Deprecated: The each() function is deprecated. This message will be suppressed on further calls in /home/zhenxiangba/zhenxiangba.com/public_html/phproxy-improved-master/index.php on line 456
RS61019B1 - Anti-her2 antitela i imunokonjugati - Google Patents
[go: Go Back, main page]

RS61019B1 - Anti-her2 antitela i imunokonjugati - Google Patents

Anti-her2 antitela i imunokonjugati

Info

Publication number
RS61019B1
RS61019B1 RS20201339A RSP20201339A RS61019B1 RS 61019 B1 RS61019 B1 RS 61019B1 RS 20201339 A RS20201339 A RS 20201339A RS P20201339 A RSP20201339 A RS P20201339A RS 61019 B1 RS61019 B1 RS 61019B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
her2
immunoconjugate
cancer
seq
Prior art date
Application number
RS20201339A
Other languages
English (en)
Inventor
Xiaocheng Chen
Mark Dennis
Jagath Reddy Junutula
Gail Lewis Phillips
Thomas Harden Pillow
Mark X Sliwkowski
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=54238547&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS61019(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of RS61019B1 publication Critical patent/RS61019B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A61K31/551—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole having two nitrogen atoms, e.g. dilazep
    • A61K31/5513—1,4-Benzodiazepines, e.g. diazepam or clozapine
    • A61K31/5517—1,4-Benzodiazepines, e.g. diazepam or clozapine condensed with five-membered rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. imidazobenzodiazepines, triazolam
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/675—Phosphorus compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pyridoxal phosphate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
    • A61K47/6809—Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6855—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from breast cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6863—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from stomach or intestines cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57515—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the breast
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5753—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the stomach or small intestine
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5758—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites
    • G01N33/5759—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites involving compounds localised on the membrane of tumour or cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/82—Translation products from oncogenes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
OBLAST
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na antitela HER2 i imunokonjugate i postupke za njihovu upotrebu.
STANJE TEHNIKE
[0002] Rak dojke je izuzetno važan uzrok morbiditeta i mortaliteta širom sveta. Godišnje se širom sveta dijagnostikuje preko 1,3 miliona slučajeva raka dojke sa više od 450000 smrtnih slučajeva povezanih sa tom bolešću (Jemal A, Bray F, Center M, i dr. Global cancer statistics. CA Cancer J Clin, 2011; 61(2):69-90).
[0003] Tirozin kinaza receptora HER2 (ErbB2) je član porodice transmembranskih receptora za receptor za epidermalni faktor rasta (EGFR). Prekomerno ispoljavanje HER2 primećeno je kod približno 20% karcinoma dojke kod čoveka i umešana je u agresivni rast i loše kliničke ishode povezane sa ovim tumorima (Slamon i dr. (1987) Science 235:177-182). Prekomerno ispoljavanje proteina HER2 može se odrediti korišćenjem imunohistohemijske procene fiksiranih tumorskih blokova (Press MF, i dr. (1993) Cancer Res 53:4960-70).
[0004] Trastuzumab (CAS 180288-69-1, HERCEPTIN®, huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, Genentech) je rekombinantno DNK, IgG1 kappa, monoklonsko antitelo koje je humanizovana verzija mišjeg anti-HER2 antitela (4D5) koje je selektivno vezuje se sa visokim afinitetom u ćelijskom testu (Kd = 5 nM) za vanćelijski domen HER2 (US 5677171; US 5,821,337; US 6,054,297; US 6,165,464; US 6,339,142; US 6,407,213; US 6,639,055; US 6,719,971; US 6,800,738; US 7,074,404; Coussens i dr. (1985) Science 230:1132-9; Slamon i dr. (1989) Science 244:707-12; Slamon i dr. (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792). Pokazano je da trastuzumab i u in vitro testovima i na životinjama inhibira proliferaciju humanih tumorskih ćelija koje prekomerno ispoljavaju HER2 (Hudziak i dr. (1989) Mol Cell Biol 9:1165-72; Lewis i dr. (1993) Cancer Immunol Immunother; 37:255-63; Baselga i dr. (1998) Cancer Res.58:2825-2831). Trastuzumab je posrednik ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela, ADCC (Lewis i dr. (1993) Cancer Immunol Immunother 37(4):255-263; Hotaling i dr. (1996) [abstract]. Proc. Annual Meeting Am Assoc Cancer Res; 37:471; Pegram MD, i dr. (1997) [abstract]. Proc Am Assoc Cancer Res; 38:602; Sliwkowski i dr. (1999) Seminars in Oncology 26(4), Suppl 12:60-70; Yarden Y. and Sliwkowski, M. (2001) Nature Reviews: Molecular Cell Biology, Macmillan Magazines, Ltd., Vol.2:127-137).
[0005] HERCEPTIN® je odobren 1998. godine za lečenje pacijenata sa metastatskim rakom dojke koji prekomerno ispoljava HER2 (Baselga i dr., (1996) J. Clin. Oncol. 14:737-744) koji su primili opsežnu prethodnu terapiju protiv raka i od tada se koristi kod preko 300000 pacijenata (Slamon DJ, i dr. N Engl J Med 2001;344:783-92; Vogel CL, i dr. J Clin Oncol 2002;20:719-26; Marty M, i dr. J Clin Oncol 2005;23:4265-74; Romond EH, i dr. TN Engl J Med 2005;353:1673-84; Piccart-Gebhart MJ, i dr. N Engl J Med 2005;353:1659-72; Slamon D, i dr. [abstract]. Breast Cancer Res Treat 2006, 100 (Suppl 1): 52). FDA je 2006. odobrila HERCEPTIN® (trastuzumab, Genentech Inc.) kao deo režima lečenja koji sadrži doksorubicin, ciklofosfamid i paklitaksel za pomoćno lečenje pacijenata sa HER2 pozitivnim karcinomom dojke pozitivnim na čvorove.
[0006] Trastuzumab-MCC-DM1 (T-DM1, trastuzumab emtanzin, ado-trastuzumab emtanzin, KADCILA®), novi konjugat antitelo-lek (ADC) za lečenje HER2-pozitivnog karcinoma dojke, sastoji se od citotoksičnog sredstva DM1 (sredstvo protiv makro-cevčica koje sadrži tiol, majtanzinoid) konjugovan sa trastuzumabom na bočnim lancima lizina preko MCC veznika, sa prosečnim opterećenjem leka (odnos leka i antitela) od oko 3,5. Nakon vezivanja za HER2 eksprimiranog na ćelijama tumora, T-DM1 prolazi kroz receptor posredovanu internalizaciju, što rezultira unutarćelijskim oslobađanjem citotoksičnih katabolita koji sadrže DM1 i posledičnom ćelijskom smrću.
[0007] Američka administracija za hranu i lekove odobrila je ado-trastuzumab emtanzin, koji se prodaje pod trgovačkim imenom KADCILA®, 22. februara 2013. godine za lečenje pacijenata sa HER2-pozitivnim, metastatskim karcinomom dojke koji su prethodno lečeni trastuzumabom i taksanom.
[0008] Pertuzumab (poznat i kao rekombinantno humanizovano monoklonsko antitelo 2C4, rhuMAb 2C4, PERJETA®, Genentech, Inc, South San Francisco) predstavlja prvo u novoj klasi sredstava poznatih kao HER inhibitori dimerizacije (HDI) i ima funkciju da inhibira sposobnost HER2 da se formiraju aktivni heterodimeri ili homodimeri sa drugim HER receptorima (kao što su EGFR/HER1, HER2, HER3 i HER4). Videti, na primer, Harari and Yarden Oncogene 19:6102-14 (2000); Yarden and Sliwkowski. Nat Rev Mol Cell Biol 2:127-37 (2001); Sliwkowski Nat Struct Biol 10:158-9 (2003); Cho i dr. Nature 421:756-60 (2003); i Malik i dr. Pro Am Soc Cancer Res 44:176-7 (2003)
[0009] Dokazano je da blokada pertuzumaba stvaranjem HER2-HER 3 heterodimera u ćelijama tumora inhibira kritičnu ćelijsku signalizaciju, što rezultira smanjenom proliferacijom i preživljavanjem tumora (Agus i dr. Cancer Cell 2:127-37 (2002)).
[0010] Pertuzumab je ispitivan u ispitivanjima II faze u kombinaciji sa trastuzumabom kod pacijenata sa HER2-pozitivnim metastatskim karcinomom dojke koji su prethodno primali trastuzumab zbog metastatske bolesti. Jedno istraživanje, koje je sproveo Nacionalni institut za rak (NC1), obuhvatilo je 11 pacijenata sa prethodno lečenim HER2-pozitivnim metastatskim karcinomom dojke. Dvoje od 11 pacijenata pokazalo je delimičan odgovor (PR) (Baselga i dr., J Clin Oncol 2007 ASCO Annual Meeting Proceedings; 25:18 S (June 20 Supplement): 1004. Rezultati neoadjuvantnog ispitivanja faze II koja procenjuje efekat novog režima kombinovanja pertuzumaba i trastuzumaba plus hemoterapija (docetaksel) kod žena sa HER2-pozitivnim karcinomom dojke u ranoj fazi, predstavljeni na CTRC-AACR simpozijumu o raku dojke u San Antoniju (SABCS ), 8. i 12. decembra 2010. godine, pokazali su da su dva HER2 antitela plus docetaksel data u neoadjuvantnom okruženju pre operacije značajno poboljšala stopu potpunog nestanka tumora (patološka stopa potpunog odgovora, pCR, od 45,8 procenata) u dojci za više od polovine u poređenju sa trastuzumabom i docetakselom (pCR od 29,0 procenata), p=0,014.
[0011] Pertuzumab, koji se prodaje pod zaštitnim imenom PERJETA®, odobren je 2012. godine za lečenje pacijenata sa uznapredovalim ili kasnim (metastatskim) HER2-pozitivnim karcinomom dojke. HER2-pozitivni karcinomi dojke imaju povećane količine HER2 proteina koji doprinosi rastu i preživljavanju ćelija karcinoma.
[0012] 30. septembra 2013. godine, Američka administracija za hranu i lekove odobrila je ubrzano odobrenje za PERJETA® (pertuzumab) kao deo kompletnog režima lečenja pacijenata sa rakom dojke u ranoj fazi (EBC) pre operacije (neoadjuvantno podešavanje). PERJETA® je prvi lek koji je odobrila FDA za neoadjuvantno lečenje raka dojke.
[0013] U struci postoje potrebe za dodatnim sigurnim i efikasnim sredstvima koji ciljaju HER2 za lečenje stanja povezanih sa HER2, kao što je rak dojke, za upotrebu u monoterapiji i kombinovanoj terapiji. Pronalazak ispunjava tu potrebu i pruža druge koristi.
[0014] US 2013/0195845, WO 98/17797, US 2005/0208043 i EP2540745 obelodanjuju anti-HER2 antitela.
REZIME
[0015] Pronalazak obezbeđuje antitela na HER2, izolovane nukleinske kiseline koje kodiraju antitela, ćelije domaćina koje sadrže nukleinske kiseline, postupke za proizvodnju antitela, imunokonjugate i postupke upotrebe antitela, kako je definisano u patentnim zahtevima.
[0016] U nekim otelotvorenjima obezbeđeno je izolovano antitelo koje se vezuje za HER2, pri čemu antitelo sadrži (i) (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:15; (b), HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:16; (c), HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:17; (d), HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:12; (e), HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:13; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:14, pri čemu antitelo vezuje HER2 sa konstantom disocijacije (KD) od ≤ 5 nM kako je određeno površinskom plazmonskom rezonancom; i/ili (ii) varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:11 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:10. U nekim otelotvorenjima, antitelo je monoklonsko antitelo. U nekim otelotvorenjima, antitelo je humanizovano ili himerno antitelo. U nekim otelotvorenjima, antitelo je fragment antitela koji vezuje HER2.
[0017] U nekim otelotvorenjima, HER2 je humani HER2 koji sadrži aminokiseline 23 do 1255 SEQ ID NO:1. U nekim otelotvorenjima, antitelo se vezuje za vanćelijski domen I HER2. U nekim otelotvorenjima, vanćelijski domen I HER2 ima sekvencu SEQ ID NO:35. U nekim otelotvorenjima, antitelo se vezuje za petlju 163-189 i petlju 185-189 vanćelijskog domena I (npr., prvu petlju definisanu aminokiselinama 163-189 i drugu petlju definisanu aminokiselinama 185-189 vanćelijskog domena I). U nekim otelotvorenjima, antitelo kontaktira His171, Ser186, Ser187 i Glu188 vanćelijskog domena I.
[0018] U nekim otelotvorenjima, antitelo je antitelo IgG1, IgG2a ili IgG2b. U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži najmanje jednu mutaciju u konstantnom regionu teškog lanca odabranom od A118C i S400C. U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži najmanje jednu mutaciju u konstantnom regionu lakog lanca odabranom od K149C i V205C, pri čemu su ostaci numerisani prema EU sistemu numerisanja.
[0019] U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži:
a) teški lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:19 i laki lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:18; ili b) teški lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:19 i laki lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:23; ili c) teški lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:24 i laki lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:18. U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži teški lanac konstantnog regiona SEQ ID NO:28. U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži laki lanac konstantnog regiona SEQ ID NO:25.
[0020] U nekim otelotvorenjima obezbeđeno je izolovano antitelo koje se vezuje za HER2, pri čemu antitelo sadrži teški lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:19 i laki lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:23. U nekim otelotvorenjima obezbeđeno je izolovano antitelo koje se vezuje za HER2, pri čemu antitelo sadrži teški lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:24 i laki lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:18.
[0021] U nekim otelotvorenjima obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina, koja kodira ovde opisano antitelo. U nekim otelotvorenjima obezbeđena je ćelija domaćin koja sadrži nukleinsku kiselinu. U nekim otelotvorenjima, obezbeđen je postupak za proizvodnju antitela, koji uključuje kultivisanje ćelije domaćina tako da se antitelo proizvodi.
[0022] U nekim otelotvorenjima, obezbeđen je imunokonjugat, koji sadrži ovde opisano antitelo i citotoksično sredstvo. U nekim otelotvorenjima, imunokonjugat ima formulu Ab-(L-D)p, gde:
a) Ab je antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 16;
b) L je veznik;
c) D je citotoksično sredstvo; i
g) p se kreće od 1-8.
U nekim otelotvorenjima, p se kreće od 1,3-2 ili od 2-5. U nekim otelotvorenjima, p je oko 2.
U nekim otelotvorenjima, citotoksično sredstvo se bira između auristatina, majtanzinoida, kaliheamicina, pirolobenzodiazepina, derivata nemorubicina i 1-(hlorometi1)-2,3-dihidro-1H-benzo[e]indola (CBI).
[0023] U nekim otelotvorenjima, obezbeđen je imunokonjugat, gde je D pirolobenzodiazepin formule A:
pri čemu isprekidane linije označavaju opciono prisustvo dvostruke veze između C1 i C2 ili C2 i C3; R<2>je nezavisno odabran iz H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, =CH-R<D>, =C(R<D>)2, O-SO2-R, CO2R i COR, i opciono dalje odabrani između halo ili dihalo, gde je R<D>nezavisno odabran iz R, CO2R, COR, CHO, CO2H, i halo;
R<6>i R<9>nezavisno odabrani iz H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn i halo;
R<7>je nezavisno odabran iz H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn i halo;
Q je nezavisno odabran iz O, S i NH;
R<11>je bilo H ili R; ili Q je O i R<11>je SO3M, gde je M katjon metala;
R i R' su svaki nezavisno izabrani između opciono supstituisanih C1-8alkil, C3-8heterociklil i C5-20aril grupa, i opciono u odnosu na grupu NRR', R i R 'zajedno sa atomom azota kome su vezani formiraju opciono supstituisani 4-, 5-, 6- ili 7-člani heterociklični prsten;
R<12>, R<16>, R<19>i R<17>su definisani za R<2>, R<6>, R<9>i R<7>respektivno;
R” je C3-12alkilenska grupa, čiji lanac može biti prekinut jednim ili više heteroatoma i/ili aromatičnih prstenova koji su opciono supstituisani; i
X i X' su nezavisno odabrani iz O, S i N(H).
U nekim otelotvorenjima, D ima strukturu:
gde je n 0 ili 1.
[0024] U nekim otelotvorenjima, obezbeđen je imunokonjugat, gde je D derivat nemorubicina. U nekim otelotvorenjima, D ima strukturu odabranu iz:
[0025] U nekim otelotvorenjima, obezbeđen je imunokonjugat, gde D sadrži 1-(hlorometil)-2,3-dihidro-1H-benzo[e]indol (CBI). U nekim otelotvorenjima, D ima formulu:
gde je
R<1>odabran iz H, P(O)3H2, C(O)NR<a>R<b>, ili je vezan za L;
R<2>odabran iz H, P(O)3H2, C(O)NR<a>R<b>, ili je vezan za L;
R<a>i R<b>su nezavisno izabrani od H i C1-C6alkila opciono supstituisani sa jednim ili više F, ili R<a>i R<b>formiraju peto- ili šestočlanu heterociklil grupu;
T je vezana grupa izabrana iz C3-C12alkilena, Y, (C1-C6alkilena)-Y-(C1-C6alkilena), (C1-C6alkilena)-Y-(C1-C6alkilena)-Y-(C1-C6alkilena), (C2-C6alkenilena)-Y-(C2-C6alkenilena), i (C2-C6alkinilena)-Y-(C2-C6alkinilena);
gde se Y nezavisno bira između O, S, NR<1>, arila i heteroarila;
gde su alkilen, alkenilen, aril i heteroaril nezavisno i opciono supstituisani sa F, OH, O(C1-C6alkil), NH2, NHCH3, N(CH3)2, OP(O)3H2, i C1-C6alkil, gde je alkil opciono supstituisan sa jednim ili više F; ili su alkilen, alkenilen, aril i heteroaril nezavisno i opciono supstituisani vezom za L;
D' je deo leka izabran iz:
gde talasasta linija označava mesto vezivanja za T;
X<1>i X<2>se nezavisno biraju između O i NR<3>, gde se R<3>bira između H i C1-C6alkila, opciono supstituisanog sa jednim ili više F;
R<4>je H, CO2R, ili veza sa veznikom (L), gde je R C1-C6alkil ili benzil; i
R<5>je ili H, C1-C6alkil.
U nekim otelotvorenjima, D ima strukturu odabranu iz:
[0026] U nekim otelotvorenjima, obezbeđen je imunokonjugat, pri čemu se veznik može deliti proteazom. U nekim otelotvorenjima, veznik je kiselinski labilan. U nekim otelotvorenjima, veznik sadrži hidrazon. U nekim otelotvorenjima, veznik sadrži disulfid.
[0027] U nekim otelotvorenjima, obezbeđen je imunokonjugat, pri čemu imunokonjugat sadrži strukturu odabranu iz:
gde je Ab antitelo opisano ovde.
[0028] U nekim otelotvorenjima, obezbeđen je imunokonjugat, pri čemu imunokonjugat sadrži strukturu odabranu iz:
i
gde je Ab antitelo opisano ovde.
[0029] U nekim otelotvorenjima, obezbeđen je imunokonjugat, pri čemu imunokonjugat sadrži strukturu odabranu iz:
i
gde je Ab antitelo opisano ovde.
[0030] U bilo kom od ovde opisanih imunokonjugata, p može biti u rasponu od 1,3-2, 1,4-2, 1,5-2 ili 2-5.
[0031] Opisana je farmaceutska formulacija koja sadrži ovde opisani imunokonjugat i farmaceutski prihvatljiv nosač. Farmaceutska formulacija može dalje sadržati dodatno terapeutsko sredstvo. Dodatno terapijsko sredstvo može biti antitelo ili imunokonjugat koji se vezuje za HER2. Dodatno terapeutsko sredstvo može biti (i) antitelo ili imunokonjugat koji se vezuje za domen II HER2, i/ili (ii) antitelo ili imunokonjugat koji se vezuje za domen IV ili HER2. Dodatno terapijsko sredstvo može biti (i) antitelo ili imunokonjugat koji se vezuje za epitop 2C4, i/ili (ii) antitelo ili imunokonjugat koji se vezuje za epitop 4D5. Dodatno terapeutsko sredstvo može biti izabran između trastuzumaba, trastuzumaba-MCC-DM1 (T-DM1) i pertuzumaba. Farmaceutska formulacija može dalje da sadrži (1) trastuzumab ili T-DM1 i (2) pertuzumab.
[0032] U nekim otelotvorenjima, obezbeđen je imunokonjugat za upotrebu u postupcima lečenja osobe koja ima HER2-pozitivan rak. U nekim otelotvorenjima, imunokonjugat za upotrebu u postupku uključuje davanje pojedincu efikasne količine ovde opisanog imunokonjugata ili ovde opisanog farmaceutskog sastava. U nekim otelotvorenjima, HER2-pozitivni rak je rak dojke ili rak želuca. U nekim otelotvorenjima, HER2-pozitivni rak dojke je rani stadijum raka dojke. U nekim otelotvorenjima, HER2-pozitivni rak dojke je metastatski rak dojke. U nekim otelotvorenjima, HER2-pozitivni rak je rekurentni rak. U nekim otelotvorenjima, rekurentni rak je lokalno rekurentni rak. U nekim otelotvorenjima, HER2-pozitivni rak je napredni rak. U nekim otelotvorenjima, HER2-pozitivni rak nije resektabilan. U nekim otelotvorenjima, postupak dalje uključuje primenu dodatnog terapijskog sredstva pojedincu.
[0033] U nekim otelotvorenjima, imunokonjugat za upotrebu u postupku lečenja pojedinca koji ima HER2-pozitivan rak uključuje davanje pojedincu efikasne količine ovde opisanog imunokonjugata i najmanje jednog dodatnog terapijskog sredstva za pojedinca. U nekim otelotvorenjima, dodatno terapeutsko sredstvo je antitelo ili imunokonjugat koji se vezuje za HER2. U nekim otelotvorenjima, dodatno terapeutsko sredstvo je (i) antitelo ili imunokonjugat koji se vezuje za domen II HER2 i/ili (ii) antitelo ili imunokonjugat koji se vezuje za domen IV ili HER2. U nekim otelotvorenjima, dodatno terapijsko sredstvo je (i) antitelo ili imunokonjugat koji se vezuje za epitop 2C4, i/ili (ii) antitelo ili imunokonjugat koji se vezuje za epitop 4D5. U nekim otelotvorenjima, dodatno terapeutsko sredstvo se bira između trastuzumaba, trastuzumaba-MCC-DM1 (T-DM1) i pertuzumaba. U nekim otelotvorenjima, dodatna terapeutska sredstva su (1) trastuzumab ili T-DM1 i (2) pertuzumab. U nekim otelotvorenjima, HER2-pozitivni rak je rak dojke ili rak želuca. U nekim otelotvorenjima, HER2-pozitivni rak dojke je rani stadijum raka dojke. U nekim otelotvorenjima, HER2-pozitivni rak dojke je metastatski rak dojke. U nekim otelotvorenjima, HER2-pozitivni rak je rekurentni rak. U nekim otelotvorenjima, rekurentni rak je lokalno rekurentni rak. U nekim otelotvorenjima, HER2-pozitivni rak je napredni rak. U nekim otelotvorenjima, HER2-pozitivni rak nije resektabilan.
[0034] U nekim otelotvorenjima, imunokonjugat za upotrebu u postupku lečenja osobe koja ima HER2 pozitivan rak sadrži:
a) podvrgavanje pojedinca neoadjuvantnom lečenju ovde opisanim imunokonjugatom ili ovde opisanom farmaceutskom formulacijom,
1
b) uklanjanje raka konačnom hirurškom intervencijom i
c) podvrgavanje pojedinca adjuvantnom lečenju ovde opisanim imunokonjugatom ili ovde opisanom farmaceutskom formulacijom.
U nekim otelotvorenjima, HER2-pozitivni rak je rak dojke ili rak želuca.
[0035] Ovde su opisani postupci inhibicije proliferacije HER2-pozitivne ćelije. Postupak može obuhvatati izlaganje ćelije ovde opisanom imunokonjugatu pod uslovima koji dozvoljavaju vezivanje imunokonjugata za HER2 na površini ćelije, čime se inhibira proliferacija ćelije. Ćelija može biti ćelija karcinoma dojke ili ćelija karcinoma želuca.
[0036] U nekim otelotvorenjima, ovde je dato antitelo koje je konjugovano sa oznakom. U nekim otelotvorenjima, oznaka je pozitronski emiter. U nekim otelotvorenjima, emiter pozitrona je<89>Zr.
[0037] U nekim otelotvorenjima su obezbeđeni postupci otkrivanja humanog HER2 u biološkom uzorku. Postupak uključuje kontakt biološkog uzorka sa ovde opisanim antitelom na HER2 pod uslovima koji dozvoljavaju vezivanje antitela na HER2 na ljudski HER2 i otkrivanje da li se formira kompleks između antitela na HER2 i prirodnog antitela humani HER2 u biološkom uzorku. U nekim otelotvorenjima, biološki uzorak je rak dojke ili rak želuca.
[0038] U nekim otelotvorenjima, obezbeđeno je antitelo konjugovano sa oznakom za upotrebu u postupcima za otkrivanje HER2-pozitivnog karcinoma kod ispitanika. Postupak se sastoji iz (i) davanja obeleženih anti-HER2 antitela kod ispitanika koji ima ili se sumnja da ima HER2-pozitivan rak, pri čemu obeleženo anti-HER2 antitelo sadrži ovde opisana antitela na HER2 i (ii) otkrivanje obeleženih anti-HER2 antitelo kod ispitanika, pri čemu otkrivanje obeleženih anti-HER2 antitela ukazuje na HER2 pozitivan rak kod ispitanika. U nekim otelotvorenjima, obeleženo anti-HER2 antitelo sadrži anti-HER2 antitelo konjugovano sa pozitronskim emiterom. U nekim otelotvorenjima, emiter pozitrona je<89>Zr.
KRATAK OPIS SLIKA
[0039]
Slika 1 prikazuje poravnanje konsenzus sekvence humane VH podgrupe I (VHI) i sekvence varijabilnog regiona teškog lanca mišjeg 7C2.B9 (“7C2”) i humanizovanog 7C2.v2.2.LA, kao što je opisano u Primeru 1.
Slika 2 pokazuje poravnanje konsenzus sekvence humanog VL kappa IV (VLKIV) i sekvence varijabilnog regiona lakog lanca mišjeg 7C2.B9 (“7C2”) i humanizovanog 7C2.v2.2.LA, kao što je opisano u Primeru 1.
Slika 3 prikazuje Her2 vanćelijsku strukturu domena, sa naznačenim domenima od I do IV, i domene za koje se vezuju anti-Her2 antitela trastuzumaba, pertuzumaba i 7C2.
Slika 4 pokazuje promenu zapremine tumora (mm3) tokom vremena nakon tretmana sa konjugatima antitelo-lek hu7C2.v2.2.LA (ADC), kao što je opisano u Primeru 3.
Slika 5 pokazuje promenu zapremine tumora (mm3) tokom vremena nakon tretmana sa konjugatima antitelo-lek hu7C2.v2.2.LA (ADC), kao što je opisano u Primeru 4.
Slika 6 pokazuje promenu zapremine tumora (mm3) tokom vremena nakon tretmana sa konjugatima antitelo-lek hu7C2.v2.2.LA (ADC), kao što je opisano u Primeru 5.
Slika 7 pokazuje promenu zapremine tumora (mm3) tokom vremena nakon tretmana sa konjugatima antitelo-lek hu7C2.v2.2.LA (ADC), kao što je opisano u Primeru 6.
Slika 8 pokazuje promenu zapremine tumora (mm3) tokom vremena nakon tretmana sa konjugatima antitelo-lek hu7C2.v2.2.LA (ADC), kao što je opisano u Primeru 7.
Slike 9 i 10 pokazuju primer postupka sinteze za dobijanje nekih međujedinjenja CB-PBD veznih lekova, kao što je opisano u Primeru 3.
Slika 11 pokazuje primer postupka sinteze za dobijanje nekih međujedinjenja CBI-CBI veznih lekova, kao što je opisano u Primeru 3.
Slike 12A-F pokazuju strukture za određene konjugate antitelo-lek korišćene u ovde navedenim primerima.
Slike 13A-B pokazuju sekvence aminokiselina lakog lanca (A) i teškog lanca (B) antitela na pertuzumab.
Slike 14A-B pokazuju primerne sekvence aminokiselina lakog lanca (A) i teškog lanca (B) antitela vrste pertuzumab.
Slike 15A-B pokazuju sekvence aminokiselina lakog lanca (A) i teškog lanca (B) antitela na trastuzumab.
Slika 16 prikazuje šemu Her2 receptora i sekvence za domene I do IV.
Slika 17 pokazuje promenu zapremine tumora (mm3) tokom vremena nakon tretmana sa konjugatima antitelo-lek hu7C2.v2.2.LA (ADC), kao što je opisano u Primeru 8.
Slika 18 pokazuje promenu zapremine tumora (mm3) tokom vremena nakon tretmana sa konjugatima antitelo-lek hu7C2.v2.2.LA (ADC), kao što je opisano u Primeru 9.
Slika 19A-D prikazuje (A) kristalnu strukturu kompleksa između HER2 ECD (površina osenčena domenom i prikazana kao model koji ispunjava prostor) i 7C2 Fab.7C2 Fab se vezuje za domen I HER2, koji se razlikuje od vezujućih epitopa trastuzumaba Fab (Tmab, PDB kod: 1N8Z) i pertuzumab Fab (Pmab, PDB kod: 1S78). (B) Superpozicija struktura HER2 ECD unutar trastuzumab/HER2 kompleksa, pertuzumab/HER2 kompleksa i 7C2/HER2 kompleksa. (C) Složeni interfejs 7C2/HER2. Bočni lanci ostataka koji su uključeni u interakciju 7C2/HER2 prikazani su kao štapići. Neke od potencijalnih intermolekularnih vodoničnih veza prikazane su isprekidanim linijama. (D) 7C2 vezujući epitop je delimično preklopljen sa chA21 jednolančanim Fv (scFv). Superpozicija strukture kompleksa chA21 scFv/HER2 (PDB kod: 3H3B) sa kompleksom 7C2/HER2.
DETALJNI OPIS
I. Sada će se detaljno upućivati na određena otelotvorenja predmetnog pronalaska, čiji su primeri ilustrovani u pratećim strukturama i formulama. Iako će pronalazak biti opisan zajedno sa navedenim otelotvorenjima, podrazumeva se da nisu namenjeni ograničavanju pronalaska tih otelotvorenja. DEFIINICIJE
[0040] Reči „sadržati”, „sadrži”, „uključuju”, „uključujući” i „uključuje” kada se koriste u ovoj specifikaciji, a patentni zahtevi imaju za cilj da navedu prisustvo navedenih karakteristika, celih brojeva, komponenata ili koraka, ali ne uključuju isključiti prisustvo ili dodavanje jedne ili više drugih karakteristika, celih brojeva, komponenata, koraka ili njihovih grupa.
[0041] ”Akceptorski humani okvir” za ovdašnje potrebe je okvir koji sadrži aminokiselinsku sekvencu okvira varijabilnog domena lakog lanca (VL) ili okvir varijabilnog domena teškog lanca (VH) izveden iz okvira humanog imunoglobulina ili okvira humanog konsenzusa, kako je definisano ispod. Akceptorski humani okvir „izveden” iz okvira humanog imunoglobulina ili okvira humanog konsenzusa može sadržati istu njegovu sekvencu aminokiselina ili može sadržati promene sekvence aminokiselina. U nekim otelotvorenjima, broj promena aminokiselina je 10 ili manji, 9 ili manje, 8 ili manje, 7 ili manje, 6 ili manje, 5 ili manje, 4 ili manje, 3 ili manje, ili 2 ili manje. U nekim otelotvorenjima, humani okvir akceptorskih VL identičan je sekvencijalno sekvenci VL humanog imunoglobulina ili sekvenci humanog konsenzusa.
[0042] ”Afinitet” se odnosi na jačinu ukupnog broja nekovalentnih interakcija između jednog mesta vezivanja molekula (npr., antitela) i njegovog vezujućeg partnera (npr., antigena). Ako nije drugačije naznačeno, kako se ovde koristi, “afinitet vezivanja” odnosi se na afinitet vezivanja koji odražava 1:1 interakciju između članova vezujućeg para (na primer, antitelo i antigen). Afinitet molekula X za njegovog partnera Y uopšteno može biti predstavljen konstantom disocijacije (Kd). Afinitet se može meriti uobičajenim postupcima poznatim u struci, uključujući one opisane ovde. Specifična ilustrativna i ogledna otelotvorenja za merenje afiniteta vezivanja su opisane u sledećem.
[0043] Antitelo sazrelo za afinitet odnosi se na antitelo sa jednom ili više izmena u jednom ili više hipervarijabilnih regiona (HVRs), u poređenju sa matičnim antitelom koje nema takve promene, a takve promene rezultiraju poboljšanjem afiniteta antitela za antigen.
[0044] Termini “antitelo HER2” i “antitelo koje se vezuje za HER2” odnose se na antitelo koje je sposobno da veže HER2 sa dovoljnim afinitetom da antitelo bude korisno kao dijagnostičko i/ili terapijsko sredstvo u ciljanju HER2. U jednom otelotvorenju, stepen vezivanja anti-HER2 antitela za nepovezani, ne-HER2 protein je manji od oko 10% vezivanja antitela za HER2, mereno, npr., radioimunološkom analizom (RIA). U nekim otelotvorenjima, antitelo koje se vezuje za HER2 ima konstantu disocijacije (Kd) ≤ 1µM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 5 nm, ≤ 4 nM,, ≤ 3 nM, ≤ 2 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM, ili ≤ 0,001 nM (npr., 10<-8>M ili manje, npr. od 10<-8>M do 10<-13>M, npr., od 10<-9>M do 10<-13>M). U nekim otelotvorenjima, anti-HER2 antitelo se vezuje za epitop HER2 koji je konzerviran među HER2 iz različitih vrsta.
[0045] Termin “antitelo” ovde se koristi u najširem smislu i obuhvata različite strukture antitela, uključujući, ali bez ograničenja, monoklonska antitela, poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr., bispecifična antitela) i fragmente antitela sve dok pokazuju željeni antigen- vezujuća aktivnost.
[0046] „Fragment antitela” odnosi se na molekul koji nije netaknuto antitelo koje sadrži deo netaknutog antitela i koji vezuje antigen za koji se netaknuto antitelo vezuje. Primeri fragmenata antitela uključuju, ali nisu ograničeni na Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; dijatela; linearna antitela; jednolančane molekule antitela (npr. scFv); i multispecifična antitela formirana iz fragmenata antitela.
[0047] ”Antitelo koje se vezuje za isti epitop” kao referentno antitelo odnosi se na antitelo koje blokira vezivanje referentnog antitela za njegov antigen u oglednom testu za 50% ili više, i obrnuto, referentno antitelo blokira vezivanje antitela za njegov antigen u oglednom testu za 50% ili više. Ovde je dat primer oglednog takmičenja.
[0048] Termini “rak” i “kancerogeni” odnose se ili opisuju fiziološko stanje sisara koje se obično karakteriše neregulisanim rastom/proliferacijom ćelija. Primeri karcinoma uključuju, ali nisu ograničeni na, karcinom, limfom, blastom, sarkom i leukemiju. U nekim otelotvorenjima, rak je rak dojke ili rak želuca. U nekim otelotvorenjima, rak je bilo koji HER2-pozitivni rak.
[0049] ”HER2-pozitivni” rak sadrži ćelije karcinoma koje imaju viši nivo od HER2 od normalnog. Primeri HER2 pozitivnog karcinoma uključuju HER2 pozitivni rak dojke i HER2 pozitivni rak želuca. Po želji, HER2-pozitivni rak ima rezultat imunohistohemije (IHC) 2+ ili 3+ i/ili odnos amplifikacije in situ hibridizacije (ISH) ≥2,0.
[0050] Termin „rak dojke u ranoj fazi (EBC)” ili „rani rak dojke” ovde se koristi za označavanje raka dojke koji se nije proširio dalje od dojke ili aksilarnih limfnih čvorova. To uključuje duktalni karcinom in situ i stadijum I, stadijum IIA, stadijum IIB i rak dojke stadijuma IIIA.
[0051] Upućivanje na tumor ili rak kao „stadijum 0”, „stadijum I”, „stadijum II”, „stadijum III” ili „stadijum IV” i razne podfaze u okviru ove klasifikacije ukazuje na klasifikaciju tumora ili raka primenom postupaka grupnog etapnog grupisanja ili rimskih brojeva, poznatih u struci. Iako stvarni stadijum karcinoma zavisi od vrste raka, generalno, stadijum 0 je in situ lezija, stadijum I je mali lokalizovani tumor, stadijum II i III je lokalni napredni tumor koji pokazuje zahvaćenost lokalnih limfnih čvorova, a stadijum IV karcinoma predstavlja metastatski rak. Određeni stadijumi za svaku vrstu tumora poznati su kvalifikovanom kliničaru.
[0052] Termin „metastatski rak dojke” označava stanje raka dojke u kome se ćelije raka prenose sa originalnog mesta na jedno ili više mesta na drugom mestu u telu, krvnim sudovima ili limfom, da bi stvorile jedan ili više sekundarnih tumora u jednom ili više organa pored dojke.
[0053] „Napredni” rak je onaj koji se proširio izvan mesta ili organa porekla, bilo lokalnom invazijom ili metastazama. Shodno tome, termin „napredni” rak uključuje lokalno uznapredovalu i metastatsku bolest.
[0054] ”Rekurentni” rak je onaj koji se ponovo vratio, bilo na početnom mestu ili na udaljenom mestu, posle odgovora na početnu terapiju, poput operacije.
[0055] „Lokalno rekurentni” rak je rak koji se nakon lečenja vraća na isto mesto kao i prethodno lečeni rak.
[0056] „Operabilni” ili „resektabilni” rak je rak koji je ograničen na primarni organ i pogodan za operaciju (resekciju).
[0057] „Neresektabilni” ili „neresektabilni” rak nije moguće ukloniti (resektovati) operativnim putem.
[0058] Termin “himerno” antitelo odnosi se na antitelo kod kojeg je deo teškog i/ili lakog lanca izveden iz određenog izvora ili vrste, dok je ostatak teškog i/ili lakog lanca izveden iz drugog izvora ili vrste.
[0059] ”Klasa” antitela odnosi se na tip konstantnog domena ili konstantnog regiona koji poseduje njegov teški lanac. Postoji pet glavnih klasa antitela: IgA, IgD, IgE, IgG, i IgM, i nekoliko njih se može dalje podeliti u podklase (izotipove), npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, i IgA2. Konstantni domeni teških lanaca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina zovu se α, δ, ε, γ, i µ, respektivno.
1
[0060] Termin “citotoksično sredstvo”, kako se ovde koristi, odnosi se na supstancu koja inhibira ili sprečava ćelijsku funkciju i/ili uzrokuje ćelijsku smrt ili uništavanje. Citotoksična sredstva uključuju, ali nisu ograničeni na, radioaktivne izotope (npr.. At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>, Pb<212>radioaktivne izotope Lu); hemoterapeutska sredstva ili lekovi (npr., metotreksat, adriamicin, alkaloidi vinca (vinkristin, vinblastin, etopozid), doksorubicin, melfalan, mitomicin C, hlorambucil, daunorubicin ili druga sredstva za interkaliranje); sredstva za inhibiciju rasta; enzimi i njihovi fragmenti kao što su nukleolitički enzimi; antibiotici; toksini kao što su toksini malih molekula ili enzimski aktivni toksini bakterijskog, gljivičnog, biljnog ili životinjskog porekla, uključujući fragmente i/ili njihove varijante; i razna antitumorska ili antikancerogena sredstva obelodanjena su u nastavku.
[0061] ”Efektorske funkcije” se odnose na one biološke aktivnosti koje se mogu pripisati Fc regionu antitela, a koje se razlikuju u zavisnosti od izotipa antitela. Primeri efektorskih efekata antitela uključuju: C1q vezivanje i citotoksičnost zavisna od komplemenata (CDC); Fc receptor vezivanja; citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC); fagocitoza; donja regulacija ćelijskih površinskih receptora (npr. B ćelijski receptor); i aktivacija B ćelija.
[0062] ”Efektivna količina” sredstva, npr., farmaceutske formulacije, odnosi se na količinu koja je efikasna, u dozama i tokom potrebnih vremenskih perioda, za postizanje željenog terapijskog ili profilaktičkog rezultata. Efikasna količina leka za lečenje raka može smanjiti broj ćelija karcinoma; smanjiti veličinu tumora; inhibira (tj. usporava do neke mere i po mogućnosti zaustavljaju) infiltraciju ćelija karcinoma u periferne organe; inhibira (tj. usporava do neke mere i po mogućnosti zaustavljaju) tumorske metastaze; inhibira, donekle, rast tumora; i/ili donekle ublažiti jedan ili više simptoma povezanih sa rakom. U meri u kojoj lek može sprečiti rast i/ili ubiti postojeće ćelije karcinoma, može biti citostatičan i/ili citotoksičan. Efektivna količina može produžiti preživljavanje bez progresije bolesti (npr. mereno kriterijumima procene odgovora za solidne tumore, RECIST ili CA-125 promene), rezultirati objektivnim odgovorom (uključujući delimični odgovor, PR ili potpuni odgovor, CR), povećati se celokupno vreme preživljavanja i/ili poboljšati jedan ili više simptoma raka (npr. prema proceni FOSI).
[0063] Termin “epitop” odnosi se na određeno mesto na molekulu antigena za koje se antitelo vezuje.
[0064] „Epitop 4D5” ili „4D5 epitop” ili „4D5” je region u vanćelijskom domenu HER2 za koji se vezuju antitelo 4D5 (ATCC CRL 10463) i trastuzumab. Ovaj epitop je blizu transmembranskog domena HER2 i unutar domena IV HER2. Da bi se izvršio pregled antitela koja se vezuju za epitop 4D5, može se izvršiti rutinski test unakrsnog blokiranja kao što je opisano u Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Alternativno, mapiranje epitopa može se izvršiti da bi se procenilo da li se antitelo vezuje za 4D5 epitop HER2 (npr. Bilo koji jedan ili više ostataka u regionu od oko ostatka 550 do približno ostatka 610, uključujući HER2) (SEQ ID NO:39).
[0065] „Epitop 2C4” ili „2C4 epitop” je region u vanćelijskom domenu HER2 za koji se antitelo 2C4 vezuje. U cilju izvržavanja pregleda antitela koja se vezuju za epitop 2C4, može se izvršiti rutinski test unakrsnog blokiranja kao što je opisano u Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Alternativno, mapiranje epitopa može se izvršiti da bi se procenilo da li se antitelo vezuje za 2C4 epitop HER2. Epitop 2C4 sadrži ostatke iz domena II u vanćelijskom domenu HER2. 2C4 antitelo i pertuzumab vezuju se za vanćelijski domen HER2 na spoju domena I, II i III (Franklin i dr. Cancer Cell 5:317-328 (2004)).
[0066] Termin “Fc region” ovde se koristi za definisanje C-terminalnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji sadrži najmanje deo konstantnog regiona. Termin uključuje Fc regione izvorne sekvence i varijante Fc regiona. U jednom otelotvorenju, Fc region teškog lanca humanog IgG proteže se od Cys226 ili od Pro230 do karboksil-kraja teškog lanca. Međutim, C-terminalni lizin (Lys447) iz Fc regiona može biti prisutan ili ne. Ako ovde nije drugačije naznačeno, numerisanje aminokiselinskih ostataka u Fc regionu ili konstantnom regionu je u skladu sa EU sistemom numerisanja, koji se takođe naziva EU indeksom, kako je opisano u Kabat i dr., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
[0067] ”Okvir” ili “FR” odnosi se na ostatke promenljivih domena koji nisu ostaci hipervarijabilnog regiona (HVR). FR promenljivog domena se obično sastoji od četiri FR domena: FR1, FR2, FR3 i FR4. Prema tome, HVR i FR sekvence obično se pojavljuju u sledećem nizu u VH (ili VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
[0068] Termini “antitelo pune dužine”, “neoštećeno antitelo” i “celo antitelo” ovde se koriste naizmenično da bi se odnosilo na antitelo koje ima strukturu u osnovi sličnu izvornoj strukturi antitela ili ima teške lance koji sadrže Fc region kao što je ovde definisano.
[0069] Termin “glikozilirani oblici HER2” odnosi se na prirodne oblike HER2 koji se post-translaciono modifikuju dodavanjem ostataka ugljenih hidrata.
[0070] Pojmovi „ćelija domaćina”, „ćelijska linija domaćina” i „ćelijska kultura domaćina” se koriste naizmenično i odnose se na ćelije u koje je uvedena egzogena nukleinska kiselina, uključujući potomstvo takvih ćelija. Ćelije domaćine uključuju „transformatore” i „transformisane ćelije”, koje uključuju primarnu transformisanu ćeliju i potomstvo dobijeno od njih bez obzira na broj prolazaka. Potomstvo možda nije u potpunosti identično po sadržaju nukleinske kiseline kao matična ćelija, ali može sadržati mutacije Ovde su uključeni mutirani potomci koji imaju istu funkciju ili biološku aktivnost kao što su ekranizovani ili odabrani u prvobitno transformisanoj ćeliji.
[0071] ”Humano antitelo” je ono koje poseduje aminokiselinsku sekvencu koja odgovara sekvenci antitela koje proizvodi čovek ili ljudska ćelija ili je izvedena iz izvora koji nije čovek, a koji koristi repertoar ljudskih antitela ili druge sekvence koje kodiraju ljudska antitela. Ova definicija humanog antitela izričito isključuje humanizovano antitelo koje sadrži ostatke koji se ne vezuju za humani antigen.
[0072] ”Okvir humanog konsenzusa” je okvir koji predstavlja najčešće prisutne aminokiselinske ostatke u izboru sekvenci humanog imunoglobulina VL ili VH okvira. Generalno, izbor VL ili VH sekvenci humanog imunoglobulina je iz podgrupe nizova promenljivih domena. Generalno, podgrupa nizova je podgrupa kao u Kabat i dr., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols.1-3. U jednom otelotvorenju, za VL, podgrupa je podgrupa kappa I kao u Kabat i dr., supra. U jednom otelotvorenju, za VH, podgrupa je podgrupa III kao u Kabat i dr., supra.
[0073] ”Humanizovano” antitelo odnosi se na himerno antitelo koje sadrži aminokiselinske ostatke nehumanih HVR i aminokiselinske ostatke humanih FR. U određenim otelotvorenjima, humanizovano antitelo će sadržati uglavnom sve najmanje jednu, i obično dve, varijabilne domene, u kojima svi ili suštinski svi HVR (npr., CDR) odgovaraju onima ne-humanih antitela, i svi ili u osnovi svi FR odgovaraju onima humanih antitela. Humanizovano antitelo opciono može da sadrži bar deo konstantnog regiona antitela izvedenog iz humanog antitela. “Humanizovani oblik” antitela, npr., ne-humano antitelo, odnosi se na antitelo koje je pretrpelo humanizaciju.
[0074] Termin “hipervarijabilni region” ili “HVR”, kako se ovde koristi, odnosi se na svaki od regiona promenljivog domena antitela koji su hipervarijabilni u sekvenci i/ili čine strukturno definisane petlje (“hipervarijabilne petlje”). Generalno, izvorna antitela sa četiri lanca sadrže šest HVR; tri u VH (HI, H2, H3), i tri u VL (LI, L2, L3). HVR obično sadrže aminokiselinske ostatke iz hipervarijabilnih petlji i/ili iz „regiona koji određuju komplementarnost” (CDR), pri čemu su poslednji promenljivi sa najvećom sekvencom i/ili su uključeni u prepoznavanje antigena. Primeri hipervarijabilnih petlji javljaju se na aminokiselinskim ostacima 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (HI), 53-55 (H2) i 96-101 (H3). (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol.
196:901-917 (1987).) Primer CDR-a (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3) javljaju se na aminokiselinskim ostacima 24-34 od L1, 50-56 od L2, 89-97 od L3 , 31-35B od H1, 50-65 od H2 i 95-102 od H3. (Kabat i dr., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).) Sa izuzetkom CDR1 u VH, CDR obično sadrže aminokiselinske ostatke koji čine hipervarijabilne petlje. CDR takođe sadrže „ostatke koji određuju specifičnost” ili „SDR”, koji su ostaci koji kontaktiraju antigen. SDR su sadržani u regionima CDR-a koji se nazivaju skraćeni CDR ili a-CDR. Primeri a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 i a-CDR-H3) javljaju se na aminokiselinskim ostacima 31-34 od L1, 50-55 od L2, 89-96 od L3, 31-35B od H1, 50-58 od H2 i 95-102 od H3. (Videti Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008).) Ako nije drugačije naznačeno, HVR ostaci i drugi ostaci u varijabilnom domenu (npr., FR ostaci) su ovde numerisani prema Kabat i dr., supra.
[0075] ”Imunokonjugat” je antitelo konjugovano sa jednim ili više heterolognih molekula, uključujući, ali ne ograničavajući se na citotoksično sredstvo.
[0076] „Pacijent” ili „pojedinac” ili „ispitanik” je sisar. Sisari uključuju, ali nisu ograničeni na, domaće životinje (npr., krave, ovce, mačke, pse i konje), primate (npr., ljude i ne-humane primate poput majmuna), zečeve i glodare (npr., miševe i pacovi). U određenim otelotvorenjima, pacijent, pojedinac ili ispitanik je čovek. U nekim otelotvorenjima, pacijent može biti “pacijent sa rakom”, tj. onaj koji pati ili rizikuje da pati od jednog ili više simptoma karcinoma, naročito raka želuca ili dojke.
1
[0077] „Populacija pacijenata” odnosi se na grupu pacijenata sa rakom. Takve populacije se mogu koristiti za dokazivanje statistički značajne efikasnosti i/ili sigurnosti leka.
[0078] „Recidivni” pacijent je onaj koji ima znake ili simptome raka nakon remisije. Po želji, pacijent je imao recidiv nakon adjuvantne ili neoadjuvantne terapije.
[0079] Uzorak raka ili biološki uzorak koji „prikazuje HER ekspresiju, pojačavanje ili aktivaciju” je onaj koji u dijagnostičkom testu izražava (uključujući prekomernu ekspresiju) HER receptor, ima pojačani HER gen i/ili na drugi način pokazuje aktivaciju ili fosforilaciju HER receptor.
[0080] ”Neoadjuvantna terapija” ili “preoperativna terapija” ovde se odnosi na terapiju koja se daje pre operacije. Cilj neoadjuvantne terapije je pružanje neposrednog sistemskog lečenja, potencijalno iskorenjivanje mikrometastaza koje bi se u suprotnom razmnožavale ukoliko bi se sledio standardni redosled hirurške intervencije praćen sistemskom terapijom. Neoadjuvantna terapija takođe može pomoći u smanjenju veličine tumora, omogućavajući tako potpunu resekciju tumora koji su u početku neresektabilni ili očuvanje delova organa i njegovih funkcija. Pored toga, neoadjuvantna terapija omogućava in vivo procenu efikasnosti lekova, što može voditi izboru sledećih tretmana.
[0081] ”Adjuvantna terapija” ovde se odnosi na terapiju koja se daje nakon definitivne hirurgije, gde se ne mogu otkriti dokazi o rezidualnoj bolesti, kako bi se smanjio rizik od ponovnog pojave bolesti. Cilj adjuvantne terapije je sprečavanje ponovnog pojave raka, a samim tim i smanjenje šanse za smrt usled raka. Adjuvantna terapija ovde posebno isključuje neoadjuvantnu terapiju.
[0082] „Definitivna hirurgija” se koristi jer se taj termin koristi u medicinskoj zajednici. Definitivna hirurgija uključuje, na primer, postupke, hirurške ili druge, koji rezultiraju uklanjanjem ili resekcijom tumora, uključujući one koji rezultiraju uklanjanjem ili resekcijom svih grubo vidljivih tumora. Definitivna hirurgija uključuje, na primer, potpunu ili kurativnu resekciju ili potpunu grubu resekciju tumora. Definitivna hirurgija uključuje postupke koji se dešavaju u jednoj ili više faza, i uključuje, na primer, višestepene hirurške zahvate gde se jedan ili više hirurških ili drugih postupaka izvodi pre resekcije tumora. Definitivna hirurgija uključuje postupke za uklanjanje ili resekciju tumora, uključujući zahvaćene organe, delove organa i tkiva, kao i okolne organe, kao što su limfni čvorovi, delovi organa ili tkiva. Uklanjanje može biti nepotpuno tako da ćelije tumora mogu ostati neotkrivene.
[0083] „Preživljavanje” odnosi se na pacijenta koji ostaje živ i uključuje preživljavanje bez bolesti (DFS), preživljavanje bez progresije bolesti (PFS) i celokupno preživljavanje (OS). Preživljavanje se može proceniti Kaplan-Meier metodom, a sve razlike u preživljavanju izračunavaju se pomoću stratifikovanog log-rank testa.
[0084] „Preživljavanje bez progresije bolesti” (PFS) je vreme od prvog dana lečenja do dokumentovanog napredovanja bolesti (uključujući izolovanu progresiju CNS) ili smrti iz bilo kog uzroka u ispitivanju, šta god se prvo dogodi.
[0085] „Preživljavanje bez bolesti (DFS)” odnosi se na to da pacijent ostaje živ, bez povratka karcinoma, tokom određenog vremenskog perioda kao što je oko 1 godina, oko 2 godine, oko 3 godine, oko 4 godine, oko 5 godina, oko 10 godina, itd., od početka lečenja ili od početne dijagnoze. U jednom aspektu pronalaska, DFS se analizira prema principu namere za lečenje, tj. pacijenti se procenjuju na osnovu dodeljene im terapije. Događaji koji se koriste u analizi DFS mogu da uključuju lokalno, regionalno i udaljeno ponavljanje raka, pojavu sekundarnog karcinoma i smrt iz bilo kog uzroka kod pacijenata bez prethodnog događaja (npr. recidiv raka dojke ili drugi primarni rak).
[0086] ”Celokupno preživljavanje” odnosi se na pacijenta koji ostaje živ tokom određenog vremenskog perioda, kao što je oko 1 godina, oko 2 godine, oko 3 godine, oko 4 godine, oko 5 godina, oko 10 godina itd., od početka lečenja ili iz početne dijagnoze. U ispitivanjima na kojima se temelji pronalazak događaj koji se koristio za analizu preživljavanja bila je smrt iz bilo kog uzroka.
[0087] Pod „produžavanjem preživljavanja” podrazumeva se povećanje DFS i/ili OS kod lečenog pacijenta u odnosu na nelečenog pacijenta ili u odnosu na protokol kontrolnog lečenja. Preživljavanje se prati najmanje oko šest meseci, ili najmanje oko 1 godinu, ili najmanje oko 2 godine, ili najmanje oko 3 godine, ili najmanje oko 4 godine, ili najmanje oko 5 godina, ili najmanje oko 10 godine itd., nakon započinjanja lečenja ili nakon početne dijagnoze.
[0088] Pod „monoterapijom” podrazumeva se terapijski režim koji uključuje samo jedno terapijsko sredstvo za lečenje karcinoma ili tumora tokom perioda lečenja.
1
[0089] Pod „terapijom održavanja” podrazumeva se terapijski režim koji se daje kako bi se smanjila verovatnoća ponovnog pojave ili progresije bolesti. Terapija održavanja može se obezbediti bilo koje vreme, uključujući produžene vremenske periode do životnog veka ispitanika. Terapija održavanja može se obezbediti nakon početne terapije ili u kombinaciji sa početnom ili dodatnom terapijom. Doze koje se koriste za terapiju održavanja mogu se razlikovati i mogu uključivati smanjene doze u poređenju sa dozama koje se koriste za druge vrste terapije.
[0090] Kako su ovde definisani, termini “trastuzumab”, “HERCEPTIN®” i “huMAb4D5-8” koriste se naizmenično. Takvo antitelo poželjno sadrži sekvence aminokiselina lakog i teškog lanca prikazane u SEQ ID NO:30 i SEQ ID NO.29, respektivno.
[0091] U ovde navedene svrhe, „pertuzumab”, „PERJETA®” i „rhuMAb 2C4” se koriste naizmenično. Takvo antitelo sadrži antitelo glavne vrste koje imaju aminokiselinske sekvence lakog i teškog lanca u SEQ ID NO:32, odnosno 31 (Slika 13A i B). U nekim otelotvorenjima, pertuzumab sadrži antitelo varijante vrste sa produžetkom amino-terminalnog lidera, na primer, sadrži aminokiselinsku sekvencu lakog lanca SEQ ID NO:34, i teški lanac aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:33. Antitelo je opciono proizvedeno putem rekombinantnih ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO).
[0092] Kao što je ovde definisano, termini “T-DM1,” “trastuzumab-MCC-DMl,” “ado-trastuzumab emtanzin,” “trastuzumab emtanzin,” i “KADCILA®” se koriste se naizmenično i odnose se na trastuzumab povezan preko dela veznika MCC za deo leka majtansinoida DM1, uključujući sve smeše različito davanih i povezanih za konjugate antitelo-lek su 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 i 8 delovi leka kovalentno povezani za trastuzumab antitelo (US 7097840; US 8,337,856; US 2005/0276812; US 2005/0166993).
[0093] ”Izolovano antitelo” je ono koje je izdvojeno iz komponente prirodnog okruženja. U nekim otelotvorenjima, antitelo se prečišćava do čistoće veće od 95% ili 99%, kako je određeno, na primer, elektroforetskim (npr., SDS-PAGE, izoelektričnim fokusiranjem (IEF), kapilarnom elektroforezom) ili hromatografskim (npr., jonoizmenjivačkom ili reverzno faznom HPLC). Za pregled postupaka za procenu čistoće antitela, videti, npr., Flatman i dr., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).
[0094] ”Izolovana nukleinska kiselina” odnosi se na molekul nukleinske kiseline koji je odvojen od komponente prirodnog okruženja. Izolovana nukleinska kiselina uključuje molekul nukleinske kiseline sadržan u ćelijama koje obično sadrže molekulu nukleinske kiseline, ali je molekul nukleinske kiseline prisutan ekstrahromozomalno ili na hromozomskoj lokaciji koja je različita od njegove prirodne hromozomske lokacije.
[0095] ”Izolovana nukleinska kiselina koja kodira anti-HER2 antitelo” odnosi se na jedan ili više molekula nukleinske kiseline koji kodiraju teške i lake lance antitela (ili njihove fragmente), uključujući takve molekule nukleinske kiseline u jednom vektoru ili odvojenim vektorima, i takve molekule nukleinske kiseline prisutne na jednoj ili više lokacija u ćeliji domaćina.
[0096] Termin “HER2”, kako se ovde koristi, odnosi se na bilo koji izvorni, zreli HER2 koji je rezultat obrade proteina HER2 preteča u ćeliji. Termin uključuje HER2 iz bilo kog izvora kičmenjaka, uključujući sisare kao što su primati (npr. ljudi i majmuni cinomolgus) i glodari (npr., miševi i pacovi), ako nije drugačije naznačeno. Termin takođe uključuje prirodne varijante HER2, npr., spojene varijante ili alelne varijante. Aminokiselinska sekvenca primernog humanog proteina prekursora HER2, sa signalnom sekvencom (sa signalnom sekvencom, aminokiseline 1-22) je prikazana u SEQ ID NO:1. Aminokiselinska sekvenca primernog zrelog humanog HER2 su aminokiseline 23-1255 od SEQ ID NO:1.
[0097] Termin “HER2-pozitivna ćelija” odnosi se na ćeliju koja na svojoj površini eksprimira HER2.
[0098] Termin “monoklonska antitela”, kao što je ovde korišćen, odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj., pojedinačna antitela koja obuhvataju populaciju su identična i/ili vezuje isti epitop, osim mogućih varijanti antitela, npr., koja prirodno sadrže mutacije ili nastaju tokom proizvodnje monoklonskog preparata antitela, a takve varijante su uglavnom prisutne u manjim količinama. Za razliku od preparata za poliklonalna antitela, koji obično uključuju različita antitela usmerena protiv različitih determinanti (epitopi), svako monoklonsko antitelo monoklonskog preparata za antitelo usmereno je protiv jedne odrednice antigena. Prema tome, modifikator “monoklonski” ukazuje na karakter antitela koje je dobijeno iz suštinski homogene populacije antitela i ne treba ga tumačiti kao da zahteva proizvodnju antitela bilo kojim određenim postupkom. Na primer, monoklonska antitela koja će se koristiti u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu se načiniti različitim tehnikama, uključujući, ali ne ograničavajući se na postupak hibridoma, rekombinantne DNK postupke, postupke fago-prikaza i postupke korišćenja transgenih životinja koje sadrže sve ili deo humanog imunoglobulinskog lokusa, takve postupke i drugi primeri primera za
1
pravljenje monoklonskih antitela koja su ovde opisana.
[0099] ”Golo antitelo” se odnosi na antitelo koje nije konjugovano sa heterološkom grupom (npr., citotoksičnom jedinicom) ili radio-obeležavanjem. Golo antitelo može biti prisutno u farmaceutskoj formulaciji.
