RS61607B1 - Kompozicije i postupci za nanočestične liofilne oblike - Google Patents

Description

Opis

TEHNIČKA OBLAST PRONALASKA

[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na oblasti biofarmaceutika i terapeutika sastavljenih od molekula na bazi nukleinske kiseline. Određenije, ovaj pronalazak odnosi se na postupke i kompozicije za liofilne oblike terapeutskih kompozicija nukleinske kiseline.

POZADINA PRONALASKA

[0002] Terapeutici na bazi jedinjenja nukleinske kiseline uključuju razne RNK oblike kao što su siRNK, antisens RNK, mikroRNK, kao i razne oblike DNK i plazmida, hibridnih oligonukleotida, i aptamera, između ostalih.

[0003] Transfekcija terapeutika nukleinske kiseline i drugih agenasa postiže se enkapsuliranjem aktivnih molekula u lipidne nanočestice. Nedostaci ove metodologije uključuju nemogućnost da se skladište kompozicije za kasniju upotrebu zbog degradacije nanočestica ili njihovog enkapsuliranog sadržaja. Na primer, kompozicije lipidnih nanočestica koje enkapsuliraju siRNK molekule mogu biti stabilne tokom svega nekoliko minuta ili sati na 25°C, a svega nekoliko dana ili nedelja na 4°C. Dalji nedostaci uključuju potrebu lipidnih nanočestičnih kompozicija ka veoma niskim temperaturama skladištenja.

[0004] Jedan način da se obezbedi dugoročno skladištenje terapeutske kompozicije je da se pripremi liofilni oblik, koji se može skladištiti i rekonstituisati radi obezbeđivanja formulacije za davanje terapeutika.

[0005] US2014/288160 A1 opisuje jedinjenja koja su navodno korisna kao nosači za lipozomalne dostave za olakšavanje dostave enkapsuliranih polinukleotida do ciljanih ćelija i naknadnu transfekciju tih ciljanih ćelija.

[0006] US 2011/237686 A1 opisuje tečne i liofilizovane formulacije malih čestica, naročito proizvodnju i liofilizaciju pegilovanih nanočestica, mikročestica, micela i lipozoma za primenu i davanje nekom subjektu.

[0007] US 2013/115274 A1 opisuje postupak za pripremu lipozoma koji efikasno enkapsulira negativno naelektrisan terapeutski polimer, npr., siRNK. Postupak uključuje pripremanje lipidne mešavine koja obuhvata katjonski lipid u organskom rastvaraču koji se meša sa vodom, kao što je etanol, pri koncentraciji od 2.3 mg/ml, i dodavanje ovog rastvora polimeru rastvorenom u vodi do konačne koncentracije od 35% etanola u vodi. Konačni odnos punjenja za lek:lipid iznosi 1:2.5. Dobijene nanočestice imaju srednju veličinu od 50 do 150 nm.

[0008] US 2005/002998 A1 opisuje postupak za pripremu stabilnog kompleksa koji cilja neke ćelije, koji obuhvata veznik i katjonski lipozom koji enkapsulira terapeutik ili dijagnostički agens, koji obuhvata (a) kombinovanje kompleksa sa rastvorom koji obuhvata stabilizujuću količinu saharoze i (b) liofilizovanje dobijenog rastvora radi dobijanja liofilizovanog preparata; pri čemu, posle rekonstitucije, preparat zadržava najmaje oko 80% svoje aktivnosti pre liofilizacije.

[0009] Međutim, nemoguće je uopšteno generisati liofilne oblike lipidnih nanočestica koji sadrže agense nukleinske kiseline, tako da lipidna nanočestica može biti regenerisana agensom nukleinske kiseline enkapsuliranim radi obrazovanja stabilne formulacije. Postupak liofilizacije može da uništi nanočestice i/ili agense nukleinske kiseline. Neki postupci uključuju hemijsko vezivanje zaštitnih grupa ili komponenata za lipidne nanočestice, ili za agens nukleinske kiseline, što predstavlja nedostatak. Drugi postupci mogu da koriste lipozome kao adjuvans, bez obezbeđivanja enkapsulacije agenasa nukleinske kiseline.

[0010] Postoji kontinuirana potreba za kompozicijama i postupcima kojima se obezbeđuju liofilni oblici nanočestica koje se mogu rekonstituisati, koje imaju poželjne karakteristike, uključujući aktivnost transfekcije, veličinu čestica, vreme skladištenja, i stabilnost u serumu radi dostave raznih agenasa nukleinske kiseline.

[0011] Ono što je potrebno su kompozicije i jedinjenja za obrazovanje stabilnih rastvora ili suspenzija lipidnih nanočestica koji se mogu skladištiti u čvrstim liofilnim oblicima, u kojima nanočestice enkapsuliraju agense nukleinske kiseline.

KRATAK PREGLED

[0012] Ovaj pronalazak obezbeđuje postupke i kompozicije za terapeutike sastavljene od molekula na bazi nukleinske kiseline. Određenije, ovaj pronalazak obezbeđuje postupke i kompozicije za liofilne oblike terapeutskih kompozicija na bazi nukleinske kiseline.

[0013] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje liofilne oblike nanočestica koji mogu biti rekonstituisani u efektivne terapeutske kompozicije, koje se mogu primeniti za dostavu terapeutskih agenasa nukleinske kiseline za transfekciju.

[0014] U nekim aspektima, ovaj pronalazak obezbeđuje kompozicije i jedinjenja za obrazovanje rastvora ili suspenzija terapeutskih lipidnih nanočestica koje su stabilne u postupcima liofilizacije. Terapeutske lipidne nanočestice mogu da enkapsuliraju agense nukleinske kiseline, i mogu se transformisati i skladištiti u čvrstim liofilnim oblicima. Ti liofilni oblici mogu biti rekonstituisani radi obezbeđivanja terapeutskih lipidnih nanočestica sa enkapsuliranim agensima nukleinske kiseline. Rekonstituisane lipidne nanočestice mogu imati začuđujuće poželjna transfekciona svojstva, uključujući veličinu i distribuciju.

[0015] Načini ostvarivanja ovog pronalaska uključuju spektar kompozicija i jedinjenja za obrazovanje rastvora ili suspenzija terapeutskih lipidnih nanočestica koje se mogu podvrgnuti postupkom liofilizacije radi obezbeđivanja stabilnih, čvrstih liofilnih oblika za dugoročno skladištenje terapeutika nukleinske kiseline.

[0016] Načini ostvarivanja ovog pronalaska uključuju sledeće:

[0017] Kompozicija za pripremu čvrstog liofilizata lipidnih nanočestica, koja obuhvata jedan ili više aktivnih agenasa nukleinske kiseline, pri čemu ta kompozicija obuhvata:

vodenu suspenziju lipidnih nanočestica u farmaceutski prihvatljivom rastvoru, pri čemu lipidne nanočestice enkapsuliraju jedan ili više aktivnih agenasa nukleinske kiseline;

jedinjenje dekstrina; i

jedinjenje saharidnog šećera, pri čemu ukupna količina jedinjenja dekstrina i šećera iznosi od 2% do 20% (w/v) kompozicije, i pri čemu jedinjenje dekstrina iznosi od 40 % do 70% (w/v) ukupne količine jedinjenja dekstrina i šećera.

[0018] Gore navedena kompozicija, pri čemu jedinjenje dekstrina iznosi od 40 % do 55% (w/v) ukupne količine jedinjenja dekstrina i šećera.

[0019] Gore navedena kompozicija, pri čemu jedinjenje dekstrina iznosi 40% do 45% (w/v) ukupne količine jedinjenja dekstrina i šećera.

[0020] Gore navedena kompozicija, pri čemu posle liofilizacije i rekonstitucije kompozicije, prosečna veličina nanočestica iznosi unutar 10% njihove veličine u originalnoj kompoziciji.

[0021] Gore navedena kompozicija, pri čemu posle liofilizacije, skladištenja i rekonstitucije kompozicije, prosečna veličina nanočestica iznosi unutar 10% njihove veličine u originalnoj kompoziciji.

[0022] Gore navedena kompozicija, pri čemu se liofilizovana kompozicija skladišti na 5°C tokom najmanje jednog meseca.

[0023] Gore navedena kompozicija, pri čemu se liofilizovana kompozicija skladišti na -20°C tokom najmanje jednog meseca.

[0024] Gore navedena kompozicija, pri čemu nanočestice imaju prosečan prečnik od 45 nm do 110 nm.

[0025] Gore navedena kompozicija, pri čemu koncentracija aktivnih agenasa nukleinske kiseline iznosi od 1 mg/mL do 10 mg/mL, ili od 3 mg/mL do 5 mg/mL.

[0026] Gore navedena kompozicija, pri čemu jedan ili više aktivnih agenasa nukleinske kiseline predstavljaju RNKi molekule koji su sposobni da posreduju interferencijom RNK. Gore navedena kompozicija, pri čemu RNKi molekuli predstavljaju siRNK, shRNK, ddRNK, piRNK, ili rasiRNK.

[0027] Gore navedena kompozicija, pri čemu jedan ili više aktivnih agenasa nukleinske kiseline predstavljaju miRNK, antisens RNK, plazmide, hibridne oligonukleotide, ili aptamere.

[0028] Gore navedena kompozicija, pri čemu farmaceutski prihvatljiv rastvor predstavlja HEPES pufer, fosfatni pufer, citratni pufer, ili pufer koji sadrži Tris(hidroksimetil)aminometan.

[0029] Gore navedena kompozicija, pri čemu jedinjenje dekstrina predstavlja ciklodekstrin.

[0030] Gore navedena kompozicija, pri čemu jedinjenje ciklodekstrina ima jedan ili više od 2, 3 i 6 hidroksil položaja supstituisanih sulfoalkil, benzensulfoalkil, acetoalkil, hidroksialkil, hidroksialkil sukcinat, hidroksialkil malonat, hidroksialkil glutarat, hidroksialkil adipat, hidroksialkil, hidroksialkil maleat, hidroksialkil oksalat, hidroksialkil fumarat, hidroksialkil citrat, hidroksialkil tartrat, hidroksialkil malat, ili hidroksialkil citrakonat grupama.

[0031] Gore navedena kompozicija, pri čemu jedinjenje ciklodekstrina predstavlja (2-hidroksipropil)-βciklodekstrin, 2-hidroksipropil-β-ciklodekstrin sukcinat, (2-hidroksipropil)-γ-ciklodekstrin, ili 2-hidroksipropil-γ-ciklodekstrin sukcinat.

[0032] Gore navedena kompozicija, pri čemu jedinjenje ciklodekstrina predstavlja sulfobutil etar βciklodekstrin ili sulfobutil etar γ-ciklodekstrin.

[0033] Gore navedena kompozicija, pri čemu jedinjenje ciklodekstrina predstavlja metil-β-ciklodekstrin ili metil-γ-ciklodekstrin.

[0034] Gore navedena kompozicija, pri čemu je jedinjenje ciklodekstrina vezano za polimerni lanac ili mrežu.

[0035] Gore navedena kompozicija, pri čemu jedinjenje ciklodekstrina uključuje jedinjenje adsorbata.

[0036] Gore navedena kompozicija, pri čemu je jedinjenje adsorbata odabrano iz grupe koju čine holesterol, lanosterol, zimosterol, zimostenol, dezmosterol, stigmastanol, dihidrolanosterol, 7-dehidroholesterol, pegilovani holesterol, holesteril acetat, holesteril arahidonat, holesteril butirat, holesteril heksanoat, holesteril miristat, holesteril palmitat, holesteril behenat, holesteril stearat, holesteril kaprilat, holesteril n-dekanoat, holesteril dodekanoat, holesteril nervonat, holesteril pelargonat, holesteril n-valerat, holesteril oleat, holesteril elaidat, holesteril erukat, holesteril heptanoat, holesteril linolelaidat, holesteril linoleat, beta-sitosterol, kampesterol, ergosterol, brasikasterol, delta-7-stigmasterol, i delta-7-avenasterol.

[0037] Gore navedena kompozicija, pri čemu jedinjenje saharidnog šećera predstavlja jedinjenje monosaharidnog ili disaharidnog šećera.

[0038] Gore navedena kompozicija, pri čemu je jedinjenje šećera odabrano iz grupe koju čine saharoza, laktoza, laktuloza, maltoza, trehaloza, celobioza, kojibioza, sakebioza, izomaltoza, soforoza, laminaribioza, gentiobioza, turanoza, maltuloza, izomaltuloza, gentiobiuloza, manobioza, melibioza, melibiuloza, i ksilobioza.

[0039] Postupak za pripremu čvrstog liofilizata od jednog ili više aktivnih agenasa nukleinske kiseline, pri čemu taj postupak obuhvata liofilizovanje prethodno opisane kompozicije. Ovaj pronalazak dalje predviđa čvrst liofilizat pripremljen gore navedenim postupkom, kao i proizvod leka pripremljen rekonstituisanjem prethodno opisanog čvrstog liofilizata.

[0040] Ovaj pronalazak dalje uključuje postupak za pripremu proizvoda leka nukleinske kiseline, pri čemu taj postupak obuhvata:

sintetizovanje lipidnih nanočestica, pri čemu lipidne nanočestice enkapsuliraju jedan ili više aktivnih agenasa nukleinske kiseline;

obezbeđivanje vodene suspenzije lipidnih nanočestica u farmaceutski prihvatljivom rastvoru; dodavanje jedinjenja dekstrina rastvoru koji sadrži lipidne nanočestice;

dodavanje jedinjenja saharidnog šećera rastvoru koji sadrži lipidne nanočestice; liofilizovanje rastvora koji sadrži lipidne nanočestice, čime se obrazuje čvrst liofilizat; rekonstituisanje liofilizata u farmaceutski prihvatljivom nosaču, čime se obrazuje proizvod leka nukleinske kiseline, pri čemu ukupna količina jedinjenja dekstrina i saharidnog šećera iznosi od 2% do 20% (w/v) rastvora koji sadrži lipidne nanočestice, i pri čemu jedinjenje dekstrina iznosi od 40% do 70% (w/v) ukupne količine jedinjenja dekstrina i saharidnog šećera.

