RS60210B1 - Novi postupak za efikasno prečišćavanje humanog albumina iz seruma - Google Patents

Description

Opis

Oblast tehnike pronalaska

[0001] Predmetni pronalazak prikazuje jednostavan, ekonomičan postupak za prečišćavanje rekombinatnog humanog albumina iz seruma iz različitih izvora. Određenije, predmetni pronalazak se odnosi na unapređenje postupka koji povećava regeneraciju proteina u svakom koraku prečišćavanja.

Stanje tehnike pronalaska

[0002] Humani albumin iz seruma je najzastupljeniji rastvorljivi, globularni, i neglikozilovani monomerni protein u humanoj plazmi sa molekulskom težinom od 66,437 do 66,600 Daltona. Sastoji se iz jednog neglikozilovanog polipeptidnog lanca od 585 aminokiselina i takođe sadrži 17 disulfidnih mostova i slobodnu tiolnu grupu. Deluje kao molekulski nosač i vezuje se za lekove, pigment, masne kiseline, jone metala i za druge proteine. Takođe transportuje hormone, masne kiseline, i druga jedinjenja, puferuje pH i održava osmotski pritisak. Humani albumin iz seruma se koristi da zameni izgubljenu tečnost i pomaže u obnavljanju zapremine krvi kod traume, opekotina i kod pacijenata koji su na hirurgiji.

[0003] Tržišna potražnja za albuminom iz humanog seruma je procenjena na više od 500 tona godišnje širom sveta. U ovom trenutku, komercijalna proizvodnja albumina iz humanog seruma se primarno zasniva na sakupljenoj humanoj plazmi, čije zalihe su ograničene ali je visoka klinička potražnja.

[0004] Rekombinantni albumin iz humanog seruma se proizvodi u kvascima uključujući Pichia, Saccharomyces, Kluyveromyces, Hensenuela, pirinču i drugim organizmima. Rekombinantni protein može da se proizvede gajenjem transgenih biljaka u poljima ili staklenim baštama ili fermentacijom iz različitih mikroorganizama. Protein koji se proizvodi na taj način mora da se prečisti kroz serije koraka da se konačno postigne stepen čistoće koji je ekvivalentan sa ili bolji od albumina iz plazme. Jedan od najvećih izazova u proizvodnji albumina je stepen čistoće koji je potrebno da se dostigne. Dok većina rekombinantnih proteina treba da budu prečišćeni tako da konačni proizvod ima proteine ćelija domaćina (HCPs) <100ppm , rekombinantni albumin, koji se koristi u visokim dozama, potrebno je da ima < 100ppb (delova po milijardi) HCPs u konačnom proizvodu. Prema tome, hiljadu puta veća čistoća je zahtevana za rekombinantni albumin u poređenju sa drugim rekombinantnim bioterapeuticima.

[0005] Prečišćavanje proteina da bi se dobio, u čistom obliku, i do homogenosti, bez: materijala za bojenje ili pigmenta, proteina ćelije domaćina, DNK ćelije domaćina, polisaharida, lipida, metalnih jona, proizvoda degradacije i agregacije albumina i glikovanog albumina. Dodatno, Cys 34 slobodni tiol, koji radi kao čistač slobodnih radikala i uključen je u obavljanje funkcija anti-oksidanasa kao i nošenje lekova i drugih molekula koji trebaju da se održe u njihovom redukovanom obliku.

[0006] S obzirom da albumin teži da se veže za mnoge nečistoće koje su prisutne u bujonu, postupci razvijeni za prečišćavanje ovog proteina su komplikovani, uključuju veliki broj koraka i na taj način povećavaju trošak uz smanjenje finalne regeneracije proizvoda.

[0007] Postoje mnogi postupci koji se opisuju za prečišćavanje rekombinantnog humanog albumina iz seruma u patentnoj i ne-patentnoj literaturi. Međutim, ovi postupci uključuju komplikovane i višestruke korake, koji mogu napraviti dodatne troškove postupka. Brojni koraci u stanju tehnike dovode do smanjene finalne regeneracije što doprinosi povećanju troškova proizvoda.

[0008] Patentna prijava CN101768206 pod nazivom "Postupak za prečišćavanje rekombinantnog humanog albumina iz seruma i njegova primena" opisuje postupak za prečišćavanje rekombinantnog proteina humanog albumina iz seruma. Ovaj postupak uključuje korake prerade fermentisane tečnosti koja sadrži rekombinantni humani albumin iz seruma pomoću keramičke membrane, prečišćavanje tečnosti supernatanta sa katjonskom izmenjivačkom hromatografijom sa visokom koncentracijom soli, izmenjivačkom hromatografijom na hidrofobnom sloju i hromatografijom sa izmenom slabih anjona. Dobijeni protein može da se koristi za proizvodnju humanih vakcina protiv virusa pomoću postupka kultivisanja ćelija, naročito za vakcine protiv besnila. Međutim, predmetni pronalazak ne govori ništa o čistoći i regeneraciji prečišćenog proteina.