[0100] ”Matična antitela” se odnose na prirodne molekule imunoglobulina sa različitim strukturama. Na primer, izvorna IgG antitela su heterotetramerni glikoproteini od oko 150 000 daltona, sastavljeni od dva identična lagana lanca i dva identična teška lanca koja su disulfidno vezana. Od N- do C-kraja, svaki teški lanac ima varijabilni region (VH), koji se takođe naziva varijabilni domen teškog ili varijabilni domen teškog lanca, a zatim slede tri konstantna domena (CHI, CH2 i CH3). Slično tome, od N- do C-kraja, svaki laki lanac ima varijabilni region (VL), koji se takođe naziva varijabilni domen lakog ili varijabilni domen teškog lanca, a sledi konstantni laki (CL) domen. Laki lanac antitela može se dodeliti jednoj od dve vrste, nazvanoj kappa (k) i lambda (λ), na osnovu aminokiselinske sekvence njegovog konstantnog domena.
[0101] „Bočica” je posuda pogodna za držanje tečnog ili liofilizovanog preparata. U jednom aspektu, bočica je bočica za jednokratnu upotrebu, npr. bočica za jednokratnu upotrebu od 20 cm3 sa zatvaračem.
[0102] Termin “dodatak za pakovanje” koristi se za upućivanje na uputstva koja su obično uključena u komercijalna pakovanja terapijskih proizvoda, koja sadrže informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, davanju, kombinovanoj terapiji, kontraindikacijama i/ili upozorenjima za upotrebu takvih terapijskih proizvoda.
[0103] ”Procentualni (%) identitet aminokiselinske sekvence” u odnosu na referentnu polipeptidnu sekvencu se definiše kao procenat aminokiselinskih ostataka u kandidatskoj sekvenci koji su identični sa aminokiselinskim ostacima u referentnoj polipeptidnoj sekvenci, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja međuprostora, ako je potrebno, za postizanje maksimalnog procenta identiteta sekvence, i ne razmatranje bilo koje konzervativne supstitucije kao dela identiteta sekvence. Usklađivanje radi određivanja postotka aminokiselinskih procenata može se postići na različite načine koji su poznati u struci, na primer, korišćenjem javno dostupnog računarskog softvera, poput softvera BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR). Oni koji poznaju ovu oblast mogu odrediti odgovarajuće parametre za poravnanje sekvenci, uključujući bilo koje algoritme potrebne za postizanje maksimalnog poravnanja po celoj dužini sekvence koja se upoređuje. Međutim, u svrhe ovde,% identičnosti sekvenci aminokiselina se generišu korišćenjem računarskog programa za poređenje sekvenci ALIGN-2. Kompjuterski program za poređenje ALIGN-2 autor je Genentech, Inc., a izvorni kod je podnesen sa korisničkom dokumentacijom u američkom uredu za autorska prava, Vašington D.C., 20559, gde je registrovan pod američkim registracionim brojem TXU510087. Program ALIGN-2 javno je dostupan od Genentech, Inc., Južni San Francisko, Kalifornija, ili se može sastaviti iz izvornog koda. Program ALIGN-2 treba da bude sastavljen za upotrebu u UNIX operativnom sistemu, uključujući digitalni UNIX V4.0D. Sve parametre za poređenje sekvenci postavlja program ALIGN-2 i ne variraju.
[0104] U situacijama kada se ALIGN-2 koristi za poređenje aminokiselinskih sekvenci, % identičnosti aminokiselinske sekvence date aminokiselinske sekvence A do, sa ili protiv date aminokiselinske sekvence B (koja se alternativno može formulisati kao data aminokiselina sekvenca A koja ima ili sadrži izvestan % identičnosti sekvence aminokiselina sa, sa ili protiv date aminokiselinske sekvence B) izračunava se na sledeći način:
100 puta veći od frakcije X/Y
gde je X broj ostataka aminokiselina postignut kao identični podudaranje programom za poravnavanje redosleda ALIGN-2 u poravnavanju A i B tog programa, a gde je Y ukupni broj aminokiselinskih ostataka u B. Razumeće se da tamo gde dužina sekvence A aminokiselina A nije jednaka dužini sekvence B aminokiselina, % identičnosti A-B sekvence aminokiselina neće biti jednak% identifikaciji sekvence B aminokiselina od B do A Ukoliko nije izričito drugačije navedeno, sve ovde identifikovane vrednosti identiteta % aminokiselinskih sekvenci dobijene su kako je opisano u prethodnom pasusu pomoću računarskog programa ALIGN-2.
[0105] Termin “farmaceutska formulacija” odnosi se na sastav koji je u takvom obliku koji omogućava da biološka aktivnost aktivnog sastojka koji se nalazi u njemu bude efikasna i koja ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za ispitanika kojem bi se davala formulacija.
[0106] ”Farmaceutski prihvatljiv nosač” odnosi se na sastojak u farmaceutskoj formulaciji, osim aktivnog sastojka, koji nije netoksičan za ispitanika. Farmaceutski prihvatljiv nosač uključuje, ali nije ograničen na,
1
pufer, ekscipijens, stabilizator ili konzervans.
[0107] Kako se ovde koristi, „lečenje” (i njegove gramatičke varijacije kao što je „lečiti” ili „lečenje”) odnosi se na kliničku intervenciju u pokušaju da se promeni prirodni tok osobe koja se leči, a može se izvoditi ili za profilaksu ili tokom tok kliničke patologije. Poželjni efekti lečenja uključuju, ali nisu ograničeni na, sprečavanje pojave ili ponovnog pojavljivanja bolesti, ublažavanje simptoma, smanjenje bilo kakvih direktnih ili indirektnih patoloških posledica bolesti, sprečavanje metastaza, smanjenje stope progresije bolesti, poboljšanje ili palijaciju bolesti i remisije ili poboljšane prognoze. U nekim otelotvorenjima, antitela iz predmetnog pronalaska se koriste da odlože razvoj bolesti ili da usporavaju napredovanje bolesti.
[0108] Pod „istovremenim davanjem” podrazumeva se intravenozno davanje dva (ili više) lekova tokom iste davanja, umesto sekvencijalnih infuzija dva ili više lekova. Generalno, ovo će uključivati kombinovanje dva (ili više) lekova u istu vrećicu za infuziju pre njihovog istovremenog davanja.
[0109] Lek koji se daje „istovremeno” sa jednim ili više drugih lekova daje se tokom istog ciklusa lečenja, istog dana lečenja kao jedan ili više drugih lekova, i, opciono, istovremeno sa jednim ili više drugih lekova. Na primer, za terapije karcinoma koje se daju svake 3 nedelje, istovremeno davani lekovi se daju na prvi dan u tronedeljnom ciklusu.
[0110] „Hemoterapija” je upotreba hemoterapeutskog sredstva korisnog u lečenju karcinoma.
[0111] „Hemoterapeutsko sredstvo” je hemijsko jedinjenje korisno u lečenju karcinoma, bez obzira na mehanizam delovanja. Klase hemoterapeutskih sredstava uključuju, ali nisu ograničene na: alkilirajuća sredstva, antimetaboliti, alkaloidi biljnih otrova biljaka, citotoksični/antitumorski antibiotici, inhibitori topoizomeraze, antitela, fotosenzibilizatori i inhibitori kinaze. Primeri hemoterapeutskih sredstava uključuju: antraciklini, kao što su epirubicin ili doksorubicin (ADRIAMYCIN®), ciklofosfamid (CYTOXAN®, NEOSAR®), antraciklin i ciklofosfamid u kombinaciji („AC”); taksan, npr., docetaksel (TAXOTERE®,) ili paklitaksel (TAXOL®), 5-FU (fluorouracil, 5-fluorouracil, CAS br. 51-21-8), lapatinib (TYKERB®), kapecitabin (XELODA®), gemcitabin (GEMZAR®, Lilly), PD-0325901 (CAS br. 391210-10-9, Pfizer), cisplatin (cis-diamin, dihloroplatina(II), CAS br. 15663-27-1), karboplatin (CAS br. 41575-94-4), temozolomid (4-metil-5-okso- 2,3,4,6,8-pentazabiciklo [4.3.0] nona-2,7,9-trien-9-karboksamid, CAS br.
85622-93-1, TEMODAR®, TEMODAL®, Schering Plough), tamoksifen ((Z)-2-[4-(1,2-difenilbut-1-enil)fenoksi]-N,N-dimetil-etanamin, NOLVADEX®, ISTUBAL®, VALODEX®).
[0112] Još primera hemoterapeutskih sredstava uključuju: oksaliplatin (ELOXATIN®, Sanofi), bortezomib (VELCADE®, Millennium Pharm.), sutent (SUNITINIB®, SU11248, Pfizer), letrozol (FEMARA®, Novartis), imatinib mezilat (GLEEVEC®, Novartis), XL-518 (MEK inhibitor, Exelixis, WO 2007/044515), ARRY-886 (Mek inhibitor, AZD6244, Array BioPharma, Astra Zeneca), SF-1126 (PI3K inhibitor, Semafore Pharmaceuticals), BEZ-235 (PI3K inhibitor, Novartis), XL-147 (PI3K inhibitor, Exelixis), PTK787/ZK 222584 (Novartis), fulvestrant (FASLODEX®, AstraZeneca), leukovorin (folinska kiselina), rapamicin (sirolimus, RAPAMUNE®, Wyeth), lonafarnib (SARASAR™, SCH 66336, Schering Plough), sorafenib (NEXAVAR®, BAY43-9006, Bayer Labs), gefitinib (IRESSA®, AstraZeneca), irinotekan (CAMPTOSAR®, CPT-11, Pfizer), tipifarnib (ZARNESTRA™, Johnson & Johnson), ABRAXANE™ (bez Cremophor), formulacije nanočestica paklitaksela prema albuminu (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, II), vandetanib (rINN, ZD6474, ZACTIMA®, AstraZeneca), hlorambucil, AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen), temsirolimus (TORISEL®, Wyeth), pazopanib (GlaxoSmithKline), kanfosfamid (TELCYTA®, Telik), tiotepa i ciklosfosfamid (CYTOXAN®, NEOSAR®); alkil sulfonati kao što su busulfan, improsulfan i piposulfan; aziridini kao što su benzodopa, karbokuon, meturedopa i uredopa; etilenimini i metilamelamini, uključujući altretamin, trietilenmelamin, trietilenfosforamid, trietilentiofosforamid i trimetilomelamin; acetogenini (posebno bullatacin i bullatacinone); kamptotecin (uključujući sintetički analogni topotekan); briostatin; kalistatin; CC-1065 (uključujući njegove sintetičke analoge adozelesina, karzelesina i bizelesina); kriptoficini (naročito kriptoficin 1 i kriptoficin 8); dolastatin; duokarmicin (uključujući sintetičke analoge, KW-2189 i CB1-TM1); eleuterobin; pankratistatin; sarkodiktin; spongistatin; azotne iperiti kao što su hlorambucil, hlornapazin, holofosfamid, estramustin, ifosfamid, mekloretamin, mehloretamin oksid hidrohlorid, melfalan, novembicin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, uracil senf; nitrozoureje kao što su karmustin, hlorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin i ranimnustin; antibiotici kao što su antibiotici enediina (npr., kaliheamicin, kaliheamicin gamma1I, kaliheamicin omegaI1 (Angew Chem. Intl. Ed. Engl. (1994) 33:183-186); dinemicin, uključujući dinemicin A; biofosfonati, kao što je klodronat; esperamicin; kao i hromofor neokarzinostatin i srodni hromoprotein enediin antibiotski hromofori), aklacinomizini, aktinomicin, autramicin, azaserin, bleomicini, kaktinomicin, karabicin, karminomicin, karzinofilin, hromomicini,
1
daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleucin, morfolino-doksorubicin, cijanomorfolino-doksorubicin, 2-pirolino-doksorubicin), epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcelomicin, mitomicini kao što su mitomicin C, mikofenolna kiselina, nogalamicin, olivomicini, peplomicin, porfiromicin, puromicin, kelamicin, rodorubicin, stretonigrin, streptozocin, tuberksicin, tuberkocidin, tuberkocin antimetaboliti poput metotreksata i 5-fluorouracila (5-FU); analozi folne kiseline kao što su denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat; purinski analozi kao što su fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin; analozi pirimidina kao što su ankitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, citarabin, dideokuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin; androgeni poput kalusteron, dromostanolona propionata, epitiostanola, mepitiostana, testolaktona; antiadrenali kao što su aminoglutetimid, mitotan, trilostan; obnavljač folne kiseline, kao što je frolinska kiselina; aceglaton; aldofosfamid glikozid; aminolevulinska kiselina; eniluracil; amsakrin; bestrabucil; bisantren; edatraksat; defofamin; demekolcin; diazikon; elfornitin; eliptinijum acetat; epotilon; etoglucid; galijum nitrat; hidroksiurea; lentinan; lonidainin; majtansinoidi kao što su majtansin i ansamitocini; mitoguazon; mitoksantron; mopidamol; nitraerin; pentostatin; fenamet; pirarubicin; losoksantron; podofilinska kiselina; 2-etilhidrazid; prokarbazin; PSK® kompleks polisaharida (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoksan; rizoksin; sizofiran; spirogermanijum; tenuazonska kiselina; triazikuon; 2,2',2”-trihlorotrietilamin; trioteceni (T-2 toksin, verakurin A, roridin A i anguidin); uretan; vindesin; dakarbazin; manomustin; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gacitosin; arabinozid (Ara-C); ciklofosfamid; tiotepa; 6-tioguanin; merkaptopurin; metotreksat; analozi platine kao što su cisplatin i karboplatin; vinblastin; etoposid (VP-16); ifosfamid; mitoksantron; vinkristin; vinorelbin (NAVELBINE®); novantron; tenipozid; edatraksat; daunomicin; aminopterin; ibandronat; CPT-11; inhibitor topoizomeraze RFS 2000; difluorometilornitin (DMFO); retinoidi kao što je retinoična kiselina; i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline i derivati bilo kog od iznad navedenih.
[0113] ”Fiksna” ili “ravna” doza terapijskog sredstva ovde se odnosi na dozu koja se daje ljudskom pacijentu bez obzira na težinu (WT) ili telesnu površinu (BSA) pacijenta. Stoga fiksna ili ravna doza nije data u dozi od mg/kg ili u dozi od mg/m2, već kao apsolutna količina terapijskog sredstva.
[0114] ”Utovarna” doza ovde generalno sadrži početnu dozu terapijskog sredstva koja se daje pacijentu, a praćena je jednom ili više doza održavanja. Generalno, daje se jedna doza za punjenje, ali ovde se razmatraju višestruke doze za punjenje. Obično primenjena doza(e) opterećenja premašuje količinu primenjene doze održavanja i/ili doza(e) davanja daju se češće od doze(a) održavanja, kako bi se postigla željena koncentracija stabilne doze terapijskog sredstva ranije nego što se može postići dozom (dozama) za održavanje.
[0115] Doza “održavanja” ovde se odnosi na jednu ili više doza terapijskog sredstva koje se daje pacijentu tokom perioda lečenja. Obično se doze održavanja daju u razmaknutim intervalima lečenja, kao što su približno svake nedelje, približno svake 2. nedelje, približno svake 3. nedelje ili približno svake 4. nedelje, po mogućnosti svake 3. nedelje.
[0116] ”Infuzija” ili “davanje infuzije” odnosi se na uvođenje rastvora koji sadrži lek u telo kroz venu u terapeutske svrhe. Generalno se to postiže putem intravenske (IV) vreće.
[0117] ”Intravenska vreća” ili “IV vreća” je vreća u kojoj se može naći rastvor koji se može davati kroz venu pacijenta. U jednom otelotvorenju, rastvor je fiziološki rastvor (npr. oko 0,9% ili oko 0,45% NaCl). Opciono, IV vreća je napravljena od poliolefina ili polivinil hlorida.
[0118] Termin “promenljivi region” ili “promenljivi domen” odnosi se na domen antitela teškog ili lakog lanca koji je uključen u vezivanje antitela na antigen. Varijabilni domeni teškog i lakog lanca (VH i VL, respektivno) izvornog antitela generalno imaju slične strukture, pri čemu svaki domen sadrži četiri sačuvana okvirna regiona (FR) i tri hipervarijabilna regiona (HVR). (Videti npr., Kindt i dr. Kuby Immunology, 6. izd., W.H. Freeman i Co., str.91 (2007).) Jedan VH ili VL domen može biti dovoljan da prenese specifičnost vezivanja antigena. U nastavku, antitela koja vezuju određeni antigen mogu biti izolovana korišćenjem VH ili VL domena iz antitela koje veže antigen za skrining biblioteke komplementarnih VL ili VH domena, respektivno. Videti npr., Portolano i dr., J. Immunol.150:880-887 (1993); Clarkson i dr., Nature 352:624-628 (1991).
[0119] Termin “vektor”, kako se ovde koristi, odnosi se na molekul nukleinske kiseline koji je sposoban da propagira drugu nukleinsku kiselinu na koju je povezan. Termin uključuje vektor kao samoobnavajuću strukturu nukleinske kiseline kao i vektor ugrađen u genom ćelije domaćina u koju je uveden. Određeni vektori su u stanju da usmere ekspresiju nukleinskih kiselina sa kojima su operativno vezani. Takvi se vektori ovde nazivaju “vektori ekspresije.”
[0120] ”Alkil” je C1-C18ugljovodonik koji sadrži normalne, sekundarne, tercijarne ili ciklične atome ugljenika.
2
Primeri su metil (Me, -CH3), etil (Et, -CH2CH3), 1-propil (n-Pr, n-propil, -CH2CH2CH3), 2-propil (i-Pr, i-propil, -CH(CH3)2), 1-butil (n-Bu, n-butil, -CH2CH2CH2CH3), 2-metil-1-propil (i-Bu, i-butil, -CH2CH(CH3)2), 2-butil (s-Bu, s-butil, -CH(CH3)CH2CH3), 2-metil-2-propil (t-Bu, t-butil, -C(CH3)3), 1-pentil (n-pentil, -CH2CH2CH2CH2CH3), 2-pentil (-CH(CH3)CH2CH2CH3), 3-pentil (-CH(CH2CH3)2), 2-metil-2-butil (-C(CH3)2CH2CH3), 3-metil-2-butil (-CH(CH3)CH(CH3)2), 3-metil-1-butil (-CH2CH2CH(CH3)2), 2-metil-1-butil (-CH2CH(CH3)CH2CH3), 1-heksil (-CH2CH2CH2CH2CH2CH3), 2-heksil (-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3), 3-heksil (-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3)), 2-metil-2-pentil (-C(CH3)2CH2CH2CH3), 3-metil-2-pentil (-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3), 4-metil-2-pentil (-CH(CH3)CH2CH(CH3)2), 3-metil-3-pentil (-C(CH3)(CH2CH3)2), 2-metil-3-pentil (-CH(CH2CH3)CH(CH3)2), 2,3-dimetil-2-butil (-C(CH3)2CH(CH3)2), 3,3-dimetil-2-butil (-CH(CH3)C(CH3)3.
[0121] Termin “C1-C8alkil”, kako se ovde koristi, odnosi se na ravan ili razgranat, zasićen ili nezasićen ugljovodonik koji ima od 1 do 8 atoma ugljenika. Reprezentativne “C1-C8alkil” grupe uključuju, ali nisu ograničene na, -metil, -etil, -n-propil, -n-butil, -n-pentil, -n-heksil, -n-heptil, -n- oktil, -n-nonil i -n-decil; dok razgranati C1-C8alkili uključuju, ali nisu ograničeni na, -izopropil, -sek-butil, -izobutil, - terc-butil, -izopentil, 2-metilbutil, nezasićeni C1-C8alkili uključuju, ali nisu ograničeni na, -vinil, -alil, - 1-butenil, -2-butenil, -izobutilenil, -1-pentenil, -2-pentenil, -3-metil-1-butenil, -2-metil-2-butenil, - 2, 3-dimetil-2-butenil, 1-heksil, 2-heksil, 3-heksil, -acetilenil, -propinil, -1-butinil, -2-butinil, - 1-pentinil, -2-pentinil, -3-metil -1 butinil. C1-C8alkil grupa može biti nesupstituisana ili supstituisana sa jednom ili više grupa uključujući, ali ne ograničavajući se na, -C1-C8alkil, -O-(C1-C8alkil), -aril, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2-NHC(O)R', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -halogen, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2i -CN; gde je svako R' nezavisno izabrano iz H, -C1-C8alkila i arila.
[0122] Termin “C1-C12alkil”, kako se ovde koristi, odnosi se na ravan ili razgranat, zasićen ili nezasićen ugljovodonik koji ima od 1 do 12 atoma ugljenika. C1-C12alkil grupa može biti nesupstituisana ili supstituisana sa jednom ili više grupa uključujući, ali ne ograničavajući se na, -C1-C8alkil, -O-(C1-C8alkil), -aril, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2-NHC(O)R', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -halogen, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2i -CN; gde je svako R' nezavisno izabrano iz H, -C1-C8alkila i arila.
[0123] Termin “C1-C6alkil”, kako se ovde koristi, odnosi se na ravan ili razgranat, zasićen ili nezasićen ugljovodonik koji ima od 1 do 6 atoma ugljenika. Reprezentativne “C1-C6alkil” grupe uključuju, ali nisu ograničene na, -metil, -etil, -n-propil, -n-butil, -n-pentil, -i n-heksil; dok razgranati C1-C6alkili uključuju, ali nisu ograničeni na, -izopropil, -sek-butil, -izobutil, -terc-butil, -izopentil i 2-metilbutil; nezasićeni C1-C6alkili uključuju, ali nisu ograničeni na, -vinil, -alil, -1-butenil, -2-butenil i -izobutilenil, -1-pentenil, -2-pentenil, -3-metil-1-butenil, -2-metil-2-butenil, - 2,3-dimetil-2-butenil, 1-heksil, 2-heksil i 3-heksil. C1-C6alkil grupa može biti nesupstituisana ili supstituisana sa jednom ili više grupa, kao što je iznad opisano za C1-C8alkil grupu.
[0124] Termin “C1-C4alkil”, kako se ovde koristi, odnosi se na ravan ili razgranat, zasićen ili nezasićen ugljovodonik koji ima od 1 do 4 atoma ugljenika. Reprezentativne “C1-C4alkil” grupe uključuju, ali nisu ograničene na, -metil, -etil, -n-propil, -n-butil; dok razgranati C1-C4alkili uključuju, ali nisu ograničeni na, -izopropil, -sek-butil, -izobutil, -terc-butil; nezasićeni C1-C4alkili uključuju, ali nisu ograničeni na, -vinil, -alil, -1-butenil, -2-butenil i -izobutilenil. C1-C4alkil grupa može biti nesupstituisana ili supstituisana sa jednom ili više grupa, kao što je iznad opisano za C1-C8alkil grupu.
[0125] „Alkoksi” je alkilna grupa pojedinačno vezana za kiseonik. Primeri alkoksi grupa uključuju, ali nisu ograničeni na, metoksi (-OCH3) i etoksi (-OCH2CH3). “C1-C5alkoksi” je alkoksi grupa sa 1 do 5 atoma ugljenika. Alkoksi grupe mogu biti nesupstituisane ili supstituisane sa jednom ili više grupa, kao što je iznad opisano za alkil grupe.
[0126] ”Alkenil” je ugljovodonik C2-C18koji sadrži normalne, sekundarne, tercijarne ili ciklične atome ugljenika sa najmanje jednim mestom nezasićenja, tj. dvostrukom vezom ugljenik-ugljenik, sp<2>. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na: etilen ili vinil (-CH=CH2), alil (-CH2CH=CH2), ciklopentenil (-C5H7), i 5-heksenil (-CH2CH2CH2CH2CH=CH2). “C2-C8alkenil” je ugljovodonik koji sadrži 2 do 8 normalnih, sekundarnih, tercijarnih ili cikličnih atoma ugljenika sa najmanje jednim mestom nezasićenja, tj. dvostrukom vezom ugljenik-ugljenik, sp<2>.
[0127] ”Alkinil” je ugljovodonik C2-C18koji sadrži normalne, sekundarne, tercijarne ili ciklične atome ugljenika sa najmanje jednim mestom nezasićenja, tj. trostrukom vezom ugljenik-ugljenik, sp. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na: acetilenski (-C=CH) i propargil (-CH2C≡CH). “C2-C8alkinil” je ugljovodonik koji sadrži 2 do 8 normalnih, sekundarnih, tercijarnih ili cikličnih atoma ugljenika sa najmanje jednim mestom nezasićenja, tj. trostrukom vezom ugljenik-ugljenik, sp.
[0128] ”Alkilen” se odnosi na zasićeni, razgranati ili ravan lanac ili ciklični ugljovodonični radikal sa 1-18 atoma ugljenika i koji ima dva monovalentna radikalna centra izvedena uklanjanjem dva atoma vodonika iz istog ili dva različita atoma ugljenika matičnog alkana. Tipični alkilenski radikali uključuju, ali nisu ograničeni na: metilen (-CH2-) 1,2-etil (-CH2CH2-), 1,3-propil (-CH2CH2CH2-), 1,4-butil (-CH2CH2CH2CH2-), i slično.
[0129] ”Alkenilen” se odnosi na nezasićeni, razgranati ili ravan lanac ili ciklični ugljovodonični radikal sa 2-18 atoma ugljenika i koji ima dva monovalentna radikalna centra izvedena uklanjanjem dva atoma vodonika iz istog ili dva različita atoma ugljenika matičnog alkena. Tipični alkenilenski radikali uključuju, ali nisu ograničeni na: 1,2-etilen (-CH=CH-).
[0130] ”Alkinilen” se odnosi na nezasićeni, razgranati ili ravan lanac ili ciklični ugljovodonični radikal sa 2-18 atoma ugljenika i koji ima dva monovalentna radikalna centra izvedena uklanjanjem dva atoma vodonika iz istog ili dva različita atoma ugljenika matičnog alkina. Tipični alkinilenski radikali uključuju, ali nisu ograničeni na: acetilen (-C=C-), propargil (-CH2C≡C-), i 4-pentinil (-CH2CH2CH2C≡C- ).
[0131] ”Aril” odnosi se na karbocikličnu aromatičnu grupu. Primeri aril grupa uključuju, ali nisu ograničeni na, fenil, naftil i antracenil. Karbociklična aromatična grupa ili heterociklična aromatična grupa može biti nesupstituisana ili supstituisana jednom ili više grupa, uključujući, ali ne ograničavajući se na, -C1-C8alkil, -O-(C1-C8alkil), -aril, -C(O)R', -OC(O)R',-C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2- NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -halogen, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2i -CN; gde je svako R' nezavisno izabrano iz H, -C1-C8alkila i arila.
[0132] aril” je aril grupa sa 5 do 20 atoma ugljenika u karbocikličnim aromatičnim prstenovima. Primeri C5-C20aril grupa uključuju, ali nisu ograničeni na, fenil, naftil i antracenil. C5-C20aril grupa može biti supstituisana ili nesupstituisana kao što je iznad opisano za aril grupe. “C5-C14aril” je aril grupa sa 5 do 14 atoma ugljenika u karbocikličnim aromatičnim prstenovima. Primeri C5-C14aril grupa uključuju, ali nisu ograničeni na, fenil, naftil i antracenil. C5-C14aril grupa može biti supstituisana ili nesupstituisana kao što je iznad opisano za aril grupe.
[0133] ”Arilen” je aril grupa koja ima dve kovalentne veze i može biti u orto, meta ili para konfiguraciji kao što je prikazano u sledećim strukturama:
u kojima fenilna grupa može biti nesupstituisana ili supstituisana sa do četiri grupe uključujući, ali ne ograničavajući se na, -C1-C8alkil, -O-(C1-C8alkil), -aril, -C(O)R', -OC(O)R',-C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2- NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -halogen, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2i -CN; gde je svako R' nezavisno izabrano iz H, -C1-C8alkila i arila.
[0134] ”Arilalkil” se odnosi na aciklični alkilni radikal u kome je jedan od atoma vodonika vezan za atom ugljenika, obično terminalni ili sp<3>atom ugljenika, zamenjen aril radikalom. Tipične arilalkil grupe uključuju, ali se ne ograničavaju na, benzil, 2-feniletan-1-il, 2-fenileten-1-il, naftilmetil, 2-naftiletan-1-il, 2-naftileten-1-il, naftobenzil, 2 -naftofeniletan-1-il i slično. Arilalkil grupa sadrži 6 do 20 atoma ugljenika, npr. alkilna grupa, uključujući alkanil, alkenil ili alkinil grupe, arilalkil grupe je 1 do 6 atoma ugljenika, a aril grupa je 5 do 14 atoma ugljenika.
[0135] ”Heteroarilalkil” se odnosi na aciklični alkilni radikal u kome je jedan od atoma vodonika vezan za atom ugljenika, obično terminalni ili sp<3>atom ugljenika, zamenjen heteroarilnim radikalom. Tipične heteroarilalkil grupe uključuju, ali nisu ograničene na, 2-benzimidazolilmetil, 2-furiletil i slično. Heteroarilalkil grupa sadrži 6 do 20 atoma ugljenika, npr. alkilni deo, uključujući alkanil, alkenil ili alkinil grupe, heteroarilalkil grupe je 1 do 6 atoma ugljenika, a heteroarilni deo je 5 do 14 atoma ugljenika i 1 do 3 heteroatoma izabranih između N, O, P i S. Heteroaril ostatak heteroarilalkil grupe može biti monocikl koji ima 3 do 7 članova prstena (2 do 6 atoma ugljenika ili bicikl koji ima 7 do 10 članova prstena (4 do 9 atoma ugljenika i 1 do 3 heteroatoma odabranih od N, O, P i S), na primer: biciklo [4,5], [5,5], [5,6], ili [6,6] sistem.
[0136] ”Supstituisani alkil”, “supstituisani aril” i “supstituisani arilalkil” označavaju alkil, aril i arilalkil, u kojima je jedan ili više atoma vodonika svaki nezavisno zamenjen supstituentom. Tipični supstituenti uključuju, ali nisu ograničeni na, -X, -R, -O-, -OR, -SR, -S-, -NR2, -NR3, =NR, -CX3, -CN, -OCN, -SCN, -N=C=O, -NCS, -NO, -NO2, =N2, -N3, NC(=O)R, -C(=O)R, -C(=O)NR2, -SO3-, -SO3H, -S(=O)2R, OS(=O)2OR, -S(=O)2NR, -S(=O)R, -OP(=O)(OR)2, -P(=O)(OR)2, -PO-3, -PO3H2, -C(=O)R, -C(=O)X, -C(=S)R, -CO2R, -CO2-, -C(=S)OR, -C(=O)SR, -C(=S)SR, -C(=O)NR2, -C(=S)NR2, -C(=NR)NR2, gde je svako X nezavisno halogen: F, Cl, Br ili I; i svaki R je nezavisno -H, C2-C18alkil, C6-C20aril, C3-C14heterocikl, zaštitna grupa ili deo proleka. Alkilenske, alkenilenske i alkinilenske grupe, kao što je iznad opisano, takođe mogu biti slično supstituisane.
[0137] ”Heteroaril” i “heterocikl” se odnose na sistem prstenova u kome je jedan ili više atoma prstena heteroatom, npr. azot, kiseonik i sumpor. Heterociklični radikal sadrži 3 do 20 atoma ugljenika i 1 do 3 heteroatoma izabranih između N, O, P i S. Heterocikl može biti monocikl koji ima 3 do 7 članova prstena (2 do 6 atoma ugljenika i 1 do 3 heteroatoma izabranih od N, O, P i S) ili bicikl koji ima 7 do 10 članova prstena (4 do 9 atoma ugljenika i 1 do 3 heteroatoma odabranih od N, O, P i S), na primer: biciklo [4,5], [5,5], [5,6], ili [6,6] sistem.
[0138] Primerni heterocikli su opisani, na primer, u Paquette, Leo A., “Principles of Modern Heterocyclic Chemistry” (W.A. Benjamin, New York, 1968), posebno u Odeljcima 1, 3, 4, 6, 7, i 9; “The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs” (John Wiley & Sons, New York, 1950 do danas posebno u tomovima 13, 14, 16, 19, i 28; i J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566.
[0139] Primeri heterocikla uključuju kao primer, a ne ograničenje piridil, dihidroipiridil, tetrahidropiridil (piperidil), tiazolil, tetrahidrotiofenil, sumpor oksidovani tetrahidrotiofenil, pirimidinil, furanil, tienil, pirolil, pirazolil, imidazolil, tetrazolil, benzofuranil, tianaftalenil, indolil, indolnil, kinolinil, izokinolinil, benzimidazolil, piperidinil, 4-piperidonil, pirolidinil, 2-pirolidonil, pirolinil, tetrahidrofuranil, bistetrahidrofuranil, tetrahidropiranil, bis-tetrahidropiranil, tetrahidrohinolinil, tetrahidroizohinolinil, dekahidrohinolinil, oktahidroizokvinolinil, azocinil, triazinil, 6H-1,2,5-tiadiazinil, 2H, 6H-1,5,2-ditiazinil, tienil, tiantrenil, piranil, izobenzofuranil, hromenil, ksantenil, fenoksatinil, 2H-pirolil, izotiazolil, izoksazolil, pirazinil, piridazinil, izoindolil, 3H-indolil, 1H-indazolil, purinil, 4H-hinolizinil, ftalazinil, naftiridinil, kinoksalinil, kinazolinil, cinolinil, pteridinil, 4aH-karbazolil, karbazolil, β-karbolinil, fenandridinil, akridinil, pirimidinil, fenantrolinil, fenazinil, fenotiazinil, furazanil, fenoksazinil, izohromanil, hromanil, imidazolidinil, imidazolinil, pirazolidinil, pirazolinil, piperazinil, indolinil, izoindolinil, kinuklidinil, morfolinil, oksazolidinil, benzotriazolil, benzizotiazolinon, oksozoizolinol, benzotriazolil, benzizoksazolil, oksindolil, benzoksazolinil i izatinoil.
[0140] Kao primer i bez ograničenja, heterocikli vezani ugljenikom su vezani na položaju 2, 3, 4, 5 ili 6 piridina, položaju 3, 4, 5 ili 6 piridazina, položaju 2, 4, 5 ili 6 pirimidina, položaj 2, 3, 5 ili 6 pirazina, položaj 2, 3, 4, ili 5 furana, tetrahidrofurana, tiofurana, tiofena, pirola ili tetrahidropirola, pozicija 2, 4 ili 5 oksazola, imidazola ili tiazola, položaj 3, 4 ili 5 izoksazola, pirazola ili izotiazola, položaj 2 ili 3 aziridina, položaj 2, 3 ili 4 azetidina, položaj 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 hinolina ili položaja 1, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 izohinolina. Još tipičnije, heterocikli vezani za ugljenik uključuju 2-piridil, 3-piridil, 4-piridil, 5-piridil, 6-piridil, 3-piridazinil, 4-piridazinil, 5-piridazinil, 6-piridazinil, 2-pirimidinil, 4- pirimidinil, 5-pirimidinil, 6-pirimidinil, 2-pirazinil, 3-pirazinil, 5-pirazinil, 6-pirazinil, 2-tiazolil, 4-tiazolil ili 5-tiazolil.
[0141] Kao primer i bez ograničenja, heterocikli vezani na azot su povezani na položaju 1 aziridina, azetidina, pirola, pirolidina, 2-pirolina, 3-pirolina, imidazola, imidazolidina, 2-imidazolina, 3-imidazolina, pirazola, pirazolin, 2-pirazolin, 3-pirazolin, piperidin, piperazin, indol, indolin, 1H-indazol, položaj 2 izoindol ili izoindolin, položaj 4 morfolina, i položaj 9 karbazola, ili β-karbolina. Još tipičnije, heterocikli vezani azotom uključuju 1-aziridil, 1-azetedil, 1-pirolil, 1-imidazolil, 1-pirazolil, i 1-piperidinil.
[0142] heterocikl” odnosi se na aromatični ili nearomatični C3-C8karbocikl u kome su jedan do četiri prstenastih atoma ugljenika nezavisno zamenjeni heteroatomom iz grupe koju čine O, S i N. Reprezentativni primeri C3-C8heterocikla uključuju, ali nisu ograničeni na, benzofuranil, benzotiofen, indolil, benzopirazolil, kumarinil, izokinolinil, pirolil, tiofenil, furanil, tiazolil, imidazolil, pirazolil, triazolil, kinolinil, pirimidinil, piridinil, piridonil, pirazinil, piridazinil, izotiazolil, izoksazolil i tetrazolil. C3-C8heterocikl može biti nesupstituisan ili supstituisan sa do sedam grupa uključujući, ali ne ograničavajući se na, -C1-C8alkil, -O-(C1-C8alkil), -aril, -C(O)R', -OC(O)R',-C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2- NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -halogen, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2i -CN; gde je svako R' nezavisno izabrano iz H, -C1-C8alkila i arila.
[0143] heterociklo” se odnosi na C3-C8heterocikličnu grupu definisanu iznad, gde je jedan od atoma vodonika heterociklične grupe zamenjen vezom. C3-C8heterociklo može biti nesupstituisan ili supstituisan sa do šest grupa uključujući, ali ne ograničavajući se na, -C1-C8alkil, -O-(C1-C8alkil), -aril, -C(O)R', -OC(O)R',-C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2- NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -halogen, -N3, -NH2, -
2
NH(R'), -N(R')2i -CN; gde je svako R' nezavisno izabrano iz H, -C1-C8alkila i arila.
[0144] odnosi se na aromatični ili nearomatični C3-C8karbocikl u kome su jedan do četiri atoma ugljenika u prstenu nezavisno zamenjeni heteroatomom iz grupe koja se sastoji iz O, S i N. C3-C20heterocikl može biti nesupstituisan ili supstituisan sa do sedam grupa uključujući, ali ne ograničavajući se na, -C1-C8alkil, -O-(C1-C8alkil), -aril, -C(O)R', -OC(O)R',-C(O)OR', - C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2-NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -halogen, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2i -CN; gde je svako R' nezavisno izabrano iz H, -C1-C8alkila i arila.
[0145] se odnosi na C3-C20heterocikličnu grupu definisanu iznad, gde je jedan od atoma vodonika heterociklične grupe zamenjen vezom.
[0146] „Karbocikl” označava zasićeni ili nezasićeni prsten koji ima 3 do 7 atoma ugljenika kao monocikl ili 7 do 12 atoma ugljenika kao bicikl. Monociklični karbocikli imaju 3 do 6 atoma u prstenu, još tipičnije 5 ili 6 atoma u prstenu. Biciklični karbocikli imaju 7 do 12 atoma u prstenu, npr. uređen kao biciklo [4,5], [5,5], [5,6]
ili [6,6] ili [6,6] sistem, ili 9 ili 10 atoma u prstenu raspoređenih kao biciklo [5,6] ili [6,6] sistem. Primeri monocikličnih karbocikla uključuju ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, 1-ciklopent-1-enil, 1-ciklopent-2-enil, 1-ciklopent-3-enil, cikloheksil, 1-cikloheks-1-enil, 1-cikloheks-2-enil, 1-cikloheks-3-enil, cikloheptil i ciklooktil.
[0147] karbocikl” je 3-, 4-, 5-, 6-, 7- ili 8-člani zasićeni ili nezasićeni nearomatični karbociklični prsten. Reprezentativni C3-C8karbocikli uključuju, ali nisu ograničeni na, -ciklopropil, -ciklobutil, -ciklopentil, -ciklopentadienil, -cikloheksil, -cikloheksenil, -1,3-cikloheksadienil, -1,4-cikloheksadienil, -cikloheptil, -1,3-cikloheptadienil, -1,3,5-cikloheptatrienil, -ciklooktil i - ciklooktadienil. C3-C8karbocikl grupa može biti nesupstituisana ili supstituisana sa jednom ili više grupa uključujući, ali ne ograničavajući se na, -C1-C8alkil, -O-(C1-C8alkil), -aril, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2-NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -halogen, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2i -CN; gde je svako R' nezavisno izabrano iz H, -C1-C8alkila i arila.
[0148] karbociklo” odnosi se na iznad definisanu C3-C8karbocikličnu grupu u kojoj je jedan od atoma vodonika karbocikličnih grupa zamenjen vezom.
[0149] ”Veznik” se odnosi na hemijski deo koji sadrži kovalentnu vezu ili lanac atoma koji kovalentno vezuje antitelo za deo leka. U različitim otelotvorenjima, veznici uključuju dvovalentni radikal kao što je alkildiil, arildiil, heteroarildiil, delovi kao što su: -(CR2)nO(CR2)n-, ponavljajuće jedinice alkiloksi (npr. polietilenoksi, PEG, polimetilenoksi) i alkilamino (npr. polietilenamino, Jeffamine™); estar kiseline i amidi, uključujući sukcinat, sukcinamid, diglikolat, malonat i kaproamid. U različitim otelotvorenjima, veznici mogu sadržati jedan ili više aminokiselinskih ostataka, kao što su valin, fenilalanin, lizin i homolizin.
[0150] Termin “hiralno” odnosi se na molekule koji imaju svojstvo ne-preklapanja partnera sa slikom u ogledalu, dok se termin “ahiralni” odnosi na molekule koji se mogu preklopiti na partneru sa slikom u ogledalu.
[0151] Termin “stereoizomeri” odnosi se na jedinjenja koja imaju identičan hemijski sastav, ali se razlikuju s obzirom na raspored atoma ili grupa u prostoru.
[0152] ”Dijastereomer” se odnosi na stereoizomer sa dva ili više chiralnih centara i čiji molekuli nisu ogledalo jedan drugom. Dijastereomeri imaju različita fizička svojstva, npr. tačke topljenja, tačke ključanja, spektralna svojstva i reaktivnost. Smeše dijastereomera mogu se razdvojiti pod analitičkim postupcima visoke rezolucije, kao što su elektroforeza i hromatografija.
[0153] ”Enantiomeri” se odnose na dva stereoizomera jedinjenja koji su slike u ogledalu koje se ne mogu preklopiti.
[0154] Stereohemijske definicije i ovde korišćene uopšteno slede S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; i Eliel, E. and Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., New York. Mnoga organska jedinjenja postoje u optički aktivnim oblicima, tj., Imaju sposobnost rotacije ravni polarizovane svetlosti. U opisu optički aktivnog jedinjenja, prefiksi D i L, ili R i S, koriste se za označavanje apsolutne konfiguracije molekula o njegovom hiralnom centru. Prefiksi d i 1 ili (+) i (-) se koriste da označe znak rotacije ravnomerno polarizovanog svetla od jedinjenja, pri čemu (-) ili 1 znači da je jedinjenje levorotatorno. Jedinjenje sa (+) prefiksom ili d je dekstrorotatorno. Za datu hemijsku strukturu, ovi stereoizomeri su identični osim što su slike u ogledalu jedan drugog. Specifični stereoizomer se takođe može nazvati enantiomerom, a smeša takvih izomera se često naziva enantiomerna smeša. Mešavina enantiomera od 50:50 naziva se racemska smeša ili racemat, a može se pojaviti tamo gde nije bilo stereoselekcije ili stereospecifičnosti u hemijskoj reakciji ili procesu. Termini “racemska smeša” i “racemat” odnose se na ekvimolarnu mešavinu dve enantiomerne vrste lišene optičke aktivnosti.
[0155] „Napuštajuća grupa” odnosi se na funkcionalnu grupu koja može biti zamenjena drugom funkcionalnom grupom. Određene napuštajuće grupe su dobro poznate u tehnici, a primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, halogenid (npr., hlorid, bromid, jodid), metansulfonil (mezil), p-toluensulfonil (tozil), trifluorometilsulfonil (triflat) i trifluorometilsulfonat.
[0156] Termin “zaštitna grupa” odnosi se na supstituent koji se obično koristi za blokiranje ili zaštitu određene funkcionalnosti dok reaguje sa drugim funkcionalnim grupama na jedinjenju. Na primer, “amino-zaštitna grupa” je supstituent vezan za amino grupu koji blokira ili štiti amino funkcionalnost u jedinjenju. Pogodne amino-zaštitne grupe uključuju, ali nisu ograničene na, acetil, trifluoroacetil, t-butoksikarbonil (BOC), benziloksikarbonil (CBZ) i 9-fluorenilmetilenoksikarbonil (Fmoc). Za opšti opis zaštitnih grupa i njihovu upotrebu videti T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991, ili kasnije izdanje..
II. SASTAVI I POSTUPCI
[0157] U jednom aspektu, pronalazak se delimično zasniva na antitelima koja se vezuju za HER2 i imunokonjugatima koji sadrže takva antitela. Antitela i imunokonjugati iz pronalaska su korisni, na primer, za dijagnozu ili lečenje HER2-pozitivnih karcinoma.
A. Primerna antitela na HER2
[0158] Ovde su data izolovana antitela koja se vezuju za domen I HER2. U nekim otelotvorenjima, antitela ne ometaju vezivanje trastuzumaba i/ili pertuzumaba za HER2. U nekim otelotvorenjima, antitela ne ometaju vezivanje trastuzumaba za HER2 i ne ometaju vezivanje pertuzumaba za HER2. U bilo kom od otelotvorenja koja su ovde opisana, antitela mogu biti monoklonska antitela. U nekim otelotvorenjima, antitela mogu biti humana antitela, humanizovana antitela ili himerna antitela.
[0159] Primeri sekvence humanog proteina prekursora HER2, sa signalnom sekvencom (aminokiseline 1-22), dati su u SEQ ID NO:1, a odgovarajuća zrela sekvenca HER2 proteina odgovara aminokiselinama 23-1255 iz SEQ ID NO:1. U nekim otelotvorenjima, domen I HER2 ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:35, domen II ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:36, domen III ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:37, i domen IV ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:38 (videti Sliku 16).
Antitelo hu7C2 i druga otelotvorenja
[0160] U nekim otelotvorenjima, pronalazak obezbeđuje antitelo na HER2 koje sadrži (i) (a) HVR-H1 koje sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:15; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:16; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:17; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:12; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:13; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:14, pri čemu antitelo vezuje HER2 sa konstantom disocijacije (KD) od ≤ 5 nM kako je određeno površinskom plazmonskom rezonancom; i/ili (ii) varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:11 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:10.
[0161] U bilo kojoj od gornjih otelotvorenja, antitelo na HER2 je humanizovano. U jednom otelotvorenju, antitelo na HER2 sadrži HVR kao u bilo kojoj od gornjih otelotvorenja, i dalje sadrži humani prihvatni okvir, npr. okvir humanog imunoglobulina ili okvir ljudskog konsenzusa. U određenim otelotvorenima, humani prihvatni okvir je humani VL kappa IV konsenzusni okvir (VLKIV) i/ili VH okvir VH1. U određenim otelotvorenima, humani prihvatni okvir je humani VL kappa IV konsenzusni okvir (VLKIV) i/ili VH okvir VH1koji sadrži bilo koju od ovde opisanih mutacija.
[0162] Anti-HER2 antitelo može sadržati sekvencu varijabilnog domena teškog lanca (VH) koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:11. VH sekvenca koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta aminokiselinskoj sekvenci iz SEQ ID NO:11 može sadržati supstitucije (npr., konzervativne supstitucije), insercije ili delecije u odnosu na referentnu sekvencu, ali anti-HER2 antitelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost vezivanja za HER2. Ukupno 1 do 10 aminokiselina je moglo biti supstituisano, umetnuto i/ili izbrisano u SEQ ID NO:11. Ukupno 1 do 5 aminokiselina je moglo biti supstituisano, umetnuto i/ili izbrisano u SEQ ID NO:11. U određenim otelotvorenjima, supstitucije, umetanja
2
ili brisanja se dešavaju u regionima izvan HVR (tj. U FR). Po izboru, antitelo na HER2 sadrži VH sekvencu SEQ ID NO:11, uključujući post-translacione modifikacije tog niza. VH sadrži HVR: (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:15, (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:16, i (f) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:17.
[0163] Anti-HER2 antitelo može sadržati laki lanac varijabilnog domena (VL) koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:10. VL sekvenca koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta aminokiselinskoj sekvenci iz SEQ ID NO:10 može sadržati supstitucije (npr., konzervativne supstitucije), insercije ili delecije u odnosu na referentnu sekvencu, ali anti-HER2 antitelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost vezivanja za HER2. Ukupno 1 do 10 aminokiselina je moglo biti supstituisano, umetnuto i/ili izbrisano u SEQ ID NO:10. Ukupno 1 do 5 aminokiselina je moglo biti supstituisano, umetnuto i/ili izbrisano u SEQ ID NO:10. U određenim otelotvorenjima, supstitucije, umetanja ili brisanja se dešavaju u regionima izvan HVR (tj. U FR). Po izboru, anti-HER2 antitelo sadrži VL sekvencu SEQ ID NO:10, uključujući post-translacione modifikacije te sekvence. VL sadrži HVR (a) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:12; (b) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:13; i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:14.
[0164] U drugom aspektu, obezbeđeno je anti-HER2 antitelo, pri čemu antitelo sadrži VH kao u bilo kojem otelotvorenju koje je navedeno iznad, i VL kao u bilo kojem otelotvorenju od iznad navedenih.
[0165] U jednom otelotvorenju, antitelo sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO:11 i SEQ ID NO:10, uključujući post-translacione modifikacije tih sekvenci.
[0166] Ovde su opisana antitela koja se vezuju za isti epitop kao ovde dato anti-HER2 antitelo. Na primer, opisano je antitelo koje se vezuje za isti epitop kao anti-HER2 antitelo koje sadrži VH sekvencu SEQ ID NO:11 i VL sekvencu SEQ ID NO.10, respektivno.
[0167] U drugom aspektu, anti-HER2 antitelo sadrži sekvencu teškog lanca koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:19. U određenim otelotvorenjima, sekvenca teškog lanca koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta aminokiselinskoj sekvenci iz SEQ ID NO:19 sadrži supstitucije (npr., konzervativne supstitucije), insercije ili delecije u odnosu na referentnu sekvencu, ali anti-HER2 antitelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost vezivanja za HER2. U određenim otelotvorenjima, ukupno 1 do 10 aminokiselina je supstituisano, umetnuto i/ili izbrisano u SEQ ID NO:19. U određenim otelotvorenjima, ukupno 1 do 5 aminokiselina je supstituisano, umetnuto i/ili izbrisano u SEQ ID NO:19. U određenim otelotvorenjima, supstitucije, umetanja ili brisanja se dešavaju u regionima izvan HVR (tj. U FR). Po izboru, anti-HER2 antitelo sadrži sekvencu teškog lanca SEQ ID NO:19, uključujući post-translacione modifikacije tog niza.
[0168] U drugom aspektu, obezbeđeno je anti-HER2 antitelo, pri čemu antitelo sadrži laki lanac koji ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 % ili 100% identičnosti sekvence aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:18. U određenim otelotvorenjima, sekvenca lakog lanca koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta aminokiselinskoj sekvenci iz SEQ ID NO:18 sadrži supstitucije (npr., konzervativne supstitucije), insercije ili delecije u odnosu na referentnu sekvencu, ali anti-HER2 antitelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost vezivanja za HER2. U određenim otelotvorenjima, ukupno 1 do 10 aminokiselina je supstituisano, umetnuto i/ili izbrisano u SEQ ID NO:18. U određenim otelotvorenjima, ukupno 1 do 5 aminokiselina je supstituisano, umetnuto i/ili izbrisano u SEQ ID NO:18. U određenim otelotvorenjima, supstitucije, umetanja ili brisanja se dešavaju u regionima izvan HVR (tj. U FR). Po izboru, anti-HER2 antitelo sadrži sekvencu lakog lanca SEQ ID NO:18, uključujući post-translacione modifikacije tog niza.
[0169] U drugom aspektu, obezbeđeno je anti-HER2 antitelo, pri čemu antitelo sadrži teški lanac kao u bilo kojem otelotvorenju koje je navedeno iznad, i laki lanac kao u bilo kojem otelotvorenju od iznad navedenih.
[0170] U jednom otelotvorenju, antitelo sadrži teški lanac i laki lanac sekvence u SEQ ID NO:19 i SEQ ID NO:18, uključujući post-translacione modifikacije tih sekvenci.
[0171] U sledećem aspektu, ovde su opisana antitela koja se vezuju za isti epitop kao ovde dato anti-HER2 antitelo. Na primer, u određenim otelotvorenjima, obezbeđeno je antitelo koje se vezuje za isti epitop kao anti-HER2 antitelo koje sadrži sekvencu teškog lanca SEQ ID NO:19 i sekvenca lakih lanaca SEQ ID NO:18, respektivno.
2
[0172] Ovde su data antitela koja sadrže varijabilni domen lakog lanca koji sadrži HVR1-LC, HVR2-LC i HVR3-LC sekvencu prema Kabat numerisanju kao što je prikazano na slici 1 i promenljivi domen teškog lanca koji sadrže HVR1-HC, HVR2-HC i HVR3 -HC sekvenca prema Kabat numerisanju kao što je prikazano na Slici 2. Antitelo može sadržati varijabilni domen lakog lanca koji sadrži sekvence HVR1-LC, HVR2-LC i/ili HVR3-LC i sekvencu FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC i/ili FR4-LC kako je prikazano na Slici 1. Antitelo može sadržati varijabilni domen teškog lanca koji sadrži sekvence HVR1-HC, HVR2-HC i/ili HVR3-HC i sekvencu FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC i/ili FR4-HC kako je prikazano na Slici 2.
[0173] U daljem aspektu pronalaska, anti-HER2 antitelo prema bilo kojoj od gornjih otelotvorenja je monoklonsko antitelo, uključujući humano antitelo. U jednom otelotvorenju, antitelo na HER2 je fragment antitela, npr., Fv, Fab, Fab', scFv, dijatelo ili F(ab')2fragment. U još jednom otelotvorenju, antitelo je suštinski antitelo pune dužine, npr., IgG1 antitelo, IgG2a antitelo ili druga klasa antitela ili izotip kako je ovde definisano.
[0174] U daljem aspektu, anti-HER2 antitelo prema bilo kojoj od gornjih otelotvorenja može da sadrži bilo koju od karakteristika, pojedinačno ili u kombinaciji, kao što je opisano u nastavku.
1. Afinitet antitela
[0175] U određenim otelotvorenjima, ovde dato antitelo ima konstantu disocijacije (Kd) od ≤ 1µM, ≤100 nM, ≤ 50 nM, ≤10 nM, ≤ 5 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM ili ≤ 0,001 nM, a opciono je ≥ 10<-13>M. (npr.10<-8>M ili manje, npr. od 10<-8>M do 10<-13>M, npr. od 10<-9>M do 10<-13>M).
[0176] Kd se može meriti radioaktivno obeleženim testom vezivanja antigena (RIA), izvedenim sa Fab verzijom antitela od interesa i njegovog antigena, kako je opisano u sledećem testu. Afinitet vezivanja rastvora za Fabs za antigen se meri izjednačavanjem Fab sa minimalnom koncentracijom (<125>I) obeleženog antigena u prisustvu niza titracija neobeleženog antigena, a zatim hvatanjem vezanog antigena pločom obloženom antitelom protiv Fab (videti, npr., Chen i dr., J. Mol. Biol.293:865-881(1999)). Da bi se uspostavili uslovi za ispitivanje, MICROTITER® ploče sa više udubljenja (Thermo Scientific) presvučene su preko noći sa 5 µg/ml hvatajućeg anti-Fab antitela (Cappel Labs) u 50 mM natrijum-karbonata (pH 9,6), a potom blokirane sa 2% (w/v) goveđeg serumskog albumina u PBS tokom dva do pet sati na sobnoj temperaturi (približno 23°C). U ne-adsorbentnoj ploči (Nunc #269620) 100 pM ili 26 pM [<125>I]-antigena se meša sa serijskim razblaživanjem Faba od interesa (npr., u skladu sa procenom anti-VEGF antitela u Presta i dr., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)). Fab od interesa se zatim inkubira preko noći; međutim, inkubacija može da traje duže vreme (npr., oko 65 sati) da se obezbedi postizanje ravnoteže. Nakon toga, smeše se prenose na hvatajuću ploču za inkubaciju na sobnoj temperaturi (npr., tokom jednog sata). Zatim se rastvor ukloni i ploča ispere osam puta sa 0,1% polisorbatom 20 (TWEEN-20®) u PBS. Kada se ploče osuše, dodaje se 150 µl/udubljenju scintiltanata (MICROSCINT-20 ™; Packard) i ploče se broje na TOPCOUNT ™ gama brojaču (Packard) tokom deset minuta. Koncentracije svakog Fab koje daju manje ili jednako 20% maksimalnog vezivanja su izabrane za upotrebu u kompetetivnim testovima vezivanja.
[0177] Prema jednom ostvarenju, Kd se meri pomoću površinskih testova plazmonske rezonance pomoću BIACORE®-2000 ili BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) na 25°C pomoću imobilisanih antigenskih CM5 čipova na ~10 jedinica odgovora (RU). Ukratko, karboksimetilirani biosenzorni čipovi dekstrana (CM5, BIACORE Inc.) aktiviraju se sa N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohloridom (EDC) i N-hidroksisukcinimidom (NHS) prema uputstvima dobavljača. Antigen je razblažen sa 10 mM natrijum acetata, pH 4,8, do 5 µg/ml (∼0,2 µM) pre injekcije brzinom protoka od 5 µl/minutu da bi se postiglo približno 10 jedinica odgovora (RU) povezanog proteina. Nakon ubrizgavanja antigena, ubrizgava se 1 M etanolamin koji blokira grupe koje ne reaguju. Za kinetička merenja, dvostruka serijska razblaženja Fab (0,78 nM do 500 nM) ubrizgavaju se u PBS sa 0,05% polisorbata 20 (TWEEN-20™) surfaktanata (PBST) na 25°C pri brzini protoka od približno 25 µl/min. Stope asocijacije (kon) i stope disocijacije (koff) izračunavaju se korišćenjem jednostavnog Langmuirovog modela vezivanja (BIACORE® Evaluacijski softver verzija 3.2) istovremeno prilagođavanjem asocijacijskih i disocijacijskih senzora. Ravnotežna konstanta disocijacije (Kd) izračunava se kao odnos koff/kon. Videti npr., Chen i dr., J. Mol. Biol.293:865-881 (1999). Ako brzina prekorači 10<6>M<-1>s<-1>testom površinske plazmonske rezonance iznad, tada se brzina može odrediti upotrebom fluorescentne tehnike gašenja koja meri povećanje ili smanjenje intenziteta emisije fluorescencije (pobuda = 295 nm; emisija = 340 nm, 16 nm opsega) na 25°C 20 nM antitela antigena (Fab oblik) u PBS, pH 7,2, u prisustvu povećanih koncentracija antigena merenih u spektrometru, kao što je spektrofotometar opremljen zaustavljanjem protoka (Aviv Instruments) ili SLM-AMINCO™ spektrofotometar serije 8000 (ThermoSpectronic) sa mešanom kivetom.
2
2. Fragmenti antitela
[0178] U određenim otelotvorenjima, ovde dato antitelo je fragment antitela. Fragmenti antitela uključuju, ali nisu ograničeni na, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv i scFv fragmente i druge dole opisane fragmente. Za pregled određenih fragmenata antitela, videti Hudson i dr. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Za pregled fragmenata scFv, videti npr., Pluckthün, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), str.269-315 (1994); videti takođe WO 93/16185; i patente SAD br.5,571,894 i 5,587,458. Za raspravu o fragmentima Fab i F(ab')2koji sadrže ostatke epitopa koji se vezuju za receptor i koji su povećali polu-raspad in vivo, videti patent SAD br.5,869,046.
[0179] Dijatela su fragmenti antitela sa dva mesta za vezivanje antigena koja mogu biti dvovalentna ili bispecifična. Videti, na primer, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson i dr., Nat. Med. 9:129-134 (2003); i Hollinger i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Triatela i tetratela su takođe opisana u Hudson i dr., Nat. Med.9:129-134 (2003).
[0180] Jednodomenska antitela su fragmenti antitela koji sadrže ceo ili deo varijabilnog domena teškog lanca ili ceo ili deo varijabilnog domena lakog lanca antitela. U određenim otelotvorenjima, antitelo sa jednim domenom je humano antitelo sa jednim domenom (Domantis, Inc., Waltham, MA; videti npr., patent SAD br.
6,248,516 B1).
[0181] Fragmenti antitela mogu se napraviti različitim tehnikama, uključujući, ali ne ograničavajući se na proteolitičku digestiju netaknutog antitela, kao i proizvodnju rekombinantnim ćelijama domaćina (npr. E. coli ili fag), kako je ovde opisano.
3. Himerna i humanizovana antitela
[0182] U određenim otelotvorenjima, ovde dato antitelo je himerno antitelo. Određena himerna antitela su opisana, npr., u patentu SAD br. 4,816,567; i Morrison i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). U jednom primeru, himerno antitelo sadrži nehumani promenljivi region (npr., promenljivi region izveden od miša, pacova, hrčka, zeca ili ne-humanog primata, kao što je majmun) i humani konstantni region. U daljem primeru, himerno antitelo je antitelo sa promenom klase u kome je klasa ili podklasa promenjena u odnosu na matično antitelo. Himerna antitela uključuju njihove antigen-vezujuće fragmente.
[0183] U određenim otelotvorenjima, himerno antitelo je humanizovano antitelo. Tipično je ne-humano antitelo humanizovano da bi smanjilo imunogenost prema ljudima, zadržavajući pritom specifičnost i afinitet roditeljskog ne-humanog antitela. Generalno, humanizovano antitelo sadrži jedan ili više promenljivih domena u kojima su HVR, npr., CDR, (ili njihovi delovi) izvedeni iz nehumanih antitela, a FR (ili njihovi delovi) izvedeni su iz sekvenci humanih antitela. Humanizovano antitelo opciono će takođe sadržati bar deo humanog konstantnog regiona. U nekim otelotvorenjima, neki FR ostaci u humanizovanom antitelu su supstituisani odgovarajućim ostacima iz ne-humanog antitela (npr., Antitelo iz kojeg su izvedeni HVR ostaci), npr., da bi se obnovila ili poboljšala specifičnost ili afinitet antitela.
[0184] Humanizovana antitela i postupci za njihovu izradu su pregledani, npr., u Almagro and Fransson, Front. Biosci.13:1619-1633 (2008), i dalje su opisani, npr., u Riechmann i dr., Nature 332:323-329 (1988); Queen i dr., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); US Patent Nos. 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321, i 7,087,409; Kashmiri i dr., Methods 36:25-34 (2005) (opisuje SDR (a-CDR) kalemljenje); Padlan, Mol. Immunol.28:489-498 (1991) (opisujući „izbijanje na površinu”); Dall'Acqua i dr., Methods 36:43-60 (2005) (opisujući “FR mešanje”); i Osbourn i dr., Methods 36:61-68 (2005) i Klimka i dr., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (opisujući pristup „vođenog izbora” mešanja FR).
