RS60850B1

RS60850B1 - Izolovanje nukleinskih kiselina

Info

Publication number: RS60850B1
Application number: RS20201088A
Authority: RS
Inventors: Stephen John Minter; Georgios Patsos
Original assignee: Revolugen Ltd
Priority date: 2015-03-17
Filing date: 2016-03-17
Publication date: 2020-10-30
Also published as: SMT202000507T1; GB201504459D0; HRP20201452T1; SI3277809T1; HUE051568T2; ES2819903T3; US20180066246A1; CY1123363T1; AU2016231944B2; PL3277809T3; EP3277809B1; US10934539B2; AU2016231944A1; AU2016231944A8; CN107743521A; DK3277809T3; PT3277809T; JP2018508239A; JP6713007B2; EP3277809A1

Description

Opis

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na izolovanje nukleinskih kiselina koje sadrže DNK iz biološkog materijala (npr. ćelija) korišćenjem postupka lize i preradom lizata za izolovanje nukleinskih kiselina koje sadrže DNK. Tačnije, predmetni pronalazak uključuje imobilizaciju nukleinskih kiselina koje sadrže DNK iz liziranog biološkog materijala na čvrstom nosaču i prečišćavanje nukleinskih kiselina koje sadrže DNK na nosaču pre eluiranja nukleinskih kiselina koje sadrže DNK sa nosača za sakupljanje. Poseban cilj ovog predmetnog pronalaska je da obezbedi proces koji je relativno brz i primenljiv u praksi i koji proizvodi nukleinske kiseline koje sadrže DNK visoke čistoće sa dobrim prinosom. Predmetni pronalazak se takođe odnosi na kompozicije za primenu u postupku lize.

[0002] Izolovanje čistih, netaknutih nukleinskih kiselina koje sadrže DNK iz biološkog materijala (npr. ćelija) je važno u brojnim poljima, npr. istraživanju i kliničkoj dijagnozi. Dakle, čisto kao primer, klinički uzorci koji sadrže ćelije pacijenta mogu biti podvrgnuti postupku (uključujući korak lize ćelije) za izolovanje nukleinskih kiselina koje sadrže DNK, koja se zatim analizira postupcima dobro poznatim u struci. Takva analiza može biti u svrhu identifikovanja DNK iz određene bakterije (da bi se utvrdilo da li je pacijent ili nije zaražen tom bakterijom) ili može biti u svrhu da li DNK pacijenta, ima ili nema, jednu ili više tačkastih mutacija odgovornih za zdravstveno stanje.

[0003] US-A-8 598 338 stavlja na uvid javnosti kompozicije i postupak za upotrebu čvrstog nosača za izolovanje DNK iz biološkog materijala (npr. ćelija). Postupak uključuje barem sledeće korake:

(a) liziranje biološkog materijala puferskom kompozicijom za liziranje koja sadrži (i) litijumovu so, npr. litijum hlorid, u koncentraciji od najmanje 1M ali sa prioritetom za mnogo veće koncentracije (do 10M), (ii) površinski aktivno sredstvo koje može biti SDS u koncentraciji od 0.05 do 0.2% ali koje je poželjno nejonsko površinski aktivno sredstvo prisutno u mnogo višim koncentracijama (npr. najmanje 5%), i (iii) opciono helatno sredstvo; (b) mešanje kompozicije iz (a) sa "rastvorom za „spajkovanje“-obogaćivanje DNK" (eng. spiking solution - rastvor sa poznatom količinom supstance) koji može biti ili (i) čist alkohol (npr. metanol, etanol ili najpoželjnije izo-propanol), ili (ii) rastvor litijumove soli u koncentraciji od 10-15M;

(c) dovođenje u kontakt rezultujuće smeše sa čvrstim nosačem radi imobilizacije DNK iz liziranog materijala;

(d) pranje nosača tečnošću za ispiranje koja sadrži alkohol, i

(e) eluiranje DNK.

[0004] Iako nije isključena iz opšte predmetne objave US-A-8 598 338, veoma je poželjno da se postupak iste izvodi bez upotrebe haotropnih agenasa (npr. soli guanidinijuma). Postupci opisani u Primerima 4 i 5 slede gore opisano učenje i koriste rastvor za lizu sa 6M LiCl i "Rastvore za „spajkovanje“ DNK"sa 10M LiCl.

[0005] Postupak US-A-8 598 338 ima taj nedostatak što visoke koncentracije litijumove soli korišćene u kompozicijama za lizu i "rastvoru za „spajkovanje“ DNK" predstavljaju rizik od kontaminacije izolovane DNK litijumovom solju. S tim u vezi, poznato je da LiCl na 30Mm inhibira PCR reakciju, videti članak pod naslovom "Inhibition of Polymerase Chain Reaction by Lithium Chloride" autora Ganaie et al (International Journal of Life Science & Pharma Research, tom 2/lzdanje 4, Okt-Dec 2012, Strane L1 do L5). Stoga, kontaminacija LiCl-om može uticati na naknadne primene.

[0006] Stoga je cilj ovog predmetnog pronalaska da ukloni ili ublaži gore pomenuti nedostatak.

