RS60450B1 - Postupak za tretiranje i kompozicije koje sadrže dvojni inhibitor pi3k delta-gama kinaze i kortikosteroid - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na postupak lečenja autoimunih, respiratornih i/ili inflamatornih bolesti i stanja koji sadrži primenu na pacijenta kome je to potrebno dvostrukog PI3K delta/gama inhibitora formule A i bar jednog kortikosteroida. U poželjnim primerima izvođenja, postupak se odnosi na lečenje psorijaze, reumatoidnog artritisa, idiopatske plućne fibroze (IPF), astme, hronične opstruktivne plućne bolesti (COPD) i bilo koje njihove kombinacije.

OSNOVA PRONALASKA

[0002] Autoimune, respiratorne i inflamatorne bolesti kao što su reumatoidni artritis (RA), idiopatska plućna fibroza (IPF), psorijaza, sistemski eritemski lupus (SLE), KOPB i astma su hronične i često progresivne bolesti povezane sa poremećenim ili hiperaktivnim imunim sistemom. Uzroci i pokretači ovih bolesti su i dalje loše definisani. Obično ih karakterišu složene ćelijske interakcije između više inflamatornih ćelija urođenog i adaptivnog imunog sistema. Shodno tome, heterogenost i složenost etiologije bolesti ovih stanja čini potragu za novim odgovarajućim ćelijskim ciljevima izazovnim, jer nije jasno ko je u ćelijskom infiltratu primarni igrač patologije nasuprot „nevinom“ posmatraču. Stoga, ciljanje signalnih molekula koji su potrebni za aktiviranje više imunih ćelija može biti verovatniji put ka uspehu u borbi protiv ovih hroničnih bolesti posredovanih imunim ćelijama.

[0003] Reumatoidni artritis (RA) je progresivna, sistemska autoimuna bolest koju karakteriše hronična upala više zglobova sa povezanim sistemskim simptomima kao što je umor. Ova upala izaziva bol u zglobovima, ukočenost i oticanje, što rezultuje gubitkom funkcije zglobova usled uništavanja kosti i hrskavice, što često dovodi do progresivne invalidnosti. Pacijenti sa RA takođe imaju povećanu verovatnoću za razvoj drugih sistemskih komplikacija kao što je osteoporoza, anemija i druge koji pogađaju pluća i kožu.

[0004] RA je jedan od najčešćih oblika autoimune bolesti i pogađa preko 21 milion ljudi širom sveta. Reumatoidni artritis ima distribuciju širom sveta sa procenjenom prevalencijom od 1 do 2%. Rasprostranjenost raste s godinama, približavajući se 5% kod žena starijih od 55 godina. Prosečna godišnja incidencija u Sjedinjenim Državama je oko 70 na 100.000 godišnje. I incidenca i prevalenca reumatoidnog artritisa dva do tri puta su veće kod žena nego kod muškaraca. Iako se reumatoidni artritis može pojaviti u bilo kom uzrastu, pacijenti najčešće oboljevaju u trećoj do šestoj deceniji. Poznato je da RA utiče na kvalitet života, uzrokujući ne samo fizičke probleme već i značajan negativan uticaj na kvalitet života. RA takođe utiče na prosečan životni vek, skraćujući ga na tri do sedam godina. Nakon 10 godina, manje od 50% pacijenata sa RA može svakodnevno raditi ili normalno funkcionisati. Takođe je objavljeno da RA dovodi do ekonomskog opterećenja nacionalnih ekonomija zbog prijema u bolnicu, troškova zdravstvene zaštite i izgubljene produktivnosti. RA je uzrok više od devet miliona poseta lekarima opšte prakse u Velikoj Britaniji godišnje, što predstavlja izgubljenu proizvodnju od 833 miliona funti. Procenjuje se da je to koštalo ekonomiju Velike Britanije 5,5 milijardi funti u 2000. U SAD, stručnjaci procenjuju da RA košta preduzeća i industriju više od bilo koje druge bolesti, sa 500.000 hospitalizacija godišnje, a teret ekonomiji koji predstavlja artritis (u celini) procenjuje se na 128 milijardi dolara.

[0005] Postoji nekoliko dostupnih tretmana za RA. Neki se bave znacima i simptomima RA, drugi imaju za cilj da modifikuju tok bolesti i pozitivno utiču na sistemske efekte RA, poput umora i anemije.

[0006] Trenutni tretmani uključuju, na primer, upotrebu:

• Biološka sredstva: Ovo su lekovi dobijeni genetskim inženjeringom koji ciljaju specifične markere na ćelijskoj površini ili supstance glasnike u imunom sistemu nazvane citokini, koje proizvode ćelije da bi regulisale druge ćelije tokom inflamatornog odgovora. Primer specifičnog citokina koji ciljaju biološka sredstva je faktor nekroze tumora alfa (TNFα).

• Tradicionalni anti-reumatski lekovi koji modifikuju bolest (DMARDs): Ovo su nespecifični imunosupresivni lekovi koji su namenjeni suzbijanju znakova i simptoma RA kao i usporavanju progresivnog uništavanja zglobova. Ovi tretmani se često koriste u kombinaciji jedan sa drugim ili u kombinaciji sa biološkim agensom za poboljšanje reakcije pacijenata

• Glukokortikosteroidi (kortikosteroidi): Ovo su anti-inflamatorni lekovi srodni kortizolu -steroidu koji se prirodno proizvodi u telu - a koji deluju tako što suzbijaju inflamaciju. Međutim, neželjeni efekti glukokortikoida, koji uključuju hiperglikemiju, osteoporozu, hipertenziju, debljanje, kataraktu, probleme sa spavanjem, gubitak mišića i osetljivost na infekcije, ograničavaju njihovu upotrebu

• Nesteroidni anti-inflamatorni lekovi (NSAID): Ovi lekovi deluju tako što smanjuju znake i simptome RA, kao što su smanjenje bola, oticanja i upale, ali ne menjaju tok bolesti ili usporavaju napredovanje uništavanja zglobova.

[0007] Takođe postoje brojne RA terapije koje ciljano deluju na druge komponente imunog sistema. One uključuju biološke tretmane koji ciljano deluju na alternativne citokine kao što su interleukin-6 (IL-6) koji pomaže da se smanji inflamacija i progresija RA u zglobovima i u telu.

[0008] Astma je najčešća hronična bolest među decom i takođe pogađa milione odraslih. Nekih 235 miliona ljudi širom sveta pati od ove bolesti. Uzroci astme nisu dovoljno poznati, ali su dostupni efikasni lekovi koji je mogu lečiti, čime se umnogome izbegava smanjenje kvaliteta života, invaliditet i smrt koje može doneti. Nažalost, za mnoge ljude sa astmom, naročito siromašne, ovi efikasni tretmani su preskupi ili uopšte nisu dostupni.

[0009] Hronična opstruktivna bolest pluća (KOPB) je veoma rasprostranjeno stanje i glavni uzrok oboljevanja i smrtnosti širom sveta. Kako bolest napreduje, pacijenti sa KOPB mogu postati skloni čestim pogoršanjima, što rezultuje anksioznošću pacijenta, pogoršanjem zdravstvenog stanja, opadanjem funkcije pluća i povećanjem stope smrtnosti. Ove epizode pogoršanja respiratornih funkcija dovode do povećanja korišćenja zdravstvene zaštite, primanja u bolnicu i troškova. Još gore, česta pogoršanja su povezana sa bržim opadanjem funkcije pluća, čime se skraćuje životni vek.

[0010] Prema preporukama Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (GOLD), terapija prve linije za COPD su β-agonisti dugotrajnog dejstva, muskarinski antagonisti dugotrajnog dejstva i inhalacioni kortikosteroidi. Međutim, ovi lekovi smanjuju simptome i pogoršanja vezana sa bolešću pre nego što ciljano deluju na njenu molekularnu i ćelijsku osnovu. Shodno tome, i dalje postoji potreba za dodatnim poboljšanjima terapije COPD.

[0011] Fosfoinozitid-3 kinaza (PI3K) pripada klasi intracelularnih lipidnih kinaza koje fosforilišu hidroksilnu grupu na poziciji 3 inozitol prstena fosfoinozitidnih lipida (Pls) stvarajući lipidne sekundarne glasnike. Dok su alfa i beta izoforme prema svom rasprostranjenju sveprisutne, ekspresija delta i gama izoformi ograničena je na cirkulišuće hematogene ćelije i endotelne ćelije. Za razliku od situacije sa PI3K-alfa ili beta, miševi kod kojih izostaje ekspresija gama ili delta ne ispoljavaju nikakve neželjene fenotipske osobine, što ukazuje da ciljanje ovih specifičnih izoformi ne bi rezultovalo ispoljavanjem toksičnosti.

[0012] Ciljani inhibitori fosfoinozitid-3-kinaznih (PI3K) puteva nedavno su predloženi kao imunomodulatorna sredstva. Interesovanje za njih proizašlo je iz činjenice da PI3K putevi imaju brojne funkcije u signalizaciji imunih ćelija, prvenstveno preko stvaranja fosfatidilinozitol (3,4,5)-trifosfata (PIP3), sekundarnog glasnika vezanog za membranu. PIP3 regrutuje proteine na citoplazmatskoj strani lipidnog dvosloja, uključujući protein kinaze i GTPaze, inicirajući kompleksnu mrežu nishodnih signalnih kaskada važnih za regulaciju adhezije, migracije i međućelijsku komunikaciju imunih ćelija.

[0013] Četiri izoforme PI3K klase I značajno se razlikuju po distribuciji u tkivima. PI3Kα i PI3Kβ su sveprisutne i aktiviraju se nishodno od receptorskih tirozin-kinaza (RTK), dok su PI3K δ i PI3Kγ prvenstveno ograničene na hematopoetske i endotelne ćelije i aktiviraju se nishodno od RTK i receptora kuplovanih sa G proteinom (GPCR), respektivno. Genetičke studije na miševima pokazale su da su PI3Kα i PI3Kβ suštinski značajne za normalan razvoj, dok gubitak PI3Kδ i/ili PI3Kγ daje vijabilno potomstvo sa selektivnim imunim nedostacima.

[0014] Funkcija i obrazac ekspresije PI3K δ i PI3K γ povećali su interesovanje za razvoj inhibitora P13Kδ/γ kao sredstava za lečenje mnogih bolesti, uključujući reumatoidni artritis, alergije, astmu, hroničnu opstruktivnu bolest pluća i multiplu sklerozu (Hirsch et al., Pharmacol. Ther., 118, 192-205, 2008; Marone et al., Biochim. Biophys. Acta., 1784, 159-185, 2008; Rommel et al., Nat. Rev. Immunol., 7, 191-201, 2007; Ruckle et al., Nat. Rev. Drug Discov., 5, 903-918, 2006). Studije u kojima se koriste farmakološki i genetički metodi pokazale su da ove dve izoforme često ispoljavaju međusobne sinergističke interakcije (Konrad et al., J. Biol. Chem., 283, 33296-33303, 2008; Laffargue et al., Immunity, 16, 441-451, 2002).

