RS61209B1 - Dobijanje plga mikrosfera napunjenih peptidima sa karakteristikama kontrolisanog oslobađanja - Google Patents

Description

Opis

TEHNIČKA OBLAST PRONALASKA

[0001] Prikazani pronalazak se odnosi na dobijanje biodegradabilnih poli (D,L-laktid-ko-glikolid) "PLGA" mikrosfera koje sadrže peptidne farmaceutski aktivne sastojke i kako postići karakteristike kontrolisanog oslobađanja. Posebno, prikazani pronalazak se odnosi na postupak ekstrakcije/isparavanja rastvarača emulzije u kojoj je oslobađanje peptida iz polimernog matriksa kontrolisano temperaturnim profilom u toku koraka isparavanja rastvarača .

STANJE TEHNIKE PRONALASKA

[0002] Peptidni lekovi se uglavnom daju sistemski, npr. parenteralno usled njihove male oralne apsorbcije i visoke nestabilnosti u želudačnim tečnostima. Međutim, parenteralno davanje može biti bolno i izazvati nelagodu, naročito pri ponovljenim dnevnim davanjima. U cilju smanjenje broja injekcija pacijenta, lekovita supstanca se pogodno daje kao depo formulacija. Parenteralno davanje peptidnih lekova kao depo formulacije u biodegradabilnom polimeru, npr. mikrosferama ili implantima, je bilo predloženo omogućavajući njihovo produženo oslobađanje posle zadržavanja u polimeru koji štiti peptid od enzimskih i hidrolitičkih uticaja u biološkom medijumu. Uobičajeni nedostatak depo formulacija je fluktuacija nivoa u plami kao što su visoki nivoi maksimuma koji izazivaju neželjene farmakološke sporedne reakcija zajedno sa nivoima u plazmi blizu nuli u toku celog perioda oslobađanja. Teško je postići terapeutski relevantne nivoe u krvi u toku produženih vremenskih perioda i zadovoljavajuće profile oslobađanja peptida koji su u praksi dobijeni samo u nekoliko slučajeva .

[0003] Identifikovani faktori koji kontrolišu karakteristike oslobađanja peptida parenteralnih depoa u obliku PLGA mikrosfera uključuju peptidni oblik (tj., slobodni peptid, oblik soli), polimerni tip (tj., molekusku masu, odnos laktida prema glikolidu, linearnu ili razgranatu strukturu , krajnju-terminalnu grupu), opterećenje lekom, veličina čestica i poroznost čestica i raspored leka u polimernom matriksu (US 5,538,739).

[0004] Nekoliko komercijalnih formulacija leka u mikrosferama sa dugotrajnim oslobađanjem je dostupno na tržištu. SANDOSTATIN LAR® je komercijalno dostupna parenteralna depo formulacija koja sadrži aktivne peptide oktreotid acetata. On je indikovan za, između ostalog, dugoročnu terapuju pacijenata sa akromegalijom, i lečenje ozbiljne dijareje i napada vrućine u vezi sa malignim karcinoidnim tumorima i vazoaktivnim intestinalnim peptidnim tumorima (vipom tumorima). Odobren u dozama 10, 20 i 30 mg (i do 40 mg za pacijente sa akromegalijom u izvesnim zemljama kao što su US i Japan), Sandostatin LAR® omogućava jednomesečnu intraglutealnu injekciju. Farmakokinetički profil ofoktreotida posle injekcije Sandostatin LAR® odražava se na profil oslobađanja iz polimernog matriksa i njegovu biodegradaciju. Posle jedne i.m. injekcije kod ljudi, koncentracija oktreotida dostiže trenutni početni maksimu u toku 1 sata posle davanja, praćen progresivnim padom na nizak nedetektabilni nivo u toku 24 sata. Posle ovog početnog oslobađanja dana 1, oktreotid ostaje u subterapeutskim nivoima kod većine pacijenata u toku sledećih 7 dana. Posle toga, koncentracija oktreotida ponovo raste i oko dana 14 (oko 2-3 nedelje posle injekcije) doseže nivoe platoa koji su održavani u toku sledeće 3 do 4 nedelje, zatim sledi period pada 6 nedelja (Sažetak karakterisitika proizvoda za Sandostatin LAR® 10 mg, 20 mg ili 30 mg prah i rastvarač za suspenziju za intramuskularnu injekciju, 2013). U saglasnosti sa gore navedenim i prema dostupnim podacima u literaturi očekivani profil oslobađanja Sandostatina LAR kod pacova sledi isti obrazac (AAPS PharmSciTech, Vol.12, No 4 (2011)).

[0005] Postoje brojne tehnike za mikroinkapsulaciju peptida u PLGA mikrosfere. Najšire korišćena tehnika i na labaratorijskoj skali i za komercijalnu proizvodnju uključuje tehniku odvajanje faza/ koacervacije, sušenje raspršivanjem i tehniku isparavanja jednostruke ili dvostuke emulzije/rastvarača (PDA J Pharm Sci and Tech 2008, 62125-154; Microencapsulation Methods and Industrial Applications Second Edition).

1. U tehnici odvajanja faza ili koacervaciji, vodeni rastvarač peptida/proteina je emulgovan ili alternatvino peptid/protein je dispergovan u čvrstom obliku u rastvoru koji sadrži dihlorometan i PLGA. Silikonsko ulje je dodato u disperziju definisanom brzinom, smanjujući rastvorljivost polimera u njegovom rastvaraču. Tečna faza bogata polimerom (koacervat) inkapsulira dispergovne moleukule peptida/proteina, i embrionalne mikrosfere su podvrgnute očvršćavanju i ispiranju korišćenjem heptana. Postupak je veoma osetljiv na osobine polimera, i takođe je važna stavka zaostali rastvarač.

