RS59790B1

RS59790B1 - Privremena zaštita normalnih ćelija tokom hemoterapije

Info

Publication number: RS59790B1
Application number: RS20191537A
Authority: RS
Inventors: Jay Copeland Strum; John Emerson Bisi; Patrick Joseph Roberts; Francis Xavier Tavares
Original assignee: G1 Therapeutics Inc
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-14
Publication date: 2020-02-28
Also published as: US20170037051A1; WO2014144847A2; LT2968290T; SMT201900681T1; US20210299130A1; US20180221378A1; CN105473140B; CN108434149B; JP2019055954A; JP2018150333A; US20230364098A1; JP6430483B2; JP2019131609A; US9487530B2; US20170065597A1; US11040042B2; US10085992B2; US10076523B2; JP6767456B2; EP4596051A2

Description

Opis

SRODNE PRIJAVE

[0001] Ova prijava zahteva benefit privremene U.S. Prijave br.61/798,772, koja je podneta 15 marta, 2013, privremene U.S. prijave br.61/861,374, koja je podneta 1 avgusta, 2013, privremene U.S. Prijave 61/911,354, koja je podneta 3 decembra, 2013, i privremene U.S. Prijave br. 61/949,786, koja je podneta 7 marta, 2014.

INTERES VLADE

[0002] Vlada SAD polaže pravo na ovaj pronalazak zahvaljujući podršci Granta br.5R44AI084284 koji je dodeljen od strane Nacionalnog Instituta za Alergijske i Infektivne bolesti.

OBLAST PRONALASKA

[0003] Ovaj pronalazak je iz oblasti unapređenih jedinjenja, kompozicija i postupaka za privremenu zaštitu zdravih ćelija, i posebno hematopoetskih stem i progenitorskih ćelija (HSPC) kao i ćelija bubrega, od oštećenja koje je povezano sa DNK oštećujućim hemoterapeutskim sredstvima. U jednom aspektu, unapređena zaštita zdravih ćelija je prikazana upotrebom prikazanih jedinjenja koja deluju kao visoko selektivna i kratko, privremeno deluju kao inhibitori ciklin-zavisne kinaze 4/6 (CDK 4/6) kada se daju subjektima koji su izloženi DNK oštećujućim hemoterapeutskim režimima za lečenje proliferativnih poremećaja.

STANJE TEHNIKE

[0004] Hemoterapija se odnosi na upotrebu citotoksičnih (obično DNK oštećujućih) lekova za lečenje proliferativnih poremećaja, uključujući kancer, tumore, psorijazu, artritis, lupus i multiple sklerozu, između ostalih. Hemoterapeutska jedinjenja imaju tendeciju da budu ne-specifična i, naročito pri visokim dozama, toksična za normalne, ćelije koje se brzo dele. Ovo često dovodi do različitih nepoželjnih sporednih efekata kod pacijenata koji su izloženi hemoterapiji.

[0005] Supresija kostne srži, ozbiljno smanjenje proizvodnje krvnih ćelija u kostnoj srži, predstavlja jedan takav nepoželjni efekat. Karakteriše se i mijelosupresijom (anemijom, neutropenijom, agranulocitozom, i trombocitopenijom) i limfopenijom. Neutropenija se karakteriše selektivnim smanjenjem broja neutrofila u krvi i povećanoj podložnosti bakterijskim infekcijama. Anemija, smanjenje broja crvenih krvnih ćelija ili eritrocita, količine hemoglobina, ili zapremine spakovanih crvenih krvnih ćelija (karakteriše se određivanjem hematokrita) pogađa približno 67% pacijenata koji imaju kancer koji su izloženi hemoterapiji u Sjedinjenim Državama. Videti BioWorld Todanu, strana 4, 23 jul, 2002. Trombocitopenija je smanjenje broja pločica uz povećanu sklonost ka krvarenju. Limfopenija je uobičajeni nepoželjni sporedni efekat hemoterapije koji se karakteriše smanjenjem u broju limfocita u krvotoku (takođe poznato pod imenom T- i B-ćelije). Limfopeni pacijenti imaju predispoziciju za brojne tipove infekcija.

[0006] Mijelosupresija i dalje predstavlja glavnu toksičnost koja ograničava dozu hemoterapije kancera, koja dovodi do značajnog morbiditeta zajedno sa potencijalnom potrebom da se zahteva smanjenje intenziteta doze hemoterapije, koji mogu da obuhvate kontrolu bolesti i preživljavanje. Značajan dokaz iz prospektivnih i retrospektivnih nasumičnih kliničkih ispitivanja jasno pokazuju da mijelosupresija koja je indukovana hemoterapijom obuhvata dugotrajnu kontrolu bolesti i preživljavanje (Lyman, G.H., Chemotherapy dose intensity and quality cancer care (Oncology (Williston Park), 2006. 20(14 Suppl 9): p. 16-25)). Dalje, režimi tretmana za, za na primer, pluća, grudi, i kolorektalni kancer preporučeni u National Comprehensive Cancer Network vodičima su sve više povezani sa značajnom mijelosupresijom ipak se češće preporučuju za lečenje ranih stadijuma bolesti kao i uznapedovalog stadijuma ili metastatske bolesti (Smith, R.E., Trends in recommendations for myelosuppressive chemotherapy for the treatment of solid tumors. J Natl Compr Canc Netw, 2006.

4(7): p. 649-58). Ovaj trend prema intenzivnijem tretmanu pacijenata sa kancerom stvara zahtev za poboljšanim merama kako bi se minimizovao rizik od mijelosupresije i komplikacija dok bi se optimizovao relativni intenzitet doze.

[0007] Pored supresije kostne srži, hemoterapeutska sredstva mogu da imaju štetan efekat na ostalim zdravim ćelijama kao što su ćelije bubrežnog epitela, pri čemu dolazi potencijalno do razvoja akutne povrede bubrega usled smrti tubuarnog epitela. Akutna povreda bubrega može da dovede do hronične bolesti bubrega, prestanaka rada više organa, sepse, i smrti.

[0008] Jedan mehanizam za smanjenje mijelosupresije, nefrotoksičnosti, i drugih hemoterapeutskih hemotokičnosti je kroz smanjenje planiranog intenziteta doze hemoterapija. Dozna smanjenja ili odlaganja u ciklusima, međutim, smanjuju efikasnost i na kraju kompromituju dugotrajnu kontrolu bolesti i preživljavanje.

[0009] Mali molekuli su korišćeni za smanjenje nekih od nepoželjnih efekata određenih hemoterapeutskih jedinjenja. Na primer, leukovorin je korišćen za ublažavanje efekata metotreksata na ćelijama kostne srži i na gastrointestinalnim mukoznim ćelijama. Amifostin je korišćen za smanjenje učestalosti groznice povezane sa neutropenijom i mukozitisom kod pacijenata koji primaju alkilirajuće ili hemoterapeutike koji sadrže platinu. Takođe, deksrazoksan je korišćen za obezbeđenje kardiozaštite od antraciklin anti-kancerogenih jedinjenja. Nažalost, prisutna je zabrinutost da mnogi hemoprotektanti, kao što je deksrazoksan i amifostin, mogu da smanje efikasnost hemoterapije koja se daje istovremeno.

[0010] Dodatne hemozaštitne terapije, posebno sa hemoterapijom koja je povezana sa anemijom i neutropenijom uključuju upotrebu faktora rasta. Hematopoetski faktori rasta su na tržištu dostupni kao rekombinovani proteini. Ovi proteini uključuju faktor stimulacije kolonije granulocita (G-CSF) i faktor stimulacije kolonije granulocita-makrofaga (GM-CSF) i njihove derivate za lečenje leukopenije, i eritropoetin (EPO) i njegovi derivati za lečenje anemije. Međutim, ovi rekombinovani proteini su skupi. Osim toga, EPO ima značaju toksičnost kod pacijenata sa kancerom, pri čemu vodi do povećane tromboze, relapsa i smrti kod nekoliko slučajnih ispitivanja. G-CSF i GM-CSF mogu da povećaju kasni (>2 godine posle terapije) rizik od sekundarnih poremećaja kostne srži kao što je leukemija i mijelodisplazija. Stoga, njihova upotreba je ograničena i nije lako više dostupna svim pacijentima kojima je potrebna. Dalje, dok faktori rasta mogu da ubrzaju opravak nekih linija ćelija krvi, ne postoji terapija za lečenje supresije pločica, makrofaga, T-ćelija ili B-ćelija.

[0011] Roberts et al u 2012 prijavljuju da Pfizer jedinjenje PD-0332991 indukuje privremeni zastoj ćelijskog ciklusa u CDK4/6 zavisnim podskupovima zdravih ćelija kao što su HSPC-e (videti Roberts et al. Multiple Roles of Ciklin-Dependent Kinase 4/6 Inhibitors in Cancer Therapy. JNCI 2012;104(6):476-487). Ovo jedinjenje je trenutno predmet ispitivanja Pfizer-a u kliničkim ispitivanjima kao antineoplastično sredstvo u odnosu na estrogen pozitivni, HER2-negativni kancer grudi.

[0012] Hematopoetske stem ćelije stvaraju progenitorske ćelije što zauzvrat stvara sve diferencirane komponente krvi kao što je prikazano na Slici 1 (npr., limfociti, eritrociti, pločice, granulociti, monociti). HSPCs zahtevaju aktivnost CDK4/6 za proliferaciju (videti Roberts et al. Multiple Roles of Ciklin-Dependent Kinase 4/6 Inhibitors in Cancer Therapy. JNCI 2012;104(6):476-487). Kod zdravih bubrega, epitel bubrega retko ulazi u ćelijske deobe (oko 1% epitelnih ćelija). Posle povrede bubrega, međutim, događa se robustan rast dolazi do proliferacije epitela (videti Humphreys, B.D. et al. Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury. Cell Stem Cell 2, 284-91 (2008)). Važno, nakon povrede bubrega, preživele epitelne ćelije bubrega se repliciraju da bi se popravilo oštećenje epitela u tubulama bubrega (videti Humphreys, B.D. et al. Popravka povređene proksimalne tubule ne uključuje specijalizovane progenitore. Proc Natl Acad Sci U S A 108, 9226-31 (2011)). Videti takođe WO 2010132725 koja je podneta od Sharpless et al.

[0013] Identifikovani su brojni CDK 4/6 inhibitori, uključujući specifične pirido[2,3-d]primidine, 2-anilinopirimidine, diaril uree, benzoil-2,4-diaminotiazole, indolo[6,7-a]pirolo[3,4-c]karbazole, i oksindole (videti P.S. Sharma, R. Sharma, R. Tyagi, Curr. Cancer Drug Targets 8 (2008) 53-75). WO 03/062236 identifikuje serije 2-(piridin-2-ilamino-pirido[2,3]pirimidin-7-one za lečenje Rb pozitivnih kancera koji pokazuju selektivnost prema CDK4/6, uključujući 6-acetil-8-ciklopentil-5-metil-2-(5-piperazin-1-il-piridin-2-ilamino)-8H-pirido-[2,3-d]-pirimidin-7-on (PD0332991). Studije kliničkih ispitivanja su prijavile brzine stope 3/4 neutropenije i leukopenije sa upotrebom PD0332991, što dovodi do 71% pacijenata koji zahtevaju prekid doze i 35% koji zahtevaju smanjenje doze; i neželjena dejstva koja dovode do 10% prekida (videti Finn, Abstract S1-6, SABCS 2012).

[0014] VanderWel et al. opisuju pirido[2,3-d]primidin-7-on koji sadrži jod (CKIA) kao potentnog i selektivnog CDK4 inhibitora (videti VanderWel et al., J. Med. Chem.48 (2005) 2371-2387).

[0015] WO 99/15500 koja je podneta od Glaxo Group Ltd prikazuje inhibitore protein kinaze i serin/treonin kinaze.

[0016] WO 2010/020675 koja je podneta od Novartis AG opisuje piroloprimidinska jedinjenja kao CDK inhibitore. WO 2011/101409 koja je takođe podneta od Novartis opisuje piroloprimidine sa CDK 4/6 inhibitornom aktivnosti.

[0017] WO 2005/052147 koja je podneta od Novartis i WO 2006/074985 koja je podneta od Janssen Pharma prikazuju dodavanje CDK4 inhibitora.

[0018] US 2007/0179118 koja je podneta od Barvian et al. objašanjava upotrebu CDK4 inhibitora za lečenje inflamacije.

[0019] WO 2012/061156 koja je podneta od Tavares i preneta na G1 Therapeutics opisuje CDK inhibitore. WO 2013/148748 koja je podneta od Tavares i preneta na G1 Therapeutics opisuje inhibitore laktam kinaze.

[0020] U.S. objava patenta 2011/0224227 to Sharpless et al. opisuje upotrebu određenih CDK4/6 inhibitora, kao što su PD0332991 i 2BrIC (videti Zhu, et al., J. Med. Chem., 46 (11) 2027-2030 (2003); PCT/US2009/059281) da bi se smanjili ili sprečili efekti citotokičnih jedinjenja na HSPCs kod subjekta koji je izložen hemoterapeutskim tretmanima. Videti takođe U.S. objavu patenta 2012/0100100.

[0021] Stone, et al., Cancer Research 56, 3199-3202 (1 jul,1996) opisuje reverzibilni, p16-posredovani zastoj u ćelijskom ciklusu kao zaštiti od hemoterapije.

[0022] Prema tome, cilj predmentnog pronalaska je da se obezbede nova jedinjenja, kompozicije i postupci za lečenje pacijenata tokom hemoterapije.

SUŠTINA PRONALASKA

[0023] Pronalazak obezbeđuje jedinjenja za upotrebu kao što je predstavljeno u patentnim zahtevima. Unapređena jedinjenja, postupci, i kompozicije su obezbeđeni da svedu na minimum efekat toksičnost hemoterapeutskog sredstva na replikaciju zdravih ćelija zavisnu od CDK4/6, kao što su hematopoetske stem ćelije i hematopoetske progenitorske ćelije (zajedno su poznate pod imenom HSPCs), i/ili epitelne ćelije bubrega, kod subjekata, obično ljudi, koji će biti, jesu, ili su bili izloženi hemoterpautskom sredstvu (obično sredstvo koje oštećuje DNK).

[0024] Specifično, ovde je obezbeđeno jedinjenje formule:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu u postupku smanjenja efekta hemoterapije na zdravim ćelijama kod subjekta koji je tretiran za proliferaciju kancera ili abnormalne ćelije koja ne zavisi od ciklin-zavisne kinaze 4/6 (CDK4/6), pri čemu su pomenute zdrave ćelije hematopoetske stem ćelije, hematopoetske progenitorske ćelije, ili epitelne ćelije bubrega, postupak obuhvata ordiniranje subjektu efikasne količine jedinjenja.

[0025] Opisana jedinjenja obezbeđuju unapređenu zaštitu replikacije zdravih ćelija koja zavisi od CDKtokom tretmana sa hemoterapeutskim sredstvom delom zbog toga što oni (i) ispoljavaju kratkotrajni, privremeni efekat zaustavljanja u G1 i (ii) ispoljavaju brzi, sinhroni ponovni ulazak u ćelijski ciklus sa ćelijama nakon prestanka hemoterapeutskog oštećujućeg efekta. Upotreba ovih CDK4/6 specifičnih, kratkih, privremenih jedinjenja koji zaustavljau u G1 fazi kao hemoprotektanti omogućavaju za, za jedinjenje, ubrzani oporavak ćelijske linije, smanjeni rizik od citotoksičnosti zbog odlaganja replikacije, i/ili minimizacije ćelijske smrti koja je indukovana hemoterapeutskim sredstvom.

[0026] Pored izveštaja korišćenja poznatih CDK4/6 inhibitora kao što su 2BrIC i PD0332991 da bi se pokazala hemozaštita, otkriveno je da ovi inhibitori ne moraju da budu najidealnija jedinjenja za upotrebu u strategijama famakološkog mirovanja (PQ). Na primer, upotreba 2BrIC in vivo je ograničena njegovom biodostupnošću, i pored relativne selektivnosti za CDK4/6 ispoljene od PD0332991, jedinjenje ima relativno dugotrajni efekat unutar ćelija (videti Roberts et al. Multiple Roles of Ciklin-Dependent Kinase 4/6 Inhibitors in Cancer Therapy. JCNI 2012;104(6):476-487 (Sl.2A)), čime se proširuje privremenost G1 zastoja izvan onoga što može da bude neophodno za dovoljnu zaštitu od hemoterapeutskih tretmana. Takav dugotrajni efekat odlaže, na primer, proliferaciju HSPC ćelijskih linija koja je potrebna da se rekonstituišu hematološke ćelijske linije koje su negativno pogođene sa hemoterapeutskim sredstvima ili su isključene tokom njihovog prirodnog životnog ciklusa. Dugotrajni G1 zastoj obezbeđen od PD0332991 može da ograniči njegovu upotrebu kao potencijalnog hemoprotektanta kod subjekata čiji režim hemoterapeutskog tretmana zahteva brzi ponovni ulazak u ćelijski ciklus sa HSPCs da bi se rekonstituisale eritoidne, pločice, i mijeloidne ćelije (monociti i granulociti) koje su negativno pogođene sa hemoterapeutskim sredstvima ili akutnim HSPC G1-zastojem da bi se ograničili mijelosupresivni ili hematološki toksični efekti. Dalje, PD0332991 može da bude ograničen u njegovoj upotrebi kao hemoprotektanta kod subjekta koji je izložen hemoterapeutskim sredstvom u redovnim i ponovljenim intervalima, na primer, u režimima koji se ponavljaju svakih nekoliko dana, tako što može da ograniči sposobnost ovih HSPC-a subjekta da ponovo uđu u ćelijski ciklus brzo pre neko što će biti potrebno da se ponovo zaustave pre sledećeg hemoterapeutskog ciklusa subjekta. U odnosu na druga pogođena tkiva, na primer bubrežne ćelije, blagovremeni nastavak proliferacije je kritičan za reparaciju tkiva, na primer reparaciju tubularnog epitela bubrega, zbog nefrotoksičnih sredstava, i prema tome, suviše dug period PQ nije poželjan.

[0027] Prema tome ovde prikazani postupci uključuju ordiniranje ovde opisanih jedinjenja u efikasnoj količini domaćinu kome je potrebno, takvo jedinjenja ispoljava jednu ili bilo koju kombinaciju sledećih faktora koji obezbeđuju unapređeni terapeutski efekat (ili zasebno ili u bilo kojoj njegovoj kombinaciji, od kojih se svaki posebno i nezavisno opisuje): i) pri čemu značan deo zdravih ćelija čija replikaja zavisi od CDK4/6 (npr. bar 80% ili više) se vraća na ili pristupa pre-tretmanu bazalne aktivnosti ćelijskog ciklusa (tj., ponovni ulazak u ćelijski ciklus) za manje od 24 h, 30 h ili 36 h od poslednjeg ordiniranja aktivnog jedinjenja kod ljudi ili na primer, upotrebom opisanog postupka u primerima u tekstu ispod; ii) pri čemu određena porcija zdravih ćelija ponovo ulazi u ćelijski ciklus istovremeno za manje od 24 h, 30 h ili 36 h od poslednjeg ordiniranja aktivnog jedinjenja; (iii) pri čemu rastvaranje inhibitornog efekta aktivnog jedinjenja CDK4/6 se događa za manje od 24 h, 30 h, ili 36 h od ordiniranja inhibitora; (iv) pri čemu aktivno jedinjenje ima IC50za CDK4 i/ili CDK6 inhibiciju koja je više od 1500 puta manja od njegove IC50koncentracije za inhibiciju CDK2; (v) gde se određena porcija zdravih ćelija vraća na ili pristupa pre-tretmana bazalne aktivnosti ćelijskog ciklusa (tj., ponovni ulazak u ćelijski ciklus) za manje od 24 h, 30 h, ili 36 h od rasipanja inhibitornog efekta CDK4/6 aktivnog jedinjenja; (vi) gde bazalna aktivnost ćelijskog ciklusa pre tretmana (tj. ponovni ulazak u ćelijski ciklus) za manje od oko 24 h, oko 30 h, ili oko 36 h od tačke u kojoj nivo koncentracije CDK4/6 inhibitora u krvi subjekta je ispod terapeutske efikasne koncentracije; ili (vii) gde određena porcija zdravih ćelija ponovo ulazi u ćelijski ciklus sinhrono za manje od 24 h, 30 h, ili 36 h od poslednjeg ordiniranja hemoterapeutskog sredstva.

[0028] Ovde opisana jedinjenja mogu da se ordiniraju subjektu pre tretmana sa hemoterapeutskim sredstvom, tokom tretmana sa hemotrapeutskim sredstvom, nakon izlaganja hemoterapeutskim sredstvom, ili njegovoj kombinaciji. Ovde opisano jedinjenje se obično ordinira na način koji omogućava lak pristup leka u krvotoku, na primer preko intravenozne injekcije ili podjezične, intraaortalne, ili drugog efikasnog načina pristupa krvotoku; međutim, oralni, topikalni, transdermalni, intranazalni, intramuskularni, ili inhaliranjem kao što je pomoću rastvora, suspenzija, ili emulzija, ili drugi poželjni načini ordiniranja mogu da se koriste. U jednom izvođenju, jedinjenje se ordinira subjektu manje od oko 24 h, 20 h, 16 h, 12 h, 8 h, ili 4 h, 2.5 h, 2 h, 1 , 1⁄2 h ili manje od tretmana hematerapeutskim sredstvom. Obično, ovde opisano aktivno jedinjenje je ordinirano subjektu pre tretmana sa hemoterapeutskim sredstvom tako da jedinjenje dostiže maksimalnu vrednost nivoa u serumu pre ili tokom tretmana sa hemoterapeutskim tretmanom. U jednom izvođenju, aktivno jedinjenje se ordinira istovremeno, ili blisko sa, izlaganjem hemoterapeutskom sredstvu. Po potrebi, aktivno jedinjenje može da se ordinira više puta tokom tretmana sa hemoterapeutskim sredstvom kako bi se povećala inhibicija do maksimuma, posebno kada je hemoterapeutski lek ordiniran tokom dugog perioda ili ima dugačak polu-život. Ovde opisano aktivno jedinjenje može da se ordinira nakon izlaganja hemoterapeutskom sredstvu ukoliko je poželjno da bi se ublažilo oštećenje zdrave ćelije koje je povezano sa izlaganjem hemoterapeutskom sredstvu. U određenim izvođenjima, aktivno jedinjenje se ordinira do oko 1⁄2 h, do oko 1 h, do oko 2 h, do oko 4 h, do oko 8 h, do oko 10 h, do oko 12 h, do oko 14 h, do oko 16 h, ili do oko 20 h ili više nakon izlaganja hemoterapeutskom sredstvu. U posebnom izvođenju, aktivno jedinjenje je ordinirano između oko 12 h i 20 h nakon izlaganja hemoterapeutskom sredstvu.

[0029] Ovde opisani CDK4/6 inhibitori pokazuju značajnu selektivnost za inhibiciju CDK4 i/ili CDK6 u poređenju sa drugim CKD, na primer CDK2. Na primer, CDK4/6 inhibitori opisani u predmetnom pronalasku obezbeđuju dozno zavisni G1-efekat zastoja na zdravim ćelijama čija replikacija zavisi od CDK4/6, na primer HSPCs ili epitelne ćelije bubrega, i ovde prikazani postupci su dovoljni da se obezbedi hemozaštita zdravih ćelija zavisnih od CDk4/6-replikacije tokom izlaganja hemoterapeutskom sredstvu, na primer, tokom vremenskog perioda gde DNK-oštećujuće hemoterapeutsko sredstvo je pogodno za DNK-oštećujuće efekte na CDK4/6-zavisnu replikaciju zdravih ćelija kod subjekta, dok se omogućava sinhroni i brzi ponovni ulazak u ćelijski ciklus od ovih ćelija kratko nakon rasipanja hemoterapeutskog sredstva zbog vremenski ograničenog CDK4/6 inhibitornog efekta obezbeđeno od ovde opisanih jedinjenja u poređenju sa, na primer, PD0332991. Slično tome, CDK4/6 inhibitori korisni u predmetnom pronalasku obezbeđuju dozno zavisni ublažavajući efekat na CDK4/6-zavisnu replikaciju zdravih ćelija koji su izloženi toksičnim nivoima hemoterapeutskih sredstava, na primer kao slučajno predoziranje, pri čemu se omogućava popravka DNK oštećenja koji su povezani sa izlaganjem hemoterapeutskim sredstvom i sinhroni, brzi ponovni ulazak u ćelijski ciklus nakon rasipanja CDK4/6 inhibitornog efekta u poređenju sa, na primer, PD0332991. U jednom izvođenju, upotrebu ovde opisanog CDK4/6 dovodi do efekta G1-zastoja na CDK4/6-zavisnu replikaciju zdravih ćelija subjekta rasipanje nakon ordiniranja CDK4/6 inhibitora tako da se zdrave ćelije subjekta se vraćaju na ili pristupaju njihovoj pre-ordiniranja bazalnoj aktivnosti ćelijskog ciklusa u manje od oko 24 h, 30 h, 36 h, ili 40 h, ordiniranja. U jednom izvođenju, G1-efekat zastoja se rasipa tako da CDK4/6-zavisna replikacija zdravih ćelija subjekta se vraća na njihovu preordiniranja bazalanu aktivnost ćelijskog ciklusa za manje od oko 24 h, 30 h, 36 h, ili 40 h.

[0030] U jednom izvođenju, upotreba ovde opisanog CDK4/6 inhibitora dovodi do G1-efekta zastoja rasipanja tako da CDk4/6-zavisne zdrave ćelije subjekta se vraćaju na ili pristupaju njihovoj preordiniranja bazalnoj aktivnosti ćelijskog ciklusa za manje od oko 24 h, 30 h, 36 h, ili 40 h efekta hemoterapeutskog sredstva. U jednom izvođenju, G1-efekat zastoja se rasipa tako da ćelije čija replikacija zavisi od CDK4/6 se vraća na njihovu pre-ordiniranja bazalnu aktivnost ćelijskog ciklusa tokom od oko 24 h, 30 h, 36 h, ili 40 h, ili u okviru oko 48 h od prestanka ordiniranja hemoterapeutskog sredstva. U jednom izvođenju, ćelije čija replikacija zavisi od CDK4/6 su HSPCs. U jednom izvođenju, zdrave ćelije čija replikacija zavisi od CDK4/6 su bubrežne epitelne ćelije.

[0031] U jednom izvođenju, upotreba ovde opisanog inhibitora CDK4/6 dovodi do rasipanja G1-efekta zastoja tako da replikacija zdravih ćelija subjekta koja zavisi od CDK4/6 se vraća na ili pristupa njihovom pre-ordiniranju bazalne aktivnosti ćelijskog ciklusa tokom od oko 24 h, 30 h, 36 h, 40 h, ili manje od oko 48 h od tačke u kojoj nivo koncentracije CDK4/6 inhibitora u krvi subjekta pada ispod terapeutski efikasne koncentracije.

[0032] U jednom izvođenju, ovde opisani CDK4/6 inhibitori su korišćeni za zaštitu bubrežnih epitelnih ćelija tokom izlaganja hemoterapeutskom sredstvu, na primer, DNK oštećujućim hemoterapeutskom sredstvu, pri čemu su bubrežne epitelne ćelije privremeno sprečene od ulaska u S-fazu u odgovoru na hemoterapeutskim sredstvom indukovano oštećenje epitela tubula bubrega za ne više od oko 24 h, oko 30 h, oko 36 h, oko 40 h, ili oko 48 h od tačke u kojoj nivo koncentracije CDK4/6 inhibitora u krvi subjekta pada ispod terapeutski efikasne koncentracije, od prestanka efekta hemoterapeutskog sredstva, ili od ordiniranja CDK4/6 ordiniranja.

[0033] CDK4/6 inhibitori korisni u opisanim postupcima mogu da budu sinhroni u njihovom „off“-efektu, koji je, nakon rasipanja efekta G1 zastoja, zdrave ćelije čija replikacija zavisi od CDK4/6 koje su izložene ovde opisanom CDK4/6 inhibitoru ponovo na sličan način ulaze u ćelijski ciklus. Zdrave ćelije čija replikacija zavisi od CDK4/6 koje ulaze u ćelijski ciklus rade tako da udeo normalnih ćelija u G1 i S se brzo i efikasno ponovo uspostavljaju, sa manje od oko 24 h, 30 h, 36 h, 40 h, ili tokom oko 48 h od tačke u kojoj nivo koncentracije inhibitora CDK4/6 u krvi subjekta pada ispod terapeutski efikasne koncentracije.

[0034] Ovo kao prednost omogućava da veći broj zdravih ćelija počne sa replikacijom nakon rasipanja G1 zastoja u poređenju sa asinhronim CDK4/6 inhibitorima kao što je PD0332991.

[0035] Dodatno, sihroni ponovni ulazak u ćelijski ciklus koji prati G1 zastoj upotrebom ovde opisanog CDK4/6 inhibitora obezbeđuje sposobnost pravovremenog davanja hematopoetskih faktora rasta da se pomogne u rekonstituciji linija hematopoetskih ćelija da se maksimalno pojača efekat faktora rasta. Kao takvo, u jednom izvođenju, upotreba jedinjenja ili ovde opisanih postupaka je kombinovana sa upotrebom hematopoetskih faktora rasta uključujući, ali bez ograničenja, faktor stimulacije kolonije granulocita (G-CSF), ktor stimulacije kolonije granulocita-makrofaga (GM-CSF), trombopojetin, interleukin (IL)-12, ’steel’ faktor, i eritropoetin (EPO), ili njihove derivate. U jednom izvođenju, CDK4/6 inhibitor je ordiniran pre ordiniranja hematopoetskog faktora rasta. U jednom izvođenju, ordiniranje hematopoetskog faktora rasta je podešeno tako da se efekat CDK4/6 inhibitora na HSPCs rastvara tj. nestaje.

[0036] U jednom aspektu, upotreba ovde opisanog CDK4/6-inhibitora omogućava hemo-zaštitni režim za upotrebu tokom standardnih rasporeda hemoterapeutskog doziranja ili režimima koji su uobičajeni u mnogim anti-kancerogenim tretmanima. Na primer, CDK4/6-inhibitor može da se ordinira tako da zdrave ćelije čija replikacija zavisi od CDK4/6 su zaustavljene u G1 tokom izlaganja hemoterapeutskom sredstvu gde, zbog brzog nestanja efekta G1-zastoja jedinjenja, značajan broj zdravih ćelija ponovo ulazi u ćelijski ciklusa i sposobne su brzo da se repliciraju nakon izlaganja hemoterapeutskom sredstvu, na primer, za manje od oko 24, 30, 40, ili 48 h, i nastavljaju da se repliciraju do ordiniranja CDK4/6-inhibitora u očekivanju sledećeg hemoterapeutskog tretmana. U jednom izvođenju, CDK4/6-inhibitor je ordiniran da se omogući kruženje zdravih ćelija čija replikacija zavisi od CDK4/6 između G1-zastoja i ponovnog uslaska u ćelijski ciklus da se prilagodi ponovljeni hemoterapeutski režim doziranja, na primer uključujući ali bez ograničenja na režim tretmana wherein se hemoterapeutsko sredstvo ordinira: u danu 1-3 svakih 21 dana; u danima 1-3 svakih 28 dana; u danu 1 svake 3 nedelje; u danu 1, danu 8, i danu 15 svakih 28 dana, u danu 1 i danu 8 svakih 28 dana; u danima 1 i 8 svakih 21 dana; u danima 1-5 svakih 21 dana; 1 dan nedeljno tokom 6-8 nedelja; u danima 1, 22, i 43; danima 1 i 2 nedeljno; danima 1-4 i 22-25; 1-4; 22-25, i 43-46; i režimima sličnog tipa, gde su ćelije čija replikacija zavisi od CDK4/6 su zaustavljene u G1 tokom izlaganja hemoterapeutksom sredstvu i značajna porcija ćelija ponovo ulazi u ćelijski ciklus između izlaganja hemoterapeutskom sredstvu. U jednom izvođenju, CDK4/6-inhibitor može da se ordinira tako da ćelije subjekta čija replikacija zavisi od CDK4/6 su zaustavljene u G1 tokom dnevnog izlaganja hemoterpaeutskom sredstvu, na primer kontinuirani višednevni hemoterapeutski režim, ali značajna porcija ćelija čija replikacija zavisi od CDK4/6 ponovo ulazi u ćelijski ciklus i repliciraju se između dnevnih tretmana. U jednom izvođenju, CDK4/6-inhibitori mogu da se ordiniraju tako da ćelije subjekta čija replikacija zavisi od CDK4/6 su zaustavljene u G1 tokom izlaganja hemoterapeutskom sredstvu, na primer kontinuirani više-dnevni hemoterapeutski režim, ali značajna porcija zdravih ćelija ponovo ulazi u ćelijski ciklus i replicira se tokom perioda pauze pre izlaganja sledećem hemoterapeutskom sredstvu. U jednom izvođenju, CDK4/6 inhibitor je ordiniran tako je obezbeđeno da da ćelije subjekta čija replikacija zavisi od CDK4/6 su zaustavljene u G1 tokom režima tretmana hemoterapeutskom sredstvom, na primer, kontinuirani više-dnevni hemoterapeutski režim, i zaustavljene ćelije su sposobne da ponovo uđu u ćelijski ciklus odmah nakon kraja više-dnevnog režima. U jednom izvođenju, kancer je kancer malih ćelija pluća i CDK4/6 inhibitor je ordiniran danima 1, 2, i 3 tokom 21-dnevnog cikusa tretmana kada se ordirnira DNK oštećujuće sredstvo je izabrano i grupe koja obuhvata karboplatin, cisplatin, i etopozid, ili njihov kombinaciju.

[0037] Subjekat koji je tretiran prema predmetnom pronalasku može da prolazi kroz hemoterapeutski tretman za lečenje proliferativnog poremećaja ili bolesti kao što je kancer. Kancer može da se karakteriše sa jednom ili kombinacijom povećane aktivnosti ciklin-zavisne kinaze 1 (CDK1), povećane aktivnosti ciklin-zavisne kinaze 2 (CDK2), gubitka, deficijencije, ili odsustva funkcionalnog supresorskog proteina retinoblastoma tumora (Rb)( eng. „Rb-null“), visokih nivoa ekspresije MYC, povećanog ciklina E1, E2, i povećanog ciklina A. Kancer može da se karakteriše smanjenom ekspresijom supresorskog proteina retinoblastoma tumora ili člana proteina retinoblastoma familije proteina (kao što je, ali bez ograničenja p107 i p130). U jednom izvođenju, subjekat može da prolazi kroz hemoterapeutski tretman za lečenje „Rb-null“ ili Rb-deficijentnog kancera, uključujući ali bez ograničenja kancer malih ćelija pluća, trostruko-negativni kancer grudi, HPV-pozitivni kancer glave i vrata, retinoblastom, Rbnegativni kancer bešike, Rb negativni kancer prostate, osteosarkom, ili cervikalni kancer. U jednom izvođenju, kancer je CDK4/6-nezavisni kancer. Ordiniranje inhibitora može da omogući veću dozu hemoterapeutskog sredstva koja će se koristiti za lečenje bolesti u odnosu na standardnu dozu koja može da se bezbedno koristi u odsustvu ordiniranja CDK4/6 inhibitora jedinjenja.

[0038] Domaćin ili subjekat, ukljčujući čoveka, može da prolazi kroz hemoterapeutski tretman za nemaligni proliferativni poremećaj, ili drugu abnormalnu ćelijsku proliferaciju, kao što je tumor, multiple sklerozu, lupus, ili artritis.

[0039] Zaštićene HSPCs uključuju hematopoetske stem ćelije, kao što su hematopoetske stem ćelije dugog trajanja (LT-HSCs) i hematopoetske stem ćelije kratkog trajanja (ST-HSCs), i hematopoetske progenitorske ćelije, uključujći multipotentne progenitore (MPPs), zajedničke mijeloidne progenitore (CMPs), zajedničke limfoidne progenitore (CLPs), progenitore granulocita-monocita (GMPs) i megakariocitne-eritroidne progenitore (MEPs). Ordiniranje jedinjenja inhibitora obezbeđuje privremeno, prolazno farmakološko mirovanje hematopoetskih stem i/ili hematopoetskih progenitorskih ćelija kod subjekta.

[0040] Ordiniranje CDK4/6 inhibitora kao što je ovde opisano može da dovede do smanjene anemije, smanjene limfopenije, smanjene trombocitopenije, ili smanjene neutropenije u poređenju sa onim što se obično očekuje posle, uglavnom posle, ili povezano sa tretmanom sa hemoterapeutskim sredstvima u odsustvu ordiniranja CDK4/6 inhibitora. Upotreba CDK4/6 inhibitora kao što se ovde opisuje ima za rezultat brži oporavak od supresije kostne srži koja je povezana sa dugotrajnom upotrebom CDK4/6 inhibitora, kao što je mijelosupresija, anemija, limfopenija, trombocitopenija, ili neutropenija, nakon prestanka korišćenja CDK4/6 inhibitora. U nekim izvođenjima, upotreba CDK4/6 inhibitora kao što je ovde opisano dovodi do smanjene ili ograničene supresije kostne srži koja je povezana sa dugotrajnom upotrebom CDK4/6 inhibitora, kao što je mijelosupresija, anemija, limfopenija, trombocitopenija, ili neutropenija.

[0041] U jednom alternativnom aspektu, ovde opisani CDK4/6 inhibitor može da se koristi za njegov anti-kancerogeni, anti-tumorski, ili antiproliferativni efekat kombinovano sa hemoterapeutskim sredstvom za lečenje Rb-negativnog kancera ili druge Rb-negativne abnormalne proliferacije. U jednom izvođenju, ovde opisani CDK4/6 inhibitor obezbeđuje aditivni efekat ili sinergistički efekat sa anti-kancerogenom ili anti-proliferativnom aktivnosti hemoterapeutika. Hemoterapeutici mogu da se kombinuju sa ovde opisanim CDK4/6 inhibitorima su bilo koji hemoterapeutici efikasni ili korisni za lečenje RB-„null“ kancera ili abnormalne ćelijske proliferacije. U jednom posebnom izvođenju, upotreba ovde opisanog jedinjenja se kombinuje sa terapeutskim režimom sa bar jednim drugim hemoterapeutskim sredstvom, i može da bude ona koja se ne oslanja na proliferaciju ili napredovanje kroz ćelijski ciklus za anti-proliferativnu aktivnost. Takva sredstva mogu da uključe, ali nisu ograničena na, tamoksifen, midazolam, letrozol, bortezomib, anastrozol, goserelin, mTOR inhibitor, inhibitore PI3 kinaze, dualne mTOR-PI3K inhibitore, MEK inhibitore, RAS inhibitore, ALK inhibitore, HSP inhibitore (na primer, inhibitore HSP70 i HSP 90, ili njihova kombinacija), BCL-2 inhibitore, jedinjenja koja indukuju apoptozu, AKT inhibitore, PD-1 inhibitore, ili FLT-3 inhibitore, ili njihove kombinacije. Primeri mTOR inhibitora uključuju ali nisu ograničeni na rapamicin i njegove analoge, everolimus (Afinitor), temsirolimus, ridaforolimus, sirolimus, i deforolimus. Primeri inhibitora P13 kinaze uključuju ali nisu ograničeni na Wortmannin, demetoksiviridin, perifozin, idelalisib, PX-866, IPI-145 (Infinity), BAY 80-6946, BEZ235, RP6503, TGR 1202 (RP5264), MLN1117 (INK1117), Pictilisib, Buparlisib, SAR245408 (XL147), SAR245409 (XL765), Palomid 529, ZSTK474, PWT33597, RP6530, CUDC-907, i AEZS-136. Primeri MEK inhibitora uključuju ali nisu ograničeni na Tametinib, Selumetinib, MEK162, GDC-0973 (XL518), and PD0325901. Primeri RAS inhibitora uključuju ali nisu ograničeni na Reolizin i siG12D LODER. Primeri ALK inhibitora uključuju ali nisu ograničeni na Crizotinib, AP26113, i LDK378. HSP inhibitori uključuju ali nisu ograničeni na Geldanamicin ili 17-N-Alilamino-17-demetoksigeldanamicin (17AAG), i Radicikol.

[0042] U određenim izvođenjima, ovde opisano jedinjenje je ordinirano subjektu pre tretmana sa drugim hemoterapeutskim sredstvom, tokom tretmana sa drugim terapeutskim sredstvom, nakon ordiniranja drugog hemoterapeutskog sredstva, ili njihove kombinacije.

[0043] U nekim izvođenjima, subjekat ili domaćin je sisar, uključujući čoveka.

[0044] U suštini, predmetni pronalazak uključuje sledeće karakteristike:

A. Jedinjenje Formule T, i njegove farmaceutski prihvatljive soli, za upotrebu u hemozaštiti zdravih ćelija čija replikacija zavisi od CDK4/6, na primer HSPCs i/ili epitelnih ćelija bubrega, tokom izlaganja hemoterapeutskom sredstvu;

B. Jedinjenje Formule T, i njegove farmaceutski prihvatljive soli, za upotrebu u hemozaštiti zdravih ćelija sa CDK4/6-zavisnom replikacijom, na primer HSPCs i/ili epitelnim ćelijama bubrega, tokom hemoterapeutskog režima za lečenje proliferativnog poremećaja;

C. Jedinjenje Formule T, i njegove farmaceutski prihvatljive soli, za upotrebu u hemozaštiti zdravih ćelija sa CDK4/6-zavisnom replikacijom, na primer HSPCs i/ili epitelnim ćelijama bubrega, tokom hemoterapeutskog režima za lečenje kancera.

D. Jedinjenje Formule T, i njegove farmaceutski prihvatljive soli, za upotrebu u kombinaciji sa hematopoetskim faktorima rasta kod subjekta koji će biti, ili jeste, ili je bio izložen hemoterapeutskim sredstvima;

E. Jedinjenje Formule T i njegove farmaceutski prihvatljive soli, za upotrebu u hemozaštiti zdravih ćelija sa CDK4/6-zavisnom replikacijom, na primer HSPCs i/ili epitelnim ćelijama bubrega;

F. Jedinjenje Formule T, i njegove farmaceutski prihvatljive soli, za upotrebu u ublažavanju DNK oštećenja zdravih ćelija sa CDK4/6-zavisnom replikacijom, na primer HSPCs i/ili epitelnim ćelijama bubrega, koje su prethodno bile izložene hemoterapeutskom sredstvu; G. Farmaceutska formulacija koja obuhvata efikasnu količinu za lečenje subjekta jedinjenja Formule T, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli za upotrebu u hemozaštiti zdravih ćelija; K. Jedinjenje Formule T ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu u postupku inhibiranja rasta Rb-negativnog kancera ili proliferativog poremećaja pri čemu postupak obuhvata ordiniranja jedinjenja u kombinaciji sa hemoterapeutikom da se obezbedi dodatak ili sinergistički efekat sa hemoterapeutikom. U jednom izvođenju, CDK4/6 inhibitori su kombinovani sa hemoterapeutikom izabranim iz grupe koja se sastoji iz MEK inhibitora, PI3 kinaze delta inhibitora, BCL-2 inhibitora, AKT inhibitora, jedinjenja koja indukuju apoptozu, AKT inhibitora, PD-1 inhibitora, FLT-3 inhibitora, HSP90 inhibitora, ili mTOR inhibitora, ili njihovih kombinacija.

1

KRATAK OPIS NACRTA

[0045]

SL. 1 je šematski prikaz hematopoeze koji pokazuje hijerarhijsku proliferaciju zdravih hematopetskih ćelija (HSC) i zdravih hematopoetskih progenitorskih ćelija sa rastućom diferencijacijom nakon proliferacije.

Sl.2A je grafik procenta ćelija u G2-M fazi (otvoreni krugovi), S fazi (trouglovi), G0-G1 fazi (kvadrati), <2N (dijamanti) u odnosu na promenljivu koncentraciju (nM) jedinjenja T u tHS68 ćelijama. Cdk4/6-zavisna ćelijska linija (tHS68) je tretirana sa naznačenim koncentracijama jedinjenja T 24 h. Nakon tretmana sa jedinjenjem T, ćelije su sakupljene i analizirane su za distribuciju ćelijskog ciklusa. Kao što je opisano za jedinjenje 152, tHS68 ćelije pokazuju jasni G1 zastoj zajedno sa odgovarajućim opadanjem broja ćelija u S-fazi. SL.2B je grafik broja tHS68 ćelija (CDK4/6-zavisna ćelijska linija) vs. DNK sadržaj ćelija (kako je mereno propidijum jodidom). Ćelije su tretirane sa DMSO 24 h, sakupljene, i analizirane su za distribuciju ćelijskog ciklusa.

SL.2C je grafik broja WM2664 ćelija (CDK4/6-zavisna ćelijska linija) vs. DNK sadržaj ćelija (kako je mereno sa propidijum jodidom). Ćelije su tretirane sa DMSO 24 h, sakupljene, i analizirane za distribuciju ćelijskog ciklusa. SL.2D je grafik broja A2058 ćelija (CDK4/6-nezavisna ćelijska linija) vs. DNK sadržaj ćelija (kako je mereno sa propidijum jodidom). Ćelije su tretirane sa DMSO 24 h, skupljene, i analizirane za distribuciju ćelijskog ciklusa. SL.2E je grafik broja tHS68 ćelija (CDK4/6-zavisna ćelijska linija) vs. DNK sadržaja ćelija (kako je mereno sa propidijum jodidom) posle tretmana sa Jedinjenjem T. Ćelije su tretirane sa Jedinjenjem T (300 nM) 24 h, sakupljene, i analizirane za distribuciju ćelijskog ciklusa. Kao što je opisano u Primeru 152, tretman tHS68 ćelija sa Jedinjenjem T uzrokuje gubitak maksimalne vrednosti S-faze (nazačeno strelicom). FSL. 2F je grafik broja WM2664 ćelija (CDK4/6- zavisna ćelijska linija) vs. DNK sadržaj ćelija (kako je mereno sa propidijum jodidom) posle tretmana sa Jedinjenjem T. Ćelije su tretirane sa Jedinjenjem T (300 nM) 24 h, sakupljene, i analizirane za distribuciju ćelijskog ciklusa. Kao što je opisano u Primeru 152, tretman WM2664 ćelija sa Jedinjenjem T uzrokuje gubitak maksimalne vrednsti S-faze (nazačeno strelicom). SL.2G je grafik broja A2058 ćelija (CDK4/6- nezavisna ćelijska linija) vs. DNK sadržaj ćelija (kako je mereno sa propidijum jodidom) posle tretmana sa Jedinjenjem T. Ćelije su tretirane sa Jedinjenjem T (300 nM) 24 h, sakupljene, i analizirane za distribuciju ćelijskog ciklusa. Kao što je opisano u Primeru 152, tretman A2058 ćelija sa Jedinjenjem T ne uzrokuje gubitak gubitak maksimalne vrednosti S-faze (nazačeno strelicom).

SL.3 je Western blot koji pokazuje nivoe fosforilacije Rb na Ser807/811 i Ser780 posle tretmana sa Jedinjenjem T. Cdk4/6-zavisne (tHS68 ili WM2664) i Cdk4/6-nezavisne ćelijske linije (A2058) su tretirane sa Jedinjenjem T (300 nM) u određenim vremenima (0, 4, 8, 16, i 24 h). Nivoi MAPK su prikazani kao kontrola za nivoe proteina. Nakon tretmana, ćelije su sakupljene i analizirane za Rbfosforilaciju Western blot analizom. Kao što je opisano u Primeru 153, tretman Jedinjenjem T dovodi do smanjenje fosforilacije-Rb posle tretmana u Cdk4/6-zavisnim ćelijskim linijama (tHS68 i WM2664), ali ne u Cdk4/6-nezavisnoj ćelijskoj liniji (A2058). SL.4A je grafik procenta ćelija u S fazi u Rb-pozitivnoj ćelijskoj liniji (WM2664) ili u Rb-negativnoj ćelijskoj liniji ćelija kancera pluća (H345, H69, H209, SHP-77, NCI417, ili H82) posle tretmana sa DMSO (tamni stupci) ili PD0332991 (svetli stupci). Ćelije su tretirane sa PD0332991 (300 nM) ili DMSO kontrolom 24 h. Ćelijska proliferacija je merena ugradnjom EdU i protočnom citometrijom. Podaci predstavljaju 100,000 ćelijskih događaja za svaki ćelijski tretman. Kao što je opisano u primeru 154, RB-null SCLC ćelijska linija je rezistentna na nhibicijuCdk4/6 i, kako nisu uočene promene u procentima ćelija u S-fazi nakon tretmana sa PD0332991.

SL. 4B je grafik procenta ćelija u S fazi u Rb-pozitivnoj ćelijskoj liniji (tHS68) ili kod Rb-negativnih ćelijskih linija kancera malih ćelija pluća (H345, H69, SHP-77, ili H82) posle tretmana sa DMSO (tamni stupci) ili Jedinjenja GG (svetliji stupci). Ćelije su tretirane sa Jedinjenjem GG (300 nM ili 1000 nM) ili DMSO kontrolom 24 h. Ćelijska proliferacija je merena ugradnjom EdU i protočnom citometrijom. Podaci predstavljaju 100,000 ćelijskih događaja za svaki tretman ćelija. Kao što je opisano u Primeru 154, RB-null SCLC ćelijska linija je rezistentna na Cdk4/6 inhibiciju, kako nisu uočene promene u procentima ćelija u S-fazi nakon tretmana sa Jedinjenjem GG.

