RS61173B1

RS61173B1 - Imunogeni wt-1 peptidi i postupci za njihovu upotrebu

Info

Publication number: RS61173B1
Application number: RS20201426A
Authority: RS
Inventors: David A Scheinberg; Tao Dao
Original assignee: Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Priority date: 2013-01-15
Filing date: 2014-01-15
Publication date: 2021-01-29
Also published as: CN116789792A; LT2945647T; CN105377291B; CN110078813B; EP2945647B1; CA3274561A1; CN105377291A; AU2023201564A1; EP2945647A2; SI2945647T1; HUE052541T2; SMT202000677T1; AU2018241209A1; US20150352201A1; ES2832546T3; AU2018241209B2; JP2016506907A; CY1123563T1; JP2021040663A; CA2898099C

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Ovaj pronalazak obezbeđuje peptide, supstance i vakcine koje obuhvataju iste, i njihovu upotrebu u lečenju, smanjenju učestalosti, i indukovanju odgovora imunog sistema na WT1 eksprimujući kancer.

STANJE TEHNIKE

[0002] Vilmsov (Wilms) tumor (WT), pedijatrijski nefroblastom koji se javlja sa učestalošću od 1 na 10.000 novorođenčadi, je predmet intenzivnog kliničkog i osnovnog istraživanja tokom nekoliko godina. Tumor je embrionskog porekla, detektuje se kod dece obično tokom prvih 5 godina života i može da se javi jednostrano ili dvostrano. WT se javlja kada kondenzovane metanefričke mezenhimne ćelije bubrega u razvoju ne uspeju da se propisno diferenciraju. Implikacija tumor supresornog gena Vilmsovog (Wilms) tumora 1 (WT1) u etiologiji Vilmsovog (Wilms) tumora (WT) je prikazala uticaj koji genetičke promene mogu imati i na razvoj i na tumorigenezu.

[0003] Protein Vilmsovog (Wilms) tumora (WT1) je faktor transkripcije cinkovog prsta eksprimovan tokom normalne ontogeneze kao što je za bubreg, testis i jajnik fetusa. Kod odraslih, WTI ekspresija je ograničena na niske nivoe na hematopoezne matične ćelije, mioepitelne progenitorske ćelije, renalne podocite i neke ćelije u testisima i jajnicima. Nedavno je pokazano da je WTI (protein Vilmsovog (Wilms) tumora (WT1)) prekomerno eksprimovan kod nekoliko tipova leukemije što ukazuje da bi WTI (protein Vilmsovog (Wilms) tumora (WT1)) bio privlačan cilj za imunoterapiju za različite kancere.

[0004] Onkogeni protein Vilmsovog (Wilms’) tumora (WT1) je privlačan cilj za imunoterapiju za leukemije i širok opseg kancera. Peptidi izvedeni iz proteina Vilmsovog (Wilms) tumora (WT1)) su identifikovani da indukuju na HLA-A0201 ograničene citotoksične CD8 T ćelije, koje su sposobne za ubijanje ćelija tumora. Dva peptida koja se vezuju na HLA-A0201 (RMFPNAPYL; SEK ID BR:56) ili HLA- A2402 (CMTWNQMNL; SEK ID BR:57) se detaljno proučavaju širom sveta i obuhvaćena su kliničkim ispitivanjima kod pacijenata sa leukemijom i drugim čvrstim tumorima (Oka et al., Scientific World Journal 2007; 7: 649665; Mundlos et al. Development 1993;119:1329-41; Keilholz et al. Leukemia 2005; 19: 1318-1323). Ovi rezultati ohrabruju i obezbeđuju jak dokaz i obrazloženje za terapijsko ciljanje WT1-izvedenih epitopa T ćelije za leukemije i širok opseg humanih kancera.

[0005] Terapijska primena gornja dva iz WT1 izvedena peptida je ograničena na ljude koji su HLA-A0201, haplotip humanog leukocitnog antigena (HLA) koji je pronađen kod oko 40% kavkaskih i HLA-A2402, haplotip pronađen kod oko 40% japanskih i drugih stanovnika Azije. Zbog toga, ostaje neispunjena potreba za WT1 izvedenim peptidima koji mogu biti korišćeni za najveći broj stanovnika u svetu. Da bi se proširila terapijska primena na širi opseg stanovnika, poželjni su novi peptidi izvedeni iz WT1 proteina koji se vezuju na više HLA haplotipova. Takvi peptidi će samim tim biti sposobni da stimulišu T ćelije iz većeg procenta ciljane populacije, koji omogućava strategiju vakcine koja će da se odnosi na veći segment populacije, sa trajnim ćelijama sa citotoksičnom memorijom.

[0006] WO 2007/120673 opisuje imunogene WT-1 peptide, imunogene supstance i vakcine koje obuhvataju peptide, i postupke za lečenje, smanjenje učestalosti, i indukovanje odgovora imunog sistema kod WT1 eksprimujućeg kancera, korišćenjem peptida i supstanci.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0007] Ova primena opisuje peptide, supstance, i imunogene supstance kao što su vakcine koje obuhvataju imunogene peptide, i postupke lečenja, redukovanja i učestalosti, i indukovanja odgovora imunog sistema kod WT1 eksprimujućeg kancera, obuhvata isporuku imunogenih peptida, ili stimulisanje T ćelija izvan humanog pacijenta koje mogu zatim da budu infuzionisane u pacijenta za lečenje.

[0008] U jednom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje izolovani peptid koji obuhvata sekvencu aminokiseline (AA) izabranu iz SEK ID BR: 6, 14, 15, 16, 17 i 22. U jednom izvođenju, izolovani peptid se vezuje na molekul HLA klase I i peptid molekula HLA klase II. U jednom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje izolovani preptid vezivanja HLA klase I koji ima sekvencu SEK ID BR:6. U jednom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje izolovani WT1 peptid vezivanja HLA klase II koji obuhvata sekvencu aminokiseline (AA) izabranu iz SEK ID BR: 14, 15, 16 i 17. Ovi peptidi se mogu pominjati kao peptidi iz ovog pronalaska.

[0009] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje molekul nukleinske kiseline koji kodira peptid iz ovog pronalaska. Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje vektor, kao što je ublaženi virusni vektor ili Salmonella typhi vektor, koji obuhvata molekul nukleinske kiseline. Vektor može još da kodira bilo koji od interleukina 1 do 15, interferon alfa, beta ili gama, faktor nekroze tumora, faktor stimulacije granulocitne-makrofag kolonije (GM-CSF), faktor stimulacije kolonije makrofaga (M-CSF), faktor stimulacije kolonije granulocita (G-CSF), protein koji aktivira neutrofil (NAP), faktor hemoatrakcije i aktivacije makrofaga (MCAF), RANTES, makrofagni inflamatorni peptidi MIP-Ia ili MIP-Ib, komplementarna komponenta, ili njihove kombinacije.

[0010] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku supstancu koja obuhvata peptid iz ovog pronalaska, ili molekul nukleinske kiseline koji kodira peptid, ili vektor koji obuhvata molekul nukleinske kiseline, ili farmaceutski prihvatljiv nosač, pomoćno sredstvo ili ekscipijent.

[0011] U još jednom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje vakcinu koja obuhvata jedan ili više peptida iz ovog pronalaska, i opciono ćeliju kod koje je prisutan antigen (APC) i/ili adjuvans, razblaživač ili nosač i/ili najmanje jedan dodatni iz WT1 izveden peptid. U jednom izvođenju, ađuvans je QS21, Frojndov (Freund’s) nepotpuni adjuvans, aluminijum fosfat, aluminijum hidroksid, BCG, alauni, faktor rasta, citokin, hemokin, interleukin, Montanid ISA 51, ili GM-CSF.

[0012] U još jednom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku supstancu ili vakcinu iz ovog pronalaska za upotrebu za lečenje kod subjekta kod koga postoji WT1 eksprimujući kancer ili smanjenje učestalosti WT1 eksprimujućeg kancera, ili relapsa.

[0013] U još jednom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje supstancu koja obuhvata (a) ćeliju u kojoj je prisutan antigen (APC) i (b) peptide iz ovog pronalaska, molekul nukleinske kiseline koji kodira peptid, ili vektor koji obuhvata molekul nukleinske kiseline.

[0014] U još jednom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje upotrebu peptida ili vakcine ili supstance iz ovog pronalaska, ili molekul nukleinske kiseline koji kodira peptid, ili vektor koji obuhvata molekul nukleinske kiseline, za indukovanje in vitro formiranje i proliferaciju citotoksičnih T limfocita (CTL) specifičnih za ćelije WT1 eksprimujućeg kancera.

[0015] U jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer jeste leukemija, dezmoplastični tumor male okrugle ćelije, kancer želuca, kancer debelog creva, kancer pluća, kancer dojke, tumor ćelije klice, kancer jajnika, kancer materice, kancer tireoidne žlezde, kancer jetre, kancer bubrega, Kapošijev sarkom, sarkom, hepatoćelijski karcinom, Vilmsov (Wilms’) tumor, akutna mijelogena leukemija (AML), mijelodisplazni sindrom (MDS), ili nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC). U jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je mezoteliom.

KRATAK OPIS SLIKA NACRTA

[0016] Na ovde prikazanim slikama, niz traka grupisanih podataka na grafikonima za svaki peptid su predstavljene istim redosledom s leve nadesno kao što je prikazano na legendi na slici odozgo nadole.

Slika 1 pokazuje rezultate T2 stabilizacionog ogleda koji pokazuje da je vezivanje NLMNLGATL peptida na HLA-A2 molekul jače od NQMNLGATL i NYMNLGATL peptida. Prirodni NQMNLGATL, heteroklitički NLMNLGATL

ili NYMNLGATL je pulsiran na T2 ćelije na naznačenim koncentracijama kao što je opisano u Materijalima i postupcima. Stabilizacija HLA-A2 molekula peptidima je izmerena ekspresijom HLA-A2 molekula;

Slika 2 A-B pokazuje da NLMNLGATL peptid indukuje jak za peptid specifičan odgovor T ćelije koji unakrsno reaguje sa svojom prirodnom sekvencom NQMNLGATL. Za svaki peptid, trake predstavljaju, s leva nadesno, CD14, prirodni peptid,

NLMNLGATL i PSMA, prema opisanom redosledu. CD3 T ćelije od zdravog HLA-A0201 homozigotnog donora je stimulisana sa bilo NQM ili NLMNLGATL peptid za 3 (A) ili 5 (B) cikluse. Odgovor specifičan za peptid je izmeren IFN-g izlučivanjem posle podsticanja sa pojedinačnim peptidom. Svaka tačka podataka predstavlja prosek /- SD trostrukih kultura;

Slika 3 pokazuje da NLMNLGATL peptid indukuje citotoksičnost T ćelija naspram WT1+HLA-A0201+ leukemija ćelija. T ćelije od HLA-A0201 pozitivnog donora su stimulisane sa NLMNLGATL peptidom tokom 5 ciklusa. Citotoksičnosti ćelija su izmerene ogledom 5hr-51Cr otpuštanja u odnosu na AML liniju ćelije SET-2 (WT1+, HLA-A0201+), HL-60 (WT1+, HLA-A0201-) ili primarne udare leukemije od HLA-A2 pozitivnog pacijenta. Svaka tačka podataka predstavlja prosek /- SD trostrukih kultura;

Slika 4 A-B pokazuje za peptid specifičan odgovor T ćelije kod HLA-A2402 donora. CD3 T ćelije od zdravog HLA-A2402 homozigotnog donora je stimulisana sa bilo NQMNLGATL, NLMNLGATL ili NYMNLGATL peptidima za 3 (A) ili 5 (B) ciklusa. Za svaki peptid, trake predstavljaju, s leva nadesno, CD14, prirodni peptid, NLMNLGATL, NYMNLGATL i irelevantan peptid, prema opisanom redosledu. Odgovor specifičan za peptid je izmeren IFN-g izlučivanjem posle podsticanja sa pojedinačnim peptidom.

Svaka tačka podataka predstavlja prosek /- SD trostrukih kultura;

Slika 5 A-B pokazuje HLA-DR.B1 za peptid specifične odgovore T ćelije. (A). CD3 T ćelije su stimulisane sa DR-het-1 ili DR-het-2 peptidom tokom 5 ciklusa i za epitop specifičan odgovor je izmeren pomoću IFN-g Elispot ogleda. Za svaki peptid, trake predstavljaju, s leva nadesno, CD14, prirodni peptid, NLMNLGATL, WT1-CMT, PSMA, DR-Nat-1/Nat-2, DR-het-1/het-2, B2A2L, BA25 i HL-60, prema opisanom redosledu. (B). CD3 T ćelije su stimulisane sa kratkim peptidima NQMNLGATL, NLMNLGATL i dugim peptidima DR-prirodni-1, DR-prirodni-2, DR-het-1 ili DR-het-2 peptid tokom 5 ciklusa i citotoksičnost je izmerena ogledom 51Cr otpuštanja, u odnosu na liniju ćelije leukemije BA-25 (HLA-A2+/A24+, WT1+) i kontrolne HL-60 ćelije. Svaka tačka podataka predstavlja prosek /- SD trostrukih kultura;

Slika 6 prikazuje CD3 T ćelije od HLA-B0702 pozitivnog donora su stimulisane sa 2 kompleta peptida (ukupno pet) tokom 5 puta in vitro. Odgovor specifičan za peptid je izmeren IFN gama ELISPOT ogledom, naspram pojedinačnog peptida; peptidi testiran s leva nadesno su SEK ID BR:34, 37, 38, 30 i 31; i za svaki peptid, trake predstavljaju, s leva nadesno, odgovore na CD14, prirodni-1 peptid, Het-1 na prirodni-1, Het-2 na prirodni-1, prirodni-2, Het-1 na prirodni-2 i kontrola, prema opisanom redosledu; i

Slika 7 prikazuje rezultate ELISPOT ogleda korišćenjem donora SA (5 stimulacija) tokom Het-1 (SEK ID BR:6) i Het-2 (SEK ID BR:7) A24 peptid, u poređenju sa prirodnom sekvencom (SEK ID BR:5). Za svaki peptid, trake predstavljaju, s leva nadesno, CD14, A24 prirodni peptid, A24-het-1, A24-het-2, A24-235, i PSMA, prema opisanom redosledu. Heteroklitički peptidi generišu unakrsno reaktivne odgovore.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0017] Ova prijava opisuje imunogene peptide, i supstance i vakcine koje obuhvataju imunogene peptide, i postupke lečenja, smanjenja učestalosti, i uvođenja odgovora imunog sistema u WT1 eksprimujući kancer, koji obuhvata isporuku jednog ili više imunogenih peptida.

[0018] Ova prijava opisuje sintetičke peptide i postupke lečenja, smanjenja učestalosti, i indukovanja odgovora imunog sistema u odnosu na WT1 eksprimujući kancer, koji obuhvataju imunogene peptide.

[0019] WT1 molekul iz kog se izvode peptidi iz ovog pronalaska ima, u drugom izvođenju sekvencu: SEK ID BR: 51:

[0020] Gore data sekvenca WT-1 proteina je ona koju su objavili Gessler et al. (Gessler M, Poustka A, Cavenee W, Neve RL, Orkin SH, Bruns GA. Homozigotno brisanje u Vilmsovim (Wilms) tumorima gena cinkovog prsta je identifikovano skakanjem hromozoma. Nature.1990;343(6260):774-778. Prethodno objavljeno 1990/02/22 kao DOI 10.1038/343774a0.) koja obuhvata 575 aminokiselina i uključuje prvih 126 aminokiselina na N terminusu kojih nema u (Exon 5+, KTS+) izoobliku WT-116.

[0021] U još jednom izvođenju, WT1 sekvenca je SEK ID BR: 52:

[0022] U još jednom izvođenju, molekul WT1 ima sekvencu: SEK ID BR: 53:

[0023] U još jednom izvođenju, molekul WT1 ima sekvencu: SEK ID BR: 54:

[0024] U još jednom izvođenju, WT1 protein ima sekvencu iznetu u GenBank, pristupni broj # NM_024426. Kod drugih izvođenja, WT1 protein ima ili obuhvata jednu od sekvenci iznetih u jednoj od sledećih unosa skevenci: NM_024425, NM_024424, NM_000378, S95530, D13624, D12496, D 12497, ili X77549. U drugom izvođenju, WT1 protein ima bilo koju drugu WT1 sekvencu poznatu u ovoj oblasti. Ova prijava opisuje peptide, supstance, i imunogene supstance kao što su vakcine koje obuhvataju imunogene peptide, i postupke lečenja, smanjenja učestalosti, i indukovanja odgovora imunog sistema kod WT1 eksprimujućeg kancera, koji obuhvata isporuku imunogenih peptida. U nekim slučajevima, peptidi opisani ovde su izvedeni iz peptida koji su prirodne sekvence WT1, i mogu se pomenuti ovde kao iz WT1 izvedeni peptidi ili kao WT1 peptid.

[0025] U jednom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje izolovani WT1 peptid koji obuhvata sekvencu aminokiseline (AA) izabranu iz NLMNLGATL (SEK ID BR: 6). U još jednom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje izolovani WT1 peptid koji obuhvata sekvencu aminokiseline izabranu iz CMTWNLMNLGATLKG (SEK ID BR:14, MTWNLMNLGATLKGV (SEK ID BR:15), TWNLMNLGATLKGVA (SEK ID BR:16), WNLMNLGATLKGVAA (SEK ID BR:17), i CMTWN- LMNLGATLKGVA (SEK ID BR:22). U jednom izvođenju, izolovani peptid se vezuje na molekul HLA klase I, molekul HLA klase II, ili njihovu kombinaciju. U jednom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje izolovani vezni WT1 peptid HLA klase I koji ima sekvencu aminokiseline NLMNLGATL (SEK ID BR:6). U jednom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje izolovani vezni WT1 peptid HLA klase II koji ima sekvencu aminokiseline izabranu iz CMT- WNLMNLGATLKG (SEK ID BR 14), MTWNLMNLGATLKGV (SEK ID BR:15), TWNLMNLGATLKGVA (SEK ID BR:16) i WNLMNLGATLKGVAA (SEK ID BR:17). Ovi peptidi se mogu pominjati kao peptidi iz ovog pronalaska.

[0026] U još jednom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje supstancu koja obuhvata (a) ćeliju u kojoj je prisutan antigen i (b) peptid iz ovog pronalaska.

[0027] U još jednom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje vakcinu koja obuhvata jedan ili više peptida iz ovog pronalaska.

[0028] U još jednom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje WT1 peptid ili vakcinu iz ovog pronalaska za upotrebu za lečenje subjekta sa WT1 eksprimujućim kancerom.

[0029] U još jednom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje WT1 peptid ili vakcinu iz ovog pronalaska za upotrebu u smanjenju učestalosti WT1 eksprimujućeg kancera, ili njegovog relapsa, kod nekog subjekta.

[0030] U još jednom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje imunogenu supstancu koja obuhvata WT1 peptid iz ovog pronalaska ili molekul nukleotida koji kodira WT1 peptid za upotrebu za indukovanje antikancernog odgovora imunog sistema kod nekog subjekta.

[0031] U još jednom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje imunogenu susptancu koja obuhvata WT1 peptid iz ovog pronalaska ili molekul nukleotida koji kodira WT1 peptid za upotrebu za lečenje subjekta sa WT1 eksprimujućim kancerom.

[0032] U još jednom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje imunogenu supstancu koja obuhvata WT1 peptid iz ovog pronalaska ili molekul nukleotida koji kodira WT1 peptid za upotrebu za smanjenje pojave WT1 eksprimujućeg kancera, ili relapsa tog kancera, kod nekog subjekta.

[0033] U jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je akutna mijelogena leukemija (AML). U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je povezan sa mijelodisplaznim sindromom (MDS). U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je MDS. U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC). U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je Vilmsov (WIlms') tumor. U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je leukemija. U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je hematološki kancer. U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je limfom. U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je dezmoplastični tumor male okrugle ćelije. U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je mezoteliom. U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je maligni mezoteliom. U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je kancer želuca. U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je kancer debelog creva. U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je kancer pluća. U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je kancer dojke. U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je tumor ćelije klice. U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je kancer jajnika. U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je kancer materice. U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je kancer tireoidne žlezde . U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je hepatocelularni karcinom. U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je kancer tireoidne žlezde (rak štitne žlezde). U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je kancer jetre. U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je kancer bubrega. U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je Kapošijev (Kaposi's) sarkom. U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je sarkom. U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je bilo koji drugi karcinom ili sarkom. U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je čvrsti tumor. U još jednom izvođenju, čvrsti tumor je povezan sa WT1 eksprimujućim kancerom. U još jednom izvođenju, čvrsti tumor je povezan sa mijelodisplaznim sindromom (MDS). U još jednom izvođenju, čvrsti tumor je povezan sa nesitnoćelijskim rakom pluća (NSCLC). U još jednom izvođenju, čvrsti tumor je povezan sa kancerom pluća. U još jednom izvođenju, čvrsti tumor je povezan sa kancerom dojke. U još jednom izvođenju, čvrsti tumor je povezan sa kolorektalnim kancerom. U još jednom izvođenju, čvrsti tumor je povezan sa kancerom prostate. U još jednom izvođenju, čvrsti tumor je povezan sa kancerom jajnika. U još jednom izvođenju, čvrsti tumor je povezan sa kancerom bubrega. U još jednom izvođenju, čvrsti tumor je povezan sa kancerom pankreasa. U još jednom izvođenju, čvrsti tumor je povezan sa kancerom mozga. U još jednom izvođenju, čvrsti tumor je povezan sa gastrointestinalnim kancerom. U još jednom izvođenju, čvrsti tumor je povezan sa kancerom kože. U još jednom izvođenju, čvrsti tumor je povezan sa melanomom.