[0041] Gore navedeni postupak, pri čemu jedinjenje dekstrina iznosi od 40% do 55% (w/v) ukupne količine jedinjenja dekstrina i saharidnog šećera.

[0042] Gore navedeni postupak, pri čemu jedinjenje dekstrina iznosi 40% do 45% (w/v) ukupne količine jedinjenja dekstrina i saharidnog šećera.

[0043] Gore navedeni postupak, pri čemu posle rekonstitucije, prosečna veličina nanočestica iznosi unutar 10% njihove veličine kada su sintetizovane.

[0044] Gore navedeni postupak, koji dalje obuhvata skladištenje liofilizata pre rekonstitucije.

[0045] Gore navedeni postupak, pri čemu posle skladištenja i rekonstitucije liofilizata, prosečna veličina nanočestica iznosi unutar 10% njihove veličine kada su sintetizovane.

[0046] Gore navedeni postupak, pri čemu se liofilizat skladišti na 5°C tokom najmanje jednog meseca.

[0047] Gore navedeni postupak, pri čemu se liofilizat skladišti na -20°C tokom najmanje jednog meseca.

[0048] Gore navedeni postupak, pri čemu nanočestice imaju prosečan prečnik od 45 nm do 110 nm.

[0049] Gore navedeni postupak, pri čemu koncentracija aktivnih agenasa nukleinske kiseline iznosi od 1 mg/mL do 10 mg/mL.

[0050] Gore navedeni postupak, pri čemu jedan ili više aktivnih agenasa nukleinske kiseline predstavljaju RNKi molekule koji su sposobni da posreduju interferencijom RNK. Gore navedeni postupak, pri čemu RNKi molekuli predstavljaju siRNK, shRNK, ddRNK, piRNK, ili rasiRNK.

[0051] Gore navedeni postupak, pri čemu jedan ili više aktivnih agenasa nukleinske kiseline predstavljaju miRNK, antisens RNK, plazmide, hibridne oligonukleotide, ili aptamere.

[0052] Gore navedeni postupak, pri čemu farmaceutski prihvatljiv nosač predstavlja sterilnu vodu, vodu za injekcije, sterilni normalni slani rastvor, bakteriostatičnu vodu za injekcije, ili rastvor za nebulizator.

[0053] Gore navedeni postupak, pri čemu farmaceutski prihvatljiv nosač predstavlja farmaceutski prihvatljiv rastvor.

[0054] Gore navedeni postupak, pri čemu farmaceutski prihvatljiv rastvor predstavlja HEPES pufer, fosfatni pufer, citratni pufer, ili pufer koji sadrži Tris(hidroksimetil)aminometan.

[0055] Gore navedeni postupak, pri čemu jedinjenje dekstrina predstavlja ciklodekstrin.

[0056] Gore navedeni postupak, pri čemu jedinjenje ciklodekstrina ima jedan ili više od 2, 3 i 6 hidroksil položaja supstituisanih sulfoalkil, benzensulfoalkil, acetoalkil, hidroksialkil, hidroksialkil sukcinat, hidroksialkil malonat, hidroksialkil glutarat, hidroksialkil adipat, hidroksialkil, hidroksialkil maleat, hidroksialkil oksalat, hidroksialkil fumarat, hidroksialkil citrat, hidroksialkil tartrat, hidroksialkil malat, ili hidroksialkil citrakonat grupama.

[0057] Gore navedeni postupak, pri čemu jedinjenje ciklodekstrina predstavlja (2-hidroksipropil)-βciklodekstrin, 2-hidroksipropil-β-ciklodekstrin sukcinat, (2-hidroksipropil)-γ-ciklodekstrin, ili 2-hidroksipropil-γ-ciklodekstrin sukcinat.

[0058] Gore navedeni postupak, pri čemu jedinjenje ciklodekstrina predstavlja sulfobutil etar βciklodekstrin ili sulfobutil etar γ-ciklodekstrin.

[0059] Gore navedeni postupak, pri čemu jedinjenje ciklodekstrina predstavlja metil-β-ciklodekstrin ili metil-γ-ciklodekstrin.

[0060] Gore navedeni postupak, pri čemu jedinjenje ciklodekstrina uključuje jedinjenje adsorbata.

[0061] Gore navedeni postupak, pri čemu jedinjenje saharidnog šećera predstavlja jedinjenje monosaharidnog ili disaharidnog šećera.

[0062] Gore navedeni postupak, pri čemu farmaceutski prihvatljiv nosač predstavlja sterilnu vodu, vodu za injekcije, sterilni normalni slani rastvor, bakteriostatičnu vodu za injekcije, ili rastvor za nebulizator.

[0063] Gore navedeni postupak, pri čemu farmaceutski prihvatljiv nosač predstavlja farmaceutski prihvatljiv rastvor.

[0064] Gore navedeni postupak, pri čemu rekonstituisan proizvod leka nukleinske kiseline ima manje od 0.001 % (w/v) nagomilanih čestica sa veličinom većom od 0.2 µm.

[0065] Gore navedeni postupak, pri čemu je proizvod leka nukleinske kiseline rekonstituisan u vremenskom periodu od 3 do 30 sekundi.

[0066] Gore navedeni postupak, pri čemu je proizvod leka nukleinske kiseline rekonstituisan posle vremenskog perioda skladištenja od šest meseci i zadržava 80% aktivnosti agenasa nukleinske kiseline.

[0067] Gore navedeni postupak, pri čemu rekonstituisan proizvod leka nukleinske kiseline ima manje od 0.001 % (w/v) nagomilanih čestica sa veličinom većom od 0.2 µm.

[0068] Gore navedeni postupak, pri čemu rekonstituisan proizvod leka nukleinske kiseline ima smanjenu aktivaciju citokina.

[0069] Gore navedeni postupak, pri čemu je proizvod leka nukleinske kiseline rekonstituisan u vremenskom periodu od 3 do 30 sekundi.

[0070] Gore navedeni postupak, pri čemu je proizvod leka nukleinske kiseline rekonstituisan posle vremenskog perioda skladištenja od šest meseci i zadržava 80% aktivnosti agenasa nukleinske kiseline.

KRATAK OPIS SLIKA

[0071]

FIG.1: Fig.1 prikazuje eksperimentalne rezultate za in vivo potenciju agensa nukleinske kiseline, koji je siRNK usmerena da suzbije Hsp47 (GP46), dobijena konačnim proizvodom leka koji je rekonstituisani rastvor čvrste, liofilizovane nanočestične formulacije siRNK. Rekonstituisane formulacije leka siRNK upotrebljene su u modelu dimetilnitrozaminom (DMN) indukovane fibroze kod pacova. Kako je prikazano na Fig.1, rekonstituisana siRNK nanočestična formulacija leka ispoljava intenzivnu i začuđujuću potenciju za utišavanje gena kod Hsp47 (GP46) in vivo. In vivo potencija predstavlja rigorozan test vijabilnosti liofilizovanih, rekonstituisanih nanočestica koje sadrže agens nukleinske kiseline. Nanočestična formulacija siRNK koja je liofilizovana uključena je u sadržaj ukupnog protektanta od 10% (w/v), koji je sastavljen od 40% (w/v) (2-hidroksipropil)-β-ciklodekstrina i 60% saharoze.

FIG.2: Fig.2 prikazuje eksperimentalne rezultate za farmakokinetike koncentracije u plazmi in vivo za liofilizovanu, rekonstituisanu siRNK nanočestičnu formulaciju. siRNK usmerena prema Hsp47 (GP46) formulisana je u lipozomalnim nanočesticama. Nanočestične formulacije liofilizovane su sa zaštitnom kompozicijom koja sadrži saharozu i (2-bidroksipropil)-β-ciklodekstrin. Nanočestična formulacija siRNK koja je liofilizovana uključena je u sadržaj ukupnog protektanta od 12.5% (w/v), koji je sastavljen od 40% (w/v) (2-hidroksipropil)-β-ciklodekstrina i 60% saharoze. Profili PK u plazmi procenjeni su na Sprague Dawley pacovima posle intravenoznog davanja u jednom doznom nivou liofilizovane formulacije u poređenju sa zamrznutom formulacijom. siRNK koncentracije u uzorcima plazme određene su ELISA postupkom baziranom na hibridizaciji. Kako je prikazano na Fig.2, farmakokinetike koncentracije u plazmi liofilizovane, rekonstituisane siRNK formulacije leka suštinski je identična kao i uporedna kontrolna formulacija koja je bila samo zamrznuta.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0072] Ovaj pronalazak obezbeđuje postupke i kompozicije za terapeutike sastavljene od molekula na bazi nukleinske kiseline. U nekim načinima ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje postupke i kompozicije za pripremu liofilnih oblika terapeutskih kompozicija koje sadrže agense nukleinske kiseline.

[0073] U nekim aspektima, ovaj pronalazak obezbeđuje liofilne oblike nanočestica koji se mogu rekonstituisati u efektivne terapeutske kompozicije. Nanočestice mogu da enkapsuliraju agense nukleinske kiseline kao sadržaj. Liofilni oblici ovog pronalaska mogu se primeniti za ponovno komponovanje i dostavu nanočestične formulacije enkapsuliranjem terapeutskih agenasa nukleinske kiseline za transfekciju.

[0074] U daljim aspektima, ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenja i postupke za obrazovanje rastvora ili suspenzije terapeutskih lipidnih nanočestica koji su stabilni u postupcima liofilizacije. Postupci liofilizacije ovog pronalaska mogu da obezbede stabilne liofilne oblike terapeutskih lipidnih nanočestica, u kojima nanočestice mogu da enkapsuliraju agense nukleinske kiseline. Liofilni oblici mogu se uskladištiti tokom nekog vremenskog perioda, i rekonstituisati radi obezbeđivanja terapeutskih lipidnih nanočestica sa enkapsuliranim agensima nukleinske kiseline.

[0075] U nekim načinima ostvarivanja, ovaj pronalazak uključuje spektar kompozicija i jedinjenja za rastvore ili suspenzije lipidnih nanočestica koje se mogu podvrgnuti postupkom liofilizacije radi obezbeđivanja stabilnih, čvrstih liofilnih oblika za dugoročno skladištenje terapeutika nukleinske kiseline. Kompozicije i postupci ovog pronalaska mogu da obezbede liofilne oblike koji se mogu rekonstituisati i obezbediti poželjnu aktivnost, veličinu, vreme skladištenja, i stabilnost u serumu.

[0076] U daljim aspektima, ovaj pronalazak odnosi se na jedinjenja, kompozicije i postupke za obezbeđivanje nanočestica radi dostave i distribuiranja aktivnih ageansa ili jedinjenja leka subjektima, do tkiva i organa.

[0077] Ovaj pronalazak obezbeđuje spektar lipidnih jedinjenja i jonizujućih jedinjenja za dostavu aktivnih agenasa do ćelija. Lipidna jedinjenja i jonizujuća jedinjenja ovog otkrivanja mogu se primeniti da obrazuju nanočestice za dostavu i distribuciju aktivnih agenasa.

[0078] Ovaj pronalazak predviđa lipidne nanočestične formulacije leka koje sadrže, na primer, siRNK agense, koje se mogu pripremiti liofilizacijom suspenzije nanočestica, i rekonstitucijom tih nanočestica u suspenziji.

[0079] U nekim načinima ostvarivanja, lipidne nanočestice mogu se sintetizovati ubrizgavanjem pri velikoj brzini rastvora lipid/etanol u siRNK puferski rastvor. Drugi pufer može biti dijafiltriran i primenjen kao eksterni pufer kroz TFF kertridže radi pripreme konačnog proizvoda vodene suspenzije.

[0080] U nekim načinima ostvarivanja, nanočestice mogu da imaju prosečan prečnik od 45 nm do 110 nm. Koncentracija aktivnih agenasa nukleinske kiseline može biti od 1 mg/mL do 10 mg/mL.

[0081] Začuđujuće je otkriveno da lipidne nanočestice mogu da prežive liofilizaciju suspenzije, kada je ta suspenzija pretvorena u zaštićenu kompoziciju.

[0082] Predmet priloženih patentnih zahteva, zaštićena kompozicija ovog pronalaska, može biti sastavljena od vodene suspenzije lipidnih nanočestica u farmaceutski prihvatljivom rastvoru, jedinjenja dekstrina, i jedinjenja saharidnog šećera. Lipidne nanočestice enkapsuliraju jedan ili više aktivnih agenasa nukleinske kiseline.

[0083] Liofilizacija zaštićene suspenzije može da obezbedi proizvod čvrstog liofilizata, koji se može rekonstituisati u suspenziji lipidnih nanočestica.

[0084] Rekonstituisana suspenzija može da sadrži lipidne nanočestice, koje enkapsuliraju aktivni agens i koje se mogu uporediti sa lipidnim nanočesticama pre liofilizacije.

[0085] U određenim načinima ostvarivanja, rekonstituisana suspenzija može da obezbedi aktivnost enkapsuliranog agensa, koja se može uporediti sa onom kod suspenzije pre liofilizacije.

[0086] U daljim aspektima, rekonstituisana suspenzija može da obezbedi stabilne nanočestice koje se mogu uporediti sa onima kod suspenzije pre liofilizacije. U određenim aspektima, prosečna veličina nanočestica može biti gotovo jednaka veličini nanočestica u suspenziji pre liofilizacije.

