RS60026B1

RS60026B1 - Molekuli koji vezuju ligande i njihove upotrebe

Info

Publication number: RS60026B1
Application number: RS20200264A
Authority: RS
Inventors: Michael Gerometta; Timothy Adams
Original assignee: Vegenics Pty Ltd
Priority date: 2013-02-18
Filing date: 2014-02-13
Publication date: 2020-04-30
Also published as: PL2956476T4; US20200165584A1; MY199344A; US20240301370A1; JP2019023198A; NZ710658A; RU2015137688A; US20170349886A1; PT2956476T; PH12015501785B1; MX2015010499A; AU2014218318B2; EP2956476A4; WO2014124487A1; US9745558B2; JP6408492B2; ES2771478T3; US10494617B2; ES3048528T3; CY1122678T1

Description

Opis pronalaska

OBLAST TEHNIKE NA KOJU SE PRONALAZAK ODNOSI

[0001] Pronalazak se generalno odnosi na modulaciju rasta krvnih sudova, posebno u oftalmologiji i onkologiji.

LISTA SEKVENCI

[0002] Lista sekvenci u elektronskom obliku čini deo opisa pronalaska.

POZNATO STANJE TEHNIKE

[0003] Proteini vaskularnog endotelnog faktora rasta (VEGF) i njihovi receptori (VEGFR) imaju važne uloge kako u vaskulogenezi, razvoju embrionalne vaskulature od rane diferencijacije endotelnih ćelija, tako i u angiogenezi, procesu obrazovanja novih krvnih sudova od prethodno postojećih, i dalje limfangiogenezi, procesu obrazovanja novih limfnih sudova. Proteini faktora rasta poreklom od trombocita (PDGF) i njihovi receptori (PDGFR) su uklјučeni u regulaciju ćelijske proliferacije, preživlјavanje i u migraciju nekoliko tipova ćelija.

[0004] Nepravnilna funkcija regulatornog sistema endotelnih ćelija je klјučna karakteristika kancera i raznih oboljenja povezanih sa abnormalnom vaskulogenezom, angiogenezom i limfangiogenezom.

[0005] Angiogeneza se javlјa u embrionalnom razvoju i normalnom rastu, popravci i regeneraciji tkiva, tokom ženskog reproduktivnog ciklusa, pri uspostavlјanju i održavanju trudnoće, saniranja rana i preloma. Pored angiogeneze koja se dešava kod zdravog pojedinca, angiogeni događaji su uklјučeni u brojne patološke procese, posebno rast i metastazu tumora, kao i u druga stanja u kojima se povećava proliferacija krvnih sudova, naročito mikrovaskularnog sistema, kao što su dijabetska retinopatija, psorijaza i artropatije. Inhibicija angiogeneze je korisna u sprečavanju ili ublažavanju ovih patoloških procesa ili usporavanju njihove progresije.

[0006] US2006110364 Hardinga i saradnika prijavljuje virusne vektore koji kodiraju polipeptid sa SEQ ID NO:2 (572 ostatka), koji je vanćelijski domen (ECD) humanog VEGFR3 fuzionisan sa Fc humanog IgG-a (Slika 1). Polipeptid je 97,1% identičan sa SEQ ID NO:3 predmetnog opisa duž 548 ostataka, ali sadrži i NDT potsekvence na pozicijama 104-106 iz SEQ ID NO:2 predmetnog opisa. Bolesti sa (limf)angiogenezom ili limfnim metastazama mogu biti lečeni vektorima.

[0007] Iako su terapije usmerene na blokadu VEGF/PDGF signalizacije preko njihovih receptora pokazale obećavajuće rezultate u inhibiciji angiogeneze i rastu tumora, ostaje potreba za novim ili pobolјšanim jedinjenjima i terapijama za lečenje ovakvih oboljenja.

KRATKO IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA

[0008] Predmetni pronalazak je definisan u priloženim patentnim zahtevima. Predmetni pronalazak se odnosi na nove kompozicije i postupke njihove upotrebe za inhibiciju aberantne angiogeneze, limfangiogeneze ili oba, kao i na inhibiciju drugih efekata vaskularnog endotelnog faktora rasta-C (VEGF-C) i vaskularnog endotelnog faktora rasta-D (VEGF- D), od kojih je svaki u stanju da se veže za najmanje jedan tirozin kinazni receptor faktora rasta (tj. VEGFR-2 ili VEGFR-3) i da stimuliše fosforilaciju istog. Kompozicije pronalaska uključuju molekule koji vezuju ligand i koji vezuju jedan ili oba od humanog VEGF-C i humanog VEGF-D. U pojedinim primerima izvođenja, molekul koji vezuje ligand sadrži polipeptid, npr. fragment vanćelijskog domena tirozin kinaznog receptora za faktor rasta (ECD). Fragment se može razlikovati od sekvence divljeg tipa na načine koji ne elimišu vezivanje faktora rasta, a poželjno je da se fragment konstruiše na načine koji su ovde opisani, da bi se poboljšale njegove osobine kao terapeutika za primenu subjektima/pacijentima kojima je potrebna.

[0009] Pronalazak takođe obezbeđuje nukleinske kiseline koje kodiraju takve molekule koji vezuju ligand. Nukleinske kiseline su korisne za ekspresiju polipeptidnih molekula koji vezuju ligand i takođe su od koristi, u pojedinim primerima izvođenja, kao terapeutici za postizanje ekspresije polipeptidnih molekula koji vezuju ligand in vivo, u biološki aktivnom obliku.

[0010] Primena kompozicija koje sadrže ovde opisan molekul koji vezuju ligand (ili polinukleotid koji ga kodira), pacijentima kojima je potreban, inhibira stimulaciju VEGF receptora faktorom rasta (npr. inhibira fosforilaciju receptora) i time inhibira biološke odgovore koji su posredovani receptorima, uključujući, ali ne ograničavajući se na, angiogenezu, limfogenezu posredovanu sa VEGFR ili oba.

[0011] VEGF-C i D se vezuju sa visokim afinitetom za, i stimulišu fosforilaciju, najmanje jednog VEGF receptora (ili receptorskog heterodimera) izabranog između VEGFR-2 i VEGFR-3. Navedena tvrdnja se odnosi na dobro poznate osobine faktora rasta u odnosu na njihove odgovarajuće receptore i nije predviđeno da bude ograničavajuća osobina za molekul koji vezuje ligand pronalaska, sama po sebi. Ipak, molekuli pronalaska koji vezuju ligand čine više od prostog vezivanja za njihove ciljne faktore rasta. Poželјni molekul koji vezuje ligand takođe inhibira faktor(e) rasta za koje se vezuje(u) tako da se stimuliše fosforilacija barem jednog (a poželjno svih) tirozin kinaznih receptora za koje se faktor(i) rasta vezuje(u). Stimulacija fosforilacije tirozina se lako meri upotrebom in vitro testova zasnovanih na ćelijama, kao i upotrebomi anti-fosfotirozinskih antitela. Pošto je fosforilacija tirozin kinaznih receptora početni korak u signalnoj kaskadi, pogodan je pokazatelј da li je molekul koji vezuje ligand sposoban da inhibira transdukciju signala posredovanu faktorom rasta koji dovodi do ćelijske migracije, ćelijskog rasta i drugih odgovora. Brojni drugi testovi zasnovanih na ćelijama i in vivo analize mogu biti upotrebljeni da bi se potvdile neutrališuće osobine faktora rasta za molekule koji vezuju ligand pronalaska.

[0012] Molekuli koji vezuju ligand i "specifični" su za određeni faktor rasta, predstavljaju molekule koji vezuju ligand i specifično prepoznaju aktivan oblik faktora rasta (npr. oblik koji se u telu nalazi u cirkluaciji). Poželјno je da molekuli koji vezuju ligand specifično vezuju i druge oblike faktora rasta. Tako se, na primer, VEGF-C (i VEGF-D) translacijom prevode u prepro-molekule sa obimnim aminoterminalnim i karboksi-terminalnim propeptidima koji se potom isecaju da bi se dobio „potpuno obrađen“ oblik VEGF-C (ili VEGF- D) koji vezuje i stimuliše VEGFR-2 i VEGFR-3. Molekuli koji vezuju lingand i specifični su za VEGF-C (ili VEGF-D), vezuju se za barem u potpunosti obrađen oblik VEGF-C (ili VEGF-D), a poželjno je i da se vezuju za delimično obrađene oblike i oblike koji nisu obrađeni.

[0013] U jednom primeru, ovde opisani molekul koji vezuje ligand je prečišćen ili izolovan polipeptid koji vezuje ligand i sadrži prvu aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, ili najmanje 85%, ili najmanje 90%, ili najmanje 92%, ili na najmanje 95%, ili najmanje 96%, ili najmanje 97%, ili najmanje 98%, ili najmanje 99% identična sekvenci aminokiselina definisanoj pozicijama 47-115 u SEQ ID NO:2 ili pozicijama 25-115 iz SEQ ID NO: 2, pod uslovom da pozicije u polipeptidu koje odgovaraju pozicijama 104-106 u SEQ ID NO: 2 nisu identične N –X-S ili N-X-T (X predstavlјa bilo koju aminokiselinu), pri čemu se polipeptid vezuje za najmanje jedan ligandni polipeptid izabran iz VEGF ili PDGF familije faktora rasta, kao što su humani VEGF-A (VEGF), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PIGF, PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C, i PDGF-D. SEQ ID NO: 2 sadrži aminokiselinsku sekvencu za humani VEGFR-3, pri čemu pozicije 1-24 u SEQ ID NO: 2 odgovaraju pretpostavlјenom signalnom peptidu, a pozicija 25 koja je ispred u SEQ ID NO: 2 odgovara pretpostavlјenom zrelom obliku receptora kome nedostaje putativni signalni peptid. Prethodni segmenti iz SEQ ID NO: 2 ugrubo odgovaraju ili uklјučuju prvi domen sličan imunoglobulinskom iz ECD humanog VEGFR-3 ("D1 u VEGFR-3"). Posebno se razmatraju konstrukti koji sadrže dodatne domene slične Ig-u iz VEGFR-3 ili drugih receptora, vezane na način koji rezultuje u peptidu koji vezuje ligand, dok se konstrukti koji vezuju drugačije ligande konstruišu variranjem komponenti receptora koje se koriste za stvaranja peptida koji vezuje ligand. U pojedinim varijacijama izvođenja, polipeptid koji vezuje ligand je prevashodno zasnovan na vanćelijskom domenu VEGFR-3, dok je, u drugim primerima izvođenja, polipeptid koji vezuje ligand zasnovan na fuziji segmenata drugih tirozin kinaznih receptora, kao što su VEGFR-1 i/ili VEGFR-2 i/ili PDGFR-α i/ili PDGFR-β. U primerima izvođenja primarno zasnovanim na VEGFR-3, najmanje jedan ligand je prirodni ligand za VEGFR-3, kao što je VEGF-C ili VEGF-D polipeptid.

[0014] U pojedinim primerima, polipeptid koji vezuje ligand sadrži drugu aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, ili najmanje 85%, ili najmanje 90%, ili najmanje 92%, ili najmanje 95%, ili najmanje 96%, ili najmanje 97%, ili najmanje 98%, ili najmanje 99% identična sekvenci aminokiselina definisanoj pozicijama 154-210 u SEQ ID NO:2 ili pozicijama 248-314 u SEQ ID NO:2, pri čemu je N-terminalni ostatak druge aminokiselinske sekvence povezan sa C-terminalnim ostatkom prve aminokiselinske sekvence, bilo direktno ili preko spejsera, i pri čemu se polipeptid vezuje za najmanje jedan polipeptid koji vezuje ligand izabran iz VEGF ili PDGF familije faktora rasta, kao što je humani VEGF-A (VEGF), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PIGF, PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C i PDGF-D. Sekvenca aminokiselina definisana pozicijama u polipeptidu koje odgovaraju pozicijama 154-210, ugrubo odgovara ili uklјučuje drugi domen sličan imunoglobulinskom iz ECD humanog VEGFR-3 ("D2 iz VEGFR-3"). Sekvenca aminokiselina definisana pozicijama polipeptida koje odgovaraju pozicijama 248-314 ugrubo odgovara ili uklјučuje treći domen sličan imunoglobulinskom ECD humanog VEGFR-3 ("D3 iz VEGFR-3"). Kada druga aminokiselinska sekvenca sadrži sekvencu aminokiselina koja ugrubo odgovara ili uklјučuje D2 iz VEGFR-3, poželјno je da polipeptid koji vezuje ligand sadrži treću aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, ili najmanje 85% ili na najmanje 90%, ili najmanje 92%, ili najmanje 95%, ili najmanje 96%, ili najmanje 97%, ili najmanje 98%, ili najmanje 99%, identična sekvenci aminokiselina definisanoj pozicijama 248 -314 u SEQ ID NO:2, pri čemu je N-terminalni ostatak treće aminokiselinske sekvence povezan sa C-terminalnim ostatkom druge aminokiselinske sekvence, bilo direktno ili preko spejsera, i pri čemu se polipeptid vezuje za najmanje jedan polipeptid koji vezuje ligand izabran iz VEGF ili PDGF familije faktora rasta, kao što je humani VEGF-A (VEGF), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PIGF, PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C i PDGF-D. Drugim rečima, u slučajevima kada polipeptid koji vezuje ligand sadrži aminokiselinske sekvence koje približno odgovaraju ili uklјučuju D1 i D2 iz VEGFR-3, poželјno je da polipeptid koji vezuje ligand takođe sadrži aminokiselinsku sekvencu koja približno odgovara ili uklјučuje D3 iz VEGFR-3.

[0015] U slučajevima kada polipeptid koji vezuje ligand sadrži aminokiselinske sekvence koje su približno odgovarajuće sa dva ili više komponentnih domena VEGFR-3, komponentni domeni mogu biti direktno povezani jedni sa drugima ili mogu biti povezani preko jednog ili više spejsera. Poželјno je da su domeni koji ga čine povezani sa jednim ili sa više spejsera. U jednom primeru, spejser sadrži jednu ili više peptidnih sekvenci između komponentnih domena koje su dužine od između 1-100 aminokiselina, poželјno 1-50 aminokiselina. U jednom primeru izvođenja, spejser između dva komponentna domena se suštinski sastoji od peptidnih sekvenci koje su prirodno povezane sa komponentnim domenom u nativnom VEGFR-3.

[0016] U slučajevima kada polipeptid koji vezuje ligand sadrži aminokiselinske sekvence koje ugrubo odgovaraju ili uklјučuju susedne komponentne domene VEGFR-3 (na primer, D1-D2 ili D1-D2-D3), komponentni domeni su povezani preko jednog ili više spejsera koji sadrže jednu ili više peptidnih sekvenci između komponentnih domena koje su dužine od između 1-100 aminokiselina, poželjno 1-50 aminokiselina. U jednom primeru, spejser između dva komponentna domena se suštinski sastoji od peptidnih sekvenci koje odgovaraju onima koje povezuju odgovarajuće susedne domene u nativnom VEGFR-3. U pojedinim primerima, spejser između dva susedna komponentna domena sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, ili najmanje 85%, ili najmanje 90%, ili najmanje 92%, ili najmanje 95%, ili najmanje 96%, ili najmanje 97%, ili najmanje 98%, ili najmanje 99% identična sekvenci aminokiselina koja povezuje susedne domene u nativnom VEGFR-3.

[0017] U jednom primeru, kada polipeptid koji vezuje ligand sadrži aminokiselinske sekvence koje ugrubo odgovaraju ili uklјučuju D1 i D2 iz VEGFR-3, komponentni domeni D1 i D2 su povezani preko spejserske aminokiselinske sekvence koja su najmanje 80%, ili najmanje 85%, ili najmanje 90%, ili najmanje 92%, ili najmanje 95%, ili najmanje 96%, ili najmanje 97%, ili najmanje 98%, ili najmanje 99% identične sekvenci aminokiselina definisanoj pozicijama 116-153 u SEQ ID NO:2. Kada polipeptid koji vezuje ligand sadrži aminokiselinske sekvence koje ugrubo odgovaraju ili uklјučuju D1, D2 i D3 iz VEGFR-3, komponentni domeni D2 i D3 su povezani preko spejserske aminokiselinske sekvence koja je najmanje 80%, ili najmanje 85%, ili najmanje 90%, ili najmanje 92%, ili najmanje 95%, ili najmanje 96%, ili najmanje 97%, ili najmanje 98%, ili najmanje 99% identična sekvenci aminokiselina definisanoj pozicijama 211-247 u SEQ ID NO:2.

[0018] U pojedinim primerima, prečišćen ili izolovan polipeptid koji vezuje ligand sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, ili najmanje 85%, ili najmanje 90%, ili najmanje 92%, ili najmanje 95%, ili najmanje 96%, ili najmanje 97%, ili najmanje 98%, ili najmanje 99% identična sekvenci aminokiselina koja je definisana pozicijama 47-210 iz SEQ ID NO:2, ili pozicijama 25-210 iz SEQ ID NO:2, ili pozicijama 47-314 iz SEQ ID NO:2, ili pozicijama 25-314 iz SEQ ID NO:2, ili pozicijama 47-752 ili 47-775 iz SEQ ID NO:2, ili pozicijama 25-752 ili 25-775 iz SEQ ID NO:2, pod uslovom da pozicije u polipeptidu koje odgovaraju pozicijama 104-106 u SEQ ID NO:2 nisu identične N-X-S ili N-X-T, pri čemu se polipeptid vezuje za najmanje jedan ligandni polipeptid izabran od humanog VEGF-A, VEGF-C, VEGF-C, VEGF-D i PIGF. U jednoj varijanti izvođenja, aminokiselina koja odgovara poziciji 104 u SEQ ID NO:2 je deletirana i zamenjena drugom aminokiselinom (poput glutamina, aspartata, glutamata, arginina i lizina). Pozicije 47-210 obuhvataju prva dva domena slična imunoglobulinskim iz humane ECD sekvence VEGFR-3, kao i ECD sekvence VEGFR-3 između prva dva motiva slična Ig motivima. Pozicije 47-314 uključuju prva tri domena slična imunoglobulinskim iz humane ECD sekvence VEGFR-3, kao i ECD sekvence VEGFR-3 između ovih motiva sličnih Ig motivima.

[0019] Još opštije, polipeptid koji vezuje ligand opisa sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, ili najmanje 85%, ili najmanje 90%, ili najmanje 92%, ili najmanje 95%, ili najmanje 96%, ili najmanje 97%, ili najmanje 98%, ili najmanje 99% identična fragmentu VEGFR-3 aminokiselinske sekvence koja je navedena u SEQ ID NO:2, pri čemu je amino-kraj fragmenta bilo koja aminokiselina izabrana od pozicija 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 i 50 u SEQ ID NO:2; i pri čemu je karboksilni kraj fragmenta bilo koja aminokiselina izabrana od pozicija 110-775 u SEQ ID NO:2 (npr. od pozicije 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116,....... 747, 748, 749, 750, 751, 752, 753, 754, 755, 756, 757, 758, 759, 760, 761, 762, 763, 764, 765, 766, 767, 768, 769, 770, 771 i 772, 773, 774, 775), pod uslovom da pozicije u polipeptidu koje odgovaraju pozicijama 104-106 u SEQ ID NO:2 nisu identične N-X-S ili N-X-T. Iz razloga koji će biti jasni iz ovog opisa, dozvolјena varijacija nije varijacija koja uvodi nove glikozilacione skevone koje se ne nalaze u VEGFR-3 divljeg tipa.

[0020] U drugom primeru, ovde opisan molekul koji vezuje ligand je prečišćen ili izolovan polipeptid koji vezuje ligand, a koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je identična sekvenci aminokiselina definisanoj pozicijama polipeptida koje odgovaraju pozicijama 47-115 u SEQ ID NO:2, 47-210 u SEQ ID NO:2, 47-314 u SEQ ID NO:2, 47-752 ili 47-775 u SEQ ID NO:2, ili 25-752 ili 25-775 u SEQ ID NO:2, pod uslovom da pozicije u polipeptidu koje odgovaraju pozicijama 104-106 u SEQ ID NO:2 nisu identične N-X-S ili N-X-T. U jednoj varijanti izvođenja, aminokiselina koja odgovara poziciji 104 u SEQ ID NO:2 je deletirana i zamenjena drugom aminokiselinom (poput glutamina, aspartata, glutamata, arginina i lizina).

[0021] U drugom primeru, ovde opisan molekul koji vezuje ligand je prečišćen ili izolovan polipeptid koji vezuje ligand i sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, ili najmanje 85%, ili najmanje 90%, ili najmanje 92%, ili najmanje 95%, ili najmanje 96%, ili najmanje 97%, ili najmanje 98%, ili najmanje 99% identična sekvenci aminokiselina koja je definisana pozicijama 47-115 u SEQ ID NO:2, pri čemu su pozicije u polipeptidu koje odgovaraju pozicijama 104-106 u SEQ ID NO:2 putativni VEGFR-3 glikozilacioni sekvoni i pri čemu je navedeni putativni glikozilacioni sekvon eliminisan iz aminokiselinske sekvence polipeptida koji vezuje ligand. Termin "eliminisan", kako se upotrebljava u ovom kontekstu, označava izmene primarne aminokiselinske sekvence u najmanje jednoj poziciji (supstitucijom, delecijom ili insercijom) da bi se poništio N-X-T sekvonski motiv.

[0022] Pronalazak takođe obuhvata multimerne konstrukte za vezivanje liganda koji sadrže dva ili više molekula koji vezuju ligand koji su ovde opisani, kovalentno ili nekovalentno vezane jedne za druge, da bi se obrazovala dimerna ili multimerna struktura. U pojedinim varijacijama izvođenja, vezivanje se odvija između sekvenci sličnih VEGFR-3 u polipeptidima koji vezuju ligand; u drugim varijacijama izvođenja, vezivanje se odvija između heterolognih polipeptida koji su vezani za jedan ili za obe sekvence slične VEGFR-3.

[0023] Upućivanje u tekstu na ovde opisan molekul koji vezuje ligand, ili na polipeptid koji vezuje ligand, obuhvata i njegove varijatne, kao što je prethodno definisano, pod uslovom da takav polipeptid ili molekuli koji vezuju ligand (bilo monomerni, dimerni ili mulitmerni) sadrži najmanje motiv sličan Ig motivu ili identičan Ig motivu 1 iz VEGFR-3 (npr. oko 47-115 iz SEQ ID NO:2), pod uslovom da pozicije u polipeptidu koje odgovaraju pozicijama 104-106 u SEQ ID NO:2 (koji predstavlјaju N-vezani glikozilacioni sekvon u nativnoj VEGFR-3 sekvenci) nisu identične N-X-S ili N-X-T.

[0024] Prema sledećem aspektu, ovde je opisan molekul koji vezuje ligand koji je izolovan ili prečišćeni polipeptid koji vezuje ligand, a koji sadrži prvi domen sličan imunoglobulinskom iz VEGFR-3ΔN2 polipeptida. Kao što se ovde upotrebljava, termin "VEGFR-3ΔN2 polipeptid" se odnosi na polipeptid koji je najmanje 95% identičan sa sekvencom aminokiselina koja definiše ECD humanog VEGFR-3, pod uslovom da je deo polipeptidne sekvence koji odgovara drugom putativnom glikozilacionom sekvonu, NDT, mutiran tako da se više ne uklapa u N-X-S/T SEQUON-ski motiv, npr. usled supstitucije na jednoj od pozicija. U pojedinim primerima izvođenja, prečišćeni polipeptid sadrži prva dva domena slična imunoglobulinskim iz VEGFR-3ΔN2 polipeptida, a poželјno obuhvata VEGFR-3 sekvencu između tih domena. U pojedinim primerima izvođenja, prečišćen polipeptid sadrži prva tri domena slična imunoglobulinskim iz VEGFR-3AN2 polipeptida, i poželјno uklјučuje VEGFR-3 sekvencu između tih domena.

[0025] U još jednom primeru, ovde je opisan molekul koji vezuje ligand, a koji je polipeptid koji sadrži ECD fragment humanog VEGFR-3, fuzionisan sa fuzionim partnerom, pri čemu je aminokiselinska sekvenca ECD fragmenta iz VEGFR-3 modifikovana od VEGFR-3 divljeg tipa da bi se eliminisao drugi putativni N-vezani glikozilacioni sekvon VEGFR-3 divlјeg tipa, pri čemu je polipeptid solubilan u humanom serumu i vezuje humani VEGF-C ili humani VEGF-D; i pri čemu fuzioni partner pobolјšava rastvorlјivost ili polu-život ECD fragmenta u serumu (npr. pri poređenju sa identičnim fragmentom koji nije fuzionisan sa fuzionim partnerom). U pojedinim primerima, fuzioni partner je heterologni polipeptid.

[0026] U pojedinim primerima, polipeptid koji vezuje ligand ili molekul koji vezuje ligand se vezuje za humani VEGF-C ili humani VEGF-D. U pojedinim primerima, polipeptid koji vezuje ligand ili molekul koji vezuje ligand inhibira vezivanje VEGF-C ili VEGF-D za VEGFR-3 ili inhibira stimulaciju VEGFR-3 posredovanu sa VEGF-C ili VEGF-D u ćeliji koja eksprimira VEGFR-3 na svojoj površini. Inhibicija stimulacije se može utvrditi, na primer, merenjem fosforilacije receptora, ili merenjem ćelijskog rasta in vitro ili in vivo, ili merenjem rasta krvnih sudova ili drugim promenama na nivou tkiva in vivo.

[0027] Molekul koji vezuje ligand preferencijalno vezuje humani VEGF-C sa Kdod oko 1 nM ili manje (npr. 500 pM, 400 pM, 300 pM, 200 pM, 100 pM, 50 pM, 10 pM ili manje). Molekul koji vezuje ligand preferencijalno vezuje humani VEGF-D sa Kdod oko 5 nM ili manje (npr. 2 nM, 1 nM, 500 pM, 400 pM, 300 pM, 200 pM, 100 pM, 50 pM, 10 pM ili manje).

[0028] U drugom primeru, prečišćen ili izolovan molekul koji vezuje ligand sadrži aminokiseline 22-290 iz SEQ ID NO:3, aminokiseline 23-290 iz SEQ ID NO:3, aminokiseline 23-537 iz SEQ ID NO:3 ili aminokiseline 22-537 iz SEQ ID NO:3. U još nekim varijacijama izvođenja, molekul sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, ili najmanje 85%, ili najmanje 90%, ili najmanje 92%, ili najmanje 95%, ili najmanje 96%, ili najmanje 97%, ili najmanje 98%, ili najmanje 99% identična bilo kojoj od prethodno navedenih sekvenci, pod uslovom da sekvenca polipeptida koja odgovara (poravnata je) sa VEGFR -3 N2 sekvonom nije glikozilaciona sekvenca.

[0029] Kao što je ovde opisano, molekuli koji vezuju ligand mogu biti hemijski modifikovani (npr. glikozilacijom, pegilacijom itd.) da bi se dobile željene karakteristike, uz zadržavanje njihovih specifičnih osobina vezivanja faktora rasta. Domeni I-III slični Ig domenima iz VEGFR-3 sadrže pet putativnih mesta N-glikozilacije (ovde označenih kao N1, N2, N3, N4 i N5 sekvoni u VEGFR-3). N1 odgovara aminokiselinama 33-35 u SEQ ID NO:2; N2 odgovara aminokiselinama 104-106 u SEQ ID NO:2; N3 odgovara aminokiselinama 166-168 u SEQ ID NO:2; N4 odgovara aminokiselinama 251-253 u SEQ ID NO:2 i N5 odgovara aminokiselinama 299-301 u SEQ ID NO:2. U pojedinim primerima izvođenja, ovde opisan molekul koji vezuje ligand sadrži modifikaciju u N2 sekvenci molekula. Na primer, u pojedinim primerima izvođenja, aminokiselina iz molekula koji vezuje ligand koji odgovara poziciji 104 u SEQ ID NO:2 je deletirana i zamenjena drugom aminokiselinom. Konzervativne supstitucije su poželјne. U pojedinim primerima izvođenja, aminokiselina koja odgovara poziciji 104 u SEQ ID NO:2 je deletirana i zamenjena sa aminokiselinom izabranom iz grupe koja se sastoji od glutamina, aspartata, glutamata, arginina i lizina. U primerima izvođenja gde je N2 sekvon iz SEQ ID NO:2 modifikovan kao što je prethodno opisano, poželjno je da su N1, N3, N4 i N5 sekvoni iz SEQ ID NO:2 neizmenjeni u pogledu aminokiselinske sekvence.

[0030] Kao što je ovde opisano, molekuli koji vezuju ligand mogu biti povezani sa fuzionim partnerima bilo direktno ili preko linkera. Fuzioni partner može biti bilo koja heterologna komponenta koja pojačava funkcionalnost molekula koji vezuje ligand. Peptidni fuzioni partner za primer sadrži fragment imunoglobulinskog konstantnog domena (Fc). U pojedinim primerima izvođenja, imunoglobulinski konstantni fragment sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, ili najmanje 85%, ili najmanje 90%, ili najmanje 92%, ili najmanje 95%, ili najmanje 96%, ili najmanje 97%, ili najmanje 98%, ili najmanje 99% identična ili je 100% identična aminokiselinama 306-537 iz SEQ ID NO:3.

[0031] Kao što je ovde opisano, molekuli koji vezuju ligand mogu biti hemijski modifikovani tako da, na primer, olakšaju povezivanje sa fuzionim partnerom (kao što je, na primer, heterologni peptid) ili obezbeđuju želјene karakteristike (kao što je, na primer, povećan poluživot u serumu, povećavana rastvorlјivost u vodenom medijumu i omogućena ciljana isporuka do specifične ćelijske populacije, npr. do tumorskih ćelija ili ćelija mrežnjače).

[0032] U pojedinim primerima izvođenja, ovde opisan molekul za vezivanje liganda po izboru sadrži najmanje jednu PEG grupu koja je vezana za molekul. Na primer, u pojedinim primerima izvođenja, PEG od oko 20-40 kDa je vezan za amino kraj molekula koji vezuje ligand.

[0033] U pojedinim primerima izvođenja, molekul koji vezuje ligand, kao što je ovde opisano, po izboru sadrži linker koji povezuje fuzionpg partnera, kao što je, na primer, heterologni peptid, sa polipeptidom koji vezuje ligand, poput linkerske sekvence PIEGRGGGGG faktora Xa (SEQ ID NO:4). U drugim primerima izvođenja, molekul koji vezuje ligand sadrži polipeptid u kome je C-terminalna aminokiselina polipeptida koji vezuje ligand direktno spojena sa N-terminalnom aminokiselinom heterolognog peptide fuzionog partnera putem peptidne veze. U pojedinim primerima izvođenja, polipeptid koji vezuje ligand i heterologni peptid su vezani (direktno ili preko linkerskog polipeptida) amidnom vezom da bi obrazovao jedan polipeptidni lanac.

[0034] U pojedinim varijacijama izvođenja, molekul koji vezuje ligand sadrži signalni peptid koji usmerava izlučivanje molekula iz ćelije koja eksprimira molekulu.

[0035] Nukleinske kiseline (polinukleotidi) pronalaska obuhvataju nukleinske kiseline koje kodiraju polipeptidne molekule koji vezuju ligand, a koje mogu biti upotrebljene za takve primene kao što su genska terapija ili rekombinantna in vitro ekspresija polipeptidnog molekula koji vezuje ligand. U pojedinim primerima izvođenja, nukleinske kiseline su prečišćene ili izolovane. U pojedinim primerima izvođenja, polinukleotidi dalјe sadrže promotorsku sekvencu operativno povezanu sa nukleotidnom sekvencom koja kodira polipeptid, pri čemu promotorska sekvenca pospešuje transkripciju sekvence koja kodira polipeptid u ćeliji domaćinu. Polinukleotidi mogu takođe sadržavati signalnu sekvencu poliadenilacije. U pojedinim varijacijama izvođenja, nukleinska kiselina sadrži kodirajuću nukleotidnu sekvencu sličnu nukleotidnoj sekvenci koja kodira humani VEGFR-3 divljeg tipa. Na primer, nukleinska kiselina sadrži kodirajuću nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 80%, ili najmanje 85%, ili najmanje 90%, ili najmanje 92%, ili najmanje 95%, ili najmanje 96%, ili najmanje 97%, ili najmanje 98%, ili najmanje 99% identična humanoj VEGFR-3 sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:1 ili njenom fragmentu. Kao primer, u kontekstu nukleotidne sekvence koja kodira aminokiseline 47-314 iz SEQ ID NO:2 i modifikovana je u N2 sekvonu, nukleinska kiselina za primer sadrži kodirajuću nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 80%, ili najmanje 85 %, ili najmanje 90%, ili najmanje 92%, ili najmanje 95%, ili najmanje 96%, ili najmanje 97%, ili najmanje 98%, ili najmanje 99% identična humanoj VEGFR-3 sekvenci navedenoj u vidu pozicija od 157 do 961 u SEQ ID NO:1, a koja odgovaraju kodonima 47-314.

[0036] Vektori koji sadrže polinukleotide predstavljaju takođe aspekte pronalaska. Takvi vektori mogu sadržavati kontrolnu sekvencu ekspresije koja je operativno povezana sa sekvencom koja kodira polipeptid. U pojedinim varijacijama izvođenja, vektor je izabran tako da se optimizuje in vitro rekombinantna ekspresija u izabranoj ćeliji domaćinu, kao što je eukariotska ćelija domaćin. U pojedinim varijacijama izvođenja, vektor je izabran za in vivo isporuku. Na primer, vektor može biti izabran iz grupe koja se sastoji od lentivirusnog vektora, adeno-asociranog virusnog vektora, adenovirusnog vektora, lipozomskog vektora i njihovih kombinacija. U pojedinim primerima izvođenja, vektor sadrži adenovirus deficijentan u replikaciji, pri čemu navedeni adenovirus sadrži polinukleotid koji je operativno povezan sa promotorom i koga okružuju adenovirusne polinukleotidne sekvence.

[0037] Ćelije domaćini koje sadrže polinukleotide, vektore i druge nukleinske kiseline, kao i postupci za upotrebu istih da bi se eksprimirali i izolovali molekuli koji vezuju ligand, takođe predstavljaju aspekte ovog pronalaska. Eukariotske ćelije domaćini, uklјučujući ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) i druge sisarske ćelijske linije koji sadrže polinukleotid koji kodira polipeptid koji vezuje ligand ili molekul koji vezuje ligand, ovde su posebno razmotrene. U pojedinim varijacijama izvođenja, ćelijska linija je odabrana ili konstruisana tako da se uvede humana ili glikozilacija slična humanoj, u okviru glikozilacionih sekvona polipeptida proizvedenog u ćelijama.

[0038] Ovde se razmatraju i postupci stvaranja polipeptida ili molekula koji vezuju ligand. (Takvi postupci takođe mogu biti opisani kao upotrebe polinukleotida ili ćelija pronalaska.) U jednom primeru, postupak obuhvata rast ćelije koja je transformisana ili transfektovana sa polinukleotidom ili vektorom koji je ovde opisan, pod uslovima u kojima je polipeptid koji vezuje ligand ili molekul koji vezuje ligand kodiran polinukleotidom. U pojedinim primerima izvođenja, postupak dalјe obuhvata prečišćavanje ili izolovanje polipeptida koji vezuje ligand ili molekula koji vezuje ligand iz ćelije ili iz medijuma za rast ćelije. U pojedinim primerima izvođenja, postupak dalјe obuhvata vezivanje jednog ili više polietilen glikolskih (PEG) ili drugih ostataka na eksprimiran i prečišćen/izolovan polipeptid.

[0039] Pronalazak takođe obuhvata kompozicije koje sadrže polipeptidni molekul koji vezuje ligand ili nukleinsku kiselinu koja isti kodira, zajedno sa farmaceutski prihvatlјivim razblaživačem, adjuvansom ili medijumom nosača. U pojedinim primerima izvođenja, kompozicija je formulisana za lokalnu primenu u oko (npr. topikalna formulacija kao što su mast ili kapi za oči, ili formulacija pogodna za intravitrealno

1

injeciranje). U drugim primerima izvođenja, kompozicija je formulisana za lokalnu primenu u tumor ili u organ ili tkivo iz koga je tumor hirurški uklonjen, npr. intravenskim injeciranjem, ili injeciranjem direktno u zahvaćeno tkivo, ili primenom preko uređaja tokom resekcije tumora.

[0040] Opis takođe obuhvata postupke upotrebe ovde opisanih materijala (polipeptida, molekula i konstrukata, polinukleotida i vektora, transformisanih ćelija, kompozicija) za inhibiranje rasta vaskularnog suda (krvnog suda i/ili limfnog suda) u terapijskom i profilaktičkom kontekstu. Postupci upotrebe koji su ovde opisani mogu alternativno biti okarakterisani kao upotrebe raznih materijala za navedenu indikaciju. Primeri subjekata za lečenje obuhvataju lјude i druge primate, stoku (npr. goveda, kopitare, svinje), životinje iz zoološkog vrta (npr. mačke, vukove, debelokožce, jelene) i kućne lјubimce (npr. pse, mačke) i glodare.

[0041] U pojedinim varijacijama izvođenja, opis obuhvata postupak inhibicije neovaskularizacije kod subjekta, postupak koji obuhvata primenu subjektu bilo kog od prethodno navedenih materijala ili kompozicija, u količini koja je efektivna za inhibiranje neovaskularizacije kod subjekta. Patogena neovaskularna stanja za primer obuhvataju stanja oka i neovaskularizaciju tumora.

[0042] U pojedinim varijacijama izvođenja, opis obuhvata postupak inhibicije neovaskularizacije mrežnjače kod subjekta, postupak koji obuhvata primenu predmetnih materija ili kompozicija koje su ovde opisane, u količini koja je efektivna za inhibiranje neovaskularizacije mrežnjače kod subjekta. U srodnim varijantama izvođenja, opis obuhvata postupak lečenja subjekta sa očnim poremećajem koji je udružen sa neovaskularizacijom mrežnjače, postupak koji obuhvata primenu subjektu materijala ili kompozicije koji su ovde opisani, u količini koja je efektivna za inhibiranje neovaskularizacije mrežnjače kod subjekta. Na primer, kompozicija koja je ovde opisana se primenjuje lokalno u oko subjekta, kao što je putem kapi za oči ili drugačijom topikalnom primenom, kao i putem subkonjunktivne primene (npr. injekcije), intravitrealne injekcije ili intravitrealnog implanta.

