinukleotid kodira kompletan variabilni region lakog ili teškog lanca himernog (na primer, humanizovanog) antitela. Pronalazak dalje upućuje na polipeptide kodirane takvim polinukleotidima.

[0035] U daljem izvodjenju, pronalazak takodje upućuje i na antigen vezujući molekul koji obuhvata barem jedan (na primer, jedan, dva, tri, četiri, pet, ili šest) region koji odredjuje komplementarnost pacovskog antitela ICR62, ili varijantu ili njegov skraćeni oblik koji sadrži najmanje ostatke koji odredjuju specifičnost za navedeni region koji odredjuje komplementarnost, i obuhvata sekvence izvedenu iz heterolognog polipeptida. U jednom izvodjenju, antigen vezujući molekul sadrži tri regiona koji odredjuju komplementarnost pacovskog ICR62 antitela, ili varijante ili njegove skraćene oblike koji sadrže najmanje ostatke koji odredjuju specifičnost za svaki od pomenuta tri navedena regiona koji odredjuje komplementarnost. U drugom aspektu, antigen vezujući molekul obuhvata variabilni region lakog ili teškog lanca antitela. U jednom posebno korisnom izvodjenju, antigen vezujući molekul je himerno, na primer, humanizovano, antitelo. Pronalazak se odnosi na postupke za dobijanje tih antigen vezujućih molekula, i na upotrebu istih u tretmanu oboljenja, uključujući maligna stanja kao što su kanceri bešike, mozga, glave i vrata, pankreasa, pluća, dojke, jajnika, debelog creva, prostate, kože i bubrega.

[0036] Ćelija domaćina prema datom pronalasku može biti izabrana iz grupe koja obuhvata, ali nije ograničena na, HEK293-EBNA ćeliju, CHO ćeliju, BHK ćeliju, NSO ćeliju, SP2/0 ćeliju, YO mijeloma ćeliju, P3X63 ćeliju mišijeg mijeloma, PER ćeliju, PER.C6 ćeliju ili hibridoma ćeliju. U jednom izvodjenju, ćelija domaćina iz pronalaska dalje sadrži transfektovane polinukleotide koji sadrže polinukleotid koji kodira VL region pacovskog ICR62 antitela ili njihove varijante i sekvencu koja kodira region ekvivalentan Fc regionu humanog imunoglobulina. U daljem izvodjenju, ćelije domaćina iz pronalaska dalje obuhvataju transfektovane polinukleotide koji sadrže polinukleotid koji kodira VH region pacovskog antitela ICR62 ili njegove varijante i sekvencu koja kodira region ekvivalentan Fc regionu humanog imunoglobulina.

[0037] U sledećem aspektu, otkriće je usmereno na ćeliju domaćina koja proizvodi ABM, koja pokazuje povećani afinitet vezivanja Fc receptora i/ili povećanu efektorsku funkciju kao rezultat modifikacije njegovih oligosaharida. U jednom izvodjenju, povećanje afiniteta vezivanja je za receptor koji aktivira Fc. U daljem izvodjenju, Fc receptor predstavlja receptor koji aktivira Fcγ, naročito, FcγRIIIA receptor. Ovde razmatrana efektorna funkcija može biti izabrana iz grupe koja uključuje, ali nije ograničena na, povećanu ćelijsku citotoksičnost posredovanu Fc; pojačano vezivanje za NK ćelije; povećano vezivanje za makrofage; povećano vezivanje za polimorfonuklearne ćelije; povećano vezivanje za monocite; povećani direktni prenos signala koji indukuje apoptozu; povećano sazrevanje dendritskih ćelija; i povećavaju prajming T ćelija.

[0038] U daljem izvodjenju, ćelija domaćina prema datom pronalasku sadrži najmanje jednu nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid sa GnTIII aktivnošću koji je funkcionalno povezan za konstitutivni element promotera.

[0039] U sledećem aspektu, otkriće iz pronalaska je usmereno na proizvodnju ABM u ćeliji domaćina, koja obuhvata: (a) kultivisanje ćelije domaćina koja je konstruisana tako da eksprimira barem jedan polinukleotid koji kodira fuzioni polipeptid sa aktivnošću GnTIII pod uslovima koji omogućavaju proizvodnju navedenog ABM i koji dozvoljavaju modifikaciju oligosaharida prisutnih na Fc region pomenutog ABM;

i (b) izolovanje pomenutog ABM; gde je navedeni ABM kompetitivan sa pacovskim ICR62 antitelom za vezivanje za EGFR i gde je pomenuti ABM himeran (na primer, humanizovan).

U jednom izvodjenju, polipeptid koji ima aktivnost za GnTIII predstavlja fuzioni polipeptid, i poželjno obuhvata katalitički domen GnTIII i Goldžijev lokalizacioni domen heterolognog Golgi rezidentnog polipeptida koji je izabran iz grupe koju čine lokalizacioni domen manozidaze II, lokalizacioni domen β(1,2)-N-acetilglukozaminiltransferaze I ("GnTI"), lokalizacioni domen manozidaze I, lokalizacioni domen β(1,2)-N-acetilglukozaminiltransferaze II ("GnTII"), i lokalizacioni domen centralne α1-6 fukoziltransferaze. Poželjno je da je Goldžijev lokalizacioni domen iz manozidaze II ili GnTI.

[0040] U sledećem aspektu, otkriće je usmereno na postupak za modifikaciju profila glikozilacije anti-EGFR ABM proizvedenog od strane ćelija domaćina, pri čemu postupak sadrži uvodjenje u ćeliju domaćina najmanje jedne nukleinske kiseline ili vektora ekspresije prema pronalasku. Jednom izvodjenju, ABM predstavlja antitelo ili njegov fragment; koji po mogućstvu sadrži Fc region IgG. Alternativno, polipeptid predstavlja fuzioni protein koji obuhvata region ekvivalentan Fc regionu humanog IgG.

[0041] U jednom aspektu, pronalazak je usmeren na rekombinantno, himerno antitelo, ili njegov fragment, sposobno da bude u kompeticiji sa pacovskim antitelom ICR62 za vezivanje za EGFR i koje ima smanjenu fukozilaciju.

[0042] U narednom aspektu, ovaj pronalazak je usmeren na postupak za modifikaciju glikozilacije rekombinantnog antitela ili njegovog fragmenta iz pronalaska primenom fuzionog polipeptida koji ima aktivost GnTIII i koji sadrži Goldžijev lokalizacioni domen heterolognog Goldžijevog rezidentnog polipeptida. U jednom izvodjenju, fuzioni polipeptidi prema pronalasku sadrže katalitički domen GnTIII. U narednom izvodjenju, Goldžijev lokalizacioni domen je izabran iz grupe koja se sastoji od: lokalizacionog domena manozidaze II, lokalizacionog domena GnTI, lokalizacionog domena manozidaze I, lokalizacionog domena GnTII i lokalizacionog domena centralne α1-6 fukoziltransferaze. Poželjno je da je Goldžijev lokalizacioni domen od manozidaze II ili GnTI.

[0043] U jednom izvodjenju, postupak iz pronalaska je usmeren na proizvodnju rekombinantnog, himernog antitela ili njegovog fragmenta, sa modifikovanim oligosaharidima gde pomenuti modifikovani oligosaharidi imaju sniženu fukozilaciju u poredjenju sa ne-modifikovanim oligosaharidima. Prema datom pronalasku, ovi izmenjeni oligosaharidi mogu biti hibridni ili u formi kompleksa. U jednom izvodjenju, postupak iz pronalaska je usmeren na proizvodnju rekombinantnog, himernog antitela ili njegovog fragmenta, sa povećanom udelom razdvojenih, ne-fukozilovanih oligosaharida u Fc regionu pomenutog polipeptida. U jednom izvodjenju, razdvojeni, ne-fukozilovani oligosaharidi su hibridni. U narednom izvodjenju, podeljeni, ne-fukozilovani oligosaharidi su u formi kompleksa. U daljem izvodjenju, postupak iz pronalaska je usmeren na proizvodnju rekombinantnog, himernog antitela ili njegovog fragmenta koji ima najmanje 20% oligosaharida u Fc regionu pomenutog polipeptida koji mogu biti razdvojeni, nefukozilovani. U poželjnom izvodjenju, najmanje 30% oligosaharida u Fc regionu pomenutog polipeptida su razdvojeni, nefukozilovani. U narednom poželjnom izvodjenju, u kojem je najmanje 35% oligosaharida u Fc regionu pomenutog polipeptida razdvojeno, nefukozilovano.

[0044] U sledećem aspektu, otkriće je usmereno na rekombinantna, himerna antitela ili njihov fragment, koje pokazuje povećani afinitet vezivanja Fc receptora i/ili povećanu efektorsku funkciju kao rezultat modifikacije njegovih oligosaharida. U jednom izvodjenju, povećanje afiniteta vezivanja je za receptor koji aktivira Fc. U daljem izvodjenju, Fc receptor predstavlja receptor koji aktivira Fcγ, naročito, FcγRIIIA receptor. Ovde razmatrana efektorna funkcija može biti izabrana iz grupe koja uključuje, ali nije ograničena na, povećanu ćelijsku citotoksičnost posredovanu Fc; pojačano vezivanje za NK ćelije; povećano vezivanje za makrofage; povećano vezivanje za polimorfonuklearne ćelije; povećano vezivanje za monocite; povećani direktni prenos signala koji indukuje apoptozu; povećano sazrevanje dendritskih ćelija; i povećani prajming T ćelija.

[0045] U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na fragment rekombinantnog, himernog (na primer, humanizovanog) antitela, koji ima specifičnost vezivanja pacovskog ICR62 antitela i koji sadrži Fc region, koji je konstruisan da se poveća efektorska funkcija proizvedena bilo kojim postupkom ovog otkrića.

[0046] U drugom aspektu, dati pronalazak se odnosi na fuzioni protein koji obuhvata polipeptid sa sekvencom koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO.: 1; SEQ ID No:3; SEQ ID No:5; SEQ ID No:7; SEQ ID No:9; SEQ ID No:11; SEQ ID No:13; SEQ ID No:15; SEQ ID No:17; SEQ ID No:19; SEQ ID No:21; SEQ ID No:23; SEQ ID No:25; SEQ ID No:27; SEQ ID No:29; SEQ ID No:31; SEQ ID No33; SEQ ID No:35; SEQ ID No:37; SEQ ID No:39; i SEQ ID No:121, i region ekvivalentan Fc regionu imunoglobulina i projektovan da ima povećanu efektorsku funkciju proizvedenu bilo kojim postupkom ovog otkrića.

[0047] U narednom aspektu, dati pronalazak se odnosi na fuzioni protein koji sadrži polipeptid koji ima sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:43, SEQ ID No:45; SEQ ID No:49; i SEQ ID No.:51 i region ekvivalentan Fc regionu imunoglobulina i koji je konstruisan tako da ima povećanu efektornu funkciju proizvedenu pomoću bilo kojeg od postupaka iz datog pronalaska.

[0048] U jednom aspektu, dati pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži rekombinantno, himerno (na primer, humanizovano) antitelo, proizvedeno pomoću bilo kojeg od postupaka iz datog pronalaska i farmaceutski prihvatljvog nosača. U sledećem aspektu, dati pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži fragment rekombinantnoh, himernog (na primer, humanizovanog) antitela koje je proizvedeno prema bilo kojem od postupaka iz datog pronalaska, i farmaceutski prihvatljivi nosač. U drugom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži fuzioni protein proizveden pomoću bilo kojeg od postupaka iz datog pronalaska i na farmaceutski prihvatljivi nosač.

[0049] U narednom aspektu, pronalazak upućuje na za postupak za targetiranje in vivo ili in vitro ćelija koje eksprimuju EGFR. Opisan je postupak za targetiranje ćelija koje eksprimuju EGFR kod ispitanika koji obuhvata davanje subjektu kompozicije koja obuhvata ABM iz pronalaska.

[0050] U još jednom aspektu, ovim pronalaskom opisan je postupak za odredjivanje prisustva in vivo ili in vitro EGFR u uzorku, na primer, za diagnosticiranje poremećaja u vezi sa ekspresijom EGFR. U jednom izvodjenju, detekcija se izvodi kontaktom uzorka koji treba da se testira, opciono sa kontrolnim uzorkom, sa ABM iz datog pronalaska u uslovma koji omogućavaju formiranje kompleksa izmedju ABM i EGFR. Tada se detektuje formiranje kompleksa (na primer, pomoću ELISA ili ostalih postupaka poznatim u stanju tehnike). Kada se koristi kontrolni uzorak sa testiranim uzorkom, svaka statistički značajna razlika u formiranju ABM-EGFR kompleksa kada se uporedjuju uzorci iz testa i kontrolni uzorci ukazuje na prisustvo EGFR u testiranom uzorku.

[0051] Pronalazak dalje upućuje na postupak lečenja poremećaja vezano za EGFR ekspresiju, posebno, na poremećaje ćelijske proliferacije gde se EGFR eksprimuje, i posebno, kada se EGFR abnormalno eksprimuje (na primer prekomerna ekspresija), uključujući kancere bešike, mozga, glave i vrata, pankreasa, pluća, dojke, jajnika, debelog creva, prostate, kože i bubrega koji obuhvata davanje terapijski efikasne količine rekombinantnih, himernih (na primer, humanizovanih) antitela ili njihovog fragmenta, proizvedenog bilo kojim od postupaka prema datom pronalasku, na humane subjekte za njihove potrebe.

KRATAK OPIS SLIKA

[0052] Slika 1 prikazuje funkcionalnu aktivnost pojedinačnih teških i lakih himernih pacov-čovek ICR62 polipeptidnih lanaca, kada se kombinuju sa humanizovanim ICR62 konstruktima I-HHC (teški lanac) i I-KB (laki lanac). rVL se odnosi na himerni laki lanac, a rVH se odnosi na himerni teški lanac. Oznaka “r” ukazuje na to da varijabilni domeni potiču od pacovskog antitela.

Na Slici 2 prikazano je vezivanje humanizovanih antitela ICR62 koja se sastoje od konstrukata varijabilnog regiona teškog lanca I-HHC, I-HHA i I-HLA i konstrukata humanizovanog varijabilnog regiona lakog lanca I-KA i I-KB, koji su upareni u različitim konfiguracijama.

Na slici 3 prikazano je vezivanje humanizovanih antitela ICR6 koja se sastoje od konstrukata varijabilnog regiona teškog lanca I-HLB, I-HLC i I-HLA i konstrukata humanizovanog varijabilnog regiona lakog lanca I-KA i I-KC, koji su upareni u različitim konfiguracijama .

Na slici 4 prikazano je vezivanje humanizovanih antitela ICR62 koja se sastoje od konstrukata varijabilnog regiona teškog lanca I-HLA2, I-HLA3 i I-HLA4 i konstrukta humanizovanog varijabilnog regiona lakog lanca I-KC u poredjenju sa himernim antitelima pacov-čovek ICR62.

Na slici 5 prikazano je vezivanje humanizovanih antitela ICR62 koja se sastoje od konstrukata varijabilnog regiona teškog lanca 1-HLA1, I-HLA3, I-HLA5 i I-HLA6 i konstrukta humanizovanog variabilnog regiona lakog lanca I-KC u poredjenju sa himernim antitelom pacov-čovek ICR62.

Na slici 6 prikazano je vezivanje humanizovanih antitela ICR62 koja se sastoje od konstrukata varijabilnog regiona teškog lanca I-HLA7, I-HLA6, i I-HHB i konstrukta humanizovanog varijabilnog regiona lakog lanca I-KC u poredjenju sa himernim antitelima pacov-čovek ICR62.

Na slici 7 prikazano je vezivanje humanizovanih antitela ICR62 koja se sastoje od konstrukata varijabilnog regiona teškog lanca I-HHF, I-HLA9, i I-HLA8 i konstrukta humanizovanog varijabilnog regiona lakog lanca I-KC u poredjenju sa himernim antitelom pacov-čovek ICR62.

Na Slici 8 prikazano je vezivanje humanizovanih antitela koja sa se sastoje od konstrukata varijabilnog regiona teškog lanca IHHB, I-HHD, I-HHG, I-HHF, I-HLA7 i I-HLA9 i konstrukta varijabilnog regiona lakog lanca I-KC.

Slika 9 prikazuje antitelom posredovane ćelijske citotoksičnosti (ADCC) za različite glikoforme himernog antitela ICR62, kao i za humanizovanu varijantu I-HLA4. “G1” se odnosi na modifikaciju antitela glikoinženjerstvom, ko-ekspresijom sa GnTIII. „G2“ se odnosi na modifikaciju antitela glikoinženjerstvom, koekspresijom sa GnTIII i ManII. „WT“ se odnosi na antitela koja nisu modifikovana glikoinženjerstvom. Konstrukti humanizovanog teškog lanca su upareni sa konstruktom I-KC laki lanac.

Slika 10 prikazuje ADCC za oblik koji nije modifikovan glikoinženjerstvom (WT) u odnosu na G2 glikoformu (tj., oblik modifikovan glikoinženjerstvom ko-ekspresijom sa GnTII i ManII) konstrukata I-HHB i I-HLA7 humanizovanog ICR62 antitela. Ista antitela su primenjena na dve različite ciljne ćelijske linije : na panelu A, korišćena je ciljna ćelijska linija LN229; na panelu B, korišćena je ciljna ćelijska linija A431. Konstrukti humanizovanog teškog lanca su upareni sa konstruktom IKC laki lanac.

Slike 11A i 11B prikazuju ADCC za oblike koji nisu modifikovani glikoinženjerstvom (WT) u odnosu na G2 glikoformu konstrukata himernog antitela ICR62 i humanizovanog antitela ICR62 I-HHB i I-HLA7. Korišćena je ciljna ćelijska linija A431. Konstrukti humanizovanog teškog lanca su upareni sa konstruktom IKC laki lanac.

Slika 12 pokazuje poredjenje 72h ADCC za G2 glikoforme himernog ICR62 i konstrukata I-HHB i I-HLA7 humanizovanog antitela ICR62. Konstrukti humanizovanog teškog lanca su upareni sa konstruktom I-KC laki lanac.

Slika 13 pokazuje poravnavanje aminokiselinske sekvence konstrukata humanizovanog varijabilnog regiona teškog lanca ICR62 poredjenjem sa sekvencama pacovske ICR62. Tačke predstavljaju identitet aminokiselinskih ostataka na datom položaju unutar datog konstrukta.

Slika 14 pokazuje ogled vezivanja FcgammaRIIIa-Fc u kojem se koriste CHO ćellije prikazujući rekombinantni humani FcgammaRIIIa. Humanizovano anti-EGFR IgG1 antitelo I-HHB/KC izmenjeno glikoinženjeringom se uporedjuje sa antitelom (Wt) koje nije izmenjeno glikoinženjeringom.

Slika 15 pokazuje MALD/TOF-MS profil oligosaharida anti-EGFR IgG1 antitela I-HHB/KC koje je izmenjeno glikoinženjerstvom. Glikoinženjering postignut prekomernom ekspresijom ćelija koje proizvode antitela za gene koji kodiraju enzime sa aktivnošću GnTIII i Goldžijeve manozidaze II, što za rezultat ima dobijanje 70% ne-fukozilovanih vezanih oligosaharida Fc-Asn297.

Slika 16 pokazuje anti-EGFR profil preciznosti vezivanja antitela (n = 6 replikata u opsegu odredjenom kalibracijom) za odredjivanje anti-EGFR u 1% matriksu majmunskog seruma (“pool “ majmunskih seruma CMS25/31/33, obezbedjen od strane HLS).

Slika 17 pokazuje reprezentativnu kalibracionu krivu anti-EGFR za odredjivanje anti-EGFR u 1% matriksu majmunskog seruma.

Slika18 prikazuje serumske koncentracije anti-EGFR prvog dana tokom nedeljne intravenske primene anti-EGFR na mužjake cinomolgus majmuna.

Slika 19 prikazuje serumske koncentracije anti-EGFR prvog dana tokom nedeljne intravenske primene anti-EGFR na ženke cinomolgus majmuna.

Slika 20 pokazuje vezu izmedju područja ispod anti-EGFR kriva koncentracije u zavisnosti od vremena za serum (AUC168) i nivo doze prvog dana tokom nedeljne intravenske primene anti-EGFR na cinomolgus majmune.

Slika 21 pokazuje serumske koncentracije anti-EGFR tokom nedeljne intravenske primene anti-EGFR na mužjake cinomolgus majmuna.

Slika 22 pokazuje serumske koncentracije anti-EGFR tokom nedeljne intravenske primene anti-EGFR na ženke cinomolgus majmuna.

Slika 23 pokazuje MALDI/TOF-MS profil oligosaharida iz anti-EGFR antitela koje je modifikovano u Fc regionu (izmenjeno glikoinženjerstvom), korišćeno u in vivo ispitivanjima na majmunima opisanim u Primerima u daljem tekstu.

Slika 24 pokazuje vezivanje na EGFR koji ispoljava humani karcinom ćelija A431 na površini epiderma. Korišćeno je anti-EGFR antitelo modifikovano u Fc regionu (konstrukt I-HHB), koje je korišćeno u in vivo ispitivanjima na majmunima, opisanim u Primerima u daljem tekstu.

Slika 25 pokazuje vezivanje na EGFR koji ispoljava majmunski COS-7 ćelija bubrega na površini. Antitelo koje se koristi je anti-EGFR antitelo (težak lanac I-HHB; laki lanac I-KC). Za referencu, prikazano je vezivanje za slabo eksprimovane ćelije humanog EGFR, ćelije kancera dojke MCF-7.

Slika 26 prikazuje vezivanje Fc-FcgamaRIIIa korišćenjem kompletne ćelije (CHO ćelije su napravljene tako da ispoljavaju humani FcgRIIa na svojoj površini). Korišćeno je anti-EGFR antitelo modifikovano u Fc regionu (izmenjeno glikoinženjerstvom), koje je korišćeno u in vivo ispitivanjima na majmunima, opisanim u Primerima u daljem tekstu. Vezivanje za Fc region koji nije modifikovan, kontrolno antitelo IgG1, je prikazano radi poređenja.

Slika 27 pokazuje ADCC posredovano anti-EGFR antitelo modifikovano u Fc regionu (izmenjeno glikoinženjerstvom). Ciljne ćelije su A549 ćelije humanog karcinoma pluća. ADCC aktivnost za oblik antitela za Fc koji nije izmenjen (nije modifikovan) pokazana je radi poredjenja.

Slika 28 pokazuje ADCC posredovano anti-EGFR antitelo modifikovano u Fc regionu (izmenjeno glikoinženjerstvom). Ciljne ćelije su CYNOM-K1 - ćelijska linija keratinocita cinomolgus majmuna. Radi uporedjivanja, pokazana je ADCC aktivnost za oblik antitela za Fc koji nije izmenjen (nije modifikovan). Slika 29 pokazuje EGFR ciljno vezivanje različitih konstrukata varijanti lakog lanca na bazi konstrukta I-KC uparenog sa konstruktom teškog lanca I-HHD.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0053] Pojmovi koji se ovde koriste se generalno upotrebljavaju u stanju tehnike, osim ukoliko nije drugačije definisano kako sledi.

[0054] U ovom tekstu, pod pojmom antitelo se podrazumevaju celi molekuli antitela, uključujući monoklonska, poliklonska i multispecifična (na primer, bispecifična) antitela, kao i fragmenti antitela koji sadrže Fc region i zadržavaju specifičnost prilikom vezivanja, i fuzioni protein koji obuhvataju region ekvivalentan Fc regionu imunoglobulian i koji zadržavaju specifičnost vezivanja. Takodje su obuhvaćeni fragmenti antitela koji zadržavaju specifičnost vezivanja koji obuhvataju, bez da su ograničeni na, VH fragmente, VL fragmente, Fab fragmente, F(ab’)2 fragmente, scFv fragmente, Fv fragmente, minitela, tzv. “diabodies, triabodies, and tetrabodies” (videti, na primer., Hudson and Souriau, Nature Med.9: 129-134 (2003)). Takodje su obuhvaćena i humanizovana, primatizovana i himerna antitela.

[0055] U ovom tekstu, izraz Fc region se odnosi na C-terminalni region teškog lanca IgG. Iako se granice Fc regiona teškog lanca IgG mogu malo razlikovati, Fc region teškog lanca humanog IgG je obično definisan da se proteže od aminokiselinskog ostatka u položaju Cys226 do karboksilne grupe na samom kraju.

[0056] U ovom tekstu, pojam region koji je ekvivalentan Fc regionu imunoglobulina odredjen je da obuhvata prirodne alelske varijante Fc region imunoglobulina kao i varijante koje imaju promene koje proizvode supstitucije, adicije, ili delecije, ali koje ne smanjuju značajno sposobnost imunoglobulina da posreduje u efektorskim funkcijama (kao što je ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela). Na primer, jedna ili više aminokiselina može biti deletirana sa N- ili C- kraja Fc regiona imunoglobulina bez značajnog gubitka biološke funkcije. Takve varijante mogu biti odabrane na osnovu opštih pravila koja su poznata u stanju tehnike tako da imaju minimalan efekat na aktivnost. (Videti, na primer., Bowie, J. U. et al., Science 247:1306-1310 (1990).

[0057] U ovom tekstu, izraz EGFR odnosi se na receptor humanog epidermalnog faktora rasta (poznatog i kao HER-1 ili Erb-B1) (Ulrich, A. et al., Nature 309:418-425 (1984); SwissProt pristupni broj #P00533; drugi po redu pristupni brojevi: O00688, O00732, P06268, Q14225, Q92795, Q9BZS2, Q9GZX1, Q9H2C9, Q9H3C9, Q9UMD7, Q9UMD8, Q9UMG5), kao i njegove prirodne izoforme i varijante. Te izoforme i varijante obuhvataju ali nisu ograničene na EGFRvIII varijantu, alternativno spojene proizvode (kao što su na primer, identifikovani pomoću SwissProt pristupnih brojeva P00533-1, P00533-2, P00533-3, P00533-4), varijante GLN-98, ARG-266, Lys-521, ILE-674, GLY-962, i PRO-988 (Livingston, R.J. et al., NIEHS-SNPs, projekat genoma životne sredine, NIEHS ES15478, Odeljenje za nauke o genomu, Seattle, WA (2004)), i ostali koji se mogu identifikovati na osnovu pristupnih brojeva: NM_005228.3, NM_201282.1, NM_201283.1, NM_201284.1 (REFSEQ mRNAs); AF125253.1, AF277897.1, AF288738.1, AI217671.1, AK127817.1, AL598260.1, AU137334.1, AW163038.1, AW295229.1, BC057802.1, CB160831.1, K03193.1, U48722.1, U95089.1, X00588.1, X00663.1; H54484S1, H54484S3, H54484S2 (MIPS assembly); DT.453606, DT.86855651, DT.95165593, DT.97822681, DT.95165600, DT.100752430, DT.91654361, DT.92034460, DT.92446349, DT.97784849, DT.101978019, DT.418647, DT.86842167, DT.91803457, DT.92446350, DT.95153003, DT.95254161, DT.97816654, DT.87014330, DT.87079224 (DOTS).

[0058] U ovom tekstu, izraz EGFR ligand odnosi se na polipeptid koji se veže i/ili aktivira EGFR. Izraz uključuje prekursore vezane za membranu EGFR liganda, kao i na proteolitički obradjene rastvorljive oblike EGFR liganda.

[0059] U ovom tekstu, pojam aktivacija liganda za EGFR odnosi se na prenos signala (na primer, koji je izazvan unutarćelijskim kinaznim domenom EGFR receptora koji fosforilizuje tirozinske ostatke u EGFR ili supstratnom polipeptidu) posredovan vezivanjem liganda za EGFR.

[0060] U ovom tekstu, izraz oboljenje ili poremećaj karakteriše se abnormalnom aktivacijom ili proizvodnjom EGFR ili EGFR liganda ili poremećaja u vezi sa EGFR ekspresijom, koji se odnosi na stanje, koje može ili ne mora uključivati malignost ili kancer, gde se abnormalna aktivacija i/ili proizvodnja EGFR i/ili EGFR liganda javlja u ćelijama ili tkivima ispitanika koji imaju ili imaju predispoziciju za oboljenje ili poremećaj.

[0061] U ovom tekstu, izrazi povećana ekspresija, povećano eksprimirani, pojačano eksprimiraju, koji se koriste u vezi sa ćelijama koje eksprimuju EGFR, odnose se na ćelije koje imaju merljivo veće nivoe EGFR na njihovoj površini u poredjenju sa normalnom ćelijom iste vrste tkiva. Takva prekomerna ekspresija može biti izazvana amplifikacijom gena ili povećanom transkripcijom ili translacijom. Ekspresija EGFR (i prema tome, prekomerna ekspresija) može se odrediti diagnostičkim ili prognostičkim ogledom na osnovu procene

nivoa EGFR prisutnih na površini ćelije ili u ćelijskom lizatu na osnovu tehnika koje su poznate u stanju tehnike: na primer, preko imunohistohemijskih ogleda, korišćenjem imunofluorescentnih tehnika, imunoenzimskih ogleda, ELISA, protočne citometrije, radioimunoloških ogleda, Western blot, vezivanjem liganda, ogled sa aktivnošću kinaze, itd. (Videti generalno, CELL BIOLOGY: A LABORATORY HANDBOOK, Celis, J., ed., Academic Press (2d ed., 1998); CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE, Coligan, J.E. et al., eds., John Wiley & Sons (1995-2003); videti takodje, Sumitomo et al., Clin. Cancer Res. 10: 794-801 (2004) (opisujući Western blot, protočnu citometriju, i imunohistohemiju))). Alternativno, ili dodatno, mogu se izmeriti nivoi molekula nukleinske kiseline koji kodiraju EGFR u ćeliji, na primer, putem fluorescentne in situ hibridizacije, tehnike Southern blotting, ili PCR tehnikama. Nivoi EGFR u normalnim ćelijama se porede sa nivoima ćelija koje su pod uticajem poremećaja u vidu ćelijske proliferacije (na primer, kancera) da bi se utvrdilo da li je EGFR izložen prekomernoj ekspresiji.

[0062] U ovom tekstu, izraz molekul koji vezuje antigen odnosi se u njegovom širem smislu na molekul koji specifično vezuje antigensku determinantu. Konkretno, molekul koji vezuje antigen koji vezuje EGFR predstavlja molekul koji se specifično vezuje za transmembranski receptor od 170 kDa, koji je obično označen kao receptor epidermalnog faktora rasta (EGFR), ali je takodje poznat i kao HER-1 or ErbB1. Pod pojmom "specifično vezuje" se podrazumeva da je vezivanje selektivno za antigen i da se može razlikovati od neželjenih ili nespecifičnih interakcija.