[0009] Patentna prijava EP0570916 A2 pod nazivom "Rekombinantni humani albumin iz seruma, postupak za proizvodnju istog i farmaceutski preparat koji ga sadrži" opisuje prečišćavanje humanog albumina iz seruma prema redosledu koraka uključujći ultra-filtraciju, tretman zagrevanjem, tretman kiselinom i još jednu ultra-filtraciju, nakon čega slede tretmani sa katjonskim izmenjivačem, hidrofobnim hromatografskim nosačem i izmenjivačem anjona, i isoljavanjem tako da se dobija čisti oblik humanog albumina iz seruma koji ne sadrži proteinske i polisaharidne kontaminante i formulisan je u farmaceutski preparat. Ovaj postupak je efikasan za prečišćavanje rekombinantnog albumina iz seruma da bi se obezbedio u suštini čisti oblik humanog albumina iz seruma koji ne sadrži supstance povezane sa domaćinom i druge kontaminante i dovoljno je oslobođen od boje. Međutim, pronalazak uključuje mnoge korake prečišćavanja sa niskom finalnom regeneracijom proizvoda.

[0010] Patentna prijava EP0699687 B1 pod nazivom "Postupak za prečišćavanje humanog albumina iz seruma" opisuje postupak prečićavanja humanog albumina iz seruma zagrevanjem medijuma kulture koji sadrži rekombinantni humani albumin iz seruma i ćelije domaćina koje proizvode ovaj protein, napajanje zagrejanog rastvora naviše u fluidizovanom sloju u kome su čestice adsorbenta suspendovane da imaju kontakt sa česticama adsorbenta na pH vrednosti od oko 3 do 5 i zatim regenerisanje adsorbovane frakcije koja sadrži rekombinantni protein. Rastvor se zagreva u prisustvu redukujućeg sredstva i zatim se izlaže najmanje jednom tretmanu prečišćavanja koji je odabran iz grupe koja se sastoji iz hromatografije sa hidrofobnim interakcijama, tretmana anjonskim izmenjivačima, tretmana helatnom smolom, tretmana bornom kiselinom/boratom i ultra-filtracijom. Pronalazak može da dovede do povećane čistoće proteina.

[0011] Patentna prijava US20030204060 pod nazivom "Postupak za prečišćavanje albumina iz seruma" opisuje prečišćavanje rekombinantnog humanog albumina iz seruma koji se sastoji iz serije koraka, opciono inkubiranjem sa adsorbentom za izmenu-anjona, zatim afinitetnom hromatografijom upotrebom hidrofobne čvrste faze i korišćenjem rastvorljivog u vodi lipidnog anjona kao desorbenta u vodenoj fazi. Stacionarna faza se sastoji iz nosača spojenog sa 2-merkapto ili 2-hidroksi alkanskom kiselinom. Protein koji je prečišćen ovim postupkom je čistoće veće od 99.9%, naročito veće od 99.95% čistoće.

[0012] Prema tome, takođe postoji potreba za razvijanjem postupka za prečišćavanje rekombinantnog albumina iz humanog seruma, koji dovodi do visoko prečišćenog proteina kroz minimalan broj koraka uz optimizaciju postupka da bi se povećao učinak svakog koraka.

[0013] Takođe postoji potreba za postupkom prečišćavanja, koji je isplativ za proizvodnju na veliko rekombinantnog humanog albumina iz seruma.

Ciljevi pronalaska

[0014] Cilj predmetnog pronalaska je da se obezbedi postupak za prečišćavanje rekombinantnog albumina iz humanog seruma u minimalnom broju koraka.

[0015] Drugi cilj predmetnog pronalaska je da se obezbedi postupak za prečišćavanje rekombinantnog albumina iz humanog seruma koji je ekonomičan.

[0016] Još jedan cilj predmetnog pronalaska je da se obezbedi postupak za prečišćavanje rekombinantnog humanog albumina iz seruma koji dovodi do visoke čistoće regenerisanog proteina.

[0017] Još jedan cilj predmetnog pronalaska je optimizacija postupka tako da je protein prečišćen u minimalnom broju koraka sa povećanim učinkom u svakom koraku.

[0018] Još jedan cilj predmetnog pronalaska je optimizacija postupka kroz redosled koraka koji osigurava završetak prečišćavanja od bistrenja do flaširanja za manje od dva dana.

Suština pronalaska

[0019] Predmetni pronalazak prikazuje jednostavan, ekonomičan postupak prečišćavanja rekombinantnog humanog albumina. Postupak dovodi do visoko prečišćenog proteina ograničenim brojem koraka prečišćavanja. Predmetni pronalazak se takođe odnosi unapređenje postupka tako da je regeneracija proteina povećana u svakom koraku prečišćavanja.