[0035] U još jednom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje supstancu koja obuhvata izolovani peptid iz ovog pronalaska u kombinaciji sa najmanje 1 dodatnim iz WT1 izvedenim peptidom. U izvesnim izvođenjima, supstanca obuhvata najmanje 2 različita peptida obezbeđena. U izvesnim izvođenjima, supstanca obuhvata najmanje 3 ili najmanje 4 različita peptida obezbeđena. U izvesni izvođenjima, supstanca iz ovog pronalaska je vakcina.

[0036] U još jednom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje WT1 peptid ili supstancu iz ovog pronalaska za upotrebu za lečenje subjekta sa WT1 eksprimujućim kancerom.

[0037] U još jednom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje peptid ili supstancu iz ovog pronalaska za upotrebu u smanjenju učestalosti WT1 eksprimujućeg kancera, ili njegovog relapsa, kod nekog subjekta.

[0038] U još jednom izvođenju, ova prijava opisuje postupak uvođenja formiranja i umnožavanja za WT1 protein specifičnog citotoksičnog T limfocita (CTL), taj postupak obuhvata dovođenje u kontakt limfocitne populacije sa peptidom ili supstancom iz ovog pronalaska, pri čemu indukovanje formiranja i umnožavanja za WT1 protein specifičnog

1

citotoksičnost limfocita (CTL). Ovaj postupak je moguće izvesti in vitro, ex vivo ili in vivo. Kada se izvede in vitro ili ex vivo, ovi citotoksični T limfociti (CTL) mogu zatim da budu infuzirani u pacijenta radi terapijskog dejstva.

[0039] U još jednom izvođenju, ova prijava opisuje postupak indukovanja, formiranja i umnožavanja za WT1 protein specifičnog CD8<+>limfocita; ili (b) CD4<+>limfocit specifičan za WT1 protein, ili njihova kombinacija, taj postupak obuhvata dovođenje u kontakt limfocitne populacije sa peptidom ii supstancom iz ovog pronalaska, čime se indukuje formiranje i umnožavanje (a) za WT1 protein specifičan CD8+ limfocit; ili (b) CD4+ limfocit specifičan za WT1 protein; ili njegove kombinacije. Ovaj postupak je moguće izvesti in vitro, ex vivo ili in vivo. Kada se izvede in vitro ili ex vivo, ovi citotoksični T limfociti (CTL) mogu zatim da budu infuzirani u pacijenta radi terapijskog dejstva.

[0040] Dakle, ovaj pronalazak obezbeđuje upotrebu peptida ili molekula nukleinske kiseline ili vektora ili supstance iz ovog pronalaska za uvođenje in vitro formiranja i umnožavanja citotoksičnih T limfocita (CTL) specifičnog za ćelije WT1 eksprimujućeg kancera.

[0041] "Peptid," u još jednom izvođenju postupaka i supstanci iz ovog pronalaska se odnosi na jedinjenje podjedinice aminokiselina (AA) spojene peptidnim vezama. U još jednom izvođenju, peptid obuhvata analog aminokiselina (AA). U još jednom izvođenju, peptid obuhvata peptidomimetik. Različiti analozi aminokiselina (AA)i peptidomimetici koje je moguće uključiti u peptide iz postupaka i supstanci iz ovog pronalaska su navedeni ovde dole u tekstu. Podjedinice su, u drugom izvođenju, povezane peptidnim vezama. U još jednom izvođenju, podjedinica je spojena drugim tipom veze, npr. estrom, etrom, itd.

[0042] Nepromenjeni peptidi iz ovog pronalaska (kao što je opisano i gore i dole u ovom tekstu) se pominju kolektivno ovde kao "WT1 peptidi." Svako od izvođenja pobrojanih dole u tekstu za "WT1 peptide" se odnosi na nepromenjene WT1 peptide i humani leukocitni antigen (HLA) klase I i klase II heteroklitičkih peptida iz ovog pronalaska.

[0043] U jednom drugom izvođenju, WT1 peptid iz ovog pronalaska se vezuje na molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) klase ili molekul klase II. U jednom drugom izvođenju peptid se vezuje i na molekul klase I i na molekul klase II. U jednom drugom izvođenju, molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II jeste HLA-DRB molekul. U jednom drugom izvođenju, molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I1 jeste HLA-DRA molekul. U još jednom izvođenju, molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) je HLA-DQA1 molekul. U još jednom izvođenju, molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) je HLA-DQB1 molekul. U još jednom izvođenju, molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) je HLA-DPA1 molekul. U još jednom izvođenju, molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) je HLA-DPB 1 molekul. U još jednom izvođenju, molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) je HLA-DMA molekul. U još jednom izvođenju, molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) je HLA- DMB molekul. U još jednom izvođenju, molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) je HLA-DOA molekul. U još jednom izvođenju, molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) je HLA-DOB molekul. U jednom drugom izvođenju, molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) je bilo koji drugi molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I1 poznat u ovoj oblasti.

[0044] U jednom drugom izvođenju, molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I čiji je motiv vezivanja sadržan u, ili obuhvata peptid iz ovog pronalaska, u jednom drugom izvođenju, jeste HLA-A molekul. U jednom drugom izvođenju, molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I jeste HLA-B molekul. U jednom drugom izvođenju, molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I jeste HLA-C molekul. U jednom drugom izvođenju, molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I jeste HLA-A0201 molekul. U jednom drugom izvođenju, molekul je HLA A1. U još jednom izvođenju, molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I je HLA A2. U još jednom izvođenju, molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I je HLA A2.1. U još jednom izvođenju, molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I je HLA A3. U još jednom izvođenju, molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I je HLA A3.2. U još jednom izvođenju, molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I je HLA A11. U još jednom izvođenju, molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I je HLA A24. U još jednom izvođenju, molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I je HLA B7. U još jednom izvođenju, molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I je HLA B27. U još jednom izvođenju, molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I je HLA B8.

[0045] U jednom drugom izvođenju, molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I koji vezuje iz WT1 izveden peptid iz ovog pronalaska se vezuje na superfamiliju molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I. U još jednom izvođenju, superfamilija je A2 superfamilija. U još jednom izvođenju, superfamilija je A3 superfamilija. U još jednom izvođenju, superfamilija je A24 superfamilija. U još jednom izvođenju, superfamilija je B7 superfamilija. U još jednom izvođenju, superfamilija je B27 superfamilija. U još jednom izvođenju, superfamilija je B44 superfamilija. U još jednom izvođenju, superfamilija je C1 superfamilija. U još jednom izvođenju, superfamilija je C4 superfamilija. U još jednom izvođenju, superfamilija je bilo koja druga superfamilija poznata u ovoj oblasti.

[0046] U jednom drugom izvođenju, HLA molekul je A0101, A0201, A0203, A2402, A6901, B0702, A3101, B3501, B3503, B3508, B3802, B3801, B3901, B4001, B4402, B4701, B5701, C0401, C1701, DRB10101, DRB10402, DRB10402, DRB10401 ili DRB11104 molekul. U jednom drugom izvođenju, peptidi iz ovog pronalaska se vezuju na molekule humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I ili klase II opisane za svaki peptid u Tabelama dole u tekstu. U jednom izvođenju, izvesni peptidi mogu da se vežu na više od jednog alela humanog leukocitnog antigena (HLA).

[0047] U jednom drugom izvođenju, WT1 peptid iz postupaka i supstanci iz ovog pronalaska je tako projektovan da ispoljava afinitet za molekul humanog leukocitnog antigena (HLA). U još jednom izvođenju, afinitet je visoki afinitet, kao što je opisano ovde u tekstu.

[0048] Molekuli humanog leukocitnog antigena (HLA), poznati u drugom izvođenju kao molekuli glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC), ili tkivne podudarnosti, vezuju peptide i predstavljaju ih ćelijama imunog sistema. Dakle, u jednom drugom izvođenju, imunogenost peptida je delimično određena njegovim afintietom za molekule humanog leukocitnog antigena (HLA). Molekuli humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I reaguju sa CD8 molekulima, koji su generalno prisutni na citotoksičnim T limfocitima (CTL). Molekuli humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II su u interakciji sa CD4 molekulima, koji su generalno prisutni na pomoćnim T limfocitima.

[0049] U jednom drugom izvođenju, peptid iz ovog pronalaska je imunogeni. U jednom drugom izvođenju, "imunogeni" se odnosi na sposobnost da stimuliše, podstakne ili učestvuje u odgovoru imunog sistema. U jednom drugom izvođenju, podstaknuti odgovor imunog sistema je ćelijom posredovan odgovor imunog sistema. U jednom drugom izvođenju, odgovor imunog sistema je kombinacija odgovora posredovanog ćelijom i humoralnog odgovora.

[0050] U jednom drugom izvođenju, T ćelije koje se vezuju na glavni kompleks histokompatibilnosti (MHC) molekul-peptida se aktiviraju i indukuju tako da umnožavaju i liziraju ćelije koje eksprimuju protein koji obuhvata peptid. T ćelije se obično početno aktiviraju pomoću "profesionalnih" antigen prezentujućih ćelija (APC) ("APC"; kao što su npr. dendritske ćelije, monocite, i makrofage), koje predstavljaju kostimulatorne molekule koji ohrabruju aktivaciju T ćelije nasuprot anergiji ili apoptozi. U jednom drugom izvođenju, odgovor je heteroklitički, kao što je ove opisano, tako da citotoksični T limfocit (CTL) lizuje neoplastičnu ćeliju koja eksprimuje protein koji ima sekvencu aminokiselina (AA) homolognu na peptid iz ovog pronalaska, ili drugačiji peptid od onog koji je korišćen da prvo stimuliše T ćeliju.

[0051] U jednom drugom izvođenju, susret T ćelije sa peptidom iz ovog pronalaska

1

indukuje diferencijaciju u efektoru i/Ili memoriji T ćelije. Naknadni susreti između efektora ili memorije T ćelije i istog peptida, ili, u drugom izvođenju, sa srodnim peptidom iz ovog pronalaska, dovode do bržeg i intenzivnijeg odgovora imunog sistema. Takvi odgovori se kalibriraju, u drugom izvođenju, merenjem stepena umnožavanja populacije T ćelije izložene tom peptidu. U jednom drugom izvođenju, takvi odgovori se kalibriraju bilo kojim od ovde u tekstu pobrojanih postupaka.

[0052] U još jednom izvođenju, peptidi iz ovog pronalaska se vezuju na molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II sa visokim afinitetom. U drugim izvođenjima, molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II je bilo koji ovde pobrojan molekul humanog leukocitnog antigena (HLA)klase II.

[0053] U još jednom izvođenju, derivati peptida iz ovog pronalaska se vezuju na molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I sa visokim afinitetom. U drugim izvođenjima, molekul glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) klase I je bilo koji ovde pobrojan molekul glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) klase I.

[0054] U jednom drugom izvođenju, peptid iz ovog pronalaska vezuje molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II sa značajnim afinitetom, dok peptid izveden iz originalnog peptida vezuje molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I sa značajnim afinitetom.

[0055] U jednom drugom izvođenju, "afinitet" se odnosi na koncentraciju peptida neophodnu za inhibiranje vezivanja standardnog peptida na naznačeni molekul glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) i to za 50%. U jednom drugom izvođenju, "visok afinitet" se odnosi na afinitet jeste takav da je koncentracija od oko 500 nanomolara (nM) ili manje tog peptida neophodna za 50% inhibicije vezivanja standardnog peptida. U jednom drugom izvođenju, neophodna je koncentracija od oko 400 nM ili manje tog peptida. U jednom drugom izvođenju, afinitet vezivanja je 300 nM. U jednom drugom izvođenju, afinitet vezivanja je 200 nM. U jednom drugom izvođenju, afinitet vezivanja je 150 nM. U jednom drugom izvođenju, afinitet vezivanja je 100 nM. U jednom drugom izvođenju, afinitet vezivanja je 80 nM. U jednom drugom izvođenju, afinitet vezivanja je 60 nM. U jednom drugom izvođenju, afinitet vezivanja je 40 nM. U jednom drugom izvođenju, afinitet vezivanja je 30 nM. U jednom drugom izvođenju, afinitet vezivanja je 20 nM. U jednom drugom izvođenju, afinitet vezivanja je 15 nM. U jednom drugom izvođenju, afinitet vezivanja je 10 nM. U jednom drugom izvođenju, afinitet vezivanja je 8 nM. U jednom drugom izvođenju, afinitet vezivanja je 6 nM. U jednom drugom izvođenju, afinitet vezivanja je 4 nM. U jednom drugom izvođenju, afinitet vezivanja je 3 nM. U jednom drugom izvođenju, afinitet vezivanja je 2 nM. U jednom drugom izvođenju, afinitet vezivanja je 1,5 nM. U jednom drugom izvođenju, afinitet vezivanja je 1 nM. U jednom drugom izvođenju, afinitet vezivanja je 0,8 nM. U jednom drugom izvođenju, afinitet vezivanja je 0,6 nM. U jednom drugom izvođenju, afinitet vezivanja je 0,5 nM. U jednom drugom izvođenju, afinitet vezivanja je 0,4 nM. U jednom drugom izvođenju, afinitet vezivanja je 0,3 nM. U jednom drugom izvođenju, afinitet vezivanja je manji od 0,3 nM.

[0056] U jednom drugom izvođenju, "afinitet" se odnosi na meru jačine vezivanja na molekul glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC). U jednom drugom izvođenju, afinitet se meri korišćenjem postupka poznatog u ovoj oblasti da se izmere konkurentni afiniteti vezivanja. U jednom drugom izvođenju, afinitet se meri korišćenjem postupka poznatog u ovoj oblasti da se izmere relativni afiniteti vezivanja. U drugom izvođenju, postupak je ogled konkurentnog vezivanja. U drugom izvođenju, postupak je radioimunotest ili RIA. U jednom drugom izvođenju, taj postupak su analize BiaCore. U jednom drugom izvođenju, taj postupak je bilo koji drugi postupak poznat u ovoj oblasti. U jednom drugom izvođenju, taj postupak daje kao prinos IC50 u vezi sa IC50 referentnog peptida poznatog afiniteta.

[0057] U jednom drugom izvođenju, "visok afinitet" se odnosi na IC50 od 0,5-500 nM. U jednom drugom izvođenju, IC50 je 1-300 nM. U jednom drugom izvođenju, IC50 je 1,5-200 nM. U jednom drugom izvođenju, IC50 je 2-100 nM. U jednom drugom izvođenju, IC50 je 3-100 nM. U jednom drugom izvođenju, IC50 je 4-100 nM. U jednom drugom izvođenju, IC50 je 6-100 nM. U jednom drugom izvođenju, IC50 je 10-100 nM. U jednom drugom izvođenju, IC50 je 30-100 nM. U jednom drugom izvođenju, IC50 je 3-80 nM. U jednom drugom izvođenju, IC50 je 4-60 nM. U jednom drugom izvođenju, IC50 je 5-50 nM. U jednom drugom izvođenju, IC50 je 6-50 nM. U jednom drugom izvođenju, IC50 je 8-50 nM. U jednom drugom izvođenju, IC50 je 10-50 nM. U jednom drugom izvođenju, IC50 je 20-50 nM. U jednom drugom izvođenju, IC50 je 6-40 nM. U jednom drugom izvođenju, IC50 je 8-30 nM. U jednom drugom izvođenju, IC50 je 10-25 nM. U jednom drugom izvođenju, IC50 je 15-25 nM.

[0058] U jednom drugom izvođenju, peptid iz ovog pronalaska se vezuje na superfamiliju molekula humanog leukocitnog antigena (HLA). Superfamilije molekula humanog leukocitnog antigena (HLA) dele veoma slične ili identične motive (šablone) vezivanja. U jednom drugom izvođenju, superfamilija jeste superfamilija humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I. U jednom drugom izvođenju, superfamilija jeste superfamilija humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II.

[0059] Pojmovi "peptid vezivanja humanog leukocitnog antigena (HLA)," "peptid vezivanja molekula humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I," i "peptid vezivanja

1

molekula humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II" se odnose, u jednom drugom izvođenju, na peptid koji vezuje molekul humanog leukocitnog antigena (HLA )sa merljivim afinitetom. U jednom drugom izvođenju, pojmovi se odnose na peptid koji vezuje molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) sa visokim afinitetom. U jednom drugom izvođenju, pojmovi se odnose na peptid koji vezuje molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) sa dovoljnim afinitetom da se aktivira prekursor T ćelije. U jednom drugom izvođenju, pojmovi se odnose na peptid koji vezuje molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) sa dovoljnim afinitetom da posreduje prepoznavanje pomoću T ćelije. Molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) je, u drugim izvođenjima, bilo koji od ovde pobrojanih molekula humanog leukocitnog antigena (HLA).

[0060] "Heteroklitični" se odnosi, u nekom drugom izvođenju, na peptid koji generiše odgovor imunog sistema koji prepoznaje originalni peptid iz kog je izveden heteroklitički peptid (npr. peptid koji ne sadrži ostatak sidra ili druge mutacije ostatka). U nekom drugom izvođenju, "originalni peptid" se odnosi na peptid iz ovog pronalaska. U jednom drugom izvođenju, "heteroklitički" se odnosi na peptid koji generiše odgovor imunog sistema koji prepoznaje originalni peptid iz kog je izveden heteroklitički peptid, pri čemu je odgovor imunog sistema generisan vakcinacijom sa heteroklitičkim peptidom veći od odgovora imunog sistema generisanog vakcinacijom sa originalnim peptidom. U jednom drugom izvođenju, "heteroklitički" odgovor imunog sistema se odnosi na odgovor imunog sistema koji prepoznaje originalni peptid iz kog je izveden poboljšani peptid (npr. peptid ne obuhvata mutacije ostatka sidra). U jednom drugom izvođenju, "heteroklitički" odgovor imunog sistema se odnosi na odgovor imunog sistema koji prepoznaje originalni peptid iz kog je izveden heteroklitički peptid, pri čemu je jačina odgovora imunog sistema generisana vakcinacijom sa heteroklitičkim peptidom veća od odgovora imunog sistema generisanog vakcinacijom sa originalnim peptidom. U jednom drugom izvođenju, jačina odgovora imunog sistema generisana vakcinacijom sa heteroklitičkim peptidom je veća od odgovora imunog sistema pretežno jednakog odgovoru na vakcinaciju sa originalnim peptidom. U jednom drugom izvođenju, jačina odgovora imunog sistema generisana vakcinacijom sa heteroklitičkim peptidom je veća od odgovora imunog sistema manjeg od odgovora na vakcinaciju sa originalnim peptidom. U jednom drugom izvođenju, heteroklitički peptid iz ovog pronalaska je heteroklitički peptid humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I. Postupci za identifikovanje ostataka humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I i klase II, i za poboljšavanje vezivanja humanog leukocitnog antigena (HLA) mutiranjem ostataka, su dobro poznati u ovoj oblasti, kao što je opisano dole u tekstu.

1

[0061] U jednom drugom izvođenju, heteroklitički peptid iz ovog pronalaska indukuje odgovor imunog sistema koji je povećan najmanje 2-struko u odnosu na WT1 peptid iz kog je izveden heterokličitički peptid ("prirodni peptid"). U jednom drugom izvođenju, povećanje je 3-struko u odnosu na prirodni peptid. U jednom drugom izvođenju, povećanje je 5-struko u odnosu na prirodni peptid. U jednom drugom izvođenju, povećanje je 7-struko u odnosu na prirodni peptid. U jednom drugom izvođenju, povećanje je 10-struko u odnosu na prirodni peptid. U jednom drugom izvođenju, povećanje je 15-struko u odnosu na prirodni peptid. U jednom drugom izvođenju, povećanje je 20-struko u odnosu na prirodni peptid. U jednom drugom izvođenju, povećanje je 30-struko u odnosu na prirodni peptid. U jednom drugom izvođenju, povećanje je 50-struko u odnosu na prirodni peptid. U jednom drugom izvođenju, povećanje je 100-struko u odnosu na prirodni peptid. U jednom drugom izvođenju, povećanje je 150-struko u odnosu na prirodni peptid. U jednom drugom izvođenju, povećanje je 200-struko u odnosu na prirodni peptid. U jednom drugom izvođenju, povećanje je 300-struko u odnosu na prirodni peptid. U jednom drugom izvođenju, povećanje je 500-struko u odnosu na prirodni peptid. U jednom drugom izvođenju, povećanje je 1000-struko u odnosu na prirodni peptid. U jednom drugom izvođenju, povećanje je više nego 1000-struko u odnosu na prirodni peptid.

[0062] U jednom drugom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje heteroklitički peptid humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II izveden iz izolovanog WT1 peptida iz ovog pronalaska. U jednom drugom izvođenju, proces izvođenja obuhvata uvođenje mutacije koja povećava vezivanje peptida na molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II. U jednom drugom izvođenju, proces izvođenja se sastoji od uvođenja mutacije koja povećava vezivanje peptida na molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I. U jednom drugom izvođenju, mutacija je u ostatku sidra humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II. U jednom drugom izvođenju, heteroklitički peptid klase II iz ovog pronalaska je identifikovan i testiran na način analogan identifikaciji i testiranju heteroklitičkih peptida humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I, kao što je ovde dato u primerima.

[0063] U jednom drugom izvođenju, mesto vezivanja humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II u peptidu iz ovog pronalaska je stvoreno ili poboljšano mutacijom ostatka sidra motiva humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II. U jednom drugom izvođenju, ostatak sidra koji je modifikovan je u P1 poziciji. U jednom drugom izvođenju, ostatak sidra je na P2 poziciji. U jednom drugom izvođenju, ostatak sidra je na P6 poziciji. U jednom drugom izvođenju, ostatak sidra je na P9 poziciji. U jednom drugom izvođenju, ostatak sidra je izabran iz P1, P2, P6, i P9 pozicija. U jednom drugom izvođenju, ostatak

1

sidra je na P3 poziciji. U jednom drugom izvođenju, ostatak sidra je na P4 poziciji. U jednom drugom izvođenju, ostatak sidra je na P5 poziciji. U jednom drugom izvođenju, ostatak sidra je na P6 poziciji. U jednom drugom izvođenju, ostatak sidra je na P8 poziciji. U jednom drugom izvođenju, ostatak sidra je na P10 poziciji. U jednom drugom izvođenju, ostatak sidra je na P11 poziciji. U jednom drugom izvođenju, ostatak sidra je na P12 poziciji. U jednom drugom izvođenju, ostatak sidra je na P13 poziciji. U još jednom izvođenju, ostatak sidra je na bilo kom drugom ostatku sidra molekula humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II koji je poznat u ovoj oblasti. U drugom izvođenju, ostaci koji nisu P1, P2, P6, i P9 služe kao sekundarni ostaci sidra; samim tim, mutiranje tih ostataka može da poboljša vezivanje humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II.

