RS61030B1 - Tretman glutenske intolerancije i srodni uslovi - Google Patents

Description

Opis

POLJE PRONALASKA

[0001] Ovde su date kompozicije za upotrebu u tretiranju ili inhibiranju glutenske intolerancije i povezanih stanja, kao što je celijačna bolest.

POZADINA PRONALASKA

[0002] Ingestija pšenice, ječma, raži i eventualno ovasa, koji sadrže gluten može izazvati abnormalne autoimune odgovore, kao što je celijačna bolest, alergija na pšenicu i herpetiformni dermatitis, kod osoba koje ne podnose gluten. Gluten je mešavina glutenin i prolamin proteinskih molekula bogatih sa glutaminom i prolinom. Većina pojedinaca koji imaju abnormalne autoimune odgovore izražavaju ljudske leukocitne antigenske (HLA) DQ2 i DQ8 molekule. Autoimune reakcije dovode do razvoja vilozne atrofije sluzokože tankog creva sa hiperplazijom kripte i inflamacijom sluzokože. Simptomi celijačne bolesti se mogu razlikovati od pojedinca do pojedinca, i mogu uključivati jedno ili više, umor, hroničnu dijareju, zatvor, malapsorpciju hranljivih sastojaka, gubitak težine, abdominalnu distenziju, anemiju, kao i značajno pojačan rizik od nastanka osteoporoze i intestinalnih maligniteta (limfom i karcinom).

[0003] Tretman za glutensku intoleranciju obično uktjučuje doživotnu strogu dijetu bez glutena. Ipak, dijeta bez glutena je nezgodna, restriktivna, a gluten je teško izbeći. Iz tog razloga su potrebni efikasni alternativni tretmani za glutensku intoleranciju.

[0004] Poznato je da brojne bakterijske vrste uzrokuju infekciju gastrointestinalnog trakta. lako se trenutni tretman za takve infekcije najviše oslanja na antibiotike, utvrđeno je da je sve veći broj bakterijskih infekcija otporan na bar neke antibiotike. Dodatno, neke bakterijske vrste formiraju endospore što ih čini posebno teškim za iskorenjivanje. Gastrične proteaze poput pepsina uglavnom nisu u stanju da unište endospore, na primer zbog nemogućnosti razgradnje proteinske obloge koja štiti endosporu. Stoga su potrebni efikasni alternativni tretmani bakterijske infekcije. Rey et al (2016) Scientific Reports 6, 20980 se bavi proteolitičkom efikasnošću kod terapije enzimske degradacije za celijačnu bolest. Kadek et al (2014) Protein Expression and Purification 95, 121-128 opisuje ekspresiju i karakterizaciju biljne aspartične proteaze nepentezin-1 iz Nepenthes gracilis. Athauda et al (2004)

Biochem J 381, 295-306 opisuje enzimsku i strukturnu karakterizaciju nepentezina. Takahashi (2012) Handbook of Proteolytic Enzymes Vols 1 and 2, 3rd Edition pages 125-128 daje opšti pregled nepentezina. Kubota et al (2010) Bioscience Biotechnology Biochemistry 74(11), 2323-2326 opisuju profile stabilnosti nepentezina u ureji i gvanidin hidrohlorida. Hatano et al (2008) Journal of Proteome Research 7(2), 809-816 opisuju analizu proteoma tečnosti iz vrča karnivorne biljke Nepenthes alata. Rey et al (2012) Molecular 6t Cellular Proteomics 12(2), 464-472 opisuju nepentezin iz vrčonoša za masenu spektroskopiju razmene vodonik/deterijum. An et al (2002) Planta 214(5), 661-667 opisuju ekspresiju asparatičnih proteinaza u vrčevima karnivorne biljke Nepenthes alata. Mazorra-Manzano et al (2010) Phytochem 71(5-6), 515-523 opisuju strukturno-funkcionalnu karakterizaciju rekombinantne aspartične proteinaze А1 iz Arabidopsis thaliana. Stepniak et al (2006) Am J Physiot 291, G621-G629 opisuje glutensku degradaciju sa novoidentifikovanom prolil endoproteazom. US 2012/225050 opisuje metode za poboljšanje zdravlja creva. EP 2090662 opisuje postupak proizvodnje fine hemikalije u organizmu. Takahasji et al (2005) Curr Prot Pep Sci 6, 513-525 opisuju enzimatsku i strukturnu karakterizaciju nepentezina.

REZIME PRONALASKA

[0005] Ovaj pronalazak se odnosi na otkriće da enzim nepentezin poseduje visoku proteolitičku aktivnost za cepanje proteina i oligopeptida (uključujući gluten), naročito pri niskim pH (na primer, oko 2 do 3). Nepentezin (EC 3.4.23.12) je aspartična proteaza biljnog porekla koja se može izolovati ili koncentrovati iz različitih biljnih izvora, poput sekreta iz vrča nepenteza, karnivorne krčag biljke, poznate kao vrčonoša u tropskim regionima. Tokes et al., Digestive Enzymes Secreted by the Carnivorous Plant Nepenth es macferlanei L., Planta (Berl.) 119, 39-46 (1974). Otkriveno je da je aktivnost nepentezina oko 1000 puta veća od aktivnosti pepzina (EC 3.4.23.1), enzima prisutnog u želucu Ijudi koji je delimično odgovoran za degradaciju proteina hrane u peptide. Takođe je otkriveno da nepentezin ima mnogo ležerniju specifičnost u odnosu na pepsin, efikasno se cepajući nakon većine aminokiselinskih ostataka uz izuzetak kod aminokiselinskih ostataka G, S, T, V, I i W. Primetno, cepa se nakon aminokiselinskih ostataka K, R i P. Poređenja radi, pepsin predstavlja visokoefikasno cepanje za hidrofobne aminokiselinske ostatke F, L i M ali je cepanje nakon aminokiselinskih ostataka P, H, K i R suštinski zabranjeno.

[0006] Nepentezin ima dve poznate izoforme: nepentezin I (poznat da ima dve varijante: nepentezin la i nepentezin lb) i II. Otkriveno je da obe izoforme imaju veći afinitet cepanja za obe aminokiseline P i Q u odnosu na pepsin. Iznenađujuće, otkriveno je da kombinacija nepentezina I i nepentezina II ima neznatno različit afinitet cepanja od samog nepentezina I. Konkretno, ekstrakt koji sadrži nepentezin I i nepentezin II cepa efikasnije nakon aminokiseline Q na N-terminalnoj strani gliadina i aminokiseline P na C- terminalnoj strani gliadina u odnosu na sam nepentezin I.

[0007] Glutenska intolerancija i povezana stanja i simptomi, kao što je celijačna bolest i/ili herpetiformni dermatitis, su izazvani pacijentovim abnormalnim imunim odgovorom na gluten u sluzokoži tankog creva. Oderđene glutenske komponente su rezistentne na cepanje od strane gastričnih i pankreatičnih peptidaza kao što su pepsin, tripsin, himotripsin i slične. Bez želje da se vezujemo za bilo koje teorije, smatra se da degradacija glutena na netoksične peptide nepentezinom, pre dolaska u intestinalni trakt pacijenta smanjuje nivoe toksičnih glutenskih proteina ili peptida koji odlaze u tanko crevo. Obzirom da je nepentezin kiselinski stabilan, kompatibilan je sa pH vrednosti želuca i digestira gluten tako da moduliše pacijentovu glutensku intoleranciju ili povezana stanja ili simptome.

[0008] Imajući u vidu njegovu visoku aktivnost pri niskoj pH i njegov širok spektar aktivnosti, nepentezin je posebno koristan kod varenja proteina glutena u želucu. Degradacija glutena na netoksične peptide se takođe naziva i detoksikacija glutena. Bez želje da se vezuje za bilo koje teorije, smatra se da se degradacija glutena, koji se sastoji od proteina bogatih sa prolinom i glutaminom, na netoksične peptide može efikasnije postići nepentezinom nego enzimima želuca kao što je pepsin.

[0009] Ovo otkriće se dalje odnosi na upotrebu nepentezina, kao što je nepentezin I i/ili nepentezin II i njihovi derivati, u lečenju bakterijskih infekcija gastrointestinalnog trakta. Uzimajući u obzir njegovu visoku aktivnost pri niskoj pH i njegov širok spektar aktivnosti, nepentezin je koristan u lečenju bakterijskih infekcija gastrointestinalnog trakta. Bez vezivanja za teoriju, veruje se da je nepentezin efikasniji od enzima želuca u remećenju bakterijskih ćelijskih zidova i slojeva endospora.

[0010] U jednom aspektu, data je kompozicija za upotrebu u lečenju ili inhibiranju glutenske intolerancije pri čemu pomenuta kompozicija sadrži rekombinantni nepentezin odabran od rekombinantnog nepentezina I, rekombinantnog nepentezina II, njihove soli ili bilo koje njihove kombinacije. U jednoj izvedbi, rekombinantni nepentezin I se primenjuje nad pomenutim pacijentom. U jednoj izvedbi, rekombinantni nepentezin II se primenjuje nad pomenutim pacijentom. U jednoj izvedbi, mešavina rekombinantnog nepentezina I i rekombinantnog nepentezina II se primenjuje nad pomenutim pacijentom.

[0011] U jednoj izvedbi otkrića, nepentezin, kao što je nepentezin I i/ili nepentezin II ili njihov derivat, je primenjen kao aditiv za hranu tako da je nepentezin ili njegov derivat spojen sa hranom koja sadrži gluten kako bi modulisao ili inhibirao stanja povezana sa intolerancijom na gluten. Nepentezin ili njegov derivat se može koristiti sam ili u kombinaciji sa takvom hranom. U jednom aspektu otkrića, koristi se nepentezin I ili njegov derivat. U jednom aspektu otkrića, koristi se nepentezin II ili njegov derivat. U jednom aspektu otkrića, koristi se mešavina nepentezina I i nepentezina II ili njihovih derivata.

[0012] U jednoj izvedbi, pomenuta intolerancija na gluten dovodi do celijačne bolesti, alergije na pšenicu, senzitivnosti na gluten i/ili herpetiformnog dermatitisa. U jednom aspektu otkrića, nepentezin I ili njegov derivat se primenjuje nad pomenutim pacijentom. U jednom aspektu otkrića, nepentezin II ili njegov derivat se primenjuje nad pomenutim pacijentom. U jednom aspektu otkrića, mešavina nepentezina I i nepentezina II ili njihovih derivata se primenjuje nad pomenutim pacijentom.

[0013] U svakom slučaju, nepentezin, kao što je nepentezin I i/ili nepentezin II ili njihov derivat, se može primeniti nad pacijentom pre, istovremeno ili neposredno nakon konzumacije hrane koja sadrži gluten ili se sumnja da sadrži gluten. U jednom aspektu otkrića, nepentezin I ili njegov derivat je primenjen nad pomenutim pacijentom. U jednom aspektu otkrića, nepentezin II ili njegov derivat je primenjen nad pomenutim pacijentom. U jednom aspektu otkrića, mešavina nepentezina I i nepentezina II ili njihovih derivata je primenjena nad pomenutim pacijentom.

[0014] U sledećem aspektu otkrića, date su metode za modulisanje intolerancije na gluten ili povezanog stanja, kao što je celijačna bolest, alergija na pšenicu, senzitivnost na gtuten ili herpetiformni dermatitis, kod pacijenta kod kog postoji potreba za tim, koje obuhvataju tretiranje hrane koja sadrži gluten ili se sumnja da sadrži gluten sa efikasnom količinom nepentezina pre konzumacije od strane pacijenta. U jednom aspektu otkrića, pomenuta hrana je tretirana sa efikasnom količinom nepentezina I ili njegovog derivata. U jednom aspektu otkrića, pomenuta hrana je tretirana sa efikasnom količinom nepentezina II ili njegovog derivata. U jednom aspektu otkrića, pomenuta hrana je tretirana sa efikasnom količinom mešavine nepentezina I i nepentezina II ili njihovih derivata.

[0015] U sledećem aspektu otkrića,data je hrana ili kompozicije koje sadrže nepentezin, kao što je nepentezin I i/ili nepentezin II ili njihovi derivati. U jednom aspektu otkrića, pomenuta hrana ili kompozicija sadrži nepentezin I ili njegov derivat. U jednom aspektu otkrića, pomenuta hrana ili kompozicija sadrži nepentezin II ili njegov derivat. U jednom aspektu otkrića, pomenuta hrana ili kompozicija sadrži mešavinu nepentezina I i nepentezina II ili njihovih derivata.

[0016] U sledećem aspektu otkrića, data je kompozicija za optimizovanje cepanja proteina glutena na prolinskom ostatku, koja sadrži mešavinu rekombinantnog nepentezina I i rekombinantnog nepentezina II. U jednom aspektu otkrića, data je kompozicija za optimizovanje cepanja proteina glutena na glutaminskom ostatku, koja sadrži mešavinu rekombinantnog nepentezina I i rekombinantnog nepentezina II.

[0017] U sledećem aspektu otkrića, data je kompozicija koja sadrži fragmentirani gluten, pri čemu kompozicija je obogaćena fragmentima glutena proizvedenim cepanjem glutena na prolinskom ostatku glutena. U jednom aspektu otkrića, data je kompozicija koja sadrži fragmentirani gluten, pri čemu kompozicija je obogaćena fragmentima glutena proizvedenim cepanjem glutena na glutaminskom ostatku.

[0018] U sledećem aspektu otkrića, dat je postupak za varenje proteina koji sadrže gluten čiji postupak obuhvata kontaktovanje pomenutih proteina sa efikasnom količinom nepentezina I i/ili nepentezina II.

[0019] U sledećem aspektu otkrića, dat je postupak za proizvodnju rekombinantnog nepentezina, kao što je nepentezin I i/ili nepentezin II ili njihov derivat, postupak obuhvata ekspresiju sekvence nukleinske kiseline u izabranom organizmu domaćina koja kodira pomenuti nepentezin ili njegov homolog i koja sekvenca nukleinske kiseline je insertovana u odgovarajuće dizajniran vektor; kako bi se dobio pomenuti nepentezin ili njegov homolog. U jednom aspektu otkrića, rekombinantni nepentezin je nepentezin I ili njegov derivat. U jednom aspektu otkrića, rekombinantni nepentezin je nepentezin II ili njegov derivat. U jednom aspektu otkrića, rekombinantni nepentezin je mešavina nepentezina I i nepentezina II ili njihovih derivata.

