RS60226B1 - Stabilne vodene formulacije adalimumaba - Google Patents

Description

Oblast pronalaska

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na vodene farmaceutske sastave pogodne za dugotrajno skladištenje adalimumaba (uključujući proteine antitela koji se smatraju ili su namenjeni kao „bio-slične“ ili „bio-bolje“ varijante komercijalno dostupnog adalimumaba), postupke proizvodnje sastava, postupke njihove primene i komplete koji ih sadrže.

Stanje tehnike

[0002] Faktor nekroze tumora alfa (TNFα) je prirodni sisarski citokin koji se proizvodi u različitim tipovima ćelija, uključujući monocite i makrofage kao odgovor na endotoksin ili druge stimuluse. TNFα je glavni posrednik upalnih, imunoloških i patofizioloških reakcija (Grell, M., i dr. (1995) Cell, 83: 793-802).

[0003] Rastvorljivi TNFα nastaje cepanjem prekursorskog transmembranskog proteina (Kriegler, i dr. (1988) Cell 53: 45-53), i izlučeni 17 kDa polipeptidi sastavljaju se u rastvorljivim homotrimer kompleksima (Smith, i dr. (1987), J. Biol. Chem.262: 6951-6954; za komentare o TNF, pogledati Butler, i dr. (1986), Nature 320:584; Old (1986), Science 230: 630). Ovi kompleksi se zatim vezuju za receptore koji se nalaze u raznim ćelijama. Vezivanje proizvodi niz pro-upalnih efekata, uključujući (i) oslobađanje drugih protiv-upalnih citokina poput interleukina (IL)-6, IL-8 i IL-1, (ii) oslobađanje matričnih metaloproteinaza i (iii) regulacija na gore eksprimiranja molekula endotelne adhezije, dodatno pojačavajući upalnu i imunu kaskadu privlačenjem leukocita u ekstravaskularna tkiva.

[0004] Postoje mnogi poremećaji povezani sa povišenim nivoom TNFα. Na primer, pokazalo se da je TNFα regulisan na gore u mnogim ljudskim bolestima, uključujući hronične bolesti kao što su reumatoidni artritis (RA), upalni poremećaji creva, uključujući Kronovu bolest i ulcerozni kolitis, sepsu, kongestivno zatajenje srca, bronhijalnu astmu i multiplu sklerozu. TNFα se takođe naziva pro-upalni citokin.

[0005] Fiziološki, TNFα je takođe povezan sa zaštitom od određenih infekcija (Cerami. i dr. (1988), Immunol. Today 9:28). TNFα se oslobađa od strane makrofaga koji su aktivirani lipopolisaharidi Gram-negativnih bakterija. Kao takav, čini se da je TNFα endogeni posrednik od centralnog značaja koji je uključen u razvoj i patogenezu endotoksičnog šoka povezanog sa bakterijskom sepsom.

[0006] Adalimumab (Humira®, AbbVie, Inc.) je rekombinantno ljudsko IgG1 monoklonsko antitelo specifično za ljudski TNF. Ovo antitelo je takođe poznato kao D2E7. Adalimumab se sastoji od 1330 aminokiselina i ima molekulsku masu od približno 148 kilodaltona.

Adalimumab je opisan i zahtevan u SAD patent br.6,090,382. Adalimumab se obično proizvodi rekombinantnom DNK tehnologijom u sistemu eksprimiranja ćelija sisara, kao što su, na primer, ćelije jajnika kineskog hrčka. Adalimumab se specifično vezuje za TNFα i neutrališe biološku funkciju TNF-a blokirajući njegovu interakciju sa p55 i p75 ćelijskim TNF receptorima.

[0007] U struci su poznate različite formulacije adalimumaba. Pogledati, na primer, SAD patente 8,216,583 i 8,420,081. Još uvek postoje potrebe za stabilnim tečnim formulacijama adalimumaba koji omogućavaju njegovo dugotrajno skladištenje bez značajnog gubitka efikasnosti.

[0008] WO 2012/065072 A2 i US 2010/0278822 A2 opisuju formulacije visokih koncentracija proteina anti-TNFα antitela.

Sažetak pronalaska

[0009] Predmetni pronalazak je definisan nezavisnim patentnim zahtevom 1. Zavisni patentni zahtev prikazuje dodatna otelotvorenja predmetnog pronalaska.

[0010] Pronalazak pruža stabilne vodene formulacije koje sadrže adalimumab koje omogućavaju njegovo dugoročno skladištenje.

[0011] U otelotvorenju (A), vodeni farmaceutski sastav se sastoji od: (i) 50 mg/mL adalimumaba, (ii) 10 mM histidinskog pufera, (iii) 120 mM glicina, (iv) 120 mM arginina i (v) 0,1% težine polisorbata 80.

[0012] U otelotvorenju (B), vodeni farmaceutski sastav se sastoji od: (i) 50 mg/ml adalimumaba, (ii) 10 mM histidinskog pufera, (iii) 120 mM glicina, (iv) 120 mM arginina i (v) 0,05% težine polisorbata 80.

[0013] U otelotvorenju (C), vodeni farmaceutski sastav se sastoji od: (i) 50 mg/ml adalimumaba, (ii) 10 mM histidinskog pufera, (iii) 120 mM glicina, (iv) 120 mM arginina i (v) 0,01% težine polisorbata 80.

[0014] U otelotvorenju (D), vodeni farmaceutski sastav se sastoji od: (i) 50 mg/mL adalimumaba, (ii) 10 mM histidinskog pufera, (iii) 120 mM glicina, (iv) 120 mM arginina i (v) 0,05% težine polisorbata 20.

[0015] U otelotvorenju (E), vodeni farmaceutski sastav se sastoji od: (i) 50 mg/ml adalimumaba, (ii) 10 mM histidinskog pufera, (iii) 120 mM glicina, (iv) 120 mM arginina i (v) 0,1% težine pluronic-a F-68.

[0016] U otelotvorenju (F), vodeni farmaceutski sastav se sastoji od: (i) 50 mg/ml adalimumaba, (ii) 20 mM histidinskog pufera, (iii) 150 mM glicina, (iv) 100 mM arginina i (v) 0,01% težine polisorbata 80.

[0017] U otelotvorenju (G), vodeni farmaceutski sastav se sastoji od: (i) 50 mg/ml adalimumaba, (ii) 20 mM histidinskog pufera, (iii) 120 mM glicina, (iv) 120 mM arginina i (v) 0,01% težine polisorbata 20.

[0018] U svakom od otelotvorenja (A)-(G), vodeni farmaceutski sastav ima pH od 5,2.

[0019] U daljem aspektu, pronalazak je usmeren na sastav za upotrebu u postupku tretmana upalnog stanja kod pacijenta koji obuhvata primenu takvom pacijentu bilo kog od otelotvorenja adalimumab formulacije (A)-(G) kao što je opisano iznad.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0020]

Slika 1 je grafikon stabilnosti različitih formulacija adalimumaba kako je određeno hromatografijom isključivanja veličine (SEC).

Slika 2 je grafikon stabilnosti različitih formulacija adalimumaba kako je određeno tečnom hromatografijom visokih performansi obrnute faze (RP) (HPLC).

Slika 3 je grafikon parcijalnog modela 1 najmanjih kvadrata (PLS) koji pokazuje uticaj citrata/fosfata na stabilnost.

Slika 4 je grafikon PLS modela 2 koji pokazuje uticaj citrata/fosfata na stabilnost. Slika 5 je grafikon PLS modela 1 koji pokazuje uticaj histidina/glicina na stabilnost. Slika 6 je grafikon PLS modela 1 koji pokazuje uticaj arginina/sorbitola na stabilnost. Slika 7 je grafikon PLS modela 1 koji pokazuje uticaj pH/histidina na stabilnost. Slika 8 je grafikon PLS modela 2 koji pokazuje uticaj pH/histidina na stabilnost. Slika 9 je grafikon PLS modela 2 koji pokazuje efekat trehaloze/PS80 na stabilnost. Slika 10 je grafikon PLS modela 2 koji pokazuje uticaj manitola/PS80 na stabilnost. Slika 11 je grafikon PLS modela 1 koji pokazuje uticaj manitola/NaCl na stabilnost. Slika 12 je grafikon PLS modela 1 koji pokazuje uticaj EDTA/metionina na stabilnost.

Slika 13 je grafikon PLS modela koji pokazuje uticaj citrata i fosfata na stabilnost. Slika 14 je grafikon PLS modela koji pokazuje uticaj pH i histidinskog pufera na stabilnost.

Slika 15 je grafikon PLS modela koji pokazuje uticaj glicina i arginina na stabilnost. Slika 16 je grafikon PLS modela koji pokazuje uticaj NaCl i polisorbata 80 (PS 80) na stabilnost.

Slika 17 je grafikon PLS modela B koji pokazuje uticaj citrata i fosfata na stabilnost. Slika 18 je grafikon PLS modela B koji pokazuje uticaj pH i histidinskog pufera na stabilnost.

Slika 19 je grafikon PLS modela B koji pokazuje uticaj arginina i glicina na stabilnost.

Slika 20 je grafikon PLS modela B koji pokazuje uticaj PS80 i manitola na stabilnost. Slika 21 je grafikon PLS modela B koji pokazuje uticaj EDTA i NaCl na stabilnost. Slika 22 je grafikon PLS modela B koji pokazuje uticaj sukcinatnog pufera i histidinskog pufera na stabilnost.

Slika 23 je grafikon PLS modela C koji pokazuje uticaj citrata i fosfata na stabilnost. Slika 24 je grafikon PLS modela C koji pokazuje uticaj pH i histidinskog pufera na stabilnost.

Slika 25 je grafikon PLS modela C koji pokazuje uticaj arginina i glicina na stabilnost.

Slika 26 je grafikon PLS modela C koji pokazuje uticaj manitola i PS 80 na stabilnost.

Slika 27 je grafikon PLS modela C koji pokazuje uticaj PS 80 i NaCl na stabilnost. Slika 28 je grafikon PLS modela C koji pokazuje uticaj pH i koncentracije proteina na stabilnost.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

[0021] Različita otelotvorenja predmetnog pronalaska su sada detaljno opisana. Kako se koristi u opisu i patentnim zahtevima, oblici jednine uključuju pozivanje i na množinu, osim ako kontekst jasno ne diktira drugačije. Takođe, kako se koristi u opisu i patentnim zahtevima, značenje „u“ uključuje „u“ i „na“, osim ako kontekst jasno ne diktira drugačije. Pored toga, neki pojmovi koji se koriste u ovoj specifikaciji su preciznije definisani u daljem tekstu.

DEFINICIJE

[0022] Izrazi korišćeni u ovoj specifikaciji uglavnom imaju svoje uobičajeno značenje u struci, u kontekstu predmetnog pronalaska i u specifičnom kontekstu gde se koristi svaki izraz. Određeni izrazi koji se koriste za opisivanje pronalaska razmatrani su u daljem tekstu ili na drugom mestu u specifikaciji, kako bi se stručnjacima omogućile dodatne smernice u pogledu opisa pronalaska. Navedeni su sinonimi za određene izraze. Navođenje jednog ili više sinonima ne isključuje upotrebu drugih sinonima. Upotreba primera bilo gde u ovoj specifikaciji, uključujući primere bilo kojih ovde opisanih izraza, samo je ilustrativna i ni na koji način ne ograničava obim i značenje pronalaska ili bilo kog primera navedenog izraza. Ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni izrazi koji su ovde korišćeni imaju isto značenje kao što je uobičajeno shvaćeno od strane stručnjaka iz oblasti na koju se predmetni pronalazak odnosi. U slučaju sukoba, preovlađuje predmetni dokument, uključujući definicije.

[0023] „Oko“, „otprilike“ ili „približno“ po pravilu znače unutar 20 procenata, unutar 10 procenata, unutar 5, 4, 3, 2 ili 1 procenta date vrednosti ili raspona. Navedene numeričke količine su približne, što znači da se izraz „oko“, „otprilike“ ili „približno“ može podrazumevati ako nije izričito naveden.

[0024] Izraz „adalimumab“ je sinonim za aktivni farmaceutski sastojak u Humira®, kao i za protein koji se smatra ili je zamišljen kao njegova bio-slična ili bio-bolja varijanta.

Adalimumab je rekombinantno ljudsko IgG1 monoklonsko antitelo specifično za ljudski TNF. Adalimumab je takođe poznat kao D2E7. Adalimumab ima dva laka lanca, svaki sa molekulskom težinom od oko 24 kilodaltona (kDa) i dva IgG1 teška lanca, svaki sa molekulskom težinom od oko 49 kDa. Svaki lanac se sastoji od 214 aminokiselinskih ostataka, i svaki teški lanac se sastoji od 451 aminokiselinskih ostatka. Tako se adalimumab sastoji od 1330 aminokiselina i ima ukupnu molekulsku masu od približno 148 kDa. Izraz adalimumab takođe treba da obuhvati takozvane bio-slične ili bio-bolje varijante adalimumab proteina koji se koristi u komercijalno dostupnom Humira®. Na primer, varijanta komercijalnog Humira® može biti prihvatljiva za FDA kada ima u osnovi iste farmakološke efekte kao komercijalno dostupni Humira®, iako može da pokaže određena fizička svojstva, kao što je profil glikozilacije, koja mogu biti slična ako nisu identična sa Humira®.

[0025] Za potrebe ove prijave, izraz „adalimumab“ takođe obuhvata adalimumab sa manjim modifikacijama u strukturi aminokiselina (uključujući brisanja, dodavanja i/ili supstitucije aminokiselina) ili u svojstvima glikozilacije, koje ne utiču značajno na funkciju polipeptida. Izraz „adalimumab“ obuhvata sve oblike i formulacije Humira®, uključujući, ali ne ograničavajući se na koncentrovane formulacije, formulacije spremne za upotrebu u injekcijama; formulacije rekonstituisane vodom, alkoholom i/ili drugim sastojcima i druge.

[0026] Izraz „ljudski TNFα“ (koji se u skraćenom obliku može nazvati hTNFα, ili jednostavno hTNF), kako se ovde koristi, odnosi se na ljudski citokin koji postoji kao oblik koji izlučuje 17 kD i 26-kD membranski oblik, biološki aktivan oblik koji se sastoji od trimera nekovalentno vezanih 17 kD molekula. Struktura hTNFα je dalje opisana, na primer, kod Pennica, D., i dr. (1984) Nature 312:724-729; Davis, J. M., i dr. (1987) Biochemistry 26:1322-1326; and Jones, E. Y., i dr. (1989) Nature 338:225-228. Izraz ljudski TNFα podrazumeva da uključuje rekombinantni ljudski TNFα (rhTNFα), koji se može pripremiti standardnim rekombinantnim postupcima eksprimiranja ili kupiti komercijalno (R & D Systems, Catalog No.210-TA, Minneapolis, Minn.).

[0027] Izraz „antitelo“, kako se ovde koristi, odnosi se na molekule imunoglobulina koji se sastoje od četiri polipeptidna lanca, dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama. Svaki teški lanac se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca (skraćeno ovde HCVR ili VH) i konstantnog regiona teškog lanca. Konstantni region teškog lanca sastoji se od tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca (skraćeno ovde LCVR ili VL) i konstantnog regiona lakog lanca. Konstantni region lakog lanca sastoji se od jednog domena, CL. VH i VL regioni mogu se dalje podeliti na regione hipervarijabilnosti, nazvane regioni koji određuju komplementarnost (CDR), koji su isprepleteni sa regionima koji su očuvaniji, i nazivaju se okvirni regioni (FR). Svaki VH i VL se sastoji od tri CDR i četiri FR, raspoređenih od aminokraja do karboksi-kraja u narednom redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. U jednom otelotvorenju predmetnog pronalaska, formulacija sadrži antitelo sa sekvencama CDR1, CDR2 i CDR3 poput onih opisanih u SAD patenti br.6,090,382; 6,258,562, i 8,216,583.