[0007] Prema prvom aspektu predmetnog pronalaska obezbeđen je postupak izolovanja nukleinskih kiselina koje sadrže DNK iz biološkog materijala, postupak koji obuhvata korake:

(i) vršenje liziranja biološkog materijala vodenim rastvorom koji sadrži litijum u koncentraciji od 0.05 do manje od 1M, helatni agens, i surfaktant za proizvodnju vodene lizirane kompozicije,

(ii) tretiranje lizirane kompozicije sa čvrstim nosačem u prisusutvu rastvorenog haotropnog agensa u koncentraciji od 0.05 do 2M i 25% do 60% po zapremini u tečnosti rastvorenog C1-

3alkanola, pri čemu je navedeni čvrsti nosač sposoban za imobilizaciju DNK,

(iii) odvajanje čvrstog nosača od tečnosti,

(iv) tretiranje čvrstog nosača rastvorom za prvo ispiranje koji sadrži litijumovu so u koncentraciji od 0.05 do 1M, pri čemu pomenuti rastvor za prvo ispiranje sadrži 20% do 90% po zapremini rastvorenog C1-3alkanola,

(v) odvajanje čvrstog nosača od prve tečnosti za ispiranje,

(vi) tretiranje čvrstog nosača sa tečnošću za drugo ispiranje koja sadrži najmanje 80% po zapremini C1-3alkanola, pri čemu je ravnoteža ako je prisutna voda,

(vii) odvajanje čvrstog nosača od rastvora za drugo ispiranje, i

(viii) eluiranje nukleinskih kiselina koje sadrže DNK iz čvrstog nosača.

[0008] Poželjne odlike ove predmetne objave, koje se mogu koristiti u bilo kojoj kombinaciji, su stavljene na uvid javnosti u Dodatku 1 ove specifikacije.

[0009] Nukleinska kiselina koja sadrži DNK izolovana postupkom prema predmetnom pronalasku može da sadrži RNK i može biti celokupna nukleinska kiselina.

[0010] Predmetni pronalazak obezbeđuje odlične rezultate u izolovanju nukleinskih kiselina koje sadrže DNK. Suprotno razmatranjima iz US-A-8 598 338, postupci lize koriste relativno niske koncentracije litijumove soli i takođe koriste haotropni agens (poželjno so guanidinijuma). Izolovane nukleinske kiseline koje sadrže DNK su visoke čistoće, sa malim rizikom od kontaminacije litijumovim solima, s obzirom na relativno male količine onih koje se koriste u procesu prema predmetnom pronalasku. Postupak prema predmetnom pronalasku rezultira izolovanjem suštinski čistih i suštinski netaknutih nukleinskih kiselina koje sadrže DNK.

[0011] Postupak iz drugog aspekta predmetnog pronalaska može da se koristi za izolovanje nukleinskih kiselina koje sadrže DNK (naročito genomsku DNK) iz širokog spektra uzoraka koji sadrže DNK biološkog porekla. Uzorak iz kojeg treba da se izoluje DNK može biti, ili može da sadrži, ćelije, na primer životinjske ćelije (uključujući sisare), biljne ćelije, bakterijske ćelije, ili ćelije kvasca ili drugih gljivica. Alternativno, uzorak iz kojeg treba da se izoluje DNK može biti, ili može da sadrži, jedan ili više virusa.

[0012] Ćelije, virus(i) ili drugi uzorak koji sadrži DNK iz kojih treba izolovati nukleinske kiseline koje sadrže DNK mogu da potiču ili su bili prisutni u uzorku tkiva ili telesnim tečnostima kao što su krv, ispljuvak, urin ili likvor (CSF – cerebrospinal fluid)

[0013] U određenim tehničkim rešenjima (npr. za lizu gram negativnih bakterija), postupak predmetnog pronalaska može se izvršiti bez tretmana ćelija bez enzima proteaze (npr. proteinaza K) i bez potrebe za korakom zagrevanja. U drugim tehničkim rešenjima (npr. za tretiranje tkiva (kao što je krv u svrhu liziranja ćelija pune krvi) i za lizu gram pozitivnih bakterija), uzorak se može dodatno tretirati proteazom (npr. proteinazom K). U potonjim tehničkim rešenjima, tretman enzimom proteazom (proteinaza K) može biti efikasan sa istovremenim tretmanom rastvorom za lizu koji sadrži litijum.

[0014] Nukleinske kiseline koje sadrže DNK dobijene postupkom prema predmetnom pronalasku su dovoljno čiste da se koriste u svrhu dalje analize tehnikama dobro poznatim u struci. DNK može da se koristi, na primer, u svrhe istraživanja ili za dijagnozu zdravstvenog stanja, prema potrebi.

[0015] Postupak predmetnog pronalaska može se pogodno primeniti na pelet biološkog materijala (npr. ćelije) koji se lizira. Pelet se može dobiti centrifugiranjem tečnog uzorka koji sadrži biološki materijal, koristeći tehnike dobro poznate u struci.

[0016] U koraku (i) postupka prema predmetnom pronalasku za izolovanje nukleinskih kiselina koje sadrže DNK iz uzorka biološkog materijala (npr. ćelija), materijal se lizira sa vodenom kompozicijom koja sadrži litijum (obezbeđen iz litijumove soli) u koncentraciji od 0.05 do manje od 1.0 molova po litru, helatni agens i surfaktant. Kompozicija može da sadrži navedene komponente, može da se sastoji suštinski od navedenih komponenti, ili se sastojati od ovih komponenti.

[0017] Litijumova so je poželjno litijum halid, najpoželjnije litijum hlorid i poželjno je da bude prisutna u kompoziciji u koncentraciji od 0.05 do manje od 1 molova po litru, poželjno 0.1 do 0.9 molova po litru, poželjnije 0.6 do 0.9 molova po litru, čak još poželjnije 0.75 do 0.85 molova po litru i najpoželjnije oko 0.8 molova po litru.