[0063] U ovom tekstu, termini fuzioni i himerni, kada se koriste u vezi sa polipeptidima kao što je ABM odnosi se na polipeptide sa aminokiselinskim sekvencama koji su izvedeni iz dva ii više heterolognih polipeptida, kao što su delovi antitela iz različitih vrsta. Za himerne ABM, na primer, komponente koje ne vezuju antigen mogu biti izvedene iz širokog opsega vrsta, uključujući primate, kao što su šimpanze i ljudi. Konstantni region himernog ABM je po mogućstvu suštinski identičan konstantnom regionu prirodnog humanog antitela; varijabilni region himernog antitela je po mogućstvu suštinski identičan onome rekombinantnog anti-EGFR antitela sa aminokiselinskom sekvencom varijabilnog regiona životinje koja pripada glodarima. Humanizovana antitela su naročito poželjan oblik fuzije ili himernih antitela.

[0064] U ovom tekstu, polipeptid koji ima aktivnost GnTIII odnosi se na polipeptide koji su u stanju da katalizuju dodavanje N-acetilglukozaminskog (GlcNAc) ostatka u β-1-4 vezu β-vezanog manozida trimanozil centralnog jezgra N-vezanih oligosaharida. Ovo obuhvata fuzione polipeptide koji ispoljavaju enzimsku aktivnost koja je slična, ali ne neophodno slična, aktivnosti β(1,4)-N-aceilglukozaminiltransferaze III, poznatoj i kao β-1,4-manozil-glikoprotein 4-beta-N-acetilglukosaminiltransferaza (EC 2.4.1.144), prema Nomenklaturi komiteta medjunarodne unije Biohemičara i Molekularnih Biologa (NC-IUBMB), merenoj odredjenim biološkim testom, sa ili bez zavnosti od doze. U slučaju gde zavisnost postoji, ona ne mora biti identična onoj kod GnTIII, već pre značajno slična zavisnosti od doze u datoj aktivnosti u poredjenju sa GnTIII (tj. polipeptidni kandidat će ispoljavati veću aktivnost ili ne više od oko 25 puta manju, i poželjno, ne više od deset puta manju aktivnost u odnosu na GnTIII.)

[0065] U ovom tekstu, izraz varijanta (ili analog) označava polipeptid koji se razlikuje od specifično navedenog polipeptida prema pronalasku prema insercijama aminokiselina, delecijama, i supstitucijama, stvorenih upotrebom, na primer, rekombinantnih DNK tehnika. Varijante ABM prema datom pronalasku uključuju himerne, primatizovane ili humanizovane molekule koji vezuju antigen, u kome su jedan ili nekoliko aminokiselinskih ostataka izmenjeni supstitucijom, adicijom i/ili delecijom na takav način koji ne utiče bitno na afinitet vezivanja antigena (na primer, EGFR). Uputstvo za odredjivanje aminokiselinskih ostataka koje može biti zamenjeno, dodato ili izbrisano bez poništavanja aktivnosti od značaja, može se naći poredjenjem sekvence odredjenog polipeptida sa homologim peptidima i minimiziranjem broja promena aminokiselinskih sekvenci izvršenih u visoko homologim regionima (konzervativni regioni) ili zamenom aminokiselina sa konsensus sekvencom.

[0066] Alternativno, rekombinantne varijante koje kodiraju ove iste ili slične polipeptide mogu da se sintetizuju ili selektuju korišćenjem"redundantnosti" u genetskom kodu. Različite supstitucije kodona, kao što su tihe promene koje proizvode različita restrikciona mesta, mogu biti uvedene da bi se optimizovalo kloniranje u plazmidnom ili virusnom vektoru ili ekspresijom u odredjenom prokariotskom ili eukariotskom sistemu. Mutacije u polinukleotidnoj sekvenci mogu da se odražavaju na polipeptid ili domene drugih peptida koji se dodaju u polipeptid da bi se izmenile osobone bilo kojeg dela popipetida, da bi se promenile karakteristike kao što su afiniteti vezivanja liganda, medjulančani afiniteti ili stopa razgradnje / ponovne sinteze.

[0067] Poželjno, aminokiselinske "supstitucije" nastaju kao rezultat zamene jedne aminokiseline drugom aminokiselinom koja ima slične strukturne i/ili hemijske osobine, tj., konzervativne aminokiselinske zamene. "Konzervativne" aminokiselinske supstitucije mogu da nastanu na osnovu sličnosti u polarnosti, naelektrisanju, rastvorljivosti, hidrofobnosti, hidrofilnosti, i/ili amfipatične prirode uključenih ostataka. Na primer, nepolarne (hidrofobne) aminokiseline uključuju alanin, leucin, izoleucin, valin, prolin, fenilalanin, triptofan, i metionin; polarne neutralne aminokiseline uključuju glicin, serin, treonin, cistein, tirozin, asparagin, i glutamin; pozitivno naelektrisane (bazne) aminokiseline obuhvataju arginin, lizin, i histidin; i negativno naelektrisane (kisele) aminokiseline obuhvataju asparaginsku kiselinu i glutaminsku kiselinu. "Insercije" ili "delecije" sup o mogućstvu u opsegu od oko 1 do 20 aminokiselina, poželjnije od 1 do 10 aminokiselina . Dozvoljena varijacija može biti eksperimentalno odredjena putem sistematskog stvaranja insercija, delecija, ili supstitucija aminokiselina u polipeptidnom molekulu korišćenjem tehnika rekombinantne DNK i ispitivanjem rezultujućih rekombinantnih varijanti za aktivnost.

[0068] U ovom tekstu, izraz humanizovan se koristi za označavanje antigen-vezujućeg molekula koji je izveden iz ne-humanog antigen-vezujućeg molekula, na primer, mišijeg antitela, koji zadržava ili značajno zadržava osobine vezivanja antigena za matični molekul ali koji je manje imunogen kod ljudi. Ovo se može postiči različitim postupcima koji uključuju (a) grafting samo ne-humanih variabilnih domena na humane konstantne regione da bi se stvorila himerna antitela,

(b) grafting samo ne-humanih CDR na humani okvirni region i konstantne regione sa ili bez zadržavanja kritičnih okvirnih ostataka (na primer, onih koji su značajni za zadržavanje dobrog afiniteta za antigen ili funkciju antitela),

ili (c) transplantacijom kompletnih ne-humanih varijabilnih domena, već njihovim "ogrtanjem" sa delom koji je sličan humanom zamenom površinskih ostataka. Takvi postupci su navedeni u Jones et al., Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994). Generalno postoje 3 regiona koja odredjuju komplementarnost, ili CDRs, (CDR1, CDR2 i CDR3) u svakom od varijabilnih domena teškog ili lakog lanca antitela, koji su okruženi sa četiri okvirna podregiona (tj., FR1, FR2, FR3, i FR4) u svakom od varijabilnih domena teškog i lakog lanca antitela: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Razmatranje humanizovanih antitela može se pored ostalog, naći, u američkom patentu br. 6,632,927, i u objavljenoj američkoj prijavi br.

2003/0175269.

[0069] Slično tome, izraz primatizovan se koristi za označavanje antigen-vezujućih molekula izvedenih iz ne-primatskog antigen-vezujućeg molekula, na primer, mišijeg antitela, koje zadržava ili značajno zadržava osobine vezivanja antigena matičnog molekula ali koji je manje imunogen kod primata.

[0070] U slučaju sa postoje dve ili više definicija izraza koji je korišćen i/ii prihvaćen unutar stanja tehnike, definicija izraza u ovom tekstu, obuhvata sva takva značenja, osim ukoliko nije navedeno suprotno. Specifični primer je upotreba izraza "region koji odredjuje komplementarnost" ("CDR") da bi se opisala ne-susedna mesta za kombinovanje antigena koja se nalaze u pormenjivom regionu i teškog i lakog lanca polipeptida. Ovaj odredjeni region je opisan od strane Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) i od strane Chothia et al., J. Mol. Biol.

196:901-917 (1987), gde definicije uključuju prekalpanje ili podgrupe aminokiselinskih ostataka kada se porede jedni sa drugima. Ipak, primena svake od definicija da bi se opisao CDR antitela ili njegove varijante treba da bude odredjen unutar opsega temina koji su ovde definisani i korišćeni. Odgovarajući aminokiselinski ostaci koji obuhvataju CDR kao što je definisano u svakoj od gore citiranih referenci, prikazani su niže u Tabeli I kao poredjenje. Tačan broj ostataka koji obuhvata odredjeni CDR variraće u zavisnosti od sekvence i veličine CDR. Stručnjaci iz date oblasti mogu rutinski da odrede koji ostaci obuhvataju odredjeni CDR imajući u vidu aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona antitela.

TABELA 1 D fini i z DR

<1>Označavanje svih definicija za CDR u Tabeli 1 je na osnovu konvencija o numerisanju koje je izneo Kabat et al. (videti niže).

<2>"AbM" se odnosi na CDR kako je definisano pomoću oksfordovog molekularnog softvera za modeliranje "AbM" antitela.

[0071] Kabat et al. su takodje definisali sistem numerisanja za sekvence varijabilnog domena koji je primenjiv za svako antitelo. Stručnjaci iz date oblasti mogu nedvosmisleno da pripišu ovaj sistem "Kabat numerisanju" za svaku sekvencu varijabilnog domena, bez oslanjanja na bilo kakve eksperimentalne rezultate izvan same sekvence. U ovom tekstu, "Kabat numerisanje" odnosi se na sistem za numerisanje naveden u Kabat et al., Američko odeljenje za zdravlje i humane usluge, "Sekvence Proteina od Imunološkog značaja" (1983). Osim ukoliko drugačije nije navedeno, numerisanje specifičnih položaja aminokiselinskih ostataka u ABM-u u skladu su sa sistemom Kabat numerisanja. Sekvence u listingu sekvenci (tj., SEQ ID NO:1 do SEQ ID NO:127) nisu numerisane prema sistemu Kabat. Medjutim, kao što je prethodno navedeno, stručnjak iz oblasti odrediće šemu Kabat numerisanja za bilo koju sekvencu varijabilnog regiona u listingu sekvenci na osnovu numerisanja sekvenci koje su prisutne u njima.

[0072] Nukleinska kiselina ili polinukleotid koji ima nukleotidnu sekvencu na primer, najmanje 95% "identičnu" ispitivanoj nukleotidnoj sekvenci iz datog pronalaska, gde je nukleotidna sekvenca polinukleotida identična referentnoj sekvenci, izuzev što polinukleotidna sekvenca može da obuhvata do pet tačaka mutacije na svakih 100 nukleotida referentne nukleotidne sekvence. Drugim rečima, da bi se dobio polinukleotid sa nukleotidnom sekvencom koja je najmanje 95% identična sa referentnom nukleotidnom sekvencom, do 5% nukleotida u referentnoj sekvenci može da bude deletirano ili supstituisano sa drugim nukleotidom, ili broj nukleotida do 5% od ukupnog broja nukleotida u referentnoj sekvenci može biti ubačen u referentnu sekvencu.

[0073] Kao praktično pitanje, da li je bilo koji odredjeni molekul nukleinske kiseline ili polipeptida može barem 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% biti identičan sa nukleotidnom sekvencom ili polipeptidnom sekvencom iz datog pronalaska, može se odrediti uobičajeno upotrebom poznatih kompjuterskih programa. Poželjan postupak za odredjivanje najboljeg ukupnog poklapanja izmedju ispitivane sekvence (sekvenca prema datom pronalasku) i predmetne sekvence, koja je takodje označena kao globalno poravnanje sekvence, može se odrediti korišćenjem FASTDB kompjuterskog programa na bazi algoritma od strane Brutlag et al., Comp. App. Biosci.6:237-245 (1990). Kod poravnavanja sekvence, ispitivane i predmetne sekvece obe predstavljaju DNK sekvence. RNK sekvenca može se uporediti pretvaranjem U u T. Rezulat globalnog ravnanja predstavljen je u procentima identičnosti. Poželjni parametri korišćeni u FASTDB poravnavanju DNK sekvenci za izračunavanje procenta identičnosti su: Matrix=Unitary, k-tuple=4, Mismatch Penalty=1, Joining Penalty=30, Randomization Group Length=0, Cutoff Score=1, Gap Penalty=5, Gap Size Penalty 0.05, Window Size=500 ili dužina predmetne nukleotidne sekvence, bilo koje, koji je kraći.

[0074] Ako je predmetna sekvenca kraća od ispitivane sekvence zbog 5’ ili 3’ delecija, ne zbog unutrašnjih delecija, mora se izvršiti manuelna korekcija rezultata. Ovo je zbog toga što FASTDB program ne uzima u obzir 5’ i 3’ skraćenja predmetne sekvence prilikom izračunavanja procenta identičnosti. Za predmetne sekvence skraćene na 5’ ili 3’ krajevima, u odnosu na ispitivanu sekvencu, procenat identiteta se ispravlja izračunavanjem broja baza iz ispitivane sekvence koje predstavljaju 5’ i 3’ predmetne sekvence, koje se ne podudaraju/ poravnavaju, kao procenat od ukupnih baza iz ispitivane sekvence. Da li se nukleotid podudarada li poravnat, odredjuje se pomoću rezultata FASTDB-poravnavanja sekvence. Ovaj procenat zatim se oduzima od procenta identičnosti, izračunatog pomoću prethodno navedenog FASTDB programa primenom odredjenih paramatara, da bi se dobio konačan skor procenta identičnosti. Ovaj korigovani skor je ono što se koristi u svrhe datog pronalaska. Samo baze izvan 5’ i 3’ baza predmetne sekvence, kao što je prikazano FASTDB poravnanjem, koje se ne poklapaju- nisu poravnate sa ispitivanom sekvencom, se proračunavaju u svrhu manuelnog podešavanja skora procenta identičnosti.

[0075] Na primer, predmetna sekvenca od 90 baza poravnata je sa ispitivanom sekvencom od 100 da bi se odredio procenat identičnosti. Delecije se javljaju na 5’ kraju predmetne sekvence i stoga, FASTDB-poravnavanje ne pokazuje podudaranje/ poravnavanje prvih 10 baza na 5’ kraju. 10 nesparnih baza predstavljaju 10% sekvence (broj baza na 5’ i 3’ krajevima ne podudara se/ukupan broj baza u ispitivanoj sekvenci) tako da se 10% oduzima od skora procenta identičnosti izračunatog pomoću FASTDB-programa. Ako se preostalih 90 baza savršeno podudara konačan procenat identičnosti bi bio 90%. U sledećem primeru, predmetna sekvenca od 90 baza uporedjivana je sa ispitivanom sekvencom od 100 baza. Ovoga puta delecije predstavljaju unutrašnje delecije tako da na 5’ ili 3’ predmetne sekvence nema baza koje se ne podudaraju/ nisu poravnate sa ispitivanom sekvencom. U ovom slučaju, procenat identičnosti izračunat pomoću FASTDB nije manuelno ispravljen. Još jednom, samo baze 5’ i 3’ predmetne sekvence koje nisu podudarne/ poravnate sa ispitivanom sekvencom manuelno su ispravljene. Nikakve druge manuelne ispravke se ne vrše u svrhu predstavljenog pronalaska.

[0076] Polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu barem 95% "identičnu" sa ispitivanom aminokiselinskom sekvencom iz datog pronalaska, podrazumeva se da je aminokiselinska sekvenca predmetnog polipeptida identična ispitivanoj sekvenci izuzev što sekvenca predmetnog polipeptida može da obuhvati do pet aminokiselinskih promena na svakih 100 aminokiselina ispitivane aminokselinske sekvence. Drugim rečima, da bi se dobio polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom koja je barem 95% identična sa ispitivanom aminokiselinskom sekvencom, do 5% aminokiselinskih ostataka u predmetnoj sekvenci može da bude insertirano, deletirano ili supstituisano drugom amino kiselinom. Ove promene referentne sekvence javljaju se na terminalnim položajima sa amino ili karboksi grupom u referentnoj aminokiselinskoj sekvenci ili bilo gde izmedju terminalnih položaja, koje su umetnute bilo pojedinačno medju ostacima u referentnoj sekvenci ili u jednom ili više uzastopnih grupa unutar referentne sekvence.

[0077] Kao praktično pitanje, da li je neki odredjeni polipeptide barem 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan referentnom polipeptidu može se odrediti na uobičajeni način korišćenjem poznatih kompjuterskih programa. Poželjna postupak za odredjivanje najboljeg ukupnog preklapanja izmedju ispitivane sekvence (sekvenca prema datom pronalasku) i predmetne sekvence, koje se takodje naziva globalno poravnavanje sekvence, može da se odredi primenom FASTDB kompjuterskog programa na bazi algoritma koji su predstavili Brutlag et al., Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990). Kod poravnavanja sekvenci, ispitivana i predmetna sekvenca su ili obe nukleotidne sekvence ili obe aminokiselinske sekvence. Rezultat navedenog globanog poravnavanja sekvence je u procentu identičnosti. Poželjni parametri koji se koriste u FASTDB aminokiselinskom poravnavanju su:

Matrix=PAM 0, k-tuple=2, Mismatch Penalty=1, Joining Penalty=20, Randomization Group Length=0, Cutoff Score=1, Window Size=sequence length, Gap Penalty=5, Gap Size Penalty=0.05, Window Size=500 ili dužina predmetne aminokiselinske sekvence, koji je kraći.

[0078] Ako je predmetna sekvenca kraća od ispitivane sekvence zbog N- ili C-terminalnih delecija, a ne zbog unutrašnjih delecija, mora se napraviti manuelna ispravka rezultata. Ovo je zbog toga što FASTDB program ne uračunava N- i C-terminalna skraćenja predmetne sekvence prilikom izračunavanja globalnog procenta identičnosti. Za predmetne sekvence koje su skraćene na N- i C-terminalnom kraju, u odnosu na ispitivanu sekvencu, procenat identičnosti je ispravljen izračunavanjem broja ostataka ispitivane sekvence koji predstavljaju N- i C-terminalne krajeve predmetne sekvence, koji se nisu podudarili/ nisu poravnati sa odgovarajućom predmetnom sekvencom, kao procenat ukupnih baza ispitivane sekvence. Da li se ostatak poklapa/da li je poravnat odredjuje se pomoću rezultata FASTDB poravnavanja sekvenci. Ovaj procenat se onda oduzima od procenta identičnosti, izračunatog pomoću gore navedenog FASTDB programa korišćenjem odredjenih parametara, da bi se postigao konačan skor procenta identičnosti. Ovaj konačni skor procenta identičnosti je ono što se koristi u svrhe ovog pronalaska. Samo ostaci prema N- i C-terminalnom kraju predmetne sekvence, koji se ne podudaraju/ nisu poravnati sa ispitivanom sekvencom, razmatraju se za svrhe manuelnog podešavanja skora procenta identičnosti. Odnosno, samo položaji ostatka ispitivane sekvence izvan najudaljenijih N- i C-terminalnih ostataka predmetne sekvence.

[0079] Na primer, 90 aminokiselinskih ostataka iz predmetne sekvence je poravnata sa ispitivanom sekvencom od 100 ostataka da bi se odredio procenat identičnosti. Delecija se javlja na N-terminalnom kraju predmetne sekvence i prema tome, FASTDB poravnavanje ne pokazuje podudaranje/poravnavanje za prvih 10 ostataka na N-terminlanom kraju. 10 nesparenih ostataka predstavlja 10% sekvence (broj ostataka na N- i C- terminalnim krajevima ne poklapa se /sa ukupnim brojem ostataka u ispitivanoj sekvenci) tako da se 10% oduzima od skora procenta identičnosti izračunatog pomoću FASTDB programa. Ako bi se 90 preostalih ostataka savršeno podudarilo, konačni skor identičnosti bi iznosio 90%. U drugom primeru, predmetna sekvenca od 90 ostataka se poredi sa ispitivanom sekvencom od 100 ostataka. Ovoga puta delecije su unutrašnje delecije tako da nema ostataka na N- ili C-terminalnim krajevima predmetne sekvence koji se ne podudaraju/ nisu poravnati sa ispitivanom sekvencom. U ovom slučaju skor identičnosti izračunat pomoću FASTDB nije ručno ispravljen. Još jednom, samo položaji ostataka izvan N- i Cterminalnih krajeva predmetne sekvence, kao što je prikazano u FASTDB poravnavanju, koje se ne podudaraju/nisu poravnate sa ispitivanom sekvencom se manuelno ispravljaju. Druge manuelne korekcije se ne mogu ispraviti u svrhe datog pronalaska.

[0080] u ovom tekstu, nukleinska kiselina koja se "hibridizuje u strogim uslovima" u sekvencu nukleinske kiseline iz pronalaska, odnosi se na polinukleotid koji hibridizuje u inkubaciji na temperaturi od 42°C tokom noći u rastvoru koji sadrži 50% formamid, 5x SSC (750 mM NaCl, 75 mM natrijum citrat), 50 mM natrijum fosfata (pH 7.6), 5x Denhardov rastvor, 10% dekstran sulfat, i 20 mg/ml denaturisane, DNK sperme lososa, što je praćeno ispiranjem filtera u 0.1x SSC na temperaturi od oko 65°C.

[0081] U ovom tekstu, izraz Goldžijev lokalizacioni domen odnosi se na aminokiselinsku sekvencu Golžijevog rezidentnog polipeptida koji je odgovoran za učvršćenje polipeptida u položaju unutar Goldžijevog kompleksa. Generalno, lokalizacioni domeni obuhvataju amino terminalne "repove" enzima.

[0082] U ovom tekstu, izraz efektorna funkcija odnosi se one biološke aktivnosti koje se mogu pripisati Fc regionu (nativne sekvence Fc regiona ili aminokiselinske sekvence varijante Fc regiona) antitela. Primeri efektornih funkcija antitela obuhvataju, ali nisu ograničeni na, afinitet vezivanja za Fc receptor, ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), ćelijsku fagocitozu zavisnu od antitela (ADCP), sekrecije citokina, pojačano preuzimanje posredovano imunskim kompleksom od strane antigen-prezentujućih ćelija, nishodnu regulaciju receptora ćelijske površine, itd..

[0083] U ovom tekstu, izrazi konstrukcija, inženjering, i glikozilacioni inženjering smatra se da obuhvataju svaku manipulaciju glikozilacionog obrasca prirodnog ili rekombinantnog polipetida ili njegovog fragmenta. Glikozilacioni inženjering obuhvata metabolički inženjering glikozilacione mašinerije ćelije, uključujući genetske manipulacije puteva sinteze oligosaharida radi postizanja promenjene glikozilacije glikoproteina eksprimiranog u ćelijama. Pored toga, glikozilacioni inženjering obuhvata efekte mutacija i ćelijske sredine na glikozilaciju. U jednom izvodjenju, glikozilacioni inženjering je promena u aktivnošću glikoziltransferaze. U jednom izvodjenju, rezultat inženjeringa je promena u aktivnosti glukozaminiltransferaze i/ili aktivnosti fukoziltransferaze.

[0084] U jednom tekstu, izraz ćelija domaćina pokriva svaki tip ćelijskog sistema koji može biti dobijen inženjeringom tako da stvara polipeptide i antigen-vezujući molekuli iz datog pronalaska. U jednom izvodjenju, ćelija domaćina je dobijena inženjeringom da bi se omogućila proizvodnja molekula sa modifikovanim glikoformama. U poželjnom izvodjenju, antigen vezujući molekul predstavlja antitelo, fragment antitela, ili fuzioni protein. U odredjenim izvodjenjima, ćelije domaćina su dalje manipulisane kako bi eksprimirale povećane nivoe jednog ili više polipeptida sa GnTIII aktivnošću. Ćelije domaćina uključuju kultivisane ćelije, na primer, kultivisane ćelije sisara, kao što su CHO ćelije, HEK293-EBNA ćelije, BHK ćelije, NS0 ćelije, SP2/0 ćelije, YO ćelije mijeloma, P3X63 mišije ćelije mijeloma, PER ćelije, PER.C6 ćelije ili hibridoma ćelije, ćelije kvasca, ćelije insekta, i biljne ćelije, da nabrojimo samo nekoliko, ali i ćelije koje se nalaze unutar transgene životinja, transgene biljke ili kultuivisanih biljnih ili životinjskih tkiva.

[0085] U ovom tekstu, izraz ćelijska citotoksičnost posredovana Fc obuhvata ćelijsku citotoksičnost posredovanu antitelom i ćelijsku citotoksičnost posredovanu rastvorljivim Fc-fuzionim proteinom sa human Fc-regionom. To je imuni mehanizam koji dovodi do liziranja "ćelija na koje deluju antitela" pomoću "humanih imunih efektornih ćelija", u kojem:

[0086] Humane imune efektorske ćelije predstavljaju populaciju leukocita koji pokazuju Fc receptore na svojoj površini preko kojih se vezuju za Fc region antitela ili za Fc fuzione proteine i obavljaju efektorske funkcije. Takva populacija može da obuhvati, ali nije ograničena na, mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i/ili prirodne ćelije ubice (NK).

[0087] Ćelije na koje ciljno deluju antitela su ćelije vezane od strane antitela ili Fc-fuzionih proteina. Antitela ili Fc fuzioni protein vezuju se za ciljne ćelije preko N-terminalnog proteinskog dela Fc regiona.

[0088] U ovom tekstu, izraz povećana ćelijska citotoksičnost posredovana Fc definisana je ili kao povećanje broja "ćelija koje ciljno deluju na antitelo" koje su lizirane u datom vremenu, pri datoj koncentraciji antitela, ili Fc-fuzionog proteina, u medijumu koji okruženog ciljnim ćelijama, pomoću gore opisanog mehanizma ćelijske citotoksičnosti posredovane Fc, i/ili smanjenje koncentracije antitela, ili Fc-fuzionog proteina, u medijumu okruženog ciljnim ćelijama, potrebnog za postizanje liziranja datog broja "ćelija koje ciljno deluju na antitelo", u datom vremenu, pomoću mehanizma ćelijske citotoksičnosti posredovanog Fc. Povećanje ćelijske citotoksičnosti posredovane Fc je u odnosu na ćelijske citotoksičnosti posredovanu preko istog antitela, ili Fc-fuzionog proteina, proizvedenog iz istog tipa ćelija domaćina, korišćenjem standardnog postupaka, prečišćavanja, formulacije i čuvanja, koji su poznati stručnjacima iz te oblasti, ali koji nisu proizvedeni od strane ćelija domaćina konstruisanih tako da eksprimiraju GnTIII glikoziltransferazu pomoću ovde opsianih postupaka.

[0089] Pomoću antitela sa povećanom ćelijskom citotoksičnošću zavisnom od antitela (ADCC) podrazumeva se antitelo, kao što je taj termin ovde definisan, koji ima povećanu ADCC kao što je odredjeno bilo kojim odgovarajućim postupkom od strane stručnjaka. Jedan prihvaćeni in vitro ADCC test je kao što sledi:

1) test koristi ciljne ćelije za koje je poznato da eksprimiraju ciljni antigen koji prepoznaje region antitela koji vezuje antigen;

2) test koristi humane mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMCs), izolovane iz krvi nesumično izabranog zdravog davaoca, kao efektorne ćelije;

3) test je izveden prema sledećem protokolu:

i) PBMC su izolovani korišćenjem standardnih postupaka centrifugiranja prema gustini i suspendovane su u 5 x 10<-6>ćelija/ml u RPMI podlozi za ćelijsku kulturu;

ii) ciljne ćelije su uzgajane pomoću standardnih postupaka za kulturu tkiva, sakupljene su iz faze eksponencijalnog rasta sa vijabilnošću većom od 90%, isprane u RPMI medijumu za ćelijsku kulturu, obeleženi sa 100 mikro-kirija od 51Cr, isprane dva puta sa medijumom za ćelijsku kulturu, i resuspendovane u medijumu za ćelijsku kulturu pri gustini od 105 ćelija po/ml;

iii) 100 mikrolitara finalne suspenzije ciljnih ćelija iz prethodnog dela se prenosi u svaki bunarčić 96-komorne mikrotitarske ploče;

iv) antitelo se serijski razblažuje od 4000 ng/ml do 0.04 ng/ml u medijumu za ćelijsku kulturu i 50 mikrolitara dobijenih rastvora antitela se dodaje u ciljne ćelije u 96-komornoj mikrotitarskoj ploči, izvršeno je testiranje u triplikatima različitih koncentracija antitela koje pokrivaju ceo opseg koncentracija naveden u prethodnom testu;

v) za kontrole sa maksimalnim oslobadjanjem (MR), u 3 dodatne komorice (bunarčiće) u ploči koja sadrži obeležene ciljne ćelije, dodaje se 50 mikrolitara 2% (V/V) vodenog rastvora ne-jonskog deterženta (Nonidet, Sigma, St. Louis), umesto rastvora antitela (tačka iv u prethodnom delu teksta);

vi) za kontrole sa sponatanim oslobadjanjem (SR), u 3 dodatne komorice (bunarčiće) u ploči koja sadrži obeležene ciljne ćelije, dodaje se 50 mikrolitara RPMI medijuma za ćelijsku kulturu umesto rastvora antitela (tačka iv u prethodnom delu teksta);

vii) 96-komorna mikrotitarska ploča se zatim centrifugira na 50 x g u vremenu od 1 minuta i inkubira 1 h na temperaturi od 4°C;

viii) 50 mikrolitara suspenzije PBMC (tačka i u prethodnom delu teksta) dodato je u svaku komoricu da bi se dobio odnos efektor: ciljna ćelija od 25:1 i ploče su postavljene u inkubator u atmosferi 5% CO2 na temperaturi od 37°C tokom 4 h;

ix) supernatant bez ćelija iz svake komorice je sakupljen i eksperimentalno oslobodjena radioaktivnost (ER) je kvantifikovana primenom gama brojača;

x) procenat specifične lize je izračunat za svaku koncentraciju antitela prema formuli (ERMR)/(MR-SR) x 100, gde je ER prosečna radioaktivnost kvantifikovana (videti tačku ix iz prethodnog dela teksta) za koncentraciju antitela, gde MR predstavlja prosečnu radioaktivnost kvantifikovanu (videti tačku ix u gornjem delu teksta) za MR kontrole (videti tačku v u gornjem delu teksta), i gde SR predstavlja prosečnu radioaktivnost kvantifikovanu (videti tačku ix u gornjem delu teksta) za SR kontrole (videti tačku vi u gornjem delu teksta);

4) "povećana ADCC" definisana je ili kao povećanje maksimalnog procenta specifične lize zabeležene unutar opsega koncentracija antitela koje je prethodno testirano, i/ili smanjenje koncentracije antitela potrebne da se postigne polovina maksimalnog procenta specifične lize zabeležene unutar opsega koncentracija antitela testiranog u prethodnom tekstu.

Povećanje ADCC je u odnosu na ADCC, mereno u prethodno navedenom testu, posredovano preko istog antitela, proizvedenog od strane iste vrste ciljnih ćelija, korišćenjem standardnog postupka, prečišćavanja, formulacije i čuvanja, koji su poznati stručnjacima upućenim u stanje tehnike, ali takodje nisu proizvedena od strane ćelija domaćina konstruisanih za prekomernu ekspresiju GnTIII.