[0015] U mastocitima, na primer, PI3Kδ je suštinski važna za degranulaciju u odgovoru na unakrsno povezivanje Fc-receptora putem IgE (Ali et al., J. Immunol., 180, 2538-2544, 2008), ali PI3Kγ igra važnu ulogu u amplifikaciji odgovora (Laffargue et al., Immunity, 16, 441-451, 2002). Slični efekti zapažaju se i kod drugih ćelijskih funkcija, uključujući "udomljavanje" limfocita i "respiratornu eksploziju" neutrofila, u kojima PI3Kγ ima kritičnu ulogu, a PI3Kδ amplifikuje ove procese. Zbog toga što su uloge PI3Kδ i PI3Kγ neredundantne ali povezane, teško je odrediti koju je od ove dve izoforme (samu ili u kombinaciji) najbolje ciljati u određenom inflamatornom poremećaju. Studije na miševima kojima nedostaje PI3Kδ i/ili PI3Kγ ili koji eksprimiraju kinazno-mrtve varijante PI3Kδ i PI3Kγ, poslužile su za bolje razumevanje njihovih uloga. Na primer, kod PI3Kδ-nokautiranih miševa pokazuju se smanjena hemotaksa neutrofila, smanjena proizvodnja antitela (i zavisna i nezavisna od T-ćelija) (Jou et al., Mol. Cell. Biol., 22, 8580-8591, 2002) i manji broj zrelih B-ćelija (Clayton et al., J. Exp. Med., 196, 753-763, 2002; Jou et al., Mol. Cell.Biol., 22, 8580-8591, 2002), kao i smanjenje njihove proliferacije u odgovoru na anti-IgM (Jou et al., Mol. Cell. Biol., 8580-8591, 2002). Ovaj fenotip bio je ponovljen u PI3Kδ kinaza-mrtvoj varijanti i sa PI3Kδ selektivnim inhibitorima, zajedno sa smanjenjem broja i proliferacije mastocita, i atenuisanim alergijskim odgovorom. PI3Kγ-nokaut miševi sadržali su veći broj neutrofila, ali sa manjom osetljivošću, manji broj makrofaga i dendritskih ćelija sa manjom osetljivošću, ispoljavali su smanjenu degranulaciju mastocita ((Laffargue et al., Immunity, 16, 441-451, 2002), viši odnos CD4+ prema CD8+ T-ćelijama, povećanu apoptozu timocita, smanjenu indukciju CXCR3 na aktiviranim T-ćelijama i smanjenu srčanu kontraktilnost. Ovaj poslednji efekat na srčano tkivo bio je razlog za zabrinutost u slučaju pacijenata koji su hronično primali inhibitore PI3Kγ. Ipak, ova zabrinutost je znatno ublažena kada je PI3Kγ kinaza-mrtva varijanta (koja pre imitira inhibiciju kinaze nego nedostatak proteina) pokazivala slične fenotipove imunih ćelija, ali, što je važno, nije dovodila do srčanih defekata. Kasnije je pokazano da su efekti na srcu nastajali usled pratećih efekata, a ne katalitičke aktivnosti PI3Kγ. Dvojno nokautirani PI3Kδ/PI3Kγ miševi bili su vijabilni, ali su pokazivali ozbiljne defekte u razvoju T-ćelija i preživljavanju timocita. Kombinacija "PI3Kγ nokaut/PI3Kδ kinaza-mrtva" davala je sličan fenotip, što je sugerisalo da je, bar u okviru imunog sistema, uloga PI3Kδ verovatno samo katalitička. Tumačenja studija u kojima su korišćeni nokaut i kinaza-mrtvi miševi mogu biti dosta zahtevna jer ovi modeli pružaju sliku samo trenutnog stanja imunog sistema, ne uključuju vremensku i doznu kontrolu i ne omogućavaju potpuno razumevanje načina kako će dinamični imuni odgovor reagovati na reverzibilnu inhibiciju. Selektivni inhibitori različitih profila (PI3Kδ, PI3Kγ, i PI3Kδ/γ) neophodni su za izučavanje signalizacije leukocita sa ciljem procene relativnog doprinosa svake PI3K aktivaciji imunih ćelija (videti Olusegon et al., Chemistry & Biology, 1, 123-134, uključujući tamo navedene reference).

[0016] Dvojna inhibicija PI3K δ/γ koristi se kao interventna strategija u alergijskim i nealergijskim zapaljenjima disajnih puteva i drugim autoimunim bolestima. Naučni dokazi o uključenosti PI3K-δ i γ u različite ćelijske procese koji su u osnovi astme i COPD izvode se iz studija sa inhibitorima i pristupa u kojima se ciljaju geni. Isto tako, rezistencija na primenu konvencionalne terapije, na primer na kortikosteroide, koja postoji kod nekih obolelih od COPD, pripisuje se pozitivnoj regulaciji PI3K δ/γ puta. Prema tome, narušavanje PI3K-δ/γ signalizacije otvara mogućnost novog strateškog pristupa čiji je cilj suprotstavljanje imunoinflamatornom odgovoru. Zbog vodeće uloge PI3K δ i γ u medijaciji funkcija inflamatornih ćelija, kao što su migracija i aktivacija leukocita i degranulacija mastocita, blokiranje ovih izoformi može predstavljati i efikasnu strategiju u lečenju reumatoidnog artritisa. Imajući u vidu poznati kritični značaj ovih izoformi u imunom nadgledanju, očekivalo bi se da inhibitori koji specifično ciljano deluju na delta i gama izoforme atenuiraju progresiju imunog odgovora koji se sreće pri inflamaciji disajnih puteva i reumatoidnog artritisa. Uzimajući u obzir ustanovljenu kritičnost ovih izoformi u imunom nadgledanju, očekuje se da inhibitori koji specifično ciljaju izoforme δ i γ uspore napredovanje imunog odgovora koji se sreće u zapaljenju disajnih puteva i reumatoidnom artritisu (William et al., Chemistry & Biology, 17:123-134, 2010; and Thompson, et al., Chemistry & Biology, 17:101-102, 2010) Pregledi i studije koji se odnose na PI3K i puteve srodnih protein kinaza dati su od strane Pixu Liu et. al.

(Nature Reviews Drug Discovery, 2009, 8, 627-644); Nathan T. et. al., Mol Cancer Ther., 2009;8 (1) Jan., 2009); Romina Marone et al., Biochimica et Biophysica Acta., 1784 (2008) 159-185) i B. Markman et al., Annals of Oncology, Advance Access published August 2009). Slično tome, pregledi i studije koji se odnose na ulogu PI3K δ i γ dati su od strane William et al., Chemistry & Biology, 17:123-134, 2010 i Timothy et al., J Med. Chem., Web Publication August, 27, 2012.

[0017] Nedavno razvijena jedinjenja, kao što su IPI-145 i CAL130 objavljena su kao dvojni inhibitori Pi3K δ/γ. IPI-145 je pod kliničkim istraživanjem za kancer kao i za astmu. Trenutno ne postoje podaci da je CAL-130 istraživan u bilo koje kliničke svrhe.

[0018] Ovde je načinjena dodatna referenca na Međunarodne patentne prijave br. PCT/IB2010/002804, podneta 3 novembra 2010, i PCT/US2012/36594, podneta 4, maja 2012; SAD patentne prijave br. 12/938,609, podnete 3 novembra 2010, i 13/464,587 podnete 4 maja 2012 kao i na jedinjenja kao što su opisana u međunarodnim prijavama br. WO 2009/088986, WO 2009/088990, WO 2011/008302 i WO 2012/097000. Dvojni PI3K δ/γ inhibitor formule A prema patentnim zahtevima je opisan u WO 2012/151525 i WO 2014/072937.

[0019] Kortikosteroidi su potentna anti-inflamatorna sredstva, sposobna da smanje broj, aktivnost i kretanje inflamatornih ćelija. Kortikosteroidi se uobičajeno koriste za tretiranje širokog opsega hroničnih i akutnih inflamatornih stanja uključujući astmu, hroničnu opstruktivnu plućnu bolest (COPD), alergijski rinitis, reumatoidni artritis, inflamatornu bolest creva i autoimune bolesti. Kortikosteroidi njihove efekte ostvaruju preko glukokortikoidnog receptora (GR). Vezivanje kortikosteroida sa GR indukuje njegovu jedarnu translokaciju koja, zauzvrat, utiče na brojne nishodne puteve preko DNK-vezivanja-zavisnih (npr. transaktivacija) i –nezavisnih (npr. transekspresija) mehanizama.

[0020] Kortikosteroidi za tretiranje hroničnih inflamatornih stanja u plućima (kao što je astma i COPD) se trenutno primenjuju preko inhalacije. Jedna od prednosti upotrebe inhalacionih kortikosteroida (ICS) je mogućnost dopremanja leka direktno na mesto dejstva, čime se ograničavaju sistemski sporedni efekti, i što rezultuje u bržem kliničkom odgovoru i višem terapeutskom odnosu.

[0021] Iako ICS treman može dati važne koristi, naročito kod astme, važno je minimizovati sistemsku izloženost ICS, koja dovodi do pojave i težih neželjenih sporednih efekata koji mogu biti povezani sa hroničnom primenom. Dodatno, ograničeno trajanje dejstva ICS koji su trenutno dostupni u kliničkoj praksi doprinosi suboptimalnoj kontroli bolesti. Dok je tehnologija inhalatora važna tačka u ciljanom dejstvu na pluća, modulacija supstituenata na kortikosteroidnoj molekularnoj osnovi je važna za optimizaciju farmakokinetičkih i farmakodinamskih osobina da bi se smanjila oralna biodostupnost, ograničila farmakološka aktivnost samo na pluća (prolekovi i meki lekovi) i povećao sistemski klirens. Dodatno, dugotrajna ICS aktivnost u plućima je veoma poželjna jer bi primena ICS jednom dnevno omogućila smanjenje učestalosti primene i, stoga, značajno poboljšala komplijansu pacijenta i, kao rezultat, menadžment i kontrolu bolesti. Sumarno, postoji velika medicinska potreba za razvojem ICS sa poboljšanim farmakokinetičkim i farmakodinamskim karakteristikama.

[0022] Opisani su glukokortikoidni izoksazolidin derivati, na primer, u WO 2006/005611, GB 1,578,446 i u "Synthesis and topical anti-inflammatory activity of some steroidal [16α,17α-d] isoxazolidines", M.J. Green et al., J. Med. Chem., 25, 1492-1495, 1982. Dodatni glukokortikoidni izoksazolidin derivati su takođe opisani u WO 2011/029547 i WO 2012/123482.

[0023] Uprkos trenutno dostupnim interventnim terapijama, autoimuni poremećaji kao što je RA, psorijaza i respiratorni poremećaji kao što su astma i COPD ostaju klase bolesti sa značajno neispunjenom medicinskom potrebom.

[0024] Shodno tome, cilj predmetnog pronalaska je da se obezbede postupci i farmaceutske kompozicije za tretman respiratornih i/ili inflamatornih bolesti i stanja koji imaju poboljšanu aktivnost. Farmaceutske kompozicije omogućavaju tretiranje autoimunih, respiratornih i inflamatornih bolesti i stanja sa manjom količinom aktivnog jedinjenja (ili više njih) i/ili omogućavaju tretiranje autoimunih, respiratornih i inflamatornih bolesti i stanja na efikasniji način, čime se minimizuje ili otklanja moguće postojanje štetnih efekata koji su generalno povezani sa bilo kojim načinom lečenja sa aktivnim jedinjenjem u visokim dozama i/ili u dužem vremenskom periodu.

[0025] Kao što je ovde opisano, cilj se može postići kombinovanjem lekova koji utiču na dva različita ali komplementarna puta, da bi bili efikasni na nižim dozama u poređenju sa onima kod bilo kog od inhibitora zasebno. Stoga, predmetni pronalazak obezbeđuje efikasni pristup kombinovanja dva različita signalna puta koji imaju značajan terapeutski potencijal kada su zajedno kombinovani. Naročito kombinacija je terapeutski korisna u smanjenju neophodne terapeutski efikasne koncentracije bilo kog ili oba, kortikosteroida i dvojnog PI3K delta-gama inhibitora.

REZIME PRONALASKA

[0026] Obim pronalaska je definisan patentnim zahtevima. Bilo koja referenca u opisu u odnosu na postupke tretmana odnosi se na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i komplete predmetnog pronalaska za upotrebu u postupku tretmana humanog/životinjskog tela sa terapijom.

[0027] Predmetni pronalazak odnosi se na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži PI3K delta i gama dvojni inhibitor formule A (prikazana u nastavku) i najmanje jedan kortikosteroid, i na upotrebu takve farmaceutske kompozicije za tretiranje autoimunih, respiratornih i inflamatornih bolesti i stanja.

[0028] Jedan primer izvođenja je farmaceutska kompozicija koja sadrži PI3K delta i gama dvojni inhibitor i najmanje jedan kortikosteroid.