[0028] Antitelo ili njegov antigen-vezujući deo može biti deo većeg imunoadhezijskog molekula, formiranog kovalentnim ili nekovalentnim povezivanjem antitela ili delova antitela sa jednim ili više drugih proteina ili peptida. Primeri takvih imunoadhezijskih molekula uključuju upotrebu regiona streptavidinskog jezgra za pravljenje tetramernog scFv molekula (Kipriyanov, S. M., i dr. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) i upotrebu ostatka cisteina, marker peptida i C-terminalne polihistidinske oznake za pravljenje bivalentnih i biotiniliranih scFv molekula (Kipriyanov, S. M., i dr. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058). Delovi antitela, kao što su Fab i F(ab')2fragmenti, mogu se pripremiti iz celih antitela koristeći uobičajene tehnike, kao što su varenje papaina ili pepsina, respektivno, od celih antitela. Štaviše, antitela, delovi antitela i imunoadhezijski molekuli mogu se dobiti korišćenjem standardnih tehnika rekombinantne DNK, kao što je ovde opisano.

[0029] Izraz „izolovano antitelo“, kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo koje je značajno bez drugih antitela koja imaju različite antigenske specifičnosti (npr., izolovano antitelo koje se specifično vezuje za hTNFα je značajno bez antitela koja specifično vezuju antigene koji nisu hTNFα). Izolovano antitelo koje se specifično vezuje za hTNFα može, međutim, da ima unakrsnu reaktivnost na druge antigene, kao što su molekuli TNFα drugih vrsta. Štaviše, izolovano antitelo može biti značajno bez drugog ćelijskog materijala i/ili hemikalija.

[0030] Izraz „glicin“ odnosi se na aminokiselinu čiji su kodoni GGT, GGC, GGA i GGG.

[0031] izraz „arginin“ odnosi se na α-aminokiselinu čiji su kodoni CCU, CCC, CCA i CCG.

[0032] Izraz „alanin“ odnosi se na aminokiselinu čiji su kodoni GCT, GCC, GCA i GCG.

[0033] Izraz „metionin“ odnosi se na aminokiselinu čiji je kodon ATG.

[0034] Izraz „glutamat“ odnosi se na aminokiselinu čiji su kodoni GAA i GAG.

[0035] Izraz „šećer“ odnosi se na monosaharide, dishaharide i polisaharide. Primeri šećera uključuju, ali nisu ograničeni na, saharozu, glukozu, dekstrozu i druge.

[0036] Izraz „poliol“ odnosi se na alkohol koji sadrži više hidroksilnih grupa. Primeri poliola uključuju, ali nisu ograničeni na, manitol, sorbitol i druge.

[0037] Izraz „metalni jon“ odnosi se na atom metala sa neto pozitivnim ili negativnim električnim nabojem. Za potrebe ove prijave, izraz „metalni joni“ takođe uključuje izvore metalnih jona, uključujući, ali ne ograničavajući se na, metalne soli.

[0038] Izraz „dugoročno skladištenje“ ili „dugoročna stabilnost“ se podrazumeva da farmaceutski sastav može da se čuva tri meseca ili više, šest meseci ili više, i poželjno tokom jedne godine ili više, najpoželjnije minimalni stabilan rok trajanja iznosi najmanje dve godine. Generalno gledano, pojmovi „dugoročno skladištenje“ i „dugoročna stabilnost“ dalje uključuju stabilno trajanje skladištenja koje je barem uporedivo ili bolje od stabilnog roka trajanja koji je obično potreban za trenutno dostupne komercijalne formulacije adalimumaba, bez gubitaka u stabilnosti koji bi učinili da formulacija nije pogodna za svoju farmaceutsku primenu. Takođe se podrazumeva da dugotrajno skladištenje znači da se farmaceutski sastav čuva ili kao tečnost na 2-8°C, ili se zamrzava, npr., na -20°C ili hladnije. Takođe se predviđa da se sastav može zamrzavati i otapati više od jednom.

[0039] Izraz „stabilan“ u pogledu dugoročnog skladištenja podrazumeva da adalimumab sadržan u farmaceutskim sastavima ne gubi više od 20%, ili još poželjnije 15%, ili još poželjnije 10%, i najpoželjnije 5% svoje aktivnosti u odnosu na aktivnost sastava na početku skladištenja.

[0040] Izraz „značajno slobodan“ znači da nije prisutna nijedna supstanca ili je samo minimalna, i količina supstancije u tragovima nema značajnog uticaja na svojstva sastava. Ako se poziva na supstancu koja nije prisutna, to treba shvatiti kao „količina koja se ne može detektovati“.

[0041] Izraz „sisar“ uključuje, ali nije ograničen na, čoveka.

[0042] Izraz „farmaceutski prihvatljiv nosač“ odnosi se na netoksično čvrsto, polu-čvrsto ili tečno punilo, razblaživač, materijal za kapsulaciju, pomoćne formulacije ili ekscipijens bilo kog konvencionalnog tipa. Farmaceutski prihvatljiv nosač nije toksičan za primaoce u korišćenim dozama i koncentracijama, i kompatibilan je sa ostalim sastojcima formulacije.

[0043] Izraz „sastav“ odnosi se na smešu koja obično sadrži nosač, kao što je farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijens koji je uobičajen u struci i koji je pogodan za primenu pacijentu u terapeutske, dijagnostičke ili profilaktičke svrhe. Može da uključuje ćelijsku kulturu u kojoj su polipeptid ili polinukleotid prisutni u ćelijama ili u medijumu za kulturu. Na primer, sastavi za oralnu primenu mogu da formiraju rastvore, suspenzije, tablete, pilule, kapsule, formulacije sa produženim oslobađanjem, oralne ispiranja ili praškove.

[0044] Izrazi „farmaceutski sastav“ i „formulacija“ se upotrebljavaju naizmenično.

[0045] Izraz „tretman“ odnosi se na svaku upotrebu ili primenu lekova za bolest kod sisara i uključuje inhibiranje bolesti, zaustavljanje njenog razvoja, olakšavanje bolesti, na primer, izazivanjem regresije ili vraćanjem ili popravljanjem izgubljenih, nestalih ili oštećenih funkcija; ili podsticanje neefikasnog procesa. Izraz uključuje dobijanje željenog farmakološkog i/ili fiziološkog efekta, koji pokriva svaki tretman patološkog stanja ili poremećaja kod sisara. Efekat može biti profilaktički u smislu da se potpuno ili delimično spreči poremećaj ili njegov simptom i/ili može biti terapeutski u smislu delimičnog ili potpunog tretmana poremećaja i/ili štetnog uticaja koji se može pripisati poremećaju. To uključuje (1) sprečavanje pojave ili ponavljanja poremećaja kod pacijenta koji može biti predisponiran za poremećaj, ali još nije simptomatski, (2) inhibiranje poremećaja, kao što je zaustavljanje njegovog razvoja, (3) zaustavljanje ili prekid poremećaja ili barem pridruženih simptoma, tako da domaćin više ne pati od poremećaja ili njegovih simptoma, poput izazivanja regresije poremećaja ili njegovih simptoma, na primer, obnavljanjem ili popravljanjem izgubljene, nestale ili oštećene funkcije ili stimulisanjem neefikasnog procesa, ili (4) ublažavanje, olakšanje ili umanjenje poremećaja ili simptoma povezanih sa njih, gde se ublažavanje koristi u širem smislu kako bi se odnosilo na barem smanjenje veličine parametra, poput upale, bola i/ili veličine tumora.

1

[0046] Izraz „bolest“ odnosi se na svako stanje, infekciju, poremećaj ili sindrom za koji je potrebna medicinska intervencija ili za koji je poželjna medicinska intervencija. Takva medicinska intervencija može da uključuje tretman, dijagnozu i/ili prevenciju.

[0047] Izraz „terapeutski efikasna količina“ odnosi se na količinu koja, kada se primenjuje živom pacijentu, postiže željeni efekat na živog pacijenta. Na primer, efikasna količina polipeptida predmetnog pronalaska za primenu kod živog pacijenta je količina koja sprečava i/ili leči integrin-αvβ3 posredovanu bolest. Tačna količina zavisi od svrhe tretmana i utvrdiće je stručnjak u oblasti koristeći poznate tehnike. Kao što je poznato u struci, prilagođavanja za sistemsku nasuprot lokalizovanoj primeni, uzrast, telesnu težinu, opšte zdravstveno stanje, pol, ishranu, vreme primene, interakciju leka i težinu stanja mogu biti potrebna, i utvrditi će se rutinskim eksperimentisanjem od strane stručnjaka.

Otelotvorenja pronalaska

[0048] Kada se farmaceutski sastavi koji sadrže adalimumab (Humira®), uključujući vodene i liofilizovane formulacije adalimumaba, čuvaju dugoročno, aktivnost adalimumaba može se izgubiti ili smanjiti usled nakupljanja i/ili razgradnje. Prema tome, predmetni pronalazak pruža vodene formulacije adalimumaba koje omogućavaju stabilno dugoročno skladištenje adalimumaba, tako da je adalimumab stabilan tokom skladištenja u tečnom ili smrznutom stanju. Navedene formulacije ne zahtevaju nikakve dodatne korake poput rehidratacije.

[0049] Brojna otelotvorenja i primeri predmetnog obelodanjenja su detaljnije objašnjeni u nastavku.

Adalimumab

[0050] Svi sastavi predmetnog pronalaska sadrže adalimumab. Kao što je objašnjeno u Stanju tehnike ove prijave, adalimumab je rekombinantno ljudsko IgG1 monoklonsko antitelo specifično za faktor nekroze ljudskog tumora (TNF). Ovo antitelo je takođe poznato kao D2E7. Adalimumab se sastoji od 1330 aminokiselina i ima molekulsku masu od približno 148 kilodaltona. Adalimumab je opisan i zahtevan u SAD patent br.6,090,382. Izraz „adalimumab“ takođe označava takozvane „bio-slične“ i „bio-bolje“ verzije aktivnog adalimumab proteina koji je prisutan u komercijalno dostupnom Humira®.

[0051] Adalimumab pogodan za čuvanje u ovom farmaceutskom sastavu može se proizvesti standardnim postupcima poznatim u stanju tehnike. Na primer, SAD patenti 6,090,382 i 8,216,583 opisuju različite postupke koji bi stručnjak mogao da upotrebi u pripremi adalimumab proteina za upotrebu u formulacijama predmetnog pronalaska. Na primer, adalimumab se može pripremiti rekombinantnim eksprimiranjem gena imunoglobulina lakog i teškog lanca u ćeliji domaćinu.

[0052] Pročišćavanje eksprimiranog adalimumaba može se izvesti bilo kojim standardnim postupkom. Kada se adalimumab proizvodi unutar ćelije, ostaci čestica se uklanjaju, na primer, centrifugiranjem ili ultrafiltracijom. Kada se adalimumab izlučuje u medijum, supernatanti iz takvih sistema eksprimiranja se mogu prvo koncentrisati korišćenjem standardnih filtera za koncentraciju polipeptida. Inhibitori proteaze se takođe mogu dodati kako bi inhibirali proteolizu i mogu se uključiti antibiotici kako bi se sprečio rast mikroorganizama.

[0053] Adalimumab se može prečistiti korišćenjem, na primer, hidroksiapatitne hromatografije, elektroforeze gela, dijalize i afinitetne hromatografije, i bilo koje kombinacije poznatih ili još neotkrivenih tehnika prečišćavanja, uključujući, ali ne ograničavajući se na, hromatografiju Proteina A, fragmentisanje na koloni za razmenu jona, taloženje etanola, HPLC obrnute faze, hromatografija na silicijum dioksidu, hromatografija na heparinu SEPHAROSET®, hromatografija smole sa razmenom anjona ili katjona (kao što je kolona poliaspartinske kiseline), hromatofokusiranje, SDS-PAGE i taloženje amonijum sulfata.

I Formulacije adalimumaba sa poliolom i/ili surfaktantom, ali bez citratnog/fosfatnog pufera

[0054] U prvom primeru, obelodanjenje pruža stabilan vodeni farmaceutski sastav koji sadrži adalimumab; stabilizator koji sadrži najmanje jedan član izabran iz grupe koju čine poliol i surfaktant; i pufer odabran iz grupe koju čine citrat, fosfat, sukcinat, histidin, tartarat i maleat, gde navedeni sastav ima pH od oko 4 do oko 8, i poželjno oko 5 do oko 6, i gde navedeni pufer ne sadrži kombinaciju citrata i fosfata. U ovom primeru, stabilizator poželjno sadrži i poliol i surfaktant. Farmaceutski sastav može da sadrži jedan, ili bilo koju kombinaciju dva ili više pufera, sve dok ne sadrži i citrat i fosfat. Surfaktant može biti bilo koji farmaceutski prihvatljiv surfaktant, poželjno polisorbati (npr. polisorbat 80) ili poloksameri (npr. Pluronic II Formulacije adalimumaba koristeći sistem sa jednim puferom

[0055] U drugom primeru, koristeći sistem sa jednim puferom, obelodanjenje pruža stabilan vodeni farmaceutski sastav koji sadrži adalimumab, poliol, surfaktant i puferski sistem koji sadrži jedan puferski agens, gde je navedeni jedan pufer izabran od citrata, fosfata, sukcinata, histidina, tartarata ili maleata, ali ne uključujuće kombinacije gore navedenog; gde formulacija ima pH od oko 4 do 8, i poželjno oko 5 do oko 6. Histidin i sukcinat su naročito pogodni za upotrebu kao pojedinačni puferski agensi. Iznenađujuće je otkriveno da su sastavi adalimumaba koji sadrže samo jedan pufer (za razliku od dva ili više pufera) stabilniji od sastava adalimumaba koji sadrže i citratni pufer i fosfatni pufer. U primeru pojedinačnog pufera, adalimumab može biti prisutan u koncentraciji od oko 20 do oko 150 mg/ml, poželjnije od oko 20 do oko 100 mg/ml, i još poželjnije od oko 30 do oko 50 mg/ml. Pufer je prisutan u koncentraciji od oko 5 mM do oko 50 mM. pH sastava je između oko 5 i oko 6. Sastavi sa jednim puferom iz obelodanjenja mogu dalje da sadrže stabilizator izabran iz grupe koju čine aminokiselina, so, etilen diamin tetra sirćetna kiselina (EDTA) i metalni jon.

Aminokiselina je izabrana iz grupe koju čine glicin, alanin, glutamat, arginin i metionin, najpoželjnije glicin, arginin i metionin. So je izabrana iz grupe koju čine natrijum hlorid i natrijum sulfat. metalni jon je izabran iz grupe koju čine cink, magnezijum i kalcijum. Sastavi predmetnog obelodanjenja mogu dalje da sadrže surfaktant. Surfaktant je polisorbatni surfaktant ili poloksamerni surfaktant. Polisorbatni surfaktanti uključuju polisorbat 80, polisorbat 40 i polisorbat 20. Poželjno, polisorbatno surfaktant je polisorbat 80. Ploksamer surfaktanti uključuju poloksamer 188 (komercijalno dostupan i kao Pluronic F-68).

Najpoželjnije, surfaktant je polisorbat 80. Sastav sa jednim puferom može dalje da sadrži poliol. Poželjno, poliol je šećerni alkohol; i još poželjnije, šećerni alkohol je manitol, sorbitol ili trehaloza. Sastava pojedinačnog pufera adalimumaba može takođe da sadrži šećer, poželjno saharozu, glukozu ili dekstrozu.