[0043] Poželjno je da se kompozicije primenjuju u količini i sa učestalošću i dužinom trajanja ponovljene primene doze koja je efektivna za inhibiranje vezivanja VEGF-C i/ili VEGF-D za ili stimulaciju VEGFR-2 i/ili VEGFR-3 koji su eksprimirani u ćelijama oka ili krvnim sudovima oka. Ovakav povoljan efekat može biti izmeren u vidu usporavanja ili zaustavlјanja pogoršanja/napredovanja patološkog stanja oka (poput makularne degeneracije, dijabetske retinopatije i makularne telangiektazije) ili u vidu pobolјšanja kliničkih simptoma. Povoljan efekat takođe može biti primetan u pogledu uočenog rasta krvnih sudova u i oko cilјnog tkiva.

[0044] Postupci i upotrebe koji su ovde opisani mogu biti primenjeni u praksi u kombinaciji sa dodatnim terapijskim agensima ili tretmanima (npr. sa različitim oblicima zračenja), kao što je ovde detalјno opisano.

[0045] Postupci (ili upotrebe) pronalaska koje su ovde opisani mogu biti izvedeni sa jednim ili sa više molekula koji vezuju ligand, ili sa najmanje jednim molekulom koji vezuje ligand u kombinaciji sa drugim terapeutikom (kao što je standardni terapeutik za lečenje kancera ili za lečenje osnovnog mehanizma poremećaja oka). U primerima izvođenja gde su molekuli koji vezuju ligand namenjeni lečenju osnovnog mehanizma oboljenje oka, razmatraju se dodatne terapije koje obuhvataju fokalni laserski tretman (ili fotokoagulaciju), tretman raspršenog dejstva lasera (ili panretinalnu fotokoagulaciju) i virektomiju. U pojedinim primerima, subjektu koji se leči mogu biti primenjeni i antibiotici.

[0046] U primerima izvođenja gde su ovde opisani molekuli za vezivanje liganda namenjeni za upotrebu u lečenju kancera, razmatrani standardi za lečenje obuhvataju anti-sens RNK, RNK interferenciju, bispecifična antitela, druge vrste antitela i male molekule, npr. hemoterapijska sredstva koja cilјano deluju na faktore rasta i/ili njihove receptore. Citokin, radioterapijsko sredstvo ili terapija zračenjem mogu biti upotrebljeni u kombinaciji sa ovde opisanim molekulom koji vezuje ligand. Hemoterapijsko sredstvo ili radioterapijsko sredstvo može biti član klase lekova poput anti-metabolita; agenasa koji oštećuju DNK; citokina ili faktora rasta; lekova koji se kovalentno vezuju za DNK; inhibitora topoizomeraze; antimitotičkog sredstva; anti-tumorskog antibiotika; sredstva za diferencijaciju; alkilirajućeg sredstva; metilujućeg agensa; hormona ili antagoniste hormona; azotnog iperita; radiosenzibilizatora; i fotosenzibilizatora. Specifični primeri ovih sredstava su opisani drugde u aplikaciji. Poželjno je da kombinovane terapije budu sinergističke, ali ne moraju biti, a aditivne terapije se takođe smatraju aspektima pronalaska.

[0047] Pored njihove upotrebe u postupcima, molekuli koji vezuju ligand se mogu kombinovati ili pakovati sa drugim terapeuticima u kompletima ili u vidu pojedinačnih doza. Neoplastična oboljenja nisu jedina oboljenja koja mogu biti lečena molekulima koji vezuju ligand. Molekuli koji vezuju ligand mogu biti upotrebljeni kao terapeutici za bilo koje oboljenje koje je udruženo sa aberantnom angiogenezom ili limfangiogenezom.

[0048] Prijava je opisana u dodatnim primerima izvođenja koji slede:

Prečišćen ili izolovan polipeptid koji vezuje ligand sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična sa sekvencom aminokiselina definisanom pozicijama 47-115 iz SEQ ID NO:2, pod uslovom da pozicije u polipeptidu koje odgovaraju pozicijama 104-106 u SEQ ID NO:2 nisu identične N-X-S ili N-X-T, pri čemu se polipeptid vezuje za najmanje jedan ligandni polipeptid izabran između humanog VEGF-C, VEGF-D i PIGF.

[0049] Prečišćen ili izolovan polipeptid koji vezuje ligand prema paragrafu [0048], sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična sa sekvencom aminokiselina definisanom pozicijama 47-210 u SEQ ID NO:2, pod uslovom da pozicije u polipeptidu koje odgovaraju pozicijama 104-106 u SEQ ID NO:2 nisu identične N-X-S ili N-X-T.

[0050] Prečišćen ili izolovan polipeptid koji vezuje ligand u skladu sa stavom [0048], sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična sa sekvencom aminokiselina definisanom pozicijama 47-314 u SEQ ID NO:2, pod uslovom da pozicije u polipeptidu koje odgovaraju pozicijama 104-106 u SEQ ID NO:2 nisu identične N-X-S ili N-X-T.

[0051] Prečišćen ili izolovan polipeptid koji vezuje ligand u skladu sa stavom [0048], sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična sa sekvencom aminokiselina definisanom pozicijama 47-752 u SEQ ID NO:2, pod uslovom da pozicije u polipeptidu koje odgovaraju pozicijama 104-106 u SEQ ID NO:2 nisu identične N-X-S ili N-X-T.

[0052] Prečišćen ili izolovan polipeptid koji vezuje ligand prema bilo kom od paragrafa od [0048] do [0051] i koji zadržava četiri sekvonska mesta N-glikozilacije koja odgovaraju pozicijama 33-35 iz SEQ ID NO:2, pozicijama 166-168 iz SEQ ID NO:2, pozicijama 251-253 iz SEQ ID NO:2 i pozicijama 299-301 iz SEQ ID NO:2.

[0053] Prečišćen ili izolovan polipeptid koji vezuje ligand prema paragrafu [0052], koji je glikozilovan na navedena 4 sekvonska mesta N-glikozilacije.

[0054] Prečišćen ili izolovan polipeptid koji vezuje ligand prema bilo kom od paragrafa od [0048] do [0053] koji je solubilan polipeptid.

[0055] Prečišćen ili izolovan polipeptid koji vezuje ligand prema bilo kom od paragrafa od [0048] do [0054] i koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je identična sekvenci aminokiselina definisanoj pozicijama 47-115 iz SEQ ID NO:2, pozicijama 47 -210 iz SEQ ID NO:2, pozicijama 47-314 iz SEQ ID NO:2 ili pozicijama 47-752 iz SEQ ID NO:2, pod uslovom da pozicije u polipeptidu odgovaraju pozicijama 104-106 u SEQ ID NO: 2 nisu identične N-X-S ili N-X-T.

[0056] Prečišćen ili izolovan polipeptid koji vezuje ligand prema bilo kom od paragrafa od [0048] do [0055] koji ne vezuje humani VEGF-C ili humani VEGF-D.

[0057] Prečišćen ili izolovan polipeptid koji vezuje ligand prema paragrafu [0056], koji inhibira vezivanje VEGF-C ili VEGF-D za VEGFR-3 ili inhibira stimulaciju VEGFR-3 posredovanu sa VEGF-C ili VEGF-D u ćeliji koja eksprimira VEGFR-3 na svojoj površini.

[0058] Prečišćen ili izolovan polipeptid koji vezuje ligand prema bilo kom od paragrafa od [0048] do [0057], koji vezuje humani VEGF-C sa Kd ili 1 nM ili manje.

[0059] Prečišćen ili izolovan polipeptid koji vezuje ligand prema bilo kom od paragrafa od [0048] do [0057], koji vezuje humani VEGF-D sa Kd od 5 nM ili manje.

[0060] Prečišćen ili izolovan polipeptid koji vezuje ligand prema bilo kom od paragrafa od [0048] do [0059], pri čemu je aminokiselina u polipeptidu koja odgovara poziciji 104 u SEQ ID NO:2 deletirana ili zamenjena drugom aminokiselinom.

[0061] Prečišćen ili izolovan polipeptid koji vezuje ligand prema paragrafu [0055], pri čemu je aminokiselina na poziciji 104 u SEQ ID NO:2 deletirana ili zamenjena drugom aminokiselinom izabranom iz grupe koja se sastoji od glutamina, aspartata, glutamata, arginina i lizina.

[0062] Prečišćen ili izolovan polipeptid koji vezuje ligand prema bilo kom od paragrafa od [0048] do [0056], pri čemu polipeptid sadrži aminokiseline 23-290 iz SEQ ID NO:3.

[0063] Prečišćen ili izolovan polipeptid koji vezuje ligand prema bilo kom od paragrafa od [0048] do [0062], koji dalјe sadrži signalni peptid.

1

[0064] Prečišćen ili izolovan polipeptid koji vezuje ligand prema bilo kom od paragrafa od [0048] do [0063], koji dodatno sadrži najmanje jedan polietilen glikolni ostatak vezan za polipeptid.

[0065] Prečišćen ili izolovan polipeptid koji vezuje ligand prema paragrafu [0064], koji sadrži polietilen glikol od oko 20 - 40 kDa koji je vezan za amino kraj polipeptida.

[0066] Molekul koji vezuje ligand i koji sadrži polipeptid koji vezuje ligand prema bilo kom od paragrafa od [0048] do [0065], povezan sa heterolognim peptidom.

[0067] Molekul koji vezuje ligand prema paragrafu [0066], pri čemu heterologni peptid sadrži fragment imunoglobulinskog konstantnog domena.

[0068] Molekul koji vezuje ligand prema prema paragrafu [0066], pri čemu je fragment imunoglobulinskog konstantnog domena fragment konstantnog domena IgG-a.

[0069] Molekul koji vezuje ligand prema prema paragrafu [0067], pri čemu imunoglobulinski konstantni fragment sadrži aminokiseline 306-537 iz SEQ ID NO:3.

[0070] Molekul koji vezuje ligand prema paragrafu 19, pri čemu molekul koji vezuje ligand sadrži aminokiseline 22-537 iz SEQ ID NO:3.

[0071] Molekul koji vezuje ligand prema bilo kom od paragrafa od [0066] do [0070], koji po izboru sadrži linker koji povezuje heterologni peptid sa polipeptidom koji vezuje ligand.

[0072] Molekul koji vezuje ligand prema bilo kom od paragrafa od [0066] do [0070], koji sadrži polipeptid u kome je C-terminalna aminokiselina polipeptida koja vezuje ligand direktno vezana za N-terminalnu aminokiselinu heterolognog peptida preko peptidne veze.

[0073] Molekul koji vezuje ligand prema bilo kom od paragrafa od [0066] do [0072], i dalje sadrži signalni peptid koji usmerava izlučivanje molekula iz ćelije koja eksprimira molekul.

[0074] Molekul koji vezuje ligand prema prema paragrafu [0066], pri čemu molekul sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:3.

[0075] Molekul koji vezuje ligand prema bilo kom od paragrafa od [0066] do [0070], pri čemu su polipeptid koji vezuje ligand i heterologni peptid povezani amidnom vezom da bi obrazovao jedan polipeptidni lanac.

[0076] Polipeptid koji vezuje ligand prema bilo kom od paragrafa od [0048] do [0065] ili molekul koji vezuje ligand prema bilo kom od paragrafa 19-28, koji dalјe sadrži obeleživač koji se može detektovati.

[0077] Konjugat koji sadrži polipeptid koji vezuje ligand prema bilo kom od paragrafa 1-18 ili molekul koji vezuje ligand prema bilo kom od paragrafa od [0066] do [0075] i hemoterapijsko sredstvo.

[0078] Izolovani polinukleotid koji sadrži kodirajuću nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid koji vezuje ligand prema bilo kom od paragrafa 1-18 ili molekul koji vezuje ligand prema bilo kom od paragrafa [0066] do [0075].

[0079] Polinukleotid prema paragrafu [0078], koji dalјe sadrži promotorsku sekvencu operativno povezanu sa kodirajućom nukleotidnom sekvencom da bi se pospešila transkripcija kodirajuće nukleotidne sekvence u ćeliji domaćinu.

[0080] Vektor koji sadrži polinukleotid paragrafa [0078] ili paragrafa [0079].

[0081] Vektor prema paragrafu [0080], koji dalјe sadrži sekvencu kontrole ekspresije operativno povezanu sa kodirajućom nukleotidnom sekvencom.

[0082] Vektor prema paragrafu [0080], pri čemu je navedeni vektor izabran iz grupe koja se sastoji od lentivirusnog vektora, adeno-asociranog virusnog vektora, adenovirusnog vektora, lipozomalnog vektora i njihovih kombinacija.

[0083] Vektor prema paragrafu [0080], pri čemu navedeni vektor sadrži adenovirus sa deficijencijom replikacije i pri čemu navedeni adenovirus sadrži polinukleotid koji je operativno povezan sa promotorom i okružen adenovirusnim polinukleotidnim sekvencama.

[0084] Izolovana ćelija ili ćelijska linija transformisana ili transfektovana sa polinukleotidom prema paragrafu [0078] do [0079] ili sa vektorom prema paragrafu od [0080] do [0083].

[0085] Izolovana ćelija ili ćelijska linija prema paragrafu [0084] koja je eukariotska ćelija.

[0086] Izolovana ćelija ili ćelijska linija prema paragrafu [0084] koja je humana ćelija.

[0087] Izolovana ćelija ili ćelijska linija prema paragrafu [0084] koja je ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO).

[0088] Postupak pripreme polipeptida koji vezuje ligand i koji podrazumeva rast ćelije prema bilo kom od paragrafa od [0084] do [0087] pod uslovima u kojima se eksprimira polipeptid koji vezuje ligand ili molekul koji vezuje ligand kodiran polinukleotidom.

[0089] Postupak prema paragrafu [0088], koji dalјe obuhvata prečišćavanje ili izolovanje polipeptida koji vezuje ligand ili molekula koji vezuje ligand iz ćelije ili iz medijuma za rast ćelije.

[0090] Kompozicija koji sadrži prečišćeni polipeptid koji vezuje ligand ili molekul koji vezuje ligand prema bilo kom od paragrafa od [0048] do [0076] i farmaceutski prihvatlјiv razblaživač, adjuvans, ekscipijens ili nosač.

[0091] Kompozicija koji sadrži polinukleotid ili vektor prema bilo kom od paragrafa od [0078] do [0083] i farmaceutski prihvatlјiv razblaživač, adjuvans, ekscipijens ili nosač.

[0092] Kompozicija prema paragrafu [0090] ili paragrafu [0091] koja je formulisana za topikalnu primenu.

[0093] Kompozicija prema paragrafu [0092], koji je u obliku čvrste supstance, paste, masti, gela, tečnosti, aerosola, pare, polimera, filma, emulzije ili suspenzije.

[0094] Kompozicija prema paragrafu [0090] ili paragrafu [0091] koja je formulisana za intravitrealnu primenu.

[0095] Postupak inhibiranja neovaskularizacije kod subjekta, postupak koji obuhvata primenu subjektu kompozicije prema bilo kom od paragrafa od [0090] do [0094] u količini koja je efektivna za inhibiranje neovaskularizacije kod subjekta.

[0096] Postupak inhibicije neovaskularizacije mrežnjače kod subjekta, postupak koji obuhvata primenu subjektu kompozicije prema bilo kom od paragrafa od [0090] do [0094] u količini koja je efektivna za inhibiranje neovaskularizacije mrežnjače kod subjekta.

1

[0097] Postupak lečenja subjekta koji boluje od očnog poremećaja udruženog sa neovaskularizacijom mrežnjače, postupak koji obuhvata primenu subjektu kompozicije prema bilo kom od paragrafa od [0090] do [0095], u količini koja je efektivna za inhibiranje neovaskularizacije mrežnjače kod subjekta.

[0098] Upotreba kompozicije prema bilo kom od paragrafa od [0090] do [0094] za inhibiciju neovaskularizacije, kao što je neovaskularizacije mrežnjače ili neovaskularizacija tumora, kod subjektu kome je to potrebno.

[0099] Postupak ili upotreba prema bilo kom od paragrafa od [0096] do [0098], pri čemu se kompozicija primenjuje lokalno u oko subjekta.

[0100] Postupak ili upotreba prema paragrafu [0099], pri čemu se kompozicija primenjuje intravitrealnom injekcijom.

[0101] Postupak ili upotreba prema paragrafu [0099], pri čemu se kompozicija primenjuje topikalnom primenom.

[0102] Postupak ili upotreba prema bilo kom od paragrafa od [0096] do [00101], pri čemu se kompozicija primenjuje u količini koja je efektivna za inhibiranje VEGF-C i/ili VEGF-D u oku subjekta putem vezivanja za ili stimulacije VEGFR -2 i/ili VEGFR-3 koji su eksprimirani u ćelijama oka ili u sudovima oka.

[0103] Postupak ili upotreba iz paragrafa [0097] ili [0098], pri čemu je očni poremećaj izabran iz grupe koja se sastoji od makularne degeneracije, dijabetske retinopatije i makularne telangiektazije.

[0104] Postupak ili upotreba prema bilo kom od paragrafa od [0096] do [00103] koji dalјe obuhvataju primenu antibiotika subjektu.

[0105] Postupak prema paragrafu [00104], pri čemu je antibiotik izabran iz grupe koja se sastoji od amikacina, gentamicina, kanamicina, neomicina, netilmicina, streptomicina, tobramicina, tejkoplanina, vankomicina, azitromicina, klaritromicina, klaritromicina, diritromicina, erititromicina, roksitromicina, troleandomicina, amoksicilina, ampicilina, azlocilina, karbenicilina, klozacilina, dikloksacilina, flukozacilina, meziocilina, nafcilina, penicilina, piperacilina, tikarcilina, bacitracina, kolistina, polimiksina B, ciprofloksacina, enoksacina, gatifloksacina, levofloksacina, lomefloksacina, moksifloksacina, norfloksacina, oflazacina, trovafloksacina, mafenida, sulfacetamida, sulfametizola, sulfasalazina, sulfizoksazola, trimetoprima, kotrimoksazola, demeklociklina, soksiciklina, minociklina, oksitetraciklina i tetraciklina.

[0106] Postupak ili upotreba prema paragrafu [0095] ili [0098], pri čemu je subjektu dijagnostifikovan tumor i pri čemu se kompozicija primenjuje u količini koja je efektivna za inhibiranje neovaskularizacije u tumoru.

[0107] Postupak ili upotreba prema paragrafu [00106], pri čemu se kompozicija primenjuje tumoru ili u organ ili tkivo iz koga je tumor hirurški uklonjen.

1

[0108] Postupak ili upotreba prema paragrafu [00106], pri čemu se kompozicija primenjuje u količini koja je efektivna za inhibiranje VEGF-C i/ili VEGF-D u tumoru subjekta putem inhibicije vezivanja za ili stimulacije VEGFR-2 i/ili VEGFR- 3 koji je eksprimiran u tumorskim ćelijama.

[0109] Nije predviđeno da ovo kratko izlaganje suštine pronalaska bude ograničavajuće ili sveobuhvatno, a dodatni primeri izvođenja su opisani u Nacrtima i detaljnom opisu pronalaska, uključujući primere. Svi takvi primeri izvođenja predstavljaju aspekte pronalaska. Štaviše, radi sažetosti, razni detalјi koji su primenlјivi na više primera izvođenja nisu ponavlјani za svaki primer izvođenja. Predviđeno je i da varijacije koje podrazumevaju kombinacije i rearanžmane primera izvođenja koji su ovde opisani predstavljaju aspekte pronalaska. Pored prethodno navedenog, pronalazak obuhvata, kao dodatni aspekt, sve primere izvođenja pronalaska koji su na bilo koji način užeg opsega od varijacija koje su specifično prethodno navedene. Na primer, za aspekte opisane kao rod ili opseg, svaki podrod, podopseg ili vrsta se specifično razmatraju kao primeri izvođenja pronalaska.

KRATAK OPIS NACRTA

[0110]

Slika 1A prikazuje PK profile VGX-300 i VGX-301-ΔN2 proizvedene tranzientnom CHO ekspresijom. Slika 1B prikazuje PK profile VGX-300 i VGX-301-ΔN2 proizvedene tranzientnom HEK ekspresijom. Slika 2 pokazuje da su se i VGX-300 i VGX-301-ΔN2 specifično vezali i za VEGF-C i za VEGF-D.

Slika 3 prikazuje da VGX-300 blokira vezivanje za i umrežavanje VEGF-C i VEGF-D sa a) VEGFR-2 i b) VEGFR-3.

Slika 4 prikazuje da VGX-300 i VGX-300-N2 blokiraju a) VEGF-C i b) VEGF-D vezivanje i umrežavanje VEGFR-3 u ispitivanju zasnovanom na Ba/F3 ćelijama. Tačke podataka predstavlјaju prosečnu vrednost za n≥2 ± SD.

Slika 5 prikazuje farmakokinetiku i biodistribuciju u oku kod zečeva nakon intravitrealne primene

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0111] Predmetni pronalazak se delimično zasniva na istraživanju koje pokazuje da su fragmenti ECD humanog VEGFR-3 koji imaju jednu ili modifikacije u N-glikanskom regionu ECD-a sposobni da se vezuju i neutrališu humani VEGF-C i humani VEGF-D in vitro i da su takođe sposobni da inhibiraju razvoj vaskulaturu u animalnim modelima degeneracije makule povezane sa starenjem.

[0112] Tirozin kinazni receptori faktora rasta obično sadrže tri glavna domena: vanćelijski domen (ECD, od engl. extracellular domain), transmembranski domen i unutarćelijski domen. ECD vezuje ligande, transmembranski domen pozicionira receptor u ćelijskoj membrani, dok unutarćelijski domen poseduje jedan ili više trozin kinaznih enzimskih domena i interaguje sa nishodnim molekulima transdukcije

1

signala. Receptori za vaskularni endotelni faktor rasta (VEGFR) vezuju svoj ligand preko svojih ECD, koji se sastoje od više domena sličnih imunoglobulinskim (domeni slični Ig domenima). Ovde su identifikovani domeni slični Ig upotrebom oznake „D#“. Na primer, "D1" se odnosi na prvi domen sličan Ig domenu određenog receptorskog ECD. "D1-3" se odnosi na konstrukt koji sadrži najmanje prva tri domena slična Ig domenima i na interventnu sekvencu između domena 1 i 2, i 2 i 3, određenog molekula koji vezuje ligand.

[0113] Kompletan ECD iz VEGFR nije potreban za vezivanje liganda (faktora rasta). ECD iz VEGFR-3 ima šest intaktnih domena sličnih Ig domenima i jedan domen sličan Ig domenu koji je nastao cepanjem - D5 iz VEGFR-3 koji se post-translaciono podvrgava cepanju na subjedinice koje su povezane disulfidnim vezama po napuštanju VEGFR-3. Veikkola T. i saradnici, Cancer Res. 60:203-212 (2000). U pojedinim primerima izvođenja, fragmenti receptora koji sadrže najmanje prva tri domena slična Ig domenima ove familije su dovolјni za vezivanje liganda. Solubilni receptori sposobni da vezuju VEGF-C i VEGF-D, čime inhibiraju aktivnost VEGF-C ili VEGF-D ili signalizaciju preko VEGFR-3, prijavljeni su i u WO2000/023565, WO2000/021560, WO2002/060950 i WO2005/087808. Ovakvi solubilni receptori, modifikovani promenom u ΔN2 sekvonu i po izvoru drugim modifikacijama koje su ovde opisane, razmatraju se kao aspekti pronalaska.

[0114] Tabela 1 definiše približne granice domena sličnih Ig domenima za humani VEGFR-3. Ove granice su značajne pošto se izabrane granice mogu upotrebiti za pripremu molekula koji vezuju ligand, što može uticati na osobine vezivanja rezultujućih konstrukata.

Tabela 1: Domeni slični imunoglobulinskim za humani VEGFR-3

Kompletan ECD se proteže otprilike do pozicije 775 u SEQ ID NO: 2.

[0115] Solubilni receptorski konstrukti za upotrebu u vidu molekula koji vezuje ligand za humani VEGF-C ili VEGF-D, poželјno sadrže najmanje jedan domen VEGFR-3 sličnan Ig domenu, kao što je opisano u Tabeli 1, ali ih mogu sadržavati čak i do sedam. Molekul koji vezuje ligand po izboru će uklјučivati sekvencu pre domena sličnog Ig domenu koji je pozicioniran najbliže N-kraju i po izboru će uklјučivati sekvencu izvan domena sličnog Ig domenu koji je pozicioniran najbliže C-kraju, a po izboru će uklјučivati i sekvencu između domena sličnih Ig domenima. Takođe se razmatraju varijante, npr. sa jednom ili sa više

1

aminokiselinskih supstitucija. U pojedinim primerima izvođenja, molekul koji vezuje ligand sadrži fragment humanog VEGFR-3 koji sadrži najmanje prva tri domena slična Ig domenima humanog VEGFR-3.

[0116] U pojedinim primerima, molekul koji vezuje ligand je polipeptid koji sadrži deo humanog VEGFR-3 ECD-a, pri čemu se taj deo vezuje za jedan ili za oba od humanog VEGF-C i humanog VEGF-D, i sadrži najmanje prvi, drugi i treći od Ig-sličnih domena VEGFR-3 ECD-a, pri čemu je aminokiselinska sekvenca ECD fragmenta VEGFR-3 modifikovana u odnosu na VEGFR-3 divlјeg tipa da bi se eliminisao drugi pretpostavlјeni N-vezani glikozilacioni sekvon VEGFR-3 divljeg tipa, i pri čemu polipeptidu nedostaju VEGFR-3 domeni slični Ig domenu 4-7 i poželјno bilo koji transmembranski domen, a poželјno i bilo koji unutarćelijski domen.

[0117] U pojedinim primerima, molekul koji vezuje ligand sadrži polipeptid sličan ili identičan u aminokiselinskoj sekvenci humanom VEGFR-3 polipeptidu (SEQ ID NO: 2) ili njegovom fragmentu, pod uslovom da pozicije molekula koji vezuju ligand odgovaraju pozicijama 104 -106 humanog polipeptida VEGFR-3 koji je naveden u SEQ ID NO: 2 nisu identične N-X-S ili N-X-T, pri čemu molekul koji vezuje ligand vezuje jedan ili više faktora rasta izabranih iz grupe koja se sastoji od humanog VEGF-C i humanog VEGF- D. Fragment minimalno sadrži dovolјno VEGFR-3 sekvence da vezuje ligand, a može sadržavati i kompletan receptor. Poželjni su ECD fragmenti. Poželјni polipeptidi su sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 80% identična njegovom fragmentu koji vezuje ligand. Fragmenti koji su sličniji, npr.

85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili 100% identični, su veoma poželјni. Razmatraju se i fragmenti koji su identični sa 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% i 75%. Rod sličnih polipeptida može alternativno biti definisan sposobnošću kodrajućih polinukleotida da hibridizuju sa komplementom nukleotidne sekvence koja odgovara sekvenci cDNK koja kodira VEGFR-3 receptor.

[0118] Termin "identitet", kao što je poznato u oblasti tehnike, odnosi se na odnos između sekvenci dva ili više polipeptidnih molekula ili dva ili više molekula nukleinske kiseline, što se određuje poravnanjem sekvenci. U oblasti tehnike, "identitet" takođe označava stepen srodnosti molekula nukleinskih kiselina ili polipeptidnih sekvenci, u zavisnosti od slučaja, što se određuje poređenjem između nizova dve ili više nukleotidne ili dve ili više aminokiselinskih sekvenci. "Identitet" meri procenat identičnih podudaranja između manje od dve ili više sekvenci uz poravnanje praznina (ukoliko su prisutne) primenom određenih matematičkih modela i upotrebom kompjuterskog programa (tj. "algoritma"). Odgovarajući algoritmi za određivanje procenta identiteta pronalaska obuhvataju BLASTP i BLASTN i upotrebu uobičajenih i opšte prihvaćenih zadatih parametara.

[0119] Molekuli koji vezuju ligand mogu takođe biti opisani kao oni koji sadrže aminokiselinsku sekvencu kodiranu sekvencom nukleinske kiseline koja je najmanje 80% identična fragmentu iz SEQ ID NO: 1 koji kodira fragment koji vezuje ligand iz VEGFR-3, pod uslovom da pozicije u molekulu koji vezuje ligand, a koje odgovaraju pozicijama 104-106 kodiranog fragmenta koji vezuje ligand iz VEGFR-3, nisu identične N-X-S ili N-X-T. Fragmenti nukleinske kiseline koji su sličniji, na primer, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,

1

95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili 100% identični, veoma su poželјni. Fragmenti koji su identični 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% i 75%, takođe se razmatraju. Na primer, poželjan molekul koji vezuje ligand sadrži aminokiselinsku sekvencu koja vezuje humani VEGF-C i/ili humani VEGF-D i koja je kodirana nukleotidnom sekvencom koja hibridizuje sa komplementom SEQ ID NO: 1 pod umereno ili jako strogim uslovima koji su ovde razmotreni.

[0120] U pojedinim primerima, molekul koji vezuje ligand sadrži polipeptid koji sadrži fragment humanog VEGFR-3 (SEQ ID NO: 2) izabran iz grupe koja se sastoji od pozicija 1-226 ili 25-226 iz SEQ ID NO: 2, pozicija 1- 229 ili 25-229 iz SEQ ID NO: 2 i pozicija 1-329 ili 25-229 iz SEQ ID NO: 2, pod uslovom da pozicije 104-106 kodiranog fragmenta koji vezuje ligand iz VEGFR-3 nisu identične N-X-S ili N-X-T. U pojedinim primerima, molekul koji vezuje ligand je polipeptid koji sadrži fragment humanog VEGFR-3 (SEQ ID NO: 2) izabran iz grupe koja se sastoji od pozicija 47-224 iz SEQ ID NO: 2, pozicija 47-225 iz SEQ ID NO: 2, pozicija 47-226 iz SEQ ID NO: 2, pozicija 47-227 iz SEQ ID NO: 2, pozicija 47-228 iz SEQ ID NO: 2, pozicija 47-229 iz SEQ ID NO: 2, pozicija 47-230 iz SEQ ID NO: 2, pozicija 47-231 iz SEQ ID NO: 2, pozicija 47-232 iz SEQ ID NO: 2, pozicija 47-236 iz SEQ ID NO: 2, pozicija 47-240 od SEQ ID NO : 2 i pozicije 47-245 SEQ ID NO: 2, pod uslovom da pozicije 104-106 kodiranog fragmenta koji vezuje ligand iz VEGFR-3 nisu identične N-X-S ili N-X-T. U pojedinim primerima, molekul koji vezuje ligand je polipeptid koji sadrži fragment humanog VEGFR-3 (SEQ ID NO: 2), izabran iz grupe koja se sastoji od pozicija 47-314 iz SEQ ID NO: 2, pozicija 47-210 iz SEQ ID NO: 2 i pozicija 47-247 SEQ ID NO: 2, pod uslovom da pozicije 104-106 kodiranog fragmenta koji vezuje ligand iz VEGFR-3 nisu identične N-X-S ili N-X-T.

[0121] Molekuli koji vezuju ligand mogu takođe biti opisani kao oni koji sadrže aminokiselinsku sekvencu koja je slična ili identična aminokiselinskoj sekvenci koja je navedena u SEQ ID NO: 3. Poželјni polipeptidi imaju aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80% identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO: 3, pod uslovom da pozicije 80-82 polipeptida navedenog u SEQ ID NO: 3 nisu identične N-X-S ili N-X-T, pri čemu molekul koji vezuje ligand vezuje jedan ili više faktora rasta izabranih iz grupe koji se sastoji od humanog VEGF-C i humanog VEGF-D. Polipeptidi koji su sličniji, npr.85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili 100% identični, veoma su poželјni. Fragmenti koji su identični 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% i 75% se takođe razmatraju. Rod sličnih polipeptida može alternativno biti definisan sposobnošću kodirajućih polinukleotida da hibridizuju sa komplementom nukleotidne sekvence koji odgovara sekvenci cDNK koja kodira VEGFR-3 receptor.

[0122] U pojedinim primerima, molekul koji vezuje ligand sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži aminokiseline 22-290 iz SEQ ID NO: 3. U pojedinim primerima, molekul koji vezuje ligand sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži aminokiseline 23-290 iz SEQ ID NO: 3. U pojedinim primerima, molekul koji vezuje ligand sadrži aminokiseline 22-537 iz SEQ ID NO: 3 ili aminokiseline 23-537 iz SEQ ID NO: 3 ili aminokiseline 1-537 iz SEQ ID NO: 3.

[0123] Izraz "komponentni domen", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na domen unutar molekula koji vezuje ligand, a koji je izveden iz ili zasnovan na proteinskom domenu unutar vanćelijskog dela

2

receptorskog proteina. Na primer, svaki Ig-domen VEGFR-3 (D1-D7) i ostalih članova familije tirozin kinaznih receptora (npr. kao što su VEGFR-1 i VEGFR-2) čine komponentne domene. Upućivanje na komponentni domen ovde obuhvata i potpuni nativni domen divljeg tipa, kao i njegove varijatne sa insercijama, delecijama i/ili supstitucijama koje suštinski zadržavaju funkcionalne karakteristike intaktnog domena. Stručnjaku u oblasti tehnike će biti očigledno da se mogu dobiti brojne varijante prethodno navedenih domena (npr. Ig-domena) koje će suštinski zadržati iste funkcionalne karakteristike kao i domen divlјeg tipa.

[0124] Receptori faktora rasta, iz kojih se mogu dobiti molekuli koji vezuju ligand, uklјučuju varijante nastale drugačijom obradom, kao i alelske varijante koje se javlјaju u prirodi. Alelske varijante su dobro poznate u oblasti tehnike i predstavlјaju alternativne oblike ili sekvence nukleinskih kiselina koje sadrže supstituciju, deleciju ili adiciju jednog ili više nukleotida, ali što ne rezultuje nikakvom značajnom funkcionalnom promenom kodiranog polipeptida. Primeri alelskih varijanti VEGFR-3 su prijavlјeni u literaturi, npr. na internet stranici http://www.uniprot.org/uniprot/P35916, i obuhvataju pozicije 149, 378, 494, 527 i 641 unutar ECD. Standardni postupci mogu biti lako upotrebljeni za stvaranje takvih polipeptida, uklјučujući mutagenezu usmerenu na mesto polinukleotida ili specifično enzimsko cepanje i ligaciju. Slično navedenom, razmatra se upotreba peptidomimetičkih jedinjenja ili jedinjenja u kojima su jedan ili više aminokiselinskih ostataka zamenjeni aminokiselinom koja se ne javlja u prirodi ili aminokiselinskim analogom pri čemu se zadržava aktivnost vezivanja. Poželјno je da kada se upotrebljava aminokiselinska supstitucija, supstitucija bude konzervativna, tj. da je aminokiselina zamenjena sa onom koja je slične veličine i sa sličnim svojstvima naelektrisanja. Kao što se ovde upotrebljava, termin "konzervativna supstitucija" označava zamenu aminokiselinskog ostatka drugim, biološki sličnim ostatkom. Primeri konzervativnih supstitucija obuhvataju supstituciju jednog hidrofobnog ostatka kao što su izoleucin, valin, leucin, alanin, cistein, glicin, fenilalanin, prolin, triptofan, tirozin, norleucin ili metionin sa drugim, ili supstituciju jednog polarnog ostatka sa drugim, kao što je supstitucija arginina lizinom, glutaminske kiseline sa asparaginskom kiselinom ili glutamina sa asparaginom i slično. Neutralne hidrofilne aminokiseline koje mogu biti supstituisane jedna drugom obuhvataju asparagin, glutamin, serin i treonin. Izraz "konzervativna supstitucija" takođe obuhvata upotrebu supstituisane aminokiseline umesto nesupstituisane aminokiseline.

[0125] Alternativno, konzervativne aminokiseline mogu biti grupisane kao što je opisano u publikaciji Lehninger-a (Biochemistry, drugo izdanje; Worth Publishers, Inc. NY:NY, str. 71-77 (1975)), a kao što je navedeno u tekstu koji sledi:

Nepolarne (hidrofobne)

A. Alifatične: A, L, I, V, P,

B. Aromatične: F, W,

C. Koje sadrže sumpor: M,

D. Granične: G.

Nenaelektrisane-polarne

A. Hidroksilne: S, T, Y,

B. Amidne: N, Q,

C. Sulfhidrilne: C,

D. Granične: G.

Pozitivno naelektrisane (bazne): K, R, H.

Negativno naelektrisane (kisele): D, E.

[0126] Da bi se izbegla sumnja, "komponentni domen" obuhvata domen koja odgovara D1 iz VEGFR-3 u kome je motiv N-X-S/T sekvence na poziciji 104-106 u SEQ ID br: 2 mutiran, npr. zahvaljujući supstituciji.

[0127] U slučajevima gde molekul koji vezuje ligand sadrži više komponentnih domena, na primer komponentne domene D1, D2 i D3 iz VEGFR-3, komponentni domeni mogu biti povezani direktno jedni sa drugima ili mogu biti povezani preko jednog ili više spejsera. Generalno, termin "spejser" označava jedan ili više molekula, na primer nukleinskih kiselina ili aminokiselina ili nepeptidnih struktura, poput polietilen glikola ili disulfidnih mostova, koji mogu biti umetnuti između jednog ili više komponentnih domena obrazujući kovalentnu vezu. Spejserske sekvence mogu biti upotrebljene za obezbeđivanje poželјnog mesta od interesa između komponenti radi lakše manipulacije. Spejser takođe može biti obezbeđen da bi se pojačala ekspresija polipeptida koji vezuje ligand iz ćelije domaćina, da bi se smanjilo steričko ometanje tako da komponenta ili grupa komponenti mogu zauzeti svoju/njihovu optimalnu tercijarnu strukturu i/ili interagovati na odgovarajući način sa svojim/njihovim cilјnim molekulima. Za spejsere i postupke identifikacije poželјnih spejsera, pogledati, na primer, George i saradnici (2003) Protein Engineering 15:871-879. Spejserska sekvenca može obuhvatati jednu ili više aminokiselina koje su prirodno povezane sa receptorskom komponentom ili može biti dodata sekvenca koja se koristi za pojačavanje ekspresije polipeptida koji vezuju ligand, a što obezbeđuje posebno poželјena mesta od interesa, omogućavajući da komponentni domeni obrazuju optimalne tercijarne strukture i/ili da pojačaju interakciju komponente ili grupe komponenti sa njenim/njihovim cilјnim molekulom. U jednom primeru izvođenja, spejser sadrži jednu ili više peptidnih sekvenci između jedne ili više komponenti koje su dužine od između 1-100 aminokiselina, poželjno 1-50 aminokiselina. U poželјnom primeru izvođenja, spejser između dva komponentna domena se suštinski sastoji od aminokiselina koje su prirodno povezane sa receptorskom komponentom iz receptora divljeg tipa. U slučaju molekula koji vezuje ligand koji sadrži višestruke komponentne domene iz istog receptora, a koji su susedni jedan drugome u nativnom receptoru, kao što su na primer D1, D2 i D3 iz VEGFR-3, u jednom primeru izvođenja, domeni su povezani jedni sa drugima (npr. D1 sa D2 i D2 sa D3) upotrebom spejsera koji odgovaraju prirodnim povezujućim aminokiselinskim sekvencima.

