RS60493B1 - Antismisaona nukleinska kiselina - Google Patents

Description

Opis

TEHNIČKA OBLAST

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na antismisaoni oligomer koji omogućava preskakanje eksona 45 u humanom distrofinskom genu, i farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata takav oligomer.

STANJE TEHNIKE

[0002] Dišenova mišićna distrofija (DMD) je nasledna progresivna miopatija sa najvećom incidencom koja se javlja kod oko jednog u 3,500 rođenih muškaraca. U ranom detinjstvu, pacijenti sa DMD pokazuju gotovo istu motoričku funkciju kao i normalni ljudi, ali pokazuju znake mišićne slabosti oko 4. do 5. godine života. Zatim, njihova mišićna slabost napreduje do gubitka pokretnosti do uzrasta od oko 12 godina i vremenom dovodi do smrti u njihovim dvadesetim godinama usled srčane ili plućne insuficijencije. DMD je tako ozbiljna bolest. Trenutno ne postoji efektivna terapija za DMD, i samim tim postoji jaka potreba za razvojem novog terapeutskog sredstva.

[0003] Poznato je da su uzroci DMD mutacije u distrofinskom genu. Distrofinski gen se nalazi na X hromozomu i predstavlja veliki gen koji se sastoji od 2.2 miliona nukleotidnih DNK parova. Ova DNK je transkriptovana u prekursor mRNK i dalje je spojena kako bi se uklonili introni, čime se dobija mRNK koja se sastoji od 79 eksona spojenih zajedno, što predstavlja dužinu od 13,993 baza. Ova mRNK je prevedena u 3,685 aminokiselina da bi se dobio distrofinski protein. Distrofinski protein je uključen u održavanje stabilnosti membrane mišićnih ćelija i potreban je kako bi mišićne ćelije bile manje sklone pucanju. Pacijenti sa DMD imaju mutacije u svom distrofinskom genu i stoga gotovo da i ne pokazuju ekspresiju funkcionalnog distrofinskog proteina u svojim mišićnim ćelijama. Iz ovog razloga, u organizmu pacijenata koji imaju DMD, mišićne ćelije ne mogu više da zadrže svoju strukturu i u mišićne ćelije dotiče velika količina jona kalcijuma. Kao rezultat, reakcija slična zapaljenju će se javiti da bi se podstakla fibroza, tako da se mišićne ćelije teško regenerišu.

[0004] Bekerova mišićna distrofija (BMD) takođe nastaje usled mutacija u distrofinskom genu. Kao njen simptom, primećena je mišićna slabost, ali je obično blaža i napreduje sporije nego kod DMD, tako da se BMD u većini slučajeva razvija u odraslom dobu. Razlike u kliničkim simptomima između DMD i BMD izgleda proističu ili iz toga da li mutacije razgrađuju ili održavaju okvir čitanja aminokiselina tokom translacije iz mRNK distrofina u distrofinski protein (nepatentni dokument 1). Naime, pacijenti sa DMD gotovo da ne pokazuju ekspresiju funkcionalnog distrofinskog proteina jer poseduju mutacije koje su odgovorne za skretanje okvira čitanja aminokiselina, dok kod pacijenata sa BMD, mutacije uzrokuju deleciju nekih eksona ali se okvir čitanja aminokiselina održava, tako da se stvara funkcionalni mada nepotpuni distrofinski protein.

[0005] Kao terapija za DMD, terapija preskakanjem eksona je obećavajuća. Ova terapija uključuje modifikaciju cepanja katjona da bi se okvir čitanja vratio u distrofinsku mRNK, čime se izaziva ekspresija distrofinskog proteina sa delimično oporavljenom funkcijom (nepatentni dokument 2). Regioni aminokiselinske sekvence koje cilja ekson su izbrisani u ovoj terapiji. Iz ovog razloga, distrofinski protein eksprimiran u ovoj terapiji je kraći od normalnog proteina, ali delimično zadržava funkciju ćelija koje stabilizuju mišiće zato što se održava okvir čitanja aminokiselina. Stoga se očekuje da preskakanje eksona omogući da DMD prikaže iste simptome koji se mogu videti i kod BMD koja je blaža. Terapija preskakanjem eksona je trenutno u kliničkom ispitivanju kod humanih DMD pacijenata nakon životinjskih eksperimenata izvedenih na miševima i psima.

[0006] Preskakanje eksona može biti izazvano vezivanjem antismisaonih nukleinskih kiselina usmerenih na jedno ili oba mesta cepanja 5' i 3' ili na unutrašnje sekvence eksona. Ekson je uključen u mRNK samo kada spliceosomski kompleks prepoznaje oba mesta cepanja. Stoga, preskakanje eksona može biti izazvano kada antismisaone nukleinske kiseline ciljaju mesta cepanja. Štaviše, da bi se izazvalo prepoznavanje eksona od strane mašine za cepanje, SR proteini koji su bogati serinom i argininom bi bili potrebni za vezivanje eksona za pojačavače cepanja (ESE); i samim tim preskakanje eksona takođe može biti izazvano nakon ciljanja ESE-ova.

[0007] Pacijenti sa DMD imaju različite mutacije u njihovom distrofinskom genu, i samim tim su potrebne razne antismisaone nukleinske kiseline u zavisnosti od položaja i tipa mutacije gena. Postoje neki izveštaji o antismisaonoj nukleinskoj kiselini koja je dizajnirana da izazove preskakanje eksona pojedinačnog eksona u distrofinskom genu ciljanjem pojedinačne kontinuirane sekvence (patentni dokumenti 1 do 6, kao i nepatentni dokumenti 1 i 2). Pored toga, postoji izveštaj koji pokazuje da kada dve različite antismisaone nukleinske kiseline usmerene na isti ekson u distrofinskom genu mogu da dejstvuju u mešavini (dvostruko ciljanje), aktivnost preskakanja može da bude pojačana u odnosu na to kada se svaka antismisaona nukleinska kiselina koristi sama (patentni dokument 7).

[0008] Međutim, ne postoji izveštaj koji pokazuje da povezane jednolančane antismisaone nukleinske kiseline usmerene na dva ili više mesta u istom eksonu (tj., antismisaona nukleinska kiselina povezanog tipa) ispoljavaju aktivnost preskakanja.

Dokumenti stanja tehnike

Patentni dokumenti

[0009]

Patentni dokument 1: WO2004/048570

Patentni dokument 2: WO2009/139630

Patentni dokument 3: WO2010/048586

Patentni dokument 4: US2010/0168212

Patentni dokument 5: WO2011/057350

Patentni dokument 6: WO2006/000057

Patentni dokument 7: WO2007/135105

Nepatentni dokumenti

[0010]

Nepatentni dokument 1: Annemieke Aartsma-Rus et al., (2002) Neuromuscular Disorders 12: S71-S77 Nepatentni dokument 2: Wilton S. D., et al., Molecular Therapy 2007: 15: p.1288-96

KRATAK SADRŽAJ OVOG PRONALASKA

PROBLEM KOJI BI OVAJ PRONALAZAK TREBALO DA REŠI

[0011] Pod takvim okolnostima, kako je gore opisano, ovaj pronalazak uglavnom ima za cilj da obezbedi novi antismisaoni oligomer povezanog tipa koji je dizajniran da izazove preskakanje eksona ciljanjem dve odvojene nukleotidne sekvence u istom eksonu distrofinskog gena, i terapeutski agens za mišićnu distrofiju koji obuhvata takav oligomer.

SREDSTVA ZA REŠAVANJE TOG PROBLEMA

[0012] Kao rezultat detaljnih ispitivanja o tehničkom sadržaju opisanom u gornjim dokumentima i o strukturi distrofinskog gena, itd., pronalazači ovog pronalaska su pronašli da su oligomeri usemreni na dva odvojena mesta u eksonu 45 humanog distrofinskog gena zajedno povezani a dobijeni antismisaoni oligomer može da izazove preskakanje ovog eksona. Pronalazači ovog pronalaska su završili ovaj pronalazak na osnovu ovog nalaza.

[0013] Naime, ovaj pronalazak je prikazan u nastavku.

[1] Antismisaoni oligomer dužine od 14 do 32 baze koji obuhvata dva povezana jedinična oligomera izabrana iz grupe koju čine (a) do (e) prikazani dole ispod, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat, pri čemu dvojedinični oligomeri nisu susedni ili niti se međusobno preklapaju:

(a) jedinični oligomer koji se sastoji od nukleotidne sekvence komplementarne sa nukleotidnom sekvencom koja se sastoji od 7 do 16 susednih baza izabranih iz nukleotidne sekvence koja se nalazi na položajima -5 do 15 od 5'-terminalnog kraja eksona 45 u humanom distrofinskom genu; (b) jedinični oligomer koji se sastoji od nukleotidne sekvence komplementarne sa nukleotidnom sekvencom koja se sastoji od 7 do 16 susednih baza izabranih iz nukleotidne sekvence koja se nalazi na položajima 48 do 70 od 5'-terminalnog kraja eksona 45 u humanom distrofinskom genu; (c) jedinični oligomer koji se sastoji od nukleotidne sekvence komplementarne sa nukleotidnom sekvencom koja se sastoji od 7 do 16 susednih baza izabranih iz nukleotidne sekvence koja se nalazi na položajima 128 do 150 od 5'-terminalnog kraja eksona 45 u humanom distrofinskom genu; (d) jedinični oligomer koji se sastoji od nukleotidne sekvence komplementarne sa nukleotidnom sekvencom koja se sastoji od 7 do 16 susednih baza izabranih iz nukleotidne sekvence koja se nalazi na položajima 15 do 40 od 5'-terminalnog kraja eksona 45 u humanom distrofinskom genu; i (e) jedinični oligomer koji se sastoji od nukleotidne sekvence komplementarne sa nukleotidnom sekvencom koja se sastoji od 7 do 16 susednih baza izabranih iz nukleotidne sekvence koja se nalazi na položajima 110 do 125 od 5'-terminalnog kraja eksona 45 u humanom distrofinskom genu.

[2] Antismisaoni oligomer ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat prema gore navedenom [1], pri čemu jedan od dva jedinična oligomera predstavlja (a).

[3] Antismisaoni oligomer ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat prema gore navedenim [1] ili [2], koji se sastoji od bilo koje nukleotidne sekvence izabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO: 7 do 12, 14 do 33, 40 do 52, 57, 64, 65 i 79 do 86.

[4] Antismisaoni oligomer ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat prema bilo kom od gore navedenih [1] do [3], koji se sastoji od bilo koje nukleotidne sekvence izabrana iz grupe koju čine SEQ ID NO: 8, 10, 25, 30, 33, 79 i 80.

[5] Antismisaoni oligomer ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat prema bilo kom od gore navedenih [1] do [4], koji predstavlja oligonukleotid.

[6] Antismisaoni oligomer ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat prema gore navedenom [5], pri čemu je najmanje jedan nukleotid koji čini oligonukleotid modifikovan na šećernoj grupi i/ili na grupi fosfatne veze.

[7] Antismisaoni oligomer ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat prema gore navedenim [5] ili [6], pri čemu šećerna grupa od najmanje jednog nukleotida koji čini oligonukleotid predstavlja ribozu u kojoj je -OH grupa na 2'-položaju supstituisana bilo kojom grupom izabranom iz grupe koju čine OR, R, R'OR, SH, SR, NH2, NHR, NR2, N3, CN, F, Cl, Br i I (pri čemu R predstavlja alkil ili aril, a R’ predstavlja alkilen).

[8] Antismisaoni oligomer ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat prema gore navedenim [6] ili [7], pri čemu grupa fosfatne veze od najmanje jednog nukleotida koji čini oligonukleotid predstavlja bilo koju izabranu iz grupe koju čine fosforotioatna veza, fosforoditiolatna veza, alkilfosfonatna veza, fosforoamidatna veza i boranofosfatna veza.

[9] Antismisaoni oligomer prema bilo kom od gore navedenih [1] do [4], koji predstavlja morfolino oligomer, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat.

[10] Antismisaoni oligomer prema gore navedenom [9], koji predstavlja fosforodiamidat morfolino oligomer, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat.

[11] Antismisaoni oligomer prema gore navedenom [4], koji predstavlja fosforodiamidat morfolino oligomer, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat.

[12] Antismisaoni oligomer prema bilo kom od gore navedenih [9] do [11], čiji 5'-terminalni kraj predstavlja bilo koji iz grupa predstavljenih hemijskim formulama (1) do (3) prikazanim dole ispod, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat.

[13] Farmaceutska kompozicija za lečenje mišićne distrofije, koja obuhvata antismisaoni oligomer ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili hidrat kao aktivni sastojak prema bilo kom od gore navedenih [1] do [12].

[14] Farmaceutska kompozicija prema gore navedenom [13], koja dalje obuhvata farmaceutski prihvatljiv nosač.

[15] Takođe je opisan i postupak za lečenje mišićne distrofije, koji obuhvata fazu davanja pacijentu sa mišićnom distrofijom antismisaonog oligomera ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili hidrata prema bilo kom od gore navedenih [1] do [12] ili farmaceutske kompozicije prema gore navedenim [13] ili [14].

[16] Postupak za lečenje prema gore navedenom [15], pri čemu je pacijent sa mišićnom distrofijom pacijent koji ima mutaciju koja se cilja preskakanjem eksona 45 u distrofinskom genu.

[17] Postupak za lečenje prema gore navedenim [15] ili [16], pri čemu je pacijent humani pacijent.

[18] Pronalazak se dalje odnosi na upotrebu antismisaonog oligomera ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili hidrata prema bilo kom od gore navedenih [1] do [12] u proizvodnji farmaceutske kompozicije za lečenje mišićne distrofije.

