Deprecated: The each() function is deprecated. This message will be suppressed on further calls in /home/zhenxiangba/zhenxiangba.com/public_html/phproxy-improved-master/index.php on line 456
RS60389B1 - Vezujući molekuli specifični za asct2 i njihove upotrebe - Google Patents
[go: Go Back, main page]

RS60389B1 - Vezujući molekuli specifični za asct2 i njihove upotrebe - Google Patents

Vezujući molekuli specifični za asct2 i njihove upotrebe

Info

Publication number
RS60389B1
RS60389B1 RS20200647A RSP20200647A RS60389B1 RS 60389 B1 RS60389 B1 RS 60389B1 RS 20200647 A RS20200647 A RS 20200647A RS P20200647 A RSP20200647 A RS P20200647A RS 60389 B1 RS60389 B1 RS 60389B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
asct2
amino acid
seq
acid sequence
Prior art date
Application number
RS20200647A
Other languages
English (en)
Inventor
Nabendu Pore
Martin J Borrok Iii
Partha Chowdhury
Emil F Michelotti
David A Tice
Robert E Hollingsworth
Chien-Ying Chang
Original Assignee
Medimmune Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Medimmune Llc filed Critical Medimmune Llc
Publication of RS60389B1 publication Critical patent/RS60389B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68035—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a pyrrolobenzodiazepine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6819—Plant toxins
    • A61K47/6825—Ribosomal inhibitory proteins, i.e. RIP-I or RIP-II, e.g. Pap, gelonin or dianthin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6831—Fungal toxins, e.g. alpha sarcine, mitogillin, zinniol or restrictocin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5758—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites
    • G01N33/5759—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites involving compounds localised on the membrane of tumour or cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Oncology (AREA)

Description

Opis
POZADINA
[0001] Familija nosača rastvorene supstance (eng. SLC), organizovana u mnoštvo potfamilija, uključuje više od 300 gena koji kodiraju membranske transportne proteine. SLC1A potfamilija uključuje transportni sistem ASC, koji posreduje u transportu neutralnih aminokiselina zavisnom od natrijuma u ćelijama kičmenjaka. Alanin, serin i cistein su preferirani supstrati ASC sistema. Identifikovana su dva podtipa ASC sistema, ASC transporter 1 (ASCT1, poznat i kao SLC1A4) i ASC transporter 2 (ASCT2, poznat i kao SLC1A5).
[0002] ASCT2 je membranski protein od 541 aminokiseline koji višestruko prolazi kroz membranu i osam transmembranskih domena. Molekularna težina ASCT2 varira od 55–75 KD zavisno od različitih profila glikozilacije. Pored transporta L-alanina, L-serina i L-cisteina, ASCT2 takođe transportuje L-treonin i L-glutamin. Štaviše, ASCT2 funkcioniše kao površinski ćelijski receptor koji imaju retrovirus majmuna tip D i virusi tip C. US2012039904 se odnosi na antitela ili njihove fragmente koji prepoznaju i vezuju ekstraćelijski region ASCT2.
[0003] Prekomerna ekspresija ASCT2 je opisana kod različitih karcinoma, uključujući kolorektalni, karcinom skvamoznih ćelija glave i vrata (eng. HNSCC), karcinom prostate, karcinom pluća, karcinom pankreasa i hematološke karcinome kao što su mijelom i limfom. Prekomerna ekspresija ASCT2, procenjena imunohistohemijskim analizama (eng. IHC), ukazuje na lošu prognozu kod različitih karcinoma uključujući kolorektalni, karcinom prostate, karcinom pluća i karcinom pankreasa (K Kaira, i sar. (2015) Histopathology; Shimizu, i sar. (2014) BJC; D Witte, i sar. (2002) Anticancer Research; R Li, i sar. (2003) Anticancer Research). Opisano je da je ASCT2 jedan ciljni pokretač signalnog puta rapamicina (mTOR) kod sisara i sledstveno rasta tumora (Nicklin P. i sar. (2009) Cell).
[0004] Konjugat antitela i leka (eng. ADC) predstavlja novi obećavajući terapijski pristup za efikasnije lečenje karcinoma uz snižavanje toksičnosti u vezi sa lekom kombinujući specifičnost antitela sa potencijom malih citotksičnih molekula ili toksina. ADC može da obuhvata citotksin, koji može biti mali molekul koji je hemijski modifikovan da obuhvata linker. Linker se potom koristi da konjuguje citotoksin i antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen. Citotoksičnost se indukuje kada se ADC vezuje za površinski antigen ciljno-pozitivne ćelije, internalizuje se i transportuje u lizozom gde se citotoksin oslobađa nakon bilo proteolize linkera koji se može odvojiti (na primer katepsin B nađen u lizozomu) ili kroz proteolitičku degradaciju antitela kada se linker koji se ne može odvojiti koristi da pričvrsti citotoksin za antitelo. Citotoksin se potom premešta iz lizozoma i u citosol gde može da se veže za svoj cilj, u zavisnosti od njegovog mehanizma delovanja. Obično ovi citotoksini indukuju zastoj ćelijskog ciklusa koji sledstveno vodi do apoptoze. Odgovarajući konjugati koji sadrže radiofarmaceutike takođe predstavljaju obećavajući novi način otkrivanja karcinomskih ćelija in vivo ili in vitro.
[0005] Ovo otkriće obezbeđuje molekule koji se specifično vezuju za ASCT2 i metode za upotrebu takvih molekula, npr. za otkrivanje ASCT2, za isporučivanje heterologe supstance ćeliji ili za lečenje bolesti ili poremećaja koje karakteriše prekomerna ekspresija ASCT2, npr. karcinoma. Ovo otkriće predstavlja anti-ASCT2 antitela konjugovana sa citotoksičnim lekom kao što je derivat tubulizina ili pirolobenzodiazepina (anti-ASCT2-ADC). Antitela pronalaska su korisna za lečenje bolesti ili poremećaja koje karakteriše prekomerna ekspresija ASCT2, npr. karcinoma. Na primer, pronalazači su pokazali da anti-ASCT2 ADC uzrokuju tumorsku regresiju u ksenogenim mišjim modelima humanog kolorektalnog i karcinoma glave i vrata.
KRATAK SAŽETAK PRONALASKA
[0006] U prvom aspektu, predmetni pronalazak predstavlja antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, koje se specifično vezuje za epitop neutralnog aminokiselinskog transportera 2 (ASCT2), naznačeno time što antitelo ili antigen vezujući fragment obuhvata tri regiona koji određuju komplementarnost teškog lanca (HCDR) varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i tri regiona koji određuju komplementarnost lakog lanca (LCDR) varijabilnog regiona lakog lanca (VL), naznačeno time što antitelo ili njegov antigen vezujući fragment obuhvata sledeće: (a) HCDR1 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 10; HCDR2 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 11; HCDR3 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 12; LCDR1 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 13; LCDR2 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 14; i LCDR3 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 15; ili (b) HCDR1 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 16; HCDR2 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 17; HCDR3 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 18; LCDR1 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 19; LCDR2 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 20; i LCDR3 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 21.
[0007] U nekim otelotvorenjima, VH antitela ili antigen vezujućeg fragmenta obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1, a VL obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2. U nekim otelotvorenjima, VH obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3, a VL obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4. U nekim otelotvorenjima, VH obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, a VL obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6. U nekim otelotvorenjima, VH obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 7, a VL obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8.
[0008] U nekim otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment obuhvata IgG konstantni region koji obuhvata umetanje cisteina (C) između serina (S) na položaju 239 i valina (V) na položaju 240, naznačeno time što numerisanje odgovara Kabat EU indeksu.
[0009] U nekim otelotvorenjima, antitelo obuhvata teški lanac aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 9.
[0010] U nekim otelotvorenjima, nakon što se antitelo veže za ASCT2 na površini ćelije, antitelo se internalizuje u ćeliju.
[0011] U nekim otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment obuhvata konstantni region lakog lanca izabranog iz grupe koja se sastoji od humanog kapa konstantnog regiona i humanog lambda konstantnog regiona.
[0012] U nekim otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment obuhvata humani kapa konstantni region SEQ ID NO: 26.
[0013] U nekim otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment se dalje konjuguje sa citotoksinom izabranim iz grupe koja se sastoji od antimikrobnog agensa, terapijskog agensa, proleka, peptida, proteina, enzima, lipida, modifikatora biološkog odgovora, farmaceutskog agensa, limfokina, heterologog antitela, fragmenta heterologog antitela, oznake koja može da se detektuje, polietilen glikola (PEG), radioizotopa i kombinacije dva ili više bilo kojih navedenih citotoksina. U nekim otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment se konjuguje sa citotoksinom. U nekim otelotvorenjima, citotoksin se bira od derivata tubulizina i pirolobenzodiazepina. U nekim otelotvorenjima, derivat tubulizina je tubulizin AZ1508. U nekim otelotvorenjima, pirolobenzodiazepin se bira od SG3315 i SG3249.
[0014] U nekim otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment se vezuje za humani ASCT2 i ASCT2 makaki majmuna.
[0015] U nekim otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment se ne vezuje specifično za humani ASCT1.
[0016] U drugom aspektu, obezbeđena je farmaceutska smeša koja obuhvata antitelo ili antigen vezujući fragment prema prvom aspektu pronalaska.
[0017] U trećem aspektu, pružen je polinukleotid ili kombinacija polinukleotida koji kodira antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema prvom aspektu pronalaska.
[0018] U četvrtom aspektu, pružen je metod pravljenja antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta prema prvom aspektu pronalaska, a koji obuhvata uzgajanje domaćina koji obuhvata polinukleotid trećeg aspekta pronalaska.
[0019] U petom aspektu, pruženo je antitelo ili antigen vezujući fragment prvog aspekta pronalaska ili farmaceutska smeša drugog aspekta pronalaska za korišćenje u lečenju karcinoma koji karakteriše prekomerna ekspresija ASCT2, naznačeno time što navedeno lečenje obuhvata primenu kod ispitanika sa potrebom za tim lečenjem, efikasne količine navedenog antitela ili antigen vezujućeg fragmenta ili navedene farmaceutske smeše.
KRATAK OPIS CRTEŽA/SLIKA
[0020]
SLIKA 1A prikazuje kvantifikaciju analiza protočne citometrije koje pokazuju visoku ASCT2 ekspresiju u aspiratima kostne srži iz uzoraka AML i MM u poređenju sa kostnom srži zdravih uzoraka.
SLIKA 1B prikazuje visoku ekspresiju ASCT2 u CD34+/CD38+ populaciji, opisani markeri definišu populaciju leukemijskih stem ćelija (eng. LSC). Dodatna ekspresija ASCT2 je procenjena u svim drugim podtipovima kao što su CD34+CD38-, CD34+CD38+ i CD34-CD38+ populacije.
SLIKA 1C prikazuje ASCT2 ekspresiju u plazma ćelijama (eng. PC; CD138+/CD19-) i stem ćelijama (eng. SC; CD138-/CD19+) iz MM uzoraka.
SLIKA 1D prikazuje ASCT2 ekspresiju procenjenu u EpCAM+/CD24+/CD44+ ćelijskoj populaciji, opisani markeri za pankreasni CSC. Analize protočne citometrije sugerišu visoku ASCT2 ekspresiju CSC kod tumora pankreasa.
SLIKA 1E prikazuje ablaciju CSC (EpCAM+/CD24+/CD44+) populacije kod tumora pankreasa nakon lečenja sa ASCT2-PBD ADC (antitelo 17c10 je konjugovano sa SG3249) in vivo.
SLIKA 2 prikazuje grafik koji opisuje promenu aktivnosti vezivanja prečišćenog humanog anti-ASCT2 IgG 1e8, 3f7, 5a2, 9b3, 10c3, 16b8, 17c10 i 17a10 sa 293F ćelijama transfektiranih putem plazmida koji eksprimira humani ASCT2.
SLIKA 3A prikazuje stubičasti grafik relativne varijabilnosti do one netretiranih kontrolnih ćelija 293F ćelija koje eksprimiraju ASCT2 tretiranih negativnom kontrolom (netretiranih); tretiranih primarnim anti-ASCT2 antitelima 1e8 i 17c10; tretiranih anti-ASCT2 antitelom konjugovanim sa saporinom; ili tretiranih kontrolnim antitelom povezanim sa saporinom (hIgG-saporin).
SLIKA 3B prikazuje grafik citotoksičnosti anti-ASCT21 E8, anti-ASCT2 17C10 i izotipsku kontrolu R347 klasično konjugovanog sa tubuluzinom AZ1508 u Sw48 ćelijama.
SLIKA 4 prikazuje stubičasti dijagram koji opisuje vezivanje anti-ASCT2 antitela 17c10 i 1e8 za WiDr ćelije ili WiDr ćelije sa shRNK obaranjem ASCT2 ekspresije, procenjene protočnom citometrijom.
SLIKA 5A prikazuje kinetiku internalizacije anti-ASCT2 antitela 17c10 i izotipa kontrole. SLIKA 5B. prikazuje kinetiku internalizacije ASCT2-ADC (antitelo 17c10 konjugovano sa AZ1508) merenu citotoksičnim ubijanjem. Ćelije su pulsirane sa ASCT2-ADC (17c10-AZ1508) za odgovarajuće vremenske periode. Nakon toga, ADC koji obuhvata medijum je zamenjen svežim medijumom i dalje inkubiran tokom 4 dana. Vijabilitet ćelije je meren korišćenjem CTG kompleta. Krive odgovora na dozu su prikazane u vidu procenta netretiranih kontrolnih ćelija.
SLIKE 6A do 6H prikazuju grafike protočne citometrije koji su rezultat vezivanja anti-ASCT2 antitela 17c10 i 1e8 i izotipa kontrole R347 sa ćelijskim linijama koje eksprimiraju ASCT2.
SLIKA 6A, humana karcinomska ćelijska linija Ca127; SLIKA 6B, humana karcinomska ćelijska linija FaDu; SLIKA 6C humana karcinomska ćelijska linija SSC15; SLIKA 6D humana karcinomska ćelijska linija WiDr; SLIKA 6E CHOK1 ćelije koje stabilno eksprimiraju humani ASCT2; SLIKA 6F CHOK1 ćelije koje stabilno eksprimiraju makaki ASCT2; SLIKA 6G makaki karcinomska ćelijska linija CynoMK1; i SLIKA 6H lažno transficirane CHOK1 ćelije.
SLIKA 7A prikazuje vezivanje anti-ASCT2 antitela 17c10 sa SKMEL-2 ćelije nisu izmenjene od strane ASCT1 shRNK, dok je vezivanje značajno smanjeno nakon ASCT2 specifičnog shRNK obaranja.
SLIKA 7B prikazuje citotoksično ubijanje anti-ASCT2 antitela ADC (antitelo 17c10 konjugovano sa AZ1508) nije bio promenjen nakon ASCT1 shRNK obaranja, dok je značajno smanjenje citotoksičnog ubijanja primećeno nakon ASCT2 shRNK prigušivanja. Podaci svih shRNK grupa obaranja su normalizovani u odnosu na netretirane kontrole.
SLIKA 8A i SLIKA 8B prikazuju citotoksični efekat anti-ASCT2 antitela 17c10 (SLIKA 8A) i 1e8 (SLIKA 8B), konjugovanih sa tubulizinom 1508 nasuprot stabilnih CHO-K1 ćelijskih linija koje eksprimiraju humane ili makaki ASCT2 proteine ili neki beznačajni receptor.
SLIKE 9A do 9D prikazuju grafike protočne citometrije za vezivanje 17c10 roditeljskog antitela, 17c10 germinativnog antitela i R347 izotipa kontrolnog antitela sa stabilnim CHO-K1 ćelijskim linijama koje eksprimiraju humani ASCT2 (SLIKA 9A); stabilne CHO-K1 ćelijske linije koje eksprimiraju makaki ASCT2 (SLIKA 9B); ćelije kolorektalnog karcinoma WiDr koje eksprimiraju ASCT2 (SLIKA 9C); i lažno transfektirane kontrolne ćelije (SLIKA 9D). SLIKE 10A do 10F prikazuju relativnu vijabilnost (%) normalizovanu do one netretiranih kontrolnih ćelija karcinoma ćelijskih linija tretiranih anti-ASCT2 antitelom 17c10 konjugovanim sa tubulizinom AZ1508 i R347 izotipa kontrolnog antitela konjugovanog sa tubulizinom AZ1508 sa pankreasnim karcinomskim ćelijama (SLIKA 10A), ćelijama karcinoma kolona (SLIKA 10B), ćelijama karcinoma pluća (SLIKA 10C), karcinomskim ćelijama HNSCC (SLIKA 10D), ćelijama karcinoma prostate (SLIKA 10E) i ćelijskom linijom koja ne eksprimira ASCT2 (SLIKA 10F).
SLIKA 11A prikazuje relativnu vijabilnost normalizovanu do one ćelija tretiranih kontrolnim antitelom konjugovanim sa SG3249 sa anti-ASCT2 antitelom 17c10 konjugovanim sa SG3249.
SLIKA 11B prikazuje relativnu vijabilnost normalizovanu do one ćelija tretiranih kontrolnim antitelom konjugovanim sa SG3315 sa anti-ASCT2 antitelom 17c10 konjugovanim sa SG3315.
SLIKE 12A, 12B i 12C prikazuju hronologiju zapremine tumora kod WiDr kolorektalnog karcinoma ili ksenograft modela primarnog pankreasnog karcinoma nakon tretiranja anti-ASCT2 antitelom 17c10 konjugovanim sa tubulizinom ili PBD. SLIKA 12A, 17c10 antitelo je konjugovano sa tubulizinom 1508; SLIKA 12B, anti-ASCT2 antitelo 17c10 je konjugovano sa SG 3315; SLIKA 12C, anti-ASCT2 antitelo 17c10 je konjugovano sa SG 3249.
SLIKA 13A prikazuje antitumorsku efikasnost ASCT2-PBD ADC (antitelo 17c10 je konjugovano sa SG3249) u diseminovanom TF1 alfa AML mišjem modelu. ADC i izotip kontrole su primenjeni u rasporedu Q1W (jednom nedeljno)x4 Morbiditet i mortalitet su praćeni svakog dana. Svi dozni nivoi ADC (0,05; 0,1; 0,25 i 0,5 mg/kg) su značajno poboljšali preživljavanje u poređenju sa netretiranom kontrolnom grupom. Podaci su prikazani u vidu Kaplan-Mejer grafika preživljavanja pokazujući sudbinu pojedinačnih životinja unutar svake grupe.
SLIKA 13B prikazuje antitumorsku aktivnost ASCT2-PBD ADC (antitelo 17c10 je konjugovano sa SG3249) u diseminovanom MM.1S MM mišjem modelu. Miševi su tretirani ADC-om ili izotipom kontrole kao što je opisano na SLICI 13A. Morbiditet i mortalitet su praćeni svakog dana. Oba dozna nivoa ADC (0,1 i 0,4 mg/kg) su značajno poboljšali preživljavanje (117 odnosno 123,5 dana) u poređenju sa netretiranom kontrolnom grupom (55,5 dana). Podaci su prikazani u vidu Kaplan-Mejer grafika preživljavanja pokazujući sudbinu pojedinačnih životinja unutar svake grupe.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0021] Predmetni pronalazak predstavlja antitela i njihove antigen vezujuće fragmente koji se specifično vezuju za ASCT2. U određenim otelotvorenjima, antitelo ili antigen vezujući fragment se konjuguje sa nekom supstancom, poželjno citotoksinom. Polinukleotidi koji kodiraju antitela i njihove antigen vezujuće fragmente, vektori koji sadrže polinukleotide i ćelije domaćina koje eksprimiraju antitela su uključeni. Smeše koje sadrže anti-ASCT2 antitela ili njihove antigen vezujuće fragmente i metode za stvaranje anti-ASCT2 antitela i antigen vezujućih fragmenata takođe su pruženi. Metode upotrebe novih anti-ASCT2 antitela, kao kod dijagnostičkih primena ili u metodama tretiranja bolesti ili poremećaja koje karakteriše prekomerna ekspresija ASCT2, npr. karcinom, dalje su pruženi.
[0022] Kako bi se predmetni pronalazak lakše razumeo, prvo će biti definisani neki pojmovi. Dodatne definicije su date tokom detaljnog opisa.
I. Definicije
[0023] Kako se koristi u ovoj specifikaciji i dodatnim patentnim zahtevima, oblici jednine uključuju referentne množine osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije. Pojmovi „jedan“, kao i pojmovi „jedan ili više“ i „najmanje jedan“ ovde se mogu koristiti naizmenično.
[0024] Nadalje, „i/ili“, treba razumeti kao specifično otkriće svake od dve naznačene karakteristike ili komponente sa drugom karakteristikom/komponentom ili bez nje. Tako, termin „i/ili“, kako se koristi u frazi poput „A i/ili B“, treba da obuhvati A i B, A ili B, (samo) A i (samo) B. Slično tome, termin „i/ili“, kako se koristi u frazi poput „A, B i/ili C“, treba da obuhvati A, B i C; A, B ili C; A ili B; A ili C; B ili C; A i B; A i C; B i C; (samo) A; (samo) B; i (samo) C.
[0025] Uvek kada su otelotvorenja opisana izrazom „obuhvata“, analogna otelotvorenja opisana terminima „sastoji se od“ i/ili „suštinski se sastoji od“ takođe su uključena.
[0026] Ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji se ovde koriste imaju isto značenje kao što je poznato osobi sa uobičajenim znanjima u oblasti na koju se ovaj pronalazak odnosi. Na primer, The Dictionary of Cell and Molecular Biology (5. izd. J.M. Lackie ed., 2013), the Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology (2. izd. R. Cammack i sar., urednici, 2008) i The Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, P-S. Juo, (2. izd. 2002) mogu da obezbede osobi sa znanjem opšte definicije nekih pojmova korišćenih ovde.
[0027] Jedinice, prefiksi i simboli su naznačeni u svom obliku prihvaćenom prema Međunarodnom sistemu jedinica (SI). Numerički rasponi uključuju brojeve koji definišu raspon. Osim ako nije drugačije naznačeno, aminokiselinske sekvence se pišu sleva nadesno u smeru amino prema karboksi. Ovde dati naslovi ne predstavljaju ograničenja različitih aspekata ili otelotvorenja pronalaska, koji se mogu dobiti uvidom u specifikaciju kao celinu. Shodno tome, pojmovi definisani u neposrednom nastavku su detaljnije definisani uvidom u specifikaciju kao celinu.
[0028] Aminokiseline se ovde označavaju svojim uobičajeno poznatim troslovnim simbolima ili jednoslovnim simbolima koje preporučuje IUPAC-IUB Komisija za biohemijsku nomenklaturu. Slično tome, nukleotidi se označavaju svojim opšteprihvaćenim jednoslovnim šiframa.
[0029] Termin „ASCT2“ se odnosi na ASC sistem aminokiselinskog transporter 2 proteina i/ili njegove aktivne fragmente. ASCT2 je transmembranski protein koji posreduje u transportu malih neutralnih aminokiselina, uključujući glutamin, alanin i serin, cistein i treonin, na način zavisan od Na<+>. RNK, DNK i aminokiselinske sekvence ASCT2 su poznate stručnjacima u predmetnoj oblasti i mogu se naći u mnogim bazama podataka, na primer, u bazi podataka Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (eng. NCBI). Primeri ovih sekvenci koje se mogu naći u NCBI su humane ASCT2 sekvence koje imaju GenBank pristupne brojeve NM_005628 i NP_005619; ASCT2 sekvence makaki majmuna (lat. Macaca fascicularis) koje imaju GenBank pristupne brojeve NM_001284054 i NP-001270983.
[0030] Pojmovi „inhibirati“, „blokirati“ i „suzbiti“ ovde se koriste naizmenično i označavaju bilo koje statistički značajno smanjenje biološke aktivnosti, uključujući punu blokadu aktivnosti. Na primer, „inhibicija“ može da se odnosi na smanjenje od oko 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 100% biološke aktivnosti ili procesa.
[0031] Pojmovi „antitelo“ ili „imunoglobulin“ se ovde koriste naizmenično. Tipično antitelo obuhvata bar dva teška (eng. H) lanca i dva laka lanca (eng. L) međusobno povezana disulfidnim vezama. Svaki teški lanac obuhvata varijabilni region teškog lanca (ovde skraćeno kao eng. VH) i konstantni region teškog lanca. Konstantni region teškog lanca obuhvata tri domena, CH1, CH2, i CH3. Svaki laki lanac obuhvata varijabilni region lakog lanca (ovde skraćeno kao eng. VL) i konstanti region lakog lanca. Konstantni region lakog lanca obuhvata jedan domen, Cl. VH i VL regioni se mogu dalje podeliti na hipervarijabilne regione, nazvane regionima koji određuju komplementarnost (eng. CDR), isprekidane regionima koji su više konzervisani, nazvanim regionima okvira (eng. FW). Svaki VH i VL se sastoji od tri CDR i četiri FW, raspoređenih od aminoterminalnog do karboksiterminalnog kraja po sledećem rasporedu: FW1, CDR1, FW2, CDR2, FW3, CDR3, FW4. Varijabilni regioni teških i lakih lanaca sadrže vezujući domen koji stupa u interakciju sa antigenom. Konstantni regioni antitela mogu da posreduju u vezivanju imunoglobulina za tkiva ili faktore domaćina, uključujući različite ćelije imunskog sistema (npr. efektorske ćelije) i prvu komponentu (C1q) klasičnog sistema komplementa. Primeri antitela predmetnog pronalaska uključuju proizvedena hibridomom mišja monoklonalna antitela 17c10 i 1e8, humanizovane, optimizovanog afiniteta, germinativne i/ili druge verzije ovih antitela, kao i optimizovanog serumskog poluživota anti-ASCT2 YTE antitela (npr. K44VHa-N56Q, K44VHa6-N56Q ili K2Ha-N56Q).