SL.4C je grafik procenta ćelija u S fazi u u Rb- pozitivnoj ćelijskoj liniji (tHS68) ili kod Rb- negativnih ćelijskih linija kancera malih ćelija pluća (H345, H209, ili SHP-77) posle tretmana sa DMSO tamni stupci) ili Jedinjenja T (svetliji stupci). Ćelije su tretirane sa Jedinjenjem T (300 nM ili 1000 nM) ili DMSO kontrolom 24 h. Ćelijska proliferacija je merena uključivanjem EdU i protočnom citometrijom. Podaci predstavljaju 100,000 ćelijskih događaja za svaki tretman ćelija. Kao što je opisano u Primeru 154, RB-null SCLC ćelijska linija je rezistentna na Cdk4/6, kako nisu uočene promene u procentima ćelija u S-fazi nakon tretmana sa Jedinjenjem T.

SL.5 je grafik ugradnje EdU vs. vreme nakon ordiniranja (h) PD0332991 zdravim miševima HSPCs i zdravim mijeloidnim progenitorskim ćelijama. PD0332991 (150mg/kg) je ordiniran oralnom gavažom da se ispita vremenski efekat prolazne CDK4/6 inhibicije zastoja u kostnoj srži kako je prijavljeno u Roberts et al. Multiple Roles of Ciklin-Dependent Kinase 4/6 Inhibitors in Cancer Therapy. JCNI 2012;104(6):476-487 (SL.2A). Kao što je opisano u Primeru 156, pojedinačna oralna doza PD0332991 dovodi do smanjenja bez prekida u HSPC ugradnji EdU (krugovi; LKS+) EdU ugradnji u mijeloidnim progenitorskim ćelijama (kvadrati; LKS-) za više od 36 h.

SL.6A je grafik odnosa ugradnje EdU u HSPCs (u poređenju sa netretiranim kontrolnim miševima) nakon oralne gavaže jedinjenja T, Q, ili GG na 150 mg/kg ili na 12 ili 24 h posle ordiniranja.

FIG.6B je grafik procenta EdU pozitivnih HSPC ćelija za miševe tretirane sa Jedinjenjem T na ili 12 ili 24 h. Miševi su dozirani sa 50 mg/kg (trougovi), 100 mg/kg (kvadrati), ili 150 (obrnuti trouglovi) mg/kg oralnom gavažom.

SL.6C je grafik procenta EdU pozitivnih HSPC ćelija za miševe tretirane sa Jedinjenjem T (150 mg/kg oralnom gavažom) na ili 12, 24, 36 i 48 h. Kao što je opisano u Primeru 157, Jedinjenje T i GG pokazuju smanjenje u ugradnju EdU na 12 h, i počinje da se vraća na normalne nivoe ćelijske deobe tokom 24 h.

SL.7 je grafik procenta EdU pozitivnih HSPC ćelija za miševe tretirane sa ili PD0332991 (trouglovi) ili Jedinjenjem T (obrnuti trouglovi) v. vreme nakon davanja (h) jedinjenja. Oba jedinjenja se ordiniraju na 150 mg/kg oralnom gavažom i procenat EdU pozitivih HSPC ćelija se meri na 12, 24, 36 ili 48 h. Kao što je opisano u Primeru 158, pojedinačna oralna doza PD0332991 dovodi do neprekidnog smanjenja proliferacije HSPC više od 36 h. Suprotno tome, pojedinačna oralna doza Jedinjenja T dovodi do početnog smanjenja proliferacije HSPC na 12 h, ali proliferacija HSPCs se nastavlja 24 posle doze Jedinjenja T.

SL.8A je grafik procenta ćelija u G0-G1 fazi ćelijskog ciklusa vs. vreme posle ispiranja Jedinjenja (h) u humanim fibroblastima (Rb-pozitivne) ćelije. SL. 8B je grafik procenta ćelija u S fazi ćelijskog ciklusa vs. vreme posle ispiranja Jedinjenja (h) u humanim fibroblastima (Rb-pozitivne) ćelije. SL.

8C je grafik procenta ćelija u G0-G1 fazi ćelijskog ciklusa vs. vreme posle ispiranja Jedinjenja (h) u humanim epitelnim (Rb-pozitivnim) ćelijama proksimalnih tubula bubrega. SL.8D je grafik procenta ćelija u S fazi ćelijskog ciklusa vs. vreme posle ispiranja Jedinjenja (h) i u humanim epitelnim (Rbpozitivnim) ćelijama proksimalnih tubula bubrega. Ovi eksperimenti ćelijskog ispiranja pokazuju da inhibitori jedinjenja iz predmetnog pronalaska imaju kratki, prolazi efekat zastoja u G1 u različitim ćelijskim tipovima. Efekat na ćelijski ciklus nakon ispiranja jedinjenja je određen na 24, 36, 40, i 48 h. Kao što je određeno u Primeru 159, rezultati pokazuju da ćelijama koje su tretirane sa PD0332991 (krugovi) treba značajno duže vreme da dostignu bazalne nivoe ćelijske deobe (videti ćelije tretirane samo sa DMSO (dijamanti)), zatim ćelije tretirane sa Jedinjenjem T (kvadrati), Jedinjenjem Q (trouglovi), Jedinjenjem GG (X), ili Jedinjenjem U (X sa krstićem).

SL.9A je grafik koncentracije leka u plazmi (ng/ml) vs. vreme posle ordiniranja (h) Jedinjenja T. SL.

9B je grafik koncentracije leka u plazmi (ng/ml) vs. vreme posle ordiniranja (h) Jedinjenja Q. SL.9C je grafik koncentracije leka u plazmi (ng/ml) vs. vremena posle ordiniranja (h) Jedinjenja GG. SL.9D je grafik koncentracije leka u plazmi (ng/ml) vs. vreme posle ordiniranja (h) Jedinjenja U. Jedinjenja su dozirana miševima u koncentraciji 30 mg/kg oralnom gavažom (dijamati) ili 10 mg/kg intravenozom injekcijom (kvadrati). Krvni uzorci su uzeti na 0, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, i 8.0 h posle doziranja i koncentracije u plazmi su određene sa HPLC.

SL.10 obezbeđuje polu-život (minuti) Jedinjenja T i PD0332991 kod čoveka i životinje (majmuna, psa, pacova, i miša) mikrozomima jetre. Kao što je opisano u Primeru 158, PD0332991 ima poluživot veći od 60 minuta u svakoj od ispitivanih vrsta. Određeno je da Jedinjenje T kraći polu život u odnosu na PD0332991 u svakoj od ispitanih vrsta.

FIG.11A je grafik ćelijskog preživljavanja ćelija koje su tretirane sa 5µM etopozidom vs. tretmanom sa naznačenom količinom Jedinjenja T. Preživljavanje ćelija je određeno 24 h posle tretmana. Kao što je opisano u Primeru 162, pokazuje da Jedinjenje T štiti tHS68 ćelije od ćelijske smrti koja je indukovana hemoterapeutikom. FIG.11B je grafik ćelijskog preživljavanja ćelija tretiranih sa 100µM karboplatinom vs. treatmentom sa naznačenom količinom Jedinjenja T. Preživljavanje ćelija je određeno 24 h posle tretmana. Kao što je opisano u Primeru 162, Jedinjenje T štiti tHS68 ćelije od ćelijske smrti koja je indukovana hemoterapeutikom.

SL. 12A je grafik relativne H2AX aktivnosti vs. varijabilnu koncentraciju Jedinjenja T (nM) u HS68 ćelijama tretiranim sa Jedinjenjem T (100 nM, 300 nM, ili 1000 nM) i hemoterapijom (etopozid, doksorubicin, karboplatin, paklitaksel, ili kamptotecin). Cdk4/6-zavisne HS68 ćelije su tretirane sa naznačenim dozama Jedinjenja T i hemoterapijom. Obrazovanje H2AX mesta je mereno da bi se procenilo oštećenje DNK koje je indukovano hemoterapijom. Kao što je opisano u Primeru 162, ćelije tretirane sa Jedinjenjem T i različitim hemoterapeutskim jedinjenjima su zaštićene od DNK oštećenja koje je indukovano hemoterapijom.

SL.12B je grafik relativne aktivnosti kaspaze 3/7 vs. varijabilnu koncentraciju Jedinjenja T (nM) kod HS68 ćelija tretiranih sa Jedinjenjem T (100 nM, 300 nM, ili 1000 nM) i hemoterapijom (etopozid, doksorubicin, karboplatin, paklitaksel, ili kamptotecin). Cdk4/6-zavisne HS68 ćelije su tretirane sa naznačenim dozama Jedinjenja T i hemoterapijom. Aktivnost kaspase 3/7 je merena da se procenila apoptoza indukovana hemoterapijom. Kao što je opisano u Primeru 162, ćelije tretirane sa Jedinjenjem T i različita hemoterapeutska jedinjenja su zaštićena od aktivacije kaspaze 3/7 indukovane hemoterapijom.

SL.13 je serija konturnih grafika koji pokazuju proliferaciju (kao što je mereno ugradnjim EdU posle 12 h) vs. sadržaj ćelijske DNK (mereno sa DAPI bojenjem). Primeri konturnih grafika pokazuju proliferaciju u WBM (ukupnoj kostnoj srži; vrh) i HSPCs (hematopoetskim stem i progenitorskim ćelijama; LSK; dno), kako je mereno EdU ugradnjom posle 12 h bez tretmana, samo sa EdU tretmanom, ili EdU plus tretmanom Jedinjenjem T. Kao što je opisano u Primeru 163, Jedinjenje T smanjuje proliferaciju ukupne kostne srži i hematopoestskih stem i/ili progenitorskih ćelija.

SL. 14A je grafik procenta EdU-pozitivnih ćelija u ukupnoj kostnoj srži (WBM) i različitih hematopoetskih stem i progenitorskih ćelija (Lin-, LSK, HSC, MPP, ili CD28+LSK ćelijske linije) tretirane sa Jedinjenjem T (otvoreni stupci) ili netretiranim (zatvoreni stupci). Kao što je opisano u Primeru 163, tretman sa Jedinjenjem T inhibira proliferaciju WBM i svih ispitanih HSPC linija. *P <0.05, **P <0.01.

SL.14B je grafik procenta EdU-pozitivnih ćelija u ukupnoj kostnoj srži (WBM) i različitih progenitora ograničenih linijom (MP, GMP, MEP, CMP, ili CLP ćelijske linije) tretirane sa Jedinjenjem T (otvoreni stupci) ili netretiranim (zatvoreni stupci). Kao što je opisano u Primeru 163, tretman sa Jedinjenjem T inhibira proliferaciju WBM i svih ispitanih progenitora ograničenih linijom. *P <0.05, **P <0.01. SL.15A je grafik procenta EdU-pozitivnih ćelija populaciji T ćeliji (Total, CD4+, CD8+, DP, DN, DN1, DN2, DN3, ili DN4) tretiranih sa Jedinjenjem T (otvoreni stupci) ili netretiranim (zatvoreni stupci). Kao što je opisano u Primeru 164, tretman sa Jedinjenjem T inhibira proliferaciju CD4+, CD8+, DP, DN, DN1, DN2, DN3, ili DN4 populacije T ćelija. *P <0.05, **P <0.01.

SL.15B je grafik procenta EdU-pozitivnih ćelija u populaciji B ćelija (B220+, B220+ sIgM+, Pre-pro-B sIgM-, Pro-B, Pre-B) tretiranih sa Jedinjenjem T (otvoreni stupci) ili netretiranim (zatvoreni stupci). Kao što je opisano u Primeru 164, tretman sa Jedinjenjem T inhibira proliferaciju različitih populacija B ćelija (B220+, B220+ sIgM+, Pre-pro- B sIgM-, Pro-B, i Pre-B). *P <0.05, **P <0.01.

1

SL.15C je grafik procenta EdU- pozitivnih ćelija u populaciji mijeloidnih ćelija (Mac1+Gr1+, Ter119+, ili CD41+) tretiranih sa Jedinjenjem T (otvoreni stupci) ili netretiranim (zatvoreni stupci). Kao što je opisano u Primeru 164, tretman sa Jedinjenjem T inhibira proliferaciju Mac1+Gr1+, Ter119+, ili CD41+ mijeloidnih ćelijskih populacija. *P <0.05, **P <0.01.

SL.16 pokazuje farmakodinamičku procenu Jedinjenja GG u kostnoj srži. Da bi se procenio efekat privremene CDK4/6 inhibicije sa Jedinjenjem GG na citotoksičnost koja je indukovana karboplatinom u kostnoj srži, FVB/n miševi (n=3 po grupi) su tretirani sa kontrolom, 90 mg/kg karboplatinom sa0 intraperitonealnom injekcijom, ili 150 mg/kg Jedinjenja GG oralnom gavažom plus 90 mg/kg karboplatinom intraperitonealnom injekcijom. 24 h posle tretmana kostna srž je sakupljena i procenat progenitora kostne srži koji kruže je izmeren ugradnjom EdU kao što je ranije objašnjeno.

SL.17A je grafik broja ukupnih ćelija krvi vs. vremena (dani) nakon ordiniranja 5-fluorouracila (5FU) (trouglovi), 5FU plus Jedinjenja T (kvadrati), ili netretirane kontrole (krugovi). FVB miševi divljeg tipa su tretirani sa Jedinjenjem T (150 mg/kg) ili kontrolom nosačem oralno gavažom trideset minuta pre ordiniranja 5-flurouracila (5FU) 150 mg/kg intraperitonelanom injekcijom. Ukupni brojevi ćelija u krvi su mereni svaka dva dana sa početkom od šestog dana. Kao što je opisano u primeru 166, oporavak ukupnih ćelija krvi je bio brži od hemoterapije (5FU) kada su prethodno tretirane sa Jedinjenjem T. SL. 17B je grafik broja ćelija neutrofila vs. vremena (dani) nakon ordiniranja 5-fluoruracila (5FU) (trouglovi), 5FU plus Jedinjenje T (kvadrati), ili netretirana kontrola (krugovi). Eksperimenti su izvedeni kao što je opisano na SL.17A. Kao što je opisano u Primeru 166, neutrofili se brže oporavljaju od hemoterapije (5FU) kada se prethodno tretiraju sa Jedinjenjem T. SL. 17C je grafik broja ćelija limfocita vs. vreme (dani) nakon ordiniranja 5-fluorouracila (5FU) (trouglovi), 5FU plus Jedinjenje T (kvadrati), ili netretirana kontrola (krugovi). Ex Eksperimenti su izvedeni kao što je opisano na SL. 17A. Kao što je opisano u Primeru 166, limfociti se brže oporavljaju od hemoterapije (5FU) kada se prethodno tretiraju sa Jedinjenjem T. SL.17D je grafik broja ćelija pločica vs. vreme (dani) nakon ordiniranja 5-fluorouracila (5FU) (trouglovi), 5FU plus Jedinjenja T (kvadrati), ili netretirane kontrole (krugovi). Eksperimenti su izvedeni kao što je opisano na SL.17A. Kao što je opisano u Primeru 166, pločice se oporavljaju brže od hemoterapije (5FU) kada se prethodno tretiraju sa Jedinjenjem T. SL.17E je grafik broja crvenih krvnih ćelija vs. vremena (dani) posle ordiniranja 5-fluoruracila (5FU) (trouglovi), 5FU plus Jedinjenja T (kvadrati), ili netretirane kontrole (krugovi). Eksperimenti su izvedeni kao što je opisano na SL.17A. Kao što je opisano u Primeru 166, crvene krvne ćelije se oporavljaju brže od hemoterapije (5FU) kada se prethodno tretiraju sa Jedinjenjem T.

SL. 17F je grafik hematokrita (%) vs. vremena (dani) nakon ordiniranja 5-fluoruracila (5FU) (trouglovi), 5FU plus Jedinjenje T (kvadrati), ili netretirana kontrola (krugovi). Eksperimenti su izvedeni kao što je opisano na SL 17A. Kao što je opisano u Primeru 166, procenat hematokrita se oporavlja brže od hemoterapije sa (5FU) kada je prethodno tretiran sa Jedinjenjem T.

SL 18A je grafik broja ukupnih ćelija iz krvi 14 dana posle ordiniranja 5-fluoruracila (5FU), 5FU plus Jedinjenja T, ili netretirane kontrole. FVB miševi divljeg tipa su tretirani sa Jedinjenjem T (150 mg/kg) ili kontrolom nosačem oralnom gavažom trideset minuta pre ordiniranja 5-flurouracila (5FU) 150 mg/kg intraperitonealnom injekcijom. Ukupni brojevi ćelija krvi su mereni u danu 14. Boksovi predstavljaju 5%-95% distribuciju, vertikalne linije sa graničnicima predstavljaju minimalne i maksimalne vrednosti, i stupac u sredini predstavlja medijanu. Studentov t test je urađen da se izračunaju dvo-strane P vrednoti. Kao što je opisano u Primeru 166, ukupne ćelije krvi se brže oporavljaju od hemoterapije (5FU) kada se prethodno tretiraju sa Jedinjenjem T.

SL 18B je grafik broja neutrofila iz krvi 14 dana pole ordiniranja 5-fluoruracila (5FU), 5FU plus Jedinjenja T, ili netretirane kontrole. Eksperimenti su izvedeni kao što je opisano na Slici 18A. Kao što je opisano u Primeru 166, ćelije neutrofila se oporavljaju brže od hemoterapije (5FU) kada se prethodno tretiraju sa Jedinjenjem T.

SL 18C je grafik broja crvenih limfocita 14 dana posle ordiniranja 5-fluoruracila (5FU), 5FU plus Jedinjenja T, ili netretirane kontrole. Eksperimenti su izvedeni kao što je opisano na Slici 18A. Kao što je opisano u Primeru 166, ćelije limfocita se oporavljaju brže od hemoterapije (5FU) kada se prethodno tretiraju sa Jedinjenjem T.

SL 18D je grafik broja crvenih krvnih ćelija 14 dana posle ordiniranja 5-fluoruracila (5FU), 5FU plus Jedinjenja T, ili netretirane kontrole. Eksperimenti su izvedeni kao što je opisano na Slici 18A. Kao što je opisano u Primeru 166, crvene krvne ćelije se oporavljaju brže od hemoterapije (5FU) kada se prethodno tretiraju sa Jedinjenjem T.

SL 18E je grafik broja pločica 14 dana posle ordiniranja 5-fluoruracila (5FU), 5FU plus Jedinjenja T, ili netretirane kontrole. Eksperimenti su izvedeni kao što je opisano na Slici 18A. Kao što je opisano u Primeru 166, ćelije pločice se oporavljaju brže od hemoterapije (5FU) kada su prethodno tretirane sa Jedinjenjem T.

SL.19A je grafik ukupnih krvnih ćelija (1000 ćelija/µl) kod netretiranih miševa (kružići), 5-fluoruracil (5FU) plus Jedinjenje T tretiranih miševa (kvadrati), ili 5-FU tretiranih miševa (trouglovi) u Ciklusu 3, Danu 10 (Danu 52). FVB miševi divljeg tipa su tretirani sa Jedinjenjem T (150 mg/kg) ili kontrolom nosačen oralnom gavažom trideset minuta pre ordiniranja 5- flurouracila (5FU) 150 mg/kg intraperitonealnom injekciom. Miševi su primili 3 ciklusa Jedinjenja T ili kontrole nosača 5FU u Danu 1 tokom 21-dnevnog ciklusa. Kompletni brojevi ćelija krvi su izmereni u Danu 10 posle druge doe (52 dana posle prve doze (Ciklus 3 Dan 10)). Kao što je opisano u Primeru 167, bele krvne ćelije pokazuju unapređeni oporavak od hemoterapije (5FU) kada su tretirane sa nekoliko ciklusa Jedinjenja T.

SL.19B je grafik neutrofila (1000 ćelija/µl) kod netretiranih miševa (kružići), 5-fluoruracil (5FU) plus Jedinjenje T tretiranih miševa (kvadrati), ili 5-FU tretiranih miševa (trouglovi) u Ciklusu 3, Danu 10 (Danu 52). Eksperimenti su izvedeni kao što je opisano u SL.19A. Kao što je opisano u Primeru 167, neutrofili pokazuju unapređeni oporavak od hemoterapije (5FU) kada su tretirani sa nekoliko ciklusa Jedinjenja T.

SL.19C je grafik limfocita (1000 ćelija/µl) kod netretiranih miševa (kružići), 5-fluoruracil (5FU) plus Jedinjenje T tretiranih miševa (kvadrati), ili 5-FU tretiranih miševa (trouglovi) u Ciklusu 3, Danu 10 (Danu 52). Eksperimenti su izvedeni kao što je opisano u SL.19A. Kao što je opisano u Primeru 167, limfociti pokazuju unapređeni oporavak od hemoterapije (5FU) kada su tretirani sa nekoliko ciklusa Jedinjenja T.

SL.19D je grafik crvenih krvnih ćelija (1000 ćelija/µl) kod netretiranih miševa (kružići), 5-fluoruracil (5FU) plus Jedinjenje T tretiranih miševa (kvadrati), ili 5-FU tretiranih miševa (trouglovi) u Ciklusu 3, Danu 10 (Danu 52). Eksperimenti su izvedeni kao što je opisano u SL.19A. Kao što je opisano u Primeru 167, crvene krvne ćelije pokazuju unapređeni oporavak od hemoterapije (5FU) kada su tretirane sa nekoliko ciklusa Jedinjenja T.

SL. 19E je grafik pločica (1000 ćelija/µl) kod netretiranih miševa (kružići), 5-fluoruracil (5FU) plus Jedinjenje T tretiranih miševa (kvadrati), ili 5-FU tretiranih miševa (trouglovi) u Ciklusu 3, Danu 10 (Danu 52). Eksperimenti su izvedeni kao što je opisano u SL.19A. Kao što je opisano u Primeru 167, nivoi pločica su povećani u oporavku od hemoterapije (5FU) kada su tretirani sa nekoliko ciklusa Jedinjenja T.

SL. 20 je grafik procenta ćelija u G2-M fazi (X), S fazi (trouglovi), G0-G1 fazi (kvadrati), ili <2N (dijamanti) u odnosu na varijabilnu koncentraciju (nM) Jedinjenja T u humanim ćelijama proksimalnih tubula bubrega. Ćelije su tretirane sa naznačenim koncentracijama Jedinjenja T 24 h. Nakon tretmana sa Jedinjenjem T, ćelije su sakupljene i analizirane za distribuciju ćelijskog ciklusa. Kao što je opisano u Primeru 168, humane ćelije proksimalnih tubula bubrega pokazuju jasan G1 zastoj koji prati odgovarajuće opadanje broja ćelija u S-fazi.

SL. 21 je grafik procenta ćelija u G2-M fazi (X), S fazi (trouglovi), G0-G1 fazi (kvadrati), ili <2N (dijamanti) u odnosu na varijabilnu koncentraciju (nM) Jedinjenja T u humanim ćelijama proksimalnih tubula bubrega tretiranih sa DMSO, etopozidom, ili cisplatinom. Ćelije su tratirane sa naznačenim koncentracijama Jedinjenja T 24 h kombinovano sa DMSO, etopozidom, ili cisplatinom. Nakon tretmana sa Jedinjenjem T, ćelije su sakupljene i analizirane za distribuciju ćelijskog ciklusa. Kao što je opisano u Primeru 169, tretman humanih ćelija proksimalnih tubula bubrega sa

1

Jedinjenjem T štiti ove ćelije od oštećenja indukovanog hemoterapijom sa etopozidom i cisplatinom.

SL.22 je grafik relativne γ-H2AX aktivnosti u odnosu na varijabilnu koncentraciju Jedinjenja T (nM) u ćelijama proksimalnih tubula bubrega tretiranih sa Jedinjenjem T i hemoterapijom (cisplatin). Ćelije tretirane sa naznačenim dozama Jedinjenja T (10 nM, 30 nM, 100 nM, 300 nM, ili 1000 nM) i hemoterapijom (25 µM cisplatin). Obrazovanje γ H2AX centara je mereno da bi se procenilo DNK oštećenje indukovano hemoterapijom. Kao što je opisano u Primeru 170, ćelije tretirane sa Jedinjenjem T su zaštićene od DNK oštećenja indukovanog hemoterapijom (cisplatin).

SL. 23 je grafik aktivacije kaspaze 3/7 (kako je mereno relativnim svetlosnim jedinicama) u epitelnim ćelijama tubula bubrega tretiranim sa naznačenim koncentracijama Jedinjenja T i ili DMSO ili cisplatinom (25 µM, 50 µM, ili 100 µM). Normalne epitelne ćelije proksimalnih tubula bubrega su dobijene od American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Ćelije su gajene u inkubatoru na 37°C u vlažnoj atmosferi koja sadrži 5% CO2u Renal Epithelial Cell Basal Media (ATCC) dopunjenom sa Renal Epithelial Cell Growth Kit (ATCC) na 37°C u vlažnoj atmosferi inkubatora. Ćelije su tretirane sa DMSO ili 30 nM, 100 nM, 300 nM ili 1 µM Jedinjenja T u ili odsustvu ili prisustvu 25, 50 µM, ili 100 µM cisplatina. Aktivacija kaspaze 3/7 je merena 24 h kasnije upotrebom Caspase-Glo 3/7 Assay System (Promega, Madison, WI) u skladu sa instrukcijama proizvođača. Kao što je opisano u Primeru 170, Jedinjenje T pokazuje dozo zavisno smanjenje u aktivaciji kaspaze 3/7 u ovim ćelijama.

SL-e.24-26 ilustruju nekoliko primera izvođenja R<2>jedinjenja iz prikaza.

SLS. 27A-27C, 28A-D, 29A-29C, 30A-30B, i 31A-31F ilustruju primere izvođenja jezgra strukture jedinjenja iz prikaza.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

[0046] Unapređeni primeri, postupci, i kompozicije su obezbeđeni da bi se minimizovao efekat toksičnosti hemoterapeutskog sredstva na zdravim ćelijama čija replikacija zavisi od CDK4/6, kao što su hematopoetske stem ćelije i/ili hematopoetske progenitorske ćelije (zajedno naznačeni sa HSPCs), i/ili epitelne ćelije bubrega, kod subjekata, obično ljudi, koji će biti, ili jesu ili su bili izloženi hemoterapeutskom sredstvu (obično sredstvu koje oštećuje DNK).

Definicije

[0047] Osim ukoliko nije drugačije naznačeno, sledeći termini koji su korišćeni u ovoj prijavi, uključujući specifikaciju i zahteve, imaju definicije prikazane u tekstu ispod. Kao što je korišćeno u specifikaciji i priloženim zahtevima, oblici koji se nalaze u množini uključuju reference množine osim ukoliko kontekst jasno ne ukazuje drugačije. Definicija standardnih hemijskih termina može da se nađe u referntnim radovima, uključujući Carey and Sundberg (2007) Advanced Organic Chemistry 5th Ed. Vols. A and B, Springer Science+Business Media LLC, New York. Praksa predmetnog pronalaska će koristiti, osim ukoliko nije drugačije naznačeno, konvencionalne postupke sintetičke organske hemije, masene spektroskopije, preparativnih i analitičkih postupaka hromatografije, hemije proteina, biohemije, postupaka rekombinovane DNK i farmakologije. Konvencionalni postupci organske hemije uključuju one koji su uključeni u March’s Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 6th Edition, M.B. Smith and J. March, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, NJ, 2007.

[0048] Termin "alkil," ili zasebno ili sa drugim termima kao što su "haloalkil" i "alkilamino," obuhvata linearne ili razgranate radikale sa jednim do oko dvanaest ugljenikovih atoma. "Niži alkil" radikali imaju jedan do oko šest ugljenikovih atoma. Primeri takvih radikala uključuju metil, etil, n-propil, izopropil, n-butil, izobutil, sek-butil, terc-butil, pentil, izoamil, heksil i slično. Termin

1

"alkilen" obuhvata premošćavanje divalentnih linearnih i razgranatih alkil radikala. Primeri uključuju metilen, etilen, propilen, izopropilen i slično.

[0049] Termin "alkenil" obuhvata linearne ili razgranate radikale koji imaju bar jednu dvostruku ugljenik-ugljenik vezu od dva do oko dvanaest ugljenikovih atoma. "Niži alkenil" radikali imaju dva do oko šest ugljenikovih atoma. Primeri alkenil radikala uključuju etenil, propenil, alil, propenil, butenil i 4-metilbutenil. Termini "alkenil" i "niži alkenil," obuhvataju radikale koji imaju "cis" i "trans" orijentacije, ili alternativno, "E" i "Z" orijentacije.

[0050] Termin "alkinil" označava linearne ili razgranate radikale koji imaju bar jednu trostruku ugljenik-ugljenik vezu i koji imaju dva do dvanaest ugljenikovih atoma. "Niži alkinil" radikali imaju dva do šest ugljenikovih atoma. Primeri takvih radikala uključuju propargil, butinil, i slično.

[0051] Alkil, alkenil, i alkinil radikali mogu opciono da budu supstituisani sa jednom ili više funkcionalnih grupa kao što su halo, hidroksi, nitro, amino, cijano, haloalkil, aril, heteroaril, heterociklo i slično.

[0052] Termin "alkilamino" obuhvata "N-alkilamino" i "N,N-dialkilamino" gde su amino grupe nezavisno supstituisane sa jednim alkil radikalom i sa dva alkil radikala, redom. "Niži alkilamino" radikaliimaju jedan ili dva alkil radikala od jednog do šest ugljenikovih atoma vezanih sa ugljenikovim atomom. Pogodni alkilamino radikali mogu da budu mono ili dialkilamino kao što su N-metilamino, N-etilamino, N.N-dimetilamino, N,N-dietilamino i slično.

[0053] Termin "halo" označava halogene kao što su atomi fluora, hlora, broma ili joda.

[0054] Termin "haloalkil" označava radikale pri čemu jedan ili više ugljenikovih atoma u alkilu je supstituisan sa jednim ili više halo kao što je definisano gore u tekstu. Primeri haloalkilnih radikala uključuju monohaloalkil, dihaloalkil i polihaloalkilne radikale uključujući perhaloalkil. Monohaloalkilni radikal, za jedan primer, može da ima jodo, bromo, hloro ili fluoro atom u radikalu. Dihalo i polihaloalkilni radikali mogu da imaju dva ili više od istih halo atoma ili kombinaciju različitih halo radikala. "Niži haloalkil" obuhvata radikale koji imaju 1-6 ugljenikovih atoma. Primeri haloalkilnih radikala uključuju fluorometil, difluorometil, trifluorometil, hlorometil, dihlorometil, trihlorometil, pentafluoroetil, heptafluoropropil, difluorohlorometil, dihlorofluorometil, difluoroetil, difluoropropil, dihloroetil i dihloropropil. "Perfluoroalkil" označava alkil radikal koji ima sve vodonikove atome zamenjene sa fluoro atomima. Primeri uključuju trifluorometil i pentafluoroetil.

[0055] Termin "aril", zasebno ili u kombinaciji, označava karbociklični aromatični sistem koji sadrži jedan ili dva prstena gde takvi prstenovi mogu zajedno da budu vezani na spojeni način. Termin "aril" obuhvata aromatične radikale kao što su fenil, naftil, indenil, tetrahidronaftil, i indanil. Poželjnije aril je fenil. Pomenuta "aril" grupa može da ima 1 ili više supstituenata kao što su niži alkil, hidroksil, halo, haloalkil, nitro, cijano, alkoksi, niži alkilamino, i slično. Aril grupa može opciono da bude supstituisana sa jednom ili više funkcionalnih grupa kao što su halo, hidroksi, nitro, amino, cijano, haloalkil, aril, heteroaril, heterociklo i slično.

[0056] Termin "heterociklil" (ili "heterociklo") obuhvata zasićene, i parcijalno zasićene radikale koji sadrže heteroatom u prstenu, gde heteroatomi mogu da budu izabrani između azota, sumpora i kiseonika. Heterociklčni prstenovi obuhvata ju monociklične 6-8 člane prstenove, kao i 5-16 članove biciklične sisteme prstena (koji mogu da uključe premošćene spojene i spiro-spojene biciklične sisteme prstena). Ne uključuje prstenove koji sadrže -O-O-.-O-S- ili -S-S- porcije.

1

Pomenuta "heterociklil" grupa može da ima 1 do 3 supstituenata kao što su hidroksil, Bok, halo, haloalkil, cijano, niži alkil, niži aralkil, okso, niži alkoksi, amino, niži alkilamino, i slično.

[0057] Primeri zasićenih heterociklo grupa uključuju zasićene 3- do 6-člane heteromonociklične grupe koje sadrže 1 do 4 atoma azota [npr. pirolidinil, imidazolidinil, piperidinil, pirolinil, piperazinil]; zasićenu 3 do 6-članu heteromonocikličnu grupu koja sadrži 1 do 2 kiseonikova atoma i 1 do 3 atoma azota [npr. morfolinil]; zasićenu 3 do 6-članu heteromonocikličnu grupu koja sadrži 1 do 2 atoma sumpora i 1 do 3 atoma azota [npr., tiazolidinil]. Primeri parcijalno zasićenih heterociklilnih radikala uključuju dihidrotienil, dihidropiranil, dihidrofuril, dihidrotiazolil, i slično.

[0058] Posebni primeri parcijalno zasićenih i zasićenih heterociklo grupa uključuju pirolidinil, imidazolidinil, piperidinil, pirolinil, pirazolidinil, piperazinil, morfolinil, tetrahidropiranil, tiazolidinil, dihidrotienil, 2,3-dihidrobenzo[1,4]dioksanil, indolinil, izoindolinil, dihidrobenzotienil, dihidrobenzofuril, izohromanil, hromanil, 1,2-dihidrohinolil, 1,2,3,4-tetrahidro-izohinolil, 1,2,3,4-tetrahidrohinolil, 2,3,4,4a,9,9a-heksahidro-1H-3-aza-fluorenil,5,6,7-trihidro-1,2,4-triazolo[3,4-a]izohinolil, 3,4-dihidro-2H-benzo[1,4]oksazinil, benzo[1,4]dioksanil, 2,3-dihidro-1H-1λ’-benzo[d]izotiazol-6-il, dihidropiranil, dihidrofuril i dihidrotiazolil, i slično.

[0059] Heterociklo grupe takođe uključuju radikale gde su heterociklični radikali spojeni/kondenzovani sa aril radikalima: nezasićena kondenzovana heterociklična grupa koja sadrži 1 do 5 atoma azota, na primer, indolil, izoindolil, indolizinil, benzimidazolil, hinolil, izohinolil, indazolil, benzotriazolil, tetrazolopiridazinil [npr., tetrazolo [1,5-b]piridazinil]; nezasićena kondenzovana heterociklična grupa koja sadrži 1 do 2 kiseonikova atoma i 1 do 3 atoma azota [npr. benzoksazolil, benzoksadiazolil]; nezasićenu kondenzovanu heterocikličnu grupu koja sadrži 1 do 2 atoma sumpora i 1 do 3 atoma azota [npr., benzotiazolil, benzotiadiazolil]; i zasićenu, parcijalno nezasićenu i nezasićenu kondenzovanu heterocikličnu grupu koja sadrži 1 do 2 atoma kiseonika ili sumpora [npr. benzofuril, benzotienil, 2,3-dihidrobenzo[1,4]dioksinil i dihidrobenzofuril].

[0060] Termin "heteroaril" označava system arilnih prstenova koji sadrže jedan ili više heteroatoma izabranih iz grupe O, N i S, pri čemu su atom(i) azota i sumpora u prstenu opciono oksidovani, i atom(i) azota su opciono kvaternizovani. Primeri uključuju nezasićenu 5 do 6 članu heteromonociklilnu grupu koja sadrži 1 do 4 atoma azota, na primer, pirolil, imidazolil, pirazolil, 2-piridil, 3-piridil, 4-piridil, pirimidil, pirazinil, piridazinil, triazolil [npr., 4H-1,2,4-triazolil, IH-1 ,2,3-triazolil, 2H-1,2,3-triazolil]; nezasićenu 5- do 6-članu heteromonocikličnu grupu koja sadrži atom kiselonika, na primer, piranil, 2-furil, 3-furil, itd.; nezasićenu 5 do 6-članu heteromonocikličnu grupu koja sadrži atom sumpora, na primer, 2-tienil, 3-tienil, itd.; nezasićenu 5- do 6-članu heteromonocikličnu grupu koja sadrži 1 do 2 atoma kiseonika i 1 do 3 atoma azota, na primer, oksazolil, izoksazolil, oksadiazolil [npr., 1,2,4-oksadiazolil, 1,3,4-oksadiazolil, 1,2,5-oksadiazolil]; nezasićenu 5 do 6-članu heteromonocikličnu grupu koja sadrži 1 do 2 atoma sumpora i 1 do 3 atoma azota, na primer, tiazolil, tiadiazolil [npr., 1,2,4-tiadiazolil, 1,3,4-tiadiazolil, 1,2,5-tiadiazolil].

[0061] Termin "heteroarilalkil" označava alkil radikale supstituisane sa heteroarilnom grupom. Primeri uključuju piridilmetil i tieniletil.

[0062] Termin "sulfonil", bilo da se koristi zasebno ili povezano sa drugim terminima kao što su alkilsulfonol, redom označava divalentne radikale -SO2-.

[0063] Termini "karboksi" ili "karboksil", bilo da se koriste zasebno ili povezano sa drugim terminima kao što su "karboksialkil", označava -C(O)-OH.

1

[0064] Termin "karbonil", bilo da se koristi zasebno ili povezano sa drugim terminima, kao što su "aminokarbonil", označava -C(O)-.

[0065] Termin "aminokarbonil" označava amidnu grupu Formule -C(O)-NH2.

[0066] Termini "heterocikloalkil" obuhvataju heterociklične-substituisane alkil radikale. Primeri uključuju piperidilmetil i morfoliniletil.

[0067] Termin "arilalkil" obuhvata aril-substituisane alkil radikale. Primeri uključuju benzil, difenilmetil i feniletil. Aril u pomenutom aralkilu može dodatno da bude supstituisan sa halo, alkil, alkoksi, halkoalkil i haloalkoksi.

[0068] Termin "cikloalkil" uključuje zasićene karbociklične grupe od 3 do 10 ugljenika. Niže cikloalkilne grupe uključuju C3-C6prstenova. Primeri uključuju ciklopentil, ciklopropil, i cikloheksil. Cikloalkilne grupe mogu opciono da budu supstituisane sa jednim ili više funkcionalnih grupa kao što su halo, hidroksi, nitro, amino, cijano, haloalkil, aril, heteroaril, heterociklo i slično.

[0069] Termin "cikloalkilalkil" obuhvata cikloalkil-supstituisane alkil radikale. "NIži cikloalkilalkil" radikali su cikloalkil radikali koji su vezani sa alkil radikalima koji imaju jedan do šest ugljenikovih atoma. Primeri uključuju cikloheksilmetil. Cikloalkil u pomenutim radikalima može dodatno da bude supstituisan sa halo, alkil, alkoksi i hidroksi.

[0070] Termin "cikloalkenil" uključuje karbociklične grupe koje imaju jednu ili više ugljenikugljenik dvostrukih veza uključujući "cikloalkildienil" jedinjenja. Primeri uključuju ciklopentenil, ciklopentadienil, cikloheksenil i cikloheptadienil

[0071] Termin "koji obuhvata" je namenjen da bude sa otvorenim krajem, uključujući naznačenu komponentu ali ne isključuje druge elemente.

[0072] Termin "okso" kao što se ovde koristi razmatra atom kiseonika koji je vezan sa dvostrukom vezom.

[0073] Termin "nitro" kao što se ovde koristi razmatra -NO2.

[0074] Termin "cijano" kao što se ovde koristi razmatra -CN.

[0075] Kao što se ovde koristi, termin "prolek" označava jedinjenje koje može da se ordinira domaćinu in vivo je konvertovano u roditeljski lek. Kao što se ovde koristi, termin "roditeljski lek" označava bilo koje od trenutno opisanih hemijskih jedinjenja koja su korisna za lečenje bilo koji od ovde opisanih poremećaja, ili za kontrolu ili unapređenje osnovnog uzroka ili simptoma koji su povezani sa bilo kojim fiziološkim ili patološkim poremećajem koji je ovde opisan kod domaćina, obično čoveka. Prolekovi mogu da se koriste da se postigne bilo koji željeni efekat, uključujući da poboljša roditeljski lek ili da unapredi farmaceutska ili farmakokinetička svojstva roditeljskog. Strategije proleka postoje koje obezbeđuju izbore u modulaciji uslova za in vivo dobijanje roditeljskog leka, od kojih su svi ovde uključeni. Neograničavajuči primeri strategija proleka uključuju kovalentna vezivanja grupa koje se mogu ukloniti, ili porcije grupa koje se mogu ukloniti, na primer, ali bez ograničenja na acilaciju, fosfororilaciju, fosfonilaciju, derivate fosforamidata, amidaciju, redukciju, oksidaciju, esterifikaciju, alkilaciju, druge karboksi derivate, sulfoksi ili sulfon derivate, karbonilaciju ili anhidrid, između ostalih.

1

[0076] Kroz specifikaciju i zahteve, data hemijska formula ili ime će obuhvatiti sve optičke i stereoizomere, kao i racemske smeše gde takvi izomeri i smeše postoje, osim ukoliko nije drugačije naznačeno.

[0077] U nekim izvođenjima, zdrava ćelija čija replikacija zavisi od CDK4/6 je hematopoetska stem progenitorska ćelija. Hematopoetska stem i progenitorske ćelije uključuju, ali nisu ograničeni na, dugotrajne hematopoetske stem ćelije (LT-HSCs), kratkotrajne hematopoetske stem ćelije (ST-HSCs), multipotentne progenitore (MPPs), zajedničke mijeloidne progenitore (CMPs), zajedničke limfoidne progenitore (CLPs), progenitore granulocita-monocita (GMPs), i megakariocitneeritroidne progenitore (MEPs). U nekim izvođenjima, zdrava ćelija čija replikacija zavisi od CDK4/6 može da bude ćelija u tkivu koje nije hematopoetsko, kao što je, ali bez ograničenja, jetra, bubreg, pankreas, mozak, pluća, nadbubrežne žlezde, crevo, želudac, stomak, koža, slušni sistem, kosti, bešika, ovarijumi, uterus, testisi, bešika, tireoidea, srce, pankreasna ostrvca, krvni sudovi, i slično. U nekim izvođenjima, zdrava ćelija čija replikacija zavisi od CDK4/6 je ćelija bubrega, i posebno epitelna ćelija bubrega, na primer, epitelne ćelije proksimalnih tubula bubrega. U nekim izvođenjima, zdrava ćelija čija replikacija zavisi od CDK4/6 je hematopoetska stem progenitorska ćelija. U nekim izvođenjima, zdrava ćelija čija replikacija zavisi od CDK4/6 može da bude ćelija u nehematopoetskom tkivu, kao što je, ali bez ograničenja na, jetru, bubreg, pankreas, mozak, pluća, nadbubrežne žlezde, crevo, želudac, stomak, kožu, slušni sistem, kosti, bešika, ovarijumi, uterus, testisi, bešika, tiroidea, srce, pankreasna ostrvca, krvni sudovi, i slično.

[0078] Termin "selektivni CDK4/6 inhibitor" korišćen u kontekstu ovde opisanih jedinjenja uključujući jedinjenja koja inhibiraju CDK4 aktivnost, CDK6 aktivnost, ili oba CDK4 i CDK6 aktivnost na IC50molarnoj koncentraciji na bar oko 500, ili 1000, ili 1500, ili 1800, 2000, 5000 ili 10,000 puta manje od IC50molarne koncentracije koja je neophodna za inhibiranje istog stepena CDK2 aktivnosti u standardnom testu fosforilacije.

[0079] Pod "indukuje G1-zastoj" je označeno da inhibitorsko jedinjenje indukuje mirno stanje u značajnom delu ćelijske populacije u G1 fazi ćelijskog ciklusa.

[0080] Pod "hematološkom definicijencijom" je označen smanjen broj hematoloških ćelijskih linija ili nedovoljnu proizvodnju krvnih ćelija (tj., mijelodisplazija) i/ili limfocita (tj., limfopenija, smanjenje u broju limfocita u krvi, kao što su B- i T-ćelije). Hematološka deficijencija može da se uoči, na primer, kao mijelosupresija u obliku anemije, smanjenje u broju pločica (tj., thrombocitopenija), smanjenje u broju belih krvnih ćelija (tj., leukopenija), ili smanjenje u broju granulocita (npr., neutropenija).

[0081] Pod "sinhronim vraćanjem u ćelijski ciklus" je označeno da zdrave ćelije čija replikacija zavisi od CDK4/6, na primer HSPCs, u G1-zastoju zbog efekta CDK4/6 inhibitora jedinjenja ponovo ulaze u ćelijski ciklus unutar relativno istog kolektivnog vremenskog okvira ili u relativno istoj brzini nakon rastvaranja efekta jedinjenja. Uporedo, pod "asinhronim vraćanjem u ćelijski ciklus" je označeno da zdrave ćelije, na primer HSPCs, u G1 zastoju zbog efekta CDK4/6 inhibitora jedinjenja sa relativno različitim kolektivnim vremenskim okvirima ili na relativno različitim brzinama nakon rastvaranja efekta jedinjenja kao što je PD0332991.

[0082] Pod "off-ciklusom" ili "pauze sa lekom" je označen vremenski period tokom koga se subjektu ne ordinira ili nije izložen hemoterapeutiku. Na primer, u režimu tretmana gde se subjektu ordinira hemoterapeutik 21 ravnih dana i hemoterapeutik se ne ordinira 7 dana, i režim je ponovljen nekoliko puta, 7 dnevni period ne ordiniranja se smatra "offciklusom" ili "pauza sa lekom." Off-target“ i pauza sa lekom mogu takođe da se odnose

2

na prekid u režimu lečenja kada se subjektu ne ordinira hemoterapeutik određeno vreme usled štetnog neželjenog dejstva, na primer, mijelosupresije.

[0083] Subjekat koji se leči je obično humani subjekat, iako treba razumeti da ovde opisani postupci su efikasni u odnosu na druge životinje, kao što su sisari i vrste kičmenjaka. Određenije, termin subjekat može da uključi životinje koje su korišćene u testovima kao što su one koje su korišćene u kliničkom ispitivanju uključujući ali bez ograničenja na miševe, pacove, majmune, pse, svinje i zečeve; kao i domestifikovane svinje (svinje i tovarne svinje), preživare konje, živinu, mačke, bovines, goveda, pse, i slično.

[0084] Pod "suštinska porcija" ili "značajna porcija" je označeno bar 80%. U alternativnim izvođenjima, porcija može da bude bar 85%, 90% ili 95% ili veća.

[0085] U nekim izvođenjima, termin kancer koji je nezavisan od "CDK4/6 replikacije" se odnosi na kancer koji ne zahteva u značajnoj meri CDK4/6 za replikaciju. Kanceri takvog tipa su često, ali ne uvek, karakterisani sa (npr., koji ima ćelije koje ispoljavaju) povećani nivo CDK2 aktivnosti ili preko smanjene ekspresije supresorskog proteina retinoblastoma tumora ili retinoblastoma familije član protein(a), kao što je, ali nije ograničeno na p107 i p130. Povećani nivo CDK2 aktivnosti ili smanjena ili deficijentna ekspresija supresorskog proteina retinoblastoma tumora ili retinoblastoma familija člana protein(a) može da bude povećana ili smanjena, na primer, u poređenju sa normalnim ćelijama. U nekim izvođenjima, povećan nivo aktivnosti CDK2 može da bude povezan sa (npr., može da nastane ili da se uoči zajedno sa) umnožavanjem ili prekomernom ekspresijom MYC protoonkogena. U nekim izvođenjima, povećan nivo CDK2 aktivnosti može da bude povezan sa prekomernom ekspresijom Ciklina E1, Ciklina E2, ili Ciklina A.

[0086] Kao što se ovde koristi termin "hemoterapija" ili "hemoterapeutsko sredstvo" se odnosi na tretman sa citostatikom ili citotoksičnim sredstvom (tj., jedinjenjem) da bi se smanjio ili eliminisano rast ili proliferacija nepoželjnih ćelija, na primer ćelija kancera. Prema tome, kao što se ovde koristi, "hemoterapija" ili "hemoterapeutsko sredstvo" se odnosi na citotoksično ili citostatičko sredstvo koje je korišćeno za lečenje proliferativnog poremećaja, na primer kancera. Citotoksični efekat sredstva može da bude, ali nije potrebno da bude, rezultat interkaliranja ili vezivanja jedne ili više nukleinske kiseline, alkilacije DNK ili RNK, inhibicije sinteze RNK ili DNK, inhibicije druge aktivnosti povezane sa nukleinskom kiselinom (npr., proteinska sinteza), ili bilo koji drugi citotoksični efekat.

[0087] Prema tome, "citotoksično sredstvo" može da bude bilo koje ili bilo koja kombinacija jedinjenja takođe opisanih kao "antineoplastična" sredstva ili "hemoterapeutska sredstva." Takva jedinjenja uključuju, ali nisu ogrančena na, jedinjenja koja oštećuju DNK i druge hemikalije koje mogu da ubiju ćelije. "DNK oštećujuća hemoterpautska sredstva" uključuju, ali nisu ograničena na, alkilirajuća sredstva, DNK interkalatore, inhibitore proteinske sinteze, inhibitore sinteze DNK ili RNK, DNK bazne analoge, inhibitore topoizomeraze, i inhibitore telomeraze ili jedinjenja koja se vezuju za telomernu DNK. Na primer, alkilirajuća sredstva uključuju alkil sulfonate, kao što su busulfan, improsulfan, i piposulfan; aziridine, kao što je benzodizepa, karbohion, meturedepa, i uredepa; etilenimine i metilmelamine, kao što je altretamin, trietilenemelamin, trietilenfosforamid, trietilentiofosforamid, i trimetilolmelamin; azotne iperite kao što su hlorambucil, hlornafazin, ciklofosfamid, estramustin, ifosfamid, mehloretamin, mehloretamin oksid hidrohlorid, melfalan, novembihin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, i uracil iperit; i nitrozo uree, kao što su karmustin, hlorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin, i ranimustin.