[0064] U jednom drugom izvođenju, heteroklitički peptid se generiše uvođenjem mutacije koja kreira motiv sidra. "Motivi sidra" ili "ostaci sidra" se odnose, u drugom izvođenju, na 1 ili niz preporučenih ostataka na specifičnim pozicijama u sekvenci vezivanja humanog leukocitnog antigena (HLA).

[0065] Sekvenca vezivanja humanog leukocitnog antigena (HLA) je sekvenca vezivanja humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II. U jednom drugom izvođenju, sekvenci vezivanja humanog leukocitnog antigena (HLA) je sekvenca vezivanja humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I. U jednom drugom izvođenju, pozicije koje odgovaraju motivima sidra su one koje igraju značajnu ulogu u vezivanju molekula humanog leukocitnog antigena (HLA). U još jednom izvođenju, ostatak sidra je primarni motiv sidra. U još jednom izvođenju, ostatak sidra je sekundarni motiv sidra.

[0066] Postupci za predviđanje epitopa glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) klase I i II su dobro poznati u ovoj oblasti. U jednom izvođenju, koristan je softver Bioinformatics & Molecular Analysis Section (National Institutes of Health, Washington, DC) dostupan na http://bi- mas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken parker comboform. Ovaj softver rangira peptide 9-mer ili 10-mer prema predviđenom vremenu poluraspada koeficijenta razdruživanja od molekula humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I (Pinilla, et al. Curr Opin Immunol, 11 (2): p. 193-202 (1999)). U još jednom izvođenju, epitop glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) klase II je predviđen korišćenjem TEPITOPE (Meister GE, Roberts CG et al, Vaccine 199513: 581-91). U jednom drugom izvođenju je predviđen epitop glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) klase II korišćenjem EpiMatrix (De Groot AS, Jesdale BM et al, AIDS Res Hum Retroviruses 1997 13: 529-31). U jednom drugom izvođenju, epitop glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) klase II je predviđen korišćenjem postupa predviđanja, (Predict Method (Yu K, Petrovsky N et al, Mol Med.20028: 137- 48)). U još jednom drugom izvođenju, predviđen

1

je epitop glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) klase II korišćenjem SYFPEITHI algoritma za predviđanje epitopa (Primeri). U još jednom izvođenju, epitop glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) klase II je predviđen korišćenjem Rankpep. U još jednom izvođenju, epitop glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) klase II je predviđen korišćenjem bilo kog drugog postupka poznatog u ovoj oblasti.

[0067] U još jednom drugom izvođenju, slučaj peptida vezivanja humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II (npr. HLA-DR-veznih peptida), ostatak sidra koji je modifikovan je na P1 poziciji. U jednom drugom izvođenju, ostatak sidra je u P2 poziciji. U jednom drugom izvođenju, ostatak sidra je u P6 poziciji. U jednom drugom izvođenju, ostatak sidra je u P9 poziciji. U drugim izvođenjima, ostatak sidra je P3, P4, P5, P6, P8, P10, P11, P12, ili P13 pozicija. U još jednom izvođenju, ostatak sidra je bilo koji drugi ostatak sidra molekula humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II koji je poznat u ovoj oblasti. U drugom izvođenju, ostaci koji nisu P1, P2, P6, i P9 služe kao sekundarni ostaci sidra; samim tim, mutiranje tih ostataka može da poboljša vezivanje humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II. U jednom drugom izvođenju, bilo koja kombinacija gore navedenih ostataka je mutirana.

[0068] U još jednom izvođenju, WT1 peptid iz ovog pronalaska se vezuje na 2 distinktivna molekula HLA klase II. U još jednom izvođenju, peptid se vezuje na tri distinktivna molekula HLA klase II. U još jednom izvođenju, peptid se vezuje na četiri distinktivna molekula HLA klase II. U još jednom izvođenju, peptid se vezuje na pet distinktivnih molekula HLA klase II. U još jednom izvođenju, peptid se vezuje na šest distinktivnih molekula HLA klase II. U jednom drugom izvođenju, peptid se vezuje na više od šest distinktivnih molekula HLA klase II.

[0069] U još jednom izvođenju, molekuli HLA klase II koji se vezuju pomoću WT1 peptida iz ovog pronalaska su kodirani pomoću dva ili više distinktivnih alela na datom lokusu HLA klase II. U jednom drugom izvođenju, molekuli HLA klase II su kodirani pomoću 3 distinktivna alela na lokusu. U jednom drugom izvođenju, molekuli HLA klase II su kodirani pomoću 4 distinktivna alela na lokusu. U jednom drugom izvođenju, molekuli HLA klase II su kodirani pomoću 5 distinktivnih alela na lokusu. U jednom drugom izvođenju, molekuli HLA klase II su kodirani pomoću 6 distinktivnih alela na lokusu. U jednom drugom izvođenju, molekuli HLA klase II su kodirani pomoću više od šest distinktivnih alela na lokusu.

[0070] U jednom drugom izvođenju, molekuli humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II vezani pomoću WT1 peptida se kodiraju pomoću gena humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II na 2 distinktivna mesta. U jednom drugom izvođenju, vezani molekuli

1

humanog leukocitnog antigena (HLA) se kodiraju pomoću gena humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II na 2 ili više distinktivna mesta. U jednom drugom izvođenju, vezani molekuli humanog leukocitnog antigena (HLA) se kodiraju pomoću gena humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II na 3 distinktivna mesta. U jednom drugom izvođenju, vezani molekuli humanog leukocitnog antigena (HLA) se kodiraju pomoću gena humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II na 3 ili više distinktivna mesta. U jednom drugom izvođenju, vezani molekuli humanog leukocitnog antigena (HLA) se kodiraju pomoću gena humanog leukocitnog antigena (HLA)klase II na 4 distinktivna mesta. U jednom drugom izvođenju, vezani molekuli humanog leukocitnog antigena (HLA) se kodiraju pomoću gena humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II na 4 ili više distinktivnih mesta. U jednom drugom izvođenju, vezani molekuli humanog leukocitnog antigena (HLA) se kodiraju pomoću gena humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II na više od 4 distinktivna mesta. U drugim izvođenjima, mesta su izabrana iz HLA-DRB mesta. U jednom drugom izvođenju, vezujuć peptid humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II je vezujući peptid. U jednom drugom izvođenju, peptid je HLA-DQA1 vezujući peptid. U jednom drugom izvođenju, peptid je HLA-DQB 1 vezujući peptid. U jednom drugom izvođenju, peptid je HLA-DPA1 vezujući peptid. U jednom drugom izvođenju, peptide je HLA-DPB 1 vezujući peptid. U jednom drugom izvođenju, peptid je HLA-DMA vezujući peptid. U jednom drugom izvođenju, peptide je HLA-DMB vezujući peptid. U jednom drugom izvođenju, peptid je HLA-DOA vezujući peptid. U jednom drugom izvođenju, peptid je HLA-DOB vezujući peptid. U jednom drugom izvođenju, peptid se vezuje na bilo koji drugi molekul klase humanog leukocitnog antigena (HLA) II poznat u ovoj oblasti.

[0071] U još jednom izvođenju, WT1 peptid iz ovog pronalaska se vezuje na 2 distinktivna molekula HLA-DRB klase II. U jednom drugom izvođenju, peptid se vezuje na 3 distinktivna HLA-DRB molekula. U jednom drugom izvođenju, peptid se vezuje na 4 distinktivna HLA-DRB molekula. U jednom drugom izvođenju, peptid se vezuje na 5 distinktivnih HLA-DRB molekula. U jednom drugom izvođenju, peptid se vezuje na 6 distinktivnih HLA-DRB molekula. U jednom drugom izvođenju, peptid se vezuje na više od 6 distinktivnih HLA-DRB molekula.

[0072] U još jednom izvođenju, WT1 peptid iz ovog pronalaska se vezuje na HLA-DRB molekule koji se kodiraju pomoću 2 distinktivna HLA-DRB alela. U jednom drugom izvođenju, HLA-DRB molekuli su kodirani pomoću 3 distinktivna HLA-DRB alela. U jednom drugom izvođenju, HLA-DRB molekuli su kodirani pomoću 4 distinktivna HLA-DRB alela. U jednom drugom izvođenju, HLA-DRB molekuli su kodirani pomoću 5 distinktivnih HLA-DRB alela. U jednom drugom izvođenju, HLA-DRB molekuli su kodirani

2

pomoću 6 distinktivnih HLA-DRB alela. U jednom drugom izvođenju, HLA-DRB molekuli su kodirani pomoću 6 distinktivnih HLA-DRB alela. U još jednom izvođenju, WT1 peptid iz ovog pronalaska se vezuje na HLA-DRB molekule koji su kodirani pomoću 2 distinktivna HLA-DRB alela izabrana iz DRB 101, DRB 301, DRB 401, DRB 701, DRB 1101, i DRB 1501. U još jednom izvođenju, WT1 peptid se vezuje na HLA-DRB molekule kodirane pomoću 3 distinktivna HLA-DRB alela izabrana iz DRB 101, DRB 301, DRB 401, DRB 701, DRB 1101, i DRB 1501. U još jednom izvođenju, WT1 peptid se vezuje na HLA-DRB molekule kodirane pomoću 4 distinktivna HLA-DRB alela izabrana iz DRB 101, DRB 301, DRB 401, DRB 701, DRB 1101, i DRB 1501. U još jednom izvođenju, WT1 peptid se vezuje na HLA-DRB molekule kodirane pomoću 5 distinktivnih HLA-DRB alela izabranih iz DRB 101, DRB 301, DRB 401, DRB 701, DRB 1101, DRB 1104 i DRB 1501. U jednom drugom izvođenju, WT1 peptid se vezuje na HLA-DRB molekule kodirane pomoću svakog od sledećih HLA-DRB alela: DRB 101, DRB 301, DRB 401, DRB 701, DRB 1101, i DRB 1501.

[0074] U jednom drugom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje supstancu koja obuhvata 2 distinktivna WT1 peptida iz ovog pronalaska. U jednom izvođenju, 2 distinktivna WT1 peptida su oba nepromenjena. U još jednom drugom izvođenju, 1 od WT1 peptida je nepromenjen, dok je drugi heteroklitičan. U jednom drugom izvođenju oba WT1 peptida su heteroklitička.

[0075] U još jednom izvođenju, supstanca obuhvata 3 distinktivna WT1 peptida iz ovog pronalaska. U još jednom izvođenju, supstanca obuhvata 4 distinktivna WT1 peptida iz ovog pronalaska. U još jednom izvođenju, supstanca obuhvata 5 distinktivnih WT1 peptida iz ovog pronalaska. U još jednom izvođenju, supstanca obuhvata više od 5 distinktivnih izolovanih WT1 peptida iz ovog pronalaska.

[0076] U još jednom izvođenju, 2 od WT1 peptida u ovoj supstanci su nepromenjeni. U još jednom izvođenju, 2 od WT1 peptida u ovoj supstanci su heteroklitički. U jednom drugom izvođenju, 2 od WT1 peptida u ovoj supstanci su nepromenjena, i 2 su heteroklitička. U još jednom izvođenju, više od 2 od WT1 peptida u ovoj supstanci su nepromenjena. U još jednom izvođenju, više od 2 od WT1 peptida u ovoj supstanci su heteroklitička. U jednom drugom izvođenju, više od 2 od WT1 peptida u ovoj supstnaci su nepromenjena, i više od 2 su heteroklitička.

[0077] U još jednom izvođenju, 1 od dodatnih WT1 peptida u supstanci iz ovog pronalaska ima sekvencu izabranu iz sekvenci iznetih u SEK ID br: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 44, 46, 47, 48, 49, 50 i 55. U još jednom izvođenju, 2 od dodatnih WT1 peptida ima sekvencu izabranu iz sekvenci iznetih u SEK ID BR: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 44, 46, 47, 48, 49, 50 i 55. U još jednom izvođenju, 3 od dodatnih WT1 peptida ima sekvencu izabranu iz sekvenci iznetih u SEK ID BR: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 44, 46, 47, 48, 49, 50 i 55.

[0078] U još jednom izvođenju, svaki drugi imunogeni WT1 peptid poznat u ovoj oblasti se koristi kao dodatni WT1 peptid. U jednom drugom izvođenju, koristi se bilo koja kombinacija imunogenih WT1 peptida poznatih u ovoj oblasti. Neograničavajući izvori drugih WT1 peptida uključuju WO2005053618, WO2007047764 i WO2007120673.

[0079] U jednom drugom izvođenju, supstanca iz ovog pronalaska obuhvata 2 heteroklitička peptida HLA klase II koji su izvedeni iz istog izolovanog WT1 peptida iz ovog pronalaska. U jednom drugom izvođenju, 2 heteroklitička peptida humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II obuhvataju mutacije u različitim ostacima sidra molekula humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II. U još jednom drugom izvođenju, 2 heteroklitička peptida humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II obuhvataju različite mutacije na istim ostacima sidra. U jednom drugom izvođenju, 2 heteroklitička peptida humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II su izvedena iz dva različita izolovana WT1 peptida iz ovog pronalaska.

[0080] U još jednom izvođenju, 2 WT1 peptida iz ovog pronalaska, ili WT1 peptidi koji odgovaraju dvoma heteroklitičkim peptidima humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II iz ovog pronalaska, se međusobno preklapaju. U jednom drugom izvođenju, preklapanje između peptida je najmanje 7 aminokiselina (AA). U još jednom izvođenju, preklapanje je najmanje 8 aminokiselina (AA). U još jednom izvođenju, preklapanje je najmanje 9 aminokiselina (AA). U još jednom izvođenju, preklapanje je 7 aminokiselina (AA). U još jednom izvođenju, preklapanje je 8 aminokiselina (AA). U još jednom izvođenju, preklapanje je 9 aminokiselina (AA). U još jednom izvođenju, preklapanje je 10 aminokiselina (AA). U još jednom izvođenju, preklapanje je 11 aminokiselina (AA). U još jednom izvođenju, preklapanje je 12 aminokiselina (AA). U još jednom izvođenju, preklapanje je 13 aminokiselina (AA). U još jednom izvođenju, preklapanje je 14 aminokiselina (AA). U još jednom izvođenju, preklapanje je 15 aminokiselina (AA). U još jednom izvođenju, preklapanje je 16 aminokiselina (AA). U još jednom izvođenju, preklapanje je više od 16 aminokiselina (AA).

[0081] U još jednom izvođenju, peptidi iz ove supstance iz ovog pronalaska se vezuju na 2 distinktivna molekula humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II. U još jednom izvođenju, peptidi se vezuju na 3 distinktivna molekula humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II. U još jednom izvođenju, peptidi se vezuju na 4 distinktivna molekula humanog leukocitnog antigena (HLA)klase II. U još jednom izvođenju, peptidi se vezuju na 5 distinktivnih molekula humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II. U jednom drugom izvođenju, peptidi se vezuju na više od 5 distinktivnih molekula humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II. U jednom drugom izvođenju, peptidi u ovoj supstanci treba da se vežu na molekule humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II.

[0082] U još jednom izvođenju, svaki od peptida iz ove supstance iz ovog pronalaska se vezuju na niz distinktivnih molekula humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II. U još jednom izvođenju, svaki od WT1 peptida se vezuje na distinktivni niz molekula humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II. U jednom drugom izvođenju, WT1 peptidi u ovoj supstanci treba da se vežu na isti niz molekula humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II. U jednom drugom izvođenju, 2 od WT1 peptida se vezuje na distinktivan ali preklapajući niz molekula humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II. U još jednom izvođenju, 2 ili više od WT1 peptida se vezuje na isti niz molekula humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II, pri čemu se drugi WT1 peptidi vezuju na distinktivan niz. U jednom drugom izvođenju, 2 ili više od WT1 peptida se vezuje na preklapajući niz molekula humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II, dok se neki drugi od WT1 peptida vezuje na neki distinktivan niz.

[0083] U jednom drugom izvođenju, 2 ili više od WT1 peptida u supstanci iz ovog pronalaska svaki se vezuje na više od 1 HLA-DRB molekula. U jednom drugom izvođenju, 4 ili više HLA-DRB molekula vezuju peptidi u ovoj supstanci koji su distinktivni jedan prema drugom. U jednom drugom izvođenju, HLA-DRB molekuli su kodirani pomoću različitih HLA-DRB alela.

[0084] u jednom drugom izvođenju, 2 ili više od molekula humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II koji se vezuju pomoću WT1 peptida u supstanci iz ovog pronalaska jesu HLA-DRB molekuli. U jednom drugom izvođenju, 3 ili više od molekula humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II koji se vezuju su HLA-DRB molekuli. U drugim izvođenjima, molekuli humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II koji se vezuju mogu biti bilo koji molekuli humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II odmolekula ovde u tekstu. U jednom drugom izvođenju, molekuli humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II koji su vezani su kodirani pomoću 2 ili više distinktivnih alela humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II na datom mestu. U jednom drugom izvođenju, molekuli humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II koji se vezuju su kodirani pomoću gena humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II na 2 ili više distinktivnih mesta.

[0085] U jednom drugom izvođenju, "niz molekula humanog leukocitnog antigena (HLA)

2

klase II" se odnosi na molekule humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II kodirane različitim alelima na specifičnom mestu. U jednom drugom izvođenju, pojam se odnosi na molekule humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II sa specifičnom specifičnošću vezivanja. U jednom drugom izvođenju, pojam se odnosi na molekule humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II sa specifičnom konsenzus sekvencom peptida. U jednom drugom izvođenju, pojam se odnosi na superfamiliju molekula humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II.

[0086] U jednom drugom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje supstancu koja obuhvata nepromenjeni WT1 peptid vezivanja molekula nepromenjenog humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II iz ovog pronalaska i drugo, WT1 peptid vezivanja molekula humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I. U jednom drugom izvođenju, supstanca obuhvata više od jednog od WT1 peptida vezivanja molekula humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II iz ovog pronalaska, pored WT1 peptida vezivanja molekula humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I. U jednom drugom izvođenju, supstanca obuhvata više od jednog od WT1 peptida 1 vezivanja molekula humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I, pored WT1 peptida vezivanja molekula humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II.

[0087] U jednom drugom izvođenju, aminokiselina (AA) sekvenca drugog WT1 peptida vezivanja molekula humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I obuhvata sekvencu izabranu iz SEK ID BR: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 44, 46, 47, 48, 49, 50 i 55. U jednom drugom izvođenju, aminokiselina (AA) sekvenca iz drugog WT1 peptida vezivanja molekula humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I je izabrana iz sekvenci izneti u SEK ID BR: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 44, 46, 47, 48, 49, 50 i 55.

[0088] U jednom drugom izvođenju, WT1 peptid vezivanja molekula humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I je heteroklitički peptid humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I. U jednom drugom izvođenju, WT1 peptid vezivanja molekula humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I sadrži mutaciju u svom ostatku sidra molekula humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I, kao što je ovde opisano u daljem tekstu. Kao što je ovde dato, peptidi izvedeni iz WT1 su modifikovani u ostacima sidra humanog leukocitnog antigena (HLA) da bi se generisali heteroklitički peptidi sa povećanim predviđenim vezivanjem na HLA-A0201 i HLA-A0301. Peptidi sa povećanim predviđenim vezivanjem takođe su pokazali povećanu sposobnost da vežu molekule HLA klase I i povećanu imunogenost.

[0089] U jednom drugom izvođenju, mutacija koja pospešuje vezivanje glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) jeste ostatak na poziciji 1 heteroklitičkog peptida iz humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I. U još jednom izvođenju, ostatak je promenjen u tirozin. U još jednom izvođenju, ostatak je promenjen u glicin. U još jednom izvođenju, ostatak je promenjen u treonin. U još jednom izvođenju, ostatak je promenjen u fenilalanin. U još jednom izvođenju, ostatak je promenjen u bilo koji drugi ostatak poznat u ovoj oblasti. U jednom drugom iz vođenju, supstitucija 1 (npr. u tirozin) stabilzuje vezivanje ostatka sidra na poziciji 2.

[0090] U još jednom izvođenju, mutacija je na poziciji 2 heteroklitičkog peptida humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I. U još jednom izvođenju, ostatak je promenjen u leucin. U još jednom izvođenju, ostatak je promenjen u valin. U još jednom izvođenju, ostatak je promenjen u izoleucin. U još jednom izvođenju, ostatak je promenjen u metionin. U još jednom izvođenju, ostatak je promenjen u bilo koji drugi ostatak poznat u ovoj oblasti.

[0091] U još jednom izvođenju, mutacija je na poziciji 6 heteroklitičkog peptida humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I. U još jednom izvođenju, ostatak je promenjen u valin. U još jednom izvođenju, ostatak je promenjen u cistein. U još jednom izvođenju, ostatak je promenjen u glutamin. U još jednom izvođenju, ostatak je promenjen u histidin. U još jednom izvođenju, ostatak je promenjen u bilo koji drugi ostatak poznat u ovoj oblasti.

