Deprecated: The each() function is deprecated. This message will be suppressed on further calls in /home/zhenxiangba/zhenxiangba.com/public_html/phproxy-improved-master/index.php on line 456
RS60918B1 - Upotreba mikrobnih zajednica za zdravlje ljudi i životinja - Google Patents
[go: Go Back, main page]

RS60918B1 - Upotreba mikrobnih zajednica za zdravlje ljudi i životinja - Google Patents

Upotreba mikrobnih zajednica za zdravlje ljudi i životinja

Info

Publication number
RS60918B1
RS60918B1 RS20201197A RSP20201197A RS60918B1 RS 60918 B1 RS60918 B1 RS 60918B1 RS 20201197 A RS20201197 A RS 20201197A RS P20201197 A RSP20201197 A RS P20201197A RS 60918 B1 RS60918 B1 RS 60918B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
composition
bacteria
intestinal
roseburia
species
Prior art date
Application number
RS20201197A
Other languages
English (en)
Inventor
Sam Possemiers
Massimo Marzorati
De Wiele Tom Van
Ilse Scheirlinck
Den Abeele Pieter Van
Selin Bolca
Davide Gottardi
Original Assignee
Univ Gent
Microbial Resource Man Health Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Gent, Microbial Resource Man Health Nv filed Critical Univ Gent
Publication of RS60918B1 publication Critical patent/RS60918B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/745—Bifidobacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0031—Rectum, anus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
    • A61K9/0056—Mouth soluble or dispersible forms; Suckable, eatable, chewable coherent forms; Forms rapidly disintegrating in the mouth; Lozenges; Lollipops; Bite capsules; Baked products; Baits or other oral forms for animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/10—Laxatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/12—Antidiarrhoeals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/26—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of pH
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/34—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of gas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/11—Lactobacillus
    • A23V2400/169—Plantarum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/51—Bifidobacterium
    • A23V2400/513—Adolescentes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/51—Bifidobacterium
    • A23V2400/533—Longum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K2035/11—Medicinal preparations comprising living procariotic cells
    • A61K2035/115—Probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)