2. U tehnici sušenja raspršivanjem polimer je rastvoren u isparljivom organskom rastvaraču kao što je dihlorometan ili aceton. Protein je suspendovan kao čvrsta supstanca ili emulgovan kao vodeni rastvor u ovom organskom rastvoru homogenizacijom. Posle toga, dobijena disperzija je atomizirana preko (zagrejanog) rasprskivača u zagrejanu vazdušnu struju. Organski rastvarači isparavaju, tako obrazujući mikrosfere sa dimenzijama tipično 1-100 m. Mikrosfere su sakupljene u ciklonskom separatoru. Za kompletno uklanjanje organskog rastvarača, mogu slediti vakuum sušenje ili korak liofilizacije. Unutrašnja struktura dobijenih polimernih mirkosfera zavisi od rastvorljivosti peptida/proteina u polimeru pre nego je raspršen sušenjem vodeći do obrazovanja formulacije proizvoda rezervoara ili matričnog tipa. Kada je inicijalna disperzija rastvor, dobijen krajnji proizvod posle sušenja raspršivanjem je matričnog ili monolitnog tipa, to jest, polimerne čestice sa rastvorenom ili dispergovanom prirodom aktivnog sastojka (definisane kao mikrosfere). Obrnuto, kada je inicijalna disperzija u suspenziji, dobijeni proizvod je rezervoarskog tipa, to jest, izraziti polimerni omotač/ljuska koja inkapsulira tečno jezgro rastvorenog aktivnog sastojka (definisano kao mikrokapsule).

3. Ulje-u-vodi (u/v) i voda-u-ulju-u-vodi (v/u/v) su dva tipa hidratnih tehnika predstavljenih, odgovarajućim obrazovanjem jednostruke i dvostruke emulzije u toku dobijanja mikrosfera. U ovim postupcima, rastvoreni su peptidi/proteini u organskom rastvaraču (npr., alkoholu) ili u vodenom rastvoru i zatim pomešani ili emulgovani sa organskim rastvorom (nemešljivim sa vodom) polimera da obrazuje odgovarajući rastvor ili emulzija voda-u-ulju (v/u). Dihlorometan služi kao organski rastvarač za PLGA i u/v primarna emulzija je obrazovana korišćenjem ili homogenizacijom sa visokim smicanjem ili ultra zvukom. Ova primarna emulzija je zatim brzo premeštena u višak vodenog medijuma koji sadrži stabilizator, uglavnom polivinil alkohol (PVA). Ponovoljena homogenizacija ili intenzivno mešanje je neophodno da se inicijalno obrazuje dvostruka emulzija v/u/v. Naknadno uklanjanje (isparavanjem) organskog rastvarača toplotom, vakuumom ili oboje dovodi do odvajanja faza polimera i jezgra da bi se dobile mikrosfere. Umesto isparavnja rastvarača, ekstrakcija rastvarača sa velikim količinama vode sa ili bez stabilizatora mogu takođe biti korišćene da bi se dobile mikrosfere koje sadrže peptid/protein. Mada izgleda da su tehnike mikroinkapsulacije v/u/v konceptualno jednostavne za izvođenje, postupak obrazovanja čestica je dosta komplikovan, i mnoštvo parametara postupka imaju uticaj na ili utiču na osobine PLGA mikrosfera napunjenih sa peptidom/proteinom.

[0006] Do sada temperaturni profil koji je primenjen u toku koraka isparavanja u tehnici isparavanja emulzija/rastvarača nije bio identifikovan kao kritični parametar postupka koji utiče na karakteristike oslobađanja peptida iz polimerne matrice. Nasuprot tome, obrada na konstantim temperaturama nešto iznad tačke ključanja organskog rastvarača se generalno primenjuje (ili malo iznad pritiska pare rastvarača kada je primenjen smanjeni pritisak/vakuum da se ubrza isparavanje rastvarača).

[0007] Tipičan mehanizam oslobađanja za ove tipove formulacija uključuje tri faze koje mogu biti generalno predstavljene kao inicijalna faza oslobađanja (faza 1), hidrataciona faza (faza 2), i faza primarnog oslobađanja (faze 3) koja je kontrolisana difuzijom, ali je olakšana erozijom polimerne matrice. Oslobađanje leka počinje posle vremena kašnjenja kada moleulska masa polimera pada ispod kritične vrednosti i tako može doći do gubitka mase (Faisant N, Siepmann J, Benoit JP. PLGA-based microspheres: elucidation of mechanisms and a new, simple mathematical model quantifying drug release. Eur J Pharm Sci. 2002 May; 15(4):355-66; Körber M. PLGA erosion: solubility-or diffusioncontrolled? Pharm Res.2010 Nov; 27(11):2414-20).

[0008] WO 2005/110369 opisuje postupak za dobijanje PLGA mikrosfera napunjenih sa oktreotidom koje sadrže PLGA u dihlorometanu, rastvaranje oktreotid acetata u metanolu, mešanje da se obrazuje emulzija i na kraju isparavanje rastvarača kontrolisanjem temperature i povećavanjem za 42°C.

[0009] US 2010/0086591 opisuje postupak proizvodnje niskim raspršivanjem PLGA mikrosfera oktreotida . PLGA je rastvoren u dihlorometanu, oktreotid je rastvoren u metanolu, pomešani su da obrazuju emulziju, koncentrovana supsenzija je isprana sa vodom na temperaturi okoline i zatim uparena povećavanjem temperature vode za ispiranje do 34-37°C. US 2011/0262545 opisuje depo formulacije koje sadrže oktreotid.

