Deprecated: The each() function is deprecated. This message will be suppressed on further calls in /home/zhenxiangba/zhenxiangba.com/public_html/phproxy-improved-master/index.php on line 456
RS60882B1 - Anti-alfa-sinukleinska antitela i postupci za njihovu primenu - Google Patents
[go: Go Back, main page]

RS60882B1 - Anti-alfa-sinukleinska antitela i postupci za njihovu primenu - Google Patents

Anti-alfa-sinukleinska antitela i postupci za njihovu primenu

Info

Publication number
RS60882B1
RS60882B1 RS20201161A RSP20201161A RS60882B1 RS 60882 B1 RS60882 B1 RS 60882B1 RS 20201161 A RS20201161 A RS 20201161A RS P20201161 A RSP20201161 A RS P20201161A RS 60882 B1 RS60882 B1 RS 60882B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
synuclein
alpha
human
seq
Prior art date
Application number
RS20201161A
Other languages
English (en)
Inventor
Markus Britschgi
Sylwia Huber
Klaus Kaluza
Thomas Kremer
Olaf Mundigl
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of RS60882B1 publication Critical patent/RS60882B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2881—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD71
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/32—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency specific for a neo-epitope on a complex, e.g. antibody-antigen or ligand-receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

OPIS
OBLAST PRONALASKA
Predmetni pronalazak se odnosi na antihumana alfa-sinukleinska antitela i postupke za njihovu primenu.
OSNOVA
Parkinsonova bolesti se odlikuje progresivnim gubitkom dopaminskih (DA) neurona nigrostrijatnog sistema i prisustvom Levijevih tela (LB) i neurita (LN), proteinskih intraneuronskih inkluzija sastavljenih prvenstveno od filamentoznih agregata alfa-sinukleina. Alfa-sinuklein je protein koji u mozgu igra centralnu ulogu u kontroli funkcija dopaminergijskih neurona, i za koji se smatra da ključno utiče na patofiziologiju PB. Zapravo, osim činjenice da je alfa-sinuklein glavna proteinska komponenta LB, genetička ispitivanja su pokazala da određene tačkaste mutacije i multiplikacije gena alfa-sinukleina uzrokuju familijarne oblike PB. Veliki broj dokaza upućuje na to da patologija alfa-sinukleina u dopaminergijskim sinapsama može biti uzrok pojave disfunkcije neuronskih ćelija i degeneracije u mozgu sa PB (Bellucci, A., i sar. Brain Res.1432 (2012) 95-113).
Levijeva tela, koja predstavljaju naslage alfa-sinukleina, patološki su znak Parkinsonove bolesti (PB) (Goedert, M., Nat. Rev. Neurosci 2 (2001) 492-501). Braak i sar. su objavili stadiranje bolesti vezano za sporadičnu PB („The staging of brain pathology related to sporadic PD“). (Neurobiology of aging 24 (2003) 197-211).
Alfa-sinukleinski fibrilarni agregati su glavna komponenta Levijevih tela i Levijevih neurita. Nedavni naučni rad ukazuje na to da prefibrilarni oligomeri alfa-sinukleina mogu biti ključni faktori u progresiji Parkinsonove bolesti (Luk, K.C., i sar. Science 338 (2012) 949-953; Auluck, P.K., i sar. Science 295 (2002) 865-868; Bodner, R.A., i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 4246-4251; Bucciantini, M., i sar. J. Biol. Chem. 279 (2004) 31374-31382; El-Agnaf, O.M., i sar. FASEB J. 20 (2006) 419-425; Kayed, R., i sar. Science 300 (2003) 486-489; Lashuel, H.A., i sar. J. Mol. Biol. 322 (2002) 1089-1102; Masliah, E., i sar. Science 287 (2000) 1265-1269.).
Chai, Y-J., i sar. su objavili da sekretovani oligomerni oblik a-sinukleina utiče na više koraka prometa kroz membranu („The secreted oligomeric form of α-synuclein affects multiple steps of membrane trafficking“) (FEBS Lett. 587 (2013) 452-459). Chang, C., i sar. su objavili rad o egzozomima BV-2 ćelija indukovanim alfa-sinukleinom kao važnom posredniku neurodegeneracije kod PB („Exosomes of BV-2 cells induced by alpha-synuclein: important mediator of neurodegeneration in PD“), Neurosci. Lett.548 (2013) 190-195). Feng, RL i sar. su objavili da alfa-sinuklein posreduje u izmenama provodljivosti membrane: potencijalna uloga oligomera alfa-sinukleina u ranjivosti ćelije („Alpha-synuclein mediates alterations in membrane conductance: a potential role for alpha-synuclein oligomers in cell vulnerability“) (Eur. J. Neurosci. 32 (2010) 10-17). Lee, HJ., i sar. su objavili da neuspeh autofaga podstiče egzocitozu i međućelijski transfer alfa-sinukleina („Autophagic failure promotes the exocytosis and intercellular transfer of α-synuclein“) (Exp. Mol. Med.45 (2013) e22). Schulz-Schaeffer, WJ, je objavio patologiju sinapsi agregacije alfa-sinukleina kod demencije sa Levijevim telima („The synaptic pathology of alpha-synuclein aggregation in dementia with Lewy bodies, Parkinson’s disease and Parkinson’s disease dementia“) (Acta Neuropathol. 120 (2010) 131-143).
Velika većina alfa-sinukleina u ljudskom mozgu je N-terminalno acetilovana (Kellie, J.F., i sar. Sci. Rep. 4 (2014) 5797) i to N-terminalno acetilovanje inhibira agregaciju alfasinukleina (Bartels, T., i sar. PLoS One 9 (2014) e103727).
Zabeleženi su različiti oligomerni oblici rekombinantnog alfa-sinukleina: oligomeri tipa A (citotoksični, dejstvo na priliv Ca<2+>), oligomeri tipa C (vrste za zasejavanje agregata), fibrili pomešani sa lipidima (zasejavanje agregacije intracelularnih agregata), mutant sa trostrukim prolinom (TP) A30P/A56P/A76P (gradi pretežno toksične oligomere) (vidite npr. Danzer, K.M., i sar. J. Neurosci. 27 (2007) 9220-9232; Danzer, K.M., i sar. J. Neurochem.
111 (2009) 192-203; Luk, C.K., i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106 (2009) 20051-20056; Desplates, P., i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106 (2009) 13010-13015; Karpinar, D.P., i sar., EMBO J.28 (2009) 3256-3268; Lee, H-J., i sar., J. Biol. Chem. 285 (2010) 9262-9272; Hansen, C., i sar., J. Clin. Invest.121 (2011) 715-725).
Luk, K.C., i sar su objavili da patološki prenos alfa-sinukleina inicira neurodegeneraciju nalik na Parkinsona kod netransgenih miševa („Pathological alphasynuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice“) (Science 338 (2012) 949-953). Danzer, K.M., i sar. su objavili da zasejavanje indukovano oligomerima alfa-sinukleina daje dokaz o širenju patologije alfa-sinukleina i egzozomskom prenosu oligomera alfa-sinukleina sa ćelije na ćeliju („The seeding induced by alphasynuclein oligomers provides evidence for spreading of alpha-synuclein pathology and the exosomal cell-to-cell transmission of alpha synuclein oligomers“) (J. Neurochem. 111 (2009) 192-203; Mol. Neurodegen. 7 (2012) 42). Braidy i sar. su objavili prenos alfa-sinukleina i mitohondrijsku toksičnost kod primarnih humanih fetalnih enterijskih neurona in vitro („Alpha-synuclein transmission and mitochondrial toxicity in primary human foetal enteric neurons in vitro“) (Neurotox. Res. (2013) elektronska publikacija, 5. oktobar 2013.). Desplats, P., i sar. su objavili formiranje inkluzije i smrt neuronskih ćelija putem prenosa alfasinukleina sa neurona na neuron („Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein“) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106 (2009) 13010-13015). Lee i sar. su objavili da direktni transfer alfa-sinukleina sa neurona na astrogliju izaziva inflamatorni odgovor kod sinukleinopatija („Direct transfer of alphasynuclein from neuron to astroglia causes inflammatory responses in synucleinopathies“) (J. Biol. Chem. 285 (2010) 9262-9272). Lee, S-J., i sar. su objavili prenos agregata alfasinukleina sa ćelije na ćeliju („Cell-to-cell transmission of alpha-synuclein aggregates“) (Meth. Mol. Biol. 849 (2012) 347-359; Nat. Rev. Neurol. 6 (2010) 702-706). Verovatno najjači dokaz o progresiji patologije alfa-sinukleina putem moguće transmisije semena agregacije alfa-sinukleina potiče iz posmrtne analize mozga određenih pacijenata sa PB koji su ispoljili Levijevu patologiju u fetalnim neuronima koji su im kalemljeni u mozak 11-16 godina ranije (Li, J-Y., i sar., Nat. Med.14 (2008) 501-503).
Agregirani alfa-sinuklein posreduje dopaminergijsku neurotoksičnost in vivo („Aggregated alpha-synuclein mediates dopaminergic neurotoxicity in vivo“) (Periquet, M., i sar., J. Neurosci. 27 (2007) 3338-3346). Pieri, L., i sar. su objavili da su sklopovi fibrilarnog alfa-sinukleina i hantingtin egzona 1 toksični za ćelije („Fibrillar alpha-synuclein and huntingtin exon 1 assemblies are toxic to the cells“) (Biophys. J.102 (2012) 2894-2905). Van Rooijen i sar. su objavili permeabilizaciju membrane oligomernim alfa-sinukleinom: u potrazi za mehanizmom („Membrane Permeabilization by Oligomeric alpha-Synuclein: In Search of the Mechanism“) (PLoS One 5 (2010) e14292).
Nedavno, Wagner i sar. pokazali su u ćelijskim testovima i na modelu alfasinukleinskog transgenog miša da mali molekul Anle138b deluje kao zaštitni modulator alfasinukleinskog oligomera, što može biti korisno kod terapije za modifikovanje bolesti u slučaju Parkinsonove bolesti (Wagner, J, i sar., Acta Neuropathol. 125 (2013) 795-813). Lynch, S.M., i sar. su objavili da scFv intratelo na neamiloidnu komponentu alfa-sinukleina smanjuje intracelularnu agregaciju i toksičnost („An scFv intrabody against the non-amyloid component of alpha-synuclein reduces intracellular aggregation and toxicity“) (J. Mol. Biol.
377 (2008) 136-147). El-Agnaf, O.M., i sar. su objavili strategiju za dizajniranje agregacije i toksičnosti alfa-sinukleina kao novo lečenje za Parkinsonovu bolest i vezane poremećaje („A strategy for designing inhibitors of alpha-synuclein aggregation and toxicity as a novel treatment for Parkinson's disease and related disorders“) (FASEB J. (2004)). Emadi, S., i sar. su objavili inhibiranje agregacije alfa-sinukleina fragmentima humanog jednolančanog antitela i izolovanje fragmenata humanog jednolančanog antitela na oligomerni alfa-sinuklein koji inhibiraju agregaciju i sprečavaju toksičnost indukovanu alfa-sinukleinom („Inhibiting aggregation of alpha-synuclein with human single chain antibody fragments and the isolation of a human single chain antibody fragment against oligomeric alpha-synuclein that inhibits aggregation and prevents alpha-synuclein-induced toxicity“) (Biochem.43 (2004) 2871-2878; J. Mol. Biol. 368 (2007) 1132-1144). Smith i sar. su objavili efekte intravenskog imunoglobulina na agregaciju i neurotoksičnost alfa-sinukleina („Effects of intravenous immunoglobulin on alpha synuclein aggregation and neurotoxicity“) (Int. Immunopharmacol.
14 (2012) 550-557). Vekrelis, K. i Stefanis, L. su objavili ciljanje intracelularnih i ekstracelularnih alfa-sinukleina kao terapeutsku strategiju kod Parkinsonove bolesti i drugih sinukleinopatija („Targeting intracellular and extracellular alpha-synuclein as a therapeutic strategy in Parkinson's Disease and other synucleinopathies“) (Expert. Opin. Ter. Targets 16 (2012) 421-432).
Antitelima potpomognut klirens cerebralne sinukleinopatije kod odgovarajućih transgenih miševa pokazan je kod aktivnog (Masliah, E., i sar., Neuron 46 (2005) 857-868) i pasivnog (Masliah, E., i sar., PLoS One 6 (2011) e19338) modela imunizacije. Bae, E-J., i sar. su objavili da vezivanje ekstracelularnog alfa-sinukleina specifičnim antitelima sprečava prenos od ćelije do ćelije agregata („Binding of extracellular alpha-synuclein by specific antibodies prevents cell-to-cell aggregate transmission“) (J. Neurosci. 32 (2012) 13454-13469).
Upotreba mimotopa alfa-sinukleinskih epitopa za lečenje bolesti Levijevih tela objavljena je u WO2011/020133. U WO2007/011907 su objavljena alfa-sinukleinska antitela i sa njima povezani postupci. Joshi i sar. su objavili da fuzija sa veoma naelektrisanom sekvencom za retargetovanje proteazoma povećava rastvornu citoplazmatsku ekspresiju i efikasnost različitih alfa-sinukleinskih intratela („Fusion to a highly charged proteasomal retargeting sequence increases soluble cytoplasmic expression and efficacy of diverse antisynuclein intrabodies“) (MABS 4 (2012) 686-693). Emadi i sar. (J. Mol. Biol. 368 (2007) 1132-1144) su objavili izolovanje fragmenta humanog jednolančanog antitela na oligomerni alfa-sinuklein koji inhibira agregaciju i sprečava toksičnost indukovanu alfa-sinukleinom („Isolation of a human single chain antibody fragment against oligomeric alpha-synuclein that inhibits aggregation and prevents alpha-synuclein-induced toxicity“). Emadi i sar. su objavili detektovanje morfološki posebnih oligomernih oblika alfa-sinukleina („Detecting Morphologically Distinct Oligomeric Forms of alpha-Synuclein“) (J. Biol. Chem. 284 (2009) 11048-11058). Zhou i sar. (Mol. Ter. 10 (2004) 1023-1031) su objavili da humano jednolančano Fv intratelo blokira aberantne ćelijske efekte prekomerno eksprimiranog alfasinukleina („A human single-chain Fv intrabody blocks aberrant cellular effects of overexpressed alpha-synuclein“). Nasstrom i sar. su objavili da antitela na alfa-sinuklein smanjuju oligomerizaciju u živim ćelijama („Antibodies against alpha-synuclein reduce oligomerization in living cells“) (PLoS One 6 (2011) e27230). Protofibril-vezujuća antitela i njihova upotreba u terapeutskim i dijagnostičkim postupcima za Parkinsonovu bolest, demenciju sa Levijevim telima i druge alfa-sinukleinopatije („Protofibril-binding antibodies and their use in therapeutic and diagnostic methods for Parkinson's Disease, dementia with Lewy bodies and other alpha-synucleinopathies“) objavljena su u WO 2011/104696. Barkhordarian i sar. su objavili izolovanje rekombinantnih antitela na specifične morfologije proteina koristeći mikroskopiju atomskih sila i tehnologiju prikaza faga („Isolating recombinant antibodies against specific protein morphologies using atomic force microscopy and phage display technologies“) (Prot. Eng. Des. Select. 19 (2006) 497-502). Kvam i sar. (PLoS One 4 (2009) e5727) su objavili da konformaciono ciljanje fibrilarnih poliglutaminskih proteina u živim ćelija dovodi do eskalacije agregacije i citotoksičnosti („Conformational targeting of fibrillar polyglutamine proteins in live cells escalates aggregation and cytotoxicity“).
WO2007/012061 objavljuje agense i postupke za lečenje bolesti povezanih sa sinukleinopatskim bolestima, uključujući Levijeva tela alfa-sinukleina u mozgu pacijenta. Takvi postupci zahtevaju primenu agenasa koji indukuju koristan imunogeni odgovor usmeren na Levijevo telo. Postupci su posebno korisni za profilaktičko i terapeutsko lečenje Parkinsonove bolesti.
Waxman, E.A., i sar. su objavili karakterizaciju antitela koja selektivno detektuju [alfa]-sinuklein u patološkim inkluzijama („Characterization of antibodies that selectively detect [alpha]-synuclein in pathological inclusions“) (Acta Neuropath. 116 (2008) 37-46). Syn 303 je alfa-sinukleinsko monoklonsko antitelo humanog izotipa IgG1 i reaguje sa humanim, mišjim ili pacovskim (putem identičnosti sekvence) sinukleinom i uzgojen je da deluje protiv oksidisanog alfa-sinukleina.
WO2007/021255 objavljuje postupke za detektovanje alfa-sinukleina i takođe identifikuje poželjne epitope alfa sinukleina za upotrebu u takvoj detekciji, i obezbeđuje antitela koja se specifično vezuju za takve epitope.
REZIME
Predmetni pronalazak je definisan patentnim zahtevima.
Pronalazak obezbeđuje antihumana alfa-sinukleinska antitela i postupke za njihovu primenu.
Antihumani alfa-sinuklein iz pronalaska je antitelo koje u teškom lancu sadrži HVR SEQ ID NO: 21, 22 i 17, a u lakom lancu HVR SEQ ID NO: 23 do 25.
Jedan aspekt, kako je ovde navedeno, je antitelo koje se specifično vezuje za humani alfa-sinuklein, pri čemu humani alfa-sinuklein ima slobodan N-terminalni metioninski ostatak.
Termin „slobodni N-terminalni metioninski ostatak“ označava metioninski ostatak u polipeptidu koji se nalazi na N-terminusu polipeptida i koji nije modifikovan, osim amidne veze pomoću koje je konjugovan sa ostatkom polipeptida. Takav slobodni N-terminalni metioninski ostatak u jednom otelotvorenju je nemodifikovani metioninski ostatak. Takav slobodni N-terminalni metioninski ostatak u jednom otelotvorenju ima slobodnu amino grupu. Humani alfa-sinuklein ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 40.
U jednom otelotvorenju, antitelo se specifično vezuje za humani i mišji alfa-sinuklein, pri čemu humani i mišji alfa-sinuklein ima slobodni N-terminalni metioninski ostatak.
U jednom otelotvorenju, alfa-sinuklein je monomerni alfa-sinuklein.
U jednom otelotvorenju, alfa sinuklein je monomerni i oligomerni alfa-sinuklein.
Antitelo je dobijeno humanizacijom antitela koje sadrži varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO: 26 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 27.
U jednom otelotvorenju, antitelo je humanizovano antitelo i sadrži u varijabilnom domenu teškog lanca HVR-e SEQ ID NO: 21, 22 i 17 i u varijabilnom domenu lakog lanca HVR-e SEQ ID NO: 23 do 25.
Antitelo je humanizovano antitelo i varijabilni domen teškog lanca je dobijen od varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO: 26, i varijabilni domen lakog lanca je dobijen od varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID NO: 27.
U jednom otelotvorenju svih prethodnih aspekata, antitelo je konjugovano sa transportnim modulom krvno-moždane barijere.
U jednom otelotvorenju, transportni modul krvno-moždane barijere je antitelo ili fragment antitela koji se specifično vezuje za LRP1, LRP8, receptor humanog transferina ili receptor humanog insulinu sličnog faktora rasta.
U jednom otelotvorenju svih prethodnih aspekata, antitelo je monoklonsko antitelo. U jednom otelotvorenju svih prethodnih aspekata, antitelo je humanizovano antitelo ili himerno antitelo.
U jednom otelotvorenju svih prethodnih aspekata, antitelo je
a) antitelo pune dužine potklase humanog IgG1, ili
b) antitelo pune dužine potklase humanog IgG4, ili
c) antitelo pune dužine potklase humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A i P329G,
d) antitelo pune dužine potklase humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E i P329G,
e) antitelo pune dužine potklase humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A i P329G u oba teška lanca i mutacijama T366W i S354C u jednom teškom lancu i mutacijama T366S, L368A, Y407V i Y349C u odgovarajućem drugom teškom lancu, ili
f) antitelo pune dužine potklase humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E i P329G u oba teška lanca i mutacijama T366W i S354C u jednom teškom lancu i mutacijama T366S, L368A, Y407V i Y349C u odgovarajućem drugom teškom lancu.
Jedan aspekt, kao što je objavljeno ovde, predstavlja antihumano alfa-sinukleinsko antitelo, naznačeno time što
a) antitelo sadrži dva teška lanca antitela od kojih svaki sadrži varijabilni domen teškog lanca i konstantni region teškog lanca, pri čemu
i) varijabilni domen sadrži HVR-e SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 i SEQ ID NO: 17, ii) konstantni region je konstantni region humanog IgG1, pri čemu C-terminalni ostatak lizina može biti prisutan ili odsutan, i
iii) konstantni region sadrži aminokiselinske izmene L234A, L235A i P329G, b) antitelo sadrži dva laka lanca antitela od kojih svaki sadrži varijabilni domen lakog lanca i konstantni domen lakog lanca, pri čemu
i) varijabilni domen sadrži HVR-e SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 i SEQ ID NO: 25, ii) konstantni region je humani konstantni region kapa lakog lanca ili humani konstantni region lambda lakog lanca.
Jedan aspekt, kao što je objavljeno ovde, predstavlja antihumano alfa-sinukleinsko antitelo, naznačeno time što
a) antitelo sadrži dva teška lanca antitela od kojih svaki sadrži u smeru od N- do C-terminusa varijabilni domen teškog lanca, konstantni region teškog lanca, peptidni linker i scFab ili scFv fragment antitela, koji se specifično vezuje za receptor humanog transferina, pri čemu
i) varijabilni domen sadrži HVR-e SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 i SEQ ID NO: 17, ii) konstantni region je konstantni region humanog IgG1, pri čemu C-terminalni ostatak lizina može biti prisutan ili odsutan, i
iii) konstantni region sadrži aminokiselinske izmene L234A, L235A i P329G, b) antitelo sadrži dva laka lanca antitela od kojih svaki sadrži varijabilni domen lakog lanca i konstantni domen lakog lanca, pri čemu
i) varijabilni domen sadrži HVR-e SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 i SEQ ID NO: 25, ii) konstantni region je humani konstantni region kapa lakog lanca ili humani konstantni region lambda lakog lanca.
Jedan aspekt, kao što je objavljeno ovde, predstavlja antihumano alfa-sinukleinsko antitelo, naznačeno time što
a) antitelo sadrži prvi teški lanac antitela koji sadrži u smeru od N- do C-terminusa varijabilni domen teškog lanca, konstantni region teškog lanca, peptidni linker i scFab ili scFv fragment antitela, koji se specifično vezuje za receptor humanog transferina, pri čemu i) varijabilni domen sadrži HVR-e SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 i SEQ ID NO: 17, ii) konstantni region je konstantni region humanog IgG1, pri čemu C-terminalni ostatak lizina može biti prisutan ili odsutan,
iii) konstantni region sadrži aminokiselinske izmene L234A, L235A i P329G, i iv) konstantni region sadrži aminokiselinske izmene T366W i S354C ili aminokiselinske izmene T366S, L368A, Y407V i Y349C,
b) antitelo sadrži drugi teški lanac antitela koji sadrži u smeru od N- do C-terminusa varijabilni domen teškog lanca i konstantni region teškog lanca, pri čemu
i) varijabilni domen sadrži HVR-e SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 i SEQ ID NO: 17, ii) konstantni region je konstantni region humanog IgG1, pri čemu C-terminalni ostatak lizina može biti prisutan ili odsutan,
iii) konstantni region sadrži aminokiselinske izmene L234A, L235A i P329G, i iv) konstantni region sadrži aminokiselinske izmene T366W i S354C ako prvi teški lanac antitela sadrži aminokiselinske izmene T366S, L368A, Y407V i Y349C ili konstantni region sadrži aminokiselinske izmene T366S, L368A, Y407V i Y349C ako prvi teški lanac antitela sadrži aminokiselinske izmene T366W i S354C,
c) antitelo sadrži dva laka lanca antitela od kojih svaki sadrži varijabilni domen lakog lanca i konstantni domen lakog lanca, pri čemu
i) varijabilni domen sadrži HVR-e SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 i SEQ ID NO: 25, ii) konstantni region je humani konstantni region kapa lakog lanca ili humani konstantni region lambda lakog lanca.
U jednom otelotvorenju, fragment antitela, koji se specifično vezuje za humani receptor transferina, sadrži varijabilni domen teškog lanca koji je humanizovani oblik varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO: 56 i varijabilni domen lakog lanca koji je humanizovani oblik varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID NO: 57.
U jednom otelotvorenju svih prethodnih aspekata, antitelo
i) inhibira citotoksičnost indukovanu alfa-sinukleinom u ljudskim neuronima i glijalnim ćelijama i/ili
ii) inhibira transmisiju od ćelije do ćelije oligomernog ljudskog alfa-sinukleina između neurona i glijalnih ćelija, i/ili
iii) smanjuje aktivnost kaspaze indukovanu alfa-sinukleinom u ljudskim ćelijama neurona i/ili
iv) specifično se vezuje za alfa-sinuklein koji ima slobodni N-terminalni metioninski ostatak i ne vezuje se specifično za alfa-sinuklein koji ima modifikovani N-terminalni metioninski ostatak.
U jednom otelotvorenju svih aspekata i otelotvorenja, ljudska neuronska ćelija je tetraciklinom kontrolisana, v-myc prekomerno eksprimirajuća ćelijska linija dobijena od ljudskog srednjeg mozga. U jednom otelotvorenju svih aspekata i otelotvorenja, ljudske neuronske ćelije su Lundove ćelije ljudskog srednjeg mozga (LUHMES).
U jednom otelotvorenju, aktivnost kaspaze je aktivnost kaspaze 3 i/ili kaspaze 7. U jednom otelotvorenju, antitelo je namenjeno za primenu u lečenju sinukleinopatija. U jednom otelotvorenju, antitelo je namenjeno za primenu u lečenju Parkinsonove bolesti.
U jednom otelotvorenju, antitelo ima utišanu efektorsku funkciju. U jednom otelotvorenju, antitelo nema efektorsku funkciju.
U jednom otelotvorenju, antitelo ima afinitet vezivanja prema monomernom ljudskom alfa-sinukleinu manji od 10<-09>M i veći od 10<-07>M.
U jednom otelotvorenju, antitelo se specifično vezuje za monomerni i oligomerni ljudski alfa-sinuklein.
U jednom otelotvorenju, antitelo se specifično vezuje za fibrilarni ljudski alfasinuklein i ne vezuje se za nefibrilarni ljudski alfa-sinuklein
U jednom otelotvorenju, antitelo je konjugovano sa transportnim modulom krvnomoždane barijere.
U jednom otelotvorenju, transportni modul krvno-moždane barijere je antitelo ili fragment antitela koji se specifično vezuje za LRP1, LRP8, receptor humanog transferina ili receptor humanog insulinu sličnog faktora rasta.
U jednom otelotvorenju, antitelo je monoklonsko antitelo.
U jednom otelotvorenju, antitelo je humanizovano antitelo ili himerno antitelo.
U jednom otelotvorenju, antitelo je fragment antitela koji se vezuje za ljudski alfasinuklein i
1
i) inhibira citotoksičnost indukovanu alfa-sinukleinom u ljudskim neuronima i glijalnim ćelijama i/ili
ii) inhibira transmisiju od ćelije do ćelije oligomernog ljudskog alfa-sinukleina između neurona i glijalnih ćelija, i/ili
iii) smanjuje aktivnost kaspaze indukovanu alfa-sinukleinom u ljudskim ćelijama neurona.
U jednoj realizaciji, antitelo je
a) antitelo pune dužine potklase humanog IgG1, ili
b) antitelo pune dužine potklase humanog IgG4, ili
c) antitelo pune dužine potklase humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A i P329G,
d) antitelo pune dužine potklase humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E i P329G,
e) antitelo pune dužine potklase humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A i P329G u oba teška lanca i mutacijama T366W i S354C u jednom teškom lancu i mutacijama T366S, L368A, Y407V i Y349C u odgovarajućem drugom teškom lancu, ili
f) antitelo pune dužine potklase humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E i P329G u oba teška lanca i mutacijama T366W i S354C u jednom teškom lancu i mutacijama T366S, L368A, Y407V i Y349C u odgovarajućem drugom teškom lancu.
Jedan aspekt, kao što je objavljeno ovde, predstavlja antihumano alfa-sinukleinsko antitelo, naznačeno time što
a) antitelo sadrži dva teška lanca antitela od kojih svaki sadrži varijabilni domen teškog lanca i konstantni region teškog lanca, pri čemu
i) varijabilni domen sadrži HVR-e SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 i SEQ ID NO: 17, ii) konstantni region je konstantni region humanog IgG1, pri čemu C-terminalni ostatak lizina može biti prisutan ili odsutan, i
iii) konstantni region sadrži aminokiselinske izmene L234A, L235A i P329G, b) antitelo sadrži dva laka lanca antitela od kojih svaki sadrži varijabilni domen lakog lanca i konstantni domen lakog lanca, pri čemu
i) varijabilni domen sadrži HVR-e SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 i SEQ ID NO: 25, ii) konstantni region je humani konstantni region kapa lakog lanca ili humani konstantni region lambda lakog lanca,
i
c) antitelo
i) inhibira citotoksičnost indukovanu alfa-sinukleinom u ljudskim neuronima i glijalnim ćelijama i/ili
ii) inhibira transmisiju od ćelije do ćelije oligomernog ljudskog alfa-sinukleina između neurona i glijalnih ćelija, i/ili
iii) smanjuje aktivnost kaspaze indukovanu alfa-sinukleinom u ljudskim ćelijama neurona.
Jedan aspekt, kao što je objavljeno ovde, predstavlja antihumano alfa-sinukleinsko antitelo, naznačeno time što
a) antitelo sadrži dva teška lanca antitela od kojih svaki sadrži u smeru od N- do C-terminusa varijabilni domen teškog lanca, konstantni region teškog lanca, peptidni linker i scFab ili scFv fragment antitela, koji se specifično vezuje za receptor humanog transferina, pri čemu
i) varijabilni domen sadrži HVR-e SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 i SEQ ID NO: 17, ii) konstantni region je konstantni region humanog IgG1, pri čemu C-terminalni ostatak lizina može biti prisutan ili odsutan, i
iii) konstantni region sadrži aminokiselinske izmene L234A, L235A i P329G, b) antitelo sadrži dva laka lanca antitela od kojih svaki sadrži varijabilni domen lakog lanca i konstantni domen lakog lanca, pri čemu
i) varijabilni domen sadrži HVR-e SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 i SEQ ID NO: 25, ii) konstantni region je humani konstantni region kapa lakog lanca ili humani konstantni region lambda lakog lanca,
i
c) antitelo
i) inhibira citotoksičnost indukovanu alfa-sinukleinom u ljudskim neuronima i glijalnim ćelijama i/ili
ii) inhibira transmisiju od ćelije do ćelije oligomernog ljudskog alfa-sinukleina između neurona i glijalnih ćelija, i/ili
iii) smanjuje aktivnost kaspaze indukovanu alfa-sinukleinom u ljudskim ćelijama neurona.
Jedan aspekt, kao što je objavljeno ovde, predstavlja antihumano alfa-sinukleinsko antitelo, naznačeno time što
a) antitelo sadrži prvi teški lanac antitela koji sadrži u smeru od N- do C-terminusa varijabilni domen teškog lanca, konstantni region teškog lanca, peptidni linker i scFab ili scFv fragment antitela, koji se specifično vezuje za receptor humanog transferina, pri čemu i) varijabilni domen sadrži HVR-e SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 i SEQ ID NO: 17, ii) konstantni region je konstantni region humanog IgG1, pri čemu C-terminalni ostatak lizina može biti prisutan ili odsutan,
iii) konstantni region sadrži aminokiselinske izmene L234A, L235A i P329G, i iv) konstantni region sadrži aminokiselinske izmene T366W i S354C ili aminokiselinske izmene T366S, L368A, Y407V i Y349C,
b) antitelo sadrži drugi teški lanac antitela koji sadrži u smeru od N- do C-terminusa varijabilni domen teškog lanca i konstantni region teškog lanca, pri čemu
i) varijabilni domen sadrži HVR-e SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 i SEQ ID NO: 17, ii) konstantni region je konstantni region humanog IgG1, pri čemu C-terminalni ostatak lizina može biti prisutan ili odsutan,
iii) konstantni region sadrži aminokiselinske izmene L234A, L235A i P329G, i iv) konstantni region sadrži aminokiselinske izmene T366W i S354C ako prvi teški lanac antitela sadrži aminokiselinske izmene T366S, L368A, Y407V i Y349C ili konstantni region sadrži aminokiselinske izmene T366S, L368A, Y407V i Y349C ako prvi teški lanac antitela sadrži aminokiselinske izmene T366W i S354C,
c) antitelo sadrži dva laka lanca antitela od kojih svaki sadrži varijabilni domen lakog lanca i konstantni domen lakog lanca, pri čemu
i) varijabilni domen sadrži HVR-e SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 i SEQ ID NO: 25, ii) konstantni region je humani konstantni region kapa lakog lanca ili humani konstantni region lambda lakog lanca,
i
d) antitelo
i) inhibira citotoksičnost indukovanu alfa-sinukleinom u ljudskim neuronima i glijalnim ćelijama i/ili
ii) inhibira transmisiju od ćelije do ćelije oligomernog ljudskog alfa-sinukleina između neurona i glijalnih ćelija, i/ili
iii) smanjuje aktivnost kaspaze indukovanu alfa-sinukleinom u ljudskim ćelijama neurona.
U jednom otelotvorenju, fragment antitela sadrži varijabilni domen teškog lanca koji je humanizovani oblik varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO: 56 i varijabilni domen lakog lanca koji je humanizovani oblik varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID NO: 57.
Jedan aspekt, kao što je objavljeno ovde, je farmaceutska formulacija koja sadrži antitelo, kao što je objavljeno ovde, i farmaceutski prihvatljiv nosač.
1
U jednom otelotvorenju, farmaceutska formulacija dalje sadrži dodatni terapeutski agens.