Description

Opis
Tehničko polje pronalaska
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na smešu bakterija koje pripadaju najmanje 6 ili 7 različitih i specifičnih vrsta bakterija, poželjno za upotrebu u sprečavanju ili lečenju gastrointestinalnih poremećaja. Poželjnije je da se pomenuta smeša bakterija uzgaja zajedno u fermentatoru pre nego što se navedena smeša da ispitaniku kako bi se sprečio ili lečio pomenuti poremećaj.
Pozadina stanja tehnike
[0002] Ekosistem ljudskih i životinjskih creva sastoji se iz mnoštva različitih staništa i metaboličkih niša koje kolonizuju takozvana mikrobiota koja sadrži više od 10<11>mikroorganizama po gramu vlažne mase sadržaja, pretežno anaeroba (Macfarlane & Macfarlane, 1997). U današnje vreme je dobro poznato da mikrobiom creva ljudi ili životinja igra presudnu ulogu u ljudskom zdravlju i blagostanju doprinoseći energetskom sakupljanju, modulirajući imuni sistem i uspostavljajući otpornost na kolonizaciju protiv oportunističkih patogena (Fuller & Gibson, 1997; Cummings & Macfarlane, 1997). Postoje dokazi da je interakcija bakterija i njihovih metabolita sa slojem sluzi i/ili sa crevnim zidom creva važna (Barnett i dr.2012). Iako je mikrobiom creva generalno stabilan tokom vremena, njegov sastav se menja usled spoljnih poremećaja, kao što su promene u ishrani, upotreba antibiotika, povećana higijena i stres. To dovodi do neuravnoteženog stanja u gastrointestinalnom traktu, koje se naziva disbioza (Clemente i dr.2012). Disbiozu karakterišu umereni ili ozbiljni poremećaji u normalnom sastavu mikrobioma creva, što uzrokuje nedostatak ključnih mikrobioloških vrsta, praznine u specifičnim mikrobnim funkcijama i, kao posledicu, poremećenu modulaciju aktivnosti crevnog zida. To može dovesti do kolonizacije patogenih mikroorganizama - uzrokujući dijareju ili nekrotizirajući enteritis (Sekirov i dr., 2008). Jedan od ekstremnih oblika takve patogeneze je CDAD (dijareja povezana sa Clostridium difficile) za koji klasična antibiotska terapija sve više ne uspeva da leči pacijenta. Ostale posledice mikrobne disbioze mogu biti ugroženi imunološki odgovor - koji rezultira hroničnom inflamacijom (Willing i dr., 2009) ili alergijama na hranu - ili povećana propustljivost creva, malapsorpcija hranljivih sastojaka ili čak bakterijemija. Neželjeni efekti disbioze na mikrobiološku funkcionalnost i fiziologiju crevnih zidova mogu na taj način ugroziti ljudsko zdravlje. U stvari, zatvor, IBS, IBD, poučitis, metabolički sindrom, gojaznost, dijabetes, kardiovaskularne bolesti, mentalna stanja, oštećena kognitivne funkcije, neurodegenerativna bolest, različite vrste karcinoma (npr. rak debelog creva), inflamacija ženskog reproduktivnog aparata, CDAD, reumatizam ili reumatoidni artritis su svi povezani sa promenama u aktivnosti/sastavu crevne mikrobiote. Stoga je jasno da disbiozu treba izbegavati ili otklanjati po njenoj pojavi.
[0003] Kada je disbioza povezana sa prisustvom patogena, očigledna strategija uklanjanja mikroorganizama štetnih po zdravlje je primena antibiotskih sredstava. Međutim, široko rasprostranjena i nepravilna upotreba antibiotika širokog spektra tokom poslednjih decenija dramatično je povećala rezistenciju na antibiotike (Brandl i dr., 2008). Štaviše, antibiotici takođe štete autohtonim crevnim mikroorganizmima - od kojih mnogi ispunjavaju ključne funkcije i donose zdravstvene koristi - što pogoršava stanje disbioze. Kao rezultat, u poslednje 2 decenije zabeležen je strašan porast u istraživanju funkcionalne hrane, posebno u razvoju prebiotičkih i probiotičkih proizvoda. Iako je prebiotički koncept atraktivan jer se tiče prehrambene modulacije autohtonih crevnih mikroorganizama koji su već prilagođeni domaćinu (Van Loo i dr., 1999), prvenstveno se koristi na preventivni način. Za terapijsku primenu, ozbiljno poremećeni crevni mikrobiom više bi imao koristi od unošenja ključnih mikrobnih vrsta, umesto davanja supstrata koji imaju koristi od vrsta koje promovišu zdravlje i koje su manje obilne ili čak odsutne kod obolele osobe. Moguće rešenje je uvođenje održivih mikroorganizama koji promovišu zdravlje, nazvanih probiotici (lannitti i Palmieri, 2010). Probiotički proizvodi se uglavnom sastoje od jednog do nekoliko međusobno povezanih sojeva mikroba (uglavnom bakterija koje proizvode mlečnu kiselinu) sa specifičnom funkcionalnošću. Međutim, preživljavanje probiotičkih sojeva tokom teških uslova gornjeg digestivnog trakta predstavlja izazov i konkurenciju ogromnom autohtonom mikrobiomu je često zanemarljivo. Ipak, koncept uvođenja novih vrsta u ugroženi ekosistem creva dobio je zamah poslednjih godina primenom fekalnih mikrobioloških transplantacija (FMT) (Khoruts i dr., 2010). To podrazumeva prenos fekalne kaše mikroba sa zdravog davaoca na obolelog primaoca. Ovaj oblik bakterioterapije uglavnom se primenjuje za lečenje infekcija otpornih na antibiotike i ima stopu izlečenja od 90% i više. Trenutno se FMT razmatra za lečenje mnogih drugih patologija koje potiču od gastrointestinalne disbioze (Kronova bolest, gojaznost, sindrom iritabilnog creva). Čini se da FMT efikasno deluje tamo gde pojedinačni probiotički sojevi često ne uspevaju. Ipak, loše okarakterisana priroda fekalnih transplantacija dolazi sa rizicima prenosa zaraznih bolesti i trenutno pokreće pitanja o široko rasprostranjenoj primeni u manje akutnim i po život opasnim patologijama (De Vrieze 2013).
[0004] Početkom 2013. godine, alternativa za fekalne mikrobiološke transplantacije ušla je na teren objavljivanjem naučnog rada (Petrof i dr., 2013) i prijavom patenta (WO2013037068 -Postupak lečenja poremećaja gastrointestinalnog sistema) o upotrebi sintetičke smeše mikroba, koji su izolovani od pojedinca na osnovu njihove kulture, kao terapeutsko sredstvo za lečenje CDAD. Takav proizvod se takođe sastoji iz poznatog skupa mikroorganizama, koji bi uklonili zabrinutost zbog prenošenja bolesti sa fekalnih transplantacija, kada se poštuju QPS kriterijumi. Međutim, mešanje mikroorganizama ne garantuje im međusobnu interakciju i zauzimanje funkcionalnih niša koje zahtevaju mikrobno umrežavanje. Stoga se ne mogu garantovati stabilnost proizvoda, standardizacija i obavljanje važnih funkcija.
[0005] U patentnoj prijavi WO2014145958A2 (Mrežni mikrobni sastavi i postupci), predloženo je davanje sisaru, kome je potrebna efikasna količina terapeutske bakterijske smeše, više izolovanih bakterija ili prečišćeni bakterijski preparat. Mnoštvo izolovanih bakterija ili prečišćeni bakterijski preparat je u stanju da formira takozvanu ekološku mrežu. Bakterije koje pripadaju ovom preparatu su odabrane na osnovu genomskih informacija i pružaju se sisarima kao labavo sastavljeni soj.
[0006] U objavi Becker i dr., (2011) opisana je zajednica koja se sastoji iz 8 različitih vrsta: Anaerostipes caccae, Bacteroides thetaiotaomicron, Bifidobacterium longum, Blautia producta, Clostridium butyricum, Clostridium ramosum, Escherichia coli, Lactobacillus plantarum. Zajednica se naziva SIHUMIx (proširena pojednostavljena ljudska mikrobiota).
Ova veštačka mikrobna zajednica je testirana u ispitivanjima na pacovima, upoređujući SIHUMIx inokulirane pacove sa konvencionalnim pacovima povezanim sa ljudima i bez klica. Autori tvrde da je zajednica reprezentativna za mikrobiotu povezanu sa ljudskim debelim crevom u pogledu sastava i funkcionalnosti. Mikrobna zajednica se razvijala u zavisnosti od starosti pacova, ali je vremenom postigla stabilan sastav.
[0007] Van den Abbeele i dr., (2013) sugerisali su mogućnost stvaranja zajednice koja razgrađuje glikan korišćenjem konvencionalnih in vitro fermentatora koji se mogu inokulirati odgovarajućim ključnim vrstama i mešavinom mikroba koji ukrštaju hranjenje. Posle inokulacije i stabilizacije, takva mikrobiološka mrežna jedinica za određene funkcije može se postići i proizvesti u velikom obimu.
[0008] Konačno, Newton i dr., (1998) koristili su anaerobne hemostate za stvaranje reproduktivno definisanih bakterijskih zajednica koje se sastoje iz 14 različitih vrsta saharolitičkog i aminokiselinskog vrenja (tj. Bifidobacterium longum, Bif. adolescentis, Bif. pseudolongum, Bif. infantis, Bacteroides thetaiotaomicron, Bact. vulgatus, Lactobacillus acidophilus, Enterococcus faecalis, Ent. faecium, Escherichia coli, Clostridium perfringens, CI. butyricum, CI. innocuum, CI. Bifermentans) za ispitivanje efekta sulfat-redukujuće bakterije (SRB) Desulfovibrio desulfuricans na druge crevne organizme.
[0009] Ipak, još uvek postoji potreba za dizajniranjem alternativnih i specifičnih smeša bakterijskih vrsta koje se mogu efikasno koristiti za sprečavanje ili lečenje gastrointestinalnih poremećaja. Štaviše, potpuno je nepoznato da li unapred prilagođene smeše deluju i terapeutski, lošije ili bolje u poređenju sa davanjem labavo sastavljenih i neprilagođenih smeša istih bakterijskih vrsta.
Kratak opis slika
[0010]
Slika 1: Šematski prikaz SHIME® jedinice koja se sastoji iz želuca, tankog creva i tri različita regiona debelog creva. Tečni SHIME® hranljivi medijum i tečnost pankreasa ulaze u odeljke koji simuliraju stomak, odnosno tanko crevo. Posle definisanog vremena boravka u ovim sterilnim odeljcima, suspenzija prelazi u tri uzastopna odeljka debelog creva, u uzlazni, dijagonalni i silazni odeljak debelog creva, od kojih svaki karakterišu različiti pH i vreme boravka. Ovi odeljci su inokulirani ljudskom fekalnom mikrobiotom. Sve posude se održavaju anaerobno ispiranjem prostora za glavu N2, neprekidno se mešaju i drže na 37°C.
Slika 2: Proizvodnja butirata iz 23 različita sastava nakon 24-časovne inkubacije (gornja ploča) i uticaj na električni otpor transepitela (TEER) Caco-2 ćelija uzgajanih u prisustvu THP1 ćelija (donji panel). Za potonje, uzorci prikupljeni iz 23 inkubacije nakon 24 sterilno su filtrirani i dodavani (1:5 v/v) tokom 24 sata u apikalni odeljak ćelija Caco-2 uzgajanih 14 dana na polupropusnim umecima i stavljeni na vrh makrofaga izvedenih iz PMA stimulisanih THP1 (kokulture). Kao kontrola je korišćen samo medijum za rast (DMEM). THP1 ćelije kultivisane u prisustvu PMA tokom 48 h indukuju oštećenje na Caco-2 ćelijama mereno smanjenjem TEER u DMEM kontroli. TEER vrednosti su normalizovane na vrednosti izmerene pre kokulture (0 h) i eksprimirane su u procentima od početne vrednosti. Kodiranje različitih sastava bilo je sledeće: MX-Y, u kome je X = broj izolata prisutnih u kompoziciji i Y = jedinstveni sastav A, B, C itd. sa X izolatima.
Slika 3: Proizvodnja butirata nakon 24h i 48h inkubacije u kondicioniranom SHIME® hranljivom medijumu bilo kompletnim sastavom 7 vrsta ili sastavima 6 vrsta, u kojima je svaki put izostavljena jedna od 7 originalnih vrsta. Rezultati su predstavljeni kao procenat proizvodnje butirata otkriven u svakoj inkubaciji sa sastavom od 6 vrsta, za razliku od sastava koji se sastoji iz svih 7 vrsta. Sastavi se nazivaju „Ukupni“ (svih 7 vrsta) ili „Ukupni - X“, pri čemu je X vrsta koja je izostavljena iz ukupnog sastava. *: p<0,05 u poređenju sa „Ukupnim“ za 24 sata; #: p<0,05 u poređenju sa „Ukupnim“ za 48 sata;
Slika 4: Nivoi (mM) butirata, propionata i acetata proizvedeni u sastavu tokom petodnevne anaerobne inkubacije u kondicioniranom SHIME® hranljivom medijumu. Sastav je proizveden ili strategijom „Skupa“ (levi panel) ili strategijom „Kolaboroma“ (desni panel).
Slika 5: Evolucija nivoa (mM) propionata (levi panel) i butirata (desni panel) tokom 14-dnevnog vremenskog perioda u 3 nezavisna proizvodna ciklusa sastava kroz strategiju „Kolaboroma“. Nakon početnog rasta u odgovarajućoj podlozi za kultivisanje, sojevi sastava su mešani, inokulirani i kultivisani tokom 14 dana u tri primerka u SHIME® postavci, koja se sastojala iz jednog regiona debelog creva pri pH 6,15-6,4.
Slika 6: Razvoj nivoa SCFA izražen kao mol% acetata, propionata i butirata tokom vremena, nakon proizvodnje sastava kroz alternativnu strategiju „Kolaboroma“.
Nakon početnog rasta u odgovarajućem medijumu za kulturu, sojevi smeše su mešani, inokulirani i kultivisani tokom 8 dana u tri primerka u pojedinačnim fermentatorima koji su radili u režimu serije. U određenim intervalima od 16 h, 40% (v:v) medijum za rast zamenjen je kondicionim SHIME® hranljivim medijumom.
Slika 7: Proizvodnja (mM) acetata, propionata, butirata i ukupnih masnih kiselina kratkog lanca (SCFA) u 24-časovnim inkubacijama sa (i) sterilnim bazalnim medijumom (gornja ploča) ili sterilnim medijumom snabdevenim sa (ii) mikrobiotom izvedenim iz SHIME regiona debelog creva (srednja ploča) ili (iii) fekalnom mikrobiotom (donja ploča). Primenjeni su različiti tretmani sa sastavom, proizvedenim kroz strategiju "Kolaboroma", u rasponu od 0% do 4% i 20% ukupne zapremine inkubacije.
Slika 8: Evolucija nivoa (mM) acetata (gornja ploča), propionata (srednja ploča) i butirata (donja ploča) u eksperimentu za oporavak antibiotika u M-SHIME®. Nakon indukcije disbioze mikrobiote debelog creva izvedene iz SHIME® davanjem koktela antibiotika (40/40/10 mg/L amoksicilina/ciprofloksacina/tetraciklina), disbiozirana mikrobiota je pet dana tretirana sastavom, proizvedenom bilo kroz strategiju „Skupa“ ili strategiju „Kolaboroma“ (1. dan = početak davanja sastava). Rezultati su izraženi kao delta SCFA nivoa u SHIME u svakoj vremenskoj tački vs. vrednosti pre davanja antibiotika.
Slika 9: Nivoi (mM) acetata (gornja ploča), propionata (srednja ploča) i butirata (donja ploča) u eksperimentu oporavka od IBD povezanim sa IBD u M-SHIME®.4 Tri nezavisne posude debelog creva SHIME® inokulirane su fekalnim materijalom pacijenta sa ulceroznim kolitisom. Istovremeno, pojedinačna doza smeše, proizvedena bilo strategijom „Skupa“ ili strategijom „Kolaboroma“, dodata je u odgovarajuću SHIME posudu debelog creva. Treći eksperiment je tekao paralelno kao kontrolni eksperiment bez davanja sastava. Proizvodnja acetata, propionata i butirata praćena je 1 i 2 dana nakon davanja sastava.
Slika 10: Evolucija nivoa (mol%) acetata, propionata i butirata u eksperimentu za oporavak antibiotika na miševima C57/BL6. Posle kontrolnog perioda u kojem su miševi hranjeni standardnom ishranom, indukovana je mikrobiotska disbioza creva dodavanjem klindamicina (250 mg/L) u vodu za piće tokom 5 dana. Posle toga, miševima (n=10/grupa) je oralno ispirano 5 dana sa bilo kojim fiziološkim rastvorom (bez kontrole bakterijske intervencije; levi panel), sastav, proizveden kroz strategiju „Saradnje“ (srednja ploča) ili prošireni sastav, proizveden kroz strategiju „Kolaboroma“ (desna tabla). Uzorci fekalija miševa dobijeni iz iste intervencione grupe su objedinjeni i kvantifikovani su nivoi acetata, propionata i butirata.
Slika 11: Evolucija indeksa aktivnosti bolesti (DAI) i promena težine u eksperimentu kolitisa izazvanog TNBS kod miševa C57/BL6. Posle jednonedeljnog perioda aklimatizacije u kojem su miševi hranjeni standardnom ishranom, započet je eksperiment. Svaka grupa (n = 9/grupi) lečena je 5 dana uzastopno oralnim vađenjem. Preventivno doziranje svih tretmana započelo je 1 dan pre rektalnog davanja 2 mg TNBS/50% EtOH i trajalo je 4 dana nakon primene TNBS, pre nego što su miševi žrtvovani. Uključeni su sledeći tretmani: TNBS fiziološki rastvor (TNBS kontrola vozila); Sastav TNBS , proizveden kroz strategiju „Skupa“, i sastav TNBS , proizveden kroz strategiju „Kolaboroma“. Konvencionalna grupa (bez tretmana TNBS-om, ali tretirana fiziološkim rastvorom) je uključena kao kontrola nosača. Slika 12: Evolucija indeksa aktivnosti bolesti (DAI) u eksperimentu hroničnog kolitisa izazvanog DSS-om na miševima C57/BL6. Posle jednonedeljnog perioda aklimatizacije u kojem su miševi hranjeni standardnom ishranom, započet je eksperiment. Svaka grupa (n = 10/grupi) lečena je 3 puta nedeljno tokom 8 uzastopnih nedelja oralnom gavažom. Preventivno doziranje svih tretmana započeto je nedelju dana pre prvog DSS ciklusa. Prvi DSS ciklus započeo je 2. nedelje i obuhvatao je nedelju davanja DSS (0,25% u vodi za piće), nakon čega su sledile dve nedelje oporavka. Ovaj prvi ciklus praćen je identičnim drugim DSS ciklusom. Treći DSS ciklus sastojao se od jedne nedelje davanja DSS, nakon čega je usledio nedelju oporavka, nakon čega su životinje žrtvovane. Uključeni su sledeći tretmani: DSS fiziološki rastvor (DSS kontrola vozila); Sastav DSS , proizveden kroz strategiju „Kolaboroma“. Konvencionalna grupa (bez tretmana DSS, ali tretirana fiziološkim rastvorom) je uključena kao kontrola nosača.
Rezime pronalaska
[0011] Predmetni pronalazak se u prvom redu odnosi na sastav koji se sastoji u osnovi iz bakterija koje pripadaju vrsti Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominis, Akkermansia muciniphila, Lactobacillus plantarum i Anaerostipes caccae poželjno za upotrebu za sprečavanje ili lečenje simptoma povezanih sa gastrointestinalnim poremećajem.
[0012] Drugim rečima, predmetni pronalazak se odnosi na postupak za sprečavanje ili lečenje simptoma povezanih sa gastrointestinalnim poremećajem kod ispitanika kome je to potrebno, koji se sastoji iz davanja terapeutski efikasne količine sastava koja se sastoji u osnovi iz bakterija koje pripadaju vrsti Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominis, Akkermansia muciniphila, Lactobacillus plantarum i Anaerostipes caccae.
[0013] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na sastav kako je iznad opisano, gde je navedeni gastrointestinalni poremećaj poremećaj barijere funkcije creva, dijareja, zatvor, sindrom iritabilnog creva, inflamatorna bolest creva, Kronova bolest, ulcerozni kolitis, celijakija, poučitis, mukozitis, infekcija creva, disbioza crevnih mikrobiota ili bilo koja njihova kombinacija.
[0014] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na sastav kako je iznad opisano, gde se navedeni gastrointestinalni poremećaj sprečava ili leči putem: a) stimulisanje rasta i/ili aktivnosti jedne ili ograničenog broja korisnih bakterija u crevnom traktu, b) inhibiranje rasta i/ili aktivnosti jedne ili ograničenog broja patogenih bakterija u crevnom traktu, c) relativno povećanje vezivanja ne patogenih bakterija na sluznicu gastrointestinalne površine, d) smanjenje nekontrolisanog unosa antigena, pro-inflamatornih, bakterija ili bakterijskih proizvoda u creva, e) pružanje antiinflamatorne aktivnosti na crevnoj površini, f) povećanje funkcionisanja crevne barijere, d) stvaranje bakterijskih metabolita ili h) bilo koja kombinacija od a) do d).
[0015] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na sastav kako je iznad opisano, a koji se bakterijama koje pripadaju vrsti Roseburia hominis eliminišu iz navedenog sastava.
[0016] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na sastav kako je iznad opisano, gde se u navedeni sastav dalje dodaju bakterije koje pripadaju vrstama Escherichia coli, Enterococcus faecium, Lactobacillus mucosae, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium longum, Bacteroides thetaiotaomicron i Bacteroides vulgatus.
[0017] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na sastav kako je iznad opisano koji dalje sadrži jedan ili više prebiotika.
[0018] U poželjnom otelotvorenju, predmetni pronalazak odnosi se na sastav kako je iznad opisano, gde su pomenute bakterije unapred adaptirane uzgajanjem u fermentatoru pre davanja pomenutog sastava za sprečavanje ili lečenje navedenih gastrointestinalnih poremećaja.
[0019] S tim u vezi, predmetni pronalazak se dalje odnosi na sastav kako je iznad opisano, gde je navedeni fermentator dinamički simulator gastrointestinalnog trakta.
[0020] Preciznije, predmetni pronalazak se odnosi na sastav kako je iznad opisano, gde su pomenute bakterije izabrane sa liste sledećih sojeva: Faecalibacterium prausnitzii LMG P-29362, Faecalibacterium prausnitzii DSMZ 17677, Butyricicoccus pullicaecorum LMG P-29360, Butyricicoccus pullicaecorum LMG24109, Roseburia inulinivorans LMG P-29365, Roseburia inulinivorans DSMZ 16841, Roseburia hominis LMG P-29364, Roseburia hominis DSMZ 16839, Akkermansia muciniphila LMG P-29361, Akkermansia muciniphila DSMZ 22959, Lactobacillus plantarum LMG P-29366, Lactobacillus plantarum ZJ316, Anaerostipes caccae LMG P-29359, Anaerostipes caccae DSMZ 14662 i/ili sojevi koji pokazuju najmanje 97% identičnosti sekvence sa 16SrRNK sekvencama najmanje jednog od navedenih sojeva.
[0021] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na sastav kako je iznad opisano, gde je navedeni sastav farmaceutski sastav formulisana ili kao rektalno davani oblik ili oralno svarljivi oblik.
[0022] S tim u vezi, predmetni pronalazak se dalje odnosi na sastav kako je iznad opisano, gde je navedeni oralno svarljivi oblik kapsula, mikrokapsula, tableta, granula, prah, lozenga, pilula, suspenzija ili sirup.
[0023] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na sastav kako je iznad opisano koji je ugrađen u hranu, piće, dodatak hrani ili nutraceutik.
[0024] Predmetni pronalazak se konkretnije odnosi na sastav kako je iznad opisano, gde navedeni sastav sadrži između 10<5>i 10<11>jedinica formiranja kolonija bakterija.
Opis pronalaska
[0025] Mikrobiom creva sadrži stotine vrsta mikroba koje koegzistiraju u okviru različitih ispitanika i koje komuniciraju međusobno i sa domaćinom. U današnje vreme se generalno veruje da mikrobiota creva igra ključnu ulogu u ljudskom zdravlju i bolestima regulišući
1