[0029] Sledeći primer izvođenja je postupak za tretiranje pacijenta koji pati od autoimune, respiratorne i/ili inflamatorne bolesti ili stanja koji sadrži primenu na pacijenta PI3K delta i gama dvojnog inhibitora i najmanje jednog kortikosteroida. U poželjnom primeru izvođenja, PI3K delta i gama dvojni inhibitor i najmanje jedan kortikosteroid su primenjeni zajedno u jednoj farmaceutskoj kompoziciji. U poželjnom primeru izvođenja, bolest ili stanje je idiopatska plućna fibroza (IPF), astma, reumatoidni artritis (RA) ili COPD.

[0030] Sledeći primer izvođenja je upotreba kombinacije PI3K delta i gama dvojnog inhibitora i najmanje jednog kortikosteroida za tretman kod pacijenta sa autoimunom, respiratornom i/ili inflamatornom bolešću ili stanjem, kao što je za tretman astme, RA ili COPD.

[0031] PI3K delta i gama dvojni inhibitor prema pronalasku je jedinjenje formule A (prikazana u nastavku) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

[0032] Pogodni kortikosteroidi uključuju deksametazon, betametazon, prednizolon, metil prednizolon, prednizon, hidrokortizon, flutikazon, triamcinolon, budezonid ili kortizon prednizolon, metilprednizolon, naflokort, deflazakort, halopredon acetat, budezonid, beklometazon dipropionat, hidrokortizon, triamcinolon acetonid, fluocinolon acetonid, fluocinonid, klokortolon pivalat, metilprednizolon aceponat, deksametazon palmitoat, tipredan, hidrokortizon aceponat, prednikarbat, alklometazon dipropionat, halometazon, metilprednizolon suleptanat, mometazon furoat, rimekzolon, prednizolon farnesilat, ciklezonid, deprodon propionat, flutikazon propionat, halobetazol propionat, loteprednol etabonat, betametazon butirat propionat, flunizolid, prednizon, deksametazon natrijum fosfat, triamcinolon, betametazon 17-valerat, betametazon, betametazon dipropionat, hidrokortizon acetat, hidrokortizon natrijum sukcinat, prednizolon natrijum fosfat, hidrokortizon probutat, i njihovih farmaceutski prihvatljivih soli.

[0033] U poželjnom primeru izvođenja, kortikosteroidi su izabrani od deksametazona, betametazona, prednizolona, metil prednizolona, prednizona, hidrokortizona, flutikazona, triamcinolona, budezonida, kortizona, i bilo koje komebinacije bilo kojih od prethodno navedenog.

[0034] Jedan primer izvođenja je farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje formule A ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i kortikosteroid. U poželjnom primeru i zvođenja, farmaceutska kompozicija sadrži terapeutski efikasnu količinu jedinjenja formule A ili njegove farmaceutski prihvatljvie soli, i terapeutski efikasnu količinu kortikosteroida (na primer, za tretiranje astme, RA, ili COPD).

[0035] Sledeći primer izvođenja je postupak tretiranja autoimune, respiratorne i/ili inflamatorne bolesti ili stanja, kao što je astma, RA ili COPD, koji sadrži primenu na pacijenata kome je to potrebno jedinjenja formule A:

ili njegove farmaceutski prihvatljive soli i kortikosteroida. U poželjnom primeru izvođenja, jedinjenje formule A ili njegova farmaceutski prihvatljiva so i najmanje jedan kortikosteroid su primenjeni zajedno u jednoj farmaceutskoj kompoziciji. U primeru izvođenja, bolest ili stanje je astma. U sledećem primeru izvođenja, bolest ili stanje je RA. U sledećem primeru izvođenja, bolest ili stanje je COPD.

[0036] Sledeći primer izvođenja je postupak za lečenje pacijenta koji pati od autoimune, respiratorne i/ili inflamatorne bolesti ili stanja, kao što je astma, RA, ili COPD, koji sadrži primenu na pacijenta jedinjenja formule A ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, i kortikosteroida izabranog od dekstametazona, betametazona, prednizolona, metil prednizolona, prednizona, hidrokortizona, flutikazona, triamcinolona, budezonida ili kortizona, i bilo koje njihove kombinacuije. U poželjnom primeru izvođenja, jedinjenje formule A ili njegova farmaceutski prihvatljiva so i najmanje jedan kortikosteroid su primenjeni zajedno u jednoj farmaceutskoj kompoziciji.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0037]

Slika 1A je bar grafikon koji prikazuje efekat jedinjenja A na IC50deksametazona (Dex) na TGF-β1 tretiranim A549 ćelijama prema proceduri u Primeru 1.

Slika 1B je bar grafikon koji prikazuje efekat jedinjenja A na IC50deksametazona (Dex) na IL-8 koncentracije u H2O2tretiranim U937 ćelijama prema proceduri iz Primera 2.

Slika 2A bar grafikon koji prikazuje efekat jedinjenja A na infiltraciju imunih ćelija indukovanu sa dimom iz cigarete kod BALF od Balb/c miševa prema proceduri u Primeru 3. Slika 2B bar grafikon koji prikazuje efekat jedinjenja A na citokine kod BALF prema proceduri u Primeru 3.

Slika 3A bar grafikon koji prikazuje efekat jedinjenja A i flutikazona na infiltraciju makrofaga indukovanu sa dimom cigarete kod BALF od Balb/c miševa prema proceduri u Primeru 4. Slika 3B je bar grafikon koji prikazuje efekat kombinacije jedinjenja A i flutikazona na infiltraciju makrofaga indukovanu sa dimom cigarete kod BALF od Balb/c miševa prema proceduri u Primeru 4.

Slika 4 je bar grafikon koji prikazuje inhibitornu krivu zavisnu od IL-8 koncentracije za neutrofile iz zdravih i COPD pacijenata stimulisanih sa CSE 5% u prisustvu Jedinjenja A (0.01 nM - 100 mM) ili deksametazona prema proceduri u Primeru 6.

Slika 5 je bar grafikon koji prikazuje inhibiciju CSE-indukovanog oslobađanja IL-8 u neutrofilima iz COPD pacijenata sa dodavanjem fiksirane koncentracije deksametazona 1 nM koncentracijama Jedinjenja A od 0.1nM, 1nM, i 10nM prema proceduri u Primeru 6.

Slika 6 je bar grafikon koji prikazuje relativnu MKP1 iRNK ekspresiju stimulisanu sa CSE 5% zasebno ili u prisustvu 10 nM ili 100 nM Jedinjenja A prema proceduri u Primeru 7.

Slika 7 je bar grafikon koji prikazuje relativnu PI3Kγ iRNK ekspresiju stimulisanu sa CSE 5% zasebno ili u prisustvu 10 nM ili 100 nM Jedinjenja A prema proceduri u Primeru 7.

Slika 8 je bar grafikon koji prikazuje PIP3 proizvodnju u prisustvu CSE 5% zasebno, CSE5% i 10 nM Jedinjenja A, ili 10 nM Jedinjenja A zasebno.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0038] U jednom aspektu, postupak za kombinovanje dvojnog PI3K delta i gama inhibitora (tj. jedinjenja formule A, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli) sa kortikosteroidom, kao što je opisano u bilo kom od ovde datih primera izvođenja, pokazuje aktivnost (tj., sinergističku aktivnost) koja je značajno veća od aktivnosti koja bi se očekivala na osnovu pojedinačnih aktivnosti svakog od dvojnog PI3K delta i gama inhibitora ili kortikosteroida zasebno.

[0039] U sledećem aspektu, postupak kombinovanja dvojnog PI3K delta i gama inhibitora (tj. jedinjenja formule A, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli) sa kortikosteroidom pokazuje aktivnost čak i kada je kortikosteroid zasebno neosetljiv kao pojedinačno sredstvo.

[0040] Stoga, ovde opisani postupci omogućavaju lečenje autoimunih, respiratornih i zapaljenskih bolesti i stanja sa manjom količinom aktivnog (aktivnih) sastojaka i / ili omogućavaju lečenje autoimunih, respiratornih i zapaljenskih bolesti i stanja tokom dužeg vremenskog perioda u više efikasan način..

[0041] Sledeći primer izvođenja je farmaceutska kompozicija koja sadrži dvojni PI3K delta i gama inhibitor (tj. jedinjenje formule A, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so) sa kortikosteroidom, za upotrebu u lečenju autoimune, respiratorne i / ili inflamatorne bolesti ili stanja.

[0042] Sledeći primer izvođenja je postupak lečenja autoimune, respiratorne i / ili inflamatorne bolesti ili stanja koji obuhvata primenu na pacijenta kome je potreban terapeutski efikasne količine farmaceutske kompozicije prema predmetnom pronalasku.

[0043] Sledeći primer izvođenja je upotreba farmaceutskog preparata prema bilo kom od primera izvođenja opisanog ovde za pravljenje leka korisnog za lečenje autoimune, respiratorne i / ili inflamatorne bolesti ili stanja.

[0044] U ovde opisanim farmaceutskim kompozicijama, dvojni PI3K delta i gama inhibitor (tj. jedinjenje formule A, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so) mogu biti u obliku izabranom od solvata, hidrata i / ili soli sa farmakološki prihvatljivim kiselinama ili bazama.

[0045] U ovde opisanim farmaceutskim kompozicijama, kortikosteroid može biti u obliku izabranom od solvata, hidrata ili soli sa farmakološki prihvatljivim kiselinama ili bazama.

[0046] Sledeći primer izvođenja predmetnog pronalaska je postupak za lečenje oboljenja povezanog sa imunim sistemom (npr., autoimunog oboljenja), oboljenja ili poremećaja koji uključuje zapaljenje (npr., astme, hronične opstruktivne bolesti pluća, reumatoidnog artritisa, zapaljenske bolesti creva, glomerulonefritisa, neuroinflamatorne bolesti, multiple skleroze, uveitisa i poremećaja imunog sistema), kancera ili drugog proliferativnog oboljenja, oboljenja ili poremećaja jetre ili oboljenja ili poremećaja bubrega. Postupak uključuje primenu efikasne količine jednog ili više kompozicija predmetnog pronalaska.

[0047] Primeri imunih poremećaja koji se mogu lečiti pomoću postupaka i kompozicija opisanih ovde uključuju, ali se ne ograničavaju na psorijazu, reumatoidni artritis, vaskulitis, zapaljensku bolest creva, dermatitis, osteoartritis, astmu, zapaljensku bolest mišića, alergijski rinitis, vaginitis, intersticijalni cistitis, sklerodermu, osteoporozu, ekcem, odbacivanje alogenog ili ksenogenog transplantiranog kalema (organa, kostne srži, matičnih ćelija i drugih ćelija i tkiva), bolest kalema protiv domaćina, eritemski lupus, zapaljensku bolest, dijabetes tipa I, plućnu fibrozu, dermatomiozitis, Sjogren-ov sindrom, tiroiditis (npr., Hashimoto-ov i autoimuni tiroiditis), mijasteniju gravis, autoimunu hemolitičku anemiju, multiplu sklerozu, cističnu fibrozu, idiopatsku plućnu fibrozu (IPF), hronični relapsni hepatitis, primarnu bilijarnu cirozu, alergijski konjunktivitis i atopijski dermatitis.

[0048] Farmaceutski prihvatljive soli, kao što su ovde opisane, uključuju soli izvedene iz neorganskih baza kao što su Li, Na, K, Ca, Mg, Fe, Cu, Zn, i Mn; soli organskih baza kao što su N,N’-diacetiletilendiamin, glukamin, trietilamin, holin, hidroksid, dicikloheksilamin, metformin, benzilamin, trialkilamin i tiamin; soli hiralnih baza kao što su alkilfenilamin, glicinol i fenil glicinol; soli prirodnih amino-kiselina kao što su glicin, alanin, valin, leucin, izoleucin, norleucin, tirozin, cistin, cistein, metionin, prolin, hidroksiprolin, histidin, omitin, lizin, arginin, i serin; kvaternarne amonijumove soli jedinjenja pronalaska sa alkil halidima, alkil sulfatima kao MeI (metil jodid) i (Me)2SO4soli neprirodnih amino-kiselina kao što su D-izomeri ili supstituisane amino-kiseline; soli guanidina; i soli supstituisanog guanidina, gde se supstituenti biraju između nitro, amino, alkil, alkenil, alkinil, amonijum ili supstituisanih amonijumovih soli i aluminijumovih soli. Soli mogu uključivati kisele adicione soli, kada je pogodno, koje su sulfati, nitrati, fosfati, perhlorati, borati, hidrohalidi, acetati, tartrati, maleati, citrati, fumarati, sukcinati, palmoati, metansulfonati, benzoati, salicilati, benzensulfonati, askorbati, glicerofosfati i ketoglutarati.