[0185] Regioni humanog okvira koji se mogu koristiti za humanizaciju uključuju, ali nisu ograničeni na: okvirni regioni izabrani postupkom „najbolje prilagođenog” (videti, npr., Sims i dr. J. Immunol. 151:2296 (1993)); okvirni regioni izvedeni iz konsenzus sekvence humanih antitela određene podgrupe varijabilnih regiona lakog ili teškog lanca (videti, npr., Carter i dr. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); i Presta i dr. J. Immunol., 151:2623 (1993)); humani zreli (somatski mutirani) okviri regiona ili okviri regiona čovekove zametne linije (videti, npr., Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); i okvirne regione izvedene iz skrininga FR biblioteka (videti, npr., Baca i dr., J. Biol. Chem.272:10678-10684 (1997) i Rosok i dr., J. Biol. Chem.271:22611-22618 (1996)).
4. Humana antitela
[0186] U određenim otelotvorenjima, ovde dato antitelo je humano antitelo. Humana antitela se mogu proizvesti upotrebom različitih tehnika poznatih u tehnici. Humana antitela su generalno opisana u van Dijk
2
and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) i Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008).
[0187] Humana antitela se mogu pripremiti davanjem imunogena transgenskoj životinji koja je modifikovana tako da proizvodi netaknuta humana antitela ili netaknuta antitela sa varijabilnim regionima čoveka kao odgovor na antigeni izazov. Takve životinje obično sadrže sve ili deo lokusa humanog imunoglobulina, koji zamenjuju endogene lokuse imunoglobulina, ili koji su prisutni ekstrahromozomski ili nasumično integrisani u hromozome životinje. Kod takvih transgenih miševa, endogeni lokusi imunoglobulina su generalno inaktivirani. Za pregled postupaka za dobijanje humanih antitela od transgenskih životinja, videti Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). Videti takođe npr., patent SAD br. 6,075,181 i 6,150,584 opisujući XENOMOUSE™ tehnologiju; patent SAD br. 5,770,429 opisujući HUMAB® tehnologiju; patent SAD br.
7,041,870 opisujući K-M MOUSE® tehnologiju, i objavu patentne prijave SAD br. US 2007/0061900, opisujući VELOCIMOUSE® tehnologiju). Humani varijabilni regioni iz netaknutih antitela koja generišu takve životinje mogu se dalje modifikovati, na primer, kombinovanjem sa različitim humanim konstantnim regionom.
[0188] Humana antitela se takođe mogu stvoriti postupcima zasnovanim na hibridomima. Opisani su humani mijelom i miš-humani heteromijelom ćelijske linije za proizvodnju humanih monoklonskih antitela. (Videti npr., Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur i dr., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, str.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); i Boerner i dr., J. Immunol., 147: 86 (1991).) Humana antitela generisana tehnologijom humanog B-ćelijskog hibridoma su takođe opisana u Li i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Dodatni postupci uključuju one opisane, na primer, u
patentu SAD br. 7,189,826 (opisujući proizvodnju monoklonskih humanih IgM antitela iz ćelijskih linija hibridoma) i Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (opisivanje hibridoma čoveka-čoveka). Tehnologija humanog hibridoma (Trioma tehnologija) je takođe opisana u Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) i Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005).
[0189] Humana antitela se takođe mogu generisati izolovanjem sekvenci promenljivog domena Fv klona odabranih iz biblioteka faga prikazanih od čoveka. Takve sekvence varijabilnog domena mogu se zatim kombinovati sa željenim humanim konstantnim domenom. Tehnike za odabir humanih antitela iz biblioteka antitela su opisane u nastavku.
5. Antitela izvedena iz biblioteke
[0190] Antitela prema pronalasku mogu se izolovati skriningom kombinatornih biblioteka na antitela sa željenom aktivnošću ili aktivnostima. Na primer, u tehnici su poznati različiti postupci za stvaranje biblioteka za prikaz faga i skrining takvih biblioteka za antitela koja imaju željene karakteristike vezivanja. Takvi postupci su pregledani, npr., u Hoogenboom i dr. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien i dr., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) i dalje opisani, npr., u McCafferty i dr., Nature 348:552-554; Clackson i dr., Nature 352: 624-628 (1991); Marks i dr., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu i dr., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee i dr., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); i Lee i dr., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004).
[0191] U određenim postupcima prikazivanja faga, repertoari VH i VL gena se odvojeno kloniraju lančanom reakcijom polimeraze (PCR) i nasumično se kombinuju u bibliotekama faga, koji se zatim mogu pregledati na fage koji vezuju antigene, kako je opisano u Winter i dr., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Fage tipično prikazuju fragmente antitela, bilo kao jednolančane Fv (scFv) fragmente ili kao Fab fragmente. Biblioteke iz imunizovanih izvora pružaju antitela visokog afiniteta na imunogen bez potrebe za konstruisanjem hibridoma. Alternativno, izvorni repertoar može da se klonira (na primer, od čoveka) da bi se pružio jedan izvor antitela za širok spektar ne-ja, a takođe i samo-antigena, bez ikakve imunizacije kako je opisano u Griffiths i dr., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Konačno, naivne biblioteke se takođe mogu napraviti sintetički kloniranjem neuređenih segmenata V-gena iz matičnih ćelija i korišćenjem PCR prajmera koji sadrže slučajnu sekvencu za kodiranje visoko promenljivih CDR3 regiona i postizanje preuređivanja in vitro, kako je opisano u Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Patentne objave koje opisuju biblioteke faga ljudskih antitela uključuju, na primer: patent SAD br. 5,750,373, i patentnu objavu SAD br.
2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, i 2009/0002360.
2
[0192] Antitela ili fragmenti antitela izolovani iz biblioteka humanih antitela ovde se smatraju humanim antitelima ili fragmentima humanih antitela.
6. Multispecifična antitela
[0193] U određenim otelotvorenjima, ovde dato antitelo je multispecifično antitelo, npr. bispecifično antitelo. Multispecifična antitela su monoklonska antitela koja imaju specifičnosti vezivanja za najmanje dva različita mesta. U određenim otelotvorenjima, jedna od specifičnosti vezivanja je za HER2, a druga za bilo koji drugi antigen. U određenim otelotvorenjima, jedna od specifičnosti vezivanja je za HER2, a druga za CD3. Videti, npr., patent SAD br. 5,821,337. U određenim otelotvorenjima, bispecifična antitela mogu se vezati za dva različita epitopa HER2. Bispecifična antitela se takođe mogu koristiti za lokalizaciju citotoksičnih sredstava u ćelijama koje eksprimiraju HER2. Bispecifična antitela se mogu pripremiti kao antitela pune dužine ili kao fragmenti antitela.
[0194] Tehnike za stvaranje multispecifičnih antitela uključuju, ali nisu ograničene na, rekombinantnu zajedničku ekspresiju dva para imunoglobulina teški lanac-laki lanac koji imaju različite specifičnosti (videti Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829, i Traunecker i dr., EMBO J.10: 3655 (1991)), i inženjering „čvor-u-jami” (videti, npr., patent SAD br. 5,731,168). Termin “čvor-u-jami” ili “KnH” tehnologija koja se ovde koristi odnosi se na tehnologiju koja usmerava uparivanje dva polipeptida zajedno in vitro ili in vivo uvođenjem izbočine (čvora) u jedan polipeptid i šupljine (jame) u drugi polipeptid na interfejsu u kojem oni međusobno deluju. Na primer, KnH su uvedeni u interfejse za vezivanje Fc:Fc, interfejse CL:CH1 ili interfejse VH/VL antitela (videti, npr., US 2011/0287009, US2007/0178552, WO 96/027011, WO 98/050431, Zhu i dr., 1997, Protein Science 6:781-788, i WO2012/106587). U nekim otelotvorenjima, KnHs povezuju uparivanje dva različita teška lanca tokom proizvodnje multispecifičnih antitela. Na primer, multispecifična antitela koja imaju KnH u svojim Fc regionima mogu dalje da sadrže pojedinačne varijabilne domene povezane sa svakim Fc regionom ili dalje da sadrže različite varijabilne domene teškog lanca koji se uparuju sa sličnim ili različitim varijabilnim domenima lakog lanca. KnH tehnologija se takođe može koristiti za uparivanje dva različita vanćelijska domena receptora ili bilo koje druge polipeptidne sekvence koje sadrže različite sekvence za prepoznavanje ciljeva (npr., uključujući veštačka tela, peptitela i druge Fc fuzije).
[0195] Termin “mutacija dugmeta” kako se ovde koristi odnosi se na mutaciju koja uvodi izbočinu (čvor) u polipeptid na interfejsu u kojem polipeptid komunicira sa drugim polipeptidom. U nekim otelotvorenjima, drugi polipeptid ima mutaciju jame.
[0196] Termin “mutacija jame” kako se ovde koristi odnosi se na mutaciju koja uvodi izbočinu (čvor) u polipeptid na interfejsu u kojem polipeptid komunicira sa drugim polipeptidom. U nekim otelotvorenjima, drugi polipeptid ima mutaciju čvora.
[0197] U nastavku je data kratka diskusija bez ograničenja.
[0198] „Izbočina” se odnosi na najmanje jedan bočni lanac aminokiselina koji izlazi iz interfejsa prvog polipeptida i zbog toga je pozicioniran u kompenzatornoj šupljini u susednom interfejsu (tj. interfejs drugog polipeptida) kako bi stabilizovao heteromultimer, i time favorizuju stvaranje heteromultimera u odnosu na stvaranje homomultimera, na primer. Izbočina može postojati u originalnom interfejsu ili se može uvesti sintetički (npr., promenom nukleinske kiseline koja kodira interfejs). U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira interfejs prvog polipeptida je izmenjena da kodira izbočinu. Da bi se to postiglo, nukleinska kiselina koja kodira najmanje jedan “originalni” aminokiselinski ostatak u interfejsu prvog polipeptida zamenjuje se nukleinskom kiselinom koja kodira najmanje jedan “uvozni” aminokiselinski ostatak koji ima veću zapreminu bočnog lanca od originalnog amino kiselinski ostatak. Biće zahvalno da može biti više originalnih i odgovarajućih uvoznih ostataka. Zapremine bočnog lanca različitih amino ostataka prikazane su, na primer, u Tabeli 1 US2011/0287009. Mutacija koja uvodi „izbočinu” može se nazvati „mutacija čvora”.
[0199] U nekim otelotvorenjima, uvozni ostaci za stvaranje izbočina su prirodni aminokiselinski ostaci odabrani između arginina (R), fenilalanina (F), tirozina (I) i triptofana (V). U nekim otelotvorenjima, uvozni ostatak je triptofan ili tirozin. U nekom otelotvorenjima, originalni ostatak za stvaranje izbočina ima malu zapreminu bočnog lanca, kao što su alanin, asparagin, asparaginska kiselina, glicin, serin, treonin ili valin.
[0200] ”Šupljina” se odnosi na najmanje jedan aminokiselinski bočni lanac koji je udubljen u interfejsu drugog polipeptida i prema tome smešta odgovarajuću izbočinu na susednoj površini prvog polipeptida. Šupljina može postojati u originalnom interfejsu ili se može uvesti sintetički (npr., promenom nukleinske kiseline koja kodira interfejs). U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira interfejs drugog polipeptida je izmenjena da kodira šupljinu. Da bi se to postiglo, nukleinska kiselina koja kodira najmanje jedan “originalni” aminokiselinski ostatak u interfejsu drugog polipeptida zamenjuje se sa DNK koja kodira najmanje jedan “uvozni” aminokiselinski ostatak koji ima manju zapreminu bočnog lanca od originalnog amino kiselinski ostatak. Biće zahvalno da može biti više originalnih i odgovarajućih uvoznih ostataka. U nekim otelotvorenjima, uvozni ostaci za formiranje šupljine su aminokiselinski ostaci koji se prirodno javljaju odabrani između alanina (A), serina (S), treonina (T) i valina (V). U nekim otelotvorenjima, uvozni ostatak je serin, alanin ili treonin. U nekim otelotvorenjima, originalni ostatak za formiranje šupljine ima veliku zapreminu bočnog lanca, kao što su tirozin, arginin, fenilalanin ili triptofan. Mutacija za uvođenje „šupljine” može se nazvati „mutacija jame”.
[0201] Izbočina je “moguća za pozicioniranje” u šupljini, što znači da su prostorni položaj izbočine i šupljine na interfejsu prvog polipeptida, odnosno drugog polipeptida, a veličine izbočine i šupljine takve da izbočina može biti smeštena u šupljini bez značajnog narušavanja normalne asocijacije prvog i drugog polipeptida na interfejsu. Budući da izbočine poput Tyr, Phe i Trp obično ne idu upravno od ose interfejsa i imaju preferirane konformacije, poravnanje izbočine sa odgovarajućom šupljinom može se, u nekim slučajevima, osloniti na modeliranje para izbočina/šupljina na osnovu trodimenzionalna struktura kakva je dobijena rentgenskom kristalografijom ili nuklearnom magnetnom rezonancom (NMR). To se može postići korišćenjem široko prihvaćenih tehnika u tehnici.
[0202] U nekim otelotvorenjima, mutacija dugmeta u konstantnom regionu IgG1 je T366W (EU numerisanje). U nekim otelotvorenjima, mutacija rupe u konstantnom regionu IgG1 sadrži jednu ili više mutacija izabranih između T366S, L368A i Y407V (EU numerisanje). U nekim otelotvorenjima, mutacija rupe u konstantnom regionu IgG1 sadrži T366S, L368A i Y407V (EU numerisanje).
[0203] U nekim otelotvorenjima, mutacija dugmeta u konstantnom regionu IgG4 je T366W (EU numerisanje). U nekim otelotvorenjima, mutacija rupe u konstantnom regionu IgG4 sadrži jednu ili više mutacija izabranih između T366S, L368A i Y407V (EU numerisanje). U nekim otelotvorenjima, mutacija rupe u konstantnom regionu IgG4 sadrži T366S, L368A i Y407V (EU numerisanje).
[0204] Multi-specifična antitela se takođe mogu stvoriti inženjerskim elektrostatičkim upravljačkim efektima za stvaranje Fc-heterodimernih molekula antitela (WO 2009/089004A1); umrežavanje dva ili više antitela ili fragmenata (videti, npr., patent SAD br.4,676,980, i Brennan i dr., Science, 229: 81 (1985)); korišćenje leucin zatvarača za proizvodnju bi-specifičnih antitela (videti, npr., Kostelny i dr., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)); koristeći tehnologiju “dijatela” za dobijanje bispecifičnih fragmenata antitela (videti, npr., Hollinger i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); i korišćenjem jednolančanih Fv (sFv) dimera (videti, npr. Gruber i dr., J. Immunol., 152:5368 (1994)); i pripremu trispecifičnih antitela kako je opisano, npr., u Tutt i dr. J. Immunol.147: 60 (1991).
[0205] Ovde su takođe obuhvaćena konstruisana antitela sa tri ili više funkcionalnih mesta vezivanja antigena, uključujući „antitela hobotnice” (videti npr., US 2006/0025576A1).
[0206] Ovde dato antitelo ili fragment takođe uključuje “dvostruko delujući FAb” ili “DAF” koji sadrži mesto vezivanja antigena koje se vezuje za HER2, kao i drugi, različiti antigen (videti, US 2008/0069820, na primer).
7. Varijante antitela
[0207] U određenim otelotvorenjima, razmatraju se varijante aminokiselinskih sekvenci ovde datih antitela. Na primer, može biti poželjno poboljšati afinitet vezivanja i/ili druga biološka svojstva antitela. Varijante aminokiselinske sekvence antitela mogu se pripremiti uvođenjem odgovarajućih modifikacija u nukleotidnu sekvencu koja kodira antitelo ili sintezom peptida. Takve modifikacije uključuju, na primer, brisanje i/ili umetanje u i/ili supstitucije ostataka unutar aminokiselinskih sekvenci antitela. Bilo koja kombinacija delecije, umetanja i supstitucije može se napraviti da bi se došlo do konačnog konstrukta, pod uslovom da konačni konstrukt poseduje željene karakteristike, na primer, vezivanje antigena.
a) Varijante supstitucije, umetanja i brisanja
[0208] U određenim otelotvorenjima, obezbeđene su varijante antitela koja imaju jednu ili više supstitucija aminokiselina. Mesta od interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju HVR i FR. Konzervativne supstitucije prikazane su u Tabeli 1 pod naslovom „poželjne supstitucije”. Značajnije promene su date u Tabeli 1 pod naslovom „Primerne supstitucije” i kao što je dalje opisano u nastavku u odnosu na klase bočnih lanaca aminokiselina. Zamene aminokiselina mogu se uvesti u antitelo od interesa i proizvodi se pregledaju za željenu aktivnost, npr., zadržavanje/poboljšanje vezivanja antigena, smanjena imunogenost ili poboljšana ADCC ili CDC.
1
TABLE 1
Aminokiseline se mogu grupisati prema uobičajenim svojstvima bočnog lanca:
(1) hidrofobnost: Norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) neutralna hidrofilnost: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) kiselost: Asp, Glu;
(4) bazičnost: His, Lys, Arg;
(5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: Gly, Pro;
(6) aromatičnost: Trp, Tyr, Phe.
[0209] Nekonzervativne supstitucije će podrazumevati supstituciju člana jedne od ovih klasa za drugu klasu.
[0210] Jedna vrsta supstitucione varijante uključuje supstituciju jednog ili više ostataka hipervarijabilnog regiona roditeljskog antitela (npr. humanizovanog ili humanog antitela). Generalno, rezultirajuće varijante izabrane za dalje proučavanje imaće modifikacije (npr. Poboljšanja) u određenim biološkim svojstvima (npr., povećani afinitet, smanjena imunogenost) u odnosu na matično antitelo i/ili će u osnovi zadržati određene biološke osobine roditeljsko antitelo. Primer supstitucione varijante je antitelo sazrelo sa afinitetom, koje može biti pogodno generisano, na primer, korišćenjem tehnika sazrevanja afiniteta zasnovanih na prikazu fagova, kao što su ovde opisane. Ukratko, jedan ili više HVR ostataka se mutiraju, a varijantna antitela se prikazuju na fagu i pregledaju za određenu biološku aktivnost (npr. afinitet vezivanja).
[0211] Promene (npr., supstitucije) mogu se izvršiti u HVR, na primer, radi poboljšanja afiniteta antitela. Takve promene se mogu izvršiti u HVR „žarištima”, tj., ostacima kodiranim kodonima koji su podvrgnuti mutaciji na visokoj frekvenciji tokom procesa somatskog sazrevanja (videti, npr., Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), i/ili SDR (a-CDR), pri čemu se rezultujuća varijanta VH ili VL testira na afinitet vezivanja. Sazrevanje afiniteta konstruisanjem i ponovnim odabirom iz sekundarnih biblioteka opisano je, npr., u Hoogenboom i dr. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien i dr., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001).) U nekim otelotvorenjima sazrevanja afiniteta, raznolikost se uvodi u promenljive gene koji su izabrani za sazrevanje bilo kojim od različitih postupaka (npr., PCR sklonom greškama, mešanje lanaca ili mutageneza usmerena na oligonukleotide). Tada se kreira sekundarna biblioteka. Zatim se pregleda biblioteka da bi se identifikovale bilo koje varijante antitela sa željenim afinitetom. Drugi postupak za uvođenje raznolikosti uključuje pristupe usmerene na HVR, u kojima je nekoliko HVR ostataka (npr., 4-6 ostataka
2
istovremeno) nasumično. HVR ostaci koji su uključeni u vezivanje antigena mogu se posebno identifikovati, npr., korišćenjem mutageneze skeniranja alanina ili modelovanjem. CDR-H3 i CDR-L3 su često na meti.
[0212] U određenim otelotvorenjima, supstitucije, insercije ili delecije mogu se desiti u okviru jednog ili više HVR, sve dok takve promene ne smanjuju u značajnoj meri sposobnost antitela da veže antigen. Na primer, konzervativne promene (npr., konzervativne supstitucije kako su ovde date) koje ne smanjuju suštinski afinitet vezivanja mogu se izvršiti u HVR. Takve promene mogu biti van HVR „žarišta” ili SDR-a. U određenim otelotvorenjima iznad navedenih varijanti VH i VL sekvenci, svaki HVR je ili nepromenjen, ili sadrži ne više od jedne, dve ili tri supstitucije aminokiselina.
[0213] Korisni postupak za identifikaciju ostataka ili regiona antitela koja mogu biti ciljana za mutagenezu naziva se “mutageneza za skeniranje alanina” kako je opisano u Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085. U ovom postupku, ostatak ili grupa ciljnih ostataka (npr., naelektrisani ostaci kao što su arg, asp, his, lys i glu) se identifikuju i zamenjuju neutralnom ili negativno naelektrisanom aminokiselinom (npr., alanin ili polialanin) da bi se utvrdilo da li je to pogođeno interakcijom antitela sa antigenom. Na mestu aminokiselina mogu se uvesti dodatne supstitucije koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na početne supstitucije. Alternativno, ili dodatno, kristalna struktura kompleksa antigen-antitelo se koristi za identifikaciju kontaktnih tačaka između antitela i antigena. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci mogu se ciljati ili eliminisati kao kandidati za supstituciju. Mogu se pregledati varijante kako bi se utvrdilo da li sadrže željena svojstva.
[0214] Insercije aminokiselinske sekvence uključuju fuzije amino- i/ili karboksilnih terminala u dužini od jednog ostatka do polipeptida koji sadrže stotinu ili više ostataka, kao i ubacivanja intrasekvenci pojedinačnih ili višestrukih aminokiselinskih ostataka. Primeri terminalnih umetaka uključuju antitelo sa N-terminalnim metionilnim ostatkom. Ostale varijante umetanja molekula antitela uključuju fuziju na N- ili C-završetku antitela sa enzimom (npr. Za ADEPT) ili polipeptidom koji povećava serumski polu-raspad antitela.
b) Varijante glikozilacije
[0215] U određenim otelotvorenjima, ovde dato antitelo je izmenjeno da poveća ili smanji stepen do kojeg je antitelo glikozilirano. Dodavanje ili brisanje mesta glikozilacije antitelu može se pogodno postići promenom aminokiselinske sekvence tako da se stvori ili ukloni jedno ili više mesta glikozilacije.
[0216] Tamo gde antitelo sadrži Fc region, ugljeni hidrati vezani za njega mogu biti izmenjeni. Matična antitela proizvedena od sisarskih ćelija obično sadrže razgranat, biantenarni oligosaharid koji je generalno vezan N-vezom na Asn297 domena CH2 u regionu Fc. Videti, npr., Wright i dr. TIBTECH 15:26-32 (1997). Oligosaharid može da obuhvata različite ugljene hidrate, npr., manozu, N-acetil glukozamin (GlcNAc), galaktozu i sijalnu kiselinu, kao i fukozu vezanu za GlcNAc u “struku” biantenarne oligosaharidne strukture. U nekim otelotvorenjima mogu se izvršiti modifikacije oligosaharida u antitelu prema pronalasku kako bi se stvorile varijante antitela sa određenim poboljšanim svojstvima.
[0217] U jednom otelotvorenju, obezbeđene su varijante antitela koja imaju strukturu ugljenih hidrata kojoj nedostaje fukoza vezana (direktno ili indirektno) za Fc region. Na primer, količina fukoze u takvim antitelima može biti od 1% do 80%, od 1% do 65%, od 5% do 65% ili od 20% do 40%. Količina fukoze određuje se izračunavanjem prosečne količine fukoze u lancu šećera na Asn297, u odnosu na zbir svih glikostruktura vezanih za Asn 297 (npr. složene, hibridne i visoko manozne strukture) mereno spektrometrijom mase MALDI-TOF, kao što je opisano u WO 2008/077546, na primer. Asn297 se odnosi na ostatak asparagina koji se nalazi na približno položaju 297 u Fc regionu (Eu numeracija ostataka Fc regiona); međutim, Asn297 se takođe može nalaziti oko ± 3 aminokiseline uzvodno ili nizvodno od položaja 297, tj. između položaja 294 i 300, zbog manjih varijacija sekvence u antitelima. Takve varijante fukozilacije mogu biti poboljšane putem ADCC funkcije. Videti, npr., patentne objave SAD br. US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Primeri publikacija koje se odnose na varijante antitela sa „defukoziliranim” ili „manjkom fukoze” uključuju: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki i dr. J. Mol. Biol.336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki i dr. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Primeri ćelijskih linija sposobnih da proizvode defukozilirana antitela uključuju Lee13 CHO ćelije sa nedostatkom fukozilacije proteina (Ripka i dr. Arch. Biochem. Biophys.
249:533-545 (1986); patentna objava SAD br. US 2003/0157108 A1, Presta, L; i WO 2004/056312 A1, Adams i dr., naročito u Primeru 11), i nokaut ćelijske linije, kao što je gen alfa-1,6-fukoziltransferaze, FUT8, nokaut CHO ćelije (videti, npr., Yamane-Ohnuki i dr. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. i dr., Biotechnol.
Bioeng., 94(4):680-688 (2006); i WO2003/085107).
[0218] Varijante antitela su dalje obezbeđene podeljenim oligosaharidima, npr., u kojima se dvolančani oligosaharid vezan za Fc region antitela deli na dva dela pomoću GlcNAc. Takve varijante antitela mogu imati smanjenu fukozilaciju i/ili poboljšanu funkciju ADCC. Primeri takvih varijanti antitela su opisani, npr., u WO 2003/011878 (Jean-Mairet i dr.); patentu SAD br.6,602,684 (Umana i dr.); i US 2005/0123546 (Umana i dr.). Takođe su date varijante antitela sa najmanje jednim ostatkom galaktoze u oligosaharidu vezanom za Fc region. Takve varijante antitela mogu biti poboljšane putem CDC funkcije. Takve varijante antitela su opisane, npr., u WO 1997/30087 (Patel i dr.); WO 1998/58964 (Raju, S.); i WO 1999/22764 (Raju, S.).
c) Varijante Fc regiona
[0219] U određenim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih modifikacija mogu se uvesti u Fc region antitela ovde obezbeđenog, stvarajući tako varijantu Fc regiona. Varijanta Fc regiona može da sadrži sekvencu humanog Fc regiona (npr., humani IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 Fc region) koji sadrži modifikaciju aminokiseline (npr. supstituciju) na jednom ili više položaja aminokiselina.
[0220] U određenim otelotvorenjima, pronalazak razmatra varijantu antitela koja poseduje neke, ali ne sve efektorske funkcije, što ga čini poželjnim kandidatom za primene u kojima je poluvreme antitela in vivo važno, ali određene efektorske funkcije (kao što su komplement i ADCC) su nepotrebni ili štetni. Analize citotoksičnosti in vitro i/ili in vivo mogu se sprovesti da bi se potvrdilo smanjenje/iscrpljivanje CDC i/ili ADCC aktivnosti. Na primer, testovi vezivanja za Fc receptor (FcR) mogu se sprovesti kako bi se osiguralo da antitelu nedostaje vezivanje za FcgR (otuda verovatno nedostaje aktivnost ADCC), ali zadržava sposobnost vezivanja za FcRn. Primarne ćelije za posredovanje ADCC, NK ćelije, eksprimiraju Fc (samo RIII, dok monociti eksprimiraju Fc (RI, Fc (RII i Fc (RIII. Ekspresija FcR na hematopoetskim ćelijama rezimirana je u Tabeli 3 na strani 464 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol.9:457-492 (1991). Neograničavajući primeri in vitro testova za procenu ADCC aktivnosti molekula od interesa opisani su u patentu SAD br.5,500,362 (videti, npr. Hellstrom, I. i dr. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) i Hellstrom, I i dr., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (videti Bruggemann, M. i dr., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). Alternativno, mogu se primeniti postupci neradioaktivnih ispitivanja (videti, na primer, ACTI™ test neradioaktivne citotoksičnosti za protočnu citometriju (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; i test neradioaktivne citotoksičnosti CytoTox96® (Promega, Madison, WI). Korisne efektorske ćelije za takve testove uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i prirodne ćelije ubice (NK). Alternativno, ili dodatno, aktivnost ADCC molekula od interesa može se proceniti in vivo, npr., na životinjskom modelu kao što je obelodanjeno u Clynes i dr. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). Testovi vezivanja za C1q mogu se takođe sprovesti da bi se potvrdilo da antitelo nije u mogućnosti da veže C1q i da zbog toga nema CDC aktivnost. Videti npr., C1q i C3c vezuju ELISA u WO 2006/029879 i WO 2005/100402. Da bi se procenila aktivacija komplementa, može se izvršiti CDC test (videti, na primer, Gazzano-Santoro i dr., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. i dr., Blood 101:1045-1052 (2003); i Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). Vezivanje FcRn i utvrđivanje klirensa/polu-raspada in vivo mogu se takođe izvršiti korišćenjem postupaka poznatih u tehnici (videti, npr., Petkova, S.B. i dr., Int'l. Immunol.
18(12): 1759-1769 (2006)).
[0221] U nekim otelotvorenjima, jedna ili više modifikacija aminokiselina mogu se uvesti u Fc deo antitela koji je ovde dat kako bi se povećalo vezivanje IgG za neonatalni Fc receptor. U određenim otelotvorenjima, antitelo sadrži sledeće tri mutacije prema EU numerisanju: M252Y, S254T, i T256E (“YTE mutacija”) (patent SAD br. 8,697,650; videti takođe Dall'Acqua i dr., Journal of Biological Chemistry 281(33):23514-23524 (2006). U određenim otelotvorenjima, mutacija YTE ne utiče na sposobnost antitela da se veže za svoj srodni antigen. U određenim otelotvorenjima, ITE mutacija povećava polu-raspad antitela u poređenju sa izvornim (tj., ne-ITE mutantnim) antitelom. U određenim otelotvorenjima, ITE mutacija povećava polu-raspad antitela u serumu za 3 puta u poređenju sa izvornim (tj., ne-ITE mutantnim) antitelom. U određenim otelotvorenjima, ITE mutacija povećava polu-raspad antitela u serumu za 2 puta u poređenju sa izvornim (tj., ne-ITE mutantnim) antitelom. U određenim otelotvorenjima, ITE mutacija povećava polu-raspad antitela u serumu za 4 puta u poređenju sa izvornim (tj., ne-ITE mutantnim) antitelom. U određenim otelotvorenjima, ITE mutacija povećava polu-raspad antitela u serumu za barem 5 puta u poređenju sa izvornim (tj., ne-ITE mutantnim) antitelom. U određenim otelotvorenjima, ITE mutacija povećava polu-raspad antitela u serumu za barem 10 puta u poređenju sa izvornim (tj., ne-ITE mutantnim) antitelom. Videti npr., patentu SAD br.8,697,650; videti takođe Dall'Acqua i dr., Journal of Biological Chemistry 281(33):23514-23524 (2006).
[0222] U određenim otelotvorenjima, ITE mutant pruža sredstvo za modulaciju aktivnosti antitela zavisne od
4
antitela ćelijski posredovane citotoksičnosti (ADCC). U određenim otelotvorenjima, ITEO mutant pruža sredstvo za modulaciju ADCC aktivnosti humanizovanog IgG antitela usmerenog protiv humanog antigena. Videti npr., patentu SAD br. 8,697,650; videti takođe Dall'Acqua i dr., Journal of Biological Chemistry 281(33):23514-23524 (2006).
[0223] U određenim otelotvorenjima, ITE mutant omogućava istovremenu modulaciju polu-raspada seruma, raspodele tkiva i aktivnosti antitela (npr., ADCC aktivnost IgG antitela). Videti npr., patentu SAD br.
8,697,650; videti takođe Dall'Acqua i dr., Journal of Biological Chemistry 281(33):23514-23524 (2006).
[0224] Antitela sa smanjenom efektorskom funkcijom uključuju ona sa supstitucijom jednog ili više ostataka Fc regiona 238, 265, 269, 270, 297, 327 i 329 (patentu SAD br. 6,737,056). Takvi Fc mutanti uključuju Fc mutante sa supstitucijama na dva ili više položaja aminokiselina 265, 269, 270, 297 i 327, uključujući takozvani “DANA” Fc mutant sa supstitucijom ostataka 265 i 297 na alanin. (patentu SAD br.7,332,581).
[0225] U određenim otelotvorenjima, prolin na položaju 329 (EU numerisanje) (P329) divljeg tipa ljudskog Fc regiona supstituisan je glicinom ili argininom ili aminokiselinskim ostatkom dovoljno velikim da uništi prolinski sendvič unutar interfejsa receptora Fc/Fc□ koji se formira između P329 Fc i ostataka triptofana W87 i W110 od FcgRIII (Sondermann i dr.: Nature 406, 267-273 (20. juli 2000)). U daljem otelotvorenju, bar jedna dalja supstitucija aminokiselina u Fc varijanti je S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D ili P331S, a još u jednom rešenju je rečeno da je bar jedna dalja zamena aminokiselina L234A i L235A humanog IgG1 Fc regiona ili S228P i L235E humanog IgG4 Fc regiona, sve prema EU numeraciji (patent SAD br.
8,969,526).
[0226] U određenim otelotvorenjima, polipeptid sadrži Fc varijantu divljeg tipa humanog IgG Fc regiona gde polipeptid ima P329 humanog IgG Fc regiona supstituisanog glicinom i gde Fc varijanta sadrži najmanje dve dalje zamene aminokiselina na L234A i L235A humanog IgG1 Fc region ili S228P i L235E humanog IgG4 Fc regiona, i pri čemu su ostaci numerisani prema EU numeraciji (patent SAD br. 8,969,526). U određenim otelotvorenjima, polipeptid koji sadrži supstitucije P329G, L234A i L235A (EU numerisanje) pokazuju smanjeni afinitet prema humanim FciRIIIA i FciRIIA, za smanjenu modulaciju ADCC na najmanje 20% ADCC indukovane polipeptidom koji obuhvata divlji tip humanog IgG Fc regiona, i/ili za donju modulaciju ADCP (patent SAD br.8,969,526).
[0227] U specifičnom otelotvorenju polipeptid koji sadrži Fc varijantu humanog Fc polipeptida divljeg tipa sadrži trostruku mutaciju: supstitucije aminokiselina na položaju Pro329, mutacija L234A i L235A prema EU numerisanju (P329/LALA) (patent SAD br. 8,969,526). U određenim otelotvorenjima, polipeptid sadrži sledeće supstitucije aminokiselina: P329G, L234A i L235A prema EU numeraciji.
[0228] Opisane su određene varijante antitela sa poboljšanim ili smanjenim vezivanjem za FcR. (Videti, npr., patent SAD br.6,737,056; WO 2004/056312, i Shields i dr., J. Biol. Chem.9(2): 6591-6604 (2001).)
[0229] U određenim otelotvorenjima, varijanta antitela sadrži Fc region sa jednom ili više supstitucija aminokiselina koje poboljšavaju ADCC, npr., supstitucije na položajima 298, 333 i/ili 334 Fc regiona (EU numerisanje ostataka).
[0230] U nekim otelotvorenjima, vrše se promene u Fc regionu koje rezultiraju izmenjenim (tj., poboljšanim ili smanjenim) C1q vezivanjem i/ili citotoksičnošću zavisnom od komplementa (CDC), npr., kako je opisano u patentu SAD br.6,194,551, WO 99/51642, i Idusogie i dr. J. Immunol.164: 4178-4184 (2000).
[0231] Antitela sa povećanim polu-raspadom i poboljšanim vezivanjem za neonatalni Fc receptor (FcRn), koji je odgovoran za prenos majčinih IgG-a na fetus (Guyer i dr., J. Immunol. 117:587 (1976) i Kim i dr., J. Immunol. 24:249 (1994)), su opisani u US2005/0014934A1 (Hinton i dr.). Ta antitela sadrže Fc region sa jednom ili više supstitucija u njemu koji poboljšavaju vezivanje Fc regiona za FcRn. Takve Fc varijante uključuju one sa supstitucijama na jednom ili više ostataka Fc regiona: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ili 434, npr., supstitucija Fc ostatka regiona 434 (patent SAD br.7,371,826).
[0232] Videti takođe Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); patent SAD br.5,648,260; patent SAD br.
5,624,821; i WO 94/29351 u vezi sa drugim primerima varijanti Fc regiona.
d) Varijante antitela projektovane cisteinom
[0233] U određenim otelotvorenjima, može biti poželjno stvoriti antitela projektovana cisteinom, na primer, “THIOMAB™”, u kojem su jedan ili više ostataka antitela supstituisani ostacima cisteina. U određenim otelotvorenjima, supstituisani ostaci se javljaju na mestima antitela koja su dostupna za konjugaciju. Supstitucijom tih ostataka cisteinom, reaktivne tiolne grupe se tako postavljaju na pristupačnim mestima antitela i mogu se koristiti za konjugaciju antitela sa drugim delovima, kao što su delovi leka ili delovi lekveznika, da bi se stvorio imunokonjugat, kao što je opisano dalje u tekstu. U određenim otelotvorenjima, bilo koji od sledećih ostataka može biti supstituisan cisteinom: K149 (Kabat numerisanje) lakog lanca; V205 (Kabat numerisanje) lakog lanca; A118 (EU numerisanje) teškog lanca; A140 (EU numerisanje) teškog lanca; L174 (EU numerisanje) teškog lanca; Y373 (EU numerisanje) teškog lanca; i S400 (EU numerisanje) teškog lanca Fc regiona. U specifičnim otelotvorenjima, ovde opisana antitela sadrže HC-A140C (EU numerisanje) supstituciju cisteina. U specifičnim otelotvorenjima, ovde opisana antitela sadrže LC-K149C (Kabat numerisanje) supstituciju cisteina. U specifičnim otelotvorenjima, ovde opisana antitela sadrže HC-A118C (EU numerisanje) supstituciju cisteina. Cistein projektovana antitela mogu da se generišu kako je opisano, npr., u patentu SAD br.7,521,541.
[0234] U određenim otelotvorenjima, antitelo sadrži jednu od sledećih supstitucija cisteina teškog lanca:
[0235] U određenim otelotvorenjima, antitelo sadrži jednu od sledećih supstitucija cisteina lakog lanca:
[0236] Neograničavajući primer hu7C2.v2.2.LA laki lanac (LC) K149C THIOMAB™ ima aminokiselinske sekvence teškog lanca i lakog lanca SEQ ID NO:19 i 23, respektivno. Neograničavajući primer hu7C2.v2.2.LA teški lanac (HC) A118C THIOMAB™ ima aminokiselinske sekvence teškog lanca i lakog lanca SEQ ID NO:24 i 18, respektivno.
[0237] Uzorni konstantni region teškog lanca konstruisan od cisteina prikazan je u SEQ ID NO:28. Konstantni region teškog lanca konstruisan od cisteina konstruisan može se spojiti sa C-završetkom varijabilnog regiona teškog lanca hu7C2.v2.2.LA prikazanog u SEQ ID NO:11. Dobijeni teški lanac hu7C2.v2.2.LA HC S400C može biti uparen sa lakim lancem hu7C2.v2.2.LA, kao što je laki lanac prikazan u SEQ ID NO:18.
[0238] Uzorni konstantni region lakog lanca koji je projektovan od cisteina prikazan je u SEQ ID NO:25. Stalni region lakog lanca koji je projektovao cistein V205C može se spojiti sa C-završetkom promenljivog regiona lakog lanca hu7C2.v2.2.LA prikazanog u SEQ ID NO:10. Dobijeni laki lanac hu7C2.v2.2.LA LC V205C može biti uparen sa teškim lancem hu7C2.v2.2.LA IgG, kao što je teški lanac prikazan u SEQ ID NO:19.
e) Derivati antitela
[0239] U određenim otelotvorenjima, ovde dato antitelo može se dalje modifikovati da sadrži dodatne neproteinske delove koji su poznati u tehnici i lako dostupni. Sastavi pogodni za derivatizaciju antitela uključuju, ali nisu ograničeni na, polimere rastvorljive u vodi. Neograničavajući primeri polimera koji se mogu rastvarati u vodi uključuju, ali nisu ograničeni na, polietilen glikol (PEG), kopolimeri etilen glikol/propilen glikol, karboksimetilceluloza, dekstran, polivinil alkohol, polivinil pirolidon, poli-1, 3-dioksolan, poli-1,3,6-trioksan, kopolimer etilen/maleinski anhidrid, poliaminokiseline (ili homopolimeri ili slučajni kopolimeri), i dekstran ili poli (n-vinil pirolidon) polietilen glikol, homopolimeri propropilen glikola, ko-polimeri prolipropilen oksid/etilen oksid, polioksietilirani polioli (npr., glicerol), polivinil alkohol i njihove smeše. Polietilen glikol propionaldehid može imati prednosti u proizvodnji zbog svoje stabilnosti u vodi. Polimer može biti bilo koje molekulske težine i može biti razgranat ili nerazgranat. Broj polimera vezanih za antitelo može varirati, a ako je vezano više od jednog polimera, to mogu biti isti ili različiti molekuli. Generalno, broj i/ili vrsta polimera koji se koriste za derivatizaciju mogu se odrediti na osnovu razmatranja koja uključuju, ali se ne ograničavaju na, određena svojstva ili funkcije antitela koje treba poboljšati, da li će se derivat antitela koristiti u terapiji pod definisani uslovi itd.
[0240] U još jednom otelotvorenju, obezbeđeni su konjugati antitela i neproteinske grupe koja se može selektivno zagrevati izlaganjem zračenju. U jednom otelotvorenju, neproteinski deo je ugljenična nanocev (Kam i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). Zračenje može biti bilo koje talasne dužine i uključuje, ali nije ograničeno na talasne dužine koje ne štete običnim ćelijama, ali koje zagrevaju neproteinski deo do temperature na kojoj se ubijaju ćelije koje su proksimalne od proteinskog-neproteinskog dela.
B. Rekombinantni postupci i sastavi
[0241] Antitela se mogu proizvesti primenom rekombinantnih postupaka i sastava, npr., kako je opisano u patentu SAD br.4,816,567. U jednom otelotvorenju, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja kodira ovde opisano antitelo na HER2. Takva nukleinska kiselina može da kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL i/ili aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela (npr.. laki i/ili teški lanci antitela). Obezbeđeni su jedan ili više vektora (npr., ekspresioni vektori) koji sadrže takvu nukleinsku kiselinu. U daljem otelotvorenju, obezbeđena je ćelija domaćin koja sadrži takvu nukleinsku kiselinu. U jednom takvom otelotvorenju, ćelija domaćin sadrži (npr., transformisana je sa): (1) vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL antitela i aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela, ili (2) prvi vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koji sadrži VL antitela i drugi vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela. U jednom otelotvorenju, ćelija domaćin je eukariotska, npr. ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO) ili limfoidna ćelija (npr., ćelija Y0, NS0, Sp20). U jednom otelotvorenju, obezbeđen je postupak za pravljenje anti-HER2 antitela, gde postupak obuhvata kultivisanje ćelije domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo, kao što je iznad dato, pod uslovima pogodnim za ekspresiju antitela i opciono obnavljanje antitela iz ćelije domaćina (ili medijuma kulture ćelije domaćina).
[0242] Za rekombinantnu proizvodnju antitela na HER2, nukleinska kiselina koja kodira antitelo, npr., Kao što je gore opisano, izoluje se i ubacuje u jedan ili više vektora za dalje kloniranje i/ili ekspresiju u ćeliji domaćinu. Takva nukleinska kiselina se može lako izolovati i sekvencirati korišćenjem konvencionalnih postupaka (npr., upotrebom oligonukleotidnih sondi koje su sposobne da se specifično vežu za gene koji kodiraju teški i laki lanac antitela).
[0243] Pogodne ćelije domaćina za kloniranje ili ekspresiju vektora koji kodiraju antitela uključuju ovde opisane prokariotske ili eukariotske ćelije. Na primer, antitela se mogu stvoriti u bakterijama, naročito kada glikozilacija i Fc efektorska funkcija nisu potrebni. Za ekspresiju fragmenata antitela i polipeptida u bakterijama, videti npr., patent SAD br.5,648,237, 5,789,199, i 5,840,523. (Videti takođe Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), str. 245-254, opisujući ekspresiju fragmenata antitela u E. coli.) Nakon ekspresije, antitelo se može izolovati iz paste bakterijskih ćelija u rastvorljivoj frakciji i može se dalje prečišćavati.
[0244] Pored prokariota, eukariotski mikrobi poput nitastih gljivica ili kvasca pogodni su za kloniranje ili ekspresiju domaćina za vektore koji kodiraju antitela, uključujući sojeve gljivica i kvasca čiji su putevi glikozilacije „humanizovani”, što rezultira stvaranjem antitela sa delimično ili potpuno humani obrazac glikozilacije. Videti Gerngross, Nat. Biotech.22:1409-1414 (2004), i Li i dr., Nat. Biotech.24:210-215 (2006).
[0245] Pogodne ćelije domaćina za ekspresiju glikoziliranih antitela su takođe izvedene iz višećelijskih organizama (beskičmenjaci i kičmenjaci). Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata. Identifikovani su brojni bakulovirusni sojevi koji se mogu koristiti zajedno sa ćelijama insekata, posebno za transfekciju ćelija Spodoptera frugiperda.
[0246] Kulture biljnih ćelija takođe se mogu koristiti kao domaćini. Videti npr., patente SAD br. 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, i 6,417,429 (opisujući PLANTIBODIES™ tehnologiju za proizvodnju antitela u transgenskim biljkama).
[0247] Ćelije kičmenjaka mogu se takođe koristiti kao domaćini. Na primer, ćelijske linije sisara koje su prilagođene za rast u suspenziji mogu biti korisne. Drugi primeri korisnih ćelijskih linija domaćina sisara su CV1 linija majmuna bubrega transformisana SV40 (COS-7); linija humanog embrionalnog bubrega (293 ili 293 ćelije kako je opisano, npr., u Graham i dr., J. Gen Virol.36:59 (1977)); ćelije bubrega beba hrčka (BHK); ćelije steroli miša (ćelije TM4 kako je opisano, npr., u Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); ćelije bubrega majmuna (CV1); Ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76); ćelije humanog karcinoma grlića materice (HELA); pseće ćelije bubrega (MDCK; ćelije jetre bizamskog pacova (BRL 3A); ćelije ljudskih pluća (W138); ćelije ljudske jetre (Hep G2); mišji tumor dojke (MMT 060562); TRI ćelije, kao što je opisano, npr., u Mather i dr., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982); MRC 5 ćelije; i FS4 ćelije. Ostale korisne ćelijske linije domaćina sisara uključuju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), uključujući ćelije DHFR-CHO (Urlaub i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); i ćelijske linije mijeloma kao što su Y0, NS0 i Sp2/0. Za pregled određenih ćelijskih linija domaćina sisara pogodnih za proizvodnju antitela, videti, npr., Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol.248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), str.
255-268 (2003).
C. Testovi
[0248] Ovde data antitela protiv HER2 mogu se identifikovati, pregledati ili naznačiti zbog njihovih fizičkohemijskih svojstava i/ili bioloških aktivnosti različitim testovima poznatim u tehnici.
[0249] Antitelo prema pronalasku može se testirati na njegovu aktivnost vezivanja antigena, npr., poznatim postupcima kao što su ELISA, BIACore®, FACS ili Vestern blot.
[0250] Analize takmičenja mogu se koristiti za identifikovanje antitela koje se takmiči sa bilo kojim ovde opisanim antitelima za vezivanje za HER2. Takvo konkurentsko antitelo se vezuje za isti epitop (npr., linearni ili konformacioni epitop) koji je vezan antitelom opisanim ovde. Detaljni primerni postupci za mapiranje epitopa za koji se antitelo vezuje su dati Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” in Methods in Molecular Biology vol.66 (Humana Press, Totowa, NJ).
[0251] U primernom testu nadmetanja, imobilisani HER2 se inkubira u rastvoru koji sadrži prvo obeleženo antitelo koje se vezuje za HER2 (npr., bilo koje od ovde opisanih antitela) i drugo neobeleženo antitelo koje se ispituje zbog njegove sposobnosti da se takmiči sa prvim antitelom za vezivanje za HER2. Drugo antitelo može biti prisutno u supernatantu hibridoma. Kao kontrola, imobilisani HER2 se inkubira u rastvoru koji sadrži prvo obeleženo antitelo, ali ne i drugo neobeleženo antitelo. Posle inkubacije pod uslovima koji dozvoljavaju vezivanje prvog antitela za HER2, višak nevezanih antitela se uklanja i meri se količina oznake povezane sa imobilizovanim HER2. Ako je količina etikete povezane sa imobilizovanim HER2 značajno smanjena u test uzorku u odnosu na kontrolni uzorak, onda to ukazuje da se drugo antitelo takmiči sa prvim antitelom za vezivanje za HER2. Videti Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
D. Imunokonjugati
[0252] Pronalazak takođe obezbeđuje imunokonjugate koji sadrže bilo koje ovde dato antitelo na HER2 konjugovano sa jednim ili više citotoksičnih sredstava, kao što su hemoterapeutski agensi ili lekovi, sredstva koja inhibiraju rast, toksini (npr., proteini toksini, enzimski aktivni toksini bakterija, gljivica, biljaka ili životinjskog porekla ili njihovi fragmenti) ili radioaktivni izotopi (tj., radiokonjugat).
[0253] Imunokonjugati omogućavaju ciljano isporučivanje dela leka tumoru i, u nekim otelotvorenjima, unutarćelijske akumulacije u njemu, gde sistemsko davanje nekonjugovanih lekova može dovesti do neprihvatljivih nivoa toksičnosti za normalne ćelije (Polakis P. (2005) Current Opinion in Pharmacology 5:382-387).
[0254] Konjugati antitela-lek (ADC), su ciljani hemoterapeutski molekuli koji kombinuju svojstva i antitela i citotoksičnih lekova ciljajući moćne citotoksične lekove na tumorske ćelije koje ispoljavaju antigen (Teicher, B.A. (2009) Current Cancer Drug Targets 9:982-1004), na taj način poboljšavajući terapeutski indeks maksimiziranjem efikasnosti i minimiziranjem toksičnosti van cilja (Carter, P.J. and Senter P.D. (2008) The Cancer Jour.14(3):154-169; Chari, R.V. (2008) Acc. Chem. Res.41:98-107.
[0255] ADC jedinjenja prema pronalasku uključuju ona koja imaju antikancerogenu aktivnost. U nekim otelotvorenjima, jedinjenja ADC uključuju antitelo konjugovano, tj. kovalentno vezano za ostatak leka. U nekim otelotvorenjima, antitelo je kovalentno vezano za ostatak leka preko veznika. Konjugati antitelo-lek (ADC) prema pronalasku selektivno isporučuju efikasnu dozu leka u tumorsko tkivo, pri čemu se može postići veća selektivnost, tj. niža efikasna doza, istovremeno povećavajući terapeutski indeks („terapijski prozor”).
[0256] Deo leka (D) konjugata antitelo-lek (ADC) može da uključuje bilo koje jedinjenje, deo ili grupu koji imaju citotoksični ili citostatički efekat. Delovi lekova mogu da daju svoje citotoksične i citostatičke efekte mehanizmima koji uključuju, ali se ne ograničavaju na vezivanje tubulina, vezivanje DNK ili interkalaciju i inhibiciju RNK polimeraze, sinteze proteina i/ili topoizomeraze. Primeri droga uključuju, ali nisu ograničeni na, majtansinoid, dolastatin, auristatin, kaliheamicin, pirolobenzodiazepin (PBD), nemorubicin i njegovi derivati, PNU-159682, antraciklin, duokarmicin, vinka alkaloid, taksan-kamen-teno, kampanin i njihovi stereoizomeri, izostere, analozi i derivati koji imaju citotoksičnu aktivnost. Neograničavajući primeri takvih imunokonjugata su detaljnije razmotreni u nastavku.
1. Primerni konjugati antitelo-lek
[0257] Primer izvođenja jedinjenja konjugata antitelo-lek (ADC) sadrži antitelo (Ab) koje cilja tumorsku ćeliju, deo leka (D) i veznički deo (L) koji vezuje Ab za D. U nekim otelotvorenjima, antitelo je vezano za vezujući deo (L) kroz jedan ili više aminokiselinskih ostataka, kao što su lizin i/ili cistein.
[0258] Primeran ADC ima Formulu I:
gde je p 1 do oko 20. U nekim otelotvorenjima, broj delova leka koji mogu biti konjugovani sa antitelom ograničen je brojem slobodnih ostataka cisteina. U nekim otelotvorenjima, ostaci slobodnog cisteina se uvode u aminokiselinsku sekvencu antitela ovde opisanim postupcima Primeri ADC formule I uključuju, ali nisu ograničeni na, antitela koja imaju 1, 2, 3 ili 4 projektovane cisteinske aminokiseline (Lyon, R. i dr. (2012) Methods in Enzym. 502:123-138). U nekim otelotvorenjima, jedan ili više slobodnih ostataka cisteina već su prisutni u antitelu, bez upotrebe tehnike, u tom slučaju se postojeći slobodni ostaci cisteina mogu koristiti za konjugaciju antitela sa lekom. U nekim otelotvorenjima, antitelo je izloženo redukcionim uslovima pre konjugacije antitela kako bi generisalo jedan ili više slobodnih ostataka cisteina.
a) Primerni veznici
[0259] ”Veznik” (L) je bifunkcionalni ili multifunkcionalni deo koji se može koristiti za povezivanje jednog ili više dela leka (D) sa antitelom (Ab) da bi se formirao konjugat antitelo-lek (ADC) formule I. U nekim realizacijama , konjugati antitelo-lek (ADC) mogu se pripremiti upotrebom Veznika koji ima reaktivne funkcije za kovalentno vezivanje za lek i antitelo. Na primer, u nekim otelotvorenjima, cistein tiol antitela (Ab) može da formira vezu sa reaktivnom funkcionalnom grupom veznika ili međujedinjenja veznika leka da bi se stvorio ADC.
[0260] U jednom aspektu, veznik ima funkcionalnost koja je sposobna da reaguje sa slobodnim cisteinom koji je prisutan na antitelu da bi se stvorila kovalentna veza. Neograničavajući primeri takvih reaktivnih funkcija uključuju maleimid, haloacetamide, α-haloacetil, aktivirane estre kao što su sukcinimidni estri, 4-nitrofenil estri, pentafluorofenil estri, tetrafluorofenil estri, anhidridi, kiseli hloridi, sulfonil hloridi, izocijanati i izotiocijanati. Videti npr., postupak konjugacije na 766. strani Klussman, i dr. (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773, i ovdašnje Primere.
[0261] U nekim otelotvorenjima, veznik ima funkcionalnost koja je sposobna da reaguje sa elektrofilnom grupom prisutnom na antitelu. Primeri takvih elektrofilnih grupa uključuju, ali nisu ograničeni na, aldehidne i ketonske karbonilne grupe. U nekim otelotvorenjima, heteroatom reaktivne funkcionalnosti veznika može da reaguje sa elektrofilnom grupom na antitelu i da formira kovalentnu vezu sa jedinicom antitela. Primeri koji ne ograničavaju takve reaktivne funkcionalnosti uključuju, ali nisu ograničeni na, hidrazid, oksim, amino, hidrazin, tiosemikarbazon, hidrazin karboksilat i arilhidrazid.
[0262] Veznik može sadržati jednu ili više komponenata veznika. Primeri komponenata veznika uključuju 6-maleimidokaproil (“MC”), maleimidopropanoil (“MP”), valin-citrulin (“val-cit” ili “vc”), alanin-fenilalanin (“ala-fe”), p-aminobenziloksikarbonil (“PAB”), N-Sukcinimidil 4-(2-piridiltio) pentanoat (“SPP”) i 4- (N-maleimidometil) cikloheksan-1 karboksilat (“MCC”). U struci su poznate različite komponente veznika, od kojih su neke opisane ispod.
[0263] Veznik može biti „deljivi veznik”, koji olakšava oslobađanje leka. Neograničavajući primerci deljivih veznika uključuju labilne kiseline (npr., sadrže hidrazon), proteaze osetljive (npr., osetljive na peptidazu) veznike, fotolabilne veze ili veznike koji sadrže disulfid (Chari i dr., Cancer Research 52:127-131 (1992); US 5,208,020).
[0264] U određenim otelotvorenjima, veznik ima sledeću Formulu II:
-Aa-Ww-Yy- II
gde je A “jedinica nosača”, a a je ceo broj od 0 do 1; W je „aminokiselinska jedinica”, a w je ceo broj od 0 do 12; Y je “razdelnička jedinica”, a y je 0, 1 ili 2; i Ab, D i p su definisani kao gore za Formulu I. Primerna otelotvorenja takvih veznika opisana su u patentu SAD br.7,498,298.
[0265] U nekim otelotvorenjima, veznička komponenta sadrži “jedinica nosača” koja povezuje antitelo sa drugom komponentom veznika ili delom leka. Neograničene uzorke nosila prikazane su ispod (pri čemu talasasta linija označava mesta kovalentnog vezivanja za antitelo, lek ili dodatne komponente veznika):
[0266] U nekim otelotvorenjima, komponenta veznika sadrži “aminokiselinsku jedinicu”. U nekim takvim otelotvorenjima, jedinica aminokiselina omogućava deljenje veznika proteazom, omogućavajući oslobađanje leka iz imunokonjugata nakon izlaganja međućelijskim proteazama, kao što su lizosomalni enzimi (Doronina i dr. (2003) Nat. Biotechnol.21:778-784). Primeri aminokiselinskih jedinica uključuju, ali nisu ograničeni na, dipeptide, tripeptide, tetrapeptide i pentapeptide. Primeri dipeptida uključuju, ali nisu ograničeni na, valincitrulin (vc ili val-cit), alanin-fenilalanin (af ili ala-phe); fenilalaninlizin (fk ili phe-lyz); fenilalanin-homolizin (phe-homoliz); i N-metil-valin-citrulin (Me-val-cit). Primeri tripeptida uključuju, ali nisu ograničeni na, glicinvalin-citrulin (gly-val-cit) i glicin-glicin-glicin (gly-gly-gly). Aminokiselinska jedinica može sadržati aminokiselinske ostatke koji se javljaju prirodno i/ili sporedne aminokiseline i/ili analoge aminokiselina koji se ne pojavljuju u prirodi, kao što je citrulin. Jedinice aminokiselina mogu biti dizajnirane i optimizovane za enzimsko deljenje određenim enzimom, na primer, proteazom povezana proteaza, katepsin B, C i D ili plazminska proteaza.
[0267] U nekim otelotvorenjima, veznik komponenta sadrži jedinicu “razdelnika” koja povezuje antitelo sa delom leka, bilo direktno ili kroz nosila i/ili aminokiselinsku jedinicu. Razdelnička jedinica može biti „samoimolativna” ili „ne-samo-imolativna”. “Ne-samo-imolativna” razdelnička jedinica je ona u kojoj deo ili cela razdelnička jedinica ostaje vezana za deo leka nakon deljenja ADC. Primeri ne-samo-imolativnih razdelničkih jedinica uključuju, ali nisu ograničeni na, glicinski razdelnik i glicin-glicinski razdelnik. U nekim otelotvorenjima, enzimatsko cepanje ADC koji sadrži glicin-glicin razdelničku jedinicu pomoću proteaze povezane sa ćelijama tumora rezultira oslobađanjem ostatka glicin-glicin-leka iz ostatka ADC. U nekim takvim otelotvorenjima, ostatak glicin-glicin-lek je podvrgnut koraku hidrolize u ćeliji tumora, čime se odvaja glicinglicin razdelnička jedinica od dela leka.
4
[0268] „Samo-žrtvujuća” razdelnička jedinica omogućava oslobađanje dela droge. U određenim otelotvorenjima, razdelnička jedinica veznika sadrži p-aminobenzil jedinicu. U nekim takvim otelotvorenjima, p-aminobenzil alkohol je vezan za aminokiselinsku jedinicu preko amidne veze, a između benzilnog alkohola i leka nastaje karbamat, metilkarbamat ili karbonat (Hamann i dr. (2005) Expert Opin. Ther. Patents (2005) 15:1087-1103). U nekim otelotvorenjima, razdelnička jedinica je p-aminobenziloksikarbonil (PAB). U nekim otelotvorenjima, ADC sadrži samo-imolativni veznik koji ima strukturu:
gde je Q -C1-C8alkil, -O-(C1-C8alkil), -halogen, -nitro, ili -cino; m je ceo broj od 0 do 4; i p je u opsegu od 1 do oko 20. U nekim otelotvorenjima, p je u opsegu od 1 do 10, 1 do 7, 1 do 5 ili 1 do 4.
[0269] Ostali primeri samo-imolativnih razdelnika uključuju, ali nisu ograničeni na, aromatična jedinjenja koja su elektronski slična PAB grupi, kao što su derivati 2-aminoimidazol-5-metanola (patent SAD br.7,375,078; Hay i dr. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett.9:2237) i orto- ili para-aminobenzilacetali. U nekim otelotvorenjima mogu se koristiti razdelnici koji podvrgavaju ciklizaciju nakon hidrolize amidne veze, kao što su supstituisani i nesupstituisani amidi 4-aminobuterne kiseline (Rodrigues i dr. (1995) Chemistry Biology 2:223), odgovarajuće supstituisan biciklo[2.2.1] i biciklo[2.2.2] sistemi prstenova (Storm i dr. (1972) J. Amer. Chem. Soc. 94:5815) amidi 2-aminofenilpropionske kiseline (Amsberry, i dr. (1990) J. Org. Chem. 55:5867). Vezivanje leka sa a-ugljenikom ostatka glicina je još jedan primer samo-požara razdelnika koji može biti koristan u (Kingsbury i dr. (1984) J. Med. Chem.27:1447).
[0270] U nekim otelotvorenjima, veznik L može biti veznik dendritičnog tipa za kovalentno vezivanje više od jednog dela leka za antitelo kroz razgranati, multifunkcionalni veznički deo (Sun i dr. (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun i dr. (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768). Dendritični veznici mogu povećati molarni odnos leka prema antitelu, tj. punjenje, što je povezano sa potencijom ADC. Prema tome, tamo gde antitelo nosi samo jednu reaktivnu cistein-tiolnu grupu, mnoštvo delova leka može biti vezano kroz dendritični veznik.
[0271] Neograničavajući primerni veznici su prikazani dole u kontekstu ADC Formule I:
[0272] Daljnji neograničavajući uzorni ADC uključuju strukture:
gde je X:
Y je:
svako R je nezavisno H ili C1-C6alkil; i n je 1 ili 12.
[0273] Obično, veznici peptidnog tipa se mogu pripremiti formiranjem peptidne veze između dve ili više aminokiselina i/ili fragmenata peptida. Takve peptidne veze mogu se pripremiti, na primer, postupkom sinteze u tečnoj fazi (npr., E. Schröder and K. Lübke (1965) “The Peptides”, volume 1, str.76-136, Academic Press).
[0274] U nekim otelotvorenjima, veznik je supstituisan sa grupama koje moduliraju rastvorljivost i/ili reaktivnost. Kao neograničavajući primer, naelektrisani supstituent kao što je sulfonat (-SO3-) ili amonijum može povećati rastvorljivost vezivnog reagensa u vodi i olakšati reakciju sprezanja vezivnog reagensa sa antitelom i/ili delom leka ili olakšati reakciju spajanja Ab-L (međujedinjenje antitelo-veznik) sa D, ili D-L (međujedinjenje link-veznik) sa Ab, u zavisnosti od sintetičkog puta koji se koristi za pripremu ADC. U nekim otelotvorenjima, deo veznika je povezan sa antitelom, a deo veznika je povezan sa lekom, a zatim je Ab-(deo veznika)<a>povezan sa lekom-(deo veznika)<b>da bi se formirao ADC formule I. U nekim takvim otelotvorenjima antitelo sadrži više od jednog (deo veznika)<a>supstituenata, tako da je više antitela povezano sa antitelom u ADC formule I.
[0275] Jedinjenja pronalaska izričito razmatraju, ali nisu ograničena na, ADC pripremljen sa sledećim reagensima za povezivanje: bis-maleimido-trioksietilen glikol (BMPEO), N-(β-maleimidopropiloksi)-N-hidroksi sukcinimid estar (BMPS), N-(ε-maleimidokaproiloksi) sukcinimid estar (EMCS), N-[γmaleimidobutiriloksi]sukcinimid estar (GMBS), 1,6-heksan-bis-vinilsulfon (HBVS), sukcinimidil 4-(N-maleimidometil)cikloheksan-1-karboksi-(6-amidokaproat) (LC-SMCC), m-maleimidobenzoil-N-hidroksisukcinimid estar (MBS), 4-(4-N-Maleimidofenil)butirična kiselina hidrazid (MPBH), sukcinimidil 3-(bromoacetamido)propionat (SBAP), sukcinimidil jodoacetat (SIA), sukcinimidil (4-jodoacetil)aminobenzoat (SIAB), N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio) propionat (SPDP), N-sukcinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoat (SPP), sukcinimidil 4-(N-maleimidometil)cikloheksan-1-karboksilat (SMCC), sukcinimidil 4-(pmaleimidofenil)butirat (SMPB), sukcinimidil 6-[(beta-maleimidopropionamido)heksanoat] (SMPH), iminotiolan (IT), sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, i sulfo-SMPB, i sukcinimidil-(4-vinilsulfon)benzoat (SVSB), i uključujući bis-maleimid reagense: ditiobismaleimidoetan (DTME), 1,4-bismaleimidobutan (BMB), 1,4 bismaleimidil-2,3-dihidroksibutan (BMDB), bismaleimidoheksan (BMH), bismaleimidoetan (BMOE), BM(PEG)2(prikazano ispod) i BM(PEG)3(prikazano ispod); bifunkcionalni derivati imidoestera (kao što je dimetil adipimidat HCl), aktivni estri (poput disukcinimidil suberata), aldehidi (poput glutaraldehida), bis-azido jedinjenja (kao što su bis-(p-azidobenzoil) heksandiamin), derivati bis-diazonijuma (poput kao bis-(p-diazonijumbenzoil)-etilendiamin), diizocijanati (kao što je toluen 2,6-diizocijanat) i bis-aktivna fluorova jedinjenja (poput 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzena). U nekim otelotvorenjima, bis-maleimidni reagensi omogućavaju vezivanje tiolne grupe cisteina u antitelu na deo leka koji sadrži tiol, veznik ili međujedinjenje veznik-lek. Ostale funkcionalne grupe koje su reaktivne sa tiol grupama uključuju, ali nisu ograničene na, jodoacetamid, bromoacetamid, vinil piridin, disulfid, piridil disulfid, izocijanat i izotiocijanat.
[0276] Određeni korisni reagensi za povezivanje mogu se dobiti iz različitih komercijalnih izvora, kao što su Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL), Molecular Biosciences Inc. (Boulder, CO), ili sintetizovani u skladu sa postupcima opisanim u tehnici; na primer, u Toki i dr. (2002) J. Org. Chem. 67:1866-1872; Dubowchik, i dr. (1997) Tetrahedron Letters, 38:5257-60; Walker, M.A. (1995) J. Org. Chem. 60:5352-5355; Frisch i dr. (1996) Bioconjugate Chem. 7:180-186; US 6,214,345; WO 02/088172; US 2,003,130,189; US2003096743; WO 03/026577; WO 03/043583; i WO 04/032828.
[0277] 1-izotiocijanatobenzil-3-metildietilen triaminpentaocetna kiselina obeležena ugljenikom-14 (MX-DTPA) je primerno sredstvo za heliranje za konjugaciju radionukleotida sa antitelom. Videti npr., WO94/11026.
b) Primerni delovi leka
(1) Majtansin i majtansinoidi
[0278] U nekim otelotvorenjima, imunokonjugat sadrži antitelo konjugovano sa jednim ili više molekula majtansinoida. Majtansinoidi su derivati majtansina i mitototski inhibitori koji deluju inhibirajući polimerizaciju tubulina. Majtansin je prvo izolovan iz istočnoafričkog grmlja Maytenus serrata (patent SAD br. 3896111). Posle toga je otkriveno da određeni mikrobi takođe proizvode majtanzinoide, kao što su majtanzinol i C-3 estri majtansinola (patent SAD br.4,151,042). S Sintetički majtansinoidi su obelodanjeni, na primer, u patentima SAD br.4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; i 4,371,533.
[0279] Delovi majtanzinoidnih lekova su atraktivni delovi lekova u konjugatima antitelo-lek, jer su: (i) relativno pristupačan za pripremu fermentacijom ili hemijskom modifikacijom ili derivatizacijom proizvoda fermentacije, (ii) podložan derivatizaciji funkcionalnim grupama pogodnim za konjugaciju putem nedisulfidnih veza do antitela, (iii) stabilan u plazmi i (iv) efikasan protiv različitih ćelijskih linija tumora.
[0280] Određeni majtanzinoidi pogodni za upotrebu kao delovi majtanzinoidnih lekova poznati su u struci i mogu se izolovati iz prirodnih izvora prema poznatim postupcima ili proizvesti tehnikama genetskog inženjeringa (videti, npr., Yu i dr. (2002) PNAS 99:7968-7973). Majtansinoidi se takođe mogu pripremiti
4
sintetički prema poznatim postupcima.
[0281] Primeri majtanzinoidnih delova lekova uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji imaju modifikovani aromatični prsten, kao što su: C-19-dehloro (Pat. SAD br. 4256746) (pripremljen, na primer, redukcijom ansamitocina P2 u litijum-aluminijum-hidridu; C-20-hidroksi (ili C-20-demetil) /-C-19-dehloro (Pat. SAD br.4361650 i 4307016) (pripremljeni, na primer, demetilacijom korišćenjem Streptomyces ili Actinomyces ili deflorisanjem upotrebom LAH); i C-20-demetoksi, C-20-aciloksi (-OCOR), /-dehloro (Pat. SAD br.
4,294,757) (pripremljeni, na primer, acilacijom pomoću acil hlorida), i oni koji imaju modifikacije na drugim položajima aromatičnog prstena.
[0282] Primeri majtanzinoidnih lekova takođe uključuju one koji imaju modifikacije kao što su: C-9-SH (Pat. SAD br. 4424219) (pripremljen, na primer, reakcijom majtanzinola sa H2S ili P2S5); C-14-alkoksimetil(demetoksi/CH2OR)(US 4331598); C-14-hidroksimetil ili aciloksimetil (CH2OH ili CH2OAc) (Pat. SAD br. 4450254) (pripremljen, na primer iz Nocardia); C-15-hidroksi/aciloksi (US 4364866) (pripremljen, na primer, konverzijom majtanzinola Streptomyces); C-15-metoksi (Pat. SAD br. 4313946 i 4315929) (na primer, izolovan od Trevia nudlflora); C-18-N-demetil (Pat. SAD br. 4362663 i 4322348) (pripremljen, na primer, demetilacijom majtanzinola pomoću Streptomyces); i 4,5-deoksi (US 4371533) (pripremljen, na primer, titan trihloridom/LAH redukcijom majtanzinola).
[0283] Mnogi položaji na majtanzinoidnim jedinjenjima korisni su kao položaj povezivanja. Na primer, estarska veza može da se formira reakcijom sa hidroksilnom grupom koristeći konvencionalne tehnike spajanja. U nekim otelotvorenjima, reakcija se može dogoditi na položaju C-3 koja ima hidroksil grupu, položaju C-14 modifikovanom hidroksimetilom, položaju C-15 modifikovanom hidroksil grupom i položaju C-20 koji ima hidroksil grupu. U nekim otelotvorenjima, veza se formira na položaju C-3 majtanzinola ili analoga majtanzinola.
[0284] Majtanzinoidni lekovi uključuju one koji imaju strukturu:
gde talasasta linija ukazuje na kovalentno vezivanje atoma sumpora dela majtanzinoidnog leka za veznik ADC. Svako R može nezavisno biti H ili C1-C6alkil. Alkilenski lanac koji vezuje amidnu grupu za atom sumpora može biti metanil, etanil ili propil, tj. m je 1, 2 ili 3 (US 633410; US 5,208,020; Chari i dr. (1992) Cancer Res.
52:127-131; Liu i dr. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci USA 93:8618-8623).
[0285] Svi stereoizomeri dela majtanzinoidnog leka su predviđeni za ADC pronalaska, tj. bilo koju kombinaciju R i S konfiguracija na hiralnim ugljenicima (US 7276497; US 6,913,748; US 6,441,163; US 633410 (RE39151); US 5,208,020; Widdison i dr. (2006) J. Med. Chem. 49:4392-4408). U nekim otelotvorenjima, deo majtanzinoidnog leka ima sledeću stereohemiju:
[0286] Primeri otelotvorenja dela majtanzinoidnih lekova uključuju, ali nisu ograničeni na, DM1; DM3; i DM4, koji imaju strukture:
pri čemu talasasta linija označava kovalentno vezivanje atoma sumpora leka za veznik (L) konjugata antitelo-
4
lek.
[0287] Drugi primerni konjugati majtanzinoid antitelo-lek imaju sledeće strukture i skraćenice (gde je Ab antitelo, a p je 1 do oko 20. U nekim otelotvorenjima, p je 1 do 10, p je 1 do 7, p je 1 do 5, ili p je 1 do 4):
[0288] Primeri konjugata antitelo-lek, gde je DM1 povezan BMPEO vezom sa tiolnom grupom antitela, imaju strukturu i skraćenicu:
gde je Ab antitelo; n je 0, 1 ili 2; i p je 1 do oko 20. U nekim otelotvorenjima, p je 1 do 10, p je 1 do 7, p je 1 do 5, ili p je 1 do 4).
[0289] Imunokonjugati koji sadrže majtansinoide, postupci za dobijanje istih i njihova terapijska upotreba obelodanjeni su, na primer, u patentima SAD br.5,208,020 i 5,416,064; US 2005/0276812 A1; i Evropskom patentu EP 0425235 B1. Videti takođe Liu i dr. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996); i Chari i dr. Cancer Research 52:127-131 (1992).
[0290] U nekim otelotvorenjima, konjugati antitelo-majtanzinoid mogu se pripremiti hemijskim vezivanjem antitela za molekul majtanzinoida bez značajnog umanjivanja biološke aktivnosti bilo antitela bilo molekula majtansinoida. Videti, npr., patent SAD br. 5,208,020 (). U nekim otelotvorenjima, ADC sa prosečno 3-4
4
molekula majtansinoida konjugovanih po molekulu antitela pokazao je efikasnost u povećanju citotoksičnosti ciljanih ćelija bez negativnog uticaja na funkciju ili rastvorljivost antitela. U nekim slučajevima se očekuje da čak i jedan molekul toksina/antitela pojača citotoksičnost tokom upotrebe golih antitela.
[0291] Primerne grupe za povezivanje za stvaranje antitela-majtanzinoidnih konjugata uključuju, na primer, one ovde opisane i one obelodanjene u patentu SAD br.5208020; EP Patent 0425235 B1; Chari i dr. Cancer Research 52:127-131 (1992); US 2005/0276812 A1; i US 2005/016993 A1.
(2) Auristatini i dolastatini
[0292] Delovi lekova uključuju dolastatine, auristatine i njihove analoge i derivate (US 5635483; US 5,780,588; US 5,767,237; US 6,124,431). Auristatini su derivati jedinjenja morskih mekušaca dolastatin-10. Iako ne nameravaju da ih vezuju neke teorije, pokazalo se da dolastatini i auristatini ometaju dinamiku mikrotubula, hidrolizu GTP i nuklearnu i ćelijsku deobu (Woyke i dr. (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584) i imaju rak (US 5663149) i antifungalna aktivnost (Pettit i dr. (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965). Deo leka dolastatin/auristatin može biti vezan za antitelo preko N (amino) završetka ili C (karboksilnog) završetka peptidnog dela leka (WO 02/088172; Doronina i dr. (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784; Francisco i dr. (2003) Blood 102(4):1458-1465).
[0293] Primeri otelotvorenja auristatina uključuju delove lekova za monometilauristatin DEi DFpovezane sa N-terminusom, obelodanjeni u US 7498298 i US 7659241:
pri čemu talasasta linija DEi DFukazuje na mesto kovalentnog vezivanja za antitelo ili komponentu veznika antitela i nezavisno na svakoj lokaciji:
R<2>je nezavisno izabran od H i C1-C8alkila;
R<3>je izabran iz H, C1-C8alkila, C3-C8karbocikla, arila, C1-C8alkil-arila, C1-C8alkil-(C3-C8karbocikla), C3-C8heterocikla i C1-C8alkil-(C3-C8heterocikla);
R<4>je izabran iz H, C1-C8alkila, C3-C8karbocikla, arila, C1-C8alkil-arila, C1-C8alkil-(C3-C8karbocikla), C3-C8heterocikla i C1-C8alkil-(C3-C8heterocikla);
R<5>je izabran od H i metila;
ili R<4>i R<5>zajedno formiraju karbociklični prsten i imaju formulu -(CR<a>R<b>)n- gde su R<a>i R<b>nezavisno izabrani iz H, C1-C8alkila i C3-C8karbocikla i n je izabran iz 2, 3, 4, 5 i 6;
R<6>je nezavisno izabran od H i C1-C8alkila;
R<7>je izabran iz H, C1-C8alkila, C3-C8karbocikla, arila, C1-C8alkil-arila, C1-C8alkil-(C3-C8karbocikla), C3-C8heterocikla i C1-C8alkil-(C3-C8heterocikla);
samo R<8>je nezavisno izabrano iz H, OH, C1-C8alkila, C3-C8karbocikla i O-(C1-C8alkila);
R<9>je nezavisno izabran od H i C1-C8alkila;
R<10>je izabran iz arila ili C3-C8heterocikla;
Z je O, S, NH, ili NR<12>, gde je R<12>C1-C8alkil;
R<11>je izabran H, C1-C20alkila, arila, C3-C8heterocikla, -(R<13>O)m-R<14>, ili -(R<13>O)m-CH(R<15>)2;
m je ceo broj u opsegu od 1-1000;
4
R<13>je C2-C8alkil;
R<14>je H ili C1-C8alkil;
svako pojavljivanje R<15>je nezavisno H, COOH, -(CH2)n-N(R<16>)2, -(CH2)n-SO3H, ili -(CH2)n-SO3-C1-C8alkil;
svako pojavljivanje R<16>je nezavisno H, C1-C8alkil, ili -(CH2)n-COOH;
R<18>je izabran iz -C(R<8>)2-C(R<8>)2-aril, -C(R<8>)2-C(R<8>)2-(C3-C8heterocikl), i -C(R<8>)2-C(R<8>)2-(C3-C8karbocikl); i
n je ceo broj u opsegu od 0-6.
[0294] U jednom otelotvorenju, R<3>, R<4>i R<7>su nezavisno izopropil ili sek-butil i R<5>je -H ili metil. U primernom otelotvorenju, R<3>i R<4>su svaki izopropil, R<5>je -H, i R<7>je sek-butil.
[0295] U još jednom otelotvorenju, R<2>i R<6>su svaki metil, i R<9>je -H.
[0296] U drugom otelotvorenju, svako pojavljivanje R<8>je -OCH3.
[0297] U primernom otelotvorenju, R<3>i R<4>su svaki izopropil, R<2>i R<6>su svaki metil, R<5>je -H, R<7>je sek-butil, svako pojavljivanje R<8>je -OCH3, i R<9>je -H.
[0298] U jednom otelotvorenju, Z je -O- ili -NH-.
[0299] U jednom otelotvorenju, R<10>je aril.
[0300] U primernom otelotvorenju, R<10>je -fenil.
[0301] U primernom otelotvorenju, kada je Z -O-, R<11>je -H, metil ili t-butil.
[0302] U jednom otelotvorenju, kada je Z -NH, R<11>je -CH(R<15>)2, gde je R<15>-(CH2)n-N(R<16>)2, i R<16>je -C1-C8alkil ili -(CH2)n-COOH.
[0303] U drugom otelotvorenju, kada je Z -NH, R<11>je -CH(R<15>)2, gde je R<15>-(CH2)n-SO3H.
[0304] Primer izvođenja auristatina formule DEje MMAE, pri čemu talasasta linija označava kovalentno vezivanje za veznik (L) konjugata antitelo-lek:
[0305] Primer izvođenja auristatina formule DFje MMAF, pri čemu talasasta linija označava kovalentno vezivanje za veznik (L) konjugata antitelo-lek:
[0306] Ostala primerna otelotvorenja uključuju jedinjenja monometilvalina koja imaju modifikacije fenilalanin karboksi na C-završetku dela leka pentapeptidnog auristatina (WO 2007/008848) i jedinjenja monometilvalina koja imaju modifikacije bočnog lanca fenilalanina na C-završetku ostatka leka pentapeptidnog auristatina (WO 2007/008603).
[0307] Neograničavajuća primerna otelotvorenja ADC formule I koje sadrže MMAE ili MMAF i razne komponente veznika imaju sledeće strukture i skraćenice (gde je “Ab” antitelo; p je 1 do oko 8, “Val-Cit” je valin-citrulin dipeptid; a “S” je atom sumpora:
4
[0308] Neograničavajući primeri otelotvorenja ADC-a formule I koji sadrže MMAF i razne komponente veznika dalje uključuju Ab-MC-PAB-MMAF i Ab-PAB-MMAF. Pokazalo se da imunokonjugati koji sadrže MMAF vezan za antitelo veznikom koji nije proteolitički deljiv poseduju aktivnost uporedivu sa imunokonjugatima koji sadrže MMAF vezan za antitelo proteolitički deljivim veznikom (Doronina i dr. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124). U nekim takvim otelotvorenjima se veruje da se oslobađanje leka vrši degradacijom antitela u ćeliji.
[0309] Obično, delovi lekova zasnovani na peptidu mogu se pripremiti formiranjem peptidne veze između dve ili više aminokiselina i/ili fragmenata peptida. Takve peptidne veze mogu se pripremiti, na primer, postupkom sinteze u tečnoj fazi (videti, npr., E. Schröder and K. Lübke, “The Peptides”, volume 1, str. 76-136, 1965, Academic Press). Delovi lekova Auristatin/dolastatin mogu se, u nekim otelotvorenjima, pripremiti prema postupcima: US 7,498,298; US 5,635,483; US 5,780,588; Pettit i dr. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465; Pettit i dr. (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G.R., i dr. Synthesis, 1996, 719-725; Pettit i dr. (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans.15:859-863; i Doronina (2003) Nat. Biotechnol.21(7):778-784.
[0310] U nekim otelotvorenjima, lekovi auristatin/dolastatin formule DEpoput MMAE i DF, kao što je MMAF, i međujedinjenja lek-veznik i njihovi derivati, kao što su MC-MMAF, MC-MMAE, MC-vc-PAB-MMAF, i MC-vc-PAB-MMAE, mogu se pripremiti korišćenjem postupaka opisanih u US 7498298; Doronina i dr. (2006) Bioconjugate Chem.17:114-124; i Doronina i dr. (2003) Nat. Biotech.21:778-784 a zatim konjugovano sa antitelom od interesa.
(3) Kaliheamicin
[0311] U nekim otelotvorenjima, imunokonjugat sadrži antitelo konjugovano sa jednim ili više molekula kaliheamicina. Porodica antibiotika kaliheamicin i njihovi analozi sposobni su da proizvode dvolančane DNK prekide pri sub-pikomolarnim koncentracijama (Hinman i dr., (1993) Cancer Research 53:3336-3342; Lode i dr., (1998) Cancer Research 58:2925-2928). Kaliheamicin ima unutarćelijska mesta delovanja, ali u određenim slučajevima ne prelazi lako kroz plazemsku membranu. Prema tome, ćelijski unos ovih sredstava putem internalizacije posredovane antitelima može, u nekim otelotvorenjima, u velikoj meri pojačati njihov citotoksični efekat. Neograničavajući primeri postupaka pripreme konjugata antitelo-lek sa delom leka kaliheamicin opisani su, na primer, u US 5712374; US 5,714,586; US 5,739,116; i US 5767285.
[0312] U nekim otelotvorenjima, ostatak leka kaliheamicin konjugovan sa antitelom je jedinjenje formule:
4
gde je X Br ili I;
L je veznik; R je vodonik, C1-6alkil ili -C(=O) C1-6alkil; i R<a>je vodonik ili C1-6alkil.
[0313] U nekim otelotvorenjima, X je Br, R<a>je vodonik i R je izopropil.
[0314] U drugim otelotvorenjima, X je Br, R<a>je vodonik i R je etil.
[0315] U drugim otelotvorenjima, X je I, R<a>je vodonik i R je izopropil.
[0316] U drugim otelotvorenjima, X je I, R<a>je vodonik i R je etil.
[0317] U nekim otelotvorenjima, X je Br, R<a>je vodonik i R je -C(=O)CH3.
[0318] U drugim otelotvorenjima, X je I, R<a>je vodonik i R je -C(=O)CH3.
[0319] U drugim otelotvorenjima, X je I, R<a>je etil i R je -C(=O)CH3.
[0320] U drugim otelotvorenjima, X je Br, R<a>je etil i R je -C(=O)CH3.
(4) Pirolobenzodiazepini
[0321] U nekim otelotvorenjima, ADC sadrži pirolobenzodiazepin (PBD). U nekim otelotvorenjima, PBD dimeri prepoznaju i vezuju se za specifične sekvence DNK. Prirodni proizvod antramicin, PBD, prvi put je prijavljen 1965 (Leimgruber, i dr., (1965) J. Am. Chem. Soc., 87:5793-5795; Leimgruber, i dr., (1965) J. Am. Chem. Soc., 87:5791-5793). Od tada je zabeleženo nekoliko PBD-ova, kako prirodnih, tako i analognih (Thurston, i dr., (1994) Chem. Rev.1994, 433-465 uključujući dimere triciklične PBD skele (US 6884799; US 7,049,311; US 7,067,511; US 7,265,105; US 7,511,032; US 7,528,126; US 7,557,099). Bez namere da bude vezan nekom određenom teorijom, veruje se da struktura dimera daje odgovarajući trodimenzionalni oblik za izoheličnost sa malim žlebom DNK oblika B, što dovodi do čvrstog prianjanja na mestu vezivanja (Kohn, In Antibiotics III. Springer-Verlag, New York, str.3-11 (1975); Hurley and Needham-VanDevanter, (1986) Acc. Chem. Res., 19:230-237). Pokazalo se da su dimerna PBD jedinjenja koja sadrže C2 aril supstituenti korisni kao citotoksična sredstva (Hartley i dr. (2010) Cancer Res.70(17):6849-6858; Antonow (2010) J. Med. Chem.
53(7):2927-2941; Howard i dr. (2009) Bioorganic and Med. Chem. Letters 19(22):6463-6466).
[0322] U nekim otelotvorenjima, PBD jedinjenja se mogu koristiti kao prolekovi tako što će ih zaštititi na položaju N10 zaštitnom grupom azota koja je uklonjiva in vivo (WO 00/12507; WO 2005/023814).
[0323] PBD dimeri su konjugovani sa antitelima i pokazalo se da rezultujući ADC ima svojstva protiv raka (US 2010/0203007). Neograničavajuća primerna mesta povezivanja na PBD dimeru uključuju petočlani pirolo prsten, vez između PBD jedinica i iminsku grupu N10-C11 (WO 2009/016516; US 2009/304710; US 2010/047257; US 2009/036431; US 2011/0256157; WO 2011/130598).
[0324] Neograničavajući uzorci komponenata PBD dimera ADC su Formule A:
i njihove soli i solvati, pri čemu:
talasasta linija označava mesto kovalentnog vezivanja za veznik;
isprekidane linije označavaju opciono prisustvo dvostruke veze između C1 i C2 ili C2 i C3; R<2>je nezavisno odabran iz H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, =CH-R<D>, =C(R<D>)2, O-SO2-R, CO2R i COR, i opciono dalje odabrani između halo ili dihalo, gde je R<D>nezavisno odabran iz R, CO2R, COR, CHO, CO2H, i halo;
R<6>i R<9>nezavisno odabrani iz H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn i halo;
R<7>je nezavisno odabran iz H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn i halo;
Q je nezavisno odabran iz O, S i NH;
R<11>je ili H, ili R ili, gde je Q O, SO3M, gde je M katjon metala;
R i R' su svaki nezavisno izabrani između opciono supstituisanih C1-8alkil, C1-12alkil, C3-8heterociklil, C3-20heterocikla i C5-20aril grupa, i opciono u odnosu na grupu NRR', R i R' zajedno sa atomom azota za koji su vezani formiraju opciono supstituisani 4-, 5-, 6- ili 7-člani heterociklični prsten;
R<12>, R<16>, R<19>i R<17>su definisani za R<2>, R<6>, R<9>i R<7>respektivno;
R” je C3-12alkilenska grupa, koji lanac može biti prekinut jednim ili više heteroatoma, npr., O, S, N(H), NMe i/ili aromatični prstenovi, npr. benzen ili piridin, koji su prstenovi opciono supstituisani; i X i X' su nezavisno odabrani iz O, S i N(H).
[0325] U nekim otelotvorenjima, R i R' su svaki nezavisno izabrani između opciono supstituisanih C1-12alkil, C3-20heterocikla i C5-20aril grupa, i opciono u odnosu na grupu NRR', R i R' zajedno sa azotom atom za koji su vezani formiraju opciono supstituisani 4-, 5-, 6- ili 7-člani heterociklični prsten.
[0326] U nekim otelotvorenjima, R<9>i R<19>su H.
[0327] U nekim otelotvorenjima, R<6>i R<16>su H.
[0328] U nekim otelotvorenjima, oba, R<7>i R<17>su OR<7A>, gde je R<7A>opciono supstituisan C1-4alkilom. U nekim otelotvorenjima, R<7A>je Me. U nekim otelotvorenjima, R<7A>je Ch2Ph, gde je Ph fenil grupa.
[0329] U nekim otelotvorenjima, X je O.
[0330] U nekim otelotvorenjima, R<11>je H.
[0331] U nekim otelotvorenjima postoji dvostruka veza između C2 i C3 u svakoj monomernoj jedinici.
[0332] U nekim otelotvorenjima, R<2>i R<12>su nezavisno izabrani između H i R. U nekim otelotvorenjima, R<2>i R<12>su nezavisno R. U nekim otelotvorenjima, R<2>i R<12>su nezavisno opciono supstituisani C5-20aril ili C5-7aril ili C8-10aril. U nekim otelotvorenjima, R<2>i R<12>su nezavisno opciono supstituisani fenil, tienil, naftil, piridil, kinolinil ili izokinolinil. U nekim otelotvorenjima, R<2>i R<12>su nezavisno izabrani između =O, =CH2, =CH-R<D>, i =C(R<D>)2. U nekim otelotvorenjima, R<2>i R<12>su svaki =CH2. U nekim otelotvorenjima, R<2>i R<12>su svaki H. U nekim otelotvorenjima, R<2>i R<12>su =O. U nekim otelotvorenjima, R<2>i R<12>su svaki = CF2. U nekim otelotvorenjima, R<2>i/ili R<12>su nezavisno =C(R<D>)2. U nekim otelotvorenjima, R<2>i/ili R<12>su nezavisno =CH-R<D>.
[0333] U nekim otelotvorenjima, kada je R<2>i/ili R<12>=CH-R<D>, svaka grupa može nezavisno imati bilo koju konfiguraciju prikazanu ispod:
U nekim otelotvorenjima, a =CH-R<D>je u konfiguraciji (I).
[0334] U nekim otelotvorenjima, R” je C3alkilenska grupa ili C5alkilenska grupa.
[0335] U nekim otelotvorenjima, primer PBD dimera komponente ADC ima strukturu formule A (I):
1
gde je n 0 ili 1.
[0336] U nekim otelotvorenjima, primer PBD dimera komponente ADC ima strukturu formule A (II):
gde je n 0 ili 1.
[0337] U nekim otelotvorenjima, primer PBD dimera komponente ADC ima strukturu formule A (III):
pri čemu su R<E>i R<E”>svaki nezavisno izabrani od H ili R<D>, pri čemu je R<D>definisan kao iznad; i gde je n 0 ili 1.
[0338] U određenim otelotvorenjima, n je 0. U određenim otelotvorenjima, n je 1. U nekim otelotvorenjima, R<E>i/ili R<E>je H. U nekim otelotvorenjima, R<E>i R<E>” su H. U nekim otelotvorenjima, R<E>i/ili R<E>” je R<D>, gde je R<D>opciono supstituisani C1-12alkil. U nekim otelotvorenjima, R<E>i/ili R<E”>je R<D>, gde je R<D>metil.
[0339] U nekim otelotvorenjima, primer PBD dimera komponente ADC ima strukturu formule A (IV):
pri čemu
ili različiti; i
gde je n 0 ili 1.
[0340] U nekim otelotvorenjima, primer PBD dimera komponente ADC ima strukturu formule A (V):
pri čemu
ili različiti; i
gde je n 0 ili 1.
[0341] U nekim otelotvorenjima, Ar<1>i Ar<2>su svaki nezavisno izabrani između opciono supstituisanog fenila, furanila, tiofenila i piridila. U nekim otelotvorenjima, Ar<1>i Ar<2>su svaki nezavisno opciono supstituisani fenil. U nekim otelotvorenjima, Ar<1>i Ar<2>su svaki nezavisno opciono supstituisani tien-2-il ili tien-3-il. U nekim
2
otelotvorenjima, Ar<1>i Ar<2>su svaki nezavisno opciono supstituisani hinolinil ili izohinolinil. Hinolinil ili izohinolinil grupa mogu biti vezane za PBD jezgro bilo kojim raspoloživim položajem prstena. Na primer, hinolinil može biti hinolin-2-il, hinolin-3-il, hinolin-4il, hinolin-5-il, hinolin-6-il, hinolin-7-il i hinolin-8-il. U nekim otelotvorenjima, hinolinil se bira između hinolin-3-il i hinolin-6-il. Izohinolinil može biti izohinolin-1-il, izohinolin-3-il, izohinolin-4il, izohinolin-5-il, izohinolin-6-il, izohinolin-7-il i izohinolin-8-il. U nekim otelotvorenjima, izohinolinil se bira između izohinolin-3-il i izohinolin-6-il.
[0342] Dalji neograničeni primerci PBD dimera ADC-a su Formule B:
i njihove soli i solvati, pri čemu:
talasasta linija označava mesto kovalentnog vezivanja za veznik;
talasasta linija povezana na OH označava S ili R konfiguraciju;
R<V1>i R<V2>su nezavisno izabrani između H, metila, etila i fenila (koji fenil može biti opciono supstituisan sa fluorom, posebno u položaju 4) i C5-6heterociklila; pri čemu R<V1>i R<V2>mogu biti isti ili različiti; i n je 0 ili 1.
[0343] U nekim otelotvorenjima, R<V1>i R<V2>su nezavisno izabrani između H, fenila i 4-fluorofenila.
[0344] U nekim otelotvorenjima, veznik može biti vezan na jednom od različitih mesta PBD dimera leka, uključujući N10 imin B prstena, C-2 endo/ekso položaj C prstena ili vezujuću jedinicu koja vezuje A prstenovi (videti dole strukture C (I) i C (II)).
[0345] Neograničavajući uzorci komponenata PBD dimera ADC-a uključuju formule C (I) i C (II):
[0346] Formule C (I) i C (II) su prikazane u obliku imina N10-C11. Primeri lekova sa PBD takođe uključuju karbinolamin i zaštićene oblike karbinolamina, kao što je prikazano u donjoj tabeli:
gde:
X je CH2(n = 1 do 5), N ili O;
Z i Z' se nezavisno biraju između OR i NR2, gde je R primarni, sekundarni ili tercijarni alkilni lanac koji sadrži 1 do 5 atoma ugljenika;
R1, R'1, R2i R'2su svaki nezavisno izabrani između H, C1-C8alkil, C2-C8alkenil, C2-C8alkinil, C5-20aril (uključujući supstituisane arile), C5-20heteroaril grupe, - NH2, -NHMe, -OH i -SH, gde, u nekim otelotvorenjima, alkil, alkenil i alkinil lanci sadrže do 5 atoma ugljenika;
R3i R'3su nezavisno izabrani između H, OR, NHR i NR2, gde je R primarni, sekundarni ili tercijarni alkilni lanac koji sadrži 1 do 5 atoma ugljenika;
R4i R'4su nezavisno izabrani između H, Me i OMe;
R5je odabran između C1-C8alkil, C2-C8alkenil, C2-C8alkinil, C5-20aril (uključujući aril supstituisan sa halo, nitro, cijano, alkoksi, alkil, heterociklil) i C5-20heteroaril grupa, gde, u neke realizacije, alkil, alkenil i alkinil lanci sadrže do 5 atoma ugljenika;
R11je H, C1-C8alkil ili zaštitna grupa (kao što su acetil, trifluoroacetil, t-butoksikarbonil (BOC), benziloksikarbonil (CBZ), 9-fluorenilmetilenoksikarbonil (Fmoc) ili deo koji sadrži samo-imolativnu jedinicu kao što je valin-citrulin-PAB);
R12je H, C1-C8alkil ili zaštitna grupa;
pri čemu je vodonik jednog od R1, R'1, R2, R'2, R5, or R12ili vodonik - OCH2CH2(X)nCH2CH2O- između A prstenova supstituisan vezom povezanom sa veznikom ADC.
[0347] Primeri dimernih delova ADC-a PBD uključuju, ali nisu ograničeni na (talasasta linija označava mesto kovalentnog vezivanja za veznik):
[0348] Neograničavajući primeri otelotvorenja ADC-a koji sadrže PBD dimere imaju sledeće strukture:
n je 0 do 12. U nekim otelotvorenjima, n je 2 do 10. U nekim otelotvorenjima, n je 4 do 8. U nekim
4
otelotvorenjima, n se bira između 4, 5, 6, 7 i 8.
[0349] Sledeći neograničavajući primer ADC koji sadrži PBD dimer može se napraviti konjugacijom PBD vezanog za monometil disulfid (prikazano u nastavku) sa antitelom:
za proizvodnju konjugata PBD antitelo-lek monometil disulfid N10:
Videti npr., PCT objava br. WO 2013/055987.
[0350] Veznici PBD dimera-val-cit-PAB-Ab i PBD dimera-Phe-Lis-PAB-Ab mogu se cepiti proteazom, dok je veznik PBD dimera-maleimid-acetala kiselinski labilan.
[0351] PBD dimeri i ADC koji sadrže PBD dimere mogu se pripremiti prema postupcima poznatim u tehnici. Videti npr., WO 2009/016516; US 2009/304710; US 2010/047257; US 2009/036431; US 2011/0256157; WO 2011/130598; WO 2013/055,987.
(5) Antraciklini
[0352] U nekim otelotvorenjima, ADC sadrži antraciklin. Antraciklini su antibiotska jedinjenja koja pokazuju citotoksičnu aktivnost. Iako ne nameravaju da budu vezani za bilo koju određenu teoriju, ispitivanja su pokazala da antraciklini mogu delovati da ubijaju ćelije putem niza različitih mehanizama, uključujući: 1) interkalacija molekula leka u DNK ćelije čime se inhibira DNK-zavisna sinteza nukleinske kiseline; 2) stvaranje lekom slobodnih radikala koji zatim reaguju sa ćelijskim makromolekulima da bi izazvali oštećenje ćelija i/ili 3) interakcije molekula leka sa ćelijskom membranom (videti, na primer,, C. Peterson i dr., “Transport And Storage Of Anthracycline In Experimental Systems And Human Leukemia” in Anthracycline Antibiotics In Cancer Therapy; N.R. Bachur, “Free Radical Damage” id. na str. 97-102). Zbog svog citotoksičnog potencijala antraciklini su korišćeni u lečenju brojnih karcinoma kao što su leukemija, karcinom dojke, karcinom pluća, adenokarcinom jajnika i sarkomi (videti npr. P.H-Viernik, u Antraciklin: Current Status And New Developments p 11).
[0353] Primeri antraciklina koji ne ograničavaju uključuju doksorubicin, epirubicin, idarubicin, daunomicin, nemorubicin i njihove derivate. Pripremljeni su i proučavani imunokonjugati i prolekovi daunorubicina i doksorubicina (Kratz i dr. (2006) Current Med. Chem. 13:477-523; Jeffrey i dr. (2006) Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362; Torgov i dr. (2005) Bioconj. Chem. 16:717-721; Nagy i dr. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834; Dubowchik i dr. (2002) Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532; King i dr. (2002) J. Med. Chem.45:4336-4343; EP 0,328,147; US 6,630,579). Konjugat antitelo-lek BR96-doksorubicin specifično reaguje sa tumorom povezanim antigenom Lewis-Y i ocenjen je u ispitivanjima faze I i II (Saleh i dr. (2000) J. Clin. Oncology 18:2282-2292; Ajani i dr. (2000) Cancer Jour. 6:78-81; Tolcher i dr. (1999) J. Clin. Oncology 17:478-484).
[0354] PNU-159682 je moćan metabolit (ili derivat) nemorubicina (Quintieri, i dr. (2005) Clinical Cancer Research 11(4):1608-1617). Nemorubicin je polu-sintetički analog doksorubicina sa 2-metoksimorfolino grupom na glikozidnom amino doksorubicinu i bio je pod kliničkom procenom (Grandi i dr. (1990) Cancer Treat. Rev. 17:133; Ripamonti i dr. (1992) Brit. J. Cancer 65:703;), uključujući ispitivanja faze II/III za hepatocelularni karcinom (Sun i dr. (2003) Proceedings of the American Society for Clinical Oncology 22, Abs1448; Quintieri (2003) Proceedings of the American Association of Cancer Research, 44:1st Ed, Abs 4649; Pacciarini i dr. (2006) Jour. Clin. Oncology 24:14116).
[0355] Neograničavajući primer ADC koji sadrži nemorubicin ili derivate nemorubicina prikazan je u formuli Ia:
pri čemu je R1atom vodonika, hidroksi ili metoksi grupa i R2je C1-C5alkoksi grupa ili njihova farmaceutski prihvatljiva so;
L1i Z su zajedno veznik (L) kako je ovde opisano;
T je antitelo (Ab) kako je ovde opisano; i
m je 1 do oko 20. U nekim otelotvorenjima, m je 1 do 10, 1 do 7, 1 do 5, ili 1 do 4.
[0356] U nekim otelotvorenjima, R1i R2su oba metoksi (-OMe).
[0357] Dalji neograničavajući primerak ADC koji sadrži nemorubicin ili derivate nemorubicina prikazan je u formuli Ib:
pri čemu je R1atom vodonika, hidroksi ili metoksi grupa i R2je C1-C5alkoksi grupa ili njihova farmaceutski prihvatljiva so;
L2i Z su zajedno veznik (L) kako je ovde opisano;
T je antitelo (Ab) kako je ovde opisano; i
m je 1 do oko 20. U nekim otelotvorenjima, m je 1 do 10, 1 do 7, 1 do 5, ili 1 do 4.
[0358] U nekim otelotvorenjima, R1i R2su oba metoksi (-OMe).
[0359] U nekim otelotvorenjima, komponenta nemorubicina ADC koji sadrži nemorubicin je PNU-159682. U nekim takvim otelotvorenjima, deo leka ADC može imati jednu od sledećih struktura:
ili
pri čemu talasasta linija označava vezanost za veznik (L).
[0360] Antraciklini, uključujući PNU-159682, mogu biti konjugovani sa antitelima kroz nekoliko mesta povezivanja i niz vezničkih lekova (US 2011/0076287; WO2009/099741; US 2010/0034837; WO 2010/009124), uključujući veznike opisane ovde.
[0361] Primeri ADC-a koji sadrže nemorubicin i veznik uključuju, ali nisu ograničeni na:
gde:
R1i R2su nezavisno izabrani između H i C1-C6alkila; i
[0362] Sledeći neograničavajući primerak ADC koji sadrži PBD dimer može se napraviti konjugacijom piridil disulfidnog PNU amida (prikazan ispod) sa antitelom:
za proizvodnju konjugata PNU-159682 povezanog sa disulfidom antitelo-lek:
[0363] Veznik PNU-159682 maleimid acetal-Ab je kiselinski labilan, dok veznici PNU-159682-val-cit-PAB-Ab, PNU-159682-val-cit-PAB-spacer-Ab i PNU-159682- val-cit-PAB-razdelnik (R1R2) -Ab se mogu podeliti proteazom.
(6) Dimeri lekova 1-(hlorometil)-2,3-dihidro-1H-benzo[e]indola (CBI)
[0364] U nekim otelotvorenjima, ADC sadrži 1-(hlorometil)-2,3-dihidro-1H-benzo[e]indol (CBI). Klasa 5-amino-1-(hlorometil)-1,2-dihidro-3H-benz[e]indol (amino CBI) klase DNK alkilatora sa malim žlebovima su snažni citotoksini (Atwell, i dr. (1999) J. Med. Chem., 42:3400), i korišćeni su kao efektorske jedinice u brojnim klasama predlekova dizajniranim za terapiju karcinoma. Uključili su konjugate antitela, (Jeffrey, i dr. (2005) J. Med. Chem., 48:1344), prolekovi za gensku terapiju na bazi nitrobenzil karbamata (Hay, i dr. (2003) J. Med. Chem. 46:2456) i odgovarajući derivati nitro-CBI kao prolekovi aktivirani hipoksijom (Tercel, i dr. (2011) Angew. Chem., Int. Ed., 50:2606-2609). Farmakofore CBI i pirolo[2,1-c][1,4]benzodiazepina (PBD) povezane su alkilnim lancem (Tercel i dr. (2003) J. Med. Chem 46:2132-2151).
[0365] U nekim otelotvorenjima, ADC sadrži dimer 1-(hlorometil)-2,3-dihidro-1 H-benzo[e]indol (CBI). U nekim takvim otelotvorenjima, dimer je heterodimer pri čemu je jedna polovina dimera CBI ostatak, a druga polovina dimera PBD ostatak.
[0366] U nekim otelotvorenjima, CBI dimer sadrži formulu:
gde je
R<1>odabran iz H, P(O)3H2, C(O)NR<a>R<b>, ili je vezan za veznik (L);
R<2>odabran iz H, P(O)3H2, C(O)NR<a>R<b>, ili je vezan za veznik (L);
R<a>i R<b>su nezavisno izabrani od H i C1-C6alkila opciono supstituisani sa jednim ili više F, ili R<a>i R<b>čine peto- ili šesto-članu heterociklil grupu;
T je vezana grupa izabrana iz C3-C12alkilena, Y, (C1-C6alkilena)-Y-(C1-C6alkilena), (C1-C6alkilena)-Y-(C1-C6alkilena)-Y-(C1-C6alkilena), (C2-C6alkenilena)-Y-(C2-C6alkenilena), i (C2-C6alkinilena)-Y-(C2-C6alkinilena);
gde se Y nezavisno bira između O, S, NR<1>, arila i heteroarila;
gde su alkilen, alkenilen, aril i heteroaril nezavisno i opciono supstituisani sa F, OH, O(C1-C6alkil), NH2, NHCH3, N(CH3)2, OP(O)3H2, i C1-C6alkil, gde je alkil opciono supstituisan sa jednim ili više F; ili su alkilen, alkenilen, aril i heteroaril nezavisno i opciono supstituisani vezom za L;
D' je deo leka izabran iz:
gde talasasta linija označava mesto vezivanja za T;
X<1>i X<2>se nezavisno biraju između O i NR<3>, gde se R<3>bira između H i C1-C6alkila, opciono supstituisanog sa jednim ili više F;
R<4>je H, CO2R, ili veza sa veznikom (L), gde je R C1-C6alkil ili benzil; i
R<5>je ili H, C1-C6alkil.
[0367] Međujedinjenja veznik-leka 51-86 iz Tabele A pripremljeni su spajanjem CBI dimera ili CBI/PBD heterodimernog dela leka sa vezničkim reagensom, prema postupcima iz WO 2015/023355.
Tabela A Veznik-CBI dimer i međujedinjenja CBI/PBD heterodimernih lekova 51-86
1
2
4
[0368] Međujedinjenja veznik-leka 87 i 88 iz Tabele B pripremljeni su spajanjem PBD dimera leka sa vezničkim reagensom prema postupcima WO 2013/055987.
Tabela B međujedinjenja lekova sa dimerom PBD 87-88
[0369] Međujedinjenja veznik-leka 89 i 90 iz Tabele C pripremljeni su spajanjem CBI dimera leka sa peptidomimetičnim vezničkim reagensom prema postupcima WO 2015/095227.
Tabela C Međujedinjenja lekova sa peptidomimetičnim CBI dimerom veznikom leka 89-90
[0370] Primeri CBI dimera ADC uključuju, ali se na njih ne ograničavaju, sledeće CBI-PBD dimere (talasasta linija označava mesto kovalentnog vezivanja za veznik):
i sledeći CBI-CBI dimer:
[0371] Neograničavajući primeri otelotvorenja ADC-a koji sadrže CBI dimere imaju sledeće strukture:
ili
i
[0372] Neograničavajući primer CBI-PBD heterodimera veznik-lekova međujedinjenja koja mogu biti konjugovana sa antitelima da bi formirali ADC uključuju, ali nisu ograničeni na:
[0373] Neograničavajući primer CBI-CBI homodimer veznik-lekova međujedinjenja koja mogu biti konjugovana sa antitelima da bi formirali ADC uključuju, ali nisu ograničeni na:
1
(7) Amatoksin
[0374] U nekim otelotvorenjima, imunokonjugat sadrži antitelo konjugovano sa jednim ili više molekula amatoksina. Amatoksini su ciklični peptidi sastavljeni od 8 aminokiselina. Mogu se izolovati iz pečurki Amanita phalloides ili pripremiti sintetički. Amatoksini specifično inhibiraju DNK zavisnu RNK polimerazu II ćelija sisara, a time i transkripciju i biosintezu proteina pogođenih ćelija. Inhibicija transkripcije u ćeliji uzrokuje zaustavljanje rasta i proliferacije. Videti npr., Moldenhauer i dr. JNCI 104:1-13 (2012), WO2010115629, WO2012041504, WO2012119787, WO2014043403, WO2014135282, i WO2012119787. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više molekula amatoksina su jedan ili više molekula a-amanitina.
(8) Ostali delovi lekova
[0375] Delovi lekova takođe uključuju geldanamicin (Mandler i dr. (2000) J. Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581; Mandler i dr. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler i dr. (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791); i enzimski aktivni toksini i njihovi fragmenti, uključujući, ali bez ograničenja, lanac difterije A, nevezujući aktivni fragmenti toksina difterije, lanac egzotoksina A (iz Pseudomonas aeruginosa), lanac ricina A, lanac abrina A, lanac modekcina A, alfa-sarcin, Aleurites fordii proteini, proteini diantina, proteini Phytolaca americana (PAPI, PAPII i PAP-S), inhibitor gorke dinje, kurcin, krotin, inhibitor sapaonaria officinalis, gelonin, mitogelin, restriktocin, fenomicin, enomicin i trihoteceni. Videti, npr., WO 93/21232.
[0376] Delovi lekova takođe uključuju jedinjenja sa nukleolitičkom aktivnošću (npr., ribonukleaza ili DNK endonukleaza).
[0377] U određenim otelotvorenjima, imunokonjugat može sadržati radioaktivni atom. Za proizvodnju radiokonjugovanih antitela dostupni su razni radioaktivni izotopi. Primeri uključuju At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>, Pb<212>i radioaktivne izotope Lu. U nekim otelotvorenjima, kada se imunokonjugat koristi za detekciju, on može sadržati radioaktivni atom za skintigrafska ispitivanja, na primer Tc<99>ili I<123>, ili
2
spin oznaku za snimanje nuklearne magnetne rezonance (NMR) (takođe poznato kao snimanje magnetnom rezonancom, MRI), kao što su cirkonijum-89, jod-123, jod-131, indijum-111, fluor-19, ugljenik-13, azot-15, kiseonik-17, gadolinijum, mangan ili gvožđe. Cirkonijum-89 može biti kompleksan za različita sredstva za heliranje i konjugovan sa antitelima, npr., za PET snimanje (WO 2011/056983).
[0378] Radio- ili druge oznake mogu biti ugrađene u imunokonjugat na poznate načine. Na primer, peptid se može biosintetizovati ili hemijski sintetizovati upotrebom odgovarajućih prekursora aminokiselina koji sadrže, na primer, jedan ili više atoma fluora-19 umesto jednog ili više vodonika. U nekim otelotvorenjima, oznake kao što su Tc<99>, I<123>, Re<186>, Re<188>i In<111>mogu se prikačiti preko ostatka cisteina u antitelu. U nekim otelotvorenjima, itrijum-90 se može vezati preko lizinskog ostatka antitela. U nekim otelotvorenjima, IODOGEN postupak (Fraker i dr. (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun.80: 49-57 može biti korišćen za inkorporiranje joda-123. “Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy” (Chatal, CRC Press 1989) opisuje određene druge postupke.
[0379] Imunokonjugat može sadržati antitelo konjugovano sa enzimom koji aktivira prolek. Enzim za aktiviranje proleka može pretvoriti prolek (npr., peptidil hemoterapeutsko sredstvo, videti WO 81/01145) u aktivni lek, kao što je lek protiv raka. Takvi imunokonjugati su korisni, na primer, u terapiji prolekovima zavisnoj od antitela (“ADEPT”). Enzimi koji mogu biti konjugovani sa antitelom uključuju, ali nisu ograničeni na, alkalne fosfataze, koje su korisne za pretvaranje prolekova koji sadrže fosfate u slobodne lekove; arilsulfataze, korisne za pretvaranje prolekova koji sadrže sulfat u slobodne lekove; citozin deaminaza, koja je korisna za pretvaranje netoksičnog 5-fluorocitozina u lek protiv raka, 5-fluorouracil; proteaze, kao što su serratia proteaza, termolizin, subtilisin, karboksipeptidaze i katepsini (kao što su katepsini B i L), koje su korisne za pretvaranje prolekova koji sadrže peptide u slobodne lekove; D-alanilkarboksipeptidaze, koje su korisne za pretvaranje prolekova koji sadrže supstituente D-aminokiselina; enzimi za deljenje ugljenih hidrata kao što su β-galaktozidaza i neuraminidaza, koji su korisni za pretvaranje glikoziliranih prolekova u slobodne lekove; β-laktamaza, koja je korisna za pretvaranje lekova derivatizovanih β-laktanima u slobodne lekove; i penicilin amidaze, kao što su penicilin V amidaza i penicilin G amidaza, koje su korisne za pretvaranje lekova izvedenih iz njihovih aminskih azota sa fenoksiacetilnom ili fenilacetilnom grupom u slobodne lekove. Enzimi se mogu kovalentno vezati za antitela tehnikama rekombinantne DNK koje su dobro poznate u tehnici. Videti, npr., Neuberger i dr., Nature 312:604-608 (1984).
c) Opterećenje leka
[0380] Opterećenje lekovima predstavljeno je sa p, prosečnim brojem ostataka antibiotika po antitelu u molekuli Formule I. Opterećenje lekovima može biti u opsegu od 1 do 20 delova leka (D) po antitelu. ADC Formule I uključuju kolekcije antitela konjugovanih sa nizom lekova, od 1 do 20. Prosečan broj delova leka po antitelu u preparatima ADC iz reakcija konjugacije može se naznačiti uobičajenim sredstvima kao što su masena spektroskopija, test ELISA i HPLC. Takođe se može odrediti kvantitativna raspodela ADC u smislu p. U nekim slučajevima, odvajanje, prečišćavanje i naznačivanje homogenih ADC gde je p određena vrednost od ADC sa drugim opterećenjima lekovima može se postići sredstvima kao što su HPLC reverzne faze ili elektroforeza.
[0381] Za neke konjugate antitelo-lek, p može biti ograničen brojem mesta vezivanja na antitelo. Na primer, tamo gde je vezanost cistein tiol, kao u određenim gornjim primerima otelotvorenja, antitelo može imati samo jednu ili više cistein tiol grupa, ili može imati samo jednu ili nekoliko dovoljno reaktivnih tiol grupa preko kojih se može povezati veznik. U nekim otelotvorenjima, veće opterećenje lekovima, npr. p > 5, može da izazove agregaciju, nerastvorljivost, toksičnost ili gubitak ćelijske propustljivosti određenih konjugata antitelolek. U nekim otelotvorenjima, srednja vrednost opterećenja lekovima za ADC je u opsegu od 1 do oko 8; od oko 2 do oko 6; ili od oko 3 do oko 5. Zaista se pokazalo da za određene ADC optimalni odnos ostataka leka po antitelu može biti manji od 8 i može biti oko 2 do oko 5 (US 7498298).
[0382] U nekim otelotvorenjima, manje od teoretskog maksimuma delova leka je konjugovano sa antitelom tokom reakcije konjugacije. Antitelo može da sadrži, na primer, lizinske ostatke koji ne reaguju sa međujedinjenjem lek-veznik ili vezom, kao što je diskutovano u daljem tekstu. Opšte, antitela ne sadrže mnogo slobodnih i reaktivnih cistein tiol grupa koje mogu biti povezane sa delom leka; zaista većina cistein tiolnih ostataka u antitelima postoji kao disulfidni mostovi. U nekim otelotvorenjima, antitelo može biti redukovano redukcionim sredstvom kao što je ditiotreitol (DTT) ili trikarboniletilfosfin (TCEP), pod delimičnim ili potpunim redukcionim uslovima, da bi se stvorile reaktivne cistein tiolne grupe. U nekim otelotvorenjima, antitelo je podvrgnuto uslovima za denaturaciju da bi se otkrile reaktivne nukleofilne grupe kao što su lizin ili cistein.
[0383] Opterećenje (odnos leka/antitela) ADC može se kontrolisati na različite načine, i na primer: (i) ograničavanjem molarnog viška međujedinjenja ili vezivnog reagensa za lek-veznik u odnosu na antitelo, (ii) ograničavanjem vremena ili temperature reakcione konjugacije, i (iii) delimičnim ili ograničavajućim reduktivnim uslovima za modifikaciju cistein tiola.
[0384] Podrazumeva se da tamo gde više od jedne nukleofilne grupe reaguje sa međujedinjenjem veznika leka ili vezivnim reagensom, tada je rezultujući proizvod smeša ADC jedinjenja sa raspodelom jednog ili više lekova vezanih za antitelo. Prosečan broj lekova po antitelu može se izračunati iz smeše dvostrukim testom ELISA antitela, koji su specifični za antitelo i specifični za lek. Pojedinačni ADC molekuli mogu se identifikovati u smeši pomoću masene spektroskopije i razdvojiti HPLC, npr. hidrofobna hromatografija interakcije (videti npr., McDonagh i dr. (2006) Prot. Engr. Design & Selection 19(7):299-307; Hamblett i dr. (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070; Hamblett, K.J., i dr. “Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate,” Abstract No. 624, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004; Alley, S.C., i dr. “Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates,” Abstract No.627, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004). U određenim otelotvorenjima, homogeni ADC sa jednom vrednosti opterećenja može biti izolovan iz smeše konjugacije elektroforezom ili hromatografijom.
d) Određeni postupci pripreme imunokonjugata
[0385] ADC formule I može se pripremiti na nekoliko načina koji koriste reakcije organske hemije, stanja i reagense poznate stručnjacima u ovoj oblasti, uključujući: (1) reakcija nukleofilne grupe antitela sa bivalentnim veznim reagensom da formira Ab-L preko kovalentne veze, posle čega sledi reakcija sa delom leka D; i (2) reakcija nukleofilne grupe dela leka sa bivalentnim veznim reagensom, da bi se formirao D-L, putem kovalentne veze, posle čega je usledila reakcija sa nukleofilnom grupom antitela. Primerni postupci za pripremanje ADC Formule I preko potonjeg puta opisani su u US 7498298.
[0386] Nukleofilne grupe antitela uključuju, ali nisu ograničene na: (i) N-terminalne aminske grupe, (ii) aminske grupe bočnih lanaca, npr. lizin, (iii) tiolne grupe bočnih lanaca, npr. cistein i (iv) šećerna hidroksilna ili amino grupa gde je antitelo glikozilirano. Aminske, tiolne i hidroksilne grupe su nukleofilne i sposobne su da reaguju da formiraju kovalentne veze sa elektrofilnim grupama na veznim delovima i veznim reagensima, uključujući: (i) aktivni estri kao što su NHS estri, HOBt estri, haloformati i halogenidi kiseline; (ii) alkil i benzil halogenidi kao što su haloacetamidi; i (iii) aldehidi, ketoni, karboksil i maleimidne grupe. Određena antitela imaju redukovane međulančane disulfide, tj. cisteinske mostove. Antitela se mogu učiniti reaktivnim za konjugaciju sa vezujućim reagensima tretmanom redukcionim sredstvom kao što je DTT (ditiotreitol) ili trikarboniletilfosfin (TCEP), tako da se antitelo u potpunosti ili delimično redukuje. Svaki cisteinski most će tako teoretski formirati dva reaktivna tiolna nukleofila. Dodatne nukleofilne grupe mogu se uvesti u antitela modifikovanjem lizinskih ostataka, npr., reakcijom lizinskih ostataka sa 2-iminotiolanom (Trautov reagens), što rezultira konverzijom amina u tiol. Reaktivne tiolne grupe takođe mogu se uvesti u antitelo unošenjem jednog, dva, tri, četiri, ili više cisteinskih ostataka (npr., pripremanjem varijantnih antitela koja sadrže jedan ili više ne-izvornih ostataka cisteinskih aminokiselina).
[0387] Konjugati lek-antibiotik predmetnog pronalaska se takođe mogu proizvesti reakcijom između elektrofilne grupe na antitelo, kao što je aldehid ili keton karbonilna grupa, sa nukleofilnom grupom na vezujućem reagensu ili leku. Korisne nukleofilne grupe na vezujućem reagensu uključuju, ali nisu ograničene na, hidrazid, oksim, amino, hidrazin, tiosemikarbazon, hidrazin karboksilat i arilhidrazid. Antitelo se može modifikovati da uvede elektrofilne delove koji su sposobni da reaguju sa nukleofilnim supstituentima na veznik reagensu ili leku. Šećeri glikoziliranih antitela mogu biti oksidisani, npr. sa periodatnim oksidacionim reagensima, da bi se formirale aldehidne ili ketonske grupe koje mogu da reaguju sa aminskom grupom veznih reagensa ili delovima lekova. Dobijene iminske Schiffove bazne grupe mogu činiti stabilnu vezu ili se mogu redukovati, npr. borohidridnim reagensima da bi stvorili stabilne aminske veze. Reakcija dela ugljenih hidrata glikoziliranog antitela bilo sa galaktozo oksidazom ili natrijum meta-periodatom može dati karbonil (aldehid i keton) grupe u antitelu koje mogu da reaguju sa odgovarajućim grupama na leku (Hermanson, Tehnike biokonjugata). Antitela koja sadrže N-terminalne ostatke serina ili treonina mogu da reaguju sa natrijum metaperiodatom, što rezultira proizvodnjom aldehida umesto prve aminokiseline (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem.3:138-146; US 5,362,852). Takav aldehid može da reaguje sa delom leka ili nukleofilom koji ima vezu.
[0388] Primeri nukleofilnih grupa na delu leka uključuju, ali nisu ograničeni na: amin, tiol, hidroksil, hidrazid,
4
oksim, hidrazin, tiosemikarbazon, hidrazin karboksilat i arilhidrazid grupe sposobne da reaguju da formiraju kovalentne veze sa elektrofilnim grupama na vezničkim delovima i vezničkim reagensima, uključujući: (i) aktivni estri kao što su NHS estri, HOBt estri, haloformati i halogenidi kiseline; (ii) alkil i benzil halogenidi kao što su haloacetamidi; (iii) aldehidi, ketoni, karboksil i maleimidne grupe.
[0389] Neograničeni primerci reagenasa za umrežavanje koji se mogu koristiti za pripremu ADC opisani su ovde u odeljku pod nazivom „Primerni veznici”. Postupci korišćenja takvih reagenasa za umrežavanje za povezivanje dva dela, uključujući proteinski deo i hemijski deo, poznati su u struci. Fuzioni protein koji sadrži antitelo i citotoksično sredstvo može se napraviti, na primer, rekombinantnim tehnikama ili sintezom peptida. Rekombinantni molekul DNK može da sadrži regione koji kodiraju antitelo i citotoksične delove konjugata, bilo susedne jedni drugima ili odvojene regijom koja kodira vezni peptid koji ne uništava željena svojstva konjugata.
[0390] Antitelo može biti konjugovano sa „receptorom” (kao što je streptavidin) za upotrebu u predciljanju tumora, pri čemu se pacijentu daje konjugat antitelo-receptor, nakon čega sledi uklanjanje nevezanog konjugata iz cirkulacije pomoću sredstva za čišćenje, a zatim davanje “liganda” (npr., avidina) koji je konjugovan sa citotoksičnim agensom (npr., lekom ili radionukleotidom).
E. Trastuzumab-MCC-DM1 i Pertuzumab
Trastuzumab-MCC-DMl (T-DM1)
[0391] Predmetni pronalazak uključuje imunokonjugate za upotrebu u terapijskim tretmanima trastuzumab-MCC-DM1 (T-DM1, takođe poznat i kao trastuzumab emtanzin), konjugat antitela i leka (CAS Reg. No.
139504-50-0), koji ima strukturu:
gde je Tr trastuzumab povezan preko vezne grupe MCC sa ostatkom majtanzinoidnog leka DM1 (US 5208020; US 6,441,163). Odnos leka i antitela ili opterećenje leka predstavljeno je p u gornjoj strukturi trastuzumaba-MCC-DM1 i kreće se u celobrojnim vrednostima od 1 do oko 8. Trastuzumab-MCC-DM1 uključuje sve smeše različito opterećenih i vezanih konjugata antitelo-lek, gde su 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 i 8 ostataka lekova kovalentno vezani za antitelo trastuzumab (US 7097840; US 8,337,856; US 2005/0276812; US 2005/0166993).