Jedan aspekt, kao što je objavljeno ovde, je antitelo, kao što je objavljeno ovde, za primenu kao lek.
Jedan aspekt, kao što je objavljeno ovde, je antitelo, kao što je objavljeno ovde, za primenu u lečenju Parkinsonove bolesti.
U jednom otelotvorenju, lek je namenjen za lečenje Parkinsonove bolesti.
U jednom otelotvorenju, lek je namenjen za inhibiciju citotoksičnosti indukovane alfa-sinukleinom u ljudskim neuronima i glijalnim ćelijama.
U jednom otelotvorenju, lek je namenjen za inhibiciju međućelijske transmisije oligomernog ljudskog alfa-sinukleina između neurona i glijalnih ćelija.
U jednom otelotvorenju, lek je za smanjivanje aktivnosti kaspaze indukovane alfasinukleinom u neuronskim ćelijama ili glijalnim ćelijama.
Antitela, kao što je objavljeno ovde, mogu da se primene u lečenju Parkinsonove bolesti. Bez ograničavanja ovom teorijom, antitela inhibiraju širenje toksičnog oligomernog alfa-sinukleina, ili inhibiraju preuzimanje toksičnog oligomernog alfa-sinukleina od strane neurona i glijalnih ćelija, ili smanjuju neuroinflamaciju.
Sa antitelima, kao što je objavljeno ovde, može se uticati na inhibiciju/smanjenje progresije sinukleopatije i neuropatologije.
Antitela, kao što je objavljeno ovde, mogu da se primene za zaštitu od razvoja Parkinsonove bolesti, ili se čak mogu koristiti za zaustavljanje napredovanja Parkinsonove bolesti.
U jednom otelotvorenju, antitelo, kao što je objavljeno ovde, i) vezuje se za alfasinuklein u delovima mozga alfa-sinukleinskih transgenih miševa i pacijenata sa Parkinsonovom bolešću; i/ili obeležava alfa-sinuklein u LUHMES ćelijama.
Antitela, kao što je objavljeno ovde, mogu da se primene u lečenju sinukleinopatije. Neke sinukleinopatije su neurodegeneracija sa akumulacijom gvožđa u mozgu tipa 1 (NBIA1), čista autonomna insuficijencija, Daunov sindrom, guamski kompleks i nekoliko poremećaja Levijevih tela, poput difuzne bolesti Levijevih tela (DLBD), varijante Levijevog tela kod Alchajmerove bolesti (LBVAD), određenih oblika Gošeove bolesti i demencije kod Parkinsonove bolesti (PDD).
KRATAK OPIS SLIKA
Slika 1: Specifičnost vezivanja zavisna od anti-alfa-sinukleinskog antitela 0017;
Traka: 1) fibrilarni alfa-sinukleinski preparat, 2) mutantni alfasinukleinski oligomeri sa trostrukim prolinom, 3) alfa-sinukleinski oligomeri tipa A, 4) alfa-sinukleinski oligomeri tipa C.
Slika 2: Specifičnost vezivanja zavisna od koncentracije anti-alfa-sinukleinskog antitela 0018; Traka: 1) fibrilarni alfa-sinukleinski preparat, 2) mutantni alfa-sinukleinski oligomeri sa trostrukim prolinom, 3) alfa-sinukleinski oligomeri tipa A, 4) alfa-sinukleinski oligomeri tipa C.
Slika 3: Specifičnost vezivanja zavisna od koncentracije anti-alfa-sinukleinskog antitela 0081; Traka: 1) fibrilarni alfa-sinukleinski preparat, 2) mutantni alfa-sinukleinski oligomeri sa trostrukim prolinom, 3) alfa-sinukleinski oligomeri tipa A, 4) alfa-sinukleinski oligomeri tipa C.
Slika 4: Alfa-sinukleinsko bojenje u moždanom stablu alfasinukleinskog[A30P]-transgenog miša; sveže zamrznuti sagitalni preseci mozga od 10 µm; uvećanje 40x; sve slike sa identičnim uslovima osvetljenja; vrhovi strelica označavaju inkluzije slične Levijevim neuritima.
Slika 5: Bojenje antitela 0017 i 0018 u ljudskom moždanom korteksu pacijenta sa Parkinsonovom bolešću (A), pacijenta sa Alchajmerovom bolešću sa pridruženom Parkinsonovom bolešću (B) i progresivnom supranuklearnom paralizom (PSP, tautopatija) (C); strelica: inkluzije slične Levijevim telima; vrh strelice: inkluzije slične Levijevim neuritima.
Slika 6: Označavanje patologije cerebralnog alfa-sinukleina u alfa-sinukleinskim mutantnim A30P transgenim miševima nakon akutne periferne injekcije specifičnih mAb (2x60 mg/kg antitela ili PBS tokom 5 d) u alfasinukleinske mutantne A30P transgene miševe stare 15 meseci; sveže zamrznuti sagitalni preseci mozga od 20 µm obojeni su konjugatom antimišje IgG1-antitelo-AF555 ili odgovarajućim anti-alfa sinukleinskim antitelom i konjugatom anti-mišje IgG1-antitelo-AF555; uvećanje 40x regiona moždanog stabla; sve slike sa uporedivim osvetljenjem; strelica: inkluzije slične Levijevim telima; vrh strelice: inkluzije slične Levijevim neuritima.
Slika 7: Ćelijska toksičnost kondicioniranih medijuma iz rekombinantnog alfasinukleina iz ćelija SHSY5Y na LUHMES ćelijama; (A) antitelo 0017; (B) antitelo 0018; (C) antitelo 12F4 (referenca).
1
Slika 8: Tretman LUHMES ćelija kondicioniranim medijumima iz rekombinantnih SHSY5Y ćelija koje eksprimiraju alfa-sinuklein; 3-dnevni tretman na sveže zasejanim LUHMES ćelijama sa a) kontrolnim medijumom = diferencijacioni medijum za LUHMES ćelije i b) kondicioniranim medijumom = LUHMES medijum za diferencijaciju sakupljen nakon 6 dana iz rekombinantnih SHSY5Y ćelija koje eksprimiraju alfa-sinuklein.
Slika 9: Antitela 0017 i 0018 su sposobna da imunoiscrpljuju alfa-sinukleinske oligomere iz vanćelijskih medijuma, i zato ta antitela smanjuju toksičnost alfa-sinukleinskih oligomera.
Slika 10: Sirovi podaci o tranziciji topljenja (otvoreni krugovi, 40°C - najviše vrednosti) i odgovarajuća uklapanja (pune linije) kako je određeno u skladu sa primerom 11.
Slika 11: Označavanje alfa-sinukleinske patologije mozga, vaskulature i parenhima kod alfa-sinukleinskih mutantnih A30P transgenih miševa nakon akutne periferne injekcije konjugata anti-alfa sinukleinskogantitela-transportnog modula krvno-moždane barijere.
Slika 12: Konfokalna mikroskopska analiza imunohistohemijski analiziranih kriosekcija mozga pacijenta sa Parkinsonovom bolešću (identične postavke za sve slike): (A) antitelo 0017, (B) antitelo 0018, (C) referentno antitelo 12F4.
Slika 13: CeluSpots™ mapiranje epitopa antitela 0018.
Slika 14: Vezivanje monomernog (N-terminalno slobodnog (1) i N-terminalno His-označenog (2)) i dimernog (3) alfa-sinukleina za antitelo 0018. Prikazani rezultati su titracija od 5 koncentracija.
1: monomer, slobodni N-terminus, 4,2 mg/ml, nikada ne otapan;
2: monomer, His-označeni N-terminal, 4,8 mg/ml;
3: dimer, slobodan N-terminus, 1,6 mg/ml.
DETALJAN OPIS OTELOTVORENJA PRONALASKA
I. DEFINICIJE
"Akceptorski humani okvir" je za ove svrhe okvir koji sadrži aminokiselinske sekvence okvira varijabilnog domena lakog lanca (VL) ili varijabilnog domena teškog lanca (VH) dobijenog od okvira humanog imunoglobulina ili okvira humanog konsenzusa, kao što je definisano dole. Akceptorski humani okvir "dobijen od" okvira humanog imunoglobulina
1
ili okvira humanog konsenzusa može da obuhvati iste aminokiselinske sekvence kao što su njihove, ili može da sadrži izmene u sekvenci aminokiselina. U nekim otelotvorenjima, broj izmena aminokiselina je 10 ili manje, 9 ili manje, 8 ili manje, 7 ili manje, 6 ili manje, 5 ili manje, 4 ili manje, 3 ili manje, ili 2 ili manje. U nekim otelotvorenjima, okvir VL humanog akceptora je po sekvenci identičan sa sekvencom okvira VL humanog imunoglobulina ili sekvencom okvira humanog konsenzusa.
„Afinitet” se odnosi na jačinu ukupnog zbira nekovalentnih interakcija između pojedinačnog mesta vezivanja molekula (npr. antitela) i njegovog partnera u vezivanju (npr. antigena). Ukoliko nije drugačije naznačeno, kao što je ovde upotrebljeno, "afinitet vezivanja" se odnosi na suštinski afinitet prema vezivanju koji odražava 1:1 interakciju između članova vezujućeg para (npr. antitela i antigena). Afinitet molekula X prema svom partneru Y može generalno da se predstavi putem konstante disocijacije (Kd). Afinitet može da se izmeri uobičajenim postupcima poznatim u struci, uključujući one opisane u ovom dokumentu. Specifične realizacije date kao ilustracija i primer za merenje afiniteta vezivanja opisane su u nastavku.
Termin „afinitetno zrelo” antitelo se odnosi na antitelo sa jednom ili više izmena u jednom ili više hipervarijabilnih regiona (HVR), u poređenju sa matičnim antitelom koje nema takve izmene, pri čemu takve izmene dovode do poboljšanja afiniteta antitela prema antigenu.
Termini „anti-humano alfa-sinukleinsko antitelo” i „antitelo koje se vezuje za humani alfa-sinuklein” se odnose na antitelo koje je sposobno da veže humani alfa-sinuklein sa dovoljnim afinitetom, na takav način da antitelo bude korisno kao dijagnostički i/ili terapeutski agens za ciljanje humanog alfa-sinukleina. U jednom otelotvorenju, opseg vezivanja antihumanog alfa-sinukleinskog antitela za nepovezani, nehumani alfa-sinukleinski protein je manji od oko 10% od vezivanja antitela za humani alfa-sinuklein, kao što je izmereno, npr. radioimunotestom (RIA).
Termin „antitelo” ovde je upotrebljen u najširem smislu i obuhvata različite strukture antitela uključujući, bez ograničenja, monoklonska antitela, poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela) i fragmente antitela, dokle god oni pokazuju željenu aktivnost vezivanja za antigen.
„Fragment antitela” ukazuje na molekul koji nije netaknuto antitelo, a koji sadrži deo netaknutog antitela koje vezuje antigen za koji se vezuje netaknuto antitelo. Primeri za fragmente antitela uključuju, ali se ne ograničavaju na Fv, Fab, Fab', Fab’-SH,F(ab')2; dijatela; linearna antitela; molekule antitela sa jednim lancem (npr. scFv); i multispecifična antitela
1
nastala od fragmenata antitela.
„Antitelo koje se vezuje za isti epitop“ u pogledu antitela odnosi se na antitelo koje ima interakcije vezivanja sa istim ostacima kao referentno antitelo na antigenu. Interakcija vezivanja može da se odredi površinskom plazmonskom rezonancom i mutiranim antigenom ili analizom rendgenske strukture kompleksa antitelo-antigen.
Termin „himerno” antitelo ukazuje na antitelo kod koga je deo teškog i/ili lakog lanca dobijen od posebnog izvora ili vrste, dok je ostatak teškog i/ili lakog lanca dobijen od različitog izvora ili vrste.
"Klasa" antitela ukazuje na vrstu konstantnog domena ili konstantnog regiona koju ima njegov teški lanac. Postoji pet glavnih klasa antitela: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a neke od njih mogu dalje da se dele na potklase (izotipove), npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, i IgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina zovu se α, δ, ε, γ, odnosno μ.
„Efektorske funkcije” ukazuju na one biološke aktivnosti koje mogu da se pripišu Fc regionu antitela, koje variraju sa klasom antitela. Primeri efektorskih funkcija antitela uključuju: Vezivanje C1q i komplement-zavisnu citotoksičnost (CDC); Fc receptorsko vezivanje; antitelo-zavisnu ćelijski posredovanu citotoksičnost (ADCC); fagocitozu; nishodno regulisanje površinskih ćelijskih receptora (npr. B-ćelijski receptor), i aktivaciju B ćelija.
„Efikasna količina” agensa, npr. farmaceutske formulacije, se odnosi na količinu koja je u potrebnim dozama i vremenskim periodima efikasna za postizanje željenog terapeutskog ili profilaktičkog rezultata.
Termin „Fc region” u ovom dokumentu se koristi da definiše C-terminalni region imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži najmanje deo konstantnog regiona. Termin uključuje nativne sekvence Fc regiona i varijante Fc regiona. U jednoj realizaciji, Fc region teškog lanca humanog IgG pruža se od Cys226, ili od Pro230, do karboksilnog terminusa teškog lanca. Shodno tome, C-terminalni lizin (Lys447) i ponekad C-terminalni dipeptid lizin-glicin (Gly446Lys447) Fc regiona mogu, ili ne moraju biti prisutni. Ako ovde nije drugačije naznačeno, numeracija aminokiselinskih ostataka u Fc regionu ili konstantnom regionu je usklađena sa EU sistemom numeracije, koji se zove i EU indeks, kao što su opisali Kabat, E.A. i sar., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.
„Okvir” ili „FR” se odnosi na ostatke varijabilnog domena koji nisu ostaci hipervarijabilnog regiona (HVR). FR varijabilnog domena generalno se sastoji od četiri FR
1
domena: FR1, FR2, FR3 i FR4. Shodno tome, HVR i FR sekvence generalno se pojavljuju u sledećoj sekvenci u VH (ili VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
Termini „antitelo pune dužine”, „netaknuto antitelo” i „kompletno antitelo” u ovom dokumentu se koriste kao sinonimi za ukazivanje na antitelo koje ima suštinski sličnu strukturu strukturi nativnog antitela, ili koje ima teške lance koji sadrže Fc region, kao što je u ovom dokumentu definisano.
Termini „ćelija domaćin”, „linija ćelije domaćina” i „kultura ćelija domaćina” koriste se naizmenično, i ukazuju na ćelije u koje je uvedena egzogena nukleinska kiselina, uključujući potomstvo takvih ćelija. Ćelije domaćini uključuju „transformante” i „transformisane ćelije”, koje uključuju primarne transformisane ćelije i potomstvo dobijeno od njih, bez obzira na broj presejavanja. Potomstvo ne mora biti po sadržaju nukleinskih kiselina sasvim istovetno matičnoj ćeliji, već može da sadrži mutacije. Ovde se uključuje mutantno potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost kao što je ispitano ili odabrano u originalno transformisanoj ćeliji.
„Okvir humanog konsenzusa“ je okvir koji predstavlja najčešće ostatke aminokiselina u izboru okvirnih sekvenci VL ili VH humanog imunoglobulina. Generalno, izbor VL ili VH sekvenci humanog imunoglobulina je iz podgrupe sekvenci varijabilnog domena. Generalno, podgrupa sekvenci je podgrupa kao u Kabat, E.A. i sar. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, tomovi 1-3. U jednom otelotvorenju, za VL, podgrupa je podgrupa kapa I, kao u Kabat i sar, gore. U jednom otelotvorenju, za VH, podgrupa je podgrupa III, kao u Kabat i sar, gore.
"Humanizovano" antitelo ukazuje na himerno antitelo koje obuhvata aminokiselinske ostatke od ne-humanih HVR i aminokiselinske ostatke od humanih FR. U određenim realizacijama, humanizovano antitelo će obuhvatati u suštini sve, ili najmanje jedan, a tipično dva varijabilna domena, u kojima svi, ili suštinski svi HVR-ovi (npr. CDR), odgovaraju onima iz ne-humanog antitela, a svi, ili suštinski svi FR-ovi, odgovaraju onima iz humanog antitela. Humanizovano antitelo opciono može da sadrži najmanje deo konstantnog regiona antitela dobijenog od humanog antitela. "Humanizovani oblik" antitela, npr. ne-humanog antitela, ukazuje na antitelo koje je pretrpelo humanizaciju.
Termin „hipervarijabilni region” ili „HVR” kao što je ovde upotrebljen, ukazuje na svaki od regiona varijabilnog domena antitela koji su hipervarijabilni u sekvenci („regioni koji određuju komplementarnost” ili „CDR“) i formiraju strukturno definisane petlje („hipervarijabilne petlje“) i/ili sadrže ostatke u kontaktu sa antigenom („antigen kontakti“). Generalno, antitela obuhvataju šest HVR regiona, tri u VH (H1, H2, H3) i tri u VL (L1, L2,
1
L3).
U ovom dokumentu, HVR regioni uključuju
(a) hipervarijabilne petlje koje se pojavljuju na aminokiselinskim ostacima 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) i 96-101 (H3) (Chothia, C. i Lesk, A.M., J. Mol. Biol.196 (1987) 901-917);
(b) CDR regione koji se pojavljuju na aminokiselinskim ostacima 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) i 95-102 (H3) (Kabat, E.A. i sar. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242);
(c) antigen kontakte koji se pojavljuju na aminokiselinskim ostacima 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) i 93-101 (H3) (MacCallum i sar. J. Mol. Biol.
262: 732-745 (1996)); i
(d) kombinacije (a), (b) i/ili (c), uključujući aminokiselinske ostatke HVR46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) i 94-102 (H3).
Ako nije drugačije naznačeno, HVR ostaci i drugi ostaci u varijabilnom domenu (npr. FR ostaci) ovde su numerisani prema radu Kabat i sar., gore.
"Imunokonjugat" je antitelo konjugovano sa jednim ili više heterolognih molekula kao što je transportni modul krvno-moždane barijere.
„Pojedinac” ili „ispitanik” je sisar. Sisari uključuju, bez ograničenja, domaće životinje (npr. krave, ovce, mačke, pse i konje), primate (npr. ljude i nehumane primate, kao što su majmuni), zečeve i glodare (npr. miševe i pacove). U određenim primerima izvođenja, pojedinac ili ispitanik je čovek.
„Izolovano” antitelo je ono koje je izdvojeno iz svog prirodnog okruženja. U nekim primerima izvođenja, antitelo je prečišćeno do čistoće veće od 95 % ili 99 % kao što je određeno, na primer, elektroforetski (npr. SDS-PAGE, izoelektrično fokusiranje (IEF), kapilarna elektroforeza) ili hromatografski (npr. jonskom izmenom ili reverzno-faznim HPLC postupkom). Za pregled metoda za određivanje čistoće antitela pogledajte npr. Flatman, S. i sar. J. Chromatogr. B848 (2007) 79-87.
„Izolovana” nukleinska kiselina ukazuje na molekul nukleinske kiseline koji je odvojen od komponenata svog prirodnog okruženja. Izolovana nukleinska kiselina uključuje molekul nukleinske kiseline koji se nalazi u ćelijama koje uobičajeno sadrže molekul nukleinske kiseline, ali je molekul nukleinske kiseline prisutan ekstrahromozomski, ili na hromozomskoj lokaciji koja se razlikuje od njegove prirodne hromozomske lokacije.
2
„Izolovana nukleinska kiselina koja kodira anti-humano alfa-sinukleinsko antitelo” ukazuje na jedan ili više molekula nukleinske kiseline koji kodiraju teške i lake lance antitela (ili njihove fragmente), uključujući takve molekule nukleinske kiseline u jednom vektoru ili odvojenim vektorima, i takve molekule nukleinske kiseline prisutne na jednoj ili više lokacija u ćeliji domaćinu.
Termin „monoklonsko antitelo”, u smislu ovog dokumenta, se odnosi na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačnih antitela koja sadržana u populaciji su identična i/ili se vezuju za isti epitop, sa izuzetkom mogućih varijanti antitela, npr. koje sadrže mutacije koje postoje u prirodi ili se mogu razviti tokom stvaranja preparata monoklonskog antitela, a takve su varijante opšteprisutne u neznatnim količinama. Nasuprot preparatima poliklonskih antitela, koji tipično uključuju različita antitela, usmerena prema različitim determinantama (epitopima), svako monoklonsko antitelo iz preparata monoklonskog antitela je usmereno na pojedinačnu determinantu na antigenu. Tako, oznaka “monoklonsko” ukazuje na karakter antitela, da je dobijeno iz suštinski homogene populacije antitela, i ne bi je trebalo tumačiti kao zahtev da se antitela proizvode bilo kojom posebnom metodom. Na primer, monoklonska antitela koja će se koristiti u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu se dobiti različitim tehnikama, uključujući, ali se ne ograničavajući na postupak hibridoma, postupke rekombinantne DNK, postupke displeja faga i postupke koje koriste transgene životinje koje sadrže kompletne lokuse humanog imunoglobulina ili njihove delove, i ovde su opisani takvi postupci i primeri drugih postupaka za dobijanje monoklonskih antitela.
„Nativna antitela” ukazuju na molekule imunoglobulina koji se sreću u prirodi, sa različitim strukturama. Na primer, nativna IgG antitela su heterotetramerni glikoproteini od oko 150.000 daltona, sastavljeni od dva identična laka lanca i dva identična teška lanca koji su povezani disulfidnim vezama. Od N- do C-kraja, svaki teški lanac ima varijabilni region (VH), koji se takođe zove varijabilni teški domen ili varijabilni domen teškog lanca, za kojim slede tri konstantna domena (CH1, CH2 i CH3). Slično tome, od N- do C-kraja, svaki laki lanac ima varijabilni region (VL), koji se takođe zove varijabilni laki domen ili varijabilni domen lakog lanca, za kojim sledi konstantni laki (CL) domen. Laki lanac antitela može se svrstati u jedan od dva tipa, koji se zovu kapa (κ) i lambda (λ), na osnovu aminokiselinske sekvence njihovog konstantnog domena.
Termin „uputstvo za upotrebu” se odnosi na uputstvo koje se uobičajeno nalazi u komercijalnim pakovanjima terapeutskih proizvoda, koje sadrži informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, primeni, kombinovanoj terapiji, kontraindikacijama i/ili upozorenjima u vezi sa upotrebom takvih terapeutskih proizvoda.
„Procenat (%) identičnosti sekvence aminokiselina” u odnosu na sekvencu referentnog polipeptida definisan je kao procenat aminokiselinskih ostataka u sekvenci kandidatu koji su identični aminokiselinskim ostacima u sekvenci referentnog polipeptida, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalni procenat identičnosti sekvence, ne uzimajući u obzir nikakve konzervativne supstitucije kao deo identiteta sekvence. Poravnavanje radi određivanja procenta identičnosti aminokiselinske sekvence može se postići na različite načine koji su poznati u okviru struke, na primer, pomoću javno dostupnog kompjuterskog softvera, kao što je BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softver. Stručnjaci za ovu oblast mogu da odrede odgovarajuće parametre za poravnavanje sekvenci, uključujući sve potrebne algoritme za postizanje maksimalnog poravnavanja u kompletnoj dužini sekvenci koje se porede. Međutim, ovde su u tu svrhu vrednosti za % identičnosti sekvence aminokiselina dobijene pomoću računarskog programa za poređenje sekvenci ALIGN-2. Računarski program za poređenje sekvenci ALIGN-2 delo je kompanije Genentech, Inc., a izvorni kod je podnet sa korisničkom dokumentacijom u U.S. Copyright Office (Patentni zavod SAD), Washington D.C., 20559, gde je registrovan pod patentnim brojem U.S. Copyright Registration No. TXU510087. Program ALIGN-2 je javno dostupan od Genentech, Inc., South San Francisco, California ili može biti kompiliran iz izvornog koda. Program ALIGN-2 treba da se kompilira za primenu na operativnom sistemu UNIX, uključujući digitalni UNIX V4.0D. Sve parametre poređenja sekvenci je postavio program ALIGN-2 i nisu se menjali.
U slučajevima kada je ALIGN-2 korišćen za poređenja sekvenci aminokiselina, % identičnosti aminokiselinske sekvence date aminokiselinske sekvence A sa datom aminokiselinskom sekvencom B, ili u odnosu na nju (što alternativno može da se izrazi kao data aminokiselinska sekvenca A koja ima ili sadrži određeni % identičnosti aminokiselinske sekvence prema, sa ili u odnosu na datu aminokiselinsku sekvencu B) izračunava se na sledeći način:
100 puta količnik X/Y
gde je X broj aminokiselinskih ostataka za koje je dobijen rezultat da su identični putem programa za poređenje sekvenci ALIGN-2 pri poravnavanju A i B u tom programu, i gde je Y ukupan broj aminokiselinskih ostataka u B. Treba shvatiti da, u slučaju da dužina aminokiselinske sekvence A nije jednaka dužini aminokiselinske sekvence B, % identičnosti aminokiselinske sekvence A u odnosu na B neće biti isti kao % identičnosti aminokiselinske sekvence B u odnosu na A. Osim ako nije drugačije objavljeno, sve ovde upotrebljene vrednosti % identičnosti aminokiselinske sekvence dobijene su kako je opisano u prethodnom paragrafu pomoću kompjuterskog programa ALIGN-2.
Termin „farmaceutska formulacija” se odnosi na preparat koji je u takvom obliku da omogućava efikasnu biološku aktivnost aktivnog sastojka koji se u njoj nalazi i koji ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za ispitanika na kome će formulacija biti primenjena.
"Farmaceutski prihvatljiv nosač" se odnosi na sastojak farmaceutske formulacije, koji nije aktivni sastojak, koji je netoksičan za ispitanika. Farmaceutski prihvatljiv nosač uključuje, ali se ne ograničava na, pufer, ekscipijens, stabilizator ili konzervans.
Termin „humani alfa-sinuklein”, kako se ovde koristi, odnosi se na nativni humani alfa-sinuklein (UniProt P37840). Termin obuhvata neobrađen humani alfa-sinuklein „pune dužine”, kao i svaki oblik humanog alfa-sinukleina koji je rezultat obrade u ćeliji. Termin takođe obuhvata prirodno postojeće varijante humanog alfa-sinukleina, npr. mutantne, splajsovane ili alelne varijante. Aminokiselinska sekvenca humanog alfa-sinukleina je prikazana u SEQ ID NO: 40.
Kao što je ovde upotrebljeno, "lečenje" (i gramatičke varijacije, kao što je "lečiti") se odnosi na kliničku intervenciju u pokušaju da se izmeni prirodni tok pojedinca koji se leči, i može se primenjivati ili radi profilakse ili tokom kliničke patologije. Poželjni efekti lečenja uključuju, bez ograničenja, sprečavanje pojave ili recidiva bolesti, ublažavanje simptoma, smanjenje svih direktnih ili indirektnih patoloških posledica bolesti, sprečavanje metastaze, usporavanje stope napredovanja bolesti, poboljšavanje ili ublažavanje stanja bolesti i remisiju ili poboljšanu prognozu. U nekim realizacijama, antitela predmetnog pronalaska se primenjuju da odlože razvoj bolesti ili da uspore napredovanje bolesti.
Termin „varijabilni region” ili „varijabilni domen” ukazuje na domen teškog ili lakog lanca antitela koji je uključen u vezivanje antitela za antigen. Varijabilni domeni teškog lanca i lakog lanca (VH i VL, datim redosledom) nativnog antitela u suštini imaju slične strukture, pri čemu svaki domen sadrži četiri očuvana okvirna regiona (FR) i tri hipervarijabilna regiona (HVR). (Vidite npr. Kindt, T.J. i sar. Kuby Immunology, 6. izd, W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), strana 91) Jedan VH ili VL domen može biti dovoljan za dodeljivanje antigenvezujuće specifičnosti. Nadalje, antitela koja vezuju određeni antigen mogu se izolovati pomoću VH ili VL domena iz antitela koje vezuje antigen, za pregledanje biblioteke komplementarnih VH, odnosno VL domena. Vidite npr. Portolano, S. i sar. J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. i sar. Nature 352 (1991) 624-628).
Termin „vektor”, kako se ovde koristi, ukazuje na molekul nukleinske kiseline koji je
2
sposoban da propagira drugu nukleinsku kiselinu za koju je vezan. Termin uključuje vektor kao samoumnožavajuću strukturu nukleinske kiseline, kao i vektor ugrađen u genom ćelije domaćina u koju je uveden. Pojedini vektori mogu da upravljaju ekspresijom nukleinskih kiselina za koje su operativno vezani. Takvi vektori se ovde pominju kao „ekspresioni vektori”.
II. KOMPOZICIJE I POSTUPCI
U jednom aspektu, pronalazak se delom zasniva na otkriću da antitela, kao što je ovde objavljeno, mogu da se koriste za smanjenje/eliminisanje toksičnosti indukovane alfasinukleinom u neuronskim i glijalnim ćelijama u mozgu. U nekim aspektima, obezbeđena su antitela koja se vezuju za humani alfa-sinuklein. Antitela iz pronalaska su korisna, npr. za dijagnostikovanje ili lečenje sinukleinopatije i neuropatije, naročito Parkinsonove bolesti i Alchajmerove bolesti sa pratećom Parkinsonovom bolešću.
A. Primeri anti-humanih alfa-sinukleinskih antitela
Antitela, kao što je ovde objavljeno, dobijena su koristeći namensku metodologiju imunizacije i svrsishodni odabir antitela sa specifičnim svojstvima vezivanja.
Zečevi su u početku imunizovani mešavinom različitih sklopova i agregata rekombinantnog alfa-sinukleina. Izolovani B-ćelijski klonovi su okarakterisani pomoću ELISA i odabrani su najbolji vezivači. U sledećem koraku, antitela su okarakterisana pomoću mapiranja epitopa koristeći metodologiju peptidnog niza i određivanjem njihove selektivnosti prema monomernom i oligomernom rekombinantnom alfa-sinukleinu npr. koristeći vestern blot. Takođe je utvrđeno vezivanje antitela za rekombinantni alfa-sinuklein i fiziološki alfasinuklein u ljudskim neuronskim ćelijama i za patološki alfa-sinuklein u delovima mozga humanih alfa-sinukleinskih transgenih miševa i pacijenata sa Parkinsonovom bolešću. Kandidati su izabrani na osnovu prethodno prikazanih podataka i određeno je in vivo vezivanje za patološki alfa-sinuklein nakon periferne injekcije. Nakon toga su izabrani najefikasniji vezivači. Klirens patologije alfa-sinukleina i/ili zaustavljanje progresije patologije alfa-sinukleina u Thy1-(A30P)aSYN transgenim miševima biće određeni po odabiru najefikasnijih vezivača.
Antitelo 0017 ima širok profil vezivanja specifičan za alfa-sinuklein, tj. ovo antitelo se vezuje za monomerni i agregirani (oligomerni) humani alfa-sinuklein. Na slici 1 prikazano je vezivanje antitela 0017 zavisno od koncentracije za monomerne i višestruke agregirane oblike humanog alfa-sinukleina. Antitelo 0017 je himerno antitelo sa varijabilnim domenima zečjeg antitela 233 izabranim prethodno prikazanim procedurama i mišjim konstantnim regionima.
Jedno poželjno antitelo je antitelo 0018. Ovo antitelo ima profil vezivanja zavisan od agregacije alfa-sinukleina, tj. ovo antitelo se vezuje za monomerni, dimerni i oligomerni alfasinuklein, pri čemu je vezivanje za monomerni humani i mišji alfa-sinuklein umanjeno ako je N-terminalni metioninski ostatak modifikovan, npr. putem acetilovanja ili biotinilovanja, ili je odsutan. Na slici 2 prikazano je vezivanje antitela 0018 zavisno od koncentracije za različito agregirane oblike humanog alfa-sinukleina. Karakter vezivanja oligomera postaje očigledan ispod koncentracije antitela od 0,5 µg/ml. Antitelo 0018 je himerno antitelo sa varijabilnim domenima zečjeg antitela 064 izabranim prethodno prikazanim procedurama i mišjim konstantnim regionima.
Nakon korišćenja peptida sa modifikovanim N-terminusom za određivanje mesta vezivanja antitela 0018 na humanom alfa-sinukleinu, nije detektovano nikakvo vezivanje. Zato je analiza epitopa antitela 0018 izvedena pomoću biblioteke preklapajućih, imobilisanih peptidnih fragmenata (dužina: 15 aminokiselina, pomeranje: 1 aminokiselina) što odgovara sekvencama α-sinukleina (1-140), β-sinukleina (60-134), γ-sinukleina (60-127) i N-acetilovanog α-sinukleinskog peptida (1-15), i koristeći postupak detektovanja zasnovan na ELISA (vidite primer 14 i sliku 13).
Otkriveno je da se antitelo 0018 vezuje za kratki (dužina 15 aminokiselina) monomerni alfa-sinukleinski peptid predstavljen na peptidnom nizu. Antitelo 0018 prepoznaje epitop na krajnjem N-terminusu alfa-sinukleina. N-terminalna aminokiselina metionin (M, MET) neophodna je za vezivanje, jer njeno uklanjanje (ili blokiranje) u potpunosti ukida vezivanje antitela 0018. Nadalje, kada je N-terminalni aminokiselinski ostatak metionina ograničen putem N-acetilovanja, ne može se uočiti nikakvo vezivanje. To je potvrđeno putem analize površinske plazmonske rezonance (vidite sliku 14).
Anti-alfa sinukleinsko antitelo 0081 pokazuje obrazac reaktivnosti zavisan od doze koji podseća na antitelo 0018 sa jednakim smanjenjem imunoreaktivnosti za sve oblike alfasinukleina na blotu (slika 3).
Na slici 4 prikazano je različito ponašanje prilikom bojenja antitela 0017 i 0018 i referentnog antitela 12F4 u sagitalnim presecima mozga alfa-sinukleinskog mutantnog A30P transgenog miša.
Na slici 5 prikazano je različito ponašanje prilikom bojenja antitela 0017 i 0018 u ljudskom moždanom korteksu pacijenta sa Parkinsonovom bolešću (A), pacijenta sa Alchajmerovom bolešću sa pratećom Parkinsonovom bolešću (B) i sa progresivnom supranuklearnom paralizom (C). Primena antitela 0017 dovela je do bojenja difuznog parenhima kao i Levijevog tela i Levijevog neurita. Antitelo 0018 pokazuje slabije bojenje
2
parenhima i uglavnom boji Levijeva tela i Levijeve neurite. Shodno tome, antitela 0017 i 0018 pokazuju različit obrazac bojenja za alfa-sinukleinske agregate u delovima mozga pacijenata sa Parkinsonovom bolešću.
Na slici 6 prikazano je označavanje patologije cerebralnog alfa-sinukleina u alfasinukleinskim mutantnim A30P transgenim miševima nakon akutne periferne injekcije specifičnih mAb. Anti-alfa sinukleinsko antitelo (2x60 mg/kg tokom 5 d) ili PBS su primenjivani na alfa-sinukleinskim mutantnim A30P transgenim miševima starim 15 meseci. Sveže zamrznuti sagitalni preseci mozga od 20 µm obojeni su konjugatom antimišje IgG1-antitelo-AF555 ili odgovarajućim anti-alfa sinukleinskim antitelom i konjugatom antimišje IgG1-antitelo-AF555.
Sa slike 7 može se videti da su antitela 0017 i 0018 sposobna da imunoiscrpljuju alfasinukleinske oligomere iz vanćelijskih medijuma i zato ta antitela smanjuju toksičnost alfasinukleinskih oligomera.