[0087] Kompozicije i postupci ovog pronalaska mogu da obezbede iznenađujuću aktivnost i stabilnost rekonstituisane suspenzije sastavljene od nanočestica sa enkapsuliranim agensom.

[0088] Zaštićena suspenzija, koja može biti liofilizovana i rekonstituisana, sadrži zaštitnu kompoziciju za liofilizaciju. Zaštitna kompozicija ovog pronalaska sastavljena je od jedinjenja dekstrina i jedinjenja saharidnog šećera. Ukupna količina jedinjenja dekstrina i šećera iznosi od 2% do 20% (w/v) zaštićene suspenzija.

[0089] Jedinjenje dekstrina iznosi od 40 % do 70% (w/v) ukupne količine jedinjenja dekstrina i šećera u zaštitnoj kompoziciji. U određenim načinima ostvarivanja, jedinjenje dekstrina može biti od 40 % do 55% (w/v) ukupne količine jedinjenja dekstrina i šećera u zaštitnoj kompoziciji. U daljim načinima ostvarivanja, jedinjenje dekstrina može biti od 40% do 45% (w/v) ukupne količine jedinjenja dekstrina i šećera u zaštitnoj kompoziciji. Ove kompozicije mogu da obezbede neočekivano poželjna svojstva rekonstituisane nanočestične suspenzije, na primer, beznačajnu promenu nanočestične veličine ili aktivnosti.

[0090] U nekim aspektima, posle liofilizacije i rekonstitucije zaštićene suspenzije nanočestica, prosečna veličina nanočestica može biti unutar 10% njihove veličine u originalnoj kompoziciji, pre liofilizacije. U određenim aspektima, posle liofilizacije i rekonstitucije zaštićene suspenzije nanočestica, prosečna veličina nanočestica može biti unutar 5% njihove veličine u originalnoj kompoziciji, pre liofilizacije.

[0091] Ovaj pronalazak predviđa lipidne nanočestične formulacije leka koje sadrže, na primer, siRNK agense, koje se mogu pripremiti liofilizacijom suspenzije nanočestica, i rekonstitucijom tih nanočestica u suspenziji posle nekog perioda skladištenja. Rekonstituisana suspenzija može da obezbedi aktivnost enkapsuliranog agensa, koja se može uporediti sa onom kod suspenzije pre liofilizacije.

[0092] Rekonstituisana suspenzija, pripremljena posle nekog perioda skladištenja, može da sadrži lipidne nanočestice, koje enkapsuliraju aktivni agens i koje se mogu uporediti sa lipidnim nanočesticama pre liofilizacije.

[0093] U određenim načinima ostvarivanja, rekonstituisana suspenzija, pripremljena posle nekog perioda skladištenja, može da obezbedi aktivnost enkapsuliranog agensa, koja se može uporediti sa onom kod suspenzije pre liofilizacije.

1

[0094] U daljim aspektima, rekonstituisana suspenzija, pripremljena posle nekog perioda skladištenja, može da obezbedi stabilne nanočestice koje se mogu uporediti sa onom kod suspenzije pre liofilizacije. U određenim aspektima, prosečna veličina nanočestica može biti gotovo jednaka veličini nanočestica u suspenziji pre liofilizacije.

[0095] U nekim načinima ostvarivanja, liofilizovana kompozicija može biti uskladištena na 5°C tokom najmanje jednog meseca. U daljim načinima ostvarivanja, liofilizovana kompozicija može biti uskladištena na - 20°C tokom najmanje jednog meseca.

Aktivni agensi

[0096] Kompozicije i postupci ovog pronalaska mogu se primeniti da distribuiraju agense za suzbijanje genske ekspresije. Primeri agensa za suzbijanje genske ekspresije uključuju inhibitorne molekule nukleinske kiseline, uključujući ribozime, anti-sens nukleinske kiseline, i molekule RNK interferencije (RNKi molekuli).

[0097] Terapeutske kompozicije ovog pronalaska mogu da uključuju inhibitorne molekule nukleinske kiseline. Primeri molekula nukleinske kiseline koji su sposobni da posreduju interferencijom RNK uključuju molekule aktivne u interferenciji RNK (RNKi molekuli), uključujući dupleks RNK kao što su siRNK (male inteferirajuće RNK), miRNK (mikro RNK), shRNK (RNK sa kratkom ukosnicom), ddRNK (DNK-usmerena RNK), piRNK (Piwi-međusobno delujuća RNK), ili rasiRNK (ponovljena povezana siRNK), i njihovi modifikovani oblici.

[0098] Primeri aktivnih terapeutika ovog pronalaska uključuju DNK, plazmide, hibridne oligonukleotide, ili aptamere.

[0099] Koncentracija aktivnih molekula nukleinske kiseline u formulaciji pre liofilizacije ovog otkrivanja može biti od oko 1 mg/mL do oko 10 mg/mL. U nekim načinima ostvarivanja, koncentracija aktivnih molekula nukleinske kiseline u formulaciji ovog otkrivanja može biti od oko 1 mg/mL do oko 5 mg/mL, ili od 2 mg/mL do 4 mg/mL.

Lipidne nanočestične formulacije pre liofilizacije

[0100] Načini ostvarivanja ovog pronalaska mogu da obezbede kompozicije lipidnih nanočestica, pri čemu te kompozicije sadrže zaštitno jedinjenje za postupak liofilizacije.

[0101] Lipidne nanočestice mogu da imaju bilo koju kompoziciju poznatu u stanju tehnike. Lipidne nanočestice mogu biti sintetizovane i opretećene enkapsuliranim sadržajem bilo kojim postupkom, uključujući postupke poznate u stanju tehnike.

[0102] U nekim načinima ostvarivanja, lipidne nanočestice mogu biti pripremljene postupkom potpoljenim ubrizgavanjem. Neki primeri postupaka za lipidne nanočestice dati su u US 2013/0115274.

[0103] Neki primeri za pripremu lipozoma dati su u Szoka, Ann. Rev. Biophys. Bioeng.9:467 (1980); Lipozomi, Marc J. Ostro, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1983, Chapter 1.

[0104] Uopšteno, lipidne nanočestice mogu se sintetizovati mešanjem lipidnih komponenata u organskom rastvaraču sa vodenim puferskim rastvorom koji sadrži aktivne agense nukleinske kiseline. Lipozomi mogu biti dimenzionisani filtracijom ili ekstruzijom. Suspenzija ili rastvor lipozoma može biti dalje transformisana dijafiltracijom.

[0105] Lipidna nanočestična kompozicija ovog pronalaska, koja je stabilizovana za postupak liofilizacije, može da sadrži lipidne nanočestice koje enkapsuliraju jedan ili više aktivnih agenasa, kao što su agensi nukleinske kiseline, u suspenziji. Suspenzija može biti vodena, i može da sadrži rastvarač koji je mešljiv sa vodom, kao što je etanol. Kompozicija, koja je stabilizovana za postupak liofilizacije, može dalje da sadrži zaštitna jedinjenja za stabilisanje lipozoma u postupku liofilizacije.

[0106] Prosečna veličina lipidnih nanočestica kao sintetizovanih može biti od 40 nm do 120 nm, ili od 45 nm do 110 nm, ili od 85 nm do 105 nm.

[0107] Koncentracija aktivnog agensa u lipidnoj nanočestičnoj kompoziciji ovog pronalaska može biti u opsegu od oko 0.1 mg/mL do oko 10 mg/mL. U nekim načinima ostvarivanja, koncentracija aktivnog agensa u lipidnoj nanočestičnoj kompoziciji ovog pronalaska može biti od 0.5 mg/mL do 8 mg/mL, ili od 1 mg/mL do 6 mg/mL, ili od 2 mg/mL do 5 mg/mL, ili od 3 mg/mL do 4 mg/mL.

[0108] Primeri jedinjenja dekstrina uključuju maltodekstrine, i beta- i gama-ciklodekstrine.

[0109] Primeri jedinjenja dekstrina uključuju metilovane jedinjenja beta- i gama-ciklodekstrina, i jedinjenja sulfoalkil etar beta- i gama-ciklodekstrina.

[0110] Primeri jedinjenja dekstrina uključuju jedinjenja ciklodekstrina sa jednim ili više od 2, 3 i 6 hidroksil položaja supstituisanih sulfoalkil, benzensulfoalkil, acetoalkil, hidroksialkil, hidroksialkil sukcinat, hidroksialkil malonat, hidroksialkil glutarat, hidroksialkil adipat, hidroksialkil, hidroksialkil maleat, hidroksialkil oksalat, hidroksialkil fumarat, hidroksialkil citrat, hidroksialkil tartrat, hidroksialkil malat, ili hidroksialkil citrakonat grupama.

[0111] Primeri jedinjenja dekstrina uključuju (2-hidroksipropil)-β-ciklodekstrin, 2-hidroksipropil-βciklodekstrin sukcinat, (2-hidroksipropil)-γ-ciklodekstrin, i 2-hidroksipropil-γ-ciklodekstrin sukcinat.

[0112] Primeri jedinjenja dekstrina uključuju hidroksietil β-ciklodekstrin.

[0113] Primeri jedinjenja dekstrina uključuju dimetil β-ciklodekstrin i trimetil β-ciklodekstrin.

[0114] Primeri jedinjenja dekstrina uključuju sulfobutil etar β-ciklodekstrin i sulfobutil etar γciklodekstrin.

[0115] Primeri jedinjenja dekstrina uključuju metil-β-ciklodekstrin i metil-γ-ciklodekstrin.

[0116] Primeri jedinjenja dekstrina uključuju hidroksipropil-sulfobutil-β-ciklodekstrin.

[0117] Primeri jedinjenja dekstrina uključuju H107 SIGMA ciklodekstrin (Sigma-Aldrich Corp.).

[0118] Primeri jedinjenja dekstrina uključuju CAVAMAX, CAVASOL, i CAVATRON ciklodekstrine (Ashland Inc.).

[0119] Primeri jedinjenja dekstrina uključuju KLEPTOSE i CRYSMEB ciklodekstrine (Roquette America Inc.).

[0120] Primeri jedinjenja dekstrina uključuju CAPTISOL ciklodekstrine (Ligand Pharmaceuticals, Inc.).

[0121] U nekim načinima ostvarivanja, primeri jedinjenja dekstrina uključuju jedinjenja dekstrina vezana za polimerni lanac ili mrežu. Na primer, molekuli ciklodekstrina mogu biti vezani za polimere poliakrilne kiseline. U daljim načinima ostvarivanja, molekuli ciklodekstrina mogu biti međusobno povezani jedinjenjima za unakrsno umrežavanje kao što su akriloil grupe. U određenim načinima ostvarivanja, mogu se primeniti oblici vinil akrilatnih hidrogelova sa vezanim jedinjenjima ciklodekstrina.

[0122] U nekim aspektima, jedinjenje dekstrina koje se koristi u lipidnoj nanočestičnoj kompoziciji ovog pronalaska može biti kombinovano sa jedinjenjem adsorbata pre uvođenja u lipidninu nanočestičnu kompoziciju. Bez želje da se vezuje za bilo koju određenu teoriju, predadsorpcija jedinjenja sterola od strane jedinjenja dekstrina može da obrazuje inkluzioni kompleks koji može sprečiti gubitak aktivnosti aktivnog agensa u rekonstituisanom proizvodu leka.

[0123] Primeri jedinjenja adsorbata uključuju holesterol, lanosterol, zimosterol, zimostenol, dezmosterol, stigmastanol, dihidrolanosterol, 7-dehidro holesterol.

[0124] Primeri jedinjenja adsorbata uključuju jedinjenja pegilovanih holesterola, i holestan 3-okso-(C1-22)acila, na primer, holesteril acetat, holesteril arahidonat, holesteril butirat, holesteril heksanoat, holesteril miristat, holesteril palmitat, holesteril behenat, holesteril stearat, holesteril kaprilat, holesteril n-dekanoat, holesteril dodekanoat, holesteril nervonat, holesteril pelargonat, holesteril n-valerat, holesteril oleat, holesteril elaidat, holesteril erukat, holesteril heptanoat, holesteril linolelaidat, i holesteril linoleat.

[0125] Primeri jedinjenja adsorbata uključuju fitosterole, beta-sitosterol, kampesterol, ergosterol, brasikasterol, delta-7-stigmasterol, i delta-7-avenasterol.

[0126] Primeri zaštitnih jedinjenja šećera uključuju monosaharide kao što su C(5-6) aldoze i ketoze, kao i disaharide kao što su saharoza, laktoza, laktuloza, maltoza, trehaloza, celobioza, kojibioza, sakebioza, izomaltoza, soforoza, laminaribioza, gentiobioza, turanoza, maltuloza, izomaltuloza, gentiobiuloza, manobioza, melibioza, melibiuloza, i ksilobioza.

[0127] Primeri zaštitnih saharidnih jedinjenja uključuju polisaharide kao što su fikol.

[0128] Koncentracija zaštitnih jedinjenja u formulaciji pre liofilizacije iznosi od 2% (w/v) do 20% (w/v), ili od 4% (w/v) do 16% (w/v), ili od 5% (w/v) do 15% (w/v), ili od 6% (w/v) do 14% (w/v), ili od 8% (w/v) do 12% (w/v).

1

[0129] U određenim načinima ostvarivanja, koncentracija zaštitnih jedinjenja u formulaciji pre liofilizacije može biti 6% (w/v), ili 8% (w/v), ili 10% (w/v), ili 12% (w/v), ili 14% (w/v), ili 16% (w/v), ili 18% (w/v), ili 20% (w/v), ili 22% (w/v), ili 24% (w/v).

Postupci liofilizacije

[0130] Postupci liofilizacije mogu biti izvedeni u bilo kom pogodnom sudu, kao što su stakleni sudovi, ili, na primer, staklene bočice, ili sudovi sa dvostrukom komorom, kakvi su poznati u farmaceutskim oblastima.