[0018] Helatni agens, koji je najpoželjnije EDTA ili njegova so kao što je so alkalnog metala (npr. natrijuma), poželjno je prisutna u kompoziciji u koncentraciji 1 do 20 mM po litru, još poželjnije 8 do 15 milimolova po litru, poželjnije 9 do 11 milimolova po litru i najpoželjnije oko 10 milimolova po litru.

[0019] Površinski aktivno sredstvo može biti nejonski surfaktant ali je poželjniji anjonski surfaktant, najpoželjnije SDS.

[0020] Rastvor za lizu može imati pH od 7 do 8 ali nije nužno puferisan u ovom pH opsegu. Dakle, rastvor za lizu može biti nepuferisana kompozicija.

[0021] U prvom tehničkom rešenju sprovođenja postupka predmetnog pronalaska, materijal koji se lizira (npr. u obliku peleta) može da se tretira rastvorom za lizu koji sadrži, sastoji se suštinski od, ili se sastoji od komponenti definisanih u koraku (i) postupka prema predmetnom pronalasku.

Materijal (npr. ćelije) se temeljno pomeša sa kompozicijom (npr. pipetiranjem) i liza se vrši na temperaturi okoline u odgovarajućem vremenskom periodu. Uglavnom je pogodan vremenski period od 15 do 25 minuta, npr. oko 20 minuta.

[0022] U skladu sa ovim prvim tehničkim rešenjem, lizat se zatim može pomešati sa rastvorom haotropnog agensa, poželjno obezbeđenom solju guanidinijuma (npr. guanidinijum hlorid, takođe poznat kao guanidinijum hidrohlorid ili guanidin hidrohlorid), pri čemu rastvor guanidinijumove soli ima koncentraciju u opsegu 0.05 do 1M, poželjno 0.1 do 1M, još poželjnije 0.5 do 0.9M, i najpoželjnije 0.6 do 0.7M. Zatim se dobijena kompozicija ponovo temeljno promeša. Etanol (ili drugi C1-3alkanol, npr. izo-propanol) se može zatim dodati uz mešanje i u takvoj količini da rastvor postane bistar. Generalno količina etanola (ili drugih alkanola) biće 35% do 45% po zapremini, najpoželjnije 35% do 40% po zapremini. Još jednom se izvrši temeljno mešanje. Dobijena smeša se onda dovede u kontakt sa čvrstim nosačem, u skladu sa postupcima koji su detaljnije opisani u daljem opisu ove specifikacije.

[0023] U alternativnom drugom tehničkom rešenju postupka prema predmetnom pronalasku, vodeni rastvor za lizu može da sadrži, sastoji se suštinski od, ili se sastoji od vode i drugih komponenata definisanih za korake (i) i (ii) postupka. U ovom tehničkom rešenju, vodeni rastvor za lizu može da sadrži, sastoji se suštinski od, ili se sastoji od vode, litijum hlorida u koncentraciji od 0.2 do 0.3M, EDTA ili njegove natrijumove soli u koncentraciji od 1 do 5mM, guanidinijum hlorida u koncentraciji od 0.6 do 0.7M, SDS-a u količini od 0.2 do 0.4% po masi i 35-40% po zapremini etanola ili drugog C1-3alkanola (npr. izo-propanola)

[0024] Za dalja tehnička rešenja postupka prema drugom aspektu predmetnog pronalaska, korak lize može da se izvrši u prisustvu čvrstog nosača. Dakle, na primer, bilo koji od prethodno definisanih rastvora za lizu može da se dovede u kontakt sa čvrstim nosačem a zatim doda biološki materijal.

[0025] Čvrsti nosač koji se koristi za postupak prema predmetnom pronalasku može biti silicijum dioksid ili materijal na bazi silicijum dioksida. Silicijum dioksid ili materijal na bazi silicijum dioksida može biti staklo, poželjno borosilikatno staklo. Nosač može da sadrži vlaknasti materijal, a poželjno sadrži vlakna silicijum dioksida ili materijal na bazi silicijum dioksida. Filter poželjno sadrži borosilikatna staklena vlakna. Kao prednost, nosač je u obliku vlaknaste ploče ili membrane u kojoj su vlakna od borosilikatnog stakla. Filteri tipa koji je dostupan pod oznakom POREX F su pogodni za primenu u predmetnom pronalasku. Pogodno, čvrst nosač je obezbeđen kao filter (u obliku ploče ili membrane) u epuveti za centrifugu tipa koji je dobro poznat u struci. Kao što je naznačeno, filter u epruveti za centrifugu je poželjno ploča ili membrana koja sadrži borosilikatna vlakna. Poželjno je da se više od jednog od takvih filtera ili ploča nalaze u epruveti za centrifugu. Najpoželjnije je da se u epruveti za centrifugu nalaze četiri takva membranska ili pločasta filtera (u odnosu licem u lice). Naročito dobri rezultati postižu se tamo gde pločasti ili membranski filteri sadrže materijal dostupan kao POREX F.

[0026] Kompozicija koja nastaje u koraku (ii) postupka (koji je mogao biti sproveden istovremeno sa korakom (i) može se uvesti u epruvetu za centrifugu i onda centrifugira. Tokom centrifugiranja, nukleinske kiseline koje sadrže DNK (koje na kraju treba izolovati) se vežu za čvrst nosač i većina nečistoća (proteini itd.) prolazi kroz čvrst nosač (filter) i sakuplja se u supernatantu, koji se potom može odbaciti.