[0128] U pojedinim varijacijama izvođenja, svaki polipeptid koji vezuje ligand je eksprimiran kao fuzioni protein sa proteinom koji mu je fuzioni partner, kao što je imunoglobulinski konstantni region, a heterologni fuzioni partneri su povezani tako da se obrazuje molekul koji vezuje ligand.

Multimeri, multimerizacione komponente, fuzioni partneri i linkeri

[0129] Fuzioni partner je svaka heterologna komponenta koja pojačava funkcionalnost molekula koji vezuje ligand. Tako, na primer, fuzioni partner može povećati rastvorlјivost, modulisati klirens, olakšati cilјano dejstvo na određeni tip ćelija ili tkiva, pojačati biološku aktivnost, pomoći u proizvodnji i/ili prinosu proizvoda, pobolјšati farmakološka svojstva ili pobolјšati farmakokinetički (PK) profil polipeptida koji vezuje ligand. U pogledu pobolјšanja PK profila, navedeno se može postići, na primer, povećanjem poluživota u serumu, penetrabilnošću u tkiva, odsustvom imunogenosti ili stabilnošću molekula koji vezuje ligand. U poželјnim slučajevima, fuzioni partner je izabran iz grupe koja se sastoji od multimerizacione komponente, serumskog proteina ili molekula sposobnog da vezuje serumski protein.

[0130] Kada je fuzioni partner serumski protein ili njegov fragment, on je izabran iz grupe koja se sastoji od α-1-mikroglobulina, AGP-1, orozomukioda, α-1-kiselog glikoproteina, proteina koji vezuje vitamin D (DBP), hemopeksina, humanog serumskog albumina (hSA), transferina, feritina, afamina, haptoglobina, α-fetoprotein tiroglobulina, α-2-HS-glikoproteina, β-2-glikoproteina, proteina koji vezuje hijaluronan, sintaksina, C1R, lanca C1q, proteina koji vezuje galektin3-Mac2, fibrinogena, polimernog Ig receptora (PIGR), α-2-makroglobulina, transportnog proteina uree, haptoglobina, IGFBP, receptora za uklanjanje makrofaga, fibronektina, giantina, Fc, α-1-antihiromotripsina, α-1-antitripsina, antitrombina III, apolipoproteina A-1, apolipoproteina B, β-2-mikrogiobulina, ceruloplazmina, komponente komplementa tipa C3 ili C4, inhibitora Cl esteraze, C-reaktivnog proteina, cistatina C i proteina C. U specifičnijem primeru, fuzioni partner je izabran iz grupe koja se sastoji od α-1-mikroglobulina, AGP-1, orozomukioda, α-1-kiselog glikoproteina, proteina za vezivanje vitamina D (DBP), hemopeksina, humanog serumskog albumina (hSA), afamina i haptoglobina. Uklјučivanje komponentih fuzionih partnera može produžiti poluživot u serumu fuzionog polipeptida prema pronalasku, kada je to poželjno. Pogledati, na primer, US patente br. 6,423,512; 5,876,969; 6,593,295 i 6,548,653, za primere fuzionih polipeptida sa serumskim albuminom. hSA je široko rasprostranjen u telu, posebno u crevnim i krvnim komponentama i ima važnu ulogu u održavanju osmolarnosti i volumena plazme. Uklanja se polako u jetri, a obično je in vivo poluživot kod lјudi 14-20 dana (Waldmann i saradnici (1977) Albumin, Structure Function and Uses; Pergamon Press; str.255-275).

[0131] Kada je fuzioni partner molekul sposoban da vezuje serumski protein, molekul može biti sintetski mali molekul, lipid ili lipozom, nukleinska kiselina, uklјučujući sintetsku nukleinsku kiselinu kao što je

2

aptamer, peptid ili oligosaharid. Molekuli mogu dalјe biti protein, kao što su, na primer, FcγRl, FcγR2, FcγR3, polimerni Ig receptor (PIGR), ScFv i drugi fragment antitela specifičan za serumski protein.

[0132] Kada je fuzioni partner multimerizaciona komponenta, to je bilo koja prirodna ili sintetska sekvenca ili jedinjenje koje je sposobno da operativno poveže prvi molekula koji vezuje ligand sa drugim molekulom koji vezuje ligand, ili sa drugom multimerizacionom komponentom drugog molekula koji vezuje ligand, da bi se obrazovala struktura višeg reda, npr. dimer, trimer, itd. Pogodne multimerizacione komponente mogu sadržavati leucinski “rajsfešlus”, uklјučujući i leucinski ziperske domene izvedene iz c-jun ili c-fos; sekvence izvedene iz konstantnih regiona kapa ili lambda lakih lanaca; sintetske sekvence kao što su motivi heliks-petlјa-heliks (Muller i saradnici (1998) FEBS Lett.432: 45-49), motivi kalem-kalem itd. ili drugi opšte prihvaćeni multimerizacioni domeni poznati u oblasti tehnike. U pojedinim primerima izvođenja, fuziona komponenta sadrži domen izveden iz imunoglobulina, na primer, iz humanog IgG, IgM ili IgA.

[0133] Prema jednom aspektu, ovde opisani molekul za vezivanje liganda se proizvodi kao multimer. Svaka subjedinica multimera sadrži ili se sastoji od molekula koji vezuje ligand, na primer, polipeptida koji vezuje ligand. Ovi multimeri mogu biti homodimerni, heterodimerni ili multimerni solubilni receptori, sa multimernim receptorima koji se sastoje od 9 ili manje subjedinica, poželјno 6 ili manje subjedinica, još poželјnije 3 ili manje subjedinica, a najpoželјnije 2 subjedinice. Poželјno je da su ovi multimerni solubilni receptori homodimeri molekula koji vezuju ligand.

[0134] Najmanje dve subjedinice u multimeru su operativno povezane jedna sa drugom. Izraz "operativno povezan" označava da su subjedinice udružene putem kovalentne i/ili nekovalentne veze. Subjedinice mogu biti kovalentno povezane na bilo koji pogodan način, kao što je putem reagensa za umrežavanja ili linkera kao što je polipeptidni ili peptidni linker. U drugom primeru izvođenja, subjedinice su povezane preko nekovalentnih veza. U pojedinim varijacijama izvođenja, dve subjedinice (npr. dva polipeptida koja vezuju ligand) su povezane peptidnom vezom, bilo direktno ili preko „peptidnog linkera“. Peptidni linker može biti kratak, sa od 1 do 3 aminokiselinska ostatka (poželјno se sastoji od malih aminokiselina kao što su glicin, serin, treonin ili alanin) ili duži, na primer, dužine od 13, 15 ili 16 aminokiselinskih ostataka koji su uvedeni između subjedinica. Poželјno je da je peptidni linker peptid koji je imunološki inertan. Navedeni linker može biti tripeptid sa sekvencom E-F-M (Glu-Phe-Met), na primer, linker sa sekvencom od 13 aminokiselina koja se sastoji od Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met (SEQ ID NO: 7), linker sa sekvencom od 15 aminokiselina koja se sastoji od (G4S)3 (SEQ ID NO: 8), linker sa sekvencom od 16 aminokiselina koja se sastoji od GGSGG SGGGG SGGGG S (SEQ ID NO: 9) ili zglobni region humanog IgG-a (npr. IgGI, IgG2, IgG3 ili IgG4). U pojedinim varijacijama izvođenja, dve subjedinice su polipeptidi koji vezuju ligand koji sadrže dva jasno različita polipeptidna lanca koji su međusobno povezani, npr. disulfidnom vezom ili drugim vezama.

[0135] U pojedinim primerima izvođenja, molekul koji vezuje ligand je u obliku fuzionog proteina koji sadrži najmanje dve subjedinice, pri čemu svaka sadrži polipeptid koji vezuje ligand. Na ovaj način, fuzioni protein može biti proizveden rekombinantno, direktnom ekspresijom molekula nukleinske kiseline koja kodira isti u ćeliji domaćinu, a u vidu jednog otvorenog okvira čitanja.

[0136] U pojedinim varijacijama izvođenja, polipeptid koji vezuje ligand je eksprimiran kao fuzija sa heterolognim proteinom kao fuzionim partnerom, kao što je imunoglobulinski konstantni region, a heterologni fuzioni partneri su povezani tako da obrazuju multimerni molekul koji vezuje ligand. U jednom primeru izvođenja, subjedinice su operativno povezane sa multimerizacionom komponentom. Multimerizaciona komponenta obuhvata bilo koju prirodnu ili sintetsku sekvencu sposbnu da se operativno poveže sa dve ili više subjedinica da bi se obrazovala struktura višeg reda, npr. dimer, trimer itd. Komponenta za multimerizaciju može operativno povezivati dve ili više subjedinica, "direktnom" interakcijom sa subjedinicama. Alternativno, multimerizirajuća komponenta za jednu subjedinicu može interagovati sa drugom multimerizacionom komponentom za drugu subjedinicu radi operativnog povezivanja subjedinica.

[0137] U jednom primeru izvođenja, subjedinice su operativno povezane sa dodatnim aminokiselinskim domenom koji obezbeđuje multimerizaciju subjedinica (preciznije, dodatni domeni sadrže bilo koji funkcionalan region koji obezbeđuje dimerizaciju subjedinica). Izraz "operativno povezan" ukazuje da su subjedinica zasnovana na VEGFR-3 i dodatni aminokiselinski domen povezani peptidnom vezom, bilo direktno ili preko "peptidnog linkera" (kao što je ovde definisano), pri čemu subjedinica zasnovana na VEGFR-3 zadržava svojstva vezivanja liganda. Dodatni aminokiselinski domen može biti lociran uzvodno (N-kraj) ili nizvodno (C-kraj) od sekvence VEGFR-3 subjedinice. Poželјno je da se nalazi nizvodno (tj. dalјe od prvog domena sličnog imunoglobulinskom (Ig-I domena). Na ovaj način, fuzioni protein može biti rekombinantno proizveden, direktnom ekspresijom molekula nukleinske kiseline koja kodira isti u ćeliji domaćinu. U takvim primerima izvođenja, ovde opisan molekul za vezivanje liganda je multimer fuzionih proteina koji sadrže polipeptide koji vezuju ligand i multimerizacionu komponentu koja je sposobna da interagujre sa multimerizacionom komponentom prisutnom u drugom fuzionom proteinu da bi obrazovala struktura višeg reda, poput dimera. Ovakav tip fuzionih proteina može biti pripremljen operativnim povezivanjem sekvence VEGFR-3 subjedinice (tj. polipeptida koji vezuje ligand) sa domenima izolovanim iz drugih proteina koji omogućavaju obrzovanje dimera, trimera, itd. Primeri za proteinske sekvence koje omogućavaju multimerizaciju ligandnih polipeptida koji su ovde opisani uklјučuju, ali nisu ograničeni na, domene izolovane iz proteina kao što su imunoglobulini, hCG (WO 97/30161), kolagen X (WO 04/33486), C4BP (WO 04/20639), Erb proteini (WO 98/02540) ili namotani peptidie sa zavojnicama (WO 01/00814).

[0138] Multimerizaciona komponenta može biti, na primer, izabrana između (i) aminokiselinskih sekvenci dužine od između 1 do oko 500 aminokiselina, (ii) leucinskih “rajsfešlusa”, (iii) motiva “helikspetlјa” i (iv) motiva “kalem-kalem”. Kada multimerizaciona komponenta sadrži aminokiselinsku sekvencu dužine od 1 do oko 500 aminokiselina, sekvenca može sadržavati jedan ili više cisteinskih ostataka

2

sposobnih da obrazuje disulfidnu vezu sa odgovarajućim cisteinskim ostatkom na drugom fuzionom polipeptidu koji sadrži multimerizacionu komponentu sa jednim ili sa više cisteinskih ostataka.

[0139] Prema posebnom aspektu, multimeri su dimeri polipeptida koji vezuju ligand gde su polipeptidi operativno povezani sa imunoglobulinom ili delom imunoglobulina kao fuzionim partnerom, a koji mogu takođe delovati kao multimerizaciona komponenta. Izraz "operativno povezan" ukazuje da su polipeptidi koji vezuju ligand i imunoglobulin ili njegov deo udruženi preko peptidne veze, bilo direktno ili preko "peptidnog linkera" (kao što je ovde definisano), pri čemu se zadržavaju osobine vezivanja liganda kod polipeptida koji vezuju ligand. U ovom primeru izvođenja, polipeptidi koji vezuju ligand su operativno povezani sa celim ili sa delom imunoglobulina, posebno sa humanim imunoglobulinom, a još posebnije sa Fc delom humanog imunoglobulina. Fc deo humanog imunoglobulina obično sadrži dva domena konstatnog regiona (domene CH2 i CH3) i zglobni region, ali mu nedostaje varijabilni region. (Pogledati npr. U.S. Pat. Nos.6,018,026 i 5,750,375.) Imunoglobulin može biti odabran iz bilo koje od glavnih klasa imunoglobulina, uklјučujući IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, kao i iz bilo koje podklase ili izotipa, npr. IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4; IgA-I i IgA-2. U jednom primeru izvođenja, Fc deo je iz humanog IgG4, koji je stabilan u rastvoru i sa malom je ili nikakvom aktivnošću aktivacije komplemenata. U drugom primeru izvođenja, Fc deo je iz humanog IgGI. Fc deo može biti mutiran da bi se sprečile neželјene aktivnosti, kao što su vezivanje komplemenata, vezivanje za Fc receptore ili slično. Aminokiselinska sekvenca izvedena iz imunoglobulina može biti vezana za C-kraj ili za N-kraj polipeptida koji vezuje ligand, poželјno za C-kraj. Takvi fuzioni proteini mogu biti pripremljeni transfekcijom ćelija sa DNK koja kodira VEGFR-3 subjedinicu:Fc fuzioni protein i ekspresijom dimera u istim ćelijama. U posebnom primeru izvođenja, polipeptidi koji vezuju ligand su sa istim monomernim subjedinicama (tj. dimer je homodimer). Postupci pripreme imunoglobulinskih fuzionih proteina su dobro poznati u oblasti tehnike, kao što su oni opisani u Hollenbaugh i Aruffo ("Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", u Current Protocols in Immunology, Supl.4, str.10.19.1-10.19.11, 1992) ili WO 01/03737, na primer.

[0140] Alternativno, dimeri polipeptida koji vezuju ligand predmetnog pronalaska mogu biti pripremljeni operativnim povezivanjem jednog od polipeptida koji vezuje ligand sa konstantnim regionom imunoglobulinskog teškog lanca i operativnim povezivanjem drugog polipeptida koji vezuje ligand sa konstantnim regionom imunoglobulinskog lakog lanca. Na primer, polipeptid koji vezuje ligand može biti operativno povezan sa CH1-zglobni region-CH2-CH3 regionom humanog IgG1, a drugi ili isti polipeptid koji vezuje ligand može biti operativno povezan sa C kapa regionom kapa lakog lanca Ig-a. U jednom primeru izvođenja, konstantni region teškog lanca je humani γ4, koji je stabilan u rastvoru i sa malom je ili nikakvom aktivnošću tipa aktivacije komplemenata. U drugom primeru izvođenja, konstantni region teškog lanca je humani γl. Konstantni region teškog lanca može biti mutiran da bi se sprečile neželjene aktivnosti, kao što su vezivanje komplemenata, vezivanje za Fc receptore ili slično.

[0141] Takođe, ukoliko je potrebno, fuzioni proteini koji su ovde opisani mogu sadržavati bilo koji funkcionalan region koji olakšava prečišćavanje ili proizvodnju. Specifični primeri takvih dodatnih

2

aminokiselinskih sekvenci obuhvataju GST sekvencu ili His tag sekvencu. U pojedinim varijacijama izvođenja, region koji olakšava prečišćavanje se uklanja prilikom formulisanja kompozicije za farmaceutsku upotrebu.

[0142] Aminokiselinska sekvenca izvedena iz imunoglobulina može biti povezana sa C-krajem ili sa N-krajem polipeptida koji vezuje ligand, poželјno sa C-krajem. Ćelije transfektovane sa DNK koja kodira fuzioni protein imunoglobulinskog lakog lanca i fuzioni protein imunoglobulinskog teškog lanca eksprimiraju heterodimere teškog lanca/lakog lanca od kojih svaki sadrži polipeptid koji vezuje ligand. Prednost je da oba polipeptida koji vezuju ligand sadrže nativni ili heterologni signalni peptid kada se prvobitno sintetišu, da bi se pospešilo izlučivanje iz ćelije, ali i da bi se signalna sekvenci po izlučivanju iseca. Razmatraju se i varijacije bilo kog od prethodno navedenih primera izvođenja koji uključuju signalni peptid. Nativan signalni peptid humanog VEGFR-3 sadrži ostatke 1-24 iz SEQ ID NO: 2. Brojni drugi signalni peptidni proteini su prijavljeni u literaturi.

[0143] Prema sledećem posebnom aspektu predmetnog pronalaska, polipeptidi koji vezuju ligand iz multimera su povezani preko nekovalentnih veza. Nekovalentno vezivanje subjedinica se može postići bilo kojim pogodnim načinom koji ne ometa njegovu biološku aktivnost (tj. njegovu sposobnost da vezuje humani VEGF-C i/ili VEGF-D). Prema posebnom aspektu, ovi multimeri su dimeri polipeptida koji vezuju ligand gde je jedan polipeptid koji vezuje ligand operativno povezan sa prvim jedinjenjem, a drugi ili isti polipeptid koji vezuje ligand je operativno povezan sa drugim jedinjenjem koje će se nekovalentno vezati za prvo jedinjenje. Primeri takvih jedinjenja su biotin i avidin. Dimeri polipeptida koji vezuju ligand mogu biti pripremljeni operativnim povezivanjem jedne VEGFR-3 subjedinice sa biotinom i operativnim povezivanjem drugog polipeptida koji vezuje ligand sa avidinom. Receptor se stoga obrazuje putem nekovalentne interakcije biotina i avidina. Ostali primeri obuhvataju subjedinice heterodimernog proteinskog hormona. U ovim primerima izvođenja, DNK konstrukt koji kodira jedan protein koji vezuje ligand, fuzionisan je sa DNK konstruktom koji kodira subjedinicu heterodimernog proteinskog hormona, kao što je hCG, a DNK konstrukt koji kodira drugi polipeptid koji vezuje ligand je fuzionisan sa DNK koja kodira drugu subjedinicu heterodimernog proteinskog hormona, kao što je hCG (kao što je prijavljeno u US 6,193,972). Ovakvi DNK konstrukti se istovremeno eksprimiraju u istim ćelijama što dovodi do ekspresije molekula koji vezuje ligand, pošto svaka koeksprimirana sekvenca sadrži odgovarajuću hormonsku subjedinicu tako da se nakon ekspresije obrazuje heterodimer. Aminokiselinska sekvenca izvedena iz heterodimernog proteinskog hormona može biti povezana sa C-krajem ili N-krajem polipeptida koji vezuju ligand, poželјno sa C-krajem. Prednost je što obe subjedinice sadrže nativni ili heterologni signalni peptid kada se prvobitno sintetišu, da bi se pospešilo izlučivanje iz ćelije, ali i što se signalna sekvenca po izlučivanju iseca.

[0144] U jednom primeru izvođenja, molekul koji vezuje ligand je operativno povezan sa vezujućom jedinicom koja nije izvedena iz VEGFR-3, tj. sa vezujućom jedinicom koja ne sadrži komponentne domene izvedene iz VEGFR-3. Takvi himerni molekuli koji vezuju ligand mogu, na primer, sadržavati

2

heterologne jedinice za vezivanje zasnovane na drugim tirozin kinaznim receptorima. U jednom primeru izvođenja, takve heterologne jedinice za vezivanje se vezuju za najmanje jedan ligandni polipeptid izabran između VEGF-A (VEGF), VEGF-B, PIGF, PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C i PDGF-D. U poželјnom primeru izvođenja, takve heterologne jedinice za vezivanje se vezuju za najmanje VEGF-A (VEGF).

[0145] U jednom primeru izvođenja, takve heterologne jedinice vezivanja sadrže komponentne domene izvedene iz VEGFR-1 ili VEGFR-2 ili oba. Primeri heterolognih jedinica za vezivanje koje mogu biti upotrebljene u kombinaciji sa molekulima koji vezuju ligand predmetnog pronalaska u obliku himernih molekula koji vezuju ligand, uklјučuju tzv. VEGF-trap molekule opisane u, na primer, WO 2000/75319, WO 2005/000895 i WO 2006/088650. Poželјna heterologna jedinica za vezivanje sadrži Ig-domen 2 iz VEGFR-1 (R1D2) i Ig-domen 3 iz VEGFR-2 (R2D3), koji su po izboru fuzionisani sa Fc delom imunoglobulina. U jednom primeru izvođenja je predviđen himerni molekul koji sadrži polipeptid koji vezuje ligand iz pronalaska koji je povezan sa Fc delom imunoglobulina operativno povezanim sa R1D2R2D3 vezujućom jedinicom fuzionisanom sa Fc delom imunoglobulina. Dve vezujuće jedinice su operativno povezane preko disulfidne veze između dva Fc dela.

Linkeri

[0146] Dok domeni humanog VEGFR-3 slični Ig domenu mogu biti direktno vezani jedni za druge (preko peptidne, disulfidne ili druge vrste kovalentne veze) ili za domene slične Ig domenima drugih receptora, ovde opisani molekuli koji vezuju ligand dodatno sadrže (jedan ili više) linkera koji povezuje dve ili više različitih vezujućih jedinica, npr. ECD fragment iz VEGFR-3 sa drugim ECD fragmentom iz VEGFR-3 ili čak sa kopijom samog sebe. Linker može takođe povezivati vezujuću jedinicu sa drugim supstituentima koji su ovde opisani. U pojedinim primerima izvođenja, linker sadrži heterologni polipeptid. Na primer, u pojedinim primerima izvođenja, linker sadrži peptid koji povezuje jedinice za vezivanje kako bi se obrazovao jedan kontinuirani peptid koji može biti eksprimiran kao jedan molekul koji vezuje ligand. Linkeri mogu biti izabrani tako da postoji manja verovatnoća da izazovu alergijsku reakciju. Polisaharidi ili druge strukture takođe mogu biti upotrebljeni za povezivanje vezujućih jedinica da bi se obrazovao molekul koji vezuje ligand.

[0147] Za molekul koji vezuje ligand može biti upotrebljeno više od jednog linkera. Linker može biti izabran za optimalnu konformacionu (steričku) slobodu između raznih jedinica za vezivanje liganda da bi im se omogućilo da međusobno interaguju, ukoliko je to poželjno, npr. da bi obrazovali dimere, ili da bi im se omogućila interakcija sa ligandom. Linker može biti linearan tako da su uzastopne vezujuće jedinice povezane u seriji ili linker može poslužiti kao mreža za koju su vezuju razne vezujuće jedinice, npr. to može biti razgranati linker. Linker takođe može imati i više ogranaka, npr. kao što je prijavljeno u Tam, J. Immunol. Methods 196:17 (1996). Vezujuće jedinice mogu biti pričvršćene jedna za drugu ili za linkersku mrežu preko N-terminalnih amino grupa, C-terminalnih karboksilnih grupa, bočnih lanaca, hemijski modifikovanih grupa, bočnih lanaca ili na druge načine.

2

[0148] Linkerski peptidi mogu biti dizajnirani tako da sadrže sekvence koje dozvolјavaju želјene karakteristike. Na primer, upotreba glicinskih ostataka omogućava relativno veliki stepen konformacione slobode, dok bi prolin imao suprotan efekat. Peptidni linkeri mogu biti izabrani tako da se postignu određene sekundarne i tercijarne strukture, npr. alfa heliksi, beta naborane ploče ili beta burad. Kvaternarna struktura takođe može biti upotrebljena za stvaranje linkera koji nekovalentno spaja dve vezujuće jedinice. Na primer, fuzija proteinskog domena sa hidrofobnom površinom za svaku vezujuću jedinicu može dozvoliti spajanje dve vezujuće jedinice putem interakcije između hidrofobnih površina dva molekula. U pojedinim primerima izvođenja, linker može obezbediti polarne interakcije. Na primer, može se upotrebiti domen leucinskog “rajsfešlusa” iz proto-onkoproteina Myc i Max. Luscher i Larsson, Ongogene 18:2955-2966 (1999). U pojedinim primerima izvođenja, linker omogućava obrazovanje mosta kroz obrazovanje soli ili putem disulfidne veze. Linkeri mogu sadržavati aminokiseline koje se ne javljaju u prirodi, kao i aminokiseline koje se javlјaju u prirodi, a koje nisu prirodno ugrađene u polipeptid. U pojedinim primerima izvođenja, linker sadrži koordinacioni kompleks između metala ili drugog jona i raznih ostataka iz višestrukih peptida koji su time spojeni.

[0149] Razmatraju se i linearni peptidni linkeri sa najmanje jednim aminokiselinskim ostatkom. U pojedinim primerima izvođenja linker sadrži više od 10000 ostataka. U pojedinim primerima izvođenja linker sadrži od 1-10,000 ostataka, 1-1000 ostataka, 1-100 ostataka, 1-50 ostataka ili 1-10 ostataka. U pojedinim primerima izvođenja, linearni peptidni linker sadrži ostatke sa relativno inertnim bočnim lancima. Aminokiselinski ostaci peptidnog linkera ne moraju biti u potpunosti ili uopšte povezani preko alfa-karboksilnih i alfa-amino grupa. Zapravo, peptidi mogu biti povezani preko grupa bočnih lanaca raznih ostataka.

[0150] Linker može uticati na to da li je polipeptid(i) za koji je fuzionisan sposoban da se dimerizuje jedan za drugoga ili sa drugim polipeptidom. Linker služi za brojne funkcije. Monomere nativnog receptora, ograničene na približno dvodimenzionalnu ravan ćelijske membrane, karakteriše relativno visoka lokalna koncentracija i dostupnost koreceptorima (vezujućim jedinicama), čime se povećava verovatnoća pronalaženja partnera. Receptorima koji su slobodni u rastvoru takve prednosti nedostaju, tako da linkeri mogu pomoći time što će povećati efektivnu koncentraciju monomera.

[0151] U pojedinim primerima izvođenja, molekul koji vezuje ligand može sadržavati više od jednog tipa linkera. Pogodni linkeri mogu takođe sadržavati hemijske modifikacije koje su prethodno razmatrane.

[0152] Ovde opisani molekuli koji vezuju ligand mogu sadržavati i dodatni N-terminalni aminokiselinski ostatak, poželјno metionin. Zaista, u zavisnosti od sistema i uslova ekspresije, polipeptidi mogu biti eksprimirani u rekombinantnoj ćeliji domaćina uz početno prisustvo metionina. Ova dodatna aminokiselina može tada biti zadržana u rezultujućem rekombinantnom proteinu ili biti eliminisana dejstvom egzopeptidaze, kao što je metionin aminopeptidaza, prema postupcima prijavljenim u literaturi (Van Valkenburgh HA i Kahn RA, Methods Enzimol. (2002) 344:186-93; Ben-Bassat A, Bioprocess Technol. (1991) 12:147-59).

2

Supstituenti i druge hemijske modifikacije

[0153] Ovde opisani molekuli koji vezuju ligand, po izboru mogu biti hemijski modifikovani sa raznim supstituentima. Poželjno je da takve modifikacije suštinski ne smanjuju afinitete vezivanja faktora rasta ili specifičnosti molekula koji vezuje ligand. Umesto toga, hemijske modifikacije bi trebale da doprinose poželjnim karakteristikama koje su ovde diskutovane. Hemijske modifikacije mogu biti brojnih različitih oblika, kao što su heterologni peptidi, polisaharidi, lipidi, radioizotopi, nestandardni aminokiselinski ostaci i nukleinske kiseline, metalni helati i razni toksini.

[0154] Fragmenti receptora (ili "vezujuće jedinice" ili "komponentni domeni") i molekuli koji vezuju ligand koji su ovde opisani, po izboru se spajaju sa heterolognim fuzionim partnerima, kao što su heterologni polipeptidi, da bi se obezbedile različite osobine, npr. povećana rastvorlјivost, modulacija klirensa, usmeravanje ka određenom tipu ćelije ili tkiva. U pojedinim primerima izvođenja, receptorski fragment je povezan sa Fc domenom IgG-a ili sa drugim imunoglobulinom. U pojedinim primerima izvođenja, fragment receptora je fuzionisan sa alkalnom fosfatazom (AP). Postupci pripreme Fc ili AP fuzionih konstrukata se mogu naći u WO 02/060950. Fuzijom polipeptida ili molekula koji vezuje ligand sa proteinskim domenima koje karakterišu specifična svojsva (npr. poluživot, bioraspoloživost, partneri za interakciju) moguće je preneti ova svojstva na molekul koji vezuje ligand (npr. molekuli se konstruišu tako da ih karakteriše specifična tkivna distribucija ili specifičan biološki poluživot). U pojedinim primerima izvođenja, molekul koji vezuje ligand uključuje ko-receptor i VEGFR fragment.

[0155] Određeni fuzioni partner (npr. heterologni polipeptid) upotrebljen u određenom molekulu koji vezuje ligand može uticati na to da li će se VEGR-3 fragment dimerizovati ili ne, što zauzvrat može uticati na vezivanje liganda.

[0156] Za supstituente poput Fc regiona humanog IgG-a, fuzija ga može direktno pripojiti molekulu koji vezuje ligand ili fuzija može biti preko intervenirajuće sekvence. Na primer, humani IgG zglobni, CH2 i CH3 region mogu biti fuzionisani bilo sa N-krajem ili C-krajem molekula koji vezuje ligand da bi se vezao Fc region. Dobijeni Fc-fuzioni konstrukt omogućava prečišćavanje na afinitetnoj koloni sa Proteinom A (Pierce, Rockford, III.). Peptid i proteini fuzionisani sa Fc regionom mogu ispoljavati značajno veći poluživot in vivo nego nefuzionisan parnjak. Fuzija za Fc region omogućava dimerizaciju/multimerizaciju fuzionog polipeptida. Fc region može biti Fc region prirodnog porekla ili se on može modifikovati radi superiornih karakteristika, npr. terapijskih kvaliteta, vremena u cirkulaciji, smanjenja agregacije.

[0157] Polipeptidi mogu biti modifikovani, na primer, glikozilacijom, amidacijom, karboksilacijom ili fosforilacijom, ili stvaranjem kiselih adicionih soli, amida, estara, a naročito C-terminalnih estera i N-acilnih derivata. Domeni I-III iz VEGFR-3 slični Ig domenima sadrže 5 putativnih mesta N-glikozilacije (ovde označenih kao sekvoni ili regioni N1, N2, N3, N4 i N5 iz VEGFR-3, tim redom). N1 odgovara aminokiselinama 33-35 iz SEQ ID NO: 2; N2 odgovara aminokiselinama 104-106 SEQ ID NO: 2; N3 odgovara aminokiselinama 166-168 SEQ ID NO: 2; N4 odgovara aminokiselinama 251-253 iz SEQ ID NO: 2 i N5 odgovara aminokiselinama 299-301 SEQ ID NO: 2. U pojedinim primerima izvođenja, ovde opisan molekul koji vezuje ligand sadrži modifikaciju u N2 regionu molekula. Na primer, u pojedinim primerima izvođenja, aminokiselina iz molekula koji vezuje ligand koja odgovara poziciji 104 u SEQ ID NO: 2 je deletirana i zamenjena drugom aminokiselinom. Konzervativne supstitucije su poželјne. U pojedinim primerima izvođenja, aminokiselina koja odgovara poziciji 104 u SEQ ID NO: 2 je deletirana i zamenjena sa aminokiselinom izabranom iz grupe koja se sastoji od glutamina, aspartata, glutamata, arginina i lizina. U još pojedinim varijacijama izvođenja, položaj 106 je supstituisan da bi se eliminisao N2 sekvon. U primerima izvođenja gde je N2 sekvon iz SEQ ID NO: 2 modifikovan kao što je prethodno opisano, poželjno je da su N1, N3, N4 i N5 sekvoni iz SEQ ID NO: 2 nemodifikovani.

[0158] Proteini takođe mogu biti modifikovani tako da obrazovanjem kovalentnih ili nekovalentnih kompleksa sa drugim ostacima nastaju peptidni derivati. Kovalentno povezani kompleksi mogu biti pripremljeni povezivanjem hemijskih ostataka sa funkcionalnim grupama na bočnim lancima aminokiselina iz polipeptida ili na N- ili C-kraju.

[0159] Polipeptidi mogu biti konjugovani sa reporterskom grupom, uklјučujući, ali ne ograničavajući se na, radio-obeleživače, fluoscentne obeleživače, enzim (npr. koji katalizuje kalorimetrijsku ili fluorometrijsku reakciju), supstrat, čvrsti matriks ili nosač (npr. biotin ili avidin). Primeri analoga su opisani u WO 98/28621 i u publikaciji Olofsson-a i saradnika, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 95:11709-11714 (1998), U.S. patente br.5,512,545, i 5,474,982; U.S. patentne prijave br.20020164687 i 20020164710.

[0160] Cisteinski ostaci najčešće reaguju sa haloacetatama (i odgovarajućim aminima), kao što su hloroacetatna kiselina ili hloroacetamid, čime nastaju karboksimetilni ili karbociamidometilni derivati. Cisteinski ostaci se takođe derivatizuju reakcijom sa bromotrifluoroacetonom, α-bromo-β(5-imidozoil)propionskom kiselinom, hloroacetil fosfatom, N-alkilmaleimidima, 3-nitro-2-piridil disulfidom, metil 2-piridil disulfidom, p-hloromerkuribenzoatom, 2-hloromerkuri-4-nitrofenolom, orhloro-7-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazolom.

[0161] Histidinski ostaci se derivatizuju reakcijom sa dietilprokarbonatom pri pH 5,5-7,0, pošto je ovo sredstvo relativno specifično za bočni lanac histidil grupe. Para-bromofenacil bromid je takođe koristan; reakcija se poželјno izvodi u 0,1M natrijum kakodilatu na pH 6,0.

[0162] Lizinski i amino terminalni ostaci reaguju sa anhidridima ćilibarne ili karboksilne kiseline. Derivatizacija ovakvim agensima ima efekat reverzije naelektrisanja lizinilnih ostataka. Drugi pogodni reagensi za derivatizaciju ostataka koji sadrže α-amino grupu uklјučuju imidoestre kao što su metil pikolinimidat; piridoksal fosfat; piridoksal; hloroborohidrid; trinitrobenzensulfonska kiselina; O-metilisurea; 2,4 pentandion; kao i reakciju katalizovanu transaminazom sa glioksilatom.

[0163] Arginilni ostaci se modifikuju reakcijom sa jednim ili sa nekoliko konvencionalnih reagensa, među kojima su fenilglioksal, 2,3-butandion, 1,2-cikloheksandion i ninhidrin. Derivatizacija ostataka arginina zahteva da se reakcija izvodi u alkalnim uslovima zbog visokog pK guanidinske funkcionalne grupe. Štaviše, ovi reagensi mogu reagovati sa grupama lizina, kao i sa argininskom epsilon-amino grupom.

1

[0164] Specifična modifikacija tirozinskih ostataka nije opsežno proučavana sama po sebi, sa posebnim osvrtom na uvođenja spektralnih obeleživača u tirozinske ostatke putem reakcije sa aromatičnim diazonijumskim jedinjenjima ili tetranitrometanom. Najčešće se upotrebljavaju N-acetilimidizol i tetranitrometan da bi se obrazovale O-acetil tirozinske vrste i 3-nitro derivati, tim redom. Tirozinskim ostacima se uvodi jod upotrebom 1251 ili 131, da bi se pripremili obeleženi proteini za upotrebu u radioimunoanalizama.

[0165] Karboksilne bočne grupe (aspartil ili glutamil) se selektivno modifikuju reakcijom sa karbodiimidima (R1), kao što su 1-cikloheksil-3-(2-morfolinil-(4-etil) karbodiimid ili 1-etil-3 (4 azonija 4,4-dimetilpentil)karbodiimid. Štaviše, aspartil i glutamil ostaci se prevode u asparaginil i glutaminil ostatke reakcijom sa amonijumskim jonima.

[0166] Derivatizacija bifunkcionalnim agensima je korisna za umrežavanje molekula koji vezuje ligand u potporne matrikse koji nisu rastvorlјivi u vodi. Takva derivatizacija može takođe obezbediti linker koji može povezivati susedne vezivne elemente u molekulu koji vezuje ligand, ili vezujuće elemente sa heterolognim peptidom, npr. sa Fc fragmentom. Sredstva za umrežavanje koja se obično koriste uklјučuju, npr. 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletan, glutaraldehid, N-hidroksisukcinimidne estre, na primer, estre sa 4-azidosalicilnom kiselinom, homo-bifunkcionalne imidoestre, uklјučujući disukcinimidil estre kao što su 3,3'-ditiiobis(sukcinimidilpropionat) i bifunkcionalni maleimidi poput bis-N-maleimido-1,8-oktana. Derivatizaciona sredstva kao što je metil-3-[(p-azidofenil)ditio] propioimidat dovode do nastanka intermedijera koji se mogu aktivirati svetlošću, tj. koji su sposobni da se umrežavaju u prisustvu svetlosti. Alternativno, za imobilizaciju proteina se mogu iskoristiti reaktivni matriksi koji nisu rastvorljivi u vodi poput uglјenih hidrata aktiviranih cijanogenim bromidom i reaktivnih supstrata opisanih u U.S. patentima br.3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; i 4,330,440.

[0167] Ostaci glutamina i asparagina se često deamiduju u odgovarajuće glutamil i aspartil ostatke. Alternativno, ovi ostaci se deamiduju pod blago kiselim uslovima. Bilo koji oblik ovih ostataka spada u obim ovog pronalaska.