[0088] Antibiotici koriščeni u lečenju kancera uključuju daktinomicin, daunorubicin, doksorubicin, idarubicin, bleomicin sulfat, mitomicin, plicamicin, i streptozocin. Hemoterapeutski antimetaboliti uključuju merkaptopurin, tioguanin, kladribin, fludarabin fosfat, fluorouracil (5-FU), floksuridin, citarabin, pentostatin, metotreksat, i azatioprin, aciklovir, adenin β-1-D-arabinozid, ametopterin, aminopterin, 2-aminopurin, afidikolin, 8-aza-guanin, azaserin, 6-azauracil, 2’-azido-2’-deoksinukleozidi, 5-bromodeoksicitidin, citozin β-1-D-arabinozid, diazooksinorleucin, dideoksinukleozidi, 5-fluorodeoksicitidin, 5-fluorodeoksiuridin, i hidroksiurea.

[0089] Inhibitori hemoterapeutske proteinske sinteze uključuju abrin, aurintrikarboksilnu kiselinu, hloramfenikol, kolicin E3, cikloheksimid, difterija toksin, edein A, emetin, eritromicin, etionin, fluorid, 5-fluorotriptofan, fuzidinska kiselina, guanilil metilen difosfonat i guanilil imidodifosfat, kanamicin, kazugamicin, kiromicin, i O-metil treonin. Dodatni inhibitori proteinske sinteze uključuju modecin, neomicin, norvalin, paktamicin, paromomicin, puromicin, ricin, šiga toksin, showdomicin, sparsomicin, spektinomicin, streptomicin, tetraciklin, tiostrepton, i trimetoprim. Inhibitori sinteze DNK, uključuju alkilirajuća sredstva kao što je dimetil sulfat, mitomicin C, azotne i sumporne iperiti; interkalirajuća sredstva, kao što su akridinske boje, aktinomicini, adriamicin, antraceni, benzopiren, etidijum bromid, propidijum dijodid-koji je umetnut između; i druga sredstva, kao što su distamicin i netropsin. Inhibitori topoizomeraze, kao što je koumermicin, nalidiksinska kiselina, novobiocin, i oksolinska kiselina; inhibitori ćelijske deobe, uključujući kolcemid, kolhicin, vinblastin, i vinkristin; i inhibitori sinteze RNK uključujući aktinomicin D, α-amanitin i druge amatoksine gljiva, kordicepin (3’-deoksiadenozin), dihlororibofuranozil benzimidazol, rifampicin, streptovaricin, i streptolidigin mogu takođe da se koriste kao jedinjenja koja oštećuju DNK.

[0090] Trenutna hemoterapeutska sredstva čiji toksični efekti mogu da budu ublaženi sa trenutno prikazanim selektivnim CDK4/6 inhibitorima uključuju, ali nisu ograničeni na, adrimicin, 5-fluorouracil (5FU), 6-merkaptopurin, gemcitabin, melfalan, hlorambucil, mitomicin, irinotekan, mitoksantron, etopozid, kamptotecin, aktinomicin-D, mitomicin, cisplatin, vodonik peroksid, karboplatin, prokarbazin, mehloretamin, ciklofosfamid, ifosfamid, melfalan, hlorambucil, busulfan, nitrozureu, daktinomicin, daunorubicin, doksorubicin, bleomicin, plikomicin, tamoksifen, taksol, transplatinu, vinblastin, vinblastin, karmustin, citarabin, mehloretamin, hlorambucil, streptozocin, lomustin, temozolomid, tiotepa, altretamin, oksaliplatin, kampotecin, i metotreksat, i slično, i sredstva koja imaju sličan način delovanja. U jednom izvođenju, DNK oštećujuće hemoterapeutsko sredstvo je izabrano iz grupe koja se sastoji iz cisplatina, karboplatina, kampotecina, doksorubicina, i etopozida.

[0091] U određenim alternativnim izvođenjima, ovde opisani CDK4/6 inhibitori su korišćeni za anti-kancerogeni ili anti-proliferativni efekat u kombinaciji sa hemoterapeutikom za lečenje CDK4/6 nezavisne replikacije, kao što je Rb-negativni, kancer ili proliferativni poremećaj. Ovde opisani CDK4/6 inhibitori mogu da obezbede aditivni ili sinergistički efekat hemoterapeutiku, pri čemu dolazi do većeg anti-kancerogenog efekta nego što se uočava kod upotrebe samog hemoterapeutika. U jednom izvođenju, ovde opisani CDK4/6 inhibitori mogu da se kombinuju sa jednim ili više gore opisanim hemoterapeutskim jedinjenjima. U jednom izvođenju, ovde opisani CDK4/6 inhibitor može da se kombinuje sa hemoterapeutikom izabranim između, ali bez ograničenja na, ali bez ograničenja na, tamoksifen, midazolam, letrozol, bortezomib, anastrozol, goserelin, mTOR inhibitor, inhibitore PI3 kinaze, dualne inhibitore mTOR-PI3K, inhibitore MEK, RAS inhibitore, ALK inhibitore, HSP inhibitore (na primer, HSP70 i HSP 90 inhibitore, ili njihova kombinacija), BCL-2 inhibitore, apopototike uključujući jedinjenja, AKT inhibitore, uključujući ali bez ograničenja na, MK-2206, GSK690693, Perifosin, (KRX-0401), GDC-0068, Triciribin, AZD5363, Honokiol, PF-04691502, i Miltefosin, PD-1 inhibitore uključujuči ali bez ograničenja na, Nivolumab, CT-011, MK-3475, BMS936558, i AMP-514 ili FLT-3 inhibitore, uključujući ali bez ograničenja na, P406, Dovitinib, Quizartinib (AC220), Amuvatinib (MP-470), Tandutinib (MLN518), ENMD-2076, i KW-2449, ili njihove kombinacije. Primeri mTOR inhibitora uključuju ali nisu ograničeni na rapamicin i njegove analoge, everolimus (Afinitor), temsirolimus, ridaforolimus, sirolimus, i deforolimus. Primeri inhibitora P13 kinaze uključuju ali nisu ograničeni na Wortmannin, demetoksiviridin, perifosin, idelalisib, PX-866, IPI-145 (Infinity), BAY 80-6946, BEZ235, RP6503, TGR 1202 (RP5264), MLN1117 (INK1117), Pictilisib, Buparlisib, SAR245408 (XL147), SAR245409 (XL765), Palomid 529, ZSTK474, PWT33597, RP6530, CUDC-907, i AEZS-136.. Primeri MEK inhibitora uključuju ali bez ograničenja Tametinib, Selumetinib, MEK162, GDC-0973 (XL518), i PD0325901. Primeri RAS inhibitora uključuju ali nisu ogrančeni na Reolysin i siG12D LODER. Primeri ALK inhibitora uključuju ali nisu ograničeni na Crizotinib, AP26113, i LDK378. HSP inhibitori uključuju ali nisu ograničeni na Geldanamycin ili 17-N-Alilamino-17-demetoksigeldanamicin (17AAG), i Radicikol.

[0092] U jednom izvođenju, ovde opisan CDK4/6 inhibitor može da bude kombinovan sa hemoterapeutikom koji je izabran između, ali nije ograničen na, Imatinib mezilat (Gleevac®), Dasatinib (Sprycel®), Nilotinib (Tasigna®), Bosutinib (Bosulif®), Trastuzumab (Herceptin®), Pertuzumab (PerjetaTM), Lapatinib (Tykerb®), Gefitinib (Iressa®), Erlotinib (Tarceva®), Cetuximab (Erbitux®), Panitumumab (Vectibix®), Vandetanib (Caprelsa®), Vemurafenib (Zelboraf®), Vorinostat (Zolin- za®), Romidepsin (Istodax®), Beksaroten (Tagretin®), Alitretinoin (Panretin®), Tretinoin (Vesanoid®), Karfilizomib (KyprolisTM), Pralatreksat (Folotyn®), Bevacizumab (Avastin®), Zivaflibercept (Zaltrap®), Sorafenib (Nexavar®), Sunitinib (Sutent®), Pazopanib (Votrient®), Regorafenib (Stivarga®), i Kabozantinib (CometriqTM).

[0093] Pod "hematološkom toksičnosti dugog trajanja" označena je hematološka toksičnost koja pogađa subjekt za period koji traje više od jedne ili više nedelja, meseci, ili godina koje prate ordiniranje hemoterapeutskog sredstva. Dugotrajna hematološka toksičnost može da nastane u poremećajima kostne srži da može da uzrokuje inefektivnu proizvodnju krvnih ćelija (tj., mijelodiplazija) i/ili limfocita (tj., limfopenija, smanjenje u broju limfocita u krvotoku, kao što su B- i T-ćelije). Hematološka toksičnost može da se uoči, na primer, kao što je anemija, smanjenja u broju pločica (tj., trombocitopenija) ili smanjenje u broju belih krvnih ćelija (tj., neutropenija). U nekim slučajevima, mijelodisplazija može da dovede do razvoja leukemije. Dugotrajna toksičnost koja je povezana sa hemoterapeutskim sredstvima može takođe da ošteti druge samoobnavljajuće ćelije kod subjekta, pored hematoloških ćelja. Prema tome, dugotrajna toksičnost može takođe da dovede do starenja i slabosti.

Aktivna jedinjenja

[0094] Predmetni pronalazak je usmeren na jedinjenje formule:

2

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, za upotrebu u postupku smanjenja efekta hemoterapije na zdravim ćelijama kod subjekta koji je tretiran za kancer koji je nezavisan od ciklin-zavisne kinaze 4/6 (CDK4/6) replikacije ili abnormalne ćelijske proliferacije, gde su pomenute zdrave ćelije hematopoetske stem ćelije, hematopoetske progenitorske ćelije, ili epitelne ćelije bubrega, postupak obuhvata ordiniranje subjektu efikasne količine jedinjenja.

[0095] U određenim izvođenjima prikaza, jedinjenje je izabrano između

ili

pri čemu R je C(H)X, NX, C(H)Y, ili C(X)2,

gde X je prava, razgranata ili ciklična C1do C5alkil grupa, uključujući metil, etil, propil, ciklopropil, izopropil, butil, sek-butil, terc-butil, izobutil, ciklobutil, pentil, izopentil, neopentil, terc-pentil, sek-pentil, i ciklopentil; i

Y je NR1R2pri čemu su R1i R2nezavisno X, ili pri čemu R1i R2su alkil grupe koje zajedno obrazuju most koji uključuje jedan ili dva heteroatoma (N, O, ili S);

i gde dve X grupe mogu zajedno da obrazuju alkil most ili most koji uključuje jedan ili više hetroatoma (N,S, ili O) da se obrazuje spiro jedinjenje.

[0096] IUPAC ime za Formulu T je 2’-((5-(4-metilpiperazin-1-il)piridin-2-il)amino)-7’,8’-dihidro-6’H-spiro[cikloheksan-1,9’-pirazino[1’,2’:1,5]pirolo[2,3-d]pirimidin]-6’-on; za Formulu Q je 2’-((5-(piperazin-1-il)piridin-2-il)amino)-7’,8’-dihidro-6’H-spiro[cikloheksan-1,9’-pirazino[1’,2’:1,5]pirolo[2,3-d]pirimidin]-6’-on; za Formulu GG je 2’-((5-(4-izopropilpiperazin-1-il)piridin-2-il)amino)-7’,8’-dihidro-6’H-spiro[cikloheksan-1,9’-pirazino[1’,2’:1,5]pirolo[2,3-d]pirimidin]-6’-on; i za Formulu U je 2’-((5-(4-morfolinopiperidin-1-il)piridin-2-il)amino)-7’,8’-dihidro-6’H- spiro[cikloheksan-1,9’-pirazino[1’,2’:1,5]pirolo[2,3-d]pirimidin]-6’-on.

2

Izotopska supstitucija

[0097] Predmetni pronalazak uključuje jedinjenja i upotrebu jedinjenja sa željenim izotopskim supstitucijama atoma, u količinama iznad prirodne količine izotopa, tj., obogaćenim. Izotopi su atomi koji imaju isti atomski broj ali različite masene brojeve, tj., isti broj protona ali različit broj neutrona. Kao opšti primer i bez ograničenja, izotopi vodonika, na primer, deuterijum (<2>H) i tricijum (<3>H) mogu da se koritste bilo gde u opisanim strukturama. Alternativno ili dodatno, mogu da se koriste izotopi ugljenika, npr.,<13>C i<14>C. Poželjna izotopska supstitucija je deuterijum za vodonik na jednom ili više položaja na molekulu da bi se unapredilo svojstvo leka. Deuterijum može da se veže na položaju prekidanja veze tokom metabolizma (α-deuterijum kinetički izotopski efekat) ili pored ili blizu mesta prekida veze (β-deuterijum kinetički izotopski efekat).

[0098] Supstitucija sa izotopima kao što je deuterijum može da omogući određene terapeutske benefite koji nastaju od veće metaboličke stabilnosti, kao što je, na primer, povećan in vivo poluživot ili smanjeni dozni zahtevi. Supstitucija deutrijumom za vodonik na mestu metaboličkog prekida može da smanji brzinu ili eliminiše metabolizam na toj vezi. Na bilo kom položaju u jedinjenju gde atom vodonika može da bude prisutan, vodonikov atom može da bude bilo koji izotop vodonika, uključujući protijum (<1>H), deuterijum (<2>H) i tricijum (<3>H). Prema tome, referenca na jedinjenje obuhvata sve potencijalne izotopske oblike osim ako kontekst jasno je ukazuje drugačije.

[0099] Termin "obeležen izotopom" analog se odnosi na analog koji je "deuterisani analog", "<13>C-obeleženi analog," ili "deuterisani/<13>C-obeleženi analog." Termin "deuterisani analog" označava ovde opisano jedinjenje, pri čemu je H-izotop, tj., vodonik/protijum (<1>H), supstituisan sa H-izotopom, tj., deuterijumom (<2>H). Supstitucija deuterijumom može da bude parcijalna ili kompletna. Parcijalna supstitucija deuterijumom označava da je bar jedan vodonik supstituisan sa bar jednim deuterijumom. U određenim izvođenjima, izotop je 90, 95 ili 99% ili više oboogaćen u izotopu na bilo kom položaju od interesa. U određenim izvođenjima to je deuterijum koji je 90, 95 ili 99% obogaćen na željenom položaju.

Ćelije čija replikacija zavisi od CDK i inhibitori ciklin-zavisnih kinaza

[0100] Tkivno specifične stem ćelije i podsetovi drugih rezidentnih proliferišućih ćelija koje su sposobne za samoobnavljanje, što znači da su sposobne same sebe da zamene tokom celog životnog veka odraslih sisara preko regulisane replikacije. Dodatno, stem ćelije imaju asimetričnu deobu pri čemu se proizvodi "potomstvo" ili "progenitorske" ćelije koje sa druge strane proizvode različite komponente u datom organu. Na primer, u hematopoetskom sistemu, hematopoetske stem ćelije prouzrokuju progenitorske ćelije koje zauzvrat prouzorokuju sve diferencirane komponente krvi (npr., bele krvne ćelije, crvene krvne ćelije, i pločice). Videti SL.1.

[0101] Određene ćelije koje proliferišu, kao što su HSPCs, zahtevaju enzimsku aktivnost proliferativnih kinaza Ciklin-zavisne kinaze 4 (CDK4) i/ili Ciklin-zavisne kinaze 6 (CDK6) za ćelijsku replikaciju. Suprotno tome, većina proliferišućih ćelija kod adultnih sisara (npr., više diferencirane ćelije koje obrazuju krv u kostnoj srži) ne zahtevaju aktivnost CDK4 i/ili CDK6 (tj., CDK4/6). Ove diferencirane ćelije mogu da proliferišu u odsustvu aktivnosti CDK4/6 upotrebom drugih proliferativnih kinaza, kao što je ciklin-zavisna kinaza 2 (CDK2) ili ciklin zavisna kinaza 1 (CDK1).

[0102] U određenim izvođenjima, CDK4/6 inhibitor je CDK4/6 inhibitor Formule T ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu zaštita obezbeđena od jedinjenja je kratkotrajna i privremena u prirodi, pri čemu omogućava da značajna porcija ćelija istovremeno ponovo uđe u

2

ćelijski cilklus brzo nakon prestanka efekta hemoterapeutskog sredstva, na primer za manje od oko 24, 30, 36, ili 40 h. Ćelije koje su stanju mirovanja u G1 fazi ćelijskog ciklusa otpornije na efekat oštećenja hemoterapeutskih sredstava u odnosu na proliferišuće ćelije. CDK4/6 inhibitorna jedinjenja za upotrebu u opisanim postupcima su visoko selektivni, potentni CDK4/6 inhibitori, sa minimalnom inhibitornom aktivnosti CDK2. U jednom izvođenju, CDK4/6 jedinjenje za upotrebu u ovde opisanim postupcima ima CDK4/CycD1 IC50inhibitornu vrednost koncentracije koja je >1500 puta, >1800 puta, >2000 puta, >2200 puta, >2500 puta, >2700 puta, >3000 puta, >3200 puta ili više niža od njegove odgovarajuće IC50vrednosti koncentracije za CDK2/CycE inhibiciju. U jednom izvođenju, CDK4/6 inhibitor za upotrebu u ovde opisanim postupcima ima IC50vrednost koncentracije inhibicije CDK4/CycD1 koja je oko <1.50 nM, <1.25 nM, <1.0 nM, <0.90 nM, <0.85 nM, <0.80 nM, <0.75 nM, <0.70 nM, <0.65 nM, <0.60 nM, <0.55 nM, ili manja. U jednom izvođenju, CDK4/6 inhibitor za upotrebu u ovde opisanim postupcima ima IC50vrednost koncentracije za CDK2/CycE inhibiciju koja je >1.0 µM, >1.25 µM, >1.50 µM, >1.75 µM, >2.0 µM, >2.25 µM, >2.50 µM, >2.75 µM, >3.0 µM, >3.25 µM, >3.5 µM ili veća. U jednom izvođenju, CDK4/6 inhibitor za upotrebu u ovde opisanim postupcima ima IC50vrednost koncentracije za CDK2/CycA IC50koja je >0.80 µM, >0.85 µM, >0.90 µM, >0.95 µM, >.1.0 µM, >1.25 µM, >1.50 µM, >1.75 µM, >2.0 µM, >2.25 µM, >2.50 µM, >2.75 µM, >3.0 µM ili veća.

[0103] U jednom izvođenju, ovde opisani CDK4/6 inhibitori su korišćeni u CDK4/6-zavisnu replikaciju zdravih ćelija cikličnim strategijama gde je subjekat izložen regularnim, ponovljenim hemoterapeutskim tretmanima, gde su zdrave ćelije zaustavljene u G1 kada je hemoterapeutsko sredstvo izloženo i omogućeno je ponovni ulazak u ćelijski ciklus pre sledećeg hemoterapeutskog tretmana subjekta. Takvo kruženje omogućava ćelije čija replikacija zavisi od CDK4/6 da se regenerišu oštećene linije ćelijska krvi između regularnih, ponovljenih tretmana, na primer onih koji su povezani sa standardnim hemoterapeutskim tretmanima za kancer, i smanjuje rizik koji je povezan sa dugotrajnom CDK4/6 inhibicijom. Ovo kruženje između stanja G1-zastoja i stanja replikacije nije izvodljivo u ograničenom vremenskom razmaku, ponovljena izlaganja hemoterapeutskom sredstvu upotrebom dužeg delovanja inhibitora CDK4/6 kao što su PD0332991, kako dugotrajni G1-zastoj efekata jedinjenja sprečavaju značajni i ponovni ulazak u ćelijski ciklus pre izlaganja sledećem hemoterapeutskom sredstvu ili odlaganja zdravih ćelija od ulaska u ćelijski ciklus i rekonstituisanja oštećenih tkiva ili ćelija nakon prestanka sa tretmanom.

[0104] Proliferativni poremećaji koji su tretirani sa hemoterapijom uključuju kancerogene i bolesti koje ne obuhvataju kancer. U običnom izvođenju, proliferativni poremećaj je poremećaj replikacije koja ne zavisi od CDK4/6. Jedinjenja su efikasna u zaštiti zdravih ćelija sa replikacijom koja zavisi od CDK4/6, na primer HSPCs, tokom hemoterapeutskog tretmana širokog opsega tipova tumora, uključujući ali bez ograničenja: grudi, prostatu, ovarijum, kožu, pluća, kolorektalni, mozga (tj., gliom) i bubrega. Poželjno, selektivni CDK4/6 inhibitor ne treba da ugroze efikasnost hemoterpapeutskog sredstva ili zastoja G1 ćelija kancera. Mnogi kanceri ne zavise od aktivnosti CDK4/6 za proliferaciju kao što mogu da koriste proliferativne kinaze promiskuitetno (npr., može da koristi CDK 1/2/4/ ili 6) ili nedostatak funkcije supresorskog proteina retinoblastoma tumora (Rb), koji je inaktiviran sa CDKs. Potencijalna osetljivost određenog tumora na CDK4/6 inhibiciju može da se izvede na osnovu tipa tumora i molekularne genetike upotrebom standardnih postupaka. Kanceri koji uobičajeno nisu povezani sa inhibicijom CDK4/6 su oni koji mogu da se karakterišu sa jednom ili više grupa uključujući, ali bez ograničenja na, povećanu aktivnost CDK1 ili CDK2, gubitak, deficijenciju, ili odsustvo supresorskog proteina retinoblastoma tumora (Rb), visokih nivoa ekspresije MYC, povećanog ciklina E (npr., E1 ili E2) i povećanog ciklina A, ili ekspresije Rbinaktivirajućeg proteina (kao što je HPV-kodirani E7). Takvi kanceri mogu da uključe, ali nisu ograničeni na, kancer malih ćelija pluća, retinoblastom, HPV pozitivne malignitete kao što je cervikalni kancer i određeni kanceri glave i vrata, MYC umnoženi tumori kao što je Burkitov limfom, i trostruko negativni kancer grudi; određene klase sarkoma, određene klase karcinoma

2

ne-malih ćelija pluća, određene klase melanoma, određene klase kancera pankreasa, određene klase leukemije, određene klase limfoma, određene klase kancera mozga, određene klase kancera debelog creva, određene klase kancera prostate, određene klase kancera ovarijuma, određene klase kancera uterusa, određene klase tiroidee i drugih kancera endokrinih tkiva, određene klase kancera pljuvačnih žezda, odeđerne klase carcinoma timusa, određene klase kancera bubrega, određene klase kancera bešike, i određene klase kancera testisa.

[0105] Gubitak ili odsustvo supresorkog proteina retinoblastoma (Rb) tumora (Rb-null) može da se odredi upotrebom bilo kog od standardnih testova koji su poznati stručnjaku iz oblasti tehnike, uključujući ali bez ograničenja Western Blot, ELISA (enzimski povezani imunosorbentni test), IHC (imunohistohemija), i FACS (sortiranje ćelija aktivirano fluorescencijom). Odabir testa će zavisiti od tkiva, ćelijske linije ili surogata uzorka tkiva koje je korišćeno npr., za na primer Western Blot i ELISA mogu da se koriste sa bilo kojim ili svim tipovima tkiva, ćelijskim linijama ili surogatima tkiva, pri čemu IHC postupak bi više odgovarao kada tkivo korišćeno u ovde prikazanim postupcima je biopsija tumora. FACs analiza bi najviše odgovarala uzorcima koji su jednoćelijske suspenzije kao što su ćelijske linije i izolovane mononuklearne ćelije iz periferne krvi. Videti na primer, US 20070212736 "Functional Immunohistochemical Cell Cycle Analysis as a Prognostic Indicator for Cancer".

[0106] Alternativno, molekularna genetička ispitivanja mogu da se koriste za određivanje genskog statusa retinoblastoma. Molekularno genetičko ispitivanje za retinoblastoma uključuje sledeće kao što je opisano u Lohmann and Gallie "Retinoblastoma. Gene Reviews" (2010) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=gene&part=retinoblastoma ili Parsam et al. "A comprehensive, sensitive and economical approach for the detection of mutations in the RB1 gene in retinoblastoma" Journal of Genetics, 88(4), 517-527 (2009).

[0107] Povećana aktivnost CDK1 ili CDK2, visoki nivoi ekspresije MYC, povećani ciiklin E i povećan ciklin A može da bude određen pomoću bilo kog od standardnih testova poznatih stručnjaku iz oblasti tehnike, uključujući ali bez ograničenja na Western Blot, ELISA (enzimski povezani imunosorbentni test), IHC (imunohistohemija), i FACS (sortiranje ćelija aktivirano fluorescencijom). Izbor testa će zavisiti od tkiva, ćelijske linije, ili surogata tkivnog uzorka koje je korišćeno npr, za na primer Western Blot i ELISA može da se koristi sa bilo kojim ili svim tipovima tkiva, ćelijskih linija, ili surogata tkiva, pri čemu postupak IHC bi više odgovarao gde je tkivo korišćeno u prikazanim postupcima bilo iz biopsije tumora. FACs analiza bi najviše mogla da se primeni na uzorcima koji su jednoćelijske suspenzije kao što su ćelijske linije i izolovane mononuklearne ćelije iz periferne krvi.

[0108] U nekim izvođenjima, kancer je izabran između kancera malih ćelija pluća, retinoblastoma, i trostruko negativnog (ER/PR/Her2 negativnog) ili "bazalno-sličnog" kancera grudi, koji skoro uvek inaktivira supresorski protein retinoblastoma tumora (Rb), i prema tome ne zahteva aktivnost CDK4/6 za proliferaciju. Trostruko negativni (bazalno-slični) kancer grudi je skoro uvek genetički ili funkcionalno Rb-nulti. Takođe, određeni kanceri indukovani virusom (npr. cervikalni kancer i podsetovi kancera glave i vrata) izlučuju virusni protein (E7) koji inaktivira Rb čime ove tumore pravi funkcionalno Rb-nultim. Veruje se da su neki kanceri pluća uzrokovani sa HPV. U jednom posebnom izvođenju, kancer je kancer malih ćelija pluća, i pacijent je tretiran sa DNK-oštećujućim sredstvom koje je izabrano između grupe koja se sastoji iz etopozida, karboplatina, i cisplatina, ili njihove kombinacije.

[0109] Odabrani ovde opisani CDK4/6 inhibitori mogu takođe da se koriste za zaštitu zdravih ćelija čija replikacija zavisi od CDK4/6 tokom hemoterapeutskih tretmana abnormalnih tkiva u nekancerogenim proliferativnim bolestima, uključujući ali bez ograničenja na: psorijazu, lupus,

2

artritis (posebno reumatoidni artritis), hemangiomatoze kod odojčadi, multiple skleroze, mijelodegenerativne bolesti, neurofibromatoze, ganglioneuromatoze, obrazovanja keloida, Pagetove bolesti kostiju, fibrocistične bolesti grudi, Peyronie-ove i Duputren-ove fibroze, restenoze, i ciroze. Dalje, selektivni CDK4/6 inhibitori mogu da se koriste za ublažavanje efekata hemoterapeutskih sredstava u događaju slučajnog izlaganja ili predoziranja (npr., predoziranja metotreksatom).

[0110] Prema predmetnom pronalasku, aktivno jedinjenje može da se ordinira subjektu koji je na bilo kom hemoterapeutskom režimu tretmana i u bilo kojoj dozi koja je u skladu sa prepisanim tokom tretmana. Jedinjenje selektivni inhibitor CDK4/6 se ordinira pre, tokom, ili posle ordiniranja hemoterapeutskog sredstva. U jednom izvođenju, CDK4/6 inhibitori koji su ovde opisani mogu da se ordiniraju subjektu tokom vremenskog perioda u opsegu od 24 h pre hemoterapeutskog tretmana do 24 h nakon izlaganja. Ovaj vremenski period, međutim, može se produžiti na vreme ranije od 24 h pre izlaganja sredstvu (npr., na osnovu vremena koje je potrebno hemoterapeutskom sredstvu da se postignu pogodne koncentracije u plazmi i/ili poluživota jedinjenja u plazmi). Dalje, vremenski perioda može da se produži na duže 24 h nakon izlaganja hemoterapeutskog sredstva sve dok kasnije ordiniranje CDK4/6 inhibitora vodi do bar nekog zaštitnog efekta. Takav tretman nakon izlaganja može posebno da bude koristan u slučajevima slučajnog izlaganja ili predoziranja.

[0111] U nekim izvođenjima, selektivni CDK4/6 inhibitor može da se ordinira subjektu u vremenskom periodu pre ordiniranja hemoterapeutskog sredstva, tako da nivoi u plazmi selektivnog CDK4/6 inhibitora dostižu maksimum vrednosti u vremenu ordiniranja hemoterapeutskog sredstva. Ako je pogodno, selektivni CDK4/6 inhibitor može da se ordinira istovremeno sa hemoterapeutskim sredstvom, da bi se pojednostavio režim tretmana. U nekim izvođenjima, hemoprotektant i hemoterapeutik mogu da budu obezbeđeni u jednoj formulaciji.

[0112] U nekim izvođenjima, selektivni CDK4/6 inhibitor može da se ordinira subjektu tako da hemoterapeutsko sredstvo može da se ordinira ili pri većim dozama (povećan intenzitet hemoterapeutske doze) ili učestalije (povećana gustina hemoterapeutske doz). Dozna gustina hemoterapije je hemoterapeutski plan lečenja u kome se lekovi daju sa manje vremena između tretmana nego u standardnom hemoterapeutskom planu lečenja. Intenzitet hemoterapeutske doze predstavlja jediničnu dozu hemoterapije koja se ordinira po jedinici vremena. Intenzitet doze može da bude povećan ili smanjen kroz naizmenično ordiniranje doze, vremenskog interval ordiniranja, ili oba. Mijelosupresija nastavlja da predstavlja glavnu toksičnost koja ograničava dozu hemoterapije kancera, što dovodi do značajnog morbiditeta i mortaliteta zajedno sa učestalim smanjenjima u intenzitetu doze hemoterapije, koja može da obuhvati kontrolu bolesti I preživljavanje. Jedinjenja i njihova upotreba kao što je ovde opisano predstavljaju način za povećanje intenziteta doze hemoterapije i/ili intenziteta doze dok se ublažavaju nepoželjni efekti kao što su, ali bez ograničenja, mijelosupresija.

[0113] Po potrebi, višestruke doze izabranog jedinjenja CDK4/6 inhibitora mogu da se ordiniraju subjektu. Alternativno, subjektu može da se ordinira jedna doza izabranog CDK4/6 inhibitora. Na primer, CDK4/6-inhibitor može da se ordinira tako da CDK4/6-zavisna replikacija zdravih ćelija je G1 zaustavljena tokom izlaganja hemoterapeutskom sredstvu gde, usled brzog razlaganja G1-efekta zaustavljanja jedinjenja, značajan broj zdravih ćelija ponovo ulazi u ćelijski ciklus i sposobne su da se brzo repliciraju odmah nakon izlaganja hemoterapeutskom sredstvu, na primer, tokom oko 24-48 h ili manje, i nastavljaju da se repliciraju sve do ordiniranja CDK4/6-inhibitora u očekivanju sledećeg hemoterapeutskog tretmana. U jednom izvođenju, CDK4/6-inhibitor je ordiniran da se omogući kruženje zdravih ćelija čija replikacija zavisi od CDK4/6 između G1-zautavljanja i ponovnog ulaska u ćelijski ciklus da se prilagodi ponovljeni-režim tretmana sa terapeutskim doziranjem, na primer, uključujući ali bez ograničenja na režim tretmana pri čemu se hemoterapeutsko sredstvo ordinira: u

2

danu 1-3 svakih 21 dana; u danu 1-3 svakih 28 dana; u danu 1 svake 3 nedelje; u danu 1, danu 8, i danu 15 svakih 28 dana, u danu 1 i danu 8 svakih 28 dana; u danu 1 i 8 svakih 21 dana; u danu 1-5 svakih 21 dana; 1 dana nedeljno tokom 6-8 nedelja; u danu 1, 22, i 43; danima 1 i 2 nedeljno; danima 1-4 i 22-25; 1-4; 22-25, i 43-46; I režimima sličnog tipa, pri čemu ćelije čija replikacija zavisi od CDK4/6 su zaustavljene u G1 tokom izlaganja hemotrapeutskom sredstvu i značajna porcija ćelija ponovo ulazi u ćelijki ciklus između izlaganja hemoterapeutskom sredstvu.

[0114] U jednom izvođenju, ovde opisani CDK4/6 inhibitor je korišćen da se obezbedi hemozaštita zdravih ćelija subjekta čija replikacija zavisi od CDK4/6 tokom CDK4/6-replikacije nezavisnog kancera malih ćelija pluća tretmana protokola. U jednom izvođenju, CDK4/6 inhibitor je ordiniran da se obezbedi hemozaštita u terapijskom protokolu kancera malih ćelija pluća kao što je, ali nije ograničen na: cisplatin 60 mg/m2 IV u danu 1 plus etopozid 120 mg/m2 IV u danima 1-3 svakih 21d za 4 ciklusa; cisplatin 80 mg/m2 IV u danu 1 plus etopozid 100 mg/m2 IV u danima 1-3 svakih 28d za 4 ciklusa; cisplatin 60-80 mg/m2 IV u danu 1 plus etopozid 80-120 mg/m2 IV u danima 1-3 svakih 21-28d (maksimum 4 ciklusa); karboplatin AUC 5-6 IV u danu 1 plus etopozid 80-100 mg/m2 IV u danima 1-3 svakih 28d (maksimum 4 ciklusa); Cisplatin 60-80 mg/m2 IV u danu 1 plus etopozid 80-120 mg/m2 IV u danima 1-3 svakih 21-28d; karboplatin AUC 5-6 IV u danu 1 plus etopozid 80-100 mg/m2 IV u danima 1-3 svakih 28d (maksimum 6 ciklusa); cisplatin 60 mg/m2 IV u danu 1 plus irinotekan 60 mg/m2 IV u danima 1, 8, i 15 svakih 28d (maksimum 6 ciklusa); cisplatin 30 mg/m2 IV u danima 1 i 8 ili 80 mg/m2 IV u danu 1 plus irinotekan 65 mg/m2 IV u danima 1 i 8 svakih 21d (maksimum 6 ciklusa); karboplatin AUC 5 IV u danu 1 plus irinotekan 50 mg/m2 IV u danima 1, 8, i 15 svakih 28d (maksimum 6 ciklusa); karboplatin AUC 4-5 IV u danu1 plus irinotekan 150-200 mg/m2 IV u danu 1 svakih 21d (maksimum 6 ciklusa); ciklofosfamid 800-1000 mg/m2 IV u danu 1 plus doksorubicin 40-50 mg/m2 IV u danu 1 plus vinkristin 1-1.4 mg/m2 IV u danu 1 svakih 21-28d (maksimum 6 ciklusa); Etopozid 50 mg/m2 PO dnevno tokom 3ned svakih 4ned; topotekan 2.3 mg/m2 PO u danima 1-5 svakih 21d; topotekan 1.5 mg/m2 IV u danima 1-5 svakih 21d; karboplatin AUC 5 IV u danu 1 plus irinotekan 50 mg/m2 IV u danima 1, 8, i 15 svakih 28d; karboplatin AUC 4 - 5 IV u danu 1 plus irinotekan 150-200 mg/m2 IV u danu 1 svakih 21d; cisplatin 30 mg/m2 IV u danima 1, 8, i 15 plus irinotekan 60 mg/m2 IV u danima 1, 8, i 15 svakih 28d; cisplatin 60 mg/m2 IV u danu 1 plus irinotekan 60 mg/m2 IV u danima 1, 8, i 15 svakih 28d; cisplatin 30 mg/m2 IV u danima 1 i 8 ili 80 mg/m2 IV u danu 1 plus irinotekan 65 mg/m2 IV u danima 1 i 8 svakih 21d; paklitaksel 80 mg/m2 IV nedeljno tokom 6ned svakih 8ned; paklitaksel 175 mg/m2 IV u danu 1 svakih 3ned; etopozid 50 mg/m2 PO dnevno tokom 3ned svakih 4ned; topotekan 2.3 mg/m2 PO u danima 1-5 svakih 21d; topotekan 1.5 mg/m2 IV u danima 1-5 svakih 21d; karboplatin AUC 5 IV u danu 1 plus irinotekan 50 mg/m2 IV u danima 1, 8, i 15 svakih 28d; karboplatin AUC 4-5 IV u danu 1 plus irinotekan 150-200 mg/m2 IV u danu 1 svakih 21d; cisplatin 30 mg/m2 IV u danima 1, 8, i 15 plus irinotekan 60 mg/m2 IV u danima 1, 8, i 15 svakih 28d; cisplatin 60 mg/m2 IV u danu 1 plus irinotekan 60 mg/m2 IV u danima 1, 8, i 15 svakih 28d; cisplatin 30 mg/m2 IV u danima 1 i 8 ili 80 mg/m2 IV u danu 1 plus irinotekan 65 mg/m2 IV u danima 1 i 8 svakih 21d; paklitaksel 80 mg/m2 IV nedeljno okom 6ned svakih 8ned; i paklitaksel 175 mg/m2 IV u danu1 svakih 3ned.

[0115] U jednom izvođenju, ovde opisani CDK4/6 inhibitor se ordinira subjektu sa kancerom malih ćelija pluća u danima 1, 2, i 3 za protokol lečenja pri čemu DNK oštećujuće sredstvo je izabrano iz grupe koja se sastoji između karboplatina, etopozida, i cisplatina, ili njihove kombinacije, se ordinira u danima 1, 2, i 3 svakog 21 dana.

[0116] U jednom izvođenju, ovde opisani CDK4/6 inhibitor je korišćen da obezbedi hemozaštitu zdravim ćelijama subjekta čija replikacija zavisi od CDK4/6 tokom protokola tretmana kancera glave i vrata čija je replikacija nezavisna od CDK4/6. U jednom izvođenju, CDK4/6 inhibitor se ordinira da obezbedi hemozaštitu u protokolu terapije kancera glave i vrata čija replikacija zavisi od CDK4/6 kao što je, bez ograničenja: cisplatin 100 mg/m2 IV u danima 1, 22, i 43 ili 40-50 mg/m2 IV nedeljno za 6-7ned; cetuksimab 400 mg/m2 IV početna doza 1ned pre početka terapije zračenjem, zatim 250 mg/m2 nedeljno (premedikacija sa deksametazonom, difenhidraminom, i ranitidinom); cisplatin 20 mg/m2 IV u danu 2 nedeljno do 7ned plus paklitaksel 30 mg/m2 IV u danu 1 nedeljno do 7ned; cisplatin 20 mg/m2/danu IV u danima 1-4 i 22-25 plus 5-FU 1000 mg/m2/danu kontinuiranom IV infuzijom u danima 1-4 i 22-25; 5-FU 800 mg/m2 kontinuiranom IV infuzijom u danima 1-5 plus hidroksiurea 1 g PO q12h (11 doza po ciklusu); hemoterapija i zračenje koje se daje svake druge nedelje ukupno 13ned; karboplatin 70 mg/m2/danu IV u danima 1-4, 22-25, i 43-46 plus 5-FU 600 mg/m2/danu kontinuiranom IV infuzijom u danima 1-4,22-25, i 43-46; karboplatin AUC 1.5 IV u danu 1 nedeljno plus paklitaksel 45 mg/m2 IV u danu 1 nedeljno; cisplatin 100 mg/m2 IV u danima 1, 22, i 43 ili 40-50 mg/m2 IV nedeljno za 6-7ned; docetaksel 75 mg/m2 IV u danu 1 plus cisplatin 100 mg/m2 IV u danu 1 plus 5-FU 100 mg/m2/danu kontinuiranom IV infuzijom u danima 1-4 svakih 3ned za 3 ciklusa, zatim 3-8ned kasnije, karboplatin AUC 1.5 IV nedeljno ili do 7ned tokom terapije zračenjem; docetaksel 75 mg/m2 IV u danu 1 plus cisplatin 75 mg/m2 IV u danu 1 plus 5-FU 750 mg/m2/danu kontinuirana IV infuzija u danima 1-4 svakih 3ned za 4 ciklusa; cisplatin 100 mg/m2 IV u danu 1 svakih 3ned za 6 ciklusa plus 5-FU 1000 mg/m2/danu kontinuiranom IV infuzijom u danima 1-4 svakih 3ned za 6 ciklusa plus cetuksimab 400 mg/m2 IV početne doze u danu 1, zatim 250 mg/m2 IV nedeljno do progresije bolesti (premedikacija sa deksametazonom, difenhidraminom, i ranitidinom); karboplatin AUC 5 IV u danu1 svakih 3ned za 6 ciklusa plus 5-FU 1000 mg/m2/danu kotinuiranom IV infuzijom u danima 1-4 svakih 3ned za 6 ciklusa plus cetuksimab 400 mg/m2 IV početne doze u danu 1, zatim 250 mg/m2 IV nedeljno do progresije bolesti (premedikacija sa deksametazonom, difenhidraminom, i ranitidinom); cisplatin 75 mg/m2 IV u danu 1 plus docetaksel 75 mg/m2 IV u danu 1 svakih 3ned; cisplatin 75 mg/m2 IV u danu 1 plus paklitaksel 175 mg/m2 IV u danu 1 svakih 3ned; karboplatin AUC 6 IV u danu1 plus docetaksel 65 mg/m2 IV u danu1 svakih 3ned; karboplatin AUC 6 IV u danu1 plus paklitaksel 200 mg/m2 IV u danu 1 svakih 3ned; cisplatin 75-100 mg/m2 IV u danu 1 svakih 3-4ned plus cetuksimab 400 mg/m2 IV početna doza u danu 1, zatim 250 mg/m2 IV nedeljno (premedikacija sa deksametazonom, difenhidraminom, i ranitidinom); cisplatin 100 mg/m2 IV u danu 1 plus 5-FU 1000 mg/m2/danu kontinuiranom IV infuzijom u danima 1-4 svakih 3ned; metotreksat 40 mg/m2 IV nedeljno (3ned jednako 1 ciklus); paklitaksel 200 mg/m2 IV svakih 3ned; docetaksel 75 mg/m2 IV svakih 3ned; cetuksimab 400 mg/m2 IV početna doza u danu 1, zatim 250 mg/m2 IV nedeljno do progresije bolesti (premedikacija sa deksametazonom, difenhidraminom, i ranitidinom); cisplatin 100 mg/m2 IV u danu 1 svakih 3ned za 6 ciklusa plus 5-FU 1000 mg/m2/danu by kontinuiranom IV infuzijom u danima 1-4 svakih 3ned za 6 ciklusa plus cetuksimab 400 mg/m2 IV početna doza u danu 1, zatim 250 mg/m2 IV nedeljno (premedikacija sa deksametazonom, difenhidraminom, i ranitidinom); karboplatin AUC 5 IV u danu 1 svakih 3ned za 6 ciklusa plus 5-FU 1000 mg/m2/danu kontinuiranom IV infuzijom u danima 1-4 svakih 3ned za 6 ciklusa plus cetuksimab 400 mg/m2 IV početna doza u danu 1, zatim 250 mg/m2 IV nedeljno (premedikacija sa deksametazonom, difenhidraminom, i ranitidinom); cisplatin 75 mg/m2 IV u danu 1 plus docetaksel 75 mg/m2 IV u danu 1 svakih 3ned; cisplatin 75 mg/m2 IV u danu 1 plus paklitaksel 175 mg/m2 IV u danu 1 svakih 3ned; karboplatin AUC 6 IV u danu1 plus docetaksel 65 mg/m2 IV u danu1 svakih 3ned; karboplatin AUC 6 IV u danu1 plus paklitaksel 200 mg/m2 IV u danu 1 svakih 3ned; cisplatin 75-100 mg/m2 IV u danu 1 svakih 3-4ned plus cetuksimab 400 mg/m2 IV početna doza u danu 1, zatim 250 mg/m2 IV nedeljno (premedikacija sa deksametazonom, difenhidraminom, i ranitidinom); cisplatin 100 mg/m2 IV u danu 1 plus 5-FU 1000 mg/m2/danu kontinuiranom IV infuzijom u danima 1-4 svakih 3ned; metotreksat 40 mg/m2 IV nedeljno (3ned jednako 1 ciklus); paklitaksel 200 mg/m2 IV svakih 3ned; docetaksel 75 mg/m2 IV svakih 3ned; cetuksimab 400 mg/m2 IV početna doza u danu 1, zatim 250 mg/m2 IV nedeljno do progresije bolesti (premedikacija sa deksametazonom, difenhidramin, i ranitidin); cisplatin 100 mg/m2 IV u danima 1, 22, i 43 sa zračenjem, zatim cisplatin 80 mg/m2 IV u danu 1 plus 5-FU 1000 mg/m2/danu kontinuiranom IV infuzijom u danima 1-4 svakih 4ned tokom 3 ciklusa; cisplatin 75 mg/m2 IV u danu 1 plus docetaksel 75 mg/m2 IV u danu 1 svakih 3ned; cisplatin 75 mg/m2 IV u danu 1 plus paklitaksel 175 mg/m2 IV u danu 1 svake 3ned; karboplatin AUC 6 IV u danu 1 plus docetaksel 65 mg/m2 IV u danu 1 svakih 3ned; karboplatin AUC 6 IV u danu 1 plus paklitaksel 200 mg/m2 IV u danu1 svakih 3ned; cisplatin 100 mg/m2 IV u danu 1 plus 5-FU 1000 mg/m2/danu kontinuiranom IV infuzijom u danima

1

1-4 svakih 3ned; cisplatin 50-70 mg/m2 IV u danu 1 plus gemcitabin 1000 mg/m2 IV u danima 1, 8, i 15 svakih 4ned; gemcitabin 1000 mg/m2 IV u danima 1, 8, i 15 svakih 4ned ili gemcitabin 1250 mg/m2 IV u danima 1 i 8 svakih 3ned; metotreksat 40 mg/m2 IV nedeljno (3ned jednako 1 ciklus); paklitaksel 200 mg/m2 IV svakih 3ned; docetaksel 75 mg/m2 IV svakih 3ned; cisplatin 75 mg/m2 IV u danu 1 plus docetaksel 75 mg/m2 IV u danu 1 svakih 3ned; cisplatin 75 mg/m2 IV u danu 1 plus paklitaksel 175 mg/m2 IV u danu 1 svakih 3ned; karboplatin AUC 6 IV u danu1 plus docetaksel 65 mg/m2 IV u danu 1 svakih 3ned; karboplatin AUC 6 IV u danu1 plus paklitaksel 200 mg/m2 IV u danu 1 svake 3ned; cisplatin 100 mg/m2 IV u danu 1 plus 5-FU 1000 mg/m2/danu kontinuiranom IV infuzijom u danima 1-4 svakih 3ned; cisplatin 50-70 mg/m2 IV u danu 1 plus gemcitabin 1000 mg/m2 IV u danima 1, 8, i 15 svakih 4ned; gemcitabin 1000 mg/m2 IV u danima 1, 8, i 15 svakih 4ned ili gemcitabin 1250 mg/m2 IV on dana 1 i 8 svakih 3ned; metotreksat 40 mg/m2 IV nedeljno (3ned jednako 1 ciklus); paklitaksel 200 mg/m2 IV svakih 3ned; i docetaksel 75 mg/m2 IV svakih 3ned.

[0117] U jednom izvođenju, ovde opisani CDK4/6 inhibitor je korišćen da obezbedi hemozaštitu zdravim ćelijama subjekta čija replikacija zavisi od CDK4/6 tokom protokola tretmana CDK4/6-replikacije nezavisnog trostruko negativnog kancera grudi. U jednom izvođenju, CDK4/6 inhibitor je ordiniran da se obezbedi hemozaštita u CDK4/6-replikacija nezavisnom trostruko negativnom protokolu terapije kancera grudi kao što je, ali bez ograničenja: doksorubicin u gustoj dozi (adriamicin) i ciklofosfamid (citoksan) svake dve nedelje za četiri ciklusa zatim sledi paklitaksel u gustoj dozi (Taksol) svake dve nedelje za četiri ciklusa; adriamicin/paklitaksel/ciklofosfomid svake tri nedelje za ukupno četiri ciklusa; adriamicin/paklitaksel/ciklofosfomid svake dve nedelje za ukupno četiri cikusa; adriamicin/ciklofosfomid nakon čega se daje paklitaksel (Taksol) svake tri nedelje za četiri ciklusa svaki; i adriamicin/ciklofosfomid zatim sledi paklitaksel (Taksol) svake nedelje za četiri ciklusa svaki.