1
[0032] Pojam „germinacija“ znači da su aminokiseline na specifičnim pozicijama u antitelu mutirale unazad do onih u germinativnoj liniji.
[0033] Pojam „antitelo“ može da označava molekul imunoglobulina koji prepoznaje cilj i specifično se vezuje za cilj, kao što je protein, polipeptid, peptid, ugljeni hidrat, polinukleotid, lipid ili kombinacija gorepomenutih putem najmanje jednog mesta za prepoznavanje antigena u varijabilnom regionu molekula imunoglobulina. Kako se ovde koristi, termin „antitelo“ obuhvata intaktna poliklonska antitela, intaktna monoklonska antitela, fragmente antitela (kao što su fragmenti Fab, Fab', F(ab')2 i Fv), jednolančane Fv (scFv) mutante, multispecifična antitela, kao što su bispecifična antitela nastala od najmanje dva intaktna antitela, himerna antitela, humanizovana antitela, humana antitela, fuzione proteine koji obuhvataju antigen determinišući deo antitela i bilo koji drugi modifikovani molekul imunoglobulina koji obuhvata mesto za prepoznavanje antigena, sve dok antitelo ispoljava željenu biološku aktivnost. Antitelo može biti bilo koje od pet glavnih klasa imunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM ili njihovih potklasa (izotipova) (npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2), na osnovu identičnosti njihovih konstantnih domena teškog lanca koji se nazivaju alfa, delta, epsilon, gama, odnosno mu. Različite klase imunoglobulina imaju različite i dobro poznate strukture podjedinica i trodimenzionalne konfiguracije. Antitela mogu biti ogoljena ili konjugovana sa drugim molekulima kao što su toksini, radioizotopi itd.
[0034] Termin „ASCT2 antitelo“ ili „antitelo koje se vezuje za ASCT2“ ili „anti-ASCT2“ označava antitelo koje je sposobno da veže ASCT2 sa dovoljnim afinitetom takvim da je antitelo korisno kao terapijski agens ili dijagnostički reagens u ciljanju na ASCT2. Stepen vezivanja anti-ASCT2 antitela za nepovezani ne-ASCT2 protein je manji od oko 10% vezivanja antitela za ASCT2 mereno npr. radioimunoesejem (RIA), BIACORE® (koristeći rekombinantni ASCT2 kao analit i antitelo kao ligand ili obratno), KINEXA® ili drugim vezujućim esejima poznatim u predmetnoj oblasti. U određenim otelotvorenjima, antitelo koje vezuje ASCT2 ima disocijativnu konstantu (KD) ≤1 µM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0,1 nM, ≤10 pM, ≤1 pM ili ≤0,1 pM.
[0035] Pojam „antigen vezujući fragment“ označava deo intaktnog antitela i označava varijabilne regione koji određuju komplementarnost intaktnog antitela. Fragmenti antitela pune dužine mogu biti antigen vezujući fragment antitela. Primeri za fragmente antitela uključuju, ali nisu ograničeni na Fab, Fab', F(ab')2 i Fv fragmente, linearna antitela, jednolančana antitela (npr. ScFvs) i multispecifična antitela izgrađena od fragmenata antitela.
[0036] „Monoklonsko antitelo“ (mAt) označava homogenu populaciju antitela uključenu u visoko specifično prepoznavanje i vezivanje pojedinačne antigenske determinante ili epitopa. Ovo je nasuprot poliklonskim antitelima koja tipično uključuju različita antitela usmerena protiv različitih antigenskih determinanti. Pojam „monoklonsko antitelo“ uključuje i intaktna i monoklonska antitela pune dužine kao i fragmente antitela (kao što su Fab, Fab', F(ab')2, Fv), jednolančane mutante (scFv), fuzione proteine koji obuhvataju deo antitela i bilo koji drugi modifikovani molekul imunoglobulina koji obuhvata mesto za prepoznavanje antigena. Nadalje, „monoklonsko antitelo“ se odnosi na takva antitela nastala na bilo koji način uključujući, ali ne ograničeno na hibridom, selekciju faga, rekombinantnu ekspresiju i transgene životinje.
[0037] Pojam „humanizovano antitelo“ označava antitelo izvedeno iz nehumanog (npr. mišjeg) imunoglobulina, koje je inženjeringom obrađeno da obuhvata minimalne nehumane (npr. mišje) sekvence. Tipično, humanizovana antitela su humani imunoglobulini kod kojih su ostaci regiona koji određuju komplementarnost (CDR) zamenjeni ostacima CDR nehumanih vrsta (npr. miš, pacov, zec ili hrčak) koji imaju željenu specifičnost, afinitet i sposobnost (Jones i sar, 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann i sar., 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen i sar., 1988, Science, 239:1534-1536). U nekim slučajevima, ostaci Fv regiona okvira (FW) humanog imunoglobulina su zamenjeni odgovarajućim ostacima u antitelu nehumanih vrsta koji imaju željenu specifičnost, afinitet i sposobnost.
[0038] Humanizovana antitela mogu dalje biti modifikovana supstitucijom dodatnih ostataka bilo u Fv regionu okvira i/ili unutar zamenjenih nehumanih ostataka da bi se poboljšala i optimizovala specifičnost antitela, afinitet i/ili sposobnost. Opšte uzeto, humanizovana antitela će sadržati u znatnoj meri sva od bar jednog, a tipično dva ili tri, varijabilna domena koja sadrže sve ili u znatnoj meri sve CDR regione koji odgovaraju nehumanom imunoglobulinu dok svi ili u znatnoj meri svi FR regioni su oni sa konsenzus sekvencom humanog imunoglobulina. Humanizovana antitela mogu takođe obuhvatati bar deo konstantnog regiona ili domena (Fc) imunoglobulina, tipično humanog imunoglobulina. Primeri metoda koje se koriste za stvaranje humanizovanih antitela su opisani u U.S. Pat. br.5,225,539 ili 5,639,641.
[0039] „Farmaceutski prihvatljiv nosač“ označava sastojak formulacije leka, osim aktivnog sastojka, koji je netoksičan za ispitanika. Farmaceutski prihvatljiv nosač obuhvata, ali nije ograničen na, pufer, ekscipijens, stabilizator ili konzervans. Kako se ovde koristi, „farmaceutski prihvatljiv nosač“ uključuje bilo koji i sve rastvarače, medije za disperziju, oblagače, antibakterijske i antigljivične agense, izotonične i supstance koji odlažu apsorpciju/resorpciju i slične koji su fiziološki kompatibilni.
[0040] „Varijabilni region“ antitela označava varijabilni region lakog lanca antitela ili varijabilni region teškog lanca antitela, bilo samog ili u kombinaciji. Varijabilni regioni svakog teškog i lakog lanca sastoje se od četiri regiona okvira (FW) povezanih putem tri regiona koji određuju komplementarnost (CDR), poznatih i kao hipervarijabilni regioni. CDR u svakom lancu se drže zajedno u bliskom kontaktu putem FW regiona i, uz CDR drugog lanca, doprinose formiranju mesta za vezivanje antigena antitela. Postoje bar dve tehnike za određivanje CDR: (1) pristup baziran na varijabilnosti sekvence među vrstama (tj. Kabat i sar. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5. izd., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.)); i (2) pristup baziran na kristalografskim studijama antigen-antitelo kompleksa (Al-lazikani i sar. (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)). Pored toga, kombinacija ova dva pristupa se nekad koristi u oblasti za određivanje CDR.
[0041] „Kabat sistem numerisanja“ se uopšteno koristi kada se govori o ostatku varijabilnog domena (približno ostaci 1–107 lakog lanca i ostaci 1–113 teškog lanca) (npr. Kabat i sar., Sequences of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)).
[0042] Numerisanje pozicije aminokiseline kao u Kabat-u, odnosi se na sistem numerisanja koji se koristi za varijabilne domene teškog lanca ili varijabilne domene lakog lanca kompilacije antitela u publikaciji Kabat i sar., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991). Koristeći ovaj sistem za numerisanje, stvarna linearna aminokiselinska sekvenca može sadržati manje ili dodatne aminokiseline koje odgovaraju skraćenju ili umetanju u FW ili CDR varijabilnog domena. Na primer, varijabilni domen teškog lanca može sadržati pojedinačni aminokiselinski umetak (ostatak 52a prema Kabat-u) nakon ostatka 52 H2 i umetnute ostatke (npr. ostaci 82a, 82b i 82c itd. prema Kabat-u) nakon ostatka teškog lanca FW 82.
1
[0043] Kabat numerisanje ostataka može biti određeno za dato antitelo putem poravnanja homologih regiona sekvence antitela sa standardnom Kabat numeričkom sekvencom. Chothia se odnosi umesto toga na lokaciju strukturnih petlji (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol.196:901-917 (1987)). Kraj Chothia CDR-H1 petlje, kada se numeriše korišćenjem Kabat konvencije za numeraciju, varira između H32 i H34 u zavisnosti od dužine petlje (ovo je zato što Kabat šema za numerisanje postavlja umetke na H35A i H35B; ako ni jedan 35A ni 35B nije prisutan, petlja se završava na 32; ako je samo 35A prisutan, petlja se završava na 33; ako su i 35A i 35B prisutni, petlja se završava na 34). AtM hipervarijabilni regioni predstavljaju kompromis između Kabat CDR i Chothia strukturnih petlji, a koristi ih AtM softver za modelovanje antitela kompanije Oxford Molecular. Niženavedena tabela 1 navodi pozicije aminokiselina koje obuhvataju varijabilne regione antitela u svakom sistemu.
TABELA 1
[0044] ImMunoGeneTics (IMGT) takođe predstavlja sistem numerisanja za varijabilne regione imunoglobulina, uključujući CDR. Videti, npr. Lefranc, M.P. i sar., Dev. Comp. Immunol.27: 55-77(2003). IMGT sistem za numerisanje je baziran na poravnanju više od 5000 sekvenci, strukturnih podataka i karakterizacije hipervarijabilnih petlji i omogućava lako poređenje varijabilnih i CDR regiona za sve vrste. Prema IMGT šemi za numerisanje, VH-CDR1 je na pozicijama 26 do 35, VH-CDR2 je na pozicijama 51 do 57, VH-CDR3 je na pozicijama 93 do 102, VL-CDR1 je na pozicijama 27 do 32, VL-CDR2 je na pozicijama 50 do 52 i VL-CDR3 je na pozicijama 89 do 97.
[0045] Kako se koristi kroz specifikaciju opisane VH CDR sekvence odgovaraju klasičnim lokacijama Kabat numerisanja, naime Kabat VH-CDR1 je na pozicijama 31–35, VH-CDR2 je na pozicijama 50–65 i VH-CDR3 je na pozicijama 95–102. VL-CDR1, VL-CDR2 i VL-CDR3 takođe odgovaraju klasičnim lokacijama Kabat numerisanja, naime pozicijama 24–34, 50–56 i 89–97, redom.
[0046] Termin „humano antitelo“ znači antitelo nastalo u ljudskom biću ili antitelo koje ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara antitelu nastalom u ljudskom biću napravljenom korišćenjem bilo koje tehnike poznate u predmetnoj oblasti. Ova definicija humanog antitela uključuje intaktna ili antitela pune dužine, njihove fragmente i/ili antitela koja obuhvataju bar jedan humani teški i/ili laki lanac polipeptida kao što je, na primer, antitelo koje obuhvata mišji laki lanac i humani teški lanac polipeptida.
[0047] Termin „himerno antitelo“ se odnosi na antitela u kojima je aminokiselinska sekvenca molekula imunoglobulina izvedena od dve ili više vrsta. Tipično, varijabilni region i lakih i teških lanaca odgovara varijabilnom regionu antitela izvedenih od jedne vrste sisara (npr. miš, pacov, zec itd.) sa željenom specifičnošću, afinitetom i sposobnošću dok su konstantni regioni homologi sekvencama kod antitela izvedenih od drugih (obično humanih) kako bi se izbeglo izazivanje imunskog odgovora kod tih vrsta.
[0048] Pojmovi „YTE“ ili „YTE mutant“ se odnose na mutaciju u IgG1 Fc koja dovodi do porasta u vezivanju za humani FcRn i poboljšava serumski poluživot antitela koje ima mutaciju. YTE mutant obuhvata kombinaciju tri mutacije, M252Y/S254T/T256E (EU numerisanje Kabat i sar. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Public Health Service, National Institutes of Health, Washington, D.C.), unetih u teški lanac IgG1. Videti U.S. Patent br. 7,658,921. Pokazano je da YTE mutant povećava serumski poluživot antitela približno četiri puta u poređenju sa verzijama divljeg tipa istog antitela (Dall'Acqua i sar., J. Biol. Chem. 281:23514-24 (2006); Robbie i sar, (2013) Antimicrob. Agents Chemother. 57, 6147-6153). Videti takođe U.S. Patent br.7,083,784.
1
[0049] „Afinitet vezivanja“ se uopšteno odnosi na snagu ukupnog zbira nekovalentnih interakcija između pojedinačnog mesta vezivanja molekula (npr. antitela) i njegovog vezujućeg partnera (npr. antigena). Osim ako nije drugačije naznačeno, kako se ovde koristi, „afinitet vezivanja“ se odnosi na unutrašnji afinitet vezivanja koji odražava interakciju 1:1 između članova vezujućeg para (npr. antitela i antigena). Afinitet molekula X prema njegovom partneru Y uopšteno se može predstaviti konstantom disocijacije (KD). Afinitet se može meriti uobičajenim postupcima poznatim u predmetnoj oblasti, uključujući one koji su ovde opisani. Antitela malog afiniteta obično polako vezuju antigen i lako se otpuštaju, dok antitela velikog afiniteta obično brže vezuju antigen i duže ostaju vezana. Različiti postupci za merenje afiniteta vezivanja su poznati u predmetnoj oblasti, bilo koji od njih može da se koristi u svrhe predmetnog pronalaska.
[0050] Potencija vezujućeg molekula se uobičajeno izražava kao IC50vrednost, u ng/ml osim ako nije drugačije navedeno. IC50je srednja inhibitorna koncentracija molekula antitela. U funkcionalnim testovima, IC50je koncentracija koja umanjuje biološki odgovor za 50% njegovog maksimuma. U studijama vezivanja liganda, IC50je koncentracija koja smanjuje vezivanje receptora za 50% specifičnog maksimalnog nivoa vezivanja. IC50može biti izračunat na bilo koji način poznat u predmetnoj oblasti.
[0051] Stepen poboljšanja potencije za antitela ili polipeptide pronalaska u poređenju sa referentnim antitelom može biti bar oko 2 puta, bar oko 4 puta, bar oko 6 puta, bar oko 8 puta, bar oko 10 puta, bar oko 20 puta, bar oko 30 puta, bar oko 40 puta, bar oko 50 puta, bar oko 60 puta, bar oko 70 puta, bar oko 80 puta, bar oko 90 puta, bar oko 100 puta, bar oko 110 puta, bar oko 120 puta, bar oko 130 puta, bar oko 140 puta, bar oko 150 puta, bar oko 160 puta, bar oko 170 puta, ili bar oko 180 puta ili više.
[0052] Potencija vezivanja antitela se uobičajeno izražava kao EC50vrednost, u nM ili pM osim ako nije drugačije navedeno. EC50je koncentracija leka koja izaziva srednji odgovor između početne vrednosti i maksimalne nakon utvrđenog vremena izlaganja. EC50može biti izračunata na bilo koji način poznat u predmetnoj oblasti.
[0053] „Terapijsko antitelo“ je ono koje može biti primenjeno kod ispitanika da leči ili prevenira bolest ili stanje. „Ispitanik“ je jedinka, posebno sisar, za koju se želi dijagnoza, prognoza ili terapija. Ispitanici sisari obuhvataju ljude, domaće životinje, životinje sa farme,
1
sportske životinje i životinje iz zoološkog vrta, npr. ljudi, nehumani primati, psi, mačke, morski prasići, zečevi, pacovi, miševi, konji, stoka itd.
[0054] „Tretirati“ označava terapijske procedure koje leče, usporavaju, umanjuju simptome i/ili zaustavljaju napredovanje dijagnostikovanog patološkog stanja ili poremećaja. Stoga, oni kojima treba lečenje uključuju one koji već imaju poremećaj. U određenim otelotvorenjima, ispitanik je uspešno „tretiran“ usled bolesti ili poremećaja, na primer, karcinoma, prema ovde pruženim metodama ako pacijent pokazuje npr. totalno, parcijalno ili prolazno olakšanje ili eliminaciju simptoma povezanih sa bolešću ili poremećajem.
[0055] „Prevenirati“ označava profilaktičke ili preventivne mere koje preveniraju i/ili usporavaju razvoj ciljanog patološkog stanja ili poremećaja. Stoga, oni kojima treba prevencija uključuju one koji su skloni ili podložni oboljenju. U određenim otelotvorenjima, bolest ili poremećaj je uspešno preveniran prema ovde pruženim metodama ako pacijent razvije, prolazno ili trajno, npr. manje ili lakše simptome povezane sa bolešću ili poremećajem, od pacijenta koji nije bio predmet metoda pronalaska.
[0056] Pojam „farmaceutska smeša“ označava preparat koji je u takvoj formi da dozvoljava da biološka aktivnost aktivnog sastojka bude efikasna i koji ne obuhvata dodatne sastojke koje su neprihvatljivo toksične za ispitanika na kome će sastav biti primenjen. Takva smeša može biti sterilna i može sadržati farmaceutski prihvatljiv nosač, kao što je fiziološki rastvor. Pogodne farmaceutske smeše mogu sadržati jedan ili više pufera (npr. acetat, fosfat ili citratni pufer), surfaktant (npr. polisorbat), stabilišući agens (npr. humani albumin), konzervans (npr. benzil alkohol) i promoter apsorpcije radi povećanja biodostupnosti i/ili druge uobičajene agense za rastvaranje ili raspršivanje.
[0057] „Efikasna količina“ antitela kako je ovde prikazano je količina dovoljna da se postigne naročito navedena svrha. „Efikasna količina“ može biti određena empirijski i na rutinski način, u odnosu na navedenu svrhu.
[0058] „Oznaka“ označava detektabilno jedinjenje ili smešu koja je direktno ili indirektno konjugovana sa vezujućim molekulom ili antitelom da bi se stvorio „označeni“ vezujući molekul ili antitelo. Oznaka može biti sama detektovana (npr. radiozotopske oznake ili
1
fluoroscentne oznake) ili, u slučaju enzimske oznake, može katalizovati hemijsku promenu jedinjenja supstrata ili smeše koja se može detektovati.
[0059] Pojmovi „polipeptid“, „peptid“ i „protein“ se ovde naizmenično koriste da označe polimere aminokiselina bilo koje dužine. Polimer može biti linearan ili razgranat, može obuhvatati modifikovane aminokiseline i neaminokiseline ga mogu prekidati. Pojmovi takođe obuhvataju aminokiselinski polimer koji je modifikovan prirodno ili intervencijom; na primer, formiranje disulfidne veze, glikozilacija, lipidacija, acetilacija, fosforilacija ili bilo koja druga manipulacija ili izmena, kao što je konjugacija sa označenim sastojkom. Uključeni takođe u definiciju su, na primer, polipeptidi koji sadrže jedan ili više analoga aminokiseline (uključujući, na primer, neprirodne aminokiseline itd.), kao i druge izmene poznate u predmetnoj oblasti. U nekim otelotvorenjima, polipeptidi se mogu javiti kao pojedinačni ili povezani lanci.
[0060] „Polinukleotid“, kako se ovde koristi može uključivati jednu ili više „nukleinskih kiselina“, „molekule nukleinskih kiselina“ ili „sekvence nukleinskih kiselina“, označava polimer nukleotida bilo koje dužine i uključuje DNK i RNK. Polinukleotidi mogu biti deoksiribonukleotidi, ribonukleotidi, modifikovani nukleotidi ili baze i/ili njihovi analozi ili bilo koji supstrat koji može biti uključen u polimer uz pomoć DNK ili RNK polimeraze. Polinukleotid može da obuhvati modifikovane nukleotide, kao što su metilovani nukleotidi i njihovi analozi. Prethodni opis se odnosi na sve polinukleotide označene ovde, uključujući RNK i DNK.
[0061] Pojam „vektor“ znači konstrukciju, koja je sposobna da isporuči i u nekim otelotvorenjima, eksprimira, jedan ili više gena ili sekvenci od interesa ćeliji domaćina. Primeri vektora uključuju, ali nisu ograničeni na, virusne vektore, ogoljene vektore za ekspresiju DNK ili RNK, plazmide, kozmide ili vektore faga, vektore za ekspresiju DNK ili RNK povezane sa katjonskim kondenzujućim agensima, vektore za ekspresiju DNK ili RNK enkapsuliranih u lizozomima i nekim eukariotskim ćelijama, kao što su produkujuće ćelije.
[0062] Polipeptid, antitelo, polinukleotid, vektor, ćelija ili smeša koja je „izolovana“ je polipeptid, antitelo, polinukleotid, vektor, ćelija ili smeša koji je u obliku koji se ne nalazi u prirodi. Izolovani polipeptidi, antitela, polinukleotidi, vektori, ćelije ili smeše uključuju one koji su prečišćeni do stepena da više nisu u obliku u kome se nalaze u prirodi. U nekim
1
otelotvorenjima, antitelo, polinukleotid, vektor, ćelija ili smeša koji je izolovana je u osnovi čista.
[0063] Pojmovi „identičan“ ili procenat „identičnosti“ u kontekstu dva ili više nukleinskih kiselina ili polipeptida, označavaju dve ili više sekvenci ili podsekvenci koje su iste ili imaju određeni procenat nukleotida ili ostataka aminokiselina koje su iste, kada se uporede i poravnaju (uključujući praznine, ako je potrebno) za maksimalno podudaranje, ne uzimajući u obzir ni jednu konzervativnu aminokiselinsku zamenu kao deo identiteta sekvence. Procenat identičnosti može biti izmeren korišćenjem softvera za poređenje sekvenci ili algoritama ili vizuelnom inspekcijom. Poznato je u predmetnoj oblasti da različiti algoritmi i softver mogu da se koriste da se dobije poravnanje aminokiseline ili nukleotidne sekvence.
[0064] Jedan takav neograničavajući primer algoritma za poravnanje sekvence je algoritam opisan u publikaciji Karlin i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-2268 (1990), modifikovan putem publikacije Karlin i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877 (1993) i uključen u NBLAST i XBLAST programe (Altschul i sar., Nucleic Acids Res.25:3389-3402 (1991)). U nekim otelotvorenjima, Gapped BLAST se može koristiti kao što su opisali Altschul i sar., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997). BLAST-2, WU-BLAST-2 (Altschul i sar., Methods in Enzymol. 266:460-480 (1996)), ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, CA) ili Megalign (DNASTAR) su dodatni javno dostupni softverski programi koji mogu biti korišćeni za poravnanje sekvenci. U određenim otelotvorenjima, procenat identičnosti između dve nukleotidne sekvence se određuje korišćenjem GAP programa u GCG softverskom paketu (npr. koristeći NWSgapdna.CMP matriks i težinu zjapa od 40, 50, 60, 70 ili 90 i dužinu težine od 1, 2, 3, 4, 5 ili 6). U nekim alternativnim otelotvorenjima, GAP program u GCG softverskom paketu, koji uključuje algoritam Needleman i Wunsch (J. Mol. Biol.
48:444-453 (1970)) može se koristiti da se odredi procenat identičnosti između dve aminokiselinske sekvence (npr. korišćenjem bilo BLOSUM 62 matriksa ili PAM250 matriksa i težine zjapa od 16, 14, 12, 10, 8, 6 ili 4 i dužine težine od 1, 2, 3, 4, 5). Alternativno, u određenim otelotvorenjima, procenat identičnosti između nukleotidnih ili aminokiselinskih sekvenci je određen korišćenjem Myers i Miller (CABIOS 4:11-17 (1989)) algoritma. Na primer, procenat identičnosti može biti određen korišćenjem programa ALIGN (verzija 2.0) i korišćenjem PAM120 sa tabelom ostataka, penal za dužinu zjapa od 12 i penal zjapa od 4. Stručnjak može da odredi odgovarajuće parametre za maksimalno poravnanje putem
1
određenog softvera za poravnanje. U određenim otelotvorenjima, koriste se podrazumevani parametri softvera za poravnanje.
[0065] U određenim otelotvorenjima, procenat identičnosti „X“ prve aminokiselinske sekvence do druge aminokiselinske sekvence se računa kao 100 x (Y/Z), gde je Y broj aminokiselinskih ostataka označenih kao identični parovi u poravnanju prve i druge sekvence (poravnanje prema vizuelnoj inspekciji ili programu poravnanja određenih sekvenci) i Z je ukupni broj ostataka u drugoj sekvenci. Ako je dužina prve sekvence veća od druge sekvence, procenat identičnosti prve sekvence prema drugoj će biti viši nego procenat identičnosti druge sekvence prema prvoj sekvenci.