[0131] Stabilizovana lipidna nanočestična kompozicija ovog pronalaska koja sadrži zaštitno jedinjenje može biti uvedena u stakleni sud. Zapremina kompozicije koja se dodaje u sud može biti od 0.1-20 mL, ili od 1-10 mL.

[0132] Može se primeniti bilo koji postupak liofilizacije, uključujući one kakvi su poznati u farmaceutskim oblastima. Videti, npr., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1990).

[0133] Postupak liofilizacije može da uključuje zamrzavanje zaštitne-stabilizovane lipidne nanočestične kompozicije na temperaturi od oko -40°C do oko -30°C. Zamrznuta kompozicija može biti osušen oblik liofilizovane kompozicije.

[0134] U nekim načinima ostvarivanja, faza zamrzavanja može oboriti temperatura od ambijentalne do konačne za svega nekoliko minuta. Temperaturna rampa može iznositi oko 1°C/minut.

[0135] U nekim načinima ostvarivanja, faza sušenja može se izvesti pri pritisku od oko 0-250 mTorr, ili 50-150 mTorr, na temperaturi od oko -15°C do oko -38°C. Faza sušenja može se nastaviti pri povišenoj temperaturi, sve do ambijentalne temperature, tokom perioda od po nekoliko dana. Nivo preostale vode u čvrstom liofilizatu može biti manje od oko 5%, ili manje od 4%, ili manje od 3%, ili manje od 2%, ili manje od 1% (w/v).

[0136] Zaštitne-stabilizovane lipidne nanočestične kompozicije ovog pronalaska, posle liofilizacije, mogu biti rekonstituisane postupcima poznatim u farmaceutskim oblastima.

[0137] U nekim aspektima, ovaj pronalazak obezbeđuje postupke za inhibiranje nivoa nagomilanih čestica u rekonstituisanom proizvodu leka, koji je pripremljen od zaštitne-stabilizovane lipidne nanočestične kompozicije ovog pronalaska posle liofilizacije.

[0138] U nekim načinima ostvarivanja, rekonstituisan proizvod leka, koji je pripremljen od zaštitnestabilizovane lipidne nanočestične kompozicije ovog pronalaska posle liofilizacije, može da ima redukovane nivoe nagomilanih čestica.

[0139] U određenim načinima ostvarivanja, rekonstituisan proizvod leka, koji je pripremljen od zaštitnestabilizovane lipidne nanočestične kompozicije ovog pronalaska posle liofilizacije, može da ima redukovane nivoe nagomilanih čestica sa veličinom većom od oko 0.2 µm, ili većom od oko 0.5 µm, ili većom od oko 1 µm.

Rekonstituisan proizvod leka

[0140] Liofilizat može biti rekonstituisan u farmaceutski prihvatljivom nosaču.

[0141] Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača uključuju sterilnu vodu, vodu za injekcije, sterilni normalni slani rastvor, bakteriostatičnu vodu za injekcije, i rastvor za nebulizator.

[0142] Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača uključuju farmaceutski prihvatljiv rastvor.

[0143] Primeri farmaceutski prihvatljivih rastvora uključuju HEPES pufer, fosfatne pufere, citratne pufere, i pufer koji sadrži Tris(hidroksimetil)aminometan.

[0144] Primeri farmaceutski prihvatljivih rastvora uključuju farmaceutski prihvatljive puferske rastvore.

[0145] Primeri farmaceutski prihvatljivih rastvora uključuju puferske rastvore maleinske kiseline, vinske kiseline, mlečne kiseline, sirćetne kiseline, natrijum bikarbonata, i glicina.

[0146] Rekonstituisan liofilizat može se primeniti kao proizvod leka.

[0147] Rekonstituisan liofilizat može biti dalje razblažen izotoničnim slanim rastvorom ili drugim ekscipijensima kao bi se obezbedila prethodno određena koncentracija za davanje.

[0148] Primeri ekscipijenasa uključuju tonifikatore.

[0149] Primeri ekscipijenasa uključuju stablizatore kao što su albumin humanog seruma, albumin goveđeg seruma, a-kazein, globulini, a-laktalbumin, LDH, lizozim, mioglobin, ovalbumin, i RNaza A.

[0150] Primeri ekscipijenasa uključuju pufere kao što su kalijum acetat, natrijum acetat, i natrijum bikarbonat.

[0151] Primeri ekscipijenasa uključuju aminokiseline kao što su glicin, alanini, arginin, betain, leucin, lizine, glutaminska kiselina, asparaginska kiselina, histidin, prolin, 4-hidroksiprolin, sarkozin, γaminobuterna kiselina, alanopin, oktopin, strombin, i trimetilamin N-oksid.

[0152] Primeri ekscipijenasa uključuju non-jonske surfaktante kao što su polisorbat 20, polisorbat 80, i poloksamer 407.

[0153] Primeri ekscipijenasa uključuju agense za dispergovanje kao što su fosfotidil holin, etanolamin, acetiltriptofanat, polietilen glikol, polivinilpirolidon, etilen glikol, glicerin, glicerol, propilen glikol, sorbitol, ksilitol, dekstran, i želatin.

[0154] Primeri ekscipijenasa uključuju antioksidanse kao što su askorbinska kiselina, cistein, tioglicerol, tioglikolna kiselina, tiosorbitol, i glutation.

[0155] Primeri ekscipijenasa uključuju agense za redukovanje kao što su ditiotreitol, tioli, i tiofeni.

[0156] Primeri ekscipijenasa uključuju helirajuće agense kao što su EDTA, EGTA, glutaminska kiselina, i asparaginska kiselina.

1

[0157] U nekim načinima ostvarivanja, liofilizat može biti rekonstituisan primenom šprica i igle kroz začepljenu bočicu. Liofilizat može biti rekonstituisan sa ili bez protresanja bočice.

[0158] Vreme za rekonstituciju može biti od 3-30 sekundi, ili duže.

[0159] U nekim načinima ostvarivanja, rekonstituisan proizvod leka nukleinske kiseline može da ima manje od 0.001 % (w/v) agregatnih čestica sa veličinom većom od 0.2 µm.

[0160] U određenim aspektima, rekonstituisan proizvod leka nukleinske kiseline može da ima smanjenu aktivaciju citokina.

[0161] U dodatnim aspektima, proizvod leka nukleinske kiseline može biti rekonstituisan posle vremenskog perioda skladištenja od šest meseci i zadržati 80% aktivnosti agenasa nukleinske kiseline.

[0162] U nekim načinima ostvarivanja, proizvod leka nukleinske kiseline može biti rekonstituisan posle vremenskog perioda skladištenja od šest meseci, a prosečna veličina lipidnih nanočestica može biti manje od 25% veća od one pre liofilizacije.

[0163] U određenim načinima ostvarivanja, proizvod leka nukleinske kiseline može biti rekonstituisan posle vremenskog perioda skladištenja od 24 meseca i zadržati 90% aktivnosti agenasa nukleinske kiseline.

[0164] U daljim načinima ostvarivanja, proizvod leka nukleinske kiseline može biti rekonstituisan posle vremenskog perioda skladištenja od 24 meseci, a prosečna veličina lipidnih nanočestica može biti manje od 25% veća od one pre liofilizacije.

RNKi molekuli

[0165] Količina aktivne interferencije RNK koju indukuje sastojak formulisan u kompoziciji ovog pronalaska može biti neka količina koja ne izaziva štetni efekat koji prevazilazi benefit davanja. Takva količina može biti određena in vitro ispitivanjem primenom uzgajanih ćelija, ili ispitivanjem na životinjskom ili sisarskom modelu kao što su miš, pacov, pas, ili svinja, itd., a takvi ispitni postupci poznati su stručnjacima iz ove oblasti. Postupci ovog pronalaska mogu se primeniti na bilo koju životinju, uključujući ljude.

[0166] Količina formulisanog aktivnog sastojka može da varira u skladu sa načinom na koji se taj agens ili kompozicija daju. Na primer, kada se veći broj jedinica kompozicije primenjuje za jedno davanje, količina aktivnog sastojka koji se formuliše u jednoj jedinici kompozicije može biti određen deljenjem količine aktivnog sastojka potrebnog za jedno davanje putem pomenutog većeg broja jedinica.

[0167] Molekuli nukleinske kiseline i RNKi molekuli ovog pronalaska mogu biti dostavljeni ili primenjeni na ćeliju, tkivo, organ, ili subjekat direktnom primenom molekula u lipozomalnim formulacijama kako bi se potpomoglo, promovisalo ili olakšalo prodiranje u ćeliju.

[0168] Molekuli nukleinske kiseline i RNKi molekuli ovog pronalaska mogu biti pripremljeni kao kompleks sa katjonskim lipidima, spakovani unutar lipozoma, i dostavljeni do ciljanih ćelija ili tkiva.

1

Nukleinska kiselina ili kompleksi nukleinske kiseline mogu biti lokalno primenjeni na relevantna tkiva ex vivo, ili in vivo putem direktne dermalne primene, transdermalne primene, ili injekcije.

[0169] Inhibitorni molekul ili kompozicija nukleinske kiseline ovog pronalaska može biti primenjen u jediničnom doznom obliku. Konvencionalna farmaceutska praksa može biti uposlena kako bi se obezbedile pogodne formulacije ili kompozicije za davanje jedinjenja pacijentima koji boluju od neke bolesti. Može se angažovati bilo koji pogodan put davanja, na primer, davanje može biti parenteralno, intravenozno, intraarterijalno, subkutano, intratumoralno, intramuskularno, intrakranijalno, intraorbitalno, oftalmološko, intraventrikularno, intrahepatično, intrakapsularno, intratekalno, intracistemalno, intraperitonealno, intranazalno, aerosolno, supozitorno, ili oralno davanje.

[0170] Kompozicije i postupci ovog otkrivanja mogu da uključuju ekspresioni vektor koji uključuje sekvencu nukleinske kiseline koja kodira najmanje jedan RNKi molekul ovog pronalaska na način da omogućava ekspresiju molekul nukleinske kiseline.

[0171] Molekuli nukleinske kiseline i RNKi molekuli ovog pronalaska mogu biti eksprimirani iz transkripcionih jedinica umetnutih u DNK ili RNK vektore. Rekombinantni vektori mogu biti DNK plazmidi ili virusni vektori.

[0172] Na primer, vektor može da sadrži sekvence koje kodiraju oba lanca RNKi molekula dupleks, ili jednog molekula nukleinske kiseline koji je samo-komplementaran i na taj način obrazuje RNKi molekul. Ekspresioni vektor može da uključuje sekvencu nukleinske kiseline koja kodira dva ili više molekula nukleinske kiseline.

[0173] Molekul nukleinske kiseline može biti eksprimiran unutar ćelija eukariotskih promotera.

Stručnjacima iz ove oblasti jasno je da bilo koja nukleinska kiselina može biti eksprimirana u eukariotskim ćelijama iz pogodnog DNK/RNK vektora.

[0174] Lipidne formulacije mogu biti primenjena na životinje intravenoznim, intramuskularnim, ili intraperitonealnim injektovanjem, ili oralno ili inhalacijom ili drugim postupcima koji su poznati u stanju tehnike.

[0175] Farmaceutski prihvatljive formulacije za davanje oligonukleotida su poznate i mogu se primeniti.

[0176] U jednom načinu ostvarivanja prethodno pomenutog postupka, inhibitorni molekul nukleinske kiseline daje se u dozi od oko 5 do 500 mg/m<2>/dan, npr., 5, 25, 50, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, ili 300 mg/m<2>/dan.

[0177] U nekim načinima ostvarivanja, inhibitorni molekuli nukleinske kiseline ovog pronalaska primenjuju se sistemski u dozama od oko 1 do 100 mg/kg, npr., 1, 5, 10, 20, 25, 50, 75, ili 100 mg/kg.

[0178] U daljim načinima ostvarivanja, doza može biti u opsegu od oko 25 do 500 mg/m<2>/dan.

[0179] Postupci poznati u stanju tehnike za pripremu formulacije mogu se naći, na primer, u "Remington: The Science and Practice of Pharmacy" Ed. A. R. Gennaro, Lippincourt Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa., 2000.

1

[0180] Formulacije za parenteralno davanje mogu, na primer, da sadrže ekscipijense, sterilnu vodu, ili slani rastvor, polialkilen glikole kao što su polietilen glikol, ulja biljnog porekla, ili hidrogenovane nafalene. Biokompatibilan, biodegradabilan laktidan polimer, laktidan/glikolidan kompolimer, ili polioksietilen-polioksipropilen kompolimeri mogu se primeniti za kontrolisanje oslobađanja jedinjenja. Drugi potencijalno korisni parenteralni sistemi za dostavu za inhibitorne molekule nukleinske kiseline uključuju čestice kompolimera etilen-vinil acetata, osmotske pumpe, implantirajuće infuzione sisteme, i lipozome. Formulacije za inhalaciju mogu da sadrže ekscipijense, na primer, laktozu, ili mogu biti vodeni rastvori koji sadrže, na primer, polioksietilen-9-lauril etar, glikoholat i deoksiholat, ili mogu biti uljasti rastvori za davanje u obliku nazalnih kapi, ili u obliku gela.

[0181] Formulacije mogu biti primenjene na humane pacijente u terapeutski efektivnim količinama (npr., količine koje sprečavaju, eliminišu, ili redukuju neko patološko stanje) radi obezbeđivanja terapije za neoplastičnu bolest ili stanje. Poželjna doza nukleotidnog oligomera ovog pronalaska može da zavisi od takvih varijabli kao što su vrsta i težina poremećaja, ukupan zdravstveni status određenog pacijenta, formulacije jedinjenja ekscipijenasa, i puta njegovog davanja.