[0168] Ostale modifikacije obuhvataju hidroksilaciju prolina i lizina, fosforilaciju hidroksilnih grupa serinskih ili treoninskih ostataka, metilaciju α-amino grupa lizina, arginina i histidinskih bočnih lanaca (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, str. 79-86, 1983), acetilaciju N-terminalnog amina i, u pojedinim primerima, amidacija C-terminalnih karboksilnih grupa. Takvi derivati su hemijski modifikovane polipeptidne kompozicije u kojima je polipeptidni molekul koji vezuje ligand povezan sa polimerom. Izabrani polimer je obično rastvorlјiv u vodi tako da se protein za koji je vezan ne taloži u vodenom okruženju, kao što je fiziološko okruženje. Izabrani polimer se obično modifikuje tako da sadrži jednu reaktivnu grupu, kao što je aktivna estarska grupa za acilaciju ili aldehid za alkilaciju, a čime se stepen polimerizacije može kontrolisati kao što je obezbeđeno u postupcima ovog pronalaska. Polimer može biti bilo koje molekulske težine, i može biti razgranat ili nerazgranat. Unutar područja polipeptidnih polimera za molekul koji vezuje ligand je i

2

smeša polimera. Poželјno je da za terapijsku upotrebu krajnjeg preparata, polimer bude farmaceutski prihvatlјiv.

[0169] Svaki polimer može biti bilo koje molekulske težine i može biti razgranat ili nerazgranat. Svaki polimer je obično sa prosečnom molekulskom težinom od između oko 2 kDa do oko 100 kDa (izraz "oko" ukazuje da će u preparatima polimera rastvorljivog u vodi, neki molekuli biti teži, neki lakši od navedene molekulske težine). Prosečna molekulska težina svakog polimera je između oko 5 kDa i oko 50 kDa, poželјnije između od oko 12 kDa do oko 40 kDa i najpoželјnije između od oko 20 kDa do oko 35 kDa.

[0170] Pogodni polimeri koji su rastvorlјivi u vodi ili njihove smeše uklјučuju, ali nisu ograničeni na, N-vezane ili O-povezane uglјene hidrate, šećere, fosfate, uglјene hidrate; šećere; fosfate; polietilen glikol (PEG) (uklјučujući PEG oblike koji se koriste za derivatizaciju proteina, pa i mono (C1-C10) alkoksi- ili ariloksi-polietilen glikol); monometoksi-polietilen glikol; dekstran (poput dekstrana niske molekularne težine od, na primer, oko 6 kD), celulozu; celulozu; druge polimere na bazi uglјenih hidrata, poli-(N-vinil pirolidon)polietilen glikol, homopolimere propilen glikola, kopolimer polipropilen oksida/etilen oksida, polioksietilovane poliole (npr. glicerol) i polivinil alkohol. Predmetni pronalazak takođe obuhvata bifunkcionalne umrežavajuće molekule koji se mogu koristiti za pripremu kovalentno vezanih multimera.

[0171] Generalno, hemijska derivatizacija može biti izvedena pod bilo kojim pogodnim uslovima koji se koriste za reakciju proteina sa aktiviranim polimernim molekulom. Postupci za pripremu hemijskih derivata polipeptida će generalno obuhvatati korake (a) reakcije polipeptida sa aktiviranim polimernim molekulom (kao što je reaktivni estar ili aldehidni derivat polimernog molekula) pod uslovima u kojima se molekul koji vezuje ligand vezuje za jedan ili za više polimernih molekula i (b) dobijanje produk(a)ta reakcije. Optimalni uslovi reakcije će biti utvrđeni na osnovu poznatih parametara i želјenog rezultata. Na primer, što je veći odnos molekula polimera i proteina, veća je količina vezanog polimernog molekula. U jednom primeru izvođenja, polipeptidni derivat molekula koji vezuje ligand može imati jedan ostatak polimernog molekula na amino kraju. (Pogledati, npr. U.S. Pat. No.5,234,784).

[0172] Posebno poželјan polimer koji je rastvorlјiv u vodi i za upotrebu je u pronalasku, je polietilen glikol (PEG). Kao što se ovde upotrebljava, terminom “polietilen glikol” se označava bilo koji oblik PEG-a koji može biti upotrebljen za derivatizaciju drugih proteina, poput mono-(C1-10)alkoksi- ili ariloksipolietilen glikola. PEG je linearan ili razgranati neutralni polietar, dostupan u širokom opsegu molekulskih težina, rastvorlјiv u vodi i većini organskih rastvarača. PEG je efektivan u isklјučivanju drugih polimera ili peptida kada je prisutan u vodi, prvenstveno zahvalјujući visokoj dinamičkoj pokretlјivosti lanca i hidrofilnoj prirodi, čime stvara vodenu “školјku” ili hidratacionu sferu kada se pričvrsti za druge proteine ili polimerne površine. PEG je netoksičan, neimunogen i odobren za unutrašnju upotrebu od strane američke Uprave za hranu i lekove.

[0173] Proteini ili enzimi su ispoljili, kada su bili konjugovani sa PEG, bioaktivnost, neantigena svojstva i smanjenu stopu klirensa prilikom primene životinjama. F. M. Veronese i saradnici, Preparation and Properties of Monomethoxypoly(ethylene glycol)-modified Enzymes for Therapeutic Applications, u J. M.

Harris izd., Poly(Ethylene Glycol) Chemistry-Biotechnical and Biomedical Applications, 127-36, 1992. Ovi fenomeni su posledica svojstva PEG da spreči/isključi prepoznavanje od strane imunog sistema. Dodatno, PEG se široko upotrebljava u procedurama modifikacija površine da bi se smanjila apsorpcija proteina i pobolјšala kompatibilnost u krvi. S. W. Kim i saradnici, Ann. N.Y. Acad. Sci.516: 116-301987; Jacobs i saradnici, Artif. Organs 12: 500-501, 1988; Park i saradnici, J. Poly. Sci, Part A 29:1725-31, 1991. Hidrofobne polimerne površine, kao što su poliuretanske i polistirenske, mogu biti modifikovane ugradnjom PEG (od 3,400 kDa) i time iskorišćene kao netrombogene površine. Površinska svojstva (kontaktni ugao) može biti konzistentniji sa hidrofilnim površinama, zahvalјujući hidratacionom efektu PEG. Još važnije, adsorpcija proteina (albumina i drugih proteina plazme) može biti značajno smanjena, što je rezultat visokog motiliteta lanaca, hidratacione sfere i svojstava ekskluzije proteina za PEG.

[0174] PEG od 3,400 kDa je utvrđen kao PEG optimalne veličine za studije imobilizacije na površinama, Park i saradnici, J. Biomed. Mat. Res. 26: 739-45, 1992, dok je PEG od 5000 kDa bio najkorisniji za smanjenje antigenosti proteina. (F. M. Veronese i saradnici, u J. M. Harris i saradnici, Poly(Ethylene Glycol) Chemistry - Biotechnical and Biomedical Applications, 127-36.)

[0175] Postupci za pripremu pegilovanih molekula koji vezuju ligand obično će obuhvatati korake (a) reakcije polipeptida sa polietilen glikolom (kao što je reaktivni estar ili aldehidni derivat PEG) pod uslovima u kojima molekul koji vezuje ligand postaje vezan za jednu ili za više PEG grupa, i (b) dobijanje proizvoda reakcije. U principu, optimalni uslovi reakcije za reakcije acilacije biće određeni na osnovu poznatih parametara i želјenog rezultata. Na primer, što je veći odnos PEG i proteina, to je veći procenat poli-pegilovanog proizvoda. U pojedinim primerima izvođenja, molekul koji vezuje ligand će sadržavato jednu PEG grupu na N-kraju. Pogledati U.S. Pat. No. 8,234,784. U pojedinim primerima izvođenja, ovde opisan molekul koji vezuje ligand po izboru sadrži najmanje jednu PEG grupu vezanu za molekul. Na primer, u pojedinim primerima izvođenja, PEG od oko 20-40 kDa je vezan na amino kraj molekula koji vezuje ligand.

[0176] Ovde su prijavljeni i derivatizovani molekuli koji vezuju ligand koje mogu karakterisati dodatne aktivnosti, pojačana ili smanjena biološka aktivnost ili druge karakteristike, kao što su povećani ili smanjeni polu-život, u poređenju sa nederivatizovanim molekulama.

Polinukleotidi koji kodiraju molekule koji vezuju ligand i ekspresioni sistemi

[0177] Pronalazak obuhvata ne samo molekule koji vezuju ligand, vezujuće jedinice i polipeptide koji su ovde opisani, već i nukleinske kiseline koje kodiraju takve molekule, vektore koji sadrže takve molekule i ćelije domaćine koje sadrže takve vektore. Postupci koji koriste bilo koje od molekula, jedinica, polipeptida, nukleinskih kiselina, vektora i ćelija domaćina se smatraju primerima pronalaska.

[0178] Kodirajuća sekvenca humanog VEGFR-3 za primer je navedena u SEQ ID NO: 1, a fragmenti SEQ ID NO: 1 (modifikovani u N2 sekvonu) se razmatraju kao kodirajuće sekvence ovde opisanih polipeptida koji vezuju ligand. (Na primer, razmatraju se fragmenti koji kodiraju sve ili delove VEGFR-3 ECD-a.) Zbog

4

dobro poznate degeneracije genetičkog koda, moguće su brojne ekvivalentne kodirajuće sekvence za bilo koju sekvencu koja kodira polipeptid, a svi takvi ekvivalenti se razmatraju kao aspekti pronalaska.

[0179] Dalјe, baš kao što se razmatra varijanta aminokiselinske sekvence za ECD iz VEGFR-3 divlјeg tipa, kao što je opisano prethodno, razmatra se i varijacija sekvenci nukleinskih kiselina. Varijacija sekvenci nukleinskih kiselina može biti okarakterisana kao procenat identiteta u odnosu na SEQ ID NO: 1 (npr. najmanje je 80, 85, 90, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ili 99% identična).

[0180] Varijacija nukleotidnih sekvenci takođe može biti okarakterisana sposobnošću hibridizacije sa komplementom poželjne koridajuće sekvence. Molekuli nukleinskih kiselina uklјučuju one molekule koji sadrže nukleotidne sekvence koje hibridizuju pod umereno ili jako strogim uslovima, kao što je ovde definisano, sa sekvencom koja kodira ECD u molekulu nukleinske kiseline koji je naveden u SEQ ID NO: 1 ili molekulu koji kodira polipeptid, pri čemu polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu tirozin kinaznog receptora navedenog u SEQ ID NO: 2 i 3, ili u fragment nukleinske kiseline koji je ovde opisan, ili u fragmentu nukleinske kiseline koji kodira polipeptid kao što je ovde opisano.

[0181] Izraz "veoma strogi uslovi" se odnosi na one uslove koji su osmišlјeni tako da se omogući hibridizacija DNK lanaca čije su sekvence visoko komplementarne i da se isklјuči hibridizacija značajno pogrešno uparenih DNK. Strogost hibridizacije se uglavnom određuje temperaturom, jonskom jačinom i koncentracijom denaturišućih agenasa poput formamida. Primeri "visoko strogih uslova" za hibridizaciju i ispiranje su 0,015 M natrijum hlorid, 0,0015 M natrijum citrat na 65-68°C ili 0,015 M natrijum hlorid, 0,0015 M natrijum citrat i 50% formamid na 42°C. Pogledati Sambrook, Fritsch i Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. izdanje, Cold Spring Harbor Laboratory (Cold Spring Harbor, N.Y.1989); i Anderson i saradnici, Nucleic Acid Hybridization: a Practical approach, poglavlje 4, IRL Press Limited (Oxford, England).Limited, Oxford, Engleska. U pufere za hibridizaciju i ispiranje mogu biti uklјučeni i drugi agensi u cilјu smanjenja nespecifične i/ili pozadinske hibridizacije. Primeri su 0,1% goveđi serumski albumin, 0,1% polivinil-pirolidon, 0,1% natrijum pirofosfat, 0,1% natrijum dodecil-sulfat (NaDodSO4ili SDS), ficoll, Denhardt-ov rastvor, sonikovana DNK sperme lososa (ili druga nekomplementarna DNK) i dekstran sulfat, mada se mogu koristiti i drugi pogodni agensi. Koncentracija i vrste ovih aditiva mogu biti promenjene bez značajnog uticaja na strogost uslova hibridizacije. Hibridizacioni eksperimenti se obično izvode pri pH 6,8-7,4; ipak, u uslovima uobičajene jonske jačine, stopa hibridizacije je skoro nezavisna od pH. Pogledati Anderson i saradnici, Nucleic Acid Hybridization: a Practical Approach, poglavlje 4, IRL Press Limited (Oxford, Engleska).

[0182] Faktori koji utiču na stabilnost DNK dupleksa uklјučuju sastav baza, dužinu i stepen pogrešno sparenih baznih parova. Uslove hibridizacije mogu biti podešeni od strane stručnjaka iz oblasti tehnike da bi se prilagodilo ovim promenlјivim parametrima i da bi se omogućilo da DNK različito srodnih sekvenci obrazuju hibride. Temperatura toplјenja savršeno sparenog dupleksa DNK može biti procenjena sledećom jednačinom:

)

gde je N dužina obrazovanog dupleksa, [Na+] je molarna koncentracija jona natrijuma u rastvoru za hibridizaciju ili ispiranje, %G+C je procenat (guaninskih+citozinskih) baza u hibridu. Za nesavršeno uparene hibride temperatura toplјenja je smanjena za približno 1°C za svaku 1% pogrešnog sparivanja.

[0183] Termin "umereno strogi uslovi" se odnosi na uslove pod kojima se odvija obrazovanje DNK dupleksa sa većim stepenom pogrešno sparenih baznih parova nego što je to slučaj pod "veoma strogim uslovima". Primeri uobičajeni "umereno strogih uslova" su 0,015 M natrijum hlorid, 0,0015 M natrijum citrat na 50-65°C ili 0,015 M natrijum hlorid, 0,0015 M natrijum citrat i 20% formamid na 37-50°C. Kao primer „umereno strogih“ su uslovi od 50°C i sa 0,015 M jona natrijuma koji će omogućiti pogrešno sparivanje od oko 21%.

[0184] Dobra procena temperature toplјenja u 1M NaCl* za oligonukleotidne probe od oko 20nt data je jednačinom: ;Tm = 2°C po A-T baznom paru 4°C po G-G baznom paru ;;*Koncentracija jona natrijuma u 6x rastvoru natrijum citratne soli (SSC) je 1 M. Pogledati Suggs i saradnici, Developmental Biology Using Purified Genes, str.683, Brown i Fox (ur.) (1981).

[0185] Uslovi pranja visoke strogosti za oligonukleotide su obično na temperaturi 0-5ºC ispod Tm oligonukleotida u 6x SSC, 0,1% SDS-u.

[0186] Razlike u sekvenci nukleinske kiseline mogu biti rezultat konzervativnih i/ili nekonzervativnih modifikacija aminokiselinske sekvence u odnosu na aminokiselinsku sekvencu u SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO: 3. Pronalazak je takođe usmeren na izolovanu i/ili prečišćenu DNK koja odgovara ili koja hibridizuje pod strogim uslovima sa bilo kom od prethodnih DNK sekvenci.

[0187] Molekul nukleinske kiseline koji kodira ceo ili deo polipeptida pronalaska, kao što je molekul koji vezuje ligand ili vezujuća jedinica koja je ovde opisana, može biti napravljen na raznovrsne načine, uklјučujući, bez ograničavanja na, hemijsku sintezu, skrining cDNK ili genomske biblioteke, skrining ekspresione biblioteke i/ili PCR amplifikaciju cDNK ili genomske DNK. Ovi postupci i drugi koji su korisni za izolovanje takve DNK su, na primer, navedeni u Sambrook i saradnici, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y , kao i od strane Ausubel-a i saradnika, izd. "Current Protocols In Molecular Biology," Current Protocols Press (1994), i Berger i Kimmel, "Methods In Enzymology: Guide To Molecular Cloning Techniques", vol.152, Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (1987). Poželјne sekvence nukleinskih kiselina su sisarske sekvence, kao što su lјudi, pacova i miša.

[0188] Hemijska sinteza molekula nukleinskih kiselina se može postići upotrebom postupaka koji su dobro poznati u oblasti tehnike, kao što su oni navedeni od strane Engels-a i saradnika, Angew. Chem. Intl. Ed., 28:716-734 (1989). Ove postupci obuhvataju, između ostalog, fosfotriestarske, fosforamiditne i H-fosfonatne postupke sinteze nukleinskih kiselina. Nukleinske kiseline duže od oko 100 nukleotida, mogu biti sintetisane u vidu više fragmenata, pri čemu je svaki fragment dužine do oko 100 nukleotida. Fragmenti se zatim mogu ligirati zajedno, kao što je opisano u dalјem tekstu, da bi se obrazovala nukleinska kiselina od interesa pune dužine. Poželјan postupak je sinteza na polimeru sa upotrebom standardne fosforamiditne hemije.

[0189] Termin "vektor" se odnosi na molekul nukleinske kiseline koji predstavlja nosača za amplifikaciju, replikaciju i/ili ekspresiju, koji je često izveden iz ili je u obliku plazmidnog ili virusnog DNK ili RNK sistema, pri čemu je plazmidna ili virusna DNK ili RNK funkcionalna u odabranoj ćeliji domaćinu, kao što je bakterijska, ćelija kvasca, biljna, ćelija beskičmenjaka i/ili sisarska ćelija domaćin. Vektor može ostati nezavisan u odnosu na genomsku DNK ćelije domaćina ili može biti integrisan u celini ili delimično unutar genomske DNK. Vektor će sadržavati sve neophodne elemente tako da bude funkcionalan u bilo kojoj ćeliji domaćina sa kojom je kompatibilan. Takvi elementi su navedeni u tekstu koji sledi.

[0190] Kada je nukleinska kiselina koja kodira polipeptid ili njegov fragment izolovana, poželjno je da se ona insertuje u vektor za amplifikaciju i/ili ekspresiju da bi se povećao broj kopije gena i/ili da bi se eksprimirao kodirani polipeptid u pogodnoj ćeliji domaćinu i/ili da bi se transformisale ćelije u cilјnom organizmu (da eksprimiraju polipeptid in vivo). Pogodni su brojni komercijalno dostupni vektori, mada se mogu koristiti i vektori koji su “domaće izrade”. Vektor se selektuje tako da bude funkcionalan u određenoj ćeliji domaćinu ili tkivu domaćinu (tj. za replikaciju i/ili ekspresiju). Polipeptid ili njegov fragment mogu biti amplifikovani/eksprimirani u prokariotskim i/ili eukariotskim ćelijama domaćinima, npr. u ćelijama kvasca, insekata (bakulovirusni sistemi), bilјaka i sisara. Odabir ćelije domaćina će barem delom zavisiti od toga da li će polipeptid ili njegov fragment biti glikozilovani. Ukoliko je to slučaj, ćelije kvasca, insekata ili sisara su poželјne; ćelije kvasca i sisara će glikozilovati polipeptid ukoliko je mesto glikozilacije prisutno u aminokiselinskoj sekvenci.

[0191] Vektori upotrebljeni u bilo kojoj ćeliji domaćinu obično sadrže 5' bočne sekvence, kao i druge regulatorne elemente poput pojačivača, promotora, elementa početka replikacije, elementa zaršetka transkripcije, komletne intronske sekvence koja sadrži donorska i akceptorska mesta obrade, kao i sekvencu signalnog peptida, element mesta vezivanja ribozoma, sekvencu poliadenilacije, polilinkerski region za inserciju nukleinske kiseline koja kodira polipeptid koji će biti eksprimiran i element selektivnog markera. Po izboru, vektor može sadržavati sekvencu "oznake" (engl. tag), tj. oligonukleotidnu sekvenca koja je locirana na 5' ili 3' kraju kodirajuće sekvence i kodira poliHis (kao što je heksaHis) ili drugu malu imunogenu sekvencu. Ovakva oznaka će biti eksprimirana zajedno sa proteinom i može poslužiti kao afinitetna oznaka za prečišćavanje polipeptida iz ćelije domaćina. Po izboru, oznaka može naknadno biti uklonjena iz prečišćenog polipeptida na razne načine, kao što je upotreba izabrane peptidaze.

[0192] Vektorski/ekspresioni konstrukt može po izboru sadržavati elemente kao što je 5' bočna sekvenca, mesto početka replikacije, sekvenca terminacije transkripcije, sekvenca selektivnog markera, mesto vezivanja ribozoma, signalna sekvenca i jedna ili više intronskih sekvenci.5' bočna sekvenca može biti homologna (tj. iz iste vrste i/ili soja kao i ćelija domaćin), heterologna (tj. iz vrste koja nije vrsta ili soj domaćina), hibridna (tj. kombinacija 5' bočnih sekvenci iz više od jednog izvora), sintetska ili to može biti nativna polipeptidna 5' bočna sekvenca. Kao takav, izvor 5' bočne sekvence može biti bilo koji jednoćelijski prokariotski ili eukariotski organizam, bilo koji organizam kičmenjaka ili beskičmenjaka, ili bilo koja biljka, pod uslovom da je 5' bočna sekvenca funkcionalna u, i da je može aktivirati mašinerija ćelije domaćina.

[0193] Element završetka transkripcije se obično nalazi na 3' kraju kodirajuće sekvence polipeptida i služi za prekid transkripcije polipeptida. Obično je element završetka transkripcije u prokariotskim ćelijama fragment bogat G-C parovima nakon kojih sledi poli T sekvenca. Ovakvi elementi mogu biti klonirani iz biblioteke, komercijalno nabavljeni kao delovi vektora i lako sintetisani.

[0194] Geni selektivnih markera kordiraju proteine neophodne za preživljavanje i rast ćelije domaćina u selektivnom medijumu za kulturu. Uobičajeni geni selektivnih markera kodiraju proteina koji (a) obezbeđuju rezistenciju na antibiotike ili druge toksine, na primer, na ampicilin, tetraciklin ili kanamicin kod prokariotskih ćelija domaćina, (b) dopunjavaju auksotrofne deficijencije ćelije; ili (c) snabdevaju ćelije kritičnim hranjivim materijama koje nisu dostupne u kompleksnom medijumu.

[0195] Element za vezivanje ribozoma, koji se obično naziva Shine-Dalgarno sekvenca (kod prokariota) ili Kozak sekvenca (kod eukariota), neophodan je za započinjanje tranlacije iRNK. Element se obično nalazi 3' u odnosu na promotor i 5' u odnosu na kodirajuću sekvencu polipeptida koji će se sintetisati. Shine-Dalgarno sekvenca je raznovrsna, ali obično predstvlja polipurin (tj. sa visokim je sadržajem A-G). Identifikovane su mnoge Shine-Dalgarno sekvence, od kojih svaka može lako biti sintetisana upotrebom prethodno navedenih postupaka.

[0196] Svi prethodno navedeni elementi, kao i drugi koji su od koristi u ovom pronalasku, dobro su poznati iskusnom stručnjaku i opisani su, na primer, u Sambrook i saradnici, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) i Berger i saradnici, ur., "Guide To Molecular Cloning Techniques", Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (1987)].

[0197] Za one primere izvođenja pronalaska u kojima je potrebno da se rekombinantni polipeptid sekretuje, poželјno je da je uklјučena signalna sekvenca koja usmerava sekreciju iz ćelije u kojoj se sintetiza odvija. Uobičajeno je da polinukleotid koji kodira signalnu sekvencu smešten na 5’ kraju kodirajućeg regiona. Identifikovane su mnoge signalne sekvence, a bilo koja od njih koja je funkcionalna u cilјnoj ćeliji ili vrsti može biti upotrebljena zajedno sa transgenom.

[0198] U mnogim slučajevima, transkripcija gena se povećava prisustvom jednog ili više introna na vektoru. Intron može biti onaj koji se javlja u prirodi, posebno kada je transgen pune dužine ili fragment genomske DNK sekvence. Intron može biti homolog ili heterolog transgenu i/ili transgenom sisaru u koji će gen biti insertovan. Pozicija introna u odnosu na promotor i transgen je važna, pošto intron mora biti prepisan da bi bio efektivan. Poželјna pozicija za intron je 3' u odnosu na mesto počeka transkripcije i 5' u odnosu na poliA sekvencu za terminaciju transkripcije. Za cDNK transgene, intron se postavlјa sa jedne ili sa druge strane (tj. 5' ili 3') u odnosu na transgenu kodirajuću sekvencu. Bilo koji intron iz bilo kog izvora, uklјučujući bilo koji virusni, prokariotski i eukariotski (bilјni ili životinjski) organizam, može biti upotrebljen za ekspresiju polipeptida, pod uslovom da je kompatibilan sa ćelijom domaćinom (ćelijama domaćinima) u koje je insertovan. Ovde su takođe uklјučeni sintetski introni. Po izboru, u vektoru može biti upotrebljeno više od jednog introna.

[0199] Vektori za rekombinantnu ekspresiju za primer su oni koji su kompatibilni sa bakterijskim, ćelijama domaćinima insekata i sisara. Takvi vektori uklјučuju, između ostalog, pCRII (Invitrogen Company, San Diego, Kalifornija), pBSII (Stratagene Company, La Jolla, Kalifornija), i pETL (BlueBacll; Invitrogen).

[0200] Nakon što je vektor konstruisan i nukleinska kiselina insertovana na odgovarajuće mesto u vektoru, kompletiran vektor može biti insertovan u odgovarajuću ćeliju domaćina radi amplifikacije i/ili ekspresije polipeptida. Najčešće se koriste: prokariotske ćelije, poput Gram-negativnih ili Grampozitivnih bakterija, tj. bilo koji soj E. coli, Bacillus, Streptomyces, Saccharomyces, Salmonella, i sličnih; eukariotske ćelije kao što su CHO ćelije (jajnika kineskog hrčka); 293 ćelije humanog bubrega; COS-7 ćelije; ćelije insekata kao što su Sf4, Sf5, Sf9, Sf21 i High 5 (sve iz kompanije Invitrogen, San Diego, Kalifornija); bilјne ćelije i razne ćelije kvasca kao što su Saccharomyces i Pichia. Pogodne su sve ćelije ili ćelijske linije koje se mogu transformisati ili transfektovati, a koje su izvedene iz bilo kog organizma poput bakterija, kvasaca, glјiva, monokotilnih ili dikotilnih biljaka, biljnih ćelija i životinja.

[0201] Insercija (takođe označena kao "transformacija" ili "transfekcija") vektora u izabranu ćeliju domaćina može biti ostvarena upotrebom postupaka kao što su taloženje kalcijum hloridom, elektroporacija, mikroinjeciranje, lipofekcija ili DEAE-dekstran postupak. Odabrani postupak će delom biti funkcija vrste ćelije domaćina koja će se koristiti. Ovakvi postupci i drugi pogodni postupci su dobro poznati iskusnom stručnjaku i navedeni su prethodno, na primer, u Sambrook i saradnici.

[0202] Ćelije domaćini koje sadrže vektor (tj. transformisane ili transfektovane) mogu biti gajene upotrebom standardnih medijuma koji su dobro poznati iskusnom stručnjaku. Medijumi obično sadrže sve hranjive materije potrebne za rast i preživljavanje ćelija. Pogodni medijumi za kultivisanje E. coli ćelija su na primer, Luria bujon (LB) i/ili tzv. Terrific bujon (TB). Pogodni medijumi za kultivaciju eukariotskih ćelija su RPMI 1640, MEM, DMEM, a svi oni mogu biti dopunjeni serumom i/ili faktorima rasta shodno potrebama određene ćelijske linije koja se uzgaja. Pogodan medijum za kulture ćelija insekata je Grace-ova medijuma u kog se po potrebi dodaju hidrolizat kvasca, laktalbuminski hidrolizat i/ili serum fetusa govečeta.

[0203] Kao suplement medijumu se obično dodaje i antibiotik ili neko drugo jedinjenje koje je korisno za selektivan rast transformisanih ćelija. Jedinjenje koje će biti upotrebljeno zavisi od elementa selektivnog makera koji je prisutan na plazmidu sa kojim je ćelija domaćin transformisana. Na primer, kada je element selektivnog makera za rezistenciju na kanamicin, jedinjenje dodato medijumu za kulturu biće kanamicin.

[0204] Količina polipeptida proizvedenog u ćeliji domaćinu može biti procenjena upotrebom standardnih postupaka poznatih u oblasti tehnike. Takvi postupci obuhvataju, bez ograničavanja samo na, imunoblot analizu, SDS-poliakrilamidnu gel elektroforezu, nedenaturišuću gel elektroforezu, HPLC razdvajanje, imunoprecipitaciju i/ili testove vezivanja.

[0205] Ukoliko je polipeptid dizajniran tako da se sekretuje iz ćelija domaćina, većina polipeptida će verovatno biti pronađena u medijumu ćelijske kulture. Ukoliko se, međutim, polipeptid ne izlučuje iz ćelija domaćina, on će biti prisutan u citoplazmi (kod eukariotskih, gram pozitivnih bakterijskih i ćelija domaćina insekata) ili u periplazmi (kod gram negativnih bakterijskih ćelija domaćina).

[0206] U slučaju unutarćelijskih polipeptida, ćelije domaćini se najpre mehanički ili osmotski uništavaju da bi se citoplazmatski sadržaj oslobodio u puferisan rastvor. Polipeptid se zatim izoluje iz ovog rastvora.

[0207] Za dugoročnu proizvodnju rekombinantnog polipeptida sa visokim prinosom, poželja je stabilna ekspresija. Na primer, ćelijske linije koje stabilno eksprimiraju polipeptid od interesa mogu biti transformisane upotrebom ekspresionih vektora koji mogu sadržavati virusna mesta početka transkripcije i/ili endogene ekspresione elemente i gene selektivnih markera na istom ili na razdvojenom vektoru. Nakon uvođenja vektora, ćelijama se može dopustit da rastu tokom 1-2 dana u obogaćenom medijumu pre nego što se prebace u selektivni medijum. Svrha selektivnog markera je da obezbedi rezistenciju na selekciju, a njegovo prisustvo omogućava rast i oporavak ćelija koje uspešno eksprimiraju uvedene sekvence. Rezistentni klonovi stabilno transformisanih ćelija se mogu umnožavati upotrebom tehnika kulture tkiva koje odgovaraju tipu ćelije. Ćelijska linija značajno obogaćena takvim ćelijama može zatim biti izolovana da bi se obezbedila stabilna ćelijska linija.

[0208] Posebno poželjan postupak za proizvodnju rekombinantnog polipeptida predmetnog pronalaska u visokom prinosu je upotreba amplifikacije dihidrofolat reduktaze (DHFR) u CHO ćelijama deficijentnim za DHFR, postepenim povećavanjem nivoa metotreksata, kao što je opisano u US 4,889,803. Dobijeni polipeptid može biti u glikozilovanom obliku.

[0209] Prečišćavanje polipeptida iz rastvora može biti ostvareno različitim tehnikama. Ukoliko je polipeptid sintetisan tako da sadrži oznaku poput heksahistidina ili drugog malog peptida bilo na njegovom karboksilnom ili amino kraju, on suštinski može biti prečišćen procesom od jednog koraka, propuštanjem rastvora kroz afinitetnu kolonu, pri čemu je matrica kolone sa visokim afinitetom za oznaku ili direktno za polipeptid (tj. monoklonsko je antitelo koje specifično prepoznaje polipeptid). Na primer, polihistidin se vezuje sa velikim afinitetom i specifičnošću za nikl, tako da afinitetna kolona nikla (kao što su Qiagen nikl kolona) može biti upotrebljena za prečišćavanje polipeptida sa His oznakom. (Pogledati, na primer, Ausubel i saradnici, izd., "Current Protocols In Molecular Biology", odeljak 10.11.8, John Wiley & Sons, New York (1993)).

4

[0210] Snažan afinitet liganda za njegov receptor omogućava afinitetno prečišćavanje molekula koji vezuju ligand i molekula koji vezuju ligand upotrebom matrice koja sadrži komplementarnog vezujućeg partnera. Može biti upotrebljeni afinitetna hromatografija, npr. upotrebom bilo prirodnih vezujućih partnera (npr. liganda prilikom prečišćavanja molekula koji vezuje ligand sa afinitetom za isti) ili antitela koja se dobijaju standardnim postupcima (npr. imunizacijom miša, zeca ili druge životinje odgovarajućim polipeptidom). Peptidi predmetnog pronalaska mogu biti upotrebljeni za generisanje takvih antitela. Poznata antitela ili antitela na poznate receptore faktora rasta mogu biti upotrebljena kada ona dele epitop sa ciljnim molekulom koji vezuje ligand.

[0211] Pored navedenog, mogu biti upotrebljeni i drugi dobro poznati postupci prečišćavanja. Takvi postupci obuhvataju, bez ograničenja, jonoizmenjivačku hromatografiju, hromatografiju sa upotrebom molekulskog sita, HPLC, nativnu gel elektroforezu u kombinaciji sa elucijom gela i preparativno izoelektrično fokusiranje ("Isoprime" mašina/tehnika, Hoefer Scientific). U pojedinim primerima, dve ili više ovih tehnika se mogu kombinovati da bi se postigla povećana čistoća. Poželјni postupci za prečišćavanje uklјučuju polihistidinsko obeležavanje i jono-izmenjujuću hromatografiju u kombinaciji sa preparativnim izoelektričnim fokusiranjem.

[0212] Polipeptid koji se nalazi u periplazmatskom prostoru bakterija ili citoplazmi eukariotskih ćelija ili sadržaj periplazme ili citoplazme, uklјučujući inkluziona tela (kod bakterija), ukoliko je obrađeni polipeptid obrazovao takve komplekse, može biti ekstrahovan iz ćelije domaćina bilo kojom standardnom tehnikom koja je poznata iskusnom stručnjaku. Na primer, ćelije domaćini se mogu lizirati da bi se oslobodio sadržaj periplazme, upotrebom “francuske” prese, homogenizacija i/ili sonikacije. Homogenat tada može biti centrifugiran.

[0213] Ukolik je polipeptid obrazovao inkluziona tela u periplazmi, inkluziona tela često mogu biti vezana za unutrašnju i/ili spolјašnju ćelijsku membranu, a tako će se ona nakon centrifugiranja naći prvenstveno u materijalu taloga. Materijal taloga može zatim biti tretian haotropnim sredstvom kao što je guanidin ili urea da bi se oslobodila, razložila ili solubilizovala inkluziona tela. Solubilizovani polipeptid može zatim biti analiziran upotrebom gel elektroforeze, imunoprecipitacije ili sličnog. Ukoliko je poželјno da se polipeptid izoluje, izolacija se može postići standardnim postupcima, kao što su oni navedeni ispod i u [Marston i saradnici, Meth. Enz., 182:264-275 (1990).]

Genska terapija

[0214] U pojedinim primerima izvođenja, polinukleotidi pronalaska dalјe sadrže dodatne sekvence da bi se olakšala genska terapija. U jednom primeru izvođenja, za gensku terapiju se koristi "goli" transgen koji kodira ovde opisan molekul koji vezuje ligand (tj. transgen bez virusnog, lipozomalnog ili drugog vekora koji olakšava transfekciju).

[0215] Vektori su takođe korisni za režime lečenja "genskom terapijom", pri čemu se polinukleotid koji kodira polipeptid ili molekul koji vezuje ligand uvodi u subjekta kome je potrebna inhibicija neovaskularizacije, u obliku koji prouzrokuje da ćelije subjekta eksprimiraju molekul koji vezuje ligand pronalaska in vivo. Aspekti genske terapije koji su opisani u U.S. Patentnoj publikaciji br.2002/0151680 i WO 01/62942 su takođe ovde primenjivi.

[0216] Bilo koji pogodan vektor može biti upotrebljen za uvođenje polinukleotida koji kodira ovde opisan molekul koji vezuje ligand u domaćina. Primeri vektora koji su opisani u literaturi obuhvataju retrovirusne vektore sa deficijencijom u replikaciji, uklјučujući, ali bez ograničavanja samo na, lentivirusne vektore (Kim i saradnici, J. Virol., 72(1): 811-816,1998; Kingsman i Johnson, Scrip Magazine, octobar 1998, str. 43-46); adeno-asocirane virusne (AAV) vektore (U.S. patenti br. 5,474,9351; 5,139,941; 5,622,856; 5,658,776; 5,773,289; 5,789,390; 5,834,441; 5,863,541; 5,851,521; 5,252,479; Gnatenko i saradnici, J. Invest. Med., 45: 87-98, 1997); adenovirusne (AV) vektore (U.S. patenti br.

5,792,453; 5,824,544; 5,707,618; 5,693,509; 5,670,488; 5,585,362; Quantin i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 2581-2584, 1992; Stratford Perricadet i saradnici, J. Clin. Invest., 90:626-630, 1992; i Rosenfeld i saradnici, Cell, 68: 143-155, 1992); adenovirusne adeno-asocirane virusne himerne (U.S. patent br.5,856,152) ili vakcinija virusne ili herpesvirusne vektore (U.S. patenti br.5,879,934; 5,849,571; 5,830,727; 5,661,033; 5,328,688); prenos gena posredovan lipofektinom (BRL); lipozomalne vektore (U.S. patent br.5,631,237, Liposomes comprising Sendai virus proteins); i njihove kombinacije.

[0217] Drugi mehanizmi za nevirusnu isporuku koji se razmatraju obuhvataju, ali nisu ograničeni na, taloženje kalcijum fosfatom (Graham i Van Der Eb, Virology, 52:456-467, 1973; Chen i Okayama, Mol. Cell Biol., 7:2745-2752, 1987; Rippe i saradnici, Mol. Cell Biol., 10:689-695, 1990) DEAE-dekstran (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190, 1985), elektroporaciju (Tur-Kaspa i saradnici, Mol. Cell Biol., 6:716-718, 1986; Potter i saradnici, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81:7161-7165, 1984), direktno mikroinjeciranje (Harland i Weintraub, J. Cell Biol., 101:1094-1099, 1985.), lipozome ispunjene sa DNK (Nicolau i Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190, 1982; Fraley i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3348-3352, 1979; Feigner, Sci Am. 276(6):102-6, 1997; Feigner, Hum Gene Ther. 7(15):1791-3, 1996), sonikaciju ćelija (Fechheimer i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:8463-8467, 1987), gensko bombardovanje upotrebom mikroprojektila velike brzine (Yang i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 87:9568-9572, 1990) i transfekciju posredovanu receptorima (Wu i Wu, J. Biol. Chem., 262:4429-4432, 1987; Wu i Wu, Biochemistry, 27:887-892, 1988; Wu i Wu, Adv. Drug Delivery Rev., 12:159-167, 1993).