[0066] „Konzervativna zamena aminokiselina“ je ona u kojoj je jedan aminokiselinski ostatak zamenjen drugim aminokiselinskim ostatkom koji ima sličan bočni lanac. Familije aminokiselinskih ostataka koje imaju slične bočne lance su definisane u predmetnoj oblasti, uključujući osnovne bočne lance (npr. lizin, arginin, histidin), kisele bočne lance (npr. aspartanska kiselina, glutaminska kiselina), nenaelektrisane polarne bočne lance (npr. asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein), nepolarne bočne lance (npr. glicin, alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan), beta razgranate bočne lance (npr. treonin, valin, izoleucin) i aromatične bočne lance (npr. tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin). Na primer, zamena fenilalanina tirozinom je konzervativna zamena. U određenim otelotvorenjima, konzervativne zamene u aminokiselinskim sekvencama vezujućih molekula, antitela i antigen vezujućih fragmenata pronalaska ne opozivaju vezivanje vezujućeg molekula ili antitela ili antigen vezujućeg fragmenta koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sa antigenom(ima), tj. ASCT2 za koji se vezujući molekul, antitelo ili antigen vezujući fragment vezuje. Metode identifikovanja nukleotida i aminokiselinskih konzervativnih izmena koje ne eliminišu vezivanje antigena su dobro poznate u predmetnoj oblasti. Videti, npr. Brummell i sar., Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi i sar., Protein Eng.12(10):879-884 (1999); Burks i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:.412-417 (1997).
II. Anti-ASCT2-antitela i antigen vezujući fragmenti
[0067] Predmetni pronalazak predstavlja anti-ASCT2 antitela i njihove antigen vezujuće fragmente, koji specifično vezuju ASCT2. Sekvence aminokiselina (aa) i nukleotida (nt) pune dužine za ASCT2 ljudi i makaki majmuna poznate su u predmetnoj oblasti i mogu se naći, bar, u bazi podataka Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (NCBI). NCBI baza
2
podataka je dostupna na internetu. U nekim otelotvorenjima, ovde izložena anti-ASCT2 antitela ili njihovi antigen vezujući fragmenti jesu humanizovana antitela ili humana antitela. U nekim otelotvorenjima, anti-ASCT2 antitela su konjugovana sa citotoksinom, stoga se označavaju kao anti-ASTC2 ADC.
[0068] U nekim otelotvorenjima, anti-ASCT2 antitela pronalaska vezuju ASCT2 na površini ćelije i internalizuju se u ćeliju. U nekim otelotvorenjima, anti-ASCT2 antitelo se internalizuje u ćeliju koja eksprimira ASCT2 sa IC50na 10 minuta od oko 100 ng/ml do oko 1 µg/ml, oko 100 ng/ml do oko 500 ng/ml, oko 100 ng/ml do oko 250 ng/ml, oko 250 ng/ml do oko 500 ng/ml, oko 350 ng/ml do oko 450 ng/ml, oko 500 ng/ml do oko 1 µg/ml, oko 500 ng/ml do oko 750 ng/ml, oko 750 ng/ml do oko 850 ng/ml ili oko 900 ng/ml do oko 1 µg/ml. U nekim otelotvorenjima, anti-ASCT2 antitelo se internalizuje u ćeliju koja eksprimira ASCT2 sa IC50na 30 minuta od oko 100 ng/ml do oko 1 µg/ml, oko 100 ng/ml do oko 500 ng/ml, oko 100 ng/ml do oko 250 ng/ml, oko 250 ng/ml do oko 500 ng/ml, oko 250 ng/ml do oko 350 ng/ml, oko 350 ng/ml do oko 450 ng/ml, oko 500 ng/ml do oko 1 µg/ml, oko 500 ng/ml do oko 750 ng/ml, oko 750 ng/ml do oko 850 ng/ml ili oko 900 ng/ml do oko 1 µg/ml. U nekim otelotvorenjima, anti-ASCT2 antitelo se internalizuje u ćeliju koja eksprimira ASCT2 sa IC50na 120 minuta od oko 50 ng/ml do oko 500 ng/ml, oko 50 ng/ml do oko 100 ng/ml, oko 100 ng/ml do oko 200 ng/ml, oko 200 ng/ml do oko 300 ng/ml, oko 300 ng/ml do oko 400 µg/ml ili oko 400 ng/ml do oko 500 ng/ml. U nekim otelotvorenjima, anti-ASCT2 antitelo se internalizuje u ćeliju koja eksprimira ASCT2 sa IC50na 8 sati od oko 5 ng/ml do oko 250 ng/ml, oko 10 ng/ml do oko 25 ng/ml, oko 25 ng/ml do oko 50 ng/ml, oko 50 ng/ml do oko 100 ng/ml, oko 100 ng/ml do oko 150 µg/ml, oko 150 ng/ml do oko 200 ng/ml ili oko 200 ng/ml do oko 250 ng/ml. U nekim slučajevima, anti-ASCT2 antitelo konjugovano sa citotoksinom je anti-ASCT2 ADC.
[0069] U određenim aspektima, ovo otkriće predstavlja anti-ASCT2 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji obuhvata tri regiona koji određuju komplementarnost teškog lanca (HCDR) i tri regiona koji određuju komplementarnost lakog lanca (LCDR), naznačeno time što HCDR1 ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10; HCDR2 ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 11; HCDR3 ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 12; LCDR1 ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 13; LCDR2 ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14; i LCDR3 ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15; ili HCDR1 ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16; HCDR2 ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 17; HCDR3 ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18; LCDR1 ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 19; LCDR2 ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 20; i LCDR3 ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 21. Kako je ovde izloženo, VH obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 5; a VL obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO: 6. U određenim aspektima, anti-ASCT2 antitelo obuhvata VH aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 5 i VL aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 6. Opciono, anti-ASCT2 antitelo obuhvata VH aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 3 ili SEQ ID NO: 7 i VL aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 4 ili SEQ ID NO: 8. U nekim otelotvorenjima, anti-ASCT2 antitelo obuhvata VH aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 7 i VL aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 8.
[0070] Nadalje, ovo otkriće predstavlja izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji se specifično vezuje za ASCT2 koji obuhvata VH i VL, gde VH i VL sadrže, redom, aminokiselinske sekvence bar 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identične referentnim aminokiselinskim sekvencama SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3 i SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5 i SEQ ID NO: 6; ili SEQ ID NO: 7 odnosno SEQ ID NO: 8.
[0071] U jednom aspektu, otkriće predstavlja anti-ASCT2 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji obuhvata VH aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5 i VL aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6. U jednom aspektu, otkriće predstavlja anti-ASCT2 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji obuhvata VH aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 7 i VL aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8.
[0072] Anti-ASCT2 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment ovde opisan može biti npr. mišje antitelo, humanizovano antitelo, himerno antitelo, monoklonalno antitelo, poliklonalno antitelo, rekombinantno antitelo, multispecifično antitelo ili bilo koja njihova kombinacija. Fragment koji vezuje antigen anti-ASCT2 antitela može biti Fv fragment, Fab fragment, F(ab')2 fragment, Fab' fragment, dsFv fragment, scFv fragment ili sc(Fv)2 fragment.
[0073] U jednom aspektu, otkriće predstavlja anti-ASCT2 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji može da se veže za ASCT2 molekule među vrstama, npr. antitelo ili fragment može da veže mišji ASCT2, ASCT2 pacova, ASCT2 zeca, humani ASCT2 i/ili ASCT2 makaki majmuna. Na primer, antitelo ili fragment može da veže humani ASCT2 i ASCT2 makaki majmuna. U drugom primeru, antitelo ili fragment može da veže i mišji ASCT2.
[0074] U nekim ovde pruženim otelotvorenjima, anti-ASCT2 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment može da se specifično veže za ASCT2, npr. humani ASCT2 i ASCT2 makaki majmuna, ali se ne vezuje specifično za humani ASCT1.
[0075] Anti-ASCT2 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment kao što je ovde opisano može da uključi, pored VH i VL, konstantni region teškog lanca ili njegov fragment. U određenim aspektima konstantni region teškog lanca je humani konstantni region teškog lanca, npr. konstantni region humanog IgG, npr. konstantni region humanog IgG1. U nekim otelotvorenjima, naročito gde je antitelo ili njegov antigen vezujući fragment konjugovan sa agensom, kao što je citotoksični agens, cisteinski ostatak je umetnut između aminokiseline S239 i V240 u CH2 regionu IgG1. Ovaj cistein se naziva „umetak 239“ ili „239i“.
[0076] U određenim aspektima, konstanti region teškog lanca ili njegov fragment, npr. konstantni region humanog IgG ili njegov fragment, može da uključi jednu ili više aminokiselinskih supstitucija kao što je konstantni domen divljeg tipa IgG naznačeno time što modifikovani IgG ima produženi poluživot u poređenju sa poluživotom IgG koji ima konstantni domen divljeg tipa IgG. Na primer, konstantni domen IgG može sadržati jednu ili više aminokiselinskih supstitucija aminokiselinskih ostataka na pozicijama 251–257, 285–290, 308–314, 385–389 i 428–436, naznačeno time što je numerisanje aminokiselinske pozicije prema EU indeksu kako je dato u Kabat-u. U određenim aspektima konstantni domen IgG može sadržati jednu ili više supstitucija aminokiselina na Kabat poziciji 252 tirozinom (Y), fenilalaninom (F), triptofanom (W) ili treoninom (T), supstituciju aminokiseline na Kabat poziciji 254 treoninom (T), supstituciju aminokiseline na Kabat poziciji 256 serinom (S), argininom (R), glutaminom (Q), glutaminskom kiselinom (E), aspartamskom kiselinom (D) ili treoninom (T), supstituciju aminokiseline na Kabat poziciji 257 leucinom (L), supstituciju aminokiseline na Kabat poziciji 309 prolinom (P), supstituciju aminokiseline na Kabat poziciji 311 serinom (S), supstituciju aminokiseline na Kabat poziciji 428 treoninom (T), leucinom (L), fenilalaninom (F) ili serinom (S), supstituciju aminokiseline na Kabat poziciji 433 argininom (R), serinom (S), izoleucinom (I), prolinom (P) ili glutaminom (Q) ili supstituciju aminokiseline na Kabat poziciji 434 triptofanom (W), metioninom (M), serinom (S), histidinom (H), fenilalaninom (F) ili tirozinom. Specifičnije, konstantni domen IgG može sadržati aminokiselinske supstitucije kao što je konstantni domen humanog IgG uključujući supstituciju aminokiseline na Kabat poziciji 252 tirozinom (Y), supstituciju aminokiseline na
2
Kabat poziciji 254 treoninom (T) i supstituciju aminokiseline na Kabat poziciji 256 glutaminskom kiselinom (E). Ovo otkriće predstavlja anti-ASCT2 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment gde je teški lanac humani IgG1 YTE mutant.
[0077] Anti-ASCT2 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment kao što je ovde prikazano npr. kao što je goreopisano, može da uključi, pored VH i VL i opciono konstantni region teškog lanca ili njegov fragment, konstantni region lakog lanca ili njegov fragment. U određenim aspektima konstantni region lakog lanca je kapa lambda konstantni region lakog lanca, npr. humani kapa konstantni region ili humani lambda konstantni region.
[0078] Kao što je gore navedeno, VH i/ili VL aminokiselinska sekvenca može biti npr. 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% slična ovde prikazanoj sekvenci, i/ili obuhvata 1, 2, 3, 4, 5 ili više supstitucija, npr. konzervativne supstitucije kao što su ovde prikazane sekvence. ASCT2 antitelo koje ima VH i VL regione koji imaju određeni procenat sličnosti sa VH ili VL regionom ili imaju jednu ili više supstitucija, npr. konzervativne supstitucije mogu biti postignute mutagenezom (npr. mutageneza usmerena na mesto ili PCR posredovana) molekula nukleinskih kiselina koji kodiraju ovde opisane VH i/ili VL regione, praćene testiranjem kodiranih izmenjenih antitela za vezivanje sa ASCT2 i opcionim testiranjem za zadržanu funkciju koristeći funkcionalne ovde opisane testove.
[0079] Afinitet ili aviditet antitela za antigen može biti određen eksperimentalno korišćenjem bilo kog odgovarajućeg metoda dobro poznatog u predmetnoj oblasti, npr. protočnom citometrijom, imunosorbent testom vezanim za enzim (ELISA) ili radioimunoesejem (RIA) ili kinetički (npr. KINEXA® ili BIACORE™ analiza). Direktno vezujući testovi kao i testovi formata kompetitivnog vezivanja mogu biti upotrebljeni. (Videti, npr. Berzofsky i sar., Antibody-Antigen Interactions, In Fundamental Immunology, Paul, W. E., urednik, Raven Press: New York, N.Y. (1984); Kuby, Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, N.Y. (1992); i metode opisane ovde.) Izmeren afinitet određene antitelo-antigen intereakcije može da varira ako je izmeren pod različitim okolnostima (npr. koncentracija soli, pH, temperatura). Stoga, merenja afiniteta i drugih antigen vezujućih parametara (npr. KDili Kd, Kon, Koff) napravljena su sa standardnim rastvorima antitela i antigena i standardizovanog pufera, kao što je poznato u struci.
[0080] U nekim otelotvorenjima, anti-ASCT2 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, može da veže ćelije koje eksprimiraju ASCT2 sa IC50nižim od oko 500 nM, nižim od oko 350 nM, nižim od oko 250 nM, nižim od oko 150 nM, nižim od oko 100 nM, nižim od oko 75 nM, nižim od oko 60 nM, nižim od oko 50 nM, nižim od oko 40 nM, nižim od oko 30 nM, nižim od oko 20 nM, nižim od oko 15 nM, nižim od oko 10 nM, nižim od oko 5 nM, nižim od oko 1 nM, nižim od oko 500 pM, nižim od oko 350 pM, nižim od oko 250 pM, nižim od oko 150 pM, nižim od oko 100 pM, nižim od oko 75 pM, nižim od oko 60 pM, nižim od oko 50 pM, nižim od oko 40 pM, nižim od oko 30 pM, nižim od oko 20 pM, nižim od oko 15 pM, nižim od oko 10 pM ili nižim od oko 5 pM, mereno protočnom citometrijom.
III. Vezujući molekuli koji se vezuju za isti epitop kao anti-ASCT2 antitela i njihovi antigen vezujući fragmenti
[0081] Ovaj pronalazak predstavlja i anti-ASCT2 antitelo koje se vezuje za isti epitop kao što čine ovde opisana anti-ASCT2 antitela. Pojam „epitop“ označava ciljnu proteinsku determinantu sposobnu za vezivanje za antitelo pronalaska. Epitopi se obično sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupa molekula kao što su aminokiseline ili šećerni bočni lanci i obično imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naboja. Konformacioni i nekonformacioni epitopi se razlikuju u tome da vezivanje za prethodni ali ne i sledeći se gubi u prisustvu denaturisanih rastvarača. Takva antitela mogu biti identifikovana bazirano na njihovoj sposobnosti da se unakrsno takmiče (npr. da kompetitivno inhibiraju vezivanje, u statistički značajnom smislu) sa antitelima kao što su ona ovde opisana u standardnom ASCT2 vezivanju ili testovima aktivnosti.
[0082] Shodno tome, otkriće predstavlja anti-ASCT2 antitela i njihove antigen vezujući fragmente, npr. monoklonska antitela, koja se takmiče za vezivanje sa ASCT2 sa drugim anti-ASCT2 antitelom ili njegovim antigen vezujućim fragmentom pronalaska, kao što su mišja monoklonska antitela 17c10 ili 1e8 ili humanizovane varijante kao što je predstavljeno ovde. Sposobnost test antitela da inhibira vezivanje, npr.17c10 ili 1e8 pokazuje da test antitelo može da se takmiči sa tim antitelom za vezivanje za ASCT2; takvo antitelo može da se, prema neograničavajućoj teoriji, vezuje za isti ili slični (npr. strukturno slični ili prostorno blizak) epitop na ASCT2 kao anti-ASCT2 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment sa kojim se takmiči. U jednom slučaju, anti-ASCT2 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji vezuje isti epitop na ASCT2 kao, npr. mišja monoklonska antitela 17c10 ili 1e8.
IV. Pripremanje anti-ASCT2 antitela i antigen vezujućih fragmenata
2
[0083] Monoklonska anti-ASCT2 antitela mogu biti pripremljena korišćenjem metoda hibridoma, kao što su one opisane od strane Kohler i Milstein, Nature 256:495 (1975). Koristeći hibridoma metod, miš, hrčak ili druga odgovarajuća životinja domaćin, imunizovana je kao što je gore opisano da izazove produkciju limfocita antitela koja će specifično da se vežu za imunizujući antigen. Limfociti mogu biti imunizovani i in vitro. Nakon imunizacije, limfociti su izolovani i spojeni sa odgovarajućom ćelijskom linijom mijeloma koristeći, na primer, polietilen glikol, radi formiranja ćelije hibridoma koje onda mogu biti izabrane između nespojenih limfocita i ćelija mijeloma. Hibridomi koji produkuju monoklonska antitela usmerena specifično protiv izabranog antigena kao što je određeno imunoprecipitacijom, imunobloting ili in vitro vezujućim testom, npr. radioimunoesejem (RIA) ili imunosorbent enzimski povezanim testom (ELISA), mogu biti propagirani bilo u in vitro kulturi korišćenjem standardnih metoda (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986) ili in vivo kao tumori sa ascitesom kod životinje. Monoklonska antitela mogu biti prečišćena iz kulture medijuma ili ascitesne tečnosti korišćenjem poznatih metoda.
[0084] Anlternativno anti-ASCT2 monoklonska antitela takođe mogu biti napravljena korišćenjem rekombinantnih DNK metoda kao što je opisano u U.S. Patent br. 4,816,567. Polinukleotidi koji kodiraju monoklonsko antitelo su izolovani iz zrelih B ćelija ili ćelija hibridoma, kao što je pomoću RT-PCR korišćenjem oligonukleotidnih prajmera koji specifično amplifikuju gene koji kodiraju teške i lake lance antitela i njihova sekvenca je određena korišćenjem konvencionalnih procedura. Izolovani polinukleotidi koji kodiraju teške i lake lance su potom klonirani u odgovarajuće vektore ekspresije, po čijoj transfekciji u ćelije domaćina kao što su ćelije E. coli, majmunske COS ćelije, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) ili ćelije mijeloma koje inače ne produkuju na drugi način protein imunoglobulina, monoklonska antitela se stvaraju od strane ćelije domaćina. Takođe, rekombinantna anti-ASCT2 monoklonska antitela ili njihovi antigen vezujući fragmenti željene vrste mogu biti izolovani iz biblioteka koje prikazuju fage koji eksprimiraju CDR željenih vrsta kao što je opisano u publikaciji McCafferty i sar., Nature 348:552-554 (1990); Clackson i sar., Nature, 352:624-628 (1991); i Marks i sar., J. Mol. Biol.222:581-597 (1991).
[0085] Polinukleotid(i) koji kodiraju anti-ASCT2 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment mogu dalje da budu modifikovani na mnogobrojne različite načine korišćenjem rekombinantne DNK tehnologije radi stvaranja alternativnih antitela. U nekim otelotvorenjima, konstantni
2
domeni lakih i teških lanaca, na primer, mišjeg monoklonskog antitela mogu biti supstituisani (1) onim regionima, na primer, humanog antitela radi stvaranja himernog antitela ili (2) neimunoglobulinskim polipeptidom radi stvaranja fuzionog antitela. U nekim otelotvorenjima, konstantni regioni se seku ili uklanjaju da stvore željeni fragment monoklonskog antitela. Mutageneza usmerena prema mestu ili visoke gustine varijabilnog regiona može biti korišćena da se optimizuje specifičnost, afinitet itd. monoklonskog antitela.
[0086] U određenim otelotvorenjima, anti-ASCT2 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment je humano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment. Humana antitela mogu biti direktno pripremljena korišćenjem različitih tehnika poznatih u struci. Besmrtni humani B limfociti imunizovani in vitro ili izolovani iz imunizovane jedinke koja produkuje antitelo usmereno protiv ciljnog antigena mogu biti stvoreni. Videti, npr. Cole i sar., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, str.77 (1985); Boemer i sar, J. Immunol. 147 (1):86-95 (1991); U.S. Patent 5,750,373.
[0087] Takođe, anti-ASCT2 humano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment mogu biti izabrani iz biblioteke faga, pri čemu ta biblioteka faga eksprimuje humana antitela, kao što je opisano, na primer, u publikaciji Vaughan i sar., Nat. Biotech.14:309-314 (1996); Sheets i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:6157-6162 (1998); Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol.
227:381 (1991); i Marks i sar., J. Mol. Biol.222:581 (1991). Tehnike za stvaranje i korišćenje biblioteka antitela faga su takođe opisane u U.S. Patent br. 5,969,108, 6,172,197, 5,885,793, 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915; 6,593,081; 6,300,064; 6,653,068; 6,706,484; i 7,264,963; i Rothe i sar., J. Molec. Biol.376:1182-1200 (2008.
[0088] Strategije za sazrevanje afiniteta i strategije za mešanje lanaca su poznate u struci i mogu biti upotrebljene da se stvore humana antitela visokog afiniteta ili njihovi antigen vezujući fragmenti. Videti Marks i sar., BioTechnology 10:779-783 (1992.
[0089] U nekim otelotvorenjima, anti-ASCT2 monoklonsko antitelo može biti humanizovano antitelo. Metode inženjeringa, humanizovanja ili izvlačenja na površinu nehumanih ili humanih antitela mogu takođe biti korišćene i dobro su poznate u struci. Humanizovano, izvučeno na površinu ili slično inženjeringom obrađeno antitelo može da ima jednu ili više aminokiselinskih ostataka od izvora koji je nehuman, npr. ali nije ograničen na, miša, pacova, zeca, nehumanog primata ili drugog sisara. Ovi nehumani aminokiselinski ostaci su zamenjeni ostacima koji se
2
često označavaju kao uneti ostaci, koji se obično uzimaju od unete varijable, konstantnog ili drugog domena poznate humane sekvence. Takve unete sekvence mogu biti korišćene da smanje imunogenost ili smanje, povećaju ili modifikuju vezivanje, afinitet, stopu paljenja, stopu gašenja, aviditet, specifičnost, poluživot ili bilo koju drugu odgovarajuću karakteristiku, kao što je poznato u struci. Uopšteno, CDR ostaci su direktno i najviše suštinski uključeni u uticaj na ASCT2 vezivanje. Shodno tome, deo ili sve nehumane ili humane CDR sekvence se održavaju dok nehumane sekvence varijabilnih i konstantnih regiona mogu da budu zamenjene humanim ili drugim aminokiselinama.
[0090] Antitela takođe mogu opciono da budu humanizovana, izvučena na površinu, obrađena inženjeringom ili humana antitela obrađena inženjeringom sa održavanjem visokog afiniteta za antigen ASCT2 i druge povoljne biološke karakteristike. Radi postizanja ovog cilja, humanizovana (ili humana) ili obrađena inženjeringom anti-ASCT2 antitela i antitela izvučena na površinu mogu opciono da budu pripremljena procesom analize roditeljske sekvence i drugih konceptualnih humanizovanih ili obrađenih inženjeringom proizvoda koristeći trodimenzionalne modele roditeljskih, obrađenih inženjeringom i humanizovanih sekvenci. Trodimenzionalni modeli imunoglobulina su obično dostupni i poznati stručnjacima. Dostupni su kompjuterski programi koji ilustruju i prikazuju moguće trodimenzionalne konformacione strukture izabranih kandidata sekvenci imunoglobulina. Pregled ovih prikaza omogućava analizu moguće uloge ostataka u funkcionisanju kandidata sekvenci imunoglobulina, tj. analiza ostataka koji utiču na sposobnost kandidata imunoglobulina da veže svoj antigen, kao što je ASCT2. Na ovaj način, FW ostaci mogu biti izabrani i kombinovani među konsenzus i unetim sekvencama tako da se željena karakteristika antitela, kao što je povećan afinitet za ciljni antigen(e), postigne.
[0091] Humanizacija, izvlačenje na površinu ili obrada inženjeringom anti-ASCT2 antitela ili njihovih antigen vezujućih fragmenata predmetnog pronalaska mogu biti izvedeni koristeći bilo koji poznati metod, kao što je ali ne ograničeno na one opisane u publikaciji Jones i sar., Nature 321:522 (1986); Riechmann i sar., Nature 332:323 (1988); Verhoeyen i sar., Science 239:1534 (1988); Sims i sar., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol.
196:901 (1987); Carter i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); Presta i sar., J. Immunol. 151:2623 (1993); U.S. Pat. br. 5,639,641, 5,723,323; 5,976,862; 5,824,514; 5,817,483; 5,814,476; 5,763,192; 5,723,323; 5,766,886; 5,714,352; 6,204,023; 6,180,370; 5,693,762; 5,530,101; 5,585,089; 5,225,539; 4,816,567, 7,557,189; 7,538,195; i 7,342,110;
2
međunarodnoj prijavi International Application br. WO/1999/006834; WO/1997/020032; WO/1992/011272; WO/92/03461 ; WO/1994/018219; PCT/GB89/01334; WO/1992/001047; WO/1993/006213; publikaciji međunarodne prijave patenta International Patent Application Publication br. WO90/14443; WO90/14424; WO90/14430; i publikaciji evropskog patenta European Patent Publication br. EP 229246.
[0092] Anti-ASCT2 humanizovana antitela i njihovi antigen vezujući fragmenti mogu takođe biti napravljeni u transgenim miševima koji sadrže humane imunoglobulinske lokuse koji su sposobni nakon imunizacije da proizvode pun repertoar humanih antitela u odsustvu endogene produkcije imunoglobulina. Ovaj pristup je opisan u U.S. Patent br. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; i 5,661,016.
