RS60909B1

RS60909B1 - Zasejavanje ćelijske populacije u dermalne matrikse za upravljanje endokrinim poremećajem

Info

Publication number: RS60909B1
Application number: RS20201215A
Authority: RS
Inventors: John Greenwood; Patrick Toby Hewlett Coates
Original assignee: Beta Cell Tech Pty Ltd
Priority date: 2016-10-19
Filing date: 2017-10-19
Publication date: 2020-11-30
Also published as: EP3413941B1; HRP20201623T1; SMT202000552T1; US20190054124A1; HUE052514T2; EP3413941A1; CY1123436T1; AU2017317607A1; PT3413941T; LT3413941T; ES2824752T3; US10695379B2; EP3413941A4; DK3413941T3; WO2018071975A1; SI3413941T1; AU2017317607B2

Description

Opis

OBLAST

[0001] Predmetna objava se odnosi na postupke i proizvode za isporuku subjektu faktora poreklom iz ćelije.

POZADINA

[0002] Ćelijska terapija postala je prepoznata kao novi modalitet lečenja za neke bolesti, posebno za bolesti koje su uzrokovane gubitkom ili oštećenjem ćelija koje proizvode faktore neophodne za kontrolu fizioloških funkcija. Ćelijska terapija obećava zamene izgubljenih ili oštećenih ćelija sa introdukovanim ćelijama da bi se poboljšala narušena fiziološka funkcija. Na primer, transplantacija ćelija Langerhansovih ostrvaca ima potencijal za obnavljanje kontrole ugljenih hidrata kod pacijenata sa dijabetesom.

[0003] Ćelijska terapija ima različita ograničenja. Na primer, jedan ograničavajući faktor je poteškoća u transplantaciji ćelija i obezbeđivanje da transplantirane ćelije nastave da funkcionišu onako kako bi funkcionisale u svom prirodnom stanju. Pored toga, introdukcija neautolognih (alogenih ili ksenogenih) ćelija tipično će izazvati imunski odgovor, što će zahtevati i terapiju imunosupresivima kod domaćina.

[0004] Na primer, dok upotreba kliničke transplantacije ostrvaca upotrebom introdukcije ćelija ostrvaca putem hepatične portne vene može postići stope nezavisnosti od insulina od ~ 80% na 1 godinu, procedura i dalje zahteva višestruke infuzije ostrvaca tokom vremena i imunosupresivnu terapiju. Direktno izlaganje ćelija krvi može takođe dovesti do inflamatorne reakcije koja može da uništi značajan deo transplantiranih ćelija i procedura nosi značajan rizik od tromboze portne vene.

[0005] Alternativni pristup ćelijske terapije je da se isporuče ćelije upotrebom uređaja koji pokušavaju da obezbede biološki pogodno okruženje za boravak ćelija. Međutim, ovaj tip pristupa tipično rezultira brzim gubitkom ćelijske funkcije. Ovaj tip pristupa takođe ima niz drugih nedostataka, kao što su jedna ili više indukcija inflamatornog odgovora kada se uređaj introdukuje u domaćina, nekompatibilnost uređaja sa biološkim miljeom, poteškoće u snimanju uređaja i/ili okruženja za implantaciju, poteškoće sa punjenjem uređaja ćelijama, potreba za hirurškim punjenjem (i ponovnim punjenjem) ćelija, nemogućnost punjenja odgovarajućeg broja ćelija za održivi terapijski efekat, i poteškoća u uklanjanju uređaja ukoliko/kada je potrebno da se zameni.

[0006] Juang (Transplantation 1996, strane 1557-1561) objavljuje da je transplantacija ostrvaca i poliglikolne kiseline (PGA) u subkutano tkivo miševa sa dijabetesom povećala telesnu težinu i načinila miševe normoglikemijskim; graftovi su sadržali revaskularizovana ostrvca koja proizvode značajnu količinu insulina.

[0007] Shodno tome, ostaje potreba za poboljšanjem postupaka ćelijske terapije.

SAŽETAK

[0008] Određeni primeri izvođenja predmetne objave obezbeđuju ćelije koje proizvode insulin za upotrebu u sprečavanju i/ili lečenju dijabetesa, predijabetesa ili insulinske rezistencije kod subjekta, pri čemu se navedene ćelije koje proizvode insulin introdukuju u intrakutano mesto kod subjekta, pri čemu se matriks implantira u navedeno intrakutano mesto kod subjekta da omogući neovaskularizaciju intrakutanog mesta sa implantiranim matriksom, pri čemu matriks sadrži biorazgradivi poliuretan; time sprečavajući i/ili lečeći subjekt isporučujući subjektu insulin proizveden od strane ćelija.

[0009] Termini "intrakutano" i "intradermalno" kao što se ovde upotrebljavaju označavaju region epidermalnog sloja i/ili dermalni sloj kože (unutar kože), specifično isključujući subkutani sloj.

[0010] Termin "matriks" kao što se ovde upotrebljava označava skelu ili okvir koji se upotrebljava da obezbedi potporu u neovaskularizovanom mestu. Skela ili okvir se formiraju od jednog materijala ili više materijala kao što je ovde opisano, ali nisu nužno ograničeni na njih.

[0011] Termin "neovaskularizovan" ili "neovaskularizacija" označava formiranje novih krvnih sudova, uobičajeno u obliku mikro-vaskularne mreže krvnih sudova koji su sposobni da omoguće ćelijama krvi da putuju unutar njih.

[0012] Drugi primeri izvođenja su opisani ovde.

KRATAK OPIS SLIKA

[0013] Primeri izvođenja koji služe kao primer bolje će se razumeti i ceniti u vezi sa sledećim detaljnim opisom primera izvođenja koji služe kao primer uzeti zajedno sa pratećim slikama. Podrazumeva se da je sledeći opis slika samo u svrhu opisivanja primera primera izvođenja i nije namenjen da bude ograničavajući u odnosu na ovu objavu.

Slika 1A-D prikazuje šemu poprečnog preseka postupka transplantacije ostrvaca u vaskularno dermalno ležište poreklom od matriksa kod pacijenta na dan 0 i u fazi posle 30 dana i 100 dana.

Slika 1E prikazuje prikaz u perspektivi potpornog matriksa predmetne objave sa unutrašnjim delom koji se može ukloniti.

Slika 2 A, B i C prikazuje vizuelizaciju humanih ostrvaca posle 7 dana od transplantacije ostrvaca u prevaskularizovani materijal matriksa.

Slika 3 prikazuje vizuelizaciju neonatalnih ostrvaca 101 dan nakon transplantacije ostrvaca u prevaskularizovani materijal matriksa.

DETALJAN OPIS

[0014] Predmetna objava se odnosi na postupke i proizvode za isporuku subjektu faktora poreklom iz ćelije.

[0015] Određeni aspekti predmetne objave usmereni su na postupke i proizvode. Na primer, neke od prednosti aspekata koji su ovde objavljeni uključuju jedno ili više od sledećeg: upotreba nehepatičnog puta za implantiranje beta ćelija pankreasa ili ćelija Langerhansovih ostrvaca; upotreba biorazgradivog i netoksičnog matriksa za implantaciju ćelija; postupak koji formira mesto kod subjekta pogodno za introdukciju ćelija; postupak implantiranja ćelija koji omogućava laku biopsiju i/ili praćenje; postupak implantiranja ćelija koji obezbeđuje poboljšani pristup za in vivo snimanje graftovane mase; postupak implantiranja ćelija koji obezbeđuje potpuni povraćaj implantiranih ćelija ukoliko je neophodno; postupak transplantacije ćelija koji može biti izveden pod minimalnom sedacijom kao ambulantna procedura; postupak implantiranja ćelija koji može obezbediti naknadne značajne uštede troškova vezane za lečenje; postupak lečenja dijabetesa koji može omogućiti smanjenje broja potrebnih infuzija ostrvaca za nezavisnost od insulina; postupak implantiranja ćelija koji omogućava lokalnu primenu lekova; da obezbedi jednu ili više prednosti; ili da obezbedi komercijalnu alternativu. Druge prednosti određenih aspekata predmetne objave su takođe ovde objavljene.