[0020] U sledećem aspektu otkrića, data je kompozicija koja sadrži rekombinantni nepentezin ili njegov derivat. U jednom aspektu otkrića, rekombinantni nepentezin je rekombinantni nepentezin I ili njegov derivat. U jednom aspektu otkrića, rekombinantni nepentezin je rekombinantni nepentezin II ili njegov derivat. U jednom aspektu otkrića, rekombinantni nepentezin je mešavina rekombinantnog nepentezina I i rekombinantnog nepentezina II ili njihovih derivata.

[0021] U sledećem aspektu otkrića, date su metode za sprečavanje ili tretiranje bakterijskih ili parazitskih infekcija gastrointestinalnog trakta kod pacijenta, čiji metod obuhvata primenu terapijski efikasne količine nepentezina, kao što je nepentezin I i/ili nepentezin II ili njegov derivat nad pomenutim pacijentom. U jednom aspektu otkrića, nepentezin I ili njegov derivat je primenjen nad pomenutim pacijentom. U jednom aspektu otkrića, nepentezin II ili njegov derivat je primenjen nad pomenutim pacijentom. U jednom aspektu otkrića, mešavina nepentezina I i nepentezina II ili njihovih derivata je primenjena nad pomenutim pacijentom.

[0022] Ovi i drugi aspekti pronalaska će biti dodatno opisani u tekstu koji sledi.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0023]

Slika 1 prikazuje preferencije cepanja nepentezina na (A) Р1 ili N-terminalnoj strani mesta cepanja i na (B) P1’ ili C-terminalnoj strani mesta cepanja. Podaci su grupisani prema tipu aminokiseline i upoređeni sa sličnim predstavljanjem podataka o pepsinu od Hamuro et at. Specifičnost imobilizovanog porcinskog pepsina u uslovima kompatibilnim sa H/D razmenom. Rapid Communications in Mass Spectrometry 22(7):1041-1046 (2008). Crne trake ukazuju na digestiju nepentezina a sive trake na digestiju pepsina. % cepanja predstavlja broj uočenih cepanja na datom ostatku, u odnosu na ukupan broj datih ostataka u setu. Podaci nepentezina<su dobijeni iz varenja šest denaturisanih proteina, kao što je opisano u Primeru 2>.

Slika 2 prikazuje XRCC4 kompozitnu mapu sekvenci peptida, poređanu prema tipu domena. Peptidi su dobijeni korišćenjem digestijom pepsina u četiri različita odnosa enzim:supstrat (65:1 do 520:1, svetlosivo/gornji set traka), i korišćenjem digestije nepentezina u četiri različita odnosa enzim:supstrat (0,0075:1 do 0,38:1, tamnosivo/donji set traka).

Slika 3 prikazuje prosečni MASCOT rezultat peptida dobijenih nakon digestije nepentezina, grupisanih Cterminalnom aminokiselinom. Broj peptida korišćenih za svako izračunavanje je povezan sa terminalnom aminokiselinom, iznad trake. Peptidi su dobijeni iz digestija šest denaturisanih proteina, kao što je opisano u Primeru 2.

Slika 4 prikazuje peptidne jonske hromatograme (PIC) XRCC4 digestirane sa (A) nepentezinom i (B) pepsinom u opsegu odnosa enzim:supstrat (prikazano u legendi). PIC za enzimsku digestiju su generisani iz istog masaopterećenje supstrata na koloni.

Slika 5 prikazuje prosečnu dužinu svih peptida identifikovanih od nepentezinske digestije gliadina iz pšenice, korišćenjem LC-MS/MS, nakon 1, 5, 10, 15, 30, 60, 130, 360 ili 810 minuta na 37 °C. Korišćena su odstranjivanja (p<0,05) sa 95% pouzdanosti na rezultatima kako bi se uklonile lažno pozitivne identifikacije. Relativna standardna devijacija dužine peptida je prikazana na umetnutoj slici.

Slika 6 prikazuje broj peptida identifikovanih putem LC-MS/MS nakon 1, 5, 10, 15, 30, 60, 130, 360 ili 810 minuta digestije na 37 °C, grupisane po dužini. Podaci kao sa slike 5.

Slika 7 prikazuje iste podatke kao sa slike 5, kao verovatnoću za dobijanje određene dužine nakon 10, 60, 120, 360

ili 810 minuta digestije na 37 °C.

Slika 8 prikazuje preferencije nepentezinskog cepanja na (A) Р1 ili N-terminalnoj strani mesta cepanja i na (B) P1’ ili C-terminalnoj strani mesta cepanja. Leve trake za svaki ostatak ukazuju na digestiju sa nepentezinskim ekstraktom, srednje trake ukazuju na digestiju sa prečišćenim nepentezinskim ekstraktom, a desne trake sa rekombinantnim nepentezinom I. % cepanja predstavlja broj uočenih cepanja na datom ostatku, u odnosu na ukupan broj prisutnih peptida. Nepentezinski podaci su dobijeni od digestija gliadina, kao što je opisano u primeru 9.

Slika 9 prikazuje poravnavanje proteinskih sekvenci za nepentezin l od Nepenthes mirabilis, Nepenthes gracilis, Nepenthes alata, Zea mays, i Оrуzа sativa, a nepenthesin II od Nepenthes mirabilis, Nepenthes gracilis, Zea mays, i Оrуzа sativa.

Slika 10 prikazuje filogenetsko stablo koje ukazuje na srodnost nepentezinskih proteina između različitih vrsta.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

I Definicije

[0024] Osim ukoliko je definisano drugačije, svi tehnički i naučni pojmovi koji se ovde koriste imaju isto značenje kao opšte shvaćeni od strane stručnjaka iz oblasti kojoj ovaj pronalazak pripada. lako se bilo koje metode i materijali slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani mogu koristiti u praksi ili testiranju predmetnog pronalaska, poželjne metode, uređaji i materijali su sada opisani. Ništa ovde ne treba tumačiti kao dozvolu da pronalazak nema pravo da prethodi takvom otkrivanju na osnovu prethodnog pronalaska.

[0025] Praksa predmetnog otkrića koristi, osim ukoliko se drugačije ne naznači, konvencionalne tehnike molekularne biologije (uključujući rekombinantne tehnike), mikrobiologiju, biologiju ćelije, biohemiju i imunologiju, koje su u opsegu naučne veštine. Takve tehnike su kompletno objašnjene u literaturi na primer u sledećim publikacijama. Videti, na primer, Sambrook and Russell eds. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3rd edition (2001); the series CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel et al. eds. (2007)); the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc., N.Y.); PCR 1: A PRACTICAL APPROACH (M. MacPherson et at. IRL Press at Oxford University Press (1991)); PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)); ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL (Harlow and Lane eds. (1999)); CULTURE OF ANIMAL CELLS: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE (R.l. Freshney 5th edition (2005)); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M. J. Gait ed. (1984)); Mullis et al. U.S. Patent No. 4,683,195; NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984)); NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (M.L.M. Anderson (1999)); TRANSCRIPTION AND TRANSLATION (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984)); IMMOBILIZED CELLS AND ENZYMES (IRL Press (1986)); B. Perbal, A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING (1984); GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (J. H. Miller and M. P. Calos eds. (1987) Cold Spring Harbor Laboratory); GENE TRANSFER AND EXPRESSION IN MAMMALIAN CELLS (S.C. Makrides ed. (2003)) IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Мауеr and Walker, eds., Academic Press, London (1987)); WEIR’S HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY (L.A. Herzenberg et al. eds (1996)).

[0026] Kao što je korišćeno u specifikaciji i zahtevima, oblik jednine „а“, ,,an“ i ,,the“ uključuje reference množine osim ukoliko kontekst jasno ne ukazuje drugačije.

[0027] Kao što je ovde korišćeno, pojam ,,obuhvata“ znači da kompozicije i metode uključuju nabrojane elemente, ali ne isključujući druge. „Sastoji se suštinski od“ kada se upotrebljava kako bi se definisale kompozicije i metode, znači isključujući druge elemente od bilo kakvog suštinskog značaja za kombinaciju. Na primer, kompozicija koja se sastoji suštinski od elemenata kao što je ovde definisano neće isključivati druge elemente koji ne utiču materijalno osnovnim i novim karakteristikama zahtevanog pronalaska. „Sastoji se od“ znači isljučujući više od količina u tragovima drugih sastojaka i značajnih navedenih koraka metoda. Izvedbe definisane od strane svakog od ovih tranzicionih pojmova su unutar opsega pronalaska.

[0028] Kao što je ovde korišćeno, pojam ,,gluten“ se generalno odnosi na proteine prisutne u pšenici ili srodnim zrnastim vrstama, uključujući ječam i raž, koji imaju potencijalno štetno dejstvo na određene pojedince. Glutenski proteini uključuju gliadine kao što su α-gliadini, β-gliadini, γ-gliadini i ω-gliadini, koji su monomerni proteini, i glutenine koji su visoko heterogene mešavine agregata visoke molekularne mase i podjedinica niske molekularne mase koje zajedno drže disulfidne veze. Mnogi pšenični glutenski proteini su okarakterisani, videti, na primer, Woychik et al., Amino Acid Composition of Proteins in Wheat Gluten, J. Agric. Food Chem., 9(4), 307-310 (1961). Pojam gluten kao što je ovde korišćeno takođe uključuje oligopeptide koji mogu biti dobijeni iz normalne Ijudske digestije glutenskih proteina iz hrane koja sadrži gluten i izaziva abnormalne imune odgovore. Neki od ovih oligopeptida su rezistentni na normalne digestivne enzime. Gluten, uključujući gore pomenute proteine i oligopeptide, se veruje da deluje kao antigeni za T ćelije u celijačnom spru kod pacijenata sa intolerancijom na gluten.

[0029] Pojam ,,nepentezin“ se odnosi na aspartičnu proteazu koja ima enzimski komisioni broj EC 3.4.23.12, i uključuje sve izoforme i varijante nepentezina kao što je nepentezin I i nepentezin II, i rekombinantni nepentezin, i njihove soli. Soli se odnosi na soli formirane od nepentezina sa jednom ili više baza ili jednom ili više kiselina koje sadržavaju biološku efikasnost i svojstva slobodnog nepentezina, i koje nisu biološki ili na drugi način nepoželjne. Soli dobijene iz neorganskih baza uključuju, ali se ne ograničavaju na, natrijumske, kalijumske, litijumske, amonijumske, kalcijumske, magnezijumske, gvozdene, cinkove, bakarne, manganske, aluminijumske soli i slične. Soli dobijene iz organskih baza uključuju, ali se ne ograničavaju na, soli primarnih, sekundarnih i tercijarnih amina, supstituisanih amina uključujući supstituisane amine koje nastaju prirodnim putem, ciklične amine i bazne jonske zamenske resine, kao što su izopropilaminski, trimetilaminski, dietilaminski, trietilaminski, tripropilaminski, etanolaminski, 2-dimetilaminoetanolski, 2-dietilaminoetanolski, diciktoheksilaminski, lizinski, argininski, histidinski, kofeinski, prokainski, hidrabaminski, hotinski, betainski, etilenediaminski, glukozaminski, metilglukaminski, teobrominski, purinski, piperazinski, piperidinski, N-etilpiperidinski, poliaminski resini i slični. Kiseline koje mogu formirati soli uključuju, ali se ne ograničavaju na, neorganske kiseline kao što su hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, sumporna kiselina, azotna kiselina, fosforna kiselina i slične, i organske kiseline kao što su acetatna kiselina, propionska kiselina, glikolna kiselina, piruvinska kiselina, oksalna kiselina, maleinska kiselina, malonska kiselina, sukcinska kiselina, fumarna kiselina, tartarna kiselina, citrična kiselina, benzoeva kiselina, cinaminska kiselina, mandelinska kiselina, metansulfonska kiselina, etansulfonska kiselina, p-toluensulfonska kiselina, salicilna kiselina i slične.

[0030] Derivati nepentezina ovog otkrića uključuju biološke ekvivalente, fragmente i produženi nepentezin, i njegove soli, koji sadržavaju proteolitičku aktivnost. U nekim izvedbama otkrića, derivati nepentezina uključuju biološke ekvivalente nepentezina. „Biološki ekvivalenti" uključuju one koji imaju najmanje oko 80% homologije ili identičnosti ili alternativno, najmanje oko 85%, ili alternativno najmanje oko 90%, ili alternativno najmanje oko 95%, ili alternativno 98% homologije sa nepentezinom, ili alternativno polipeptid ili protein kodiran polinukleotidom koji se pod strogim uslovima hibridizuje sa nukleotidnom sekvencom koja kodira nepentezin ili njegov komplement, istovremeno održavajući željenu strukturu i prikazujući bar deo proteolitičke aktivnosti nepentezina.

[0031] U nekim izvedbama otkrića, derivat nepentezina je fragment nepentezina koji ima najmanje oko 20 susednih aminokiselina punog nepentezinskog proteina, ili najmanje oko 50 susednih aminokiselina, ili sadrži 100 ili više susednih aminokiselina, sve do kompletnog proteina nepentezina. Derivati nepentezina ovog otkrića takođe uključuju nepentezin koji ima dodatne sekvence.

[0032] U nekim izvedbama otkrića, derivat nepentezina ima bar oko 10% proteolitičke aktivnosti nepentezina, ili bar oko 50%, ili bar oko 70%, ili bar oko 90% proteolitičke aktivnosti nepentezina iti 100% ili više proteolitičke aktivnosti nepentezina.

[0033] Kao što je ovde korišćeno, pojam „njegov biološki ekvivalent" ima za cilj da bude sinonim sa „njegov ekvivalent” koji kada se odnosi na referentni protein, antitelo, polipeptid ili nukleinsku kiselinu, podrazumeva one koji imaju minimalnu homologiju a da istovremeno održavaju željenu strukturu ili funkcionalnost. U alternativnoj izvedbi otkrića, pojam „biološki ekvivalent" polinukleotida se odnosi na onaj koji se pod strogim uslovima hibridizuje sa referentnim polinukleotidom ili njegovim komplementom. Osim ukoliko ovde nije konkretno naznačeno, podrazumeva se da bilo koji ovde pomenuti polinukleotid, polipeptid ili protein takođe uključuje njegove ekvivalente. Na primer, ekvivalent namerava najmanje oko 80% homologije ili identičnosti i alternativno, najmanje oko 85%, ili alternativno najmanje oko 90%, ili alternativno najmanje oko 95%, ili alternativno 98%, ili alternativno 99% homotogije ili sekventne identičnosti i iskazuje suštinski ekvivalentnu biološku aktivnost referentnom proteinu, potipeptidu ili nukleinskoj kiselini.