[0093] U određenim otelotvorenjima fragment anti-ASCT2 antitela je obezbeđen. Za proizvodnju fragmenata antitela su poznate različite tehnike. Tradicionalno, ovi fragmenti su pribavljeni putem proteolitičke digestije intaktnih antitela, kao što je opisano, na primer od strane Morimoto i sar., J. Biochem. Biophys. Meth.24:107-117 (1993) i Brennan i sar., Science 229:81 (1985). U određenim otelotvorenjima, fragmenti anti-ASCT2 antitela su proizvedeni rekombinantno. Fab, Fv i scFv fragmenti antitela mogu svi da budu eksprimirani u i sekretovani od strane E. coli ili drugih ćelija domaćina, time omogućujući proizvodnju velikih količina ovih fragmenata. Takvi fragmenti anti-ASCT2 antitela mogu takođe biti izolovani iz gorenavedenih biblioteka antitela faga. Fragmenti anti-ASCT2 antitela mogu takođe biti linearna antitela kao što je opisano u U.S. Patent br.5,641,870. Druge tehnike za proizvodnju fragmenata antitela će biti očigledne iskusnom stručnjaku.
[0094] Prema predmetnom pronalasku, tehnike mogu biti adaptirane za proizvodnju antitela jednostrukog lanca specifičnog za ASCT2. Videti, npr. U.S. Pat. br. 4,946,778). Dodatno, metode mogu biti izmenjene za konstruisanje biblioteka za Fab ekspresiju kako bi se omogućila brza i efikasna identifikacija monoklonskih Fab fragmenata sa željenom specifičnošću za ASCT2 ili derivative, fragmente, analoge ili njihove homologe. Videti, npr. Huse i sar., Science 246:1275-1281 (1989). Fragmenti antitela mogu biti proizvedeni putem tehnika poznatih u struci uključujući, ali ne ograničeno na sledeće: F(ab')2 proizveden digestijom pepsina molekula antitela; Fab fragment stvoren smanjenjem disulfidnih mostova F(ab')2 fragmenta; Fab fragment stvoren tretiranjem molekula antitela papainom i redukujućim agensom; ili Fv fragmenti.
2
[0095] U određenim aspektima, anti-ASCT2 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment može biti modifikovan da bi se povećao njegov serumski poluživot. Ovo se može postići, na primer, unošenjem spasilačkog receptora vezujućeg epitopa u antitelo ili fragment antigena, mutacijom odgovarajućeg regiona u antitelu ili fragmentu antigena ili unošenjem epitopa u peptidnu oznaku koja se zatim spaja sa antitelom ili fragmentom antitela na bilo kom kraju ili u sredini ( npr. putem DNK ili sinteze peptida) ili putem YTE mutacije. Druge metode za produženje serumskog poluživota antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta, npr. konjugacija sa heterologim molekulom, kao što je PEG, poznate su u struci.
[0096] Modifikovana anti-ASCT2 antitela ili njihovi antigen vezujući fragmenti kao što je ovde opisano mogu sadržati bilo koji tip varijabilnog regiona koji obezbeđuje povezivanje antitela ili polipeptida sa ASCT2. U ovom pogledu, varijabilni region može sadržati ili biti izveden iz bilo kog tipa sisara koji može biti indukovan da pokrene humoralni odgovor i stvori imunoglobuline protiv željenog antigena. Kao takav, varijabilni region ASCT2 antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta može biti, na primer, humanog, mišjeg porekla, porekla od nehumanog primata (npr. makaki majmuna, makakija itd.) ili vučjeg porekla. U nekim otelotvorenjima i varijabilni i konstantni regioni modifikovanih anti-ASCT2 antitela ili njihovih antigen vezujućih fragmenata su humani. U drugim otelotvorenjima varijabilni regioni kompatibilnih antitela (obično dobijenih iz nehumanog izvora) mogu biti obrađeni inženjeringom ili specifično prilagođeni da poboljšaju vezujuće osobine ili smanje imunogenost molekula. U ovom pogledu, korisni varijabilni regioni u predmetnom pronalasku mogu biti humanizovani ili na drugi način izmenjeni kroz uključivanje unetih aminokiselinskih sekvenci.
[0097] U određenim otelotvorenjima, varijabilni regioni i u teškim i u lakim lancima anti-ASCT2 antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta su izmenjeni bar delimičnom zamenom jednog ili više CDR i/ili parcijalnom zamenom okvira regiona i promenom sekvence. Iako CDR može biti izveden iz antitela iste klase ili čak potklase kao antitelo iz kog su izvedeni regioni okvira, predviđeno je da će CDR biti izvedeni iz antitela različite klase i u nekim otelotvorenjima iz antitela različite vrste. Nije neophodno da se zamene svi CDR sa kompletnim CDR iz donorskog varijabilnog regiona da bi se preneo kapacitet za vezivanje antigena jednog varijabilnog domena na drugi. Radije, jedino je neophodno da se prenesu oni ostaci koji su neophodni za održavanje aktivnosti mesta za vezivanje antigena. Pošto su objašnjenja data u U.S. Pat. br. 5,585,089, 5,693,761 i 5,693,762, stručnjaci će biti u mogućnosti da izvedu rutinske eksperimente za dobijanje funkcionalnog antitela sa smanjenom imunogenošću.
[0098] Ne uzimajući u obzir promene varijabilnog regiona, stručnjaci će imati u vidu da će modifikovana anti-ASCT2 antitela ili njihovi antigen vezujući fragmenti ovog pronalaska sadržati antitela (npr. antitela pune dužine ili njihove antigen vezujuće fragmente) u kojima bar frakcija jednog ili više domena konstantnog regiona je izbrisana ili na drugi način izmenjena da obezbedi željene biohemijske karakteristike kao što je povećana lokalizacija tumora ili smanjen serumski poluživot u poređenju sa antitelom približno iste imunogenosti koje obuhvata nativni ili nepromenjeni konstantni region. U nekim otelotvorenjima, konstanti region modifikovanih antitela će sadržati humani konstanti region. Modifikacije konstantnog regiona kompatibilne sa ovim pronalaskom sadrže dodatke, delecije ili supstitucije jedne ili više aminokiselina u jednom ili više domena. To jest, modifikovana antitela opisana ovde mogu sadržati promene ili modifikacije na jednom ili više od tri konstantnih domena teškog lanca (CH1, CH2 ili CH3) i/ili konstantnog domena lakog lanca (CL). U nekim otelotvorenjima, razmatraju se modifikovani konstantni regioni naznačeni time što jedan ili više domena su delimično ili potpuno obrisani. U nekim otelotvorenjima, modifikovana antitela će sadržati konstrukcije obrisanog domena ili varijante naznačene time što je ceo CH2 domen uklonjen (ΔCH2 konstrukcije). U nekim otelotvorenjima, izostavljeni domen konstantnog regiona može biti zamenjen kratkim aminokiselinskim razdelnikom (npr.10 ostataka) koji obezbeđuje nešto molekularne fleksibilnosti tipično pružene od strane odsutnog konstantnog regiona.
[0099] Pored njegove konfiguracije, u struci je poznato da konstantni region posreduje u nekoliko efektorskih funkcija. Na primer, antitela se vezuju za ćelije putem Fc regiona, sa Fc receptorskim mestom na antitelu Fc regiona koje se vezuje za Fc receptor (FcR) na ćeliji. Postoji više Fc receptora koji su specifični za različite klase antitela, uključujući IgG (gama receptore), IgE (eta receptore), IgA (alfa receptore) i IgM (mu receptore). Vezivanje antitela Fc receptora na površini ćelije pokreće više važnih i raznolikih bioloških odgovora uključujući obuhvatanje i uništavanje čestica obloženih antitelom, čišćenje imunskih kompleksa, lizu ciljnih ćelija obloženih antitelom od strane ćelija ubica (nazvanu ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela ili ADCC), otpuštanje inflamatornih medijatora, placentarni transfer i kontrolu proizvodnje imunoglobulina.
1
[0100] U određenim otelotvorenjima, anti-ASCT2 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment obezbeđuje izmenjene efektorske funkcije koje, sa druge strane, utiču na biološki profil primenjenog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta. Na primer, delecija ili inaktivacija (kroz tačkaste mutacije ili na druge načine) domena konstantnog regiona može da smanji vezivanje Fc receptora cirkulišućeg modifikovanog antitela. U drugim slučajevima to mogu biti modifikacije konstantnog regiona, umereno vezivanje komplementa i stoga smanjenje serumskog poluživota i nespecifične povezanosti konjugovanog citotoksina. Druge modifikacije konstantnog regiona mogu biti korišćene da se eliminišu disulfidne veze ili oligosaharidni ostaci koji dozvoljavaju povećanu lokalizaciju usled povećane antigenske specifičnosti ili fleksibilnosti antitela. Slično, modifikacije konstantnog regiona u saglasnosti sa ovim pronalaskom mogu lako da budu napravljene korišćenjem dobro poznatih biohemijskih ili inženjering tehnika koje su u delokrugu iskusnog stručnjaka.
[0101] U određenim otelotvorenjima, molekul koji vezuje ASCT2 koji je antitelo ili njegov antigen vezujući fragment nema jednu ili više efektorskih funkcija. Na primer, u nekim otelotvorenjima, antitelo ili njegov antigen vezujući fragment nema aktivnost ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC) i/ili aktivnost citotoksičnosti zavisne od komplementa (CDC). U određenim otelotvorenjima, anti-ASCT2 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment ne vezuje Fc receptor i/ili faktore komplementa. U određenim otelotvorenjima, antitelo ili njegov antigen vezujući fragment nema efektorsku funkciju.
[0102] U određenim otelotvorenjima, anti-ASCT2 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment može biti izmenjen inženjeringom radi spajanja CH3 domena direktno za region šarke odgovarajućih modifikovanih antitela ili njegovih fragmenata. U drugim konstrukcijama peptidni razdelnik može biti umetnut između regiona šarke i modifikovanog CH2 i/ili CH3 domena. Na primer, mogu da budu eksprimirane kompatibilne konstrukcije u kojima je CH2 region izbrisan i preostali CH3 domen (modifikovan ili nemodifikovan) se spaja za region šarke sa 5–20 aminokiselinskih razdelnika. Takav razdelnik može biti dodat, na primer, da se obezbedi da regulatorni elementi konstantnog regiona ostanu slobodni i dostupni ili da region šarke ostane fleksibilan. Aminokiselinski razdelnici mogu, u nekim slučajevima, da pokažu da su imunogeni i da izazovu neželjeni imunski odgovor protiv konstrukcije. Prema tome, u određenim otelotvorenjima, bilo koji razdelnik dodat konstrukciji može biti relativno neimunogen ili čak potpun izostavljen, da bi se održali željeni biohemijski kvaliteti modifikovanih antitela.
2
[0103] Pored delecije čitavih domena konstantnih regiona, ovde opisana anti-ASCT2 antitela ili njihovi antigen vezujući fragmenti mogu da budu modifikovani parcijalnom delecijom ili supstitucijom nekoliko ili čak jedne aminokiseline u konstantom regionu. Na primer, mutacija pojedinačne aminokiseline u izabranim regijama CH2 domena može da bude dovoljna da suštinski smanji Fc vezivanje i tako poveća tumorsku lokalizaciju. Slično tome, jedan ili više domena konstantnog regiona koji kontroliše efektorsku funkciju (npr. vezivanje C1Q komplementa) može biti u potpunosti ili parcijalno obrisano. Takve parcijalne delecije konstantnih regiona mogu da poboljšaju izabrane karakteristike antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta (npr. serumski poluživot) dok ostavljaju intaktnim druge poželjne funkcije povezane sa domenom konstantnog regiona ispitanika. Štaviše, konstanti regioni predstavljenih anti-ASCT2 antitela ili njihovih antigen vezujućih fragmenata mogu da budu modifikovani kroz mutaciju ili supstituciju jedne ili više aminokiselina koje povećavaju profil rezultujuće konstrukcije. U ovom pogledu moguće je prekinuti aktivnost obezbeđenu mestom konzervativnog vezivanja (npr. Fc vezivanje) dok se suštinski održava konfiguracija i imunogeni profil modifikovanog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta. Određena otelotvorenja mogu sadržati dodatak jedne ili više aminokiselina konstantnom regionu radi povećanja željenih karakteristika kao što je smanjenje ili povećanje efektorske funkcije ili obezbeđenja više citotoksinskih ili karbohidratnih dodataka. U takvim otelotvorenjima može biti poželjno da se umetnu ili replikuju specifične sekvence izvedene iz izabranih domena konstantnog regiona.
[0104] Pronalazači dalje razmatraju varijante i ekvivalente koji su dovoljno homologi ovde predstavljenim mišjim, himernim, humanizovanim ili humanim anti-ASCT2 antitelima ili njihovim antigen vezujućim fragmentima. Oni mogu da sadrže, na primer, konzervativne supstitucione mutacije, tj. supstituciju jedne ili više aminokiselina sličnim aminokiselinama. Na primer, konzervativna susptitucija označava supstituciju jedne aminokiseline drugom unutar iste opšte klase kao što je, na primer, jedna kisela aminokiselina drugom kiselom aminokiselinom, jedna bazna aminokiselina drugom baznom aminokiselinom ili jedna neutralna aminokiselina drugom neutralnom aminokiselinom. Ono što se smatra konzervativnom aminokiselinskom supstitucijom je dobro poznato u struci.
[0105] Anti-ASCT2 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment može biti dalje modifikovan da obuhvata dodatne hemijske ostatke koji nisu normalno deo proteina. Ovi izvedeni ostaci mogu da poboljšaju rastvorljivost, biološki poluživot i apsorpciju proteina. Ostaci mogu takođe da smanje ili eliminišu bilo koje željene sporedne efekte proteina i slično. Pregled ovih ostataka može se naći u Remington's Pharmaceutical Sciences, 22. izd., urednik Lloyd V. Allen, Jr. (2012).
V. Konjugati anti-ASCT2 antitela
[0106] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje anti-ASCT2 antitelo ili njegov fragment kao što je gore opisano, konjugovan sa heterologim agensom. U svrhe predmetnog pronalaska, konjugovan znači povezan putem kovalentne ili jonske veze. U određenim aspektima, agens može biti antimikrobni agens, terapijski agens, prolek, peptid, protein, enzim, lipid, modifikator biološkog odgovora, farmaceutski agens, limfokin, heterologa antitela ili njihov fragment, oznaka koja može da se detektuje, PEG ili kombinacija dva ili više od bilo kojih navedenih agenasa. U nekim otelotvorenjima, takvi molekuli koji vezuju ASCT2 su ASCT2-ADC.
[0107] Stoga, predmetni pronalazak takođe obezbeđuje ADC koji obuhvata ovde predstavljeno anti-ASCT2 antitelo, koji dalje obuhvata bar jedan citotoksičan agens. U nekim aspektima, ADC dalje obuhvata bar jedan opcioni razdelnik. U nekim aspektima, bar jedan razdelnik je peptidni razdelnik. U nekim aspektima, bar jedan razdelnik je nepeptidni razdelnik.
[0108] Citotkosični agens ili citotoksin može biti bilo koji molekul poznat u struci koji inhibira ili prevenira funkciju ćelija i/ili uzroka uništavanja ćelija (ćelijska smrt), i/ili zahteva antineoplastične/antiproliferativne efekte. Za više klasa citotksičnih agenasa je poznato da imaju korisni potencijal kod ADC molekula. Ovi uključuju, ali nisu ograničeni na, amanitine, auristatine, daunomicine, doksorubicine, duokarmicine, dolastatine, enedine, leksitropsine, taksane, piromicine, majtansinoide, vinka alkaloide, tubulizine i pirolobenzodiazepine (PBD). Primeri takvih citotksičnih agenasa su AFP, MMAF, MMAE, AEB, AEVB, auristatin E, paklitaksel, docetaksel, CC-1065, SN-38, topotekan, morfolino-doksorubicin, rizoksin, cianomorfolino-doksorubicin, dolastatin-10, ehinomicin, kombretastain, haliheamicin, majtansin, DM-1, vinblastin, metotreksat i netropsin i njihovi derivati i analozi. Dodatno izlaganje u pogledu citotoksina odgovarajućih za korišćenje kod ADC može se pronaći, na primer, u publikaciji međunarodne prijave patenta International Patent Application Publication br. WO 2015/155345 i WO 2015/157592.
4
[0109] U jednom otelotvorenju, citotoksični agens je tubulizin ili derivat tubulizina. Tubulizin A ima sledeću hemijsku strukturu:
[0110] Tubulizini su članovi klase prirodnih proizvoda izolovanih iz miksobakterijskih vrsta (Sasse i sar., J. Antibiot. 53:879-885 (2000)). Kao agensi koji intereaguju sa citoskeletom, tubulizini su mitotički otrovi koji inhibiraju polimerizaciju tubulina i vode zastoju ćelijskog ciklusa i apoptozi (Steinmetz i sar., Chem. Int. izd.43:4888-4892 (2004); Khalil i sar., Chem. Biochem. 7:678-683 (2006); Kaur i sar., Biochem. J. 396: 235-242 (2006)). Kao što se ovde koristi, termin tubulizin označava i kolektivne i individualne do prirodnih tubilizina i analoga i derivata tubulizina. Ilustrativni primeri tubulizina su prikazani, na primer, u WO2004005326A2, WO2012019123A1, WO2009134279A1, WO2009055562A1, WO2004005327A1, US7776841, US7754885, US20100240701, US7816377, US20110021568 i US20110263650. Treba razumeti da takvi derivati uključuju, na primer, tubulizin prolekove ili tubulizine koji uključuju jednu ili više zaštita ili zaštitnih grupa, jednog ili više vezujućih ostataka.
[0111] U određenim aspektima, tubulizin je tubulizin 1508, takođe ovde označen kao „AZ1508“ i opisan detaljnije u WO 2015157594, koji ima sledeću strukturu:
[0112] U drugom otelotvorenju, citotoksični agens može biti pirolobenzodiazepin (PBD) ili derivat PBD. PBD se translocira u nukleus gde unakrsno vezuje DNK, sprečavajući replikaciju tokom mitoze, oštećujući DNK putem indukovanja prekida pojedinačnog lanca i sledstveno vodeći ka apoptozi. Neki PBD imaju sposobnost da prepoznaju i vežu specifične sekvence DNK; preferirana sekvenca je PuGPu. PBD imaju opštu strukturu:
[0113] PBD se razlikuju u broju, tipu i poziciji supstituenata, u oba njihova aromatična A prstena i pirolo C prstena i u stepenu saturacije C prstena. U B-prstenu postoji bilo imin (N=C), koarbinolamin (NH-CH(OH)) ili karbinolamin metil eter (NH-CH(OMe)) na poziciji N10-C11 koji je elektrofilni centar odgovoran za alkilaciju DNK. Svi poznati prirodni proizvodi imaju (S)-konfiguraciju na hiralnoj C11a poziciji koja im obezbeđuje desnostrano okretanje kada se gleda od C prstena prema A prstenu. Ovo im daje odgovarajući trodimenzionalni oblik za izoheličnost sa manjim žlebom od B-forme DNK, vodeći ka bliskom kontaktu na mestu vezivanja (Kohn, In Antibiotics III. Springer-Verlag, New York, str.3–11 (1975); Hurley and Needham-VanDevanter, Acc. Chem. Res.,19, 230-237 (1986)). Njihova sposobnost da formiraju adukt u manjem žlebu omogućava im da ometaju obradu DNK, iz čega potiče njihova upotreba kao antitumorskih agenasa.
[0114] Prvi PBD antitumorski antibiotik, antramicin, otkriven je 1965. godine (Leimgruber i sar., J. Am. Chem. Soc.87:5793-5795 (1965); Leimgruber i sar., J. Am. Chem. Soc.87:5791-5793 (1965)). Od tad, opisano je više prirodnih PBD i razvijeno preko 10 sintetičkih puteva za mnoštvo analoga (Thurston i sar., Chem. Rev. 1994:433-465 (1994); Antonow, D. and Thurston, D.E., Chem. Rev. 111:2815-2864 (2011)). Članovi familije uključuju abeimicin (Hochlowski i sar, J. Antibiotics 40:145-148 (1987)), kikamicin (Konishi i sar., J. Antibiotics 37:200-206 (1984)), DC-81 (japanski patent Japanese Patent 58-180487; Thurston i sar., Chem. Brit. 26:767-772 (1990); Bose i sar., Tetrahedron 48:751-758 (1992)), mazetramicin (Kuminoto i sar., J. Antibiotics 33:665-667 (1980)), neotramicine A i B (Takeuchi i sar., J. Antibiotics 29:93-96 (1976)), porotramicin (Tsunakawa i sar., J. Antibiotics 41:1366-1373 (1988)), protrakarcin (Shimizu i sar., J. Antibiotics 29:2492-2503 (1982); Langley and Thurston, J. Org. Chem. 52:91-97 (1987)), sibanomicin (DC-102) (Hara i sar., J. Antibiotics 41:702-704 (1988); Itoh i sar., J. Antibiotics 41:1281-1284 (1988)), sibiromicin (Leber i sar., J. Am. Chem. Soc. 110:2992-2993 (1988)) i tomamicin (Arima i sar., J. Antibiotics 25:437-444 (1972)). PBD i ADC koji ih obuhvataju su takođe opisani u publikaciji međunarodne prijave patenta International Patent Application Publication br. WO 2015/155345 i WO 2015/157592.
[0115] U određenim aspektima, PBD je PBD 3249, takođe ovde označen kao „SG3249“ i opisan detaljnije u WO 2014/057074, koji ima sledeću strukturu:
[0116] U određenim aspektima, PBD je PBD 3315, takođe ovde označen kao „SG3315“ i opisan detaljnije u WO 2015/052322, koji ima sledeću strukturu:
[0117] Anti-ASCT2 antitela i njihovi antigen vezujući fragmenti, ovde prikazani, mogu da budu konjugovani sa heterologim agensima koristeći metode konjugacije specifične za mesto ili nespecifične za mesto. U nekim aspektima, ADC obuhvata jedan, dva, tri, četiri ili više terapijskih ostataka. U nekim aspektima, svi terapijski ostaci su isti.
[0118] Konvencionalne strategije konjugacije za antitela ili njihove antigen vezujuće fragmente zasnivaju se na nasumično konjugovanim skupom antitela ili fragmenta kroz lizine ili cisteine. Shodno tome, u nekim aspektima antitelo ili njegov antigen vezujući fragment je nasumično konjugovan sa agensom, na primer, parcijalnom redukcijom antitela ili fragmenta, praćeno reakcijom sa željenim agensom, sa ili bez dodatog ostatka linkera. Antitelo ili fragment može da bude redukovan korišćenjem DTT ili sličnog redukujućeg agensa. Agens sa ili bez prikačenog ostatka linkera može zatim biti dodat molarnim viškom redukovanom antitelu ili fragmentu u prisustvu DMSO. Nakon konjugacije, višak slobodnog cisteina može biti dodat da ugasi agens koji nije reagovao. Reakcija mešavine može potom biti prečišćena i izmenjena puferom u PBS.
[0119] U drugim aspektima, konjugacija specifična za mesto terapijskih ostataka sa antitelima korišćenjem reaktivnih aminokiselinskih ostataka na specifičnim pozicijama daje homogene ADC preparate sa uniformnom stehiometrijom. Konjugacija specifična za mesto može biti kroz ostatak cisteina ili neprirodnom aminokiselinom. U jednom otelotvorenju, citotoksični agens ili radiofarmak je konjugovan sa antitelom ili njegovim antigen vezujućim fragmentom kroz bar jedan ostatak cisteina. U nekim aspektima, svaki terapijski ostatak je hemijski konjugovan sa bočnim lancem aminokiseline na specifičnoj Kabat poziciji u Fc regionu. U nekim otelotvorenjima, citotoksični agens ili radiofarmak je konjugovan sa antitelom ili njegovim antigen vezujućim fragmentom kroz supstituciju cisteina od bar jedne pozicije 239, 248, 254, 273, 279, 282, 284, 286, 287, 289, 297, 298, 312, 324, 326, 330, 335, 337, 339, 350, 355, 356, 359, 360, 361, 375, 383, 384, 389, 398, 400, 413, 415, 418, 422, 440, 441, 442, 443 i 446, naznačeno time što numerisanje odgovara Kabat EU indeksu. U nekim aspektima, specifične Kabat pozicije su 239, 442 ili obe. U nekim aspektima, specifične pozicije su Kabat pozicija 442, aminokiselinski umetak između Kabat pozicija 239 i 240 ili oba. U nekim aspektima, agens je konjugovan sa antitelom ili njegovim antigen vezujućim fragmentom kroz vezivanje tiol-malemid. U nekim aspektima, aminokiselinski bočni lanac je sulfhidril bočni lanac.
[0120] U jednom otelotvorenju, molekul koji vezuje npr. ASCT2, ASCT2-ADC, anti-ASCT2 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, isporučuje citotoksični skup ćelijama koje eksprimiraju ASCT2 i inhibiraju ili suprimiraju proliferaciju za bar 10% ili bar 20% ili bar 30% ili bar 40% ili bar 50% ili bar 60% ili bar 70% ili bar 80% ili bar 90% ili oko 100%. Ćelijska proliferacija može biti testirana koristeći tehnike poznate u struci koje mere stopu ćelijske podele i/ili frakcije ćelija unutar ćelijske populacije koja podleže podeli ćelija i/ili stopu gubitka ćelija od ćelijske populacije usled terminalne diferencijacije ili ćelijske smrti (npr. uključivanje timidina).
VI. Polinukleotidi koji kodiraju molekule koji vezuju ASCT2 i njihova ekspresija
[0121] Ovaj pronalazak opisuje polinukleotide koji obuhvataju sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju polipeptid koji specifično vezuje ASCT2 ili njegov antigen vezujući fragment. Tačnije, pronalazak opisuje polinukleotid koji obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja kodira anti-ASCT2 antitelo pronalaska ili kodira antigen vezujući fragment takvog antitela.