[0027] U sledećem koraku postupka, čvrst nosač se ispira kako bi se uklonile sve preostale nečistoće i ostavile suštinski čiste nukleinske kiseline koje sadrže DNK imobilisane na nosaču. Ispiranje se vrši u dve faze. U prvoj fazi ispiranja, čvrst nosač se tretira sa tečnošću za prvo ispiranje koja sadrži litijumovu so (poželjno litijum halid, najpoželjnije litijum hlorid) u koncentraciji od 0.05 do 1M (poželjno 0.3 do 1M, npr. 0.3 do 0.6M, ili 0.6 do 1M) i etanol (ili drugi C1-3alkanol, npr. izo-propanol) u količini of 45-55% po zapremini. Prva tečnost za ispiranje može se, na primer, pripremiti rastvaranjem odgovarajuće količine litijumove soli u, recimo 50% vodenom etanolu (ili drugom C1-3alkanolu, npr. izo-propanolu). Prva tečnost za ispiranje poželjno se sastoji u osnovi od litijumove soli, etanola (ili drugog C1-3alkanola, npr. izo-propanola) i vode. Otkrili smo da je kombinacija litijumove soli (poželjno litijum hlorida) i etanola (ili drugog C1-

3alkanola, npr. izo-propanola) posebno efikasna kao prva tečnost za ispiranje. Najpoželjnije je da prva tečnost za ispiranje sadrži litijum hlorid u koncentraciji od oko 400mM do 800mM (npr. oko 400mM ili oko 800mM) u 50% vodenom etanolu (ili drugom C1-3alkanolu, npr. izo-propanolu).

[0028] Ako se postupak izolovanja izvodi u epruveti za centrifugu, onda se prva tečnost za ispiranje dodaje u epruvetu za centrifugu i zatim se centrifugira da bi prva tečnost za ispiranje prošla kroz filter i uklonila barem neke od preostalih nečistoća koje se sakupljaju u supernatantu, koji se zatim odbacuje.

[0029] Zatim se izvodi drugi i obično završni korak ispiranja tečnošću za drugo ispiranje koja sadrži najmanje 80% po zapremini etanola ili drugog C1-3alkanola (npr. izo-propanola), pri čemu je ravnoteža ako je prisutna voda. Ova druga tečnost za ispiranje poželjno sadrži (ili se suštinski sastoji od ili se sastoji od) oko 90% po zapremini etanola ili drugog C1-3alkanola (npr. izopropanola).

[0030] U slučaju kada se postupak izvodi pomoću epruvete za centrifugu, druga tečnost za ispiranje se dodaje u epruvetu za centrifugu i zatim se centrifugira da bi druga tečnost za ispiranje prošla kroz filter i uklonila preostale nečistoće koje se sakupljaju u supernatantu, koji se zatim odbacuje.

[0031] U ovoj fazi, željene nukleinske kiseline koje sadrži DNK su imobilisane, u suštinski čistom obliku, na čvrstom nosaču i mogu se eluirati rastvorom za eluiranje. Rastvor za eluiranje može da sadrži (sastoji se suštinski od ili se sastoji od) puferski rastvor EDTA ili njegovu so. Naročito pogodan rastvor za eluiranje sadrži Tris-HCl u koncentraciji od oko 10mM, i EDTA dinatrijum so dihidrat u koncentraciji od oko 0.5mM, pri čemu rastvor ima pH 9.

[0032] U slučaju kada se postupak prema predmetnom pronalasku primenjuje sa spin-kolonom koja sadrži filter na kome su imobilisane nukleinske kiseline koje sadrže DNK, rastvor za eluiranje se može dodati u spin kolonu koja se zatim centrifugira da bi rastvor za eluiranje eluirao nukleinske kiseline koje sadrže DNK sa čvrstog nosača za sakupljanje.

[0033] Sakupljene nukleinske kiseline koje sadrže DNK mogu se zatim dalje analizirati prema potrebi.

[0034] Kao što je gore naznačeno, postupak prema predmetnom pronalasku se poželjno izvodi pomoću epruvete za centrifugu. Tipičan protokol za sprovođenje postupka prema predmetnom pronalasku dat je u nastavku:

[0035] Do sada je predmetni pronalazak opisan posebno u pogledu postupka izolovanja nukleinskih kiselina koje sadrže DNK i kompozicija rastvora kako se koriste u ovom postupku. Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje kitove koji se mogu koristiti za praktičnu primenu postupka za dobijanje nukleinskih kiselina koje sadrže DNK.

[0036] Prema daljem (trećem) aspektu predmetnog pronalaska obezbeđen je kit za ekstrakciju genomske DNK iz ćelija, koji uključuje u kombinaciji:

(i) vodeni rastvor koji sadrži, sastoji se suštinski od, ili se sastoji od vode, litijum hlorida u koncentraciji od 0.7 do 0.9 molova po litru, EDTA ili njegove natrijum soli u koncentraciji od 5 do 15mM, i 0.9 do 1.1% po masi SDS-a,

(ii) vodeni rastvor guanidinijum soli, (poželjno oko 2M koncentracije štoka od kojeg se 350µl može koristiti u konačnoj zapremini od 1050µl),

(iii) etanol,

(iv) prvu tečnost za ispiranje koja sadrži litijum hlorid u koncentraciji od 0.3 do 0.6M, pri čemu navedena prva tečnost sadrži etanol u količini od 45% do 55% po zapremini,

(v) drugu tečnost za ispiranje koja sadrži najmanje 80% po masi etanola, pri čemu je ravnoteža ako je prisutna voda,

(vi) pufer za eluiranje, i

(vii) spin kolonu koja ima filter za imobilizaciju DNK.