[0392] Trastuzumab se može proizvesti suspenzijskom kulturom ćelija sisara (jajnik kineskog hrčka, CHO). Proto-onkogen HER2 (ili c-erbB2) kodira protein transmembranskog receptora od 185 kDa, koji je strukturno povezan sa receptorima za epidermalni faktor rasta. Trastuzumab je antitelo koje ima ostatke koji vežu antigen ili su izvedeni iz mišjeg 4D5 antitela (ATCC CRL 10463, deponovano u American Tipe Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20852 prema Budimpeštanskom ugovoru od 24. maja 1990). Primeri humanizovanih 4D5 antitela uključuju huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 i huMAb4D5-8 (trastuzumab, HERCEPTIN®7) kao u US 5821337. U nekim otelotvorenjima, deo antitela T-DM1 sadrži sekvence aminokiselina lakog i teškog lanca prikazane u SEQ ID NO:30 i SEQ ID NO.29, respektivno.
[0393] Trastuzumab-MCC-DM1 se može pripremiti, na primer, prema Primeru 1 patentne objave SAD br.
20110165155, na primer.
[0394] Kao opšti predlog, početna farmaceutski efikasna količina trastuzumaba-MCC-DM1 davana po dozi biće u opsegu od oko 0,3 do 15 mg/kg/dan telesne težine pacijenta.
[0395] Komercijalna formulacija T-DM1 (KADCILA®, ado-trastuzumab emtanzin) je sterilni, beli do gotovo beli konzervans bez liofilizovanog praška u bočicama za jednokratnu upotrebu. Svaka bočica sadrži 100 mg ili 160 mg ado-trastuzumaba emtanzina. Nakon rekonstitucije, svaka bočica za jednokratnu upotrebu sadrži ado-trastuzumab emtanzin (20 mg/ml), polisorbat 20 [0,02% (w/v)], natrijum sukcinat (10 mM) i saharozu [6% (w/v)] sa pH od 5,0 i gustinom od 1,026 g/mL. Dobijeni rastvor koji sadrži 20 mg/ml ado-trastuzumab emtanzina daje se intravenoznom infuzijom nakon razblaživanja. U nekim otelotvorenjima, ado-trastuzumab emtanzin se primenjuje u dozi od 3,6 mg/kg svake tri nedelje. U nekim otelotvorenjima, ado-trastuzumab emtanzin se primenjuje u dozi od 2,4 mg/kg svake nedelje.
Pertuzumab sastavi
[0396] Sastav pertuzumaba sadrži smešu glavnih antitela na pertuzumab, kao što je ovde iznad definisano, i jedne ili više njihovih varijanti. Poželjno otelotvorenje antitela na glavnu vrstu pertuzumaba je ona koja sadrži aminokiselinsku sekvencu lakog lanca SEQ ID NO:32, i teški lanac aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:31 (uključujući deamidirane i/ili oksidovane varijante tih sekvenci). Sastav može sadržati mešavinu glavnih vrsta antitela na pertuzumab i njegovu varijantu aminokiselinske sekvence koja sadrži amino-terminalno produženje lidera, na primer, sadrži lanac lanaca aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO:34, i teški lanac aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:33. Poželjno je da se produžavanje amino-terminalnog vođe nalazi na laganom lancu varijante antitela (npr. na jednom ili dva laka lanca varijante antitela). Glavna vrsta HER2 antitela ili varijanta antitela mogu biti antitelo pune dužine ili fragment antitela (npr. Fab od F(ab')2 fragmenata), ali poželjno su oba antitela pune dužine. Ovde navedena varijanta antitela može da sadrži amino-terminalni produžetak vođe na bilo kom jednom ili više njihovih teških ili lakih lanaca. Poželjno je da je produžavanje amino-terminalnog vođe na jednom ili dva laka lanca antitela. Amino-terminalno produžavanje vođe poželjno sadrži ili se sastoji od VHS-. Prisustvo produžetka amino-terminalnog lidera u sastavu može se otkriti različitim analitičkim tehnikama, uključujući, ali ne ograničavajući se na, analizu N-terminalne sekvence, test za heterogenost naelektrisanja (na primer, hromatografija izmenjivanja katjona ili elektroforeza kapilarne zone), masena spektrometrija itd. Količina varijante antitela u kompoziciji uglavnom se kreće od količine koja čini granicu detekcije bilo kog testa (poželjno analiza N-terminalne sekvence) koja se koristi za detekciju varijante do količine manje od količine antitela glavne vrste. Generalno, oko 20% ili manje (npr. od oko 1% do oko 15%, na primer od 5% do oko 15%) molekula antitela u sastavu sadrže produženje amino-terminalnog lidera. Takve procentualne količine se poželjno određuju korišćenjem kvantitativne analize N-terminalne sekvence ili analize katjonske razmene (poželjno upotrebom kolone za razmenu katjona visoke rezolucije, kao što je PROPAC WCX-10™ kolona za razmenu katjona). Pored varijante produžetka amino-terminalnog lidera, razmatraju se i dalje promene sekvence aminokiselina glavnog antitela i/ili varijante glavne vrste, uključujući, ali bez ograničenja, antitelo koje sadrži C-terminalni lizinski ostatak na jednom ili oba teška lanca, a varijanta deamidiranih antitela itd.
[0397] Štaviše, glavna vrsta antitela ili varijanta mogu dalje sadržati varijacije glikozilacije, čiji neograničavajući primeri uključuju antitelo koje sadrži G1 ili G2 oligosaharidnu strukturu vezanu za njegov Fc region, antitelo koje sadrži ugljeni hidratni deo vezan za laki lanac (npr. jedan ili dva ugljenikohidratna dela, kao što su glukoza ili galaktoza, vezani za jedan ili dva laka lanca antitela, na primer vezani za jedan ili više ostataka lizina), antitelo koje sadrži jedan ili dva ne-glikozilirana teška lanca ili antitelo koje sadrži silifikovani oligosaharid pričvršćen za jedan ili dva teška lanca itd.
[0398] Sastav se može povratiti iz genetski projektovane ćelijske linije, npr. ćelijska linija jajnika kineskog hrčka (CHO) koja eksprimira HER2 antitelo ili se može dobiti sintezom peptida.
[0399] Za više informacija u vezi sa primerima sastava pertuzumaba, videti Pat. SAD br.7,560,111 i 7,879,325 kao i US 2009/0202546A1.
[0400] Komercijalna formulacija pertuzumaba (PERJETA®) sadrži pertuzumab 420 mg/14 ml (30 mg/ml) u obliku rastvora bez konzervansa za IV infuziju. U nekim otelotvorenjima, terapija pertuzumabom obuhvata davanje početne doze opterećenja od 840 mg, zatim primenu ravne doze održavanja od 420 mg svake tri nedelje.
F. Postupci i sastavi za dijagnostiku i otkrivanje
[0401] U određenim otelotvorenju, bilo koje ovde dato antitelo na HER2 je korisno za otkrivanje prisustva HER2 u biološkom uzorku. Termin “otkrivanje” kako se ovde koristi obuhvata kvantitativnu ili kvalitativnu detekciju. “Biološki uzorak” sadrži, npr., ćeliju ili tkivo (npr., materijal za biopsiju, uključujući kancerogeno ili potencijalno kancerogeno tkivo dojke).
[0402] Obezbeđeno je antitelo na HER2 za upotrebu u postupcima dijagnoze ili detekcije. U sledećem aspektu, dat je postupak detekcije prisustva humanog HER2 u biološkom uzorku. Postupak uključuje kontakt biološkog uzorka sa ovde opisanim antitelom na HER2 pod uslovima koji dozvoljavaju vezivanje antitela na HER2 na ljudski HER2 i otkrivanje da li se formira kompleks između antitela na HER2 i prirodnog antitela humani HER2 u biološkom uzorku. Takav postupak može biti in vitro ili in vivo postupak. U jednom otelotvorenju, anti-HER2 antitelo se koristi za izbor ispitanika koji ispunjavaju uslove za terapiju antitelom protiv HER2, npr. gde je HER2 biomarker za izbor pacijenata. U daljem otelotvorenju, biološki uzorak je ćelija ili tkivo.
[0403] U daljem otelotvorenju, anti-HER2 antitelo je za upotrebu in vivo za otkrivanje, npr. In vivo snimanjem, HER2-pozitivnog karcinoma kod subjekta, npr., u svrhu dijagnoze, progresije ili stadijuma raka, određujući odgovarajući tok terapije ili praćenje odgovora raka na terapiju. Jedan postupak poznat u struci za in vivo detekciju je imuno-pozitronska emisiona tomografija (imuno-PET), kao što je opisano, npr., u van Dongen i dr., The Oncologist 12:1379-1389 (2007) i Verel i dr., J. Nucl. Med.44:1271-1281 (2003). U takvim otelotvorenjima, obezbeđen je postupak za otkrivanje HER2-pozitivnog kancera kod ispitanika, postupak koji uključuje davanje obeleženih anti-HER2 antitela ispitaniku koji ima ili sumnja da ima HER2-pozitivni kancer i detekciju obeleženih anti-HER2. antitela kod ispitanika, pri čemu detekcija obeleženih anti-Staph antitela ukazuje na HER2-pozitivni kancer kod ispitanika. U izvesnim takvim otelotvorenjima, obeleženo anti-HER2 antitelo sadrži anti-HER2 antitelo konjugovano sa pozitronskim emiterom, kao što su<68>Ga,<18>F,<64>Cu,<86>Y,<76>Br,<89>Zr, i<124>I. U naročitim otelotvorenjima, pozitron emiter je<89>Zr.
[0404] U daljim otelotvorenjima, postupak dijagnoze ili detekcije obuhvata kontaktiranje prvog anti-HER2 antitela imobilizovanog na supstratu sa biološkim uzorkom koji se testira na prisustvo HER2, izlaganje supstrata drugom anti-HER2 antitelu i detektovanje da li se drugo anti-HER2 antitelo vezuje na kompleks između prvog anti-HER2 antitela i HER2 u biološkom uzorku. Supstrat može biti bilo koji potporni medijum, npr., staklo, metal, keramika, polimerne kuglice, dijapozitivi, čips i drugi supstrati. Biološki uzorak može sadržati ćeliju ili tkivo. Prvo ili drugo antitelo na HER2 može biti bilo koje od ovde opisana antitela.
[0405] Primeri poremećaja koji se mogu dijagnostifikovati ili otkriti u skladu sa bilo kojim od gornjih ostvarenja uključuju HER2-pozitivni rak, kao što je HER2-pozitivni rak dojke i HER2-pozitivni rak želuca. U nekim otelotvorenjima, HER2-pozitivni rak ima rezultat imunohistohemije (IHC) 2+ ili 3+ i/ili odnos amplifikacije in situ hibridizacije (ISH) ≥2,0.
[0406] U nekim otelotvorenjima, obezbeđena su obeležena anti-HER2 antitela. Oznake uključuju, ali nisu ograničene na, etikete ili delove koji se detektuju direktno (kao što su fluorescentne, hromoforne, elektro-guste, hemiluminiscentne i radioaktivne oznake), kao i delove, kao što su enzimi ili ligandi, koji se otkrivaju indirektno, npr., enzimatskom reakcijom ili molekularnom interakcijom. Primeri etiketa uključuju, ali nisu ograničeni na, radioizotope<32>P,<14>C,<125>I,<3>H, i<131>I, fluorofori kao što su retki zemljani helati ili fluorescein i njegovi derivati, rodamin i njegovi derivati, danzil, umeliferon, luciferaze, npr., luciferaza leptira i bakterijska luciferaza (patent SAD br. 4,737,456),luciferin, 2,3-dihidroftalazindioni, renova peroksidaza (HRP), alkalna fosfataza, β-galaktoza, glukoamilaza, lizocim, saharidne oksidaze, npr., ksantin oksidaza, zajedno sa enzimom koji koristi vodonik peroksid za oksidaciju prekursora bojila kao što su HRP, laktoperoksidaza ili mikroperoksidaza, biotin/avidin, spin etikete, oznake bakteriofaga, stabilni slobodni radikali i slično. U drugom otelotvorenju, etiketa je pozitronski emiter. Pozitronski emiteri uključuju, ali nisu ograničeni na njih<68>Ga,<18>F,<64>Cu,<86>Y,<76>Br,<89>Zr, i<124>I. U naročitom otelotvorenju, pozitron emiter je<89>Zr.
G. Farmaceutske formulacije
[0407] Farmaceutske formulacije anti-HER2 antitela ili imunokonjugata kako su ovde opisane pripremaju se mešanjem takvih antitela ili imunokonjugata željenog stepena čistoće sa jednim ili više opcionalnih farmaceutski prihvatljivih nosača (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora. Farmaceutski prihvatljivi nosači uglavnom nisu toksični za primaoce u dozama i koncentracijama koje se koriste i uključuju, ali nisu ograničeni na: puferi kao što su fosfat, citrat i druge organske kiseline; antioksidanti uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervansi (kao što je oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid; benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil paraben poput metila ili propil parabena; katehol; resorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptidi niske molekularne mase (manje od oko 10 ostataka); proteini, kao što su albumin u serumu, želatina ili imunoglobulini; hidrofilni polimeri, poput polivinilpirolidona; aminokiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharidi, disaharidi i drugi ugljeni hidrati uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helirajuća sredstva kao što je EDTA; šećeri kao što su saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontra-joni koji stvaraju sol kao što je natrijum; metalni kompleksi (npr., Zn-protein kompleksi); i/ili nejonske površinski aktivne materije kao što je polietilen glikol (PEG). Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača ovde dalje uključuju sredstva za disperziju intersticijalnih lekova kao što su rastvorljivi neutralno aktivni glikoproteini hijaluronidaze (sHASEGP), na primer, rastvorljivi u čoveku PH-20 hijaluronidaza glikoproteini, kao što je rHuPH20 (HILENEX®, Baxter International, Inc.). Određeni primerni sHASEGP-ovi i načini upotrebe, uključujući rHuPH20, opisani su u patentnim objavama SAD br. 2005/0260186 i 2006/0104968. U jednom aspektu, sHASEGP se kombinuje sa jednom ili više dodatnih glikozaminoglikanaza kao što su hondroitinaze.
[0408] Primeri formulacija liofilizovanih antitela ili imunokonjugata opisani su u patentu SAD br.6,267,958. Vodene formulacije antitela ili imunokonjugata uključuju one opisane u patentu SAD br. 6,171,586 i WO2006/044908, a poslednje formulacije uključuju pufer histidin-acetata.
[0409] Formulacija ovde takođe može sadržati više od jednog aktivnog sastojka po potrebi za određenu indikaciju koja se leči, po mogućnosti one sa komplementarnim aktivnostima koje međusobno ne negativno deluju.
[0410] Aktivni sastojci se mogu ugraditi u mikrokapsulu pripremljenu, na primer, tehnikama ko-acervacije ili interfacijalnom polimerizacijom, na primer, hidroksimetilcelulozom ili želatinsko-mikrokapsulom, odnosno poli-(metilmetakrilatskim) mikrokapsulama, u sistemima za koloidnu primenu lekova (na primer, lipozomi, mikrosfere albumina, mikroemulzije, nano-čestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su obelodanjene u Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).
[0411] Mogu se pripremiti preparati sa odloženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa odloženim oslobađanjem uključuju polupropusne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koji sadrže antitelo ili imunokonjugat, a koje su matrice u obliku oblikovanih predmeta, npr. filmovi ili mikrokapsule.
[0412] Formulacije koje se koriste za in vivo davanje su generalno sterilne. Sterilnost se može lako postići, npr., filtriranjem kroz sterilne membrane za filtriranje.
H. Terapijski postupci i sastavi
[0413] Bilo koje ovde dato antitelo na HER2 ili imunokonjugati može se koristiti u postupcima, npr., u terapijskim postupcima.
[0414] Ovde je opisano anti-HER2 antitelo ili imunokonjugat koji se ovde koristi u postupku inhibiranja proliferacije HER2-pozitivne ćelije, postupak koji uključuje izlaganje ćelije anti-HER2 antitelu ili imunokonjugatu pod uslovima koji dozvoljavaju vezivanje anti- HER2 antitelo ili imunokonjugat sa HER2 na površini ćelije, čime inhibira proliferaciju ćelije. Postupak može biti in vitro ili in vivo postupak. Ćelija može biti ćelija raka dojke ili ćelija karcinoma želuca.
[0415] Inhibicija ćelijske proliferacije in vitro može se ispitati korišćenjem testa CellTiter-Glo™ luminiscentne ćelijske održivosti, koji je komercijalno dostupan od kompanije Promega (Madison, WI). Taj test određuje broj održivih ćelija u kulturi na osnovu određivanja prisutnog ATP, što je pokazatelj metabolički aktivnih ćelija. Videti Crouch i dr. (1993) J. Immunol. Meth.160:81-88, US Pat. No.6,602,677. Test se može sprovesti u formatu sa 96 ili 384 udubljenja, što ga čini podložnim automatskom skriningu velike propusnosti (HTS). Videti Cree i dr. (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404. Postupak ispitivanja uključuje dodavanje jednog reagensa (CellTiter-Glo® Reagent) direktno u kultivisane ćelije. Ovo rezultira lizom ćelija i generisanjem luminiscentnog signala proizvedenog reakcijom luciferaze. Luminiscentni signal je proporcionalan količini prisutnog ATP-a, što je direktno proporcionalno broju održivih ćelija prisutnih u kulturi. Podaci se mogu snimati luminometrom ili uređajem za snimanje CCD kamerom. Izlaz luminiscencije izražava se kao relativne svetlosne jedinice (RLU).
[0416] U drugom aspektu, obezbeđeno je antitelo na HER2 ili imunokonjugat za upotrebu kao lek. U daljim aspektima, obezbeđeno je antitelo na HER2 ili imunokonjugat za upotrebu u postupku lečenja. U određenim otelotvorenjima, obezbeđen je imunokonjugat, kako je definisan u zahtevima, za upotrebu u lečenju HER2-pozitivnog karcinoma. U određenim otelotvorenjima, pronalazak obezbeđuje imunokonjugat, kako je definisano u patentnim zahtevima, za upotrebu u postupku lečenja osobe koja ima HER2-pozitivan rak, pri čemu se postupak sastoji od davanja pojedincu efikasne količine antitela na HER2 ili imunokonjugata. U jednom takvom otelotvorenju, postupak dalje uključuje davanje pojedincu efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapijskog sredstva, na primer, kako je opisano u nastavku.
[0417] HER2-pozitivni rak u skladu sa bilo kojim od gornjih ostvarenja može biti, na primer, HER2-pozitivni rak dojke ili HER2-pozitivni rak želuca. U nekim otelotvorenjima, HER2-pozitivni rak ima rezultat imunohistohemije (IHC) 2+ ili 3+ i/ili odnos amplifikacije in situ hibridizacije (ISH) ≥2,0.
[0418] ”Pojedinac”, “pacijent” ili “ispitanik” u skladu sa bilo kojim od gornjih otelotvorenja može biti čovek.
[0419] Takođe su obezbeđene farmaceutske formulacije koje sadrže bilo koje od antitela na HER2 ili imunokonjugat ovde obezbeđeno, na primer, za upotrebu u bilo kojoj od iznad navedenih terapijskih postupaka. Farmaceutska formulacija može sadržati bilo koje ovde dato antitelo na HER2 ili imunokonjugate i farmaceutski prihvatljiv nosač. Farmaceutska formulacija može sadržati bilo koje ovde dato anti-HER2 antitelo ili imunokonjugate i najmanje jedno dodatno terapijsko sredstvo, na primer, kako je opisano ispod.
[0420] Antitela ili imunokonjugati prema pronalasku mogu se koristiti ili sami ili u kombinaciji sa drugim sredstvima u terapiji. Na primer, antitelo ili imunokonjugat prema pronalasku (npr., konjugat antitelo-lek hu7C2.v.2.2.LA (hu7C2 ADC)) može se davati zajedno sa najmanje jednim dodatnim terapijskim sredstvom. U nekim otelotvorenjima, dodatno terapeutsko sredstvo je takođe antitelo ili imunokonjugat koji se vezuje za HER2. U nekim otelotvorenjima, dodatno terapeutsko sredstvo je (i) antitelo ili imunokonjugat koji se vezuje za domen II HER2 i/ili (ii) antitelo ili imunokonjugat koji se vezuje za domen IV ili HER2. U nekim otelotvorenjima, dodatno terapijsko sredstvo je (i) antitelo ili imunokonjugat koji se vezuje za epitop 2C4, i/ili (ii) antitelo ili imunokonjugat koji se vezuje za epitop 4D5.
[0421] U nekim otelotvorenjima, konjugat antitela i leka hu7C2.v.2.2.LA (hu7C2 ADC) daje se istovremeno sa jednim ili više dodatnih terapijskih sredstava izabranih između trastuzumaba (Herceptin®), T-DM1 (Kadcila®) i pertuzumaba (Perjeta®). U nekim otelotvorenjima, hu7C2 ADC se daje zajedno sa trastuzumab. U nekim otelotvorenjima, hu7C2 ADC se daje zajedno sa T-DM1. U nekim otelotvorenjima, hu7C2 ADC se daje zajedno sa pertuzumab. U nekim otelotvorenjima, hu7C2 ADC se daje zajedno sa trastuzumabom i pertuzumabom. U nekim otelotvorenjima, hu7C2 ADC se daje zajedno sa T-DM1 i pertuzumabom.
[0422] Takve kombinovane terapije iznad pomenute obuhvataju kombinovanu primenu (gde su dva ili više terapijskih sredstava uključena u iste ili odvojene formulacije) i odvojenu primenu, u kom slučaju se primena antitela ili imunokonjugata prema pronalasku može desiti pre, istovremeno i/ili nakon, primena dodatnog terapijskog sredstva i/ili pomoćnog sredstva. Antitela ili imunokonjugati iz pronalaska mogu se takođe koristiti u kombinaciji sa terapijom zračenjem.
[0423] Antitelo ili imunokonjugat iz pronalaska (i bilo koji dodatni terapeutski agens) mogu se primeniti na bilo koji pogodan način, uključujući parenteralno, intrapulmonalno i intranazalno, i, ako je poželjno za lokalni tretman, intralezijsko davanje. Parenteralne infuzije uključuju intramuskularno, intravensko, intraarterijsko, intraperitonealno ili potkožno davanje. Doziranje može biti bilo kojim pogodnim putem, npr. injekcijama, kao što su intravenske ili potkožne injekcije, delimično u zavisnosti od toga da li je davanje kratko ili hronično. Ovde su razmotreni različiti rasporedi doziranja, uključujući, ali bez ograničenja, jednokratno ili višestruko davanje tokom različitih vremenskih tačaka, davanje bolusa i infuziju pulsa.
[0424] Antitela ili imunokonjugati iz pronalaska bi se formulisali, dozirali i davanje na način koji je u skladu sa dobrom medicinskom praksom. Faktori koji treba uzeti u obzir u ovom kontekstu uključuju određeni poremećaj koji se leči, određeni sisar koji se leči, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto isporuke sredstava, način davanja, raspored davanja i drugi faktori poznati lekarima. Antitelo ili imunokonjugat ne moraju biti, ali su opciono formulisani sa jednim ili više sredstava koja se trenutno koriste za sprečavanje ili lečenje predmetnog poremećaja. Efektivna količina takvih drugih sredstava zavisi od količine antitela ili imunokonjugata prisutnih u formulaciji, vrste poremećaja ili lečenja i drugih iznad navedenih faktora. Oni se obično koriste u istim dozama i sa načinima administracije kako su ovde opisani, ili oko 1 do 99% ovde opisanih doza, ili u bilo kojoj dozi i bilo kojim putem za koji se empirijski/klinički utvrdi da je prikladan.
[0425] Za prevenciju ili lečenje bolesti, odgovarajuća doza antitela ili imunokonjugata prema pronalasku (kada se koristi samostalno ili u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapijskih sredstava) zavisiće od vrste bolesti koja se leči i vrste antitela ili imunokonjugat, težina i tok bolesti, bilo da se antitelo ili imunokonjugat daju u preventivne ili terapeutske svrhe, prethodna terapija, klinička istorija pacijenta i odgovor na antitelo ili imunokonjugat i diskrecija lekara koji dolazi. Antitelo ili imunokonjugat se pogodno daje pacijentu odjednom ili tokom niza tretmana. U zavisnosti od vrste i težine bolesti, oko 1 µg/kg do 15 mg/kg (npr. 0,1 mg/kg-10 mg/kg) antitela ili imunokonjugata može biti početna doza kandidata za primenu kod pacijenta, bilo da se na primer, jednom ili više odvojenih davanja ili kontinuiranom infuzijom. Jedna tipična dnevna doza može se kretati od oko 1 µg/kg do 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od iznad pomenutih faktora. Kod ponovljenih davanja tokom nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, tretman bi se generalno održavao sve dok se ne dogodi željena supresija simptoma bolesti. Jedno davanje doza antitela ili imunokonjugata bila bi u opsegu od oko 0,05 mg/kg do oko 10 mg/kg. Prema tome, pacijentu se mogu davati jedna ili više doza od oko 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ili 10 mg/kg (ili bilo koja njihova kombinacija). Takve doze se mogu davati s prekidima, npr. svake nedelje ili svake tri nedelje (npr. takve da pacijent primi od oko dve do oko dvadeset, ili npr. oko šest doza antitela). Može se davati početna veća doza opterećenja, praćena jednom ili više nižih doza. Međutim, drugi režimi doziranja mogu biti korisni. Napredak ove terapije lako se prati konvencionalnim tehnikama i testovima.
[0426] Podrazumeva se da se bilo koja od gornjih formulacija ili terapijskih postupaka može izvoditi primenom imunokonjugata pronalaska i antitela na HER2.
I. Artikli proizvodnje
[0427] Opisani su proizvodi za proizvodnju ili “kompleti” koji sadrže hu7C2.v.2.2.LA konjugat antitelo-lek (hu7C2 ADC) i trastuzumab-MCC-DM1 i/ili pertuzumab korisni za ovde opisane postupke lečenja. Komplet može sadržati ambalažu koji sadrži hu7C2 ADC. Komplet može dalje sadržati ambalažu koja sadrži trastuzumab-MCC-DM1. Komplet može dalje sadržati ambalažu koji sadrži pertuzumab. Komplet može dalje sadržati ambalažu koji sadrži trastuzumab-MCC-DM1 i ambalažu koji sadrži pertuzumab. Ambalaža može sadržati dva ili više hu7C2 ADC, trastuzumab-MCC-DM1 i pertuzumab u istoj ambalaži. Ambalaža može dalje sadržati oznaku ili umetak za pakovanje, na ili povezan sa ambalažom. Termin “dodatak za pakovanje” koristi se za upućivanje na uputstva koja su obično uključena u komercijalna pakovanja terapijskih proizvoda, koja sadrže informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, davanju, kontraindikacijama i/ili upozorenjima za upotrebu takvih terapijskih proizvoda. Pogodni kontejneri uključuju, na primer, boce, bočice, špriceve, blister pakovanja itd. Kontejner može biti izrađen od različitih materijala kao što su staklo ili plastika. Kontejner može sadržati hu7C2 ADC i, opciono, trastuzumab-MCC-DM1 i/ili pertuzumab ili njegovu formulaciju koja je efikasna za upotrebu u ovde opisanom postupku lečenja, a može imati i sterilni pristupni otvor (na primer, kontejner može biti vreća za intravenski rastvor ili bočica koja ima čep koji se može probosti iglom za hipodermijsku injekciju). Oznaka ili uložak pakovanja ukazuje da se sastav koristi u postupku lečenja kako je ovde opisano i zahtevano. Proizvodni proizvod može takođe sadržati još jednu ambalažu koja sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BVFI), fiziološki rastvor puferisan fosfatom, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Takođe može da obuhvata i druge materijale poželjne sa komercijalnog i korisničkog stanovišta, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.
[0428] Komplet može dalje sadržati uputstva za davanje hu7C2 ADC i, opciono, trastuzumab-MCC-DM1 i/ili pertuzumaba. Na primer, ako komplet sadrži prvi sastav koji sadrži hu7C2 ADC i drugu farmaceutsku formulaciju, komplet može dalje sadržati uputstva za istovremeno, uzastopno ili odvojeno davanje prve i druge farmaceutske kompozicije pacijentu kome je to potrebno.
[0429] Kompleti mogu biti pogodni za isporuku čvrstih oralnih oblika hu7C2 ADC i, opciono, trastuzumab-MCC-DM1 i/ili pertuzumaba, kao što su tablete ili kapsule. Takav komplet poželjno uključuje određeni broj jediničnih doza. Takvi kompleti mogu sadržati karticu sa doziranjem orijentisanim prema redosledu predviđene upotrebe. Primer takvog kompleta je „blister pakovanje”. Blister pakovanja su dobro poznata u industriji ambalaže i široko se koriste za pakovanje farmaceutskih jediničnih oblika doziranja. Po želji se može obezbediti memorijsko pomagalo, na primer u obliku brojeva, slova ili drugih oznaka ili sa kalendarskim uloškom, naznačujući dane u rasporedu lečenja u kojima se mogu primenjivati doze.
[0430] Komplet može sadržati (a) prvi kontejner sa hu7C2 ADC, i opciono, (b) drugi kontejner sa trastuzumabom-MCC-DM1 koji se u njemu nalazi i/ili sa pertuzumabom koji se u njemu nalazi. U nekim otelotvorenjima, komplet može sadržati (a) prvi kontejner sa hu7C2 ADC, (b) drugi kontejner sa trastuzumabom-MCC-DM1 koji se u njemu nalazi i (c) treći kontejner sa pertuzumabom koji se u njemu nalazi. Komplet može dalje sadržati ambalažu koja sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fiziološki rastvor puferisan fosfatom, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Takođe može da obuhvata i druge materijale poželjne sa komercijalnog i korisničkog stanovišta, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.
[0431] Tamo gde komplet sadrži sastav hu7C2 ADC i trastuzumab-MCC-DM1 i/ili pertuzumab, komplet može sadržati ambalažu za odvojene sastave kao što su podeljena bočica ili podeljeni paket folije, međutim, odvojeni sastavi mogu takođe koja se nalazi u jednoj nepodeljenoj ambalaži. Tipično, komplet sadrži uputstva za davanje odvojenih komponenti. Oblik kompleta je naročito koristan kada se odvojene komponente poželjno primenjuju u različitim oblicima doziranja (npr., oralno i parenteralno), ako se primenjuju u različitim intervalima doziranja ili kada lekar koji propisuje lekove želi titraciju pojedinačnih komponenti kombinacije.
[0432] Proizvod ovde može sadržati intravensku (IV) vreću koja sadrži stabilnu smešu hu7C2 ADC i pertuzumaba i/ili T-DM1 pogodnu za primenu pacijentu sa rakom. Po želji, smeša je u fiziološkom rastvoru; na primer sadrži oko 0,9% NaCl ili oko 0,45% NaCl. Primer IV vreće je poliolefinska ili polivinilhloridna infuzijska vreća, npr. vrećica od 250 ml IV. Smeša može sadržati oko 420 mg ili oko 840 mg pertuzumaba i od oko 100 mg do oko 160 mg T-DM1.
[0433] Po želji, smeša u IV vreći je stabilna do 24 sata na 5°C ili 30°C. Stabilnost smeše se može proceniti jednim ili više testova izabranih iz grupe koju čine: boja, izgled i jasnoća (CAC), analiza koncentracije i zamućenja, analiza čestica, hromatografija isključenja veličine (SEC), hromatografija sa jonoizmenjivanjem (IEC), elektroforeza kapilarnih zona (CZE), izoelektrično fokusiranje kapilarnih slika (iCIEF) i test potencije .
III. PRIMERI
[0434] Slede primeri postupaka i sastava pronalaska. Podrazumeva se da se mogu primeniti razna druga otelotvorenja, imajući u vidu iznad opisani opšti opis.
Primer 1: Humanizacija mišijeg 7C2 antitela
[0435] Anti-HER2 mišje antitelo 7C2 se vezuje za epitop u domenu I HER2. Videti npr., PCT objava br. WO 98/17797. Ovaj epitop se razlikuje od epitopa vezanog trastuzumabom, koji se vezuje za domen IV HER2, i epitopa vezanog pertuzumabom, koji se vezuje za domen II HER2. Pogledajte Slike 3, 16 i 18 Vezujući domen IV, trastuzumab remeti ligand-nezavisne HER2-HER3 komplekse, čime inhibira nizvodnu signalizaciju (npr. PI3K/AKT). Suprotno tome, vezivanje pertuzumaba za domen II sprečava interakciju HER2 vođenu ligandom sa drugim članovima HER porodice (npr. HER3, HER1 ili HER4), čime sprečava i prenošenje nižeg signala. Vezivanje MAb 7C2 za domen I ne dovodi do smetnji u vezivanju trastuzumaba ili pertuzumaba za domene IV, odnosno II, nudeći time potencijal kombinovanja MAb 7C2 ADC sa trastuzumabom, trastuzumabom emtanzinom (T-DM-1) i/ili pertuzumab.
[0436] Mišije antitelo 7C2 (7C2.B9, videti objava PCT br. WO 98/17797) je humanizovano na sledeći način.
A. Materijali i postupci
[0437] Brojevi ostataka su prema Kabatu (Kabat i dr., Sequences of proteins of immunological interest, 5. izd., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)).
[0438] Direktni hipervarijabilni region nakalemljuje se na prihvatljivi humani okvir konsenzusa. Varijante konstruisane tokom humanizacije 7C2 procenjene su u obliku IgG. VL i VH domeni iz mišjeg 7C2 bili su usklađeni sa konsenzus sekvencama humane VL kappa IV (VLKIV) i humane VH podgrupe I (VHI). Hipervarijabilni regioni (HVR) mišjeg antitela 7C2 (7C2.B9) projektovani su u VLKIVi VHi akceptorske okvire da bi se generisale CDR-varijante kalemljenja. Iz mu7C2 VL domena, položaji 24-34 (L1), 50-56 (L2) i 89-97 (L3) su usađeni u VLKI. Iz mu7C2 VH domena, položaji 26-35 (HI), 50-65 (H2) i 95-102 (H3) ugravirani su u VHI(Slike 1 i 2). Definicije HVR definisane su hipervarijabilnošću sekvence (Wu, T. T. & Kabat, E. A. (1970)), njihovom strukturnom lokacijom (Chothia, C. & Lesk, A. M. (1987)) i njihovo učešće u kontaktima antigen-antitelo (MacCallum i dr. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)). Da bi se procenili okvirni nonijski položaji koji bi mogli biti važni, izabrani nonijsi položaji vraćeni su u mišiju sekvencu. Nonijski položaji uključuju položaje 4 i 49 u VL i položaje 37, 67, 69, 71 i 73 u VH. Tri različite verzije VL sekvenci i VH sekvenci su sintetizovane (Blue Heron, Bothell, WA) i potom podklonirane u vektore ekspresije sisara. Kombinovanjem različitih verzija LC sa HC, ukupno devet različitih varijanti kalemljenja hu7C2 (v1.1, v1.2, v1.3, v2.1, v2.2, v2.3, v3.1, v3.2 i v3.3).
[0439] Biblioteka zrenja afiniteta. Korišćen je monovalentni Fag-g3 prikaz fagemidnog vektora sa 2 otvorena okvira za čitanje pod kontrolom jednog foA promotera. Prvi otvoreni okvir za čitanje sastoji se od stII signalne sekvence spojene sa VL i CH1 domenima akceptorskog lakog lanca, a drugi se sastoji od stII signalne sekvence stopljene sa VH i CH1 domenima akceptorskog teškog lanca praćene manjim slojem faga protein P3. Varijanta HVR kalema (7C2.v2.1) generisana je Kunkelovom mutagenezom korišćenjem odvojenih oligonukleotida za svaki hipervarijabilni region i prikazana na fagu kao Fab.
[0440] Da bi se poboljšao afinitet, generisane su biblioteke faga koje sadrže promene u svakom hipervarijabilnom regionu. Raznolikost sekvenci je uvedena odvojeno na svakom položaju u hipervarijabilnim regionima 7C2.v2.1 korišćenjem Kunkelove mutageneze. Položaji u hipervarijabilnom regionu 7C2.v2.1 bili su potpuno nasumično postavljeno jedan po jedan na svih mogućih 20 aminokiselina koristeći oligonukleotide koji kodiraju NNS. Ukupno je napravljeno 68 biblioteka, od kojih se svaka sastoji od 20 članova, sa jednim položajem smeštenim u jednom od hipervarijabilnih regiona 7C2 u potpunosti nasumično. Biblioteke sa
1
položajima u istom hipervarijabilnom regionu udružene su da generišu ukupno šest biblioteka.
[0441] Generisanje fagnih biblioteka. Oligonukleotidi dizajnirani da uvedu raznolikost u svaki hipervarijabilni region, kao što je iznad navedeno, fosforilisani su odvojeno u reakcijama od 20 µl koje sadrže 660 ng oligonukleotida, 50 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 20 mM DTT i 5 U polinukleotidnu kinazu za 1 h na 37°C.
[0442] Da bi se generisala biblioteka sazrevanja afiniteta, izvedeno je 68 pojedinačnih Kunkelovih reakcija mutageneze na PCR ploči sa 96 udubljenja. Iz reakcija fosforilisanih oligonukleotida (iznad) dodato je 2 µl u 500 ng Kunkel šablona u 50 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2u konačnoj zapremini od 25 µl. Smeša je žarena na 90°C 1 minut, 50°C 3 minuta, a zatim je ohlađena na ledu. Zatim je žareni obrazac popunjen dodavanjem 0,5 µl 10 mM ATP, 0,5 µl 10 mM dNTP (po 10 mM od dATP, dCTP, dGTP i dTTP), 1 µl 100 mM DTT, 1 µl 10X TM pufera (0,5 M Tris pH 7,5, 0,1 M MgCl2), 80 U T4 ligaze i 4 U T7 polimeraze u ukupnoj zapremini od 30 µl tokom 2 sata na sobnoj temperaturi. Ovi napunjeni i podvezani proizvodi su zatim transformisani u XL1-plave ćelije. Biblioteke koje sadrže položaje u istom CDR regionu su objedinjene i obnavljane u medijumu od 10 ml SOC tokom 1 sata na 37°C. Dodati su karbenicilin (50 µg/ml) i pomoćni fag M13/KO7 (MOI 10). Kulture su inkubirane još 30 minuta na 37°C i premeštene u 500 ml 2YT koji sadrži 50 µg/ml karbenicilina i 50 µg/ml kanamicina i uzgajane 20 sati na 37°C.
[0443] Selekcija faga. Her2 vanćelijski domen (Her2 ECD) biotiniliran je kroz slobodne amine koristeći NHS-PEG4-Biotin (Pierce). Za reakcije biotinilacije, u PBS je korišćen četvorostruki molarni višak biotinskog reagensa. Reakcije su praćene dijalizom u PBS.
[0444] Fage su sakupljeni iz supernatanta ćelijske kulture i suspendovani u PBS koji sadrži 1% BSA. Biblioteke faga su inkubirane sa biotiniliranim Her2 ECD na sobnoj temperaturi, a fag vezan za biotin-Her2 je zatim uhvaćen tokom 5 minuta na neutrAvidinu (10 µg/ml) koji je imobilizovan u PBS na MaxiSorp mikrotitarskim pločicama (Nunc) preko noći u 4°C. Mikrotitarska udubljenja su oprana opsežno PBS-om koji sadrži 0,05% Tween 20 (PBST), a vezani fag je eluiran inkubiranjem jažica sa 20 mM HCl, 500 mM KCl tokom 30 minuta. Eluirani fagi su neutralisani sa 1 M Tris, pH 7,5 i pojačani primenom XL1-plavih ćelija i pomoćnog faga M13/KO7 i uzgajani preko noći na 37°C u 2IT, 50 µg/ml karbenacilina i 50 µg/ml kanamicina. Da bi se procenilo obogaćivanje, titri faga eluirani iz udubljenja koje sadrži cilj upoređen su sa titrima faga izvučene iz udubljenja koja nije sadržavala metu. Strogost selekcije povećana je smanjenjem koncentracije biotinilovanog Her2 ECD (sa 5 nM na 0,2 nM) tokom vezivanja i povećanjem vremena takmičenja (od 0 do 60 minuta na sobnoj temperaturi) sa 1µM neobeleženog Her2 ECD u rastvoru.
[0445] Procena površinske plazmonske rezonance varijanti. Varijante 7C2 izražene su kao IgG 293 privremene transfekcije. IgG je prečišćen afinitetnom hromatografijom na proteinu G. Afinitet svake 7C2 IgG varijante prema Her2 određen je površinskom plazmonskom rezonancom korišćenjem BIAcoreT100. Čipovi senzora Biacore serije S CM5 imobilizovani su monoklonskim mišjim antitelom protiv humanog IgG (Fc) (komplet za hvatanje humanih antitela, GE Healthcare). Serijska trostruka razblaženja svake 7C2 varijante ubrizgavana su brzinom protoka od 30 µl/min. Svaki uzorak je analiziran 3-minutnom asocijacijom i 10-minutnom disocijacijom. Posle svakog ubrizgavanja čip se regeneriše pomoću 3 M MgCl2. Odgovor vezivanja je korigovan oduzimanjem RU od protočne ćelije koja je uhvatila irelevantan IgG slične gustine. Za analizu kinetike korišćen je Langurov model simultanog uklapanja koni koff.
B. Rezultati i diskusija
[0446] Humanizacija 7C2 Okviri za prihvatanje ljudi koji se koriste za humanizaciju 7C2 zasnovani su na ljudskom konsenzusu VL kappa IV (VLKIV) i humanom VHIkonsenzusu. VL i VH domeni mišjeg 7C2 bili su poravnati sa humanim VLKIVi VHIdomenima; hipervarijabilni regioni su identifikovani i usađeni u ljudski prihvatni okvir da bi se generisao 7C2.v1.1. Monovalentni afinitet 7C2.v1.1 je smanjen 2,5 puta u odnosu na mu7C2.B9 kako je procenjeno SPR (videti Tabelu 2).
Tabela 2: Afinitet 7C2 CDR kalemljenih antitela
2
[0447] Da bi se poboljšao afinitet vezivanja 7C2.v1.1, položaji 4 i 49 u lakom lancu i položaji 37, 67, 69, 71 i 73 u teškom lancu promenjeni su u ostatke nađene na ovim položajima u mu7C2.B9. Kombinacije ovih izmenjenih lakih i teških lanaca sa lancima iz 7C2.v1.1 transfektovane su u 293 ćelije, izražene kao IgG i prečišćene, a SPR je procenilo vezivanje za Her2 ECD (videti Tabelu 2). Varijanta 7C2.v3.3, koja sadrži 2 izmenjena položaja u lakom lancu i 5 izmenjenih položaja u teškom lancu, imala je monovalentni afinitet uporediv sa himernim mu7C2.B9 (videti Tabelu 2).
[0448] Biblioteke sazrevanja prema afinitetu su istražene u pokušaju da se regrutuju dalja poboljšanja koristeći okvir 7C2.v2.1, koji sadrži minimalno izmenjenu poziciju nonijusa (Y49K) u laganom lancu. Za svaki hipervarijabilni region, svih 20 aminokiselina je uvedeno odvojeno u pojedinačnom položaju koristeći Kunkel mutagenezu (ukupno 68 biblioteka, svaka od njih 20, udruženih u šest biblioteka za sazrevanje afiniteta). Šest biblioteka za sazrevanje po afinitetu je pakovano tokom 4 runde u rastvoru sa biotiniliranim Her2 ECD. Strogost selekcije je postepeno povećavana smanjenjem koncentracije biotin-Her2 ECD (sa 5 na 0,2 nM) i povećanjem vremena takmičenja (sa 0 na 1 sat na sobnoj temperaturi) zasićenom količinom neobeležene Her2 ECD. Primećeno je obogaćivanje faga od dve hiljade puta za H2 biblioteku.
[0449] Ukupno 588 klonova iz poslednjeg kruga je odabrano za analizu sekvence DNK. Pojedinačne promene sekvence su identifikovane u svakom HVR (videti Tabelu 3). Najzastupljeniji klonovi su imali promene u VH na položaju S53 u Met ili Leu. Varijante S53M i S53L izražene su kao što IgG i SPR analiza pokazuju da S53M i S53L imaju sličan afinitet sa Her2. Varijanta S53L je izabrana pošto je metionin sklon oksidaciji tokom proizvodnog procesa. Potencijalno mesto formiranja izo-asparaginske kiseline u HVR-H2 eliminisano je mutacijom S55A (videti Tabelu 4).
Tabela 3: Kinetika varijanti poboljšanih afinitetom
Tabela 4: Rezime afiniteta varijante hu7C2
[0450] Poravnanje humanih VLKIVi VHIdomena i varijabilnih regiona teškog lanca i lakog lanca mu7C2.B9 (“7C2”) i hu7C2.v2.2.LA (u sledećim primerima označeni kao “hu7C2”) prikazano je u Slike 1 i 2.
Primer 2: Proizvodnja konjugata protiv antitela hu7C2
[0451] Za veću proizvodnju antitela, antitela su proizvedena u CHO ćelijama. Vektori koji kodiraju teški laki i laki lanac transformisani su u CHO ćelije i IgG je prečišćen iz podloga ćelijske kulture pomoću afinitetne hromatografije proteina A.
A. Sinteza međujedinjenja leka za amidni veznik piridil disulfida PNU
[0452] Međujedinjenje leka piridil disulfid PNU amidnog veznika ((2S,4S)-4-[[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-metoksi-1-metil-3,4,4a,6,7,9,9a,10a-oktahidro-1H-pirano[1,2]oksazolo[3,4-b][1,4]oksazin-3-il]oksi]-2,5,12-trihidroksi-7-metoksi-6,11-diokso-N-[2-(2-piridildisulfanil)etil]-3,4-dihidro-1H-tetracen-2-karboksamid; “LD-51”) ima sledeću formulu.
je sintezovano kao što sledi. Prateći Primer 3 US 8389697, rastvoru PNU-159682 (15,3 mg, 0,02038 mmol), pripremljenom kako je navedeno u WO 1998/02446 i Primer 1 US 8470984, u 3 ml metanola i 2 ml H2O, dodat je rastvor NaIO4(5,1 mg, 0,0238 mmol) u 1 ml H2O. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 3 sata, sve dok se nije otkrio početni materijal (TLC i HPLC analiza). Rastvarači su uklonjeni pod smanjenim pritiskom i sirova crvena čvrsta supstanca (2S,4S)-2,5,12-trihidroksi-7-metoksi-4-{[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-metoksi-1-metiloktahidro-1H-pirano[4',3':4,5][1,3]oksazolo[2,3-c][1,4]oksazin-3-il]oksi}-6,11-diokso-1,2,3,4,6,11-heksahidrotetracen-2-karboksilna kiselina 51a je korišćena bez daljeg prečišćavanja u sledećem koraku. MS (ESI): 628 [M+H]<+>.
[0453] Rastvoru sirovog intermedijera 51a u bezvodnom dihlorometanu u atmosferi argona dodat je bezvodni trietilamin, TBTU (O-(Benzotriazol-1-il)-N,N,N',N--tetrametiluronijum tetrafluoroborat, takođe nazvan: N,N,N,N'-tetrametil-O-(benzotriazol-1-il)uronijum tetrafluoroborat, CAS br. 125700-67-6, Sigma-Aldrich B-2903), i N-hidroksisukcinimid za formiranje intermedijarnog NHS estra od 51a. Alternativno se mogu koristiti i drugi reagensi za spajanje kao što su DCC ili EDC. Posle jednog sata, dodat je 2-(piridin-2-ildisulfanil)etanamin hidrohlorid (CAS br. 106139-15-5) je dodat. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 30 minuta, sve dok nestane polazni materijal (HPLC-MS analiza). Rastvarač je isparen pod vakuumom, a ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na koloni na silika gelu, dajući LD-51. MS (ESI): 796,88 [M+H]<+>.
B. Sinteza međujedinjenja CBI-PBD lekova veznika
[0454] CBI-PBD dimer (piperazin-karbamat prolek)-2-propil piridil disulfid međujedinjenje veznik-leka (2-(2-piridildisulfanil)propil 3-[6-[1-(hlorometil)-5-(4-metilpiperazin-1-karbonil)oksi-1,2-dihidrobenzo[e]indol-3-il]-6-okso-heksoksi]-6-hidroksi-2-metoksi-11-okso-6a,7,8,9-tetrahidro-6H-pirolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-karboksilat; jedinjenje 81 iz Tabele A) ima formulu:
4
i CBI-PBD dimer (fosfat)-2-propil piridil disulfid međujedinjenje veznik-leka (2-(2-piridildisulfanil)propil 3-[6-[1-(hlorometil)-5-fosfonooksi-1,2-dihidrobenzo[e]indol-3-il]-6-okso-heksoksi]-6-hidroksi-2-metoksi-11-okso-6a,7,8,9-tetrahidro-6H-pirolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-karboksilat; jedinjenje 82 iz Tabele A) ima formulu:
je sintezovano kao što sledi. Za reakcionu šemu, uključujući reagens i srednje formule, videti Slike 9 i 10. Ova sinteza je takođe pogodna za proizvodnju 2-(2-piridildisulfanil)propil 3-[6-[1-(hlorometil)-5-hidroksi-1,2-dihidrobenzo[e]indol-3-il]-6-okso-hexoksi]-6-hidroksi-2-metoksi-11-okso-6a,7,8,9-tetrahidro-6H-pirolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-karboksilata (“CBI-PBD-2-propil piridil disulfid”).
[0455] Smeša 1 (1,40 g, 4,00 mmol, pripremljen po proceduri iz literature: J. Med. Chem. 2003, 46, 2132-2151), 2 (1,31 g, 5,22 mmol, pripremljeno sledeći literaturnu proceduru: WO2004065491 A1) i K2CO3(829 mg, 6,00 mmol) u suvom DMA (15 mL) mešano na sobnoj temperaturi 43 sata. Smeša je zatim razblažena sa EtOAc i H2O, dobro izmešana i slojevi su odvojeni. Organski sloj je ispran sa H2O (3 x), slanim rastvorom (1 x) i osušen (Na2SO4) i rastvarač je uklonjen pod vakuumom. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni na silika gelu upotrebom EtOAc:Hex 50:50 do 67:33 do 100:0 da bi se dobilo jedinjenje 3 (1,74 g, 84%) u obliku žutog ulja.<1>H NMR δ (400 MHz, CDCl3) 8,77 (br s, 1H), 7,79 (s, 1H), 6,82 (s, 1H), 6,02-5,92 (m, 1H), 5,36 (dq, J = 17,2, 1,5 Hz, 1H), 5,26 (dq, J = 10,4, 1,2 Hz, 1H), 4,69-4,60 (m, 2H), 4,47-4,39 (m, 1H), 4,28 (br s, 1H), 4,09-4,05 (m, 2H), 3,83 (s, 3H), 3,90-3,80 (m, 1H), 3,74-3,70 (m, 1H), 3,65-3,59 (m, 1H), 3,54-3,47 (m, 1H), 2,25 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 2,20-2,15 (m, 1H), 1,93-1,84 (m, 3H), 1,81-1,72 (m, 1H), 1,70-1,63 (m, 3H), 1,53-1,47 (m, 2H), 1,44 (s, 9H). HRMS m/z 543,2666 [(M+Na)<+>izračunato za C27H40N2NaO8543,2677].
[0456] Et3N (1,32 ml, 9,47 mmol) je dodat rastvoru 3 (821 mg, 1,58 mmol) u suvom DCM (6 mL) na sobnoj temperaturi. Zatim je dodat anhidrid sirćetne kiseline (0,75 ml, 7,93 mmol) i smeša je mešana na sobnoj temperaturi.4,5 h. Reakciona smeša je ohlađena na 0 °C i dodat je suv MeOH (1 mL) i smeša je mešana na 0 °C tokom 15 minuta. Zatim je dodat EtOAc (120 mL) i smeša je isprana sa H2O (2 x), slanim rastvorom (1 x), osušena (Na2SO4) i rastvarač uklonjen pod vakuumom da bi se dobilo jedinjenje 4 (891 mg, kvantitativno) koje je korišćeno u sledećem korak bez prečišćavanja.<1>H NMR δ (400 MHz, CDCl3) 8,88 (br s, 1H), 7,82 (s, 1H), 6,81 (s, 1H), 6,01-5,91 (m, 1H), 5,36 (dq, J = 17,2, 1,5 Hz, 1H), 5,25 (dq, J = 10,4, 1,3 Hz, 1H), 4,65-4,62 (m, 2H), 4,61-4,54 (m, 1H), 4,32-4,22 (m, 2H), 4,09-4,06 (m, 2H), 3,83 (s, 3H), 3,55-3,47 (m, 2H), 2,26-2,23 (m, 2H), 2,18-2,12 (m, 1H), 2,07 (s, 3H), 1,97-1,77 (m, 5H), 1,70-1,63 (m, 2H), 1,54-1,47 (m, 2H), 1,44 (s, 9H). HRMS m/z 585,2774 [(M+Na)<+>izračunato za C29H42N2NaO9585,2783].
[0457] Pirolidin (1,6 ml, 19,2 mmol) je dodat rastvoru 4 (1,06 g, 1,88 mmol) u suvom DCM (20 mL) na sobnoj temperaturi. Zatim je dodat Pd(PPh3)4(109 mg, 0,0943 mmol) i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 40 minuta. Reakciona smeša je isprana sa 0,25 M rastvorom HCl (2 x 75 ml), osušena (Na2SO4) i rastvarač uklonjen pod vakuumom. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni na silika gelu upotrebom EtOAc:Hex 50:50 do 100:0 da bi se dobilo jedinjenje 5 (726 mg, 81%) u obliku žutog ulja.<1>H NMR δ (400 MHz, DMSO-d6) 6,67 (s, 1H), 6,35 (s, 1H), 5,08 (s, 2H), 4,35-4,30 (m, 1H), 4,13-4,06 (m, 2H), 3,87 (t, J = 6,4 Hz, 2H), 3,63 (s, 3H), 3,50-3,44 (m, 1H), 3,42-3,35 (m, 1H), 2,21 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 2,07-2,00 (m, 1H), 2,01 (s, 3H), 1,89-1,82 (m, 1H), 1,77-1,67 (m, 4H), 1,59-1,51 (m, 2H), 1,44-1,36 (m, 2H), 1,39 (s, 9H). HRMS m/z 501,2573 [(M+Na)<+>izračunato za C25H38N2NaO7501,2571].
[0458] Difosgen (0,22 ml, 1,82 mmol) je dodat smeši 5 (726 mg, 1,52 mmol) i DMAP (557 mg, 4,56 mmol) u suvom DCM (25 ml) na sobnoj temperaturi pod azotom. Posle 30 minuta rastvor od 6 (2,60 g, 12,9 mmol; sveže napravljen iznad pomenutim postupkom - nije dodat nijedan broj prethodno dodeljen alkoholu) u suvom DCM (25 mL) i smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom noći. Posle 18 h reakciona smeša je isprana sa H2O (1 x), osušena (Na2SO4) i rastvarač uklonjen pod vakuumom. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni na silika gelu primenom DCM:EtOAc 100:0 do 95:5 do 94:6 dok se višak 6 ne eluira, a zatim EtOAc:Hex 70:30 dajući jedinjenje 7 (920 mg, 86%) kao bledo žuto ulje.<1>H NMR δ (400 MHz, DMSO-d6) 9,16 (br s, 1H), 8,45-8,43 (m, 1H), 7,83-7,78 (m, 2H), 7,25-7,21 (m, 1H), 7,15 (d, J = 2,8 Hz, 1H), 6,87 (s, 1H), 4,29 (br s, 1H), 4,17-3,99 (m, 4H), 3,92 (t, J = 6,4 Hz, 2H), 3,75 (s, 3H), 3,42-3,30 (m, 3H), 2,20 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 2,06-1,95 (m, 4H), 1,83 (br s, 1H), 1,77-1,68 (m, 4H), 1,58-1,49 (m, 2H), 1,43-1,36 (m, 2H), 1,39 (s, 9H), 1,29 (d, J = 6,8 Hz, 3H). HRMS m/z 706,2832 [(M+H)<+>izračunato za C34H48N3O9S2706,2826].
[0459] Smeša 7 (949 mg, 1,34 mmol) i K2CO3(1,85 g, 13,4 mmol) u DCM-MeOH (34 mL/17 mL) je mešana na sobnoj temperaturi 45 minuta. Smeša je razblažena DCM-om, sipana u ledenu H2O (200 mL), dobro izmešana i slojevi su odvojeni. Vodeni sloj je ekstrahovan DCM (1 x), kombinovani organski slojevi su osušeni (Na2SO4) i rastvarač uklonjen pod vakuumom. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni na silika gelu upotrebom DCM:EtOAc 100:0 do 50:50 da bi se dobilo jedinjenje 8 (808 mg, 91%) u obliku bledo žutog ulja.<1>H NMR δ (400 MHz, DMSO-d6) 9,20 (br s, 1H), 8,44 (d, J = 4,7 Hz, 1H), 7,81-7,80 (m, 2H), 7,25-7,20 (m, 2H), 6,94 (s, 1H), 4,75 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 4,17-3,99 (m, 3H), 3,92 (t, J = 6,4 Hz, 2H), 3,74 (s, 3H), 3,60-3,46 (m, 2H), 3,37-3,20 (m, 3H), 2,20 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 1,93-1,76 (m, 3H), 1,75-1,68 (m, 3H), 1,58-1,51 (m, 2H), 1,44-1,36 (m, 2H), 1,39 (s, 9H), 1,29 (d, J = 6,9 Hz, 3H). HRMS m/z 664,2721 [(M+H)<+>izračunato za C32H46N3O8S2664,2724].
[0460] (Diacetoksijodo)benzen (259 mg, 0,804 mmol) je dodat smeši 8 (349 mg, 0,526 mmol) i TEMPO (82,2 mg, 0,526 mmol) u suvom DCM (10 mL) na sobnoj temperaturi i reakciona smeša je mešana preko noći. Posle 24 h smeša je razblažena DCM i zasićenim vodenim rastvorom Na2S2O3i dobro izmešana. Slojevi su odvojeni i organski sloj je ispran zasićenim vodenim rastvoromNa2S2O3(1 x), zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3(1 x), osušen (Na2SO4) i rastvarač uklonjen pod vakuumom. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni na silika gelu upotrebom EtOAc:Hex 70:30 do 100:0 da bi se dobilo jedinjenje 9 (248 mg, 71%) u obliku bele pene<1>H NMR δ (400 MHz, DMSO-d6) 8,45-8,43 (m, 1H), 7,79-7,69 (m, 1H), 7,51-7,48 (m, 1H), 7,24-7,20 (m, 1H), 7,10 (s, 1H), 6,96 i 6,91 (2s, 1H), 6,55 (t, J = 5,9 Hz, 1H), 5,46 (dd, J = 8,9, 6,1 Hz, 1H), 4,31-4,21 (m, 1H), 4,02-3,84 (m, 3H), 3,80 i 3,79 (2s, 3H), 3,52-3,46 (m, 1H), 3,40-3,18 (m, 3H), 2,19-2,13 (m, 2H), 2,09-2,00 (m, 1H), 1,96-1,85 (m, 3H), 1,70-1,67 (m, 2H), 1,56-1,45 (m, 2H), 1,40-1,34 (m, 2H), 1,38 i 1,37 (2s, 9H), 1,15-1,10 (m, 3H). HRMS m/z 662,2592 [(M+H)<+>izračunato za C32H44N3O8S2662,2564].
[0461] Smeša 9 (254 mg, 0,384 mmol) i 4 M HCI u dioksanu (11 mL) mešana je na sobnoj temperaturi za 1 h 15 minuta. Rastvarač je uklonjen pod vakuumom na 25-30 °C da bi se dobilo jedinjenje 10 (162 mg, 70%) koje je korišćeno u sledećem koraku bez prečišćavanja.
[0462] Smeša 10 (161 mg, 0,266 mmol), 58b (195 mg, 0,542 mmol, sveže napravljeno iznad pomenutim postupkom), EDCI. HCl (253 mg, 1,32 mmol) i TsOH (19,5 mg, 0,113 mmol) u suvom DMA (5 mL) je mešan na sobnoj temperaturi preko noći, pod azotom. Posle 23 sata reakciona smeša je razblažena sa EtOAc i zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3i dobro izmešana. Slojevi su odvojeni, a vodeni sloj ekstrahovan sa EtOAc (1 x). Kombinovani organski slojevi su isprani sa H2O (1 x), slanim rastvorom (1 x), osušeni (Na2SO4) i rastvarač uklonjen pod vakuumom. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni na silika gelu primenom DCM:MeOH 100:0 do 93:7 i materijal je unapred ispravljen upotrebom DCM: MeOH 99:1 do 94:6 da bi se dobilo 11 (Jedinjenje br. 81, 118 mg, 47 %, HPLC čistoća: 98,0%) kao bledo žuta pena.<1>H NMR δ (400 MHz, DMSO-d6) 8,43-8,41 (m, 1H), 8,22 (s, 1H), 7,96 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,83 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,73-7,66 (m, 1H), 7,61-7,56 (m, 1H), 7,51-7,45 (m, 2H), 7,22-7,17 (m, 1H), 7,10 (s, 1H), 6,97 i 6,92 (2s, 1H), 6,56 (t, J = 6,0 Hz, 1H), 5,46 (dd, J = 9,1, 6,2 Hz, 1H), 4,42-4,20 (m, 4H), 4,05-3,76 (m, 7H), 3,80 i 3,79 (2s, 3H), 3,52-3,47 (m, 1H), 3,38-3,11 (m, 4H), 2,09-1,99 (m, 1H), 1,94-1,88 (m, 3H), 1,77-1,74 (m, 2H), 1,65-1,62 (m, 2H), 1,48-1,42 (m, 2H), 1,35-1,23 (m, 1H), 1,15-1,10 (m, 3H), 9H delimično prikriveni pomoću DMSO. HRMS m/z 969,3070 [(M+Na)<+>izračunato za C47H55ClN6NaO9S2969,3053].
[0463] Jedinjenje 82 je pripremano kao što sledi:
[0464] Smeša 10 (162 mg, 0,267 mmol), 66d (178 mg, 0,418 mmol, sveže napravljeno iznad pomenutim postupkom), EDCI. HCl (184 mg, 0,960 mmol) i TsOH (11 mg, 0,0639 mmol) u suvom DMA (5 mL) je mešan na sobnoj temperaturi preko noći, pod azotom. Posle 18,5 h reakciona smeša je razblažena sa EtOAc i H2O i dobro izmešana. Slojevi su odvojeni i organski sloj je ispran zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3(1 x), H2O (1 x), slanim rastvorom (1 x), osušen (Na2SO4) i rastvarač uklonjen pod vakuumom. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni na silika gelu upotrebom EtOAc:MeOH 100:0 do 95:5 da bi se dobio žuti ostatak. Ovo je dalje prečišćeno preparativnom HPLC (kolona: Synergi-MAX RP 4 µ, 21,20 x 250 mm; protok: 12 mL/min; mobilna faza: rastvarač A: H2O/amonijum-formiat pufer pH 3,45, rastvarač B: MeCN/H2O 90:10; postupak: gradijent, rastvarač A: rastvarač B 90:10 do 10:90 do 0:100 tokom 30 minuta) dajući jedinjenje 12 (89,3 mg, 33%, HPLC čistoća: 99,5%) kao bela pena.<1>H NMR δ (400 MHz, DMSO-d6) 8,56 (s, 1H), 8,43-8,41 (m, 1H), 8,04 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,92 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,73-7,67 (m, 1H), 7,60-7,56 (m, 1H), 7,51-7,45 (m, 2H), 7,22-7,17 (m, 1H), 7,10 (s, 1H), 6,98 i 6,92 (2s, 1H), 6,55 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 5,47-5,44 (m, 1H), 4,40-4,36 (m, 1H), 4,30-4,19 (m, 3H), 4,04-3,86 (m, 4H), 3,86-3,75 (m, 1H), 3,80 i 3,79 (2s, 3H), 3,52-3,46 (m, 1H), 3,38-3,22 (m, 3H), 3,21-3,15 (m, 1H), 2,09-1,99 (m, 1H), 1,94-1,85 (m, 3H), 1,78-1,74 (m, 2H), 1,69-1,60 (m, 2H), 1,55-1,40 (m, 2H), 1,47 i 1,47 (2s, 18H), 1,28-1,23 (m, 1H), 1,15-1,10 (m, 3H). HRMS m/z 1035,3162 [(M+Na)<+>izračunato za C49H62ClN4NaO11PS21035,3175].
[0465] Smeša 12 (84,0 mg, 0,0829 mmol) i TFA (1 mL) u suvom DCM (2 mL) je mešana na sobnoj temperaturi 40 minuta. Rastvarač je zatim uklonjen pod vakuumom na 25 °C da bi se dobio zeleni ostatak. Ostatak je rastvoren u DCM, rastvor je razblažen sa EtOAc i DCM je uklonjen pod vakuumom da bi se dobila bela čvrsta supstanca, a preostali rastvarač je pretočen. Ovaj postupak je ponovljen i rezultujuća čvrsta supstanca je triturisana sa EtOAc i osušena da bi se dobilo 13 (Jedinjenje 82 iz Tabele A, 43,8 mg, 59%, HPLC čistoća: 93,8%) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR δ (400 MHz, DMSO-d6) 8,47 (s, 1H), 8,44-8,42 (m, 1H), 8,08 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,90 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,74-7,68 (m, 1H), 7,58-7,54 (m, 1H), 7,51-7,48 (m, 1H), 7,47-7,43 (m, 1H), 7,22-7,18 (m, 1H), 7,10 (s, 1H), 6,98 i 6,93 (2s, 1H), 5,46 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 4,39-4,18 (m, 4H), 4,04-3,95 (m, 3H), 3,90-3,85 (m, 1H), 3,84-3,76 (m, 1H), 3,80 i 3,80 (2s, 3H), 3,52-3,47 (m, 1H), 3,40-3,27 (m, 3H), 3,21-3,15 (m, 1H), 2,10-2,02 (m, 1H), 1,94-1,88 (m, 3H), 1,78-1,74 (m, 2H), 1,69-1,60 (m, 2H), 1,48-1,42 (m, 2H), 1,35-1,23 (m, 1H), 1,16-1,10 (m, 3H), 3H nije posmatrano. HRMS m/z 923,1938 [(M+Na)<+>izračunato za C41H46ClN4NaO11PS2923,1923].
[0466] Jedinjenje 83 je pripremano kao što sledi:
[0467] Smeša 10 (45,0 mg, 0,0743 mmol), 67d (24,3 mg, 0,0899 mmol, sveže napravljeno iznad pomenutim postupkom), EDCI. HCl (42,7 mg, 0,223 mmol) i TsOH (3 mg, 0,0174 mmol) u suvom DMA (3 mL) je mešan na sobnoj temperaturi pod azotom na 5 sati. Dodatni delovi 67d (24,3 mg, 0,0899 mmol) i EDCI. HCl (16,0 mg, 0,0835 mmol) su dodati smeši i reakcija je mešana na sobnoj temperaturi. preko noći. Posle 22 sata reakciona smeša je razblažena sa EtOAc i isprana sa H2O (2 x), slanim rastvorom (1 x), osušena (Na2SO4) i rastvarač uklonjen pod vakuumom. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni na silika gelu upotrebom EtOAc da bi se dobio zeleni prah. Ovo je dalje prečišćeno sprovodeći hromatografiju na koloni na silika gelu koristeći EtOAc drugi put dajući 14 (Jedinjenje 83 iz Tabele A, 8,3 mg, 13,5%, HPLC čistoća: 81,2%) kao bež čvrsta supstanca.<1>H NMR δ (400 MHz, DMSO-d6) 10,33 (s, 1H), 8,43-8,42 (m, 1H), 8,07 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,98 (s, 1H), 7,77 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,74-7,67 (m, 1H), 7,50-7,46 (m, 2H), 7,33-7,29 (m, 1H), 7,24-7,18 (m, 1H), 7,10 (s, 1H), 6,98 i 6,92 (2s, 1H), 6,56 (t, J = 6,0 Hz, 1H), 5,47-5,44 (m, 1H), 4,33-4,21 (m, 2H), 4,15-4,13 (m, 2H), 4,05-3,93 (m, 3H), 3,90-3,75 (m, 2H), 3,80 i 3,79 (2s, 3H), 3,52-3,47 (m, 1H), 3,38-3,13 (m, 4H), 2,10-1,99 (m, 1H), 1,94-1,89 (m, 3H), 1,77-1,74 (m, 2H), 1,66-1,62 (m, 2H), 1,52-1,41 (m, 2H), 1,32-1,24 (m, 1H), 1,15-1,10 (m, 3H). HRMS m/z 843,2258 [(M+Na)<+>izračunato za C41H45ClN4NaO8S2843,2260].