[0056] U jednom primeru formulacije adalimumaba sa jednim puferom, obelodanjenje pruža stabilan vodeni farmaceutski sastav koji sadrži adalimumab u koncentraciji od oko 20 do oko 150 mg/ml, polisorbat 80 u koncentraciji od oko 1 do 50 µM, i sukcinat u koncentraciji od oko 5 mM i oko 50 mM, gde navedeni sastav ima pH od oko 5 do oko 5,5, i gde je navedeni sastav značajno bez bilo kakvih drugih pufera.

[0057] U drugom primeru formulacije adalimumaba sa jednim puferom, obelodanjenje pruža

1

stabilan vodeni farmaceutski sastav koji sadrži adalimumab u koncentraciji od oko 20 do oko 150 mg/ml, polisorbat 80 u koncentraciji od oko 1 do 50 µM, i histidin u koncentraciji od oko 5 mM i oko 50 mM, gde navedeni sastav ima pH od oko 5 do oko 5,5, i gde je navedeni sastav značajno bez bilo kakvih drugih pufera.

[0058] U narednom primeru formulacije adalimumaba sa jednim puferom, obelodanjenje pruža stabilan vodeni farmaceutski sastav koji sadrži adalimumab u koncentraciji od oko 20 do oko 150 mg/ml, polisorbat 80 u koncentraciji od oko 1 do 50 µM, ili bilo tartarat, maleat ili acetat u koncentraciji od oko 5 mM i oko 50 mM, gde navedeni sastav ima pH od oko 5 do oko 5,5, i gde navedeni sastav ne sadrži značajno bilo koji drugi pufer.

III Formulacije adalimumaba koji isključuju pufer

[0059] U trećem primeru, obelodanjenje pruža stabilan vodeni farmaceutski sastav koji sadrži adalimumab, stabilizator koji sadrži najmanje jedan član izabran od poliola i surfaktanata, gde navedeni sastav ima pH od oko 4 do oko 8, i poželjno oko 5 do oko 6, i gde je navedeni sastav značajno bez pufera. Izraz „bez pufera“ treba razumeti tako da omogućava uključivanje inherentnog puferskog efekta samog proteina. U formulaciji bez pufera, takođe mogu biti prisutni navedeni stabilizatori (npr. glicin, arginin i njihove kombinacije).

IV Formulacije adalimumaba koji isključuju surfaktant

[0060] U četvrtom primeru, obelodanjenje pruža stabilan vodeni farmaceutski sastav koji sadrži adalimumab, poliol i pufer odabran iz grupe koju čine citrat, fosfat, sukcinat, histidin, tartarat i maleat, gde navedeni sastav ima pH od oko 4 do oko 8 i poželjno oko 5 do oko 6, i gde je navedeni sastav bez, ili značajno bez surfaktanta. Poželjno, sastav (i) ne sadrži pufersku kombinaciju citrata i fosfata; i (ii) pufer je najmanje jedan član izabran iz grupe koju čine histidin i sukcinat; i (iii) poliol nije manitol u koncentracijama manjim od oko 150 mM, ali je umesto toga izabran iz grupe koju čine manitol u koncentracijama većim od oko 150 mM, sorbitol i trehaloza.

V Formulacije adalimumaba koje isključuju poliol

[0061] U petom primeru, obelodanjenje pruža stabilan vodeni farmaceutski sastav koji sadrži adalimumab, surfaktant i pufer odabran iz grupe koju čine citrat, fosfat, sukcinat, histidin, tartarat i maleat, gde navedeni sastav ima pH od oko 4 do oko 8, i poželjno oko 5 do oko 6, i gde je navedeni sastav značajno bez poliola. Poželjno, sastav (i) ne sadrži pufersku kombinaciju citrata i fosfata; i (ii) pufer je najmanje jedan član izabran iz grupe koju čine histidina i sukcinat.

[0062] Dodatni stabilizatori korisni u primerima I do V.

Opciono, u svakom od gore navedenih pet primera, smeša može dalje da sadrži stabilizator izabran iz grupe koju čine aminokiselina, so, etilen diamin tetra sirćetna kiselina (EDTA) i metalni jon. Aminokiselina stabilizator može biti izabran iz grupe koju čine glicin, alanin, glutamat, arginin i metionin. So stabilizator može biti izabrana iz grupe koju čine natrijum hlorid i natrijum sulfat. Metalni jon stabilizator može se izabrati iz grupe koju čine cink, magnezijum i kalcijum. Poželjno, formulacije adalimumaba koje sadrže ranije navedene stabilizatore takođe ne sadrže puferske sisteme u kojima su fosfatni pufer i citratni pufer prisutni u kombinaciji. Najpoželjnije (i) opcioni dodatni stabilizator prisutan u ovom primeru nije natrijum hlorid i sadrži najmanje jedan ili oba od arginina i glicina; (ii) pufer, kada je prisutan, ne sadrži kombinaciju citrata i fosfata, već je najmanje jedan od histidina i sukcinata; i (iii) stabilizator kada sadrži poliol nije manitol, osim u količinama većim od oko 150 mM, i može takođe da uključuje trehalozu i sorbitol. Poželjno, količina manitola je veća od oko 150 mM, i najpoželjnije veća od oko 200 mM.

VI Formulacije adalimumaba koji zamenjuju surfaktant i poliol sa drugim stabilizatorima

[0063] Dalje je otkriveno da se može postići zadovoljavajuća stabilizacija kada se navedeni stabilizatori koriste umesto poliola i surfaktanata, shodno tome, u šestom primeru, obelodanjenje pruža stabilan vodeni farmaceutski sastav koji sadrži adalimumab, opciono pufer, stabilizator izabran iz grupe koju čine aminokiselina, so, EDTA i metalni jon i gde navedeni sastav ima pH od oko 4 do oko 8, i poželjno oko 5 do oko 6, i gde je navedeni sastav bez, ili značajno bez poliola i surfaktanta. Kada je pufer prisutan u ovom primeru, naročito je poželjno da (i) pufer ne uključuje kombinaciju citrata i fosfata; (ii) pufer je izabran iz grupe koju čine histidin i sukcinat; i (iii) stabilizator ne sadrži natrijum hlorid, već je najmanje jedan član izabran iz grupe koju čine arginin i glicin. Takođe je poželjno da pufer bude bez, ili značajno bez citratnog pufera, jer smo otkrili da je on generalno lošiji u pogledu doprinosa stabilnosti u odnosu na druge pufere, poput histidina i sukcinata.

[0064] U svakom od gore navedenih primera može da postoji opciono najmanje jedan od narednih povoljnih uslova (osim ako nije navedeno da se zahteva): (i) pufer poželjno ne

1

sadrži kombinaciju citrata i fosfata, ili je bez ili značajno bez citratnog pufera; (ii) pufer je poželjno najmanje jedan član izabran iz grupe koju čine histidin i sukcinat; i (iii) stabilizator poželjno ne sadrži natrijum hlorid, ili ako je prisutan, kontroliše se na nivoe manje od oko 100 mM; (iv) stabilizator je najmanje jedan član izabran iz grupe koju čine arginin i glicin, uključujući njihove kombinacije; i (v) poželjno je da poliol nije manitol (osim ako manitol nije prisutan u količinama većim od oko 150 mM i poželjno većim od oko 200 mM), ali može uključivati sorbitol i trehalozu. Kada se koriste polioli za stabilizaciju, otkriveno je da manitol je destabilizujući u poređenju sa sorbitolom i trehalozom, osim ako manitol nije prisutan u količinama većim od oko 150 do 200 mM. Kada se koriste drugi stabilizatori, ovde je otkriveno da natrijum hlorid destabilizuje u poređenju sa argininom ili glicinom, ali primećujemo određenu stabilizaciju kada se nivoi natrijum-hlorida kontrolišu na manje od oko 100 mM i poželjno manje od oko 75 mM.

[0065] Poželjno, adalimumab je prisutan u sastavu predmetnog obelodanjenja u koncentraciji od oko 20 do oko 150 mg/ml, poželjnije od oko 20 do oko 100 mg/ml, i još poželjnije od oko 30 do oko 50 mg/ml.

[0066] Pufer, ako je prisutan, prisutan je u koncentraciji od oko 5 mM do oko 50 mM.

[0067] Surfaktant, ako je prisutan, poželjno je polisorbat (PS). U još poželjnijem primeru polisorbat je polisorbat 80 (PS 80). Poloksamer surfaktanti su takođe pogodni (npr.

Pluronic® F-68).

[0068] Poliol, ako postoji, je šećerni alkohol. U još povoljnijem primeru, šećerni alkohol je izabran iz grupe koju čine manitol, sorbitol i trehaloza, i najpoželjnije sorbitol i trehaloza.

[0069] Poželjno, poliol je u koncentraciji od oko 1 do oko 10%, poželjnije, od oko 2 do oko 6%, i još poželjnije od oko 3 do 5%, gde su navedene vrednosti težina po zapremini (w/v) ukupnog sastava.

[0070] Stabilizator, ako je prisutan, može se izabrati iz grupe koju čine aminokiselina, so, etilen diamin tetra sirćetna kiselina (EDTA) i metalni jon. Aminokiselina može biti izabrana iz grupe koju čine glicin, alanin, glutamat, arginin i metionin. So može biti izabrana iz grupe koju čine natrijum hlorid i natrijum sulfat. Metalni jon može biti izabran iz grupe koju čine

1

cink, magnezijum i kalcijum. Glicin i arginin su naročito poželjni stabilizatori.

[0071] Cink, magnezijum i kalcijum, kada su prisutni za stabilizaciju, mogu biti u koncentraciji od oko 1 mM do oko 100 mM, i još poželjnije od oko 1 do oko 10 mM.

[0072] Glicin ili arginin ili njihove kombinacije, ako su prisutni za stabilizaciju, su u ukupnoj koncentraciji do oko 300 mM, i poželjno oko 150 do 300 mM.

[0073] Metionin, ako je prisutan za stabilizaciju, prisutan je u koncentraciji od oko 1 do oko 10 mg/ml, poželjnije od oko 1 mg/ml do oko 5 mg/ml.

[0074] Natrijum hlorid, ako je prisutan za stabilizaciju, je u koncentraciji od oko 5 do oko 150 mM, još poželjnije, od oko 20 do oko 140 mM, i još poželjnije manje od oko 100 mM.

[0075] Natrijum sulfat, ako je prisutan za stabilizaciju, je u koncentraciji od oko 5 do oko 150 mM, još poželjnije, od oko 20 do oko 120 mM, i još poželjnije od oko 60 do oko 100 mM.

[0076] EDTA, ako je prisutan za stabilizaciju, je prisutan u koncentraciji od oko 0,01% do oko 0,05%, poželjnije od oko 0,05% do oko 0,25%, i još poželjnije od oko 0,08% do oko 0,2%.

[0077] Poželjno, pH sastava je od oko 5 do oko 5,5; i još poželjnije je oko 5,2 do 5,4.

[0078] U gore navedenom primeru primera I i II, obelodanjenje pruža stabilan vodeni farmaceutski sastav koji sadrži adalimumab u koncentraciji od oko 20 do oko 150 mg/ml, sorbitol ili trehalozu u koncentraciji od oko 1 do 10% težine po zapremini, polisorbat 80 u koncentraciji od oko 1 do 50 µM, i najmanje jedan sukcinatni, histidinski, fosfatni, tartaratni, maleatni ili citratni pufer, u koncentraciji od oko 5 mM do oko 50 mM, gde navedeni sastav ima pH od oko 5 do oko 5,5, i pod uslovom da je navedeni sastav bez, ili značajno bez kombinacije citratnog/fosfatnog pufera. Dalje, svrstavamo citrat kao najlošiji pufer, i poželjno ga izbegavamo iako je još uvek unutar raspona otelotvorenja kako bi se formulisale stabilne formulacije adalimumaba koje uključuju citratni pufer, ako ne i njegovu kombinaciju sa fosfatom.

1

[0079] U primeru primera IV, obelodanjenje pruža stabilan vodeni farmaceutski sastav koji sadrži adalimumab u koncentraciji od oko 20 do oko 150 mg/ml, sorbitol ili trehalozu u koncentraciji od oko 1 do 10% težine po zapremini i najmanje jedan sukcinatnog, histidinskog, fosfatnog, tartaratnog, maleatnog ili citratnog pufera, u koncentraciji od oko 5 mM do oko 50 mM, gde navedeni sastav ima pH od oko 5 do oko 5,5, i gde navedeni sastav uglavnom ne sadrži surfaktant i, opciono, i poželjno, bez ili značajno bez kombinacije citratnog/fosfatnog pufera.

[0080] U primeru primera VI, obelodanjenje pruža stabilan vodeni farmaceutski sastav koji sadrži adalimumab u koncentraciji od oko 20 do oko 150 mg/ml, glicin u koncentraciji od oko 20 do oko 200 mM, i najmanje jedan sukcinatni, histidinski, fosfatni, tartaratni, maleatni ili citratni pufer, u koncentraciji od oko 5 mM do oko 50 mM, gde navedeni sastav ima pH od oko 5 do oko 5,5, i gde je navedeni sastav bez, ili značajno bez, poliola; surfaktant (npr. PS8) je poželjno, ali opciono prisutan; i smeša je, opciono, i poželjno, bez ili značajno bez kombinacije citratnog/fosfatnog pufera.

[0081] U narednom primeru primera VI, obelodanjenje pruža stabilan vodeni farmaceutski sastav koji sadrži adalimumab u koncentraciji od oko 20 do oko 150 mg/ml, arginin ili glicin u koncentraciji od oko 1 do oko 250 mM, i najmanje jedan iz grupe koju čine sukcinatni, histidin, fosfatni, tartaratni, maleatni ili citratni pufer, u koncentraciji od oko 5 mM i oko 50 mM, gde navedeni sastav ima pH od oko 5 do oko 5,5, i gde navedeni sastav uglavnom ne sadrži poliol. Surfaktant (npr. PS80) je poželjno, ali opciono, prisutan, i smeša je, opciono, i poželjno, bez ili značajno bez kombinacije citratnog/fosfatnog pufera.

[0082] U narednom primeru primera VI, obelodanjenje pruža stabilan vodeni farmaceutski sastav koji sadrži adalimumab u koncentraciji od oko 20 do oko 150 mg/ml, natrijum hlorid u koncentraciji od oko 5 do oko 150 mM, i najmanje jedan sukcinat, pufer histidin, fosfat, tartarat, maleat ili citrat, u koncentraciji od oko 5 mM i oko 50 mM, gde navedeni sastav ima pH od oko 5 do oko 5,5, i gde je navedeni sastav bez, ili značajno bez poliola. Surfaktant (npr. PS80) je poželjno, ali opciono prisutan; i smeša je, opciono, i poželjno, bez ili značajno bez kombinacije citratnog/fosfatnog pufera.

[0083] U primeru primera V, obelodanjenje pruža stabilan vodeni farmaceutski sastav koji sadrži adalimumab u koncentraciji od oko 20 do oko 150 mg/ml, natrijum hlorid u

1

koncentraciji od oko 5 do oko 150 mM, polisorbat 80 u koncentraciji od oko 1 do 50 µM, i bar jedan sukcinatni, histidinski, fosfatni, tartaratni, maleatni ili citratni pufer, u koncentraciji od oko 5 mM i oko 50 mM, gde navedeni sastav ima pH od oko 5 do oko 5,5, i gde je navedeni sastav bez ili značajno bez poliola i, po izboru, poželjno, bez ili značajno bez citratnog/fosfatnog pufera.

[0084] U primeru primera I i II, sa dodatnom stabilizacijom, obelodanjenje pruža stabilan vodeni farmaceutski sastav koji sadrži adalimumab u koncentraciji od oko 20 do oko 150 mg/ml, polisorbat 80 u koncentraciji od oko 1 do oko 50 µM, sorbitol ili trehalozu u koncentraciji od oko 1 do oko 10% težine po zapremini, EDTA u koncentraciji od oko 0,01% do oko 0,5%, i najmanje jedan sukcinat, histidin, fosfat, tartarat, maleat ili citrat, kao jedini pufer, u koncentraciji od oko 5 mM i oko 50 mM, gde navedeni sastav ima pH od oko 5 do oko 5,5, i gde je sastava bez, ili značajno bez kombinacije citratnog/fosfatnog pufera.