Polinukleotidi pronalaska mogu biti u obliku RNK ili u obliku DNK. DNK uključuje cDNK, genomsku DNK i sintetičku DNK i može biti dvolančana ili jednolančana i ako je jednolančana, može biti kodirajući niz ili nekodirajući (besmisleni) niz.
[0122] U nekim otelotvorenjima, polinukleotid može biti izolovan. U nekim otelotvorenjima, polinukleotid može biti u osnovi čist. U nekim otelotvorenjima, polinukleotid može biti cDNK ili izveden iz cDNK. U nekim otelotvorenjima, polinukleotid može biti nasumično proizveden. U određenim otelotvorenjima, polinukleotid može da obuhvata kodirajuću sekvencu za zreli polipeptid spojen u istom čitajućem okviru za polinukleotid koji pomaže, na primer, u ekspresiji i sekreciji polipeptida iz ćelije domaćina (npr. vodeća sekvenca koja funkcioniše kao sekretorna sekvenca za kontrolu transporta polipeptida iz ćelije). Polipeptid koji ima vodeću sekvencu je preprotein i može imati vodeću sekvencu koji se cepa od strane ćelije domaćina radi formiranja zrele forme polipeptida. Polinukleotidi mogu takođe da kodiraju proprotein koji vezuje ASCT2 i koji je zreli protein plus dodatni 5' aminokiselinski ostaci.
[0123] Pronalazak dalje predstavlja izolovani polinukleotid koji obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira VH antitelo, naznačeno time što VH obuhvata aminokiselinsku sekvencu bar 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identičnu referentnoj aminokiselinskoj sekvenci izabranoj iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 i SEQ ID NO: 7.
[0124] Štaviše, pronalazak predstavlja izolovani polinukleotid koji obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira VL antitelo, naznačeno time što VL obuhvata aminokiselinsku sekvencu bar 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identičnu referentnoj aminokiselinskoj sekvenci izabranoj iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 i SEQ ID NO: 8.
[0125] Pronalazak predstavlja izolovani polinukleotid koji obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira VH antitelo, naznačeno time što VH obuhvata aminokiselinsku sekvencu bar 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identičnu referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 1 i nukleinsku kiselinu koja kodira VL antitelo, naznačeno time što VL obuhvata aminokiselinsku sekvencu bar 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identičnu referentnoj aminokiselinskoj sekvenci izabranoj iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 2. Pronalazak predstavlja izolovani polinukleotid koji obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira VH antitelo, naznačeno time što VH obuhvata aminokiselinsku sekvencu bar 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identičnu referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 3 i nukleinsku kiselinu koja kodira VL antitelo, naznačeno time što VL obuhvata aminokiselinsku sekvencu bar 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identičnu referentnoj aminokiselinskoj sekvenci izabranoj iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 4. Pronalazak predstavlja izolovani polinukleotid koji obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira VH antitelo, naznačeno time što VH obuhvata aminokiselinsku sekvencu bar 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identičnu referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 5 i nukleinsku kiselinu koja kodira VL antitelo, naznačeno time što VL obuhvata aminokiselinsku sekvencu bar 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identičnu referentnoj aminokiselinskoj sekvenci izabranoj iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 6. Pronalazak predstavlja izolovani polinukleotid koji obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira VH antitelo, naznačeno time što VH obuhvata aminokiselinsku sekvencu bar 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identičnu referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 7 i nukleinsku kiselinu koja kodira VL antitelo, naznačeno time što VL obuhvata aminokiselinsku sekvencu bar 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identičnu referentnoj aminokiselinskoj sekvenci izabranoj iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 8.
[0126] U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen vezujući fragment obuhvata VH ili VL kodiran polinukleotidom kao što je gore opisano, može da specifično veže ASCT2, npr. humani ASCT2 ili ASCT2 makaki majmuna. U određenim slučajevima takvo antitelo ili njegov antigen vezujući fragment može da specifično veže isti epitop kao antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji obuhvata VH i VL od 17c10 ili 1e8. U određenim aspektima pronalazak predstavlja polinukleotid ili kombinaciju polinukleotida koji kodiraju vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, koji se specifično vezuje za ASCT2.
[0127] Dalje, obezbeđen je vektor koji obuhvata polinukleotid kao što je gore opisano. Odgovarajući vektori su ovde opisani i poznati onima prosečne stručnosti u predmetnoj oblasti.
[0128] U određenim aspektima, pronalazak predstavlja sastav, npr. farmaceutski sastav, koji obuhvata polinukleotid ili vektor kao što je gore opisano, opciono dalje obuhvata jedan ili više nosača, rastvarač, ekscipijens ili druge aditive.
[0129] U polinukleotidnom sastavu kao što je gore opisano, polinukleotid koji obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira VH i polinukleotid koji obuhvata nukleinsku kiselinu koja
4
kodira VL mogu da se nalaze u pojedinačnom vektoru ili mogu biti na različitim vektorima. Shodno tome pronalazak obezbeđuje jedan ili više vektora koji sadrže polinukleotidnu smešu opisanu gore.
[0130] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje ćeliju domaćina koja obuhvata polinukleotid, polinukleotidnu smešu ili vektor kao što je gore opisano, pri čemu ćelija domaćina može, u nekim slučajevima, da eksprimira antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji specifično vezuje ASCT2. Takva ćelija domaćina može da se koristi u okviru metoda za pravljenje antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta kao što je ovde opisano, pri čemu metod uključuje (a) kultivisanje ćelije domaćina i (b) izolovanje antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta eksprimiranog iz ćelije domaćina.
[0131] U određenim otelotvorenjima polinukleotidi sadrže kodirajuće sekvence za zreli polipeptid koji vezuje ASCT2, npr. anti-ASCT2 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, spojen u isti okvir za čitanje sa marker sekvencom što omogućava, na primer, prečišćavanje kodiranog proteina. Na primer, marker sekvenca može biti heksahistidin oznaka obezbeđena od pQE-9 vektora da obezbedi prečišćavanje zrelog polipeptida spojenog sa markerom, u slučaju bakterijskog domaćina, ili marker sekvenca može biti hemaglutinin (HA) oznaka izvedena iz proteina hemaglutinina influence kada se koristi domaćin sisar (npr. COS-7 ćelije).
[0132] Varijante polinukleotida su takođe predstavljene. Polinukleotidne varijante mogu da sadrže promene u kodirajućim regionima, nekodirajućim regionima ili oba. U istim otelotvorenjima polinukleotidne varijante sadrže promene koje proizvode tihe supstitucije, dodavanja ili delecije, ali ne menjaju osobine ili aktivnosti kodiranog polipeptida. U nekim otelotvorenjima, polinukleotidne varijante su proizvedene putem tihih supstitucija usled degeneracije genetskog koda. Polinukleotidne varijante mogu biti proizvedene iz mnogobrojnih razloga, npr. da optimizuju ekspresiju kodona za određenog domaćina (promene kodone u humanom mRNK za one koje preferira bakterijski domaćin kao što je E. coli). Vektori i ćelije koji sadrže ovde opisane polinukleotide su takođe predstavljeni.
[0133] U nekim otelotvorenjima DNK sekvenca koja kodira molekul koji vezuje ASCT2 može biti konstruisana hemijskom sintezom korišćenjem oligonukleotidnog sintetizatora. Takvi oligonukleotidi mogu biti stvoreni na bazi aminokiselinske sekvence željenog polipeptida i izborom onih kodona koji su preferirani u ćeliji domaćina u kojoj će rekombinanti polipetid od interesa biti proizveden. Standardne metode mogu biti primenjene da se sintetiše izolovana polinukletidna sekvenca koja kodira izolovani polipeptid od interesa. Na primer, kompletna aminokiselinska sekvenca može biti korišćena da se konstruiše gen koji se translatuje unazad. Dalje, DNK oligomer koji obuhvata nukleotidnu sekvencu za kodiranje određenog izolovanog polipeptida može da bude sintetisan. Na primer, više malih oligonukleotida koji kodiraju delove željenog polipeptida mogu biti sintetisani i potom povezani. Pojedinačni oligonukleotidi tipično sadrže 5' ili 3' spojnice za komplementarni sklop.
[0134] Jednom sklopljene (sintezom, mutagenezom usmerenom ka mestu ili drugom metodom), polinukleotidne sekvence koje kodiraju određeni izolovani polipeptid od interesa mogu biti umetnute u vektor za ekspresiju i operativno povezane za kontrolnu sekvencu za ekspresiju odgovarajuću za ekspresiju u proteinu željenog domaćina. Odgovarajući sklop može biti potvrđen, npr. sekvencioniranjem nukleotida, restriktivnim mapiranjem i/ili ekspresijom biološki aktivnog polipeptida u odgovarajućem domaćinu. Da bi se dobili visoki nivoi ekspresije trensfektiranog gena kod domaćina, gen može da operativno bude povezan sa ili doveden u vezu sa transkripcionim i translacionim kontrolnim sekvencama za ekspresiju koje su funkcionalne u izabranom domaćinu za ekspresiju.
[0135] U određenim otelotvorenjima, rekombinanti vektori za ekspresiju se koriste da povećaju i eksprimuju DNK koja kodira anti-ASCT2 antitela ili njihove antigen vezujući fragmente. Rekombinanti vektori za ekspresiju su replikabilne DNK konstrukcije koje imaju sintetičke ili DNK fragmente izvedene iz cDNK koji kodiraju polipeptidni lanac anti-ASCT2 antitela ili njegov antigen vezujući fragment, operativno povezan sa odgovarajućim transkripcionim ili translacionim regulacionim elementima izvedenim iz gena sisara, mikroba, virusa ili insekata. Transkripciona jedinica obično obuhvata skup (1) genetičkog elementa ili elemenata koji imaju regulatornu ulogu u ekspresiji gena, na primer, transkripcione promotere ili pojačivače, (2) strukturnu ili kodirajuću sekvencu koja se transkribuje u mRNK i translatira u protein i (3) odgovarajuće inhibicije transkripcije i translacije i sekvenci terminacije, kao što je ovde detaljno opisano. Takvi regulatorni elementi mogu da uključe sekvencu operatora radi kontrole transkripcije. Sposobnost da se replikuje u domaćinu, obično određena poreklom replikacije, kao i izbor gena da olakša prepoznavanje transformanata, može dodatno da se uključi. DNK regioni su operativno povezani kada su funkcionalno povezani jedan sa drugim. Na primer, DNK za pojedinačni peptid (sekretorni vodič) je operativno povezan sa DNK za polipeptid ako je eksprimovan kao prekursor koji učestvuje u sekreciji polipeptida; promoter je operativno povezan sa kodirajućom sekvencom ako ona kontroliše transkripciju sekvence; ili mesto vezivanja ribozoma je operativno povezano za kodirajuću sekvencu ako je tako pozicionirano da dozvoljava translaciju. Strukturni elementi namenjeni za korišćenje u sistemima ekspresije kvasca uključuju vodeću sekvencu koja omogućava ekstracelularnu sekreciju translatiranog proteina od strane ćelije domaćina. Alternativno, kada je rekombinanti protein eksprimovan bez vodeće ili transportne sekvence, protein može da uključi N-terminalni ostatak metionina. Ovaj ostatak opciono može da sledstveno bude pocepan od eksprimovanog rekombinantog proteina da obezbedi finalni proizvod.
[0136] Izbor sekvence za kontrolu ekspresije i vektora ekspresije će zavisiti od izbora domaćina. Širok izbor kombinacija domaćina/vektora za ekspresiju može biti upotrebljen. Korisni vektori za ekspresiju za eukariotske domaćine uključuju, na primer, vektore koji sadrže kontrolne sekvence za ekspresiju iz SV40, kravljeg papilloma virusa, adenovirusa i citomegalovirusa. Korisni vektori za ekspresiju za bakterijske domaćine uključuju poznate bakterijske plazmide, kao što su plazmidi iz E. coli, uključujući pCR 1, pBR322, pMB9 i njihove derivate, širi opseg plazmida domaćina, kao što su M13 i filamentozni jednolančani DNK fagi.
[0137] Odgovarajuće ćelije domaćina za ekspresiju molekula koji vezuje ASCT2 uključuju prokariote, kvasac, insekte ili više eukariotske ćelije, pod kontrolom odgovarajućih promotera. Prokarioti uključuju gram negativne ili gram pozitivne organizme, na primer E. coli ili bacile. Više eukariotske ćelije uključuju utvrđene ćelijske linije sisarskog porekla kao što je ovde opisano. Sistemi za translaciju bez ćelija se takođe mogu upotrebiti. Dodatne informacije u pogledu metoda proizvodnje proteina, uključujući proizvodnju antitela, mogu se naći u npr. publikaciji U.S. Patent Publication br.2008/0187954, U.S. Patent br. 6,413,746 i 6,660,501 i publikaciji međunarodnog patenta International Patent Publication br. WO 04009823.
[0138] Različiti sistemi kultura ćelija sisara ili insekata mogu biti povoljno upotrebljeni da eksprimuju rekombinantne molekule koji vezuju ASCT2. Ekspresija rekombinantnih proteina u ćelijama sisara može biti izvedena zato što takvi proteini su uobičajeno pravilno savijeni, odgovarajuće modifikovani i kompletno funkcionalni. Primeri odgovarajućih ćelijskih linija domaćina sisara uključuju HEK-293 i HEK-293T, COS-7 linije ćelija bubrega majmuna, opisanih od strane Gluzman, Cell 23:175 (1981), kao i druge ćelijske linije koje uključuju, na primer, L ćelije, C127, 3T3, jajnik kineskog hrčka (CHO), HeLa i BHK ćelijske linije. Vektori ekspresije kod sisara mogu da sadrže netranskribovane elemente kao što je poreklo replikacije,
4
odgovarajući promoter i pojačivač povezan sa genom koji se eksprimuje i druge 5' ili 3' bočne netranskibujuće sekvence, kao i 5' ili 3' netranslantujuće sekvence, kao što su neophodna mesta za vezivanje ribozoma, mesto poliadenilacije, mesto donora spojnice i prihvatioca i sekvence za terminaciju transkripcije. Sistemi bakulovirusa za proizvodnju heterologih proteina u ćelijama insekata su predstavljeni od strane Luckow and Summers, BioTechnology 6:47 (1988).
[0139] Molekuli koji vezuju ASCT2 proizvedeni od strane transformisanog domaćina mogu biti prečišćeni prema bilo kom odgovarajućem metodu. Takve standardne metode uključuju hromatografiju (npr. jonsku izmenu, afinitet i hromatografiju dimenzioniranja kolone), centrifugiranje, diferencionalnu rastvorljivost ili putem bilo koje druge standardne tehnike za prečišćavanje proteina. Oznake afiniteta, kao što je heksahistidin, domen za vezivanje maltoze, sekvenca oblaganja influence i glutation S-transferaza, mogu biti prikačene za protein da omoguće lako prečišćavanje putem prelaska preko odgovarajuće kolone afiniteta. Izolovani proteini mogu takođe biti fizički okarakterisani korišćenjem tehnika kao što je proteoliza, nuklearna magnetna rezonanca i rendgenska kristalografija.
[0140] Na primer, supernatanti iz sistema koji sekretuju rekombinanti protein u kulturu medija mogu biti prvo koncentrovani korišćenjem komercijalno dostupnog filtera za koncentraciju proteina, na primer, Amicon ili Millipore Pellicon jedinice za ultrafiltraciju. Nakon koraka ultrafiltracije, koncentrat može biti primenjen na matriks odgovarajuće prečišćenosti. Alternativno, smola za jonsku izmenu može biti upotrebljena, na primer, matriks ili supstrat ima bočne dietilaminoetil (DEAE) grupe. Matrice mogu biti akrilamid, agaroza, dekstran, celuloza ili drugi tipovi uobičajeno primenjeni u purifikaciji proteina. Alternativno, korak izmene katjona se može upotrebiti. Odgovarajući izmenjivači katjona uključuju različite nerastvorljive matrice koje sadrže sulfopropil ili karboksimetil grupe. Na kraju, jedan ili više koraka reverzne faze tečne hromatografije (RP-HPLC) visoke performanse upotrebljavajući RP-HPLC medijum, npr. silika gel koji ima bočne metil ili druge alifatične grupe, može biti upotrebljeno da se dalje prečisti molekul koji vezuje ASCT2. Neki ili svi gorepomenuti koraci za prečišćavanje, u različitim kombinacijama, mogu takođe biti upotrebljeni da omoguće homogeni rekombinanti protein.
[0141] Rekombinantni molekul koji vezuje ASCT2 proizveden u bakterijskoj kulturi može biti izolovan, na primer, inicijalnom ekstrakcijom iz ćelijskih peleta, praćenih jednom ili više koraka koncentracija, isoljavanja, vodenom izmenom jona ili hromatografijom isključivanja veličine. Tečna hromatografija visoke performanse (HPLC) može biti upotrebljena za krajnje korake prečišćavanja. Mikrobne ćelije upotrebljene u ekspresiji rekombinantnog proteina mogu biti prekinute bilo kojim odgovarajućim metodom, uključujući ciklus zamrzavanjaotapanja, sonikacije, mehaničkim prekidom ili korišćenjem agenasa za ćelijsko liziranje.
[0142] Metode poznate u struci za prečišćavanje antitela i drugih proteina takođe uključuju, na primer, one opisane u publikaciji U.S. Patent Publication br. 2008/0312425, 2008/0177048 i 2009/0187005.
VII. Farmaceutski sastavi i metode primene
[0143] Metode pripremanja i primene ovde opisanih molekula koji vezuju ASCT2 ispitaniku koji ima potrebu za njima su dobro poznati ili se lako određuju od strane stručnjaka. Put primene molekula koji vezuje ASCT2 može biti, na primer, oralni, parenteralni, inhalacijom ili topikalni. Termin parenteralni kao što se ovde upotrebljava uključuje, npr. intravensku, intraarterijsku, intraperitonealnu, intramuskularnu, supkutanu, rektalnu ili vaginalnu primenu. Dok su svi ovi oblici primene jasno predviđeni kao da su unutar obuhvata pronalaska, drugi primer oblika primene bi bio rastvor za injekcije, tačnije za intravensku ili intraarterijsku injekciju ili infuziju. Obično, odgovarajuća farmaceutska smeša može sadržati pufer (npr. acetat, fosfat ili citratni pufer), surfaktant (npr. polisorbat), opciono stabilišući agens (npr. humani albumin) itd. U drugim metodama kompatibilnim sa učenjima ovde, molekuli koji vezuju ASCT2 ovde obezbeđeni mogu biti isporučeni direktno na mesto suprotne ćelijske populacije time povećavajući izloženost obolelog tkiva terapijskom agensu. U jednom otelotvorenju, primena je direktno u disajni put, npr. putem inhalacije ili intranazalnom primenom.
[0144] Kao što je ovde prodiskutovano, molekuli koji vezuju ASCT2 ovde opisani mogu biti primenjeni u farmaceutski efikasnoj količini za in vivo lečenje bolesti ili poremećaja koje karakteriše prekomerna ekspresija ASCT2, kao što je kolorektalni karcinom, HNSCC, karcinom prostate, karcinom pluća, karcinom pankreasa, melanom, karcinom endometrijuma, hematološki karcinomi (AML, MM, DLBCL (difuzni B krupnoćelijski limfom)) i karcinomi koji sadrže CSC. U ovom pogledu, opisani molekuli za vezivanje mogu biti formulisani tako da olakšaju primenu i promovišu stabilnost aktivnog agensa. Farmaceutske smeše u saglasnosti sa predmetnim pronalaskom mogu sadržati farmaceutski prihvatljiv, netoksičan, sterilan nosač kao što je fiziološki rastvor, netoksični puferi, konzervansi i slično. U svrhe trenutne aplikacije,
4
farmaceutski efikasna količina molekula koji vezuje ASCT2 znači količinu dovoljnu da se postigne efikasno vezivanje za cilj i da se postigne korist, npr. da se poboljšaju simptomi bolesti ili stanja ili da se otkrije supstanca ili ćelija. Odgovarajuće formulacije za upotrebu u ovde opisanim terapijskim metodama opisane su u publikaciji Remington's Pharmaceutical Sciences, 22. izd., urednik Lloyd V. Allen, Jr. (2012).
[0145] Određeni farmaceutski sastavi ovde opisani mogu biti oralno primenjeni u prihvatljivoj doznoj formi koja uključuje npr. kapsule, tablete, vodene suspenzije ili rastvore. Određeni farmaceutski sastavi mogu biti primenjeni putem nazalnog aerosola ili inhalacije. Takvi sastavi mogu biti pripremljeni kao rastvori u fiziološkom rastvoru, upotrebom benzil alkohola ili drugih odgovarajućih konzervanasa, promotera apsorpcije da se poveća biodostupnost i/ili drugih konvencionalnih agenasa za rastvaranje ili dispergovanje.
[0146] Količina molekula koji vezuje ASCT2 koja može biti kombinovana sa materijalima za prenošenje za proizvodnju pojedinačnog doznog oblika variraće u zavisnosti od lečenog ispitanika i određenog načina primene. Sastav može biti primenjen kao pojedinačna doza, više doza ili tokom utvrđenog vremenskog perioda u infuziji. Dozni režimi takođe mogu biti prilagođeni da se obezbedi željeni odgovor.
[0147] U saglasnosti sa obuhvatom predmetnog pronalaska, molekuli koji vezuju ASCT2 mogu biti primenjeni na ljudima ili drugim životinjama u saglasnosti sa gorepomenutim metodama lečenja u količini dovoljnoj da proizvede terapijski efekat. Ovde opisani molekuli koji vezuju ASCT2 mogu biti primenjeni takvim ljudima ili drugim životinjama u konvencionalnoj doznoj formi pripremljenoj kombinovanjem molekula koji vezuje ASCT2 pronalaska sa konvencionalnim farmaceutski prihvatljivim nosačem ili rastvaračem prema poznatim tehnikama. Oblik i karakter farmaceutski prihvatljivog nosača ili rastvarača može biti diktiran od strane količine aktivnog sastojka koji se kombinuje, puta primene i drugih dobro poznatih varijabli. Koktel koji obuhvata jednu ili više vrsta molekula koji vezuju ASCT2, npr. ASCT2-ADC, anti-ASCT2 antitela ili njihovi antigen vezujući fragmenti, varijante ili derivati iz pronalaska, može takođe biti korišćen.
[0148] Pod „terapijskim efikasnom dozom ili količinom“ ili „efikasnom količinom“ se smatra količina molekula koji vezuje ASCT2 koja, kada je primenjena, donosi pozitivan terapijski odgovor u pogledu lečenja pacijenta sa bolešću ili poremećajem koji se tretira.
4
[0149] Terapijski efikasne doze sastava predmetnog pronalaska, za lečenje bolesti ili poremećaja u kojima je ASCT2 prekomerno eksprimirana, kao što su neki karcinomi, variraju u zavisnosti od mnogo različitih faktora, uključujući način primene, ciljno mesto, fiziološko stanje pacijenta, da li je pacijent čovek ili životinja i drugih primenjenih lekova. Obično, pacijent je čovek, ali nehumani sisari, uključujući transgene sisare, mogu takođe biti tretirani. Doze za lečenje mogu biti titrirane korišćenjem rutinskih metoda poznatih stručnjacima da se optimizuje bezbednost i efikasnost.
[0150] Količina bar jednog molekula koji vezuje ASCT2 koji se primenjuje se lako određuje od strane osobe uobičajene stručnosti u struci bez nepotrebnog eksperimentisanja u odnosu na ovo otkriće. Faktori koji utiču na način primene i odgovarajuću količinu bar jednog molekula koji vezuje ASCT2 uključuju, ali nisu ograničeni na, ozbiljnost bolesti, istoriju bolesti, kao i godine, visinu, težinu, zdravlje i fizičko stanje osobe koja prima terapiju. Slično, količina molekula koji vezuje ASCT2 koja se daje će zavisiti od načina primene i toga da li će ispitanik primiti pojedinačnu dozu ili više doza ovog agensa.
[0151] Ovaj pronalazak takođe predviđa upotrebu molekula koji vezuje ASCT2, npr. ASCT2-ADC, anti-ASCT2 antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta, varijante ili derivata, za korišćenje u lečenju bolesti ili poremećaja karakterisanih prekomernom ekspresijom ASCT2, npr. kolorektalni karcinom, HNSCC, karcinom prostate, karcinom pluća, karcinom pankreasa ili hematološki karcinom.
[0152] Ovaj pronalazak takođe predviđa upotrebu molekula koji vezuje ASCT2, npr. ASCT2-ADC, anti-ASCT2 antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta, varijante ili derivata, za proizvodnju leka za lečenje bolesti ili poremećaja karakterisanih prekomernom ekspresijom ASCT2, npr. kolorektalni karcinom, HNSCC, karcinom prostate, karcinom pluća, karcinom pankreasa ili hematološki karcinom.
VIII Dijagnostika
[0153] Ovaj pronalazak dalje opisuje dijagnostički metod koristan tokom dijagnoze bolesti karakterisane prekomernom ekspresijom ASCT2, kao što su neki karcinomi, što uključuje merenje nivoa ekspresije ASCT2 u ćelijama ili tkivu pojedinca i poređenje merenog nivoa ekspresije sa standardnom ASCT2 ekspresijom u normalnim ćelijama ili tkivu, gde je porast u
4
nivou ekspresije u poređenju sa standardnim indikativan za poremećaj koji se može tretirati ovde opisanim molekulom za vezivanje ASCT2.