[19] Antismisaoni oligomer ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat prema bilo kom od gore navedenih [1] do [12] za upotrebu u lečenju mišićne distrofije.

[20] Antismisaoni oligomer ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat prema gore navedenom [19], pri čemu u lečenju, pacijent sa mišićnom distrofijom ima mutaciju koja se cilja preskakanjem eksona 45 u distrofinskom genu.

[21] Antismisaoni oligomer ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat prema gore navedenim [19] ili [20], pri čemu je pacijent humani pacijent.

EFEKTI OVOG PRONALASKA

[0014] Antismisaoni oligomer prema ovom pronalasku omogućava efektivnu indukciju preskakanja eksona 45 u humanom distrofinskom genu. Pored toga, farmaceutska kompozicija prema ovom pronalasku, kada se daje, omogućava efektivno olakšavanje simptoma kod Dišenove mišićne distrofije. Izbrisani eksoni kod pacijenata koji se ciljaju uključuju ekson 18-44, 44, 46, 46-47, 46-48, 46-49, 46-51, 46-53, itd.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0015]

Fig.1 predstavlja grafikon koji prikazuje efikasnost preskakanja eksona 45 u humanom distrofinskom genu u ćelijama humanog rabdomiosarkoma (RD ćelije).

Fig.2 predstavlja grafikon koji prikazuje efikasnost preskakanja eksona 45 u humanom distrofinskom genu u ćelijama humanog rabdomiosarkoma (RD ćelije).

Fig.3 predstavlja grafikon koji prikazuje efikasnost preskakanja eksona 45 u humanom distrofinskom genu u ćelijama humanog rabdomiosarkoma (RD ćelije).

Fig.4 predstavlja grafikon koji prikazuje efikasnost preskakanja eksona 45 u humanom distrofinskom genu u ćelijama humanog rabdomiosarkoma (RD ćelije).

Fig.5 predstavlja grafikon koji prikazuje efikasnost preskakanja eksona 45 u humanom distrofinskom genu u ćelijama humanog rabdomiosarkoma (RD ćelije).

Fig.6 predstavlja grafikon koji prikazuje efikasnost preskakanja eksona 45 u humanom distrofinskom genu u ćelijama humanog rabdomiosarkoma (RD ćelije).

Fig.7 predstavlja grafikon koji prikazuje efikasnost preskakanja eksona 45 u humanom distrofinskom genu u ćelijama humanog rabdomiosarkoma (RD ćelije).

Fig.8 predstavlja grafikon koji prikazuje efikasnost preskakanja eksona 45 u humanom distrofinskom genu u ćelijama humanog rabdomiosarkoma (RD ćelije).

Fig.9 predstavlja grafikon koji prikazuje efikasnost preskakanja eksona 45 u humanom distrofinskom genu u ćelijama humanog rabdomiosarkoma (RD ćelije).

Fig.10 predstavlja grafikon koji prikazuje efikasnost preskakanja eksona 45 u humanom distrofinskom genu u ćelijama humanog rabdomiosarkoma (RD ćelije).

Fig.11 predstavlja grafikon koji prikazuje efikasnost preskakanja eksona 45 u humanom distrofinskom genu u ćelijama humanog rabdomiosarkoma (RD ćelije).

Fig.12 predstavlja grafikon koji prikazuje efikasnost preskakanja eksona 45 u humanom distrofinskom genu u ćelijama humanog rabdomiosarkoma (RD ćelije).

Fig.13 predstavlja grafikon koji prikazuje efikasnost preskakanja eksona 45 u humanom distrofinskom genu u ćelijama humanog rabdomiosarkoma (RD ćelije).

Fig.14 predstavlja grafikon koji prikazuje efikasnost preskakanja eksona 45 u humanom distrofinskom genu u ćelijama humanog rabdomiosarkoma (RD ćelije).

Fig.15 predstavlja grafikon koji prikazuje efikasnost preskakanja eksona 45 u humanom distrofinskom genu u ćelijama humanog rabdomiosarkoma (RD ćelije).

Fig.16 predstavlja grafikon koji prikazuje efikasnost preskakanja eksona 45 u humanom distrofinskom genu u ćelijama humanog rabdomiosarkoma (RD ćelije).

Fig.17 predstavlja grafikon koji prikazuje efikasnost preskakanja eksona 45 u humanom distrofinskom genu u ćelijama humanog rabdomiosarkoma (RD ćelije).

Fig.18 predstavlja grafikon koji prikazuje efikasnost preskakanja eksona 45 u humanom distrofinskom genu u ćelijama humanog rabdomiosarkoma (RD ćelije).

Fig.19 predstavlja grafikon koji prikazuje efikasnost preskakanja eksona 45 u humanom distrofinskom genu u ćelijama humanog rabdomiosarkoma (RD ćelije).

Fig.20 predstavlja grafikon koji prikazuje efikasnost preskakanja eksona 45 u humanom distrofinskom genu u ćelijama humanog rabdomiosarkoma (RD ćelije).

Fig.21 predstavlja grafikon koji prikazuje efikasnost preskakanja eksona 45 u humanom distrofinskom genu u ćelijama humanog rabdomiosarkoma (RD ćelije).

Fig.22 predstavlja grafikon koji prikazuje efikasnost preskakanja eksona 45 u humanom distrofinskom genu u ćelijama humanog rabdomiosarkoma (RD ćelije).

Fig.23 predstavlja grafikon koji prikazuje efikasnost preskakanja eksona 45 u humanom distrofinskom genu u ćelijama humanog rabdomiosarkoma (RD ćelije).

Fig.24 predstavlja grafikon koji prikazuje efikasnost preskakanja eksona 45 u humanom distrofinskom genu u ćelijama humanog rabdomiosarkoma (RD ćelije).

Fig.25 predstavlja grafikon koji prikazuje efikasnost preskakanja eksona 45 u humanom distrofinskom genu u ćelijama humanog rabdomiosarkoma (RD ćelije).

OPIS NAČINA OSTVARIVANJA

[0016] Ovaj pronalazak će detaljnije biti opisan u nastavku. Sledeći načini ostvarivanja su ilustrovani u cilju opisivanja ovog pronalaska, i njihova namera nije da ograniče ovaj pronalazak samo na ove načine ostvarivanja. Ovaj pronalazak može biti primenjen na različite načine a da se ne odstupi od duha ovog pronalaska.

[0017] Trebalo bi imati na umu da su sve ovde navedene objave, uključujući dokumente iz prethodnog stanja tehnike, patentne glasnike i druge patentne dokumente, dati kao referenca. Štaviše, ova specifikacija inkorporira sadržaj otkriven u specifikaciji i crtežima japanske patentne prijave br.2015-182145 (podnete 15. septembra 2015.), na osnovu koje sadašnja prijava zahteva prioritet.

1. Antismisaoni oligomer

[0018] Ovaj pronalazak obezbeđuje antismisaoni oligomer koji omogućava preskakanje eksona 45 u humanom distrofinskom genu, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili hidrat (u daljem tekstu zajednički označeni kao "oligomer prema ovom pronalasku").

[Ekson 45 u humanom distrofinskom genu]

[0019] U kontekstu ovog pronalaska, predviđeno je da izraz "gen" obuhvata ne samo genomski gen, već takođe i cDNK, prekursor mRNK, i mRNK. Gen poželjno predstavlja prekursor mRNK, tj., pre-mRNK.

[0020] U humanom genomu, humani distrofinski gen se nalazi na mestu Xp21.2. Humani distrofinski gen ima veličinu od 3.0 Mbp i predstavlja najveći gen među poznatim humanim genima. Međutim, kodirajući regioni u humanom distrofinskom genu čine samo 14 kb i distribuirani su u više od 79 eksona unutar distrofinskog gena (Roberts, RG., et al., Genomics, 16: 536-538 (1993)). Pre-mRNK transkriptovana iz humanog distrofinskog gena je pocepana kako bi se proizvela zrela mRNK od 14 kb. Poznata je nukleotidna sekvenca humanog distrofinskog gena divljeg tipa (GenBank pristupni br. NM_004006).

[0021] Nukleotidna sekvenca eksona 45 u humanom distrofinskom genu divljeg tipa je prikazana u SEQ ID NO: 13. Štaviše, u nukleotidnoj sekvenci (SEQ ID NO: 13) eksona 45 u humanom distrofinskom genu divljeg tipa, sekvenca koja se sastoji od baza na položajima -5 do 15 računato od 5'-terminalnog kraja je prikazana u SEQ ID NO: 3. Slično tome, sekvenca koja se sastoji od baza na položajima 48 do 70, sekvenca koja se sastoji od baza na položajima 128 do 150, sekvenca koja se sastoji od baza na položajima 15 do 40 i sekvenca koja se sastoji od baza na položajima 110 do 125 su prikazane u SEQ ID NO: 4 do 6 i 143, redom.

[0022] Oligomer prema ovom pronalasku je sada pripremljen tako da uzrokuje preskakanje eksona 45 u humanom distrofinskom genu sa ciljem modifikovanja proteina kojeg kodira DMD distrofinski gen u BMD distrofinski protein. Stoga, ekson 45 u distrofinskom genu koji bi oligomer prema ovom pronalasku trebalo da preskoči uključuje ne samo divlji tip, već i mutirane oblike.

[0023] Specifičnije, mutirani ekson 45 u humanom distrofinskom genu ili njegov deo predstavljaju polinukleotid prikazan pod (I) ili (II) dole ispod:

(I) polinukleotid koji može da hibridizuje u striktnim uslovima sa polinukleotidom koji se sastoji od nukleotidne sekvence komplementarne sa bilo kojom nukleotidnom sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 i SEQ ID NO: 143; ili

(II) polinukleotid koji se sastoji od nukleotidne sekvence koja deli identitet 90% ili više sa bilo kojom nukleotidnom sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 i SEQ ID NO: 143.

[0024] Kako se ovde upotrebljava, predviđeno je da izraz "polinukleotid" označava DNK ili RNK.

[0025] Kako se ovde upotrebljava, predviđeno je da izraz "polinukleotid koji može da hibridizuje u striktnim uslovima" označava, na primer, polinukleotid koji može da se dobije pomoću hibridizacije kolonija, hibridizacije plaka, južne hibridizacije ili drugih tehnika hibridizacije koristeći, kao test, ceo ili deo polinukleotida koji se sastoji od nukleotidne sekvence komplementarne sa bilo kojom nukleotidnom sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 i SEQ ID NO: 143. Za hibridizaciju, moguće je da se koriste tehnike kako je opisano u, npr., "Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol.3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001" i "Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997."

[0026] Kako se ovde upotrebljava, izraz "komplementaran sa nukleotidnom sekvencom" nije ograničen samo na nukleotidnu sekvencu koja formira parove Watson-Crick sa ciljnom nukleotidnom sekvencom i takođe obuhvata nukleotidne sekvence koje formiraju parove labave baze sa ciljnom nukleotidnom sekvencom. U ovom smislu, Watson-Crick par je predviđen da označava bazni par koji formira vodoničnu vezu između adenina i timina, između adenina i uracila ili između guanina i citozina, dok je za par labave baze predviđeno da označava bazni par koji formira vodoničnu vezu između guanina i uracila, između inozina i uracila, između inozina i adenina ili između inozina i citozina. Štaviše, takva "komplementarna sa nukleotidnom sekvencom" nema nužno 100% komplementarnost sa ciljnom nukleotidnom sekvencom i može da sadrži nekomplementarnu bazu (npr., 1 do 3 baze, 1 ili 2 baze, ili pojedinačnu bazu) sa ciljnom nukleotidnom sekvencom.

[0027] Kako se ovde upotrebljava, izraz "striktni uslovi" mogu biti bilo koji od nižih striktnih uslova, umereno striktnih uslova i visoko striktnih uslova. "Niži striktni uslovi" se odnose, na primer, na uslove od 5 × SSC, 5 × Denhardt-ov rastvor, 0.5% SDS, 50% formamida na 32°C. Slično tome, "umereno striktni uslovi" se odnose, na primer, na uslove od 5 × SSC, 5 × Denhardt-ov rastvor, 0.5% SDS, 50% formamida na 42°C ili uslove od 5 × SSC, 1% SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50% formamida na 42°C. "Visoko striktni uslovi" se odnose, na primer, na uslove od 5 × SSC, 5 × Denhardt-ov rastvor, 0.5% SDS, 50% formamida na 50°C ili uslove od 0.2 × SSC, 0.1% SDS na 65°C. U ovim uslovima, može se očekivati da je polinukleotid višeg identiteta efikasnije dobijen na višim temperaturama. Međutim, na striktnost hibridizacije će uticati mnogo faktora, uključujući temperaturu, koncentraciju probe za ispitivanje, dužinu probe ispitivanja, jačinu jona, vreme reakcije, koncentraciju soli i tako dalje. Stručnjaci će biti u mogućnosti da postignu istu striktnost biranjem ovih faktora kao prikladnih.

[0028] Trebalo bi imati na umu da ukoliko se za hibridizaciju koristi komercijalno dostupan komplet, u tu svrhu, primera radi, mogu da se koriste Alkphos Direct Labelling i Detection System (GE Healthcare). U ovom slučaju, hibridizacija može da se postigne u skladu sa protokolom koji je uključen u komplet, tj., nakon što je membrana inkubirana preko noći sa obeleženom probom za ispitivanje a zatim oprana puferom za primarno pranje koji sadrži 0.1 mas./vol.% SDS na 55°C, može da se detektuje hibridizovani polinukleotid. Alternativno, ukoliko se za obeležavanje digoksigenina (DIG) ispitivanja koristi komercijalno dostupan reagens (npr., PCR Labeling Mix (Roche Diagnostics)) tokom pripreme probe za ispitivanje na osnovu cele ili dela nukleotidne sekvence komplementarne sa bilo kojom nukleotidnom sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 i SEQ ID NO: 143 ili izabranom iz grupe koju čine SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 i SEQ ID NO: 143, komplet DIG Nucleic Acid Detection Kit (Roche Diagnostics) može da se koristi za detekciju hibridizacije.