Primeri lipidnih kompozicija

[0182] U određenim načinima ostvarivanja, četiri lipidne komponente, tj. jedan ili više jonizujućih lipidnih molekula, strukturalni lipid, jedan ili više stabilizatorskih lipida, i jedan ili više lipida za redukovanje imunogenosti kompozicije, mogu biti 100% lipidne komponente kompozicije.

[0183] Primeri lipidnih nanočestičnih kompozicija prikazani su u Tabeli 1.

Tabela 1: Kompozicije lipidnih komponenata (svaka u mol% ukupnog)

1

Jonizujući lipidni molekuli

[0184] Primeri jonizujućeg molekula uključuju jedinjenja strukture prikazane u Formuli I

pri čemu R<1>i R<2>predstavljaju

R<1>= CH2(CH2)nOC(=O)R<4>

R<2>= CH2(CH2)mOC(=O)R<5>

pri čemu n i m su svaki nezavisno od 1 do 2; i R<4>i R<5>su nezavisno za svako pojavljivanje C(12-20) alkil grupa, ili C(12-20) alkenil grupa;

pri čemu R<3>je odabrano iz grupe koju čine 1-azetidini, 1-pirolidini, 1-piperidini, 4-morfolini, i 1,4-piperazini pri čemu prstenovi mogu biti supstituisani na bilo kom položaju atoma ugljenika,

1

a takođe mogu biti odabrani iz grupe koju čine amino i aminoalkil grupe, koje mogu biti supstituisane,

pri čemu

svaki R<6>je nezavisno odabran iz grupe koju čine H, alkil, hidroksil, hidroksialkil, alkoksi, alkoksialkoksi, i aminoalkil;

svaki R<7>je nezavisno odabran iz grupe koju čine H, alkil, hidroksialkil, i aminoalkil;

svaki R<8>je nezavisno odabran iz grupe koju čine H, alkil, hidroksialkil, i aminoalkil, a bilo koja dva R<8>mogu da obrazuju prsten;

q iznosi od nula do četiri;

Q je O ili NR<7>;

p iznosi od 1 do 4.

[0185] Primeri jonizujućeg lipida uključuju sledeće jedinjenje:

JEDINJENJE A6

[0186]

koje je ((2-((3S,4R)-3,4-dihidroksipirolidin-1-il)acetil)azandiil)bis(etan-2,1-diil) (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-bis(oktadeka-9,12-dienoat).

2

[0187] Primeri jonizujućeg lipida uključuju sledeće jedinjenje:

JEDINJENJE A9

[0188]

koje je ((2-(3-(hidroksimetil)azetidin-1-il)acetil)azandiil)bis(etan-2,1-diil) ditetradekanoat.

[0189] Primeri jonizujućeg lipida uključuju sledeće jedinjenje:

JEDINJENJE AA

[0190]

koje je ((2-(4-(2-hidroksipropil)piperazin-1-il)acetil)azandiil)bis(etan-2,1-diil) (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-bis(oktadeka-9,12-dienoat).

[0191] Primeri jonizujućeg lipida uključuju sledeće jedinjenje:

JEDINJENJE AB

[0192]

koje je ((2-(4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il)acetil)azandiil)bis(etan-2,1-diil) (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-bis(oktadeka-9,12-dienoat).

[0193] Primeri jonizujućeg lipida uključuju sledeće jedinjenje:

JEDINJENJE C2

koje je 2-((1-(((9Z,12Z)-heptadeka-9,12-dien-1-il)oksi)-5-(((9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-il)oksi)-1,5-dioksopentan-3-il)amino)-N,N,N-trimetil-2-oksoetan-1-aminijum.

[0195] Primeri jonizujućeg lipida uključuju sledeće jedinjenje:

JEDINJENJE F5

[0196]

koje je 2-((9Z,12Z)-N-(3-(dimetilamino)propil)oktadeka-9,12-dienamido)etil (9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dienoat.

[0197] Primeri jonizujućeg lipida uključuju sledeće jedinjenje:

JEDINJENJE F7

[0198]

koje je N,N,N-trimetil-3-((9Z,12Z)-N-(2-(((9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dienoil)oksi)etil)oktadeka-9,12-dienamido)propan-1-aminijum.

[0199] Primeri jonizujućeg lipida uključuju sledeće jedinjenje:

JEDINJENJE C24

koje je N,N,N-trimetil-2-(((S)-3-(((9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-il)oksi)-2-((9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dienamido)-3-oksopropil)amino)-2-oksoetan-1-aminijum.

Strukturalni lipidi

[0201] Primeri strukturalnih lipida uključuju holesterole, sterole, i steroide.

[0202] Primeri strukturalnih lipida uključuju holane, holestan, ergostane, kampestane, poriferastane, stigmastane, gorgostane, lanostane, gonane, estrane, androstane, pregnane, i cikloartane.

[0203] Primeri strukturalnih lipida uključuju sterole i zoosterole kao što su holesterol, lanosterol, zimosterol, zimostenol, dezmosterol, stigmastanol, dihidrolanosterol, i 7-dehidroholesterol.

[0204] Primeri strukturalnih lipida uključuju jedinjenja pegilovanih holesterola, i holestan 3-okso-(C1-22)acila, na primer, holesteril acetat, holesteril arahidonat, holesteril butirat, holesteril heksanoat, holesteril miristat, holesteril palmitat, holesteril behenat, holesteril stearat, holesteril kaprilat, holesteril n-dekanoat, holesteril dodekanoat, holesteril nervonat, holesteril pelargonat, holesteril n-valerat, holesteril oleat, holesteril elaidat, holesteril erukat, holesteril heptanoat, holesteril linolelaidat, i holesteril linoleat.

[0205] Primeri strukturalnih lipida uključuju sterole kao što su fitosterol, beta-sitosterol, kampesterol, ergosterol, brasikasterol, delta-7-stigmasterol, i delta-7-avenasterol.

Stabilizatorski lipidi

[0206] Primeri stabilizatorskih lipida uključuju cviterjonske lipide.

[0207] Primeri stabilizatorskih lipida uključuju jedinjenja kao što su fosfolipidi.

[0208] Primeri fosfolipida uključuju fosfatidilholin, fosfatidiletanolamin, fosfatidilserin, fosfatidilinozitol, fosfatidna kiselina, palmitoiloleoil fosfatidilholin, lizofosfatidilholin, lizofosfatidiletanolamin, dipalmitoilfsfatidilholin, dioleoilfosfatidilholin, distearoilfosfatidilholin i dilinoleoilfosfatidilholin.

[0209] Primeri stabilizatorskih lipida uključuju jedinjenja fosfatidil etanolamina i jedinjenja fosfatidil holina.

[0210] Primeri stabilizatorskih lipida uključuju 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoholin (DOPC).

[0211] Primeri stabilizatorskih lipida uključuju difitanoil fosfatidil etanolamin (DPhPE) i 1,2-difitanoil-snglicero-3-fosfoholin (DPhPC).

2

[0212] Primeri stabilizatorskih lipida uključuju 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoholin (DSPC), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoholin (DPPC), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin (DPPE), i 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin (DOPE).

[0213] Primeri stabilizatorskih lipida uključuju 1,2-dilauroil-sn-glicerol (DLG); 1,2-dimiristoil-sn-glicerol (DMG); 1,2-dipalmitoil-sn-glicerol (DPG); 1,2-distearoil-sn-glicerol (DSG); 1,2-diarahidoil-sn-glicero-3-fosfoholin (DAPC); 1,2-dilauroil-sn-glicero-3-fosfoholin (DLPC); 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoholin (DMPC); 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-O-etil-3-fosfoholin (DPePC); 1,2-dilauroil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin (DLPE); 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin (DMPE); 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin (DSPE); 1-palmitoil-2-linoleoil-sn-glicero-3-fosfoholin; 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoholin (POPC); 1-palmitoil-2-lizo-sn-glicero-3-fosfoholin (P-Lizo-PC); i 1-stearoil-2-lizo-sn-glicero-3-fosfoholin (S-Lizo-PC).

Lipidi za redukovanje imunogenosti

[0214] Primeri lipida za redukovanje imunogenosti uključuju polimerna jedinjenja i polimer-lipid konjugate.

[0215] Primeri lipida za redukovanje imunogenosti uključuju pegilovane lipide koji imaju polietilenglikol (PEG) regione. Ti PEG regioni mogu biti bilo koje molekulske mase. U nekim načinima ostvarivanja, PEG region može da ima molekulsku masu od 200, 300, 350, 400, 500, 550, 750, 1000, 1500, 2000, 3000, 3500, 4000 ili 5000 Da.

[0216] Primeri lipida za redukovanje imunogenosti uključuju jedinjenja koja imaju metoksipolietilenglikol region.

[0217] Primeri lipida za redukovanje imunogenosti uključuju jedinjenja koja imaju karbonilmetoksipolietilenglikol region.

[0218] Primeri lipida za redukovanje imunogenosti uključuju jedinjenja koja imaju više-razgranat PEG region.

[0219] Primeri lipida za redukovanje imunogenosti uključuju jedinjenja koja imaju poliglicerin region.

[0220] Primeri lipida za redukovanje imunogenosti uključuju polimerne lipidi kao što su DSPE-mPEG, DMPE-mPEG, DPPE-mPEG, i DOPE-mPEG.

[0221] Primeri lipida za redukovanje imunogenosti uključuju PEG-fosfolipide i PEG-ceramide.

Katjonski lipidi

[0222] Primeri katjonskih lipida uključuju HEDC jedinjenja opisana u US 2013/022665 A1, i druga jedinjenja opisana u US 2013/0330401 A1 i US 2013/0115274 A1. Dodatni primeri katjonskih lipida su poznati u stanju tehnike.

Nanočestične formulacije

[0223] Načini ostvarivanja ovog pronalaska mogu da obezbede lipozomalne nanočestične kompozicije.

[0224] U određenim načinima ostvarivanja, jonizujući molekul ovog pronalaska može se primeniti da obrazuje lipozomalne kompozicije, koje mogu da imaju dvosloj lipidnih molekula.

[0225] Nanočestična kompozicija može da ima jedan ili više jonizujućih molekula ovog pronalaska u lipozomalnoj strukturi, dvoslojnoj strukturi, miceli, lamelarnoj strukturi, ili njihovoj mešavini.

[0226] U nekim načinima ostvarivanja, kompozicija može da uključuje jedan ili više komponenti tečnih nosača. Tečni nosač koji je pogodan za dostavu aktivnih agenasa ovog pronalaska može biti farmaceutski prihvatljiv tečni nosač. Tečni nosač može da uključuje organski rastvarač, ili kombinaciju vode i organskog rastvarača.

[0227] Načini ostvarivanja ovog pronalaska mogu da obezbede lipidne nanočestice koje imaju veličinu od 10 do 1000 nm. U nekim načinima ostvarivanja, lipozomalne nanočestice mogu da imaju veličinu od 10 do 150 nm.

[0228] U određenim načinima ostvarivanja, lipozomalne nanočestice ovog pronalaska mogu da enkapsuliraju RNKi molekul i da zadrže najmanje 80% enkapsuliranih RNKi molekula posle 1 sata izlaganja humanom serumu. Ovaj pronalazak može da obezbedi kompoziciju za upotrebu u distibuiranju aktivnog agensa u ćelije, tkiva ili organe, organizme, i subjekte, pri čemu kompozicija uključuje jedan ili više jonizujuća lipidna molekula ovog pronalaska.

[0229] Kompozicije ovog pronalaska mogu da uključuju jedan ili više jonizujućih lipidnih molekula, zajedno sa strukturalnim lipidom, jedan ili više stabilizatorskih lipida, i jedan ili više lipida za redukovanje imunogenosti kompozicije.

[0230] Jonizujući lipidni molekul ovog pronalaska može biti bilo kog mol% kompozicije ovog pronalaska.

[0231] Jonizujući lipidni molekuli kompozicije ovog pronalaska mogu biti od 15 mol% do 40 mol% lipidnih komponenti kompozicije. U određenim načinima ostvarivanja, jonizujući lipidni molekuli kompozicije mogu biti od 20 mol% do 35 mol% lipidnih komponenti kompozicije. U daljim načinima ostvarivanja, jonizujući lipidni molekuli kompozicije mogu biti od 25 mol% do 30 mol% lipidnih komponenti kompozicije.

[0232] Strukturalne lipidne kompozicije ovog pronalaska mogu biti od 25 mol% do 40 mol% lipidnih komponenti kompozicije. U određenim načinima ostvarivanja, strukturalne lipidne kompozicije mogu biti od 30 mol% do 35 mol% lipidnih komponenti kompozicije.

[0233] Zbir stabilizatorskih lipida kompozicije ovog pronalaska može biti od 25 mol% do 40% mol% lipidnih komponenti kompozicije. U određenim načinima ostvarivanja, zbir stabilizatorskih lipida kompozicije može biti od 30 mol% do 40 mol% lipidnih komponenti kompozicije.

[0234] U nekim načinima ostvarivanja, kompozicija ovog pronalaska može da uključuje dva ili više stabilizatorskih lipida, pri čemu svaki od stabilizatorskih lipida pojedinačno može biti od 5 mol% do 35

2

mol% lipidnih komponenti kompozicije. U određenim načinima ostvarivanja, kompozicija ovog pronalaska može da uključuje dva ili više stabilizatorskih lipida, pri čemu svaki od stabilizatorskih lipida pojedinačno može biti od 10 mol% do 30 mol% lipidnih komponenti kompozicije.

[0235] U određenim načinima ostvarivanja, zbir jednog ili više stabilizatorskih lipida može biti od 25 mol% do 40 mol% lipida kompozicije, pri čemu svaki od stabilizatorskih lipida pojedinačno može biti od 5 mol% do 35% mol%.