[0218] Ekspresioni konstrukt (ili zapravo ovde opisan molekul koji vezuje ligand) može biti zarobljen u lipozomu. Lipozomi su vezikularne strukture koje karakteriše dvoslojna fosfolipidna membrana i unutrašnji vodeni medijum. Multilamelarni lipozomi sadrže više lipidnih slojeva razdvojenih vodenim medijumom. Oni nastaju spontano kada se fosfolipidi resuspenduju u višku vodenog rastvora. Lipidne komponente se podvrgavaju samopreuređivanju pre obrazovanja zatvorenih struktura i ulaska vode i rastvorenih supstanci između lipidnih dvosloja (Ghosh i Bachhawat, u: Liver diseases, targeted diagnosis and therapy using specific receptors and ligands, Wu G, Wu C ur., New York: Marcel Dekker, str.87-104, 1991). Dodavanje DNK katjonskim lipozomima prouzrokuje topološki prelaz iz lipozoma u optički birefregentne tečno-kristalne kondenzovane globule (Radler i saradnici, Science, 275(5301):810-4, 1997). Ovi DNK-lipidni kompleksi su potencijalni nevirusni vektori za upotrebu u genskoj terapiji i isporuci.

[0219] Isporuka nukleinskih kiselina posredovana lipozomima i ekspresija strane DNK in vitro je bila uspešna. U predmetnom pronalasku se razmatraju i razni komercijalni pristupi koji uklјučuju tehnologiju "lipofekcije". U određenim primerima izvođenja pronalaska, lipozom može biti uveden u kompleks sa hemaglutinirajućim virusom (HVJ). Pokazano je da ovo olakšava fuziju sa ćelijskom membranom i da pospešuje ulazak DNK inkapsulirane u lipozomu u ćeliju (Kaneda i saradnici, Science, 243:375-378, 1989). U drugim primerima izvođenja, lipozom može biti uveden u kompleks ili upotrebljen u kombinaciji sa jedarnim nehistonskim hromozomskim proteinima (HMG-1) (Kato i saradnici, J. Biol. Chem., 266: 3361-3364, 1991). U još dalјim primerima izvođenja, lipozom može biti biti uveden u kompleks ili upotrebljen u kombinaciji i sa HVJ i sa HMG-1. Takvi ekspresioni konstrukti su tako uspešno korišćeni u prenosu i ekspresiji nukleinske kiseline in vitro i in vivo, te su stoga primenjivi i za predmenti pronalazak.

[0220] Sledeći primer izvođenja pronalaska za prenošenje ekspresionog konstrukta “gole” DNK u ćelije može uklјučivati bombardovanje česticama. Ova postupak zavisi od sposobnosti ubrzavanja mikroprojektila obloženih sa DNK do velikih brzina, što im omogućava da probiju ćelijske membrane i uđu u ćelije, a da ih ne ubiju (Klein i saradnici, Nature, 327:70-73, 1987). Razvijeno je nekoliko uređaja za akceleraciju sitnih čestica. Jedan takav uređaj se oslanja na visokonaponsko pražnjenje kojim se generiše električna struja, što zauzvrat obezbeđuje pokretačku silu (Yang i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 87:9568-9572, 1990). Upotrebljeni mikroprojektili su se sastojali od biološki inertnih supstanci, poput kuglica volframa ili zlata.

[0221] U primerima izvođenja u kojima se upotrebljava virusni vektor, poželјni polinukleotidi i dalјe uklјučuju pogodan promotor i poliadenilacionu sekvencu, kao što je to prethodno opisano. Štaviše, biće očigledno da u ovim primerima izvođenja polinukleotid dalјe obuhvata vektorske polinukleotidne sekvence (npr. adenovirusne polinukleotidne sekvence) koje su operativno povezane sa sekvencom koja kodira polipeptid ovog pronalaska.

Terapijske upotrebe molekula koji vezuju ligand

[0222] Ovde opisani polipeptidi i molekuli koji vezuju ligand, kao i polinukleotidi i vektori koji ih kodiraju, korisni su za inhibiciju ćelijskih procesa koji su posredovani endotelnim faktorom rasta koji indukuje transdukciju signala preko VEGFR-2 ili VEGFR-3, a indikovani su za profilaksu ili terapiju poremećaja povezanih sa aberantnom angiogenezom i/ili limfangiogenezom (npr. raznih očnih poremećaja i kancera) koji se stimulišu dejstvom takvih faktora rasta na ove receptore. Ovde opisani polipeptidi i molekuli koji vezuju ligand, kao i polinukleotidi i vektori koji ih kodiraju, su terapijski korisni za lečenje ili prevenciju bilo kog bolesnog stanja koje se pobolјšava, ublažava, inhibira ili sprečava uklanjanjem, inhibicijom ili redukcijom VEGF-C i/ili VEGF-D. Neiscrpna lista specifičnih stanja koja se poboljšavaju

4

inhibicijom ili smanjenjem VEGF-C i/ili VEGF-D (a posebno sa najmanje VEGF-C) obuhvata: klinička stanja koja su okarakterisana prekomernom proliferacijom vaskularnih endotelnih ćelija, vaskularnom propustljivošću, edemom ili upalom, poput edema mozga koji prati povrede, moždani udar ili tumore; edema povezanog sa inflamatornim poremećajima kao što je psorijaza ili artritis, uklјučujući reumatoidni artritis; astmu; generalizovane edeme povezane sa opekotinama; ascites i pleuralni izliv povezan sa tumorima, upalom ili traumom; hroničnu upalu disajnih puteva; sindrom curenja kapilara; sepsu; bolest bubrega povezanu sa povećanim curenjem proteina; i poremećaje oka kao što su senilna degeneracija makule i dijabetska retinopatija.

[0223] Iako su u daljem tekstu ukratko opisani mnogi postupci koji se odnose na kompozicije koje sadrže molekul koji vezuje ligand, podrazumeva se da se razmatra i praksa pronalaska sa bilo kojim konstruktom koji je ovde opisan (poput polipeptida, molekula i konstrukata koji vezuju ligand i polinukleotida koji ih kodiraju, dimera i drugih multimera itd.).

[0224] Primer terapijske upotrebe je postupak inhibicije neovaskularizacije kod subjektu kome je ista potrebna, a koji obuhvata primenu kompozicije koja sadrži ovde opisan molekul koji vezuje ligand subjektu, u količini koja je efektivna za inhibiciju neovaskularizacije kod subjekta. U pojedinim primerima izvođenja, neovaskularizacija obuhvata horoidnu ili retinalnu neovaskularizaciju. U pojedinim primerima izvođenja, neovaskularizacija je neovaskularizacija tumora koja se javlјa kod malignih kancera i drugih tumora.

[0225] U drugom primeru, ovde je opisan postupak za profilaksu ili terapiju očnog poremećaja koga prati neovaskularizacija, postupak koji obuhvata primenu kompozicije koja sadrži ovde opisan molekul koji vezuje ligand subjektu kome je potrebna profilaksa ili terapija očnog poremećaja.

[0226] U sledećem primeru, ovde je opisan postupak za profilaksu ili terapiju očnog poremećaja koji rezultuje u retinalnom edemu, postupak koji obuhvata primenu kompozicije koja sadrži ovde opisan molekul koji vezuje ligand subjektu kome je potrebna profilaksa ili terapija očnog poremećaja ili oboljenja.

[0227] Primeri očnih poremećaja koji mogu biti lečeni obuhvataju horoidnu neovaskularizaciju, dijabetski makularni edem, degeneraciju makule povezanu sa starenjem, proliferativnu dijabetsku retinopatiju, okluziju retinalne vene i neovaskularizaciju rožnjače/odbacivanje transplanta. Poželјno je da je količina upotreblјenog molekula za vezivanje liganda efektivna u inhibiciji vezivanja VEGF-C i/ili VEGF-D liganda za VEGFR-3 (a poželjno i za VEGFR-2) ili stimulativnog efekta VEGF-C i/ili VEGF-D na VEGFR-3 (a poželjno i za VEGFR-2).

[0228] U jednom primeru izvođenja, očni poremećaj je makularna degeneracija povezana sa starenjem. Primeri degeneracije makule povezane sa starenjem su makularna degeneracija koju ne prati neovaskularizacija (poznata i kao „suva“) i ona koju prati neovaskularizacija (poznata i kao „vlažna“). U poželјnom primeru izvođenja, očni poremećaj je vlažna makularna degeneracija povezana sa starenjem.

Lečenje ili prevencija vlažne degeneracije makule povezane sa starenjem takođe obuhvata lečenje ili prevenciju horoidne neovaskularizacije ili odvajanja pigmentnog epitela.

[0229] U jednom primeru izvođenja, očni poremećaj je polipoidna horoidna vaskulopatija. Polipoidnu horoidnu vaskulopatiju karakteriše lezija unutrašnje horoidne vaskularne mreže sudova koja se završava u aneurizmnoj izbočini ili spoljnoj projekciji (Ciardella i saradnici (2004) Surv Ophthalmol.49:25-37).

[0230] U jednom primeru izvođenja, očni poremećaj je stanje povezano sa horoidnom neovaskularizacijom. Primeri stanja povezanih sa horoidnom neovaskularizacijom uklјučuju degenerativno, inflamatorno, traumatsko ili idiopatsko stanje. Lečenje ili prevencija degenerativnog poremećaja povezanog sa horoidnom neovaskularizacijom takođe obuhvata lečenje ili prevenciju heredodegenerativnog (naslednog degenerativnog) poremećaja. Primeri heredodegenerativnih poremećaja uklјučuju viteliformnu makularnu distrofiju, fundus flavimaculatus i druzen na početku optičkog nerva. Primeri degenerativnih stanja povezanih sa horoidnom neovaskularizacijom uklјučuju miopsku degeneraciju ili angioidne strije. Lečenje ili prevencija inflamatornog poremećaja povezanog sa horoidnom neovaskularizacijom takođe obuhvata lečenje ili prevencija sindroma okularne histoplazmoze, multifokalni horoiditis, serpininozni horoiditis, toksoplazmozu, toksokariazu, rubeole, Vogt-Koyanagi-Harada sindrom, Behčetov sindrom ili simpatičku oftalmiju. Lečenje ili prevencija traumatskog poremećaja povezanog sa horoidnom neovaskularizacijom takođe obuhvata lečenje ili prevencija horoidne rupture ili traumatično stanje prouzrokovano intenzivnom fotokoagulacijom.

[0231] U jednom primeru izvođenja, očni poremećaj je hipertenzivna retinopatija.

[0232] U jednom primeru izvođenja, očni poremećaj je dijabetska retinopatija. Dijabetska retinopatija može biti neproliferativna ili proliferativna dijabetska retinopatija. Primeri neproliferativne dijabetske retinopatije uklјučuju makularni edem i makularnu ishemiju.

[0233] U jednom primeru izvođenja, očni poremećaj je retinopatija srpastih ćelija.

[0234] U jednom primeru izvođenja, očni poremećaj je stanje povezano sa perifernom neovaskularizacijom mrežnjače. Primeri stanja povezanih sa perifernom neovaskularizacijom mrežnjače obuhvataju ishemijsku vaskularnu bolest, inflamatornu bolest sa mogućom ishemijom, pigmentu inkontinenciju, pigmentozu retinitis, retinošizu ili hronično odvajanje mrežnjače.

[0235] Primeri ishemijske vaskularne bolesti uklјučuju proliferativnu dijabetsku retinopatiju, perifernu okluziju retinalne vene, perifernu okluziju retinalne arteriole, karotidnu kavernoznu fistulu, srpastu hemoglobinopatiju, nesrpastu hemoglobinopatiju, IRVAN sindrom (retinalni vaskulitični poremećaj koga karakteriše idiopatski retinalni vasculitis, aneurizma i neuroretinitis), embolizaciju mrežnjače, prevremenu retinopatiju, familijarnu eksudativnu vitoreoretinopatiju, sindrom hiperviskoznosti, sindrom aortnog luka ili Eales-ovu bolest. Primeri srpaste hemoglobinopatije uklјučuju SS hemoglobinopatiju i SC hemoglobinopatiju. Primeri nesrpaste hemoglobinopatije uklјučuju AC hemoglobinopatiju i AS hemoglobinopatiju. Primeri sindroma hiperviskoznosti uklјučuju leukemiju, Valdenstromovu makroglobulinemiju, multipli mijelom, policitemiju ili mijeloproliferativni poremećaj.

4

[0236] Lečenje ili prevencija inflamatornog oboljenja sa mogućom ishemijom takođe obuhvata lečenje ili prevencija retinalnog vaskulitisa povezanog sa sistemskom bolešću, retinalni vaskulitis povezan sa infektivnim agensom, uveitisom ili “birdshot” retinopatijom. Primeri sistemskih bolesti uklјučuju sistemski eritematozni lupus, Behčetovu bolest, inflamatornu bolest creva, sarkoidozu, multiplu sklerozu, Vegenerovu granulomatozu i poliarteritis nodozu. Primeri zaraznih uzročnika uklјučuju bakterijske agense koji su uzročnici sifilisa, tuberkuloze, lajmske bolesti ili bolesti mačje ogrebotine, virusa poput herpes virusa ili parazita kao što je Toxocara canis ili Tokoplasma gondii. Primeri uveitisa obuhvataju pars planitis ili Fuchs-ov uveitisni sindrom.

[0237] U jednom primeru izvođenja, očni poremećaj je prevremena retinopatija. Prevremena retinopatija može biti rezultat abnormalnog rasta krvnih sudova u vaskularnom dnu koji podržava mrežnjaču u razvoju (Pollan C (2009) Neonatal Netv.28: 93-101).

[0238] U jednom primeru izvođenja, očni poremećaj je venska okluzivna bolest. Primeri venske okluzivne bolesti uklјučuju perifernu okluziju retinalne vene i centralnu okluziju retinalne vene. Periferna okluzija retinalne vene može biti blokada dela cirkulacije koji drenira krv iz mrežnjače. Blokada može prouzrokovati povratni pritisak u kapilarima, što može dovesti do krvarenja, ali i do curenja tečnosti i drugih sastojaka krvi.

[0239] U jednom primeru izvođenja, očni poremećaj je arterijska okluzivna bolest. Primeri arterijske okluzivne bolesti uklјučuju perifernu okluziju retinalne arterije, centralnu okluziju retinalne arterije ili očni ishemijski sindrom. Periferna okluzija retinalne arterije (BRAO) se može javiti kada se javi začepljenje jedne od grana arterijskog snabdevanja mrežnjace.

[0240] U jednom primeru izvođenja, očni poremećaj je centralna serozna horioretinopatija (CSC). U jednom primeru izvođenja, za CSC je karakteristično curenje tečnosti u centralnoj makuli.

[0241] U jednom primeru izvođenja, očni poremećaj je cistoidni makularni edem (CME). U jednom primeru izvođenja, CME utiče na centralnu mrežnjaču ili makulu. U drugom primeru izvođenja, CME se javlјa nakon operacije katarakte.

[0242] U jednom primeru izvođenja, očni poremećaj je telengiektazija mrežnjače. U jednom primeru izvođenja, telangiektaziju mrežnjače karakteriše dilatacija i tortuoznost retinalnih sudova i obrazovanje višestrukih aneurizmi. Idiopatska JXT, Leberova milijarna aneurizma i Coats-ova bolest su tri vrste telangiektazije mrežnjače.

[0243] U jednom primeru izvođenja, očni poremećaj je arterijska makroaneurizma.

[0244] U jednom primeru izvođenja, očni poremećaj je angiomatoza mrežnjače. U jednom primeru izvođenja, angiomatoza mrežnjače nastaje kada očna vaskulatura obrazuju višestruke angiome.

[0245] U jednom primeru izvođenja, očni poremećaj je retinopatija izazvana zračenjem (RIRP). U jednom primeru izvođenja, RIRP može ispoljiti simptome poput makularnog edema i neproliferativne i proliferativne retinopatije.

4

[0246] U jednom primeru izvođenja, očni poremećaj je rubeozis iridis. U drugom primeru izvođenja, rezultat rubeozis iridisa je obrazovanje neovaskularnog glaukoma. U drugom primeru izvođenja, rubeozni iridis je prouzrokovan dijabetskom retinopatijom, centralnom okluzijom retinalne vene, sindromom očne ishemije ili hroničnim odvajanjem mrežnjače.

[0247] U jednom primeru izvođenja, očni poremećaj je neoplazma. Primeri neoplazmi uklјučuju tumor očnog kapka, tumor konjuktive, horoidni tumor, tumor dužice, tumor očnog nerva, tumor mrežnjače, infiltrativni intraokularni tumor ili orbitalni tumor. Primeri tumora očnog kapka obuhvataju karcinom bazalnih ćelija, skvamozni karcinom, karcinom lojnih žlezdi, maligni melanom, kapilarni hemangiom, hidrocistom, nevus ili seboreičnu keratozu. Primori tumora konjuktive obuhvataju konjunktivni Kapošijev sarkom, skvamozni karcinom, intraepitelnu neoplaziju konjunktive, epibularni dermoid, limfom konjunktive, melanom, pinguekulum ili pterigijum. Primeri horoidnog tumora obuhvataju horoidni nevus, horoidni hemangiom, metastatski horoidni tumor, horoidni osteom, horoidni melanom, melanom cilijarnog tela ili nevus Ota. Primeri tumora irisa (dužice) uklјučuju anteriornu uvealnu metastazu, cistu irisa, melanocitom irisa, melanom irisa ili bisernu cistu irisa. Primeri tumora optičkog nerva uklјučuju melanocitom optičkog nerva, meningiom omotača optičkog nerva, horoidni melanom koji utiče na optički nerv ili cirkumpapilarnu metastazu sa optičkom neuropatijom. Primeri tumora mrežnjače uklјučuju hipertrofiju retinalnog pigmentnog epitela (RPE), RPE adenom, RPE karcinom, retinoblastom, hamartom RPE ili von Hippel-ov angiom. Primeri infiltrativnog intraokularnog tumora uklјučuju hroničnu limfocitnu leukemiju, infiltrativnu horoidopatiju ili intraokularni limfom. Primeri orbitalnog tumora uklјučuju adenoidni cistični karcinom sužne žlezde, kavernozni hemangiom orbite, limfangiom orbite, orbitalni mukocele, orbitalni pseudotumor, orbitalni rabdomiosarkom, periokularni hemangiom u detinjstvu ili sklerozirajući orbitalni pleodotumor.

[0248] Prema sledećem aspektu, opis obuhvata postupak lečenja povrede oka koji obuhvata lokalnu primenu efektivne količine ovde opisanog molekula koji vezuje ligand subjektu kome je potrebna, tako da se povreda oka ublažava ili pobolјšava. Poželјno je da povreda oka bude tipa povrede rožnjače ili povrede konjuktive i da postupak lečenja smanju angiogenezu i upalu povezanu sa povredom oka. U pojedinim primerima izvođenja, postupak je koristan za lečenje akutne i sub-akutne povrede rožnjače ili povredu konjuktive. Akutna povreda rožnjače može biti tretirana u roku od 24 sata od nastanka i obuhvata povredu rožnjače ili povredu konjuktive prozrokovanu prodiranjm objekta, stranog tela ili hemijsku ili povredu u vidu opekotine. Subakutna povreda može biti lečena do dve nedelje nakon povrede i može uključivati prethodno navedene porede kao i infektivne etiologije. U pojedinim primerima izvođenja, povreda oka je prouzrokovana traumama, npr. hirurškim povredama, hemijskim opekotinama, infektivnim ili inflamatornim bolestima.

[0249] Dužina lečenja će se razlikovati u zavisnosti od povrede, ali trajanje lečenja može biti kratko, npr. do jednog meseca, i može obuhvatati period praćenja od 3-6 meseci, tokom koga se može obezbediti ponovno lečenje. Primena može takođe uključivati drugo sredstvo, kao što je imunosupresivno sredstvo,

4

na primer, jedan ili više kortikosteroida, deksametazon ili ciklosporina A. Lokalna primena obuhvata, na primer, primenu molekula koji vezuje ligand u kapima za oči koje se nanose u oko ili subkonjuktivnom injekcijom u oko.

[0250] U dalјem primeru, ovde je opisan postupak zarastanja očne povrede, koja obuhvata lokalno primenu efektivne količine ovde opisanog molekula koji vezuje ligand subjektu kome je potrebna, tako da povreda oka zaceli.

[0251] U dalјem primeru, ovde je opisan postupak smanjenja ili ublažavanja angiogeneze povezane sa oštećenjem oka, koja obuhvata lokalnu primenu efektivne količine ovde opisanog molekula koji vezuje ligand subjektu kome je potrebna, tako da se angiogeneza povezana sa povredom oka smanjuje ili ublažava.

[0252] U dalјem primeru, ovde je opisan postupak smanjenja ili ublažavanja upale povezane sa oštećenjem oka, koja obuhvata lokalnu primenu efektivne količine ovde opisanog molekula koji vezuje ligand subjektu kome je potrebna, tako da se upala povezana sa povredom oka smanjuje ili ublažava.

[0253] U dalјem primeru, ovde je opisan postupak primene molekula koji vezuje ligand predmetnog pronalaska za lečenje angiogeneze i/ili upale povezane sa povredom ili infekcijom oka, koji obuhvata lokalnu primenu kapima za oči koje sadrže ovde opisan molekul koji vezuje ligand ili subkonjuktivnu primenu injekcijom ili implantacijom.

[0254] U dalјem primeru, ovde opisani postupak je postupak za produženje preživlјavanja transplatata rožnjače nakon transplantacije rožnjače kod pacijenta, primenom efektivne količine farmaceutske kompozicije koja sadrži ovde opisan molekul koji vezuje ligand pacijentu (čime se suzbija angiogeneza i/ili limfangiogeneza u rožnjaci pacijenta).

[0255] Studije doznog odgovora omogućavaju tačno određivanje ispravne količine molekula koji vezuje ligand koju je potrebno upotrebiti. Efektivne količine mogu biti procenjene, na primer, merenjem afiniteta vezivanja polipeptida za cilјni receptor, količine receptora prisutnog na cilјnim ćelijama, očekivanog volumena razblaženja (npr. na osnovu težine pacijenta i volumena krvi za in vivo primere izvođenja) i stope klirensa polipeptida. Na primer, postojeća literatura koja se odnosi na doziranje poznatih VEGF-C antitela takođe obezbeđuje smernice za doziranje ovde opisanih molekula koji vezuju ligand. Literatura koja opisuje doziranje Aflibercepta (Regeneron), hvatača liganda zasnovanog na VEGFR-1/VEGFR-2, takođe može biti upotrebljena da bi se obezbedile smernice za doziranje ovde opisanih terapijskih molekula.

[0256] U pojedinim primerima, kada se primenjuje intravitrealnom injekcijom, molekul koji vezuje ligand se primenjuje u koncentraciji od oko 2 mg do oko 4 mg po oku (ili oko 1 mg do oko 3 mg ili oko 1 mg do oko 4 mg ili oko 3 mg do oko 4 mg ili oko 1 mg do oko 2 mg po oku). U pojedinim primerima, molekul koji vezuje ligand se primenjuje u koncentraciji od oko 1 mg ili oko 2 mg ili oko 3 mg ili oko 4 mg ili oko 5 mg ili oko 6 mg po oku. Molekul koji vezuje ligand, u pojedinim primerima izvođenja, prisutan je u bilo kojoj od prethodno navedenih koncentracija u zapremini od 10 µl, 15 µl, 20 µl, 25 µl, 30 µl, 35 µl, 40 µl,

4

45 µl, 50 µl, 50 µl, 60 µl, 70 µl, 80 µl, 90 µl, 95 µl ili 100 µl. U pojedinim primerima, molekul koji vezuje ligand se primenjuje u koncentraciji od oko 2-4 mg/50 µl.

[0257] Ovde opisan molekul za vezivanje liganda može biti primenjen isklјučivo kao profilaktički tretman radi prevencije neovaskularizacije kod subjekata koji su sa rizikom razvoja očnog oboljenja koje je udruženo sa neovaskularizacijom (npr. dijabetske retinopatije, degeneracije makule) ili kao terapijski tretman za subjekte koji boluju od očne bolesti, u svrhu inhibicije neovaskularizacije u oku subjektu kome je to potrebno.

[0258] Subjekti sa rizikom od razvoja dijabetske retinopatije ili makularne degeneracije obuhvataju subjekte starije od pedeset godina; subjekte obolele od reumatoidnog artritisa, subjekte sa dijabetesom, subjekte sa abnormalnostima štitne žlezde, subjekte sa astmom, subjekte sa kataraktom, subjekte sa glaukomom, subjekte sa lupusom, subjekte sa povišenim krvnim pritiskom i subjekte sa odvajenom mrežnjačom. Ostali faktori rizika uklјučuju genetiku, ishranu, pušenje i izlaganje manjku svetlosti.

[0259] U pojedinim primerima, ovde je opisan postupak odabira terapijskog režima za subjekta kome je isti potreban, koja obuhvata proveru da li je kod subjekta prisutan jedan ili više simptoma očnog poremećaja udruženog sa neovaskularizacijom mrežnjače i propisivanje subjektu primene kompozicije koja sadrži opisan ovde molekul koji vezuje liganda. U drugom primeru, ovde je opisan postupak lečenja subjekta koji boluje od očnog poremećaja udruženog sa neovaskularizacijom mrežnjače, koji obuhvata identifikovanje subjekta kao onog sa jednim ili sa više simptoma očnog poremećaja i primenu kompozicije koja sadrži molekul koji vezuje ligand subjektu. Simptomi povezani sa poremećajem oka koji je udružen sa neovaskularizacijom mrežnjače obuhvataju, ali nisu ograničeni na, zamaglјen vid i spor gubitak vida tokom vremena, pojavu sitnih čestica koje lebde unutar oka, na senke ili delove vidnog polja koji nedostaju, izobličen vid i noćno slepilo.

[0260] U pojedinim primerima, ovde opisani postupci dalje obuhvataju propisivanje (ili primenu) standarda režima nege za lečenje suvih oboljenja oka. U kontekstu ovde opisanih postupaka, „standard nege“ se odnosi na lečenje koje je opšte prihvaćeno od strane kliničara za određeni tip pacijenta kome je postavljena dijagnoza sa tipom oboljenja. Na primer, za dijabetsku retinopatiju i makularnu degeneraciju, aspekt pronalaska je da se poboljša standard nege, istovremenom terapijom sa ovde opisanim molekulom koji vezuje ligand, a koji inhibira neovaskularizaciju mrežnjače. Primeri standardne terapije za dijabetsku retinopatiju i makularnu degeneraciju uklјučuju, ali nisu ograničeni na, higijenu očnih kapaka, topikalne antibiotike (uklјučujući, ali ne ograničavajući se na eritromicinske ili bacitracinske masti), oralne tetracikline (tetraciklin, doksiciklin ili minociklin), anti-inflamatorna jedinjenja (uklјučujući, ali ne ograničavajući se samo na, ciklosporin), kortikosteroide, lasersku fotokoagulaciju i fotodinamičku terapiju.

[0261] Takođe se razmatraju postupci lečenja sisarskih subjekata sa očnim poremećajem povezanim sa neovaskularizacijom mrežnjače koji slabo odgovara na standardni režim nege za lečenje očnih

4

poremećaja, koji obuhvataju primenu molekula koji vezuje ligand subjektu u količini koja je efektivna za lečenje poremećeja.

[0262] Poželjno je da je sisarski subjekt humani subjekt. Takođe se razmatra praksa postupaka opisa kod drugih sisarskih subjekata, posebno sisara koji se konvencionalno koriste kao modeli za ispitivanje terapijske efikasnosti kod lјudi (npr. kod primata, svinja, pasa ili zečeva).

Kombinovane terapije i dodatna aktivna sredstva

[0263] Kombinovana terapija i profilaktički primeri izvođenja pronalaska obuhvataju proizvode i postupke. Jedinjenja za primer koja mogu biti primenjena u kobminaciji sa jednim ili sa više od ovde opisanih molekula koji vezuju ligand obuhvataju, ali nisu ograničena na, jedinjenja obezbeđena u Tabeli 2.

1

[0264] Molekuli koji vezuju ligand mogu biti primenjeni u kombinaciji sa jednim ili sa više dodatnih aktivnih jedinjenja ili terapija, uklјučujući molekul drugog “hvatajućeg” receptora, citotoksično sredstvo, operaciju, kateterske uređaje i zračenje. Primeri kombinovanih proizvoda uklјučuju dva ili više sredstava formulisanih kao jedna kompozicija ili upakovanih zajedno u zasebne kompozicije, npr. kao paket ili komplet sa jediničnom dozom. Kombinovani postuci za primer obuhvataju propisivanje za primenu ili primenu dva ili više sredstava simultano ili istovremeno ili postepeno (tj. uzastopno).

2

[0265] Izraz "citotoksično sredstvo", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na supstancu koja inhibira ili sprečava funkciju ćelija i/ili prouzrokuje destrukciju ćelija. Predviđeno je da termin uključi radioaktivne izotope (npr. J<131>, J<125>, Y<90>i Re<186>), hemoterapijska sredstva i toksine kao što su enzimski aktivni toksini bakterijskog, glјivičnog, bilјnog ili životinjskog porekla ili njihovi fragmenti.

[0266] "Hemoterapijsko sredstvo" je hemijsko jedinjenje korisno u lečenju kancera. Primeri hemoterapijskih sredstava obuhvataju alkilujuća sredstva kao što su tiotepa i ciklosfosfamid (Citoxan®); alkil sulfonate poput busulfana, improsulfana i piposulfana; aziridine kao što su benzodopa, karbokvon, meturedopa i uredopa; etilenimine i metilamelamine, uklјučujući altretamin, trietilenmelamin, trietilenfosforamid, trietilentiofosfaoramid i trimetilolomelamin; azot iperite kao što su hlorambucil, hlornafazin, holofosfamid, estrainustin, ifosfamid, mehloretamin, mehlorethamin oksid hidrohlorid, melfalan, novembicin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, uracil iperit; nitrozuree poput karmustina, hlorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustin; antibiotike kao što su aklacinomizini, aktinomicin, autramicin, azaserin, bleomicini, kaktinomicin, kalihemicin, karabicin, karminomicin, karzinofilin, chromomicini, daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleucin, doksorubicin, epirubicin, ezorubicin, idarubicin, marcelomicin, mitomicini, mikofenolna kiselina, nogalamicin, olivomicini, peplomicin, potfiromicin, puromicin, kelamicin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimeks, zinostatin, zorubicin; anti-metabolite kao što su metotreksat i 5-fluorouracil (5-FU); analozi folne kiseline kao što su denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat; purinske analoge kao što su fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin; analoge pirimidina kao što su ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, citarabin, dideoksiuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin; androgene poput kalusterona, dromostanolon propionata, epitiostanola, mepitiostana, testolaktona; anti-adrenalne kiseline kao što su aminoglutetimid, mitotan, trilostan; obnavljači folne kiseline kao što je frolinska kiselina; aceglaton; aldofosfamid glikozid; aminolevulinska kiselina; amsakrin; bestrabucil; bisantren; edatraksat; defofamin; demekolcin; diazikvon; elfornitin; eliptinijum acetat; etoglucid; galijum nitrat; hidroksiurea; lentinan; lonidamin; mitoguazon; mitoksantron; mopidamol; nitracrin; pentostatin; fenamet; pirarubicin; podofilinska kiselina; 2-etilhidrazid; prokarbazin; PSK®; razoksan; sizofiran; spirogermanijum; tenuazonska kiselina; triazikvon; 2,2',2"-trihlorotrietilamin; uretan; vindezin; dakarbazin; manomustin; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gacitozin; arabinozid ("Ara-C"); ciklofosfamid; tiotepa; taksani, npr. paklitaksel (Taxol®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) i docetaksel (Taxotere®; Aventis Antony, France); hlorambucil; gemcitabin; 6- tioguanin; merkaptopurin; metotreksat; analozi platine, kao što su cisplatin i karboplatin; vinblastin; platina; etopozid (VP-16); ifosfamid; mitomicin C; mitoksantron; vinkristin; vinorelbin; navelbin; novantron; tenipozid; daunomicin; aminopterin; kseloda; ibandronat; CPT-11; inhibitor topoizomeraze RFS 2000; difluorometilornitin (DMFO); retinoična kiselina; esperamicini; kapecitabin; ili farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati bilo kog od prethodno navedenih. Takođe su ovom definicijom obuhvaćeni antihormonska sredstva koja deluju na regulisanje ili inhibiciju delovanja hormona na tumore, kao što su anti-estrogeni, uklјučujući na primer tamoksifen, raloksifen, inhibitor aromataze 4(5)-imidazole, 4-hidroksitamoksifen, trioksifen, keoksifen, LY 117018, onapriston i toremifen (Fareston); kao i antiandrogene poput flutamida, nilutamida, bikalutamida, leuprolida i goserelina; i farmaceutski prihvatlјive soli, kiseline ili derivati bilo kod od prethodno navedenih.

[0267] "Sredstvo za inhibiciju rasta", kada se ovde upotrebljava, odnosi se na jedinjenje ili kompoziciju koja inhibira rast ćelije, posebno kancerske ćelije bilo in vitro ili in vivo. Primeri sredstava za inhibiciju rasta uklјučuju sredstva koja blokiraju napredovanje ćelijskog ciklusa (na mestu koje nije S faza), kao što su agensi koji indukuju zaustavljanje u G1 fazi i zaustavljanje u M-fazi. Klasični blokatori M-faze uklјučuju vinke (vinkristin i vinblastin), Taksol® i inhibitore topo II, kao što su doksorubicin, epirubicin, daunorubicin, etopozid i bleomicin. Oni agensi koji indukuju zaustavljanje u G1 fazi takođe učestvuju u indukciji zaustavljanja u S fazi, na primer, to su sredstva koja alkiluju DNK, kao što su tamoksifen, prednizon, dakarbazin, mehloretamin, cisplatin, metotreksat, 5-fluorouracil i ara-C.

Inhibitorni proizvodi za VEGF-A (VEGF)

[0268] U pojedinim primerima, ovde opisani postupci po izboru obuhvataju primenu terapijskog aktivnog sredstva za inhibiciju vezivanja VEGF-A za jedan ili više njegovih receptora, naročito VEGFR-2. Inhibitorni proizvod za VEGF-A može biti primenjen u kombinaciji sa jednim ili sa više ovde opisanih molekula koji vezuju ligand. U pojedinim primerima izvođenja, inhibitorni proizvod za VEGF-A se primenjuje istovremeno, u vidu jedne kompozicije, sa molekulom koji vezuje ligand. U drugim slučajevima, inhibitorni proizvod za VEGF-A se primenjuje kao odvojena kompozicija od molekula koji vezuje ligand.

[0269] U jednom primeru izvođenja, inhibitorni proizvod za VEGF-A je izabran između ranibizumaba, bevacizumaba, aflibercepta, KH902 fuzionog proteina VEGF receptora i Fc, 2C3 antitela, ORA102, pegaptaniba, bevaziraniba, SIRNA-027, dekurzina, dekurzinola, pikropodofilina, gugulsterona, PLG101, ejkozanoida LXA4, PTK787, pazopaniba, aksitiniba, CDDO-Me, CDDO-Imm, šikonina, betahidroksiizovalerilišikonina, EYE001, gangliozida GM3, antitela DC101, antitela Mab25, antitela Mab73, antitela 4A5, antitela 4F10, antitela 4F10, antitela 5F12, antitela VA01, antitela BL2, proteina srodnog VEGF-u, sFLT01, sFLT02, Peptida B3, TG100801, sorafeniba ili antitela G6-31 ili farmaceutski prihvatlјive soli bilo kog od prethodno navedenih.

[0270] cDNK i aminokiselinske sekvence humanog VEGFR-2 ECD su navedene u SEQ ID NO: 5 i 6, tim redom. "Inhibitorni proizvod za VEGF-A" može biti bilo koji molekul koji deluje specifično na smanjenje interakcije tipa VEGF-A/VEGFR-2, npr. blokiranjem vezivanja VEGF-A za VEGFR-2 ili smanjenjem ekspresije VEGFR-2. Termin "VEGF-A, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na vaskularni endotelni faktor rasta koji indukuje angiogenezu ili angiogeni proces i obuhvata različite podvrste VEGF-a koje nastaju, na primer, alternativnom obradom VEGF-A gena, uklјučujući VEGF121, VEGF165i VEGF189koji

4

indukuju angiogenezu ili angiogeni proces. Termin "VEGF" može biti upotrebljen za označavanje "VEGF" polipeptida ili gena ili nukleinske kiseline koji kodiraju "VEGF".

[0271] Izraz "inhibitorni proizvod za VEGF-A" se odnosi na sredstvo koje smanjuje ili inhibira, bilo delimično ili u potpunosti, aktivnost ili proizvodnju VEGF-A. Inhibitorni proizvod za VEGF-A može direktno ili indirektno smanjiti ili inhibirati aktivnost ili proizvodnju specifičnog VEGF-A kao što je VEGF165. Pored toga, "inhibitorni proizvod za VEGF-A" obuhvata agense koji deluju bilo na VEGF-A ligand ili na njegov odgovarajući receptor tako da se smanji ili inhibira signal udružen sa receptorom. Primeri "inhibitornog proizvoda za VEGF-A" uklјučuju antisens molekule, ribozime ili RNKi koji ciljano deluju na nukleinsku kiselinu za VEGF-A; VEGF-A aptamere; VEGF-A antitela; solubilne strukture VEGF receptora koje sprečavaju vezivanje VEGF-A za njegov odgovarajući receptor; antisens molekule, ribozimi ili RNKi koji cilјano deluju na nukleinsku kiselinu odgovarajućeg VEGF-A receptora (VEGFR-1 i/ili VEGFR-2); VEGFR-1 i VEGFR-2 aptamere ili VEGFR-1 i VEGFR-2 antitela; i VEGFR-1 i/ili VEGFR-2 tirozin kinazne inhibitore.