[0037] Reagensi i komponente kita mogu biti kao što je potpunije opisano gore.

[0038] U modifikaciji kita iz trećeg aspekta predmetnog pronalaska, modifikovani kit može da sadrži vodeni etanolni (ili drugi C1-3alkanski) rastvor guanidinijum soli (tj. kombinovanje (ii) i (iii) gore navedenih).

[0039] Prema četvrtom aspektu predmetnog pronalaska obezbeđen je kit za ekstrakciju genomskih nukleinskih kiselina koje sadrže DNK iz ćelije, pri čemu kit sadrži u kombinaciji:

(i) vodeni rastvor koji sadrži, suštinski se sastoji od, ili se sastoji od litijum hlorida u koncentraciji od 0.2 do 0.3 molova po litru, EDTA ili njegove natrijum soli u koncentraciji od 1 do 5 milimolova po litru, SDS-a u količini od 0.2-0.4% po masi, guanidinijum soli koncentracije od 0.6 do 0.7M i etanola u količini od 35-45% po zapremini,

(ii) prvu tečnost za ispiranje koja sadrži litijum hlorid u koncentraciji od 0.3 do 0.6M, pri čemu navedena prva tečnost sadrži etanol u količini od 45% do 55% po zapremini,

(iii) drugu tečnost za ispiranje koja sadrži najmanje 80% po masi etanola, pri čemu je ravnoteža ako je prisutna voda,

(iv) pufer za eluiranje, i

(v) spin kolonu koja ima filter za imobilisanje nukleinskih kiselina koje sadrže DNK.

[0040] Reagensi i komponente kita mogu biti kao što je poptpunije opisano gore.

[0041] Takođe je stavljena na uvid javnosti vodena kompozicija za lizu, koja sadrži, sastoji se od, ili suštinski se sastoji od vodenog rastvora koji sadrži litijumovu so u koncentraciji od 0.5 do 1.0M, helatnog agensa, i surfaktanta.

[0042] Predmetni pronalazak će sada biti ilustrovan pozivajući se na sledeće neograničavajuće Primere 1-5 i Slike 1-5 pratećih crteža.

[0043] U Primerima 1-4, upućuje se na "Postupak_A". Ovo je postupak u skladu sa predmetnim pronalaskom i sproveden je u skladu sa sledećim protokolom.

(a) Peletirati ćelije centrifugiranjem i odbaciti supernatant

(b) Dodati 300µl rastvora za lizu (800mM LiCI, 10mM dihidrata EDTA dinatrijum soli, 1% SDS) i dobro izmešati pipetiranjem

(c) Inkubirati tokom 20minuta na Sobnoj Temperaturi

(d) Dodati 350µl 2M Guanidin hidrohlorida i mešati okretanjem epruvete ili pipetiranjem (e) Dodati 400µl EtOH-a i mešati okretanjem epruvete ili pipetiranjem

(f) Staviti 600µl u spin kolonu (sa 4 POREX F filtera) i vrteti na 8,000opm tokom 1min (g) Staviti preostali lizat u spin kolonu i vrteti na 8,000opm tokom 1min

(h) Dodati 500µl prve tečnosti za ispiranje (400mM LiCI, 50% EtOH) i vrteti na 8,000 opm tokom 1min

(i) Dodati 500µl druge tečnosti za ispiranje (400mM LiCI, 90% EtOH) i vrteti na 14,000 opm tokom 3 minuta

(j) Vrteti na 14,000opm tokom 1min

(k) Dodati 200µl pufera za eluiranje (10mM Tris-HCl,0.5mM EDTA dinatrijum soli dehidrat dihidrata, pH 9.0) i eluirati na 8,000opm tokom 1min

Primer 1

IVD primena

[0044] Postupak_A je razvijen za in vitro dijagnostičku (IVD) primenu, prvenstveno ciljajući na STI-e (polno prenosive infekcije) kao što je Neisseria gonorrhoea (NG) Chlamydia trachomatis (CT), ali nije ograničen na STI-e ili samo na NG i CT.

[0045] Klinički uzorci korišćeni da verifikuju IVD potencijal Postupka_A su već dijagnostifikovani kao NG-pozitivni, CT-pozitivni ili negativni (NEG) i za NG i CT upotrebom BD Viper sistema koji testira prisustvo oba i NG i CT (brojevi služe za identifikaciju pacijenta). Približno 10ml kliničkih uzoraka urina se vrti u zapečaćenim kantama za centrifugu pri 5000 x g tokom 30minuta i peleti su obrađeni pomoću Postupka_A. DNK ekstrakti su korišćeni kao šabloni u kvantitativnim (q) i digitalno kapljčnim (eng. digital droplet (dd)) PCR eksperimentima. U oba eksperimenta dijagnoza koja je izvedena primenom Postupka _A poklapala se sa dijagnozom BD Viper sistema (Tabela 1).

Tabela 1. Ekstrakti DNK prema Postupku_A koji su izvedeni iz kliničkih uzoraka urina potvrdili su početnu dijagnozu primenom qPCR-a i ddPCR-a. Ct vrednost predstavlja qPCR vrednost praga ciklusa.