[0016] Predmetna objava se zasniva na tome što je prepoznato da matriks koji podržava vaskularizaciju kada se implantira kod subjekta formira vaskularizovano, neinflamirano okruženje u koje mogu biti transplantirane beta ćelije pankreasa ili ćelije Langerhansovih ostrvaca i time se subjektu obezbeđuje insulin. Sposobnost introdukovanja ćelija koje proizvode faktor poreklom iz ćelije u vaskularizovano, neinflamirano okruženje obezbeđuje novu metodologiju za isporuku subjektu faktora poreklom iz ćelije.

[0017] Određeni aspekti predmetne objave obezbeđuju postupak isporučivanja subjektu faktora poreklom iz ćelije.

[0018] Određeni aspekti predmetne objave obezbeđuju postupak isporučivanja subjektu faktora poreklom iz ćelije, postupak sadrži:

implantiranje matriksa u mesto kod subjekta da omogući neovaskularizaciju mesta sa implantiranim matriksom; i

introdukovanje ćelija koje proizvode faktor poreklom iz ćelije u mesto;

time dostavljajući faktor poreklom iz ćelije subjektu iz ćelija koje su introdukovane u mesto.

[0019] U određenim aspektima, faktor poreklom iz ćelije sadrži jedan ili više peptidnih hormona, hormon, citokin, faktor rasta i hemokin, i/ili prekursor, nezreli oblik, ili prethodno obrađeni oblik bilo kog od ranije pomenutih. Drugi tipovi faktora poreklom iz ćelije se razmatraju.

[0020] U određenim aspektima, faktor poreklom iz ćelije je endokrini faktor.

[0021] U određenim aspektima, faktor poreklom iz ćelije je prirodno proizveden faktor. U određenim aspektima, faktor poreklom iz ćelije je rekombinantni faktor.

[0022] U određenim aspektima, faktor poreklom iz ćelije je singeni faktor. U određenim aspektima, faktor poreklom iz ćelije je alogeni faktor. U određenim aspektima, faktor poreklom iz ćelije je ksenogeni faktor.

[0023] U određenim aspektima, faktor sadrži insulin.

[0024] Termin "subjekt" kao što se ovde upotrebljava označava humanog ili životinjskog subjekta.

[0025] U određenim primerima izvođenja, subjekt je sisar, stoka (kao što su konj, krava, ovca, koza, svinja), domaća životinja (kao što su pas ili mačka) ili druga vrsta životinje kao što su primat, zec, pacov, miš, ptica i laboratorijska životinja. Druge vrste životinja se razmatraju. Veterinarske primene predmetne objave se razmatraju. Životinjski modeli se razmatraju.

[0026] U određenim primerima izvođenja, subjekt je humani subjekt.

[0027] U određenim primerima izvođenja, subjekt pati od, ili je podložan, bolesti, okolnosti ili stanju koje bi imalo koristi od isporuke ćelija subjektu.

[0028] Na primer, postupak se može upotrebljavati u režimima lečenja koji su korisni za dijabetes, predijabetes ili insulinsku rezistenciju. U određenim aspektima, postupak se može upotrebljavati kod subjekta koji je podvrgnut pankreatektomiji.

[0029] U određenim primerima izvođenja, ćelije za introdukciju sadrže singene ćelije. U određenim primerima izvođenja, ćelije sadrže alogene ćelije. U određenim primerima izvođenja, ćelije sadrže ksenogene ćelije. Postupci za izolovanje singenih, alogenih i ksenogenih ćelija su poznati u struci.

[0030] U određenim aspektima, ćelije sadrže ćeliju koja proizvodi faktor poreklom iz ćelije, ili progenitorski tip ćelije koja proizvodi, ili je sposobna da proizvede, faktor poreklom iz ćelije. Na primer, mogu se proizvesti pluripotentne matične ćelije ili druge progenitorske ćelije koje formiraju beta ćelije, kao što je opisano u Rezania et al. (2014) Nat Biotechnol.

32(11):1121-33, Pagliuca et al. (2014) Cell 159(2):428-39, i Kroon et al. (2008) Nat Biotechnol. 26(4):443-52.

[0031] U određenim primerima izvođenja, ćelije sadrže ćelije Langerhansovih ostrvaca, beta ćelije pankreasa i/ili njihove progenitore. Drugi tipovi ćelija se razmatraju.

[0032] U određenim primerima izvođenja, ćelije se izoluju iz domaćina u kog ih treba introdukovati (singene ćelije). U određenim primerima izvođenja, ćelije se izoluju iz alogenog davaoca (alogene ćelije). U određenim primerima izvođenja, ćelije se izoluju iz ksenogenog davaoca (ksenogene ćelije).

[0033] U određenim primerima izvođenja, ćelije sadrže in vitro propagirane ćelije.

[0034] U određenim primerima izvođenja, ćelije sadrže prirodne ćelije. U određenim primerima izvođenja, ćelije sadrže projektovane ćelije. U određenim primerima izvođenja, ćelije sadrže egzogenu nukleinsku kiselinu. U određenim primerima izvođenja, ćelije sadrže rekombinantnu nukleinsku kiselinu. U određenim primerima izvođenja, ćelije sadrže smanjenu ekspresiju jednog ili više antigena.

[0035] U određenim aspektima, mesto sadrži jedno ili više intradermalno mesto, intramuskularno mesto, mesto u omentumu, i mesto u mezenteri creva i trbušnog zida. U određenim aspektima, mesto sadrži jedno ili više intradermalno mesto, ili intramuskularno mesto. Drugi tipovi mesta za introdukciju ćelija se razmatraju.

[0036] Termin "matriks" kao što se ovde upotrebljava označava čvrst ili polučvrst supstrat, nosač ili skelu, koji može biti biorazgradiv ili trajan i koji podržava formiranje novih krvnih sudova kada se implantira i/ili se može zameniti (delimično ili u potpunosti) vaskularizovanim tkivom kada se implantira.

[0037] U određenim primerima izvođenja, matriks sadrži sintetički matriks. U određenim primerima izvođenja, matriks sadrži prirodni matriks, ili matriks poreklom iz prirodnog proizvoda. U određenim primerima izvođenja, matriks sadrži kombinaciju sintetičkih i prirodnih (bioloških) komponenata.

[0038] U određenim primerima izvođenja, matriks se formira od jednog ili više polimera.

[0039] Primeri matriksa uključuju čvrst matriks, polučvrst matriks, gel matriks, porozni matriks, vlaknasti matriks, prostirku, mrežu, sunđer, ili penu. Drugi tipovi matriksa se razmatraju.

[0040] U određenim primerima izvođenja, matriks sadrži porozni matriks.

[0041] U određenim primerima izvođenja, matriks sadrži prosečnu veličinu pore od 100 μm ili veću, 200 μm ili veću, 300 μm ili veću, 400 μm ili veću, 500 μm ili veću, 600 μm ili veću, 700 μm ili veću, 800 μm ili veću, 900 μm ili veću ili 1000 μm ili veću.

[0042] Postupci za utvrđivanje veličine pore poznati su u struci. U određenim primerima izvođenja, veličina pore sadrži veličinu najvećeg prečnika poprečnog preseka pore.