[0468] Jedinjenje 85 je pripremano kao što sledi:
Rastvoru od 82 (15 mg, 16,64 umol) u DMF (1,0 ml) dodat je rastvor 5-nitropiridin-2-tiola (25,99 mg, 166,41 umol) na 20 °C. Reakciona smeša je mešana na 20°C 1 h. Reakciona smeša je filtrirana i prečišćena pomoću prep-HPLC (FA) da bi se dobila 2-((5-nitropiridin-2-il)disulfanil)propil (11aS)-8-((6-((S)-1-(hlorometil)-5-(fosfonooksi)-1,2-dihidro-3H-benzo[e]indol-3-il)-6-oksoheksil)oksi)-11-hidroksi-7-metoksi-5-okso-2,3,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-karboksilat 85 (7,5 mg, 47,62%) kao siva čvrsta supstanca. LCMS: (10-80, CD_NEG, 3,0 min), 1,161 min, MS = 944,2 [M-1]-;<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9,18 (s, 1H), 8,41 (br, 1H, J = 7,6 Hz), 8,11 (br, 1H), 7,80 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 7,67 (d, 1H, J = 8,4 Hz), 7,46 (d, 1H, J = 7,6 Hz), 7,30 (s, 1H), 7,07 (s, 1H), 6,99-6,93 (m, 1H), 5,52 (d, 1H, J = 8,4 Hz), 4,26-4,14 (m, 4H), 3,98-3,80 (m, 4H), 3,76 (s, 3H), 3,40-3,26 (m, 5H), 2,40-2,28 (m, 2H), 2,10-1,80 (m, 5H), 1,79-1,55 (m, 5H), 1,40 (br, 1H), 1,19 (s, 1H), 1,12 (d, 3H, J = 8,8 Hz).
[0469] Jedinjenje 86 je pripremano kao što sledi:
Korak A: Sinteza (S)-di-terc-butil(1-(hlorometil)-3-(2,2,2-trifluoroacetil)-2,3-dibidro-1H-benzo[e]indol-5-il) fosfata 1u
[0470]
[0471] U mešani homogeni rastvor terc-butil (S)-1-(hlorometil)-5-hidroksi-1,2-dihidro-3H-benzo[e]indol-3-karboksilata (3,34 g, 10,0 mmol) u suvom DCM (25 ml) na 20 °C u atmosferi azota dodat je 4M HCI u dioksanu (12,5 ml, 50,0 mmol). Posle dodavanja, reakciona smeša je mešana na 20 °C pod azotom još 20 h. Smeša je razblažena petrolej etrom (250 mL) i mešana na 20 °C pod azotom tokom 20 minuta. Rastvarači su pretočeni i postupak je ponovljen još jednom sa petrolej etrom (250 mL). Dobijena čvrsta supstanca je sušena u vakuumu na 25 °C tokom 1 sata da bi se dobio (S)-1-(hlorometil)-2,3-dihidro-1H-benzo[e]indol-5-ol hidrohlorid (2,7 g, 100%) ;<1>H NMR [(CD3)2SO] δ 10,80 (s, 1 H), 8,15 (d, J = 8,3 Hz, 1 H), 7,87 (d, J = 8,2 Hz, 1 H), 7,58 (br t, J = 7,5 Hz, 1 H), 7,43 (br t, J = 7,4 Hz, 1 H), 6,81 (s, 1 H), 4,27-4,17 (m, 1 H), 4,01 (dd, J = 11,0, 3,2 Hz, 1 H), 3,93-3,74 (m, 3 H), 2 protoni nisu posmatrani. Sirovi proizvod je korišćen za sledeći korak bez daljeg prečišćavanja.
[0472] U mešanu heterogenu smešu (S)-1-(hlorometil)-2,3-dihidro-1H-benzo[e]indol-5-ol hidrohlorida (2,7 g, 10,0 mmol) u suvom DCM (10 mL) i dioksana (30 mL) na 0 °C u atmosferi azota dodat je trifluorosirćetni anhidrid (TFAA) (3,4 ml, 24,0 mmol), praćen diizopropiletilaminom (DIPEA) (8,71 ml, 50,0 mmol). Posle dodavanja, reakciona smeša je mešana na 0 °C pod azotom još 50 minuta. Dodat je etil acetat (400 ml) i dodat je 1 HC1 (200 mL) na 0 °C i smeša je mešana 20 minuta pod azotom. Sloj etil acetata je odvojen, uzastopno ispran sa IN HCI (200 mL) i vodom (2x200 mL), a zatim osušen (MgS04) i uparen pod smanjenim pritiskom na temperaturi kupatila od 25 °C da bi se dobio (S)-1-(1-(hlorometil)-5-hidroksi-1,2-dihidro-3H-benzo[e]indol-3-il)-2,2,2-trifluoroetan-1-on (3,3 g, 100%) kao zeleno-siva čvrsta supstanca. Ovaj materijal je upotrebljen za sledeći korak bez daljeg prečišćavanja
[0473] Mešanom homogenom rastvoru (S)-1-(1-(hlorometil)-5-hidroksi-1,2-dihidro-3H-benzo[e]indol-3-il)-2,2,2-trifluoroetan- 1-on (3,3 g, 10,0 mmol) u suvom THF (40 ml) na 20 °C u atmosferi azota dodan je di-tercbutil-N,N-diizopropilfosforamidit (4,31 ml, 13,0 mmol). Posle dodavanja, reakciona smeša je mešana na 20 °C pod azotom 5-10 minuta, a zatim je kapanjem u toku 17 minuta dodat tetrazol (3% rastvor u CH3CN, 38,0 ml, 13,0 mmol). Konačna reakciona smeša je dalje mešana na 20 °C pod azotom tokom 19 sati. Smeša je ohlađena u ledenom kupatilu i dodato je 30% H2O2(11,3 mL, 100,0 mmol). Posle dodavanja, reakciona smeša je mešana na 20 °C još 1 h 30 min. Smeša je razblažena etil acetatom (300 mL) i 10% vodenim rastvorom Na2S2O3(500 mL) na 20 minuta mešanja na 0 °C. Etil acetatni sloj je odvojen i uzastopno ispran vodom (200 mL), zasićenim NaHCO3(200 mL) i vodom (200 mL), a zatim osušen (MgSO4) i isparen pod redukovanim pritiskom na temperaturi kupatila od 25 °C, dajući ulje boje ćilibara. Prečišćavanjem hromatografijom na silika gelu (eluiranje etil acetatom:petrolej etar 1:3) dobija se 1u (4,7 g, 90%) kao bezbojna penasta čvrsta supstanca, tt 39-42 °C; [α]D-61,8°(c 1,02, CHCl3). Anal. (C23H28ClF3NO5P) Izrač.: C, 52,93; H, 5,41; N, 2,68. Pronađeno: C, 53,05; H, 5,43; N, 2,80.
Korak B: Sinteza ((S)-1-(2 -((((4-((S)-2-(((aliloksi)karbonil)amino)-6-((terc-butoksikarbonil)amino) heksanamido)benzil)oksi)karbonil)amino)-4-((6-((S)-1-(hlorometil)-5-((di-terc-butoksifosforil)oksi)-1,2-dihidro-3H-benzo[e]indol-3-il)-6-oksoheksil)oksi)-5-metoksibenzoil)pirolidin-2-il)metil acetat 3g
[0474]
[0475] U mešani rastvor 2,2,2-trihloroetil (S)-6-(5-(((aliloksi)karbonil)amino)-4-(2-(hidroksimetil)pirolidin-1-karbonil)-2-metoksifenoksi)heksanoat 3a (4,14 g, 6,95 mmol) (J. Med. Chem.2003, 46, 2132-2151) u suv DCM (25 mL) dodan je anhidrid sirćetne kiseline (3,30 ml, 34,8 mmol) i trietilamin (5,81 ml, 41,7 mmol). Smeša je mešana na 20 °C 3 h 30 minuta. Suvi MeOH (4,0 mL) je dodat i smeša je mešana 30 minuta. Smeša je podeljena između EtOAc (400 mL) i vode (400 mL). Sloj EtOAc je odvojen, ispran vodom (2x200mL), a zatim osušen (MgSO4) i uparen da bi se dobio 2,2,2-trihloroetil (S)-6-(4-(2-(acetoksimetil) pirolidin-1-karbonil )-5-(((aliloksi) karbonil) amino) -2-metoksifenoksi) heksanoat 3b (4,28 g, 96%) u obliku ulja; [α]D-57,4° (c 0,21, CHCl3);<1>H NMR [(CD3)2SO] δ 9,10 (s, 1 H), 7,17 (s, 1 H), 6,87 (s, 1 H), 6,01-5,87 (m, 1 H), 5,32 (dd, J = 17,2, 1,5 Hz, 1 H), 5,21 (dd, J = 10,4, 1,4 Hz, 1 H), 4,89 (s, 2 H), 4,54 (d, J = 5,4 Hz, 2 H), 4,39-4,20 (m, 3 H), 3,93 (t, J = 6,4 Hz, 2 H), 3,75 (s, 3 H), 3,46-3,27 (m, 2 H), 2,13-1,90 (m, 4 H), 1,89-1,60 (m, 7 H), 1,54-1,40 (m, 2 H), 2 protoni zaklonjeni vrhom DMSO. HRMS (ESI) m/z izrač. za C27H36Cl3N2O9: 637,1481, pronađeNO:637,1475 [MH<+>]; izrač. za C27H35Cl3N2NaO9: 659,1300, pronađeNO:659,1303 [MNa<+>]; izrač. za C27H35Cl3KN2O9: 675,1040, pronađeNO:675,1035 [MK<+>].
[0476] Mešanom rastvoru 3b (4,27 g, 6,69 mmol) u acetonu (75 mL), vodi (50 mL) i THF (30 mL) dodan je cink u prahu (17,5 g, 268 mmol) i NH4CI (28,6 g, 535 mmol). Smeša je mešana na 20°C pod atmosferom azota tokom 42 sata. Dodat je aceton (100 ml), smeša je mešana 10 minuta, a supernatant je pretočen. Postupak je ponovljen dva puta i kombinovani supernatanti su ispareni pod redukovanim pritiskom da bi se uklonili aceton i THF. Ostatak je razblažen vodom (50 mL) i zakiseljen vodenom otopinom 1N HCI do pH oko. 1. Kisela smeša je isprana petrolej etrom (2x200 mL) i ekstrahovana sa EtOAc (400 mL). Ekstrakt EtOAc je ispran vodom (200 ml) i osušen (MgSO4) a rastvarač je isparen da bi se dobio (S)-6-(4-(2-(acetoksimetil)pirolidin-1-karbonil)-5-(((aliloksi)karbonil)amino)-2-metoksifenoksi) heksanska kiselina 3c (2,72 g, 80%) u obliku ulja;
[α]D-73,5° (c 1,12, CHCl3);<1>H NMR [(CD3)2SO] δ 11,99 (s, razmenljiv sa D2O, 1 H), 9,10 (s, razmenljiv sa D2O, 1 H), 7,17 (s, 1 H), 6,87 (s, 1 H), 6,00-5,86 (m, 1 H), 5,32 (dd, J = 17,2, 1,5 Hz, 1 H), 5,20 (dd, J = 10,4, 1,5 Hz, 1 H), 4,57-4,52 (m, 2 H), 4,37-4,03 (m, 3 H), 3,93 (t, J = 6,5 Hz, 2 H), 3,75 (s, 3 H), 3,40-3,10 (m, 2 H), 2,23 (t, J = 7,3 Hz, 2 H), 2,07-1,93 (m, 4 H), 1,89-1,66 (m, 5 H), 1,62-1,49 (m, 2 H), 1,47-1,34 (m, 2 H). HRMS (ESI) m/z izrač. za C25H35N2O9: 507,2337, pronađeNO:507,2340 [MH<+>]; izrač. za C25H34KN2O9: 545,1896, pronađeNO:545,1906 [MK<+>]; izrač. za C25H34N2NaO9: 529,2157, pronađeNO:529,2169 [MNa<+>].
[0477] U mešani rastvor (S) -di-terc-butil(1-(hlorometil)-3-(2,2,2-trifluoroacetil)-2,3-dibidro-1H-benzo[e]indol-5-il)fosfatu 1u (1,38 g, 2,64 mmol) u MeOH (10 ml) na 0°C u atmosferi azota dodan je Cs2CO3(1,03 g, 3,17 mmol). Smeša je mešana na 0°C tokom 2 sata i 30 minuta, a zatim je podeljena između EtOAc (200 mL) i vode (150 mL). Sloj EtOAc je odvojen i ponovo ispran vodom (100 mL), a zatim osušen (MgSO4)
1
i isparen pod redukovanim pritiskom na temperaturi kupanja od 25 ° C da bi se dobio (S)-di-terc-butil (1-( hlorometil)-2,3-dihidro-1H-benzo[e]indol-5-il) fosfat 1v (1,17 g) kao bledo žuta penasta čvrsta supstanca koja je obrađena sa 3c (1,24 g, 2,45 mmol), EDCI. HCl (1,41 g, 7,35 mmol) i p-toluensulfonska kiselina (84 mg, 0,49 mmol) u suvom DMA (14 mL) na 0-20°C tokom 22 sata. Smeša je podeljena između EtOAc (400 mL) i vode (300 mL). Sloj EtOAc je odvojen i ponovo ispran vodom (100 mL), a zatim osušen (MgSO4) i isparen. Prečišćavanje hromatografijom na silika gelu (eluiranje sa EtOAc:petrolej etar 2:1) dalo je ((S)-1-(2-(((aliloksi)karbonil)amino)-4-((6-((S)-1-(hlorometil)-5-((di-terc-butoksifosforil)oksi)-1,2-dihidro-3H-benzo[e]indol-3-il)-6-oksoheksil)oksi)-5-metoksibenzoil)pirolidin- 2-il)metil acetat 3d (1,49 g, 66%) kao bledo žuta penasta čvrsta supstanca, mp 55-59°C; [α]D-68,0° (c 1,00, CHCl3);<1>H NMR [(CD3)2SO] δ 9,10 (s, razmenljiv sa D2O, 1 H), 8,56 (s, 1 H), 8,03 (d, J = 8,1 Hz, 1 H), 7,92 (d, J = 8,4 Hz, 1 H), 7,57 (t, J = 8,1 Hz, 1 H), 7,47 (t, J = 7,6 Hz, 1 H), 7,19 (s, 1 H), 6,86 (s, 1 H), 5,99-5,86 (m, 1 H), 5,32 (dd, J = 17,2, 1,6 Hz, 1 H), 5,20 (dd, J = 10,4, 1,5 Hz, 1 H), 4,53 (d, J = 5,4 Hz, 2 H), 4,45-3,84 (m, 10 H), 3,74 (s, 3 H), 3,44-3,26 (m, 2 H), 2,68-2,47 (m, 2 H), 2,02 (br s, 3 H), 1,93-1,43 (m, 10 H), 1,474 i 1,469 (2 s, 18 H). HRMS (ESI) m/z izračunato za C46H62ClN3O12P: 914,3754, pronađeNO:914,3749 [MH<+>]; izrač. za C46H61ClKN3O12P: 952,3313, pronađeNO:952,3381 [MK<+>]; izrač. za C46H61ClN3NaO12P: 936,3574, pronađeNO:936,3589 [MNa<+>].
[0478] Mešanom rastvoru 3d (548 mg, 0,60 mmol) u DCM (8 ml) na 20°C u atmosferi azota dodat je Pd(Ph3P)4(17,1 mg; 9,8% Pd) i pirolidin (0,49 ml, 6,00 mmol). Smeša je mešana na 20°C tokom 30 minuta, a zatim je podeljena između EtOAc (200 mL) i vode (150 mL). Sloj EtOAc je odvojen i ponovo ispran vodom (50 mL), a zatim osušen (MgSO4) i isparen pod smanjenim pritiskom na temperaturi kupke od 25°C. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na silika gelu (eluiranje sa EtOAc:MeOH 50:1) da bi se dobio ((S)-1-(2-amino-4-((6-((S)-1-(hlorometil)-5-((di-terc-butoksifosforil)oksi)-1,2-dihidro-3H-benzo[e]indol-3-il)-6-oksoheksil)oksi)-5-metoksibenzoil)pirolidin- 2-il)metil acetat 3e (323 mg, 65%) kao bledo žuta penasta čvrsta supstanca, mp 46-49°C; [α]D-85,2° (c 0,36, CHCl3);<1>H NMR [(CD3)2SO] δ 8,56 (s, 1 H), 8,04 (d, J = 8,3 Hz, 1 H), 7,93 (d, J = 8,4 Hz, 1 H), 7,58 (t, J = 8,2 Hz, 1 H), 7,47 (t, J = 8,1 Hz, 1 H), 6,67 (s, 1 H), 6,37 (s, 1 H), 5,09 (s, razmenljiv sa D2O, 2 H), 4,46-3,85 (m, 10 H), 3,63 (s, 3 H), 3,52-3,34 (m, 2 H), 2,69-2,50 (m, 2 H), 2,08-1,94 (m, 1 H), 2,01 (s, 3 H), 1,91-1,61 (m, 7 H), 1,58-1,44 (m, 2 H), 1,476 i 1,470 (2 s, 18 H). HRMS (ESI) m/z izračunato za C42H58ClN3O10P: 830,3522, pronađeNO:830,3543 [MH<+>].
[0479] Mešanom rastvoru 3e (293 mg, 0,35 mmol) i DMAP (202 mg, 1,65 mmol) u suvom DCM (7 ml) na 20°C u atmosferi azota dodat je rastvor difosgena u suvom DCM (0,05 M, 6,7 ml, 0,33 mmol). Smeša je mešana 25 minuta, a zatim rastvor alil terc-butil (6-((4-(hidroksimetil)fenil)amino)-6-oksoheksan-1,5-diil) (S)-dikarbamata 3f (1,54 g , 3,54 mmol) u suv DCM (20 mL). Smeša je mešana na 20°C pod atmosferom azota tokom 68 sata, a zatim je podeljena između EtOAc (300 mL) i vode (200 mL). Sloj EtOAc je odvojen, ponovo ispran vodom (100 mL), a zatim osušen (MgSO4) i isparen na temperaturi kupke od 30°C. Dobijeno narandžasto ulje prečišćeno je hromatografijom na silika gelu (eluiranje sa EtOAc:MeOH:petroleter 30:0,5:10) da bi se dobilo ((S-1-(2-((((4-((S)-2-(((aliloksi)karbonil)amino)-6-((tercbutoksikarbonil)amino)heksanamido)benzil)oksi)karbonil)amino)-4-((6-((S)-1-(hlorometil)-5-((di-tercbutoksifosforil)oksi)-1,2-dibidro-3H-benzo[e]indol-3-il)-6-oksoheksil)oksi)-5-metoksibenzoil) pirolidin-2-il)metil acetat 3g (385 mg, 84%) kao penasta čvrsta supstanca, mp 72-75°C; [α]D-55,2° (c 0,53, CHCl3);<1>H NMR [(CD3)2SO] δ 10,04 (s, razmenljiv sa D2O, 1 H), 9,12 (br s, razmenljiv sa h D2O, 1 H), 8,56 (s, 1 H), 8,03 (d, J = 8,3 Hz, 1 H), 7,92 (d, J = 8,4 Hz, 1 H), 7,65-7,52 (m, 3 H, redukovan na 2 H nakon D2O), 7,46 (t, J = 7,8 Hz, 2 H), 7,31 (d, J = 8,5 Hz, 2 H), 7,20 (br s, 1 H), 6,86 (s, 1 H), 6,75 (loše rešen t, razmenljiv sa D2O, 1 H), 5,97-5,83 (m, 1 H), 5,30 (br d, J= 17,3 Hz, 1 H), 5,17 (br d, J = 10,6 Hz, 1 H), 5,18-4,97 (m, 2 H), 4,51-3,85 (m, 13 H), 3,74 (s, 3 H), 3,43-3,23 (m, 2 H, delimično zaklonjen vodenim vrhom), 2,94-2,83 (m, 2 H), 2,65-2,50 (m, 2 H, delimično zaklonjen DMSO vrhom), 2,07-1,91 (m, 1 H), 2,01 (br s, 3 H), 1,88-1,43 (m, 11 H), 1,473-1,468 (2 s, 18 H), 1,43-1,20 (m, 4 H), 1,35 (s, 9 H). HRMS (ESI) m/z izračunato za C65H89ClN6O17P: 1291,5665, pronađeNO:1291,5705 [MH<+>]; izrač. za C65H88ClKN6O17P: 1329,5262, pronađeNO:1329,5264 [MK<+>]; izrač. za C65H88ClN6NaO17P: 1313,5554, pronađeNO:1313,5524 [MNa<+>].
Korak C: Sinteza 86
[0480]
2
[0481] Smeša 3g (366 mg, 0,28 mmol) i K2CO3(1,14 g, 8,24 mmol) u DCM (9 mL) i MeOH (9 mL) mešana je na 0°C tokom 3 sata i 30 minuta. Smeša je mešana sa hladnim EtOAc (200 mL) i ledenom kupkom (150 mL) tokom 10 minuta. Sloj EtOAc je odvojen, ponovo ispran vodom (100 ml), a zatim osušen (MgS04) i uparen na temperaturi kupatila od 25°C da bi se dobio alil terc-butil ((S)-6-((4-((((5-((6-((S)-1-(hlorometil)-5-((di-terc-butoksifosforil)oksi)-1,2-dihidro-3H-benzo[e]indol-3-il)-6-oksoheksil)oksi)-2-((S)-2-(hidroksimetil)pirolidin-1-karbonil)-4-metoksifenil)karbamoil)oksi)metil)fenil)amino)-6-oksoheksan-1,5-diol)dikarbamat 3h (343 mg, 97%) kao bezbojna penasta čvrsta supstanca, mp 71-75°C; [α]D-58,2° (c 0,57, CHCl3);<1>H NMR [(CD3)2SO] δ 10,04 (s, razmenljiv sa D2O, 1 H), 9,11 (br s, razmenljiv sa D2O, 1 H), 8,56 (s, 1 H), 8,03 (d, J = 8,3 Hz, 1 H), 7,92 (d, J = 8,4 Hz, 1 H), 7,65-7,53 (m, 3 H, redukovan na 2 H nakon D2O), 7,46 (t, J = 7,6 Hz, 2 H), 7,32 (d, J = 8,6 Hz, 2 H), 7,27 (br s, 1 H), 6,93 (s, 1 H), 6,75 (loše rešen t, razmenljiv sa D2O, 1 H), 5,97-5,82 (m, 1 H), 5,29 (br d, J = 17,2 Hz, 1 H), 5,17 (br d, J = 10,5 Hz, 1 H), 5,03 (br s, 2 H), 4,73 (t, J = 5,8 Hz, razmenljiv sa D2O, 1 H), 4,50-3,82 (m, 11 H), 3,74 (s, 3 H), 3,62-3,44 (m, 2 H), 3,40-3,21 (m, 2 H, delimično zaklonjen vodenim vrhom), 2,95-2,80 (m, 2 H), 2,65-2,50 (m, 2 H, delimično zaklonjen DMSO vrhom), 1,93-1,21 (m, 16 H), 1,473-1,468 (2 s, 18 H), 1,35 (s, 9 H). HRMS (ESI) m/z izrač. za C63H86ClKN6O16P: 1287,5158, pronađeNO:1287,5113 [MK<+>]; izrač. za C63H86ClN6NaO16P: 1271,5419, pronađeNO:1271,5381 [MNa<+>].
[0482] U mešani rastvor od 3h (322 mg, 0,26 mmol) u suvom DCM (14 mL) na 0°C dodat je Dess-Martin perjodinan (DMP) (131 mg, 0,31 mmol) u delovima tokom 3 minuta. Reakciona smeša je mešana na 0°C još 2 sata, a zatim na 20°C tokom 50 sati. Smeša je razblažena sa DCM (40 ml) i 10% Na2S2O3(40 ml), mešana je na 20°C tokom 10 minuta, a zatim je podeljena između DCM (200 ml) i zasićenog rastvora NaHCO3(150 ml). DCM sloj je odvojen, a vodeni sloj je dalje ekstrahovan sa DCM (2x50 mL). Kombinovani DCM ekstrakti su isprani zasićenim rastvorom NaHCO3(2x100 mL) i vodom (2x100 mL), a zatim sušeni (MgSO4) i isparen na temperaturi kupke od 25°C. Dobijeno narandžasto ulje prečišćeno je hromatografijom na silika gelu (eluiranje sa CHCl3:MeOH 40:1) da bi dalo 4-((S)-2-(((aliloksi)karbonil)amino)-6-((tercbutoksikarbonil)amino)heksanamido)benzil (11aS)-8-((6-((S)-1-(hlorometil)-5-((di-tercbutoksifosforil)oksi)-1,2-dihidro-3H-benzo[e]indol-3-il)-6-oksokesil)oksi)-11-hidroksi-7-metoksi-5-okso-2,3,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-karboksilat 3i (228 mg, 71%) kao bledo braon čvrsta penasta supstanca, mp 98°C (dekomp); [α]D+74,5° (c 0,26, CHCl3);<1>H NMR [(CD3)2SO] δ 10,02 (s, razmenljiv sa D2O, 1 H), 8,56 (s, 1 H), 8,04 (d, J = 8,3 Hz, 1 H), 7,92 (d, J = 8,4 Hz, 1 H), 7,65-7,47 (m, 5 H, redukovan do 4 H nakon D2O), 7,25-7,12 (m, 2 H, br s i 1 H on D2O razmenljiv), 7,03 (s, 1 H), 6,83-6,64 (m, 2 H), 6,48 (br s, razmenljiv sa D2O, 1 H), 5,96-5,80 (m, 1 H), 5,52-5,39 (m, d na D2O razmenljiv, J = 9,6 Hz, 1 H), 5,27 (br d, J = 16,8 Hz, 1 H), 5,21-5,10 (m, 2 H), 4,81 (br d, J = 12,3 Hz, 1 H), 4,54-3,85 (m, 8 H), 3,83-3,70 (m, 5 H), 3,53-3,21 (m, 3 H, delimično zaklonjen vodenim vrhom), 2,93-2,82 (m, 2 H), 2,64-2,47 (m, 2 H, delimično zaklonjen DMSO vrhom), 2,10-1,20 (m, 16 H), 1,470 i 1,464 (2 s, 18 H), 1,34 (s, 9 H). HRMS (ESI) m/z izrač. za C63H84ClKN6O16P: 1285,5002, pronađeNO:1285,4938 [MK<+>]; izrač. za C63H84ClN6NaO16P: 1269,5262, pronađeNO:1269,5220 [MNa<+>].
[0483] Mešanom rastvoru 3i (125 mg, 0,10 mmol) u DCM (2 ml) na 20°C u atmosferi azota dodat je Pd(Ph3P)4(2,9 mg; 9,8% Pd) i pirolidin (0,08 ml, 1,00 mmol). Smeša je mešana na 20°C i praćena pomoću TLC (EtOAc:MeOH 20:1). Posle 40 minuta više Pd(Ph3P)4(5,8 mg; dodati su 9,8% Pd) i pirolidin (0,16 ml, 2,00 mmol) i smeša je mešana još 3 sata. Smeša je podeljena između EtOAc (100 mL) i vode (100 mL). Sloj EtOAc je odvojen i ponovo ispran vodom (50 mL), a zatim osušen (MgSO4) i isparen na temperaturi kupke od 25°C. Sirovi 4-((S)-2-amino-6-((terc-butoksikarbonil)amino)heksanamido)benzil (11aS)-8-((6-((S)-1-(hlorometil)-5-((di-terc-butoksifosforil)oksi)-1,2-dihidro-3H-benzo[e]indol-3-il)-6-oksokesil)oksi)-11-hidroksi-7-metoksi-5-okso-2,3,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-karboksilat 3j (94 mg, 81%) je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. HRMS (ESI) m/z izračunato za C59H81ClN6O14P: 1163,5231, pronađeNO:1163,5188 [MH<+>].
[0484] Rastvor 3j (91 mg, 0,078 mmol) u suvom DMA (1,0 ml) tretiran je prethodno formiranom (na 20°C tokom 10 minuta) smešom 1-((5-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)pentil)karbamoil)ciklobutankarboksilna kiselina 1p (36 mg, 0,12 mmol), EDCI. HCl (34 mg, 0,18 mmol) i TsOH (4,0 mg, 0,023 mmol) na suvom DMA (0,5 ml) na 20°C u atmosferi azota. Posle 10 minuta dodat je DIPEA (0,016 ml, 0,078 mmol) i reakciona smeša je mešana 23 sata. Smeša je podeljena između EtOAc (100 mL) i vode (100 mL). Sloj EtOAc je odvojen i dalje ispran zasićenim NaHCO3(50 mL), vodom (50 mL), a zatim osušen (MgSO4). Isparavanjem rastvarača na temperaturi kupatila od 25°C dobija se sirovi proizvod koji je prečišćen hromatografijom na silika gelu (eluiranje sa CHCl3:EtOAc: MeOH 30:10:2) da bi se dobio 4-((S)-6-((terc-butoksikarbonil)amino)-2-(1-((5-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)pentil)karbamoil)ciklobutan-1-karboksamido)heksanamido)benzil(11aS)-8-((6-((S)-1-(hlorometil)-5-(fosfonooksi)-1,2-dihidro-3H-benzo[e]indol-3-il)-6-oksoheksil)oksi)-11-hidroksi-7-metoksi-5-okso-2,3,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-karboksilat 3k (63 mg, 56%) kao svetlo smeđa penasta čvrsta supstanca; mp 67-70°C; [α]D+23,9° (c 2,09, CHCl3);<1>H NMR [(CD3)2SO] δ 10,05 (s, razmenljiv sa D2O, 1 H), 8,56 (s, 1 H), 8,03 (d, J = 8,3 Hz, 1 H), 7,92 (d, J = 8,4 Hz, 1 H), 7,84-7,71 (m, 2 H, razmenljiv sa D2O), 7,62-7,52 (m, 3 H), 7,46 (t, J = 7,7 Hz, 1 H), 7,22-7,13 (m, 2 H), 7,03 (br s, 1 H), 6,96 (s, 2 H), 6,71 (br s, 2 H, redukovan do 1 H nakon D2O), 6,49 (br s, razmenljiv sa D2O, 1 H), 5,51-5,41 (m, but d on D2O razmenljiv sa J = 9,5 Hz, 1 H), 5,15 (d, J = 12,2 Hz, 1 H), 4,82 (br d, J = 12,4 Hz, 1 H), 4,47-3,85 (m, 8 H), 3,77 (br s, 3 H), 3,52-3,20 (m, 3 H, delimično zaklonjen vodenim vrhom), 3,12-3,20 (m, ali t na D2O razmenljiv sa J = 6,7 Hz, 2 H), 2,92-2,80 (m, 2 H), 2,65-2,50 (m, 2 H, delimično zaklonjen DMSO vrhom), 2,39 (t, J = 7,9 Hz, 2 H), 2,07-1,24 (m, 28 H), 1,469 i 1,463 (2 s, 18 H), 1,33 (s, 9 H). HRMS (ESI) m/z izrač. za C74H98ClN8NaO18P: 1475,6317, pronađeNO:1475,6267 [MNa<+>].
4
[0485] Mešanom rastvoru 3k (45 mg, 0,031 mmol) u DCM (1,0 ml) na 20°C pod azotom dodat je TFA (1,0 ml) i smeša je mešana 15 minuta. Dodat je petrolej etar (20 mL) i smeša je mešana 30 minuta. Supernatant je dekantiran i postupak je ponovljen upotrebom EtOAc:petrolej etar (1:5) (2×20 mL). Dobijena čvrsta supstanca je sakupljena i prečišćena preparativnom HPLC [Sinergi PolarRP kolona; vodeni rastvor TFA (pH = 2,56; 90% do 2%)/10% vode u CH3CN (10% do 98%); gradijentna elucija tokom 23 min sa brzinom protoka od 12 ml/min] dajući čistih 86 (17,5 mg, 38%) u obliku bež čvrste supstance, čistoće (HPLC): 99,1%; [α]D+54,9° (c 0,18, MeOH);<1>H NMR [(CD3)2SO] δ 10,20 (s, razmenljiv sa D2O, 1 H), 8,50 (s, 1 H), 8,20-7,78 (m, 7 H, redukovan do 1H nakon D2O), 8,12 (d, J = 9,1 Hz, 1 H), 7,72-7,47 (m, 4 H, redukovan do 3H nakon D2O), 7,40 (t, J = 7,5 Hz, 1 H), 7,17 (br d, J = 7,3 Hz, 2 H), 7,03 (br s, 1 H), 6,97 (s, 2 H), 6,66 (br s, razmenljiv sa D2O, 1 H), 5,51 (br s, 1 H), 5,48 (br d, J = 9,7 Hz, 1 H), 5,32-5,18 (m, ali d nakon D2O, J = 12,6 Hz, 1 H), 4,75 (br d, J = 12,4 Hz, 1 H), 4,44-3,81 (m, 8 H), 3,77 (s, 3 H), 3,52-3,21 (m, 5 H, delimično zaklonjen vodenim vrhom), 3,04 (q, ali t nakon D2O sa J = 6,8 Hz, 2 H), 2,80-2,68 (m, 2 H), 2,39 (t, J = 7,7 Hz, 2 H), 2,12-1,08 (m, 28 H). HRMS (ESI) m/z izračunato za C61H75ClN8O16P: 1241,4722, pronađeNO:1241,4700 [MH<+>]; izrač. za C61H74ClN8NaO16P: 1263,4541, pronađeNO:1263,4531 [MNa<+>].
C. Sinteza CBI međujedinjenja dimernog vezničkog leka
[0486] CBI-CBI dimer ([(1S)-1-(hlorometil)-3-[(E)-3-[4-[(E)-3-[(1S)-1-(hlorometil)-5-fosfonooksi-1,2-dihidrobenzo[e]indol-3-il]-3-okso-prop-1-enil]-2-[2-[2-(2,5-dioksopirol-1-il)etoksi]etoksi]fenil]prop-2-enoil]-1,2-dihidrobenzo[e]indol-5-il]dihidrogen fosfat jedinjenje 78 iz Tabele A) ima formulu:
je sintezovano kao što sledi. Za reakcionu šemu, uključujući reagens i srednje formule, videti Sliku 11.
[0487] Na sobnoj temperaturi do rastvora (S)-terc-butil 1-(hlorometil)-5-hidroksi-1H-benzo[e]indol-3(2H)-karboksilata 51a (2,00 g, 5,99 mmol) u DMF (5 mL) su dodati benzil bromid (7,13 mL, 59,90 mmol), kalijum jodid KI (50 mg, 0,30 mmol) i kalijum karbonat K2CO3(4,14 g, 30,00 mmol). Smeša je mešana 2 h, a zatim je razblažena etil acetatom. Talog se odfiltrira. Filtrat je preraspodeljen između etil acetata i vode. Vodena faza je ekstrahovana etil acetatom tri puta. Kombinovani organski ekstrakti su isprani vodom i slanim rastvorom, osušeni iznad bezvodnog Na2SO4i filtrirani kroz celit. Rastvarač je uklonjen rotacionim isparivačem i višak benzil bromida je ispumpan. Dobijeni ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni primenom smeše etil acetata i petrolej etra (v/v 1:10) kao eluenta da bi se dobio (S)-terc-butil 5-(benziloksi)-1-(hlorometil)-1H-benzo[e]indol-3(2H)-karboksilat 57a kao bela čvrsta supstanca (1,97 g, 78%); mp 186-188°C.<1>H NMR (CDCl3) δ 8,29 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,86 (br s, 1H), 7,65 (d, J = 8,29 Hz, 1H), 7,55-7,49 (m, 3H), 7,45-7,41 (m, 2H), 7,38-7,31 (m, 2H), 5,26 (s, 2H), 4,26 (br s, 1H), 4,13 (t, J = 10,8 Hz, 1H), 4,00-3,92 (m, 2H), 3,44 (t, J = 10,5 Hz, 1H), 1,61 (s, 9H) ppm. LRMS (APCI) pronađeno m/z 424,8 (M H). C25H27ClNO3zahteva 424,2. (Boger D., Ishizakilb T., Kitos P. and Suntornwat O., (1990) J. Org. Chem., 55, 5823-5832.)
[0488] Rastvoru (S)-terc-butil 5-(benziloksi)-1-(hlorometil)-1H-benzo[e]indol-3(2H)-karboksilata 57a, pripremljenog od (S)-terc-butil 1-(hlorometil)-5-hidroksi-1H-benzo[e]indol-3(2H)-karboksilat 51a (1,595 g, 3,76 mmol) u DCM (15 mL) ohlađenom u ledenom kupatilu dodat je 4N HCI u dioksanu (40 mL). Smeša je ostavljena da se zagreje do sobne temperature i mešana je 2 sata. Sve isparljive komponente su ispumpane. Dobijeni ostatak je preraspodeljen između etil acetata i hladnog vodenog 5% amonijaka. Vodena faza je ekstrahovana etil acetatom tri puta. Kombinovani organski ekstrakti su isprani vodom i slanim rastvorom, osušeni iznad bezvodnog Na2SO4i filtrirani kroz celit. Rastvarač je uklonjen da bi se dobio (S)-5-(benziloksi)-1-(hlorometil)-2,3-dihidro-1H-benzo[e]indol 57b kao smeđa guma, koja se direktno koristila;<1>H NMR (DMSO) δ 8,04 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,61 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,53 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 7,45-7,34 (m, 4H), 7,14 (t, J = 7,3 Hz, 1H), 6,60 (s, 1H), 5,24 (s, 2H), 3,96-3,92 (m, 1H), 3,84 (dd, J = 3,4, 10,7 Hz, 1H), 3,70 (t, J = 9,3 Hz, 1H), 3,60 (dd, J = 2,4, 10,0 Hz, 1H), 3,55 (t, J = 10,3 Hz, 1H) ppm. HRMS (ESI) pronađeno m/z 324,1150 (M H). C20H19ClNO zahteva 324,1150.
[0489] Međujedinjenje 57b je ohlađeno u ledenom kupatilu i dodat je piridin (15 mL), a zatim trifluorosirćetni anhidrid (3,14 ml, 22,57 mmol). Dobijena smeša je mešana 10 minuta i dodat je led. Smeša je preraspodeljena između etil acetata i vode. Vodena faza je ekstrahovana etil acetatom tri puta. Kombinovani organski ekstrakti su isprani vodom i slanim rastvorom, osušeni iznad bezvodnog Na2SO4i filtrirani kroz celit. Rastvarač je uklonjen, a rezultujući ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni primenom smeše etil acetata i petroletra (v/v 1:10) kao eluenta da bi se dobio (S)-1-(5-(benziloksi)-1-(hlorometil)-1H-benzo[e]indol-3(2H)-il)-2,2,2-trifluoroetanon 66a kao bela čvrsta supstanca (1,11 g, 70%); mp 167-170°C.<1>H NMR (CDCl3) δ 8,37 (d, J = 8,3Hz, 1H), 8,05 (s, 1H), 7,72 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,61-7,54 (m, 3H), 7,49-7,42 (m, 3H), 7,39-7,35 (m, 1H), 5,30 (AB q, J = 11,7, 15,7 Hz, 2H), 4,63-4,59 (m, 1H), 4,43-4,38 (m, 1H), 4,15-4,09 (m, 1H), 3,97-3,93 (m, 1H), 3,49 (dd, J = 9,9, 11,3 Hz, 1H) ppm. HRMS (ESI) pronađeno m/z 442,0799 (M Na). C22H17ClF3NNaO2zahteva 442,0795.
[0490] Na -10°C, u rastvor 66a (1,10 g, 2,62 mmol) u THF (20 mL) dodat je 25% vodeni rastvor amonijumformata (20 mL) praćen Pd-C katalizatorom (10%, vlažno, 550 mg) i smeša je mešana 2 h pre dodavanja još Pd-C katalizatora (550 mg). Dobijena smeša je mešana na -10°C preko noći i katalizator je filtriran kroz celit. THF je uklonjen iz filtrata i ostatak je preraspodeljen između etil acetata i vode. Vodena faza je ekstrahovana etil acetatom tri puta. Kombinovani organski ekstrakti su isprani vodom i slanim rastvorom, osušeni iznad bezvodnog Na2SO4i filtrirani kroz celit. Rastvarač je uklonjen, a rezultujući ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni primenom smeše etil acetata i petroletra (v/v 1:5) kao eluenta da bi se dobio (S)-1-(1-(hlorometil)-5-(hidroksi-1H-benzo[e]indol-3(2H)-il)-2,2,2-trifluoroetanon 66b kao beličasta čvrsta supstanca (758 mg, 88%); mp 209-212 °C.<1>H NMR (CDCl3) δ 8,33 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 8,10 (s, 1H), 7,85 (s, 1H), 7,64 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,60-7,56 (m, 1H), 7,51-7,47 (m, 1H), 4,60-4,56 (m, 1H), 4,41-4,36 (m, 1H), 4,00-3,95 (m, 1H), 3,93-3,90 (m, 1H), 3,44 (dd, J = 9,8, 11,3 Hz, 1H) ppm. HRMS (ESI) pronađeno m/z 352,0331 (M Na). C15H11ClF3NNaO2zahteva 352,0323.
[0491] U mešani rastvor 66b (250 mg, 0,76 mmol) u THF (15 mL) dodat je tetrazol (3% u acetonitrilu, 13,5 mL, 4,55 mmol) praćeno sa di-terc-butil-N,N-di-izopropil fosforamiditom (1,51 mL, 4,55 mmol). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći i zatim ohlađena u ledenoj kupki i H2O2(30% vodeni rastvor, 0,78 mL, 7,58 mmol) je dodavan u kapima. Dobijena smeša je ostavljena da se zagreje do sobne temperature i mešana 5 h. Reakcija je ugašena dodavanjem 10% vodenog rastvora natrijum sulfita uz hlađenje u ledenom kupatilu. Organske isparljive materije uklonjene su rotacionim isparivačem. Dobijena smeša je preraspodeljena između etil acetata i vode. Vodena faza je ekstrahovana etil acetatom tri puta. Kombinovani organski ekstrakti su isprani vodom i slanim rastvorom, osušeni iznad bezvodnog Na2SO4i filtrirani kroz celit. Rastvarač je uklonjen, a rezultujući ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni Florisil® (US Silica) koristeći gradijentne smeše etil acetata i petroleum etra (v/v 1:6 do 1:3) kao eluent dajući (S)-di- terc-butil 1-(hlorometil)-3-(2,2,2-trifluoroacetil)-2,3-dihidro-1 H-benzo[e]indol-5-il fosfat 66c kao bezbojno ulje (367 mg, 93%) ;<1>H NMR (DMSO) δ 8,44 (d, J = 1,0 Hz, 1H), 8,11 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 8,06 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,69-7,65 (m, 1H), 7,63-7,59 (m, 1H), 4,61-4,56 (m, 1H), 4,46-4,41 (m, 1H), 4,15-4,12 (m, 1H), 4,06-4,00 (m, 1H), 1,50 (s, 9H), 1,48 (s, 9H) ppm.<31>P NMR (DMSO) δ -15,54 ppm. HRMS (ESI) pronađeno m/z 544,1236 (M Na). C23H28ClF3NNaO5P zahteva 544,1238.
[0492] Rastvoru od 66c (239 mg, 0,46 mmol) u MeOH (2 mL), ohlađenom u ledenom kupatilu, dodat je CsCO3(298 mg, 0,92 mmol) i nekoliko kapi vode. Smeša je mešana u ledenom kupatilu 1 sat, a zatim je preraspodeljena između etil acetata i vode. Vodena faza je ekstrahovana etil acetatom tri puta. Kombinovani organski ekstrakti su isprani vodom i slanim rastvorom, sušeni preko bezvodnog Na2SO4, filtrirani kroz celit i rastvarač je uklonjen. Dobijeni ostatak je rastvoren u etil acetatu i filtriran kroz sloj hromatografije Florisil® (US Silica) kolone da bi se dobio (S)-di-terc-butil 1-(hlorometil)-2,3-dihidro-1H-benzo[e]indol-5-il fosfat 66d kao prljavo bela guma (183 mg, 94%) koja se koristi direktno bez daljeg prečišćavanja;<1>H NMR (DMSO) δ 8,08 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,58 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,46-7,42 (m, 1H), 7,25-7,21 (m, 1H), 7,13 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 4,00-3,93 (m, 1H), 3,87-3,78 (m, 2H), 3,54-3,42 (m, 2H), 1,50 (s, 9H), 1,49 (s, 9H) ppm.<31>P NMR (DMSO) δ -15,58 ppm. HRMS (ESI) pronađeno m/z 426,1587 (M H). C21H30ClNO4P zahteva 426,1595.
[0493] U 76 mg (0,18 mmol) 1 (66d, sveže napravljen gore pomenutim postupkom) dodaju se 2 (18 mg, 0,045 mmol), EDCI hidrohlorid (69 mg, 0,36 mmol), toluensulfonska kiselina (0,8 mg, 0,005 mmol) i DMA (0,25 ml). Nakon mešanja smeše preko noći, većina DMA je uklonjena pod vakuumom, a ostatak je preraspodeljen između etil acetata i vode. Vodena faza je ekstrahovana etil acetatom tri puta. Kombinovani organski ekstrakti su isprani vodom, zatim slanim rastvorom, sušeni preko bezvodnog Na2SO4, i filtrirani kroz jastučić od Celita. Rastvarač je uklonjen i rezultujući ostatak je rastvoren u minimalnom DCM i precipitiran je dodavanjem heptana dajući sirovi proizvod (54 mg), koji je dalje prečišćen preparativnom HPLC (kolona: Synergi-Max RP 4µ, 250 × 21,20 mm; Mobilna faza: A/B = od 20% do 1% (A: amonijum format pH 3,45, B: 90% acetonitrila u vodi); brzina protoka 12 ml/min, gradijentni postupak; talasna dužina: 254 nm, 325 nm) da bi dalo 3 (17 mg, 30%) kao žuta čvrsta supstanca..<1>H NMR (CDCl3) δ 8,72 (br s, 2H), 8,23 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,96 (d, J = 15,2 Hz, 1H), 7,83 (d, J = 15,3 Hz, 1H), 7,71 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 7,54-7,50 (m, 3H), 7,42-7,39 (m, 2H), 7,26-7,12 (m, 3H), 6,95-6,88 (m, 1H), 6,67 (s, 2H), 4,57-4,52 (m, 2H), 4,47-4,38 (m, 2H), 4,28-4,24 (m, 2H), 4,16-4,09 (m, 2H), 4,00-3,94 (m, 4H), 3,78 (prividan s, 4H), 3,55-,348 (m, 2H), 1,57 (s, 36H) ppm.<31>P NMR (CDCl3) δ - 15,64 (s) ppm. HRMS (ESI) pronađeno m/z 1238,3862 (M Na). C62H73Cl2N3NaO14P2zahteva 1238,3837.
[0494] Rastvoru od 3 (16 mg, 0,013 mmol) u DCM (1 mL), ohlađenom u ledenom kupatilu, dodat je TFA (0,5 ml, 3,24 mmol). Smeša je ostavljena da se zagreje do sobne temperature i mešana je 3 sata. Sve isparljive komponente su ispumpane i rezultujući ostatak je triturisan sa etil acetatom da bi se dobilo Jedinjenje 78 kao žuta čvrsta supstanca (13 mg, 100%, HPLC čistoća 100%).<1>H NMR (DMSO) δ 8,60 (s, 2H), 8,12 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,95-7,87 (m, 4H), 7,72 (d, J = 15,1 Hz, 1H), 7,61-7,57 (m, 2H), 7,53-7,45 (m, 4H), 7,38-7,32 (m, 2H), 6,97 (s, 2H), 4,60-4,48 (m, 4H), 4,30-4,28 (m, 4H), 4,08-3,88 (m, 6H), 3,68-3,58 (m, 4H).<31>P NMR (DMSO) δ -5,94 (s) ppm. HRMS (ESI) pronađeno m/z 1014,1301 (M Na). C46H41Cl2N3NaO14P2zahteva 1014,1333.
D. Konjugacija delova veznik-lek za antitela
[0495] Konjugati Hu7C2 antitelo-lek (ADC) nastaju konjugacijom hu7C2.v.2.2.LA sa mutacijom teškog lanca A118C (tio-hu7C2-HC A118C) ili mutacijom K149C lakog lanca (tio-hu7C2-LC-K149C) izabrani deo veznika leka. Kao prvobitno izolovani, konstruisani ostaci cisteina u antitelima postoje kao mešani disulfidi sa ćelijskim tiolima (npr., glutation) i zbog toga nisu dostupni za konjugaciju. Delimično smanjenje ovih antitela (npr., sa DTT), prečišćavanje i reoksidacija dehidroaskorbinskom kiselinom (DHAA) daju antitela sa slobodnim cistein sulfhidrilnim grupama dostupnim za konjugaciju, kao što je prethodno opisano, npr., u Junutula i dr. (2008) Nat. Biotechnol. 26:925-932 i US 2011/0301334. Ukratko, antitela se kombinuju sa ostatkom veznika leka kako bi se omogućila konjugacija ostatka lek-veznik sa slobodnim ostacima cisteina antitela. Posle nekoliko sati, ADC se prečišćavaju. Utvrđeno je opterećenje lekom (prosečni broj ostataka leka po antitelu) za svaki ADC koji je bio u opsegu od 1,4-2,0.
[0496] Rezultujuće ADC strukture i termini koji se za njih koriste u nastavku prikazani su na Slici 12.
Primer 3: Efikasnost konjugata antitela na hu7C2 u MMTV-Her2 Fo5 modelima transgenskih transplantacija tumora mlečnih žlezda, Ksenograft
[0497] CRL nu/nu mice (Charles River Laboratory) su implantirani sa ∼2x2 mm fragmenti MMTV-Her2 Fo5 transgenih tumora dojke. Kada su tumori dostigli srednju zapreminu tumora od 100-250 mm<3>, životinje su grupisane u 7 grupa od po 8-10 miševa. Miševi su primili jednokratno davanje 1. dana jednog od sledećih tretmana, intravenoznom injekcijom repne vene: (1) sredstvo za prenošenje (20 mM L-histidin, 240 mM sukroza, 0,02% Tween-20, pH 5,5), (2) thio-hu7C2-HC-A118C-disulfid-PBD, 0,3 mg/kg; (3) tio-hu7C2-HC-A118C-disulfid-PBD, 1 mg/kg; (4) tio-hu7C2-LC-K149C-disulfid-PBD, 0,3 mg/kg; (5) tio-hu7C2-LC-K149C-disulfid-PBD, 1 mg/kg; (6) tio-controlAb-HC-A118C-disulfid-PBD, 1 mg/kg; ili (7) tio-controlAb-LC-K149C-disulfid-PBD, 1 mg/kg. Merenja tumora i telesne težine vršena su najmanje jednom nedeljno tokom trajanja ispitivanja. Miševi su eutanazirani kada su tumori dostigli 1000-2000 mm<3>ili ako je miš izgubio 20% ili više telesne težine. Zapremina tumora izmerena je u dve dimenzije (dužina i širina) pomoću čeljusti, a zapremina tumora izračunata je po formuli: Veličina tumora (mm<3>) = (duže merenje x kraće merenje<2>) x 0,5.
[0498] Rezultati tog eksperimenta prikazani su u Tabeli 5 i na Slici 4. Podaci u Tabeli 5 su od 21. dana, osim za kontrolnu grupu vozila, koja je od 10. dana. Svaka grupa sadržala je 8 miševa na početku ispitivanja i 8 miševa 21. dana (ili 8 miševa 10. dana za kontrolnu grupu sredstva za prenošenje). AUC/dan% TGI (inhibicija rasta tumora) izračunava se pomoću sledeće formule: %TGI = 100 x (1 - AUClečenje/Dan ÷ AUCsredstvo za prenošenje/Dan). PR = delimični odgovor, koji se definiše kao više od 50%, ali manje od 100% smanjenja zapremine tumora, u poređenju sa početnom zapreminom tumora, bilo kog dana tokom ispitivanja. Nijedna životinja nije pokazala potpun odgovor u ovom eksperimentu.
Tabela 5: Efikasnost hu7C2 ADC-a u MMTV-Her2 Fo5 transgenom modelu ksenografta tumora dojke
[0499] Kao što je prikazano u Tabeli 5, tio-hu7C2-LC-K149C-disulfid-PBD pokazao je 8 delimičnih odgovora pri 1 mg/kg i 1 delimični odgovor pri 0,3 mg/kg. Tio-hu7C2-HC-A118C-disulfid-PBD pokazao je dva delimična odgovora pri 1 mg/kg i nije imao delimični odgovor pri 0,3 mg/kg.
Primer 4: Efikasnost konjugata antitela na hu7C2 u MMTV-Her2 Fo5 modelima transgenskih transplantacija tumora mlečnih žlezda, Ksenograft
[0500] CRL nu/nu miševi (Charles River Laboratory) su implantirani sa ∼2x2 mm fragmenti MMTV-Her2 Fo5 transgenih tumora dojke. Kada su tumori dostigli srednju zapreminu tumora od 100-250 mm<3>, životinje su grupisane u 9 grupa od po 8-10 miševa. Miševi su primili jednokratno davanje 1. dana jednog od sledećih tretmana, intravenoznom injekcijom repne vene: (1) sredstvo za prenošenje (20 mM L-histidin, 240 mM sukroza, 0,02% Tween-20, pH 5,5), (2) tio-hu7C2-LC-K149C-CBI dimer, 1 mg/kg; (3) tio-hu7C2-LC-K149C-CBI dimer, 3 mg/kg; (4) tio-hu7C2-LC-K149C-CBI dimer, 6 mg/kg; (5) tio-hu7C2-LC-K149C-disulfid-CBI-PBD, 1 mg/kg; (6) tio-hu7C2-LC-K149C-disulfid-CBI-PBD, 3 mg/kg; (7) tio-hu7C2-LC-K149C-disulfid-CBI-PBD, 6 mg/kg; (8) tio-controlAb-LC-K149C-CBI dimer, 6 mg/kg; ili (9) tio-controlAb-LC-K149C-disulfid-CBI-PBD, 6 mg/kg. Merenja tumora i telesne težine vršena su najmanje jednom nedeljno tokom trajanja ispitivanja. Miševi su eutanazirani kada su tumori dostigli 1000-2000 mm<3>ili ako je miš izgubio 20% ili više telesne težine. Zapremina tumora izmerena je u dve dimenzije (dužina i širina) pomoću čeljusti, a zapremina tumora izračunata je po formuli: Veličina tumora (mm<3>) = (duže merenje x kraće merenje<2>) x 0,5.
[0501] Rezultati tog eksperimenta prikazani su u Tabeli 6 i na Slici 5. Podaci u Tabeli 6 su od 21. dana, osim za kontrolnu grupu vozila, koja je od 14. dana. Svaka grupa sadržala je 8 miševa na početku ispitivanja i 8 miševa 21. dana, osim kontrolne grupe koja je imala 8 miševa na početku ispitivanja i 7 miševa 14. dana. AUC/dan% TGI (inhibicija rasta tumora) i PR određeni su kako je opisano u prethodnom primeru. CR = potpuni odgovor, koji se definiše kao 100% smanjenje zapremine tumora (bez merljivog tumora), bilo kog dana tokom ispitivanja. Odnos lek:antitelo (DAR) za svaki konjugat antitelo-lek korišćen u eksperimentu prikazan je u drugoj koloni.
Tabela 6: Efikasnost hu7C2 ADC-a u MMTV-Her2 Fo5 transgenom modelu ksenografta tumora dojke
[0502] Kao što je prikazano u Tabeli 6, dimer tio-hu7C2-LC-K149C-CBI pokazao je 1 delimični odgovor na 1 mg/kg, 6 delimičnih odgovora na 3 mg/kg i 5 delimičnih odgovora i 2 kompletna odgovora na 6 mg/kg. Tiohu7C2-LC-K149C-disulfid-CBI-PBD pokazao je 1 delimični odgovor pri 6 mg/kg. U drugom ispitivanju u kojem su doze smanjene na 1 mg/kg, dimer tio-hu7C2-LC-K149C-CBI pri 1 mg/kg uzrokovao je regresiju tumora, dok je dimer tio-controlAb-LC-K149C-CBI pri 1 mg/kg izazvao je %TGI od 60%. Bez namere da bude vezan nekom određenom teorijom, veruje se da aktivnost kontrole odražava ne-ciljanu aktivnost.
Primer 5: Efikasnost konjugata antitela na hu7C2 u MMTV-Her2 Fo5 modelima transgenskih transplantacija tumora mlečnih žlezda, Ksenograft
[0503] CRL nu/nu miševi (Charles River Laboratory) su implantirani sa ∼2x2 mm fragmenti MMTV-Her2 Fo5 transgenih tumora dojke. Kada su tumori dostigli srednju zapreminu tumora od 100-250 mm<3>, životinje su grupisane u 7 grupa od po 8-10 miševa. Miševi su primili jednokratno davanje 1. dana jednog od sledećih tretmana, intravenoznom injekcijom repne vene: (1) sredstvo za prenošenje (20 mM L-histidin, 240 mM sukroza, 0,02% Tween-20, pH 5,5), (2) thio-hu7C2-LC-K149C-disulfid-PNU, 1 mg/kg; (3) tio-hu7C2-LC-K149C-disulfid-PNU, 3 mg/kg; (4) tio-controlAb-LC-K149C-disulfid-PNU, 1 mg/kg; (5) tio-controlAb-LC-K149C-disulfid-PNU, 3 mg/kg; (6) trastuzumab-MCC-DM1 (T-DM1, trastuzumab emtanzin, adotrastuzumab emtanzin), 3 mg/kg; ili (7) T-DM1, 10 mg/kg. Merenja tumora i telesne težine vršena su najmanje jednom nedeljno tokom trajanja ispitivanja. Miševi su eutanazirani kada su tumori dostigli 1000-2000 mm<3>ili ako je miš izgubio 20% ili više telesne težine. Zapremina tumora izmerena je u dve dimenzije (dužina i širina) pomoću čeljusti, a zapremina tumora izračunata je po formuli: Veličina tumora (mm<3>) = (duže merenje x kraće merenje<2>) x 0,5.
[0504] Rezultati tog eksperimenta prikazani su u Tabeli 7 i na Slici 6. Podaci u Tabeli 7 datiraju od 20. dana, osim za kontrolnu grupu sredstva za prenošenje, tio-controlAb-LC-K149C-disulfid-PNU 1 mg/kg grupu i T-DM13 mg/kg grupu, koji su od 14. dana. Svaka grupa sadržala je 8 miševa na početku ispitivanja i 8 miševa 21. dana, osim kontrolne grupe koja je imala 8 miševa na početku ispitivanja i 7 miševa na kraju. AUC/dan% TGI (inhibicija rasta tumora određena je kako je opisano u prethodnim primerima. U ovom eksperimentu nije bilo delimičnih ili potpunih odgovora. Odnos lek:antitelo (DAR) za svaki konjugat antitelo-lek korišćen u eksperimentu prikazan je u drugoj koloni.
Tabela 7: Efikasnost hu7C2 ADC-a u MMTV-Her2 Fo5 transgenom modelu ksenografta tumora dojke
[0505] Ovi podaci sugerišu da tio-hu7C2-LC-K149C-disulfid-PNU (3 mg/kg) ima veću efikasnost od T-DM1 ili kontrolnog imunokonjugata u ovom modelu.
Primer 6: Efikasnost konjugata antitela na hu7C2 u MMTV-Her2 Fo5 modelima transgenskih transplantacija tumora mlečnih žlezda, Ksenograft
[0506] CRL nu/nu miševi (Charles River Laboratory) su implantirani sa ∼2x2 mm fragmenti MMTV-Her2 Fo5 transgenih tumora dojke. Kada su tumori dostigli srednju zapreminu tumora od 100-250 mm<3>, životinje su grupisane u 9 grupa od po 8-10 miševa. Miševi su primili jednokratno davanje 1. dana jednog od sledećih tretmana, intravenoznom injekcijom repne vene: (1) sredstva za prenošenje (20 mM L-histidin, 240 mM saharoza, 0,02% Tween-20, pH 5,5), (2) tio-hu7C2-HC-A1 18C-maleimid-PNU, ∼1 mg/kg (doza leka odgovara grupi IV); (3) tio-hu7C2-LC-K149C-maleimid-PNU, 0,3 mg/kg; (4) tio-hu7C2-LC-K149C-maleimid-PNU, 1 mg/kg; (5) tio-hu7C2-LC-K149C-maleimid-PNU, 3 mg/kg; (6) tio-controlAb-LC-K149C-maleimid-PNU, 3 mg/kg; (7) tio-hu7C2-LC-K149C-CBI dimer, 0,3 mg/kg; (8) tio-hu7C2-LC-K149C-CBI dimer, 1 mg/kg; ili (9) tio-controlAb-LC-K149C-CBI dimer, 1 mg/kg. Merenja tumora i telesne težine vršena su najmanje jednom nedeljno tokom trajanja ispitivanja. Miševi su eutanazirani kada su tumori dostigli 1000-2000 mm<3>ili ako je miš izgubio 20% ili više telesne težine. Zapremina tumora izmerena je u dve dimenzije (dužina i širina) pomoću čeljusti, a zapremina tumora izračunata je po formuli: Veličina tumora (mm<3>) = (duže merenje x kraće merenje<2>) x 0,5.
[0507] Rezultati tog eksperimenta prikazani su u Tabeli 8 i na Slici 7. Podaci u Tabeli 8 datiraju od poslednjeg dana studije za svaku grupu, naznačeni u drugoj koloni tabele. Svaka grupa sadržala je 8 miševa na početku ispitivanja i 8 miševa na kraju, osim grupe (9), koja je imala 7 miševa na kraju ispitivanja. AUC/dan% TGI (inhibicija rasta tumora), PR i CR određeni su kako je opisano u prethodnim primerima. Odnos lek:antitelo (DAR) za svaki konjugat antitelo-lek korišćen u eksperimentu prikazan je u drugoj koloni.
Tabela 8: Efikasnost hu7C2 ADC-a u MMTV-Her2 Fo5 transgenom modelu ksenografta tumora dojke
1
[0508] Kao što je prikazano u Tabeli 8, tio-hu7C2-LC-K149C-maleimid-PNU pokazao je 3 delimična odgovora pri 1 mg/kg i 8 kompletnih odgovora pri 3 mg/kg. Dimer tio-hu7C2-LC-K149C-CBI pokazao je 5 delimičnih odgovora pri 1 mg/kg.
Primer 7: Efikasnost konjugata protiv antitela na hu7C2 u modelu ksenografta KPL4 ćelijske linije raka dojke
[0509] SCID bež miševi (C.B-17 SCID.bg, Charles River Laboratories) inokulirani su sa 3 miliona ćelija po mišu suspendovanim u HBSS/Matrigelu u grudnu masnu podlogu mlečne žlezde u zapremini od 0,2 ml. Kada su tumori dostigli srednju zapreminu tumora od 100-250 mm<3>, životinje su grupisane u 9 grupa od po 8-10 miševa. Miševi su primili jednokratno davanje 1. dana jednog od sledećih tretmana, intravenoznom injekcijom repne vene: (1) sredstvo za prenošenje (20 mM L-histidin, 240 mM sukroza, 0,02% Tween-20, pH 5,5), (2) thio-hu7C2-LC-K149C-maleimid-PNU, 0,3 mg/kg; (3) tio-hu7C2-LC-K149C-maleimid-PNU, 1 mg/kg; (4) tio-hu7C2-LC-K149C-maleimid-PNU, 3 mg/kg; (5) tio-hu7C2-LC-K149C-disulfid-PNU, 0,3 mg/kg; (6) tiohu7C2-LC-K149C-disulfid-PNU, 1 mg/kg; (7) tio-hu7C2-LC-K149C-disulfid-PNU, 3 mg/kg; (8) tiocontrolAb-LC-K149C-maleimid-PNU, 3 mg/kg; (9) tio-controlAb-LC-K149C-disulfid-PNU, 3 mg/kg. Merenja tumora i telesne težine vršena su najmanje jednom nedeljno tokom trajanja ispitivanja. Miševi su eutanazirani kada su tumori dostigli 1000-2000 mm<3>ili ako je miš izgubio 20% ili više telesne težine. Zapremina tumora izmerena je u dve dimenzije (dužina i širina) pomoću čeljusti, a zapremina tumora izračunata je po formuli: Veličina tumora (mm<3>) = (duže merenje x kraće merenje<2>) x 0,5.
[0510] Rezultati tog eksperimenta prikazani su u Tabeli 9 i na Slici 8. Podaci u Tabeli 9 datiraju od 22. dana za sve grupe, osim za kontrolnu grupu sredstava za prenošenje i tio-controlAb-LC-K149C-disulfid-PNU grupu, koje su od 18. dana. Svaka grupa sadržala je 8 miševa na početku ispitivanja i 8 miševa na kraju, osim grupe (6), koja je imala 7 miševa na kraju ispitivanja. AUC/dan% TGI (inhibicija rasta tumora), PR i CR određeni su kako je opisano u prethodnim primerima. Odnos lek:antitelo (DAR) za svaki konjugat antitelo-lek korišćen u eksperimentu prikazan je u drugoj koloni.
Tabela 9: Efikasnost hu7C2 ADC u modelu ksenografta ćelijske linije raka dojke KPL4
[0511] Kao što je prikazano u Tabeli 9, tio-hu7C2-LC-K149C-maleimid-PNU pokazao je 7 delimičnih
1 1
odgovora i 1 potpuni odgovor pri 3 mg/kg. Tio-hu7C2-LC-K149C-disulfid-PNU pokazao je 7 delimičnih odgovora pri 3 mg/kg.
Primer 8: Efikasnost konjugata antitela na hu7C2 u MMTV-Her2 Fo5 modelima transgenskih transplantacija tumora mlečnih žlezda, Ksenograft modeli
[0512] CRL nu/nu miševi (Charles River Laboratory) su implantirani sa ∼2x2 mm fragmenti MMTV-Her2 Fo5 transgenih tumora dojke. Kada su tumori dostigli srednju zapreminu tumora od 100-250 mm<3>, životinje su grupisane u 7 grupa od po 8-10 miševa. Miševi su primili jednokratno davanje 0. dana jednog od sledećih tretmana, intravenoznom injekcijom repne vene: (1) sredstvo za prenošenje (20 mM L-histidin, 240 mM sukroza, 0,02% Tween-20, pH 5,5), (2) thio-hu7C2-LC-K149C-disulfid-CBI-PBD, 2 mg/kg; (3) tio-hu7C2-LC-K149C-disulfid-CBI-PBD, 5 mg/kg; (4) tio-controlAb-LC-K149C-disulfid-CBI-PBD, 5 mg/kg; (5) tiohu7C2-LC-K149C-disulfid-CBI-PBD (fosfat), 2 mg/kg; (6) tio-hu7C2-LC-K149C-disulfid-CBI-PBD (fosfat), 5 mg/kg; ili (7) tio-hu7C2-LC-K149C-disulfid-CBI-PBD (fosfat), 5 mg/kg. Merenja tumora i telesne težine vršena su najmanje jednom nedeljno tokom trajanja ispitivanja. Miševi su eutanazirani kada su tumori dostigli 1000-2000 mm<3>ili ako je miš izgubio 20% ili više telesne težine. Zapremina tumora izmerena je u dve dimenzije (dužina i širina) pomoću čeljusti, a zapremina tumora izračunata je po formuli: Veličina tumora (mm<3>) = (duže merenje x kraće merenje<2>) x 0,5.
[0513] Rezultati tog eksperimenta prikazani su u Tabeli 10 i na Slici 17. Podaci u Tabeli 10 su od 21. dana. Svaka grupa sadržala je 7 miševa na početku ispitivanja i 7 miševa na kraju, osim grupe (1), koja je imala 5 miševa na kraju ispitivanja, i grupe (4), koja je imala 6 miševa na kraju ispitivanja. AUC/dan% TGI (inhibicija rasta tumora) i PR određeni su kako je opisano u prethodnim primerima. Nijedan miš nije pokazao potpun odgovor u ovom eksperimentu. Odnos lek:antitelo (DAR) za svaki konjugat antitelo-lek korišćen u eksperimentu prikazan je u drugoj koloni.
Tabela 10: Efikasnost hu7C2 ADC-a u MMTV-Her2 Fo5 transgenom modelu ksenografta tumora dojke
[0514] Kao što je prikazano u Tabeli 10, tio-hu7C2-LC-K149C-disulfid-CBI-PBD pokazao je 2 delimična odgovora pri 2 mg/kg i 4 delimična odgovora pri 5 mg/kg. Tio-hu7C2-LC-K149C-disulfid-CBI-PBD (fosfat) pokazao je 1 delimični odgovor na 2 mg/kg i 7 delimičnih odgovora na 5 mg/kg.
Primer 9: Efikasnost konjugata leka hu7C2 u modelu Ksenograft za transplantaciju HCC1569X2
[0515] Linija ćelija karcinoma dojke HCC1569 dobijena je od ATCC (American Type Culture Collection; Manassas, VA) i podlinija HCC1569Ks2 je generisana u Genentech za optimalan rast miševa.
[0516] Ženke C.B-17 SCID-bež miševa (laboratorija Charles River) inokulirane su u područje grudne masne podloge mlečne žlezde sa 5 miliona ćelija HCC1569X2 suspendovanih u HBSS/Matrigelu (odnos 1:1). Kada su ksenograftski tumori dostigli prosečnu zapreminu tumora od 100-300 mm3 (dan 0), životinje su nasumično postavljene u 7 grupa sa po 7 miševa po grupi i primile su jednokratnu primenu jednog od sledećih tretmana, intravenoznom injekcijom repne vene: (1) nosač (20 mM L-histidina, 240 mM saharoze, 0,02% Tween-20, pH 5,5), (2) trastuzumab-MCC-DM1 (T-DM1, trastuzumab emtanzin, ado-trastuzumab emtanzin). 3 mg/kg; (3) tio-hu7C2-LC-K149C-disulfid-CBI-PBD, 0,5mg/kg; (4) tio-hu7C2-LC-K149C-disulfid-CBI-PBD, 1mg/kg; (5) tio-hu7C2-LC-K149C-disulfid-CBI-PBD, 2mg/kg; (6) T-DM1, 3mg/kg tio-hu7C2- LC-K149C-disulfid-CBI-PBD, 0,5mg/kg; ili (7) T-DM1, 3mg/kg tio-hu7C2-LC-K149C-disulfid-CBI-PBD, 1mg/kg. Tumori i telesna težina miševa merili su se 1-2 puta nedeljno tokom ispitivanja. Miševi su eutanazirani kada je gubitak
1 2
telesne težine bio > 20% njihove početne težine. Sve životinje su eutanazirane pre nego što su tumori dostigli 3000 mm<3>ili pokazali znake predstojeće ulceracije. Zapremina tumora izmerena je u dve dimenzije (dužina i širina) pomoću čeljusti, a zapremina tumora izračunata je po formuli: Veličina tumora (mm<3>) = (duže merenje x kraće merenje<2>) x 0,5.
[0517] Rezultati tog eksperimenta prikazani su u Tabeli 11 i na Slici 18. Podaci u Tabeli 11 datiraju od 14. dana, a sve grupe imaju 7 miševa.
Tabela 11: Efikasnost konjugata leka hu7C2 u modelu Ksenograft za transplantaciju HCC1569X2
[0518] U ovom ispitivanju, tio-hu7C2-LC-K149C-disulfid-CBI-PBD pokazao je zavisnu od doze inhibiciju rasta tumora, sa regresijom tumora primećenom u dozi od 2 mg/kg. Kombinacija tio-hu7C2-LC-K149C-disulfid-CBI-PBD i T-DM1 rezultirala je većom efikasnošću nego samo jedno sredstvo i dobro se tolerisala na osnovu minimalnih promena telesne težine životinja u poređenju sa grupom nosača.
Primer 10: Kristalna struktura 7C2 Fab vezana za HER2
Postupci
[0519] Ekspresija, prečišćavanje i kristalizacija 7C2/HER2 kompleksa - 7C2 Fab je eksprimiran u E. coli i prečišćen upotrebom protein afinitetne smole sefarozne smole (GE), hromatografijom izmenjene katjonske SP sefaroze i hromatografijom isključivanja veličine (SEC). Vanćelijski domen HER2 (ECD) je eksprimiran u CHO ćelijama i prečišćen afinitetnom hromatografijom korišćenjem antitela trastuzumaba povezanog sa staklenim kuglicama sa kontrolisanim porama, praćeno DEAE anjonskom razmenom i hromatografijom za isključivanje veličine.
[0520] Kompleks između Fab 7C2 i HER2 ECD prečišćen je pomoću SEC. Kompleks je deglikoziliran upotrebom kombinacije enzima (Endo F1, F2, F3, Endo H i PNGase), praćeno prečišćavanjem pomoću SEC u 0,1 M NaCl, 20 mM HEPES pH 7,2 i 2% glicerola. Kompleks je kristalisan što je rezultiralo debelim pločama nakon sedmice u visećim kapima koristeći jednake delove proteina od 10 mg/ml i rezervoar (30% v/v PEG 550 monometileter, 0,1 M natrijum citrat trobazni dihidrat pH 5,0) i kratko tretiran rezervoarom pre potapanja u tečni azot.
[0521] Podaci o difrakciji kompleksa koji se protežu na 2,7 A rezoluciju prikupljeni su pri ∼110 K na SSRL liniji snopa 11-1. Difrakcione slike integrisane su i skalirane pomoću programa HKL2000 i elemenata paketa CCP4. Videti Winn i dr., 2011, Acta Crystallogr D. Biol. Crystallogr.67: 235-42.
[0522] Struktura je rešena molekularnom zamenom (MR) pomoću programa Phaser. Videti McCoy i dr., 2005, Acta Crystallogr D. Biol. Crystallogr. 61: 458-64. MR modeli pretraživanja uključuju HER2 ECD domen izveden iz kristalne strukture HER2/Herceptin Fab kompleksa (PDB kod: 1N8Z), Fab konstantni domen (PDB kod: 1N8Z) i predviđeni model za varijabilni domen koji generiše program Modeller. Videti Fiser i dr., 2003, Methods Enzymol., 374: 461-91. Struktura je usavršena programima REFMAC5 (Marshudov i dr., 2011, Acta Crystallogr D. Biol. Crystallogr. 67: 355-67) i PHENIX.refine (Adams i dr., 2010, Acta Crystallogr D. Biol. Crystallogr.66 (pt.2): 213-21) koristeći ciljne funkcije maksimalne verovatnoće, anizotropne pojedinačne B-faktore i TLS prečišćavanje Podaci i precizirani statistički podaci rezimirani su u Tabeli 12.
Tabela 12: Statistika prikupljanja podataka o difrakciji rendgenskih zraka i usavršavanja strukture (vrednosti u zagradama su za zadnju rezolucijsku ljusku)
1
Prikupljanje podataka SSRL 11-1
Razdelnička grupa C2221
Ćelijski parametri (Å) a=136,8, b=171,9, c=162,5
Rezolucija (Å) 50-2,75 (2,85-2,75)
Rsym 0,112 (0,689)
Broj posmatranja 319169
Jedinstvene refleksije 49078
Redundanse 6,5 (5,5)
Kompletnost (%) 98,8 (92,2)
<|>/<σ|> 20 (2,2)
Vm(A<3>/Da) 4,2
Prefinjenost
Rezolucija (Å) 48,33-2,75
Broj refleksija 49053
R, Rfree 0,23, 0,25
Broj ostataka 1047
Broj voda 109
Broj atoma 8039
RMSD veze (Å) 0,007
RMSD uglovi (°) 1,2
Srednja vezana ΔB (Å<2>) 5,5
Ramachandranova analiza 93/6/1
(%)
Broj TLS grupa 3
<B><e>(Å<2>) 7C2/HER2 88
Rezultati
[0523] Kristalna struktura kompleksa 7C2 Fab/HER2 određena je pri rezoluciji 2,75 Å. Svaka asimetrična jedinična ćelija sadrži jedan Fab/HER2 kompleks. Struktura je otkrila da se 7C2 Fab vezuje za domen I HER2 ECD (Slika 19A). Vezujući epitop se razlikuje od onih u prethodno okarakterisanim kompleksima HER2 ECD sa Fab fragmentima terapijskih antitela trastuzumab (Tmab) ili pertuzumab (Pmab), koji se nalaze u domenima IV, odnosno II. Pogledajte npr., Cho i dr., 2003, Nature, 421: 756-60; Eigenbrot i dr., 2010, PNAS, 107: 15039-44; i Franklin i dr., 2004, Caner Cell, 5: 17-28. Zaista, prekrivanje strukture kompleksa 7C2 Fab/HER2 ECD sa strukturama kompleksa Tmab/HER2 ECD i kompleksa Pmab/HER2 ECD pokazuje da tri Fab-a imaju nezavisne epitope koji se ne preklapaju i ne bi prostorno ometali međusobno vezivanje za HER2 ( Slika 19A). Superpozicija HER2 ECD struktura u okviru Tmab/HER2 ECD kompleksa, Pmab/HER2 ECD kompleksa i 7C2 Fab/HER2 ECD kompleksa pokazala je minimalne strukturne razlike (Slika 19B). Ovo zapažanje sugeriše da je HER2 ECD relativno krut, što je u skladu sa prethodnim izveštajima u literaturi. Pogledajte npr., Cho i dr., 2003, Nature, 421: 756-60; Eigenbrot i dr., 2010, PNAS, 107: 15039-44; i Franklin i dr., 2004, Caner Cell, 5: 17-28.
[0524] 7C2 Fab se vezuje za petlju 163-175 i petlju 185-189 unutar HER2 domena I (tj. Aminokiseline 163-175 i 185-189 zrelog HER2, npr., SEQ ID NO:39; domen I je prikazan u SEQ ID NO:35). Vezivo zakopava ∼1160Å<2>površine rastvarača dostupne na svakoj strani interfejsa. Postoji zamršena mreža hidrofobnih, vodoničnih veza i jonskih interakcija. Određeni ostaci koji su uključeni u vezivanje označeni su na Slici 19C. Bočni lanac His171 uspostavlja kontakt sa ostacima teškog lanca His52 i Asp55. HER2 ostaci Ser186, Ser187 i Glu188 formiraju vodoničnu vezu sa D102 iz teškog lanca i dva Tyr ostatka (Tyr36 i Tyr54) iz lakog lanca.
[0525] 7C2 vezujući epitop delimično se preklapa sa onim iz prethodno prijavljenog anti-HER2 antitela, chA21 (Slika 19D). Videti Zhou i dr., 2011, JBC, 286: 31676-83. Oba epitopa uključuju petlju u domenu I (ostaci 163-187). Zanimljivo je da ostatak His171 igra ulogu u interakciji sa oba antitela. Međutim, epitop za vezivanje za chA21 obuhvata ∼1820Å<2>površine rastvarača dostupne površini, koja je za ∼660Å<2>veća od epitopa 7C2 i uključuje dve dodatne N-terminalne petlje, ostatke 100-105 i ostatke 135-144.
Tabela sekvenci
NAZIV SEKVENCA SEQ
1 4
1
1
1
�
�
11
11
11
11
11
11
11
12
12
12
��
12
��
12
1
11
12
1
��
1
1
1
1
1
��
��
14
��

Claims (51)

  1. Patentni zahtevi 1. Izolovano antitelo koje se vezuje za HER2, pri čemu antitelo sadrži: (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:15; (b), HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:16; (c), HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:17; (d), HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:12; (e), HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:13; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:14, pri čemu antitelo vezuje HER2 sa konstantom disocijacije (KD) od ≤ 5 nM kako je određeno površinskom plazmonskom rezonancom; i/ili (ii) varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:11 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:10.
  2. 2. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:11 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:10.
  3. 3. Antitelo prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, koje je monoklonsko antitelo.
  4. 4. Antitelo prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, koje je humanizovano ili himerno antitelo.
  5. 5. Antitelo prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, koje je IgG1, IgG2a ili IgG2b antitelo.
  6. 6. Antitelo prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, koje je fragment antitela koji se vezuje za HER2.
  7. 7. Antitelo prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde se antitelo vezuje za vanćelijski domen I HER2, pri čemu vanćelijski domen I HER2 ima sekvencu SEQ ID NO:35.
  8. 8. Antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva, gde antitelo sadrži najmanje jednu mutaciju u konstantnom regionu teškog lanca odabranog između A118C i S400C i/ili sadrži najmanje jednu mutaciju u konstantnom regionu lakog lanca odabranog od K149C i V205C, pri čemu su ostaci numerisani prema EU sistemu numerisanja.
  9. 9. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, gde antitelo sadrži: a) teški lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:19 i laki lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:18; ili b) teški lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:19 i laki lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:23; ili c) teški lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:24 i laki lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:18.
  10. 10. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, gde antitelo sadrži teški lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:19 i laki lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:23.
  11. 11. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, gde antitelo sadrži konstantni region teškog lanca SEQ ID NO:28 ili gde antitelo sadrži konstantni region lakog lanca SEQ ID NO:25.
  12. 12. Izolovana nukleinska kiselina koja kodira antitelo iz bilo kog od prethodnih zahteva.
  13. 13. Ćelija domaćin koja sadrži nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 12.
  14. 14. Postupak za proizvodnju antitela, koji uključuje kultivisanje ćelije domaćina prema patentnom zahtevu 13, tako da se proizvodi antitelo.
  15. 15. Imunokonjugat koji sadrži antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 11 i citotoksično sredstvo.
  16. 16. Imunokonjugat prema patentnom zahtevu 15, koji sadrži antitelo prema patentnom zahtevu 2 ili patentnom zahtevu 10 i citotoksično sredstvo.
  17. 17. Imunokonjugat prema patentnom zahtevu 15 ili patentnom zahtevu 16, gde imunokonjugat ima formulu Ab-(L-D)p, gde: (a) Ab je antitelo; (b) L je veznik; (c) D je citotoksično sredstvo; i (d) p se kreće od 1-8.
  18. 18. Imunokonjugat prema patentnom zahtevu 17, gde je p u rasponu od 1,3-2 ili od 2-5.
  19. 19. Imunokonjugat prema patentnom zahtevu 17, gde je p oko 2.
  20. 20. Imunokonjugat prema bilo kom od patentnih zahteva 15 do 19, gde je citotoksično sredstvo odabrano iz auristatina, majtanzinoida, kaliheamicina, pirolobenzodiazepina, derivata nemorubicina i 1-(hlorometil)-2,3-dihidro-1H-benzo[e]indola (CBI).
  21. 21. Imunokonjugat prema bilo kom od patentnih zahteva 15 do 19, gde je citotoksično sredstvo pirolobenzodiazepin formule A:
    pri čemu isprekidane linije označavaju opciono prisustvo dvostruke veze između C1 i C2 ili C2 i C3; R<2>je nezavisno odabran iz H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, =CH-R<D>, =C(R<D>)2, O-SO2-R, CO2R i COR, i opciono dalje odabrani između halo ili dihalo, pri čemu je R<D>nezavisno izabrani iz R, CO2R, COR, CHO, CO2H, i halo; R<6>i R<9>nezavisno odabrani iz H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn i halo; R<7>je nezavisno odabran iz H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn i halo; Q je nezavisno odabran iz O, S i NH; R<11>je bilo H ili R; ili Q je O i R<11>je SO3M, gde je M katjon metala; R i R' su svaki nezavisno izabrani između opciono supstituisanih C1-8alkil, C3-8heterociklil i C5-20aril grupa, i opciono u odnosu na grupu NRR', R i R 'zajedno sa atomom azota kome su vezani formiraju opciono supstituisani 4-, 5-, 6- ili 7-člani heterociklični prsten; R<12>, R<16>, R<19>i R<17>su definisani za R<2>, R<6>, R<9>i R<7>respektivno; R” je C3-12alkilenska grupa, čiji lanac može biti prekinut jednim ili više heteroatoma i/ili aromatičnih prstenova koji su opciono supstituisani; i X i X' su nezavisno odabrani iz O, S i N(H).
  22. 22. Imunokonjugat prema patentnom zahtevu 21, gde D ima strukturu:
    gde je n 0 ili 1.
  23. 23. Imunokonjugat prema bilo kom od patentnih zahteva 15 do 19, gde je citotoksično sredstvo derivat nemorubicina.
  24. 24. Imunokonjugat prema patentnom zahtevu 23, gde citotoksično sredstvo ima strukturu odabranu iz: 14
  25. 25. Imunokonjugat prema jednom od patentnih zahteva 15 do 19, gde citotoksično sredstvo sadrži 1-(hlorometil)-2,3-dihidro-1H-benzo[e]indol (CBI).
  26. 26. Imunokonjugat prema patentnom zahtevu 25, gde citotoksično sredstvo ima formulu:
    gde je R<1>odabran iz H, P(O)3H2, C(O)NR<a>R<b>, ili je vezan za L; R<2>odabran iz H, P(O)3H2, C(O)NR<a>R<b>, ili je vezan za L; R<a>i R<b>su nezavisno izabrani od H i C1-C6alkila opciono supstituisani sa jednim ili više F, ili R<a>i R<b>formiraju peto- ili šestočlanu heterociklil grupu; T je vezana grupa izabrana iz C3-C12alkilena, Y, (C1-C6alkilena)-Y-(C1-C6alkilena), (C1-C6alkilena)-Y-(C1-C6alkilena)-Y-(C1-C6alkilena), (C2-C6alkenilena)-Y-(C2-C6alkenilena), i (C2-C6alkinilena)-Y-(C2-C6alkinilena); gde se Y nezavisno bira između O, S, NR<1>, arila i heteroarila; gde su alkilen, alkenilen, aril i heteroaril nezavisno i opciono supstituisani sa F, OH, O(C1-C6alkil), NH2, NHCH3, N(CH3)2, OP(O)3H2, i C1-C6alkil, gde je alkil opciono supstituisan sa jednim ili više F; ili su alkilen, alkenilen, aril i heteroaril nezavisno i opciono supstituisani vezom za L; D' je deo leka izabran iz:
    14
    gde talasasta linija označava mesto vezivanja za T; X<1>i X<2>se nezavisno biraju između O i NR<3>, gde se R<3>bira između H i C1-C6alkila, opciono supstituisanog sa jednim ili više F; R<4>je H, CO2R, ili veza sa veznikom (L), gde je R C1-C6alkil ili benzil; i R<5>je ili H, C1-C6alkil.
  27. 27. Imunokonjugat prema patentnom zahtevu 26, gde citotoksično sredstvo ima strukturu odabranu iz:
    1
  28. 28. Imunokonjugat prema bilo kom od patentnih zahteva 17 do 27, gde se veznik može podeliti proteazom.
  29. 29. Imunokonjugat prema bilo kom od patentnih zahteva 17 do 27, gde je veznik labilno kiselinski.
  30. 30. Imunokonjugat prema patentnom zahtevu 29, gde veznik sadrži hidrazin.
  31. 31. Imunokonjugat prema bilo kom od patentnih zahteva 17 do 29, gde veznik sadrži disulfid.
  32. 32. Imunokonjugat prema bilo kom od patentnih zahteva 17 do 19, koji ima strukturu odabranu iz:
    1 1
    ��
  33. 33. Imunokonjugat prema bilo kom od patentnih zahteva 15 do 19, gde citotoksično sredstvo sadrži strukturu:
  34. 34. Imunokonjugat prema bilo kom od patentnih zahteva 15 do 33, koji se koristi za lečenje osobe koja ima HER2-pozitivan rak.
  35. 35. Imunokonjugat za upotrebu prema patentnom zahtevu 34, gde je HER2-pozitivni rak rak dojke ili rak želuca.
  36. 36. Imunokonjugat za upotrebu prema patentnom zahtevu 35, gde je HER2-pozitivni rak dojke rani stadijum raka dojke.
  37. 37. Imunokonjugat za upotrebu prema patentnom zahtevu 35, gde je HER2-pozitivni rak dojke metastatski rak dojke. 1
  38. 38. Imunokonjugat za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 34 do 37, gde je imunokonjugat za upotrebu u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapijskih sredstava.
  39. 39. Imunokonjugat za upotrebu prema patentnom zahtevu 38, gde je jedno ili više dodatnih terapijskih sredstava antitelo ili imunokonjugat koji se vezuje za HER2.
  40. 40. Imunokonjugat za upotrebu prema patentnom zahtevu 39, gde je jedno ili više dodatnih terapijskih sredstava (i) antitelo ili imunokonjugat koji se vezuje za domen II HER2, i/ili (ii) antitelo ili imunokonjugat koji se vezuje za domen IV ili HER2.
  41. 41. Imunokonjugat za upotrebu prema patentnom zahtevu 39, gde su jedno ili više dodatnih terapijskih sredstava (1) izabrani između trastuzumaba, trastuzumaba-MCC-DM1 (T-DM1) i pertuzumaba; (2) trastuzumaba; (3) T-DM1; (4) pertuzumaba; ili (5) trastuzumaba i pertuzumaba.
  42. 42. Imunokonjugat za upotrebu prema patentnom zahtevu 41, gde je HER2-pozitivni rak metastatski rak dojke, a gde je dodatno terapijsko sredstvo T-DM1.
  43. 43. Imunokonjugat za upotrebu prema patentnom zahtevu 41, gde je HER2-pozitivni rak metastatski rak dojke, i gde je dodatno terapijsko sredstvo trastuzumab, pertuzumab i hemoterapeutsko sredstvo.
  44. 44. Imunokonjugat za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 34 do 43, gde je HER2-pozitivni rak rekurentni rak.
  45. 45. Imunokonjugat za upotrebu prema patentnom zahtevu 44, gde je rekurentni rak lokalno rekurentni rak.
  46. 46. Imunokonjugat za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 34 do 43, pri čemu je HER2-pozitivni rak uznapredovali rak.
  47. 47. Imunokonjugat za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 34 do 46, pri čemu HER2-pozitivni rak nije resektabilan.
  48. 48. Imunokonjugat za upotrebu prema patentnom zahtevu 34 ili patentnom zahtevu 35, gde lečenje obuhvata: a) podvrgavanje pojedinca neoadjuvantnom lečenju imunokonjugatom, b) uklanjanje raka konačnom hirurškom intervencijom i b) uklanjanje raka konačnom hirurškom intervencijom i
  49. 49. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 11, konjugovano sa oznakom, pri čemu je oznaka opciono pozitronski emiter, pri čemu je pozitronski emiter opciono 89Zr.
  50. 50. Postupak detekcije humanog HER2 u biološkom uzorku, koji obuhvata kontakt biološkog uzorka sa antitelom na HER2 prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 11 i 49 pod uslovima koji dozvoljavaju vezivanje anti-HER2 antitela na humani HER2, i otkrivanje da li se u biološkom uzorku formira kompleks između antitela na HER2 i prirodnog HER2 čoveka, pri čemu je biološki uzorak opciono uzorak raka dojke ili želuca.
  51. 51. Antitelo prema patentnom zahtevu 49 za upotrebu u otkrivanju HER2 pozitivnog karcinoma, pri čemu otkrivanje obuhvata (i) davanje antitela ispitaniku koji ima ili sumnja da ima HER2 pozitivan rak, i (ii) otkrivanje antitela kod ispitanika, pri čemu otkrivanje antitela ukazuje na HER2-pozitivan rak kod ispitanika. 1 4
RS20201339A 2014-09-12 2015-09-11 Anti-her2 antitela i imunokonjugati RS61019B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462049594P 2014-09-12 2014-09-12
PCT/US2015/049549 WO2016040723A1 (en) 2014-09-12 2015-09-11 Anti-her2 antibodies and immunoconjugates
EP15772090.5A EP3191135B1 (en) 2014-09-12 2015-09-11 Anti-her2 antibodies and immunoconjugates