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje izolovana antitela koja se vezuju za humani alfa-sinuklein. U određenim otelotvorenjima, antihumano alfa-sinukleinsko antitelo:
● se vezuje za peptid koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 01 i vezuje se za monomerni ali ne za fibrilarni alfa-sinuklein, ili
se vezuje za isti epitop kao i antitelo koje ima par varijabilnih domena SEQ ID NO: 26 i 27 ili SEQ ID NO: 38 i 39 i vezuje se za fibrilarni alfa-sinuklein ali ne za monomerni alfa-sinuklein,
● inhibira toksičnost indukovanu alfa-sinukleinom u neuronima i glijalnim ćelijama, ● inhibira transmisiju između ćelija alfa-sinukleinske agregacije,
● smanjuje aktivnost kaspaze indukovanu alfa-sinukleinom (npr. u LUHMES ćelijama).
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje antitelo koje sadrži
(a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 21; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 22; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 17; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 23; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 25.
U svim gorepomenutim otelotvorenjima, anti-alfa sinukleinsko antitelo je humanizovano. U jednom otelotvorenju, antihumano alfa-sinukleinsko antitelo sadrži HVR-ove kao u svakom od prethodnih otelotvorenja, i dalje sadrži akceptorski humani okvir, npr.
2
okvir humanog imunoglobulina ili okvir humanog konsenzusa.
U drugom otelotvorenju, VH ili VL sadrže supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), insercije ili delecije u odnosu na referentnu sekvencu, ali antihumano alfasinukleinsko antitelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost vezivanja za humani alfasinuklein.
U nekim otelotvorenjima, obezbeđeno je antitelo koje se vezuje za slobodni N-terminalni epitop (slobodni N-terminalni metioninski ostatak) u fragmentu humanog alfasinukleina koji se sastoji od aminokiselina 1-15 iz SEQ ID NO: 40.
U jednom otelotvorenju, obezbeđeno je antitelo koje se vezuje za humani alfasinuklein koje ima slobodan N-terminalni metioninski ostatak i koje se vezuje za konformacioni epitop u okviru ostataka 1 do 15 i 188-195 humanog alfa-sinukleina.
U daljem aspektu pronalaska, antihumano alfa-sinukleinsko antitelo prema bilo kom od prethodnih otelotvorenja je monoklonsko antitelo, uključujući himerno, humanizovano ili humano antitelo. U jednom otelotvorenju, antihumano alfa-sinukleinsko antitelo je fragment antitela, npr. Fv, Fab, Fab’, scFv, dijatelo, ili fragment F(ab’)2. U drugom otelotvorenju, antitelo je antitelo pune dužine, npr. netaknuto IgG1 ili IgG4 antitelo ili druga klasa ili izotip antitela, kao što je ovde definisano.
U daljem aspektu, antihumano alfa-sinukleinsko antitelo prema bilo kom od prethodnih otelotvorenja može da uključi bilo koju karakteristiku, samu ili u kombinaciji, kao što je opisano u poglavljima 1-5 u nastavku:
1. Afinitet antitela
U nekim otelotvorenjima, ovde dato antitelo ima konstantu disocijacije (Kd) ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ili između 1 nM i 100 nM (npr.10<-7>M ili manje, npr. od 10<-7>M do 10<-9>M).
U jednom otelotvorenju, Kd se meri testom vezivanja radioaktivno označenog antigena (RIA). U jednom otelotvorenju, RIA se izvodi sa Fab verzijom željenog antitela i njegovog antigena. Na primer, afinitet vezivanja FAB u rastvoru za antigen se meri uravnotežavanjem Fab sa minimalnom koncentracijom antigena obeleženog sa (<125>I) u prisustvu titracionih serija neobeleženog antigena, a zatim hvatanjem vezanog antigena pomoću ploče prevučene anti-Fab antitelom (videti npr., Chen, Y. i sar. J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881). Da bi se utvrdili uslovi za test, MICROTITER® ploče sa više bunarčića (Thermo Scientific) su preko noći prevučene sa 5 μg/ml anti-Fab antitela koje služi za hvatanje (Cappel Labs) u 50 mM natrijum karbonatu (pH 9,6) i nakon toga su blokirane 2% (m/V) albuminom goveđeg seruma u PBS-u tokom dva do pet sati na sobnoj temperaturi (oko
2
23°C). Na neadsorbujućoj ploči (Nunc br. 269620), 100 pM ili 26 pM [<125>I]-antigena je pomešano sa serijskim razblaženjima željenog Fab (npr. u skladu sa procenom anti-VEGF antitela, Fab-12 u radu Presta i sar. Cancer Res. 57 (1997) 4593-4599). Željeni Fab se zatim inkubira tokom noći; međutim, inkubacija može da se nastavi u dužem periodu (npr. oko 65 sati) kako bi se obezbedilo uspostavljanje ravnoteže. Nakon toga, smeše se prenose na ploču za hvatanje i inkubiraju se na sobnoj temperaturi (npr. jedan sat). Rastvor se zatim ukloni i ploča se ispere osam puta 0,1 % polisorbatom 20 (TWEEN-20®) u PBS-u. Kada se ploče osuše, dodaje se 150 μl scintilansa po bunarčiću (MICROSCINT-20™; Packard), a zatim se ploče mere na TOPCOUNT™ gama brojaču (Packard) tokom deset minuta. Koncentracije svakog Fab koje daju manje od ili jednako 20 % maksimalnog vezivanja, izabrane su za primenu u analizama kompetitivnog vezivanja.
Prema drugom otelotvorenju, Kd se meri pomoću testa površinske plazmonske rezonance BIACORE®. Na primer, analiza pomoću uređaja BIACORE®-2000 ili BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) obavljena je na 25°C sa CM5 čipovima sa imobilisanim antigenom uz ~10 jedinica odgovora (response units, RU). U jednom otelotvorenju, biosenzorski čipovi sa karboksimetilovanim dekstranom (CM5, BIACORE, Inc.) aktivirani su pomoću N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohlorida (EDC) i N-hidroksisukcinimida (NHS) prema uputstvu dobavljača. Antigen je razblažen pomoću 10 mM natrijum acetata, pH 4,8, do 5 μg/ml (∼0,2 μM) pre injektovanja pri protoku od 5 μl/min da bi se dobilo oko 10 jedinica odgovora (RU) kuplovanog proteina. Nakon injektovanja antigena, injektovan je 1 M etanolamin da bi se blokirale neproreagovale grupe. Za merenja kinetike, injektovane su dvostruke serije razblaženja Fab (0,78 nM do 500 nM) u PBS-u sa 0,05% polisorbatom 20 (TWEEN-20™) surfaktanta (PBST) na 25 °C pri protoku od oko 25 μl/min. Brzine asocijacije (kon) i brzine disocijacije (koff) izračunate su pomoću jednostavnog jedan-na-jedan Lengmirovog modela vezivanja (BIACORE® Evaluation Software verzija 3.2) simultanim podešavanjem senzorgrama asocijacije i disocijacije. Ravnotežna konstanta disocijacije (Kd) je izračunata kao odnos koff/kon(vidite, npr. Chen, Y. i sar. J. Mol. Biol.293 (1999) 865-881). Ako brzina asocijacije pređe 10<6>M<-1>s<-1>prema gore opisanom testu površinske plazmonske rezonance, onda brzina asocijacije može da se odredi primenom tehnike fluorescentnog prigušivanja, koja meri porast ili opadanje intenziteta fluorescentne emisije (ekscitacija = 295 nm; emisija = 340 nm, 16 nm širina trake) na 25 °C kod 20 nM anti-antigen antitela (Fab oblik) u PBS-u, pH7,2, u prisustvu rastućih koncentracija antigena, određeno spektrometrom, kao što je spektrofotometar sa mogućnošću zaustavljanja toka (Aviv Instruments) ili spektrofotometar serije 8000 SLM-AMINCO™ (ThermoSpectronic) sa
2
kivetom sa mešanjem.
2. Fragmenti antitela
U određenim realizacijama, antitelo koje je ovde dato je fragment antitela. Fragmenti antitela uključuju, ali se ne ograničavaju na Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, Fv i scFv fragmente, i druge fragmente opisane u nastavku. Za pregled određenih fragmenata antitela, videti Hudson, P.J. i sar. Nat. Med. 9 (2003) 129-134. Za pregled scFv fragmenata, videti npr., Plueckthun, A., u; The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, tom 113, Rosenburg i Moore (izd.), Springer-Verlag, New York (1994), str.269-315; videti takođe WO93/16185; i US5,571,894 i US5,587,458. Raspravu o Fab i F(ab')2fragmentima koji sadrže regenerisane ostatke receptorski vezujućih epitopa i koji imaju produžen poluživot in vivo videti u US5,869,046.
Dijatela su fragmenti antitela sa dva mesta za vezivanje antigena koja mogu biti bivalentna ili bispecifična. Pogledajte, na primer, EP 0404 097; WO 1993/01161; Hudson, P.J. i sar. Nat. Med. 9 (2003) 129-134; i Holliger, P. i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448. Trijatela i tetratela su takođe opisana u Hudson, P.J. i sar. Nat. Med. 9 (20039 129-134).
Antitela sa jednim domenom su fragmenti antitela koji sadrže kompletan varijabilni domen teškog lanca antitela ili njegov deo, ili kompletan varijabilni domen lakog lanca antitela ili njegov deo. U pojedinim realizacijama, antitelo sa jednim domenom je humano antitelo sa jednim domenom (Domantis, Inc., Waltham, MA; videti, npr., US6,248,516).
Fragmenti antitela se mogu dobiti različitim tehnikama, uključujući ali se ne ograničavajući na proteolitičku digestiju netaknutog antitela, kao i proizvodnju pomoću rekombinantnih ćelija domaćina (npr. E. coli ili faga), kao što je ovde opisano.
3. Himerna i humanizovana antitela
U pojedinim otelotvorenjima, ovde dato antitelo je himerno antitelo. Pojedina himerna antitela su opisana npr. u US 4,816,567; i Morrison, S.L. i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855). U jednom primeru, himerno antitelo sadrži nehumani varijabilni region (npr. varijabilni region dobijen od miša, pacova, hrčka, zeca ili nehumanog primata, kao što je majmun) i humani konstantni region. U daljem primeru, himerno antitelo je antitelo "sa zamenjenom klasom", kod koga je klasa ili potklasa zamenjena klasom ili potklasom matičnog antitela. Himerna antitela uključuju njihove antigen-vezujuće fragmente.
U određenim otelotvorenjima, himerno antitelo je humanizovano antitelo. Tipično, nehumano antitelo je humanizovano da bi se smanjila imunogenost za ljude, pri čemu zadržava specifičnost i afinitet matičnog nehumanog antitela. Generalno, humanizovano
2
antitelo sadrži jedan ili više varijabilnih domena kod kojih su HVR-ovi, npr. CDR-ovi (ili njihovi delovi) dobijeni od ne-humanog antitela, a FR-ovi (ili njihovi delovi) su dobijeni od sekvenci humanog antitela. Humanizovano antitelo opciono takođe sadrži najmanje deo humanog konstantnog regiona. U nekim otelotvorenjima, neki FR ostaci u humanizovanom antitelu su supstituisani odgovarajućim ostacima nehumanog antitela (npr. antitela sa koga su dobijeni HVR ostaci), npr. da bi se povratila ili poboljšala specifičnost antitela ili njegov afinitet.
Pregled humanizovanih antitela i postupaka za njihovo dobijanje dali su, npr. Almagro, J.C. i Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633, i dalje su opisani, npr. u Riechmann, I. i sar. Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C. i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033; US 5, 821,337, US 7,527,791, US 6,982,321 i US 7,087,409; Kashmiri, S.V. i sar. Methods 36 (2005) 25-34 (opisuje graftovanje regiona za određivanje specifičnosti (SDR)); Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 (opisuje “površinske promene"); Dall'Acqua, W.F. i sar. Methods 36 (2005) 43-60 (opisuje “mešanje FR"); i Osbourn, J. i sar. Methods 36 (2005) 61-68 i Klimka, A. i sar. Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260 (opisuje pristup “vođene selekcije” kod mešanja FR).
Humani regioni okvira koji mogu da se koriste za humanizaciju uključuju, ali se ne ograničavaju na: regione okvira izabrane postupkom "najboljeg slaganja" (pogledajte, npr. Sims, M.J. i sar. J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308; regione okvira dobijene od sekvence konsenzusa humanih antitela konkretne podgrupe varijabilnih regiona lakog ili teškog lanca (pogledajte, npr. Carter, P. i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; i Presta, L.G. i sar. J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632); humane zrele (somatski mutirane) regione okvira ili regione okvira humanog embriona (pogledajte, npr. Almagro, J.C. i Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633); i regione okvira dobijene pregledanjem FR biblioteka (pogledajte, npr. Baca, M. i sar. J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684 i Rosok, M.J. i sar. J. Biol. Chem. 271 (1996922611-22618).
4. Multispecifična antitela
U pojedinim otelotvorenjima, ovde dato antitelo je multispecifično antitelo, npr. bispecifično antitelo. Multispecifična antitela su monoklonska antitela koja imaju sposobnost specifičnog vezivanja za najmanje dva različita mesta. U određenim otelotvorenjima, jedna od specifičnosti vezivanja je za humani alfa-sinuklein, a druga je za bilo koji drugi antigen. U određenim otelotvorenjima, bispecifična antitela mogu da se vežu za dva različita epitopa humanog alfa-sinukleina. Bispecifična antitela mogu takođe da se upotrebe za lokalizaciju citotoksičnih agenasa na ćelije koje eksprimiraju humani alfa-sinuklein. Bispecifična antitela mogu da se dobiju kao antitela kompletne dužine ili kao fragmenti antitela.
Tehnike za dobijanje multispecifičnih antitela uključuju, ali nisu ograničene na, rekombinantnu koekspresiju dva imunoglobulinska para teški lanac-laki lanac sa različitim specifičnostima (videti Milstein, C. i Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540, WO 93/08829, i Traunecker, A. i sar. EMBO J.10 (1991) 3655-3659), i tehniku „dugme u rupici” (videti, npr., US 5,731,168). Multispecifična antitela takođe mogu da se dobiju putem konstruisanja efekata elektrostatičkog upravljanja za dobijanje Fc-heterodimernih molekula (WO 2009/089004); unakrsnim povezivanjem dva ili više antitela ili fragmenata (vidite, npr. US 4,676,980, i Brennan, M. i sar. Science 229 (1985) 81-83); koristeći leucinske zatvarače za proizvodnju bispecifičnih antitela (vidite, npr. Kostelny, S.A. i sar. J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553; koristeći tehnologiju „dijatela“ za dobijanje bispecifičnih fragmenata antitela (pogledajte, npr. Holliger, P. ei sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448); i koristeći dimere jednolančanog Fv (sFv) (vidite, npr. Gruber, M i sar. J. Immunol.152 (1994) 5368-5374); i pripremom trispecifičnih antitela kao što je opisano, npr. u Tutt, A. i sar. J. Immunol. 147 (1991) 60-69).
Ovde su takođe obuhvaćena konstruisana antitela sa tri ili više funkcionalnih mesta vezivanja antigena, uključujući „antitela hobotnice” (videti, npr., US 2006/0025576).
Ovde dato antitelo ili fragment takođe uključuje „dvojno delujući Fab” ili „DAF”, koji sadrži mesto vezivanja antigena koji se vezuje za humani alfa-sinuklein, kao i za drugi, različiti antigen (videti, na primer, US 2008/0069820).
Ovde dato antitelo ili njegov fragment takođe obuhvata multispecifična antitela opisana u WO2009/080251, WO2009/080252, WO2009/080253, WO2009/080254, WO2010/112193, WO2010/115589, WO2010/136172, WO2010/145792 i WO2010/145793.
5. Varijante antitela
U pojedinim otelotvorenjima, razmatrane su varijante aminokiselinskih sekvenci antitela koja su ovde data. Na primer, može biti poželjno da se poboljša afinitet vezivanja i/ili druga biološka svojstva antitela. Varijante aminokiselinskih sekvenci antitela se mogu dobiti uvođenjem odgovarajućih modifikacija u sekvencu nukleotida koja kodira antitelo ili putem sinteze peptida. Takve modifikacije uključuju, na primer, uklanjanja, i/ili umetanja, i/ili supstitucije ostataka u aminokiselinskim sekvencama antitela. Svaka kombinacija izbacivanja, ubacivanja i supstitucije može se načiniti da se dođe do finalnog konstrukta, pod uslovom da finalni konstrukt ima željene karakteristike, npr. antigen-vezujuće.
a) Varijante supstitucije, ubacivanja i izbacivanja
U pojedinim otelotvorenjima, date su varijante antitela koja imaju jednu ili više
1
supstitucija aminokiselina. Mesta od interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju FR-ove. Konzervativne supstitucije su prikazane u Tabeli 1 pod naslovom „poželjne supstitucije”. Konkretnije izmene su date u Tabeli 1 pod naslovom „primeri supstitucija” i, kako je opisano u nastavku, prema klasama bočnih nizova aminokiselina. Supstitucije aminokiselina mogu biti uvedene u željeno antitelo i proizvodi ispitani na željenu aktivnost, npr. zadržano/poboljšano vezivanje antigena, smanjena imunogenost, ili poboljšan ADCC ili CDC.
TABELA 1
2
Aminokiseline mogu da se grupišu prema zajedničkim osobinama bočnog lanca:
(1) hidrofobne: Norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) neutralne hidrofilne: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) kisele: Asp, Glu;
(4) bazne: His, Lys, Arg;
(5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: Gly, Pro;
(6) aromatične: Trp, Tyr, Phe.
Nekonzervativne supstitucije zahtevaju izmenu člana jedne od ovih klasa drugom klasom.
Korisni postupak za identifikovanje ostataka ili regiona antitela koji mogu biti ciljani za mutagenezu se zove „skenirajuća mutageneza sa alaninom”, i opisali su je Cunningham, B.C. i Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085. U tom postupku, ostatak ili grupa ciljnih ostataka (npr. naelektrisani ostaci, kao što su arg, asp, his, lys i glu) se identifikuje i zamenjuje neutralnom ili negativno naelektrisanom aminokiselinom (npr. alaninom ili polialaninom) da bi se odredilo da li to utiče na interakciju antitela sa antigenom. Dalje supstitucije mogu biti uvedene na lokacijama aminokiselina koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na inicijalne supstitucije. Alternativno, ili pored toga, kristalna struktura kompleksa antigen–antitelo služi za identifikovanje tačaka kontakta antitela sa antigenom. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci mogu biti ciljani, ili eliminisani kao kandidati za supstituciju. Mogu se pregledati varijante da bi se odredilo da li imaju željena svojstva.
Ubacivanja aminokiselinskih sekvenci uključuju fuzije amino- i/ili karboksi-kraja, pri čemu se dužina kreće od jednog ostatka do polipeptida koji sadrže stotine ostataka ili više, kao i ubacivanja u sekvencu jednog ostatka aminokiselina, ili većeg broja. Primeri terminalnih umetanja uključuju antitelo sa N-terminalnim metionil ostatkom. Druge varijante ubacivanja kod molekula antitela uključuju fuziju sa N- ili C- krajem antitela sa enzimom (npr. za ADEPT) ili polipeptidom, što povećava poluživot antitela u serumu.
b) Varijante glikozilacije
U određenim otelotvorenjima, antitelo koje je ovde dato je izmenjeno da bi se povećao ili smanjio stepen do kog je antitelo glikozilovano. Adicija ili uklanjanje mesta glikozilacije antitela može se pogodno postići izmenom aminokiselinske sekvence, tako da jedno ili više mesta glikozilacije nastane ili se ukloni.
Kada antitelo uključuje Fc region, može biti izmenjen ugljovodonik vezan za njega. Nativna antitela koja proizvode ćelije sisara tipično obuhvataju razgranati, biantenarni oligosaharid koji je tipično vezan N-vezom za Asn297 CH2 domena Fc regiona (videti, npr., Wright, A. i Morrison, S.L., TIBTECH15 (1997) 26-32). Oligosaharid može da uključuje različite ugljovodonike, npr. manozu, N-acetil glukozamin (GlcNAc), galaktozu i sijalinsku kiselinu, kao i fukozu vezanu za GlcNAc u „osnovi” biantenarne oligosaharidne strukture. U nekim otelotvorenjima, modifikacije oligosaharida u antitelu iz predmetnog pronalaska mogu biti načinjene da bi se dobile varijante antitela sa određenim poboljšanim svojstvima.
U jednom otelotvorenju, date su varijante antitela koja imaju ugljovodoničnu strukturu kojoj nedostaje fukoza vezana (direktno ili indirektno) za Fc region. Na primer, količina fukoze u tom antitelu može biti od 1% do 80%, od 1% do 65%, od 5% do 65% ili od 20% do 40%. Količina fukoze se određuje izračunavanjem prosečne količine fukoze u šećernom lancu na Asn297, u odnosu na zbir svih glikostruktura vezanih za Asn297 (npr. kompleksne, hibridne ili strukture sa visokim sadržajem manoze), kao što je određeno MALDI-TOF masenom spektrometrijom, npr. kao što je opisano u WO2008/077546. Asn297 se odnosi na asparaginski ostatak koji se nalazi oko položaja 297 u Fc regionu (prema EU numeraciji ostataka Fc regiona); međutim, Asn297 takođe može da se nalazi oko ± 3 aminokiseline više ili niže od položaja 297, tj. između položaja 294 i 300, usled manjih varijacija sekvenci kod antitela. Takve varijante fukozilacije mogu da imaju poboljšanu ADCC funkciju. Vidite, npr. US2003/0157108; US2004/0093621. Primeri publikacija vezanih za „defukozilovane“ ili varijante antitela „sa manjkom fukoze“ uključuju: S 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki, A. ei sar. J. Mol. Biol.336 (2004) 1239-1249; Yamane-Ohnuki, N. i sar. Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622. Primeri ćelijskih linija koje mogu da proizvedu defukozilovana antitela uključuju Lec13 CHO ćelije sa manjkom fukozilacije proteina (Ripka, J. i sar. Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545; US 2003/0157108; i WO 2004/056312, naročito u primeru 11), i nokaut ćelijske linije, poput gena alfa-1,6-fukoziltransferaze, FUT8, nokaut CHO ćelije (vidite, npr. Yamane-Ohnuki, N. i sar. Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622; Kanda, Y. i sar. Biotechnol. Bioeng.94 (2006) 680-
4
688; i WO2003/085107).
Varijante antitela su dalje obezbeđene sa bisektovanim oligosaharidima, npr. kod kojih je biantenarni oligosaharid vezan za Fc region antitela bisektiran pomoću GlcNAc. Takve varijante antitela mogu da imaju smanjenu fukozilaciju i/ili poboljšanu ADCC funkciju. Primeri takvih varijanti antitela su opisani, npr. u WO2003/011878, US6,602,684 i US2005/0123546. Varijante antitela sa najmanje jednim ostatkom galaktoze u oligosaharidu vezanim za Fc region takođe su obezbeđene. Takve varijante antitela mogu da imaju poboljšanu CDC funkciju. Takve varijante antitela su opisane, npr. u WO1997/30087, WO1998/58964 i WO1999/22764.
c) Varijante Fc regiona
U određenim otelotvorenjima, jedna ili više modifikacija aminokiselina može biti uvedena u Fc region antitela koje je ovde dato, time stvarajući varijantu Fc regiona. Varijanta Fc regiona može da sadrži sekvencu humanog Fc regiona (npr. Fc region humanog IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4) koji sadrži modifikaciju aminokiseline (npr. supstituciju) na jednom ili više aminokiselinskih mesta.
U određenim otelotvorenjima, pronalazak razmatra varijantu antitela koja ima neke, ali ne sve efektorske funkcije, što je čini pogodnim kandidatom za primene kod kojih je poluživot antitela in vivo važan, dok su pojedine efektorske funkcije (kao što su komplementna i ADCC) nepotrebne ili štetne. In vitro i/ili in vivo testovi citotoksičnosti mogu se sprovesti radi potvrde smanjenja/sniženja CDC i/ili ADCC aktivnosti. Na primer, testovi vezivanja Fc receptora (FcR) mogu se sprovesti kako bi se obezbedilo da antitelo nema FcγR vezivanje (stoga, verovatno nema ADCC aktivnost), ali zadržava sposobnost vezivanja FcRn. Primarne ćelije za posredovanje ADCC, NK ćelije, eksprimiraju samo FcγRIII, dok monociti eksprimiraju FcγRI, FcγRII i FcγRIII. Ekspresija FcR na hematopoetskim ćelijama je rezimirana u Tabeli 3 na strani 464 Ravetch, J.V. i Kinet, J.P., Annu. Rev. imunol. 9 (1991) 457-492. Neograničavajući primeri in vitro testova za određivanje ADCC aktivnosti željenog molekula opisani su u US 5,500,362 (vidite npr. Hellstrom, I. i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063; i Hellstrom, I. i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502); US 5,821,337 (vidite Bruggemann, M. i sar. J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361). Alternativno, za testove mogu da se koriste neradioaktivni postupci (pogledajte, npr. ACTI™ neradioaktivni test citotoksičnosti za protočnu citometriju (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; i CytoTox 96® neradioaktivni test citotoksičnosti (Promega, Madison, WI). Korisne efektorske ćelije za takve testove uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK). Alternativno, ili dodatno, ADCC aktivnost željenog molekula može se odrediti in vivo, npr. na životinjskom modelu, kao što je onaj koji su objavili Clynes, R. i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656. Testovi vezivanja C1q mogu takođe da se izvedu kako bi se potvrdilo da antitelo ne može da veže C1q i da, stoga, nema CDC aktivnost. Videti, npr., ELISA test vezivanja C1q i C3c u WO2006/029879 i WO2005/100402. Da bi se odredila komplementarna aktivacija, može da se obavi CDC test (pogledajte, na primer, Gazzano-Santoro, H. i sar. J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171; Cragg, M.S. i sar. Blood 101 (2003) 1045-1052; i Cragg, M.S. i M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743). FcRn vezivanje i in vivo određivanje klirensa/poluživota može takođe da se izvrši pomoću postupaka poznatih u struci (pogledajte, npr. Petkova, S.B. i sar. Int. Immunol. 18 (2006: 1759-1769).
Antitela sa redukovanom efektorskom funkcijom uključuju ona sa supstitucijom jednog ili više ostataka Fc regiona 238, 265, 269, 270, 297, 327 i 329 (US6,737,056). Takvi Fc mutanti uključuju Fc mutante sa supstitucijama na dva ili više položaja aminokiselina 265, 269, 270, 297 i 327, uključujući takozvani „DANA“ Fc mutant sa supstitucijom ostataka 265 i 297 alaninom (US 7,332,581).
Opisane su pojedine varijante antitela sa poboljšanim ili smanjenim vezivanjem za FcR. (Vidite, npr. US 6,737,056; WO 2004/056312 i Shields, R.L. i sar. J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604)
U pojedinim otelotvorenjima, varijanta antitela sadrži Fc region sa jednom ili više supstitucija aminokiselina koje poboljšavaju ADCC, npr. supstitucije na položajima 298, 333 i/ili 334 Fc regiona (EU numeracija ostataka).
U nekim otelotvorenjima, napravljene su izmene u Fc regionu koje imaju za rezultat izmenjeno (tj. poboljšano ili smanjeno) C1q vezivanje i/ili komplementno zavisnu citotoksičnost (CDC), npr. kao što je opisano u US 6,194,551, WO 99/51642, i Idusogie, E.E. i sar. J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184.
Antitela sa produženim poluživotom i poboljšanim vezivanjem za neonatalni Fc receptor (FcRn), koji je odgovoran za transfer IgG-ova majke na fetus (Guyer, R.L. i sar. J. Immunol. 117 (1976) 587-593, i Kim, J.K. i sar. J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434), opisana su u US 2005/0014934. Ta antitela obuhvataju Fc region sa jednom ili više supstitucija koje poboljšavaju vezivanje Fc regiona za FcRn. Takve Fc varijante uključuju one sa supstitucijom na jednom ostatku ili više ostataka Fc regiona: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ili 434, npr. supstitucija ostatka Fc regiona 434 (US7,371,826).
Videti i Duncan, A.R. i Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740; US5,648,260; US5,624,821; i WO94/29351 za druge primere varijanti Fc-regiona.
d) Varijante antitela projektovane sa cisteinom
U pojedinim otelotvorenjima, može biti poželjno da se naprave antitela projektovana sa cisteinom, npr. "tioMAb", kod kojih je jedan ili više ostataka antitela supstituisan ostacima cisteina. U određenim otelotvorenjima, supstituisani ostaci se nalaze na pristupačnim mestima na antitelu. Supstitucijom tih ostataka cisteinom, reaktivne tiolske grupe se time postavljaju na pristupačna mesta na antitelu, i mogu se koristiti za konjugovanje antitela sa drugim funkcionalnim ostacima, kao što su funkcionalni ostaci lekova ili funkcionalni ostaci linker-lek, da bi se dobio imunokonjugat, kao što je opisano ovde. U pojedinim otelotvorenjima, bilo koji, ili više ostataka navedenih u nastavku mogu biti supstituisani cisteinom: V205 (Kabatova numeracija) lakog lanca; A118 (EU numeracija) teškog lanca i S400 (EU numeracija) Fc regiona teškog lanca. Antitela projektovana sa cisteinom mogu se dobiti kao što je opisano, npr. u US7,521,541.
e) Derivati antitela
U pojedinim otelotvorenjima, ovde dato antitelo se može dalje modifikovati da sadrži dodatne neproteinske funkcionalne ostatke koji su poznati u struci i koji su dostupni. Funkcionalni ostaci pogodni za derivatizaciju antitela uključuju, bez ograničenja, polimere rastvorljive u vodi. Neograničavajući primeri hidrosolubilnih polimera uključuju, ali nisu ograničeni na polietilen glikol (PEG), kopolimere etilen glikol/propilen glikol, karboksimetilcelulozu, dekstran, polivinil alkohol, polivinil pirolidon, poli-1,3-dioksolan, poli-1,3,6-trioksan, kopolimer etilen/anhidrid maleinske kiseline, poliaminokiseline (homopolimere ili nasumične kopolimere), i dekstran ili poli(n-vinil pirolidon)polietilen glikol, homopolimere propropilen glikola, kopolimere polipropilen oksid/etilen oksid, polioksietilovane poliole (npr. glicerol), polivinil alkohol, i njihove smeše. Polietilen glikol propionaldehid može imati prednosti u proizvodnji zbog svoje stabilnosti u vodi. Polimer može imati bilo koju molekulsku masu, a može biti razgranat ili sa ravnim nizom. Broj polimera vezanih za antitelo može da varira i, ako je više od jednog polimera vezano, to mogu biti isti ili različiti molekuli. U suštini, broj i/ili vrsta polimera korišćenih za derivatizaciju može se odrediti na osnovu razmatranja, uključujući, bez ograničenja, naročite osobine ili funkcije antitela koje treba poboljšati i da li će derivat antitela biti korišćen u terapiji pod definisanim uslovima, itd.
U drugom otelotvorenju, dati su konjugati antitela i neproteinskog ostatka koji mogu selektivno da se zagrevaju izlaganjem radijaciji. U jednom otelotvorenju, neproteinski ostatak je ugljenična nanocevčica (Kam, N.W. i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605). Radijacija može biti na bilo kojoj talasnoj dužini, i uključuje, ali nije ograničena na talasne dužine koje ne oštećuju obične ćelije, ali koje zagrevaju neproteinski ostatak na temperaturu na kojoj ćelije u blizini neproteinskog ostatka antitela bivaju ubijene.
f) Fuzije sa transportnim modulom krvno-moždane barijere
Monoklonska antitela imaju ogroman terapeutski potencijal za lečenje neuroloških bolesti ili bolesti centralnog nervnog sistema (CNS), ali njihov prolaz u mozak je ograničen krvno-moždanom barijerom (KMB). Prethodna ispitivanja su pokazala da veoma mali procenat (oko 0,1%) IgG iz krvotoka prolazi kroz KMB u CNS (Felgenhauer, K., Klin. Wschr. 52 (1974) 1158-1164), pri čemu koncentracija antitela u CNS-u može biti nedovoljna za jači efekat.
U određenim otelotvorenjima, ovde dato antitelo može biti dalje modifikovano tako da sadrži jedan ili više modula transportera kroz krvno-moždanu barijeru koji su poznati u struci i lako dostupni.
Jedan ili više transportnih modula krvno-moždane barijere može da se fuzioniše sa bilo kojim terminusom lakog ili teškog lanca. U jednom poželjnom otelotvorenju, modul transportera kroz krvno-moždanu barijeru je spojen sa C-terminusom teškog lanca.
C-terminus teškog lanca može biti kompletni C-terminus koji se završava aminokiselinskim ostacima PGK. C-terminus teškog lanca može biti skraćeni C-terminus u kojem su uklonjeni jedan ili dva ostatka C-terminalnih aminokiselina. U jednom poželjnom otelotvorenju, C-terminus teškog lanca je skraćeni C-terminus koji se završava sa PG.
Jedan ili više modula za transport kroz krvno-moždanu barijeru se može spojiti odgovarajućim lancem antitela neposredno ili putem peptidnog linkera. U jednom poželjnom otelotvorenju, peptidni linker ima aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 41).
Modul transportera kroz krvno-moždanu barijeru može biti fragment scFv antitela. U jednom otelotvorenju, modul transportera kroz krvno-moždanu barijeru je scFv koji sadrži u pravcu od N- do C-terminusa varijabilni domen lakog lanca-konstantni domen lakog lancapeptidni linker-varijabilni domen teškog lanca-konstantni domen 1 teškog lanca.
U jednom poželjnom otelotvorenju, modul transportera kroz krvno-moždanu barijeru je scFv fragment antitransferinskog receptorskog antitela 8D3 sa (G4S)6peptidnim linkerom ili njegova humanizovana varijanta