[0010] Postoji potreba u stanju tehnike za poboljšanim postupkom proizvodnje za kontrolisanje profila oslobađanja peptidne lekovite supstance iz polimerne matrice mikrosfera.

SUŠTINA PRONALASKA

[0011] Prikazani pronalazak se odnosi na tehniku isparavanja jednostruke ili dvostruke emulzije/rastvarača za dobijanje PLGA mikrosfera sa produženim oslobađanjem peptidnih lekova, posebno oktreotida, gde je oslobađanje peptida iz polimerne matrice kontrolisano temperaturnim profilom primenjenim u toku koraka isparavanja rastvarača. Drugi peptidi uključuju; eksenatid, leuporelin, goserelin, liraglutid i teduglutid. Specifično, pronalazak se odnosi na postupak prema zahtevu 1.

[0012] U jenom aspektu, prikazani pronalazak se odnosi na postupak u kome korak isparavanja rastvarača je izveden pod kontrolisanom temperaturom koja raste tokom temperature koraka isparavanja da bi došlo do očvršćavanja mikrosfera. Dobijene mikrosfere su sakupljene prosejavanjem, isprane i na kraju osušene u vakuumu u filter sušaču da se obezbedi prah sa dobim protočnim osobinama.

[0013] Ovde je opisan postupak za dobijanje poli(D,L laktid-ko-glikolid) polimernih mikrosfera peptida, pri čemu peptidi mogu takođe biti u obliku farmaceutski prihvatljive soli, koji obuhvata:

a. rastvaranje peptida, ili njegove soli, u bar jednom organskom rastvaraču koji se meša sa vodom, i opciono takođe sadrži vodu, da bi se obazovala vodena faza;

b. obrazovanje emulzije ulja-u-vodi ili vode-u-ulju-u-vodi u pogodnoj uljanoj fazi koja sadrži organski rastvor poli(D,L laktid-ko-glikolid) polimera, rastvor je nemešljiv sa vodenom fazom;

c. isparavanje bar jednog organskog rastvarača korišćenog pod a. iz emulzije da bi se obrazovale mikrosfere kontrolisanjem temperature u toku koraka isparavanja i povećavanje temperature u toku koraka isparavanja.

[0014] U daljem aspektu, karakteristike oslobađanja mikrosfera, prema obezbeđenim in-vitro i in vivo podacima, su kontrolisane stepenom povećavanja temperature u toku koraka isparavanja rastvarača. Određenije, temperatura u toku isparavanja rastvarača povećavanjem temperature od polazne temperature od oko 15 do 25°C, poželjno oko 20°C. Poželjno maksimalna postignuta temperatura je do 38°C ili 38°. Temperatura je podignuta u toku vremenskog perioda od 20 min do 3 sata. Sušenje se može nastaviti u produženom periodu posle perioda podizanja temperature. Poželjno stopa temperaturnog porasta je 0.1°C/min -1°C/min. Temperaturni rast moće biti konstantan u toku perioda ili u etapama. Pod etapom mi mislimo da je svaka promena u temperaturi etapa i zatim je temperatura održavana u toku perioda pre sledeće promene. Takođe mogu biti mešovite promene u etapama i konstantoj temperaturi u toku koraka isparavanja.

[0015] Pod izrazom "karakteristike oslobađanja" mi smatramo profil oslobađanja formulacija u postupku koji je u korelaciji sa in vivo PK profilom formulacija kod pacova posle pojedinačne intramuskularne injekcije. U jednom aspektu, tip A in vitro in vivo korelacije je ustanovljen između in vitro profila rastvaranja i in vivo profila rastvaranja kako je izračunat iz dekonvulzije koncentracionih krivi u plazmi primenom modela jedne komponente. Određenije, "profil rastvaranja" odnosi se na količinu ili sadržaj oktreotida koji je oslobađan iz mikrosfera kao funkcija vremena u prihvatljivom puferu 1 mM pH 4.0 na 37°C.

[0016] Karakteristike oslobađanja su izražene sa inicijalnim istiskanjem (faza 1), vremenom zadržavanja (faza 2) i trajanjem i nagibom faze primarnog oslobađanja (faza 3). Određenije, profil rastvaranja je uklapan u sledeću jednačinu gde se konstanta yoodražava inicijalno istiskivanje, konstanta xoodražava vreme kašnjenja i konstante a i b opisuju fazu primarnog oslobađanja.

[0017] Prikazani opis se odnosi na postupak isparavanja emulzije (jednostruke ili dvostruke)/rastvarača za dobijanje PLGA mikrosfera koje sadrže farmaceutski aktivan peptid u kome stopa povećanja temperature u toku koraka isparavanja rastvarača je korišćena kao kontrola karakteristika oslobađanja zarobljenog peptida. Određenije, stopa temperaturnog porasta u toku faze isparavanja rastvarača je korišćena za kontrolu vremena kašnjenja profila oslobađanja peptida koji je izražen izračunavanjem konstante xoprofila rastvaranja mikrosfera. Vreme kašnjenje profila oslobađanja dobijenih mikrosfera je testirano u acetatnom puferu 1 mM pH 4.0 na 37°C.