[0043] U određenim primerima izvođenja, matriks je biorazgradiv. Biorazgradivi matriksi su opisani, na primer, u Calandrelli L et al. (2000) Polymer 41(22):8027-8033. U određenim primerima izvođenja, biorazgradiv matriks ima vreme poluživota in vivo (na primer kao mereno zadržanom masom) od 10 do 120 dana, 20 do 120 dana, 30 do 120, 10 do 90 dana, 20 do 90 dana, 30 do 90 dana, 10 do 30 dana, 20 do 30 dana ili 10 do 20 dana.

[0044] Matriks sadrži biorazgradivi poliuretan.

[0045] Poliuretanski polimeri, i postupci za njihovu proizvodnju, opisani su na primer, u međunarodnim patentnim publikacijama WO 2008/014561, WO 2009/043099, WO 2005/089778, WO/2004/009227 i WO/2005/085312.

[0046] U određenim primerima izvođenja, introdukovanje ćelija događa se nakon neovaskularizacije mesta. Postupci za procenu vaskularizacije poznati su u struci.

[0047] U određenim primerima izvođenja, introdukovanje ćelija događa se pre vaskularizacije mesta. U određenim primerima izvođenja, introdukovanje ćelija događa se tokom vaskularizacije mesta.

[0048] U određenim primerima izvođenja, mesto je delimično ili znatno vaskularizovano u vreme introdukovanja ćelija. U određenim primerima izvođenja, mesto je delimično vaskularizovano u vreme introdukovanja ćelija. U određenim primerima izvođenja, mesto je znatno vaskularizovano u vreme uvođenja ćelija.

[0049] U određenim primerima izvođenja, matriks je delimično ili znatno zamenjen tkivom u vreme introdukcije ćelija.

[0050] U određenim primerima izvođenja, matriks je delimično ili znatno zamenjen neovaskulirizovanim tkivom u vreme introdukcije ćelija.

[0051] U određenim primerima izvođenja, ćelije se introdukuju u mesto 0 do 90 dana posle implantacije matriksa.

[0052] U određenim primerima izvođenja, ćelije se introdukuju u mesto 0 do 90 dana, 0 do 75 dana, 0 do 60 dana, 0 do 45 dana, 0 do 30 dana, 0 do 15 dana, 15 do 90 dana, 15 do 75 dana, 15 do 60 dana, 15 do 45 dana, 15 do 30 dana, 30 do 90 dana, 30 do 75 dana, 30 do 60 dana, 30 do 45 dana, 45 do 90 dana, 45 do 70 dana, 45 do 60 dana, 60 do 90 dana, 60 do 75 dana ili 75 do 90 dana posle implantacije matriksa. Drugi vremenski periodi se razmatraju.

[0053] U određenim primerima izvođenja, ćelije se procenjuju za jedno ili više od broja, vijabilnbosti i sterilnosti pre implantacije.

[0054] U određenim primerima izvođenja, matriks se implantira u mesto na više od 30 dana.

[0055] U određenim primerima izvođenja, matriks je delimično ili znatno inervisan i vaskularizovan u vreme introdukcije ćelija.

[0056] U određenim primerima izvođenja, matriks je biorazgradiv i znatno ujednačen u kompoziciji.

[0057] U određenim primerima izvođenja, mesto sadrži rez ili prazninu načinjenu u tkivu, i matriks se implantira u rez ili prazninu. U određenim primerima izvođenja, mesto sadrži hirurški rez ili prazninu načinjenu u tkivu, i matriks se implantira u rez ili prazninu.

[0058] U određenim aspektima, postupak sadrži kreiranje otvorenog subkutanog i/ili otvorenog dermalnog mesta kod subjekta, i implantiranje matriksa u otvoreno subkutano i/ili otvoreno dermalno mesto kod subjekta.

[0059] U određenim aspektima, postupak sadrži kreiranje otvorenog subkutanog i/ili otvorenog dermalnog mesta kod subjekta, i implantiranje biorazgradivog matriksa u otvoreno subkutano i/ili otvoreno dermalno mesto kod subjekta.

[0060] U određenim primerima izvođenja, matriks dodatno sadrži zaptivač.

[0061] U određenim primerima izvođenja, zaptivač zatvara mesto implantacije i/ili smanjuje gubitak vode isparavanjem sa mesta implantacije.

[0062] U određenim primerima izvođenja, matriks dodatno sadrži ne-biorazgradiv zaptivač.

[0063] U određenim primerima izvođenja, zaptivač sadrži poliuretan, poliamid, poliuretanureu, polipropilen ili bilo koji drugi polimer koji je sposoban da se formira u slojeve ili filmove, ili silikon.

[0064] U određenim primerima izvođenja, matriks sadrži zaptivač i zaptivač se uklanja pre introdukcije ćelija. U određenim primerima izvođenja, zaptivač se uklanja pre introdukcije ćelija i ćelije se introdukuju kroz tkivo izloženo nakon uklanjanja zaptivača.

[0065] U određenim aspektima, postupak sadrži kreiranje otvorenog dermalnog mesta kod subjekta, i implantiranje biorazgradivog matriksa u otvoreno dermalno mesto kod subjekta, pri čemu matriks dodatno sadrži ne-biorazgradiv zaptivač za zatvaranje mesta nakon implantacije matriksa.

[0066] Veličina/zapremina matriksa koji se implantira mogu biti odabrani, na primer tako da su pogodni za mesto implantacije koje će se koristiti i/ili broj ćelija koje će biti implantirane. U određenim primerima izvođenja, matriks sadrži zapreminu u opsegu od 0,2 cm<3>do 20 cm<3>. U određenim primerima izvođenja, matriks sadrži zapreminu u rasponu od 0,2 cm<3>do 5 cm<3>. U određenim primerima izvođenja, matriks sadrži zapreminu u opsegu od 0,2 cm<3>do 0,8 cm<3>. U određenim primerima izvođenja, matriks sadrži zapreminu od 0,2 cm<3>ili veću, 0,8 cm<3>ili veću, 3,2 cm<3>ili veću, ili 5 cm<3>ili veću, na primer, matriks za implantaciju može imati veličinu od 1 x 1 cm sa dubinom od 2-5 mm, veličinu od 2 do 4 cm sa 2 do 4 cm sa dubinom od 2-5 mm, do veličine od 10 x 10 cm sa dubinom od 2-5 mm za upotrebu u trbušnom zidu.

[0067] U određenim primerima izvođenja, matriks ne proizvodi znatnu inflamatornu reakciju (lokalnu ili sistemsku) kada se implantira. Postupci za procenu inflamacije poznati su u struci.

[0068] U određenim primerima izvođenja, broj ćelija za introdukciju sadrži 1 x 10<3>do 1,2 x 104 ekvivalenata ostrvaca po kg telesne težine subjekta. Tipične konačne zapremine ćelija za transplantaciju ostrvaca su 1 do 7 cm<3>ćelijskog materijala.

[0069] U određenim aspektima, postupak sadrži primenu imunosupresivnog agensa subjektu. U određenim aspektima, primena imunosupresivnog agensa sadrži sistemsku primenu imunosupresivnog agensa.

[0070] U određenim aspektima, primena imunosupresivnog agensa sadrži lokalnu primenu imunosupresivnog agensa u regionu mesta implantacije ili poreklom od matriksa. Postupci za primenu agenasa su poznati u struci.

[0071] U određenim primerima izvođenja, subjekt je humani subjekt. U određenim primerima izvođenja, subjekt pati od, ili je podložan, dijabetesu tipa 1, dijabetesu tipa 2, insulinskoj rezistenciji i predijabetesu.

[0072] U određenim primerima izvođenja, subjekt je subjekt podvrgnut pankreatektomiji, kako bi imao naknadnu autotransplantaciju ostrvaca svojih sopstvenih ćelija ostrvaca nazad u svoje telo.