Termin njegova humanizovana varijanta označava molekul koji je dobijen graftovanjem CDR mišjeg antitela 8D3 na humani okvir uz opciono uvođenje jedne do tri mutacije nezavisno jedne od druge u svaki od regiona okvira (FR) i/ili hipervarijabilnih regiona (HVR).
U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje fuzioni polipeptid antihumanog alfa-sinukleinskog antitela koji sadrži antihumano alfa-sinukleinsko antitelo, dva peptidna linkera i dva jednovalentna vezujuća entiteta koji se vezuju za receptor krvno-moždane barijere, pri čemu linker vezuje antihumano alfa-sinukleinsko antitelo sa jednovalentnim vezujućim entitetima koji se vezuju za receptor krvno-moždane barijere.
U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje fuzioni polipeptid antihumanog alfa-sinukleinskog antitela koji sadrži antihumano alfa-sinukleinsko antitelo, peptidni linker i jedan jednovalentni vezujući entitet koji se vezuje za receptor krvno-moždane barijere, pri čemu linker vezuje antihumano alfa-sinukleinsko antitelo sa jednovalentnim vezujućim entitetom koji se vezuje za receptor krvno-moždane barijere.
U jednom otelotvorenju, jednovalentni vezujući entitet koji se vezuje za receptor krvno-moždane barijere je izabran iz grupe koja se sastoji od proteina, polipeptida i peptida.
U jednom otelotvorenju, jednovalentni vezujući entitet koji se vezuje za receptor krvno-moždane barijere sadrži molekul izabran iz grupe koja se sastoji od liganda krvnomoždane barijere, scFv, Fv, scFab, VHH, u jednom poželjnom otelotvorenju, scFv ili scFab.
U jednom otelotvorenju, receptor krvno-moždane barijere je izabran iz grupe koja se sastoji od transferinskog receptora, insulinskog receptora, receptora insulinu sličnog faktora rasta, proteina 8 koji je povezan sa lipoproteinskim receptorom male gustine, proteina 1 koji je povezan sa lipoproteinskim receptorom male gustine i faktora rasta sličnog epidermalnom faktoru rasta koji vezuje heparin. U jednom poželjnom otelotvorenju, receptor krvnomoždane barijere je transferinski receptor.
U jednom otelotvorenju, jednovalentni vezujući entitet koji se vezuje za receptor krvno-moždane barijere sadrži jedan scFab ili jedan scFv usmeren na transferinski receptor, konkretnije scFab ili scFv koji prepoznaje epitop u transferinskom receptoru sadržan u aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 52, 53 i 54.
U jednom otelotvorenju, jednovalentni vezujući entitet koji se vezuje za receptor krvno-moždane barijere je kuplovan sa C-terminalnim krajem teškog lanca antihumanog alfasinukleinskog antitela putem linkera.
U jednom otelotvorenju, peptidni linker je aminokiselinska sekvenca čija je dužina najmanje 15 aminokiselina, poželjnije dužine od 18 do 25 aminokiselina.
U jednom otelotvorenju, antihumano alfa-sinukleinsko antitelo je antitelo kompletne dužine, u jednom poželjnom otelotvorenju IgG kompletne dužine. Termin antitelo kompletne dužine označava antitelo koje se sastoji od dva polipeptida lakog lanca antitela i dva polipeptida teškog lanca antitela, pri čemu u dva polipeptida teškog lanca antitela C-terminalni ostatak lizina (K) može biti prisutan ili odsutan.
U jednom poželjnom otelotvorenju, fuzioni polipeptid antihumanog alfasinukleinskog antitela sadrži antihumano alfa-sinukleinsko antitelo kompletne dužine IgG kao entitet moždanog efektora, linker sa sekvencom (SEQ ID NO: 41) i jedan scFab kao jednovalentni vezujući entitet koji se vezuje za receptor humanog transferina kao receptor krvno-moždane barijere, pri čemu je scFab kuplovan putem linkera sa C-terminalnim krajem (Fc dela) jednog od teških lanaca antihumanog alfa-sinukleinskog antitela kompletne dužine, i pri čemu scFab prepoznaje epitop u receptoru humanog transferina sadržan u aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 52, 53 i 54.
U jednom poželjnom otelotvorenju, fuzioni polipeptid antihumanog alfasinukleinskog antitela sadrži antihumano alfa-sinukleinsko antitelo kompletne dužine IgG kao entitet moždanog efektora, linker sa sekvencom (SEQ ID NO: 41) i jedan scFv kao jednovalentni vezujući entitet koji se vezuje za receptor humanog transferina kao receptor krvno-moždane barijere, pri čemu je scFab kuplovan putem linkera sa C-terminalnim krajem (Fc dela) jednog od teških lanaca antihumanog alfa-sinukleinskog antitela kompletne dužine, i pri čemu scFab prepoznaje epitop u receptoru humanog transferina sadržan u aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 52, 53 i 54.
U jednom otelotvorenju, prvi teški lanac antihumanog alfa-sinukleinskog antitela sadrži prvi dimerizacioni modul i drugi teški lanac antitela sadrži drugi dimerizacioni modul, što omogućava heterodimerizaciju dva teška lanca.
U jednom otelotvorenju, prvi dimerizacioni modul prvog teškog lanca antihumanog alfa-sinukleinskog antitela je teški lanac dugmeta i dimerizacioni modul drugog teškog lanca antihumanog alfa-sinukleinskog antitela je teški lanac rupice (prema strategiji dugme u rupici).
Fuzioni polipeptid antihumanog alfa-sinukleinskog antitela kao što je ovde objavljeno može da se koristi kao lek, konkretno može da se koristi za lečenje neuroloških poremećaja kao što je npr. Parkinsonova bolest.
Fuzioni polipeptid antihumanog alfa-sinukleinskog antitela kao što je ovde objavljeno može da se koristi za transport antihumanog alfa-sinukleinskog antitela (efektorski entitet mozga) kroz krvno-moždanu barijeru.
U jednom otelotvorenju, teški lanac antihumanog alfa-sinukleinskog antitela koji je
4
spojen na svom C-terminalnom kraju Fc regiona sa scFab kao jednovalentnim vezujućim entitetom koji se vezuje za humani transferinski receptor ima sledeću strukturu u smeru od N-do C-terminusa:
● teški lanac IgG,
● peptidni linker koji spaja C-terminalni kraj Fc regiona teškog lanca IgG sa N-terminalnim krajem VL domena scFab, u jednom poželjnom otelotvorenju, peptidni linker ima aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 41),
● varijabilni domen lakog lanca (VL) i C-kapa domen lakog lanca scFab,
● peptidni linker koji spaja C-terminalni kraj C-kapa domena lakog lanca scFab sa N-terminalnim krajem VH domena scFab, u jednom poželjnom otelotvorenju, peptidni linker ima aminokiselinsku sekvencu (G4S)6GG (SEQ ID NO: 55),
● varijabilni domen teškog lanca (VH) scFab antitela i CH1 domen teškog lanca IgG. U jednom otelotvorenju, teški lanac antihumanog alfa-sinukleinskog antitela koji je spojen na svom C-terminalnom kraju Fc regiona sa scFv kao jednovalentnim vezujućim entitetom koji se vezuje za humani transferinski receptor ima sledeću strukturu u smeru od N-do C-terminusa:
● teški lanac IgG,
● peptidni linker koji spaja C-terminalni kraj Fc dela teškog lanca IgG sa N-terminalnim krajem VL domena scFv fragmenta antitela, u jednom poželjnom otelotvorenju, peptidni linker je peptid sa aminokiselinskom sekvencom (SEQ ID NO: 41),
● varijabilni domen lakog lanca (VL),
● peptidni linker koji spaja C-terminalni kraj varijabilnog domena lakog lanca sa N-terminalnim krajem VH domena scFv, u jednom poželjnom otelotvorenju, peptidni linker je peptid sa aminokiselinskom sekvencom (G4S)6GG (SEQ ID NO: 55),
● varijabilni domen teškog lanca (VH) scFv fragmenta antitela.
U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje fuzioni polipeptid za transport efektorskog entiteta mozga kroz krvno-moždanu barijeru koji sadrži entitet Ig CH2-CH3, peptidni linker i jedan scFab ili scFv usmeren na receptor krvno-moždane barijere, pri čemu su scFab ili scFv kuplovani sa C-terminalnim krajem entiteta Ig CH2-CH3 putem peptidnog linkera.
U jednom otelotvorenju, transportni modul krvno-moždane barijere/scFab ili scFv usmeren na receptor krvno-moždane barijere dobijen je od humanizovanog antitransferinskog receptorskog antitela 8D3 (vidite npr. Boado, R.J., i sar. Biotechnol. Bioeng. 102 (2009) 1251-1258). Mišji varijabilni domen teškog lanca ima aminokiselinsku sekvencu
(SEQ ID NO: 56).
Mišji varijabilni domen lakog lanca (varijanta 1) ima aminokiselinsku sekvencu
(SEQ ID NO: 57), I
mišji varijabilni domen lakog lanca (varijanta 2) ima aminokiselinsku sekvencu
(SEQ ID NO: 58).
Jedan modul za transport kroz krvno-moždanu barijeru
U jednom aspektu, fuzioni polipeptid antihumanog alfa-sinukleinskog antitela sadrži tačno jedan modul za transport kroz krvno-moždanu barijeru, pri čemu modul za transport kroz krvno-moždanu barijeru sadrži humanizovane varijabilne domene mišjeg antihumanog transferinskog receptorskog antitela 8D3, pri čemu modul za transport kroz krvno-moždanu barijeru koji sadrži humanizovane varijabilne domene mišjeg antihumanog transferinskog receptorskog antitela 8D3 transportuje antihumano alfa-sinukleinsko antitelo kroz krvnomoždanu barijeru. Varijabilni domeni antihumanog transferinskog receptorskog antitela 8D3 imaju aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 56 i 57.
Jedan ili dva modula transportera kroz krvno-moždanu barijeru
U jednom aspektu, fuzioni polipeptid antihumanog alfa-sinukleinskog antitela sadrži jedan ili dva modula za transport kroz krvno-moždanu barijeru, pri čemu se modul za transport kroz krvno-moždanu barijeru dobijen od antitela vezuje sa malim afinitetom za receptor krvno-moždane barijere (KMB-R), pri čemu modul za transport kroz krvnomoždanu barijeru dobijen od antitela koje se sa malim afinitetom vezuje za receptor krvnomoždane barijere transportuje antihumano alfa-sinukleinsko antitelo kroz krvno-moždanu barijeru.
U drugom aspektu, KMB-R je izabran iz grupe koja se sastoji od transferinskog receptora (TfR), insulinskog receptora, receptora insulinu sličnog faktora rasta (IGF receptor), proteina 8 koji je u vezi sa lipoproteinskim receptorom male gustine (LRP8), proteina 1 koji je u vezi sa lipoproteinskim receptorom male gustine (LRP1) i faktora rasta sličnog epidermalnom faktoru rasta koji vezuje heparin (HB-EGF). U drugom takvom aspektu, KMB-R je humani KMB-R. U jednom takvom aspektu, KMB-R je TfR. U drugom takvom aspektu, KMB-R je TfR i antitelo ne inhibira aktivnost TfR. U drugom takvom aspektu, KMB-R je TfR i antitelo ne inhibira vezivanje TfR za transferin.
U drugom aspektu, antitelo ne pogoršava vezivanje KMB-R za jedan ili više svojih prirodnih liganda. U drugom takvom aspektu, antitelo se specifično vezuje za humani transferinski receptor (hTfR) na takav način da ne inhibira vezivanje hTfR za humani transferin.
U jednom aspektu, anti-KMB-R antitelo ima IC50za KMB-R od oko 1 nM do oko 100 µM. U drugom takvom aspektu, IC50je od oko 5 nM do oko 100 µM. U drugom takvom aspektu, IC50je od oko 50 nM do oko 100 µM. U drugom takvom aspektu, IC50je od oko 100 nM do oko 100 µM. U drugom aspektu, antitelo ima afinitet prema KMB-R od oko 5 nM do oko 10 µM. U drugom takvom aspektu, antitelo, kada je povezano sa antihumanim alfasinukleinskim antitelom, ima afinitet prema KMB-R od oko 30 nM do oko 1 µM. U drugom takvom aspektu, antitelo, kada je povezano sa antihumanim alfa-sinukleinskim antitelom, ima afinitet prema KMB-R od oko 50 nM do oko 1 µM. U jednom aspektu, afinitet anti-KMB-R antitela ili fuzionog polipeptida antihumanog alfa-sinukleinskog antitela prema KMB-R se meri korišćenjem Skačardove analize. U drugom aspektu, afinitet anti-KMB-R antitela ili fuzionog polipeptida antihumanog alfa-sinukleinskog antitela prema KMB-R se meri korišćenjem BIACORE analize. U drugom aspektu, afinitet anti-KMB-R antitela ili fuzionog polipeptida antihumanog alfa-sinukleinskog antitela prema KMB-R se meri korišćenjem kompetitivnog ELISA testa.
Upotreba transportera kroz krvno-moždanu barijeru koji sadrži fuzione polipeptide antitela
U drugom otelotvorenju, ovde je obezbeđen postupak za povećanje izloženosti CNS antihumanom alfa-sinukleinskom antitelu, pri čemu je antihumano alfa-sinukleinsko antitelo spojeno sa antitelom ili fragmentom antitela koji se sa malim afinitetom vezuje za KMB-R, čime se povećava izloženost CNS antihumanom alfa-sinukleinskom antitelu. U drugom aspektu, porast izloženosti CNS antihumanom alfa-sinukleinskom antitelu se meri u odnosu na izloženost CNS antihumanom alfa-sinukleinskom antitelu spojenom sa tipičnim antitelom koje nema smanjeni afinitet prema KMB-R. U drugom aspektu, porast izloženosti CNS antihumanom alfa-sinukleinskom antitelu se meri kao odnos količine antihumanog alfasinukleinskog antitela nađenog u CNS prema količini nađenoj u serumu nakon primene. U
4
drugom takvom aspektu, povećana izloženost CNS-a dovodi do odnosa koji je veći od 0,1%. U drugom aspektu, povećana izloženost CNS-a antihumanom alfa-sinukleinskom antitelu se meri u odnosu na izloženost CNS-a antihumanom alfa-sinukleinskom antitelu u odsustvu kuplovanog anti-KMB-R antitela. U drugom aspektu, povećana izloženost CNS-a antihumanom alfa-sinukleinskom antitelu se meri snimanjem. U drugom aspektu, povećana izloženost CNS-a antihumanom alfa-sinukleinskom antitelu se meri indirektnim očitavanjem, kao što je promena jednog ili više fizioloških simptoma.
Postupak za povećanje zadržavanja u CNS-u antihumanog alfa-sinukleinskog antitela primenjenog na ispitaniku, pri čemu je antihumano alfa-sinukleinsko antitelo spojeno sa antitelom ili fragmentom antitela koji se sa malim afinitetom vezuje za KMB-R, čime se povećava zadržavanje antihumanog alfa-sinukleinskog antitela u CNS-u.
U drugom otelotvorenju, pronalazak obezbeđuje postupak za optimizaciju farmakokinetike i/ili farmakodinamike antihumanog alfa-sinukleinskog antitela, kako bi bilo efikasno u CNS-u ispitanika, pri čemu je antihumano alfa-sinukleinsko antitelo povezano sa antitelom ili fragmentom antitela koji se sa malim afinitetom vezuje za KMB-R, pri čemu su antitelo ili fragment antitela izabrani tako da njihov afinitet prema KMB-R nakon vezivanja za antihumano alfa-sinukleinsko antitelo dovodi do obima transporta antitela ili fragmenta antitela povezanog sa antihumanim alfa-sinukleinskim antitelom kroz KMB koji optimizuje farmakokinetiku i/ili farmakodinamiku antihumanog alfa-sinukleinskog antitela u CNS-u.
U drugom otelotvorenju, pronalazak obezbeđuje postupak za lečenje neurološkog poremećaja kod sisara, koji obuhvata lečenje sisara antitelom ili fragmentom antitela koji vezuje KMB-R i povezan je sa antihumanim alfa-sinukleinskim antitelom, pri čemu je antitelo izabrano tako da ima mali afinitet prema KMB-R i tako poboljšava preuzimanje antitela i vezanog antihumanog alfa-sinukleinskog antitela u CNS-u. U jednom otelotvorenju, lečenje dovodi do smanjenja ili eliminacije simptoma poremećaja. U drugom aspektu, lečenje dovodi do ublažavanja neuroloških poremećaja.
U jednom otelotvorenju svih prethodnih aspekata, anti-KMB-R antitelo ima IC50za KMB-R od oko 1 nM do oko 100 µM. U drugom takvom otelotvorenju, IC50je od oko 5 nM do oko 100 µM. U drugom takvom otelotvorenju, IC50je od oko 50 nM do oko 100 µM. U drugom takvom otelotvorenju, IC50je od oko 100 nM do oko 100 µM. U drugom otelotvorenju, antitelo ima afinitet prema KMB-R od oko 5 nM do oko 10 µM. U drugom otelotvorenju, antitelo, kada je povezano sa antihumanim alfa-sinukleinskim antitelom, ima afinitet prema KMB-R od oko 30 nM do oko 1 µM. U drugom otelotvorenju, antitelo, kada je povezano sa antihumanim alfa-sinukleinskim antitelom, ima afinitet prema KMB-R od oko 50 nM do oko 1 µM. U jednom otelotvorenju, afinitet anti-KMB-R antitela ili fuzionog polipeptida antihumanog alfa-sinukleinskog antitela prema KMB-R se meri korišćenjem Skačardove analize. U drugom otelotvorenju, afinitet anti-KMB-R antitela ili fuzionog polipeptida antihumanog alfa-sinukleinskog antitela prema KMB-R se meri korišćenjem BIACORE analize. U drugom otelotvorenju, afinitet anti-KMB-R antitela ili fuzionog polipeptida antihumanog alfa-sinukleinskog antitela prema KMB-R se meri korišćenjem kompetitivnog ELISA testa.
U drugom otelotvorenju, fuzioni polipeptid antihumanog alfa-sinukleinskog antitela je obeležen. U drugom otelotvorenju, anti-KMB-R antitelo ili fragment ne pogoršava vezivanje KMB-R za jedan ili više svojih prirodnih liganda. U drugom otelotvorenju, anti-KMB-R antitelo se specifično vezuje za hTfR na takav način da ne inhibira vezivanje hTfR za humani transferin. U drugom otelotvorenju, fuzioni polipeptid antihumanog alfa-sinukleinskog antitela se primenjuje na sisaru. U drugom otelotvorenju, sisar je čovek. U drugom otelotvorenju, sisar ima neurološki poremećaj. U drugom otelotvorenju, neurološki poremećaj je izabran iz grupe koja se sastoji od Alchajmerove bolesti (AD), moždanog udara, demencije, mišićne distrofije (MD), multiple skleroze (MS), amiotrofne lateralne skleroze (ALS), cistične fibroze, Angelmanovog sindroma, Lidlovog sindroma, Parkinsonove bolesti, Pikove bolesti, Padžetove bolesti, kancera i traumatske povrede mozga.
B. Rekombinantni postupci i kompozicije
Antitela se mogu proizvesti korišćenjem rekombinantnih postupaka i kompozicija, npr., kao što je opisano u US4,816,567. U jednom otelotvorenju, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja kodira antihumano alfa-sinukleinsko antitelo koje je ovde opisano. Takva nukleinska kiselina može kodirati aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL i/ili aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela (npr. lake i/ili teške lance antitela). U sledećem otelotvorenju, obezbeđen je jedan ili više vektora (npr., ekspresionih vektora) koji sadrže takvu nukleinsku kiselinu. U sledećem otelotvorenju, obezbeđena je ćelija domaćin koja sadrži takvu nukleinsku kiselinu. U jednom takvom otelotvorenju, ćelija domaćin sadrži (npr., transformisana je sa): (1) vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL antitela, i aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela, ili (2) prvi vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL antitela, i drugi vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela. U jednoj realizaciji, ćelija domaćin je eukariotska, npr. ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO) ili limfoidna ćelija (npr., Y0, NS0, Sp20 ćelija). U jednom otelotvorenju, obezbeđen je postupak za proizvodnju antihumanog
4
alfa-sinukleinskog antitela, pri čemu postupak obuhvata uzgajanje ćelije domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo, kao što je prethodno dato, u uslovima koji su pogodni za ekspresiju antitela i, eventualno, izolovanje antitela iz ćelije domaćina (ili medijuma za uzgajanje ćelija domaćina).
Za rekombinantnu proizvodnju antihumanog alfa-sinukleinskog antitela, nukleinska kiselina koja kodira antitelo, npr. kako je gore opisano, izoluje se i ubacuje u jedan ili više vektora radi daljeg kloniranja i/ili ekspresije u ćeliji domaćina. Takva nukleinska kiselina može biti lako izolovana i sekvencirana korišćenjem klasičnih postupaka (npr. korišćenjem oligonukleotidnih sondi koje su sposobne da se selektivno vežu za gene koji kodiraju teške i lake lance antitela).
Pogodne ćelije domaćini za kloniranje ili ekspresiju vektora koji kodiraju antitelo uključuju prokariotske ili eukariotske ćelije, ovde opisane. Na primer, antitela se mogu proizvesti u bakteriji, naročito kada nije neophodna glikozilacija niti Fc efektorska funkcija. Za ekspresiju fragmenata antitela i polipeptida u bakterijama, videti npr., US5,648,237, US5,789,199 i US5,840,523. (Videti takođe Charlton, KA, u: Methods in Molecular Biology, sveska 248, Lo, B.K.C. (izd.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), str.245-254, gde je opisana ekspresija fragmenata antitela u E. coli.) Nakon ekspresije, antitelo može da se izoluje iz paste bakterijskih ćelija u rastvorljivoj frakciji, i može dalje da se prečišćava.
Osim prokariota, eukariotski mikrobi, kao što su filamentozne gljivice ili kvasci, pogodni su domaćini za kloniranje ili ekspresiju za vektore koji kodiraju antitelo, uključujući sojeve gljivica i kvasaca čiji su putevi glikozilacije "humanizovani", što dovodi do stvaranja antitela sa delimično ili potpuno humanim glikozilacionim obrascem. Vidite Gemgross, T.U., Nat. Biotech.22 (2004) 1409-1414; i Li, H. i sar. Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215.
Pogodne ćelije domaćini za ekspresiju glikozilovanog antitela su takođe izvedene od višećelijskih organizama (beskičmenjaka i kičmenjaka). Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata. Identifikovani su brojni sojevi bakulovirusa koji mogu da se koriste zajedno sa ćelijama insekata, naročito za transfekciju ćelija Spodoptera frugiperda.
Kulture biljnih ćelija se, takođe, mogu koristiti kao domaćini. Videti, npr., US5,959,177, US6,040,498, US6,420,548, US7,125,978 i US6,417,429 (opisuju PLANTIBODIES™ tehnologiju za proizvodnju antitela u transgenim biljkama).
Ćelije kičmenjaka se, slično tome, mogu upotrebiti kao domaćini. Na primer, mogu se koristiti ćelijske linije sisara koje su adaptirane za rast u suspenziji. Drugi primeri ćelijskih linija sisara koje se koriste kao domaćini su: CV1 linija bubrega majmuna transformisana pomoću SV40 (COS-7); bubrežna linija humanog embriona (293 ili 293 ćelije su opisane, npr.
4
u Graham, F.L. i sar. J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74); bubrežne ćelije bebe hrčka (BHK); mišje sertolijeve ćelije (TM4 ćelije su opisane, npr. u Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252); ćelije bubrega majmuna (CV1); ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76); ćelije humanog karcinoma cerviksa (HELA); bubrežne ćelije psa (MDCK; ćelije jetre bufalo pacova (BRL3A); ćelije pluća čoveka (W138); ćelije jetre čoveka (Hep G2); mišji tumor dojke (MMT 060562); TRI ćelije, kako su opisane, npr. u Mather, J.P. i sar. Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68; MRC5 ćelije; i FS4 ćelije. Druge korisne ćelijske linije domaćina sisara uključuju ćelije ovarijuma kineskog hrčka (CHO), uključujući DHFR<->CHO ćelije (Urlaub, G. i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220); i ćelijske linije mijeloma poput Y0, NS0 i Sp2/0. Za pregled izvesnih ćelijskih linija domaćina sisara, pogodnih za proizvodnju antitela, vidite, npr. Yazaki, P. i Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, sveska 248, Lo, B.K.C. (izd.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), str.255-268.
C. Testovi
Antihumana alfa-sinukleinska antitela koja su ovde data mogu se identifikovati, pretražiti ili okarakterisati prema svojim fizičkim/hemijskim svojstvima i/ili biološkoj aktivnosti, putem različitih testova poznatih u struci.
1. Testovi vezivanja i drugi testovi
U jednom aspektu, antitelo predmetnog pronalaska je ispitano da bi se odredila njegova antigen vezujuća aktivnost, npr., poznatim postupcima kao što je ELISA, alfaLISA, vestern blot, niz antitela ili reversnofazni niz, itd.
U primeru ELISA ili alfaLISA testa, alfa-sinuklein u rastvoru (ćelijski supernatant, lizati ćelija ili tkiva, telesne tečnosti, itd.) se vezuje antitelom za hvatanje, koje se specifično vezuje za prvi epitop na alfa-sinukleinu, ili alfa-sinuklein u određenoj konformaciji i antitelo za detekciju povezano sa entitetom za detekciju, koji se specifično vezuje za drugi epitop ili konformaciju alfa-sinukleina. Očitavanje se temelji na entitetu za detekciju (hemiluminescencija, fluorescencija, luminescencija indukovana prenosom energije, itd.). U nekim slučajevima, isto antitelo može da se upotrebi u istom testu kao antitelo za hvatanje i detekciju, za otkrivanje agregiranih oblika alfa-sinukleina (videti npr. Tokuda, T. i sar. Neurology 75 (2010) 1766-1772).
U slučaju niza antitela, antitela se primećuju na staklenim ili nitroceluloznim čipovima. Slajdovi se blokiraju i inkubiraju sa rastvorom koji sadrži alfa-sinuklein, ispiraju kako bi se uklonila nevezana antitela, a vezana antitela se detektuju fluorescentno označenim odgovarajućim sekundarnim antitelom. Signal fluorescencije se meri pomoću skenera za fluorescentne slajdove. Slično kao kod reversnofaznog niza, rekombinantni alfa-sinuklein,
4
ćelijski supernatant, lizati ćelija ili tkiva, telesne tečnosti, itd. se primećuju na staklenim ili nitroceluloznim čipovima. Slajdovi se blokiraju i pojedinačni nizovi se inkubiraju sa antitelom na specifični epitop na alfa-sinukleinu. Nevezana antitela se ispiraju, a vezana antitela se detektuju pomoću fluorescentno obeleženog odgovarajućeg sekundarnog antitela. Signal fluorescencije se meri pomoću skenera za fluorescentne slajdove (Dernick, G., i sar. J. Lipid Res.52 (2011) 2323-2331).
U primeru za vestern blot, agregirani rekombinantni alfa-sinuklein ili alfa-sinuklein dobijen iz ćelijskog supernatanta, lizata ćelija ili tkiva, telesnih tečnosti, itd. se odvaja prema molekulskoj masi u uslovima SDS PAGE ili nativnog gela i blotuje se na nitroceluloznu ili PVDF membranu. Nakon blokiranja, membrana se inkubira sa antitelima specifičnim za aminokiselinsku sekvencu ili konformacije alfa-sinukleina. Nakon toga, membrana se ispira radi uklanjanja nevezanog antitela. Vezana antitela se detektuju odgovarajućim sekundarnim antitelima povezanim sa entitetima za detekciju hemiluminiscencije ili fluorescencije ili drugim sredstvima detekcije. Antitela specifična za aminokiselinske sekvence alfa-sinukleina vezaće se za alfa-sinuklein u različitim agregatnim oblicima i sa različitim molekulskim masama sve dok epitop ne bude maskiran agregacijom. Sa druge strane, antitela specifična za konformaciju će detektovati samo određene agregirane oblike alfa-sinukleina otkrivajući samo trake sa određenim molekulskim masama (vidite, npr. Towbin, H., i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) 4350-4353; Burnette, W.N., Anal. Biochem. 112 (1981) 195-203).
U drugom aspektu, mogu se koristiti kompetitivni testovi za identifikovanje antitela koje se takmiči sa antitelom 0017, antitelom 0018 ili antitelom 0081 u vezivanju za humani alfa-sinuklein. U određenim otelotvorenjima, takvo konkurentsko antitelo se vezuje za isti epitop (npr. linearni ili konformacioni epitop) za koji se vezuje antitelo, kao što je objavljeno ovde, kao što je antitelo 0017, antitelo 0018 i antitelo 0081. Detaljni primeri postupaka za mapiranje epitopa na koje se antitelo vezuje su dati u Morris, G.E. (izd.), Epitope Mapping Protocols, u: Methods in Molecular Biology, tom 66, Humana Press, Totowa, NJ (1996).
U primeru kompetitivnog testa, imobilisani humani alfa-sinuklein je inkubiran u rastvoru koji sadrži prvo obeleženo antitelo koje se vezuje za humani alfa-sinuklein (npr. antitelo 0017, antitelo 0018 ili antitelo 0081) i drugo neobeleženo antitelo, čija sposobnost takmičenja sa prvim antitelom u pogledu vezivanja za humani alfa-sinuklein se ispituje. Kao kontrola, imobilisani humani alfa-sinuklein je inkubiran u rastvoru koji sadrži prvo obeleženo antitelo, ali ne i drugo neobeleženo antitelo. Nakon inkubacije, u uslovima koji dopuštaju vezivanje prvog antitela za humani alfa-sinuklein, višak nevezanog antitela se uklanja, i meri se količina obeleživača vezanog za imobilisani humani alfa-sinuklein. Ako je količina
4
obeleživača vezanog za imobilisani humani alfa-sinuklein u ispitivanom uzorku značajno smanjena u odnosu na kontrolni uzorak, to ukazuje da se drugo antitelo takmiči sa prvim antitelom u pogledu vezivanja za humani alfa-sinuklein (vidite npr. Harlow, E. i Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Poglavlje 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988)).
2. Testovi za merenje aktivnosti
U jednom aspektu, dati su testovi za identifikaciju antihumanih alfa-sinukleinskih antitela koja imaju biološku aktivnost. Biološka aktivnost može uključivati, npr. zaštitu od/smanjenje/inhibiciju citotoksičnosti indukovane putem alfa-sinukleina i/ili zaštitu od/smanjenje/inhibiciju transfera oligomernog humanog alfa-sinukleina sa ćelije na ćeliju, i/ili smanjenje aktivnosti kaspaze indukovane alfa-sinukleinom u ljudskim neuronskim ćelijama. Antitela koja imaju takvu biološku aktivnost in vivo i/ili in vitro takođe su obezbeđena.
U pojedinim realizacijama, antitelo predmetnog pronalaska je ispitano na takvu biološku aktivnost.
Zaštitna biološka aktivnost se može proceniti dodavanjem kondicioniranog medijuma koji sadrži sekretovani alfa-sinuklein, koji izaziva ćelijsku smrt neuronskih ćelija primaoca. Ova toksičnost se može preokrenuti dodavanjem zaštitnih antitela, kao što je ovde opisano. Toksična priroda sekretovanog alfa-sinukleina je prethodno ustanovljena (Emmanouilidou, E., i sar. J. Neurosci., 30 (2010) 6838-6851).
D. Postupci i kompozicije za dijagnostiku i detektovanje
U pojedinim otelotvorenjima, svako od anti-humanih alfa-sinukleinskih antitela koja su ovde data je korisno za detektovanje prisustva humanog alfa-sinukleina u biološkom uzorku. Termin "detekcija" kako se ovde koristi obuhvata kvantitativnu ili kvalitativnu detekciju. U pojedinim otelotvorenjima, biološki uzorak uključuje ćeliju ili tkivo, kao što je moždano tkivo.
U jednom otelotvorenju, dato je antihumano alfa-sinukleinsko antitelo za primenu u postupcima za dijagnozu ili detekciju. U sledećem aspektu, dat je postupak za detekciju prisustva humanog alfa-sinukleina u biološkom uzorku. U pojedinim otelotvorenjima, postupak obuhvata kontakt biološkog uzorka sa antihumanim alfa-sinukleinskim antitelom, kao što je ovde opisano, pod uslovima koji dopuštaju vezivanje antihumanog alfasinukleinskog antitela za humani alfa-sinuklein, i detektovanje nastajanja kompleksa između antihumanog talfa-sinukleinskog antitela i humanog alfa-sinukleina. Takav postupak može biti in vitro ili in vivo postupak. U jednom otelotvorenju, antihumano alfa-sinukleinsko
4
antitelo je upotrebljeno da se izabere ispitanik podoban za terapiju antihumanim alfasinukleinskim antitelom, npr. kada je humani alfa-sinuklein biomarker za izbor pacijenata.
Primeri poremećaja koji se mogu dijagnostikovati primenom antitela predmetnog pronalaska uključuju neurodegeneraciju sa akumulacijom gvožđa u mozgu tipa 1 (NBIA1), čistu autonomnu insuficijenciju, Daunov sindrom, guamski kompleks i nekoliko poremećaja Levijevih tela, poput difuzne bolesti Levijevih tela (DLBD), varijante Levijevog tela kod Alchajmerove bolesti (LBVAD), određenih oblika Gošeove bolesti i demencije kod Parkinsonove bolesti (PDD).
U pojedinim otelotvorenjima, data su obeležena antihumana anti-sinukleinska antitela. Oznake uključuju, ali nisu ograničene na, oznake ili ostatke koji se detektuju direktno (kao što su fluorescentne, hromoforne, elektronski nepropusne, hemiluminescentne i radioaktivne oznake), kao i funkcionalne ostatke, kao što su enzimi ili ligandi, koji se detektuju indirektno, npr. putem enzimske reakcije ili molekulske interakcije. Primeri oznaka uključuju, ali se ne ograničavaju na radioizotope<32>P,<14>C,<125>I,<3>H, i<131>I, fluorofore, kao što su helati retkih zemalja ili fluorescein i njegovi derivati, rodamin i njegovi derivati, dansil, umbeliferon, luceriferaze, npr. luciferaza svica i bakterijska luciferaza (US4,737,456), luciferin, 2,3-dihidroftalazindioni, peroksidaza rena (HRP), alkalna fosfataza, β-galaktozidaza, glukoamilaza, lizozim, saharid oksidaze, npr. glukoza oksidaza, galaktoza oksidaza i glukoza-6-fosfat dehidrogenaza, heterociklične oksidaze, kao što je urikaza i ksantin oksidaza, vezane sa enzimom koji koristi vodonik peroksid za oksidaciju prekursora boje, kao što je HRP, laktoperoksidaza ili mikroperoksidaza, biotin/avidin, spin oznake, oznake bakteriofagi, stabilni slobodni radikali, i slično.
E. Farmaceutske formulacije