[0029] Pored ovih navedenih gore, drugi polinukleotidi koji mogu da hibridizuju uključuju polinukleotide koji dele identitet 90% ili više, 91% ili više, 92% ili više, 93% ili više, 94% ili više, 95% ili više, 96% ili više, 97% ili više, 98% ili više, 99% ili više, 99.1% ili više, 99.2% ili više, 99.3% ili više, 99.4% ili više, 99.5% ili više, 99.6% ili više, 99.7% ili više, 99.8% ili više, ili 99.9% ili više sa sekvencom koja se sastoji od bilo kog polinukleotida izabranog iz grupe koju čine SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 i SEQ ID NO: 143, kako je izračunato pomoću softvera za pretragu homologije BLAST upotrebom fabričkih parametara.

[0030] Trebalo bi imati na umu da se identitet nukleotidnih sekvenci može odrediti korišćenjem algoritma Karlin i Altschul, BLAST-a (Basic Local Alignment Search Tool) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990; Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993). Na osnovu algoritma BLAST-a, razvijeni su programi koji se zovu BLASTN i BLASTX (Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990). Ukoliko se BLASTN koristi za analizu nukleotidne sekvence, parametri mogu biti podešeni, na primer, na rezultat = 100 i dužinu reči od = 12. Ukoliko se koriste programi BLAST i Gapped BLAST, u svakom programu mogu da se koriste fabrički parametri.

[0031] U određenom načinu ostvarivanja, oligomer prema ovom pronalasku predstavlja antismisaoni oligomer dužine od 14 do 32 baze koji obuhvata povezana dva jedinična oligomera izabrana iz grupe koju čine (a) do (e) prikazani u nastavku, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat:

(a) jedinični oligomer koji se sastoji od nukleotidne sekvence komplementarne sa nukleotidnom sekvencom koja se sastoji od 7 do 16 susednih baza izabranih iz nukleotidne sekvence koja se nalazi na položajima -5 do 15 od 5'-terminalnog kraja eksona 45 u humanom distrofinskom genu; (b) jedinični oligomer koji se sastoji od nukleotidne sekvence komplementarne sa nukleotidnom sekvencom koja se sastoji od 7 do 16 susednih baza izabranih iz nukleotidne sekvence koja se nalazi na položajima 48 do 70 od 5'-terminalnog kraja eksona 45 u humanom distrofinskom genu; (c) jedinični oligomer koji se sastoji od nukleotidne sekvence komplementarne sa nukleotidnom sekvencom koja se sastoji od 7 do 16 susednih baza izabranih iz nukleotidne sekvence koja se nalazi na položajima 128 do 150 od 5'-terminalnog kraja eksona 45 u humanom distrofinskom genu; (d) jedinični oligomer koji se sastoji od nukleotidne sekvence komplementarne sa nukleotidnom sekvencom koja se sastoji od 7 do 16 susednih baza izabranih iz nukleotidne sekvence koja se nalazi na položajima 15 do 40 od 5'-terminalnog kraja eksona 45 u humanom distrofinskom genu; i (e) jedinični oligomer koji se sastoji od nukleotidne sekvence komplementarne sa nukleotidnom sekvencom koja se sastoji od 7 do 16 susednih baza izabranih iz nukleotidne sekvence koja se nalazi na položajima 110 do 125 od 5'-terminalnog kraja eksona 45 u humanom distrofinskom genu.

[0032] Gore navedeni jedinični oligomeri (a) do (e) (u daljem tekstu jednostavno označeni kao "jedinice") pri čemu svaki ima dužinu od 7 do 16 baza, poželjno 8 do 16 baza, poželjnije 9 do 16 baza. Odgovarajuće dužine mogu da budu iste ili različite veličine.

[0033] Štaviše, kada su dva jedinična oligomera izabrana iz grupe koju čine (a) do (e), ta dva jedinična oligomera mogu da budu kombinacija istih jedinica (tj., (a) i (a), (b) i (b), (c) i (c), (d) i (d), ili (e) i (e)) ili mogu da budu kombinacija različitih jedinica, ali poželjno kombinacija različitih jedinica. Na primer, ukoliko je (a) izabrana kao jedna jedinica, druga jedinica je poželjno bilo koja od (b) do (e). Slično tome, ukoliko je (b) izabrana kao jedna jedinica, druga jedinica je poželjno (a), (c), (d) ili (e), dok ukoliko je (c) izabrana kao jedna jedinica, druga jedinica je poželjno (a), (b), (d) ili (e).

[0034] Kada su dve jedinice izabrane od (a) do (e), jedna od dve izabrane jedinice može da se nalazi na strani 5'-terminala. Ukoliko su (a) i (b) izabrane, jedinica (a) je poželjno povezana sa stranom 3'-terminala. Ukoliko su (b) i (c) izabrane, jedinica (b) je poželjno povezana sa stranom 3'-terminala.

Ukoliko su (a) i (c) izabrane, jedinica (a) je poželjno povezana sa stranom 3'-terminala. Ukoliko su (a) i (d) izabrane, jedinica (a) je poželjno povezana sa stranom 3'-terminala. Ukoliko su (a) i (e) izabrane, jedinica (a) je poželjno povezana sa stranom 3'-terminala.

[0035] Kako se ovde upotrebljava, predviđeno je da izraz "povezan" označava da su dve jedinice odabrane od (a) do (e) direktno povezane jedna sa drugom. Naime, kada su dve jedinice povezane, to znači da 3'-terminalni kraj jedinice koja se nalazi na strani 5'-terminala i 5'-terminalni kraj jedinice koja se nalazi na strani 3'-terminala formiraju fosfatnu vezu ili bilo koju od narednih grupa:

(u kojoj

X predstavlja -OH, -CH2R<1>, -O-CH2R<1>, -S-CH2R<1>, -NR<2>R<3>ili F;

R<1>predstavlja H ili alkil;

R<2>i R<3>, koji mogu da budu isti ili različiti, pri čemu svaki predstavlja H, alkil, cikloalkil ili aril;

Y1predstavlja O, S, CH2ili NR<1>;

Y2predstavlja O, S ili NR<1>; i

Z predstavlja O ili S).

[0036] Predviđeno je da izraz "koji omogućava preskakanje eksona 45 u humanom distrofinskom genu" znači da po vezivanju oligomera prema ovom pronalasku za mesto koje odgovara eksonu 45 u transkriptu (npr., pre-mRNK) humanog distrofinskog gena, taj transkript je pocepan kako bi se utvrdila veza između baze koja odgovara 3'-terminalnom kraju eksona 43 i baze koja odgovara 5'-terminalnom kraju eksona 46 u slučaju pacijenata sa DMD sa delecijom eksona 44, na primer, kako bi se time formirala zrela mRNK koja je bez pomaka okvira kodona.

[0037] Izraz "vezivanje" se ovde koristi kako bi se označilo da jednom kada je oligomer prema ovom pronalasku pomešan sa transkriptom humanog distrofinskog gena, oba će biti međusobno hibridizovana u fiziološkim uslovima kako bi se formirao dupleks. Izraz "u fiziološkim uslovima" se koristi kako bi označio uslove podešene tako da oponašaju in vivo pH, kompoziciju soli i temperaturu, primera radi uslove od 25°C do 40°C, poželjno 37°C, pH 5 do 8, poželjno pH 7.4, i koncentraciju natrijumhlorida od 150 mM.

[0038] Da bi se potvrdilo da li je preskakanje eksona 45 uzrokovano ili nije u humanom distrofinskom genu, oligomer prema ovom pronalasku može biti transfektovan u distrofin-eksprimirajuće ćelije (npr., ćelije humanog rabdomiosarkoma) a region oko eksona 45 u mRNK humanog distrofinskog gena može biti amplifikovan putem RT-PCR iz ukupne RNK od gore pomenutih distrofin-eksprimirajućih ćelija, nakon čega sledi ugnezdena PCR ili analiza sekvencioniranja na PCR proizvodu amplifikacije. Efikasnost preskakanja može da se odredi na sledeći način: mRNK humanog distrofinskog gena je sakupljena iz ispitivanih ćelija i mRNK je izmerena za polinukleotidni nivo "A" u pojasu sa preskakanjem eksona 45 i polinukleotidni nivo "B" u pojasu bez preskakanje eksona 45, nakon čega je usledilo izračunavanje na osnovu ovih izmerenih vrednosti "A" i "B" prema sledećoj jednačini.

Efikasnost preskakanja (%) = A/(A+B) x 100

[0039] Oligomer prema ovom pronalasku poželjno uzrokuje preskakanje eksona 45 sa efikasnošću od 10% ili više, 20% ili više, 30% ili više, 40% ili više, 50% ili više, 60% ili više, 70% ili više, 80% ili više, ili 90% ili više.

[0040] Što se tiče izračunavanja efikasnosti preskakanja, referenca je WO2012/029986.

[0041] Oligomer prema ovom pronalasku može biti primer oligonukleotida, morfolino oligomer ili oligomer peptidne nukleinske kiseline (PNA), pri čemu svaki ima dužinu od 14 do 32 baze. Oligomer prema ovom pronalasku poželjno ima dužinu od 16 do 30 baza, 17 do 30 baza, 18 do 30 baza, 19 do 30 baza, 20 do 30 baza, 20 do 29 baza, 20 do 28 baza, 20 do 27 baza, 20 do 26 baza ili 21 do 26 baza, i poželjno je morfolino oligomer.

[0042] Gore pomenuti oligonukleotid (u daljem tekstu označen kao "oligonukleotid prema ovom pronalasku") predstavlja oligomer prema ovom pronalasku, čija je sastavna jedinica nukleotid, a takav nukleotid može biti bilo koji od ribonukleotida, deoksiribonukleotida ili modifikovan nukleotid.

[0043] Modifikovan nukleotid se odnosi na ribonukleotid ili deoksiribonukleotid čije su nukleobaza, šećerna grupa i fosfatna vezujuća grupa u potpunosti ili delimično modifikovane.

[0044] Primeri nukleobaze uključuju adenin, guanin, hipoksantin, citozin, timin, uracil, ili njihovu modifikovanu bazu. Primeri takve modifikovane beze su pseudouracil, 3-metiluracil, dihidrouracil, 5-alkilcitozini (npr., 5-metilcitozin), 5-alkiluracili (npr., 5-etiluracil), 5-halouracili (npr., 5-bromouracil), 6-azapirimidin, 6-alkilpirimidini (npr., 6-metiluracil), 2-tiouracil, 4-tiouracil, 4-acetilcitozin, 5 -(karboksihidroksimetil)uracil, 5'-karboksimetilaminometil-2-tiouracil, 5-karboksimetilaminometiluracil, 1-metiladenin, 1-metilhipoksantin, 2,2-dimetilguanin, 3-metilcitozin, 2-metiladenin, 2-metilguanin, N6metiladenin, 7-metilguanin, 5-metoksiaminometil-2-tiouracil, 5-metilaminometiluracil, 5-metilkarbonilmetiluracil, 5-metiloksiuracil, 5-metil-2-tiouracil, 2-metiltio-N6-izopenteniladenin, uracil-5-oksisirćetna kiselina kiselina, 2-tiocitozin, purin, 2,6-diaminopurin, 2-aminopurin, izoguanin, indol, imidazol, ksantin i tako dalje, ali bez ograničenja na iste.

[0045] Modifikacije na šećernoj grupi mogu biti primera radi prikazane kao modifikacije na 2'-poziciji riboze i modifikacije na drugim pozicijama šećera. Primeri modifikacija na 2'-poziciji riboze uključuju modifikacije koje su predviđene da zamene -OH grupu na 2'-poziciji riboze sa OR, R, R'OR, SH, SR, NH2, NHR, NR2, N3, CN, F, Cl, Br ili I, pri čemu R predstavlja alkil ili aril, a R’ predstavlja alkilen.

[0046] Primeri modifikacija na drugim pozicijama šećera uključuju zamenu O sa S na 4'-poziciji riboze ili deoksiriboze, i premošćavanje između 2'- i 4'-pozicije šećera, kako je primerom prikazano putem LNA (zaključane nukleinske kiseline) ili ENA (2'-O,4'-C-etilen-premošćene nukleinske kiseline), ali nisu ograničene na njih.

[0047] Modifikacije na grupi fosfatne veze mogu biti primera radi prikazane kao modifikacije predviđene da zamene vezu fosfodiestra sa fosforotioatnom vezom, fosforoditiolatnom vezom, alkilfosfonatnom vezom, fosforoamidatnom vezom ili boranofosfatnom vezom (Enya et al: Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2008, 18, 9154-9160) (videti, npr., JP WO2006/129594 i JP WO2006/038608).

[0048] Alkil je poželjno ravan ili razgranat alkil koji sadrži 1 do 6 atoma ugljenika. Specifičnije, primeri uključuju metil, etil, n-propil, izopropil, n-butil, izobutil, sec-butil, tert-butil, n-pentil, izopentil, neopentil, tert-pentil, n-heksil i Izoheksil. Takav jedan alkil može biti supstituisan sa 1 do 3 supstituenta uključujući halogen, alkoksi, cijano, nitro, itd.

[0049] Cikloalkil je poželjno cikloalkil koji sadrži 5 do 12 atoma ugljenika. Specifičnije, primeri uključuju ciklopentil, cikloheksil, cikloheptil, ciklooktil, ciklodecil i ciklododecil.

[0050] Halogeni uključuju fluor, hlor, brom i jod.