[0118] Trostruko negativni kancer grudi (TNBC) je definisan kao odsustvo bojenja za receptore estrogena, receptor progesterona, i HER2/neu. TNBC nije osetljiv na neke od najefikasnijih terapija koje su dostupne za tretman kancera grudi uključujući HER2-usmerenu terapiju kao što je trastuzumab i endokrine terapije kao što je tamoksifen ili inhibitori aromataze. Kombinovana citotoksična hemoterapija se ordinira u gustoj dozi ili metronomski režim ostaje standardna terapija za rani stadijum TNBC. Sredstva koja sadrže platinu su se pojavila kao lekovi od interesa za lečenje TNBC sa karboplatinom koji se dodaje paklitaksel i adriamicin plus hemoterapija ciklofosfamidom u neoadjuvansnoj postavci. Inhibitori poli (ADP-riboza) polimeraze (PARP) se pojavljuju kao obećavajući terapeutici za tretman TNBC. PARPs su familija enzima uključeni sa brojnim ćelijskim procesima, uključujući popravku DNK.

[0119] Kao ilustracija koja ne ograničava, subjekat je izložen hemoterapeutskom sredstvu bar 5 puta nedeljno, bar 4 puta nedeljno, bar 3 puta nedeljno, bar 2 puta nedeljno, bar 1 put nedeljno, bar 3 puta mesečno, bar 2 puta mesečno, ili bar 1 put mesečno, pri čemu CDK4/6-replikacija zavisnih zdravih ćelija je G1 zaustavljena tokom tretmana i omogućeno je da uđe u ciklus između izlaganja hemoterapeutskom sredstvu, na primer tokom pause sa tretmanom. U jednom izvođenju, subjekat ulazi u 5 pet puta nedeljni hemoterapeutski tretman, pri čemu CDK4/6-replikacija zavisna zdravih ćelija su G1 zaustavljeni tokom izlaganja hemoterapeutskom sredstvu I omogućeno je da ponovo uđu u ciklus tokom pauze od 2 dana, na primer, tokom vikenda.

[0120] U jednom izvođenju, upotreba ovde opisanog CDK4/6 inhibitora, zdrave ćelije subjekta čija replikacija zavisi od CDK4/6 su zaustavljene u celom vremenskom periodu u kome su izložene hemoterapeutskom sredstvu, na primer, tokom kontinuiranih više-doznih režima, ćelije su zaustavljene u vremenskom periodu koji je potreban da se završi više-dozni kurs, i zatim im je omogućeno recikliranje na kraju više-doznog kursa. U jednom izvođenju, upotrebom ovde opisanog CDK4/6 inhibitora, zdrave ćelije subjekta čija replikacija zavisi od CDK4/6 su zaustavljene tokom celog

2

hemoterapijskog režima, na primer, u dnevnom hemoterapeutskom izlaganju tokom tri nedelje, i brzo ponovo ulaze u ćelijski ciklus nakon završetka terapeutskog režima.

[0121] U jednom izvođenju, subjekat je izložen hemoterapeutskom sredstvu, i, upotrebom ovde opisanog CDK4/6 inhibitora, zdrave ćelije subjekta čija replikacija zavisi od CDK4/6 su postavljene u G1 zastoju nakon izlaganja da bi se umanjilo, na primer, oštećenje DNK. U jednom izvođenju, inhibitor CDK4/6 se ordinira bar 1⁄2 h, bar 1 h, bar 2 h, bar 3 h, bar 4 h, bar 5 h, bar 6 h, bar 7 h, bar 8 h, bar 10 h, bar 12 h, bar 14 h, bar 16 h, bar 18 h, bar 20 h ili više nakon izlaganja hemoterapeutskom sredstvu.

[0122] U nekim izvođenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje postupke za zaštitu sisara, posebno ljudi, od akutnih i hroničnih tokičnih efekata hemoterapeutskih sredstava forsiranjem replikacije zdravih ćelija koja zavisi od CDK4/6, na primer hematopetskih stem i progenitorskih ćelija (HSPCs) i/ili epitelnih ćelija bubrega, u mirujućem stanju prolaznom (npr., preko manje od oko 40, 36, 30, 24 h ili u manjem periodu) tretmana sa CDK4/6 inhibitorom Formule T. Ćelija čija replikacija zavisi od CDK4/6 se oporavljaju iz ovog perioda prolaznog mirovanja, i zatim funkcionišu normalno posle tretmana sa inhibitorom je zaustavljeno, i njegov intra-ćelijski efekat se rasipa. U periodu mirovanja, ćelije čija replikacija zavisi od CDK4/6 su zaštićene od efekata hemoterapeutskih sredstava.

[0123] U nekim izvođenjima, zdrave ćelije zavisne od replikacije CDK4/6 su zaustavljene u dužim vremenskim periodima, na primer, tokom perioda sati, dana, i/ili nedelje, kroz višestruka, vremenski razdvojena ordiniranja ovde opisanog CDK4/6 inhibitora. Zbog brzog i sinhronog ponovnog ulaska u ćelijski ciklus zdravih ćelija zavisnih od replikacije CDK4/6, na primer HSPCs, nakon rasipanja efektora intra-ćelijskih CDK4/6 inhibitora, ćelije su sposobne brže da rekonstitušu ćelijske linije nego CDK4/6 inhibitori sa dužim profilima zaustavljanja u G1, na primer PD0332991.

[0124] Smanjenje u hemotoksičnosti omogućeno od selektivnih CDK4/6 inhibitora može da omogući pojačavanje doze (npr., više terapije može da se daje u fiksnom vremenskom periodu) u medicinski povezanim hemoterapijama, koje će dovesti do bolje efikasnosti. Prema tome, trenutno prikazani postupci mogu da dovedu do hemoterapeutskih režima koji su manje toksični i efikasniji. Takođe, suprotno sa zaštitnim tretmanima sa egzogenim biološkim faktorima rasta, ovde opisani selektivni CDK4/6 inhibitori su oralno dostupni mali molekuli, koji mogu da budu formulisani za ordiniranje preko brojih različitih načina davanja. Kada je potrebno, mali molekuli mogu da budu formulisani za oralno, topikalno, intranazalno, inhhalaciju, intravenozno ili bilo koji drugi povoljni način davanja.

[0125] CDK4/6 inhibitor korišćen u ovde opisanim postupcima je jedinjenje selektivni CDK4/6 inhibitor koji selektivno inhibira bar jednu CDK4 i CDK6, ili čiji predominantni način davanja je preko inhibicije CDK4 i/ili CDK6. U jednom izvođenju, selektivni CDK4/6 inhibitori imaju IC50za CDK4 kako je mereno u CDK4/CycD1 IC50fosforilacija testa koja je bar 1500, 2000, 5000 ili čak 10,000 puta veća ili manja od IC50jedinjenja za CDK2 kao što je mereno u CDK2/CycE IC50testu fosforilacije. U jedom izvođenju, CDK4/6 inhibitori su bar oko 10 puta ili više potentniji (tj., imaju IC50uCDK4/CycD1 testu fosforilacije koji je bar 10 puta ili više niži) od PD0332991.

[0126] Upotreba odabranog CDK4/6 inhibitora kao što je ovde opisano može da indukuje selektivni G1 zastoj u CDK4/6-zavisnim ćelijama (npr., kao što je mereno u in vitro testu zasnovanom na ćelijama). U jednom izvođenju, CDK4/6 inhibitor je sposoban za povećanje CDK4/6-zavisnih ćelija u G1 fazi, dok se smanjuje procenat CDK4/6-zavisnih ćelija u G2/M fazi i S fazi. U jednom izvođenju, selektivni CDK4/6 inhibitor indukuje u suštini čisti (tj., "čisti") zastoj G1 ćelijskog ciklusa u CDK4/6-zavisnim ćelijama (npr., gde tretman sa selektivnim CDK4/6 inhibitorom indukuje zaustavljanje ćelijskog ciklusa tako da je većina ćelija zaustavljena u G1 kao što se definiše standardnim postupcima (npr. bojenjem sa propidijum jodidom (PI) ili drugima) sa populacijom ćelija u G2/M i S fazama kombinovano manje od oko 30%, oko 25%, oko 20%, oko 15%, oko 10%, oko 5%, oko 3% ili manje od ukupne ćelijske populacije. Postupci za procenu ćelijske faze populacije ćelija su poznati u oblasti tehnike (videti, na primer, u U.S. Patent Application Publication No. 2002/0224522) i uključuju citometrijsku analizu, mikroskopsku analizu, centrifugiranje na gradijentu, razdvajanje, postupci fluorescencije koji uključuju imuofluorescenciju, i njihove kombinacije. Citometrijski postupci uključuju izlaganje ćelije sredstvu za obeležavanje ili boji, kao što su boje koje se vezuju za DNK, npr., PI, i analizom ćelijskog DNK sadržaja protočnom citometrijom. Imunofluorescentni postupci uključuju detekciju specifični indikatora ćelijskog ciklusa, kao što su na primer, analozi timidina (npr., 5-bromo-2-deoksiuridin (BrdU) ili jododeoksiuridin), sa fluorescentnim antitelima.

[0127] U nekim izvođenjima, upotreba ovde opisanog selektivnog CDK4/6 inhibitora dovodi do smanjenih ili u suštini slobodnih efekata van mete, posebno povezanih sa inhibicijom kinaza koje nisu CDK4 i ili CDK6 kao što su CDK2, kao selektivni inhibitori CDK4/6 ovde opisani su slabi inhibitori (npr., >1 µM IC50) CDK2. Dalje, zbog visoke selektivnosti za CDK4/6, upotreba ovde opisanih jedinjenja ne treba da indukuje zaustavljanje ćelijskog ciklusa kod CDK4/6-nezavisnih ćelija. Pored toga, zbog kratke privremene prirode efekta G1-zastoja, ćelije zavisne od CDK4/6-replikacije brže ponovo ulaze u ćelijski ciklus, uporedo, upotreba PD0332991 obezbeđuje, što dovodi do smanjenog rizika, u jednom izvođenju, razvoja hematološke toksičnosti tokom dugotrajnih režima tretmana zbog sposobnosti HSPCs da se repliciraju između hemoterapeutskih tretmana.

[0128] U nekim izvođenjima, upotreba ovde opisanog selektivnog CDK4/6 inhibitora smanjuje rizik od nepoželjnih efekata koji nisu usmereni na metu uključujući, ali bez ograničenja na, dugotrajnu toksičnost, anti-oksidansne efekte, i estrogene efekte. Anti-oksidansni efekti mogu da se odrede standardnim postupcima koji su poznati u oblasti tehnike. Na primer, jedinjenje bez značajnih antioksidansnih efekata je jedinjenje koje značlajno ne uklanja slobodne radikale, kao što su radikali kiseonika. Anti-oksidansni efekti jedinjenja mogu da se porede sa jedinjenjem sa poznatom antioksidansnom aktivnosti, kao što je genistein. Prema tome, jedinjenje bez značajne anti-oksidansne aktivnosti može da bude ono koje ima manje od oko 2, 3, 5, 10, 30, ili 100 puta anti-oksidansnu aktivnost u odnosu na genistein. Estrogene aktivnosti mogu takođe da se odrede preko poznati testova. Na primer, ne-estrogeno jedinjenje je oko koje se ne veuje značajno i aktivira estrogenski receptor. Jedinjenje koje je u suštini slobodno od estrogenih efekata može da bude ono koje ima manje od oko 2, 3, 5, 10, 20, ili 100 puta estrogene aktivnosti u odnosu na jedinjenje koje ima aktivnost estrogena, npr., genistein.

4

Sinteza izabranih CDK4/6 inhibitora

[0129] CDK4/6 inhibitori iz predmentog pronalaska mogu da se sintetišu bilo kojim sredstvima koja su poznata stručnjacima iz oblasti tehnike, uključujući na primer, prema generalizovanim Šemama od 1 do 9 u tekstu ispod. Specifična sinteza može da se pronađe u, na primer, WO2012/061156 (5-(4-izopropilpiperazin-1-il)piridin-2-aminu i 5-(4-morfolino-l-piperidil)piridin-2-aminu redom). Formula I i Formula II mogu da se sintetišu prema Šemi 1 upotrebom odgovarajućih supstituisanih 2-aminoprimidina ili kao što je opisano u WO2012/061156.

Šema 1

Šema 2

[0130] U Šemi 2 , Ref-1 je WO 2010/020675 A1; Ref-2 je White, J. D.; et al. J. Org. Chem. 1995, 60, 3600; i Ref-3 Presser, A. i Hufner, A. Monatshefte für Chemie 2004, 135, 1015.

Šema 3

[0131] U Šemi 3, Ref-1 je WO 2010/020675 A1; Ref-4 je WO 2005/040166 A1; i Ref-5 je Schoenauer, K i Zbiral, E. Tetrahedron Letters 1983, 24, 573.

Šema 4

[0132] U Šemi 4, Ref-1 je WO 2010/020675 A1.

Šema 5

PRIMERI

Šema 8

Šema 9

[0133] U Šemi 9, Ref-1 je WO 2010/020675 A1; Ref-2 je WO 2005/040166 A1; i Ref-3 je Schoenauer, K I Zbiral, E. Tetrahedron Letters 1983, 24, 573.

4

Šema 10

[0134] U jednom izvođenju laktam intermedijar je tretiran sa BOK-anhidridom u prisustvu orgaske baze kao što je trietilamin u organskom rastvaraču kao što je dihlorometan. Bok zaštićeni laktam je tretiran sa ugljen dioksidom u prisustvu katalizatora nikla da se dobije karboksilna kiselina. Karboksilna kiselina reaguje sa tionil hloridom u prisustvu organskog rastvarača kao što je toluen. Dobijeni kiseli hlorid je tretiran sa aminom da se dobije amid kome može da se ukloni zaštita sa jakom kiselinom kao što je trifluorosirćetna kiselina da se dobije konačno ciljno jedinjenje.

[0135] Alternativno, laktam može da se dobije reagovanjem karboksilne kiseline sa zaštićenim aminom u prisustvu jake kiseline i dehidrirajućeg sredstva, koje može da bude zajedno u jednom ostatku kao što je jaki kiseli anhidrid. Jedinjenja jakih kiselih anhidrida uključuju, ali nisu ograničena na, anhidrid trifluorosirćetne kiseline, anhidrid tribromosirćetne kiseline, anhidrid trihlorosirćetne kiseline, ili mešane anhidride. Dehidrirajuće sredstvo može da bude jedinjenje zasnovano na karbodiimidu kao što je ali bez ograničenja na DCC (N,N-dicikloheksilkarbodiimid), EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid ili DIC (N,N-diizopropilkarbodiimid). Može biti potreban dodatni korak za uklanjanje N-zaštitne grupe I postupci su poznati stučnjacima iz oblasti tehnike

[0136] Alternativno, ostatak halogena koji je vezan za pirimidinki prsten može da bude supstiuisan sa bilo kojom odlazećom grupom koja se može zameniti primarnim aminom, na primer da se dobije intermedijar za konačni proizvod kao što je Br, I, F, SMe, SO2Me, SOalkil, SO2alkil. Videti, na primer, PCT /US2013/037878 to Tavares.

[0137] Drugi intermedijari amina i konačna jedinjenja amina mogu da se sintetišu od strane stručnjaka iz oblasti tehnike. Jasno je da hemija može da koristi reagense koji sadrže reaktivne funkcionalne grupe koje mogu da budu zaštićene i sa kojih zaštita može da bude uklonjena i tokom pronalaska će biti poznate stručnjacima iz oblasti tehnke. Videti, na primer, Greene, T.W. and Wuts, P.G.M., Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis, 4th edition, John Wiley and Sons.

[0138] Formule T, Q, GG i U koje su gore dobijene se karakterišu masenom spektrometrijom i NMR kao što je prikazano u tekstu ispod:

Formula T

7.25 (s, 1 H) 7.63 (br. s., 2 H) 7.94 (br. s., 1 H) 8.10 (br. s., 1 H) 8.39 (br. s., 1 H) 9.08 (br. s., 1 H) 11.59 (br. s., 1 H). LCMS ESI (M H) 447.

Formula Q

1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.82 (d, J=7.32 Hz, 2 H) 1.08 - 1.37 (m, 3 H) 1.38 -1.64 (m, 2 H) 1.71 (br. s., 1 H) 1.91 (br. s., 1 H) 2.80 (br. s., 1 H) 3.12 (s, 1 H) 3.41 (br. s., 4 H) 3.65 (br. s., 4 H) 4.09 (br. s., 1 H) 7.26 (s, 1 H) 7.52 - 7.74 (m, 2 H) 7.94 (br. s., 1 H) 8.13 (br. s., 1 H) 8.40 (br. s., 1 H) 9.09 (br. s., 1 H) 9.62 (br. s., 1 H) 11.71 (br. s., 1 H). LCMS ESI (M ) 433

Formula GG

1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.85 (br. s., 1 H) 1.17 - 1.39 (m, 7 H) 1.42 - 1.58 (m, 2 H) 1.67 - 1.84 (m,3 H) 1.88 - 2.02 (m, 1 H) 2.76 - 2.93 (m, 1 H) 3.07 - 3.22 (m, 1 H) 3.29 - 3.39 (m, 1 H) 3.41 - 3.61 (m, 4 H) 3.62 - 3.76 (m, 4 H) 3.78 - 3.88 (m, 1 H) 4.12 (br. s., 1H) 7.28 (s, 1 H) 7.60 - 7.76 (m, 2 H) 7.98 (s, 1 H) 8.13 (br. s., 1 H) 8.41 (s, 1 H) 9.10 (br. s., 1 H) 11.21 (br. s., 1 H) 11.54 (s, 1 H). LCMS ESI (M H) 475

Formula U

1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.84 (t, J=7.61 Hz, 2 H) 1.13 - 1.39 (m, 4 H) 1.46 (d, J=14.05 Hz, 2 H) 1.64- 1.99 (m, 6 H) 2.21 (br. s., 1 H) 2.66 - 2.89 (m, 2 H) 3.06 (br. s., 1 H) 3.24 - 3.36 (m, 1 H) 3.37 - 3.50 (m, 2 H) 3.56 - 3.72 (m, 2 H) 3.77 - 4.00 (m, 4 H) 4.02 - 4.19 (m, 2 H) 7.25 (s, 1 H) 7.50 - 7.75 (m, 2 H) 7.89 (d, J=2.93 Hz, 1 H) 8.14 (d, J=7.32 Hz, 1 H) 8.38 (br. s., 1 H) 9.06 (s, 1 H) 11.53 (br. s., 1 H). LCMS ESI (M+H) 517 Aktivna jedinjenja, soli i formulacije

[0139] Kao što se ovde koristi, termin "aktivno jedinjenje" se odnosi na ovde opisana jedinjenja selektivne inhibitore CDK 4/6 ili njihove farmaceutski prihvatljive soli ili izotopski analog. Aktivno jedinjenje može da se ordinira subjektu preko bilo kog pogodnog pristupa. Količina i vreme ordiniranja aktivnog jedinjenja može, naravno, da zavisi od subjekta koji se leči, doze hemoterapije kojoj se smatra da je subjekat izložen, vremenskom toku izlaganja hemoterapeutskom sredstvu, načina ordiniranja, farmakokinetičkih svojstava posebnog aktivnog jedinjenja, i od procene lekara koji propisuje lek. Prema tome, zbog varijabilnosti od subjekta do subjekta, doze koje su predstavljene u tekstu ispod su smernice i lekar može da titrira doze jedinjenja da se postigne tretman koji lekar smatra odgovarajućim za subjekta. Uzimajući u obzir stepen željenog tretmana, lekar može da izbalansira različite faktore kao što su starosna dob i težina subjekta, prisustvo već postojeće bolesti, ka oi prisutvo drugih bolesti.

Farmaceutske formulacije mogu da se dobiju za bilo koji način ordiniranja uključujući, ali bez ograničenja na, oralno, intravenozno, ili ordiniranje preko aerosoli, kao što je detaljnije razmatrano u tekstu ispod.

[0140] Terapeutski efikasna doza bilo kog ovde opisanog jedinjenja će biti određena od strane praktičara iz zdravstvene nege u zavisnosti od stanja, veličine i godina pacijenta kao i načina isporuke. U jednom neograničavajućem izvođenju, doza od oko 0.1 do oko 200 mg/kg ima terapeutsku efikasnost, sa svim težinama koje su izračunate na osnovu težine aktivnog jedinjenja, uključujući slučajeve u kojima se koristi so. U nekim izvođenjima, doza može da bude količina jedinjenja koja je potrebna da se obezbedi koncentracija aktivnog jedinjenja u serumu do između oko 1 i 5, 10, 20, 30, ili 40 μM. U nekim izvođenjima, doza od oko 10 mg/kg do oko 50 mg/kg može da se koristi za oralno davanje. Obično, doza od oko 0.5 mg/kg do 5 mg/kg može da se koristi za intramuskularnu injekciju. U nekim izvođenjima, doze mogu da budu od oko 1 μmol/kg do oko 50 μmoll/kg, ili, opciono, između oko 22 μmol/kg i oko 33 μmol/kg jedinjenja za intravenozno ili oralno davanje. Oralni dozni oblik može da uključi bilo koju odgovarajuću količinu aktivnog materijala, uključujući na primer od 5 mg do, 50, 100, 200, ili 500 mg po tableti ili drugom čvrstom doznom obliku.

[0141] U skladu sa trenutno opisanim postupcima, farmaceutski aktivna jedinjenja koja su ovde opisana mogu da se oralno primenjuju kao čvrsta supstanca ili tečna, ili mogu da se ordiniraju intramuskularno, intravenozno, ili inhalacijom kao rastvor, suspenzija, ili emulzija. U nekim izvođenjima, jedinjenja ili soli mogu takođe da se ordiniraju inhalacijom, intravenozno, ili intramuskularno u obliku lipozomalne suspenzije. Kada se ordinira inhalacijom aktivno jedinjenje ili so mogu da budu u obliku brojnih čvrstih čestica ili kapljica koje imaju bilo koju željenu veličinu čestica, i na primer, od oko 0.01, 0.1 ili 0.5 do oko 5, 10, 20 ili više mikrona, i opciono od oko 1 do oko 2 mikrona. Jedinjenja kao što su prikazana u predmetnom pronalasku su pokazala dobra farmakokinetička i farmakodinamička svojstva, na primer kada se ordiniraju oralnim ili intravenoznim načinima davanja.

[0142] U jednom izvođenju iz pronalaska, ovi unapređeni CDK4/6 inhibitori mogu da se ordiniraju u koncnetrovanom režimu sa sa sredstvom krvnog faktora rasta. Kao takvo, u jednom izvođenju, upotreba ovde opisanih jedinjenja i postupaka je kombinovana sa upotrebom hematopoetskih faktora rasta uključujući, ali bez ograničenja na, faktor stimulacije kolonije granulocita (G-CSF, na primer, u prodaji poznato pod imenom Neupogen (filgrastin), Neulasta (peg-filgrastin), ili lenograstin), faktora stimulacije kolonije granulocita-makrofaga (GM-CSF, na primer u prodaji poznato pod imenom molgramostim i sargramostim (Leukine)), M-CSF (factor stimulacije kolonije makrofaga), trombopojetin (factor rasta razvoja mekakariocita (MGDF), na primer u prodaji poznat pod imenom Romiplostim i Eltrombopag) interleukin (IL)-12, interleukin-3, interleukin-11 (faktor inhibicije adipogeneze ili oprelvekin), SCF (faktor stem ćelija, ‘steel’ faktor, kit-ligand, ili KL) i eritropojetin (EPO), i njihovi derivati (u prodaji poznati pod imenom na primer epoetin-α kao Darbopoetin, Epocept, Nanokin, Epofit, Epogin, Epreks i Prokrit; epoetin-α koji je u prodaji poznat pod imenom NeoRecormon, Recormon i Micera), epoetin-delta (prodat pod na primer Dynepo), epoetin-omega (prodat pod na primer Epomaks), epoetin zeta (prodat pod na primer Silapo i Reacrit) kao i za na primer Epocept, EPOTrust, Erypro Safe, Repoeitin, Vintor, Epofit, Erykine, Wepox, Espogen, Relipoeitin, Shanpoietin, Zyrop i EPIAO).

[0143] Farmaceutske kompozicije mogu da sadrže ovde opisano aktivno jedinjenje ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, u bilo kom pogodnom farmaceutski prihvatljivom nosaču. Ukoliko je poželjan rastvor, voda može da bude nosač od izbora za jedinjenja ili soli koje se rastvaraju u vodi. U odnosu na jedinjenja ili soli koje se rastvaraju u vodi, organski nosač, kao što je glicerol, propilen glikol, polietilen glikol, ili njihove smeše, mogu da budu odgovarajuće. U poslednjem slučaju,

4

organski nosač može da sadrži značajnu količinu vode. Rastvor u svakom slučaju može zatim da bude sterilizovan na odgovarajući način iz oblasti tehnike, i za ilustraciju ceđenjem kroz filter prečnika pora 0.22-mikrona. Posle sterilizacije, rastvor može da se raspodeli u odgovarajuće posude, kao što su bočice od depirogenizovanog stakla. Raspodela se obično izvodi aseptičkim postupkom. Zatim se na bočice mogu staviti sterilisani zatvarači i, po potrebi, sadržaj u bočicama može da bude liofilizovan.

[0144] Pored aktivnih jedinjenja ili njihovih soli, farmaceutske formulacije mogu da sadrže druga pomćna sredstva, kao što su sredstva za podešavanje pH. Posebno, korina sredstva za podešavanje pH uključuju kiseline, kao što je hlorovodonična kiselina, baza ili pufere, kao što je natrijum laktat, natrijum acetat, natrijum fosfat, natrijum citrat, natrijum borat, ili natrijum glukonat. Dalje, formulacije mogu da sadrže antimikrobna sredstva. Korisni antimikrobni konzervansi uključuju metilparaben, propilparaben, i benzil alkohol. Antimikrobni konzervans se obično koristi kada je formulacija postavljena u posudu koja je dizajnirana za višedoznu upotrebu. Ovde opisane farmaceutske formulacije mogu da budu liofilizovane upotrebom postupaka koji su dobro poznati iz oblasti tehnike.

[0145] Za oralnu primenu farmaceutska kompozicija može da se nalazi u obliku rastvora, suspenzija, tableta, pilula, kapsula, praškova, i slično. Tablete koje sadrže različite ekscipijense kao što je natrijum citrat, kalcijum karbonat i kalcijum fosfat mogu da se koriste zajedno sa različitim dezintegrantima kao što je skrob (npr., krompirov ili skrob tapioke) i određeni kompleks silikata, zajedno sa sredstvima za vezivanje kao što je polivinilpirolidon, saharoza, želatin i akacija. Dodatno, sredstva za podmazivanje kao što je magnezijum stearat, natrijum lauril sulfat, i talk su četo veoma korisni za svrhe tabletiranja. Čvrste kompozicije sličnog tipa mogu da se koriste kao sredstva za punjenje u mekim i tvrdim punjenim želatinskim kapsulama. Materiali u vezi sa tim takođe mogu da sadrže laktozu ili mlečni šećer kao I polietilenglikole visoke molekulske mase. Kada su vodene suspenzije i/ili eliksiri poželjni za orlanu primenu, jedinjenja iz prikazanog predmeta mogu da se kombinuju sa različitim zalađivačima, sredstvima za davanje ukusa, sredstvima za bojenje, sredstvima za emulgovanje i/ili sredstvima za supenziju, kao i takve rastvarače kao što je voda, etanol, propilen glikol, glicerin i njihove različite kombinacije.

[0146] U još jednom izvođenju predmeta koji je ovde opisan, obezbeđena je injektabilna, stablna, sterilna formulacija koja obuhvata aktivno jedinjenje kao što je ovde opisano, ili njegovu so, u jediničnom doznom obliku u zatvorenom kontejneru. Jedinjenje ili so obezbeđeno u obliku liofilizata, koje je sposobno da se rekonstituiše sa pogodnim farmaceutski prihvatljivim nosačem da se obrazuje tečna formulacija koja je pogoda za injekciju kod subjekta. Kada je jedinjenje ili so u suštini nerastvorljivo u vodi, dovoljna količina sredstva za emulgovanje, koja je fiziološki prihvatljiva, može da se koristi u dovoljoj količini za emulgovanje jedinjenja ili soli u vodednom nosaču. Posebno korisna sredstva za emulgovanje uključuju fosfatidil holin i lecitin.

[0147] Ovde obezbeđena dodatna izvođenja uključuju lipozomalne formulacije ovde prikazanih aktivnih jedinjenja. Tehnologija za obrazovanje lipozomalnih suspenzija je dobro poznata oblasti tehnike. Kada je jedinjenje so koja je rastvorljiva u vodi, upotrebom konvencionalne tehnologije lipozoma, isto može da da bude uključeno u lipidne nosače. U takvom slučaju, zbog rastvorljivosti aktivnog jedinjenja u vodi, aktivno jedinjenje u suštini može da bude obuhvaćeno u hidrofilnom centru ili jezgru lipozoma. Korišćeni lipidni sloj može da bude od bilo koje pogodne kompoziije I može da sadrži ili holesterol ili može da bude oslobođen holesterola. Kada je aktivno jedinjenje od interesa nerastvorljivo u vodi, ponovna upotreba konvencionalnog postupka za obrazovaje limfozoma, so može da se u suštini nalazi u lipidnom dvosloju koji obrazuje strukturu lipozoma. U svakom slučaju, lipozomi koji su proizvedeni mogu da imaju smanjenu veličinu, kroz upotrebu standardnih postupaka razbijanja ultrazvučnim talasima i homogenizacije. Lipozomalne formulacije koje sadrže ovde prikazana aktivna jedinjenja mogu da se liofilizuju da bi se proizveo liofilizat, koji može da bude rekonstiuisan sa farmaceutski privatljivim nosačem, kao što je voda, da bi se regenerisala lipozomalna suspenzija.

[0148] Takođe su obezbeđene farmaceutske formulacije koje su pogodne za ordiniranje u obliku aerosoli inhaliranjem. Ov formulacije sadrže rastvor ili suspenziju ovde opisanog željeog jedinjenja ili njegove soli, ili veliki broj čvrstih čestica jedinjenja ili soli. Željena formulacija može da se nalazi u maloj komori i može da se nebulizuje. Nebulizacija može da se postigne kompresovanim vazduhom ili ultrasoničnom energijom da se obrazuje veliki broj tečnih kapljica ili čvrstih čestica koje sadrže jedinjenja ili soli. Tečne kapljice ili čvrste čestice mogu za jedinjenje da imaju veličinu čestice od oko 0.5 do oko 10 mikrona, i opciono od oko 0.5 do oko 5 mikrona. Čvrste čestice mogu da se dobiju obradom čvrstog jedinjenja ili njegove soli, na odgovarajći način koji je poznat iz oblasti tehnike, kao što je mikronizacija. Opciono, veličina čvrstih čestica ili kapljica može da bude od oko 1 do oko 2 mikrona. U tom pogledu, radi postizanja ove svrhe dostupni su komercijalni nebulizatori. Jedinjenja mogu da se ordiniraju u obliku suspenzije aerosoli čestica koje mogu da se unose disanjem na način predstavljen u U.S. Pat. No.

5,628,984.

[0149] Kada farmaceutska formulacija pogodna za ordiniranje kao aerosol je u tečnom obliku, formulacija može da obuhvati aktivno jedinjenje rastvorljivo u vodi u nosaču koji sadrži vodu. Može da bude prisutan surfaktant, koji snižava površinsku tenziju formulacije dovoljno da dovede do obrazovanja kapljica unutar željenog opsega veličine kada se izloži nebulizaciji.

[0150] Termin "farmaceutski prihvatljive soli" kao što se ovde koristi se odnosi na one soli koje su, u okviru zdrave medicinske procene, pogodne za upotrebu u kontaktu sa subjektima (npr., humani subjekti) bez nepoželjne toksičnosti, iritacije, alergijskog odgovora, i slično, srazmerno sa razumnim odnosom benefita/rizika, i efikasne su za njihovu namenjenu upotrebu, ka oi cviterjonski oblici, gde su mogući, jedinjenja iz trenutno prikazanog predmeta.

[0151] Prema tome, termin "soli" se odnosi na relativno ne-toksične, neorganske i organske kisele adicione soli jedinjenja iz trenutno prikazanog predmeta. Ove soli mogu da se dobiju in situ tokom finalnog izolovanja i prečišćavanja jedinjenja ili odvojeno reagovanjem prečišćenog jedinjenja u njegovom slobodnom baznom obliku sa pogodnom organskom ili neorganskom kiselinom i izolovanja soli koja se na taj način obrazuje. Farmaceutski prihvatljive bazne adicione soli mogu da se dobiju sa metalima ili aminima, kao što su alkalni i hidroksidi zemnoalkalnih metala, ili organskih amina. Jedinjenja metala korišćenih kao katjoni, uključuju, ali bez ograničenja, natrijum, kalijum, magnezijum, kalcijum, i slično. Jedinjenja pogodnih amina uključuju, ali nisu ograničeni na, N,N’-dibenziletilendiamin, hloroprokain, holin, dietanolamin, etilendiamin, N-metilglukamin, i prokain.

[0152] Soli mogu da se dobiju iz neorganskih kiselina sulfata, pirosulfata, bisulfata, sulfita, bisulfita, nitrata, fosfata, monohidrogenfosfata, dihidrogenfosfata, metafosfata, pirofosfata, hlorida, bromida, jodida kao što je hlorovodnična, azotna, fosforna, sumporna, bromovodnična, jodovodonična, fosforna, i slično. Primeri soli uključuju hidrobrom, hidrohlorid, sulfat, bisulfat, nitrat, acetat, oksalat, valerat, oleat, palmitat, stearat, laurat, borat, benzoat, laktat, fosfat, tozilat, citrat, maleat, fumarat, sukcinat, tartrat, naftilat mezilat, glukoheptonat, laktobionat, laurilsulfonat i izetionatne soli, i slično. Soli takođe mogu da se dobiju iz organskih kiselina, kao što su alifatične mono- i dikarboksilne kiseline, fenil-supstituisane alkanoične kiseline, hidroksi alkanoične kiseline, alkandijoske kiseline, aromatične kiseline, alifatične i aromatične sulfonske kiseline, itd. i slično. Primeri soli uključuju acetat, propionat, kaprilat,

4

izobutirat, oksalat, malonat, sukcinat, suberat, sebakat, fumarat, maleat, mandelat, benzoat, hlorobenzoat, metilbenzoat, dinitrobenzoat, ftalat, benzensulfonat, toluensulfonat, fenilacetat, citrat, laktat, maleat, tartrat, metansulfonat, i slično. Farmaceutski prihvatljive soli mogu da uključe katjone koji su zasnovani na alkalnim i zemnoalkalnim metalima, kao što je natrijum, litijum, kalijum, kalcijum, magnezijum i slično, kao i ne-toksični amonijum, kvaternarni amonijum, i aminske katjone uključujući, ali bez ograničenja na, amonijum, tetrametilamonijum, tetraetilamonijum, metilamin, dimetilamin, trimetilamin, trietilamin, etilamin, i slično. Takođe su razmotrene soli aminokiselina kao što su arginat, glukonat, galakturonat, i slično. Videti, na primer, Berge et al., J. Pharm. Sci., 1977, 66, 1-19.

PRIMERI

[0153] Intermedijari B, E, K, L, 1A, IF i 1CA su sintetisani u skladu sa US 8,598,186 pod nazivom CDK Inhibitori prema Tavares, F.X. i Strum, J.C.

Primer 1

Sinteza terc-butil N-[2-[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4il)amino]etil]karbamata, Jedinjenje 1 [0154]

[0155] U rastvor 5-bromo-2,4-dihloropirimidina (3.2 g, 0.0135 mola) u etanolu (80 mL) se dodaje Hunig-ova baza (3.0 mL) zatim se dodaje rastvor N-(terc-butoksikarbonil)-1,2-diaminoetana (2.5 g, 0.0156 mol) u etanolu (20 mL). Sadržaji su mešani preko noći u trajanju od 20 h. Rastvarač je uparen pod vakuumom. Etil acetat (200 mL) i voda (100 mL) su dodati i slojevi su razdvojeni. Organski sloj je osušen sa magnezijum sulfatom i zatim je koncentrovan pod vakuumom. Hromatografija na koloni od silika gela uporebom heksan/etil acetata (0- 60%) je dala terc-butil N-[2-[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]etil]karbamat.<1>HNMR (d6-DMSO) δ ppm 8.21 (s, 1H), 7.62 (brs, 1H), 7.27 (brs, 1H), 3.39 (m, 2H), 3.12 (m, 2H), 1.34 (s, 9H). LCMS (ESI) 351 (M H).

Primer 2

Sinteza terc-butil N-[2-[[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4-il]amino]etil]karbamata, Jedinjenje 2

4

[0157] U terc-butil N-[2-[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]etil]karbamat (1.265 g, 3.6 mmol) u THF (10 mL) je dodat acetal (0.778 mL, 5.43 mmol), Pd(dppf)CH2Cl2(148 mg), i trietilamin (0.757 mL, 5.43 mmol). Sadržaji su degasirani i zatim su prečišćeni sa azotom. U ovo je zatim dodat CuI (29 mg). Reakciona smeša je zagrejana na refluksu 48 h. Nakon hlađenja, sadržaji su proceđeni preko CELITE™ zatim su koncentrovani. Hromatografija na koloni dobijenog ostatka upotrebom heksan/etil acetata (0- 30%) je dala terc-butil N-[2-[[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4-il] amino] etil] karbamat.<1>HNMR (d6-DMSO) δ ppm 8.18 (s, 1H), 7.63 (brs, 1H), 7.40 (brs, 1H), 5.55 (s, 1H), 3.70 (m, 2H), 3.60 (m, 2H), 3.42 (m, 2H), 3.15 (m, 2H), 1.19 - 1.16 (m, 15H). LCMS (ESI) 399 (M H).

Primer 3

Sinteza terc-butil N-[2-[2-hloro-6-(dietoksimetil)pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il] etil] karbamata, Jedinjenje 3

[0158]

[0159] U rastvoru spojenog proizvoda (2.1 g, 0.00526 mol) u THF (30 mL) je dodat TBAF u čvrstom obliku (7.0 g). Sadržaji su zagrejani do i održavani na 65 stepeni 2 h. Koncentrovanje koje prati hromatografija na koloni korišćenjem etil acetat/heksana (0-50%) je dalo terc-butil N-[2-[2-hloro-6-(dietoksimetil)pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il]etil]karbamat u obliku svetlo braon tečnosti (1.1 g).

<1>HNMR (d6-DMSO) δ ppm 8.88 (s, 1H), 6.95 (brs, 1H), 6.69 (s, 1H), 5.79 (s, 1H), 4.29 (m, 2H), 3.59 (m, 4H), 3.34 (m, 1H), 3.18 (m, 1H), 1.19 (m, 9H), 1.17 (m, 6H). LCMS (ESI) 399 (M H).

Primer 4

4

Sinteza terc-butil N-[2-(2-hloro-6-formil-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)etil]karbamata, Jedinjenje 4

[0160]

[0161] U acetal (900 mg) iz prethodnog koraka je dodat AcOH (8.0 mL) i voda (1.0 mL). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi 16 h. Konc. i hromatografija na koloni preko silika gela upotrebom etil acetata/heksanima (0-60%) je dala terc-butil N-[2-(2-hloro-6-formil-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il)etil]karbamat u obliku pene (0.510 g).<1>HNMR (d6-DMSO) δ ppm 9.98 (s, 1H), 9.18 (s, 1H), 7.66 (s, 1H), 6.80 (brs, 1H), 4.52 (m, 2H), 4.36 (m, 2H), 1.14 (s, 9H). LCMS (ESI) 325 (M H).

Primer 5

Sinteza 7-[2-(terc-butoksikarbonilamino)etil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]pirimidin-6-karboksilne kiseline, Jedinjenje 5

[0162]

[0163] U aldehid (0.940 g) iz prethodnog koraka u DMF (4 mL) se dodaje okson (1.95 g, 1.1 ekv). Sadržaji su mešani na sobnoj temperaturi 7 h. Hromatografija na koloni od silika gela upotrebom heksana/etil acetata (0- 100%) je dala 7-[2-(terc-butoksikarbonilamino)etil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]pirimidin-6-karboksilnu kiselinu (0.545 g).<1>HNMR (d6-DMSO) δ ppm 9.11 (s, 1H), 7.39 (s, 1H), 4.38 (m, 2H), 4.15 (m, 2H), 1.48 (m, 9H). LCMS (ESI) 341(M H).

Primer 6

Sinteza metil 7-[2-(terc-butoksikarbonilamino)etil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]pirimidin-6-karboksilata, Jedinjenje 6

[0164]

4

[0165] U rastvoru 2-hloro-7-propil-pirolo[2,3-d]pirimidin-6-karboksilne kiseline (0.545 g, 0.00156 mol) iz prethodnog koraka u toluenu (3.5 mL) i MeOH (1 mL) se dodaje TMS-diazometan (1.2 mL). Posle mešanja preko noći na sobnoj temperaturi, višak TMS-diazometana je ugašen sa sirćetnom kiselinom (3 mL) i reakcija je koncentrovana pod vakuumom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni od silika gela sa heksan/etil acetatom (0- 70%) da se dobije metil 7-[2-(terc-butoksikarbonilamino)etil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]pirimidin-6-karboksilat kao čvrsta supstanca beličaste boje (0.52 g).<1>HNMR (d6-DMSO) δ ppm 9.10 (s, 1H), 7.45 (s, 1H), 6.81 (brs, 1H) 4.60 (m, 2H), 3.91 (s, 3H), 3.29 (m, 2H), 1.18 (m, 9H) LCMS (ESI) 355 (M H).

Primer 7

Sinteza hloro tricikličnog amida, Jedinjenje 7

[0166]

[0167] U metil 7-[2-(terc-butoksikarbonilamino)etil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]pirimidin-6-karboksilat (0.50 g, 0.0014 mol) iz prethodnog koraka u dihlorometanu (2.0 mL) je dodat TFA (0.830 mL). Sadržaji su mešani na sobnoj temperaturi 1 h. Koncentrovanje pod vakuumom je omogućilo da se dobije sirov amino estar koji je suspendovan u toluenu (5 mL) i Hunig-ovoj bazi (0.5 mL). Sadržaji su zagrejani na refluksu 2 h. Koncentrovanje koje prati hromatografija na koloni od silika gela upotrebom heksana/etil acetata (0- 50%) je omogućilo da se dobije željeni hloro triciklični amid (0.260 g).<1>HNMR (d6-DMSO) δ ppm 9.08 (s, 1H), 8.48 (brs, 1H), 7.21 (s, 1H) 4.33 (m, 2H), 3.64 (m, 2H). LCMS (ESI) 223 (M H).

Primer 8

Sinteza hloro-N-metiltricikličnog amida, Jedinjenje 8

[0168]

4

[0169] U rastvor hloro tricikličnoglaktama, Jedinjenje 7, (185 mg, 0.00083 mol) u DMF (2.0 mL) se dodaje natrijum hidrid (55% disperzija u ulju, 52 mg). Posle mešanja u trajanju 15 minuta, metil jodid (62 µL, 1.2 ekv). Sadržaji su mešani na sobnoj temperaturi 30 minuta. Nakon dodavanja metanola (5 mL), dodaje se zas. NaHCO3zatim se dodaje etil acetat. Razdvajanje organskog sloja nakon čega prati sušenje sa magnezijum sulfatom i koncentrovanje pod vakuumom pri čemu se dobija N-metilovani amid u kvantitativnom prinosu.<1>HNMR (d6-DMSO) δ ppm 9.05 (s, 1H), 7.17 (s, 1H) 4.38 (m, 2H), 3.80 (m, 2H), 3.05 (s, 3H). LCMS (ESI) 237 (M H).

Primer 9

Sinteza 1-metil-4-(6-nitro-3-piridil)piperazina, Jedinjenje 9

[0170]

[0171] U 5-bromo-2-nitropiridin (4.93 g, 24.3 mmol) u DMF (20 mL) je dodat N-metilpiperazin (2.96 g, 1.1 ekv) zatim se dodaje DIPEA (4.65 mL, 26.7 mmol). Sadržaji su zagrejani na 90 stepeni 24 h. Posle dodavanja etil acetata (200 mL), dodaje se voda (100 mL) i slojevi se razdvajaju. Sušenje koje prati koncentrovanje je omogućilo dobijanje sirovog proizvoda koji je pročišćen hromatografijom na koloni od silika gela upotrebom (0-10%) DCM/Metanola.<1>HNMR (d6-DMSO) δ ppm 8.26 (s, 1H), 8.15 (1H, d, J = 9.3 Hz), 7.49 (1H, d, J = 9.4 Hz), 3.50 (m, 4H), 2.49 (m, 4H), 2.22 (s, 3H).

Primer 10

Sinteza 5-(4-metilpiperazin-1-il)piridin-2-amin, Jedinjenje 10

[0172]

[0173] U 1-metil-4-(6-nitro-3-piridil)piperazina (3.4 g) u etil acetatu (100 mL) i etanolu (100 mL) je dodat 10% Pd/C (400 mg) i zatim je reakcija mešana pod vodonikom (10 psi) preko noći. Nakon ceđenja kroz CELITE™, rastvarači su ispareni i sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni od silika gela upotrebom DCM/ 7N amonijuma u MeOH (0- 5%) da se dobije 5-(4-metilpiperazin-1il)piridin-2-amin (2.2 g).<1>HNMR (d6-DMSO) δ ppm 7.56 (1H, d, J = 3 Hz), 7.13 (1H, m), 6.36 (1H, d, J = 8.8 Hz), 5.33 (brs, 2H), 2.88 (m, 4H), 2.47 (m, 4H), 2.16 (s, 3H).

Primer 11

Sinteza terc-butil 4-(6-amino-3-piridil)piperazin-1-karboksilata, Jedinjenje 11

[0174]

[0175] Ovo jedinjenje je pripremljeno kao što je opisano u WO 2010/020675 A1.

Primer 12

Sinteza terc-butil N-[2-(benziloksikarbonilamino)-3-metil-butil] karbamata, Jedinjenje 12

[0176]

[0177] U benzil N-[1-(hidroksimetil)-2-metil-propil]karbamat (11.0 g, 0.0464 mol) u dioksanu (100 mL) koji je ohlađen do 0°C je dodat difenilfosforil azid (10.99 mL, 1.1 ekv) zatim se dodaje DBU (8.32 mL, 1.2 ekv). Sadržajima je omogućeno zagrevanje do sobne temperature i mešani su u trajanju od 16 h. Nakon dodavanja etil acetata (300 mL) i vode (100 mL), organski sloj je razdvojen i ispran sa zas. NaHCO3(100 mL). Organski sloj je zatim osušen (magnezijum sulfat) i koncentrovan pod vakuumom. U ovaj intermedijar u DMSO (100 mL) je dodat natrijum azid (7.54 g) i sadržaji su zatim zagrejani do 90 stepeni 2 h. Nakon dodavanja etil acetata i vode slojevi su razdvojeni. Organski sloj je osušen sa magnezijum sulfatom nakon čega sledi koncentrovanje pod vakuumom da se dobije ulje koje je prečišćeno hromatografijom na koloni od silika gela upotrebom heksana/etil acetata (0-70%) da se dobije benzil N-[1-(azidometil)-2-metil-propil] karbamat 6.9 g kao bezbojno ulje.

[0178] U benzil N-[1-(azidometil)-2-metil-propil] karbamatu (6.9 g, 0.0263 mola) u THF (100 mL) se dodaje trifenil fosfin (7.59 g, 1.1 ekv). Sadržaji su mešani 20 h. Posle dodavanja vode (10 mL), i mešanja dodatnih 6 h, dodaje se etil acetat i slojevi su razdvojeni. Nakon sušenja sa magnezijum sulfatom i koncentrovanja pod vakuumom, sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni od silika gela upotrebom DCM/MeOH (0 - 10%) da se dobije benzil N-[1-(aminometil)-2-metil-propil] karbamat kao ulje žute boje.

[0179] U benzil N-[1-(aminometil)-2-metil-propil] karbamat (4.65 g, 0.019 mola) u THF (70 mL) je dodat 2N NaOH (20 mL) nakon čega se dodaje di-terc-butil dikarbonat (5.15 g, 1.2 ekv). Nakon

1

mešanja 16 h, dodat je etil acetat i slojevi su razdvojeni. Posle sušenja sa magnezijum sulfatom i koncentrovanja pod vakuumom, sirovi proizvod je prečišćen korišćenjem heksana/etil acetatu (0-40%) preko kolone od silika gela da se dobije intermedijar A, terc-butil N-[2-(benziloksikarbonilamino)-3-metil-butil] karbamat, (6.1 g).<1>HNMR (600 MHz, HLOROFORM-d) δ ppm 0.89 (d, J=6.73 Hz, 3 H) 0.92 (d, J=6.73 Hz, 3 H) 1.38 (s, 9 H) 1.70 - 1.81 (m, 1 H) 3.18 (d, J=5.56 Hz, 2 H) 3.47 - 3.60 (m, 1 H) 4.76 (s, 1 H) 4.89 (d, J=7.90 Hz, 1 H) 5.07 (s, 2 H) 7.25 - 7.36 (m, 5 H). LCMS (ESI) 337 (M H).

Primer 13

Sinteza terc-butil N-[2-(benziloksikarbonilamino)-4-metil-pentil] karbamata, Jedinjenje 13 [0180]

[0181] U rastvor benzil N-[1-(hidroksimetil)-3-metil-butil]karbamata (6.3 g, 0.025 mola) u DCM (100 mL) je dodat diizopropiletil amin (5.25 mL, 1.2 ekv) nakon čega se dodaje metan sulfonilhlorid (2.13 mL, 1.1 ekv) na 0 stepeni. Nakon mešanja 3 h, voda (100 mL) je dodata i organski sloj je razdvojen. Posle sušenja sa magnezijum sulfatom i koncentrovan pod vakuumom sirovi [2-(benziloksikarbonilamino)-4-metil-pentil] metansulfonat se koristi direktno u sledećem koraku.