[0236] U određenim načinima ostvarivanja, zbir jednog ili više stabilizatorskih lipida može biti od 30 mol% do 40 mol% lipida kompozicije, pri čemu svaki od stabilizatorskih lipida pojedinačno može biti od 10 mol% do 30% mol%.

[0237] Jedan ili više lipida za redukovanje imunogenosti kompozicije može biti od ukupno od 1 mol% do 8 mol% lipidnih komponenti kompozicije. U određenim načinima ostvarivanja, jedan ili više lipida za redukovanje imunogenosti kompozicije može biti od ukupno od 1 mol% do 5 mol% lipidnih komponenti kompozicije.

[0238] U dodatnim aspektima, kompozicija ovog pronalaska može dalje da uključuje katjonski lipid, koji može biti od 5 mol% do 25 mol% lipidnih komponenti kompozicije. U određenim načinima ostvarivanja, kompozicija ovog pronalaska može dalje da uključuje katjonski lipid, koji može biti od 5 mol% do 15 mol% lipidnih komponenti kompozicije. U ovim aspektima, molarni odnos koncentracije katjonskog lipida prema jonizujućim lipidnim molekulima kompozicije ovog pronalaska može biti od 5:35 do 25:15.

[0239] U kompozicijama ovog pronalaska, celina lipidnih komponenti može da uključuje jedan ili više jonizujućih lipidnih molekulskih komponenti, jedan ili više strukturalnih lipida, jedan ili više stabilizatorskih lipida, i jedan ili više lipida za redukovanje imunogenosti kompozicije.

[0240] U nekim načinima ostvarivanja, kompozicija može da sadrži jonizujuće lipidno jedinjenje A6, strukturalni lipidni holesterol, stabilizatorske lipide DOPC i DOPE, i lipide za redukovanje imunogenosti DPPE-mPEG. U određenim načinima ostvarivanja, jedinjenje A6 može biti 15 do 25 mol% kompozicije; kombinovani holesterol, DOPC, i DOPE mogu biti 75 do 85 mol% kompozicije; i DPPE-mPEG mogu biti 5 mol% kompozicije.

[0241] U jednom načinu ostvarivanja, jedinjenje A6 može biti 25 mol% kompozicije; holesterol može biti 30 mol% kompozicije, DOPC može biti 20 mol% kompozicije, DOPE može biti 20 mol% kompozicije; i DPPE-mPEG(2000) može biti 5 mol% kompozicije.

Farmaceutske kompozicije

[0242] Ovaj pronalazak dalje predviđa postupke za distribuiranje aktivnog agensa do organa subjekta radi tretiranja bolesti davanjem subjektu kompozicije ovog pronalaska. Organi koji se mogu tretirati uključuju pluća, jetru, pankreas, bubrege, debelo crevo, kosti, kožu, i creva.

[0243] U daljim aspektima, ovaj pronalazak obezbeđuje spektar farmaceutskih formulacija.

2

[0244] Ovde navedena farmaceutska formulacija može da uključuje aktivni agens, kao i nosač leka, ili lipid ovog pronalaska, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem ili razblaživačem. Uopšteno, aktivni agensi iz ovog opisa uključuju bilo koje aktivne agense za maligni tumor, uključujući bilo koje inhibitorne molekule nukleinske kiseline i bilo koje lekove malih molekula. Primeri inhibitornih molekula nukleinske kiseline uključuju ribozime, anti-sens nukleinske kiseline, i molekule RNK interferencije (RNKi molekuli).

[0245] Farmaceutska formulacija ovog pronalaska može da sadrži jedan ili više svakih od sledećeg: površinski aktivni agens, razblaživač, ekscipijens, konzervans, stabilizator, boju, i suspendujući agens.

[0246] Neki farmaceutski nosači, razblaživači i komponente za farmaceutsku formulaciju, kao i postupci za formulisanje i davanje jedinjenja i kompozicija ovog pronalaska opisani su u Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1990).

[0247] Primeri konzervanasa uključuju natrijum benzoat, askorbinsku kiselinu, i estre phidroksibenzojeve kiseline.

[0248] Primeri površinski aktivnih agenasa uključuju alkohole, estre, sulfatisane alifatične alkohole.

[0249] Primeri ekscipijenasa uključuju saharozu, glukozu, laktozu, skrob, kristalnu celulozu, manitol, lake anhidrovane silikate, magnezijum aluminat, magnezijum metasilikat aluminat, sintetički aluminijum silikat, kalcijum karbonat, kiselinu natrijum karbonata, kalcijum hidrogen fosfat, i kalcijum karboksimetil celulozu.

[0250] Primeri suspendujućih agenasa uključuju kokosovo ulje, maslinovo ulje, susamovo ulje, ulje kikirikija, soju, celulozu acetat ftalat, kompolimer metilacetat-metakrilata, i estar ftalate.

[0251] Terapeutska formulacija ovog pronalaska za dostavu jednog ili više molekula aktivnih za utišavanje gena, mogu biti primenjeni na sisara kome je to potrebno. Terapeutski efektivna količina formulacije i aktivnog agensa, koji može biti enkapsuliran u lipozomu, mogu biti primenjeni na sisara radi sprečavanja ili tretiranja malignog tumora.

[0252] Put davanja može biti lokalan ili sistemski.

[0253] Terapeutski-efektivna formulacija ovog pronalaska može biti primenjena na razne puteve, uključujući intravenozne, intraperitonealne, intramuskularne, subkutane, i oralne.

[0254] Putevi davanja mogu da uključuju, na primer, parenteralnu dostavu, uključujući intramuskularne, subkutane, intravenozne, intramedularne injekcije, kao i intratekalne, direktne intraventrikularne, intraperitonealne, intranazalne, ili intraokularne injekcije.

[0255] Formulacija takođe može biti primenjeni u doznim oblicima sa produženim ili kontrolisanim oslobađanjem, uključujući depot injekcije, osmotske pumpe, i slično, za produženo i/ili vremenski određeno, pulsno davanje pri prethodno određenoj brzini.

[0256] Kompozicija ovog pronalaska može biti primenjena pomoću raznih puteva uključujući i oralne i parenteralne puteve, a njihovi primeri uključuju, ali se ne ograničavaju na, oralne, intravenozne,

2

intramuskularne, subkutane, lokalne, intrapulmonarne, intra disajnim putevima, intratrahealne, intrabronhijalne, nazalne, rektalne, intraarterijalne, intraportalne, intraventrikularne, intramedularne, intra-limfnim čvorom, intralimfatične, intramoždane, intratekalne, intracerebroventrikularne, transmukozalne, perkutane, intranazalne, intraperitonealne, i intramaterične puteve, i ona može biti formulisana u dozni oblik pogodan za svaki put davanja. Takav dozni oblik i postupak formulacije može biti pogodno odabran od bilo kog od poznatih doznih oblika i postupaka. Videti npr. Hyojun Yakuzaigaku, Standard Pharmaceutics, Ed. by Yoshiteru Watanabe et al., Nankodo, 2003.

[0257] Primeri doznih oblika pogodnih za oralno davanje uključuju, ali se ne ograničavaju na, prašak, granule, tabletu, kapsulu, tečnost, suspenziju, emulziju, gel, i sirup, a primeri doznog oblika pogodan za parenteralno davanje uključuju injekcije kao što su injektabilni rastvor, injektabilna suspenzija, injektabilna emulzija, i injekcije spremne za upotrebu. Formulacije za parenteralno davanje može biti oblika kao što su vodeni ili nevodeni izotonični sterilni rastvor ili suspenzija.

[0258] Farmaceutske formulacije za parenteralno davanje, npr., bolus injekcijom ili kontinualnom infuzijom, uključuju vodene rastvore aktivne formulacije u obliku rastvorljivom u vodi. Suspenzije aktivnih jedinjenja mogu biti pripremljene kao pogodne uljaste injektabilne suspenzije. Vodene injekcione suspenzije mogu da sadrže neke supstance, koje povećavaju viskoznost suspenzije, kao što su natrijum karboksimetil celulozu, sorbitol, ili dekstran. Opciono, suspenzija takođe može da sadrži pogodne stablizatore ili agense koji povećavaju rastvorljivost jedinjenja kako bi se omogućila priprema veoma koncentrovanih rastvora.

[0259] Formulacije za injekcije mogu biti formulisane u jediničnom doznom obliku, npr., u ampulama ili u višedoznim kontejnerima, sa dodatim konzervansom. Formulacije mogu biti oblicima kao što su suspenzije, rastvori ili emulzije u uljastim ili vodenim nosačima, i mogu da sadrže formulacione agense kao što su agensi za suspendovanje, stabilizovanje i/ili agense za dispergovanje. Alternativno, aktivni sastojak može biti u praškastom obliku za konstituisanje sa pogodnim nosačem, npr., sterilna voda bez pirogena, pre upotrebe.

[0260] Pored prethodno opisanih preparata, formulacije takođe mogu biti formulisane kao depot preparat. Takve dugodelujuće formulacije mogu biti primenjene intramuskularnom injekcijom. Na taj način, na primer, formulacija može biti formulisana sa pogodnim polimernim ili hidrofobnim materijalima, na primer kao emulzija u prihvatljivom ulju, ili jono izmenjivačke smole, ili kao umereno rastvorljivi derivati, na primer, kao umereno rastvorljiva so.

[0261] Kompozicije i formulacije ovog pronalaska takođe mogu biti formulisane za topikalnu dostavu i mogu se primeniti na koži subjekta primenom bilo kog pogodnog postupka za primenu nosača za topikalnu dostavu. Na primer, formulacija može se može naneti ručno, upotrebom aplikatora, ili postupkom koji uključuje oba. Posle primene, formulacija može biti utrljana u kožu subjekta, npr., utrljavanjem. Primena može biti izvedena na bazi više dnevnih ili jedno dnevnih primena. Na primer,

2

formulacija može biti naneta na kožu subjekta jednom dnevno, dva puta dnevno ili više puta na dan, ili se može naneti jedanput svaka dva dana, jedanput svaka tri dana, ili približno jednom svake nedelje, jednom svake dve nedelje, ili jednom svakih nekoliko nedelja.

[0262] Ovde opisani formulacije ili farmaceutske kompozicije mogu se primeniti kod nekog subjekta bilo na bilo koji pogodan način. Primeri postupaka davanja uključuju, između ostalih, (a) davanje putem injekcije, subkutano, intraperitonealno, intravenozno, intramuskularno, intradermalno, intraorbitalno, intrakapsularno, intraspinalno, intrasternalno, ili slično, uključujući dostavu infuzionim pumpama; (b) lokalno davanje kao što je direktno injektovanje u bubrežne ili kardio regije, npr., depot implantiranjem; kao i na način koji stručnjaci iz ove oblasti smatraju pogodnim za dovođenje aktivnog jedinjenja u kontakt sa živim tkivima.

[0263] Precizna formulacija, put davanja i doza za farmaceutske kompozicije mogu se izabrati od strane pojedinačnih fizijatara u pogledu stanja pacijenta. Videti, npr., Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 12th Ed., Sec.1, 2011. Typically, dozni opseg kompozicije koji se primenjuje na pacijenta može biti od oko 0.5 do oko 1000 mg/kg telesne težine pacijenta. Doza može biti jedna ili serija dve ili više datih u trajanju od jednog ili više dana, što zavisi od potreba pacijenta. U slučajevima u kojima su utvrđene humane doze za najmanje neko stanje, doze će biti skoro iste, ili doze koje su oko 0.1% do oko 500%, poželjnije oko 25% do oko 250% utvrđene humane doze. Kada nije utvrđena humana doza, što bi bio slučaj kod novo otkrivenih farmaceutskih kompozicija, pogodna humana doza može se zaključiti iz ED50 ili ID50 vrednosti, ili drugih pogodnih vrednosti izvedenih iz in vitro ili in vivo ispitivanja, kao što su kvalifikovana ispitivanja toksičnosti i ispitivanja efikasnosti na životinjama.

PRIMERI

Primer 1: Priprema siRNK lipidne nanočestične formulacije leka liofilizacijom i rekonstitucijom.

[0264] Lipidne nanočestice sintetizovane su injektovanjem velike brzine rastvora lipid/etanol u siRNK puferski rastvor tokom oko 10 minuta. Posle toga, drugi pufer, odabran iz grupe koju čine citratni pufer pH 6.1, PBS pH 7.0, Tris pH 7.2, i HEPES pH 7.4, dijafiltriran je i upotrebljen kao eksterni pufer kroz TFF kertridže radi pripreme konačnog proizvoda vodene suspenzije.

[0265] Razne količine zaštitnog jedinjenja dodate su konačnom proizvodu vodene suspenzije, praćeno 0.2/0.8 mikrometarskom filtracijom. Lipidne nanočestice pripremljene su ili u 500 mL ili 1000 mL šaržama.

[0266] Rezultati: Začuđujuće je otkriveno da su lipidne nanočestice preživele postupak liofilizacije, i da je taj liofilizat obezbedio rekonstituisanu suspenziju lipidnih nanočestica sa prosečnom veličinom približnom veličini koja je prisutna u originalnoj suspenziji.

2

Primer 2: Rekonstituisane formulacije leka siRNK ovog pronalaska pokazuju stabilnu veličinu i siRNK enkapsulaciju, koje su pogodne za primenu u proizvodima leka. Iznenađujući nivo stabilnosti siRNK formulacija ovog pronalaska proizilazi iz svojstava zaštićene liofilizacione kompozicije.

[0267] U ovom ispitivanju, siRNK koja je usmerena ka Hsp47 formulisana je u lipozomalnim nanočesticama sa sledećom približnom kompozicijom: jonizujući lipidi, 40 mol%, DOPE, 30 mol%, Holesterol, 25 mol%, i PEG-DMPE, 5.0 mol%.