[0085] U narednom primeru primera I i II, sa dodatnom stabilizacijom, obelodanjenje pruža stabilan vodeni farmaceutski sastav koji sadrži adalimumab u koncentraciji od oko 20 do oko 150 mg/ml, polisorbat 80 u koncentraciji od oko 1 do oko 50 µM, sorbitol ili trehalozu u koncentraciji od oko 1 do oko 10% težine po zapremini metionina u koncentraciji od oko 1 do oko 10 mg/ml,%, i najmanje jedan sukcinat, histidin, fosfat, tartarat, maleat ili citrat pri koncentraciji od oko 5 mM i oko 50 mM gde navedeni sastav ima pH od oko 5 do oko 5,5, gde je sastav bez ili značajno bez bilo koje kombinacije citratnog/fosfatnog pufera.

[0086] U narednom primeru primera I i II, sa dodatnom stabilizacijom aminokiselina, pružen je stabilan vodeni farmaceutski sastav koji sadrži adalimumab u koncentraciji od oko 20 do oko 150 mg/ml, polisorbat 80 u koncentraciji od oko 1 do oko 50 µM, manitol, sorbitol ili trehalozu (poželjno sorbitol) u koncentraciji od oko 1 do oko 10% težine po zapremini i aminokiselina koja je poželjno jedna, ali ne obe od (a) arginina u koncentraciji od oko 1 do oko 250 mg/ml i (b) glicina u koncentraciji od oko 20 do 200 mg/ml, i histidinski pufer ili sukcinatni pufer u koncentraciji od oko 5 mM i oko 50 mM, i gde navedeni sastav ima pH od oko 5 do oko 5,5; i gde je sastav bez ili značajno bez bilo koje kombinacije citratnog/fosfatnog pufera.

[0087] U narednom primeru primera IV, sa dodatnom stabilizacijom aminokiselina, obelodanjenje pruža stabilan vodeni farmaceutski sastav koji sadrži adalimumab u

1

koncentraciji od oko 20 do oko 150 mg/ml, polisorbat 80 u koncentraciji od oko 1 do oko 50 µM, arginin u koncentraciji od oko 1 do oko 250 mg/ml, glicin u koncentraciji od oko 20 do 200 mg/ml, i histidinski pufer ili sukcinatni pufer u koncentraciji od oko 5 mM do oko 50 mM, i gde navedeni sastav ima pH od oko 5 do oko 5,5 i bez je, ili je značajno bez poliola; i, opciono, gde je sastav poželjno bez bilo koje kombinacije citratnog/fosfatnog pufera.

[0088] Brojna otelotvorenja i primeri formulacija adalimumaba predmetnog obelodanjenja pripremljene su u osam odvojenih blokova eksperimenata, koji se ovde nazivaju od „Bloka A“ do „Bloka H“. Svaki blok imao je 12 do 16 različitih formulacija koje su bile izložene ubrzanim uslovima skladištenja, 1 nedelja na 40°C i 2 nedelje na 25°C. Za svaku vremensku tačku merena je hemijska i fizička stabilnost adalimumab proteina sa SEC, RP, UV, pH, CE-IEF i CE-SDS.

MATERIJALI I POSTUPCI

[0089]

1. Oprema koja se koristi u formulacijama ispitivanja

2. Hemikalije i materijali koji se koriste u formulacijama

2

3. HPLC kolone koji se koriste u formulacijama ispitivanja

[0090] Obrada Humira®. Blok A Eksperimenti su koristili adalimumab prisutan u komercijalno dostupnom Humira®. Humira® materijal je dijalizovan na naredni način: 100 µL Humira® je smešteno u jedinice za mini dijalizu sa 3,5 MWCO i dijalizovano u 1 L pufera za formulaciju tokom 24 sata na 4 do 8°C. Nekoliko uzoraka doživelo je malo povećanja zapremine usled dijalize, ali nikada do te mere da je koncentracija polisorbata 80 pala ispod CMC (kritična koncentracija micela).

[0091] Koncentracija proteina za svaku formulaciju merena je UV apsorbancionom spektroskopijom, koristeći izračunatu eksperimentalnu molarnu apsorptivnost na osnovu prijavljene koncentracije Humira®, 50 mg/mL. Za brojne formulacije, koncentracija proteina je podešena upotrebom centrifugalnog koncentratora. Uzorak je smešten u centrifugalni koncentratora i rotiran na 14.000 o/min tokom 30 do 60 sekundi. Koncentracija proteina je zatim proverena sa UV. Nakon što je dostignuta ciljana koncentracija proteina oko 50 mg/ml, uzorci su filtrirani kroz sterilni filter od 0,22 µM u sterilnim bočicama u poklopcu za biološku sigurnost. Zatim su uzorci smešteni na stabilnost na 40°C tokom jedne i dve nedelje.

[0092] Prerada vlasničkog adalimumab proteina. Ovde opisana ispitivanja formulacija koristila su vlasnički bio-slični adalimumab protein koji nije sadržao polisorbat 80. Materijal je dijaliziran pomoću 7000 MWCO Slide-A-Lyzera u različitim puferima za formulacije tokom 24 sata na temperaturnom rasponu između 4 do 8°C. Nakon dijalize koncentracija proteina je izmerena pomoću UV i, i izmerena je pH vrednost uzorka. Ciljana koncentracija uzoraka bila je 50 ± 2,5 mg/mL, koja je prilagođena ako koncentracija uzorka ispadne iz gore navedenog raspona. Neki od uzoraka su imali povećanu zapreminu uzorka do razblaživanja, zahtevajući da se koncentracija proteina poveća. Za ove uzorke koncentracija proteina je povećana korišćenjem centrifugalnog koncentratora, obično pri 14.000 o/min tokom 30 do 60 sekundi. pH većeg broja uzoraka je podešen pomoću 1M NaOH ili 1M HCl kako bi se dostigao ciljani pH od 5,2.

[0093] Nakon što se utvrdi da je ciljana koncentracija proteina i pH uzoraka unutar eksperimentalnih parametara, uzorci su filtrirani kroz sterilni filter od 0,22 µM u sterilnim bočicama u poklopcu za biološku sigurnost. Zatim su uzorci stavljeni na stabilnost na 40°C tokom jedne nedelje i na 25°C tokom dve nedelje.

[0094] Uslovi zamrzavanja i odmrzavanja: Uzorci zamrzavanja i odmrzavanja pripremljeni su na dan analize kako bi se podudarali sa t=0. Uzorci su zamrznuti na -80°C između 3 i 7 minuta. Zamrznuti uzorak se zatim odmrzava na sobnoj temperaturi dok se sav led nije otopio. Ciklus zamrzavanja i odmrzavanja ponovljen je 5 puta za svaki uzorak.

[0095] Studije agitacije. Uzorci su agregirani na 150 o/min tokom 24 sata na 4°C na ploči. Pripremljen je kontrolni sloj i postavljen pored potporne ploče za svaki uzorak koji je podvrgnut agitaciji.

[0096] pH merenja. pH svakog uzorka je meren pomoću mikro-pH sonde. Pre početka analize, pH sonda je kalibrisana sa tri pH standarda naručena od Fisher. pH vrednosti uzorka stabilnosti merene su prenošenjem 60 µL svakog uzorka stabilnosti u 100 µL PCR epruvete. Zatim je mikro-pH sonda potopljena u uzorak, i vrednost je zabeležena nakon što je stabilizovana.

[0097] UV apsorpciona spektroskopija. Za merenje koncentracije proteina u uzorcima korišćena je UV spektroskopija. Koeficijent izumiranja mola na 280 nm za sirovinu iznosio je 1,6355 mg/mL, što je utvrđeno eksperimentalno. Koncentracije proteina svih formulacija za LB-140 merene su korišćenjem dužine ćelijskog puta 0,0096 cm. U nastavku su parametri analize koji se koriste za LB-140.

2

Raspon skeniranja: 400 do 200 nm

Prosečno vreme (min): 0.1

Datum intervala (nm): 1

Brzina skeniranja (nm/min): 600

Broj ciklusa: 5

[0098] Postupak hromatografije za isključivanje veličine (SEC). SEC postupak koji se koristi za analizu uzoraka stabilnosti LB-140 razvijena je odstrane Legacy BioDesign. U nastavku je dat kratak rezime parametra SEC postupka koji se koriste za analizu LB-140 uzoraka.

Parametri postupka

[0099] Informacije o koloni: ACQUITY UPLC BEH200 SEC, kolona 1,7 µm, 4,6 x 150 mm Pufer za analizu: 50 mM fosfat, 250 mM NaCl, pH 6.8

Brzina protoka: 0,3 ml/min

Temperatura kolone: 30°C

Detekcija: 280 nm

Zapremina ubrizgavanja: 2 µL

Temperatura uzorka: Približno 0°C

[0100] RP RPLC postupak. Otkriveno je da RPLC postupak pokazuje stabilnost i koristi se za analizu stabilnosti LB-140 uzoraka. U nastavku je rezime parametara RP postupka koji se koriste za analizu LB-140.

Parametri postupka

[0101] Informacije o koloni: Poroshell 300SB-C8,2,1x75mm, 5um

Faza mobilne A: 98% (v/v) H2O/2% (v/v) IPA/0,1% (v/v) TFA

Faza mobilne B: 10% (v/v) H2O/70% (v/v) IPA/20% (v/v) ACN/0,1% (v/v) TFA Brzina protoka: 0,25 mL/min

Temperatura kolone: 80°C

Detekcija: 225 nm

Zapremina ubrizgavanja: 1 µL

Temperatura uzorka: Približno 0°C

Vreme trajanja: 15 minuta

Gradijent:

[0102] CE-IEF analiza. Kapilarno izoelektrično fokusiranje (clEF) je sprovedeno kao što je opisano u PA 800 plus Application Guide koji je objavljen od strane Beckman Coulter.

Detaljniji opis može se naći u članku o istraživanju koji je objavljen od strane Mack i dr<1>. Sve analize su vršene korišćenjem Beckman Coulter P/ACE MDQ sistema (Beckman Coulter, Inc.; Brea, CA) na sobnoj temperaturi, sa 30 cm ukupne dužine (efektivno 20 cm) neutralnog kapilara. Neutralni kapilar pripremljen je imobilizovanjem poli (akrilamida) na zid kapilare koristeći postupak koji je opisan od strane Gao i dr.<2>clEF uzorci su pripremljeni mešanjem proteina od interesa u 0,25 mg/ml sa smešom 3M urea-clEF gela koji sadrži amfolit, katodni stabilizator, anodni stabilizator i pl markere. Uzorak se pod pritiskom ubrizgava u 9,5 psi u kapilar tokom 4,1 min, nakon čega se fokusira primenom napona od 25 kV tokom 15 minuta između analita i katolita. Nakon ovog koraka usledila je hemijska mobilizacija na 30 kV tokom 30 minuta između analita i hemijskog mobilizatora. Pl markeri i protein od interesa su detektovani sa apsorpcijom na 280 nm tokom koraka mobilizacije. Pl proteina je izračunat iz rezultujuće regresione jednačine pl u odnosu na prvi vršni trenutak dobijen iz pl standarda.

[0103] CE-SDS analiza. Analiza pomoću CE-SDS izvršena je pod redukcionim uslovima koristeći postupak prilagođen od SOP koji je objavljen od strane Beckman-Coulter za određivanje čistoće/heterogenosti IgG. Ukratko, antitelo je razblaženo sa DDI vodom do 6 mg/mL, denaturisano dodavanjem pufera za uzorke (0,1 M Tris/1,0% SDS, pH 8,0), i redukovano dodavanjem 2-merkaptoetanola; krajnja koncentracija antitela je bila 1,2 mg/mL. Denaturisanje i redukcija su olakšani zagrevanjem uzorka na 70°C tokom 10 minuta. Uzorak je hlađen 10 min na sobnoj temperaturi pre analize. Korak centrifuge (300 g, 5 minuta) je korišćen pre zagrevanja uzorka i neposredno nakon hlađenja. CE analiza je rađena pomoću Beckman Coulter P/ACE MDQ sistema koji radi na sobnoj temperaturi sa 30 cm ukupne dužine (efektivno 20 cm, 50 µm i.d.) neutralnog kapilara. Pre unošenja uzorka, kapilar je sekvencijalno ispran sa 0,1 M NaOH, 0,1M HCL, DDI vodom i SDS-gel puferskim rastvorom. Uzorak je ubrizgan elektrokinetički na 5 kV tokom 30 sekundi, i zatim

2

razdvajanjem na 30 kV tokom 30 min. Za ubrizgavanje i razdvajanje, instrument je radio u režimu obrnutog polariteta. Fragmenti antitela detektovani su korišćenjem apsorbancije na 214 nm (4 Hz akvizicija) i vremenski normalizovanim oblastima za izmerene vrhove.

BLOK A ISPITIVANJA FORMULACIJE

[0104] Ispitivanja Bloka A ispitala su različite sisteme pufera i koristile se komercijalno dostupan materijal adalimumaba koji je prerađen za ova ispitivanja. Primećujemo da SAD patent 8,216,583 navodi stabilnost formulacije adalimumaba u odnosu na upotrebu sistema citrata/fosfatnog pufera na pH 5,2, i u stvari je patent zahtevao upotrebu takve kombinacije pufera. Rad koji smo uradili, odražen ovde, ukazuje da je citrat/fosfat u stvari prilično loš izbor pufera u poređenju sa drugima, poput histidina i sukcinata. U donjim ispitivanjima Bloka A, pH je ostao konstantan na 5,2. Koncentracije manitola i polisorbata 80 takođe su održavane konstantnim. Uzorci su zadržani na 40°C dve nedelje. Dizajn studije sažet je u Tabeli u nastavku.

TABELA A

[0105] Analiza pomoću SEC pokazala je da formulacija samo sa citratom deluje lošije od kombinacije pufera (Tabela A), što ukazuje da je fosfat bio glavni stabilizator u toj kombinaciji. Ovo je bilo iznenađujuće i neočekivano, pošto je ovaj pH izvan raspona nominalnog puferskog kapaciteta fosfata, ali sasvim unutar puferskog raspona citrata. Dalje, sukcinat, histidin i tartarat su bili isti ili bolji od kombinacije citrata/fosfata, što ukazuje da će drugi puferski sistemi pružiti jednaku ili superiornu stabilnost za adalimumab. Shodno tome, Predmetni pronalazak je u jednom svom otelotvorenju usmeren na formulacije adalimumaba koje pokazuju dugoročnu stabilnost, gde se izbegava puferska kombinacija citrata i fosfata u

2

korist histidina. Čistoća ovih uskladištenih uzoraka je proverena pomoću RP HPLC (Slika 2). Kao i kod SEC, citratna formulacija je pokazala najnižu stabilnost, dok su svi ostali puferi bili isti ili bolji od puferske kombinacije koja postoji kod komercijalno dostupnog adalimumaba (Humira®). Ovi rezultati pokazuju naše otkriće, odnosno da promena pufera (tj. izbegavanje citratne/fosfatne puferske kombinacije komercijalnog adalimumaba) može poboljšati profil stabilnosti adalimumaba.

BLOK B ISPITIVANJA FORMULACIJE.

[0106] Izvršeno je drugo istraživanje („BLOK B“) koje je ispitivalo samo promene u puferima, gde pH (5,2) nije promenjen, kao što je navedeno u tabeli u nastavku pod nazivom„BLOK B dizajn ispitivanja“. U ovom slučaju, komercijalno dostupna formulacija za Humira® je korišćena kao kontrola, dok su sve ostale formulacije koristile vlasnički protein bio-sličan adalimumabu. Tabela B-1 u nastavku ukratko iznosi procenat monomera za formulacije Bloka B (kao i procenat količine nečistoće za koju je utvrđeno da je fragment adalimumab proteina).