[0049] Kada se u ovom tekstu koriste opsezi, obuhvaćene su sve kombinacije i podkombinacije opsega i specifičnih primera izvođenja. Izraz "oko", kada se odnosi na broj ili brojni opseg, znači da je naznačeni broj ili brojni opseg aproksimiran unutar eksperimentalne varijabilnosti (ili unutar statističke eksperimentalne greške), pa tako broj ili brojni opseg može varirati od, na primer, 1% do 15% od navedenog broja ili brojnog opsega. Izraz "koji sadrži" (i srodni izrazi kao "sadrže" ili "sadrži" ili "ima" ili "uključuje") uključuje primere izvođenja, na primer, primer izvođenja svake smeše materija, smeše, metoda ili procesa ili slično, koji se "sastoje od" ili "sastoje suštinski od" opisanih odlika.

[0050] U tekstu, sledeće skraćenice i izrazi imaju navedena značenja: PI3-K = Fosfoinozitid 3-kinaza; PI = fosfatidilinozitol.

[0051] Skraćenice upotrebljene u ovom tekstu imaju značenja uobičajena u okviru hemijske i biološke struke, osim ukoliko je drugačije naznačeno.

[0052] Izraz "efikasna količina" ili "terapijski efikasna količina" odnosi se na količinu jedinjenja opisanog u ovom tekstu, koja je dovoljna za ispunjenje namene, uključujući, ali ne ograničavajući se na lečenje bolesti, kako je dole definisano. Terapijski efikasna količina može varirati u zavisnosti od nameravanog načina primene (in vitro ili in vivo), ili stanja subjekta i bolesti koja se leči, npr., težine i starosti subjekta, jačine bolesti, načina primene i slično, što lako može da odredi prosečno obučeni stručnjak u oblasti. Izraz se takođe odnosi na dozu koja će indukovati određeni odgovor u ciljnim ćelijama, npr., smanjenje adhezije pločica i/ili ćelijske migracije. Specifična doza će varirati u zavisnosti od određenog odabranog jedinjenja, režima doziranja koji se prati, da li se jedinjenje primenjuje u kombinaciji sa drugim jedinjenjima, vremena primene, tkiva na koje se primenjuje i fizičkog sistema za dostavu koji ga nosi.

[0053] U ovom tekstu, izrazi „lečenje“ i „tretman" odnose se na pristup za dobijanje korisnih ili željenih rezultata, uključujući, ali ne ograničavajući se na terapijsku korisnost i/ili profilaktičku korisnost. Pod terapijskom korisnošću misli se na iskorenjivanje ili ublažavanje poremećaja koji se leči. Isto tako, terapijska korisnost se postiže iskorenjivanjem ili ublažavanjem jednog ili više fizioloških simptoma udruženih sa osnovnim poremećajem, tako da se kod pacijenta zapazi poboljšanje uprkos tome što on i dalje može biti pogođen osnovnim poremećajem. Da bi se ostvarila profilaktička korisnost, smeše mogu da se primenjuju kod pacijenta koji je pod rizikom za razvijanje određene bolesti ili kod pacijenta koji saopštava jedan ili više fizioloških simptoma bolesti, čak i ako dijagnoza date bolesti još nije postavljena.

[0054] "Terapijski efekat" kao izraz koji se koristi u ovom tekstu, obuhvata terapijsku korisnost i/ili profilaktičku korisnost, kako je gore opisano. Profilaktički efekat uključuje odlaganje ili eliminisanje pojave bolesti ili stanja, odlaganje ili eliminisanje ispoljavanja simptoma bolesti ili stanja, usporavanje, zaustavljanje ili reverziju napredovanja bolesti ili stanja, ili bilo koju njihovu kombinaciju.

[0055] Izraz "subjekt" ili "pacijent" odnosi se na životinju (npr., pas, mačka, konj ili svinja), kao što je sisar, na primer čovek. Metodi opisani u ovom tekstu mogu da se primenjuju i u lečenju ljudi i u veterini. U nekim primerima izvođenja, pacijent je sisar i u nekim primerima izvođenja, pacijent je čovek. U veterinarske svrhe, termin "subjekt" i "pacijent" uključuju, ali nisu ograničeni na, domaće životinje uključujući krave, ovce, svinje, konje i koze; životinje kućne ljubimce, kao što su psi i mačke; egzotične i / ili životinje u zoološkom vrtu; laboratorijske životinje, uključujući miševe, pacove, zečeve, zamorce i hrčke; i živina kao što su pilići, ćurke, patke i guske.

[0056] Izraz "selektivna inhibicija" ili "selektivno inhibira", kada se primenjuje na biološki aktivno sredstvo, odnosi se na sposobnost tog sredstva da selektivno smanjuje signalnu aktivnost cilja, u poređenju sa signalnom aktivnošću "mimo cilja", putem direktne ili indirektne interakcije sa ciljem.

[0057] Kao što je ovde korišćeno, termin "dvojni inhibitor delta (δ) i gama (γ) PI3-kinaze" uopšteno se odnosi na jedinjenje koje inhibira aktivnost i δ i γ izozima PI3-kinaze efikasnije od ostalih izozima iz porodice PI3K. Jedinjenje dualnog inhibitora δ i γ PI3-kinaze je stoga selektivnije za δ i γ PI3-kinazu od klasičnih PI3K inhibitora, kao što je CAL-130, vortmanin i LI294002, koji su "neselektivni inhibitori PI3K. "Primeri" dvojnog PI3-kinaza delta (δ) i gama (γ) inhibitora "uključuju, ali nisu ograničeni na, jedinjenja kao što su IPI-145 i jedinjenja otkrivena u Međunarodnim patentnim prijavama br. PCT / IB2010 / 002804, podneto 3. novembra 2010, i PCT / US2012 / 36594, podneto 4. maja 2012; Američkom patentu br. 12 / 938.609, podnet 3. novembra 2010, i 13 / 464.587, podnet 4. maja 2012, i jedinjenjima koja su otkrivena u međunarodnim br. VO 2009/088986, VO 2009/088990, VO 2011/008302 i VO 2012/097000.

[0058] Na primer, dvojni selektivni inhibitor δ i γ PI3-kinaze može da se odnosi na jedinjenje koje pokazuje 50% inhibitorne koncentracije (IC50) u odnosu na delta i gama tipa I PI3-kinaze koja je najmanje 10 puta veća, najmanje 20 puta, najmanje 50 puta ili najmanje 100 puta niža od IC50 inhibitora u odnosu na ostale vrste PI3 kinaza (tj. alfa i beta).

[0059] Inhibicija PI3-kinaze δ i γ može biti terapijski korisna za lečenje različitih stanja, npr., stanja koja se karakterišu inflamatornim odgovorom, uključujući, ali ne ograničavajući se na autoimune bolesti, alergijske bolesti i artritisne bolesti. Važno je da inhibicija funkcije PI3-kinaze δ i γ izgleda da ne utiče na biološke funkcije kao što su vijabilnost i fertilitet.

[0060] "Inflamatorni odgovor", kako se ovde koristi, karakteriše se crvenilom, povišenom temperaturom, otokom i bolom (tj., inflamacijom) i tipično uključuje povredu ili destrukciju tkiva. Inflamatorni odgovor je obično lokalizovan zaštitni odgovor podstaknut povredom ili destrukcijom tkiva, koji služi da uništi, razblaži ili izoluje (sekvestrira) sredstvo koje je izazvalo povredu i povređeno tkivo. Inflamatorni odgovori su jasno udruženi sa influksom leukocita i/ili hemotaksijom leukocita (npr., neutrofila). Inflamatorni odgovori mogu biti rezultat infekcije patogenim organizmima i virusima, mogu biti neinfektivnog porekla kao u slučaju traume ili reperfuzije posle infarkta miokarda ili moždanog udara, mogu biti rezultat imunog odgovora na strane antigene i autoimunih bolesti. Inflamatorni odgovori podložni lečenju postupcima i jedinjenjima prema pronalasku obuhvataju stanja udružena sa reakcijama specifičnog odbrambenog sistema kao i sa stanjima udruženim sa reakcijama sistema nespecifične odbrane.

[0061] Terapeutski postupci pronalaska obuhvataju postupke za lečenje stanja udruženih sa aktivacijom inflamatornih ćelija. "Aktivacija inflamatornih ćelija" odnosi se na indukovanje stimulusom (uključujući, ali ne ograničavajući se na citokine, antigene ili autoantitela) proliferativnog ćelijskog odgovora, proizvodnju rastvorljivih medijatora (uključujući, ali ne ograničavajući se na citokine, kiseonične radikale, enzime, prostanoide, ili vazoaktivne amine), ili ekspresiju na površini ćelije novih ili brojnijih medijatora (uključujući, ali ne ograničavajući se na antigene glavnog kompleksa histokompatibilnosti ili molekule ćelijske adhezije) u inflamatornim ćelijama (uključujući, ali ne ograničavajući se na monocite, makrofage, T-limfocite, B-limfocite, granulocite (polimorfonuklearne leukocite uključujući neutrofile, bazofile i eozinofile) mastocite, dendritske ćelije, Langerhansove ćelije i endotelne ćelije). Stručnjak u oblasti će razumeti da aktivacija jednog ili kombinacije navedenih fenotipova u ovim ćelijama može doprineti inicijaciji, održavanju ili pogoršanju zapaljenskog stanja.

[0062] "Autoimuna bolest", kako se ovde koristi, označava svaku grupu poremećaja u kojima je povreda tkiva udružena sa humoralnim ili ćelijama posredovanim odgovorom tela na sopstvene konstituente.

[0063] "Odbacivanje transplantata", kako se ovde koristi, označava svaki imuni odgovor usmeren protiv kalemljenog tkiva (uključujući organe ili ćelije (npr., kostna srž), koji se karakteriše gubitkom funkcije kalema i okolnih tkiva, bolom, otokom, leukocitozom i trombocitopenijom).

[0064] "Alergijsko oboljenje", kako se ovde koristi, označava sve simptome, oštećenje tkiva ili gubitak funkcije tkiva, koji su rezultat alergije.

[0065] "Artritisno oboljenje", kako se ovde koristi, označava sva oboljenja koja se karakterišu inflamatornim lezijama zglobova, koje se mogu pripisati različitim etiologijama.

[0066] "Dermatitis", kako se ovde koristi, označava sva iz velike familije kožnih oboljenja koja se karakterišu inflamacijom kože, koje se može pripisati različitim etiologijama.

[0067] Primer izvođenja je kompozicija koja sadrži dvojni PI3K delta i gama inhibitor (tj. the jedinjenje formule A, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so) i najmanje jedan kortikosteroid i izborno jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača ili ekscipijenata.

[0068] U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija uključuje terapeutski efikasnu količinu dvojnog PI3K delta i gama inhibitora (tj. jedinjenja formule A, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli) i najmanje jednog kortikosteroida, i izborno jednog ili više farmaceutski prihvatljivih nosača ili ekscipijenata. Farmaceutska kompozicija može uključivati jedan ili više dodatnih aktivnih sastojaka kao što je ovde opisano.

[0069] Farmaceutski nosači i/ili ekscipijenti mogu da se izabrati od razblaživača, potpornih supstanci, soli, dezintegrišućih sredstava, vezujućih sredstava, lubrikanata, klizajućih sredstava, sredstava za vlaženje, matriksa za kontrolisano oslobađanje, koloranata, sredstava za poboljšanje mirisa i ukusa, stabilizera, solubilizera i njihovih kombinacija.