[0051] Alkoksi može biti ravan ili razgranat alkoksi koji sadrži 1 do 6 atoma ugljenika, kako su primera radi dati metoksi, etoksi, n-propoksi, izopropoksi, n-butoksi, izobutoksi, sec-butoksi, tert-butoksi, npentiloksi, izopentiloksi, n-heksiloksi, izoheksiloksi i tako dalje. Naročito je poželjan alkoksi koji sadrži 1 do 3 atoma ugljenika.

[0052] Aril je poželjno aril koji sadrži 6 do 10 atoma ugljenika. Specifičnije, primeri uključuju fenil, αnaftil i β-naftil. Naročito je poželjan fenil. Takav jedan aril može biti supstituisan sa 1 do 3 substituenta uključujući alkil, halogen, alkoksi, cijano, nitro, itd.

[0053] Alkilen je poželjno ravan ili razgranat alkilen koji sadrži 1 do 6 atoma ugljenika. Specifičnije, primeri uključuju metilen, etilen, trimetilen, tetrametilen, pentametilen, heksametilen, 2-(etil)trimetilen i 1-(metil)tetrametilen.

[0054] Acil može da bude ravan ili razgranat alkanoil ili aroil. Primeri takvog jednog alkanoila uključuju formil, acetil, 2-metilacetil, 2,2-dimetilacetil, propionil, butiril, izobutiril, pentanoil, 2,2-dimetilpropionil, heksanoil i tako dalje. Primeri aroila uključuju benzoil, toluoil i naftoil. Takav jedan aroil može biti supstituisan na bilo kojoj poziciji koja može da bude supstituisana i može da bude supstituisan alkilom(ima).

[0055] Oligonukleotid prema ovom pronalasku je poželjno oligomer prema ovom pronalasku, čiju sastavnu jedinicu predstavlja grupa koja je predstavljena sledećom opštom formulom, u kojoj je -OH grupa na 2'-poziciji riboze supstituisana metoksijem, a grupa fosfatne veze je fosforotioatna veza:

(u kojoj baza predstavlja nukleobazu).

[0056] Oligonukleotid prema ovom pronalasku može da bude odmah sintetisan sa raznim automatskim uređajima za sintezu (npr., AKTA oligopilot plus 10/100 (GE Healthcare)), ili alternativno, njegova sinteza može da bude poverena trećem licu (npr., Promega ili Takara), itd.

[0057] Gore pomenuti morfolino oligomer predstavlja oligomer prema ovom pronalasku, čiju sastavnu jedinicu predstavlja grupa koja je predstavljena sledećom opštom formulom:

(u kojoj je baza ista kako je gore definisana; a

W predstavlja grupu koja je predstavljena bilo kojom od sledećih formula:

(u kojoj X predstavlja -CH2R<1>, -O-CH2R<1>, -S-CH2R<1>, -NR<2>R<3>ili F;

R<1>predstavlja H ili alkil;

R<2>i R<3>, koji mogu da budu isti ili različiti, pri čemu svaki predstavlja H, alkil, cikloalkil ili aril;

Y1predstavlja O, S, CH2ili NR<1>;

Y2predstavlja O, S ili NR<1>; a

Z predstavlja O ili S)).

[0058] Morfolino oligomer je poželjno oligomer čiju sastavnu jedinicu predstavlja grupa prikazana sledećom formulom (tj., fosforodiamidatni morfolino oligomer (u daljem tekstu označen kao "PMO")):

(u kojoj su baza, R<2>i R<3>isti kako je gore definisano).

[0059] Na primer, morfolino oligomer može da bude pripremljen u skladu

sa WO1991/009033 ili WO2009/064471. Određenije, PMO može da bude pripremljen u skladu sa postupcima opisanim u WO2009/064471 ili može da bude pripremljen u skladu sa postupcima opisanim u WO2013/100190.

[Postupak za pripremu PMO]

[0060] Kao jedan način ostvarivanja PMO, jedinjenje predstavljeno sledećom opštom formulom (I) (u daljem tekstu označeno kao PMO (I)) može da bude dato kao primer:

[u kojoj su i baza i R<2>i R<3>isti kako su gore definisani; a

n predstavlja bilo koji ceo broj u opsegu od 1 do 99, poželjno bilo koji ceo broj u opsegu od 13 do 31].

PMO (I) može da bude pripremljen u skladu sa poznatim postupcima, na primer, izvođenjem postupaka koji su prikazani u narednim fazama.

[0061] Jedinjenja i reagensi koji se upotrebljavaju u narednim fazama nisu ni na koji način ograničeni sve dok se upotrebljavaju onako kako se uobičajeno upotrebljavaju za pripremu PMO.

[0062] Štaviše, sve sledeće faze mogu da se postignu postupkom tečne faze ili postupkom čvrste faze (ponavljanjem šaržnih reakcija ili upotrebom komercijalno dostupnog automatskog uređaja za sintezu čvrste faze). Kada je PMO pripremljen postupkom čvrste faze, poželjno je da se koristi automatski uređaj za sintezu u smislu jednostavnog postupka i tačne sinteze.

(1) Faza A:

[0063] Ovo je faza u kojoj je jedinjenje predstavljeno sledećom opštom formulom (II) (u daljem tekstu označeno kao jedinjenje (II)) tretirano kiselinom kako bi se pripremilo jedinjenje predstavljeno sledećom opštom formulom (III) (u daljem tekstu označeno kao jedinjenje (III)):

[u kojoj su n, R<2>i R<3>isti kako je gore definisano;

svako B<P>nezavisno predstavlja nukleobazu koja može da bude zaštićena;

T predstavlja tritil grupu, monometoksitritil grupu ili dimetoksitritil grupu; a

L predstavlja vodonik, acil ili grupu koja je predstavljena sledećom opštom formulom (IV) (u daljem tekstu označena kao grupa (IV))]:

[0064] "Nukleobaza" moguća za B<P>može da bude primera radi prikazana istom "nukleobazom" kako je navedeno za bazu, pod uslovom da amino grupe ili hidroksil grupe u ovim nukleobazama za B<P>mogu da budu zaštićene.

[0065] Zaštitne grupe za ove amino grupe nisu ograničene ni na koji način budući da se koriste kao zaštitne grupe za nukleinske kiseline. Specifičnije, primeri uključuju benzoil, 4-metoksibenzoil, acetil, propionil, butiril, izobutiril, fenilacetil, fenoksiacetil, 4-tert-butilfenoksiacetil, 4-izopropilfenoksiacetil, i (dimetilamino)metilen. Zaštitne grupe za hidroksil grupe uključuju, na primer, 2-cijanoetil, 4-nitrofentil, fenilsulfoniletil, metilsulfoniletil, trimetilsililetil, fenil koji može biti supstituisan sa 1 do 5 grupa koje povlače elektrone na bilo kojim poziciji(ama) koje mogu da se supstituišu, difenilkarbamoil, dimetilkarbamoil, dietilkarbamoil, metilfenilkarbamoil, 1-pirolidinilkarbamoil, morfolinokarbamoil, 4(tert-butilkarboksi)benzil, 4-[(dimetilamino)karboksi]benzil, i 4-(fenilkarboksi)benzil (videti, npr., WO2009/064471).

[0066] "Čvrsti nosač" nije ni na koji način ograničen sve dok je nosač dostupan za upotrebu u reakciji čvrste faze nukleinskih kiselina, ali je poželjno da se koristi, na primer, nosač koji (i) je umereno rastvorljiv u reagensima dostupnim za upotrebu u sintezi derivata morfolino nukleinske kiseline (npr., dihlorometan, acetonitril, tetrazol, N-metilimidazol, piridin, sirćetni anhidrid, lutidin, trifluorosirćetna kiselina), (ii) je hemijski stabilan u odnosu na reagense dostupne za upotrebu u sintezi derivata morfolino nukleinske kiseline, (iii) može da bude hemijski modifikovan, (iv) može da se puni željenim derivatima morfolino nukleinske kiseline, (v) ima jačinu dovoljnu da podnese visok pritisak tokom obrade, i (vi) ima određeni opseg veličine i distribucije čestica. Specifičnije, primeri uključuju polisitiren koji može da bubri (npr., aminometil polistirenska smola umrežena sa 1% divinilbenzenom (200 do 400 promer) (2.4 do 3.0 mmol/g) (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., Japan), aminometil polistirenska smola HCl [divinilbenzen 1%, 100 do 200 promer] (Peptide Institute, Inc., Japan)), polistiren koji ne bubri (npr., Primer Support (GE Healthcare)), PEG polistirene pričvršćene za lanac (npr., NH2-PEG resin (Watanabe Chemical Industries, Ltd., Japan), TentaGel resin), staklo sa kontrolisanom veličinom pora (CPG) (npr., CPG Inc.), oksalisano staklo sa kontrolisanom veličinom pora (videti, npr., Alul et al., Nucleic Acids Research, Vol.19, 1527 (1991)), TentaGel support-aminopolietilen glikol-derivatizovani nosač (videti, npr., Wright et al., Tetrahedron Letters, Vol.34, 3373 (1993)), i Poros-polistiren/divinilbenzen kopolimer.

[0067] Kao "veznik," moguće je da se koristi poznati veznik koji se uobičajeno koristi da bi se povezala nukleinska kiselina ili derivat morfolino nukleinske kiseline, a primeri uključuju 3-aminopropil, sukcinil, 2,2'-dietanol sulfonil, i dugolančani alkilamino (LCAA).

[0068] Ova faza može da bude praćena tretiranjem jedinjenja (II) kiselinom.

[0069] Primeri "kiseline" dostupne za upotrebu u ovoj fazi uključuju trifluorosirćetnu kiselinu, dihlorosirćetnu kiselinu ili trihlorosirćetnu kiselinu. Količina kiseline koja se koristi je, na primer, razumno u opsegu od 0.1 molarnih ekvivalenata do 1000 molarnih ekvivalenata, poželjno u opsegu od 1 molarnog ekvivalenta do 100 molarnih ekvivalenata, u odnosu na 1 mol jedinjenja (II).

[0070] Štaviše, moguće je da se koristi organski amin zajedno sa gore pomenutom kiselinom. Bilo koji organski amin može da bude korišćen u ovu svrhu, a primeri uključuju trietilamin. Količina organskog amina koja se koristi je, na primer, razumno u opsegu od 0.01 molarnih ekvivalenata do 10 molarnih ekvivalenata, poželjno u opsegu od 0.1 molarnih ekvivalenata do 2 molarnih ekvivalenata, u odnosu na 1 mol kiseline.

[0071] U slučaju gde se kiselina i organski amin koriste kao so ili mešavina u ovoj fazi, primeri uključuju so ili mešavinu trifluorosirćetne kiseline i trietilamina, specifičnije mešavinu koja sadrži 2 ekvivalenta trifluorosirćetne kiseline i 1 ekvivalent trietilamina.

[0072] Kiselina dostupna za upotrebu u ovoj fazi može da bude korišćena tako što se razblaži odgovarajućim rastvaračem da bi se dobila koncentracija u opsegu od 0.1% do 30%. Bilo koji rastvarač može da bude korišćen u ovu svrhu dokle god je inertan prema reakciji, a primeri uključuju dihlorometan, acetonitril, alkohole (npr., etanol, izopropanol, trifluoroetanol), vodu, ili njihove mešavine.

[0073] Temperatura reakcije u gornjoj reakciji je, na primer, poželjno u opsegu od 10°C do 50°C, poželjnije u opsegu od 20°C do 40°C, i čak poželjnije u opsegu od 25°C do 35°C.

[0074] Vreme reakcije će varirati u zavisnosti od vrste kiseline koja se koristi i/ili temperature reakcije, ali je generalno razumno u opsegu od 0.1 minuta do 24 sata, a poželjno u opsegu od 1 minuta do 5 sati.

[0075] Štaviše, nakon završetka ove faze, opciono može da se doda baza kako bi se neutralisala preostala kiselina u sistemu. Bilo koja "baza" može da bude korišćena u ovu svrhu i primeri uključuju diizopropiletilamin. Takva baza može da bude korišćena tako što je razblažena odgovarajućim rastvaračem kako bi se dobila koncentracija u opsegu od 0.1 (vol./vol.%) do 30 (vol./vol.%).

[0076] Bilo koji rastvarač može da bude korišćen u ovoj fazi dokle god je inertan prema reakciji, a primeri uključuju dihlorometan, acetonitril, alkohole (npr., etanol, izopropanol, trifluoroetanol), vodu, ili njihove mešavine. Temperatura reakcije je, na primer, poželjno u opsegu od 10°C do 50°C, poželjnije u opsegu od 20°C do 40°C, i čak poželjnije u opsegu od 25°C do 35°C.

[0077] Vreme reakcije će varirati u zavisnosti od vrste baze koja se koristi i/ili temperature reakcije, ali je generalno razumno u opsegu od 0.1 minuta do 24 sata, a poželjno u opsegu od 1 minuta do 5 sati.

[0078] Trebalo bi imati na umu da jedinjenje (II) u kojem je n = 1, a L je grupa (IV), tj., jedinjenje predstavljeno sledećom opštom formulom (IIa) (u daljem tekstu označeno kao jedinjenje (IIa)) može da bude pripremljeno u skladu sa sledećim postupcima:

[u kojoj su B<P>, T, veznik i čvrsti nosač isti kako je gore definisano].

Faza 1:

[0079] Ovo je faza gde je jedinjenje predstavljeno sledećom opštom formulom (V) tretirano agensom acilovanja da bi se pripremilo jedinjenje predstavljeno sledećom opštom formulom (VI) (u daljem tekstu označeno kao jedinjenje (VI)):

[u kojoj su B<P>, T i veznik isti kako je gore definisano; a

R<4>predstavlja hidroksil grupu, halogen ili amino].