TABELA B

TABELA B-1

2

[0107] Kao što se može videti iz Tabele B-1 iznad, nakon skladištenja dve nedelje na 40 C, sadržaj monomera se smanjuje za više od 1% za sve uzorke u Bloku B, osim za onaj koji sadrži histidinski (His) pufer (Tabela B-1). Iz ovog ispitivanja otkrili smo verovatnoću da će His biti superiorni puferski sistem za adalimumab. (Primetili smo da se nivo fragmenta, meren uz pomoć SEC, prijavljen za Formulaciju 2, čini netačnim jer su svi ostali početni nivoi fragmenta manji od 0,1%.)

BLOK C ISPITIVANJA FORMULACIJE.

[0108] U ispitivanjima sprovedenim u Bloku C sprovedeno je široko ispitivanje formulacija (pogledati tabelu C, u nastavku). Uzorci su čuvani jednu nedelju na 40°C (u daljem tekstu: „t1“) ili dve nedelje na 25 C (u daljem tekstu: „t2“). Ovi uslovi su korišćeni tokom ostatka naših ispitivanja, tako da će ova terminologija biti korišćena tokom čitave sadašnje detaljne diskusije. Blok C je osmišljen tako da proširi procenu pufera sprovedenu u Bloku B. Pored toga, ispitivani su glicin (Gly) i/ili arginin (Arg) kao mogući stabilizatori umesto manitola i/ili NaCl (Tabela C). Treba imati na umu da sistem pufera korišćen u proizvodu Humira® koristi 8 mM citratni/18 mM fosfatni pufer, koji je sastav Formulacije 1 Bloka C. U ovom slučaju, za formulaciju Bloka C korišten je vlasnički protein bio-sličan adalimumabu, umesto

2

adalimumab proteina dobijenog iz komercijalno dostupnog Humira®.

TABELA C

2

TABELA C-1

TABELA C-2

TABELA C-3

1

�

TABELA C-5

4

Razmatranje rezultata Bloka C

[0109] Pozivajući se na Tabelu C-1 iznad, pH je izmeren i otkriveno je da je relativno stabilan za sve formulacije. Međutim, početne vrednosti pH su bile nešto više za formulacije citrata/fosfata. SEC analizom, čini se da je najmanje stabilna formulacija 1, ona koja koristi Humira® puferski sistem. Poređenjem smo otkrili da formulacije koje koriste His kao pufer i/ili formulacije koje sadrže Gly ili Arg pokazuju najveću stabilnost (pogledati Tabelu C-2). Slični trendovi se primećuju kada se uzme u obzir čistoća pomoću RP HPLC (pogledati Tabelu C-3). Izgleda da SEC može biti bolji pokazatelj stabilnost od RP HPLC, premda, ako se uzme u celini, RP HPLC postupak izgleda kao pokazatelj stabilnosti. Na osnovu podataka Bloka C koji su sažeti iznad, otkrili smo da je Histidin pogodan kao pufer u smislu stabilnosti formulacije, i da su glicin ili arginin, ili njihove kombinacije, takođe komponente za poboljšanje stabilnosti za uključivanje u formulaciju adalimumaba.

[0110] Sačuvani uzorci su dalje analizirani pomoću clEF na t1 i t2 (Tabela C-4 iznad).

Materijal vlasničkog adalimumaba ima četiri do pet vrhova sa integrisanim intenzitetom većim od 1%. Uglavnom, postoji neki mali pad intenziteta glavnog vrha nakon skladištenja. Ovi gubici su obično veći pri t1 nego pri t2. Ipak, nisu primećeni novi značajni vrhovi koji sugerišu da dolazi do minimalne hemijske razgradnje koja bi dovela do promene ukupnog naelektrisanja proteina. Različitost podataka ukazuje da ovaj postupak, iako koristan za karakterizaciju, ne deluje stabilno.

[0111] Poslednji analitička postupak koja se koristi za procenu stabilnosti formulacije adalimumaba je CE-SDS, što je u osnovi CE verzija SDS-PAGE gelova za ploče. Ovaj postupak pokazuje da se relativne površine LC vrha smanjuju kada se čuvaju na povišenim temperaturama (Tabela C-5), dok se količina novih vrhova (kumulativno nazvani „Ostalo“) povećava. Sve u svemu, ove promene su obično manje od 2% za bilo koju formulaciju.

Postoji nekoliko uzoraka gde je procenat 'Ostalog' u rasponu od 4-6%, ali to su verovatno artefakti.

BLOK D ISPITIVANJA FORMULACIJE

[0112] Još jedan set formulacija procenjen je kao „Blok D.“ Šesnaest formulacija je dizajnirano kako bi se procenili drugi stabilizatore kao alternative manitolu, poput sorbitola i trehaloze (pogledati Tabelu D). Blok D je takođe ispitan koristeći manitol ili NaCl kao jedini agens za toničnost, umesto korišćenja mešavine dva ekscipijensa. pH stabilnost formulacija je bila prilično dobra, mada su stvarne početne pH vrednosti bile nešto niže od ciljanih vrednosti nekih formulacija (Tabela D-1).

TABELA D

TABELA D-1

TABELA D-2

TABELA D-3

4

�

Rezultati bloka D

[0113] pH stabilnost je bila prilično dobra za ove formulacije (Tabela D-1). Još jednom, komercijalna formulacija adalimumaba (Humira®) je korišćena kao kontrola (ali koristeći vlasnički protein bio-slični adalimumabu kao API). Komercijalna formulacija je ponovo pokazala lošiju stabilnost od SEC od onih koji koriste pojedinačne pufere poput fosfata i His (pogledati tabelu D-2). Od dva pufera koja se koriste u Humira®, otkrili smo da je fosfat bolji stabilizator. To je iznenađujuće, jer fosfat praktično nema puferski kapacitet na pH 5,2, dok su citratni puferi dobri na ovom pH. Ovo sugeriše da razlike u profilu stabilnosti mogu biti posledica direktne interakcije pufera sa proteinom, fenomena za koji, u slučaju komercijalne formulacije Humira®, verujemo da prethodno nije shvaćen ili uvažen. Shodno tome, uporedna korist izbora fosfata kao pufera u formulaciji adalimumaba, zahvaljujući superiornoj stabilnosti formulacije u odnosu na izbor kombinacije citrat/fosfat, predstavlja jedan od važnih aspekata našeg obelodanjenja.

[0114] I sorbitol i trehaloza pokazuju bolje profile stabilnosti od manitola kada se u ovim formulacijama koristi kao jedini agens za toničnost. Takođe se čini da uklanjanje polisorbata 80 (PS 80) donekle smanjuje stabilnost. Čini se da je najbolji profil stabilnosti od strane SEC za formulacije 10 i 11, koje sadrže visoke koncentracije sorbitola ili trehaloze umesto manitola/NaCl (Tabela D-2). Ovi rezultati nam pokazuju da će uklanjanje NaCl iz formulacije ili ograničavanje njegove koncentracije ispod određenih ciljanih nivoa (na primer manje od oko 100 mM) biti korisni za stabilnost. (Primetili smo da izgleda da manitol deluje kao stabilišujući sastojak, ali na nivou iznad 150 i najpoželjnije

[0115] RP podaci pokazuju da citrat ili fosfat pružaju bolju stabilnost od kombinacije koja se koristi u Humira® (Tabela D-3). Opet, izbegavanje citrat/fosfat kombinacije predstavlja važno svojstvo našeg pronalaska. Nije se moglo znati ili predvideti da će sam citrat ili fosfat pružiti bolju stabilnost formulacije od komercijalnog sistema pufera koji sadrži kombinaciju citrata i fosfata.

[0116] clEF analize su rađene za uzorke Bloka D (Tabela D-4 gore). Kao i do sada, postoji neko smanjenje intenziteta glavnog vrha, ali ne primećuju se novi vrhovi. U nekim slučajevima postoji neki mali porast intenziteta kiselijih vrhova. Čini se da su smanjenja glavnog vrha veća kod t1 nego kod t2, što sugeriše da bi degradacija na 5°C bila gotovo neprimetna. Ipak, u celini izgleda da je manje od 5% (a verovatno mnogo manje od 5%)

4

degradirajuće, kako je mereno pomoću clEF (Tabela D-4). Slično tome, malo degradacije primećuje se pomoću CE-SDS (Tabela D-5). Primećuje se degradacija od najviše 2 do 4%, ali promenljivost u postupku otežava utvrđivanje da li su to stvarne promene. Čini se da postoje viši nivoi nečistoća (Ostalo) za Formulacije 1 i 2 i 10 do 14.

BLOK E ISPITIVANJA FORMULACIJE

[0117] Ovaj blok formulacija dizajniran je za procenu stabilnosti formulacija na različitim nivoima pH. Ako pufer nije naveden, upotrebljen je acetatni pufer (10 mM) (Tabela E).

Sekundarni cilj je bio proceniti Gly i Arg u višim koncentracijama i u kombinaciji kao alternativni stabilizatori za manitol i NaCl.

TABELA E

TABELA E-1

4

TABELA E-2

TABELA E-3

4

4

�

Rezultati ispitivanja Bloka E

[0118] pH stabilnost bila je skromna, sa porastom pH koji se dešava na t1 za mnoge formulacije, posebno one puferisane acetatom pri niskom pH (Tabela E-1 gore). Dva uzorka (Formulacije 6 i 12) želatinirana su na t1.

[0119] Bilo je znatnih gubitaka u sadržaju monomera za pH3,5 uzorke (Tabela E-3), dok su pH 5,2 uzorci pokazali stabilnost uporedivu sa onom što je viđeno u prethodnim Blokovima. Takođe je bilo jasno da je degradacija mnogo izraženija na 40 C nego na 25, uprkos tome što je bila čuvana dvostruko duže od vremena. Zapravo, formulacija 8 je izgubila manje od 1% monomera na t2 (Tabela E-2). Gly i Arg formulacije su pokazale dobru stabilnost pod uslovom da je pH bio zadržan na 5,2. Podaci u ovom bloku ispitivanja potvrđuju naše otkriće da su glicin ili arginin, ili njihova mešavina, dobri stabilizatori u formulaciji adalimumaba.

[0120] RP RPLC podaci pokazuju veliko smanjenje čistoće, mada ni približno tako veliko kao za gubitak monomera od strane SEC (Tabela E-3). Ovo sugeriše da je hemijska nestabilnost manja od fizičke nestabilnosti. Kao i kod SEC rezultata, gubitak stabilnosti je izraženiji kod t1 nego kod t2.

[0121] CE-SDS rezultati pokazuju velika povećanja novih vrhova, gde se kategorija Ostalo povećava na 15-20% za uzorke niskog pH na t1 (Tabela E-4). Čini se da je najstabilnija formulacija, pomoću CE-SDS, formulacija 11 koja sadrži i Gly i Arg kao modifikatore/stabilizatore toničnosti.

[0122] Naišli smo na poteškoće pri pokretanju clEF za mnoge uzorke Bloka E. Međutim, s obzirom na očigledno lošu stabilnost pri pH 3,5, malo je verovatno da će clEF dati bilo kakve nove informacije o tim profilima stabilnosti. Na primer, formulacija 4 (pH 3,5) pokazuje

1

cepanje glavnog vrha na t1.

ISPITIVANJA FORMULACIJE BLOKA F

[0123] Ispitivanja Bloka F su imala za cilj da ispitaju stabilnost formulacije koja sadrži His koristeći manitol, Gly ili Arg kao jedine modifikatore toničnosti (Tabela F u nastavku).

Poslužili su i kao prilika za procenu aditiva kao što su EDTA i metionin (Met), koji mogu biti efikasni u usporavanju oksidacije. Pored toga, ispitana je jedna visoka koncentracija citrata i jedna formulacija visoke koncentracije fosfata.

TABELA F

2

TABELA F-1

TABELA F-2

TABELA F-3

4

Rezultati Bloka F

[0124] U ovom bloku formulacija, pH vrednosti su bile nešto niže od ciljane vrednosti pH 5,2 (Tabela F-1). Pored toga, pH se menja za oko 0,1 jedinica za većinu formulacija kada se meri na t1. Ove razlike su uzete u obzir pri konstruisanju matematičkih modela podataka, kao što je razmatrano u nastavku.

[0125] Dodatak EDTA čini se da poboljšava stabilnost za najgoru formulaciju (Formulacija 1). Da li povećava stabilnost uopšte, bilo je manje jasno na osnovu podataka SEC (Tabela F-2). Formulacije koje sadrže visoke koncentracije Arg ili Gly pokazale su se prilično dobrim nakon skladištenja (Tabela F-2).

[0126] Početne čistoća pomoću RP HPLC bile su univerzalno niže nego što se očekivalo za ove formulacije (Tabela F-3). Nakon skladištenja na t1 i t2, dolazi do neznatnih razlika, gde formulacije na bazi Gly i Arg pokazuju najveću stabilnost. Na osnovu RP HPLC podataka, izgleda da EDTA nije značajan stabilizator (Tabela F-3). Slično tome, čini se da je efekat Met minimalan na stabilnost izmerenu pomoću RP HPLC ili SEC, sa izuzetkom sadržaja monomera za najvišu koncentraciju Met (Tabela F-2, Formulacija 7).

[0127] Analiza CE-SDS pokazuje da se vrlo malo degradacije dešava nakon skladištenja (obično je manje od 1% povećanje pod 'Ostalim') (Tabela F-4). Međutim, postoje neke formulacije koje započinju višim sadržajem „Ostalog“ (na primer, Formulacije 4 do 7). Sve su to formulacije koje koriste visoku koncentraciju manitola (240 mM). Isto izgleda da važi za formulacije koje sadrže 120 mM manitola.

[0128] Što se tiče analize od strane clEF, malo je promena u relativnim intenzitetima glavnog vrha, bar na sistematski način koji bi omogućio uočavanje trendova stabilnosti (Tabela F-5). Promene su, uglavnom, manje kod t2 nego kod t1.

BLOK G ISPITIVANJA FORMULACIJA

[0129] Blok G ispitivanja formulacija ispitivao je različite formulacije sa kombinacijama Gly i Arg kao primarnim stabilizatorima (Tabela XXXIV). Pored toga, dva surfaktanta (Pluronic F-68 i polisorbat 20, PS 20) su procenjena pored PS 80. Konačno, procenjen je raspon koncentracija PS 80.

TABELA G

TABELA G-1

TABELA G-2

TABELA G-3

�

�

TABELA G-6

TABELA G-7

TABELA G-7

4

Rezultati Bloka G

[0130] Sve pH vrednosti bile su blizu ciljanih vrednosti (Tabela G-1), sa relativno malim promenama koje su se dešavale nakon skladištenja. Čini se da ima postoje preferencije u pogledu polisorbata nad F-68 u pogledu stabilnosti, mereno pomoću SEC (Tabela G-2). Međutim, razlike su relativno male. Čini se da sukcinatne formulacije (Formulacije 9 i 10) deluju razumno onoliko koliko se zadržao sadržaj monomera.

[0131] RPLC RP podaci su vrlo bliski, pa je svako određivanje razlika u stabilnosti praktično nemoguće (Tabela G-3). Ovi podaci će biti interpretirani samo ako se ispituju u širem kontekstu svih blokova skrining ispitivanja.

[0132] Rezultati CE-SDS sugerišu da je PS 20 najbolji stabilizator u koncentraciji od 0,1% za Humira® formulaciju (Formulacije 1 do 3) (Tabela G-4). U suprotnom, čini se da su razlike premale i varijabilne da bi se napravili bilo kakvi opšti zaključci.