[0073] Određeni aspekti predmetne objave obezbeđuju postupak isporuke subjektu faktora poreklom iz ćelije, postupak sadrži:

implantiranje biorazgradivog matriksa u intrakutano i/ili dermalno mesto kod subjekta; omogućavanje neovaskularizacije mesta sa implantiranim matriksom kako bi se formiralo neovaskularizovano mesto; i

introdukovanje ćelija koje proizvode faktor poreklom iz ćelije u tkivo u neovaskularizovano mesto, time isporučujući subjektu faktor poreklom iz ćelije proizveden iz ćelija koje su introdukovane u mesto.

[0074] Određeni aspekti predmetne objave obezbeđuju postupak isporuke faktora poreklom iz ćelije subjektu, postupak sadrži:

kreiranje otvorenog intrakutanog i/ili otvorenog dermalnog mesta kod subjekta; implantiranje biorazgradivog matriksa u otvoreno intrakutano i/ili otvoreno dermalno mesto kod subjekta, pri čemu matriks dodatno sadrži ne-biorazgradiv zaptivač za zatvaranje mesta nakon implantacije matriksa;

omogućavanje neovaskularizacije mesta sa implantiranim matriksom kako bi se formiralo neovaskularizovano mesto; i

[0075] U određenim aspektima, postupak kao što je ovde opisano upotrebljava se za sprečavanje i/ili lečenje bolesti, okolnosti ili stanja kod subjekta.

[0076] U određenim aspektima, postupak kao što je ovde opisano upotrebljava se za sprečavanje i/ili lečenje dijabetesa tipa 1, dijabetesa tipa 2, insulinske rezistencije i/ili predijabetesa kod subjekta.

[0077] Određeni aspekti predmetne objave obezbeđuju postupak sprečavanja i/ili lečenja bolesti, okolnosti ili stanja koje bi imalo koristi od introdukcijke ćelija koje proizvode faktor poreklom iz ćelije.

1

[0078] Određeni aspekti predmetne objave obezbeđuju postupak sprečavanja i/ili lečenja bolesti, okolnosti ili stanja kao što je ovde opisano implantiranjem matriksa u mesto kod subjekta kako bi se omogućila neovaskularizacija mesta sa implantiranim matriksom, i introdukovanjem ćelija koje proizvode faktor poreklom iz ćelije u mesto, time sprečavajući i/ili lečeći subjekt.

[0079] Određeni aspekti predmetne objave obezbeđuju postupak sprečavanja i/ili lečenja dijabetesa, predijabetesa ili insulinske rezistencije kod subjekta, postupak sadrži:

implantiranje matriksa u mesto kod subjekta kako bi se omogućila neovaskularizacija mesta sa implantiranim matriksom; i

introdukovanje ćelija koje proizvode, ili su sposobne da proizvedu insulin u mesto, time sprečavajući i/ili lečeći subjekt isporučujući subjektu insulin proizveden iz ćelija.

[0080] Određeni primeri izvođenja predmetne objave obezbeđuju ćelije koje proizvode insulin za upotrebu u sprečavanju i/ili lečenju dijabetesa, predijabetesa ili insulinske rezistencije kod subjekta, pri čemu se navedene ćelije koje proizvode insulin introdukuju u intrakutano mesto kod subjekta, pri čemu se matriks implantira u navedeno intrakutano mesto kod subjekta da se omogući neovaskularizacija intrakutanog mesta sa implantiranim matriksom, pri čemu matriks sadrži biorazgradivi poliuretan; time sprečavajući i/ili lečeći subjekt isporučujući subjektu insulin proizveden iz ćelija.

[0081] Primeri ćelija za introdukciju su kao što je ovde opisano. U određenim primerima izvođenja, ćelije sadrže alogene ćelije. U određenim primerima izvođenja, ćelije sadrže ksenogene ćelije. Postupci za dobijanje ćelija za introdukciju u subjekt su poznati u struci.

[0082] U određenim primerima izvođenja, ćelije su deo heterogenog (višećelijskog) klastera kao što su Langerhansova ostrvca, ili sadrže beta ćelije pankreasa i/ili njihov progenitorski tip ćelije.

[0083] Primeri mesta za introdukciju ćelija su kao što je ovde opisano. U određenim aspektima, mesto sadrži intradermalno mesto ili intramuskularno mesto.

[0084] Primeri matriksa su kao što je ovde opisano. U određenim primerima izvođenja, matriks je biorazgradiv.

[0085] U određenim primerima izvođenja, matriks dodatno sadrži jedan ili više od kolagena, glikozaminoglikana, kopolimera i/ili smeše kolagen-GAG, mukopolisaharida, poli(alfahidroksi kiseline), poli(mlečne kiseline) i/ili njen strukturni izomer, poliglikolne kiseline i/ili njen strukturni izomer, hitozana, polimlečno-poliglikolnog polimera, i polikaprolaktona.

[0086] Matriks sadrži biorazgradivi poliuretan.

[0087] Primeri introdukovanja ćelija su kao što je ovde opisano. U određenim primerima izvođenja, introdukovanje ćelija se događa posle neovaskularizacije mesta.

[0088] U određenim primerima izvođenja, introdukovanje ćelija događa se pre vaskularizacije mesta. U određenim primerima izvođenja, introdukovanje ćelija se događa tokom vaskularizacije mesta.

[0089] U određenim primerima izvođenja, mesto je delimično ili znatno vaskularizovano u vreme introdukovanja ćelija. U određenim primerima izvođenja, mesto je delimično vaskularizovano u vreme introdukovanja ćelija. U određenim primerima izvođenja, mesto je znatno vaskularizovano u vreme introdukovanja ćelija.

[0090] U određenim primerima izvođenja, matriks je delimično ili znatno zamenjen tkivom, u vreme introdukcije ćelija.

[0091] U određenim primerima izvođenja, matriks je delimično ili znatno zamenjen neovaskulirizovanim tkivom u vreme introdukcije ćelija.

[0092] U određenim primerima izvođenja, matriks je trajno implantiran u mesto.

[0093] U određenim primerima izvođenja, matriks je delimično ili znatno inervisan i vaskularizovan u vreme introdukcija ćelija.

[0094] U određenim primerima izvođenja, mesto sadrži rez ili prazninu načinjenu u tkivu i matriks se implantira u rez ili prazninu.

[0095] U određenim aspektima, postupak sadrži kreiranje otvorenog intrakutanog i/ili otvorenog dermalnog mesta kod subjekta, i implantiranje matriksa u otvoreno intrakutano i/ili otvoreno dermalno mesto kod subjekta.

[0096] U određenim aspektima, postupak sadrži kreiranje otvorenog intrakutanog i/ili otvorenog dermalnog mesta kod subjekta, i implantiranje biorazgradivog matriksa u otvoreno intrakutano i/ili otvoreno dermalno mesto kod subjekta.

[0097] U određenim primerima izvođenja, matriks dodatno sadrži zaptivač. U određenim primerima izvođenja, matriks dodatno sadrži ne-biorazgradiv zaptivač. U određenim primerima izvođenja, zaptivač sadrži poliuretan.

[0098] U određenim primerima izvođenja, zaptivač zatvara mesto implantacije i/ili smanjuje gubitak vode isparavanjem sa mesta implantacije.

[0099] U određenim primerima izvođenja, matriks sadrži zaptivač i zaptivač se uklanja pre introdukcije ćelija. U određenim primerima izvođenja, zaptivač se uklanja pre introdukcije ćelija i ćelije se introdukuju kroz tkivo izloženo nakon uklanjanja zaptivača.

