Deprecated: The each() function is deprecated. This message will be suppressed on further calls in /home/zhenxiangba/zhenxiangba.com/public_html/phproxy-improved-master/index.php on line 456
RS61778B1 - Kompozicije i postupci za modulaciju faktora rasta - Google Patents
[go: Go Back, main page]

RS61778B1 - Kompozicije i postupci za modulaciju faktora rasta - Google Patents

Kompozicije i postupci za modulaciju faktora rasta

Info

Publication number
RS61778B1
RS61778B1 RS20201467A RSP20201467A RS61778B1 RS 61778 B1 RS61778 B1 RS 61778B1 RS 20201467 A RS20201467 A RS 20201467A RS P20201467 A RSP20201467 A RS P20201467A RS 61778 B1 RS61778 B1 RS 61778B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
tgf
antibody
proteins
protein
antibodies
Prior art date
Application number
RS20201467A
Other languages
English (en)
Inventor
Thomas Schurpf
Nagesh K Mahanthappa
Michelle Marie Straub
Original Assignee
Scholar Rock Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=51867850&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS61778(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Scholar Rock Inc filed Critical Scholar Rock Inc
Publication of RS61778B1 publication Critical patent/RS61778B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/00113—Growth factors
    • A61K39/001134—Transforming growth factor [TGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/495—Transforming growth factor [TGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/005—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies constructed by phage libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1037—Screening libraries presented on the surface of microorganisms, e.g. phage display, E. coli display
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/32—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency specific for a neo-epitope on a complex, e.g. antibody-antigen or ligand-receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G01N2333/495—Transforming growth factor [TGF]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Hematology (AREA)

Description

Opis pronalaska
OBLAST TEHNIKE PRONALASKA
[0001] Primeri izvođenja predmetnog pronalaska mogu uključivati rekombinantne proteine, kao i antitela usmerena na takve proteine. U pojedinim primerima izvođenja, takvi proteini i antitela mogu biti povezani sa oblašću kao što je biologija članova TGF-β familije.
STANJE TEHNIKE
[0002] Ćelijski signalni molekuli stimulišu raznovrsne ćelijske aktivnosti. Takva signalizacija je često strogo regulisana i često se ostvaruje kroz interakcije sa drugim biomolekulima, vanćelijskim i/ili ćelijskim matriksom ili unutar određenog ćelijskog okruženja ili niše. Takve interakcije mogu biti direktne ili indirektne.
[0003] Ćelijske signalne kaskade su uključene u brojne različite biološke puteve, uključujući, ali ne ograničavajući se na, modulaciju ćelijskog rasta, modulaciju tkivne homeostaze, dinamike vanćelijskog matriksa (ECM), modulaciju ćelijske migracije, invazije i imunsku modulaciju/supresiju. U pojedinim slučajevima, proteini uključeni u ćelijsku signalizaciju se sintetišu i/ili sekvestriraju u latentnom obliku, zahtevajući neku vrstu stimulusa za učešće u signalnim događajima. U oblasti tehnike ostaje potreba za agensima, alatima i postupcima za modulisanje ćelijske signalizacije i/ili ćelijskih aktivnosti.
[0004] US 2011/053221 A1 (Chen i saradnici) opisuje ekspresione sisteme za proizvodnju autentičnih rekombinantnih humanih proteina. Biswas i saradnici, u J Clin Invest, tom 117, br.5, maj 2007. godine (2007-05), stranice 1305-1313, opisuju upotrebu neutrališućeg pan-TGF-β antitela (2G7) koje se vezuje za slobodni, zreli TGF-β tek nakon njegovog oslobađanja iz latentnog kompleksa.
IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA
[0005] Pronalazak obezbeđuje antitelo sposobno da vezuje rekombinantan antigen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1 ili kompleks faktora rasta sa prodomenom (GPC) koji sadrži SEQ ID NO: 38; pri čemu navedeno antitelo moduliše oslobađanje TGF-β1 iz GPC; i gde navedeni rekombinantni antigen opciono predstavlja proteinski kompleks koji sadrži: i.) protein izabran iz grupe koja se sastoji od latentnog proteina koji vezuje TGF-β tipa 1S (LTBP1S), glikoproteina A sa preovladavajućim ponavljanjima (GARP), LTBP1, LTBP2, LTBP3, LTBP4, fibrilina-1, fibrilina-2, fibrilina-3, fibrilina-4, proteina 33 koji sadrži ponovke bogate leucinom (LRRC33), perlekana, dekorina, elastina i kolagena i/ili ii.) protein koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih sekvenci izabranih iz grupe koji se sastoji od SEQ ID NO: 156, 159, 143-155, 157, 158, 160, 161, 286-294 i njihovih kombinacija ili fragmenata.
[0006] Pronalazak dodatno obezbeđuje prethodno navedeno antitelo, za upotrebu u postupku modulisanja aktivnosti faktora rasta u biološkom sistemu, što obuhvata dovođenje navedenog biološkog sistema u kontakt sa antitelom.
[0007] Pronalazak dalje obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži prethodno navedeno antitelo i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.
[0008] Pronalazak dalje obezbeđuje komplet koji sadrži prethodno navedenu farmaceutsku kompoziciju i uputstva za njegovu upotrebu.
[0009] Pronalazak dalje obezbeđuje postupak generisanja prethodno navedenog antitela, pri čemu se antitelo priprema upotrebom rekombinantnog antigena koji sadrži SEQ ID NO: 1 ili njegovog fragmenta, ili rekombinantnog antigena koji sadrži kompleks faktor rasta sa prodomenom (GPC) koji sadrži SEQ ID NO: 38.
[0010] Pronalazak dodatno obezbeđuje postupak generisanja antitela koje moduliše oslobađanje TGF-β1 iz kompleksa faktora rasta i prodomena (GPC), koji obuhvata korake: a) odabir antitela iz skupa dva ili više antitela-kandidata, na osnovu sposobnosti povezivanja sa antigenom, pri čemu antigen sadrži GPC koji sadrži TGF-β1 prodomen i TGF-β1 faktor rasta; i b) odabir antitela iz skupa dva ili više antitelakandidata na osnovu sposobnosti modulisanja nivoa i/ili aktivnosti TGF-β1 faktora rasta.
[0011] U pojedinim slučajevima, predmetni opis obezbeđuje rekombinantne proteine koji obuhvataju jedan ili više proteina srodnih TGF-β, koji sadrže jedan ili više proteinskih modula izabranih iz grupe koja se sastoji od različitih kompleksa faktora rasta sa prodomenom (GPC), peptida povezanih sa latencijom (LAP), domena sličnih LAP, regiona tipa “ludačke košulje”, domena faktora rasta, regiona pričvršćivača, regiona furinskog mesta cepljenja, regiona kraka, regiona sa prstićima, N-terminalnih regiona za vanćelijska udruživanja, petlji latencije, alfa 1 helikalnih regiona, alfa 2 helikalnih regiona, regiona RGD sekvenci, regiona pokretačkih petlji i regiona tipa “leptir-mašne”. U pojedinim slučajevima, rekombinantni proteini predmetnog opisa mogu sadržavati jedan ili više proteinskih modula iz vrsta koje su kičmenjaci. U pojedinim slučajevima, rekombinantni proteini predmetnog opisa mogu sadržavati jedan ili više proteinskih modula koji sadrže jednu ili više mutacija. U pojedinim slučajevima, rekombinantni proteini predmetnog opisa mogu sadržavati jednu ili više mutacija koje obuhvataju jedan ili više regiona furinskih mesta cepanja. U pojedinim slučajevima, takve mutacije mogu sprečiti enzimsko cepanje rekombinantnih proteina predmetnog opisa. U pojedinim slučajevima, rekombinantni proteini predmetnog opisa mogu sadržavati jednu ili više mutacija koje sadrže mutaciju aminokiselinske sekvence RXXR u aminokiselinsku sekvencu RXG. U pojedinim slučajevima, rekombinantni proteini predmetnog opisa mogu sadržavati jednu ili više mutacija koje sadrže mutaciju aminokiselinske sekvence RXXR u aminokiselinsku sekvencu AXXA. U pojedinim slučajevima, rekombinantni proteini predmetnog opisa mogu sadržavati jednu ili više mutacija koje uključuju N-terminalne regione za vanćelijska udruživanja. U pojedinim slučajevima, rekombinantni proteini predmetnog opisa mogu sadržavati jednu ili više mutacija koje uključuju supstituciju i/ili deleciju najmanje jednog cisteinskog ostatka prisutnog unutar prvih, približno 4, 5, 6 ili 7 N-terminalnih aminokiselinskih ostataka. U pojedinim slučajevima, rekombinantni proteini predmetnog opisa mogu sadržavati jednu ili više supstitucija najmanje jednog cisteinskog ostatka sa najmanje jednim ostatkom serina.
[0012] U pojedinim slučajevima, rekombinantni proteini predmetnog opisa mogu biti u kompleksu sa proteinom izabranim iz grupe koja se sastoji od LTBP1, LTBP1S, LTBP2, LTBP3, LTBP4, fibrilina-1, fibrilina-2, fibrilina-3, fibrilina-4, GARP, LRRC33 i njihovih kombinacija ili fragmenata. U pojedinim slučajevima, rekombinantni proteini predmetnog opisa mogu sadržavati jedan ili više obeleživača koji se mogu detektovati. Takvi obeleživači koji se mogu detektovati mogu obuhvatati obeleživače sa biotinom, polihistidinske obeleživače (tagove) i/ili oktapeptidne tagove (engl. flag tag).
[0013] U pojedinim slučajevima, predmetni opis obezbeđuje himerne proteine koji sadrže jedan ili više proteinskih modula iz najmanje dva proteina srodna TGF-β, pri čemu navedeni proteinski moduli mogu biti izabrani iz grupe koja se sastoji od različitih kompleksa faktora rasta sa prodomenom (GPC), peptida povezanih sa latencijom (LAP), domena sličnih LAP, regiona tipa “ludačke košulje”, domena faktora rasta, regiona pričvršćivača, regiona furinskog mesta cepljenja, regiona kraka, regiona sa prstićima, N-terminalnih regiona za vanćelijska udruživanja, petlji latencije, alfa 1 helikalnih regiona, regiona RGD sekvenci, regiona pokretačkih petlji, regiona tipa “leptir-mašne” i bilo kojih od onih navedenih u Tabelama 2, 3 i 11. U pojedinim slučajevima, himerni proteini predmetnog opisa mogu sadržavati jedan ili više proteinskih modula izabranih iz jedne ili više vrsta kičmenjaka. U pojedinim slučajevima, himerni proteini predmetnog opisa mogu sadržavati GPC. U pojedinim slučajevima, takvi GPC mogu sadržavati najmanje jedan LAP ili domen sličan LAP iz člana TGF-β familije, kao i najmanje jedan domen faktora rasta iz člana TGF-β familije, pri čemu su LAP ili domen sličan LAP i domen faktora rasta iz različitih članova TGF-β familije. U pojedinim slučajevima, himerni proteini predmetnog opisa mogu sadržavati najmanje jedan LAP ili domen sličan LAP i najmanje jedan domen faktora rasta, od kojih je svaki izabran iz grupe koja se sastoji od TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, GDF-8, GDF-11 i inhibina beta A. U pojedinim slučajevima, himerni proteini predmetnog opisa mogu sadržavati jedan ili više GPC gde je najmanje jedan N-terminalni region iz člana TGF-β familije, najmanje jedan C-terminalni region iz člana TGF-β familije i gde su N-terminalni region i C-terminalni region iz različitih članova TGF-β familije. U pojedinim slučajevima, himerni proteini predmetnog opisa mogu sadržavati najmanje jedan N-terminalni region i najmanje jedan C-terminalni region izabrane od terminalnih regiona TGF-β1, terminalnih regiona TGF-β2, terminalnih regiona TGF-β3, terminalnih regiona GDF-8, terminalnih regiona GDF-11 i terminalnih regiona inhibina beta A. U pojedinim slučajevima, himerni proteini predmetnog opisa mogu sadržavati GPC iz najmanje jednog člana TGF-β familije koji sadrži najmanje jedan region ručice iz drugog člana TGF-β familije. U pojedinim slučajevima, himerni proteini predmetnog opisa mogu sadržavati GPC koji sadrži najmanje jednog člana TGF-β familije koji sadrži najmanje jedan region pokretačke petlje iz drugog člana TGF-β familije. U pojedinim slučajevima, himerni protein predmetnog opisa može sadržavati bilo koju kombinaciju proteinskih modula navedenu u Tabeli 12.
[0014] U pojedinim slučajevima, himerni protein predmetnog opisa može biti u kompleksu sa proteinom izabranim iz grupe koja se sastoji od LTBP1, LTBP1S, LTBP2, LTBP3, LTBP4, fibrilina-1, fibrilina-2, fibrilina-3, fibrilina-4, GARP i LRRC33 i njihovih kombinacija ili fragmenata. U pojedinim slučajevima, himerni proteini predmetnog opisa mogu sadržavati jedan ili više obeleživača koji se mogu detektovati. U pojedinim slučajevima, takvi obeleživači koji se mogu detektovati mogu uključivati najmanje jedan biotinski obeleživač, polihistidinski tag i/ili oktapeptidni tag.
[0015] U pojedinim primerima izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo kao što je prethodno definisano. U pojedinim primerima izvođenja, takva antitela obuhvataju monoklonska antitela. U pojedinim primerima izvođenja, antitela predmetnog pronalaska su suštinski izolovana. U pojedinim primerima izvođenja, monoklonska antitela predmetnog pronalaska su stabilišuća antitela. U pojedinim primerima izvođenja, stabilišuća antitela predmetnog pronalaska smanjuju nivo slobodnog faktora rasta u odnosu na nivo faktora rasta koji je udružen sa jednim ili sa više GPC. U pojedinim primerima izvođenja, stabilišuća antitela mogu smanjiti ćelijsku signalizaciju koja zavisi od faktora rasta. U pojedinim primerima izvođenja, monoklonska antitela predmetnog pronalaska mogu predstavljati oslobađajuća antitela. Takva antitela mogu povećati nivo slobodnog faktora rasta u odnosu na nivo faktora rasta povezanog sa jednim ili sa više GPC. U pojedinim primerima izvođenja, oslobađajuća antitela predmetnog pronalaska mogu povećati ćelijsku signalizaciju zavisnu od faktora rasta.
[0016] U pojedinim slučajevima, predmetni opis obezbeđuje kompozicije koje sadrže jedan ili više od bilo kojih rekombinantnih proteina, jedan ili više od bilo kojih himernih proteina i/ili jedan ili više od bilo kojih antitela koja su ovde opisana, u kombinaciji sa najmanje jednim ekscipijensom.
[0017] U pojedinim slučajevima, predmetni opis obezbeđuje postupke modulisanja nivoa slobodnog faktora rasta u subjektu ili ćelijskoj niši, što obuhvata upotrebu jedne ili više od kompozicija koje su ovde opisane. U pojedinim takvim postupcima, moduliše se nivo signalizacije faktora rasta.
[0018] U pojedinim primerima izvođenja, predmetni opis obezbeđuje postupke za selektovanje željenog antitela koji obuhvataju upotrebu jednog ili više testova, pri čemu takvi testovi sadrže jedan ili više rekombinantnih proteina opisa. Pojedini takvi postupci obuhvataju korake 1) obezbeđivanja testa za vezivanje antitela, 2) dovođenja testa vezivanja u kontakt sa jednim ili sa više antitelakandidata, 3) dobijanja podataka vezivanja koji se odnose na afinitet antitela-kandidata za jedan ili više rekombinantnih proteina i 4) selektovanje poželjnog antitela na osnovu podataka vezivanja. Testovi vezivanja u skladu sa takvim postupcima mogu obuhvatati imunosorbentni test povezan sa enzimom (ELISA) i/ili test zasnovan na sortiranju ćelija povezanom sa fluorescencijom (FACS). U pojedinim slučajevima, rekombinantni proteini u okviru takvih testova mogu biti u kompleksu sa proteinom izabranim iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 153-161 i 286-292 ili može biti u kompleksu sa proteinom izabranim iz grupe koja se sastoji od LTBP1, LTBP1S, LTBP2, LTBP3, LTBP4, fibrilina-1, fibrilina-2, fibrilina-3, fibrilina-4, GARP, LRRC33, perlekana, dekorina, elastina i kolagena. U pojedinim slučajevima, rekombinantni proteini mogu uključivati himerni protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 199-236 i 273.
[0019] Ostali postupci selektovanja željenog antitela mogu obuhvatati korake 1) obezbeđivanja testa za aktivnost faktora rasta, 2) dovođenja testa aktivnosti faktora rasta u kontakt sa jednim ili sa više antitela-kandidata, 3) dobijanje podataka o aktivnosti faktora rasta i 4) odabir željenog antitela na osnovu podataka o aktivnosti faktora rasta. Testovi aktivnosti faktora rasta u skladu sa takvim postupcima mogu obuhvatati testove zasnovane na ćelijama, izabrane iz grupe koja se sastoji od testova zasnovanih na luciferazi i testova proliferacije. Ovakvi testovi zasnovani na ćelijama mogu sadržavati jednu ili više eksprimirajućih ćelija koje eksprimiraju jedan ili više rekombinantnih proteina opisa ili njihov kompleks. Takvi testovi mogu dalje sadržavati jednu ili više reaktivnih ćelija koje daju podatke o ekspresiji gena i/ili podatke o vijabilnost.
[0020] U pojedinim primerima izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže prethodno definisana antitela i najmanje jedan farmaceutski ekscipijens.
[0021] Pojedine kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju indikacije koja je povezana sa TGF-β kod subjekta, što obuhvata kontakt navedenog subjekta sa kompozicijom pronalaska. Indikacije povezane sa TGF-β mogu obuhvatati fibrotične indikacije (npr. fibrozu pluća, fibrozu bubrega, fibrozu jetre, kardiovaskularnu fibroza, fibrozu kože i fibrozu kosne srži), mijelofibrozu, kancer ili stanja povezana sa kancerom (npr. kancer debelog creva, kancer bubrega, kancer dojke, maligni melanom i glioblastom) i mišićne poremećaje i/ili povrede [npr. kaheksiju, mišićnu distrofiju, hroničnu opstruktivnu bolest pluća (HOBP), bolest motornih neurona, traumu, neurodegenerativnu bolest, infekciju, reumatoidni artritis, imobilizaciju, sarkopeniju, miozitis sa inkluzionim telima i dijabetes.]
[0022] U pojedinim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje komplet koji sadrži kompoziciju pronalaska i uputstva za njenu upotrebu.
KRATAK OPIS SLIKA
[0023] Prethodni i drugi ciljevi, karakteristike i prednosti će postati očigledni iz opisa određenih primera izvođenja pronalaska koji sledi, kao i na osnovu ilustrovanog u okviru pridruženih nacrta. Nacrti nisu nužno u skali, već je naglasak stavljen na ilustrovanje principa raznih primera izvođenja pronalaska.
Slika 1 je dijagram stabla TGF-beta superfamilije, gde je divergencija proporcionalna dužini grane.
Slika 2 je šematski prikaz jednog primera izvođenja u kome je linearno predstavljen translatiran monomer faktora rasta. U takvim primerima izvođenja, translatirani faktori rasta mogu sadržavati signalne peptide za sekreciju, prodomene i domene faktora rasta. U primerima izvođenja u skladu sa primerom koji je ovde prikazan, translatirani faktori rasta mogu takođe sadržavati mesto cepanja između prodomena i regiona faktora rasta.
Slika 3 je šematski prikaz jednog primera izvođenja kompleksa faktora rasta sa prodomenom (GPC), kao i primera izvođenja slobodnog dimera faktora rasta i slobodnog dimera peptida povezanog sa latencijom (LAP). Strelica ukazuje na sposobnost proteina u skladu sa ovim primerom izvođenja da se menja između slobodnog i oblika koji je u kompleksu.
Slika 4 je šematski prikaz jednog primera izvođenja za slobodan dimer LAP i slobodan dimer faktora rasta sa obeleženim karakteristikama i/ili proteinskim modulima.
Slika 5 je šematski prikaz primera izvođenja za rekombinantan GPC.
Slika 6 je šematski prikaz primera izvođenja za mutirane rekombinantne GPC.
Slika 7 pokazuje šematske prikaze za pet rekombinantnih proteina samostalno ili u kompleksu sa LTBP ili GARP
Slika 8 prikazuje poravnanje zasnovano na strukturi između proteina koji su članovi TGF-β familije [adaptirano iz Shi i saradnici (Shi M. i saradnici, Latent TGF-β structure and activation. Nature.2011 Jun 15; 474(7351):343-9] Ostaci cisteina potrebni za interakciju sa LTBP i/ili GARP su uokvireni. Ostaci koji su mutirani u Kamurati-Engelmanovom sindromu su označeni zvezdicom. Mesta cepanja proteazama su označena strelicom usmerenom nagore. Proteinski moduli i sekundarni strukturni elementi su označeni podebljanim linijama. Ostaci koji su podvučeni na N-kraju GDF-8 odgovaraju alternativno predviđenim mestima za obradu signalnih peptida. „Tačke prekida himernih modula“ označavaju regione u kojima su očuvane strukturne karakteristike i koji kod svih članova familije obezbeđuju module za kontruisanje himernih proteina (zamenu modula između članova familije). Regioni N-kraja su prikazani na (A), unutrašnji regioni su prikazani na (B), a regioni C-kraja su prikazani na (C).
Slike 9A do C predstavljaju 3 tabele koje pokazuju procenat identičnosti između aminokiselinskih sekvenci pronađenih u TGF-β familiji. Slika 9A pokazuje procenat identičnosti među pro-proteinima (koje čine prodomen i faktora rasta.) Procenat identičnosti među domenima faktora rasta je predstavljen na Slici 9B, dok je procenat identičnosti među prodomenama prikazan na Slici 9C.
Slika 10 predstavlja poravnanje sprovedeno između dimera GDF-8 (miostatina,) GDF-11, Inhibina A i GDF-8. Strelice označavaju mesta cepanja. Regioni uključeni u interne interakcije su uokvireni. Popunjeni pravougaonici se pojavljuju iznad ostataka za koje je predviđeno da su uključeni u sterička ometanja u okviru himernih kontrukata. Zvezdice označavaju važne tačke prekida u proteinskim modulima.
Slika 11 prikazuje ekspresiju i prečišćavanje rekombinantnih antigena i antigenskih kompleksa (SDS-PAGE obojen sa Coomassie plavom bojom).
Slika 12 predstavlja rezultate iz analiza ćelijskih linija koje stabilno eksprimiraju TGF-β1/GARP komplekse. 300.19 ćelije koje su bile stabilno transfektovane sa praznom vektorskom kontrolom (A), proTGF-β1-GARP (B) ili TGF-β1 LAP-GARP (C), fluorescentno su obeležavane sa antitelima usmerenim na eksprimirane proteine i ispitivan je intenzitet fluorescencije protočnom citometrijom. Podaci luciferaznog testa su predstavljeni na (D) i pokazuju signalnu aktivnost TGF-β koja je rezultat istovremenog kultivisanja ovih ćelija sa ćelijama koje eksprimiraju ανβ6integrin.
Slika 13 prikazuje rekombinantan proGDF-8 obeležen histidinskim tagom, razdvojen SDS-PAGE postupkom pod redukujućim i neredukujućim uslovima i vizuelizovan bojenjem sa Coomassie plavim.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0024] Faktori rasta su ćelijski signalni molekuli koji stimulišu raznovrsne ćelijske aktivnosti. Usled njihovog uticaja koji široko doseže unutar bioloških sistema, signalizacija faktora rasta je strogo regulisana, često kroz interakcije sa drugim biomolekulima, vanćelijskim i/ili ćelijskim matriksom ili unutar određenog ćelijskog okruženja ili niše. Ovakve interakcije mogu biti direktne ili indirektne.
[0025] Faktori rasta iz familije transformišućeg faktora rasta beta (TGF-β) su uključeni u različite ćelijske procese. Vezivanje faktora rasta za receptore tipa II dovodi do fosforilacije i aktivacije receptora tipa I (Denicourt C. i saradnici, Another twist in the transforming growth factor β-induced cell-cycle arrest chronicle. PNAS. 2003. 100(26): 15290-1.) Aktivirani receptori tipa I mogu zauzvrat fosforilisati SMAD proteine povezane sa receptorima (R-SMAD), čime se podstiču obrazovanje ko-SMAD (npr. SMAD4) dimera/trimera i translokacija u jedro. SMAD kompleksi sarađuju sa kofaktorima da bi se modulisala ekspresiju ciljnih gena članova TGF-β familije.
[0026] Signalne kaskade članova TGF-β familije su uključene u brojne raznovrsne biološke puteve, uključujući, ali ne ograničavajući se na, inhibiciju ćelijskog rasta, tkivnu homeostazu, preuređivanje vanćelijskog matriksa (ECM), tranziciju endotela u mezenhim (EMT) u ćelijskoj migraciji i invaziji i imunskoj modulaciji/supresiji, kao i u tranziciji mezenhima u epitel. Signalizacija TGF-β povezana sa inhibicijom rasta i tkivnom homeostazom može uticati na epitelne, endotelne, hematopoetske i imunske ćelije, putem aktivacije p21 i p15<INK>koji posreduju u zaustavljanju ćelijskog ciklusa i represiji myc. U kontekstu preuređivanja ECM, TGF-β signalizacija može povećati populacije fibroblasta i deponovanje ECM (npr. kolagena). TGF-β signalizacija povezana sa ćelijskom migracijom i invazijom može uticati na epitelne i/ili endotelne ćelije, indukujući fenotipove slične matičnim ćelijama. Ovaj aspekt signalizacije može imati ulogu u proliferaciji glatkih mišićnih ćelija nakon vaskularne hirurgije i/ili ugradnje stenta. U imunskom sistemu, TGF-β ligand je neophodan za funkciju regulatornih T ćelija i održavanje rasta i homeostaze imunskih prekursorskih ćelija. Skoro sve imunske ćelije sadrže receptore za TGF-β, a TGF-β nokaut miševi umiru odmah po rođenju, delom usled inflamatornih patologija. Konačno, TGF-β suprimira aktivaciju prirodnih ćelija-ubica indukovanu interferonom-gama (Wi J. i saradnici, 2011. Hepatology.53(4):1342-51).
[0027] Nedavno dobijeno rešenje kristalne strukture za latentan oblik TGF-beta je prvo koje je dobijeno za celu TGF-beta familiju i ono omogućava dublji uvid u ove komplekse (Shi M. i saradnici, Latent TGF-β structure and activation. Nature.2011 Jun 15; 474(7351):343-9). Gotovo sva signalizacija u TGF-beta familiji se odvija kroz zajednički put u kome dimerni ligand biva prepoznat od strane heterotetramernog receptorskog kompleksa koji sadrži dva receptora tipa I i dva tipa II. Svaki receptor sadrži serin-treoninski kinazni domen. Receptori tipa II fosforilišu receptore tipa I, koji zauzvrat fosforilišu Smad proteine koji su regulisani receptorima i koji se zatim translociraju i nakupljaju u jedru i regulišu transkripciju.
[0028] Postoje 33 različita člana TGF-beta familije kod ljudi (Slika 1). Članovi obuhvataju morfogene proteine kostiju (BMP), inhibin, aktivin, faktor rasta i diferencijacije (GDF), miostatin, nodal, anti-Milerov hormon i tzv. lefty proteine (engl.). Revijski pregled članova TGF-β familije, srodnih signalnih molekula, kao i njihovih odnosa se može pronaći u Massague., 2000. Nature Reviews Molecular Cell Biology.1:169–78. U pojedinim primerima izvođenja, zreli faktori rasta se sintetišu zajedno sa njihovim prodomenima, u vidu pojedinačnih polipeptidnih lanaca (pogledati Sliku 2). U pojedinim primerima izvođenja, takvi polipeptidni lanci mogu sadržavati mesta cepanja, za odvajanje prodomena od zrelih faktora rasta. U pojedinim primerima izvođenja, takva mesta cepanja su furinska mesta cepanja koja prepoznaju i cepaju proproteinske konvertaze.
[0029] U principu, homologija između domena faktora rasta kod članova TGF-β familije je relativno visoka. Interesantno je i da je homologija prodomena znatno niža. Ovakav nedostatak homologije može biti važan faktor u izmenjenoj regulaciji faktora rasta među članovima familije. U pojedinim slučajevima, prodomeni mogu voditi pravilno uvijanje i/ili dimerizaciji domena faktora rasta. Nedavno je prepoznato i da su prodomeni, u određenim slučajevima, sa važnim funkcijama u usmeravanju faktora rasta (nakon sekrecije) ka specifičnim lokacijama u vanćelijskom matriksu (ECM) i/ili ćelijskom matriksu, sve dok se ne prime drugi signali koji prouzrokuju oslobađanje faktora rasta iz latentnosti. Oslobađanje iz latentnosti se može odvijati u visoko lokalizovanim sredinama, pri čemu faktori rasta mogu delovati na kratkim udaljenostima (npr. od oko 1 ćelijskog prečnika do oko nekoliko ćelijskih prečnika, od oko 2 ćelijska prečnika do oko 100 ćelijska prečnika i/ili od oko 10 ćelijska prečnika do oko 10.000 ćelijska prečnika), a zatim biti izbačeni klirensom kada dostignu do cirkulacije. Pojedini kompleksi faktora rasta i prodomena se izlučuju kao homodimeri. U pojedinim primerima izvođenja, kompleksi prodomena i faktora rasta mogu biti izlučeni kao heterodimeri.
[0030] Kao što se ovde upotrebljava, termin "protein srodan TGF-β" se odnosi na izoformu TGF-β, člana TGF-β familije ili protein srodan članu familije TGF-β. Članovi TGF-β familije mogu obuhvatati, ali nisu ograničeni na bilo koji od onih prikazanih na Slici 1 i/ili navedenih u Tabeli 1. Oni uključuju, ali nisu ograničeni na, TGF-β proteine, BMP, miostatin, GDF i inhibine. U pojedinim slučajevima, predmetni opis obezbeđuje alate i/ili postupke za izolovanje, karakterizaciju i ili modulisanje proteina srodnih TGF-β. Aspekti predmetnog opisa obezbeđuju alate i/ili postupke za karakterizaciju i/ili modulaciju ćelijskih aktivnosti povezanih sa signalizacijom proteina srodnih TGF-β. U drugim slučajevima, alati predmetnog opisa mogu uključivati antigene koji sadrže jednu ili više komponenti jednog ili više od proteina srodnih TGF-β. Pojedini alati mogu sadržavati antitela usmerena na antigene predmetnog opisa. U dodatnim primerima izvođenja, alati predmetnog opisa mogu sadržavati testove za detekciju i/ili karakterizaciju proteina srodnih TGF-β, za detekciju i/ili karakterizaciju antitela usmerenih na proteine srodne TGF-β i/ili za detekciju i/ili karakterizacija ćelijskih aktivnosti i/ili njihovu ćelijsku signalizaciju povezanu sa proteinima srodnim TGF-β.
Proteini od interesa
[0031] Proteini srodni TGF-β su uključeni u brojne ćelijske procese. U embriogenezi, 33 člana TGF-β familije proteina su uključeni u regulisanje glavnih razvojnih procesa, kao i u detalje obrazovanja mnogih organa. Veliki deo ovakve regulacije se odvija pre rođenja; ipak, proteini ove familije nastavljaju da regulišu mnoge procese i nakon rođenja, uključujući, ali ne ograničavajući se na, imunske odgovore, zarastanje rana, rast kostiju, endokrine funkcije i mišićnu masu. Proteini srodni TGF-β su navedeni u vidu liste i opisani u privremenoj U.S. patentnoj prijavi 61/722,919, podnetoj 6. novembra 2012. godine; 61/722,969, podnetoj 6. novembra 2012. godine, kao i 61/823,552, podnetoj 15. maja 2013. godine.
[0032] Spisak pro-proteina TGF-β familije za primer, tj. proteina koji nastaju nakon uklanjanja signalne sekvence za sekreciju, prikazan je u Tabeli 1. Pro-protein sadrži, i predstavlja prekursor od, prodomena i faktora rasta. U Tabeli su prikazana imena originalnog člana TGF-β familije i sekvenca pro-proteina. Identifikovana su i mesta cepanja za proproteinske konvertaze, označena "podebljanim slovima" i "podvlačenjem". Nakon cepanja, rezultujući prodomen zadržava ovo mesto, dok zreli faktor rasta počinje nakon mesta cepanja. Naglašeno je i da se Lefty 1 i Lefty 2 ne cepaju proproteinskim konvertazama neposredno pre početka zrelog faktor rasta.
Tabela 1. Pro-proteini iz TGF-beta familije
[0033] Naglašeno je i da se pojedini prodomeni mogu cepati proproteinskim konvertaznim enzimima. Kao što se ovde upotrebljava, termin "proproteinska konvertaza" se odnosi na enzim koji cepa prodomen iz translatiranog proteina, da bi se olakšalo sazrevanje proteina. Pojedine proproteinske konvertaze predmetnog opisa obuhvataju enzime koji su članovi familije proproteinskih konvertaza sličnih subtilizinu (SPC). SPC familija sadrži serinske endoproteaze zavisne od kalcijuma koje obuhvataju, ali nisu ograničene na, furin/PACE, PC1/3, PC2, PC4, PC5/6, PACE4 i PC7 (Fuller i saradnici, 2009. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50(12):5759-68.) GDF-11 može, u pojedinim slučajevima, biti podvrgnut cepanju sa PC5/6. U pojedinim slučajevima, proproteinske konvertaze mogu cepati proproteine na dodatnim mestima, drugačijim od onih koji su označeni u Tabeli 1. U pojedinim slučajevima, pro-proteini se mogu cepati na prvom mestu cepanja (pri čemu, prvo mesto je mesto najbliže N-kraju). U drugim slučajevima, proproteini se mogu cepati na mestu cepanja koje je različito od prvog mesta cepanja. U pojedinim slučajevima, može doći do cepanja proproteinskom konvertazom unutar ćelije. U pojedinim slučajevima, može doći do vanćelijskog cepanja sa proproteinskom konvertazom.
[0034] Mnogi proteini koji su članovi TGF-β familije se sintetišu zajedno sa prodomenama. Pojedini prodomeni mogu ostati povezani sa faktorima rasta nakon cepanja. Ovakva udruživanja mogu obrazovati latentne komplekse faktora rasta i prodomena (GPC) koji modulišu dostupnost faktora rasta za ćelijsku signalizaciju. Faktori rasta mogu biti oslobođeni iz latentnosti koja je prisutna u GPC kroz udruživanje sa jednim ili sa više vanćelijskih proteina. U pojedinim slučajevima, oslobađanje faktora rasta se može oslanjati na silu koja se primenjuje na GPC kroz interakcije vanćelijskih proteina. Takve sile mogu povući iz C-terminalnog i/ili N-terminalnog regiona GPC, a rezultat je oslobađanje udruženih faktora rasta.
[0035] U pojedinim članovima TGF-β familije, prodomenski deo GPC je odgovoran za zadržavanje faktora rasta i blokiranje interakcije takvih vezanih faktora rasta sa njihovim receptorima. Prodomenski delovi GPC koji funkcionišu u ovom kontekstu, označeni su kao peptidi udruženi sa latencijom (LAP). Poznato je da TGF-β1, 2 i 3 sadrže LAP. Pojedini prodomeni mogu sadržavati domene slične LAP. Kao što se ovde upotrebljava, termin "domen sličan LAP" se odnosi na prodomenske delove GPC i/ili slobodne prodomene koji mogu biti strukturno slični ili sintetisani na sličan način kao LAP domeni, ali koji možda neće funkcionisati u prevenciji interakcija faktora rasta/receptora. Prodomeni GDF-8 i GDF-11 sadrže domene slične LAP.
[0036] U zavisnosti od raznovrsnih faktora, faktori rasta mogu biti slobodni ili udruženi sa jednim ili sa više LAP ili domena sličnih LAP. Slika 3 je šematski prikaz koji pokazuje primer izvođenja gde dimer faktora rasta može biti udružen sa LAP dimerom. U pojedinim primerima izvođenja, GPC sadrže proteinske module neophodne za različite aspekte signalizacije, sekrecije, latencije i/ili oslobađanja faktora rasta iz latentnih GPC. Kao što se ovde upotrebljava, termin "proteinski modul" se odnosi na bilo koju komponentu, region i/ili osobinu proteina. Proteinski moduli mogu varirati u dužini, obuhvatajući jednu ili više aminokiselina. Proteinski moduli mogu biti dužine od oko 2 aminokiselinska ostatka do oko 50 aminokiselinskih ostataka, od oko 5 aminokiselinskih ostataka u dužini do oko 75 aminokiselinskih ostataka u dužini, od oko 10 aminokiselinskih ostataka u dužini do oko 100 aminokiselinskih ostataka u dužini, od oko 25 aminokiselinskih ostataka u dužini do oko 150 aminokiselinskih ostataka u dužini, od oko 125 aminokiselinskih ostataka u dužini do oko 250 aminokiselinskih ostataka u dužini, od oko 175 aminokiselinskih ostataka u dužini do oko 400 aminokiselinskih ostataka u dužini, od oko 200 aminokiselinskih ostataka u dužini do oko 500 aminokiselinskih ostataka u dužini i/ili najmanje 500 aminokiselinskih ostataka u dužini.
[0037] U pojedinim slučajevima, proteinski moduli sadrže jedan ili više regiona sa poznatim funkcionalnim osobinama (npr. domen vezivanja proteina, domen vezivanja nukleinske kiseline, hidrofobni džep, itd.) Proteinski moduli mogu sadržavati funkcionalne proteinske domene neophodne za različite aspekte signalizacije, sekrecije, latencije i/ili oslobađanja faktora rasta iz latentnih konformacija.
[0038] U pojedinim slučajevima, proteinski moduli mogu biti izvedeni iz proteina srodnih TGF-β. Takvi proteinski moduli mogu obuhvatati, ali nisu ograničeni na peptide povezane sa latencijom (LAP), domene slične LAP, domene faktora rasta, regione pričvršćivača, mesta cepanja za proproteinske konvertaze (npr. furinska mesta cepanja), B/TP mesta cepanja, regione ručica, regione prstiju, ostatke (kao što su, na primer, cisteinski ostaci) za udruživanja sa vanćelijskim proteinom [npr. latentnim proteinom vezivanja za TGF-β (LTBP), fibrilinom i/ili glikoproteinom A sa preovladavajućim ponavljanjima (GARP)], petlje latencije (ovde označene i kao lasa latencije), alfa 1 helikalni regioni, alfa 2 helikalni regioni, RGD sekvence i regioni tipa “leptir-mašne”. Slika 4 je šematski dijagram primera izvođenja u kome je pokazan dimer LAP i faktora rasta koji sadrže proteinske module.
[0039] U pojedinim slučajevima, proteinski moduli mogu biti izvedeni iz jedne ili više od TGF-β izoformi (npr. TGF-β1, TGF-β2 i/ili TGF-β3). Takvi proteinski moduli mogu sadržavati proteinske module i/ili aminokiselinske sekvence navedene u Tabeli 2. Pojedini proteinski moduli predmetnog pronalaska mogu sadržavati aminokiselinske sekvence slične onima u Tabeli 2, ali sadrže i dodatne ili nešto manje aminokiselina od onih koje su navedene. Takve aminokiselinske sekvence mogu sadržavati oko 1 aminokiselinu više ili manje, oko 2 aminokiseline više ili manje, oko 3 aminokiseline više ili manje, oko 4 aminokiseline više ili manje, oko 5 aminokiselina više ili manje, oko 6 aminokiselina više ili manje, oko 7 aminokiselina više ili manje, oko 8 aminokiselina više ili manje, oko 9 aminokiselina više ili manje, oko 10 aminokiselina više ili manje ili više od 10 aminokiselina više ili manje na N-terminalnim i/ili C-terminalnim krajevima.
Tabela 2. Proteinski moduli TGF-β
[0040] U pojedinim slučajevima, LAP ili domeni slični LAP sadrže prodomenski deo proteina srodnog TGF-β i/ili GPC. Pojedini LAP ili domeni slični LAP se mogu udruživati sa faktorima rasta u GPC. Pojedini LAP mogu sterično sprečavati udruživanje faktora rasta sa jednim ili sa više ćelijskih receptora. LAP ili domeni slični LAP mogu sadržavati regione ručica i/ili regione tipa “ludačkih košulja”. Pojedini LAP ili domeni slični LAP mogu sadržavati C-terminalne regione koji su ovde označeni kao regioni tipa “leptirmašne”. U pojedinim dimerima LAP ili domena sličnih LAP, regioni tipa “leptir-mašne” svakog monomera se mogu udruživati i/ili interagovati. Takva udruživanja mogu podrazumevati obrazovanje disulfidne veze, kao što je to pronađeno između monomera LAP regiona TGF-β izoformi.
[0041] U pojedinim slučajevima, regioni ručica mogu sadržavati regione pokretačke petlje. Pokretačke petlje mogu sadržavati regione koji se udružuju sa integrinima. Takvi regioni mogu sadržavati aminokiselinske sekvence koje sadrže RGD (Arg-Gly-Asp). Regioni koji sadrže RGD sekvence su ovde označeni kao regioni RGD sekvenci. U pojedinim slučajevima, LAP ili domeni slični LAP sadrže petlje latencije (ovde označene i kao lasa latencije). Pojedine petlje latencije mogu održavati povezanost između LAP ili domena sličnih LAP i faktora rasta prisutnih unutar GPC. LAP ili domeni slični LAP mogu takođe sadržavati regione pričvršćivača. Takvi regioni pričvršćivača mogu održavati povezanost između LAP ili domena sličnih LAP i faktora rasta prisutnih unutar GPC. Pojedini regiona pričvršćivača mogu održavati LAP ili domenske konformacije slične kao kod LAP, a koje pospešuju zadržavanje faktora rasta.
[0042] U pojedinim slučajevima, može biti potrebno enzimsko cepanje GPC da bi se disosovali vezani faktori rasta. U pojedinim slučajevima, takvo cepanje mogu izvršiti članovi familije proteinaza sličnih BMP-1/Toloidnim proteinazama (B/TP) (Muir i saradnici, 2011. J Biol Chem. 286(49):41905-11.) Ovakve metaloproteinaze mogu obuhvatati, ali nisu ograničene na, BMP-1, toloidni protein sisara (mTLD), sisarski protein sličan toloidu tipa 1 (mTLL1) i sisarski protein sličan toloidu tipa 2 (mTLL2.) GPC za primer koji se mogu cepati takvim metaloproteinazama mogu obuhvatati, ali nisu ograničeni na GDF-8 i GDF-11. U pojedinim slučajevima, GDF-8 može biti podvrgnut cepanju sa mTLL2. U pojedinim slučajevima, cepanja sa toloidom se može odvijati unutarćelijski. U pojedinim slučajevima, može doći do vanćelijskog cepanja sa toloidom.
[0043] Regioni tipa “ludačke košulje” mogu sadržavati alfa 1 helikalne regione. U pojedinim slučajevima, alfa 1 helikalni regioni mogu biti pozicionirani između monomera faktora rasta. Pojedini alfa 1 helikalni regioni sadrže N-terminalne regione iz LAP ili domena sličnih LAP. Alfa 1 helikalni regioni mogu takođe sadržavati N-terminalne regione za vanćelijska udruživanja. Takva vanćelijska udruživanja mogu obuhvatati proteine vanćelijskog matriksa i/ili proteine povezane sa vanćelijskim matriksom. Pojedina vanćelijska udruživanja mogu podrazumevati udruživanja sa proteinima koje mogu obuhvatati, ali bez ograničavanja samo na, LTBP (npr. LTBP1, LTBP2, LTBP3 i/ili LTBP4), fibriline (npr. fibrillin-1, fibrilin-2, fibrilin-3 i/ili fibrilin-4), perlekan, dekorin i/ili GARP (npr. GARP i/ili LRRC33). N-terminalna vanćelijska udruživanja mogu podrazumevati disulfidne veze između ostataka cisteina. U pojedinim slučajevima, proteini vanćelijskog matriksa i/ili proteini povezani sa vanćelijskom matriksom mogu sadržavati veze sa jednim ili sa više regiona LAP/domena sličnih LAP koji su drugačiji od N-terminalnih regiona.
[0044] U pojedinim slučajevima, domeni faktora rasta sadrže jedan ili više monomera faktora rasta. Pojedini domeni faktora rasta sadrže dimere faktora rasta. Takvi domena faktora rasta mogu sadržavati homodimere ili heterodimere faktora rasta (koji sadrže monomere faktora rasta iz različitih proteina srodnih TGF-β). Pojedini domeni faktora rasta mogu sadržavati regione sa prstićima. Takvi regioni sa prstićima mogu sadržavati β-naborane ploče. Regioni prstića se mogu povezivati sa LAP ili domenima sličnim LAP. Pojedini regioni sa prstićima mogu održavati vezu između domena faktora rasta i LAP ili domena sličnih LAP.
[0045] U pojedinim slučajevima, rekombinantni proteini predmetnog opisa mogu sadržavati proteinske module iz proteina faktora diferencijacije i rasta (GDF). Takvi GDF proteinski moduli mogu sadržavati proteinske module i/ili aminokiselinske sekvence navedene u Tabeli 3. U pojedinim slučajevima, proteinski moduli predmetnog opisa mogu sadržavati aminokiselinske sekvence slične onima u Tabeli 3, ali i da sadrže dodatne ili nešto manje aminokiselina od onih koje su navedene. Pojedine takve aminokiselinske sekvence mogu sadržavati oko 1 aminokiseline više ili manje, oko 2 aminokiseline više ili manje, oko 3 aminokiseline više ili manje, oko 4 aminokiseline više ili manje, oko 5 aminokiselina više ili manje, oko 6 aminokiselina više ili manje, oko 7 aminokiselina više ili manje, oko 8 aminokiselina više ili manje, oko 9 aminokiselina više ili manje, oko 10 aminokiselina više ili manje ili više od 10 aminokiselina više ili manje na N-terminalnim i/ili C-terminalnim krajevima.
Tabela 3. Proteinski moduli GDF-a
[0046] Domeni faktora rasta među članovima TGF-β familije su više evolutivno očuvani, dok su prodomeni među članovima familije sa znatno nižim procentom identičnosti (Slika 9). Tabela 5 pokazuje ovaj trend među izoformama TGF-β.
Tabela 5. Procenat identičnosti među izoformama TGF-β: LAP u odnosu na faktor rasta
[0047] Dužine prodomena mogu varirati od oko 50 do oko 200, od oko 100 do oko 400 ili od oko 300 do oko 500 aminokiselinskih ostataka. U pojedinim slučajevima, prodomeni su opsega od oko 169 do oko 433 ostatka. Prodomeni mogu biti različiti u sekvenci i/ili sa niskom homologijom. Pojedini prodomeni mogu imati slične sekundarne i/ili trodimenzionalne strukture. Prodomeni članova TGF-β familije mogu sadržavati petlje latencije. Takve petlje mogu biti bogate prolinom. Dužina petlji latencije može biti utvrđena na osnovu sposobnosti takvih petlji da okruže regione sa prstićima faktora rasta.
[0048] U pojedinim slučajevima, proteinski moduli iz pojedinih članova TGF-β familije sadrže sekvence koje su niske identičnosti sa proteinskim modulima iz drugih članova TGF-β familije. Takva niska identičnost sekvenci može ukazivati na specijalizovane uloge za takve članove familije sa različitim proteinskim modulima.
[0049] Udruživanje GPC sa vanćelijskim proteinima može pojačati interakcije prodomena i faktora rasta. U pojedinim slučajevima, takvi vanćelijski proteini mogu obuhvatati, ali nisu ograničeni na, LTBP, fibriline i/ili GARP. U pojedinim slučajevima, udruživanja sa vanćelijskim proteinima su potrebna da bi se održala latentnost faktora rasta u GPC.
[0050] Pokazano je i da je ekspresija GARP potrebna za površinsku ekspresiju GPC, na površini ćelija hematopoetskog porekla (Tran D.Q. i saradnici, GARP (LRRC32) is essential for the surface expression of latent TGF-β on platelets and activated FOXP3+ regulatory T cells. PNAS. 2009, Jun 2. 106(32): 13445-50). GARP može delovati kao premošćujuća veza za zadržavanje GPC na mestu, na površini ovih ćelija, uključujući, ali ne ograničavajući se na, regulatorne T-ćelije i/ili trombocite.
Rekombinantni proteini
[0051] U pojedinim slučajevima, predmetni opis obezbeđuje rekombinantne proteine. Kao što se ovde upotrebljava, termin "rekombinantni protein" se odnosi na protein proizveden veštačkim genom i/ili procesom (npr. genetičkim inženjeringom). Takvi rekombinantni proteini mogu sadržavati jedan ili više proteinskih modula iz jednog ili više proteina srodnih TGF-β. Pojedini od rekombinantnih proteina koji su ovde opisani, mogu biti korisni kao rekombinantni antigeni. Kao što se ovde upotrebljava, termin "rekombinantan antigen" se odnosi na rekombinantni protein koji može biti upotrebljen za imunizaciju jednog ili više domaćina radi proizvodnje antitela usmerenih na jedan ili više epitopa prisutnih na takvim rekombinantnim antigenima. Pojedini rekombinantni antigeni mogu biti antigeni zasnovani na ćelijama. Kao što se ovde upotrebljava, termin "antigen zasnovan na ćelijama" se odnosi na rekombinantne antigene koji se eksprimiraju u ćelijama radi prikazivanje takvih antigena na ćelijskoj površini. Takve ćelije mogu biti upotrebljene za imunizaciju domaćina radi proizvodnje antitela usmerenih na takve antigene zasnovane na ćelijama.
[0052] U pojedinim slučajevima, ovde opisani rekombinantni proteini mogu biti upotrebljeni kao terapeutici. Rekombinantni proteini koji su ovde opisani mogu modulisati nivoe i/ili aktivnost (npr. signalizaciju) faktora rasta (npr. faktora rasta koji obuhvataju proteine srodne TGF-β) nakon primene i/ili uvođenja u jednog ili u više subjekata i/ili niša.
[0053] U pojedinim slučajevima, ovde opisani rekombinantni proteini mogu biti upotrebljeni za ispitivanje nivoa i/ili aktivnosti (npr. signalizaciju) faktora rasta (npr. faktora rasta koji obuhvataju proteine srodne TGF-β). Pojedini rekombinantni proteini koji su ovde opisani mogu biti upotrebljeni u izolovanju antitela usmerenih na proteine srodne TGF-β. Rekombinantni proteini predmetnog opisa mogu takođe biti upotrebljeni kao rekombinantni antigeni u razvoju stabilišućih [onih koja samnjuju ili sprečavaju disocijaciju između dva agensa (npr. oslobađanje faktora rasta iz GPC, oslobađanje GPC iz jedne ili više proteinskih interakcija)] i/ili oslobađajućih antitela [onih koja pojačavaju disocijaciju između dva agensa (npr. oslobađanje faktora rasta iz GPC, oslobađanje GPC iz jedne ili više proteinskih interakcija)]. Rekombinantni proteini predmetnog opisa mogu obuhvatati proteine koji su članovi TGF-β familije, kao i njihove komponente i/ili proteinske module. Pojedini rekombinantni proteini predmetnog opisa mogu sadržavati prodomene bez udruženih faktora rasta, mutante sa deficijencijom u cepanju sa furinom, mutante sa deficijencijom u udruživanju sa vanćelijskim proteinima i/ili njihove kombinacije.
[0054] U pojedinim slučajevima, rekombinantni proteini mogu sadržavati obeleživače koji se mogu detektovati. Obeleživači koji se mogu detektovati mogu biti upotrebljeni da bi se omogućili detekcija i/ili izolacija rekombinantnih proteina. Pojedini obeleživači koji se mogu detektovati mogu obuhvatati obeleživače sa biotinom, polihistidinske tagove i/ili oktapeptidne tagove. Takvi tagovi mogu biti upotrebljeni za izolaciju obeleženih proteina. Proizvedeni proteini mogu sadržavati dodatne aminokiseline koje kodiraju jedno ili više mesta cepanja za 3C proteazu. Takva mesta omogućavaju cepanje na 3C proteaznom mestu cepanja nakon tretmana sa 3C proteazom, uključujući, ali ne ograničavajući se na, rinovirusnu 3C proteazu. Takva mesta cepanja se uvode da bi se omogućilo uklanjanje obeleživača koji se mogu detektovati iz rekombinantnih proteina.
Rekombinantni GPC
[0055] Slika 5 je šematski prikaz jednog slučaja rekombinantnog GPC. Rekombinantni proteini prema Slici 5, koji obuhvataju proteine koji su članovi TGF-β familije, mogu sadržavati karakteristike koje obuhvataju, ali nisu ograničene na, C-terminalne regione zrelog faktora rasta, N-terminalne regione prodomena i/ili proproteinska mesta cepanja. Proproteinsko mesto cepanja rekombinantnih TGF-β GPC može, na primer, sadržavati furinsku konsenzusnu sekvencu RXXR, gde je R arginin, a X označava aminokiselinske ostatke koji mogu varirati među članovima TGF-β familije. Sekvence furinskog mesta cepanja (iako nisu ograničene samo na cepanje furinom i mogu obuhvatati cepanje drugim proproteinskim konvertaznim enzimima) za svakog člana TGF-β familije su naznačene u Tabeli 1. Rekombinantni GPC prema primeru prikazanom na Slici 5, takođe mogu sadržavati jedan ili više cisteinskih ostataka unutar i/ili blizu N-terminalnog regiona prodomena. Takvi cisteinski ostaci mogu biti udaljeni od oko 1 do oko 10 aminokiselina, od oko 4 do oko 15 aminokiselina, od oko 5 do oko 20 aminokiselina i/ili od oko 7 do oko 50 aminokiselina od N-kraja prodomena. Rekombinantni GPC mogu takođe sadržavati obeleživače koje se mogu detektovati. Takvi obeleživači koji se mogu detektovati mogu biti korisni za detekciju i/ili izolovanje rekombinantnih GPC. Obeleživači koji se mogu detektovati mogu sadržavati 2 ili više histidinskih (His) ostataka. Takvi obeleživači koji se mogu detektovati, mogu ovde biti označeni i kao polihistidinski tagovi. Polihistidinski tagovi mogu obuhvatati heksa-histidinske tagove ili HIS-TAG™ (EMD Biosciences, Darmstadt, Nemačka) koji se sastoje od lanca sa šest histidinskih ostataka. Pojedini polihistidinski tagovi mogu biti prisutni na N-kraju rekombinantnih proteina koji su ovde opisani. Pojedini polihistidinsku tagovu mogu biti prisutnu na C-kraju rekombinantnih proteina koji su ovde opisani. Proizvedeni proteini mogu sadržavati dodatne aminokiseline koje kodiraju jedno ili više mesta cepanja za 3C proteaze. Takva mesta omogućavaju cepanje na 3C proteaznom mestu cepanja nakon tretmana sa 3C proteazom, uključujući, ali ne ograničavajući se na, rinovirusnu 3C proteazu. Pojedina mesta cepanja mogu biti uvedena da bi se omogućilo uklanjanje obeleživača koji se mogu detektovati iz rekombinantnih proteina.