Primer 2

Procenat oporavka ekstrahovane DNK

[0046] Približno 10<8>Neisseria gonorrhoea (NG) ćelija laboratorijske kulture tretirano je u skladu sa Postupkom_A da bi se ekstrahovale nukleinske kiseline koje sadrže DNK u triplikatu u dva nezavisna eksperimenta. Koncentracija i čistoća svakog od replikata procenjena je Nanodrop kvantifikacijom. Prosečna koncentracija i odnos vrednosti A260/A280 za svaki experiment su zatim korišćeni za izračunavanje proseka i StDev za oba eksperimenta. Utvrđeno je da je čistoća DNK koja će se koristiti kao ulaz u proceni potencijala za oporavak DNK Postupka_A u okviru prihvaćenih standarda (Tabela 2).

Tabela 2. Koncentracioni prinos i čistoća uzoraka koji se koriste za procenu procenta oporavka

DNK.

[0047] Za svaki od dva eksperimenta objedinjeni su triplikati. Svaka grupa je korišćena za alikvot 2, 4 i 6µg DNK za eksperimente za procenat oporavka DNK. Detaljnije, svaka grupa je korišćena za izradu dva skupa triplikata koji će se naknadno koristiti u dva eksperimenta po grupi. Ukratko, prečišćeni uzorci DNK su prošli kroz ekstrakcioni protokol Postupka_A, a vrednosti Nanodropa pre i posle ekstrakcije su korišćene za izračunavanje procenta oporavka DNK sistema Postupka_A. Prosečne vrednosti procenta oporavka za svaki od četiri pojedinačna eksperimenta korišćeni su za izračunavanje proseka i StDev-e za sve eksperimente. U zaključku oporavak DNK Postupka_A je visok (80 do 90%) u zavisnosti od ukupne koncentracije ulazne DNK. Iako se procenat oporavka DNK smanjuje sa porastom količina DNK, opseg koncentracije korišćen u ovim eksperimentima (2 do 6µg) je znatno veći od DNK koncentracija koje se predviđaju koje potiču iz kliničkih uzoraka (stotine nanograma; podaci nisu prikazani) (Tabela 3 i Slika 1).

Tabela 3. Procenat oporavka DNK Postupka_A.

Primer 3

Poređenje fenotipa, prinosa i čistoće ekstrahovane DNK prema DNeasy

[0048] Približno 0.5 x 10<8>NG ćelija laboratorijske kulture tretirano je u skladu sa Postupkom_A da bi se u četvorostrukom uzorku ekstrahovale nukleinske kiseline koje sadrže DNK, upoređujući Postupak_A (20minuta lize) sa DNeasy (1sat lize) koristeći Gram negativni deo ekstrakcije protokola. Kao standard poređenja izabran je DNeasy, jer se smatra jednim od kitova za ekstrakciju DNK sa najboljim prinosom na tržištu. DNK koja je ekstrahovana korišćenjem oba postupka proizvela je vrlo sličan fenotip prema oceni elektroforeze na agaroznom gelu (Slika 2). Pored toga Postupak_A je proizveo DNK vrste niže molekulske mase sa većim prinosom od DNeasy. Čistoća (A260/A280) i prinos procenjeni su Nanodrop kvantifikacijom (Tabela 4). Veća očitavanja za Postupak_A mogu se objasniti uglavnom razlikom u količini za trake nižih molekulskih masa. Donje dve trake na gelu su, prema dobavljaču soja: NCTC (Public Health England), kriptični plazmid od NG i njegov supernamotani derivat. Zbog toga je sistem Postupka_A posebno efikasan u izolovanju bakterijskih plazmida. Bakterijski plazmidi su veoma važni dijagnostički ciljevi tj. rezistentnost NG na antibiotik, i kriptični plazmid Chlamydia trachomatis (CT) konzerviran među serovarima. Dodatno, antimikrobna rezistencija kodirana plazmidima je široko raširen fenomen za mnoge bakterijske vrste - videti na primer članak čiji je autor P.M. Bennett pod naslovom "Plasmid Encoding Antibiotic Resistance: and Transfer of Antibiotic Resistance Genes in Bacteria (British Journal of Pharmacology (2008) 153, S347-S357).

Tabela 4. Poređenje prinosa i čistoće DNK između Postupka_A i komercijalnog DNeasy.

Primer 4

Osetljivost

[0049] Da bi se testirala osetljivost Postupka_A NG ćelije laboratorijske kulture titrovane su u pozadini od 300,000 HeLa epitelnih ćelija, što je veoma veliki broj jedarnih ćelija za stvarne uzorke urina (očekuje se -7000 humanih jedarnih ćelija po ml urina). Titracije su izvedene struganjem NG ćelija sa ploče sa čokoladnim agarom (O/N NG kultura) i zatim suspendovanjem bakterija u 1x PBS.1/100, 1/1000, 1/10,000, 1/100,000 i 1/1,000,000 titratcije bakterijskog štoka pripremljene su u četvorostrukom uzorku i centrifugirane su zajedno sa HeLa ćelijama, prema tome obogaćivanja 300,000 HeLa ćelija sa različitim brojevima NG ćelija. Dva replikata su korišćena za ekstrakciju DNK i još dve uzgajane O/N na pločama sa čokoladnim agarom za ukupan broj vijabilnih mikroorganizama (eng.total viable counts (TVC)). 5µl svakog ekstrakta (ukupan ekstrakt od 200µl eluata) je korišćeno kao šablon u PCR reakciji (NG specifični prajmeri). 3µl amplikona je pokrenuto na 2% agaroznom gelu (Slika 3). Elektroforeza na agaroznom gelu ne može da se koristi za pouzdanu kvantifikaciju izlaza PCR amplifikacije, stoga je korišćena kombinacija vrednosti TVC i testa λ-egzonukleaze (kao što je stavljeno na uvid javnosti u PCT patentnoj prijavi br. PCT/GB2015/052561) da bi se izračunao broj vijabilnih NG ćelija koje su lizirane za svako razblaženje i to povezalo sa merljivim izlaznim testom. Pošto su ploče sa čokoladnim agarom prekrivene tepihom NG ćelija za većinu razblaženja, izbrojane su samo 1/1,000,000 ploče i ploče sa 1/100,000 razblaženjem i na osnovu ovih brojanja ekstrapoliran je broj ćelija za ostala razblaženja.1/1,000,000 i 1/100,000 razblaženje dalo je u proseku -30 i 300 NG ćelija, redom, prema tome ove vrednosti su korišćene za ekstrapolaciju broja ćelija za ostala razblaženja.