metaboličke funkcije i imunološku homeostazu (Cénit i dr, 2014). Nekoliko ispitivanja je istraživalo ove složene mikrobne zajednice u crevima u pokušaju da definišu „osnovni mikrobiom“, podrazumevajući da sve ljudske jedinke dele ključni broj esencijalnih vrsta ili sojeva koji definišu funkcionalne mogućnosti zdravog crevnog mikrobioma (Kinross i dr., 2011). Na osnovu ovog koncepta (tj. da su svi ljudi naseljeni osnovnim mikrobiomom), dostupna je opsežna literatura o sastavu i funkciji crevne mikrobiote (npr. ključne vrste, sluznica u odnosu na luminalnu mikrobiotu, proksimalne u odnosu na distalne bakterije debelog creva, itd.) i funkcionalne analize genoma, mogla bi se identifikovati lista mikrobnih kandidata koja pokriva glavne funkcionalnosti složenog mikrobioma ljudskog creva.
[0026] Predmetni pronalazak se u prvom redu odnosi na specifičan izbor podgrupe bakterijskih vrsta mikrobioma ljudskog creva koje imaju poseban i iznenađujući efekat. Preciznije, predmetni pronalazak se odnosi na sastav koji se sastoji u osnovi iz bakterija koje pripadaju vrsti Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominis, Akkermansia muciniphila, Lactobacillus
plantarum i Anaerostipes caccae poželjno za upotrebu za sprečavanje ili lečenje simptoma povezanih sa gastrointestinalnim poremećajem. Termin „koji se u osnovi sastoji iz“ ukazuje da pomenuti sastav može da uključuje druge bakterijske vrste i/ili druge komponente pod uslovom da ne utiču negativno na efekat (tj. sprečavanje ili lečenje simptoma povezanih sa gastrointestinalnim poremećajem) pomenutog sastava. U jednom otelotvorenju, sastav pronalaska sadrži bakterije koje pripadaju vrsti Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominis, Akkermansia muciniphila, Lactobacillus plantarum i Anaerostipes caccae.
[0027] U drugom otelotvorenju, sastav pronalaska sastoji se iz bakterija koje pripadaju vrsti Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominis, Akkermansia muciniphila, Lactobacillus plantarum i Anaerostipes caccae.
[0028] Bakterijska vrsta Faecalibacterium prausnitzii (Duncan i dr.2002), Butyricicoccus pullicaecorum (Eeckhaut i dr.2008), Roseburia inulinivorans (Duncan i dr.2006), Roseburia hominis (Duncan i dr.2006), Akkermansia muciniphila (Derrien i dr.2004), Lactobacillus plantarum (Walter 2008) i Anaerostipes caccae (Schwiertz i dr.2002) su dobro poznate bakterijske vrste stručnjaku. Termini „simptomi povezani sa gastrointestinalnim poremećajem“ odnose se na zdravstvene probleme kod ljudi i životinja. Upotreba sastava predmetnog pronalaska preciznije dovodi do prevencije/oporavka od disbioze što rezultira pozitivnom modulacijom interakcije između bakterija i crevne površine. Kao rezultat, dobija se poboljšano funkcionisanje crevne površine: na primer. barijera, hormonalno, imunološko funkcionisanje. Efekat na crevnu površinu je brži kada se dozira „unapred prilagođeni sastav“ u poređenju sa labavo sastavljenim skupom istih sojeva (videti dalje). Kako se ovde koristi, moduliranje ili poboljšanje barijere, hormonalne ili imunološke funkcije crevne površine podrazumeva menjanje bilo kog parametra koji utiče na normalnu homeostazu crevne površine, a posebno na njegovu ulogu u odbrani prve linije od invazije patogena, antigeni ili druge štetne materije i njihova uloga u stvaranju supstanci (npr. imuni molekuli, hormoni) koji imaju sistemski uticaj na domaćina. Navedeni parametri uključuju, ali nisu ograničeni na:
• stimulacija rasta i/ili aktivnosti jedne ili ograničenog broja korisnih bakterija u crevnom traktu (npr. laktobacili, bifidobakterije, bakterije koje proizvode butirat ili propionat, druge);
• inhibicija rasta i/ili aktivnosti jedne ili većeg broja patogenih bakterija u crevnom traktu;
• relativno povećanje vezivanja ne patogenih bakterija za sluznicu crevne površine; • smanjenje nekontrolisanog unosa iz creva antigena, pro-inflamatornih molekula, bakterija ili bakterijskih proizvoda;
• modulacija limfoidnog tkiva povezanog sa crevima (GALT) i imunološkog sistema domaćina;
• proizvodnja specifičnih bakterijskih metabolita (npr. propionat, butirat); i
• modulacija proizvodnje određenih crevnih signalnih molekula koji direktno ili indirektno moduliraju metaboličku homeostazu (npr. pro-glukagon, GLP-1, GLP-2, FIAF).
[0029] Predmetni pronalazak se stoga odnosi na sastav kako je iznad opisano, gde se navedeni gastrointestinalni poremećaj sprečava ili leči putem: a) stimulisanje rasta i/ili aktivnosti jedne ili ograničenog broja korisnih bakterija u crevnom traktu, b) inhibiranje rasta i/ili aktivnosti jedne ili ograničenog broja patogenih bakterija u crevnom traktu, c) relativno povećanje vezivanja ne patogenih bakterija na sluznicu gastrointestinalne površine, d) smanjenje nekontrolisanog unosa antigena, pro-inflamatornih, bakterija ili bakterijskih proizvoda u creva, e) pružanje antiinflamatorne aktivnosti na crevnoj površini, f) povećanje funkcionisanja crevne barijere, d) stvaranje bakterijskih metabolita ili h) bilo koja kombinacija od a) do d).
[0030] Zdravstvena stanja koja mogu biti povezana sa opštim gastrointestinalnim poremećajima uključuju -ali nisu ograničena na-: zatvor, sindrom iritabilnog creva (IBS), inflamatorne bolesti creva (IBD), mikrobiota creva, mukozitis, metabolički sindrom, gojaznost, dijabetes, kardiovaskularna bolest, sindrom hroničnog umora, mentalno stanje, oštećena kognitivna funkcija, neurodegenerativna bolest, oblik raka, autoimuno stanje, poremećeno imunološko funkcionisanje, reumatizam, reumatoidni artritis, inflamacija ženskog reproduktivnog aparata, infekcija patogena (bakterija, virusa i gljivica). Primeri neurodegenerativnih bolesti uključuju, ali nisu ograničeni na ALS, demenciju, Alchajmerovu, Parkinsonovu i Hantingtonovu bolest. Primeri vrsta karcinoma uključuju, ali nisu ograničeni na rak pluća, rak dojke, rak prostate, rak pankreasa i naročito kolorektalni karcinom. Primeri autoimunih bolesti uključuju, ali nisu ograničeni na multiplu sklerozu, atopijski dermatitis, celijakiju, psorijazu i lupus.
[0031] Na osnovu zapažanja da sastavi predmetnog pronalaska pojačavaju interakciju i/ili aktivnost ne patogenih bakterija na sluznom sloju gastrointestinalnog epitela, predviđeno je da su navedeni preparati posebno korisni za poboljšanje barijerne funkcije crevne površine, kao što je na primer sprečavanje ili smanjenje nekontrolisanog unosa iz creva antigena, proinflamatornih molekula, patogenih bakterija ili bakterijskih proizvoda. Jedna od takvih indikacija, sa oštećenom sluznom barijerom, je inflamatorna bolest creva. Kako je opšte prihvaćeno da je kod inflamatornih bolesti creva povreda sluzokože sa oštećenom rezolucijom lezija jedan od ključnih elemenata koji dovode do ovih hroničnih indikacija, sastavi predmetnog pronalaska imaju blagotvorno dejstvo na navedenu indikaciju. Shodno tome, cilj predmetnog pronalaska je da obezbedi upotrebu sastava predmetnog pronalaska u prevenciji i lečenju stanja povezanih sa oštećenom funkcijom barijere i koje karakteriše nekontrolisano unošenje iz creva antigena, pro-inflamatornih molekula, patogene bakterije ili bakterijski proizvodi.
[0032] "Inflamatorne bolesti creva" koje se takođe koriste kao "hronične bolesti debelog creva", kako se ovde koriste, uključuju svako stanje koje karakteriše uporna inflamacija sluzokože na različitim nivoima gastrointestinalnog trakta, kao što su na primer sindrom inflamatornog creva, mukozitis, čir na želucu, Kronova bolest, ulcerozni kolitis, rak debelog creva i poučitis.
1
[0033] Kako se mukozitis generalno prepoznaje kao suštinski okarakterisan upalom površine sluzokože koja pokriva usta i gastrointestinalni trakt, tipično kao neželjeni događaj hemoterapije i radioterapije ili transplantacije matičnih ćelija, takođe treba predvideti da primena sastava predmetnog pronalazak imaju blagotvorno dejstvo na pomenutu indikaciju. Shodno tome, cilj predmetnog pronalaska je da obezbedi upotrebu sastava predmetnog pronalaska u prevenciji i lečenju stanja povezanih sa mukozitisom. Mukozitis se može javiti bilo gde duž gastrointestinalnog trakta. U slučaju pojave u usnoj šupljini, obično se naziva oralni mukozitis.
[0034] Takođe treba predvideti da primena sastava predmetnog pronalaska pruža zaštitu od invazije antigenima koji uzrokuju alergijske reakcije, pri čemu takvi alergeni mogu sadržati određene prehrambene supstance, hemikalije i druge molekule. Prema tome, u sledećem otelotvorenju, predmetni pronalazak obezbeđuje upotrebu sastava u prevenciji i lečenju stanja povezanih sa invazijom antigenima koji uzrokuju alergijske reakcije (npr. alergije na hranu, astma, ekcem)
[0035] Dalje se takođe predviđa da primena sastava utiče i na limfoidno tkivo povezano sa crevima (GALT), kao i na sistemski imuni sistem. Između ostalih efekata, ovo može rezultirati smanjenom ekspresijom pro-inflamatornih citokina i povećanom proizvodnjom imunoregulacionih faktora i poboljšanom aktivnošću limfocita. Stoga se predviđa da su navedeni sastavi posebno korisni u poboljšanju razvoja i funkcionisanja imunološkog sistema domaćina.
[0036] U drugom aspektu pronalaska, na osnovu zapažanja da sastavi predmetnog pronalaska moduliraju epitelnu barijeru i posledično smanjuju hroničnu inflamaciju, predviđeno je da su pomenuti sastavi naročito korisni u kontroli i poboljšanju metaboličke homeostaze.
Neograničavajući efekti navedenih preparata na metaboličku homeostazu uključuju kontrolu unosa hrane i metabolizma masti i glukoze, poboljšanje sekrecije i osetljivosti insulina i kontrolu sinteze i metabolizma holesterola. Shodno tome, cilj predmetnog pronalaska je da obezbedi upotrebu sastava predmetnog pronalaska u upravljanju unosom hrane, indukciji sitosti, kontroli telesne težine, prevenciji i lečenju stanja povezanih sa oštećenom metaboličkom homeostazom, kao što je npr. gojaznost i dijabetes tipa 2.
[0037] Na osnovu zapažanja da sastav predmetnog pronalaska smanjuje nekoliko utvrđenih uzročno-posledičnih faktora rizika od kardiovaskularnih bolesti (CVD), u drugom aspektu pronalaska treba predvideti da su navedeni sastavi posebno korisni za prevenciju CVD. CVD se tehnički odnosi na bilo koju bolest koja pogađa kardiovaskularni sistem, ali se obično koristi za označavanje bolesti povezane sa aterosklerozom. Potonji je sindrom koji pogađa arterijske krvne sudove, hronični inflamatorni odgovor u zidovima arterija, velikim delom usled nakupljanja belih krvnih zrnaca makrofaga i promovisan lipoproteinima male gustine. Razvoj CVD zavisi od više mehanizama i identifikovan je niz jasnih uzročnih faktora rizika. Ovi faktori uključuju, ali nisu ograničeni na, povišeni LDL holesterol, trigliceride u plazmi, metaboličke bolesti (gojaznost, dijabetes, ...), hronična inflamacija i oksidativni stres.
Naročito su poslednja dva faktora od najveće važnosti. Ateroskleroza se razvija tako što LDL postaje oksidisan (LDL-oksid) slobodnim radikalima, posebno slobodnim radikalima kiseonika, u situacijama oksidativnog stresa. Prekomerni odgovor imunološkog sistema, u slučaju hronične inflamacije, na oštećenja uzrokovana LDL dalje promoviše širenje bolesti. Shodno tome, cilj predmetnog pronalaska je da obezbedi upotrebu sastava predmetnog pronalaska u prevenciji ili lečenju CVD.
[0038] U daljem aspektu, s obzirom na blagotvorno dejstvo sastava predmetnog pronalaska na prianjanje normalne mikrobiote za sloj sluzokože, predviđeno je da primena sastava pruža zaštitu od vezivanja sluzokože i invazije patogenima. Primeri patogena uključuju, ali nisu ograničeni na Bacillus anthracis; Bacillus cereus; Bordetella pertussis; Borrelia burgdorferi; Brucella abortus; Brucella canis; Brucella melitensis; Brucella suis; Campylobacter jejuni; Chlamydia pneumonia; Chlamydia trachomatis; Chlamydophila psittaci; Clostridium botulinum; Clostridium difficile; Clostridium perfringens; Clostridium tetani;
Corynebacterium diphtheria; Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC); Enteropathogenic E. coli; E. coli O157:H7; Francisella tularensis; Haemophilus influenza; Helicobacter pylori; Legionella pneumophila; Leptospira interrogans; Listeria monocytogenes; Mycobacterium leprae; Mycobacterium tuberculosis; Mycoplasma pneumonia; Neisseria gonorrhoeae;
Neisseria meningitides; Pseudomonas aeruginosa; Rickettsia rickettsia; Salmonella typhi; Salmonella typhimurium; Shigella sonnei; Staphylococcus aureus; Staphylococcus epidermidis; Staphylococcus saprophyticus; Streptococcus agalactiae; Streptococcus pneumonia; Streptococcus pyogenes; Treponema pallidum; Vibrio cholera; Yersinia pestis; Candida spp.; Norovirus (Norwalk Virus); Hepatitis A; virusi koji izazivaju boginje, grip, zauške, morbile, varičelu, ebolu i rubeolu. Prema tome, u daljem otelotvorenju, predmetni
1
pronalazak obezbeđuje upotrebu sastava predmetnog pronalaska u prevenciji i lečenju stanja povezanih sa vezivanjem sluzokože i invazijom patogena; posebno u lečenju i prevenciji stečene dijareje i putničke dijareje.
[0039] Predmetni pronalazak se stoga odnosi na postupak za sprečavanje ili lečenje simptoma povezanih sa gastrointestinalnim poremećajem kod ispitanika kome je to potrebno, koji se sastoji iz davanja terapeutski efikasne količine sastava koja se sastoji u osnovi iz bakterija koje pripadaju vrsti Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominis, Akkermansia muciniphila, Lactobacillus
plantarum i Anaerostipes caccae.
[0040] Termin „ispitanik u potrebi“ odnosi se na čoveka ili ne-humanu životinju koja ima gastrointestinalni poremećaj kako je iznad opisano.
[0041] Termin „terapeutski efikasna količina“ odnosi se na minimalnu kombinovanu ukupnu količinu 7 bakterijskih vrsta koja je sposobna da izvrši svoj profilaktički ili terapeutski efekat. U nastavku je navedeno 7 vrsta bakterija: Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominis, Akkermansia muciniphila, Lactobacillus plantarum i Anaerostipes caccae
[0042] Međutim, „terapeutski efikasna količina“ takođe se može odnositi na najmanje kombinovanu ukupnu količinu od 6 vrsta bakterija koje su dalje navedene: Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Akkermansia muciniphila, Lactobacillus plantarum i Anaerostipes caccae.
[0043] U zavisnosti od konačne primene, pomenuta ukupna količina može biti rezultat jednakih količina svake od 7 vrsta bakterija ili nejednake količine 7 vrsta bakterija, u kojima svaka pojedinačna vrsta od 7 vrsta bakterija ima minimalnu zastupljenost od 0,0001% kombinovane ukupne količine, još poželjnije minimalna količina od 0,001% kombinovane ukupne količine i najpoželjnija minimalna količina od 0,01% kombinovane ukupne količine. Ako tako, na primer, 6 vrsta ima obilje 10,00% kombinovane ukupne količine, onda 7. vrsta ima 40,00% kombinovane ukupne količine. U zavisnosti od konačne primene, pomenuta kombinovana količina kreće se između dnevne doze od 10<2>do 10<14>bakterijskih ćelija, poželjno se kreće između dnevne doze od 10<3>do 10<13>bakterijskih ćelija, poželjnije je između
1
dnevne doze od 10<4>i 10<12>bakterijskih ćelija i većine poželjno je u rasponu između dnevne doze od 10<5>do 10<11>bakterijskih ćelija.
[0044] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na sastav kako je iznad opisano, a koji se bakterijama koje pripadaju vrsti Roseburia hominis eliminišu iz navedenog sastava. Termin „eliminisan“ odnosi se naročito na pravljenje sastava od 6 bakterijskih vrsta kako je dalje naznačeno u odeljku Primeri, bez dodavanja ili uklanjanja vrste Roseburia hominis kao 7. vrste.
[0045] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na sastav kako je iznad opisano, gde se u navedeni sastav dalje dodaju bakterije koje pripadaju vrstama Escherichia coli, Enterococcus faecium, Lactobacillus mucosae, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium longum, Bacteroides thetaiotaomicron i Bacteroides vulgatus.
[0046] Bakterijska vrsta Escherichia coli (Rath i dr., 1999), Enterococcus faecium (Schleifer i dr., 1984), Lactobacillus mucosae (Roos i dr., 2000), Bifidobacterium adolescentis (Scharek i dr., 2000), Bifidobacterium longum (Bahaka i dr., 1993), Bacteroides
thetaiotaomicron (Scharek i dr., 2000) i Bacteroides vulgatus (Rath i dr., 1999) su dobro poznate bakterijske vrste stručnjaku. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na sastav kako je iznad opisano koji dalje sadrži jedan ili više prebiotika.
[0047] Termin „prebiotik“ odnosi se na bilo koju hemikaliju koja indukuje rast ili aktivnost mikroorganizama (npr., bakterija) koji doprinose blagostanju svog domaćina. Otuda prebiotici mogu uticati ili izmeniti sastav organizama u mikrobiomu creva. Međutim, u principu je to opštiji pojam koji se može odnositi i na druga područja tela. Tipični, ali neograničavajući prebiotici su neprobavljiva jedinjenja vlakana koja barem delimično prolaze nesvarena kroz gornji deo gastrointestinalnog trakta i podstiču rast ili aktivnost korisnih bakterija koje kolonizuju debelo crevo delujući kao supstrat za njih.
[0048] U poželjnom otelotvorenju, predmetni pronalazak odnosi se na sastav kako je iznad opisano, gde su pomenute bakterije uzgajane u fermentatoru pre davanja pomenutog sastava za sprečavanje ili lečenje navedenih gastrointestinalnih poremećaja. Potonji sastavi se takođe nazivaju (videti dalje) kao „Strategija Kolaboroma“ ili kao „alternativna strategija Kolaboroma“. Suprotno tome, sastav u kome se pomenute bakterije ne uzgajaju u
1
fermentatoru pre davanja, naziva se (videti dalje) kao „Strategija Kolaboroma“.
[0049] S tim u vezi, predmetni pronalazak se dalje odnosi na sastav kako je iznad opisano, gde je navedeni fermentator dinamički simulator gastrointestinalnog trakta. U ovom konkretnom slučaju, potonji sastavi se takođe nazivaju (videti dalje) kao „Strategija Kolaboroma“.
[0050] SHIME® (simulator humanog mikrobnog ekosistema) je dinamični in vitro model gastrointestinalnog trakta čoveka koji se sastoji iz pet sudova sa dvostrukom košuljom, simulirajući stomak, tanko crevo i tri regije debelog creva (uzlazno, dijagonalno i silazno debelo crevo), sa ukupnim vremenom zadržavanja od 72 h (Sl.1). Tri puta dnevno u odeljke želuca i tankog creva dodavani su 140 ml SHIME® hrane i 60 ml soka pankreasa (Van den Abbeele i dr., 2010). Nakon početnog dvonedeljnog perioda stabilizacije - koji omogućava mikrobioti da se prilagodi nametnutim uslovima in vitro - pokrenut je postupak izolacije. Odabrani sojevi mikroba iz predmetnog pronalaska mogu se na taj način inokulirati u jednostepene (alternativna strategija Kolaboroma) ili višestepene reaktore ili dinamičke simulatore gastrointestinalnog trakta (npr. SHIME® ili M-SHIME®, strategija Kolaboroma) pod standardizovanim uslovima reprezentativnim za GI trakt. Shodno tome, pronalazak se odnosi na reaktor koji sadrži sastav koji sadrži, sastoji se iz ili se sastoji u osnovi od bakterija koje pripadaju 6 ili 7 ili do 14 vrsta kako su ovde definisane i dalje navedene u nastavku:
• sadrži sastav koji sadrži, sastoji se ili se sastoji u osnovi od bakterija koje pripadaju vrsti Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominis, Akkermansia muciniphila, Lactobacillus plantarum and Anaerostipes caccae ili
• sadrži sastav koji sadrži, sastoji se ili se sastoji u osnovi iz bakterija koje pripadaju vrsti Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Akkermansia muciniphila, Lactobacillus plantarum i Anaerostipes caccae ili
• sadrži sastav koji sadrži, sastoji se ili se sastoji u osnovi iz bakterija koje pripadaju vrsti Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominis, Akkermansia muciniphila, Lactobacillus plantarum, Anaerostipes caccae, Escherichia coli, Enterococcus faecium, Lactobacillus mucosae, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium longum, Bacteroides thetaiotaomicron i Bacteroides vulgatus.
1
[0051] U poželjnom otelotvorenu, ovaj reaktor koji sadrži pomenuti sastav je pod standardizovanim uslovima reprezentativnim za GI trakt kao što je definisano ispod.
[0052] Parametri koji karakterišu standardizovane uslove uključuju, ali nisu ograničeni na: pH (u rasponu između 1,5 i 8); dostupnost izvora ugljenika (bilo ugljenih hidrata ili proteina ili njihove kombinacije); vreme zadržavanja u određenom reaktoru (opseg između 10 min i 200 h); dostupnost kiseonika (raspon između 0 i 8 g/L); dostupnost mikroelemenata; prisustvo/odsustvo antibiotika; koncentracija žučnih soli (u rasponu između 0 i 20 mM); prisustvo teških metala; prisustvo faktora domaćina kao imunoloških molekula. U poželjnom otelotvorenju, parametri koji karakterišu standardizovane uslove uključuju pH, vreme zadržavanja u određenom reaktoru i koncentraciju žučnih soli, sve kako je ovde ranije definisano. U zavisnosti od složenosti Kolaboroma, potreban je period od 1 do 15 dana za dobijanje funkcionalno stabilnog Kolaboroma. U proseku, da bi se razvio Kolaborom sastavljen od 7 do 14 članova, vreme između 3 i 10 dana je dovoljno za dobijanje funkcionalno stabilnog Kolaboroma (u zavisnosti od uslova okoline). Sastav kako je ovde definisan, stoga se može dobiti nakon što je obučen ili kultivisan tokom vremena između 3 i 10 dana pod uslovima u kojima su pH, vreme zadržavanja u određenom reaktoru i koncentracija žučnih soli postavljeni kako je ovde definisano. Takav postupak omogućava proizvodnju sastava ili Kolaboroma koji su funkcionalno stabilni.
[0053] U kontekstu pronalaska, "funkcionalno stabilan Kolaborom" je sastav kako je ovde definisan i dalje sadrži početni različiti broj vrsta bakterija nakon najmanje 3 ili 5 ili 10 dana kultivisanja.
[0054] U daljem aspektu, obezbeđen je reaktor koji radi pod standardizovanim uslovima reprezentativnim za GI trakt, koji sadrži: pH u rasponu između 1,5 i 8; dostupnost izvora ugljenika; vreme zadržavanja između 10 minuta i 200 h; dostupnost kiseonika između 0 i 8 g/L; dostupnost mikroelemenata; prisustvo/odsustvo antibiotika; koncentracija žučnih soli između 0 i 20 mM; prisustvo teških metala; prisustvo faktora domaćina kao imunoloških molekula. U jednom otelotvorenju, navedeni reaktor je takav da parametri koji karakterišu standardizovane uslove uključuju pH, vreme zadržavanja u određenom reaktoru i koncentraciju žučnih soli kako je definisano u prethodnom pasusu. U jednom otelotvorenju, takav reaktor sadrži sastav od 5 i 20 različitih članova bakterija, ili 6 do 14 različitih članova bakterija ili 5 do 15 različitih članova bakterija. U poželjnom otelotvorenju, takav sastav