[0133] Kao što je prethodno vidljivo, rezultati za clEF podatke su dovoljno promenljivi da otežavaju interpretaciju (Tabela G-5). Čini se da su promene u formulacijama Gly/Arg manje nego kod formulacija koje koriste druge stabilizatore, poput manitola. Ipak, sveukupno, stabilnost pomoću clEF izgleda prilično dobra za mnoge formulacije u ovom ispitivanju. Blok G (F/T i agitacija) ispitivanja.

[0134] Za tečnu formulaciju je važno proceniti osetljivost na interfacijalni stres. Odabrane su dve vrste ispitivanja stresa. Prvi je mešanje na 150 o/min na orbitalnom mikseru tokom 24 sata na 2-8°C. Drugi je pet uzastopnih ciklusa zamrzavanja i odmrzavanja (F/T), gde bi ovaj ciklus trebalo da stvori sve veće količine oštećenog proteina, ako protein je osetljiv na interfacijalna oštećenja. Četiri formulacije iz Bloka G su odabrane za procenu, i one su istaknute plavim podebljanim tekstom Tabela G-6.

[0135] Nakon ponovljenog F/T ciklusa, dolazi do vrlo malog smanjenja sadržaja monomera za sve testirane formulacije (Tabela G-7). Stoga se čini da ima malo interfacijalne osetljivosti na ovaj stres i da prisustvo PS 80 nije kritično za zaštitu. Što se tiče agitovanih uzoraka, gubici su još manji. Trendovi u RPLC podacima RP su u osnovi isti (Tabela G-7). Mali su gubici čistoće nakon izlaganja interfacijalnom stresu, ako ih uopšte ima.

BLOK H ISPITIVANJA FORMULACIJA

[0136] Formulacije Bloka H usredsređene su na tri aspekta formulacije adalimumaba: (1) veće koncentracije proteina, (2) formulacije bez pufera (osim proteina) i (3) korišćenje različitih kombinacija pufera pored citrat-fosfata (pogledati Tabelu H).

TABELA H

TABELA H-1

TABELA H-2

TABELA H-3

Rezultati Bloka H

[0137] pH stabilnost ovih formulacija je bila prihvatljiva (< 0,1 jedinica), osim za formulacije 4 i 5. To su formulacije bez pufera koje koriste Gly i Arg kao stabilizatore (Tabela H-1). Takođe je došlo do neznatnog porasta pH za Formulaciju 1 (Humira® formulacija u koncentraciji proteina od 100 mg/ml).

[0138] Stabilnost formulacija Bloka H je praćena korišćenjem SEC i RP HPLC. Postoji mali gubitak u sadržaju monomera, i čini se da je Formulacija 1 najmanje stabilna pomoću SEC (Tabela H-2). Pri 100 mg/ml adalimumabu bio-sličnog API, izgleda da je formulacija puferisana histidinom koja sadrži Gly i Arg prilično stabilna. Uglavnom, čini se da je najbolja kombinacija pufera His-sukcinat (Formulacije 7 i 12). Formulacije bez pufera sa Gly i Arg takođe pokazuju prihvatljivu stabilnost (Tabela H-2). RPLC RP podaci pokazuju da formulacije bez pufera (4 i 5) nisu tako dobre, kako pokazuje SEC (Tabela H-3), sa merljivim smanjenjem čistoće, ali se veruje da su zadovoljavajuće za dobijanje formulacije koja ima dugoročnu stabilnost.

[0139] CE-SDS podaci otkrivaju najmanje promene u Formulaciji 12, koja je His-sukcinatna formulacija (Tabela H-4). Najveća promena na t1 dešava se sa Formulacijom 7, koja je takođe His-sukcinatna formulacija, ali koristeći manitol i NaCl kao modifikatore toničnosti.

PLS modeliranje

PLS postupak

[0140] Podaci za formulacije adalimumaba u Blokovima A do H analizirani su zajedno koristeći hemometrijski postupak koja se naziva parcijalni najmanji kvadrat (PLS).

[0141] Objavljeni su detaljni opisi PLS modeliranja. Pogledati, na primer, Katz, M.H.

Multivariate Analysis: A Practice Guide for Clinicians. Cambridge University Press, New York, pp.158-162 (1999); Stahle, L., Wold, K., Multivariate data analysis and experimental design in biomedical research. Prog. Med. Chem. 1988, 25: 291-338; Wold S. PLS-regression: a basic tool of chemometrics. Chemom. Intell. Lab. Syst. 2001, 58: 109-130; i Martens, H.; Martens, M. Multivariate Analysis of Quality: An Introduction, Wiley and Sons, Chichester, UK (2001).

[0142] Za bilo koju veliku matricu vrednosti, gde postoji razuman broj uzoraka (koji zajedno čine takozvanu X matricu), mogu se konstruisati matematički modeli koji objašnjavaju najveću količinu varijanse zavisne promenljive (i) od interesa (Y matrica). Najbolji pojedinačni opis odnosa između varijacije u X matrici i krajnje tačke (Y matrica) naziva se prva glavna komponenta, PC1. Sledeća važna (u smislu opisivanja varijanse u Y matriksu) komponenta naziva se druga glavna komponenta, PC2, i tako dalje. Često su potrebne samo jedna ili dve PC kako bi se objasnila većina varijansi u Y matrici. Svaka od ovih PC sadrži određeni doprinos svake od promenljivih u X matrici. Ako promenljiva unutar X matrice u velikoj meri doprinosi izgradnji date PC, onda se ona rangira kao značajna. U stvari, koeficijenti regresije mogu se izračunati za svaku promenljivu u X matrici za dati model, gde je model sastavljen od određenog broja PC kako bi se dobio adekvatan opis Y matrice.

Ukratko, PLS uzima informacije iz X matrice, izračunava željeni broj PC i konstruiše odgovarajući model. Model koji uključuje sve uzorke naziva se kalibracionim modelom [1,2]. Ukupni koeficijent utvrđivanja (r2) označava kvalitet modela. Svi PLS proračuni vršeni su korišćenjem Unscrambler® softvera(CAMO, Corvallis, OR). PLS analiza izvedena sa jednom promenljivom u Y matrici naziva se PLS1 analiza. Izgradnja modela koji uklapa više promenljivih u Y matrici naziva se PLS2 analiza.

[0143] Potpuna unakrsna validacija izvršena je na svim modelima kalibracije koristeći standardne tehnike. Ukratko, uklanja se jedan uzorak odjednom, skup podataka se ponovo kalibriše i konstruiše se novi model. Ovaj postupak se ponavlja sve dok se svi kalibracioni uzorci ne uklone jednom i kvantifikuju kao model validacije. Stoga se prvi set, koji sadrži sve uzorke, naziva kalibracioni set, dok se onaj nakon unakrsne provere naziva validacioni set. Jack-knife algoritam (pogledati, Martens i dr) korišćen je za određivanje statističke značajnosti bilo kog faktora koji se koristi u konstrukciji gore navedenih PLS modela.

PLS MODELIRANJE ADALIMUMAB FORMULACIJA

1

(BLOKOVI B, C i D)

(Pogledati Slike 3 do 12)

[0144] Napomena: PLS površinski grafikoni prikazani na slikama 3 do 12 zasnivaju se na podacima dobijenim iz Blokova B, C i D. Sledi diskusija o nalazima koji su prikazani na PLS površinskim grafikonima prikazanim na Slikama 3 do 12.

PLS Model 1-Slika 3.

[0145] Slika 3 sadrži prikaz sadržaja monomera na t1 (model 1) u zavisnosti od koncentracije citrata i fosfata. pH je fiksiran na 5,2. model je ukazao da su fosfat i citrat sami po sebi slabi destabilizatori (koji nisu statistički značajni), zajedno sa tartaratom i maleatom. Za poređenje, sukcinat, koji je strukturno sličan citratu, tartaratu i maleatu, bio je slab stabilizator. Jedini pufer za koji je otkriveno da je značajan stabilizator bio je histidin. Nijedan od ovih nalaza nije mogao da se predvidi na osnovu literature ili ispitivanja hemijske strukture svakog pufera. Model je takođe ukazao da kada se citratni i fosfatni pufer zajedno koriste, formulacija je najmanje stabilna. Ako se koristi samo jedan pufer, posebno fosfat, stabilnost se poboljšava. To je iznenađujuće, jer fosfat ima mali ili nikakav puferski kapacitet na pH 5,2, dok citratni pufer ima. Ništa od ovog ponašanja nije bilo moguće predvideti na osnovu onoga što je poznato u tehnici.

PLS Model 2-Slika 4.

[0146] Slika 4 sadrži prikaz sadržaja monomera na t2 (model 2). Isto tako, konstruisan je model koristeći sadržaj monomera od strane SEC na t2 kao krajnjoj tački. Ovaj model je takođe pokazao da je stabilnost najniža kada se zajedno koriste citrat i fosfat. Najniža stabilnost prikazana je kada je citrat iznad 10 mM, i fosfat između 5 i 15 mM. Stabilnost se poboljšava kada je koncentracija citrata snižena i/ili koncentracija fosfata smanjena ili povećana. Ovi nalazi sugerišu da je poželjan sastav sa jednim puferom. Isti trend stabilizacije pufera je primećen kao kod PLS Modela 1, gde su citrat i fosfat slabi stabilizatori (nisu statistički značajni), dok je histidin jak stabilizator (statistički značajan).

PLS Model 1-Slika 5.

[0147] Slika 5 je PLS Model 1 koji pokazuje uticaj histidina i glicina na stabilnost formulacija. Sadrži prikaz sadržaja monomera na t1 (model 1). Ovaj model je pokazao da kombinacija histidina i glicina pruža veoma dobre rezultate stabilnosti. I za histidin (His) i za glicin (Gly) je utvrđeno da su stabilizatori. Najniža stabilnost na površini odgovora

2

(prikazana plavom bojom) je kada postoji najmanja koncentracija His i Gly. Efekat His na stabilnost je veći, gde 20 mM His pruža stabilizaciju uporedivu sa 120 mM Gly (treba imati na umu suprotne uglove grafikona). Model ukazuje da će postojati dodatna korist za stabilnost upotrebom oba ekscipijensa, gde će se najveća stabilnost pojaviti kada koncentracija His iznosi 20 mM, a koncentracija Gly iznosi 120 mM.

PLS Model 1-Slika 6.

[0148] Slika 6 je PLS model 1 koji pokazuje uticaj arginina i sorbitola na stabilnost formulacija. Sadrži prikaz sadržaja monomera na t1 (model 1). Ovaj model je ukazao da je arginin dobar stabilizator, dok je sorbitol loš stabilizator. Isto tako, arginin (Arg) pruža stepen stabilizacije koji je sličan onome koji je utvrđen za Gly. Najlošija stabilnost na koju ukazuje ovaj model je kada je koncentracija Arg niska, i kada je koncentracija sorbitola niska (plava oblast grafikona). Kako se koncentracije svakog ekscipijenta povećavaju, sadržaj monomera na t1 raste. Dejstvo sorbitola je otprilike linearno sa koncentracijom, dok se čini da se efekat Arg brže povećava kad koncentracija pređe 60 mM. Iako se predviđa da sorbitol povećava stabilnost adalimumaba u odnosu na zadržani monomer, njegova sposobnost da poveća stabilnost je manja od one koja je utvrđena za Gly i Arg (na molarnoj osnovi).

PLS Model 1-Slika 7.

[0149] Slika 7 je PLS model 1 koji pokazuje uticaj pH i histidina na stabilnost formulacija. Sadrži prikaz sadržaja monomera na t1 (model 1). Ovaj model je ukazao da se čini da je histidin najbolji pufer, dok pH treba da bude iznad 5 ili viši za najbolju stabilnost.

PLS Model 2-Slika 8.

[0150] Slika 8 je PLS model 2 koji pokazuje uticaj pH i histidina na stabilnost formulacija. Sadrži prikaz sadržaja monomera na t2 (model 2). Ovaj model je ukazao da se čini da je histidin najbolji pufer, dok pH treba da bude iznad 5 ili viši za najbolju stabilnost. Rezultati pokazuju da je optimalni pH blizu 5,2. Od svih pufera koji su pregledani, histidin pruža najveći stepen stabilizacije. Ova površina odgovora ilustruje dve važne tačke. Prvo, čini se da je stabilnost maksimalna blizu pH 5,2, padajući pri višem i nižem pH. Drugo, pokazalo se da histidin pruža značajno povećanje stabilnosti. Kada se histidin koristi na 20 mM, on pruža značajno povećanje stabilnosti u odnosu na niže koncentracije pufera. U stvari, čini se da je efekat nelinearan, sa većom stabilizacijom od 10 do 20 mM nego od 0 do 10 mM. Dalje, gubitak stabilnosti je nagliji kod viših pH nego kod nižih.

PLS Model 2-Slika 9.

[0151] Slika 9 je PLS model 2 koji pokazuje uticaj trehaloze i PS80 na stabilnost formulacija. Sadrži prikaz sadržaja monomera na t2. Ovaj model je ukazao da trehaloza izgleda kao slab stabilizator, dok PS80 poboljšava termičku stabilnost. Površina odgovora prikazana na Slici 9 pokazuje da je PS 80 moćan stabilizator za zaštitu adalimumaba od toplotnog stresa, sa koncentracijom od 0,1% koja pruža maksimalnu stabilnost. Koncentracija PS 80 nije bila promenljiva osim pri 0 i 0,1%. Radi poređenja, ovaj model pokazuje da je efekat stabilizacije trehaloze prilično mali, sigurno manji od onog koji je viđen sa sorbitolom.

Slika PLS 2-Slika 10.

[0152] Slika 10 je PLS model 2 koji pokazuje uticaj manitola i PS80 na stabilnost formulacija. Sadrži prikaz sadržaja monomera na t2 (model 2). Ovaj model je ukazao da izgleda da manitol predstavlja destabilizator, dok PS80 poboljšava termičku stabilnost. PLS model koji koristi sadržaj monomera od strane SEC na t2 omogućava ispitivanje relativnih efekata bilo kog od faktora koji su uključeni u model. Kako se koncentracija manitola povećava, ukupna stabilnost opada. Za poređenje, uticaj PS80 na stabilnost je prilično mali.

PLS Model 1- Slika 11.

[0153] Slika 11 je PLS model 1 koji pokazuje uticaj manitola i NaCl na stabilnost formulacija. Sadrži prikaz sadržaja monomera na t1 (model 1). Ovaj model je ukazao da izgleda da su manitol i NaCl destabilizatori. Stabilnost, kako je naznačeno sa sadržajem monomera na t1, je najniža kada je koncentracija manitola bilo gde ispod 150 mM. Isto tako, dodavanje NaCl takođe smanjuje stabilnost adalimumaba.

PLS Model 1- Slika 12.

[0154] Slika 12 je PLS model 1 koji pokazuje uticaj EDTA i metionina na stabilnost formulacija. Sadrži prikaz sadržaja monomera na t1. U slučaju EDTA, stabilnost se lagano smanjuje kako koncentracija ovog aditiva raste. Suprotno tome, čini se da Met poboljšava stabilnost.

PLS modeliranje formulacija adalimumaba

za Blokove B do G

(Pogledati Slike 13 do 28)

4

Prvi PLS model („PLS model A)

[0155] Prvi PLS model (PLS Model A) koristio je razliku u sadržaju monomera na t1 kao krajnju tačku. Model je koristio tri PC, i imao je koeficijent korelacije za kalibracioni set 0,83 i r-vrednost 0,67 za validacioni set. U pitanju je kvadratni model koji uključuje pH-pufer i pufer-pufer međusobno delovanje.