[0182] U sirovi [2-(benziloksikarbonilamino)-4-metil-pentil] metansulfonat iz gore navedene reakcije u DMF-u (50 mL), se dodaje 2.43 g natrijum azida. Reakciona smeša je zatim zagrejana do 85 stepeni 3 h. Nakon hlađenja, dodaju se etil acetat (300 mL) i voda. Organski sloj je razdvojen, osušen sa magnezijum sulfatom i zatim je koncentrovan pod vakuumom da se dobije sirovi benzil N-[1-(azidometil)-3-metil-butil] karbamat. U ovaj sirovi intermedijar je dodat THF (100 mL) nakon čega se dodaje trifenilfosfin 7.21 g i meša se pod azotom tokom16 h. Nakon dodavanja vode (10 mL), i mešanja dodatnih 6 h, dodat je etil acetat i slojevi su razdvojeni. Nakon sušenja sa magnezijum sulfatom i koncentrovanja pod vakuumom, sirovi proizvod prolazi kroz kolonu pomoću DCM/MeOH (0 - 10%) da se dobije benzil N-[1-(aminometil)-3-metil-butil] karbamat (4.5 g).

[0183] U benzil N-[1-(aminometil)-3-metil-butil] karbamat (4.5 g, 0.018 mola) u THF (60 mL) se dodaje 2N NaOH (18 mL) nakon čega se dodaje di-terc-butil dikarbonat (4.19 g, 1.07 ekv). Posle mešanja 16 h, dodaje se etil acetat i slojevi su razdvojeni. Posle sušenja sa magnezijum sulfatom i koncentrovanja pod vakuumom, sirovi proizvod se uzima u sledećem koraku.<1>HNMR (600 MHz, HLOROFORM-d) δ ppm 0.89 (d, J=6.73 Hz, 6 H) 1.25 - 1.34 (m, 1 H) 1.39 (s, 9 H) 1.57 - 1.71 (m, 2 H) 3.04 - 3.26 (m, 2 H) 3.68 - 3.80 (m, 1 H) 4.72 - 4.89 (m, 2 H) 5.06 (s, 2 H) 7.25 - 7.38 (m, 5 H). LCMS (ESI) 351 (M H).

2

Primer 14

Sinteza terc-butil N-[(2R)-2-(benziloksikarbonilamino)-3-metil-butil] karbamata, Jedinjenje 14 [0184]

[0185] Jedinjenje 14 je sintetisano iz benzil N-[(1R)-1-(hidroksimetil)-2-metil-propil] karbamata upotrebom sličnih sintetičkih koraka kao što je opisano za Jedinjenje 13. Analitički podaci (NMR i masena spek) su skladu sa onim za Jedinjenje 12.

Primer 15

Sinteza terc-butil N-[(2S)-2-(benziloksikarbonilamino)-3-metil-butil]karbamata, Jedinjenje 15

[0186]

[0187] Jedinjenje 15 je sintetisano iz benzil N-[(1S)-1-(hidroksimetil)-2-metil-propil] karbamata korišćenjem sličnih sintetičkih koraka kao što je opisano za Jedinjenje 13. Analitički podaci (NMR i mas spek) suu skladu sa onim za Jedinjenje 12.

Primer 16

Sinteza terc-butil N-[(1S)-1-(aminometil)-2-metil-propil]karbamata, Jedinjenje 16

[0188]

[0189] U rastvor terc-butil N-[(1S)-1-(hidroksimetil)-2-metil-propil]karbamat karbamat (6.3 g, 0.025 mol) u THF (100 mL) se dodaje diizopropiletil amin (5.25 mL, 1.2 ekv) nakon čega se dodaje metan sulfonilhlorid (2.13 mL, 1.1 ekv) na 0 stepeni. Posle mešanja 3 h, voda (100 mL) je dodata i organski sloj je razdvojen. Nakon sušenja sa magnezijum sulfatom i koncentrovanja pod vakuumom, sirovi [(2S)-2-(terc-butoksikarbonilamino)-3-metil-butil] metansulfonat je korišćen direktno u sledećem koraku.

[0190] U sirovi [(2S)-2-(terc-butoksikarbonilamino)-3-metil-butil] metansulfonat iz gornje reakcije u DMSO (50 mL), je dodat natrijum azid (2.43 g). Reakciona smeša je zatim zagrejana do 85 stepeni 3 h. Posle hlađenja, dodaju se etil acetat (300 mL) i voda. Organski sloj je razdvojen, osušen sa magnezijum sulfatom i nakon čega je koncentrovan pod vakuumom da se dobije sirovi benzil N-[1-(azidometil)-3-metil-butil] karbamat. U ovaj sirovi intermedijar se dodaje THF (100 mL) zatim se dodaje trifenilfosfin (7.21 g) i reakcija je mešana pod azotom 16 h. Posle dodavanja vode (10 mL), i mešanja dodatnih 6 h, dodaje se etil acetat i slojevi se razdvajaju. Posle sušenja sa magnezijum sulfatom i koncentrovanja pod vakuumom, sirovi proizvod je prećišćen hromatografijom na koloni od silika gela upotrebom DCM/MeOH (0 - 10%) da se dobije benzil N-[1-(aminometil)-3-metilbutil] karbamat (4.5 g). LCMS (ESI) 203 (M H).

Primer 17

Sinteza terc-butil N-[(1R)-1-(aminometil)-2-metil-propil]karbamata, Jedinjenje 17

[0191]

[0192] Jedinjenje 17 je sintetisano iz terc-butil N-[(1R)-1-(hidroksimetil)-2-metilpropil] karbamata korišćenjem slične sintetičke sekvence kao što je opisano za Jedinjenje 16. Analitički podaci (NMR i mas spek) su skladu sa Jedinjenjem 16.

Primer 18

Sinteza terc-butil N-[(2S)-2-(benziloksikarbonilamino)-4-metil-pentil] karbamata, Jedinjenje 18

[0193]

4

[0194] Jedinjenje 18 je sintetisano iz benzil N-[(1S)-1-(hidroksimetil)-3-metilbutil]karbamata korišćenjem slične sintetičke sekvence kao što je opisano za Jedinjenje 13. Analitički podaci (NMR i mas spek) su u skladu sa Jedinjenjem 13.

Sinteza terc-butil N-[(2S)-2-(benziloksikarbonilamino)-2-fenil-etil] karbamata, Jedinjenje 19 [0195]

[0196] Jedinjenje 19 je sintetisano iz benzil N-[(1S)-2-hidroksi-1-fenil-etil] karbamata korišćenjem slične sintetičke sekvence kao što je opisano za Jedinjenje 13.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.20 - 1.33 (m, 9 H) 3.11 (t, J=6.29 Hz, 2 H) 4.59 - 4.68 (m, 1 H) 4.88 - 5.01 (m, 2 H) 6.81 (t, J=5.42 Hz, 1 H) 7.14 - 7.35 (m, 10 H) 7.69 (d, J=8.49 Hz, 1 H). LCMS (ESI) 371 (M H).

Primer 20

Sinteza terc-butil N-[(2S)-2-(benziloksikarbonilamino)-3-metil-pentil] karbamata, Jedinjenje 20

[0197]

[0198] Jedinjenje 20 je sintetisano iz benzil N-[(1S)-1-(hidroksimetil)-2-metil-butil] karbamata upotrebom slične sintetičke sekvence kao što je opisano za Jedinjenje 13.<1>HNMR (600 MHz, HLOROFORM-d) δ ppm 0.85 - 0.92 (m, 6 H) 1.05 - 1.15 (m, 1 H) 1.35 - 1.41 (m, 9 H) 1.45 - 1.56 (m, 2 H) 3.14 - 3.24 (m, 2 H) 3.54 - 3.64 (m, 1 H) 4.78 (s, 1 H) 4.96 (d, J=7.91 Hz, 1 H) 5.06 (s, 2 H) 7.27 - 7.37 (m, 5 H). LCMS (ESI) 351 (M H).

Primer 21

Sinteza terc-butil N-[(2S)-2-(benziloksikarbonilamino)-3,3-dimetil-butil] karbamata, Jedinjenje 21

[0200] Jedinjenje 21 je sintetisano iz benzil N-[(1S)-1-(bidroksimetil)-2,2-dimetilpropil]karbamata upotrebom slične sintetičke sekvence kao što je opisano za Jedinjenje 13. LCMS (ESI) 351.

Primer 22

Sinteza terc-butil N-[[1-(benziloksikarbonilamino)cikloheksil]metil]karbamata, Jedinjenje 22

[0201]

[0202] U rastvor benzil N-[1-(aminometil)cikloheksil]karbamata (10.0 g, 0.0381 mol) u THF (150 mL) se dodaje di-terc-butil dikarbonat (9.15 g, 1.1 ekv) i sadržaji su mešani na sobnoj temperaturi 16 h. Zatim se dodaju etil acetat i voda. Organski sloj je razdvojen, osušen preko magnezijum sulfata i zatim je koncentrovan pod vakuumom da se dobije terc-butil N-[[1-(benziloksikarbonilamino)cikloheksil]metil] karbamat (13.1 g).<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.92 - 1.54 (m, 17 H) 1.76 - 2.06 (m, 2 H) 3.09 (d, J=6.15 Hz, 2 H) 4.92 (s, 2 H) 6.63 (d, J=17.27 Hz, 1 H) 7.16 - 7.49 (m, 6 H). LCMS (ESI) 363 (M H).

Primer 23

Sinteza terc-butil N-[[1-(benziloksikarbonilamino)ciklopentil]metil]karbamata, Jedinjenje 23

[0203]

[0204] terc-butil N-[[1-(benziloksikarbonilamino)ciklopentil]metil]karbamat je sintetisan na način koji je analogan sa terc-butil N-[[1-(benziloksikarbonilamino) cikloheksil]metil] karbamatom. LCMS (ESI) 349 (M H).

Primer 24

Sinteza 2-nitro-5-[4-(1-piperidil)-1-piperidil]piridina, Jedinjenje 24

[0205]

[0206] U 5-bromo-2-nitropiridin (1.2 g, 5.9 mmol) u DMSO (4 mL) se dodaje 1-(4-piperidil)piperidin (1.0 g, 5.9 mmol) i trietilamin (0.99 mL, 7.1 mmola). Sadržaji su zagrejani do 120°C u CEM Discovery mikrotalasnom sistemu 3 sata. Sirova reakcija je zatim prečišćena hromatografijom na koloni od silika gela sa DCM/metanolom (0-20%) da se dobije 2-nitro-5-[4-(1-piperidil)-1-piperidil]piridin u obliku ulja (457 mg).<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.26 - 1.36 (m, 2 H) 1.43 (m, 6 H) 1.76 (m, 2 H) 2.37 (m, 5 H) 2.94 (t, J=12.74 Hz, 2 H) 4.06 (d, J=13.47 Hz, 2 H) 7.41 (dd, J=9.37, 2.64 Hz, 1 H) 8.08 (d, J=9.37 Hz, 1 H) 8.20 (d, J=2.64 Hz, 1 H).

Primer 25

Sinteza 5-[4-(1-piperidil)-1-piperidil]piridin-2-amina, Jedinjenje 25

[0207]

[0208] 5-[4-(1-piperidil)-1-piperidil]piridin-2-amin je pripremljen na način koji je sličan onom koji je korišćen u sintezi 5-(4-metilpiperazin-1-il)piridin-2-amina.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.13 -1.37 (m, 6 H) 1.40 - 1.63 (m, 6 H) 1.71 (m, 2 H), 2.24 (m, 1H) 2.43 (m, 2 H) 3.33 (d, J=12.30 Hz, 2 H) 5.31 (s, 2 H) 6.33 (d, J=8.78 Hz, 1 H) 7.10 (dd, J=8.78, 2.93 Hz, 1 H) 7.55 (d, J=2.64 Hz, 1 H). LCMS (ESI) 261 (M H).

Primer 26

Sinteza 4-[1-(6-nitro-3-piridil)-4-piperidil] morfolina, Jedinjenje 26

[0209]

[0210] 4-[1-(6-nitro-3-piridil)-4-piperidil]morfolin je sintetisan na način koji je sličan onom koji je korišćen u sintezi 2-nitro-5-[4-(1-piperidil)-1-piperidil]piridina.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.41 (m, 2 H) 1.82 (m, 2 H) 2.42 (m, 5 H) 2.98 (t, J=12.44 Hz, 2 H) 3.52 (s, 4 H) 4.04 (d, J=12.88 Hz, 2 H) 7.42 (d, J=9.37 Hz, 1 H) 8.08 (d, J=9.08 Hz, 1 H) 8.21 (s, 1 H).

Primer 27

Sinteza 5-(4-morfolino-1-piperidil) piridin-2-amina, Jedinjenje 27

[0211]

[0212] 5-(4-morfolino-1-piperidil)piridin-2-amin je pripremljen na način koji je sličan onom koji je korišćen u sintezi 5-(4-metilpiperazin-1-il)piridin-2-amina.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.34 -1.52 (m, 2 H) 1.78 (m, 2 H) 2.14 (m, 1 H) 2.43 (m, 4 H) 3.32 (d, J=12.30 Hz, 4 H) 3.47 - 3.59 (m, 4 H) 5.32 (s, 2 H) 6.34 (d, J=8.78 Hz, 1 H) 7.11 (dd, J=8.93, 2.78 Hz, 1 H) 7.47 - 7.62 (m, 1 H). LCMS (ESI) 263 (M H).

Primer 28

Sinteza 4-[1-(6-nitro-3-piridil)-4-piperidil] tiomorfolina, Jedinjenje 28

[0213]

[0214] 4-[1-(6-nitro-3-piridil)-4-piperidil] tiomorfolin je sintetisan na način koji je sličan onom koji je korišćen u sintezi 2-nitro-5-[4-(1-piperidil)-1-piperidil]piridina.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.40 - 1.52 (m, 2 H) 1.71 (m, 2 H) 2.49 - 2.55 (m, 4 H) 2.56 - 2.63 (m, 1 H) 2.68 - 2.75 (m, 4 H) 2.88 -2.98 (m, 2 H) 4.09 (d, J=13.18 Hz, 2 H) 7.42 (dd, J=9.22, 3.07 Hz, 1 H) 8.08 (d, J=9.37 Hz, 1 H) 8.20 (d, J=3.22 Hz, 1 H).

Primer 29

Sinteza 5-(4-tiomorfolino-1-piperidil) piridin-2-amina, Jedinjenje 29

[0215]

[0216] 5-(4-tiomorfolino-1-piperidil) piridin-2-amin je pripremljen na način koji je sličan onom koji je korišćen u sintezi 5-(4-metilpiperazin-1-il)piridin-2-amina.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.47 -1.59 (m, 2 H) 1.65 (m, 2 H) 2.22 - 2.38 (m, 1 H) 2.50 - 2.59 (m, 6 H) 2.68 - 2.82 (m, 4 H) 3.33 (d, J=12.00 Hz, 2 H) 5.31 (s, 2 H) 6.33 (d, J=9.08 Hz, 1 H) 7.10 (dd, J=8.78, 2.93 Hz, 1 H) 7.55 (d, J=2.64 Hz, 1 H). LCMS (ESI) 279 (M H).

Primer 30

Sinteza 2-nitro-5-(1-piperidil)piridina, Jedinjenje 30

[0217]

[0218] 2-nitro-5-(1-piperidil) piridin je sintetisan na način koji je sličan onom koji je korišćen u sintezi 2-nitro-5-[4-(1-piperidil)-1-piperidil]piridina.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.56 (m, 6 H) 3.49 (d, J=4.39 Hz, 4 H) 7.30 - 7.47 (m, 1 H) 8.02 - 8.12 (m, 1 H) 8.15-8.26 (m, 1 H).

Primer 31

Sinteza 5-(1-piperidil)piridin-2-amina, Jedinjenje 31

[0219]

[0220] 5-(1-piperidil) piridin-2-amin je pripremljen na način koji je sličan onom koji je korišćen u sintezi 5-(4-metil- piperazin-1-il)piridin-2-amina.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.39 - 1.46 (m, 2 H) 1.51 - 1.62 (m, 4 H) 2.75 - 2.92 (m, 4 H) 5.30 (s, 2 H) 6.34 (d, J=8.78 Hz, 1 H) 7.09 (dd, J=8.78, 2.93 Hz, 1 H) 7.54 (d, J=2.93 Hz, 1 H). LCMS (ESI) 178 (M H).

Primer 32

Sinteza 4-(6-nitro-3-piridil) tiomorfolina, Jedinjenje 32

[0221]

[0222] 4-(6-nitro-3-piridil) tiomorfolin je sintetisan na način koji je sličan onom koji je korišćen u sintezi 2-nitro-5-[4-(1-piperidil)-1-piperidil]piridina.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.56 - 2.69 (m, 4 H) 3.79 - 3.92 (m, 4 H) 7.43 (dd, J=9.22, 3.07 Hz, 1 H) 8.10 (d, J=9.37 Hz, 1 H) 8.20 (d, J=2.93 Hz, 1 H). Primer 33

Sinteza 5-tiomorfolinopiridin-2-amina, Jedinjenje 33

[0223]

[0224] 5-tiomorfolinopiridin-2-amin je pripremljen na način koji je sličan onom koji je korišćen u sintezi 5-(4-metilpiperazin-1-il) piridin-2-amina.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.59 - 2.73 (m, 4 H) 3.04 - 3.20 (m, 4 H) 5.41 (s, 2 H) 6.35 (d, J=8.78 Hz, 1 H) 7.10 (dd, J=8.78, 2.93 Hz, 1 H) 7.57 (d, J=2.64 Hz, 1 H). LCMS (ESI) 196 (M H).

Primer 34

Sinteza terc-butil (4R)-5-(6-nitro-3-piridil)-2,5-diazabiciklo[2.2.1]heptan-2-karboksilata, Jedinjenje 34

[0225]

[0226] terc-butil (4R)-5 -(6-nitro-3 -piridil)-2,5-diazabiciklo [2.2.1]heptan-2-karboksilat je sintetisan na način koji je sličan onom koji je korišćen u sintezi 2-nitro-5-[4-(1-piperidil)-1-piperidil]piridina.<1>HNMR (600 MHz, DMSO- d6) δ ppm 1.33 (d, J=32.21 Hz, 11 H) 1.91 (m, 2 H) 3.15 (d, J=10.25 Hz, 1 H) 3.58 (m, 1 H) 4.46 (m, 1 H) 4.83 (s, 1 H) 7.16 (s, 1 H) 7.94 (s, 1 H) 8.05 - 8.16 (m, 1 H).

Primer 35

Sinteza terc-butil (4R)-5-(6-amino-3-piridil)-2,5-diazabiciklo[2.2.1]heptan-2-karboksilata, Jedinjenje 35

[0228] terc-butil (4R)-5-(6-amino-3-piridil)-2,5-diazabiciklo[2.2.1]heptan-2-karboksilat je pripremljen na način koji je sličan onom koji je korišćen u sintezi 5-(4-metilpiperazin-1-il)piridin-2-amina.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.31 (d, J=31.91 Hz, 11 H) 1.83 (m, 2 H) 2.71 - 2.82 (m, 1 H) 3.44 (m,1 H) 4.30 (d, 2H) 5.08 (s, 2 H) 6.35 (d, J=8.78 Hz, 1 H) 6.77 - 6.91 (m, 1 H) 7.33 (s, 1 H). LCMS (ESI) 291 (M H).

Primer 36

Sinteza N,N-dimetil-1-(6-nitro-3-piridil)piperidin-4-amina, Jedinjenje 36

[0229]

[0230] N,N-dimetil-1-(6-nitro-3-piridil)piperidin-4-amin je sintetisan na način koji je sličan onom koji je korišćen u sintezi 2-nitro-5-[4-(1-piperidil)-1-piperidil]piridina.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.30 - 1.45 (m, 2 H) 1.79 (m, 2 H) 2.14 (s, 6 H) 2.33 (m, 1 H) 2.92 - 3.04 (m, 2 H) 4.03 (d, J=13.76 Hz, 2 H) 7.42 (dd, J=9.22, 3.07 Hz, 1 H) 8.04 - 8.11 (m, 1 H) 8.21 (d, J=2.93 Hz, 1 H).

Primer 37

Sinteza 5-[4-(dimetilamino)-1-piperidil]piridin-2-amina, Jedinjenje 37

[0231]

[0232] 5-[4-(dimetilamino)-1-piperidil]piridin-2-amin je pripremljen na način koji je sličan onom koji je korišćen u sintezi 5-(4-metilpiperazin-1-il)piridin-2-amina.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.35 - 1.50 (m, 2 H) 1.69 - 1.81 (m, 2 H) 2.00 - 2.10 (m, 1 H) 2.11 - 2.22 (s, 6 H) 3.17 - 3.36 (m, 4 H) 5.19 -

1

5.38 (s, 2 H) 6.34 (d, J=8.78 Hz, 1 H) 7.10 (dd, J=8.78, 2.93 Hz, 1 H) 7.55 (d, J=2.63 Hz, 1 H). LCMS (ESI) 221 (M H).

Primer 38

Sinteza 4-(6-nitro-3-piridil) morfolina, Jedinjenje 38

[0233]

[0234] 4-(6-nitro-3-piridil) morfolin je pripremljen na način koji je sličan onom koji je korišćen u sintezi 2-nitro- 5-[4-(1-piperidil)-1-piperidil]piridina.

Primer 39

Sinteza 5-morfolinopiridin-2-amina, Jedinjenje 39

[0235]

[0236] 5-morfolinopiridin-2-amin je pripremljen na način koji je sličan onom koji je korišćen u sintezi 5-(4-metil- piperazin-1-il)piridin-2-amina.<1>HNMR (600 MHz, HLOROFORM-d) δ ppm 2.91 - 3.00 (m, 4 H) 3.76 - 3.84 (m, 4 H) 4.19 (br. s., 2 H) 6.45 (d, J=8.78 Hz, 1 H) 7.12 (dd, J=8.78, 2.93 Hz, 1 H) 7.72 (d, J=2.93 Hz, 1 H).

Primer 40

Sinteza 5-(4-izobutilpiperazin-1-il)piridin-2-amina, Jedinjenje 40

[0237]

[0238] 1-izobutil-4-(6-nitro-3-piridil)piperazin je sintetisan na način koji je sličan onom koji je korišćen u sintezi 2-nitro-5-[4-(1-piperidil)-1-piperidil]piridina koji je zatim konvertovan u 5-(4-izobutilpiperazin-1-il)piridin-2-amin na način koji je sličan onom koji je korišćen u sintezi 5-(4-metilpiperazin-1-il)piridin-2-amina.<1>HNMR (600 MHz, HLOROFORM-d) δ ppm 0.88 (d, J=6.73 Hz, 6 H)

2

1.71 - 1.84 (m, 1 H) 2.10 (d, J=7.32 Hz, 2 H) 2.46 - 2.58 (m, 4 H) 2.97 - 3.07 (m, 4 H) 4.12 (s, 2 H) 6.45 (d, J=8.78 Hz, 1 H) 7.14 (dd, J=8.78, 2.93 Hz, 1 H) 7.75 (d, J=2.93 Hz, 1 H). LCMS (ESI) 235 (M H). Primer 41

Sinteza 5-(4-izopropilpiperazin-1-il) piridin-2-amina, Jedinjenje 41

[0239]

[0240] 1-izopropil-4-(6-nitro-3-piridil)piperazin je sintetisan na način koji je sličan onom koji je korišćen u sintezi 2-nitro-5-[4-(1-piperidil)-1-piperidil]piridina koji je zatim konvertovan u 5-(4-izopropilpiperazin-1-il)piridin-2-amin na način koji je sličan onom koji je korišćen u sintezi 5-(4-metilpiperazin-1-il)piridin-2-amina.<1>HNMR (600 MHz, HLOROFORM-d) δ ppm 1.06 (d, J=6.44 Hz, 6 H) 2.59 - 2.75 (m, 5 H) 2.97 - 3.10 (m, 4 H) 4.13 (s, 2 H) 6.45 (d, J=8.78 Hz, 1 H) 7.15 (dd, J=9.08, 2.93 Hz, 1 H) 7.76 (d, J=2.93 Hz, 1 H). LCMS (ESI) 221 (M H).

Primer 42

Sinteza 5-[(2R,6S)-2,6-dimetilmorfolin-4-il]piridin-2-amina, Jedinjenje 42

[0241]

[0242] (2S,6R)-2,6-dimetil-4-(6-nitro-3-piridil)morfolin je sintetisan na način koji je sličan onom koji je korišćen u sintezi 2-nitro-5-[4-(1-piperidil)-1-piperidil]piridina koji je zatim konvertovan u 5-[(2R,6S)-2,6-dimetilmorfolin-4-il]piridin-2-amin na način sličan onom koji je korišćen u sintezi 5-(4-metilpiperazin-1-il)piridin-2-amina.<1>HNMR (600 MHz, HLOROFORM-d) δ ppm 1.20 (d, J=6.44 Hz, 6 H) 2.27 - 2.39 (m, 2 H) 3.11 - 3.21 (m, 2 H) 3.70 - 3.84 (m, 2 H) 4.15 (s, 2 H) 6.45 (d, J=8.78 Hz, 1 H) 7.12 (dd, J=8.78, 2.93 Hz, 1 H) 7.72 (d, J=2.63 Hz, 1 H). LCMS (ESI) 208 (M H).

Primer 43

Sinteza 5-[(3R,5S)-3,5-dimetilpiperazin-1-il]piridin-2-amina, Jedinjenje 43

[0244] (3S,5R)-3,5-dimetil-1-(6-nitro-3-piridil)piperazin je sintetisan na način koji je sličan onom koji je korišćen u sintezi 2-nitro-5-[4-(1-piperidil)-1-piperidil]piridina koji je zatim konvertovan u 5-[(3R,5S)-3,5-dimetilpiperazin-1-il]piridin-2-amin na način koji je sličan onom koji je korišćen u sintezi 5-(4-metilpiperazin-1-il)piridin-2-amina.<1>HNMR (600 MHz, HLOROFORM-d) δ ppm 1.09 (d, J=6.44 Hz, 6 H) 2.20 (t, J=10.83 Hz, 2 H) 2.95 - 3.08 (m, 2 H) 3.23 (dd, J=11.71, 2.05 Hz, 2 H) 4.13 (s, 2 H) 6.45 (d, J=8.78 Hz, 1 H) 7.14 (dd, J=8.78, 2.93 Hz, 1 H) 7.73 (d, J=2.63 Hz, 1 H). LCMS (ESI) 207 (M H).

Primer 44

Sinteza Jedinjenja 44

[0245]

terc-butil N-[2-[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]-3-metil-butil] karbamat

[0246]

[0247] Rastvor intermedijera A u etanolu (100 mL) je hidrogenizovan pod 30 psi vodonika upotrebom 10% Pd/C (0.7 g) u bombi pod pritiskom tokom 7 h. Nakon ceđenja reakcione smeše kroz CELITE™, organski sloj je koncentrovan pod vakuumom da se dobije terc-butil N-(2-amino-3-metil-butil) karbamat (3.8 g).

4

[0248] U rastvor 5-bromo-2,4-dihloro-pirimidina (7.11 g, 0.0312 mola) u etanolu (100 mL) se dodaje diizo-propiletil amin (5.45 mL, 1.0 ekv.) i terc-butil N-(2-amino-3-metilbutil) karbamat (6.31 g, 0.0312 mol). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 20 h. Nakon koncentrovanja pod vakuumom, dodati su etil acetat i voda. Organski sloj je razdvojen, osušen sa magnezijum sulfatom i zatim je koncentrovan pod vakuumom. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni od silika gela upotrebom heksan/etil acetata (0- 30%) da se dobije terc-butil N-[2-[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]-3-metil-butil] karbamat.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.77 - 0.85 (d, J=6.5 Hz, 3 H) 0.87 (d, J=6.73 Hz, 3 H) 1.31 - 1.39 (m, 9 H) 1.82 - 1.93 (m, 1 H) 2.94 (d, J=5.56 Hz, 1 H) 3.08 - 3.22 (m, 2 H) 3.98 (d, J=8.20 Hz, 1 H) 6.96 (d, J=8.78 Hz, 1 H) 8.21 (s, 1 H). LCMS (ESI) 393 (M H).

terc-butil N-[2-[2-hloro-6-(dietoksimetil)pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il]-3-metil-butil] karbamat [0249]

[0250] terc-butil N- [2- [2 -hloro -6 -(dietoksimetil)pirolo [2,3 -d]pirimidin-7-il] -3 -metilbutil]karbamat je sintetisan stavljanjem terc-butil N-[2-[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]-3-metilbutil]karbamata u Sonogo-shira uslovima kao što je opisano za terc-butil N-[2-[[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4-il] amino] etil] karbamat nakon čega sledi tretman sa TBAF kao što je opisano u sintezi terc-butil N-[2-[2-hloro-6-(di-etoksimetil)pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il]etil]karbamata.

<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.11 (d, J=6.44 Hz, 3 H) 1.18 (t, J=7.03 Hz, 6 H) 1.21 - 1.26 (m, 12 H) 2.88 (br. s., 1 H) 3.43 - 3.78 (m, 6 H) 3.97 - 4.08 (m, 1 H) 5.61 (s, 1 H) 6.65 (s, 1 H) 6.71 - 6.78 (m, 1 H) 8.87 (s, 1 H). LCMS (ESI) 441 (M H).

7-[1-[(terc-butoksikarbonilamino)metil]-2-metil-propil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]pirimidin-6-karboksilna kiselina

[0251]

[0252] U rastvor terc-butil N-[2-[[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4-il]amino]etil]karbamata u THF-u dodaje se TBAF i sadržaji su zagrejani na refluksu 3 h. Zatim su dodati etil acetat i voda i organski sloj je razdvojen, osušen sa magnezijum sulfatom i zatim je koncentrovan pod vakuumom. U ovu sirovu reakciju je dodata sirćetna kiselina/voda u odnosu (9:1) i sadržaji su mešani 12 h na sobnoj temperaturi. Posle koncentrovana u vakuumu, dodaju sa zas. NaHCO3i etil acetat. Organski sloj je razdvojen, osušen i koncentrovan pod vakuumom. Sirovi proizvod reakcije koji je zatim dobijen je rastvoren u DMF, zatim se dodaje okson i sadržaji su mešani 3 h. Posle dodavanja etil acetata, reakciona smeša je proceđena kroz CELITE™ i koncentrovana je pod vakuumom. Hromatografija sirovog proizvoda na koloni od silika gela upotrebom heksana/etil acetata (0- 100%) je omogućila dobijanje 7-[1-[(terc-butoksikarbonilamino)metil]-2-metil-propil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]pirimidin-6-karboksilne kiseline.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.85 (d, J=7.03 Hz, 3 H) 0.97 (d, J=6.73 Hz, 3 H) 1.52 (s, 9 H) 1.99 - 2.23 (m, 1 H) 3.98 (dd, J=14.05, 3.51 Hz, 1 H) 4.47 - 4.71 (m, 2 H) 7.47 (s, 1 H) 9.17 (s, 1 H). LCMS (ESI) 383 (M H).

Jedinjenje 44

[0253] U 7-[1-[(tec-butoksikarbonilamino)metil]-2-metil-propil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]pirimidin-6-karboksilnu kiselinu (0.050 g, 0.00013 mol) u DCM (1.5 mL) je dodat DIC (32.7 mg) i DMAP (10 mg). Sadržaji su mešani 2 h. Zatim je dodata trifluorosirćetna kiselina (0.4 mL) i mešanje je nastavljeno dodatnih 30 minuta. Posle dodavanja zas. NaHCO3da bi se neutralisala kiselina u višku, dodat je etil acetat i organski sloj je razdvojen, osušen upotrebom magnezijum sulfata i zatim je koncentrovan pod vakuumom. Sirovi proizvod je prečišćen sa hromatografijom na koloni od silica gela upotrebom heksan/etil acetata (0- 100%) da se dobije proizvod.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.72 (d, J=6.73 Hz, 3 H) 0.97 (d, J=6.73 Hz, 3 H) 2.09 - 2.22 (m, 1 H) 3.57 (dd, J=13.18, 4.98 Hz, 1 H) 3.72 (dd, J=13.61, 4.25 Hz, 1 H) 4.53 (dd, J=8.05, 3.95 Hz, 1 H) 7.20 (s, 1 H) 8.34 (d, J=4.98 Hz, 1 H) 9.08 (s, 1 H). LCMS (ESI) 265 (M H).

Primer 45

Sinteza Jedinjenja 45

[0254]

[0255] Jedinjenje 14 je hidrogenizovano sa 10% Pd/C da se dobije intermedijar terc-butil N-[(2R)-2-amino-3-metil-butil] karbamat, koji kada je tertian sa 5-bromo-2,4-dihloro-pirimidinom upotrebom analogih reakcionih uslova kao što je opisano za Jedinjenje 44 da se dobije Jedinjenje 45 Analitički podaci su u skladu sa podacima koji su prijavljeni za racemat (Intermedijar 1A).

Primer 46

Sinteza Jedinjenja 46

[0256]

[0257] Jedinjenje 15 je hidrogenizovano sa 10% Pd/C da se dobije intermedijar terc-butil N-[(2S)-2-amino-3-metil- butil]karbamat, koji je zatim tretiran sa 5-bromo-2,4-dihloro-pirimidinom upotrebom analogih reakcionih uslova kao što je opisano za Jedinjenje 44 da se dobije Jedinjenje 46. Analitički podaci (NMR i LCMS) su bili u skladu sa prijavljenim za racemat Jedinjenja 44.

Primer 47

Sinteza Jedinjenja 47

[0258]

[0259] U rastvor Jedinjenja 44 (80 mg, 0.00030 mol) u DMF (3 mL) je dodata 60% disperzija natrijum hidrida u ulju (40 mg). Posle mešanja 15 minuta, dodat je metil jodid (37 µL, 2ekv). Sadržaji su mešani na sobnoj temperaturi 30 minuta. Zatim je dodat zasićeni NaHCO3nakon čega se dodaje etil acetat. Organski sloj je osušen sa magnezijum sulfatom i zatim je koncentrovan pod vakuumom da se dobije sirovi proizvod.<1>HNMR (600 MHz, DMSO- d6) δ ppm 0.74 (d, J=6.73 Hz, 3 H) 0.91 (d, J=6.73 Hz, 3 H) 2.04 - 2.20 (m, 1 H) 3.04 (s, 3 H) 3.69 (dd, J=13.76, 1.17 Hz, 1 H) 3.96 (dd, J=13.76, 4.68 Hz, 1 H) 4.58 (dd, J=7.32, 3.51 Hz, 1 H) 7.16 (s, 1 H) 9.05 (s, 1 H). LCMS (ESI) 279 (M H).

Primer 48

Sinteza Jedinjenja 48

[0260]

terc-butil N-[(2S)-2-[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]-4-metil-pentil]karbamat

[0261]

[0262] Jedinjenje 18 je hidrogenizovano sa 10% Pd/C u etanolu pod pokrivačem hidrogena na 50 psi u bombi pod pristiskom da se dobije terc-butil N-[(2S)-2-amino-4-metil-pentil]karbamat koji je zatim izreagovao sa 5-bromo-2,4-dihloro-pirimidinom upotrebom analognih reakcionih uslova kao što je opisano za terc-butil N-[2-[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]- 3-metilbutil]karbamat da se dobije terc-butil N-[(2S)-2-[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]-4-metil-pentil]karbamat.<1>HNMR (600 MHz, HLOROFORM-d) δ ppm 0.91 (d, J=6.44 Hz, 3 H) 0.94 (d, J=6.44 Hz, 3 H) 1.32 - 1.51 (m, 11 H) 1.55 - 1.67 (m, 1 H) 3.28 (t, J=5.86 Hz, 2 H) 4.21 - 4.42 (m, 1 H) 4.84 (s, 1 H) 5.84 (d, J=7.32 Hz, 1 H) 8.07 (s, 1 H). LCMS (ESI) 407 (M H).

[0263] U rastvor terc-butil N-[(2S)-2-[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]-4-metilpentil]karbamata (5.0 g, 12.3 mmol) u toluenu (36 mL) i trietilaminu (7.2 mL) pod azotom se dodaje 3,3-dietoksiprop-1-in (2.8 mL, 19.7 mmol), Pd2(dba)3(1.1g, 1.23 mmol), i trifenilarsin (3.8 g, 12.3 mmol). Sadržaji su zagrejani do 70 stepeni 24 h. Posle hlađenja do sobne temperature, reakciona smeša je proceđena kroz CELITE™ i zatim je koncentrovana pod vakuumom. Sirovi proizvod je pročišćen hromatografiom na koloni od silika gela upotrebom heksan/etil acetatu (0- 30%) da se dobije (2S)-N2-[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4-il]-4-metil-pentan-1,2-diamin. LCMS (ESI) 455 (M H).

[0264] 7-[(1S)-1-[(tert-butoksikarbonilamino)metil]-3-metil-butil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]pirimidin-6-karboksilna kiselina je sintetisana upotrebom analoge sintetičke sekvence kao što je opisano za 7-[1-[(terc-butoksikarbonilamino)metil]-2-metil-propil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]pirimidin-6-karboksilnu kiselinu.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.88 (d, J=6.44 Hz, 3 H) 0.97 (d, J=6.44 Hz, 3 H) 1.47 (s, 9 H) 1.49 - 1.54 (m, 1 H) 1.56 (t, J=7.17 Hz, 2 H) 3.98 (dd, J=13.91, 3.07 Hz, 1 H) 3.76 (dd, J=13.31, 4.13 Hz, 1 H) 4.38 (d, J=14.05 Hz, 1 H) 4.90 (t, J=7.17 Hz, 1 H) 7.41 (s, 1 H) 9.11 (s, 1 H). LCMS (M H) 397.

[0265] Jedinjenje 48 je sintetisano upotrebom analoge sintetičke sekvence kao što je opisano za Jedinjenje 44.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.82 (d, J=6.73 Hz, 3 H) 0.97 (d, J=6.44 Hz, 3 H) 1.34 - 1.46 (m, 1 H) 1.48 - 1.65 (m, 2 H) 3.40 (dd, J=13.32, 5.42 Hz, 1 H) 3.76 (dd, J=13.47, 4.10 Hz, 1 H) 4.76 - 4.92 (m, 1 H) 7.17 (s, 1 H) 8.34 (d, J=5.27 Hz, 1 H) 9.04 (s, 1 H). LCMS (ESI) 279 (M H).

Primer 49

Sinteza Jedinjenja 49

[0266]

[0267] Jedinjenje 49 je sintetisano na način sličan onom koji je opisan za Jedinjenje 47.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.82 (d, J=6.44 Hz, 3 H) 0.97 (d, J=6.44 Hz, 3 H) 1.37 - 1.68 (m, 3 H) 3.04 (s, 3 H) 3.56 (d, J=13.47 Hz, 1 H) 4.00 (dd, J=13.32, 4.25 Hz, 1 H) 4.82 - 4.94 (m, 1 H) 7.16 (s, 1 H) 9.03 (s, 1 H). LCMS (ESI) 293 (M H).

Primer 50

Sinteza Jedinjenja 50

[0268]

terc-butil N-[(2S)-2-[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]-3-metil-pentil]karbamat

[0269]

[0270] Jedinjenje 20 je hidrogenizovano upotrebom 10% Pd/C pod vodonikom na 50 psi u posudi pod pritiskom da se dobije terc- butil N-[(2S)-2-amino-3-metil-pentil]karbamat koji je izreagovao sa 5-bromo-2,4-dihloro-pirimidinom upotrebom analognih reakcionih uslova kao što je opisano za tercbutil N-[2-[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]-3-metil-butil]karbamat da se dobije terc-butil N-[(2S)-2-[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]-3-metil-pentil]karbamat.<1>HNMR (600 MHz, HLOROFORM-d) δ ppm 0.88 - 0.95 (m, 6 H) 1.11 - 1.20 (m, 1 H) 1.34 (s, 9 H) 1.44 - 1.54 (m, 1 H) 1.64 -1.72 (m, 1 H) 3.17 - 3.27 (m, 1 H) 3.33 - 3.43 (m, 1 H) 4.11 - 4.21 (m, 1 H) 4.81 (s, 1 H) 5.92 (d, J=8.20 Hz, 1 H) 8.05 (s, 1 H). LCMS (ESI) 407.

tert-butil N-[(2S)-2-[[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4-il]amino]-3-metilpentil] karbamat

[0271]

[0272] tert-butil N-[(2S)-2-[[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4-il]amino]-3-metilpentil]karbamat je sintetisan upotrebom sličnih eksperimentalnih uslova kao što su oni koji su korišćeni u sintezi (2S)-N2-[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4-il]-4-metilpentan-1,2-diamina.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.76 - 0.89 (m, 6 H) 1.03 (q, J=7.22 Hz, 3 H) 1.10 - 1.17 (m, 3 H) 1.25 - 1.42 (m, 11 H) 1.59 - 1.73 (m, 1 H) 3.35 - 3.47 (m, 4 H) 3.51 - 3.73 (m, 2 H) 3.99 - 4.11 (m, 1 H) 5.52 - 5.56 (m, 1 H) 6.76 - 7.03 (m, 2 H) 8.12 - 8.23 (m, 1 H). LCMS (ESI) 455 (M H).

7-[(1S)-1-[(terc-butoksikarbonilamino)metil]-2-metil-butil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]pirimidin-6-karboksilna kiselina

[0273]

[0274] 7-[(1S)-1-[(terc-butoksikarbonilamino)metil]-2-metil-butil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]pirimidin-6-karboksilna kiselina je sintetisana upotrebom analoge sintetičke sekvence kao što je ona koja je opisana za 7-[1-[(terc-butoksikarbonilamino)metil]-2-metil-propil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]pirimidin-6-karboksilne kiseline.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.80 (t, J=7.47 Hz, 3 H) 0.86 (d, J=7.03 Hz, 3 H) 1.06 - 1.30 (m, 2 H) 1.48 (s, 9 H) 1.79 - 1.96 (m, 1 H) 3.95 (dd, J=14.05, 3.22 Hz, 1 H) 4.52 (d, J=14.35 Hz, 1 H) 4.61 - 4.73 (m, 1 H) 7.43 (s, 1 H) 9.13 (s, 1 H). LCMS (ESI) 397 (M H).

[0275] Jedinjenje 50 je sintetisano upotrebom analoge sintetičke sekvence kao što je ona koja je opisana za Jedinjenje 44.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.74 (t, J=7.32 Hz, 3 H) 0.89 (d, J=6.73 Hz, 3 H) 1.00 - 1.12 (m, 2 H) 1.82 - 1.94 (m, 1 H) 3.55 (dd, J=13.91, 4.83 Hz, 1 H) 3.70 (dd, J=13.61, 4.25 Hz, 1 H) 4.57 (dd, J=7.91, 4.10 Hz, 1 H) 7.17 (s, 1 H) 8.31 (d, J=5.27 Hz, 1 H) 9.05 (s, 1 H). LCMS (ESI) 279 (M H).

Primer 51

Sinteza Jedinjenja 51

1

[0277] Jedinjenje 51 je sintetisano na način koji je sličan za Jedinjenje 47.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.77 (t, J=7.47 Hz, 3 H) 0.84 (d, J=6.73 Hz, 3 H) 1.07 - 1.16 (m, 2 H) 1.82 - 1.95 (m, 1 H) 3.03 (s, 3 H) 3.68 (d, J=13.76 Hz, 1 H) 3.96 (dd, J=13.76, 4.39 Hz, 1 H) 4.59 - 4.70 (m, 1 H) 7.16 (s, 1 H) 9.04 (s, 1 H). LCMS (ESI) 293 (M H).

Primer 52

Sinteza Jedinjenja 52

[0278]

terc-butil N-[(2S)-2-[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]-3,3-dimetil-butil] karbamat

[0279]

[0280] Jedinjenje 21 je hidrogenizovano upotrebom 10% Pd/C pod vodonikom na 50 psi u posudi pod pritiskom da se dobije terc-butil N-[(2S)-2-amino-3,3-dimetil-butil]karbamat koji je zatim izreagovao sa 5-bromo-2,4-dihloro-pirimidinom upotrebom analogih reakcionih uslova kao što je opisano upotrebom analognih reakcionih uslova kao što je opisano za terc-butil N-[2-[(5-bromo-2-hloro-

2

pirimidin-4-il)amino]-3-metil-butl]karbamat da se dobije terc-butil N-[(2S)-2-[(5-bromo-2-hloropirimidin-4-il)amino]-3,3-dimetil-butil]karbamat. LCMS (ESI) 407 (M H).

terc-butil N-[(2S)-2-[[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4-il]amino]-3,3-dimetilbutil] karbamat

[0281]

[0282] terc-butil N-[(2S)-2-[[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4-il]amino]-3,3-dimetilbutil]karbamat je sintetisan upotrebom sličnih eksperimentalnih uslova sa onima koji su korišćeni za sintezu (2S)-N2-[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4-il]-4-metilpentan-1,2-diamina. LCMS (ESI) 455 (M H).

7-[(1S)-1-[(terc-butoksikarbonilamino)metil]-2,2-dimetil-propil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]pirimidin-6-karboksilna kiselina

[0283]

[0284] 7-[(1S)-1-[(terc-butoksikarbonilamino)metil]-2,2-dimetil-propil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]pirimidin-6-karboksilna kiselna je sintetisana upotrebom analogne sintetičke sekvence kao što je opisano za 7-[1-[(terc-butoksikarbonilamino)metil]-2-metil-propil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]pirimidin-6-karboksilnu kiselinu. LCMS (ESI) 397 (M H). Intermedijar 1F je sintetisan upotrebom analogne sintetičke sekvence kao što je opisano za intermedijar 1A. LCMS (ESI) 279 (M H).

Primer 53

Sinteza Jedinjenja 53

[0285]

[0286] Jedinjenje 53 je sintetisano na način koji je sličan onom koji je opisan za Intermedijar 1CA. LCMS (ESI) 293 (M H).

Primer 54

Sinteza Jedinjenja 54

[0287]

terc-butil N-[(2S)-2-[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]-2-fenil-etil] karbamat

[0288]

[0289] Jedinjenje 21 je hidrogenizovano upotrebom 10% Pd/C pod vodonikom na 50 psi u posudi pod pritiskom da se dobije terc-butil N-[(2S)-2-amino-2-fenil-etil]karbamat koji je zatim izreagovao sa 5-bromo-2,4-dihloro-pirimidinom upotrebom analogih reakcionih uslova kao što je opisano za terc-butil N-[2-[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]-3-metil-butil]karbamat da se dobije terc-butil N-[(2S)-2-[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]-2-fenil-etil]karbamat.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm

4

1.32 (s, 9 H) 3.29 - 3.50 (m, 2 H) 5.12 - 5.24 (m, 1 H) 7.10 (t, J=5.27 Hz, 1 H) 7.21 (t, J=6.88 Hz, 1 H) 7.26 - 7.34 (m, 4 H) 7.89 (d, J=7.32 Hz, 1 H) 8.24 (s, 1 H). LCMS (ESI) 427 (M H).

terc-butil N-[(2S)-2-[[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4-il]amino]-2-fenil-etil] karbamat [0290]

[0291] terc-butil N-[(2S)-2-[[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4-il]amino]-2-feniletil]karbamat je sintetisan upotrebom sličnih eksperimentalnih uslova sa onima koji su korišćeni za sintezu (2S)-N2-[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4-il]-4-metilpentan-1,2-diamina.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.14 (t, J=7.03 Hz, 6 H) 1.32 (s, 9 H) 3.39 (s, 2 H) 3.52 - 3.61 (m, 2 H) 3.64 - 3.73 (m, 2 H) 5.17 - 5.26 (m, 1 H) 5.57 (s, 1 H) 7.07 - 7.14 (m, 1 H) 7.20 - 7.25 (m, 1 H) 7.26 - 7.33 (m, 4 H) 7.90 (d, J=7.61 Hz, 1 H) 8.19 (s, 1 H). LCMS (ESI) 475 (M H).

7-[(1S)-2-(terc-butoksikarbonilamino)-1-fenil-etil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]pirimidin-6-karboksilna kiselina

[0292]

[0293] 7-[(1S)-2-(terc-butoksikarbonilamino)-1-fenil-etil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]pirimidin-6-karboksilna kiselina je sintetisana upotrebom analogne sintetičke sekvence kao što je opisano za 7-[1-[(tercbutoksikarbonilamino)metil]-2-metil-propil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]pirimidin-6-karboksilnu kiselinu. LCMS (ESI) 417 (M H).

Jedinjenje 54

[0294] Jedinjenje 54 je sintetisano upotrebom analogne sintetičke sekvence kao što je opisano za Jedinjenje 44.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3.58 - 3.69 (m, 1 H) 4.13 (dd, J=13.47, 4.39 Hz, 1 H) 6.07 (d, J=3.81 Hz, 1 H) 6.85 (d, J=7.32 Hz, 2 H) 7.19 - 7.31 (m, 3 H) 7.34 (s, 1 H) 8.27 (d, J=5.27 Hz, 1 H) 9.13 (s, 1 H). LCMS (ESI) 299 (M H).