1
boravi vreme između 3 i 14 dana ili 3 i 10 dana u takvom reaktoru da bi se dobio funkcionalno stabilan Kolaborom.
[0055] Pronalazak se konkretnije odnosi na sastav i upotrebu skupa mikrobnih sojeva, koji imaju specifične funkcionalne karakteristike i unapred su prilagođeni da funkcionišu zajedno u cilju sprečavanja ili lečenja zdravstvenih problema kod ljudi i životinja i postizanja bržeg bioterapijskog početka i veće efikasnosti. u poređenju sa slabo sastavljenim skupom istih sojeva (=„strategija Skupa“). Takav skup mikroorganizama koji su unapred prilagođeni da funkcionišu zajedno uzima naziv „strategija Kolaboroma“ ili alternativna strategija Kolaboroma ".
[0056] Drugim rečima, pronalazak se odnosi na unapred prilagođene sastave skupova sojeva mikroba, poželjno za upotrebu da bi se značajno smanjilo vreme bioterapijskog početka i/ili da bi se značajno povećao efekat lečenja disbioze u poređenju sa labavo sastavljenim setom istih sojevi mikroba.
[0057] Termini „značajno smanjuju vreme bioterapijskog početka“ znače da, unapred adaptiranim, skup mikroorganizama može svoju funkcionalnost ostvariti najmanje 5% brže (u vremenskoj skali), po mogućnosti najmanje 10% brže, poželjnije na najmanje 20% brže i najpoželjnije najmanje 30% brže u poređenju sa labavo sastavljenim setom istih sojeva. Svaka vrednost ispod 5% smatra se fiziološki nebitnom.
[0058] Termini „značajno povećavaju efekat lečenja“ znače da, unapred adaptiranim, skup mikroorganizama može da izvrši svoju funkcionalnost sa najmanje 5% većom efikasnošću, poželjno bar 10% efikasnijom, poželjnije najmanje 20% i većinom po mogućnosti najmanje 30% efikasnije. Efikasnost zavisi od krajnje tačke za koju je skup mikroorganizama dizajniran. Moguće funkcije uključuju, ali nisu ograničene na proizvodnju masnih kiselina sa kratkim lancem (SCFA); poboljšanje propustljivosti crevne barijere; smanjenje/povećanje proinflamatornih citokina; povećanje antiinflamatornih citokina; smanjenje koncentracije patogena (najmanje 0.5 log); smanjenje proizvodnje gasa; stimulacija specifičnih receptora zidova creva; itd... Svaka vrednost ispod 5% smatra se fiziološki nebitnom.
[0059] Otuda se predmetni pronalazak konkretnije odnosi na postupak za sprečavanje ili lečenje disbioze ljudi i životinja kojima je to potrebno, koji uključuje primenu terapeutske
2
količine unapred prilagođenog sastava skupa mikrobnih sojeva navedenim ljudima ili životinjama, pri čemu navedeni tretman rezultira brži bioterapijski početak i/ili povećana efikasnost u poređenju sa davanjem labavo sastavljenog skupa istih sojeva mikroba.
[0060] Preciznije, predmetni pronalazak se odnosi na sastav kako je iznad opisano, gde su pomenute bakterije izabrane sa liste sledećih sojeva: Faecalibacterium prausnitzii LMG P-29362, Faecalibacterium prausnitzii DSMZ 17677, Butyricicoccus pullicaecorum LMG P-29360, Butyricicoccus pullicaecorum LMG24109, Roseburia inulinivorans LMG P-29365, Roseburia inulinivorans DSMZ 16841, Roseburia hominis LMG P-29364, Roseburia hominis DSMZ 16839, Akkermansia muciniphila LMG P-29361, Akkermansia muciniphila DSMZ 22959, Lactobacillus plantarum LMG P-29366, Lactobacillus plantarum ZJ316, Anaerostipes caccae LMG P-29359, Anaerostipes caccae DSMZ 14662 i/ili sojevi koji pokazuju najmanje 97% identičnosti sekvence sa 16SrRNK sekvencama najmanje jednog od navedenih sojeva.
[0061] Iznad navedeni sojevi koji imaju pristupne brojeve LMG P-29362, LMG P-29360, LMG P-29365, LMG P-29364, LMG P-29361, LMG P-29366 i LMG P-29359 deponovani su u BCCM/LMG Laboratorium voor Microbiologie, Universiteit Gent (UGent), KL Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent, Belgija.
[0062] Iznad navedeni sojevi koji imaju pristupne brojeve DSMZ 17677, LMG24109, DSMZ 16841, DSMZ 16839, DSMZ 22959, ZJ316 i DSMZ 14662 deponovani su u javnim kolekcijama, intenzivno su opisivani i dostupni su kvalifikovanim ljudima širom sveta.
[0063] Dalje bi trebalo da bude jasno da su varijante svakog od navedenih sojeva koji pokazuju najmanje 97% (tj.97, 98, 99%) homologije sekvence sa sekvencom 16S rRNK svakog od navedenih odgovarajućih sojeva takođe deo predmetnog pronalaska. Primer za određivanje takve "sekvence homologije" opisali su, na primer, Eeckhaut i dr., (2008). Kako se ovde koristi, termin "16S rRNK" odnosi se na sekvencu nukleinske kiseline od oko 1542 nukleotida koja je komponenta male prokariotske ribozomske podjedinice (30S). Poznato je da 16S rRNK deluje kao skela koja definiše položaj ribozomskih proteina. Sekvenca 16S rRNK se obično koristi za filogenetska ispitivanja, jer je poznato da je visoko konzervirana sekvenca. Uporedna analiza sekvenci 16S rRNK iz hiljada organizama pokazala je prisustvo sekvenci potpisa oligonukleotida. Kako se ovde koristi, termin "homologija" odnosi se na sličnost sekvenci nukleinskih kiselina. Na primer, generalno, ako dve nukleinske kiseline imaju identične sekvence, one pokazuju 100% homologiju. Promena nukleotidne sekvence jedne od nukleinskih kiselina smanjuje procenat homologije. Generalno, procenat homologije kvantifikuje stepen identičnosti između dve rečenice nukleinske kiseline.
[0064] Identitet sekvence ili homologija sekvence ovde je definisana kao veza između dve ili više sekvenci aminokiselina (polipeptidnih ili proteinskih) ili dve ili više sekvenci nukleinskih kiselina (polinukleotida), kako je utvrđeno upoređivanjem sekvenci. Obično se identiteti ili sličnosti sekvenci upoređuju tokom cele dužine upoređenih sekvenci. U struci, "identičnost" takođe znači stepen povezanosti sekvenci između sekvenci aminokiselina ili nukleinskih kiselina, u zavisnosti od slučaja, kako je određeno podudaranjem nizova takvih sekvenci. „Sličnost“ između dve aminokiselinske sekvence određuje se upoređivanjem aminokiselinske sekvence i njenih konzerviranih aminokiselinskih zamena jednog polipeptida sa sekvencom drugog polipeptida. "Identičnost" i "sličnost" mogu se lako izračunati različitim postupcima, poznatim stručnjacima u ovoj oblasti. U poželjnom otelotvorenju, identičnosti sekvence se određuje upoređivanjem cele dužine sekvenci kako su ovde identifikovane.
[0065] Poželjni postupci za određivanje identiteta dizajnirane su tako da omoguće najveće podudaranje između testiranih sekvenci. Postupci za utvrđivanje identiteta i sličnosti kodifikovane su u javno dostupnim računarskim programima. Poželjni postupci računarskog programa za utvrđivanje identiteta i sličnosti između dve sekvence uključuju npr. the BestFit, BLASTP, BLASTN i FASTA (Altschul, S. F. i dr., J. Mol. Biol.215:403-410 (1990), javno dostupan od NCBI i drugih izvora (BLAST Manual, Altschul, S., i dr., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894). Najpoželjniji algoritam koji se koristi je EMBOSS (http://www.ebi.ac.uk/emboss/align). Poželjni parametri za poređenje aminokiselinskih sekvenci pomoću EMBOSS su otvoreni otvor 10,0, produženi jaz 0,5, matrica Blosum 62. Poželjni parametri za upoređivanje sekvenci nukleinske kiseline pomoću EMBOSS su otvoreni otvor 10,0, jaz produžen 0,5, DNK puna matrica (DNK matrica identiteta).
[0066] Opciono, pri određivanju stepena sličnosti aminokiselina, vešt čovek može takođe uzeti u obzir takozvane "konzervativne" supstitucije aminokiselina, što će stručnjaku biti jasno. Konzervativne supstitucije aminokiselina odnose se na zamenljivost ostataka koji imaju slične bočne lance. Na primer, grupa aminokiselina koja ima alifatske bočne lance je glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; grupa aminokiselina koja ima alifatično-hidroksilne bočne lance je serin i treonin; grupa aminokiselina koja ima bočne lance koji sadrže amid je asparagin i glutamin; grupa aminokiselina koja ima aromatične bočne lance je fenilalanin, tirozin i triptofan; grupa aminokiselina sa osnovnim bočnim lancima je lizin, arginin i histidin; i grupa aminokiselina koja ima bočne lance koji sadrže sumpor je cistein i metionin. Poželjne konzervativne supstitucione grupe aminokiselina su: valin-leucin-izoleucin, fenilalanin-tirozin, lizin-arginin, alanin-valin i asparagin-glutamin. Supstitucione varijante aminokiselinske sekvence ovde obelodanjene su one kod kojih je uklonjen najmanje jedan ostatak u otkrivenim sekvencama, a umesto njega je umetnut drugi ostatak. Poželjno je da je promena aminokiselina konzervativna. Poželjne konzervativne supstitucije za svaku od prirodnih aminokiselina su sledeće: Ala u ser; Arg u lys; Asn u gln ili his; Asp u glu; Cys u ser ili ala; Gln u asn; Glu u asp; Gly u pro; His u asn ili gin; Ile u leu ili val; Leu u ile ili val; Lys u arg; gln ili glu; Met u leu ili ile; Phe u met, leu ili tyr; Ser u thr; Thr u ser; Trp u tyr; Tyr u trp ili phe; i, Val u ile ili leu.
[0067] Stručnjaku je dobro poznato da sekvence 16s rRNK mogu da se deponuju na mreži, na primer u GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) i da se do njih može doći na osnovu njihov jedinstveni pristupni broj za upotrebu kao referentna sekvenca 16S rRNK u proceni homologije sekvenci, kao što je na primer opisano od strane Eeckhaut i dr. (2008). Brojevi pristupa GenBank za sekvence 16S rRNK 7 bakterijskih vrsta sastava su u nastavku. Ovi pristupni brojevi se mogu koristiti za pronalaženje odgovarajućih 16S rRNK sekvenci sa http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ za procenu homologije sekvenci.
2
[0068] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na sastav kako je iznad opisano, gde je navedeni sastav farmaceutski sastav formulisana ili kao rektalno davani oblik ili oralno svarljivi oblik.
[0069] S tim u vezi, predmetni pronalazak se dalje odnosi na sastav kako je iznad opisano, gde je navedeni oralno svarljivi oblik kapsula, mikrokapsula, tableta, granula, prah, lozenga, pilula, suspenzija ili sirup.
[0070] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na sastav kako je iznad opisano koji je ugrađen u hranu, piće, dodatak hrani ili nutraceutik.
[0071] Predmetni pronalazak se prema tome odnosi na sastav kako je iznad opisan koji se koristi kao hrana, dodatak hrani ili lek za čoveka, domaću ili uzgajanu kopnenu životinju koja nije čovek ili vodenu životinju. Sastav se na taj način može uvesti u hranu, funkcionalnu hranu, suplemente, kozmetiku, nutraceutske formulacije, probiotički sastav ili farmaceutske proizvode. Hrana je obično jestivi materijal koji se sastoji uglavnom od jednog ili više makronutrijenata proteina, ugljenih hidrata i masti. Hrana takođe može da sadrži jedan ili više mikronutrijenata kao što su vitamini ili minerali.
[0072] Termin hrana, kako se ovde koristi, takođe obuhvata napitak. Primeri hrane u koju sastav može biti ugrađen uključuju grickalice, žitarice, lepinje, kifle, kekse, kolače, peciva, prerađeno povrće, slatkiše, probiotičke formulacije, uključujući jogurte, pića, tečnosti na bazi biljnih ulja, tečnosti na bazi životinjskih masti, smrznute poslastice i sireve. Preferirana hrana uključuje jogurte, sireve i druge mlečne proizvode. Primeri pića uključuju bezalkoholna pića, sirupe, tikve, mešavine suvih napitaka i nutritivne napitke. Nutraceutik je sastojak hrane, dodatak hrani ili prehrambeni proizvod za koji se smatra da pruža medicinsku ili zdravstvenu korist, uključujući prevenciju i lečenje bolesti. Funkcionalna hrana je hrana koja se obično prodaje na tržištu koja pruža zdravstvenu korist osim one koja pruža potrošaču čistu ishranu.
[0073] Pronalazak takođe obezbeđuje probiotik koji sadrži ovde razmatrani sastav. Probiotik je obično živi dodatak koji može poboljšati crevnu mikrobiotu. Takvi probiotici se mogu davati posebno ljudima ali takođe i poljoprivrednim i domaćim životinjama i vodenim organizmima. Probiotik može dodatno sadržati jednu ili više prihvatljivih pomoćnih supstanci ili aroma, koje su pogodne za gutanje od strane čoveka ili životinje.
[0074] Sastav pronalaska se može koristiti u proizvodnji farmaceutskih sastava. Prema tome, pronalazak dalje obezbeđuje farmaceutski sastav koji sadrži sastav prema pronalasku i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens ili nosač.
[0075] Sastavi koji sadrže jedinjenja pronalaska mogu biti u različitim oblicima, na primer u obliku tablete, kapsule ili praha. Primeri ekscipijensa koji mogu biti prisutni u takvim sastavima uključuju razređivače (npr. skrob, derivate celuloze ili derivate šećera), stabilizator (npr. higroskopni ekscipijensi poput silicijum dioksida ili maltodekstrina), mazivo (npr. magnezijum stearat), pufer (npr. fosfatni pufer), vezivno sredstvo, premaz, konzervans ili sredstvo za suspenziju. Pogodni ekscipijensi su dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti.
[0076] Predmetni pronalazak se konkretnije odnosi na sastav kako je iznad opisan, pri čemu navedeni sastav sadrži ukupno između 10<5>i 10<11>jedinica koje formiraju kolonije bakterija predmetnog pronalaska.
[0077] U ovom dokumentu i u njegovim patentnim zahtevima, glagol „obuhvatati“ i njegove konjugacije koriste se u svom neograničavajućem smislu da znače da su uključeni predmeti koji slede reč, ali nisu isključeni predmeti koji nisu posebno pomenuti. Pored toga, glagol "sastojati se" može biti zamenjen sa "sastojati se u osnovi iz", što znači da sastav kako je ovde definisan može sadržavati dodatne komponente od onih koje su posebno identifikovane, pomenute dodatne komponente ne menjaju jedinstvenu karakteristiku pronalaska. Pored toga, pozivanje na element neodređenog člana „a“ ili „an“ ne isključuje mogućnost da je prisutan više od jednog elementa, osim ako kontekst jasno zahteva da postoji jedan i samo jedan od elemenata. Stoga neodređeni član „a“ ili „an“ obično znači „bar jedan“.
[0078] Sledeći primeri su ponuđeni samo u ilustrativne svrhe i nisu namenjeni ograničavanju obima predmetnog pronalaska na bilo koji način
2
Primeri
Primer 1. Utvrđivanje prema predmetnom pronalasku
1.1 Izolacija bakterija za sastav
[0079] Za inokulaciju SHIME® modela odabran je mladi, zdravi davalac bez prethodnog izlaganja antibiotskoj terapiji. Kontrolom nekoliko operativnih parametara modela SHIME® (Sl. 1, Van den Abbeele i dr., 2010), može se obogatiti i odabrati za mrežu crevnih mikrobiota koje imaju blagotvorni uticaj na zdravlje ljudi, poput mikrobiota uključenih u dijetalna vlakna fermentacija, metabolizam žučnih kiselina, razgradnja laktoze itd. SHIME® postavka korišćena je za izolaciju sojeva bakterija sa različitim funkcionalnim svojstvima, kao što su razgrađivači vlakana (npr. Bifidobacteria, Bacteroides), fermentativi
(npr. Escherichia coli) ili proizvođači laktata (npr. Lactobacilli, Pediococci i Enterococci), proizvođači butirata (npr. Anaerostipes caccae, Butyricicoccus pullicaecorum, Faecalibacteruim prausnitzii, Roseburia hominis, Roseburia inulinivorans, Clostridium butyricum) i proizvođači propionata (npr. Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides vulgatus, Roseburia inulinivorans, Akkermansia muciniphila). U tu svrhu izabrane su selektivne podloge poput LAMVAB (laktobacili; Hartemink i dr 1997), RB (bifidobakterije; Hartemink i dr.1996), Enterococcus podloga (Enterococci; Possemiers i dr.2004), TBX (Escherichia coli; Le Bon i dr.2010), BBE (Bacteroides fragilis grupa; Livingston i dr. 1978), Mucinski minimalni medijum (Akkermansia; Derrien i dr.2004), M2GSC (proizvođači butirata; Barcenilla i dr.2000) ili minimalni SHIME medijum koji sadrži laktat (proizvođači butirata), minimalni SHIME medijum koji sadrži sukcinat i fukozu (proizvođači propionata), minimalni medijum obogaćen sulfatom (redukatori sulfata), minimalni SHIME medijum koji sadrži arabinoksilan i ploče sa agarima krvi (Prevotella). Pored SHIME, bakterije su takođe izolovane direktno iz svežeg uzorka fekalija zdravog davaoca, koristeći istu strategiju.
[0080] U praksi su napravljena desetostruka razblaženja uzoraka sakupljenih iz odeljenja debelog creva SHIME ili homogenizovanih uzoraka fekalija i raširena na agar pločama sa specifičnim sastavom medijuma kako je iznad opisano. Ploče su inkubirane na 37°C, uzimajući u obzir odgovarajuće uslove rasta različitih bakterijskih grupa. Nakon inkubacije, približno 30 kolonija je pokupljeno po bakterijskoj grupi i inkubirano u odgovarajućem tečnom medijumu za rast pod odgovarajućim uslovima. Koncentracije masnih kiselina kratkog lanca u kulturama preko noći su analizirane pomoću gasne hromatografije kako je
2
opisano u Possemiers i dr. (2004). Dalje, uzorak tečnih kultura korišćen je za filogenetsku analizu. DNK je ekstrahovana kako je opisano u Possemiers i dr.2004. i skoro čitave sekvence 16S rRNK su pojačane za svaki izolat korišćenjem univerzalnih eubakterijskih prajmera fD1 i rD1 (Weisburg i dr.1991). Nakon prečišćavanja, uzorci DNK su poslati na sekvenciranje. Dobijene sekvence su usklađene sa postojećim sekvencama za identifikaciju svakog izolata pomoću BLAST alata (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
1.2 Dizajn sastava prema predmetnom pronalasku
[0081] Za kombinovanje različitih sojeva bakterija u stvarne funkcionalne mikrobne mreže, korišćene su čiste kulture izolovane iz SHIME® reaktora i fekalne kiseline (kao što je opisano u primeru 1.1). Pored toga, čiste kulture su dobijene iz zbirki kultura kao što su BCCM/LMG (http://bccm.belspo.be) i DSMZ (www.dsmz.de).
[0082] Kratkolančane masne kiseline (SCFA) su krajnji proizvodi fermentacije dijetalnih vlakana crevnom mikrobiotom i poznato je da imaju nekoliko blagotvornih efekata na zdravlje domaćina. Glavni proizvedeni SCFA su acetat, butirat i propionat u približno molarnom odnosu od 60:20:20. Dok acetat može da se apsorbuje iz creva i da ga domaćin koristi kao energetski supstrat, butirat deluje kao glavni izvor energije za epitel creva i ima dokazane zaštitne efekte protiv inflamacije i raka debelog creva. Propionat ima sličnu lokalnu aktivnost u crevima u poređenju sa butiratom, ali se takođe transportuje u jetru gde se pokazalo da ima pozitivne efekte na smanjenje holesterola i efekte na kontrolu glikemije.
[0083] Uzimajući u obzir važne i raznovrsne fiziološke uloge SCFA, poremećaj ove mikrobiološke funkcije creva (npr. kod gastrointestinalnih poremećaja) može imati značajan uticaj na zdravlje domaćina. Shodno tome, u ovom primeru je izvršen skrining za dizajn sastava koji može da indukuje najveću ukupnu proizvodnju SCFA i najzanimljivije relativne odnose proizvodnje SCFA. Za ovo drugo, butirat se smatrao najzanimljivijim među različitim proizvedenim SCFA. Dalje, efekat različitih sastava na integritet crevne barijere procenjen je pomoću kokulture epitelnih i imunih ćelija.
[0084] U praksi je ukupno 20 izolata sa najzanimljivijim profilima fermentacije, dobijenih iz kruga izolacije i selekcije kako je opisano u 1.1 (nazvano „Izolat-X“) ili naručenih iz zbirki kultura, uzeto iz njihovih zaliha glicerola i uzgajano pod njihovi optimalni uslovi rasta za dobijanje homogenih suspenzija sojeva bakterija.
2
[0085] Izolati su kombinovani u brojevima od 2 do 10 u nizu od 98 pojedinačnih početnih skrining eksperimenata. Za svaki eksperiment započeta je fermentacija u sterilnim bočicama za inkubaciju koje sadrže sterilisani SHIME® hranljivi medijum prilagođen na pH 6.8 sa KH2PO4/K2HPO4i ispran azotom. Zatim je sterilisani medijum inokuliran sa 10% (v/v) mešanog inokuluma koji se sastoji od jednakih količina izabranih vrsta. Inkubacione boce su isprane azotom da bi se osigurali anaerobni uslovi i inkubirane su na 37°C (90 o/min). Uzorci su analizirani nakon 24 sata za proizvodnju SCFA. Zatim su odabrani sastavi sa najvećom proizvodnjom butirata i dalje korišćene u završnom eksperimentu sa 23 različita skupa bakterija (nazvanim MX-Y, u kojima je X = broj izolata prisutnih u sastavu i Y = jedinstveni sastav A, B, C itd. sa izolatima X).
2
[0086] Ove 23 kombinacije su ponovo inkubirane kako je prethodno opisano. Posle 24 sata, uzorci su sakupljeni za SCFA analizu i za kombinaciju sa modelom kokulture Caco-2 i THP1 ćelija, kao što je opisano u Possemiers i dr. (2013). Krajnja tačka potonjeg eksperimenta bila je trans-epitelna električna otpornost (TEER) kao mera zaštitnih efekata na funkciju crevne barijere.
[0087] Slika 2 opisuje nivoe butirata dobijene tokom 24 sata inkubacije 23 različita sastava, kao i njihov uticaj na vrednosti TEER. Primećene su snažne varijacije u nivou butirata i efektima na funkcionisanje crevne barijere i kombinacijama sa najvišim nivoima butirata koji ne moraju nužno indukovati najviše zaštitne efekte na nivoe TEER, što pokazuje različito rangiranje. Iznenađujuće je da je jedan sastav od 7 različitih izolata (na Sl.2 označen kao M7-B) rangiran na prvo mesto na oba nivoa butirata nakon 24 sata, a posebno po zaštitnim efektima prema funkciji crevne barijere. Ovaj sastav je sadržao 6 izolata iz SHIME i jednu kulturu dobijenu iz uzorka ljudske fekalije. Sekvenciranje gena 16S rRNK i upoređivanje sekvence sa bazom podataka NCBI BLAST otkrilo je da je M7-B sastavljen od novih SHIME izolata Lactobacillus plantarum, Faecalibacterium prausnitzii, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominis, Akkermansia muciniphila i Anaerostipes caccae i novog fekalnog izolata iz Butyricicoccus pullicaecorum. Zanimljivo je da su svi novi izolati bili prisutni u najmanje jednom od ostalih sastava prikazanih na Sl.2, ali nijedan drugi sastav nije postigao istu efikasnost u pogledu proizvodnje butirata i zaštite vrednosti TEER. To pokazuje da uočeni efekat nije povezan sa nekom od specifičnih vrsta prisutnih u sastavu, već da samo specifična