[0020] Rekombinantni humani albumin iz seruma koji se proizvodi fermentacijom se podvrgava prečišćavanju. Bujon (eng. broth) za fermentaciju se obično bira između bakterija, gljiva, ćelija sisara ili homogenata transgenih biljaka koji proizvode rekombinantni humani albumin. Ćelije se odvajaju iz bujona za fermentaciju i podvrgavaju se centrifugi. Supernatant oslobođen od ćelija je mikrofiltriran korišćenjem filtera sa šupljim vlaknima od 0.1-0.45 mikrona. Mikrofiltrirani uzorak se koncentruje i bujon se dijafiltrira naspram vode upotrebom filtera sa šupljim vlaknima u neprekidnom režimu sve dok provodljivost nije manja od 3mS/cm. Dijafiltrirani uzorak se nanosi na kolonu za izmenu katjona sa ’on line’ pH podešavanjem do 4.5 korišćenjem 2% 1M natrijum acetatnog pufera. Eluent iz ovog koraka je podvrgnut hromatografiji sa hidrofobnim interakcijama, koja koristi polipropilenglikol (PPG), u režimu slobodnog protoka.

[0021] Frakcije slobodnog protoka i ispiranja prečićavanja na HIC su dijafiltrirane i nanete na anjonsku izmenjivačku smolu za hromatografiju. Na taj način eluirani protein je koncentrovan do 200mg/ml i dijafiltriran naspram vode. Finalni koncentrovani proizvod je doveden do 20mM fosfatnog pufera pH 7.0 , 144mM natrijum hlorida i 8mM natrijum kaprilata dodavanjem odgovarajućih zapremina iz štoka njihovih rastvora. Protein je sterilno proceđen i flaširan. Flaširani protein je podvrgnut terminalnoj pasterizaciji na 60°C u trajanju od 1-10 h.

[0022] Krajnje serije postupka se spoje tako da postoji jednostavan prelaz iz jednog koraka ka sledećem, pri čemu se smanjuje ukupno vreme trajanja postupka. Ukupni postupak prečišćavanja je završen tokom dva dana od sakupljanja do konačnog proizvoda.

[0023] Prečišćeni proten je bezbojan do bledo žute boje sa odnosom tiola od > 0.75, agregata < 2%, sa fizičkohemijskim karakteristikama i karakteristikama vezivanja standarnog albumina.

[0024] Predmetni pronalazak omogućava da postupak bude komercijalno isplativ.

Kratak opis nacrta

[0025] Ovaj pronalazak je ilustrovan priloženim slikama nacrta.

SL 1 ilustruje dijagram toka prečišćavanja rekombinantnog humanog albumina iz seruma.

SL 2 ilustruje rezultat SDS PAGE frakcija dobijenih iz katjonske izmenjivačke hromatografije nanetih na 10% SDS PAGE gel i podvrgnutih komasi (eng. coomassie) bojenju.

SL 3 ilustruje odvajanje agregata i proizvoda degradacije na PPG kao što se može videti na SEC- HPLC upotrebom BioSep s2000 kolone.

SL 4 ilustruje različite frakcije dobijene frakcionisanjem humanog albumina iz seruma na PPG nanete na 10% SDS-PAGE Gel. SL 4 takođe pokazuje efekat dodavanja kaprilata i cisteina na povećanu regenraciju proteina u frakcijama slobodnog protoka/ispiranja.

SL 5 ilustruje SDS PAGE na finalnom prečišćenom proizvodu posle anjonske izmenjivačke hromatografije.

SL 6 ilustruje intaktnu masu finalnog rekombinantnog humanog albumina iz seruma u poređenju sa standardnim albuminom.

SL 7 ilustruje nativnu PAGE, SDS-PAGE pod redukujućim i neredukujćim uslovima i ’western blot’ rekombinantnog albumina koji je hibridizovao sa anti-humanim antitelom specifičnim za albumin u poređenju sa standardnim albuminom.

SL 8 ilustruje rezultate poređenja različitih tipova iz spektra rekombinantnog humanog albumina sa standardnim albuminom.

SL 9 ilustruje HPLC profile finalnog prečišćenog rekombinantnog humanog albumina iz seruma na SEC-HPLC i RP-HPLC.

SL 10 ilustruje način nanošenja bujona nakon dijafiltracije na koloni za izmenu katjona.

SL 11 ilustruje način nanošenja bujona, posle tretmana zagrevanjem, na kolonu za izmenu katjona.

SL 12 ilustruje suštinu postupka koji sledi za katjonsku izmenjivačku hromatografiju

SL 13 ilustruje dosledno smanjenje pigmenta na kraju katjonske izmenjivačke hromatografije. SL 14 ilustruje specifikacije finalnog prečišćenog rekombinantnog humanog albumina koji se dobija upotrebom opisanog postupka za prećišćavanje.