Primer 55

Sinteza Jedinjenja 55

[0295]

terc-butil N-[(1S)-1-[[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]metil]-2-metil-propil] karbamat [0296]

[0297] terc-butil N-[(1S)-1-[[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]metil]-2-metilpropil]karbamat je sintetisan upotrebom 5-bromo-2,4-dihloro-pirimidina i Intermedijera E upotrebom analognih uslova reakcije kao što je opisano za terc-butil N-[2-[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]-3-metilbutil]karbamat.<1>HNMR (600 MHz, HLOROFORM- d) δ ppm 0.95 - 1.02 (m, 6 H) 1.35 - 1.45 (m, 9 H) 1.75 - 1.90 (m, 1 H) 3.35 - 3.48 (m, 1 H) 3.52 - 3.61 (m, 1 H) 3.64 -3.76 (m, 1 H) 4.56 (d, J=8.49 Hz, 1 H) 6.47 (s, 1 H) 8.07 (s, 1 H). LCMS (ESI) 393 (M H).

terc-butil N-[(1S)-1-[[[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4-il]amino]metil]-2-metil-propil] karbamat

[0298]

[0299] terc-butil N-[(1S)-1-[[[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4-il]amino]metil]-2-metilpropil]karbamat je sintetisan upotrebom sličnih eksperimentalnih uslova kao što su oni koji se koriste u sintezi (2S)-N2-[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4-il]-4-metil-pentan-1,2-diamina.

<1>HNMR (600 MHz, HLOROFORM-d) δ ppm 0.90 -1.00 (m, 6 H) 1.18 -1.25 (m, 6 H) 1.34 - 1.36 (m, 9 H) 1.69 - 1.90 (m, 1 H) 3.34 - 3.82 (m, 6 H) 4.53 - 4.77 (m, 1 H) 5.45 - 5.55 (m, 1 H) 6.37 (dd, J=15.37, 6.59 Hz, 1 H) 6.56 (s, 1 H) 8.05 (s, 1 H). LCMS (ESI) 441 (M H).

7-[(2S)-2-(terc-butoksikarbonilamino)-3-metil-butil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]pirimidin-6-karboksilna kiselina

[0300]

[0301] 7-[(2S)-2-(terc-butoksikarbonilamino)-3-metil-butil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]primidin-6-karboksilna kiselina je sintetisana upotrebom analogne sintetičke sekvence kao što je opisano za 7-[1-[(terc-butoksikarbonilamino)metil]-2-metil-propil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]primidin-6-karboksilnu kiselinu.<1>HNMR (600 MHz, HLOROFORM-d) δ ppm 0.90 (d, J=6.73 Hz, 3 H) 0.96 (d, J=7.03 Hz, 3 H) 1.55 - 1.66 (m, 10 H) 4.14 (dd, J=13.61, 3.95 Hz, 1 H) 4.52 - 4.63 (m, 1 H) 4.84 (dd, J=13.61, 1.32 Hz, 1 H) 7.37 (s, 1 H) 8.95 (s, 1 H). LCMS (ESI) 383 (M H).

Jedinjenje 55

[0302] Jedinjenje 55 je sintetisano upotrebom analogne sintetičke sekvence kao što je opisano za Jedinjenje 44. LCMS (ESI) 265 (M H).

Primer 56

Sinteza Jedinjenja 56

[0303]

[0304] Jedinjenje 56 je sintetisano upotrebom 5-bromo-2,4-dihloro-primidina i Jedinjenja 17 kao polaznih materijala, i nakon slične sekvence sintetičkih koraka kao za Jedinjenje 55. Analitički podaci su bili u skladu sa onim opisanim za njegov antipod (Jedinjenje 55).<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.88 (d, J=6.44 Hz, 6 H) 1.73 - 1.86 (m, 1 H) 3.67 - 3.76 (m, 2 H) 4.11 - 4.21 (m, 1 H) 7.13 - 7.19 (m, 1 H) 8.56 (s, 1 H) 9.05 (s, 1 H). LCMS (ESI) 265 (M H).

Primer 57

Sinteza Jedinjenja 57

[0305]

terc-butil N-[2-[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]-2-metil-propil]karbamat

[0306]

[0307] terc-butil N-[2-[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]-2-metil-propil]karbamat je sintetisan upotrebom 5-bromo-2,4-dihloro-primidina i terc-butil N-(2-amino-2-metilpropil)karbamata upotrebom analognih reakcionih uslova kao što je opisano za terc-butil N-[2-[(5-bromo-2-hloropirimidin-4-il)amino]-3-metil-butil]karbamat. LCMS (ESI) 379 (M+ H).

terc-butil N-[2-[[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4-il]amino]-2-metil-propil] karbamat [0308]

[0309] terc-butil N-[2-[[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4-il]amino]-2-metilpropil]karbamat je sintetisan upotrebom sličnih eksperimentalnih uslova sa onima koji se koriste u sintezi (2S)-N2-[2-hloro-5-(3,3-dietoksi-prop-1-inil)pirimidin-4-il]-4-metil-pentan-1,2-diamina.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.11 - 1.22 (m, 6 H) 1.31 - 1.45 (m, 15 H) 3.10 - 3.24 (m, 2 H) 3.51 - 3.76 (m, 4 H) 5.60 (s, 1 H) 6.94 (s, 1 H) 7.33 (t, J=6.44 Hz, 1 H) 8.18 (s, 1 H). LCMS (ESI) 427 (M H).

7-[2-(terc-butoksikarbonilamino)-1,1-dimetil-etil]-2-hloro-pirolo [2,3-d]primidin-6-karboksilna kiselina

[0310]

[0311] 7-[2-(terc-butoksikarbonilamino)-1,1-dimetil-etil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]primidin-6-karboksilna kiselina je sintetisana upotrebom analogne sintetičke sekvence kao što je opisano za 7-[1-[(tercbutoksikarbonilamino)metil]-2-metil-propil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]primidin-6-karboksilna kiselinu.

<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.43 (s, 9H) 1.73 (s, 6 H) 4.06 (s, 2 H) 7.46 (s, 1 H) 9.23 (s, 1H). LCMS (ESI) 369 (M H).

Jedinjenje 57

[0312] Jedinjenje 57 je sintetisano upotrebom analoge sintetičke sekvence kao što je opisano za Jedinjenje 44.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.73 (s, 6 H) 3.50 (d, J=2.93 Hz, 2 H) 7.25 (s, 1 H) 8.46 - 8.55 (m, 1 H) 9.07 (s, 1 H). LCMS (ESI) 251 (M H).

Primer 58

Sinteza Jedinjenja 58

[0313]

terc-butil N-[[1-[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]cikloheksil]metil]karbamat

[0314]

[0315] terc-butil N-[[1-[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]cikloheksil]metil] karbamat je sintetisan upotrebom 5-bromo-2,4-dihloro-primidina i Intermedijera K upotrebom analogih reakcionih uslova kao što je opisano za terc-butil N-[2-[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]-3-metil-butil] karbamat.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.18 - 1.54 (m, 17 H) 2.23 (d, J=14.35 Hz, 2 H) 3.36 (d, J=6.44 Hz, 2 H) 5.82 (s, 1 H) 6.93 (s, 1 H) 8.22 (s, 1 H). LCMS (ESI) 419 (M H).

terc-butil N-[[1-[[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4-il]amino]cikloheksil] metil] karbamat [0316]

[0317] terc-butil N-[[1-[[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4-il]amino]cikloheksil]metil] karbamat je sintetisan upotrebom sličnih eksperimentalnih uslova sa onima koji su korišeni za sintezu (2S)-N2-[2-hloro-5-(3,3-dietoksi-prop-1-inil)pirimidin-4-il]-4-metil-pentan-1,2-diamina.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm1.08 - 1.16 (m, 6 H) 1.17 - 1.54 (m, 17 H) 2.13 (br. s., 2 H) 3.36 (d, J=6.73 Hz, 2 H) 3.50 - 3.69 (m, 4 H) 5.72 (s, 1 H) 6.94 (s, 1 H) 5.72 (br. s., 1H) 8.17 (s, 1 H). LCMS (ESI) 467 (M H).

7-[1-[(terc-butoksikarbonilamino)metil]cikloheksil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]primidin-6-karboksilna kiselina

[0318]

[0319] 7-[1-[(terc-butoksikarbonilamino)metil]cikloheksil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]primidin-6-karboksilna kiselina je sintetisana upotrebom analoge sintetičke sekvence kao što je opisano za 7-[1-[(terc-butoksikarbonilamino)metil]-2-metil-propil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]primidin-6-karboksilnu kiselinu.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.37 - 1.54 (m, 13 H) 1.75 (br. s., 4 H) 2.74 (br. s., 2 H) 3.78 - 3.84 (m, 2 H) 7.44 - 7.51 (m, 1 H) 8.23 (s, 1 H) 9.11 (s, 1 H). LCMS (ESI) 409 (M H).

Jedinjenje 58

[0320] Jedinjenje 58 je sintetisano upotrebom analogne sintetičke sekvence kao što je opisano za Jedinjenje 44.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.28 (br. s., 2 H) 1.42 (br. s., 2 H) 1.70 (br. s., 4 H) 1.85 - 1.95 (m, 2 H) 2.69 (m, 2 H) 7.16 - 7.25 (m, 1 H) 8.41 (br. s., 1 H) 9.04 (s, 1 H). LCMS 291 (M H).

Primer 59

Sinteza Jedinjenja 59

[0321]

terc-butil N-[[1-[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]ciklopentil]metil]karbamat

[0322]

1

[0323] terc-butil N-[[1-[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]ciklopentil]metil] karbamat je sintetisan upotrebom 5-bromo-2,4-dihloro-primidina i Intermedijara L upotrebom analognih reakcionih uslova kao što je opisano za terc-butil N-[2-[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]-3-metil-butil]karbamat.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.34 (s, 9 H) 1.50 - 1.58 (m, 2 H) 1.63 - 1.78 (m, 4 H) 1.96 - 2.06 (m, 2 H) 3.25 (d, J=6.15 Hz, 2 H) 6.71 (s, 1 H) 7.18 (t, J=6.29 Hz, 1 H) 8.20 (s, 1 H). LCMS (ESI) 405 (M H).

terc-butil N-[[1-[[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4-il]amino]ciklopentil] metil]karbamat [0324]

[0325] terc-butil N-[[1-[[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4-il]amino]ciklopentil]metil]karbamat je sintetisan upotrebom sličnih eksperimentalnih uslova sa onima koji su korišćeni za sintezu (2S)-N2-[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4-il]-4-metil-pentan-1,2-diamina. LCMS (ESI) 453 (M H).

7-[1-[(terc-butoksikarbonilamino)metil]ciklopentil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]primidin-6-karboksilna kiselina

[0326]

2

[0327] 7-[1-[(terc-butoksikarbonilamino)metil]ciklopentil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]primidin-6-karboksilna kiselina je sintetisana upotrebom analoge sintetičke sekvence kao što je opisano za 7-[1-[(terc-butoksikarbonilamino)metil]-2-metil-propil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]primidin-6-karboksilnu kiselinu.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.47 (s, 9 H) 1.74 (br. s., 2 H) 1.88 (br. s., 2 H) 2.04 (br. s., 2 H) 2.41 - 2.45 (m, 2 H) 4.06 (s, 2 H) 7.45 (s, 1 H) 9.11 (s, 1 H). LCMS (ESI) 395 (M H).

Jedinjenje 59

[0328] Jedinjenje 59 je sintetisano upotrebom analoge sintetičke sekvence kao što je opisano za Jedinjenje 44.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.72 (br. s., 2 H) 1.86 - 1.93 (m, 2 H) 1.99 (d, J=3.81 Hz, 2 H) 2.40 (br. s., 2 H) 3.48 (d, J=2.34 Hz, 2 H) 7.22 (s, 1 H) 8.53 (br. s., 1 H) 9.05 (s, 1 H). LCMS (ESI) 277 (M H).

Primer 60

Sinteza Jedinjenja 60

[0329]

terc-butil N-[2-[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]-4-metil-pentil] karbamat

[0330]

[0331] terc-butil N-[2-[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]-4-metil-pentil]karbamat je sintetisan upotrebom 5-bromo-2,4-dihloro-primidina i Intermedijara B upotrebom analogih reakcionih uslova kao što je opisano za terc-butil N-[2-[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]-3-metil-butil]karbamat. Analitički podaci su u skladu sa onim koji su opisani za L-enantiomer.

terc-butil N-[2-[[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4-il]amino]-4-metil-pentil] karbamat [0332]

[0333] terc-butil N-[2-[[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4-il]amino]-4-metilpentil]karbamat je sintetisan upotrebom sličnih eksperimentalnih uslova sa onim koji su korišćeni za sintezu terc-butil N-[2-[[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4-il]amino]etil]karbamata.

<1>HNMR (600 MHz, HLOROFORM-d) δ ppm 1.21 - 1.31 (m, 12 H) 1.38 - 1.46 (m, 11 H) 1.70 (m, 1H) 3.24 (m, 2 H) 3.65 - 3.82 (m, 4 H) 4.86 (br s., 1H), 5.65 (s, 1 H) 5.85 (br s., 1H) 6.94 (s, 1 H) 8.21 (s, 1 H). LCMS (ESI) 455 (M H).

7-[1-[(terc-butoksikarbonilamino)metil]-3-metil-butil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]primidin-6-karboksilna kiselina

[0334]

[0335] 7-[1-[(terc-butoksikarbonilamino)metil]-3-metil-butil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]primidin-6-karboksilna kiselina je sintetisana upotrebom analogne sintetičke sekvence kao što je opisano za 7-[1-[(terc-butoksikarbonilamino)metil]-2-metil-propil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]primidin-6-karboksilnu kiselinu. Analitički podaci su u skladu sa opisanim za L-izomer.

Jedinjenje 60

4

[0336] Jedinjenje 60 je sintetisano upotrebom analoge sintetičke sekvence kao što je opisano za Jedinjenje 44. Analitički podaci su u skladu sa opisanim za L-izomer.

Primer 61

Sinteza Jedinjenja 61

[0337]

[0338] U rastvor jedinjenja 60 (100 mg, 0.00024 mol) u DMF-u (3.0 mL) se dodaje natrijum hlorid (60 % disperzija u ulju), (27.6 mg, 3 ekv). Posle mešanja 15 minuta, dodaje se metil jodid (30, 2 ekv). Sadržaji su mešani na sobnoj temperaturi 30 minuta. Posle dodavanja zas. NaHCO3, dodaje se etil acetat. Razdvajanje organskog sloja koje sledi nakon sušenja sa magnezijum sulfatom i koncentrovanja pod vakuumom je omogućilo dobijanje proizvoda. Analitički podaci su bili slični sa Jedinjenjem 49.

Primer 62

Sinteza Jedinjenja 62

[0339]

terc-butil N-[(1S,2S)-2-[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]ciklopentil]karbamat

[0340]

[0341] terc-butil N-[(1S,2S)-2-[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]ciklopentil]karbamat je sintetisan tretiranjem terc-butil N-[(1S,2S)-2-aminociklopentil]karbamata sa 5-bromo-2,4-dihloroprimidinom upotrebom analogih reakcionih uslova kao što je opisano za terc-butil N-[2-[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]-3-metil-butil]karbamat.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.27 (s, 9H) 1.42 - 1.54 (m, 2 H) 1.56 - 1.65 (m, 2 H) 1.80 - 1.88 (m, 1 H) 1.96 - 2.01 (m, 1 H) 3.88 - 3.96 (m, 1 H) 4.03 - 4.09 (m, 1 H) 6.91 (d, J=8.20 Hz, 1 H) 7.41 (d, J=7.32 Hz, 1 H) 8.18 (s, 1 H). LCMS (ESI) 391 (M H).

terc-butil N-[(1S,2S)-2-[[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4-il]amino]ciklopentil]karbamat [0342]

[0343] terc-butil N-[(1S,2S)-2-[[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4-il]amino]ciklopentil]karbamat je sintetisan upotrebom sličnih eksperimentalnih uslova sa onima koji su korišćeni za sintezu (2S)-N2-[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4-il]-4-metil-pentan-1,2-diamina.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.13 (t, 6 H) 1.28 (s, 9 H) 1.42 - 1.52 (m, 2 H) 1.58 - 1.65 (m, 2 H) 1.81 - 1.90 (m, 1 H) 1.99 - 2.08 (m, 1 H) 3.49 - 3.60 (m, 2 H) 3.63 - 3.71 (m, 2 H) 3.84 - 3.93 (m, 1 H) 3.96 - 4.04 (m, 1 H) 5.53 (s, 1 H) 6.96 (d, J=7.90 Hz, 1 H) 7.34 (d, J=7.03 Hz, 1 H) 8.14 (s, 1 H). LCMS (ESI) 439 (M H).

7-[(1S,2S)-2-(terc-butoksikarbonilamino)ciklopentil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]primidin-6-karboksilna kiselina

[0344]

[0345] 7-[(1S,2S)-2-(terc-butoksikarbonilamino)ciklopentil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]primidin-6-karboksilna kiselina je sintetisana upotrebom analoge sintetičke sekvence kao što je opisano za 7-[1-[(terc-butoksikarbonilamino)metil]-2-metil-propil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]primidin-6-karboksilnu kiselinu.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.41 - 1.52 (m, 9 H) 1.55 - 1.68 (m, 1 H) 1.88 - 2.00 (m, 2 H) 2.05 - 2.15 (m, 1 H) 2.26 - 2.35 (m, 1 H) 2.71 - 2.89 (m, 1 H) 4.01 - 4.16 (m, 1 H) 4.28 - 4.45 (m, 1 H) 7.41 (s, 1 H) 9.11 (s, 1 H). LCMS (ESI) 381 (M H).

Jedinjenje 62

[0346] Jedinjenje 62 je sintetisano upotrebom analogne sintetičke sekvence kao što je opisano za Jedinjenje 44.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.48 - 1.60 (m, 1 H) 1.88 - 1.98 (m, 3 H) 1.99 - 2.08 (m, 1 H) 2.66 - 2.75 (m, 1 H) 3.63 - 3.74 (m, 1 H) 3.99 - 4.12 (m, 1 H) 7.21 (s, 1 H) 8.89 (s, 1 H) 9.04 (s, 1 H). LCMS (ESI) 263 (M H).

Primer 63

Sinteza Jedinjenja 63

[0347]

[0348] U hloro tricikličnilaktam (0.050 g, 0.225 mmol) u dioksanu (2.0 mL) pod azotom je dodat 5-(4-metil-piperazin-1-il)piridin-2-amin (0.052 g, 1.2 ekv, 0.270 mmol) nakon čega se dodaje Pd2(dba)3(18.5 mg), BINAP (25 mg) i natrijum-terc-butoksid (31 mg , 0.324 mmola). Sadržaji iz balona su degasirani 10 minuta nakon čega su zagrejani na 100 stepeni 12h. Sirova reakcija je naneta na kolonu od silika gela i eluirana je sa DCM/MeOH (0-15%) da se dobije željeni proizvod (26 mg). U ovo jedinjenje koje je rastvoreno u DCM/MeOH (10%) je dodat 3N HCl u izo-propanolu (2 ekv) i reakcija je mešana preko noći. Koncentrovanje pod vakuumom je obezbedilo hidrohloridnu so.<1>HNMR (d6-DMSO) δ ppm 11.13 (brs, 1H), 9.07 (s, 1H), 8.42 (s, 1H), 8.03 (br m 1H), 7.99 (s, 1H), 7.67 (brm, 1H), 7.18 (s, 1H), 4.33 (m, 2H), 3.79 (m, 2H), 3.64 (m, 2H), 3.50 (m, 2H), 3.16 (m, 4H), 2.79 (s, 3H). LCMS (ESI) 379 (M H). Primer 64

Sinteza Jedinjenja 64

[0349]

[0350] U hloro tricikličnilaktam (0.075 g, 0.338 mmola) u dioksanu (3.5 mL) pod azotom je dodat tercbutil 4-(6- amino-3-piridil)piperazin-1-karboksilat (0.098 g, 1.05 ekv) nakon čega se dodaje Pd2(dba)3(27 mg), BINAP (36 mg) i natrijum- terc-butoksid (45 mg). Sadržaji su zagrejani na refluksu 11 h. Sirova reakcija je naneta na kolonu od silika gela i eluirana je sa DCM/MeOH (0- 10 %) da se dobije željeni proizvod (32 mg).<1>HNMR (d6-DMSO) δ ppm 9.48 (s, 1H), 8.84 (s, 1H), 8.29 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 7.99 (s, 1H), 7.42 (m, 1H), 6.98 (s, 1H), 4.23 (m, 2H), 3.59 (m, 2H), 3.45 (m, 4H), 3.50 (m, 2H), 3.05 (m, 4H). LCMS (ESI) 465 (M H).

Primer 65

Sinteza Jedinjenja 65

[0351]

[0352] U rastvor Jedinjenja 64 (23 mg) u 10% DCM/MeOH se dodaje 10 mL 3M rastvora HCl u izopropanolu. Sadržaji su mešani 16 h. Kocentrovanje reakcione smeše je omogućilo dobijanje hidrohloridne soli.<1>HNMR (d6-DMSO) δ ppm 9.01 (s, 1H), 7.94 (m, 1H), 7.86 (m, 1H), 7.23 (s, 1H), 4.30 (m, 2H), 3.64 (m, 2H), 3.36 (m, 4H), 3.25 (m, 4H). LCMS (ESI) 465 (M H).

Primer 66

Sinteza Jedinjenja 66

[0353]

[0354] U hloro-N-metiltriciklični amid (0.080 g, 0.338 mmol) u dioksanu (3.5 mL) pod azotom se dodaje terc-butil 4-(6-amino-3-piridil)piperazin-1-karboksilat 0.102 g (1.1 ekv) zatim se dodaje Pd2(dba)3(27 mg), BINAP (36 mg) i natrijum-terc-butoksid (45 mg). Sadržaji su zagrejani na refluksu 11 h. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni od silika gela sa eluentom dihlorometan/metanolu (0- 5%) da se dobije željeni proizvod (44 mg).<1>HNMR (d6-DMSO) δ ppm 9.49 (s, 1H), 8.85 (s, 1H), 8.32 (m, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.44 (m, 1H), 7.00 (s, 1H), 4.33 (m, 2H), 3.80 (m, 2H), 3.48 (m, 4H), 3.07 (m, 4H), 3.05 (s, 3H), 1.42 (s, 9H). LCMS (ESI) 479 (M H).

Primer 67

Sinteza Jedinjenja 67

[0355]

[0356] U Jedinjenje 66 (32 mg) je dodat 3N HCL (10 mL) u izopropanolu i sadržaji su mešani 16 h na sobnoj temperaturi preko noći. Koncentrovanje je omogućilo dobijanje hidrohloridne soli.<1>HNMR (d6-DMSO) δ ppm 9.13 (m, 2H), 8.11 (m, 1H), 8.10 (s, 1H), 7.62 (m, 1H), 7.21 (s, 1H), 4.43 (m, 2H), 3.85 (m, 2H), 3.41 (m, 4H), 3.28 (m, 4H), 3.08 (s, 3H). LCMS (ESI) 379 (M H).

Primer 68

Sinteza Jedinjenja 68

[0357]

[0358] Jedinjenje 68 je sintetisano upotrebom sličnih eksperimentalnih uslova koji su opisani za Jedinjenje 64.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.79 (d, J=7.03 Hz, 3 H) 1.01 (d, J=6.73 Hz, 3 H) 1.35 - 1.48 (m, 9 H) 2.16 (dd, J=14.64, 6.73 Hz, 1 H) 3.00 - 3.14 (m, 4 H) 3.40 - 3.51 (m, 4 H) 3.51 - 3.60 (m, 1 H) 3.63 - 3.74 (m, 1 H) 4.44 (dd, J=7.90, 3.81 Hz, 1 H) 6.99 (s, 1 H) 7.46 (dd, J=8.93, 2.78 Hz, 1 H) 7.94 - 8.09 (m, 2 H) 8.31 (dd, J=9.08, 1.46 Hz, 1 H) 8.85 (s, 1 H) 9.46 (s, 1 H). LCMS (ESI) 507 (M H).

Primer 69

Sinteza Jedinjenja 69

[0359]

[0360] Jedinjenje 69 je sintetisano upotrebom sličnih eksperimentalnih uslova koji su opisani za Jedinjenje 63 i oporavljeno je kao HCl so.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.77 - 0.86 (m, 3 H) 0.96 (d, J=7.03 Hz, 3 H) 2.10 - 2.24 (m, 1 H) 3.07 (s, 3 H) 3.37 - 3.79 (m, 8 H) 4.00 (dd, J=13.61, 4.54 Hz, 2 H) 4.63 - 4.73 (m, 1 H) 7.20 (s, 1 H) 7.58 - 7.71 (m, 1 H) 7.99 (d, J=2.34 Hz, 1 H) 8.12 (d, J=9.37 Hz, 1 H) 9.11 (s, 1 H) 9.41 (br. s., 2 H) 11.76 (br. s., 1 H). LCMS (ESI) 421 (M H).

Primer 70

Sinteza Jedinjenja 70

[0361]

[0362] Jedinjenje 70 je sintetisano upotrebom sličnih eksperimentalnih uslova koji su opisani za jedinjenja 64 i 65 i oporavljeno je kao HCl so. Podaci karakterizacije (NMR i LCMS) su bili u skladu sa onim koji su prijavljeni za Jedinjenje 71.

Primer 71

Sinteza Jedinjenja 71

[0363]

[0364] Jedinjenje 71 je sintetisano upotrebom sličnih eksperimentalnih uslova koji su opisani za jedinjenja 64 i 65 i oporavljeno je kao HCl so.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.79 (d, J=6.73 Hz, 3 H) 1.01 (d, J=6.73 Hz, 3 H) 2.18 (dd, J=14.49, 7.17 Hz, 1 H) 3.18 - 3.84 (m, 10 H) 4.53 - 4.71 (m, 1 H) 7.24 (s, 1 H) 7.65 (d, J=9.37 Hz, 1 H) 8.01 (d, J=2.64 Hz, 1 H) 8.14 (d, J=1.46 Hz, 1 H) 8.35 (d, J=5.27 Hz, 1 H) 9.14 (s, 1 H) 9.46 (s, 2 H) 11.80 (s, 1 H) LCMS (ESI) 407 (M+H).

Primer 72

Sinteza Jedinjenja 72 (Jedinjenje UUU)

[0365]

[0366] Jedinjenje 72 je sintetisano upotrebom sličnih eksperimentalnih uslova koji su opisani za jedinjenja 64 i 65 i oporavljeno je kao HCl so.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.77 (d, J=7.03 Hz, 3 H) 0.99 (d, J=6.73 Hz, 3 H) 2.10 - 2.24 (m, 1 H) 3.18 - 3.81 (m, 10 H) 4.54 - 4.69 (m, 1 H) 7.22 (s, 1 H) 7.63 (d, J=9.08 Hz, 1 H) 7.99 (d, J=2.63 Hz, 1 H) 8.11 (s, 1 H) 8.33 (d, J=5.27 Hz, 1 H) 9.12 (s, 1 H) 9.43 (s, 2 H) 11.77 (s, 1 H). LCMS (ESI) 407 (M+H).

Primer 73

Sinteza Jedinjenja 73

[0367]

1

[0368] Jedinjenje 73 je sintetisano upotrebom sličnih eksperimentalnih uslova koji su opisani za jedinjenja 64 i 65 i oporavljeno je kao HCl so.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.84 (d, J=6.73 Hz, 3 H) 0.98 (d, J=6.73 Hz, 3 H) 2.12 - 2.26 (m, 1 H) 3.09 (s, 3 H) 3.22 - 3.81 (m, 8 H) 4.01 (dd, J=13.61, 4.25 Hz, 2 H) 4.59 - 4.72 (m, 1 H) 7.19 (s, 1 H) 7.74 (s, 1 H) 7.96 - 8.10 (m, 2 H) 9.08 (s, 1 H) 9.22 (s, 2 H). LCMS (ESI) 421 (M+H).

Primer 74

Sinteza Jedinjenja 74

[0369]

[0370] Jedinjenje 74 je sintetisano upotrebom sličnih eksperimentalnih uslova sa onim koja su opisana za Jedinjenje 63 i oporavljeno je u obliku HCl soli.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.85 (d, J=4.98 Hz, 3 H) 0.95 (d, J=4.98 Hz, 3 H) 1.42 - 1.70 (m, 3 H) 2.77 (d, J=2.93 Hz, 3 H) 3.07 - 4.14 (m, 10 H) 4.95 (s, 1 H) 7.20 (s, 1 H) 7.66 (d, J=9.66 Hz, 1 H) 7.94 (s, 1 H) 8.08 - 8.16 (m, 1 H) 8.33 (d, J=4.68 Hz, 1 H) 9.09 (s, 1 H) 11.38 (s, 1 H) 11.71 (s, 1 H). LCMS (ESI) 435 (M+H).

Primer 75

Sinteza Jedinjenja 75

[0371]

2

[0372] Jedinjenje 75 je sintetisano upotrebom sličnih eksperimentalnih sa opisanim za jedinjenja 64 i 65 i oporavljeno je u obliku HCl soli.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.87 (d, J=6.15 Hz, 3 H) 0.94 (d, J=6.15 Hz, 3 H) 1.57 (d, J=84.61 Hz, 3 H) 3.05 (s, 3 H) 3.13 - 3.55 (m, 8 H) 3.69 (d, J=78.17 Hz, 2 H) 4.90 (s, 1 H) 7.15 (s, 1 H) 7.63 - 7.85 (m, 1 H) 7.93 (s, 1 H) 8.26 (s, 1 H) 9.03 (s, 1 H) 9.20 (s, 2 H). LCMS (ESI) 421 (M+H).

Primer 76

Sinteza Jedinjenja 76

[0373]

[0374] Jedinjenje 76 je sintetisano upotrebom sličnih eksperimentalnih uslova sa onim koji su opisani za Jedinjenje 63 i oporavljeno je u obliku HCl soli.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.85 (d, J=6.44 Hz, 3 H) 0.95 (d, J=6.44 Hz, 3 H) 1.43 - 1.70 (m, 3 H) 2.78 (d, J=2.93 Hz, 3 H) 3.05 (s, 3 H) 3.24 - 3.84 (m, 8 H) 4.01 (d, J=9.66 Hz, 2 H) 4.89 - 5.01 (m, 1 H) 7.15 (s, 1 H) 7.77 (s, 1 H) 7.91 - 8.05 (m, 2 H) 9.03 (s, 1 H) 10.96 - 11.55 (m, 2 H). LCMS (ESI) 449 (M+H).

Primer 77

Sinteza Jedinjenja 77

[0375]

[0376] Jedinjenje 77 je sintetisano upotrebom sličnih eksperimentalnih uslova sa opisanim za jedinjenja 64 i 65 i oporavljeno je kao HCl so.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.83 - 0.88 (d, J=6.15 Hz, 3 H) 0.95 (d, J=6.15 Hz, 3 H) 1.40 - 1.71 (m, 3 H) 3.28 - 3.83 (m, 8 H) 4.00 (d, J=3.22 Hz, 2 H) 4.91 -5.08 (m, 1 H) 7.17 (s, 1 H) 7.68 (d, J=9.66 Hz, 1 H) 7.93 (s, 1 H) 8.07 (s, 1 H) 9.06 (s, 1 H) 9.40 (s, 2 H) 11.59 (s, 1 H). LCMS (ESI) 435 (M+H).

Primer 78

Sinteza Jedinjenja 78

[0377]

[0378] U 0.060 g Jedinjenja 50 (0.205 mmol) je dodat 5-(4-metilpiperazin-1-il)piridin-2-amin (35.42 mg, 0.9 ekv) zatim se dodaje 1,4-dioksan (3 mL). Nakon degasiranja sa azotom, dodaju se Pd2dba3(12 mg), BINAP (16 mg) i natrijum terc-butoksid (24 mg). Sadržaji su zatim zagrejani na 90 stepeni u CEM Discovery mikrotalasnoj 3 h. Reakcija je zatim naneta na kolonu od silika gela i prečišćena je eluiranjem sa DCM/MeOH (0- 15%).<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.75 (t, J=7.47 Hz, 3 H) 0.91 (d, J=6.73 Hz, 3 H) 1.04 - 1.20 (m, 2 H) 1.80 - 1.98 (m, 1 H) 2.77 (d, J=3.81 Hz, 3 H) 2.94 - 3.90 (m, 10 H) 4.54 - 4.68 (m, 1 H) 7.06 - 7.23 (m, 2 H) 7.56 - 7.75 (m, 1 H) 7.90 - 8.12 (m, 2 H) 8.29 (s, 1 H) 9.07 (s, 1 H) 10.98 -11.74 (m, 2 H). LCMS (ESI) 435 (M H).

Primer 79

Sinteza Jedinjenja 79

[0379]

4

[0380] Jedinjenje 79 je sintetisano na sličan način koji je opisan za Jedinjenje 78 nakon čega sledi korak deblokiranja koji je opisan za Jedinjenje 65 i konvertovano je u HCl so.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.75 (t, J=7.3 Hz, 3 H) 0.90 (d, J=6.73 Hz, 3 H) 1.07 - 1.15 (m, 2 H) 1.85 - 1.94 (m, 1 H) 3.17 - 3.75 (m, 10 H) 4.58 - 4.67 (m, 1 H) 7.17 (s, 1 H) 7.71 (s, 1 H) 7.96 (s, 1 H) 7.98 - 8.05 (m, 1 H) 8.28 (d, J=4.10 Hz, 1 H) 9.06 (s, 1 H) 9.39 (s, 2 H). LCMS (ESI) 421 (M+H).

Primer 80

Sinteza Jedinjenja 80

[0381]

[0382] Jedinjenje 80 je sintetisano na sličan način koji je opisan za Jedinjenje 78.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.78 (t, J=7.32 Hz, 3 H) 0.86 (d, J=6.73 Hz, 3 H) 1.13 - 1.21 (m, 2 H) 1.84 - 1.96 (m, 1 H) 2.77 (d, J=4.39 Hz, 3 H) 3.04 (s, 3 H) 3.11 - 3.84 (m, 8 H) 3.98 (dd, J=13.61, 4.25 Hz, 2 H) 4.66 - 4.74 (m, 1 H) 7.17 (s, 1 H) 7.64 (s, 1 H) 7.96 (d, J=2.34 Hz, 1 H) 8.03 - 8.13 (m, 1 H) 9.08 (s, 1 H) 11.26 (s, 1 H) 11.66 (s, 1 H). LCMS (ESI) 449 (M+H).

Primer 81

Sinteza Jedinjenja 81

[0383]

[0384] Jedinjenje je sintetisano na sličan način koji je opisan za Jedinjenje 78 nakon čega sledi korak deblokiranja koji je opisan za Jedinjenje 65 i konvertovano je u HCl so.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.78 (t, J=7.32 Hz, 3 H) 0.85 (d, J=6.73 Hz, 3 H) 1.10 - 1.27 (m, 2 H) 1.82 - 1.99 (m, 1 H) 3.04 (s, 3 H) 3.28 - 3.77 (m, 8 H) 3.97 (dd, J=13.91, 4.54 Hz, 2 H) 4.62 - 4.75 (m, 1 H) 7.07 - 7.24 (m, 1 H) 7.62 -7.75 (m, 1 H) 7.94 (d, J=2.34 Hz, 1 H) 7.97 - 8.08 (m, 1 H) 9.05 (s, 1 H) 9.29 (s, 2 H). LCMS (ESI) 435 (M+H).

Primer 82

Sinteza Jedinjenja 82

[0385]

[0386] Jedinjenje je sintetisano na sličan način koji je opisan za Jedinjenje 78 nakon čega sledi korak deblokiranja koji je opisan za Jedinjenje 65 i konvertovano je u HCl so.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.96 (s, 9 H) 3.15 - 3.87 (m, 10 H) 4.42 - 4.53 (m, 1 H) 6.99 (s, 1 H) 7.24 (s, 1 H) 8.06 (s, 1 H) 8.11 -8.21 (m, 1 H) 8.79 - 8.98 (m, 2 H) 9.25 (s, 2 H) 9.88 (s, 1 H). LCMS (ESI) 421 (M+H).

Primer 83

Sinteza Jedinjenja 83

[0387]

[0388] Jedinjenje 83 je sintetisano na sličan način koji je opisan za Jedinjenje 78 nakon čega sledi korak deblokiranja koji je opisan za Jedinjenje 65 i konvertovano je u HCl so.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.95 (s, 9 H) 2.79 (d, J=4.10 Hz, 3 H) 3.06 - 3.86 (m, 10 H) 4.56 - 4.67 (m, 1 H) 7.17 (s, 1 H) 7.70 (s, 1 H) 7.96 (d, J=2.63 Hz, 1 H) 7.99 - 8.08 (m, 1 H) 8.26 (s, 1 H) 9.06 (s, 1 H) 10.80 (s, 1 H). LCMS (ESI) 435 (M+H).

Primer 84

Sinteza Jedinjenja 84

[0389]

[0390] Jedinjenje 84 je sintetisano na sličan način koji je opisan za Jedinjenje 78 i konvertovano je u HCl so.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.75 - 2.81 (m, 3 H) 3.12 - 3.16 (m, 2 H) 3.46 - 3.54 (m, 4 H) 3.60 - 3.69 (m, 2 H) 3.72 - 3.79 (m, 1 H) 4.07 - 4.18 (m, 2 H) 6.06 - 6.09 (m, 1 H) 6.90 (d, J=7.61 Hz, 2 H) 7.20 - 7.31 (m, 3 H) 7.33 (s, 1 H) 7.49 - 7.55 (m, 1 H) 7.62 - 7.70 (m, 1 H) 7.92 (d, J=2.93 Hz, 1 H) 8.22 (s, 1 H) 9.14 (s, 1 H). LCMS (ESI) 455 (M H).

Primer 85

Sinteza Jedinjenja 85

[0391]

[0392] Jedinjenje 85 je sintetisano na sličan način koji je opisan za Jedinjenje 78 nakon čega sledi korak deblokiranja koji je opisan za Jedinjenje 65 i konvertovano je u HCl so.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3.21 (s, 4 H) 3.35 - 3.67 (m, 5 H) 4.07 - 4.20 (m, 2 H) 6.13 (s, 1 H) 6.90 (d, J=7.32 Hz, 2 H) 7.22 -7.31 (m, 3 H) 7.36 (s, 1 H) 7.48 (d, J=9.37 Hz, 1 H) 7.93 (d, J=2.34 Hz, 1 H) 8.04 - 8.11 (m, 1 H) 8.25 (d, J=4.98 Hz, 1 H) 9.17 (s, 1 H) 11.77 (br, s., 1H). LCMS (ESI) 441 (M H).

Primer 86

Sinteza Jedinjenja 86

[0394] Jedinjenje 86 je sintetisano na sličan način koji je opisan za Jedinjenje 78 nakon čega sledi korak deblokiranja koji je opisan za Jedinjenje 65 i konvertovano je u HCl so.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.90 (d, J=6.15 Hz, 6 H) 1.72 - 1.89 (m, 1 H) 3.15 - 3.92 (m, 9 H) 4.10 - 4.46 (m, 2 H) 7.18 (s, 1 H) 7.59 (d, J=8.78 Hz, 1 H) 8.00 (s, 1 H) 8.13 (d, J=9.37 Hz, 1 H) 8.55 (s, 1 H) 9.09 (s, 1 H) 9.67 (s, 2 H) 11.91 (s, 1 H). LCMS (ESI) 407 (ESI).

Primer 87

Sinteza Jedinjenja 87

[0395]

[0396] Jedinjenje 87 je sintetisano na sličan način koji je opisan za Jedinjenje 86 i konvertovano je u HCl so. Podaci karakterizacije (NMR i LCMS) su bili slični sa dobijenim za antipod Jedinjenje 86.

Jedinjenje 88

Sinteza Jedinjenja 88

[0397]

[0398] Jedinjenje 88 je sintetisano na sličan način koji je opisan za Jedinjenje 78 nakon čega sledi korak deblokiranja koji je opisan za Jedinjenje 65 i konvertovano je u HCl so.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.78 (s, 6 H) 3.40 - 3.53 (m, 6 H) 3.64 - 3.73 (m, 4 H) 7.27 (s, 1 H) 7.66 (d, J=9.37 Hz, 1 H) 7.98 (d, J=2.34 Hz, 1 H) 8.12 (br. s., 1 H) 8.47 (br. s., 1 H) 9.11 (s, 1 H) 9.45 (br. s., 2 H) 11.62 (br. s., 1 H). LCMS (ESI) 393 (M H).

Primer 89

Sinteza Jedinjenja 89 (takođe označeno kao Jedinjenje T)

[0399]

[0400] Jedinjenje 89 je sintetisano na sličan način koji je opisan za Jedinjenje 78 i konvertovano je u HCl so.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.47 (br. s., 6 H) 1.72 (br. s., 2 H) 1.92 (br. s., 2 H) 2.77 (br. s., 3 H) 3.18 (br. s., 2 H) 3.46 (br. s., 2 H) 3.63 (br. s., 2 H) 3.66 (d, J=6.15 Hz, 2 H) 3.80 (br. s., 2 H) 7.25 (s, 1 H) 7.63 (br. s., 2 H) 7.94 (br. s., 1 H) 8.10 (br. s., 1 H) 8.39 (br. s., 1 H) 9.08 (br. s., 1 H) 11.59 (br. s., 1 H). LCMS (ESI) 447 (M H).

Primer 90

Sinteza Jedinjenja 90 (takođe označeno kao Jedinjenje Q)

[0401]

[0402] Jedinjenje 90 je sintetisano na sličan način sa onim koji je opisan za Jedinjenje 78 nakon čega sledi korak deblokiranja koji je opisan za Jedinjenje 65 i konvertovano je u HCl so.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.27 - 1.64 (m, 6 H) 1.71 (br. s., 2 H) 1.91 (br. s., 2 H) 2.80 (br. s., 1 H) 3.17 - 3.24 (m, 2 H) 3.41 (br. s., 4 H) 3.65 (br. s., 4 H) 7.26 (br. s., 1 H) 7.63 (br. s., 1 H) 7.94 (br. s., 1 H) 8.13 (br. s., 1 H) 8.40 (br. s., 1 H) 9.09 (br. s., 1 H) 9.62 (br. s., 1 H) 11.71 (br. s., 1 H). LCMS (ESI) 433 (M H).

Primer 91

Sinteza Jedinjenja 91 (takođe označeno kao Jedinjenje ZZ)

[0403]

[0404] Jedinjenje 91 je sintetisano upotrebom sličnih uslova sa onim koji su opisani za Jedinjenje 78 i konvertovano je u HCl so.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.64 - 1.75 (m, 2 H) 1.83 - 1.92 (m, 2 H) 1.96 - 2.06 (m, 2 H) 2.49 - 2.58 (m, 2 H) 2.79 (d, J=3.81 Hz, 3 H) 3.06 - 3.18 (m, 4 H) 3.59 - 3.69 (m, 2 H) 3.73 - 3.83 (m, 2 H) 4.04 - 4.12 (m, 2 H) 7.17 (br. s., 1 H) 7.60 - 7.70 (m, 2 H) 7.70 - 7.92 (m, 2 H) 7.96 (br. s., 1 H) 8.41 (br. s., 1 H) 8.98 (br. s., 1 H) 10.77 (br. s., 1 H). LCMS (ESI) 433 (M H).

Primer 92

Sinteza Jedinjenja 92

[0405]

[0406] Jedinjenje 92 je sintetisano na sličan način koji je opisan za Jedinjenje 78 nakon čega sledi korak deblokiranja koji je opisan za Jedinjenje 65 i konvertovano je u HCl so.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.64 - 1.75 (m, 2 H) 1.84 - 1.92 (m, 2 H) 1.96 - 2.05 (m, 2 H) 2.48 - 2.56 (m, 2 H) 3.22 (br. s., 4 H) 3.42 - 3.48 (m, 4 H) 3.60 - 3.69 (m, 2 H) 4.05 - 4.13 (m, 1 H) 7.18 (s, 1 H) 7.65 (d, J=13.47 Hz, 1 H) 7.70

1

- 7.77 (m, 1 H) 7.94 (d, J=1.76 Hz, 1 H) 8.42 (br. s., 1 H) 9.00 (s, 1 H) 9.15 (br. s., 2 H). LCMS (ESI) 419 (M H).

Primer 93

Sinteza Jedinjenja 93

[0407]

[0408] Jedinjenje 93 je sintetisano na sličan način koji je opisan za Jedinjenje 78 nakon čega sledi korak deblokiranja koji je opisan za Jedinjenje 65 i konvertovano je u HCl so.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.76 (br. s., 2 H) 1.89 (br. s., 2 H) 2.03 (br. s., 2 H) 2.47 - 2.58 (m, 2 H) 3.04 (s, 3 H) 3.22 (br. s., 4 H) 3.39 (br. s., 4 H) 3.66 (s, 2 H) 7.21 (s, 1 H) 7.67 (d, J=9.37 Hz, 1 H) 7.93 (br. s., 1 H) 7.98 - 8.09 (m, 1 H) 9.04 (s, 1 H) 9.34 (br. s., 2 H) 11.31 (br. s., 1 H). LCMS (ESI) 433 (M H).

Primer 94

Sinteza Jedinjenja 94

[0409]

[0410] Jedinjenje 94 je sintetisano upotrebom sličnih uslova koji su opisani za Jedinjenje 78 i konvertovano je u HCl so.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.66 - 1.77 (m, 2 H) 1.84 - 1.94 (m, 2 H) 1.96 - 2.08 (m, 2 H) 2.48 - 2.57 (m, 2 H) 3.36 - 3.52 (m, 4 H) 3.60 - 3.80 (m, 6 H) 7.21 (s, 1 H) 7.53 - 7.74 (m, 2 H) 7.86 (s, 1 H) 8.02 (s, 1 H) 8.45 (s, 1 H) 9.03 (s, 1 H) 11.19 (br. s., 1 H). LCMS (ESI) 420 (M+H).

Primer 95

1 1

Sinteza Jedinjenja 95

[0411]

[0412] Jedinjenje 95 je sintetisano upotrebom sličnih uslova koji su opisani za Jedinjenje 78 i konvertovano je u HCl so.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.65 - 1.79 (m, 2 H) 1.85 - 1.95 (m, 2 H) 1.97 - 2.08 (m, 2 H) 2.47 - 2.54 (m, 2 H) 3.40 - 3.58 (m, 5 H) 3.65 (dd, J=21.67, 5.56 Hz, 1 H) 3.69 - 3.78 (m, 4 H) 7.24 (s, 1 H) 7.97 - 8.17 (m, 2 H) 8.48 (s, 1 H) 9.08 (s, 1 H) 11.81 (s, 1 H). LCMS (ESI) 421 (M+H).

Primer 96

Sinteza Jedinjenja 96

[0413]

[0414] Jedinjenje 96 je sintetisano upotrebom sličnih uslova koji su opisani za Jedinjenje 78 i konvertivano je u HCl so.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.55 - 1.74 (m, 2 H) 1.80 - 1.98 (m, 4 H) 2.48 - 2.60 (m, 2 H) 3.40 - 3.50 (m, 4 H) 3.57 - 3.72 (m, 2 H) 3.90 - 4.20 (m, 4 H) 7.08 (s, 1 H) 7.37 - 7.57 (m, 2 H) 7.70 (m, 2 H) 8.32 (s, 1 H) 8.88 (s, 1 H) 9.98 (s, 1 H). LCMS (ESI) 419 (M+H).

Primer 97

Sinteza Jedinjenja 97 (takođe označeno kao Jedinjenje III)

[0415]

1 2

[0416] Jedinjenje 97 je sintetisano upotrebom sličnih uslova koji su opisani za Jedinjenje 78 I konvertovano je u HCl so.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.30 (d, J=5.27 Hz, 6 H) 1.65 - 1.78 (m, 2 H) 1.83 - 1.95 (m, 2 H) 1.97 - 2.10 (m, 2 H) 2.45 - 2.55 (m, 2H) 3.25 - 3.36 (m, 1 H) 3.39 - 3.48 (m, 4 H) 3.60 - 3.70 (m, 4 H) 3.75 - 4.15 (m, 2 H) 7.24 (s, 1 H) 7.54 - 7.75 (m, 2 H) 7.95 (s, 1 H) 8.10 (s, 1 H) 8.49 (s, 1 H) 9.07 (s, 1 H) 11.25 (s, 1 H) 11.48 (s, 1 H). LCMS (ESI) 461 (M+H).

Primer 98

Sinteza Jedinjenja 98

[0417]

[0418] Jedinjenje 98 je sintetisano upotrebom sličnih uslova koji su opisani za Jedinjenje 78 i konvertovano je u HCl so.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.99 (d, J=6.15 Hz, 6 H) 1.65 - 1.78 (m, 2 H) 1.90 (m, 2 H) 1.97 - 2.08 (m, 2 H) 2.08 - 2.17 (m, 1 H) 2.45 - 2.55 (m, 2H) 2.88 - 3.02 (m, 2 H) 3.33 - 3.48 (m, 4 H) 3.50 - 3.90 (m, 6 H) 7.24 (s, 1 H) 7.67 (s, 2 H) 7.94 (s, 1 H) 8.12 (s, 1 H) 8.49 (s, 1 H) 9.07 (s, 1 H) 10.77 (s, 1 H) 11.51 (s, 1 H). LCMS (ESI) 475 (M+H).

Primer 99

Sinteza Jedinjenja 99

[0419]

1

[0420] Jedinjenje 99 je sintetisano upotrebom sličnih uslova koji su opisani za Jedinjenje 78 I konvertovano je u HCl so.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.13 (d, J=5.86 Hz, 6 H) 1.66 - 1.77 (m, 2 H) 1.84 - 1.94 (m, 2 H) 1.97 - 2.09 (m, 2 H) 2.40 - 2.53 (m, 2 H) 3.37 - 3.49 (m, 2 H) 3.50 - 3.59 (m, 2 H) 3.59 - 3.73 (m, 4 H) 7.23 (s, 1 H) 7.64 (m, 3 H) 7.85 (s, 1 H) 8.11 (s, 1 H) 8.47 (s, 1 H) 9.05 (s, 1 H).