[0090] U jednom aspektu, dati pronalazak upućuje na antigen vezujuće molekule koji imaju specifičnost vezivanja pacovskog ICR62 (tj., veže se čvrsto za isti epitop), i na otkriće da se njihove efektorne funkcije mogu pojačati promenjenom glikozilacijom. U jednom izvodjenju, antigen vezujući molekul je himerno antitelo. U poželjnom izvodjenju, otkriće upućuje na himerno antitelo, ili na njegov fragment, koji sadrži jedan ili više (na primer, jedan, dva, tri, četiri, pet, ili šest) CDR regiona bilo kog od SEQ ID NOs:53-108 i/ili SEQ ID NO:s 122-127. Naročito u poželjnom izvodjenju, pronalazak se odnosi na izolovani polinukleotid koji sadrži: (a) sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od: SEQ ID NO:54 SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:122, i SEQ ID NO:124; (b) sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od: SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:106, i SEQ ID NO:126; i (c) SEQ ID NO:108. U drugom poželjnom izvodjenju, pronalazak upućuje na izolovani polinukleotid koji sadrži (a) sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:112 i SEQ ID NO:114; (b) sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:116 i SEQ ID NO:118; i (c) SEQ ID NO:119. U jednom izvodjenju, bilo koji od ovih polinukleotida kodira fuzioni polipeptid.

[0091] U narednom izvodjenju, antigen vezujući molekul obuhvata VH domen pacovskog antitela ICR62 kodiranog pomoću SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2, ili njihovu varijantu; i ne-mišiji polipeptid. U drugom poželjnom izvodjenju, pronalazak se odnosi na antigen vezujući molekul koji sadrži VL domen pacovskog antitela kodiranog sa SEQ ID NO:43 ili SEQ ID NO:44, ili njegovu varijantu; i ne-mišiji polipeptid .

[0092] U drugom aspektu, pronalazak upućuje na antigen vezujuće molekule koji sadrži jedan ili više (na primer, jedan, dva, tri, četiri, pet, ili šest) skraćenih CDR regiona ICR62. Tako skraćeni CDR regioni sadrže minimalno, aminokiselinske ostatke koji odredjuju specifičnost za dati CDR. Pod "odredjivanjem specifičnosti ostatka" podrazumevaju se oni ostaci koji su direktno uključeni u interakciju sa antigenom. Uopšteno, samo oko jedne petine do jedne trećine ostataka u datom CDR učestvuju u vezivanju za antigen. Ostaci koji odredjuju specifičnost u odredjenom CDR mogu se identifikovati, na primer, izračunavanjem medjuatomskih kontakata iz trodimenzionalnog modeliranja i odredjivanjem varijabilnosti sekvence na datom položaju ostatka u skladu sa postupcima koji su opisani kod Padlan et al., FASEB J. 9(1):133-139 (1995).

[0093] Prema tome, pronalazak takodje upućuje na izolovani polinukleotid koji sadrži barem jedan (na primer, jedan, dva, tri, četiri, pet, ili šest) region koji odredjuje komplementarnost pacovskog antitela ICR62, ili njegove varijante ili skraćenog oblika koji sadrži barem ostatke koji odredjuju specifičnost za navedeni region koji odredjuje komplementarnost, gde pomenuti izolovani polinukleotid kodira fuzioni polipeptid. Po mogućstvu, izolovani polinukleotidi kodiraju fuzioni polipeptid koji je antigen vezujući molekul. U jednom izvodjenju, polinukleotid obuhvata tri regiona koja odredjuju komplementarnost pacovskog antitela ICR62, ili njihove varijante ili skraćene oblike koji sadrže barem ostatke koji odredjuju specifičnost za svaki od pomenuta tri regiona koja odredjuju komplementarnost. U jednom izvodjenju, polinukleotid sadrži najmanje jedan od CDR koji su prikazani u Tabelama 2-5, niže. U narednom izvodjenju, polinukleotid kodira kompletan varijabilni region lakog ili teškog lanca himernog (na primer, humanizovanog) antitela. Pronalazak je dalje usmeren na polipeptide kodirane od strane takvih polinukleotida.

[0094] U narednom izvodjenju, pronalazak upućuje na antigen vezujući molekul koji sadrži barem jedan (na primer, jedan, dva, tri, četiri, pet, ili šest) region koji odredjuje komplementarnost pacovskog antitela ICR62, , ili njihove varijante ili skraćene oblike koji sadrže barem ostatke koji odredjuju specifičnost za svaki od pomenuta tri regiona koja odredjuju komplementarnost, i koji sadrže sekvencu izvedenu iz heterologog polipeptida. U jednom izvodjenju, antigen vezujući molekul sadrži tri regiona koji odredjuju komplementarnost pacovskog antitela ICR62, ili njihove varijante ili skraćene oblike koji sadrže barem ostatke koji odredjuju specifičnost za svaki od pomenuta tri regiona koja odredjuju komplementarnost. U jednom izvodjenju, antigen vezujući molekul sadrži najmanje jedan od CDR koji su prikazani u Tabelama 2-5, niže. U narednom izvodjenju, antigen vezujući molekul kodira kompletan varijabilni region lakog ili teškog lanca antitela. U jednom posebno korisnom izvodjenju, antigen vezujući molekul je himerno, na primer, humanizovano, antitelo. Pronalazak se takodje odnosi na postupke za pripremanje tih antigen vezujućih molekula, i upotrebe istih u lečenju oboljenja, naročito poremećaja ćelijske proliferacije gde se EGFR eksprimuje, naročito gde se EGFR abnormalno eksprimuje (na primer, prekomernom ekspresijom) u poredjenju sa normalnim tkivom istog ćelijskog tipa. Takvi poremećaji obuhvataju, ali nisu ograničeni na kancere bešike, mozga, glave i vrata, pankreasa, pluća, dojke, jajnika, debelog creva, prostate, kože i bubrega. Nivoi ekspresije EGFR odredjuju se postupcima poznatim stručnjacima i onima opisanim u tekstu (na primer, preko imunohistohemijskih ogleda, korišćenjem imunofluorescentnih tehnika, imunoenzimskih ogleda, ELISA, protočne citometrije, radioimunoloških ogleda, Western blot, vezivanjem liganda, aktivnosti kinaze, itd.).

[0095] Pronalazak se takodje odnosi na postupak za targetiranje in vivo ili in vitro ćelija koje eksprimuju EGFR. Ćelije koje eksprimuju EGFR mogu biti targetirane za terapijske svrhe (na primer, za lečenje poremećaja koji se mogu lečiti poremećajem signala posredstvom EGFR, na primer blokiranjem vezivanja liganda, ili targetiranjem EGFR-eksprimovanih ćelija za uništavanje imunog sistema). U jednom izvodjenju, ovaj pronalazak upućuje na postupak za targetiranje ćelija koje eksprimuju EGFR u ispitaniku, obuhvata davanje ispitaniku kompozicije koja sadrži ABM iz pronalaska. Ćelije koje eksprimuju EGFR mogu da budu targetirane u dijagnostičke svrhe (na primer, da se utvrdi da li ćelije eksprimuju EGFR, bilo normalno ili abnormalno). Stoga je otkriće usmereno na postupke za odredjivanje prisustva EGFR ili ćelijske ekspresije EGFR, ili in vivo ili in vitro. Jedan postupak za detektovanje ekspresije EGFR prema datom pronalasku obuhvata kontakt uzorka koji treba da se testira, opciono sa kontrolnim uzorkom, sa ABM iz datog pronalaska u uslovima koji omogućavaju formiranje kompleksa izmedju ABM i EGFR. Tada se detektuje formiranje kompleksa (na primer, pomoću ELISA ili ostalih postupaka poznatim u stanju tehnike). Kada se koristi kontrolni uzorak sa testiranim uzorkom, svaka statistički značajna razlika u formiranju ABM-EGFR kompleksa kada se uporedjuju uzorci iz testa i kontrolni uzorci ukazuje na prisustvo EGFR u testiranom uzorku.

TABELA 2

TABELA 3

TABELA 4

[0096] Poznato je da je nekoliko mehanizama uključeno u terapijsku efikasnost anti-EGFR antitela, uključujući blokiranje liganda (na primer, EGF, TGF-α, itd.) vezivanje za EGFR i naknadno aktiviranje signalnih puteva, ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), i indukciju zaustavljanja rasta ili terminalne diferecijacije.

[0097] U objavljenoj PCT prijavi br. WO 95/20045 diskutovano je o monoklonskom antitelu pacova ICR62 (IgG2b). Ono je usmereno na C epitope EGFR, i pokazalo se da inhibira vezivanje liganda, inhibira rast in vitro skvamoznih ćelija karcinoma koje eksprimuju EGFR, i izazivaju regresiju ksenografta tumora kod atimičnih miševa (WO 95/20045; Modjtahedi et al., Br. J. Cancer 73:228-235 (1996)). Kao antitelo koje je u potpunosti iz životinje koja pripada glodarima, davanje pacovskog monoklonskog antitela ICR62 ljudima dovodi do HARA odgovora kod nekih pacijenata čak i posle jedne doze. (objavljeni patent WO 95/20045; Modjtahedi et al., Br. J. Cancer 73:228-235 (1996)).

[0098] Opisana su himerna mišija/humana antitela. Videti, na primer, Morrison, S. L. et al., PNAS I1:6851-6854 (November 1984); European Patent Publication No.173494; Boulianna, G. L, et al., Nature 312:642 (December 1984); Neubeiger, M. S. et al., Nature 314:268 (March 1985); European Patent Publication No.

125023; Tan et al., J. Immunol.135:8564 (November 1985); Sun, L. K et al., Hybridoma 5(1):517 (1986); Sahagan et al., J. Immunol. 137:1066-1074 (1986). Videti generalno, Muron, Nature 312:597 (December 1984); Dickson, Genetic Engineering News 5(3) (March 1985); Marx, Science 229:455 (August 1985); i Morrison, Science 229:1202-1207 (September 1985). IMC-C225 (Erbitux®, Imclone) predstavlja himerno monoklonsko antitelo usmereno prema EGFR i sa mišijim varijabilnim regionom i humanim konstantnim regionom (Videti Herbst and Shin, Cancer 94: 1593-1611 (2002)). IMC-225 životinje koje pripada glodarima, a koji je izveden iz M225, za koji je otkriveno da vezuje EGFR i inhibira fosforilaciju zavisne tirozin kinaze izazvane EGF, kao i da može da izazove apoptozu u tumorskim ćelijskim linijama sa prekomernom ekspresijom EGFR (Herbst and Shin, Cancer 94: 1593-1611 (2002)). Medjutim, M225 izaziva HAMA reakciju kod pacijenata lečenih sa antitelom u Fazi I kliničkih ispitivanja (Herbst and Shin, Cancer 94: 1593-1611 (2002)). IMC-225 je testiran in vivo i in vitro, i koristi se u kombinaciji sa radijacionom terapijom i hemoterapijom kod mnogih vrsta tumora, uključujući one povezane sa lošom prognozom (Herbst and Shin, Cancer 94: 1593-1611 (2002)). Medjutim, IMC-225 je povezan sa toksičnošću kao što su alergijske i kožne reakcije kod pacijenata kod kojih je primenjivano antitelo IMC-225 u kliničkim ispitivanjima (Herbst and Shin, Cancer 94: 1593-1611 (2002)).

[0099] U posebno poželjnom izvodjenju, himerni ABM iz datog pronalaska predstavlja humanizovano antitelo. Postupci za humanizaciju ne-humanih antitela poznati su u stanju tehnike. Na primer, humanizovani ABM iz datog pronalaska mogu se dobiti prema postupcima iz američkog Pat. br.5,225,539 kod Winter, U.S. Pat. No. 6,180,370 kod Queen et al., U.S. Pat. No.6,632,927 kod Adair et al., ili prema objavljenoj Pat. prijavi br. 2003/0039649 kod Foote. Po mogućstvu, humanizovano antitelo ima jedan ili više aminokiselinskih ostataka koji su uneti u njega iz izvora koji je ne-humani. Ovi ne-humani aminokiselinski ostaci često se nazivaju "uvozni" ostaci, koji se obično uzimaju iz "uvoznog" varijabilnog domena. Humanizacija se suštinski izvodi prema postupku Winter-a i saradnika (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), supstitucijom hipervarijabilnog regiona za odgovarajuće sekvence humanog antitela. Prema tome, takva "humanizovana" antitela su himerna antitela (U.S. Pat. No.4,816,567) u kojima je u značajno manjoj meri od intaktnog humanog varijabilnog domena supstituisana odgovarajuća sekvenca iz nehumanih vrsta. U praksi, humanizovana antitela su obično humana antitela u kojima su neki ostaci hipervarijabilnog regiona i moguće neki FR ostaci supstituisani ostacima iz analognih mesta u glodarskim antitelima. Predmetna humanizovana anti-EGFR antitela sadržaće konstantne regione humanog imunoglobulina.

[0100] Izbor humanih varijabilnih domena, kako lakog tako i teškog lanca, za upotrebu u stvaranju humanizovanih antitela veoma je važan za smanjenje antigenosti. Prema takozvanom "best-fit" postupku (postupku najboljeg preklapanja), sekvenca varijabilnog domena glodarskog antitela ispitivana je u odnosu na celokupnu bioblioteku poznatih humanih sekvenci varijabilnog domena. Humana sekvenca koja je najbliža onoj kod glodara je zatim prihvaćena kao humani okvirni region (FR) za humanizovana antitela (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Sledeći postupak za selekciju humane okvirne sekvence je poredjenje sekvence svakog pojedinačnog podregiona celog glodarskog okvirnog (tj., FR1, FR2, FR3, i FR4) regiona ili neke kombinacije pojedinačnih podregiona (na primer, FR1 i FR2) sa bibliotekom poznatih humanih sekvenci varijabnog regiona koja odgovara tom okvirnom podregionu (na primer, kao što je odredjeno na osnovu Kabat nuerisanja), i izbor humane sekvence za svaki podregion ili kombinacije koja je najbliža onoj od glodara (Leung, objavljena američka Patent patentna prijava br.2003/0040606A1, objavljena Feb.27, 2003). Sledeći postupak koristi odredjeni okvirni region koji je izveden od konsenzus sekvence svih humanih antitela odredjene podgrupelakih ili teških lanaca. Isti okvirni region može se koristiti za nekoliko različitih humanizovanih antitela (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)).

[0101] Dalje je značajno da antitela budu humanizovana uz zadržavanje visokog afiniteta za antigen i drugih povoljnih bioloških osobina. Da bi se postigao ovaj cilj, prema poželjnom postupku, humanizovana antitela se dobijaju pomoću postupka analize roditeljskih sekvenci i različitih konceptualnih humanizovanih proizvoda korišćenjem trodimenzionalnih modela roditeljskih i humanizovanih sekvenci. Trodimenzionalni modeli imunoglobulina mogu da budu generisani korišćenjem kompjuterskih programa koji su bliski stručnjacima iz oblasti (na primer, InsightII, Accelrys, Inc. (formerly MSI), ili na http://swissmodel. expasy.org). Ovi kompjuterski programi mogu da ilustruju i da prikažu moguće trodimenzionalne konformacione strukture izabranih imunoglobulinskih sekvenci kandidata. Pregled ovih mogućih struktura omogućava analizu verovatne uloge ostataka u funkcionisanju imunoglobulinskih sekvenci kandidata, tj. analizu ostataka koji utiču na sposobnost imunoglobulina kandidata da vežu svoj antigen. Na ovaj način, FR ostaci mogu biti izabrani i kombinovani od sekvenci primaoca i uvoznih sekvenci tako da se postižu željene karakteristike antitela, kao što je povećani afinitet za ciljni antigen(e). Uopšteno, ostaci hipervarijabilnog regiona su direktno i najznačajnije uključeni u delovanje na vezivanje antigena.

[0102] U jednom izvodjenju, antitela iz datog pronalaska sadrže humani Fc region. U konkretnom izvodjenju, humani konstantni region je IgG1, kao što je navedeno u SEQ ID NOs 109 i 110, i kao što je navedeno u delju teksta koji sledi:

Nukleotidna Sekvenca IgG1 (SEQ ID NO/110)

ACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCTCCAAGAGCAACCTCTGG GGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTG ACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGG CTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCC TCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCA GCAACAACCAAGGTGGACAAGAAAGCAGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTC ACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTC CTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGT CACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAAC TGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAG GAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACC AGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCT CCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA CCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGG TCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAG TGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGC TGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGC AGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGC ACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGTAAATGA

Aminokiselinska sekvenca IGg1 (SEQ ID NO:109)

TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSCDKTHTCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGOPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

[0103] Medjutim, varijante i izoforme humanog Fc regiona takodje su obuhvaćene datim pronalaskom. Na primer, varijante Fc regiona pogodni za upotrebu u ovom pronalasku mogu se proizvesti na osnovu postupka iz američkog Pat. br.6,737,056 od strane Presta (varijante Fc regiona sa izmenjenom efektorskom funkcijom zbog jedne ili više modifikacije aminokiselina); ili u američ. Pat. prijavama br. 60/439,498; 60/456,041; 60/514,549; ili WO 2004/063351 (varijante Fc regiona sa povećanim afinitetom vezivanja zbog modifikacije aminokiseline); ili u amer. pat. prijavi br.10/672,280 ili WO 2004/099249 (Fc varijante sa izmenjenim afinitetom vezivanja za FcyR usled modifikacije aminokiseline).

[0104] U jednom izvodjenju, antigen vezujući molekuli iz datog pronalaska konstruisani su da imaju poboljšani afinitet vezivanja, na primer, u skladu sa, postupcima opisanim u objavljenoj američ. pat. Prijavi br. 2004/0132066 za Balint et al..

[0105] U jednom izvodjenju, antigen vezujući molekul iz datog pronalaska se konjuguje (spaja) za dodatnu grupu, kao što je radioaktivni obeleživač ili toksin. Takvi konjugovani ABM mogu biti proizvedeni brojnim postupcima koji su dobro poznati u stanju tehnike.

[0106] Različiti radionuklidi su primenjivi u ovom pronalasku i stručnjaci upućeni u stanje tehnike sa sposobnošću da se lako utvrdi koji radionuklid je najprikladniji u različitim okolnostima. Na primer, 131jod je dobro poznati radionuklid koji se koristi za ciljanu imunoterapiju. Medjutim, klinička upotrebljivost 131joda može biti ograničena zbog nekoliko faktora uključujući: fizički polu-život od osam dana; dehalogenaciju jodovanog antitela kako u krvi tako i na mestima tumora; i emisione karakteristike (na primer, velika gama komponenta) koje mogu biti suboptimalne za lokalizovano deponovanje doze u tumoru. Sa pojavom boljih helatnih agenasa, mogućnost vezivanja metalnih helatnih grupa za proteine dovodi do povećanja mogućnosti da se koriste drugi radionuklidi kao što je 111indijum i 90itrijum.

90Itrijum obezbedjuje nekoliko prednosti za upotrebu u radioimunoterapijskim primenama: 64-očasovni polu-život 90itrijuma je dovoljno dug da bi se omogućilo nagomilavanje antitela od strane tumora i, za razliku od na primer, 131joda, 90itrijum predstavlja čisti beta emiter visoke energije bez pratećeg gama zračenja pri njegovom raspadu, sa opsegom u tkivu od 100 do 1000 ćelijskih prečnika. Pored toga, minimalna količina prodirujućeg zračenja omogućava primenu na ambulantnog pacijenta antitela obeleženih sa 90itrijumom. Pored toga, internalizacija obeleženog antitela nije potrebna za ubijanje ćelija, i lokalna emisiija jonizujućeg zračenja treba da bude smrtonosna za susedne tumorske ćelije kojima nedostaje ciljni antigen.

[0107] Efikasne pojedinačne doze (tj., terapijski efikasnih količina) 90itrijumom obeleženih anti-EGFR antitela u opsegu su izmedju 5 i oko 75 mCi, poželjnije izmedju 10 i oko 40 mCi. Efikasne pojedinačne doze 131jodom obeleženih anti-EGFR antitela koje ne oštećuju koštanu srž u opsegu su izmedju 5 i oko 70 mCi, poželjnije izmedju 5 i oko 40 mCi. Efikasne jednokratne ablativne doze za lečenje (tj, može zahtevati autolognu transplantaciju koštane srži) 131jodom obeleženih anti-EGFR antitela u rasponu izmedju 30 i oko 600 mCi, još poželjnije izmedju 50 i manje od oko 500 mCi. Zajedno sa himernim anti-EGFR antitelima, zahvaljujući dužem poluživotu u cirkulaciji u odnosu na mišija antitela, efikasne pojedinačne doze 131jodom obeleženih himernih anti-EGFR antitela koja ne oštećuju koštanu srž u opsegu su od oko 5 i oko 40 mCi, poželjnije manje od oko 30 mCi. Kriterijumi za vizuelizaciju (imidžing) za npr., 111indijumski obeleživač su obično manji od oko 5 mCi.

[0108] U odnosu na radioaktivno obeležena anti-EGFR antitela, terapija se takodje može odvijati korišćenjem pojedinačnog tretmana ili primenom višestrukih tretmana. Zbog radionuklidne komponente, poželjno je da se pre tretmana, periferne matične ćelije ("PSC") ili ćelije koštane srži ("BM") "sakupe" za pacijente koji imaju potencijalno fatalnu toksičnost koštane srži i koja je rezultat zračenja. BM i/ili PSC su sakupljeni korišćenjem standardnih tehnika, i zatim prečišćeni i zamrznuti za moguću reinfuziju. Osim toga, najpoželjnije je da pre tretmana na pacijentu izvede dijagnostičko dozimetrijsko ispitivanje primenom dijagnostičkog obeleženog antitela (na primer, korišćenjem 111indijuma), čija svrha da se obezbedi da terapeutski obeleženo antitelo (na primer, korišćenjem 90itrijuma) neće postati suviše “koncentrovano” u bilo kom organu li tkivu.

[0109] U poželjnom izvodjenju, dati pronalazak upućuje na izolovani polinukleotid koji sadrži sekvencu koja kodira polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom koja je navedena niže u Tabeli 7. U poželjnom izvodjenju, pronalazak upućuje na izolovani polinukleotid koji sadrži sekvencu prikazanu niže u Tabeli 6. Pronalazak se dalje odnosi na izolovanu nukleinsku kiselinu koja obuhvata sekvencu barem 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnu nukleotidnoj sekvenci prikazanoj niže u Tabeli 6.U narednom izvodjenju, pronalazak upućuje na izolovanu nukleinsku kiselinu koja sadrži sekvencu koja kodira polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom koja je barem 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci u Tabeli 7. Pronalazak takodje obuhvata izolovanu nukleinsku kiselinu koja sadrži sekvencu koja kodira polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom bilo kojeg od konstrukta u Tabeli 7 sa konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama.

TABELA 7

[0110] U narednom izvodjenju, ovaj pronalazak je usmeren na vektor ekspresije i/ili ćeliju domaćina koja sadrži jedan ili više izolovanih polinukleotida iz datog pronalaska.

[0111] Generalno, bilo koja vrsta kultivisane ćelijske linije može se koristiti za eksprimovanje ABM iz datog pronalaska. U poželjnom izvodjenju, HEK293-EBNA ćelije, CHO ćelije, BHK ćelije, NS0 ćelije, SP2/0 ćelije, YO ćelije mijeloma, P3X63 mišije ćelije mijeloma, PER ćelije, PER.C6 ćelije ili hibridoma ćelije, druge ćelije sisara, ćelije kvasca, ćelije insekata, ili biljne ćelije, koriste se kao osnovna ćelijska linija za stvaranje ćelija domaćina iz pronalaska izmenjenih inženjeringom.

[0112] Terapijska efikasnost ABM iz datog pronalaska može se poboljšati njihovom proizvodnjom u ćeliji domaćina koja dalje eksprimira polinukleotid koji kodira polipeptid koji ima GnTIII aktivnost.U poželjnom izvodjenju, polipeptid koji ima GnTIII aktivnost, predstavlja fuzioni polipeptid koji sadrži Goldžijev lokalizacioni domen Goldžijevog rezidentnog polipeptida. U narednom poželjnom izvodjenju, ekspresija ABM iz datog pronalaska u ćeliji domaćina koja eksprimira polinukleotid koji kodira polipeptid sa aktivnošću GnTIII za rezultat ima ABM sa povećanim afinitetom vezivanja za Fc receptor i povećanom efektorskom funkcijom. Prema tome, u jednom izvodjenju, dati pronalazak se odnosi na ćeliju domaćina koja sadrži (a) izolovanu nukleinsku kiselinu koja obuhvata sekvencu koja kodira polipeptid sa aktivnošću GnTIII;

i (b) izolovani polinukleotid koji kodira ABM iz datog pronalaska, kao što je himerno, primatizovano ili humanizovano antitelo koje vezuje humani EGFR. U poželjnom izvodjenju, polipeptid koji ima aktivnost GnTIII predstavlja fuzioni polipeptid koji sadrži katalitički domen GnTIII i Goldžijev lokalizacioni domen predstavlja lokalizacioni domen manozidaze II. Postupci za stvaranje takvih fuzionih polipeptida i njihovu upotrebu u proizvodnji antitela sa povećanim efektorskim funkcijama opisani su u američkoj patentnoj prijavi br. 60/495,142 i objavljenoj američkoj Patentnoj prijavi br. 2004/0241817 A1. U narednom poželjnom izvodjenju, himerni ABM je himerno antitelo ili njegov fragment, koji ima specifičnost vezivanja za pacovsko antitelo ICR62. U posebno poželjnom izvodjenju, himerno antitelo sadrži humani Fc. U narednom poželjnom izvodjenju, antitelo je primatizovano ili humanizovano.

[0113] U jednom izvodjenju, jedan ili nekoliko polinukleotida koji kodiraju ABM iz datog pronalaska mogu biti eksprimirani pod kontrolom konstitutivnog promotera ili, alternativno, regulisanog ekspresionog sistema. Odgovarajući regulisani ekspresioni sistemi obuhvataju, ali nisu ograničeni na, ekspresioni sistem regulisan tetraciklinom, ekspresioni sistem koji se može indukovati ekdisonom, lac-switch ekspresionim sistemom koji se može indukovati glukokortikoidom, sistem promotora koji se može indukovati temperaturom i ekspresioni sistem koji se može indukovati metalotionein metalom. Ukoliko se nekoliko različitih nukleinskih kiselina koje kodiraju ABM iz datog pronalaska sadrži unutar sistema ćelije domaćina, neke od njih mogu biti eksprimirane pod kontrolom konstitutivnog promotera, dok se fruge eksprimuju pod kontrolom regulisanog promotora. Maksimalni nivo ekspresije smatra se najvišim mogućim nivom ekspresije stabilnog polipetida koji nema u značajnoj meri štetni efekat na stopu ćelijskog rasta, i biće odredjen primenog rutinskog eksperimentisanja. Nivoi ekspresije su odredjeni pomoću postupaka koji su generalno poznati u stanju tehnike, uključujući Western blot analizu korišćenjem antitela specifičnog za ABM ili antitela specifičnog za peptidni obeleživač fuzionisan za ABM; i Northern blot analize. Kao sledeća mogućnost, polinukleotid može biti operativno povezan za reporter gen; nivoi ekspresije himernih (na primer, humanizovanih) ABM molekula imaju suštinski istu specifičnost vezivanja za pacovsko antitelo ICR62 i odredjeni su merenjem signala koji je u korelaciji sa nivoom ekspresije reporter gena. Reporter gen može biti transkribovan zajedno sa nukleinskom kiselinom(ama) koje kodiraju pomenuti fuzioni polipeptid kao jedan mRNK molekul; njihove odgovarajuće kodirajuće sekvence mogu biti vezane ili preko unutrašnjeg mesta za vezivanje ribozoma (IRES) ili preko cap-nezavisnog pojačivača translacije (CITE). Reporter gen može biti translatiran zajedno sa barem jednom nukleinskom kiselinom koja kodira himerni (na primer, humanizovani) ABM koji ima u značajnoj meri istu specifičnost vezivanja kao pacovsko antitelo ICR62 tako da se formira jedan polipeptidni lanac. Nukleinske kiseline koje kodiraju AMB iz datog pronalaska mogu biti operativno vezane za reporter gen pod kontrolom jednog promotora, tako da su nukleinska kiselina koja kodira fuzioni polipeptid i reporter gen transkribovani u molekul RNK koji je alternativno upleten/spojen u dva odvojena informaciona molekula RNK (mRNK); jedna od rezultujućih mRNK je translatirana u navedeni reporter protein, i druga je translatirana u navedeni fuzioni polipeptid.

[0114] Postupci koji su dobro poznati stručnjacima iz date oblasti mogu da se koriste za konstruisanje ekspresionih vektora koji sadrže kodirajuću sekvencu ABM molekula koji imaju u značajnoj meri istu specifičnost vezivanja kao pacovsko antitelo ICR62 zajedno sa odgovarajućim transkripcionim/translacionim kontrolnim signalima. Ovi postupci obuhvataju in vitro rekombinantne DNK tehnike, sintetičke tehnike i in vivo rekombinaciju/genetičku rekombinaciju. Videti na primer, tehnike koje su opisane kod Maniatis et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989) i Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989).

[0115] Niz različitih vektorskih sistema sa ekspresijom u domaćinu može da se koristi za ekspresiju kodirajuće sekvence ABM iz datog pronalaska. Po mogućstvu, ćelije koriste kao sistemi ćelija domaćina transfektovanih rekombinantnom plazmidnom DNK ili kozmidnim DNK ekspresionim vektorima koji sadrže kodirajuću sekvencu proteina od interesa i kodirajuću sekvencu fuzionog polipeptida. Najpoželjnije, HEK293-EBNA ćelije, CHO ćelije, BHK ćelije, NS0 ćelije, SP2/0 ćelije, YO ćelije mijeloma, P3X63 mišije ćelije mijeloma, PER ćelije, PER.C6 ćelije ili hibridoma ćelije, druge ćelije sisara, ćelije kvasca, ćelije insekata, ili biljne ćelije, koriste se kao sistem ćelije domaćina. Neki primeri ekspresionih sistema i postupaka za selekciju opisani su u sledećoj literaturi, kao i u literaturi koja je citirana u radovima: Borth et al., Biotechnol. Bioen. 71(4):266-73 (2000-2001), u Werner et al., Arzneimittelforschung/Drug Res.