[0100] U određenim aspektima, postupak sadrži kreiranje otvorenog intrakutanog i/ili otvorenog dermalnog mesta kod subjekta, i implantiranje biorazgradivog matriksa u otvoreno intrakutano i/ili otvoreno dermalno mesto kod subjekta, pri čemu matriks dodatno sadrži nebiorazgradiv zaptivač za zatvaranje mesta nakon implantacije matriksa.

[0101] U određenim primerima izvođenja, matriks ne proizvodi znatnu inflamatornu reakciju kada se implantira.

[0102] Primeri postupaka za introdukovanje ćelija su kao što je ovde opisano. U određenim primerima izvođenja, introdukovanje ćelija u mesto sadrži injektiranje ćelija u mesto. U određenim primerima izvođenja, introdukovanje ćelija u mesto sadrži postavljanje ćelija unutar mesta pomoću uređaja.

[0103] U određenim primerima izvođenja, broj ćelija za introdukciju sadrži 1 x 10<3>do 1,2 x 104 ekvivalenata ostrvaca po kg telesne težine subjekta.

[0104] U određenim primerima izvođenja, introdukovanje ćelija u mesto sadrži zasejavanje ćelija u matriks pre neovaskularizacije.

[0105] Postupci za procenu efikasnosti lečenja su poznati u struci. Na primer, procena efikasnosti lečenja dijabetesa može da uključuje jedno ili više od obnavljanja nivoa glukoze u krvi, nivoa c-peptida i poboljšanje jednog ili više simptoma dijabetesa.

[0106] Određeni aspekti predmetne objave obezbeđuju postupak sprečavanja i/ili lečenja dijabetesa, predijabetesa ili insulinske rezistencije kod subjekta, postupak sadrži:

introdukovanje ćelija koje proizvode insulin u tkivo u neovaskularizovano mesto, time isporučujući subjektu insulin proizveden iz ćelija koje su introdukovane u mesto.

[0107] Određeni aspekti predmetne objave obezbeđuju postupak sprečavanja i/ili lečenja dijabetesa, predijabetesa ili insulinske rezistencije kod subjekta, postupak sadrži:

1

[0108] Određeni aspekti predmetne objave obezbeđuju upotrebu biorazgradivog matriksa za sprečavanje i/ili lečenje bolesti, okolnosti ili stanja kao što je ovde opisano.

[0109] Određeni aspekti predmetne objave obezbeđuju upotrebu biorazgradivog matriksa za implantaciju u subjekt za sprečavanje i/ili lečenje dijabetesa, predijabetesa ili insulinske rezistencije kod subjekta.

[0110] Određeni aspekti predmetne objave obezbeđuju kombinovani proizvod.

[0111] Određeni aspekti predmetne objave obezbeđuju kombinovani proizvod, proizvod sadrži:

matriks koji kada se implantira u mesto kod subjekta omogućava neovaskularizaciju mesta sa implantiranim matrksom; i

uređaj za introdukovanje ćelija u mesto.

[0112] U određenim aspektima, matriks sadrži sintetički matriks. U određenim aspektima, matriks sadrži prirodni matriks i/ili matriks poreklom iz prirodnog proizvoda.

[0113] U određenim aspektima, matriks je biorazgradiv matriks. U određenim primerima izvođenja, biorazgradiv matriks sadrži poliuretan.

[0114] U određenim aspektima, biorazgradiv matriks sadrži zaptivač. U određenim aspektima, biorazgradiv matriks sadrži ne-biorazgradiv zaptivač. Primeri zaptivača su kao što je ovde opisano.

[0115] Određeni aspekti predmetne objave obezbeđuju kombinovani proizvod, proizvod sadrži:

biorazgradiv matriks koji kada se implantira u mesto kod subjekta omogućava neovaskularizaciju mesta sa implantiranim matriksom; i

uređaj za introdukovanje ćelija u mesto.

[0116] Primeri uređaja su kao što je ovde opisano. U određenim primerima izvođenja, uređaj sadrži špric za injektiranje ćelija u mesto.

[0117] Određeni aspekti predmetne objave obezbeđuju upotrebu kombinovanog proizvoda kao što je ovde opisano za sprečavanje i/ili lečenje dijabetesa, predijabetesa ili insulinske rezistencije kod subjekta.

[0118] Određeni aspekti predmetne objave obezbeđuju komplet za upotrebu u postupku kao što je ovde opisano.

[0119] Određeni aspekti predmetne objave obezbeđuju komplet za isporučivanje subjektu faktora poreklom iz ćelije, komplet sadrži biorazgradiv matriks koji kada se implantira u mesto kod subjekta omogućava neovaskularizaciju mesta sa implantiranim matriksom i opciono jedan ili više reagenasa i/ili uređaja za pripremanje i/ili isporučivanje ćelija koje proizvode faktor poreklom iz ćelije u mesto.

[0120] Komplet može uključivati jedan ili više reagenasa, komponenata, i uređaja kao što je ovde opisano, i/ili uputstva za izvođenje postupka kao što je ovde opisano.

[0121] Na primer, komplet može sadržati matriks, i jedan ili više od enzima, pufera, aditiva, stabilizatora, razblaživača, medijuma za kulturu, agenasa, faktora rasta, potrošnog materijala, i uputstava.

[0122] Određeni aspekti predmetne objave obezbeđuju ne-humanu životinju koja proizvodi faktor poreklom iz egzogene ćelije, faktor poreklom iz egzogene ćelije proizveden iz ćelija koje su introdukovane postupkom kao što je ovde opisano.

[0123] Upotreba ne-humane životinje kao životinjskog modela za sprečavanje i/ili lečenje bolesti, okolnosti ili stanja je kao što je ovde opisano.

[0124] Određeni aspekti predmetne objave obezbeđuju ne-humanu životinju koja proizvodi faktor poreklom iz egzogene ćelije, faktor poreklom iz egzogene ćelije proizveden iz ćelija koje su introdukovane u neovaskularizovano mesto kod životinje, ćelije koje proizvode, ili su sposobne da proizvedu, faktor poreklom iz egzogene ćelije, i pri čemu se neovaskularizovano mesto formira implantiranjem biorazgradivog matriksa u mesto i omogućavanjem neovaskularizacije mesta sa implantiranim matriksom.

[0125] Primeri faktora poreklom iz ćelije su kao što je ovde opisano. U određenim primerima izvođenja, faktor poreklom iz ćelije sadrži insulin.

[0126] Ne-humane životinje su kao što je ovde opisano. U određenim aspektima, ne-humana životinja je životinja kao što su ne-humani primat, zec, pacov, miš, pas, mačka, konj, krava, ovca, koza, ili svinja. Druge vrste ne-humanih životinja se razmatraju.

[0127] Određeni aspekti predmetne objave obezbeđuju ne-humane životinje koje imaju egzogene ćelije introdukovane u životinju postupkom kao što je ovde opisano.

1

[0128] Određeni aspekti predmetne objave obezbeđuju ne-humanu životinju koja sadrži egzogene ćelije introdukovane u neovaskularizovano mesto u životinji, ćelije koje proizvode, ili su sposobne da proizvedu, faktor poreklom iz ćelije, i pri čemu se formira neovaskularizovano mesto implantiranjem biorazgradivog matriksa u mesto i omogućavanjem neovaskularizacije mesta sa implantiranim matriksom.

[0129] Primeri faktora poreklom iz ćelije su kao što je ovde opisano. U određenim aspektima, faktor poreklom iz ćelije je insulin.

[0130] U određenim aspektima, egzogene ćelije sadrže heterogeni (višećelijski) klaster kao što su Langerhansova ostrvca, ili beta ćelije pankreasa i/ili njihov progenitor.

[0131] Određeni aspekti predmetne objave obezbeđuju upotrebu ne-humane životinje kao što je ovde opisano kako bi se identifikovalo lečenje dijabetesa, predijabetesa ili insulinske rezistencije.