[0080] Ova faza može da bude postignuta počev od jedinjenja (V) bilo kojom poznatom reakcijom za uvođenje veznika.

[0081] Određenije, jedinjenje predstavljeno sledećom opštom formulom (VIa) može da bude pripremljeno bilo kojim poznatim postupkom kao što je reakcija esterifikacije uz upotrebu jedinjenja (V) i sukcinskog anhidrida:

[u kojoj su B<P>i T isti kako je gore definisano].

Faza 2:

[0082] Ovo je faza u kojoj jedinjenje (VI) reaguje sa čvrstim nosačem tako što je tretirano agensom za kondenzovanje ili njemu sličnim da bi se napravilo jedinjenje (IIa):

[u kojoj su B<P>, R<4>, T, veznik i čvrsti nosač isti kako je gore definisano].

[0083] Ova faza može da bude postignuta bilo kojim postupkom poznatim kao reakcija kondenzacije uz upotrebu jedinjenja (VI) i čvrsti nosač.

[0084] Jedinjenje (II) u kojem je n = 2 do 99, a L je grupa (IV), tj., jedinjenje predstavljeno sledećom opštom formulom (IIa2) može da bude pripremljeno počev od jedinjenja (IIa) ponavljanjem željenih vremena faza A i B postupka za pripremu PMO otkrivenog ovde:

[u kojoj su B<P>, R<2>, R<3>, T, veznik i čvrsti nosač isti kako je gore definisano; a

n' predstavlja 1 do 98].

[0085] Slično tome, jedinjenje (II) u kojem je n = 1, a L je vodonik, tj., jedinjenje predstavljeno sledećom opštom formulom (IIb) može da bude pripremljeno, na primer, postupcima opisanim u WO1991/009033:

[u kojoj su B<P>i T isti kako je gore definisano].

[0086] Jedinjenje (II) u kojem je n = 2 do 99, a L predstavlja vodonik, tj., jedinjenje predstavljeno sledećom opštom formulom (IIb2) može da bude pripremljeno počev od jedinjenja (IIb) ponavljanjem željenih vremena faza A i B postupka za pripremu PMO opisanog ovde:

[u kojoj su B<P>, n', R<2>, R<3>i T isti kako je gore definisano].

[0087] Slično tome, jedinjenje (II) u kojem je n = 1, a L predstavlja acil, tj., jedinjenje predstavljeno sledećom opštom formulom (IIc) može da bude pripremljeno od jedinjenja (IIb) bilo kojim poznatim postupkom kao što je reakcija acilovanja:

[u kojoj su B<P>i T isti kako je gore definisano; a

R<5>predstavlja acil].

[0088] Jedinjenje (II) u kojem je n = 2 do 99, a L predstavlja acil, tj., jedinjenje predstavljeno sledećom opštom formulom (IIc2) može da bude pripremljeno počev od jedinjenja (IIc) ponavljanjem željenih vremena faza A i B postupka za pripremu PMO opisanog ovde:

[u kojoj su B<P>, n', R<2>, R<3>, R<5>i T isti kako je gore definisano].

(2) Faza B:

[0089] Ovo je faza gde je jedinjenje (III) tretirano jedinjenjem morfolino monomera u prisustvu baze kako bi se pripremilo jedinjenje predstavljeno sledećom opštom formulom (VII) (u daljem tekstu označeno kao jedinjenje (VII)):

[u kojoj je svaki od B<P>, L, n, R<2>, R<3>i T isti kako je gore definisano].

[0090] Ova faza može da bude postignuta tretiranjem jedinjenja (III) jedinjenjem morfolino monomera u prisustvu baze.

[0091] Takvo jedinjenje morfolino monomera može da bude dato primera radi kao jedinjenje predstavljeno sledećom opštom formulom (VIII):

[u kojoj su B<P>, R<2>, R<3>i T isti kako je gore definisano].

[0092] Primeri "baze" dostupne za upotrebu u ovoj fazi uključuju diizopropiletilamin, trietilamin ili N-etilmorfolin. Količina baze koja se koristi je, na primer, razumno u opsegu od 1 molarnog ekvivalenta do 1000 molarnih ekvivalenata, poželjno u opsegu od 10 molarnih ekvivalenata do 100 molarnih ekvivalenata, u odnosu na 1 mol jedinjenja (III).

[0093] Takvo jedinjenje morfolino monomera i baza dostupna za upotrebu u ovoj fazi mogu da budu korišćeni tako što se razblaže odgovarajućim rastvaračem da bi se dobila koncentracija od 0.1% do 30%. Bilo koji rastvarač može da bude korišćen u ovu svrhu dokle god je inertan prema reakciji, a primeri uključuju N,N-dimetilimidazolidinon, N-metilpiperidon, DMF, dihlorometan, acetonitril, tetrahidrofuran, ili njihove mešavine.

[0094] Temperatura reakcije je, na primer, poželjno u opsegu od 0°C do 100°C, i poželjnije u opsegu od 10°C do 50°C.

[0095] Vreme reakcije će varirati u zavisnosti od vrste baze koja se koristi i/ili temperature reakcije, ali je generalno razumno u opsegu od 1 minuta do 48 sati, i poželjno u opsegu od 30 minuta do 24 sata.

[0096] Štaviše, nakon završetka ove faze, opciono može da se doda sredstvo za acilovanje. Primeri "sredstva za acilovanje" uključuju sirćetni anhidrid, acetilhlorid i anhidrid fenoksisirćetne kiseline. Takvo jedno sredstvo za acilovanje može da bude korišćen tako što se razblaži odgovarajućim rastvaračem da bi se dobila koncentracija u opsegu od, primera radi, 0.1% do 30%. Bilo koji rastvarač može da bude korišćen u ovu svrhu dokle god je inertan prema reakciji, a primeri uključuju dihlorometan, acetonitril, alkohole (npr., etanol, izopropanol, trifluoroetanol), vodu, ili njihove mešavine.

[0097] Ukoliko je neophodno, moguće je da se koristi baza (npr., piridin, lutidin, kolidin, trietilamin, diizopropiletilamin, N-etilmorfolin) zajedno sa sredstvom za acilovanje. Količina sredstva za acilovanje koja se koristi je poželjno u opsegu od 0.1 molarnih ekvivalenata do 10000 molarnih ekvivalenata, i poželjnije u opsegu od 1 molarnog ekvivalenta do 1000 molarnih ekvivalenata. Količina baze koja se koristi je, na primer, razumno u opsegu od 0.1 molarnih ekvivalenata do 100 molarnih ekvivalenata, poželjno u opsegu od 1 molarnog ekvivalenta do 10 molarnih ekvivalenata, u odnosu na 1 mol sredstva za acilovanje.

[0098] Temperatura reakcije u ovoj reakciji je poželjno u opsegu od 10°C do 50°C, poželjnije u opsegu od 10°C do 50°C, čak poželjnije u opsegu od 20°C do 40°C, i dalje čak poželjnije u opsegu od 25°C do 35°C. Vreme reakcije će varirati, npr., u zavisnosti od vrste sredstva za acilovanje koji se koristi i/ili temperature reakcije, ali je generalno razumno u opsegu od 0.1 minuta do 24 sata, i poželjno u opsegu od 1 minuta do 5 sati.

(3) Faza C:

[0099] Ovo je faza u kojoj se agens za uklanjanje zaštite upotrebljava kako bi se uklonile zaštitne grupe sa jedinjenja (VII) pripremljenog u fazi B, pri čemu je priprema jedinjenja prikazana opštom formulom (IX):

[u kojoj su baza, B<P>, L, n, R<2>, R<3>i T isti kako je gore definisano].

[0100] Ova faza može da bude postignuta tretiranjem jedinjenja (VII) agensom za skidanje zaštite.

[0101] Primeri "agensa za skidanje zaštite " uključuju koncentrovani vodeni amonijum i metilamin. Takav "agens za skidanje zaštite " dostupan za upotrebu u ovoj fazi može da bude korišćen tako što se razblaži vodom, metanolom, etanolom, izopropilalkoholom, acetonitrilom, tetrahidrofuranom, DMF, N,N-dimetilimidazolidinonom, N-metilpiperidonom, ili njihovim razblaženim rastvaračem. Među njima, poželjan je etanol. Količina agensa za skidanje zaštite koja se koristi je, na primer, razumno u opsegu od 1 molarnog ekvivalenta do 100000 molarnih ekvivalenata, poželjno u opsegu od 10 molarnih ekvivalenata do 1000 molarnih ekvivalenata, u odnosu na 1 mol jedinjenja (VII), primera radi.

[0102] Temperatura reakcije je, na primer, razumno u opsegu od 15°C do 75°C, poželjno u opsegu od 40°C do 70°C, i poželjnije u opsegu od 50°C do 60°C. Vreme reakcije za skidanje zaštite će varirati u zavisnosti od vrste jedinjenja (VII) i/ili temperature reakcije, itd., ali je razumno u opsegu od 10 minuta do 30 sati, poželjno u opsegu od 30 minuta do 24 sata, i poželjnije u opsegu od 5 sata do 20 sati.

(4) Faza D:

[0103] Ovo je faza gde je jedinjenje (IX) pripremljeno u fazi C tretirano kiselinom da bi se pripremio PMO

[u kojoj su n, R<2>, R<3>i T isti kako je gore definisano].

[0104] Ova faza može da bude postignuta dodavanjem kiseline u jedinjenje (IX).

[0105] Primeri "kiseline" dostupne za upotrebu u ovoj fazi uključuju trihlorosirćetnu kiselinu, dihlorosirćetnu kiselinu, sirćetnu kiselinu, fosfornu kiselinu i hlorovodoničnu kiselinu, itd. Što se tiče količine kiseline koja se koristi, razumno je da se koristi kiselina u količini koja će dati pH rastvora, na primer, u opsegu od 0.1 do 4.0, poželjnije u opsegu od 1.0 do 3.0. Bilo koji rastvarač može da bude korišćen u ovoj fazi sve dok je inertan prema reakciji, a primeri uključuju acetonitril, vodu, ili njihove mešane rastvarače.

[0106] Temperatura reakcije je poželjno u opsegu od 10°C do 50°C, poželjnije u opsegu od 20°C do 40°C, i čak poželjnije u opsegu od 25°C do 35°C. Vreme reakcije za uklanjanje zaštite će varirati u zavisnosti od vrste jedinjenja (IX) i/ili temperature reakcije, itd., ali je razumno u opsegu od 0.1 minuta do 5 sati, poželjno u opsegu od 1 minuta do 1 sata, i poželjnije u opsegu od 1 minuta do 30 minuta.

[0107] PMO (I) može da bude dobijen iz reakcione mešavine dobijene u ovoj fazi uobičajenim sredstvima razdvajanja i prečišćavanja uključujući ekstrakciju, koncentraciju, neutralizaciju, filtraciju, centrifugu, rekristalizaciju, C8do C18hromatografiju na obrnutim fazama na koloni, katjonsko-izmenjivačku hromatografiju na koloni, anjonsko-izmenjivačku hromatografiju na koloni, gel-filtracionu hromatografiju na koloni, tečnu hromatografiju visokog učinka, dijalizu, ultrafiltraciju i druga sredstva, koja mogu da se koriste ili sama ili u kombinaciji, pri čemu željeni PMO (I) može da bude izolovan i prečišćen (videti, npr., WO1991/09033).

[0108] U slučaju upotrebe hromatografije na obrnutim fazama za prečišćavanje PMO (I), mešani rastvor od 20 mM pufera trietilamin/acetata i acetonitrila može da bude korišćen kao elucioni rastvarač, primera radi.

[0109] Slično tome, u slučaju upotrebe jonoizmenjivačke hromatografije za prečišćavanje PMO (I), mešani rastvor od 1 M vodenog natrijumhlorida i 10 mM vodenog natrijumhidroksida može da bude korišćen, primera radi.

[0110] Gore pomenuti oligomer peptidne nukleinske kiseline predstavlja oligomer prema ovom pronalasku, čiju sastavnu jedinicu predstavlja grupa predstavljena sledećom opštom formulom:

(u kojoj je baza ista kako je gore definisano).

[0111] Peptidne nukleinske kiseline mogu da budu pripremljene, na primer, u skladu sa dole navedenim dokumentima.

1) P. E. Nielsen, M. Egholm, R. H. Berg, O. Buchardt, Science, 254, 1497 (1991)

2) M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, R. H. Berg, Jacs., 114, 1895 (1992)

3) K. L. Dueholm, M. Egholm, C. Behrens, L. Christensen, H. F. Hansen, T. Vulpius, K. H. Petersen, R. H. Berg, P. E. Nielsen, O. Buchardt, J. Org. Chem., 59, 5767 (1994)

4) L. Christensen, R. Fitzpatrick, B. Gildea, K. H. Petersen, H. F. Hansen, T. Koch, M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, J. Coull, R. H. Berg, J. Pept. Sci., 1, 175 (1995)

5) T. Koch, H. F. Hansen, P. Andersen, T. Larsen, H. G. Batz, K. Otteson, H. Orum, J. Pept. Res., 49, 80 (1997)

[0112] Štaviše, oligomer prema ovom pronalasku može da bude konfigurisan tako da njegov 5'-terminalni kraj predstavlja bilo koji iz grupe predstavljenih hemijskim formulama (1) do (3) prikazanim dole ispod, pri čemu je (3) -OH poželjna.

[0113] Grupe predstavljene gornjim formulama (1), (2) i (3) su dalje u tekstu redom označene kao "grupa (1)," "grupa (2)" i " grupa (3)".