[0034] Polinukleotid ili polinukleotidni region (ili polipeptid ili polipeptidni region) koji ima određen procenat (na primer, 80%, 85%, 90% ili 95%) „sekventne identičnosti" sa drugom sekvencom znači da, kada se poravnaju, da je procenat baza (ili aminokiselina) isti u poređenju sa dve sekvence. Poravnanje i procenat homologije ili sekventna identičnost mogu biti utvrđeni korišćenjem softverskih programa poznatih u nauci, na primer onih koji su opisani u Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1987) Supplement 30, section 7.7.18, Table 7.7.1. Poželjno, za poravnavanje se koriste podrazumevana podešavanja. Jedan program za poravnavanje je BLAST, koristi podrazumevane parametre. Primeri programa uključuju BLASTN i BLASTP, koriste sledeće podrazumevane parametre: genetički kod = standardan; filter= nema; strand = oba; prekidanje = 60; očekivano = 10; matrica = BLOSUM62; opisi = 50 sekvenci; sortiranje po = oceni; baze podataka = neredundantne, GenBank EMBL DDBJ PDB GenBank CDS translacije SwissProtein SPupdate PIR. Detalji ovih programa se mogu pronaći na sledećoj internet adresi: ncbi.nlm.nih.gov/cgibin/BLAST.

[0035] Pogodni ekspresioni vektori uključuju vektore sposobne za ekspresiju polinukleotida operativno povezanog sa regulatornim elementom, kao što je promotorska regija i/ili pojačivač koji je sposoban za regulisanje ekspresije takve DNK. Stoga, ekspresioni vektor se odnosi na rekombinantni DNK ili RNK konstrukt, kao što je plazmid, fag, rekombinantni virus ili drugi vektor koji, po uvođenju u odgovarajuću ćeliju domaćina, dovodi do ekspresije insertovane DNK. Odgovarajući ekspresioni vektori uključuju one koji se mogu repticirati u eukariotskim ćelijama i/ili prokariotskim ćelijamai one koji ostaju epizomalni ili oni koji se integrišu u genom ćelije domaćina.

[0036] Kao što je ovde korišćeno, pojam ,,vektor“ se odnosi na nehromozomsku nukleinsku kiselinu koja sadrži netaknuti replikon takav da se vektor može replikovati kada se postavi unutar ćelije, na primer procesom transformacije. Vektori mogu biti virusni ili nevirusni. Virusni vektori uključuju retroviruse, adenoviruse, herpevirus, papovirus ili na drugi način modifikovane viruse koji nastaju prirodnim putem. Primerni nevirusni vektori za isporučivanje nukleinske kiseline uključuju golu DNK; DNK kompleksovana sa katjonskim lipidima, sama ili u kombinaciji sa katjonskim polimerima; anjonski i katjonski lipozomi; DNK proteinski kompleksi i čestice koje sadrže DNK kondenzovanu sa katjonskim polimerima kao što je heterogeni polilizin, oligopeptide definisane dužine, i polietilen imin, u nekim slučajevima sadržan u lipozomima; i upotreba tercijarnih kompleksa koji sadrže virus i polilizin-DNK.

[0037] Nevirusni vektor može uključivati plazmid koji obuhvata heterologni polinukleotid sposoban da bude isporučen u ciljnu ćeliju, bilo da je in vitro, in vivo ili ex-vivo. Heterologni polinukleotid može obuhvatati sekvencu od interesa i može biti operativno povezan sa jednim ili više regulatornih elemenata i može kontrolisati transkripciju interesne sekvence nukleinske kiseline. Kao što je ovde korišćeno, vektor ne mora biti sposoban za replikaciju u krajnjoj ciljnoj ćeliji ili subjektu. Pojam vektor može uključivati ekspresioni vektor i klonirajući vektor.

[0038] „Homologija" ili „identičnost" ili ,,sličnost“ se odnosi na sekventnu sličnost između dva peptida ili između dva molekula nukleinske kiseline. Homologija može biti utvrđena upoređivanjem pozicije u svakoj sekvenci koja može biti poravnata zbog poređenja. Kada je pozicija u uporednoj sekvenci zauzeta istom bazom ili aminokiselinom, onda su molekuli homologni na toj poziciji. Stepen homologije između sekvenci je funkcija broja poklapanja ili homolognih pozicija koje dele sekvence. „Nepovezana" ili ,,nehomologna“ sekvenca deli manje od 40% identičnosti, ili alternativno manje od 25% identičnosti, sa jednom od sekvenci predmetnog otkrića.

[0039] „Hibridizacija" se odnosi na hibridizacione reakcije koje se mogu izvesti pod uslovima različite ,,strogosti“. Uslovi koji povećavaju stringenciju hibridizacione reakcije su široko poznati i objavljeni u nauci: videti, na primer, Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition. Primeri relevantnih uslova uključuju (u cilju povećanja stringencije): inkubacione temperature od 25° C, 37°C, 50°C i 68 °C; pufer koncentracije od 10 X SSC, 6 X SSC, 1 X SSC, 0,1 X SSC (pri čemu SSC je 0,15 M NaCl i 15 mM citrat pufera) i njihov ekvivalent korišćenjem drugih pufer sistema; koncentracije formamida od 0%, 25%, 50% i 75%; inkubaciona vremena od 5 minuta do 24 sata i pranja sve dužeg trajanja, povećavanje frekvencije, ili smanjivanje pufernih koncentracija.

[0040] U jednoj izvedbi otkrića, „terapijski efikasna količina“ se odnosi na količinu jedinjenja koja će za rezultat imati prevenciju ili ublažavanje simptoma kod pacijenta ili željeni biološki ishod, na primer, poboljšane kliničke znake, odložen početak bolesti, itd. Efikasna količina može biti utvrđena od strane osobe sa opštim znanjem iz nauke. Izabran dozni nivo može zavisiti od ozbiljnosti stanja koje se tretira, i stanja i medicinske istorije pacijenta koji se leči. Ipak, u opsegu znanja i iskustva je da se doze jedinjenja započnu na nivoima nižim od zahtevanih za postizanje željenog terapijskog efekta i da se postepeno povećavaju sve do postizanja željenog efekta.

[0041] „Istovremena administracija", ili zajednički tretman, kao što je ovde korišćeno uključuje administraciju agenasa zajedno, ili pre ili posle drugog.

[0042] Pojam „moduliše" ili ,,modulacija“ znači bilo koji tretman bolesti ili poremećaja kod subjekta, kao što je sisar, uključujući:

• prevenciju ili zaštitu od bolesti ili poremećaja, odnosno, uzrokovanja da se abnormalna biološka reakcija ili simptomi ne razviju;

• inhibiranje bolesti ili poremećaja, odnosno, zaustavljanje ili sprečavanje razvoja abnormalnih bioloških reakcija i/ili kliničkih simptoma; i/ili

• ublažavanje bolesti ili poremećaja, odnosno, izazivanje regresije abnormalnih bioloških reakcija i/ili kliničkih simptoma.

[0043] Kao što je ovde korišćeno, pojam „sprečavanje" se odnosi na profilaktički tretman pacijenta kom je neophodan. Profilaktički tretman može biti postignut obezbeđivanjem odgovarajuće doze terapijskog agensa subjektu koji je pod rizikom od oboljenja, čime se u velikoj meri sprečava nastanak oboljenja.

[0044] Kao što je ovde korišćeno, pojam „stanje" se odnosi na stanje bolesti za koju se koriste ovde data jedinjenja, kompozicije i metode.

[0045] Kao što je ovde korišćeno, pojam ,,pacijent“ ili „subjekt" se odnosi na sisare i uključuje ljude i neljudske sisare. U određenim izvedbama ovog otkrića, pacijent ili subjekt je čovek.

[0046] Pojam ,,približno“ kada se koristi pre numeričke vrednosti ukazuje na to da vrednost može varirati unutar razumnog opsega, kao što je -5%, -1% i -0,2%.

II Metode

[0047] U jednom aspektu otkrića, date su metode za modulisanje gutenske intolerancije kod pacijenta sa glutenskom intolerancijom čiji metod obuhvata primenu efikasne količine nepentezina, kao što je nepentezin I i/ili nepentezin II, ili njihovog derivata nad pomenutim pacijentom.

[0048] U jednoj izvedbi otkrića, nepentezin ili njegov derivat je administriran kao aditiv hrane tako da je nepentezin ili njegov derivat spojen sa hranom koja sadrži gluten kako bi modulirao ili inhibirao stanja povezana sa intolerancijom na gluten. Nepentezin ili njegov derivat se može koristiti sam ili u kombinaciji sa takvom hranom.

[0049] U sledećem aspektu otkrića, pružene su metode za modulisanje stanja posredovanog intolerancijom na gluten kod pacijenta gde metod obuhvata primenu efikasne količine nepentezina ili njegovog derivata nad pomenutim pacijentom. Takva stanja primera radi uključuju samo celijačnu bolest, alergiju na pšenicu, senzitivnost na gluten i herpetiformni dermatitis. Nepentezin ili njegov derivat se mogu dati pacijentu pre, tokom ili neposredno nakon unošenja hrane koja sadrži gluten ili za koju se sumnja da sadrži gluten.

[0050] U nekim izvedbama, nepentezin kao što je nepentezin I i/ili nepentezin II ili njihov derivat, je primenjen nad pacijentom pre unošenja hrane koja sadrži gluten ili za koju se sumnja da sadrži gluten. U nekim izvedbama otkrića, nepentezin ili njegov derivat je primenjen unutar perioda tokom kog je nepentezin ili njegov derivat barem delimično efikasan (na primer, barem oko 10%, 20%, 50%, 70%, 90% originalne aktivnosti) u razgradnji glutena iz hrane koju će pacijent uneti. U nekim izvedbama otkrića, nepentezin ili njegov derivat je primenjen ne više od oko 4 sata, 3 sata, 2 sata, 1 sat ili 30 minuta pre unošenja hrane od strane pacijenta.

[0051] U nekim izvedbama, nepentezin li njegov derivat je primenjen nad pacijentom istovremeno sa unošenjem hrane koja sadrži gluten ili za koju se sumnja da sadrži gluten. U nekim izvedbama otkrića, nepentezin ili njegov derivat je administriran sa hranom, kao sastojak ili aditiv hrani. U nekim izvedbama otkrića, nepentezin ili njegov derivat se administrira odvojeno od hrane.

[0052] U nekim izvedbama, nepentezin ili njegov derivat se primenjuje nad pacijentom neposredno nakon uzimanja hrane koja sadrži gluten ili za koju se sumnja da sadrži gluten. U nekim izvedbama otkrića, nepentezin ili njegov derivat je primenjen unutar perioda tokom kog je barem deo (a primer, barem oko 10%, 20%, 50%, 70%, 90%) glutena u hrani još uvek u želucu pacijenta. I nekim izvedbama otkrića, nepentezin ili njegov derivat je primenjen ne duže od 4 sata, 3 sata, 2 sata, 1 sat ili 30 minuta nakon unošenja hrane od strane pacijenta.

[0053] U sledećem aspektu otkrića, date su metode za prevenciju ili tretiranje bakterijskih ili parazitskih infekcija gastrointestinalnog trakta kod pacijenta, gde metod obuhvata primenu kompozicije ko ja sadrži efikasnu količinu nepentezina ili njegovog derivata nad pomenutim pacijentom. Isključivo primera radi, takve bakterijske infekcije mogu biti izazvane bakterijama kao što su Bacillus cereus, Bacillus anthracis, Helicobacter pylori, Salmonella, Campylobacter, E. coli, Shigella, Clostridium difficile, Vibrio cholerae, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, Campylobacter jejuni i Listeria monocytogenes. U jednom aspektu otkrića, pomenuta kompozicija sadrži nepentezin I ili njegov derivat. U jednom aspektu otkrića, pomenuta kompozicija sadrži nepentezin II ili njegov derivat. U jednom aspektu otkrića, pomenuta kompozicija sadrži mešavinu nepentezina I i nepentezina II ili njihovih derivata.

[0054] C. difficile su intestinalna flora koja nastaje prirodnim putem u maloj podgrupi populacije. Ipak, većina ljudi je izložena C. difficile kao pacijenti u bolnici, staračkom domu ili sličnoj ustanovi ingestijomo spora bakterije. C. difficile može preplaviti gastrointestinalni trakt pod oportunističkim uslovima, obično usled tretmana sa širokim spektrom antibiotika koji uništavaju normalnu crevnu floru. Bakterija oslobađa toksine koji mogu izazvati nadimanje, dijareju i jake bolove u stomaku. C. difficile infekcije su najčešći uzrok pseudomembranoznog kolitisa, koji se u retkim slučajevima razvija u toksični megakolon opasan po život. Stopu C. difficile stiče značajan broj pacijenata sa dugim bolničkim boravkom: procenjuje se da je akvizicija 13% kod pacijenata sa bolničkim boravkom do dve nedelje, a 50% kod onih sa bolničkim boravkom dužim od četiri nedelje. Clabots, CR; Johnson, S; Olson, MM; Peterson, LR; Gerding, DN (September 1992). "Acquisition of Clostridium difficile by hospitalized patients: evidence for colonized new admissions as a source of infection". Journal of Infectious Diseases 166 (3): 561-7.

[0055] Otkriven je helicobacter koji živi u sluznici gornjeg dela gastrointestinalnog trakta, kao i u jetri sisara i nekih ptica. H. pylori inficira do 50% Ijudske populacije i može biti patogen za Ijude. H. pylori je čvrsto povezana sa peptičnim ulcerima, hroničnim gastritisom, duodenitisom i karcinomom želuca. Druge Helicobacter vrste su takođe bile povezane sa ovim stanjima, uključujući H. suis, H. felis, H. bizzozeronii i H. salomonis.

[0056] U jednom aspektu otkrića, terapijski efikasna količina farmaceutske kompozicije pronalaska je primenjena nad pacijentom koji ima ili za kog se sumnja da ima infekciju gastrointestinalnog trakta. U sledećem aspektu otkrića, kompozicija je primenjena nad pacijentom koji je rizičan za inficiranje, na primer, pacijent sa dugim bolničkim boravkom i/ili pacijent kom je prepisan širok spektar antibiotika.