[0092] U još jednom izvođenju, mutacija je na poziciji 9 heteroklitičkog peptida humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I. U još jednom izvođenju, ostatak je promenjen u valin. U još jednom izvođenju, ostatak je promenjen u treonin. U još jednom izvođenju, ostatak je promenjen u izoleucin. U još jednom izvođenju, ostatak je promenjen u leucin. U još jednom izvođenju, ostatak je promenjen u alanin. U još jednom izvođenju, ostatak je promenjen u cistein. U još jednom izvođenju, ostatak je promenjen u bilo koji drugi ostatak poznat u ovoj oblasti.

[0093] U jednom drugom izvođenju, mutacija u tački je u ostatku primarnog sidra. U drugom izvođenju, primarni ostaci sidra humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I su pozicije 1 i 9. U jednom drugom izvođenju, mutacija u tački je u sekundarnom ostatku primarnog sidra. U drugom izvođenju, sekundarni ostaci sidra humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I su pozicije 1 i 8. U drugom izvođenju, sekundarni ostaci sidra humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I su pozicije 1, 3, 6, 7. i 8. U još jednom izvođenju, tačka mutacija je na poziciji izabranoj iz pozicija 4, 5, i 8.

[0094] U jednom drugom izvođenju, mutacija u tački je u 1 ili više ostataka na pozicijama izabranim iz pozicija 1, 2, 8, i 9 motiva vezivanja humanog leukocitnog antigena (HLA)

2

klase I. U još jednom izvođenju, tačka mutacija je na 1 ili više ostataka na pozicijama izabranim iz pozicija 1, 3, 6, i 9. U još jednom izvođenju, tačka mutacija je na 1 ili više ostataka na pozicijama izabranim iz pozicija 1, 2, 6, i 9. U još jednom izvođenju, tačka mutacija je na 1 ili više ostataka na pozicijama izabranim iz pozicija 1, 6, i 9. U još jednom izvođenju, tačka mutacija je na 1 ili više ostataka na pozicijama izabranim iz pozicija 1, 2, i 9. U još jednom izvođenju, tačka mutacija je na 1 ili više ostataka na pozicijama izabranim iz pozicija 1, 3, i 9. U još jednom izvođenju, tačka mutacija je na 1 ili više ostataka na pozicijama izabranim iz pozicija 2 i 9. U još jednom izvođenju, tačka mutacija je na 1 ili više ostataka na pozicijama izabranim iz pozicija 6 i 9.

[0095] U jednom drugom izvođenju, WT peptid vezivanja molekula humanog leukocitnog antigena (HLA) klase ima dužinu od 9 aminokiselina (AA). U jednom drugom izvođenju, peptid ima dužinu od 10 aminokiselina (AA). Kao što je ovde dato, prirodni i heteroklitički peptidi iz 9-10 aminokiselina (AA) ispoljenog supstancijalnog vezivanja na molekule humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I i sposobnost da daju izlučivanje citokina i citolize pomoću citotoksičnih T limfocita (CTL).

[0096] U jednom drugom izvođenju, molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I koji je vezan pomoću WT1 peptida vezivanja molekula humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I jeste HLA-A molekul. U još jednom izvođenju, molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I je HLA-A2 molekul. U još jednom izvođenju, molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I je HLA-A3 molekul. U još jednom izvođenju, molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I je HLA-A1 1 molekul. U jednom drugom izvođenju, molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I jeste HLA-B 8 molekul. U još jednom izvođenju, molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I je HLA-0201 molekul. U jednom drugom izvođenju, molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I vezuje bilo koji drugi molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I poznat u ovoj oblasti.

[0097] U jednom drugom izvođenju, WT1 peptid iz ovog pronalaska ima dužinu od 9-11 aminokiselina (AA). U jednom drugom izvođenju opsezi peptida u veličini od 9-18, ili u drugom izvođenju, 9-15, ili drugom izvođenju, 9-11 aminokiselina (AA) u dužini. U jednom drugom izvođenju, peptid je 9 aminokiselina (AA) ili u drugom izvođenju, 10 aminokiselina (AA) ili u drugom izvođenju, 12 aminokiselina (AA) u dužini, ili u drugom izvođenju, bilo koje dužine između tih navedenih.

[0098] U jednom drugom izvođenju, peptid iz ovog pronalaska ima varijantnu dužinu peptida pobrojanog u Primerima. U jednom drugom izvođenju. ta varijantna dužina je za jednu aminokiselinu (AA) kraća od peptida iz Primera. U jednom drugom izvođenju. ta

2

varijantna dužina je dve aminokiseline (AA) kraća od peptida iz Primera. I drugom izvođenju, varijantna dužina je više od dve aminokiselina (AA) kraće od peptida iz Primera. U jednom drugom izvođenju, kraći peptid je zarubljen na kraju N terminusa. U jednom drugom izvođenju, kraći peptid je zarubljen na kraju C terminusa. U jednom varijantno izvođenju, zarubljeni peptid je zarubljen na oba kraja N terminusa. Peptidi su, u drugom izvođenju, pogodni za zarubljivanje pogodni za promenu afiniteta bez značajne promene afiniteta za molekule humanog leukocitnog antigena (HLA), što je dobro poznato u ovoj oblasti.

[0099] U još jednom izvođenju, varijanta dužine je duža od peptida pobrojanog u Primerima iz ovog pronalaska. U još jednom izvođenju, duži peptid je produžen na kraju N terminusa u skladu sa okolnom WT1 sekvencom. Peptidi su, u drugom izvođenju, pogodni za produženje na kraju N terminusa bez promene afiniteta za molekule humanog leukocitnog antigena (HLA), što je dobro poznato u ovoj oblasti. Takvi peptidi su dakle ekvivalenti peptida pobrojanih u Primerima. U još jednom izvođenju, N terminus produženog peptida je produžen za jedan ostatak. U još jednom izvođenju, N terminus produženog peptida je produžen za dva ostatka. U još jednom izvođenju, N terminus produženog peptida je produžen za tri ostatka. U još jednom izvođenju, N terminus produženog peptida je produžen za više od tri ostatka.

[0100] U još jednom izvođenju, duži peptid je produžen na kraju C terminusa u skladu sa okolnom WT1 sekvencom. Peptidi su, u drugom izvođenju, pogodni za produženje na kraju C terminusa bez promene afiniteta za molekule humanog leukocitnog antigena (HLA), što je dobro poznato u ovoj oblasti. Takvi peptidi su dakle ekvivalenti peptida pobrojanih u Primerima iz ovog pronalaska. U još jednom izvođenju, C terminus produženog peptida je produžen za jedan ostatak. U još jednom izvođenju, C terminus produženog peptida je produžen za dva ostatka. U još jednom izvođenju, C terminus produženog peptida je produžen za tri ostatka. U još jednom izvođenju, C terminus produženog peptida je produžen za više od tri ostatka.

[0101] U još jednom izvođenju produženi peptid je produžen na oba kraja i na N terminusu i na C terminusu u skladu sa okolnom WT1 sekvencom.

[0102] U još jednom izvođenju, zarubljeni peptid iz ovog pronalaska zadržava ostatke sidra humanog leukocitnog antigena (HLA) (npr. ostatke sidra humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I) na drugom ostatku i ostatak C terminusa, sa manjim brojem interventnih ostataka (npr., 5) nego što je peptid pobrojan u Primerima iz ovog pronalaska. Peptidi su, u drugom izvođenju, pogodni za takvu mutaciju bez promene afiniteta za molekule humanog leukocitnog antigena (HLA). U još jednom izvođenju, takvi zarubljeni peptid je

2

projektovan uklanjanjem jednog od interventnih ostataka jedne od gornjih sekvenci. U još jednom izvođenju, ostaci sidra humanog leukocitnog antigena (HLA) su zadržani na drugom ostatku i na osmom ostatku. U još jednom izvođenju, ostaci sidra humanog leukocitnog antigena (HLA) su zadržani na prvom i osmom ostatku.

[0103] U još jednom izvođenju, produženi peptid iz ovog pronalaska zadržava ostatke sidra humanog leukocitnog antigena (HLA) (npr. ostatke sidra humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I) na drugom ostatku i ostatak C terminusa, sa većim brojem interventnih ostataka (npr., 7 ili 8) nego što je peptid pobrojan u Primerima iz ovog pronalaska. U još jednom izvođenju, takav produženi peptid je projektovan dodavanjem jednog ili više ostataka između dva od interventnih ostataka od jedne od gornjih sekvenci. Dobro je poznato u ovoj oblasti da ostaci mogu biti uklonjeni iz ili dodati između interventnih sekvenci peptida koji vezuju humani leukocitni antigen (HLA) bez promene afiniteta za humani leukocitni antigen (HLA). Takvi peptidi su dakle ekvivalenti peptida pobrojanih u Primerima iz ovog pronalaska. U još jednom izvođenju, ostaci sidra humanog leukocitnog antigena (HLA) su zadržani na drugom ostatku i na devetom ostatku. U još jednom izvođenju, ostaci sidra humanog leukocitnog antigena (HLA) su zadržani na prvom i osmom ostatku. U još jednom izvođenju, ostaci sidra humanog leukocitnog antigena (HLA) se zadržavaju na dva ostatka osvojena pomoću šest interventnih ostataka.

[0104] "Fragment," u drugom izvođenju, se odnosi na peptid dužine od 11 ili više aminokiselina (AA). U jednom drugom izvođenju, peptid iz ovog pronalaska je dug 16 aminokiselina (AA). U još jednom izvođenju, peptid je dug 12 aminokiselina (AA). U još jednom izvođenju, peptid je 13 aminokiselina (AA). U još jednom izvođenju, peptid je 14 aminokiselina (AA). U još jednom izvođenju, peptid ima 15 ili više aminokiselina (AA). U još jednom izvođenju, peptid je 17 aminokiselina (AA).

[0105] U još jednom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje supstancu koja obuhvata peptid iz ovog pronalaska. U jednom drugom izvođenju, supstanca još obuhvata farmaceutski prihvatljiv nosač. U jednom drugom izvođenju, supstanca još obuhvata adjuvans. U još jednom izvođenju, supstanca obuhvata 2 ili više peptida iz ovog pronalaska. U jednom drugom izvođenju, supstanca još obuhvata bilo koji od aditiva, jedinjenja, ili ekscipijenata iznetih ovde dole u tekstu. U još jednom izvođenju, adjuvans je iz školjke morskog puža (KLH), QS21, Frojndov (Freund’s) kompletni ili nekompletni adjuvans, aluminijum fosfat, aluminijum hidroksid, BCG (be-se-že) ili alauni. U drugim izvođenjima, nosač je bilo koji ovde nabrojan nosač. U drugim izvođenjima, adjuvans je bilo koji ovde pobrojan adjuvans.

2

[0106] U jednom drugom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje vakcinu koja obuhvata peptid iz ovog pronalaska. U jednom drugom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje vakcinu koja obuhvata antigen prezentujuću ćeliju (APC) i peptid iz ovog pronalaska. U jednom drugom izvođenju, vakcina još obuhvata nosač. U jednom drugom izvođenju, vakcina još obuhvata adjuvans. U jednom drugom izvođenju, vakcina još obuhvata antigen prezentujuću ćeliju (APC). U jednom drugom izvođenju, vakcina još obuhvata kombinaciju više od 1 od antigena, nosača, i/ili antigen prezentujuću ćeliju (APC). U jednom drugom izvođenju, vakcina je supstanca na bazi ćelije.

[0107] U jednom drugom izvođenju, pojam "vakcina" se odnosi na materijal ili supstancu koja, kada je uvedena u subjekat, obezbeđuje profilaktički ili terapijski odgovor za specifičnu bolest, stanje, ili simptom istog. U jednom drugom izvođenju, ovaj pronalazak obuhvata vakcine na bazi peptida, pri čemu taj peptid obuhvata bilo koje ovde navedeno izvođenje, uključujući imunomodulaciona jedinjenja kao što su citokini, adjuvansi, itd.

[0108] U jednom drugom izvođenju, vakcina iz ovog pronalaska još obuhvata adjuvans. U jednom drugom izvođenju, taj adjuvans je Montanid ISA 51. Montanid ISA 51 sadrži prirodno ulje koje je moguće metabolisati i rafinisani emulzifikator. U još jednom izvođenju, taj adjuvans je GM-CSF. Rekombinantni GM-CSF je humani protein odgajan, u jednom drugom izvođenju, u vektoru kvasca (S. cerevisiae). GM-CSF pospešuje ekspanziju klona i diferencijaciju hematopoeznih progenitorskih ćelija, antigen prezentujuću ćeliju (APC), i dendritskih i T ćelija.

[0109] U jednom drugom izvođenju, adjuvans je citokin. U još jednom izvođenju, adjuvans je faktor rasta. U još jednom izvođenju, adjuvans je populacija ćelije. U još jednom izvođenju, taj adjuvans je QS21. U još jednom izvođenju, adjuvans je Frojndov (Freund’s) nepotpuni adjuvans. U još jednom izvođenju, adjuvans je aluminijum fosfat. U još jednom izvođenju, adjuvans je aluminijum hidroksid. U još jednom izvođenju, taj adjuvans je BCG. U još jednom izvođenju, taj adjuvans je alauni.

[0110] U jednom drugom izvođenju, adjuvans je interleukin. U još jednom izvođenju, taj adjuvans je hemokin. U još jednom izvođenju, taj adjuvans je bilo koji drugi tip adjuvansa poznatog u ovoj oblasti. U još jednom izvođenju, WT1 vakcina obuhvata dva gornja adjuvansa. U još jednom izvođenju, WT1 vakcina obuhvata više od dva gornja adjuvansa.

[0111] U nekim drugim izvođenjima, vakcina ili supstanca iz ovog pronalaska može obuhvatiti bilo koje od izvođenja WT1 peptida iz ovog pronalaska i njihove kombinacije.

[0112] Treba razumeti da je bilo koje od ovde opisanih izvođenja, u vezi peptida, vakcina i supstanci iz ovog pronalaska moguće koristiti u bilo kojoj od medicinskih upotreba iz ovog pronalaska.

2

[0113] U još jednom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje WT1 vakcinu iz ovog pronalaska za upotrebu za lečenje subjekta sa WT1 eksprimujućim kancerom.

[0114] U još jednom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje WT1 vakcinu iz ovog pronalaska za upotrebu za lečenje subjekta sa mijelodisplaznim sindromom (MDS).

[0115] U još jednom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje WT1 vakcinu iz ovog pronalaska za upotrebu za sprečavanje ili zaustavljanje napredovanja WT1 eksprimujućeg kancera.

[0116] U još jednom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje WT1 vakcinu iz ovog pronalaska za upotrebu u smanjenju učestalosti WT1 eksprimujućeg kancera kod nekog subjekta.

[0117] U još jednom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje WT1 vakcinu iz ovog pronalaska za upotrebu za smanjenje učestalosti akutne mijelogene leukemije (AML).

[0118] U još jednom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje WT1 vakcinu iz ovog pronalaska za upotrebu u smanjenju učestalosti pojave relapsa WT1 eksprimujućeg kancera kod nekog subjekta.

[0119] U još jednom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje WT1 vakcinu iz ovog pronalaska za upotrebu u smanjenju učestalosti pojave akutne mijelogene leukemije (AML) kod nekog subjekta.

[0120] U još jednom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje WT1 vakcinu iz ovog pronalaska za upotrebu za prekidanje tolerancije T ćelije na WT1 eksprimujući kancer.

[0121] U još jednom izvođenju, ova prijava opisuje postupak lečenja subjekta koji ima WT1 eksprimujući kancer, koji obuhvata (a) uvođenje u donora formiranja i umnožavanja humanih citotoksičnih T limfocita (CTL) koji prepoznaju malignu ćeliju kancera i pomoću ovde opisanog postupka; i (b) infuziju humanih citotoksičnih T limfocita (CTL) u tog subjekta, čime se leči subjekat koji ima kancer.

[0122] U još jednom izvođenju, ova prijava opisuje postupak lečenja subjekta koji ima WT1 eksprimovanje kancera, koje obuhvata (a) uvođenje ex vivo formiranja i umnožavanja humanih citotoksičnih T limfocita (CTL) koji prepoznaju malignu ćeliju kancera pomoću ovde opisanog postupka, pri čemu se humane ćelije imunog sistema dobijaju od donora; i (b) infuziju humanih citotoksičnih T limfocita (CTL) u tog subjekta, čime se leči subjekat koji ima kancer.

[0123] Postupci za ex vivo imunoterapiju su dobro poznati u ovoj oblasti i opisani, na primer, u prijavama patenta USA pod serijskim brojem 2006/0057130, 2005/0221481, 2005/0214268, 2003/0175272, 2002/0127718, i patentu USA broj 5,229,115. Dodati postupci su dobro poznati u ovoj oblasti i opisani su, na primer, u radu Dejvisa ID i saradnika (Davis ID et al (Blood dendritic cells generated with Flt3 ligand and CD40 ligand prime CD8+ T cells efficiently in cancer patients (Dendritske ćelije krvi generisane sa Flt3 ligandom i CD40 ligandom aktiviraju efikasno CD8+ T ćelije kod pacijenata sa kancerom). J Immunother. 2006 Sep-Oct;29(5):499-511) i Mičela MS i saradnika (Mitchell MS et al (The cytotoxic T cell response to peptide analogs of the HLA-A *0201 - restricted MUC1 signal sequence epitope, M1.2 (Odgovor citotoksične T ćelije na analoge peptida od HLA-A *0201 - ograničenog MUC1 epitopa signalne sekvence, M1.2). Cancer Immunol Immunother. 2006 JuI 28)).

[0124] U jednom drugom izvođenju, ova prijava opisuje postupak uvođenja formiranja i umnožavanja citotoksičnog T limfocita (CTL) specifičnog za ćelije WT1 eksprimujućeg kancera, pri čemu taj postupak obuhvata dovođenje u kontakt limfocitne populacije sa vakcinom iz ovog pronalaska. U još jednom izvođenju, vakcina je antigen prezentujuća ćelija (APC) povezana sa peptidom iz ovog pronalaska. U još jednom izvođenju, vakcina je antigen prezentujuća ćelija (APC) povezana sa mešavinom peptida iz ovog pronalaska.

[0125] Dakle u još jednom izvođenju ovaj pronalazak obezbeđuje peptid iz ovog pronalaska ili molekul nukleinske kiseline koji kodira peptid, ili vektor koji obuhvata molekul nukleinske kiseline, za indukovanje in vitro formiranja i proliferacije citotoksičnih T limfocita (CTL) specifičnih za ćelije WT1 eksprimujućeg kancera.

[0126] U jednom drugom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje vakcinu iz ovog pronalaska za upotrebu u generisanju heteroklitičkog odgovora imunog sistema usmerenog protiv WT1 eksprimujućeg kancera kod subjekta.

[0127] U još jednom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje imunogenu supstancu koja obuhvata peptid iz ovog pronalaska za upotrebu u uvođenju anti-mezoteliomnog odgovora imunog sistema kod subjekta. U još jednom izvođenju, mezoteliom je maligni mezoteliom.

[0128] U još jednom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje imunogenu supstancu koja obuhvata molekul nukleotida koji kodira peptid iz ovog pronalaska za upotrebu u uvođenju anti-mezoteliomnog odgovora imunog sistema kod subjekta. U još jednom izvođenju, mezoteliom je maligni mezoteliom.

[0129] U jednom drugom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje imunogenu supstancu koja obuhvata peptid iz ovog pronalaska za upotrebu za lečenje subjekta sa mezoteliomom. U još jednom izvođenju, mezoteliom je maligni mezoteliom.

[0130] U još jednom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje imunogenu supstancu koja obuhvata molekul nukleotida koji kodira peptid iz ovog pronalaska za upotrebu za lečenje subjekta sa mezoteliomom. U još jednom izvođenju, mezoteliom je maligni mezoteliom.

1

[0131] U još jednom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje imunogenu supstancu koja obuhvata peptid iz ovog pronalaska za upotrebu za smanjenje pojave mezotelioma, ili njegovog relapsa, kod subjekta. U još jednom izvođenju, mezoteliom je maligni mezoteliom.

[0132] U još jednom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje imunogenu supstancu koja obuhvata molekul nukleotida koji kodira peptid iz ovog pronalaska za upotrebu za smanjenje pojave mezotelioma, ili njegovog relapsa, kod subjekta. U još jednom izvođenju, mezoteliom je maligni mezoteliom.

[0133] U još jednom izvođenju, ciljna ćelija odgovora imunog sistema dobijena pomoću peptida iz ovog pronalaska predstavlja WT1 peptid iz ovog pronalaska, ili odgovarajući WT1 fragment, na molekulu humanog leukocitnog antigena (HLA). U još jednom izvođenju, molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) je molekul humanog leukocitnog antigena klase I. U drugim izvođenjima, molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) je bilo koji podtip humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I ili molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I poznat u ovoj oblasti. U jednom drugom izvođenju, odgovor imunog sistema protiv WT1 peptida ili fragmenta je heteroklitički odgovor imunog sistema.