2. Farmaceutska kompozicija

[0114] Oligomer prema ovom pronalasku omogućava preskakanje eksona 45m u distrofinskom genu. Stoga je očekivano da simptomi mišićne distrofije mogu biti ublaženi kada se farmaceutska kompozicija koja obuhvata oligomer prema ovom pronalasku daje pacijentima sa DMD koji imaju mutaciju koja se cilja preskakanjem eksona 45 (tj., mutacija je konvertovana u plamen preskakanjem eksona 45) u njihovom distrofinskom genu. Štaviše, zbog njegovog kratkog lanca, oligomer prema ovom pronalasku je poželjan po tome što su faze njegove pripreme jednostavne i dalje u tome što troškovi njegove pripreme mogu biti smanjeni.

[0115] Samim tim, u drugom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju za lečenje mišićne distrofije, koja obuhvata oligomer prema ovom pronalasku, njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili hidrat kao aktivni sastojak (u daljem tekstu označena kao "kompozicija prema ovom pronalasku").

[0116] Primeri farmaceutski prihvatljive soli oligomera prema ovom pronalasku koja ulazi u sastav kompozicije prema ovom pronalasku uključuju soli alkalnih metala (npr., natrijumova so, kalijumova so, litijumova so); alkalne soli zemnih metala (npr., kalcijumova so, magnezijumova so); metalne soli (npr., aluminijumova so, železna so, cinkova so, bakrna so, niklova so, kobaltna so); amonijumova so; organske aminske soli (npr., t-oktilaminska so, dibenzilaminska so, morfolinska so, glukozaminska so, fenilglicin alkil estarska so, etilendiaminska so, N-metilglukaminska so, guanidinska so, dietilaminska so, trietilaminska so, dicikloheksilaminska so, N,N'-dibenziletilendiaminska so, hloroprokainska so, prokainska so, dietanolaminska so, N-benzil-fentilaminska so, piperazinska so, tetrametilamonijumska so, tris(hidroksimetil)aminometanska so); soli halogenisanih hidrokiselina (npr., hidrofluoridna so, hidrohloridna so, hidrobromidna so, hidrojodidna so); soli neorganskih kiselina (tj., nitratna so, perhloratna so, sulfatna so, fosfatna so); soli nižih alkanesulfonskih kiselina (npr., metansulfonatska so, trifluorometansulfonatska so, etanesulfonatska so); soli arilsulfonske kiseline (npr., benzensulfonatska so, p-toluenesulfonatska so); soli organskih kiselina (npr., acetatna so, malatna so, fumaratna so, sukcinatna so, citratna so, tartratna so, oksalatna so, maleatna so); aminokiselinske soli (npr., glicinska so, lizinska so, argininska so, ornitinska so, glutamatska so, aspartatska so), itd. Ove soli mogu da budu pripremljene na bilo koji poznat način. Alternativno, oligomer prema ovom pronalasku koji ulazi u sastav kompozicije prema ovom pronalasku može da bude u obliku njegovog hidrata.

[0117] Kompozicija prema ovom pronalasku može da se daje na bilo koji farmaceutski prihvatljiv način, koji može da bude izabran kao odgovarajući za predviđeni terapeutski postupak. Međutim, u smislu lake isporuke do mišićnog tkiva, poželjna je intravenska primena, intraarterijska primena, intramuskularna primena, supkutana primena, oralna primena, interstijalna primena, perkutana primena i tako dalje. Štaviše, kompozicija prema ovom pronalasku može da bude u bilo kom doznom obliku, a primeri uključuju razne vrste injekcija, oralne formulacije, kapi, sredstva za udisanje, masti, losione, itd.

[0118] U slučaju gde se oligomer prema ovom pronalasku daje pacijentima sa mišićnom distrofijom, kompozicija prema ovom pronalasku poželjno obuhvata nosač koji promoviše isporuku oligomera u mišićno tkivo. Takav nosač nije ni na koji način ograničen sve dok je farmaceutski prihvatljiv, a primeri uključuju katjonske nosače (npr., katjonske lipozome, katjonske polimere) ili virusne nosače bazirane na omotaču. Primeri katjonskih lipozoma uključuju lipozome formirane od 2-O-(2-dietilaminoetil)karbamoil-1,3-O-dioleoil glicerola i fosfolipida kao esencijalnih sastavnih članova (u daljem tekstu označen kao "lipozom A"), Oligofectamine® (Invitrogen), Lipofectin® (Invitrogen), Lipofectamine® (Invitrogen), Lipofectamine 2000® (Invitrogen), DMRIE-C® (Invitrogen), GeneSilencer® (Gene Therapy Systems), TransMessenger® (QIAGEN), TransIT TKO® (Mirus) i Nukleofector II (Lonza). Među njima, poželjan je lipozom A. Primeri katjonskih polimera uključuju JetSI® (Qbiogene) i Jet-PEI® (polietilenimin, Qbiogene). Primeri virusnih nosača baziranih na omotaču uključuju GenomeOne® (HVJ-E lipozoms, Ishihara Sangyo Kaisha, Ltd., Japan). Alternativno, takođe je moguće da se koristi farmaceutsko sredstvo prikazano u japanskom patentu br.2924179 ili katjonski nosači prikazani u JP WO2006/129594 i

JP WO2008/096690.

[0119] Koncentracija oligomera prema ovom pronalasku koji ulazi u sastav kompozicije prema ovom pronalasku će varirati, npr., u zavisnosti od vrste nosača, ali je razumno u opsegu od 0.1 nM do 100 µM, poželjno u opsegu od 1 nM do 10 µM, a poželjnije u opsegu od 10 nM do 1 µM. Slično tome, maseni odnos nosača i oligomera prema ovom pronalasku koji ulazi u sastav kompozicije prema ovom pronalasku (tj., odnos nosač/oligomer) će varirati, npr., u zavisnosti od svojstava oligomera i vrste nosača, ali je razumno u opsegu od 0.1 do 100, poželjno u opsegu od 1 do 50, a poželjnije u opsegu od 10 do 20.

[0120] Kompozicija prema ovom pronalasku može opciono da obuhvati farmaceutski prihvatljiv dodatak, pored oligomera prema ovom pronalasku i gore opisani nosač. Primeri takvog jednog aditiva uključuju pomoć emulgatora (npr., masna kiselina koja sadrži 6 do 22 atoma ugljenika ili njena farmaceutski prihvatljiva so, albumin, dekstran), stabilizator (npr., holesterol, fosfatidinska kiselina), izotonski agens (npr., natrijumhlorid, glukoza, maltoza, laktoza, sukroza, trehaloza), i sredstvo za podešavanje pH (npr., hlorovodoničnu kiselinu, sumpornu kiselinu, fosfornu kiselinu, sirćetnu kiselinu, natrijumhidroksid, kalijumhidroksid, trietanolamin). Ovi aditivi mogu da se koriste ili sami ili u kombinaciji. Sadržaj aditiva(a) u kompoziciji prema ovom pronalasku je razumno 90 mas.% ili manje, poželjno 70 mas.% ili manje, i poželjnije 50 mas.% ili manje.

[0121] Kompozicija prema ovom pronalasku može da bude pripremljena dodavanjem oligomera prema ovom pronalasku disperziji nosača, nakon čega sledi adekvatno mešanje. Aditiv(i) mogu da budu dodati u bilo kojoj odgovarajućoj fazi, pre ili posle dodavanja oligomera prema ovom pronalasku. Bilo koji vodeni rastvarač može da bude korišćen za dodavanje oligomera prema ovom pronalasku dokle god je farmaceutski prihvatljiv, a primeri uključuju injektabilnu vodu, injektabilnu destilovanu vodu, elektrolitičke rastvore (npr., fiziološki slani rastvor), i šećerne rastvore (npr., rastvor glukoze, rastvor maltoze). Štaviše, u ovom slučaju, stručnjaci kao odgovarajuće mogu da izaberu uslove uključujući pH i temperaturu.

[0122] Primera radi, kompozicija prema ovom pronalasku može da bude formulisana u rastvor ili njegov liofiliziran oblik. Takva liofilizirana formulacija može da bude pripremljena na standardan način sušenjem zamrzavanjem kompozicije prema ovom pronalasku u obliku rastvora. Na primer, kompozicija prema ovom pronalasku u obliku rastvora može da bude sterilisana kao odgovarajuća a zatim dispergovana u datim količinama u bočice, nakon čega sledi preliminarno zamrzavanje u uslovima ispod od oko -40°C do - 20°C oko 2 sata, primarnim sušenjem na oko 0°C do 10°C pod sniženim pritiskom i sekundarnim sušenjem na oko 15°C do 25°C pod sniženim pritiskom. Štaviše, u većini slučajeva, bočice mogu da budu prečišćene gasom azota a zatim prekrivene, čime se dobija liofilizirana formulacija kompozicije prema ovom pronalasku.

[0123] Takva liofilizirana formulacija kompozicije prema ovom pronalasku generalno može da se koristi nakon što je rekonstituisana dodavanjem bilo kog odgovarajućeg rastvora (tj., rastvora za rekonstituciju). Primeri takvog rastvora za rekonstituciju uključuju injektabilnu vodu, fiziološki slani rastvor, i druge infuzione rastvore koji se uobičajeno koriste. Zapremina takvog rastvora za rekonstituisanje će varirati, npr., u zavisnosti od predviđene upotrebe i nije ni na koji način ograničena, ali je razumno 0.5- do 2-puta veća od zapremine rastvora pre sušenja smrzavanjem, ili je 500 mL manja.

[0124] Doza davanja kompozicije prema ovom pronalasku se poželjno podešava uzimajući u obzir vrstu oligomera prema ovom pronalasku koji je u sastavu te kompozicije, predviđeni dozni oblik, stanje pacijenta kao što su uzrast i telesna masa, način primene, i prirodu i ozbiljnost bolesti. Međutim, dnevna doza za odrasle je generalno u opsegu od 0.1 mg do 10 g/čovek, poželjno u opsegu od 1 mg do 1 g/čovek, računato kao količina oligomera prema ovom pronalasku. Ovaj numerički opseg može da varira u zavisnosti od vrste bolesti koja se cilja, načina davanja, i/ili vrste ciljnog molekula. Samim tim, doza koja je niža od ovog opsega može da bude dovoljna u nekim slučajevima, ili obrnuto, doza veća od ovog opsega bi trebalo da bude potrebna u nekim slučajevima. Štaviše, kompozicija prema ovom pronalasku može da se daje jednom do više puta dnevno ili u intervalima od jednog do sedam dana.

[0125] U drugom načinu ostvarivanja, kompozicija prema ovom pronalasku može da bude farmaceutska kompozicija koja obuhvata vektor koji može da eksprimira oligonukleotid prema ovom pronalasku i gore opisani nosač. Takav jedan ekspresioni vektor može da eksprimira mnogo oligonukleotida prema ovom pronalasku. Takva kompozicija opciono može da obuhvata farmaceutski prihvatljiv aditiv, kao u slučaju kompozicije prema ovom pronalasku koja obuhvata oligomer prema ovom pronalasku. Koncentracija ekspresionog vektora koji je u sastavu ove kompozicije će varirati, npr., u zavisnosti od vrste nosača, ali je razumno u opsegu od 0.1 nM do 100 µM, poželjno u opsegu od 1 nM do 10 µM, i poželjnije u opsegu od 10 nM do 1 µM. Maseni odnos nosača i ekspresionog vektora koji je u sastavu ove kompozicije (tj., odnos nosač/ekspresioni vektor) će varirati, npr., u zavisnosti od svojstava ekspresionog vektora i vrste nosača, ali je razumno u opsegu od 0.1 do 100, poželjno u opsegu od 1 do 50, i poželjnije u opsegu od 10 do 20. Štaviše, sadržaj nosača koji je u sastavu ove kompozicije je isti kao i u slučaju kompozicije prema ovom pronalasku koja obuhvata oligomer prema ovom pronalasku, a postupci pripreme su takođe isti kao u slučaju kompozicije prema ovom pronalasku.

[0126] Ovaj pronalazak će dalje biti detaljnije opisan kroz ilustrativne primere i primere ispitivanja, iako ovaj pronalazak nije samo na njih ograničen.

PRIMERI

[Referentni primer 1]

4-{[(2S,6R)-6-(4-Benzamido-2-oksopirimidin-1-il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoksi}-4-oksobutanoična kiselina napunjena u aminopolistirensku smolu

Faza 1: Priprema 4-{[(2S,6R)-6-(4-benzamido-2-oksopirimidin-1(2H)-il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoksi} -4-oksobutanoične kiseline

[0127] U atmosferi argona, N-{1-[(2R,6S)-6-(hidroksimetil)-4-tritilmorfolin-2-il]-2-okso-1,2-dihidropirimidin-4-il}benzamid (3.44 g) i 4-dimetilaminopiridin (4-DMAP) (1.1 g) su suspendovani u dihlorometanu (50 mL), a zatim je tome dodat sukcinski anhidrid (0.90 g), nakon čega je usledilo mešanje na sobnoj temperaturi tokom 3 sata. Reakcioni rastvor je mešan sa metanolom (10 mL) i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je ekstraktovan etilacetatom i 0.5 M vodenog rastvora dihidrogenfosfata. Dobijeni organski sloj je sekvencijalno opran sa 0.5 M vodenog kalijumdihidrogenfosfata, vodom i zasićenim vodenim natrijumhloridom. Dobijeni organski sloj je osušen preko nastrijumsulfata i koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobilo 4.0 g željenog proizvoda.