Detaljni opis pronalaska

[0026] Predmetni pronalazak se odnosi na postupak za prečišćavanje rekombinantnog humanog albumina, postupak (100) obuhvata korake:

a. odvajanje mnoštva ćelija iz fermentacionog bujona ili sakupljanje centrifugom (101);

b. mikrocfiltraciju dobijenog supernatanta bez ćelija (102);

c. koncentrovanje mikrofiltriranog supernatanta i njegove dijafiltracije naspram vode (103);

d. nanošenje dijafiltriranog uzorka na kolonu za izmenu katjona za prečišćavanje u režimu vezivanja i eluiranja (104);

e. odvajanje monomernog albumina od agregata i proizvoda degradacije hromatografijom sa hidrofobnim interakcijama dodavanjem 5-30mM cisteina u 5-30mM kaprilata u režimu slobodnog protoka (105);

f. sakupljanje frakcija slobodnog protoka i ispiranja i dijafiltracije istih prema vodi (106);

g. nanošenje albumina na hromatografsku smolu za izmenu anjona u režimu vezivanja i eluiranja (107);

h. koncentrovanje eluiranog proteina i njegove dijafiltracije naspram vode (108); i

i. sterilnog ceđenja proteina i podvrgavanja pasterizaciji na 60°C u trajanju od 1-10 sati (109).

[0027] Da bi se jasnije i sažeto opisalo i ukazalo na predmet za koji se traži zaštita, obezbeđene su definicije koje slede za specifične termine, koje se koriste u sledećem pisanom opisu.

[0028] Termin "Rekombinantni humani albumin iz seruma" se odnosi na humani albumin iz seruma poizveden postupkom rekombinantne DNK.

[0029] Termin "Prečišćavanje proteina" se odnosi na serije postupaka namenjene za izolovanje jednog ili nekoliko proteina iz kompleksne smeše, obično ćelija, tkiva ili celih organizama ili fermentacionog bujona.

[0030] Termin "SDS-PAGE" se odnosi na natrijum dodecilsulfat poliakrilamidni gel za elektroforezu (SDS- PAGE), tehniku za odvajanje proteina na osnovu njihove sposobnosti da se kreću pod uticajem električne struje, što je funkcija dužine njihovih polipeptidnih lanaca ili njihove molekulske težine.

[0031] Termin "Katjonska izmenjivačka hromatografija" se odnosi na oblik jonoizmenjivačke hromatografije koja koristi smole ili pakovanja sa funkcionalnim grupama koji odvajaju katjone. Ovo može da uključi filtere sa funkcionalnim grupama koji odvajaju katjone

[0032] Termin "Mikofiltracija" se odnosi na fizički postupak ceđenja gde tečnost prolazi kroz memebranu sa veličinom pora od 0.1-0.45 mikrona da bi se odvojile ćelije, ćelijski debrs, suspendovale čestice ili druge komponente čija veličina je veća od 0.1 - 0.45 mikrona, iz tečnosti postupka.

[0033] Predmetni pronalazak prikazuje postupak za prečišćavanje rekombinantnog humanog albumina iz seruma.

[0034] SL 1 ilustruje grafikon za postupak prečišćavanja rekombinantog humanog albumina iz seruma. Postupak (100) prečišćavanja počinje (101) odvajanjem ćelija iz fermentacionog bujona iz bilo kog gajenog izvora pomoću bilo kog organizma. Fermentacioni bujon je obično odabran iz grupe koja se sastoji od bakterija, gljiva, ćelija sisara ili homogenata transgenih biljaka koji proizvode rekombinantni humani albumin. Bujon je razblažen sa jednakom zapreminom vode i nakon toga je centrifugiran. Protein, može, po potrebi, da se podvrgne termičkom tretmanu od 60C u trajanju od 1-2 h za virusnu inaktivaciju ili prevenciju aktivnosti kisele proteaze pre prelaska na sledeći korak mikrofiltracije. Međutim, ovo je opcioni korak .

[0035] U koraku (102), supernatant bez ćelija koji se dobija nakon centrifugiranja je podvrgnut mikrofiltraciji upotrebom filtera sa šupljim vlakinima. Nastali bujon je u potpunosti oslobođen čestica i ćelijskog debrisa. U koraku (103), mikrofiltrirani uzorak je koncentrovan i dijafiltriran naspram vode da se postigne provodljivost manja od 3mS/cm. U koraku (104), dijafiltrirani uzorak je prečišćen sa katjonskom izmenjivačkom hromatografijom. pH uzorka je podešen „on-line“ do 4.5 i nanet je na smolu za izmenu katjona. Vreme zadržavanja proteina se postepeno povećava tako da je ukupno 140-230 mg proteina naneto po ml smole. Protein je eluiran sa 60mM natrijum fosfatom, pH 5.8 sa 10mM natrijum kaprilatom. Dodavanje masnih kiselina kao što je kaprilat u elucioni pufer značajno pojačava regeneraciju, smanjuje agregaciju i dovodi do smanjenja pigmenta. U koraku (105), protein je podvrgnut hromatografiji sa hidrofobnim interakcijama, koja koristi polipropilenglikol (PPG), smolu sa različitom selektivnosti u odnosu na druge HIC smole, da bi se odvojli agregati i proizvod degradacije od 45kDa od rekombinantnog humanog albumina iz seruma. U koraku (106), protein sakupljen iz frakcija slobodnog protoka i ispiranja u prethodnom koraku je koncentrovan do 50mg/ml i dijafiltriran naspram vode. U koraku (107), uzorak pH je podešen do 7.0 i nanet na smolu za izmenu anjona za hromatografiju. U koraku (108), protein je eluiran sa smole za izmenu anjona sa natrijum acetatom, pH 4.5. Eluirani protein je podešen do pH 7.0 i dijafiltriran naspram vode. Ovaj protein je koncentrovan do 200mg/ml i dijafiltriran naspram vode. Natrijum fosfatni pufer pH 7.0, natrijum hlorid i natrijum kaprilat su dodati do finalne koncentracije 20mM, 144mM i 8mM tim redom. U koraku (109), koncentrovani protein je sterilno proceđen i flaširan. Flaširan protein je podvrgnut pasterizaciji na 60°C u trajanju od 1 -10 h.