[0134] U jednom drugom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je akutna mijelogena leukemija (AML). U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je povezan sa mijelodisplaznim sindromom (MDS). U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je mijelodisplazni sindrom (MDS). U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC). U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je Vilmsov (Wilms') tumor. U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je leukemija. U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je hematološki kancer. U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je limfom. U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je dezmoplastični tumor male okrugle ćelije. U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je mezoteliom. U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je maligni mezoteliom. U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je kancer želuca. U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je kancer debelog creva. U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je kancer pluća. U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je kancer dojke. U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je tumor ćelije klice. U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je kancer jajnika. U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je kancer materice. U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je tiroidni kancer (rak štitne žlezde). U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je hepatocelularni karcinom. U još jednom izvođenju,

2

WT1 eksprimujući kancer je tiroidni kancer (rak štitne žlezde). U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je kancer jetre. U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je kancer bubrega. U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je Kapošijev (Kaposi's) sarkom. U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je sarkom. U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je bilo koji drugi karcinom ili sarkom. U još jednom izvođenju, WT1 eksprimujući kancer je čvrsti tumor. U još jednom izvođenju, čvrsti tumor je povezan sa WT1 eksprimujućim kancerom. U još jednom izvođenju, čvrsti tumor je povezan sa mijelodisplaznim sindromom (MDS). U još jednom izvođenju, čvrsti tumor je povezan sa nesitnoćelijskim rakom pluća (NSCLC). U još jednom izvođenju, čvrsti tumor je povezan sa kancerom pluća. U još jednom izvođenju, čvrsti tumor je povezan sa kancerom dojke. U još jednom izvođenju, čvrsti tumor je povezan sa kolorektalnim kancerom. U još jednom izvođenju, čvrsti tumor je povezan sa kancerom prostate. U još jednom izvođenju, čvrsti tumor je povezan sa kancerom jajnika. U još jednom izvođenju, čvrsti tumor je povezan sa kancerom bubrega. U još jednom izvođenju, čvrsti tumor je povezan sa kancerom pankreasa. U još jednom izvođenju, čvrsti tumor je povezan sa kancerom mozga. U još jednom izvođenju, čvrsti tumor je povezan sa gastrointestinalnim kancerom. U još jednom izvođenju, čvrsti tumor je povezan sa kancerom kože. U još jednom izvođenju, čvrsti tumor je povezan sa melanomom.

[0136] U još jednom izvođenju, za kancer ili tumor koji treba lečiti pomoću ovog pronalaska se sumnja da eksprimuje WT1. U jednom drugom izvođenju, WT1 eksprimovanje nije verifikovano testiranjem stvarnog uzorka tumora. U još jednom izvođenju, kancer ili tumor pripada tipu poznatom da eksprimuje WT1 u velikom broju slučajeva. U još jednom izvođenju, tip eksprimuje WT1 u velikom broju slučajeva.

[0137] Bilo koje od ovde opisanih izvođenja, u vezi peptida, vakcina i supstanci iz ovog pronalaska moguće koristiti u bilo kojoj od medicinskih upotreba iz ovog pronalaska.

[0138] U jednom drugom izvođenju, više peptida iz ovog pronalaska se koristi da stimuliše odgovor imunog sistema u postupcima iz ovog pronalaska.

[0139] Za postupke opisane ovde će biti jasno stručnjacima u ovoj oblasti da omogućavaju projektovanje drugih iz WT1 izvedenih peptida. Postupci još omogućavaju projektovanje vezivanja peptida na druge molekule humanog leukocitnog antigena (HLA). Ti postupci još omogućavaju projektovanje vakcina kombinovanjem iz WT1 izvedenih peptida iz ovog pronalaska.

[0140] U jednom drugom izvođenju, vakcine iz ovog pronalaska imaju prednost da aktiviraju ili daju za WT1 specifične CD4<+> T ćelije koje obuhvataju ranzovrsne različite alele humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II. U jednom drugom izvođenju, vakcine imaju prednost aktiviranje ili izazivanje za WT1 -specifičnih CD4<+> T ćelija u značajnoj proporciji te populacije (npr. u različitim izvođenjima, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%. 85%, 90%, 95%, ili većim od 95%). U drugom izvođenju, vakcine aktiviraju ili izazivaju za WT1-specifične CD4<+> T ćelije u značajnoj proporciji specifične populacije (npr. američkih belaca).

[0141] U još jednom drugom izvođenju, terapije iz ovog pronalaska obezbeđuje poboljšanje odgovora imunog sistema koji je već izgrađen od strane subjekta. U drugom izvođenju, terapije iz ovog pronalaska obuhvataju isporuku peptida, supstance, ili vakcine 2 ili više puta. U još jednom izvođenju, peptidi se razlikuju po svom sastavu, koncentraciji, ili kombinacijama sastava i koncentracije. U još jednom izvođenju, peptidi obezbeđuju pokretanje odgovora imunog sistema naspram antigena od interesa kod subjekta koji još uvek nije pokrenu odgovor imunog sistema protiv tog antigena. U jednom drugom izvođenju, citotoksični T limfociti (CTL) koji su indukovani se umnožavaju kao odgovor na prezentovanje peptida na antigen prezentujućoj ćeliji (APC) ili ćeliji kancera. U drugim izvođenjima, upućivanje na modulaciju odgovora imunog sistema uključuje, bilo koji ili oba iz skupa koji čine humoralni i ćelijom posredovani krak imunog sistema, što prati i prisustvo Th2 i ThI T ćelijama pomoćnicama, prema opisanom redosledu, ili u drugom izvođenju, svakog kraka pojedinačno.

[0142] U drugim izvođenjima, terapije koje utiču na rast tumora daju kao rezultat (1) direktnu inhibiciju deobe ćelije tumora, ili (2) imunom ćelijom posredovanu lizu ćelije tumora, ili oba, što dovodi do sprečavanja mrežnog širenja ćelija tumora.

[0143] Ograničenje rasta tumora bilo kojim od ova dva mehanizma može lako odrediti prosečan stručnjak u ovoj oblasti na osnovu dobro poznatih postupaka. U jednom drugom izvođenju, inhibicija tumora je određena merenjem stvarne veličine tumora tokom nekog vremenskog perioda. U drugom izvođenju, inhibiciju tumora moguće je odrediti procenom veličine tumora (tokom nekog vremenskog perioda) korišćenjem postupaka dobro poznatih stručnjacima u ovoj oblasti. Preciznije, raznovrsni postupci radiološkog snimanja (npr. jednofotonske i pozitronske emisione kompjuterizovane tomografije, videti generalno, "Nuclear Medicine in Clinical Oncology (Nuklearna medicina u kliničkoj onkologiji)," Winkler, C. (ed.) Springer-Verlag, New York, 1986), mogu biti korišćeni da bi se procenila veličina tumora. Takvi postupci mogu takođe da koriste raznovrsne agense za snimanje, uključujući na primer, uobičajene agense za snimanje (npr., Galijum-67 (Gallium-67) citrat), kao i specijalizovane reagense za snimanje metabolita, snimanje receptora, ili imunološko snimanje (npr. radiooznačeni za monoklonalno antitelo specifični markeri tumora). Pored toga je moguće koristiti neradioaktivne postupke kao što je

4

ultrazvuk (videti, "Ultrasonic Differential Diagnosis of Tumors (Ultrazvučne diferencijalne dijagnoze tumora)", Kossoff and Fukuda, (eds.), Igaku-Shoin, New York, 1984), da bi se procenila veličina tumora.

[0144] Pored in vivo postupaka za određivanje inhibicije (ograničenja) tumora razmatranih gore u tekstu, razni in vitro postupci mogu biti korišćeni da bi se predvidela in vivo inhibicija tumora. Predstavnici primera uključuju limfocitom posredovanu antitumorsku citolitičku aktivnost određenu na primer, <51>Cr ogledom otpuštanja (Primeri), od tumora zavisno umnožavanje limfocita (Ioannides, et al., J. Immunol. 146(5):1700-1707, 1991), in vitro generisanje antitela specifičnih za tumor (Herlyn, et al., J. Immunol. Meth. 73:157-167, 1984), ćelijska (npr. citotoksičnim T limfocitima (CTL), pomoćnom T ćelijom) ili humoralna (npr. antitelo) posredovana inhibicija rasta ćelije in vitro (Gazit, et al., Cancer Immunol Immunother 35:135-144, 1992), i, za bilo koje od ovih ogleda, određivanje frekvencije ćelije prekursora (Vose, Int. J. Cancer 30:135-142 (1982), i drugih.

[0145] U nekom drugom izvođenju, postupci sprečavanja rasta tumora ukazuju na stanje rasta koje je umanjeno u poređenju sa rastom bez kontakta sa, ili izlaganjem peptidu iz ovog pronalaska. Rast ćelije tumora je moguće proceniti bilo kojim sredstvima poznatim u ovoj oblasti, uključujući, ali ne i ograničeno na, merenje veličine tumora, određivanje da li se ćelije tumora umnožavaju korišćenjem ogleda inkorporiranja <3>H-timidina, ili brojanjem ćelija tumora. "Sprečavanje" rasta ćelije tumora se odnosi, u drugim izvođenjima, na usporavanje, odlaganje, ili zaustavljanje rasta tumora, ili na skupljanje tumora.

[0146] U drugom izvođenju, meri se WT1 ekspresija. U drugom izvođenju, meri se ekspresija WT1 transkripta. U drugom izvođenju, mere se nivoi WT1 proteina u tumoru.

[0147] Postupci određivanja prisustva i jačine odgovora imunog sistema su dobro poznati u ovoj oblasti. U nekom drugom izvođenju, ogledi umnožavanja limfocita, pri čemu apsorpcija T ćelije neke radioaktivne supstance, npr. <3>H-timidin je izmerena kao funkcija umnožavanja ćelije. U drugim izvođenjima, detekcija umnožavanja T ćelije je izvršena merenjem povećanja u proizvodnji interleukina-2 (IL-2), Ca<2+> fluks, ili apsorpciji boje, kao što je 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazolijum.

[0148] U jednom drugom izvođenju stimulacija citotoksičnim T limfocitima (CTL) se određuje načinima poznatim stručnjaku u ovoj oblasti, uključujući detekciju umnožavanja ćelije, proizvodnju citokina i drugim. Analiza tipova i količina citokina izlučenih od strane T ćelija posle dovođenja u kontakt ligandima impulsiranih meta može da bude mera funkcionalne aktivnosti. Citokine je moguće izmeriti ELISA ili ELISPOT ogledima da bi se odredila brzina i ukupna količina proizvodnje citokina. (Fujihashi K. et al. (1993) J. Immunol. Meth.160: 181 ; Tanguay S. and Killion J. J. (1994) Lymphokine Cytokine Res.

13:259).

[0149] U jednom drugom izvođenju, aktivnost citotoksičnog T limfocita (CTL) je određena ogledom lize za <51>Cr-otpuštanje. Lizu peptidom impulsiranih <51>Cr-označenih meta pomoću antigen specifičnih T ćelija moguće je uporediti za ciljne ćelije impulsirane sa kontrolnim peptidom. U jednom drugom izvođenju, T ćelije su stimulisane sa peptidom iz ovog pronalaska, i moguće je odrediti lizu ciljnih ćelija koje eksprimuju prirodni peptid u kontekstu glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC). Kinetika liza kao i ukupna ciljna liza u fiksnoj vremenskoj tački (npr., 4 sata) se koristi, u drugom izvođenju, da bi se procenio učinak liganda. (Ware C. F. et al. (1983) J Immunol 131: 1312).

[0150] Postupci određivanja afiniteta peptida za molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) su dobro poznati u ovoj oblasti. U još jednom izvođenju, afinitet je određen ogledima stabilizacije transportera povezanog sa obradom antigena (TAP).

[0151] U jednom drugom izvođenju afinitet se određuje konkurentnim radioimunim ogledom. U jednom drugom izvođenju, koristi se sledeći protokol: Ciljne ćelije se peru dva puta u PBS sa 1% albumina goveđeg seruma (BSA; Fisher Chemicals, Fairlawn, NJ). Ćelije su vraćene u suspenziju na 10<7>/ml na ledu, i peptidi vezani na površini prirodne ćelije su odstranjeni tokom 2 minuta na 0 [deg.] C korišćenjem citrat-fosfatnog puferskog rastvora u prisustvu 3 mg/ml beta2 mikroglobulina. Pelet je vraćen u suspenziju na 5 x 10<6> ćelija/ml u PBS/1 % BSA u prisustvu 3 mg/ml beta2 mickoglobulina i 30 mg/ml deoksiribonukleaze, i 200 ml alikvota se inkubira u prisustvu ili odsustvu peptida specifičnih za humani leukocitni antigen (HLA) tokom 10 min na 20<0>C, zatim sa <125>I-označenim peptidom tokom 30 min na 20<0>C. Ukupno vezano <125>I je određeno posle dva pranja sa PBS/2% BSA i jedno pranje sa PBS. Relativni afiniteti su određeni upoređivanjem eskalirajućih koncentracija peptida koji se testira naspram poznatog vezujućeg peptida.

[0152] U jednom drugom izvođenju, analiza specifičnosti vezivanja peptida na humani leukocitni antigen (HLA) na površini živih ćelija (npr. SKLY-16 ćelija) se sprovodi da bi se potvrdilo da to vezivanje jeste na odgovarajući molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) i da bi se karakterisalo njegovo ograničenje. Ovo uključuje, u još jednom izvođenju, takmičenje sa pristupom neoznačenim peptidima poznatim da se vezuju na iste ili nejednake molekule humanog leukocitnog antigena (HLA) i upotreba ciljnih ćelija koje eksprimuju iste ili nejednake tipove humanog leukocitnog antigena (HLA). Ovaj ogled je izveden, u drugom izvođenju, na živim svežim ili 0,25% paraformaldehidom fiksiranim humanim PBMC, linijama ćelije leukemije i sa Epštajn-Barovim virusom (EBV) transformisanim linijama T ćelije specifičnih tipova humanog lekucitnog antigena (HLA). Relativna avidnost (jačina vezivanja između antitela i antigena) peptida za koje je utvrđeno da vezuju molekule glavnog histokompatibilnog kompleksa (MHC) na specifične ćelije se pokazuje ogledima konkurencije kao što je opisano gore u tekstu naspram <125>I-označenih peptida poznatih po visokom afinitetu za relevantne molekule humanog leukocitnog antigena (HLA), npr. sekvenca tirozinaze ili HBV peptidna sekvenca. [00165] U jednom drugom izvođenju, peptid vezivanja humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II iz postupaka i supstanci iz ovog pronalaska je duži od minimalne dužine za vezivanje na molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II, koja je, u drugom izvođenju, oko 12 aminokiselina (AA). U jednom drugom izvođenju, povećanje dužine peptida vezivanja humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II omogućava vezivanje na više od jednog molekula humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II. U jednom drugom izvođenju, povećanje dužine omogućava vezivanje na molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II čiji motiv vezivanja nije poznat. U jednom drugom izvođenju, povećanje dužine omogućava vezivanje na molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I. U jednom drugom izvođenju, motiv vezivanja molekula humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I je poznat. U jednom drugom izvođenju, motiv vezivanja molekula humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I nije poznat.

[0153] U jednom drugom izvođenju, peptidi iz ovog pronalaska obuhvataju neklasičnu aminokiselinu kao što je: 1,2,3,4-tetrahidroizohinolin-3-karboksilat (Kazmierski et al. (1991) J. Am Chem. Soc. 113:2275-2283); (2S,3S)-metil-fenilalanin, (2S,3R)-metilfenilalanin, (2R,3S)-metil-fenilalanin i (2R,3R)-metil-fenilalanin (Kazmierski and Hruby (1991) Tetrahedron Lett. 32(41): 5769-5772); 2-aminotetrahidronaftalen-2-karboksilna kiselina (Landis (1989) Ph.D. Thesis, University of Arizona); hidroksi-1,2,3, 4-tetrahidroizohinolin-3-karboksilat (Miyake et al. (1984) J. Takeda Res. Labs.43:53-76) histidin izohinolin karboksilna kiselina (Zechel et al. (1991) Int. J. Pep. Protein Res.

38(2):131-138); i HIC (histidin ciklična urea), (Dharanipragada et al.(1993) Int. J. Pep. Protein Res.42(1):68-77) i ((1992) Acta. Crst., Crystal Struc. Comm.48(IV): 1239-124).

[0154] U jednom drugom izvođenju, peptid iz ovog pronalaska obuhvata analog ili peptidomimetik aminokiseline (AA) koji, u drugim izvođenjima, indukuje ili prednost daje specifičnim sekundarnim strukturama. Takvi peptidi obuhvataju, u drugim izvođenjima sledeće: LL-Acp (LL-3-amino-2-propenidon-6-karboksilnu kiselinu), [beta]-okretom indukujući dipeptidni analog (Kemp et al. (1985) J. Org. Chem. 50:5834-5838); [beta]-ravan indukujući analozi (Kemp et al. (1988) Tetrahedron Lett. 29:5081-5082); [beta]okret indukujući analozi (Kemp et al. (1988) Tetrahedron Lett. 29:5057-5060); alfazavojnica indukujući analozi (Kemp et al. (1988) Tetrahedron Lett.29:4935-4938); gamaokret indukujući analozi (Kemp et al. (1989) J. Org. Chem.54:109:115); analozi koje daju sledeće reference: Nagai and Sato (1985) Tetrahedron Lett.26:647-650; and DiMaio et al. (1989) J. Chem. Soc. Perkin Trans, p.1687; Analog Gly- Ala okreta (Kahn et al. (1989) Tetrahedron Lett. 30:2317); amidna izoster veza (Jones et al. (1988) Tetrahedron Lett.

29(31):3853-3856); tretrazol (Zabrocki et al. (1988) J. Am. Chem. Soc.110:5875-5880); DTC (Samanen et al. (1990) Int. J. Protein Pep. Res.35:501:509); i analozi koje opisuju Olson et al. (1990) J. Am. Chem. Sci.112:323-333 and Garveyet al. (1990) J. Org. Chem.

55(3):936-940. Konformaciono ograničeni mimetici beta okreta i beta ispupčenja, i peptidi koji ih sadrže, su opisani u U.S. Pat. br.5,440,013, izdat 8. avgusta 1995, na ime Kahn.

[0155] U drugim izvođenjima, peptid iz ovog pronalaska je konjugovan na jedan od različitih drugih molekula, kao što je opisano ovde dole u tekstu, što može da bude preko kovalentne ili nekovalentne veze (kompleksiran), čija priroda varira, u drugom izvođenju, zavisno od specifične svrhe. U jednom drugom izvođenju, peptid je kovalentno ili nekovalentno kompleksiran na makromolekularni nosač, (npr. imunogeni nosač), uključujući, ali ne i ograničeno na, prirodne i sintetičke polimere, proteine, polisaharide, polipeptide (aminokiselina), polivinil alkohol, polivinil pirolidon, i lipide. U jednom drugom izvođenju, peptid iz ovog pronalaska je povezan na neki supstrat. U jednom drugom izvođenju, taj peptid je konjugovan na masnu kiselinu za uvođenje u lipozom (U.S. Pat. br. 5,837,249). U jednom drugom izvođenju, peptid iz ovog pronalaska je kompleksiran kovalentno ili nekovalentno sa čvrstom potporom, čije je raznovrsnost poznata u ovoj oblasti. U jednom drugom izvođenju, veza peptida na nosač, supstrat, masnu kiselinu, ili čvrstu potporu služi da bi se povećao izazvani odgovor imunog sistema.

[0156] U drugim izvođenjima, nosač je tiroglobulin, albumin (npr. humani serumski albumin), tetanus toksoid, poliaminokiseline kao što je poli (lizin: glutaminska kiselina), protein influence (gripa), protein jezgra virusa hepatitisa B, hemocijanin iz školjke morskog puža (keyhole limpet) (KLH), albumin, ili još jedan protein nosač ili peptid nosač; rekombinantna vakcina virusa hepatitisa B, ili antigen prezentujuća ćelija (APC).

[0157] U nekom drugom izvođenju, pojam "aminokiselina" (AA) se odnosi na prirodni ili, u drugom izvođenju, neprirodnu ili sintetičku aminokiselinu (AA), i može da uključuje, u drugim izvođenjima, glicin, D- ili L optičke izomere, analoge, peptidomimetike aminokiselina (AA), ili kombinacije navedenih.

[0158] U jednom drugom izvođenju, pojmovi "kancer," "neoplazam," "neoplastični" ili "tumor," se koriste ravnopravno i odnose se na ćelije koje su prošle malignu transformaciju što ih čini patološkim u organizmu domaćinu. Primarne ćelije kancera (to jest, ćelije dobijene od obližnjeg mesta maligne transformacije) mogu lako da se razlikuju od nekancernih ćelija pomoću dobro uspostavljenih tehnika, posebno histološkog ispitivanja. Definicija ćelije kancera, kako je ovde korišćeno, uključuje ne samo primarnu ćeliju kancera, već takođe bilo koju drugu ćeliju izvedenu iz pretka ćelije kancera. Ovo uključuje metastazirane ćelije kancera, i in vitro kulture i linije ćelije izvedene iz ćelija kancera. U jednom drugom izvođenju, tumor je moguće detektovati na bazi mase tumora; npr., takvim postupcima kao što je CAT snimak, magnetno rezonantno snimanje (MRI), rendgensko snimanje, ultrazvučno ili opipavanjem i u drugom izvođenju, identifikuje se biohemijskim ili imunološkim otkrićima, ova kasnija se koriste da bi se identifikovale kancerne ćelije, kao i u drugim izvođenjima.

[0159] Postupci za sintetisanje peptida su dobro poznati u ovoj oblasti. U nekom drugom izvođenju, peptidi iz ovog pronalaska se sintetišu korišćenjem odgovarajućeg čvrstog stanja postupka sinteze (videti na primer, Steward and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Freemantle, San Francisco, Calif. (1968); Merrifield (1967) Recent Progress in Hormone Res 23: 451). Aktivnost ovih peptida se testira, u drugim izvođenjima, korišćenjem ogleda kao što je ovde opisano.

[0160] U jednom drugom izvođenju, peptidi iz ovog pronalaska se prečišćavanju standardnim postupcima uključujući hromatografiju (npr., jonskom izmenom, afinitetnom, i hromatografijom u koloni prema veličini), centrifugiranje, diferencijalnu rastvorljivost, ili bilo kojom drugom standardnom tehnikom za prečišćavanje proteina. U jednom drugom izvođenju, koristi se imuno-afinitetna hromatografija, pri čemu je epitop izolovan vezivanjem na svoju afinitetnu kolonu koja obuhvata antitela koja su uzgajana naspram tog peptida, ili srodnog peptida iz ovog pronalaska, i koji su pričvršćeni na neku stacionarnu potporu.