[0050] Dodatno, test λ-egzonukleaze je visoko specifični enzimski test izotermalne amplifikacije koji može da prihvati PCR amplikone kao analite. Izlazni podaci ovog testa su direktno proporcionalni početnoj količini analita koja se prati očitavanjem u realnom vremenu na čitaču fluorescentnih ploča. Zbog svoje visoke specifičnosti, kvantifikacija je relativna samo za ciljnu sekvencu a ne i za nespecifične amplifikovane sekvence, prajmer-dimere itd. U ovom konkretnom testu ispitivan je NG konzervirani region koji bi bio prisutan u amplikonu (Slika 4). Nakon 30minuta inkubacije na 37C očitane su RFU vrednosti na čitaču ploča, od svih uzoraka oduzeta je fluorescencija pozadine (prazan PCR uzorak) od svih uzoraka. U zaključku, sistem Postupka_A može da se koristi za ekstrakciju PCR-skih DNK od nekoliko desetina do stotina (niže osetljivosti na oko -30 do 300) bakterijskih ćelija protiv visoke pozadine humanih jedarnih ćelija.

Primer 5

[0051] Ovaj Primer koristi sledeću proceduru ("Postupak _B") za ekstrakciju nukleinske kiseline koja sadrži DNK iz peletiranih ćelija.

1. Dodati 300 µL rastvora za lizu (0.8M LiCI, 10mM EDTA, 1% SDS) peletu i temeljno pipetirati.

2. Dodati 20 µL Proteinaze K (20mg/mL rastvora štoka) i vorteksovati 5 sekundi.

3. Inkubirti na 56°C tokom 20 minuta.

4. Dodati 350 µL (2M guanidin hidrohlorida) i vorteksovati 5 sekundi.

5. Dodati 400 µL etanola i vorteksovati 5 sekundi.

6. Dodati 600 µL rezultirajućeg rastvora u spin kolonu.

7. Centrifugirati na 8,000 do 11,000opm tokom 1 minut.

8. Odbaciti rezultujuću tečnost nakon protoka (eng. the flow-through).

9. Dodati ostatak uzorka u spin kolonu.

10. Centrifugirati na 8,000 do 11,000opm tokom 1 minut.

11. Odbaciti rezultujuću tečnost nakon protoka.

12. Dodati 500 µL prve tečnosti za ispiranje (0.8M LiCI u 50% etanolu) u spin kolonu.

13. Centrifugirati na 8,000 opm tokom 1 minut.

14. Odbaciti rezultujuću tečnost nakon protoka.

15. Dodati 500 µL druge tečnosti za ispiranje (90% etanol) u spin kolonu.

16. Centrifugirati na 14,000 opm tokom 3 minuta.

17. Odbaciti rezultujuću tečnost nakon protoka.

18. Centrifugirati spin kolonu na 14,000 opm tokom 1 minuta.

19. Odbaciti rezultujuću tečnost nakon protoka.

20. Dodati 100 do 200 µL pufera za eluiranje (10mM Tris-HCI, 0.5mM EDTA, pH9.0) u spin kolonu.

21. Inkubirati na sobnoj temperaturi tokom 1 minuta.

22. Eluirati na 8,000 opm tokom 1 minuta u Eppendorf epruvete od 1.5 mL.

[0052] Brzine punjenja mogu da variraju (8000 do 11000opm) u zavisnosti od gustine uzorka, EB elucione zapremine mogu varirati (100 do 200 µL) u zavisnosti od toga koliko treba ekstrakt da bude koncentrovan,

Postupak_B je korišćen za ekstrakciju nukleinske kiseline koja sadrži DNK iz 10<9>ćelija Escherichia coli i 5µl ekstrakata je nanešeno na 1% agarozni gel sa etidijum bromidom zajedno sa Hind III lestvicom. Rezultati su prikazani na Sl.5. Svi replikati su pokazali genomsku DNK traku velike molekulske mase zajedno sa tipičnim RNK fenotipom.

[0053] 2ml ekstrakata je takođe kvantifikovano nanodrop spektrofotometrijom i rezultati su prikazani u nastavku u Tabeli 5.