[0154] Ovde opisani molekuli za vezivanje ASCT2 mogu biti korišćeni za test nivoa ASCT2 proteina u biološkom uzorku korišćenjem klasičnih imunohistoloških metoda poznatih stručnjacima. Videti Jalkanen i sar., J. Cell Biol.105:3087-3096 (1987); Jalkanen, i sar., J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985). Druge metode bazirane na antitelu korisne za otkrivanje ekspresije ASCT2 proteina uključuju imunoeseje, kao što je ELISA, imunoprecipitacija ili Western blotting.
[0155] „Testiranje nivoa ekspresije ASCT2 polipeptida“ podrazumeva kvalitativno ili kvantitativno merenje ili procenu nivoa ASCT2 polipeptida u prvom biološkom uzorku bilo direktno (npr. određivanjem ili procenom apsolutnog nivoa proteina) ili relativno (npr. poređenjem sa nivoom proteina u vezi sa bolešću u drugom biološkom uzorku). Nivo ekspresije ASCT2 polipeptida u prvom biološkom uzorku može biti meren ili procenjen i poređen sa standardnim nivoom ASCT2 polipeptida, pri čemu je standard uzet iz drugog biološkog uzorka dobijenog od pojedinca koji nema poremećaj ili je određen određivanjem srednje vrednosti nivoa iz populacije pojedinaca koji nemaju poremećaj. Kao što se smatra u struci, jednom kada je poznat standardni nivo ASCT2 polipeptida, može biti ponovo korišćen kao standard za poređenje.
[0156] Pod biološkim uzorkom se smatra bilo koji biološki uzorak dobijen od pojedinca, ćelijske linije, kulture tkiva ili drugog izvora ćelija koje potencijalno eksprimuju ASCT2. Metode za dobijanje biopsija tkiva i telesnih tečnosti sisara su dobro poznate u struci.
IX. Kompleti koji sadrže molekule koji vezuju ASCT2
[0157] Ovaj pronalazak dalje predstavlja komplete koji sadrže molekul koji vezuje ASCT2 pronalaska i koji mogu biti korišćeni da se izvedu ovde opisane metode. U određenim otelotvorenjima, komplet obuhvata bar jedno pročišćeno anti-ASCT2 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment u jednom ili više kontejnera. U nekim otelotvorenjima, komplet obuhvata bar jedan prečišćeni ASCT2-ADC u jednom ili više kontejnera. U nekim otelotvorenjima, kompleti sadrže sve komponente neophodne i/ili dovoljne da se izvede test za otkrivanje, uključujući sve kontrole, uputstva za izvođenje testa i bilo koji softver neophodan za analizu i predstavljanje rezultata. Stručnjak će lako da prepozna da opisani molekuli koji
4
vezuju ASCT2 mogu biti lako uključeni u jedan od utvrđenih oblika kompleta koji su dobro poznati u struci.
X. Imunoeseji
[0158] Ovde opisani molekuli koji vezuju ASCT2 mogu biti korišćeni u testovima za imunospecifično vezivanje putem bilo kog metoda poznatog u struci. Imunoeseji koji mogu biti korišćeni uključuju, ali nisu ograničeni na, kompetitivne i nekompetitivne sisteme testova koji koriste tehnike kao što su Western blot, RIA, ELISA, ELISPOT, sendvič imunoeseji, testovi za imunoprecipitaciju, reakcije precipitacije, reakcije koje precipitiraju gel difuziju, testovi imunodifuzije, testovi aglutinacije, testovi za fiksiranje komplementa, imunoradiometrički testovi, fluoroscentni testovi i imunoeseji proteina A. Takvi testovi su rutinski i dobro poznati u struci. Videti, npr. Ausubel i sar, urednici, (1994) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., NY) Vol.1.
[0159] Ovde opisani molekuli koji vezuju ASCT2 mogu biti upotrebljeni histološki, kao imunofluorescencija, imunoelektronska mikroskopija ili neimunološki testovi, na primer, za in situ detekciju ASCT2 ili sačuvanih varijanti ili njihovih peptidnih fragmenata. In situ detekcija može biti postignuta uklanjanjem histološkog uzorka od pacijenta i primenom na takvom uzorku označenog molekula koji vezuje ASCT2, npr. primenjeno postavljanjem označenog molekula koji vezuje ASCT2 preko biološkog uzorka. Kroz upotrebu takve procedure, moguće je odrediti ne samo prisustvo ASCT2 ili konzerviranih varijanti ili peptidnih fragmenata, već takođe njegovu distribuciju u ispitanom tkivu. Koristeći predmetni pronalazak, osobe uobičajene stručnosti će lako primetiti da bilo koja od širokog raspona histoloških metoda (kao što su procedure bojenja) može biti modifikovana da bi se postigla takva in situ detekcija.
[0160] Aktivnost vezivanja datog skupa molekula koji vezuje ASCT2 može biti određena prema dobro poznatim metodama. Stručnjaci će moći da odrede operativne i optimalne uslove za test za svaku determinaciju upotrebom rutinskih eksperimenata.
[0161] Metode i reagensi odgovarajući za determinisanje karakteristika vezivanja izolovanog molekula koji vezuje ASCT2 su poznati u struci i/ili su komercijalno dostupni. Oprema i softver dizajniran za takve kinetičke analize su komercijalno dostupni (npr. BIAcore®, BIAevaluation® softver, GE Healthcare; KINEXA® softver, Sapidyne Instruments).
4
[0162] Primena predmetnog pronalaska će koristiti, ako nije drugačije naznačeno, uobičajene tehnike ćelijske biologije, ćelijskog uzgajanja, molekularne biologije, transgene biologije, mikrobiologije, rekombinantne DNK i imunologije, koje su pokrivene znanjima u struci. Takve tehnike su u potpunosti objašnjene u literaturi. Pogledajte, na primer, Sambrook i sar. urednik (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2. izd.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook i sar., urednik (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover urednik, (1985) DNA Cloning, svezak I i II; Gait, urednik (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis i sar. U.S. Pat. br.4,683,195; Hames i Higgins, urednici (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames i Higgins, urednici (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller i Calos urednici (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu i sar., urednici, Methods In Enzymology, svezak 154 i 155; Mayer i Walker, urednici (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London); Weir i Blackwell, urednici, (1986) Handbook Of Experimental Immunology, svezak I–IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); i u publikaciji Ausubel i sar. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.).
[0163] Opšti principi konstruisanja antitela su dati u Borrebaeck, urednik (1995) Antibody Engineering (2. izd.; Oxford Univ. Press). Opšti principi konstruisanja proteina su dati u Rickwood i sar., urednici (1995) Protein Engineering, A Practical Approach (IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, Eng.). Opšti principi antitela i vezivanja antitelo-hapten su dati u: Nisonoff (1984) Molecular Immunology (2. izd.; Sinauer Associates, Sunderland, Mass.); i Steward (1984) Antibodies, Their Structure and Function (Chapman and Hall, New York, N.Y.). Pored toga, standardni postupci u imunologiji poznati u struci koji nisu specifično opisani generalno se prate kao u Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Stites i sar., urednici (1994) Basic and Clinical Immunology (8. izd; Appleton & Lange, Norwalk, Conn.) i Mishell i Shiigi (urednici) (1980) Selected Methods in Cellular Immunology (W.H. Freeman and Co., NY).
[0164] Standardni referentni radovi koji postavljaju generalne principe imunologije uključuju Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Klein (1982) J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination (John Wiley & Sons, NY); Kennett i sar., urednici (1980) Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses (Plenum Press, NY); Campbell (1984) „Monoclonal Antibody Technology“ u Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, urednik Burden i sar. (Elsevere, Amsterdam); Goldsby i sar. urednici (2000) Kuby Immunnology (4. izd.; H. Freemand & Co.); Roitt i sar. (2001) Immunology (6. izd.; London: Mosby); Abbas i sar. (2005) Cellular and Molecular Immunology (5. izd.; Elsevier Health Sciences Division); Kontermann i Dubel (2001) Antibody Engineering (Springer Verlan); Sambrook i Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Lewin (2003) Genes VIII (Prentice Hall 2003); Harlow i Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Dieffenbach i Dveksler (2003) PCR Primer (Cold Spring Harbor Press).
PRIMERI
[0165] Sledeći primeri su dati kao ilustracija, i ne treba ih tumačiti kao ograničavajuće.
[0166] Otelotvorenja predmetnog pronalaska mogu biti dalje definisana putem referenciranja sledećih neograničavajućih primera, koji detaljno opisuju pripremu određenih antitela predmetnog pronalaska i metoda za korišćenje antitela predmetnog pronalaska. Biće očigledno stručnjacima da mnoge modifikacije, i materijala i metoda, mogu biti izvedene bez odstupanja od opsega predmetnog pronalaska.
Primer 1. Ekspresija ASCT2 u humanim normalnim i karcinomskim tkivima
Ekspresija ASCT2 proteina u normalnom i tumorskom tkivu analizirana putem IHC
[0167] Radi procene ekspresije proteina ASCT2, IHC je izveden u delovima iz normalnog humanog i humanih tumorskih tkiva fiksiranih formaldehidom. Nakon lečenja uzimanja antigena sa citratnim puferom (pH=6,0), tkiva su testirana anti-ASCT2 zečjim poloklonalnim antitelom (EMD Millipore, Billerica, MA; kat. br. ABN73), prateći protokol proizvođača. Optimizacija protokola izvedena je koristeći HT29 ćelijske linije kao pozitivne kontrole i primarne humane ćelije hepatocita kao negativne kontrole.
[0168] U normalnim tkivima, nije primećeno bojenje za ASCT2 na jetri, srcu, pneumocitima, glomerulima i mozgu.
Ekspresija ASCT2 u humanim tumorima
1
[0169] Ekspresija ASCT2 je procenjena putem IHC preko raznih karcinomskih tkiva. Snažna membranska ASCT2 ekspresija je primećena kod solidnih tumora uključujući karcinom kolona, karcinom skvamoznih ćelija pluća, karcinom glave i vrata i u hematološkim karcinomima kao što su AML, MM i DLBCL. Dodatno, visoka ASCT2 ekspresija je primećena u endometrijalnim karcinomskim tkivima jajnika i u tkivima melanoma. Niženavedena tabela 2 obezbeđuje sažetak ekspresije ASCT2 u humanim tkivima karcinoma.
Tabela 2
Ekspresija ASCT2 u humanim tumorima
2
[0170] Ekspresija ASCT2 je primećena u stem ćelijama karcinoma iz AML i MM. ASCT2 u stem ćelijama karcinoma je procenjena protočnom citometrijom korišćenjem ASCT2 antitela 17c10 konjugovanih sa fluoroforom Alexa 647. Ekspresija ASCT2 u AML i MM pacijenata je bila u osnovi viša nego u normalnoj kostnoj srži kao što je opisano na SLICI 1A. Korišćenjem protočne citometrije razvrstavanja različitih subpopulacija, kao što su CD38<+>, CD38-, CD34<+>; CD34-; CD38<+>i CD34<+>; i CD38<->i CD34-, ćelije su izolovane i osobine njihovih stem ćelija su dalje okarakterisane izvođenjem klonogenog testa na svakoj populaciji. Našli smo da samo CD38<+>, CD34<+>ćelije su formirale kolonije koje dalje doprinose otkriću opisanom u literaturi (Lapidot T i sar., Nature 1994; 367(6464):645-8; Bonnet D i sar. Nat Med 1997; 3(7):730-7.). ASCT2 ekspresija je procenjena u svim goreopisanim subpopulacijama. SLIKA 1B opisuje visoku ekspresiju ASCT2 u leukemijskoj stem ćelijskoj populaciji, naime CD38<+>, CD34<+>populacija AML uzoraka pacijenta. Na taj način, ekspresija ASCT2 je takođe visoka u gomili ili neleukemijskoj populaciji stem ćelija u AML kao što je opisano na SLICI 1C. Štaviše, ekspresija ASCT2 je takođe procenjena u CD138+, CD19- (plazma ćelije) i CD138-, CD19+ (stem ćelije) ćelijama MM tumora. Histogrami na SLICI 1C sugerišu visoku ASCT2 ekspresiju u plazma ćelijama u poređenju sa stem ćelijama MM. Podaci koji podržavaju ekspresiju ASCT2 su primećeni u kostnoj srži iz AML i MM uzorcima pacijenta u poređenju sa kostnom srži normalnog donora. Štaviše, ASCT2 je visoko prekomerno eksprimovan u stem ćelijama leukemije (LSC) (CD34<+>/CD38<+>) uzoraka AML pacijenata. Štaviše, CD138<+>, CD19-takođe definisane kao MM plazma ćelije pokazuju visoku ekspresiju ASCT2 u poređenju sa populacijom stem ćelija (CD138-, CD19<+>).
[0171] Ekspresija ASCT2 je takođe primećena u stem ćelijama karcinoma iz tumora pankreasa. Fragmenti solidnog tumora pankreasa su bili digestirani kolagenom III i suspenzija pojedinačne ćelije je napravljena. Odvojene ćelije su obojene sa antitelom protiv proteina ćelijske površine, EpCAM, CD44, CD24 i sa ASCT2 antitelom ranije opisanim. Potpisi proteina ćelijske površine za stem ćelije karcinoma pankreasa su dobro okarakterisani. EpCAM<+>CD44<+>CD24<+>ćelije su definisane kao stem ćelije karcinoma u tumorima pankreasa (Li, C i sar. Cancer Res. 2007;67:1030-1037). Primer ASCT2 ekspresije u CSC populaciji (EpCAM+, CD44+, CD24+) je opisan na SLICI 1D. Koristeći istu strategiju, ekspresija ASCT2 je procenjena u populacijama stem ćelija karcinoma tumora pankreasa nakon pojedinačne doze tretmana sa ASCT2-PBD ADC ili izotipa kontrole ADC. SLIKA 1E prikazuje da ASCT2- PBD ADC vrši ablaciju populacija stem ćelija karcinoma. Podaci ovde prikazuju da bi ciljanje ASCT2 ne samo kod solidnih tumora, nego takođe i hematoloških karcinoma i stem ćelija karcinoma bilo efikasno.
Primer 2. Generacija anti-ASCT2 antitela
Imunizacija i generacija hibridoma
4
[0172] Antitela ASCT2 su stvorena putem DNK imunizacije (Chowdhury i sar., J. Immunol. Methods 249:147, 2001) plazmida koji nosi humani ASCT2 gen. Gen za humani ASCT2 je kloniran za ekspresiju plazmida pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA). VelocImmune II miševi (Regeneron, Tarrytown, NY) stari osam nedelja su intradermalno injektovani u bazu repa svake druge nedelje sa 100 µg plazmida koji eksprimuje ASCT2 na 1 mg/ml u PBS. Testovi krvarenja su skupljeni u intervalima od 2 nedelje počevši na 28. dan nakon prve injekcije i ispitani testom za antitela specifična za ASCT2 putem protočne citometrije. Serijska razblaženja testa krvarenja su inkubirana sa 293F ćelijama koje eksprimiraju bilo ASCT2 ili beznačajni protein ćelijske površine. Na 56. i 70. dan, miševi sa najvišim specifičnim titrima su žrtvovani. Limfociti iz limfnih čvorova su izolovani i spojeni sa ćelijskom linijom mijeloma P3x/63Ag8.653 u odnosu 1:1 nakon metode spajanja polietilen glikola (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). Spojene ćelije su izabrane u mediju za rast hibridoma koji sadži hipoksantin aminopterin timidin (HAT).
Skrining test protočne citometrije
[0173] Supernatanti hibridoma su procenjeni za vezivanje sa HEK 293F ćelijama koje eksprimiraju ASCT2. Supernatanti za koje je otkriveno da specifično vezuju HEK 293F ćelije koje eksprimuju ASCT2 putem protočne citometrije su dalje potvrđeni za ASCT2 specifično vezivanje putem bojenja protočne citometrije sa panelom ćelijskih linija karcinoma koje eksprimiraju ASCT2. Na kraju, potvrđeni supernatanti su pretvoreni u humani IgG1 za dalju procenu vezivanja.
Kloniranje i ekspresija humanog anti-ASCT2 IgG mAt i Fab
[0174] Hibridomi su subklonirani ograničenjem razblaženja. Supernatanti afiniteta proteina A prečišćenih IgG subklonova su ispitani za antitela specifična za ASCT2 putem protočne citometrije kao što je gore pomenuto za roditeljske hibridome. mRNK subkloniranih hibridoma su izolovani korišćenjem kompleta Dynabeads mRNK Direct Kit (Invitrogen). Prvi niz cDNK je sintetisan korišćenjem SuperScript III reverzne transkriptaze (Invitrogen) i nasumičnih heksamer prajmera. Humani Ig VL i VH geni su pojačani putem PCR sa setom Novagen® degenerativnih Ig-prajmera (EMD Millipore, kataloški br. 69830). PCR pojačani VL i VH proizvodi su klonirani u plazmid pCR2.1-TOPO (Invitrogen) i sekvencionirani. VH i VL geni iz svakog hibridoma su ponovo pojačani putem PCR, dodajući mesta restriktivnih enzima za kloniranje do humanog IgGkapa pOE vektora, gde je VL kloniran na BssHII/BsiWI mestu spojenom sa humanim c-kapa, a VH je kloniran u BsrGI/SalI mestu spojenom sa humanim IgG-1 konstantnim regionom teškog lanca (ili CH1 regiona za Fab generaciju). Rezultujući pOE plazmidi su verifikovani putem DNK sekvencioniranja.
[0175] Anti-ASCT2 antitela su prolazno eksprimovana bilo u Hek293F (Invitrogen) ili CHO-G22 ćelijama. Za ekspresiju u Hek293F ćelijama, transfekcija je izvedena korišćenjem 293 fectin™ (Invitrogen; kat. br.12347-019) prema protokolu proizvođača. Ćelije su kultivisane u FreeStyle™ 293 medijumu za ekspresiju (Invitrogen; kat. br. 12338-018), i volumen kultivisanja je dupliran trećeg i šestog dana nakon infekcije. Transfektirane Hek293F ćelije su kultivisane tokom ukupno jedanaest dana. Za ekspresiju u CHO-G22 ćelija, ćelije su transfektirane korišćenjem linearnog polietilenamina (Polysciences, Warrington, PA) od 25 kDa korišćenjem protokola proizvođača. Ćelije su kultivisane u CD CHO medijumu (Invitrogen) i hranjene svaki drugi dan domaćom ishranom. Transfektirane CHO-G22 ćelije su kultivisane tokom ukupno dvanaest dana.
[0176] Nakon što su humani IgG pune dužine izolovani putem hromatografije proteina A, vezivanje je ponovo procenjeno putem protočne citometrije. SLIKA 2 opisuje stubičasti dijagram koji prikazuje stepen promene u vezivanju izolovanog humanog IgG 1e8, 3f7, 5a2, 9b3, 10c3, 16b8, 17c10 i 17a10, sa ćelijama koje eksprimiraju humani ASCT2 u poređenju sa lažno transfektiranim ćelijama. Kao što se vidi na slici, za nekoliko humanih IgG pune dužine je utvrđeno da održavaju aktivnost ASCT2 vezivanja.
Primer 3. Antitela koja vezuju ASCT2 kao konjugati antitelo-lek (ADC)
Procena citotoksičnosti posredovane ADC antitela koje vezuju ASCT2
[0177] Kako bi se potvrdilo unošenje roditeljskih antitela i kako bi se predvidelo da li oni mogu da isporuče citotoksični skup, roditeljska antitela su testirana u internalizacionom testu Hum-ZAP antitela (Advanced Targeting Systems, San Diego, CA) prema uputstvima proizvođača. Ukratko, ASCT2-pozitivne WiDr ćelije su zasejane u medijumu za kultivisanje sa gustinom od 1000 ćelija po bunarčiću ploča tkiva tretiranih kulturom sa 96 bunarčića i ostavljene da se prilepe tokom noći na 37 °C / 5% CO2. Radi pripreme test primeraka, svako roditeljsko antitelo je inkubirano sa sekundarnim antitelom (kozji anti-humani IgG) konjugovanim sa proteinom koji inaktivira ribozom, saporinom, na 30 minuta na sobnoj temperaturi da se formira sekundarni konjugat. Serijska razblaženja ovog sekundarnog konjugata su potom pripremljena i dodata bunarčićima koji sadrže ćelije.
[0178] Nakon inkubacije na 37 °C / 5% CO2tokom 72 sata, korišćen je esej CellTiter-Glo® Luminescent Viability Assay (Promega, Madison, WI) za određivanje relativne citotoksičnosti. Ukratko, CellTiter-Glo® reagens je dodat u svaki bunarčić i omogućena je njegova inkubacija tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi uz blago mešanje. Apsorpcija svakog uzorka je pročitana na 560 nM korišćenjem Perkin Elmer EnVision® luminometra. Relativna stopa proliferacije (%) ćelija tretiranih sa roditeljskim antitelima 1E8 ili 17C10, anti-ASCT2 hemijski vezan za saporin (hIgG-saporin), ili izotipska kontrola hemijski povezana sa saporinom je upoređena sa onom relativnom vijabilnošću netretiranih kontrolnih ćelija. Kao što je prikazano na SLICI 3A, relativna stopa proliferacije ćelija je bila niža u ćelijama tretiranim sa anti-ASCT2 antitelima koja nisu hemijski povezana sa saporinom nego u onim ćelijama tretiranim sa antitelima konjugovanim sa saporinom.
Procena citotoksičnosti posredovane ADC klasično konjugovanih anti-ASCT2 antitela sa tubulizin skupom
[0179] Da bi se potvrdilo ubijanje posredovano ADC od strane anti-ASCT2 antitela konjugovanih sa tubulizin skupom, vodeća antitela 1E8 i 17C10 su direktno konjugovana sa toksinom tubulizin klase i citotoksično ubijanje sa konjugovanim antitelima je testirano na ćelijama karcinoma kolona pozitivnim na ASCT2. Ukratko, SW48 ćelije su zasejane u medijumu za kultivisanje sa gustinom od 1000 ćelija po bunarčiću ploča tkiva tretiranih kulturom sa 96 bunarčića i ostavljene da se prilepe tokom noći na 37 °C / 5% CO2. Radi pripreme test primeraka, svako antitelo (ASCT2 vodiči 1E8 i 17C10 i kontrola izotipa) konjugovano sa tubulizin skupom je serijski razblaženo i dodato u odgovarajuće bunarčiće. Nakon inkubacije na 37 °C / 5% CO2 tokom 72 sata, korišćen je esej CellTiter-Glo® Luminescent Viability Assay da se odredi relativna citotoksičnost, kao što je goreopisano.
[0180] Procenat ćelijske vijabilnosti je izračunat korišćenjem sledeće formule: (prosečna luminiscencija nanizanih uzoraka/prosečna luminiscencija kontrolnih uzoraka) x100. IC50vrednosti su određene korišćenjem logističke nelinearne regresione analize sa GraphPad Prism softverom. SLIKA 3B prikazuje grafik citotoksičnosti anti-ASCT2 1 E8, anti-ASCT217C10 i kontrolu izotipa R347 klasično konjugovanog sa tubulozinom AZ1508. Slika prikazuje da oba anti-ASCT2 antitela imaju sličnu citotoksičnost. Izračunate IC50vrednosti su prikazane u niženavedenoj tabeli 3.
Tabela 3
Citotoksično ubijanje posredovano ADC od strane ASCT2 vodećih antitela
Kloniranje mutacija cisteina za konjugaciju specifičnu za mesto
[0181] Standardno prepokrivajuće PCR metode su korišćene da se uvede cisteinski ostatak između aminokiselina S239 i V240 u CH2 regionu anti-ASCT2 antitela 1E8 i 17C10. Ovaj cistein, označen kao „239 umetak“ ili „239i“ će služiti kao mesto konjugacije za citotoksične lekove u pripremi anti-ASCT2 ADC antitela. Aminokiselinska sekvenca kičme teškog lanca koja obuhvata Maia umetak je prikazana na SEQ ID NO: 9. Antitela koja sadrže uneti cistein su konjugovana sa tubulizin skupom (tubulizin AZ1508) ili sa skupom pirolobenzodiazepina (PBD) (SG3249 ili SG3315), suštinski kao što je niže opisano.
Konjugacija lekova koji sadrže maleimid
[0182] Svi sastojci procenjeni za skupove ADC (AZ1508, SG3249, SG3315) sadrže veznik i malemid grupu koja se lako konjuguje sa tiol ostatkom antitela, formirajući tiol-malemid vezu. Citotoksini koji sadrže malemidnu grupu (npr. tubulizin 1508) mogu biti konjugovani sa specifičnim ostacima cisteina ubačenih inženjeringom u anti-ASCT2 antitela pronalaska (npr.
17c10, 1e8). Alternativno ili opciono, mogu se koristiti klasični metodi konjugacije da se prikači citotoksični agens na opisana antitela. Metode za konjugaciju citotoksina sa nativnim lizinom i ostacima cisteina na antitela su dobro poznate u struci. Reprezentativne metode za konjugaciju specifičnu za mesto (na ostacima cisteina obrađenih inženjeringom) i klasičnu konjugaciju (na nativnim ostacima cisteina) su dole opisane.