[0272] Inhibitor VEGF-A može biti polipeptid koji sadrži solubilni VEGFR-2 ECD fragment (aminokiseline 20-764 u SEQ ID NO: 6) koji vezuje VEGF; solubilni VEGFR-1 ECD fragment, solubilnu strukturu za vezivanje liganda zadnovanu na VEGFR-1/R2, kao što je Aflibercept (Regeneron); neki od antisens polinukleotida ili kratkih ometajućih RNK molekula (siRNK) za VEGFR-2; neko od anti-VEGFR-2 antitela; VEGFR-2 polipeptidni inhibitor koji sadrži fragment koji vezuje antigen anti-VEGFR-2 antitela koji inhibira vezivanje između VEGFR-2 i VEGF-a; aptamer koji inhibira vezivanje između VEGFR-2 i VEGF-A. U pojedinim varijacijama izvođenja, struktura za hvatanje liganda zasnovana na VEGFR-2 sadrži fuzioni protein koji sadrži solubilni VEGFR-2 polipeptidni fragment spojen sa fragmentom konstantnog regiona imunoglobulina (Fc). U pojedinim primerima izvođenja, VEGFR-2 polipeptidni fragment je fuzionisan sa alkalnom fosfatazom (AP). Postupci pripreme Fc ili AP fuzionih konstrukata se mogu naći u WO 02/060950.

[0273] Opisana su brojna VEGF-A antitela, pogledati na primer, U.S. patente br. 8,349,322; 8,236,312; 8,216,571; 8,101,177; 8092,797; 8,088,375; 8,034,905; 5,730,977; 6,342,219, 6,524,583, 6,451,764, 6,448,077, 6,416,758, 6,342,221 i PCT publikacije WO 96/30046, WO 97/44453, i WO 98/45331. VEGF-A antitela za primer obuhvataju Bevacizumab (Avastin®) i Ranibizumab (Lucentis®). U pojedinim primerima, jedan ili više od ovde opisanih molekula koji vezuju ligand se primenjuje u kombinaciji sa bevacizumabom. U pojedinim primerima izvođenja, jedan ili više od ovde opisanih molekula koji vezuju ligand se primenjuje u kombinaciji sa ranibizumabom.

[0274] U pojedinim primerima izvođenja, inhibitor VEGF-A je EYE001 (prethodno označen kao NX1838), koji je modifikovan, PEGilovan aptamer koji se vezuje sa visokim i specifičnim afinitetom za glavnu solubilnu izoformu humanog VEGF-a (pogledati U.S. Pat. br.6,011,020; 6,051,698; i 6,147,204). Aptamer vezuje i inaktivira VEGF na način sličan kao antitela visokog afiniteta usmerenog na VEGF. Drugi koristan VEGF aptamer je EYE001 u svom nepegilovanom obliku.

[0275] U poželјnom primeru, jedan ili više od ovde opisanih molekula koji vezuju ligand se primenjuju u kombinaciji sa afliberceptom (Eylea®) (Holash i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99: 11393-11398, 2002.

[0276] Opisana su brojna VEGFR-2 antitela, pogledati na primer, U.S. patent br. 6,334,339 i U.S. patentne publikacije br. 2002/0064528, 2005/0214860, i 2005/0234225. Antitela su korisna za modulisanje VEGFR-2/VEGF interakcije zbog sposobnosti da lako generisu antitela sa relativnom specifičnošću, a zahvaljujući stalnom unapređivanju tehnologija za prilagođavanje antitela humanoj terapiji. Stoga, opis razmatra upotrebu antitela (npr. monoklonskih i poliklonskih antitela, jednolančanih antitela, himernih antitela, bifunkcionalnih/bispecifičnih antitela, humanizovanih antitela, humanih antitela i antitela sa ugrađenim regionima koji određuju komplementarnost (CDR), uklјučujući jedinjenja koja sadrže CDR sekvence koje specifično prepoznaju polipeptid ovog pronalaska) koja su specifična za VEGFR-2. Humana antitela takođe mogu biti proizvedena upotrebom raznih tehnika poznatih u oblasti, uključujući biblioteke prikaza na fagima [Hoogenboom i Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks i saradnici, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]. Tehnike Cole-a i saradnika i Boerner-a i saradnika su takođe dostupne za pripremu humanih monoklonskih antitela (Cole i saradnici, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) i Boerner i saradnici, J. Immunol., 147(1):8695 (1991). Slično tome, humana antitela mogu biti proizvedena uvođenjem humanog imunoglobulinskog lokusa u transgene životinje, npr. miševe kod kojih su endogeni imunoglobulinski geni delimično ili potpuno inaktivirani. Nakon izazova sistema, uočava se proizvodnja humanih antitela koja u velikoj meri podsećaju na ona koja se javljaju kod ljudi, uklјučujući preuređivanje gena, njihovo udruživanja i repertoar antitela. Navedeni pristup je opisan, na primer, u U.S. patentima br. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, i u sledećim naučnim publikacijama: Marks i saradnici, Biotechnology 10, 779783 (1992); Lonberg i saradnici, Nature 368856859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild i saradnici, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg i Huszar, Intern. Rev. Immunol.13:65-93 (1995).

Inhibitorni proizvod za PDGF

[0277] U pojedinim primerima, ovde opisani postupci po izboru obuhvataju primenu terapijski aktivnog sredstva za inhibiciju vezivanja PDGF za jedan ili više njegovih receptora. Inhibitorni proizvod za PDGF može biti primenjen u kombinaciji sa jednim ili sa više od ovde opisanih molekula koji vezuju ligand. U pojedinim primerima, inhibitorni proizvod za PDGF i molekul koji vezuje ligand se primenjuju istovremeno, u vidu jedne kompozicije. U drugim slučajevima, inhibitorni proizvod za PDGF se primenjuje kao odvojena kompozicija od molekula koji vezuje ligand.

[0278] Termin "PDGF" se odnosi na faktor rasta poreklom iz trombocita koji reguliše ćelijski rast ili deobu ćelija. Kao što se ovde upotrebljava, termin "PDGF" obuhvata razne podtipove PDGF uklјučujući PDGF-B, PDGF-A, PDGF-C, PDGF-D, varijante njihovih oblika i njihove dimerizovane oblike, uključujući PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC i PDGF-DD. Faktori rasta poreklom iz trombocita obuhvataju homo- ili heterodimere A-lanca (PDGF-A) i B-lanca (PDGF-B) koji ispoljavaju svoju aktivnost putem vezivanja za i dimerizacije dva srodna tirozin kinazna receptora, receptora za faktor rasta poreklom iz trombocita na površini ćelije (tj. PDGFR), PDGFR-α i PDGFR-β. Dodatno, identifikovani su i PDGF-C i PDGF-D, dva dodatna liganda koji se aktiviraju proteazama za PDGFR komplekse (Li i saradnici, (2000) Nat. Cell. Biol. 2: 302-9; Bergsten i saradnici, (2001) Nat. Cell. Biol. 3: 512-6; i Uutele i saradnici, (2001) Circulation 103: 2242-47). Zbog različitih specifičnosti vezivanja liganda za PDGFR, poznato je da PDGFR-α/α vezuje PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB i PDGF-CC; PDGFR-β/β vezuje PDGF-BB i PDGF-DD; dok PDGFR-α/β vezuje PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC i PDGF-DD (Betsholtz i saradnici, (2001) BioEssays 23: 494-507). Kao što se ovde upotrebljava, termin "PDGF" se takođe odnosi na one članove klase faktora rasta koji indukuju sintezu DNK i mitogenezu vezivanjem i aktiviranjem PDGFR na tipu ćelije koji na to odgovara. PDGF može uticati na, na primer: usmerenu ćelijsku migraciju (hemotaksiju) i aktivaciju ćelije; aktivaciju fosfolipaze; povećan obrt fosfatidilinozitola i metabolizam prostaglandina; stimulaciju sinteze i kolagena i kolagenaze u osetljivim ćelijama; promenu ćelijskih metaboličkih aktivnosti, uklјučujući sintezu matriksa, proizvodnju citokina i preuzimanje lipoproteina; indukciju, indirektno, proliferativnog odgovora u ćelijama kojima nedostaju PDGF receptori; i snažnu vazokonstriktivnu aktivnost. Termin "PDGF" može biti upotrebljen i da se označe "PDGF" polipeptid, gen ili nukleinska kiselina koji kodiraju "PDGF" ili njegov dimerizovan oblik.

[0279] Izraz "inhibitorni proizvod za PDGF" se odnosi na sredstvo koje smanjuje ili inhibira, bilo delimično ili u potpunosti, aktivnost ili proizvodnju PDGF-a. Inhibitorni proizvod za PDGF može direktno ili indirektno smanjiti ili inhibirati aktivnost ili proizvodnju specifičnog PDGF-a, kao što je PDGF-B. Dodatno, "inhibitorni proizvodi za PDGF" obuhvataju agense koji deluju na PDGF ligand ili njegov odgovarajući receptor tako da se smanjuje ili inhibira signal koji je udružen sa PDGF receptorom. Primeri "inhibitornih proizvoda za PDGF" obuhvataju antisens molekule, ribozime ili RNKi koji cilјano deluju na PDGF nukleinsku kiselinu; PDGF aptamere, PDGF antitela na sam PDGF ili njegov receptor ili na solubilne strukture PDGF receptora koje sprečavaju vezivanje PDGF-a za njegov odgovarajući receptor; antisens molekule, ribozimi ili RNKi koji cilјano deluju na nukleinsku kiselinu odgovarajućeg PDGF receptora (PDGFR); PDGFR aptamere ili PDGFR antitela koja se vezuju za odgovarajući PDGFR receptor; kao i tirozn kinazne inhibitore za PDGFR.

[0280] U jednom primeru izvođenja, inhibitorni proizvod za PDGF je izabran između: jedinjenja Formule A, B, C, D ili E, kao što su ona opisana i definisana u US 2012/0100136, antitela p1B3, antitela CDP860, IMC-3G3, antitela 162.62, antitela 163.31, antitela 169.14, antitela 169.31, antitela αR1, antitela 2A1E2, antitela M4TS.11, antitela M4TS.22, antitela Hyb 120.1.2.1.2, antitela Hyb 121.6.1.1.1, antitela Hyb 127.5.7.3.1, antitela Hyb 127.8.2.2.2, antitela Hyb 1.6.1, antitela Hyb 1.11.1, antitela Hyb 1.17.1, antitela Hyb 1.18.1, antitela Hyb 1.19.1, antitela Antitela Hyb 1.23.1, antitela Hyb 1.24, antitela Hyb 1.25, antitela Hyb 1.29, antitela Hyb 1.33, antitela Hyb 1.38, antitela Hyb 1.39, antitela Hyb 1.40, antitela Hyb 1.45, antitela Hyb 1.46, antitela Hyb 1.48, antitela Hyb 1.49, Hyb 1.51, antitela Hyb 6.4.1, antitela F3, humanizovanog F3 antitela, antitela C1, humanizovanog C1 antitela, antitela 6.4, kozjeg anti-mPDGF-C IgG antitela, antitela C3.1, PDGFR-B1 monoklonskog antitela, PDGFR-B2 monoklonskog antitela, 6D11 monoklonskog antitela, Sis 1 monoklonskog antitela, PR7212 monoklonskog antitela, PR292 monoklonskog antitela, HYB 9610 monoklonskog antitela, HYB 9611 monoklonskog antitela, HYB 9612 monoklonskog antitela ili HYB 9613 monoklonskog antitela, ili njihovih farmaceutski prihvatlјivih soli, bilo kog od prethodno navedenih.

[0281] U poželјnom primeru, jedan ili više od ovde opisanih molekula koji vezuju ligand se primenjuje u kombinaciji sa PDGFR-beta antitelom (poput onog koje je razvila kompanija Regeneron Inc. za očne indikacije) ili sa anti-PDGF aptamerom (kao što je E10030 koga je razvila kompanija Ophthotech Inc. za očne indikacije).

[0282] Fragmenti antitela, na primer, iz inhibitornih proizvoda za VEGF-A i PGDF, uklјučujući Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, takođe se razmatraju. Izraz "specifičan za", kada se koristi za opisivanje antitela pronalaska, ukazuje da varijabilni regioni antitela pronalaska prepoznaju i vezuju isklјučivo polipeptid od interesa (tj. sposobni su da razlikuju polipeptide od interesa, a od drugih poznatih polipeptida iste familije, zahvalјujući merlјivim razlikama u afinitetu vezivanja, uprkos mogućem postojanju lokalizovanog identiteta, homologije ili sličnosti između sekvenci članova familije). Podrazumeva se da specifična antitela takođe mogu interagovati sa drugim proteinima (na primer, sa proteinom A iz S. aureus ili drugim antitelima u ELISA tehnici) kroz interakcije sa sekvencama izvan varijabilnog regiona antitela, a posebno u konstantnom regionu molekula. Skrining analize za određivanje specifičnosti vezivanja antitela pronalaska su dobro poznati i rutinski se primenjuju u oblasti tehnike. Za sveobuhvatno razmatranje takvih analiza, pogledati Harlow i saradnici (izd), Antibodies A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, NY (1988), poglavlјe 6. Antitela pronalaska mogu biti proizvedena upotrebom bilo kog postupka koji je dobro poznat i rutinski se primenjuje u oblasti tehnike.

[0283] U drugom primeru, ovde opisani postupci po izboru obuhvataju primenu anti-sens (npr. antisens u odnosu na VEGFR-2) molekula nukleinske kiseline subjektu. Antisens molekuli nukleinske kiseline za određeni protein (npr. VEGFR-2) su terapijski korisni da bi se inhibirala translacija iRNK koja kodira taj protein (npr. VEGFR-2) pri čemu terapijski cilј podrazumeva želјu da se eliminiše prisustvo proteina ili da se smanji njegov nivo. VEGFR-2 anti-sens RNK, na primer, može biti korisna kao antagonizujuće sredstvo za VEGFR-2 u lečenju oboljenja u kojima VEGFR-2 predstavlja uzročujući agens, npr. kod inflamatornih oboljenja.

[0284] Antisens nukleinska kiselina sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna “sens” nukleotidnoj kiselini koja kodira protein (npr. komplementarna je kodirajućem lancu dvolančanog cDNK molekula ili je komplementarna sekvenci iRNK). (Pogledati npr. VEGFR-3 cDNK sekvencu u SEQ ID NO: 1). Postupci dizajniranja i optimizacije antisens nukleotida su opisane u Lima i saradnici (J Biol Chem; 272:626-38.1997) i Kurreck i saradnici (Nucleic Acids Res.; 30:1911-8.2002). U specifičnim slučajevima, obezbeđeni su antisens molekuli nukleinske kiseline koji sadrže sekvencu komplementarnu sa najmanje oko 10, 25, 50, 100, 250 ili 500 nukleotida ili sa celim lancem koji kodira protein (npr. VEGFR-2) ili sa samo njegovim delom. Razmatraju se i molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju fragmente, homologe, derivate i analoge proteina (npr. VEGFR-2) ili antisens nukleinske kiseline komplementarne sekvenci nukleinske kiseline proteina (VEGFR-2).

[0285] U jednom primeru izvođenja, antisens molekul nukleinske kiseline je antisens u odnosu na "kodirajući region" kodirajućeg lanca nukleotidne sekvence koja kodira protein kao što je npr. VEGFR-2. Izraz "kodirajući region" se odnosi na region nukleotidne sekvence koji sadrži kodone koji se prevode u aminokiselinske ostatke. U drugom primeru izvođenja, antisens molekul nukleinske kiseline je antisens u odnosu na "bočni region" kodirajućeg lanca nukleotidne sekvence koja kodira protein kao što je npr. VEGFR-2. Izraz "bični region" se odnosi na 5’ i 3' sekvence koje okružuju kodirajući region i ne prevode se u aminokiseline (tj. onačavaju se i kao 5’ i 3' netranslirajući regioni).

[0286] Antisens nukleinske kiseline opisa mogu biti dizajnirane prema pravilima Votsona i Krika ili Hoogsteen-ovog sparivanja baza. Molekul antisens nukleinske kiseline može biti komplementaran celom kodirajućem regionu proteina iz iRNK, ali je poželјnije da je oligonukleotid koji je antisens za samo deo kodirajućeg ili nekodirajućeg regiona proteina u iRNK. Antisens oligonukleotid može biti, na primer, dužine od oko 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ili 50 nukleotida. Antisens nukleinska kiselina opisa može biti konstrisana upotrebom hemijske sinteze i reakcijama enzimskih ligacija, upotrebom procedura koje su poznate u oblasti tehnike. Na primer, antisens nukleinska kiselina (npr. antisens oligonukleotid) može biti hemijski sintetisan upotrebom nukleotida koji se javlјaju u prirodi ili različito modifikovanih nukleotida dizajniranih da povećaju biološku stabilnost molekula ili da povećaju fizičku stabilnost dupleksa koji se obrazuje između antisens i sens nukleinskih kiselina (npr. upotrebljavaju se fosforotioatni derivati i nukleotidi supstituisani akridinom).

[0287] Primeri modifikovanih nukleotida koji mogu biti upotrebljeni za generisanje antisens nukleinske kiseline obuhvataju: 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-hlorouracil, 5-jodouracil, hipoksantin, ksantin, 4-acetilcitozin, 5- (karboksihidroksilmetil) uracil, 5-karboksimetilmetil-2-tiouridin, 5-karboksimetilaminometiluracil, dihidroracil, beta-D-galaktozilkveozin, inozin, N6-izopenteniladenin, 1-metilguanin, 1-metilinozin, 2,2-dimetilguanin, 2-metiladenin, 2-metilguanin, 3-metilcitozin, 5-metilcitozin, N6-adenin, 7-metilguanin, 5-metilaminometiluracil, 5-metoksiaminometil-2-tiouracil, beta-D-manozilkveozin, 5'-metoksikarboksimetiluracil, 5-metoksiuracil, 2-metiltio-N6-izopenteniladenin, uracil-5-oksisirćetna kislina (v), vibutokozin, pseudouracil, kveozin, 2-tiocitozin, 5-metil-2-tiouracil, 2-tiouracil, 4-tiouracil, 5-metiluracil, metilestar uracil-5-oksisirćetne kiseline, uracil-5- oksisirćetnu kiselinu (v), 5-metil-2-tiouracil, 3-(3-amino-3-N-2-karboksipropil)uracil, (acp3)w i 2,6-diaminopurin. Alternativno, antisens nukleinska kiselina može biti biološki poizvedena upotrebom ekspresionog vektora u koji je nukleinska kiselina subklonirana u antisens orijentaciji.

[0288] Antisens molekuli nukleinske kiseline se obično primenjuju subjektu ili generišu in situ tako da hibridizuju sa ili se vezuju na ćelijsku iRNK i/ili genomsku DNK koja kodira protein (npr. VEGFR-2) da bi se time inhibirala ekspresija proteina (npr. inhibicijom transkripcije i/ili translacije). Hibridizacija može biti uobičajenom nukleotidnom komplementarnošću da bi se dobio stabilan dupleks ili, na primer, u slučaju antisens molekula nukleinske kiseline koji se vezuje za duplekse DNK, kroz specifične interakcije u glavnom žljebu dvostruke spirale.

[0289] U još jednom drugom primeru, RNK proteina može biti upotrebljena za indukciju interferirajuće RNK (RNKi), upotrebom dvolančane (dsRNK) (Fire i saradnici, Nature 391: 806-811. 1998) ili kratke interferirajuće RNK (siRNK) sekvence (Yu i saradnici, Proc Natl Acad Sci U S A.99:6047-52, 2002). "RNKi" je proces kojim dsRNK indukuje razgradnju komplementarne iRNK zavisnu od homologije. U jednom primeru, molekul nukleinske kiseline opisa hibridizuje sa „sens“ ribonukleinskom kiselinom opisa putem komplementarnog uparivanja baza, da bi se obrazovala dvolančana RNK. Obezbeđeni su dsRNK antisens i sens molekuli nukleinskih kiselina koji odgovaraju najmanje oko 20, 25, 50, 100, 250 ili 500 nukleotida ili celokupnom kodirajućem lancu proteina (npr. VEGFR-2) ili samo njegovom delu. U alternativnom primeru izvođenja, siRNK su dužine od 30 nukleotida ili manje, a poželјnije 21-23-nukleotida, i sa karakterističnim su krajevima u vidu ispusta od po 2 do 3 nukleotida, koji nastaju cepanjem sa ribonukleazom III iz dužih dsRNK. Pogledati npr. Tuschl T. (Nat Biotechnol.20: 446-48).2002). Priprema i upotreba RNKi jedinjenja je opisana u U.S. patentnoj publikaciji br.2004/0023390.

[0290] Unutarćelijska transkripcija malih RNK molekula se može postići kloniranjem siRNK matrica u transkripcione jedinice RNK polimeraze III (Pol III), koje normalno kodiraju malu nuklearnu RNK (snRNK) U6 ili humanu RNazu P RNK H1. Za ekspresiju siRNK mogu biti upotrebljena dva pristupa: u jednom primeru izvođenja, sens i antisens lanci koji čine siRNK dupleks se prepisuju pojedinačnim promotorima (Lee i saradnici Nat. Biotechnol. 20, 500-505. 2002); u alternativnom primeru izvođenja, siRNK se eksprimiraju kao RNK strukture ukosnice od koje nakon unutarćelijske obrade dalje nastaju siRNK (Brummelkamp i saradnici, Science 296:550-553.2002).

[0291] Najčešće se dsRNK/siRNK primenjuju anilingom sens i antisens RNK lanaca in vitro, a pre isporuke organizmu. U alternativnom primeru, primena RNKi se može izvesti primenom sens i antisens nukleinskih kiselina opisa u istom rastvoru i bez anilinga pre primene, a može se čak uraditi i primena nukleinskih kiselina u razdvojenim nosačima unutar veoma kratkog vremenskomg okvira. Razmatraju se i molekuli nukleinskih kiselina koji kodiraju fragmente, homologe, derivate i analoge proteina (poput npr. VEGFR-2) ili antisens nukleinske kiseline koje su komplementarne sekvenci nukleinske kiseline za mVEGFR-2.

[0292] Aptameri su drugi postupak zasnovan na nukleinskim kiselinama za ometanje interakcije receptora i njegovog odgovarajućeg liganda, kao što je npr. to slučaj za interakciju VEGFR-2 sa VEGF-A i PDGFR sa PGDF-om. Aptameri su molekuli DNK ili RNK koji su izabrani iz nasumičnih smeša na osnovu njihove sposobnosti da vezuju druge molecule. Odabrani su aptameri koji vezuju nukleinsku kiselinu, proteine, mala organska jedinjenja, pa čak i cele organizme. Postupci i kompozicije za identifikaciju i pravlјenje aptamera su poznati stručnjacima i opisani su, na primer, u U.S. patentu br. 5,840,867 i U.S. patentu br.5,582,981.

[0293] Skorašni napretci u polju kombinatornih nauka su identifikovali kratke polimerne sekvence visokog afiniteta i specifičnosti za dati ciljni molekul. Na primer, SELEX tehnologija je upotrebljena za identifikovanje DNK i RNK aptamera sa svojstvima vezivanja, a koja su u rivalitetu sa sisarskim antitelima; u polјu imunologije su generisana i izolovana antitela ili fragmenti antitela koja se vezuju za bezbroj jedinjenja, dok je prikazivanje na fagima bilo iskorišćeno za otkrivanje novih peptidnih sekvenci sa veoma povolјnim svojstvima vezivanja. Na osnovu uspeha ovih tehnika molekularne evolucije, sigurno je da se mogu stvoriti molekuli koji se vezuju za bilo koji cilјni molekul. Struktura petlјe je često uklјučena u obezbeđivanje želјenih atributa vezivanja kao u slučaju: aptamera, koji često koriste petlјe tipa ukosnice stvorene iz kratkih regiona bez komplementarnog uparivanja baza; prirodno izvedenih antitela koja koriste kombinatorno uređenje hipervarijabilnih regiona petlji i novih biblioteka prikazivanja na fagima koje koriste ciklične peptide koji su pokazali pobolјšane rezultate u poređenju s rezultatima prikaza linearnih peptida na fagima. Stoga, prikupljeno je dovolјno dokaza koji ukazuju da ligandi visokog afiniteta mogu biti kreirani i identifikovani tehnikama kombinatorne molekularne evolucije. U kontektu predmetnog opisa, tehnike molekularne evolucije mogu biti upotrebljene za izolovanje molekula koji vezuju ligande koji su specifični za ligande koji su ovde opisani. Za više o aptamerima, pogledati generalno, Gold L., Singer B., He Y.Y., Brodi E., "Aptamers As Therapeutic And Diagnostic Agents," J. Biotechnol. 74:5-13 (2000). U U.S. Pat. No. 6,699,843 se mogu naći relevantne tehnike za generisanje aptamera.

[0294] U pojedinim primerima izvođenja, aptamer može biti generisan pripremom biblioteke nukleinskih kiselina; kontaktom biblioteke nukleinskih kiselina sa faktorom rasta, pri čemu se selektuju nukleinske kiseline sa većim afinitetom vezivanja za faktor rasta (u odnosu na druge nukleinske kiseline iz biblioteke) koje se dalje amplifikuju da bi se dobila smeša nukleinskih kiselina obogaćena za nukleinske kiseline sa relativno većim afinitetom i specifičnošću u vezivanju za faktor rasta. Procesi mogu biti ponovljeni, a odabrane nukleinske kiseline mutirati i ponovo pregledati, pri čemu se identifikuje aptamer za faktor rasta.

[0295] U još jednoj varijanti izvođenja, inhibitorni proizvod za VEGF-A sadrži solubilni ECD fragment iz VEGFR-1 koji vezuje VEGF i inhibira vezivanje VEGF za VEGFR-2. cDNK i aminokiselinske sekvence VEGFR-1 su navedene u SEQ ID NO: 10 i 11. Primeri ECD fragmenata VEGFR-1 su opisani u U.S. patentnoj publikaciji br.2006/0030000 i Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO 2005/087808.

1

Anti-inflamatorna sredstva

[0296] U drugom primeru, ovde opisani postupci po izboru obuhvataju primenu jednog ili više antiinflamatornih sredstava subjektu. U pojedinim primerima, anti-inflamatorno sredstvo i molekul koji vezuje ligand se primenjuju istovremeno, u jednoj kompoziciji. U drugim slučajevima, anti-inflamatorno sredstvo se primenjuje kao zasebna kompozicija u odnosu na molekul koji vezuje ligand. Posebno se razmatraju kombinacije koje uključuju molekul koji vezuje ligand, inhibitorni proizvod za VEGF-A i antiinflamatorno sredstvo. Kako se ovde koristi, pojam "anti-inflamatorno sredstvo", u principu se odnosi na bilo koje sredstvo koje smanjuje inflamaciju ili oticanje kod subjekta. Ovde su navedeni mnogi primeri anti-inflamatornih sredstava, ali je potrebno napomenuti da mogu biti pogodni i dodatni antiinflamatorni agensi koji nisu ovde specifično navedeni, ali koji su obuhvaćeni predmetnim opisom.

[0297] U jednoj varijanti izvođenja, anti-inflamatorno sredstvo je nesteroidni anti-inflamatorni lek (NSAID). Primeri NSAID obuhvataju, ali nisu ograničeni na: aspirin, Sulfasalazin™, Asacol™, Dipendtum™, Pentasa™, Anaprox™, Anaprox DS™ (natrijum naproksen); Ansaid™ (flurbiprofen); Arthrotec™ (diklofenak natrijum mizoprostil); Cataflam™/Voltaren™ (diklofenak kalijum); Clinoril™ (sulindak); Daypro™ (oksaprozin); Disalcid™ (salsalat); Dolobid™ (diflunizal); EC Naprosyn™ (naproksen natrijum); Feldene™ (piroksikam); Indocin™, Indocin SR™ (indometacin); Lodine™, Lodine XL™ (etodolak); Motrin™ (ibuprofen); Naprelan™ (naproksen); Naprosyn™ (naproksen); Orudis™, (ketoprofen); Oruvail™ (ketoprofen); Relafen™ (nabumeton); Tolectin™, (tolmetin natrijum); Trilisate™ (holin magnezijum trisalicilat); Cox-1 inhibitore; Cox-2 inhibitore kao što su Vioxx™ (rofekoksib); Arcoxia<tm>(etorikoksib), Celebrex™ (celekoksib); Mobic™ (meloksikam); Bextra™ (valdekoksib), Dynastat™ parakoksib natrijum; Prexige™ (lumirakoksib) i nambumeton. Dodatni pogodni NSAID uklјučuju, ali nisu ograničeni na, sledeće: 5-aminosalicilnu kiselinu (5-ASA, mezalamin, lesalazin), ε-acetamidokapronsku kiselinu, S-adenotilmetitionin, 3-amino-4-hidroksibuternu kiselinu, amiksetrin, anitrazafen, antrafenin, bendazak, bendazac lizinat, benzidamin, beprozin, broperamol, bukolom, bufezolak, ciprokvazon, kloksimat, dazidamin, deboksamet, detomidin, difenpiramid, difenpiramid, difizalamin, ditazol, emorfazon, fanetizol mesilat, fenflumizol, floktafenin, flumizol, fluniksin, fluprokvazon, fopirtolin, fosfozal, guajmezal, guajazolen, izoniksirn, lefetamin HCI, leflunomid, lofemizol, lotifazol, lizin kloniksinat, mezeklazon, nabumeton, niktindol, nimezulid, orgotein, orpanoksin, oksaceprolm, oksapadol, paranilin, perizoksal, perizoksal citrat, pifoksim, piproksen, pirazolak, pirfenidon, prokvazon, proksazol, tielavin B, tiflamizol, timegadin, tolektin, tolpadol, triptamid i oni šiframa kompanija kao što su 480156S, AA861, AD1590, AFP802, AFP860, AI77B, AP504, AU8001, BPPC, BW540C, CHINOIN 127, CN100, EB382, EL508, F1044, FK-506, GV3658, ITF182, KCNTEI6090, KME4, LA2851, MR714, MR897, MY309, ONO3144, PR823, PV102, PV108, R830, RS2131, SCR152, SH440, SIR133, SPAS510, SQ27239, ST281, SY6001, TA60, TAI-901 (4-benzoil-1-indankarboksilna kiselina), TVX2706, U60257, UR2301 i WY4177.

2

[0298] U drugoj varijanti izvođenja, anti-inflamatorno sredstvo sadrži jedinjenje koje inhibira interakciju inflamatornih citokina sa njihovim receptorima. Primeri inhibitora citokina koji su korisni u kombinaciji sa specifičnim vezivajućim sredstvima predmetnog pronalaska uklјučuju, na primer, antagoniste (kao što su antitela) TGF-α (npr. Remikad), kao i antagoniste (kao što su antitela) usmerene na interleukine koji su uklјučeni u inflamaciju. Takvi interleukini su ovde opisani i poželјno uklјučuju, ali nisu ograničeni na, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-12, IL-13, IL-17 i IL-18. Pogledati Feghali i saradnici, Frontiers in Biosci., 2:12-26 (1997).

[0299] U drugoj varijanti izvođenja, anti-inflamatorno sredstvo je kortikosteroid. Primeri kortikosteroida uklјučuju, ali nisu ograničeni na, difloroazone diacetat, klobetazol propionat, halobetazol propionat, betametazon, betametazon dipropionat, budezonid, kortizon, deksametazon, fluocinonid, halcinonid dezoksimetazon, triamcinolon, flutikazon propionat, fluocinolon acetonid, flurandrenolid, mometazon furoat, betamethozon, flutikazon propionat, fluocinolon acetonid, aklometazom dipropionat, metilprednizolon, prednizolon, prednizon, triamicinolon, dezonid i hidrokortizon.

[0300] U drugoj varijanti izvođenja, anti-inflamatorno sredstvo je ciklosporin.

Antibiotici

[0301] U drugom primeru, ovde opisani postupci mogu po izboru dalje obuhvatati primenu antibiotika subjektu. U pojedinim primerima, antibiotik i molekul koji vezuje ligand se primenjuju istovremeno, u jednoj kompoziciji. U drugim slučajevima, antibiotik se primenjuje kao zasebna kompozicija od molekula koji vezuje ligand. Primeri antibiotika obuhvataju, ali nisu ograničeni na, tetraciklin, aminoglikozide, peniciline, cefalosporine, sulfonamidne lekove, hloramfenikol natrijum sukcinat, eritromicin, vankomicin, linkomicin, klindamicin, nistatin, amfotericin B, amantidin, idoksuridin, p-amino salicilnu kiselinu, izoniazid, rifampin, antinomicin D, mitramicin, daunomicin, adriamicin, bleomicin, vinblastin, vinkristin, prokarbazin i imidazol karboksamid.

Inhibitori tirozin kinaze

[0302] U drugom primeru, ovde opisani postupci mogu po izboru dodatno obuhvatati primenu inhibitora tirozin kinaze koji inhibiraju aktivnost VEGFR-2 i/ili VEGFR-3.

[0303] Primeri inhibitora tirozin kinaze za upotrebu u ovde opisanim postupcima uklјučuju, ali nisu ograničeni na, AEE788 (TKI, VEGFR-2, EGFR: Novartis); ZD6474 (TKI, VEGFR-1, -2,-3, EGFR: Zactima: AstraZeneca); AZD2171 (TKI, VEGFR-1, -2: AstraZeneca); SU 11248 (TKI, VEGFR-1, -2, PDGFR: Sunitinib: Pfizer); AG13925 (TKI, VEGFR-1, -2: Pfizer); AG013736 (TKI, VEGFR-1, -2: Pfizer); CEP-7055 (TKI, VEGFR-1, - 2,-3: Cephalon); CP-547,632 (TKI, VEGFR-1, -2: Pfizer); GW7S6024 (TKL VEGFR-1, -2, - 3: GlaxoSmithKline); GW786034 (TKI, VEGFR-1, -2, -3: GlaxoSmithKline); sorafenib (TKI, Bay 43-9006, VEGFR-1, -2, PDGFR: Bayer/Onyx); SU4312 (TKI, VEGFR-2, PDGFR: Pfizer); AMG706 (TKI, VEGFR-1, -2, -3: Amgen); XL647 (TKI, EGFR, HER2, VEGFR, ErbB4: Exelixis); XL999 (TKI, FGFR, VEGFR, PDGFR, FII-3: Exelixis); PKC412 (TKI, KIT, PDGFR, PKC, FLT3, VEGFR-2: Novartis); AEE788 (TKI, EGFR, VEGFR2, VEGFR-1: Novartis): OSI-030 (TKI, c-kil, VEGFR: OSI Pharmaceuticals); OS1-817 (TKI c-komplet, VEGFR: OSI Pharmaceuticals); DMPQ (TKI, ERGF, PDGFR, ErbB2. p56. pkA, pkC); MLN518 (TKI, Flt3, PDGFR, c-KIT (T53518: Millennium Pharmaceuticals); lestaurinib (TKI, FLT3, CEP-701, Cephalon); ZD 1839 (TKI, EGFR: gefitinib, Iressa: AstraZcneca); OSI-774 (TKI, EGFR: Erlotininb: Tarceva: OSI Pharmaceuticals); lapatinib (TKI, ErbB-2, EGFR i GD2016: Tykerb: GlaxoSmithKline)

[0304] U pojedinim primerima, ovde opisani postupci dodatno obuhvataju primenu tirozin kinaznog inhibitora koji inhibira angiogenezu kod subjekta. Primeri anti-angiogenih inhibitora tirozin kinaze i njihovi cilјni molekuli su navedeni u Tabeli 2 ispod.

r

[0305] Molekuli koji vezuju ligand mogu biti primenjeni u kombinaciji sa više od jednog dodatnog aktivnog jedinjenja ili terapije. U jednom primeru izvođenja, molekul koji vezuje ligand predmetnog pronalaska se primenjuje u kombinaciji sa inhibitornim poizvodom za PDGF i sa inhibitornim poizvodom za VEGF-A. Na primer, molekul koji vezuje ligand (kao što je onaj koji sadrži aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 3) može biti primenjen u kombinaciji sa (i) Afliberceptom (Eylea®) i (ii) PDGFR antitelom (poput onog koji je razvijen u kompaniji Regeneron Inc. za okularne indikacije) ili PDGF apatamerom (poput E10030 (Fovista™) koji je razvijen u kompaniji Ophthotech Inc. za okularne indikacije).

Primena kombinovane terapije

[0306] Kombinovana terapija sa jednim ili sa više od ovde opisanih dodatnih aktivnih agenasa se može postići primenom subjektu jedne kompozicije ili farmakološke formulacije koja sadrži molekul koji vezuje ligand i jedno ili više dodatnih aktivnih agensa, ili primenom subjektu dve (ili više) jasno različitih kompozicija ili formulacija u isto vreme, pri čemu jedna kompozicija sadrži molekul koji vezuje ligand, a druga sadrži dodatno aktivno sredstvo.

[0307] Alternativno, kombinovana terapija koja koristi ovde opisan molekul koji vezuje ligand može prethoditi ili slediti za lečenjem sa drugim agensom u intervalima raspona od minuta do nedelјe. U

4

slučajevima kada se drugi agens i molekul koji vezuje ligand primenjuju odvojeno, potrebno je u principu osigurati da između vremena svake isporuke ne protekne značajan period vremena, a da bi agens i molekul koji vezuju ligand i dalјe mogu da ispolje povoljan kombinovani efekat. U takvim slučajevima, predviđeno je da se oba modaliteta primene u roku od oko 12-24 sata jedan u odnosu na drugog i, poželјnije, u roku od oko 6-12 sati jedan u odnosu na drugog, pri čemu je najpoželјnije vreme odlaganja od oko 12 sati. U pojedinim situacijama, međutim, može biti poželјno da se vremenski period značajno produži, tako da vreme između njihovih primena iznosi od nekoliko dana (2, 3, 4, 5, 6 ili 7) do nekoliko nedelјa (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8). Posebno se razmatraju ponovljeni tretmani jednog ili oba sredstva.

Formulacije i farmaceutski prihvatlјivi nosači

[0308] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže molekul koji vezuje ligand pronalaska. Takve kompozicije sadrže terapijski efektivnu količinu jednog ili više molekula koji vezuju ligand i farmaceutski prihvatlјiv nosač. U jednom primeru izvođenja, takve kompozicije sadrže jedan ili više molekula koji vezuju ligand i po izboru, jedno ili više dodatnih aktivnih sredstava (u slučaju kombinovane terapije). U jednom primeru izvođenja, takve kompozicije sadrže jedan ili više molekula koji vezuju ligand i po izboru jedno ili više od dodatnih aktivnih sredstava izabranih između inhibitornih proizvoda za PDGF i inhibitornih proizvoda za VEGF-A. U drugom primeru, primenjuju se kompozicija koja sadrži jedan ili više molekula koji vezuju ligand pronalaska i druga kompozicija koja sadrži inhibitorni proizvod za PDGF ili inhibitorni proizvod za VEGF-A.