48(8):870-80 (1998), in Andersen and Krummen, Curr. Op. Biotechnol.13:117-123 (2002), in Chadd and Chamow, Curr. Op. Biotechnol. 12:188-194 (2001), and in Giddings, Curr. Op. Biotechnol. 12: 450-454 (2001). U alternativnim izvodjenjima, mogu biti razmtrani drugi sistemi eukariotskih ćelija domaćina, uključujući ćelije kvasca transformirane rekombinantnim ekspresionim vektorima kvasca koji sadrže kodirajuću sekvencu ABM iz datog pronalaska, kao što su ekspresioni sistemi navedeni u američkim Patentnim prijavama br.60/344,169 i WO 03/056914 (postupke proizvodnje glikoproteina sličnih ljudima u eukariotskoj ćeliji domaćina koja nije čovek); sistemi ćelija insekata inficiranih rekombinantnim virusnim ekspresionim vektorima (na primer, bakulovirus) koji sadrži kodirajuću sekvencu himernih ABM koji imaju u značajnoj meri istu specifičnost vezivanja kao pacovsko antitelo ICR62; sistemi biljnih ćelija inficiranih sa rekombinantim virusnim ekspresionim vektorima (npr., mozaični virus karfiola, CaMV; mozaični virus duvana, TMV) ili transformisane rekombinantnim virusnim ekspresionim vektorima (na primer, Ti plazmid) koji sadrži kodirajuću sekvencu ABM iz pronalaska, koja obuhvata, ali nije ograničena na, ekspresione sisteme opisane u U.S. Pat. br. 6,815,184 (postupke za ekspresiju i sekreciju biološki aktivnih polipeptida iz genetski modifikovane sočivice); objavljenog pat. WO 2004/057002 (proizvodnja glikozilovanih proteina u biljnim ćelijama briofita uvodjenjem gena glikozil transferaze) i objavljenog patenta WO 2004/024927 (postupci dobijanja ekstracelularnih heterolognih proteina koji nisu biljnog porekla u protoplastu mahovine); i američke Pat. prijave. br. 60/365,769, 60/368,047, i WO 2003/078614 (prerada glikoproteina u transgenim biljkama koje sadrže funkcionalni GnTIII enzim kod sisara); ili životinjski ćelijski sistemi koji su inficirani sa rekombinantnim virusnim ekspresionim vektorima (na primer, adenovirus, VACV virus) uključujući ćelijske linije konstruisane da sadrže više kopija kodirajuće DNK za himerni ABM koji imaju u značajnoj meri istu specifičnost vezivanja kao pacovsko antitelo ICR62 bilo da je stabilno amplifikovana (CHO/dhfr) ili nestabilno amplifikovana u “doubleminute” hromozomima (na primer, mišijim ćelijskim linijama). U jednom izvodjenju, vektor koji obuhvata polinukleotid(e) koji kodira ABM iz pronalaska je policistronski. Takodje, u jednom izvodjenju ovde razmatrani ABM predstavlja antitelo ili njegov fragment. U poželjnom izvodjenju, ABM predstavlja humanizovano antitelo.

[0116] Za postupke iz ovog pronalaska, stabilna ekspresija je generalno poželjnija od prolazne ekspresije zbog toga što ona obično postiže rezultate koji su reproducibilni i takodje je pristupačnija za proizvodnju velikim razmerama. Pre nego što bi se koristili ekspresioni vektori koji sadrže virusno poreklo replikacije, ćelije domaćina mogu da se transformišu sa odgovarajućim kodirajućim nukleinskim kiselinama kontrolisanim od strane odgovarajućih ekspresionih kontrolnih elemenata (na primer, promoter, pojačivačke sekvence, terminatori transkripcije, poliadenilaciona mesta, itd.), i selektivni marker. Posle uvodjenja strane DNK, konstruisane ćelije mogu da budu ostavljene da rastu tokom 1-2 dana u obogaćenom medijumu, i zatim se prebacuju u selektivni medijum. Selektivni marker u rekombinantnom plazmidu daje otpornost na selekciju i omogućava selekciju ćelija koje su stabilno integrisale plazmid u svoje hromozome i koje rastu da bi se formirali fokusi koji će zatim biti klonirani i ekspandirani u ćelijske linije.

[0117] Moguće je koristiti odredjeni broj selekcionih sistema, uključujući bez ograničenja, gene herpes simpleks virus timidin kinaze (Wigler et al., Cell 11:223 (1977)), hipoksantin-guanin fosforiboziltransferaze (Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026 (1962)), i adenin fosforiboziltransferaze (Lowy et al., Cell 22:817 (1980)), koji se mogu koristiti redom u tk-, hgprt- ili aprtćelijama. Takodje, otpornost na antimetabolit može da koristi kao osnova za selekciju gena dhfr, koji utiču na otpornost metatreksata (Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77:3567 (1989); O’Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)); gpt, koji daje otpornost na mikofenolnu kiselinu (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)); neo, koji daje otpornost na aminoglikozid G-418 (Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1 (1981)); i hygro gena, koji daju otpornost na higromicin (Santerre et al., Gene 30:147 (1984). Nedavno su opisani dodatni selektabilni geni, i to trpB, koji omogućava ćelijama sa koriste indol umesto triptofana; hisD, koji omogućava ćelijama da koriste histinol umesto histidina (Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047 (1988)); sistem glutamin sintaze; i ODC (ornitin dekarboksilaze) koja daje otpornost na inhibitor ornitin dekarboksilaze, 2-(difluorometil)-DL-ornitin, DFMO (McConlogue, u: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed. (1987)).

[0118] Dati pronalazak se dalje odnosi na postupak za modifikaciju glikozilacionog profila ABM molekula prema datom pronalasku koji su proizvedeni pomoću ćelje domaćina, koja sadrži ekspresiju pomenute ćelije domaćina nukleinske kiseline koja kodira ABM iz pronalaska i nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid sa GnTIII aktivnošću, ili vektor sadrži takve nukleinske kiseline. Po mogućstvu, izmenjeni polipeptid IgG ili njegov fragment sadrži Fc region. U naročito poželjnom izvodjenju ABM predstavlja humanizovano antitelo ili njegov fragment.

[0119] Modifikovani ABM molekuli proizvedeni od strane ćelija domaćina iz pronalaska pokazuju povećani afinitet vezivanja za Fc receptor i/ili povećanu efektornu funkciju kao rezultat modifikacije. U naročito poželjnom izvodjenju ABM je humanizovano antitelo ili njegov fragment koji sadrži Fc region. Kod povećanog afiniteta vezivanja Fc receptora poželjno je povećano vezivanje za aktivišuće Fcγ receptore, kao što je FcγRIIIa. Povećana efektorna funkcija predstavlja po mogućstvu povećanje u jednom ili u više od sledećih: povećana ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela, povećana ćelijska fagocitoza zavisna od antitela (ADCP), povećana sekrecija citokina, pojačano preuzimanje posredovano imunskim kompleksom od strane antigen-prezentujućih ćelija, povećana ćelijska citotoksičnost posredovana Fc, povećano vezivanje za NK ćelije, povećano vezivanje za makrofage, povećano vezivanje za polimorfonuklearne ćelije (PMNs), povećano vezivanje za monocite, povećano unakrsno vezivanje antitela vezanih za ciljno mesto, povećani direktni prenos signala koji indukuje apoptozu, povećano sazrevanje dendritskih ćelija, i povećavaju prajming T ćelija.

[0120] Dati pronalazak je takodje usmeren na postupak za proizvodnju ABM iz datog pronalaska, koji ima modifikovane oligosaharide u ćeliji domaćina koja sadrži (a) kultivisanje ćelije domaćina koja je konstruisana da eksprimuje najmanje jednu nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid sa GnTIII aktivnošću u uslovima koji omogućavaju proizvodnju ABM prema datom pronalasku, gde pomenuti polipeptid ima aktivnost GnTIII eksprimiranu u količini koja je dovoljna da modifikuje oligosaharide u Fc regionu pomenutog ABM proizvedenog od strane pomenute ćelije domaćina; i (b) izolovanje navedenog ABM. U poželjnom izvodjenju, polipeptid koji ima aktivnost GnTIII predstavlja fuzioni polipeptid koji sadrži katalitički domen GnTIII. U naročito poželjnom izvodjenju, fuzioni polipeptid dalje sadrži Goldžijev lokalizacioni domen Goldžijevog rezidentnog polipeptida.

[0121] Po mogućstvu, Goldžijev lokalizacioni domen predstavlja lokalizacioni domen manozidaze II ili GnTI. Alternativno, Goldžijev lokalizacioni domen je izabran iz grupe koja se sastoji od: lokalizacionog domena manozidaze I, lokalizacionog domena GnTII, i lokalizacionog domena α 1-6 core fukoziltransferaze. ABM molekuli proizvedeni postupcima iz datog pronalaska imaju povećani afinitet vezivanja Fc receptora i/ili povećanu efektornu funkciju. Po mogućstvu, povećana efektorna funkcija predstavlja jednu ili više iz grupe koja sledi: povećana ćelijska citotoksičnost posredovana preko Fc (uključujući povećanu ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela), povećana ćelijska fagocitoza zavisna od antitela (ADCP), povećana sekrecija citokina, pojačano preuzimanje posredovano imunskim kompleksom od strane antigen-prezentujućih ćelija, povećano vezivanje za NK ćelije, povećano vezivanje za makrofage, povećano vezivanje za monocite, povećano vezivanje za polimorfonuklearne ćelije, povećani direktni prenos signala koji indukuje apoptozu, povećano unakrsno vezivanje antitela vezanih za ciljno mesto, povećano sazrevanje dendritskih ćelija, i povećavaju prajming T ćelija. Povećani afinitet vezivanja za Fc receptor po mogućstvu predstavlja povećano vezivanje za Fc aktivirajuće receptore kao što je FcyRIIIa. U naročito poželjnom izvodjenju ABM predstavlja humanizovano antitelo ii njen fragment.

[0122] U narednom izvodjenju, dati pronalazak upućuje na himerni ABM koji ima u značajnoj meri istu specifičnost vezivanja kao pacovsko antitelo ICR62 proizvedeno postupcima iz pronalaska, a koje ima povećani udeo razdvojenih oligosaharida u Fc regionu pomenutog polipeptida. Zamišljeno je da takav ABM obuhvata antitela ili njegove fragmente koji sadrže Fc region. U poželjnom izvodjenju, ABM je humanizovano antitelo. U jednom izvodjenju, procenat razdvojenih oligosaharida u Fc regionu ABM je najmanje 50%, poželjno, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, ili barem 90%, i najpoželjnije barem 90-95% od ukupnog broja oligosaharida. U još jednom izvodjenju, ABM proizveden pomoću postupaka iz pronalaska ima povećan udeo nefukozilovanih oligosaharida u Fc regionu kao rezultat izmene oligosaharida postupcima iz datog pronalaska. U jednom izvodjenju, procenat nefukozilovanih oligosaharida iznosi najmanje 50%, poželjno, barem 60% do 70%, i najpoželjnije najmanje 75%. Nefukozilovani oligosaharidi mogu biti hibridnog tipa ili u formi kompleksa. U posebno poželjnom izvodjenju, ABM proizveden od strane ćelija domaćina i postupaka iz pronalaska ima povećani udeo razdvojenih, nefukozilovanih oligosaharida u Fc regionu. Razdvojeni, nefukozilovani oligosaharidi mogu biti ili hibridnog tipa ili u formi kompleksa. Konkretno, postupci prema datom pronalasku mogu da se koriste za proizvodnju ABM molekula u kojima je najmanje 15%, poželjnije barem 20%, poželjnije najmanje 25%, poželjnije najmanje 30%, poželjnije najmanje 35% oligosaharida u Fc regionu ABM molekula su razdvojeni, nefukozilovani. Postupci prema datom pronalasku mogu da se koriste za proizvodnju polipeptida u kojima najmanje 15%, poželjnije najmanje 20%, poželjnije najmanje 25%, poželjnije najmanje 30%, još poželjnije barem 35% oligosaharida u Fc regionu polipeptida predstavljaju razdvojeni nefukozilovani hibrid.

[0123] U narednom izvodjenju, ovaj pronalazak upućuje na himerni ABM molekul koji ima u značajnoj meri istu specifičnost vezivanja kao pacovsko antitelo ICR62 konstruisano tako da ima povećanu efektornu funkciju i/ili povećani afinitet vezivanja za Fc receptor, proizveden pomoću postupaka prema pronalasku. Po mogućstvu, povećana efektorska funkcija predstavlja jednu ili više funkcija iz grupe koju čine: povećana ćelijska citotoksičnost posredovana Fc (uključujući povećanu ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela), povećana ćelijska fagocitoza zavisna od antitela (ADCP), povećana sekrecija citokina, pojačano preuzimanje posredovano imunskim kompleksom od strane antigen-prezentujućih ćelija, povećano vezivanje za NK ćelije, povećano vezivanje za makrofage, povećano vezivanje za monocite, povećano vezivanje za polimorfonuklearne ćelije, povećani direktni prenos signala koji indukuje apoptozu, povećano unakrsno vezivanje antitela vezanih za ciljno mesto, povećano sazrevanje dendritskih ćelija, ili povećavaju prajming T ćelija. U poželjnom izvodjenju, povećani afinitet vezivanja za Fc receptor predstavlja povećano vezivanje za Fc aktivirajući receptor, po mogućstvu FcγRIIIa. U jednom izvodjenju, ABM predstavlja antitelo, fragment antitela koji sadrži Fc region, ili fuzioni protein koji obuhvata region ekvivalentan Fc regionu imunoglobulina. U naročito poželjnom izvodjenju, ABM je humanizovano antitelo.

[0124] Ovaj pronalazak dalje upućuje na farmaceutske kompozicije koje obuhvataju ABM molekule iz datog pronalaska i farmaceutski prihvatljivi nosač.

[0125] Ovaj pronalazak se dalje odnosi na upotrebu tih farmaceutskih kompozicija u postupku lečenja kancera. Konkretno, ovaj pronalazak upućuje na postupak lečenja kancera koji obuhvata davanje terapijski efikasne količine farmaceutske kompozicije iz pronalaska.

[0126] Dati pronalazak dalje opisuje postupke za stvaranje i upotrebu ćelija domaćina za proizvodnju glikoformi ABM molekula iz datog pronalaska, koje imaju povećani afinitet vezivanja za Fc receptor, koje imaju povećani afinitiet vezivanja za Fc receptor, poželjno povećanje vezivanja za Fc aktivirajuće receptore i/ili koji imaju povećane efektorne funkcije, uključujući ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela. Metodologija glikoinženjeringa koja se može koristi sa ABM molekulima iz datog pronalaska detaljnije je opisana u američkom Pat. br. 6,602,684, objavljenoj američkoj Pat. prijavi br. 2004/0241817 A1, objavljenoj američkoj Pat. prijavi br.2003/0175884 A1, američkoj patentnoj prijavi sa privremenim brojem br. 60/441,307 i objavljenom patentu WO 2004/065540. ABM molekuli iz datog pronalaska mogu se alternativno podvrgnuti glikoinžinjeringu da bi imali smanjene ostatke fukoze u Fc regionu na osnovu tehnika opisanim u objavljenoj američ. Pat. prijavi. br.2003/0157108 (Genentech), or in EP 1176195 A1, WO 03/084570, WO 03/085119 and U.S. Pat. Appl. Pub. Nos.2003/0115614, 2004/093621, 2004/110282, 2004/110704, 2004/132140 (Kyowa). ABM molekuli iz pronalaska koji su podvrgnuti glikoinženjeringu takodje mogu biti proizvedeni u sistemima ekspresije koji proizvode modifikovane glikoproteine, kao što su obelodanjeni u objavljenoj američkoj. Pat. Prijavi br.60/344,169 i objavljenom patentu WO 03/056914 (GlycoFi, Inc.) ili u objavljenom patentu WO 2004/057002 i WO 2004/024927 (Greenovation).

Stvaranje ćelijskih linija za proizvodnju proteina sa izmenjenim obrascem glikozilcije

[0127] Dato otkriće opisuje ekspresione sisteme ćelija domaćina za stvaranje ABM molekula datog otkrića koji imaju modifikovane obrasce glikozilacije. Konkretno, dato otkriće opisuje sisteme ćelija domaćina za dobijanje glikoformi ABM molekula prema datom otkriću koje imaju poboljšanu terapeutsku vrednost. Prema tome, otkriće opisuje ekspresione sisteme ćelija domaćina koji su selektovani ili konstruisani tako da eksprimiraju polipeptid koji ima aktivnost GnTIII. U jednom izvodjenju, polipeptid koji ima aktivnost GnTIII je fuzioni polipeptid koji sadrži Goldžijev lokalizacioni domen heterolognog Goldžijevog rezidentnog polipeptida. Naročito, takvi ekspresioni sistemi ćelija domaćina mogu biti konstruiani tako da sadrže rekombinantni molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid koji ima GnTIII, funkcionalno vezan za konstitutivni ili regulisani promotorski sistem.

[0128] U jednom specifičnom izvodjenju, dato otkriće opisuje ćeliju domaćina koja je konstruisana tako da eksprimira najmanje jednu nukleinsku kiselinu koja kodira fuzioni polipeptid koji ima aktivnost GnTIII i koji sadrži Goldžijev lokalizacioni domen heterolognog Goldžijevog rezidentnog polipeptida. U jednom aspektu, ćelija domaćin je konstruisana pomoću molekula nukleinske kiseline koji sadrži najmanje jedan gen koji kodira fuzioni polipeptid koji ima aktivnost GnTIII i koji sadrži Goldžijev lokalizacioni domen heterolognog Goldžijevog rezidentnog polipeptida.

[0129] Uopšteno, bilo koji tip kultivisane ćelijske linije, uključujući ćelijske linije razmatrane u prethodnom tekstu, može da se koristi kao osnova za konstruisanje ćelijskih linija-domaćina datog otkrića. U poželjnom izvodjenju, HEK293-EBNA ćelije, CHO ćelije, BHK ćelije, NS0 ćelije, SP2/0 ćelije, YO mijeloma ćelije, P3X63 ćelije mišjeg mijeloma, PER ćelije, PER.C6 ćelije ili ćelije hibridoma, druge sisarske ćelije, ćelije kvasca, ćelije insekata ili biljne ćelije koriste se kao osnovna ćelijska linija za stvaranje konstruisanih ćelija domaćina prema otkriću.

[0130] Predvidjeno je da otkriće obuhvati sve konstruisane ćelije-domaćine koje eksprimiraju polipeptid koji ima aktivnost GnTIII, uključujući fuzioni polipeptid koji sadrži Goldžijev lokalizacioni domen heterolognog Goldžijevog rezidentnog polipeptida kao što je ovde definisano.

[0131] Jedna ili nekoliko nukleinskih kiselina koje kodiraju polipeptid koji ima aktivnost GnTIII mogu biti eksprimirane pod kontrolom konstitutivnog promotora ili, alternativno, regulisanog ekspresionog sistema. Takvi sistemi su dobro poznati u stanju tehnike, i obuhvataju sisteme koji su razmatrani u prethodnom tekstu. Ako je nekoliko različitih nukleinskih kiselina, koje kodiraju polipeptide koji imaju aktivnost GnTIII i koji sadrže Goldžijev lokalizacioni domen heterolognog Goldžijevog rezidentnog polipeptida, sadržano unutar sistema ćelije domaćina, neke od njih mogu da budu eksprimirane pod kontrolom konstitutivnog promotora, dok su druge eksprimirane pod kontrolom regulisanog promotora. Nivoi ekspresije fuzionih polipeptida koji imaju aktivnost GnTIII odredjuju se pomoću postupaka koji su generalno poznati u stanju tehnike, uključujući Western blot analizu, Northern blot analizu, analizu ekspresije reporterskog gena ili merenje aktivnosti GnTIII. Alternativno, može da se koristi lektin koji se vezuje za biosintetičke proizvode GnTIII, na primer, E4-PHA lektin. Alternativno, može da se koristi funkcionalni test koji meri povećano vezivanje za Fc receptor ili povećanu efektorsku funkciju posredovanu antitelima koja proizvede ćelije koje su konstruisane sa nukleinskom kiselinom koja kodira polipeptid sa aktivnošću GnTIII.

Identifikacija transfektanata ili transformanata koji eksprimiraju protein koji ima modifikovani glikozilacioni obrazac

[0132] Ćelije domaćini koje sadrže kodirajuću sekvencu himernog (npr., humanizovanog) ABM molekula koji ima suštinski istu specifičnost vezivanja kao pacovsko antitelo ICR62, i koje eksprimiraju biološki aktivne genske proizvode mogu biti identifikovane pomoću najmanje četiri opšta pristupa; (a) DNK-DNK ili DNK-RNK hibridizacija; (b) prisustvo ili odsustvo funkcija "marker" gena; (c) procena nivoa transkripcije merenog ekspresijom odgovarajućih transkripata iRNK u ćeliji domaćinu; i (d) detekcija genskog proizvoda ostvarena pomoću imunološkog testa ili preko njegove biološke aktivnosti.

[0133] U prvom pristupu, prisustvo kodirajuće sekvence himernog (npr., humanizovanog) ABM koji ima suštinski istu specifičnost vezivanja kao pacovsko antitelo ICR62 i kodirajuće sekvence polipeptida koji ima aktivnost GnTIII, može da se detektuje putem DNK-DNK ili DNK-RNK hibridizacije primenom proba koje sadrže nukleotidne sekvence koje su homologe odgovarajućim kodirajućim sekvencama, redom, ili njihovim delovima ili derivatima.

[0134] U drugom pristupu, sistem rekombinantni ekspresioni vektor/domaćin može da bude identifikovan i izabran na osnovu prisustva ili odsustva odredjenih funkcija "marker" gena (npr., aktivnost timidin kinaze, otpornost na antibiotike, otpornost na metotreksat, transformacioni fenotip, formiranje okluzionih tela kod bakulovirusa, itd.). Na primer, ako su kodirajuća sekvenca ABM molekula prema otkriću, ili njen fragment, i kodirajuća sekvenca polipeptida koji ima aktivnost GnTIII, ubačene unutar sekvence marker gena u vektoru, rekombinanti koji sadrže odgovarajuće kodirajuće sekvence mogu biti identifikovani prema odsustvu funkcije marker gena. Alternativno, marker gen može biti postavljen u tandemu sa kodirajućim sekvencama pod kontrolu istog ili različitog promotora koji se koristi za kontrolu ekspresije kodirajućih sekvenci. Ekspresija markera kao odgovor na indukciju ili selekciju ukazuje na ekspresiju kodirajuće sekvence ABM molekula prema otkriću i kodirajuće sekvence polipeptida koji ima aktivnost GnTIII.

[0135] U trećem pristupu, transkripciona aktivnost kodirajućeg regiona ABM molekula prema otkriću, ili njegovog fragmenta, i kodirajuće sekvence polipeptida koji ima aktivnost GnTIII, može da bude odredjena hibridizacionim testovima. Na primer, RNK može da bude izolovana i analizirana pomoću analize Northern blot korišćenjem probe koja je homologa kodirajućim sekvencama ABM molekula prema otkriću, ili njihovom fragmentu, i kodirajućoj sekvenci polipeptida koji ima aktivnost GnTIII, ili njihovim odredjenim delovima. Alternativno, može da se ekstrahuje ukupna nukleinska kiselina ćelije-domaćina i analizira njena hibridizacija sa takvim probama.

[0136] U četvrtom pristupu, ekspresija proteinskih proizvoda može da se odredi imunološki, na primer pomoću analize Western blot, imunoloških testova kao što su radioimunoprecipitacija, enzimski vezani imunološki testovi i slično. Završni test za procenu uspeha ekspresionog sistema, medjutim, obuhvata detekciju biološki aktivnih genskih proizvoda.

Stvaranje i primena ABM molekula koji imaju povećanu efektorsku funkciju uključujući ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela

[0137] U poželjnim izvodjenjima, dato otkriće opisuje glikoforme himernih (npr., humanizovanih) ABM molekula koji imaju suštinski istu specifičnost vezivanja kao pacovsko antitelo ICR62 i koji imaju povećanu efektorsku funkciju, uključujući ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela. Glikozilacioni inženjering antitela opisan je ranije. Videti, npr., SAD Patent br.6,602,684.

[0138] Klinička ispitivanja nekonjugovanih monoklonalnih antitela (mAbs) za lečenje nekih tipova kancera nedavno su dala ohrabrujuće rezultate. Dillman, Cancer Biother. & Radiopharm.12:223-25 (1997); Deo et al., Immunology Today 18:127 (1997). Himerni, nekonjugovani IgG1 odobren je za nisko-stepeni ili folikularni B-ćelijski ne-Hočkinov limfom, Dillman, Cancer Biother. & Radiopharm. 12:223-25 (1997), dok drugo nekonjugovano mAb, humanizovani IgG1 koji ciljno deluje na solidne tumore dojke, takodje pokazuje perspektivne rezultate u kliničkim ispitivanjima faze III. Deo et al., Immunology Today 18:127 (1997). Antigeni ova dva mAb visoko su eksprimirani u ćelijama odgovarajućih tumora i ova antitela posreduju u snažnom uništavanju tumora preko efektorskih ćelija in vitro i in vivo. Nasuprot tome, mnoga druga nekonjugovana mAb sa finim tumorskim specifilnostima ne mogu da pokrenu dovoljno snažene efektorske funkcije da bi bila klinički korisna. Frost et al., Cancer 80:317-33 (1997); Surfus et al., J. Immunother. 19:184-91 (1996). Za neka od ovih slabijih mAb, trenutno se ispituje dodatna terapija citokinima. Dodavanje citokina može da stimuliše ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC) povećanjem aktivnosti i broja limfocita u cirkulaciji. Frost et al., Cancer 80:317-33 (1997); Surfus et al., J. Immunother. 19:184-91 (1996). ADCC, litički napad na ćelije na koje ciljno deluje antitelo, pokreće se usled vezivanja leukocitnih receptora za konstantni region (Fc) antitela. Deo et al., Immunology Today 18:127 (1997).

[0139] Drugačiji, ali komplementaran pristup za povećanje ADCC aktivnosti nekonjugovanih IgG1 je konstrukcija Fc regiona antitela. Studije konstrukcije proteina pokazale su da FcγRs interaguje sa nižim zglobnim regionom CH2 domena IgG. Lund et al., J. Immunol.157:4963-69 (1996). Medjutim, vezivanje FcγR takodje zahteva prisustvo oligosaharida kovalentno vezanih na konzervativnom Asn 297 u CH2 regionu, Lund et al., Immunol. 157:4963-69 (1996); Wright and Morrison, Trends Biotech. 15:26-31 (1997), što sugeriše da ili oligosaharid i polipeptid direktno doprinose mestu interakcije, ili je oligosaharid potreban za održavanje aktivne konformacije CH2 polipeptida. Modifikacija oligosaharidne strukture može prema tome da se ispita kao sredstvo za povećanje afiniteta interakcije.

[0140] IgG molekul nosi dva N-vezana oligosaharida u svom Fc regionu, po jedan na svakom teškom lancu. Kao svaki glikoprotein, antitelo je proizvedeno kao populacija glikoformi koje dele isti polipeptidni osnovni lanac, ali imaju različite oligosaharide vezane za glikozilaciona mesta. Oligosaharidi koji se normalno nalaze u Fc regionu serumskog IgG su složenog biantenalnog tipa (Wormald et al., Biochemistry 36:130-38 (1997), sa niskim nivoom terminalne sijalinske kiseline i N-acetilglukozaminom (GlcNAc) podeljenim na dva jednaka dela, i promenljivim stepenom terminalne galaktozilacije i fukozilacije jezgra. Izvesne studije sugerišu da minimalna ugljenohidratna struktura koja je potrebna za FcγR vezivanje leži unutar oligosaharidnog jezgra. Lund et al., J. Immunol.157:4963-69 (1996).

[0141] Ćelijske linije poreklom od miša ili hrčka koje se koriste u industriji i nauci za proizvodnju nekonjugovanih terapeutskih mAb, normalno vezuju potrebne oligosaharidne determinante za Fc mesta. IgG koji su eksprimirani u ovim ćelijskim linijama nemaju, medjutim, GlcNAc podeljen na dva jednaka dela, koji se nalazi u malim količinama u serumskim IgG. Lifely et al., Glycobiology 318:813-22 (1995). Nasuprot tome, nedavno je zabeleženo da humanizovani IgG1 (CAMPATH-1H) proizveden iz mijeloma pacova nosi GlcNAc podeljen na dva jednaka dela u nekim od njegovih glikoformi. Lifely et al., Glycobiology 318:813-22 (1995). Antitelo izvedeno iz ćelija pacova dostiglo je sličnu maksimalnu in vitro ADCC aktivnost kao CAMPATH-1H antitela proizvedena u standardnim ćelijskim linijama, ali sa značajno nižim koncentracijama antitela.

[0142] CAMPATH antigen je normalno prisutan u visokim nivoima na ćelijama limfoma, i njegovo himerno mAb ima visoku ADCC aktivnost u odsustvu GlcNAc podeljenog na dva jednaka dela. Lifely et al., Glycobiology 318:813-22 (1995). U N-vezanom glikozilacionom putu, GlcNAc podeljen na dva jednaka dela dodaje se pomoću GnTIII. Schachter, Biochem. Cell Biol.64:163-81 (1986).

[0143] Prethodne studije su koristile jednu CHO ćelijsku liniju koja proizvodi antitelo, koja je prethodno konstruisana tako da eksprimira, na način koji je spolja regulisan, različite nivoe enzima kloniranog GnT III gena (Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999)). Ovaj pristup je po prvi put ustanovio strogu korelaciju izmedju ekspresije GnTIII i ADCC aktivnosti modifikovanog antitela. Prema tome, otkriće razmatra rekombinantno, himerno antitelo ili njegov fragment sa specifičnošću vezivanja pacovskog antitela ICR62, koje ima promenjenu glikozilaciju kao rezultat povećane aktivnosti GnTIII. Povećana aktivnost GnTIII ima za rezultat povećanje procenta oligosaharida podeljenih na dva jednaka dela, kao i smanjenje procenta fukoznih ostataka, u Fc regionu ABM molekula. Ovo antitelo, ili njegov fragment, ima povećani afinitet vezivanja za Fc receptor i povećanu efektorsku funkciju. Pored toga, otkriće je usmereno na fragment antitela i fuzione proteine koji sadrže region koji je ekvivalentan Fc regionu imunoglobulina. U poželjnom izvodjenju, antitelo je humanizovano.