[0183] Reprezentativni proces konjugacije antitelo-lek specifičan za mesto uključuje korake (a) otvaranja bočnih lanaca derivatibilnih aminokiselina (npr. cisteina), (b) oksidacije, (c) konjugovanja skupa (npr. citotoksični agens kao što je tubulizin 1508) i (d) poliranja uklanjanjem reagenasa konjugacije i nereaktivnog skupa. Na primer, konjugacija sa inženjeringom obrađenim cisteinom može biti sprovedena formulacijom antitela u 1X PBS sa 1 mM etilendiamintetraacetičnom kiselinom (EDTA). Blaga redukcija se koristi da se stvore slobodni tioli dodavanjem četrdeset ekvivalenata tri(2-karboksietil)fosfin hidrohlorida po antitelu i inkubacijom na 37 °C tokom tri sata. Tri sukcesivne dijalize u 1X PBS sa 1mM EDTA su upotrebljene da se ukloni tri(2-karboksietil)fosfin hidrohlorid. Alternativno, desalinirane kolone mogu biti upotrebljene da se ukloni tri(2-karboksietil)fosfin hidrohlorid. Međulančane disulfidne veze antitela su puštene da se ponovo formiraju dodavanjem oko 20 ekvivalenata dehidroabietične kiseline (dhAA) i inkubacijom od oko četiri sata na sobnoj temperaturi.
[0184] U pripremi za konjugaciju, dimetilsulfoksid je dodat anti-ASCT2 antitelu do deset procenata v/v. Osam ili dvanaest ekvivalenata skupa tubulizin 1508 (za 2T odnosno 4T punjenje leka) je dodato u dimetil sulfoksid i mešavina je inkubirana na sobnoj temperaturi tokom oko 1 sata. Alternativno, inkubacija može da se izvede na 4 °C tokom 16 sati. Reakcija je ugašena dodavanjem oko 4 molarna ekvivalenta N-aktil cisteina (NAC) po skupu (tj.32 ili 48). Slobodan skup je uklonjen od konjugovanog antitela upotrebom keramičkog hidroksiapatita prateći uputstva proizvođača. Po želji, krajnji proizvod može biti izložen izmeni pufera. Kako bi se potvrdila čistoća i konjugacija sa teškim lancem, konjugovana antitela mogu biti analizirana bilo kojom metodom poznatom u struci. U nekim slučajevima, neredukujući i redukujući SDS-PAGE mogu biti upotrebljeni da se potvrdi čistoća i konjugacija sa teškim lancem.
[0185] ADC sa lekovima nasumično konjugovanim sa nativnim ostacima cisteina se pripremaju parcijalnom redukcijom antitela praćenom reakcijom sa željenim linker lekom. Antitelo koncentracije 5 mg/ml se delimično redukuje dodavanjem oko 3 molarna ekvivalenta DTT na pH 8,0, praćeno inkubacijom na oko 37 °C tokom oko 2 sata. Reakcija redukcije se potom hladi u ledu i višak DTT se uklanja, na primer, dijafiltracijom. Lek linker se potom dodaje u lek linker/tiol molarnom odnosu od oko 1:10. Reakcija konjugacije se sprovodi u prisustvu ∼10% v/v DMSO. Nakon konjugacije, višak slobodnog cisteina (oko 2 puta molarnog odnosa preko linker leka) se dodaje da ugasi nereagovali linker lek radi proizvodnje dodatka cistein linker lek. Reakciona mešavina se prečišćava (npr. hromatografijom hidrofobnom interakcijom) i izlaže se puferskoj izmeni u PBS. Distribucija mase leka je određena upotrebom standardnih metoda, kao što je hromatografija hidrofobnom interakcijom i redukovanom hromatografijom reverzne faze.
Primer 4. Karakterizacija mAt i ADC koji vezuju ASCT2
ASCT2 specifično vezivanje ASCT2 antitela kod ćelija kolorektalnog karcinoma
[0186] Kako bi se odredilo da li je vezivanje određenih klonova hibridoma bilo specifično za ASCT2 antigen, vezivanje je procenjeno nakon shRNK nagiba ASCT2 ekspresije. Ukratko, WiDr ćelije su transdukovane sa lentivirusom koji eksprimira ASCT2 shRNK ili neciljanu shRNK (NTshRNK). Vezivanje dva anti-ASCT2 klona hibridoma 17c10 i 1e8 je procenjeno 72 sata nakon infekcije. Kao što se vidi na SLICI 4, obaranje ASCT2 ekspresije značajno umanjuje vezivanje odgovarajućih klonova i dalje potvrđuje vezivanje specifično za antigen ASCT2 mAt 17c10 i 1e8.
Kinetika internalizacije anti-ASCT2 nekonjugovanog antitela
[0187] Internalizacija antitela nakon vezivanja sa ciljnim antigenom je preduslov postizanja željenog ADC efekta. Stoga, karakteristike internalizacije ASCT2 antitela su ispitane. WiDr ćelije su inkubirane sa anti-ASCT2 antitelom 17c10 konjugovanim sa Alexa 488 (17c10-Alexa 488) tokom različitih vremenskih perioda. Ćelije su potom oprane i inkubirane sa ili bez anti-Alexa 488 antitela tokom 45 minuta na ledu da se ugase signali površine ćelije. Intenziteti fluorescencije ukupnog signala i ugašeni signal (koji predstavlja internalizovano antitelo) su izmereni analizom protočnom citometrijom. Kao što se vidi na SLICI 5A, anti-ASCT2 antitelo 17c10 je pokazalo povećanu internalizaciju u vremenu u poređenju sa izotipskim kontrolnim antitelom, koje nije pokazalo internalizaciju.
Kinetika internalizacije ASCT2-ADC (17c10AZ1508) izmerena citotoksičnim ubijanjem
[0188] Ćelije su pulsirane sa anti-ASCT2 antitelom konjugovanim sa tubulizinom AZ1508 (17C10-AZ1508) tokom različitih perioda vremena. Nakon toga, ADC koji obuhvata medijum je zamenjen svežim medijumom i ćelije dalje inkubirane tokom 4 dana. Vijabilitet ćelije je meren korišćenjem CTG kompleta. Krive doznog odgovora su nacrtane kao procenat netretiranih kontrolnih ćelija i reprezentativni grafik je prikazan na SLICI 5B. IC50vrednosti su izračunate kako je napred opisano i rezultati su sumirani u niženavedenoj tabeli 4.
Tabela 4
Određivanje afiniteta (vezivanje 17c10 i 1e8 za ćelijske linije koje eksprimiraju ASCT2)
[0189] Humane ćelijske linije, ćelijske linije makaki majmuna i CHO izvedene ćelijske linije koje eksprimiraju ASCT2 korišćene su za procenjen afinitet vezivanja i unakrsnu reaktivnost antitela specifičnih za ASCT2. Očigledni afiniteti su izmereni titriranjem fluoroforom označenih antitela. Reprezentativni rezultati su sumirani u niženavedenoj tabeli 6 i prikazani na SLICI 6.
[0190] SLIKA 6 prikazuje grafike protočne citometrije koji su rezultat vezivanja anti-ASCT2 antitela 17c10 i 1e8 i kontrolnog izotipa R347 sa ćelijskim linijama koje eksprimuju ASCT2. Rezultati za humanu ćelijsku liniju karcinoma Cal27 su prikazani na SLICI 6A; rezultati za humanu ćelijsku liniju karcinoma FaDu su prikazani na SLICI 6B; rezultati za humanu ćelijsku liniju karcinoma SSC15 su prikazani na SLICI 6C; rezultati za humanu ćelijsku liniju karcinoma WiDr su prikazani na SLICI 6D; rezultati za CHOK1 ćelije koje stabilno eksprimiraju humani ASCT2 su prikazani na SLICI 6E; rezultati za CHOK1 ćelije koje stabilno eksprimiraju makaki ASCT2 su prikazani na SLICI 6F); rezultati za makaki ćelijsku liniju karcinoma CynoMK1 su prikazani na SLICI 6G; i rezultati za lažno transfektovane CHOK1 ćelije su prikazani na SLICI 6H. EC50vrednosti za 17c10 i 1e8 koje se vezuju za ćelijske linije koje eksprimiraju ASCT2 su prikazane u dolenavedenoj tabeli 5.
Tabela 5
1
Specifičnost 17c10 antitela za ASCT2 antigen
[0191] Anti-ASCT2 antitelo 17c10 nema afinitet za ASCT1 (SLC1A4), drugog člana SLC1A familije. Utišavanje ASCT1 ekspresije putem shRNK ne umanjuje vezivanje specifično za ASCT2 17c10 u SKMEL-2 ćelijama kao što se vidi na grafiku prikazanom na SLICI 7A.
Efikasnost obaranja shRNK je dalje potvrđena western blot analizom. Štaviše, nikakva promena nije primećena u profilu citotoksičnosti ćelija u kojima je ekspresija ASCT1 utišana odgovarajućim shRNK kao što se vidi na grafiku na SLICI 7B. Rezultati su sumirani u niženavedenoj tabeli 6.
Tabela 6
Ukrštena reaktivnost i citotoksičnost ASCT2-ADC antitela na cyno ASCT2
[0192] Anti-ASCT2-vezujući klonovi 17c10 i 1e8 konjugovani sa tubulizinom AZ1508 su procenjeni na vezivanje sa makaki ASCT2 stabilno eksprimiranim u CHOK1 ćelijama, humanim ASCT2 stabilno eksprimiran u CHOK1 ćelijama i kontrolnim molekulima eksprimiranim u CHOK1 ćelijama. ASCT2 antitelo 17c10 (SLIKA 8A) i ASCT2 antitelo 1e8
2
(SLIKA 8B), kada se konjuguje sa skupom tubulizina 1508, pokazuje potentnu citotoksičnu aktivnost u CHOK1 ćelijama koje eksprimiraju humani i makaki ASCT2, ali ne u netransfektiranim CHOK1 ili CHOK1-ABCB5. Ove vrednosti su sumirane u niženavedenoj tabeli 7.
Tabela 7
Germinacija 17c10
[0193] Aminokiselinske sekvence za VH i VL domene za 17c10 su poravnate sa poznatim germinativnim sekvencama u bazi podataka VBASE i najbliža germinativna linija je identifikovana putem sličnosti sekvenci. Za VH domen, ovo je bilo IgVh4-34<∗>01; za VL domen, to je bilo IgKv1-5<∗>03. Za 17c10, germinativni proces je uključivao vraćanje 1 okvirnog ostatka u VH domen i 5 ostataka u VL domen. U VH domenu, reverzna mutacija bila je na Kabat poziciji 82a, gde je treonin (T) vraćen u serin (S). U VL domenu, mutacije su bile na Kabat poziciji 13, 21, 39, 70 i 76, gde je na Kabat poziciji 13 treonin (T) pretvoren u alanin (A); na Kabat poziciji 21 leucin (L) je pretvoren u izoleucin (I); na Kabat poziciji 39 asparagin (N) je pretvoren u lizin (K); na Kabat poziciji 70 aspartat (D) je pretvoren u glutamat (E) i na Kabat poziciji 76 treonin (T) je pretvoren u serin (S). Ove promene su napravljene sintetisanjem VH i VL domena sa ovim mutacijama i zamenom postojećih VH i VL koristeći ograničenu digestiju i povezivanje. I germinativni i originalni (negerminativni) 17c10 su eksprimirani kao IgG i njihov afinitet za mnogobrojne ćelijske linije koje eksprimiraju ASCT2 je procenjen putem protočne citometrije. Kao što se vidi na SLIKAMA 9A do 9D, nije bilo razlike u vezivanju germinativne 17c10 ili roditeljske 17c10 za WiDr ćelije ili CHO ćelije koje eksprimiraju HuASCT2 ili CyASCT2.
Primer 5. Citotoksično ubijanje putem ASCT2-ADC u različitim karcinomima
[0194] 17c10 antitelo je konjugovana sa PBD (SG3315) ili tubulizin skupom (AZ1508) putem konjugacionog mesta specifičnog za mesto, kao što je napred opisano. Odnos lek-antitelo (DAR) je procenjen na oko 2,0 za svaki par. Citotoksični testovi su izvedeni koristeći ćelije karcinoma iz različitih indikacija kao što je karcinom pankreasa, karcinom kolona, karcinom pluća, skvamozni karcinom glave i vrata (HNSCC), karcinom prostate i ASCT2 negativan karcinom pluća. Kako što je prikazano na SLIKAMA 10A do 10 F, 17c10 ADC antitelo konjugovano sa AZ1508 je imalo višu citotoksičnu aktivnost od kontrolnog antitela vezanog za tubulizin. Anti-ASCT2 antitelo 17c10 konjugovano sa SG3249 ili SG3315 takođe je imalo veću citotoksičnu aktivnost od kontrolnih antitela vezanih sa tubulizinom AZ1508 ili vezanih sa PBD SG3249 ili vezanih sa SG3315. Grafik koji prikazuje rezultate citotksičnih testova korišćenjem 17c10 konjugovanog sa SG3249 prikazani je na SLICI 11A, a grafik koji prikazuje rezultate citotksičnih testova korišćenjem 17c10 konjugovanog sa SG3315 prikazan je na SLICI 11B. IC50vrednosti su sumirane u niženavedenoj tabeli 8.
Tabela 8:
4
Primer 6. ASCT2-ADC inhibira rast tumora in vivo
[0195] Sve in vivo procedure su izvedene u saglasnosti sa institucionim vodičima u AAALAC-akreditovanom postrojenju i odobrene su od strane Odbora za institucionalnu negu i korišćenje životinja kompanije Medlmmune, LLC. Radi testiranja sposobnosti ASCT2-ADC antitela za ubijanje tumorskih ćelija, WiDr (100 µl/10<6>ćelija/mišu) ili primarni tumori pankreasa (PDX) su ubrizgani supkutano u desni bok ženskog golog miša starog 3–5 nedelja (Charles River Laboratories, Wilmington, MA). Miševi su čuvani tokom nekoliko nedelja da razviju tumore; kada su tumori dostigli oko 150–200 mm<3>, miševi su randomizovani i podeljeni u grupu za tretman (10 miševa/grupi). Potom, miševima su intravenski ubrizgane različite doze anti-ASCT2 ADC (17c10-Az1508 ili 17c10-SG3315 ili 17c10-SG3249) ili izotipska kontrola antitela konjugovanog sa lekom. Telesna težina i zapremina tumora tretiranog ksenograft miša su praćeni tokom odgovarajućih perioda vremena. Zapremina tumora je izračunata korišćenjem sledeće formule: (najkraći dijametar)<2>x (najduži dijametar) x 0,5, a rezultati su prikazani na SLIKAMA 12A, 12B i 12C.
[0196] Dodatno, in vivo efikasnost 17c10-SG3249 je procenjena na panelu modela hematoloških maligniteta koji predstavljaju različite subpopulacije koje eksprimiraju varirajuće nivoe ASCT2. ADC su primenjeni nedeljno u dozi od 0,4 mg/kg (ili 0,5 mg/kg) i 0,1 mg/kg do ukupno četiri doze u ksenograft modelima diseminovanih tumora. Kaplan-Meier krive prikazuju značajan porast koristi preživljavanja za 17c10-SG3249 kohorte u poređenju sa netretiranim ili izotip ADC kontrolama kao što je prikazano na SLIKAMA 13A i 13B.
Primena 17c10-SG3249 kod više AML ksenograft modela tumora je prikazala značajan porast u koristi preživljavanja u poređenju sa drugim kohortama kao što su SOC (standardna terapija), nelečena i sa izotipskom kontrolom ADC. U TF1a AML modelima, 17c10-SG3249 je pokazao superiornu aktivnost (srednje preživljavanje >205 dana) u poređenju sa izotipskom kontrolom ADC (66 dana). Slično tome, 17c10-SG3249 je demonstrirao robustnu inhibiciju rasta tumora i korist preživljavanja kod više MM1.S modela multiplog mijeloma (MM) (srednje preživljavanje 123,5 dana nasuprot 55,5 dana za netretirane kontrole). Rezultati za 17c10-SG3249 u više hematoloških maligniteta su sumirani u niženavedenoj tabeli 9.
Tabela 9: Srednje hematološko preživljavanje
Primer 7. Konjugovani hemijski ostaci anti-ASCT2 antitela za formiranje ADC
[0197] Metod prečišćavanja za anti-ASCT2 mAt je razvijen. Ukratko, sakupljena tečnost kulture ćelija je izložena koraku hvatanja proteina A izvedenom upotrebom MAbSelect Sure smole (GE Healthcare) da se uhvati protein iz supernatanta kulture ćelija i da se uklone nečistoće u vezi sa procesom i proizvodom. Svi procesni koraci su izvedeni pri linearnoj brzini protoka od 300 cm/h. Smola je uravnotežena sa 50 mM Tris, pH 7,4 i kondicioniranim medijumom je napunjena kolona do krajnjeg punjena smole od 30 g/l. Kolona je ponovo ekvilibrisana sa 50 mM Tris, pH 7,4 i potom izložena dvama koracima pranja optimizovanim da smanje nečistoće i umanje višak lakog lanca prisutnog u kondicioniranom medijumu. Prvi korak ispiranja se sastojao od 50 mM Tris, 500 mM natrijum hlorida pH 7, a drugo ispiranje je sadržalo 50 mM natrijum acetata, 500 mM natrijum hlorida, pH 5,0. Kolona je potom ponovo ekvilibrisana sa 50 mM Tris, pH 7,4, a proizvod je obložen sa 25 mM natrijum acetata, pH 3,6. Proizvod je skupljen od 0,5 OD na rastućoj strani vrha oblaganja do 0,5 OD na opadajućoj strani. Nakon svakog ciklusa prečišćavanja, kolona je oljuštena sa 100 mM acetatne kiseline i potom ponovo ekvilibrisana sa 50 mM Tris, pH 7,4, očišćena pomoću 0,1 N natrijum hidroksida i čuvana u 2% (v/v) benzil alkohola, 100 mM natrijum acetata, pH 5,0. Tipičan prinos za ovaj korak je 70–75%.
[0198] Tretiranje niskim pH je izvedeno zbog virusne inaktivacije. Ukratko, MAbSelect Sure proizvod je prilagođen na ciljani pH 3,5 dodavanjem 1 M sirćetne kiseline. Nakon vremena čekanja od 60 minuta, rastvor je neutralizovan dodatkom 1M Tris do ciljnog pH 7,4. Proizvod je sledstveno filtriran.
[0199] Kao intermedijarni korak prečišćavanja, hromatografija mešanog moda je izvedena upotrebom smole Capto Adhere smola (GE Healthcare). Ova kolona je izvedena u modu protoka: Kolona je ekvilibrisana sa 50mM Tris, pH 7,4 i neutralizovani rastvor proteina je dodat na kolonu. Nečistoće se vezuju za smolu, dok se proizvod prikuplja tokom protoka kroz bazen. Tipični prinos koraka je bio 80–84%.
[0200] Korak za poliranje je izveden upotrebom smole za katjonsku izmenu HS 50 (POROS). Ovaj korak je izveden u modu vezivanja-oblaganja i služi da dalje umanji nečistoće u vezi sa procesom. Kolona je ekvilibrisana sa 50 mM Tris, pH 7,4 i proizvod koraka mešovitog moda hromatografije je postavljen u kolonu. Kolona je sledstveno isprana sa 50 mM Tris, pH 7,4, potom sa 50mM Tris, 150 mM natrijum hlorida, pH 7,4, a onda obložena sa 50 mM Tris, 400 mM natrijum hlorida, pH 7,4. Proizvod je skupljen od 0,5 OD na rastućoj strani vrha oblaganja do 0,5 OD na opadajućoj strani. Nakon svakog ciklusa prečišćavanja, kolona je oljuštena upotrebom 50 mM Tris, 500 mM natrijum hlorida, pH 7,4, očišćena sa 1N natrijum hidroksida i čuvana u 0,1 N NaOH. Tipičan prinos za ovaj korak je bio 95–98%.
[0201] Prečišćeni intermedijarni proizvod mAt je koncentrovan upotrebom Pellicon 3 Ultracel membrane sa 30 kDa granicom molekularne težine (MWCO) i prenet na formulacioni pufer (20 mM histidin, 240 mM sukroza pH 6,0) dijafiltracijom. Koncentracija krajnjeg proizvoda je bila oko 20 mg/ml. Ako je bilo potrebno, protein je čuvan smrznut na -80 °C do konjugacije. Niženavedena tabela 10 sumira kvalitet proizvoda tokom procesa prečišćavanja monoklonskog antitela.
Tabela 10
Konjugacija anti-ASCT2 antitela sa tubulizinom AZ1508
[0202] Konjugat antitelo-lek je pripremljen konjugacijom tubulizina (AZ1508) usmerenim ka mestu dva slobodna ostatka cisteina obrađenih inženjeringom putem hemije melamida.
[0203] Prečišćeni mAt intermedijerni proizvod je otopljen i pH je prilagođen na pH 7,0 dodavanjem 1 M Tris baze. Proteinski rastvor je razblažen do finalne koncentracije od 7,5 mg/ml sa 20 mM histidinskog pufera, pH 7,0 i EDTA dodatog u finalnu koncentraciju od 1 mM. Protein je prenet u odgovarajući sud za reakciju, a temperatura podešena na 37 °C. Redukujući agens tri(2-karboksietil)fosfin (TCEP) je dodat iz sveže pripremljene 50 mM zalihe rastvora u molarnom odnosu TCEP:mAt = 30:1. Rastvor je inkubiran uz blago mešanje na 37 °C tokom 3 sata. Nakon ovog vremena inkubacije, redukujući agens je uklonjen dijalizom ili dijafiltracijom protiv 20 mM histidina/1 mM EDTA pufera, pH 7,0. Dobijeni proizvod je filtriran kroz filter od 0,22 µm. Za oksidaciju, rastvor proteina je inkubiran sa dehidroaskorbinskom kiselinom (DHA) u molarnom odnosu 10:1 (DHA:mAt). Inkubacija je izvedena na 22–25 °C tokom 4 sata uz blago mešanje (pri brzini mešanja od 50 o/min). Nakon ovog vremena, skup tubulizina (AZ1508) je dodat iz 10 mM zalihe rastvora u DMSO pri molarnom odnosu od skup:mAt 8:1. Dodatni DMSO je dodat ukapavanjem da se dobije krajnja koncentracija od 10% (v/v). Mešavina je inkubirana tokom 1 sata na 22–25 °C uz blago mešanje da se omogući formiranje konjugata antitelo-lek. Reakcija je prekinuta dodavanjem N-acetilcisteina (NAC) iz 100 mM količine rastvora u molarnom odnosu NAC:tubulizin od 5:1.
[0204] Da bi se uklonili proteinski fragmenti, agregati i višak slobodnog skupa tubulizina, prečišćavanje nakon konjugacije je izvedeno upotrebom keramičkog hidroksiapatita (CHT) tip I (Biorad). Kolona je izvedena u modu vezivanja-oblaganja pri linearnoj stopi protoka od 180 cm/h. Prekinutoj mešavini konjugata antitelo-lek, dodat je natrijum fosfat u finalnoj koncentraciji od 10 mM od 300 mM zalihe rastvora. CHT kolona je prethodno ekvilibrisana sa 300 mM natrijum fosfata, pH 6,5, i ekvilibrisana sa 10 mM natrijum fosfata, pH 6,5. Mešavina konjugata antitelo-lek je napunjena do krajnjeg punjenja od 20 g/l, a kolona je ponovo ekvilibrisana sa 10 mM natrijum fosfata, pH 6,5. Oblaganje je izvedeno sa linearnim gradijentom do 1M natrijum hlorida u 10 mM natrijum fosfata, pH 6,5, preko 10 zapremina kolone. Vrh oblaganja je frakcioniran i frakcije su analizirane putem HP SEC. Frakcije koje sadrže konjugovani protein sa monomernom čistoćom >95% su sakupljene. Nakon svakog ciklusa prečišćavanja, kolona je oljuštena sa 300 mM natrijum fosfata, pH 6,5, očišćena sa 1N natrijum hidroksida i čuvana u 0,1 N NaOH.
[0205] Skupljeni konjugat antitelo-lek (ADC) je koncentrisan i izmenjen u krajnju formulaciju pufera pomoću tangencijalne protočne filtracije upotrebom bilo regenerisane celuloze ili PES membrana sa 30 kDa MWCO. Ekscipijens PS80 je imao skok iz količine rastvora od 10%. Krajnja ADC koncentracija je bila 5 mg/ml u 20 mM histidina, 240 mM sukroze, 0,02% PS80, pH 6,0. Pod ovim uslovima, stvoreni ADC prikazivao je <12% nekonjugovanog teškog lanca, 75 to 82% monokonjugovanog teškog lanca i odnos leka prema antitelu od 1,8-1,9.
Konjugacija anti-ASCT2 antitela sa pirolobenzodiazepinom (PBD) SG3249
[0206] Konjugat antitelo-lek je pripremljen konjugacijom PBD (SG3249) usmerenim ka mestu dva slobodna ostatka cisteina obrađenih inženjeringom putem hemije melamida. Sekvenca procesa je ista kao ona navedena za konjugaciju tubulizina iznetu prethodno, iako se tačne okolnosti razlikuju.
[0207] Prečišćeni mAt intermedijerni proizvod je otopljen i pH je prilagođen na pH 7,0 dodavanjem 1 M Tris baze. Redukcija, oksidacija i koraci konjugacije za PBD konjugat su izvedeni pri koncentraciji proteina od 20 mg/ml u 20 mM histidina, 1 mM EDTA, pH 7,0. Protein je prenet u odgovarajući sud za reakciju, a temperatura podešena na 37 °C. Redukujući agens ditiotreitol (DTT) je dodat iz sveže pripremljenog 50 mM zalihe rastvora u molarnom odnosu DTT:mAt = 30:1. Rastvor je inkubiran uz blago mešanje na 37 °C tokom 1 sata. Nakon ovog vremena inkubacije, redukujući agens je uklonjen dijalizom ili dijafiltracijom protiv 20 mM histidina/1 mM EDTA pufera, pH 7,0. Dobijeni proizvod je filtriran kroz filter od 0,22 µm. Za oksidaciju, rastvor proteina je inkubiran sa dehidroaskorbinskom kiselinom (DHA) u molarnom odnosu 10:1 (DHA:mAt). Inkubacija je izvedena na 22–25 °C tokom 1 sata uz blago mešanje (pri brzini mešanja od 50 o/min). Nakon ovog vremena, skup PBD (SG3249) je dodat iz 10 mM zalihe rastvora u DMSO pri molarnom odnosu skup:mAt od 8,5:1. Dodatni DMSO nije dodat ovoj reakciji, efektivna DMSO koncentracija usled DHA i dodatak skupa je bio oko 11,4%. Mešavina je inkubirana tokom 1 sata na 22–25 °C uz blago mešanje da se omogući formiranje konjugata antitelo-lek. Reakcija je prekinuta dodavanjem N-acetilcisteina (NAC) iz 100 mM količine rastvora u molarnom odnosu NAC:PBD od 4:1.