[0309] Izraz "farmaceutski prihvatlјiv" označava da je agens odobren od strane regulatorne agencije savezne vlade ili vlade države ili naveden u američkoj Farmakopeji ili drugoj opšte priznatoj farmakopeji za upotrebu kod životinja, a naročito kod lјudi. Termin "nosač" se odnosi na razblaživač, adjuvans, ekscipijens ili nosač sa kojim se terapeutik primenjuje. Takvi farmaceutski nosači mogu biti sterilne tečnosti, kao što su voda i ulјa, uklјučujući petrolejska, ulja životinjskog, bilјnog ili sintetskog porekla, poput ulja kikirikija, sojinog ulјa, mineralnog ulјa, ulјa susama i sličnih. Pogodni farmaceutski pomoćni sastojci uklјučuju skrob, glukozu, laktozu, saharozu, želatin, slad, pirinač, brašno, kredu, silika gel, natrijum stearat, glicerol monostearat, talk, natrijum hlorid, obrano mleko u prahu, glicerol, propilen, glikol, vodu, etanol i slično. Kompozicija, ukoliko je to poželjno, takođe može sadržavati manje količine ovlaživača ili emulgatora ili pH puferskih sredstava.

[0310] Kompozicije mogu biti u obliku rastvora, suspenzija, emulzija, tableta, pilula, kapsula, praškova, granulata, gelova, uklјučujući hidrogelove, paste, masti, krema, uređaja za isporuku, formulacija sa produženim oslobađanjem, čepića, injekcija, implanta, sprejeva, kapi, aerosola i sličnih. Kompozicije koje sadrže molekul koji vezuje ligand, jedno ili više dodatnih aktivnih sredstava ili oboje, mogu biti formulisane u skladu sa konvencionalnom farmaceutskom praksom (pogledati npr. Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (20. izdanje) ur. A. R. Gennaro, 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa. i Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, ur. J. Swarbrick i J. C. Boylan, 1988-2002, Marcel Dekker, New York). Primeri pogodnih farmaceutskih nosača su opisani u „Remington's Pharmaceutical Sciences" od strane E.W. Martin-a.

[0311] Primena kompozicija može biti bilo kojim pogodnim načinom, što rezultuje u količini molekula koji vezuje ligand i/ili dodatnog aktivnog agensa koja je efektivna u lečenju ili prevenciji određenog oboljenja ili poremećaja. Na primer, svaki molekul koji vezuje ligand može biti pomešan sa pogodnom supstancom nosača i obično je prisutan u količini od 1-95 tež% ukupne težine kompozicije. Kompozicija može biti obezbeđena u doznom obliku koji je pogodan za oftalmičku, oralnu, parenteralnu (npr. intravensku, intramuskularnu, subkutanu), rektalnu, transdermalnu, nazalnu ili primenu inhalacijom. U jednom primeru izvođenja, kompozicija je u obliku koji je pogodan za injekciranje direktno u oko [0312] Molekuli koji vezuju ligand pronalaska i, kada su prisutni u kombinovanoj terapiji, jedno ili više dodatnih aktivnih sredstava, mogu biti formulisani kao neutralni ili u obliku soli. Farmaceutski prihvatlјive soli uklјučuju one koje su obrazovane sa slobodnim amino grupama, kao što su one dobijene sa hlorovodoničnom, fosfornom, sirćetnom, oksalnom, vinskom kiselinom itd., kao i one obrazovane sa slobodnim karboksilnim grupama, kao što su one koje su izvedene iz natrijum, kalijum, amonijum, kalcijum, feri hidroksida, izopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanola, histidina, prokaina itd.

[0313] Molekuli koji vezuju ligand i dodatni aktivni agensi predmetnog pronalaska mogu sadržavati dovoljno baznu funkcionalnu grupu koja može reagovati sa bilo kojom od brojnih neorganskih i organskih kiselina, da bi se obrazovala farmaceutski prihvatlјivu so. Farmaceutski prihvatlјiva kisela adiciona so se obrazuje iz farmaceutski prihvatlјive kiseline, kao što je dobro poznato u oblasti tehnike. Takve soli uklјučuju farmaceutski prihvatlјive soli navedene u Journal of Pharmaceutical Science, 66, 2-19 (1977) i The Handbook of Pharmaceutical Salts; Properties, Selection, and Use. P. H. Stahl i C. G. Wermuth (ur), Verlag, Cirih (Švajcarska) 2002.

[0314] Farmaceutski prihvatlјive soli uklјučuju sulfat, citrat, acetat, oksalat, hlorid, bromid, jodid, nitrat, bisulfat, fosfat, kiseli fosfat, izonikotinat, laktat, salicilat, kiseli citrat, tartarat, oleat, tanat, pantotenat, bitartrat, askorbat, sukcinat, maleat, gentizinat, fumarat, glukonat, glukaronat, saharat, format, benzoat, glutamat, metansulfonat, etansulfonat, benzennesulfonat, p-toluensulfonat, kamforsulfonat, pamoat, feni! acetat, trifluoroacetat, aerilat, hloro benzoate, dinitrobenzoat, hidroksibenzoat, metoksibenzoat, metilbenzoat, o-acetoksibenzoat, naftalen-2-benzoat, izobutirat, fenilbutirat, alfa-hidroksibutirat, butin-1,4-dikarboksilat, heksin-1,4-dikarboksilat, kaprat, kaprilat, cinamat, glikolat, heptanoat, hipurat, malat, hidroksimaleat, malonat, mandelat, mezilat, nikotinat, ftalat, teraftalat, propiolat, propionat, fenilpropionat, sebakat, suberat, p-bromobenzensulfonat, hlorobenzensulfonat, etilsulfonat, 2-hidroksietilsulfonat, metilsulfonat, naftalen-1-sulfonat, naftalen-2-sulfonat, naftalen-1,5-sulfonat, ksilensulfonat i tartaratne soli.

[0315] Izraz "farmaceutski prihvatlјiva so" se takođe odnosi na so molekula koji vezuje ligand i dodatnog aktivnog sredstva koja sadrži kiselu funkcionalnu grupu, kao što je funkcionalna grupa karboksilne kiseline i baze. Pogodne baze uklјučuju, ali nisu ograničene na, hidrokside alkalnih metala, kao što su natrijuma, kalijuma i litijuma; hidrokside zemnoalkalnih metala, kao što su kalcijuma i magnezijuma; hidrokside drugih metala, kao što su aluminijuma i cinka; amonijak i organske amine, kao što su nesupstituisani ili hidroksi-supstituisani mono-, di- ili tri-alkilamini, dicikloheksilamin; tributil amin; piridin; N-metil, N-etilamin; dietilamin; trietilamin; mono-, bis- ili tris-(2-OH-niži alkilamin), kao što su mono-, bis- ili tris-(2-hidroksietil)amin, 2-hidroksi-terc-butilamin ili tris(hidroksimetil) metilamin, N,N-diniži alkil-N(hidroksi-niži alkil)-amini, kao što je N,N-dimetil-N-(2-hidroksietil)amin ili tri-(2-hidroksietil)amin; N-metil-D-glukamin; i aminokiseline kao što su arginin, lizin i slične. Izraz "farmaceutski prihvatlјiva so" takođe obuhvata hidrat jedinjenja pronalaska.

[0316] Kompozicije se, prema jednom korisnom aspektu, primenjuju parenteralno (npr. intramuskularnim, intraperitonealnim, intravenskim, intraokularnim, intravitrealnim, retro-bulbarnim, subkonjuktivnim, subtenonskim ili subkutanim injeciranjem ili implantom) ili sistemski. Formulacije za parenteralnu ili sistemsku primenu obuhvataju sterilne vodene ili nevodne rastvore, suspenzije ili emulzije. Može biti upotrebljeno mnoštvo vodenih nosača, npr. voda, puferisana voda, fiziološki rastvor i slično. Primeri drugih pogodnih nosača uklјučuju polipropilen glikol, polietilen glikol, bilјna ulјa, želatin, hidrogelove, hidrogenizovane naftalene i organske estre koji se mogu injecirati, kao što je etil oleat. Takve formulacije mogu takođe sadržavati pomoćne supstance, kao što su konzervansi, ovlaživači, sredstva za puferisanje, emulgovanje i/ili dispergovanje. Biokompatibilni, biorazgradivi laktidni polimer, kopolimer laktida/glikolida ili polioksietilen-polioksipropilenski kopolimeri mogu biti upotrebljeni za kontrolu oslobađanja aktivnih sastojaka.

[0317] Alternativno, kompozicije mogu biti primenjene oralno, gutanjem. Kompozicije namenjene za oralnu upotrebu mogu biti pripremljene u čvrstim ili tečnim oblicima, prema bilo kom postupku poznatom u oblasti proizvodnje farmaceutskih kompozicija.

[0318] Čvrsti dozni oblici za oralnu primenu obuhvataju kapsule, tablete, pilule, praškove i granule. Generalno, ovi farmaceutski preparati sadrže aktivne sastojke pomešane sa netoksičnim farmaceutski prihvatlјivim pomoćnim materijalima. Oni uklјučuju, na primer, inertne razblaživače, kao što su kalcijum karbonat, natrijum karbonat, laktoza, saharoza, glukoza, manitol, celuloza, skrob, kalcijum fosfat, natrijum fosfat, kaolin i slično. Vezujuća, puferska i/ili sredstva za podmazivanje (npr. magnezijum stearat) takođe mogu biti upotrebljena. Tablete i pilule mogu biti dodatno pripremljene sa enteričkim oblogama. Kompozicije mogu po izboru sadržavati zaslađivače, arome, boje, agense za ukus, miris i konzervanse kako bi se obezbedio ukusan preparat.

[0319] Čvrsti dozni oblici mogu biti korisni za lečenje očnih poremećaja. Kompozicije korisne za okularnu upotrebu uklјučuju tablete koje sadrže jedan ili više molekula koji vezuju ligand u mešavini sa farmaceutski prihvatlјivim ekscipijensom. Ovi eksipijensi mogu biti, na primer, inertni razblaživači ili ispunjivači (npr. saharoza i sorbitol), sredstva za podmazivanje, glidansi i antiadhezivi (npr. magnezijum stearat, cink stearat, stearinska kiselina, silike, hidrogenizovana bilјna ulјa ili talk).

[0320] Kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti primenjivane intraokularno, intravitrealnom injekcijom u oko, kao i subkonjuktivnim i subtenonskim injekcijama. Ostali putevi primene uklјučuju transkleralnu, retrobulbarnu, intraperitonealnu, intramuskularnu i intravensku primenu. Alternativno, kompozicije mogu biti primenjene upotrebom uređaja za isporuku lekova ili intraokularnog implanta.

[0321] Tečni dozni oblici za oralnu primenu mogu obuhvatati farmaceutski prihvatlјive emulzije, rastvore, suspenzije, sirupe i meke želatinske kapsule. Ovi oblici mogu sadržavati inertne razblaživače koji se obično koriste u oblasti tehnike, kao što su voda ili ulјani medijum, a mogu sadržavati i adjuvanse, kao što su sredstva za vlaženje, emulgatori i sredstva za resuspendovanje.

[0322] U pojedinim primerima, kompozicije se takođe mogu primenjivati topikalno, na primer, flasterom ili direktnom primenom na region, kao što je epiderm ili oko, koji je podložan ili pogođen neovaskularnim poremećajem, kao i jontoforezom.

[0323] U slučaju kombinovanih terapija predmetnog pronalaska, molekuli koji vezuju ligand i jedno ili više dodatnih aktivnih sredstava mogu biti pomešani u tabletu ili drugi nosač, ili mogu biti podelјeni. U jednom primeru, molekul koji vezuje ligand se nalazi u unutrašnjosti tablete, a dodatno aktivno sredstvo je sa spolјašnje strane, tako da se značajan deo dodatnog aktivnog sredstva otpušta pre oslobađanja molekula koji vezuje ligand sadržanog u unutrašnjosti.

[0324] U jednom primeru izvođenja, kompozicije koje sadrže molekul koji vezuje ligand (i po izboru jednon ili više dodatnih aktivnih srestava) može sadržavati jedan ili više farmaceutski prihvatlјivih eksipijenasa. U jednom primeru izvođenja, takvi ekscipijensi uklјučuju, ali nisu ograničeni na, puferske agense, nejonske površinski aktivne materije, konzervanse, agense za toničnost, aminokiseline, šećere i agense za podešavanje pH. Pogodna puferska sredstva uklјučuju, ali nisu ograničena na, monobazni natrijum fosfat, dvobazni natrijum fosfat i natrijum acetat. Pogodni nejonski površinski aktivni sastojci uklјučuju, ali nisu ograničeni na, polioksietilen sorbitan estre masnih kiselina kao što su polisorbat 20 i polisorbat 80. Pogodni konzervansi uklјučuju, ali nisu ograničeni na, benzil alkohol. Pogodni agensi za toničnost uklјučuju, ali nisu ograničeni na natrijum hlorid, manitol i sorbitol. Pogodni šećeri uklјučuju, ali nisu ograničeni na, dehidrat α,α-trehaloze. Pogodne aminokiseline uklјučuju, ali nisu ograničene na glicin i histidin. Pogodni agensi za podešavanje pH uklјučuju, ali nisu ograničeni na, hlorovodoničnu kiselinu, sirćetnu kiselinu i natrijum hidroksid. U jednom primeru izvođenja, sredstvo ili sredstava za podešavanje pH su prisutna u količini koja je efektivna za obezbeđivanje pH od oko 3 do oko 8, oko 4 do oko 7, oko 5 do oko 6, oko 6 do oko 7 ili oko 7 do oko 7,5. U jednom primeru izvođenja, kompozicija koja sadrži molekul koji vezuje ligand ne sadrži konzervans. U drugom primeru izvođenja, kompozicija koja sadrži molekul koji vezuje ligand ne sadrži antimikrobno sredstvo. U sledećem primeru izvođenja, kompozicija koja sadrži molekul koji vezuje ligand ne sadrži bakteriostatsko sredstvo.

[0325] U jednom primeru izvođenja, kompozicija koja sadrži molekul koji vezuje ligand (i po izboru jedan ili više dodatnih aktivnih agensa) je u obliku vodenog rastvora koji je pogodan za injeciranje. U jednom primeru izvođenja, kompozicija sadrži molekul koji vezuje ligand, pufersko sredstvo, sredstvo za podešavanje pH i vodu za injekcije. U sledećem primeru izvođenja, kompozicija sadrži molekul koji vezuje ligand, monobazni natrijum fosfat, dvobazni natrijum fosfat, natrijum hlorid, hlorovodoničnu kiselinu i natrijum hidroksid. U drugom primeru izvođenja, kompozicija sadrži molekul koji vezuje ligand, fosfat (npr. monobazni natrijum fosfat), trehalozu, natrijum hlorid i polisorbat.

[0326] Vodene kompozicije korisne za primenu postupaka opisa u okularnom okruženju su sa pH i osmomolarnošću koji su oftalmički kompatibilni. Jedno ili više oftalmički prihvatlјivih sredstava za podešavanje pH i/ili puferskih sredstava može biti uklјučeno u kompoziciju ovog pronalaska, uklјučujući kiseline kao što su sirćetna, borna, limunska, mlečna, fosforna i hlorovodonična kiselina; baze kao što su natrijum hidroksid, natrijum fosfat, natrijum borat, natrijum citrat, natrijum acetat i natrijum laktat; i pufere kao što su citrat/dekstroza, natrijum bikarbonat i amonijum hlorid. Takve kiseline, baze i puferi su uklјučeni u količini koja je potrebna za održavanje pH kompozicije u oftalmološki prihvatlјivom opsegu. Jedna ili više oftalmički prihvatlјivih soli mogu biti uklјučene u kompoziciju u količini dovolјnoj da se osmolalnost kompozicije dovede u oftalmološki prihvatlјiv opseg. Takve soli uklјučuju one koje sadrže katjone natrijuma, kalijuma ili amonijuma, kao i hloridne, citratne, askorbatne, boratne, fosfatne, bikarbonatne, sulfatne, tiosulfatne ili bisulfitne anjone.

[0327] U pojedinim primerima izvođenja, kompozicija koja sadrži molekul koji vezuje ligand predmetnog pronalaska je formulisana za isporuku u oko subjekta. Pogodni oftalmički nosači su poznati stručnjacima i svi takvi konvencionalni nosači mogu biti upotrebljeni u ovom pronalasku. Primeri jedinjenja koja se ugrađuju da bi se olakšala i ubrzala transdermalna primena topikalnih kompozicija u očna ili adneksna tkiva uklјučuju, ali nisu ograničena na, alkohol (etanol, propanol i nononol), masni alkohol (lauril alkohol), masnu kiselinu (valeričnu kiselinu, kaproinsku kiselinu i kaprinsku kiselinu), estar masne kiseline (izopropil miristat i izopropil n-heksanoat), alkil estar (etil acetat i butil acetat), poliol (propilen glikol, propandion i heksanetriol), sulfoksid (dimetilsulfoksid i decilmetilsulfoksid), amid (ureu, dimetilacetat i derivate pirolidona), površinski aktivno sredstvo (natrijum lauril sulfat, cetiltrimetilanmonijum-bromid, polaksamere, span-ove, tween-ove, žučne soli i lecitin), terpen (d-limonen, alfaterpeneol, 1,8-cineol i menton) i alkanone (N-heptan i N-nonan). Štaviše, kompozicije koje se primenjuju topikalno sadrže agense za modulaciju površinske adhezije molekula, uklјučujući, ali ne ograničavajući se na, antagonistu kadherina, antagonistu selektina i antagonistu integrina. Prema tome, određeni nosač može biti oblika sterilne, oftalmičke masti, kreme, gela, rastvora ili disperzije. Takođe se kao pogodni oftalmički nosači razmatraju polimeri za sporo otpuštanje, npr. "Ocusert" polimeri, "Hydron" polimeri, itd.

[0328] Primer pojačivača oftalmičke viskoznosti koji se mogu koristiti u predmetnoj formulaciji uklјučuju: natrijum karboksimetil celulozu; metilcelulozu; hidroksipropil celulozu; hidroksipropilmetil celulozu; hidroksietil celulozu; polietilen glikol 300; polietilen glikol 400; polivinil alkohol; i providone.

[0329] Neki prirodni proizvodi, kao što su veegum, alginati, ksantanska guma, želatin, guma akacije i tragakant guma, takođe mogu biti upotrebljeni za povećanje viskoznosti oftalmoloških rastvora.

[0330] Toničnost je važna pošto hipotonične kapi za oči uzrokuju edem rožnjače, a hipertonične kapi za oči uzrokuju deformaciju rožnjače. Idealna toničnost je približno 300 mOsM. Toničnost se može postići postupcima opisanim u Remington: The Science and Practice of Pharmacy, poznatih onima sa iskustvom u oblasti tehnike.

[0331] Mogu biti upotrebljeni i stabilizatori, kao što su, na primer, helatni agensi, npr. EDTA. Antioksidansi se takođe mogu koristiti, npr. natrijum bisulfit, natrijum tiosulfit, 8-hidroksi-hinolin ili askorbinska kiselina. Sterilnost će obično biti održavana uobičajenim oftalmičkim konzervansima, npr. sa hiorbutanolom, benzalkonijum hloridom, cetilpiridijum hloridom, fenilnom soli žive, timerosalom itd., za vodene formulacije, a u količinama koje nisu toksične i koje uglavnom variraju od oko 0,001 do oko 0,1 tež.% vodenog rastvora. Konvencionalni konzervansi za masti uklјučuju metil i propil parabene. Uobičajene baze za masti obuhvataju beli vazelin i mineralno ulјe ili tečni vazelin. Međutim, poželјni su vodeni nosači sa konservansima. Rastvori se mogu isporučivati u oko ručno, u pogodnom doznom obliku, npr. kao kapi za oči, ili mogu biti isporučeni pogodnim aparatom za mikrokapi ili sprej koji obično omogućavaju i primenu odmerene doze leka. Primeri pogodnih oftalmičkih nosača uklјučuju sterilne, pretežno izotonične vodene rastvore koji sadrže minimalne količine, tj. manje od oko 5 tež.% hidroksipropilmetilceluloze, polivinil alkohola, karboksimetilceluloze, hidroksietilceluloze, glicerina i EDTA. Poželjno je i da se rastvori održavaju na suštinski neutralnom pH i izotoničnima sa odgovarajućim količinama konvencionalnih pufera, npr. fosfata, borata, acetata, trisa.

[0332] U pojedinim primerima izvođenja, oftalmološkom nosaču se dodaju pojačivači prodiranja.

[0333] Količina molekula koji vezuje ligand koja će biti efektivna za njegovu predviđenu terapijsku upotrebu može se odrediti standardnim kliničkim tehnikama na osnovu ovog opisa. Dodatno, mogu po izboru biti upotrebljena in vitro ispitivanja da bi se pomoglo u identifikaciji optimalnih opsega doziranja. Količina molekula koji vezuje ligand koja se meša sa nosačima kako bi se proizvela pojedinačna doza može varirati u zavisnosti od sisara koji se leči i određenog načina primene.

[0334] Doza molekula koji vezuje ligand može zavisiti od više faktora, uklјučujući ozbilјnost stanja, da li će se stanje lečiti ili sprečavati, kao i od starosti, težine i zdravlјa osobe koju treba lečiti. Dodatno, na primenjenu dozu mogu uticati i farmakogenomske informacije (efekat genotipa na farmakokinetički, farmakodinamički ili profil efikasnosti terapeutika) za određenog pacijenta. Štaviše, tačne pojedinačne doze se mogu donekle prilagoditi u zavisnosti od raznih faktora, uklјučujući specifične kombinirane terapije koje se primenjuju, vreme primene, put primene, prirodu formulacije, brzinu izlučivanja, određenu bolest koja leči (npr. određeni očni poremećaj koji se leči), težinu poremećaja i anatomsku lokaciju neovaskularnog poremećaja. Mogu se očekivati neke varijacije u dozi.

[0335] Generalno, kada se primenjuje sisaru oralno, doza molekula koji vezuje ligand predmetnog pronalaska je normalno od 0,001 mg/kg/dan do 100 mg/kg/dan, 0,01 mg/kg/dan do 50 mg/kg/dan ili od 0,1 mg/kg/dan do 10 mg/kg/dan. Generalno, kada se oralno primenjuje čoveku, doza antagoniste predmetnog pronalaska je normalno 0,001 mg do 300 mg dnevno, 1 mg do 200 mg dnevno ili 5 mg do 50 mg dnevno. Doze do 200 mg dnevno mogu biti potrebne.

[0336] Za primenu antagoniste predmetnog pronalaska parenteralnom injekcijom, doza je normalno 0,1 mg do 250 mg dnevno, 1 mg do 20 mg dnevno ili od 3 mg do 5 mg dnevno. Injekcije se mogu primenjivati do četiri puta na dan.

[0337] Generalno, kada se primenjuje oralno ili parenteralno, doza molekula koji vezuje ligand za upotrebu u ovom pronalasku je normalno 0,1 mg do 1500 mg dnevno ili 0,5 mg do 10 mg dnevno ili 0,5 mg do 5 mg dnevno. Može biti primenjivana doza do 3000 mg dnevno.

[0338] Kada se oftalmološki primenjuje čoveku, na primer intravitrealno, doza molekula koji vezuje ligand po oku po aplikaciji je normalno u opsegu od 0,003 mg, 0,03 mg, 0,03 mg, 0,1 mg ili 0,5 mg do 5,0 mg, 4 mg, 3 mg, 2 mg ili 1 mg ili 0,5 mg do 1,0 mg. Doze molekula koji vezuje ligand je obično opsega od 0,003 mg do 5,0 mg po oku po aplikaciji ili 0,03 mg do 4,0 mg po oku po aplikaciji ili 0,1 mg do 4,0 mg po oku po aplikaciji ili 0,03 mg do 3,0 mg po oko po aplikaciji ili 0,1 mg do 3,0 mg po oku po aplikaciji ili 0,1 mg do 1,0 mg po oku po aplikaciji ili 0,5 mg do 4,0 mg po oku po aplikaciji ili 0,5 mg do 3,0 mg po oku po aplikaciji, 0,5 mg do 2,0 mg po oku po aplikaciji ili 1,0 mg do 4,0 mg po oku po aplikaciji ili 1,0 mg do 3,0 mg po oku po aplikaciji ili 1,0 mg do 2,0 mg po oku po aplikaciji. U pojedinim primerima izvođenja, molekul koji vezuje ligand primenjuje se u koncentraciji od oko 1 mg ili oko 2 mg ili oko 3 mg ili oko 4 mg ili oko 5 mg ili oko 6 mg po primeni po oku. Molekul koji vezuje ligand, u pojedinim primerima izvođenja, prisutan je u bilo kojoj od prethodno navedenih koncentracija u zapremini 10 µl, 15 µl, 20 µl, 25 µl, 30 µl, 35 µl, 40 µl, 45 µl, 50 µl, 60 µl, 70 µl, 80 µl, 90 µl, 95 µl ili 100 µl. U pojedinim primerima izvođenja, molekul koji vezuje ligand primenjuje se u koncentraciji od oko 2-4 mg/50 µl. Zapremina doze koja se primenjuje po oku može biti opsega od 0,01 ml do 0,2 ml, ili 0,03 ml do 0,15 ml, ili 0,05 ml do 0,10 ml.

[0339] U pojedinim primerima izvođenja, kada se primenjuje intravitrealnom injekcijom, molekul koji vezuje ligand se primenjuje u koncentraciji od oko 2 mg do oko 4 mg po oku (ili oko 1 mg do oko 3 mg ili oko 1 mg do oko 4 mg ili oko 3 mg do oko 4 mg ili oko 1 mg do oko 2 mg po oku). U pojedinim primerima izvođenja, molekul koji vezuje ligand se primenjuje u koncentraciji od oko 1 mg ili oko 2 mg ili oko 3 mg ili oko 4 mg ili oko 5 mg ili oko 6 mg po oku. Molekul koji vezuje ligand, u pojedinim primerima izvođenja, prisutan je u bilo kojoj od prethodno navedenih koncentracija u zapremini 10 µl, 15 µl, 20 µl, 25 µl, 30 µl, 35 µl, 40 µl, 45 µl, 50 µl, 60 µl, 70 µl, 80 µl, 90 µl, 95 µl ili 100 µl. U pojedinim primerima izvođenja, molekul koji vezuje ligand se primenjuje u koncentraciji od oko 2-4 mg/50 µl.

[0340] Generalno, pogodni rasponi doza za intravensku primenu su obično oko 50-5000 mikrograma aktivnog jedinjenja po kilogramu telesne težine. Pogodni rasponi doza za intranazalnu primenu su obično oko 0,01 pg/kg telesne mase do 1 mg/kg telesne težine. Efektivne doze mogu se ekstrapolirati iz kriva odgovora na dozu izvedenih iz in vitro ili ispitivanja na animalnim modelima.

[0341] Za sistemsku primenu, terapijski efektivna doza se u početku može proceniti na osnovu in vitro analize. Na primer, doza može biti formulisana u animalnom modelu tako da se postigne opseg

1

koncentracija u cirkulaciji koji bi obuhvatao IC50 koji je određen u ćelijskoj kulturi. Takve informacije mogu biti upotrebljene za tačnije određivanje doza korisnih za lјude. Početne doze se takođe mogu proceniti na osnovu in vivo podataka, npr. upotrebom životinjskih modela i tehnika koje su dobro poznate u oblasti tehnike. Osoba sa prosečim iskustvom u oblasti tehnike, lako može optimizovati primenu kod ljudi na osnovu podataka dobijenih za životinje.

[0342] Količina doze i interval mogu biti podešeni individualno da bi se obezbedili nivoi jedinjenja u plazmi koji su dovolјni za održavanje terapijskog efekta. U slučajevima lokalne primene i selektivnog preuzimanja, efektivna lokalna koncentracija jedinjenja ne mora biti povezana sa koncentracijom u plazmi. Osoba sa prosečim iskustvom u oblasti tehnike će biti u stanju da optimizuje terapijski efektivne lokalne doze bez nepotrebnog eksperimentisanja.

[0343] Količina primenjenog jedinjenja će, naravno, zavisiti od subjekta koji se leči, od telesne težine subjekta, težine oboljenja, načina primene i procene lekara koji propisuje terapiju. Terapija se može povremeno ponavlјati, sve dok se simptomi mogu detektovati ili čak i kada su nedetektabilni. Terapija može biti obezbeđena kao stamostalna ili u kombinaciji sa drugim lekovima.

[0344] Primena molekula koji vezuje ligand i, kada je prisutan u kombinovanim terapijama, dodatnog sredstva, može, nezavisno, biti od jedan do četiri puta dnevno ili od jedan do četiri puta mesečno ili od jedan do šest puta godišnje ili jednom na svakih dve, tri, četiri ili pet godina. Primena može biti u trajanju od jednog dana ili jednog meseca, dva meseca, tri meseca, šest meseci, jedne godine, dve godine, tri godine, pa čak može biti i tokom celog života pacijenta. U jednom primeru izvođenja, primena se izvodi jednom mesečno tokom tri meseca. Hronična, dugotrajna primena će biti indikovana u mnogim slučajevima. Doza se može primenjivati kao pojedinačna doza ili podelјena u više doza. Generalno, želјenu dozu treba primenjivati u određenim intervalima tokom dužeg perioda, obično tokom najmanje nekoliko nedelјa ili meseci, mada mogu biti potrebni i duži periodi primene od nekoliko meseci ili godina ili više.

[0345] Pored lečenja već postojećih poremećaja, kompozicije se mogu primenjivati i profilaktički da bi se sprečio ili usporio početak nastanka ovih poremećaja. U profilaktičkim primenama, kompozicija se može primenjivati pacijentu koji je podložan ili je na drugi način sa rizikom za određeni poremećaj, kao što je očni poremećaj.

Načini primene

[0346] Kompozicija koja sadrži ovde opisan molekul koji vezuje ligand, može biti primenjena pacijentu na razne načine u zavisnosti, delom, i od tipa agensa koji će se primenjivati i istorije, faktora rizika i simptoma pacijenta. Putevi primene koji su pogodni za postupke predmetnog opisa obuhvataju i sistemsku i lokalnu primenu. Kao što se ovde upotrebljava, termin "sistemska primena" označava način primene čiji je rezultat isporuka farmaceutske kompozicije suštinski u celo telo pacijenta. Primeri načina sistemske primene uklјučuju, bez ograničenja, intravensku injekciju i oralnu primenu. Izraz "lokalna

2

primena", kako se ovde upotrebljava, označava način primene čiji je rezultat isporuka značajno veće količine farmaceutske kompozicije u ili oko očiju (ili tumora ili drugog cilјnog tkiva) nego u regione koji su udaljeni od očiju (ili tumora ili drugog cilјnog tkiva).

[0347] Sistemski i lokalni putevi primene koji su korisni u postupcima ovog opisa obuhvataju, bez ograničavanja, oralnu gavažu; intravensku injekciju; intraperitonealnu injekciju; intramuskularnu injekciju; subkutanu injekciju; transdermalnu difuziju i elektroforezu; topikalne kapi za oči i masti; periokularnu i intraokularnu injekciju, uklјučujući subkonjuktivnu injekciju; uređaje za produženo oslobađanje, uklјučujući lokalno ugrađene uređaje za produženu isporuku; i intraokularne i periokularne implante, uklјučujući bioerozibilne i imlante na bazi rezervoara.

[0348] Prema tome, u jednom primeru, postupak lečenja očnih poremećaja povezanih sa neovaskularizacijom mrežnjače se praktično izvodi lokalnom primenom molekula koji vezuje ligand subjektu. Na primer, u pojedinim primerima, farmaceutska kompozicija koja sadrži molekul koji vezuje ligand se primenjuje topikalno ili lokalnom injekcijom (npr. intraokularnom, npr. intravitrealnom injekcijom) ili se oslobađa iz intraokularnog ili periokularnog implanta, kao što je bioerozibilni ili implant na bazi rezervoara. Poželjno je da se kompozicija primeni u količini koja je efektivna da inhibira da se VEGF-C i/ili VEGF-D u oku subjekta veže za ili stimuliše VEGFR-2 i/ili VEGFR-3 koji je eksprimiran u ćelijama oka ili u sudovima oko.

[0349] U slučaju kombinovanih terapija, primena molekula koji vezuje ligand i dodatnog sredstva može biti sekvencijalna u vremenu ili istovremena. Kada se primenjuju uzastopno, primena svakog može biti na isti ili na različit način. U jednom primeru izvođenja, dodatno sredstvo (npr. inhibitorni proizvod za VEGF-A ili PDGF) se primenjuje u roku od 90 dana, 30 dana, 10 dana, 5 dana, 24 sata, 1 sat, 30 minuta, 10 minuta, 5 minuta ili jednog minuta od primene molekula koji vezuje ligand. Kada se dodatno sredstvo primenjuje pre molekula koji vezuje ligand, molekul koji vezuje ligand se primenjuje unutar vremena i u takvoj količini da ukupna količina dodatnog sredstva i molekula koji vezuje ligand bude efektivna za lečenje ili prevencija cilјane indikacije, npr. očnog poremećaja. Kada se molekul koji vezuje ligand primenjuje pre dodatnog agensa, dodatno sredstvo se primenjuje unutar vremena i u takvoj količini da ukupna količina dodatnog sredstva i molekula koji vezuje ligand bude efektivna za lečenje ili prevenciju cilјane indikacije, npr. očnog poremećaja

[0350] Farmaceutske kompozicije prema pronalasku mogu biti formulisana tako da se oslobađa molekul koji vezuje ligand i po izboru dodatno sredstvo u kombinovanoj terapiji, uglavnom odmah po primeni ili u bilo kom unapred određenom vremenskom periodu nakon primene, upotrebom formulacije sa kontrolisanim oslobađanjem. Na primer, farmaceutska kompozicija se može obezbediti u obliku sa produženim oslobađanjem. Upotreba kompozicija sa trenutnim ili produženim oslobađanjem zavisi od prirode stanja koje se leči. Ukoliko se stanje sastoji od akutnog poremećaja, lečenje oblikom za trenutno oslobađanje može imati prednosti u odnosu na kompoziciju sa produženim oslobađanjem. Za određene preventivne ili dugoročne tretmane, kompozicija sa produženim oslobađanjem takođe može biti pogodna.

[0351] Primena molekula koji vezuje ligand ili i molekula koji vezuje ligand i jednog ili više dodatnih sredstava u formulacijama sa kontrolisanim oslobađanjem može biti korisna kada molekul koji vezuje ligand, bilo samostalno ili u kombinaciji, ima (i) uzak terapijski indeks (npr. razlika između koncentracije u plazmi koja dovodi do štetnih sporednih efekata ili toksičnih reakcija i koncentracije u plazmi koja dovodi do terapijskog efekta je mala; generalno, terapijski indeks, TI, je definisan kao odnos medijane letalne doze (LD50) sa medijanom efektivne doze (ED 5 0)); (ii) uzak apsorpcioni prozor u gastrointestinalnom traktu; ili (iii) kratak biološki poluživot, tako da je potrebna česta primena doza tokom dana da bi se nivo u plazmi održao na terapijskom nivou.

[0352] Za dobijanje kontrolisanog oslobađanja u kome brzina oslobađanja nadmašuje brzinu degradacije ili metabolizma aktivnih komponenti mogu biti upotrebljene mnoge strategije. Na primer, kontrolisano oslobađanje se može obezbediti odgovarajućim izborom parametara formulacije i sastojaka, uklјučujući, na primer, odgovarajuće kompozicije i obloge sa kontrolisanim oslobađanjem. Primeri uklјučuju pojedinačne ili višestruke jedinične tablete ili kapsule kompozicije, ulјane rastvore, suspenzije, emulzije, mikrokapsule, mikrosfere, nanočestice, flastere i lipozome. Postupci za pripremanje takvih formulacija sa produženim ili kontrolisanim oslobađanjem su dobro poznati u oblasti tehnike.

[0353] Molekul koji vezuje ligand i, ukoliko je prisutno, dodatno sredstvo, takođe mogu biti isporučeni upotrebom uređaja za isporuku leka, kao što je implant. Kako se ovde upotrebljava, pojam "implant" se odnosi na svaki materijal koji ne se ne pomera značajno sa mesta umetanja nakon implantacije. Implant može biti biorazgradiv, onaj koji nije biorazgradiv ili sastavlјen i od biorazgradivih i nerazgradivih materijala. Implant koji nije biorazgradiv može da sadrži, ukoliko je to poželjno, rezervoar za ponovno punjenje. Implanti korisni u postupcima ovog opisa obuhvataju, na primer, flastere, čestice, listove, plakove, mikrokapsule i slično i mogu biti bilo kog oblika i veličine koji su kompatibilni sa izabranim mestom umetanja, a što mogu biti, bez ograničavanja samo na, zadnja komora, prednja komora, suprahoroid prostor ili subkonjunktiva. Podrazumeva se da implant koristan u ovom pronalasku generalno oslobađa implantirani farmaceutsku kompoziciju u efektivnoj dozi u oko pacijenta, tokom dužeg vremenskog perioda.

Raznovrsni očni implanti i formulacije sa produženim oslobađanjem pogodne za oslobađanje u oku su dobro poznati u oblasti tehnike, kao što je opisano, na primer, u U.S. patentima br. 5,869,079 i 5,443,505. Uređaji za isporuku leka u oko mogu biti umetnuti u komoru oka, kao što je prednja ili zadnja komora, ili se mogu ugraditi u skleru, horoidni prostor ili avaskularizovan region koji se nalazi spolja u odnosu na staklasto telo. U jednom primeru izvođenja, implant se može postaviti iznad avaskularnog regiona, kao što je na skleri, tako da se omogućava transkleralna difuzija molekula koji vezuju ligand i bilo kog dodatnog agensa do želјenog mesta lečenja, npr. intraokularnog prostora i makule oka. Dodatno, mesto transkleralne difuzije može biti proksimalno od mesta neovaskularizacije, kao što je

4

mesto koje je proksimalno u odnosu na makulu. Pogodni uređaji za primenu lekova su opisani, na primer, u U.S. patentnim publikacijama br. 2008/0286334; 2008/0145406; 2007/0184089; 2006/0233860; 2005/0244500; 2005/0244471; i 2005/0244462, i U.S. patentima br. 6,808,719 i 5,322,691.