2
kombinacija ovih 7 bakterija dovodi do iznenađujuće pozitivnih rezultata.
[0088] Sedam novih izolata deponovano je u zbirci BCCM/LMG bakterija (Ghent Belgija), sa pristupnim brojevima: Faecalibacterium prausnitzii LMG P-29362, Butyricicoccus pullicaecorum LMG P-29360, Roseburia inulinivorans LMG P-29365, Roseburia hominis LMG P-29364, Akkermansia muciniphila LMG P-29361, Lactobacillus plantarum LMG P-29366 i Anaerostipes caccae LMG P-29359.
[0089] Kao dodatni eksperimentalni dokaz iznenađujuće sinergije između 7 izolata i potrebe za prisustvom svake od vrsta, postavljen je eksperiment u kojem je svaki put kada je jedan od izolata uklonjen (tj. eliminisan) iz prvobitnog sastava 7 izolata. U praksi, započeta je fermentacija u sterilnim bočicama za inkubaciju koje sadrže sterilisani SHIME® hranljivi medijum prilagođen na pH 6.8 sa KH2PO4/K2HPO4i ispran azotom. Zatim je sterilisani medijum inokuliran sa 10% (v/v) mešanog inokuluma koji se sastoji iz jednakih zapremina 6 od 7 izolata. Kompletni sastav od 7 izolata delovao je kao kontrola, što je rezultiralo sa ukupno 8 paralelnih inkubacija. Inkubacione boce su isprane azotom da bi se osigurali anaerobni uslovi i inkubirane su na 37°C (90 o/min). Uzorci su analizirani nakon 24 sata i 48 sati na proizvodnju butirata. Kao što je prikazano na Sl.3, uklanjanje samo jedne vrste iz originalnog sastava značajno je smanjilo nivo proizvodnje butirata nakon 24 sata za sve sastave od 6 vrsta na ispod 80% proizvodnje butirata u originalnom sastavu. Takođe nakon 48 sati inkubacije, nivo butirata je bio značajno niži za sve sastave od 6 vrsta, sa izuzetkom sastava koji isključuje Roseburia hominis. Ovo potvrđuje da su svi izolati smeše neophodni za postizanje punog potencijala sastava. Kako je samo sastav koji isključuje Roseburia hominis i dalje rezultirao sličnom funkcionalnošću kompletnog sastava nakon 48 sati inkubacije, takođe se može predvideti - kao drugo najbolje - korišćenje sastava od 6 vrsta, koji se u osnovi sastoje iz Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Akkermansia muciniphila, Lactobacillus plantarum i Anaerostipes caccae.
1.3. Proizvodnja prema predmetnom pronalasku
[0090] Sastav koji se sastoji iz vrsta Lactobacillus plantarum, Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominis, Akkermansia muciniphila and Anaerostipes caccae se proizvodi koristeći 3 različite strategije. Ove strategije uključuju ili 1) uzgajanje vrsta sastava odvojeno, praćeno međusobnim mešanjem, 2) uzgajanje vrsta sastava zajedno u višestepenom fermentatoru (tj. in vitro SHIME® model kako je iznad opisano) i 3) uzgajanje vrsta sastava u jednostepenom fermentatoru.
[0091] U prvoj strategiji (= strategija „Skupa“), odabrane vrste su preuzete iz zaliha glicerola i uzgajane u njihovim odgovarajućim optimalnim uslovima rasta da bi se dobile homogene suspenzije sojeva bakterija. Da bi se procenila njihova funkcionalna aktivnost, stvoren je mešoviti inokulum koji se sastojao iz jednakih količina izabranih vrsta. Ovaj inokulum je dodat sa 10% (v/v) u sterilne boce za inkubaciju koje sadrže sterilisani SHIME® hranljivi medijum prilagođen na pH 6,8 sa KH2PO4/K2HPO4. Inkubacione boce su isprane azotom da bi se osigurali anaerobni uslovi i inkubirane su na 37°C (90 o/min). U određenim intervalima od 16 h, 40% (v:v) medijum za rast zamenjen je kondicionim SHIME® hranljivim medijumom. Kondicionirani SHIME® hranljivi medijum pripremljen je inkubacijom 700 mL normalne SHIME® hrane (pH2) tokom jednog sata na 37°C, nakon čega je 300 mL soka pankreasa (pH 6,8) - dopunjeno sa 25g/L NaHCO3, 23,6 g/L KH2PO4i 4,7 g/L K2HPO4- je dodato. Uzorci su analizirani tokom perioda od 5 dana za proizvodnju SCFA (Sl.4). Nivoi butirata dostigli su 7 mM nakon 24 sata inkubacije sklopa i maksimalno 14 mM nakon 5 dana.
[0092] U drugoj strategiji (tj. strategija „Kolaboroma“ ili strategija „gde se pomenute bakterije uzgajaju zajedno u dinamičkom simulatoru gastrointestinalnog trakta pre davanja“), odabrane vrste su preuzete iz zaliha glicerola i uzgajane pod njihovim odgovarajući optimalni uslovi rasta za dobijanje homogenih suspenzija sojeva bakterija. Zatim su sojevi pomešani i inokulirani u tri primerka u SHIME® postavci (Van den Abbeele i dr., 2010) koja se sastojala iz jednog regiona debelog creva pri pH 6,15-6,4. Izveden je dvonedeljni period adaptacije kako bi se stvorio funkcionalni sastav Kolaboroma. Potreba i relevantnost takvog perioda adaptacije jasno se pokazuje evolucijom SCFA profila tokom kultivacije sastava odabranih vrsta (Sl.5). U početku, sastavu je potrebno vreme da se prilagodi jedni drugima i da postane aktivan u pretvaranju isporučenih podloga u SCFA. Međutim, četiri do šest dana nakon inokulacije, proizvodnja SCFA u sastavu je počela da se stabilizuje i izmereni su visoki nivoi butirata. Poslednjeg dana inkubacije (14. dan) svaka od tri ponovljene inkubacije rezultirala je vrlo sličnim, stabilnim, jako aktivnim funkcionalnim sastavom sa nivoima butirata koji su dostizali 19 mM.
[0093] Kada je stabilizovani kolaborom zamrznut na -80°C kao zaliha glicerola, a zatim odmrznut za upotrebu kao inokulum na isti način kao i za strategiju montaže, nivoi butirata -
1
iznenađujuće - su se brže povećavali i dostizali 25% više nivoe pod istim uslovima inkubacije kao za skupljanje pojedinih vrsta (Sl.4). Nivoi butirata već su dostigli 12 mM nakon 24 sata inkubacije sklopa, a maksimum od 19 mM već je dostignut nakon 2 dana.
[0094] U trećoj strategiji, proizvodnja navedenog sastava je preduzeta korišćenjem optimizovanog jednostepenog pristupa fermentatora, koji je funkcionisao u režimu hranjenja u serijama (tj. alternativna strategija „kolaboroma“ ili strategija „u kojoj se pomenute bakterije uzgajaju u fermentatoru pre davanja“). Odabrane vrste su preuzete iz njihovih zaliha glicerola i uzgajane pod njihovim odgovarajućim optimalnim uslovima rasta da bi se dobile homogene suspenzije sojeva bakterija. Fermentacija je započeta u sterilnim bočicama za inkubaciju koje sadrže sterilisanu SHIME® hranu prilagođenu pH 6,8 sa KH2PO4/K2HPO4i isprana azotom. Zatim je sterilisani medijum inokuliran sa 10% (v/v) mešanog inokuluma koji se sastoji od jednakih količina izabranih vrsta. Inkubacione boce su isprane azotom da bi se osigurali anaerobni uslovi i inkubirane su na 37°C (90 o/min). U određenim intervalima od 16 h, 40% (v:v) medijum za rast zamenjen je kondicionim SHIME® hranljivim medijumom. Kondicionirani SHIME® hranljivi medijum pripremljen je inkubacijom 700 mL normalne SHIME® hrane (pH2) tokom jednog sata na 37°C, nakon čega je 300 mL soka pankreasa (pH 6,8) - dopunjeno sa 25g/L NaHCO3, 23,6 g/L KH2PO4i 4,7 g/L K2HPO4- je dodato.
[0095] Kao što je prikazano na Sl.6, ukupna proizvodnja SCFA i odnos SCFA proizvedenih u sastavu bio je stabilan nakon 6 ciklusa zamene. Kada je ponovo inokuliran u istoj strategiji kao što je prethodno opisano, stabilizovani Kolaborom je doveo do maksimizovane proizvodnje SCFA (odnos acetat/propionat/butirat bio je oko 14/12/74) 2 dana ranije u poređenju sa istim skupom vrsta u skupu strategiju i 25% veću proizvodnju butirata.
Primer 2: Eksperimenti in vitro
2.1 Efekat dodavanja funkcionalnog sastava složenim mikrobnim zajednicama creva [0096] Ovaj eksperiment pokazuje da je funkcionalni sastav aktivan kada se inokulira u mešovitu mikrobnu zajednicu creva, gde postoji jaka konkurencija supstrata debelog creva sa članovima ove složene crevne zajednice za koju se procenjuje da se sastoji iz 500 do 1000 mikrobnih vrsta. Da bi se rešio ovaj problem, izveden je eksperiment u malim bočicama za inkubaciju upotrebom sastava koji sadrži Lactobacillus plantarum, Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominis, Akkermansia muciniphila i Anaerostipes caccae i proizvedeno kroz strategiju Kolaborom iz
2
primera 1.3. Sve veća koncentracija unapred prilagođenog sastava (0, 4 i 20%) je isprana u PBS i dodata u tri različita medija:
1) Sterilni bazalni medijum [2 g/L pepton, 2 g/L ekstrakt kvasca, 2 mL/L Tween 80, 10 µL/L, vitamin K1, 500 mg/L L-cistein HCI, 100 mg/L NaCl, 40 mg/L K2HPO4, 40 mg/L KH2PO4, 10 mg/L MgSO4.7H2O, 6,7 mg/L CaCl2.2H2O, 1,5 mg/L resazurin, 50 mg/L hemin (50 mg/L) - pH 5.5] skrob 6 g/L
2) Bazalni medijum 20% fekalna suspenzija (pripremljena kako je opisano u De Boever i dr., 2000);
3) Bazalni medijum 20% SHIME® suspenzija debelog creva, koja sadrži kompletnu mikrobiotu.
[0097] Povećana koncentracija unapred prilagođenog konzorcijuma za proizvodnju butirata sa 0% na 4% i 20% rezultirala je proporcionalnim povećanjem apsolutnih nivoa butirata (Sl.
7). Ovo nije primećeno samo u sterilnom medijumu, već i kod podloga dopunjenih mešovitom mikrobiotom dobijenom iz uzorka fekalija ili iz regiona debelog creva SHIME®. Ovaj eksperiment tako pokazuje da sastav nije aktivan samo kada je prisutan u ne konkurentnom okruženju debelog creva, već da rezultira i višim nivoima butirata kada se daje mešovitoj mikrobioti gde se mnogi crevni mikrobi nadmeću za iste hranljive sastojke. Dalje, nije samo porasla proizvodnja butirata, već je snažno porasla i proizvodnja propionata.
Kombinacija ovih povećanja i smanjenja acetata u inkubaciji predviđa da sastav može modulirati opšte profile mikrobiološke fermentacije u korisniji profil za zdravlje.
2.2 Efikasnost funkcionalnog sastava za obnavljanje metaboličkih funkcija mikrobne zajednice disbioziranog creva izazvane antibiotikom
[0098] Veruje se da upotreba antibiotika uzrokuje velike poremećaje u zajednici mikrobiota creva. Pokazano je da je disbiozirani mikrobni sastav podložniji infekcijama patogenima. Dalje, brojna gastrointestinalna oboljenja povezana su sa disbioziranim mikrobnim sastavom, poput inflamatornih bolesti creva, podvlačeći važnost zdravog crevnog mikrobioma.
Oporavak taksonomskog sastava i posebno funkcionalnosti nakon dugotrajnog unosa antibiotika obično traje tri meseca da bi se postiglo stanje pre tretmana, zdrava mikrobiološka zajednica creva (Panda i dr., 2014). Smanjenje vremena oporavka nakon izlaganja antibiotskoj terapiji moglo bi tako smanjiti rizik od teških infekcija i promovisati zdravlje domaćina uopšte. U tom pogledu, uočena funkcionalna aktivnost odabranog sastava može biti obećavajuća strategija za poboljšanje obnavljanja mikrobnih zajednica nakon disbioze izazvane antibioticima i smanjenje rizika od infekcije.
[0099] U ovom primeru, antibiotika indukovana disbioza modelirana je u in vitro SHIME® modelu doziranjem odgovarajućih antibiotika. Cilj ovog eksperimenta bio je da se proceni oporavak tipičnih 'zdravih' profila metabolita u simuliranom crevnom okruženju nakon davanja funkcionalnog sastava. Dalje, cilj eksperimenta je bio da se razlikuje efikasnost kompozicije, bilo proizvedene kroz strategiju „Skupa“ ili strategiju „Kolaboroma“ (videti primer 1.3). Eksperiment je ponovo izveden sa sastavom koji sadrži Lactobacillus plantarum, Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominis, Akkermansia muciniphila i Anaerostipes caccae. Da bi se bolje imitirao kompletan profil funkcionalnosti crevnog mikrobioma, sastav je u ovom specifičnom eksperimentu dalje dopunjen sa Escherichia coli, Enterococcus faecium, Lactobacillus mucosae, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium longum, Bacteroides thetaiotaomicron i Bacteroides vulgatus.
[0100] U praksi, posude SHIME® (pH 6,15-6,40) inokulirane su fekalnim materijalom i ostavljene da se stabilizuju tokom 14 dana (postavljeno M-SHIME® - Van den Abbeele i dr., 2012). Posle kontrolnog perioda od 2 nedelje, mikrobiota debelog creva izvedena iz SHIME® tretirana je koktelom antibiotika (40/40/10 mg/L amoksicilina/ciprofloksacina/tetraciklina) da bi se izazvala disbioza. Dan kasnije, disbiozirana mikrobiota je pet dana tretirana funkcionalnim sastavom, proizvedenim ili strategijom „Skupa“ ili strategijom „Kolaboroma“. Krajnja tačka ispitivanja bila je procena oporavka tipičnih „zdravih“ SCFA profila metabolita u simuliranom crevnom okruženju debelog creva. Uključen je kontrolni SHIME® sud za simulaciju spontanog oporavka metaboličke aktivnosti crevne zajednice nakon izlaganja antibiotiku, bez primene sastava. Rezultati su izraženi kao delta SCFA nivoa u SHIME u svakoj vremenskoj tački vs. vrednosti pre davanja antibiotika (Sl.8).
[0101] Nakon antibiotskog tretmana SHIME® posuda, primećen je značajan pad proizvodnje acetata, propionata i butirata. Ovo otkriće potvrđuje poremećaj mikrobne zajednice u crevima. Oporavak profila metabolita (u smislu proizvodnje SCFA) u stanje pre tretmana prikazan je na Sl.8 kao evolucija acetata, propionata i butirata tokom petodnevnog perioda. To pokazuje da je oporavak funkcionalnosti bio spor u kontrolnoj situaciji (nije bilo primene smeše) i nije mogao da se primeti potpuni oporavak acetata i propionata u roku od 5 dana. Zanimljivo je da je tretman sastavom rezultirao bržim oporavkom u poređenju sa kontrolnim
4
uslovima za sva 3 SCFA. Dalje, dok je sastav strategijom Skupa indukovao puni oporavak propionata i butirata posle 5, odnosno 3 dana, sastav strategije kolaboroma indukovao je brži oporavak za razliku od strategije Kolaboroma sa potpunim oporavkom propionata i butirata nakon 4 dana, odnosno 2,5 dana. Konačno, kolaboromska strategija je takođe rezultirala povećanom završnom aktivnošću sa povećanim nivoima propionata i butirata za razliku od skupštinske strategije. Ovi rezultati ističu potencijal sastava za oporavak mikrobne disbioze posredovane antibioticima. Pored toga, otkriće jasno pokazuje da preadaptacija kroz strategiju Kolaboroma rezultira efikasnijim oporavkom mikrobiološke proizvodnje SCFA nakon izlaganja antibioticima u poređenju sa strategijom Skupa.
2.3: Efikasnost funkcionalnog sastava za obnavljanje metaboličkih funkcija disbiozirane crevne mikrobne zajednice kod inflamatornih bolesti creva
[0102] Inflamatorne bolesti creva (IBD) povezane su sa oštećenim interakcijama domaćinmikrob, što je barem delimično povezano sa stanjem disbioze mikrobiote creva. Ovo poslednje, na primer, uključuje nižu količinu butiril CoA:acetat CoA transferaze i propionat kinaze (Vermeiren i dr., FEMS 2011), što zauzvrat negativno utiče na proizvodnju uravnoteženog SCFA proizvodnog kapaciteta. S obzirom na važne efekte SCFA na normalan razvoj i održavanje creva, obnavljanje sastava mikrobiota i funkcionalnost u pogledu proizvodnje SCFA mogu pozitivno uticati na simptome povezane sa IBD. U tom pogledu, uočena funkcionalna aktivnost odabranog sastava može biti obećavajuća strategija za poboljšanje obnavljanja mikrobnih zajednica kod IBD disbioze kao osnove za obnavljanje i održavanje zdrave crevne barijere.
[0103] U ovom primeru, IBIO povezana disbioza modelirana je u in vitro M-SHIME® modelu, kao što je prethodno opisano (Vigsnaes i dr.2013). Cilj ovog eksperimenta bio je da se proceni oporavak mikrobiote u smislu SCFA profila u simuliranom okruženju creva creva nakon davanja funkcionalnog sastava. Dalje, cilj eksperimenta je bio da se razlikuje efikasnost sastava, bilo proizvedene kroz strategiju „Skupa“ ili strategiju „Kolaboroma“ (videti primer 1.3). Eksperiment je ponovo izveden sa sastavom koji sadrži Lactobacillus plantarum, Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominis, Akkermansia muciniphila i Anaerostipes caccae.
[0104] U praksi su posude SHIME® (pH 6,15-6,40) inokulirane fekalnim materijalom pacijenta sa ulceroznim kolitisom (postavljeno M-SHIME® - Van den Abbeele i dr., 2012).
Istovremeno, jedna doza funkcionalnog sastava, proizvedena ili strategijom „Skupa“ ili strategijom „Kolaborom“, dodata je u region debelog creva radi simulacije davanja. Treći eksperiment je tekao paralelno kao kontrolni eksperiment bez davanja sastava. Proizvodnja acetata, propionata i butirata praćena je 1 i 2 dana nakon davanja sastava.
[0105] Rezultati su predstavljeni na Sl.9: davanje sastava, proizvedene u skupštinskoj strategiji, rezultirala je povećanom proizvodnjom SCFA (uglavnom acetata i butirata) 1. dana, ali ovaj efekat više nije bio očigledan 2. dana. To ukazuje na to da je sastav funkcionalno aktivan u IBD mikrobiomskom okruženju. Zanimljivo je da je efekat na proizvodnju propionata i butirata bio mnogo izraženiji pri primeni sastava strategije Kolaboroma, sa četvorostrukim i trostrukim povećanjem proizvodnje propionata i butirata, za razliku od kontrole IBD. Za razliku od sastava strategije Skupa, efekat je i dalje bio izražen na d2 i poklapao se sa nižom proizvodnjom acetata (indikacija povećanog ukrštanja i samim tim poboljšanog umrežavanja). Ovi rezultati naglašavaju potencijal sastava za oporavak mikrobne disbioze povezane sa IBD. Pored toga, otkriće jasno pokazuje da preadaptacija kroz strategiju Kolaboroma rezultira efikasnijim oporavkom mikrobiološke proizvodnje SCFA pod uslovima IBD u poređenju sa strategijom Skupa.
2.4: Efikasnost funkcionalnog sastava za inhibiranje rasta vegetativnog Clostridium difficile u simulacionom testu in vitro
[0106] U ovom primeru je izveden test izazivanja Clostridium difficile sa ciljem da se proceni da li funkcionalni sastav nije samo funkcionalno aktivan u crevnim uslovima, već takođe može da zaštiti crevno okruženje od infekcija. U takvom testu izazivanja, sastav je izazvana vegetativnim ćelijama Clostridium difficile (Cdif) da bi se procenila njegova sposobnost da inhibira rast Cdif pod simuliranim gastrointestinalnim uslovima. Dalje, cilj eksperimenta je bio da se razlikuje efikasnost sastava, bilo proizvedene kroz strategiju „Skupa“ ili strategiju „Kolaboroma“ (videti primer 1.3). Eksperiment je ponovo izveden sa sastavom koji sadrži Lactobacillus plantarum, Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominis, Akkermansia muciniphila i Anaerostipes caccae.
[0107] U praksi, zaliha glicerola Clostridium difficile (LMG 21717T) je odmrznuta i inokulirana u bočici koja sadrži čorbu ojačanog klostridijskog medija (RCM) koja je isprana azotom da bi se osigurali anaerobni uslovi. Boca je inkubirana u inkubatoru za mućkanje (90 o/min) tokom 24 sata i 10% uzgajane kulture je ponovo inokulirano u RCM čorbi. Posle 24 sata rasta, homogenizovana kultura C. difficile je alikvotirana (u tri primerka) u boce (10% v:v) koje sadrže:
1) Bazalni medijum (prazno);
2) Bazalni medijum koji sadrži sastav skupštinske strategije;
3) Bazalni medijum koji sadrži sastav strategije kolaboroma;
4) Bazalni medijum koji sadrži suspenziju debelog creva SHIME®.
[0108] Flaše su inkubirane na 37°C u mućkalici (90 o/min). U redovnim vremenskim tačkama, uzorak je sakupljan i odmah smrzavan na -80°C pre kvantifikovanja C. difficile pomoću qPCR testa na osnovu detekcije i kvantifikacije gena trioze fosfat izomeraze. U tu svrhu je ekstrahovana genomska DNK prema Boon i dr. (2003). Reakcija amplifikacije obuhvatala je napredni i reverzni oligonukleotid: 5'- TATGGACTATGTTGTAATAGGAC-3' (napred) i 5'-CATAATATTGGGTCTATTCCTAC-3' (unazad). Apsolutna kvantifikacija PCR proizvoda dobijena je stvaranjem standardne krive.
[0109] U ovom kontrolisanom in vitro simulacionom testu, primećen je rast C. difficile u bazalnom medijumu nakon 48 sati inkubacije, što potvrđuje validnost slepe u in vitro simulacionom testu. Suspenzija debelog creva SHIME® (kao simulacija stvarne fekalne transplantacije) pokazala je najviši C. difficile inhibicija rasta nakon 48h inkubacije (tj.58%). Zanimljivo je da je sličan rezultat dobijen za sastav strategije Kolaboroma, pokazujući približno 53% inhibicije rasta C. difficile. Najmanji efekat je primećen kada je dodat sastav strategije Skupa (tj.23% inhibicije rasta). Ovaj eksperiment jasno pokazuje da sastav C. difficile u svom rastu značajno inhibira rast i da je ta inhibicija najizraženija u slučaju preadaptacije sastava kroz strategiju Kolaboroma.
2.5: Efekat funkcionalnog sastava na biomarkere domaćina na funkcionisanje crevne barijere i crevnog imuniteta
[0110] Primeri 2.1 do 2.3 su pokazali da je sastav funkcionalno aktivan u složenim crevnim uslovima i može da obnovi profile crevnih metabolita, sa najvećom aktivnošću u slučaju proizvodnje kroz strategiju kolaboroma. To zauzvrat može blagotvorno uticati na crevni epitel, a time i na funkcionisanje crevne barijere i lokalni imunitet.
[0111] Da bi se procenila ta mogućnost, ovaj primer opisuje kombinaciju uzoraka prikupljenih iz prethodnih eksperimenata na utvrđenom modelu ćelija zajedničke kulture enterocita (Caco-2 ćelije) i makrofaga (THP1) (Possemiers i dr.2013). U ovom modelu, stimulacija THP1 ćelija sa LPS rezultira povećanom proizvodnjom pro-inflamatornih citokina, što zauzvrat teži da poremeti sloj enterocita stvarajući takozvano curenje creva. Efekat na curenje creva meri se procenom efekta električnog otpora transepitela (TEER) [merenje efikasnosti barijere creva] i stvaranja inflamatornih citokina, u poređenju sa kontrolnim stanjem.
[0112] U praksi su uzorci prikupljeni 1. dana iz eksperimenta M-SHIME iz primera 2.3 kombinovani sa modelom curenja creva kokulture.
2.6: Uticaj varijacija identiteta soja na funkcionalnu aktivnost sastava
[0113] Da bi se procenilo da li je iznenađujući sinergijski efekat između 7 izolata u kompoziciji specifičan za soj ili se takođe može postići sa drugim sojevima iste vrste, izveden je dodatni eksperiment. U ovom primeru, dva različita sastava su proizvedene kroz strategiju „Kolaborom“ (videti primer 1.3). Dok sastav 1 sadrži specifične izolate opisane u primeru 1.2, sastav 2 se sastoji iz sojeva iste vrste dobijenih iz zbirki kultura:
• Sastav 1: Faecalibacterium prausnitzii LMG P-29362, Butyricicoccus pullicaecorum LMG P-29360, Roseburia inulinivorans LMG P-29365, Roseburia hominis LMG P-29364, Akkermansia muciniphila LMG P-29361, Lactobacillus plantarum LMG P-29366 i Anaerostipes caccae LMG P-29359
• Sastav 2: Lactobacillus plantarum ZJ316, Faecalibacterium prausnitzii (DSMZ 17677), Butyricicoccus pullicaecorum (LMG 24109), Roseburia
inulinivorans (DSMZ 16841), Roseburia hominis (DSMZ 16839), Akkermansia muciniphila (DSMZ 22959) i Anaerostipes caccae (DSMZ 14662)
[0114] U praksi, odabrane vrste su preuzete iz njihovih zaliha glicerola i uzgajane pod njihovim odgovarajućim optimalnim uslovima rasta da bi se dobile homogene suspenzije sojeva bakterija. Zatim su sojevi pomešani u Sastavu 1, odnosno Sastavu 2, i svaki inokuliran u tri primerka u SHIME® postavci (Van den Abbeele i dr., 2010) koja se sastojala od jednog regiona debelog creva pri pH 6,15-6,4. Profil proizvodnje butirata praćen je tokom perioda od 14d.
[0115] Zanimljivo je da je dinamika proizvodnje butirata bila vrlo slična za oba sastava, sa početnim jakim fluktuacijama, praćenim stabilizacijom nivoa butirata nakon približno 6 dana. Na kraju eksperimenta (d14), nivoi butirata za Sastav 1 dostigli su 19,3 mM, dok su nivoi za Sastav 2 iznosili 18,8 mM. To pokazuje da bi se sinergijski efekat primećen u sastavu iz primera 1.2 mogao ponoviti korišćenjem različitih sojeva dobijenih od iste vrste.
Primer 3: In vivo eksperimenti
3.1: Mišji model poremećaja gastrointestinalne mikrobiote izazvanog antibiotikom [0116] Cilj eksperimenta u ovom primeru bio je da se proceni da li funkcionalni sastav takođe može in vivo da obnovi metabolički kapacitet crevnog mikrobioma nakon disbioze izazvane antibioticima.
[0117] U ovom primeru, sastav, koji sadrži Lactobacillus plantarum, Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominis, Akkermansia muciniphila i Anaerostipes caccae, je korišćen i proizveden pomoću strategije „Kolaborom“ iz Primera 1.3. Dalje, da bi se procenila potreba za potpunijim oponašanjem kompletnog profila funkcionalnosti crevnog mikrobioma, izveden je dodatni eksperiment u kome je sastav dalje dopunjen Escherichia coli, Enterococcus faecium, Lactobacillus mucosae, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium longum, Bacteroides thetaiotaomicron i Bacteroides vulgatus (naziva se „prošireni sastav“).
[0118] U praksi su „sastav“ i „prošireni sastav“ pripremljeni sveži u skladu sa strategijom kolaboroma, dva puta isprani u PBS (u anaerobnoj komori da bi se osigurali anaerobni uslovi), koncentrovani u 100 µL i davani miševima oralnim davanjem čim je trebalo moguće. Miševi (C57/BL6) stari najmanje 5 nedelja su kupljeni, držani u uslovima bez patogena i hranjeni standardnom ishranom. Eksperimenti na mišima su izvedeni u skladu sa protokolima koje je odobrio Etički komitet za ispitivanja životinja sa Univerziteta u Ghent, Belgija. Da bi se izazvala antibiotska indukovana disbioza, antibiotik klindamicin doziran je u vodu za piće u koncentraciji od 250 mg/L. Posle 5 dana antibiotskog tretmana, sadržaj želuca miševa je neutralisan NaHCO3, nakon čega se miševima (10 miševa u grupi) daje oralna vatra pet uzastopnih dana sa:
1) sastav u fiziološkom rastvoru;
2) prošireni sastav u fiziološkom rastvoru i
3) fiziološki rastvor (Kontrola).
[0119] Konvencionalna grupa (bez lečenja antibioticima, ali tretirana fiziološkim rastvorom) je uključena kao kontrola kako bi se isključila varijabilnost koja proizilazi iz postupka davanja. Tokom eksperimenta, uzorci fekalija (približno 100 mg/mišu) sakupljani su i čuvani na -80°C za buduće analize.
[0120] SCFA profili, dobijeni iz objedinjenih uzoraka fekalija miševa poreklom iz istih grupa, pokazuju da 5 dana lečenja antibioticima značajno smanjuje proizvodnju butirata i propionata do te mere da je ostao samo acetat (Sl.10). Kao što je prikazano na Sl.10, spontani oporavak metaboličkih funkcija je spor i započet je tek oko 5 dana (d10) nakon poslednjeg tretmana antibiotikom, iako molarni odnosi tri glavna SCFA (acetat, propionat i butirat) nisu ipak se vratite u pre-antibiotsko stanje. Međutim, kada su miševi tretirani bilo sastavom, bilo proširenim sastavom strategije kolaboroma, oporavak metabolizma butirata započeo je otprilike 3 dana (d8) nakon lečenja antibiotikom. Dalje, metabolička aktivnost miševa tretiranih sa obe smeše pokazala je gotovo potpun oporavak 5 dana nakon poslednje doze antibiotika (d10), uz dobru proizvodnju i propionata i butirata. Prošireni sastav je sadržao veću raznolikost proizvođača acetata i propionata u poređenju sa sastavom, što se takođe odražava na malo drugačiji profil fermentacije na d10 eksperimenta. U zaključku, ovaj primer daje in vivo potvrdu da je funkcionalni sastav efikasan u postizanju bržeg i snažnijeg oporavka crevnih metaboličkih profila nakon disbioze izazvane antibioticima. Pored toga, varijacije tačnih kombinacija vrsta u sastavu omogućavaju podešavanje krajnjeg rezultata u određene metaboličke profile.
3.2: TNBS model miša za inflamaciju
[0121] Model TNBS (2,4,6-trinitrobenzensulfonska kiselina) je uobičajeni model za kolitis koji oponaša neke od karakteristika Kronove bolesti (Scheiffele i dr.2001), uključujući gubitak kilograma, krvavu dijareju i zadebljanje crevnih zidova. U histopatologiji, TNBS uzrokuje neravnomerno transmuralnu inflamaciju creva sa stvaranjem dubokih čireva, klasičnih karakteristika kod pacijenata sa CD. Ovo čini TNBS model dobrim kandidatom za in vivo procenu kapaciteta funkcionalnog sastava za sprečavanje i/ili vraćanje oštećenja crevne sluznice kod IBD i za pomoć u održavanju/razvoju zdrave crevne barijere.
[0122] U ovom primeru, sastav, koji sadrži Lactobacillus plantarum, Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominis, Akkermansia muciniphila i Anaerostipes caccae je korišćen za procenu blagotvornih efekata nakon procene u TNBS modelu. Dalje, cilj eksperimenta je bio da se razlikuje efikasnost sastava, bilo proizvedene kroz strategiju „Skupa“ ili strategiju „Kolaboroma“ (videti primer 1.3). Kolitis je izazvan kod životinja rektalnom instalacijom TNBS, sredstava za
4
senzibilizaciju sluznice razređenih u etanolu. Primena etanola je preduslov za probijanje barijere sluzokože debelog creva kako bi se omogućio prodor TNBS u laminu propriju. TNBS haptenizira lokalizovane mikrobne proteine debelog creva i creva da bi postali imunogeni, pokrećući tako urođene i adaptivne imunološke reakcije domaćina.
[0123] U praksi, muški miševi C57BL6/J stari 8 do 10 nedelja bili su smešteni u temperaturno kontrolisanu prostoriju na 20°C sa 12:12-časovnim ciklusom svetlo-tamno. Životinje su imale slobodan pristup vodi i komercijalnom čaju. Miševi su nasumično postavljeni u kaveze kako bi se izbegli efekti kaveza. Posle jedne nedelje aklimatizacije, započet je eksperiment. Svaka grupa (n = 9/grupa) lečena je 5 dana uzastopno oralnim vađenjem. Preventivno doziranje svih tretmana započelo je 1 dan pre davanja 2 mg TNBS/50% EtOH rektalno i trajalo je 4 dana nakon primene TNBS, pre nego što su miševi žrtvovani. Uključeni su sledeći tretmani:
1) TNBS sastav strategije Skupa u fiziološkom rastvoru;
2) TNBS sastav strategije Kolaboroma u fiziološkom rastvoru i
3) TNBS fiziološki rastvor (Kontrola).
[0124] Konvencionalna grupa (bez lečenja pomoću TNBS, ali tretirana fiziološkim rastvorom) je uključena kao kontrola kako bi se isključila varijabilnost koja proizilazi iz postupka davanja. Kao krajnja tačka ispitivanja, aktivnost bolesti praćena je svakodnevno (pre svakodnevnog lečenja) merenjem telesne težine, gubitka fekalne krvi (ColoScreen) i opšteg izgleda.
[0125] Rezultati ovog primera predstavljeni su na Sl.11. Nisu primećeni efekti na težinu niti aktivnost bolesti za kontrolnu grupu vozila (fiziološki rastvor) sa fiziološkim rastvorom bez TNBS, dok je kontrolna grupa koja je primila TNBS pokazala trenutni gubitak težine na d1 od 8% i snažan porast aktivnosti bolesti. I gubitak kilograma i aktivnost bolesti delimično su obnovljeni do kraja ispitivanja. Zanimljivo je da je snažan zaštitni efekat sastava primećen i na gubitak težine i na aktivnost bolesti, ali obim ovog zaštitnog efekta zavisio je od proizvodne strategije sastava. Iako je početna blaga zaštita primećena na d1 za strategiju Skupa, kao što je prikazano kao smanjenje gubitka težine i aktivnost bolesti, ovaj zaštitni efekat više nije primećen narednih dana ispitivanja. Suprotno tome, primena kompozicije proizvedene kroz strategiju Kolaboroma dovela je do snažnog preventivnog efekta na gubitak težine i aktivnost bolesti na d1, u poređenju sa kontrolom TNBS, i brže i potpuno obnavljanje do kraja ispitivanja, kao što je prikazano povratkom aktivnosti bolesti na nivo kontrole vozila. U zaključku, ovaj primer daje in vivo potvrdu da je funkcionalni sastav efikasan u postizanju snažnije prevencije i bržeg i snažnijeg oporavka od inflamacije creva i aktivnosti bolesti nakon indukcije kolitisa izazvane TNBS. Štaviše, ovo otkriće jasno pokazuje da preadaptacija kroz strategiju Kolaboroma rezultira efikasnijom aktivnošću u poređenju sa strategijom Skupa
3.3: DSS model miša za inflamaciju
[0126] Hronični DSS model je uobičajeni model za kolitis koji oponaša neke od karakteristika Kronove bolesti, uključujući gubitak težine i krvavu dijareju. U histopatologiji, hronična primena DSS uzrokuje zapaljenje creva sa tipičnim arhitektonskim promenama kao što su izobličenje kripte, infiltracija (pod) sluzokože inflamatornih ćelija i fibroza, karakteristike koje se mogu naći kod pacijenata sa CD. Ovo čini DSS model dobrim kandidatom za in vivo procenu kapaciteta funkcionalnog sastava za sprečavanje i/ili vraćanje oštećenja crevne sluznice kod IBD i za pomoć u održavanju/razvoju zdrave crevne barijere.
[0127] U ovom primeru, sastav, sadrži Lactobacillus plantarum, Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominis, Akkermansia muciniphila i Anaerostipes caccae, i proizveden kroz strategiju „Kolaboroma“ (videti primer 1.3), koristi se za procenu blagotvornih efekata nakon procene u hroničnom DSS modelu. Kolitis se kod životinja izaziva ponovljenim davanjem DSS u vodu za piće (izazov od 0,25%). Eksperiment se izvodi tokom ukupno 8 nedelja, sa 3 ciklusa davanja i oporavka DSS-a.
[0128] U praksi, muški miševi C57BL6/J stari 6 nedelja smešteni su u prostoriju sa kontrolisanom temperaturom na 20°C sa 12:12-časovnim ciklusom svetlo-tamno. Životinje su imale slobodan pristup vodi i komercijalnom čaju. Miševi su nasumično postavljeni u kaveze kako bi se izbegli efekti kaveza. Posle jedne nedelje aklimatizacije, započet je eksperiment. Svaka grupa (n = 10/grupi) lečena je 3 puta nedeljno tokom 8 uzastopnih nedelja oralnim vađenjem. Preventivno doziranje svih tretmana započeto je nedelju dana pre prvog DSS ciklusa. Prvi DSS ciklus započeo je 2. nedelje i obuhvatao je nedelju davanja DSS (0,25% u vodi za piće), nakon čega su sledile dve nedelje oporavka. Ovaj prvi ciklus praćen je identičnim drugim DSS ciklusom. Treći DSS ciklus sastojao se od jedne nedelje davanja DSS, nakon čega je usledio nedelju oporavka, nakon čega su životinje žrtvovane. Uključeni su sledeći tretmani:
1) ne-DSS kontrola
2) DSS sastav strategije kolaboroma u fiziološkom rastvoru (3 puta nedeljno) i
3) DSS fiziološki rastvor (DSS kontrola).
[0129] Kao krajnja tačka ispitivanja, indeks aktivnosti bolesti (DAI) praćen je tokom svakog DSS ciklusa, tri puta nedeljno (pre svakodnevnog tretmana) praćenjem telesne težine, gubitka fekalne krvi (ColoScreen) i opšteg izgleda. Kao što je prikazano na Sl.12, nisu primećeni efekti na DAI za kontrolnu grupu vozila (fiziološki rastvor) bez DSS, dok je kontrolna grupa koja je primila DSS pokazala snažan porast DAI u svakom ciklusu davanja. Zanimljivo je da je snažan zaštitni efekat (približno 25% niži DAI u svakom ciklusu) sastava primećen na aktivnost bolesti. Ovo dalje pokazuje da je funkcionalni sastav efikasan u postizanju snažnog zaštitnog efekta od upale creva i aktivnosti bolesti nakon indukcije kolitisa izazvane DSS-.
Primer 3.5: Model mukozitisa
[0130] Mukozitis je klinički termin koji se koristi za opisivanje oštećenja sluzokože nakon terapija protiv raka. Javlja se u čitavom gastrointestinalnom traktu (GT) (uključujući usta) i genito-urinarnom traktu, a u manjoj meri i na drugim površinama sluzokože. Njegova težina i trajanje variraju u zavisnosti od doze i vrste leka koji se koristi.
[0131] Značaj mukozitisa je u tome što ograničava dozu hemoterapije. GI epitel kripte je posebno osetljiv na hemoterapeutsku toksičnost, sa simptomima koji uključuju mučninu i povraćanje, bolove u stomaku, rastezanje i dijareju zbog direktnih efekata citotoksičnih supstanci na sluznicu. Keefe i dr., model mukozitisa creva kod pacova izazvanog 5-fluorouracilom (5FU) za procenu efekata hemoterapije na GI trakt i to je sada jedan od najopsežnijih modela za ispitivanje mukozitisa izazvanog hemoterapijom kod pacova (Keefe 2004).
[0132] U ovom primeru, sastav, sadrži Lactobacillus plantarum, Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Akkermansia muciniphila i Anaerostipes caccae, je korišćena kao osnova za eksperiment i proizvedena je pomoću strategije „Kolaboroma“ iz Primera 1.3. Mukozitis se indukuje pomoću jedne intraperitonealne doze od 5FU.
[0133] U praksi je ukupno 30 pacova bilo nasumično raspoređeno u kontrolnu ili eksperimentalnu grupu prema određenoj vremenskoj tački. Svi pacovi u eksperimentalnim
4
grupama primili su jednu intraperitonealnu dozu od 5FU (150mg 5FU/kg telesne mase). Pacovi u kontrolnim grupama su bili tretirani rastvaračem (dimetilsulfoksidom). Nakon davanja lekova za hemoterapiju, krajnje tačke ispitivanja poput mortaliteta, dijareje i opšteg kliničkog stanja procenjivane su četiri puta u periodu od 24 sata. Podgrupe pacova su ubijene eksanguinacijom i iščašenjem grlića materice u 24, 48 i 72 sata nakon davanja leka. Primarne krajnje tačke od interesa bile su razvoj telesne težine, dijareja i opšte dobro (ocena bolesti). Sekundarne krajnje tačke su uključivale histologiju crevnih uzoraka i analizu mikrobiote sluzokože stolice i creva.
[0134] Da bi se procenio efekat smeše na prevenciju ili smanjenje procenjenih simptoma, deo pacova je davana 8 dana uzastopno sa sastavom oralnom gavažom. Preventivno doziranje je započelo 5 dana pre davanja 5FU i trajalo je 3 dana nakon davanja 5FU ili dok pacovi nisu žrtvovani. Kontrolne životinje nisu dobile sastav.
Reference
[0135]
• Bahaka i dr.1993 - Phenotypic and genomic analyses of human strains belonging or related to Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, and Bifidobacterium breve. - Int J Syst Evol Microbiol.43: 565-573
• Barcenilla i dr.2000 - Phylogenetic relationships of butyrate-producing bacteria from the human gut - Appl Environ Microbiol 66, 1654-1661
• Barnett i dr.2012 - The interactions between endogenous bacteria, dietary components and the mucus layer of the large bowel. - Food Funct.3: 690-9
• Becker i dr.2011 - Human intestinal microbiota: characterization of a simplified and stable gnotobiotic rat model - Gut Microbes, 2: 25-33
• Boon i dr.2003 - Bioaugmentation as a tool to protect the structure and function of an activated-sludge microbial community against a 3-chloroaniline shock load - Appl Environ Microbiol, 69: 1511-1520
• Brandl i dr.2008 - Vancomycin-resistant enterococci exploit antibiotic-induced innate immune deficits - Nature.455: 804-7
• Cénit i dr.2014 - Rapidly expanding knowledge on the role of the gut microbiome in health and disease - Biochim Biophys Acta.1842: 1984-1992
• Clemente i dr.2012 - The impact of the gut microbiota on human health: an integrative view - Cell.148: 1258-70
Cummings & Macfarlane, 1997 - Role of intestinal bacteria in nutrient metabolism - J Parenter Enteral Nutr.21: 357-65
Derrien i dr.2004 - Akkermansia muciniphila gen. nov., sp. nov., a human intestinal mucin-degrading bacterium - Int J Syst Evol Microbiol.54: 1469-1476
De Vrieze 2013 - Medical research. The promise of poop - Science. 341: 954-7 Duncan i dr. (2002) - Growth requirements and fermentation products of Fusobacterium prausnitzii, and a proposal to reclassify it as Faecalibacterium prausnitzii gen. nov., comb. nov. - Int J Syst Evol Microbiol.52: 2141-2146 Duncan i dr. (2006) - Proposal of Roseburia faecis sp. nov., Roseburia hominis sp. nov. and Roseburia inulinivorans sp. nov., based on isolates from human faeces - Int J Syst Evol Microbiol.56: 2437-2441
Eeckhaut i dr. (2008) - Butyricicoccus pullicaecorum gen. nov., sp. nov., an anaerobic, butyrate-producing bacterium isolated from the caecal content of a broiler chicken - Int J Syst Evol Microbiol, 58: 2799-2802
Fuller & Gibson, 1997 - Modification of the intestinal microflora using probiotics and prebiotics - Scand J Gastroenterol Suppl.222: 28-31
Hartemink i dr.1996 - Raffinose-Bifidobacterium (RB) agar, a new selective medium for bifidobacteria - J Microbiol Methods, 27: 33-43
Hartemink i dr.1997 - LAMVAB-A new selective medium for the isolation of lactobacilli from faeces - J Microbiol Methods, 29: 77-84
lannitti and Palmieri, 2010 - Therapeutical use of probiotic formulations in clinical practice - Clin Nutr.29: 701-25
Le Bon i dr.2010 - Influence of probiotics on gut health in the weaned pig - Livestock Sci, 133: 179-181
Livingston i dr.1798 - New medium for selection and presumptive identification of the Bacteroides fragilis group. J Clin Microbiol 7: 448-453
Keefe 2004 - Gastrointestinal mucositis: a new biological model - Supp Care Canc, 12: 6-9
Khoruts i dr, 2010 - Changes in the composition of the human fecal microbiome after bacteriotherapy for recurrent Clostridium difficile-associated diarrhea - J Clin Gastroenterol. 44: 354-60
Kinross i dr.2011 - Gut microbiome-host interactions in health and disease - Genome Med. 3: 14
Macfarlane & Macfarlane, 1997 - Human colonic microbiota: ecology, physiology
4
and metabolic potential of intestinal bacteria - Scand J Gastroenterol, 32: 3-9 Newton i dr 1998 - Growth of a human intestinal Desulfovibrio desulfuricans in continuous cultures containing defined populations of saccharolytic and amino acid fermenting bacteria - J Appl Microbiol 85: 372-380
Panda i dr.2014 - Short-Term Effect of Antibiotics on Human Gut Microbiota - PloS One, 9: e95476
Petrof i dr, 2013 - Stool substitute transplant therapy for the eradication of Clostridium difficile infection: 'RePOOPulating' the gut - Microbiome 1: 3-10 Possemiers i dr.2004 - PCR-DGGE-based quantification of stability of the microbial community in a simulator of the human intestinal microbial ecosystem - FEMS Microbiol Ecol, 49: 495-507
Possemiers i dr.2013 - A dried yeast fermentate selectively modulates both the luminal and mucosal gut microbiota, enhances butyrate production and protects against inflammation, as studied in an integrated in vitro approach - J Agric Food Chem, 61: 9380-9392
Rath i dr.1999 - Differential induction of colitis and gastritis in HLA-B27 transgenic rats selectively colonized with Bacteroides vulgatus or Escherichia coli. - Infect Immun, 67: 2969-2974
Roos i dr.2000 - Lactobacillus mucosae sp. nov., a new species with in vitro mucusbinding activity isolated from pig intestine. Int J Syst Evol Microbiol, 50: 251-258 Scharek i dr.2000 - Bifidobacterium adolescentis Modulates the Specific Immune Response to Another Human Gut Bacterium, Bacteroides thetaiotaomicron, in Gnotobiotic Rats - Immunobiology, 5: 429-441
Scheiffele and Fuss 2002 - Induction of TNBS colitis in mice. Curr Protocols Immunol, doi: 10.1002/0471142735.im1519s49
Schleifer i dr.1984 - Transfer of Streptococcus faecalis and Streptococcus faecium to the Genus Enterococcus nom. rev. as Enterococcus faecalis comb. nov. and Enterococcus faecium comb. nov. - Int J Syst Evol Microbiol 34: 31-34 Schwiertz i dr.2002 - Anaerostipes caccae gen. nov., sp. nov., a new saccharolytic, acetate-utilising, butyrate-producing bacterium from human faeces - Syst Appl Microbiol 25, 46-51
Sekirov i dr, 2008 - Antibiotic-induced perturbations of the intestinal microbiota alter host susceptibility to enteric infection - Infect Immun.76: 4726-36
Van den Abbeele i dr.2010 - Microbial community development in a dynamic gut
4
model is reproducible, colon region specific, and selective for Bacteroidetes and Clostridium cluster IX - Appl Environ Microbiol 76: 5237-5246
Van den Abbeele i dr.2013 - Prebiotics, faecal transplants and microbial network units to stimulate biodiversity of the human gut microbiome - Microb Biotechnol.6: 335-40
Van Loo i dr, 1999 - Functional food properties of non-digestible oligosaccharides: a consensus report from the ENDO project (DGXII AIRII-CT94-1095) - Br J Nutr.81: 121-32
Vermeiren i dr.2011 - Decreased colonization of fecal Clostridium coccoides/Eubacterium rectale species from ulcerative colitis patients in an in vitro dynamic gut model with mucin environment - FEMS Microbiol Ecol, 79: 685-696 Vigsnaes i dr.2013 - Microbiotas from UC patients display altered metabolism and reduced ability of LAB to colonize mucus - Sci Rep.3: 1110
Walter 2008 - Ecological Role of Lactobacilli in the Gastrointestinal Tract:
Implications for Fundamental and Biomedical Research - Appl Environ Microbiol, 74: 4985-4996
Weisburg i dr.1991 - 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study - J. Bacteriol, 173: 697-703
Willing i dr, 2009 - Twin studies reveal specific imbalances in the mucosa-associated microbiota of patients with ileal Crohn's disease - Inflamm Bowel Dis.15: 653-60 WO2013037068 - Method for treatment of disorders of the gastrointestinal system (Allen-Vercoe and Petrof, 2013)
WO2014145958A2 - Network-based microbial compositions and methods (Henn i dr 2014)
4
4
4
1
2
�

Claims (13)

Patentni zahtevi
1. Sastav koji se u osnovi sastoji iz bakterija koje pripadaju vrsti Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominis, Akkermansia muciniphila, Lactobacillus plantarum i Anaerostipes caccae, ili, pripadaju vrstama Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Akkermansia muciniphila, Lactobacillus plantarum i Anaerostipes caccae, ili, pripadaju vrstama Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominis, Akkermansia muciniphila, Lactobacillus plantarum, Anaerostipes caccae, Escherichia coli, Enterococcus faecium, Lactobacillus mucosae, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium longum, Bacteroides thetaiotaomicron i Bacteroides vulgatum.
2. Sastav prema patentnom zahtevu 1, koji je za upotrebu u prevenciji ili lečenju simptoma povezanih sa gastrointestinalnim poremećajem.
3. Sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 2, gde je navedeni gastrointestinalni poremećaj poremećaj barijerne funkcije creva, dijareja, zatvor, sindrom iritabilnog creva, inflamatorna bolest creva, Kronova bolest, ulcerozni kolitis, celijakija, poučitis, mukozitis, infekcija creva, disbioza mikrobiote creva i bilo koja njihova kombinacija.
4. Sastav za upotrebu prema patentnim zahtevima 2-3, gde se navedeni gastrointestinalni poremećaj sprečava ili leči putem: a) stimulisanje rasta i/ili aktivnosti jedne ili ograničenog broja korisnih bakterija u crevnom traktu, b) inhibiranje rasta i/ili aktivnosti jedne ili ograničenog broja patogenih bakterija u crevnom traktu, c) relativno povećanje vezivanja ne patogenih bakterija na sluznicu gastrointestinalne površine, d) smanjenje nekontrolisanog unosa antigena, pro-inflamatornih, bakterija ili bakterijskih proizvoda u creva, e) pružanje antiinflamatorne aktivnosti na crevnoj površini, f) povećanje funkcionisanja crevne barijere, d) stvaranje bakterijskih metabolita ili h) bilo koja kombinacija od a) do d).
5. Sastav koji se u osnovi sastoji iz bakterija koje pripadaju vrsti Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominis, Akkermansia muciniphila, Lactobacillus plantarum i Anaerostipes caccae, ili, pripadaju vrstama Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Akkermansia muciniphila, Lactobacillus plantarum i Anaerostipes caccae, ili, pripadaju vrstama Faecalibacterium prausnitzii, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominis, Akkermansia muciniphila, Lactobacillus plantarum, Anaerostipes caccae, Escherichia coli, Enterococcus faecium, Lactobacillus mucosae, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium longum, Bacteroides thetaiotaomicron Bacteroides vulgatum i jedan ili više probiotika.
6. Sastav prema patentnim zahtevima 1–2 i 5, gde se pomenute bakterije uzgajaju zajedno u fermentatoru pre davanja pomenutog sastava radi sprečavanja ili lečenja navedenih gastrointestinalnih poremećaja.
7. Sastav prema patentnom zahtevu 6, gde je navedeni fermentator dinamički simulator gastrointestinalnog trakta.
8. Sastav prema patentnom zahtevu 1, gde su pomenute bakterije odabrane sa liste sledećih sojeva: Faecalibacterium prausnitzii LMG P-29362, Faecalibacterium prausnitzii DSMZ 17677, Butyricicoccus pullicaecorum LMG P-29360, Butyricicoccus
pullicaecorum LMG24109, Roseburia inulinivorans LMG P-29365, Roseburia inulinivorans DSMZ 16841, Roseburia hominis LMG P-29364, Roseburia hominis DSMZ 16839, Akkermansia muciniphila LMG P-29361, Akkermansia muciniphila DSMZ 22959, Lactobacillus plantarum LMG P-29366, Lactobacillus plantarum ZJ316, Anaerostipes caccae LMG P-29359, Anaerostipes caccae DSMZ 14662 ili sojevi koji pokazuju najmanje 97% identičnosti sekvence sa 16SrRNK sekvencama najmanje jednog od navedenih sojeva.
9. Sastav prema patentnim zahtevima 1- 2 i 5 do 8, gde je navedeni sastav farmaceutski sastav formulisan ili kao rektalno davani oblik ili oralno svarljivi oblik
10. Sastav prema patentnom zahtevu 9, gde je navedeni oralno svarljivi oblik kapsula, mikrokapsula, tableta, granula, prah, lozenga, pilula, suspenzija ili sirup.
11. Sastav prema patentnom zahtevu 10, koji je ugrađen u hranu, piće, dodatak hrani ili nutraceutik.
12. Sastav prema patentnim zahtevima 1-2 i 5-11, gde pomenuti sastav sadrži između 10<5>i 10<11>jedinica formiranja kolonija bakterija.
13. Reaktor koji sadrži sastav kako je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 2 i 5-12
RS20201197A 2016-02-04 2017-02-03 Upotreba mikrobnih zajednica za zdravlje ljudi i životinja RS60918B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP16154288 2016-02-04
EP17703726.4A EP3411052B8 (en) 2016-02-04 2017-02-03 Use of microbial communities for human and animal health
PCT/EP2017/052422 WO2017134240A1 (en) 2016-02-04 2017-02-03 Use of microbial communities for human and animal health