[0070] Farmaceutske smeše predmetnog pronalaska mogu da se primene same ili u kombinaciji sa jednim ili više aktivnih sredstava. Po želji, predmetna jedinjenja i drugo sredstvo (sredstva) mogu se pomešati u preparatu ili se obe komponente mogu formulisati u različitim preparatima kako bi se koristile u kombinaciji zasebno ili u isto vreme.

[0071] dvojni PI3K delta i gama inhibitor i kortikosteroid mogu se primeniti zajedno ili na sekvencijalni način sa jednim ili više drugih aktivnih sredstava. Gde je poželjno, predmetna jedinjenja i drugo sredstvo (sredstva) mogu se zajedno primeniti ili se obe komponente mogu primeniti sekvencijalno da bi se koristile kao kombinacija.

[0072] Jedinjenja i farmaceutske smeše predmetnog pronalaska mogu da se primene bilo kojim putem koji omogućava da se jedinjenje dostavi na mesto delovanja, na primer, oralnim, intranazalnim, površinskim (npr., transdermalno), intraduodenalnim, parenteralnim (uključujući intravenski, intraarterijski, intramuskularni, intravaskularani, intraperitonealni put ili injekcijom ili infuzijom), intradermalnim, intramamarnim, intratekalnim, intraokularnim, retrobulbalnim, intrapulmonalnim (npr., aerosolizovani lekovi) ili subkutanim putem (uključujući depo primenu za dugotrajno oslobađanje npr., ugrađivanje ispod slezinske kapsule, u mozak ili korneu), sublingvalnim, analnim, rektalnim, vaginalnim putem, ili hirurškom implantacijom (npr., ugrađivanje ispod slezinske kapsule, u mozak ili korneu).

[0073] Smeše mogu da se primene u čvrstoj, polučvrstoj, tečnoj ili gasovitoj formi ili mogu biti u vidu suvog praška, na primer u liofilizovanoj formi. Farmaceutske smeše mogu da se pakuju u forme pogodne za dostavu, uključujući, na primer, čvrste dozne forme kao što su kapsule, saketi, kašeti, želatini, papiri, tablete, supozitorije, peleti, pilule, troheje i lozenge. Tip pakovanja će uopšteno zavisiti od željenog puta primene. Implantabilne formulacije sa dugotrajnim oslobađanjem takođe se razmatraju, kao i transdermalne formulacije.

[0074] Učestalost doziranja jedinjenja može varirati. Na primer, dvojni PI3K delta i gama inhibitor se može primeniti sa učestalošću u opsegu od dva puta na dan do jednom svake tri nedelje. Kortikosteroid se može primeniti sa učestalošću u opsegu od dva puta na dan do jednom svake tri nedelje.

[0075] Količina jedinjenja koja će se primeniti zavisi od sisara koji se leči, jačine poremećaja ili stanja, stope primene, raspoloživosti jedinjenja i diskrecije ordinirajućeg lekara. Međutim, efikasna doza je u opsegu od oko 0.001 do oko 100 mg po kg telesne težine na dan, poželjno oko 1 do oko 35 mg/kg/dan, u jednoj ili podeljenim dozama. Za čoveka težine 70 kg, ova količina bi iznosila oko 0.05 do 7 g/dan, poželjno oko 0.05 do oko 2.5 g/dan. Efikasna količina jedinjenja pronalaska može da se primeni u vidu jedne ili više doza (npr dva ili tri puta dnevno).

[0076] U jednom primeru izvođenja, farmaceutske kompozicije opisane ovde sadrže od oko 0.001 mg do oko 1000 mg, kao što je od oko 0.01 mg do oko 500 mg ili od 0.010 mg do oko 250 mg ili od oko 0.030 mg do oko 125 mg dvojnog PI3K delta i gama inhibitora (tj. jedinjenja formule A, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli) i/ili od oko 0.001 mg do oko 1000 mg, kao što je od oko 0.01 mg do oko 500 mg ili od oko 0.010 mg do oko 250 mg ili od oko 0.010 mg do oko 125 mg ili od oko 0.030 mg do oko 50 mg najmanje jednog kortikosteroida.

[0077] U jednom primeru izvođenja, farmaceutske kompozicije opisane ovde sadrže dvojni PI3K delta i gama inhibitor i kortikosteroid u odnosu od između oko 100:1 i oko 1:100 po težini, kao što je između oko 50: 1 i oko 1: 50 po težini ili između oko 1: 10 i oko 10: 1 po težini, ili između oko 1: 5 i oko 5: 1 po težini.

[0078] Izraz "istovremena primena", "primenjen u kombinaciji sa", i njihovi gramatički ekvivalenti, kako se ovde koristi, obuhvata primenu dva ili više agensa (kao što su dvojni PI3K delta i gama inhibitor i kortikosteroid) životinji tako da su i agensi i/ili njihovi metaboliti prisutni u životinji istovremeno. Istovremena primena uključuje istovremeno davanje u odvojenim kompozicijama, primenu u različito vreme u odvojenim kompozicijama ili primenu u kompoziciji u kojoj su prisutna oba sredstva.

[0079] Ovde opisane farmaceutske kompozicije mogu sadržati jedan ili više kortikosteroida izabranih od deksametazona, betametazona, prednizolona, metil prednizolona, prednizona, hidrokortizona, flutikazona, triamcinolona, budezonida ili kortizon prednizolona, metilprednizolona, naflokorta, deflazakorta, halopredon acetata, budezonida, beklometazon dipropionata, hidrokortizona, triamcinolon acetonida, fluocinolon acetonida, fluocinonida, klokortolon pivalata, metilprednizolon aceponata, deksametazon palmitoata, tipredana, hidrokortizon aceponata, prednikarbata, alklometazon dipropionata, halometazona, metilprednizolon suleptanata, mometazon furoata, rimekzolona, prednizolon farnesilata, ciklezonida, deprodon propionata, flutikazon propionata, halobetazol propionata, loteprednol etabonata, betametazon butirat propionata, flunizolida, prednizona, deksametazon natrijum fosfata, triamcinolona, betametazon 17-valerata, betametazona, betametazon dipropionata, hidrokortizon acetata, hidrokortizon natrijum sukcinata, prednizolon natrijum fosfata, hidrokortizon probutata, i bilo koje kombinacije prethodno navedenog.

[0080] U određenim primerima izvođenja, kortikosteroid je izabran od deksametazona, betametazona, prednizolona, metil prednizolona, prednizona, hidrokortizona, flutikazona, triamcinolona, budezonida ili kortizona, i bilo koje njihove kombinacije.

[0081] Poseban primer izvođenja predmetnog pronalaska odnosi se na farmaceutske kompozicije gde kortikosteroid je is flutikazon.

[0082] Sledeći poseban primer izvođenja predmetnog pronalaska odnosi se na farmaceutske kompozicije gde kortikosteroid je budezonid.

[0083] Sledeći poseban primer izvođenja predmetnog pronalaska odnosi se na farmaceutske kompozicije gde kortikosteroid je prednizolon.

[0084] Sledeći poseban primer izvođenja predmetnog pronalaska odnosi se na farmaceutske kompozicije gde kortikosteroid je deksametazon.

[0085] Sledeći primer izvođenja predmetnog pronalaska odnosi se na postupak za tretiranje indikacije izabrane od respiratornih bolesti i stanja kao što su bolesti vazdušnih puteva i pluća koje su praćene sa povećanom ili izmenjenom proizvodnjom sluzi i/ili inflamatorne i/ili opstruktivne bolesti vazdušnih puteva kao što su akutni bronhitis, hronični bronhitis, hronični opstruktivni bronhitis (COPD), kašalj, emfizem pluća, alergijski ili ne-alergijski rinitis ili sinuzitis, hronični sinuzitis ili rinitis, nazalni polipi, hronični rinosinuzitis, akutni rinosinuzitis, astma, alergijski bronhitis, alveolitis, Farmer-ova bolest, hiper-reaktivni vazdušni putevi, bronhitis ili pneumonitis izazvan infekcijom, npr. sa bakterijama ili virusima ili helmintima ili gljivama ili protozoama ili drugim patogenima, pedijatrijska astma, bronhiektazija, plućna fibroza, sindrom respiratornog distresa kod odraslih, bronhijalni i plućni edem, bronhitis ili pneumonitis ili intersticijalni pneumonitis različitog porekla, npr. aspiracija, udisanje toksičnih gasova, isparenja, bronhitis ili pneumonitis ili intersticijalni pneumonitis izazvan zastojem srca, rendgenskim zracima, zračenjem, hemoterapijom, bronhitis ili pneumonitis ili intersticijalni pneumonitis povezan sa kolagenozom, npr. eritemski lupus, sistemska skleroderma, fibroza pluća, idiopatska plućna fibroza (IPF), intersticijalna bolest pluća ili intersticijalni pneumonitis različitog porekla, uključujući azbestozu, silikozu, M. Boeck ili sarkoidozu, granulomatozu, cističnu fibrozu ili mukoviscidozu, ili nedostatak a-1-antitripsina; ili izabrana od upalnih bolesti i stanja kao što su upalna oboljenja gastrointestinalnog trakta različitog porekla, kao što su upalni pseudopolipi, Crohn-ova bolest, ulcerozni kolitis, upalna oboljenja zglobova, kao što su reumatoidni artritis ili alergijska upalna oboljenja oro-nazofarinksa, kože ili očiju, kao što je atopijski dermatitis, sezonski i višegodišnji, hronična uritkarija, osipi nepoznatog uzroka i alergijski konjuktivitis; a posebno izabrani od astme, alergijskog i nealergijskog rinitisa, COPD i atopijskog dermatitisa; koji obuhvata davanje terapeutski efikasne količine farmaceutske kompozicije prema predmetnom pronalasku pacijentu kome je potrebno.

[0086] Sledeći primer izvođenja predmetnog pronalaska odnosi se na upotrebu farmaceutske kompozicije prema predmetnom pronalasku za pravljenje medikamenta za lečenje respiratornih i/ili inflamatornih bolesti i stanja, naročito tamo gde su respiratorne i/ili inflamatorne bolesti ili stanja izabrani od astme, alergijskog i ne-alergijskog rinitisa, COPD i atopijskog dermatitisa.

[0087] Sledeći primer izvođenja predmetnog pronalaska odnosi se na upotrebu farmaceutske kompozicije prema bilo kom primeru izvođenja datom ovde, za upotrebu u tretmanu respiratornih i/ili inflamatornih bolesti i stanja, naročito tamo gde su respiratorne i/ili inflamatorne bolesti ili stanja izabrani od astme, alergijskog i ne-alergijskog rinitisa, COPD i atopijskog dermatitisa.

[0088] Predmetni pronalazak je sada dodatno ilustrovan sledećim, neograničavajućim, primerima.

PRIMERI

[0089] U nastavku su obezbeđeni ilustrativni primeri kombinacije PI3K delta i gama dvojnog inhibitora formule A i kortikosteroida.

Primer 1: TGF-β1 indukovana neosetljivost na kortikosteroid u A549 ćelijama

Procedura testa

[0090] A549 ćelije su tripsinizovane i 2∗10<4>ćelija po bunarčiću je zasejano na ploču sa 96 bunarčića i inkubirano na 37° C i 5% CO2.

[0091] Medijum je uklonjen i dodato je 100 µl medijuma bez seruma sa 0.1 µM Jedinjenja A i inkubirano je 30 min.

[0092] Dodato je 50 µl 3X TGF-β1 u F12K sa 0.5% BSA tako da je finalna koncentracija bila 400 pM i inkubirana na 37° C i 5% CO24 h.

[0093] 50 µl 4X željenih koncentracija deksametazona (Dex) je dodato u toku 45 min na 37°C i 5% CO2.

[0094] Dodato je 50 µl 5X koncentracije TNF-α tako da je finalna koncentracija bila 1 ng/ml da bi se indukovao IL-8 i inkubirano je 24 h.

[0095] Supernatant je sakupljen i IL-8 je procenjen sa ELISA.