Terapeutske primene ABM molekula proizvedenih prema postupcima u skladu sa pronalaskom

[0144] U najširem smislu, ABM molekuli datog otkrića mogu da se koriste za ciljno in vivo ili in vitro delovanje na ćelije koje eksprimiraju EGFR. Na ćelije koje eksprimiraju EGFR može ciljno da se deluje u dijagnostičke ili terapeutske svrhe. U jednom aspektu, ABM molekuli datog otkrića mogu da se koriste za detektovanje prisustva EGFR u uzorku. U drugom aspektu, ABM molekuli datog otkrića mogu da se koriste za inhibiranje ili redukovanje prenosa signala posredovanog preko EGFR u ćelijama koje eksprimiraju EGFR na svojoj površini. EGFR se abnormalno eksprimira (npr., prekomerno eksprimira) kod mnogih humanih tumora u poredjenju sa tkivom istog ćelijskog tipa koje nije tumorsko. Prema tome, ABM molekuli prema otkriću su posebno korisni u sprečavanju obrazovanja tumora, eradikaciji tumora i inhibiciji rasta tumora. Sprečavanjem vezivanja liganda EGFR za EGFR, ABM prema otkriću inhibiraju aktivaciju tumorskih ćelija zavisnu od EGF, uključujući EGFR fosforilaciju tirozina, povećanu stopu vanćelijske acidifikacije, i ćelijsku proliferaciju. ABM molekuli prema otkriću takodje deluju na zaustavljanje ćelijskog ciklusa, izazivaju apoptozu ciljnih ćelija (npr., tumorskih ćelija), i inhibiraju angiogenezu i/ili diferencijaciju ciljnih ćelija. ABM molekuli prema otkriću mogu da se koriste za lečenje bilo kog tumora koji eksprimira EGFR. Konkretni maligniteti koji mogu da se leče ABM molekulima prema otkriću uključuju, ali nisu ograničeni na karcinome epidermalnih i skvamoznih ćelija, nesitnoćelijske karcinome pluća, gliome, kancer pankreasa, kancer jajnika, kancer prostate, kancer dojke, kancer bešike, kancer glave i vrata, i karcinome renalnih ćelija.

[0145] ABM molekuli koji su ovde opisani mogu da se koriste pojedinačno za ciljno delovanje i ubijanje ćelija tumora in vivo. ABM molekuli takodje mogu da se koriste zajedno sa odgovarajućim terapeutskim sredstvom za lečenje humanog karcinoma. Na primer, ABM molekuli mogu da se koriste u kombinaciji sa standardnim ili uobičajenim postupcima za lečenje kao što je hemoterapija, terapija zračenjem ili mogu da budu konjugovani ili vezani za terapeutski lek, ili toksin, kao i za limfokin ili tumor-inhibitorni faktor rasta, za isporuku terapeutskog sredstva na mesto pojave karcinoma. Konjugati ABM ovog otkrića koji su od primarnog značaja su (1) imunotoksini (konjugati ABM i citotokisčne grupe) i (2) obeleženi (npr. radioaktivno obeleženi, enzimski obeleženi ili fluorohromom obeleženi) ABM molekuli u kojima obeleživač obezbedjuje sredstvo za identifikaciju imunih kompleksa koji obuhvataju obeleženi ABM. ABM molekuli takodje mogu da se koriste za indukciju lize preko prirodnog procesa komplementa, i za interakciju sa citotoksičnim ćelijama zavisnim od antitela koje su normalno prisutne.

[0146] Citotoksična grupa imunotoksina može biti citotoksičan lek ili enzimski aktivan toksin bakterijskog ili biljnog porekla, ili enzimski aktivan fragment ("A lanac") takvog toksina. Enzimski aktivni toksini i njihovi fragmenti koji se koriste su A lanac difterije, nevezujući aktivni fragmenti toksina difterije, A lanac egzotoksina (iz Pseudomonas aeruginosa), A lanac ricina, A lanac abrina, A lanac modekcina, alfa-sarcin, proteini Aleurites fordii, diantin proteini, proteini Phytolacca americana (PAPI, PAPII i PAP-S), inhibitor Momordica charantia, kurcin, krotin, inhibitor Sapaonaria officinalis, gelonin, mitogelin, restriktocin, fenomicin i enomicin. U drugom izvođenju, ABM molekuli su konjugovani za niskomolekulske lekove protiv kancera. Konjugati ABM molekula i takvih citotoksičnih grupa napravljeni su primenom različitih bifunkcionalnih proteinskih kuplujućih sredstava. Primeri takvih reagenasa su SPDP, IT, bifunkcionalni derivati imidoestara kao što je dimetil adipimidat HCl, aktivni estri kao što je disukcinimidil suberat, aldehidi kao što je glutaraldehid, bis-azido jedinjenja kao što je bis (p-azidobenzoil) heksandiamin, derivati bis-diazonijuma kao što je bis-(p-diazonijumbenzoil)-etilendiamin, diizocijanati kao što je tolilen 2,6-diizocijanat i bis-aktivna jedinjenja fluora kao što je 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen. Lizirajući deo toksina može biti spojen za Fab fragment ABM molekula. Dodatni odgovarajući toksini su poznati u stanju tehnike, kao što je prikazano u npr., objavljenoj SAD patentnoj prijavi br.2002/0128448.

[0147] U jednom izvodjenju, himerni (npr., humanizovani), ABM molekul izmenjen glikoinženjerstvom koji ima suštinski istu specifičnost vezivanja kao pacovsko antitelo ICR62, konjugovan je za A lanac ricina. Najpogodnije, A lanac ricina je deglikozilisan i proizveden pomoću rekombinantnih sredstava. Pogodan postupak za pripremu imunotoksina ricina opisan je kod Vitetta et al., Science 238, 1098 (1987).

[0148] Kada se koriste za ubijanje ćelija humanog kancera in vitro za dijagnostičke svrhe, konjugati će tipično biti dodati podlozi za ćelijsku kulturu u koncentraciji od najmanje oko 10 nM. Formulacija i način primene za in vitro primenu nisu kritični. Vodene formulacije koje su kompatitiblne sa podlogom za kulturu ili perfuzionim medijumom će se koristiti normalno. Citotoksičnost može da se očita uobičajenim tehnikama za odredjivanje prisustva ili stepena kancera.

[0149] Kao što je razmatrano u prethodnom tekstu, citotoksični radiofarmaceutik za lečenje kancera može da se napravi konjugacijom radioaktivnog izotopa (npr., I, Y, Pr) sa himernim ABM molekulom izmenjenim glikoinženjerstvom, koji ima suštinski istu specifičnost vezivanja kao pacovsko antitelo ICR62. Termin "citotoksična grupa", kako se ovde koristi, namenjen je da obuhvata takve izotope.

[0150] U sledećem izvodjenju, lipozomi su ispunjeni citotoksičnim lekom i lipozomi su obloženi ABM molekulima datog otkrića. Budući da na površini maligne ćelije koja eksprimira EGFR ima mnogo EGFR molekula, ovaj postupak omogućava isporuku velikih količina leka do pravog tipa ćelija.

[0151] Tehnike za konjugaciju takvih terapeutskih sredstava za antitela su dobro poznate (videti, npr., Arnon et al., "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy", u Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", u Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp.623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", u Monoclonal Antibodies ’84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp.

475-506 (1985); i Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)).

[0152] Druge terapeutske primene ABM molekula prema otkriću obuhvataju konjugaciju ili vezivanje, npr., pomoću tehnika rekombinantne DNK, za enzim koji je sposoban da prevede prolek u citotoksičan lek i upotrebu tog konjugata antitela i enzima u kombinaciji sa prolekom da bi se prolek preveo u citotoksično sredstvo na mestu pojave tumora (videti, npr., Senter et al., "Anti-Tumor Effects of Antibody-alkaline Phosphatase", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4842-46 (1988); "Enhancement of the in vitro and in vivo Antitumor Activities of Phosphorylated Mitocycin C and Etoposide Derivatives by Monoclonal Antibody-Alkaline Phosphatase Conjugates", Cancer Research 49:5789-5792 (1989); i Senter, "Activation of Prodrugs by Antibody-Enzyme Conjugates: A NewApproach to Cancer Therapy", FASEBJ. 4:188-193 (1990)).

[0153] Sledeća terapeutska primena ABM molekula prema otkriću obuhvata primenu, bilo nekonjugovanih, u prisustvu komplementa, ili kao dela konjugata antitelo-lek ili antitelo-toksin, u uklanjanju ćelija tumora iz koštane srži pacijenata sa kancerom. Prema ovom pristupu, autologna koštana srž može da bude prečišćena ex vivo tretmanom sa antitelom i vraćena infuzijom nazad u telo pacijenta [videti, npr., Ramsay et al., "Bone Marrow Purging Using Monoclonal Antibodies", J. Clin. Immunol., 8(2):81-88 (1988)].

[0154] Pored toga, predviđeno je da otkriće obuhvata jednolančani imunotoksin koji sadrži antigenvezujuće domene koji omogućavaju suštinski istu specifičnost vezivanja kao pacovsko ICR62 antitelo (npr., polipeptidi koji sadrže CDR regione pacovskog ICR62 antitela) i dalje sadrže polipeptid toksina. Jednolančani imunotoksini prema otkriću mogu da se koriste za lečenje humanog karcinoma in vivo.

[0155] Slično, fuzioni protein koji sadrži najmanje antigen-vezujući region ABM prema otkriću, spojen sa najmanje funkcionalno aktivnim delom drugog proteina koji ima antitumorsku aktivnost, npr., limfokina ili onkostatina, može da se koristi za lečenje humanog karcinoma in vivo.

[0156] Dato otkriće opisuje postupak za selektivno ubijanje ćelija tumora koje eksprimiraju EGFR. Ovaj postupak obuhvata reakciju imunokonjugata (npr., imunotoksina) prema otkriću sa navedenim ćelijama tumora. Ove ćelije tumora mogu da potiču od humanog karcinoma.

[0157] Dodatno, ovo otkriće opisuje postupak za lečenje karcinoma (na primer, humanih karcinoma) in vivo. Ovaj postupak sadrži primenu kod subjekta farmaceutski efikasne količine kompozicije koja sadrži najmanje jedan od imunokonjugata (npr., imunotoksin) prema otkriću.

[0158] U sledećem aspektu, otkriće je usmereno na poboljšani postupak za lečenje poremećaja ćelijske proliferacije u kojima se eksprimira EGFR, naročito u kojima se EGFR abnormalno eksprimira (npr. prekomerno eksprimira), uključujući kancere bešike, mozga, glave i vrata, pankreasa, pluća, dojke, jajnika, debelog creva, prostate, kože i bubrega, koji obuhvata primenu terapeutski efikasne količine ABM datog otkrića kod humanog subjekta kod koga postoji potreba za tim. U poželjnom izvodjenju, ABM je anti-EGFR antitelo izmenjeno glikoinženjerstvom sa specifičnošću vezivanja koja je suštinski ista kao ona kod pacovskog ICR62 antitela. U sledećem poželjnom izvodjenju, antitelo je humanizovano. Primeri poremećaja ćelijske proliferacije koji mogu da se leče pomću ABM datog otkrića uključuju, ali nisu ograničeni na neoplazme smeštene u: abdomenu, kostima, dojci, digestivnom sistemu, jetri, pankreasu, peritoneumu, endokrinim žlezdama (adrenalnoj, paratiroidnoj, hipofizi, testisima, jajniku, timusu, tiroidnoj), oku, glavi i vratu, nervnom sistemu (centralnom i perifernom), limfnom sistemu, karlici, koži, mekom tkivu, slezini, regionu grudnog koša, i urogenitalnom sistemu.

[0159] Slično, i drugi poremećaji ćelijske proliferacije mogu da se leče ABM molekulima datog otkrića. Primeri takvih poremećaja ćelijske proliferacije uključuju, ali nisu ograničeni na: hipergamaglobulinemiju, limfoproliferativne poremećaje, paraproteinemije, purpuru, sarkoidozu, Sezary sindrom, Waldenstron-ovu makroglobulinemiju, Gaucher-ovu bolest, histiocitozu, i bilo koju drugu bolest ćelijske proliferacije, pored neoplazije, smeštene u gore navedenom organskom sistemu.

[0160] U skladu sa praktikovanjem ovog otkrića, subjekat može da bude čovek, konj, svinja, govedo, miš, pas, mačka i ptica. Druge toplokrvne životinje su takodje obuhvaćene ovim otkrićem.

[0161] Predmet otkrića dalje opisuje postupke za inhibiciju rasta humanih tumorskih ćelija, lečenje tumora kod subjekta, i lečenje bolesti proliferativnog tipa kod subjekta. Ovi postupci sadrže primenu efikasne količine kompozicije prema otkriću kod subjekta.

[0162] Otkriće je dalje usmereno na postupke za lečenje ne-malignih bolesti ili poremećaja kod sisara koji se odlikuju abnormalnom aktivacijom ili proizvodnjom EGFR ili jednog ili više liganda EGFR, koji obuhvataju primenu kod sisara terapijski efikasne količine ABM prema otkriću. Subjekat će uopšteno imati ćelije koje eksprimiraju EGFR, na primer u svom obolelom tkivu, tako da su ABM molekuli prema otkriću sposobni da se vežu za ćelije u telu subjekta.

[0163] Abnormalna aktivacija ili ekspresija EGFR ili liganda EGFR može da se odvija u ćelijama subjekta, npr. u obolelom tkivu subjekta. Abnormalna aktivacija EGFR može da se pripiše amplifikaciji, prekomernoj ekspresiji ili aberantnoj proizvodnji EGFR i/ili liganda EGFR. U jednom izvodjenju otkrića, biće uradjen dijagnostički ili prognostički test da bi se utvrdilo da li se abnormalna proizvodnja ili aktivacija EGFR (ili liganda EGFR) javlja kod subjekta. Na primer, može da se odredi genska amplifikacija i/ili prekomerna ekspresija EGFR i/ili liganda. Različiti testovi za odredjivanje takve amplifikacije/prekomerne ekspresije su dostupni u stanju tehnike i uključuju IHC, FISH i testove za izlučivanje antigena koji su opisani iznad. Alternativno, ili dodatno, nivoi liganda EGFR, kao što je TGF-α u uzorku, ili povezano sa uzorkom, mogu da se odrede poznatim procedurama. Takvi testovi mogu da detektuju protein i/ili nukleinsku kiselinu koja ga kodira u ispitivanom uzorku. U jednom izvodjenju, nivoi liganda EGFR u uzorku mogu da se odrede upotrebom imunohistohemije (IHC); videti, na primer, Scher et al. Clin. Cancer Research 1:545-550 (1995). Alternativno, ili dodatno, mogu da se procene nivoi nukleinske kiseline koja kodira EGFR u ispitivanom uzorku; npr. putem tehnika FISH, Southern blotting, ili PCR.

[0164] Osim toga, prekomerna ekspresija ili amplifikacija EGFR ili liganda EGFR može da se proceni upotrebom in vivo dijagnostičkih testova, npr. primenom molekula (kao što je antitelo) koji se vezuje za molekul koji treba da se detektuje i obeležen je detektabilnom oznakom (npr. radioaktivnim izotopom) i eksternim skeniranjem pacijenta za lokalizovanje oznake.

[0165] Alternativno, mogu da se detektuju heterodimeri EGFR, posebno heterodimeri EGFR-ErbB2, EGFR-ErbB3 ili EGFR-ErbB4, kod pacijenta, npr. u njegovom obolelom tkivu, pre terapije. Dostupni su različiti postupci koji detektuju nekovalentne interakcije protein-protein ili na neki drugi način ukazuju na blizinu proteina od interesa. Primeri postupaka za detekciju heterodimera EGFR uključuju, bez ograničenja, postupke na bazi imunoafiniteta, kao što je imunoprecipitacija; transfer fluorescentne rezonantne energije (FRET) (Selvin, Nat. Struct. Biol. 7:730-34 (2000); Gadella & Jovin, J. Cell Biol. 129:1543-58 (1995); i Nagy et al., Cytometry 32:120-131 (1998)); ko-lokalizaciju EGFR sa ErbB2 ili ErbB3 upotrebom standardnih tehnika direktne ili indirektne imunofluorescencije i konfokalne laserske skenirajuće mikroskopije; snimanje laserskim skeniranjem (LSI) za detekciju vezivanja antitela i ko-lokalizaciju EGFR sa ErbB2 ili ErbB3 u formatu visoke propusnosti, kao što je mikrotitar ploča (Zuck et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:11122-11127 (1999)); ili eTag/m test-sistem (Aclara Bio Sciences, Mountain View, Calif.; i SAD patentna prijava 2001/0049105, objavljena 6. decembra 2001.).

[0166] Očigledno je, prema tome, da dato otkriće obuhvata farmaceutske kompozicije, kombinacije i postupke za lečenje humanih maligniteta kao što su kanceri bešike, mozga, glave i vrata, pankreasa, pluća, dojke, jajnika, debelog creva, prostate, kože i bubrega. Na primer, otkriće obuhvata farmaceutske kompozicije za primenu u lečenju humanih maligniteta koje sadrže farmaceutski efikasnu količinu antitela datog otkrića i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0167] Kompozicije ABM prema otkriću mogu da se primenjuju upotrebom uobičajenih načina primene uključujući, ali bez ograničenja intravensku, intraperitonealnu, oralnu, intralimfatičku primenu ili primenu direktno u tumor. Intravenska primena je poželjna.

[0168] U jednom aspektu otkrića, terapeutske formulacije koje sadrže ABM molecule prema otkriću pripremljene su za čuvanje mešanjem antitela koje ima željeni stepen čistoće sa izbornim farmaceutski prihvatljivim nosačima, ekscipijensima ili stabilizatorima (REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora. Prihvatljivi nosači, ekscipijensi ili stabilizatori su netoksični za primaoce u korišćenim dozama i koncentracijama, i obuhvataju pufere kao što su fosfat, citrat i druge organske kiseline; antioksidante uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što je oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabeni kao što je metil ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide niske molekulske težine (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što su serumski albumin, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide, i druge ugljene hidrate uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatirajuća sredstva kao što je EDTA; šećere kao što je saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; protiv-jone koji formiraju so kao što je natrijum; metalne komplekse (npr., Zn-protein kompleksi); i/ili ne-jonska površinski aktivna sredstva kao što je TWEEN™, PLURONICS™ ili polietilen glikol (PEG).

[0169] ABM molekuli datog otkrića mogu da se primene kod subjekta za lečenje bolesti ili poremećaja koji se odlikuje abnormalnom aktivnošću EGFR ili liganda EGFR, kao što je tumor, bilo sami, ili u kombinovanoj terapiji sa, na primer, hemoterapeutskim agensom i/ili radijacionom terapijom. Primeri formulacija anti-EGFR antitela opisani su kod Herbst i Shen, Cancer 94(5):1593-1611. Pogodni hemoterapeutski agensi uključuju cisplatin, doksorubicin, topotekan, paklitaksel, vinblastin, karboplatin i etopozid.

[0170] Liofilizovane formulacije prilagodjene za subkutanu primenu opisane su u WO97/04801. Takve liofilizovane formulacije mogu biti rekonstituisane sa pogodnim razblaživačem do visoke koncentracije proteina i rekonstituisana formulacija može biti primenjena subkutano kod sisara koji treba da se leči.

[0171] Formulacija u ovom dokumentu može takodje da sadrži više od jednog aktivnog jedinjenja ako je neophodno za odredjenu indikaciju koja se leči, poželjno jedinjenja sa komplementarnim aktivnostima koja ne utiču negativno jedna na druga. Na primer, može biti poželjno da se dalje obezbedi citotoksično sredstvo, hemoterapeutsko sredstvo, citokin ili imunosupresivno sredstvo (npr. ono koje deluje na T ćelije, kao što je ciklosporin ili antitelo koje vezuje T ćelije, npr., ono koje vezuje LFA-1). Efikasna količina takvih drugih sredstava zavisi od količine antagonista prisutnog u formulaciji, tipa bolesti, poremećaja ili lečenja, i drugih faktora koji su razmatrani u prethodnom tekstu. Oni se generalno koriste u istim dozama i istim načinima primene kao što je opisano u prethodnom tekstu ili od oko 1 do 99% do sada korišćenih doza.

[0172] Aktivni sastojci mogu takodje da budu obuhvaćeni mikrokapsulama pripremljenim, na primer, pomoću tehnika koacervacije ili pomoću medjupovršinske polimerizacije, na primer, hidroksimetilcelulozne ili želatinske-mikrokapsule i poli-(metilmetakrilatne) mikrokapsule, redom, u koloidnim sistemima za isporuku leka (na primer, lipozomima, albuminskim mikrosferama, mikroemulzijama, nanočesticama i nanokapsulama) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su opisane u Remington’s Pharmaceutical Sciences 16h edition, Osol, A. Ed. (1980).

[0173] Mogu da budu pripremljeni preparati sa produženim oslobadjanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobadjanjem obuhvataju polupropustljive matrice čvrstih hidrofobnih polimera koje sadrže antagonist, pri čemu su te matrice u obliku oblikovanih artikala, npr., filmova ili mikrokapsula. Primeri matrica sa produženim oslobodjanjem obuhvataju poliestre, hidrogelove (na primer, poli(2-hidroksietilmetakrilat), ili poli(vinilalkohol)), polilaktide (SAD pat. br.3,773,919), kopolimere L-glutaminske kiseline i γ-etil-L-glutamata, nerazgradivi etilen-vinil acetat, razgradive kopolimere mlečne kiseline i glikolne kiseline kao što je LUPRON DEPOT™ (injektabilne mikrosfere sačinjene od kopolimera mlečne kiseline i glikolne kiseline i leuprolid acetata), i poli-D-(-)-3-hidroksibuternu kiselinu.

[0174] Formulacije za primenu za in vivo primenu moraju da budu sterilne. To se lako postiže filtracijom kroz sterilne filtracione membrane.

[0175] Kompozicije prema otkriću mogu da budu u različitim oblicima doze koji obuhvataju, ali bez ograničenja tečne rastvore ili suspenzije, tablete, pilule, praškove, supozitorije, polimerne mikrokapsule ili mikrovezikule, lipozome i rastvore za injekciju ili infuziju. Poželjan oblik zavisi od načina primene i terapeutske primene.

[0176] Kompozicije prema otkriću takodje poželjno obuhvataju uobičajene farmaceutski prihvatljive nosače i adjuvanse poznate u stanju tehnike kao što je humani serumski albumin, jonski izmenjivači, aluminijum trioksid, lecitin, puferske supstance kao što su fosfati, glicin, sorbinska kiselina, kalijum sorbat i soli ili elektroliti kao što je protamin sulfat.

[0177] Najefikasniji način primene i režim doziranja za farmaceutske kompozicije ovog pronalaska zavise od težine i toka bolesti, zdravstvenog stanja pacijenta i odgovora na tretman i mišljenja nadležnog lekara. Prema tome, doze kompozicija trebalo bi da se titriraju prema pojedinačnom pacijentu. Ipak, efikasna doza kompozicija prema ovom otkriću generalno će biti u opsegu od oko 0.01 do oko 2000 mg/kg. U jednom izvodjenju, efikasna doza je u opsegu od oko 1.0 mg/kg do oko 15.0 mg/kg. U specifičnijem izvodjenju, doza je u opsegu od oko 1.5 mg/kg do oko 12 mg/kg. U drugim izvodjenjima, doza je u opsegu od oko 1.5 mg/kg do oko 4.5 mg/kg, ili od oko 4.5 mg/kg do oko 12 mg/kg. Doza prema datom otkriću može takodje da bude bilo koja doza unutar ovih opsega, uključujući, ali bez ograničenja, 1.0 mg/kg, 1.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 2.5 mg/kg, 3.0 mg/kg, 3.5 mg/kg, 4.0 mg/kg, 4.5 mg/kg, 5.0 mg/kg, 5.5 mg/kg, 6.0 mg/kg, 6.5 mg/kg, 7.0 mg/kg, 7.5 mg/kg, 8.0 mg/kg, 8.5 mg/kg, 9.0 mg/kg, 9.5 mg/kg, 10.0 mg/kg, 10.5 mg/kg, 11.0 mg/kg, 11.5 mg/kg, 12.0 mg/kg, 12.5 mg/kg, 13.0 mg/kg, 13.5 mg/kg, 14.0 mg/kg, 14.5 mg/kg, ili 15.0 mg/kg.

[0178] Molekuli koji su ovde opisani mogu biti u različitim oblicima doze koji obuhvataju, ali bez ograničenja tečne rastvore ili suspenzije, tablete, pilule, praškove, supozitorije, polimerne mikrokapsule ili mikrovezikule, lipozome, i rastvore za injekciju ili infuziju. Poželjan oblik zavisi od načina primene i terapeutske primene.

[0179] Doze prema datom otkriću mogu, u nekim slučajevima, da se odrede upotrebom prediktivnih biomarkera. Prediktivni biomarkeri su molekulski markeri koji se koriste za odredjivanje (tj., za zapažanje i/ili kvantifikovanje) obrasca ekspresije i/ili aktivacije gena ili proteina povezanih sa tumorom, ili ćelijskih komponenti signalnog puta povezanog sa tumorom. Razjašnjavanje bioloških dejstava usmerenih terapija u tumorskom tkivu i pravljenje korelacije ovih dejstava sa kliničkim odgovorom pomaže u identifikovanju predominantnih puteva rasta i preživljavanja koji deluju u tumorima, čime se uspostavlja profil subjekata koji će verovatno odgovoriti na terapiju, i obrnuto, pruža se osnov za kreiranje strategija za prevazilaženje rezistencije. Na primer, biomarkeri za anti-EGFR terapiju mogu da sadrže molekule koji su u nishodnom signalnom putu EGFR koji vodi do poremećaja ćelijske proliferacije uključujući, ali bez ograničenja Akt, RAS, RAF, MAPK, ERK1, ERK2, PKC, STAT3, STAT5 (Mitchell, Nature Biotech.22: 363-364 (2004); Becker, Nature Biotech 22:15-18 (2004); Tsao and Herbst, Signal 4:4-9 (2003)). Biomarkeri za anti-EGFR terapiju mogu takodje da sadrže receptore faktora rasta kao EGFR, ErbB-2 (HER2/neu), i ErbB-3 (HER3), i mogu da budu pozitivni ili negativni prognostički faktori za odgovor pacijenta na terapiju sa anti-EGFR. Na primer, utvrdjeno je da je receptor faktora rasta ErbB-3 (HER3) negativni prognostički biomarker za anti-EGFR antitelo ABX-EGF (obj. SAD pat. prij. br.2004/0132097 A1).

[0180] Prognostički biomarkeri mogu da se mere testovima na ćelijama koji su dobro poznati u stanju tehnike uključujući, ali bez ograničenja imunohistohemiju, protočnu citometriju, imunofluorescenciju, testove vezivanja i detekcije, i reverzno-fazne testove, i/ili testove prikazane u obj. SAD pat. prij. br.

2004/0132097 A1. Prognostički biomarkeri za anti-EGFR terapiju, po sebi, mogu da se identifikuju u skladu sa tehnikama prikazanim u obj. SAD pat. prij. br.2003/0190689A1.

[0181] U jednom aspektu, dato otkriće opisuje postupak za lečenje poremećaja povezanog sa EGFR koji obuhvata predvidjanje odgovora na anti-EGFR terapiju kod humanog subjekta kome je lečenje potrebno, ispitivanjem uzorka uzetog od humanog subjekta pre terapije pomoću jednog ili više reagenasa koji detektuju ekspresiju i/ili aktivaciju prognostičkih biomarkera za poremećaj povezan sa EGFR kao što je kancer; odredjivanje obrasca ekspresije i/ili aktivacije jednog ili više prognostičkih biomarkera, pri čemu obrazac predvidja odgovor humanog subjekta na anti-EGFR terapiju; i primenu kod humanog subjekta za koga se predvidja da će pozitivno odgovoriti na lečenje sa anti-EGFR terapeutski efikasne količine kompozicije koja sadrži ABM datog otkrića. Kako se ovde koristi, humani subjekat za koga se predvidja da će pozitivno odgovoriti na lečenje sa anti-EGFR je onaj kod koga će anti-EGFR imati merljivo dejstvo na poremećaj povezan sa EGFR (npr., regresiju/smanjivanje tumora) i kod koga korist od anti-EGFR terapije ne prevazilaze neželjeni efekti (npr., toksičnost). Kako se ovde koristi, uzorak znači bilo koji biološki uzorak uzet iz organizma, posebno čoveka, koji sadrži jednu ili više ćelija, uključujući pojedinačne ćelije bilo kog porekla, uzorke tkiva ili biopsije koja je uklonjena iz organa kao što su dojka, pluća, gastrointestinalni trakt, koža, grlić materice, jajnik, prostata, bubreg, mozak, glava i vrat, ili bilo koji drugi organ ili tkivo u telu, i druge telesne uzorke uključujući, ali bez ograničenja, briseve, sputum, izlučevine, cerebrospinalnu tečnost, žuč, krv, limfnu tečnost, urin i feces.

[0182] Kompozicija koja sadrži ABM prema datom otkriću biće formulisana, dozirana i primenjena na način koji je u skladu sa dobrom medicinskom praksom. Faktori za razmatranje u ovom kontekstu obuhvataju odredjenu bolest ili poremećaj koji se leči, odredjenog sisara koji se leči, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzrok bolesti ili poremećaja, mesto isporuke sredstva, postupak primene, režim primene i druge faktore poznate lekarima. Terapeutski efikasna količina antagonista namenjena za primenu biće odredjena prema takvim faktorima.

[0183] Kao uopšteni predlog, terapeutski efikasna količina antitela koja je primenjena parenteralno po dozi biće u opsegu od oko 0.1 do 20 mg/kg telesne težine pacijenta na dan, sa tipičnim početnim opsegom korišćenog antagonista u opsegu od oko 2 do 10 mg/kg. U jednom izvodjenju, terapeutski efikasna količina je u opsegu od oko 1.0 mg/kg do oko 15.0 mg/kg. U specifičnijem izvodjenju, doza je u opsegu od oko 1.5 mg/kg do oko 12 mg/kg. U drugim izvodjenjima, doza je u opsegu od oko 1.5 mg/kg do oko 4.5 mg/kg, ili od oko 4.5 mg/kg do oko 12 mg/kg. Doza prema datom otkriću može takodje da bude bilo koja doza unutar ovih opsega, uključujući, ali bez ograničenja, 1.0 mg/kg, 1.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 2.5 mg/kg, 3.0 mg/kg, 3.5 mg/kg, 4.0 mg/kg, 4.5 mg/kg, 5.0 mg/kg, 5.5 mg/kg, 6.0 mg/kg, 6.5 mg/kg, 7.0 mg/kg, 7.5 mg/kg, 8.0 mg/kg, 8.5 mg/kg, 9.0 mg/kg, 9.5 mg/kg, 10.0 mg/kg, 10.5 mg/kg, 11.0 mg/kg, 11.5 mg/kg, 12.0 mg/kg, 12.5 mg/kg, 13.0 mg/kg, 13.5 mg/kg, 14.0 mg/kg, 14.5 mg/kg, ili 15.0 mg/kg.

[0184] U poželjnom izvodjenju, ABM je antitelo, poželjno humanizovano antitelo. Pogodne doze za takvo nekonjugovano antitelo su, na primer, u opsegu od oko 20 mg/m<2>do oko 1000 mg/m<2>. Na primer, moguće je primeniti kod pacijenta jednu ili više doza od suštinski manje od 375 mg/m<2>antitela, npr., pri čemu je doza u opsegu od oko 20 mg/m<2>do oko 250 mg/m<2>, na primer od oko 50 mg/m<2>do oko 200 mg/m<2>.