[0056] U pojedinim slučajevima predmetnog opisa, rekombinantni GPC mogu sadržavati mutacije jedne ili više aminokiselina u poređenju sa sekvencama divljeg tipa. U pojedinim slučajevima, mogu biti mutirani jedan ili više regiona proteolitičke obrade. Takvi regioni mogu sadržavati mesta cepanja za proproteinske konvertaze. Mutacije mesta cepanja za proproteinske konvertaze (npr. furin) sprečavaju enzimsko cepanje na tom mestu i/ili sprečavaju enzimsko cepanje faktora rasta od njihovih prodomena (pogledati Sliku 6.) Pojedina mesta cepanja za proproteinske konvertaze, koja sadrže RXXR sekvence, mogu biti mutirana u RXG (gde X označava mesto gde aminokiselinski ostaci mogu biti varijabilni). Takve mutacije su ovde skraćeno označavaju kao "D2G" mutacije i mogu biti otporne na enzimsko cepanje. U pojedinim slučajevima, furinska mesta cepanja koja sadrže RXXR sekvence se mutiraju u AXXA. Takve AXXA sekvence mogu takođe biti otporne na enzimsko cepanje.
[0057] U pojedinim slučajevima, regioni proteolitičke obrade sa toloidom i/ili proteinima sličnim toloidu, mogu biti mutirani da bi se sprečila takva proteolitička obrada. U pojedinim slučajevima, regioni za obradu toloidom u GDF-8 i/ili GDF-11 mogu biti mutirani. U pojedinim slučajevima, mutacija ostataka asparaginske kiseline u ostatke alanina unutar regiona obrade sa toloidom sprečava obradu sa toloidom. Pokazano je i da mutacija ostatka asparaginske kiseline na poziciji 76 (D76) u proproteinu GDF-8 (miostatinu) sprečava proteolitičku aktivaciju latentnog GDF-8 (Wolfman N.M. i saradnici, PNAS.2003, 6. oktobar 100(26): 15842-6.) U pojedinim slučajevima, Asp 120 (D120, broj ostataka je obeležen brojem polazeći od početka translatiranog proteina, D98 u proproteinu sa SEQ ID NO: 4) u GDF-11 može biti mutiran da bi se sprečila obrada sa toloidom (Ge i saradnici, 2005. Mol Cell Biol.
25(14):5846-58.)
[0058] U pojedinim slučajevima, jedna ili više aminokiselina mogu biti mutirane da bi se obrazovali rekombinantni GPC sa smanjenom latencijom. Takve mutacije se ovde označavaju kao „aktivirajuće mutacije“. Ovakve mutacije mogu uvesti jedan ili više regiona steričkog sukoba između kompleksa prodomena i domena faktora rasta. Kao što se ovde upotrebljava, termin "sterički sukob", kada se odnosi na interakciju između dva proteina ili između dva domena i/ili epitopa unutar istog proteina, odnosi se na repulzivnu interakciju između takvih proteina, domena i/ili epitopa usled preklapanja pozicija u trodimenzionalnom prostoru. Sterični sukob unutar GPC može smanjiti afinitet između prodomena i domena faktora rasta, što rezultuje povišenim odnosima slobodnog faktora rasta i latentnog faktora rasta. U pojedinim slučajevima, jedna ili više aminokiselina mogu biti mutirane da bi se obrazovali rekombinantni GPC sa povećanom latencijom. Takve mutacije su ovde označene kao "stabilišuće mutacije". Ovakve mutacije mogu povećati afinitet između prodomena i domena faktora rasta, što rezultuje smanjenim odnosima slobodnog faktora rasta i latentnog faktora rasta.
[0059] U pojedinim slučajevima, rekombinantni proteini predmetnog opisa mogu sadržavati bilo koju od sekvenci navedenih u Tabeli 6 ili njihove fragmente.
Tabela 6. Rekombinantni proteini
[0060] U pojedinim slučajevima, aktivirajuće mutacije mogu obuhvatati ostatke kritične za dimerizaciju LAP ili proteina sličnih LAP. Pojedine aktivirajuće mutacije mogu uključivati TGF-β izoforme (TGF-β1, TGF-β2 i/ili TGF-β3). Mutirani GPC sa aktivirajućim mutacijama mogu sadržavati mutacije koje odgovaraju mutacijama identifikovanim u Kamurati-Engelmanovoj bolesti (CED). Subjekti koji boluju od CED obično sadrže genetičke defekte u TGF-β1. Mutacije identifikovane kod takvih subjekata obuhvataju, ali nisu ograničene na, mutacije u ostacima Y81, R218, H222, C223 i C225. Ostaci C223 i C225 su neophodni za obrazovanje disulfidnih veza u dimerizaciji LAP. Mutacije R218, H222, C223 i/ili C225 mogu voditi oslabljenom ili poremećenom obrazovanju disulfidnih veza i dimerizacije LAP. U pojedinim slučajevima, CED mutacije dovode do povišenog oslobađanja TGF-β i/ili povećane aktivnosti TGF-β. U pojedinim slučajevima, rekombinantni GPC koji sadrže TGF-β1 sa CED mutacijama sadrže sekvence navedene u Tabeli 7. Aminokiselinske supstitucije naznačene u ovim proteinima odražavaju broj ostataka koji je izbrojan polazeći od početka translatiranog proteina (pre uklanjanja signalne sekvence za sekreciju).
Tabela 7. Rekombinantni GPC sa Kamurati-Engelmanovim mutacijama
[0061] GPC koji sadrže CED mutacije mogu naći nekoliko primena u kontekstu predmetnog pronalaska. U pojedinim slučajevima, takvi GPC mogu biti upotrebljeni za proizvodnju rekombinantnih proteina koji sadrže LAP ili domene slične LAP, u kompleksu sa GARP. U pojedinim slučajevima, može biti potrebna koekspresija celokupnog GPC sa GARP radi pravilnog povezivanja i uvijanja. Kroz ekspresiju GPC koji sadrže CED mutacije, faktori rasta mogu biti u stanju da disociraju, napuštajući željeni GARP-LAP kompleks. U tom pogledu, mogu biti korisne mutacije tipa Y81H. Mutacije tipa Y81H dovode do oslobađanja faktora rasta, ali ne narušavaju disulfidno povezivanje između LAP monomera na ostacima C223 i C225. Prema tome, GARP-LAP kompleksi obrazovani ekspresijom Y81H GPC mutanata, mogu sadržavati intaktne LAP dimere iz kojih su se faktori rasta izdvojili disosovanjem. U pojedinim slučajevima, dodatna koekspresija, ili dodavanje furina u višku tokom proizvodnog procesa, može takođe povećati disocijaciju faktora rasta.
[0062] GPC koji sadrže CED mutacije mogu biti eksprimirani tako da se omogući proizvodnja i oslobađanje zrelog faktora rasta. Pojedini faktori rasta bez GPC koji su eksprimirani u skladu sa ovim postupkom, mogu biti upotrebljeni za ispitivanje reaktivnosti antitela, na primer, u imunosorbentnim testovima povezanim sa enzimima (ELISA). Pojedini GPC koji sadrže CED mutacije mogu biti eksprimirani tako da se omogući proizvodnja i oslobađanje faktora rasta povezanih sa GPC. GPC koji sadrže CED mutacije mogu biti eksprimirani tako da se omogući proizvodnja i oslobađanje himernih proteina koji sadrže TGF-β1 LAP (ili njihovih proteinskih modula ili fragmenata) eksprimiranih sa jednim ili sa više proteinskih modula iz drugih članova TGF-β familije. Takvi himerni proteini mogu sadržavati TGF-β1 LAP i domene faktora rasta TGF-β2 ili TGF-β3.
[0063] Furinsko cepanje rekombinantnih proteina opisa se u pojedinim slučajevima može odvijati unutarćelijski. U pojedinim slučajevima, furinsko cepanje rekombinantnih proteina opisa se može odvijati vanćelijski.
[0064] U pojedinim slučajevima, rekombinantni GPC predmetnog opisa mogu sadržavati mutacije u jednom ili u više N-terminalnih regiona za vanćelijske udruživanja. Kao što se ovde upotrebljava, termin "N-terminalni region za vanćelijsko udruživanje" se odnosi na regioni na ili blizu N-kraja proteina, a koji mogu biti neophodni za vanćelijska udruživanja sa jednim ili sa više N-terminalnih regiona. Takvi regioni mogu sadržavati najmanje prvi N-terminalni ostatak, najmanje prvih 5 N-terminalnih ostataka, najmanje prvih 10 N-terminalnih ostataka, najmanje prvih 20 aminokiselinskih ostataka i/ili najmanje prvih 50 aminokiselinskih ostataka. Pojedine mutacije mogu obuhvatati od oko 1 aminokiselinskog ostatka do oko 30 aminokiselinskih ostataka, od oko 5 aminokiselinskih ostataka do oko 40 aminokiselinskih ostataka i/ili od oko 10 aminokiselinskih ostataka do oko 50 aminokiselinskih ostataka na ili blizu N-kraja proteina. Takvi regioni mogu sadržavati ostatke za udruživanje sa LTBP, fibrilinom i/ili GARP. U pojedinim slučajevima, jedan ili više cisteinskih ostataka koji su prisutni unutar i/ili u blizini N-terminalnih regiona za vanćelijska udruživanja, mogu biti neophodni za takva udruživanja. U pojedinim slučajevima, cisteinski ostaci prisutni unutar i/ili blizu N-terminalnih regiona za vanćelijska udruživanja, prisutni su unutar oko prva 2 N-terminalna ostatka, oko prva 3 N-terminalna ostatka, oko prva 4 N-terminalna ostatka, oko prvih 5 N-terminalnih ostataka, oko prvih 6 N-terminalnih ostataka, oko prvih 7 N-terminalnih ostataka i/ili unutar najmanje prvih 30 N-terminalnih ostataka. Pojedine mutacije u jednom ili u više N-terminalnih regiona za vanćelijska udruživanja obuhvataju supstituciju i/ili deleciju takvih cisteinskih ostataka. Takve mutacije mogu modulisati udruživanje GPC i/ili prodomena sa jednim ili sa više vanćelijskih proteina, uključujući, ali ne ograničavajući se na, LTBP, fibriline i/ili GARP. Ovakve mutacije mogu takođe obuhvatati supstituciju jednog ili više cisteina sa drugom aminokiselinom. Supstitucije cisteinskih ostataka su ovde skraćene kao "C#X", pri čemu # predstavlja broj ostatka [računajući od N-kraja pro-proteina (bez signalnog peptida)] originalnog cisteniskog ostatka, a X predstavlja kod za aminokiselinu u vidu jednog slova za aminokiselinu koja je upotrebljena za supstituciju. Bilo koja aminokiselina može biti upotrebljena za takve supstitucije. U pojedinim slučajevima, serinski (S) ostaci se upotrebljavaju za supstituciju cisteinskih ostataka. Neograničavajući primeri takvih mutacija mogu obuhvatati C4S, C5S i/ili C7S. U rekombinantnim GPC koji sadrže N-terminalne prodomenske regione iz TGF-β1, mogu biti mutirani cisteinski ostaci koji se nalaze na aminokiselinskoj poziciji broj 4. U rekombinantnim GPC koji sadrže N-terminalne prodomenske regione iz TGF-β2, mogu biti mutirani cisteinski ostaci koji se nalaze na aminokiselinskoj poziciji broj 5. U rekombinantnim GPC koji sadrže N-terminalne prodomenske regione iz TGF-β3, mogu biti mutirani cisteinski ostaci koji se nalaze na poziciji 7.
[0065] U pojedinim slučajevima, jedan ili više cisteina, u jednom ili više drugih regiona GPC, mogu biti supstituisani ili uklonjeni delecijom. U pojedinim slučajevima, takve GPC modifikacije mogu pospešiti oslobađanje zrelog faktora rasta iz prodomena. U pojedinim slučajevima, takvi cisteini mogu uključivati one koji su prisutni u jednom ili u više zrelih faktora rasta, alfa 2 heliksima, pričvršćivačima, lasima latencije i/ili regionima tipa “leptir-mašni”.
[0066] U pojedinim slučajevima, rekombinantni proteini predmetnog opisa mogu sadržavati proteinske module izvedene iz jedne ili iz više vrsta, uključujući sisare, uključujući, ali bez ograničavanja samo na, miševe, pacove, zečeve, svinje, majmune i/ili ljude. Rekombinantni proteini mogu sadržavati jednu ili više aminokiselina iz jedne ili više aminokiselinskih sekvenci izvedenih iz jedne ili više proteinskih sekvenci koje nisu humane i navedene su u Tabeli 8. U pojedinim slučajevima, rekombinantni proteini predmetnog opisa mogu sadržavati takve sekvence sa ili bez nativnog signalnog peptida.
Tabela 8. Proteini koji nisu humani
[0067] U pojedinim slučajevima, rekombinantni proteini se mogu kombinovati i/ili uvesti u kompleks sa jednom ili sa više dodatnih rekombinantnih komponenti. Takve komponente mogu obuhvatati vanćelijske proteine za koje je poznato da se udružuju sa GPC, uključujući, ali bez ograničavanja samo na, LTBP, fibriline, perlekan, GASP1/2 proteine, folistatin, gen srodan folistatinskom (FLRG), dekorin i/ili GARP (uključujući, ali ne ograničavajući se na, rekombinantne oblike ovakvih proteina). Pojedini rekombinantni GPC predmetnog opisa moraju biti istovremeno eksprimirani sa jednim ili sa više od takvih vanćelijskih proteina radi pravilne ekspresije i/ili uvijanja.
[0068] U pojedinim slučajevima, LTBP u kompleksu mogu obuhvatati, ali nisu ograničeni na LTBP1, LTBP2, LTBP3 i/ili LTBP4. LTBP u kompleksu mogu sadržavati fragmente LTBP i/ili mutacije. Pojedini rekombinantni oblici LTBP u kompleksu sa rekombinantnim GPC mogu sadržavati varijante LTBP nastale alternativnom obradom. Pojedine takve varijante LTBP1 su skraćene na N-kraju i ovde su označene kao LTBP1 S. Pojedini rekombinantni proteini predmetnog opisa mogu sadržavati LTBP, njihove fragmente ili mutante koji sadrže aminokiselinske sekvence navedene u Tabeli 9.
Tabela 9. Sekvence LTBP
[0069] U pojedinim slučajevima, LTBP mogu sadržavati obeleživače koje se mogu detektovati. Obeleživači koji se mogu detektovati mogu biti upotrebljeni da bi se omogućili detekcija i/ili izolacija rekombinantnih proteina koji sadrže LTBP. Pojedini obeleživači koji se mogu detektovati mogu sadržavati obeleživače sa biotinom, polihistidinske tagove i/ili oktapeptidne tagove. Takvi tagovi mogu biti upotrebljeni za izolaciju obeleženih proteina. Proizvedeni proteini mogu sadržavati dodatne aminokiseline koje kodiraju jedno ili više mesta cepanja za 3C proteaze. Takva mesta omogućavaju cepanje na 3C proteaznom mestu cepanja nakon tretmana sa 3C proteazom, uključujući, ali ne ograničavajući se na, rinovirusnu 3C proteazu. Takva mesta cepanja mogu biti uvedena da bi se omogućilo uklanjanje obeleživača koji se mogu detektovati iz rekombinantnih proteina.
[0070] U pojedinim slučajevima, GARP, uključujući, ali ne ograničavajući se na, rekombinantne oblike GARP, mogu biti uvedeni u kompleks sa rekombinantnim GPC. Pojedini rekombinantni GPC predmetnog opisa mogu biti istovremeno eksprimirani sa GARP, da bi se osiguralo pravilno uvijanje i/ili ekspresija. U drugim slučajevima, GARP homolog, protein 33 koji sadrži ponovke bogate leucinom (LRRC33,) ili njegovi fragmenti i/ili mutanti mogu biti supstituenti za GARP [koji se ovde označava kao protein 32 koji sadrži ponovke bogate leucinom (LRRC32)] Takvi LRRC33 fragmenti i/ili mutanti mogu sadržavati jedan ili više regiona iz LRRC33 sekvence navedene u Tabeli 10 u nastavku teksta. Rekombinantni GARP mogu takođe obuhvatati mutante i/ili GARP fragmente. Pojedini rekombinantni GARP mogu biti solubilni (ovde su označeni kao sGARP).
[0071] U pojedinim slučajevima, rekombinantni GARP mogu sadržavati jednu ili više aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 10. Pojedini rekombinantni GARP koji su ovde upotrebljeni, mogu biti eksprimirani bez N-terminalnih ostataka AQ. Eksprimirani GARP mogu sadržavati obeleživače koji se mogu detektovati. Takvi obeleživači koji se mogu detektovati, mogu biti upotrebljeni da bi se omogućili detektovanje i/ili izolovanje. Pojedini obeleživači koji se mogu detektovati mogu sadržavati obeleživače sa biotinom, polihistidinske tagove i/ili oktapeptidne tagove. Takvi tagovi mogu biti upotrebljene za izolovanje obeleženih proteina. Proizvedeni proteini mogu sadržavati dodatne aminokiseline koje kodiraju jedno ili više mesta cepanja za 3C proteaze. Takva mesta omogućavaju cepanje na mestu cepanja 3C proteaze nakon tretmana sa 3C proteazom, uključujući, ali ne ograničavajući se na, rinovirusnu 3C proteazu. Mesta cepanja za 3C proteaze mogu biti uvedena da bi se omogućilo uklanjanje obeleživača koji se mogu detektovati iz rekombinantnih proteina.
Tabela 10. Sekvence GARP
[0072] GPC vezani za LTBP mogu usvojiti trodimenzionalne konformacije koje su jasno različite od konformacija koje se mogu naći kod GPC koji su vezani za GARP ili druge matriksne proteine. To može biti posledica, u pojedinim slučajevima, prisustva cisteina koji su dostupni na LTBP-u za obrazovanje disulfidnih veza sa GPC, a koji su dovoljno udaljeni jedan od drugoga u odnosu na odgovarajuće cisteine koji su dostupni za obrazovanje disulfidnih veza na GARP. Takve razlike u trodimenzionalnim konformacijama mogu obezbediti jedinstvene epitope zavisne od konformacije na GPC. U pojedinim primerima izvođenja, antitela pronalaska su usmerena na takve epitope koji zavise od konformacije. Takva antitela mogu funkcionisati selektivno u aktivaciji ili inhibiciji aktivnosti faktora rasta, u zavisnosti od identiteta vezanog proteina (npr. LTBP ili GARP). U pojedinim slučajevima, različiti epitopi koji zavise od konformacije mogu biti prisutni na N-terminalnim alfa heliksima proTGF-β kada su oni vezani za LTBP ili GARP.
[0073] Pojedini rekombinantni proteini mogu biti koeksprimirani sa perlekanom. Takvi rekombinantni proteini mogu obuhvatati, ali nisu ograničeni na GDF-8. Studije Sengle-a i saradnika (Sengle i saradnici, 2011. J Biol Chem. 286(7):5087-99) su utvrdile da se GDF-8 prodomen udružuje sa perlekanom. Ddodatne studije su ukazale da nokaut perlekana dovodi do mišićne hipertrofije, ukazujući da interakcija između GDF-8 i perlekana može doprinositi aktivnosti GDF-8 (Xu i saradnici, 2010. Matrix Biol.29(6):461–70.)
[0074] U pojedinim slučajevima, rekombinantni proteini opisa mogu biti koeksprimirani sa folistatinom i/ili FLRG. Takvi rekombinantni proteini mogu uključivati, ali nisu ograničeni na GDF-8. Poznato je da i folistatin i FLRG antagonizuju pojedine proteine koji su članovi TGF-β familije, uključujući, ali ne ograničavajući se na, GDF-8 (Lee S-J. i saradnici, 2010. Mol Endocrinol.24(10): 1998-2008, Takehara-Kasamatsu Y. i saradnici, 2007. J Med Invest. 54(3-4):276-88.) Pokazano je i da folistatin blokira aktivnost GDF-8, vezivanjem za slobodan faktor rasta i sprečavanjem vezivanja receptora. I za folistatin i FLRG se pretpostavlja da su uključeni u modulisanje aktivnosti faktora rasta tokom razvića.
[0075] U pojedinim slučajevima, rekombinantni proteini opisa mogu biti koeksprimirani sa dekorinom. Takvi rekombinantni proteini mogu uključivati, ali nisu ograničeni na TGF-β i GDF-8. Dekorin je poznati antagonista aktivnosti TGF-β (Zhu J. i saradnici, 2007. J Biol Chem.282:25852-63), a pozato je i da može antagonizovati druge članove TGF-β familije, uključujući, ali ne ograničavajući se na, GDF-8. Pokazano je i da inhibicija aktivnosti TGF-β i GDF-8 koja je zavisna od dekorina, smanjuje fibrozu u raznim tkivima. Takođe je pokazano da ekspresija dekorina povećava ekspresiju folistatina, poznatog inhibitora slobodnog GDF-8.
[0076] U pojedinim slučajevima, rekombinantni proteini predmetnog opisa mogu obuhvatati one prikazane na Slici 7. Pojedini rekombinantni proteini predmetnog opisa mogu sadržavati jednu ili više karakteristika i/ili kombinacije proteinskih modula iz slučajeva prikazanih na Slici 7.
Rekombinantni aktivini i inhibini
[0077] Aktivini i inhibini su proteini koji su članovi TGF-β familije i čija aktivnost često rezultuje suprotnim funkcijama (Bilezikjian i saradnici, 2012). Poput ostalih članova familije, i ovi proteini se fiziološki javljaju kao dimeri. Aktivini i inhibini su delom izgrađeni od istih β-subjedinica, koje mogu uključivati inhibin-beta A, inhibin-beta B, inhibin-beta C i inhibin-beta E (ovde označene kao βsubjedinica A, B, C i E, tim redom). Strukturno, razlika između aktivina i inhibina je u tome što su aktivini dimeri β-subjedinica, dok su inhibini heterodimeri, pri čemu je druga subjedinica inhibin-a. Aktivini su nazvani po svojim parovima subjedinica, tako da aktivin A sadrži homodimer dve A subjedinice, aktivin AB sadrži dimer A i B subjedinica, B sadrži dimer B subjedinica itd. (Muenster i saradnici, 2011). Aktivini su uključeni u raznovrsne funkcije koje mogu obuhvatati, ali nisu ograničene na, ćelijski rast, diferencijaciju, programiranu ćelijsku smrt, endokrine funkcije, ćelijski metabolizam, rast kostiju itd. Posebno je prepoznata njihova kontrola ciklusa reproduktivnih hormona. U tom pogledu, signalizacija aktivinina i inhibina često funcioniše zapravo antagonistički.
[0078] U pojedinim slučajevima, rekombinantni proteini predmetnog opisa mogu sadržavati integrine. Integrini su heterodimeri na ćelijskoj površini koje obrazuju alfa i beta subjedinice, od kojih svaka sadrži transmembranski domen, a koje se spajaju u N-terminalnom delu vanćelijskog domena da bi se obrazovalo mesto vezivanja liganda. Rekombinantni proteini predmetnog opisa mogu sadržavati integrine i/ili integrinske subjedinice. Takvi integrini i/ili integrinske subjedinice mogu sadržavati bilo koje od onih opisanih u privremenoj U.S. patentnoj prijavi broj 61/722,919, podnetoj 6. novembra 2012. godine.
[0079] Rekombinantni proteini pronalaska mogu uključivati međućelijski adhezioni molekul tipa 1 (ICAM-1). U pojedinim slučajevima, ICAM-1 proteini predmetnog opisa mogu biti upotrebljeni kao kontrolni proteini tokom razvoja antitela i/ili ispitivanja antitela. U pojedinim slučajevima, ICAM-1 može biti upotrebljen kao kontrola tokom selekcije molekula vezivanja, upotrebom tehnologije prikaza u fagima. U pojedinim slučajevima, ICAM-1 proteini pronalaska sadrže jedan ili više obeleživača koji se mogu detetkovati. Obeleživači koji se mogu detektovati mogu podrazumevati, na primer, histidinske tagove.
Himerni proteini
[0080] U pojedinim slučajevima, rekombinantni proteini predmetnog opisa mogu sadržavati himerne proteine. Kao što se ovde upotrebljava, izraz "himerni protein" se odnosi na protein koji sadrži jedan ili više proteinskih modula iz najmanje dva različita proteina [obrazovana iz istog gena (npr. varijanti koje nastaju alternativnom obradom) ili iz različitih gena]. Himerni proteini mogu sadržavati proteinske module iz dva ili više proteina koji su članovi TGF-β familije. Takvi himerni proteini mogu sadržavati proteinske module iz TGF-β1, TGF-β2 i/ili TGF-β3. Pojedini himerni proteini predmetnog opisa mogu sadržavati proteinske module koji uključuju, ali nisu ograničeni na proteinske module i/ili aminokiselinske sekvence navedene u Tabeli 12 (brojevi ostataka odgovaraju sekvencama proproteina navedenim u Tabeli 1). Pojedini himerni proteini predmetnog opisa mogu sadržavati proteinske module koji sadrže aminokiselinske sekvence slične onima u Tabeli 12, ali koje sadrže i dodatne ili nešto manje aminokiselina u odnosu na one koje su navedene. Takvi moduli mogu sadržavati oko 1 aminokiseline više ili manje, oko 2 aminokiseline više ili manje, oko 3 aminokiseline više ili manje, oko 4 aminokiseline više ili manje, oko 5 aminokiselina više ili manje, oko 6 aminokiselina više ili manje, oko 7 aminokiselina više ili manje, oko 8 aminokiselina više ili manje, oko 9 aminokiselina više ili manje, oko 10 aminokiselina više ili manje ili više od 10 aminokiselina više ili manje na N-terminalnim i/ili C-terminalnim krajevima.
Tabela 12. Proteinski moduli
[0081] U pojedinim slučajevima, himerni proteini predmetnog opisa mogu sadržavati kombinacije bilo kog proteinskog modula koji je naveden u Tabeli 12. Pojedini himerni proteini koji sadrže GPC mogu sadržavati proteinske module koji su supstituisani sa bilo kojim proteinskim modulima navedenim u Tabeli 12.
[0082] U pojedinim slučajevima, himerni proteini predmetnog opisa mogu sadržavati kombinacije proteinskih modula koji obuhvataju, ali nisu ograničeni samo na, kombinacije proteinskih modula i/ili aminokiselinske sekvence navedene u Tabeli 13. Pojedini himerni proteini predmetnog opisa mogu sadržavati proteinske module koji sadrže aminokiselinske sekvence slične onima u Tabeli 13, ali mogu sadržavati i dodatne ili nešto manje aminokiselina od onih koje su navedene. Takve aminokiselinske sekvence mogu sadržavati oko 1 aminokiselinu više ili manje, oko 2 aminokiseline više ili manje, oko 3 aminokiseline više ili manje, oko 4 aminokiseline više ili manje, oko 5 aminokiselina više ili manje, oko 6 aminokiselina više ili manje, oko 7 aminokiselina više ili manje, oko 8 aminokiselina više ili manje, oko 9 aminokiselina više ili manje, oko 10 aminokiselina više ili manje ili više od 10 aminokiselina više ili manje na N-terminalnim i/ili C-terminalnim krajevima.
Tabela 13. Kombinacije proteinskih modula
[0083] Himerni proteini mogu biti upotrebljeni za karakterizaciju i/ili mapiranje epitopa povezanih sa GPC. Kao što se ovde upotrebljava, termini "mapa" ili "mapiranje" se odnose na identifikaciju, karakterizaciju i/ili utvrđivanje jednog ili više funkcionalnih regiona jednog ili više proteina. Takve karakterizacije mogu biti neophodne za određivanje interakcija između jednog ili više proteinskih modula i drugog agensa (npr. drugog proteina i/ili proteinskog modula). Pojedini himerni proteini mogu biti upotrebljeni za karakterizaciju funkcija povezanih sa jednim ili sa više proteina i/ili proteinskih modula.
[0084] U pojedinim slučajevima, himerni proteini predmetnog opisa mogu sadržavati sekvence navedene u Tabeli 14 ili njihove fragmente.
Tabela 14. Himerni proteini
[0085] U pojedinim slučajevima, himerni proteini mogu sadržavati jedan ili više proteinskih modula iz TGF-β2. Iako je kristalna struktura za faktor rasta TGF-β2 razjašnjena (Daopin S. i saradnici, Crystal structure of transforming growth factor-β2: an unusual fold for the superfamily. Science. 1992.
257(5068):369-73,) mehanizmi aktivacije još nisu u potpunosti poznati. Aktivacija može zavisiti od jedne ili više interakcija između pokretačke petlje TGF-β2 i α9β1integrina. Aktivirajuća petlja TGF-β2 može sadržavati slične strukturne i/ili funkcionalne karakteristike povezane sa RGD sekvencama. TGF-β2 pokretačke petlje mogu vezivati integrine, uključujući, ali ne ograničavajući se na, α9β1integrine.
[0086] Prema bojenju mišjeg tkiva, integrinska subjedinica α9je široko eksprimirana u skeletnim i srčanim mišićima, visceralnim glatkim mišićima, hepatocitima, epitelu disajnih puteva, skvamoznom epitelu, epitelu horoidnog pleksusa, kao i na neutrofilima (Palmer E.L. i saradnici, Sequence and tissue distribution of the integrin α9 subunit, a novel partner of β1 that is widely distributed in epithelia and muscle. Journal of Cell Biology.1993.123(5):1289-97.) Ekspresija α9nije detektovana ranije od E12,5, što ukazuje da nema glavnu ulogu u najranijoj morfogenezi tkiva (Wang A. i saradnici, Expression of the integrin subunit α9 in the murine embryo. Developmental Dynamics.1995.204:421-31.) In vivo funkcije α9su nejasne. Fenotipovi uočeni kod nokaut miševa ukazuju na ulogu u razvoju limfnih zalistaka (Bazigou E. i saradnici, Integrin- α9 is required for fibronectin matrix assembly during lymphatic valve morphogenesis. Dev Cell.2009 august.17(2):175-86.) Prijavljeni interagujući partneri integrina α9β1uključuju VCAM-1, treći FnIII domen na tenascinu C, osteopontin, polidom/SVEP1, VEGF-A i NGF (Yokasaki Y. i saradnici, Identification of the ligand binding site for the integrin α9β1 in the third fibronectin type III repeat of tenascin C. The Journal of Biological Chemistry. 1998.
273(19):11423-8; Marcinkiewicz C. i saradnici, Inhibitory effects of MLDG-containing heterodimeric disintegrins reveal distinct structural requirements for interaction of the integrin α9β1 with VCAM-1, tenascin-C, and osteopontin. JBC.2000.275(41):31930-7; Oommen S. i saradnici, Vacular endothelial growth factor A (VEGF-A) induces endothelial and cancer cell migration through direct binding to integrin α9β1. JBC.2011.286(2): 1083-92; Sato-Nishiuchi R. i saradnici, Polydom/SVEP1 is a ligand for integrin α9β1. JBC.2012.287(30):25615-30; Staniszewska I. i saradnici, Integrin α9β1 is a receptor for nerve growth factor and other neurotrophins. Journal of Cell Science.2007.121(Pt 4):504-13; Yokosaki Y. i saradnici, The integrin α9β1 binds to a novel recognition sequence (SVVYGLR) in the thrombincleaved amino-terminal fragment of osteopontin. JBC.1999.274(51):36328-34.)
[0087] Mesta vezivanja na proteinima koji interaguju sa α9β1su mapirana upotrebom linearnih peptida. Ova mesta obuhvataju mesta vezivanja na tenascinu C (AEIDGIEL; SEQ ID NO: 237), osteopontinu (SVVYGLR; SEQ ID NO: 238), polidomu/SVEP1 (EDDMMEVPY; SEQ ID NO: 239) i VEGF-A (EYP). Za razliku od α4β1i α5β1, α9β1ne zahteva kanonski motiv RGD sekvence. Pojedini, ali ne svi od prijavljenih ciljnih molekula su sa kiselim ostatkom/hidrofobnim ostatkom/prolinskim motivom. Pojedini takođe sadrže tirozinski ostatak.
[0088] Okidačka petlja TGF-β1 i TGF-β3 nosi RGD sekvencu gde se αvβ6i/ili αvβ8vezuju, da bi se omogućilo oslobađanje faktora rasta. Region pokretačke petlje TGF-β2 se razlikuje od onih u TGF-β1 i TGF-β3, koji sadrže sekvencu FAGIDGTSTYTSGDQKTIKSTRKKNSGKTP (SEQ ID NO: 65), bez RGD trimera. Od ovog regiona, ostaci AGIDGTST (SEQ ID NO: 240) se mogu poravnati sa peptidom na trećem FnIII domenu tenascina-C koji je mapiran kao mesto vezivanja α9β1. Takođe, tirozin koji sledi nakon ovog regiona može imati ulogu u mogućem vezivanju α9β1. Prema tome, vezivanje α9β1za TGF-β2 bi moglo biti fiziološki relevantno. U pojedinim slučajevima, himerni proteini predmetnog opisa mogu sadržavati sekvence pokretačkih petlji koje sadrže bilo koju sekvencu navedenu u Tabeli 15.
Tabela 15. Sekvence pokretačkih petlji
[0089] U pojedinim slučajevima, himerni proteini predmetnog opisa mogu sadržavati jednu ili više pokretačkih petlji TGF-β2. Takve himerne proteine može karakterisati aktivacija (npr. oslobađanje faktora rasta) koja je regulisana na način sličan onome kod TGF-β2. Pojedini himerni proteini predmetnog opisa mogu sadržavati proteine srodne TGF-β gde su jedan ili više proteinskih modula supstituisani sa jednim ili sa više proteinskih modula koji sadrže jednu ili više pokretačkih petlji TGF-β2. Pojedini himerni proteini sadrže proteine srodne TGF-β gde su jedan ili više proteinskih modula koji sadrže najmanje jednu RGD sekvencu, supstituisani sa jednim ili sa više proteinskih modula koji sadrže jednu ili više pokretačkih petlji TGF-β2. U drugim slučajevima, himerni proteini mogu sadržavati TGF-β1 i/ili TGF-β3 proteine, gde su jedan ili više proteinskih modula koji sadrže najmanje jednu RGD sekvencu supstituisani sa jednim ili više proteinskih modula koji sadrže jednu ili više pokretačkih petlji TGF-β2. Takvi himerni proteini mogu ispoljavati aktivnost svojstvenu TGF-β1.
[0090] U pojedinim slučajevima, himerni proteini predmetnog opisa mogu sadržavati jedan ili više proteinskih modula iz BMP. Proteinski moduli koji sadrže sekvence iz BMP mogu sadržavati sekvence iz bilo kog od onih BMP modula koji su prikazani na Slici 8. Himerni proteini predmetnog opisa koji sadrže jedan ili više BMP proteinskih modula mogu biti korisni za razvoj antitela i/ili testove za proučavanje, poboljšanje i/ili remećenje interakcija BMP sa drugim proteinima, uključujući, ali ne ograničavajući se na, RGM proteine.
[0091] Himerni proteini mogu sadržavati obeleživače koji se mogu detektovati. Obeleživači koji se mogu detektovati mogu biti upotrebljeni da bi se omogućili detekcija i/ili izolovanje himernih proteina. Takvi obeleživači koji se mogu detektovati mogu sadržavati obeleživače sa biotinom, polihistidinske tagove i/ili oktapeptidne tagove. Obeleživači mogu biti upotrebljene za identifikovanje i/ili izolovanje obeleženih proteina. Proizvedeni proteini mogu sadržavati dodatne aminokiseline koje kodiraju jedno ili više 3C proteaznih mesta cepanja. Takva mesta omogućavaju cepanje na mestu cepanja za 3C proteazu nakon tretmana sa 3C proteazom, uključujući, ali ne ograničavajući se na, rinovirusnu 3C proteazu. Mesta cepanja za 3C proteazu mogu biti uvedena da bi se omogućilo uklanjanje obeleživača koji se mogu detektovati iz himernih proteina.
Ekspresija proteina
[0092] U pojedinim slučajevima, sinteza rekombinantnih proteina predmetnog opisa se može vršiti u skladu sa bilo kojim postupkom koji je poznat u oblasti tehnike. Pojedine proteinske sinteze se mogu vršiti in vitro. Pojedine proteinske sinteze se mogu vršiti upotrebom ćelija. Takve ćelije mogu biti bakterijske i/ili eukariotske. U pojedinim slučajevima, za sintezu proteina mogu biti upotrebljene eukariotske ćelije. Pojedine takve ćelije mogu biti sisarske. Pojedine sisarske ćelije koje se upotrebljavaju za espresiju proteina mogu obuhvatati, ali nisu ograničene na, ćelije miša, ćelije zeca, ćelije pacova, ćelije majmuna, ćelije hrčka i ćelije čoveka. Takve ćelije mogu biti izvedene iz ćelijske linije. U drugim slučajevima mogu biti upotrebljene humane ćelije. U dodatnim slučajevima, ćelijske linije mogu obuhvatati, ali nisu ograničene na, HEK293 ćelije, CHO ćelije, HeLa ćelije, Sw-480 ćelije, EL4 T limfomske ćelije, TMLC ćelije, 293T/17 ćelije, Hs68 ćelije, CCD1112sk ćelije, HFF-1 ćelije, keloidne fibroblaste, A204 ćelije, L17 RIB ćelije i C2C12ćelije.
[0093] U pojedinim slučajevima, za sintezu rekombinantnih proteina predmetnog opisa se upotrebljavaju 293 ćelije. Ove ćelije su humane ćelije koje post-translaciono modifikuju proteine sa strukturama sličim humanim (npr. glikane). Takve ćelije se lako mogu transfektovati i lako im se može podesiti skala proizvodnje, a u stanju su i da rastu u velikim gustinama u kulturi tipa suspenzije.293 ćelije mogu uključivati 293E ćelije. 293E ćelije su HEK293 ćelije koje stabilno eksprimiraju EBNA1 (nuklearni antigen-1 Epštajn-Barovog virusa). U pojedinim slučajevima, 293E ćelije se mogu uzgajati u medijumu bez seruma da bi se pojednostavilo naknadno prečišćavanje. U pojedinim slučajevima, mogu biti upotrebljene 293-6E ćelije (NRC Kanada, Otava, Kalifornija). Takve ćelije eksprimiraju skraćeni EBNA1 (EBNA1t) i možeih karakterisati pojačana proizvodnja rekombinantnih proteina, a mogu biti optimizovane za rast i/ili ekspresiju proteina u medijumu bez seruma da bi se pojednostavilo naknadno prečišćavanje. U pojedinim slučajevima, za ekspresiju rekombinantnih proteina opisa mogu biti upotrebljene ćelije insekata. U pojedinim slučajevima, ekspresija u ćelijama insekata se može vršiti upotrebom ćelija Spodoptera frugiperda, uključujući, ali ne ograničavajući se na, Sf9 i/ili Sf-21 ćelije. U pojedinim slučajevima, kulture ćelija insekata mogu sadržavati ćelije Trichoplusia ni, uključujući, ali bez ograničavanja samo na, Tn-368 i/ili HIGH-FIVE™ BTI-TN-5B1-4 ćelije. Dodatni spisak ćelijskih linija insekata za primer se može pronaći u US patentu br.5,024,947.
[0094] U pojedinim slučajevima, rekombinantni proteini opisa mogu sadržavati Fc domen antitela da bi se stvorio Fc fuzioni protein. Obrazovanje Fc fuzionog proteina sa bilo kojim od rekombinantnih proteina koji su ovde opisani, može se izvoditi prema bilo kom postupku poznatom u stanju tehnike, uključujući postupak opisan u Czajkowski D.M. i saradnici, 2012. EMBO Mol Med.4(10):1015-28, kao i u US patentima br. 5,116,964; 5,541,087 i 8,637,637. Fc fuzioni proteini mogu biti povezani sa zglobnim regionom IgG Fc preko cisteinskih ostataka u zglobnom regionu Fc. Dobijeni Fc fuzioni proteini mogu biti strukture slične antitelima, ali bez CH1domena ili lakih lanaca. U pojedinim slučajevima, Fc fuzione proteine mogu karakterisati farmakokinetički profili koji su uporedivi sa nativnim antitelima. U pojedinim slučajevima, Fc fuzione proteine može karakterisati produžen poluživot u cirkulaciji i/ili izmenjena biološka aktivnost. U pojedinim slučajevima, Fc fuzioni proteini mogu biti pripremljeni upotrebom bilo kog od proteina iz TGF-β familije ili proteina srodnih TGF-β koji su ovde opisani. U pojedinim slučajevima, Fc fuzioni proteini mogu sadržavati TGF-β, GDF-8 i/ili GDF-11.
[0095] Sekvence koje kodiraju rekombinantne proteine predmetnog opisa mogu biti insertovane u bilo koji broj DNK vektora koji su poznati u oblasti tehnike za ekspresiju. Takvi vektori mogu uključivati plazmide. U pojedinim slučajevima, sekvence koje kodiraju rekombinantne proteine predmetnog opisa se kloniraju u pTT5 vektore (NRC Biotechnology Research Institute, Montreal, Kvebek.) U drugim slučajevima, mogu biti upotrebljeni pTT22, pTT28, pYD5, pYD7, pYD11 (NRC Biotechnology Institute, Montreal, Kvebek) i/ili pMA vektori (Life Technologies, Carlsbad, CA). Vektori mogu sadržavati promotorske sekvence za modulisanje ekspresije sekvenci koje kodiraju rekombinantne proteine predmetnog opisa. Takvi promotori mogu biti konstitutivno aktivni i/ili mogu biti regulisani spoljašnjim i/ili unutrašnjim faktorima. Pojedini spoljašnji faktori mogu biti upotrebljeni za pojačavanje ili suprimiranje ekspresije sekvenci koje kodiraju rekombinantne proteine predmetnog opisa. Pojedini vektori mogu kodirati signale lokalizacije u jedru, a koji mogu biti uključeni u rekombinantne proteine predmetnog opisa nakon translacije. Pojedini vektori mogu proizvoditi iRNK transkripte koji sadrže sinale za transport iz jedra. RNK transkribovana sa modifikovanog pTT5 vektora (pTT5-WPRE) sadrži element koji olakšava transport transkripata iz jedra. Pojedini vektori mogu biti modifikovani insertovanjem jedne ili više kaseta za kloniranje koje ne zavisi od ligacije (LIC), da bi se obezbedilo jednostavnije kloniranje.
[0096] Vektori koji kodiraju rekombinantne proteine predmetnog opisa mogu biti isporučeni ćelijama u skladu sa bilo kojim postupkom koji je poznat u oblasti tehnike, uključujući, ali ne ograničavajući se na, transfekciju, elektroporaciju i/ili transdukciju. U pojedinim slučajevima, vektori mogu sadržavati jedan ili više elemenata za pojačavanje replikacije vektora u ćelijama domaćinima. U pojedinim slučajevima, vektori mogu sadržavati oriP mesta za epizomalnu replikaciju u ćelijama koje eksprimiraju EBNA-1.
[0097] U pojedinim slučajevima, ćelije su stabilno transfektovane da bi proizvodile rekombinantne proteine predmetnog opisa. Stabilno transfektovane ćelije prenose transfektovane gene u ćerke ćelije tokom ćelijske deobe, čime se eliminiše potreba za ponovnom transfekcijom. U pojedinim slučajevima, transfektovani geni su stabilno insertovani u genom transformisanih ćelija. Transfektovani geni mogu sadržavati gene za selekciju ćelija, kao što su geni koji obezbeđuju rezistenciju na jedan ili na više od toksičnih ili represivnih jedinjenja. Takvi geni mogu biti upotrebljeni za podržavanje rasta samo onih ćelija koje su sa stabilno ugrađenim transfektovanim genima, kada se uzgajaju u prisustvu jednog ili više takvih toksičnih ili represivnih jedinjenja (npr. puromicina, kenomicina itd.) Selekcija ćelija može takođe obuhvatati odabir ćelija na osnovu ukupnog nivoa ekspresije rekombinantnih proteina. Određivanje takvih nivoa se može vršiti, na primer, imunoblot i/ili ELISA postupkom.
[0098] U pojedinim slučajevima, nukleotidne sekvence koje kodiraju rekombinantne proteine predmetnog opisa mogu sadržavati jedan ili više post-transkripcionih regulatornih elemenata virusa hepatitisa kod mrmota (WPRE). RNK nukleinske kiseline koje sadrže takve elemente mogu sadržavati sekvencu GCCACGGCGGAACUCAUCGCCGCCUGCCUUGCCCGCUGCUGGACAGGGGCUCGGCUGUUGGGCACUGAC AAUUCCGUGGU (SEQ ID NO: 255). RNK koja sadrži WPRE može biti transkripcijom prepisana sa DNK koja sadrži sekvencu AATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTT GCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTT CCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAG GAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCA ACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTT TCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGA CAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGT CCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTG CTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCT CTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGG CCGCCTCCCCGCCTG
(SEQ ID NO: 256). WPRE mogu pojačati translaciju nukleinskih kiselina koje sadrže WPRE. Takva pojačana translacija može biti posledica povećanog eksporta novotranskribovane iRNK u citoplazmu.
[0099] U pojedinim slučajevima, rekombinantni proteini mogu sadržavati jednu ili više signalnih sekvenci za sekreciju. Kao što se ovde upotrebljava, termin "signalna sekvenca sekrecije" se odnosi na lanac aminokiselina (ili nukleotida koji ih kodiraju na nivou nukleinske kiseline) koje, kada su deo proteina, modulišu sekreciju takvih proteina iz ćelija. Pojedine signalne sekvence sekrecije se mogu nalaziti na krajevima proteina. U drugim slučajevima, signalne sekvence sekrecije mogu biti N-terminalne aminokiselinske sekvence. Ostale signalne sekvence sekrecije mogu sadržavati signal sekrecije iz Ig kapa lanaca. Takvi Ig kapa lanci mogu biti humani Ig kapa lanci. U pojedinim slučajevima, signalne sekvence sekrecije mogu sadržavati aminokiselinsku sekvencu MDMRVPAQLLGLLLLWFSGVLG (SEQ ID NO: 257).
[0100] U pojedinim primerima izvođenja, rekombinantni proteini predmetnog opisa mogu zahtevati istovremenu ekspresiju sa jednim ili sa više drugih proteina radi pravilne ekspresije, uvijanja, sekrecije, aktivnosti i/ili funkcije. Pojedini rekombinantni GPC predmetnog opisa mogu biti koeksprimirani sa LTBP proteinima, fibrilinima i/ili GARP
[0101] U pojedinim slučajevima, rekombinantni proteini predmetnog opisa mogu biti obeleženi biotinom. Kao što se ovde upotrebljava, termin "biotinizacija" se odnosi na vezivanje jednog ili više biotinskih obeleživača. Takvi biotinski obeleživači mogu olakšati interakciju biotinizovanih rekombinantnih proteina sa površinama i/ili proteinima obloženim avidinom i/ili streptavidinom. Kao što se ovde upotrebljava, "biotinski obeleživač" se odnosi na obeleživača koji se može detektovati i koji sadrži jedan ili više molekula biotina. Termin "biotinizovan" se odnosi na molekul ili protein koji sadrži jedan ili više biotinskih obeleživača. Molekuli biotina se vezuju za molekule avidina i streptavidina sa visokim afinitetom. Ovo svojstvo može biti upotrebljeno za hvatanje biotinizovanih proteina, upotrebom materijala obloženih avidinom i/ili stretavidinom. Pojedini rekombinantni GPC predmetnog opisa mogu biti biotinizovani blizu N-kraja. Takvi rekombinantni GPC mogu biti uvedeni na površine ćelija u kulturi koje su prevučene avidinom/streptavidinom, omogućavajući time biotinizovanim rekombinantnim GPC da adheriraju za površinu, a tako da orijentacija i vezivanje takvih vezanih GPC oponaša orijentaciju i vezivanje GPC za LTBP, fibriline i/ili GARP.
[0102] U pojedinim slučajevima, proizvedeni rekombinantni proteini mogu biti analizirani u svrhu kontrole kvaliteta, da bi se ispitale kako biofizičke osobine, tako i bioaktivna svojstva. Biofizička karakterizacija može obuhvatati ispitivanje obrasca migracije proteina nakon redukujućeg i/ili ne redukujućeg SDS PAGE. Biofizička karakterizacija može takođe obuhvatati filtraciju na gelu, masenu spektrometrijsku analizu i/ili analizu udruživanja/disocijacije između LAP ili domena sličnih LAP i domena faktora rasta. Bioaktivne osobine mogu biti analizirane ispitivanjem reaktivnosti sa antitelima i/ili signalne aktivnosti disosovanih faktora rasta i/ili latentnih GPC.
[0103] Pojedini proizvedeni proteini mogu sadržavati dodatne aminokiseline koje kodiraju jedan ili više obeleživača koji se mogu detektovati, radi prečišćavanja [npr. polihistidinski tag, oktapeptidni tag itd.] U pojedinim slučajevima, proteini su obeleženi na N-kraju. U pojedinim slučajevima, proteini su obeleženi na C-kraju. U pojedinim slučajevima, proteini se obeleženi biotinom. U pojedinim primerima izvođenja, rekombinantni proteini predmetnog opisa su obeleženi biotinom na N-kraju.
[0104] Proizvedeni proteini mogu sadržavati dodatne aminokiseline koje kodiraju jedno ili više mesta cepanja sa 3C proteazom. Takva mesta omogućavaju cepanje između ostataka Q i G u 3C proteaznom mestu cepanja nakon tretmana sa 3C proteazom, uključujući, ali ne ograničavajući se na, rinovirusnu 3C proteazu. U pojedinim slučajevima, takva mesta cepanja se uvode da bi se omogućilo uklanjanje obeleživača koji se mogu detektovati iz rekombinantnih proteina.
[0105] U pojedinim slučajevima, modifikacija eksprimiranih proproteina faktora rasta se može sprovoditi enzimskim cepanjem. U pojedinim slučajevima, mogu biti upotrebljene proproteinske konvertaze. Takve proproteinske konvertaze mogu obuhvatati, ali nisu ograničene na, furin/PACE3, PC1/3, PC2, PC4, PC5/6, PACE4 i PC7. Cepanje proproteinskim konvertazama se može sprovoditi u rastvoru ili u kulturi tkiva. U pojedinim slučajevima, proproteinske konvertaze se eksprimiraju u ćelijama koje eksprimiraju proproteine koje je potrebno podvrgnuti cepaju. U pojedinim slučajevima, proproteinske konvertaze se dodaju u tkivne kulture ćelija koje eksprimiraju proproteine koje je potrebno podvrgnuti cepaju.
Antitela
[0106] Jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska sadrže antitela ili njihove fragmente. Kao što se ovde upotrebljava, termin "antitelo" se u najširem smislu odnosi i specifično obuhvata razne primere izvođenja, uključujući, ali se ne ograničavajući na, monoklonska antitela, poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela obrazovana od najmanje dva intaktna antitela), kao i fragmente antitela poput dimernih antitela, sve dok ona ispoljavaju željenu biološku aktivnost. Antitela su primarno molekuli na bazi aminokiselina, ali mogu sadržavati i jednu ili više modifikacija (uključujući, ali ne ograničavajući se na, dodavanje šećernih ostataka, fluorescentnih grupa, hemijskih oznaka itd.)
Upotreba rekombinantnih i himernih proteina u generisanju antitela
[0107] U pojedinim slučajevima, rekombinantni i/ili himerni proteini koji su ovde opisani, mogu biti upotrebljeni kao antigeni (ovde označeni kao antigeni proteini) za generisanje antitela. Takvi antigeni proteini mogu sadržavati epitope koji mogu biti manje dostupni pri generisanju antitela sa sličnim proteinima divljeg tipa. Pojedina antitela usmerena na antigene proteine predmetnog opisa, mogu modulisati oslobađanje jednog ili više faktora rasta iz jednog ili više GPC.) Pojedina takva antitela mogu biti stabilišuća [mogu smanjivati ili sprečavati disocijaciju između dva agensa, (npr. oslobađanje faktora rasta iz GPC, oslobađanje GPC iz jedne ili više proteinskih interakcija)] i/ili oslobađajuća antitela [mogu pojačavati disocijaciju između dva agensa (npr. oslobađanje faktora rasta iz GPC, oslobađanje GPC iz jedne ili više interakcija proteina)]. Antigeni proteini predmetnog opisa mogu sadržavati proteine srodne TGF-β, kao i njihove komponente i/ili proteinske module. U pojedinim slučajevima, antigeni proteini predmetnog opisa mogu sadržavati prodomene bez udruženih faktora rasta, mutante sa deficijencijom u cepanju furinom, mutante sa deficijencijom udruživanja sa vanćelijskim proteinima i/ili njihove kombinacije.
[0108] U pojedinim slučajevima, antigeni proteini mogu sadržavati proteine srodne TGF-β i/ili njihove module. Takvi antigeni proteini mogu sadržavati epitope iz regiona gde se faktori rasta povezuju sa ili čine stereološki blizak region sa prodomenskim regionima. Antitela predmetnog pronalaska usmerena na takve epitope se mogu vezivati za preklapajuće regione između faktora rasta i prodomena. Takva antitela mogu stereološki inhibirati disocijaciju faktora rasta iz GPC.
[0109] U pojedinim slučajevima, antigeni proteini sadrže samo prodomen ili samo faktor rasta iz određenog GPC. Epitopi prisutni na takvim antigenim proteinima mogu biti prepokriveni ili neeksponirani u netaknutim GPC. Pojedina antitela predmetnog pronalaska mogu biti usmerena na takve epitope. Takva antitela mogu biti oslovađajuća antitela koja pospešuju disocijaciju faktora rasta iz GPC. Dalja antitela mogu biti u kompeticiji sa slobodnim faktorom rasta u vezivanju za prodomene, čime se pospešuja disocijacija faktora rasta iz GPC.
[0110] U pojedinim slučajevima, antigeni proteini mogu sadržavati mutacije u mestu cepanja proproteinskom konvertazom (npr. furinom). Takve mutacije mogu sprečiti enzimsko cepanje faktora rasta i izdvajanje njihovih prodomena. Pojedina antitela predmetnog pronalaska mogu biti usmerena na epitope prisutne na takvim mutiranim proteinima. Takva antitela mogu stabilizovati vezu između prodomena i faktora rasta. U pojedinim slučajevima, mutanti na mestu cepanja furinom obuhvataju D2G mutante, kao što je ovde opisano.