[0036] Prema postupku iz predmetnog pronalaska, pomenuto nanošenje i dijafiltriranog uzorka na smolu za izmenu katjona je izvedeno postepenim povećanjem vremena zadržavanja, pri čemu se omogućava povećanje kapaciteta nanošenja za 75-150% iznad obeleženog kapaciteta vezivanja smole.

[0037] Postupak prema predmetnom pronalasku omogućava povećanje regeneracije proteina albumina u pulu (eng. pool) frakcija slobodnog protoka i ispiranja do > 87% u HIC u režimu slobodnog protoka.

[0038] Finalne serije postupka se spajaju tako da postoji laki prelaz sa poslednjeg koraka na sledeći. Ovo dovodi do smanjenja vremena za završetak postupka. Celi postupak prečišćavanja je završen u toku dva dana od sakupljanja do dobijanja konačnog proizvoda. Ovo čini postupak isplativim i komercijalno održivim.

[0039] SL 2 ilustruje rezultat Natrijum Dodecil Sulfat Poliakrilamidne Gel Elektroforeze (SDS PAGE) frakcija dobijenih iz katjonske izmenjivačke hromatografije nanetih na 10% SDS PAGE gel i podvrgnutih komasi bojenju. Dijafiltrirani uzorak je nanet na kolonu za izmenu katjona sa „online“ pH podešavanjem do 4.5 upotrebom 2% 1M natrijum acetatnog pufera, pH 4.5. Protein je eluiran sa 60mM natrijum fosfatom, pH 5.8 koji sadrži 10mM natrijum kaprilat. Frakcije iz različitih koraka u postupku uključujući slobodni protok, ispiranje 1, ispiranje 2, elucije i regeneracije su naneti na gel.

[0040] SL 3 ilustruje odvajanje agregata i proizvoda degradacije na PPG, HIC smoli. 50 mikrolitara frakcija slobodnog protoka i regenerisanih uzoraka je ubrizgrano na BipSep TM s2000 kolonu za eksluzionu hromatografiju po veličini. Rezultati pokazuju prisustvo monomernog humanog albumina iz seruma u frakciji slobodnog protoka dok regeneraciona frakcija uglavnom sadrži agregate i proizvode degradacije.

[0041] SL 4 ilustruje različite frakcije dobijene frakcionisanjem humanog albumina iz seruma na PPG nanetog na 10% SDS-PAGE Gel. Levi panel ilustruje rezultate hromatografije bez dodavanja kaprilata i cisteina pri nanošenju dok panel na desnoj strani pokazuje rezultate dodavanja kaprilata i cisteina pri nanošenju. Dodavanje kaprilata i cisteina dovodi do porasta količine monomera u frakcijama slobodnog protoka i ispiranja od 60-70% (bez aditiva) do 87-97%. Ovaj postupak omogućava odvajanje do 30% agregata i 30% proizvoda degradacije u jednom koraku.

[0042] SL 5 ilustruje SDS PAGE finalnog prečišćenog proizvoda posle anjonske izmenjivačke hromatografije.20 mikrograma proteina je naneto na 10% SDS-PAGE i podvrnuto je bojenju komasi plavim . Rezultati pokazuju čistoću rekombinantnog humanog albumina iz seruma.

[0043] SL 6 ilustruje intaktnu masu finalnog rekombinantnog humanog albumina iz seruma. Intaktna masa rekombinovanog humanog albumina iz seruma ima 66.483kDa i identična je sa standardnim HSA.

[0044] SL 7 ilustruje nativni PAGE, SDS-PAGE pod redukujućim i neredukujućim uslovima i ’western blot’ i hibridizaciju sa anti-humanim albuminskim antitelom rekombinantnog albumina u poređenju sa standardnim albuminom. Rezultati pokazuju identičnost između rekombinantnog humanog albumina iz seruma prečišćenog u predmetnom pronalasku sa standardnim albuminom.