[0268] Nanočestične formulacije liofilizovane su sa zaštitnom kompozicijom koja sadrži saharozu i (2-bidroksipropil)-β-ciklodekstrin. Ukupni zaštitni sadržaj kompozicije bio je 10% (w/v). Količine koje su upotrebljene bile su 6% saharoze i 4% (2-hidroksipropil)-β-ciklodekstrina). Prema tome, sadržaj (2-hidroksipropil)-β-ciklodekstrina bio je 40% (w/v) ukupne količine saharoze plus (2-hidroksipropil)-βciklodekstrina.

[0269] Lipidne nanočestice sintetizovane su ubrizgavanjem pri velikoj brzini rastvora lipid/etanol u siRNK puferski rastvor, radi pripreme konačnog proizvoda vodene suspenzije. Početna masovna formulacija nanočestica koje sadrže siRNK imala je prosečnu veličinu nanočestica u opsegu od 99-101 nm.

[0270] Liofilizovane, rekonstituisane formulacije leka siRNK ispitane su na stabilnost veličine i enkapsulaciju siRNK.

[0271] Uopšteno, najpoželjnije je da siRNK nanočestične formulacije pokazuju manje od oko 10% promene u prosečnoj veličini između pred-liofilizovanog stanja i liofilizovanog, rekonstituisanog stanja. Dalje, najpoželjnije je da siRNK nanočestične formulacije pokazuju najmanje oko 85% efikasnosti siRNK enkapsulacije u liofilizovanom, rekonstituisanom stanju.

[0272] Stabilnosti rekonstituisanih siRNK nanočestičnih proizvoda prikazane su u Tabeli 2. U Tabeli 2, prosečna veličina i efikasnost siRNK enkapsulacije posle liofilizacije (AL) i rekonstitucije, prikazane su zajedno sa sličnim rezultatima dobijenim iz zamrznutog, odmrznutog rastvora pre liofilizacije (BL). Tabela 2: Nanočestična stabilnost pre liofilizacije i posle rekonstitucije

[0273] U Tabeli 2, sve zaštitne kompozicije ispoljavaju pogodnu stabilnost finalne rekonstituisane formulacije leka siRNK. Pored uzoraka sa najvišim nivoima siRNK koncentracije i ukupne zaštite (15%), siRNK nanočestične formulacije ispoljavaju manje od 10% promene u prosečnoj veličini između predliofilizovanog stanja i liofilizovanog, rekonstituisanog stanja, kao i najmanje 85% efikasnost enkapsulacije siRNK u liofilizovanom, rekonstituisanom stanju.

[0274] Rezultati u Tabeli 2 pokazuju da rekonstituisane formulacije leka siRNK ovog pronalaska koje su pripremljene od nanočestičnih formulacija liofilizacijom iz zaštitne kompozicije koja sadrži 60% saharoze i 40% (2-hidroksipropil)-β-ciklodekstrina, poželjno su stabilne u prosečnoj veličini i efikasnosti siRNK enkapsulacije.

Primer 3: Model dimetilnitrosaminom (DMN) indukovane fibroze kod pacova.

[0275] Rekonstituisane formulacije leka siRNK ovog pronalaska ispoljavaju intenzivnu i začuđujuću potenciju za utišavanje gena in vivo. Zapažen je in vivo nokdaun sa liofilizovanim i rekonstituisanim siRNK formulacijama. siRNK enkapsulirana u lipozomalnoj formulaciji upotrebljene su u modelu dimetilnitrozaminom (DMN) indukovane fibroze kod pacova.

[0276] siRNK usmerena ka Hsp47 (GP46) formulisana je u lipozomalnim nanočesticama sa sledećom približnom kompozicijom: jonizujući lipidi, 40 mol%, DOPE, 30 mol%, Holesterol, 25 mol%, i PEG-DMPE, 5.0 mol%.

[0277] Nanočestične formulacije liofilizovane su sa zaštitnom kompozicijom koja sadrži saharozu i (2-bidroksipropil)-β-ciklodekstrin. Ukupni zaštitni sadržaj bio je 10% (w/v). Sadržaj (2-hidroksipropil)-βciklodekstrina varirao je od 20% do 40% (w/v).

[0278] Uzorci su dobijeni kao svež, istog dana liofilizovan kolač uskladišten na -80C. Uzorci su rekonstituisani slanim rastvorom i dalje razblaženi slanim rastvorom do dsotizanja koncentracije od 0.17 mg/mL siRNK. Vreme rekonstitucije bilo je oko 20 s sa 3 mL zapremine.

1

[0279] Konačni rekonstituisan rastvori proizvoda leka Hsp47 siRNK ispitani su na in vivo potenciju, koja predstavlja rigorozan test vijabilnosti liofilizovanih, rekonstituisanih nanočestica koje sadrži agens nukleinske kiseline.

[0280] Naivni Sprague Dawley pacovi u deset grupa od 7-8 mužijaka koji su težili u opsegu od 180-200 g upotrebljeni su u ovom ispitivanju. Tečni dozni oblik sa PBS pri pH 7.4 je upotrebljen. Na dan doziranja, pre davanja, formulacija je rekonstituisana i razblažena primenom slanog rastvora u koncentracijama od strane grupe. Zamrznuta kontrolna formulacija je otopljena i razblažena jedan dan pre davanja. Količina DMN za postizanje 5 mg/mL bistrog doznog rastvora na dan injektovanja dodata je u PBS pri pH 7.4. Davanje je bilo intraperitonealnom injekcijom. Doziranje je bilo QD, Dan 1-3, tokom 3 uzastopna dana. Doza je bila 0.5 do 1.5 mg/kg (siRNK) koja je primenjivala spektar koncentracije formulacije od 0.17 - 0.5 mg/mL, sa primenjenom zapreminom od 3 mL/kg. Pacovi su izmereni pre davanja DMN i životinjeama je ubrizgano na dan 1-3 intraperitonealno 10 mg/kg DMN (rastvor pri 5mg/ml), sa zapreminom doziranja od 2 mL/kg. Na dan 4-6, životinjama je ubrizgan DMN u doznoj zapremini od 1 mL/kg. Na dan 5, DMN-tretirane životinje nasumično su raspoređene u grupe na bazi telesne mase (dan 5) pre davanja leka. Ispitni artikal dat je na dan 6 (prvi dan DMN injekcije bio je dan 1). Na dan 7, obezbeđene su jetre pacova i odmah su isprane sa PBS, pH 7.4 (40 mL pri brzini od 20 mL/min) kroz isečenu hepatičnu portalnu venu. Jedna 2 mm debela poprečna sekcija jetre je sakupljena iz levih lateralnih režnjeva.

[0281] gp46 mRNK nokdaun evaluacija. Ukupna RNK iz jetre pacova ekstraktovana je primenom RNeasy kolona (Qiagen). RNK je kvantifikovana primenom Nanodrop spektrofotometra.

[0282] Kako je prikazano na Fig.1, rekonstituisana siRNK formulacija leka ovog pronalaska koja je zaštićena sa 40% (2-hidroksipropil)-β-ciklodekstrina ispoljava intenzivnu i začuđujuću potenciju za utišavanje gena kod Hsp47 (GP46) in vivo.

[0283] Određenije, in vivo potencija Hsp47 (GP46) utišavanja gena formulacije koja je zaštićena sa 40% (2-hidroksipropil)-β-ciklodekstrina suštinski je iznosila 100%.

[0284] Nasuprot tome, in vivo potencija formulacija koje sadrže 20% do 30% (2-hidroksipropil)-βciklodekstrina ispoljava nprihvatljivo nizak genski nokdaun, pri čemu on iznosi samo 47% i 32%, respektivno.

[0285] Kao zakjlučak, neočekivano poželjan rezultat pokazuje da zaštitne kompozicije za liofilizaciju lipozomalnih siRNK formulacija ovog pronalaska mogu biti pripremljene sa najmanje 40% (2-hidroksipropil)-β-ciklodekstrina u kompoziciji koja sadrži saharozu i (2-bidroksipropil)-β-ciklodekstrin.

[0286] Fizička karakterizacija je pokazala da rekonstituisane formulacije leka siRNK ovog pronalaska koje su pripremljene od nanočestične formulacije liofilizacijom iz zaštitne kompozicije koja sadrži od oko 40% do oko 70% (2-hidroksipropil)-β-ciklodekstrina, i preostale saharoze, poželjno su stabilne u prosečnoj veličini. Ispod približno 40% (2-hidroksipropil)-β-ciklodekstrina, formulacije imaju tendenciju da imaju anomalično povećane vrednosti enkapsulacije, što je pokazatelj neželjenih strukturalnih promena.

2

Prema tome, poželjan opseg za komponentu (2-hidroksipropil)-β-ciklodekstrina je od oko 40% do oko 70%.

[0287] Kao zaključak, rekonstituisana siRNK formulacija leka ovog pronalaska koristi od 40% do 70% (2-hidroksipropil)-β-ciklodekstrina sa iznenađujućom potencijom za agens lek nukleinske kiseline in vivo.

Primer 4: Rekonstituisane formulacije leka siRNK ovog pronalaska ispoljavaju dovoljnu koncentraciju u plazmi za utišavanje gena in vivo. Farmakokinetike u plazmi liofilizovanih i rekonstituisanih siRNK formulacija zapažene su in vivo.

[0288] siRNK usmerena prema Hsp47 (GP46) formulisana je u lipozomalnim nanočesticama sa sledećom približnom kompozicijom: jonizujući lipidi, 40 mol%, DOPE, 30 mol%, Holesterol, 25 mol%, i PEG-DMPE, 5.0 mol%.

[0289] Nanočestične formulacije liofilizovane su sa zaštitnom kompozicijom koja sadrži saharozu i (2-bidroksipropil)-β-ciklodekstrin. Ukupni zaštitni sadržaj iznosio je 12.5% (w/v). Sadržaj (2-hidroksipropil)-β-ciklodekstrina bio je 40% (w/v) ukupne zaštite, preostalo je bila saharoza.

[0290] Profili PK u plazmi procenjeni su na Sprague Dawley pacovima posle intravenoznog davanja u jednom doznom nivou liofilizovane formulacije u poređenju sa zamrznutom formulacijom. siRNK koncentracije u uzorcima plazme određene su ELISA postupkom baziranom na hibridizaciji. Sprague-Dawley pacovi su pripremljeni putem dvostrukog katereta u vratnoj veni. Životinjama je data jedna bolus intravenozna doza injekcije test materijala putem jednog katetera kroz vratnu venu tokom 15 sekundi na Dan 1. Približno 0.30 mL ukupne krvi je sakupljeno putem katetera iz vratne vene od svake životinje u K2EDTA epruvete u svakoj vremenskoj tački.

[0291] Kako je prikazano na Fig.2, farmakokinetičke koncentracije u plazmi liofilizovane, rekonstituisane siRNK formulacije leka suštinski su identične kao i kod uporedne kontrolne formulacije koja je bila samo zamrznuta. Liofilizovana, rekonstituisana formulacija leka siRNK nukleinske kiseline obezbedila je iznenađujuće nivoe efikasnosti agensa leka u plazmi.

[0292] Za ovaj eksperiment, površina ispod krive vreme-koncentracija (AUC) i pik koncentracije u plazmi (Cmax) posle jedne doze, prikazani su Tabeli 3.

Table 3: Farmakokinetike u plazmi za liofilizovane, rekonstituisane formulacije nukleinske kiseline

[0293] Kao zaključak, ovaj eksperiment prikazuje da su farmakokinetike koncentracije u plazmi liofilizovane, rekonstituisane formulacije leka nukleinske kiseline suštinski iste kao kod uporedne pozitivne kontrolne formulacije koja je samo bila zamrznuta. Prema tome, liofilizovana, rekonstituisana formulacija leka siRNK nukleinske kiseline obezbeđuje iznenađujuće nivoe efikasnosti agensa leka u plazmi, i nije degradirana u odnosu na ne-liofilizovanu kompoziciju.

Primer 5: Zaštitne lipidne nanočestice u 100 nm opsegu veličine.

[0294] Lipidne nanočestice sintetizovane su sa disperzijom rastvora lipid/etanol u siRNK puferu, radi pripreme konačnog proizvoda vodene suspenzije. Nanočestice su imale prosečnu veličinu od 105-106 nm. Nanočestice su sintetizovane primenom jedinjenja HEDC kao jonizujućeg lipida (videti, npr. US 2013/022665 A1). Nanočestice su enkapsulirale siRNK koja cilja Hsp47.

[0295] Tabela 4 prikazuje nanočestične karakteristike pre liofilizacije, pri čemu je konačni proizvod vodene suspenzije jedva zamrznut, a zatim odmrznut. Tabela 5 prikazuje nanočestične karakteristike posle liofilizacije.

[0296] Povećanje u prosečnoj veličini od Tabele 4 do Tabele 5 iznosi svega 6.7%.

Tabela 4: Nanočestične karakteristike pre liofilizacije (100 nm opseg veličine)

Tabela 5: Nanočestične karakteristike posle liofilizacije (100 nm opseg veličine)

4

[0297] U dodatnom ispitivanju, devet rastvora konačnih proizvoda koji sadrže 6% (w/v) saharoze, 4% (w/v) (2-hidroksipropil)-β-ciklodekstrina, i koncentraciju siRNK usmerena prema Hsp47 od 2 mg/mL, ispitani su na povećanje prosečne veličine posle liofilizacije i rekonstitucije. Posle liofilizacije, rekonstituisani proizvodi leka pokazuju iznenađujuće malo povećanje u prosečnoj veličini od manje od 5%, od 102 nm do 107 nm, u poređenju sa konačnim proizvodima rastvora pre liofilizacije.

Primer 6: Zaštitne lipidne nanočestice u 50 nm opsegu veličine.