[0018] Određenije, tehnika isparavanja jednostruke emulzije/rastvarača uključuje sledeće korake (Slika 1):

i. Oktreotid je rastvoren u odgovarajućoj količini rastvarača, poželjno metanola

ii. Poli(D,L-laktid-ko-glikolid) polimer je rastvoren u dihlorometanu i rastvor je ohlađen na 10°C ili ispod, poželjno 5°C ili ispod.

iii. Dva rastvora su mešana zajedno uz intenzivno mešanje da bi se obrazovala dispergovana pomenuta uljana faza.

iv. Vodena, pomenuta kontinualna faza je napravljena rastvaranjem dinatrijum hidrogen fosfata i kalijum dihidrogen fosfata u PVA rastvoru i ohlađena na 10°C ili ispod , poželjno 5°C ili ispod.

v. Dispergovane i kontinualne faze su zajedno pomešane, poželjno pomoću in-line raspršivača sa visokim smicanjem, obrazovanjem polučvrstih mikrosfera željene raspodele veličina čestica. Protok kontinualne faze je postignut sa peristaltičkom pumpom dok se protok konstantne brzine postiže špric pumpom

vi. Obrazovane mikrosfere su prenete od izlaza u pogodan sud kontrolisan na između 15 i 25°C, poželjno oko 20°C, uz mešanje

vii. Očvršćavanje mikrosfera je postignuto postepenim povećavanjem temperature kao što je ovde opisano

viii. Posle nekoliko sati ukupnog sušenja, oko 4, osušene mikrosfere su premeštene u filter sušač

ix. Čestice su isprane u filter sušaču sa vodom, poželjno na sobnoj temepraturi, i posle isušivanja mikrosfere su ostavljena da se osuše u toku bar 12 sati, poželjno 24 sata, poželjno pod vakuumom od 10 mbar i blago mešane.

[0019] Prema tome, tehnika dvostrukog isparavanja emulzije/rastvarača uključuje sledeće korake (slika 2):

i. Oktreotid je rastvoren u odgovarajućoj količini vode

ii. Poli(D,L-laktid-ko-glikolid) polimer je rastvoren u dihlorometanu i rastvor je ohlađen na 10°C ili ispod, poželjno 5°C ili ispod.

iii. Dva rastvora su emulgovana, poželjno na 20.000 oum u toku 1 minuta pomoću digitalnog T25 ULTRA-TURRAX gore montiranog disperzera koji obrazuje dispergovanu pomenutu uljanu fazu i hlađena na 10°C ili niže, poželjno 5°C ili niže.

iv. Vodena kontinualna faza je napravljena rastvaranjem dinatrijum hidrogen fosfata i kalijum dihidrogen fosfata u PVA rastvoru i ohlađena na 10°C ili ispod, poželjno 5°C ili ispod.

v. Dispergovane i kontinualne faze su zajedno pomešane, poželjno pomoću in-line raspršivača sa visokim smicanjem, obrazovanjem polučvrstih mikrosfera željenog rasporeda veličina čestica. Protok kontinualne faze je postignut sa peristaltičkom pumpom pri čemu je protok konstantne brzine postignut sa špric pumpom

vi. Obrazovane mikrosfere su prenete od izlaza u reakcioni sud koji je kontrolisan između 15 i 25°C, poželjno oko 20°C, uz mešanje

vii. Očvršćavanje mikrosfera je postignuto postepenim povećavanjem temperature kako je ovde opisano

viii. Posle nekoliko sati ukupnog sušenja, oko 4, osušene mikrosfere su prenete u filter sušač ix. Čestice su isprane u filter sušaču sa vodom, poželjno na sobnoj temperaturi, i posle isušivanja mikrosfere su ostavljene da se suše u toku bar 12 sati, poželjno 24 sata, poželjno pod vakuumom od 10 mbar i blago mešane.

KRATAK OPIS SLIKA NACRTA

[0020]

Slika 1a: Šematski dijagram postupka dvostrukog emuglovanja

Slika 1b: Šematski dijagram postupka jednostrukog emulgovanja

Slika 2a: Grafik rasporeda veličina čestica za formulacije 1a-1c

Slika 2b: Grafik rasporeda veličina čestica za formulacije 2a-2c

Slika 3a: Slike SEM i poprečnog preseka SEM za formulacije 1a-1c

Slika 3b: Slike SEM i poprečnog preseka SEM za formulacije 2a-2c

Slika 4a: Profili uporednog rastvaranja Sandostatina LAR i formulacija 1a-1c

Slika 4a: Profili uporednog rastvaranja Sandostatina LAR i formulacije 2a-2c

Slika 5: Profili koncentracije u plazmi pacova Sandostatina LAR i formulacija 1a i 2c

Slika 6a: Upoređivanje in vivo primećenih i naknadno izračunatih koncentracija u plazmi Sandostatin LAR

Slika 6b: Upoređivanje primećenih i naknadno izračunatih koncentracija u plazmi formulacije 1a

Slika 6c: Upoređivanje primećenih i predviđenih koncentracija u plazmi formulacije 2c

DETALJI OPIS PRONALASKA

[0021] Prikazani pronalazak obezbeđuje formulaciju sa produženim oslobađanjem oktreotid acetata sa karakteristikama oslobađanja kontrolisanim kontrolisanjem i povećavanjem temperature u toku koraka isparavanja rastvarača postupka proizvodnje prema zahtevu 1.