[0208] Da bi se uklonili proteinski fragmenti, agregati i višak slobodnog skupa PBD, prečišćavanje nakon konjugacije je izvedeno upotrebom keramičkog hidroksiapatita (CHT) tip I (BioRad). Kolona je izvedena u modu vezivanja-oblaganja pri linearnoj stopi protoka od 180 cm/h. pH mešavine prekinute reakcije antitelo-lek je prilagođen na pH 7,0 dodavanjem 1 M
Tris baze. CHT kolona je prethodno ekvilibrisana sa 300 mM natrijum fosfata, pH 6,5, i
ekvilibrisana sa 10 mM natrijum fosfata, pH 6,5. Mešavina konjugata antitelo-lek je napunjena
do krajnjeg punjenja od 20 g/l, a kolona je ponovo ekvilibrisana sa 10 mM natrijum fosfata,
pH 6,5. Vezani protein je potom ispran sa 10 mM natrijum fosfata, 25 mM natrijum kaprilata,
pH 6,5 da se ukloni višak slobodnog leka, praćeno ponovno ekvilibrisanjem sa 10 mM natrijum
fosfata, pH 6,5. Oblaganje je izvedeno sa linearnim gradijentom od 0,3 do 1M natrijum hlorida
u 10 mM natrijum fosfata, pH 6,5, preko 10 zapremina kolone. Vrh oblaganja je frakcioniran i
sve frakcije analizirane putem HP SEC. Frakcije koje sadrže konjugovani protein sa
monomernom čistoćom >95% su sakupljene. Nakon svakog ciklusa prečišćavanja, kolona je
oljuštena sa 2 M natrijum hlorida, očišćena sa 1N natrijum hidroksida i čuvana u 0,1 N natrijum
hidroksida.
[0209] ADC je koncentrisan i izmenjen u krajnju formulaciju pufera pomoću tangencijalne
protočne filtracije upotrebom bilo regenerisane celuloze ili PES membrana sa 30 kDa MWCO.
Ekscipijens PS80 je imao skok iz količine rastvora od 10%. Krajnja ADC koncentracija je bila
5 mg/ml u 20 mM histidina, 240 mM sukroze, 0,02% PS80, pH 6,0.
AMINOKISELINSKE SEKVENCE:
[0210]
Originalni 17C10 VH; SEQ ID NO: 1 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIHHSGG ANYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLTSVTAADTAVYYCARGQGKNWHYDYFDYW GQGTLVTVSSA
Originalni 1710 VL; SEQ ID NO: 2 DIQMTQSPSTLSTSVGDRVTLTCRASQSIRSWLAWYQQNPGKAPKLLIYKASILKIGV PSRFSGSGSGTDFTLTITSLQPDDFATYYCQQYYSYSRTFGQGTKVEIK
Originalni 1е8 VН; SEQ ID NO: 3 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIPQPPGKGVEWIGEINHSGS TNYNPSLKSRVTISSDTSKNQFSLKLTSVTAADTAVYYCARGQGKNWNYDYFDYW GQGTLVTVSSA
Originalni 1e8 VL; SEQ ID NO: 4
1
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTLTCRASQSIRSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLKSG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQYYSFSRTFGQGTKVEIK
Germinativni 17C10 VH; SEQ ID NO: 5 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIHHSGG ANYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGQGKNWHYDYFDYW GQGTLVTVSSA
Germinativni 17C10 VL; SEQ ID NO: 6 DIQMTQSPSTLSASYGDRYTITCRASQSIRSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASILKIGY PSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYYSYSRTFGQGTKVEIK
Germinativni 1е8 VH; SEQ ID NO: 7
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIHHSGS TNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGQGKNWNYDYFDYGQ GTLVTVSSA
Germinativni 1е8 VL; SEQ ID NO: 8 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIRSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLKSGV PSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYYSFSRTFGQGTKVEIK
Maia osnova teškog lanca (umetanje cisteina uokvireno i podebljano); SEQ ID NO: 9 STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEL LGGPSCVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
17c10 germinativni HCDR1 (Kabat numerisanje); SEQ ID NO: 10
GYYWS
17c10 germinativni HCDR2 (Kabat numerisanje); SEQ ID NO: 11
EIHHSGGANYNPSLKS
17c10 germinativni HCDR3 (Kabat numerisanje); SEQ ID NO: 12
GQGKNWHYDYFDY
2
17c10 germinativni LCDR1 (Kabat numerisanje); SEQ ID NO: 13 RASQSIRSWLA
17c10 germinativni LCDR2 (Kabat numerisanje); SEQ ID NO: 14 KASILKI
17c10 germinativni LCDR3 (Kabat numerisanje); SEQ ID NO: 15 QQYYSYSRT
1e8 germinativni HCDR1 (Kabat numerisanje); SEQ ID NO: 16 GYYWS
1e8 germinativni HCDR2 (Kabat numerisanje); SEQ ID NO: 17 EIHHSGSTNYNPSLKS
1e8 germinativni HCDR3 (Kabat numerisanje); SEQ ID NO: 18 GQGKNWNYDYFDY
1e8 germinativni LCDR1 (Kabat numerisanje); SEQ ID NO: 19 RASQSIRSWLA
1e8 germinativni LCDR2 (Kabat numerisanje); SEQ ID NO: 20 KASSLKS
1e8 germinativni LCDR3 (Kabat numerisanje); SEQ ID NO: 21 QQYYSFSRT
Konsenzus HCDR2; SEQ ID NO: 22 EIHHSGX1X2NYNPSLKS; gde X1 je S ili G, a X2 je A ili T
Konsenzus HCDR3; SEQ ID NO: 23 GQGKNWX1YDYFDY; gde X1 je H ili N
Konsenzus LCDR2; SEQ ID NO: 24
KASX1LKX2; gde X1 je I ili S, a X2 je I ili S
Konsenzus LCDR3; SEQ ID NO: 25
QQYYSX1SRT; gde X1 je Y ili F
Humani kapa laki lanac; SEQ ID NO: 26 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVT EQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
4
1
2
4

Claims (20)

Zahtevi
1. Antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, koji se specifično vezuje za epitop ASCT2, naznačeno time što antitelo ili antigen vezujući fragment obuhvata tri regiona koji određuju komplementarnost teškog lanca (HCDR) varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i tri regiona koji određuju komplementarnost lakog lanca (LCDR) varijabilnog regiona lakog lanca (VL), naznačeno time što antitelo ili njegov antigen vezujući fragment obuhvata sledeće:
(a) HCDR1 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 10; HCDR2 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 11; HCDR3 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 12; LCDR1 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 13; LCDR2 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 14; i LCDR3 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 15; ili
(b) HCDR1 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 16; HCDR2 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 17; HCDR3 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 18; LCDR1 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 19; LCDR2 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 20; i LCDR3 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 21.
2. Antitelo ili antigen vezujući fragment iz zahteva 1, naznačeno time što:
(a) VH obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1 i naznačeno time što VL obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2;
(b) VH obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3 i naznačeno time što VL obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4;
(c) VH obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5 i naznačeno time što VL obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6; ili
(d) VH obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 7 i naznačeno time što VL obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8.
3. Antitelo ili antigen vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1 ili 2, naznačeno time što VH obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, a VL obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6.
4. Antitelo ili antigen vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1 ili 2, naznačeno time što VH obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 7, a VL obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8.
5. Antitelo ili antigen vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1 do 4, naznačeno time što antitelo ili antigen vezujući fragment obuhvata IgG konstantni region koji obuhvata umetak cisteina (C) između serina (S) na položaju 239 i valina (V) na položaju 240, naznačeno time što numerisanje odgovara Kabat EU indeksu.
6. Antitelo ili antigen vezujući fragment prema zahtevu 5, naznačeno time što antitelo obuhvata teški lanac aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 9.
7. Antitelo ili antigen vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1 do 6, naznačeno time što se antitelo vezuje za ASCT2 na površini ćelije, antitelo se unosi u ćeliju.
8. Antitelo ili antigen vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1 do 7, koji obuhvata konstantni region lakog lanca izabranog od grupe koja se sastoji od humanog kapa konstantnog regiona i humanog lambda konstantnog regiona.
9. Antitelo ili antigen vezujući fragment prema zahtevu 8, naznačeno time što antitelo obuhvata humani kapa konstanti region SEQ ID NO: 26.
10. Antitelo ili antigen vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1 do 9, dalje konjugovani sa citotoksinom izabranim od grupe koja se sastoji od antimikrobnog agensa, terapijskog agensa, proleka, peptida, proteina, enzima, lipida, modifikatora biološkog odgovora, farmaceutskog agensa, limfokina, heterologog antitela, fragmenta heterologog antitela, oznake koja može da se detektuje, polietilen glikola (PEG), radioizotopa i kombinacije dva ili više od bilo kojih navedenih citotoksina.
11. Antitelo ili antigen vezujući fragment prema zahtevu 10, koji je konjugovan sa citotoksinom.
12. Antitelo ili antigen vezujući fragment prema zahtevu 11, naznačeno time što je citotoksin izabran od tubulizin derivata i pirolobenzodiazepina.
13. Antitelo ili antigen vezujući fragment prema zahtevu 12, naznačeno time što je tubulizin derivat tubulizin AZ1508.
14. Antitelo ili antigen vezujući fragment prema zahtevu 12, naznačeno time što je pirolobenzodiazepin izabran od SG3315 i SG3249.
15. Antitelo ili antigen vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1 do 14, naznačeno time što antitelo vezuje humani ASCT2 i ASCT2 makaki majmuna.
16. Antitelo ili antigen vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1 do 15, naznačeno time što antitelo ne vezuje specifično humani ASCT1.
17. Farmaceutska smeša koja obuhvata antitelo ili antigen vezujući fragment iz bilo kog od zahteva 1 do 16 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
18. Polinukleotid ili kombinacija polinukleotida koja kodira antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1 do 16.
19. Metod pravljenja antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta iz bilo kog od zahteva 1 do 16 koji sadrži kultivisanje domaćina koji obuhvata polinukleotid iz zahteva 18.
20. Antitelo ili antigen vezujući fragment iz bilo kog od zahteva 1 do 16 ili farmaceutska smeša iz zahteva 17 za upotrebu u lečenju karcinoma koji karakteriše prekomerna ekspresija ASCT2, naznačeno time što navedeno lečenje obuhvata davanje efikasne količine navedenog antitela ili antigen vezujućeg fragmenta ili navedene farmaceutske smeše ispitaniku sa potrebom za navedenim lečenjem.
RS20200647A 2015-11-10 2016-11-10 Vezujući molekuli specifični za asct2 i njihove upotrebe RS60389B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562253371P 2015-11-10 2015-11-10
US201562253774P 2015-11-11 2015-11-11
PCT/US2016/061219 WO2017083451A1 (en) 2015-11-10 2016-11-10 Binding molecules specific for asct2 and uses thereof
EP16802197.0A EP3374398B1 (en) 2015-11-10 2016-11-10 Binding molecules specific for asct2 and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60389B1 true RS60389B1 (sr) 2020-07-31

Family

ID=57421946

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200647A RS60389B1 (sr) 2015-11-10 2016-11-10 Vezujući molekuli specifični za asct2 i njihove upotrebe

Country Status (29)

Country Link
US (2) US10829554B2 (sr)
EP (2) EP3374398B1 (sr)
JP (1) JP6898925B2 (sr)
KR (1) KR20180073675A (sr)
CN (1) CN108290949B (sr)
AU (1) AU2016352967A1 (sr)
BR (1) BR112018008983A2 (sr)
CA (1) CA3003468C (sr)
CL (1) CL2018001238A1 (sr)
CO (1) CO2018004930A2 (sr)
CY (1) CY1123525T1 (sr)
DK (1) DK3374398T3 (sr)
ES (2) ES2959663T3 (sr)
HR (1) HRP20200882T1 (sr)
HU (1) HUE050312T2 (sr)
IL (1) IL259036B (sr)
LT (1) LT3374398T (sr)
MX (1) MX2018005541A (sr)
MY (1) MY192146A (sr)
PL (1) PL3374398T3 (sr)
PT (1) PT3374398T (sr)
RS (1) RS60389B1 (sr)
RU (1) RU2710194C9 (sr)
SG (2) SG10202103712VA (sr)
SI (1) SI3374398T1 (sr)
SM (1) SMT202000285T1 (sr)
TW (1) TWI726936B (sr)
WO (1) WO2017083451A1 (sr)
ZA (1) ZA201803841B (sr)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6730260B2 (ja) 2014-09-12 2020-07-29 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア マクロピノサイトーシスによるヒト抗ｃｄ４６抗体及び標的とされた癌治療薬
AU2017359155A1 (en) * 2016-11-10 2019-06-13 Medimmune, Llc Binding molecules specific for ASCT2 and uses thereof
WO2020056021A1 (en) * 2018-09-11 2020-03-19 The Johns Hopkins University Force - dependent drug release system to enhance selective killing and minimize adverse effects in cancer treatment
JP7590328B2 (ja) 2018-12-21 2024-11-26 レゲネロン ファーマシューティカルス，インコーポレーテッド ツブリシン及びタンパク質－ツブリシンコンジュゲート
EP4192511A1 (en) * 2020-08-07 2023-06-14 Fortis Therapeutics, Inc. Immunoconjugates targeting cd46 and methods of use thereof
US20240058464A1 (en) * 2021-01-07 2024-02-22 Fortis Therapeutics, Inc. Combination therapy with for46 for cancer
EP4431528A1 (en) * 2021-10-29 2024-09-18 Longbio Pharma (Suzhou) Co., Ltd. Isolated antigen binding protein and use thereof
EP4463135A2 (en) 2022-01-10 2024-11-20 Sana Biotechnology, Inc. Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
WO2024081820A1 (en) 2022-10-13 2024-04-18 Sana Biotechnology, Inc. Viral particles targeting hematopoietic stem cells
WO2024119157A1 (en) 2022-12-02 2024-06-06 Sana Biotechnology, Inc. Lipid particles with cofusogens and methods of producing and using the same
EP4382120A1 (en) * 2022-12-05 2024-06-12 Institut Regional du Cancer de Montpellier Anti-slc1a4 monoclonal antibodies and uses thereof
EP4716750A1 (en) 2023-05-23 2026-04-01 Sana Biotechnology, Inc. Tandem fusogens and related lipid particles
EP4471061A1 (en) * 2023-06-01 2024-12-04 Emergence Therapeutics AG Anti-asct2-antibodies and adcs derived therefrom
WO2025149667A1 (en) 2024-01-12 2025-07-17 Pheon Therapeutics Ltd Antibody drug conjugates and uses thereof
WO2025184529A1 (en) 2024-03-01 2025-09-04 Sana Biotechnology, Inc. Viral particles with fusogen display and related compositions and methods
CN118406145B (zh) * 2024-05-29 2024-11-15 北京励和同创生物科技有限公司 一种抗磷酸化ASC_Tyr 144抗体及其应用

Family Cites Families (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS58180487A (ja) 1982-04-16 1983-10-21 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 抗生物質ｄｃ−８１およびその製造法
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US6492107B1 (en) 1986-11-20 2002-12-10 Stuart Kauffman Process for obtaining DNA, RNA, peptides, polypeptides, or protein, by recombinant DNA technique
DE229046T1 (de) 1985-03-30 1987-12-17 Marc Genf/Geneve Ballivet Verfahren zum erhalten von dns, rns, peptiden, polypeptiden oder proteinen durch dns-rekombinant-verfahren.
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
DE3600905A1 (de) 1986-01-15 1987-07-16 Ant Nachrichtentech Verfahren zum dekodieren von binaersignalen sowie viterbi-dekoder und anwendungen
US5681718A (en) 1986-03-14 1997-10-28 Celltech Limited Methods for enhanced production of tissue plasminogen activator in cell culture using alkanoic acids or salts thereof
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
AU652539B2 (en) 1989-05-16 1994-09-01 Medical Research Council Co-expression of heteromeric receptors
CA2016841C (en) 1989-05-16 1999-09-21 William D. Huse A method for producing polymers having a preselected activity
CA2016842A1 (en) 1989-05-16 1990-11-16 Richard A. Lerner Method for tapping the immunological repertoire
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
CA2095633C (en) 1990-12-03 2003-02-04 Lisa J. Garrard Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
PT1024191E (pt) 1991-12-02 2008-12-22 Medical Res Council Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos
EP0571613B1 (en) 1991-12-13 2003-09-17 Xoma Corporation Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US7264963B1 (en) 1995-08-18 2007-09-04 Morphosys Ag Protein(poly)peptide libraries
ES2176484T3 (es) 1995-08-18 2002-12-01 Morphosys Ag Bancos de proteinas/(poli)peptidos.
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
WO2001002588A2 (en) 1999-07-02 2001-01-11 Morphosys Ag Generation of specific binding partners binding to (poly)peptides encoded by genomic dna fragments or ests
US7658921B2 (en) 2000-12-12 2010-02-09 Medimmune, Llc Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
US7083784B2 (en) 2000-12-12 2006-08-01 Medimmune, Inc. Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
US7538195B2 (en) 2002-06-14 2009-05-26 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
US7776814B2 (en) 2002-07-09 2010-08-17 R&D-Biopharmaceuticals Gmbh Tubulysin conjugates
DK1523493T3 (da) 2002-07-09 2013-12-02 Alexander Doemling Nye tubulysinanaloge
GB0216648D0 (en) 2002-07-18 2002-08-28 Lonza Biologics Plc Method of expressing recombinant protein in CHO cells
ZA200503075B (en) 2002-11-07 2006-09-27 Immunogen Inc Anti-CD33 antibodies and method for treatment of acute myeloid leukemia using the same
DE10254439A1 (de) 2002-11-21 2004-06-03 GESELLSCHAFT FüR BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) Tubulysine, Herstellungsverfahren und Tubulysin-Mittel
US20080187954A1 (en) 2004-03-10 2008-08-07 Lonza Ltd. Method For Producing Antibodies
CA2581208A1 (en) 2004-08-30 2006-03-09 Lonza Biologics Plc. Affinity- plus ion exchange- chromatography for purifying antibodies
WO2006076734A2 (en) 2005-01-14 2006-07-20 Medical College Of Georgia Research Institute Prodrugs of short-chain fatty acids and treatment methods
RU2008141912A (ru) * 2006-03-23 2010-04-27 Новартис АГ (CH) Противоопухолевые лекарства на основе антител к клеточным антигенам
US7691980B2 (en) 2007-01-09 2010-04-06 Bio-Rad Laboratories, Inc. Enhanced capacity and purification of antibodies by mixed mode chromatography in the presence of aqueous-soluble nonionic organic polymers
FR2912314B1 (fr) 2007-02-09 2012-08-03 Geneuro Sa Composition pharmaceutique comprenant des anticorps diriges contre l'enveloppe de herv-w.
EP2181101A2 (en) 2007-07-20 2010-05-05 Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH Tubulysin d analogues
US8476451B2 (en) 2007-07-20 2013-07-02 The Regents Of The University Of California Tubulysin D analogues
CN101909441B (zh) 2007-10-25 2015-05-13 恩多塞特公司 微管蛋白抑制剂及其制备方法
PE20091163A1 (es) 2007-11-01 2009-08-09 Wyeth Corp Anticuerpos para gdf8
US8168586B1 (en) 2007-11-21 2012-05-01 Celera Corporation Cancer targets and uses thereof
EP2238154B1 (en) 2008-01-18 2015-09-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Enhanced purification of phosphorylated and non-phosphorylated biomolecules by apatite chromatography
JP5470817B2 (ja) 2008-03-10 2014-04-16 日産自動車株式会社 電池用電極およびこれを用いた電池、並びにその製造方法
US8268592B2 (en) * 2008-07-17 2012-09-18 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Anti-system ASC amino acid transporter 2 (ASCT2) antibody
WO2010031185A1 (en) 2008-09-19 2010-03-25 Protox Therapeutics Inc. Treating cancer stem cells using targeted cargo proteins
CA2742969A1 (en) 2008-11-07 2010-05-14 Fabrus Llc Anti-dll4 antibodies and uses thereof
KR20120115511A (ko) * 2010-01-15 2012-10-18 교와 핫꼬 기린 가부시키가이샤 항시스템 ａｓｃ 아미노산 트랜스포터 ２（ａｓｃｔ２） 항체
JP2013535220A (ja) 2010-08-06 2013-09-12 エンドサイト，インコーポレイテッド ツブリシンを調製するためのプロセス
WO2013176626A1 (en) 2012-05-25 2013-11-28 National University Of Singapore Method of identifying foetal erythroblast
MX338711B (es) 2012-10-12 2016-04-28 Medimmune Ltd Pirrolobenzodiazepinas y conjugados de las mismas.
JP6136279B2 (ja) 2013-01-15 2017-05-31 株式会社ジェイテクト 転がり軸受装置
TWI503850B (zh) 2013-03-22 2015-10-11 Polytronics Technology Corp 過電流保護元件
TWI510996B (zh) 2013-10-03 2015-12-01 Acer Inc 控制觸控面板的方法以及使用該方法的可攜式電腦
GB201317982D0 (en) 2013-10-11 2013-11-27 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
WO2015155345A1 (en) 2014-04-11 2015-10-15 Medimmune Limited Antibodies and antibody-drug conjugates
EA032203B1 (ru) 2014-04-11 2019-04-30 МЕДИММЬЮН ЭлЭлСи Производные тубулизина
JP6685924B2 (ja) 2014-04-11 2020-04-22 メディミューン，エルエルシー システイン操作抗体を含むコンジュゲート化合物
SG11201608192SA (en) 2014-04-11 2016-10-28 Medimmune Llc Bispecific her2 antibodies
US9816280B1 (en) 2016-11-02 2017-11-14 Matthew Reitnauer Portable floor
AU2017359155A1 (en) 2016-11-10 2019-06-13 Medimmune, Llc Binding molecules specific for ASCT2 and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
HK1258317A1 (zh) 2019-11-08
ES2796560T3 (es) 2020-11-27
IL259036A (en) 2018-06-28
US11608375B2 (en) 2023-03-21
WO2017083451A8 (en) 2018-02-01
US20180273617A1 (en) 2018-09-27
SG11201803068YA (en) 2018-05-30
MX2018005541A (es) 2018-08-01
KR20180073675A (ko) 2018-07-02
SI3374398T1 (sl) 2020-07-31
CA3003468C (en) 2024-06-18
CN108290949B (zh) 2021-12-14
PT3374398T (pt) 2020-06-16
SMT202000285T1 (it) 2020-07-08
JP6898925B2 (ja) 2021-07-07
CN108290949A (zh) 2018-07-17
CO2018004930A2 (es) 2018-11-30
MY192146A (en) 2022-08-01
RU2710194C2 (ru) 2019-12-24
NZ743023A (en) 2021-08-27
RU2018120695A (ru) 2019-12-16
DK3374398T3 (da) 2020-06-08
BR112018008983A2 (pt) 2018-10-30
WO2017083451A1 (en) 2017-05-18
AU2016352967A1 (en) 2018-06-21
ZA201803841B (en) 2019-04-24
CL2018001238A1 (es) 2018-10-12
IL259036B (en) 2020-04-30
EP3719039A1 (en) 2020-10-07
EP3374398A1 (en) 2018-09-19
PL3374398T3 (pl) 2020-08-24
LT3374398T (lt) 2020-09-10
SG10202103712VA (en) 2021-05-28
TWI726936B (zh) 2021-05-11
HUE050312T2 (hu) 2020-11-30
CA3003468A1 (en) 2017-05-18
TW201726738A (zh) 2017-08-01
JP2018535674A (ja) 2018-12-06
CY1123525T1 (el) 2022-03-24
EP3374398B1 (en) 2020-03-18
US10829554B2 (en) 2020-11-10
HRP20200882T1 (hr) 2020-09-04
ES2959663T3 (es) 2024-02-27
US20210024629A1 (en) 2021-01-28
RU2710194C9 (ru) 2020-09-14
EP3719039B1 (en) 2023-07-26
RU2018120695A3 (sr) 2019-12-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11608375B2 (en) Binding molecules specific for ASCT2 and uses thereof
US20190367605A1 (en) Binding Molecules Specific For ASCT2 And Uses Thereof
EP3095797B1 (en) Anti dll3 antibodies and methods of use thereof
KR20250075625A (ko) L1cam에 결합하는 신규 결합 분자
HK40038789A (en) Binding molecules specific for asct2 and uses thereof
HK1260476A1 (en) Binding molecules specific for asct2 and uses thereof
HK1260476B (en) Binding molecules specific for asct2 and uses thereof
NZ743023B2 (en) Binding molecules specific for asct2 and uses thereof
HK40010481A (en) Binding molecules specific for asct2 and uses thereof
HK1258317B (en) Binding molecules specific for asct2 and uses thereof