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS61019B1 true RS61019B1 (sr) 2020-12-31

Family

ID=54238547

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20201339A RS61019B1 (sr) 2014-09-12 2015-09-11 Anti-her2 antitela i imunokonjugati

Country Status (31)

Country Link
US (5) US9518118B2 (sr)
EP (2) EP3782654A1 (sr)
JP (2) JP7085837B2 (sr)
KR (1) KR102508173B1 (sr)
CN (2) CN107001479B (sr)
AR (1) AR101845A1 (sr)
AU (2) AU2015314954B2 (sr)
BR (1) BR112017004631A2 (sr)
CA (1) CA2957238C (sr)
CL (1) CL2017000545A1 (sr)
CO (1) CO2017001919A2 (sr)
CR (2) CR20170131A (sr)
DK (1) DK3191135T3 (sr)
EA (1) EA201790545A1 (sr)
ES (1) ES2830385T3 (sr)
HR (1) HRP20201719T1 (sr)
HU (1) HUE052460T2 (sr)
IL (1) IL250440B (sr)
LT (1) LT3191135T (sr)
MA (1) MA40576B1 (sr)
MX (1) MX2017003126A (sr)
MY (1) MY186334A (sr)
PE (1) PE20170935A1 (sr)
PH (1) PH12017500322A1 (sr)
PL (1) PL3191135T3 (sr)
PT (1) PT3191135T (sr)
RS (1) RS61019B1 (sr)
SG (2) SG10201809668TA (sr)
SI (1) SI3191135T1 (sr)
TW (2) TWI758784B (sr)
WO (1) WO2016040723A1 (sr)

Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2799540A1 (en) * 2010-06-08 2011-12-15 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
LT3191135T (lt) 2014-09-12 2020-11-25 Genentech, Inc. Anti-her2 antikūnai ir imunokonjugatai
SG11201701128YA (en) * 2014-09-12 2017-03-30 Genentech Inc Cysteine engineered antibodies and conjugates
MX2017003472A (es) * 2014-09-17 2017-10-31 Genentech Inc Inmunoconjugados que comprenden anticuerpos anti-her2.
WO2016148674A1 (en) 2015-03-13 2016-09-22 Endocyte, Inc. Conjugates for treating diseases
GB201510010D0 (en) 2015-06-09 2015-07-22 King S College London PDD and BPD compounds
CN108064246A (zh) * 2015-06-15 2018-05-22 基因泰克公司 抗体和免疫结合物
US20180339985A1 (en) 2015-08-21 2018-11-29 Femtogenix Limited Pdd compounds
GB201514928D0 (en) 2015-08-21 2015-10-07 King S College London PDD compounds
CR20180243A (es) 2015-10-02 2018-07-31 Genentech Inc Conjugados de anticuerpo-fármaco de pirrolobenzodiazepina y métodos de uso
WO2017172930A1 (en) * 2016-03-29 2017-10-05 Endocyte, Inc. Pbd conjugates for treating diseases
US20190119403A1 (en) * 2016-03-31 2019-04-25 University Of Southern California Methods of constructing immunoglobulin fusion proteins inhibiting cathepsin b and compositions thereof
CN109641910A (zh) 2016-06-24 2019-04-16 梅尔莎纳医疗公司 吡咯并苯二氮*及其缀合物
CN109689111B (zh) 2016-08-11 2024-04-05 基因泰克公司 吡咯并苯并二氮杂䓬前药及其抗体缀合物
EP4649966A3 (en) 2016-12-01 2026-02-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Radiolabeled anti-pd-l1 antibodies for immuno-pet imaging
EA201991673A1 (ru) 2017-02-10 2020-01-17 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Меченные радиоактивным изотопом антитела к lag3 для иммуно-пэт-визуализации
IL268959B2 (en) 2017-02-28 2025-01-01 Seagen Inc Cystine-mutated antibodies, compositions containing them and uses thereof
AR111651A1 (es) * 2017-04-28 2019-08-07 Novartis Ag Conjugados de anticuerpos que comprenden agonistas del receptor de tipo toll y terapias de combinación
EP3634401A1 (en) * 2017-06-07 2020-04-15 Silverback Therapeutics, Inc. Antibody construct conjugates
CA3064804A1 (en) * 2017-06-14 2018-12-20 Adc Therapeutics Sa Dosage regimes for the administration of an anti-cd19 adc
SG11202000073XA (en) 2017-07-24 2020-02-27 Regeneron Pharma Anti-cd8 antibodies and uses thereof
ES2983006T3 (es) * 2017-08-11 2024-10-21 Georg August Univ Goettingen Método para la síntesis de profármacos bifuncionales monoprotegidos y conjugados anticuerpo-fármaco a base de los mismos así como un método para preparar conjugados anticuerpo-fármaco
IL325995A (en) 2018-02-08 2026-03-01 Genentech Inc Bispecific antigen binding molecules and methods of use
SG11202007961QA (en) 2018-04-13 2020-09-29 Hoffmann La Roche Her2-targeting antigen binding molecules comprising 4-1bbl
GB201814281D0 (en) 2018-09-03 2018-10-17 Femtogenix Ltd Cytotoxic agents
EA202190749A1 (ru) 2018-09-10 2021-07-09 Мирати Терапьютикс, Инк. Способы комбинированной терапии
US20200179500A1 (en) 2018-12-05 2020-06-11 Wayne State University Methods and immunogenic compositions relating to her2 with selective sequence modifications
GB201901197D0 (en) 2019-01-29 2019-03-20 Femtogenix Ltd G-A Crosslinking cytotoxic agents
JP2022523854A (ja) * 2019-03-07 2022-04-26 エービーエル バイオ インコーポレイテッド 抗体－薬物コンジュゲート及びその用途
AU2020349462A1 (en) 2019-09-16 2022-03-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Radiolabeled MET binding proteins for immuno-PET imaging
EP4058024A1 (en) 2019-11-15 2022-09-21 Seagen Inc. Methods of treating her2 positive breast cancer with tucatinib in combination with an anti-her2 antibody-drug conjugate
BR112022011848A2 (pt) * 2019-12-20 2022-11-22 Pfizer Tratamento com conjugados de anticorpo-fármaco her2 específicos de sítio
CN111606996B (zh) * 2020-06-05 2020-12-25 北京鼎成肽源生物技术有限公司 一种靶向4d5的鼠源单克隆抗体及其制备方法和应用
AU2021295549A1 (en) 2020-06-23 2022-11-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Agonistic CD28 antigen binding molecules targeting Her2
GB2597532A (en) 2020-07-28 2022-02-02 Femtogenix Ltd Cytotoxic compounds
AR124414A1 (es) 2020-12-18 2023-03-22 Century Therapeutics Inc Sistema de receptor de antígeno quimérico con especificidad de receptor adaptable
EP4345113A1 (en) * 2022-09-30 2024-04-03 SDS Optic Spolka Akcyjna Anti-her2 antibody, a nucleic acid molecule encoding the variable region of said antibody, a method of detecting her2 in a biological sample, an immuno-enzymatic elisa assay and use of said anti-her2 antibody or fragments therefof
AU2023393382A1 (en) 2022-12-14 2025-06-19 Pheon Therapeutics Ltd Cytotoxic compounds
WO2024138128A2 (en) 2022-12-23 2024-06-27 Genentech, Inc. Cereblon degrader conjugates, and uses thereof
WO2026006689A2 (en) 2024-06-28 2026-01-02 Firefly Bio, Inc. Bcl-xl degrader antibody conjugates and uses thereof
WO2026077405A1 (zh) * 2024-10-11 2026-04-16 烟台蓝纳成生物技术股份有限公司 一种抗her2抗体、抗体核素偶联物及其应用

Family Cites Families (230)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US633410A (en) 1898-09-22 1899-09-19 George A Ames Ice-cutter.
US3896111A (en) 1973-02-20 1975-07-22 Research Corp Ansa macrolides
US4151042A (en) 1977-03-31 1979-04-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for producing maytansinol and its derivatives
US4137230A (en) 1977-11-14 1979-01-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for the production of maytansinoids
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4265814A (en) 1978-03-24 1981-05-05 Takeda Chemical Industries Matansinol 3-n-hexadecanoate
JPS5562090A (en) 1978-10-27 1980-05-10 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55164687A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS5566585A (en) 1978-11-14 1980-05-20 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS55164685A (en) 1979-06-08 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164686A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4309428A (en) 1979-07-30 1982-01-05 Takeda Chemical Industries, Ltd. Maytansinoids
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
WO1981001145A1 (en) 1979-10-18 1981-04-30 Univ Illinois Hydrolytic enzyme-activatible pro-drugs
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4427588A (en) 1982-11-08 1984-01-24 Bristol-Myers Company Process for conversion of oxotomaymycin to tomaymycin
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
JP3040121B2 (ja) 1988-01-12 2000-05-08 ジェネンテク，インコーポレイテッド 増殖因子レセプターの機能を阻害することにより腫瘍細胞を処置する方法
IL106992A (en) 1988-02-11 1994-06-24 Bristol Myers Squibb Co Acylhydrazone derivatives of anthracycline and methods for their preparation
EP0368684B2 (en) 1988-11-11 2004-09-29 Medical Research Council Cloning immunoglobulin variable domain sequences.
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
CA2095633C (en) 1990-12-03 2003-02-04 Lisa J. Garrard Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
AU657961B2 (en) 1991-04-19 1995-03-30 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical formulation and process
US6800738B1 (en) 1991-06-14 2004-10-05 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US7018809B1 (en) 1991-09-19 2006-03-28 Genentech, Inc. Expression of functional antibody fragments
US5362852A (en) 1991-09-27 1994-11-08 Pfizer Inc. Modified peptide derivatives conjugated at 2-hydroxyethylamine moieties
FI941572A7 (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenete lmä
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
CA2372813A1 (en) 1992-02-06 1993-08-19 L.L. Houston Biosynthetic binding protein for cancer marker
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
DK0752248T3 (da) 1992-11-13 2000-11-13 Idec Pharma Corp Terapeutisk anvendelse af kimæriske og radioaktivt mærkede antistoffer mod humant B-lymfocytbegrænset differentieringsantig
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
AU691811B2 (en) 1993-06-16 1998-05-28 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
EP0731106B1 (en) 1993-10-01 2004-11-17 Teikoku Hormone Mfg. Co., Ltd. Dolastatin derivatives
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5663149A (en) 1994-12-13 1997-09-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide heterocyclic and halophenyl amides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
GB2315067B (en) 1996-07-11 2000-02-16 Pharmacia Spa Morpholinyl anthracycline derivatives
US7371376B1 (en) * 1996-10-18 2008-05-13 Genentech, Inc. Anti-ErbB2 antibodies
KR20060079258A (ko) * 1996-10-18 2006-07-05 제넨테크, 인크. 항-ＥｒｂＢ２ 항체
ATE299938T1 (de) 1997-05-02 2005-08-15 Genentech Inc Ein verfahren zur herstellung multispezifischer antikörper die heteromultimere und gemeinsame komponenten besitzen
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
ES2244066T3 (es) 1997-06-24 2005-12-01 Genentech, Inc. Procedimiento y composiciones de glicoproteinas galactosiladas.
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
US6602677B1 (en) 1997-09-19 2003-08-05 Promega Corporation Thermostable luciferases and methods of production
AU759779B2 (en) 1997-10-31 2003-05-01 Genentech Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
DK1034298T3 (da) 1997-12-05 2012-01-30 Scripps Research Inst Humanisering af murint antistof
WO1999048527A1 (en) 1998-03-27 1999-09-30 Genentech, Inc. Apo-2 ligand-anti-her-2 antibody synergism
ATE375365T1 (de) 1998-04-02 2007-10-15 Genentech Inc Antikörper varianten und fragmente davon
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
DK1071700T3 (da) 1998-04-20 2010-06-07 Glycart Biotechnology Ag Glykosylerings-modifikation af antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellulær cytotoksicitet
NZ507557A (en) 1998-05-06 2003-10-31 Genentech Inc Protein purification by ion exchange chromatography
GB9818731D0 (en) 1998-08-27 1998-10-21 Univ Portsmouth Compounds
DE69925133T2 (de) 1998-08-27 2006-01-19 Spirogen Ltd., Ryde Pyrrolobenzodiazepine
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
PL209392B1 (pl) 1999-01-15 2011-08-31 Genentech Inc Przeciwciało, komórka gospodarza, sposób wytwarzania przeciwciała oraz zastosowanie przeciwciała
CA2704600C (en) 1999-04-09 2016-10-25 Kyowa Kirin Co., Ltd. A method for producing antibodies with increased adcc activity
US7041292B1 (en) 1999-06-25 2006-05-09 Genentech, Inc. Treating prostate cancer with anti-ErbB2 antibodies
US6949245B1 (en) 1999-06-25 2005-09-27 Genentech, Inc. Humanized anti-ErbB2 antibodies and treatment with anti-ErbB2 antibodies
ES2248127T3 (es) 1999-10-04 2006-03-16 Medicago Inc. Metodo para regular la transcripcion de genes foraneos en presencia de nigtrogeno.
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
EP1229125A4 (en) 1999-10-19 2005-06-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk PROCESS FOR PREPARING A POLYPEPTIDE
EP1240319A1 (en) 1999-12-15 2002-09-18 Genentech, Inc. Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
AU767394C (en) 1999-12-29 2005-04-21 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising modified doxorubicins and daunorubicins and their therapeutic use
US7097840B2 (en) 2000-03-16 2006-08-29 Genentech, Inc. Methods of treatment using anti-ErbB antibody-maytansinoid conjugates
JP2003531588A (ja) 2000-04-11 2003-10-28 ジェネンテック・インコーポレーテッド 多価抗体とその用途
CA2407556C (en) 2000-05-19 2011-06-21 Genentech, Inc. Gene detection assay for improving the likelihood of an effective response to an erbb antagonist cancer therapy
US6984494B2 (en) 2000-08-15 2006-01-10 Genentech, Inc. Analytical method
CA2953239A1 (en) 2000-10-06 2002-04-18 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Antibody composition-producing cell
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
CA2430013C (en) 2000-11-30 2011-11-22 Medarex, Inc. Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
US6441163B1 (en) 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
NZ571596A (en) 2001-08-03 2010-11-26 Glycart Biotechnology Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
US7091186B2 (en) 2001-09-24 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. p-Amidobenzylethers in drug delivery agents
WO2003026577A2 (en) 2001-09-24 2003-04-03 Seattle Genetics, Inc. P-amidobenzylethers in drug delivery agents
CA2463879C (en) 2001-10-25 2012-12-04 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
CA2467242A1 (en) 2001-11-20 2003-05-30 Seattle Genetics, Inc. Treatment of immunological disorders using anti-cd30 antibodies
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
US6660856B2 (en) 2002-03-08 2003-12-09 Kaohsiung Medical University Synthesis of pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepine analogues
CA2481658A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method of enhancing of binding activity of antibody composition to fcy receptor iiia
EP1500400A4 (en) 2002-04-09 2006-10-11 Kyowa Hakko Kogyo Kk MEDICAMENT WITH ANTIBODY COMPOSITION
BR0309145A (pt) 2002-04-09 2005-02-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk Células das quais o genoma é modificado
CA2481925A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Therapeutic agent for patients having human fc.gamma.riiia
ATE503829T1 (de) 2002-04-09 2011-04-15 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Zelle mit erniedrigter oder deletierter aktivität eines am gdp-fucosetransport beteiligten proteins
EP1498490A4 (en) 2002-04-09 2006-11-29 Kyowa Hakko Kogyo Kk PROCESS FOR PREPARING ANTIBODY COMPOSITION
CA2488441C (en) 2002-06-03 2015-01-27 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US20050180972A1 (en) 2002-07-31 2005-08-18 Wahl Alan F. Anti-CD20 antibody-drug conjugates for the treatment of cancer and immune disorders
DK1545613T3 (da) 2002-07-31 2011-11-14 Seattle Genetics Inc Auristatinkonjugater og deres anvendelse til behandling af cancer, en autoimmun sygdom eller en infektiøs sygdom
AR040956A1 (es) 2002-07-31 2005-04-27 Schering Ag Nuevos conjugados de efectores, procedimientos para su preparacion y su uso farmaceutico
DE60336149D1 (de) 2002-08-16 2011-04-07 Immunogen Inc Vernetzer mit hoher reaktivität und löslichkeit und ihre verwendung bei der herstellung von konjugaten für die gezielte abgabe von kleinmolekularen arzneimitteln
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
TWI335821B (en) 2002-12-16 2011-01-11 Genentech Inc Immunoglobulin variants and uses thereof
WO2004065416A2 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
BR0318028A (pt) 2003-01-24 2005-12-06 Schering Ag Corantes hidrofìlicos de cianina reativos a tiol e conjugados dos mesmos com biomoléculas para diagnóstico por fluorescência
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
ATE421967T1 (de) 2003-03-31 2009-02-15 Council Scient Ind Res Nichtvernetzende pyrroloä2,1-cüä1, 4übenzodiazepine als potentielle antitumor- agentien und ihre herstellung
US7755007B2 (en) 2003-04-17 2010-07-13 K&H Manufacturing, Inc Heated pet mat
US7276497B2 (en) 2003-05-20 2007-10-02 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising new maytansinoids
GB0321295D0 (en) 2003-09-11 2003-10-15 Spirogen Ltd Synthesis of protected pyrrolobenzodiazepines
JPWO2005035586A1 (ja) 2003-10-08 2007-11-22 協和醗酵工業株式会社 融合蛋白質組成物
JPWO2005035778A1 (ja) 2003-10-09 2006-12-21 協和醗酵工業株式会社 α１，６−フコシルトランスフェラーゼの機能を抑制するＲＮＡを用いた抗体組成物の製造法
WO2005040170A2 (en) 2003-10-22 2005-05-06 Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Pyrrolobenzodiazepine derivatives, compositions comprising the same and methods related thereto
US9296820B2 (en) 2003-11-05 2016-03-29 Roche Glycart Ag Polynucleotides encoding anti-CD20 antigen binding molecules with increased Fc receptor binding affinity and effector function
EP2478912B1 (en) 2003-11-06 2016-08-31 Seattle Genetics, Inc. Auristatin conjugates with anti-HER2 or anti-CD22 antibodies and their use in therapy
WO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 抗体組成物を含有する医薬
US7004206B2 (en) 2004-01-29 2006-02-28 Viken James P Automatic fluid exchanger
CA2556752C (en) 2004-02-23 2016-02-02 Genentech, Inc. Heterocyclic self-immolative linkers and conjugates
GB0404577D0 (en) 2004-03-01 2004-04-07 Spirogen Ltd Pyrrolobenzodiazepines
WO2005085251A1 (en) 2004-03-01 2005-09-15 Spirogen Limited 11-hydroxy-5h-pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-one derivatives as key intermediates for the preparation of c2 substituted pyrrolobenzodiazepines
WO2005085260A1 (en) 2004-03-09 2005-09-15 Spirogen Limited Pyrrolobenzodiazepines
EP1740615B1 (en) 2004-03-31 2014-11-05 Genentech, Inc. Humanized anti-tgf-beta antibodies
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
PT1737891E (pt) 2004-04-13 2013-04-16 Hoffmann La Roche Anticorpos anti p-selectina
FR2869231B1 (fr) 2004-04-27 2008-03-14 Sod Conseils Rech Applic Composition therapeutique contenant au moins un derive de la pyrrolobenzodiazepine et la fludarabine
NZ579482A (en) 2004-06-01 2011-02-25 Genentech Inc Antibody drug conjugates and methods
DK1771482T3 (da) 2004-07-22 2014-10-20 Genentech Inc HER2-antistofsammensætning
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
DK1791565T3 (en) 2004-09-23 2016-08-01 Genentech Inc Cysteingensplejsede antibodies and conjugates
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
CN102580084B (zh) 2005-01-21 2016-11-23 健泰科生物技术公司 Her抗体的固定剂量给药
EP1850874B1 (en) 2005-02-23 2013-10-16 Genentech, Inc. Extending time to disease progression or survival in ovarian cancer patients using pertuzumab
WO2007008848A2 (en) 2005-07-07 2007-01-18 Seattle Genetics, Inc. Monomethylvaline compounds having phenylalanine carboxy modifications at the c-terminus
ES2708763T3 (es) 2005-07-07 2019-04-11 Seattle Genetics Inc Compuestos de monometilvalina que tienen modificaciones de la cadena lateral de fenilalanina en el extremo C
SI1934174T1 (sl) 2005-10-07 2011-08-31 Exelixis Inc Inhibitorji MEK in postopki za njihovo uporabo
ES2577292T3 (es) 2005-11-07 2016-07-14 Genentech, Inc. Polipéptidos de unión con secuencias hipervariables de VH/VL diversificadas y consenso
EP1973951A2 (en) 2005-12-02 2008-10-01 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
RS52060B (sr) 2006-01-25 2012-04-30 Sanofi Citotoksični agensi koji sadrže nove derivate tomaimicina
TW200812616A (en) 2006-05-09 2008-03-16 Genentech Inc Binding polypeptides with optimized scaffolds
MX2009000709A (es) 2006-07-18 2009-02-04 Sanofi Aventis Anticuerpo antagonista contra epha2 para el tratamiento de cancer.
WO2008027236A2 (en) 2006-08-30 2008-03-06 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
EP1914242A1 (en) 2006-10-19 2008-04-23 Sanofi-Aventis Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
SI2019104T1 (sl) 2007-07-19 2013-12-31 Sanofi Citotoksična sredstva, ki obsegajo nove tomaimicinske derivate, in njihova terapevtska uporaba
JP6157046B2 (ja) 2008-01-07 2017-07-05 アムジェン インコーポレイテッド 静電的ステアリング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｓｔｅｅｒｉｎｇ）効果を用いた抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための方法
TWI472339B (zh) 2008-01-30 2015-02-11 Genentech Inc 包含結合至ｈｅｒ２結構域ii之抗體及其酸性變異體的組合物
EP2240495B1 (en) 2008-02-01 2015-07-15 Genentech, Inc. Nemorubicin metabolite and analog reagents, antibody-drug conjugates and methods
AU2009270988A1 (en) 2008-07-15 2010-01-21 Genentech, Inc. Anthracycline derivative conjugates, process for their preparation and their use as antitumor compounds
GB0819097D0 (en) 2008-10-17 2008-11-26 Spirogen Ltd Pyrrolobenzodiazepines
GB0819095D0 (en) 2008-10-17 2008-11-26 Spirogen Ltd Pyrrolobenzodiazepines
RU2683325C2 (ru) 2009-02-05 2019-03-28 Иммьюноджен, Инк. Новые производные бензодиазепина
ES2784829T3 (es) 2009-04-08 2020-10-01 Faulstich Heinz Dr Componentes de unión a la superficie de células terapéuticas provistos de amatoxina diseñados para terapia de tumores
FR2949469A1 (fr) 2009-08-25 2011-03-04 Sanofi Aventis Derives anticancereux, leur preparation et leur application en therapeutique
US20110165155A1 (en) 2009-12-04 2011-07-07 Genentech, Inc. Methods of treating metastatic breast cancer with trastuzumab-mcc-dm1
KR20130020765A (ko) 2010-02-16 2013-02-28 메디뮨 엘엘씨 Ｈｓａ-관련 조성물 및 사용방법
CN102167742B (zh) * 2010-02-25 2014-05-14 上海百迈博制药有限公司 一种全人源抗her2单克隆抗体、其制备方法及用途
CA2795349C (en) 2010-04-15 2016-11-29 Seattle Genetics, Inc. Targeted pyrrolobenzodiazepine conjugates
JP5875083B2 (ja) 2010-04-15 2016-03-02 メディミューン リミテッド 増殖性疾患治療用ピロロベンゾジアゼピン
SI2528625T1 (sl) 2010-04-15 2013-11-29 Spirogen Sarl Pirolobenzodiazepini in njihovi konjugati
KR101860963B1 (ko) 2010-04-23 2018-05-24 제넨테크, 인크. 이종다량체 단백질의 생산
CA2799540A1 (en) 2010-06-08 2011-12-15 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
FR2963007B1 (fr) 2010-07-26 2013-04-05 Sanofi Aventis Derives anticancereux, leur preparation et leur application therapeutique
ES2402254T3 (es) 2010-09-30 2013-04-30 Heidelberg Pharma Ag Conjugados de amatoxinas con ligadores mejorados
KR101897307B1 (ko) 2010-12-02 2018-09-10 네르비아노 메디칼 사이언시스 에스.알.엘. 모르폴리닐 안트라사이클린 유도체의 제조 방법
RU2018108836A (ru) 2011-02-04 2019-03-14 Дженентек, Инк. ВАРИАНТЫ Fc И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ
JP5826863B2 (ja) 2011-02-15 2015-12-02 イミュノジェン・インコーポレーテッド 細胞傷害性ベンゾジアゼピン誘導体
CN202049853U (zh) 2011-03-01 2011-11-23 旭丽电子(广州)有限公司 薄型变压器及灯管
EP2497499A1 (en) 2011-03-10 2012-09-12 Heidelberg Pharma GmbH Amatoxin-conjugates with improved linkages
ES2692268T5 (en) 2011-03-29 2025-02-26 Roche Glycart Ag Antibody fc variants
SG11201400770SA (en) 2011-09-20 2014-04-28 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines as unsymmetrical dimeric pbd compounds for inclusion in targeted conjugates
EP2751111B1 (en) 2011-10-14 2017-04-26 MedImmune Limited Asymmetrical bis-(5H-Pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-one) derivatives for the treatment of proliferative or autoimmune diseases
BR112014009050B1 (pt) 2011-10-14 2022-06-21 Medimmune Limited Conjugado anticorpo-fármaco de pirrolbenzodiazepinas, composição farmacêutica que compreende o mesmo, bem como compostos de pirrolbenzodiazepinas
CN103997893B (zh) 2011-10-14 2019-04-12 西雅图基因公司 吡咯并苯并二氮杂卓和靶向结合物
CA2850373C (en) 2011-10-14 2019-07-16 Seattle Genetics, Inc. Pyrrolobenzodiazepines and targeted conjugates
WO2013171157A1 (en) 2012-05-14 2013-11-21 Sanofi Method for producing recombinant 11-de-o-methyltomaymycin
WO2013177481A1 (en) 2012-05-25 2013-11-28 Immunogen, Inc. Benzodiazepines and conjugates thereof
AR091703A1 (es) 2012-07-09 2015-02-25 Genentech Inc Anticuerpos e inmunoconjugados que comprenden anticuerpos anti-cd22
US20150218220A1 (en) 2012-09-12 2015-08-06 Brian Alan MENDELSOHN Amatoxin derivatives and cell-permeable conjugates thereof as inhibitors of rna polymerase
RS57694B1 (sr) 2012-10-12 2018-11-30 Adc Therapeutics Sa Pirolobenzodiazepin - anti-psma konjugati antitela
SI2906252T1 (sl) 2012-10-12 2017-10-30 Adc Therapeutics Sa Pirolobenzodiazepin-anti-HER2 protitelesni konjugati
EP2906249B1 (en) 2012-10-12 2018-06-27 MedImmune Limited Synthesis and intermediates of pyrrolobenzodiazepine derivatives for conjugation
JP6392765B2 (ja) 2012-10-12 2018-09-19 エイディーシー・セラピューティクス・エス・アーＡｄｃ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｓａ ピロロベンゾジアゼピン−抗体結合体
EP2906296B1 (en) 2012-10-12 2018-03-21 ADC Therapeutics SA Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
WO2014057118A1 (en) 2012-10-12 2014-04-17 Adc Therapeutics Sarl Pyrrolobenzodiazepine-anti-cd22 antibody conjugates
HRP20190366T1 (hr) 2012-10-12 2019-04-19 Medimmune Limited Pirolobenzodiazepini i njihovi konjugati
HRP20182129T1 (hr) 2012-10-12 2019-02-08 Adc Therapeutics Sa Konjugati protutijelo - pirolobenzodiazepin
EP2906297B1 (en) 2012-10-12 2017-12-06 ADC Therapeutics SA Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
ES2680153T3 (es) 2012-10-12 2018-09-04 Adc Therapeutics Sa Conjugados de anticuerpos anti-PSMA-pirrolobenzodiazepinas
CN105189507A (zh) 2012-12-21 2015-12-23 斯皮罗根有限公司 吡咯并苯并二氮杂卓及其结合物
CN110627797A (zh) 2012-12-21 2019-12-31 麦迪穆有限责任公司 用于治疗增殖性和自身免疫疾病的非对称吡咯并苯并二氮杂卓二聚物
ES2731681T3 (es) 2013-02-22 2019-11-18 Abbvie Stemcentrx Llc Conjugados de anticuerpo anti-DLL3 y PBD y usos de los mismos
EP2774624A1 (en) 2013-03-04 2014-09-10 Heidelberg Pharma GmbH Amatoxin derivatives
BR112016002829A2 (pt) 2013-08-12 2017-09-19 Genentech Inc Composto e processo para preparar o composto de conjugado anticorpo-¿droga, composição farmacêutica, método de tratamento do câncer, kit para o tratamento do câncer, intermediário ligante¿-droga, porção e composto de porção droga de dímero cbi
WO2015095227A2 (en) 2013-12-16 2015-06-25 Genentech, Inc. Peptidomimetic compounds and antibody-drug conjugates thereof
KR102337414B1 (ko) 2013-12-16 2021-12-10 제넨테크, 인크. 펩타이드 모방체 화합물 및 이의 항체-약물 컨쥬게이트
LT3191135T (lt) * 2014-09-12 2020-11-25 Genentech, Inc. Anti-her2 antikūnai ir imunokonjugatai
SG11201701128YA (en) 2014-09-12 2017-03-30 Genentech Inc Cysteine engineered antibodies and conjugates
CN107073136A (zh) 2014-09-17 2017-08-18 健泰科生物技术公司 吡咯并苯并二氮杂卓及其抗体二硫化物偶联物
MX2017003472A (es) 2014-09-17 2017-10-31 Genentech Inc Inmunoconjugados que comprenden anticuerpos anti-her2.
CR20180243A (es) 2015-10-02 2018-07-31 Genentech Inc Conjugados de anticuerpo-fármaco de pirrolobenzodiazepina y métodos de uso
SE547027C2 (en) 2023-08-22 2025-04-08 S2H2 Bm Concept Ab Solar panel suspension system

Also Published As

Publication number Publication date
TW201619199A (zh) 2016-06-01
AU2015314954A1 (en) 2017-03-02
US12492263B2 (en) 2025-12-09
AR101845A1 (es) 2017-01-18
MX2017003126A (es) 2017-08-28
IL250440B (en) 2021-06-30
HRP20201719T1 (hr) 2020-12-25
US20230041134A1 (en) 2023-02-09
MA40576B1 (fr) 2020-11-30
PT3191135T (pt) 2020-11-12
US20200255539A1 (en) 2020-08-13
US9518118B2 (en) 2016-12-13
KR20170057280A (ko) 2017-05-24
KR102508173B1 (ko) 2023-03-10
SG10201809668TA (en) 2018-11-29
BR112017004631A2 (pt) 2018-01-30
HUE052460T2 (hu) 2021-04-28
US10556966B2 (en) 2020-02-11
AU2015314954B2 (en) 2021-05-13
AU2021215166A1 (en) 2021-09-02
US20160096893A1 (en) 2016-04-07
EP3191135A1 (en) 2017-07-19
CA2957238A1 (en) 2016-03-17
CR20180210A (es) 2018-07-31
CA2957238C (en) 2024-02-20
CN107001479A (zh) 2017-08-01
DK3191135T3 (da) 2020-10-12
EP3782654A1 (en) 2021-02-24
LT3191135T (lt) 2020-11-25
TWI758784B (zh) 2022-03-21
EP3191135B1 (en) 2020-08-19
CL2017000545A1 (es) 2017-10-06
CN114106185A (zh) 2022-03-01
SI3191135T1 (sl) 2021-01-29
EA201790545A1 (ru) 2017-07-31
PH12017500322A1 (en) 2017-07-10
CO2017001919A2 (es) 2017-07-19
PL3191135T3 (pl) 2021-01-25
CN107001479B (zh) 2021-09-28
ES2830385T3 (es) 2021-06-03
PE20170935A1 (es) 2017-07-13
US10179820B2 (en) 2019-01-15
IL250440A0 (en) 2017-03-30
JP2017534253A (ja) 2017-11-24
TW202118785A (zh) 2021-05-16
US20170174782A1 (en) 2017-06-22
WO2016040723A1 (en) 2016-03-17
JP7085837B2 (ja) 2022-06-17
MY186334A (en) 2021-07-12
JP2020124196A (ja) 2020-08-20
SG11201701623UA (en) 2017-03-30
CR20170131A (es) 2017-07-19
TWI702231B (zh) 2020-08-21
US20190177429A1 (en) 2019-06-13
MA40576A (fr) 2017-07-19
JP7250724B2 (ja) 2023-04-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12492263B2 (en) Anti-HER2 antibodies and immunoconjugates
JP6242865B2 (ja) 抗ｐｍｅｌ１７抗体および免疫複合体
JP6404811B2 (ja) 抗ｌｇｒ５抗体および免疫複合体
JP6730261B2 (ja) 抗ｈｅｒ２抗体を含む免疫複合体
JP2015531750A (ja) 抗ｃｄ７９ｂ抗体を含む免疫複合体
JP2015529656A (ja) 抗ｅｔｂｒ抗体および免疫複合体
HK40068763A (en) Anti-her2 antibodies and immunoconjugates
HK1241900B (zh) 抗her2抗體和免疫綴合物
HK1241900A1 (en) Anti-her2 antibodies and immunoconjugates
HK1241386B (zh) 抗-cll-1抗體和免疫綴合物