[0022] Oktreotid (takođe poznat kao (4R,7S,10S,13R,16S,19R)-19-[(2R)-2-amino-3-fenilpropanamido]-10-(4-aminobutil)-16-benzil-N-[(2R,3R)-1 ,3-dihidroksibutan-2-il]-7-(-(1-hidroksi etil)-13-(1H-indol-3-ilmetil)-6,9,12,15,18-pentaokso-1,2-ditia-5,8,11,14,17-pentaazacikloikozan-4-karboksamid, poželjno u obliku acetatne soli (ili bilo koje druge farmaceutski prihvatljive soli ) ili je takođe poznat kao 4D-fenilalanil-L-cisteinil-L-fenilalanil-D-triptofil-L-lizil-L-treonil-N-((1R,2R)-2-hidroksi-1-(hidroksimetil)propil)-L-cisteinamid ciklični (2-7)-disulfid acetat (so) ili L-Cisteinamid-D-fenilalanil-L-cisteinil-L-fenilalanil-D-triptofil-L-lizil-L-treonil-N-(2-hidroksi-1-(hidroksimetil)propil)-ciklični(2-7)disulfid (R-(R∗,R∗)), acetat (so)) je sintetički oktapeptid (DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol) analog hormona somatostatina koji se javlja u prirodi, i odobren je za upotrebu u kontroli tumora kod neuroendokrinih poremećaja kao što su akromegalija i gastroenteropankreasni neuroendokrini tumori. Hemijska struktura oktreotid acetata je prikazana dole:

[0023] Pogodni komercijalno dostupni polimeri za upotrebu u dobijanju PLGA mikrosfera prema prikazanom pronalasku uključuju RESOMER® i LAKESHORE BIOMATERIALS od Evonik Industries AG, Expansorb® od PCAS., PURASORB® od PURAC Biochem BV. PLGA polimeri korišćeni u prikazanom pronalasku mogu imati odnos mlečne kiseline i glikolne kiseline u opsegu oko 50:50 do oko 65:35 i prosečne molekulske mase (Mm) u opsegu od 10,000 do 70,000. Poželjno prikazani pronalazak koristi PLGA koji ima odnos monomera 50:50 i prosečnu molekulsku masu u opsegu od 30,000 -50,000.

[0024] Organski rastvarači koji mogu biti korišćeni za PLGA u prikazanom pronalasku uključuju etilacetat, tetrahidrofuran, acetonitril, dihlorometan, heksafluoroizopropanol, hloroform i aceton. Poželjnije, u prikazanom pronalasku korišćen je dihlorometan. Koncentracija polimera u organskom rastvaraču je 10-40% mas., poželjnije 20-30% mas.

[0025] U prikazanom pronalasku oktreotid acetat je rastvoren u pogodnom organskom rastvaču koji se meša sa vodom, poželjno metanolu, da bi se došlo do koncentracije 5-20% mas., poželjnije 10% mas. Korišćen je opciono organski rastvarač koji se meša sa vodom.

[0026] Za dobijanje dispergovane faze, rastvor oktreotid acetata je dispergovan u rastvoru polimera korišćenjem disperzera sa visokim smicanjem u šaržnom režimu pri brzini smicanja od 15,000 -30,000 s<-1>. Poželjnije, primenjena je brzina smicanja 20,000 -25,000 s<-1>. Alternativno, rastvor oktreotid acetata u metanolu je dodat u rastvor polimera koji je mešan. Disperovana faza je kontrolisana na temperaturi nižoj od 20°C, poželjnije 5 -10°C.

[0027] U prikazanom pronalasku kontinualna faza se sastoji od vodenog rastvora sa površinski aktivnim sredstvom, poželjno polivinil alkoholom (PVA). Primeri drugih površinski aktivnih supstanci koje opciono mogu biti korišćene uključuju jedan ili više; anjonski površinski aktivnih supstanci (kao što su, natrijum oleat, natrijum stearat ili natrijum lauril sulfat), nejonska površinski aktivna sredstva (kao što su, Poloksameri, Tweens), polivinilpirolidon, natrijum karboksimetil celuloza i želatin, korišćeni pojedinačno ili u kombinaciji. PVA, poželjno ima prosečnu molekulsku masu od oko 10,000 do oko 150,000 Da što odgovara opsegu viskoznosti od 3-9 cP kada se meri kao 4% vodeni rastvor na 20°C, 85-89% stepeni hidrolize i estarskom broju 130-150. Izabrani PVA kvalitet koji je korišćen u prikazanom pronalasku obuhvata Emprove PVA 4-88 (Mw 25,000-30,000; viskoznost 4% u vodi: 3.4-4.6 cPs), PVA 8-88 (Mm oko 65,000; viskoznost 4% u vodi 6.8-9.2 cPs) i PVA 18-88 (Mm oko 130,000; viskoznost 4% u vodi) dostupne kod Merck KGaA. Količina površinski aktivnih sredstava koja je dodata u vodenu fazu je poželjno do 5.0% (mas/mas) relativno u odnosu na masu vodenog rastvora. Poželjnije količina površinski aktivnog sredstva (optimalno PVA količina) je od oko 0.5 do oko 2.5 % mas/mas. Kontinualna faza je termostatirana na temperaturi koja je niža od 20°C, poželjnije 5 -10°C.

[0028] U prikazanom pronalasku emulgovanje vodene faze u konitualnoj uljanoj fazi je izvedeno sa jednim od sledećih sredstava: i) mehaničkim mešanjem, ii) šaržnim disperzerom iii) disperzerom u liniji. Poželjno, postupak emulgovanja se odvija u in-line disperzeru MT-3000 dostupnom kod Kinematica koji radi na brzini smicanja 5,000 -20,000 s<-1>, poželjnije u ospegu od 10,000 -15,000 s<-1>da dovede do obrazovanja mikrosfera od 10-250 μm, poželjnije 20-100 μm. Maseni odnos između dispergovane i kontinualne faze u toku je 1:20 -1:150, još poželjnije 1:75 -1:100.