TABELA J

[0156] Kvalitet modela je prihvatljiv s obzirom na koeficijente korelacije kalibracionog seta i validacionog seta. Ukupni koeficijenti korelacije za različite faktore obuhvaćene modelom sumirani su u Tabeli J. Treba imati u vidu da kvadratni i interakcioni izrazi nisu ovde navedeni. Kako je krajnja tačka razlika u sadržaju monomera, želja je da se minimizuje ova vrednost. Dakle, stabilizatori pokazuju negativne koeficijente korelacije, dok destabilizatori imaju pozitivne r-vrednosti. Od stabilizatora su najsnažniji His, Gly, Arg i PS 80, mada manitol i sukcinat takođe imaju stabilizujući efekat (Tabela J). U međuvremenu, postoje značajni destabilizatori, kao što su NaCl, citrat i fosfat. Treba imati na umu da su ovi modeli sastavni deo svih podataka o stabilnosti prikupljenih u različitim blokovima formulacija, od A do H, i pojedinačne formulacije mogu varirati od modela. Iako je tabela koeficijenata korelacije korisna za procenu efekata različitih faktora, oni ne obuhvataju nelinearne i interakcione efekte, tako da je korisno pregledati površine odgovora kako biste detaljnije pregledali efekte različitih parametara, kao što je prikazano na površinama odgovora koje su reprodukovane na Slikama 13 do 28.

Razmatranje PLS Modela A - Slike 13 i 14.

[0157] Krause-ov patent '583 opisuje citratno-fosfatni puferski sistem kao sastavni deo stabilnosti proizvoda. Naše studije pokazuju da to nije slučaj. Najlošija stabilnost bi se dogodila kada bi se ta dva pufera koristila u kombinaciji i efekat bi se pogoršavao kako se koncentracije pufera povećavaju, prema ovom modelu (Slika 13 [1]). Površina odgovora ukazuje da fosfat i citrat podjednako destabilizuju, suprotno nekim ranijim zapažanjima, ali kvantitativnu prirodu ovih površina treba sagledati sa pažnjom, jer uključuje podatke iz svih formulacija iz Blokova B do H.

[0158] Uticaj pH i His prikazan je na Slici 14. To pokazuje da se His destabilizuje pri niskom pH, gde je očigledno izvan puferskog kapaciteta His. Opet, ovaj rezultat je funkcija svih praćenja pH u ovom ispitivanju, a ne samo onih koje uključuju His (mada se to može učiniti). Prema ovoj površini odgovora, optimalni pH može biti bliži 5,4 nego 5,2, mada je površina relativno ravna kroz ovo područje, što ukazuje na površinu plitkog odgovora od pH 5 do 5,4 (Slika 14).

Razmatranje PLS Modela A - Slika 15

[0159] Površina odgovora za Gly i Arg prikazana je na Slici 15. Studije više puta pokazuju da ove dve aminokiseline mogu biti snažni stabilizatori adalimumaba. Treba imati na umu da je minimalna razlika u sadržaju monomera (tj. plavi deo površine) dostignuta pri 100 mM Arg, ali pri 200 mM Gly, što sugeriše da je Arg možda bolji stabilizator za adalimumab pri pH 5,2.

Razmatranje PLS Modela A - Slika 16

[0160] Konačna površina odgovora prikazana za PLS Model A je za efekat NaCl i PS 80 (Slika 16). Pokazuje da se stabilnost adalimumaba smanjuje dodavanjem NaCl, naročito iznad 100 mM. U međuvremenu, PS 20 pruža značajnu stabilnost kada se koristi iznad 0,04%.

Drugi PLS model (PLS Model B)

[0161] Drugi PLS model (PLS Model B) koristio je sadržaj monomera na t1 i na t2 kao krajnje tačke. Model je koristio četiri PC i imao je koeficijent korelacije za kalibracioni set 0,82 i r-vrednost 0,67 za validacioni set. U pitanju je kvadratni model koji uključuje pH-pufer i pufer-pufer međusobno delovanje. U pogledu kvaliteta modela, ovo je uporedivo sa prvim PLS Modelom A opisanim iznad.

TABELA K (L)

[0162] Krajnje tačke za PLS Model B su ukupni sadržaji monomera i na t1 i na t2. Stoga želimo da maksimizujemo ove vrednosti. To znači da će stabilizatori sa pozitivnim koeficijentima korelacije i destabilizatori prikazati negativne r-vrednosti (Tabela K). Kao i kod prethodnog modela, citrat, fosfat i NaCl su značajni destabilizatori. S druge strane, His, Gly Arg i PS 20 su snažni stabilizatori. U ovom modelu, trehaloza, sorbitol i manitol imaju vrlo malo efekta. Primarne razlike su da je pH sada značajan faktor i da je EDTA značajan destabilizator, dok se čini da je i Met stabilizator.

Razmatranje PLS Modela B-Slika 17

[0163] Ovaj model sugeriše da dodavanje citrata ima mali efekat na stabilnost ako fosfat nije prisutan (pogledati zadnju ivicu površine odgovora sa Slike 5). Sa druge strane, dodani fosfat smanjuje sadržaj monomera (pogledati desnu ivicu), i kombinacija je još više destabilizujuća (Slika 5). Stoga kombinacija citratno-fosfatnog pufera nije efikasna u stabilizaciji adalimumaba, suprotno onome što je navedeno u patentu '583. Detabilizirajući efekat fosfata prema ovom modelu je oko trostruko veći nego za citrat.

Razmatranje PLS Modela B-Slika 18

[0164] Upotreba His pri niskom pH ima male ili štetne efekte (Slika 18 [6\). Međutim, kada se koristi pri pH 5,2 ili više, His pruža značajno povećanje stabilnosti (mereno sadržajem monomera pomoću SEC).

Razmatranje PLS Modela B-Slika 19

[0165] Površina odgovora za Gly i Arg prikazana je na Slici 19. Uključivanje oba stabilizatora u visokim koncentracijama bilo bi korisno za stabilnost, ali nepraktično iz razloga toničnosti. Čini se da je Arg snažniji stabilizator u ovom modelu u odnosu na Gly, gde koncentracija Arg od 75 mM ima isti efekat kao -120 mM Gly. Model označava da će svaki sam biti dobar, kao i da će kombinacija biti efikasna.

Razmatranje PLS Modela B-Slika 20

[0166] PLS model B pokazuje skroman uticaj manitola na stabilnost, dok je PS 80 efikasan stabilizator iznad koncentracije blizu 0,05% (Slika 20). Dakle, iz ovih podataka bi se moglo zaključiti da se stabilna formulacija može sastojati od 240 mM manitola i 0,1% PS 80 pri pH 5,2.

Razmatranje PLS Modela B-Slika 21

[0167] Tokom čitavog projekta, čini se da je NaCl destabilizator adalimumaba, posebno kada koncentracija dostigne 100 mM ili više, kao što je prikazano na ovoj površini odgovora (Slika 21). Iako je testirano samo nekoliko formulacija koje su uključivale EDTA, čini se da je ovaj ekscipijens destabilizujući, osim ako koncentracija nije bila 0,1%. Takođe napominjemo da je efekat Met bio povoljan u pogledu stabilnosti, ali nije se pokazao kao značajan efekat, verovatno zbog toga što je procenjeno relativno malo primera.

Razmatranje PLS Modela B-Slika 22

[0168] Konačna reakciona površina iz PLS modela B koju treba razmotriti je efekat sukcinata i His (Slika 22). Model je uključio sve relevantne pufer-pufer interakcije. Ova površina pokazuje da sukcinat ima male ili čak štetne efekte sam po sebi (pogledati prednju ivicu grafikona). Međutim, u saradnji sa His pokazuje da povećava ukupnu stabilnost (npr. treba imati u vidu zadnju ivicu površine). Stoga se čini da je His-sukcinatni pufer sistem najpovoljniji od svih dosad testiranih kombinacija pufera.

Treći PLS model (PLS model C)

[0169] Treći PLS model C koristio je razliku u procentu čistoće pomoću RP HPLC na t1 kao krajnju tačku. Model je koristio dve PC i imao je koeficijent korelacije za kalibracioni set 0,86 i r-vrednost 0,67 za validacioni set. U pitanju je kvadratni model koji uključuje pH-pufer i pufer-pufer međusobno delovanje. U pogledu kvaliteta modela, ovo je vrlo slično prethodnom modelu.

TABELA L

[0170] PLS Model C pokazuje da RP HPLC pokazuje stabilnost, iako je osetljivost možda manja nego za SEC. Model otkriva da se i fosfat i citrat destabilizujeju, i efekat fosfata je statistički značajan (Tabela LI). Isto tako, acetat je jak destabilizator kao i EDTA. Pokazalo se da su i Gly i Arg stabilizatori, ali efekti se ne smatraju statistički značajnim. Nađeno je da je samo His značajan stabilizator (zajedno sa koncentracijom proteina).

Razmatranje PLS Modela C - Slika 23

[0171] Površina reakcije za citrat i fosfat pri pH 5,2 prikazana je na Slici 23 [11]. Oba pufera su destabilizujući (prate prednju i levu ivicu grafikona). Iznad koncentracija od -10 mM, kombinacija postaje prilično destabilizujuća. Sve u svemu, predviđa se da će fosfat biti destabilizujejući prema ovom modelu (Slika 11).

Razmatranje PLS Modela C - Slika 24

[0172] Kao što se vidi u prethodnim modelima, stabilnost adalimumaba opada kako je pH smanjen na manje od 5,0 (slika 12). U ovom modelu stabilizirajući efekat His se vidi kroz sve pH vrednosti, ali je najizraženiji kada je pH niži.

Razmatranje PLS Modela C - Slika 25

[0173] Efekti Gly i Arg prikazani su na Slici 25. Oba ekscipijensa smanjuju gubitak čistoće kako koncentracija raste, i za njih se predviđa da će biti približno izjednačeni, ako je suditi po nagibima duž ivica površine odgovora. Inače, čini se da je potrebno manje Arg (75 mM) kako bi se postigao optimalni gubitak čistoće (plava oblast grafikona) nego za Gly (-200 mM).

Razmatranje PLS Modela C - Slika 26

[0174] Uticaj manitola i PS 80 vidi se na površini odgovora na Slici 26 [14]. Jasno je da se hemijska stabilnost uveliko poboljšava dodavanjem PS 80, posebno u koncentracijama iznad 0,04%. U međuvremenu, manitol je takođe stabilizujući, ali čak 240 mM manitola ima manje dejstva od manjeg sadržaja surfaktanta.

Razmatranje PLS Modela C - Slika 27

[0175] Iako se veruje da je manitol stabilizator u Humira® formulaciji, NaCl je očigledno destabilizator, kako u ovom modelu (pogledati Sliku 27[15]), tako i u prethodnim PLS modelima. Efekat je značajan kada koncentracija NaCl prelazi 75 mM ili slično.

Razmatranje PLS Modela C - Slika 28

[0176] Konačna površina odgovora iz PLS Modela C vidi se na Slici 28 [16] koja opisuje efekte pH i koncentracije proteina. Kao što je već prikazano, stabilnost je najbolja kad je pH iznad 4,8 ili 5,0. Što se tiče efekta proteina, ovaj model predviđa da je stabilnost, zasnovana na RP HPLC, bolja pri većim koncentracijama proteina. Sličan trend, iako prilično slab, primećen je za SEC podatke (sadržaj monomera na t1 i t2). Stoga je moguće postići slične profile stabilnosti u koncentracijama od 100 mg/ml kao što bi se moglo dobiti pri 50 mg/ml.

SAŽETAK NALAZA ZA BLOKOVE A DO H

[0177] Studije formulacije u blokovima A do H procenjivale su formulacije adalimumaba čuvane na povišenoj temperaturi koja je tokom nedelju dana održavana na 40°C, ili dve nedelje na 25°C. Stabilnost je praćena korišćenjem SEC, RP HPLC, clEF i CE-SDS.

[0178] Čini se da je optimalni pH 5,2 ± 0,2. Od svih ispitivanih puferskih sastava, citratfosfat kombinacija je inferiornija u odnosu na bilo koji drugi ispitivani puferski sistem, stoga je važan aspekt predmetnog pronalaska uopšte izbegavanje ovog kombinovanog sistema pufera. Izgleda da je najbolji pojedinačni pufer His, dok His-sukcinatni pufer takođe nudi

1

veoma dobru stabilnost. Čak i sistemi bez pufera, koji se oslanjaju na sposobnost proteina da puferiše formulaciju, izgleda da imaju prihvatljive profile stabilnosti u uslovima ubrzanog stresa.

[0179] Od svih procenjenih stabilizatora/modifikatora tonika, i Arg i Gly izazivaju vrlo dobru stabilizaciju adalimumaba. Oba rade bolje od manitola. Iako se čini da manitol predstavlja stabilizator, otkrili smo da ako se koristi treba da bude u najvećim mogućim koncentracijama, ali u svakom slučaju većim od oko 150 mM, i najbolje je oko 200 mM ili više. Za poređenje, NaCl je očigledno destabilizator, posebno kada koncentracije prelaze 75-100 mM; stoga NaCl, ako postoji, treba kontrolisati do nivoa ispod oko 75 mM. Čini se da drugi polioli, poput sorbitola i trehaloze, deluju približno kao i manitol, pa mogu da budu zamenjeni manitolom po želji.

[0180] Iznenađujuće, polisorbat 80 (PS 80) pruža značajnu zaštitu od toplotnog stresa. Iako mehanizam stabilizacije nije poznat, izgleda da drugi testirani površinski aktivni agensi (PS 20 i F-68) nisu tako efikasni kao PS 80. Stoga je izbor PS80 u odnosu na PS 20 poželjna karakteristika predmetnog obelodanjenja. Formulacije prema predmetnom obelodanjenju poželjno sadrže najmanje 0,04% (w/v) PS 80.

[0181] Na osnovu nalaza u ispitivanjima formulacija Blokova A do H, naredne formulacije adalimumaba su naročito poželjne prema predmetnom obelodanjenju.

TABELA M

2

Dodatne komponente pruženih farmaceutskih sastava

[0182] Formulacije predmetnog obelodanjenja mogu takođe da sadrže i druge pufere (osim ako nisu posebno izuzeti u opisu konkretnih primera obelodanjenje), modifikatore toničnosti, ekscipijense, farmaceutski prihvatljive nosače i druge uobičajene neaktivne sastojke farmaceutskih sastava.

[0183] Modifikator toničnosti je molekul koji doprinosi osmolalnosti rastvora. Osmolalnost farmaceutskog sastava je poželjno podešena tako da maksimizuje stabilnost aktivnog sastojka i/ili da umanji nelagodu pacijentu nakon primene. Uglavnom je poželjno da farmaceutski sastav bude izotoničan sa serumom, tj. Da ima istu ili sličnu osmolalnost, što se postiže dodavanjem modifikatora toničnosti.

[0184] U poželjnom otelotvorenju, osmolalnost pruženih formulacija je od oko 180 do oko 420 mOsM. Međutim, treba razumeti da osmolalnost može biti ili veća ili niža, ukoliko to zahtevaju specifični uslovi.

[0185] Primeri modifikatora toničnosti pogodni za modifikovanje osmolalnosti uključuju, ali nisu ograničeni na aminokiseline (ne uključuju arginin) (npr. cistein, histidin i glicin), soli (npr., natrijum hlorid ili kalijum hlorid) i/ili šećere/poliole (npr., saharoza, sorbitol, maltoza i laktoza).

[0186] U poželjnom primeru koncentracija modifikatora toničnosti u formulaciji je poželjno između oko 1 mM do oko 1 M, poželjnije od oko 10 mM do oko 200 mM. Modifikatori toničnosti su dobro poznati u struci, proizvode se poznatim postupcima, i dostupni su od komercijalnih dobavljača.

[0187] Pogodni modifikatori toničnosti mogu da budu prisutni u sastavima obelodanjenja, osim ako nisu posebno izuzeti u opisu konkretnih primera obelodanjenja.