[0298] Lipidne nanočestice sintetizovane su injektovanjem velike brzine rastvora lipid/etanol u siRNK pufer, radi pripreme konačnog proizvoda vodene suspenzije. Nanočestice su imale prosečnu veličinu od 48-50 nm. Nanočestice su sintetizovane primenom Jedinjenja A6 kao jonizujući lipid. Nanočestice su enkapsulirale siRNK usmerenu prema Hsp47 pri 2 mg/mL.

[0299] Tabela 6 prikazuje nanočestične karakteristike pre liofilizacije (BL) i posle liofilizacije (AL) nanočestica u opsegu veličine od 50 nm.

Tabela 6: Nanočestične karakteristike pre i posle liofilizacije nanočestica u opsegu veličine od 50 nm

Primer 7: Zaštitne siRNK lipidne nanočestice za dugoročno skladištenje.

[0300] Rekonstituisane formulacije leka siRNK ovog pronalaska ispoljavaju dugoročnu stabilnost za utišavanje gena in vivo.

[0301] siRNK usmerena prema Hsp47 (GP46) formulisana je u lipozomalnim nanočesticama sa sledećom približnom kompozicijom: jonizujući lipidi, 40 mol%, DOPE, 30 mol%, Holesterol, 25 mol%, i PEG-DMPE, 5.0 mol%.

[0302] Nanočestične formulacije liofilizovane su sa zaštitnom kompozicijom koja sadrži saharozu i (2-bidroksipropil)-β-ciklodekstrin. Ukupni zaštitni sadržaj iznosio je 10% do 12.5% do 15% (w/v). Sadržaj (2-hidroksipropil)-β-ciklodekstrina iznosio je 40% (w/v), saharoze 60%. Ciklodekstrin je bio CAVITRON W7 HP5 PHARMA ciklodekstrin.

[0303] Bočice su uskladištene na temperaturama prikazanim u Tabeli 7 tokom 4 nedelje. Posle skladištenja i rekonstitucije, prosečna veličina nanočestica (PS, Z-pros.) bila je iznenađujuće stabilna, kako je prikazano u Tabeli 7.

[0304] Kako je prikazano u Tabeli 7, veličina siRNK nanočestica bila je unutar 4% njihove veličine u originalnoj kompoziciji.

Tabela 7: Nanočestične karakteristike

Primer 8: Zaštitne siRNK lipidne nanočestice za dugoročno skladištenje.

[0305] Rekonstituisane formulacije leka siRNK ovog pronalaska ispoljavaju dugoročnu stabilnost za utišavanje gena in vivo.

Claims (21)

1. [0306] siRNK koja je usmerena prema Hsp47 (GP46) formulisana je u lipozomalnim nanočesticama sa sledećom približnom kompozicijom: jonizujući lipidi, 40 mol%, DOPE, 30 mol%, Holesterol, 25 mol%, i PEG-DMPE, 5.0 mol%. [0307] Nanočestične formulacije liofilizovane su sa zaštitnom kompozicijom koja sadrži saharozu i (2-bidroksipropil)-β-ciklodekstrin. Ukupni zaštitni sadržaj iznosio je od 10% do 12.5% do 15% (w/v). Sadržaj (2-hidroksipropil)-β-ciklodekstrina iznosio je 40% (w/v), saharoze 60%. Ciklodekstrin je bio CAVITRON W7 HP7 PHARMA ciklodekstrin. [0308] Bočice su uskladištene na temperaturama prikazanim u Tabeli 8 tokom 4 nedelje. Posle skladištenje i rekonstitucije, prosečna veličina nanočestica (PS, Z-pros.) bila je iznenađujuće stabilna, kako je prikazano u Tabeli 8. [0309] Kako je prikazano u Tabeli 8, veličina siRNK nanočestica bila je unutar 5% njihove veličine u originalnoj kompoziciji. Tabela 8: Nanočestične karakteristike

   Patentni zahtevi 1. Kompozicija za pripremu čvrstog liofilizata lipidnih nanočestica koja obuhvata jedan ili više aktivnih agenasa nukleinske kiseline, pri čemu ta kompozicija obuhvata: vodenu suspenziju lipidnih nanočestica u farmaceutski prihvatljivom rastvoru, pri čemu lipidne nanočestice enkapsuliraju jedan ili više aktivnih agenasa nukleinske kiseline; jedinjenje dekstrina; i jedinjenje saharidnog šećera, pri čemu ukupna količina jedinjenja dekstrina i šećera iznosi od 2% do 20% (w/v) kompozicije, i pri čemu jedinjenje dekstrina iznosi od 40 % do 70% (w/v) ukupne količine jedinjenja dekstrina i šećera.
2. 2. Kompozicija prema zahtevu 1, pri čemu posle liofilizacije i rekonstitucije kompozicije, prosečna veličina nanočestica iznosi unutar 10% njihove veličine u originalnoj kompoziciji.
3. 3. Kompozicija prema zahtevu 1, pri čemu nanočestice imaju prosečan prečnik od 45 nm do 110 nm.
4. 4. Kompozicija prema zahtevu 1, pri čemu koncentracija aktivnih agenasa nukleinske kiseline iznosi od 1 mg/mL do 10 mg/mL.
5. 5. Kompozicija prema zahtevu 1, pri čemu lipidne nanočestice obuhvataju jedinjenje odabrano iz grupe koju čine jedinjenje A6, jedinjenje A9, jedinjenje AA, jedinjenje AB, jedinjenje C2, jedinjenje F5, jedinjenje F7, jedinjenje C24, i HEDC (2-(bis(2-(tetradekanoiloksi)etil)amino)-N-(2-hidroksietil)-N,N-dimetil-2-oksoetan-amonijum bromid).
6. 6. Kompozicija prema zahtevu 1, pri čemu jedan ili više aktivnih agenasa nukleinske kiseline predstavljaju RNKi molekule koji su sposobni da posreduju interferencijom RNK, poželjno siRNK, shRNK, ddRNK, piRNK, ili rasiRNK; ili pri čemu jedan ili više aktivnih agenasa nukleinske kiseline predstavljaju miRNK, antisens RNK, plazmide, hibridne oligonukleotide, ili aptamere.
7. 7. Kompozicija prema zahtevu 1, pri čemu farmaceutski prihvatljiv rastvor predstavlja HEPES pufer, fosfatni pufer, citratni pufer, ili pufer koji sadrži Tris(hidroksimetil)aminometan.
8. 8. Kompozicija prema zahtevu 1, pri čemu jedinjenje dekstrina predstavlja ciklodekstrin, poželjno jedinjenje ciklodekstrina koje ima jedno ili više od 2, 3 i 6 hidroksil položaja supstituisanih sulfoalkil, benzensulfoalkil, acetoalkil, hidroksialkil, hidroksialkil sukcinat, hidroksialkil malonat, hidroksialkil glutarat, hidroksialkil adipat, hidroksialkil, hidroksialkil maleat, hidroksialkil oksalat, hidroksialkil fumarat, hidroksialkil citrat, hidroksialkil tartrat, hidroksialkil malat, ili hidroksialkil citrakonat grupama; ili pri čemu jedinjenje ciklodekstrina predstavlja (2-hidroksipropil)-β-ciklodekstrin, 2-hidroksipropil-βciklodekstrin sukcinat, (2-hidroksipropil)-γ-ciklodekstrin, 2-hidroksipropil-γ-ciklodekstrin sukcinat, sulfobutil etar β-ciklodekstrin, sulfobutil etar γ-ciklodekstrin, metil-β-ciklodekstrin, ili metil-γciklodekstrin; ili pri čemu je jedinjenje ciklodekstrina vezano za polimerni lanac ili mrežu; ili pri čemu jedinjenje ciklodekstrina uključuje jedinjenje adsorbata, poželjno odabrano iz grupe koju čine holesterol, lanosterol, zimosterol, zimostenol, dezmosterol, stigmastanol, dihidrolanosterol, 7-dehidroholesterol, pegilovani holesterol, holesteril acetat, holesteril arahidonat, holesteril butirat, holesteril heksanoat, holesteril miristat, holesteril palmitat, holesteril behenat, holesteril stearat, holesteril kaprilat, holesteril n-dekanoat, holesteril dodekanoat, holesteril nervonat, holesteril pelargonat, holesteril n-valerat, holesteril oleat, holesteril elaidat, holesteril erukat, holesteril heptanoat, holesteril linolelaidat, holesteril linoleat, beta-sitosterol, kampesterol, ergosterol, brasikasterol, delta-7-stigmasterol, i delta-7-avenasterol.
9. 9. Kompozicija prema zahtevu 1, pri čemu jedinjenje saharidnog šećera predstavlja jedinjenje monosaharidnog ili disaharidnog šećera, poželjno odabranog iz grupe koju čine saharoza, laktoza, laktuloza, maltoza, trehaloza, celobioza, kojibioza, sakebioza, izomaltoza, soforoza, laminaribioza, gentiobioza, turanoza, maltuloza, izomaltuloza, gentiobiuloza, manobioza, melibioza, melibiuloza, i ksilobioza.
10. 10. Postupak za pripremu čvrstog liofilizata od jednog ili više aktivnih agenasa nukleinske kiseline, pri čemu taj postupak obuhvata liofilizovanje kompozicije prema bilo kom od zahteva 1-9.
11. 11. Čvrst liofilizat pripremljen postupkom prema zahtevu 10.
12. 12. Postupak za pripremu proizvoda leka koji obuhvata rekonstituisanje čvrstog liofilizata prema zahtevu 11.
13. 13. Proizvod leka pripremljen postupkom prema zahtevu 12.
14. 14. Postupak za pripremu proizvoda leka nukleinske kiseline, pri čemu taj postupak obuhvata: sintetizovanje lipidnih nanočestica, pri čemu lipidne nanočestice enkapsuliraju jedan ili više aktivnih agenasa nukleinske kiseline; obezbeđivanje vodene suspenzije lipidnih nanočestica u farmaceutski prihvatljivom rastvoru; dodavanje jedinjenja dekstrina rastvoru koji sadrži lipidne nanočestice; dodavanje jedinjenja saharidnog šećera rastvoru koji sadrži lipidne nanočestice; liofilizovanje rastvora koji sadrži lipidne nanočestice, čime se obrazuje čvrst liofilizat; čime se obrazuje proizvod leka nukleinske kiseline, pri čemu ukupna količina jedinjenja dekstrina i saharidnog šećera iznosi od 2% do 20% (w/v) rastvora koji sadrži lipidne nanočestice, i pri čemu jedinjenje dekstrina iznosi od 40% do 70% (w/v) ukupne količine jedinjenja dekstrina i saharidnog šećera.
15. 15. Postupak prema zahtevu 14, pri čemu posle rekonstitucije, prosečna veličina nanočestica iznosi unutar 10% njihove veličine kada su sintetizovane.
16. 16. Postupak prema zahtevu 14, pri čemu nanočestice imaju prosečan prečnik od 45 nm do 110 nm.
17. 17. Postupak prema zahtevu 14, pri čemu koncentracija aktivnih agenasa nukleinske kiseline iznosi od 1 mg/mL do 10 mg/mL.
18. 18. Postupak prema zahtevu 14, pri čemu jedan ili više aktivnih agenasa nukleinske kiseline predstavljaju RNKi molekule koji su sposobni da posreduju interferencijom RNK.
19. 19. Postupak prema zahtevu 14, pri čemu farmaceutski prihvatljiv rastvor predstavlja HEPES pufer, fosfatni pufer, citratni pufer, ili pufer koji sadrži Tris(hidroksimetil)aminometan.
20. 20. Postupak prema zahtevu 14, pri čemu jedinjenje dekstrina predstavlja ciklodekstrin, poželjno jedinjenje ciklodekstrina koje ima jedno ili više od 2, 3 i 6 hidroksil položaja supstituisanih sulfoalkil, benzensulfoalkil, acetoalkil, hidroksialkil, hidroksialkil sukcinat, hidroksialkil malonat, hidroksialkil glutarat, hidroksialkil adipat, hidroksialkil, hidroksialkil maleat, hidroksialkil oksalat, hidroksialkil fumarat, hidroksialkil citrat, hidroksialkil tartrat, hidroksialkil malat, ili hidroksialkil citrakonat grupama; ili pri čemu jedinjenje ciklodekstrina predstavlja (2-hidroksipropil)-β-ciklodekstrin, 2-hidroksipropil-βciklodekstrin sukcinat, (2-hidroksipropil)-γ-ciklodekstrin, 2-hidroksipropil-γ-ciklodekstrin sukcinat, sulfobutil etar β-ciklodekstrin, sulfobutil etar γ-ciklodekstrin, metil-β-ciklodekstrin, ili metil-γciklodekstrin; ili pri čemu je jedinjenje ciklodekstrina vezano za polimerni lanac ili mrežu; ili pri čemu jedinjenje ciklodekstrina uključuje jedinjenje adsorbata, poželjno odabrano iz grupe koju čine holesterol, lanosterol, zimosterol, zimostenol, dezmosterol, stigmastanol, dihidrolanosterol, 7-dehidroholesterol, pegilovani holesterol, holesteril acetat, holesteril arahidonat, holesteril butirat, holesteril heksanoat, holesteril miristat, holesteril palmitat, holesteril behenat, holesteril stearat, holesteril kaprilat, holesteril n-dekanoat, holesteril dodekanoat, holesteril nervonat, holesteril pelargonat, holesteril n-valerat, holesteril oleat, holesteril elaidat, holesteril erukat, holesteril heptanoat, holesteril linolelaidat, holesteril linoleat, beta-sitosterol, kampesterol, ergosterol, brasikasterol, delta-7-stigmasterol, i delta-7-avenasterol.
21. 21. Postupak prema zahtevu 14, pri čemu jedinjenje saharidnog šećera predstavlja jedinjenje monosaharidnog ili disaharidnog šećera.