[0111] U pojedinim slučajevima, antigeni proteini koji sadrže prodomene mogu sadržavati N-terminalne mutacije koje dovode do smanjenog udruživanja prodomena sa LTBP i/ili GARP i stoga mogu predstavljati epitope u N-terminalnom regionu koji bi takvim udruživanjem bili prepokriveni. Pojedina antitela predmetnog pronalaska mogu biti usmerena na takve epitope. Pojedini antigeni proteini koji sadrže TGF-β1 prodomene mogu sadržavati C4S mutacije. Takve mutacije mogu sprečiti udruživanje antigenih proteina sa LTBP i/ili GARP, čineći ove proteine korisnim za prezentovanje N-terminalnih epitopa. Antitela usmerena na C4S mutante mogu sprečiti udruživanje GPC sa LTBP i/ili GARP. Pojedina antitela usmerena na C4S mutante mogu smanjiti signalizaciju faktora rasta u određenoj niši. Pojedina takva antitela mogu smanjiti ili sprečiti oslobađanje faktora rasta, blokiranjem sposobnosti GPC da se sa sigurnošću udruže sa vanćelijskim matriksom.
[0112] U pojedinim slučajevima, antigeni proteini mogu sadržavati jedan ili više rekombinantnih LTBP. Takvi rekombinantni LTBP mogu sadržavati LTBP1, LTBP2, LTBP3, LTBP4, alternativno obrađene varijante i/ili njihove fragmente. Rekombinantni LTBP mogu takođe biti modifikovani tako da sadrže jedan ili više obeleživača koji se mogu detektovati. Takvi obeleživači koji se mogu detektovati mogu obuhvatati, ali nisu ograničene na, biotinske obeleživače, polihistidinske tagove, myc tagove, HA tagove i/ili fluorescentne tagove.
[0113] U pojedinim slučajevima, antigeni proteini mogu sadržavati jedan ili više rekombinantnih proteina i/ili himernih proteina u kompleksu sa jednim ili sa više rekombinantnih LTBP. Pojedini antigeni proteini mogu sadržavati mutante mesta cepanja proproteinskim konvertazama (npr. D2G mutante, AXXA mutante) u kompleksu sa jednim ili sa više rekombinantnih LTBP. Pojedini takvi rekombinantni LTBP mogu sadržavati LTBP1S. Pojedini rekombinantni LTBP mogu sadržavati jedan ili više obeleživača koji se mogu detektovati, uključujući, ali ne ograničavajući se na, biotinske obeleživače, polihistidinske tagove i/ili oktapeptidne tagove.
[0114] U pojedinim slučajevima, antigeni proteini mogu sadržavati GARP (ili njegove homologe, uključujući, ali ne ograničavajući se na, LRRC33). Takav GARP može biti rekombinantan i ovde je označen kao rekombinantan GARP. Pojedini rekombinantni GARP mogu sadržavati jednu ili više modifikacija, skraćivanja i/ili mutacija u poređenju sa GARP divljeg tipa. Rekombinantni GARP mogu biti modifikovani tako da budu solubilni. U drugim slučajevima, rekombinantni GARP se modifikuju tako da sadrže jedan ili više obeleživača koji se mogu detektovati. U daljim slučajevima, takvi obeleživači koji se mogu detektovati mogu obuhvatati, ali nisu ograničeni na, biotinske obeleživače, polihistidinske tagove, oktapeptidne tagove, myc tagove, HA tagove i/ili fluorescentne tagove. U pojedinim slučajevima, antigeni proteini mogu sadržavati jedan ili više rekombinantnih proteina i/ili himernih proteina u kompleksu sa jednim ili sa više rekombinantnih GARP. U pojedinim slučajevima, antigeni proteini sadrže LAP (npr. TGF-β LAP) i/ili domene slične LAP domenima, u kompleksu sa rekombinantnim GARP. U pojedinim slučajevima, antigeni proteini sadrže D2G mutante (npr. TGF-β D2G mutante) u kompleksu sa rekombinantnim GARP. U pojedinim slučajevima, rekombinantni GARP iz kompleksa mogu biti solubilni oblici GARP (sGARP). U pojedinim slučajevima, sGARP sadrže jedan ili više biotinskih obeleživača, polihistidinskih tagova i/ili oktapeptidnih tagova.
[0115] U pojedinim slučajevima, GARP u kompleksu sa LAP i/ili domenima sličnim LAP domenima su poželjni kao antigeni, u testovima i/ili za razvoj antitela. U takvim slučajevima, LAP i/ili domeni slični LAP mogu sadržavati CED mutacije. Takvi LAP i/ili domeni slični LAP mogu biti eksprimirani kao GPC da bi se olakšali pravilno uvijanje proteina, konformacija i/ili ekspresija, ali prisutne CED mutacije mogu pojačati oslobađanje faktora rasta, ostavljajući nakon toga željeni GARP-LAP (ili domen sličan LAP) kompleks. Kompleksi GARP-LAP (ili domena sličnog LAP) mogu biti korisni kao antigeni u proizvodnji oslobađajućih antitela koja specifično deluju na GPC udružene sa GARP.
[0116] U pojedinim slučajevima, GPC koji sadrže CED mutacije mogu delovati tako da stabilizuju izvorno zauzete konformacije LAP (ili domena sličnog LAP) koje karakteriše smanjeno udruživanje sa faktorom rasta (kako slobodnih LAP ili domena sličnih LAP tako i/ili GARP i/ili LTBP/LAP kompleksa), čime se izlažu epitopi koji mogu inače u proteinima divljeg tipa biti manje izloženi. Takve mutacije mogu dovesti do pomeraja u konformacionoj ravnoteži LAP ili domena sličnih LAP da bi se olakšala proizvodnja aktivirajućih antitela.
[0117] U pojedinim slučajevima, ovde opisani rekombinantni proteini (uključujući, ali ne ograničavajući se na, himerne proteine) mogu biti upotrebljeni u studijama za identifikovanje i mapiranje epitopa koji mogu biti važna mesta ciljnog delovanja za razvoj antitela. Takve studije mogu biti upotrebljene za identifikovanje epitopa koji mogu podstaći oslobađanje faktora rasta ili stabilizaciju GPC nakon vezivanja antitela.
Oslobađajuća antitela
[0118] Kao što se ovde upotrebljava, termin "oslobađajuće antitelo" se odnosi na antitelo koje povećava odnos aktivnog i/ili slobodnog faktora rasta u odnosu na neaktivan i/ili faktor rasta za koji je vezan prodomen, nakon uvođenja antitela u GPC, ćeliju, nišu, prirodni depo ili bilo koje drugo mesto sekvestracije faktora rasta. U tom kontekstu, oslobađajuća antitela mogu biti okarakterisana kao agonisti. Kao što se ovde upotrebljava, izraz "prirodni depo" se odnosi na mesto unutar ćelije, tkiva ili organa gde se čuvaju povećani nivoi biomolekula ili jona. Na primer, vanćelijski matriks može delovati kao prirodno depo za jedan ili više faktora rasta.
[0119] Kontakt koji je neophodan za oslobađanje faktora rasta se može definisati kao direktan ili indirektan kontakt antitela sa GPC ili njegovom komponentom ili sa ćelijskom strukturom kao što je protein vanćelijskog i/ili ćelijskog matriksa i/ili protein povezan sa vanćelijskim i/ili ćelijskim matriksom [npr. LTBP (npr. LTBP1, LTBP2, LTBP3 i/ili LTBP4), fibrilini (npr. fibrillin-1, fibrilin-2, fibrilin-3 i/ili fibrilin-4,) perlekan, dekorin, elastin, kolagen i/ili GARP (npr. GARP i/ili LRRC33)] radi oslobađanja faktora rasta. Oslobađanje faktora rasta od najmanje 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili više je dovoljno da se antitela predmetnog pronalaska okarakterišu kao oslobađajuća antitela. Podrazumeva se da oslobađanje faktora rasta nakon primene antitela može biti lokalno i da se može odvijati tokom dužeg vremenskog perioda, kao i da može uključivati pikove ili skokove otpuštanja. Antitela predmetnog pronalaska mogu delovati tako da oslobađaju jedan ili više faktora rasta tokom vremenskog perioda u minutima, satima, danima ili duže.
[0120] Profili oslobađanja mogu biti sa početnim maksimumom ili serijom maksimuma unutar od oko 4 sata do oko 7 dana od kontakta in vivo ili kraćih perioda in vitro. Na primer, početni maksimum ili serija maksimuma se mogu javiti od oko 4 sata do oko 5 sati, ili od oko 4 sata do oko 6 sati, ili od oko 4 sata do oko 7 sati, ili od oko 4 sata do oko 8 sati, ili od oko 4 sata do oko 9 sati, ili od oko 4 sata do oko 10 sati, ili od oko 4 sata do oko 11 sati, ili od oko 4 sata do oko 12 sati, ili od oko 4 sata do oko 24 sata, ili od oko 4 sata do oko 36 sati, ili od oko 4 sata do oko 48 sati, ili od oko 1 dana do oko 7 dana, ili od oko 1 dana do oko 2 dana, ili od oko 1 dana do oko 3 dana, ili od oko 1 dan do oko 4 dana, ili od oko 4 dana do oko 5 dana, ili od oko 4 dana do oko 6 dana, ili od oko 4 dana do oko 7 dana. Jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu stimulisati oslobađanje prisutnog faktora rasta od 5 do 100%. Na primer, procenat oslobađanja faktora rasta može biti od oko 5% do oko 10%, ili od oko 5% do oko 15%, ili od oko 5% do oko 20%, ili od oko 5% do oko 25%, ili od oko 10% do oko 30%, ili od oko 10% do oko 40%, ili od oko 10% do oko 50%, ili od oko 10% do oko 60%, ili od oko 20% do oko 70%, ili od oko 20% do oko 80%, ili od oko 40% do oko 90%, ili od oko 40% do oko 100%.
[0121] Oslobađajuća antitela generisana u skladu sa postupcima koji su ovde opisani, mogu biti generisana tako da oslobađaju faktore rasta iz GPC koji sadrže bilo koji od pro-proteina navedenih u Tabeli 1. U pojedinim slučajevima, oslobađajuća antitela su usmerena na GPC koji sadrže TGF-β izoforme i/ili jedan ili više modula takvih izoformi. U pojedinim slučajevima, oslobađajuća antitela su usmerena na GPC koji sadrže GDF i/ili jedan ili više modula iz GDF.
Stabilišuća antitela
[0122] Kao što se ovde upotrebljava, termin "stabilišuće antitelo" se odnosi na antitelo koje smanjuje odnos aktivnog i/ili slobodnog faktora rasta u odnosu na neaktivan i/ili faktor rasta povezan sa prodomenom, nakon uvođenja antitela u jedan ili više GPC, ćelija, niša, prirodnih depoa i/ili bilo kog drugog mesta sekvestracije faktora rasta. U ovom kontekstu, antitela mogu biti okarakterisana kao antagonisti. Kao što se ovde upotrebljava, "antagonista" je onaj koji ometa ili inhibira fiziološko delovanje drugog. Rezultat antagonističkog dejstva može čak biti stimulacija ili aktivacija nishodne signalizacije i stoga može delovati agonistički u odnosu na drugi put, odvojen od onog koji je antagonizovan. Putevi su međusobno povezani, tako da bi, u jednom neograničavajućem primeru, TGF-β antagonista mogao da deluje kao BMP agonista i obrnuto. U kontekstu ćelijskih događaja, kako se ovde upotrebljava, termin "nishodni" se odnosi na bilo koji signalni ili ćelijski događaj koji se dešava nakon delovanja, vezivanja ili ciljanog dejstva jedinjenja i/ili kompozicija predmetnog pronalaska.
[0123] Kontakt neophodan za inhibiciju ili stabilizaciju, može biti direktan ili indirektan kontakt između antitela i GPC ili njegovih komponenti, ili sa ćelijskim strukturama poput proteina vanćelijskog i/ili ćelijskog matriksa i/ili proteina povezanih sa vanćelijskim i/ili ćelijskim matriksom [npr. LTBP (npr. LTBP1, LTBP2, LTBP3 i/ili LTBP4), fibrilina (npr. fibrillina-1, fibrilina-2, fibrilina-3 i/ili fibrilina-4,) perlekana, dekorina, elastina, kolagena i/ili GARP (npr. GARP i/ili LRRC33)] čime se inhibira oslobađanje faktora rasta. Inhibicija oslobađanja faktora rasta od najmanje 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili više može biti dovoljna, u pojedinim slučajevima, da se okarakterišu antitela predmetnog pronalaska kao inhibitorna ili stabilišuća. Inhibitorna antitela mogu stabilizovati GPC i zarobiti ih u vidu heterodimera.
[0124] Podrazumeva se da inhibicija oslobađanja faktora rasta nakon kontakta sa jednim ili sa više antitela predmetnog pronalaska može biti lokalna i da se može odvijati tokom dužeg vremenskog perioda, kao i da može uključivati maksimume, padove i skokove. Inhibitorna antitela koja mogu funkcionisati i u stabilizaciji GPC, mogu biti definisana njihovim kinetikama oslobađanja. Oslobađanje faktora rasta i odgovarajuće kinetike oslobađanja, čak i lokalno, mogu biti direktno izmerene ili se o njima može zaključiti na osnovu nishodnih signalnih događaja. U pojedinim primerima izvođenja, promene u koncentracijama proteina ili nukleinskih kiselina ili fenotipskim odgovorima mogu biti indikativni za efekte jedinjenja i/ili kompozicija predmetnog pronalaska.
[0125] Antitela predmetnog pronalaska mogu delovati tako što inhibiraju oslobađanje faktora rasta tokom vremenskog perioda trajanja u minutima, satima ili danima. Profili inhibicije i/ili stabilizacije mogu biti sa početnim nižim nivoom unutar perioda od oko 4 sata do oko 7 dana od uvođenja in vivo, ili kraćih perioda in vitro. Na primer, početni pad inhibicije ili stabilizacije se može odvijati od oko 4 sata do oko 5 sati, ili od oko 4 sata do oko 6 sati, ili od oko 4 sata do oko 7 sati, ili od oko 4 sata do oko 8 sati, ili od oko 4 sata do oko 9 sati, ili od oko 4 sata do oko 10 sati, ili od oko 4 sata do oko 11 sati, ili od oko 4 sata do oko 12 sati, ili od oko 4 sata do oko 24 sata, ili od oko 4 sata do oko 36 sati, ili od oko 4 sata do oko 48 sati, ili od oko 1 dana do oko 7 dana, ili od oko 1 dana do oko 2 dana, ili od oko 1 dana do oko 3 dana, ili od oko 1 dana do oko 4 dana, ili od oko 4 dana do oko 5 dana, ili od oko 4 dana do oko 6 dana, ili od oko 4 dana do oko 7 dana. Uvođenje jedinjenja i/ili kompozicija predmetnog pronalaska može dovesti do inhibicije i/ili stabilizacije prisutnog faktora rasta za od 5% do 100%. Na primer, procenat inhibicije ili stabilizacije faktora rasta može biti od oko 5% do oko 10%, od oko 5% do oko 15%, od oko 5% do oko 20%, od oko 5% do oko 25%, od oko 10% do oko 30%, od oko 10% do oko 40%, od oko 10% do oko 50%, od oko 10% do oko 60%, od oko 20% do oko 70%, od oko 20% do oko 80%, od oko 40% do oko 90% ili od oko 40% do oko 100%.
[0126] Stabilišuća antitela generisana prema postupcima koji su ovde opisani, mogu biti generisana za blokiranje oslobađanja faktora rasta iz GPC koji sadrže bilo koji od pro-proteina navedenih u Tabeli 1.
Takva antitela mogu fizički interagovati sa mestima cepanja GPC proteazama i/ili mogu blokirati interakciju proteolitičkih enzimi koji mogu ciljano delovati na takva mesta cepanja. U pojedinim slučajevima, stabilišuća antitela su usmerena na GPC koji sadrže TGF-β izoforme i/ili jedan ili više modula takvih izoformi. U pojedinim slučajevima, stabilišuća antitela su usmerena na GPC koji sadrže GDF i/ili jedan ili više modula iz GDF.
[0127] Stabilišuća antitela usmerena na GPC koji sadrže GDF-8, mogu blokirati cepanje takvih komplekasa metaloproteinazama. Takvi agensi se mogu vezivati za GPC koji sadrže GDF-8 na takav način da se fizički spreči interakcija između takvih GPC i metaloproteinaza koje ciljano deluju na takav GPC. Agensi koji zapravo sami po sebi ciljano deluju na metaloproteinaze su prethodno opisani (pogledati Američki patent br. US 7,572,599)
Selekcija antitela
[0128] Željeno antitelo može biti odabrano iz većeg skupa dva ili više antitela-kandidata, na osnovu sposobnosti željenog antitela da se povezuje sa željenim antigenima i/ili epitopima. Takvi antigeni i/ili epitopi mogu obuhvatati, ali nisu ograničeni na bilo koji od onih koji su ovde opisani, uključujući, ali ne ograničavajući se na, rekombinantne proteine, himerne proteine, GPC, prodomene (npr. LAP ili domene slične LAP), faktore rasta, proteinske module, LTBP, fibriline, GARP, proteine srodne TGF-β i/ili mutante i/ili varijante i/ili komplekse i/ili njihove kombinacije. Odabir željenih antitela se može izvršiti upotrebom testa za ispitivanje vezivanja antitela, kao što je test zasnovan na površinskoj plazmonskoj rezonanciji, imunosorbentni test povezan sa enzimima (ELISA) ili test zasnovan na sortiranju ćelija povezanom sa fluorescencijom (FACS). Takvi testovi mogu koristiti željeni antigen za vezivanje željenog antitela, a zatim upotrebljavati jedan ili više postupaka detekcije za detektovanje vezivanja.
[0129] U pojedinim primerima izvođenja, antitela predmetnog pronalaska mogu biti izabrana iz većeg skupa od dva ili više antitela-kandidata, na osnovu njihove sposobnosti da se povežu sa željenim antigenima i/ili epitopima iz više vrsta (ovde je postupak označen kao „pozitivna selekcija“).
[0130] U pojedinim primerima izvođenja, takve vrste mogu obuhvatati vrste kičmenjaka. U pojedinim primerima izvođenja, takve vrste mogu obuhvatati sisarske vrste. U pojedinim primerima izvođenja, takve vrste mogu obuhvatati, ali nisu ograničene na, miševe, pacove, zečeve, koze, ovce, svinje, konje, krave i/ili ljude.
[0131] U pojedinim primerima izvođenja, za uklanjanje antitela iz većeg skupa od dva ili više antitelakandidata upotrebljava se negativna selekcija. Kao što se ovde upotrebljava, izraz "negativna selekcija" se odnosi na uklanjanje jednog ili više faktora iz grupe, na osnovu njihove sposobnosti da se vezuju za jedan ili za više neželjenih antigena i/ili epitopa. U pojedinim primerima izvođenja, neželjeni antigeni i/ili epitopi mogu obuhvatati, ali nisu ograničeni na bilo koji od onih koji su ovde opisani, uključujući, ali ne ograničavajući se na, rekombinantne proteine, himerne proteine, GPC, prodomene (npr. LAP ili domene slične LAP), faktore rasta, proteinske module, LTBP, fibriline, GARP, proteine srodne TGF-β i/ili mutante i/ili njihove varijante i/ili njihove kombinacije i/ili komplekse.
[0132] U pojedinim primerima izvođenja, antitela predmetnog pronalaska mogu biti usmerena na prodomene (npr. prodomenski deo GPC i/ili slobodne LAP ili domene slične LAP) koji smanjuju signalizaciju faktora rasta i/ili nivoe (npr. signalizaciju i/ili nivoe TGF-β1 faktora rasta) u datoj niši. U pojedinim primerima izvođenja, antitela predmetnog pronalaska mogu biti usmerena na LAP ili domene slične LAP, a što povećava signalizaciju i/ili nivoe faktora rasta u datoj niši. U pojedinim primerima izvođenja, antitela predmetnog pronalaska mogu biti usmerena na prodomene (npr. LAP ili domene slične LAP domenima) i/ili GPC samo kada su u kompleksu sa LTBP, fibrilinima i/ili GARP
[0133] U pojedinim primerima izvođenja, antitela predmetnog pronalaska mogu biti odabrana iz većeg skupa od dva ili više antitela-kandidata na osnovu njihove sposobnosti da modulišu nivoe i/ili aktivnost faktora rasta. U pojedinim slučajevima, testovi aktivnosti faktora rasta mogu biti upotrebljeni za ispitivanje sposobnosti antitela-kandidata da modulišu aktivnost faktora rasta. Analize aktivnosti faktora rasta mogu obuhvatati testove zasnovane na ćelijama, poput onih opisanih u nastavku teksta. Dodatni testovi koji mogu biti upotrebljeni za određivanje efekta antitela-kandidata na aktivnost faktora rasta mogu obuhvatati, ali nisu ograničeni na, imunsorbentni test povezan sa enzimom (ELISA), imunoblot postupak, reporterske testove (npr. reporterske testove zasnovane na luciferazi i druge reporterske testove zasnovane na enzimima), PCR analizu, RT-PCR analizu i/ili druge postupke poznate u oblasti tehnike, uključujući i bilo koji od postupaka koji je opisan u privremenoj U.S. patentnoj prijavi br. 61/722,919, podnetoj 6. novembra 2012. godine, kao i 61/722,969, podnetoj 6. novembra 2012. godine.
[0134] U pojedinim primerima izvođenja, jedan ili više rekombinantnih proteina ili antitela koji su ovde opisani, mogu biti upotrebljeni u testovima za ispitivanje, razvoj i/ili odabir antitela. Rekombinantni GPC mogu biti eksprimirani da bi se ispitale oslobađajuće ili stabilišuće sposobnosti antitela koja se analiziraju. U pojedinim primerima izvođenja, rekombinantni proteini mogu biti eksprimirani kao pozitivne ili negativne kontrolne komponente testova. U pojedinim primerima izvođenja, višestruki rekombinantni proteini mogu biti eksprimirani odjednom da bi se modulisali oslobađanje i/ili aktivnost faktora rasta, pri čemu takvi rekombinantni proteini mogu u takvoj modulaciji delovati sinergistički ili antagonistički.
[0135] U pojedinim primerima izvođenja, GPC koji sadrže CED mutacije mogu obezbediti osnovni nivo aktivnosti faktora rasta u testovima dizajniranim za ispitivanje oslobađajućih antitela, pošto su ovakvi mutirani proteini dovoljni za proizvodnju biološkog efekta kod ljudi. U pojedinim primerima izvođenja, GPC koji sadrže CED mutacije mogu biti upotrebljeni kao pozitivne kontrole u testovima aktivnosti usmerenim na skrining oslobađajućih antitela. U pojedinim primerima izvođenja, GPC koji sadrže CED mutacije mogu biti upotrebljeni za skrining stabilišuće aktivnosti antitela, pošto se pretpostavlja da mogu biti aktivirani u odsustvu integrina. U takvim testovima, GPC koji sadrže CED mutacije mogu biti eksprimirani u ćelijskim linijama (npr. 293 ćelijama ili drugim), a aktivnost i/ili oslobađanje faktora rasta mogu biti utvrđeni u prisustvu ili odsustvu antitela koja se ispituju. U pojedinim primerima izvođenja, koekspresija GPC koji sadrže CED mutaciju sa GPC divljeg tipa (uključujući, ali ne ograničavajući se na, TGF-β1, TGF-β2 ili TGF-β3) takođe može biti upotrebljena za regulisanje nivoa slobodnog faktora rasta. U takvim primerima izvođenja, modulacija nivoa slobodnog faktora rasta se može postići istovremenom transfekcijom sa GPC divljeg tipa i mutiranim GPC u različitim odnosima (npr. od 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:10). U pojedinim primerima izvođenja, dalja koekspresija LTBP, fibrilina ili GARP se može sprovoditi da bi se dodali jedan ili više dodatnih nivoa modulisanja slobodnog faktora rasta.
Razvoj antitela
[0136] U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska koje sadrže antitela, fragmente antitela, njihove varijante ili derivate, kao što je prethodno opisano, specifično su imunoreaktivni sa antigenim proteinima, kao što je ovde opisano.
[0137] Antitela predmetnog pronalaska mogu biti okarakterisana svojim ciljnim molekulima, antigenima koji su upotrebljeni za njihovo generisanje, njihovom funkcijom (bilo da su agonisti, antagonisti, oslobađajuća za faktor rasta, stabilišuća, aktivirajuća i/ili inhibirajuća za GPC) i/ili ćelijskom nišom u kojoj funkcionišu.
[0138] Kao što se ovde upotrebljava, termin "fragment antitela" se odnosi na bilo koji deo intaktnog antitela. U pojedinim primerima izvođenja, fragmenti antitela obuhvataju regione koji vezuju antigen iz intaktnih antitela. Primeri fragmenata antitela mogu obuhvatati, ali nisu ograničeni na Fab, Fab', F(ab')2i Fv fragmente; dijatela; linearna antitela; jednolančane molekule antitela; i multispecifična antitela obrazovana od fragmenata antitela. Papainskom digestijom antitela nastaju dva identična fragmenta koji vezuju antigen, označeni kao „Fab“ fragmenti, pri čemu je svaki od njih sa jednim mestom za vezivanje antigena. Takođe se proizvodi rezidualni "Fc" fragment, čije ime odražava njegovu sposobnost da lako kristališe. Tretman pepsinom dovodi do nastanka F(ab')2fragmenta koji sadrži dva mesta za vezivanje antigena i još uvek je sposoban da se umreži sa antigenom. Jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu sadržavati jedan ili više od ovih fragmenata. Za svrhe koje su ovde navedene, "antitelo" može sadržavati varijabilni domen teškog i lakog lanca, kao i Fc region.
[0139] Kao što se ovde upotrebljava, termin "nativno antitelo" se odnosi na obično heterotetramerni glikoprotein od oko 150000 daltona, sastavljen od dva identična laka (L) lanca i dva identična teška (H) lanca. Svaki laki lanac je povezan sa teškim lancem putem jedne kovalentne disulfidne veze, dok broj disulfidnih veza varira među teškim lancima u okviru različitih imunoglobulinskih izotipova. Svaki teški i laki lanac takođe sadrži pravilno raspoređene intralančane disulfidne mostove. Svaki teški lanac na jednom kraju sadrži varijabilni domen (VH), nakon koga sledi niz konstantnih domena. Svaki laki lanac sadrži varijabilni domen (VL) na jednom kraju i konstantni domen na njegovom drugom kraju; konstantni domen lakog lanca je poravnat sa prvim konstantnim domenom teškog lanca, dok je varijabilni domen lakog lanca poravnat sa varijabilnim domenom teškog lanca.
[0140] Kao što se ovde upotrebljava, termin "varijabilni domen" se odnosi na specifične domene antitela koji se bitno razlikuju u sekvenci među antitelima i koji se upotrebljavaju u vezivanju i specifičnosti svakog određenog antitela za njegov određeni antigen.
Kao što se ovde upotrebljava, termin "Fv" se odnosi na fragmente antitela koji sadrže kompletna mesta za prepoznavanje antigena i vezivanje antigena. Takvi regioni se sastoje od dimera varijabilnog domena jednog teškog lanca i jednog lakog lanca u čvrstoj, nekovalentnoj vezi.
[0141] Kao što se ovde upotrebljava, termin „laki lanac“ se odnosi na komponentu antitela iz bilo koje vrste kičmenjaka, koja se može razdvojiti na dva jasno različita tipa, označene kao kapa i lambda, na osnovu aminokiselinskih sekvenci konstantnih domena. U zavisnosti od aminokiselinske sekvence konstantnog domena njihovih teških lanaca, antitela mogu biti podeljena u različite klase. Postoji pet glavnih klasa intaktnih antitela: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a nekoliko njih se može dalje podeliti u potklase (izotipove), npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA i IgA2.
Kao što se ovde upotrebljava, termin "jednolančani Fv" ili "scFv" se odnosi na fuzioni protein od VHi VLdomena antitela, pri čemu su ti domeni zajedno povezani u jedan polipeptidni lanac. U pojedinim primerima izvođenja, Fv polipeptidni linker omogućava scFv da obrazuje željenu strukturu za vezivanje antigena.
[0142] Kao što se ovde upotrebljava, termin "bispecifično antitelo" se odnosi na antitelo koje je u stanju da se veže za dva različita antigena. Takva antitela obično sadrže regione iz najmanje dva različita antitela. Bispecifična antitela mogu obuhvatati bilo koja od onih opisanih u Riethmuller G.
2012. Cancer Immunity.12:12-18, Marvin J.S. i saradnici, 2005. Acta Pharmacologica Sinica.26(6):649-58 i Schaefer W. i saradnici, 2011. PNAS.108(27):11187-92.
[0143] Kao što se ovde upotrebljava, termin "dijatelo" se odnosi na mali fragment antitela sa dva mesta za vezivanje antigena. Dijatela sadrže varijabilni domen teškog lanca VHpovezan sa varijabilnim domenom lakog lanca VLu istom polipeptidnom lancu. Upotrebom linkera koji je previše kratak da bi omogućio uparivanje između dva domena u istom lancu, domeni se prisiljavaju da se uparuju sa komplementarnim domenima drugog lanca i da kreiraju dva mesta za vezivanje antigena. Dijatela su detaljnije opisana u, na primjer, EP 404,097; WO 93/11161; i Hollinger i saradnici (Hollinger P. i saradnici, "Diabodies": Small bivalent and bispecific antibody fragments. PNAS.1993.90:6444-8).
[0144] Kao što se ovde upotrebljava, termin "monoklonsko antitelo" se odnosi na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih ćelija (ili klonova), tj. pojedinačna antitela koja čine populaciju su identična i/ili vezuju isti epitop, osim mogućih varijanti koje mogu nastati tokom proizvodnje monoklonskih antitela, pri čemu su takve varijante uglavnom prisutne u minornim količinama. Za razliku od preparata poliklonskih antitela koji obično sadrže različita antitela, usmerena na različite determinante (epitope), svako monoklonsko antitelo je usmereno na jedinstvenu determinantu na antigenu
[0145] Modifikator "monoklonski" ukazuje na karakter antitela dobijenog iz suštinski homogene populacije antitela i ne treba ga tumačiti kao da zahteva proizvodnju antitela bilo kojim određenim postupkom. Monoklonska antitela ovde obuhvataju „himerna“ antitela (imunoglobuline) u kojima je deo teškog i/ili lakog lanca identičan ili homolog odgovarajućim sekvencama u antitelima koja su poreklom iz određene vrste ili koja pripadaju određenoj klasi ili potklasi antitela, dok je ostatak lanca(lanaca) identičan ili homolog odgovarajućim sekvencama u antitelima poreklom iz druge vrste ili koja pripadaju drugoj klasi ili potklasi antitela, kao i fragmente takvih antitela.
[0146] Kao što se ovde upotrebljava, termin "humanizovano antitelo" se odnosi na himerno antitelo koje sadrži minimalni deo iz jednog ili više izvora antitela koja nisu humani (npr. mišja su), dok je ostatak poreklom iz jednog ili više humanih imunoglobulinskih izvora. Većim delom, humanizovana antitela su humani imunoglobulini (recipijentna antitela) u kojima se ostaci u okviru hipervarijabilnog regiona iz antitela primaoca zamenjuju ostacima iz hipervarijabilnog regiona antitela iz vrste koja nije čovek (donorskog antitela) kao što je npr. iz miša, pacova, zeca ili primata različitog od čoveka, a koje je sa željenom specifičnošću, afinitetom i/ili kapacitetom.
[0147] Kao što se ovde upotrebljava, termin "hipervarijabilni region" se odnosi na regione unutar domena koji vezuje antigen antitela koji sadrže aminokiselinske ostatke odgovorne za vezivanje antigena. Aminokiseline prisutne u hipervarijabilnim regionima određuju strukturu regiona koji određuje komplementarnost (CDR). Kao što se ovde upotrebljava, termin "CDR" se odnosi na regione antitela koja sadrže strukturu koja je komplementarna njegovom ciljnom antigenu ili epitopu.
[0148] U pojedinim slučajevima, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog opisa mogu biti mimetici antitela. Kao što se ovde upotrebljava, termin "mimetik antitela" se odnosi na bilo koji molekul koji oponaša funkciju ili efekat antitela i koji se specifično i sa velikim afinitetom vezuje za njihove ciljne molekule. U pojedinim slučajevima, mimetici antitela mogu biti monotela, dizajnirana tako da uključuju domen fibronektina tipa III (Fn3) kao proteinsku osnovu (US 6,673,901; US 6,348,584). U pojedinim slučajevima, mimetici antitela mogu biti oni koji su poznati u oblasti tehnike, uključujući, ali bez obraničavanja na, molekule afitela, afiline, afitine, antikaline, avimere, centirine, DARPINS™, finomere i Kunitz i domenske peptide. U drugim slučajevima, mimetici antitela mogu uključivati jedan ili više nepeptidnih regiona.
[0149] Kao što se ovde upotrebljava, termin "varijanta antitela" se odnosi na biomolekul koja podseća na antitelo po strukturi i/ili funkciji, ali koga karakterišu izvesne razlike u aminokiselinskoj sekvenci, sastavu ili strukturi u poređenju sa nativnim antitelom.
[0150] Priprema antitela, bilo da su ona monoklonska ili poliklonska, poznata je u oblasti tehnike. Tehnike za proizvodnju antitela su dobro poznate u stanju tehnike i opisane su, npr. u Harlow i Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Harlow i Lane, "Using Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999 i "Therapeutic Antibody Engineering: Current and Future Advances Driving the Strongest Growth Area in the Pharmaceutical Industry" Woodhead Publishing, 2012.
Standardno generisanje monoklonskih antitela
[0151] U pojedinim primerima izvođenja, antitela se generišu u nokaut miševima kojima nedostaje gen koji kodira željene ciljne antigene. Takvi miševi možda neće tolerisati ciljne antigene i stoga mogu biti pogodniji za generisanje antitela na takve antigene koji mogu unakrsno reagovati sa humanim i mišjim oblicima antigena. Za proizvodnju monoklonskih antitela, miševi domaćini mogu biti imunizovani sa rekombinantnim proteinima, da bi se indukovali limfociti koji se specifično vezuju za takve proteine. Dobijeni limfociti mogu zatim biti prikupljeni i fuzionisani sa imortalizovanim ćelijskim linijama. Dobijene hibridomske ćelije mogu biti kultivisane u pogodnom medijumu za kuluturu, uz upotrebu selekcionih agenasa koji podržavaju rast samo fuzionisanih ćelija.
[0152] Željene hibridomske ćelijske linije mogu biti identifikovane analizom specifičnosti vezivanja izlučanih antitela za ciljne peptide, a klonovi takvih ćelija mogu biti subklonirani procedurama ograničenog razblaživanja i dalje gajenja standardnim postupcima. Antitela proizvedena subkloniranim hibridomskim ćelijama, mogu biti izolovana i prečišćena iz medijuma kultura standardnim procedurama za prečišćavanja imunoglobulina
Rekombinantna antitela
[0153] Rekombinantna antitela predmetnog pronalaska mogu biti generisana u skladu sa bilo kojim postupkom koji je opisan u privremenoj U.S. patentnoj prijavi 61/722,919, podnetoj 6. novembra 2012. godine, kao i 61/722,969, podnetoj 6. novembra 2012. godine. U pojedinim primerima izvođenja, rekombinantna antitela se mogu proizvesti upotrebom hibridomskih ćelija proizvedenih u skladu sa ovde opisanim postupcima. Sekvence cDNK varijabilnog regiona teškog i lakog lanca antitela mogu biti utvrđene upotrebom standardnih biohemijskih tehnika. Ukupna RNK može biti ekstrahovana iz hibridomskih ćelija koje proizvode antitela i zatim prevedena u cDNK reverznom transkriptazom (RT) za lančane reakcije polimeraze (PCR). PCR amplifikacija se može vršiti na tako dobijenoj cDNK, da bi se umnožili geni varijabilnog regiona. Takva amplifikacija može podrazumevati upotrebu prajmera koji su specifični za amplifikaciju sekvenci teškog i lakog lanca. Rezultujući PCR proizvodi mogu zatim biti subklonirani u plazmide za analizu sekvence. Jednom sekvencirane, sekvence koje kodiraju antitela mogu biti ugrađene u ekspresione vektore. Za humanizaciju i zamenu homolognih mišjih sekvenci, mogu biti upotrebljene kodirajuće sekvence konstantnih domena humanog teškog i lakog lanca. Dobijeni konstrukti mogu zatim biti transfektovani u sisarske ćelije radi translacije u velikom obimu.
Razvoj citotoksičnih antitela
[0154] U pojedinim primerima izvođenja, antitela predmetnog pronalaska mogu biti u stanju da indukuju citotoksičnost posredovanu ćelijama koja je zavisna od antitela (ADCC), citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC) i/ili ćelijsku fagocitozu zavisnu od antitela (ADCP.) ADCC je imunski mehanizam u kome dolazi do lize ćelija usled napada imunskih ćelija. Takve imunske ćelije mogu uključivati CD56+ ćelije, CD3- ćelije prirodne ubice (NK), monocite i neutrofile (Strohl W.R. Therapeutic Antibody Engineering. Woodhead Publishing, Philadelphia PA.2012. Poglavlje 8, str.186)
[0155] U pojedinim slučajevima, antitela predmetnog pronalaska mogu biti konstruisana tako da sadrže dati izotip, u zavisnosti od toga da li je nakon vezivanja antitela poželjan ADCC ili ADCP ili ne. Takva antitela, na primer, mogu biti konstruisana u skladu sa bilo kojom od postupaka koji su opisani u Alderson K.L. i saradnici, J Biomed Biotechnol.2011.2011:379123.). U slučaju mišjih antitela, različiti izotipovi antitela su efektivniji u podsticanju ADCC. Na primer, IgG2a je efektivniji u indukovanju ADCC nego što je to IgG2b. Pojedina antitela predmetnog pronalaska koja sadrže mišja IgG2b antitela, mogu biti ponovno kontruisana tako da sadrže IgG2a antitela. Takva rekontruisana antitela mogu biti efektivnija u indukovanju ADCC nakon vezivanja antigena koji su povezani sa ćelijama.
[0156] U pojedinim primerima izvođenja, geni koji kodiraju varijabilne regione antitela razvijenih u skladu sa predmetnim pronalaskom, mogu biti klonirana u sisarske ekspresione vektore koji kodiraju humane Fc regione. Takvi Fc regioni mogu sadržavati Fc regione iz humanog IgG1κ. IgG1κ Fc regioni mogu sadržavati aminokiselinske mutacije za koje je poznato da pojačavaju vezivanje tipa Fc-receptor i citotoksičnost posredovanu ćelijama i zavisnu od antitela, ADCC.
[0157] U pojedinim slučajevima, antitela mogu biti konstruisana tako da se smanjuje ADCC. Antitela koja ne aktiviraju ADCC ili koja su povezana sa smanjenim nivoima ADCC, mogu biti poželjna u primerima izvođenja antitela predmetnog pronalaska, u pojedinim slučajevima, usled nedostatka ili ograničenog klirensa koji je posredovan imunitetom, što zapravo omogućava duži poluživot u cirkulaciji.
Tehnike skrininga biblioteka fragmenata antitela
[0158] U pojedinim primerima izvođenja, antitela predmetnog pronalaska mogu biti proizvedena i/ili optimizovana upotrebom postupaka opisa sa visokim obimom pregleda. Takvi postupci mogu uključivati bilo koju od tehnika prikazivanja (npr. tehnike skrininga biblioteka) koje su opisane u privremenoj U.S. patentnoj prijavi 61/722,919, podnetoj 6. novembra 2012. godine, kao i 61/722,969, podnetoj 6. novembra 2012. godine. U pojedinim primerima izvođenja, sintetska antitela mogu biti dizajnirana, selektovana i optimizovana skriningom sa ciljnim antigenima upotrebom tehnologija prikaza (npr. tehnologija prikazivanja u fagu.) Biblioteke prikaza u fagu mogu sadržavati od miliona do milijardi čestica faga, od kojih svaka eksprimira jedinstvene fragmente antitela na svojim virusnim omotačima. U pojedinim slučajevima, cDNK koja kodira svaki fragment može sadržavati istu sekvencu sa izuzetkom jedinstvenih sekvenci koje kodiraju varijabilne petlje regiona koji određuju komplementarnost (CDR). VHlanci CDR mogu biti eksprimirani kao fuzioni protein, povezan sa proteinima virusnog omotača (npr. sa N-krajem proteina virusnog omotača tipa pIII) VLlanci mogu biti eksprimirani odvojeno da bi se udružili sa VHlancima u periplazmi, pre ugradnje kompleksa u virusne omotače.
[0159] Za selekciju, ciljni antigeni mogu biti inkubirani, in vitro, sa fagnim česticama za prikazivanje u vidu biblioteke, u cilju taloženja pozitivnih partnera za vezivanje. Ovaj postupak se ovde označava kao „obogaćivanje faga“. U pojedinim slučajevima, obogaćivanje faga obuhvata obogaćivanje faga u čvrstoj fazi. U skladu sa takvim obogaćivanjem, ciljni antigeni su vezani za supstrat (npr. pasivnom adsorpcijom) i dovode se u kontakt sa jednim ili sa više rastvora koji sadrže čestice faga. Čestice faga sa afinitetom za takve ciljne antigene će se istaložiti iz rastvora. U pojedinim slučajevima, obogaćivanje faga obuhvata obogaćivanje faga u fazi rastvora, pri čemu su ciljni antigeni prisutni u rastvoru koji se kombinuje sa rastvorima faga. Prema takvim postupcima, ciljni antigeni mogu sadržavati obeleživače koji se mogu detektovati (npr. biotinske obeleživače) da bi se olakšalo preuzimanje iz rastvora i izdvajanje vezanog faga.
[0160] Nakon selekcije, cDNK koja kodira CDR precipitiranih članova biblioteke, mogu biti sekvencirane iz vezanog faga. Takve sekvence mogu biti direktno ugrađene u sekvence antitela za proizvodnju rekombinantnih antitela, ili mogu biti mutirane i upotrebljene za dalju optimizaciju putem in vitro afinitetnog sazrevanja.
[0161] U pojedinim slučajevima, skrining fagne biblioteke može biti upotrebljen za generisanje široko raznolikih panela antitela. Takva raznolikost može biti izmerena raznolikošću sekvenci antitela i/ili raznolikošću ciljnih epitopa.
Tehnike afinitetnog sazrevanja
[0162] Tehnike afinitetnog sazrevanja predmetnog opisa mogu obuhvatati bilo koju od tehnika opisanih u privremenoj U.S. patentnoj prijavi 61/722,919, podnetoj 6. novembra 2012. godine, kao i 61/722,969, podnetoj 6. novembra 2012. godine. Nakon identifikovanja fragmenata antitela koji su u stanju da vezuju ciljne antigene (npr. upotrebom fagnih biblioteka, kao što je prethodno opisano,) iz njih su se mogli izvesti mutanti visokog afiniteta putem procesa afinitetnog sazrevanja. Tehnologija sazrevanja afiniteta se upotrebljava za identifikovanje sekvenci koje kodiraju CDR sa najvećim afinitetom za ciljne antigene. Upotrebom takvih tehnologija, odabrane CDR sekvence (npr. one koje su bile izolovane ili proizvedene u skladu sa procesima koji su ovde opisani) mogu biti nasumično mutirati kao celokupni molekuli ili na određenim ostacima, da bi se stvorili milioni do milijardi varijanti. Takve varijante mogu dalje biti podvrgnute ponovljenim rundama skrininga afiniteta (npr. skriningom biblioteka prikaza) u odnosu na njihovu sposobnost da vezuju ciljne antigene. Takvi ponovljeni ciklusi selekcije, mutacije i ekspresije mogu biti sprovedeni da bi se identifikovale sekvence fragmenata antitela sa najvećim afinitetom za ciljne antigene. Takve sekvence mogu biti direktno ugrađene u sekvence antitela za proizvodnju rekombinantnih antitela.
Karakterizacija antitela
[0163] Jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska koji sadrže antitela, mogu delovati na smanjenje lokalne koncentracije jednog ili više GPC, uklanjanjem istih fagocitozom, pinocitozom ili inhibicijom udruživanja u vanćelijskom matriksu i/ili ćelijskom matriksu. Uvođenje jedinjenja i/ili kompozicija predmetnog pronalaska može dovesti do uklanjanja 5% do 100% faktora rasta koji je prisutan u datom području. Na primer, procenat uklanjanja faktora rasta može biti od oko 5% do oko 10%, od oko 5% do oko 15%, od oko 5% do oko 20%, od oko 5% do oko 25%, od oko 10 % do oko 30%, od oko 10% do oko 40%, od oko 10% do oko 50%, od oko 10% do oko 60%, od oko 20% do oko 70%, od oko 20% do oko 80%, od oko 40% do oko 90% ili od oko 40% do oko 100%.
[0164] Merenja oslobađanja, inhibicije ili uklanjanja jednog ili više faktora rasta mogu biti izvršena u odnosu na standard ili prirodno oslobađanje ili aktivnost faktora rasta, pod normalnim fiziološkim uslovima, in vitro ili in vivo. Merenja takođe mogu biti rađena u odnosu na prisustvo ili odsustvo antitela. Takvi postupci merenja nivoa, oslobađanja, inhibicije ili uklanjanja faktora rasta obuhvataju standardno merenje u tkivu i/ili tečnostima (npr. serumu ili krvi), postupcima kao što su imunoblot postupak, imunosorbentni test povezan sa enzimom (ELISA), testovi aktivnosti, reporterski testovi, luciferazni testovi, serijske lančane reakcije polimeraze (PCR), mikročipovi genske ekspresije, postupak revezne-transkripcije i PCR-a u realnom vremenu (RT) i slično.
[0165] Antitela predmetnog pronalaska se mogu vezivati ili interagovati sa bilo kojim brojem epitopa na ili duž GPC ili njihovih povezanih struktura, da bi se pojačala ili inhibirala signalizaciju faktora rasta. Takvi epitopi mogu obuhvatati bilo koja i sva moguća mesta za izmenu, pojačavanje ili inhibiranje funkcije GPC. U pojedinim primerima izvođenja, takvi epitopi obuhvataju, ali nisu ograničeni na, epitope na ili unutar faktora rasta, regulatornih elemenata, GPC, modulatornih faktora GPC, ćelija ili receptora koji primaju faktor rasta, LAP ili domena sličnih LAP, regiona pričvršćivača, furinskih mesta cepanja, regiona ručica, regiona sa prstićima, domena vezivanja LTBP, domena vezivanja fibrilina, domena vezivanja glikoproteina A sa preovladavajućim ponavljanjima (GARP), lasa latencije, alfa 1 regiona, RGD sekvenci, regiona tipa “leptir-mašne”, komponenti vanćelijskog matriksa i/ili ćelijskog matriksa i/ili epitopa obrazovanih kombinovanjem regiona ili delova bilo kojih od prethodno navedenih.
[0166] Jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska ispoljavaju svoje efekte vezivanjem (reverzibilno ili ireverzibilno) za jedan ili više epitopa i/ili regiona prepoznavanja antitela. Bez želje da bude vezano za teoriju, takva mesta vezivanja za antitela najčešće obrazuju proteini, proteinski domeni ili regioni. Mesta vezivanja mogu; međutim, uključivati biomolekule poput šećera, lipida, molekula nukleinskih kiselina ili bilo koji drugi oblik vezujućeg epitopa.
[0167] U pojedinim primerima izvođenja, antagonistička antitela predmetnog pronalaska se mogu vezivati za prodomene TGF-β, stabilišući i sprečavajući oslobađanje posredovano integrinom, na primer, blokiranjem RGD mesta ili stabilizacijom strukture. Takva antitela bi bila korisna u lečenju Kamurati-Engelmanove bolesti, u kojoj mutacije u prodomenu prouzrokuju prekomernu aktivaciju TGF-β. Takva antitela bi takođe bila korisna kod Marfanovog sindroma, u kome mutacije u fibrilinima ili LTBP menjaju aktivaciju TGF-β i BMP.
[0168] U pojedinim primerima izvođenja, antitela predmetnog pronalaska selektivno inhibiraju oslobađanje TGF-β iz GPC udruženih sa LTBP, ali ne i onih udruženih sa GARP. Takva antitela funkcionišu kao antifibrotski terapeutici, ali ispoljavaju i minimalne inflamatorne efekte. U pojedinim primerima izvođenja, antitela koja vezuju GPC-LTBP kompleks se ne vezuju za GPC-GARP komplekse. U pojedinim primerima izvođenja, takva antitela možda nisu specifična za određeni LTBP ili GPC, ali se mogu vezati za GPC u blizini ili preklapanjem sa mestima vezivanja GARP, tako da vezivanje ometa GARP, ali ne i LTBP. U pojedinim primerima izvođenja obezbeđena su antitela koja selektivno vezuju jedan ili više kombinatornih epitopa između GARP i proTGF-β. U pojedinim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, obezbeđena su jedinjenja i/ili kompozicije koji indukuju oslobađanje TGF-β iz GARP-proTGF-β kompleksa. Takva antitela mogu biti izabrana zbog njihove sposobnosti da se vezuju za binarne komplekse GARP prodomena, ali ne i za GARP-proTGF-β ternarne komplekse, sam GARP ili same prodomene.
[0169] Alternativno ili dodatno, antitela predmetnog pronalaska mogu funkcionisati kao mimetici liganda koji bi indukovali internalizaciju GPC. Takva antitela mogu delovati kao netradicionalni nosači korisnog tereta, delujući tako što isporučuju i/ili prevoze vezane ili konjugovane lekovite terete do određenih mesta specifičnih za GPC i/ili proteine srodne GPC.
[0170] Rezultat promena izazvanih antitelima predmetnog pronalaska mogu biti neomorfne promene u ćeliji. Kao što se ovde upotrebljava, termin "neomorfna promena" se odnosi na promenu ili izmenu koja je nova ili drugačija. Na primer, antitelo koje izaziva oslobađanje ili stabilizaciju jednog ili više faktora rasta koji obično nije udružen sa određenim GPC na koje antitelo ciljano deluje, bilo bi neomorfno antitelo, a oslobađanje bi bila neomorfna promena.
[0171] U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu delovati tako da menjaju i/ili kontrolišu proteolitičke događaje. U pojedinim primerima izvođenja, takvi proteolitički događaji mogu biti unutarćelijski ili vanćelijski. U pojedinim primerima izvođenja, takvi proteolitički događaji mogu uključivati izmenu furinskog cepanja i/ili druge događaje proteolitičke obrade. U pojedinim primerima izvođenja, takvi proteolitički događaji mogu obuhvatati proteolitičku obradu signalnih molekula faktora rasta ili nishodne kaskade pokrenute signalnim molekulima faktora rasta.
[0172] U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu indukovati ili inhibirati dimerizaciju ili multimerizaciju faktora rasta (liganada) ili njihovih receptora. U pojedinim primerima izvođenja, takva delovanja mogu biti ostvarena putem stabilizacije monomernih, dimernih ili multimernih oblika ili putem remećenja dimernih ili multimernih kompleksa.
[0173] U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu delovati na homo i/ili heterodimere monomernih jedinica koje sadrže bilo receptorske grupe ili GPC ili druge parove signalnih molekula.
[0174] Antitela predmetnog pronalaska mogu biti internalizovana u ćelije pre vezivanja ciljnih antigena. Nakon internalizacije, takva antitela mogu delovati tako što povećavaju ili smanjuju jedan ili više signalnih događaja, oslobađaju ili stabilizuju jedan ili više GPC, blokiraju ili olakšavaju oslobađanje faktora rasta i/ili menjaju jednu ili više ćelijskih niša.
[0175] U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu takođe izmeniti vreme zadržavanja jednog ili više faktora rasta u jednom ili više GPC i/ili izmeniti vreme zadržavanja jednog ili više GPC u vanćelijskom matriksu i/ili ćelijskom matriksu. Rezultat takvih izmena može biti irevezibilna lokalizacija i/ili privremena lokalizacija.
[0176] Antitela predmetnog pronalaska mogu biti dizajnirana, proizvedena i/ili selektovana upotrebom bilo kojih postupaka koji su poznati stručnjacima. U pojedinim primerima izvođenja, antitela i/ili ćelije koje proizvode antitela predmetnog pronalaska se proizvode prema bilo kom od postupaka navedenih u privremenoj U.S. patentnoj prijavi 61/722,919, podnetoj 6. novembra 2012. godine, kao i 61/722,969, podnetoj 6. novembra 2012. godine.
Generisanje antitela u nokaut miševima
[0177] U pojedinim primerima izvođenja, antitela ovog pronalaska mogu biti generisati u nokaut miševima kojima nedostaje gen koji kodira jedan ili više željenih antigena. Takvi miševi ne bi bili tolerantni na takve antigene i stoga mogu biti u stanju da generišu antitela na njih koja bi mogla unakrsno da reaguju sa humanim i mišjim oblicima antigena. Za proizvodnju monoklonskih antitela, miševi domaćini se imunizuju ciljnim peptidom da bi indukovali limfocite koji se specifično vezuju za taj peptid. Limfociti se zatim prikupljaju i fuzionišu sa imortalizovanom ćelijskom linijom. Dobijene hibridomske ćelije se kultivišu u pogodnom medijumu za kulturu, sa selekcionim agensom koji podržava rast samo fuzionisanih ćelija.
[0178] U pojedinim primerima izvođenja, genetičko isključivanje (engl. knock-out) jednog ili više gena za faktore rasta može biti smrtonosno i/ili proizvesti fetus ili novorođenče koje nije vijabilno. U pojedinim primerima izvođenja, novorođene životinje mogu preživeti samo nekoliko nedelja (npr.1, 2, 3, 4 ili 5 nedelja). U takvim primerima izvođenja, imunizacija se može izvršiti kod novorođenih životinja ubrzo nakon rođenja. Oida i saradnici (Oida T. i saradnici, TGF-β induces surface LAP expression on Murine CD4 T cells independent of FoxP3 induction. PLOS One.2010.5(11):e15523) su pokazali da imunizacija novorođenih TGF-β nokaut miševa, upotrebom injekcija galektina-1 za produženje preživljavanja (obično 3-4 nedelje nakon rođenja, kod ovih miševa). Miševi su bili imunizovani svaki drugi dan ćelijama koje su eksprimirale mišji TGF-β, tokom 10 dana, počevši od 8. dana nakon rođenja, pa su ćelije slezine prikupljene 22. dana nakon rođenja. Prikupljene ćelije slezine su fuzionisane sa mijelomskim ćelijama, a od nastalih hibridomskih ćelija, za mnoge je utvrđeno da uspešno proizvode anti-LAP antitela. U pojedinim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, ovi postupci mogu biti upotrebljeni za generisanje antitela. U pojedinim primerima izvođenja, takvi postupci mogu uključivati upotrebu humanih antigena. U pojedinim primerima izvođenja, ćelije koje su upotrebljavane za imunizaciju mogu eksprimirati TGF-β i GARP. U takvim primerima izvođenja, GARP može biti eksprimiran sa nativnim transmembranskim domenima da bi se omogućilo da GARP-TGF-β kompleksi ostanu premošćivanjem vezani za ćelijsku površinu transfektovanih ćelija, upotrebljenih iz imunizacije. Pojedini antigeni mogu sadržavati proTGF-β1 premošćivanjem vezan za LTBP (npr. LTBP1S.). U pojedinim slučajevima, kao antigeni mogu biti upotrebljeni rekombinantni proteini srodni drugim članovima TGF-β familije.