11.35 (br s., 1H). LCMS (ESI) 448 (M+H).

Primer 100

Sinteza Jedinjenja 100

[0421]

[0422] Jedinjenje 100 je sintetisano upotrebom sličnih uslova koji su opisani za Jedinjenje 78 i konvertovano je u HCl so.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.50 - 1.57 (m, 2 H) 1.62 - 1.68 (m, 3 H) 1.68 - 1.75 (m, 2 H) 1.84 - 1.92 (m, 2 H) 1.97 - 2.08 (m, 2 H) 2.48 - 2.53 (m, 2 H) 3.14 - 3.23 (m, 4 H) 3.43 - 3.47 (m, 2 H) 3.58 - 3.70 (m, 2 H) 7.22 (s, 1 H) 7.58 - 7.70 (m, 2 H) 7.85 - 8.00 (m, 1 H) 8.16 (d, 1 H) 8.46 (s, 1 H) 9.04 (s, 1 H) 11.37 (br s., 1H). LCMS (ESI) 418 (M H).

Primer 101

Sinteza Jedinjenja 101 (takođe označeno kao Jedinjenje WW)

[0423]

1 4

[0424] Jedinjenje 101 je sintetisano upotrebom sličnih uslova koji su opisani za Jedinjenje 78 i konvertovano je u HCl so.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.72 (s, 2 H) 1.90 (s, 4 H) 2.03 (s, 2 H) 2.21 (s, 2 H) 2.48 - 2.54 (m, 2 H) 2.73 (s, 2 H) 3.03 (s, 2 H) 3.25 - 3.35 (m, 1 H) 3.38 - 3.48 (m, 4 H) 3.65 - 3.99 (m, 5 H) 7.23 (s, 1 H) 7.63 (d, J=9.66 Hz, 1 H) 7.90 (s, 1 H) 8.13 (s, 1 H) 8.47 (s, 1 H) 9.06 (s, 1 H) 10.50 (br s., 1H). LCMS (ESI) 503 (M H).

Primer 102

Sinteza Jedinjenja 102 (takođe označeno kao Jedinjenje HHH)

[0425]

[0426] Jedinjenje 102 je sintetisano upotrebom sličnih uslova koji su opisani za Jedinjenje 78 I konvertovano je u HCl so.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.63 - 1.85 (m, 6 H) 1.87 - 1.92 (m, 2 H) 1.99 - 2.06 (m, 2 H) 2.15 - 2.23 (m, 2 H) 2.47 - 2.53 (m, 1 H) 2.69 - 2.79 (m, 2 H) 2.81 - 2.91 (m, 2 H) 2.98 - 3.08 (m, 2 H) 3.32 - 3.48 (m, 4 H) 3.57 - 3.72 (m, 4 H) 3.77 - 3.85 (m, 2 H) 7.22 (s, 1 H) 7.60 - 7.68 (m, 2 H) 7.90 (s, 1 H) 8.07 (s, 1 H) 8.46 (s, 1 H) 9.04 (s, 1 H).11.41 (br s., 1H). LCMS (ESI) 501 (M H).

Primer 103

Sinteza Jedinjenja 103

[0427]

1

[0428] Jedinjenje 103 je sintetisano upotrebom sličnih uslova koji su opisani za Jedinjenje 78 i konvertovano je u HCl so.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.64 - 1.76 (m, 2 H) 1.87 - 1.93 (m, 2 H) 2.00 - 2.07 (m, 2 H) 2.48 - 2.53 (m, 2 H) 2.67 - 2.72 (m, 4 H) 3.44 - 3.47 (m, 2 H) 3.50 - 3.55 (m, 4 H) 7.24 (s, 1 H) 7.61 (d, J=9.37 Hz, 2 H) 7.86 (d, J=2.63 Hz, 1 H) 8.09 (d, J=12.88 Hz, 1 H) 8.48 (s, 1 H) 9.06 (s, 1 H) 11.41 (br s., 1H). LCMS (ESI) 436 (M H).

Primer 104

Sinteza Jedinjenja 104

[0429]

[0430] Jedinjenje 104 je sintetisano upotrebom sličnih uslova koji su opisani za Jedinjenje 78 i konvertovano je u HCl so.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.29 (d, J=6.73 Hz, 6 H) 1.66 - 1.79 (m, 2 H) 1.84 - 1.95 (m, 2 H) 1.98 - 2.09 (m, 2 H) 2.46 - 2.55 (m, 2 H) 3.29 - 3.39 (m, 2H) 3.58 - 3.70 (m, 4H) 3.77 - 3.86 (m, 4H) 7.24 (s, 1 H) 7.66 (d, J=9.37 Hz, 1 H) 7.96 (d, J=2.93 Hz, 1 H) 8.08 (s, 1 H) 8.48 (s, 1 H) 9.06 (s, 1 H) 9.28 (s, 1 H) 9.67 (s, 1 H) 11.36 (s, 1H). LCMS (ESI) 447 (M H).

Primer 105

Sinteza Jedinjenja 105

[0431]

1

[0432] Jedinjenje 105 je sintetisano upotrebom sličnih uslova koji su opisani za Jedinjenje 78 i konvertovano je u HCl so.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.73 (s, 2 H) 1.76 - 1.85 (m, 2 H) 1.85 -1.94 (m, 2 H) 1.98 - 2.07 (m, 2 H) 2.19 - 2.26 (m, 2 H) 2.48 - 2.52 (m, 1 H) 2.70 - 2.81 (m, 4 H) 3.13 -3.20 (m, 1 H) 3.30 - 3.48 (m, 3 H) 3.58 - 3.71 (m, 4 H) 3.78 - 3.84 (m, 4 H) 7.24 (s, 1 H) 7.62 (d, J=9.37 Hz, 2 H) 7.89 (d, J=1.17 Hz, 1 H) 8.09 - 8.18 (m, 1 H) 8.48 (s, 1 H) 9.06 (s, 1 H) 11.46 (br s., 1H). LCMS (ESI) 519 (M H).

Primer 106

Sinteza Jedinjenja 106

[0433]

[0434] Jedinjenje 106 je sintetisano upotrebom sličnih uslova koji su opisani za Jedinjenje 78 nakon čega sledi korak deblokiranja koji je opisan za Jedinjenje 65 i konvertovano je u HCl so.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.65 - 1.75 (m, 2 H) 1.85 - 1.93 (m, 2 H) 1.93 - 1.99 (m, 1 H) 2.00 - 2.06 (m, 2 H) 2.08 - 2.14 (m, 1 H) 2.47 - 2.55 (m, 2 H) 3.07 - 3.25 (m, 2 H) 3.25 - 3.69 (m, 5 H) 4.46 (s, 1 H) 4.67 (s, 1 H) 7.22 (s, 1 H) 7.58 - 7.69 (m, 2 H) 8.46 (s, 1 H) 9.02 (s, 1 H) 9.34 (s, 1 H) 9.65 (s, 1 H). LCMS (ESI) 431 (M H).

Primer 107

Sinteza Jedinjenja 107 (takođe označeno kao Jedinjenje YY)

1

[0436] Jedinjenje 107 je sintetisano upotrebom sličnih uslova koji su opisani za Jedinjenje 78 i konvertovano je u HCl so.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.65 - 1.82 (m, 3 H) 1.89 (br. s., 2 H) 1.98 - 2.08 (m, 2 H) 2.13 (br. s., 2 H) 2.47 - 2.55 (m, 2 H) 2.68 (d, J=4.98 Hz, 6 H) 2.71 - 2.80 (m, 2 H) 3.29 - 3.71 (m, 10 H) 7.16 - 7.26 (m, 1 H) 7.67 (d, J=9.66 Hz, 2 H) 7.91 (d, J=2.05 Hz, 1 H) 8.14 (br. s., 1 H) 8.48 (br. s., 1 H) 9.05 (s, 1 H) 11.14 (br. s., 1 H) 11.43 (br.

s., 1 H). LCMS (ESI) 461 (M H).

Primer 108

Sinteza Jedinjenja 108

[0437]

[0438] Jedinjenje 108 je sintetisano na način koji je sličan onom koji je opisan za jedinjenja 64 i 65 i oporavljeno je kao HCl so. Analitički podaci su u skladu sa onim koji su opisani za antipod jedinjenje 75.

Primer 109

Sinteza Jedinjenja 109

[0439]

1

[0440] Jedinjenje 109 je sintetisano na način koji je sličan onom koji je opisan za jedinjenja 64 i 65 i oporavljeno je kao HCl so. Analitički podaci su u skladu sa onim koji su opisani za antipod jedinjenje 75.

Primer 110

Sinteza Jedinjenja 110

[0441]

[0442] Jedinjenje 110 je sintetisano na sličan način kao što je opisano za Jedinjenje 78 i zatim je konvertovano u njegovu hidrohloridnu so.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.50 - 1.65 (m, 1 H) 1.92 - 2.02 (m, 3 H) 2.06 - 2.15 (m, 1 H) 2.78 (d, J=3.81 Hz, 4 H) 3.10 - 3.20 (m, 4 H) 3.47 - 3.51 (m, 2 H) 3.64 - 3.71 (m, 1 H) 3.76 - 3.83 (m, 2 H) 3.98 - 4.14 (m, 1 H) 7.20 (s, 2 H) 7.77 (s, 1 H) 7.97 (s, 2 H) 8.81 (s, 1 H) 9.03 (s, 1 H) 10.97 (br s., 1H). LCMS (ESI) 419 (M H).

Primer 111

Sinteza Jedinjenja 111

[0443]

1

[0444] Jedinjenje 111 je sintetisano na sličan način koji je opisan za Jedinjenje 78 i nakon čega je konvertovano u njegovu hidrohloridnu so.<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.54 - 1.59 (m, 1 H) 1.92 - 2.01 (m, 3 H) 2.06 - 2.15 (m, 1 H) 2.76 - 2.84 (m, 1 H) 3.17 - 3.24 (m, 6 H) 3.64 - 3.71 (m, 2 H) 4.02 - 4.11 (m, 2 H) 7.22 (s, 2 H) 7.64 (s, 1 H) 7.97 (s 2 H) 8.75 (s, 1 H) 8.97 (s, 1 H) 9.21 (s, 1 H). LCMS (ESI) 405 (M H).

Primer 112

Sinteza Jedinjenja 112

[0445]

[0446] Jedinjenje 112 je sintetisano upotrebom sličnih eksperimentalnih uslova koji su opisani za jedinjenje 64.

Primer 113

Sinteza terc-butil N-[2-[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]etil]karbamata, Jedinjenje 113

[0447]

[0448] U rastvor 5-bromo-2,4-dihloroprimidina (12.80 g, 0.054 mola) u etanolu (250 mL) dodaje se Hunig-ova baza (12.0 mL) nakon čega je dodat rastvor N-(terc-butoksikarbonil)-1,2-diaminoetana (10 g, 0.0624 mol) u etanolu (80 mL). Sadržaji su mešani preko noći 20 h. Rastvarač je isparavan pod vakuumom. Etil acetat (800 mL) i voda (300 mL) su dodati i slojevi su razdvojeni. Organski sloj je osušen sa magnezijum sulfatom i zatim je koncentrovan pod vakuumom. Hromatografija na koloni od silika gela upotrebom heksana/etil acetata (0- 60%) je omogućila dobijanje terc-butil N-[2-[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]etil]karbamata. LCMS (ESI) 351 (M H).

Primer 114

11

Sinteza terc-butil N-[2-[[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4 il]amino]etil]karbamata, Jedinjenje 114

[0449]

[0450] U terc-butil N-[2-[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]etil]karbamat (5 g, 14.23 mmola) u toluenu (42 mL) i trietilaminu (8.33 mL) pod azotom je dodat trifenil arsin (4.39 g), 3,3-dietoksiprop-1-in (3.24 mL) i Pddba (1.27 g). Sadržaji su zagrejani na 70 stepeni 24 h. Posle ceđenja kroz CELITE®, sirova reakcija je provučena kroz kolonu upotrebom heksan/etil acetata (0- 20%) da se dobije željeni proizvod 3.9 g). Hromatografija željenog ostataka na koloni upotrebom heksan/etil acetata (0- 30%) je omogućila dobijanje terc-butil N-[2-[[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4-il]amino]etil]karbamata. LCMS (ESI) 399 (M H).

Primer 115

Sinteza terc-butil N-[2-[2-hloro-6-(dietoksimetil)pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il]etil]karbamata, Jedinjenje 115

[0451]

[0452] U rastvor Jedinjenja 114 (3.9 g, 0.00976 mola) u THF (60 mL) je dodat TBAF (68.3 mL, 7ekv). Sadržaji su zagrejani do 45 stepeni 2 h. Koncentrovanje koje prati hromatografija na koloni upotrebom etil acetata/heksanu (0-50%) je omogućila dobijanje terc-butil N-[2-[2-hloro-6-(dietoksimetil)pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il]etil]karbamata kao svetlo braon tečnosti (1.1 g).<1>HNMR (d6-DMSO) δ ppm 8.88 (s, 1H), 6.95 (brs, 1H), 6.69 (s, 1H), 5.79 (s, 1H), 4.29 (m, 2H), 3.59 (m, 4H), 3.34 (m, 1H), 3.18 (m, 1H), 1.19 (m, 9H), 1.17 (m, 6H). LCMS (ESI) 399 (M+H).

Primer 116

Sinteza terc-butil N-[2-[2-hloro-6-(dietoksimetil)-5-jodo-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il]etil]karbamata, Jedinjenje 116

[0453]

[0454] U terc-butil N-[2-[2-hloro-6-(dietoksimetil)pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il]etil]karbamatu (0.1 g, 0.00025 mola) u acetonitrilu (2 mL) je dodat 1,3-dijodo-5,5-dimetilhidantoin (95 mg, 1 ekv), i čvrsti NaHCO3(63 mg, 3 ekv). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi 16 h. Reakcija je proceđena i koncentrovana u vakuumu. Proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni od silika gela upotrebom heksan/etilacetata (0 - 50%) da se dobije terc-butil N-[2-[2-hloro-6-(dietoksimetil)-5-jodo-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il]etil]karbamat kao bledo žuta čvrsta supstanca (0.03 g). LCMS (ESI) 525 (M H).

Primer 117

Sinteza terc-Butil N-[2-[2-hloro-6-(dietoksimetil)-5-(o-tolil)pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il]etil]karbamata, Jedinjenje 117

[0455]

[0456] U terc-butil N-[2-[2-hloro-6-(dietoksimetil)-5-iodo-pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il]etil]karbamat (0.1g, 0.19 mmola) u dioksanu (3 mL) je dodata 2-metilfenilborna kiselina (28 mg), tetrakis(trifenilfosfin)paladijum (25 mg) i kalijum fosfat (250 mg) u vodi (0.3 mL). Reakcija je zagrejana u CEM Discovery mikrotalasnoj na 90 °C 3 h. Sirova reakcija je naneta na gel od silike i postavljena na kolonu upotrebom heksana/etil acetatu (0 - 30%) da se dobije terc-butil N-[2-[2-hloro-6-(dietoksimetil)-5-(o-tolil)pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il]etil]karbamat (0.06 g). LCMS (ESI) 489 (M H). Primer 118

Sinteza 7-[2-(terc-butoksikarbonilamino)etil]-2-hloro-5-(o-tolil)pirolo[2,3-d]primidin-6-karboksilna kiselina, Jedinjenje 118

[0457]

[0458] U terc-butil N-[2-[2-hloro-6-(dietoksimetil)-5-(o-tolil)pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il]etil]karbamat (0.85 g, 1.74 mmola) u AcOH (10 mL) je dodata voda (1.5 mL). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi 16 h. Sirova reakcija je zatim koncentrovana pod vakuumom. Nakon dodavanja etil acetata (50 mL), organski sloj je ispran sa zas. NaHCO3. Organski sloj je osušen sa magnezijum sulfatom i zatim je koncentrovan pod vakuumom da se dobije sirovi intermedijar, terc-butil N-[2-[2-hloro-6-formil-5-(o-tolil)pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il]etil]karbamat. U ovaj sirovi intermedijar u DMF (5 mL) se zatim dodaje okson (1.3 g). Posle mešanja 2.5 h, dodati su voda (20 mL) i etil acetat (100 mL). Organski sloj je razdvojen, osušen i zatim je koncentrovan pod vakuumom da se dobije sirovi proizvod koji je postavljen na kolonu preko silika gela upotrebom heksana/etil acetata (0 - 50%) da se dobije 7-[2-(terc-butoksi-karbonilamino)etil]-2-hloro-5-(o-tolil)pirolo[2,3-d]primidin-6-karboksilna kiselina (0.112 g). LCMS (ESI) 431 (M H).

Jedinjenje 119

Sinteza Jedinjenja 119

[0459]

11

[0460] U 7-[2-(terc-butoksikarbonilamino)etil]-2-hloro-5-(o-tolil)pirolo[2,3-d]primidin-6-karboksilnu kiselinu (0.1 g, 0.261 mmol) u DCM (4.1 mL) je dodat DMAP (20 mg) nakon čega se dodaje N,N’-diizopropilkarbodiimid (0.081 mL, 2ekv). Posle mešanja 3 h, dodata je TFA (0.723 mL). Mešanje se zatim nastavlja dodatnih 30 minuta. Reakciona smeša je neutralizovana sa zas. NaHCO3. Zatim je dodat DCM (20 mL) i organski sloj je razdvojen, osušen sa magnezijum sulfatom i zatim je koncentrovan pod vakuumom da se dobije sirovi proizvod koji je postavljen na kolonu upotrebom heksan/etilacetata (0-100%) da se dobije hloro triciklični amid Jedinjenja 119 (0.65 g). LCMS (ESI) 313 (M H).

Primer 120

Sinteza Jedinjenja 120

[0461]

[0462] U hloro triciklični amid (0.040 g, 0.128 mmola) (Jedinjenje 119) u dioksanu (2.5 mL) pod azotom je dodat Pd2(dba)3(12 mg), natrijum terc-butoksid (16 mg), BINAP (16 mg) i 4-morfolinoanilin (22.7 mg, 1 ekv). Reakciona smeša je zagrejana na 90 °C u CEM Discovery mikrotalasnoj 3.0 h. Sirova reakcija je naneta na kolonu od silika gela i sadržaji su eluirani sa DCM/MeOH (0-6%) da se dobije proizvod (10 mg). LCMS (ESI) 455 (M H).<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.14 (s, 3 H) 3.23 - 3.50 (m, 2 H) 3.57 - 3.73 (m, 2 H), 3.81 - 3.92 (m, 8H), 7.11 -7.31 (m, 4 H) 7.31 - 7.48 (m, 1 H) 7.58 - 7.73 (m, 1 H) 7.77 -7.95 (m, 2 H) 8.05 - 8.21 (m, 1 H) 8.44 (s, 1 H) 9.85 - 10.01 (m, 1 H).

Primer 121

Sinteza Jedinjenja 121

[0463]

[0464] U hloro triciklični amid (0.024 g) (Jedinjenje 119) u N-metil-2-pirolidonu (NMP) (1.5 mL) je dodat trans-4-aminocikloheksanol (0.0768 mmol, 26.54 mg, 3 ekv) i Hunigova baza (0.4 mL). Reakcija je zagrejana u CEM Discovery mikrotalasnoj posudi na 150 °C 1.2 h. Sirova reakcija je naneta na kolonu od silika gela i sadržaji su eluirani sa DCM/MeOH (0 - 10%) da se dobije proizvod (21 mg). LCMS (ESI) 392 (M H).<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.23 (d, J=8.78 Hz, 4 H) 1.84 (br. s., 4 H) 2.11 (s, 3 H) 3.34 - 3.43 (m, 1 H) 3.55 (br. s., 2 H) 3.72 (br. s., 1 H) 4.13 (br. s., 2 H) 4.50 (br. s., 1 H) 7.03 (br. s., 1 H) 7.12 - 7.28 (m, 4 H) 7.96 (br. s., 1 H) 8.18 (br. s., 1 H).

Primer 122

Sinteza7-[2-(terc-butoksikarbonilamino)etil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]primidin-6-karboksilna kiselina, Jedinjenje 122

[0465]

[0466] 7-[2-(terc-butoksikarbonilamino)etil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]primidin-6-karboksilna kiselina je sintetisana upotrebom sličnog eksperimentalnog postupka kao što je opisano za sintezu 7-[2-(tercbutoksikarbonilamino)etil]-2-hloro-5-(o-tolil)pirolo[2,3-d]primidin-6-karboksilnu kiselinu. LCMS (ESI) 341 (M H).

Primer 123

Sinteza Jedinjenja 123

[0467]

[0468] Hloro triciklični amid, Jedinjenje 123, je sintetisan upotrebom sličnog eksperimentalnog posupka kao što je opisan za sintezu hloro tricikličnog amida (Jedinjenje 119). LCMS (ESI) 223 (M H).

Primer 124

Sinteza Jedinjenja 124

[0469]

11

[0470] U hloro triciklični amid, Jedinjenje 123 (0.035 g, 0.00157 mol) u NMP (1.5 mL) je dodata Hunigova baza (0.3 mL) zatim se dodaje trans-4-aminocikloheksanol (54.2 mg). Reakciona smeša je zagrejana na 150 °C 1.5 h. Sirova reakcija se nanosi na kolonu od silika gela i kolona je eluirana sa DCM/MeOH (0 - 10%) da se dobije proizvod (5 mg). LCMS (ESI) 302 (M H).

Primer 125

Sinteza terc-butil N-[2-[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]-2-metilpropil]karbamata, Jedinjenje 125

[0471]

[0472] terc-butil N-[2-[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]-2-metil-propil]karbamat je sintetisan tretiranjem 5-bromo-2,4-dihloroprimidina sa terc-butil N-(2-amino-2-metil-propil)karbamatom upotrebom sličnih eksperimentalnih uslova kao što je opisano za sintezu terc-butil N-[2-[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]etil]karbamata. LCMS (ESI) (M+H) 379.

Primer 126

Sinteza terc-butil N-[2-[[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4-il]amino]-2-metilpropilkarbamata, Jedinjenje 126

[0473]

11

[0474] terc-butil N-[2-[[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4-il]amino]-2-metilpropil]karbamat je sintetisan tretiranjem terc-butil N-[2-[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]-2-metil-propil]karbamata sa 3,3-di-etoksiprop-1-inom u prisustvu katalizatora kao što je Pddba upotrebom sličnih eksperimentalnih uslova kao što je opisano za sintezu terc-butil N-[2-[[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4il]amino]etil]karbamata. LCMS (ESI) (M+H) 427.

Primer 127

Sinteza terc-butil N-[2-[2-hloro-6-(dietoksimetil)pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il]-2-metilpropil]karbamata, Jedinjenje 127

[0475]

[0476] terc-butil N-[2-[2-hloro-6-(dietoksimetil)pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il]-2-metilpropil]karbamat je sintetisan tretiranjem terc-butil N-[2-[[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4-il]amino]-2-metil-propil]karbamata sa TBAF upotrebom sličnih eksperimentalnih uslova kao što je opisano za sintezu terc-butil N-[2-[2-hloro-6-(dietoksimetil)pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il]etil]karbamata. LCMS (ESI) (M+H) 427.

Primer 128

Sinteza 7-[2-(terc-butoksikarbonilamino)-1,1-dimetil-etil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]primidin-6-karboksilne kiseline, Jedinjenje 128

[0477]

11

[0478] 7-[2-(terc-butoksikarbonilamino)-1,1-dimetil-etil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]primidin-6-karboksilna kiselina je sintetisana upotrebom sličnog eksperimentalnog postupka kao što je opisano za sintezu 7-[2-(terc-butoksikarbonilamino)etil]-2-hloro-5-(o-tolil)pirolo[2,3-d]primidin-6-karboksilne kiseline. LCMS (ESI) 369 (M H).

Primer 129

Sinteza Jedinjenja 129

[0479]

[0480] Hloro triciklični amid, Jedinjenje 129, je sintetisano upotrebom sličnog postupka kao što je opisano za sitezu hloro tricikličnog amida, Jedinjenje 119. LCMS (ESI) 251 (M H).

Primer 130

Sinteza Jedinjenja 130

[0481]

[0482] Jedinjenje 130 je sintetisano tretiranjem hlorotricikličnog amina Jedinjenja 129 sa trans-4-aminocikloheksanolom upotrebom sličnih eksperimentalnih uslova kao za Jedinjenje 124. LCMS (ESI) 330 (M H).<1>HNMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.07 - 1.34 (m, 4 H) 1.47 - 2.05 (m, 10 H) 3.09 (m, 1H) 3.51 (d, J = 2.91 Hz, 2 H) 3.57 (m, 1H) 4.50 (br. s., 1 H) 6.89 (s, 1 H) 6.94 - 7.05 (m, 1 H) 8.04 (br. s., 1 H) 8.60 (s, 1 H) 9.00 (br. s., 1 H).

Primer 131

Sinteza benzil N-[1-[[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]metil]propil]karbamata, Jedinjenje 131 [0483]

11

[0484] Benzil N-[1-[[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]metil]propil]karbamat je sintetisan tretiranjem 5-bromo-2,4-dihloroprimidina sa benzil N-[1-(aminometil)propil]karbamatom upotrebom sličnih eksperimentalnih uslova kao što je opisano za sintezu terc-butil N-[2-[(5-bromo-2-hloropirimidin-4-il)amino]etil]karbamata. LCMS (ESI) (M+H) 413.

Primer 132

Sinteza benzil N-[1-[[[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4-il]amino]metil]propil]karbamata, Jedinjenje 132

[0485]

[0486] Benzil N-[1-[[[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4-il]amino]metil]propil]karbamat je pripremljen tretiranjem benzil N-[1-[[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]metil]propil]-karbamata sa 3,3-dietoksiprop-1-inom u prisustvu katalizatora kao što je Pddba upotrebom sličnih eksperimentalnih uslova opisnanih za sintezu terc-butil N-[2-[[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4-il]amino]etil]karbamata LCMS (ESI) (M+H) 461.

Primer 133

Sinteza benzil N-[1-[[2-hloro-6-(dietoksimetil)pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il] metil]propil]karbamata, Jedinjenje 133

[0487]

11

[0488] Benzil N-[1-[[2-hloro-6-(dietoksimetil)pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il]metil]propil]karbamat je sintetisan tretiranjem benzil N-[1-[[[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4-il]amino]metil]propil]karbamata sa TBAF upotrebom sličnih eksperimentalnih uslova kao što je opisano za sintezu terc-butil N-[2-[2-hloro-6-(dietoksimetil)pirolo[2,3 d]pirimidin-7-il]etil]karbamata. LCMS (ESI) (M+H) 461.

Primer 134

Sinteza 7-[2-(benziloksikarbonilamino)butil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]primidin-6-karboksilne kiseline, Jedinjenje 134

[0489]

[0490] 7-[2-(benziloksikarbonilamino)butil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]primidin-6-karboksilna kiselina je sintetisana upotrebom sličnog eksperimentalnog postupka kao što je opisano za sintezu 7-[2-(tercbutoksikarbonilamino)etil]-2-hloro-5-(o-tolil)pirolo[2,3-d]primidin-6-karboksilne kiseline. LCMS (ESI) 403 (M H).

Primer 135

Sinteza Jedinjenja 135

[0491]

[0492] U rastvor 7-[2-(benziloksikarbonilamino)butil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]primidin-6-karboksilne kiseline u dihlorometanu je dodat HBr, reakcija je mešana na 45 stepeni 3 h. Nakon koncentrovanja, dodaje se 2N NaOH za pojačanje baznosti (pH = 8.0) reakcije nakon čega se dodaje THF (20 mL). Zatim se dodaje Boc2O se zatim dodaje (1.2 ekv) i reakcija se meša 16 h. U sirovu reakcionu smešu se zatim dodaje etil acetat (100 mL) i voda (50 mL) i organska faza je razdvojena, osušena (magnezijum sulfat) i zatim je koncentrovana pod vakuumom. U sirovi proizvod je dodat dihlorometan (30 mL) zatim se dodaje DIC i DMAP. Posle mešanja 2 h, dodat je TFA i sadržaji su mešani u trajanju od jednog sata. Rastvarači su isparavani pod vakuumom i ostataku je povećana baznost sa zas. NaHCO3. Nakon toga se dodaje etil acetat i organski sloj je razdvojen, osušen (magnezijum sulfat) i koncentrovan pod vakuumom. Hromatografija na koloni sa heksanom/etil acetatom (0 -100%) je omogućila dobijanje željenog hlorotricikličnog jezgra, Jedinjenje 135. LCMS (ESI) 251 (M H).

12

Primer 136

Sinteza Jedinjenja136

[0493]

[0494] Jedinjenje 136 je sintetisano tretiranjem hlorotricikličnog amina, Jedinjenje 135, sa trans-4-aminocikloheksanolom upotrebom sličnih eksperimentalnih uslova kao što je opisano za Jedinjenje 124. LCMS (ESI) 330 (M H).<1>HNMR (600 MHz, DMSO- d6) δ ppm 0.80 - 0.95 (m, 3 H) 1.35 - 1.92 (m, 10 H) 3.66 (br. m., 3 H) 4.17 (br. s., 2 H) 4.47 (br. s., 1 H) 6.85 (s, 1 H) 6.96 (br. s., 1 H) 8.15 (br. s., 1 H) 8.62 (br. s., 1 H).

Primer 137

Sinteza terc-butil N-[1-[[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]metil]ciklopentil]karbamata, Jedinjenje 137

[0495]

[0496] terc-butil N-[1-[[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]metil]ciklopentil]karbamat je sintetisan tretiranjem 5-bromo-2,4-dihloroprimidina sa terc-butil N-[1-(aminometil)ciklopentil]karbamata upotrebom sličnih eksperimentalnih uslova kao što je opisano za sintezu terc-butil N-[2-[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]etil]karbamata. LCMS (ESI) 405 (M+H).

Primer 138

Sinteza terc-butil N-[1-[[[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4-il]amino]metil]ciklopentil]karbamata, Jedinjenje 138

[0497]

[0498] terc-butil N-[1-[[[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4-il]amino]metil]ciklopentil]karbamat je sintetisan tretiranjem terc-butil N-[1-[[(5-bromo-2-hloropirimidin-4-il)amino]metil]ciklopentil]karbamata sa 3,3-dietoksiprop-1-inom u prisustvu katalizatora kao što je Pddba upotrebom sličnih eksperimentalnih uslova kao što je opisano za sintezu terc-butil N-[2-[[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4 il]amino]etil]karbamata LCMS (ESI) 453 (M+H). Primer 139

Sinteza terc-butil N-[1-[[2-hloro-6-(dietoksimetil)pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il]metil]ciklopentil]karbamata, Jedinjenje 139

[0499]

[0500] terc-butil N-[1-[[2-hloro-6-(dietoksimetil)pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il]metil]ciklopentil]karbamat je sintetisan tretiranjem terc-butil N-[2-[[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4-il]amino]-2-metil-propil]karbamata sa TBAF upotrebom sličnih eksperimentalnih uslova kao što je opsano za sintezu terc-butil N-[2-[2-hloro-6-(di-etoksimetil)pirolo[2,3d]pirimidin-7-il]etil]karbamata. LCMS (ESI) 453 (M+H).

Primer 140

Sinteza 7-[[1-(terc-butoksikarbonilamino)ciklopentil]metil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]primidin-6-karboksilne kiseline, Jedinjenje 140

[0501]

[0502] 7-[[1-(terc-butoksikarbonilamino)ciklopentil]metil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]primidin-6-karboksilna kiselina je sintetisana upotrebom sličnog eksperimentalnog postupka kao što je opisano za sintezu 7-[2-(terc-butoksikarbonilamino)etil]-2-hloro-5-(o-tolil)pirolo[2,3-d]primidin-6-karboksilne kiseline. LCMS (ESI) 395 (M H).

Primer 141

Sinteza Jedinjenja 141

[0503]

[0504] Hlorotriciklično jezgro Jedinjenja 141 je sintetisano upotrebom sličnog eksperimentalnog postupka kao što je opisano za sintezu hloro tricikličnog amida Jedinjenja 119. LCMS (ESI) 277 (M H).

Primer 142

Sinteza Jedinjenja142

[0505]

[0506] Jedinjenje 142 je sintetisano tretiranjem hlorotricikličnog amina, Jedinjenja 141, sa trans-4-aminocikloheksanolom upotrebom sličnih eksperimentalnih uslova kao za Jedinjenje 124. LCMS (ESI) 356 (M H).<1>HNMR (600 MHz, DMSO- d6) δ ppm 1.08 - 1.32 (m, 8 H) 1.60 - 2.09 (m, 8 H) 3.03 - 3.17 (m, 1 H) 3.35 (s, 2 H) 3.54 - 3.62 (m, 1 H) 4.51 (d, J=4.39 Hz, 1 H) 6.88 (s, 1 H) 6.96 (br. s., 1 H) 8.07 (br. s., 1 H) 8.58 (s, 1 H).

12

Primer 143

Sinteza terc-butil N-[[1-[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]ciklopentil]metil]karbamata, Jedinjenje 143

[0507]

[0508] terc-butil N-[[1-[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]ciklopentil]metil]karbamat je sintetisan tretiranjem 5-bromo-2,4-dihloroprimidina sa terc-butil N-[(1-aminociklopentil)metil]karbamatom upotrebom sličnih eksperimentalnih uslova kao što su opisani za sintezu terc-butil N-[2-[(5-bromo-2-hloro-pirimidin-4-il)amino]etil]karbamata. LCMS (ESI) 405 (M+H).

Primer 144

Sinteza terc-butil N-[2-[[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4-il]amino]-2-metilpropil]karbamata, Jedinjenje 144

[0509]

[0510] terc-butil N-[[1-[[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-l-inil)pirimidin-4-il]amino]ciklopentil]metil]karbamat je sintetisan tretiranjem terc-butil N-[2-[(5-bromo-2-hloropirimidin-4-il)amino]-2-metil-propil]karbamata sa 3,3-di-etoksiprop-1-inom u prisustvu katalizatora kao što je Pddba upotrebom sličnih eksperimentalnih uslova koji su opisani za sintezu terc-butil N-[2-[[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4 il] amino] etil] karbamata. LCMS (ESI) 453 (M+H). Primer 145

Sinteza terc-butil N-[[1-[2-hloro-6-(dietoksimetil)pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il]ciklopentil]metil]karbamata, Jedinjenje 145

[0511]

[0512] terc-Butil N-[[1-[2-hloro-6-(dietoksimetil)pirolo[2,3-d]pirimidin-7-il]ciklopentil]metil]karbamat je sintetisan tretiranjem terc-butil N-[2-[[2-hloro-5-(3,3-dietoksiprop-1-inil)pirimidin-4-il]amino]-2-metil-propil]karbamata sa TBAF upotrebom sličnih eksperimentalnih uslova kao što je opisano za sintezu terc-butil N-[2-[2-hloro-6-(dietoksimetil)pirolo[2,3 d]pirimidin-7-il]etil]karbamata. LCMS (ESI) 4534 (M+H).

Primer 146

Sinteza 7-[2-(terc-butoksikarbonilamino)-1,1-dimetil-etil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]primidin-6karboksilne kiseline, Jedinjenje 146

[0513]

[0514] 7-[2-(terc-Butoksikarbonilamino)-1,1-dimetil-etil]-2-hloro-pirolo[2,3-d]primidin-6-karboksilna kiselina je sintetisana upotrebom sličnog eksperimentalnog postupka kao što je opisano za sintezu 7-[2-(terc-butoksikarbonilamino)etil]-2-hloro-5-(o-tolil)pirolo[2,3-d]primidin-6-karboksilne kiseline. LCMS (ESI) 395 (M H).

Primer 147

Sinteza Jedinjenja 147

[0515]

12

[0516] Hloro triciklični amid, Jedinjenje 147 je sintetisano upotrebom sličnog eksperimentalnog postupka kao što je opisano za hloro triciklični amid, Jedinjenje 119. LCMS (ESI) 277 (M H).

Primer 148

Sinteza Jedinjenja148

[0517]

[0518] Jedinjenje 148 je sintetisano tretiranjem hlorotricikličnog amina, Jedinjenje 147, sa trans-4-aminocikloheksanolom upotrebom sličnih eksperimentalnih uslova kao za Jedinjenje 124. LCMS (ESI) 356 (M H).<1>HNMR (600 MHz, DMSO- d6) δ ppm 1.06 - 1.35 (m, 8 H) 1.45 - 1.95 (m, 8 H) 3.10 (m, 1 H) 3.58 (br. s., 2 H) 3.95 (br. s., 1 H) 4.49 (br. s., 1 H) 6.84 (s, 1 H) 6.85 - 6.93 (m, 1 H) 8.29 (s, 1 H) 8.61 (br. s., 1 H).

Primer 149

Sinteza Jedinjenja 149

[0519]

Korak 1: Jedinjenje 59 Boc zaštićeno prema postupku A. Sarkar et al. (JOC, 2011, 76, 7132-7140). Korak 2: Boc-Jedinjenje 59 je tretirano sa 5 mol% NiCl2(Ph3)2, 0.1 ekv trifenilfosfinom, 3 ekv Mn, 0.1 ekv tetraetilamonijum jodidom, u DMI pod CO2 (1 atm) na 25 °C 20 h da se konvertuje derivat aril halogenida u karboksilnu kiselinu.

Korak 3: Karboksilna kiselina iz Koraka 2 je konvertovana u odgovarajući kiseli hlorod upotrebom standardnih uslova.

12

Korak 4: Kiseli hlorid iz Koraka 3 je reagovao sa N-metil piperazinom da se dobije odgovarajući amid.

Korak 5: Amidu iz Koraka 4 je uklonjena zaštita upotrebom trifluorosirćetne kiseline u metilen hloridu da se dobije ciljno Jedinjenje. Jedinjenje 149 je prečišćeno hromatografijom na koloni od silika gela eluiranjem sa gradijentom dihlorometana- metanola da se dobije Jedinjenje 149.

[0520] Svako od jedinjenja 119 kroz 149 i odgovarajućih jedinjenja sa različitim R8, R1 i Z definicijama može da reaguje sa natrijum hidridom i alkil halogenidom ili drugim halogenidom da se insertuje željena R supstitucija pre reagovanja sa amino, kao što je opisano gore u tekstu za sintezu Jedinjenja 120, da bi se proizveo željeni proizvod Formula I, II, III, IV, ili V.

Primer 150

In vitro test inhibicije CDK4/6

[0521] Ovde prikazana izabrana jedinjenja su ispitana u CDK4/ciklinDl, CDK6/CycD3 CDK2/CycA i CDK2/ciklinE kinaznim testovima od Nanosyn (Santa Clara, CA) da bi se odredio njihov inhibitorni efekat na ovim CDKs. Testovi su izvedeni upotrebom tehnologije mikrofluidne kinazne detekcije (Caliper Assay Platform). Jedinjenja su ispitana u formatu 12 doznih odgovora u jednom uzorku Km za ATP. Korišćena koncentracija fosfoakceptorskog supstrata peptida je bila 1 µM za sve testove i Staurosporin je korišćen kao referentno jedinjenje u svim testovima. Specifičnosti svakog ispitivanja su kao što je navedeno u tekstu ispod:

CDK2/CiklinA: Koncentracija enzima: 0.2 nM; ATP koncentracija: 50 µM; Vreme inkubiranja: 3 h. CDK2/CiklinE: Koncentracija enzima: 0.28 nM; ATP koncentracija: 100 µM; Vreme inkubiranja: 1 h. CDK4/CiklinDl: Koncentracija enzima: 1 nM; ATP koncentracija: 200 µM; Vreme inkubiranja: 10 h. CDK6/CiklinD3: Koncentracija enzima: 1 nM; ATP koncentracija: 300 µM; Vreme inkubiranja: 3 h.

[0522] Inhibitorne IC50vrednosti za Jedinjenja T, Q, U i GG za CDK4/CycD1, CDK2/CycE, CDK2/CycA, kao i stepen selektivnosti je prikazan u Tabeli 2.

Tabela 2: Selektivna inhibicija CDK4

[0523] Da bi se dalje karakterisala njegova kinazna aktivnost, sproveden je skrining Jedinjenja T u odnosu na 456 (395 ne-mutirane) kinaze upotrebom DiscoveRx’s KINOMEscan™ servisa profilisanja. Skrining jedinjenja je izvršen upotrebom pojedinačne koncentracije od 1000 nM (> 1000 puta IC50za Cdk4). Rezultati iz ovog skrininga potvrđuju visoku potennost u odnosu na Cdk4 i visoku selektivnost prema Cdk2. Dodatno, profilisanje kinoma potvrđuje da je Jedinjenje T bilo relativno selektivno za Cdk4 i Cdk6 u poređenju sa drugim ispitanim kinazama. Specifično, kada se koristi prag inhibicije od 65%, 90%, ili 99%, Jedinjenje T je inhibiralo redom 92 (23.3%), 31 (7.8%) ili 6 (1.5%) od 395 nemutiranih kinaza.

12

[0524] Pored CDK4 kinazne aktivnosti, takođe je ispitano nekoliko jedinjenja prema CDK6 kinaznoj aktivnosti. Rezultati CDK6/CycD3 kinaznih testova, zajedno sa CDK4/CiklinDl, CDK2/CycA i CDK2/CiklinE kinaznim testovima, su prikazani za PD0332991 (Referenca) i jedinjenja T, Q, GG, i U u Tabeli 3. IC5010 nM za CDK4/CiklinD1 i 10uM za CDK12/ CiklinE se dobro slaže sa ranije objavljenim izveštajima za PD0332991 (Fry et al. Molecular Cancer Therapeutics (2004) 3(11)1427-1437; Toogood et al. Journal of Medicinal Chemistry (2005) 48, 2388-2406). Jedinjenja T, Q, GG, i U su potentnija (niža IC50) u odnosu na referentno Jedinjenje (PD0332991) i pokazuju veći stepen selektivnosti u odnosu na referentno Jedinjenje (CDK2/CycE IC50podeljeno sa CDK4/CycDl IC50).

Tabela 3: Inhibicija CDK kinaza sa jedinjenjima T, Q, GG, i U

Primer 151

Test G1 zastoja (Ćelijska G1 i S-faza)

[0525] Za određivanje ćelijskih frakcija u različitim stadijumima ćelijskog ciklusa nakon različitih tretmana, HS68 ćelije (ćelijska linija fibroblasta humane kože (Rb-pozitivna)) su obojene sa rastvorom propidijum jodida za bojenje i nanete su na Dako Cyan protični citometar. Frakcija DNK ćelija u G0-G1 ćelijskom ciklusu u odnosu na frakciju DNK S-faze ćelijskog ciklusa je određena upotrebom FlowJo 7.2 .2 analize.

[0526] Jedinjenja T, Q, GG i U su ispitana za njihovu sposobnost da zaustave HS68 ćelije u G1 fazi ćelijskog ciklusa. Iz rezultata testa ćelijskog G1 zaustavljanja, opseg inhibitornih EC50vrednosti koje su neophodne za G1 zaustavljanje HS68 ćelija je bio po 22 nM do1500 nM (videti kolonu sa nazivom "Ćelijsko G1 zaustavljanje EC50" u Tabeli 4).

Primer 152

Zaustavljanje ćelijskog ciklusa sa Jedinjenjem T kod Cdk4/6-zavisnih ćelija

[0527] Da bi se ispitala sposobnost Cdk4/6 inhibitora za indukovanje jasnog G1-zastoj, korišćen je postupak koji se zasniva na skriningu ćelija koji se sastoji iz dve Cdk4/6-zavisne ćelijske linije (tHS68 i WM2664; Rb-pozitivne) i jedne Cdk4/6-nezavisne (A2058; Rb-negativne) ćelijske linije. Dvadeset četiri časova nakon zasejavanja, svaka ćelijska linija je tretirana sa Jedinjenjem T na dozno zavisan način 24 h. Na kraju eksperimenta, ćelije su sakupljene, fiksirane i obojene sa propidijum jodidom (DNK interkalirajućim sredstvom), koje fluorescira jako crveno (maksimalna emisiona vrednost 637 nm) kada je pobuđen sa 488nm svetlosti. Uzorci su naneti na Dako Cyan protočni citometar i > 10,000 događaja je sakupljeno za svaki događaj. Podaci su analizirani upotrebom FlowJo 2.2 softvera razvijenim od strane TreeStar, Inc.

12

[0528] SL.2B je grafik broja tHS68 ćelija (CDK4/6-zavisna ćelijska linija) vs. DNK sadržaj ćelija (kako je mereno propidijum jodidom). Ćelije su tretirane sa DMSO 24 h, sakupljene, i analizirane su za distribuciju ćelijskog ciklusa. SL. 2C je grafik broja WM2664 ćelija (CDK4/6-zavisna ćelijska linija) vs. DNK sadržaj ćelija (kako je mereno propidijum jodidom). Ćelije su tretirane sa DMSO 24 h, sakupljene, i analizirane su za distribuciju ćelijskog ciklusa. SL.2D je grafik broja A2058 ćelija (CDK4/6-nezavisna ćelijska linija) vs. DNK sadržaj u ćelijama (kako je mereno propidijum jodidom). Ćelije su tretirane sa DMSO 24 h, sakupljene, i analizirane su za distribuciju ćelijskog ciklusa. SL. 2E je grafik broja tHS68 ćelija (CDK4/6-zavisna ćelijska linija) vs. DNK sadržaj u ćelijama (kako je mereno propidijum jodidom) nakon tretmana sa Jedinjenjem T. Ćelije su tretirane sa Jedinjenjem T (300 nM) 24 h, sakupljene, i analizirane su za distribuciju ćelijskog ciklusa. Kao što je opisano u Primeru 152, tretman tHS68 ćelija sa Jedinjenjem T uzrokuje gubitak maksimalne vrednosti u S-fazi (naznačeno strelicom). SL.2F je grafik broja WM2664 ćelija (CDK4/6- zavisna ćelijska linija) vs. DNK sadržaj u ćelijama (kako je mereno propidijum jodidom) nakon tretmana sa Jedinjenjem T. Ćelije su tretirane sa Jedinjenjem T (300 nM) 24 h, sakupljene, i analizirane su za distribuciju ćelijskog ciklusa. Kao što je opisano u Primeru 152, tretman WM2664 ćelija sa Jedinjenjem T uzrokuje gubitak maksimalne vrednosti u S-fazi (naznačeno strelicom). SL. 2G je grafik broja A2058 ćelija (CDK4/6-nezavisna ćelijska linija) vs. DNK sadržaj u ćelijama (kako je mereno propidijum jodidom) nakon tretmana sa Jedinjenjem T. Ćelije su tretirane sa Jedinjenjem T (300 nM) 24 h, sakupljene, i analizirane su za distribuciju ćelijskog ciklusa. Kao što je opisano u Primeru 152, tretman A2058 ćelija sa Jedinjenjem T ne uzrokuje gubitak maksimalne vrednosti u S-fazi (nazačeno strelicom).

Primer 153

Jedinjenje T Inhibira fosforilaciju RB

[0529] Cdk4/6-ciklin D kompleks je ključan za progresiju DNK iz G1 u S-fazu ćelijskog ciklusa. Ovaj kompleks fosforiluje supresorski protein retinoblastoma tumora (Rb). Da bi se pokazao uticaj Cdk4/6 inhibicije na fosforilaciju Rb (pRb), Jedinjenje T je izloženo u tri ćelijske linije, dve Cdk4/6 zavisne (tHS68, WM2664; Rb-pozitivna) i jedna Cdk4/6 nezavisna (A2058; Rb-negativna). Dvadeset četiri časa posle zasejavanja, ćelije su tretirane sa Jedinjenjem T na finalnoj koncentraciji 300nM tokom 4, 8, 16, i 24 h. Uzorci su lizirani i protein je ispitan sa western blot analizom. Rb fosforilacija je merena na dva mesta ciljano sa Cdk4/6-ciklin D kompleksom, Ser780 i Ser807/811 upotrebom antitela specifičnih za vrstu. Rezultati pokazuju da Jedinjenje T blokira fosforilaciju Rb u Rb-zavisnim ćelijskim linijama posle 16 h izlaganja, dok nema efekat na Rb-nezavisne ćelije (Slika 3).

Primer 154

Ćelije kancera malih ćelija pluća (SCLC) su rezistentne na CDK4/6 Inhibitore

[0530] Supresor retinoblastoma (RB) tumora je glavni negativni regulator ćelijskog ciklusa koji je inaktivisan kod približno 11% svih humanih kancera. Funkcionalni gubitak RB je obligatorni događaj ui razvoju kancera malih ćelija pluća (SCLC). Kod RB kompetentnih tumora, aktivirani Cdk2/4/6 promoviše prelazak iz G1 u S fazu fosforilacijom i inaktivacijom RB (i srodnih članova familije). Suprotno tome, kanceri sa delecijom RB ili inaktivacijom ne zahtevaju aktivnost Cdk4/6 za progresiju ćelijskog ciklusa. S obzirom da je inaktivacija RB obligatorni događaj u razvoju SCLC, ovaj tip tumora je visoko rezistentan na inhibitore Cdk4/6 i istovremeno ordiniranje inhibitora Cdk4/6 sa DNK oštećujućim hemoterapeutskim sredstvima kao što su ona koja se koriste u SCLC ne treba da antagonizuje efikasnost takvih sredstava.