[0185] Pored toga, moguće je primeniti jednu ili više početnih doza antitela, praćenu jednom ili većim brojem naknadnih doza, pri čemu doza u mg/m<2>antitela u naknadnoj dozi (dozama) prevazilazi dozu u mg/m<2>antitela u početnoj dozi (dozama). Na primer, početna doza može da bude u opsegu od oko 20 mg/m<2>do oko 250 mg/m<2>(npr., od oko 50 mg/m<2>do oko 200 mg/m<2>), a naknadna doza može da bude u opsegu od oko 250 mg/m<2>do oko 1000 mg/m<2>.

[0186] Kao što je napomenuto u prethodnom tekstu, medjutim, ove predložene količine ABM molekula su u velikom stepenu podložne mišljenju lekara. Ključni faktor u izboru odgovarajuće doze i režima doziranja je dobijeni rezultat, kao što je naznačeno u prethodnom tekstu. Na primer, relativno više doze mogu da budu potrebne za početno lečenje tekućih i akutnih bolesti. Da bi se dobili najefikasniji rezultati, u zavisnosti od bolesti ili poremećaja, antagonist se primenjuje što je bliže moguće prvom simptomu, dijagnozi, izgledu ili pojavi bolesti ili poremećaja tokom remisija bolesti ili poremećaja.

[0187] U slučaju anti-EGFR antitela koja su korišćena za lečenje tumora, optimalni terapeutski rezultati su uglavnom postizani sa dozom koja je dovoljna da potpuno zasiti EGF receptore na ciljnim ćelijama. Doza koja je neophodna za postizanje zasićenja zavisiće od broja EGF receptora eksprimiranih po tumorskoj ćeliji (koji može značajno da varira medju različitim tipovima tumora). Serumske koncentracije niske kao 30 nM bile su efikasne u lečenju nekih tumora, dok kod drugih tumora koncentracije iznad 100 nM mogu da budu neophodne za postizanje optimalnog terapeutskog dejstva. Doza koja je neophodna za postizanje zasićenja za dati tumor može lako da se odredi in vitro putem radioimunoeseja ili imunoprecipitacije.

[0188] Uopšteno, za kombinovanu terapiju sa zračenjem, jedan pogodan terapeutski režim uključuje osam nedeljnih infuzija anti-EGFR ABM prema otkriću sa udarnom dozom od 100-500 mg/m<2>praćenom dozama održavanja od 100-250 mg/m<2>i zračenjem u količini od 70.0 Gy u dozi od 2.0 Gy dnevno. Za kombinovanu terapiju sa hemoterapijom, jedan pogodan terapijski režim uključuje primenu anti-EGFR ABM prema otkriću u vidu nedeljnih udarnih doza/doza održavanja od 100/100 mg/m<2>, 400/250 mg/m<2>, ili 500/250 mg/m<2>u kombinaciji sa cisplatinom u dozi od 100 mg/m<2>svake tri nedelje. Alternativno, umesto cisplatina mogu da se koriste gemcitabin ili irinotekan.

[0189] ABM datog otkrića primenjuje se na bilo koji pogodni način, uključujući parenteralnu, subkutanu, intraperitonealnu, intrapulmonarnu i intranazalnu, i, ako je potrebno za lokalni imunosupresivni tretman, intralezionu primenu. Parenteralne infuzije obuhvataju intramuskularnu, intravensku, intraarterijsku, intraperitonealnu ili subkutanu primenu. Pored toga, antagonist može pogodno da bude primenjen pulsnom infuzijom, npr., sa opadajućim dozama antagonista. Poželjno, doziranje se izvodi injekcijama, najpoželjnije intravenskim ili subkutanim injekcijama, u zavisnosti delimično od toga da li je primena kratkoročna ili hronična.

[0190] Ovde je moguće primenjivati druga jedinjenja, kao što su citotoksična sredstva, hemoterapeutska sredstva, imunosupresivna sredstva i/ili citokini sa antagonistima. Kombinovana primena obuhvata istovremenu primenu, upotrebom odvojenih formulacija ili pojedinačne farmaceutske formulacije, i zatim primenu po bilo kom redosledu, pri čemu, poželjno postoji vremenski period u kome oba (ili sva) aktivna sredstva istovremeno ispoljavaju svoje biološke aktivnosti.

[0191] Jasno je da doza kompozicije prema otkriću koja je potrebna da bi se lečenje ostvarilo može biti dodatno smanjena sa optimizacijom režima doziranja.

[0192] U skladu sa izvodjenjem pronalaska, farmaceutski nosač može da bude lipidni nosač. Lipidni nosač može da bude fosfolipid. Pored toga, lipidni nosač može da bude masna kiselina. Takodje, lipidni nosač može da bude deterdžent. Kako se ovde koristi, deterdžent je bilo koja supstanca koja menja površinski napon tečnosti, generalno ga snižavajući.

[0193] U jednom primeru otkrića, deterdžent može da bude nejonski deterdžent. Primeri nejonskih deterdženata obuhvataju, ali nisu ograničeni na polisorbat 80 (takodje poznat kao Tween 80 ili polioksietilensorbitan monooleat), Brij i Triton (na primer Triton WR-1339 i Triton A-20).

[0194] Alternativno, deterdžent može da bude jonski deterdžent. Primer jonskog deterdženta obuhvata, ali nije ograničen na alkiltrimetilamonijum bromid.

[0195] Pored toga, u skladu sa otkrićem, lipidni nosač može da bude lipozom. Kao što se koristi u ovoj prijavi, "lipozom" je bilo koja membranski vezana vezikula koja sadrži bilo koji molekul prema pronalasku ili njihove kombinacije.

[0196] U još jednom izvodjenju, otkriće se odnosi na ABM prema datom otkriću za upotrebu kao lek, posebno za upotrebu u lečenju ili profilaksi kancera ili za upotrebu kod prekanceroznog stanja ili lezije. Kancer može da bude, na primer, kancer pluća, nesitnoćelijski kancer pluća (NSCL), kancer bronhoalveolarnih ćelija pluća, kancer kosti, kancer pankreasa, kancer kože, kancer glave ili vrata, kožni ili intraokularni melanom, kancer materice, kancer jajnika, kancer rektuma, kancer analne regije, kancer stomaka, kancer želuca, kancer debelog creva, kancer dojke, kancer materice, karcinom Falopijevih tuba, karcinom endometrijuma, karcinom grlića materice, karcinom vagine, karcinom stidnice, Hočkinova bolest, kancer jednjaka, kancer tankog creva, kancer endokrinog sistema, kancer tiroidne žlezde, kancer paratiroidne žlezde, kancer adrenalne žlezde, sarkom mekog tkiva, kancer uretre, kancer penisa, kancer prostate, kancer bešike, kancer bubrega ili uretera, karcinom renalnih ćelija, karcinom bubrežne karlice, mezoteliom, hepatocelularni kancer, kancer žučnih puteva, hronična ili akutna leukemija, limfocitni limfomi, neoplazme centralnog nervnog sistema (CNS), tumori kičmenog stuba, gliom moždanog stabla, multiformni glioblastom, astrocitomi, švanomi, ependimomi, meduloblastomi, meningiomi, karcinomi skvamoznih ćelija, adenomi hipofize, uključujući refraktorne verzije bilo kog od gore navedenih kancera, ili kombinacije jednog ili više gore navedenih kancera. Prekancerozno stanje ili lezija uključuje, na primer, grupu koja se sastoji od oralne leukoplakije, aktinične keratoze (solarne keratoze), prekanceroznih polipa debelog creva ili rektuma, gastrične epitelne displazije, adenomatozne displazije, sindroma naslednog nepolipoznog kancera debelog creva (HNPCC), Baretovog jednjaka, displazije bešike i prekanceroznih stanja grlića materice.

[0197] Poželjno, navedeni kancer je odabran iz grupe koja se sastoji od kancera dojke, kancera bešike, kancera glave i vrata, kancera kože, kancera pankreasa, kancera pluća, kancera jajnika, kancera debelog creva, kancera prostate, kancera bubrega i kancera mozga.

[0198] Još jedan primer izvodjenja je upotreba ABM molekula prema datom otkriću za proizvodnju leka za lečenje ili profilaksu kancera. Kancer je kao što je gore definisano.

[0199] Poželjno, navedeni kancer je izabran iz grupe koja se sastoji od kancera dojke, kancera bešike, kancera glave i vrata, kancera kože, kancera pankreasa, kancera pluća, kancera jajnika, kancera debelog creva, kancera prostate, kancera bubrega i kancera mozga.

[0200] Takodje poželjno, navedeni antigen-vezujući molekul se koristi u terapeutski efikasnoj količini od oko 1.0 mg/kg do oko 15 mg/kg.

[0201] Takodje još poželjnije, navedeni antigen-vezujući molekul se koristi u terapeutski efikasnoj količini od oko 1.5 mg/kg do oko 12 mg/kg.

[0202] Takodje još poželjnije, navedeni antigen-vezujući molekul se koristi u terapeutski efikasnoj količini od oko 1.5 mg/kg do oko 4.5 mg/kg.

[0203] Takodje još poželjnije, navedeni antigen-vezujući molekul se koristi u terapeutski efikasnoj količini od oko 4.5 mg/kg do oko 12 mg/kg.

[0204] Najpoželjnije, navedeni antigen-vezujući molekul se koristi u terapeutski efikasnoj količini od oko 1.5 mg/kg.

[0205] Takodje najpoželjnije, navedeni antigen-vezujući molekul se koristi u terapeutski efikasnoj količini od oko 4.5 mg/kg.

[0206] Takodje najpoželjnije, navedeni antigen-vezujući molekul se koristi u terapeutski efikasnoj količini od oko 12 mg/kg.

[0207] U još jednom izvodjenju, dato otkriće je usmereno na postupak za lečenje poremećaja povezanog sa EGFR kod sisara kome je lečenje potrebno koji obuhvata primenu kod sisara ABM datog otkrića, pri čemu lečenje rezultuje serumskim koncentracijama navedenog ABM izmedju oko 1 i oko 500 μg/ml, tokom perioda od najmanje 4 nedelje, i pri čemu lečenje ne uzrokuje klinički značajan nivo toksičnosti kod navedenog sisara. U drugim izvodjenjima, serumska koncentracija je količina izabrana iz grupe koja se sastoji od više od 1 μg/ml, više od 25 μg/ml, više od 50 μg/ml, više od 100 μg/ml, više od 200 μg/ml, više od 300 μg/ml, više od 400 μg/ml, više od 500 μg/ml, izmedju oko 1 i oko 100 μg/ml, izmedju oko 1 i oko 200 μg/ml, izmedju oko 1 i oko 300 μg/ml, izmedju oko 1 i oko 400 μg/ml, i izmedju oko 1 i oko 500 μg/ml. U poželjnom izvodjenju, sisar je čovek. U jednom izvodjenju ABM je antitelo. U poželjnom izvodjenju, antitelo je izmenjeno glikoinženjerstvom i ima povećano vezivanje FcgamaRIII u poredjenju sa oblikom antitela koje nije izmenjeno glikoinženjerstvom.

Proizvodni artikli

[0208] U još jednom izvodjenju prema otkriću, obezbedjen je proizvodni artikal koji sadrži materijale korisne za lečenje gore opisanih poremećaja. Proizvodni artikal sadrži kontejner i etiketu ili uputstvo na kontejneru, ili povezano sa kontejnerom. Pogodni kontejneri uključuju, na primer, boce, vajle, špriceve, itd. Kontejneri mogu da budu oblikovani od različitih materijala kao što je staklo ili plastika. Kontejner sadrži kompoziciju koja je efikasna za lečenje stanja i može da ima sterilan pristupni otvor (na primer kontejner može da bude kesa sa intravenskim rastvorom ili vajla koja ima zapušač koji može da se probije hipodermijskom injekcionom iglom). Najmanje jedan aktivni agens u kompoziciji je anti-EGFR antitelo. Etiketa ili uputstvo ukazuje na to da se kompozicija koristi za lečenje stanje po izboru, kao što je nemaligna bolest ili poremećaj, gde bolest ili poremećaj uključuje abnormalnu aktivaciju ili proizvodnju EGFR receptora i/ili EGFR-liganda, na primer benignu hiperproliferativnu bolest ili poremećaj. Osim toga, proizvodni artikal može da sadrži (a) prvi kontejner sa kompozicijom sadržanom u njemu, pri čemu kompozicija sadrži prvo antitelo koje vezuje EGFR i inhibira rast ćelija koje prekomerno eksprimiraju EGFR; i (b) drugi kontejner sa kompozicijom sadržanom u njemu, pri čemu kompozicija sadrži drugo antitelo koje vezuje EGFR i sprečava aktivaciju EGFR receptora ligandom. Proizvodni artikal u ovom izvodjenju prema otkriću može dodatno da sadrži uputstvo koje označava da prva i druga kompozicija antitela mogu da se koriste za lečenje nemaligne bolesti ili poremećaja sa spiska takvih bolesti ili poremećaja u odeljku definicija u tekstu iznad. Osim toga, uputstvo može da uputi korisnika kompozicije (koja sadrži antitelo koje vezuje EGFR i sprečava aktivaciju EGFR receptora ligandom) da kombinuje terapiju sa antitelom i bilo kojom od dodatnih terapija opisanih u prethodnom odeljku (npr. hemoterapeutski agens, lek koji ciljno deluje na EGFR, antiangiogeni agens, imunosupresivni agens, inhibitor tirozin kinaze, antihormonsko jedinjenje, kardioprotektant i/ili citokin). Alternativno, ili dodatno, proizvodni artikal može dodatno da sadrži drugi (ili treći) kontejner koji sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fosfatno puferisani slani rastvor, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. On može dodatno da uključuje druge materijale poželjne sa komercijalne i tačke gledišta korisnika, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.

[0209] Primeri dati ispod u tekstu objašnjavaju otkriće detaljnije. Sledeći preparati i primeri dati su da omoguće stručnjacima u oblasti da bolje razumeju i praktikuju dato otkriće.

PRIMERI

[0210] Osim ako nije drugačije navedeno, navedeni brojevi pozicija specifičnih aminokiselinskih ostataka u primerima koji slede dati su prema sistemu numeracije Kabata. Ako nije drugačije navedeno, materijali i metode korišćene za pravljenje antitela opisane u ovim radnim primerima su u skladu sa onim opisanim u primerima SAD patentne prijave br.10/981,738.

PRIMER 1

Materijali i metode

Pristup upotrebe akceptora visoke homologije

[0211] Pretraga akceptorskih okvirnih regiona antitela visoke homologije sprovedena je poravnavanjem proteinske sekvence pacovskog ICR62 sa kolekcijom humanih sekvenci klicine linije i odabirom humane sekvence koja je pokazala najveću identičnost sekvence, uz očuvanje svih kanonskih ostataka na funkcionalnom nivou. U ovom slučaju, sekvenca 1-e iz familije VH1 u bazi podataka VBase odabrana je kao akceptorska sekvenca okvirnog regiona teškog lanca, a sekvenca A30 iz familije VK1 u bazi podataka VBase odabrana je kao akceptorski okvirni region za laki lanac. Na ova dva akceptorska okvirna regiona nakalemljena su tri regiona koja odredjuju komplementarnost (CDR) i/ili ostaci koji odredjuju specifičnost ovih CDR regiona varijabilnog domena teškog i lakog lanca ICR62 pacova. Budući da okvirni region 4 nije deo varijabilnog regiona gena klicine linije, poravnanje za tu poziciju sprovedeno je pojedinačno. Region JH6 je odabran za teški lanac, a region JK2 je odabran za laki lanac. Molekulsko modelovanje konstruisanog imunoglobulinskog domena otkrilo je jednu poziciju van CDR1 po Kabatu, koja potencijalno zahteva mišje aminokiselinske ostatke umesto humanih izvan CDR. Ponovno uvodjenje mišjih aminokiselinskih ostataka u humani okvirni region stvorilo bi takozvane "povratne mutacije". Na primer, humani akceptorski aminokiselinski ostatak na poziciji 27 po Kabatu (glicin u 1-e) je povratno mutiran u tirozinski ostatak. Da bi se pokazao značaj ostataka za vezivanje antigena, konstruisane su humanizovane varijante antitela koje ili uključuju ili isključuju povratne mutacije. Laki lanac humanizovanog antitela nije zahtevao nikakve povratne mutacije. Posle konstruisanja proteinskih sekvenci, DNK sekvence koje kodiraju ove proteine sintetisane su kao što je detaljno prikazano u tekstu ispod.

Pristup upotrebe mešanih okvirnih regiona

[0212] Da bi se izbegla potreba za uvodjenjem povratnih mutacija na kritičnim pozicijama (kritičnim za očuvanje dobrog afiniteta za vezivanje antigena ili funkcija antitela) humanog akceptorskog okvirnog regiona, istraživano je da li okvirni region 1 (FR1), okvirni regioni 1 (FR1) i 2 (FR2) zajedno, ili okvirni region 3 (FR3) funkcionalno humanizovanog antitela mogu da se zamene humanim sekvencama antitela koje već imaju donorske ostatke, ili aminokiselinske ostatke koji su funkcionalno ekvivalentni donorskim ostacima, na važnim pozicijama ostataka u prirodnoj sekvenci humane klicine linije. U tu svrhu, VH okvirni regioni 1, 2 i 3 u VH sekvencama ICR62 pacova poravnati su pojedinačno sa sekvencama humane klicine linije. U ovom slučaju, najveća identičnost sekvence nije korišćena za odabir akceptorskih okvirnih regiona; umesto toga sprovedeno je podudaranje nekoliko kritičnih ostataka. Ovi kritični ostaci sadrže takozvane kanonske ostatke, i takodje one ostatke na pozicijama 27, 28 i 30 (numeracija po Kabatu), koji leže izvan CDR1 definisanog po Kabatu, ali su često uključeni u vezivanje antigena. Dodatno, kritični ostaci su oni koji pokazuju važne interakcije sa CDR, što se može odrediti upotrebom molekulskog modelovanja. Sekvenca IGHV1-58 u IMGT (ulazni br. M29809), IGHV5-51 (ulazni br. M99686), kao i sekvenca 1-02 u VBase iz familije VH1 izabrane su kao pogodne za zamenu FR1, 2, ili 3. Ukratko: IGHV1-58 je pokazala obećavajući obrazac na pozicijama 27 do 30 po Kabatu, ali ne ispunjava kriterijum za kanonsku poziciju 71. IGHV5-51 ima odgovarajući ostatak 71, tako da njen FR3 može da se koristi. Takodje, njen FR1 je blizak željenoj FR1 sekvenci.

[0213] Sekvenca 1-e u VH1 je ispunjavala sve kriterijume osim za poziciju 27. Sekvenca 1-02 je smatrana prihvatljivom za FR1 i FR2 regione, ali bi zahtevala povratnu mutaciju u FR3.

[0214] Posle konstruisanja proteinskih sekvenci, DNK sekvence koje kodiraju ove proteine sintetisane su kao što je detaljno opisano u daljem tekstu. Upotrebom ovog pristupa, povratne mutacije nisu bile neophodne u većini konstrukata teškog lanca, kako bi se zadržali dobri nivoi vezivanja antigena. Vremenski tok i način donošenja zaključaka tokom stvaranja konstrukata mešanih okvirnih regiona objašnjeni su u odeljku sa rezultatima.

Sinteza gena antitela

[0215] Posle konstruisanja aminokiselinske sekvence V regiona humanizovanog antitela, stvorena je DNK sekvenca. Podaci o DNK sekvenci pojedinačnih okvirnih regiona nadjeni su u bazama podataka (npr. IMGT ili VBase) za sekvence humane klicine linije. Informacije o DNK sekvenci za CDR regione uzete su iz objavljene sekvence ICR62 antitela pacova (videti, npr., PCT objavu WO 95/20045). U ovim sekvencama, cela DNK sekvenca je virtuelno sklopljena. Imajući ove podatke o DNK sekvenci, dijagnostička restrikciona mesta su uvedena u virtuelnu sekvencu uvodjenjem tihih mutacija, čime su stvorena mesta prepoznavanja za restrikcione endonukleaze. Da bi se fizički dobio lanac DNK, sintetisani su geni (videti, npr., Wheeler et al.1995). U ovom postupku, oligonukleotidi su konstruisani od gena od interesa, tako što jedan niz oligonukleotida potiče od kodirajućeg lanca, a drugi niz od nekodirajućeg lanca. 3’ i 5’ krajevi svakog oligonukleotida (osim prvog i poslednjeg u redu) uvek ispoljavaju komplementarne sekvence sa dva prajmera poreklom od suprotnog lanca. Kada se ovi oligonukleotidi stave u reakcioni pufer pogodan za bilo koju toplotno-stabilnu polimerazu, i dodaju Mg<2+>, dNTP i DNK polimeraza, svaki oligonukleotid se produžava na svom 3’ kraju. Novoformirani 3’ kraj jednog prajmera zatim se sparuje sa sledećim prajmerom suprotnog lanca, i njegova sekvenca se dalje produžava pod uslovima pogodnim za elongaciju DNK lanca zavisnu od matrice. Finalni proizvod je kloniran u konvencionalni vektor za propagaciju u E. coli.

Proizvodnja antitela

[0216] Za konstruisanje ekspresionih vektora za himerni (tj., potpuno pacovski V region i humani C region) i humanizovani laki i teški lanac anti-EGFR antitela, humane liderske sekvence (za sekreciju) teškog i lakog lanca dodate su uzvodno od DNK sekvenci varijabilnog regiona. Nizvodno od varijabilnih regiona, dodati su konstantni regioni IgG1 za teški lanac, i kapa konstantni region za laki lanac upotrebom standardnih tehnika molekularne biologije. Rezultujuće DNK sekvence teškog i lakog lanca celog antitela subklonirane su u sisarske ekspresione vektore (jedan za laki lanac i jedan za teški lanac) pod kontrolom MPSV promotora i uzvodno od sintetskog polyA mesta, pri čemu svaki vektor nosi OriP sekvencu iz EBV.

[0217] Antitela su proizvedena ko-transfekcijom ćelija HEK293-EBNA vektorima ekspresije teškog i lakog lanca antitela sisara pomoću metode transfekcije kalcijum fosfatom. Ćelije HEK293-EBNA u eksponencijalnoj fazi rasta transficirane su pomoću kalcijum fosfatnog postupka. Za proizvodnju nemodifikovanog antitela, ćelije su transficirane samo vektorima ekspresije teškog i lakog lanca antitela u odnosu 1:1. Za proizvodnju antitela izmenjenog glikoinženjerstvom, ćelije su ko-transficirane sa četiri plazmida, dva za ekspresiju antitela, jednim za ekspresiju fuzionog polipeptida GnTIII, jednim za ekspresiju manozidaze II u odnosu 4:4:1:1, redom. Ćelije su uzgajane kao jednoslojne adherirane kulture u T flaskovima upotrebom DMEM podloge za kuluturu obogaćene sa 10% FCS, i transficirane su kada su bile konfluentne izmedju 50 i 80%. Za transfekciju T75 flaska, 8 miliona ćelija je zasejano 24 časa pre transfekcije u 14 ml DMEM podloge za kulturu obogaćene sa FCS (u 10% zapr./zapr. krajnje koncentracije), 250 µg/ml neomicina, i ćelije su smeštene na 37°C u inkubator sa atmosferom sa 5% CO2preko noći. Za svaki T75 flask koji će biti transficiran, rastvor DNK, CaCl2i vode je pripremljen mešanjem 47 µg ukupne plazmidne vektorske DNK podeljene jednako izmedju ekspresionih vektora lakog i teškog lanca, 235 µl 1M CaCl2rastvora, i dodavanjem vode do krajnje zapremine od 469 µl. Ovom rastvoru dodato je 469 µl 50 mM HEPES, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na2HPO4rastvora na pH 7.05, odmah mešano tokom 10 sekundi i ostavljeno da odstoji na sobnoj temperaturi 20 sekundi. Suspenzija je razblažena sa 12 ml DMEM obogaćenog sa 2% FCS, i dodata u T75 umesto postojeće podloge. Ćelije su inkubirane na 37°C, 5% CO2tokom od oko 17 do 20 časova, zatim je podloga zamenjena sa 12 ml DMEM, 10% FCS. Kondicionirani medijum kulture ja sakupljen 5 do 7 dana posle transfekcije, centrifugiran 5 min na 1200 rpm, a zatim je izvršeno drugo centrifugiranje od 10 min na 4000 rpm, i skladišten na 4°C.

[0218] Izlučena antitela prečišćena su pomoću protein A afinitne hromatografije, praćene katjonskom izmenjivačkom hromatografijom i finalnim korakom ekskluzione hromatografije na koloni Superdex 200 (Amersham Pharmacia) izmenom pufera u fosfatno puferisani slani rastvor i sakupljanjem čistih monomernih IgG1 antitela. Koncentracija antitela je odredjena primenom spektrofotometra iz apsorbance na 280 nm. Antitela su formulisana u 25 mM kalijum fosfatu, 125 mM natrijum hloridu, 100 mM rastvoru glicina na pH 6.7.

[0219] Varijante humanizovanog antitela izmenjene glikoinženjerstvom proizvedene su ko-transfekcijom vektora ekspresije antitela zajedno sa vektorom ekspresije glikoziltransferaze GnT-III, ili zajedno sa vektorom ekspresije GnT-III i vektorom ekspresije Goldži manozidaze II. Antitela izmenjena glikoinženjerstvom prečišćena su i formulisana kao što je gore opisano za antitela koja nisu izmenjena glikoinženjerstvom. Oligosaharidi vezani za Fc region antitela analizirani su pomoću MALDI/TOF-MS kao što je opisano u tekstu ispod.

Analiza oligosaharida

[0220] Oligosaharidi su enzimatski oslobodjeni iz antitela pomoću razgradnje enzimom PNGaseF, pri čemu su antitela bila imobilizovana na PVDF membrani, ili u rastvoru.

[0221] Rastvor dobijen enzimskom razgradnjom koji sadrži oslobodjene oligosaharide pripremljen je direktno za MALDI/TOFMS analizu ili je dalje podvrgnut razgradnji EndoH glikozidazom pre pripreme uzoraka za MALDI/TOF-MS analizu.

Postupak oslobadjanja oligosaharida za antitela imobilizovana na PVDF membrani

[0222] Bunarčići ploče sa 96 bunarčića napravljene sa PVDF (Immobilon P, Millipore, Bedford, Massachusetts) membranom ovlaženi su sa 100 µl metanola i tečnost je izvučena kroz PVDF membranu primenom vakuuma primenjenog na multiskrin vakum kondenzator (Millipore, Bedford, Massachusetts). PVDF membrane su isprane tri puta sa 300 µl vode. Bunarčići su zatim isprani sa 50 µl RCM pufera (8M urea, 360 mM Tris, 3.2 mM EDTA, pH 8.6). Izmedju 30-40 μg antitela je sipano u bunarčić koji sadrži 10 µl RCM pufera. Tečnost u bunarčiću je izvučena kroz membranu primenom vakuuma, i membrana je zatim isprana dva puta sa 50 µl RCM pufera. Redukcija disulfidnih mostova izvedena je dodavanjem 50 µl 0.1M ditiotreitola u RCM i inkubacijom na 37°C tokom 1 časa.

[0223] Posle redukcije, primenjen je vakuum da bi se uklonio ditiotreitolski rastvor iz bunarčića. Bunarčići su isprani tri puta sa 300 µl vode pre izvodjenja karboksimetilacije cisteinskih ostataka dodavanjem 50 µl 0.1 M jodosirćetne kiseline u RCM pufer i inkubacijom na sobnoj temperaturi u mraku tokom 30 min.

[0224] Posle karboksimetilacije, bunarčići su ispražnjeni vakuumom i zatim isprani tri puta sa 300 µl vode. PVDF membrana je zatim blokirana, da bi se sprečila adsorpcija endoglikozidaze, inkubacijom 100 µl 1% vodenog rastvora polivinilpirolidona 360 na sobnoj temperaturi tokom 1 časa. Blokirajući reagens je zatim uklonjen blagim vakuumom, nakon čega su usledila tri ispiranja sa 300 µl vode.

[0225] N-vezani oligosaharidi su oslobodjeni dodavanjem 2.5 mU peptid-N-glikozidaze F (rekombinantna N-glikanaza, GLYKO, Novato, CA) i 0.1 mU sialidaze (GLYKO, Novato, CA), da bi se uklonili svi potencijalno naelektrisani ostaci monosaharida, u krajnjoj zapremini od 25 µl u 20 mM NaHCO3, pH 7.0). Enzimska razgradnja je izvedena tokom 3 časa na 37°C.

Postupak oslobadjanja oligosaharida za antitela u rastvoru

[0226] Izmedju 40 i 50 µg antitela je mešano sa 2.5 mU PNGaseF (Glyko, U.S.A.) u 2 mM Tris, pH 7.0 u krajnjoj zapremini od 25 mikrolitara, i mešavina je inkubirana 3 časa na 37 ̊C.

Upotreba enzimske razgradnje oligosaharida, oslobođenih dejstvom PNGaseF, endoglikozidazom H za raspodelu hibridnih oligosaharidnih struktura podeljenih na dva jednaka dela prema MALDI/TOF-MS pikovima neutralnih oligosaharida

[0227] Oligosaharidi oslobođeni dejstvom PNGaseF su zatim podvrgnuti razgradnji endoglikozidazom H (EC 3.2.1.96). Za razgradnju endoglikozidazom H, 15 mU endoglikozidaze H (Roche, Switzerland) dodato je u proizvod razgradnje enzimom PNGaseF (postupak za antitela u rastvoru iz prethodnog teksta), da bi se dobila krajnja zapremina od 30 mikrolitara, i mešavina je inkubirana 3 časa na 37 ̊C. Endoglikozidaza H razdvaja N-acetilglukozaminske ostatke od hitobioznog jezgra N-vezanih oligosaharida. Enzim može da razgradi samo oligomanozu i najhibridniji tip glikana, pri čemu ologosaharidi složenog tipa ne hidrolizuju.

Priprema preparata za MALDI/TOF-MS

[0228] Proizvodi enzimske digestije koji sadrže oslobodjene oligosaharide inkubirani su još 3 časa na sobnoj temperaturi posle dodavanja sirćetne kiseline do krajnje koncentracije od 150 mM, a zatim su propušteni kroz 0.6 ml katjonske izmenjivačke smole (AG50W-X8 smola, vodonični oblik, 100-200 meša, BioRad, Switzerland) pakovane u mikro-bio-spin hromatografsku kolonu (BioRad, Switzerland) da bi se uklonili katjoni i proteini. Jedan mikrolitar dobijenog uzorka je nanet na nerdjajuću čeličnu ciljnu ploču, i pomešan na ploči sa 1 µl sDHB matrice. Matrica sDHB je pripremljena rastvaranjem 2 mg 2,5-dihidroksibenzoeve kiseline sa 0.1 mg 5-metoksisalicilnom kiselinom u 1 ml etanola/10 mM vodenog rastvora natrijum hlorida 1:1 (zapr./zapr.). Uzorci su sušeni na vazduhu, dodato je 0.2 µl etanola i uzorci su konačno ostavljeni da rekristališu na vazduhu.