[0161] U jednom drugom izvođenju, afinitetne oznake kao što je heksa-His (Invitrogen), domen vezivanja maltoze (Maltose binding domain) (New England Biolabs), sekvenca obloge influence (Kolodziej et al. (1991) Meth. Enzymol. 194:508-509), glutation-S-transferaza, ili drugi, su spojeni na peptide iz ovog pronalaska da bi omogućili lako prečišćavanje provlačenjem iznad odgovarajuće afinitetne kolone. Izolovani peptidi mogu takođe da budu fizički karakterizirani, u nekim drugim izvođenjima, korišćenjem tehnika kao što je proteoliza, nuklearna magnetna rezonanca, i rendgenska kristalografija.

[0162] U jednom drugom izvođenju, peptidi iz ovog pronalaska se proizvode pomoću in vitro translacije, kroz poznate tehnike, kao što će biti očigledno stručnjaku u ovoj oblasti. U jednom drugom izvođenju, peptidi su diferencijalno modifikovani tokom ili posle translacije, npr., fosforilacijom, glikosilacijom, unakrsnim povezivanjem, acilacijom, proteolitskim cepanjem, cepanjem na molekul antitela, molekul membrane ili drugi ligand, (Ferguson et al. (1988) Ann. Rev. Biochem.57:285-320).

[0163] U jednom drugom izvođenju, peptidi iz ovog pronalaska još obuhvataju detektibilnu oznaku, koja u drugom izvođenju, jeste fluorescentna, ili u drugom izvođenju, luminescentna, ili u još jednom izvođenju, radioaktivna, ili u još jednom izvođenju, nepropusna za elektrone. U nekim drugim izvođenjima, detektibilna oznaka obuhvata, na primer, zeleni fluorescentni protein (GFP), DS-Red (crveni fluorescentni protein), izlučenu alkalnu fosfatazu (SEAP), beta-galaktozidazu, luciferazu, <32>P, <125>I, <3>H i <14>C, fluorescein i njegove derivate, danzil i umbeliferon, luciferin ili bilo koji drugi broj drugih takvih oznaka poznatih stručnjaku u ovoj oblasti. Specifična upotrebljena oznaka će zavisiti od tipa korišćenog imunoogleda.

[0164] U jednom drugom izvođenju, peptid iz ovog pronalaska je povezan na supstrat, koji u drugom izvođenju služi kao nosač. U još jednom izvođenju, veza peptida na supstrat služi da bi se povećao izazvani odgovor imunog sistema.

[0165] U još jednom izvođenju, peptidi iz ovog pronalska su povezani na druge molekule, kao što je ovde opisano, upotrebom uobičajenih agenasa unakrsnog povezivanja kao što su karbodiimidi. Primeri karbodiimida su 1-cikloheksil-3-(2-morfolinil-(4-etil)karbodiimid (CMC), 1-etil-3-(3-dimetiaminopropil) karbodiimid (EDC) i 1-etil-3-(4-azonia-44-dimetilpentil) karbodiimid.

[0166] U drugim izvođenjima agensi unakrsnog povezivanja obuhvataju cijanogen bromid, glutaraldehid i sukcinski anhidrid. Generalno, moguće je upotrebiti bilo koji od brojnih homo-bifunkcionalnih agenasa uključujući homo- bifunkcionalni aldehid, homobifunkcionalni epoksid, homo-bifunkcionalni imido-estar, homo-bifunkcionalni N-hidroksisukcinimid estar, homo-bifunkcionalni maleimid, homo-bifunkcionalni alkil halid, homo-bifunkcionalni piridil disulfid, homo-bifunkcionalni aril halid, homo-bifunkcionalni hidrazid, homo-bifunkcionalni diazonijum derivat i homo-bifunkcionalno fotoreaktivno jedinjenje. Takođe su zamišljena, u drugim izvođenjima, hetero-bifunkcionalna jedinjenja, na primer, jedinjenja koja imaju amin-reaktivnu i sulfhidril-reaktivnu grupu, jedinjenja sa amin-reaktivnom i fotoreaktivnom grupom i jedinjenja sa karbonil-reaktivnom i sulfhidrilreaktivnom grupom.

[0167] U nekim drugim izvođenjima, homo-bifunkcionalni agensi unakrsnog povezivanja uključuju bifunkcionalne N-hidroksisukcinimid estre ditiobis(sukcinimidilpropionat), disukcinimidil suberat, i disukcinimidil tartarat; bifunkcionalne imido-estre dimetil adipimidat, dimetil pimelimidat, i dimetil suberimidat; bifunkcionalne sulfhidril-reaktivne

4

unakrsne vezivače 1,4-di-[3’-(2’- piridilditio)propionamido]butan, bismaleimidoheksan, i bis-N-maleimido-1,8-oktan; bifunkcionalne aril halide 1 ,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen i 4,4’-difluoro-3,3’-dinitrofenilsulfon; bifunktionalne fotoreaktivne agense kao što je bis-[b-(4-azidosalicilamido)etil]disulfid; bifunkcionalne aldehide formaldehid, malondialdehid, sukcinaldehid, glutaraldehid, i adipaldehid; bifunkcionalni epoksid kao što je 1,4-butanodiol diglicidil etar; bifunkcionalne hidrazide kao što je dihidrazid adipinske kiseline, karbohidrazid, i dihidrazid sukcinske kiseline; bifunkcionalne diazonijume o-tolidin, diazotizovani i bis-diazotizovani benzidin; bifunkcionalne alkilhalide N1N’-etilenbis(jodoacetamid), N1N’-heksametilen-bis(jodoacetamid), N1N’-undekametilenbis(jodoacetamid), kao i benzilhalide i haloslačice, kao što je ala’-dijodo-p-ksilen sulfonska kiselina i tri(2-hloroetil)amin, prema opisanom redosledu,

[0168] U drugim izvođenjima, hetero-bifunkcionalni agensi sa unakrsnim povezivanjem korišćeni da povežu peptide na druge molekule, kao što je opisano ovde, uključuju, ali se ne ograničavaju na, SMCC (sukcinimidil-4-(N-rnaleimidometil)cikloheksan- 1 -karboksilat), MB S (m-maleimidobenzoil-N-hidroksisukcinimid estar), SIAB (N-sukcinimidil(4-jodoacetil)aminobenzoat), SMPB (sukcinimidil-4-(pmaleimidofenil)butirat), GMBS (N-(.gama.-maleimidobutiriloksi)sukcmimid estar), MPBH (4-(4-N-maleimidopohenil) butirna kiselina hidrazid), M2C2H (4-(N-maleimidometil)cikloheksan-1-karboksilhidrazid), SMPT (sukcinimidiloksikarbonil-ametil-a-(2-piridilditio)toluen), i SPDP (N-sukcinimidil 3-(2-piridilditio)propionat).

[0169] U jednom drugom izvođenju, peptidi iz ovog pronalaska se formulišu kao nekovalentni spoj monomera kroz jonske, adsorptivne, ili biospecifične interakcije. Kompleksi peptida sa visoko pozitivnim molekulima ili negativno naelektrisanim molekulima mogu biti dobijeni, u nekom drugom izvođenju, kroz formiranje slanog mosta u slabim sredinama jonske jačine, kao što je u dejonizovanoj vodi. Velike komplekse je moguće kreirati, u nekom drugom izvođenju, korišćenjem naelektrisanih polimera kao što je poli-(L-glutaminska kiselina) ili poli-(L-lizin), koji obuhvata brojne negativne ili pozitivne promene, prema opisanom redosledu. U jednom drugom izvođenju, peptidi se adsorbuju na površinama kao što su mikročestične lateks perlice ili drugi hidrofobni polimeri, formiranjem nekovalentno povezanih peptid superantigen kompleksa efektivno oponašaju unakrsno povezan ili hemijski polimerizovan protein, u drugim izvođenjima. U jednom drugom izvođenju, peptidi su nekovalentno povezani kroz upotrebu biospecifičnih interakcija između drugih molekula. Na primer, korišćenje jakog afiniteta biotina za proteine kao što je avidin ili streptavidin ili njihovi derivati moguće je koristiti da bi se formirali peptidni kompleksi. Peptidi, prema ovom varijantnom rešenju, i u drugom izvođenju, mogu da budu modifikovani da poseduju biotin grupe korišćenjem zajedničkih reagenasa biotinilacije kao što je N-hidroksisukcinimidil estar od D-biotina (NHS-biotin), koji reaguje sa dostupnim amin grupama.

[0170] U jednom drugom izvođenju, peptid iz ovog pronalaska je povezan na nosač. U jednom drugom izvođenju, nosač je iz školjke morskog puža (KLH). U drugim izvođenjima, nosač je bilo koji drugi nosač poznati u ovoj oblasti, uključujući, na primer, tiroglobulin, albumine kao što je humani albumin u serumu, tetanus toksoid, poliamino kiseline kao što je poli protein (lizin: glutaminska kiselina), protein influence, protein jezgra virusa hepatitis B, rekombinantna vakcina virusa hepatitisa B i slično.

[0171] U jednom drugom izvođenju, peptidi iz ovog pronalaska se konjuguju na lipid, kao što je P3 CSS. U jednom drugom izvođenju, peptidi iz ovog pronalaska se konjuguju na perlicu.

[0172] U jednom drugom izvođenju, supstance iz ovog pronalaska još obuhvataju imunomodulaciona jedinjenja. U nekim drugim izvođenjima, imunomodulaciono jedinjenje je citokin, hemokin, ili komponenta komplementa koja pospešuje eksprimovanje imunog sistema dostupni su ili adhezioni molekuli, i njihovi receptori ili njihove kombinacije. U nekim izvođenjima, imunomodulaciono jedinjenje uključuje interleukin 1 do 15, interferone alfa, beta ili gama, faktor nekroze tumora, faktor stimulacije granulocitne-makrofag kolonije (GM-CSF), faktor stimulacije kolonije makrofaga (M-CSF), faktor stimulacije kolonije granulocita (G-CSF), hemokine kao što je protein koji aktivira neutrofil (NAP), faktor hemoatrakcije i aktivacije makrofaga (MCAF), RANTES, makrofagni inflamatorni peptidi MIP-Ia ili MIP-Ib, komplementna komponenta, ili njihove kombinacije. U nekim drugim izvođenjima, imunomodulaciono jedinjenje stimuliše eksprimovanje, ili pospešenu ekspresiju OX40, OX40L (gp34), limfotaktina, CD40, CD40L, B7.1, B7.2, TRAP, ICAM-1, 2 ili 3, receptora citokina, ili njihove kombinacije.

[0173] U jednom drugom izvođenju, imunomodulatorno jedinjenje indukuje ili povećava ekspresiju kostimulatornih molekula koji učestvuju u odgovoru imunog sistema, koji uključuje, u nekim izvođenjima, CD40 ili njegov ligand, CD28, CTLA-4 ili B7 molekul. U jednom drugom izvođenju, imunomodulatorno jedinjenje indukuje ili pospešuje eksprimovanje antigena stabilnog na toplotu (HSA) (Liu Y. et al. (1992) J. Exp. Med.

175:437-445), hondroitin sulfatom modifikovan nepromenljivi lanac (Ii-CS) glavnog histokompatibilnog kompleksa (MHC) (Naujokas M. F. et al (1993) Cell 74:257-268), ili molekul 1 međućelijske adhezije (ICAM-I) (Van R. H. (1992) Cell 71 : 1065-1068), što pomaže, u jednom izvođenju, kostimulacija interakcijom sa njihovim poznatim ligandima na T ćelije.

[0174] U nekom drugom izvođenju, supstanca obuhvata rastvarač, uključujući vodu, disperzionu podlogu, podlogu kulture ćelije, izotonične agense i slično. U još jednom izvođenju, rastvarač je vodeni izotonični puferski rastvor sa pH vrednošću od oko 7,0. U još jednom izvođenju, supstanca obuhvata razblaživač kao što je voda, fosfatni puferski slani rastvor, ili slani rastvor. U još jednom izvođenju, supstanca obuhvata rastvarač, koji je nevodeni, kao što je propil etilen glikol, polietilen glikol i biljna ulja.

[0175] U nekom drugom izvođenju, supstanca je formulisana za isporuku bilo kojom od brojnih tehnika poznatih stručnjacima u ovoj oblasti. Na primer, ovaj pronalazak obezbeđuje isporuku farmaceutske supstance parenteralno, intravenozno, potkožno, intradermalno, intamukozno, topikalno, oralno, ili inhalacijom.

[0176] U još jednom izvođenju, vakcina koja obuhvata peptid iz ovog pronalaska još obuhvata populaciju ćelije, koja, u još jednom izvođenju, obuhvata limfocite, monocite, makrofage, dendritskih ćelija, endotelne ćelije, matične ćelije ili njihove kombinacije, koje su, u još jednom izvođenju autologne, singeneične ili alogeneične, jedne u odnosu na druge. U drugom izvođenju, populacija ćelije obuhvata peptid iz ovog pronalaska. U još jednom izvođenju, populacija ćelije zauzima peptid.

[0177] U još jednom izvođenju, populacije ćelije iz ovog pronalaska se dobiju iz in vivo izvora, kao što je, na primer, periferna krv. leukoferezni proizvod krvi, aferezni proizvod krvi, periferni limfni čvorovi, limfna tkiva povezana sa crevima, slezina, timus (grudna žlezda), krv iz pupčane vrpce, mezenterni limfni čvorovi, jetra, mesta imunoloških lezija, npr. sinovijalni fluid, pankreas, cerebrospinalni fluid, uzorci tumora, granulomatozno tkivo, ili bilo koji drugi izvor gde je takve ćelije moguće dobiti. U još jednom izvođenju, populacije ćelija se dobiju iz humanih izvora, koji su, u drugim izvođenjima, iz izvora kao što je ljudsko novorođenče, dete, ili odraslo ljudsko biće. U jednom drugom izvođenju, populacije ćelija iz ovog pronalaska se dobijaju iz izvora kao što je životinja, kao što je, na primer, svinja ili viši primati (simiiformi), ili bilo koja druga životinja koja je predmet interesovanja. U jednom drugom izvođenju, populacije ćelija iz ovog pronalaska se dobiju iz subjekata koji su normalni, ili u drugom izvođenju, oboleli, ili u drugom izvođenju, podložni za bolest koja je predmet interesovanja.

[0178] U još jednom izvođenju, populacija ćelija su odvojene preko postupaka za separaciju na osnovu afiniteta. Tehnike za afinitetnu separaciju uključuju, u drugim izvođenjima, magnetnu separaciju, korišćenjem antitelom obloženih magnetnih perlica, afinitetnu hromatografiju, citotoksične agense spojene na monoklonalno antitelo ili upotrebu u vezi sa monoklonalnim antitelom, na primer, komplement i citotoksine, i 'paning'' (pranje radi pronalaženja) sa antitelom spojenim na čvrstu matricu, kao što je

4

pločica, ili bilo koja druga pogodna tehnika. U drugom izvođenju, tehnike separacije uključuju upotrebu fluorescentno aktiviranih sortirača ćelije, koji mogu imati različite stepene sofistikacije, kao što su višestruki kanali boje, kanali za detektovanje rasipanja svetlosti pod malim i tupim uglom, kanali impendance, itd. U drugim izvođenjima, bilo koja tehnika koja omogućava odvajanje populacija ćelije iz ovog pronalaska može da se koristi, i treba da se smatra delom ovog pronalaska.

[0179] U još jednom izvođenju, dendritske ćelije su od raznovrsne populacije morfološki sličnih tipova ćelije pronađenih u raznovrsnim limfoidnim i nelimfoidnim tkivima, kvalifikovanim kao takvim (Steinman (1991) Ann. Rev. Immunol.9:271-296). U još jednom izvođenju, dendritske ćelije korišćene u ovom pronalasku su izolovane iz koštane srži, ili u drugom izvođenju, izvedene iz progenitorskih ćelija koštane srži, ili, u drugom izvođenju, iz izolovanih /izvedenih iz periferne krvi, ili u drugom izvođenju, izvedenih iz, ili su linija ćelije.

[0180] U još jednom izvođenju, ovde opisane populacije ćelije su izolovane iz frakcije ćelija belih krvnih zrnaca iz sisara, kao što je mišja, višeg primata ili čoveka (Videti, npr., WO 96/23060). Frakcija ćelije belih krvnih zrnaca može da bude, u još jednom izvođenju, izolovana iz periferne krvi sisara.

[0181] Postupci izolovanja dendritskih ćelija su dobro poznati u ovoj oblasti. U još jednom izvođenju, DC su izolovane preko postupka koji uključuje sledeće korake: (a) obezbeđivanje frakcije ćelije belog krvnog zrnca dobijene iz izvora kao što je sisar postupcima poznatim u ovoj oblasti kao što je leukoforeza; (b) odvajanje frakcije ćelije belog krvnog zrnca iz koraka (a) u četiri ili više podfrakcija protivstrujnom centrifugalnom elutriacijom; (c) stimulisanje konverzije monocita u jednoj ili više frakcija iz koraka (b) u dendritske ćelije dovođenjem u kontakt ćelija sa kalcijum jonoforom, GM-CSF i IL-13 ili GM-CSF i IL-4, (d) identifikovanje dendritskom ćelijom obogaćene frakcije iz koraka (c); i (e) prikupljanje obogaćene frakcije iz koraka (d), preporučljivo na oko 4 [deg.] C.

[0182] u jednom drugom izvođenju, dendritskom ćelijom obogaćena frakcija je identifikovana fluorescentno aktiviranim razvrstavanjem ćelije, koje identifikuje najmanje jedan od sledećih markera: HLA-DR, HLA-DQ, ili B7.2, i istovremeno odsustvo sledećih markera: CD3, CD14, CD16, 56, 57, i CD 19, 20.

[0183] U još jednom izvođenju, populacija ćelije obuhvata limfocite, koji su, u drugom izvođenju, T ćelije, ili u nekom drugom izvođenju, B ćelije. T ćelije su, u drugim izvođenjima, karakterisane kao NK ćelije, T ćelije pomoćnice, citotoksični T limfociti (CTL), TBL, prirodne T ćelije, ili njihove kombinacije. Treba razumeti da T ćelije koje su primarne, ili linije ćelije, klonovi, itd. treba posmatrati kao deo ovog pronalaska. U jednom drugom izvođenju, T ćelije su citotoksične T limfocitne (CTL) ćelije, ili linije citotoksičnih T limfocitnih (CTL) ćelija, klonovi citotoksičnih T limfocitnih (CTL) ćelija, ili citotoksični T limfocitni (CTL) izolovani iz tumora, inflamatorni, ili drugi infiltrati.

[0184] U jednom drugom izvođenju, hematopoezne matične ili rane progenitorske ćelije obuhvataju populacije ćelije korišćene u ovom pronalasku. U još jednom izvođenju, takve populacije su izolovane ili izvedene, leukaforezom. U još jednom izvođenju, leukofereza prati isporuku citokina, iz koštane srži, periferne krvi (PB) ili neonatalne krvi iz pupčane vrpce. U jednom drugom izvođenju, matične ili progenitorske ćelije karakteriše njihova površinska ekspresija na površini antigen markera poznata kao CD34<+>, i isključivanje ekspresije površinske linije antigen markera, Lin-.

[0185] U jednom drugom izvođenju, peptid, supstanca ili vakcina iz ovog pronalaska treba da se isporuči subjektu u vezi sa ćelijama koštane srži. U još jednom izvođenju, isporuka zajedno sa izvođenjem ćelija koštane srži prati prethodno zračenje subjekta, kao deo toka terapije, da bi se potisnuo, onemogućio ili lečio kancer kod tog subjekta.

[0186] U jednom drugom izvođenju, fraza "dovođenje u kontakt ćelije" ili "dovođenje u kontakt populacije" se odnosi na postupak izlaganja, koji može biti, u drugim izvođenjima, direktan ili indirektan. U još jednom izvođenju, takav kontakt obuhvata direktno ubrizgavanje ćelije kroz bilo koja sredstva dobro poznata u ovoj oblasti, kao što je mikroinjekcija. Takođe se predviđa, u drugom izvođenju, da je dovod do ćelije indirektan, kao što je preko obezbeđivanja u podlozi kulture koja okružuje tu ćeliju, ili isporuka subjektu, preko bilo koje rute dobro poznate u ovoj oblasti, i kao što je opisano ovde u tekstu.

[0187] U još jednom izvođenju, generisanje citotoksičnih T limfocita (CTL) opisano ovde je izvedeno in vivo, i sprovodi se uvođenjem u subjekta antigen prezentujuće ćelije dovedene u kontakt in vitro sa peptidom iz ovog pronalaska (Videti na primer Paglia et al. (1996) J. Exp. Med.183:317-322).

[0188] U još jednom izvođenju, peptidi i supstance iz ovog pronalaska su isporučeni antigen prezentujućim ćelijama (APC). U jednom drugom izvođenju, peptidom impulsirane antigen prezentujuće ćelije (APC) treba isporučiti subjektu da izazovu odgovor imunog sistema ili da leče ili onemoguće rast ili ponovnu pojavu tumora.

[0189] U jednom drugom izvođenju, peptidi se isporučuju antigen prezentujućim ćeijama (APC) u obliku komplementarne DNK (cDNA) koja kodira peptide. U jednom drugom izvođenju, pojam "antigen prezentujuće ćelije" (APC) se odnosi na dendritske ćelije (DC), monocite/makrofage, B limfocite ili druge tipove ćelije koji eksprimuju neophodne MHC/kostimulatorne molekule, koji delotvorno omogućavaju prepoznavanje T ćelije iz

4

prisutnog peptida. U drugom izvođenju, antigen prezentujuća ćelija (APC) je ćelija kancera.

[0190] U još jednom drugom izvođenju, citotoksični T limfociti (CTL) se dovode u kontakt sa 2 ili više populacija antigen prezentujućih ćelija (APC). U još jednom izvođenju, 2 ili više populacija antigen prezentujućih ćelija (APC) predstavljaju različite peptide.