[0531] Nekoliko jedinjenja (PD0332991, Jedinjenje GG, i Jedinjenje T) su ispitani za njihovu sposobnost da blokiraju ćelijsku proliferaciju u panelu SCLC ćelijskih linija sa poznatim genetičkim gubitkom RB.

12

SCLC ćelije su tretirane sa DMSO ili naznačenim Cdk4/6 inhibitorom 24 h. Efekat Cdk4/6 inhibicije na proliferaciju je meren ugradnjom EdU. RB-intaktna, Cdk4/6-zavisna ćelijska linija (WM2664 ili tHS68) i panel RB-negativnih SCLC ćelijskih linija (H69, H82, H209, H345, NCI417, ili SHP-77) su analizirane za inibiciju rasta sa različitim CDK4/6 inhibitorima.

[0532] Kao što je prikazano na Slici 4, Rb-negativne SCLC ćelije su rezistentne na inhibiciju Cdk4/6. Na Slici 4A, PD0332991 inhibira Rb-pozitivnu ćelijsku liniju (WM2664), ali ne utiče na rast Rb-negativnih linija ćelija malih ćelija kancera pluća (H345, H69, H209, SHP-77, NCI417, i H82). Na Slici 4B, Jedinjenje GG inhibira Rb-pozitivnu ćelijsku liniju (tHS68), ali ne utiče na rast Rb-negativnih ćelijskih linija (H345, H69, SHP-77, i H82). Na Slici 4C, Jedinjenje T inhibira Rb-pozitivnu ćelijsku liniju (tHS68), ali ne utiče na rast Rb-negativnih ćelijskih linija (H69, SHP-77, i H209). Ova analiza je pokazala da su RB-„null“ SCLC ćelijske linije rezistentne na inhibiciju Cdk4/6, kako nisu uočene promene u procentu u S-fazi nakon tretmana sa bilo kojim od ispitanih inhibitora Cdk4/6, uključujući Jedinjenje T i Jedinjenje GG, dok RB-kompetentna ćelijska linija u svakom eksperimentu je visoko senzitivna na inhibiciju Cdk4/6 pri čemu skoro ni jedna ćelija ne ostaje u S-fazi posle 24 h tretmana.

Primer 155

Rb-Negativne ćelije kancera su rezistentne na inhibitore CDK4/6

[0533] Testovi kojima se ispituje ćelijska proliferacija su sprovedeni upotrebom sledećih Rb-negativnih linija ćelija kancera: H69 (humane male ćelije kancera pluća - Rb-negativne) ćelije ili A2058 (humane metastatske ćelije melanoma-Rb-negativne). Ove ćelije su zasejane u Costar (Tewksbury, Massachusetts) 3093 pločama sa 96 bunarića za kulturu tretiranih tkiva sa belim zidovima/prozirnim dnom. Ćelije su tretirane sa jedinjenjima T, Q, GG i U kao serije razblaženja doznog odgovora od devet tačaka od 10µM do 1nM. Ćelije su izložene jedinjenjima i nakon toga je određena ćelijska varijabilnost nakon osam časova (H69) ili šest (A2058) dana kao što je naznačeno upotrebom CellTiter-Glo® luminescentog testa za ispitivanje ćelijske vijabilnosti (CTG; Promega, Madison, Wisconsin, United States of America) u skladu sa preporukama proizvođača. Ploče su čitane na BioTek (Winooski, Vermont) Syngergy2 čitaču ploča sa više načina. Relativne svetlosne jedinice (RLU) su predstavljene kao rezultat promenjive molarne koncentracije i podaci su analizirani upotrebom Graphpad (LaJolla, Californaia) Prism 5 statističkog softvera da se odredi EC50za svako jedinjenje.

[0534] Odabrana ovde prikazana jedinjenja su procenjena odnosu na ćelijsku liniju malih ćelija kancera pluća (H69) i humanu ćelijsku liniju metastatskog melanoma (A2058), dve Rb-deficijentne (Rbnegative) ćelijske linije. Rezultati ovde prikazanih ćelijskih testova su prikazane u Tabeli 4. Opseg inhibitornih EC50vrednosti potrebnih za inhibiciju H69 ćelija kancera malih ćelija pluća je bio 2040 nM do >3000 nM. Opseg inhibitornih EC50vrednosti potrebnih za inhibiciju A2058 ćelijske proliferacije malignih melanoma je bio 1313 nM do >3000 nM. Suprotno sa začajnom inhibicijom koja se uočava kod Rb pozitivnih ćelijskih linija, pronađeno je da ispitana jedinjenja nisu bila značajno efikasna u inhibiciji proliferacije kancera malih ćelija pluća ili ćelija melanoma.

1

Tabela 4: Rezistencija Rb-Negativnih ćelija kancera prema inhibitorima CDK4/6

Primer 156

Studije supresije rasta HSPC

[0535] Prethodno je prikazan efekat PD0332991 na HSPCs. Slika 5 pokazuje ugradnju EdU u mišjim HSPC i mijeloidnim progenitorskim ćeliijama zatim se daje pojedinačna doza 150 mg/kg PD0332991 oralnom gavažom da se ispita vremenski efekat privremene CDK4/6 inhibicije na zastoj u kostnoj srži kao što je prijavljeno u Roberts et al. Multiple Roles of Cyclin-Dependent Kinase 4/6 Inhibitors in Cancer Therapy. JCNI 2012;104(6):476-487. Kao što se može uočiti na Slici 5, pojedinačna oralna doza PD0332991 dovodi do produženog smanjenja HSPC (LKS+) i mijeloidnih progenitorskih ćelija (LKS-) više od 36 h. Sve dok 48 h posle oralnog doziranja HSPC i mijeloidne progenitorske ćelije se vraćaju na bazalni nivo ćelijske deobe.

Primer 157

Proliferacija kostne srži se procenjuje korišćenjem EdU ugradnje i analizom protočnom citometrijom [0536] Za eksperimente HSPC proliferacije, mlade odrasle ženke FVB/N miševa su tretirane sa pojedinačnom dozom kao što je naznačeno za jedinjenje T, jedinjenje Q, jedinjenje GG ili PD0332991 oralnom gavažom. Miševi su zatim žrtvovani u naznačenim vremenima (0, 12, 24, 36, ili 48 h posle ordiniranja jedinjenja), i koštana srž je sakupljena (n = 3 miševa po vremenskoj tački), kao što je prethodno opisano (Johnson et al. J. Clin. Invest. (2010) 120(7), 2528-2536). Četiri sata pre nego što je koštana srž sakupljena, miševi su tretirani sa 100 µg EdU intraperitonealnim ubrizgavanjem (Invitrogen). Mononuklearne ćelije iz kostne srži su sakupljene i određen je imunofenotip upotrebom prethodno opisanih postupaka i zatim su određeni procenti EdU pozitivnih ćelija (Johnson et al. J. Clin. Invest. (2010) 120(7), 2528-2536). Ukratko, HSPCs su identifikovane ekspresijom markera specifičnih za liniju (Lin-), Sca1 (S+), i c-Kit (K+).

[0537] Analiza kod miševa je odredila da Jedinjenje T, Jedinjenje Q, i Jedinjenje GG pokazuje dozno zavisni, prolazni, i reverzibilni G1-zastoj na stem ćelijama iz kostne srži (HSPC) (Slika 6). Šest miševa po grupi je dozirano oralnom gavažom u koncentraciji 150 mg/kg Jedinjenja T, Jedinjenja Q, Jedinjenja GG, ili samo nosača. Četiri sata pre nego što su životinje žrtvovane i kostna srž je sakupljena, miševi su tretirani sa 100 µg EdU intraperitonealnim ubrizgavanjem. Tri miša po grupi je žrtvovano 12 h i preostale tri životinje po grupi su žrtvovane tokom 24 h. Rezultati su prikazani na Slici 6A kao odnos EdU pozitivnih ćelija za tretirane životinje na 12 ili 24 h vremenskim tačkama u poređenju sa kontrolom. Jedinjenje T i GG pokazuje smanjenje u ugradnji EdU tokom 12 h koje je počelo da se vraća na normalu tokom 24 h. Jedinjenje Q takođe pokazuje neko smanjenje tokom 12 h i počinj da se vraća na bazalni nivo 24 h uprkos činjenici da oralna biodostupnost Jedinjenja Q je niska.

[0538] Dalji eksperimenti su završeni sa Jedinjenjem T ispitivanjem doznog odgovora i dužim periodima tretmana jedinjenjem. Jedinjenje T je dozirano oralnom gavažom 50, 100 ili 150 mg/kg i EdU ugradnja u kostnu srž je određena na 12 i 24 h kao što je opisano gore u tekstu. Alternativno,

1 1

Jedinjenje T je dozirano oralnom gavažom 150 mg/kg i EdU ugradnja u kostnu srž je određena na 12, 24, 36 i 48 h. Kao što se može uočiti na Slikama 6B i 5C, i slično sa eksperimentima ćelijskog ispiranja, ćelije kostne srži, i posebno HSPCs se vraćaju normalnoj ćelijskoj deobi kako je određeno ugradnjom EdU 24 h zatim oralnom gavažom u većem broju doza.150 mg/kg oralna doza Jedinjenja T na Slici 6C može direktno da se uporedi sa rezultatima iste doze PD0332991 prikazane na Slici 5 gde ćelije još ne ulaze u proces deobe (kao što je određeno niskom EdU ugradnjom) na 24 i 36 h, vraćaju se na normalne vrednosti tokom 48 h.

Primer 158

Ispitivanja supresije HSPC rasta poređenjem Jedinjenja T i PD0332991

[0539] Slika 7 je grafik procenta EdU pozitivnih HSPC ćelija za miševe koji su tretirani ili sa PD0332991 (trouglovi) ili jedinjenjem T (obrnuto okrenuti trouglovi) v. vreme ordiniranja (sati) jedinjenja. Oba jedinjenja su ordinirana u koncentraciji od 150 mg/kg oralnom gavažom. Jedan sat pre sakupljanja kostne srži, EdU je IP ubrizgan obeleženim ćelijama koje ulaze u ciklus. Kostna srž je sakupljena 12, 24, 36, i 48 h nakon tretmana jedinjenjem i procenat EdU pozitivnih HSPC ćelija je određen u svakoj vremenskoj tački.

[0540] Kao što se može videti na Slici 7, pojedinačna oralna doza PD0332991 rezultuje u produženom smanjenju HSPCs za više od 36 h. Suprotno tome, pojedinačna oralna doza Jedinjenja T rezultuje početnim smanjenjem HSPC proliferacije tokom 12 h, ali proliferacija HSPCs se nastavlja 24 h posle doziranja Jedinjenja T.

Primer 159

Eksperiment ispiranja ćelija

[0541] HS68 ćelije su zasejane u koncentraciji od 40,000 ćelija/ bunariću u 60mm ploči u danu 1 u DMEM koji sadrži 10% serum fetusa govečeta, 100 U/ml penicilin/ streptomicin i 1x Glutamax (Invitrogen) kako je opisano (Brookes et al. EMBO J, 21(12)2936-2945 (2002) and Ruas et al. Mol Cell Biol, 27(12)4273-4282 (2007)).24h posle zasejavanja, ćelije su tretirane sa jedinjenjem T, jedinjenjem Q, jedinjenjem GG, jedinjenjem U, PD0332991, ili DMSO samo nosačem na konačnoj koncentraciji 300nM jedinjenja koja se ispituju. U danu 3, jedan set uzorka tretiranih ćelija je sakupljen u triplikatu (0 sati uzorak). Preostale ćelije su dva puta isprane u PBS-CMF i vraćene su u medijum kulture kome nedostaje jedinjenje koje se ispituje. Setovi uzoraka su sakupljeni u triplikatima na 24, 40, i 48 h.

[0542] Alternativno, isti eksperiment se izvodi upotrebom normalnih epitelnih ćelija proksimalnih tubula bubrega (Rb-pozitivnih) dobijenih od American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Ćelije su gajene u inkubatoru na 37°C u vlažnoj atmosferi koju čii 5% CO2u bazalnom medijumu epitelnih ćelija bubrega (ATCC) dopunjenim sa kitom za rast epitelnih ćelija bubrega (ATCC) na 37°C vlažnom inkubatoru.

[0543] Nakon sakupljanja ćelija, uzorci su obojeni sa rastvorom propidijum jodida za bojenje i uzorci se nanose na Dako Cyan protočni citometar. Frakcija DNK ćelija u G0-G1 ćelijskom ciklusu u odnosu na frakciju DNK u S-fazi ćelijskog ciklusa je određena upotrebom FlowJo 7.2.2 analize.

[0544] Slika 8 pokazuje eksperimente ćelijskog ispiranja koji pokazuju da jedinjenja inhibitori iz predmetnog pronalaska imaju kratki, privremeni efekat zastoja u G1 u različitim tipovima ćelija. Jedinjenja T, Q, GG, i U su upoređena sa PD0332991 kod ili humanih ćelija fibroblasta (Rb-pozitivnih)

1 2

(SL.8A & 8B) ili humanim epitelnim ćelijama proksimalnih tubula bubrega (Rb-pozitivnim) (SL-e.8C & 8D) i efekat na ćelijski ciklus koji prati ispiranje jedinjenja je određen na 24, 36, 40, i 48 h.

[0545] Kao što je prikazano na Slici 8 i slično sa rezultatima in vivo kao što je prikazano na Slici 5, PD0332991 zahteva više od 48 h posle ispiranja da se ćelije vrate na normalni bazalni nivo ćelijske deobe. Ovo je uočeno na Slici 8A i Slici 8B kao vrednosti ekvivalentne sa onima za DMSO kontrolu za ili G0-G1 frakciju ili S-fazu ćelijske deobe, redom, su dobijene. Suprotno tome, HS68 ćelije tretirane sa predmetnim pronalaskom se vraćaju na normalni bazalni nivo ćelijske deobe za samo 24 h ili 40 h, razlike od PD0332991 u istim vremenskim tačkama. Rezultati korišćenjem korišćenjem humanih epitelnih ćelija proksimalnih tubula bubrega (SL-e. 8C & 8D) takođe pokazuju da PD0332991-tretiranim ćelijama treba značajno duže vreme da se vrate na bazalne nivoe ćelijske deobe u poređenju sa ćelijama tretiranim sa jedinjenjima T, Q, GG, ili U.

Primer 160

Farmakokinetička i farmakodinamička svojstva CDK4/6 inhibitora

[0546] Jedinjenja iz predmetnog pronalaska pokazuju dobra farmakokinetička i farmakodinamička svojstva. Jedinjenja T, Q, GG, i U su miševima dozirana u koncentraciji 30 mg/kg oralnom gavažom ili 10 mg/kg intravenoznom injekcijom. Uzorci krvi su uzeti na 0, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, i 8.0 h posle doziranja i koncentracije jedinjenja T, Q, GG, ili U u plazmi su određene HPLC. Jedinjenja T, GG, i U su pokazala da imaju izvrsna oralna farmakokinetička i farmakodinamička svojstva kao što je prikazano u Tabeli 5. Ovo uključuje veoma visoku oralnu biodostupnost (F(%)) od 52% do 80% i polu-život u plazmi od 3 do 5 h posle oralnog davanja. Pokazano je da Jedinjenja T, Q, GG, i U imaju odlična farmakokinetička i farmakodinamička svojstva kada se isporuče intravenoznim davanjem. Primeri IV i oralnih PK kriva za sva četiri jedinjenja su prikazani na Slici 9.

Tabela 5: Farmakokinetička i farmakodinamička svojstva inhibitora CDK4/6

Primer 161

Metabolička stabilnost

[0547] Metabolička stabilnost Jedinjenja T u poređenju sa PD0332991 je određena u mikrozomima jetre kod čoveka, psa, pacova, majmuna, i miša. Mikrozomi jetre čoveka, miša, i psa su kupljeni od Xenotech, i mikrozomi jetre Sprague-Dawley pacova su pripremljeni sa Absorption Systems. Pripremljena je reakciona smeša koja sadrži 0.5 mg/mL mikrozoma jetre, 100 mM kalijum fosfata, pH 7.4, 5 mM magnezijum hlorida, i 1 µM jedinjenja koje se ispituje. Jedinjenje koje se ispituje se dodaje u reakcionu smešu u konačnoj koncentraciji od 1 µM. Alikvota reakcione smeše (bez kofaktora) je

1

inkubirana mešanjem u vodenom kupatilu na 37 stp. C 3 minuta. Kontrolno jedinjenje, testosteron, se istovremeno nanosi sa jedinjenjem koje se ispituje u odvojenoj reakciji. Reakcija je inicirana dodavanjem kofaktora (NADPH), i smeša je zatim inkubirana mešanjem u vodenom kupatilu na 37 stp. C. Alikvote (100 µM) su povučene na 0, 10, 20, 30, i 60 minuta za jedinjenje koje se ispituje i 0, 10, 30, i 60 minuta za testosteron. Uzorci jedinjenja koje se ispituje su odmah kombinovani sa 100 µM ledenohladnim acetonitrilom koji sadrži unutrašnji standard za završetak reakcije. Uzorci testosterona su odmah kombinovani sa 800 µM ledeno hladnim 50/50 acetonitrilom/dH2O koji sadrži 0.1% mravlju kiselinu i unutrašnji standard za završetak reakcije. Uzorci su testirani upotrebom proverenog LC-MS/MS postupka. Uzorci jedinjenja koje se ispituje su analizirani upotrebom masenog spektrometra Orbitrap visoke rezolucije da bi se kvantifikovao nestanak roditeljskog jedinjenja koje se ispituje test i detektovao pojavljivanje metabolita. Odnos površine maksimalne vrednosti odgovora (PARR) sa unutrašnjim standardnom je upoređen sa PARR u vremenu 0 da se odredi procent jedinjenja koje se ispituje ili pozitivna kontrola koja ostaje u vremenskoj tački. Polu-životi su izračunati upotrebom GraphPad softvera, uklapanjem sa jednofaznom eksponencijalnom jednačinom raspada.

[0548] Polu-život je izračunat na osnovu tl/2 = 0.693k, gde k je konstanta brzine eliminacije zasnovana na nagibu grafika prostalog prirodnog logaritma u odnosu na vreme inkubacije. Kada je izračunat poluživot je bio duži od trajanja eksperimenta, polu-život je izražen kao > najdužeg vremena inkubiranja. Izračunati polu-život je takođe naznačen u zagradama. Ukoliko je izračunati polu-život > 2x trajanja eksperimenta, polu-život nije prijavljen. Blagovremeno nastavljanje ćelijske proliferacije je potrebno za reparaciju tkiva, i prema tome previše dugi period zastoja nije poželjan u zdravim ćelijama kao što su HSPCs. Karakteristike CDK4/6 inhibitora koje diktiraju njegovo trajanje zastoja su njegovi farmakokinetički (PK) i enzimski polu-životi. Jednom iniciran, G1-zastoj in vivo će se održavati sve dok jedinjenje u cirkulaciji ostane na inhibitornom nivou, i sve dok jedinjenje koristi enzim. PD032991, na primer, sadrži sveukupno dug PK polu-život i sasvim sporu enzimsku brzinu disocijacije. Kod ljudi, PD0332991 ispoljava poluživot PK od 27 časova (videti Schwartz, GK et al. (2011) BJC, 104:1862-1868). Kod ljudi, jedno ordiniranje PD0332991 proizvodi zastoj u ćelijskom ciklusu HSPC koji traje približno jednu nedelju. Ovo odražava 6 dana za uklanjanje jedinjenja (5 polu-života x 27 časovni polu-život), kao i dodatnih 1.5 do 2 dana inhibicije enzimske CDK4/6 funkcije. Ovaj račun sugeriše da je ukupno potrebno 7+ dana za vraćanje normalne kostne srži, vreme tokom kojeg je proizvodnja nove krvi smanjena. Ova zapažanja mogu da objasne tešku granulocitopeniju koja se uočava sa PD0332991 u klinici.

[0549] Dalji eksperimenti su kompletirani sa Jedinjenjem T i PD0332991 da se uporedi metabolička stabilnost (polu-život) kod čoveka, psa, pacova, majmuna, i mišjih mikrozoma jetre. Kao što je prikazano na Slici 10, kada se analizira stabilnost jedinjenja u mikrozomima jetre kroz vrste, polu-život Jedinjenja T koji može da se odredi je kraći u svakim vrstama u poređenju sa onim koji je prijavljen za PD0332991. Dalje, kao što je prethodno opisano gore u tekstu i na Slici 8, izgleda da PD0332991 takođe ima produžem enzimski polu-život, kako je potvrđeno proizvodnjom izraženog zastoja u ćelijskom ciklusu u humanim ćelijama koji traje više od četrdeset osam sati čak nakon što je jedinjenje uklonjeno iz medijuma ćelijske kulture (tj., u in vitro eksperimentu ispitanja). Kako je dalje prikazano na Slici 8, uklanjanje ovde opisanih jedinjenja iz medijuma kulture vodi do brzog nastavka proliferacije, u skladu sa brzom enzimskom stopom disocijacije. Ove razlike u stopama disocijacije enzima se prevode u značajnu razliku farmakodinamičkog (PD) efekta, kao što je prikazano na Slikama 5, 6C, i 7. Kako je prikazano jedna oralna doza PD0332991 proizvodi 36+ časovni zastoj u rastu hematopoetskih i progenitorskih ćelija (HSPCs) u mišjoj kostnoj srži, koji je veći nego što bi moglo da se objasni 6 časovnim PK polu-životom PD0332991 kod miševa. Suprotno tome, efekat Jedinjenja T je mnogo kraći, omogućava brzi ponovni ulazak u ćelijski ciklus, obezbeđujući izvrsnu in vivo kontrolu HSPC proliferacije.

Primer 162

1 4

Jedinjenje T sprečava ćelijsku smrt indukovanu hemoterapijom, oštećenje DNK, i aktivaciju kaspaze [0550] Kako bi se pokazalo da farmakološko mirovanje koje je indukovano tretmanom sa Jedinjenjem T treatment omogućava otpornost na hemoterapeutska sredstva sa različitim mehanizmima delovanja, kao in vitro model je razvijen upotrebom telomerizovanih humanih diploidnih fibroblasta (tHDFs; linija humanih fibroblasta kožice imortalizovana sa ekspresijom humane telomeraze). Ove ćelije su visoko Cdk4/6-zavisne za proliferaciju kao što je pokazano njihovim potpunim G1 zastojem nakon tretmana sa Cdk4/6 inhibitorima (Videti Roberts PJ, et al. Multiple Roles of Cyclin-Dependent Kinase 4/6 Inhibitors in Cancer Therapy. J Natl Cancer Inst 2012;Mar 21;104(6): 476-87). Ćelijsko preživljavanje je određeno sa Cell TiterGlo testom u skladu sa preporukama proizvođača. Za oba γ-H2AX i kaspaza 3/7 testove, ćelije su zasejane i omogućeno im je 24 časa da postanu adherentne. Ćelije su zatim tretirane sa Jedinjenjem T (na naznačenim koncentracijama) ili kontrolom nosača tokom 16 h, u vreme kada je naznačena hemoterapija dodata na prethodno tretirane ćelije. Za γ-H2AX, ćelije su sakupljene za analizu 8 časova nakon izlaganja hemoterapiji. Za γ-H2AX test, ćelije su fiksirane, permeabilizovane, i obojene sa anti-γ-H2AX u skladu sa γ-H2AX Flow Kit (Millipore) i kvantifikovane protočnom citometrijom. Podaci su analizirani upotrebom FlowJo 2.2 softvera razvijenim od strane TreeStar, Inc. Za in vitro test kaspaza 3/7, ćelije su sakupljene 24 časova posle terapije hemotretmanom. Aktivacija kaspaze 3/7 je merena upotrebom Caspase-Glo® 3/7 testa sistema (Promega) u skladu sa preporukama proizvođača.

[0551] Kao što je prikazano na Slici 11, Jedinjenje T obezbeđuje selektivnu zaštitu od ćelijske smrti indukovane karboplatinom i etopozidom. Tretman tHS68 humanih fibroblasta sa rastućim koncentracijama Jedinjenja T u prisustvu etopozida (5 µM; Slika 11A) ili karboplatina (100 µM; Slika 11B) selektivno indukuje preživljavanje ćelija koje zavisi od doza kao što je indukovano sa Cell TiterGlo.

[0552] Tretman na Jedinjenjem T pre tretmana sa nekoliko DNK oštećujućih sredstava (npr., karboplatin, doksorubicin, etopozid, kamptotecin) ili anti-mitotikom (paklitaksel) je umanjilo DNK oštećenje kako je izmereno obrazovanjem γ-H2AX (Slika 12A). Dodatno, tretman tHDF ćelija sa Jedinjenjem T pre izlaganja karboplatinu, doksorubicinu, etopozidu, kamptotecinu, i paklitakselu pokreće snažno smanjenje u aktivaciji kaspaze 3/7 na način koji zavisi od doze (Slika 12B). Ovi podaci pokazuju da privremeni zastoj ćelijskog ciklusa u Gl, indukovan sa inhibicijom Cdk4/6, smanjuje toksičnost različitih uobičajeno korišćenih citotoksičnih hemoterapeutskih sredstava koji su povezani sa mijelosupresijom kod Cdk4/6-osetljivih ćelija.

Primer 163

Jedinjenje T inhibira proliferaciju hematopoetskih stem i/ili progenitorskih ćelija (HSPCs)

[0553] Da bi se opisali efekti tretmana Jedinjenjem T na proliferaciju različitih mišjih hematopoetskih stem ćelija, ženke 8-starosti C57B1/6 miševe su dobile jednu dozu samog nosača (20% Solutol) ili Jedinjenja T (150 mg/kg) oralnom gavažom. Deset sati kasnije, svi miševi su primili jednu i.p. injekciju 100 mcg EdU (5-etinil-2’-deoksiuridina) da bi se obeležile ćelije u S-fazi ćelijskog ciklusa. Svi tretirani miševi su eutanizovani 2 sata posle EdU injekcije, ćelije kostne srži su sakupljene i obrađene su za analizu ugradnje EdU protočnim citometrom (Slika 13).

[0554] Na Slici 13, reprezentativni konturni grafici pokazuju proliferaciju u WBM (ukupna kostna srž; vrh) i HSPCs (hematopoetskim stem i progenitorskim ćelijama; LSK; dno), kako je mereno sa EdU ugradnjom za ćelije bez tretmana, samo EdU tretmanom, ili EdU plus tretmanom jedinjenjem T. Pronađeno je da Jedinjenje T smanjuje proliferaciju pune kostne srži i hematopoetskih stem i progenitorskih ćelija.

1

[0555] U poređenju sa miševima koji su tretirani sa nosačem, miševi tretirani sa Jedinjenjem T pokazuju značajno manje EdU-pozitivnih (EdU+) ćelija u svim analiziranim hematopoetskim linijama. Smanjenje u EdU+ učestalosti ćelija je verovatno zbog smanjenog ulaska u S-fazu, što je u skladu sa činjenicom da Jedinjenje T potentno inhibira Cdk4/6 aktivnost. Sve u svemu, tretman Jedinjenjem T uzrokuje∼70% smanjenje u EdU+ učestalosti ćelija u nepodeljenim ukupnim ćelijama kostne srži (Videti Sliku 13 i Sliku 14). U hematopoetskim stem i progenitorskim ćelijama (HSPC), tretman jedinjenjem T dovodi do potentnog zastoja u ćelijskom ciklusu hematopoetskih stem ćelija (HSC, 74% inhibicija), najprimitivnije ćelije u celoj hijerarhiji hematopoetske linije, kao i multipotentni progenitori (MPP, 90% inhibicija), neposredno nishodno potomstvo HSCs (Slika 14A).

[0556] Kao što je prikazano na Slici 14B, dalje dole prema hijerarhiji diferencijacije linija, proliferacija linijski ograničenih mijeloidnih (CMP, GMP i MEP) i limfoidnih progenitora (CLP) je takođe značajno inhibirana sa Jedinjenjem T, pri čemu pokazuje između 76-92% smanjenja u EdU+ učestalosti ćelija.

Primer 164

Jedinjenje T inhibira proliferaciju diferenciranih hematopoetskih ćelija

[0557] Upotrebom istog eksperimentalnog protokola kao što je objašnjeno u Primeru X gore u tekstu i prikazano na Slikama 13 i 14, ispitani su efekti Jedinjenja T na proliferaciju diferenciranih hematopoetskih ćelija. Dobijeni efekat Jedinjenja T u diferenciranim hematopoetskim ćelijama se više razlikovao nego što je uočeno u HSPCs. Dok T i B ćelijski progenitori su visoko senzitivni na Jedinjenje T (> 99% i > 80% smanjenje u redom EdU+učestalostima ćelija), proliferacija diferenciranih mijeloeritroidnih ćelija je otpornija na Jedinjeje T, sa Mac1+G1+ mijeloidnim ćelijama koje pokazuju 46% smanjenje EdU+učestalosti ćelija, i Ter119+ eritroidne ćelije koje pokazuju 58% smanjenje EdU+ učestalosti ćelija (Slika 15). Zajedno, ovi podaci sugerišu da dok su sve hematopoetske ćelije osetljive na Jedinjenjem T-indukovani zastoj ćelijskog ciklusa, stepen inhibicije se razlikuje između različitih linija ćelija, sa mijeloidnim ćelijama koje pokazuju manji efekat Jedinjenja T na proliferaciju ćelija nego što se može uočiti u drugim ćelijskim linijama.

Primer 165

Jedinjenje GG štiti progenitore kostne srži

[0558] Da bi se ispitao efekat privremene CDK4/6 inhibicije od strane Jedinjenja GG na karboplatinomindukovanu citotoksičnost u kostnoj srži, FVB/n miševi (n=3 po grupi) su tretirani sa kontrolom nosača, 90 mg/kg karboplatina intraperitonealnom injekcijom, ili 150 mg/kg Jedinjenja GG oralnom gavažom plus 90 mg/kg karboplatina intraperitonealnom injekcijom. 24 h posle tretmana kostna srž je sakupljena i procenat ciklusa progenitora kostne srži je meren ugradnjom EdU kao što je ranije objašnjeno. Kao što je prikazano na Slici 16, ordiniranje Jedinjenja GG istovremeno sa ordiniranjem karboplatina za rezultat ima značajnu zaštitu progenitora kostne srži. Uključivanje EdU u kontrolnim životinjama je normalizovano sa 100% i upoređeno sa ugradnjom EdU za kostnu srž iz životinja tretiranih karboplatinom ili životinja tretiranih sa karboplatinom i Jedinjenjem GG.

Primer 166

Jedinjenje T smanjuje 5FU-indukovanu mijelosupresiju

[0559] Da bi se odredila sposobnost Jedinjenja T da modulira mijelosupresiju indukovanu hemoterapijom, korišćen je dobro karakterisan režim pojedinačne doze 5-fluorouracila (5FU), za kog

1

je poznato da je visoko mijelosupresivan kod miševa. FVB/n ženke miševi su primile oralne doze nosača ili Jedinjenja T na 150 mg/kg, zatim 30 minuta kasnije jednom intraperitonealnom dozom 5FU na 150 mg/kg. Ukupni brojevi ćelija u krvi su mereni svaka dva dana počev od šestog dana.

[0560] Istovremeno davanje Jedinjenja T pozitivno utiče na oporavak svih hematopoetskih linija od 5-FU indukovane mijelosupresije. Slika 17 pokazuje vremenski tok oporavka različitih tipova ćelija u krvi kod miševa tretiranih sa Jedinjenjem T ili kontrolom nosačem pre 5FU ordiniranja. Određeno je da u svakoj ispitanoj hematopoetskoj liniji ćelija (ukupne ćelije krvi, neutrofili, limfociti, pločite, i crvena krevna zrnca), Jedinjenje T obezbeđuje brži oporavak tih ćelija koje su tretirane samo sa 5FU. Ovi podaci pokazuju da tretman jedinjenjem T verovatno smanjuje 5FU-indukovano oštećenje DNK u HSPCs, pri čemu dolazi do ubrzanog oporavka krvne slike posle terapije.

[0561] Slika 18 pokazuje podatke iz dana 14 ispitivanja mijelosupresije koja su opisana gore u tekstu i prikazana na Slici 17. Ukupni brojevi ćelija u krvi su analizirani u danu 14. Slika 18 pokazuje rezultate za bele krvne ćelije (Slika 18A), neutrofile (Slika 18B), limfocite (Slika 18C), crvena krvna zrnca (Slika 18D), i pločice (Slika 18E). U svim slučajevima, Jedinjenje T kada se ordinira sa 5FU dovodi do značajne zaštite svakog tipa ćelije u Danu 14 u poređenju sa mijelosupresivnim efektom samog 5FU tretmana.

Primer 167

Jedinjenje T smanjuje 5FU-indukovanu mijelosupresiju kroz ponovljene cikluse 5FU tretmana [0562] Da bi se odredila sposobnost Jedinjenja T da modulira mijelosupresiju indukovanu hemoterapijom, korišćen je dobro uspostavljeni režim 5-fluorouracilom (5FU), za kog je poznato da je visoko mijelosupresivan kod miševa. C57B1/6 miševi ženke 8-nedelja starosti su primile jednu oralnu doz nosača (20% Solutol) Jedinjenja T na 150mg/kg koju prati 30 minuta kasnije interperitonealna doza 5FU na 150 mg/kg. Ovo je ponovljeno svakih 21 dana tokom 3 ciklusa. Uzorci krvi su uzeti za hematološku analizu u Danu 10 u Ciklusima 1-3.

[0563] Istovremeno davanje Jedinjenja T smanjuje mijelosupresiju u Danu 10 trećeg ciklusa (Slika 19), kao i drugim ciklusima (podaci nisu prikazani). U skladu sa ispitivanjem pojedinačne doze koje je opisano gore u tekstu, ovi podaci pokazuju da tretman Jedinjenjem T verovatno smanjuje 5FU-indukovano DNK oštećenje HSPCs, što dovodi do povećanog broja hematopoetskih krvnih ćelija. Primeri 168

Analiza DNK ćelijskog ciklusa in humanim ćelijama proksimalne ćelije bubrega

[0564] Da bi se ispitala sposobnost Cdk4/6 inhibitora da indukuju jasni G1-zastoj u nehematopoetskim ćelijama, G1 zastoj je ispitan u humanim ćelijama proksimalnih tubula bubrega. Ćelije su tretirane sa Jedinjenjem T na način koji zavisi od doze tokom 24 h. Na kraju eksperimenta, ćelije su sakupljene, fiksirane, i obojene propidijum jodidom (DNK interkalator), koji fluorescira jako crveno (maksimum emisije 637 nm) kada se pobudi sa 488nm svetlosti. Uzorci su naneti na Dako Cyan protočni citometar. Podaci su analizirani upotrebom FlowJo 2.2 softvera koji je razvijen od TreeStar, Inc. Testovi su sprovedeni u triplikatu, i stupci greške nisu bili uočeni. Kao što je uočeno na Slici 20, podaci pokazuju da Jedinjenje T indukuje snažan zastoj G1 ćelijskog ciklusa u humanim ćelijama proksimalnih tubula burega, kao što su skoro sve ćelije pronađene u G0-G1 fazi nakon tretmana sa rastućim količinama Jedinjenja T.

1

Primer 169

Jedinjenje T štiti epitelne ćelije proksimalnih tubula bubrega od oštećenja DNK indukovanog hemoterapijom

[0565] Sposobnost Cdk4/6 inhibitora da zaštite humane ćelije proksimalnih tubula bubrega od DNK oštećenja indukovanog hemoterapijom je analizirana upotrebom etopozida i cisplatina. Ćelije su tretirane sa Jedinjenjem T na način koji zavisi od doze (10 nM, 30 nM, 100 nM, 300 nM, ili 1000 nM). Na kraju eksperimenta, ćelije su pokupljene, fiksirane, i obojene sa propidijum jodidom (DNK interkalator), koji fluorescira jako crveno (maksimalna emisija 637 nm) kada se pobudi sa svetlosti 488nm. Uzorci su naneti na Dako Cyan protočni citometar. Podaci su analizirani na FlowJo 2.2 softver koji je razvijen od TreeStar, Inc. As kao što se vidi na Slici 21, rezultati pokazuju da Jedinjenje T štiti epitelne ćelije proksimalnih tubula bubrega od oštećenja DNK indukovanog hemoterapijom kako rastuće doze Jedinjenja T u kombinaciji sa etopozidom ili cisplatinom dovode do povećanja procenta ćelija u S-fazi, sa odgovarajućim porastom procenta ćelija u G0-G1 fazi.

Primer 170

Jedinjenje T sprečava oštećenje DNK indukovanog hemoterapijom i aktivaciju kaspaze u humanim ćelijama proksimalni tubula bubrega

[0566] Da bi se pokazalo da farmakološko mirovanje indukovano sa tretmanom CDK4/6 inhibitora omogućava rezistentnost na hemoterapeutska sredstva kod nehematopoetskih ćelija, analiziran je zaštititni efekat Jedinjenja T na humanim ćelijama proksimalnih tubula bubrega. Normalne epitelne ćelije proksimalnih tubula burega su dobijene od American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Ćelije su gajene u inkubatoru na 37°C u vlažnoj atmosferi koja sadrži 5% CO2u bazalnom medijumu bubrežnih epitelnih ćelja (ATCC) koji je dopunjen sa kitom rasta bubrežnih epitelnih ćelija (ATCC) na 37°C u vlažnom inkubatoru. Ćelije su tretirane ili sa DMSO ili 10 nM, 30 nM, 100 nM, 300 nM ili 1 µM Jedinjenja T u ili odsustvu ili prisustvu 25 µM cisplatina. Za γ-H2AX test, ćelije su fiksirane, permeabilizovane, i obojene sa anti-γ-H2AX u skladu sa γ-H2AX Flow Kit (Millipore) i kvantifikovane protočnom citofluorimetrijom. Podaci su analizirani upotrebom FlowJo 2.2 softvera razvijenim od TreeStar, Inc. Aktivacija kaspaze 3/7 je merena upotrebom Kaspaza-Glo 3/7 test sistema (Promega, Madison, WI) u skladu sa instrukcijama proizvođača.

[0567] Tretman ćelija proksimalnih tubula bubrega sa Jedinjenjem T u kombinaciji sa cisplatinom atenuiranim DNK oštećenjem kao što je mereno obrazovanjem γ-H2AX (Slika 22). Kao što je uočeno na Slii 22, DNK oštećenje inndukovano cisplatinom se smanjuje na način koji zavisi od doze posle tretmana sa Jedinjenjem T.

[0568] Sposobnost Jedinjenja T da zaštiti epitelne ćelije proksimalnih tubula bubrega u odnosu na apoptozu indukovanu cisplatinom (aktivacija kaspaze 3/7) je takođe ispitana. Kao što je prikazano na Slici 23, Jedinjenje T pokazuje dono zavisno smanjenje u aktivaciji kaspae 3/7 kod ovih ćelija. Ovo smanjenje u aktivnosti kaspaze 3/7 je uočeno na sva tri nivoa ispitivanja cisplatina (25 µM, 50 µM, ili 100 µM). Ovi podaci pokazuju da privremeni zastoj ćelijskog ciklusa u Gl, indukovan sa Cdk4/6 inhibicijom, može da zaštiti ćelije proksimalnog tubula bubrega od DNK oštećenja indukovanog hemoterapijom.

Primer 171

1

Dobijanje proizvoda leka

[0569] Aktivna jedinjenja iz predmetnog pronalaska mogu da se dobiju za intravenozno ordiniranj upotrebom sledeće procedure. Ekscipijensi hidroksipropil-beta-ciklodekstrin i dekstroza mogu da se dodaju u 90% zapremine količine USP Sterilne vode za injekciju ili irigaciju sa mešanjem; mešanjem do rastvaranja. Aktivno jedinjenje je u obliku hidrohloridne soli dodaje se i meša do rastvaranja. pH je podešena sa IN NaOH do pH 4.3 0.1 i IN HCl može da se koristi za ponovnu titraciju ako je potrebno. USP Sterilne vode za injekciju ili irigaciju može da se koristi da se rastvor dovede do konačne količine težine. Zatim je pH proveren da se osigura da pH je pH 4.3 0.1. Ukoliko pH izvan opsega dod IN HCl ili IN NaOH kao odgovarajućeg da se pH dovede do 4.3 0.1. Rastvor je zatim sterilno proceđen da se napuni 50 ili 100 mL bočica od kremenastog stakla, zatvori i kompresuje.

1

Claims

Patentni zahtevi 1. Jedinjenje formule:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu u postupku smanjenja efekta hemoterapije na zdravim ćelijama kod subjekta koji se leči od ciklin-zavisne kinaze 4/6 (CDK4/6) replikacije nezavisnog kancera ili abnormalne proliferacije ćelija, gde pomenute zdrave ćelije su hematopoetske stem ćelije, hematopoetske progenitorske ćelije, ili epitelne ćelije bubrega, postupak obuhvata ordiniranje subjektu efektivne količine jedinjenja.
2. Jedinjenje za upotrebu prema zahtevu 1, gde se jedinjenje ordinira subjektu pre tretmana sa hemoterapeutskim sredstvom, u toku tretmana sa hemoterapeutskim sredstvom, nakon izlaganja hemoterapeutskom sredstvu, ili njihovoj kombinaciji.
3. Jedinjenje ili so za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 2, gde je subjekat čovek.
4. Jedinjenje ili so za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 3, gde jedinjenje ili so je ordinirano subjektu 24 sata ili manje pre izlaganja bar jednom hemoterapeutskom sredstvu.
5. Jedinjenje ili so za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 4, gde subjekat ima kancer.
6. Jedinjenje ili so za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 4, gde subjekat ima abnormalnu proliferaciju ćelija.
7. Jedinjenje ili so, za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 6, gde se jedinjenje ili so ordinira subjektu oko 4 sata ili manje pre izlaganja bar jednom hemoterapeutskom sredstvu.
8. Jedinjenje ili so za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 7, gde kancer ili abnormalna proliferacija ćelija je naznačena sa gubitkom ili odsustvom supresorskog proteina tumora retinoblastoma (RB).
9. Jedinjenje ili so za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 7, gde je kancer kancer malih ćelija pluća, retinoblastom, trostruko negativni kancer pluća, humani papilomavirus (HPV) pozitivni kancer glave ili vrata, HPV pozitivni cervikalni kancer, ili Rb-negativni kancer bešike.
10. Jedinjenje ili so za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 9, gde je hemoterapija izabrana između alkilirajućeg sredstva, DNK interkalatora, inhibitora proteinske sinteze, inhibitora sinteze DNK ili RNK, baznog analoga DNK, inhibitora topoizomeraze, inhibitora telomeraze, ili jedinjenja koje se vezuje za telomernu DNK.
11. Jedinjenje ili so za upotrebu prema zahtevu 5, gde kancer je karcinom malih ćelija pluća i bar jedno hemoterapeutsko sredstvo je izabrano iz grupe koja obuhvata etopozid, cisplatin ili karboplatin, ili njihovu kombinaciju.
12. Jedinjenje ili so za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 11, gde bar 80% ili više hematopoetskih stem ćelija, hematopoetskih progenitorskih ćelija, ili epitelnih ćelija bubrega u subjektu se vrati na ili pristupi bazalnoj aktivnosti ćelijskog ciklusa pre tretmana za manje od oko 36 sati od poslednjeg ordiniranja jedinjenja ljudima.
13. Jedinjenje ili so za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 11, gde se rastvaranje jedinjenja ili soli CDK4/6 inhibitornog efekta dešava u manje od 36 sati od ordiniranja jedinjenja.
14. Jedinjenje ili so za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 13, gde bar jedno hemoterapeutsko sredstvo je etopozid.
15. Jedinjenje ili so za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 13, gde bar jedno hemoterapeutsko sredstvo je cisplatin.
16. Jedinjenje ili so za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 13, gde bar jedno hemoterapeutsko sredstvo je karboplatin.
17. Jedinjenje ili so za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 3, 5 ili 9 gde se jedinjenje ordinira da se obezbedi hemozaštita u protokolu terapije kancera malih ćelija pluća kao što je, bez ograničenja na: cisplatin 60 mg/m2 IV u danu 1 plus etopozid 120 mg/m2 IV u danima 1-3 svakih 21d tokom 4 ciklusa; cisplatin 80 mg/m2 IV u danu 1 plus etopozid 100 mg/m2 IV u danima 1-3 svakih 28d tokom 4 ciklusa; cisplatin 60-80 mg/m2 IV u danu 1 plus etopozid 80-120 mg/m2 IV u danima 1-3 svakih 21-28d (maksimum 4 ciklusa); karboplatin AUC 5-6 IV u danu 1 plus etopozid 80-100 mg/m2 IV u danima 1-3 svakih 28d (maksimum 6 ciklusa); cisplatin 60-80 mg/m2 IV u danu 1 plus etopozid 80-120 mg/m2 IV u danima 1-3 svakih 21-28d; karboplatin AUC 5-6 IV u danu 1 plus etopozid 80-100 mg/m2 IV u danima 1-3 svakih 28d (maksimum 6 ciklusa); cisplatin 60 mg/m2 IV u danu 1 plus irinotekan 60 mg/m2 IV u danima 1, 8, i 15 svakih 28d (maksimum 6 ciklusa); cisplatin 30 mg/m2 IV u danima 1 i 8 ili 80 mg/m2 IV u danu 1 plus irinotekan 65 mg/m2 IV u danima 1 i 8 svakih 21d (maksimum 6 ciklusa); karboplatin AUC 5 IV u danu 1 plus irinotekan 50 mg/m2 IV u danima 1, 8, i 15 svakih 28d (maksimum 6 ciklusa); karboplatin AUC 4-5 IV u danu 1 plus irinotekan 150-200 mg/m2 IV u danu 1 svakih 21d (maksimum 6 ciklusa); ciklofosfamid 800-1000 mg/m2 IV u danu 1 plus doksorubicin 40-50 mg/m2 IV u danu 1 plus vinkristin 1-1.4 mg/m2 IV u danu 1 svakih 21-28d (maksimum 6 ciklusa); Etopozid 50 mg/m2 PO dnevno 3ned svake 4ned; topotekan 2.3 mg/m2 PO u danima 1-5 svakih 21d; topotekan 1.5 mg/m2 IV u danima 1-5 svakih 21d; karboplatin AUC 5 IV u danu 1 plus irinotekan 50 mg/m2 IV u danima 1, 8, i 15 svakih 28d; karboplatin AUC 4 - 5 IV u danu 1 plus irinotekan 150-200 mg/m2 IV u danu 1 svakih 21d; cisplatin 30 mg/m2 IV u danima 1, 8, i 15 plus irinotekan 60 mg/m2 IV u danima 1, 8, i 15 svakih 28d; cisplatin 60 mg/m2 IV u danu 1 plus irinotekan 60 mg/m2 IV u danima 1, 8, i 15 svakih 28d; cisplatin 30 mg/m2 IV u danima 1 i 8 ili 80 mg/m2 IV u danu 1 plus irinotekan 65 mg/m2 IV u danima 1 i 8 svakih 21d; paklitaksel 80 mg/m2 IV nedeljno tokom 6ned svakih 8ned; paklitaksel 175 mg/m2 IV u danu 1 svakih 3ned; etopozid 50 mg/m2 PO dnevno 3ned svake 4ned; topotekan 2.3 mg/m2 PO u danima 1-5 svakih 21d; topotekan 1.5 mg/m2 IV u danima 1-5 svakih 21d; karboplatin AUC 5 IV u danu 1 plus irinotekan 50 mg/m2 IV u danima 1, 8, i 15 svakih 28d; karboplatin AUC 4-5 IV u danu 1 plus irinotekan 150-200 mg/m2 IV u danu 1 svakih 21d; cisplatin 30 mg/m2 IV u danima 1, 8, i 15 plus irinotekan 60 mg/m2 IV u danima 1, 8, i 15 svakih 28d; cisplatin 60 mg/m2 IV u danu 1 plus irinotekan 60 mg/m2 IV u danima 1, 8, i 15 svakih 28d; cisplatin 30 mg/m2 IV u danima 1 i 8 ili 80 mg/m2 IV u danu 1 plus irinotekan 65 mg/m2 IV u danima 1 i 8 svakih 21d; paklitaksel 80 mg/m2 IV nedeljno 6ned svakih 8ned; ipaklitaksel 175 mg/m2 IV u danu 1 svake 3ned..
18. Jedinjenje ili so za upotrebu prema zahtevu 17, gde se jedinjenje ordinira da se obezbedi hemozaštita u protokolu terapije kancera malih ćelija pluća sa topotekanom od 1.5 mg/m2 IV u danima 1-5 svakih 21d.
19. Jedinjenje ili so za upotrebu prema bilo kom od zahteva 17 gde se jedinjenje ordinira da se obezbedi hemozaštita u protokolu terapije kancera malih ćelija pluća topotekanom od 2.3 mg/m2 PO u danima 1-5 svakog 21d.
20. Jedinjenje ili so za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 16, gde se jedinjenje ili so ordinira intravenozno.
21. Jedinjenje ili so za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 16, gde se jedinjenje ili so ordinira oralno u farmaceutskoj kompoziciji.
22. Jedinjenje ili so za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 13, gde se subjekat leči od kancera malih ćelija pluća, i bar jedno hemoterapeutsko sredstvo je izabrano iz grupe koja obuhvata etopozid i karboplatin, ili njihovu kombinaciju.
23. Jedinjenje ili so za upotrebu prema zahtevu 9, gde se subjekat leči od trostruko negativnog kancera grudi.