[0179] Postupci predmetnog pronalaska mogu takođe obuhvatati jedan ili više koraka imunizacionih postupaka koje su opisali Oida i saradnici, u kombinaciji sa jednim ili sa više dodatnih i/ili modifikovanih koraka. Modifikovani koraci mogu obuhvatati, ali nisu ograničeni na, upotrebu alternativnih tipova ćelija za fuzije, prikupljanje različitog broja ćelija slezine prilikom izvođenja fuzija, izmenu režima injeciranja, izmenu datuma izdvajanja ćelija slezine, promenu imunogena i/ili izmenu doza imunogena. Dodatni koraci mogu obuhvatati prikupljanje drugih tkiva (npr. limfnih čvorova) iz imunizovanih miševa.
Aktivirajuća i inhibirajuća antitela
[0180] Antitela predmetnog pronalaska mogu obuhvatati aktivirajuća ili inhibirajuća antitela. Kao što se ovde upotrebljava, termin "aktivirajuće antitelo" se odnosi na antitelo koje podstiče aktivnost faktora rasta. Aktivirajuća antitela obuhvataju antitela koja ciljano deluju na bilo koji epitop koji pospešuje aktivnost faktora rasta. Takvi epitopi se mogu nalaziti u okviru prodomena (npr. LAP i domena sličnih LAP,) faktora rasta ili drugih epitopa koji dovode do aktivnosti faktora rasta kada su vezani za antitela.
[0181] Kao što se ovde upotrebljava, termin "inhibirajuće antitelo" se odnosi na antitelo koje smanjuje aktivnost faktora rasta. Inhibirajuća antitela obuhvataju antitela koja ciljano deluju na bilo koji epitop koji smanjuje aktivnost faktora rasta, kada je povezan sa takvim antitelima. Takvi epitopi se mogu nalaziti u okviru prodomena (npr. LAP i domena sličnih LAP,) faktora rasta ili drugih epitopa koji dovode do smanjenja aktivnosti faktora rasta kada su vezani za antitela
[0182] Primeri izvođenja predmetnog pronalaska obuhvataju postupke upotrebe aktivirajućih i/ili inhibirajućih antitela u rastvoru, u ćelijskoj kulturi i/ili kod subjekata, zarad modifikovanja signalizacije faktora rasta.
Anti-LAP i antitela na domene slične LAP
[0183] U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu sadržavati jedno ili više antitela koja ciljano deluju na prodomen, uključujući LAP i/ili domene slične LAP. Takva antitela mogu smanjiti ili podići signalizaciju faktora rasta, u zavisnosti od specifičnog LAP ili domena sličnog LAP domenu koji je vezan, i/ili u zavisnosti od specifičnog epitopa na koji takva antitela ciljano deluju. Anti-LAP i/ili antitelo pronalaska na domen sličan LAP, mogu pospešivati disocijaciju slobodnih faktora rasta iz GPC. Takva disocijacija može biti indukovana nakon vezivanja antitela za GPC ili disocijacija može biti pospešena sprečavanjem ponovnog povezivanja slobodnog faktora rasta sa LAP ili proteinom sličnim LAP. U pojedinim slučajevima, obezbeđena su anti-TGF-β LAP antitela. Anti-TGF-β LAP antitela mogu sadržavati antitela koja aktiviraju TGF-β. Takva antitela mogu povećati aktivnost TGF-β, u pojedinim slučajevima oslobađanjem slobodnog TGF-β faktora rasta iz latentnih GPC i/ili sprečavanjem ponovnog povezivanja slobodnog faktora rasta TGF-β sa LAP. U pojedinim slučajevima, antitela na TGF-β LAP mogu povoljnije povećati aktivnost TGF-β kada je proTGF-β povezan sa LTBP. U pojedinim slučajevima, antitela na TGF-β LAP mogu povoljnije povećavati aktivnost TGF-β kada je proTGF-β povezan sa GARP. U pojedinim slučajevima, anti-TGF-β LAP antitela mogu sinergistički funkcionisati sa drugim aktivatorima TGF-β (npr. αvβ6i/ili αvβ8) da bi se povećala aktivnost TGF-β.
Varijacije
[0184] Jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu postojati u vidu celokupnog polipeptida, mnoštva polipeptida ili fragmenata polipeptida, koji nezavisno mogu biti kodirani sa jednom ili sa više nukleinskih kiselina, mnoštvom nukleinskih kiselina, fragmentima nukleinskih kiselina ili varijantama bilo čega od prethodno navedenog. Kao što se ovde upotrebljava, termin "polipeptid" se odnosi na polimer aminokiselinskih ostataka (prirodnih ili neprirodnih) koji su povezani zajedno, najčešće peptidnim vezama. Termin, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na proteine, polipeptide i peptide bilo koje veličine, strukture ili funkcije. U pojedinim slučajevima, kodirani polipeptid je manji od oko 50 aminokiselina i polipeptid se tada označva kao peptid. Ukoliko je polipeptid peptid, biće dug najmanje oko 2, 3, 4 ili najmanje 5 aminokiselinskih ostataka. Stoga, polipeptidi uključuju genske proizvode, polipeptide koji se javljaju u prirodi, sintetske polipeptide, homologe, ortologe, paraloge, fragmente i druge ekvivalente, varijante i analoge prethodno navedenog. Polipeptid može biti jedan molekul ili može biti višemolekulski kompleks kao što je to dimer, trimer ili tetramer. Oni takođe mogu sadržavati jednolančane ili višelančane polipeptide i mogu biti udruženi ili povezani. Termin polipeptid se takođe može primeniti na polimere aminokiselina u kojima su jedan ili više aminokiselinskih ostataka veštački hemijski analog odgovarajuće aminokiseline koja se javlja u prirodi.
[0185] Kao što se ovde upotrebljava, termin "polipeptidna varijanta" se odnosi na molekule koji se razlikuju u njihovoj aminokiselinskoj sekvenci od nativne ili referentne sekvence. Varijante aminokiselinske sekvence mogu biti sa supstitucijama, delecijama i/ili insercijama na određenim pozicijama unutar aminokiselinske sekvence, u poređenju sa nativnom ili referentnom sekvencom. Uobičajeno je da su varijante identične najmanje oko 50% (homologne) sa nativnom ili referentnom sekvencom, a poželjno će biti najmanje oko 80%, još poželjnije najmanje oko 90% identične (homologne) nativnoj ili referentnoj sekvenci.
[0186] U pojedinim primerima izvođenja, obezbeđene su „imitacije varijanti“. Kao što se ovde upotrebljava, izraz "imitacija varijante" se odnosi na varijantu koja sadrži jednu ili više aminokiselina koje bi imitirale aktiviranu sekvencu. Na primer, glutamat može poslužiti kao imitacija fosfo-treonina i/ili fosfo-serina. Alternativno, imitacije varijanti mogu rezultovati u deaktivaciji ili u inaktiviranom proizvodu koji sadži imitaciju, npr. fenilalanin može delovati kao inaktivirajuća supstitucija za tirozin; ili alanin može delovati kao inaktivirajuća supstitucija za serin. Aminokiselinske sekvence jedinjenja i/ili kompozicije pronalaska mogu sadržavati aminokiseline koje se javljaju u prirodi i kao takve se mogu smatrati proteinima, peptidima, polipeptidima ili njihovim fragmentima. Alternativno, jedinjenja i/ili kompozicije mogu sadržavati i prirodne i aminokiseline koje se ne javljaju u prirodi.
[0187] Kao što se ovde upotrebljava, termin „varijanta aminokiselinske sekvence“ se odnosi na molekule sa određenim razlikama u njihovim aminokiselinskim sekvencama u poređenju sa nativnom ili početnom sekvencom. Varijante aminokiselinske sekvence mogu karakterisati supstitucije, delecije i/ili insercije na određenim pozicijama unutar aminokiselinske sekvence. Kao što se ovde upotrebljava, termini "nativni" ili "početni", kada se odnose na sekvence, predstavljaju relativne termine koji se odnose na originalni molekul sa kojim se poređenje može izvršiti. Nativne ili početne sekvence ne treba mešati sa sekvencama divljeg tipa. Nativne sekvence ili molekuli mogu predstavljati divlji tip (one sekvence koji se nalaze u prirodi), ali ne moraju biti identični sa sekvencama divljeg tipa.
[0188] Obično će varijante posedovati najmanje oko 70% homologije sa nativnom sekvencom, a poželjno će biti najmanje oko 80%, još poželjnije najmanje oko 90% homologne sa nativnom sekvencom.
[0189] Kao što se ovde upotrebljava, termin „homologija“, kada se primenjuje na aminokiselinske sekvence, definiše se kao procenat ostataka u aminokiselinskoj sekvenci-kandidatu koji je identičan sa ostacima u aminokiselinskoj sekvenci druge sekvence nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja gapova, ukoliko je to potrebno za postizanje maksimalnog procenta homologije. Postupci i kompujuterski programi za poravnavanje su dobro poznati u oblasti tehnike. Podrazumeva se da homologija zavisi od izračunavanja procenta identičnosti, ali i da se vrednosti mogu razlikovati usled uvođenja razmaka i ograničenja u proračun.
[0190] Kao što se ovde upotrebljava, termin "homolog", kada se primenjuje na aminokiselinske sekvence, označava da je odgovarajuća sekvenca iz drugih vrsta suštinski identična drugoj sekvenci iz druge vrste.
[0191] Kao što se ovde upotrebljava, predviđeno je da termin „analog“ obuhvata polipeptidne varijante koje se razlikuju u jednoj ili u više aminokiselinskih izmena, npr. usled supstitucija, adicija ili delecija aminokiselinskih ostataka koji i dalje održavaju osobine parentalnog polipeptida.
[0192] Kao što se ovde upotrebljava, termin "derivat" se upotrebljava kao sinonim sa terminom "varijanta" i odnosi se na molekul koji je bio modifikovan ili promenjen na bilo koji način u odnosu na referentni molekul ili početni molekul.
[0193] Predmetni pronalazak razmatra nekoliko vrsta jedinjenja i/ili kompozicija na bazi aminokiselina, uključujući varijante i derivate. Tu spadaju supstitucione, insercione, delecione i kovalentne varijante i derivati. Kao takvi, obuhvaćeni obimom ovog pronalaska su i jedinjenja i/ili kompozicije koji sadrže supstitucije, insercije, adicije, delecije i/ili kovalentne modifikacije. Na primer, obeleživači sekvence ili aminokiseline, kao što je jedan ili više lizina, mogu biti dodati peptidnim sekvencama pronalaska (npr. na N-terminalnim ili C-terminalnim krajevima). Obeleživači sekvence mogu biti upotrebljeni za prečišćavanje ili lokalizaciju peptida. Lizini mogu biti upotrebljeni za povećanje rastvorljivosti peptida ili za omogućavanje biotinizacije. Alternativno, aminokiselinski ostaci locirani u karboksi i amino terminalnim regionima aminokiselinske sekvence peptida ili proteina, mogu opciono biti uklonjeni delecijom i time obezbeđivati skraćene sekvence. Određene aminokiseline (npr. C-terminalni ili N-terminalni ostaci) mogu alternativno biti deletirane u zavisnosti od upotrebe sekvence, kao na primer, kada se sekvenca eksprimira kao deo veće sekvence koja je rastvorljiva ili povezana sa čvrstim podlogom.
[0194] „Supstitucione varijante“, kada se odnose na proteine, su one kojima je uklonjen najmanje jedan aminokiselinski ostatak u nativnoj ili početnoj sekvenci i umesto njega je na istoj poziciji insertovana različita aminokiselina. Supstitucije mogu biti pojedinačne, kada je supstituisana samo jedna aminokiselina u molekulu, ili mogu biti višestruke, kada su u istom molekulu supstituisane dve ili više aminokiselina.
[0195] Kao što se ovde upotrebljava, termin "konzervativna aminokiselinska supstitucija" se odnosi na supstituciju aminokiseline koja je normalno prisutna u sekvenci, sa različitim aminokiselinama slične veličine, naelektrisanja ili polarnosti. Primeri konzervativnih supstitucija obuhvataju supstituciju nepolarnog (hidrofobnog) ostatka kao što je izoleucin, valin i leucin sa drugim nepolarnim ostatkom. Slično tome, primeri konzervativnih supstitucija obuhvataju supstituciju jednog polarnog (hidrofilnog) ostatka sa drugim, kao što je to između arginina i lizina, između glutamina i asparagina i između glicina i serina. Pored toga, supstitucija baznog ostatka kao što je lizin, arginin ili histidin sa drugim, ili supstitucija jednog kiselog ostatka kao što je asparaginska kiselina ili glutaminska kiselina sa drugim kiselim ostatkom, dodatni su primeri konzervativnih supstitucija. Primeri nekonzervativnih supstitucija obuhvataju supstituciju nepolarnih (hidrofobnih) aminokiselinskih ostataka kao što su izoleucin, valin, leucin, alanin, metionin sa polarnim (hidrofilnim) ostacima kao što su cistein, glutamin, glutaminska kiselina ili lizin i/ili polarnog ostatka sa nepolarnim ostatkom.
[0196] Kao što se ovde upotrebljava, termin "insercione varijante", kada se odnosi na proteine, obuhvata one sa insercijom jedne ili više aminokiselina neposredno uz aminokiselinu na određenoj poziciji u nativnoj ili početnoj sekvenci. Kao što se ovde upotrebljava, termin "neposredno susedno" se odnosi na susednu aminokiselinu koja je povezana bilo sa alfa-karboksi ili alfa-amino funkcionalnom grupom početne ili referentne aminokiseline.
[0197] Kao što se ovde upotrebljava, termin "delecione varijante", kada se odnosi na proteine, obuhvata one u kojima je uklonjena jedna ili više aminokiselina u nativnoj ili početnoj sekvenci aminokiselina. Uobičajeno je da delecione varijante podrazumevaju deleciju jednu ili više aminokiselina u određenom regionu molekula.
[0198] Kao što se ovde upotrebljava, termin "derivati", kako se ovde navodi, obuhvata varijante nativnog ili polaznog proteina koje sadrže jednu ili više modifikacija sa organskim proteinskim ili neproteinskim agensima za derivatizaciju, kao i post-translacione modifikacije. Kovalentne modifikacije se tradicionalno uvode reakcijom ciljanih aminokiselinskih ostataka proteina sa organskim agensom za derivatizaciju koji je u stanju da reaguje sa odabranim bočnim lancima ili terminalnim ostacima, ili spregom sa mehanizmima post-translacionih modifikacija koje funkcionišu u odabranim rekombinantnim ćelijama domaćinima. Dobijeni kovalentni derivati su korisni u programima usmerenim na identifikovanje ostataka važnih za biološku aktivnost, za imunotestove ili za pripremu anti-proteinskih antitela za imunoafinitetno prečišćavanje rekombinantnog glikoproteina. Takve modifikacije su u okviru uobičajenih znanja u oblasti tehnike i izvode se bez nepotrebnog dodatnog eksperimentisanja.
[0199] Određene post-translacione modifikacije su rezultat delovanja rekombinantnih ćelija domaćina na eksprimirani polipeptid. Ostaci glutaminila i asparaginila se često post-translaciono deamiduju u odgovarajuće ostatke glutamila i aspartila. Alternativno, ovi ostaci se deamiduju pod blago kiselim uslovima. Bilo koji oblik ovih ostataka može biti prisutan u proteinima upotrebljenim u skladu sa predmetnim pronalaskom.
[0200] Ostale post-translacione modifikacije obuhvataju hidroksilaciju prolina i lizina, fosforilaciju hidroksilnih grupa serilskih ili treonilskih ostataka, metilaciju alfa-amino grupa bočnih lanaca lizina, arginina i histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, str.79-86 (1983))).
[0201] Kovalentni derivati specifično uključuju fuzione molekule u kojima su proteini pronalaska kovalentno vezani za neproteinski polimer. Neproteinski polimer je obično hidrofilni sintetski polimer, tj. polimer koji se inače ne nalazi u prirodi. Ipak, polimeri koji postoje u prirodi i koji se proizvode rekombinantnim ili in vitro postupcima su korisni, kao što su to polimeri koji su izolovani iz prirode. Obimom predmetnog pronalaska su obuhvaćeni hidrofilni polivinilni polimeri, npr. polivinilalkohol i polivinilpirolidon. Posebno su korisni polivinilalkilenski etri, poput polietilen glikola, polipropilen glikola. Proteini mogu biti povezani sa raznim neproteinskim polimerima, kao što su polietilen glikol, polipropilen glikol ili polioksialkileni, na način koji je naveden u U.S. pat. br. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 ili 4,179,337.
[0202] Kao što se ovde upotrebljava, termin "karakteristike", kada se odnosi na proteine, definisan je kao jasno različita komponenta molekula zasnovana na aminokiselinskoj sekvenci. Karakteristike proteina predmetnog pronalaska uključuju površinske manifestacije, lokalni konformacioni oblik, uvijanja, petlje, polu-petlje, domene, polu-domene, mesta, krajeve ili bilo koju od njihovih kombinacije.
[0203] Kao što se ovde upotrebljava, termin "površinska manifestacija", kada se odnosi na proteine, odnosi se na komponentu proteina, zasnovanu na polipeptidu, koja se pojavljuje na najudaljenijoj površini.
[0204] Kao što se ovde upotrebljava, termin "lokalni konformacioni oblik", kada se odnosi na proteine, odnosi se na strukturnu manifestaciju proteina zasnovanu na polipeptidu, koja se nalazi unutar određenog prostora proteina koji se može definisati.
[0205] Kao što se ovde upotrebljava, termin "uvijanje", kada se odnosi na proteine, odnosi se na konfomaciju aminokiselinske sekvence koja je rezultat utroška minimuma energije. Uvijanje se može odvijati na sekundarnom ili tercijarnom nivou procesa uvijanja. Primeri sekundarnog nivoa uvijanja obuhvataju beta ploče i alfa zavojnice. Primeri tercijarnih tipova uvijanja obuhvataju domene i regione nastale usled agregacije ili razdvajanja energetskih sila. Ovako obrazovani regioni obuhvataju hidrofobne i hidrofilne džepove i slično.
[0206] Kao što se ovde upotrebljava, termin "zaokret", kada se odnosi na konformaciju proteina, odnosi se na savijanje kojim se menja smer okosnice peptida ili polipeptida, a koji može uključivati jedan, dva, tri ili više aminokiselinskih ostataka.
[0207] Kao što se ovde upotrebljava, termin "petlja", kada se odnosi na proteine, odnosi se na strukturnu karakteristiku peptida ili polipeptida koji preokreće smer okosnice peptida ili polipeptida i sadrži četiri ili više aminokiselinskih ostataka. Oliva i saradnici su identifikovali najmanje 5 klasa proteinskih petlji (Oliva B. i saradnici, An automated classification of the structure of protein loops. J Mol Biol.1997.266(4):814-30.)
[0208] Kao što se ovde upotrebljava, termin "polu-petlja", kada se odnosi na proteine, odnosi se na deo identifikovane petlje koji sadrži najmanje polovinu broja aminokiselinskih ostataka kao petlja iz koje potiče. Podrazumeva se da petlje ne moraju uvek sadržavati paran broj aminokiselinskih ostataka. Prema tome, u onim slučajevima kada petlja sadrži, ili je identifikovano da sadrži, neparan broj aminokiselina, polupetlja petlje neparnog broja će sadržavati deo celog broja ili sledeći deo petlje celog broja (broj aminokiselina petlje/2 /- 0,5 aminokiseline). Na primer, petlja identifikovana kao petlja sa 7 aminokiselina može proizvesti polu-petlje od 3 aminokiseline ili 4 aminokiseline (7/2=3,5+/-0,5 je 3 ili 4).
[0209] Kao što se ovde upotrebljava, termin „domen“, kada se odnosi na proteine, odnosi se na motiv polipeptida sa jednom ili sa više strukturnih ili funkcionalnih karakteristika ili svojstava koji se mogu identifikovati (poput npr. kapaciteta vezivanja, mesta koje služi za interakcije tipa protein-protein).
[0210] Kao što se ovde upotrebljava, termin "poludomen", kada se odnosi na proteine, odnosi se na deo identifikovanog domena, koji sadrži najmanje polovinu broja aminokiselina u odnosu na domen iz kojeg je izveden. Podrazumeva se da domeni ne moraju uvek sadržavati paran broj aminokiselinskih ostataka. Prema tome, u onim slučajevima kada domen sadrži, ili je identifikovano da sadrži, neparan broj aminokiselina, poludomen domena sa neparnim brojem aminokiselina će činiti deo koji je celog broja ili sledeći deo sa celim brojem (broj aminokiselina domena/2 /- 0,5 aminokiseline). Na primer, domen identifikovan kao domen od 7 aminokiselina može proizvoditi poludomene od 3 aminokiseline ili 4 aminokiseline (7/2=3,5+/-0,5 je 3 ili 4). Podrazumeva se takođe da unutar domena ili poludomena mogu biti identifikovani pod-domeni, pri čemu ovakvi pod-domeni poseduju manje od svih strukturnih ili funkcionalnih karakteristika koje su identifikovane za domene ili poludomene iz kojih su izvedeni. Takođe se podrazumeva da aminokiseline koje ovde čine bilo koji od tipova domena ne moraju biti u nizu duž okosnice polipeptida (tj. nesusedne aminokiseline se mogu strukturno uvijati i tako proizesti domen, poludomen ili pod-domen).
[0211] Kao što se ovde upotrebljava, termini „mesto“, kada se odnose na primere izvođenja zasnovane na aminokiselinama, upotrebljavaju se kao sinonimi za „aminokiselinski ostatak“ i „aminokiselinski bočni lanac“. Mesto predstavlja poziciju unutar peptida ili polipeptida kojom se može manipulisati, koja može biti modifikovana, izmenjena, derivatizovana ili promenjena unutar molekula na bazi peptida predmetnog pronalaska.
[0212] Kao što se ovde upotrebljava, termini "krajevi" ili "kraj", kada se odnose na proteine, odnose se na ekstremitet peptida ili polipeptida. Takav ekstremitet nije ograničen samo na prvo ili poslednje mesto peptida ili polipeptida, već može obuhvatati dodatne aminokiseline u terminalnim regionima. Molekuli predmetnog pronalaska na bazi polipeptida mogu biti okarakterisati kao oni koji imaju i N-kraj (završen aminokiselinom sa slobodnom amino grupom (NH2)) i C-kraj (završen aminokiselinom sa slobodnom karboksilnom grupom (COOH)). Proteini pronalaska su u pojedinim slučajevima sačinjeni od višestrukih polipeptidnih lanaca okupljenih zajedno disulfidnim vezama ili nekovalentnim silama (multimeri, oligomeri). Ovakve vrste proteina će imati višestruke N- i C-krajeve. Alternativno, krajevi polipeptida mogu biti modifikovani tako da započinju ili se završavaju, što može biti slučaj, sa ostatkom koji nije bazi polipeptida, kao što je to organski konjugat.
[0213] Jednom kada je bilo koja od karakteristika identifikovana ili definisana kao komponenta molekula pronalaska, bilo koja od nekoliko manipulacija i/ili modifikacija ovih karakteristika može biti sprovedena pomeranjem, zamenom, invertovanjem, delecijom, randomizacijom ili dupliranjem. Štaviše, podrazumeva se da rezultat manipulacija karakteristikama može biti isti ishod kao što je to modifikacija molekula pronalaska. Na primer, rezultat manipulacije koja je uključivala deleciju domena će biti promena dužine molekula baš kao što bi to učinila modifikacija nukleinske kiseline tako da ista kodira manje od molekule pune dužine.
[0214] Modifikacije i manipulacije se mogu postići postupcima koji su poznati u oblasti tehnike, poput mutageneze usmerene na mesto. Dobijeni modifikovani molekuli mogu zatim biti ispitani u kontekstu njihove aktivnosti, upotrebom in vitro ili in vivo testova, poput onih koji su ovde opisani ili bilo kojih drugih pogodnih testova za skrining koji su poznati u oblasti tehnike.
[0215] U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu sadržavati jedan ili više atoma koji su izotopi. Kao što se ovde upotrebljava, termin "izotop" se odnosi na hemijski element koji sadrži jedan ili više dodatnih neutrona. U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja predmetnog pronalaska mogu biti deuterizovana. Kao što se ovde upotrebljava, termin "deuterizacija" se odnosi na postupak zamene jednog ili više atoma vodonika u supstanci, sa deuterijumskim izotopima. Deuterijumski izotopi su izotopi vodonika. Jezgro vodonika sadrži jedan proton, dok jezga deuterijuma sadrže i proton i neutron. Jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti deuterizovani da bi se izmenila jedna ili više fizičkih osobina, poput stabilnosti, ili da bi se omogućilo da se jedinjenja i/ili kompozicije koriste u dijagnostičkoj i/ili eksperimentalnoj primeni.
Konjugati i kombinacije
[0216] Predmetni pronalazak razmatra da jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti u kompleksu, konjugovani ili u kombinaciji sa jednim ili sa više homolognih ili heterolognih molekula. Kao što se ovde upotrebljava, termin "homologni molekul" se odnosi na molekul koji je sličan u najmanje jednoj strukturi ili funkciji sa početnim molekulom, dok je "heterologni molekul" onaj koji se razlikuje najmanje u jednoj strukturi ili funkciji u odnosu na početni molekul. Strukturni homolozi su stoga molekuli koji suštinski mogu biti strukturno slični. U pojedinim primerima izvođenja, takvi homolozi mogu biti identični. Funkcionalni homolozi su molekuli koji mogu biti suštinski funkcionalno slični. U pojedinim primerima izvođenja, takvi homolozi mogu biti identični.
[0217] Jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu činiti konjugate. Takvi konjugati pronalaska mogu sadržavati supstance ili ligande koji se javljaju u prirodi, kao što su proteini (npr. humani serumski albumin (HSA), lipoprotein male gustine (LDL), lipoprotein velike gustine (HDL) ili globulin); ugljeni hidrati (npr. dekstran, pululan, hitin, hitozan, inulin, ciklodekstrin ili hijaluronska kiselina); ili lipidi. Konjugati mogu takođe biti rekombinantni ili sintetski molekuli, kao što su sintetski polimeri, npr. sintetske poliaminokiseline, oligonukleotid (npr. aptamer). Primeri poliaminokiselina mogu obuhvatati polilizin (PLL), poli L-asparaginsku kiselinu, poli L-glutaminsku kiselinu, anhidridni kopolimer stiren-maleinske kiseline, poli(L-laktid-ko-glikolikovan) kopolimer, kopolimer divinil etra i maleinskog anhidrida, N-(2-hidroksipropil)metakrilamidni kopolimer (HMPA), polietilen glikol (PEG), polivinil alkohol (PVA), poliuretan, poli(2-etilakrilnu kiselinu), N-izopropilakrilamidne polimere ili polifosfazin. Primeri poliamina obuhvataju: polietilenimin, polizin (PLL), spermin, spermidin, poliamin, pseudopeptid-poliamin, peptidomimetički poliamin, dendrimerni poliamin, arginin, amidin, protamin, katjonski lipid, katjonski porfirin, kvaternu so poliamina ili alfa helikalni peptid.
[0218] U pojedinim primerima izvođenja, konjugati takođe mogu uključivati grupe sa ciljanim dejstvom. Kao što se ovde upotrebljava, termin "grupa sa ciljanim dejstvom" se odnosi na funkcionalnu grupu ili ostatak koji je vezan za agens, a koji olakšavaju lokalizaciju agensa u željenom regionu, tkivu, ćeliji i/ili sa željenim proteinom. Takve grupe za ciljano delovanje mogu obuhvatati, ali nisu ograničene na, agense ili grupe koji ciljano deluju na ćelije ili tkiva (npr. lektine, glikoproteine, lipide, proteine, antitelo koje se vezuje za određeni tip ćelije kao što je ćelija bubrega ili drugi ćelijski tip). U pojedinim primerima izvođenja, grupe sa ciljanim dejstvom mogu obuhvatati tirotropine, melanotropine, lektine, glikoproteine, surfaktantni protein A, mucinske ugljene hidrate, multivalentnu laktozu, multivalentnu galaktozu, N-acetil-galaktozamin, N-acetil-gulukozamin, multivalentnu manozu, multivalentnu fukozu, glikozilovane poliaminokiseline, multivalentnu galaktozu, transferin, bisfosfonat, poliglutamat, poliaspartat, lipide, holesterol, steroide, žučne kiseline, folate, vitamin B12, biotin, RGD peptide, mimetike RGD peptida ili aptamer.
[0219] U pojedinim primerima izvođenja, grupe sa ciljanim dejstvom mogu biti proteini, npr. glikoproteini, ili peptidi, npr. molekuli sa specifičnim afinitetom za ko-liganda, ili antitela, npr. antitelo koje se vezuje za određeni tip ćelije, kao što je to kancerska ćelija, endotelna ćelija ili ćelija kosti. Grupe sa ciljanim dejstvom mogu takođe obuhvatati hormone i/ili hormonske receptore.
[0220] U pojedinim primerima izvođenja, grupe sa ciljanim dejstvom mogu biti bilo koji ligand koji je u stanju da ciljano deluje na specifične receptore. Primeri uključuju, bez ograničenja, folat, GalNAc, galaktozu, manozu, manozu-6-fosfat, apatamere, ligande integrinskog receptora, ligande hemokinskog receptora, transferin, biotin, ligande serotoninskog receptora, PSMA, endotelin, GCPII, somatostatin, LDL i HDL ligande. U pojedinim primerima izvođenja, grupe sa ciljanim dejstvom su aptameri. Takvi aptameri mogu biti nemodifikovani ili sadržavati bilo koju kombinaciju ovde opisanih modifikacija.
[0221] U još dodatnim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti kovalentno konjugovani sa polipeptidima koji prodiru u ćelije. U pojedinim primerima izvođenja, peptidi koji prodiru u ćelije mogu takođe sadržavati signalne sekvence. U pojedinim primerima izvođenja, konjugati pronalaska mogu biti dizajnirani tako da imaju povećanu stabilnost, povećanu sposobnost ćelijske transfekcije i/ili izmenjenu biodistribuciju (npr. da ciljano deluju na specifična tkiva ili tipove ćelija).
[0222] U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenjima i/ili kompozicijama predmetnog pronalaska mogu biti dodate konjugujuće grupe koje omogućavaju vezivanje obeleživača koji se mogu detektovati na grupe za ciljano dejstvo, u svrhu njihovog klirensa. Takve obeleživači koji se mogu detektovati obuhvataju, ali nisu ograničeni na, biotinske obeleživače, ubikvitine, fluorescentne molekule, hemaglutinin humanog virusa gripa (HA), c-myc, histidin (His), oktapeptidni tag, glutation S-transferazu (GST), V5 (epitop paramiksovirusnog simian virusa tipa 5), biotin, avidin, streptavidin, peroksidazu rena (HRP) i digoksigenin.
[0223] U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja pronalaska mogu biti konjugovana sa Fc domenom antitela da bi nastao Fc fuzioni protein. Obrazovanje Fc fuzionog proteina sa bilo kojim od ovde opisanih jedinjenja se može vršiti u skladu sa bilo kojim postupkom koji je poznat u oblasti tehnike, uključujući postupke opisane u US patentima br.5,116,964; 5,541,087 i 8,637,637. Fc fuzioni proteini pronalaska mogu sadržavati jedinjenje pronalaska povezano sa zglobnim regionom IgG Fc preko cisteinskih ostataka u zglobnom regionu Fc. Rezultujući Fc fuzioni proteini mogu sadržavati strukturu sličnu antitelima, ali bez CH1domena ili lakih lanaca. U pojedinim slučajevima, Fc fuzione proteine mogu karakterisati farmakokinetički profili koji su uporedivi sa onima za nativna antitela. U pojedinim slučajevima, Fc fuzione proteine pronalaska mogu karakterisati produženi poluživot u cirkulaciji i/ili izmenjena biološka aktivnost.
[0224] U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska se mogu kombinovati jedni sa drugima ili sa drugim molekulima u lečenju oboljenja i/ili stanja.
Nukleinske kiseline
[0225] U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti kodirani molekulima nukleinskih kiselina. Takvi molekuli nukleinskih kiselina obuhvataju, ne nisu ograničeni samo na, molekule DNK, molekule RNK, polinukleotide, oligonukleotide, molekule iRNK, vektore, plazmide i slično. U pojedinim primerima izvođenja, predmetni pronalazak može obuhvatati ćelije programirane ili generisane tako da eksprimiraju molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska.
Postupci upotrebe
[0226] Postupci predmetnog opisa obuhvataju postupke modifikovanja aktivnosti faktora rasta u jednom ili u više bioloških sistema. Takvi postupci mogu obuhvatati kontakt jednog ili više bioloških sistema sa jedinjenjem i/ili kompozicijom pronalaska. U pojedinim slučajevima, takvi postupci uključuju modifikovanje nivoa slobodnog faktora rasta u biološkom sistemu (npr. u ćelijskoj niši ili subjektu.) Jedinjenja i/ili kompozicije u skladu sa takvim postupcima mogu obuhvatati, ali nisu ograničene na, biomolekule, uključujući, ali bez ograničavanja samo na, ovde opisane rekombinantne proteine, proteinske komplekse i/ili antitela.
[0227] U pojedinim primerima izvođenja, postupci predmetnog opisa mogu biti upotrebljeni za iniciranje ili povećanje aktivnosti faktora rasta, a koji su ovde označeni kao "postupci aktiviranja". Pojedini takvi postupci mogu obuhvatati oslobađanje faktora rasta iz GPC i/ili inhibiciju ponovnog udruživanja faktora rasta u latentni GPC. U pojedinim slučajevima, postupci aktiviranja mogu uključivati upotrebu antitela, rekombinantnog proteina i/ili proteinskog kompleksa. Prema pojedinim postupcima aktiviranja, obezbeđeni su jedno ili više aktivirajućih antitela. U takvim postupcima, jedan ili više faktora rasta mogu biti oslobođeni ili sprečeni da budu povučeni nazad u GPC. U jednom, neograničavajućem primeru, može biti obezbeđeno anti-LAP antitelo koje pojačava disocijaciju između faktora rasta i GPC i/ili koje sprečava ponovno obrazovanje GPC.
[0228] Primeri predmetnog opisa obuhvataju i postupke upotrebe anti-LAP i/ili antitela na domene slične LAP, u cilju modifikovanja aktivnosti faktora rasta. U pojedinim slučajevima, takvi postupci mogu uključivati upotrebu anti-TGF-β-LAP antitela kao antitela koja aktiviraju TGF-β. U pojedinim slučajevima, postupci upotrebe i/ili ispitivanja takvih antitela mogu obuhvatati bilo koju od postupaka prijavljen u Tsang M. i saradnici, 1995. Cytokine 7(5):389-97.
[0229] U pojedinim slučajevima, postupci predmetnog opisa mogu biti upotrebljeni za smanjenje ili uklanjanje aktivnosti faktora rasta, a koji su ovde označeni kao "postupci inhibicije". Pojedine takvi postupci mogu obuhvatati zadržavanje faktora rasta u GPC-u i/ili podsticanje ponovnog udruživanja faktora rasta u latentni GPC. U pojedinim slučajevima, postupci inhibicije mogu uključivati upotrebu antitela kompanije Therapeutics
[0230] U pojedinim primerima izvođenja, kompozicije pronalaska mogu biti upotrebljene za lečenje širokog spektra oboljenja, poremećaja i/ili stanja. U pojedinim slučajevima, takva oboljenja, poremećaji i/ili stanja mogu biti indikacije povezane sa TGF-β. Kao što se ovde upotrebljava, termin "indikacija povezana sa TGF-β" se odnosi na bilo koje oboljenje, poremećaj i/ili stanje koje je povezano sa ekspresijom, aktivnošću i/ili metabolizmom proteina koji je član TGF-β familije, ili na bilo koje oboljenje, poremećaj i/ili stanje za koje može biti od koristi modulacija aktivnosti i/ili nivoa jednog ili više proteina koji su članovi TGF-β familije. Indikacije povezane sa TGF-β mogu obuhvatati, ali nisu ograničene na, fibrozu, anemiju u starenju, kancer (uključujući, ali ne ograničavajući se na, kancer debelog creva, bubrega, dojke, maligni melanom i glioblastom), olakšavanje brze hematopoeze nakon hemoterapije, zarastanje kostiju, sindrome proliferacije endotela, astmu i alergiju, gastrointestinalne poremećaje, aneurizmu aorte, orfanske indikacije (poput Marfanovog sindroma i Kamurati-Engelmanove bolesti,) gojaznost, dijabetes, artritis, multiplu sklerozu, mišićnu distrofiju, amiotrofičnu lateralnu sklerozu (ALS,) Parkinsonovu bolest, osteoporozu, osteoartritis, osteopeniju, metaboličke sindrome, poremećaje ishrane, atrofiju organa, hroničnu opstruktivnu bolest pluća (HOBP) i anoreksiju. Dodatne indikacije mogu obuhvatati bilo koju od onih koje su opisane u US pub. br.
2013/0122007, US pat. br.8,415,459 ili u Međunarodnoj pub. br. WO 2011/151432.
[0231] Efikasnost lečenja ili ublažavanja oboljenja se može proceniti, na primer, merenjem progresije oboljenja, remisije oboljenja, ozbiljnosti simptoma, smanjenja bola, kvaliteta života, doze leka potrebne za održavanje efekta lečenja, nivoa markera oboljenja ili bilo kog drugog merljivog parametra koji je pogodan za procenu odrešenog oboljenja koje se leči ili na koje se ciljano deluje u kontekstu prevencije. U okviru je sposobnosti stručnjaka iz oblasti tehnike da prati efikasnost lečenja ili prevencije, merenjem bilo kog od ovakvih parametara, ili bilo koje kombinacije parametara. U vezi sa primenom kompozicija predmetnog pronalaska, „efektivno delovanje na“, na primer, kancer, ukazuje da je rezultat primene na klinički odgovarajući način, zapravo povoljno dejstvo kod najmanje statistički značajne frakcije pacijenata, a u vidu poboljšanja simptoma, izlečenja, smanjenja opterećenja oboljenjem, smanjenja u tumorskoj masi ili broju ćelija, kao i u produženja života, poboljšanja kvaliteta života ili drugog dejstva koje se generano prepoznaje kao pozitivno od strane lekara upućenih u lečenje određene vrste kancera.
[0232] Lečenje ili preventivni efekat je očligledan kada postoji statistički značajno poboljšanje u jednom ili u više parametara statusa oboljenja, ili kada ne dođe do pogoršanja ili razvoja simptoma koji bi se inače očekivali. Kao primer se navodi da je pokazatelj efektivnog lečenja zapravo promena od najmanje 10% u merljivom parametru oboljenja, a poželjno od najmanje 20%, 30%, 40%, 50% ili više. Efikasnost za datu kompoziciju ili formulaciju predmetnog pronalaska može takođe biti procenjena upotrebom eksperimentalnog životinjskog modela za datu bolest, kao što je to poznato u oblasti tehnike. Kada se koristi eksperimentalni životinjski model, efikasnost lečenja se dokazuje utvrđivanjem statistički značajnih promena.
Terapeutici za fibrozu
[0233] U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti korisni za izmenu fibroze. U pojedinim primerima izvođenja, takva jedinjenja i/ili kompozicije su antagonisti TGF-β. TGF-β je prepoznat kao centralni usaglašavajući molekul fibrotičnog odgovora. Antitela koja ciljano deluju na TGF-β smanjuju fibrozu u brojnim pretkliničkim modelima. Takva antitela i/ili jedinjenja na bazi antitela obuhvataju i LY2382770 (Eli Lilly, Indianapolis, IN). Uključeni su i ona koja su opisana u U.S. patentima br. US 6,492,497; US 7,151,169 i US 7,723,486, kao i u US publikaciji US2011/0008364.
[0234] Fibroza je uobičajena posledica mnogih vrsta oboljenja sa destrukcijom tkivna. Kada se remećenjem diferenciranih ćelija, progenitora ili matičnih ćelija koje normalno zauzimaju nišu u tkivu, stvori novi prostor, deluje da je glavni put koji se aktivira zapravo proliferacija ćelija vezivnog tkiva, npr. fibroblasta, a da bi se popunio prazan prostor. Navedeno dalje prati proizvodnja konstituenata vanćelijskog matriksa, uključujući kolagene, što dovodi do obrazovanja ožiljaka i trajnog osipanja tkiva.
[0235] Otežavajući aspekt fibroze je njena hroničnost, a koja može zahtevati kontinuiranu terapiju do završetka uništavanja parenhimskih ćelija u osnovi oboljenja, ili do zamene ćelija sa pulom matičnih ćelija ili sa transplantacijom. Smatra se da je fibrozu mnogo lakše zaustaviti nego preokrenuti. Familija TGF-beta je od centralnog značaja za regulisanje rasta fibroblasnih ćelija, kao i za proizvodnju konstituenata vanćelijskog matriksa, uključujući kolagen. Integrini αvβ6i αvβ8(a moguće i αvβ1) mogu učestvovati u aktivaciji TGF-beta1 i 3. Integrin VLA-1 je receptor za kolagen koji je eksprimiran na limfocitima samo u kasnim fazama nakon njihove aktivacije, pri čemu podaci snažno ukazuju na njegovu uključenosti u razvoj fibrotičnog oboljenja.
[0236] U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska su dizajnirani tako da blokiraju aktivaciju TGF-beta sa integrinima αvβ6, αvβ8i αvβ1, da bi se inhibirala fibroza. U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska su dizajnirani tako da ciljano deluju na mesta interakcija između GPC i LTBP, dok dejstvo na mesta interakcije između GPC i GARP ostaje neizmenjeno. Takva jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu stoga delovati kao inhibitorna antitela, sprečavajući signalizaciju faktora rasta i inhibirajući fibrozu. U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska su dizajnirani tako da ciljano deluju na jedan ili više od TGF-β1, 2 i 3 ili na njihove himerne antigene.
[0237] Fibrotične indikacije za koja se jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu terapijski upotrebljavati obuhvataju, ali nisu ograničene na, indikacije na plućima [npr. idiopatsku plućnu fibrozu (IPF), hronični opstruktivni poremećaj pluća (HOPP), alergijsku astmu, akutnu povredu pluća, eozinofilni ezofagitis, plućnu arterijsku hipertenziju i povredu hemijskim gasovima,] indikacije na bubrezima [npr. dijabetsku glomerulosklerozu, fokalno-segmentalnu glomeruloklerozu (FSGS), hroničnu bolest bubrega, fibrozu povezanu sa transplantacijom bubrega i hroničnim odbacivanjem, IgA nefropatiju i hemolitički uremijski sindrom,] fibrozu jetre [npr. nealkoholni steatohepatitis (NASH), hronični virusni hepatitis, parazitemiju, urođene greške u metabolizmu, fibrozu posredovanu toksinima, kao što je alkoholna fibroza, nealkoholni steatohepatitis-hepatocelularni karcinom (NASH-HCC), primarna bilijarna ciroza i sklerozirajući holangitis,] kardiovaskularnu fibrozu (npr. kardiomiopatiju, hipertrofičnu kardiomiopatiju, aterosklerozu i restenozu,) sistemsku sklerozu, kožnu fibrozu (npr. fibrozu kože u sistemskoj sklerozi, difuznu kožnu sistemsku sklerozu, sklerodermu, patološko obrazovanje ožiljaka na koži, keloida, obrazovanje ožiljaka nakon operacija, nakon revizionih operacija, ožiljka indukovanih zračenjem i hronične rane) i kancere ili sekundarne fibroze (npr. mijelofibrozu, kancer glave i vrata, M7 akutnu megakarioblasnu leukemiju i mukozitis.) Ostala oboljenja, poremećaji ili stanja koji su povezani sa fibrozom, a koji mogu biti lečeni upotrebom jedinjenja i/ili kompozicija predmetnog pronalaska obuhvataju, ali nisu ograničeni na, Marfanov sindrom, sindrom uštavljene kože, sklerodermu, reumatoidni artritis, fibrozu kosne srži, Kronovu bolest, ulcerozni kolitis, sistemski eritematozni lupus, mišićnu distrofiju, Dupuitrenovu kontrakturu, Kamurati-Engelmanovu bolest, nervne ožiljke, proliferativnu vitreoretinopatiju, povredu rožnjače, komplikacije nakon hirurške drenaže glaukoma i multiplu sklerozu.
[0238] Testovi koji su korisni u utvrđivanju efikasnosti jedinjenja i/ili kompozicija predmetnog pronalaska za izmenu fibroze obuhvataju, ali nisu ograničeni na, histološke testove za brojanje fibroblasta i osnovne imunohistohemijske analize koje su poznate u oblasti tehnike.
[0239] Životinjski modeli su takođe dostupni za analizu efikasnosti jedinjenja i/ili kompozicija predmetnog pronalaska u izmenama fibroze. Primeri životinjskih modela fibroze koji su korisni za takvu analizu mogu obuhvatati, na primer, bilo koje od onih koje su opisali Schaefer D.W. i saradnici, 2011. Eur Respir Rev.20: 120, 85-97. Takvi modeli mogu obuhvatati, ali nisu ograničeni na one opisane u Tabeli 1 te publikacije, uključujući modele fibroze pluća, modele fibroze bubrega, modele fibroze jetre, kardiovaskularne modele i/ili modele indukovane kolagenom. Schaefer i saradnici objašanjavaju i upotrebu pirfenidona u lečenju fibroze. U pojedinim slučajevima, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti upotrebljeni u kombinaciji sa pirfenidonom.
[0240] U pojedinim slučajevima, jedinjenja i/ili kompozicije pronalaska mogu biti upotrebljeni u lečenju fibroze pluća. Modeli fibroze pluća mogu biti upotrebljeni u razvoju i/ili ispitivanju jedinjenja i/ili kompozicija pronalaska. Modeli fibroze pluća mogu obuhvatati modele povrede pluća izazvane bleomicinom i/ili modele povrede pluća izazvane hroničnom primenom bleomicina. Modeli povreda pluća izazvane bleomicinom mogu biti izvođeni kao što je opisano u Schaefer i saradnici, kao i u Horan i saradnici (Horan G. S. i saradnici, 2008. Am J Respir Crit Care Med, 177(1):56-65. Epub 2007, 4. oktobar) Prema Horanovoj studiji, kod SV129 miševa koji su trahealno izlagani bleomicinu dolazi do razvoja fibroze pluća. U ovom modelu, potencijalni terapeutici se primenjuju putem intraperitonealnih injekcija, dok se tkiva pluća ili bronhoalveolarne lavaže prikupljene nakon žrtvovanja mogu upotrebiti za analizu nivoa hidroksiprolina kao indikatora fibrotične aktivnosti. Upotrebom iste tehnike, miševi koji nose luciferazni resporterski gen pod kontrolom promotora gena za kolagen Iα2, mogu biti upotrebljeni u modelu, tako da se fibrotična aktivnost može odrediti analizom aktivnosti luciferaze u funkciji indukcije gena kolagena. Dodatni modeli fibroze pluća indukovane bleomicinom mogu biti dobijeni prema onome što je opisano od strane Thrall-a i saradnika (Thrall R.S. i saradnici, 1979. Am J Pathol. 95:117-30.) Dodatni modeli za pluća mogu uključivati mišje modele astme. Remodelovanje disajnih puteva (fibroza pluća) može biti ozbiljan problem kod osoba sa hroničnom astmom. Modeli astme mogu obuhvatati bilo koji od onih koje su opisali Nials i saradnici (Nials A.T. i saradnici, 2008. Disease Models and Mechanisms. 1:213-20) Mogu biti upotrebljeni i modeli hronične opstruktivne bolesti pluća (HOBP). Takvi modeli mogu podrazumevati bilo koji od onih koje su opisali Vlahos i saradnici (Vlahos R. i saradnici, 2014. Clin Sci.126:253-65) Mogu biti upotrebljeni i modeli emfizema prouzrokovanog pušenjem cigareta. Takvi modeli se mogu izvoditi kao što je opisano u Ma i saradnici, 2005. J Clin Invest. 115:3460-72. Dalje mogu biti upotrebljeni i modeli hronične fibroze pluća. Takvi modeli kod glodara mogu biti uspostavljeni u skladu sa modelom intratrahealne instilacije fluorescein izotiocijanata (FITC) koji je opisan u Roberts S.N. i saradnici. 1995. J Pathol. 176(3):309-18. Takođe mogu biti upotrebljeni modeli povreda pluća indukovane azbestom i silikom. Takvi modeli se mogu dobiti kao što je opisano u Coin P.G. i saradnici, 1996. Am J Respir Crit Care Med. 154(5):1511-9. U pojedinim slučajevima, mogu biti upotrebljeni modeli zračenja pluća. Takvi modeli mogu biti uspostavljeni kao što je opisano u Pauluhn J. i saradnici, 2001. Toxicology.161:153-63. U pojedinim slučajevima, mogu biti upotrebljeni modeli povrede pluća indukovani forbol miristat acetatom (PMA). Takvi modeli mogu biti dobijeni kao što je opisano u Taylor R.G. i saradnici, 1985. Lab Invest.52(1):61– 70.
[0241] Modeli fibroze bubrega mogu biti upotrebljeni za razvoj i/ili ispitivanje jedinjenja i/ili kompozicija predmetnog pronalaska. U pojedinim primerima izvođenja, može biti upotrebljen dobro uspostavljen model fibroze bubrega, model jednostrane opstrukcije uretera (UUO). U ovom modelu, miševi se podvrgavaju ligaciji proksimalnog uretera. Nakon perioda od nekoliko sati do nekoliko dana, fibroza se ispituje u regionima koji su bili blokirani ligacijom (Ma L.J. i saradnici, 2003. American Journal of Pathology. 163(4):1261-73) U jednom primeru, ovakav postupak je upotrebljen od strane Meng X.M. i saradnika (Meng X.M. i saradnici, Smad2 Protects against TGF-beta/Smad3- Mediated Renal Fibrosis. J Am Soc Nephrol.2010 Sep;21(9):1477-87. Epub 2010 Jul 1) da bi se ispitala uloga SMAD-2 u renalnoj fibrozi. SMAD-2 je unutarćelijski član ćelijskog signalnog puta TGF-beta. U pojedinim slučajevima, mogu biti upotrebljeni modeli nefropatije indukovani ciklosporinom A. Takvi modeli se mogu dobiti kao što je opisano u Ling H. i saradnici, 2003. J Am Soc Nephrol.14:377-88. U pojedinim slučajevima, mogu biti upotrebljeni modeli disfunkcije bubrega u Alportovom sindromu. U studijama Alportovog sindroma mogu naime biti upotrebljeni transgeni miševi sa genetički isključenim kolagenom III (knockout). Ovakvi miševi razvijaju progresivnu fibrozu u svojim bubrezima. Modeli Alportovog sindroma se mogu uspostaviti kao što je opisano u Koepke M.L. i saradnici, 2007. Nephrol Dial Transplant.22(4):1062-9 i/ili Hahm K. i saradnici, 2007. Am J Pathol.170(1):110–5.
[0242] U pojedinim slučajevima, modeli kardiovaskularne fibroze mogu biti upotrebljeni za razvoj i/ili ispitivanje jedinjenja i/ili kompozicija pronalaska u svrhu lečenja kardiovaskularnih fibrotičnih indikacija. U pojedinim slučajevima, mogu biti upotrebljeni modeli vaskularnih povreda. Takvi modeli mogu obuhvatati modele povreda balonizacijom. U pojedinim slučajevima, modeli se mogu uspostaviti kao što je opisano u Smith i saradnici, 1999. Circ Res.84(10): 1212-22. Pokazano je tako da blokiranje TGF-β u ovom modelu blokira obrazovanje neointime. Shodno tome, antitela predmetnog pronalaska koja inhibiraju TGF-β, mogu biti upotrebljena za smanjenje i/ili blokiranje obrazovanja neointime.
[0243] U pojedinim primerima izvođenja, radi lečenja fibrotičnih indikacija u jetri, za razvoj i/ili ispitivanje jedinjenja i/ili kompozicija pronalaska mogu biti upotrebljeni modeli fibroze jetre. Modeli jetre mogu uključivati bilo koji od onih opisanih u Iredale J.P.2007. J Clin Invest.117(3):539-48. Oni uključuju, ali nisu ograničeni na, bilo koji model od onih navedenih u Tabelama 1 i/ili 2. U pojedinim slučajevima, modeli jetre mogu obuhvatati modele fibroze jetre indukovane ugljen-tetrahloridom. Takvi modeli se mogu upsostaviti prema postupcima opisanim u Fujii T. i saradnici, 2010. BMC Gastroenterology.10:79.
[0244] U pojedinim primerima izvođenja, modeli zarastanja rana mogu biti upotrebljeni za razvoj i/ili ispitivanje jedinjenja i/ili kompozicija pronalaska za lečenje indikacija tipa fibrotičnih rana. Modeli rana mogu uključivati modele hroničnih rana.
[0245] U pojedinim slučajevima, modeli fibroze povezane sa GI povredom mogu biti upotrebljeni za razvoj i/ili ispitivanje jedinjenja i/ili kompozicija pronalaska za lečenje fibroze povezane sa GI. Takvi modeli povreda mogu uključivati, ali nisu ograničeni na, modele kolitisa indukovane sa 2,4,6-trinitrobenzensulfonskom kiselinom (TNBS). Takvi modeli se mogu uspostaviti kao što je opisano u Scheiffele F. i saradnici, 2002. Curr Protoc Immunol. Poglavlje 15: jedinica 15.19.
[0246] U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije pronalaska mogu biti upotrebljeni za lečenje oboljenja, poremećaja i/ili stanja povezanih sa fibrozom kosne srži. U pojedinim slučajevima, modeli fibroze kosne srži mogu biti upotrebljeni za razvoj i/ili ispitivanje takvih jedinjenja i/ili kompozicija. Modeli mogu obuhvatati model adoptivnog prenosa ćelija srži koji je opisan u Lacout C. i saradnici, 2006. Blood.108(5):1652–60, kao i transgeni mišji model, uključujući, ali ne ograničavajući se na, model opisan u Vannucchi A.M. i saradnici, 2002. Blood.100(4):1123–32. Dodatni modeli mogu obuhvatati modele mijelofibroze indukovane trombopoetinom. Takvi modeli se mogu izvoditi kao što je opisano u Chagraoui H. i saradnici, 2002. Blood.100(10):3495-503.