[0057] Obično, nepentezin kao nepentezin I i/ili nepentezin II ili njihov derivat je primenjen u količini koja je bezbedna i dovoljna da proizvede željeno dejstvo glutenske detoksikacije ili lečenja bakterijske infekcije. Doza jedinjenja nepentezina ili njegovog derivata može varirati u zavisnosti od mnogih faktora kao što je konkretni nepentezin ili njegov derivat koji se primenjuje, osetljivost pacijenta na gluten, količina i tipovi uzete hrane koja sadrži gluten, farmakodinamička svojstva, način primene, uzrast, zdravstveno stanje i masa primaoca, priroda i obim simptoma, učestalost tretmana i tip istovremenih tretmana, ukoliko postoje, i stopa klirensa jedinjenja. Neko sa iskustvom iz oblasti može utvrditi odgovarajuću dozu na osnovu gore navedenih faktora. Jedinjenja mogu biti primenjena inicijalno u pogodnoj dozi koja se može prilagoditi po potrebi, u zavisnosti od kliničkog odgovora. Količina nepentezina kao što je nepentezin I i/ili nepentezin II ili njihovi derivati koja će biti efikasna u lečenju bolesti u korelaciji sa ili izazvana infekcijom sa patogenom bakterijom, na primer, može biti utvrđena standardnim kliničkim tehnikama na osnovu ovog opisa. Dodatno, in vitro testovi mogu opciono biti upotrebljeni kako bi pomogli u identifikovanju optimalnih doznih opsega. Precizna doza koja treba da se primeni u formulaciji će takođe zavisiti od načina primene, i ozbiljnosti bolesti ili poremećaja, i o njoj treba odlučivati u skladu sa mišljenjem praktičara i okolnostima svakog subjekta.

[0058] Doza ili dozni režim odraslog pacijenta može biti proporcionalno prilagođena za decu i bebe, i takođe prilagođena za drugu primenu i za druge formate, proporcionalno na primer molekularnoj masi ili imunom odgovoru. Primena ili tretmani mogu biti ponovljeni u odgovarajućim intervalima, po nahođenju lekara.

[0059] Generalno, nepentezin ili njegov derivat se primenjuje po potrebi, kada će ili kada konzumira ili kada će konzumirati hranu koja sadrži gluten ili za koju se sumnja da sadrži gluten, ili kada ima ili kada se sumnja da ima bakterijsku infekciju. Alternativno, farmaceutska kompozicija koja sadrži nepentezin ili njegov derivat može biti administrirana nad pacijentom sa potrebom. U bilo kom slučaju, može biti administrirano u dozama od oko 0,001 mg do oko 1000 mg/kg telesne težine dnevno, ili oko 1 mg do oko 100 g po dozi za prosečnu osobu. U nekim izvedbama, nepentezin iti njegov derivat može biti primenjen sa 0,001, 0,01, 0,1, 1, 5, 10, 50, 100, 500 ili 1000 mg/kg telesne težine po danu, i varira između bilo koje dve od ovih vrednosti (uključujuči krajnje tačke). U nekim izvedbama otkrića, nepentezin ili njegov derivat može biti primenjen sa 1 mg, 10 mg, 100 mg, 200 mg, 500 mg, 700 mg, 1 g, 10 g, 20 g, 50 g, 70 g, 100 g po dozi, i varira između bilo koje dve od ovih vrednosti (uključujući krajnje tačke). U nekim izvedbama otkrića, može biti primenjeno jednom, dva puta, tri puta, itd. dnevno, u zavisnosti od toga koliko puta pacijent unese hranu koja sadrži gluten, ili u zavisnosti od tipa, ozbiljnosti ili rizika bakterijske ili parazitske infekcije.

[0060] Jedinjenja ovog pronalaska mogu biti primenjena kao jedini aktivni agens ili se mogu primeniti u kombinaciji sa drugim agensima (simultano, sekvencionalno ili odvojeno, ili kroz ko-formulaciju), uključujući druga jedinjenja koja prikazuju istu ili sličnu terapijsku aktivnost i za koja je utvrđeno da su bezbedna i efikasna za takvu kombinovanu primenu.

[0061] U nekim izvedbama, nepentezin ili njegov derivat je primenjen sa drugim enzimom, kao što je gastrična proteaza (na primer, pepsin i pepsinogen), druga aspartična proteaza, kao što su one opisane od strane Chen et al., Aspartic proteases gene family in rice: Gene structure and expression, predicted protein features and phylogenetic

relation, Gene 442:108-118 (2009), i enzimi kao što su prolil endopeptidaza (PEP), dipeptidil peptidaza IV (DPP IV), i dipeptidil karboksipeptidaza (DCP) ili cisteinska proteinaza B opisano u US Pat. No. 7,910,541.

[0062] U nekim izvedbama, nepentezin je primenjen nad pacijentom sa drugim agensom. Neograničavajući primeri agenasa koji mogu biti primenjeni sa nepentezinom uključuju inhibitore tkivne transglutaminaze, antiinflamatorne agense kao što su HMG-CoA reduktazni inhibitori (na primer, kompaktin, lovastatin, simvastatin, pravastatin i atorvastatin), receptorski antagonisti leukotriena (na primer, montelukast i zafirlukast), СОХ-2 inhibitori (na primer, celekoksib i rofekoksib), inhibitori p38 MAP kinaze (na primer, BIRB-796); agensi za stabilizaciju mastocita kao što su natrijum hromoglikat (hromolin), pemirolast, proksikromil, repirinast, doksantrazol, amleksanoks, nedokromil i probikromil, anti-ulcerni agensi, anti-alergijski agensi kao što su antihistaminski agensi (na primer, akrivastin, cetirizin, desloratadin, ebastin, feksofenadin, levocetirizin, loratadin i mizolastin), inhibitori transglutaminaze 2 (TG2), anti-TNFa agensi i antibiotici.

[0063] U nekim izvedbama otkrića, nepentezin je zajednički primenjen sa antibiotikom, kao što je penicilin, cefalosporin, karbapenem, polimiksin, rifamicin, lipiarmicin, hinolon, sulfonamid, β-laktam, fluorohinolon, glikopeptid, ketolid, linkozamid, streptogramin, aminoglikozid, makrolid, tetraciklin, ciklični lipopeptid, a glicilciklin ili oksazolidinon. Antibiotici u ovim klasama su poznati u nauci.

[0064] U nekim izvedbama otkrića, nepentezin je zajednički primenjen sa anti-infektivnim agensom (na primer, antifungalni triazol ili amfotericin). Oni mogu uključiti karbapeneme, na primer meropenem ili imipenem, kako bi se proširila terapijska efikasnost.

[0065] Ovde je takođe otkrivena upotreba nepentezina ili njegovog derivata u proizvodnji leka za (ečenje ili prevenciju jednog od gore navedenih stanja i bolesti.

Kompozicije

[0066] Nepentezin kao nepentezin I i/ili nepentezin II ili njihovi derivati može biti primenjen u mnoštvu kompozicija sam ili sa odgovarajućim, farmaceutski prihvatljivim nosiocima ili diluentima ili dijetetskim sastojcima.

[0067] Shodno tome, u sledećem aspektu otkrića, ovde je data kompozicija koja sadrži nepentezin ili njegov derivat. U nekim izvedbama otkrića, kompozicija je jestiva kompozicija. U nekim izvedbama otkrića, kompozicija je dijetetski suplement. U nekim izvedbama otkrića, kompozicija je farmaceutska kompozicija. U nekim izvedbama otkrića, kompozicija je hrana ili dodatak hrani. Kompozicije mogu biti formulisane kao čvrste, polučvrste ili tečne forme, kao što su tablete, kapsule, prahovi, granule, masti, rastvori, injekcije, gelovi i mikrosfere. Administracija nepentezina ili njegovog derivata se može postići na razne načine, na primer, putem oralne primene.

[0068] U nekim izvedbama otkrića, farmaceutske kompozicije sadrže terapijski efikasnu količinu agensa i farmaceutski prihvatljiv nosilac. U određenoj izvedbi otkrića, pojam „farmaceutski prihvatljiv" znači odobren od strane regulatorne agencije savezne ili državne vlade li naveden u U.S. Pharmacopeia ili drugoj opštepoznatoj farmakopeji za upotrebu na životinjama, a naročito na Ijudima. Pojam „nosilac" se odnosi na diluent, ađuvans, ekscipijens ili nosilac sa kojim se daje terapijsko sredstvo. Takvi farmaceutski nosioci mogu biti sterilne tečnosti, kao što su voda ili ulja, uključujući ona od petrolejskog, životinjskog, biljnog ili sintetičkog porekla, kao što su ulje kikirikija, ulje soje, mineralno ulje, susamovo ulje i slična. Fiziološki rastvori i vodena dekstroza i glicerolski rastvori se takođe mogu koristiti kao tečni nosioci.

[0069] Pogodni farmaceutski ekscipijensi uključuju skrob, glukozu, laktozu, sukrozu, želatin, slad, pirinač, brašno, kredu, silikagel, natrijum stearat, glicerol monostearat, talk, natrijum hlorid, isušeno obrano mleko, glicerol, propilen glikol, vodu, etanol i slične. Kompozicija, po želji, može takođe sadržati manje količine agenasa za vlaženje ili emulgovanje, ili agense za puferovanje pH. Ove kompozicije mogu primiti formu rastvora, suspenzija, emulzija, tableta, pilula, kapsula, prahova, formulacija sa produženim oslobađanjem i sličnih. Primeri pogodnih farmaceutskih nosilaca su opisani u "Remington’s Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin. Takve kompozicije će sadržati terapijski efikasnu količinu nepentezina ili njegovog derivata, poželjno u prečišćenoj formi, zajedno sa pogodnom količinom nosioca tako da obezbedi formu za odgovarajuću primenu nad subjektom. Formulacija bi trebalo da odgovara načinu primene.

[0070] Kod oralne primene, nepentezin ili njegov derivat se mogu koristiti sami ili u kombinaciji sa

1

odgovarajućim aditivima kako bi se napravile tablete, prahovi, granule, kapsule, sirupi, tečnosti, suspenzije, itd. Na primer, čvrste oralne forme nepentezina ili njegovog derivata mogu biti pripremljene sa konvencionalnim aditivima, dezintegratorima, lubrikantima, diluentima, agensima za puferovanje, agensima za vlaženje, konzervansima i agensima za aromu. Neograničavajući primeri ekscipijenata uključuju laktozu, manitol, kukuruzni skrob, krompirov skrob, kristalnu celulozu, derivate celuloze, bagrem, kukuruzni skrob, natrijum karboksimetilcelulozu, talk, magnezijum stearat, arome i boje. U nekim izvedbama otkrića, formulacija oslobađa nepentezin ili njegov derivat u želucu pacijenta tako da gluten može biti razgrađen nepentezinom ili njegovim derivatom.

[0071] Nepentezin ili njegov derivat može biti liofilizovan iz vodenog rastvora opciono u prisustvu odgovarajućih pufera (na primer, fosfat, citrat, histidin, imidazol puferi) i ekscipijenata (na primer, krioprotektanti kao što su sukroza, laktoza, trehaloza). Liofilizovani kolači se opciono mogu mešati sa ekscipijentima i praviti u različitim oblicima.

[0072] U sledećem aspektu otkrića, date su metode za tretiranje intolerancije na gluten ili povezanog stanja, kao što je celijačna bolest, alergija na pšenicu, osetljivost na gluten i herpetiformni dermatitis, kod pacijenata sa potrebom, koji obuhvataju tretiranje hrane koja sadrži gluten ili za koju se sumnja da sadrži gluten sa efikasnom količinom nepentezina li njegovog derivata pre konzumiranja od strane pacijenta. U nekim izvedbama otkrića, hrana je spojena sa efikasnom količinom nepentezina ili njegovog derivata tokom svoje pripreme, poželjno nakon bilo kog koraka zagrevanja.

[0073] U nekim izvedbama otkrića, nepentezin ili njegov derivat je primenjen kao aditiv hrani zajedno sa hranom koja sadrži gluten ili za koju se sumnja da sadrži gluten, kao što je hleb, testenine, žitarice i slične, napravljene od pšenice, raža i ječma, itd. U nekim izvedbama otkrića, nepentezin ili njegov derivat je dodat kao sastojak u takvu hranu. U nekim izvedbama otkrića, nepentezin ili njegov derivat je rasut u hranu pre konzumacije, opciono pri pH gde je neaktivan, kao što je pH od oko ili iznad 5. U nekim izvedbama otkrića, nepentezin ili njegov derivat može biti napravljen ili inkorporiran u prah, namaz, sprej, sos, umak, šlag, itd., koji može biti primenjen na hranu koja sadrži gluten kada je pacijent konzumira. U nekim izvedbama otkrića, nepentezin ili njegov derivat mogu biti napravljeni u formama koje zadovoljavaju nečiji apetit, kao što su bombone, žvakaće gume, žvakaći dijetetski suplement, sirup, itd. radi lakše administracije. U nekim izvedbama otkrića, nepentezin ili njegov derivat može biti pomešan sa uobičajenim prehrambenim proizvodima, kao što su šećer, so, preliv za salate, začini, sir, puter, margarini, namazi, puter, skraćivanje prženja, majonezi, mlečni proizvodi, maslaci od oraha, maslaci od semenki, maslaci od zrna, puter od kikirikija, itd. Poželjno, prehrambeni proizvodi ili aditivi koji sadrže nepentezin ne zahtevaju zagrevanje pre nego što ih pacijent proguta tako da se moguć gubitak aktivnosti nepentezina ili njegovog derivata usled povišene temperature može minimizovati.

[0074] U sledećem aspektu otkrića, dat je prehrambeni proizvod koji sadrži nepentezin ili njegov derivat. U nekim izvedbama otkrića, prehrambeni proizvod sadrži gluten ili se sumnja da sadrži gluten, kao što su pekarski proizvodi (na primer, kolači, mafini, krofne, peciva, rolnice i hleb), testenine, krekeri, tortilja čips, žitarice itd. napravljeni od pšenice, raža i ječma. U nekim izvedbama otkrića, prehrambeni proizvod se može konzumirati drugim prehrambenim proizvodom koji sadrži gluten ili za koji se sumnja da sadrži gluten. Neograničavajući primeri takve hrane uključuju prah, namaz, sprej, sos, umak, šlag, bombone, žvakaće gume, sirup, šećer, so, preliv za salatu, začine, sir, puter, margarine, namaze, puter, skraćenje prženja, majoneze, mlečne proizvode, maslace od oraha, maslace od semena, maslace od zrna, puter od kikirikija, itd.

[0075] U nekim izvedbama otkrića, nepentezin ili njegov derivat je pomešan sa hranom, ili korišćen da se prethodno tretiraju prehrambene namirnice koje sadrže glutene. Nepentezin koji je prisutan u hrani može biti enzimski aktivan kako bi se redukovao nivo glutena u hrani pre ili tokom ingestije.