[0029] Obrazovana suspenzija mikrosfera je premeštena (od izlaza u in-line disperzer) u pogodan sud (po mogućnosti izolovani da bi se pomogla kontrola temperature) koja je inicijalno kontroliše iznad 15°C, poželjno na oko 20°C. Temperatura u toku isparavanja rastvarača je povećana od polazne temeprature od oko 15 do 25°C, poželjno oko 20°C. Poželjno maksimalna postignuta temepratura je do 35°C ili 38°C. Temperatura je podignuta u vremenskim periodima od 20 min do 3 sata. Sušenje se može nastaviti u produženom periodu posle perioda podizanja temperature.

[0030] Stopa podizanja temperature je 0.1°C/min -1°C/min. Porast temperature može biti konstantan u toku perioda ili u etapama. Pod etapama mi mislimo na svaku promenu u koraku promene temperature i zatim da je temperatura održavana u toku perioda pre sledeće promene. Takođe mogu biti mešovite promene u etapama i konstantoj temperaturi u toku koraka isparavanja.

[0031] Isparavanje rastvarača iz mikrosfera se odvija u skladu sa primenjenim temperaturnim profilom uz mešanje i parcijalni vakum, poželjno je da je parcijalni vakum malo ispod napona pare dihloromentana.

[0032] Posle isparavanja rastvarača čvrste čestice su sakupljene iz suspenzije u filter sušaču uz lagano mešanje . Poželjno, korišćen je filter sušač od PSL (Powder System Limited). Sakupljene čestice su isprane sa vodom i zatim osušene u filter sušaču primenom vakuuma od oko 10 mbar.

[0033] Dobijene mikrosfere su analizirane u odnosu na veličinu čestice, napunjenost lekovima, molekulsku masu polimera, zaostali rastvarač i in vitro oslobađanje kao što je dole opisano. Rezultati su ukratko dati u tabelama 1 i 2 i takođe na slikama 3-4. Izabrane formulacije (tj., 1a i 2c) zajedno sa referentim proizvodom Sandostatinom LAR su testirane na pacovima da se ustanovi in vitro in vivo model korelacije. Podaci PK ispitivanja i primenjene metodologije za razvoj i eksterno su dati u nastavku . In vivo rezultati su obezbeđeni na slikama 5-6.

Analiza rasporeda veličina čestica (PSD)

[0034] Raspored veličina čestica je meren difrakcijom lasera pomoću Malvern Master Sizer 2000 Hidro2000S. Srednja veličina čestica je izražena kao srednji prečnik zapremine u mikronima.

Određivanje napunjenosti lekom

[0035] Oko 50 mg mikrosfera je potpuno rastvoreno u 10 ml metilen hlorida (30 min podvrguto ultra zvuku).20 ml 0.1M acetatnog pufera (pH 4.0) je dodato u rastvor za ekstrakciju oktreotida u vodenoj fazi. Dve faze su potpuno pomešane vorteksom u toku 5 min zatim odvojene centrifugiranjem na 4000 oum u toku 5 min. Vodena faza je uzorkovana za HPLC analizu da se izmeri sadržaj oktreotida. Uzorak je proceđen kroz filter za špric od 0.45 μm pre analize. HPLC uslovi su bili kao što sledi: gradijentno razvdajanje je izvedeno sa kolonom Inertsil ODS3 (4.6x250 mm, veličina čestica 5 μm); mobilna faza se sastojala od 0.1% trifluorosirćetne kiseline (TFA) u destilovanoj vodi (eluent A) i 0.1% TFA u acetonitrilu (eluent B) i propuštan je linearni gradijent od 20% do 35% eluenta B u toku 18 min. Brzina protoka je bila 1.0 ml/min, injekciona zapremina je bila 10 μl i talasna dužina za detekciju je bila 210 nm.

Merenje prosečne molekulske mase

[0036] Molekulska masa mikrosfera je određena gel permeacionomm hromatografijom (GPC) pomoću Agilent Model GPC 50Plus sistema snabdevenog sa 2 kolone PLgel 5 μm mešovitog-D 300 X 7.5 mm povezanih u serije i detektorom indeksa prelamanja (eng. refractive index - RI). Mobilna faza je THF sa brzinom protoka 1 ml/min i temperatura kolone je 30oC. Za analiziranje uzorka, 10-15 mg mikrosfera je rastvoreno u 5 mL THF i rastvor je ostavljen preko noći da se meša.2 ml je uzeto, proceđeno kroz 40 μm PTFE filtere i analizirano. Injekciona zapremina je 100 μL. Sakupljane podataka i analiza su izvedeni pomoćug Cirrus softvera. Standardi polistirena sa MM u opsegu između 162 i 371100 su bili korišćeni za kalibraciju.

In vitro postupak oslobađanja

[0037] Oko 150 mg formulisanih mikrosfera je smešteno u bočicu od 100 ml i inkubirano u 30 ml acetatnog pufera (ImM, pH 4.0) na 37°C u kupatilu za mućkanje (85 oum). Medijum za oslobađanje je uzorkovan u različitim tačkama , proceđen kroz špric filter od 0.45 μm i analiziran pomoću HPLC. HPLC uslovi su bili kao što sledi: gradijentno razvdajanje je izvedeno na Inertsil ODS3 koloni (4.6x250 mm, veličina čestica 5 μm); mobilna faza se sastojala od 0.1% trifluorosirćetne kiselne (TFA) u destilovanoj vodi (eluent A) i 0.1% TFA u acetonitrilu (eluent B) i propušten je linerani gradijent od 25% do 35% eluenta B u toku 25 min. Protok je bio 1.0 ml/min, injekciona zapremina je bila 10 μl i talasna dužina za detekciju je bila 210 nm.