[0247] U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije pronalaska mogu biti upotrebljeni za lečenje oboljenja, poremećaja i/ili stanja povezanih sa mišićnom distrofijom (MD), uključujući, ali ne ograničavajući se na, Dišenovu MD i Bekerovu MD. U pojedinim slučajevima, MD modeli mogu biti upotrebljeni za razvoj i/ili ispitivanje takvih jedinjenja i/ili kompozicija. Takvi modeli mogu obuhvatati one opisane u Ceco E. i saradnici, 2013. FEBS J.280(17):4198-209.
[0248] Jedinjenja i/ili kompozicije pronalaska se mogu, u pojedinim slučajevima, kombinovati sa jednim ili sa više drugih terapeutika za lečenja jedne ili više fibrotičnih indikacija. Primeri takvih drugih terapeutika mogu obuhvatati, ali nisu ograničeni na, antagoniste LPA1 receptora, inhibitore lizil oksidaze 2, hedgehog inhibitore, inhibitore IL-3/IL-4, inhibitore CTGF, anti-αvβ6antitela i anti-IL-13 antitela.
[0249] U pojedinim slučajevima, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska su dizajnirani tako da se poveća aktivnost TGF-β faktora rasta da bi se pospešila fibroza u lečenju oboljenja, poremećaja i/ili stanja u kojima fibroza može biti korisna. Takva jedinjenja mogu uključivati aktivirajuća antitela.
Terapeutici za mijelofibrozu
[0250] Mijelofibroza je hronični kancer krvi prouzrokovan mutacijama u matičnim ćelijama kosne srži. Bolest se karakteriše oštećenom sposobnošću stvaranja normalnih krvnih ćelija. Pacijenti razvijaju splenomegaliju i hepatomegaliju, a u kosnoj srži dolazi do prekomerne fibroze. Mijeloproliferativne neoplazme (MPN) je zajednički naziv za tri srodna tipa mijelofibroze sa različitim kliničkim karakteristikama: za primarnu mijelofibrozu (PMF), esencijalnu trombocitemiju i policitemiju vera. Sve tri karakteriše prekomerna signalizacija JAK-STAT ćelijskog signalnog puta (Klampfi i saradnici, 2013. NEJM 369:2379-90) Karakteristike primarne mijelofibroze (PMF) su i povećana angiogeneza, retikulinska i kolagenska fibroza. Kako bolest napreduje, broj osteoklasta raste, tako da kosna srž postaje toliko mala da se ne može ni aspirirati. Pojedine PMF fibroze mogu biti revertovane transplantacijom matičnih ćelija (SCT.) Kod osoba sa policitemijom verom, 98% njih sadrži mutiran JAK2, a što dovodi do prekomerno aktivne JAK-STAT signalizacije.
[0251] Trenutni terapeutici za MPN uključuje alogenu transplantaciju hematopoetskih ćelija (HCT) i inhibiciju Janus kinaze (JAK). Alogeni HCT je udružen sa smrtnošću do 10%, kao i sa otkazivanjem rada transplantata i sa značajnim neželjenim efektima i toksičnošću. Inhibitorna terapija za JAK podrazumeva upotrebu Ruksolitiniba (Rux,) inhibitora JAK2 tipa malog molekula koji je odobren 2011. godine za lečenje MPN. Rux se prodaje na tržištu pod nazivima JAKAFI® i JAKAVI® od strane kompanija Incyte pharmaceuticals (Wilmington, DE) i Novartis (Basel, Švajcarska). Iako je u stanju da poboljša splenomegaliju i hepatomegaliju, Rux ne dovodi do izlečenje, a pojedine studije nisu ukazale na veliku korist od njegove primene (Odenike O., 2013. Hematology.2013(1):545-52)
[0252] U pojedinim slučajevima, jedinjenja i/ili kompozicije pronalaska mogu biti upotrebljeni za lečenje mijeloproliferativnih poremećaja, uključujući, ali ne ograničavajući se na, primarnu mijelofibrozu, sekundarnu mijelofibrozu, esencijalnu trombocitemiju, policitemiju veru, idiopatsku mijelofibrozu i hroničnu mijeloidnu leukemiju. U pojedinim slučajevima, lečenja se mogu izvoditi u kombinaciji sa jednom ili sa više poznatih terapija za mijelofibrozu, uključujući, ali ne ograničavajući se na, alogeni HCT, inhibiciju JAK, tretman sa frezolimumabom (GC1008; Genzyme, Cambridge, MA) za blokiranje TGF-β1, 2 i 3 (Mascarenhas J. i saradnici, 2014. Leukemia and Lymphoma. 55:450-2), tretman simtuzumabom (Gilead Biosciences, Foster City, CA) za blokiranje aktivnosti lizil oksidaze i umrežavanje kolagena, kao i tretman sa Pentraksinom-2 (Promedior, Lexington, MA) za stimulisanje regulatornih makrofaga i inhibiciju mijelofibroblasta. U pojedinim slučajevima, modeli mieloproliferativnih poremećaja mogu biti upotrebljeni za razvoj i/ili ispitivanje onih jedinjenja i/ili kompozicija pronalaska za koje je predviđeno da se upotrebljavaju za lečenje mijelofibroze. Modeli mogu uključivati model adoptivnog prenosa ćelija srži koji je opisan u Lacout C. i saradnici, 2006. Blood.
108(5):1652–60, kao i transgeni mišji model, uključujući, ali ne ograničavajući se na, model opisan u Vannucchi A.M. i saradnici, 2002. Blood. 100(4):1123–32. Modeli mijelofibroze mogu obuhvatati mijelofibrozu indukovanu trombopoetinom. Takvi modeli se mogu izvoditi kao što je opisano u Chagraoui H. i saradnici, 2002. Blood. 100(10):3495-503. Shodno ovom modelu, pokazano je i da je TGF-β1 primarni agonista fibroze. Dodatni modeli mijelofibroze se mogu dobiti kao što je opisano u Mullally A. i saradnici, 2010. Cancer Cell.17: 84-96.
Terapeutici za ožiljke i zarastanje rana
[0253] U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti korisne u promenama zarastanja rana i/ili obrazovanja ožiljaka. U pojedinim slučajevima, jedinjenja i/ili kompozicije pronalaska mogu osigurati pravilno zarastanje rana (uključujući, ali ne ograničavajući se na, hronične rane.) U pojedinim slučajevima, jedinjenja i/ili kompozicije pronalaska mogu biti upotrebljeni za smanjenje, lečenje i/ili prevenciju obrazovanja ožiljaka. Takva jedinjenja i/ili kompozicije mogu sadržavati anti-TGF-β antitela. U pojedinim slučajevima, za podsticanje zarastanja rana mogu biti upotrebljena antitela koja aktiviraju TGF-β.
Terapeutici za poremećaje metabolizma gvožđa
[0254] Tokom hemoterapije, ćelijska deoba se privremeno zaustavlja da bi se sprečili rast i širenje kancerskih ćelija. Nepovoljan sporedni efekat je gubitak crvenih krvnih ćelija koji zavisi od aktivne ćelijske deobe ćelija kosne srži. U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti upotrebljeni za lečenje anemije koja nastaje kao posledica hemoterapije.
[0255] U pojedinim slučajevima, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska se mogu kombinovati sa bilo kojim od ovde opisanih terapeutika da bi se povećala efikasnost.
Terapeutici za anemiju, trombocitopeniju i neutropeniju
[0256] Tokom hemoterapije, ćelijska deoba se privremeno zaustavlja da bi se sprečili rast i širenje kancerskih ćelija. Nepovoljan sporedni efekat je gubitak crvenih krvnih ćelija, trombocita i belih krvnih ćelija, a koji zavisi od aktivne ćelijske deobe ćelija kosne srži. U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti dizajnirani za lečenje pacijenata koji pate od anemije (gubitka crvenih krvnih ćelija), trombocitopenije (smanjenje u broju trombocita) i/ili neutropenije (smanjenja u broju neutrofila).
Terapeutici za kancer
[0257] Razni kanceri mogu biti lečeni sa jedinjenjima i/ili kompozicijama predmetnog pronalaska. Kao što se ovde upotrebljava, termin "kancer" se odnosi na bilo koju od raznovrsnih malignih neoplazmi koju karakteriše proliferacija anaplastičnih ćelija sa tendencijom istih da napadnu okolno tkivo i da metastaziraju na nova mesta u organizmu, a odnosi se i na patološko stanje koje karakteriše takav maligni neoplastičan rast. Kanceri mogu biti tumori ili hematološki maligniteti, koji uključuju, mada nisu ograničeni na, sve vrste limfoma/leukemija, karcinoma i sarkoma, poput kancera ili tumora koji se mogu naći u anusu, bešici, žučnom kanalu, kostima, mozgu, dojci, grliću materice, debelom crevu/rektumu, endometrijumu, jednjaku, oku, žučnoj kesi, glavi i vratu, jetri, bubregu, grkljanu, plućima, medijastinumu (grudnom košu), ustima, jajnicima, pankreasu, penisu, prostati, koži, tankom crevu, želucu, kičmenoj srži, repnoj kosti, testisima, štitnoj žlezdi i materici.
[0258] Kod kancera, TGF-β može ili podsticati rast ili biti inhibitor rasta. Na primer, kod kancera pankreasa, rast tumora sa SMAD4 divljeg tipa može biti inhibiran u odgovoru na TGF-β, ali kako bolest napreduje, obično postaje prisutan konstitutivno aktiviran receptor tipa II. Pored toga, postoje kanceri pankreasa koji su SMAD4-null. U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska su dizajnirani tako da selektivno ciljano deluju na komponente TGF-β signalnih puteva, a koje jedinstveno funkcionišu u jednom ili u više oblika kancera. Leukemije, ili kanceri krvi ili kosne srži koje karakteriše abnormalna proliferacija belih krvnih ćelija, tj. leukocita, mogu biti podeljeni u četiri glavne klasifikacije, uključujući akutnu limfoblastnu leukemiju (ALL), hroničnu limfocitnu leukemiju (CLL), akutnu mijelogenu leukemiju ili akutnu mijeloidnu leukemiju (AML) (AML sa translokacijama između hromozoma 10 i 11 [t(10, 11)], hromozoma 8 i 21 [t(8;21)], hromozoma 15 i 17 [t(15;17)], i sa inverzijom u hromozomu 16 [inv(16)]; AML sa displazijom više ćelijskih loza, koja uključuje pacijente koji su prethodno imali mijelodisplastični sindrom (MDS) ili mijeloproliferativnu bolest koja se transformisala u AML; AML i mijelodisplastični sindrom (MDS), povezani sa terapijom, što je kategorija koja uključuje pacijente koji su prethodno primali hemoterapiju i/ili zračenje i nakon toga su razvili AML ili MDS; d) AML koji nije drugačije kategorisan, što obuhvata podtipove AML koji ne spadaju ni u jedno od prethodno navedenih kategorija; i e) akutne leukemije dvosmislenog porekla, što se javlja kada se leukemijske ćelije ne mogu klasifikovane ni kao mieloidne niti kao limfoidne ćelije, ili tamo gde su prisutne obe vrste ćelija); i hroničnu mijelogenu leukemiju (CML).
[0259] Tipovi karcinoma obuhvataju, ali nisu ograničeni na, papilom/karcinom, horiokarcinom, endodermalni tumor sinusa, teratom, adenom/adenokarcinom, melanom, fibrom, lipom, lejomiom, rabdomiom, mezoteliom, angiom, osteom, hondrom, gliom, limfom/leukemiju, karcinom skvamoznih ćelija, sitnoćelijski karcinom, krupnoćelijske nediferencirane karcinome, karcinom bazalnih ćelija i sinonazalni nediferencirani karcinom.
[0260] Tipovi sarkoma obuhvataju, ali nisu ograničeni na, sarkome mekog tkiva kao što su sarkom mekog dela alveola, angiosarkom, dermatofibrosarkom, dezmoidni tumor, dezmoplastični tumor malih okruglih ćelija, vanskeletni hondrosarkom, vanskeletni osteosarkom, fibrosarkom, hemangiopericitom, hemangiosarkom, Karpošijev sarkom, lejomiosarkom, liposarkom, limfangiosarkom, limfosarkom, maligni fibrozni histiocitom, neurofibrosarkom, rabdomiosarkom, sinovijalni sarkom i Askinov tumor, Juingov sarkom (primitivni neuroektodermalni tumor), maligni hemangioendoteliom, maligni švanom, osteosarkom i hondrosarkom.
[0261] U pojedinim primerima izvođenja, kompozicije pronalaska mogu biti upotrebljene za lečenje jednog ili više tipova kancera ili stanja povezanog sa kancerom, koji mogu obuhvatati, ali nisu ograničena na, kancer debelog creva, kancer bubrega, kancer dojke, maligni melanom i glioblastome (Schlingensiepen i saradnici, 2008; Ouhtit i saradnici, 2013.)
[0262] Gliomi visokog stepena (npr. anaplastični astrocitomi i glioblastomi) čine oko 60% malignih tumora mozga. Utvrđeno je da je TGF-β2 prekomerno eksprimiran u preko 90% takvih glioma, kao i da su nivoi ekspresije u korelaciji sa progresijom tumora. Dodatno, studije u kojima je kod pacijenata sa kancerom upotrebljavano smanjenje TGF-β2 na nivou iRNK, ukazale su na značajno poboljšanje ishoda tumora (Bogdahn i saradnici, 2010.) U svetlu ovih studija, pojedine kompozicije predmetnog opisa mogu biti terapijski upotrebljene za lečenje osoba sa gliomima visokog stepena. Takve kompozicije mogu delovati na snižavanje nivoa slobodnog TGF-β2 i/ili nivoa aktivnosti TGF-β2.
[0263] U pojedinim slučajevima, aktivnost TGF-β2 može doprinositi razvoju tumora modulacijom metastaziranja, angiogeneze, proliferacije i/ili imunosupresivnih funkcija koje narušavaju imunološki nadzor tumora (Schlingensiepen i saradnici, 2008.) Studija Reed-a i saradnika (Reed i saradnici, 1994) je ukazala na ekspresiju TGF-β2 iRNK u velikom procentu melanocitnih lezija, uključujući primarno invazivne melanome i metastatske melanome. Pojedina jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog opisa mogu biti upotrebljeni za modulisanje aktivnosti i/ili nivoa TGF-β2 u takvim lezijama ili za sprečavanje stvaranja lezija. Takođe je pokazano da aktivnost TGF-β2 utiče na rast ćelija melanoma u moždanom parenhimu (Zhang i saradnici, 2009). Pojedina jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog opisa mogu biti upotrebljeni za prevenciju ili kontrolu takvog rasta ćelija, putem modulacije aktivnosti i/ili nivoa TGF-β2.
[0264] Među ženama širom sveta, kancer dojke je oblik kancera koji je sa najvećom prevalencijom. Metastaze kancera dojke su delom posredovane interakcijama između kancerskih ćelija i komponenti vanćelijskog matriksa, poput hijaluronske kiseline (HA). Pokazano je i da je CD44 glavni receptor za HA na kancerskim ćelijama (Ouhtit i saradnici, 2013.) Interakcija između CD44 i HA dovodi do modulisanja ćelijske pokretljivosti, adhezije u cilju preživljavanja i proliferacije. Transkripcija TGF-β2 je takođe pozitivno regulisana signalnom aktivnoću CD44, tako da se veruje da doprinosi i rezultujućim promenama u pokretljivosti ćelija. Nažalost, današnje terapije imaju ograničenu efikasnost i mnoge su sa štetnim efektima usled nedostatka specifičnosti. U pojedinim slučajevima, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog opisa mogu biti upotrebljeni za izmenu ćelijskih aktivnosti koje se indukuju pozitivnom regulacijom TGF-β2.
[0265] Pronalazak se dalje odnosi na upotrebu jedinjenja i/ili kompozicija predmetnog pronalaska u lečenju jednog ili više oblika kancera, u kombinaciji sa drugim farmaceutskim proizvodima, npr. sa poznatim farmaceuticima kao što su, na primer, oni koji se trenutno koriste za lečenje ovih poremećaja. Na primer, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti primenjivani i zajedno sa jednim ili sa više dodatnih tretmana za kancer, kao što su biološka terapija, hemoterapija i radioterapija. Shodno tome, tretman može uključivati, na primer, tretman imatinibom (Gleevac), celokupno trans-retinočnom kiselinom, monoklonskim antitelima (gemtuzumabom, ozogamicinom), hemoterapiju (na primer, hlorambucilom, prednizonom, prednizolonom, vinkristinom, citarabinom, hlofarabinom, inhibitorima farnezil transferaze, decitabinom, inhibitorima MDR1), tretman sa rituksimabom, interferonom-a, antraciklinskim lekovima (kao što su daunorubicin ili idarubicin), L-asparaginazom, doksorubicinom, ciklofosfamidom, doksorubicinom, bleomicinom, fludarabinom, etopozidom, pentostatinom ili kladribinom), transplantaciju kosne srži, transplantaciju matičnih ćelija, terapiju zračenjem, tretman antimetaboličkim lekovima (metotreksatom i 6-merkaptopurinom) ili bilo koju od njihovih kombinacija.
[0266] Terapija zračenjem (označena i kao radioterapija, rendgenska terapija ili ozračivanje) predstavlja upotrebu jonizujućeg zračenja za ubijanje kancerskih ćelija i smanjenje tumora. Terapija zračenjem se može primenjivati spolja, putem radioterapije sa spoljašnjim snopom (EBRT), ili interno, putem brahiterapije. Efekti terapije zračenjem su lokalizovani i ograničeni na region koji se leči. Terapija zračenjem može biti upotrebljena za lečenje gotovo svih vrsta solidnih tumora, uključujući kancere mozga, dojke, grlića materice, grkljana, pluća, pankreasa, prostate, kože, želuca, materice ili sarkome mekih tkiva. Zračenje se koristi i za lečenje leukemije i limfoma.
[0267] Hemoterapija je lečenje kancera sa lekovima koji mogu uništiti kancerske ćelije. U trenutnoj upotrebi, termin „hemoterapija“ se obično odnosi na citotoksične lekove koji generalno utiču na ćelije koje se brzo dele, za razliku od ciljane terapije. Hemoterapijski lekovi ometaju ćelijsku deobu na razne moguće načine, npr. na nivou duplikacije DNK ili razdvajanja novonastalih hromozoma. Većina oblika hemoterapije ciljano deluje na sve ćelije koje se brzo dele i nisu specifični za ćelije kancera, mada određeni stepen specifičnosti može proizaći iz nemogućnosti mnogih ćelija kancera da poprave oštećenja DNK, dok normalne ćelije to obično mogu.
[0268] Većina hemoterapijskih režima se daje u kombinaciji. Primeri hemoterapijskih agenasa su, ali nisu ograničeni samo na, Pojačivač 5-FU, 9-AC, AG2037, AG3340, Inhibitor agrekanaze, Aminoglutetimid, Amsakrin (m-AMSA), Asparaginaza, Azacitidin, Batimastat (BB94), BAY 12-9566, BCH-4556, bis-Naftalimid, Busulfan, Kapecitabin, Karboplatin, Karmustain+Polifepr Osan, inhibitori cdk4/cdk2, Hlorombucil, CI-994, Cisplatin, Kladribin, CS-682, Citarabin HCl, D2163, Daktinomicin, Daunorubicin HCl, DepoCyt, Deksifozamid, Docetaksel, Dolastain, Doksifluridin, Doksorubicin, DX8951f, E 7070, EGFR, Epirubicin, Eritropoetin, Natrijum estramustin fosfat, Etopozid (VP16-213), Inhibitor farnezil-transferaze, FK 317, Flavopiridol, Floksuridin, Fludarabin, Fluorouracil (5-FU), Flutamid, Fragilin, Gemcitabin, Heksametilmelamin (HMM), Hidroksiurea (hidroksikarbamid), Ifosfamid, Interferon Alfa-2a, Interferon alfa-2b, Interleukin-2, Irinotekan, ISI 641, Krestin, Lemonal DP 2202, Leuprolid acetat (analog faktora oslobađanja LHRH), Levamizol, LiGLA (litijum-gama linolenat), Lodinske klice, Lometeksol, Lomustin (CCNU), Marimistat, Mehloretamin HCl (iperit azota), Megestrol acetat, Meglamin GLA, Merkaptopurin, Mesna, Mitoguazon (metil-GAG; metil glioksal bisguanilhidrazon; MGBG), Mitotan (o.p’-DDD), Mitoksantron, Mitoksantron HCl, MMI 270, MMP, MTA/LY 231514, Oktreotid, ODN 698, OK-432, oralna platina, oralni Taksoid, Paklitaksel (TAXOL.RTM.), inhibitori PARP, PD 183805, Pentostatin (2’ dezoksikoformicin), PKC 412, Plikamicin, Prokarbazin HCl, PSC 833, Ralitreksed, Inhibitor RAS Farnezil transferaze, Inhibitor RAS onkogena, Semustin (metil-CCNU), Streptozocin, Suramin, Tamoksifen citrat, analog Taksana, Temozolomid, Tenipozid (VM-26), Tioguanin, Tiotepa, Topotekan, Tirozin kinaza, UFT (Tegafur/Uracil), Valrubicin, Vinblastin sulfat, Vindezin sulfat, VX-710, VX-853, YM 116, ZD 0101, ZD 0473/Anormed, ZD 1839, ZD 9331.
[0269] Biološke terapije koriste imunski sistem organizma, bilo direktno ili indirektno, za borbu protiv kancera ili za smanjenje sporednih efekata koji mogu biti prouzrokovani pojedinim tretmanima za kancer. U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska se mogu smatrati biološkom terapijom po tome što, na primer, mogu stimulisati delovanje imunog sistema na jedan ili više tumora. Ipak, ovakav pristup se može razmatrati kao dodatni za druge takve biološke pristupe, npr. terapije koje modifikuju imunski odgovor, a kao što su to primena interferona, interleukina, faktora stimulacije kolonija, drugih monoklonskih antitela, vakcina, genske terapije, dok se nespecifični imunomodulatorni agensi takođe razmatraju kao terapije za kancer za koje je predviđeno da se kombinuju sa jedinjenjima i/ili kompozicijama predmetnog pronalaska.
[0270] Lekovi za ciljanu terapiju tipa malih molekula su generalno inhibitori enzimskih domena na zrelim, prekomperno eksprimiranim ili drugačije kritičnim proteinima unutar kancerske ćelije, kao što su to inhibitori tirozin kinaze poput imatiniba (Gleevec/Glivec) i gefitiniba (Iressa). Primeri terapija monoklonskim antitelima koje mogu biti upotrebljene sa jedinjenjima i/ili kompozicijama predmetnog pronalaska obuhvataju, ali nisu ograničeni na, anti-HER2/neu antitelo trastuzumab (Herceptin), koje se koristi kod kancera dojke, i anti-CD20 antitelo rituksimab, koje se upotrebljava kod raznovrsnih B-ćelijskih maligniteta. Rast pojedinih vrsta kancera može biti inhibiran obezbeđivanjem ili blokiranjem određenih hormona. Uobičajeni primeri tumora osetljivih na hormone obuhvataju određene vrste kancera dojke i prostate. Uklanjanje ili blokiranje estrogena ili testosterona je često važan dodatni tretman. Kod određenih kancera, primena hormonskih agonista, kao što su progestogeni, može biti terapijski korisna.
[0271] Imunoterapija kancera se odnosi na raznolik skup terapijskih strategija koje su dizajnirane tako da se indukuje sopstveni imunski sistem pacijenta u borbi protiv tumora, a ista uključuje, ali bez ograničavanja samo na, intravezikalnu BCG imunoterapiju kod površinskog kancera bešike, vakcine za generisanje specifičnih imunskih odgovora, kao što je to za maligni melanom i karcinom bubrežnih ćelija, i dalje upotrebu Sipuleucela-T za kancer prostate, u kome su zapravo pristune dendritične ćelije iz pacijenta u koje su uvedeni peptidi fosfataze prostatske kiseline da bi indukovao specifičan imunski odgovor na ćelije koje su poreklom iz prostate.
[0272] U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska su dizajnirani tako da spreče inhibiciju T ćelija. Takva jedinjenja i/ili kompozicije mogu sprečiti disocijaciju faktora rasta od prodomena u okiru GPC ili od komponenti vanćelijskog matriksa i/ili ćelijskog matriksa, uključujući, ali ne ograničavajući se na, GARP, fibriline ili LTBP.
Terapeutici za zarastanje kostiju
[0273] Jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti upotrebljeni za lečenje poremećaja kostiju i/ili za poboljšanje zarastanja ili popravljanja kostiju. Ćelijsko preuređivanje kostiju je proces koji se odvija tokom celog života i pomaže u održanju integriteta skeleta. Ovaj proces uključuje cikluse resorpcije kostiju osteoklastima i dalje obrazovanje nove kosti koje funcioniše tako da se poprave defekti i regioni slabosti u kostima. Smatra se da su članovi TGF-beta familije, poželjno BMP, važni faktori u povezivanju procesa resorpcije i obrazovanja od strane osteoklasta. Članovi TGF-beta familije preovladavaju u matriksu kostiju i pozitivno su regulisani prilikom povreda kostiju. Veruje se takođe da članovi TGF-beta familije doprinose snazi potpuno obrazovanog matriksa kostiju, obezbeđujući otpornost na prelome. Uloga članova TGF-beta familije u remodelovanju kostiju ih čini atraktivnim ciljnim molekulima za potencijalne terapeutike u lečenju poremećaja i oboljenja kostiju.
[0274] Brojna oboljenja i/ili poremećaji pogađaju kosti i zglobove. Takva oboljenja i/ili poremećaji mogu biti urođeni, genetički i/ili stečeni. Takva oboljenja i/ili poremećaji obuhvataju, ali nisu ograničeni na, ciste u kostima, infektivni artritis, Pagetovu bolest kostiju, Osgud-Šlaterovu bolest, Kolerovu bolest kostiju, kosne trnove (osteofite), tumore kostiju, kraniosinostozu, progresivnu fibrodisplaziju osifikans, fibroznu displaziju, tumor gigantskih ćelija kostiju, hipofosfataziju, Klipel-Fejlov sindrom, metaboličku bolest kostiju, osteoartritis, osteitis deformans, osteitis fibrozu cistika, osteitis pubis, kondenzujući osteitis, osteitis condensans ilii, osteohondritis disekans, osteohondrom, osteogenezu imperfekta, osteomalaciju, osteomijelitis, osteopeniju, osteopetrozu, osteoporozu, osteosarkom, porotičnu hiperostozu, primarni hiperparatiroidizam, bubrežnu osteodistrofiju i vodu u kolenu.
[0275] Mišji modeli za procenu efikasnosti terapeutika na razvoj i popravljanje kostiju su dobro poznati u oblasti tehnike. U jednom takvom modelu, Mohammad i saradnici. (Mohammad K.S. i saradnici, Pharmacologic inhibition of the TGF-beta type I receptor kinase has anabolic and anti-catabolic effects on bone. PLoS One.2009;4(4):e5275. Epub 2008, 16. apr), pokazano je da se inhibicija receptora za TGF-beta tipa I može postići kod C57Bl/6 miševa primenom moćnog inhibitora, SD-208, gavažom, dva puta dnevno. Potom je analizirana mineralna gustina kostiju (BMD) upotrebom denzitometra PIXImus za miševe (GE Lunar II, Faxitron Corp., Wheeling, IL). Promene u BMD su izražene kao procenat promene u skeniranom području. Studijom je utvrđeno da je nakon 6 nedelja lečenja, kod mužjaka miševa došlo do porasta u prirastu kostiju od 4,12%, dok je kod ženki miševa porast iznosio 5,2%.
[0276] Jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti korisni kao terapije za jednostavne ili složene prelome kostiju i/ili za zarastanje kostiju. U takvim tretmanima, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti uvedeni direktno na mesto povrede ili posredstvom ugradnje u uređaje za implantaciju i u okviru obloženih biomatrica. Dodatno, razmatraju se tretmani u kojima se jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska dopremaju u područje lečenja zajedno sa jednim ili sa više GPC, čime se olakšava sporo otpuštanje jednog ili više faktora rasta iz takvih GPC.
Terapeutici za angiogenezu i stanja sa proliferacijom endotela
[0277] Jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti upotrebljeni za lečenje angiogenih i sindroma, bolesti ili poremećaja sa proliferacijom endotela. Termin "angiogeneza", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na obrazovanje i/ili reorganizaciju novih krvnih sudova. Angiogena bolest uključuje gubitak kontrole nad angiogenezom u telu. U takvim slučajevima, rast, obrazovanje ili reorganizacija krvnih sudova mogu biti prekomerno aktivni (uključujući priod tokom rasta tumora i kancera, gde nekontrolisan rast ćelija zahteva povećano snabdevanje krvlju) ili nedovoljni za održavanje zdravih tkiva. Takva stanja mogu obuhvatati, ali nisu ograničena na, angiome, angiosarkome, telangiektazije, limfangiome, urođene vaskularne anomalije, tumorsku angiogenezu i vaskularne strukture nakon operacija. Prekomerna angiogeneza je zabeležena kod kancera, makularne degeneracije, dijabetskog slepila, reumatoidnog artritisa, psorijaze, kao i kod mnogih drugih stanja. Prekomerna angiogeneza se često podstiče prekomernom ekspresijom angiogenog faktora rasta. Jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu delovati tako da blokiraju faktore rasta koji su uključeni u prekomernu angiogenezu. Alternativno, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti iskorišćeni za podsticanje signalizacije faktora rasta, a da bi se pojačala angiogeneza u stanjima gde je angiogeneza inhibirana. Takva stanja obuhvataju, ali nisu ograničena na, bolest koronarnih arterija, moždani udar, dijabetes i hronične rane.
Terapeutici za orfanske indikacije i oboljenja
[0278] Jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti upotrebljeni za lečenje orfanskih indikacija i/ili oboljenja. Takva oboljenja uključuju Marfanov sindrom. Ovaj sindrom je poremećaj vezivnog tkiva koji utiče na telesni rast i razvoj. Tkiva i organi koji su najteže ugroženi obuhvataju srce, krvne sudove, kosti, oči, pluća i vezivno tkivo koje okružuje kičmenu moždinu. Nažalost, efekti mogu biti opasni po život. Marfanov sindrom je prouzrokovan genetičkom mutacijom u genu koji proizvodi fibrilin, glavnu komponentu telesnog vezivnog tkiva. Latentni protein koji vezuje TGF-β (LTBP) je važan regulator TGF-β signalizacije, a koji je bliko sličan članovima familije fibrilinskih proteina. Funkcionalan LTBP je potreban za kontrolu oslobađanja aktivnog TGF-β (Oklu R. i saradnici, The latent transforming growth factor beta binding protein (LTBP) family. Biochem J. 2000, 15. dec;352 Pt 3:601-10). U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska su dizajnirani tako da menjaju profil oslobađanja TGF-β. U takvim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije mogu sadržavati antitela koja su okarakterisana kao inhibitorna antitela.
[0279] U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti korisni u lečenju Kamurati-Engelmanove bolesti (CED). Ova bolest prvenstveno pogađa kosti, što rezultuje povećanom gustinom kostiju. Posebno su pogođene duge kosti nogu i ruku; međutim, kosti lobanje i kukovi mogu takođe biti pogođeni. Rezultat oboljenja je bol u nogama i rukama, kao i niz drugih simptoma. CED je vrlo redak, prijavljen je kod približno 200 osoba širom sveta, a prouzrokuje je mutacija u TGF-β genu. TGF-β proizveden u telima ovakvih osoba je sa defektnim prodomenom, što vodi prekomernoj TGF-β signalizaciji (Janssens K. i saradnici, Transforming growth factor-beta 1 mutations in Camurati-Engelmann disease lead to increased signaling by altering either activation or secretion of the mutant protein. J Biol Chem.2003 Feb 28;278(9):7718-24. Epub 2002 Dec 18). Kao što su opisali Shi i saradnici, (Shi M. i saradnici, Latent TGF-beta structure and activation. Nature.2011 Jun 15;474(7351):343-9,) među CED mutacijama, Y81H remeti ostatak u α2-zavojnici što dalje remeti strukturu prstića u TGF-β. Reverzija naelektrisanja sa E169K i H222D mutacijama narušava pH-regulisani most u vidu soli između Glu 169 i His 222 na površini kontakta za dimerizaciju u okviru prodomena. Ostatak Arg 218 je suštinski zaklonjen: on obrazuje katjonsku-π vezu sa Tyr 171 i mostove u vidu soli duž površine kontakta dimera, sa ostatkom Asp 226 iz regiona tipa “leptir-mašne” u regionu prodomenskog kompleksa faktora rasta (GPC). Štaviše, CED mutacije u Cys 223 i Cys 225 pokazuju značaj disulfidnih veza u regionu tipa “leptir-mašne” u kontekstu zadržavanja TGF-β u neaktivnom obliku. U ovom primeru izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska koji sadrže jedno ili više inhibitornih antitela, mogu poslužiti za ublažavanje simptoma. U pojedinim primerima izvođenja, primena bi bila neonatalnom subjektu.
Terapeutici za imunska i autoimunska oboljenja i poremećaje
[0280] Jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti upotrebljeni za lečenje imunskih i autoimunskih poremećaja. Takvi poremećaji obuhvataju, ali nisu ograničeni na, akutni diseminovani encefalomielitis (ADEM), akutni nekrotizirajući hemoragični leukoencefalitis, Adisonovu bolest, agamaglobulinemiju, alopeciju areata, amiloidozu, ankilozirajući spondilitis, anti-GBM/anti-TBM nefritis, antifosfolipidni sindrom (APS), autoimunski angioedem, autoimunsku aplastičnu anemiju, autoimunsku disautonomiju, autoimunski hepatitis, autoimunsku hiperlipidemiju, autoimunsku imunodeficijenciju, autoimunsku bolest unutrašnjeg uha (AIED), autoimunski miokarditis, autoimunski pankreatitis, autoimunsku retinopatiju, autoimunsku trombocitopeničnu purpuru (ATP), autoimunsku bolest štitne žlezde, autoimunsku utrikariju, aksonske i neuronske neuropatije, Balo bolest, Behčetovu bolest, bulozni pemfigoid, kardiomiopatiju, Kastlemanovu bolest, celijakiju, Šagasovu bolest, sindrom hroničnog umora, hroničnu inflamatornu demijelinizacionu polineuropatiju (CIDP), hronični rekurentni multifokalni ostomijelitis (CRMO), Churg-Strauss-ov sindrom, cikatricijalni pemfigoidni/benigni mukozni pemfigoid, Kronovu bolest, Kogansov sindrom, bolest hladnih aglutinina, kongenitalni srčani blok, koksaki miokarditis, CREST bolest, esencijalnu mešovitu krioglobulinemiju, demijelinizacione neuropatije, dermatitis herpetiformis, dermatomiozitis, Devikovu bolest (neuromielitis optica), dijabetes tipa I, diskoidni lupus, Dreslerov sindrom, endometriozu, eozinofilni ezofagitis, eozinofilni fasciitis, nodozni eritem, eksperimentalni alergijski encefalomielitis, Evansov sindrom, fibromijalgiju, fibrozirajući alveolitis, arteritis džinovskih ćelija (temporalni arteritis), glomerulonefritis, Gudpasterov sindrom, granulomatozu sa poliangiitisom (GPA), pogledati Vegenerovu, Gravesovu bolest, Guillain-Barre-ov sindrom, Hašimotov encefalitis, Hašimotov tireoiditis, hemolitičku anemiju, Henoch-Schonlein-ovu purpuru, Herpes gestationis, hipogamaglobulinemiju, idiopatsku trombocitopeničnu purpuru (ITP), IgA nefropatiju, sklerozirajuću bolest povezanu sa IgG4, imunoregulatorne lipoproteine, miozitis sa inkluzionim telima, dijabetes zavisan od insulina (tipa 1), intersticijski cistitis, juvenilni artritis, juvenilni dijabetes, Kavasaki sindrom, Lambert-Eaton-ov sindrom, vaskulopatiju velikih krvnih sudova, leukocitoklastični vaskulitis, Lichen planus, Lichen sclerosus, konjunktivitis lignozu, linearnu IgA bolest (LAD), Lupus (SLE), Lajmsku bolest, hroničnu, Manijerovu bolest, mikroskopski poliangiitis, mešovitu bolest vezivnog tkiva (MCTD), Murenov čir, Mucha-Habermann-ovu bolest, sindrome višestrukih endokrinih neoplazija, multiplu sklerozu, miozitis, mijasteniju gravis, narkolepsiju, očni neuromijelitis (Devikov), neutropeniju, okularni cikatricijalni pemfigoid, optički neuritis, palindromski reumatizam, PANDAS (pedijatrijski autoimunski neuropsihijatrijski poremećaji povezani sa streptokokom), paraneoplastičnu cerebelarnu degeneraciju, paroksizmalnu noćnu hemoglobinuriju (PNH), Parry Romberg-ov sindrom, Parsonnage-Turner-ov sindrom, Pars planitis (periferni uveitis), pemfigus, perifernu neuropatiju, perivenski encefalomijelitis, pernicioznu anemiju, POEMS sindrom, poliarteritis nodoza, autoimunski poliglandularni sindromi tipa I, II i III, poliendokrinopatije, polimijalgiju reumatika, polimiozitis, sindrom nakon infarkta miokarda, sindrom nakon perikardiotomije, progesteronski dermatitis, primarnu bilijarnu cirozu, primarni sklerozirajući holangitis, psorijazu, psorijatični artritis, idiopatsku plućnu fibrozu, piodermu gangrenozum, čistu aplaziju crvenih ćelija, Rajnadsov fenomen, reaktivni artritis, refleksnu simpatičku distrofiju, Rajterov sindrom, relapsirajući polihondritis, sindrom nemirnih nogu, retroperitonealnu fibrozu, reumatsku groznicu, reumatoidni artritis, sarkoidozu, Šmitov sindrom, skleritis, sklerodermu, Sjogrenov sindrom, vaskulopatiju malih krvnih sudova, autoimunost sperme i testisa, sindrom ukočene osobe, subakutni bakterijski endokarditis (SBE), Susakov sindrom, simpatičku oftalmiju, Takajasuov artritis, privremeni arteritis/arteritis džinovskih ćelija, trombocitopeničnu purpuru (TTP), Tolosa-Hunt-ov sindrom, transverzalni mijelitis, tubularni autoimunski poremećaj, ulcerativni kolitis, nediferenciranu bolest vezivnog tkiva (UCTD), uveitis, vezikulobuloznu dermatozu, vaskulitis, vitiligo i Vegenerovu granulomatozu (poznatu i kao granulomatoza sa poliangiitisom (GPA)).
[0281] TGF-β ima aktivnu ulogu u diferencijaciji, proliferaciji i aktivaciji leukocita što ga čini važnim faktorom u imunskim i autoimunskim oboljenjima. Pored toga, TGF-β podstiče hemotaksiju leukocita i utiče na lokalizaciju posredovanu adhezivnim molekulima. Pokazana je uloga TGF-β u srčanim, plućnim i gastričnim inflamacijama. Štaviše, miševi sa deficijencijom SMAD3 su skloni hroničnim infekcijama sluzokože usled oštećenja u aktivaciji T-ćelija i smanjenog imuniteta sluzokože (Blobe G.C. i saradnici, Role of transforming growth factor beta in human disease. N Engl J Med. 2000 May 4;342(18):1350-8). Pokazano je i da TGF-β, kao imunosupresiv, takođe inhibira funkciju inflamatornih ćelija, kao i da poboljšava funkciju regulatornih T ćelija. Skorašnje studije su pokazale da se latentni kompleks TGF-β faktora rasta sa prodomenom (GPC) vezuje za regulatorne T ćelije interakcijom sa Glicoprotein-A anonimnim proteinom sa ponavljanjima (GARP). U stvari, GARP je neophodan za udruživanje TGF-β sa T ćelijama (Tran D.Q. i saradnici, GARP (LRRC32) is essential for the surface expression of latent TGF-β on platelets and activated FOXP3+ regulatory T cells. PNAS. 2009.
106(32):13445-50). Ova interakcija obezbeđuje platformu neophodnu za oslobađanje aktivnog TGF-β iz GPC na način koji je zavisan od integrina (Wang R. i saradnici, GARP regulates the bioavailability and activation of TGFβ. Mol Biol Cell.2012 Mar;23(6): 1129-39. Epub 2012 Jan 25). U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska modulišu interakciju između GARP i TGF-β. Takva modulacija može selektivno modulisati aktivnost T ćelija zarad lečenja oboljenja (npr. autoimunske bolesti i/ili kancera). U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti upotrebljeni za lečenje imunskih i/ili autoimunskih poremećaja. U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu specifično delovati na GPC koji je vezan za GARP, GARP ili mesto interakcije između GARP i GPC. U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska koji sadrže antitela, dizajnirani su tako da podstiču oslobađanje faktora rasta (uključujući, ali ne ograničavajući se na, TGF-β) iz GPC vezanih za GARP, ali i tako da ne utiču na oslobađanje faktora rasta iz GPC vezanih za LTBP. Lečenje imunskih i autoimunskih poremećaja sa jedinjenjima i/ili kompozicijama predmetnog pronalaska se može kombinovati sa standardnom negom (SOC) ili sinergističnim kombinacijama ili sa pratećom dijagnostikom.
Terapeutici za infektivne agense
[0282] U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti korisni za lečenje infektivnih oboljenja i/ili poremećaja, na primer, kod subjekata sa jednom ili sa više infekcija. U pojedinim primerima izvođenja, subjekti su sa jednom ili sa više infekcija, ili su sa rizikom da razviju jednu ili više infekcija. Kao što se ovde upotrebljava, termin "infekcija" se odnosi na bolest ili stanje u domaćinu koje se može pripisati prisustvu jednog ili više stranih organizama ili agenasa, a koji su u stanju da se reprodukuju unutar domaćina. Infekcije obično obuhvataju probijanje jedne ili više normalnih barijera sluzokože ili drugih tkivnih barijera sa jednim ili sa više infektivnih organizama ili agenasa. Subjekti sa jednom ili sa više infekcija su subjekti koji u svom telu sadrže jedan ili više prisutnih i objektivno merljivih infektivnih organizama ili agenasa. Subjekti sa rizikom da imaju jednu ili više infekcija su subjekti koji su skloni razvoju jedne ili više infekcija. Takvi subjekti mogu obuhvatati, na primer, subjekte za koje je poznato ili se sumnja da su bili izloženi jednom ili više infektivnih organizama ili agenasa. U pojedinim primerima izvođenja, subjekti sa rizikom od infekcija, mogu takođe obuhvatati subjekte sa stanjima koja su povezana sa oštećenim sposobnostima da se uspostavi imunski odgovor na infektivne organizme i/ili agense, npr. subjekte sa urođenom i/ili stečenom imunodeficijencijom, subjekte koji se podvrgavaju zračenju i/ili hemoterapiji, subjekte sa opekotinama, subjekte sa traumatičnim povredama i subjekte koje su podvrgavani operaciji ili drugim invazivnim medicinskim ili stomatološkim procedurama.
[0283] Infekcije se široko klasifikuju kao bakterijske, virusne, gljivične i/ili parazitske, na osnovu kategorije infektivnih organizama i/ili agenasa koji su uključeni. Druge manje učestale vrste infekcija su takođe poznate u oblasti tehnike, uključujući, na primer, infekcije u koje su uključene rikecije, mikoplazme i agensi koji izazivaju svab, goveđu spongiformnu encefalopatiju (BSE) i prionske bolesti (npr. kuru i Krojcfeld-Jakobovu bolest). Primeri bakterija, virusa, gljivica i parazita koji mogu prouzrokovati infekciju su dobro poznati u oblasti tehnike. Infekcija može biti akutna, subakutna, hronična ili latentna, a može biti lokalizovana ili sistemska. Kao što se ovde upotrebljava, termin „hronična infekcija“ se odnosi na one infekcije koje se ne uklanjaju uobičajenim delovanjem urođenih ili adaptivnih imunskih odgovora i koji traju u subjektu tokom dugog vremenskog perioda, reda veličine u nedeljama, mesecima i godinama. Hronična infekcija može odražavati latenciju infektivnog agensa i može obuhvatati periode u kojima nisu prisutni infektivni simptomi, tj. asimptomatske su periode. Primeri hroničnih infekcija obuhvataju, ali nisu ograničeni na, HIV infekciju i infekcije herpes virusima. Štaviše, infekcija može biti pretežno unutarćelijska ili vanćelijska tokom najmanje jedne faze životnog ciklusa infektivnog organizma ili agensa u domaćinu.
[0284] Jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska i dodatni terapijski agensi mogu biti primenjivani u kombinaciji, u istoj kompoziciji (npr. parenteralno), kao deo zasebne kompozicije ili nekim drugim postupkom koji je ovde opisan.
Terapeutici za oboljenja, poremećaje i/ili stanja povezana sa očima
[0285] U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti korisne u lečenju oboljenja, poremećaja i/ili stanja povezanih sa očima. Oni mogu obuhvatati, ali nisu ograničeni na glaukom, sušenje oka i/ili zarastanje rana na rožnjači. U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije mogu biti korisni u lečenju glaukoma. Dokazi ukazuju da je TGF-β2 pojačano regulisan u glaukomu (Picht G. i saradnici, Transforming growth factor beta 2 levels in the aqueous humor in different types of glaucoma and the relation to filtering bleb development. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol.2001 Mar.239(3):199-207; Tripathi R.C. i saradnici, Aqueous humor in glaucomatous eyes contains an increased level of TGF-β2. Exp Eye Res.1994 Dec.59(6):723-7.) Navedeno obuhvata primarni glaukom otvorenog ugla i juvenilni glaukom. Postoje takođe i dokazi da TGF-β2 može indukovati efekte slične senescenciji u humanim ćelijama trabekularne mreže, koje kontrolišu intraokularni pritisak (često disfunkcionalnim u galukomu) (Yu A. L. i saradnici, TGF-β2 induces senescence-associated changes in human trabecular meshwork cells. Invest Ophthalmol Vis Sci.2010 Nov. 51(11): 5718-23.) U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti upotrebljeni za smanjenje odnosa slobodnog TGF-β2 prema TGF-β2 koji je vezan sa GPC (neaktivan) u ili oko očnih tkiva pogođenih ili povezanih sa glaukomom. Proteini srodni TGF-β mogu takođe uticati na zarastanje rana na rožnjači (npr. nakon hirurške intervencije i/ili LASIK tretmana) (Huh M.I. i saradnici, Distribution of TGF-β isoforms and signaling intermediates in corneal fibrotic wound repair. J Cell Biochem. 2009 Oct 1. 108(2): 476-88; Sumioka T. i saradnici, Inhibitory effect of blocking TGF-beta/Smad signal on injuryinduced fibrosis of corneal endothelium. Mol Vis.
2008;14:2272-81. Epub 2008 Dec 11; Carrington L.M. i saradnici, Differential regulation of key stages in early corneal wound healing by TGF-beta isoforms and their inhibitors. Invest Ophthalmol Vis Sci.
2006 May;47(5): 1886-94.) Jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti upotrebljeni za modulaciju proteina srodnih TGF-β u rožnjači, da bi se omogućilo i/ili poboljšalo zarastanje rana. Takva jedinjenja i/ili kompozicije bi bili dobrodošli u polju gde su prethodni pokušaji bili neuspešni. Mead i saradnici (Mead A.L. i saradnici, Evaluation of anti-TGF-beta2 antibody as a new postoperative anti-scarring agent in glaucoma surgery. Invest Ophthalmol Vis Sci.2003. avg; 44(8):3394-401) razvili su anti-TGF-β2 antitela za sprečavanje obrazovanja ožiljaka u očnim tkivima; međutim, na osnovu rezultata kliničkih ispitivanja se nije mogao izvesti zaključak. U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti upotrebljeni za modulaciju nivoa TGF-β2 (slobodnog u odnosu na onaj koji je vezan za GPC), obezbeđujući tako alternativan postupak za pristup terapiji ožiljaka.
Terapeutici za kardiovaskularne indikacije
[0286] U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti upotrebljeni za lečenje jedne ili više kardiovaskularnih indikacija, uključujući, ali ne ograničavajući se na, srčanu hipertrofiju. Hipertrofija srca podrazumeva uvećanje srca usled, obično usled povećane ćelijske zapremin srčanih ćelija (Aurigemma 2006. N Engl J Med.355(3):308-10.)
[0287] U pojedinim primerima izvođenja, kompozicije pronalaska mogu biti upotrebljene za lečenje jednog ili više tipova arterijskih poremećaja. Takvi poremećaji mogu obuhvatati, ali nisu ograničeni na, razvoj aneurizmi aorte. Aneurizme aorte mogu nastati usled različitih uzroka, ali većina na kraju rezultuje prekomernom ekspresijom TGF-β2. Studija Boileau-a i saradnika (Boileau i saradnici, Nature Genetics Letters.2012.44(8):916-23) je prijavila uzročne mutacije u TGF-β2 koje su bile povezane sa pojedinim naslednim oblicima podložnosti torakalnoj aortnoj bolesti. Zanimljivo je da, iako je predviđeno da mutacije uzrokuju haploinsuficijenciju za TGF-β2, aortna tkiva pojedinaca sa takvim mutacijama sadrže povećane nivoe TGF-β2, što je utvrđeno imunobojenjem. Slični nalazi su utvrđeni u tkivima aorte kod osoba koje boluju od Marfansovog sindroma (Nataatmadja i saradnici, 2006.) U pojedinim slučajevima, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti upotrebljeni za smanjenje ili prevenciju povišene TGF-β2 signalizacije u takvim slučajevima, čime se ograničavaju razvoj i/ili progresija aneurizme.
[0288] U pojedinim primerima izvođenja, za razvoj i/ili ispitivanje jedinjenja i/ili kompozicija predmetnog pronalaska mogu biti upotrebljeni životinjski modeli, radi ispitivanja upotrebe u lečenju kardiovaskularnih oboljenja, poremećaja i/ili stanja. U pojedinim slučajevima, mogu biti upotrebljeni modeli vaskularnih povreda. Takvi modeli mogu obuhvatati modele povreda balonizacijom. U pojedinim slučajevima, ovi modeli mogu biti uspostavljeni kao što je opisano u Smith i saradnici, 1999. Circ Res.84(10):1212-22.
Terapeutici za gastrointestinalna oboljenja, poremećaje i/ili stanja
[0289] U pojedinim primerima izvođenja, kompozicije pronalaska mogu biti upotrebljene za lečenje jedne ili više vrsta gastrointestinalnih (GI) poremećaja. Takvi poremećaji mogu obuhvatati, ali nisu ograničeni na, inflamatornu oblest creva (IBD) (npr. Kronovu bolest i ulcerozni kolitis).
[0290] TGF-β2 može imati ulogu u homeostazi creva i može imati anti-inflamatornu ulogu, štiteći tako od poremećaja povezanih sa GI, poput mukozitisa i određenih oblika kolitisa. U jednoj studiji je pokazano da TGF-β2 suprimira inflamatorne odgovore maktrofaga u crevima u razvoju, kao i da štiti od inflamatornih povreda sluzokože (Maheshwari i saradnici, 2011.) Zanimljivo je i da su nivoi TGF-β2 visoki u majčinom mleku, što ukazuje da TGF- β2 može funkcionisati, u pojedinim slučajevima, lokalno. Zaista, TGF-β2 u majčinom mleku može utišati inflamatorne reakcije (Rautava i saradnici, 2011.) Pojedina jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti upotrebljeni za modulaciju nivoa i/ili aktivnosti TGF-β2 u GI, u svrhu održavanja homeostaze, i/ili u kontroli poremećaja povezanih sa GI.
[0291] U pojedinim slučajevima, modeli oboljenja, poremećaja i/ili stanja povezanih sa GI mogu biti upotrebljeni za razvoj i/ili ispitivanje jedinjenja i/ili kompozicija pronalaska, a zarad lečenja oboljenja, poremećaja i/ili stanja povezanih sa GI. U pojedinim slučajevima, mogu biti upotrebljeni modeli povrede GI. Takvi modeli povreda mogu obuhvatati, ali nisu ograničeni na, modele kolitisa indukovane sa 2,4,6-trinitrobenzensulfonskom kiselinom (TNBS). Takvi modeli se mogu dobiti kao što je opisano u Scheiffele F. i saradnici, 2002. Curr Protoc Immunol. Poglavlje 15: Jedinica 15.19.
Primene u veterini
[0292] U pojedinim primerima izvođenja, smatra se da će kompozicije pronalaska pronaći korisnost u oblasti veterinarske nege, uključujući negu i lečenje kičmenjaka različitih od čoveka. Kao što je ovde opisano, termin "kičmenjaci" obuhvata sve kičmenjake uključujući, ali ne ograničavajući se na, ribe, vodozemce, ptice, gmizavce i sisare (uključujući, ali ne ograničavajući se na, alpaku, bantenga, bizona, kamilu, mačku, goveda, jelena, psa, magarca, gajala, kozu, zamorca, konja, lamu, miševe, majmune, mazgu, svinju, zeca, pacove, irvasa, ovcu, bivola, jaka i ljude.) Kao što se ovde upotrebljava, izraz "kičmenjak različit od čoveka" se odnosi na bilo kog kičmenjaka sa izuzetkom ljudi (tj. Homo sapiensa). Kičmenjaci različiti od čoveka za primer su oni koji obuhvataju divlje i pripitomljene vrste kao što su ljubimci i stoka. Stoka obuhvata odomaćene životinje koje se uzgajaju u poljoprivrednom okruženju radi proizvodnje materijala kao što su hrana, radna snaga i derivati poput vlakana i hemikalija. Stoka uglavnom obuhvata sve sisare, price i ribe koji su sa potencijalnim poljoprivrednim značajem. Preciznije, četvoronožne životinje za ishranu uključuju volove, junice, krave, telad, bikove, goveda, svinje i ovce.
Biološka obrada
[0293] U pojedinim slučajevima, predmetni opis obezbeđuje postupke za proizvodnju jednog ili više bioloških proizvoda u ćelijama domaćinima, dovođenjem takvih ćelija u kontakt sa jedinjenjima i/ili kompozicijama predmetnog pronalaska koji su u stanju da modulišu ekspresiju ciljnih gena ili da izmene nivo signalnih molekula faktora rasta, pri čemu takva modulacija ili promena poboljšava proizvodnju bioloških proizvoda. Prema predmetnom pronalasku, postupci biološke obrade mogu biti poboljšani upotrebom jednog ili više jedinjenja i/ili kompozicija predmetnog pronalaska. Mogu biti poboljšani i dopunjavanjem, zamenom ili dodavanjem jednog ili više jedinjenja i/ili kompozicija.
Farmaceutske kompozicije
[0294] Farmaceutske kompozicije koje su ovde opisane mogu biti okarakterisane sa jednim ili sa više od bioraspoloživosti, terapijskog prozora i/ili zapremine distribucije.