[0076] U nekim izvedbama otkrića, kompozicija (kao što je farmaceutska kompozicija ili jestiva kompozicija) ili prehrambeni proizvod sadrži od oko 0,1% do oko 99%, od oko 0,5% do oko 95%, od oko 1% do oko 95%, od oko 5% do oko 95%, od oko 10% do oko 90%, od oko 20% do oko 80%, od oko 25% do oko 75% nepentezina. U nekim izvedbama otkrića, nepentezin u kompoziciji (kao što je farmaceutska kompozicija ili jestiva kompozicija) ili prehrambenom proizvodu je oko 0,01%, oko 0,1%, oko 0,5%, oko 1%, oko 5%, oko 10%, oko 20%, oko 25%, oko 30%, oko 35%, oko 40%, oko 45%, oko 50%, oko 55%, oko 60%, oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90% ili oko 95% ukupne kompozicije ili prehrambenog proizvoda, ili u opsegu između bilo koje dve vrednosti (uključujući krajnje tačke).

[0077] U sledećem aspektu otkrića, data je kompozicija za optimizovanje cepanja glutenskog proteina na prolinskom ostatku, koja sadrži mešavinu rekombinantnog nepentezina I i rekombinantnog nepentezina II. U jednom aspektu otkrića, data je kompozicija za optimiovanje cepanja glutenskog proteina na glutaminskom ostatku, koja sadrži mešavinu rekombinantnog nepentezina I i rekombinantnog nepentezina II. U nekim izvedbama otkrića, kompozicija je bar oko 20%, 50%, 2 puta, 5 puta ili 10 puta efikasnija u cepanju glutenskog proteina na prolinskom ostatku u poređenju sa kompozicijom koja sadrži istu količinu ili koncentraciju samog nepentezina I ili nepentezina II. U nekim izvedbama otkrića, kompozicija je bar оkо 20%, 50%, 2 puta, 5 puta ili 10 puta efikasnija u cepanju glutenskog proteina na glutaminskom ostatku u poređenju sa kompozicijom koja sadrži istu količinu ili koncentraciju samog nepentezina I ili nepentezina II.

[0078] U sledećem aspektu otkrića, data je kompozicija za optimizovanje cepanja proteina na aminokiselinskim ostacima, kao što je H, K, R, D, E, S, T i/ili N. U nekim izvedbama otkrića, kompozicija je bar oko 20%, 50%, 2 puta, 5 puta ili 10 puta efikasnija u cepanju proteina na datim aminokiselinskim ostacima u poređenju sa kompozicijom koja sadrži istu količinu ili koncentraciju samog nepentezina I ili nepentezina II. U nekim izvedbama otkrića, kompozicija je bar oko 10 puta, 100 puta, 500 puta, 1000 puta, 1400 puta ili 2000 puta ili više, efikasnija u cepanju proteina na datim aminokiselinskim ostacima u poređenju sa kompozicijom koja sadrži istu količinu ili koncentraciju pepsina. U nekim izvedbama otkrića, ostatak je ostatak koji može biti cepan pepsinom. U nekim izvedbama otkrića, ostatak je ostatak koji se ne cepa efikasno pepsinom.

[0079] U sledećem aspektu otkrića, data je kompozicija koja sadrži fragmentiran gluten, pri čemu kompozicija je obogaćena glutenskim fragmentima proizvedenim cepanjem glutena na prolinskom ostatku glutena. U jednom aspektu otkrića, data je kompozicija koja sadrži fragmentiran gluten, pri čemu kompozicija je obogaćena gluten fragmentima nastalim cepanjem glutena na glutaminskom ostatku. U nekim izvedbama otkrića, glutenski fragmenti nastali cepanjem glutena na prolinskom ostatku glutena su najmanje 2 puta, 5 puta ili 10 puta glutenskih fragmenata nastalih cepanjem glutena na prolinskom ostatku glutena kompozicijom koja sadrži istu količinu ili koncentraciju samog nepentezina I ili nepentezina II. U nekim izvedbama otkrića, glutenski fragmenti nastati cepanjem glutena na glutaminskom ostatku glutena su najmanje 2 puta, 5 puta, 10 puta glutenskih fragmenata nastalih cepanjem glutena na glutaminskom ostatku glutena kompozicijom koja sadrži istu količinu ili koncentraciju samog nepentezina I ili nepentezina II.

[0080] U sledećem aspektu otkrića, data je kompozicija za optimizovanje cepanja proteina na drugim aminokiselinskim ostacima, kao što su H, K, R, D, E, S, T i/ili N. U nekim izvedbama otkrića, proteinski fragmenti nastali cepanjem proteina na datim aminokiselinskim ostacima proteina su bar 2 puta, 5 puta ili 10 puta od proteinskih fragmenata proizvedenih cepanjem proteina na datim aminokiselinskim ostacima proteina kompozicijom koja sadrži istu količinu ili koncentraciju samog nepentezina I ili nepentezina II. U nekim izvedbama otkrića, proteinski fragmenti nastali cepanjem proteina na datim aminokiselinskim ostacima proteina su bar oko 10 puta, 50 puta, 500 puta, 1000 puta, 1400 puta ili 2000 puta ili više, od proteinskih fragmenata nastalih cepanjem proteina na datim aminokiselinskim ostacima proteina kompozicijom koja sadrži istu količinu ili koncentraciju pepsina. U nekim izvedbama otkrića, ostatak je ostatak koji može biti cepan pepsinom. U nekim izvedbama otkrića, ostatak je ostatak koji se ne cepa efikasno pepsinom.

Postupci pripremanja

[0081] Nepentezin može biti koncentrovan (ili ekstraktovan) ili prečišćen putem poznatih postupaka, kao što je filtracija ili prečišćavanje afiniteta na osnovu imobilizovanog pepstatina, od prirodnog porekla, kao što su sekrecije iz vrča biljaka kao što je vrčonoša. Nepentezin I i II se pronalaze u relativno maloj količini u prirodnim biljnim sekrecijama. Proizvodnja nepentezina I i/ili nepentezina II se može povećati, na primer, korišćenjem tehnologija bioinženjeringa kako bi se stvorile transgene biljke koje eksprimiraju i/ili izlučuju povećane količine nepentezina I ili nepentezina II, ili njihovog derivata.

[0082] Pored toga što je izolovan iz biljnog izvora, nepentezin kao što je nepentezin I i/ili nepentezin II ili njihov derivat može biti pripremljen hemijskom sintezom. Hemijska sinteza se može postići kuplovanjem aminokiselina u skladu sa sekvencom nepentezina. Dostupne su različite peptidne kuplujuće metode i komercijalni peptidni sintetički uređaji za sintezu peptida ili proteina, na primer, automatizovani sintetizatori od Applied Biosystems, Inc., Foster City, Calif., Beckman, i drugih proizvođača.

[0083] U sledećem aspektu otkrića, dat je metod za pripremanje nepentezina korišćenjem rekombinantne proizvodnih sistema transformisanjem ili transfekcijom ćelije sa DNK i/ili prenosnom RNK nepentezina tako da je ćelija sposobna za proizvodnju nepentezina. Na primer, nepentezin se može proizvesti uspostavljanjem sistema vektora domaćina u organizmima kao što su Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Lactobacillus, Bacilli, Aspergilli i biljne ćelijske kulture, kao što su ćelije duvana, itd.

[0084] Takođe su otkriveni vektori i ćelije domaćina, kao što je E. coli, koje obuhvataju polinukleotide i kompozicije koje sadrže bilo koji od polinukleotida ili polipeptida.

[0085] U sledećem aspektu otkrića, dat je metod za proizvodnju rekombinantnog nepentezina kao što je nepentezin I i/ili nepentezin II ili njihov derivat koji obuhvata ekspresiju u odabranom organizmu domaćina sekvence nukleinske kiseline koja kodira pomenuti nepentezin ili njegov homolog, i umetanje sekvence nukleinske kiseline u odgovarajuće dizajniran vektor. U jednom aspektu otkrića, rekombinantni nepentezin je nepentezin I njegov derivat. U jednom aspektu otkrića, rekombinantni nepentezin je nepentezin II ili njegov derivat. U jednom aspektu otkrića, rekombinantni nepentezin je mešavina nepentezina I i nepentezina II ili njihovih derivata.

[0086] U sledećem aspektu otkriča, data je kompozicija koja sadrži rekombinantni nepentezin kao što je nepentezin I i/ili nepentezin II ili njihov derivat. U jednom aspektu otkrića, rekombinantni nepentezin je nepentezin I ili njegov derivat. U jednom aspektu otkrića, rekombinantni nepentezin je nepentezin II ili njegov derivat. U jednom aspektu otkrića, rekombinantni nepentezin je mešavina nepentezina I i nepentezina II ili njihovih derivata.

[0087] Nepentezin ima dve poznate izoforme: nepentezin I (poznat po tome što ima dve varijante nepentezin la i nepentezin Ib) i II. Sekvence nepentezina i nukleotidno sekvenciranje cDNK koja kodira nepentezin su poznati u nauci, na primer, opisano u Athauda SB et al., Enzymic and structural characterization of nepenthesin, a unique member of a novel subfamily of aspartic proteinases, Biochem. J. 381:295-306 (2004). Sekvence nepentezin I mRNK su opisane iz nekoliko vrsta, na primer, Nepenthes mirabilis (GenBank Accession No. ЈХ494401), Nepenthes gracilis (GenBank Accession No. AB114914) i Nepenthes alata (GenBank Accession No. AB266803). Sekvence nepentezin II mRNK su opisane iz nekoliko vrsta, na primer, Nepenthes mirabilis (GenBank Accession No. ЈХ494402), Nepenthes gracilis (GenBank Accession No. AB114915) i Zea mays (GenBank Accession No. NM_001147869). Proteinske sekvence nepentezin I su opisane iz nekoliko vrsta, na primer, Nepenthes mirabilis (GenBank Accession No. AFV26024), Nepenthes gracilis (GenBank Accession No. BAD07474), Nepenthes alata (GenBank Accession No. BAF98915) i Zea mays (NCBI Reference Sequence: NP_001150925). Proteinske sekvence nepentezin II su opisane iz nekoliko vrsta, na primer, Nepenthes mirabilis (GenBank Accession No. AFV26025), Nepenthes gracilis (GenBank Accession No. BAD07475) i Zea mays (NCBI Reference Sequence: NP_ 001149229). Putativni protein nepentezin I je opisan za Оrуzа sativa (GenBank Accession No. BAD38020). Putativni protein nepentezin II je opisan za Oryza sativa (GenBank Accession No. BAD82000).

[0088] Poravnavanje sekvence poznatih nepentezin proteina (i putativnih proteina) je prikazano na crtežu 9, sa odgovarajućim rezultatima poravnanja u paru u tabeli 1. Filogenetsko stablo koje predstavlja podatke je prikazano na crtežu 10. Athauda, et al. dalje porede nepentezine sa srodnim tipičnim aspartičnim proteazama. Athauda, et al. su predvideli kičmenu strukturu nepentezina la na osnovu strukture porcinskog pepsina A (nepentezin Ib i II su predviđeni kao suštinski isti kao nepentezin la). Ostaci putativne katalitičke asparaginske kiseline su konzervirani na osnovu ove analize.

[0089] U nekim izvedbama otkrića, biosinteza nepentezina se može postići transformisanjem ćelije sa vektorom koji sadrži cDNK koja kodira nepentezin I, na primer nukleotidna sekvenca sekvencionog identifikacionog broja 1, GenBank Accession No. ЈХ494401, GenBank Accession No. AB114914 ili GenBank Accession No. AB266803. U nekim izvedbama otkrića, biosinteza nepentezina se može postići transformisanjem ćelije sa vektorom koji sadrži sekvencu homolognu cDNK koja kodira nepentezin I, čija sekvenca kodira protein sa proteaznom aktivnošću. Sekvenca može imati najmanje oko 60% homologije sa cDNK koja kodira nepentezin I. Sekvenca može imati najmanje oko 70% homologije sa cDNK koja kodira nepentezin I. Sekvenca može imati najmanje oko 80% homologije sa cDNK koja kodira nepentezin I. Sekvenca može imati najmanje oko 85% homologije sa cDNK koja kodira nepentezin I. Sekvenca može imati najmanje oko 90% homologije sa cDNK koja kodira nepentezin I. Sekvenca može imati najmanje oko 95% homologije sa cDNK koja kodira nepentezin I. Sekvenca može imati najmanje oko 96% homologije sa cDNK koja kodira nepentezin I. Sekvenca može imati najmanje oko 97% homologije sa cDNK koja kodira nepentezin I. Sekvenca može imati najmanje oko 98% homologije sa cDNK koja kodira nepentezin I. Sekvenca može imati najmanje oko 99% homologije sa cDNK koja kodira nepentezin I.

[0090] U nekim izvedbama otkrića, biosinteza nepentezina se može postići transformisanjem ćelije sa vektorom koji sadrži cDNK koja kodira nepentezin II, na primer nukleotidna sekvenca GenBank Accession No. ЈХ494402 ili GenBank Accession No. AB114915. U nekim izvedbama otkrića, biosinteza nepentezina se može postići transformisanjem ćelije sa vektorom koji sadrži sekvencu homolognu cDNK koja kodira nepentezin II, čija sekvenca kodira protein sa proteaznom aktivnošću. Sekvenca može imati najmanje oko 60% homologije sa cDNK koja kodira nepentezin II. Sekvenca može imati najmanje oko 70% homologije sa cDNK koja kodira nepentezin II. Sekvenca može imati najmanje oko 80% homologije sa cDNK koja kodira nepentezin II. Sekvenca može imati najmanje oko 85% homologije sa cDNK koja kodira nepentezin II. Sekvenca može imati najmanje oko 90% homologije sa cDNK koja kodira nepentezin II. Sekvenca može imati najmanje oko 95% homologije sa cDNK koja kodira nepentezin II. Sekvenca može imati najmanje oko 96% homologije sa cDNK koja kodira nepentezin II. Sekvenca može imati najmanje oko 97% homologije sa cDNK koja kodira nepentezin II. Sekvenca može imati najmanje oko 98% homologije sa cDNK koja kodira nepentezin II. Sekvenca može imati najmanje oko 99% homologije sa cDNK koja kodira nepentezin II.

[0091] Sintetički nepentezin kao što je nepentezin I i/ili nepentezin II ili njihov derivat može biti koncentrovan ili prečišćen u skladu sa poznatim postupcima, kao što su oni za izolovanje nepentezina ili njegovog derivata iz tečnosti biljke vrčonoše.

1

[0092] U nekim izvedbama otkrića, proteinski proizvod izolovan iz prirodnog izvora ili sintetičkog izvora sadrži najmanje 20% mase nepentezina ili njegovog derivata. U nekim izvedbama otkrića, izolovan proteinski proizvod sadrži najmanje oko 50%, oko 75%, oko 90%, oko 95% mase nepentezina ili njegovog derivata. U nekim izvedbama otkrića, izolovan proteinski proizvod sadrži najmanje 99% mase nepentezina ili njegovog derivata.