[0045] SL 8 ilustruje rezultate poređenja različitih tipova spektra rekombinantnog humanog albumina iz seruma sa standarnim albuminom. Prečišćeni rekombinantni humani albumin iz seruma je upoređen sa standardnim albuminom sa UV, fluorescencijom i CD spektroskopijom. Rezultati ovih spektara pokazuju sličnost rekombinantnog humanog albumina iz seruma sa standardnim albuminom.

[0046] SL 9 ilustruje HPLC profile standardnog i rekombinantnog albumina. Prečišćeni rekombinantni humani albumin iz seruma je podvrgnut SEC HPLC i RP HPLC. SEC HPLC pokazuje visok procent čistoće proteina sa manje od 1% agregata. RP HPLC pokazuje 100% čistoću rekombinantog humanog seruma.

[0047] Na taj način dobijeni rekombinantni protein u gore navedenim koracima se karakteriše masenom spektrometrijom, koja pokazuje 100% čistoću. N terminalno sekvenciranje prečišćenog rekombinantnog humanog albumina iz seruma pokazuje identičnost sa albuminom plazme. Odnos tiola u rekombinantnom albuminu koji je prečišćen sa gore navedenim postupkom pokazuje da više od 75% molekula imaju slobodnu tiolnu grupu u poređenju sa maksimumom od 30% u albuminu plazme. Imajući u vidu da je slobodni tiol veoma važan za funkciju albumina kao molekul nosač, rekombinantni albumin obezbeđuje značajnu prednost u odnosu na albumin iz plazme zbog visokog procenta molekula koji sadrže slobodnu tiolnu grupu.

[0048] Prema postupku iz predmetnog pronalaska, odnos slobodnog tiola albumina veći od 0.7 u HIC u režimu slobodnog protoka.

[0049] Rekombinantni humani albumin iz seruma pokazuje sličnu glikaciju, nečistoće niske molekulske težine, karakteristike vezivanja za bilirubin, varfarin i masne kiseline kao standardni albumin.

[0050] Da bi se ovaj pronalazak potpunije razumeo, dati su sledeći preparativni primeri i ispitivanja. Ovi primeri su samo u svrhu ilustracije i ne treba ih tumačiti kao ograničenje obima pronalaska na bilo koji način.

Primer 1: Bistrenje

[0051]

a. Prvi korak prečišćavanja proteina je odvajanje ćelija. Fermentacioni bujon je razblažen sa jednakom zapreminom vode i podvrgnut je centrifugiranju na 5000 oum u trajanju od 5 minuta. Ovaj korak dovodi do regeneracije >90% proteina.

b. Supernatant bez slobodnih ćelija koji je izolovan u prethodnom koraku je podvrgnut mikrofiltraciji na filterima veličine pora od 0.1-0.45 mikrona. >90% proteina se regeneriše pri čemu je filtrat u potpunosti oslobođen ćelija, ćelijskog debrisa i čestica.

Primer 2: Dijafiltracija

[0052] Mikrofiltrirani bujon iz Primera 1 je podvrgnut dijafiltraciji. Filtrat je koncentrovan do 20mg/ml i dijafiltriran naspram vode upotrebom filtera sa šupljim vlakanima od 30kDa dok provodljivost nije dostigla <2mS/cm. Dijafiltrirani uzorak je korišćen za hromatografiju na koloni. Regeneracija u ovom koraku je >90%.

[0053] Opcioni korak tretmana zagrevanjem može da se uvede posle mikrofiltracije, gde se 5-20mM natrijum kaprilat i 5-20mM cistein dodaju u bujon i uzorci su zagrevani do 60°C u trajanju od 60-120 minuta. Ovaj korak je efikasan u denaturaciji kiselih proteaza, ukoliko su prisutne, koje bi inače uzrokovale degradaciju proteina. Međutim, ovaj korak je samo opcioni i nije neophodan da bi se postiglo prečišćavanje rekombinantnog proteina.

Primer 3: Katjonska izmenjivačka hromatografija

[0054] SP Sefaroza FF, katjonska izmenjivačka smola koja je i jeftina i dugotrajna – smola je ispitana za 300 ciklusa, spakovana je na debljnu sloja od 15cm. Ekivilibrisana je sa 50mM natrijum acetatnim puferom, pH 4.5. Dijafiltrirani uzorak na neutralnoj pH, je razblažen sa vodom do 10mg/ml. Protein je nanet na kolonu sa „on-line“ pH podešavanjem do 4.5 upotrebom 2% 1M natrijum acetata, pH 4.5. Vreme zadržavanja proteina se postepeno povećava da se dobije maksimum vezivanja albumina za smolu. Nanošenje se izvodi kako je prikazano na SL 10.

[0055] Pod gore navedenim uslovima, 230 mg albumina je naneto po ml smole. Frakcije slobodnog protoka ili ekvilibracinog ispiranja ne sadrže bilo koje tragove albumina. Smatra se da SP Sefaroza FF iz GE ispoljava kapacitet vezivanja 130mg/ml za BSA na 10% probijanje (engl. breakthrough), ovaj postupak vezivanja omogućava 75% veće vezivanje za smolu prema tome smanjuje trošak po gramu finalnog proizvoda.