Citokinski test

[0096] IL-8 trake su postavljene sa svežim ili odmrznutim supernatantima i inkubirane na sobnoj temperaturi 2 h ili preko noći na 4° C.

[0097] Sadržaji su odbačeni i trake su isprane sa 200 µl pufera za ispiranje po bunarčiću 15 s ukupno 5 puta.

[0098] Trake su osušene blotovanjem i dodato je 100 µl po bunarčiću 1X detekcionog antitela na sobnoj temperaturi 1 h.

[0099] Sadržaji su odbačeni i trake su isprane sa 200 µl pufera za ispiranje po bunarčiću 15 s ukupno 5 puta.

[0100] Trake su osušene blotovanjem i dodato je 100 µl po bunarčiću 1X Avidin-HRP antitela i inkubirano na sobnoj temperaturi 30 min.

[0101] Sadržaji su odbačeni i trake su isprane sa 200 µl pufera za ispiranje po bunarčiću 15 s ukupno 5 puta.

[0102] Dodato je 100 µl po bunarčiću TMB supstrata i inkubirano na sobnoj temperaturi 5-15 min.

[0103] Reakcija je zaustavljena dodavanjem 50 µl po bunarčiću 2N H2SO4.

[0104] Apsorbanca je očitana na čitaču ploča na A450 nm i A570 nm.

[0105] % inhibicije za vrednosti apsorbance od kojih je oduzeta vrednost za blanko određene su na osnovu kontrolnih bunarčića. Podaci su plotovani korišćenjem GraphPad Prism (Version 5.02).

Rezultati

[0106] Rezultati su prikazani na Slici 1A. Jedinjenje A (Cpd A) smanjilo je IC50deksametazona za IL-8 koncentracije u TGF-β1 tretiranim A549 ćelijama ukazujući na značajnu potencijaciju aktivnosti deksametazona.

Primer 2: Neosetljivost na kortikosteroid izazvana sa H2O2 u U937 ćelijama Procedura testa

[0107] U937 ćelije su održavane u RPMI-1640 sa 15 mM glutaminom.6∗10<6>ćelija je uzeto u T-25 bocu sa 12 ml svežeg medijuma i tretirano sa 1 µM Jedinjenja A i inkubirano na 37° C i 5% CO230 min.

[0108] Prethodno pomenutim ćelijama dodat je H2O2u finalnoj koncentraciji od 200 µM i inkubirano je 2 h.

[0109] Ćelije su istaložene i resuspendovane u medijumu bez seruma i zasejane na ploču sa 96 bunarčića sa 0.15∗10<6>ćelija po bunarčiću u 100 µl.

[0110] Dodato je 50 µl 3X deksametazona na željenim koncentracijama i inkubirano 45 min.

[0111] Dodato je 50 µl 4X koncentracije TNF-α tako da je finalna koncentracija bila 10 ng/ml, da bi se indukovao IL-8 i inkubirano 18 h.

[0112] Supernatant je sakupljen i IL-8 je procenjen sa ELISA.

Citokinski test

[0113] IL-8 trake su postavljene sa svežim ili odmrznutim supernatantima i inkubirane na sobnoj temperaturi 2 h ili preko noći na 4° C.

[0114] Sadržaji su odbačeni i trake su isprane sa 200 µl pufera za ispiranje po bunarčiću 15 s ukupno 5 puta.

[0115] Trake su osušene blotovanjem i dodato je 100 µl po bunarčiću 1X detekcionog antitela na sobnoj temperaturi 1 h.

[0116] Sadržaji su odbačeni i trake su isprane sa 200 µl pufera za ispiranje po bunarčiću 15 s ukupno 5 puta.

[0117] Trake su osušene blotovanjem i dodato je 100 µl po bunarčiću 1X Avidin-HRP antitela i inkubirano na sobnoj temperaturi 30 min.

[0118] Sadržaji su odbačeni i trake su isprane sa 200 µl pufera za ispiranje po bunarčiću 15 s ukupno 5 puta.

[0119] Dodato je 100 µl po bunarčiću TMB supstrata i inkubirano na sobnoj temperaturi 5-15 min.

[0120] Reakcija je zaustavljena dodavanjem 50 µl po bunarčiću 2N H2SO4.

[0121] Apsorbanca je očitana na čitaču ploča na A450 nm i A570 nm.

Rezultati

[0122] Kao što je prikazano na Slici 1B, Jedinjenje A (Cpd A) smanjilo je IC50deksametazona (Dex) na IL-8 koncentracijama u H2O2tretiranim U937 ćelijama ukazujući na značajnu potencijaciju aktivnosti deksametazona.

Primer 3: Infiltracija ćelija izazvana hroničnim izlaganjem dimu cigarete u Male Balb/c miševima

[0123] Životinje su aklimatizovane sedam dana pre početka eksperimenta. Životinje su slučajnim izborom raspoređene u različite grupe na osnovu njihovih telesnih težina. Miševi su izloženi struji dima od 2 cigarete takom dana 1 do dana 11. Izlaganje dimu svake cigarete je trajalo 10 min (svaka cigareta je potpuno sagorela u prva dva minuta, nakon čega je sledila sa struja sa ventilatorom za životinje) i izloženi su sledećih 20 min svežem vazduhu prostorije. Nakon svake druge cigarete napravljena je dodatna pauza od 20 min sa izlaganjem svežem vazduhu prostorije. Kontrolne životinje su izložene vazduhu komore u prostoriji. Test jedinjenje je primenjeno intranazalnim putem kao suspenzija od dana 12 do dana 14, 30 minuta pre izlaganja celog tela dimu. Miševi su izlagani struji dima od 1 cigarete od dana 12 do dana 14. Na dan 15, 24 časa nakon izlaganja dimu poslednje cigarete (CS) životinjama je izvučena krv pod anestezijom, i stavljena je kanila u dušnik i izvršena je lavaža pluća sa 0.5 ml alikvotama heparinizovanog PBS (1 jedinica/ml) četiri puta kroz trahealnu kanilu (ukupna zapremina 2 ml). Sakupljeni bronhioalveolar (BAL) je uskladišten na 2-8 °C do testa za određivanje ukupnog broja ćelija i diferencijalni broj leukocita. BAL fluid je centrifugiran (5003g 10 min) i rezultujući ćelijski pelet je resuspendovan u 0.5 ml heparinizovanog fiziološkog rastvora. Ukupna broj belih krvnih ćelija je određen u BAL fluid i krvi korišćenjem brojača krvnih ćelija i podešen na 1x10<6>ćelija/ml. Diferencijalni broj ćelija je izračunat ručno. Četrdeset mikrolitara ćelijske suspenzije je centrifugirano korišćenjem cytospin 3 da bi se pripremio krvni razmaz. Krvni razmaz je obojen sa rastvorom za bojenje krvi za diferencijaciju i mikroskopski je posmatran identifikacijom svake ćelije prema njenim morfološkim karakteristikama. Broj ćelija svakog tipa među 300 belih krvnih ćelija u ćelijskom razmazu određen je i izražen kao procenat, i broj neutrofila i makrofaga u svakom BAL fluidu je izračunat. Dodatno BAL supernatant je analiziran u odnosu na različite citokine korišćenjem ELISA testa.

[0124] Rezultati su prikazani u Tabeli 1 i Slikama 2A i 2B.

[0125] Sve životinje su preživele do zakazane terminacije. Jedinjenje A je pokazalo značajan korisni terapeutski efekat u ustanovljenom mišjem modelu hroničnog COPD kao što je određeno procenom broja ćelija u BAL. Infiltracija makrofaga u BAL fluid sa tretiranim životinjama značajno se razlikovala od bolesne kontrole sa značajnim smanjenjima (prema normali) BAL broja ćelija koje su uočene kod miševa tretiranih sa Jedinjenjem A (0.003-3 mg/kg) na dozno zavisni način. Broj makrofaga je bio značajno smanjen prema normalnom broju za miševe kojima je dato 0.003-3 mg/kg Jedinjenja A. Procenti inhibicije citokina dati su Tabeli 1.

Primer 4: Reverzija neosetljivosti na kortikosteroid kod ćelijske infiltracije izazvane hroničnom primenom dima cigarete kod mužjaka Balb/c miševa

[0126] Životinje su aklimatizovane sedam dana pre početka eksperimenta. Životinje su slučajnim izborom raspoređene u različite grupe na osnovu njihovih telesnih težina. Miševi su izloženi struji dima od 2 cigarete takom dana 1 do dana 11. Izlaganje dimu svake cigarete je trajalo 10 min (svaka cigareta je potpuno sagorela u prva dva minuta, nakon čega je sledila sa struja sa ventilatorom za životinje) i izloženi su sledećih 20 min svežem vazduhu prostorije. Nakon svake druge cigarete napravljena je dodatna pauza od 20 min sa izlaganjem svežem vazduhu prostorije. Kontrolne životinje su izložene vazduhu komore u prostoriji. Kortikosteroid, flutikazon je primenjen intranazalnim putem od dana 6 do dana 11 pre 30 minutnog izlaganja celog tela dimu. Miševi su izloženi struji dima 1 cigarete od dana 12 do dana 14. Test jedinjenje je primenjeno intranazalnim putem kao suspenzija od dana 12 do dana 14 pre 30 minutnog izlaganja celog tela dimu. Na dan 15, 24 časa nakon izlaganja dimu (CS) poslednje cigarete životinje su iskrvarene pod anestezijom, i stavljena je kanila u dušnik i izvršena je lavaža pluća sa 0.5 ml alikvotama heparinizovanog PBS (1 jedinica/ml) četiri puta kroz trahealnu kanilu (ukupna zapremina 2 ml). Sakupljeni bronhioalveolar (BAL) je uskladišten na 2-8 °C do testa za određivanje ukupnog broja ćelija i diferencijalni broj leukocita. BAL fluid je centrifugiran (5003g 10 min) i rezultujući ćelijski pelet je resuspendovan u 0.5 ml heparinizovanog fiziološkog rastvora. Ukupna broj belih krvnih ćelija je određen u BAL fluid i krvi korišćenjem brojača krvnih ćelija i podešen na 1x106 ćelija/ml. Diferencijalni broj ćelija je izračunat ručno. Četrdeset mikrolitara ćelijske suspenzije je centrifugirano korišćenjem cytospin 3 da bi se pripremio krvni razmaz. Krvni razmaz je obojen sa rastvorom za bojenje krvi za diferencijaciju i mikroskopski je posmatran identifikacijom svake ćelije prema njenim morfološkim karakteristikama. Broj ćelija svakog tipa među 300 belih krvnih ćelija u ćelijskom razmazu određen je i izražen kao procenat, i broj neutrofila i makrofaga u svakom BAL fluidu je izračunat. Dodatno BAL supernatant je analiziran u odnosu na različite citokine korišćenjem ELISA testa.

[0127] U kombinaciji sa flutikazonom (FLT), Jedinjenje A pokazalo je značajan koristan terapeutski efekat i reverziju neosetljivosti na kortikosteroid pokazujući sinergistički efekat na infiltraciju makrofaga. ED50kombinacije bila je 0.021 mg/kg u ustanovljenom mišjem modelu hronične COPD kao što je određeno procenom broja ćelija u BAL u poređenju sa ED50od 0.093 mg/kg samog Jedinjenja A. Rezultati su takođe prikazani na Slikama 3A i 3B.

Primer 5: Opšti opis koji se odnosi na identifikaciju pacijenta, izolaciju neutrofila i pripremu ekstrakta dima cigarete (CSE) za in-vitro testiranje Jedinjenja A

A. Izbor pacijenta

[0128] Zdravi subjekti i COPD pacijenti su uključeni u eksperimente sa leukocitima. Testovi plućne funkcije (nametnuta spiromertija) i merenja gasova u arterijskoj krvi izvedeni su tokom dana pre uzorkovanja. Prema njihovim spirometrijskim rezultatima i pušačkim navikama, pacijenti su klasifikovani u dve grupe: A) Zdravi subjekti, pacijenti sa normalnom plućnom funkcijom i koji nisu pušili; B) COPD, pacijenti koji su pušili više od 10 paklica – godina i sa opstrukcijom vazdušnih puteva koja je dokazana nametnutom ekspiratornom zapreminom u 1 s (FEV1) od <80% predviđene i FEV1 odnosom nametnutog vitalnog kapaciteta (FVC) od <70%. Kliničke karakteristike pacijenata su obezbeđene u Tabeli 2.