Farmaceutske formulacije anti-humanog alfa-sinukleinskog antitela, prema opisu iz ovog dokumenta, pripremaju se mešanjem takvog antitela koje ima željeni stepen čistoće sa jednim farmaceutski prihvatljivim nosačem ili više takvih opcionih nosača (Remington's Pharmaceutical Sciences 16. izdanje, Osol, A. (izd.) (1980)), u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora. Farmaceutski prihvatljivi nosači su uglavnom netoksični za primaoca u primenjenim dozama i koncentracijama i uključuju, bez ograničenja: pufere, kao što je fosfatni, citratni, i puferi drugih organskih kiselina; antioksidanse, uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što je oktadecil dimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabene, kao što je metil ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide male molekulske mase (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što je albumin iz seruma, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere, kao što je poli(vinilpirolidon); aminokiseline, kao što je glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatne agense, kao što je EDTA; šećere, kao što je saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontrajone koji grade soli, kao što je natrijum; metalne komplekse (npr. kompleksi Zn-protein); i/ili nejonske surfaktante, kao što je polietilen glikol (PEG). Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača ovde dalje uključuju agense za intersticijalnu disperziju lekova, kao što su rastvorljivi neutralno aktivni glikoproteini hijaluronidaze (sHASEGP), na primer, humani rastvorljivi PH-20 glikoproteini hijaluronidaze, kao što je rhuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Pojedine primere sHASEGP i postupke primene, uključujući rhuPH20, opisuje US2005/0260186 i US2006/0104968. U jednom aspektu, sHASEGP se kombinuje sa jednom ili više dodatnih glikozaminoglikanaza, kao što je hondroitinaza.
Primeri liofilizovanih formulacija antitela su opisani u US6,267,958. Vodene formulacije antitela uključuju one opisane u US6,171,586 i WO2006/044908, pri čemu ove druge formulacije uključuju histidin-acetatni pufer.
Formulacija ovde može takođe da sadrži više od jednog aktivnog sastojka, kao što je neophodno za naročitu indikaciju koja se leči, poželjno one sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču negativno jedna na drugu. Na primer, može biti poželjno da se dalje obezbede [[navesti lekove koji se mogu kombinovati sa anti-humanim alfasinukleinskim antitelom]]. Takvi aktivni sastojci su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za nameravane svrhe.
Aktivni sastojci mogu biti zarobljeni u pripremljenim mikrokapsulama, na primer, tehnikom koacervacije ili interfacijalne polimerizacije, na primer, hidroksimetilceluloze, odnosno želatinskih mikrokapsula, odnosno mikrokapsula poli(metilmetakrilata), u koloidnim sistemima za isporuku lekova (na primer, lipozomi, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su objavljene u Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. izdanje, Osol A. (izd.) (1980).
Mogu se pripremiti preparati sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju polupropustljive matrice čvrstih hidrofobnih polimera koje sadrže antitelo, a te matrice su u određenom obliku, npr. film ili mikrokapsule.
Formulacije za primenu in vivo generalno su sterilne. Sterilnost se može lako postići, npr. filtracijom kroz sterilne filtracione membrane.
F. Postupci lečenja i kompozicije
1
Svako od anti-humanih alfa-sinukleinskih antitela koja su ovde data može biti upotrebljeno u postupcima lečenja.
U jednom aspektu, obezbeđeno je antihumano alfa-sinukleinsko antitelo da se koristi kao lek. U daljim aspektima, obezbeđeno je antihumano alfa-sinukleinsko antitelo da se koristi u lečenju Parkinsonove bolesti. U pojedinim otelotvorenjima, obezbeđeno je antihumano alfa-sinukleinsko antitelo za primenu u postupku lečenja. U pojedinim otelotvorenjima, pronalazak obezbeđuje antihumano alfa-sinukleinsko antitelo za primenu u postupku lečenja pojedinca koji ima Parkinsonovu bolest, koji obuhvata primenu na pojedincu efikasne količine antihumanog alfa-sinukleinskog antitela. U jednom takvom otelotvorenju, postupak dalje uključuje davanje pojedincu efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, npr. kao što je opisano u nastavku. U daljim otelotvorenjima, pronalazak obezbeđuje antihumano alfa-sinukleinsko antitelo za primenu u inhibiciji citotoksičnosti indukovane putem alfa-sinukleina u ljudskim neuronima i glijalnim ćelijama, ili inhibiciji prenosa oligomernog humanog alfa-sinukleina sa ćelije na ćeliju između neurona i glijalnih ćelija, ili smanjenju aktivnosti kaspaze indukovane putem alfa-sinukleina. U nekim otelotvorenjima, pronalazak obezbeđuje antihumano alfa-sinukleinsko antitelo za primenu u postupku inhibicije citotoksičnosti indukovane putem alfa-sinukleina u ljudskim neuronima i glijalnim ćelijama, ili inhibicije prenosa oligomernog humanog alfa-sinukleina sa ćelije na ćeliju između neurona i glijalnih ćelija, ili smanjenja aktivnosti kaspaze indukovane putem alfa-sinukleina kod pojedinca, uključujući davanje pojedincu efikasne količine anti-humanog alfa-sinukleinskog antitela za inhibiciju citotoksičnosti indukovane putem alfa-sinukleina u ljudskim neuronima i glijalnim ćelijama ili inhibiciju prenosa oligomernog humanog alfasinukleina sa ćelije na ćeliju između neurona i glijalnih ćelija, ili smanjenje aktivnosti kaspaze indukovane putem alfa-sinukleina. "Pojedinac" prema svakom od gornjih otelotvorenja je poželjno čovek.
U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje upotrebu antihumanog alfa-sinukleinskog antitela u proizvodnji ili pripremi leka. U jednom otelotvorenju, lek je namenjen za lečenje Parkinsonove bolesti. U daljem otelotvorenju, lek je predviđen za upotrebu u postupku lečenja Parkinsonove bolesti koji uključuje davanje efikasne količine leka pojedincu koji ima Parkinsonovu bolest. U jednom takvom otelotvorenju, postupak dalje uključuje davanje pojedincu efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, npr. kao što je opisano u nastavku. U daljem otelotvorenju, lek je namenjen za inhibiciju citotoksičnosti indukovane putem alfa-sinukleina u ljudskim neuronima i glijalnim ćelijama, ili inhibiciju prenosa oligomernog humanog alfa-sinukleina sa ćelije na ćeliju između neurona i glijalnih
2
ćelija, ili smanjenje aktivnosti kaspaze indukovane putem alfa-sinukleina. U daljem otelotvorenju, lek je predviđen za primenu u postupku inhibicije citotoksičnosti indukovane putem alfa-sinukleina u ljudskim neuronima i glijalnim ćelijama, ili inhibicije prenosa oligomernog humanog alfa-sinukleina sa ćelije na ćeliju između neurona i glijalnih ćelija, ili smanjenja aktivnosti kaspaze indukovane putem alfa-sinukleina kod pojedinca koji uključuje davanje pojedincu efikasne količine leka za inhibiciju citotoksičnosti indukovane putem alfasinukleina u ljudskim neuronima i glijalnim ćelijama ili inhibiciju prenosa oligomernog humanog alfa-sinukleina sa ćelije na ćeliju između neurona i glijalnih ćelija, ili smanjenje aktivnosti kaspaze indukovane putem alfa-sinukleina. "Pojedinac" prema bilo kom od gornjih otelotvorenja može biti čovek.
U daljem aspektu, pronalazak daje farmaceutske formulacije koje sadrže bilo koje od ovde datih anti-humanih alfa-sinukleinskih antitela, npr. za primenu u bilo kom od gorenavedenih terapeutskih postupaka. U jednom otelotvorenju, farmaceutska formulacija sadrži bilo koje od ovde datih antihumanih alfa-sinukleinskih antitela i farmaceutski prihvatljiv nosač. U drugom otelotvorenju, farmaceutska formulacija sadrži bilo koje od ovde datih anti-humanih alfa-sinukleinskih antitela, i najmanje jedno dodatno lekovito sredstvo, npr. kao što je opisano u nastavku.
Antitela iz pronalaska se mogu koristiti ili sama ili u kombinaciji sa drugim agensima u terapiji. Na primer, antitelo predmetnog pronalaska može biti primenjeno uz najmanje jedan dodatni terapeutski agens.
Takve kombinovane terapije koje su gore pomenute obuhvataju kombinovanu primenu (gde su dva ili više terapeutskih agenasa obuhvaćeni istom formulacijom, ili različitim formulacijama), i odvojenu primenu, u kom slučaju primena antitela predmetnog pronalaska može da se odigra pre primene dodatnog terapeutskog agensa i/ili agenasa, istovremeno sa njim i/ili nakon njegove primene. U jednom otelotvorenju, primena antihumanog alfa-sinukleinskog antitela i primena dodatnog terapeutskog agensa se dešavaju približno u roku od jednog meseca, ili približno u roku od jedne, dve ili tri nedelje, ili približno u roku od jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest dana, jedna od druge.
Antitelo predmetnog pronalaska (i svaki dodatni terapeutski agens) može biti primenjeno bilo kojim pogodnim postupkom, uključujući parenteralnu, intrapulmonarnu i intranazalnu, i, ako se želi za lokalno lečenje, intralezionu primenu. Parenteralne infuzije uključuju intramuskularnu, intravensku, intraarterijsku, intraperitonealnu ili supkutanu primenu. Doziranje može biti bilo kojim prikladnim načinom, npr. putem injekcija, kao što su intravenske ili supkutane injekcije, što delimično zavisi od toga da li je primena kratkotrajna ili hronična. Ovde su razmatrani različiti rasporedi doziranja uključujući, bez ograničenja, pojedinačnu ili višestruku primenu u različitim terminima, bolusnu primenu i pulsnu infuziju.
Antitela iz predmetnog pronalaska biće formulisana, dozirana i primenjena u skladu sa dobrom lekarskom praksom. Faktori za razmatranje u ovom kontekstu uključuju konkretni poremećaj koji se leči, konkretnog sisara koji se leči, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto isporuke agensa, postupak primene, raspored primene i druge faktore poznate lekarima. Antitelo ne mora da bude, ali je opciono formulisano sa jednim ili više agenasa koji se trenutno primenjuju za sprečavanje ili lečenje poremećaja o kome se radi. Efikasna količina takvih drugih agenasa zavisi od količine antitela prisutnog u formulaciji, vrste poremećaja ili lečenja, kao i drugih faktora koji su razmatrani u gornjem tekstu. Oni se generalno koriste u istim dozama i sa istim načinom primene kao što je gore opisano, ili od oko 1 do 99% doza koje su ovde opisane, ili u bilo kojoj dozi i sa bilo kojim načinom primene za koje je empirijski/klinički dokazano da su odgovarajući.
Za prevenciju ili lečenje bolesti, odgovarajuća doza antitela predmetnog pronalaska (kada se koristi samostalno ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih dodatnih terapeutskih agenasa) zavisiće od vrste bolesti koja se leči, vrste antitela, težine i toka bolesti, bilo da se antitelo primenjuje u preventivne ili terapeutske svrhe, kao i od prethodne terapije, kliničke istorije pacijenta i njegovog odgovora na antitelo, kao i odluke nadležnog lekara. Antitelo se pogodno primenjuje na pacijentu jednokratno, ili kao serija terapija. U zavisnosti od vrste i težine bolesti, oko 1 µg/kg do 15 mg/kg (npr. 0,5 mg/kg-10 mg/kg) antitela može biti kandidat za početnu dozu za primenu na pacijentu, na primer, bilo kao jedna ili više odvojenih primena, ili kao kontinualna infuzija. Jedna tipična dnevna doza može biti u opsegu od oko 1 µg/kg do 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od gore pomenutih faktora. Kod ponovljene primene tokom nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje će generalno biti nastavljeno sve do željenog suzbijanja simptoma bolesti. Doza antitela navedena kao primer bila bi u opsegu od oko 0,05 mg/kg do oko 10 mg/kg. Stoga jedna ili više doza od oko 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ili 10 mg/kg (ili bilo koja njihova kombinacija) može se dati pacijentu. Takve doze mogu se primenjivati povremeno, npr, svake nedelje ili svake tri nedelje (npr. tako da pacijent primi od oko dve do oko dvadeset, ili npr. oko šest doza antitela). Može se primeniti veća početna doza, a nakon toga jedna ili više manjih doza. Međutim, mogu biti korisni i drugi dozni režimi. Napredak ove terapije jednostavno se prati klasičnim tehnikama i testovima. Podrazumeva se da bilo koja od gorenavedenih formulacija ili terapeutskih postupaka može biti izvedena uz upotrebu imunokonjugata iz pronalaska umesto antihumanog alfa-sinukleinskog antitela ili kao
4
njegovog dodatka.
III. Proizvodi
U drugom aspektu pronalaska, obezbeđen je proizvod koji sadrži materijale korisne u lečenju, prevenciji i/ili dijagnostikovanju prethodno opisanih poremećaja. Proizvod uključuje pakovanje i etiketu ili uputstvo za upotrebu, na pakovanju ili uz njega. Pogodno pakovanje uključuje, na primer, boce, bočice, špriceve, kese za IV rastvor, itd. Pakovanje može biti izrađeno od različitih materijala, kao što je staklo ili plastika. Pakovanje sadrži kompoziciju koja je sama po sebi ili u kombinaciji sa drugom kompozicijom efikasna u lečenju, prevenciji i/ili dijagnostikovanju stanja, i može imati priključak za sterilni pristup (na primer, pakovanje može biti kesa za intravenski rastvor ili bočica sa zapušačem koji može da se probuši iglom za potkožnu injekciju). Najmanje jedan aktivni agens u kompoziciji je antitelo predmetnog pronalaska. Oznaka ili uputstvo za upotrebu ukazuje na to da se kompozicija koristi za lečenje stanja po izboru. Pored toga, proizvod može da sadrži (a) prvo pakovanje sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, pri čemu kompozicija sadrži antitelo predmetnog pronalaska; i (b) drugo pakovanje sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, pri čemu kompozicija sadrži dodatni citotoksični ili drugi terapeutski agens. Proizvod u ovom otelotvorenju predmetnog pronalaska može dalje da sadrži uputstvo za upotrebu koje ukazuje da kompozicija može da se koristi za lečenje specifičnog stanja. Alternativno, ili pored toga, proizvod može dalje da uključuje drugo (ili treće) pakovanje koje sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Može dalje da obuhvati druge materijale poželjne sa komercijalnog i aspekta upotrebe, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.
Podrazumeva se da svaki od gorepomenutih proizvoda može da sadrži imunokonjugat predmetnog pronalaska umesto ili pored antihumanog alfa-sinukleinskog antitela.
IV. PRIMERI
Podrazumeva se da mogu biti primenjena razna druga otelotvorenja, na osnovu opšteg opisa koji je gore dat.
Materijali i postupci
Tehnike rekombinantne DNK
Standardni postupci su korišćeni za manipulaciju DNK, kao što je opisano u Sambrook, J. i sar. Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Reagensi za molekularnu biologiju su korišćeni prema uputstvu proizvođača.
Sinteza gena i oligonukleotida
Željeni segmenti gena su pripremljeni hemijskom sintezom u kompaniji Geneart GmbH (Regensburg, Nemačka). Sintetisani fragmenti gena su klonirani u plazmidu E. coli za propagaciju/amplifikaciju. DNK sekvence subkloniranih genskih fragmenata su proverene sekvenciranjem DNK. Alternativno, kratki sintetički fragmenti DNK su sakupljeni žarenjem hemijski sintetisanih oligonukleotida ili putem PCR-a. Odgovarajuće oligonukleotide je pripremila kompanija metabion GmbH (Planegg-Martinsried, Nemačka)
Reagensi
Sve komercijalne hemikalije, antitela i kompleti su korišćeni prema protokolu proizvođača, ako nije drugačije naznačeno.
Ćelijski klonovi
antitelo 0017 = ASYN-233HC_110-IV = aSyn.S019.006A08
antitelo 0018 = ASYN-064HC_110-II = aSyn.S003.006A11
antitelo 0081 = ASYN-235HC_110-IV = aSyn.S019.005A08
antitelo 0070 = antitelo 0017 modul za transport kroz krvno-moždanu barijeru antitelo 0076 = antitelo 0018 modul za transport kroz krvno-moždanu barijeru Primer 1
Priprema antigena
Materijali
Proteini:
- liofilizovani alfa-sinuklein divljeg tipa (100 µg, 200 µg ili 500 µg alikvoti);
- humani mutantni TP alfa-sinuklein (8,2 mg/ml, dijaliziran u 50 mM HEPES/100 mM NaCl)
Puferi i rastvori (čuvaju se na sobnoj temperaturi i štite od neposrednog izlaganja sunčevoj svetlosti):
- Osnovni PB (5x): 250 mM fosfatni pufer, pH 7,0 (filtrirano 0,22 µm)
- Osnovni EtOH: etanol apsolutnog kvaliteta za analizu (EMSURE) (Merck; kat. br.
1.00989.1000)
- Voda kvaliteta za HPLC (LiChrosolv, Merck)
- 50 mM HEPES/100 mM NaCl, pH 7,4 (filtrirano 0,22 µm)
- TBS (50 mM Tris/100 mM NaCl) pH 7,0 (filtrirano 0,22 µm)
- BioPORTER reagens za isporuku proteina (Genlantis, kat. br. BP502424) Priprema A1-oligomera
Za referencu vidite Danzer, K.M., i sar. J. Neurosci. 27 (2007) 9220-9232, i Danzer, K.M., i sar. J. Neurochem. 111 (2009) 192-203.
Liofilizovani alfa-sinuklein je rastvoren u HPLC vodi radi dobijanja rastvora oko 70 µM u alfa-sinukleinu (100 µl po 100 µg proteina). Rastvor je tokom 30 s podvrgnut ultrazvuku u ultrazvučnom vodenom kupatilu pomoću uređaja za plutanje. Nakon toga je dodato 500 µl vode HPLC kvaliteta, 200 µl 250 mM PB pH 7,0, 200 µl apsolutnog EtOH za analizu. Smeša je vrtložno mešana tokom 10 sekundi punom brzinom. Nakon toga, dobijen je 100 µg/ml alfa-sinukleinski rastvor u 50 mM PB pH 7,0/20% etanolu. Za referentni uzorak, isti puferi su pomešani u odsustvu alfa-sinukleina. Reakciona smeša je mešana uz trešenje 4 h u mešalici nutator na sobnoj temperaturi. Nakon trešenja, rastvori su zamrznuti na suvom ledu i odmah liofilizovani. Liofilizacija je izvedena preko noći na sobnoj temperaturi pod stalnim centrifugiranjem (npr. u uređaju Speedvac). Liofilizat je ponovo suspendovan u 0,5 ml 50 mM PB pH 7,0 sa 10% etanola. Etanol je uparen na 20-21°C tokom 24 h u kapeli sa otvorenim poklopcem (Eppendorf Thermomixer 5436, brzina 5). Nakon toga, poklopac je zatvoren i trešenje je nastavljeno na sobnoj temperaturi tokom 6 dana. A1-oligomeri su koncentrovani do 1 mg/ml pomoću Vivaspin 500 (presek na 30 kD) i sakupljeni za imunizaciju. Za dugotrajno skladištenje, oligomeri su čuvani na -80°C. Kontrola kvaliteta za pravilno formiranje oligomera obavljena je pomoću SDS-PAGE i EM.
Priprema Cl-oligomera
Za referencu vidite Danzer, K.M., i sar. J. Neurosci. 27 (2007) 9220-9232, i Danzer, K.M., i sar. J. Neurochem. 111 (2009) 192-203.
Liofilizovani alfa-sinuklein je rastvoren u vodi HPLC kvaliteta radi dobijanja rastvora sa koncentracijom od oko 70 µM (100 µl po 100 µg proteina). Rastvor je tokom 30 s podvrgnut ultrazvuku u ultrazvučnom vodenom kupatilu pomoću uređaja za plutanje. Nakon toga je dodato 500 µl vode HPLC kvaliteta, 200 µl 250 mM PB pH 7,0, 200 µl apsolutnog etanola za analizu. Smeša je vrtložno mešana tokom 10 sekundi punom brzinom. Dobijeni su rastvori 100 µg/ml alfa-sinukleina u 50 mM PB pH 7,0/20% etanolu. Za kontrolne uzorke, isti puferi su pomešani bez alfa-sinukleina. Rastvori su mućkani 16 sati na sobnoj temperaturi na mešalici nutator (npr. preko noći). CI-oligomeri su koncentrovani do 1 mg/ml pomoću Vivaspin 500 (presek na 30 kD) i sakupljeni za imunizaciju. Za dugotrajno skladištenje, oligomeri su čuvani na -80°C. Kontrola kvaliteta za pravilno formiranje oligomera obavljena je pomoću SDS-PAGE i EM.
Priprema TP mutantnih alfa-sinukleinskih oligomera
Prilagođeno iz Karpinar, D.P., i sar. EMBO J.28 (2009) 3256-3268.
Alikvoti od 100 µl 8,2 mg/ml (oko 590 mM) TP alfa-sinukleina u 50 mM HEPES/100 mM NaCl pH 7,4 su mešani sa 2 x 5 mm mikro magnetskom mešalicom na 37 °C (200 o/min) 6 dana. Kontrola kvaliteta za pravilno formiranje oligomera obavlja se pomoću SDS-PAGE i EM.
Formiranje alfa-sinukleinskih fibrila i mešanje sa BioPORTER
Prilagođeno iz Luk, K.C., i sar. Biochem. 46 (2007) 12522-12526, i Luk, K.C., i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106 (2009) 20051-20056.
Liofilizovani i vakuumirani alikvot alfa-sinukleina (sa -80°C) doveden je na sobnu temperaturu (RT) tokom 10-15 minuta bez otvaranja vakuumirane kese. U međuvremenu je orbitalni šejker za epruvete prethodno zagrejan na 37 °C. Nakon toga je otvorena kesa sa epruvetama i po potrebi su obrisane kapljice vode sa spoljašnje strane epruvete. 100 µg liofilizovanog alfa-sinukleina je rastvoreno u 100 µl TBS pH 7. Epruvete su stavljene u orbitalnu mešalicu za epruvete i inkubirane su 96 h na 37 °C/1000 o/min. Nakon toga, epruveta je centrifugirana punom brzinom (20.000 g) 10 minuta na sobnoj temperaturi. Uklonjeno je 90 µl supernatanta. Pelet je ponovo suspendovan sa 90 µl svežeg TBS-a (pretpostavljena koncentracija oko 1 mg/ml). Kontrola kvaliteta za pravilno formiranje fibrila obavlja se pomoću SDS-PAGE i EM. Za dugotrajno skladištenje uzorak je čuvan na -80°C.
Malo pre imunizacije, 100 µl 1 mg/ml dobro suspendovanih fibrila dodato je u 20 µl suvog filma reagensa BioPORTER i snažno mešano vrtloženjem i ultrazvukom u vodenom kupatilu. Rastvor je inkubiran tokom 10 min na sobnoj temperaturi pre korišćenja za imunizaciju.
Primer 2
Imunizacija zečeva
Tri novozelandska bela zeca su imunizovana smešom alfa-sinukleinskih Cl oligomera, alfa-sinukleinskih fibrila i alfa-sinukleinskih TP mutantnih oligomera (400 µg svake komponente za prvu imunizaciju; 200 µg svake komponente za uzastopne imunizacije; za pripremu videti primer 1). Životinje su primale imunogen, emulgovan sa kompletnim Frojndovim adjuvansom, putem intradermalne primene 0. dana i naizmenično intramuskularnom i supkutanom primenom 7, 14, 35, 63. i 91. dana. Krv (10% procenjene ukupne količine krvi) je uzeta 21, 41, 69. i 97. dana. Pripremljen je serum koji je korišćen za određivanje titra pomoću ELISA (vidite u nastavku). Izolovane su periferne mononuklearne ćelije koje su korišćene kao izvor antigen-specifičnih B-ćelija u procesu kloniranja B-ćelija (primeri 3 i 4).
Određivanje titra u serumu
Titri su posebno određeni za svaku komponentu smeše imunogena. Alfa-sinukleinski Cl oligomeri, alfa-sinukleinski fibrili ili alfa-sinukleinski TP mutirani oligomeri su imobilisani na ploči sa 96 bunarčića NUNC Maxisorb pri 0,6 µg/ml, 100 µl/bunarčiću, u PBS-u (fiziološki rastvor puferovan fosfatom), nakon čega sledi: blokiranje ploče sa 2% CroteinC u PBS-u, 200 µl/bunarčiću; primena serijskih razblaženja antiseruma, u duplikatima, u 0,5% CroteinC u PBS-u, 100 µl/bunarčiću; detekcija sa HRP-konjugovanim (konjugovanim sa peroksidazom rena) magarećim antizečjim IgG antitelom (Jackson Immunoresearch) razblaženim 1:16.000 u 0,5% CroteinC u PBS-u, 100 µl/bunarčiću. Za sve korake, ploče su inkubirane jedan sat na 37°C. Između svih koraka, ploče su isprane tri puta sa 0,05% Tween 20 u PBS-u. Signal je razvijen dodavanjem rastvorljivog supstrata BM Blue POD (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Nemačka), 100 µl/bunarčiću, i zaustavljen dodavanjem 1 M HCl, 100 µl/bunarčiću. Apsorbanca je očitana na 450 nm, nasuprot 690 nm kao referenci. Titar je definisan kao razblaženje antiseruma koje daje polumaksimalni signal.
Primer 3
Izolovanje antihumanog alfa-sinukleinskog antitela koje proizvodi B-ćelije Izolovanje mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) zeca
Tri zeca (opisana u primeru 2) korišćena su kao izvor krvi. EDTA koji sadrži punu krv dvostruko je razblažen sa 1x PBS (fiziološki rastvor puferovan fosfatom; PAA, Pasching, Austrija) pre gradijentnog centrifugiranja pomoću medijuma lympholyte za sisare (Cedarlane Laboratories, Burlington, Ontario, Kanada) prema specifikacijama proizvođača. PBMC su dva puta isprane sa 1x PBS.
EL-4 B5 medijum
RPMI 1640 (Pan Biotech, Aidenbach, Nemačka) dopunjen sa 10% FCS-a (Hyclone, Logan, UT, SAD), 2 mM glutaminom, 1% rastvorom penicilina/streptomicina (PAA, Pasching, Austrija), 2 mM natrijum piruvatom, 10 mM HEPES (PAN Biotech, Aidenbach, Nemačka) i 0,05 mM β-merkaptoetanolom (Gibco, Paisley, Škotska).
Iscrpljivanje makrofaga/monocita
Sterilne ploče sa 6 bunarčića (čistoće za ćelijsku kulturu) koriste se za iscrpljivanje makrofaga i monocita putem nespecifične adhezije. Svaki bunarčić je bio napunjen sa maksimalno 4 ml medijuma i do 6x10<6>PBMC imunizovanog zeca i ostavljen da se veže tokom 1 h na 37°C u inkubatoru. Ćelije u supernatantu (limfociti periferne krvi (PBL)) korišćene su u koraku ispiranja antigena.
Premazivanje ploča
Ploče sa 6 bunarčića za sterilnu ćelijsku kulturu su premazane smešom dva različita humana alfa-sinukleinska oligomera (1 µg/ml C1 oligomera i 1 µg/ml TP mutantnog oligomera) u karbonatnom puferu (0,1 M natrijum bikarbonat, 34 mM dinatrijum hidrogenkarbonat, pH 9,55) preko noći na 4°C. Ploče su isprane u sterilnom PBS-u tri puta pre upotrebe.
Obogaćivanje B-ćelija na humanim alfa-sinukleinskim oligomerima
Ploče sa 6 bunarčića za kulture tkiva premazane su alfa-sinukleinskim oligomerima i zasejane sa do 6x10<6>PBL po 4 ml medijuma, i ostavljene da se vežu tokom 1 h na 37°C u inkubatoru. Nakon koraka obogaćivanja na alfa-sinukleinskim oligomerima, nevezane ćelije su uklonjene pažljivim ispiranjem bunarčića 1-2 puta sa 1x PBS-om. Preostale lepljive ćelije su odvojene tripsinom tokom 10 min na 37°C u inkubatoru. Delovanje tripsina je prekinuto pomoću medijuma EL-4 B5. Ćelije su čuvane na ledu sve do imunološkog fluorescentnog bojenja.
Imunološko fluorescentno bojenje i protočna citometrija
Konjugat anti-IgG antitela FITC (AbD Serotec, Düsseldorf, Nemačka) korišćen je za sortiranje pojedinačnih ćelija. Za površinsko bojenje, ćelije iz koraka iscrpljivanja i obogaćivanja su inkubirane sa konjugatom anti-IgG antitela FITC u PBS-u i inkubirane tokom 45 minuta. u mraku na 4°C. Nakon bojenja, PBMC su isprane dva puta ledeno hladnim PBS-om. Konačno, PBMC su ponovo suspendovane u ledeno hladnom PBS-u i smesta podvrgnute FACS analizama. Pre FACS analiza, dodat je propidijum jodid u koncentraciji od 5 µg/ml (BD Pharmingen, San Diego, CA, SAD) da bi se razlikovale mrtve i žive ćelije.
Becton Dickinson FACSAria opremljeni kompjuterom i softverom FACSDiva (BD Biosciences, SAD) korišćeni su za sortiranje pojedinačnih ćelija.
Uzgajanje B ćelija
Uzgajanje zečjih B-ćelija pripremljeno je postupkom sličnim onom koji opisuju Zubler i sar. (J. Exp. Med. 160 (1984) 1170-1183). Ukratko, pojedinačno sortirane zečje B-ćelije inkubirane su na pločama sa 96 bunarčića sa 200 µl/bunarčiću medijuma EL-4 B5 sa Pansorbin ćelijama (1:100000) (Calbiochem (Merck), Darmstadt, Nemačka), 5% supernatantom timocita zeca (šarža 20100908, interna proizvodnja) i gama-ozračenim EL-4-B5 ćelijama mišjeg timoma (2,5 x 10<4>/bunarčiću) tokom 7 dana na 37°C u atmosferi 5% CO2. Supernatanti od uzgajanja B-ćelija su uklonjeni radi ispitivanja. Paralelno, mRNK preostalih ćelija je smesta očuvana u 100 µl RLT pufera (Qiagen, Hilden, Nemačka) i lizati su zamrznuti na -80°C.
Primer 4
Određivanje varijabilnog domena antitela koji kodira nukleinske kiseline PCR amplifikacija V-domena i sekvenciranje
Ukupna RNK je pripremljena pomoću NucleoSpin 8/96 RNK kompleta (Macherey&Nagel; kat. br. 740709.4, 740698) prema protokolu proizvođača. Svi koraci su izvedeni na sistemu za rukovanje tečnostima epMotion 5075 (Eppendorf). RNK je eluirana sa 60 µl vode bez ribonukleaze. 6 µl RNK je korišćeno za stvaranje kDNK reakcijom reversne transkriptaze koristeći Superscript III First-Strand Synthesis SuperMix (Invitrogen; kat. br.
18080-400) i oligo dT-prajmer prema uputstvu proizvođača. Korišćeno je 4 µl kDNK za amplifikaciju varijabilnih regiona teškog i lakog lanca imunoglobulina (VH i VL) sa AccuPrime SuperMix (Invitrogen; kat. br. 12344-040) u konačnoj zapremini od 50 µl koristeći prajmere rbHCfinal.up
.
sledeći: vruć start na 94°C tokom 5 min; 35 ciklusa od 20 s na 94°C, 20 s na 70°C, 45 s na 68°C, i finalna ekstenzija na 68°C tokom 7 min.
Osam mikrolitara od 50 µl rastvora PCR naneto je na 48 E-Gel 2% (Invitrogen; kat. br. G8008-02). Pozitivne PCR reakcije su prečišćene korišćenjem kompleta NucleoSpin Extract II (Macherey&Nagel; kat. br. 740609250) prema protokolu proizvođača i eluirane u 50 µl elucionog pufera. 12 µl prečišćenih PCR proizvoda je sekvencirano direktno u oba smera korišćenjem rbHCfinal.up i rbHCfinal.do za teške lance i rbLCfinal.up i rbLCfinal.do za lake lance.
Primer 5
Humanizacija zečjih antihumanih alfa-sinukleinskih antitela
Zečja antihumana alfa-sinukleinska antitela mogu da se humanizuju prema standardnim tehnikama, kao što je CDR graftovanje.
Primer 6
Stvaranje rekombinantnih ekspresionih vektora
a) Stvaranje vektora za ekspresiju teških lanaca imunoglobulina pomoću konstantnog regiona mišjeg IgG1
Mišji IgG1 koji kodira fuzioni gen koji sadrži konstantni region mišjeg IgG1 (CH1, šarka, CH2, CH3) i VH domen anti-alfa sinukleinskog antitela dobijen od zeca sastavljen je fuzionisanjem fragmenta DNK koji kodira VH domen odgovarajućeg antitela specifičnog za anti-alfa sinuklein sa elementom sekvence koji kodira konstantni region mišjeg IgG1.
1
Konstantni region mišjeg IgG1 ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:
(SEQ ID NO: 46.).
Ekspresioni vektor takođe sadrži poreklo replikacije iz vektora pUC18, što omogućava replikaciju ovog plazmida u E. coli, i gen beta-laktamaze koji daje otpornost na ampicilin u E. coli.
Transkripciona jedinica teškog lanca antitela sadrži sledeće funkcionalne elemente u smeru 5' do 3':
- trenutni rani pojačivač i promoter iz humanog citomegalovirusa (P-CMV) sa intronom A,
- 5’-netranslatovani region (5’UTR) humanog teškog imunoglobulinskog lanca, - signalnu sekvencu mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca,
- varijabilni domen teškog lanca (VH) koji kodira nukleinsku kiselinu,
- konstantni region mišjeg IgG1 koji kodira nukleinsku kiselinu, i
- poliadenilacionu sekvencu goveđeg hormona rasta (BGH pA).
b) Stvaranje vektora za ekspresiju lakih lanaca imunoglobulina pomoću konstantnog regiona mišjeg Ig-kapa
Mišji kapa laki lanac koji kodira fuzioni gen koji sadrži konstantni region mišjeg Igkapa (CL-kapa) i VL (kapa) domen anti-alfa sinukleinskog antitela dobijen od zeca sastavljen je fuzionisanjem fragmenta DNK koji kodira VL (kapa) domen odgovarajućeg anti-alfasinukleinskog antitela sa elementom sekvence koji kodira konstantni region mišjeg Ig-kapa.
Konstantni region mišjeg Ig-kapa ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:
(SEQ ID NO: 47.).
Ekspresioni vektor takođe sadrži poreklo replikacije iz vektora pUC18, što omogućava replikaciju ovog plazmida u E. coli, i gen beta-laktamaze koji daje otpornost na ampicilin u E. coli.
Transkripciona jedinica kapa lakog lanca antitela sadrži sledeće funkcionalne elemente u smeru 5' do 3':
2
- trenutni rani pojačivač i promoter iz humanog citomegalovirusa (P-CMV) sa intronom A,
- 5’-netranslatovani region (5’UTR) humanog teškog imunoglobulinskog lanca, - signalnu sekvencu mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca,
- varijabilni domen lakog lanca (VL) koji kodira nukleinsku kiselinu,
- konstantni region mišjeg Ig-kapa koji kodira nukleinsku kiselinu, i
- poliadenilacionu sekvencu goveđeg hormona rasta (BGH pA).
c) Stvaranje vektora za ekspresiju lakih lanaca imunoglobulina pomoću konstantnog regiona mišjeg Ig-lambda
Mišji lambda laki lanac koji kodira fuzioni gen koji sadrži konstantni region mišjeg Ig-lambda (CL-lambda) i VL (lambda) domen anti-alfa sinukleinskog antitela dobijen od zeca sastavljen je fuzionisanjem fragmenta DNK koji kodira VL (lambda) domen odgovarajućeg anti-alfa sinukleinskog antitela sa elementom sekvence koji kodira konstantni region mišjeg Ig-lambda.
Konstantni region mišjeg Ig-lambda ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:
(SEQ ID NO: 48.).
Ekspresioni vektor takođe sadrži poreklo replikacije iz vektora pUC18, što omogućava replikaciju ovog plazmida u E. coli, i gen beta-laktamaze koji daje otpornost na ampicilin u E. coli.
Transkripciona jedinica lambda lakog lanca antitela sadrži sledeće funkcionalne elemente u smeru 5' do 3':
- trenutni rani pojačivač i promoter iz humanog citomegalovirusa (P-CMV) sa intronom A,
- 5’-netranslatovani region (5’UTR) humanog teškog imunoglobulinskog lanca, - signalnu sekvencu mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca,