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60918B1 true RS60918B1 (sr) 2020-11-30

Family

ID=55310719

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230900A RS64782B1 (sr) 2016-02-04 2017-02-03 Upotreba mikrobnih zajednica za zdravlje ljudi i životinja
RS20201197A RS60918B1 (sr) 2016-02-04 2017-02-03 Upotreba mikrobnih zajednica za zdravlje ljudi i životinja

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230900A RS64782B1 (sr) 2016-02-04 2017-02-03 Upotreba mikrobnih zajednica za zdravlje ljudi i životinja

Country Status (23)

Country Link
US (7) US11096971B2 (sr)
EP (3) EP3639834B1 (sr)
JP (3) JP7016112B2 (sr)
KR (2) KR102816794B1 (sr)
CN (2) CN116570631A (sr)
AU (2) AU2017216285B2 (sr)
CA (1) CA3011083A1 (sr)
CY (1) CY1123954T1 (sr)
DK (2) DK3411052T3 (sr)
ES (2) ES2824536T3 (sr)
FI (1) FI3639834T3 (sr)
HR (1) HRP20231182T1 (sr)
HU (2) HUE063584T2 (sr)
IL (3) IL293486B2 (sr)
LT (2) LT3411052T (sr)
MX (1) MX382399B (sr)
PL (2) PL3411052T3 (sr)
PT (1) PT3639834T (sr)
RS (2) RS64782B1 (sr)
RU (1) RU2758387C2 (sr)
SI (2) SI3411052T1 (sr)
SM (1) SMT202000547T1 (sr)
WO (1) WO2017134240A1 (sr)

Families Citing this family (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2964480A1 (en) 2014-10-31 2016-05-06 Whole Biome Inc. Methods and compositions relating to microbial treatment and diagnosis of disorders
EP3639834B1 (en) 2016-02-04 2023-07-12 Universiteit Gent Use of microbial communities for human and animal health
CN115887508A (zh) * 2016-03-04 2023-04-04 加利福尼亚大学董事会 微生物聚生体及其用途
KR102708641B1 (ko) 2016-09-27 2024-09-24 더 보드 오브 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 미생물유전체를 조정함으로써 면역 체크포인트 차단 요법을 증강시키는 방법
US11723935B2 (en) * 2017-02-06 2023-08-15 New York University Methods and compositions for treating and diagnosing pancreatic cancers
CN107384828B (zh) * 2017-08-22 2020-06-16 中国农业科学院农产品加工研究所 阿克曼氏粘细菌培养基及其制备方法
JP2020532515A (ja) 2017-08-30 2020-11-12 ペンデュラム セラピューティクス， インコーポレイテッド マイクロバイオーム関連障害の処置のための方法および組成物
KR102250597B1 (ko) 2017-11-20 2021-05-11 경희대학교 산학협력단 신규 유산균 및 이의 용도
WO2019098810A2 (ko) * 2017-11-20 2019-05-23 경희대학교 산학협력단 신규 유산균 및 이의 용도
EP3773645A4 (en) 2018-04-10 2021-11-24 Siolta Therapeutics, Inc. MICROBIAL CONSORTIA
AU2019253616A1 (en) * 2018-04-13 2020-11-05 Med-Life Discoveries Lp Long chain dicarboxylic fatty acid (LCDFA) producing microbes and uses thereof
KR20210005116A (ko) * 2018-05-04 2021-01-13 4디 파마 리서치 리미티드 모의 장내 환경
EP3823651A4 (en) 2018-07-19 2022-04-27 Pendulum Therapeutics, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR MICROBIAL TRANSPLANTATION
US11859214B1 (en) 2018-08-17 2024-01-02 The Government Of The United States, As Represented By The Secretary Of The Army Automated system for simulating the human lower gastrointestinal tract
US12144834B2 (en) * 2018-09-13 2024-11-19 Xbiome Inc. Methods and compositions for treating gastrointestinal and inflammatory disorders
WO2020079026A1 (en) * 2018-10-15 2020-04-23 Pharmabiome Ag A method of manufacturing a consortium of bacterial strains
CN113271796A (zh) 2018-11-05 2021-08-17 芝加哥大学 用于治疗感染性、自身免疫和过敏性疾病的方法和组合物
US12551515B2 (en) 2018-11-21 2026-02-17 Board Of Regents Of The University Of Texas System Methods and compositions for treating cancer
EP3911161A4 (en) * 2019-01-16 2022-09-14 Board of Regents, The University of Texas System METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF COLITIS-ASSOCIATED IMMUNE CHECKPOINT INHIBITOR
PH12021553137A1 (en) 2019-07-19 2022-07-25 Finch Therapeutics Holdings Llc Methods and products for treatment of gastrointestinal disorders
CN110607262B (zh) * 2019-09-25 2022-03-25 君维安(武汉)生命科技有限公司 一种干预炎性肠炎的益生菌组合物及其筛选方法和应用
CN110448577B (zh) * 2019-09-26 2023-06-23 青岛农业大学 一种溃疡性结肠炎修复益生菌微胶囊制剂
CN120732903A (zh) 2019-10-07 2025-10-03 谢尔塔治疗公司 治疗性药物组合物
EP4040991A4 (en) * 2019-10-09 2024-01-24 Mayo Foundation for Medical Education and Research TREATMENT OF GASTROINTESTINAL DISORDERS
GB201915144D0 (en) * 2019-10-18 2019-12-04 Multigerm Uk Entpr Ltd Method of promoting SCFA production by gut microbiota
CN110916192B (zh) * 2019-11-25 2021-04-13 垒途智能教科技术研究院江苏有限公司 一种具有防治儿童青少年自闭症的益生菌矿物粉及其应用
EP4104844A4 (en) * 2019-12-13 2024-02-14 Meiji Co., Ltd Composition for lowering heart rate
PH12022551506A1 (en) 2019-12-23 2023-04-24 Evonik Operations Gmbh Bacterial consortium comprising at least one bacillus and lactobacillus strain for gluten degradation
CN114657083A (zh) * 2019-12-24 2022-06-24 顾青 一种乳酸菌发酵乳
CN111117925B (zh) * 2020-01-13 2021-05-25 浙江大学 Anaerostipes sp B2131菌及其在炎症性肠病中的应用
CN111413503A (zh) * 2020-03-28 2020-07-14 浙江大学 骨桥蛋白作为靶分子在调节高脂饮食引起的肥胖中的应用
AU2021254477A1 (en) * 2020-04-08 2022-11-10 Megmilk Snow Brand Co., Ltd. Composition for improving gut microbiota
JP7663322B2 (ja) * 2020-04-08 2025-04-16 雪印メグミルク株式会社 ビフィズス菌増殖促進剤
WO2021206480A1 (en) * 2020-04-08 2021-10-14 Psomagen, Inc. Composition and method for an antibiotic-inducing imbalance in microbiota
KR102169794B1 (ko) * 2020-06-24 2020-10-27 주식회사 엔테로바이옴 신규한 피칼리박테리움 프로스니치 균주 eb-fpdk11 및 그의 용도
KR20230088680A (ko) * 2020-08-14 2023-06-20 프롤랙타 바이오사이언스, 인코포레이티드 박테리아 요법에 사용하기 위한 인간 모유 올리고당 조성물
CN111938158B (zh) * 2020-08-18 2023-07-07 广东弘元普康医疗科技有限公司 一种防止肠道Akkermansia muciniphila菌丰度降低的组合物
CN112080445A (zh) * 2020-08-20 2020-12-15 浙江工商大学 植物乳杆菌zj316和在抑制幽门螺旋杆菌方面的应用
JP2022052715A (ja) * 2020-09-23 2022-04-04 雪印メグミルク株式会社 腸内細菌叢改善用組成物
GB202015687D0 (en) * 2020-10-02 2020-11-18 Microbiotica Ltd Therapeutic composition
CN113215020B (zh) * 2021-02-22 2022-06-17 中国科学院微生物研究所 罗氏菌mgb-2及其应用
CN113214976B (zh) * 2021-03-29 2023-04-14 中南大学 一种高效筛选嗜酸微生物的装置及其筛选方法
BE1029496B1 (fr) * 2021-08-19 2023-01-16 The Akkermansia Company Composition comprenant de l'Akkermansia muciniphila pasteurisée pour le traitement ou la prévention des troubles de la contractilité intestinale, en particulier des troubles de l'amplitude de la contractilité duodénale
AU2022348603A1 (en) * 2021-09-20 2024-02-29 Hudson Institute of Medical Research Biotherapeutic enterococcus isolates
CN118647388A (zh) * 2021-12-27 2024-09-13 Mrm健康公共有限责任公司 微生物群落
CN114292781B (zh) * 2021-12-28 2023-08-01 中山大学 一种长双歧杆菌sysu-02及其应用
CN114304380A (zh) * 2022-01-13 2022-04-12 合肥河川生物医药科技有限公司 普拉梭菌在猪鸡上的应用
NL2032642B1 (en) * 2022-07-29 2024-02-06 Academisch Ziekenhuis Leiden Improvement of muscle mass and strength
WO2024049207A1 (ko) * 2022-08-31 2024-03-07 주식회사 바이오뱅크힐링 신규 균주, 및 그의 유래의 소포체 및 그의 항염증 및 항균 용도
CN115737687A (zh) * 2022-10-16 2023-03-07 新疆医科大学第一附属医院 普拉梭菌在制备预防或/和治疗冠心病药物或/和保健品中的应用
CN116004440B (zh) * 2022-10-25 2025-06-13 深圳未知君生物科技有限公司 一株粘膜粘液乳杆菌及其在制备治疗癌症的药物中的应用
WO2024123891A1 (en) * 2022-12-07 2024-06-13 The University Of North Carolina At Chapel Hill Office Of Technology Commercialization Engineered microorganism compositions and applications thereof
AU2023201304B2 (en) * 2023-03-02 2026-02-26 Kemin Industries, Inc. Methods and compositions for improving food safety and enhancing feed efficiency in poultry
WO2024249585A1 (en) * 2023-05-31 2024-12-05 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for treating mental and metabolic disorders
CN116836880B (zh) * 2023-07-24 2023-11-28 中山大学 一种普氏梭杆菌及其应用
CN116925975B (zh) * 2023-08-18 2024-01-23 善恩康生物科技（苏州）有限公司 一种Akkermansia muciniphila及其产品和应用
WO2025100480A1 (ja) * 2023-11-08 2025-05-15 慶應義塾 組成物、飲食品、及び病原性細菌又は病原性真菌に起因する疾患の検査及び診断を補助する方法
WO2025183115A1 (ja) * 2024-02-28 2025-09-04 三菱ケミカル株式会社 乳酸産生菌及び酪酸産生菌を含む整腸用組成物
CN118421503B (zh) * 2024-04-12 2025-02-11 善恩康生物科技（苏州）有限公司 一株新型Akkermansia muciniphila及其应用
CN118489883A (zh) * 2024-05-10 2024-08-16 河北弗蒙特生物科技有限公司 嗜黏蛋白阿克曼氏菌发酵物及其制备方法与应用

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0307026D0 (en) 2003-03-27 2003-04-30 Rowett Res Inst Bacterial supplement
EP1931363B1 (en) 2005-09-28 2015-11-18 Nordisk Rebalance A/S Treatment of ibd using both probiotic bacteria and fermented cereal as treatment effectors
CN101353633B (zh) 2008-06-13 2011-12-28 浙江工商大学 Lactobacillus plantarum ZJ316、产生的抗菌肽及其制备与应用
GB0903016D0 (en) * 2009-02-23 2009-04-08 Univ Gent Method for alleviating intestinal problems and novel bacterial strains therefor
WO2011060123A1 (en) * 2009-11-12 2011-05-19 Nestec S.A. Nutritional composition for promoting gut microbiota balance and health
US8445226B2 (en) 2010-02-01 2013-05-21 Microbios, Inc. Process and composition for the manufacture of a microbial-based product
US20120034198A1 (en) 2010-08-04 2012-02-09 Microbios, Inc. Carriers for storage and delivery of biologics
WO2012142605A1 (en) 2011-04-15 2012-10-18 Samaritan Health Services Rapid recolonization deployment agent
ES2660775T3 (es) 2011-05-16 2018-03-26 Belano Medical Ag Nuevas bacterias del ácido láctico y composiciones que las contienen contra los resfriados bacterianos
US20140363397A1 (en) 2011-09-14 2014-12-11 Queen's University At Kingston Method for treatment of disorders of the gastrointestinal system
GB201117313D0 (en) 2011-10-07 2011-11-16 Gt Biolog Ltd Bacterium for use in medicine
CN103082292B (zh) * 2011-11-02 2015-03-04 深圳华大基因研究院 罗斯氏菌(Roseburia)在治疗和预防肥胖相关疾病中的应用
KR102069460B1 (ko) * 2012-06-12 2020-01-22 레네시엔스 아/에스 바이오메탄 생산을 위한 방법들 및 조성물들
WO2014075745A1 (en) 2012-11-19 2014-05-22 Université Catholique de Louvain Use of akkermansia for treating metabolic disorders
US8906668B2 (en) * 2012-11-23 2014-12-09 Seres Health, Inc. Synergistic bacterial compositions and methods of production and use thereof
SG11201503966PA (en) 2012-11-23 2015-06-29 Seres Health Inc Synergistic bacterial compositions and methods of production and use thereof
JP2016509003A (ja) 2013-02-04 2016-03-24 セレス セラピューティクス インコーポレイテッド 組成物および方法
BR112015020819A2 (pt) * 2013-03-05 2017-07-18 Academisch Ziekenhuis Groningen uso de faecalibacterium prausnitzii htf-f (dsm 26943) para supressão de inflamação
EP2971148A4 (en) * 2013-03-14 2016-08-17 Seres Therapeutics Inc METHODS OF DETECTING PATHOGENS AND ENRICHING FROM MATERIALS AND COMPOSITIONS
WO2014145958A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Seres Health, Inc. Network-based microbial compositions and methods
US10058576B2 (en) * 2013-10-03 2018-08-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods comprising a defined microbiome and methods of use thereof
PL236218B1 (pl) 2013-11-13 2020-12-28 Inst Biotechnologii Surowic I Szczepionek Biomed Spolka Akcyjna Zastosowanie kompozycji probiotycznej
CN105979952B (zh) 2013-11-25 2022-04-08 赛里斯治疗公司 协同细菌组合物以及其制造方法和用途
EP2944696A1 (en) * 2014-05-13 2015-11-18 Evonik Degussa GmbH Method of producing organic compounds
CA2964480A1 (en) * 2014-10-31 2016-05-06 Whole Biome Inc. Methods and compositions relating to microbial treatment and diagnosis of disorders
EP3150562B1 (de) * 2015-10-01 2022-02-16 Heraeus Quarzglas GmbH & Co. KG Verwendung von optischem filtermaterial aus dotiertem quarzglas sowie das optische filtermaterial enthaltende uv-lampe
EP3639834B1 (en) * 2016-02-04 2023-07-12 Universiteit Gent Use of microbial communities for human and animal health
JP2024519409A (ja) * 2021-04-08 2024-05-13 株式会社ソフィ 腸内微生物叢、行動パターン、α－シヌクレインレベル、睡眠パターン、および／または血清メラトニンを改善するための組成物

Also Published As

Publication number Publication date
RS64782B1 (sr) 2023-11-30
FI3639834T3 (fi) 2023-09-27
IL260337A (en) 2018-08-30
IL283594B (en) 2022-06-01
HK1257070A1 (zh) 2019-10-11
JP7016112B2 (ja) 2022-02-04
CN116570631A (zh) 2023-08-11
HRP20231182T1 (hr) 2024-01-05
EP3411052B8 (en) 2020-09-30
IL293486A (en) 2022-08-01
US11596658B2 (en) 2023-03-07
US12458672B2 (en) 2025-11-04
SMT202000547T1 (it) 2020-11-10
CA3011083A1 (en) 2017-08-10
EP3411052B1 (en) 2020-07-08
CY1123954T1 (el) 2022-03-24
US20220072071A1 (en) 2022-03-10
AU2017216285A1 (en) 2018-07-26
EP4257194A3 (en) 2023-12-20
EP3411052A1 (en) 2018-12-12
DK3639834T5 (da) 2024-08-26
HUE063584T2 (hu) 2024-01-28
LT3411052T (lt) 2021-01-11
JP2022058615A (ja) 2022-04-12
DK3411052T3 (da) 2020-10-12
IL283594A (en) 2021-07-29
BR112018015097A2 (pt) 2018-12-26
US20210353694A1 (en) 2021-11-18
MX382399B (es) 2025-03-13
AU2017216285B2 (en) 2023-10-05
IL260337B (en) 2021-06-30
US20190015465A1 (en) 2019-01-17
CN108712906A (zh) 2018-10-26
MX2018009539A (es) 2019-02-11
AU2023248066B2 (en) 2025-12-11
RU2018131244A (ru) 2020-03-04
US20230028557A1 (en) 2023-01-26
KR20250079251A (ko) 2025-06-04
DK3639834T3 (da) 2023-10-09
US11633440B2 (en) 2023-04-25
JP7737657B2 (ja) 2025-09-11
ES2824536T3 (es) 2021-05-12
PL3411052T3 (pl) 2021-03-08
ES2960781T3 (es) 2024-03-06
JP2019511563A (ja) 2019-04-25
EP4257194A2 (en) 2023-10-11
PL3639834T3 (pl) 2024-01-29
RU2021130638A (ru) 2021-11-18
RU2018131244A3 (sr) 2020-06-18
LT3639834T (lt) 2023-11-10
JP2024028833A (ja) 2024-03-05
HUE051114T2 (hu) 2021-01-28
EP3639834B1 (en) 2023-07-12
US20220040245A1 (en) 2022-02-10
WO2017134240A1 (en) 2017-08-10
IL293486B1 (en) 2023-12-01
US20220023357A1 (en) 2022-01-27
SI3411052T1 (sl) 2021-01-29
RU2758387C2 (ru) 2021-10-28
US11096971B2 (en) 2021-08-24
KR20180127972A (ko) 2018-11-30
EP3639834A1 (en) 2020-04-22
KR102816794B1 (ko) 2025-06-05
JP7460979B2 (ja) 2024-04-03
US20230045069A1 (en) 2023-02-09
IL293486B2 (en) 2024-04-01
CN108712906B (zh) 2023-06-30
PT3639834T (pt) 2023-10-12
US11491196B2 (en) 2022-11-08
SI3639834T1 (sl) 2024-02-29
AU2023248066A1 (en) 2023-11-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11596658B2 (en) Use of microbial communities for human and animal health
HK40101989A (en) Use of microbial communities for human and animal health
RU2823233C2 (ru) Использование микробных сообществ для лечения человека и животных
HK40088402A (zh) 微生物群落用於人类和动物健康的用途
HK1257070B (en) Use of microbial communities for human and animal health
BR112018015097B1 (pt) Composição, reator e uso da composição