Tabela 2: Kliničke karakteristike. COPD: hronična opstruktivna plućan bolest; FEV1: nametnuta ekspiratorna zapremina u jednoj sekundi; FVC: nametnuti vitalni kapacitet; Paklica-god = 1 godina pušenja 20 cigareta na dan. Podaci su srednje vrednosti ± SE.

[0129] Periferni neutrofili i monociti kao i cela krv dobijena je od 8 pacijenata sa COPD, definisanih prema GOLD uputstvima i 7 zdravih subjekata. Pacijenti su bili starosti od 65.1 ± 14 godina, FEV158.2 ± 3 % predviđeno. Svi pacijenti su aktivni pušači. Nije bilo pogoršanja bolesti unutar 2 nedelje pre uzimanja uzoraka krvi.

[0130] 7 kontrolnih subjekata nepušača odgovarajuće starosti sa normalnom funkcijom pluća (starost 66.1 ± 6 godina, FEV1 98 ± 3 % predviđena) koji nisu imali nikakvu respiratornu bolest, su takođe regrutovani kao normalne kontrole, respektivno. Rutinski testovi plućne funkcije su izvedeni da bi se procenio nametnuti vitalni kapacitet (FVC), nametnuta ekspiratorna zapremina u 1 s (FEV1) i FEV1/FVC odnos korišćenjem Vitalograph® alpha III spirometra (Vitalograph, Maids Moreton, UK). Ovaj projekat je odobren od strane lokalne etičke komisije Opšte univerzitetske bolnice, Valensija, Španija, i pisana saglasnost je uzeta od svakog pacijenta ili volontera pre počeka uzorkovanja krvi i testiranja plućne funkcije.

B. Izolacija humanih neutrofila

[0131] Neutrofili su izolovani iz periferne venske krvi standardnim laboratorijskim procedurama. Ukratko, periferna venska krv je mešana sa dextran 500 na 3% (u 0.9% fiziološkom rastvoru) u odnosu od 2:1. Ova smeša je inkubirana na sobnoj temperaturi 30 min do sedimetacije eritrocita. Gornja faza je pažljivo sakupljena i dodata na Ficoll-Paque Histopaque 1077 (Amershan Pharmacia Biotech, Barcelona, España) gradijent gustine u odnosu 3:1. Dve stvorene faze su centrifugirane na 150 g, 4°C 30 min. Tako dobijeni pelet (koji se sastojao od smeše neutrofila i niskog odnosa rezidualnih eritrocita i tragova eozinofila i bazofila) je resuspendovan u puferu za liziranje eritrocita (Biolegend, UK) 5 min u ledu. Ćelijska suspenzija je isprana dva puta sa fosfatnim puferom (PBS). Preparati su bili >97% čisti u odnosu na neutrofile što je procenjeno Giemsa bojenjem, i imali su vijabilnost od >99%, mereno sa isključivanjem sa tripan plavim. Ni čistoća ni vijabilnost nije promenjena u različitim eksperimentalnim uslovima studije.

C. Priprema rastvora ekstrakta dima cigarete

[0132] CSE je pripremljen kao što sledi: Ukratko, dim istraživačke cigarete (2R4F; Tobacco Health Research, University of Kentucky, KY, USA) stvoren je respiratornom pumpom (Apparatus Rodent Respirator 680; Harvard, Germany) preko puf mehanizma koji je srodan obrascu pušenja kod ljudi (3 puf/min; 1 puf 35 ml; svaki puf od 2 s trajanja sa 0.5 cm iznad filtera) i barbotiran je u bocu koja sadrži 25 ml prethodno zagrejanog (37°C) Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medijuma kulture. CSE rastvor je sterilizovan filtracijom kroz 0.22-µm sistem za sterilizaciju sa celuloza acetatom (Corning, NY). Rezultujući CSE rastvor je smatran 100% CSE i korišćen je za eksperimente unutar 30 min od pripreme. CSE 10% približno odgovara izlaganju povezanom sa pušenjem dve paklice na dan. Kvalitet pripremljenog CSE rastvora procenjen je na osnovu apsorbance na 320 nm, što je specifična apsorpciona talasna dužina peroksinitrita. Korišćeni su stok rastvori sa vrednošću apsorbance od 3.0 ± 0.1. Da bi se testirala citotoksičnost od CSE, izolovani neutrofili su tretirani sa CSE koncentracijama od do 5% 24 h. Nije bilo značajne razlike u nivou supernatanta laktat dehidrogenaze (test citotoksičnosti laktat dehidrogenaze; Cayman, Spain) u poređenju sa kontrolnom grupom (podaci nisu prikazani).

Primer 6

Test: Efekat Jedinjenja A, deksametazona i njihove kombinacije na izlučivanje inflamatornog markera IL-8 indukovanog sa CSE u neutrofilima periferne krvi od zdravih nepušača i COPD pušača pacijenata.

[0133] Izolovani humani neutrofili od zdravih volontera i COPD pacijenata su inkubirani sa Jedinjenjem A (0.01 nM-100 µM) i deksametazonom (0,1 nM-1 µM) ili vehikulumom 30 minuta pre inkubacije sa ili bez CSE 5% 6 časova pri standardnim uslovima za ćelijsku kulturu (37°C i 5% CO2). Supernatanti su sakupljeni da bi se izmerili različiti inflamatorni markeri.

[0134] IL-8 je meren sa ELISA korišćenjem komercijalno dostupnog kompleta.

[0135] Eksperimenti su urađeni u triplikatu u skoro tri pacijenta po eksperimentalnom uslovu.

[0136] Neutrofili od zdravih i COPD pacijenata su stimulisani sa CSE 5% u prisustvu Jedinjenja A (0.01 nM – 100 µM) ili deksametazona (DEX; 0.1 nM-1 µM) 6 h i mereni su IL-8 supernatanti. Inhibitorne krive u zavisnosti od koncentracije su prikazane na Slici 4 i u Tabeli 3.

Tabela 3. Inhibicija IL-8 oslobađanja u izolovanim neutrofilima periferne krvi od zdravih (N=3) i COPD pacijenata (N=3). Inhibitorne krive zavisne od koncentracije su stvorene inkubacijom sa Jedinjenjem A (Cpd A; 0.01 nM-100 µM) ili deksametazonom (DEX; 0.1 nM-1 µM) kao odgovor na ekstrakt dima cigarete (CSE 5%). Vrednosti su srednje vrednosti ± SEM od 3 nezavisna eksperimenta izvedena u triplikatu. IC50vrednosti za polu-maksimalnu inhibiciju su izračunate nelinearnom regresionom analizom. *p < 0.05 vs vrednosti za zdrave.

[0137] Dodavanje fiksnih koncentracija deksametazona 1 nM rastućim koncentracijama Jedinjenja A od 0.1 nM, 1 nM, i 10 nM, pokazalo je povećanja u inhibiciji CSE-indukovanog IL-8 oslobađanja u neutrofilima od COPD pacijenata (Slika 5).

[0138] Jedinjenje A na način zavisan od koncentracije je inhibiralo IL-8 sekreciju u neutrofilima od zdravih i COPD pacijenata sa maksimalnim procentom inhibicije od 97.4 ± 5.3% i 85.14 ± 8.24%, respektivno. Kao referenca, anti-inflamatorni deksametazon je pokazao poželjni inhibitorni profil na CSE-indukovano IL-8 oslobađanje samo u neutrofilima od zdravih pacijenata sa maksimalnim procentom inhibicije od 83.9 ± 10%. Međutim u neutrofilima od COPD pacijenata, deksametazon nije bio u stanju da značajno inhibira IL-8 oslobađanje pokazujući profil neosetljivosti na kortikosteroid.

Primer 7

Test: Efekat Jedinjenja A na bazalnu ekspresiju RNK medijatora rezistencije na kortikosteroid i PI3K izoformi korišćenjem neutrofila iz periferne krvi od zdravih nepušača i COPD pušača pacijenata

[0139] Merenje bazalne RNK ekspresije medijatora rezistencije na kortikosteroid:

Ukupna RNK je izolovana iz perifernih humanih neutrofila iz COPD pacijenata u bazalnim uslovima i nakon eksperimentalnih uslova. Ćelije su homogenizovane i RNK je ekstrahovana korišćenjem TriPure® Isolation Reagent (Roche, Indianapolis, USA). Reverzna transkripcija je izvedena u 300 ng od ukupne RNK sa TaqMan reverse transcription reagents kit (Applied Biosystems, Perkin-Elmer Corporation, CA, USA). 1.5 µl rezultujuće cDNK je amplifikovan sa specifičnim predizajniranim prajmerima (Applied Biosystems) za MIF (cat no. Hs00236988), MKP-1 (cat no. Hs00610256), PI3K-δ (cat no. Hs00192399), PI3Kγ (cat no. Hs00277090) i GAPDH (cat no.4310884E) kao endogene kontrole u 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystem) korišćenjem Universal Master Mix (Applied Biosystems). Relativna kvantifikacija ovih različitih transkripata je određena sa 2-<ΔΔCt>postupkom i normalizovana prema kontrolnim grupama.

[0140] Ekspresija iRNK od MIF, MKP-1, PI3K-δ i PI3Kγ gena je merena u bazalnim uslovima i na kraju eksperimenata.

[0141] Eksperimenti su urađeni u triplikatu kod najmanje tri pacijenta po eksperimentalnom uslovu.

[0142] Rezultati: Ekspresija MIF nije bila značajno pogođena sa izlaganjem CSE ili Jedinjenju A. Nasuprot tome, CSE je smanjio ekspresiju MKP1 do približno 0.4-puta u odnosu na kontrolu. Jedinjenje A je povećalo ekspresiju MKP1 blizu kontrolnih nivoa što je u dobroj korelaciji sa inhibitornim efektom Jedinjenja A na oslobađanje IL-8. Videti Sliku 6. Dok PI3Kδ nije bila pogođena CSE tretmanom, primena Jedinjenja A izazvala je značajno smanjenje u CSE indukovanoj PI3Kγ ekspresiji (Slika 7).

Primer 8

Test: Efekat Jedinjenja A, deksametazona i njihove kombinacije na bazalnu ekspresiju PI3K izoformi korišćenjem neutrofila iz periferne krvi od zdravih nepušača i COPD pušača pacijenata.

[0143] Merenje Pi3K izoformi: Da bi se merila PI3K aktivnost, neutrofili od COPD pacijenata su izolovani i inkubirani sa Jedinjenjem A na 10 nM 1 h. Zatim su ćelije stimulisane sa CSE 5% 30 min. Nakon stimulacije ćelija, neutrofili su centrifugirani i ukupni protein je ekstrahovan iz neutrofila. Ukupna količina proteina je merena sa Bio-Rad assay (Bio-Rad Laboratories Ltd., Herts, UK) da bi se osigurala jednaka količina. PI3K aktivnost je merena korišćenjem PI3-Kinaza Activity ELISA: Pico (cat. No. k-1000s, Echelon Bioscience, Salt Lake City, USA) prema uputstvu proizvođača. Ukratko, PI3-K reakcije su izvedene sa Class I PI3-K fiziološkim supstratom PI(4,5)P2 (PIP2). Enzimske reakcije, PIP3 standardi i kontrole su zatim pomešani i inkubirani sa PIP3 vezujućim proteinom koji je visoko specifičan i senzitivan na PIP3. Ova smeša je zatim preneta na PIP3-obloženu mikroploču za kompetitivno vezivanje. Nakon toga, sekundarni detektor povezan sa peroksidazom i kolorimetrijska detekcija su korišćeni za detekciju količine PIP3 proizvedenog od strane PI3-K preko poređenja enzimskih reakcija sa PIP3 standardnom krivom.