[0056] Dalje, uzorci koji su tretirani zagrevanjem nakon dijafiltracije su razblaženi do 5mg/ml sa vodom i naneti su na kolonu sa „on-line“ podešavanjem pH do 4.5 kao što je prikazano na SL 11.

[0057] Pod gore navedenim uslovima, do 140mg albumina je naneto po ml smole bez bilo kog probijanja. Takođe je obavljeno vezivanje gde je albumin vezan za 80mg/ml smole sa 5-to minutnim vremenom zadržavanja zatim sledi nanošenje do 140mg/ml sa 15-to minutnim vremenom zadržavanja.140mg albumina/ml smole se uspešno vezuje pod ovim uslovima bez tragova albumina u frakciji slobodnog protoka.

[0058] Postupak koji sledi nakon nanošenja je predstavljen na SL 12.

[0059] Posle nanošenja, kolona se ispira sa ekvilibracionim puferom, nakon čega se ispira sa 3CVs 25mM natrijum acetatom, pH 4.5 koji sadrži 50mM amonijum sulfat i 2% Tween 20. Ovaj korak ispiranja uklanja pigment, protein ćelije domaćina i određene proizvode degradacije albumina. Nakon toga sledi ispiranje sa 2-3 CVs 25mM natrijum acetatom, pH 4.5 zatim sa 3 CVs 25mM natrijum acetatom, pH 4.5 koji sadrži 2M ureu. Ovaj korak ispiranja veoma efikasno uklanja pigment. Urea je uklonjena iz kolone ispiranjem sa 3CVs 25mM natrijum acetatom, pH 4.5.

[0060] Protein se eluira sa 60 mM natrijum fosfatnim puferom, pH 5.8 sa 10mM natrijum kaprilatom. Regeneracija proteina u ovom koraku je >90%.

[0061] Druge smole za izmenu katjona mogu da se koriste umesto SP Sefaroza FF korišćene u ovom primeru. Izmenjivači katjona koji zahtevaju više kapacitete vezivanja će, upotrebom gore navednog postupka nanošenja, biti sposobni da daju 75% do dvostuko veći kapacitet vezivanja za albumin u poređenju sa tvrdnjom proizvođača.

[0062] Dodavanje kaprilata pojačava regeneraciju proteina i smanjuje agregaciju. Dosledno smanjenje pigmenta se uočava na kraju katjonske izmenjivačke hromatografije kao što je predstavljeno u tabeli na SL 13.

Primer 4: Hromatografija sa hidrofobnim interakcijama

[0063] Protein prečišćen u Primeru 3 obuhvata albumin, njegove agregate i njegov proizvod degradacije od 45kDa. Protein je podvrgnut hromatografiji sa hidborfobnim interakcijama u režimu slobodnog protoka upotrebom PPG kao izabranom smolom .

[0064] U eluent iz prethodnog koraka, dodaje se amonijum sulfat u finalnoj koncentraciji od 1.2M. Cistein se dodaje u finalnoj koncentraciji od 10mM. pH je podešen do 7.0 i koncentracija kaprilata je podešena do 10mM sa daljim dodavanjem željene zapremine 1M natrijum kaprilata. Dobijeni uzorak je nanet na HIC kolonu.

[0065] PPG smola je spakovana na visinu sloju od 15cm i ekvilibrisana je sa 25mM fosfatnim puferom, pH 7.0 sa 1.2M amonijum sulfatom, 10mM cisteinom i 10mM kaprilatom. Gore pripremljeni uzorak se nanosi na kolonu sa vremenom zadržavanja od 15 minuta. Monomerni albumin se ne vezuje pod gore navednim uslovima dok se proizvod degradacije od 45kDa i agregati albumina vezuju za kolonu. Smola ima kapacitet vezivanja od 15mg/ml. Stoga do 150 mg albumina/ml smole je naneto na kolonu dok su zbir agregata i proizvoda degradacije albumuna <10% ukupnog albumina. Ukoliko procenat agregata i proizvoda degradacije albumina prelazi preko 10%, količina albumina koja treba da se nanese je tome prilagođena.

[0066] Većina monomernog albumina protiče kroz kolonu. Ispiranje sa 3-5 CVs ekvilibracionim puferom uklanja ostatak monomernog albumina, koji je slabo vezan za smolu. Agregati i proizvodi degradacije se eluiraju sa vodom.

[0067] Frakcije slobodnog protoka i ispiranja se zajedno sakupljaju. Regeneracija u ovom koraku je 87-97%. Dodavanje kaprilata dovodi do > 87 % regeneracije monomera dok je u njegovom odsustvu postignuta regeneracija od <70%. Cistein pomaže u održavanju pojedinačnog tiola "slobodnim" i smanjuje pigment u finalnom proizvodu.

[0068] Agregati na kraju ovog koraka su < 2.5%, slobodni tiol >70% i A350/A280= 0.03-0.035. Nisu uočeni tragovi proizvoda degradacije u konačnom pulu.