[0354] U drugim primerima izvođenja, ovde opisan molekul za vezivanje liganda se primenjuje oku putem lipozoma. U još jednom izvođenju, molekul koji vezuje ligand se nalazi u uređaju za kontinuirano ili selektivno oslobađanje, na primer, u membranama kao što su, ali ne ograničavajući se samo na one koje se koriste u sistemu Ocusert™ (Alza Corp., Palo Alto, Kalifornija). Dodatni primer izvođenja je da se molekul koji vezuje ligand nalazi unutar, nosi ga ili je povezvan sa kontaktnim sočivima koja se postavlјaju u oko. U još jednom izvođenju, molekul koji vezuje ligand se nalazi na aplikatoru sa vatom ili sunđerom koji može biti primenjen na povšinu oka. Sledeći primer izvođenja predmetnog pronalaska obuhvata molekul koji vezuje ligand, a koga sadrži tečni sprej koji može biti primenjen na površinu oka.

[0355] U jednom primeru izvođenja, implant sadrži molekul koji vezuje ligand i, po potrebi, dodatno sredstvo, dispergovano u biorazgradivom polimernom matriksu. Matriks može sadržavati PLGA (kopolimer polilaktične kiseline i poliglikolne kiseline), polimer sa modifikovanim krajnjim estrom, polimer sa modifikovanom krajnjom kiselinom ili njihovu smešu. U sledećem primeru izvođenja, implant sadrži molekul koji vezuje ligand i po izboru, ukoliko je prisutno, dodatno sredstvo, površinski aktivno sredstvo i lipofilno jedinjenje. Lipofilno jedinjenje može biti prisutno u količini od oko 80-99 tež.% implanta. Pogodna lipofilna jedinjenja uklјučuju, ali nisu ograničena na, gliceril palmitostearat, dietilen glikol monostearat, propilen glikol monostearat, gliceril monostearat, gliceril monolinoleat, gliceril monooleat, gliceril monopalmitat, gliceril monolaurat, gliceril dilaurat, gliceril monomiristat, gliceril dimiristat, gliceril monopalmitat, gliceril dipalmitat, gliceril mono stearat, gliceril distearat, gliceril monooleat, gliceril dioleat, gliceril monolinoleat, gliceril dilinoleat, gliceril monoarahidat, gliceril diarahidat, gliceril monobehenat, gliceril dibehenat i njihove smeše. U sledećem primeru izvođenja, implant sadrži molekul koji vezuje ligand i, po izboru, ukoliko je prisutno, dodatno sredstvo, smeštene unutar šuplјeg aplikatora kapaljke. Molekul koji vezuje ligand i, ukoliko je moguće, dodatno sredstvo, isporučuju se očima umetanjem aplikatora u oko, oslobađanjem implanta iz aplikatora u oko, a zatim uklanjanjem aplikatora iz oka. Primer ovog uređaja za isporuku je opisan u U.S. publikaciji br.

2005/0244462.

[0356] U jednom primeru izvođenja, implant je fleksibilan uređaj za umetanje u oči prilagođen za kontrolisano produženo oslobađanje molekula koji vezuje ligand i, ukoliko je moguće, dodatnog sredstva u oko. U jednom primeru izvođenja, uređaj obuhvata izduženo telo polimernog materijala u obliku štapića ili cevi koje sadrži molekul koji vezuje ligand, i po izboru dodatno sredstvo, pri čemu je telo uređaj sa najmanje dve izbočine za pozicioniranje koje se šire radijalno prema spolјa. Uređaj može biti dužine od najmanje 8 mm, a prečnik njegovog centralnog dela zajedno sa izbočinama ne sem prelaziti 1,9 mm. Mehanizam za produženo oslobađanje može biti, na primer, difuzijom ili osmozom ili bioerozijom. Uređaj za umetanje može biti insertovan u gornji ili donji luk oka tako da bude nezavisan od kretanja oka zahvalјujući anatomiji luka. Izbočine mogu biti raznih oblika kao što su rebraste, sa navojima, rupicama ili kvrgama, kao i sa hrapavim konusnim segmentima ili pletenastim segmentima. U sledećem primeru izvođenja, polimerni materijal za telo uređaja je izabran kao onaj koji bubri u tečnom okruženju. Tako može biti upotrebljen uređaj manje početne veličine. Uređaj za umetanje može biti veličine i konfiguracije koji su takvi da nakon umetanja u gornji ili donji luk, uređaj ostaje van vidnog polјa, a da bi tokom dužeg perioda upotrebe ostao na svom mestu i bio neprimetan za osobu koja ga nosi. Uređaj se može zadržati u gornjem ili donjem luku tokom od 7 do 14 dana ili duže. Primer ovog uređaja je opisan u U.S. patent br.5,322,691.

[0357] U sledećem primeru, postupak inhibicije neovaskularizacije kod subjektu kome je dijagnostikovan tumor podrazumeva lokalnu primenu molekula koji vezuje ligand subjektu. Na primer, u pojedinim primerima, farmaceutske kompozicije koje sadrže molekul koji vezuje ligand se primenjuju lokalno tumoru ili organu ili u tkivo iz koga je tumor hirurški uklonjen. U takvim primerima izvođenja, poželjno je da se kompozicija primenjuje u količini efektivnoj da inhibira neovaskularizaciju u tumoru.

[0358] U slučajevima kada je molekul koji vezuje ligand molekul nukleinske kiseline, primena farmaceutske kompozicije koja sadrži molekul nukleinske kiseline se može sprovesti upotrebom jednog od brojnih postupaka koji su dobro poznati u oblasti genske terapije. Takvi postupci uklјučuju, ali nisu ograničeni na, lentivirusnu transformaciju, adenovirusnu transformaciju, citomegaloviralnu transformaciju, mikroinjeciranje i elektroporaciju.

Kompleti i jedinične doze

[0359] Opis se takođe odnosi na komplete koji sadrže jednu ili više farmaceutskih kompozicija i uputstva za upotrebu. Molekul koji vezuje ligand može biti upakovan ili formulisan zajedno sa drugim molekulom koji vezuje ligand ili sa drugim terapeutikom koji je ovde opisan, npr. u komletu ili pakovanju ili jediničnoj dozi, a da bi se omogućila istovremena primena; ove dve komponente mogu biti formulisane zajedno (tj. u smeši) ili biti u odvojenim kompozicijama (tj. ne u smeši) i u pojedinačnim doznim količinama. Svaki sastojak kompleta kože biti sadržan unutar posebnog spremnika. U pojedinim primerima, dve komponente za komplet/jediničnu dozu su upakovane sa uputstvima za primenu ta dva jedinjenja humanom subjektu u cilju lečenja jednog od ovde opisanih poremećaja i bolesti.

[0360] Kompleti mogu sadržavati spremnik. Spremnik može biti upotrebljen za razdvajanje komponenti i podrazumevati, na primer, podelјenu bocu ili pakovanje podeljeno folijom. Odvojene kompozicije mogu takođe da se nalaze u jednom, nepodelјenom kontejneru, ukoliko je to poželjno. Kompleti mogu takođe sadržavati uputstva za primenu komponenti. Kompleti su naročito povolјni kada se odvojene komponente primenjuju u različitim doznim oblicima, kada se primenjuju u različitim nivoima doza ili kada je poželjna titracija individualnih antagonista.

[0361] U slučaju sukoba, predmetna prijava, uklučujući bilo koju definiciju koja je ovde navedena, ima prvenstvo.

PRIMERI

Primer 1 - ECD fragmenti VEGFR proteina.

[0362] Eksperimenti su urađeni da bi se okarakterisali fragmenti i varijante i fuzije VEGFR-3 i/ili VEGFR-2 i/ili VEGFR-1 koji su efektivni u vezivanju za ciljne ligande, kao što su VEGF-C i/ili VEGF-D i/ili VEGF- A. Pogledati Međunarodne patentne prijave br. WO 2005/087808, WO 2005/000895, WO 2006/088650, WO 2006/099154, WO 2004/106378, WO 2005/123104 i U.S. patent br. 7,855,178. Ova istraživanja pokazuju da ECD regioni ovih receptora mogu biti skraćeni, kao i da se domeni iz različitih receptora mogu rekombinovati, da bi se obrazovali molekuli koji vezuju ligand.

Primer 2 - Generisanje VGX-301-ΔN2 molekula koji vezuje ligande

[0363] Molekul koji vezuje ligand i sadrži domene I-III slične Ig iz VEGFR-3 (označene ovde kao "VGX-300") pripremlјen je kao što je opisano u Makinen i saradnici, Nat. Med., 7:199-205, 2001.

[0364] Klјučna karakteristika VGX-300 molekula je da sadrži 12 mesta glikozilacije; 2 x 6 potencijalnih mesta N-vezane glikozilacije, 5 na svakom fragmentu receptora (VEGFR-3 domeni I, II i III slični Ig) i po 1 u svakom Fc region gama lanca. Nema dokaza o prisustvu O-vezane glikozilacije.

[0365] Glikozilacione karakteristike mogu uticati na PK, ali Fc glikani imaju mali uticaj na PK (Jones i saradnici, Glicobiology, 17(5), 2007. str. 529-540). Ukratko, asijaloglikoproteinski receptor se vezuje za složene N-vezane glikanske strukture u kojima nedostaju dve ili više sijalnih kiselina, pri čemu osnovni ostaci galaktoze (Gal) postaju terminalni saharidi. Pored toga, manozni (Man) receptor prepoznaje visoko-Man-N-vezane glikone i terminalne N-acetilglukozaminske (tGlcNAc) ostatke. Oba ova receptora mogu prouzrokovati brzi metabolički klirens proteina.

[0366] Da bi se identifikovalo koja su mesta glikozilacije važna za aktivnost proizvoda, urađene su sekvencijalne delecije svakog od pet pretpostavlјenih mesta N-vezane glikozilacije. Pet parova prajmera je upotrebljeno za uvođenje pojedinačnih mutacija u kodirajući region VGX-300 kako bi se uništilo konsenzusno mesto vezivanja za svaki od pet N-vezanih glikana (N-Q).

[0367] Upotreblјeni parovi prajmera su bili sledeći:

N1 sens: 5’ GACCCCCCCGACCTTGCAGATCACGGAGGAGTCACAC 3' (SEQ ID NO: 12)

N1 anti-sens: 5’ GTGTGACTCCTCCGTGATCTGCAAGGTCGGGGGGGTC 3' (SEQ ID NO: 13)

N2 sens: 5’ CTGCACGAGGTACATGCCCAGGACACAGGCAGCTACGTC 3' (SEQ ID NO: 14)

N2 anti-sens: 5’ GACGTAGCTGCCTGTGTCCTGGGCATGTACCTCGTGCAG 3' (SEQ ID NO: 15) N3 sens: 5’ GTCCATCCCCGGCCTCCAAGTCACGCTGCGCTCGC 3' (SEQ ID NO: 16)

N3 anti-sens: 5’ GCGAGCGCAGCGTGACTTGGAGGCCGGGGATGGAC 3' (SEQ ID NO: 17)

N4 sens: 5’ GGGAGAAGCTGGTCCTCCAGTGCACCGTGTGGGCTGA 3' (SEQ ID NO: 18)

N4 anti-sens: 5’ TCAGCCCACACGGTGCACTGGAGGACCAGCTTCTCCC 3' (SEQ ID NO: 19)

N5 sens: 5’ AGCATCCTGACCATCCACCAGGTCAGCCAGCACGACCT 3' (SEQ ID NO: 20)

N5 anti-sens: 5’ AGGTCGTGCTGGCTGACCTGGTGGATGGTCAGGATGCT 3' (SEQ ID NO: 21)

[0368] Prisustvo mutacija je potvrđeno sekvenciranjem, nakon čega su plazmidni vektori tranzijentno transfektovani u 293T ćelije (HEK). Uzorci kulture su analizirani imunoblot analizom. Vijabilni konstrukti su zatim amplifikovani u tranzijentnim 293F ćelijama (HEK) prilagođenim za suspenzije, pa su supernatanti prečišćeni ProSepA hromatografijom i gel filtracijom, radi dalјeg ispitivanja pomoću imunosorbentnog testa povezanog sa enzimom (ELISA) i BaF/3 biološkog testa za određivanje prinosa i aktivnosti. Tabela 3 u nastavku, sumira podatke ekspresije i aktivnosti za svakog mutanta koji je dobijen.

Tabela 3.

[0369] Tabela 3 pokazuje da samo N2 mutant (ovde označen kao "VGX-301-ΔN2") ispoljava povolјne karakteristike ekspresije i aktivnosti u odnosu na matični molekul (tj. VGX-300). VGX-301-ΔN2 i matični VGX-300 su proizvedeni u CHO i HEK ćelijama tranzientnom ekspresijom, a farmakokinetika (PK) svakog molekula je ispitivana na sledeći način. Pacovi Sprague-Dawley su raspodelјeni bilo u grupe od po 2, 3 ili 5, po jedinjenju u svakom eksperimentu. Pacovi iz svake grupe su primili jednu dozu VGX-300 ili VGX-301-ΔN2, intravenskom primenom u vidu bolusne injekcije, u koncentraciji doze od 1 mg/kg. Uzorci krvi su prikuplјeni lateralnom punkcijom repne vene prvog dana (pre primene doze) i u ukupno 12 vremenskih tačaka nakon primene doze, u rasponu od 5 minuta do 14 dana nakon početnog tretmana.

Uzorci seruma su pripremljeni iz svakog uzorka krvi i ispitivani su dalje upotrebom kvantitativnog ELISA testa za vezivanje VEGF-C liganda da bi se odredila koncentracija svakog jedinjenja u cirkulaciji. Rezultati ovih analiza su zatim upotrebljeni za izračunavanja farmakokinetičkih parametara. PK podaci za VGX-300 i VGX-301-ΔN2 su prikazani ispod, u Tabeli 4.

Tabela 4.

[0370] PK krive su obezbeđene na Slici 1, a podaci iz Tabele 4 pokazuju da VGX-301-ΔN2 može imati povoljan uticaj na PK u poređenju sa VGX-300 koji je proizveden u istom ekspresionom sistemu.

Primer 3 - VGX-301-ΔN2 vezuje VEGF-C i VEGF-D

[0371] Da bi se odredila specifičnost vezivanja VGX-300 i VGX-301-ΔN2 za VEGF-C i VEGF-D, VEGF-C ili VEGF-D (2 µg/mL) su prethodno vezani za ELISA ploče i upotrebljeni kao antigeni za “hvatanje”. Rastuće koncentracije bilo VGX-300 ili VGX-301-ΔN2 (0 do 10 ug/mL) su nanete na ploču i potom detektovane upotrebom zečjeg anti-humanog IgG konjugovanog sa peroksidazom rena, upotrebom kompleta sa tetrametilbenzidinskim supstratom. Rezultati su pokazali da su se i VGX-300 i VGX-301-ΔN2 vezali i za VEGF-C i za VEGF-D. Pogledati Sliku 2. Iznenađujuće, VGX-301-ΔN2 je pokazao jače vezivanje za oba liganda od VGX-300.

Primer 4 - Afiniteti vezivanja VGX-300 i VGX-301-ΔN2

[0372] Vezivanje VEGF-C i VEGF-D za VGX-300 ili VGX-301-ΔN2 je analizirano površinskom plazmonskom rezonancom (SPR), upotrebom biosenzora ProteOn XPR36 (Bio-Rad). Imobilisan protein G na GLM senzorskom čipu je bio vezan bilo za VGX-300 ili za VGX-301-ΔN2 i izmeren je afinitet molekula za VEGF-C ili VEGF-D. Rezultati iz eksperimenta za određivanje afiniteta su prikazani ispod, u Tabeli 5.

Tabela 5.

[0373] Podaci predstavlјeni prethodno, u Tabeli 5, pokazuju da su uzorci VGX-300 i VGX-301-ΔN2 vezali humani VEGF-C i VEGF-D sa gotovo identičnim afinitetima, pri čemu oba molekula pokazuju jače vezivanje za VEGF-C nego za VEGF-D.

Primer 5 - VGX-301-ΔN2 bokira vezivanje VEGF-C i VEGF-D i umrežavanje VEGFR-3

[0374] Analize zasnovane na ćelijama su razvijene radi procene kapaciteta liganada VEGF familije da se vezuju za i umreže VEGFR-2 i VEGFR-3. Ova biološka ispitivanja su iskorišćena za ispitivanje aktivnosti neutralizacije VGX-300 i VGX-301-ΔN2. Ćelijske linije biološkog ispitivanja su podrazumevale mišju pro-B ćelijsku liniju Ba/F3 zavisnu od IL-3 koja je stabilno tranfektovana sa himernim receptorom, a koji se sastojao od ECD VEGFR-2 ili VEGFR-3 i bio je fuzionisan sa transmembranskim i unutarćelijskim domenima mišjeg eritropoetinskog receptora (isti okvir čitanja) (kao što je opisano u Primeru 5 iz WO 2005/087808. U odsustvu IL-3, ove ćelije opstaju i razmnožavaju se samo u prisustvu faktora rasta koji su sposobni da vezuju i umrežavaju ECD odgovarajućeg VEGFR.

[0375] Ukratko, Ba/F3 ćelije transfektovane sa VEGFR-2 ili VEGFR-3 (10.000 ćelija/bunariću; ploča sa 96 mesta) su gajene u medijumu u koji je bio dodat VEGF-C ili VEGF-D u prisustvu rastućih koncentracija VGX-300 iz VGX-301-AN2 (0-100 ug/mL) tokom 48 sati na 37°C. Proliferacija ćelija je merena upotrebljenjem WST 1 reagensa; ćelije su inkubirane 4 sata na 37°C sa WST-1, pa je izmerena apsorbancija na 450 nm (n=3; vrednost greške = standardna greška srednje vrednosti, SEM).

[0376] Rezultati su pokazali da VGX-300 neutrališe aktivnost VEGF-C i VEGF-D, što je pokazano inhibicijom VEGF-C i VEGF-D koja je bila zavisna od doze u testu sa VEGFR-2 i VEGFR-3 Ba/F3. VGX-300 je pokazao pojačanu moć neutralizacije VEGF-C u poređenju sa VEGF-D, i u VEGFR-2 i -3 testu. Pogledati Slike 3 i 4.

[0377] Analiza VGX-301-ΔN2 je pokazala da je ovaj molekul takođe sposoban da blokira i VEGF-C i VEGF-D u vezivanju za VEGFR-3. Neutrališuća aktivnost VGX-301-N2 je bila nešto jača od one za VGX-300.

Pogledati Sliku 4. Tabela 6 prikazuje vezivanje (IC50) VGX-300 i VGX-301-ΔN2 za VEGF-C i VEGF-D u VEGFR-3 Ba/F3 bioeseju.

Tabela 6

Primer 6 - Okularna distribucija i farmakokinetika VGX-300 i VGX-301ΔN2 nakon intravitrealne primene

[0378] Ovo studija je urađena da bi se istražila distribucija i farmakokinetika VGX-300, VGX-301-ΔN2 i Aflibercepta (EYLEA) u očima, nakon primene jedne intravitrealne doze pigmentisanim zečevima.

[0379] Dizajn studije se sastojao od 3 grupe, a u svaku grupu je raspoređeno po 8 ženki zečeva. Životinjama je primenjeno po 500 µg radioaktivno obeleženog VGX-300, VGX-301-ΔN2 ili Aflibercepta putem intravitrealne injekcije od 50 µL u oba oka.

[0380] Jedna životinja po grupi je eutanazirana 1, 12, 24, 72, 168, 366, 504 i 672 sata nakon primene doze. U svakoj toj vremenskoj tački je uzimana krv koja je potom obrađena do seruma, a izabrana su i tkiva oka koja su zatim prikupljena i u kojima je radioanalizom doređena koncentracija radioaktivnosti. Prikupljena tkiva oka su uključival i vodeni humor, horoid, rožnjaču, iris-hilijarno telo (ICB), sočiva, optički nerv, mrežnjaču, retinalni pigmentni epitel (RPE), skleru, trabekularnu mrežu i staklast humor. Slika 5 prikazuje srednje koncentracije radioaktivnosti u raznim tkivima i serumu tokom praćenog vremenskog perioda.

[0381] Ispitivani proizvodi, [<125>J] VGX-300, [<125>J] Aflibercept (EYLEA) i [<125>J] VGX-301-ΔN2 su bili dobro tolerisani, stabilni u staklastom humoru i bili su sa produženim dejstvoma na tkiva oka i u posteriornom i u anteriornom segmentu. Iako su postojale razlike u izloženosti seruma dejstvu [<125>J] VGX-300 i [<125>J] VGX-301-ΔN2 nakon intravitrealne primene, oba, [<125>J] VGX-300 i [<125>J] VGX-301-ΔN2 je karakterisala sasvim mala sistemska izloženost u poređenju sa afliberceptom (EYLEA), a koja je verovatno rezultat

1

izlučivanja putem apsorpcije u horoid, kao i oticanjem vodenog humora. PK i biodistribucija za [<125>J] VGX-300 i [<125>J] VGX-301-ΔN2 koji su uočeni u ovom istraživanju, bili su slični za oba jedinjenja i uporedivi sa onim za [<125>J] Aflibercept (EYLEA).

Primer 7 – Model prevremene retinopatije

[0382] Primer koji sledi je analiza za primer kojom se procenjuje sposobnost VGX-300 i VGX-301-ΔN2 da inhibiraju početak neovaskularizacije mrežnjače, upotrebljenjem ROP modela. U ovom modelu, postnatalni miševi, stari 7 dana (P7), bili su izloženi hiperoksiji (75% kiseonika) tokom 5 dana (do P12). Nakon hiperoksične izloženosti, P12 miševi su vraćeni u normoksiju i primenjena im je intravitrealana injekcija humanog izotipskog kontrolnog antitela, VGX-300, VGX-301-ΔN2, Eylea (VEGF-Trap), VGX-300 Eylea ili VGX-301-ΔN2 Eylea. Svi miševi su gajeni u normoksičnim uslovima tokom 5 dana, a pre žrtvovanja dana P17, enukleacije i fiksacije u 10% formalinu/PBS-u. Sudovi su bili kvantifikovani u svakoj grupi upotrebom H&E i/ili IHC postupaka bojenja.

Primer 8 – Horoidna neovaskularizacija (ARV) indukovana argonskim laserom

[0383] U ovom modelu degeneracije makule povezane sa starenjem (AMD), CNV je indukovan rupturom Bruhove membrane sa argonskim laserom kod miševa Dana 0 (3 opekotine po mišu). Ispitivane su grupe od po 10 miševa i tretmani su primenjivani nedljeno, intravitrealnim injekcijama (Dana 0 i 7) humanih izotipskih kontrolnih antitela, VGX-301-ΔN2, VGX-300, Eylea (VEGF-Trap), VGX-301-ΔN2 Eylea ili VGX-300 Eylea. Na Dan 14, životinje su žrtvovane i pripremljeni su ravni horoidni preseci koji su dalje obojeni sa ICAM-2 da bi se vizualizovala neovaskularizacija fluorescentnom mikroskopijom.

[0384] Pretpostavilo se da će VGX-301-ΔN2, kao samostalni agens, značajno inhibirati horoidnu neovaskularizaciju u mišjem modelu neovaskularnog AMD-a, uporedivu sa efektom koji pokazuje Eylea®.

Primer 9 – Inhibitorni efekat molekula koji vezuje ligand na rast tumora i metastaze posredovane sa VEGF-C

[0385] Da bi se pokazala sposobnost ovde opisanog molekula koji vezuje ligand da inhibira rast i/ili metastazu tumora, može biti upotrebljen bilo koji prihvaćen model tumora. Model za primer obuhvata životinje predisponirane za razvoj različitih vrsta kancera, životinje kojima su injecirani tumori ili tumorske ćelije ili tumorske ćelijske linije iz istih ili različitih vrsta, uključujući po izboru ćelije transformisane tako da rekombinantno prekomerno eksprimiraju jedan ili više faktora rasta, kao što su VEGF-C ili VEGF-D. Da bi se obezbedio model za tumore in vivo u kojima se može detektovati više faktora rasta, moguće je transformisati tumorske ćelijske linije egzogenom DNK koja bi prouzrokovala ekspresija više faktora rasta.

2

[0386] Ovde opisani molekul za vezivanje liganda mogu biti primenjivani direktno, npr. u vidu proteina, i.v. transfuzijom ili implantiranim mikropumpama, ili u vidu nukleinske kiseline što bi predstavljalo deo režima genske terapije. Poželjno je da su subjekti grupisani prema polu, težini, starosti i istoriji bolesti da bi se smanjile varijacije među subjektima.

[0387] Efikasnost je merena smanjenjem tumora, njegove veličine (zapremine) i težine. Moguće je takođe ispitati prirodu efeketa na veličinu tumora, njegovo širenje (metastaze), kao i na broj tumora. Na primer, upotreba specifičnih ćelijskih markera može biti upotrebljena da bi se pokazao efekat na angiogenezu u odnosu na limfangiogenezu, pri čemu se očekuje da VEGF-A vezujući konstrukti ispolje veći efekat na prvonavedeno, dok se za VEGF-C vezujuće konstrukte očekuje da budu sa većim efektom na drugonavedeni fenomen. Životinje se mogu posmatrati u celini, i može se pratiti vreme preživlјavanja i promene težine. Tumori i uzorci su ispitivani da bi se pokazalo prisustvo angiogeneze, limfangiogeneze i/ili nekroze.

[0388] Za procenu sposobnosti ovde opisanog molekula koji vezuje ligand da inhibira ili sprečava rast tumora mogu biti upotrebljeni SCID miševi kao subjekti. Molekul koji vezuje ligand upotrebljen u terapiji je generalno izabran tako da se vezuje za ligand faktora rasta koji je eksprimiran pd strane tumorske ćelije u odnosu na ćelije u subjektu koje nisu neoplastične. U SCID modelu, tumorske ćelije, npr. MCF-7 ćelije, mogu biti transfektovane sa virusom koji kodira određeni faktor rasta pod kontrolom promotora ili druge sekvence kontrole ekspresije koja obezbeđuje prekomernu ekspresiju faktora rasta kao što je opisano u WO 02/060950. Alternativno, mogu biti upotrebljeni i druge ćelijske linije, npr. HT-1080, kao što je opisano u U.S. Pat. No. 6,375,929. Tumorske ćelije mogu biti transfektovane sa onoliko liganada faktora rasta koliko je poželjno prekomerno eksprimirati ili mogu biti izabrane tumorske ćelije koje već prekomerno eksprimiraju jedan ili više liganada faktora rasta od interesa. Jedna grupa subjekata se imlantira sa ćelijama koje su bile lažno tranformisane, tj. sa vektorom kome je nedostajao insert liganda faktora rasta.

[0389] I ranije, istovremeno sa ili nakon implantacije tumora prethodno opisanih ćelija, subjekti su tretirani određenim molekulom koji vezuje ligand. Postoji više različitih načina primene molekula koji vezuje ligand. Može biti upotrebljena i in vivo i/ili ex vivo genska terapija. Na primer, ćelije mogu biti transfektovane adenovirusom ili drugim vektorom koji kodira molekul koji vezuje ligand i zatim implantirane sa tumorskim ćelijama koje eksprimiraju faktor(e) rasta, pri čemu ćelije koje su transfektovane sa molekulom koji vezuje ligand mogu biti iste kao one koje su transformisane sa faktorima rasta (ili već prekomerno eksprimiraju faktor(e) rasta). U pojedinim primerima izvođenja, injecira se adenovirus koji kodira taj molekul koji vezuje ligand in vivo, npr. intravenski. U pojedinim primerima izvođenja, sam molekul koji vezuje ligand (npr. u obliku proteina) se primenjuje sistemski ili lokalno, npr. upotrebom mikro pumpe. Kada se ispituje efikasnost određenog vezujućeg konstrukta, koristi se najmanje jedna kontrola. Na primer, u slučaju terapije zasnovane na vektoru, koristi se vektor sa praznim insertom ili LacZ, ili insert može biti molekul koji vezuje ligand koji sadrži kompletan ECD VEGFR-3 sposoban da vezuje VEGF-C ili VEGF- D, tako da se kao kontrola može upotrebiti više od jedno ECD konsturkta, ukoliko je to potrebno (npr. za vezivanje višestrukih liganada, ukoliko se koriste vezujući konstrukti sa više afiniteta za vezivanje liganda).

A. Procedure za primer

Priprema plazmida ekspresionih vektora, transfekcija ćelija i ispitivanje istih

[0390] U pEBS7 plazmid se uvodi cDNK koja kodira VEGF-C ili VEGF-D ili njihove kombinacije (Peterson i Legerski, Gene, 107:279-84, 1991.). Isti vektor može biti upotrebljen za ekspresiju molekula koji vezuje ligand.

[0391] Subklon MCF-7S1 humane MCF-7 ćelijske linije karcinoma dojke transfektovan je sa plazmidnom DNK upotrebom elektroporacije, a stabilne ćelijske smeše su selektovane i kultivisane kao što je to prethodno opisano (Egeblad i Jaattela, Int. J. Cancer, 86: 617-25, 2000). Ćelije su metabolički obeležavane u MEM medijumu oslobođenom od metionina i cisteina (Gibco) u koji je bilo dodavano 100 µCi/ml [35S]-metionina i [35S]-cisteina (Redivue Pro-Mix, Amersham Pharmacia Biotech). Obeleženi faktori rasta su imunoprecipitirani iz kondicioniranog medijuma upotrebom antitela za eksprimiran(e) faktor(e) rasta. Imunokompleksi i vezujući kompeksi su precipitirani upotrebom protein A sefaroze (Amersham Pharmacia Biotech), isprani su dva puta sa 0,5% BSA, 0,02% Tween 20 u PBS-u i jednom u PBS-u i analizirani SDS-PAGE postupkom pod redukujućim uslovima.

Priprema i lečenje subjekata

[0392] Ćelije (20.000/bunariću) su zasejane u četvoroplikatu u ploče sa 24 mesta, pa su tripsinizovane na istovetnim pločama nakon 1, 4, 6 ili 8 dana i prebrojavane upotrebom hemocitometra. Svež medijum je obezbeđen nakon 4 i 6 dana. Za ispitivanje tumogeneze, sub-konfluentne kulture se prikupljene tripsinizacijom, isprane dva puta i po 10<7>ćelija u PBS-u je inokulirano u masne jastučiće sekundarnih (aksilarnih) mlečnih žlezda kod ovarijektomisanih SCID miševa sa subkutano ugrađenim peletima za sporo oslobađanje tokom 60 dana, koji su sadržavali 0,72 mg 17β-estradiola (Innovative Research of America). Ovarijektomija i implantacija peleta je rađena 4-8 dana pre inokulacije tumorskih ćelija.

[0393] U plazmid pAdBgIII i adenoviruse proizvedene kao što je prethodno opisano, subklonirana je cDNK koja kodira za vezujuće konstruk(e) (Laitinen i saradnici, Hum. Gene Ther. 9: 1481-6. 1998). Molekul(i) koji vezuju ligand ili LacZ kontrolni (Laitinen i saradnici, Hum. Gene Ther. 9: 1481-6. 1998) adenovirusi, 10<9>pfu/mišu, injecirani su intravenski u SCID miševe 3 sata pre inokulacije tumorskih ćelija.

Analiza efikasnosti lečenja

4

[0394] Dužina i širina tumora su merene dva puta nedelјno na objektivan način, a zapremina tumora je izračunavana na osovu formule: dužina x širina x dubina x 0,5, uz pretpostavku da je tumor poluelipsoidan i da je dubina jednaka širini (Benz i saradnici, Breast Cancer Res. Treat., 24: 85-95, 1993).

[0395] Tumori su disekovani, fiksirani u 4% paraformaldehidu (pH 7,0) tokom 24 sata i parafinizovani. Preseci (7 µm) su obojeni imunohistohemijski sa monoklonskim antitelima za, na primer, PECAM-1 (Pharmingen), VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3 (Kubo i saradnici, Blood, 96:546-553, 2000) ili PCNA (Zymed Laboratories), PDGFR-α, PDGFR-β ili poliklonskim antitelima za LYVE-1 (Banerji i saradnici, J Cell Biol, 144:789-801, 1999), VEGF-C (Joukov i saradnici, EMBO J., 16:3898-911, 1997), laminin prema objavlјenim protokolima (Partanen i saradnici, Cancer, 86: 2406-12, 1999) ili za bilo koji od faktora rasta. Prosečan broj krvnih sudova pozitivnih na PECAM-1 je određivan na tri površine (uvećanje 60x) sa najvećom vaskularnom gustinom (“vruće tačke” vaskularizacije) na preseku. Sve histološke analize preseka su bile urađene po principu “slepog eksperimenta”.

[0396] Tri nedelјe nakon injeciranja adenovirusnih konstrukata i/ili proteinske terapije, četiri miša iz svake grupe su narkotizovana, otvorena je ventralna koža i u tumor je injecirano nekoliko milrolitara 3% Evansove plave boje (Sigma) u PBS-u. Drenaža boje iz tumora je praćena makroskopski.

[0397] Mogu biti urađena i snimanja krvi ili proteina krvi da bi se obezbedile indikacije zdravlja subjekta i opseg tumorske vaskulature.

Primer 10 - Efekti na progresiju tumora kod subjekata primenom kombinovane terapije molekula koji vezuje ligand i hemoterapijskog sredstva

[0398] Ova studija je urađena da bi se ispitala efikasnost upotrebe ovde opisanog molekula koji vezuje ligand u kombinaciji sa drugim antikancerskim terapijama. Takve terapije uklјučuju hemoterapiju, terapiju zračenjem, anti-sens terapiju, RNK interferenciju i monoklonska antitela usmerena na ciljne kancere. Kombinovani efekat može biti aditivan, ali je poželјno da je sinergističan u svojim antikancerskim efektima, npr. prevenciji, suzbijanju, regresiji i eliminaciji kancera, produženju života i/ili smanjenju sporednih efekata.

[0399] Subjekti su podelјeni u grupe, pri čemu je jedna grupa primala hemoterapijsko sredstvo, jedna grupa je primala molekul koji vezuje ligand i jedna grupa je primala i hemoterapijsko sredstvo i molekul koji vezuje ligand u pravilnim periodičnim intervalima, npr. dnevno, nedelјno ili mesečno. U istraživanjima na lјudima, subjekti su uglavnom grupisani po polu, težini, starosti i istoriji bolesti da bi se smanjile varijacije između subjekata. U idealnom slučaju, subjektima je postavljena dijagnoza istog tipa kancera. Kod humanih i subjekata različitih od čoveka, progresija se mogla pratiti merenjem veličine tumora, metastaza, dobitka/gubitka telesne težine, vaskularizacije u tumorima i brojeva belih krvnih zrnaca.

[0400] Biopsije tumora su uzimane u pravilnim intervalima i pre i nakon lečenja. Na primer, biopsije su uzimane neposredno pre lečenja, nakon nedelјu dana, a nakon toga sa razmacima od mesec dana, ili kad god je to bilo moguće, npr. pošto su tumori disekovani. Biopsije se analiziraju na ćelijske markere, sveukupnu ćelijsku i tkivnu morfologiju da bi se ispitala efektivnost tretmana. Dodatno, ili kao alternative, mogle su se upotrebiti tehnike medicinskih snimanja.

[0401] U studijama sa životinjama različitim od čoveka, mogu se dodatno upotrebiti dodatne, placebo kontrole. Studije na životinjama, sprovedene u skladu sa NIH smernicama, takođe obezbeđujeju prednost za insercije u reltivno uniformnu populaciju kancerskih ćelija ili tumora koji selektivno prekomerno eksprimiraju jedan ili više faktora rasta ka kojima se usmeravaju molekuli koji vezuju ligand.

Claims

Patentni zahtevi

1. Molekul koji vezuje ligand i sadrži polipeptid koji vezuje ligand fuzionisan sa fragmentom konstantnog domena imunoglobulina, polipeptid koji vezuje ligand koji sadrži aminokiselinsku sekvencu definisanu pozicijama 25-314 u SEQ ID NO: 2, pod uslovom da pozicije polipeptida koje odgovaraju pozicijama 104-106 u SEQ ID NO: 2 nisu identične sa N-X-S ili N-X-T,

pri čemu se molekul koji vezuje ligand vezuje za i inhibira humani VEGF-C i humani VEGF-D; i pri čemu polipeptid koji vezuje ligand zadržava četiri sekvonska mesta N-glikozilacije koja odgovaraju pozicijama 33-35 u SEQ ID NO: 2, pozicijama 166-168 u SEQ ID NO: 2, pozicijama 251-253 u SEQ ID NO: 2 i pozicijama 299-301 u SEQ ID NO: 2 i glikozilovan je na navedena 4 sekvonska mesta N-glikozilacije; i

pri čemu je molekul koji vezuje ligand solubilan.

2. Molekul koji vezuje ligand prema patentnom zahtevu 1, pri čemu se molekul koji vezuje ligand sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 3.

3. Izolovani polinukleotid koji sadrži kodirajuću nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid koji vezuje ligand prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2.

4. Vektor koji sadrži polinukleotid prema patentnom zahtevu 3.

5. Izolovana ćelija ili ćelijska linija transformisana ili transfektovana sa polinukleotidom prema patentnom zahtevu 3 ili sa vektorom prema patentnom zahtevu 4.

6. Postupak dobijanja molekula koji vezuje ligand, postupak koji obuhvata rast ćelije prema patentnom zahtevu 5, pod uslovima u kojima se eksprimira molekul koji vezuje ligand kodiran polinukleotidom, i, po izboru, prečišćavanje ili molekula koji vezuje ligand iz ćelije ili iz medijuma za rast ćelije.

7. Kompozicija koji sadrži:

(i) molekul koji vezuje ligand prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, ili polinukleotid ili vektor prema patentnom zahtevu 3 ili patentnom zahtevu 4; i

(ii) farmaceutski prihvatlјiv razblaživač, adjuvans, eksipijens ili nosač.

8. Kompozicija prema patentnom zahtevu 7, za upotrebu u terapiji.

9. Kompozicija prema patentnom zahtevu 8, za upotrebu u lečenju ili prevenciji oboljenja ili stanja koje se poboljšava, popravlja, inhibira ili sprečava uklanjanjem, inhibicijom ili smanjenjem VEGF-C i/ili VEGF-D, izabranog od:

Horoidne neovaskularizacije;

Dijabetskog makularnog edema;

Senilne makularne degeneracije;

Proliferativne dijabetske retinopatije;

Neovaskularizacije/odbacivanja transplanta rožnjače; i

Vlažnog oblika senilne makularne degeneracije.