- varijabilni domen lakog lanca (VL) koji kodira nukleinsku kiselinu,
- konstantni region mišjeg Ig-lambda koji kodira nukleinsku kiselinu, i
- poliadenilacionu sekvencu goveđeg hormona rasta (BGH pA).
d) Stvaranje vektora za ekspresiju lanaca imunoglobulina konjugovanih sa modulom za transport kroz krvno-moždanu barijeru
U slučaju ekspresionih vektora koji kodiraju konstrukte teškog lanca IgG, IgG deo molekula bio je u genomskoj organizaciji, tj. introni su bili prisutni u signalnom peptidu, između domena VH i CH1, između domena CH1 i regiona šarke, između regiona šarke i domena CH2, i između domena CH2 i CH3. Na njega je fuzionisan (C-terminalno/na 3' kraju) element kDNK koji kodira moždani modul za transport. Za proizvodnju molekula antitela koji imaju samo jedan moždani modul za transport po kompletnom molekulu antitela korišćena je tehnologija „dugme u rupici“.
Teški lanac sa rupicom obuhvata sledeće mutacije: T366W.
Teški lanac sa dugmetom obuhvata sledeće mutacije: T366S/L368A/Y407V.
Opciono, veštačka disulfidna veza može da se uvede između ostatka 354 teškog lanca sa rupicom i ostatka 349 teškog lanca sa dugmetom. Dodatne zahtevane mutacije su S354C u teškom lancu sa rupicom i Y349C u teškom lancu sa dugmetom.
U slučaju ekspresionih vektora koji kodiraju konstrukte lakog lanca Ig, Ig-kapa ili Iglambda deo molekula bio je u genomskoj organizaciji, tj. introni su bili prisutni u signalnom peptidu i između domena VL i CL.
Pored ekspresione jedinice/kasete u kojoj se nalazi gen koji treba da se eksprimira, osnovni/standardni ekspresioni plazmid za sisare sadrži
i) Stvaranje vektora za ekspresiju teških lanaca imunoglobulina koji sadrže modul za transport pomoću konstantnog regiona humanog IgG1 sa mutacijom „rupice“
Humani IgG1 koji kodira fuzioni gen koji sadrži konstantni region humanog IgG1 (CH1, šarka, CH2, CH3) i VH domen anti-alfa sinukleinskog antitela dobijen od zeca sastavljen je fuzionisanjem fragmenta DNK koji kodira VH domen odgovarajućeg anti-alfa sinukleinskog antitela sa elementom sekvence koji kodira konstantni region humanog IgG1 koji sadrži mutaciju „rupice“. Konstrukt je bio u genomskoj organizaciji, tj. introni su bili prisutni u signalnom peptidu, između domena VH i CH1, između domena CH1 i regiona šarke, između regiona šarke i domena CH2, i između domena CH2 i CH3.
Konstantni region humanog Ig1 ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:
(SEQ ID NO: 49.).
Konstantni region humanog Ig1 sa rupicom ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:
4
(SEQ ID NO: 50.).
Ekspresioni vektor takođe sadrži poreklo replikacije iz vektora pUC18, što omogućava replikaciju ovog plazmida u E. coli, i gen beta-laktamaze koji daje otpornost na ampicilin u E. coli.
Transkripciona jedinica teškog lanca antitela sa rupicom sadrži sledeće funkcionalne elemente u smeru 5' do 3':
- trenutni rani pojačivač i promoter iz humanog citomegalovirusa (P-CMV),
- 5’-netranslatovani region (5’UTR) humanog teškog imunoglobulinskog lanca, - signalnu sekvencu mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca,
- varijabilni domen teškog lanca (VH) koji kodira nukleinsku kiselinu,
- konstantni region humanog IgG1 sa mutacijom „rupice“ koji kodira nukleinsku kiselinu,
- opciono, GS-linker koji kodira nukleinsku kiselinu fuzionisanu sa modulom za transport kroz krvno-moždanu barijeru koji kodira nukleinsku kiselinu, i
- poliadenilacionu sekvencu goveđeg hormona rasta (BGH pA).
ii) Stvaranje vektora za ekspresiju teških lanaca imunoglobulina koji sadrže modul za transport pomoću konstantnog regiona humanog IgG1 sa mutacijom „dugmeta“ Humani IgG1 koji kodira fuzioni gen koji sadrži konstantni region humanog IgG1 (CH1, šarka, CH2, CH3) i VH domen anti-alfa sinukleinskog antitela dobijen od zeca sastavljen je fuzionisanjem fragmenta DNK koji kodira VH domen odgovarajućeg anti-alfa sinukleinskog antitela sa elementom sekvence koji kodira konstantni region humanog IgG1 koji sadrži mutaciju „dugmeta“. Konstrukt je bio u genomskoj organizaciji, tj. introni su bili prisutni u signalnom peptidu, između domena VH i CH1, između domena CH1 i regiona šarke, između regiona šarke i domena CH2, i između domena CH2 i CH3.
Konstantni region humanog Ig1 sa dugmetom ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:
(SEQ ID NO: 51.).
Ekspresioni vektor takođe sadrži poreklo replikacije iz vektora pUC18, što omogućava replikaciju ovog plazmida u E. coli, i gen beta-laktamaze koji daje otpornost na ampicilin u E. coli.
Transkripciona jedinica teškog lanca antitela sa dugmetom sadrži sledeće funkcionalne elemente u smeru 5' do 3':
- trenutni rani pojačivač i promoter iz humanog citomegalovirusa (P-CMV),
- 5’-netranslatovani region (5’UTR) humanog teškog imunoglobulinskog lanca, - signalnu sekvencu mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca,
- varijabilni domen teškog lanca (VH) koji kodira nukleinsku kiselinu,
- konstantni region humanog IgG1 sa mutacijom „dugmeta“ koji kodira nukleinsku kiselinu,
- opciono, GS-linker koji kodira nukleinsku kiselinu fuzionisanu sa modulom za transport kroz krvno-moždanu barijeru koji kodira nukleinsku kiselinu, i
- poliadenilacionu sekvencu goveđeg hormona rasta (BGH pA).
iii) Stvaranje vektora za ekspresiju lakih lanaca kapa imunoglobulina pomoću konstantnog regiona humanog Ig-kapa
Humani kapa laki lanac Ig koji kodira fuzioni gen koji sadrži konstantni region humanog Ig-kapa (CL-kapa) i VL (kapa) domen anti-alfa sinukleinskog antitela dobijen od zeca sastavljen je fuzionisanjem fragmenta DNK koji kodira VL (kapa) domen odgovarajućeg anti-alfa sinukleinskog antitela sa elementom sekvence koji kodira konstantni region humanog Ig-kapa. Konstrukt je bio u genomskoj organizaciji, tj. introni su bili prisutni u signalnom peptidu i između domena VL (kapa) i CL-kapa.
Ekspresioni vektor takođe sadrži poreklo replikacije iz vektora pUC18, što omogućava replikaciju ovog plazmida u E. coli, i gen beta-laktamaze koji daje otpornost na ampicilin u E. coli.
Transkripciona jedinica kapa lakog lanca antitela sadrži sledeće funkcionalne elemente u smeru 5' do 3':
- trenutni rani pojačivač i promoter iz humanog citomegalovirusa (P-CMV)
- 5’-netranslatovani region (5’UTR) humanog teškog imunoglobulinskog lanca, - signalnu sekvencu mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca,
- varijabilni domen lakog lanca (VL) koji kodira nukleinsku kiselinu,
- konstantni region humanog IgG kapa,
- opciono, GS-linker koji kodira nukleinsku kiselinu fuzionisanu sa modulom za transport kroz krvno-moždanu barijeru koji kodira nukleinsku kiselinu, i
- poliadenilacionu sekvencu goveđeg hormona rasta (BGH pA).
iv) Stvaranje vektora za ekspresiju lambda lakih lanaca imunoglobulina pomoću konstantnog regiona humanog Ig-lambda
Humani lambda laki lanac Ig koji kodira fuzioni gen koji sadrži konstantni region humanog Ig-lambda (CL-lambda) i VL (lambda) domen anti-alfa sinukleinskog antitela dobijen od zeca sastavljen je fuzionisanjem fragmenta DNK koji kodira VL (lambda) domen odgovarajućeg anti-alfa sinukleinskog antitela sa elementom sekvence koji kodira konstantni region humanog Ig-lambda. Konstrukt je bio u genomskoj organizaciji, tj. introni su bili prisutni u signalnom peptidu i između domena VL (lambda) i CL-lambda.
Ekspresioni vektor takođe sadrži poreklo replikacije iz vektora pUC18, što omogućava replikaciju ovog plazmida u E. coli, i gen beta-laktamaze koji daje otpornost na ampicilin u E. coli.
Transkripciona jedinica lambda lakog lanca antitela sadrži sledeće funkcionalne elemente u smeru 5' do 3':
- trenutni rani pojačivač i promoter iz humanog citomegalovirusa (P-CMV)
- 5’-netranslatovani region (5’UTR) humanog teškog imunoglobulinskog lanca, - signalnu sekvencu mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca,
- varijabilni domen lakog lanca (VL) koji kodira nukleinsku kiselinu,
- konstantni region humanog IgG lambda,
- opciono, GS-linker koji kodira nukleinsku kiselinu fuzionisanu sa modulom za transport kroz krvno-moždanu barijeru koji kodira nukleinsku kiselinu, i
- poliadenilacionu sekvencu goveđeg hormona rasta (BGH pA).
Primer 7
Rekombinantna proizvodnja anti-humanih alfa-sinukleinskih antitela Antitela su proizvedena u prolazno transficiranim HEK293 ćelijama (linija dobijena iz ljudskih embrionskih ćelija bubrega 293) uzgajena u medijumu F17 (Invitrogen Corp.). Za transfekciju odgovarajućih vektora, kao što je opisano u primeru 6, korišćen je transfekcioni reagens „bez 293“ (Novagen). Antitela i fuzije antitela i modula za transport kroz krvnomoždanu barijeru eksprimiraju se iz pojedinačnih ekspresionih plazmida. Transfekcije se obavljaju na način naveden u uputstvu proizvođača. Supernatanti ćelijske kulture koji sadrže rekombinantno antitelo su sakupljani tri do sedam dana nakon transfekcije. Supernatanti su čuvani na sniženoj temperaturi (npr. -80 °C) do prečišćavanja.
Opšte informacije u vezi sa rekombinantnom ekspresijom humanih imunoglobulina, npr. u HEK293 ćelijama, date su u: Meissner, P. i sar. Biotechnol. Bioeng.75 (2001) 197-203.
Primer 8
Prečišćavanje rekombinantnih anti-humanih alfa-sinukleinskih antitela
Supernatanti kulture koji sadrže antitelo su filtrirani i prečišćeni u dva hromatografska koraka.
Antitela su uhvaćena afinitetnom hromatografijom korišćenjem HiTrap MabSelectSuRe (GE Healthcare) ekvilibrisanog PBS-om (1 mM KH2PO4, 10 mm Na2HPO4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl), pH 7,4. Nevezani proteini su uklonjeni ispiranjem ekvilibracionim puferom, a antitelo je izolovano 25 mM citratnim puferom, pH 3,1, koji je odmah nakon elucije podešen na pH 6,0 sa 1 M Tris-bazom, pH 9,0.
Gel hromatografija na Superdex 200™ (GE Healthcare) je korišćena kao drugi korak prečišćavanja. Gel hromatografija je obavljena u 20 mM histidinskom puferu, 0,14 M NaCl, pH 6,0. Rastvori koji sadrže antitelo su koncentrovani pomoću Ultrafree-CL centrifugalnog filtera opremljenog Biomax-SK membranom (Millipore, Billerica, MA, SAD) i skladišteni na -80 °C.
Tabela: prosečni prinosi po litru supernatanta kulture
Primer 9
Karakterizacija specifičnosti vezivanja pomoću površinske plazmonske rezonance
U svim opisanim postupcima primenjeni su instrumenti BIAcore 2000, 3000 ili T200 (GE Healthcare, BIAcore, Uppsala, Švedska). Svi koraci imobilizacije i testovi vezivanja obavljeni su na 25°C. Imobilizacija i testovi vezivanja su obavljeni (ako nije posebno napomenuto) sa 5, odnosno 30 µl min<-1>.
a) Karakterizacija vezivanja monomernog alfa-sinukleina za imobilisana monoklonska antitela
Puferi:
Pufer za imobilizaciju:
10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 0,05% polisorbat 20 (P20) na pH 7,5
Pufer za hvatanje i vezivanje:
10 mM Hepes, pH 7,5, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,05% P20
Test vezivanja prečišćenog monomernog α-sinukleinskog-heksaHis za imobilisana monoklonska antitela na antitelu za hvatanje
i) Imobilizacija kozjeg antimišjeg imunoglubulina IgG (antitelo za hvatanje) Imobilizacija kozjeg antimišjeg IgG (komplet za hvatanje mišjeg antitela; kat. br. BR-1008-38; GE Healthcare, Uppsala, Švedska) obavljena je u puferu koji sadrži 10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 0,05% P20 na pH 7,5. U prvom koraku, karboksilne grupe sa površine senzorskog čipa CM5 su transformisane u reaktivne sukcinimidne estre putem dovođenja u kontakt površine senzora tokom sedam minuta sa rastvorom 0,2 M N-etil-N-dimetil amino polikarbodiimida (EDC) i 0,05 M N-hidroksisukcinimida (NHS). Nakon aktivacije, površina senzora je tokom 3 minuta dovedena u kontakt sa kozjim antimišjim IgG sa 30 µg/ml u 10 mM natrijum acetatnom puferu (pH 5,0). IgG je imobilisan do nivoa od oko 3000 RU (jedinica odgovora). Konačno, višak aktiviranih karboksilnih grupa na površini ugašen je etanolaminom (1 M, pH 8,5, 7 min).
ii) Hvatanje anti-alfa sinukleinskih antitela
Monoklonska anti-alfa sinukleinska antitela (100 nM rastvor u radnom puferu) hvatana su na imobilisanom IgG antitelu sve dok nije dostignuta količina uhvaćenih antitela od 200-250 RU. Jedan kanal senzorskog čipa je korišćen sa imobilisanim kozjim antimišjim antitelom kao referentni kanal.
iii) Eksperiment vezivanja monomernog alfa-sinukleina sa N-terminalnom heksahistidinskom oznakom
Eksperiment vezivanja je izveden u puferu koji sadrži 10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,05% P20 na pH 7,5. Prečišćeni monomerni alfa-sinukleinski heksaHis je titrisan do 334 nM (5 tačaka, faktor razblaženja 2) preko površine uhvaćenih monoklonskih anti-alfa sinukleinskih antitela. Nakon svake titracije prečišćenog monomernog alfasinukleinskog heksaHis, kompleks alfa-sinukleina i monoklonskog anti-alfa sinukleinskog antitela uklonjen je sa čipa kratkim impulsima 10 mM rastvora glicin-HCl (pH 1,7). Nova monoklonska anti-alfa sinukleinska antitela su nakon toga uhvaćena na površini čipa.
b) Karakterizacija vezivanja monoklonskih anti-alfa sinukleinskih antitela za monomerni alfa-sinuklein imobilisan putem His-oznake na čipu sa NTA (nitrilosirćetna kiselina)
Puferi:
Pufer za imobilizaciju:
10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 0,05% P20, pH 7,5
Vezujući pufer:
10 mM Hepes, pH 7,5, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,05% P20
i) Imobilisanje prečišćenog monomernog alfa-sinukleina na površini NTA senzora Imobilizacija monomernog α-sinukleinskog-heksaHis (N-terminalni) na površini NTA senzora (nitrilosirćetna kiselina) obavljeno je u radnom puferu koji sadrži 10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 0,05% P20 na pH 7,5. Površina NTA senzora je prvo isprana tri puta po 1 min sa 0,35 M EDTA pri protoku od 5 µl/min. Nakon toga, površina senzora je napunjena Ni<2+>-jonima putem kontakta od 1 min površine čipa sa 500 µM NiCl2u radnom puferu i dodatno aktivirana tokom 7 min pomoću rastvora 0,2 M EDC i 0,05 M NHS. Nadalje, heksaHisobeleženi alfa-sinuklein u radnom puferu (< 0,1 µg/ml) doveden je u kontakt sa površinom senzora kako bi se dobila površina male gustine (do 5 RU) koja omogućava dalju detekciju jednovalentnog vezivanja monoklonskih anti-alfa sinukleinskih antitela za alfa-sinuklein. Konačno, preostale grupe aktivnog estra su deaktivirane tokom 5 minuta pomoću 1 M Tris, pH 7,5. Protočni kanal bez imobilisanog alfa-sinukleina je korišćen kao referentni kanal. ii) Test vezivanja sa monoklonskim antitelima sa imobilisanim α-sinukleinom Test vezivanja je obavljen u puferu koji sadrži 10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,05% P20 na pH 7,5. Monoklonska anti-alfa sinukleinska antitela su analizirana pri pojedinačnim koncentracijama od 100 nM da bi se dobio odgovor o vezivanju Da/Ne, ili su titrisana u radnom puferu do koncentracije od 100 nM (pojedinačna injektovanja 5 koncentracija sa faktorom razblaživanja 2) radi procene kinetike i afiniteta vezivanja prema monomernom alfa-sinukleinu. Nakon praćenja krive vezivanja za svaku koncentraciju svakog anti-alfa sinukleinskog-antitela, površina alfa-sinukleina je regenerisana sa dva kratka impulsa 100 mM fosforne kiseline (2 x 1 min) kako bi se ispralo vezano antitelo i omogućilo praćenje vezivanja drugog antitela.
c) Karakterizacija vezivanja monoklonskih anti-alfa sinukleinskih antitela za monomerni alfa-sinuklein imobilisan na DOPC:DOPS lipozomima na L1 senzoru Puferi: Pufer za imobilizaciju i vezivanje:
50 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7,5
i) Priprema DOPC:DOPS lipozoma
25 mg/ml (7:3 (m/m)) smeše lipida DOPC:DOPS (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoholin:1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serin) u hloroformu je upareno u staklenoj boci u struji argona pod digestorom kako bi se dobio lipidni film na zidu boce. Lipidni film je hidriran u Hepes puferu (50 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7,5) radi dobijanja 5 mM puferskog rastvora lipida. Lipidni rastvor je ekstrudovan mini-ekstruderom (Avanti Polar Lipids, Alabaster, SAD) propuštanjem lipidnog rastvora 15 puta kroz ekstruder-filtere od 100 nm kako bi se dobio rastvor lipozoma. Kvalitet i veličina lipozoma dokazani su dinamičkim rasipanjem svetlosti.
ii) Imobilizacija prečišćenog monomernog α-sinukleina na DOPC:DOPS lipozomima Imobilizacija alfa-sinuklein-heksaHis (N-terminalna oznaka) na DOPC:DOPS lipozomima izvedena je u puferu koji sadrži 50 mM Hepes, 150 mM NaCl na pH 7,5. Svi protočni kanali površine L1 senzora su prvo isprani tokom 1 min 20 mM rastvorom Chaps radi dobijanja stabilne bazne linije. Rastvor lipozoma DOPC: DOPS dobijen ekstruzijom razblažen je 5 puta u radnom puferu i nanet na senzorsku površinu svih protočnih kanala za postizanje nivoa imobilizacije od oko 3000 RU. U sledećem koraku, svi protočni kanali su blokirani pomoću rastvora BSA (albumin goveđeg seruma) pri 0,1 mg/ml radi smanjivanja nespecifičnog vezivanja alfa-sinukleina na/za površinu senzora. Alfa-sinuklein je razblažen u radnom puferu do koncentracije od 5,0 µg/ml i imobilisan na lipozomima do male gustine (< 30 RU) na odabranim protočnim kanalima, što omogućava detekciju vezivanja jednovalentnih antitela za alfa-sinuklein. Protočni kanal sa imobilisanim lipozomima ali bez alfa-sinukleina korišćen je kao referentni kanal.
iii) Test vezivanja monoklonskih antitela za imobilisani alfa-sinuklein na DOPC:DOPS lipozomima
U testu vezivanja, svako antitelo je analizirano u jednoj koncentraciji od 100 nM za odgovor Da/Ne o vezivanju, ili je titrisano u radnom puferu preko aktivnih i referentnih kanala do koncentracije od 100 nM (5 tačaka sa faktorom razblaženja 2) radi procene kinetike i afiniteta vezivanja prema alfa-sinukleinu. Nakon praćenja vezivanja antitela, površina senzora je regenerisana tokom 1 min sa 20 mM Chaps i ekvilibrisana radnim puferom za
1
sledeću imobilizaciju lipozoma.
d) Karakterizacija vezivanja monoklonskih anti-alfa sinukleinskih antitela za alfasinukleinske predformirane fibrile (PFF)
Puferi:
Pufer za imobilizaciju:
10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 0,05% P20, pH 7,5
Vezujući pufer:
10 mM Hepes, pH 7,5, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,05% P20
i) Imobilizacija α-sinukleinskih predformiranih fibrila na površini NTA senzora His-obeležena imobilizacija alfa-sinuklein PFF (koja sadrži alfa-sinuklein sa N-terminalnom heksa-His oznakom i neoznačeni alfa-sinuklein u odnosu 1:10) izvedena je na NTA senzoru u radnom puferu koji sadrži 10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 0,05 % P20 na pH 7,5. Površina NTA senzora je prvo isprana tokom 1 min 0,35 M rastvorom EDTA pri protoku od 5 µl/min. Nakon toga, površina senzora je napunjena Ni<2+>-jonima putem kontakta od 1 min površine sa 500 µM NiCl2u radnom puferu i dodatno aktivirana tokom 7 min sa 0,2 M EDC i 0,05 M NHS. Razblaženi rastvor alfa-sinukleinskih PFF u radnom puferu je doveden u kontakt sa površinom senzora kako bi se ostvarile različite gustine fibrila na površini senzora (oko 20 RU, oko 200 RU i oko 2000 RU). Deaktivacija preostalih slobodnih grupa aktivnog estra obavljena je tokom 5 min sa 1 M Tris na pH7,5. Jedan od protočnih kanala, na kome nisu imobilisani alfa-sinukleinski fibrili, korišćen je kao referentni kanal.
ii) Test vezivanja monoklonskih antitela za imobilisani PFF
Vezivanje svakog anti-alfa sinukleinskog antitela je praćeno u eksperimentu titracije do koncentracije od 100 nM (5 tačaka, faktor razblaženja 2) paralelno na sva četiri kanala. Nakon praćenja krive vezivanja za svako antitelo, površina alfa-sinukleinskog PFF je regenerisana kratkim impulsima (2 x 1 min) 100 mM fosforne kiseline radi ispiranja vezanog antitela.
REZULTATI:
Vezivanje različitih alfa-sinukleinskih antitela, kako je ovde objavljeno, kao i u vidu fuzija sa modulom za transport kroz krvno-moždanu barijeru i određenih referentnih antitela kako je utvrđeno pomoću SPR, kao što je prethodno opisano, prikazano je u tabeli u nastavku.
Tabela: Vezivanje anti-alfa sinukleinskih antitela za različite oblike alfa-sinukleina.
2
- Antitelo 0070 je fuzija modula za transport kroz krvno-moždanu barijeru antitela 0017 sa scFv antitransferinskog receptorskog antitela 8D3;
- Antitelo 0076 je fuzija modula za transport kroz krvno-moždanu barijeru antitela 0018 sa scFv antitransferinskim receptorskim antitelom 8D3.
Primer 10
Imunohistohemijska analiza i testovi citotoksičnosti
Imunohistohemijska analiza delova mozga sa PB
Kriosekcije (10 µm) mozga ljudskog pacijenta sa Parkinsonovom bolešću obojene su sa 5,0 µg/ml primarnog IgG antitela 0017, antitela 0018 ili antitela 0057 (mišji Fc) i kontrastirane sa 5,0 µg/ml zečjeg anti-alfa-sinukleinskog antitela (Cell Signaling; kat. Br.
2628S).
Kao sekundarna antitela, Alexa Fluor 488 konjugovana kozja antimišja IgG antitela (H+L) (Invitrogen, kat. Br. A11001) i Alexa Fluor 594 konjugovana kozja antizečja IgG antitela (H+L) (veoma unakrsno adsorbovana, Invitrogen, kat. br. A11037) su korišćena.
Uzorci su snimljeni na LEICA konfokalnom mikroskopu (SP5x) koristeći 63x sočivo 1,2NA, 1,6x uveličanje, Pinhole @ 1,0AU.
Alexa 488 je pobuđena na @ 497nm (10% WLL); emisija @ 505-571 nm (98% HyD) Alexa 594 je pobuđena na @ 590nm (8% WLL); emisija @ 596-680 nm (92% HyD). Slike su uprosečene 5x uprosečavanjem linija.
Rezultate videti na slici 12.
Model funkcionalnih ćelija ljudskih neuronskih ćelija (LUHMES) za zaštitu od toksičnosti posredovane alfa-sinukleinom putem terapeutskih antitela
LUHMES ćelije su diferencirane tokom 5 dana na pločama sa 384 bunarčića, kao što je detaljno opisano u nastavku. 24 sata nakon zasejavanja, supernatanti kondicionirane ćelijske kulture iz SHSY5Y ćelija uzgajanih u medijumu za diferencijaciju LUHMES dodati su sa razblaženjem 1:1 radi indukovanja egzozomno posredovane alfa-sinukleinske toksičnosti. Kontrolne kulture su dobile medijum za diferencijaciju LUHMES. Antitela koja se testiraju dodata su zajedno sa kondicioniranim SHSY5Y medijumom u krajnjoj koncentraciji od 10 µg/ml. Ćelijska vijabilnost je utvrđena nakon dodatna 4 dana pomoću CellTiterGlo testa (Promega, kat. br. REF G7571). Vrednosti vijabilnosti su prikazane kao broj po sekundi, CPS.
Postupci za uzgajanje ćelija
- Premaz, medijum i aditivi:
- Poli-L-ornitin: Sigma-Aldrich, kat. br. P-3655-100mg
- Fibronektin (rastvor): Sigma-Aldrich, kat. br. F-1141-5mg
- Unapređeni DMEM/F-12: Gibco/Invitrogen, kat. br.12634-010
- N-2: Gibco/Invitrogen, kat. br.17502048 ili PAA F005-004
- L-glutamin: Sigma-Aldrich, kat. br. G7513
- FGF: R&D Systems, kat. br.4114-TC (1 mg)
- GDNF: R&D Systems, kat. br.212-GD (50 µg)
- Tetraciklin: Sigma-Aldrich, kat. br. T-7660
- cAMP: Sigma-Aldrich, kat. br. D0627
Uzgajanje i diferencijacija LUHMES:
Premaz (sve ploče i boce moraju biti Nunclon):
4
Rastvor za premazivanje je sipan u ploče i boce (T75 boca: 7 ml; T175 boca: 14 ml; ploča sa 96 bunarčića: 50 µl po bunarčiću, ploča sa 24 bunarčića: 250 µl po bunarčiću, ploča sa 12 bunarčića: 500 µl po bunarčiću, ploča sa 6 bunarčića: 1 ml po bunarčiću). Ploče i boce su inkubirane najmanje 3 h (ili preko noći) na 37°C. Nakon inkubacije, rastvor za premaz je aspiriran. Boce su dva puta isprane Milli Q vodom. Pre upotrebe, ploče i boce su sušene ispod laminatora.
Medijum za proliferaciju:
Medijum za diferencijaciju:
Subkultura:
Ćelije koje su uzgajane u boci od 75 cm<2>u medijumu za proliferaciju podeljene su kada su dostigle 80% konfluencije. Ćelije su prvo dva puta isprane sa 10 ml PBS-a. Zatim je dodato 4 ml ATV-tripsina (2 ml 2 x osnovnog rastvora ATV-tripsina je prethodno pomešano sa 2 ml PBS-a). Ćelije su inkubirane tokom 3 min na 37°C. Kad su se ćelije odvojile, dodat je 21 ml unapređenog DMEM/F12 medijuma bez aditiva. Ćelijska suspenzija je centrifugirana u Falcon epruveti od 50 ml na 300 x g tokom 5 minuta. Supernatant je uklonjen, i ćelije su ponovo suspendovane u 5 ml unapređenog DMEM/F12 medijuma bez aditiva. Ćelije su prebrojane u Nojbauerovoj komori.
Za subkulturu, ćelije su podeljene nakon 2, 3 ili 4 dana. Ako je cilj dva dana, 2<*>10<6>ćelija (podela 1:5) zasejano je u bocu od 75 cm<2>. Za trodnevnu kulturu je dovoljno 1<*>10<6>ćelija (podela 1:10) i za četvorodnevnu kulturu 500.000 ćelija (podela 1:20). Ćelije su zasejane u bocu od 75 cm<2>koja sadrži 10 ml medijuma za proliferaciju.
Prediferencijacija:
Prediferencijacija LUHMES ćelija obavljena je u boci od 175 cm<2>. Tako, 6<*>10<6>ćelija je zasejano u 20 ml medijuma za proliferaciju. Nakon 24 sata vezivanja i proliferacije, medijum je zamenjen. Medijum za proliferaciju je zamenjen medijumom za diferencijaciju. Nakon dodatnih 48 h, prediferencijacija je završena.
Ćelije su zasejane na ploče sa više bunarčića. Zato je medijum usisan. Ćelije su isprane dva puta sa 10 ml PBS-a. Zatim je dodato 8 ml ATV-tripsina (4 ml 2 x osnovnog rastvora ATV-tripsina je prethodno pomešano sa 4 ml PBS-a). Ćelije su inkubirane 3 do 5 minuta na 37°C. Dodato je 42 ml unapređenog DMEM/F12 bez dodataka. Ćelijska suspenzija je centrifugirana u Falcon epruveti od 50 ml na 300 x g tokom 5 minuta. Supernatant je uklonjen, i ćelije su ponovo suspendovane u 10 ml medijuma za diferencijaciju. Ćelije su prebrojane u Nojbauerovoj komori.
Diferencijacija:
Dalja diferencijacija je obavljena na premazanim pločama za ćelijsku kulturu.
Ćelije su razblažene medijumom za diferencijaciju i zasejane sa odgovarajućom zapreminom medijuma za diferencijaciju u ploče za ćelijsku kulturu. Nakon dodatnih 72 h, diferencijacija je završena. Rezultate videti na slikama 7 i 9.
Primer 11
Termalna stabilnost
Tačke denaturacije (tačke topljenja, Tm) monoklonskih anti-alfa-sinukleinskih antitela (2 µM) određene su pomoću testa termalnog pomeranja koristeći Sypro Orange kao reporterski fluorofor.
Prelazi topljenja bili su podešeni prema Bolcmanovoj sigmoidnoj jednačini, a tačka pregiba na polovini maksimalne amplitude signala je definisana kao temperatura topljenja Tmna kojoj je polovina antitela denaturisana (Slika 10). Utvrđene su Tmvrednosti između 60°C i 75°C.
Tabela: tačke topljenja (Tm) odabranih anti-alfa-sinukleinskih antitela
Tm[°C]
mAb His-pufer DPBS TBS
0017 69,7 73,6 73,0
0018 69,2 71,9 71,8
0057 63,9 66,6 65,7
Primer 12
Mapiranje epitopa
Mapiranje epitopa je obavljeno na PepStar™ peptidnim mikronizovima koji su napravljeni po meri i nabavljeni od JPT Peptide Technologies. Peptidne sekvence su imale dužinu od 15 aminokiselinskih ostataka, i bile su projektovane da pokriju celu sekvencu humanog alfa-sinukleina (UniProt pristupni broj: P37840). Susedni peptidi su imali preklapajuće sekvence od 11 aminokiselina. Dodatni peptidi sadrže sekvence sa poznatim mestima alfa-sinukleinskih mutacija koje su vezane za bolest (A30P, A53T, E57K) i sekvence za procenu unakrsne reaktivnosti sa alfa-sinukleinom glodara. Nadalje, uočeno je 12 peptida/proteina koji služe kao kontrole za reaktivnost i specifičnost primarnih i sekundarnih antitela. Proteini su bili sledeći: Albumin goveđeg seruma, humani IgG, zečji IgG, mišji IgG, humani tau protein, humani alfa-sinuklein, humani beta-sinuklein, humani gama-sinuklein, humani IgM, mišji IgM, fosfo-tirozin peptid, humani mutantni alfa-sinuklein sa trostrukim prolinom (A30P, A56P, A76P).
Mapiranje epitopa je obavljeno prema uputstvu proizvođača.
Tabela: Podaci odabranih anti-alfa-sinukleinskih antitela prema mapiranju peptida.
Primer 13
Akutno in vivo obeležavanje patologije alfa-sinukleina putem konjugata anti-alfa sinukleinskog antitela-modula za transport kroz krvno-moždanu barijeru
Dizajn studije
Tri grupe petnaestomesečnih alfa-sinukleinskih transgenih miševa Thy1-(A30P) (Kaleovi miševi; n = 3 po grupi) i divlje vrste kao kontrola (n = 1 po grupi) dobile su injekciju tri različita konjugata anti-alfa sinuklein-modul za transport kroz krvno-moždanu barijeru:
- antitelo 0070 -> konjugat antitela 0017-scFab8D3
- antitelo 0076 -> konjugat antitela 0018-scFab8D3
- referenca -> konjugat 12F4-scFab8D3
Jedan transgeni miš i jedan miš divljeg tipa uključeni su kao kontrola bez injektovanja. Studija je obuhvatila ukupno 14 miševa.
Bojenje/detekcija vezanog mAb-moždanog transportera u moždanom tkivu
Ciljana zauzetost u mozgu detektovana je AF-555-označenim anti-huIgG-antitelom na 20 µm kriosekcijama mozga (4 po mišu; fiksirane u acetonu, blokirane sa NGS). Obavljeno je zajedničko bojenje: krvni sudovi (anti-podokaliksin, AF647); DAPI.
Rezultat
Parenhim moždanog stabla: varira od velikih neuritskih/alfa-sinukleinskih akumuliranih struktura do difuznog tačkastog bojenja sličnog sinaptičkom bojenju.
Neuritska patologija (= glavna patološka karakteristika u ovom modelu miša) ograničena je na moždano stablo, i jako je varijabilna od miša do miša.
Ceo mozak, takođe kod ne-transgenih miševa: uglavnom tačkasto bojenje; slično sinaptičkom bojenju.
Videti sliku 11.
Primer 14
CelluSpots™ sinteza i mapiranje epitopa
Peptidni niz za analizu epitopa antitela 0018 pripremljen je koristeći tehnologiju Intavis CelluSpots™. U ovom pristupu, sinteza peptida obavlja se pomoću automatizovanog sintetizatora (Intavis MultiPep RS) na modifikovanim celuloznim diskovima koji se rastvaraju nakon sinteze. Rastvori pojedinačnih peptida koji ostaju kovalentno vezani za makromolekulsku celulozu se zatim nanose na obložene mikroskopske preparate. Sinteza CelluSpots™ je izvršena postepeno korišćenjem 9-fluorenilmetoksikarbonilne (Fmoc) hemije na amino-modifikovanim celuloznim diskovima na ploči za sintezu sa 384 bunarčića. U svakom ciklusu spajanja, odgovarajuće aminokiseline su aktivirane rastvorom DIC/HOBt u DMF. Između koraka spajanja, amino grupe koje nisu reagovale (tj. slobodne) zatvorene su sa smešom anhidrida sirćetne kiseline, diizopropiletil amina i 1-hidroksibenzotriazola. Po završetku sinteze, celulozni diskovi su prebačeni na ploču sa 96 bunarčića i tretirani smešom trifluorsirćetne kiseline (TFA), dihlormetana, triizopropilsilana (TIS) i vode radi deprotekcije bočnog lanca. Posle uklanjanja rastvora za cepanje, peptidi vezani za celulozu su rastvoreni u smeši TFA, TFMSA (trifluor etansulfonska kiselina), TIS i vode, istaloženi sa diizopropil etrom i ponovo suspendovani u DMSO-u. Ovi peptidni rastvori su naknadno uočeni na Intavis CelluSpots™ slajdovima korišćenjem Intavis robota za praćenje slajdova.
Za analizu epitopa, pripremljene pločice su isprane etanolom i zatim TBS-om (Trispuferisani fiziološki rastvor; 50 mM Tris, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, pH 8) pre nego što je korak blokiranja izveden tokom 16 sati na 4°C sa 5 ml 10x Vestern Blocking reagensa (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Nemačka), 2,5 g saharoze u TBS-u, 0,1% Tween-20. Posle ispiranja pomoću TBS-T (TBS+0,1% Tween-20), pločice su inkubirane sa rastvorom (1 µg/ml) antitela 0018 u TBS-u koji sadrži 0,1% Tween-20 na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Nakon ispiranja, pločice su inkubirane radi detekcije sa antimišjim ili antizečjim sekundarnim antitelom konjugovanim sa peroksidazom rena (HRP) (1:20000 u TBS-T) nakon čega sledi inkubiranje sa DAB (3,3'-diaminobenzidin) supstratom / peroksidnim puferom (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Nemačka). ELISA-pozitivni SPOT-ovi su kvantifikovani, i dodeljivanjem odgovarajućih peptidnih sekvenci su identifikovani epitopi koji vezuju antitela. Iako je pronalazak koji prethodi opisan prilično detaljno pomoću ilustracija i primera za lakše razumevanje, opise i primere ne treba tumačiti kao ograničenja za opseg primene pronalaska.
1
2
4
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1