[0144] Eksperimenti su izvedeni u triplikatu kod najmanje tri pacijenta po eksperimentalnom uslovu.

[0145] Rezultati: U neutrofilima od COPD pacijenata, CSE 5% je povećao PI3K aktivnost što je mereno kao proizvodnja PIP3. Dodavanje Jedinjenja A na 10 nM kompletno je suprimiralo PI3K aktivnost (Slika 8).

Claims (20)

1. Patentni zahtevi 1. Dvojni PI3K delta i gama inhibitor i kortikosteroid za upotrebu u tretmanu autoimune, respiratorne i/ili inflamatorne bolesti ili stanja, pri čemu postupak sadrži primenu na subjekta kome je to potrebno terapeutski efikasne količine (i) dvojnog PI3K delta i gama inhibitora, i (ii) kortikosteroida, naznačeno time da dvojni PI3K delta i gama inhibitor je jedinjenje formule A:

   ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
2. 2. Dvojni PI3K delta i gama inhibitor i kortikosteroid za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time da kortikosteroid je izabran iz grupe koja se sastoji od deksametazona, betametazona, prednizolona, metil prednizolona, prednizona, hidrokortizona, flutikazona, triamcinolona, budezonida ili kortizon prednizolona, metilprednizolona, naflokorta, deflazakorta, halopredon acetata, budezonida, beklometazon dipropionata, hidrokortizona, triamcinolon acetonida, fluocinolon acetonida, fluocinonida, klokortolon pivalata, metilprednizolon aceponata, deksametazon palmitoata, tipredana, hidrokortizon aceponata, prednikarbata, alklometazon dipropionata, halometazona, metilprednizolon suleptanata, mometazon furoata, rimekzolona, prednizolon farnesilata, ciklezonida, deprodon propionata, flutikazon propionata, halobetazol propionata, loteprednol etabonata, betametazon butirat propionata, flunizolida, prednizona, deksametazon natrijum fosfata, triamcinolona, betametazon 17-valerata, betametazona, betametazon dipropionata, hidrokortizon acetata, hidrokortizon natrijum sukcinata, prednizolon natrijum fosfata, hidrokortizon probutata, i njihovih farmaceutski prihvatljivih soli.
3. 3. Dvojni PI3K delta i gama inhibitor i kortikosteroid za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, naznačeno time da kortikosteroid je izabran iz grupe koja se sastoji od deksametazona, betametazona, prednizolona, metil prednizolona, prednizona, hidrokortizona, flutikazona, triamcinolona, budezonida, kortizona, i njihovih farmaceutski prihvatljivih soli.
4. 4. Dvojni PI3K delta i gama inhibitor i kortikosteroid za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, naznačeno time da kortikosteroid je izabran od deksametazona, flutikazona, i njihovih farmaceutski prihvatljivih soli.
5. 5. Dvojni PI3K delta i gama inhibitor i kortikosteroid za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, naznačeno time da terapeutski efikasna količina (i) dvostrukog PI3K delta i gama inhibitora, i terapeutski efikasna količina (ii) kortikosteroida su istovremeno primenjene kao kombinovana formulacija.
6. 6. Dvojni PI3K delta i gama inhibitor i kortikosteroid za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, naznačeno time da terapeutski efikasna količina (i) dvostrukog PI3K delta i gama inhibitora, i terapeutski efikasna količina (ii) kortikosteroida su primenjene sekvencijalno.
7. 7. Dvojni PI3K delta i gama inhibitor i kortikosteroid za upotrebu prema patentnom zahtevu 6, naznačeno time da terapeutski efikasna količina kortikosteroida je primenjena pre efikasne količine dvostrukog PI3K delta i gama inhibitora.
8. 8. Dvojni PI3K delta i gama inhibitor i kortikosteroid za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, naznačeno time da terapeutski efikasna količina PI3K delta i gama inhibitora je primenjena dva puta dnevno do jednom svake tri nedelje, i terapeutski efikasna količina kortikosteroida je primenjena dva puta dnevno do jednom svake tri nedelje.
9. 9. Dvojni PI3K delta i gama inhibitor i kortikosteroid za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 to 8, naznačeno time da autoimuna, respiratorna i/ili inflamatorna bolest ili stanje je izabrano iz grupe koja se sastoji od astme, hronične opstruktivne plućne bolesti, reumatoidnog artritisa, inflamatorne bolesti creva, glomerulonefritisa, neuro inflamatornih bolesti, multiple skleroze, uveitisa, psorijaze, artritisa, vaskulitisa, dermatitisa, osteoartritisa, inflamatorne bolesti mišića, alergijskog rinitisa, vaginitisa, intersticijalnog cistitisa, skleroderme, osteoporoze, ekcema, odbacivanja alogene ili ksenogene transplantacije grafta (organa, kostne srži, matičnih ćelija i drugih ćelija i tkiva), bolesti graft-protiv-domaćina, eritemskog lupusa, inflamatorne bolesti, dijabetesa Tipa I, plućne fibroze, dermatomiozitisa, Sjogren-ovog sindroma, tiroiditisa, miastenije gravis, autoimune hemolitičke anemije, cistične fibroze, idiopatske plućne fibroze (IPF), hroničnog relapsnog hepatitisa, primarne bilijarne ciroze, alergijskog konjuktivitisa, atopijskog dermatitisa, i njihovih kombinacija.
10. 10. Dvojni PI3K delta i gama inhibitor i kortikosteroid za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, naznačeno time da autoimuna, respiratorna i/ili inflamatorna bolest ili stanje je izabrano iz grupe koja se sastoji od astme, alergijskog rinitisa, ne-alergijskog rinitisa, reumatoidnog artritisa, hronične opstruktivne plućne bolesti, idiopatske plućne fibroze (IPF) i atopijskog dermatitisa.
11. 11. Dvojni PI3K delta i gama inhibitor i kortikosteroid za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10, naznačeno time da je svaki od dvostrukog PI3K delta i gama inhibitora i kortikosteroida primenjen u količini u opsegu od oko 0.01 mg do oko 1000 mg.
12. 12. Dvojni PI3K delta i gama inhibitor i kortikosteroid za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 11, naznačeno time da dvojni PI3K delta i gama inhibitor i kortikosteroid su primenjeni u odnosu od oko 1:100 do oko 100:1 po težini.
13. 13. Farmaceutska kompozicija koja sadrži (i) dvojni PI3K delta i gama inhibitor, (ii) kortikosteroid, i (iii) izborno, farmaceutski prihvatljiv nosač, klizajuće sredstvo, razblaživač, ili ekscipijent; naznačeno time da dvojni PI3K delta i gama inhibitor je jedinjenje formule A:

    ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
14. 14. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 13, naznačeno time da kortikosteroid je izabran iz grupe koja se sastoji od deksametazona, betametazona, prednizolona, metil prednizolona, prednizona, hidrokortizona, flutikazona, triamcinolona, budezonida ili kortizon prednizolona, metilprednizolona, naflokorta, deflazakorta, halopredon acetata, budezonida, beklometazon dipropionata, hidrokortizona, triamcinolon acetonida, fluocinolon acetonida, fluocinonida, klokortolon pivalata, metilprednizolon aceponata, deksametazon palmitoata, tipredana, hidrokortizon aceponata, prednikarbata, alklometazon dipropionata, halometazona, metilprednizolon suleptanata, mometazon furoata, rimekzolona, prednizolon farnesilata, ciklezonida, deprodon propionata, flutikazon propionata, halobetazol propionata, loteprednol etabonata, betametazon butirat propionata, flunizolida, prednizona, deksametazon natrijum fosfata, triamcinolona, betametazon 17-valerata, betametazona, betametazon dipropionata, hidrokortizon acetata, hidrokortizon natrijum sukcinata, prednizolon natrijum fosfata, hidrokortizon probutata, i njihovih farmaceutski prihvatljivih soli.
15. 15. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 13 ili patentnom zahtevu 14, naznačeno time da kortikosteroid je izabran iz grupe koja se sastoji od deksametazona, betametazona, prednizolona, metil prednizolona, prednizona, hidrokortizona, flutikazona, triamcinolona, budezonida, kortizona, i njihovih farmaceutski prihvatljivih soli.
16. 16. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 13 do 15, naznačeno time da kortikosteroid je izabran od deksametazona, flutikazona, i njihovih farmaceutski prihvatljivih soli.
17. 17. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 13 do 16, naznačeno time da kompozicija sadrži oko 0.01 mg do oko 1000 mg dvostrukog PI3K delta i gama inhibitora i oko 0.01 mg do oko 1000 mg kortikosteroida.
18. 18. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 13 do 17, za upotrebu u lečenju autoimune, respiratorne i/ili inflamatorne bolesti ili stanja izabranog iz grupe koja se sastoji od astme, hronične opstruktivne plućne bolesti, reumatoidnog artritisa, inflamatorne bolesti creva, glomerulonefritisa, neuro inflamatornih bolesti, multiple skleroze, uveitisa, psorijaze, artritisa, vaskulitisa, dermatitisa, osteoartritisa, inflamatorne bolesti mišića, alergijskog rinitisa, vaginitisa, intersticijalnog cistitisa, skleroderme, osteoporoze, ekcema, odbacivanja alogene ili ksenogene transplantacije grafta (organa, kostne srži, matičnih ćelija i drugih ćelija i tkiva), bolesti graft-protiv-domaćina, eritemskog lupusa, inflamatorne bolesti, dijabetesa Tipa I, plućne fibroze, dermatomiozitisa, Sjogren-ovog sindroma, tiroiditisa (npr., Hashimoto-ov i autoimuni tiroiditis), miastenije gravis, autoimune hemolitičke anemije, cistične fibroze, idiopatske plućne fibroze (IPF), hroničnog relapsnog hepatitisa, primarne bilijarne ciroze, alergijskog konjuktivitisa, atopijskog dermatitisa, i njihovih kombinacija.
19. 19. Komplet za upotrebu u tretmanu autoimune, respiratorne i/ili inflamatorne bolesti ili stanja, pri čemu komplet sadrži: (i) dvojni PI3K delta i gama inhibitor, i (ii) kortikosteroid, ili njihovu farmaceutski prihvatljivu so, ili kao jednu farmaceutsku kompoziciju ili u posebnim farmaceutskim kompozicijama, (ii) izborno, uputstva za tretiranje autoimune, respiratorne i/ili inflamatorne bolesti ili stanja sa dvojnim PI3K delta i gama inhibitorom i kortikosteroidom i (iii) izborno, spremnik za stavljanje farmaceutske kompozicije ili farmaceutskih kompozicija: naznačeno time da dvojni PI3K delta i gama inhibitor je jedinjenje formule A:
20. 20. Komplet za upotrebu prema patentnom zahtevu 19, naznačeno time da dvojni PI3K delta i gama inhibitor i kortikosteroid su za upotrebu u tretmanu autoimune, respiratorne i/ili inflamatorne bolesti ili stanja izabranog od astme, hronične opstruktivne plućne bolesti, reumatoidnog artritisa, inflamatorne bolesti creva, glomerulonefritisa, neuro inflamatornih bolesti, multiple skleroze, uveitisa, psorijaze, artritisa, vaskulitisa, dermatitisa, osteoartritisa, inflamatorne bolesti mišića, alergijskog rinitisa, vaginitisa, intersticijalnog cistitisa, skleroderme, osteoporoze, ekcema, odbacivanja alogene ili ksenogene transplantacije grafta (organa, kostne srži, matičnih ćelija i drugih ćelija i tkiva), bolesti graft-protiv-domaćina, eritemskog lupusa, inflamatorne bolesti, dijabetesa Tipa I, plućne fibroze, dermatomiozitisa, Sjogren-ovog sindroma, tiroiditisa (npr., Hashimoto-ov i autoimuni tiroiditis), miastenije gravis, autoimune hemolitičke anemije, cistične fibroze, idiopatske plućne fibroze (IPF), hroničnog relapsnog hepatitisa, primarne bilijarne ciroze, alergijskog konjuktivitisa i atopijskog dermatitisa.