Biološka raspoloživost
[0295] U pojedinim slučajevima, farmaceutske kompozicije sadrže komplekse jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog opisa sa GPC. U takvim primerima izvođenja, kompleksi mogu biti implantirani na željenim terapijskim mestima, a gde može doći do stabilne disocijacije faktora rasta iz kompleksa tokom željenog vremenskog perioda. U pojedinim primerima izvođenja, kompleksi za implantaciju mogu biti primenjeni zajedno sa matricama sličnim sunđeru i/ili kostima. Takve implantacije mogu uključivati, ali nisu ograničene na, mesta zubnih implantata i/ili mesta za popravku kostiju.
[0296] U pojedinim slučajevima, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog opisa se prave u ćelijama sa deficijencijom u furinu. GPC proizvedeni u takvim ćelijama mogu biti korisni za lečenje u područjima gde je oslobađanje usporeno usled činjenice da je cepanje furinom ograničeno in vivo tokom obrade GPC. U pojedinim slučajevima, jedno ili više mesta za toloid i/ili furin u GPC su mutirani, čime se usporava dejstvo endogenih toloidnih i/ili furinskih proteaza. U takvim slučajevima, oslobađanje faktora rasta može biti usporeno (npr. na mestima implantacije.)
[0297] Antitela predmetnog pronalaska, kada su formulisana u kompozicijama sa agensima za isporuku/formulisanje ili sa nosačima koji su ovde opisanai, mogu ispoljavati povećanu bioraspoloživost u poređenju sa kompozicijama kojima nedostaju agensi za isporuku koji su kao što je ovde opisano. Kao što se ovde upotrebljava, termin "bioraspoloživost" se odnosi na sistemsku dostupnost date količine određenog agensa koja je primenjena subjektu. Bioraspoloživost može biti procenjena merenjem površine ispod krive (AUC) ili maksimalne koncentracije u serumu ili plazmi (Cmax) za nepromenjen oblik jedinjenja, a nakon primene jedinjenja sisaru. AUC je određivanje površine ispod krive koja predstavlja grafički prikaz koncentracije jedinjenja u serumu ili plazmi duž ordinate (Y-ose) u odnosu na vreme prikazano duž apscise (X-ose). U principu, AUC za određeno jedinjenje može biti izračunata upotrebom postupaka koji su poznati prosečno iskusnim stručnjacima iz oblasti tehnike i kao što je opisano u G. S. Banker, Modern Pharmaceutics, Drugs and the Pharmaceutical Sciences, v.72, Marcel Dekker, New York, Inc., 1996.
[0298] Vrednosti Cmax su maksimalne koncentracije jedinjenja koje su postignute u serumu ili plazmi subjekta nakon primene jedinjenja subjektu. Vrednosti Cmax za određena jedinjenja mogu biti izmerene upotrebom postupaka poznatih prosečno iskusnim stručnjacima iz oblasti tehnike. Kao što se ovde upotrebljava, fraze „povećanje bioraspoloživosti“ ili „poboljšanje farmakokinetika“, odnose se na akcije koje mogu povećati sistemsku dostupnost jedinjenja i/ili kompozicija predmetnog pronalaska (što je izmereno sa AUC, Cmaxili Cmin) u subjektu. U pojedinim primerima izvođenja, takve akcije mogu obuhvatati istovremenu primenu sa jednim ili sa više agenasa za isporuku, kao što je ovde opisano. U pojedinim primerima izvođenja, bioraspoloživost jedinjenja i/ili kompozicija se može povećati za najmanje oko 2%, najmanje oko 5%, najmanje oko 10%, najmanje oko 15%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 45%, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95% ili oko 100%.
Terapijski prozor
[0299] Jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska, kada su formulisani sa jednim ili sa više agenasa za isporuku kao što je ovde opisano, mogu ispoljavati poraste u terapijskom prozoru primene jedinjenja i/ili kompozicije, u poređenju sa terapijskim prozorom jedinjenja i/ili kompozicija primenjenih bez jednog ili više agenasa za isporuku koji je ovde opisan. Kao što se ovde upotrebljava, termin "terapijski prozor" se odnosi na opseg koncentracija u plazmi ili na opseg nivoa terapijski aktivne supstance na mestu delovanja, sa velikom verovatnoćom da se izazove terapijski efekat. U pojedinim primerima izvođenja, terapijski prozori jedinjenja i/ili kompozicija, kada se primenjuju istovremeno sa jednim ili sa više agensa za isporuku kao što je ovde opisano, mogu se povećati za najmanje oko 2%, najmanje oko 5%, najmanje oko 10%, najmanje oko 15 %, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 45%, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95% ili oko 100%.
Zapremina distribucije
[0300] Jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska, kada su formulisani sa jednim ili više agenasa za isporuku kao što je ovde opisano, mogu pokazivati poboljšanu zapreminu distribucije (Vdist), npr. smanjenu ili ciljanu, u odnosu na formulacije kojima nedostaje jedan ili više agenasa za isporuku koji su ovde opisani. Vdistje odnos količine agensa u telu sa koncentracijom istog agensa u krvi ili plazmi. Kao što se ovde upotrebljava, termin "zapremina distribucije" se odnosi na zapreminu tečnosti koja bi bila potrebna da sadrži ukupnu količinu agensa u organizmu u istoj koncentraciji kao u krvi ili plazmi: Vdistje jednaka količini agensa u telu/koncentraciji agensa u krvi ili plazmi. Na primer, za dozu od 10 mg datog agensa i koncentraciju u plazmi od 10 mg/L, zapremina distribucije bi bila 1 litar. Zapremina distribucije odražava obim do koga je agens prisustan u tkivu van krvnih sudova. Velike zapremine distribucije odražavaju tendenciju agensa da se vezuje za komponente tkiva u poređenju sa proteinima plazme. U kliničkim uslovima, Vdistmogu biti upotrebljeni za određivanje udarnih doza potrebnih za postizanje stabilnih koncentracija. U pojedinim primerima izvođenja, zapremine distribucije jedinjenja i/ili kompozicija predmetnog pronalaska, kada se primenjuju istovremeno sa jednim ili sa više agenasa za isporuku kao što je ovde opisano, mogu biti smanjene za najmanje oko 2%, najmanje oko 5%, najmanje oko 10%, najmanje oko 15%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 45%, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%.
Formulisanje, primena, isporuka i doziranje
[0301] U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska su farmaceutske kompozicije. Kao što se ovde upotrebljava, termin "farmaceutska kompozicija" se odnosi na jedinjenje i/ili kompoziciju predmetnog pronalaska koja je formulisana sa jednim ili sa više farmaceutski prihvatljivih ekscipijensa. U pojedinim primerima izvođenja, farmaceutske kompozicije mogu opciono sadržavati i jednu ili više dodatnih aktivnih supstanci, npr. terapijski i/ili profilaktički aktivne supstance. Opšta razmatranja u formulisanju i/ili proizvodnji farmaceutskih agenasa se mogu naći, na primer, u Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21. izd., Lippincott Williams & Wilkins, 2005 (ovde uključenom u vidu reference).
[0302] U pojedinim primerima izvođenja, kompozicije mogu biti primenjene ljudima, ljudskim pacijentima ili subjektima. Za potrebe predmetnog opisa, fraza "aktivni sastojak" se generalno odnosi na jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska koje je potrebno isporučiti kao što je ovde opisano.
[0303] Iako su opisi farmaceutskih kompozicija koji su ovde obezbeđene uglavnom usmereni na farmaceutske kompozicije koje su pogodne za primenu kod ljudi, podrazumeva se da je stručnjacima jasno da su takve kompozicije u principu pogodne za primenu drugim subjektima, npr. životinjama različitim od čoveka, npr. sisarima koji su različiti od čoveka. Modifikacija farmaceutskih kompozicija pogodnih za primenu ljudima, da bi se kompozicije učinile pogodnim za primenu raznim životinjama je dobro uspostavljena, a prosečno iskusan veterinarski farmakolog lako može dizajnirati i/ili izvršiti takvu modifikaciju sa skoro uobičajenim, ukoliko uopšte, eksperimentisanjem. Subjekti za koje je primena farmaceutskih kompozicija predviđena obuhvataju, ali nisu ograničeni na, ljude i/ili druge primate; sisare, uključujući komercijalno relevantne sisare kao što su goveda, svinje, konji, ovce, mačke, psi, miševi i/ili pacovi; i/ili ptice, uključujući komercijalno relevantne ptice kao što su živina, pilići, patke, guske i/ili ćurke.
[0304] U pojedinim primerima izvođenja, formulacije farmaceutskih kompozicija koje su ovde opisane mogu biti pripremljene bilo kojim postupkom koji je poznat ili se dalje razvija u oblasti farmakologije. U principu, takvi postupci pripreme obuhvataju korak dovođenja aktivnih sastojaka u vezu sa eksipijensima i/ili sa jednim ili sa više dodatnih pomoćnih sastojaka, a zatim, ukoliko je to potrebno i/ili poželjno, deljenje, oblikovanje i/ili pakovanje proizvoda u željene pojedinačne ili višedozne jedinice.
[0305] U pojedinim primerima izvođenja, farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti pripremljene, upakovane i/ili prodate na veliko, kao pojedinačne jedinične doze i/ili kao mnoštvo pojedinačnih jediničnih doza. Kao što se ovde upotrebljava, termin "jedinična doza" se odnosi na diskretnu količinu farmaceutske kompozicije koja sadrži unapred određenu količinu aktivnog sastojka. Količine aktivnog sastojka su generalno jednake dozi aktivnih sastojaka koju bi trebalo primeniti subjektu i/ili pogodnim frakcijama takvih doza kao što je to, na primer, polovina ili jedna trećina takvih doza.
[0306] U pojedinim primerima izvođenja, relativne količine aktivnih sastojaka, farmaceutski prihvatljivih ekscipijensa, i/ili bilo kojih dodatnih konstituenata u farmaceutskim kompozicijama predmetnog pronalaska, mogu varirati, u zavisnosti od identiteta, veličine i/ili stanja subjekata koji se leče, a dalje i u zavisnosti od puta kojim će se kompozicija primenjivati. Kao primer se može navesti da kompozicije mogu sadržavati između oko 0,1% i 100%, npr. od oko 0,5% do oko 50%, od oko 1% do oko 30%, od oko 5% do oko 80% ili najmanje 80% (m/m) aktivnog sastojka. U pojedinim primerima izvođenja, aktivni sastojci su antitela usmerena na regulatorne elemente i/ili GPC.
Formulacije
[0307] Jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti formulisani upotrebom jednog ili više eksipijenasa da bi se: (1) povećala stabilnost; (2) povećala permeabilnost ćelija; (3) dozvolilo usporeno ili odloženo oslobađanje (npr. jedinjenja i/ili faktora rasta iz takvih formulacija); i/ili (4) izmenila biodistribucija (npr. ciljnih jedinjenja do specifičnih tkiva ili tipova ćelija). Pored tradicionalnih eksipijenasa, kao što su bilo koji i svi rastvarači, disperzioni medijumi, razblaživači, tečni nosači, pomoćna sredstva za disperziju, pomoćna sredstva za resuspendovanje, površinski aktivni agensi, izotonični agensi, agensi za zgušnjavanje, emulgatori i konzervansi, formulacije predmetnog pronalaska mogu sadržavati, bez ograničavanja samo na, lipozome, lipidne nanočestice, polimere, lipoplekse, nanočestice sa centralnim jezgrom i omotačem, peptide, proteine, ćelije transfektovane jedinjenjima i/ili kompozicijama predmetnog pronalaska (npr. radi transplantacije u subjekte) i njihove kombinacije.
Eksipijensi
[0308] U oblasti tehnike su poznati razni eksipijensi za formulisanje farmaceutskih kompozicija, kao i tehnike pripreme kompozicija (pogledati Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006; ovde uključen u vidu reference).
[0309] U pojedinim primerima izvođenja, upotreba konvencionalnih eksipijentnih medijuma se razmatra u okviru obima predmetnog opisa, osim u meri u kojoj bilo koji konvencionalni ekscipijentni medijum može biti nekompatibilan sa supstancama i/ili njihovim derivatima, kao što je na primer proizvođenjem bilo kakvih neželjenih bioloških efekata ili drugačijih interakcija koje mogu biti štetna sa bilo kojim drugim komponentama farmaceutskih kompozicija.
[0310] Formulacije ovde opisanih farmaceutskih kompozicija mogu biti pripremljene bilo kojim postupkom koji je poznat ili se ovde i dalje razvija u oblasti farmakologije. U principu, takvi postupci pripreme obuhvataju korake udruživanja aktivnih sastojaka sa eksipijensima i/ili sa drugim pomoćnim sastojcima.
[0311] Farmaceutske kompozicije, u skladu sa predmetnim opisom, mogu biti pripremljene, upakovane i/ili prodavane u velikom obimu, kao jednokratne jedinične doze i/ili kao mnoštvo jednokratnih jediničnih doza.
[0312] Relativne količine aktivnih sastojaka, farmaceutski prihvatljivih eksipijenasa i/ili dodatnih sastojaka u farmaceutskim kompozicijama predmetnog opisa mogu varirati, u zavisnosti od identiteta, veličine i/ili stanja subjekata koji se leče, a dalje i u zavisnosti od puta kojim farmaceutske kompozicije mogu biti primenjene.
[0313] U pojedinim primerima izvođenja, farmaceutski prihvatljiv ekscipijens je čist najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100%. U pojedinim primerima izvođenja, ekscipijensi su odobreni za upotrebu kod ljudi i/ili za veterinarsku upotrebu. U pojedinim primerima izvođenja, ekscipijensi su odobreni od stane Američke administracije za hranu i lekove. U pojedinim primerima izvođenja, ekscipijensi su farmaceutskog stepena čištoće. U pojedinim primerima izvođenja, ekscipijensi ispunjavaju standarde Američke farmakopeje (USP), Evropske farmakopeje (EP), Britanske farmakopeje i/ili Međunarodne farmakopeje.
[0314] U pojedinim primerima izvođenja, farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi predmetnog pronalaska mogu obuhvatati, ali nisu ograničeni na, inertne razblaživače, agense za dispergovanje i/ili granulisanje, površinski aktivna agense i/ili emulgatore, agense za raspadanje, povezujuće agense, konzervanse, puferske agense, lubrikante i/ili ulja. Takvi ekscipijensi mogu opciono biti uključeni u farmaceutske kompozicije.
[0315] Primeri razblaživača obuhvataju, ali nisu ograničeni na, kalcijum karbonat, natrijum karbonat, kalcijum fosfat, dikalcijum fosfat, kalcijum sulfat, kalcijum hidrogen fosfat, natrijum fosfatnu laktozu, saharozu, celulozu, mikrokristalnu celulozu, kaolin, manitol, sorbitol, inozitol, natrijum hlorid, suvi skrob, kukuruzni skrob, šećer u prahu itd. i/ili njihove kombinacije.
[0316] Primerni agenasa za granulisanje i/ili dispergovanje obuhvataju, ali nisu ograničeni na, skrob krompira, kukuruzni skrob, skrob tapioke, natrijum skrobni glikolat, gline, alginsku kiselinu, guar gumu, citrusnu pulpu, agar, bentonit, celulozu i proizvode od drveta, prirodni sunđer, kation-izmenjivačke smole, kalcijum karbonat, silikate, natrijum karbonat, umrežen poli(vinil-pirolidon) (krospovidon), natrijum karboksimetilni skrob (natrijum skrobni glikolat), karboksimetil celulozu, umreženu natrijum karboksimetil celulozu (kroskarmelozu), metilcelulozu, preželatinizovani skrob (skrob 1500), mikrokristalni skrob, skrob nerastvorljiv u vodi, kalcijum karboksimetil celulozu, magnezijum aluminijum silikat (VEEGUM®), natrijum lauril sulfat, jedinjenja kvaternarnog amonijuma itd. i/ili njihove kombinacije.
[0317] Primeri površinski aktivnih agenasa i/ili emulgatora obuhvataju, ali nisu ograničeni na, prirodne emulgatore (npr. akaciju, agar, alginsku kiselinu, natrijum alginat, tragakant, hondruks, holesterol, ksantan, pektin, želatin, žumance, kazein, mast vune, holesterol, vosak i lecitin), koloidne gline (npr. bentonit [aluminijum silikat] i VEEGUM® [magnezijum aluminijum silikat]), derivate aminokiselina dugog lanca, alkohole visoke molekulske težine (npr. stearil alkohol, cetil alkohol, oleil alkohol, triacetin monostearat, etilen glikol distearat, gliceril monostearat i propilen glikolni monostearat, polivinil alkohol), karbomere (npr. karboksi polimetilen, polikarilnu kiselinu, polimer akrilne kiseline i karboksivinilni polimer), karagenan, derivate celuloze (npr. natrijum karboksimetilcelulozu, celulozu u prahu, hidroksimetil celulozu, hidroksipropil celulozu, hidroksipropil metilcelulozu, metilcelulozu), estre sorbitana sa masnim kiselinama (npr. polioksietilen sorbitan monolaurat [TWEEN®20], polioksietilen sorbitan [TWEENn®60], polioksietilen sorbitan monooleat [TWEEN®80], sorbitan monopalmitat [SPAN®40], sorbitan monostearat [Span®60], sorbitan tristearat [Span®65], gliceril monooleat, sorbitan monooleat [SPAN®80]), polioksietilenske estre (npr. polioksietilen monostearat [MYRJ®45], polioksietilensko hidrogenizovano ricinusovo ulje, polietoksilovano ricinusovo ulje, polioksimetilen stearat i SOLUTOL®), estere masnih kiselina i saharoze, polietilen glikolne estere masnih kiselina (npr. CREMOPHOR®), polioksietilenske etre [(npr. polioksietilen lauril etar [BRIJ®30]), poli(vinil-pirolidon), dietilen glikolni monolaurat, trietanolamin oleat, natrijum oleat, kalijum oleat, etil oleat, oleinsku kiselinu, etil laurat, natrijum lauril sulfat, PLUORINC®F 68, POLOKSAMER®188, cetrimonijum bromid, cetilpiridinijum hlorid, benzalkonijum hlorid, dokuzat natrijum, itd. i/ili njihove kombinacije.
[0318] Primeri vezivnih agenasa obuhvataju, ali nisu ograničeni na, skrob (npr. kukuruzni skrob i skrobnu pastu); želatin; šećere (npr. saharozu, glukozu, dekstrozu, dekstrin, melase, laktozu, laktitol, manitol); prirodne i sintetske gume (npr. akacije, natrijum alginat, ekstrakt irske mahovine, panvarsku gumu, gati gumu, sluz izopolove ljuske, karboksimetilcelulozu, metilcelulozu, etilcelulozu, hidroksietilcelulozu, hidroksipropil celulozu, hidroksipropil metilcelulozu, mikrokristalnu celulozu, celulozu acetat, poli(vinil-pirolidon), magnezijum aluminijum silikat (Veegum®) i arabogalaktan ariša); alginate; polietilen oksid; polietilen glikol; neorganske soli kalcijuma; silicijumsku kiselinu; polimetakrilate; voskove; vodu; alkohol; itd.; i njihove kombinacije.
[0319] Primeri konzervansa mogu obuhvatati, ali nisu ograničeni na, antioksidanse, helatorne agense, antimikrobne konzervanse, antifungalne konzervanse, alkoholne konzervanse, kisele konzervanse i/ili druge konzervanse. Primeri antioksidanasa obuhvataju, ali nisu ograničeni na, alfa tokoferol, askorbinsku kiselinu, akorbil palmitat, butilisan hidroksianizol, butilisan hidroksitoluen, monotioglicerol, kalijum metabisulfit, propionsku kiselinu, propil galat, natrijum askorbat, natrijum bisulfit, natrijum metabisulfit i/ili natrijum sulfit. Primeri helatornih agenasa uključuju etilendiamintetrasirćetnu kiselinu (EDTA), monohidrat limunske kiseline, dinatrijum edetat, dikalijum edetat, edetsku kiselinu, fumarnu kiselinu, jabučnu kiselinu, fosfornu kiselinu, natrijum edetat, vinsku kiselinu i/ili trinatrijum edetat. Primeri antimikrobnih konzervanasa obuhvataju, ali nisu ograničeni na, benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid, benzil alkohol, bronopol, cetrimid, cetilpiridinijum hlorid, hlorheksidin, hlorobutanol, hlorokrezol, hloroksilenol, krezol, etil alkohol, glicerin, heksetidin, imidureu, fenol, fenoksietanol, feniletil alkohol, fenilmerkurni nitrat, propilen glikol i/ili timerosal. Primeri antifugalnih konzervansa obuhvataju, ali nisu ograničeni na, butil paraben, metil paraben, etil paraben, propil paraben, benzoevu kiselinu, hidroksibenzoevu kiselinu, kalijum benzoat, kalijum sorbat, natrijum benzoat, natrijum propionat i/ili sorbinsku kiselinu. Primeri alkoholnih konzervanasa obuhvataju, ali nisu ograničeni samo na, etanol, polietilen glikol, fenol, fenolna jedinjenja, bisfenol, hlorobutanol, hidroksibenzoat i/ili feniletil alkohol. Primeri kiselih konzervanasa obuhvataju, ali nisu ograničeni na, vitamin A, vitamin C, vitamin E, beta-karoten, limunsku kiselinu, sirćetnu kiselinu, dehidrosirćetnu kiselinu, askorbinsku kiselinu, sorbinsku kiselinu i/ili fitinsku kiselinu. Ostali konzervansi obuhvataju, ali nisu ograničeni na, tokoferol, tokoferol acetat, deteroksim mezilat, cetrimid, butilisani hidroksianizol (BHA), butilisani hidroksitoluened (BHT), etilendiamin, natrijum lauril sulfat (SLS), natrijum lauril etarski sulfat (SLES), natrijum bisulfit, natrijum metabisulfit, kalijum sulfit, kalijum metabisulfit, GLYDANT PLUS®, PHENONIP®, metilparaben, GERMALL®115, GERMABEN®II, NEOLONE™, KATHON™ i/ili EUXYL®.
[0320] Puferski agensi za primer obuhvataju, ali nisu ograničeni na, rastvore citratnog pufera, rastvore acetatnog pufera, rastvore fosfatnog pufera, amonijum hlorid, kalcijum karbonat, kalcijum hlorid, kalcijum citrat, kalcijum glubionat, kalcijum gluceptat, kalcijum glukonat, D-glukonsku kiselinu, kalcijum glicerofosfat, kalcijum laktat, propanoičnu kiselinu, kalcijum levulinat, pentansku kiselinu, dvobazni kalcijum fosfat, fosfornu kiselinu, trobazni kalcijum fosfat, kalcijum hidroksid fosfat, kalijum acetat, kalijum hlorid, kalijum glukonat, kalijumske smeše, dvobazni kalijum fosfat, monobazni kalijum fosfat, smeše kalijum fosfata, natrijum acetat, natrijum bikarbonat, natrijum hlorid, natrijum citrat, natrijum laktat, dvobazni natrijum fosfat, monobazni natrijum fosfat, smeše natrijum fosfata, trometamin, magnezijum hidroksid, aluminijum hidroksid, alginsku kiselinu, vodu oslobođenu pirogena, izotoničan fiziološki rastvor, Ringerov rastvor, etil alkohol itd. i/ili njihove kombinacije.
[0321] Primeri lubrikanata obuhvataju, ali nisu ograničeni na, magnezijum stearat, kalcijum stearat, stearinsku kiselinu, siliku, talk, slad, gliceril behanat, hidrogenizovana biljna ulja, polietilen glikol, natrijum benzoat, natrijum acetat, natrijum hlorid, leucin, magnezijum lauril sulfat, natrijum lauril sulfat, itd. i njihove kombinacije.
[0322] Ulja za primer obuhvataju, ali nisu ograničena na, ulje badema, koštice kajsije, avokada, babasua, bergamota, semena crne ribizle, borača, kleke, kamilice, kanole, kima, karnauba, ricinusa, cimeta, kakao puter, ulje kokosa, jetre bakalara, kafe, kukuruza, semena pamuka, emua, eukaliptusa, noćurka, ribe, lanenog semena, geraniola, tikve, semena grožđa, lešnika, miloduha, izopropil miristat, ulje jojobe, kukni oraha, lavandina, lavande, limuna, litsea cubeba, makadamijskog oraha, sleza, semena manga, semena livadske trave, vinke, muskatnog oraščica, masline, pomarandže, atlantske sluzoglavke, palme, koštice palme, koštice breskve, kikirikija, makovog semena, semena bundeve, ulјane repice, mekinja pirinča, ruzmarina, šafrana, sandalovine, saskuana, čubra, helјde, susama, šea puter, silikonsko ulje, ulje soje, suncokreta, drveta čaja, čička, čubakije, vetivera, oraha i pšeničnih klica. Ulja za primer obuhvataju, ali nisu ograničena na, butil stearat, kaprilni triglicerid, kaprilatni triglicerid, ciklometikon, dietil sebakat, dimetikon 360, izopropil miristat, mineralno ulje, oktildodekanol, oleil alkohol, silikonsko ulje i/ili njihove kombinacije.
[0323] Eksipijensi kao što su kakao puter i voskovi za supozitorije, agensi za boju, agensi za oblaganje, zaslađivači, arome i/ili parfemi mogu biti prisutni u kompoziciji, shodno proceni osobe koja obavlja formulisanje.
Nosači za formulisanje: lipozomi, lipopleksi i lipidne nanočestice
[0324] Jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti formulisani upotrebom jednog ili više lipozoma, lipopleksa i/ili lipidnih nanočestica. U pojedinim primerima izvođenja, farmaceutske kompozicije sadrže lipozome. Lipozomi su veštački pripremljene vezikule koje se prvenstveno mogu sastojati od lipidnog dvosloja i koje mogu biti upotrebljene kao nosači za primenu hranljivih sastojaka i farmaceutskih formulacija. Lipozomi mogu biti različitih veličina, kao što su, ali bez ograničavanja samo na, višeslojne vezikule (MLV) koji mogu biti prečnika u stotinama nanometara i mogu sadržavati serije koncentričnih dvoslojnih membrana razdvojenih uskim vodenim odeljcima, a dalje i male jednoćelijske vezikule (SUV) koji mogu biti prečnika manjeg od 50 nm i velike jednoslojne vezikule (LUV) koje mogu biti prečnika između 50 i 500 nm. Komponente lipozoma mogu obuhvatati, ali nisu ograničene na, opsonine ili ligande, a da bi se poboljšalo vezivanje lipozoma za nezdravo tkivo ili da bi se aktivirali događaji poput, ali ne ograničavajući se samo na, endocitozu. Lipozomi mogu sadržavati nizak ili visok pH. U pojedinim primerima izvođenja, pH lipozoma se može varirati da bi se poboljšala isporuka farmaceutskih formulacija.
[0325] U pojedinim primerima izvođenja, obrazovanje lipozoma može zavisiti od fizičko-hemijskih karakteristika, kao što su, ali ne ograničavajući se samo na, one od farmaceutske formulacije koja je “zarobljena”, lipozomskih sastojaka, ali može zavisiti i od prirode medijuma u kome se lipidne vezikule disperguju, od efektivne koncentracije “zarobljenih” supstanci, njihove potencijalne toksičnosti, dodatnih procesa koji su uključeni tokom primene i/ili isporuke vezikula, veličine optimizacije, polidisperznosti, roka trajanja vezikula za predviđenu primenu, ponovljivosti od serije do serije i mogućnosti proizvodnje sigurnih i efikasnih lipozomskih proizvoda u velikom obimu.
[0326] U pojedinim primerima izvođenja, formulacije mogu biti udružene ili kompozicije izmenjene tako da su pasivno ili aktivno usmerene na različite tipove ćelija in vivo.
[0327] U pojedinim primerima izvođenja, formulacije mogu selektivno delovati putem ekspresije različitih liganada na površinama formulacija, kao što su primeri pristupa sa, ali bez ograničavanja samo na, folatom, transferinom, N-acetilgalaktozaminom (GalNAc) i ciljanim antitelima.
[0328] U pojedinim primerima izvođenja, farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti formulisane sa lipozomima, lipopleksima i/ili lipidnim nanočesticama da bi se poboljšala efikasnost funkcije. Takve formulacije mogu biti u stanju da farmaceutskim kompozicijama povećaju ćelijsku transfekciju. U pojedinim primerima izvođenja, lipozomi, lipopleksi ili lipidne nanočestice mogu biti upotrebljeni za povećanje stabilnosti farmaceutske kompozicije.
[0329] U pojedinim primerima izvođenja, lipozomi su specifično formulisani za farmaceutske kompozicije koje sadrže jedno ili više antitela. Takvi lipozomi mogu biti pripremljeni prema tehnikama koje su poznate u oblasti tehnike, poput onih koje su opisali Eppstein i saradnici (Eppstein D.A. i saradnici, Biological activity of liposome-encapsulated murine interferon gamma is mediated by a cell membrane receptor. Proc Natl Acad Sci USA.1985 Jun;82(11):3688-92); Hwang i saradnici (Hwang K.J. i saradnici, Hepatic uptake and degradation of unilamellar sphingomyelin/cholesterol liposomes: a kinetic study. Proc Natl Acad Sci U S A. 1980 Jul;77(7):4030-4); US 4,485,045 i US 4,544,545. Proizvodnja lipozoma sa produženim vremenom u cirkulaciji je takođe opisana u US 5,013,556.
[0330] U pojedinim primerima izvođenja, lipozomi predmetnog pronalaska koji sadrže antitela, mogu biti generisati upotrebom reverznog faznog uparavanja, upotrebom lipida kao što su fosfatidilholin, holesterol, kao i fosfatidiletanolamin koji je dobijen derivatizacijom iz polietilen glikola. Filteri sa definisanom veličinom pora se upotrebljavaju za istiskivanje lipozoma željenog prečnika. U još jednom primeru izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti konjugovani sa spoljnim površinama lipozoma, reakcijama disulfidne izmene, kao što su opisali Martin i saradnici (Martin F. J. i saradnici, Irreversible coupling of immunoglobulin fragments to preformed vesicles. An improved method for liposome targeting. J Biol Chem.1982 Jan 10;257(1):286-8).
Nosači za formulisanje: polimeri i nanočestice
[0331] Jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti formulisani upotrebom prirodnih i/ili sintetskih polimera. Neograničavajući primeri polimera koji mogu biti upotrebljene za isporuku obuhvataju, ali nisu ograničeni na DMRI/DOPE, poloksamer, hitozan, ciklodekstrin i polimere poli(laktatne-ko-glikolne kiseline) (PLGA). U pojedinim primerima izvođenja, polimeri mogu biti biorazgradivi.
[0332] U pojedinim primerima izvođenja, formulacija polimera može omogućiti kontinuirano i/ili odloženo oslobađanje jedinjenja i/ili kompozicija (npr. nakon intramuskularnog i/ili supkutanog injeciranja). Rezultat izmenjenog profila oslobađanja jedinjenja i/ili kompozicija predmetnog pronalaska može biti, na primer, oslobađanje jedinjenja tokom produženog vremenskog perioda. Polimerne formulacije se takođe mogu upotrebljavati za povećanje stabilnosti jedinjenja i/ili kompozicija predmetnog pronalaska.
[0333] U pojedinim primerima izvođenja, polimerne formulacije mogu selektivno delovati putem ekspresije različitih liganada, na primer, ali ne ograničavajući se na, folat, transferin i N-acetilgalaktozamin (GalNAc) (Benoit D. S. i saradnici, Synthesis of folate-functionalized RAFT polymers for targeted siRNA delivery. Biomacromolecules.201112:2708-14; Rozema D.B. i saradnici, Dynamic polyconjugates for targeted in vivo delivery of siRNA to hepatocytes. Proc Natl Acad Sci U S A.2007 104: 12982-12887; Davis M.E. i saradnici, The first targeted delivery of siRNA in humans via a selfassembling, cyclodextrin polymer-based nanoparticle: from concept to clinic. Mol Pharm.20096:659-668; Davis M.E. i saradnici, Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature.2010.464:1067-70)
[0334] Jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti formulisani kao nanočestice, upotrebom kombinacija polimera, lipida i/ili drugih biorazgradivih agenasa, kao što su, ali ne ograničavajući se na, kalcijum fosfati. U pojedinim primerima izvođenja, komponente se mogu kombinovati u kontrukcijama tipa jezgro-omotač, hibrida i/ili sloj-po-sloj, da bi se omogućilo fino podešavanje strukture nanočestica i time poboljšala isporuka. Za antitela predmetnog pronalaska, mogu biti upotrebljeni sistemi zasnovani na poli(2-(metakriloiloksi)etil fosforilholin)-blok-(2-(diizopropilamino)etil metakrilatu), (PMPC-PDPA), dimernom koplimernom bloku koji je osetljiv na pH i koji se udružuje sam sa sobom da bi se obrazovale vezikule veličine u nanometrima, na fiziloškom pH, a koje su poznate i kao polimerzomi. Pokazano je da ovi polimerzomi mogu uspešno isporučivati relativno visoku količinu antitela u žive ćelije. (Massignani M. i saradnici, Cellular delivery of antibodies: effective targeted subcellular imaging and new therapeutic tool. Nature Proceedings.
2010. p1-17.)
[0335] U pojedinim primerima izvođenja, za obrazovanje nanočestica za isporuku jedinjenja i/ili kompozicija predmetnog pronalaska mogu biti upotrebljeni PEG polimeri promenljivog naelektrisanja (Pitella F. i saradnici, Enhanced endosomal escape of siRNA-incorporating hybrid nanoparticles from calcium phosphate and PEG-block charge-conversional polymer for efficient gene knockdown with negligible cytotoxicity. Biomaterials. 2011 32:3106-14). U pojedinim primerima izvođenja, PEG polimeri promenljivog naelektrisanja mogu biti poboljšani do PEG-polianjonskih blok kopolimera cepanjem do polikatjona na kiselom pH, povećavajući tako izbegavanje endozoma.
[0336] U pojedinim primerima izvođenja, obrazovanje kompleksa, isporuka i/ili internalizacija polimernih nanočestica mogu biti precizno kontrolisani izmenama hemijskog sastava, kako u komponentama jezgra, tako i komponentama omotača nanočestica (Siegwart D.J. i saradnici, Combinatorial synthesis of chemically diverse core-shell nanoparticles for intracellular delivery. Proc Natl Acad Sci U S A.2011108:12996-3001).
[0337] U pojedinim primerima izvođenja, za isporuku jedinjenja i/ili kompozicija pronalaska se upotrebljavaju matrice poli(etilen-ko-vinil acetata). Takve matrice su opisane od strane drugih (Sherwood J.K. i saradnici, Controlled antibody delivery systems. Nature Biotechnology. 1992.
10:1446-9.)
Formulacije antitela
[0338] Antitela predmetnog pronalaska mogu biti formulisana za intravensku primenu ili vanvaskularnu primenu (Daugherti, i saradnici, Formulation and delivery issues for monoclonal antibody therapeutics. Adv Drug Deliv Rev. 2006 Aug 7;58(5-6):686-706 i US patentna prijava broj US2011/0135570). Putevi vanvaskularne primene mogu obuhvatati, ali nisu ograničeni na, supkutanu primenu, intraperitonealnu primenu, intracerebralnu primenu, intraokularnu primenu, intralezijsku primenu, topikalnu primenu i intramuskularnu primenu.
[0339] U pojedinim primerima izvođenja, strukture antitela mogu biti modifikovane tako da se poboljša njihova efektivnost u vidu terapeutika. Poboljšanja mogu obuhvatati, ali nisu ograničena na, poboljšanje termodinamičke stabilnosti, smanjenje sposobnosti vezivanja za Fc receptor i/ili poboljšanje efikasnosti uvijanja. Modifikacije mogu obuhvatati, ali nisu ograničene na, aminokiselinske supstitucije, glikozilaciju, palmitoilaciju i/ili proteinsku konjugaciju.
[0340] U pojedinim primerima izvođenja, antitela predmetnog pronalaska mogu biti formulisana sa antioksidansima, da bi se smanjila oksidacija antitela. Antitela predmetnog pronalaska mogu takođe biti formulisana sa aditivima, da bi se smanjila proteinska agregacija. Takvi aditivi mogu obuhvatati, ali nisu ograničeni na albumin, aminokiseline, šećere, ureu, guanidinijum hlorid, polialhohole, polimere (poput polietilen glikola i dektrana), surfaktante (uključujući, ali ne ograničavajući se na, polisorbat 20 i polisorbat 80) ili čak druga antitela.
[0341] U pojedinim primerima izvođenja, antitela predmetnog pronalaska mogu biti formulisana tako da se smanji uticaj vode na strukturu i funkciju antitela. Preparati antitela u takvim formulacijama mogu biti liofilizovani. Formulacije koje se podvrgavaju liofilizaciji mogu sadržavati ugljene hidrate ili poliolska jedinjenja radi zaštite i/ili stabilizacije strukture antitela. Takva jedinjenja mogu obuhvatati, ali nisu ograničena na saharozu, trehalozu i manitol.
[0342] U pojedinim primerima izvođenja, antitela predmetnog pronalaska mogu biti formulisana sa polimerima. U pojedinim primerima izvođenja, polimerne formulacije mogu sadržavati hidrofobne polimere. Takvi polimeri mogu biti mikrosfere formulisane sa polilaktid-ko-glikolidom postupcima inkapsuliranja tipa čvrsto-u-ulju-u-vodi. U pojedinim primerima izvođenja, mikrosfere koje sadrže etilenvinil acetatni kopolimer mogu biti takođe biti upotrebljene za isporuku antitela i/ili za produženje vremenskog toka oslobađanja antitela na mestima isporuke. U pojedinim primerima izvođenja, polimeri mogu biti vodeni gelovi. Takvi gelovi mogu, na primer, sadržavati karboksimetilcelulozu. U pojedinim primerima izvođenja, vodeni gelovi mogu takođe sadržavati hidrogelove hijaluronske kiseline. U pojedinim primerima izvođenja, antitela mogu biti kovalentno vezana za takve gelove putem hidrazonskih veza koje omogućavaju kontinuiranu isporuku u tkivima, uključujući, ali ne ograničavajući se na, tkiva centralnog nervnog sistema.
Nosači formulacija: peptidi i proteini
[0343] Jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti formulisani sa peptidima i/ili proteinima. U pojedinim primerima izvođenja, peptidi kao što su, ali ne ograničavajući se samo na, peptidi koji mogu da prodiru u ćelije, i/ili proteini/peptidi koji omogućavaju unutarćelijsku isporuku, mogu biti upotrebljeni za isporuku farmaceutskih formulacija. Neograničavajući primeri peptida koji prodiru u ćelije i koji mogu biti upotrebljeni sa farmaceutskim formulacijama predmetnog pronalaska, obuhvataju peptidne sekvence koje prodiru u ćelije i koje su vezane za polikatjone, što olakšava isporuku u unutarćelijski prostor, npr. TAT peptid poreklom iz HIV-a, penetratine, transportane ili peptide koji prodiru u ćelije poreklom iz hCT (pogledati, npr. Caron N. J. i saradnici, Intracellular delivery of a Tat-eGFP fusion protein into muscle cells. Mol Ther. 2001. 3(3):310-8; Langel U., Cell-Penetrating Peptides: Processes and Applications, CRC Press, Boca Raton FL, 2002; El-Andaloussi S. i saradnici, Cell-penetrating peptides: mechanisms and applications. Curr Pharm Des. 2003.
11(28):3597-611; i Deshayes S. i saradnici, Cell-penetrating peptides: tools for intracellular delivery of therapeutics. Cell Mol Life Sci. 2005. 62(16):1839-49) Jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu takođe biti formulisani tako da uključuju agense za prodiranje u ćelije, npr. lipozome, koji pojačavaju isporuku kompozicija u unutarćelijske prostore. Jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti u kompleksu sa peptidima i/ili proteinima kao što su, ali ne ograničavajući se samo na, peptidi i/ili proteini od kompanija Aileron Therapeutics (Cambridge, MA) i Permeon Biologics (Cambridge, MA), da bi se omogućila unutarćelijska isporuka (Cronican J.J. i saradnici, Potent delivery of functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo using a supercharged protein. ACS Chem Biol. 2010. 5:747-52; McNaughton B.R. saradnici, Mammalian cell penetration, siRNA transfection, and DNA transfection by supercharged proteins. Proc Natl Acad Sci, USA. 2009. 106:6111-6; Verdine G.L. i saradnici, Stapled peptides for intracellular drug targets. Methods Enzymol.2012.503:3-33).
[0344] U pojedinim primerima izvođenja, polipeptidi koji prodiru u ćelije mogu sadržavati prvi i drugi domen. Prvi domeni mogu sadržavati supernaelektrisane polipeptide. Drugi domeni mogu sadržavati partnera koji se vezuje za proteine. Kao što se ovde upotrebljava, partneri koji vezuju proteine mogu uključivati, ali nisu ograničeni na, antitela i njihove funkcionalne fragmente, skafoldne protein i/ili peptide. Polipeptidi koji prodiru u ćelije mogu dalje sadržavati unutarćelijske partnere za vezivanje za partnere koji vezuju proteine. U pojedinim primerima izvođenja, polipeptidi koji prodiru u ćelije mogu biti u stanju da se izluče iz ćelija gde jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti uvedene.
[0345] Kompozicije predmetnog pronalaska koje sadrže peptide i/ili proteine mogu biti upotrebljene za povećanje transfekcije ćelija i/ili promene biološke distribucije jedinjenja/kompozicije (npr. ciljanim dejstvom na specifična tkiva ili tipova ćelija).
Nosači formulacija: ćelije
[0346] Formulacije jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska zasnovane na ćelijama, mogu biti upotrebljene za osiguravanje ćelijske transfekcije (npr. u ćelijskim nosačima) ili za izmenu biološke distribucije (npr. ciljanim dejstvom ćelijskih nosača na specifična tkiva ili tipove ćelija).
Postupci prenosa ćelija
[0347] U oblasti tehnike su poznati raznovrsni postupci koji su pogodni za uvođenje nukleinskih kiselina ili proteina u ćelije, uključujući tehnike posredovane virusima ili one koje nisu posredovane virusima. Primeri uobičajenih tehnika koje koje nisu posredovane virusima obuhvataju, ali nisu ograničeni na, elektroporaciju, transfer posredovan kalcijum fosfatom, nukleofekciju, sonoporaciju, toplotni udar, magnetofekciju, transfer posredovan lipozomima, mikroinjeciranje, transfer posredovan mikroprojektilima (nanočesticama), transfer posredovan katjonskim polimerima (DEAE-dekstranom, polietileniminom, polietilen glikolom (PEG) i sličnim) ili ćelijsku fuziju.
[0348] Tehnika sonoporacije, ili ćelijske sonikacije, predstavlja upotrebu zvuka (npr. ultrazvučne frekvencije) za modifikovanje propustljivosti ćelijskih plazmatskih membrana. Postupci sonoporacije su poznati stručnjacima i upotrebljavaju se za isporuku nukleinskih kiselina in vivo (Yoon C.S. i saradnici, Ultrasound-mediated gene delivery. Expert Opin Drug Deliv.20107:321-30; Postema M. i saradnici, Ultrasound-directed drug delivery. Curr Pharm Biotechnol.20078:355-61; Newman C.M. i saradnici, Gene therapy progress and prospects: ultrasound for gene transfer. Gene Ther. 2007.
14(6):465-75). Postupci sonoporacije su poznati u oblasti tehnike i takođe su objašnjeni, na primer, kada se odnose na bakterije, u US patentnoj prijavi br. US2010/0196983, a kada se odnose i na druge tipove ćelija u, na primer, US patentnoj prijavi US2010/0009424.
[0349] Tehnike elektroporacije su takođe dobro poznate u oblasti tehnike i koriste se za isporuku nukleinskih kiselina in vivo i klinički (Andre F.M. i saradnici, Nucleic acids electrotransfer in vivo: mechanisms and practical aspects. Curr Gene Ther.201010:267-80; Chiarella P. i saradnici, Application of electroporation in DNA vaccination protocols. Curr Gene Ther. 2010. 10:281-6; Hojman P., Basic principles and clinical advancements of muscle electrotransfer. Curr Gene Ther.201010:128-38). U pojedinim slučajevima, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog opisa mogu biti isporučiti elektroporacijom.
Primena i isporuka
[0350] Jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti primenjeni bilo kojim od standardnih postupaka ili puteva koji su poznati u oblasti tehnike. Ovakvi postupci mogu obuhvatati bilo koji put primene čiji je rezultat terapijski efektivan ishod. Navedeno stoga obuhvata, ali nije ograničeno na, enteralnu, gastroenteralnu, epiduralnu, oralnu, transdermalnu, epiduralnu (periduralnu), intracerebralnu (u veliki mozak), intracerebroventrikularnu (u moždane komore), epikutanu (nanošenje na kožu), intradermalnu, (u samu kožu), supkutanu (ispod kože), nazalnu primenu (kroz nos), intravensku (u venu), intraarterijsku (u arteriju), intramuskularnu (u mišić), intrakardijalnu (u srce), intraosealnu infuziju (u kosnu srž), intratekalnu (u kičmeni kanal), intraperitonealnu, (infuzija ili injekcija u peritoneum), intravezikalnu infuziju, intravitrealnu, (kroz oko), intrakavernoznu injekciju, (u bazu penisa), intravaginalnu primenu, intrauterinu, ekstraamniotsku primenu, transdermalnu (difuzijom kroz intaktnu kožu zarad sistemske distribucije), transmukoznu primenu (difuzijom kroz sluzokožu), insuflaciju (ušmrkavanje), sublingvalnu, sublabijalnu primenu, klistir, kapi za oči (na konjunktivu) ili u vidu kapi za uši. U specifičnim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti primenjeni na načine koji im omogućavaju da prođu kroz krvno-moždanu barijeru, vaskularne barijere ili druge epitelne barijere. Postupci formulisanja i primene mogu obuhvatati bilo koje od onih koji su opisani u US pub. br.
2013/0122007, US pub. br.8,415,459 ili Međunarodnoj pub. br. WO 2011/151432. Neograničavajući načini primene za jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska su opisani u nastavku teksta.
Parenteralna i primena injeciranjem
[0351] U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti primenjivani parenteralno. Tečni dozni oblici za oralnu i parenteralnu primenu obuhvataju, ali nisu ograničeni na, farmaceutski prihvatljive emulzije, mikroemulzije, rastvore, suspenzije, sirupe i/ili eliksire. Pored aktivnih sastojaka, tečni dozni oblici mogu sadržavati inertne razblaživače koji se uobičajeno koriste u oblasti tehnike, kao što su, na primer, voda ili drugi rastvarači, agensi za rastvaranje i emulgatori kao što su etil alkohol, izopropil alkohol, etil karbonat, etil acetat, benzil alkohol, benzil benzoat, propilen glikol, 1,3-butilen glikol, dimetilformamid, ulja (posebno ulja semena pamuka, kikirikija, kukuruza, klica, maslina, ricinusovo i susamovo ulje), glicerol, tetrahidrofurfuril alkohol, polietilen glikoli i esteri masnih kiselina i sorbitana i njihove smeše. Pored inertnih razblaživača, oralne kompozicije mogu sadržavati asjuvanse kao što su agensi za vlaženje, emulgatori i resuspendujući agensi, zaslađivači, arome i/ili agense za miris. U određenim primerima izvođenja za parenteralnu primenu, kompozicije se mešaju sa agensima za solubilizaciju kao što su to CREMOPHOR®, alkoholi, ulja, modifikovana ulja, glikoli, polisorbati, ciklodekstrini, polimeri i/ili njihove kombinacije. U drugim primerima izvođenja, uključeni su i surfaktanti, poput hidroksipropilceluloze.
[0352] Preparati za injeciranje, na primer, sterilne vodene ili uljne suspenzije koje se mogu injecirati, mogu biti formulisani u skladu sa onim što je poznato u oblasti tehnike, upotrebom pogodnih agenasa za dispergovanje, agenasa za vlaženje i/ili agenasa za resuspendovanje. Sterilni preparati za injeciranje mogu biti sterilni rastvori, suspenzije i/ili emulzije koji se mogu injecirati, u netoksičnim, parenteralno prihvatljivim razblaživačima i/ili rastvaračima, na primer, kao što je to rastvor u 1,3-butandiolu. Među prihvatljivim nosačima i rastvaračima koji mogu biti upotrebljeni su voda, Ringerov rastvor, U.S.P. i izotoničan rastvor natrijum hlorida. Sterilna, neisparljiva ulja, takođe se uobičajeno koriste kao rastvarač ili medijum za resuspendovanje. U tu svrhu može biti upotrebljeno bilo koje blago neisparljivo ulje, uključujući sintetske mono- ili digliceride. Masne kiseline, poput oleinske kiseline, mogu biti upotrebljene u pripremi injekcija.
[0353] Formulacije za injeciranje mogu biti sterilisane, na primer, filtracijom kroz filter koji zadržava bakterije i/ili ugradnjom agenasa za sterilizaciju, u obliku sterilnih čvrstih kompozicija koje se mogu rastvoriti ili dispergovati u sterilnoj vodi ili u drugom sterilnom medijumu koji je pogodan za injeciranje, pre upotrebe.
[0354] Da bi se produžilo dejstvo aktivnih sastojaka, često je poželjno usporiti apsorpciju aktivnih sastojaka iz supkutanih ili intramuskularnih injekcija. Ovo se može postići upotrebom tečnih suspenzija kristalnog ili amorfnog materijala sa slabom rastvorljivošću u vodi. Brzina apsorpcije aktivnih sastojaka zavisi od stope rastvaranja koja, zauzvrat, može zavisiti od veličine kristala i kristalnog oblika. Alternativno, odložena apsorpcija parenteralno primenjenog oblika leka se postiže rastvaranjem ili resuspendovanjem leka u uljnom nosaču. Depo oblici za injeciranje se pripremaju obrazovanjem mikrokapsulnih matrica leka u biorazgradivim polimerima poput polilaktid-poliglikolida. U zavisnosti od odnosa leka i polimera, kao i od prirode određenog polimera koji se koristi, brzina oslobađanja leka se može kontrolisati. Primeri drugih biorazgradivih polimera uključuju poli(ortoestre) i poli(anhidride). Depo formulacije za injeciranje se pripremaju “zarobljavanjem” leka u lipozomima ili mikroemulzijama koje su kompatibilne sa telesnim tkivima.
Rektalna i vaginalna primena
[0355] U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti primenjivani rektalno i/ili vaginalno. Kompozicije za rektalnu ili vaginalnu primenu su obično supozitorije koje mogu biti pripremljene mešanjem kompozicija sa odgovarajućim neiritirajućim eksipijensima kao što su kakao puter, polietilen glikol ili vosak za supozitorije, koji su čvrsti na sobnoj temperaturi, ali su tečni na telesnoj temperaturi i stoga se tope u rektumu ili vaginalnoj šupljinu i tako oslobađaju aktivnu supstancu.
Oralna primena
[0356] U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti primenjivani oralno. Čvrsti dozni oblici za oralnu primenu obuhvataju kapsule, tablete, pilule, praškove i granule. U takvim čvrstim doznim oblicima, aktivan sastojak se meša sa najmanje jednim inertnim, farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom poput natrijum citrata ili dikalcijum fosfata i/ili sa ispunjivačima ili ekstenderima (npr. sa skrobovima, laktozom, saharozom, glukozom, manitolom i silicijumskom kiselinom), agensima za povezivanje (npr. karboksimetilcelulozom, alginatima, želatinom, polivinilpirolidinonom, saharozom i akacijom), ovlaživačima (npr. glicerolom), agensima za raspadanje (kao što su npr. agar, kalcijum-karbonat, skrob krompira ili tapioke, alginska kiselina, određeni silikati i natrijum-karbonat), agensima za usporavanje rastvaranja (npr. parafinom), ubrzivačima apsorpcije (npr. kvaternarnim amonijumskim jedinjenjima), agensima za vlaženje (npr. cetil alkoholom i glicerol monostearatom), agensima za apsorpciju (npr. kaolinom i bentonitnom glinom) i lubrikantima (kao što su npr. talk, kalcijum stearat, magnezijum stearat, čvrsti polietilen glikoli, natrijum lauril sulfat) i njihovim smešama. U slučaju kapsula, tableta i pilula, dozni oblik može sadržavati puferska agense.
Topikalna ili transdermalna primena
[0357] Kao što je ovde opisano, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti formulisani za topikalnu primenu. Koža je možda idealno ciljno mesto za isporuku pošto je lako dostupna. Uobičajeno se razmatraju tri puta isporuke jedinjenja i/ili kompozicija predmetnog pronalaska na kožu: (i) topikalna primena (npr. za lokalno/regionalno lečenje i/ili kozmetičke primene); (ii) intradermalna injekcija (npr. za lokalno/regionalno lečenje i/ili kozmetičke primene); i (iii) sistemska isporuka (npr. za lečenje dermatoloških oboljenja koje pogađaju i kožu i regione van kože). Jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti isporučeni na kožu upotrebom nekoliko različitih pristupa koji su poznati u oblasti tehnike.
[0358] U pojedinim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje raznovrsne obloge (npr. obloge za rane) ili zavoje (npr. lepljive zavoje) za pogodno i/ili efektivno sprovođenje postupaka predmetnog opisa. Uobičejne obloge ili zavoji mogu sadržavati dovoljne količine ovde opisanih jedinjenja i/ili kompozicija predmetnog pronalaska, da bi se korisnicima omogućilo izvođenje višestrukih tretmana.
[0359] Dozni oblici za topikalnu i/ili transdermalnu primenu mogu obuhvatati masti, paste, kreme, losione, gelove, praškove, rastvore, sprejeve, inhalante i/ili flastere. U principu, aktivni sastojci se mešaju u sterilnim uslovima sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijentima i/ili sa bilo kojim od potrebnih konzervanasia i/ili pufera. Pored toga, predmetni pronalazak razmatra upotrebu transdermalnih flastera, koji često imaju dodatnu prednost u obezbeđivanju kontrolisane isporuke jedinjenja i/ili kompozicija predmetnog pronalaska u telo. Takvi dozni oblici mogu biti pripremljeni, na primer, rastvaranjem i/ili doziranjem jedinjenja i/ili kompozicija u odgovarajućem medijumu. Alternativno ili dodatno, stope se mogu kontrolisati bilo obezbeđivanjem membrana za kontrolu brzine otpuštanja i/ili dispergovanjem jedinjenja i/ili kompozicija u polimernom matriksu i/ili gelu.
[0360] Formulacije pogodne za topikalnu primenu obuhvataju, ali nisu ograničene na, tečne i/ili polutečne preparate kao što su linimenti, losioni, emulzije tipa ulje-u-vodi i/ili voda-u-ulju, kao što su kreme, masti i/ili paste i/ili rastvori i/ili suspenzije.
[0361] Formulacije za topikalnu primenu mogu, na primer, sadržavati od oko 1% do oko 10% (m/m) aktivnog sastojka, iako koncentracija aktivnog sastojka može biti toliko visoka kolika je granica rastvorljivosti aktivnog sastojka u rastvaraču. Formulacije za topikalnu primenu mogu dalje sadržavati jedan ili više od ovde opisanih dodatnih sastojaka.