[0132] Određeni primeri izvođenja koji služe kao primer i aspekti ilustrovani su nekim od sledećih primera. Treba razumeti da je sledeći opis u svrhu opisivanja samo određenih primera izvođenja i aspekata i nije namenjen da bude ograničavajući u odnosu na opis iznad.

PRIMER 1 – Kreiranje vaskularizovanog mesta u koži za transplantaciju ostrvaca upotrebom materijala matriksa

[0133] Inicijalno de novo vaskularno ležište kreirano je implantiranjem biorazgradive skele ili materijala matriksa intrakutano, koji su dizajnirani da se integrišu, postajući neoderm.

Lečenje dijabetesa

[0134] Pacijenti sa dijabetesom tipa 1 identifikovani su upotrebom poznatih protokola. Koža 5 se sastoji od tankog površinskog epiderma 15 i debelog dubokog derma 20. Kod takvih pacijenata rez ili otvor 10 načinjen je kroz epiderm 15 i derm 20 do nivoa spoja derma i subkutanog sloja 22 (ali ne protežući se u subkutani sloj). Ovaj rez se kreira tamo gde postoji prirodna labavost kože (na primer, u koži medijalne strane gornjeg dela ruke, u žlebu između biceps mišića i brahialis mišića ili u koži u fleksionom naboru donjeg dela stomaka. Ovo će kreirati prostor u koji se može implantirati matriks ili skela 30 sa zaptivačem ili površinskim slojem 35. Tipično mesto za graft od 4 cm<2>do 25 cm<2>je kreirano 10, kao što je prikazano na Slici 1A, koja je na dan 0. Materijal matriksa 30 insertovan je na takav način da je zaptivač 30 približno u ravni sa površinom kože 5, iako ovo nije neophodno. Donja površina 37 materijala

1

matriksa 30 se ne proteže u subkutani sloj 22, tako da je ceo matriks intrakutan 12 (unutar kože).

[0135] Zatim je izvršena izolacija ćelija ostrvaca za alo-transplantaciju ili auto-transplantaciju kao što je zahtevano od strane onih koji su stručni u oblasti upotrebom poznatih procedura.

[0136] Približno dana 30, kada su dostupne izolovane ćelije ostrvaca, zaptivač 35 ili površinski sloj (epidermalni sloj) koji pokriva gornju površinu 32 materijala matriksa 30 pažljivo je uklonjen. Kao što je prikazano na Slici 1B, materijal matriksa 30 postao je vaskularizovan kako bi se kreiralo neovaskularizovano područje 40, u kome su krvni sudovi 42 prodrli u materijal matriksa 30 koji obezbeđuje pogodno okruženje za zasejavanje ostrvaca. Ćelije ostrvaca su zatim direktno zasejane ili injektirane u sada vaskularizovani materijal matriksa 30 direktnim injektiranjem kroz sada izloženu gornju površinu 32 materijala matriksa 30, kao što je prikazano na Slici 3C sa redovima 55 mesta injektiranja. Otvor 10 je zatim zatvoren preklapanjem materijala matriksa 30 kreirajući V-formaciju 60 na poprečnom preseku i kreirajući linearnu ranu, koja se može osigurati 70 pomoću šavova ili spajalica kao što je prikazano na Slici 1D na 100 dana, na kojoj se otvor 10 zalečio i funkcionalne ćelije ostrvaca se nalaze unutar materijala matriksa za oslobađanje insulina za lečenje pacijenta.

[0137] Normalna koža sadrži molekularni derm i ćelijski epiderm. Materijal matriksa formira neoderm kada se implantira intrakutano u ranu. Veličina pora (srednja vrednost 200 mikrometara), i otvoreno-ćelijska struktura poliuretanske pene (materijal matriksa), podstiče razrastanje krvnih sudova (neovaskularizacija) i invaziju fibroblasta (dermalnih ćelija), sa depozicijom kolagena na takav način da iznenađujuće kreira prostor i kapacitet za implantaciju egzogenih ćelija. Depozicija kolagena unutar materijala matriksa neoderma je spiralna, pre nego laminarna, i edemska. Stoga, rastresito raspoređena poliuretanska pena (materijal matriksa) neoderma može iznenađujuće primiti ćelijsku implantaciju gde normalni derm čvrsto strukturisanog kolagena/elastina neće. Kao takva, ćelijska primena u poliuretansku penu neoderma materijala matriksa čini intrakutanu (unutar kože) primenu.

[0138] U dopunskom obliku primene, materijal matriksa može sadržati primarnu (1°) strukturu matriksa i sekundarnu (2°) strukturu matriksa kao što je prikazano na Slici 1E na kojoj postoji primarni materijal matriksa 100, koji je insertovan u otvor pogodne veličine u kožu pacijenata, u intrakutanom sloju. Primarni materijal matriksa 100 ima unutrašnji deo koji se može ukloniti 110, koji se, posle boravka unutar primarnog otvora tokom potrebnog vremena kako bi se omogućila neovaskularizacija, može ukloniti da ostavi sekundarni otvor 120. Unutrašnji deo 110 se označava kao sekundarni materijal matriksa.

1

[0139] Pogodno izolovan materijal ćelija ostrvaca zatim može biti insertovan u unutrašnji deo 110 materijala matriksa pod kontrolisanim uslovima kako bi se napunio izolovanim ćelijama ostrvaca injekcijom u njegovu gornju površinu. Ovaj napunjeni unutrašnji deo 110 se zatim može ponovo insertovati u sekundarni otvor 120, i primarni otvor zatvoriti na način kao što je opisano iznad.

[0140] Alternativno, sekundarni materijal matriksa 110 može se odbaciti i u sekundarni otvor 120 može se insertovati novi zasebni insert sekundarnog materijala matriksa 130, koji može biti od istog materijala matriksa kao što je in situ primarni materijal matriksa 100 ili može biti od različitog materijala matriksa, koji je prethodno napunjen odgovarajućim ćelijama za lečenje stanja pacijenta. U ovom slučaju novi zasebni insert sekundarnog materijala matriksa 130 je prethodno napunjen izolovanim ćelijama ostrvaca koje mogu biti injektirane u gornju površinu 135 ili u stranice 140. Ovo zatim omogućava efikasno punjenje ćelija ostrvaca u novi zasebni sekundarni materijal matriksa 130 u pogodno kontrolisanim uslovima i tačno postavljanje u otvor 120 u in situ primarnom glavnom materijalu matriksa 100. Vaskularizacija u neovaskularizovanoj zoni primarnog glavnog materijala matriksa 100 neposredno uz prethodno napunjeni novi zasebni insert sekundarnog materijala matriksa 130 i otvoreno ćelijski oblik materijala matriksa omogućava da ćelijski materijal, u ovom slučaju ćelije ostrvaca, direktno difunduju u susednu neovaskularizovanu zonu, kao i omogućava da se dogodi vaskularizacija novog zasebnog sekundarnog materijala matriksa 130.

[0141] Nezavisnost od insulina će se postići sa ukupno > 10000 ekvivalenata ostrvaca po kg telesne težine primaoca.

[0142] Nivoi glukoze i c-peptida u krvi pacijenta se zatim mogu naknadno pratiti kako bi se procenila funkciju ostrvaca.

[0143] Predviđeno je da će introdukcija ćelija na način opisan iznad smanjiti potrebu za podržavajućom imunosupresivnom terapijom.