Claims

Patentni zahtevi

1. Postupak izolovanja nukleinskih kiselina koje sadrže DNK iz biološkog materijala, postupak koji obuhvata korake:

(i) vršenja liziranja biološkog materijala vodenim rastvorom koji sadrži litijum u koncentraciji od 0.05 do manje od 1M, helatni agens, i surfaktant za proizvodnju vodene lizirane kompozicije,

(ii) tretiranja lizirane kompozicije čvrstim nosačem u prisustvu rastvorenog haotropnog agensa u koncentraciji od 0.05 do 2M i 25% do 60% po zapremini u tečnosti rastvorenog C1-3alkanola, pri čemu je navedeni čvrst nosač sposoban za imobilizaciju DNK, (iii) odvajanja čvrstog nosača od tečnosti,

(iv) tretiranja čvrstog nosača prvim rastvorom za ispiranje koji sadrži litijum u koncentraciji od 0.05 do 1M, pri čemu navedeni prvi rastvor za ispiranje sadrži 20% do 90% po zapremini rastvorenog C1-3alkanola,

(v) odvajanja čvrstog nosača od prve tečnosti za ispiranje,

(vi) tretiranja čvrstog nosača drugom tečnošću za ispiranje koja sadrži najmanje 80% po zapremini C1-3alkanola, pri čemu je ravnoteža ako je prisutna voda,

(vii) odvajanja čvrstog nosača od drugog rastvora za ispiranje, i

(viii) eluiranja DNK sa čvrstog nosača.

2. Postupak prema patentnom zahtevu 1 gde vodeni rastvor opisan u koraku (i) sadrži litijum u koncentraciji od 0.05 do 0.9M.

3. Postupak prema patentnom zahtevu 1 gde se rastvor za lizu suštinski sastoji od vode, litijum hlorida u koncentraciji od 0.7 do 0.9M, EDTA ili natrijumove soli istog u koncentraciji od 5 do 15mM i 0.9 do 1.1% po masi SDS, opciono gde u koraku (ii) haotropni agens je gvanidinijum hlorid u koncentraciji od 0.6 do 0.7M i alkanol je etanol prisutan u količini od 35-40% po zapremini tečnosti.

4. Postupak prema patentnom zahtevu 1 gde se rastvor za lizu sastoji suštinski od vode, litijum hlorida u koncentraciji od 0.2 do 0.3M, EDTA ili natrijumove soli istog u koncentraciji od 1 do 5mM, gvanidinijum hlorida u koncentraciji od 0.6 do 0.7M, SDS u količini od 0.2 do 0.4% po masi i 35-40% po zapremini etanola.

5. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4 gde se prva tečnost za ispiranje suštinski sastoji od a) vode, litijum hlorida u koncentraciji od 0.3 do 0.6M, i 45% do 55% po zapremini etanola; ili b) vode, litijum hlorida u koncentraciji od 0.6 do 1M, i 45% do 55% po zapremini etanola.

6. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5 gde a) druga tečnost za ispiranje se suštinski sastoji od 80% do 95% po zapremini etanola i vode i/ili b) čvrsti nosač sadrži silicijumdioksid; i/ili c) korak (iii) se vrši u epruveti za centrifugu u kojoj navedeni čvrst nosač je filter i koraci (iii), (v), (vii) i (viii) se vrše uz centrifugiranje.

7. Postupak prema patentnom zahtevu 6 (c) gde filter sadrži vlakna borosilikatnog stakla, opciono gde je veliki broj navedenih filtera obezbeđen u epruveti za centrifugu, opciono dalje gde su četiri filtera obezbeđena.

8. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7 a) koji se vrši na temperaturi okoline; i/ili b) koji se vrši bez vorteksovanja; i/ili c) gde biološki materijal iz kojeg će nukleinske kiseline koje sadrže DNK biti izolovane sadrži ćelije, opciono gde su ćelije u obliku peleta.

9. Kit za ekstrakciju nukleinskih kiselina koje sadrže DNK iz ćelija, pri čemu kit sadrži u kombinaciji:

(A)

(i) vodeni rastvor koji sadrži, sastoji se u suštini od, ili se sastoji od vode, litijum hlorida u koncentraciji od 0.7 do 0.9 mola po litru, EDTA ili natrijumove soli istog u koncentraciji od 5 do 15mM, i 0.9 do 1.1% po masi SDS,

(ii) vodeni rastvor soli gvanidinijuma, (poželjno oko 2M),

(iii) etanol,

(iv) prvu tečnost za ispiranje koja sadrži litijum hlorid u koncentraciji od 0.3 do 0.6M, pri čemu navedena prva tečnost sadrži etanol u količini od 45% do 55% po zapremini, (v) drugu tečnost za ispiranje koja sadrži barem 80% po zapremini etanola, pri čemu je ravnoteža ako je prisutna voda,

(vi) elucioni pufer, i

(vii) spin kolonu koja ima filter za imobilizaciju DNK;

ILI

(B)

(i) vodeni rastvor koji sadrži, sastoji se u suštini od, ili se sastoji od litijum hlorida u koncentraciji od 0.2 do 0.3 mola po litru, EDTA ili natrijumove soli istog u koncentraciji od 1 do 5 milimola po litru, SDS u količini od 0.2-0.4% po masi, soli gvanidinijuma koja ima koncentraciju od 0.6 do 0.7M i etanola u količini od 35-45% po zapremini,

(ii) prvu tečnost za ispiranje koja sadrži litijum hlorid u koncentraciji od 0.3 do 0.6M, pri čemu navedena prva tečnost sadrži etanol u količini od 45% do 55% po zapremini, (iii) drugu tečnost za ispiranje koja sadrži barem 80% po zapremini etanola, pri čemu je ravnoteža ako je prisutna voda,

(iv) elucioni pufer, i

(v) spin kolonu koja ima filter za imobilizaciju DNK.

10. Kit prema patentnom zahtevu 9 gde filter sadrži barem jednu ploču boro-silikatnih vlakana.

11. Kit prema patentnom zahtevu 10 gde filter sadrži četiri ploče boro-silikatnih vlakana.