[0093] U nekim izvedbama otkrića, rekombinantni nepentezin sadrži suštinski samo nepentezin I. U nekim izvedbama otkrića, rekombinantni nepentezin sadrži suštinski samo nepentezin II. U nekim izvedbama otkrića, rekombinantni nepentezin sadrži odnos nepentezina I prema nepentezinu II od najmanje oko 100:1. U nekim izvedbama otkrića, rekombinantni nepentezin sadrži odnos nepentezina I prema nepentezinu II od najmanje oko 90:1. U nekim izvedbama otkrića, rekombinantni nepentezin sadrži odnos nepentezina I prema nepentezinu II od najmanje oko 70:1. U nekim izvedbama otkrića, rekombinantni nepentezin sadrži odnos nepentezina I prema nepentezinu II od najmanje oko 60:1. U nekim izvedbama otkrića, rekombinantni nepentezin sadrži odnos nepentezina I prema nepentezinu II od najmanje oko 50:1. U nekim izvedbama otkrića, rekombinantni nepentezin sadrži odnos nepentezina I prema nepentezinu II od najmanje oko 40:1. U nekim izvedbama otkrića, rekombinantni nepentezin sadrži odnos nepentezina I prema nepentezinu II od najmanje oko 30:1. U nekim izvedbama otkrića, rekombinantni nepentezin sadrži odnos nepentezina I prema nepentezinu II od najmanje oko 20:1. U nekim izvedbama otkrića, rekombinantni nepentezin sadrži odnos nepentezina I prema nepentezinu II od najmanje oko 10:1. U nekim izvedbama otkrića, rekombinantni nepentezin sadrži odnos nepentezina I prema nepentezinu II od najmanje oko 5:1. U nekim izvedbama otkrića, rekombinantni nepentezin sadrži odnos nepentezina I prema nepentezinu II od najmanje oko 4:1. U nekim izvedbama otkrića, rekombinantni nepentezin sadrži odnos nepentezina I prema nepentezinu II od najmanje oko 3:1.U nekim izvedbama otkrića, rekombinantni nepentezin sadrži odnos nepentezina I prema nepentezinu II od najmanje oko 2:1. U nekim izvedbama otkrića, rekombinantni nepentezin sadrži odnos nepentezina I prema nepentezinu II od najmanje oko 1:1. U nekim izvedbama otkrića, rekombinantni nepentezin sadrži odnos nepentezina I prema nepentezinu II od najmanje oko 1:2. U nekim izvedbama otkrića, rekombinantni nepentezin sadrži odnos nepentezina I prema nepentezinu II od najmanje oko 1:3. U nekim izvedbama otkrića,rekombinantni epentezin sadrži odnos nepentezina I prema nepentezinu II od najmanje oko 1:4. U nekim izvedbama otkrića, rekombinantni nepentezin sadrži odnos nepentezina I prema nepentezinu II od najmanje oko 1:5. U nekim izvedbama otkrića, rekombinantni nepentezin sadrži odnos nepentezina I prema nepentezinu II od najmanje oko 1:10. U nekim izvedbama otkrića, rekombinantni nepentezin sadrži odnosnepentezina I prema nepentezinu II od najmanje oko 1:20. U nekim izvedbama otkrića,rekombinantni nepentezin sadrži odnos nepentezina I prema nepentezinu II od najmanje oko 1:30. U nekim izvedbama otkrića, rekombinantni nepentezin sadrži odnos nepentezina I prema nepentezinu II od najmanje oko 1:40. U nekim izvedbama otkrića, rekombinantni nepentezin sadrži odnos nepentezina I prema nepentezinu II od najmanje oko 1:50. U nekim izvedbama otkrića, rekombinantni nepentezin sadrži odnosnepentezina I prema nepentezinu II od najmanje oko 1:60. U nekim izvedbama otkrića, rekombinantni nepentezin sadrži odnos nepentezina I prema nepentezinu II od najmanje oko 1:70. U nekim izvedbama otkrića, rekombinantni nepentezin sadrži odnos nepentezina I prema nepentezinu II od najmanje oko 1:80. U nekim izvedbama otkrića, rekombinantni nepentezin sadrži odnos nepentezina I prema nepentezinu II od najmanje oko 1:90. U nekim izvedbama otkrića, rekombinantni nepentezin sadrži odnos nepentezina I prema nepentezinu II od najmanje oko 1:100.

[0094] U nekim izvedbama otkrića, proteinski proizvod izolovan iz prirodnog izvora ili sintetičkog izvora sadrži protein koji je najmanje oko 70% homologan nepentezinu I i zadržava aktivnost proteaze. Protein može biti najmanje oko 80% homologan nepentezinu I. Protein može biti najmanje oko 85% homologan nepentezinu I. Protein može biti najmanje oko 90% homologan nepentezinu I. Protein može biti najmanje oko 95% homologan nepentezinu I. Protein može biti najmanje oko 96% homologan nepentezinu I. Protein može biti najmanje oko 97% homologan nepentezinu I. Protein može biti najmanje oko 98% homologan nepenteinu I. Protein može biti najmanje oko 99% homologan nepentezinu I.

[0095] U nekim izvedbama otkrića, proteinski proizvod izolovan iz prirodnog izvora ili sintetičkog izvora sadrži protein koji je oko 70% homologan nepentezinu II i zadržava aktivnost proteaze. Protein može biti najmanje oko 80% homologan nepentezinu II. Protein može biti najmanje oko 85% homologan nepentezinu II. Protein može biti najmanje oko 90% homologan nepentezinu II. Protein može biti najmanje oko 95% homologan nepentezinu II. Protein može biti najmanje oko 96% homologan nepentezinu II. Protein može biti najmanje oko 97% homologan nepentezinu II. Protein može biti najmanje oko 98% homologan nepentezinu II. Protein može biti najmanje oko 99% homologan nepentezinu II.

[0096] U nekim izvedbama otkrića, proteinski proizvod izolovan iz prirodnog izvora ili sintetičkog izvora sadrži nepentezin ili njegov derivat sa najmanje oko 10% originalne aktivnosti proteaze nepentezina I. U nekim izvedbama otkrića, proteinski proizvod sadrži nepentezin ili njegov derivat sa najmanje oko 20% originalne aktivnosti proteaze nepentezina I. U nekim izvedbama otkrića, proteinski proizvod sadrži nepentezin ili njegov derivat sa najmanje oko 30% originalne aktivnosti proteaze nepentezina I. U nekim izvedbama otkrića, proteinski proizvod sadrži nepentezin ili njegov derivat sa najmanje oko 40% originalne aktivnosti proteaze nepentezina I. U nekim izvedbama otkrića, proteinski proizvod sadrži nepentezin ili njegov derivat sa najmanje oko 50% originatne aktivnosti proteaze nepentezina I. U nekim izvedbama otkrića, proteinski proizvod sadrži nepentezin ili njegov derivat sa najmanje oko 60% originalne aktivnosti proteaze nepentezina I. U nekim izvedbama otkrića, proteinski proizvod sadrži nepentezin ili njegov derivat sa najmanje oko 70% originalne aktivnosti proteaze nepentezina I. U nekim izvedbama otkrića, proteinski proizvod sadrži nepentezin ili njegov derivat sa najmanje oko 80% originalne aktivnosti proteaze nepentezina I. U nekim izvedbama otkrića, proteinski proizvod sadrži nepentezin ili njegov derivat sa najmanje oko 90% originalne aktivnosti proteaze nepentezina I. U nekim izvedbama otkrića, proteinski proizvod sadrži nepentezin ili njegov derivat sa više od oko 100% originalne aktivnosti proteaze nepentezina I.

[0097] U nekim izvedbama otkrića, proteinski proizvod izolovan iz prirodnog izvora ili sintetičkog izvora sadrži nepentezin ili njegov derivat sa najmanje oko 10% originalne aktivnosti proteaze nepentezina II. U nekim izvedbama otkrića, proteinski proizvod sadrži nepentezin ili njegov derivat sa najmanje oko 20% originalne aktivnosti proteaze nepentezina II. U nekim izvedbama otkrića, proteinski proizvod sadrži nepentezin ili njegov derivat sa najmanje oko 30% originalne aktivnosti proteaze nepentezina II. U nekim izvedbama otkrića, proteinski proizvod sadrži nepentezin ili njegov derivat sa najmanje oko 40% originalne aktivnosti proteaze nepentezina II. U nekim izvedbama otkrića, proteinski proizvod sadrži nepentezin ili njegov derivat sa najmanje oko 50% originalne aktivnosti proteaze nepentezina II. U nekim izvedbama otkrića, proteinski proizvod sadrži nepentezin ili njegov derivat sa najmanje oko 60% originalne aktivnosti proteaze nepentezina II. U nekim izvedbama otkrića, proteinski proizvod sadrži nepentezin ili njegov derivat sa najmanje oko 70% originalne aktivnosti proteaze nepentezina II. U nekim izvedbama otkrića, proteinski proizvod sadrži nepentezin ili njegov derivat sa najmanje oko 80% originalne aktivnosti proteaze nepentezina II. U nekim izvedbama otkrića, proteinski proizvod sadrži nepentezin ili njegov derivat sa najmanje oko 90% originalne aktivnosti proteaze nepentezina II. U nekim izvedbama otkrića, proteinski proizvod sadrži nepentezin ili njegov derivat sa više od oko 100% originalne aktivnosti proteaze nepentezina II.

III Primeri

[0098] Osim ukoliko nije drugačije navedeno, skraćenice korišćene u celoj specifikaciji imaju sledeća značenja:

g = gram

kDa = kilodalton

kg = kilogram

L = litar

LC = tečna hromatografija

mg = miligram

min = minut

mL = mililitar

mM = milimolar

MS = masena spektrometrija

nM = nanomolar

pM = pikomolar

s.d. = standardna devijacija

mCi = mikrokiri

mg mikrogram

mL = mikrolitar

mM = mikromolar

mm = mikrometar

°C = stepen celzijusa

[0099] Ovi jednoslovni simboli imaju sledeće značenje kada predstavljaju aminokiseline:

A = Alanin

R = Arginin

N = Asparagin

D = Asparaginska kiselina

1

С = Cistein

Е = Glutaminska kiselina

Q = Glutamin

G = Glicin

H = Histidin

I = Izoleucin

L = Leucin

K = Lizin

M = Metionin

F = Fenilalanin

P = Prolin

S = Serin

T = Treonin

W = Triptofan

Y = Tirozin

V = Valin

Primer 1

Priprema ekstrakta nepentezina

Hemikalije

[0100] Voda i acetonitril, HPLC razred forma Burdick i Jackson, su kupljeni od VWR. Metanska kiselina, tris, glicin su kupljeni od Sigma Aldrich.

Biljna kultura

[0101] Transbiljke Nepenthes rafflesiana, Nepenthes ampularia, Nepenthes mirabilis i Nepenthes globosa su kupljene od Keehns Carnivores (http://www.keehnscarnivores.ca). Posute su drvenom korom, perlitom, tresetnom mahovinom i humusom (40, 35, 10, 5% respektivno). Uslovi rasta su podrazumevali 14 sati svetlosti dnevno, 80% vlažnosti i temperaturu u opsegu 23-28 °C sa 2 do 3 zalivanja nedeljno. Po zrelosti vrča, biljke su hranjene sa jednom ili dve Drosophila po vrču a tečnost vrča je prikupljena nedelju dana kasnije. Vrčevi i njihove sekrecije su ostavljeni da se oporave nedelju dana pre sledećeg kruga hranjenja i ekstrakcije.

Pripremanje ekstrakta

[0102] Tečnost vrča je prikupljena od sve četiri vrste biljaka i spojena. Sirova tečnost vrča je prvo pročišćena kroz 0,22 mm filter, zatim koncentrovana 80 do 100 puta korišćenjem Amicon Ultra centrifugalno 10 kDa molekularne mase cut-off filter (oba od Millipore). Pre korišćenja u digestijama, koncentrat je aktiviran kiselinom sa 100 mM glicin HCl (pH 2,5) tokom 3 sata, zatim ispran 3 puta sa 100 mM glicin-HCl (pH 2,5) u filtracionom uređaju, korišćenjem 10 puta zapremine tečnosti za svako pranje). Konačni izolat je zatim ponovo razblažen do 11Х koncentracije na osnovu originalnog uzrokovanja tečnosti iz vrča.

Karakterizacija ekstrakta tečnosti iz vrča

[0103] Tečne sekrecije vrčonoše su koncentrovane i digestioni enzimi su aktivirani redukcijom pH (pH 2,5). Uticaj procesa obogaćivanja i aktivacija proteoma fluida je određena korišćenjem proteomskih metoda. Prvo, kako bi se potvrdilo prisustvo nepentezimskog enzima, neaktivni koncentrat je razdvojen sa SDS-PAGE. Sedam susednih zona gela sa vrlo slabim comasi bojanjem je digestirano sa tripsinom i analizirano sa nanoLCMS/MS korišćenjem standardnih metoda. Ne očekuje se da će ovo biti kompletni katalog aktiviranog tečnog proteoma, ali je analizom potvrđeno prisustvo aspartične proteaze nepentezina l/ll, kao i glukanaze, hitinaze, karboksipeptidaze i peroksidaze biljnog porekla, plus skromnih nivoa Drosophita i bakterijske kontaminacije. Niska kompleksnost tečnog proteoma je u skladu sa nedavnim analizama, Hatano N, Hamada T (2012). Proteomska analiza izlučenog proteina indukovanog komponentom plena u tečnosti vrča mesožderke biljke Nepentes alata. Journal of Proteomics 3;75(15):4844-52 (Epub Jun. 15, 2012), ali u ovoj analizi je otkriveno da je nepentezin I raspoređen u mnogo širem opsegu mase (40 -70 kDa). Tečnost aktivirana kiselinom je nakon toga obrađena i analizirana na sličan način. Aktivacioni

1

postupak je redukovao ukupni proteinski prinos, a takođe deluje i da je pojednostavio kompoziciju. Pored nepentezina I, evidentirana je samo manja kontaminacija keratinom i aktinom. Ove analize su ukazale na nisku kompleksnost obogaćene tečnosti, tamo gde je nepentezin glavna komponenta. Ukupna koncentracija proteina aktivirane i 80 puta obogaćene tečnosti je izmerena 22 ng/mL sa BCA testom. Ova vrednost je u skladu sa ranijom studijom koja je opisivala obogaćivanje tečnosti. Tokes ZA, et al., Digestive Enzymes Secreted by Carnivorous Plant Nepenthes-Macferlanei-L. Planta 119(1 ):39-46 (1974).

Primer 2

Mapiranje digestije proteina ekstraktom pepsina i nepentezina

Mapiranje digestije nepentezina masenom spektrometrijom

[0104] Ekstrakt nepentezina je pripreman kao u Primeru 1.