Claims (8)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Anti-humano alfa-sinukleinsko antitelo koje sadrži
(a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 21;
(b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 22;
(c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 17;
(d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 23;
(e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24; i
(f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 25.
2. Antihumano alfa-sinukleinsko antitelo prema zahtevu 1, pri čemu, anti-alfa sinukleinsko antitelo je humanizovano.
3. Antihumano alfa-sinukleinsko antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 2, pri čemu antihumano alfa-sinukleinsko antitelo dalje sadrži humani akceptorski okvir.
4. Antihumano alfa-sinukleinsko antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 3, naznačeno time što
a) antitelo sadrži dva teška lanca antitela od kojih svaki sadrži varijabilni domen teškog lanca i konstantni region teškog lanca, pri čemu
i) varijabilni domen sadrži HVR-e SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 i SEQ ID NO: 17, ii) konstantni region je konstantni region humanog IgG1, pri čemu C-terminalni ostatak lizina može biti prisutan ili odsutan, i
iii) konstantni region sadrži aminokiselinske izmene L234A, L235A i P329G, b) antitelo sadrži dva laka lanca antitela od kojih svaki sadrži varijabilni domen lakog lanca i konstantni domen lakog lanca, pri čemu
i) varijabilni domen sadrži HVR-e SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 i SEQ ID NO: 25, ii) konstantni region je humani konstantni region kapa lakog lanca ili humani konstantni region lambda lakog lanca,
i
c) antitelo
i) inhibira citotoksičnost indukovanu alfa-sinukleinom u ljudskim neuronima i glijalnim ćelijama i/ili
ii) inhibira transmisiju od ćelije do ćelije oligomernog ljudskog alfa-sinukleina između neurona i glijalnih ćelija, i/ili
iii) smanjuje aktivnost kaspaze indukovanu putem alfa-sinukleina u Lundovim ćelijama ljudskog srednjeg mozga (LUHMES), pri čemu je numeracija u Fc regionu u skladu sa Kabatovim EU indeksom.
5. Antihumano alfa-sinukleinsko antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 3, naznačeno time što
a) antitelo sadrži dva teška lanca antitela od kojih svaki sadrži u smeru od N- do C-terminusa varijabilni domen teškog lanca, konstantni region teškog lanca, peptidni linker i scFab ili scFv fragment antitela, koji se specifično vezuje za receptor humanog transferina, pri čemu
i) varijabilni domen sadrži HVR-e SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 i SEQ ID NO: 17, ii) konstantni region je konstantni region humanog IgG1, pri čemu C-terminalni ostatak lizina može biti prisutan ili odsutan, i
iii) konstantni region sadrži aminokiselinske izmene L234A, L235A i P329G, b) antitelo sadrži dva laka lanca antitela od kojih svaki sadrži varijabilni domen lakog lanca i konstantni domen lakog lanca, pri čemu
i) varijabilni domen sadrži HVR-e SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 i SEQ ID NO: 25, ii) konstantni region je humani konstantni region kapa lakog lanca ili humani konstantni region lambda lakog lanca,
i
c) antitelo
i) inhibira citotoksičnost indukovanu alfa-sinukleinom u ljudskim neuronima i glijalnim ćelijama i/ili
ii) inhibira transmisiju od ćelije do ćelije oligomernog ljudskog alfa-sinukleina između neurona i glijalnih ćelija, i/ili
iii) smanjuje aktivnost kaspaze indukovanu putem alfa-sinukleina u LUHMES ćelijama,
pri čemu je numeracija u Fc regionu prema Kabatovom EU indeksu.
6. Farmaceutska formulacija koja sadrži antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 5 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
7. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 5 za primenu kao lek.
8. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 5 za upotrebu u lečenju Parkinsonove bolesti.
1
RS20201161A 2013-11-21 2014-11-18 Anti-alfa-sinukleinska antitela i postupci za njihovu primenu RS60882B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP13193892 2013-11-21
EP14799764.7A EP3071597B1 (en) 2013-11-21 2014-11-18 Anti-alpha-synuclein antibodies and methods of use
PCT/EP2014/074840 WO2015075011A1 (en) 2013-11-21 2014-11-18 ANTI-alpha-SYNUCLEIN ANTIBODIES AND METHODS OF USE