Faza 2: Priprema 4-{[(2S,6R)-6-(4-benzamido-2-oksopirimidin-1-il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoksi}-4-oksobutanoične kiseline koja se puni na aminopolistirenskoj smoli

[0128] 4-{[(2S,6R)-6-(4-benzamido-2-oksopirimidin-1(2H)-il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoksi}-4-oksobutanoična kiselina (4.0 g) je rastvorena u piridinu (dehidriranom) (200 mL), nakon čega je usledilo dodavanje 4-DMAP (0.73 g) i 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimidhidrohlorida (11.5 g). Zatim su u ovu mešavinu dodati aminopolistirenska smola Primer support 200 amino (GE Healthcare Japan, 17-5214-97) (25.0 g) i trietilamin (8.5 mL), nakon čega je usledilo mućkanje na sobnoj temperaturi tokom 4 dana. Posle ove reakcije, smola je skupljena filtracijom. Dobijena smola je sekvencijalno oprana piridinom, metanolom i dihlorometanom, a zatim je osušena pod sniženim pritiskom. Dobijenoj smoli su dodati tetrahidrofuran (dehidrirani) (200 mL), sirćetni anhidrid (15 mL) i 2,6-lutidin (15 mL), nakon čega je usledilo mućkanje na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Smola je sakupljena filtracijom, sekvencijalno oprana piridinom, metanolom i dihlorometanom, a zatim je osušena pod sniženim pritiskom da bi se dobilo 26.7 g željenog proizvoda.

[0129] Da bi se odredila količina za punjenje željenog proizvoda, molarna količina tritila po gramu smole je merena na poznat način kao UV apsorbanca na 409 nm. Zaključeno je da količina za punjenje na smoli iznosi 129.2 µmol/g.

Uslovi za Uv merenje

[0130]

Instrument: U-2910 (Hitachi, Ltd., Japan)

Rastvarač: metansulfonska kiselina

Talasna dužina: 409 nm

ε vrednost: 45000

[Referentni primer 2]

4-{[(2S,6R)-6-(5-Metil-2,4-dioksopirimidin-1-il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoksi}-4-oksobutanoična kiselina punjena na aminopolistirenskoj smoli

[0131] Isti postupci kao što su prikazani u referentnom primeru 1 su ponovljeni da bi se pripremilo nazivno jedinjenje, izuzev što je N-{1-[(2R,6S)-6-(hidroksimetil)-4-tritilmorfolin-2-il]-2-okso-1,2-dihidropirimidin-4-il}benzamid korišćen u fazi 1 referentnog primera 1 zamenjen u ovoj fazi 1-[(2R,6S)-6-(hidroksimetil)-4-tritilmorfolin-2-il]-5-metilpirimidin-2,4(1H,3H)-dionom.

[0132] Da bi se odredila količina za punjenje željenog proizvoda, molarna količina tritila po gramu smole je izmerena na poznat način kao UV apsorbanca na 409 nm. Zaključeno je da količina za punjenje na smoli iznosi 164.0 µmol/g.

[Referentni primer 3]

4-{[(2S,6R)-6-(6-Benzamidopurin-9-il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoksi}-4-oksobutanoična kiselina punjena na aminopolistirenskoj smoli

[0133] Isti postupci kao što su prikazani u referentnom primeru 1 su ponovljeni da bi se pripremilo nazivno jedinjenje, izuzev što je N-{1-[(2R,6S)-6-(hidroksimetil)-4-tritilmorfolin-2-il]-2-okso-1,2-dihidropirimidin-4-il}benzamid korišćen u fazi 1 referentnog primera 1 zamenjen u ovoj fazi N-{9-[(2R,6S)-6-(hidroksimetil)-4-tritilmorfolin-2-il]purin-6-il}benzamidom.

[0134] Da bi se odredila količina za punjenje željenog proizvoda, molarna količina tritila po gramu smole je izmerena na poznat način kao UV apsorbanca na 409 nm. Zaključeno je da količina za punjenje na smoli iznosi 185.7 µmol/g.

[Referentni primer 4]

4-{{(2S,6R)-6-{6-(2-Cijanoetoksi)-2-[(2-fenoksiacetil)amino]purin-9-il}-4-tritilmorfolin-2-il}metoksi}-4-oksobutanoična kiselina punjena na aminopolistirenskoj smoli

[0135] Isti postupci kao što su prikazani u referentnom primeru 1 su ponovljeni da bi se pripremilo nazivno jedinjenje, izuzev što je N-{1-[(2R,6S)-6-(hidroksimetil)-4-tritilmorfolin-2-il]-2-okso-1,2-dihidropirimidin-4-il}benzamid korišćen u fazi 1 referentnog primera 1 zamenjen u ovoj fazi N-{6-(2-cijanoetoksi)-9-[(2R,6S)-6-(hidroksimetil)-4-tritilmorfolin-2-il]purin-2-il}-2-fenoksiacetamidom.

[0136] Da bi se odredila količina za punjenje željenog proizvoda, molarna količina tritila po gramu smole je izmerena na poznat način kao UV apsorbanca na 409 nm. Zaključeno je da količina za punjenje na smoli iznosi 164.8 µmol/g.

[0137] U skladu sa opisima u primeru 1 prikazanim dole ispod, PMO koji imaju nukleotidne sekvence PMO br.1 do 81 označene u tabeli 1 su sintetisani (pri čemu R<2>i R<3>svako predstavlja metil, a 5'-terminalni kraj je grupa (3)). Tako sintetizovani PMO su svaki pojedinačno rastvoreni u vodi za injekciju (Otsukfarmaceutska Factory, Inc., Japan).

[Tabela 1-1]

[Tabela 1-2]

[Tabela 1-3]

[Primer 1]

[0138] 4-{[(2S,6R)-6-(4-benzamido-2-oksopirimidin-1(2H)-il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoksi}-4-oksobutanoična kiselina punjena na aminopolistirenskoj smoli (referentni primer 1) ili 4-{[(2S,6R)-6-(5-metil-2,4-dioksopirimidin-1-il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoksi}-4-oksobutanoična kiselina punjena na aminopolistirenskoj smoli (referentni primer 2) ili 4-{[(2S,6R)-6-(6-benzamidopurin-9-il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoksi}-4-oksobutanoična kiselina punjena na aminopolistirenskoj smoli (referentni primer 3) ili 4-{{(2S,6R)-6-{6-(2-cijanoetoksi)-2-[(2-fenoksiacetil)amino]purin-9-il}-4-tritilmorfolin-2-il}metoksi}-4-oksobutanoična kiselina punjena na aminopolistirenskoj smoli (referentni primer 4), pri čemu svaka odgovara 5'-terminalnoj bazi, je punjena u količini od 0.2 g u kolonu opremljenu sa filterom koji inicira cikluse sinteze koji slede upotrebom uređaja za sintezu nukleinske kiseline (AKTA Oligopilot 10 plus). Da bi se dobila nukleotidna sekvenca svakog jedinjenja naznačenog u tabeli 1, željeno jedinjenje morfolino monomera je dodato u svaki kuplujući ciklus (videti tabelu 2 dole ispod).

[Tabela 2]

[0139] Trebalo bi imati na umu da je rastvor koji je korišćen za deblokiranje bio rastvor dihlorometana koji sadrži 3 (mas./vol.%) trifluorosirćetne kiseline. Rastvor za nutralisanje/pranje koji je korišćen je pripremljen rastvaranjem N,N-diizopropiletilamina na 10 (vol./vol.%) i tetrahidrofurana na 5 (vol./vol.%) u rastvoru dihlorometana koji sadrži 35 (vol./vol.%) acetonitrila. Kuplujući rastvor A koji je korišćen je pripremljen rastvaranjem jedinjenja morfolino monomera na 0.10 M u tetrahidrofuranu. Kuplujući rastvor B koji je korišćen je pripremljen rastvaranjem N,N-diizopropiletilamina na 20 (vol./vol.%) i tetrahidrofurana na 10 (vol./vol.%) u acetonitrilu. Rastvor za prekrivanje koji je korišćen je pripremljen rastvaranjem sirćetnog anhidrida na 20 (vol./vol.%) i 2,6-lutidina na 30 (vol./vol.%) u acetonitrilu.

[0140] Aminopolistirenska smola koja je napunjena sa PMO sintetisana kako je prethodno opisano je sakupljena iz reakcionog suda i osušena na sobnoj temperaturi tokom 2 sata ili duže pod sniženim pritiskom. Osušeni PMO napunjen na aminopolistirenskoj smoli je uveden u reakcioni sud i dodato je 5 mL 28% vodenog amonijum-etanola (1/4), nakon čega je usledilo mešanje na 55°C tokom 15 sati. Aminopolistirenska smola je odvojena filtracijom i oprana sa 1 mL vode-etanola (1/4). Dobijeni filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostatak je rastvoren u 10 mL mešanog rastvarača koji sadrži 20 mM pufera sirćetne kiseline-trietilamina (TEAA pufer) i acetonitril (4/1), a zatim je filtriran kroz membranski filter. Dobijeni filtrat je prečišćen HPLC na obrnutim fazama. Korišćeni uslovi su naznačeni u tabeli 3 ispod.

[Tabela 3]

[0141] Svaka od frakcija je analizirana da bi se sakupio željeni proizvod, koji je zatim koncentrovan pod sniženim pritiskom. Koncentrovani ostatak je razblažen sa 2 M vodene fosforne kiseline (0.5 mL) i mešan tokom 15 minuta. Dalje, ostatak je učinjen alkalnim sa 2 M vodenog natrijumhidorksida (2 mL) i filtriran kroz membranski filter (0.45 µm).

[0142] Dobijeni vodeni rastvor koji sadrži željeni proizvod je prečišćen kroz kolonu sa anjonskom izmenjivačkom smolom. Korišćeni uslovi su naznačeni u tabeli 4 ispod.

[Tabela 4]

[0143] Od frakcija svaka je analizirana (putem HPLC) da bi se dobio željeni proizvod u obliku vodenog rastvora. Dobijeni vodeni rastvor je neutralisan sa 0.1 M fosfatnog pufera (pH 6.0) a zatim desalinizovan putem HPLC na obrnutim fazama u uslovima naznačenim u tabeli 5 ispod.

[Tabela 5]

[0144] Željeni proizvod je sakupljen i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostatak je rastvoren u vodi i osušen zamrzavanjem da bi se dobilo željeno jedinjenje u obliku bele fluorescentne čvrste materije. Izračunate i izmerene vrednosti ESI-TOF-MS su prikazane u tabeli 6.

[Tabela 6-1]

[Tabela 6-2]

[Tabela 6-3]

[Primer ispitivanja 1]

In vitro ispitivanje

[0145] U 3.5 × 10<5>RD ćelije (ćelijska linija humanog rabdomiosarkoma), svaki od antismisaonih oligomera prikazan u tabeli je transfektovan na 1 do 10 µM kroz Nukleofector II (Lonza) upotrebom kompleta Amaxa Cell Line Nukleofector Kit L. Korišćen je program T-030.

[0146] Nakon transfekcije, ćelije su kultivisane tri noći na 37°C u uslovima 5% CO2u 2 mL Iglovog minimalnog esencijalnog medijuma (EMEM) (SIGMA; isti se primenjuje i u nastavku) koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) (Invitrogen).

[0147] Nakon što su ćelije jednom oprane sa PBS (Nissui Farmaceutska Co., Ltd., Japan; isto se primenjuje u nastavku), 350 µL pufera RLT (QIAGEN) koji sadrži 1% 2-merkaptoetanola (Nacalai Tesque, Inc., Japan) je dodato u te ćelije, i te ćelije su lizirane tako što su ostavljene da odstoje par minuta na sobnoj temperaturi. Ćelijski lizat je sakupljen u QIAshredder homogenizatoru (QIAGEN) i centrifugiran na 15,000 o/m tokom 2 minuta kako bi se pripremio homogenat. Ukupna RNK je ekstraktovana u skladu sa protokolom priloženim uz RNeasy Mini Kit (QIAGEN). Koncentracija ekstraktovane ukupne RNK je izmerena spektrofotometrom NanoDrop ND-1000 (LMS Co., Ltd., Japan).

[0148] Jednofazna RT-PCR je izvedena na 400 ng ukupne ekstraktovane RNK upotrebom kompleta QIAGEN OneStep RT-PCR Kit (QIAGEN). Reakcioni rastvor je pripremljen u skladu sa protokolom priloženim uz uputstvo. Korišćen je uređaj za termalno kruženje PTC-100 (MJ Research) ili TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Touch (Takara Bio Inc., Japan). Korišćen RT-PCR program je onakav kako je prikazano u nastavku.

50°C za 30 minuta: reakcija obrnute transkripcije

95°C za 15 minuta: aktivacija polimeraze, inaktivacija obrnute transkriptaze, cDNK termalna denaturacija

[94°C za 30 sekundi; 60°C za 30 sekundi; 72 °C za 1 minut] × 35 ciklusa: PCR amplifikacija

72°C za 10 minuta: reakcija konačne elongacije

[0149] Nukleotidne sekvence prednjih i obrnutih prajmera upotrebljene za RT-PCR su onakve kako su prikazane u nastavku.

Prednji prajmer: 5'-GCTCAGGTCGGATTGACATT-3' (SEQ ID NO: 1)

Obrnuti prajmer: 5'-GGGCAACTCTTCCACCAGTA-3' (SEQ ID NO: 2)

[0150] Gore pomenuti PCR reakcioni proizvod (1 µL) je analiziran upotrebom bioanalizatora (Agilent) i MultiNA sistema (Shimadzu Corporation, Japan).

[0151] Izmereni su polinukleotidni nivo "A" u traci sa preskakanjem eksona 45 i polinukleotidni nivo "B" u traci bez preskakanja eksona 45. Na osnovu izmerenih vrednosti "A" i "B," efikasnost preskakanja je određena prema sledećoj jednačini.