Primena u vidu depo-preparata
[0362] Kao što je ovde opisano, u pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska su formulisani u vidu depo-preparata za produženo oslobađanje. U principu, ciljano se deluje na specifične organe ili tkiva („ciljana tkiva“).
[0363] Prema pojedinim aspektima pronalaska, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska sa prostorno zadržavaju unutar ili proksimalno u odnosu na ciljna tkiva. Prijavljeni su stoga postupci obezbeđivanja jedinjenja i/ili kompozicija ciljnim tkivima kod sisarskih subjekata, dovođenjem ciljnih tkiva (koja sadrže jednu ili više ciljnih ćelija) u kontakt sa jedinjenjima i/ili kompozicijama, pod uslovima koji omogućavaju da se u velikoj meri zadrže u ciljnim tkivima, što označava da se najmanje 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9, 99,99 ili više od 99,99% kompozicije zadržava u ciljnim tkivima. Zadržavanje se određuje i merenjem količine jedinjenja i/ili kompozicija koja ulazi u jednu ili više ciljnih ćelija. Na primer, prednost je kada je najmanje 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,9%, 99,99% ili više od 99,99% jedinjenja i/ili kompozicija koje su primenjene subjektima prisutno unutar ćelije u vremenskom periodu nakon primene. Na primer, intramuskularna injekcija sisarskim subjektima se može izvršiti upotrebom vodenih kompozicija koje sadrže jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska i jedan ili više reagensa za transfekciju, a zadržavanje se određuje merenjem količine jedinjenja i/ili kompozicija prisutnih u mišićnim ćelijama.
[0364] Određeni aspekti opisa su usmereni na postupke obezbeđivanja jedinjenja i/ili kompozicija predmetnog pronalaska ciljnim tkivima sisarskih subjekata, dovođenjem ciljnih tkiva (koje sadrže jednu ili više ciljnih ćelija) u kontakt sa jedinjenjima i/ili kompozicijama pod uslovima koji omogućavaju oni se u značajnoj meri zadržavaju u takvim ciljnim tkivima. Jedinjenja i/ili kompozicije sadrže dovoljno aktivnog sastojka tako da se efekat od interesa proizvodi u najmanje jednoj ciljnoj ćeliji. U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije generalno sadrže jedan ili više agenasa za prodiranje u ćelije, mada se takođe razmatraju "gole" formulacije (kao što su one bez agenasa za prodiranje u ćelije ili drugih agenasa), sa ili bez farmaceutski prihvatljivih nosača.
[0365] U pojedinim primerima izvođenja, poželjno je da se poveća količina faktora rasta koja je prisutna u ćelijama u tkivu. Poželjno je i da je ovo povećanje faktora rasta prostorno ograničeno na ćelije unutar ciljnog tkiva. Tako, opisani su i postupci povećanja količine faktora rasta od interesa u tkivima sisarskih subjekata. U pojedinim primerima izvođenja, obezbeđene su formulacije koje sadrže jedinjenja i/ili kompozicije okarakterisane time što je obezbeđena određena jedinična količina za koju je utvrđeno da poizvodi željeni nivo faktora rasta od interesa u značajnom procentu ćelija sadržanih u unapred određenim zapreminama ciljnog tkiva.
[0366] U pojedinim primerima izvođenja, formulacije sadrže mnoštvo različitih jedinjenja i/ili kompozicija, pri čemu jedan ili više njih ciljano deluje na biomolekule od interesa. Opciono, formulacije mogu takođe sadržavati agense za prodiranje u ćelije koji pomažu u unutarćelijskoj isporuci jedinjenja i/ili kompozicija. U takvim primerima izvođenja, određuju se doza jedinjenja i/ili kompozicije koja je potrebna za ciljano dejstvo na biomolekule od interesa u značajnom procentu ćelija sadržanih u unapred određenim zapreminama ciljnog tkiva (u principu, bez ciljnih biomolekula od interesa u susednim ili distalnim tkivima). Utvrđene doze se zatim uvode direktno u tkiva subjekta. U pojedinim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje da se jedinjenja i/ili kompozicije isporučuju u više primena ili primenom podeljene doze.
Primena u pluća
[0367] U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti pripremani, upakovani i/ili prodavani u formulacijama pogodnim za primenu u pluća. U pojedinim primerima izvođenja, takva primenu se vrši putem bukalne šupljine. U pojedinim primerima izvođenja, formulacije mogu sadržavati suve čestice koje sadrže aktivne sastojke. U takvim primerima izvođenja, suve čestice mogu bit prečnika u opsegu od oko 0,5 nm do oko 7 nm ili od oko 1 nm do oko 6 nm. U pojedinim primerima izvođenja, formulacije mogu biti u obliku suvih prahova, za primenu upotrebom uređaja koji sadrže rezervoare sa suvim prahom na koje mogu da budu usmerene struje propelanta za raspršivanje takvog praha. U pojedinim primerima izvođenja mogu biti upotrebljeni spremnici u kojima je prisutan i prah i propelent u vidu rastvarača. U takvim primerima izvođenja, aktivni sastojci mogu biti rastvoreni i/ili resuspendovani u propelentu sa niskom tačkom ključanja, u zaptivenim spremnicima. Takvi prahovi mogu sadržavati čestice u kojima je najmanje 98% čestica po težini sa prečnikom koji je veći od 0,5 nm, a najmanje 95% čestica po broju je prečnika manjeg od 7 nm. Alternativno, najmanje 95% čestica po težini je sa prečnikom većim od 1 nm, a najmanje 90% čestica po broju je prečnika manjeg od 6 nm. Kompozicije suvog praha mogu sadržavati čvrsti razblaživač u vidu finog praha, kao što je to šećer, a pogodno je da su obezbeđene u vidu jediničnih doznih oblika.
[0368] Propelenti niske takčke ključanja obično podrazumevaju propelente sa tačkom ključanja ispod 65 °F na atmosferskom pritisku. U principu, propelenti mogu činiti 50% do 99,9% (m/m) kompozicije, dok aktivni sastojak može činiti 0,1% do 20% (m/m) kompozicije. Propelenti mogu dalje sadržavati dodatne sastojke kao što su tečni nejonski i/ili čvrsti anjonski surfaktant i/ili čvrsti razblaživač (koji mogu imati čestice veličine koja je istog reda kao i čestice koje čine aktivne sastojke).
[0369] Farmaceutske kompozicije formulisane za primenu u pluća mogu obbezbeđivati aktivne sastojke u obliku kapljica rastvora i/ili suspenzije. Takve formulacije mogu biti pripremljene, upakovane i/ili se prodavati kao vodeni i/ili razblaženi alkoholni rastvori i/ili suspenzije, opciono sterilni, koji sadrže aktivne sastojke, a koji se mogu konvencionalno primenjivati upotrebom bilo kojeg uređaja za nebulizaciju i/ili atomizera. Takve formulacije mogu dodatno sadržavati jedan ili više dodatnih sastojaka koji obuhvataju, ali nisu ograničeni na, aromu poput natrijum saharina, isparljivo ulje, puferski agens, površinski aktivan agens i/ili konzervans kao što je metilhidroksibenzoat. Kapljice obezbeđene ovim načinom primene mogu biti prosečnog prečnika u opsegu od oko 0,1 nm do oko 200 nm.
Intranazalna, nazalna i bukalna primena
[0370] U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti primenjivani nazalno i/ili intranazalno. U pojedinim primerima izvođenja, formulacije koje su ovde opisane kao korisne za isporuku u pluća, mogu biti korisne i za intranazalnu primenu. U pojedinim primerima izvođenja, formulacije za intranazalnu primenu sadrže grubi prah koji sadrži aktivni sastojak i sa prosečnim je česticama od oko 0,2 μm do 500 μm. Takve formulacije se primenjuju na način na koji se ušmrkava, tj. brzim udisanjem kroz nosni prolaz iz posude sa prahom koja se drži blizu nosa.
[0371] Formulacije pogodne za nazalnu primenu mogu, na primer, sadržavati malo, kao što je od oko 0,1% (m/m), do čak 100% (m/m) aktivnog sastojka, a mogu sadržavati i jedan ili više od dodatnih sastojaka koji su ovde opisani. Farmaceutska kompozicija mogu biti pripremljene, upakovane i/ili se prodavati u vidu formulacije pogodne za bukalnu primenu. Takve formulacije mogu, na primer, biti u obliku tableta i/ili pastila napravljenih uobičajenim postupcima, a mogu, na primer, 0,1% do 20% (m/m) aktivnog sastojka, pri čemu se pazi na ravnotežu oralnog rastvaranja i/ili razgradivosti kompozicije, kao i jedan ili više od dodatnih sastojaka koji su ovde opisani. Alternativno, formulacije pogodne za bukalnu primenu mogu sadržavati praškove i/ili aerosolizovane i/ili atomizovane rastvore i/ili suspenzije koji sadrže aktivne sastojke. Takve praškaste, aerosolizovane i/ili aerosolizovane formulacije, kada se rasprše, mogu sadržavati čestice i/ili kapljice prosečne veličine koja je opsega od oko 0,1 nm do oko 200 nm, a mogu dalje sadržavati jedan ili više od bilo kojih dodatnih sastojaka koji su ovde opisani.
Oftamološka ili ušna primena
[0372] U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti pripremljeni, upakovani i/ili se prodavati u formulacijama pogodnim za oftalmološku i/ili ušnu primenu. Takve formulacije mogu, na primer, biti u obliku kapi za oči i/ili uši, uključujući, na primer, 0,1/1,0% (m/m) rastvor i/ili suspenziju aktivnog sastojka u vodenom i/ili uljnom tečnom ekscipijensu. Takve kapi mogu dalje sadržavati puferska agense, soli i/ili jedan ili više od bilo kojih dodatnih sastojaka koji su ovde opisani. Ostale formulacije koje se mogu primeniti i oftamološki su korisne, obuhvataju one koje sadrže aktivne sastojke u mikrokristalnom obliku i/ili u lipozomskim preparatima. Subretinalni umeci takođe mogu biti upotrebljeni kao oblici za primenu.
Primenjivanje korisnih supstanci: agensi koji se mogu detektovati i terapijski agensi
[0373] U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti upotrebljeni u brojnim različitim scenarijima u kojima je poželjna isporuka supstance („korisnog tereta“) do biološkog cilja, na primer, isporuka supstanci koje se mogu detektovati radi detekcije ciljnog molekula, ili isporuka terapijskih i/ili dijagnostičkih agenasa. Potupci detekcije mogu obuhvatati, ali nisu ograničeni na, i in vitro i in vivo postupke snimanja, npr. imunohistohemiju, bioluminiscentno snimanje (BLI), snimanje magnetnom rezonancijom (MRI), pozitronsku emisionu tomografiju (PET), elektronsku mikroskopiju, rendgensku kompjuterizovanu tomografiju, Ramanovo snimanje, optičku koherentnu tomografiju, apsorpciono snimanje, termičko snimanje, snimanje fluorescentnom reflektancijom, fluorescentnu mikroskopiju, fluorescentno molekulsko tomografsko snimanje, snimanje nuklearnom magnetnom rezonancijom, rendgensko snimanje, ultrazvučno snimanje, fotoakustično snimanje, laboratorijske testove ili bilo koju situaciju u kojoj potrebno obeležavanje/bojenje/snimanje.
[0374] U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije mogu biti dizajnirani tako da sadrže i linkere i koristne supstance, u bilo kojoj korisnoj orjentaciji. Na primer, kod linkera se mogu upotrebiti oba kraja, jedan kraj za vezivanje za korisnu supstancu i drugi kraj za vezivanje za jedinjenja i/ili kompozicije. Jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu sadržavati više od jedne korisne supstance. U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije mogu sadržavati jedan ili više linkera koji se mogu cepati. U pojedinim primerima izvođenja, korisni tereti mogu biti vezani za jedinjenja i/ili kompozicije preko linkera i mogu biti fluorescentno obeleženi u svrhu in vivo praćenje, npr. unutar ćelije.
[0375] U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti upotrebljeni u reverzibilnoj isporuci lekova u ćelije.
[0376] Jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti upotrebljeni i za ciljano usmeravanje korisnih supstanci unutar ćelije, npr. agenasa koji se mogu detektovati ili terapijskih agenasa, do specifičnih organela. Pored toga, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti upotrebljeni za isporuku terapijskih agenasa do ćelija ili tkiva, npr. kod živih životinja. Na primer, ovde opisana jedinjenja i/ili kompozicije mogu biti upotrebljeni za isporuku hemoterapijskih agenasa za ubijanje kancerskih ćelija. Jedinjenja i/ili kompozicije mogu biti vezani za terapijske agense preko jednog ili više linkera koji mogu olakšati prodiranje kroz membranu, omogućavajući time da terapijski agensi putuju u ćelije i stignu do ciljnih mesta unutar ćelije.
[0377] U pojedinim primerima izvođenja, korisan teret može biti terapijski agens poput citotoksina, radioaktivnih jona, hemoterapeutika ili drugih terapijskih agenasa. Citotoksini i/ili citotoksični agensi mogu obuhvatati bilo koje agense koja mogu biti štetni za ćelije. Primeri obuhvataju, ali nisu ograničeni na, taksol, citohalazin B, gramicidin D, etidijum bromid, emetin, mitomicin, etopozid, tenipozid, vinkristin, vinblastin, kolhicin, doksorubicin, daunorubicin, dihidroksiantracin dion, mitoksantron, mitramicin, aktinomicin D, 1-dehidrotestosteron, glukokortikoide, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol, puromicin, majtanzinoide, npr. majtanzinol (pogledati U.S. pat. br.5,208,020), rahelmicin (CC-1065, pogledati U.S. pat. br. 5,475,092; 5,585,499, i 5,846,545) i njihove analoge ili homologe. Radioaktivni joni obuhvataju, ali nisu ograničeni na, jod (npr.<125>jod ili<131>jod),<89>stroncijum, fosfor, paladijum, cezijum, iridijum, fosfat, kobalt,<90>itrijum,<153>samarijum i prazeodimijum. Ostali terapijski agensi obuhvataju, ali nisu ograničeni na, antimetabolite (npr. metotreksat, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, citarabin, 5-fluorouracil dekarbazin), alkilirajuće agense (npr. mehloretamin, tiotepa hlorambucil, rahelmicin (CC-1065) melfalan, karmustin (BSNU), lomustin (CCNU), ciklofosfamid, busulfan, dibromomanitol, streptozotocin, mitomicin C i cis-dihlorodiamin platinu (II) (DDP) cisplatin), antracikline (npr. daunorubicin (ranije daunomicin) i doksorubicin), antibiotike (npr. daktinomicin (ranije aktinomicin), bleomicin, mitramicin i antramicin (AMC)) i antimitotske agense (npr. vinkristin, vinblastin, taksol i majtanzinoide).
[0378] U pojedinim primerima izvođenja, korisne supstance mogu biti agensi koji se mogu detektovati, poput različitih organskih malih molekula, neorganskih jedinjenja, nanočestica, enzima ili enzimskih supstrata, fluorescentnih materijala, luminiscentnih materijala (npr. luminola), bioluminiscentnih materijala (npr. luciferaze, luciferina i ekvorina), hemiluminescentnih materijala, radioaktivnih materijala (npr.<18>F,<67>Ga,<81m>Kr,<82>Rb,<111>In,<123>I,<133>Xe,<201>T1,<125>I,<35>S,<14>C,<3>H ili<99m>Tc (npr. poput pertehnetata (tehnetat(VII), TcO4-)) i kontrastnih agenasa (npr. zlata (npr. nanočestica zlata), gadolinijuma (npr. heliranog Gd), oksida gvožđa (npr. superparamagnetnog oksida gvožđa (SPIO), monokristalnih nanočestica oksida gvožđa (MION) i ultra malog superparamagnetnog oksida gvožđa (USPIO)), helata mangana (npr. Mn-DPDP), barijum sulfata, jodiranih kontrastnih medijuma (ioheksola), mikromehurići ili perfluorokarbona). Takve obeleživači koji se mogu detektovati obuhvataju, na primer, bez obraničavanja samo na, 4-acetamido-4'-izotiocijanatostilben-2,2'disulfonsku kiselinu; akridin i derivate (npr. akridin i akridin izotiocijanat); 5-(2'-aminoetil)aminonaftbalen-1-sulfonsku kiselinu (EDANS); 4-amino-N-[3-vinilsulfonil)fenil]naftalimid-3,5 disulfonat; N-(4-anilino-1-naftil)maleimid; antranilamid; BODIPY; brilijantno žutu; kumarin i derivate (npr. kumarin, 7-amino-4-metilkumarin (AMC, Kumarin 120) i 7-amino-4-trifluorometilkumarin (Kumarin 151)); cijaninske boje; cijanozin; 4',6-diaminidino-2-fenilindol (DAPI); 5' 5"-dibromopirogalol-sulfonaftalein (bromopirogalol crvenu); 7-dietilamino-3-(4'-izotiocijanatofenil)-4-metilkumarin; dietilentriamin pentaacetat; 4,4'-diizotiocijanatodihidro-stilben-2,2-disulfonsku kiselinu; 4,4'-diizotiocijanatostilbene-2,2'-disulfonsku kiselinu; 5-[dimetilamino]naftalen-1-sulfonil hlorid (DNS, danzilhlorid); 4-dimetilaminofenilazofenil-4'-izotiocijanat (DABITC); eozin i derivate (npr. eozin i eozin izotiocijanat); eritrozin i derivate (npr. eritrozin B i eritrozin izotiocijanat); etidijum; fluorescein i derivate (npr.5-karboksifluorescein (FAM), 5-(4,6-dihlorotriazin-2-il) aminofluorescein (DTAF), 2',7'-dimetoksi-4' 5'-dihloro-6-karboksifluorescein, fluorescein, fluorescein izotiocijanat, X-rodamin-5-(i -6)-izotiocijanat (QFITC ili XRITC) i fluorescamin); 2-[2-[3-[[1,3-dihidro-1,1-dimetil-3-(3-sulfopropil)-2H-benz[e]indol-2-iliden]etiliden]-2-[4-(etoksikarbonil)-1-piperazinil]-1-ciklopenten-1-il]etenil]-1,1-dimetil-3-(3-sulfopropil)-1H-benz[e]indolijum hidroksid, unutrašnju so, jedinjenje sa n,n-dietiletan-aminom (1:1) (IR144); 5-hloro-2-[2-[3-[(5-hloro-3-etil-2(3H)-benzotiazol-iliden)etiliden]-2-(difenilamino)-1-ciklopenten-1-il]etenil]-3-etil benzotiazolijum perhlorat (IR140); Malahit zeleni izotiocijanat; 4-metilumbeliferon ortokrezolftalein; nitrotirozin; pararozanilin; Fenol crveno; B-fikoeritrin; o-ftaldialdehid; piren i derivate (npr. piren, piren butirat i sukcinimidil 1-piren); butiratne kvantne tačke; Reaktivno crvenu 4 (CIBACRON™ briljantna crvena 3B-A); rodamin i derivate (npr.6-karboksi-X-rodamin (ROX), 6-karboksirodamin (R6G), lizamin rodamin B sulfonil hlorid rodarnin (Rhod), rodamin B, rodamin 123, rodamin X izotiocijanat, sulforhodamin B, sulforhodamin 101, derivat sulfonil hlorida sulforhodamina 101 (Teksas crveno), N,N,N',N'tetrametil-6-karboksirodamin (TAMRA) tetrametil rodamin i tetrametil rodamin izotiocijanat (TRITC)); riboflavin; rozolnu kiselinu; derivate terbijum helata; cijanin-3 (Cy3); cijanin-5 (Cy5); cijanin-5,5 (Cy5.5), cijanin-7 (Cy7); IRD 700; IRD 800; Aleka 647; La Jolta plavo; ftalo cijanin; i naftalo cijanin.
[0379] U pojedinim primerima izvođenja, agens koji se može detektovati može biti u vidu prekursora koji se ne može detektovati, a koji postaje detektabilan nakon aktivacije (npr. to su konstrukti fluorogenog tetrazina i fluorofora (npr. tetrazin-BODIPY FL, tetrazin-Oregon Green 488 ili tetrazin-BODIPY TMR-X) ili fluorogeni agensi koji se aktiviraju enzimima (npr. PROSENSE® (VisEn Medical)). In vitro testovi u kojima mogu biti upotrebljene kompozicije obeležene enzimima obuhvataju, ali nisu ograničeni na, imunosorbentne testove povezane sa enzimima (ELISA), imunoprecipitacione testove, imunofluorescenciju, enzimske imunotestove (EIA), radioimunoeseje (RIA) i imunoblot analizu.
Kombinacije
[0380] U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti upotrebljeni u kombinaciji sa jednim ili više drugih terapijskih, profilaktičkih, dijagnostičkih ili agenasa za snimanje. Nije predviđeno da izraz "u kombinaciji sa" podrazumeva da agensi moraju biti primenjeni u isto vreme i/ili da budu formulisani zajedno radi isporuke, iako su ovakvi postupci isporuke obuhvaćeni obimom predmentog opisa. Jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti primenjivani istovremeno sa, pre ili nakon jednog ili više drugih željenih terapijskih ili medicinskih postupaka. U principu, svaki agens će biti primenjivan u dozi i/ili prema vremenskom rasporedu koji je utvrđen za taj agens. U pojedinim primerima izvođenja, predmetni opis obuhvata isporuku farmaceutskih, profilaktičkih, dijagnostičkih ili kompozicija za snimanja u kombinaciji sa agensima koji mogu poboljšati njihovu bioraspoloživost, smanjiti i/ili modifikovati njihov metabolizam, inhibirati njihovo izlučivanje i/ili modifikovati njihovu distribuciju unutar tela.
[0381] U pojedinim slučajevima, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska se mogu kombinovati sa jednim ili sa više terapijskih agenasa koji su poznati u oblasti tehnike. Takvi agensi mogu obuhvatati BYM338 (Novartis, Bazel, Švajcarska), pri čemu primena može obuhvatati bilo koji od postupaka koji je opian u kliničkom ispitivanju broj NCT01925209 pod nazivom Efficacy and Safety of Bimagrumab/BYM338 at 52 Weeks on Physical Function, Muscle Strength, Mobility in sIBM Patients (RESILIENT). Ostali agensi koji mogu biti upotrebljeni u kombinaciji sa jedinjenjima i/ili kompozicijama predmetnog pronalaska mogu obuhvatati bilo koji od onih koji su opisani u US pub. br.2013/0122007, US pat. br.8,415,459 ili Međunarodnoj pub. br. WO 2011/151432.
Doziranje i dozni oblici
[0382] Predmetni opis obuhvata isporuku jedinjenja i/ili kompozicija predmetnog pronalaska za bilo koju od terapijskih, farmaceutskih, dijagnostičkih ili primena u svrhu snimanja, na bilo koji odgovarajući način, uzimajući u obzir verovatni napredak u naukama o isporuci lekova. Isporuka može biti isporuka supstance samostalno ili formulacije.
Isporuka bez eksipijenasa
[0383] Jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti isporučeni ćelijama, tkivima, organima i/ili organizmima bez eksipijenasa. Kao što se ovde upotrebljava, izraz "bez eksipijenasa" se odnosi na jedinjenja i/ili kompozicije isporučene bez agenasa ili modifikacija koje pospešuju transfekciju ili propustljivost. Jedinjenja i/ili kompozicije bez eksipijenasa mogu biti dostavljeni ćelijma, tkivima, organima i/ili organizmima upotrebom puteva primene koji su poznati u oblasti tehnike i opisani ovde. U pojedinim primerima izvođenja, ovakva isporuka može uključivati formulacije u jednostavnom puferu kao što je fiziološki rastvor ili PBS.
Isporuka u formulacijama
[0384] U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti formulisani, upotrebom postupaka koji su ovde opisani. Formulacije mogu sadržavati jedinjenja i/ili kompozicije koji mogu biti modifikovani i/ili nemodifikovani. Formulacije mogu dalje obuhvatati, ali nisu ograničene na, agense za prodiranje u ćelije, farmaceutski prihvatljive nosače, agense za isporuku, bioerodibilne ili biokompatibilne polimere, rastvarače i/ili depoe za isporuku sa odloženim oslobađanjem. Formulacije predmetnog pronalaska mogu biti isporučene ćelijama upotrebom načina primene koji su poznati u oblasti tehnike i ovde opisani.
[0385] Kompozicije mogu takođe biti formulisane za direktnu isporuku do organa i tkiva na bilo koji od nekoliko načina koji su poznati u oblasti tehnike, uključujući, ali ne ograničavajući se na, direktno potapanje ili kupanje, putem katetera, gelovima, prahom, mastima, kremama, gelovima, losionima i/ili kapima, upotrebom podloga kao što su tkanina ili biorazgradivi materijali prevučeni ili impregnirani kompozicijama i slično.
Doziranje
[0386] Predmenti opis obezbeđuje postupke koji obuhvataju primenu jednog ili više od jedinjenja i/ili kompozicija, subjektima kojima je to potrebno. Jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska, ili njihove profilaktičke kompozicije, mogu biti primenjivani subjektima upotrebom bilo koje količine i bilo kog načina primene koji je efektivan za prevenciju, lečenje, postavljanje dijagnoze ili snimanje oboljenja, poremećaja i/ili stanja. Tačna količina koja je potrebna će varirati od subjekta do subjekta, u zavisnosti od vrste, starosti i/ili opšteg stanja subjekta, ozbiljnosti oboljenja, konkretne kompozicije koja se primenjuje, njenog načina primene, načina aktivnosti i sličnog. Kompozicije u skladu sa pronalaskom su obično formulisane u jediničnim doznim oblicima radi lakše primene i ujednačenosti primenjenih doza. Podrazumeva se, međutim, da će ukupna dnevna doza kompozicije predmetnog pronalaska biti određena od strane ordinirajućeg lekara, a u okvirima dobre medicinske prakse. Specifičan terapijski efektivan, profilaktički efektivan ili odgovarajući nivo doze za snimanja, za svakog određenog pacijenta će zavisiti od raznovrsnih faktora, uključujući poremećaj koji se leči i ozbiljnost poremećaja; aktivnost određenog specifičnog jedinjenja koje se koristi; specifičnu kompoziciju koja se koristi; starost, telesnu težinu, opšte zdravstveno stanje, pol i ishranu pacijenta; vreme primene, način primene i stopu izlučivanja određenog jedinjenja koje se koristi; trajanje lečenja; lekove koji se koriste u kombinaciji ili istovremeno sa određenim jedinjenjem koje se koristi; i slične faktore koji su dobro poznati u oblasti medicine.
[0387] U određenim primerima izvođenja, kompozicije u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu biti primenjene u doznim nivoima koji su dovoljni za isporuku od oko 0,0001 mg/kg do oko 100 mg/kg, od oko 0,01 mg/kg do oko 50 mg/kg, od oko 0,1 mg/kg do oko 40 mg/kg, od oko 0,5 mg/kg do oko 30 mg/kg, od oko 0,01 mg/kg do oko 10 mg/kg, od oko 0,1 mg/kg do oko 10 mg/kg, ili od oko 1 mg/kg do oko 25 mg/kg telesne težine subjekta po danu, jedan ili više puta dnevno, da bi se postigao željeni terapijski, dijagnostički, profilaktički ili efekat prilikom medicinskog snimanja. Željena doza može biti isporučena tri puta dnevno, dva puta dnevno, jednom dnevno, svaki drugi dan, svaki treći dan, svake nedelje, na svake dve nedelje, na svake tri nedelje ili na svake četiri nedelje. U određenim primerima izvođenja, željena doza može biti isporučena upotrebom višestrukih primena (npr. sa dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest, četrnaest ili više primena).
[0388] Prema predmetnom pronalasku, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska se mogu primenjivati u režimima podeljene doze. Kao što se ovde upotrebljava, "podeljena doza" je kada se jednokratna jedinična doza ili ukupna dnevna doza raspodeli u dve ili više doza, npr. u dve ili više primena do te jedne jedinične doze. Kao što se ovde upotrebljava, "jednokratna jedinična doza" je doza bilo kog terapeutika koja je primenjuje u jednoj dozi/odjednom/jednim načinom primene/jednom tačkom kontakta, tj. u vidu jednog događaja primene. Kao što se ovde upotrebljava, „ukupna dnevna doza“ je količina koja se daje ili propisuje u periodu od 24 sata. U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti primenjeni kao jednokratna jedinična doza. U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti primenjeni subjektima u podeljenim dozama. U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti formulisani samo u puferu ili u formulacijama koje su ovde opisane. Farmaceutske kompozicije koje su ovde opisane mogu biti formulisane u dozne oblike koji su ovde opisani, kao što su to oblici za topikalnu, intranazalnu, intratrahealnu ili primenu injeciranjem (npr. intravenski, intraokularno, intravitrealno, intramuskularno, intrakardijalno, intraperitonealno, supkutano). Opšta razmatranja formulacija i/ili proizvodnje farmaceutskih agenasa se mogu naći, na primer, u Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21. izd., Lippincott Williams & Wilkins, 2005 (ovde uključenom u vidu reference).
Premazi ili obloge
[0389] Čvrsti dozni oblici tipa tableta, dražeja, kapsula, pilula i granula mogu biti pripremljeni sa premazima ili oblogama poput enteričke obloge i drugih obloga koje su dobro poznate u oblasti farmaceutskog formulisanja. One opciono mogu sadržavati agense za opacifikaciju i mogu biti takvog sastava da oslobađaju smo aktivan sastojak (aktivne sastojke), ili poželjno, da to čine u određenom delu crevnog trakta, a opciono, na odložen način. Primeri kompozicija koje mogu biti upotrebljene za takvo ugrađivanje su polimerne supstance i voskovi. Čvrste kompozicije sličnog tipa mogu biti upotrebljeni kao ispunjivači u mekim i tvrdo napunjenim želatinskim kapsulama, upotrebom takvih eksipijenasa kao što su to laktoza i/ili mlečni šećer, kao i polietilen glikoli velike molekulske težine i slično.
Testovi
[0390] U pojedinim slučajevima, rekombinantni proteini (uključujući, ali ne ograničavajući se na, himerne proteine) koji su ovde opisani, i/ili antitela usmerena na takve proteine, mogu biti detektovani upotrebom testova koji su ovde opisani. U pojedinim slučajevima, rekombinantni proteini (uključujući, ali ne ograničavajući se na, himerne proteine) koji su ovde opisani, i/ili antitela usmerena na takve proteine, mogu biti upotrebljeni u testovima za detektovanje drugih rekombinantnih proteina i/ili antitela predmetnog opisa.
Testovi vezivanja
[0391] U pojedinim primerima izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje testove vezivanja. Kao što se ovde upotrebljava, termin "test vezivanja" se odnosi na test koji se koristi za procenu sposobnosti povezivanja dva ili više faktora. Takvi testovi mogu procenjivati sposobnost željenog antigena da se vezuje za željeno antitelo, a zatim upotrebljavati jedan ili više postupaka detekcije za detektovanje vezivanja. Testovi vezivanja pronalaska mogu obuhvatati, ali nisu ograničene na, testove zasnovane na površinskoj plazmonskoj rezonanci, ELISA i FACS postupcima. Testovi vezivanja pronalaska mogu uključivati upotrebu jednog ili više od ovde opisanih rekombinantnih proteina, uključujući, ali ne ograničavajući se na, bilo koji protein iz TGF-β familije, bilo koji himerni protein, bilo koji kofaktor i bilo koji njihov modul, kombinaciju ili fragment.
Testovi zasnovani na ćelijama
[0392] U pojedinim primerima izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje testove zasnovane na ćelijama. Kao što se ovde upotrebljava, termin "test zasnovan na ćelijama" se odnosi na test koji obuhvata najmanje jedan aspekt koji uključuje upotrebu žive ćelije ili ćelijske kulture. U pojedinim primerima izvođenja, ovi mogu biti korisni za procenu modulacije oslobađanja faktora rasta iz GPC i stoga su ovde označeni kao "testovi oslobađanja faktora rasta". U pojedinim primerima izvođenja, testovi zasnovani na ćelijama mogu biti korisni za procenu modulacije aktivnosti faktora rasta i stoga su ovde označeni kao "testovi aktivnosti faktora rasta". Testovi zasnovani na ćelijama predmetnog pronalaska mogu uključivati ekspresione ćelije i/ili reaktivne ćelije. Ekspresione ćelije, kako su ovde označene, predstavljaju ćelije koje eksprimiraju jedan ili više faktora koji se analiziraju u određenom testu. Takva ekspresija može biti priroda ili može rezultat transfekcije i/ili transdukcije stranog gena. U pojedinim primerima izvođenja, ekspresija jednog ili više faktora od strane ekspresionih ćelija se može poboljšati ili suprimirati dodavanjem jednog ili više egzogenih faktora. U pojedinim primerima izvođenja, ekspresione ćelije mogu predstavljati ćelijske linije (npr. HEK293 ćelije, CHO ćelije, TMLC ćelije, 293T/17 ćelije, Hs68 ćelije, CCD1112sk ćelije, HFF-1 ćelije, keloidne fibroblaste ili Sw-480 ćelije.) U pojedinim primerima izvođenja, ćelijske linije koje uključuju ekspresione ćelije mogu eksprimirati jedan ili više rekombinantnih proteina predmetnog opisa (npr. prirodno i/ili putem transfekcije, stabilne transfekcije i/ili transdukcije).
[0393] U pojedinim primerima izvođenja, testovi oslobađanja/aktivnosti faktora rasta mogu uključivati ekspresione ćelije koje eksprimiraju GPC. U takvim primerima izvođenja, dodatni faktori mogu biti koeksprimirani u i/ili ku kombinovani sa ekspresionim ćelijama da bi se utvrdio njihov efekat na oslobađanje faktora rasta iz takvih GPC. U pojedinim primerima izvođenja, integrini (uključujući, ali ne ograničavajući se na, αvβ6integrin, αvβ8integrin i/ili α9β1integrin) su istovremeno eksprimirani i/ili na drugi način uvedeni u ekspresione ćelije koje eksprimiraju GPC. U pojedinim primerima izvođenja, takva dodatna ekspresija integrina može olakšati oslobađanje faktora rasta. U pojedinim primerima izvođenja, LTBP, fibrilini i/ili GARP i/ili njihove varijante se koeksprimiraju i/ili na drugi način uvode u ekspresione ćelije.
[0394] U pojedinim primerima izvođenja, jedan ili više gena mogu biti nokautirani, utišani i/ili na drugi način modulisani u ekspresionim ćelijama, u zavisnosti od fokusa određenog testa. U pojedinim primerima izvođenja, jedan ili više genskih proizvoda mogu biti modulisani na nivou RNK i/ili proteina. U pojedinim primerima izvođenja, genski proizvodi može biti smanjen putem uvođenja molekula siRNK u ekspresione ćelije. U pojedinim primerima izvođenja, genski proizvodi LTBP, fibrilinskog i/ili GARP gena mogu biti smanjeni i/ili eliminisati iz ekspresionih ćelija predmetnog pronalaska.
[0395] Testovi na bazi ćelija predmetnog pronalaska, uključujući, ali ne ograničavajući se na, testove oslobađanja/aktivnosti faktora rasta, mogu sadržavati ćelije koje reaguju. Kao što se ovde upotrebljava, termin "ćelija koja reaguje" se odnosi na ćeliju u kojoj dolazi do odgovora na jedan ili više faktora uvedenih u test. U pojedinim primerima izvođenja, takvi odgovori mogu obuhvatati promenu u ekspresiji gena, pri čemu takve ćelije modulišu transkripciju jednog ili više gena nakon kontakta sa jednim ili više uvedenih faktora. U pojedinim primerima izvođenja, ćelije koje reaguju se mogu podvrgavati promeni u fenotipu, ponašanju i/ili vijabilnosti.
[0396] U pojedinim primerima izvođenja, reaktivne ćelije sadrže jedan ili više reporterskih gena. Kao što se ovde upotrebljava, termin "reporterski gen" se odnosi na sintetski gen koji obično sadrži promotor i kodirajući region proteina koji kodira jedan ili više genskih proizvoda koji se mogu detektovati. Reporterski geni su obično dizajnirani na takav način da njihova ekspresija može biti modulisana u odgovoru na jedan ili više faktora koji se analiziraju određenim testom. Navedeno može biti sprovedeno manipulisanjem promotora reporterskog gena. Kao što se ovde upotrebljava, termin promotor se odnosi na deo gena koji inicira transkripciju tog gena. Promotori obično sadrže nukleotide na 3 'kraju antisens lanca datog gena i ne prepisuju se tokom genske ekspresije. Promotori obično funkcionišu interakcijom sa jednim ili sa više transkripcionih faktora, kao i sa RNK polimeraznim enzimima, da bi se pokrenula transkripcija dela gena koji kodira protein. Segmenti promotora koji fizički interaguju sa jednim ili sa više transkripcionih faktora i/ili polimeraznih enzima, ovde su označeni kao elementi odgovora. U pojedinim primerima izvođenja, reporterski geni su dizajnirani tako da sadrže promotore i/ili elemente odgovora za koje je poznato da reaguju na jedan ili više faktora (uključujući, ali ne ograničavajući se na, faktore rasta) koji se analiziraju u datom testu. Promene u genskoj ekspresiji ćelija koje reaguju mogu biti izmerene bilo kojim postupcima koji su dostupni u oblasti tehnike za dobijanje podataka o genskoj ekspresiji. Takvi podaci o genskoj ekspresiji mogu biti dobijeni u obliku podataka o aktivnosti luciferaze [često merenoj u vidu relativnih svetlosnih jedinica (RLU).]
[0397] U pojedinim slučajevima, reaktivne ćelije prolaze kroz promenu u vijabilnosti kao odgovor na jedan ili više faktora uvedenih u test. Takve reaktivne ćelije mogu biti upotrebljene u testovima proliferacije, kao što je ovde opisano. Promene u vijabilnosti reaktivnih ćelija mogu biti detektovane brojanjem ćelija i/ili drugim postupcima koji su pozanti stručnjacima iz oblasti tehnike za dobijanje podataka o vijabilnosti reaktivnih ćelija.
[0398] Regioni reporterskih gena koji kodiraju protein obično kodiraju jedan ili više proteina koji se mogu detektovati. Proteini koji se mogu detektovati se odnose na sve proteine koji su u stanju da budu detektovani upotrebom jednog ili više postupaka koji su poznati u oblasti tehnike. Takvi postupci detekcije mogu obuhvatati, ali nisu ograničeni na, imunoblot, ELISA, postupak ispitivanja enzimske aktivnosti detektabilnih proteina (npr. katalazne aktivnosti, aktivnosti β-galaktozidaze i/ili luciferazne aktivnosti,) imunocitohemijsku detekciju, detekciju površinskom plazmonskom rezonancijom i/ili detekciju fluorescentnih proteina koji se mogu detektovati. Kada se reporterski gen koristi u testu, ekspresija proteina koji se mogu detektovati je u korelaciji sa sposobnošću faktora koji se analiziraju da aktiviraju promotor koji je prisutan u reporterskom genu. U primerima izvođenja koje uključuju testove oslobađanja/aktivnosti faktora rasta, promotori reporterske gena obično reaguju na signalizaciju faktora rasta. U takvim primerima izvođenja, nivo proizvedenog proteina koji se može detektovati je u korelaciji sa nivoom signalizacije faktora rasta, što ukazuje na oslobađanje i/ili aktivnost datog faktora rasta.
[0399] U pojedinim primerima izvođenja, reporterski geni kodiraju luciferazne enzime. Hemijske reakcije između luciferaznih enzima i molekula supstrata su reakcije koje emituju svetlost. Usled takvih reakcija koje emituju svetlost, nivo luciferaznih enzima može biti kvantifikovan dodavanjem molekula supstrata i naknadnom fotodetekcijom emitovane svetlosti. U pojedinim primerima izvođenja, reporterski geni predmetnog pronalaska kodiraju luciferazu svica, čija je sekvenca klonirana iz Photinus pyralis. U pojedinim primerima izvođenja, reaktivne ćelije predmetnog pronalaska sadrže reporterske gene koji eksprimiraju luciferazu sa promotorima koji reaguju na faktore rasta. U takvim primerima izvođenja, luciferazna aktivnost može biti u korelaciji sa nivoima aktivnosti faktora rasta, što omogućava utvrđivanje aktivnosti faktora rasta i/ili oslobađanje iz GPC.
[0400] U pojedinim primerima izvođenja, reporterski geni se insertuje u bakterijske plazmide da bi se omogućila replikacija i/ili olakšalo uvođenje u ćelije. U pojedinim primerima izvođenja, takvi plazmidi su dizajnirani tako da sadrže sekvence koje kodiraju genske proizvode koji se mogu detektovati i mogu biti manipulisani tako da se insertuju promotorske sekvence koje mogu biti reaktivne na jedan ili više faktora od interesa. Ovakvi plazmidi se ovde označavaju kao reporterski plazmidi. U pojedinim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, promotori koji mogu reagovati na jedan ili više faktora od interesa, mogu biti insertovani u reporterske plazmide, uzvodno od sekvenci koje kodiraju genske proizvode koji se mogu detektovati, a da bi se obrazovali funkcionalni reporterski geni unutar takvih reporterskih plazmida. Reporterski plazmidi koji sadrže najmanje jedan funkcionalan reporterski gen su ovde označeni kao reporterski konstrukti. U pojedinim primerima izvođenja, reporterski konstrukti predmetnog pronalaska mogu sadržavati pGL2 reporterske plazmide (Promega BioSciences, LLC, Madison, WI), pGL3 reporterske plazmide (Promega BioSciences, LLC, Madison, WI), pGL4 reporterske plazmide (Promega BioSciences, LLC, Madison, WI) ili njihove varijante. Takvi reporterski konstrukti eksprimiraju luciferazu svica kao odgovor na aktivaciju promotora.
[0401] U pojedinim primerima izvođenja, reporterski konstrukti mogu biti uvedeni direktno u ekspresione ćelije ili mogu biti uvedeni u jednu ili više ćelija koje reaguju. Ćelije predmetnog pronalaska koje su reaktivne i sadrže jedan ili više reporterskih gena, ovde su označene kao reporterske ćelije. U pojedinim primerima izvođenja, reporterske ćelije mogu biti tranzijentno transfektovane sa reporterskim konstruktima ili mogu biti sa stabilnom ekspresijom takvih konstrukata (npr. reporterski konstrukti se uspešno replikuju zajedno sa genomskom DNK tokom svakog ciklusa ćelijske deobe). Ćelijske linije koje stabilno sadrže reporterske konstrukte, ovde su ozančene kao reporterske ćelijske linije. U pojedinim primerima izvođenja, reporterske ćelije su sisarske. U pojedinim primerima izvođenja, reporterske ćelije mogu obuhvatati ćelije miša, ćelije zeca, ćelije pacova, ćelije majmuna, ćelije hrčka i ćelije čoveka. U pojedinim primerima izvođenja, ćelijske linije korisne za tranzijentnu i/ili stabilnu ekspresiju reporterskih gena mogu obuhvatati, ali nisu ograničene na, HEK293 ćelije, HeLa ćelije, Sw-480 ćelije, TMLC ćelije [kao što su opisali Abe i saradnici (Abe M. i saradnici, An assay for transforming growth factor-β using cells transfected with a plasminogen activator inhibitor-1 promoter-luciferase construct. Analytical Biochemistry. 1994.
216:276-84,)] 293T/17 ćelije, Hs68 ćelije, CCD1112sk ćelije, HFF-1 ćelije, keloidne fibroblaste, A204 ćelije, L17 RIB ćelije [kao što su to opisali Cash i saradnici (Cash J.N i saradnici, The structure of myostatin:follistatin 288: insights into receptor utilization and heparin binding. The EMBO Journal.
2009.28:2662-76,)] C2C12ćelije i EL4 T limfomske ćelije.
[0402] U primerima izvođenja gde se koristi jedna ili više reporterskih ćelija i/ili reporterskih ćelijskih linija, takve ćelije mogu biti kultivisane sa ekspresionim ćelijama kao deo sistema kokulture. U pojedinim primerima izvođenja, reporterske ćelije/reporterske ćelijske linije mogu biti kultivisati odvojeno od ekspresionih ćelija. U takvim primerima izvođenja, lizati i/ili medijumi iz ekspresionih ćelija mogu biti spojeni sa kulturama reportersloj ćelija/reporterskih ćelijskih linija da bi se ispitali eksprimirani faktori (uključujući, ali ne ograničavajući se na, faktore rasta).
[0403] U pojedinim primerima izvođenja, testovi predmetnog pronalaska zasnovani na ćelijama mogu sadržavati samo ekspresione ćelije, ali ne i ćelije koje reaguju. U takvim primerima izvođenja, eksprimirani proteini, uključujući, ali ne ograničavajući se na, GPC i/ili faktore rasta, mogu biti detektovani sa jednim ili sa više postupaka koji nisu zasnovani na ćelijama. Takvi postupci mogu obuhvatati, ali nisu ograničeni na, imunoblot, imunosorbentni test povezan sa enzimom (ELISA,) imunocitohemiju, test površinske plazmonske rezonance i druge postupke koji su poznati u oblasti tehnike za detekciju proteina. U pojedinim primerima izvođenja, oslobađanje TGF-β u ekspresionim ćelijskim kulturama i/ili medijumu za kulturu može biti detektovano upotrebom ELISA postupka. U pojedinim primerima izvođenja, takvi testovi mogu koristiti anti-TGF-β antitelo, klona 1D11 (R&D Systems, Minneapolis, MN) kao antitelo za hvatanje, sposobno da prepozna TGF-β izoforme 1, 2 i 3 u više vrsta, uključujući, ali ne ograničavajući se na krave, piliće, miševe i ljude. U pojedinim primerima izvođenja, kao antitelo za detekciju može biti upotrebljen biotinizovan pileći anti-TGF-β1 IgY (BAF240; R&D Systems, Minneapolis, MN). U pojedinim primerima izvođenja, ELISA postupkom može biti detektovano oslobađanje GDF-8/miostatina u ekspresionim ćelijskim kulturama i/ili medijumu za kulturu. U pojedinim primerima izvođenja, može biti upotrebljen GDF-8/miostatinski kvantikin ELISA komplet (R&D Systems, Minneapolis, MN). Primeri anti-GDF-8/miostatin antitela koja mogu biti upotrebljena za detekciju uključuju AF1539, MAB788 i AF788 (R&D Systems, Minneapolis, MN.)
[0404] U pojedinim primerima izvođenja, reporterski geni predmetnog pronalaska sadrže promotore koji reaguju na faktore rasta. Kao što se ovde upotrebljava, termin "promotor koji reaguje na faktor rasta" se odnosi na genski promotor koji olakšava transkripciju nishodnog gena kao odgovor na ćelijsku signalizaciju faktora rasta koja je indukovana sa jednim ili sa više faktora rasta. U pojedinim primerima izvođenja, promotori koji reaguju na faktor rasta reaguju na signalizaciju faktora rasta koji je član TGF-β familije. U pojedinim primerima izvođenja, promotori koji reaguju na faktor rasta su predstavljeni sa jednom ili sa više sekvenci navedenih u Tabeli 16 ili sa njihovim fragmentima ili varijantama. Navedeno uključuje dve verzije promotora inhibitora aktivatora plazminogena tipa 1 (PAI-1) [VI, kao što je opisano u Abe i saradnici (Abe M. i saradnici, An assay for transforming growth factor-β using cells transfected with a plasminogen activator inhibitor-1 promoter-luciferase construct. Analytical Biochemistry.1994.216:276-84) i V2 kao što je opisano u WO 2011/034935], promotor kolagena tipa 1, alfa 1, promotor kolagena tip 1, alfa 2, FoxP3 promotor, CAGA12 promotor [odgovara na signalizaciju zavisnu od Smad, kao što je opisano u Thies i saradnici (Thies R.S. i saradnici, GDF-8 propeptide binds to GDF-8 and antagonizes biological activity by inhibiting GDF-8 receptor binding. Growth Factors.2001.18:251-9) i glavni kasni promotor adenovirusa.
Tabela 16. Promotori koji reaguju na faktor rasta
[0405] U pojedinim primerima izvođenja, mogu biti upotrebljene reporterske ćelijske linije epitela pluća nerca/PAI. Epitelne ćelije pluća nerca ne proizvode TGF-β, ali eksprimiraju visoke nivoe TGF-β receptora (Munger i saradnici). Reporterske ćelijske linije epitela pluća nerca/PAI sadrže reporterske konstrukte koji sadrže promotorske elemente iz PAI i/ili COL1A gena koji reaguju na TGF-β i koji modulišu ekspresiju dela koji kodira protein iz gena luciferaze. U pojedinim primerima izvođenja, sa epitelnim ćelijama pluća nerca mogu biti upotrebljeni drugi reporterski konstrukti. U pojedinim primerima izvođenja, mogu biti upotrebljeni reporterski konstrukti koji reaguju na SMAD3.
Test oslobađanja TGF-β2
[0406] U pojedinim slučajevima, predmetni opis obezbeđuje testove za detektovanje oslobađanja i/ili aktivnosti TGF-β2. Takvi testovi mogu sadržavati ćelijske linije (npr. HEK293 ćelije, 293T/17 ćelije, Hs68 ćelije, CCD1112sk ćelije, HFF-1 ćelije, keloidne fibroblaste ili Sw-480 ćelije) koje eksprimiraju GPC koji sadrže TGF-β2 (npr. prirodno i/ili putem transfekcije, stabilne transfekcije i/ili transdukcije) i/ili njihove rekombinantne i/ili himerne proteinske derivate. U pojedinim slučajevima, u ćelijama koje eksprimiraju TGF-β2 se eksprimiraju i/ili kombinuju i dodatni faktori da bi se utvrdio njihov efekat na oslobađanje TGF-β2 faktora rasta. U pojedinim slučajevima, mogu biti eksprimirani integrini. U pojedinim slučajevima, može biti eksprimiran α9β1integrin.
[0407] U pojedinim slučajevima, oslobađanje TGF-β2 se može detektovati upotrebom jednog ili više testova oslobađanja faktora rasta koji su u skladu sa onima koji su ovde opisani. U pojedinim slučajevima, takvi testovi mogu uključivati upotrebu reporterskih ćelijskih linija plućnog epitela nerca/PAI radi merenja oslobađanja i/ili aktivnosti TGF-β2. U pojedinim slučajevima, testovi oslobađanja TGF-β2 mogu biti upotrebljeni za skrining inhibitornih i/ili aktivirajućih osobina antitela u kontekstu oslobađanje TGF-β2 iz GPC i/ili aktivnosti Tregindukcionog testa
[0408] Tregćelije su imunske ćelije koje karakteriše supresorska ćelijska funkcija od važnosti za regulisanje autoimunosti. Takve ćelije vode poreklo od prekusorskih ćelija nakon indukcije FoxP3 gena (Wood i Sakaguchi, Nature Reviews, 2003). FoxP3 je transkripcioni faktor, čija ekspresija može biti regulisana do određenog stepena sa proteinima srodnim TGF-β. Wan i Flavell (2005) su pokazali da u odgovoru na egzogeni TGF-β, aktivirane primarne T ćelije karakteriše de novo FoxP3 i ekspresija "ubačenog (knocked-in)" fluorescentnog proteina, kao i indukcija supresorske ćelijske funkcije. Tone i saradnici (2008) su pokazali da su ključni pojačivački elementi koji reaguju na TGF-β, i koji pokreću ekspresiju FoxP3 u primarnim T ćelijama, prisutni u EL4 T limfomskoj liniji. U pojedinim primerima izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje reporterske konstrukte koji sadrže promotorske elemente iz FoxP3 gena koji modulišu ekspresiju takvih reporterskih konstrukata (ovde označenih kao reporterske konstrukti pod kontrolom FoxP3). U pojedinim primerima izvođenja, reporterski konstrukti pod kontrolom FoxP3 sadrže promotorske elemente koji reaguju na ćelijsku signalnu aktivnost proteina ćelija srodnih TGF-β. U pojedinim primerima izvođenja, reporterski konstrukti pod kontrolom FoxP3 se uvode (tranzientno i/ili stabilno) u jednu ili više ćelija i/ili ćelijskih linija. Takve ćelije su ovde označene kao reporterske ćelije pod kontrolom FoxP3. U pojedinim primerima izvođenja, takve ćelije su sisarske. U pojedinim primerima izvođenja, takve sisarske ćelije mogu obuhvatati, ali nisu ograničene na, ćelije miša, ćelije zeca, ćelije pacova, ćelije majmuna, ćelije hrčka i ćelije čoveka. Takve ćelije mogu biti izvedene iz ćelijske linije. U pojedinim primerima izvođenja mogu biti upotrebljeni humane ćelije. U pojedinim primerima izvođenja, ćelijske linije mogu obuhvatati, ali nisu ograničene na, HEK293 ćelije, HeLa ćelije, Sw-480 ćelije, EL4 T limfomske ćelije, TMLC ćelije, 293T/17 ćelije, Hs68 ćelije, CCD1112sk ćelije, HFF-1 ćelije, keloidne fibroblaste, A204 ćelije, L17 RIB ćelije i C2C12ćelije. U pojedinim primerima izvođenja, mogu biti upotrebljene EL4 T limfomske ćelije. Poznato je da EL4 T limfomske ćelije sadrže elemente pojačivača transkripcije koji reaguju na signalizaciju proteina srodnih TGF-β. U pojedinim primerima izvođenja, reporterske ćelije pod kontrolom FoxP3 mogu biti upotrebljene za skrining sposobnost antitela da aktiviraju i/ili inhibiraju ekspresiju gena zavisnu od FoxP3.
Testovi proliferacije
[0409] U pojedinim primerima izvođenja, testovi predmetnog pronalaska zasnovani na ćelijama mogu uključivati testove proliferacije. Kao što se ovde upotrebljava, termin "test proliferacije" se odnosi na test koji određuje efekat jednog ili više agenasa na ćelijsku proliferaciju.
[0410] U pojedinim slučajevima, testovi proliferacije mogu obuhvatati HT2 testove proliferacije. Takvi testovi se mogu izvoditi, na primer, prema postupcima opisanim u Tsang M. i saradnici, 1995. Cytokine 7(5):389-97. HT2 ćelije (ATCC CRL-1841) se gaje u prisustvu IL-2, a koji, kada je prisutan u medijumu, dovodi do neosetljivosti na TGF-β1. Kada se HT2 ćelije prebace u medijum koji sadrži IL-4, one će nastaviti da se razmnožavaju, ali će reagovati na TGF-β1 u medijumu kulture indukcijom apoptoze. U medijima koji sadrže IL-4, ćelijska smrt usled TGF-β1 u medijumu za kulturu se odvija na način koji zavisi od doze, što može biti blokirano brojnim reagensima koji interferiraju sa TGF-β signalnim putem. Ovo omogućava upotrebu ovog testa za ispitivanje sposobnosti reagenasa da modulišu aktivaciju TGF-β1.