Zaostali rastvarači (dihlorometan)

[0038] Ispitivano je da li su etanol i/ili metilen hlorid uklonjeni iz mikro-čestica oktreotida. Mikročestice su totalno rastvorene u dimetilsulfoksidu (DMSO). Prema tome, koncentracije etanola i metilen hlorida u organskom rastvaraču su kvantifikovane gasnom hromatografijom (GC). Količina 90 mg svežih mikročestica je rastvorena u 5 mL dimetil sulfoksida u GC fioli pre GC analze gornjeg prostora. Isparavanje zaostalih rastvarča je postignuto inkubacijom od 30 min. uzorka na 100°C u GC peći. GC analiza je izvedena sa GC-2010 plusom (Shimadzu, Japan). Korišćena je kolona RTX-5 (RESTEK, USA) za analize pomoću Crossbonda 5% difenil/ 95% dimetil polisiloksana kao stacionarne faze . Kvalitet rastvarača je meren korišćenjem kalibracionih kriva standarda . Vreme zadržavanja dihlorometana je 5.75min

1

Ispitivanje na životinjama

[0039] Formulacije mikrosfera posle mešanja sa kristalnim manitolom (tj., 17% manitola u odnosu na ukupnu masu) su podvrgnute sterilizaciji uz UV zračenje na 365 nm u toku 180 min pomoću 6 Watt UV svetlosnog izvora koji se koristi u farmakokinetičkim ispitivanjima na muškim Sprague-Dawley pacovima. Pacovi (šest po grupi) koji su težili oko 240-250 grama i starosti od 8 -12 nedelja su injekotvani sa formulacijama koje se testiraju. Pre injekcije, uzorci suvog praha su suspendovani u sterilnom rastvaraču (nosaču) koji se sastoji od vode za injekciju, natrijum karboksimetilceluloze 0.5% mas. i manitola 0.6% mas. Životinjama se daje jedna intramuskularna injekcija u fiksnoj dozi od oko 60 mg oktreotida u formulaciji (mikrosfera)/pacovu koja odgovara 3 mg oktreotida aktivne supstance /pacovu u zapremini 0.25 ml/pacovu nosača, na jedno mesto. Suspenzija je davana pomoću hipodremijske igle od 26G intramuskularno u kvadriceps pacova koji je smešten na kranijalnu butnu kost. Uzorci krvi pacova su sakupljeni pre doziranja leka i posle toga u prethodno određenjim vremenskim tačkama uključujući 0.5 h, 1 h, 2 h, 6 h, 24 h, dan 3, 7, 14, 18, 21, 28, 35, 42, 49, 56 i dan 70 posle doze. U svakoj vremenskoj tački, približno 0.5 ml krvi je bilo uzeto iz retro-orbitalnog pleksusa pod blagom anestezijom izoflurana i premešteno u obeležene epruvete koje sadrže 200 mM K2EDTA kao antikoagulanta i promešani manualnom inverzijom u toku 4-5 puta. Uzorci krvi su održavani na vlažnom ledu sve vreme i plazma je odvojena centrifugiranjem u toku 1 h od sakupljanja uzorka. Uzorci plazme su čuvani ispod -60°C do bioanaliza pomoću validiranih LC-MS/MS postupaka.

In vitro in vivo korelacija

[0040] Za razvijanje IVIVC modela, praćene su donje procedure: (1) odabir formulacija sa različitim brzinama oslobađanja uključujući Sandostatin LAR, formulaciju 1a i formulaciju 2c, (2) merenje in vitro profila rastvaranja različitim postupcima rastvaranja , (3) merenje PK in vivo proifla koncentracije u plazmi formulacija (tj., Sandostatin LA, formulacija 1a i formualcija 2c) posle pojedinačnog intramuskularnog davanja pacovima , (4) procene in vivo profila oslobađanja izmerenim profilima koncetracije u plazmi pomoću Wagner-Nelson-ove (modela jednog odeljka) dekonvulacione tehnike , (5) izračunavanje korelacije između dekonvulzije in vivo profila oslobađanja i in vitro profila rastvaranja pomoću sakupljenih podataka za Sandostatin LAR i formulaciju 1a, (6) odabiranje odgovarajućeg postupka rastvaranja sa višim korelacijama prema in vivo podacima i ustanovljanje IVIVC primenom linearne regresione analize (6) unutrašnje validacije ustanovljenog modela upoređivanjem profila naknadno izračunatih koncentracija u plazmi korišćenjem Wagner-Nelson-ovog konvulzionog modela za formulaciju Sandostatin LAR i formulaciju 1a i (7) spoljašnja validacije ustanovljenog modela upoređivanjem predviđenih koncentracija u plazmi izračunatih in vitro profilom rastvaranja formulacije 2c i postavljenog modela i primećenog profila in vivo koncentracije u plazmi formualcije 2c.

Primer 1a -c (jednostruka emulzija) (nije prema patentim zahtevima)

[0041] 4 g poli(D,L-laktid-ko-glikolida) sa molekulskim odnosom 50:50 (Mm = 41,000 i polidisperznost ca 1.65), komercijalno dostupnog pod PURAC pod imenom PURASORB 5004A, je rastvoreno u 30 g dihlorometana uz mešanje magnetnom mešalicom . Polimerni rastvor je ohlađen na 5°C. 0.2941 g oktreotid acetata je rastvoreno u 0.5882 g vode za injekciju uz mešanje . Rastvor oktreotid acetata je dodat u polimerni rastvor i emulgovan pomoću Ultra Turrax® u toku 1 minuta na 20,000 oum da se obrazuje prva emulzija (DF-disperzna faza ). 11.5 g poli(vinil alkohola) EMROVE® 18-88 od Merck je rastvoreno u 2307 g vode za injekcije na 80°C praćeno dodavanjem 17.46 g dinatrijum hidrogen fosfata i 4.18 g kalijum dihidrogen fosfata. Rastvor je ohlađen na 5°C obrazovanjem kontinualne faze (KF).