MALDI/TOF-MS

[0229] MALDI-TOF maseni spektrometar korišćen da bi se dobili maseni spektri bio je Voyager Elite (Perspective Biosystems). Instrument je radio u linearnoj konfiguraciji, sa ubrzanjem od 20 kV i zadržavanjem od 80 ns. Spoljašnja kalibracija uz upotrebu oligosaharidnih standarda korišćena je za dodeljivanje mase jonima. Spektri od 200 laserskih snopova sabrani su da bi se dobio krajnji spektar.

Test vezivanja antigena

[0230] Ispitivano je vezivanje prečišćenih monomernih varijanti humanizovanog antitela za receptor za humani epidermalni faktor rasta (EGFR, u literaturi označen i kao HER-1 ili ErbB1) na humanoj epidermalnoj ćelijskoj liniji A431, upotrebom testa na bazi protočne citometrije. 200000 ćelija (npr., iz humane ćelijske linije A431) u 180 μl FACS pufera (PBS koji sadrži 2% FCS i 5 mM, EDTA) prebačeno je u polistirenske epruvete od 5 ml i dodato je 20 μl uzoraka 10 puta koncentrovanog anti-EGFR antitela (primarno antitelo) (finalne koncentracije 1-5000 ng/ml) ili samo PBS. Posle pažljivog mešanja uzoraka, epruvete su inkubirane na 4 ̊C 30 min u mraku. Zatim, uzorci su isprani dva puta sa FACS puferom i istaloženi na 300 x g tokom 3 min. Supernatant je usisan i ćelije su sipane u 50 μl FACS pufera i dodato je 2 μl sekundarnog antitela (anti-Fc-specifični F(ab’)2-FITC fragmenti (Jackson Immuno Research Laboratories, SAD)) i epruvete su inkubirane na 4°C tokom 30 min. Uzorci su isprani dva puta FACS puferom i sipani u 500 μl FACS pufera za analizu prtočnom citometrijom. Vezivanje je odredjeno pravljenjem grafikona geometrijske sredine fluorescencije u odnosu na koncentracije antitela.

Vezivanje glikovarijanti monomernog IgG1 za ćelijsku liniju CHO koja eksprimira FcɣRIIIA

[0231] CHO ćelije su transficirane elektroporacijom (280 V, 950 μF, 0.4 cm) ekspresionim vektorom koji kodira α-lanac i γ-lanac Fc gamaRIIIA-Va1158. Transfektanti su selekcionisani dodavanjem 6 μg/ml puromicina i stabilni klonovi su analizirani pomoću FACS upotrebom 10 μl FITC-konjugovanog-anti-FcgamaRIII 3G8 monoklonskog antitela (BD Biosciences, Allschwil/Switzerland) za 10<6>ćelija. Sprovedeno je vezivanje IgG1 za CHO ćelije koje eksprimiraju Fc gamaRIIIAVal158. Ukratko, F(ab’)2fragmenti anti-FcgammaRIIIA 3G8 (Ancell, Bayport, MN/USA) su dodati u koncentraciji od 10 μg/ml da kompetiraju vezivanju glikovarijanti antitela (3 μg/ml). Intenzitet fluorescencije koji odgovara vezanim varijantama antitela odredjen je pomoću uredjaja FACSCalibur (BD Biosciences, Allschwil /Switzerland).

Test ADCC

[0232] Humane mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) korišćene su kao efektorske ćelije i pripremljene su primenom Histopaque-1077 (Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, MO63178 USA) i sledeći uglavnom uputstva proizvodjača. Ukratko, venska krv je uzeta heparinizovanim špricevima od zdravih dobrovoljaca. Krv je razblažena 1:0.75-1.3 sa PBS (ne sadrži Ca<++>ili Mg<++>) i naneta u sloju na Histopaque-1077. Gradijent je centrifugiran na 400 x g tokom 30 min na sobnoj temperaturi (RT) bez prekida. Međufaza koja sadrži PBMC je sakupljena i isprana sa PBS (50 ml po ćelijama iz dva gradijenta) i sakupljena centrifugiranjem na 300 x g tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi. Posle resuspendovanja taloga sa PBS, PBMC su brojane i isprane drugi put centrifugiranjem na 200 x g tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi. Ćelije su zatim resuspendovane u odgovarajuću podlogu za kasnije procedure.

[0233] Odnos efektorskih i ciljnih ćelija koji je korišćen za testove ADCC bio je 25:1 i 10:1 za PBMC, odnosno NK ćelije. Efektorske ćelije su pripremljene u AIM-V podlozi u odgovarajućoj koncentraciji kako bi se dodalo 50 μl po bunarčiću ploča sa 96 bunarčića sa okruglim dnom. Ciljne ćelije su bile humane ćelije koje eksprimiraju EGFR (npr., A431, EBC-1, ili LN229) uzgajane u DMEM koji sadrži 10% FCS. Ciljne ćelije su isprane u PBS, izbrojane i resuspendovane u AIM-V pri 0.3 miliona po ml da bi se dodalo 30000 ćelija u 100 μl po mikrobunarčiću. Antitela su razblažena u AIM-V, dodata po 50 μl prethodno zasejanim ciljnim ćelijama i ostavljena da se vežu za ciljna mesta 10 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim su dodate efektorske ćelije i ploča je inkubirana 4 časa na 37°C u vlažnoj atmosferi koja sadrži 5% CO2. Ubijanje ciljnih ćelija je procenjeno merenjem oslobadjanja laktat dehidrogenaze (LDH) iz oštećenih ćelija primenom kompleta za detekciju citotoksičnosti (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Switzerland). Posle 4-časovne inkubacije, ploče su centrifugirane na 800 x g.100 μl supernatanta iz svakog bunarčića prebačeno je u novu providnu ploču sa 96 bunarčića sa ravnim dnom. U svaki bunarčić je dodato po 100 μl pufera sa obojenim supstratom iz kompleta. Vrednosti Vmax bojene reakcije odredjivane su u ELISA čitaču na 490 nm najmanje 10 min upotrebom kompjuterskog programa SOFTmax PRO (Molecular Devices, Sunnyvale, CA94089, USA). Spontano oslobadjanje LDH mereno je iz bunarčića koji sadrže samo ciljne i efektorske ćelije, ali ne i antitela. Maksimalno oslobadjanje je odredjeno iz bunarčića koji sadrže samo ciljne ćelije i 1% Triton X-100. Procenat ubijanja ćelija posredovanog preko specifičnog antitela izračunat je na sledeći način: ((x-SR)/(MR - SR)*100, gde je x srednja vrednost za Vmax na specifičnoj koncentraciji antitela, SR je srednja vrednost za Vmax spontanog oslobadjanja i MR je srednja vrednost za Vmax maksimalnog oslobadjanja.

PRIMER 2

Rezultati i diskusija

[0234] Poredjenje vezivanja za humani EGF-receptor varijanti antitela I-HHA, I-HHB, I-HHC, I-HLA, I-HLB, IHLC, I-HLA1, I-HLA2, I-HLA3, I-HLA4, I-HLA5, I-HLA6, I-HLA7, I-HLA8, I-HLA-9, I-HHD, I-HHE, I-HHF i I-HHG, ili u kompleksu sa lakim lancem himernog ICR62 ili sa lakim lancima humanizovanog ICR62 (I-KA, I-KB, ili I-KC) i parentalnog, himernog antitela ch-ICR62, pokazalo je da sva antitela imaju vrednosti EC50 koje su slične u okviru jednog log. Samo I-HHA ima jako smanjenu aktivnost vezivanja (videti sliku 2). Slika 1 pokazuje funkcionalnu aktivnost pojedinačnih polipeptidnih lanaca himernog ICR62 (ch-ICR62) kada se kombinuju sa humanizovanim konstruktima I-HHC, odnosno I-KB. U ovom eksperimentu, laki lanac, teški lanac, ili oba lanca istovremeno u ch-ICR62 zamenjena su gore pomenutim humanizovanim konstruktima. Ovo pokazuje da, kako izgleda, formiranje medjuspoja VH/VL funkcioniše kako kod antitela glodara, tako i u humanizovanim konstruktima.

[0235] Kao što je prikazano na slici 2, humanizovani teški lanac I-HHA nije mogao da obnovi aktivnost vezivanja ni sa lakim lancem I-KA, niti I-KB. Kako I-HLA nije ispoljio vezivanje ni sa I-KA, ni sa I-KB, pronalazači ovog pronalaska zaključili su da teški lanac iz I-HHA nije funkcionalan u vezivanju antigena. Slike 1 i 2, u kombinaciji sa slikom 3, pokazuju da konstrukti lakog lanca I-KA, I-KB i I-KC ispoljavaju svojstvo vezivanja koje se ne može razlikovati od njihovog glodarskog analoga. Varijante I-KC nemaju nikakve povratne mutacije, i dodatno imaju delimično humanizovani CDR1, tako da ostaci 24-29 mogu da se dobiju od humane akceptorske sekvence (A30 iz VK1, kao što je ranije pomenuto).

[0236] U serijama I-HHA, I-HHB i I-HHC, samo dve poslednje varijante su ispoljile zadovoljavajuće svojstvo vezivanja (slike 2 i 3). Analiza sekvence za I-HHA otkrila je tri potencijalna aminokiselinska ostatka odgovorna za ovo svojstvo: Lys33, His35 i Tyr50. Konstrukti koji imaju Lys33 zamenjen tirozinom pokazali su dobro vezivanje, kao i konstrukti koji imaju Tyr50 zamenjen triptofanom. Samo kada su ova dva ostatka bila zamenjena alaninom odnosno glicinom, vezivanje se izgubilo. Kako I-HHC nije pokazao bolje vezivanje od I-HHB, pronalazači ovog pronalaska zaključili su da ostaci Asn60, Glu61, Lys64 i Ser65 ne moraju da budu glodarskog porekla; ili mogu da budu zamenjeni sa Ala, Gln, Gln i Gly, redom. Ovaj postupak vodi konstruktu u kome je CDR2 humanizovaniji, jer su aminokiselinske pozicije 60 do 65 deo CDR po definiciji Kabata, ali nema potrebe za kalemljenjem glodarskih donorskih ostataka u slučaju ovog antitela.

[0237] Slike 4 i 5 porede konstrukte niza I-HLA1, 1-HLA2, I-HLA3, I-HLA4, I-HLA5 i I-HLA6. Najbolje svojstvo vezivanja zapaženo je kod konstrukata ch-ICR62, I-HLA1 i IHLA2, sa vrednošću EC50 od pribl.

300 ng/ml. Drugi konstrukti su imali ovu vrednost povećanu za faktor dva, i stoga su imali blago smanjenu aktivnost vezivanja. Prvi zaključak iz ovih podataka je da su, u Kabatovom CDR1, supstitucije Lys33Tyr i Ile34Met tolerisane. Ove dve pozicije se nalaze u CDR1 po Kabatovoj definiciji, ali van granica CDR prema sistemu Chothia (ovo je zasnovano na strukturnoj analizi, pre nego na analizi sekvence). U poslednjem delu CDR1, prema tome, dozvoljena je bar izvesna raznorodnost.

[0238] Drugi zaključak je to da, u CDR2, pored gorepomenutih zamena ostataka Asn60 i Glu61 ostacima koji nisu donorski, Asn60Ser, Glu61Pro i Lys62Ser, takodje su dozvoljene i supstitucije koje nisu donorske u Kabatovom CDR regionu. Ovi ostaci potiču od humane IGHV5-51 akceptorske sekvence klicine linije, koja je korišćena kao FR3 akceptorska sekvenca. Konstrukti I-HLA3 i I-HLA4 se razlikuju od I-HLA1 i I-HLA2 samo po uklanjanju povratne mutacije Phe27Tyr, i oba, i I-HLA3 i I-HLA4 konstrukt, gube afinitet u poredjenju sa svojim parentalnim konstruktom. Stoga, treći zaključak poredjenja I-HLA1, I-HLA2, I-HLA3, I-HLA4, I-HLA5 i I-HLA6 je učešće Phe27 u vezivanju antigena, bilo direktno ili indirektno, putem modifikovanja konformacije petlje u CDR1.

[0239] Varijante I-HLA5 i I-HLA6 imaju FR1 iz I-HLA1, odnosno I-HLA2, zamenjen drugom akceptorskom sekvencom klicine linije sa prirodno prisutnim Phe27 (tj., IGHV1-58). Ovo je moglo da se postigne samo istovremenim uvodjenjem nekoliko drugih mutacija koje su: Val2Met, Ala9Pro i Alal6Thr. Samim tim, koristan efekat (ponovnog) uvodjenja Phe27 ponovo je ukinut.

[0240] Konstrukt I-HLA7 je procenjivan da bi se odredilo da li će obnavljanje dodatnih donorskih ostataka u CDR1 i CDR2 teškog lanca u I-HLA6 konstruktu obnoviti potpunu aktivnost vezivanja u poredjenju sa ICR62. Kao što je prikazano na slici 6, to nije bio slučaj.

[0241] Kao što je prikazano na slikama 7 i 8, dva dodatna konstrukta, I-HLA8 i I-HLA9, ispitana su da bi se odredilo da li može da se ostvari potpuna aktivnost vezivanja u poredjenju sa ch-ICR62. Polazeći od konstrukta I-HHB, FR1 regioni su zamenjeni FR1 regionima koji imaju maksimalnu homologiju u CDR1 regionu prema sistemu Chothia. Konstrukt I-HLA8 ima FR1 sekvence IGHV1-58, a I-HLA9 ima FR1 region iz IGHV5-51. Oba konstrukta vezivala su antigen bar isto tako dobro kao i antitelo ch-ICR62. Konstrukt I-HLA8 može, zapravo, da bude čak i bolji, sa vrednošću EC50 sniženom za faktor 2. Konstrukt I-HLA8 ima istu FR1 sekvencu kao konstrukti I-HLA5 i I-HLA6 i stoga ima iste ostatke koji nisu donorski (tj., Val2Met, Ala9Pro i Ala16Thr), sugerišući da prisustvo ovih ostataka koji nisu donorski nema negativno dejstvo na vezivanje. Mutacije koje nisu korisne koje se javljaju u I-HLA5 i 6 nastaju iz kombinacije VH1 FR1 sparenog sa VH5 FR3, što bi se potencijalno moglo nadoknaditi u prisustvu FR1 i FR3 iz iste familije VH.

[0242] Na slici 8 prikazani su konstrukti koji sadrže ostatke koji nisu donorski u CDR regionima. Prema tome, ovi konstrukti su čak dodatno humanizvani u CDR regionima jer se ostaci koji nisu donorski javljaju u humanim okvirnim regionima koji su odabrani za ove konstrukte. Svi konstrukti, I-HHE (His35Ser), I-HHF (Thr58Asn) i I-HHG (Ser57Ala), imaju jedan ostatak u CDR1 ili CDR2 koji je humanizovan (u poredjenju sa konstruktom I-HHB). Konstrukt I-HHD (Gly24Ala) je takodje ispitivan. I-HHF je pokazao smanjeno vezivanje ukazujući na važnost Thr58. Nasuprot CDR ostatku 58 prema Kabatu, aminokiselina 57 je tolerantnija na supstitucije, budući da mutacija Ser57Ala očigledno ne utiče na vezivanje (slika 8).

[0243] Kako FR3 region u IGHV5-51 izgleda pokazuje obećavajuća svojstva u konstruktima I-HLA1 i 2, a FR1 iste sekvence klicine linije se pokazao korisnim u konstruktu I-HLA9, FR1, FR2 i FR3 iz IGHV5-51 su konstruisani da se koriste zajedno u svojstvu akceptora za kalemljenje petlje.

[0244] Sažetak analize kanonskih ostataka u humanizovanim konstruktima ICR62:

VL: Pozicija 2 po Kabatu: Ile verovatno neophodan.

Pozicija 71 po Kabatu: Ile ili Phe dozvoljen.

VH: Poz. 24, Gly, Thr, Ala, Val, Ser dozvoljen.

Poz.26, Gly dozvoljen.

Poz.29, Phe, Ile, Leu, Val, Ser dozvoljen.

Poz.34, Ile, Met, Leu, Val, Trp, Tyr, Thr dozvoljen.

Poz.71, Ala, Leu, Val, Thr dozvoljen.

Pos 94, Arg, Gly, Asn, Lys, Ser, His, Thr, Ala dozvoljen.

Rezultati eksperimenata ADCC

[0245] Slika 9 pokazuje poredjenje ćelijske citotoksičnosti posredovane antitelom (ADCC) za različite glikoforme himernog ICR62 antitela, kao i za humanizovanu varijantu I-HLA4. Različite glikoforme su označene oznakom koja označava antitelo koje nije izmenjeno glikoinženjerstvom (WT), glikoformu 1 (G1), ili glikoformu 2 (G2). "G1" označava glikoinženjerstvo antitela pomoću ko-ekspresije sa GnTIII. "G2" označava glikoinženjerstvo antitela pomoću ko-ekspresije sa GnTIII i ManII. "WT" označava antitela koja nisu izmenjena glikoinženjerstvom. Laki lanac za humanizovane konstrukte je varijanta I-KC, i nije eksplicitno označen.

[0246] Jačina i efikasnost himernog, kao i humanizovanog antitela su poboljšane pomoću dva različita pristupa glikoinženjerstva. Konstrukt ch-ICR62 je imao neznatno bolji učinak od I-HLA4, za divlji tip ili glikoforme, redom. Kao što se vidi na slici 4, kada se porede afiniteti dva antitela prema njihovom antigenu, ch-ICR62 ima dvostruko nižu vrednost EC50. Razlika u afinitetu se ovde odražava u razlikama u efikasnosti.

[0247] Slika 10 prikazuje poredjenje ćelijske citotoksičnosti posredovane antitelom (ADCC) za formu koja nije izmenjena glikoinženjerstvom ("divlji tip") i G2 glikoformu humanizovanih konstrukata I-HHB i I-HLA7 antitela ICR62. Ista antitela su primenjena na dve različite ciljne ćelijske linije. Na panelu A slike 10, korišćena je ciljna ćelijska linija LN229; a na panelu B slike 10, korišćena je ćelijska linija A431. Ćelije A431 bile su očigledno podložnije ćelijskom ubijanju posredovanom antitelom nego ćelije LN229. Što je još važnije, glikoinženjerstvo je poboljšalo jačinu oba antitela. Ovo dejstvo je izgleda izraženije kod I-HLA7 nego kod I-HHB. Procenat ubijanja ćelija pri maksimalnoj koncentraciji antitela za I-HHB mogao bi da se pomeri sa ∼30% na ∼40% uvodjenjem varijante G2 izmenjene glikoinženjerstvom, kada se koristi

ciljna ćelijska linija LN229. Kada se koristi ćelijska linija A431, ova vrednost je naizgled nepromenjena. Ovo ponašanje je bilo potpuno drugačije kada je u pitanju antitelo I-HLA7. Ubijanje ciljnih ćelija pri maksimalnoj koncentraciji antitela pomereno je sa oko 10% na oko 50%, za ćelije LN229, i sa oko 40% na oko 70% za ćelije A431 uvodjenjem G2 varijanti izmenjenih glikoinženjerstvom. U ovom slučaju, uprkos nižoj aktivnosti antitela IHLA7 u odnosu na I-HHB kada antitela nisu izmenjena glikoinženjerstvom, rangiranje aktivnosti je obrnuto za antitela izmenjena glikoinženjerstvom. Slike 11 i 12 takodje prikazuju poredjenje formi koje nisu izmenjene glikoinženjerstvom (WT) i glikoformi G2 himernog ICR62 i humanizovanih konstrukata I-HHB i I-HLA7 antitela ICR62.

PRIMER 3

Preliminarna studija toksičnosti pri intravenskoj (bolus) primeni kod majmuna cinomolgus - bioanalitička analiza

UVOD

Test anti-EGFR antitela izmenjenih glikoinženjerstvom

[0248] Ova bioanalitička analiza opisuje merenje anti-EGFR antitela u uzorcima poreklom od majmuna cinomolgus nakon intravenske (bolus) primene anti-EGFR antitela (rekombinantno, anti-EGFR antitelo izmenjeno glikoinženjerstvom proizvedeno u sisarskim ćelijama u kulturi transficiranim vektorima ekspresije antitela koji nose gene teškog lanca IHHB i lakog lanca I-KC kao što je gore opisano, i prečišćeno kao što je gore opisano), kao što je opisano u protokolu prikazanom u tekstu ispod. Ukupno 78 uzoraka majmunskog seruma bilo je skladišteno zamrznuto na oko -20 °C do upotrebe.

[0249] Bioanalitičke metode korišćene za odredjivanje anti-EGFR antitela koristile su test ELISA za merenje serumskih koncentracija anti-EGFR antitela. Kriterijumi prihvatljivosti bili su podešeni na ±20% (±25% niski nivo QC) za preciznost i nepreciznost.

MATERIJALI I METODE

[0250] Cilj: Cilj ove studije bio je procena sistemskog toksičnog potencijala gliko-mAb (anti-EGFR) pri intravenskoj (bolus) primeni kod majmuna cinomolgus praćenoj periodom oporavka od 8 nedelja.

TABELA 8

TABELA 9: Tretmanske grupe i doze

Obrazloženje za izbor nivoa doze

[0251] 1.5-7.5 mg/kg je očekivani opseg u studijama na ljudima (7.5 mg/kg predstavlja odgovarajuću dozu za slično jedinjenje kod ljudi).

TABELA 10: Identitet grupa tretmana

TABELA 11: Životinje

TABELA 12: Primena anti-EGFR antitela

TABELA 13: Klinička zapažanja

TABELA 14: Učestalost doziranja:

TABELA 15: Toksikokinetika

TABELA 16: Uzorci

Histologija

[0252]

TABELA 17: Fiksacija tkiva

TABELA 18: Histologija

Procedura imunološkog ispitivanja

[0253] Ploča je obložena sa 100 μl po bunarčiću rastvora za oblaganje (5 μl ovčijeg anti-humanog IgG (majmunski adsorbovani IgG, the Binding Site, UK) dodatog u 11495 μl bikarbonatnog pufera (0.05M, pH 9.6) i inkubirana približno 2 časa na sobnoj temperaturi. Ploča je oprana 3 puta sa 400 μl po bunarčiću rastvora za pranje (PBS (Sigma Chemical Co., UK) 0.01% (zapr./zapr.) Triton-X100 (Sigma Chemical Co., UK)) i osušena lupkanjem.

[0254] Pufer za test (1% tež./zapr. BSA, Sigma Chemical Co., UK) dodat je u količini od 200 μl po bunarčiću i inkubiran približno 1 čas na sobnoj temperaturi. Ploča je oprana 3 puta sa 400 μl po bunarčiću rastvora za pranje i osušena lupkanjem.

[0255] Kalibracioni standardi, kontrole kvaliteta (QC) i/ili uzorci su dodati u količini od 100 μl po bunarčiću i inkubirani približno 2 časa na sobnoj temperaturi, nakon čega je ploča oprana 3 puta sa 400 μl po bunarčiću rastvora za pranje i osušena lupkanjem.

[0256] Rastvor konjugata (6 μl kozjeg anti-humanog IgG kapa-HRP konjugata (Bethyl Laboratories Inc., USA) dodato je u 12 ml pufera za test) dodat je u količini od 100 μl po bunarčiću i inkubiran približno 1 čas na sobnoj temperaturi. Ploča je oprana 3 puta sa 400 μl po bunarčiću rastvora za pranje i osušena lupkanjem.

[0257] Trimetilbenzidin (TMB; Europa Bioproducts, Ely, UK) je dodat u količini od 100 μl po bunarčiću. Ploča je pokrivena i inkubirana približno 15 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim je u svaki bunarčić dodato po 100 μl rastvora za zaustavljanje reakcije (0.5M HCl, Fisher, UK). Apsorbance su očitane na 450 nm (referentni filter 630 nm) na čitaču mikroploča DYNATECH MRX (Mettler Instruments, UK).

REZULTATI I DISKUSIJA

Analiza ispitivanih uzoraka

[0258] Koncentracije anti-EGFR antitela merene su imunološkom metodom (ELISA) u 78 uzoraka majmunskog seruma dobijenih prema protokolu opisanom u ovom dokumentu u tekstu iznad. Ovi rezultati su prikazani u tabelama 19-21, ispod.

TABELA 19

TABELA 20

TABELA 21

PRIMER 4

Preliminarna studija toksičnosti pri intravenskoj (bolus) primeni kod majmuna cinomolgus -toksikokinetika

Rezime

[0259] Tri grupe majmuna cinomolgus (1 mužjak i 1 ženka po grupi) su primile intravenske bolus doze anti-EGFR antitela na dane 1, 8, 15 i 22, 28-dnevne studije toksičnosti kako bi se ocenilo sistemsko izlaganje životinja anti-EGFR antitelu. Serumske koncentracije anti-EGFR antitela u uzorcima sakupljenim do 672 časa posle prve doze odredjene su pomoću metode imunološkog testa. Farmakokinetička analiza podataka serumska koncentracija-vreme dala je sledeće farmakokinetičke parametre:

22 LA E B A

T

[0260] Odnosi izmedju površina ispod krivih serumska koncentracija anti-EGFR - vreme (AUC168) i doznog nivoa na dan 1 prikazani su ispod:

TABELA 23

[0261] Stopa i obim sistemskog izlaganja majmuna anti-EGFR antitelima, okarakterisani vrednošću AUC168, povećavali su se približno proporcionalno sa povećanjem doze u doznom opsegu 1.5 do 4.5 mg/kg/dogadjaju, ali više nego proporcionalno pri povećanju doze u doznom opsegu 4.5 do 12 mg/kg/dogadjaju na dan 1. Pri najvišoj dozi (12 mg/kg/dogadjaju), vrednost AUC168bila je približno 2.8 puta veća od one koja proizilazi iz linearnog odnosa.

[0262] Obim (AUC168) sistemskog izlaganja ženki majmuna anti-EGFR bio je uglavnom sličan izlaganju mužjaka majmuna.

[0263] Posle ponovljenih intravenskih doza, serumske koncentracije anti-EGFR pred primenu doze bile su uopšteno više od vrednosti posle jednokratne doze i ukazivale na akumulaciju anti-EGFR antitela u serumu tokom perioda ispitivanja.

[0264] Konačni poluživot nije mogao da bude ocenjen na odgovarajući način za sve životinje, već je mogao da bude procenjen u opsegu 32.5 do 63.1 čas i izgleda da se kod mužjaka povećavao sa dozom. Ukupni serumski klirens anti-EGFR izgleda da nije zavisio od doze u opsegu 1.5 - 4.5 mg/kg/dogadjaju, ali je bio smanjen pri najvišoj dozi kod mužjaka i ženki majmuna.

[0265] U zaključku, obim sistemskog izlaganja majmuna cinomolgus anti-EGFR antitelima izgleda se odlikuje nelinearnom (dozno-zavisnom) kinetikom u doznom opsegu 1.5 do 12 mg/kg/dogadjaju na dan 1 ispitivanja intravenske toksičnosti. Povećanje doze anti-EGFR više od 4.5 mg/kg/dogadjaju verovatno rezultuje većim sistemskim izlaganjem nego što bi to proizašlo iz linearnog odnosa, što je u skladu sa mogućnošću da postupak eliminacije anti-EGFR ima ograničeni kapacitet.

[0266] Pored toga, ispitivanje je takodje pružilo dokaz da uopšteno nema razlike izmedju sistemskog izlaganja mužjaka i ženki majmuna anti-EGFR antitelima, kao i da posle ponovljene intravenske primene dolazi do akumulacije antitela.

Uvod

[0267] Anti-EGFR antitela primenjena su intravenskom bolus injekcijom kod tri grupe od po jednog mžjaka i jedne ženke majmuna cinomolgus, u doznim nivoima od 1.5, 4.5 i 12 mg/kg/dogadjaju na dan 1, 8, 15 i 22 preliminarnog ispitivanja toksičnosti. Od svake životinje uzeti su uzorci krvi u sledećim vremenskim tačkama nakon primene na dan 1: 1, 4, 12, 24, 72 i 120 časova posle doziranja. Pored toga, uzorci su uzeti pred doziranje i 1 čas posle doziranja na dane 8, 15 i 22 i na 672 časa posle prve doze na dan 1. Izdvojeni serum je zamrznut na oko -20°C pre analize serumskih koncentracija anti-EGFR antitela metodom imunološkog ogleda.

Skraćenice

[0268]

AUC Površina ispod krive serumska koncentracija-vreme do beskonačnog vremena

AUC168Površina ispod krive serumska koncentracija-vreme tokom 168-časovnog intervala doziranja

BLQ Ispod nivoa kvantifikacije

ca Približno

CL Ukupni serumski klirens

Cmax Maksimalna serumska koncentracija

F Ženka

k Konstanta konačne brzine

M Mužjak

t1⁄2Konačni poluživot

Tmax Vreme u kome se javlja Cmax

Vss Volumen distribucije u ravnotežnom stanju

Antitelo korišćeno u studiji

[0269] Gliko-mAb (Anti-EGFR), anti-EGFR antitelo modifikovano u Fc regionu u cilju povećanja afiniteta vezivanja za Fc-FcgamaRIII receptor i povećane ADCC, proizvedeno je, prečišćeno i okarakterisano kao što je iznad opisano. Ukratko, antitelo je proizvedeno ko-transfekcijom ćelija HEK-293-EBNA sa vektorima plazmidne DNK za ekspresiju teškog lanca I-HHB antitela, lakog lanca I-KC antitela, GnT-III i ManII. Korišćena je linearno uvećana verzija iznad opisane metode transfekcije, transfekcijom jednoslojnih ćelija gajenih u rotirajućim bocama umesto T-flaskova. Dodatni korak protočne anjonske izmenjivačke hromatografije upotrebom matrice od Q-sefaroze uključen je u postupak prečišćavanja neposredno pre gore opisanog koraka ekskluzione hromatografije.

[0270] Obrazac glikozilacije antitela koje je modifikovano u Fc regionu analiziran je kao što je gore opisano upotrebom spektometrije MALDI/TOFMS enzimski oslobodjenih oligosaharida poreklom od Fc. Oligosaharidni profil prikazan je na slici 23.

[0271] Vezivanje za humani EGFR i majmunski EGFR prikazano je vezivanjem za celu ćeliu kao što je gore opisano upotrebom A431, odnosno COS-7 ćelija, i FACS-analizom. Krive vezivanja prikazane su na slikama 24, odnosno 25.

[0272] Povećano vezivanje za FcgamaRIII receptor koje nastaje kao rezultat primenjenog modifikovanja Fc prikazano je, kao što je gore opisano, putem vezivanja za cele CHO ćelije konstruisane tako da na svojoj površini eksprimiraju humani FcgamaRIII i pomoću FACS-analize. Rezultati su prikazani na slici 26. Dodatno, modifikovano antitelo ima stepen modifikacije u Fc regionu ekvivalentan antitelu „gliko-2“ (75% oligosaharida na Fc je nefukozilisanog tipa) opisanom na drugom mestu (Ferrara, C. et al., J Biol Chem.