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60882B1 true RS60882B1 (sr) 2020-11-30

Family

ID=49619846

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20201161A RS60882B1 (sr) 2013-11-21 2014-11-18 Anti-alfa-sinukleinska antitela i postupci za njihovu primenu

Country Status (24)

Country Link
US (5) US9493553B2 (sr)
EP (2) EP3071597B1 (sr)
JP (3) JP2017504566A (sr)
KR (3) KR102399292B1 (sr)
CN (3) CN105722857B (sr)
AR (2) AR098465A1 (sr)
AU (3) AU2014351996B2 (sr)
CA (1) CA2924268C (sr)
ES (1) ES2821904T3 (sr)
HR (1) HRP20201493T1 (sr)
HU (1) HUE051982T2 (sr)
IL (1) IL244495B (sr)
LT (1) LT3071597T (sr)
MX (3) MX375020B (sr)
MY (1) MY176237A (sr)
NZ (1) NZ717673A (sr)
PL (1) PL3071597T3 (sr)
PT (1) PT3071597T (sr)
RS (1) RS60882B1 (sr)
RU (2) RU2718990C1 (sr)
SG (1) SG10202007189VA (sr)
SI (1) SI3071597T1 (sr)
TW (1) TW201609804A (sr)
WO (1) WO2015075011A1 (sr)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015121339A1 (en) 2014-02-14 2015-08-20 RUHR-UNIVERSITäT BOCHUM Biosensor for conformation and secondary structure analysis
WO2016207245A1 (en) 2015-06-24 2016-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Humanized anti-tau(ps422) antibodies and methods of use
HUE057952T2 (hu) 2015-06-24 2022-06-28 Hoffmann La Roche Anti-transzferrin receptor antitestek testreszabott affinitással
GB201512203D0 (en) * 2015-07-13 2015-08-19 Lundbeck & Co As H Agents,uses and methods
GB2541003A (en) * 2015-08-05 2017-02-08 Kran Life Sciences Llp Neurodegenerative disorders
AR106189A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
TWI873952B (zh) 2015-10-02 2025-02-21 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 雙特異性抗‐人類cd20/人類轉鐵蛋白受體抗體及使用方法
US10160800B2 (en) * 2016-06-02 2018-12-25 Medimmune Limited Antibodies to α-synuclein and uses thereof
BR112018014281A2 (pt) 2016-11-15 2018-12-18 H Lundbeck As agentes, usos e métodos para o tratamento da sinucleinopatia
ES2834484T3 (es) 2016-11-21 2021-06-17 Univ Ruhr Bochum Método para la preselección de fármacos para enfermedades de plegamiento incorrecto de proteínas
EP3555127B1 (en) 2016-12-16 2024-12-18 H. Lundbeck A/S Agents, uses and methods
US10364286B2 (en) 2016-12-22 2019-07-30 H. Lundbeck A/S Monoclonal anti-alpha-synuclein antibodies for preventing tau aggregation
BR112019013953A2 (pt) 2017-01-06 2020-02-11 Abl Bio Inc. Anticorpo anti-a-syn e uso do mesmo
CN110506055A (zh) 2017-02-17 2019-11-26 戴纳立制药公司 工程改造的转铁蛋白受体结合多肽
CA3051839A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to alpha-synuclein and uses thereof
EP3618870A4 (en) 2017-05-01 2021-04-21 The Trustees of The University of Pennsylvania MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST ALPHA-SYNUCLEIN FIBRILLES
DE102017010455A1 (de) * 2017-06-13 2018-12-13 Forschungszentrum Jülich GmbH Verfahren zum Nachweis von Aggregaten biotherapeutischer Substanzen in einer Probe
WO2018237338A1 (en) * 2017-06-23 2018-12-27 Denali Therapeutics Inc. Anti-alpha-synuclein antibodies and methods of use thereof
EP3661961A4 (en) * 2017-08-02 2021-04-14 Stressmarq Biosciences Inc. ANTIBODIES BINDING TO ACTIVE ALPHA-SYNUCLEIN
US11155608B2 (en) 2017-08-23 2021-10-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Monoclonal antibodies against pathological alpha-synuclein, and methods using same
EP3725806A4 (en) 2017-12-14 2022-03-30 ABL Bio Inc. BISPECIFIC ANTIBODIES AGAINST A-SYN/IGF1R AND ASSOCIATED USE
GB201720970D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201720975D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Ucb Biopharma Sprl Anti-alpha synuclein antibodies
US20210032369A1 (en) * 2018-02-12 2021-02-04 The Scripps Research Institute Methods related to parkinson?s disease and synucleinopathies
CA3108986A1 (en) 2018-08-09 2020-02-13 Ventana Medical Systems, Inc. Determination of parkinson's disease
MX2021004454A (es) * 2018-10-19 2021-07-07 Janssen Vaccines & Prevention Bv Anticuerpos anti-sinucleina.
US11542322B2 (en) 2019-02-13 2023-01-03 Iowa State University Research Foundation, Inc. Nano-theranostics for Parkinson's disease
WO2021048423A1 (en) * 2019-09-12 2021-03-18 Genmab A/S Bispecific antibodies binding to 5t4 and cd3 for use in treatment of cancer
CA3159964A1 (en) * 2019-12-04 2021-06-10 Ac Immune Sa Novel molecules for therapy and diagnosis
US12454580B2 (en) 2020-04-10 2025-10-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. FRB antibodies
US20230265204A1 (en) 2020-04-24 2023-08-24 Hoffmann-La Roche Inc. Enzyme and pathway modulation with sulfhydryl compounds and their derivatives
CN115667281A (zh) 2020-07-29 2023-01-31 国立大学法人东北大学 用于预防或治疗共核蛋白病的肽
CN117279618A (zh) * 2020-11-30 2023-12-22 弗莱德哈钦森癌症中心 用于靶标分子的选择性耗竭的组合物和方法
WO2026037779A1 (en) * 2024-08-12 2026-02-19 Hultqvist Greta Stable forms of alpha-synuclein oligomers

Family Cites Families (118)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
EP0368684B2 (en) 1988-11-11 2004-09-29 Medical Research Council Cloning immunoglobulin variable domain sequences.
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
CA2095633C (en) 1990-12-03 2003-02-04 Lisa J. Garrard Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US7018809B1 (en) 1991-09-19 2006-03-28 Genentech, Inc. Expression of functional antibody fragments
FI941572A7 (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenete lmä
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
CA2372813A1 (en) 1992-02-06 1993-08-19 L.L. Houston Biosynthetic binding protein for cancer marker
AU691811B2 (en) 1993-06-16 1998-05-28 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
ES2244066T3 (es) 1997-06-24 2005-12-01 Genentech, Inc. Procedimiento y composiciones de glicoproteinas galactosiladas.
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
AU759779B2 (en) 1997-10-31 2003-05-01 Genentech Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
DK1034298T3 (da) 1997-12-05 2012-01-30 Scripps Research Inst Humanisering af murint antistof
ATE375365T1 (de) 1998-04-02 2007-10-15 Genentech Inc Antikörper varianten und fragmente davon
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
DK1071700T3 (da) 1998-04-20 2010-06-07 Glycart Biotechnology Ag Glykosylerings-modifikation af antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellulær cytotoksicitet
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
PL209392B1 (pl) 1999-01-15 2011-08-31 Genentech Inc Przeciwciało, komórka gospodarza, sposób wytwarzania przeciwciała oraz zastosowanie przeciwciała
CA2704600C (en) 1999-04-09 2016-10-25 Kyowa Kirin Co., Ltd. A method for producing antibodies with increased adcc activity
ES2248127T3 (es) 1999-10-04 2006-03-16 Medicago Inc. Metodo para regular la transcripcion de genes foraneos en presencia de nigtrogeno.
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
EP1229125A4 (en) 1999-10-19 2005-06-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk PROCESS FOR PREPARING A POLYPEPTIDE
EP1240319A1 (en) 1999-12-15 2002-09-18 Genentech, Inc. Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
JP2003531588A (ja) 2000-04-11 2003-10-28 ジェネンテック・インコーポレーテッド 多価抗体とその用途
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
CA2953239A1 (en) 2000-10-06 2002-04-18 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Antibody composition-producing cell
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
CA2430013C (en) 2000-11-30 2011-11-22 Medarex, Inc. Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
NZ571596A (en) 2001-08-03 2010-11-26 Glycart Biotechnology Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
CA2463879C (en) 2001-10-25 2012-12-04 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
EP1498490A4 (en) 2002-04-09 2006-11-29 Kyowa Hakko Kogyo Kk PROCESS FOR PREPARING ANTIBODY COMPOSITION
ATE503829T1 (de) 2002-04-09 2011-04-15 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Zelle mit erniedrigter oder deletierter aktivität eines am gdp-fucosetransport beteiligten proteins
CA2481925A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Therapeutic agent for patients having human fc.gamma.riiia
CA2481658A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method of enhancing of binding activity of antibody composition to fcy receptor iiia
BR0309145A (pt) 2002-04-09 2005-02-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk Células das quais o genoma é modificado
EP1500400A4 (en) 2002-04-09 2006-10-11 Kyowa Hakko Kogyo Kk MEDICAMENT WITH ANTIBODY COMPOSITION
CA2488441C (en) 2002-06-03 2015-01-27 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
US9034337B2 (en) * 2003-10-31 2015-05-19 Prothena Biosciences Limited Treatment and delay of outset of synucleinopathic and amyloidogenic disease
TWI335821B (en) 2002-12-16 2011-01-11 Genentech Inc Immunoglobulin variants and uses thereof
WO2004065416A2 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
JPWO2005035586A1 (ja) 2003-10-08 2007-11-22 協和醗酵工業株式会社 融合蛋白質組成物
JPWO2005035778A1 (ja) 2003-10-09 2006-12-21 協和醗酵工業株式会社 α１，６−フコシルトランスフェラーゼの機能を抑制するＲＮＡを用いた抗体組成物の製造法
US9296820B2 (en) 2003-11-05 2016-03-29 Roche Glycart Ag Polynucleotides encoding anti-CD20 antigen binding molecules with increased Fc receptor binding affinity and effector function
WO2005047860A2 (en) * 2003-11-08 2005-05-26 Elan Pharmaceuticals, Inc. Antibodies to alpha-synuclein
WO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 抗体組成物を含有する医薬
EP1740615B1 (en) 2004-03-31 2014-11-05 Genentech, Inc. Humanized anti-tgf-beta antibodies
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
PT1737891E (pt) 2004-04-13 2013-04-16 Hoffmann La Roche Anticorpos anti p-selectina
EA013752B1 (ru) * 2004-08-09 2010-06-30 Элан Фармасьютикалз, Инк. Предупреждение и лечение синуклеинопатических и амилоидогенных заболеваний
ZA200701531B (en) * 2004-08-09 2009-03-25 Elan Pharm Inc Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
DK1791565T3 (en) 2004-09-23 2016-08-01 Genentech Inc Cysteingensplejsede antibodies and conjugates
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
WO2007011907A2 (en) * 2005-07-19 2007-01-25 University Of Rochester Alpha-synuclein antibodies and methods related thereto
WO2007021255A1 (en) * 2005-08-09 2007-02-22 Elan Pharmaceuticals, Inc. Antibodies to alpha-synuclein
ES2577292T3 (es) 2005-11-07 2016-07-14 Genentech, Inc. Polipéptidos de unión con secuencias hipervariables de VH/VL diversificadas y consenso
EP1973951A2 (en) 2005-12-02 2008-10-01 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
GB0602992D0 (en) * 2006-02-15 2006-03-29 Morvus Technology Ltd Methods, genes and proteins
RU2429244C2 (ru) * 2006-03-23 2011-09-20 Байоарктик Ньюросайенс Аб Улучшенные селективные в отношении протофибрилл антитела и их применение
TW200812616A (en) 2006-05-09 2008-03-16 Genentech Inc Binding polypeptides with optimized scaffolds
AU2007281684C1 (en) * 2006-08-07 2013-12-19 Abbvie Biotherapeutics Inc. Methods of treating multiple myeloma using combination therapies based on anti-CS1 antibodies
US8759297B2 (en) 2006-08-18 2014-06-24 Armagen Technologies, Inc. Genetically encoded multifunctional compositions bidirectionally transported between peripheral blood and the cns
WO2008027236A2 (en) 2006-08-30 2008-03-06 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
WO2008081008A1 (en) 2007-01-05 2008-07-10 University Of Zurich Method of providing disease-specific binding molecules and targets
US8147833B2 (en) * 2007-02-23 2012-04-03 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
PL2583978T3 (pl) * 2007-02-23 2016-07-29 Prothena Biosciences Ltd Co Profilaktyka i leczenie chorób synukleinopatycznych i amyloidogennych
EP2154969B1 (en) * 2007-05-16 2015-11-18 The Brigham and Women's Hospital, Inc. Treatment of synucleinopathies
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
JP6157046B2 (ja) 2008-01-07 2017-07-05 アムジェン インコーポレイテッド 静電的ステアリング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｓｔｅｅｒｉｎｇ）効果を用いた抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための方法
AT506535B1 (de) * 2008-02-22 2010-04-15 Affiris Forschungs & Entwicklungs Gmbh Vaccine enthaltend alpha-synuclein-mimotope auf basis von peptiden
CN102317316B (zh) * 2008-12-19 2014-08-13 帕尼玛制药股份公司 人抗α突触核蛋白自身抗体
CA2756244A1 (en) 2009-04-02 2010-10-07 Roche Glycart Ag Multispecific antibodies comprising full length antibodies and single chain fab fragments
SG175077A1 (en) 2009-04-07 2011-11-28 Roche Glycart Ag Trivalent, bispecific antibodies
EP2417164A1 (en) * 2009-04-07 2012-02-15 Roche Glycart AG Bispecific anti-erbb-2/anti-c-met antibodies
PE20120540A1 (es) 2009-05-27 2012-05-09 Hoffmann La Roche Anticuerpos triespecificos o tetraespecificos
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
US8703132B2 (en) 2009-06-18 2014-04-22 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific, tetravalent antigen binding proteins
AT508638B1 (de) 2009-08-21 2011-08-15 Affiris Ag Verwendung von peptiden und polypeptiden zur behandlung und/oder prävention von synukleinopathien
JP2013510297A (ja) * 2009-11-04 2013-03-21 ノバルティス アーゲー モノマーからのタンパク質凝集体の分離における結合試薬としての正に荷電した種
JP5894939B2 (ja) 2010-02-26 2016-03-30 バイオアークティック ニューロサイエンス アーベー プロトフィブリル結合抗体ならびにパーキンソン病、レビー小体型認知症および他のα−シヌクレイノパチーの治療および診断方法におけるこれらの使用
WO2012061789A2 (en) * 2010-11-05 2012-05-10 Brandeis University Tetrameric alpha-synuclein and use thereof
CA2818173C (en) * 2010-11-30 2022-05-03 Genentech, Inc. Low affinity blood brain barrier receptor antibodies and uses therefor
RU2013150331A (ru) * 2011-04-20 2015-05-27 Рош Гликарт Аг СПОСОБ И УСТРОЙСТВА ДЛЯ рН-ЗАВИСИМОГО ПРОХОЖДЕНИЯ ГЕМАТОЭНЦЕФАЛИЧЕСКОГО БАРЬЕРА
EP2701743A4 (en) * 2011-04-27 2015-08-19 Univ Northwestern FOR PATHOLOGICAL TAU-DIMERE AND PREAFIBRILLARY PATHOLOGICAL TAU-OLIGOMER SELECTIVE ANTIBODIES AND THEIR USES IN THE APPLICATION, DIAGNOSIS AND MONITORING OF TAUOPATHIES
DK2807188T3 (da) * 2012-01-27 2019-10-07 Prothena Biosciences Ltd Humaniserede antistoffer, der genkender alpha-synuclein
HUE045144T2 (hu) * 2012-08-29 2019-12-30 Hoffmann La Roche Véragygát-shuttle
BR112016008993B1 (pt) 2013-10-25 2021-08-31 Nch Corporation Composição probiótica para tratar animais, plantas, ou camas para animais, sistema para administrar uma composição probiótica, e, método para aumentar populações bacterianas benéficas nos tratos gastrointestinais de animais
CN105899540B (zh) * 2014-01-03 2020-02-07 豪夫迈·罗氏有限公司 双特异性抗-半抗原/抗-血脑屏障受体的抗体、其复合物及它们作为血脑屏障穿梭物的应用

Also Published As

Publication number Publication date
ES2821904T3 (es) 2021-04-28
AU2020200683B2 (en) 2021-04-22
CN105722857B (zh) 2023-03-24
JP7074784B2 (ja) 2022-05-24
SI3071597T1 (sl) 2020-11-30
JP7367101B2 (ja) 2023-10-23
MX375020B (es) 2025-03-06
HUE051982T2 (hu) 2021-04-28
KR102358311B1 (ko) 2022-02-08
CN105722857A (zh) 2016-06-29
HK1220473A1 (zh) 2017-05-05
US9493553B2 (en) 2016-11-15
PT3071597T (pt) 2020-10-08
CN111499743A (zh) 2020-08-07
MX2016005631A (es) 2016-07-14
US20180237510A1 (en) 2018-08-23
HRP20201493T1 (hr) 2020-12-11
US10316082B2 (en) 2019-06-11
KR20160078998A (ko) 2016-07-05
CA2924268C (en) 2021-05-18
MX2020008436A (es) 2020-09-25
US20150140003A1 (en) 2015-05-21
AU2020200684B2 (en) 2021-04-22
CN111499743B (zh) 2024-01-12
US20170114123A1 (en) 2017-04-27
AU2014351996B2 (en) 2020-01-02
KR20220019838A (ko) 2022-02-17
AR098465A1 (es) 2016-05-26
JP2020073565A (ja) 2020-05-14
TW201609804A (zh) 2016-03-16
BR112016010065A2 (pt) 2017-12-05
US9670274B2 (en) 2017-06-06
AU2020200683A1 (en) 2020-02-20
AR132864A2 (es) 2025-08-06
MX2020002289A (es) 2020-07-13
KR102202925B1 (ko) 2021-01-14
RU2718990C1 (ru) 2020-04-15
CN111499742B (zh) 2024-05-07
JP2022078255A (ja) 2022-05-24
JP2017504566A (ja) 2017-02-09
US20190292248A1 (en) 2019-09-26
CA2924268A1 (en) 2015-05-28
EP3071597A1 (en) 2016-09-28
IL244495A0 (en) 2016-04-21
WO2015075011A1 (en) 2015-05-28
KR102399292B1 (ko) 2022-05-17
AU2020200684A1 (en) 2020-02-20
IL244495B (en) 2020-06-30
AU2014351996A1 (en) 2016-03-24
US10647761B2 (en) 2020-05-12
EP3783020A1 (en) 2021-02-24
US9890209B2 (en) 2018-02-13
RU2016124325A (ru) 2017-12-26
LT3071597T (lt) 2020-10-12
KR20210006509A (ko) 2021-01-18
MY176237A (en) 2020-07-24
PL3071597T3 (pl) 2020-11-30
CN111499742A (zh) 2020-08-07
SG10202007189VA (en) 2020-09-29
EP3071597B1 (en) 2020-07-29
NZ717673A (en) 2020-02-28
US20170327566A1 (en) 2017-11-16
RU2697098C1 (ru) 2019-08-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7367101B2 (ja) 抗アルファ－シヌクレイン抗体及び使用方法
CN105899533B (zh) 人源化的抗-Tau(pS422)抗体和使用方法
HK40028622B (zh) 抗-α-突触核蛋白抗体及使用方法
HK40028621B (zh) 抗-α-突触核蛋白抗体及使用方法
HK40028622A (en) Anti-alpha-synuclein antibodies and methods of use
HK40028621A (en) Anti-alpha-synuclein antibodies and methods of use
HK1220473B (en) Anti-alpha-synuclein antibodies and methods of use