[0191] U još jednom drugom izvođenju, tehnike koje vode ekspresiji antigena u citosolu antigen prezentujuće ćelije (APC) (npr. DC) se koriste da isporuče peptide u antigen prezentujuće ćelije (APC). Postupci za eksprimovanje antigena na antigen prezentujućim ćelijama (APC) su dobro poznati u ovoj oblasti. U još jednom izvođenju, te tehnike uključuju (1) uvođenje u antigen prezentujuće ćelije (APC) ogoljene DNK koja kodira peptid iz ovog pronalaska, (2) infekcija antigen prezentujuće ćelije (APC) sa rekombinantnim vektorima koji eksprimuju peptid iz ovog pronalaska, i (3) uvođenje peptida iz ovog pronalaska u citosol antigen prezentujuće ćelije (APC) korišćenjem lipozoma. (Videti Boczkowski D. et al. (1996) J. Exp. Med. 184:465-472; Rouse et al. (1994) J. Virol.68:5685-5689; i Nair et al. (1992) J. Exp. Med.175:609-612).

[0192] U jednom drugom izvođenju, gajene antigen prezentujuće ćelije (APC) kao što su one koje su izvedene iz humane linije ćelije 174xCEM.T2, koje se pominju kao T2, koje obuhvataju mutaciju u svojoj putanji obrade antigena koja ograničava udruživanje endogenih peptida sa molekulima glavnog histokompatibilnog kompleksa (MHC) klase na površini ćelije (Zweerink et al. (1993) J. Immunol.150:1763-1771), se koriste, kao što je ovde primerima objašnjeno.

[0193] U jednom drugom izvođenju, kao što je ovde opisano, subjekat je izložen peptidu, ili supstanci /populaciji ćelije koja obuhvata peptid iz ovog pronalaska, koja se razlikuje od eksprimovanog prirodnog proteina, pri čemu se naknadno razvija unakrsna reaktivnost imunog sistema domaćina sa prirodnim proteinom/antigenom.

[0194] U jednom drugom izvođenju, subjekat, kao što se pominje u bilo kom od postupaka ili izvođenja iz ovog pronalaska je ljudsko biće. U drugim izvođenjima, subjekat je sisar, koji može biti miš, pacov, zec, hrčak, morsko prase, konj, krava, ovca, koza, svinja, mačka, pas, majmun, ili čovekoliki majmuni.

[0195] U jednom drugom izvođenju, peptidi, vakcine, i supstance iz ovog pronalaska stimulišu odgovor imunog sistema što kao rezultat daje lizu ćelije tumora.

[0196] U jednom drugom izvođenju, bilo koji od ovde opisanih postupaka se koristi da izazove citotoksične T limfocite (CTL), koji se izazivaju in vitro. U jednom drugom izvođenju, citotoksični T limfociti (CTL) se izazivaju ex-vivo. U još jednom drugom izvođenju, citotoksični T limfociti (CTL) se izazivaju in vitro. Rezultati citotoksičnih T

4

limfocita (CTL), treba, u nekom drugom izvođenju, isporučiti subjektu, čime se leči stanje povezano sa peptidom, eksprimovanje proizvoda koji obuhvata peptid, ili njegov homolog.

[0197] U jednom drugom izvođenju, opisani postupak povlači uvođenje genetičke sekvence koja kodira peptide iz ovog pronalaska korišćenjem, npr., jedne ili više tehnika isporuke nukleinske kiseline. Nukleinske kiseline iz ovog pronalaska obuhvataju, u nekom drugom izvođenju, DNK, RNK i mešavine DNK i RNK, same ili u vezi sa komponentama nenukleinske kiseline. U još jednom drugom izvođenju, opisani postupak obuhvata isporuku subjektu vektora koji obuhvata sekvencu nukleotida, koja kodira peptid iz ovog pronalaska (Tindle, R. W. et al. Virology (1994) 200:54). U još jednom drugom izvođenju, opisani postupak obuhvata isporuku subjektu ogoljene DNK koja kodira neki peptid, ili u nekom drugom izvođenju, dva ili više peptida iz ovog pronalaska (Nabel, et al. PNAS-USA (1990) 90: 11307). U još jednom drugom izvođenju koriste se, više-epitopne, analogno zasnovane vakcine kancera (Fikes et al, Design of multi-epitope, analoguebased cancer vaccines. Expert Opin Biol Ther.2003 Sep;3(6):985-93).

[0198] Nukleinske kiseline je moguće isporučiti subjektu preko bilo kog sredstva kao što je poznato u ovoj oblasti, uključujući parenteralnu ili intravenoznu isporuku, ili u drugom izvođenju, pomoću genskog pištolja. U jednom drugom izvođenju, nukleinske kiseline koje treba isporučiti u supstanci, koje odgovaraju, u drugim izvođenjima, bilo kom ovde navedenom izvođenju.

[0199] Vektori za upotrebu prema ovom pronalasku mogu da obuhvataju bilo koji vektor koji olakšava ili omogućava ekspresiju peptida iz ovog pronalaska. Vektori obuhvataju, u nekim izvođenjima, oslabljene viruse, kao što je vaccinia (kravlje boginje) ili virus boginja pernate živine i ptica, kao što je opisano u, npr., U.S. Pat. br.4,722,848. U jednom drugom izvođenju, vektor je BCG (Bacille Calmette Guerin), kao što je opisano od strane Stovera i saradnika (Stover et al. (Nature 351:456-460 (1991))). Veoma veliki broj različitih vektora korisnih za terapijsku isporuku ili imunizaciju peptida iz ovog pronalaska, npr. Salmonella typhi vektori i slični, će biti očigledni stručnjacima u ovoj oblasti iz ovde datog opisa.

[0200] U još jednom izvođenju, vektor još kodira imunomodulatorno jedinjenje, kao što je opisano ovde. U još jednom izvođenju, subjektu treba isporučiti dodatni vektor koji kodira isti, istovremeno, pre ili posle isporuke vektora koji kodira peptid iz ovog pronalaska subjektu.

[0201] U još jednom izvođenju, peptide, supstance i vakcine iz ovog pronalaska treba isporučiti subjektu, ili koristiti u terapijama iz ovog pronalaska, u kombinaciji sa drugim antikancernim jedinjenjima i hemoterapeuticima, uključujući monoklonalna antitela usmerena protiv alternativnih antigena kancera, ili, u drugom izvođenju, epitopa koji

4

obuhvataju sekvencu aminokiselina (AA) koja odgovara, ili je deo, nje iz koje se izvode peptidi iz ovog pronalaska.

[0202] Različita izvođenja opsega doze se razmatraju ovim pronalaskom. [mu] se odnosi na mikro; [mu]g se odnosi na mikrogram ili mikrograme. U još jednom izvođenju, doza je 20 [mu]g po peptidu na dan. U još jednom izvođenju, doza je 10 [mu]g/peptida/dan. U još jednom izvođenju, doza je 30 [mu]g/peptida/dan. U još jednom izvođenju, doza je 40 [mu]g/peptida/dan. U još jednom izvođenju, doza je 60 [mu]g/peptida/dan. U još jednom izvođenju, doza je 80 [mu]g/peptida/dan. U još jednom izvođenju, doza je 100 [mu]g/peptida/dan. U još jednom izvođenju, doza je 150 [mu]g/peptida/dan. U još jednom izvođenju, doza je 200 [mu]g/peptida/dan. U još jednom izvođenju, doza je 300 [mu]g/peptida/dan. U još jednom izvođenju, doza je 400 [mu]g/peptida/dan. U još jednom izvođenju, doza je 600 [mu]g/peptida/dan. U još jednom izvođenju, doza je 800 [mu]g/peptida/dan. U još jednom izvođenju, doza je 1000 [mu]g/peptida/dan. U još jednom izvođenju, doza je 1500 [mu]g/peptida/dan. U još jednom izvođenju, doza je 2000 [mu]g/peptida/dan.

[0203] U još jednom izvođenju, doza je 10 [mu]g/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 30 [mu]g/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 40 [mu]g/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 60 [mu]g/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 80 [mu]g/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 100 [mu]g/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 150 [mu]g/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 200 [mu]g/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 300 [mu]g/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 400 [mu]g/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 600 [mu]g/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 800 [mu]g/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 1000 [mu]g/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 1500 [mu]g/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 2000 [mu]g/peptida/dozi.

[0204] U još jednom izvođenju, doza je 10 -20 [mu]g/peptida/dozi. U jednom drugom izvođenju, doza je 20-30 [mu]g/peptida/dozi. U jednom drugom izvođenju, doza je 20-40 [mu]g/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 30 -60 [mu]g/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 40 -80 [mu]g/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 50 -100 [mu]g/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 50 -150 [mu]g/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 100 -200 [mu]g/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 200 -300 [mu]g/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 300 -400 [mu]g/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 400 -600 [mu]g/peptida/dozi. U jednom drugom izvođenju, doza je 500-800 [mu]g/peptida/dozi. U jednom drugom izvođenju, doza je 800-1000 [mu]g/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 1000 -

4

1500 [mu]g/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 1500 -2000 [mu]g/peptida/dozi.

[0205] U još jednom izvođenju, ukupna količina peptida po dozi ili po danu jeste jedna od gore navedenih količina. U još jednom izvođenju, ukupna doza peptida po dozi je jedna od gore navedenih količina.

[0206] Različita izvođenja opsega doze se razmatraju ovim pronalaskom. U još jednom izvođenju, doza je 20 mg po peptidu na dan. U još jednom izvođenju, doza je 10 mg/peptida/dan. U još jednom izvođenju, doza je 30 mg/peptida/dan. U još jednom izvođenju, doza je 40 mg/peptida/dan. U još jednom izvođenju, doza je 60 mg/peptida/dan. U još jednom izvođenju, doza je 80 mg/peptida/dan. U još jednom izvođenju, doza je 100 mg/peptida/dan. U još jednom izvođenju, doza je 150 mg/peptida/dan. U još jednom izvođenju, doza je 200 mg/peptida/dan. U još jednom izvođenju, doza je 300 mg/peptida/dan. U još jednom izvođenju, doza je 400 mg/peptida/dan. U još jednom izvođenju, doza je 600 mg/peptida/dan. U još jednom izvođenju, doza je 800 mg/peptida/dan. U još jednom izvođenju, doza je 1000 mg/peptida/dan. U još jednom izvođenju, doza je 10 mg/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 30 mg/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 40 mg/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 60 mg/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 80 mg/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 100 mg/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 150 mg/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 200 mg/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 300 mg/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 400 mg/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 600 mg/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 800 mg/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 1000 mg/peptida/dozi.

[0208] U još jednom izvođenju, doza je 10 -20 mg/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 20 -30 mg/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 20 -40 mg/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 30 -60 mg/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 40 -80 mg/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 50 -100 mg/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 50 -150 mg/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 100 -200 mg/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 200 -300 mg/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 300 -400 mg/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 400 -600 mg/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 500 -800 mg/peptida/dozi. U još jednom izvođenju, doza je 800 -1000 mg/peptida/dozi.

[0209] U još jednom izvođenju, ukupna količina peptida po dozi ili po danu jeste jedna od gore navedenih količina. U još jednom izvođenju, ukupna doza peptida po dozi je jedna od gore navedenih količina.

4

[0210] U jednom drugom izvođenju, ova prijava opisuje pribor koji obuhvata peptid, supstancu ili vakcinu iz ovog pronalaska. U još jednom drugom izvođenju, pribor još obuhvata oznaku ili umetak unutar pakovanja. U još jednom izvođenju, pribor se koristi za detektovanje za WT1 specifičnog odgovora CD4 kroz upotrebu testa hipersenzitivnosti odloženog tipa. U jednom drugom izvođenju, pribor se koristi za bilo koji ovde nabrojan postupak. U jednom drugom izvođenju, taj pribor se koristi za bilo koji drugi postupak poznat u ovoj oblasti.

PRIMER 1. Materijali i postupci

[0211] Projektovanje peptida. Korišćenjem tri kompjuterski zasnovana algoritma za predviđanje BIMAS (http://www-bimas.cit.nih. gov/cgibin/molbio/ken_parker_comboform), SYFPEITHI (http://www.syfpeithi.de/) i RANKPEP (http://bio.dfci.har- vard.edu/Tools/rankpep.html), epitopi su izabrani za oba CD8 i CD4 T ćelije pokretanjem sa prirodnim WT1 proteinskim sekvencama koje su sposobne da indukuju odgovor imunog sistema kod normalnih donora. Heteroklitički peptidi su projektovani promenom pojedinačne aminokiseline u ostacima sidra prirodnih peptida za klasu I, što je kao rezultat dalo viši stepen predviđenog vezivanja nego kod njegovih prirodnih sekvenci. Peptidi klase II su projektovani dodavanjem prirubnih ostataka na peptide klase I, da bi se istovremeno stimulisale obe ćelije, i CD4 i CD8 T ćelije. Kako je veliki broj sekvenci moguće predvideti algoritmima, ovi modeli ne predviđaju vezivanje na MHC kada su testirani na živim ćelijama u 30% slučajeva (Gomez-Nunez et al. Leuk Res.2006;30(10): 1293-8), samim tim in vitro testiranje jeste neophodno. Pored toga, čak i ako je pokazano vezivanje, odgovor citotoksične T ćelije može izostati, što zahteva dodatnu in vitro studiju.

[0212] Sinteza peptida. Svi peptidi su kupljeni i sintetisani od Genemed Synthesis, Inc. (San Antonio, TX). Peptidi su bili sterilni sa čistoćom od 70% do 90%. Peptidi su rastvoreni u DMSO i razblaženi u slanom rastvoru na 5 mg/mL i čuvani na -80 °C. Kontrolni peptidi koji su korišćeni su: za HLA-DR.B1: JAK-2-izvedeni DR.B1-vezujući peptid JAK2- DR (GVCVCGDENILVQEF; SEK ID BR:59) ili BCR.ABL-izvedeni peptid (IVHSATGFKQSSKALQRPVASDFEP; SEK ID BR:60); za HLA-A0201: peptid izveden iz Juingovog (ewing) sarkoma EW (QLQNPSYDK; SEK ID BR:61) i za HLA-A2402: kod prostate specifičan membranski antigen (PMSA)-izveden peptid 624-632 (TYSVSFDSL; SEK ID BR:62).

[0213] Linije ćelija, citokini i antitela. Humane linije BA25 ćelija leukemije i HL-60 su korišćene kao ciljevi za merenje citotoksičnosti T ćelija. Humani granulocitni faktor stimulacije kolonije makrofaga (GM-CSF), interleukin (IL)-1beta, IL-4, IL-6, IL-15, faktor nekroze tumora (TNF)-alfa i prostaglandin E2 (PGE2) su kupljeni od kompanije R&D Systems (Minneapolis, MN). Beta 2-mikroglobulin (b2-m) je kupljen od Sigma (St. Louis, MO). Antitela korišćena za oglede imunofluorescencije uključujući mAbs na humanim CD3, CD4, CD8, HLA-A2 (klon BB7.2) i izotipne kontrole su dobijeni od kompanije BD Biosciences (San Diego, CA). Pribori izolacije ćeljie za CD14 i CD3 su kupljeni od kompanije Miltenyi Biotec. (Bergisch Gladbach, Germany).

[0214] T2 ogled za vezivanje peptida. T2 ćelije (TAP-, HLA-A0201+) su inkubirane tokom noći na 37°C na 1 x 106 ćelija/ml u RPMI podlozi bez FCS suplementiranoj sa 10ug/ml humanog beta-2m (Sigma, St Louis, MO, USA) u odsustvu (negativne kontrole) ili prisustvu peptida na različitim finalnim koncentracijama (50, 10 i 2 ug/ml). Brefeldin A (Sigma) na 5 ug/ml je dodat u kulture za dva sata inkubacije na kraju. Zatim su T2 ćelije oprane i obojene anti- HLA-A2.1 (BB7.2) mAb konjugovane na FITC tokom 30 min na 4°C i posle toga je usledilo pranje sa puferom za bojenje (PBS plus 1% FBS i 0,02% azida). Ekspresija HLA-A2 na površini ćelije je izmerena protočnom citometrijom na FACScalibur (Becton Dickinson) i analizirana sa FlowJo 9.6.3 softverom.

[0215] In vitro stimulacija i humane T-ćelijske kulture. Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMCs) od zdravih donora tipiziranih humanim leukocitnim antigenom (HLA) je dobijeno pomoću Ficoll (Fikol) centrifugiranja gustine. CD14+ monociti su izolovani pozitivnom selekcijom korišćenjem mAb na humani CD14 spojen sa magnetnim perlicama (Miltenyi Biotec) i korišćeni su za prvu stimulaciju T ćelija. Ćelije CD14 frakcije PBMC su korišćene za izolaciju CD3, negativnom imunomagnetnom separacijom ćelije korišćenjem pribora za izolaciju T ćelije ispiranjem (Miltenyi Biotec). Čistoća ćelija je uvek bila veća od 98%. T ćelije su stimulisane tokom 7 dana u prisustvu RPMI 1640 suplementiranog sa 5% autolognom plazmom (AP), 20 ug/mL sintetičkim peptidima, 1 ug/mL B2-m, i 10 ng/mL IL-15. Monocitno izvedene dendritske ćelije (DC) su generisane iz CD14+ ćelija, kultivisanjem ćelija u RPMI 1640 podlogom suplementiranom sa 1% AP, 500 jedinica/mL rekombinantni IL-4, i 1,000 jedinica/mL GM-CSF.2 i 4. dana inkubacije, sveža podloga sa IL-4 i GM-CSF je ili dodata ili je zamenila polovinu podloge kulture.5. dana, 20 ug/mL peptida klase II je dodato u nezrele dendritske ćelije (DC), za procesiranje ili obradu. 6. dana, dodat je koktel sazrevanog citokina (Dao et al. Plos One 2009; 4(8):e6730). 7. ili 8. dana, T ćelije su ponovo stimulisane sa zrelim dendritskim ćelijama (DC), sa IL-15. U većini slučajeva, T ćelije su stimulisane 3 puta na isti način, korišćenjem bilo dendritskih ćelija (DC) ili CD14+ ćelija kao antigen prezentujućih ćelija (APC). Nedelju

1

dana posle krajnje stimulacije, odgovor T ćelije specifične za peptid je ispitan IFN-g sa enzimom povezan ogled imuno bojenja (ELISPOT) i ispitana je citotoksičnost, pomoću ogleda otpuštanja 51 hrom (Cr).

[0216] IFN-g ELISPOT. HA-Multiscreen ploče (Millipore) su obložene sa 100 uL mišjeg anti-humanog IFN-g antitela (10 Ag/mL; klon 1-D1K; Mabtech) u PBS, inkubirane tokom noći na 4 C, oprane sa PBS da bi se uklonilo nevezano antitelo, i blokirane sa RPMI 1640/10% autolognom plazmom (AP) tokom 2 sata na 37 °C. Prečišćene CD3+ T ćelije (>98% čiste) su raspoređene na ploču sa bilo autolognim CD14+ (10:1 E: APC odnos) ili autolognim dendritskim (DC) (30:1 E: APC odnos). Različiti ispitivani peptidi dodati su u pregrade u količini od 20 ug/mL. Pregrade sa negativnom kontrolom su sadržale autologne plazma ćelije (APC) i T ćelije bez peptida ili sa nerelevantnim peptidima. Pozitivne kontrolne pregrade su sadržale T ćelije plus autologne plazma ćelije (APC) plus 20 ug/mL fitohemaglutinin (PHA, Sigma). Svi uslovi su urađeni u tri primerka. Mikrotitarske ploče su inkubirane tokom 20 sati na 37 °C i zatim su ekstenzivno oprane sa PBS/ 0,05% Tween i 100 ul/pregradi biotinilisano detekciono antitelo naspram humanog IFN-g (2 ug/mL; klon 7-B6-1; Mabtech) je dodato. Ploče su inkubirane tokom dodatna 2 sata na 37 °C i razvoj boja je urađen kao što je opisano (Dao et al., op. cit.). Brojevi boja su automatski određeni upotrebom kompjuterski asistiranog analizatoa slike sa KS ELISPOT 4.0 softverom (Carl Zeiss Vision).

[0217] Ogled otpuštanja<51>hroma. Prisustvo specifičnih citotoksičnih T limfocitnih ćelija (CTL) je izmereno u standardnom ogledu otpuštanja hroma kao što je opisano (Dao et al., op. cit.). Ukratko, ciljne ćelije same, ili impulsirane sa 50 ug/mL ili sintetičkih peptida tokom 2 sata (u nekim slučajevima tokom noći) na 37 °C, su označene sa 50 uCi/miliona ćelija od Na2<51>CrO4 (NEN Life Science Products, Inc.). Posle detaljnog pranja, ciljne ćelije su inkubirane sa T ćelijama sa E: T odnosima u opsegu od 100:1 do 10:1. Svi uslovi su urađeni u tri primerka. Ploče su inkubirane tokom 4-5 sati na 37 °C u 5% CO2. Supernatantni fluidi su pokupljeni i radioaktivnost je izmerena u gama brojaču. Procenat specifične lize je određen iz sledeće formule: [(eksperimentalno otpuštanje - spontano otpuštanje) / (maksimalno otpuštanje - spontano otpuštanje)] x 100%. Maksimalno otpuštanje je određeno lizom radiooznačenih ciljeva u 1% SDS.