2005 Dec 5; [E-objava pre štampane]). Takva antitela modifikovana u Fc regionu imaju do 50 puta povećan afinitet vezivanja za humani FcgamaRIII u odnosu na standardno antitelo koje nije modifikovano u Fc regionu (ravnotežna konstanta disocijacije od 15 i 150 nM za 158V i 158F polimorfne varijante humanog receptora naspram 750 i 5000 nM za iste varijante receptora, redom, kada se vezuju za humana IgG1 antitela koja nisu modifikovana u Fc regionu).

[0273] ADCC je merena kao što je gore opisano upotrebom dve ciljne ćelijske linije: ćelija humanog karcinoma pluća A549 i keratinocita majmuna cinomolgus CYNOM-K1. Rezultati su prikazani na slikama 27, odnosno 28.

Obrada podataka

[0274] Farmakokinetički parametri su izračunati upotrebom kompjuterskog programa WinNonlin Pro version 3.3 (Pharsight Corporation, SAD).

[0275] Sve serumske koncentracije uvedene kao deo ovog ispitivanja prikazane su do 4 značajne cifre ili 3 decimalna mesta. Farmakokinetički parametri su prikazani kao što sledi: Cmax, AUC168, CL i Vss do 4 značajne cifre; k do 4 decimalna mesta; t1⁄2do 1 decimalnog mesta.

[0276] Vrednosti koje su bile BLQ (<0.195 μg/mL) unete su kao nula u obradu farmakokinetičkih podataka.

Toksikokinetika

[0277] Maksimalne serumske koncentracije anti-EGFR (Cmax) i vremena njihove pojave (Tmax) bile su posmatrane vrednosti. Površine ispod krivih serumska koncentracija anti-EGFR-vreme unutar 168-časovnog doznog intervala (AUC168), procenjene su primenom linearnog trapezoidnog pravila. Pri izračunavanju vrednosti AUC168serumske koncentracije anti-EGFR u nula časova procenjene su povratnom ekstrapolacijom upotrebom log-linearne regresione analize, na osnovu prva dva vremena uzorkovanja, medjutim, ako serumska koncentracija nije opala tokom tog perioda, tada je serumska koncentracija u nula časova smatrana ekvivalentnom koncentraciji u vreme prvog uzorkovanja. Površine ispod krivih serumska koncentracija anti-EGFR-vreme do beskonačnog vremena (AUC), procenjene su pomoću sledećeg izraza:

AUC = AUC168+ Clast/k,

gde je Clast predvidjena serumska koncentracija na poslednjoj merljivoj tački uzorkovanja, a k je konstanta konačne brzine.

[0278] Konstante konačne brzine (k) su procenjene prilagodjavanjem linearne regresije log koncentracije u odnosu na vreme. Da bi procena za k bila prihvaćena kao pouzdana, postavljeni su sledeći kriterijumi:

1. Konačne tačke podataka su bile očigledno nasumično rasporedjene oko jedne ravne linije (pri vizuelnom pregledu)

2. Najmanje 3 tačke podataka su bile dostupne za regresiju

3. Koeficijent regresije bio je ≥0.95, i frakcija varijanse koja se računa bila je ≥0.90

4. Interval koji uključuje tačke podataka izabranih za regresiju bio je bar dvostruko veći nego sam poluživot.

[0279] Konačni poluživoti (t1⁄2) izračunati su kao ln2/k. Ukupni serumski klirens (CL) izračunat je kao Doza/AUC. Volumen distribucije u stabilnom stanju (Vss) izračunat je kao Doza.AUMC/AUC2. Akumulacija (R) je procenjena kao odnos minimalne koncentracije posle davanja poslednje doze (dan 22) prema minimalnoj koncentraciji posle prve doze (dan 1) tj. serumska koncentracija na 672 časa/serumska koncentracija na 168 časova (pred doziranje na dan 8).

Rezultati i diskusija

[0280] Uzorci krvi su uzimani do 120 časova posle doziranja na dan 1; pred davanje doze i 1 čas posle davanja doze na dane 8, 15 i 22, i na 672 časa posle doziranja na dan 1 tokom studije toksičnosti da bi se ocenilo sistemsko izlaganje mužjaka i ženki majmuna anti-EGFR antitelima posle intravenske bolus primene anti-EGFR antitela pri doznim nivoima od 1.5, 4.5 i 12 mg/kg/dogadjaju na dane 1, 8, 15 i 22 tokom ispitivanja. Serumske koncentracije anti-EGFR u uzorcima uzetim 168 časova posle doziranja predstavljene su u tabelama 27-29, a profili srednja serumska koncentracija-vreme ilustrovani su na slikama 18 i 19.

[0281] Farmakokinetički parametri anti-EGFR prikazani su u tabeli 30, a vrednosti AUC168sumirane su ispod:

TABELA 24

[0282] Vremena u kojima su se javljale maksimalne serumske koncentracije (Tmax) bila su uopšteno 1 čas posle doziranja (prva tačka uzorkovanja), ali su se javila 4 časa posle doziranja (druga tačka uzorkovanja) kod ženki 2F462 (4.5 mg/kg) i 3F612 (12 mg/kg). Medjutim, kod obe ove ženke, koncentracije na 4 časa posle doziranja bile su veoma slične koncentracijama na 1 čas posle doziranja, i bile su verovatno u okviru varijabilnosti testa. Stoga prividno kašnjenje Tmax verovatno nema nikakvog značaja.

[0283] Serumske koncentracije anti-EGFR pre sledeće doze bile su merljive kod svih životinja osim mužjaka 2M461 na dan 22 (dozni nivo 4.5 mg/kg/dogadjaju), prema tome, uopšteno, životinje su bile kontinuirano izložene merljivim koncentracijama anti-EGFR tokom doznog intervala.

[0284] Odnosi izmedju površina ispod krivih serumska koncentracija anti-EGFR antitela - vreme (AUC168) i dozni nivo na dan 1 prikazani su ispod:

TABELA 25

[0285] Stopa i obim sistemskog izlaganja majmuna anti-EGFR antitelima, okarakterisani vrednošću AUC168, povećavali su se približno proporcionalno sa povećanjem doze u doznom opsegu 1.5 do 4.5 mg/kg/dogadjaju, ali više nego proporcionalno pri povećanju doze u doznom opsegu 4.5 do 12 mg/kg/dogadjaju na dan 1. Pri najvišoj dozi (12 mg/kg/dogadjaju), vrednost AUC168bila je približno 2.8 puta veća od one koja proizilazi iz linearnog odnosa (slika 20).

[0286] Obim (AUC168) sistemskog izlaganja ženki majmuna anti-EGFR bio je uglavnom sličan izlaganju mužjaka majmuna.

[0287] Posle ponovljenih intravenskih doza, serumske koncentracije anti-EGFR pred primenu doze bile su uopšteno više od vrednosti posle jednokratne doze (slike 21-22) i ukazivale na akumulaciju anti-EGFR u serumu tokom perioda ispitivanja. Ova akumulacija je uopšteno bila niža kod ženki nego kod mužjaka, osim na najvišem doznom nivou. Odnosi minimalnih (pre doziranja) koncentracija nakon poslednje doze na dan 22 (672 časa posle doze na dan 1) prema minimalnoj koncentraciji posle prve doze na dan 1 prikazani su u tabeli 26, ispod:

TABELA 26

[0288] Konstante konačne brzine (k), i odgovarajući konačni poluživoti (t1⁄2), anti-EGFR na dan 1 prikazani su u tabeli 30. Konačni poluživot nije mogao da bude ocenjen na odgovarajući način za sve životinje, već je mogao da bude procenjen u opsegu 32.5 do 63.1 čas i izgleda da se kod mužjaka povećavao sa dozom. Ukupni serumski klirens anti-EGFR izgleda da nije zavisio od doze u opsegu 1.5 - 4.5 mg/kg/dogadjaju, ali je bio smanjen pri najvišoj dozi kod mužjaka i ženki majmuna.

[0289] U zaključku, obim sistemskog izlaganja majmuna cinomolgus anti-EGFR antitelima izgleda se odlikuje nelinearnom (dozno-zavisnom) kinetikom u doznom opsegu 1.5 do 12 mg/kg/dogadjaju na dan 1 ispitivanja intravenske toksičnosti. Povećanje doze anti-EGFR više od 4.5 mg/kg/dogadjaju verovatno rezultuje većim sistemskim izlaganjem nego što bi to proizašlo iz linearnog odnosa, što je u skladu sa mogućnošću da postupak eliminacije anti-EGFR ima ograničeni kapacitet.

[0290] Pored toga, ispitivanje je takodje pružilo dokaz da uopšteno nema razlike izmedju sistemskog izlaganja mužjaka i ženki majmuna anti-EGFR antitelima, kao i da dolazi do akumulacije antitela posle ponovljene intravenske primene.

TABELA 27

TABELA 28

TABELA 29

TABELA 30

Bioemijska analiza krvi i hematologija

[0291] Uzorci krvi su uzeti iz bedrene vene majmuna cinomolgus kojima je data intravenska bolus injekcija gliko-MAb anti-EGFR na dane 1, 8, 15 i 22. Uzorci su uzeti iz ekstremiteta koji nije korišćen za davanje

doze, nakon uskraćivanja hrane tokom noći (bez uginulih). Uzorci su ispitivani pre tretmana, tri dana posle

druge doze, i na kraju ispitivanja za sledeće parametre, upotrebom litijum heparina kao antikoagulansa:

Alkalna fosfataza

Alanin amino-transferaza

Aspartat amino-transferaza

Bilirubin - ukupni

Urea

Kreatinin

Glukoza

Holesterol - ukupni

Trigliceridi

Natrijum

Kalijum

Hlorid

Kalcijum

Fosfor

Ukupni protein

Proteinski elektroforetogram

Odnos albumin/globulin

[0292] Podaci o prosečnoj normalnoj biohemijskoj analizi krvi majmuna cinomolgus prikazani su u tabeli

31.

TABELA 31

[0293] Uzorci za hematološku analizu periferne krvi uzeti su iz bedrene vene majmuna cinomolgus kojima je data intravenska bolus injekcija gliko-MAb anti-EGFR na dane 1, 8, 15 i 22. Uzorci su uzeti iz ekstremiteta koji nije korišćen za davanje doze, nakon uskraćivanja hrane tokom noći (bez uginulih). Uzorci su ispitivani pre tretmana, tri dana posle druge doze, i na kraju ispitivanja za sledeće parametre: 1) Upotrebom EDTA kao antikoagulansa -

Hematokrit - koncentracija hemoglobina

Broj eritrocita

Retikulociti

Prosečan ćelijski hemoglobin

Prosečna koncentracija ćelijskog hemoglobina

Prosečna zapremina ćelija

Ukupan broj leukocita

Leukocitna formula

Broj trombocita

Abnormalnosti morfologije krvi

Anizocitoza

Mikrocitoza

Makrocitoza

Hipohromazija

Hiperhromazija

2) Upotrebom citrata kao antikoagulansa -

Protrombinsko vreme

Aktivirano parcijalno tromboplastinsko vreme

[0294] Podaci o normalnoj prosečnoj hematološkoj analizi majmuna cinomolgus prikazani su u tabeli 32.

TABELA 32

[0295] Kumulativne pojedinačne vrednosti biohemije za majmune prikazane su u tabelama 33a-h, ispod:

33b

ELA B TA

M

R

TABELA 33c

TABELA 33d

33e

ELA B TA

M

33f

LA E B A T

M R E

T

TABELA 33g

TABELA 33h

[0296] Kumulativne pojedinačne hematološke vrednosti za majmune prikazane su u tabelama 34a-1, ispod:

TABELA 34a

TABELA 34c

34d

ELA B TA

TABELA 34e

34f

LA E B A T

M

TABELA 34g

TABELA 34i

0

0 0

0j

34

A4EL B TA4

4

M R E

T

TABELA 34k

l43

A EL B TA

M R E

T

Mikroskopski nalazi patologije povezane sa tretmanom

[0297] Periholangitis (zapaljenje vezivnog tkiva oko žučnog kanala) prijavljeno je kod ženke majmuna koja je primila dozu od 12 mg/kg/dan, ali ne i kod bilo koje druge ženke ili mužjaka majmuna. Ovaj nalaz može da bude povezan sa tretmanom sa gliko-mAb (anti-EGFR), ali sa tako malim brojem životinja značaj je neizvestan. Svi drugi nalazi su smatrani slučajnim i bez toksikološkog značaja.

Makropatologija i histopatologija

[0298] Sažetak histopatologije svih ispitivanih životinja prikazan je u tabeli 35, ispod:

TABELA 35

Pojednačni nalazi za sve životinje

[0299] Patološka zapažanja za pojedinačne životinje prikazana su u tabeli 36, ispod:

TABELA 36

[0300] Pojedinačne telesne težine majmuna cinomolgus prikazane su u tabeli 37, ispod:

ti nos edvrčneina edoj:P ine ež net es Tel 37: LA E B A

T

Zaključci

[0301] Nije bilo dejstva tretmana na mestima injektovanja i nije bilo kliničkih nalaza za koje se smatra da su povezani sa tretmanom sa gliko-mAb (anti-EGFR). Promene telesne težine bile su u okviru normalnih očekivanih opsega. Nije bilo nalaza za koje se smatra da su povezani sa tretmanom pri makroskopskom ispitivanju i težine organa životinja bile su u okviru normalnih očekivanih opsega. U zaključku, tretman sa 1.5, 4.5 ili 12 mg/kg/dogadjaju bio je dobro tolerisan bez jasnih nalaza o sistemskoj toksičnosti.

[0302] EGFR nije ciljno mesto delovanja specifično za tumor, jer je prisutan na površini raznih normalnih tkiva uključujući jetru, bubreg i kožu. Anti-EGFR antitela sa Fc regionom humanog IgG1 su ranije primenjivana kod ljudi i pokazala su tolerabilan profil neželjenih dejstava (Vanhoefer, U. et al., Clin. Oncol.

2004 Jan 1;22(1):175-84; Needle MN, Semin Oncol.2002 Oct;29 (5 Suppl 14):55-60). Jasno je da bi, pri primeni anti-EGFR antitela sa značajno povećanom ADCC kod čoveka ili drugog sisara, postojala značajna zabrinutost zbog pojačane aktivnosti ubijanja ćelija koja bi mogla da se ispolji protiv kritičnih normalnih tkiva kao što su jetra, bubreg i koža. Iznenadjujuće, pronalazači ovog pronalaska su našli da primena takvog anti-EGFR antitela modifikovanog u Fc regionu, kao što je gore opisano i sa do 1000 puta povećanom ADCC aaktivnošću, in vivo kod sisara nije vodila značajnoj toksičnosti. Koncentracije antitela su održavane na više od 1 mikrograma po mililitru tokom najmanje 4 nedelje (i više od 100 mikrograma po mililitru za neke životinje). Takvi nivoi izlaganja su tipični za terapiju antitelima. Maksimalna ADCC za antitelo ove studije je već postignuta pri koncentracijama od 1 mikrograma po mililitru. Pojedinačne primene doza od 40 i 100 mg anti-EGFR antitela (parentalno ICR62 antitelo pacova) kod humanih pacijenata sa kancerom pokazale su specifično ciljno delovanje na tumore in vivo (Modjtahedi, H. et al., Br J Cancer. 1996 Jan;73(2):228-35.). Efektorske ćelije majmuna cinomolgus imaju visoko-homologi FcgamaRIII receptor i pokazano je da posreduju u pojačanoj ADCC aktivnosti sa antitelima modifikovanim u Fc regionu (i sa antitelima koja su izmenjena glikoinženjerstvom tako da imaju povećane nivoe nefukozilisanih oligosaharida u Fc regionu). Nivo povećanja ADCC je veoma sličan onom zapaženom kod humanih efektorskih ćelija (PBMC).

[0303] Ukupno, našli smo da anti-EGFR antitela koja su modifikovana u Fc regionu tako da imaju povećani afinitet vezivanja za Fc-FcgamaRIII i povećanu ADCC aktivnost mogu da se primene kod sisara tako da daju koncentracije veće od 1 mikrograma antitela po mililitru seruma tokom perioda od najmanje 4 nedelje, kako bi se dobilo izlaganje leku koje je normalno povezano sa značajnom akumulacijom antitela na ciljnim ćelijama in vivo, bez značajne toksičnosti.

[0304] Toksičnost antigen vezujućeg molekula prema predmetnom pronalasku može da se meri i/ili odredi upotrebom bilo kog postupka i/ili parametara (npr. biohemijske vrednosti krvi, histopatološki indikatori, itd.) opisanog iznad u tekstu, ili na bilo koji način poznatog stručnjaku u ovoj oblasti. Stručnjak u datoj oblasti podrazumeva da je klinički značajan nivo toksičnosti nivo koji prevazilazi nivoe koje uopšteno prihvata Američka administracija za hranu i lekove za antitela koja se klinički primenjuju.

PRIMER 5

Modifikacije CDR regiona lakog lanca

[0305] Upotrebom gore opisanih postupaka, stvorene su varijante varijabilnog regiona lakog lanca anti-EGFR iz konstrukta varijabilnog regiona lakog lanca I-KC (SEQ ID NO:43 i SEQ ID NO:45), u kojima je sekvenca koja kodira aminokiselinski ostatak na različitim pozicijama u CDR ICR62 pacova zamenjena odgovarajućim aminokiselinskim ostatkom iz genske sekvence humane klicine linije. Tabela 38 prikazuje supstitucije koje su uvedene u CDR regione konstrukta varijabilnog regiona lakog lanca IKC (SEQ ID NO:45):

Tabela 38: Minimizovani CDR regioni lakog lanca

[0306] Svi gore navedeni supstitucioni ostaci potiču od humane VK1_6 akceptorske sekvence osim izmene Y32W, u kojoj je W srodne sekvence humane klicine linije supstituisana za Y na poziciji 32 u SEQ ID NO:45.

[0307] Svaka od varijanti konstrukta I-KC (I-KC1 do I-KC9) sparena je sa varijabilnim regionom teškog lanca koji sadrži konstrukt I-HHD (SEQ ID NO:16 i SEQ ID NO:15) i test vezivanja je izveden postupcima opisanim u prethodnim primerima. Afinitet vezivanja za EGFR u ciljnim ćelijama A431 konstrukata I-KC1 do I-KC9 uporedjen je sa konstruktom I-KC (SEQ ID NO:46 i SEQ ID NO:45) (slika 29). Kao što se vidi na slici 29, samo modifikacija ostatka 34 u njegovu odgovarajuću humanu sekvencu (N34G) rezultovala je blagim smanjenjem afiniteta vezivanja (vrednost EC50 povećana ja za faktor 10). Svi drugi konstrukti zadržali su aktivnost vezivanja uporedivu sa konstruktom I-KC (SEQ ID NO:45). Prema tome, kada se spari sa himernim (npr., humanizovanim) konstruktom teškog lanca specifičnim za EGFR, laki lanac može da bude potpuno humani (npr., iz V genske sekvence humanog lakog lanca), a da i dalje zadrži specifično vezivanje za EGFR. Konkretno, CDR2 i CDR3 mogu da budu u potpunosti u obliku humane klicine linije.

Antigen-vezujući molekuli koji sadrže CDR regione specifične za EGFR

[0308] Dato otkriće stoga razmatra antigen-vezujući molekul koji sadrži himerni (npr., humanizovani) varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR regione specifične za EGFR sparene sa varijabilnim regionom lakog lanca, pri čemu varijabilni region lakog lanca ima manje od deset aminokiselinskih ostataka koji nisu humanog porekla. U drugim izvodjenjima, varijabilni region lakog lanca ima manje od devet, osam, sedam, šest, pet, četiri, tri, dva, ili jednog aminokiselinskog ostatka koji nije humanog porekla. U poželjnim izvodjenjima, varijabilni region lakog lanca ima manje od dva ili manje od jednog (tj., nijedan) aminokiselinski ostatak koji nije humanog porekla. U jednom izvodjenju, varijabilni region lakog lanca sadrži jednu ili više genskih sekvenci varijabilnog regiona humane klicine linije. Genske sekvence varijabilnog regiona humane klicine linije koje kodiraju varijabilne regione lakog lanca poznate su u stanju tehnike, i mogu da se nadju, na primer, u bazi podataka IMGT, dostupnoj na http://imgt.cines.fr/home.html. U poželjnom izvodjenju, sekvenca humane klicine linije potiče od VK1_6 sekvence klicine linije. U drugim izvodjenjima, aminokiselinski ostaci unutar aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona lakog lanca humane klicine linije mogu da budu supstituisani jednim ili većim brojem ostataka iz druge sekvence varijabilnog regiona lakog lanca humane klicine linije.

[0309] U jednom izvodjenju, dato otkriće je usmereno na antigen-vezujući molekul koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO.:1; SEQ ID No:3; SEQ ID No:5; SEQ ID No:7; SEQ ID No:9; SEQ ID No:11; SEQ ID No:13; SEQ ID No:15; SEQ ID No:17; SEQ ID No:19; SEQ ID No:21; SEQ ID No:23; SEQ ID No:25; SEQ ID No:27; SEQ ID No:29; SEQ ID No:31; SEQ ID No33; SEQ ID No:35; SEQ ID No:37; SEQ ID No:39; i SEQ ID No:121, i laki lanac koji sadrži polipeptid kodiran jednom ili većim brojem genskih sekvenci varijabilnog regiona humane klicine linije. U poželjnom izvodjenju, sekvenca humane klicine linije potiče od VK1_6 sekvence klicine linije.

[0310] U još jednom izvodjenju, dato otkriće usmereno je na antigen-vezujući molekul koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od: SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:122, i SEQ ID NO:124; (b) sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od: SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:106, i SEQ ID NO:126; (c) SEQ ID NO:108; i (d) polipeptid koji sadrži humani varijabilni region lakog lanca kodiran jednom ili većim brojem genskih sekvenci humane klicine linije. U odredjenom izvodjenju, sekvenca humane klicine linije potiče od VK1_6 sekvence klicine linije. U drugom izvodjenju, genska sekvenca varijabilnog regiona humane klicine linije sadrži VK1_6 gensku sekvencu klicine linije sa supstitucijom jednog ili više aminokiselinskih kodona sekvencom iz drugačije genske sekvence varijabilnog regiona lakog lanca humane klicine linije.

[0311] U drugim izvodjenjima, antigen-vezujući molekul datog otkrića sadrži varijabilni region teškog lanca specifičan za EGFR prema datom otkriću, i varijantu SEQ ID NO:45. U jednom izvodjenju, varijanta SEQ ID NO:45 sadrži aminokiselinsku supstituciju na jednoj ili više pozicija u regionima koji odredjuju komplementarnost (CDR). U specifičnim izvodjenjima, supstitucija je izvedena na aminokiselinskom ostatku na poziciji odabranoj iz grupe koja se sastoji od: aminokiselinske pozicije 30 u SEQ ID NO:45; aminokiselinske pozicije 32 u SEQ ID NO:45; aminokiselinske pozicije 34 u SEQ ID NO:45; aminokiselinske pozicije 50 u SEQ ID NO:45; aminokiselinske pozicije 51 u SEQ ID NO:45; aminokiselinske pozicije 52 u SEQ ID NO:45; aminokiselinske pozicije 53 uf SEQ ID NO:45; aminokiselinske pozicije 56 u SEQ ID NO:45; aminokiselinske pozicije 94 u SEQ ID NO:45; i bilo koje njihove kombinacije supstitucija. U specifičnijim izvodjenjima, supstitucija u SEQ ID NO:45 je izabrana iz grupe koja se sastoji od: supstitucije arginina (R) za asparagin (N) na poziciji 30 u SEQ ID NO:45; supstitucije triptofana (W) za tirozin (Y) na poziciji 32 u SEQ ID NO:45; supstitucije glicina (G) za asparagin (N) na poziciji 34 u SEQ ID NO:45; supstitucije treonina (T) za asparagin (N) na poziciji 50 u SEQ ID NO:45; supstitucije alanina (A) za treonin (T) na poziciji 51 u SEQ ID NO:45; supstitucije serina (S) za asparagin (N) na poziciji 52 u SEQ ID NO:45; supstitucije serina (S) za asparagin (N) na poziciji 53 u SEQ ID NO:45; supstitucije serina (S) za treonin (T) na poziciji 56 u SEQ ID NO:45; supstitucije tirozina (Y) za fenilalanin (F) na poziciji 94 u SEQ ID NO:45; i bilo koje njihove kombinacije. U odredjenom izvodjenju, sve ove supstitucije aminokiselinskih ostataka u SEQ ID NO:45 ugradjene su u jednu varijantu lakog lanca. U poželjnim izvodjenjima, antigen-vezujući molekuli koji sadrže varijante lakog lanca sa aminokiselinskim supstitucijama u CDR regionima ICR62 zadržavaju specifično vezivanje za EGFR (u poredjenju sa antigen-vezujućim molekulom koji sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:45) kada se varijanta lakog lanca spari sa polipeptidom koji sadrži varijabilni region teškog lanca prema datom otkriću.

[0312] Dato otkriće je takodje usmereno na polinukleotide koji kodiraju bilo koji od gore navedenih polipeptida i/ili antigen-vezujućih molekula. Dato otkriće je dalje usmereno na gore opisane antigenvezujuće molekule, sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

Claims (20)

PATENTNI ZAHTEVI:

1. Humanizovano anti-EGFR antitelo koje specifično vezuje humani EGFR, naznačen time, što pomenuto antitelo obuhvata:

(a) varijabilni region teškog lanca izabran iz grupe koja obuhvata sekvencu SEQ ID NO:15; i

(b) varijabilni region lakog lanca koji obuhvata sekvencu SEQ ID NO:45;

i gde pomenuto antitelo obuhvata humani Fc region izmenjen glikoinženjeringom, sa smanjenim brojem fukoznih ostataka u poredjenju sa antitelom u obliku koji nije izmenjen glikoinženjerstvom.

2. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što je Fc region izmenjen glikoinženjerstvom: (a) da ima barem 70% ne-fukolizovanih oligosaharida;

(b) da ima povećan odnos GlcNAc ostataka u odnosu na ostake fukoze u poredjenju sa antitelom u obliku neizmenjenom glikoinženjerstvom;

(c) da ima povećani vezivni afinitet Fc receptora u poredjenju sa antitelom u obliku neizmenjenom glikoinženjerstvom; ili

(d) da ima povećanu efektorsku funkciju u poredjenju sa antitelom u obliku neizmenjenom glikoinženjerstvom.

3. Antitelo prema patentnom zahtevu 2, naznačen time, što efektorna funkcija može biti izabrana iz grupe koja se sastoji od, povećane ćelijske citotoksičnosti posredovane Fc; pojačanog vezivanja za NK ćelije; povećanog vezivanja za makrofage; povećanog vezivanja za polimorfonuklearne ćelije; povećanog vezivanja za monocite; povećanog direktnog prenosa signala koji indukuje apoptozu; povećanog sazrevanja dendritskih ćelija; i povećavanja prajminga T ćelija.

4. Polipeptid koji obuhvata amino kiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog i lakog lanca antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 3.

5. Polinukleotid koji kodira varijabilni region teškog lanca antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 4 i varijabilni region lakog lanca antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 4.

6. Vektor koji obuhvata polinukleotid koji kodira varijabilni region teškog lanca antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 4 i polinukleotid koji kodira varijabilni region lakog lanca antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 4.

7. Vektor prema patentnom zahtevu 6, naznačen time, što je policistronski.

8. Ćelija domaćina koja obuhvata polinukleotid koji kodira varijabilni region teškog lanca antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 4 i polinukleotid koji kodira varijabilni region lakog lanca antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 4, ili vektor prema patentnom zahtevu 6 ili 7.

9. Ćelija domaćina prema patentnom zahtevu 8, naznačena time, što je pomenuta ćelija domaćina konstruisana tako da eksprimira barem jednu nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid koji ima aktivnost β(1,4)-N-acetilglukozaminiltransferaze III.

10. Ćelija domaćina prema patentnom zahtevu 9, naznačena time, što je pomenuta ćelija dalje konstruisana da eksprimuje nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid sa aktivnošću Goldžijeve manozidaze II.

11. Ćelija domaćina prema patentnom zahtevu 9, naznačen time, što polipeptid sa aktivnošću β(1,4)-N-acetilglukozaminiltransferaze III koji predstavlja fuzioni polipeptid dalje obuhvata Goldžijev lokalizacioni domen heterolognog Goldžijevog rezidentnog polipeptida.

12. Ćelija domaćina prema patentnom zahtevu 11, naznačen time, što je Goldžijev lokalizacioni domen izabran iz lokalizacionog domena manozidaze II, lokalizacionog domena β(1,2)-N-acetilglukozaminiltransferaze I, β(1,2)-N-acetilglukozaminiltransferaze II, manozidaze I ili centralne α1-6 fukoziltransferaze.

13. Postupak za proizvodnju humanizovanog anti-EGFR antitela izmenjenog glikoinženjeringom koji ima humani Fc region izmenjen glikoinženjeringom koji je sposoban da bude u kompeticiji sa pacovskim antitelom ICR62 za vezivanje humanog EGFR, gde pomenuto pacovsko antitelo ICR62 obuhvata varijabilni region teškog lanca of SEQ ID NO:1 i varijabilni region lakog lanca SEQ ID NO:43, gde pomenuti postupak obuhvata:

(a) kultivisanje ćelije domaćina prema bilo kojem od patentnih zahteva od 8 do 12 u uslovima koji dozvoljavaju proizvodnju pomenutog antitela; i

(b) izolovanje pomenutog antitela.

14. Antitelo koje specifično vezuje humani EGFR, naznačen time, što se antitelo može dobiti postupkom prema patentnom zahtevu 13 ili se može dobiti pomoću ćelije domaćina prema bilo kojem od patentnih zahteva od 8 to 12.

15. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata antitelo prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 3 ili 14 i farmaceutski prihvatljivi nosač.

16. Antitelo prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 3 ili 14 za upotrebu kao leka.

17. Antitelo prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 3 ili 14 za upotrebu u lečenju profilakse ili kancera.

18. Upotreba antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 3 ili 14 za proizvodnju farmaceutske kompozicije za lečenje profilakse ili kancera.

19. Antitelo iz patentnog zahteva 17 ili upotreba prema patentnom zahtevu 18, naznačen time, što se pomenuto antitelo koristi u terapijski efikasnoj količini od 1.0 mg/kg to 15 mg/kg.

20. Antitelo prema bilo kojem od patentnih zahteva od 17 do 19 ili za upotrebu prema patentnim zahtevima 18 ili 19, naznačen time, što je pomenuti kancer izabran iz grupe koju čine kancer bešike, mozga, glave i vrata, pankreasa, pluća, dojke, jajnika, debelog creva, kože, prostate i bubrega.