[0105] Digestije proteina su izvršene u rastvoru korišćenjem LEAP НТХ-PAL sistema za automatsko uzrokovanje i doziranje dizajniran za aplikacije vodonik/deuterijum razmene (HDX), i podaci su prikupljeni sa AB Sciex Triple-TOF

5600 QqTOF masenim spektrometrom. Peptidi su identifikovani upotrebom Mascot (v2.3) iz MS/MS podataka. Ukratko, 8mL od 8mM proteina (XRCC4, XLF, ligaza IV-tandem BRCT domeni, PNK, mioglobin ili citohrom C) su pomešani sa 10 mL od 11 х koncentrovane tečnosti tokom 2 minuta na 10 °C. Mioglobin i citohrom C su kupljeni od Sigma. Nakon dilucije na 1mM supstratne koncentracije, 15 mL je ubrizgano u LC sistem ohlađene reverzne faze (4°C) povezan za maseni spektrometar. Peptidi su zadržani na 5 cm, 200 mm i.d. Опух C18 monolitnoj koloni (Phenomenex Inc.) i eluirani sa gradijentom acetonitrila od 3% do 40% u 10 minuta. Peptidi koji su detektovani u ovim analizama su izabrani za fragmentaciju CID u višestrukim informaciono zavisnim akvizicijama MS/MS spektra, slično strategiji frakcionisanja gasne faze. Blonder J, et al., Proteomsko inspitivanje prirodnih ubica ćelija mikrozoma korišćenjem frakcionacije gasne faze masenom spektrometrijom. Biochimica Et Biophysica Acta-Proteins and Proteomics 1698(1 ):87-95 (2004). Spektri su pretraženi u minijaturnoj bazi podataka koja sadrži sekvence za svih šest proteina. Rezultati sekvenciranja su ručno verifikovani.

Rezultati

[0106] Serije proteina su digestirane sa obogaćenom tečnošću pod uslovima koji su pogodni za HDX-MS eksperimente. Specifičnost digestije koncentrata je karakterisana na pozicijama Pl i P1’ (slika 1), kako bi se podržalo poređenje sa sličnim istraživanjima primenjenim na pepsinu. Hamuro Y, et al., Specifičnost imobilisanog porcinskog pepsina u uslovima kompatibilnim sa H/D razmenom. Rapid Communications in Mass Spectrometry 22(7): 1041-1046 (2008). U ovom primeru, odnos enzim prema supstratu je bio 1:85 na osnovu pretpostavke da je sav meren protein u obogaćenoj tečnosti nepentezin, iako je očigledno da su neki kontaminirajući proteini bili prisutni.

[0107] Podaci o nepentezinu predstavljaju procenu od 1612 ostataka i iako nisu toliko ekstenzivni kao odgovarajući podaci o pepsinu (13,766 ostataka), sekventni diverzitet je dovoljno visok u setu proteina da opravdava poređenje na nivou pozicija Pl i Р1 ’. Čini se da je najveća specifičnost za pepsin na Pl poziciji. Predstavlja cepanje visoke efikasnosti hidrofobnih ostataka F, L i M ati cepanje nakon P, H, K i R je suštinski zabranjeno. Nepentezin cepa nakon većine ostataka sa izuzetkom G, S, T, V, I i W. Podržava visoku stopu cepanja nakon očekivanih pepsin Р1 ostataka ali takođe kod ostataka zabranjenih u digestiji pepsina, naročito K, R i P. Na Р1 ’ poziciji, pepsin prikazuje preferencu za hidrofobne ostatke uopšteno, uključujući bilo koji ostatak sa aromatičnošću. Suprotno tome, nepentezin pokazuje malo u smislu selektivnosti na P1’ poziciji, izuzev možda za G, P i H. Sve u svemu, nepentezin pokazuje značajno ležerniju specifičnost na Pl poziciji u odnosu na pepsin, i pruža indikaciju veoma visoke efikasnosti.

Primer 3

Mapiranje digestije multidomenskog proteina, XRCC4, ekstraktom pepsina i nepentezina

HD razmena kompleksa uključenog u popravku štete DNK

[0108] Ekstrakt nepentezina je pripreman kao u primeru 1.

[0109] Rastvori XRCC4 (1-200) sa BRCT i XRCC4 (puna dužina) sa BRCT su razblaženi u puferu (10 mM Tris-HCl, pH 7,5) do ekvimolarnih koncentracija (10 mM) i inkubirani na 4 °C tokom minimalno 30 minuta radi promovisanja kompleksacije. Uzorci su držani na 4 °C do HDX analize. Alikvoti su deturisani

1

tokom 2 minuta na 20 °C uz dodavanje D20 (25% v/v). Alikvoti su zatim digestirani na dva načina. Kod prve digesticione strategije, proteinska deuteracija je ugašena dodavanjem uzorka ohlađenom 100 mM glicin- HCl (pH 2,5), i ugašen proteinski rastvor je ubrizgan u pepsinski mikroreaktor. Ovaj mikroreaktor je instaliran u НТХ-PAL sistem između ventila za ubrizgavanje i C18 kolone. Proteinska digestija je uhvaćena na monolitnoj C18 kapilarnoj koloni i eluirana u maseni spektrometar. Svi fluidni elementi, uključujući mikroreaktor, su ohlađeni na 4 °C kako bi se minimizovala povratna razmena deuterijuma tokom vremena analize (<15 minuta). U drugoj digestionoj strategiji, ekvivalentna količina deuterovanog proteina je simultano ugašena i digestovana sa 3 ili 5 mL 11Х nepentez tečnosti tokom 3 ili 5 minuta, respektivno, na 10 °C. Uzorak je ubrizgan u ohlađen LC sistem povezan sa masenim spektrometrom.

[0110] Napravljena su replikatna merenja pomeranja mase (4 ili više) i referencirana na kontrolu stanja proteina - slobodno XRCC4 (1-200), slobodno XRCC4 (puna dužina) i slobodno LigIV-BRCT. Prosečan nivo deuterijuma za svaki peptid je utvrđen korišćenjem Mass Spec Studio (rukopis u pripremanju), što je obnova Hydra v1.5. Slysz GW, et al., Hydra: software for tailored processing of H/D exchange data from MS or tandem MS analyses. Bmc Bioinformatics 10 (2009). Preturbacije u pomeranjima mase su smatrane značajnim ukoliko (a) su prošle two-tailed t test (p<0,05) korišćenjem objedinjenih standardnih devijacija od analize svakog stanja, (b) prošle distribucionu analizu da bi se zaštitile od spektralnog preklapanja i (c) premašile su graničnu vrednost pomeranja (62 s.d.) na osnovu merenja šuma pomeranja i pretpostavke njene normalne distribucije Bennett MJ, et al., Discovery and Characterization of the Laulimalide- Microtubule Binding Mode by Mass Shift Perturbation Mapping. Chemistry 6t Biology 17(7):725-734 (2010).

Rezultati

[0111] Kako bi se utvrdilo da li se reklasirana specifičnost translatuje u poboljšanje u sekventnom mapiranju za HDX-MS aplikacije, profilisani su XRCC4 pune dužine, protein koji sadrži globularni domen, produženi spiralni stalk i dug neuređen C-terminal. Hammel M, et al., XLF Regulates Filament Architecture of the XRCC4. Ligase IV Complex. Structure 18(11):1431-1442 (2010); and Junop MS, et al., Crystal structure of the Xrcc4 DNA repair protein and implications for end joining. Embo J 19(22):5962-5970 (2000). Takve multidomenske proteine je teško obuhvatiti u jednom digestionom protokolu, a naročito, suštinski uneređeni regioni imaju tendenciju za slabu digestiju sa pepsinom jer su relativno siromašni sa hidrofobnim ostacima i obogaćeni prolinom i naelektrisanim ostacima. Dunker AK, et al. Intrinsically disordered protein. Journal of Molecular Graphics & Modelling 19(1 ):26-59 (2001). Mape pepsina i nepentezina za ovaj protein su prikazane na slici 2. U ovom poređenju, sprovedeno je iscrpno mapiranje za oba enzima, korišćenjem opsega različitih proteaznih količina, i rekurzivnih MS/MS eksperimenata. Nepentezin pruža superiornu pokrivenost proteina pune dužine: 357 peptida za nepentezin (tamnosive trake) u poređenju sa 187 za pepsin (svetlosive trake). (Prosečna dužina peptida od 11 ostataka je bila ista za oba enzima.) Oba enzima predstavljaju globularne i stalk regione sa velikim brojem preklapajućih peptida ali komplementarnost koju pruža nepentezin je očigledna. Na primer, nepentezin pruža značajno dublju pokrivenost β-sheet regiona u globularnom domenu (ostaci 1-30). Neuređeni region C-terminala je takođe pokriven u mnogo većoj meri i sa znatno višim nivoom redundancije. Svaki ostatak u ovom neuređenom tail repnom regionu dobija 16Х pokrivenost upotrebom nepentezina a samo 4,7X pokrivenosti sa pepsinom.

[0112] Postojanje bilo kakve sklonosti prilikom detekcije peptida je istraženo odabirom prosečne ocene pretrage kao metrike (slika 3). Pristup naglašava poverenje u sekventnu identifikaciju kao glavno sredstvo kojim se definišu sekventne mape. Jedan outliner je R. Viši rezultati peptida koji se završavaju u R verovatno odražavaju kombinaciju višeg prosečnog intenziteta peptida i bolju fragmentaciju, što je u skladu sa onim što znamo iz bottomup proteomija na bazi tripsina. Warwood S, et al. Guanidination chemistry for qualitative and quantitative proteomics. Rapid Communications in Mass Spectrometry 20(21 ):3245-3256 (2006).

Primer 4

Digestija XRCC4 sa različitim odnosima enzim:supstrat

[0113] Enzimska efikasnost je detaljnije ispitana. Stepen u kom peptidna masena mapa može varirati, ili prilagoditi, jednostavnim menjanjem odnosa enzim-supstrat je prikazan na slici 4. Opterećenje nepentezina je variralo u opsegu od preko 50 puta za digestije u rastvoru. Kod eksperimenta sa pepsinom, radije je korišćen imobilizovani pepsin u obliku kaše nego slobodni pepsin kako bi se izbegla ekstenzivna autoliza pepsina. Enzimsko opterećenje je variralo u opsegu od 8 puta; niže količine su dovele do slabih intenziteta peptida i veće količine nisu imale uticaj na mapu. Otkriveno je da je nepentezin generisao vrlo nizak profil autolize čak i pri većim opterećenjima. Agregatni peptidni jonski hromatogram (PIC) je

1

korišćen kao mera efikasne digestije. Poređenje relativno sličnih distribucija otkriveno pri 0,38:1 (nepentezin:supstrat) sa 520:1 (pepsimsupstrat) predstavlja izuzetno 1400 puta poboljšanje efikasnosti nepentezina u odnosu na pepsin u HDX aplikacijama.

[0114] Digestija nepentezina bi se moglo lakše prilagoditi sa velikih fragmenata na male promenom enzimskog opterećenja, i generisanjem varijabilne reprezentacije XRCC4. Ovo je demonstrirano na slici 4A tranzicijom u PIC iz dugih retencionih vremena pri malom opterećenju u kratka retenciona vremena pri velikom opterećenju. Ova tranzicija je u korelaciji sa prosečnom dužinom peptida za najzastupljenije peptide koja se kretala od >12 pri niskom enzimskom opterećenju do 10 pri visokom enzimskom opterećenju. Suprotno tome, različito opterećenje pepsina nije značajno promenilo PIC ili prosečnu dužinu peptida (slika 4B). Mikroreaktor pepsina sa prinudnim protokom može poboljšati podešavanje ali najverovatnije neće generisati manje fragmente.

Primer 5

Digestija gliadina ekstraktom nepentezina

[0115] Digestije gliadina nepentezinom su sprovedene u rastvoru korišćenjem LEAP НТХ-PAL sistema za automatsko uzrokovanje i doziranje dizajniranog za aplikacije vodonik/deuterijum razmene (HDX). Podaci su prikupljeni upotrebom AB Sciex Triple-TOF 5600 QqTOF masenog spektrometra. Peptidi su identifikovani korišćenjem Mascot (v2.3) iz MS/MS podataka. Ukratko, 12 pmol sirovog gliadina (kupljeno od Sigma Aldrich) je pomešano sa 2 mL 100x kocentrovanog ekstrakta, proizvedenog kao što je opisano u primeru 1. Nakon digestije cela zapremina je ubrizgana u LC sistem sa reverznom fazom povezan sa masenim spektrometrom. Peptidi su zaustavljeni na 7 cm, 150 mm i.d. Magic C18 koloni i eluirani sa gradijentom acetonitrila od 10% do 40% tokom 10 ili 30 minuta. Peptidi detektovani u ovim analizama su izabrani iz CID fragmentacije u višestrukim informaciono zavisnim akvizicijama MS/MS spektra. Spektri su pretraženi zbog minijaturne baze podataka koja sadrži sekvence za sve identifikovane proteine pšeničnog gliadina (a, B, у, ш) plus glutenina niske i visoke molekularne mase. Slika 5 prikazuje prosečnu dužinu svih peptida identifikovanih iz nepentezinske digestije gliadina iz pšenice, korišćenjem LC-MS/MS, nakon 1, 5, 10, 15, 30, 60, 130, 360 ili 810 minuta pri 37 °C. Granično pouzdanje (p<0,05) od 95% je korišćeno na rezultatima kako bi se uklonila lažno pozitivna identifikacija. Relativna standardna devijacija dužine peptida je prikazana na umetnutoj slici.

[0116] Slika 6 prikazuje jedan broj peptida identifikovanih sa LC-MS/MS nakon 1, 5, 10, 15, 30, 60, 130, 360 ili 810 minuta digestije na 37 °C, grupisane po dužini. Podaci kao na slici 5.

[0117] Slika 7 prikazuje iste podatke kao na slici 5, kao verovatnoću dobijanja određene dužine nakon 10, 60, 120, 360 ili 810 minuta digestije na 37 °C.

Primer 6

Prečišćavanje ekstrakta nepentezina

Prečišćavanje ekstrakta

[0118] Sefarozom imobitizovan pepstatin u 50 х 2 cm ID koloni je uravnotežen u 20 mM Glycine-HCl, pH 2,5-3. Filtrirana tečnost iz vrča (pripremano kao što je opisano u primeru 1) je ciklirana dva puta kroz kolonu, i kolona je isprana sa 100 mL ekvilibracionog pufera (20 mM glicin HCl, pH 2,5). Kolona je eluirana sa 100 mM amonijum bikarbonata pH 8,7 i prikupljene su frakcije. Kako bi se očuvala maksimalna enzimska aktivnost, pH je smanjena na 4 odmah nakon skupljanja frakcija sa 2 M glicina HCl, pH 2,5. Aktivnost je potvrđena korišćenjem digestionog testa, i najaktivnije frakcije su spojene i koncentrovane na približno 80x, na osnovu originalne zapremine tečnosti.