PRIMER 2. Vezivanje prirodnih i njegovih analognih peptida na HLA-A0201 i HLA-A2402

[0218] Korišćenjem skupa od 15 mer preklapajućih peptida koji se prostiru na humanom

2

WT1 proteinu da bi se senzitizirale humane T ćelije in vitro, sekvenca 239-248 (NQMNLGATL; SEK ID BR:5; ovde skraćena NQM ili) je nedavno identifikovana kao imunogeni epitop CD8 T ćelije u kontekstu HLA-A2402 (Doubrovina et al., Blood 2012; 123(8):1633-46). Da bi se generisali analogni peptidi sa jačom imunogenošću, rezultati predviđanja prirodnog peptida i mogućih analoza sa različtim supstitucijama aminokiseline na poziciji 2 i 9 (ostataka sidra klase I) su pregledani, korišćenjem tri onlajn dostupne baze podataka (BIMAS, RANKPEP i SYFPEITHI). Predviđeni rezultati vezivanja iz sve tri baze podataka su pokazali bolje vezivanje prirodnog NQMNLGATL (SEK ID BR:5) peptida na HLA-A0201 nego HLA-A2402 molekul (Tabela I). Kada je glutamin na poziciji 2 supstituisan leucinom, rezultat vezivanja na HLA-A2402 je ostao na istom nivou za sva 3 programa predviđanja. Međutim, značajno jači rezultat vezivanja je predviđen za HLA-A0201. Sa druge strane, kada je glutamin na poziciji 2 supstituisan tirozinom, rezultat vezivanja na HLA-A2402 je dramatično poboljšan, što je pokazalo oko 90-struko povećano vezivanje prema BIMAS prognozi. Bilo je predviđanje da će se sva tri peptida rascepiti na C terminusu putem RANKPEP algoritma, što je nagovestilo preradu fragmenta peptida. Rezultat vezivanja je proveren supstitucijom sa različitim aminokiselinama na poziciji 9 ali nijedan od njih nije pokazao značajno poboljšano vezivanje u poređenju sa supstitucijom na poziciji 2. Samim tim, dva analogna peptida NLMNLGATL (SEK ID BR:6; ovde skraćeno NLM ili A24-het-1) i NYMNLGATL (SEK ID BR:7; ovde skraćeno NYM ili A24-het-2) su izabrana za dalje studije.

Tabela 1. Predvidivi rezultati vezivanja peptida na HLA-A0201 i A2402

(nastavak)

Primer 3. Vezivanje peptida na molekule HLA-A0201 i HLA-A2402

[0219] Imunogenost peptida ograničenih glavnim kompleksom histokompatibilnosti (MHC) klase I zahteva sposobnost da se vezuju i stabilizuju molekuli glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) klase I na površini žive ćelije. Pored toga, kompjutersko predviđanje ima preciznost od samo najviše 70%; samim tim, direktno merenje je traženo za jačinu interakcije između molekula peptida i HLA-A0201 korišćenjem uobičajenog ogleda vezivanja i stabilizacije koji koristi HLA-A0201 humane T2 ćelije nedovoljne za transport antigena (TAP2 negativne). T2 ćelije nemaju funkciju TAP i samim tim su neispravne za propisno učitavanje molekula klase I sa antigenim peptidima generisanim u citosolu. Udruživanje egzogeno dodatih peptida sa termolabilnim praznim HLA-A0201 molekulima ih stabilizuje i daje kao rezultat povećanje nivoa površine HLA-A0201 koju može prepoznati specifično anti-HLA-A0201 mAb kao što je BB7.2.

[0220] T2 ogled vezivanja je pokazao da prirodni peptid NQMNLGATL (SEK ID BR:5) nije povećao HLA-A2 ekspresiju na T2 ćelijama (Slika 1, gornji panel). Međutim, NLMNLGATL (SEK ID BR:6) analogni peptid je stabilizovao HLA-A2 molekul pokazavši povećanje zavisno od doze u HLA-A2 ekspresiji, u poređenju sa T2 ćelijama bez peptidnog pulsiranja (Sl. 1 srednji panel). Slično prirodnom peptidu NQMNLGATL, NYMNLGATL (SEK ID BR:7) peptid nije povećao HLA-A2 ekspresiju (Sl.1 donji panel). Ovi podaci su potvrdili HLA-A2 rezultate vezivanja, predviđene računarski zasnovanim algoritmom.

Primer 4. Indukovanje odgovora specifičnog za peptid CD8 T ćelije, kontekst HLA-A0201 i A2402 molekula

[0221] Iako je afinitet za MHC molekule neophodan za prezentovanje peptida, prepoznavanje T ćelije peptida prezentovanog molekulima humanog leukocitnog antigena (HLA) je drugi važan zahtev za dobijanje odgovora specifičnog za peptid. Samim tim, korišćenje in vitro protokola stimulacije, novi sintetički analozi WT1 peptida su procenjeni za njihovu sposobnost da stimulišu za peptid specifičan odgovor T ćelije kod oba donora, i HLA-A0201 i A2402.

[0222] Da bi se proširili za peptid specifični prekursori T ćeije tri do pet in vitro stimulacija su izvedene i specifični odgovor T ćelije je izmeren IFN-g proizvodnjom, kada je podstican pojedinačnim peptidom. NLMNLGATL peptid je indukovao jako IFN-g izlučivanje koje je unakrsno reagovalo sa prirodnim NQMNLGATL peptidom. Pet stimulacija T ćelija je

4

pospešilo odgovor pokazavši više IFN-g mrlja (Sl.2B) nego stimulacija 3 (Sl.2A). T ćelije posle stimulacije 5 sa NLMNLGATL peptidom su takođe testirane za citotoksičnost korišćenjem<51>Cr ogleda otpuštanja. Nije primećeno nikakvo ubijanje naspram HL-60 ćelija koje su bile WT1 pozitivne ali HLA-A2 negativne. Međutim, T ćelije su ubijene sa WT1+i HLA-A0201+ AML linijom ćelije SET-2 i primarnim udarima leukemije izvedenim iz pacijenta koji je HLA-A0201 pozitivan (Sl.3). Utvrđeno je da li bi oba heteroklitička peptida, i NLMNLGATL i NYMNLGATL, mogla da indukuju bolje odgovore CD8 T ćelije kod HLA-A2402 donora. NLMNLGATL peptid bi mogao da indukuje odgovore T ćelije naspram i NLMNLGATL i prirodne NQMNLGATL peptide, ali nema značajnog poboljšanja u poređenju sa odgovorom odgovora T ćelije indukovanog prirodnim NQMNLGATL peptida. Nasuprot tome, NYMNLGATL peptid je indukovao jak odgovor T ćelije naspram samog sebe i prirodnog peptida posle stimulacije 3 (Sl.4A) ali odgovor je odbačen posle 5 ciklusa stimulacije (Sl. 4B), što je takođe pokazalo slabu unakrsnu reaktivnost sa prirodnom sekvencom. Ovi podaci su pokazali da je NLMNLGATL heteroklitički peptid je jak epitop za CD8 T ćelije u kontekstu HLA-A0201 molekula. NYMNLGATL peptid, sa druge strane, je indukovao odgovor CD8 T ćelije kod na HLA-A0201 pozitivnih donora, ali odgovor nije bio značajno bolji od NQMNLGATL peptida.

Primer 5. Indukcija odgovora T ćelije pomoću HLA-DR.B1 peptida koji prepoznaje epitop NQMNLGATL CD8 T ćelije

[0223] Pokazano je da peptid kombinuje oba CD4 i CD8 epitopa je efikasniji od pojedinačnog epitopa klase I za dobijanje delotvornog odgovora imunog sistema za projektovanje vakcine, zbog toga što CD4 T ćelije mogu da pomognu CD8 citotoksičnih T limfocita (CTL) potpunim aktiviranjem DC kroz CD40/CD40L signaliziranje kao i proizvodnjom IL-2 i IFN-g. Pored toga, ako su T ćelije stimulisane sa dužim peptidima, kod kojih su epitopi CD8 T ćelije ll umetnuti, da bi mogli da prepoznaju kratke peptide, to bi potvrdilo preradu epitopa CD8 T ćelije. Samim tim, projektovana su četiri HLA-DR.B1-vezna peptida koja se prostiru na NQMNLGATL i NLMNLGATL epitopima, prema opisanom redosledu:

DR-prirodni-1: cmtwNQMNLGATLkg (SEK ID BR:8)

DR-prirodni-2: wNQMNLGATLkgvaa (SEK ID BR:9)

DR-het-1: cmtwNLMNLGATLkg (SEK ID BR:14)

DR-het-2: wNLMNLGATLkgvaa (SEK ID BR:17)

[0224] Pošto ne postoji definitivni postupak da se predvidi cepanje peptida klase II, dve različite verzije peptida klase II su projektovani korišćenjem BIMAS, SYFPEITHI i RANKPEP algoritama (Tabela 2).

. B

R

-D LA

Htida pep njaiva ezti v ultarezivi vid

Pred 2. ela ab T

[0225] Kada su T ćelije stimulisane sa dva "heteroklitička" DR.B1 peptida na epitopu NLMNLGATL, one su indukovale odgovore T ćelije koji su bili specifični i za kratke i za duge peptide, pokazivanjem IFN-g izlučivanja. Pošto su CD4 peptidi indukovali jači odgovor usled njihove masivne proizvodnje citokina, pozadina je obično viša od stimulacije peptida CD8 T ćelije. Samim tim, iako su oba DR-heteroklitička peptida indukovala specifične odgovore, DR-het-2 peptid je pokazao jasniji odgovor od DR-het-1 peptida kod donora prikazano na Sl.5A. Bilo je očigledno da je DR-het-2 peptid indukovao odgovore koji su bili specifični i za kratke peptide NQMNGATL i NLMNGATL, i za DR-prirodn 2 i het-2 peptide. Što je važnije, odgovori su usmereni naspram ozračene linije ćelije tumora BA-25 (WT1+A2+), ali ne za HL-60 ćelije koje su bile WT1+ but A0201 negativne. Takođe, kada su T ćelije stimulisane kratkim peptidima (NQMNLGATL ili NLMNGATL) ili dugim peptidima kao što je naznačeno na Sl.5B, ubijene su samo BA-25 ali ne i HL-60 ćelije.

Primer 6. Drugi HLA-DR.B1 vezni peptidi koji prepoznaju epitop NQMNLGATL CD8 T ćelije

[0226] Pored DR peptida opisanih gore u tekstu, dodatni HLA-DR.B1-vezni peptidi koji se prostiru na epitopima NQMNLGATL, NLMNLGATL i NLMNLGATL su projektovani i procenjeni (Tabela 3):

Tabela 3. Predvidivi rezultati vezivanja peptida na HLA-DR.B1

PRIMER 7. Generisanje peptida izvedenih iz WT1 onkoproteina koji se vezuju na molekule humanog HLA-B7 klase I i HLA- Dr klase II

[0227] Peptidi su takođe projektovani tako da se vezuju na HLA-B0702 (Tabela 4). Projektovane su sledeće sekvence peptida: RQRPHPGAL (B7-Prirodna 1; SEK ID BR:34), RLRPHPGAL (B7-het-1; SEK ID BR:37), RIRPHPGAL (B7- het-2; SEK ID BR:38), GALRNPTAC (Prirodni 2; SEK ID BR:29), i GALRNPTAL (B7-het-3;SEK ID BR:31). Predvidivi rezultati vezivanja ovih i drugih varijantnih rešenja su prikazani u Tabeli 4. Ovi peptidi su testirani in vitro i stimulišu odgovore heteroklitičke T ćelije (Slika 6). CD3 T ćelije od HLA-B0702 pozitivnog donora su stimulisane sa 2 kompleta peptida (ukupno pet) tokom 5 puta in vitro. Odgovor specifičan za peptid je izmeren pomoću ogleda IFN-gama ELISPOT, naspram pojedinačnog peptida.

[0228] Za prvi komplet peptida, i heteroklitički 1 i heteroklitički 2, su indukovali odgovore specifične za peptid, ali je unakrsna reaktivnost na prirodnom 1 (N1) peptidu bila jača za het-2 nego za het-1 peptid. Za drugi niz peptida, heteroklitički peptid je indukovao jaku IFN-g proizvodnju, kada je izazivan sa stimulacionim peptidom, ali nikakva unakrsna reaktivnost na prirodnoj sekvenci nije utvrđena.

Tabela 4. Predvidivi rezultati vezivanja B7 peptida na HLA-B7 i druge haplotipove.

1

(nastavak)

2

[0229] Na osnovu otkrića da prirodni peptidi RQRPHPGAL (p-125 do -117; SEK ID BR:34) i GALRNPTAC (p-118 do-110; SEK ID BR:29) indukuju odgovore T ćelija u kontekstu HLA-B7 molekula, korišćenjem algoritam za predviđanje vezivanja humanog limfocitnog antigena (HLA), jedan heterokličitički peptid za GALRNPTAC peptid je projektovan (SEK ID BR:31), i dva heteroklitička peptida za RQRPHPGAL (SEK ID BR:37 i 38). Na osnovu prognoze vezivanja, ovi peptidi mogu imati sposobnost stimulacije T ćelija u kontekstu drugih haplotipova humanog leukocitnog antigena (HLA), kao što je: A0201, A0301, B8, B1501, B37 i B5101 (Tabela 4).

PRIMER 8. Generisanje peptida izvedenih iz WT1 onkoproteina koji se vezuju na molekule humanog HLA-B35, A0101, A0301, A1101 klase I i HLA-DR klase II

[0230] Peptid QFPNHSFKHEDPMGQ (p170-182) (SEK ID BR:39) indukuje odgovor T ćelija u kontekstu HLA- DR.B1 0301 i 0401. Kratke sekvence umetnute unutar dugog peptida, HSFKHEDPM, indukuju odgovor T ćelije u kontekstu B3501. Na osnovu predviđanja pomoću algoritama predviđanja vezivanja humanog leukocitnog antigena (HLA), projektovan je jedan heteroklitički dugi peptid, koji je produžetak het-B35-1 kratkog peptida.

[0231] Sekvence peptida su: Peptid klase II: DR.B1-03/04-Prirodni: QFPNHSFKHEDPM (SEK ID BR:42), DR.B1-03/04- Het: QFPNHSFKHEDPY (SEK ID BR:43; peptidi klase I: 1. Prirodni: HSFKHEDPM (SEK ID BR:40), 2. Het-01/03-1: HSFKHEDPY (za A0101 i A0301) (SEK ID BR:41), i 3. Het-03/11-1 HSFKHEDPK (za A0301 i A1101) (SEK ID BR:42). Heteroklitički peptidi za HLA-B3501 haplotip su testirani in siliko (Tabela 5).

Tabela 5. Predvidivi rezultati vezivanja prirodnih peptida na HLA-DR.B1-0301, 0402 i B3501, A0101, A0301 i

A1101.

4

PRIMER 9. Generisanje peptida izvedenih iz WT1 onkoproteina koji se vezuju na molekule humanog HLA-A1, A3, A11 klase I i HLA-DR.B1-0401 klase II

[0232] Peptid KRPFMCAYPGCNK (320-332) (SEK ID BR:44) je pokazao da indukuje odgovor T ćelije u kontekstu HLA-DR.B1 0401. Kratka sekvenca umetnuta unutar dugog peptida, FMCAYPGCN (SEK ID BR:45), indukuje odgovor T ćelije u kontekstu B35, B7 i A0101 (Tabela 6). Rezultati vezivanja su ispitani tih peptida na više haplotipova humanog leukocitnog antigena (HLA) korišćenjem algoritama predviđanja. Projektovan je jedan heteroklitički dugi peptid koji je produžetak het-1 kratkog peptida. Projektovana su dva kratka heteroklitička peptida koja se vezuju bolje na HLA-A0101, 0301 i 1101. Sekvence peptida su: Peptid klase II: DR.B1-04 prirodni: KRPFMCAYPGCNK (SEK ID BR:44), DR.B1-04 het: KRPFMCAYPGCYK (SEK ID BR:46); peptidi klase I: 1. Prirodni: FMCAYPGCN (SEK ID BR:45), 2. DR.B1-04- Het-1 kratki: FMCAYPGCY (za A0101) (SEK ID BR:47), 3. DR.B1-04-Het-2-kratki: FMCAYPGCK (za A0301 i A1101) (SEK ID BR:48). KRPFMCAYPGCYK (SEK ID BR:46) je produžetak DR.B1-04-het 1 kratke, FMCAYPGCN (SEK ID BR:45), kod koje kraj sekvenca CN postaje CY.

Tabela 6. Predvidivi rezultati vezivanja peptida na HLA-DR.B1-0401 i B35, B7, A0101, A0301 i A1101.

PRIMER 10. Dodatne studije unakrsne reaktivnosti

[0233] ELISPOT ogled je izveden korišćenjem donora SA sa 5 stimulacija za Het24-1 (SEK ID BR:6) i Het24-2 (SEK ID BR:7) A24 peptide, u poređenju sa prirodnom sekvencom (SEK ID BR:5). Kao što je prikazano na Slici 7, heteroklitički peptidi generišu odgovore unakrsne reaktivnosti<.>

1

2

4

�

2

4

Claims

Patentni zahtevi

1. Izolovani peptid koji obuhvata sekvencu aminokiseline NLMNLGATL (SEK ID BR:6).

2. Izolovani peptid koji obuhvata sekvencu aminokiseline izabranu iz

CMTWNLMNLGATLKG (SEK ID BR:14), MTWNLMNLGATLKGV (SEK ID BR:15),

TWNLMNLGATLKGVA (SEK ID BR:16), WNLMNLGATLKGVAA (SEK ID BR: 17), i CMTWNLMNLGATLKGVA (SEK ID BR: 22).

3. Izolovani peptid iz patentnog zahteva 1 ili 2, pri čemu se izolovani peptid vezuje na molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I, molekul humanog leukocitnog antigena (HLA) klase II, ili njihovu kombinaciju.

4. Izolovani vezujući peptid klase I obuhvata sekvencu NLMNLGATL (SEK ID BR: 6).

5. Izolovani vezujući peptid klase II koji obuhvata sekvencu aminokiseline izabranu iz

CMTWNLMNLGATLKG (SEK ID BR:14), MTWNLMNLGATLKGV (SEK ID BR:15),

TWNLMNLGATLKGVA (SEK ID BR:16), i WNLMNLGATLKGVAA (SEK ID BR: 17).

6. Molekul nukleinske kiseline koji kodira peptid iz bilo kog od patentnih zahteva 1-5.

7. Vektor, kao što je ublaženi virusni vektor ili Salmonella typhi vektor, obuhvata molekul nukleinske kiseline iz patentnog zahteva 6.

8. Vektor iz patentnog zahteva 7, još obuhvata bilo koji od interleukina 1 do 15, interferon alfa, beta ili gama, faktor nekroze tumora, faktor stimulacije granulocitne-makrofag kolonije (GM-CSF), faktor stimulacije kolonije makrofaga (M-CSF), faktor stimulacije kolonije granulocita (G-CSF), protein koji aktivira neutrofil (NAP), faktor hemoatrakcije i aktivacije makrofaga (MCAF), RANTES, makrofagni inflamatorni peptidi MIP-Ia ili MIP-Ib, komplementna komponenta, ili njihove kombinacije.

9. Farmaceutska supstanca koja obuhvata peptid iz bilo kog od patentnih zahteva 1-5 ili molekul nukleinske kiseline iz patentnog zahteva 6 ili vektor iz bilo kog od patentnih zahteva 7-8, i farmaceutski prihvatljiv nosač, pomoćno farmaceutsko sredstvo sredstvo ili ekscipijent.

10. Vakcina obuhvata jedan ili više izolovanih peptida iz patentnih zahteva 1-5.

11. Vakcina iz patentnog zahteva 10 još obuhvata ćeliju koja predstavlja antigen i/ili adjuvans, razblaživač ili nosač.

12. Vakcina iz patentnog zahteva 10 ili 11 još obuhvata najmanje jedan dodatni iz WT1 izveden peptid.

13. Vakcina iz patentnog zahteva 12, pri čemu pomenuti adjuvans jeste QS21, Frojndov (Freund’s) nepotpuni adjuvans, aluminijum fosfat, aluminijum hidroksid, BCG, alauni, faktor rasta, citokin, hemokin, interleukin, Montanid ISA 51, ili GM-CSF.

14. Farmaceutska supstanca iz patentnog zahteva 9 ili vakcina iz bilo kog od patentnih zahteva 10-13 za upotrebu za lečenje subjekta sa WT1 eksprimujućim kancerom ili smanjenje učestalosti WT1 eksprimujućeg kancera, ili relaps kancera.

15. Farmaceutska supstanca ili vakcina za upotrebu prema patentnom zahtevu 14, pri čemu pomenuti WT1 eksprimujući kancer jeste leukemija, dezmoplastični tumor male okrugle ćelije, kancer želuca, kancer debelog creva, kancer pluća, kancer dojke, tumor ćelije klice, kancer jajnika, kancer materice, kancer tiroidne žlezde, kancer jetre, kancer bubrega, Kapošijev sarkom, sarkom, hepatoćelijski karcinom, Vilmsov (Wilms’) tumor, akutna mijelogena leukemija (AML), mijelodisplazni sindrom (MDS), ili nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC).

16. Farmaceutska supstanca ili vakcina za upotrebu prema patentnom zahtevu 15, pri čemu WT1 eksprimujući kancer jeste mezoteliom.

17. Supstanca koja obuhvata (a) ćeliju koja prezentuje antigen (b) peptid iz bilo kog od patentnih zahteva 1-5 ili molekul nukleinske kiseline iz patentnog zahteva 6 ili vektor iz bilo kog od patentnih zahteva 7-8.

18. Upotreba peptida iz bilo kog od patentnih zahteva 1-5 ili molekula nukleinske kiseline iz patentnog zahteva 6 ili vektora iz bilo kog od patentnih zahteva 7-8 ili vakcine iz bilo kog od patentnih zahteva 10-13 ili supstance iz patentnog zahteva 17 za indukovanje in vitro formiranja i umnožavanja citotoksičnih T limfocita (CTL) specifičnih za ćelije WT1 eksprimujućeg kancera.

19. Upotreba prema patentnom zahtevu 18, pri čemu pomenuti WT1 eksprimujući kancer jeste leukemija, dezmoplastični tumor male okrugle ćelije, kancer želuca, kancer debelog creva, kancer pluća, kancer dojke, tumor ćelije klice, kancer jajnika, kancer materice, kancer tiroidne žlezde, kancer jetre, kancer bubrega, Kapošijev sarkom, sarkom, hepatoćelijski karcinom, Vilmsov (Wilms’) tumor, akutna mijelogena leukemija (AML), mijelodisplazni sindrom (MDS), ili nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC).

20. Upotreba prema patentnom zahtevu 18 ili 19 pri čemu je kancer mezoteliom.