Efikasnost preskakanja = A/(A B) x 100

Rezultati eksperimenata

[0152] Dobijeni rezultati su prikazani na Fig.1 do 5, 8, 10, 11 i 16 do 24. Ovaj eksperiment je pokazao da je oligomer prema ovom pronalasku efektivno uzrokovao preskakanje eksona 45.

[Primer ispitivanja 2]

In vitro ispitivanje

[0153] Isti postupci koji su prikazani u primeru ispitivanja 1 su bili ponovljeni kako bi se izveo ovaj eksperiment, osim što su 3.5 × 10<5>RD ćelije (ćelijska linija humanog rabdomiosarkoma) transfektovane samo sa oligomerom prema ovom pronalasku (PMO br.11 ili PMO br.9) ili sa jednim od dva jedinična oligomera koja čine oligomer prema ovom pronalasku ili sa njegovom mešavinom pri koncentraciji od 3 µM kroz Nukleofector II (Lonza) upotrebom kompleta Amaxa Cell Line Nukleofector Kit L. Korišćen je program T-030. Kombinacije transfektovanih sekvenci su prikazane dole ispod.

[Tabela 7]

Rezultati eksperimenata

[0154] Dobijeni rezultati su prikazani na Fig.6 i 25. Ovaj eksperiment je pokazao da se svaki oligomer prema ovom pronalasku, tj., PMO br.11 (SEQ ID NO: 10), PMO br.9 (SEQ ID NO: 8) ili PMO br.72 (SEQ ID NO: 79), pri čemu se svaki sastoji od dva antismisaona oligomera koja ciljaju različita mesta u eksonu 45, uzrokovao preskakanje eksona 45 veće efikasnosti u poređenju sa odgovarajućim antismisaonim oligomerima koji čine svaki oligomer (tj., PMO br.27 (SEQ ID NO: 36), PMO br.28 (SEQ ID NO: 37), PMO br. 25 (SEQ ID NO: 34), PMO br.26 (SEQ ID NO: 35), PMO br.82 (SEQ ID NO: 144) ili PMO br.83 (SEQ ID NO: 145)) ili njihova mešavina (tj., PMO br.27 i PMO br.28, PMO br.25 i PMO br.26, ili PMO br.82 i PMO br.83).

[Primer ispitivanja 3]

In vitro ispitivanje

[0155] Ovaj eksperiment je izveden upotrebom antismisaonih oligomera u 2'-O-metoksifosforotioatnom obliku (2'-OMe-S-RNK) prikazanom u SEQ ID NO: 89 do 141, 11 i 12. Ovi razni antismisaoni oligomeri korišćeni za ispitivanje su nabavljeni od Japan Bio Services Co., Ltd. Sekvence ovih raznih antismisaonih oligomera su prikazane dole ispod.

[Tabela 8-1]

[Tabela 8-2]

[0156] U ploče sa 24 bunarčića, posejane su 5 × 10<4>RD ćelije (ćelijska linija humanog rabdomiosarkoma) po bunarčiću i kultivisane su preko noći na 37°C u uslovima 5% CO2u 0.5 mL Iglovog minimalnog esencijalnog medijuma (EMEM) (SIGMA; isto se primenjuje u nastavku) koji sadrži 10% fetalnog telećeg seruma (FCS) (Invitrogen). Gore pomenuti razni antismisaoni oligomeri za preskakanje eksona 45 (Japan Bio Services Co., Ltd., Japan) (1 µM ili 300 nM) su obrazovani u konjugate sa lipofektaminom 2000 (Invitrogen), i svaki od konjugata je dodat RD ćelijama, koje su zamenjene u 0.45 mL sveže podloge, u zapremini od 50 µL po bunarčiću da bi se dobila konačna koncentracija od 100 nM ili 30 nM.

[0157] Nakon dodavanja, ćelije su kultivisane preko noći. Nakon što su ćelije jednom oprane sa PBS (Nissui Farmaceutska Co., Ltd., Japan; isto se primenjuje u nastavku), 350 µL pufera RLT (QIAGEN) koji sadrži 1% 2-merkaptoetanol (Nacalai Tesque, Inc., Japan) je dodato u ćelije, i te ćelije su lizirane tako što su ostavljene da odstoje par minuta na sobnoj temperaturi. Ćelijski lizat je sakupljen u a QIAshredder homogenizatoru (QIAGEN) i centrifugiran na 15,000 o/m tokom 2 minuta kako bi se pripremio homogenat. Ukupna RNK je ekstraktovana u skladu sa protokolom priloženim uz RNeasy Mini Kit (QIAGEN). Koncentracija ekstraktovane ukupne RNK je izmerena spektrofotometrom NanoDrop ND-1000 (LMS Co., Ltd., Japan).

[0158] Jednofazna RT-PCR je izvedena na 400 ng ukupne ekstraktovane RNK upotrebom kompleta QIAGEN OneStep RT-PCR Kit (QIAGEN). Reakcioni rastvor je pripremljen u skladu sa protokolom priloženim uz uputstvo. Korišćen je uređaj za termalno kruženje PTC-100 (MJ Research) ili TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Touch (Takara Bio Inc., Japan). Korišćeni RT-PCR program je onakav kako je prikazano dole ispod.

50°C za 30 minuta: reakcija obrnute transkripcije

95°C za 15 minuta: aktivacija polimeraze, inaktivacija obrnute transkriptaze, cDNK termalna denaturacija

[94°C za 30 sekundi; 60°C za 30 sekundi; 72 °C za 1 minut] × 35 ciklusa: PCR amplifikacija

72°C za 10 minuta: reakcija konačne elongacije

[0159] Nukleotidne sekvence prednjih i obrnutih prajmera upotrebljene za RT-PCR su onakve kako su prikazane dole ispod.

Prednji prajmer: 5'-GCTCAGGTCGGATTGACATT-3' (SEQ ID NO: 1)

Obrnuti prajmer: 5'-GGGCAACTCTTCCACCAGTA-3' (SEQ ID NO: 2)

[0160] Gore pomenuti PCR reakcioni proizvod (1 µL) je analiziran bioanalizatorom (Agilent) i sistemom MultiNA (Shimadzu Corporation, Japan).

[0161] Izmereni su polinukleotidni nivo "A" u traci sa preskakanjem eksona 45 i polinukleotidni nivo "B" u traci bez preskakanja eksona 45. Na osnovu izmerenih vrednosti "A" i "B," efikasnost preskakanja je određena prema sledećoj jednačini.

Efikasnost preskakanja (%) = A/(A B) x 100

Rezultati eksperimenta

[0162] Dobijeni rezultati su prikazani na Fig.7 i 12 do 15. Ovaj eksperiment je pokazao da je antismisaoni oligomer prema ovom pronalasku efektivno uzrokovao preskakanje eksona 45.

[Primer ispitivanja 4]

In vitro ispitivanje

[0163] Isti postupci koji su prikazani u primeru ispitivanja 1 su bili ponovljeni kako bi se izveo ovaj eksperiment, osim što su 3.5 × 10<5>RD ćelije (ćelijska linija humanog rabdomiosarkoma) transfektovane samo sa oligomerom prema ovom pronalasku (PMO br.2, PMO br.31 ili PMO br.32) ili sa jednim od dva jedinična oligomera koja čine oligomer prema ovom pronalasku pri koncentraciji od 3 µM ili 10 µM kroz Nukleofector II (Lonza) upotrebom kompleta Amaxa Cell Line Nukleofector Kit L. Korišćen je program T-030. Kombinacije transfektovanih sekvenci su prikazane dole ispod.

[Tabela 9]

Rezultati eksperimenata

[0164] Dobijeni rezultati su prikazani na Fig.9. Ovaj eksperiment je pokazao da je oligomer prema ovom pronalasku, tj., PMO br.2 (SEQ ID NO: 7), PMO br.31 (SEQ ID NO: 11) i PMO br.32 (SEQ ID NO: 12), pri čemu se svaki sastoji od dve povezane antismisaone nukleinske kiseline koje ciljaju različita mesta u eksonu 45, uzrokovao preskakanje eksona 45 sa većom efikasnošću u poređenju sa odgovarajućim antismisaonim nukleinskim kiselinama koje čine svaki oligomer (tj., PMO br.66, PMO br.63, PMO br.64 ili PMO br.65).

INDUSTRIJSKA PRIMENA

[0165] Kao što se može videti iz rezultata eksperimenata predstavljenih u primerima ispitivanja, zaključeno je da oligomer prema ovom pronalasku, koji se sastoji od kratkih međusobno povezanih oligomera, uzrokuje preskakanje eksona 45 u RD ćelijama. Stoga je oligomer prema ovom pronalasku veoma koristan u lečenju DMD.

Claims (15)

1. Patentni zahtevi 1. Antismisaoni oligomer dužine od 14 do 32 baze koji obuhvata dva povezana jedinična oligomera izabrana iz grupe koju čine (a) do (e) prikazani u nastavku, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat, pri čemu ta dva jedinična oligomera nisu susedna ili se međusobno ne preklapaju: (a) jedinični oligomer koji se sastoji od nukleotidne sekvence komplementarne sa nukleotidnom sekvencom koja se sastoji od 7 do 16 susednih baza izabranih iz nukleotidne sekvence koja se nalazi na položajima -5 do 15 od 5'-terminalnog kraja eksona 45 u humanom distrofinskom genu; (b) jedinični oligomer koji se sastoji od nukleotidne sekvence komplementarne sa nukleotidnom sekvencom koja se sastoji od 7 do 16 susednih baza izabranih iz nukleotidne sekvence koja se nalazi na položajima 48 do 70 od 5'-terminalnog kraja eksona 45 u humanom distrofinskom genu; (c) jedinični oligomer koji se sastoji od nukleotidne sekvence komplementarne sa nukleotidnom sekvencom koja se sastoji od 7 do 16 susednih baza izabranih iz nukleotidne sekvence koja se nalazi na položajima 128 do 150 od 5'-terminalnog kraja eksona 45 u humanom distrofinskom genu; (d) jedinični oligomer koji se sastoji od nukleotidne sekvence komplementarne sa nukleotidnom sekvencom koja se sastoji od 7 do 16 susednih baza izabranih iz nukleotidne sekvence koja se nalazi na položajima 15 do 40 od 5'-terminalnog kraja eksona 45 u humanom distrofinskom genu; i (e) jedinični oligomer koji se sastoji od nukleotidne sekvence komplementarne sa nukleotidnom sekvencom koja se sastoji od 7 do 16 susednih baza izabranih iz nukleotidne sekvence koja se nalazi na položajima 110 do 125 od 5'-terminalnog kraja eksona 45 u humanom distrofinskom genu.
2. 2. Antismisaoni oligomer ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat prema zahtevu 1, pri čemu jedan od ta dva jedinična oligomera predstavlja (a).
3. 3. Antismisaoni oligomer ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat prema zahtevu 1 ili 2, koji se sastoji od bilo koje nukleotidne sekvence izabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO: 7 do 12, 14 do 33, 40 do 52, 57, 64, 65 i 79 do 86.
4. 4. Antismisaoni oligomer ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat prema bilo kom od zahteva 1 do 3, koji se sastoji od bilo koje nukleotidne sekvence izabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO: 8, 10, 25, 30, 33, 79 i 80.
5. 5. Antismisaoni oligomer ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat prema bilo kom od zahteva 1 do 4, koji predstavlja oligonukleotid.
6. 6. Antismisaoni oligomer ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat prema zahtevu 5, pri čemu je najmanje jedan nukleotid koji čini oligonukleotid modifikovan na šećernoj grupi i/ili na grupi fosfatne veze.
7. 7. Antismisaoni oligomer ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat prema zahtevu 5 ili 6, pri čemu šećerna grupa od najmanje jednog nukleotida koji čini oligonukleotid predstavlja ribozu u kojoj je -OH grupa na 2'-položaju supstituisana bilo kojom grupom izabranom iz grupe koju čine OR, R, R'OR, SH, SR, NH2, NHR, NR2, N3, CN, F, Cl, Br i I (pri čemu R predstavlja alkil ili aril, a R' predstavlja alkilen).
8. 8. Antismisaoni oligomer ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat prema zahtevu 6 ili 7, pri čemu grupa fosfatne veze od najmanje jednog nukleotida koji čini oligonukleotid predstavlja bilo koju izabranu iz grupe koju čine fosforotioatna veza, fosforoditiolatna veza, alkilfosfonatna veza, fosforoamidatna veza i boranofosfatna veza.
9. 9. Antismisaoni oligomer prema bilo kom od zahteva 1 do 4, koji predstavlja morfolino oligomer, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat.
10. 10. Antismisaoni oligomer prema zahtevu 4 ili 9, koji predstavlja fosforodiamidat morfolino oligomer, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat.
11. 11. Antismisaoni oligomer prema bilo kom od zahteva 9 do 10, čiji 5'-terminalni kraj predstavlja bilo koji iz grupa predstavljenih hemijskim formulama (1) do (3) prikazanim u nastavku, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat.
12. 12. Farmaceutska kompozicija za lečenje mišićne distrofije, koja obuhvata antismisaoni oligomer ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili hidrat kao aktivni sastojak prema bilo kom od zahteva 1 do 11.
13. 13. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 12, koja dalje obuhvata farmaceutski prihvatljiv nosač.
14. 14. Antismisaoni oligomer ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat prema bilo kom od zahteva 1 do 11 za upotrebu u lečenju mišićne distrofije kod pacijenta sa mišićnom distrofijom, pri čemu je taj pacijent opciono humani pacijent.
15. 15. Antismisaoni oligomer ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat za upotrebu prema zahtevu 14, pri čemu u lečenju, pacijent sa mišićnom distrofijom ima mutaciju koja se cilja preskakanjem eksona 45 u distrofinskom genu, pri čemu je taj pacijent opciono humani pacijent.