1

Primer 5: Dijafiltracija

[0069] Dobijene frakcije slobodnog protoka i ispiranja su koncentrovane do > 50mg/ml i dijafiltrirane u odnosu na vodu sve do provodljivosti od <2-3 mS/cm. Regeneracija u ovom koraku je 95-98%. Primer 7: Anjonska izmenjivačka hromatografija

[0070] Anjonska izmenjivačka smola (DEAE Sefaroza Fast Flow ili bilo koja druga anjonska izmenjivačka smola) je spakovana na visinu sloja od 15cm i ekvilibrisana je sa 20mM fosfatnim puferom, pH 7.0. Protein koji se dobija u Primeru 5 je razblažen do 5mg/ml sa vodom i nanosi se na anjonsku jonoizmenjivačku smolu. Kolona je isprana sa 5 CVs pufera za ekvilibrisanje nakon čega sledi eluiranje sa 50mM natrijum acetatom pH 4.5. Ovaj korak dovodi do 98-100% regeneracije proteina.

[0071] Agregati na kraju ovog postupka su < 2.5%, slobodni tiol 0.75-0.80. Pigment se smanjuje na A350/A280= 0.025-0.015.

Primer 8: Koncentrovanje proteina

[0072] Protein koji je eluiran u primeru 7 je podešen na pH 7.0 sa natrijum hidroksidom. Protein se koncentruje do 200 mg/ml i dijafiltrira naspram vode. Fosfatni pufer, pH 7.0, natrijum hlorid i natrijum kaprilat se dodaju u finalnoj koncentraciji od 20mM natrijum fosfatnog pufera, pH 7.0. 144 mM natrijum hlorida i 8mM natrijum kaprilata, respektivno. Protein je proceđen kroz filtere od 0.2 mikrona u boce za skladištenje. Flaširani protein je podvrgnut pasterizaciji na 60°C u trajanju od 10h. Finalni proizvod ima karakteristike koje su prikazane na SL 14.

[0073] Fizičkohemijske karakteristike albumina su identične sa standardnim albuminom kako je određeno masenom spektrofotometrijom, N terminalnim sekvenciranjem, C terminalnim sekvenciranjem, IEF, 2 D IEF, UV, fluorescencijom i CD spektrom i karakteristikama vezivanja za bilirubin, varfarin i masne kiseline.

[0074] Protein koji je prečišćen postupkom iz predmetnog pronalaska ima za rezultat humani rekombinantni albumin iz seruma visoke čistoće. Čitav proces prečišćavanja je završen u toku dva dana od sakupljanja do finalnog dobijenog proizvoda . Ovo proces čini komercijalno uspešnim i održivim. Prema tome, postupak je isplativ.

Claims (5)

Patentni zahtevi

1. Postupak za prečišćavanje rekombinantnog humanog albumina, a postupak (100) obuhvata korake:

a. odvajanje mnoštva ćelija iz fermentacionog bujona ili sakupljanje centrifugiranjem (101);

b. mikrofiltraciju dobijenog supernatanta bez ćelija (102);

c. koncentrovanje mikrofiltriranog supernatanta i njegovu dijafiltraciju prema vodi (103);

d. nanošenje dijafiltriranog uzorka na kolonu za izmenu katjona za prečišćavanje u režimu vezivanja i eluiranja (104);

e. odvajanje monomernog albumina od agregata i proizvoda degradacije hromatografijom sa hidrofobnim interakcijama dodavanjem 5-30mM cisteina u 5-30mM kaprilata u režimu slobodnog protoka (105);

f. sakupljanje frakcija slobodnog protoka i ispiranja i dijafiltracije istih naspram vode (106);

g. nanošenja albumina na hromatografsku smolu za izmenu anjona u režimu vezivanja i eluiranja (107);

h. koncentrovanje eluiranog proteina i njegove dijafiltracije naspram vode (108); i

i. sterilnog ceđenja proteina i izlaganja pasterizaciji na 60°C u trajanju od 1-10 sati (109).

2. Postupak prema bilo kom od zahteva 1, gde je fermentacioni bujon odabran iz grupe koja se sastoji od bakterija, gljiva, ćelija sisara ili homogenata transgenih biljaka koje proizvode rekombinantni humani albumin.

3. Postupak prema bilo kom od zahteva 1-2, gde se pomenuto nanošenje dijafiltriranog uzorka na smolu za izmenu katjona izvodi postepenim povećanjem vremena zadržavanja, tako omogućavajući povećavanje kapaciteta nanošenja 75-150% iznad obeleženog kapaciteta vezivanja smole.

4. Postupak prema bilo kom od zahteva 1-3, gde je porast regeneracije proteina albumina u pulu frakcija slobodnog protoka i ispiranja do > 87% u HIC u režimu slobodnog protoka.

5. Postupak prema bilo kom od zahteva 1-4, gde je odnos slobodnog tiola albumina 0.7 u HIC u režimu slobodnog protoka.