[0188] Ekscipijensi, koji se takođe nazivaju hemijskim aditivima, ko-rastvaračima ili elementima ko-rastvarača, koji stabilizuju polipeptid u rastvoru (takođe u osušenom ili smrznutom obliku), takođe se mogu dodati farmaceutskom sastavu. ekscipijensi su dobro poznate u struci, proizvode se poznatim postupcima, i dostupne su od komercijalnih dobavljača.

[0189] Primeri pogodnih ekscipijenasa uključuju, ali nisu ograničeni na šećere/poliole, poput: saharoze, laktoze, glicerola, ksilitola, sorbitola, manitola, maltoze, inozitola, trehaloze, glukoze; polimeri kao što su: serumski albumin (goveđi serumski albumin (BSA), ljudski SA ili rekombinantni HA), dekstran, PVA, hidroksipropil metilceluloza (HPMC), polietilenimin, želatin, polivinilpirolidon (PVP), hidroksietilceluloza (HEC); nevodeni rastvarači kao što su: viševodonični alkoholi (npr. PEG, etilen glikol i glicerol) dimetisulfoksid (DMSO) i dimetilformamid (DMF); aminokiseline kao što su: prolin, L-serin, natrijum-glutaminska kiselina, alanin, glicin, lizin hidrohlorid, sarkozin i gama-amino-buterna kiselina; surfaktanti kao što su: Tween® -80 (polisorbat 80), Tween®-20 (polisorbat 20), SDS, polisorbati, poloksameri; i razne ekscipijensi kao što su: kalijum fosfat, natrijum acetat, amonijum sulfat, magnezijum sulfat, natrijum sulfat, trimetilamin N-oksid, betain, CHAPS, monolaurat, 2-O-beta-mannoglicerit ili bilo koja kombinacija gore navedenog.

[0190] Pogodni ekscipijenti mogu da budu prisutni u sastavima pronalaska, osim ako nisu posebno izuzeti u opisu specifičnih otelotvorenja predmetnog pronalaska.

[0191] Koncentracija jednog ili više ekscipijenata u formulaciji prema ovom pronalasku je poželjno je između oko 0,001 do 5% težine po zapremini, Poželjnije oko 0,1 do 2 procenata težine.

Sastavi za upotrebu u postupcima tretmana

[0192] U drugom primeru, obelodanjenje pruža smešu za upotrebu u postupku tretmana

4

sisara koji sadrži primenu terapeutski efikasne količine farmaceutskih sastava predmetnog pronalaska sisaru, gde sisar ima bolest ili poremećaj koji može biti korisno tretiran adalimumabom.

[0193] U poželjnom primeru, sisar je čovek.

[0194] Bolesti ili poremećaji koji se mogu tretirati datim sastavima uključuju, ali nisu ograničeni na reumatoidni artritis, psorijatični artritis, ankilozirajući spondilitis, Wegener-ovu bolest (granulomatoza), Kronovu bolest (ili upalnu bolest creva), hroničnu opstruktivnu bolest pluća (COPD), hepatitis C, endometriozu, astmu, kaheksiju, psorijazu i atopični dermatitis. Dodatne bolesti ili poremećaji koji se mogu tretirati sastavima predmetnog pronalaska uključuju one opisane u U.S. Patent Nos.6,090,382 i 8,216,583.

[0195] Pruženi farmaceutski sastavi mogu se primenjivati pacijentu kom je potreban tretman sistemskim injekcijama, kao što je intravenska injekcija; ili injekcijom ili nanošenjem na relevantno mesto, kao što je direktna injekcija ili direktna primena na mesto kada je mesto izloženo hirurškom zahvatu; ili lokalnom primenom.

[0196] U jednom aspektu, pronalazak pruža sastav za upotrebu u postupku tretmana i/ili sprečavanja reumatoidnog artritisa koji uključuje primenu sisaru kome je to potrebno, terapeutski efikasne količine jednog od pruženih sastava adalimumaba.

[0197] Terapeutski efikasna količina adalimumaba u pruženim sastavima zavisiće od stanja koje se tretira, težine stanja, prethodne terapije i kliničke anamneze pacijenta i odgovora na terapeutski agens. Odgovarajuća doza može se prilagoditi prema proceni lekara tako da se pacijentu može primenjivati jednokratno ili tokom niza primena.

[0198] U jednom otelotvorenju, efektivna količina adalimumaba po dozi za odrasle je oko 1-500 mg/m<2>ili od oko 1-200 mg/m<2>ili od oko 1-40 mg/m<2>ili oko 5-25 mg/m<2>.

[0199] Alternativno, može se primeniti ravna doza, čija količina može biti u rasponu od 2-500 mg/doza, 2-100 mg/doza ili otprilike 10-80 mg/doza.

[0200] Ako se doza treba primenjivati više od jednog puta nedeljno, primerni raspon doza je isti kao prethodno opisani rasponi doza ili niži, i poželjno je da se primenjuje dva ili više puta nedeljno u rasponu doza od 25-100 mg/doza.

[0201] U drugom otelotvorenju, prihvatljiva doza za primenu injekcijama sadrži 80-100 mg/doza, ili alternativno, sadrži 80 mg po dozi.

[0202] Doza se može primenjivati nedeljno, dvonedeljno, ili sa nekoliko nedelja razmaka (na primer 2 do 8).

[0203] U jednom aspektu, adalimumab se pruža u dozi od 40 mg jednom subkutanom (SC) injekcijom.

[0204] U nekim slučajevima, poboljšanje stanja pacijenta biće postignuto primenom doze do oko 100 mg farmaceutskog sastava jednom do tri puta nedeljno u periodu od najmanje tri nedelje. Tretman tokom dužih perioda može biti potreban da se izazove željeni stepen poboljšanja. Kod neizlečivih hroničnih stanja režim se može nastaviti u nedogled. Za pedijatrijske bolesnike (uzrasta od 4 do 17 godina) pogodan režim može uključivati primenu doze od 0,4 mg/kg do 5 mg/kg adalimumaba, jednom ili više puta nedeljno.

[0205] U drugom otelotvorenju, farmaceutske formulacije predmetnog pronalaska mogu da se pripreme u formulaciji u velikim razmerama, i kao takve, komponente farmaceutskog sastava su podešene da budu u većoj količini nego što je potrebno za primenu i razblažavaju se na odgovarajući način pre primene.

[0206] Farmaceutski sastavi se mogu primeniti kao jedini terapeutski agens ili u kombinaciji sa dodatnim terapijama po potrebi. Prema tome, u jednom otelotvorenju, pruženi sastavi za upotrebu u postupcima tretmana i/ili prevencije se koriste u kombinaciji sa primenom terapeutski efikasne količine drugog aktivnog agensa. Drugi aktivan agens može se primeniti pre, tokom ili nakon primene farmaceutskih sastava predmetnog pronalaska. Drugi aktivan agens može se primeniti bilo kao deo pruženih sastava ili alternativno, kao posebna formulacija.

[0207] Primena pruženih farmaceutskih sastava može se postići na različite načine, uključujući parenteralnu, oralnu, bukalnu, nazalnu, rektalnu, intraperitonealnu, intradermalnu, transdermalnu, subkutanu, intravensku, intraarterijalnu, intrakardijalnu, intraventrikularnu, intrakranijalnu, intratrahealnu, intratekularnu primenu, intramuskularnu injekciju, intravitralnu injekciju i lokalnu primenu.

[0208] Farmaceutski sastavi predmetnog pronalaska su posebno korisne za parenteralnu primenu, tj. subkutano, intramuskularno, intravenski, intraperitonealno, intracerebrospinalno, intraartikularno, intrasinovialno i/ili intratekalno. Parenteralna primena može biti bolusnom injekcijom ili kontinuiranom infuzijom. Farmaceutski sastavi za injekcije mogu biti u jediničnom doznom obliku, npr., u ampulama ili u više-doznim posudama, sa dodatkom konzervansa. Pored toga, razvijeni su brojni noviji pristupi isporuke lekova, i farmaceutski sastavi predmetnog pronalaska su pogodni za primenu pomoću ovih novih postupaka, npr. Inject-ease®, Genject®, injekcione olovke kao što je GenPen® i uređaji bez igle. kao što su MediJector® i BioJector®. Predmetni farmaceutski sastav se takođe može prilagoditi za još uvek otkrivene postupke primene. Takođe pogledati Langer, 1990, Science, 249:1527-1533.

[0209] Dobijeni farmaceutski sastavi se takođe mogu formulisati kao depo sastav. Takve dugodelujuće formulacije mogu se primeniti implantacijom (na primer subkutano ili intramuskularno) ili intramuskularnom injekcijom. Tako, na primer, formulacije mogu biti modifikovane sa pogodnim polimernim ili hidrofobnim materijalima (na primer kao emulzija u prihvatljivom ulju) ili jonoizmenjivačke smole, ili kao teško rastvorljivi derivati, na primer, u vidu teško rastvorljive soli.

[0210] Farmaceutski sastavi mogu, po želji, biti dati u bočici, pakovanju ili dozirnom uređaju koji može sadržati jedan ili više jediničnih doznih oblika koji sadrže aktivni sastojak. U jednom primeru uređaj za raspršivanje može sadržati špric sa jednom dozom tečne formulacije spremne za injekciju. Špric može da bude priložen uputstvima za primenu.

[0211] U drugom primeru, predmetni pronalazak je usmeren na komplet ili kontejner koji sadrži vodeni farmaceutski sastav predmetnog pronalaska. Koncentracija polipeptida u vodenom farmaceutskom sastavu može da varira u širokom rasponu, ali je uglavnom u rasponu od oko 0,05 do oko 20.000 mikrograma po mililitru (µg/ml) vodene formulacije. Komplet takođe može imati priložena uputstva za upotrebu.

[0212] Pored formulacija na koje se odnose ispitivanja formulacija Blokova A do H, naredni dodatni primeri su dati kao dodatni primeri pronalaska:

PRIMER 1

Stabilizovana formulacija adalimumaba (pojedinačni pufer) koja sadrži poliol; bez surfaktanta

[0213] Stabilan vodeni farmaceutski sastav koji sadrži adalimumab, koristeći jedan pufer, i koji je značajno bez surfaktanta, može se pripremiti na naredni način:

Svaka čvrsta komponenta formulacije može se izmeriti do količine potrebne za datu količinu pufera za formulaciju. Te komponente se zatim mogu kombinovati u čaši ili posudi koja može da nosi i meri datu količinu pufera za formulaciju. Zapremina dejonizovane vode jednaka približno 3⁄4 ciljanog pufera za formulaciju može se dodati u čašu, i komponente se mogu rastvoriti pomoću magnetne mešalice. pH pufera može da se podesi na pH ciljane formulacije koristeći 1 molarni natrijum hidroksid i/ili 1 molarni hlorovodonik. Konačna zapremina pufera za formulaciju može se tada povećati do ciljane zapremine dodavanjem dejonizovane vode. Rastvor se zatim može mešati sa magnetnom mešalicom nakon konačnog dodavanja vode. Rastvor adalimumaba može se zatim smestiti u kućište materijala za dijalizu (kao što je Thermo Scientific Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Unit 10,000 MWCO), koji se tada može staviti u dodir sa željenim puferom za formulaciju tokom 12 sati na 4°C.

Zapremina pufera formulacije u odnosu na zapreminu rastvora proteina ne sme biti manja od 1000:1. Kućište dijalize i rastvor proteina koji sadrži mogu se zatim staviti u drugu, jednaku zapreminu pufera za formulaciju tokom dodatnih 12 sati na 4°C.

[0214] Dobijeni rastvor adalimumaba može se zatim ukloniti iz kućišta materijala za dijalizu, i koncentracija adalimumaba može se potom odrediti pomoću ultraljubičaste spektroskopije. Koncentracija adalimumaba može se zatim podesiti na željeni nivo pomoću centrifugiranja (kao što su Amicon Ultra 10,000 MWCO centrifugalni koncentratori) i/ili razblaživanja puferom za formulaciju.

[0215] Primer uzorka obelodanjenja predstavljen je u Tabeli 1 u nastavku:

Tabela 1

[0216] Sastav obelodanjen u Tabeli 1 ne sadrži kombinaciju citratnog i fosfatnog pufera. Takođe ne zahteva prisustvo surfaktanta.

PRIMER 2

Stabilizovana formulacija adalimumaba (pojedinačni pufer) bez polvola ili surfaktanta [0217]

PRIMER 3

Stabilizovana formulacija adalimumaba (pojedinačni pufer) koja sadrži poliol bez surfaktanta

[0218]

[0219] Sastavi iz primera 2 i 3 imaju dugoročnu stabilnost, ne sadrže kombinaciju citratnog i fosfatnog pufera i ne zahtevaju prisustvo surfaktanta.

PRIMER 4

Stabilizovana formulacija adalimumaba (pojedinačni pufer) koja sadrži surfaktant; bez poliola

[0220]

4A

4B

4C

4D

4E

4F

[0221] Sastavi obelodanjeni u Primerima 4(a) do 4(f) iznad će omogućiti stabilnost bez potrebe za poliolom, kao i bez potrebe za kombinovanim sistemom pufera. Za sada je predmetni pronalazak otkrio da kombinacija citratnog/fosfatnog pufera, koja je potrebna u SAD patentu 8,216,583, nije potrebna za stabilizaciju formulacija adalimumaba prema predmetnom pronalasku, stručnjaci će primeti, u praktičnim primerima 4(a) do 4(f), da se mogu koristiti dodatni puferi u kombinaciji sa ovde obelodanjenim histidinskim i sukcinatnim puferima (npr. acetatni, citratni, maleatni, tartaratni i fosfatni puferi); pod uslovom da formulacija ne koristi pufersku kombinaciju citrata i fosfata.

PRIMER 5

Stabilizovana formulacija adalimumaba (pojedinačni pufer) koja sadrži surfaktant: i poliol

[0222]

5A

1

5B

2

Claims (2)

Patentni zahtevi

1. Vodeni farmaceutski sastav koji se sastoji od:

(A)

(i) 50 mg/mL adalimumaba,

(ii) 10 mM histidinskog pufera,

(iii) 120 mM glicina,

(iv) 120 mM arginina, i

(v) 0,1% težine polisorbata 80;

(B)

(i) 50 mg/mL adalimumaba,

(ii) 10 mM histidinskog pufera,

(iii) 120 mM glicina,

(iv) 120 mM arginina, i

(v) 0,05% težine polisorbata 80;

(C)

(i) 50 mg/mL adalimumaba,

(ii) 10 mM histidinskog pufera,

(iii) 120 mM glicina,

(iv) 120 mM arginina, i

(v) 0,01% težine polisorbata 80;

(D)

(i) 50 mg/mL adalimumaba,

(ii) 10 mM histidinskog pufera,

(iii) 120 mM glicina,

(iv) 120 mM arginina, i

(v) 0,05% težine polisorbata 20;

(E)

(i) 50 mg/mL adalimumaba,

(ii) 10 mM histidinskog pufera,

(iii) 120 mM glicina,

(iv) 120 mM arginina, i

(v) 0,1% težine pluronic-a F-68;

(F)

(i) 50 mg/mL adalimumaba,

(ii) 20 mM histidinskog pufera,

(iii) 150 mM glicina,

(iv) 100 mM arginina, i

(v) 0,01% težine polisorbata 80; or

(G)

(i) 50 mg/mL adalimumaba,

(ii) 20 mM histidinskog pufera,

(iii) 120 mM glicina,

(iv) 120 mM arginina, i

(v) 0,01% težine polisorbata 20;

gde svaki od (A)-(G) ima pH od 5,2.

2. Sastav za upotrebu u postupku tretmana upalnog stanja kod pacijenta, gde postupak sadrži primenu terapeutski efikasne količine farmaceutskog sastava prema patentnom zahtevu 1.

4