[0144] U slučaju da se smatra neophodnim da se upotrebljava imunosupresivna terapija za podršku funkciji alo-transplantiranih ćelija, lekar može započeti imunosupresivnu terapiju, na primer upotrebom Edmonton protokola. Primeri tipičnih imunosupresivnih lekova su daklizumab (Zenapax), sirolimus (Rapamune), i takrolimus (Prograf). Primeri drugih imunosupresivnih lekova koji se upotrebljavaju kod transplantacije ostrvaca uključuju antitimocit globulin (Thymoglobulin), alemtuzumab (Campath), baziliksimab (Simulect), belatacept (Nulojix), etanercept (Enbrel), everolimus (Zortress), i mikofenolat mofetil (Cell-Cept, Myfortic).

1

PRIMER 2 – Kompleti i proizvodi

[0145] Za komplete i proizvode za upotrebu u postupcima predmetne objave se smatra da potpadaju unutar obima predmetne objave.

[0146] Komplet može uključivati jednu ili više od sledećih komponenti:

(a) Matriks ili skela za implantiranje u pogodno mesto. Na primer, pena debljine 2-5 mm sa površinom od 4 cm<2>do 25 cm<2>, i koja je biorazgradiv matriks proizveden od poliuretana, opciono sa 150 μm debelom, ne-biorazgradivom, mikroporoznom poliuretanskom membranom za zaptivanje vezanom za površinu. Tipično se steriliše γzračenjem i drži u zapečaćenim paketima.

(ii) Reagensi za introdukovanje ćelija, kao što su ćelije Langerhansovih ostrvaca ili beta ćelije pankreasa, u subjekt, kao što je fiziološki rastvor puferisan fosfatom.

(iii) Uređaj za introdukovanje ćelija u subjekt, kao što je pogodan špric za injektiranje ćelija u željeno vaskularizovano mesto.

(vii) Uputstva.

[0147] Jedna ili više od komponenti kompleta mogu biti upakovane u sterilnom obliku. Druge komponente u kompletu se razmatraju.

[0148] Kombinovani proizvodi koji uključuju jedan ili više od matriksa, uređaja za introdukovanje ćelija i reagenasa takođe se razmatraju. Na primer, kombinovani proizvod može sadržati matriks za implantaciju i uređaj za introdukovanje ćelija u subjekt.

Postupci

Studija na životinjama

[0149] Studija je sprovedena u objektu za životinje akreditovanom za dobru laboratorijsku praksu i odobrena je od strane lokalnog etičkog odbora za životinje. Velike bele/landras (landrace) svinje (Sus scrofa - početna težina 25-30 kg) upotrebljene su u eksperimentima ksenogene transplantacije, dok su vestran (westran) svinje upotrebljene za izogene

1

transplantacije. Standardna ishrana i opšti standardni postupci nege životinja ispoštovani su tokom cele studije. Sve životinje su postile preko noći pre operacije. Intramuskularni koamoksiklav (Clavulox, 3,5 ml) posle operacije i oralno (Clavulox, 2 tablete dva puta dnevno) tokom celog postoperativnog perioda nakon transplantacije. One životinje koje su bile podvrgnute alogenoj ili ksenogenoj transplantaciji stavljene su na imunosupresivni režim koji se sastojao od 0,25 mg/kg takrolimusa i mikofenolata (500 mg) dva puta dnevno, počevši od 1-2 nedelje pre transplantacione operacije.

Materijal mariksa

[0150] Koristi se model svinjske rane kao što je ranije objavljeno (Dearman et al 2012). Materijal matriksa (biorazgradivi privremeni matriks BTM) je obezbedio PolyNovo Biomaterials Pty. Ltd (Port Melbourne, Victoria, Australija) i transplantiran je na zadnji bok svinje. Za ovu studiju, biorazgradiv mikroporozni poliuretanski membranski materijal matriksa debljine 2 mm vezan je za površinsku površinu zaptivača. Četiri rane od 4 cm x 4 cm su hirurški kreirane, gde je puna debljina kože uklonjena do nivoa panniculus adiposus pod opštom anestezijom indukovanom intramuskularnim ketaminom 1 mg/10 kg i održavana je 2,5% izofluoranom putem endotrahealne intubacije. Dlake sa boka i leđa su ošišane, zatim obrijane, pripremljena su dva mesta rana na svakom boku jednako udaljena (4 cm) od kičme sa 4 cm između ipsilateralnih bočnih rana. Sve označene margine rane infiltrirane su subkutano sa 0,5% lignokaina sa 1:400000 adrenalina da pomogne u postoperativnom komforu i smanji gubitak krvi. Zatim je hirurško područje pripremljeno povidon jodom. Rane su bile previjene da bi se smanjilo smicanje i minimalizovala trauma pomoću Acticoat™ (Smith & Nephew Ltd, Hull, Ujedinjeno Kraljevstvo) da bi se minimalizovala infekcija; i na mestu ih drži Hypafix™ (BSN Medical GmBH, Hamburg, Nemačka). Materijal za previjanje u kombinaciji vata/tkanina upotrebljen je za dodatnu zaštitu mesta.

Transplantacija ostrvaca

[0151] Materijalu matriksa je omogućeno da se integriše tokom 17-25 dana pre infuzije ostrvcima. Ostrvca su peletirana u polietilenske tube (unutrašnji prečnik 0,58 mm i spoljašni prečnik 0,965 mm) pre uklanjanja ne-biorazgradivog zaptivača sa svakog mesta rane (delaminacija). Upotrebom čelične šipke od 2 mm kreiran je kanal koji omogućava inserciju kanile napunjene ostrvcima. Hamilton špric sa zavrtanjem je zatim upotrebljen za polaganu

2

infuziju ostrvaca u kreirani kanal. Zatim je uzet rascepljeni kožni graft sa susedne kože i postavljen preko rane. Hirurške spajalice su upotrebljene za zadržavanje grafta kože na mestu.

Ksenogena transplantacija

[0152] Humana ostrvca izolovana u udaljenom centru za izolovanje prebačena su u Adelajd gde su kultivisana tokom maksimalno 6 dana u CMRL kompletnom medijumu suplementovanom sa 2 mM glutamaksa, 10 mM HEPES, pen/strep i 10% humanog albumina (Albumex 20, Crveni krst Australije). Na dan transplantacije ostrvca su isprana sa HBSS, pre punjenja u kanilu. Životinje su humano ubijene 7 dana nakon transplantacije.

Izogena transplantacija

[0153] Izolovana su neonatalna svinjska ostrvca iz vestran prasića u centru za izolovanje u bolnici Vestmid (Westmead) kao što je prethodno objavljeno (Jimenez-Vera et al, 2015) i prebačena su u Adelajd, gde su smeštena u kulturu preko noći pre transplantacije. Ostrvca su transplantirana u vestran primaoce (40-50 kg) posle ispiranja fiziološkim rastvorom i punjenja u kanilu. Sam fiziološki rastvor je upotrebljen kao kontrola transplantacije. Životinje su humano ubijene najmanje 100 dana nakon transplantacije u studiji dugoročnog preživljavanja.