Mikrosfere i željenji raspored veličine čestica je pripremljen dostavljanjem KP pri 2.3 L/min i DF pri 15.6 mL/min, u in-line Kinematica MT 3000 disperzer. Supenzija mikrosfera je prihvaćena u stakleni sud reaktora sa dvostrukom košuljicom, kontrolisan na 20° i uz intenzivno mešanje, u cilju uklanjanja rastvarača. Temperatura u sudu je povećana na 38°C prema prethodo određenim vremenskim intervalima kao što je prikazano u sledećoj tabeli (Tabela 1). Posle 4 sata mikrosfere su prenete u stakleni filter sušač, isprane sa viškom vode na sobnoj temperaturi i ostavljene na vakuumu od 10 mbar uz blago mešanje u toku 24 sata da se osuše.

Primer 2a-c (dvostruka emulzija)

[0042] 4 g poli(D,L-laktid-co-glikolida) sa molarnim odnosom 50:50 (Mm = 41,000 i polidisperznost ca 1.65), komercijalno dostupnom od PURAC pod imenom PURASORB 5004A, je rastvoren u 30 g dihlorometana uz mešanje magnetnom mešalicom. Polimerni rastvor je ohlađen na 5°C. Polimerni rastvor je sterilizovan ceđenjem kroz filter špric i ohlađen na 5°C. 0.2941 g oktreotid acetata je rastvoreno u 2.941 g metanola uz mešanje . Rastvor oktreotid acetata je dodat u polimerni rastvor i pomešan mešanjem da bi se obrazovala uljana faza (DF-disperzna faza ). 11.5 g poli(vinil alkohola) EMROVE® 18-88 od Merck-a je rastvoreno u 2307 g vode za injekcije na 80°C praćeno dodavanjem 17.46 g dinatrijum vodonik fosfata i 4.18 g kalijum dihidrogen fosfata. Rastvor je ohlađen na 5°C obrazovanjem kontinualne faze (KF). Mikrosfere sa željenim rasporedom veličina čestica su pripremljene dostavljanjem KF pri 2.3 L/min i DF pri 18.7 mL/min, u in-line Kinematica MT 3000 disperzeru. Suspenzija mikrosfera je prihvaćena u staklenom sudu reaktora sa duplom košuljicom, kontrolisana na 20°C i uz intenzivno mešanje, u cilju uklanjanja rastvarača . Temperatura u sudu je povećana na 38°C prema prethodno određenim vremenskim intervalima kako je prikazano u sledećoj tabeli (Tabela 2). Posle 4 sata mikrosfere su premeštene u stakleni filter sušač , isprane sa viškom vode na sobnoj temperaturi i ostavljene na vakumu od 10 mbar i uz blago mešanje u toku 24 sata da se osuše.

1

oslobađanje 46.96<)>0 d(0.9) a (krajnje oslobađanje 76.958 81.<)>5 b (nagib)

3.9

c 180 5.03 40,230 d(0.1) 0.19 0.85 xo (vreme kašnjenja 28.644 31.7 d(0.5) yo (početno oslobađanje 46.742<)>5.0 d(0.9) a (krajnje oslobađanje 75.041 84.<)>1 b (Nagib)

3.9

Claims (6)

Patentni zahtevi

1. Postupak dobijanja poli(D,L laktid-ko-glikolid) polimernih mikrosfera oktreotid acetata, koji obuhvata:

a. rastvaranje oktreotid acetata u bar jednom organskom rastvaraču koji se meša sa vodom, i opciono koji takođe sadrži vodu, da bi se obrazovala vodena faza ;

b. obrazovanje emulzije ulje-u-vodi ili vode-u-ulju-u-vodi u pogodnoj uljanoj fazi koja sadrži organski rastvor poli(D,L laktid-ko-glikolid) polimera, rastvor se ne meša sa vodenom fazom pri čemu je pomenuti organski rastvor poli(D,L laktid-ko-glikolid) polimera ohlađen na 5°C ili ispod;

c. isparavanje bar jednog organskog rastvarača korišćenog u koraku (a) iz emulzije da se obrazuju mikrosfere kontrolisanjem temperature u toku koraka isparavanja i povećavanjem temperaure u toku koraka isparavanja sa stopom od 0.1°C/min do 1°C/min;

pri čemu su in-vivo i in-vitro karakteristike oslobađanja oktreotid acetata iz mikrosfera kontrolisane odabirom stope povećanja temperature u toku koraka isparavanja.

2. Postupak prema zahtevu 1, što je organski rastvarač metanol i dodata je voda .

3. Postupak prema zahtevu 1, što je poli(D,L laktid-ko-glikolid) polimer rastvoren u dihlorometanu.

4. Postupak prema zahtevu 1, što je korak isparavanja u koraku (c) započet iznad 15°C i u toku koraka isparavanja temperatura emulzije je podignuta iznad 35°C.

5. Postupak prema zahtevu 1, što je temperatura podignuta u toku vremenskog perioda od 20 min do 3 sata.

6. Postupak prema 5 u kome se dalje sušenje nastavlja u toku produženog perioda posle perioda povećanja temperature .