Primer 7

Rekombinantni nepentezin I

[0119] Gen za nepentezin I (videti sekvencioni identifikacioni broj: 1; kodira aminokiselinske ostatke 20- 413, iz N. gracilis, bez biljne signalne sekvence) je pripreman iz nepentezin I cDNK, i postavljen između Ndel i Hindlll restrikcionih potožaja. Ova sekvenca je ktonirana u pET21a, korišćenjem T4 DNK tigaze (1 U) (New England Bio, NEB), T4 DNK ligaznog pufera (NEB), ATP (0,5 mM) (NEB), 0,5 mg pET21a vektora i 2 mg nepentezin I cDNK. To je inkubirano na 18 °C tokom 4 sata. Ligaciona smeša (5 mL) je dodata u 200 mL NovaBlue competentnih ćelija i inkubirana na ledu tokom 15 minuta. Ćelije su transformisane toplotnim

1

šokom (45 sekundi na 42 °C a zatim odmah na led, sa 1 ml LB medijuma) i inkubirane tokom 1 sata na 37 °C, i obložene sa antibioticima (tetraciklin i ampicilin). Nakon potvrđivanja prisustva gena u nekoliko belih kolonija, izabrana je reprezentativna kolonija za maxiprep. Dobijen rekombinantni plazmid pET21a/R.Nepl je transformisan u E. coli C41 toplotnim šokom kao što je navedeno u prethodnom tekstu, za ekspresiju pod indukcijom pomoću IPTG. Ovde, ćelije su uzgajane do OD660od 0,6 i indukovane sa 0,1 mM IPTG tokom četiri sata na 37°C. Eksprimiran protein je otišao u inkluziona tela.

[0120] Inkluziona tela su izolovana kao što sledi. Ćelije su centrifugirane, dodat je pufer za lizu sukroze (25% saharoze, 50 mM TrisCl pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM NaN3i inhibitori proteaze), i ćelije su podvrgnute sa

četiri runde smrzavanja/otapanja i sonikaciji. Ovo je praćeno dodavanjem DNKse i RNKse tokom 30 minuta. inkubacija na sobnoj temperaturi. Preparat je centrifugiran (~15 minuta pri 5000 х g) kako bi se peletirala inkluziona tela i membranski fragmenti. Ovaj pelet je ponovo suspendovan u triton pufe ru (50 mMTrisClpH 7,4, 10 mM NaCl, 1 mM β-merkaptoetanol, 1 mM NaN3, 0,5% Triton Х100 inhibitori proteaze)

i sonikacija izvršena na ledu. To je još jednom centrifugirano, kako bi se peletirala inkluziona tela, i pelet je ispran dva puta na ledu (sa mešanjem i sonikacijom) u puferu bez tritona (50 mM TrisCl pH 7,4, 10 mM NaCl, 1 mM B-merkaptoetanol, 1 mM NaN3, inhibitori proteaze).

[0121] Proteinski pelet je nakon toga podvrgnut ponovnom preklapanju. Jedan g inkluzionih tela je suspendovan u 1 L 50 mM CAPS pH 10,5, 8 M ureje, 1 mM EDTA, 1 mM glicina, 500 mM NaCl, 300 mM B-merkaptoetanola i mućkan tokom 1 sata. Suspenzija je dijalizovana od 50 mM tris, pH 11, dva puta po 1 sat, a zatim jedan dan dijalize od 50 mM tris, pH 7,5, i konačno, dijalizovana od fosfatnog pufera sa 300 mM NaCl, pH 7,0.

[0122] Rastvor je centrifugiran pri visokoj brzini (10000 х g tokom 15 minuta) kako bi se uklonio bilo kakav unrefolded protein, i supernatant filtriran kroz .22 mm membranu. Nepentezin I je aktiviran pri pH 2,5 (glicin-HCl) preko noći na 4 °C. Prinosi variraju od 10 do 100 mg preklopljenog, aktiviranog proteina, počevši od 1 L ćelijske kulture.

Primer 8

Rekombinantni nepentezin II

[0123] cDNK nepentezina II (iz N. gracilis, bez biljne signalne sekvence) je korišćena za pripremu nepentezin II cDNK. Ova sekvenca je klonirana u pET21a između Ndet i HindIII restrikcionih potožaja, korišćenjem T4 DNK ligaze (1 U) (New England Bio, NEB), T4 DNK ligaznog pufera (NEB), ATP (0,5 mM) (NEB), 0,5 mg pET21a vektora i 2 mg nepentezin II cDNK. To je inkubirano na 18 °C tokom 4 sata. Ligaciona smeša (5 mL) je dodata u 200 mL NovaBlue competentnih ćelija i inkubirana na ledu tokom 15 minuta. Ćelije su transformisane toplotnim šokom (45 sekundi na 42 °C, zatim momentalno na ledu, sa 1 ml LB medijuma) i inkubirane tokom 1 sata na 37 °C, i obložene sa antibioticima (tetraciklin i ampicilin). Nakon potvrđivanja prisustva gena u nekoliko belih kolonija, izabrana je reprezentativna kolonija za maxiprep. Dobijen rekombinantni plazmid pET21a/R.Nepl je transformisan u E. coli C41 toplotnim šokom kao što je navedeno u prethodnom tekstu, za ekspresiju pod indukcijom pomoću IPTG. Ovde, ćelije su uzgajane do OD660od 0,6 i indukovane sa 0,1 mM IPTG tokom četiri sata na 37°C. Eksprimiran protein je otišao u inkluziona tela.

[0124] Inkluziona tela su izolovana kao što sledi. Ćelije su centrifugirane, dodat je pufer lize sukroze (25% saharoze, 50 mM trisClpH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM NaN3i inhibitori proteaze), i ćelije su podvrgnute sa 4 runde smrzavanja/otapanja i sonikaciji. To je praćeno sa dodavanjem DNKse i RNKse tokom 30 minuta. inkubacija na sobnoj temperaturi. Preparat je centrifugiran (~15 minuta na 5000 х g) kako bi se peletirala inkluziona tela i membranski fragmenti. Pelet je ponovo suspendovan u triton puferu (50 mM trisClpH 7,4, 10 mM NaCl, 1 mM B-merkaptoetanol, 1 mM NaN3, 0,5% triton Х100 inhibitori proteaze) i sonikacija je izvršena na ledu. To je još jednom centrifugirano, kako bi peletirala inkluziona tela, i pelet je ispran dva puta na ledu (sa mešanjem i sonikacijom) u puferu bez tritona (50 mM trisCl pH 7,4, 10 mM NaCl, 1 mM β- merkaptoetanol, 1 mM NaN3, inhibitori proteaze).

[0125] Proteinski pelet je zatim podvrgnut ponovnom preklapanju. Jedan g inkluzionih tela je suspendovan u 1L 50 mM CAPS pH 10,5, 8 M ureje, 1 mM EDTA, 1 mM glicina, 500 mM NaCl, 300 mM β- merkaptoetanola i mućkan tokom 1 sata. Suspenzija je dijalizovana od 50 mM tris pH 11 dva puta tokom 1 sata, a zatim jedan dan dijalize od 50 mM tris pH 7,5, i konačno, dijaliza od fosfatnog pufera sa 300 mM NaCl, pH 7,0.

[0126] Rastvor je centrifugiran pri velikoj brzini (10000 х g for 15 minuta) kako bi se uklonio bilo koji un- refolded protein, i supernatant je filtriran kroz .22 mm membranu. Nepentezin II je aktiviran pri pH 2,5 (glicin-HCl) preko noći na 4 °C. Prinosi variraju od 10 do 100 mg preklopljenog, aktiviranog proteina,

2

počevši od 1 L ćelijske kulture.

Primer 9

Mapiranje digestije gliadina nepentezinom

[0127] Ekstrakt nepentezina je pripreman kao što je opisano u primeru 1. Prečišćen ekstrakt nepentezina je pripreman kao što je opisano u primeru 6. Rekombinantni nepentezin I je pripreman kao što je opisano u primeru 7.

[0128] Digestija gliadina je izvršena kao što je opisano u primeru 5, izuzev što je odnos supstrat:enzim bio približno 1000:1. Gliadin je digestiran na 37 °C tokom 2 sata sa ekstraktom nepentezina, prečišćenim ekstraktom nepentezina ili rekombinantnim nepentezinom I.

[0129] Gliadin je klasa proteina koja se nalazi u pšenici i drugim i ostalim žitaricama. Gliadini su visoko obogaćeni prolinskim i glutaminskim ostacima. Utvrdili smo da rekombinantni nepentezin I digestira gliadinski protein veoma efikasno pri pH 2-3. Pl preferenca cepanja rekombinantnog nepentezina i je veoma slična onoj od koncentrovanog ekstrakta fluida, kao i prečišćenoj frakciji ekstrakta (slika 8A). Iznenađujuće, ekstrakt je prikazao veću preferencu za glutamin nego za prečišćeni ekstrakt ili rekombinantni nepentezin I.

[0130] Pl preferenca cepanja rekombinantnog nepentezina I je veoma slična onoj od koncentrovanog ekstrakta fiuida, kao i prečišćenoj frakciji ekstrakta (slika 8B). Iznenađujuće, ekstrakt je prikazao veću preferencu za prolin nego za prečišćen ekstrakt ili rekombinantni nepentezin I.

[0131] Ekstrakt sadrži i nepentezin I i nepentezin II, ali strategija prečišćavanja obnavlja daleko manje aktivan nepentezin II u odnosu na nepentezin I. Bez vezivanja za bilo koju teoriju, veruje se da je pojačano cepanje ekstraktom na Р1 glutaminskoj poziciji i Р1’ prolinskoj poziciji usled nepentezina II i/ili sinergije između nepentezina I i nepentezina II.

Primer 10

Poređenje nepentezinskih proteina

[0132] Proteinske sekvence poznatih i putativnih nepentezinskih proteina su poravnate korišćenjem Clustal 2.1 Multiple Sequence Alignment. Sekvence nepentezina I su bile: Nepenthes mirabilis (GenBank Accession No. AFV26024), Nepenthes gracilis (GenBank Accession No. BAD07474), Nepenthes alata (GenBank Accession No. BAF98915), Zea mays (NCBI Reference Sequence: NP_001150925) i Oryza sativa (GenBank Accession No. BAD38020). Sekvence nepentezina II su bile: Nepenthes mirabilis (GenBank Accession No. AFV26025), Nepenthes gracilis (GenBank Accession No. BAD07475),Zea mays (NCBI Reference Sequence: NP_001149229) i Оrуzа sativa (GenBank Accession No. BAD82000). Dobijeno poravnavanje je prikazano na slici 9. Slika 10 prikazuje filogenetsko stablo koje ukazuje na srodnost proteina nepentezina između različitih vrsta. Tabela 1 prikazuje rezultate poravnavanja u parovima između svake sekvence.

[0133] Podaci kao što je navedeno u gornjim primerima pokazuju da nepentezin, bilo kao smeša ili njegov prečišćen ili rekombinantni sastojak, efikasno digestira gluten, dok pepsin ne. Shodno tome, ovo otkriće obezbeđuje metod koji omogućava digestiju glutena u proteinu koji sadrži gluten korišćenjem mešavine nepentezina ili njegovih prečišenih ili rekombinantnih komponenti.

2

�

�

�

�

�

�

�

�

Claims (11)

Patentni zahtevi

1. Kompozicija za upotrebu u lečenju ili inhibiranju glutenske intolerancije pri čemu navedena kompozicija sadrži rekombinantni nepentezin odabran od rekombinantnog nepentezina I, rekombinantnog nepentezina II, njihove soli, ili bilo koje njihove kombinacije.

2. Kompozicija za upotrebu patentnog zahteva 1, pri čemu navedeni rekombinantni nepentezin je administriran u dozama od 0.001 do 1000 mg/kg telesne mase po danu.

3. Kompozicija za upotrebu patentnog zahteva 1 ili patentnog zahteva 2, pri čemu je navedeni rekombinantni nepentezin administriran u dozama od 0.001, 0.01, 0.1, 1, 5, 10, 50, 100, 500 ili 1000 mg/kg telesne mase po danu.

4. Kompozicija za upotrebu bilo kojeg od patentnih zahteva od 1 do 3, koja je administrirana sa drugim agensom odabranim od: inhibitora tkivne transglutaminaze, anti-inflamatornog agensa, leukotrienskog receptora antagonista, СОХ-2 inhibitora, p38 MAP inhibitora kinaze, agensa za stabilizaciju mastocita, antiulcernog agensa, antialergijskog agensa, inhibitora transglutaminaze 2 (TG2), anti-TNF-a agensa i antibiotika.

5. Kompozicija za upotrebu bilo kojeg od patentnih zahteva od 1 do 3, koja je administrirana sa drugim enzimom odabranim od gastrične proteaze, aspartične proteaze, i prolil endopeptidaze, dipeptidil peptidaze IV (DPP IV), dipeptidil karboksipeptidaze (DCP) i cistein proteinaze B.

6. Kompozicija za upotrebu bilo kojeg od patentnih zahteva od 1 do 5, pri čemu navedena glutenska intolerancija dovodi do celijačne bolesti, alergije na pšenicu, glutenske senzitivnosti, i/ili herpetiformnog dermatitisa.

7. Kompozicija za upotrebu bilo kojeg od patentnih zahteva od 1 do 6, pri čemu je rekombinantni nepentezin mešavina rekombinantnog nepentezina I i nepentezina II.

8. Kompozicija za upotrebu bilo kojeg od patentnih zahteva od 1 do 6, pri čemu rekombinantni nepentezin je rekombinantni nepentezin I.

9. Kompozicija za upotrebu bilo kojeg od patentnih zahteva od 1 do 6, pri čemu rekombinantni nepentezin je rekombinantni nepentezin II.

10. Kompozicija za upotrebu bilo kojeg od patentnih zahteva od 1 do 9, pri čemu je administracija navedene kompozicije putem oralne administracije.

11. Kompozicija za upotrebu patentnog zahteva 10, pri čemu navedena kompozicija je administrirana pre ingestije hrane koja sadrži gluten ili za koju se sumnja da sadrži gluten; sa ingestijom hrane koja sadrži gluten ili za koju se sumnja da sadrži gluten; ili nakon ingestije hrane koja sadrži gluten ili za koju se sumnja da sadrži gluten.