Imunofluorescencija

[0154] Sva tkiva su fiksirana 10% puferisanim formalinom tokom najmanje 3 dana pre obrade. Uzorci su ukalupljeni u parafin i isečeni su preseci od 3 μm i montirani na superfrost plus pločice. Preseci su deparafinisani i rehidratisani pre podvrgavanja otkrivanju antigena koje je posredovano toplotom (citratni pufer pH 6). Preseci su inkubirani sa anti-humani insulin antitelom zamorca (AB7842; Abcam, Cambridge, UK) preko noći kao samim primarnim antitelom na 2 μg/ml na 4 °C. Bojenje insulina je zatim vizuelizovano sekundarnim kozjim anti-zamorca konjugovanim sa rodamin fluorohromom (Jackson ImmunoReasearch, Pennsylvania, SAD) razblaženim 1 u 200 i inkubirano na sobnoj temperaturi u mraku tokom 1 h. Inače su preseci obojeni sa unakrsno reaktivnim zečjim antimišjim CD31 kao primarnim antitelom preko noći na 4 °C (razblaženje 1:50 Ab28364, Abcam Cambridge, UK). HRP-konjugovano kozje anti-zečje poliklonalno (1:2000) je upotrebljeno kao sekundarno antitelo, pre nego što je podvrgnuto pojačavanju signala Tyramide kompletom za pojačavanje signala kao po uputstvima proizvođača (Molecular probes, Thermofisher). Kao što je prikazano na Slici 2, humana ostrvca su transplantirana u prevaskularizovano mesto materijala matriksa 24 dana nakon implantacije u imunosuprimiranu belu landras svinju. A) Hematoksilin i eozin bojenje transplantiranog preseka, strelice označavaju arhitekturu mogućeg ostrvca. Slika snimljena na uvećanju od 100x na Nikon Eclipse. B) Nivo takrolimusa kod transplantirane svinje, x-osa prikazuje dane nakon započinjanja režima imunosupresije lekom koji se sastoji od takrolimusa (0,25 mg/kg) i mikofenolata (500 mg) dva puta dnevno. Crvena strelica označava dan transplantacije sa humanim ostrvcima. C) Imunofluorescentno bojenje mesta materijala matriksa 7 dana nakon transplantacije humanih ostrvaca, gde su preseci od 3 μm podvrgnuti otkrivanju antigena u citratnom puferu pre ciljanja antigena insulina sa kozjim anti-humani insulin primarnim antitelom, koje je zatim vizuelizovano sa kozjim anti-zamorca rodamin konjugovanim sekundarnim (crveno). Preseci su kontra obojeni sa DAPI kako bi se vizuelizovali nukleusi (plavo). Slike su snimljene pomoću Olympus FV3000 konfokalnog laserskog skenirajućeg mikroskopa na uvećanju od 200x.

[0155] Pozivajući se sada na Sliku 3, vestran neonatalna svinjska ostrvca su transplantirana u prevaskularizovano mesto materijala matriksa 18-24 dana nakon implantacije u izogene vestran primaoce. Infuzija fiziološkim rastvorom upotrebljena je kao kontrola transplantacije. A) Hematoksilin i eozin bojenje preseka sa kontrolom transplantacije fiziološkim rastvorom, strelica označava skelu materijala matriksa. Slika snimljena na uvećanju od 40x na Nikon Eclipse. B) Hematoksilin i eozin bojenje preseka sa transplantacijom neonatalnim ostrvcima 101 dan nakon transplantacije. Slika snimljena na uvećanju od 40x na Nikon Eclipse. Crveni okvir označava područje transplantacije. C) Imunofluorescentno bojenje mesta materijala matriksa 101 dan nakon transplantacije neonatalnih ostrvsca, gde su preseci od 3 μm podvrgnuti otkrivanju antigena u citratnom puferu pre ciljanja antigena insulina sa kozjim anti-humani insulin primarnim antitelom, koje je zatim vizuelizovano sa kozjim anti-zamorca rodamin konjugovanim sekundarnim (crveno). Preseci su kontra obojeni sa DAPI kako bi se vizualizovali nukleusi (plavo). Slike su snimljene pomoću Olympus FV3000 konfokalnog laserskog skenirajućeg mikroskopa na uvećanju od 200x.

[0156] Ono što smo videli je da je prateći postupke objave kao što je opisano, insercija ćelija ostrvaca u intrakutani sloj rezultirala većom aktivnošću u proizvodnji insulina u poređenju sa poznatim modelima transplantacije ćelija ostrvaca, kao što su u blizini jetre ili u subkutanoj lokaciji. Povećanje aktivnosti ćelija ostrvaca u intrakutanom sloju bila je najneočekivanija.

[0157] Iako je predmetna objava opisana s pozivanjem na posebne primere, biće cenjeno od strane iskusnih u struci da objava može biti primerno izvedena u mnogim drugim oblicima.

[0158] Pozivanje na bilo koje prethodno stanje tehnike u ovoj specifikaciji nije, i ne bi trebalo da bude uzeto, kao priznanje ili bilo koji oblik sugestije da je ovo prethodno stanje tehnike deo uobičajenog opšteg znanja u bilo kojoj zemlji.

[0159] Kao što se ovde upotrebljava, oblici jednine određenih i neodređenih članova mogu označavati množinu (tj. "jedan ili više", "najmanje jedan", itd.), osim ukoliko specifično nije drugačije naznačeno.

[0160] Kroz celu ovu specifikaciju, ukoliko kontekst ne zahteva drugačije, reč "sadrže", ili varijacije kao što je "sadrži" ili "koji sadrži" podrazumevaće uključivanje navedenog elementa ili celog broja ili grupe elemenata ili celih brojeva ali ne i izuzimanje bilo kog drugog elementa ili celog broja ili grupe elemenata ili celih brojeva.

[0161] Naslovi predmeta upotrebljeni ovde su uključeni samo zarad lakoće upućivanja čitaoca i ne treba ih upotrebljavati za ograničavanje predmetne teme koja se nalazi kroz celu objavu ili patentne zahteve. Naslove predmeta ne treba upotrebljavati u tumačenju obima patentnih zahteva ili ograničavanju patentnih zahteva.

2

Claims

Patentni zahtevi

1. Ćelije koje proizvode insulin za upotrebu u sprečavanju i/ili lečenju dijabetesa, predijabetesa ili insulinske rezistencije kod subjekta, naznačeno time što se navedene ćelije koje proizvode insulin introdukuju u intrakutano mesto kod subjekta, pri čemu se matriks implantira u navedeno intrakutano mesto kod subjekta da omogući neovaskularizaciju intrakutanog mesta sa implantiranim matriksom, pri čemu matriks sadrži biorazgradivi poliuretan; time sprečavajući i/ili lečeći subjekt isporučujući subjektu insulin proizveden iz ćelija.

2. Ćelije koje proizvode insulin za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačeno time što ćelije sadrže alogene ćelije.

3. Ćelije koje proizvode insulin za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 ili 2, naznačeno time što ćelije sadrže ćelije Langerhansovih ostrvaca, beta ćelije pankreasa i/ili njihov progenitorski tip ćelije.

4. Ćelije koje proizvode insulin za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 3 naznačeno time što matriks dodatno sadrži jedan ili više od kolagena, glikozaminoglikana, kopolimera i/ili smeše kolagen-GAG, mukopolisaharida, poli(alfahidroksi kiseline), poli(mlečne kiseline) i/ili njen strukturni izomer, poliglikolne kiseline, hitozana, polimlečno-poliglikolnog polimera, i polikaprolaktona.

5. Ćelije koje proizvode insulin za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 4, naznačeno time što intrakutano mesto sadrži rez ili prazninu načinjenu u tkivu i matriks se implantira u rez ili prazninu.

6. Ćelije koje proizvode insulin za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 5, naznačeno time što matriks dodatno sadrži ne-biorazgradiv zaptivač.

7. Ćelije koje proizvode insulin za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 6, naznačeno time što matriks ne proizvodi znatnu inflamatornu reakciju kada se implantira.

8. Ćelije koje proizvode insulin za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 7, naznačeno time što se 1 x 10<3>do 1,2 x 10<4>ekvivalenata ostrvaca po kg telesne težine subjekta introdukuje u subjekta.

9. Ćelije koje proizvode insulin za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 8, naznačeno time što upotreba sadrži primenu imunosupresivnog agensa subjektu.

10. Ćelije koje proizvode insulin za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 9, naznačeno time što subjekt pati od, ili je podložan, dijabetesu tipa 1, dijabetesu tipa 2, insulinskoj rezistenciji i predijabetesu ili je subjekt podvrgnut pankreatektomiji.