[0411] Detekcija promena u broju ćelija se može izvoditi, u pojedinim primerima izvođenja, kroz detekciju i/ili kvantifikaciju nivoa ATP-a u ćelijama. Nivoi ATP-a su obično u korelaciji sa brojem ćelija prisutnih u datom uzorku, bunariću, ploči ili petri šolji koja se ispituje. U pojedinim primerima izvođenja, nivoi ATP-a mogu biti utvrđeni upotrebom CELLTITER-GLO® luminiscentnog testa ćelijske vijabilnosti (Promega BioSciences, LLC, Madison, WI).
Kompleti i uređaji
[0412] Bilo koje od jedinjenja i/ili kompozicija predmetnog pronalaska može biti sadržano u kompletu. U neograničavajućem primeru, reagensi za generisanje jedinjenja i/ili kompozicija, uključujući antigene molekule, uključeni su u jedan ili više kompleta. U pojedinim primerima izvođenja, kompleti mogu dalje uključivati reagense i/ili uputstva za stvaranje i/ili sintezu jedinjenja i/ili kompozicija predmetnog pronalaska. U pojedinim primerima izvođenja, kompleti mogu takođe sadržavati jedan ili više pufera. U pojedinim primerima izvođenja, kompleti pronalaska mogu sadržavati komponente za pravljenje genskih ili proteinskih čipova ili biblioteka i tako mogu uključivati, na primer, čvrste nosače.
[0413] U pojedinim primerima izvođenja, komponente kompleta mogu biti upakovane bilo u vodenom medijumu ili u liofilizovanom obliku. Načini skladištenja u kompletima generalno podrazumevaju najmanje jednu bočicu, epruvetu, tikvicu, bočicu, špric ili druga način skladištenja u koji komponenta može biti stavljena, a poželjno je i pogodno alikvotirana. Tamo gde postoji više od jedne komponente kompleta (reagens za obeležavanje i obeleživač mogu biti upakovani zajedno), kompleti mogu generalno sadržavati i drugu, treću ili još dodatnih posuda u koje mogu odvojeno biti smeštene dodatne komponente. U pojedinim primerima izvođenja, kompleti mogu takođe uključivati druge načine skladišenja za smeštanje sterilnih, farmaceutski prihvatljivih pufera i/ili drugih razblaživača. U pojedinim primerima izvođenja, razne kombinacije komponenata mogu biti sadržane u jednoj ili u više bočica. Kompleti predmetnog pronalaska takođe mogu uobičajeno sadržavati posude koje mogu da sadrže jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska, npr. proteine, nukleinske kiseline i bilo koji druge spremnike sa reagensom u zatvorenom prostoru namenjenom za komercijalnu prodaju. Takvi kontejneri mogu sadržavati injekcije ili plastične, oblikovane držače sa udubljenjima u koje se željene bočice mogu ubaciti.
[0414] U pojedinim primerima izvođenja, komponente kompleta su obezbeđene u jednom i/ili u više tečnih rastvora. U pojedinim primerima izvođenja, tečni rastvori su vodeni rastvori, sa sterilnim vodenim rastvorima kao posebno poželjnim. U pojedinim primerima izvođenja, komponente kompleta mogu biti obezbeđene kao suvi prah (prahovi). Kada su reagensi i/ili komponente obezbeđeni kao suvi prahovi, takvi prahovi mogu biti rekonstituisani dodavanjem odgovarajućih zapremina rastvarača. U pojedinim primerima izvođenja, predviđeno je i da rastvarači mogu biti obezbeđeni u drugim tipovima spremišta. U pojedinim primerima izvođenja, boje za obeležavanje su obezbeđene kao osušeni prahovi. U pojedinim primerima izvođenja, razmatra se da 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 mikrograma, ili najmanje ili najviše od ovih količina osušene boje, bude obezbeđeno u kompletima pronalaska. U takvim primerima izvođenja, boja se zatim može resuspendovati u bilo kom pogodnom rastvaraču, kao što je DMSO.
[0415] U pojedinim primerima izvođenja, kompleti mogu sadržavati uputstva za upotrebu komponenti kompleta, kao i za upotrebu bilo kog drugog reagensa koji nije uključen u komplet. Uputstva mogu sadržavati varijacije koje se mogu primeniti.
[0416] U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska se mogu kombinovati sa, upotrebiti u vidu premaza za ili ugraditi u uređaj. Uređaji mogu obuhvatati, ali nisu ograničeni na, zubne implantate, stentove, zamene za kosti, veštačke zglobove, zaliske, pejsmejkere i/ili druge terapijske uređaje koji se mogu implantirati.
Definicije
[0417] Na raznim mestima u ovoj specifikaciji, supstituenti jedinjenja predmetnog opisa su opisani u grupama ili u vidu opsega. Posebno je predviđeno da predmetni opis uključuje svaki i sve pojedinačne potkombinacije članova takvih grupa i opsega. Tekst koji sledi je neograničavajuća lista definicija termina.
Aktivnost: Kao što se ovde upotrebljava, termin "aktivnost" se odnosi na stanje u kome se stvari događaju ili izvršavaju. Kompozicije pronalaska mogu imati aktivnost i ova aktivnost može uključivati jedan ili više bioloških događaja. U pojedinim primerima izvođenja, takav biološki događaj može uključivati faktor rasta i/ili signalizaciju faktora rasta. U pojedinim primerima izvođenja, biološki događaji mogu uključivati ćelijske signalne događaje povezane sa interakcijama faktora rasta i receptora. U pojedinim primerima izvođenja, biološki događaji mogu obuhvatati ćelijske signalne događaje povezane sa interakcijama TGF-β ili proteina srodnih TGF-β sa jednim ili sa više odgovarajućih receptora.
Primenjeno u kombinaciji: Kao što se ovde upotrebljava, termin "primenjeno u kombinaciji" ili "kombinovana primena" se odnosi na istovremeno izlaganje jednog ili više subjekata dejstvu dva ili više agenasa koja se primenjuju istovremeno ili unutar intervala koji je takav da je subjekat u nekom trenutku istovremeno izložen i jednima i drugima ili/i takav da može doći do preklapanja u dejstvu svakog agensa na pacijenta. U pojedinim primerima izvođenja, najmanje jedna doza jednog ili više agenasa se primenjuje unutar perioda od oko 24 sata, 12 sati, 6 sati, 3 sata, 1 sata, 30 minuta, 15 minuta, 10 minuta, 5 minuta ili 1 minuta od najmanje jedne doza jednog ili više drugih agenasa. U pojedinim primerima izvođenja, primena se odvija u režimima doziranja koji se preklapaju. Kao što se ovde upotrebljava, termin "režim doziranja" se odnosi na mnoštvo doza raspoređenih u vremenu. Takve doze se mogu javljati u redovnim intervalima ili mogu obuhvatati jedan ili više prekida tokom primene. U pojedinim primerima izvođenja, primena pojedinačnih doza jednog ili više jedinjenja i/ili kompozicija predmetnog pronalaska, kao što je ovde opisano, međusobno su raspoređene dovoljno blizu da se postigne kombinatorni (npr. sinergističan) efekat.
Životinja: Kao što se ovde upotrebljava, termin "životinja" se odnosi na bilo kog člana životinjskog carstva. U pojedinim primerima izvođenja, "životinja" se odnosi na ljude u bilo kojoj fazi razvoja. U pojedinim primerima izvođenja, "životinja" se odnosi na životinje različite od čoveka, u bilo kojoj fazi razvoja. U određenim rešenjima, životinja različita od čoveka je sisar (npr. glodar, miš, pacov, zec, majmun, pas, mačka, ovca, govedo, primat ili svinja). U pojedinim primerima izvođenja, životinje uključuju, ali nisu ograničene na, sisare, ptice, gmizavce, vodozemce, ribe i crve. U pojedinim primerima izvođenja, životinja je transgena životinja, životinja kontrusana genetičkim inženjeringom ili je klon.
Antigeni od interesa ili željeni antigeni: Kao što se ovde upotrebljava, termini „antigeni od interesa“ ili „željeni antigeni“, odnose se na one proteine i/ili druge biomolekule koji su ovde obezbeđeni, koji su imunospecifično vezani ili su u interakciji sa antitelima predmetnog pronalaska i/ili njihovim fragmentima, mutantima, varijantama i/ili izmenama koje su ovde opisane. U pojedinim primerima izvođenja, antigeni od interesa mogu obuhvatati proteine srodne TGF-β, faktore rasta, prodomene, GPC, proteinske module ili regioni koji se međusobno preklapaju.
Približno: Kao što se ovde upotrebljava, termin "približno" ili "oko", primenjen na jednu ili više vrednosti od interesa, odnosi se na vrednost koja je slična navedenoj referentnoj vrednosti. U određenim primerima izvođenja, pojam "približno" ili "oko" se odnosi na opseg vrednosti koji spadaju u 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12 %, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% ili manje, u bilo kom smeru (većem ili manjem od) navedene referentne vrednosti, osim ukoliko nije drugačije naznačeno ili je drugačije jasno uočljivo iz konteksta (osim kada bi takav broj premašio 100% moguće vrednosti).
Udružen sa: Kao što se ovde upotrebljava, termini "udruženi sa", "konjugovani", "vezani", "premošćeni" i "vezani", kada se upotrebljavaju u odnosu na dva ili više ostataka, označavaju da su ostaci fizički udruženi ili povezani jedan sa drugim, bilo direktno ili preko jednog ili više dodatnih ostataka koji služe kao agensi za povezivanje, a da bi se obrazovala struktura koja je dovoljno stabilna, tako da delovi ostaju fizički povezani pod uslovima u kojima se takva struktura koristi, npr. u fiziološkim uslovima. „Udruživanje“ ne mora biti striktno direktnom kovalentnom hemijskom vezom. Može naime ukazati na jonsku ili vodoničnu vezu ili na udruživanje zasnovano na hibridizaciji koja je dovoljno stabilnta tako da „udruženi“ entiteti ostaju fizički povezani.
Biomolekul: Kao što se ovde upotrebljava, termin "biomolekul" je bilo koji prirodni molekul koji je na bazi aminokiselina, nukleinskih kiselina, ugljenih hidrata ili lipida, i slično.
Biološki aktivan: Kao što se ovde upotrebljava, termin „biološki aktivan“ se odnosi na karakteristiku bilo koje supstance koja je sa aktivnošću u biološkom sistemu i/ili organizmu. Na primer, supstanca koja, kada se primeni organizmu, ispoljava biološki efekat na taj organizam, smatra se biološki aktivnom. U određenim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska se mogu smatrati biološki aktivnima ukoliko je čak i samo njegov deo biološki aktivan ili oponaša aktivnost koja se smatra biološki relevantnom.
Biološki sistem: Kao što se ovde upotrebljava, termin „biološki sistem“ se odnosi na grupu organa, tkiva, ćelija, unutarćelijskih komponenti, proteina, nukleinskih kiselina, molekula (uključujući, ali ne ograničavajući se na, biomolekule) koji zajedno funkcionišu da bi izvršio određeni biološki zadatak unutar ćelijske membrane, ćelijskih odeljaka, ćelija, tkiva, organa, sistema organa, višećelijskih organizama ili bilo kojih drugih bioloških entiteta. U pojedinim primerima izvođenja, biološki sistemi su ćelijski signalni putevi koji sadrže unutarćelijske i/ili vanćelijske ćelijske signalne biomolekule. U pojedinim primerima izvođenja, biološki sistemi sadrže signalne događaje koje pokreću faktori rasta unutar vanćelijskog matriksa, ćelijskog matriksa i/ili ćelijskih niša.
Antitelo-kandidat: Kao što se ovde upotrebljava, termin "antitelo-kandidat" se odnosi na antitelo iz skupa jednog ili više antitela iz kojeg jedno ili više željenih antitela može biti izabrano.
Ćelijski matriks: Kao što se ovde upotrebljava, termin "ćelijski matriks" se odnosi na biohemijsko i strukturno okruženje povezano sa spoljnim delom ćelijske membrane. Takve ćelijske membrane mogu takođe uključivati membrane trombocita. Komponente ćelijskog matriksa mogu uključivati, ali nisu ograničene na, proteoglikane, molekule ugljenih hidrata, integralne membranske proteine, glikolipide i slično. U pojedinim slučajevima, komponente ćelijskog matriksa mogu uključivati faktore rasta i/ili modulatore aktivnosti faktora rasta. Pojedini proteini ćelijske matriksa uključuju integrine, GARP i LRRC33.
Jedinjenje: Kao što se ovde upotrebljava, termin "jedinjenje" se odnosi na jasno različit hemijski entitet. Termin ovde može biti upotrebljen za označavanje peptida, proteina, proteinskih kompleksa ili antitela pronalaska. U pojedinim primerima izvođenja, određeno jedinjenje može postojati u jednom ili više izomernih ili izotopskih oblika (uključujući, ali ne ograničavajući se na, stereoizomere, geometrijske izomere i izotope). U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenje se obezbeđuje ili koristi u samo jednom takvom obliku. U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenje se obezbeđuje ili koristi kao smeša dva ili više takvih oblika (uključujući, ali ne ograničavajući se na, racemsku smešu stereoizomera). Stručnjaci u ovoj oblasti će lako prepoznati da pojedina jedinjenja postoje u takvim različitim oblicima, pokazuju različite osobine i/ili aktivnosti (uključujući, ali ne ograničavajući se na, biološke aktivnosti). U takvim slučajevima, unutar je znanja prosečno iskusnog stručnjaka iz oblasti tehnike da odabere ili izbedne određene oblike jedinjenja za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom. Na primer, jedinjenja koja sadrže asimetrično supstituisane atome ugljenika, mogu biti izolovani u optički aktivnim ili racemskim oblicima. Postupci kako da se pripremaju optički aktivni oblici od optički aktivnih polaznih materijala su poznati u oblasti tehnike, kao što su to razdvajanje racemskih smeša ili stereoselektivna sinteza.
Evolutivno očuvano: Kao što se ovde upotrebljava, termin "očuvan" se odnosi na nukleotide ili aminokiselinske ostatke polinukleotidnih ili polipeptidnih sekvenci, tim redom, koje se javljaju na istim pozicijama u dve ili više sekvenci koje se porede i nisu izmenjeni. Nukleotidi ili aminokiseline koji su relativno očuvani su oni koji su očuvani među srodnijim sekvencama u odnosu na nukleotide ili aminokiseline koji se pojavljuju negde drugde u sekvencama.
U pojedinim primerima izvođenja, za dve ili više sekvenci se kaže da su „potpuno očuvane“ ukoliko su 100% identične jedna drugoj. U pojedinim primerima izvođenja, kaže se da su dve ili više sekvenci „visoko očuvane“ ukoliko su najmanje 70% identične, najmanje 80% identične, najmanje 90% identične ili najmanje 95% identične jedna drugoj. U pojedinim primerima izvođenja, kaže se da su dve ili više sekvenci „visoko očuvane“ ukoliko su identične jedna drugoj u oko 70%, identične jedna drugoj u oko 80%, identične jedna drugoj u oko 90%, identične jedna drugoj u oko 95%, identične jedna drugoj u oko 98% ili identične jedna drugoj u oko 99%. U pojedinim primerima izvođenja, kaže se da su dve ili više sekvenci „očuvane“ ukoliko su najmanje 30% identične, najmanje 40% identične, najmanje 50% identične, najmanje 60% identične, najmanje 70% identične, najmanje 80% identične, najmanje 90% identične ili najmanje 95% identične. U pojedinim primerima izvođenja, kaže se da su dve ili više sekvenci „očuvane“ ukoliko su oko 30% identične, oko 40% identične, oko 50% identične, oko 60% identične, oko 70% identične, oko 80% identične, oko 90 % identične, oko 95% identične, oko 98% identične ili oko 99% identične jedna sa drugom. Očuvanje sekvence može biti primenjeno na celokupanu dužinu oligonukleotida ili polipeptida ili se može primeniti na njihov deo, region ili karakteristiku.
U jednom primeru izvođenja, očuvane sekvence nisu susedne. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu lako shvatiti kako da se postigne poravnavanje između sekvenci kada su kontinuiranom poravnjanju prisutne praznine, kao i da se poravnaju odgovarajući ostaci koji ne tolerišu prisutne insercije ili delecije.
Isporuka: Kao što se ovde upotrebljava, "isporuka" se odnosi na čin ili način isporuke jedinjenja, supstance, entiteta, ostatka, tereta ili korisnog tereta.
Agens za isporuku: Kao što se ovde upotrebljava, "agens za isporuku" se odnosi na bilo koji agens koji olakšava, barem delom, in vivo isporuku jedne ili više supstanci (uključujući, ali ne ograničavajući se na, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska) ćelijama, subjektima ili ćelijama drugog biološkog sistema.
Željena antitela: Kao što se ovde upotrebljava, termin "željeno antitelo" se odnosi na antitelo koje se potražuje, u pojedinim slučajevima, iz skupa antitela-kandidata.
Destabilizovano: Kao što se ovde upotrebljava, termin "nestabilan", "destabilizuje" ili "destabilišući region" označava region ili molekul koji je manje stabilan od početnog, referentnog, nativnog ili oblika divljeg tipa istog regiona ili molekula.
Obeleživač koji se može detektovati: Kao što se ovde upotrebljava, „obeleživač koji se može detektovati“ se odnosi na jedan ili više markera, signala ili ostataka koji su prikačeni, ugrađeni ili udruženi sa bilo kojim drugim entitetom, pri čemu se markeri, signali ili ostaci lako detektuju postupcima koji su poznati u oblasti tehnike, uključujući radiografiju, fluorescenciju, hemiluminescenciju, enzimsku aktivnost, apsorbanciju, imunološku detekciju i slično. Obeleživači koji se mogu detektovati mogu obuhvatati radioizotope, fluorofore, hromofore, enzime, boje, metalne jone, ligande, biotin, avidin, streptavidin i haptene, kvantne tačke, polihistidinske tagove, myc tagove, oktapeptidne tagove, hemaglutininske (HA) tagove humanog virusa influence i slično. Obeleživači se mogu nalaziti na bilo kom mestu u entitetu sa kojim su povezani, u koji su ugrađeni ili udruženi. Na primer, kada su vezani, ugrađeni ili udruženi sa peptidom ili proteinom, oni mogu biti unutar aminokiselina, peptida ili proteina, ili mogu biti smešteni na N- ili C-krajevima.
Distalno: Kao što se ovde upotrebljava, termin "distalno" označava poziciju koja je udaljena od centra ili od tačke ili regiona od interesa.
Konstruisan: Kao što se ovde upotrebljava, primeri izvođenja pronalaska su „konstruisani“ kada su dizajnirani tako da imaju osobinu ili svojstvo, bilo strukturno ili hemijsko, koje se razlikuje od početne tačke, molekula divljeg tipa ili nativnog molekula. Tako, konstruisani agensi ili entiteti su oni čiji dizajn i/ili proizvodnja uključuju čin čoveka.
Epitopa: Kao što se ovde upotrebljava, "epitop" se odnosi na površinu ili region na molekulu koji je sposoban da interaguje sa komponentama imunskog sistema, uključujući, ali se ne ograničavajući na, antitela. U pojedinim primerima izvođenja, kada se odnosi na protein ili proteinski modul, epitop može sadržavati linearni niz aminokiselina ili trodimenzionalnu strukturu koja se obrazuje od uvijenih aminokiselnskih lanaca.
Ekspresija: Kao što se ovde upotrebljava, „ekspresija“ sekvence nukleinske kiseline se odnosi na jedan ili više od sledećih događaja: (1) proizvodnju RNK matrice sa DNK sekvence (npr. transkripcijom); (2) obradu RNK transkripta (npr. spajanjem, uređivanjem, obrazovanjem 5' kape i/ili obradom 3' kraja); (3) translaciju RNK u polipeptid ili protein; (4) uvijanje polipeptida ili proteina; i (5) post-translacionu modifikaciju polipeptida ili proteina.
Vanaćelijski matriks: Kao što se ovde upotrebljava, termin "vanćelijski matriks" ili "ECM" se odnosi na područje koje okružuje ćelije i/ili područje između ćelija, a koje obično sadrži strukturne proteine, kao i ćelijske signalne molekule. Komponente vanćelijskog matriksa mogu uključivati, ali nisu ograničene na, proteine, nukleinske kiseline, membrane, lipide i šećere koji mogu biti direktno ili indirektno povezani sa strukturnim komponentama vanćelijskog okruženja. Strukturne komponente vanćelijskog matriksa mogu obuhvatati, ali nisu ograničene na, proteine, polisaharide (npr. hijaluronsku kiselinu), glikozaminoglikane i proteoglikane (npr. heparin sulfat, hondroitin sulfat i keratin sulfat). Takve strukturne komponente mogu obuhvatati, ali nisu ograničene na, fibrozne komponente (npr. kolagene i elastine), fibriline, fibronektin, laminine, agrin, perlekan, dekorin i slično. Ostali proteini koji mogu biti komponente vanćelijskog matriksa uključuju i LTBP. Komponente vanćelijskog matriksa mogu takođe obuhvatati faktore rasta i/ili modulatore aktivnosti faktora rasta.
Osobina: Kao što se ovde upotrebljava, "osobina" se odnosi na karakteristiku, svojstvo ili element koji se može jasno razlikovati od drugog.
Formulacija: Kao što se ovde upotrebljava, "formulacija" uključuje najmanje jedinjenje i/ili kompoziciju predmetnog pronalaska i sredstvo za isporuku.
Fragment: "Fragment", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na deo. Na primer, fragmenti proteina mogu sadržavati polipeptide dobijene digestijom proteina pune dužine koji su izolovnai iz kultivisanih ćelija. U pojedinim primerima izvođenja, fragment proteina uključuje najmanje 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250 ili više aminokiselina. U pojedinim primerima izvođenja, fragmenti antitela obuhvataju delove antitela koja su podvrgnuta enzimskoj digestiji ili su sintetisani kao takvi.
Funkcionalno: Kao što se ovde upotrebljava, "funkcionalan" biološki molekul je biološki entitet sa strukturom i u obliku u kome ispoljava osobinu i/ili aktivnost koe ga karakterišu.
Homologija: Kao što se ovde upotrebljava, termin "homologija" se odnosi na sveukupan odnos između polimernih molekula, npr. između molekula nukleinskih kiselina (npr. molekula DNK i/ili molekula RNK) i/ili između polipeptidnih molekula. U pojedinim primerima izvođenja, polimerni molekuli se smatraju „homolognim“ jedni sa drugima ukoliko su njihove sekvence najmanje 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70 %, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 99% identično ili slične. Izraz "homologni" nužno se odnosi na poređenje između najmanje dve sekvence (polinukleotidne ili polipeptidne sekvence). U skladu sa pronalaskom, dve polinukleotidne sekvence se smatraju homolognim ukoliko su polipeptidi koje kodiraju najmanje oko 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ili čak 99% u nizu koga čini najmanje oko 20 aminokiselina. U pojedinim primerima izvođenja, homologne polinukleotidne sekvence karakteriše sposobnost da kodiraju niz od najmanje 4-5 jedinstveno naznačenih aminokiselina. Za polinukleotidne sekvence dužine manje od 60 nukleotida, homologija se obično određuje sposobnošću da kodiraju niz od najmanje 4-5 jedinstveno naznačenih aminokiselina. U skladu sa pronalaskom, dve proteinske sekvence se smatraju homolognim ukoliko su proteini najmanje oko 50%, 60%, 70%, 80% ili 90% identični u okviru niza od najmanje oko 20 aminokiselina. U mnogim primerima izvođenja, homologni protein može pokazati visok ukupan stepen homologije i visok stepen homologije duž najmanje jednog kratkog niza od najmanje 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ili više aminokiselina. U mnogim primerima izvođenja, homologni proteini dele jedan ili više karakterističnih elemenata sekvence. Kao što se ovde upotrebljava, termin "karakteristični element sekvence" se odnosi na motiv koji je prisutan u srodnim proteinima. U pojedinim primerima izvođenja, prisustvo takvih motiva je u koralaciji sa određenom aktivnošću (kao što je biološka aktivnost).
Identičnost: Kao što se ovde upotrebljava, termin "identičnost" se odnosi na sveukupan odnos između polimernih molekula, npr. između oligonukleotidnih molekula (npr. molekula DNK i/ili molekula RNK) i/ili između polipeptidnih molekula. Na primer, izračunavanje procenta identičnosti dve polinukleotidne sekvence se može izvršiti poravnavanjem dve sekvence radi optimalnog poređenja (npr. mogu biti uvedene praznine u jednoj ili u ovde od prve i druge sekvence nukleinskih kiselina radi optimalnog poravnanja, a neidentične sekvence se mogu zanemariti radi poređenja). U određenim rešenjima, dužina poravnatih sekvenci za svrhe poređenja iznosi najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% od dužine referentne sekvence. Zatim se upoređuju nukleotidi na odgovarajućim pozicijama nukleotida. Kada poziciju u prvoj sekvenci zauzima isti nukleotid kao i odgovarajuću poziciju u drugoj sekvenci, tada su molekuli identični na tom poziciji. Procenat identičnosti između dve sekvence je funkcija broja identičnih pozicija koje sekvence dele, uzimajući u obzir broj praznina i dužinu svake praznine, a koje je potrebno uvesti radi optimalnog poravnanja dve sekvence. Poređenje sekvenci i utvrđivanje procenta identičnosti između dve sekvence se može postići upotrebom matematičkog algoritma. Na primer, procenat identičnosti između dve nukleotidne sekvence može biti određen upotrebom postupaka poput onih opisanih u Computational Molecular Biology, Lesk A. M., ur., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith D. W., ur., Academic Press, New York, 1993; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje G., Academic Press, 1987; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin A. M. i Griffin H. G., ur., Humana Press, New Jersey, 1994; i Sequence Analysis Primer, Gribskov M. i Devereux J., ur., M Stockton Press, New York, 1991; od kojih je svaka ovde uključena u vidu reference. Na primer, procenat identičnosti između dve nukleotidne sekvence može biti određen, na primer, upotrebom algoritma Meyers-a i Miller-a (CABIOS, 1989, 4:11-17), koji je ugrađen u program ALIGN (verzija 2.0), upotrebom PAM120 matrice za težinu ostataka, granične vrednosti dužine praznine od 12 i granične vrednosti praznine od 4. Procenat identičnosti dve nukleotidne sekvence se, alternativno, može utvrditi upotrebom GAP programa u okviru programskog paketa GCG, upotrebom NWSgapdna.CMP matrice. Postupci koji se uobičajeno koriste za utvrđivanje procenta identičnosti između sekvenci uključuju, ali nisu ograničene na, one opisane u Carillo H. i Lipman D., SIAM J Applied Math., 48:1073 (1988); ovde ukljuenoj u vidu reference. Tehnike utvrđivanja identičnosti su ugrađene u vidu kodova u javno dostupnim računarskim programima. Primer računarskog softvera za utvrđivanje homologije između dve sekvence obuhvata, ali nije ograničen na, programski paket GCG, Devereux J. i saradnici, Nucleic Acids Research, 12(1), 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, i FASTA Altschul S. F. i saradnici, J. Molec. Biol., 215, 403 (1990)).
Inhibira ekspresiju gena: Kao što se ovde upotrebljava, fraza „inhibira ekspresiju gena“ označava prouzrokovanje smanjenja u količini ekspresionog proizvoda gena. Produkt ekspresije može biti RNK transkribovana sa gena (npr. iRNK) ili polipeptid tranlatiran sa iRNK koja je transkribovana sa gena. Uobičajeno je da smanjenje u nivou iRNK rezultuje smanjenjem nivoa polipeptida koji se iz nje translatira. Nivo ekspresije može biti određen upotrebom standardnih tehnika za merenje iRNK ili proteina.
In vitro: Kao što se ovde upotrebljava, termin "in vitro" se odnosi na događaje koji se odvijaju u veštačkom okruženju, npr. u epruveti ili reakcionoj posudi, u ćelijskoj kulturi, u Petrijevoj posudi itd. a ne unutar organizma (npr. životinje, biljke ili mikroba).
In vivo: Kao što se ovde upotrebljava, termin „in vivo“ se odnosi na događaje koji se odvijaju u organizmu (npr. životinji, biljci ili mikrobu ili njihovoj ćeliji ili tkivu).
Izolovan: Kao što se ovde upotrebljava, termin „izolovan“ je sinonim za „razdvojen“, ali sa sobom nosi zaključak da je razdvajanje izvršeno čovečijom rukom. U jednom primeru izvođenja, izolovana supstanca ili entite je ona koja je izdvojena od najmanje nekih komponenti sa kojima je prethodno bila povezana (bilo u prirodi ili u eksperimentalnom okruženju). Izolovane supstance mogu imati različite nivoe čistoće u odnosu na supstance sa kojima su bile povezane. Izolovane supstance i/ili entiteti mogu biti odvojeni od najmanje oko 10%, oko 20%, oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 90% ili više ostalih komponenti sa kojima su u početku bile povezane. U pojedinim primerima izvođenja, izolovani agensi su više od oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 91%, oko 92%, oko 93%, oko 94%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, oko 99% ili više od oko 99% čisti. Kao što se ovde upotrebljava, supstanca je „čista“ ukoliko suštinski oslobođena od ostalih komponenti.
Suštinski izolovan: Pod „suštinski izolovanim“ se podrazumeva da je jedinjenje suštinski odvojeno od sredine u kojoj je nastalo ili je detektovano. Delimično razdvajanje može uključivati, na primer, kompoziciju obogaćenu jedinjenjem predmetnog pronalaska. Značajno razdvajanje može podrazumevati kompozicije koje sadrže najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 97% ili najmanje oko 99 težinskih% jedinjenja predmetnog pronalaska ili njegove soli. Postupci za izolovanje jedinjenja i njihovih soli su uobičajeni u oblasti tehnike. U pojedinim primerima izvođenja, izolacija supstance ili entiteta uključuje remećenje hemijskih asocijacija i/ili veza. U pojedinim primerima izvođenja, izolacija uključuje samo razdvajanje od komponenata sa kojima je izolovana supstanca ili entitet prethodno bila u kombinaciji i ne uključuje takva remećenja.
Linker: Kao što se ovde upotrebljava, linker se odnosi na ostatak koji povezuje dva ili više domena, delova ili entitea. U jednom primeru izvođenja, linker može sadržavati 10 ili više atoma. U daljem primeru izvođenja, linker može sadržavati grupu atoma, npr.10-1000 atoma, i može se sastojati od atoma ili grupa kao što su, ali ne ograničavajući se na, ugljenik, amino, alkilamino, kiseonik, sumpor, sulfoksid, sulfonil, karbonil i imin. U pojedinim primerima izvođenja, linker može sadržavati jednu ili više nukleinskih kiselina koje sadrže jedan ili više nukleotida. U pojedinim primerima izvođenja, linker može sadržavati aminokiselinu, peptid, polipeptid ili protein. U pojedinim primerima izvođenja, ostatak vezan linkerom može uključivati, ali nije ograničen na atom, hemijsku grupu, nukleozid, nukleotid, nukleobazu, šećer, nukleinsku kiselinu, aminokiselinu, peptid, polipeptid, protein, proteinski kompleks, korisni teret (npr. terapijski agens). ili marker (uključujući, ali ne ograničavajući se na, hemijski, fluorescentni, radioaktivni ili bioluminiscentni marker). Linker može biti upotrebljen u bilo koju korisnu svrhu, kao što je obrazovanje multimera ili konjugata, kao i za upravljanje korisnim teretom, kao što je ovde opisano. Primeri hemijskih grupa koje se mogu ugraditi u linker obuhvataju, ali nisu ograničeni na, alkil, alkenil, alkinil, amido, amino, etarsku, tioetarsku, estarsku, alkilensku, heteroalkilensku, arilnu ili heterociklilnu grupu, od kojih svaka može biti opciono supstituisana, kao što je ovde opisano. Primeri linkera obuhvataju, ali nisu ograničeni na, nezasićene alkane, polietilen glikole (npr. monomerne jedinice etilena ili propilen glikola, npr. dietilen glikol, dipropilen glikol, trietilen glikol, tripropilen glikol, tetraetilen glikol ili tetraetilen glikol) i dekstranske polimere, Ostali primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, ostakte koji se mogu cepati unutar linkera, kao što su, na primer, disulfidna veza (-S-S-) ili azo veza (-N=N-), koje mogu biti biti podvrgnute cepanju upotrebom redukujućeg agensa ili fotolizom. Neograničavajući primeri selektivnih veza koje se mogu podvrgnuti cepanju uključuju amido vezu koja se može cepati, na primer, upotrebom tris(2-karboksietil)fosfina (TCEP), ili drugih redukujućih agenasa, i/ili fotolizom, kao i estarske veze koja se može cepati, na primer, kiselom ili baznom hidrolizom.
Modifikovan: Kao što se ovde upotrebljava, termin "modifikovan" se odnosi na izmenjeno stanje ili strukturu molekula ili entiteta u poređenju sa matičnim ili referentnim molekulom ili entitetom. Molekuli mogu biti modifikovani na mnogo načina, uključujući hemijski, strukturno i funkcionalno. U pojedinim primerima izvođenja, jedinjenja i/ili kompozicije predmetnog pronalaska se modifikuju uvođenjem neprirodnih aminokiselina.
Mutacija: Kao što se ovde upotrebljava, termin "mutacija" se odnosi na promenu i/ili izmenu. U pojedinim primerima izvođenja, mutacije mogu biti promene i/ili izmene u okviru proteina (uključujući peptide i polipeptide) i/ili nukleinskih kiselina (uključujući polinukleinske kiseline). U pojedinim primerima izvođenja, mutacije obuhvataju promene i/ili izmene proteinske i/ili sekvence nukleinske kiseline. Takve promene i/ili izmene mogu obuhvatati adiciju, supstituciju i/ili deleciju jedne ili više aminokiselina (u slučaju proteina i/ili peptida) i/ili nukleotida (u slučaju nukleinskih kiselina i/ili polinukleinskih kiselina). U primerima izvođenja u kojima mutacije obuhvataju adiciju i/ili supstituciju aminokiselina i/ili nukleotida, takve adicije i/ili supstitucije mogu obuhvatati 1 ili više aminokiselinskih i/ili nukleotidnih ostataka i mogu uključivati modifikovane aminokiseline i/ili nukleotide.
Javljaju se u prirodi: Kao što se ovde upotrebljava, „javlja se u prirodi“ označava postojanje u prirodi bez veštačke pomoći ili umešanosti čovečije ruke.
Niša: Kao što se ovde upotrebljava, termin "niša" se odnosi na mesto, zonu i/ili stanište. U pojedinim primerima izvođenja, niše obuhvataju ćelijske niše. Kao što se ovde upotrebljava, termin "ćelijska niša" se odnosi na jedinstveni skup fizioloških uslova u ćelijskom sistemu unutar tkiva, organa ili organskog sistema koji se nalazi unutar ili je izveden iz organizma sisara. Ćelijksa niša može podrazumevati proces in vivo, in vitro, ex vivo, ili in situ. S obzirom na složenu prirodu i dinamičke procese koji su uključeni u signalizaciju faktora rasta, ćelijska niša može biti okarakterisana funkcionalno, prostorno ili vremenski ili može biti upotrebljena za označavanje bilo kog okruženja koje obuhvata jednu ili više ćelija. Kao takva, u pojedinim primerima izvođenja, ćelijska niša uključuje okruženje tipa bilo koje ćelije koja je susedna drugoj ćeliji koja obezbeđuje podršku, kao što je na primer, ćelija hranilica. U pojedinim primerima izvođenja, niše mogu obuhvatati one koje su opisane u privremenoj U.S. patentnoj prijavi 61/722,919, podnetoj 6. novembra 2012. godine, kao i 61/722,969, podnetoj 6. novembra 2012. godine.
Kičmenjaci različiti od čoveka: Kao što se ovde upotrebljava, "kičmenjak različit od čoveka" obuhvata sve kičmenjake, osim Homo sapiens-a, uključujući divlje i pripitomljene vrste. Primeri kičmenjaka različitih od čoveka obuhvataju, ali nisu ograničeni na, sisare, kao što su alpaka, banteng, bizon, kamila, mačka, stoka, jelen, pas, magarac, gajal, koza, zamorče, konj, lama, mazga, svinja, zec, irvasi, ovca vodni bivo i jak.
Van mesta ciljanog dejstva: Kao što se ovde upotrebljava, "van mesta ciljanog dejstva" se odnosi na bilo koji neželjeni efekat, na bilo kom od jednog ili više ciljnih molekula, gena i/ili ćelijskih transkripata.
Operativno povezani: Kao što se ovde upotrebljava, termin "operativno povezan" se odnosi na funkcionalnu vezu između dva ili više molekula, konstrukata, transkripata, entiteta, ostataka ili sličnog.
Paratop: Kao što se ovde upotrebljava, "paratop" se odnosi na mesto na antitelu kojim se vezuje za antigen.
Pasivna adsorpcija: Kao što se ovde upotrebljava, "pasivna adsorpcija" se odnosi na postupak imobilizacije čvrstih faza reaktanata na jednoj ili više površina (npr. membrana, posuda, posuda za kulturu, ploča za testove itd.) Do imobilizacije obično dolazi usled afiniteta između takvih reaktanata i komponenata površine.
Pacijent: Kao što se ovde upotrebljava, „pacijent“ se odnosi na subjekta koji može tražiti ili mu je potrebno lečenje, kome je potreban tretman, leči se, lečiće se ili predstavlja subjekta koji je pod brigom obučenog (npr. licenciranog) stručnjaka za određeno oboljenje ili stanje.
Peptid: Kao što se ovde upotrebljava, termin "peptid" se odnosi na lanac aminokiselina koji je dužine manje ili jednake od oko 50 aminokiselina, npr. dug je oko 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ili 50 aminokiselina.
Farmaceutski prihvatljiv: Izraz "farmaceutski prihvatljiv" se ovde upotrebljava da označi ona jedinjenja, materijale, kompozicije i/ili dozne oblike koji su, u okviru dobre medicinske procene, pogodni za upotrebu u kontaktu sa tkivima ljudskih bića i životinja bez prekomerne toksičnost, iritacije, alergijskog odgovora ili drugih problema ili komplikacija, srazmerno razumnom odnosu koristi i rizika.
Farmaceutski prihvatljivi eksipijensi: Kao što se ovde upotrebljava, termin "farmaceutski prihvatljiv ekscipijens", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na bilo koji sastojak drugačiji od aktivnih agenasa (npr. kao što je ovde opisano), a koji je prisutan u farmaceutskim kompozicijama i sa svojstvom je da je suštinski netoksičan i da kod subjekta ne dovodi do inflamacije. U pojedinim primerima izvođenja, farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi su nosači sposobni da resuspenduju i/ili rastvore aktivne agense. Eksipijensi mogu obuhvatati, na primer: antiadherente, antioksidanse, povezujuće agense, premaze, pomoćna agense za kompresiju, agense za dezintegraciju, boje (obojene supstance), emolijente, emulgatore, ispunjivače (razblaživače), agnese za obrazovanje filmova ili obloga, arome, mirise, glidanse (pojačivače protoka), lubrikante, konzervanse, mastila za štampu, sorbente, agense za resuspendovanje ili dispergovanje, zaslađivače i vode za hidrataciju. Primeri eksipijenasa obuhvataju, ali nisu ograničeni na: butilisani hidroksitoluen (BHT), kalcijum-karbonat, kalcijum-fosfat (dvobazni), kalcijum-stearat, kroskarmelozu, umreženi polivinil-pirolidon, limunsku kiselinu, krospovidon, cistein, etilcelulozu, želatin, hidroksipropil celulozu, hidroksipropil metilcelulozu, laktozu, magnezijum stearat, maltitol, manitol, metionin, metilcelulozu, metil paraben, mikrokristalnu celulozu, polietilen glikol, polivinil pirolidon, povidon, preželatinizovani skrob, propil paraben, retinil palmitat, šelak, silicijum dioksid, natrijum karboksimetil celulozu, natrijum citrat, natrijum skrobni glikolat, sorbitol, skrob (kukuruza), stearinsku kiselinu, saharozu, talk, titanijum dioksid, vitamin A, vitamin E, vitamin C i ksilitol.
Farmaceutski prihvatljive soli: Farmaceutski prihvatljive soli ovde opisanih jedinjenja su oblici opisanih jedinjenja gde je kiseli ili bazni ostatak u obliku soli (npr. nastaje reakcijom slobodne bazne grupe sa pogodnom organskom kiselinom). Primeri farmaceutski prihvatljivih soli obuhvataju, ali nisu ograničeni na, soli mineralnih ili organskih kiselina sa baznim ostacima kao što su amini; alkalne ili organske soli kiselih ostataka kao što su karboksilne kiseline; i slično. Reprezentativne kisele adicione soli uključuju acetat, adipat, alginat, askorbat, aspartat, benzensulfonat, benzoat, bisulfat, borat, butirat, kamforat, kamforsulfonat, citrat, ciklopentanpropionat, diglukonat, dodecilsulfat, etansulfonat, fumarat, glukoheptonat, glicerofosfat, hemisulfat, heptonat, heksanoat, hidrobromid, hidrohlorid, hidrojodid, 2-hidroksi-etansulfonat, laktobionat, laktat, laurat, lauril sulfat, malat, maleat, malonat, metansulfonat, 2-naftalensulfonat, nikotinat, nitrat, oleat, oksalat, palmitat, pamoat, pektinat, persulfat, 3-fenilpropionat, fosfat, pikrat, pivalat, propionat, stearat, sukcinat, sulfat, tartarat, tiocijanat, toluensulfonat, undekanoat, valerat i slično. Reprezentativne soli alkalnih ili zemnoalkalnih metala uključuju soli natrijuma, litijuma, kalijuma, kalcijuma, magnezijuma i sličnog, kao i netoksične soli amonijuma, kvaternarnog amonijuma i aminske katione, uključujući, ali ne ograničavajući se na, amonijum, tetrametilamonijum, tetraetilamonijum, metilamin, dimetilamin, trimetilamin, trietilamin, etilamin i slično. Farmaceutski prihvatljive soli obuhvataju i uobičajene netoksične soli, na primer, iz netoksičnih neorganskih ili organskih kiselina. U pojedinim primerima izvođenja, farmaceutski prihvatljiva so se priprema od matičnog jedinjenja koje sadrži bazni ili kiseli ostatak, konvencionalnim hemijskim postupcima. U principu, takve soli se mogu dobiti reakcijom slobodnih kiselih ili baznih oblika ovih jedinjenja sa stehiometrijskom količinom odgovarajuće baze ili kiseline, u vodi ili u organskom rastvaraču, ili u smeši ova dva; u principu su poželjni nevodni medijumi poput etra, etil acetata, etanola, izopropanola ili acetonitrila. Spiskovi pogodnih soli se mogu pronaći u Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17. izd., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, str. 1418, Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P.H. Stahl i C.G. Wermuth (ur.), Wiley-VCH, 2008, i Berge i saradnici, Journal of Pharmaceutical Science, 66, 1-19 (1977). Farmaceutski prihvatljiv solvat: Termin "farmaceutski prihvatljiv solvat", kako se ovde upotrebljava, se odnosi na kristalni oblik jedinjenja u kome su molekuli pogodnog rastvarača ugrađeni u kristalnu rešetku. Na primer, solvati se mogu pripremiti kristalizacijom, rekristalizacijom ili taloženjem iz rastvora koji uključuje organske rastvarače, vodu ili njihovu smešu. Primeri pogodnih rastvarača su etanol, voda (na primer, mono-, di- i tri-hidrati), N-metilpirolidinon (NMP), dimetil sulfoksid (DMSO), N,N'-dimetilformamid (DMF), N,N'-dimetilacetamid (DMAC), 1,3-dimetil-2-imidazolidinon (DMEU), 1,3-dimetil-3,4,5,6-tetrahidro-2-(1H)-pirimidinon (DMPU), acetonitril (ACN), propilen glikol, etil acetat, benzil alkohol, 2-pirolidon, benzil benzoat i slično. Kada je rastvarač voda, solvat se označava kao „hidrat“. U pojedinim primerima izvođenja, rastvarač ugrađen u solvat je tipa ili u nivou koji je fiziološki podnošljiv za organizam kome se solvat daje (npr. u obliku jedinične doze farmaceutske kompozicije).
Farmakokinetika: Kao što se ovde upotrebljava, "farmakokinetika" se odnosi na bilo koju jednu ili više karakteristika molekula ili jedinjenja, pošto se odnosi na određivanje sudbine supstanci primenjenih živim organizmima. Farmakokinetika je podeljena na nekoliko oblasti, uključujući obim i brzinu apsorpcije, distribucije, metabolizam i izlučivanje. Ovo se obično označava sa ADME gde: (A) apsorpcija je proces kojim supstanca ulazi u krvnu cirkulaciju; (D) Distribucija je raspršivanje ili širenje supstanci kroz tečnosti i tkiva tela; (M) Metabolizam (ili biotransformacija) je nepovratna transformacija matičnih jedinjenja u ćerke metabolite; i (E) Izlučivanje (ili eliminacija) se odnosi na uklanjanje supstanci iz tela. U retkim slučajevima, pojedini lekovi se ireverzibilno nakupljaju u tkivima organizma.
Fizičko-hemijski: Kao što se ovde upotrebljava, "fizičko-hemijski" označava ili se odnosi na fizičku i/ili hemijsku osobinu.
Prevencija: Kao što se ovde upotrebljava, termin "prevencija" se odnosi na delimično ili potpuno odlaganje početka infekcije, oboljenja, poremećaja i/ili stanja; delimično ili potpuno odlaganje pojave jednog ili više simptoma, obeležja ili kliničkih manifestacija određene infekcije, oboljenja, poremećaja i/ili stanja; delimično ili potpuno odlaganje pojave jednog ili više simptoma, karakteristika ili manifestacija određene infekcije, oboljenja, poremećaja i/ili stanja; delimično ili potpuno odlaganje progresije infekcije, određene bolesti, poremećaja i/ili stanja; i/ili smanjenja rizika od razvoja patologije povezane sa infekcijom, bolešću, poremećajem i/ili stanjem.
Prolek: Predmetni opis takođe obuhvata prolekove jedinjenja koja su ovde opisana. Kao što se ovde upotrebljava, „prolekovi“ se odnose na bilo koju supstancu, molekul ili entitet koji je oblika koji prethodi supstacni, molekulu ili entitetu, a koji deluje kao terapeutik nakon hemijske ili fizičke izmene. Prolekovi mogu biti kovalentno vezani ili sekvestrirani na neki način dok se ne prevedeu u aktivan lekoviti ostatak, pre, tokom ili nakon primene sisarskom subjektu. Prolekovi se mogu pripremati modifikovanjem funkcionalnih grupa prisutnih u jedinjenjima, na takav način da se modifikacije cepaju, bilo u rutinskoj manipulaciji ili in vivo, na matična jedinjenja. Prolekovi uključuju jedinjenja u kojima su hidroksilne, amino, sulfhidrilne ili karboksilne grupe vezane za bilo koju grupu koja se, kada se primeni sisarskom subjektu, cepa da bi obrazovala slobodna hidroksilna, amino, sulfhidrilna ili karboksilna grupa. O pripremi i upotrebi prolekova se diskutuje u T. Higuchi i V. Stella, "Pro-drugs as Novel Delivery Systems," tom 14 za A.C.S. Symposium Series, and in Bioreversible Carriers in Drug Design, ur. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987.
Proliferisati: Kao što se ovde upotrebljava, termin „proliferisati“ označava rasti, širiti, umnožavati ili povećavati se ili prouzrokovati rast, širenje, replikaciju ili povećanje. „Proliferativni“ označava imati sposobnost proliferacije. „Anti-proliferativno“ označava imati svojstva koja su suprotna proliferativnim svojstvima ili su u suprotnosti sa njima.
Protein od interesa: Kao što se ovde upotrebljava, termini "proteini od interesa" ili "željeni proteini" uključuju one koji su ovde obezbeđeni, kao i njihove fragmente, mutante, varijante i njihove izmene.
Proksimalno: Kao što se ovde upotrebljava, termin "proksimalno" označava da je nešto smešteno bliže centru ili tački ili regionu od interesa.
Prečišćeno: Kao što se ovde upotrebljava, termin "prečišćavanje" označava da se nešto u osnovi učini čistim ili da se čisti od neželjenih komponenti, zaprljanosti materijala, primesa ili nesavršenosti. „Prečišćeno“ se odnosi na stanje čistoće. „Prečišćavanje“ se odnosi na proces stvaranja čistog.
Region: Kao što se ovde upotrebljava, termin "region" se odnosi na zonu ili generalno područje. U pojedinim primerima izvođenja, kada se odnosi na protein ili proteinski modul, region može obuhvatati linearnu sekvencu aminokiselina duž proteina ili proteinskog modula ili može obuhvatati trodimenzionalno područje, epitop i/ili klaster eptiopa. U pojedinim primerima izvođenja, regioni obuhvataju terminalne regione. Kao što se ovde upotrebljava, termin "terminalni region" se odnosi na regione koji se nalaze na krajevima ili završecima datog agensa. Kada se odnose na proteine, terminalni regioni mogu sadržavati N- i/ili C-završetke. N-krajevi se odnose na krajeve proteina koji sadrži aminokiselinu sa slobodnom amino grupom. C-krajevi se odnose na krajeve proteina koji sadrži aminokiselinu sa slobodnom karboksilnom grupom. N- i/ili C-terminalni regioni mogu sadržavati N- i/ili C-krajeve, kao i okolne aminokiseline. U pojedinim primerima izvođenja, N- i/ili C-terminalni regioni sadrže od oko 3 aminokiseline do oko 30 aminokiselina, od oko 5 aminokiselina do oko 40 aminokiselina, od oko 10 aminokiselina do oko 50 aminokiselina, od oko 20 aminokiselina do oko 100 aminokiselina i/ili najmanje 100 aminokiselina. U pojedinim primerima izvođenja, N-terminalni regioni mogu sadržavati bilo koju dužinu aminokiselina koja uključuje N-kraj, ali ne uključuje C-kraj. U pojedinim primerima izvođenja, C-terminalni regioni mogu sadržavati bilo koju dužinu aminokiselina koja uključuju C-kraj, ali ne sadrži N-kraj.
Region prepoznavanja antitela: Kao što se ovde upotrebljava, termin "region prepoznavanja antitela" se odnosi na jedan ili više regiona na jednom ili više antigena ili između dva ili više antigena, a koje odgovarajuća antitela mogu specifično prepoznati i za koje se mogu vezati. U pojedinim primerima izvođenja, regioni prepoznavanja antitela mogu sadržavati 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili najmanje 10 aminokiselinskih ostataka. U pojedinim primerima izvođenja, regioni prepoznavanja antitela sadrže spoj između dva proteina ili između dva domena istog proteina koji su u neposrednoj blizini jedan sa drugim.
Uzorak: Kao što se ovde upotrebljava, termin "uzorak" se odnosi na alikvot ili deo uzet iz izvora i/ili obezbeđen za analizu ili obradu. U pojedinim primerima izvođenja, uzorak je iz biološkog izvora kao što je tkivo, ćelija ili njihov sastavni deo (npr. telesna tečnost, uključujući, ali ne ograničavajući se na, krv, sluz, limfnu tečnost, sinovijalnu tečnost, cerebrospinalnu tečnost, pljuvačku, plodovu vodu, krv pupčane vrpce, urin, vaginalna tečnost i sperma). U pojedinim primerima izvođenja, uzorak može biti ili sadržavati homogenat, lizat ili ekstrakt pripremljen iz celog organizma ili podskupa njegovih tkiva, ćelija ili sastavnih delova istih, ili iz frakcija i delova istih, uključujući, ali ne ograničavajući se na, na primer, plazmu, serum, spinalnu tečnost, limfnu tečnost, spoljne delove kože, respiratornog, crevnog i genitourinarnog trakta, suze, pljuvačku, mleko, krvne ćelije, tumore, organe. U pojedinim primerima izvođenja, uzorak je ili sadrži medijum, poput hranljive podloge ili gela, koji može sadržavati ćelijske komponente, poput proteina ili molekula nukleinske kiseline. U pojedinim primerima izvođenja, "primarni" uzorak je alikvot dobijen iz izvora. U pojedinim primerima izvođenja, primarni uzorak se podvrgava jednom ili više koraka obrade (npr. razdvajanju, prečišćavanju itd.). da bi se pripremio uzorak za analizu ili drugu upotrebu.
Signalne sekvence: Kao što se ovde upotrebljava, termin "signalne sekvence" se odnosi na sekvencu koja može usmeriti transport ili lokalizaciju proteina.
Jednokratna jedinična doza: Kao što se ovde upotrebljava, "jednokratna jedinična doza" je doza bilo kog terapijskog agense koja se primenjuje u jednoj dozi/odjednom/jednim putem primene/jednom tačkom kontakta, tj. u jednom događaju primene. U pojedinim primerima izvođenja, jednokratna jedinična doza je obezbeđena kao diskretni dozni oblik (npr. tableta, kapsula, flaster, napunjen špric, bočica itd.).
Sličnost: Kao što se ovde upotrebljava, termin "sličnost" se odnosi na sveukupan odnos između polimernih molekula, npr. između polinukleotidnih molekula (npr. molekula DNK i/ili molekula RNK) i/ili između polipeptidnih molekula. Izračunavanje procenta sličnosti polimernih molekula jednih sa drugima se može izvršiti na isti način kao i izračunavanje procenta identičnosti, s tim što izračunavanje procenta sličnosti uzima u obzir konzervativne supstitucije, kao što se to podrazumeva u oblasti tehnike.
Podeljena doza: Kao što se ovde upotrebljava, "podeljena doza" je podela jednokratne jedinične doze ili ukupne dnevne doze na dve ili više doza.
Stabilno: Kao što se ovde upotrebljava, "stabilno" se odnosi na jedinjenje ili entitet koji je dovoljno robustan da preživi izolaciju do korisnog stepena čistoće iz reakcione smeše, a poželjno je sposoban i da bude formulisan u ekikasan terapijski agens.
Stabilizovano: Kao što se ovde upotrebljava, termini "stabilizovati", "stabilizovan", "stabilizovan region" označavaju postupak da se nešto učini ili da postane sabilno. U pojedinim primerima izvođenja, stabilnost se meri u odnosu na apsolutnu vrednost. U pojedinim primerima izvođenja, stabilnost se meri u odnosu na referentno jedinjenje ili entitet.
Subjekat: Kao što se ovde upotrebljava, termin "subjekat" ili "pacijent" se odnosi na bilo koji organizam kome se može primeniti kompozicija u skladu sa pronalaskom, npr. u eksperimentalne, dijagnostičke, profilaktičke i/ili terapijske svrhe. Uobičajeni subjekti obuhvataju životinje (npr. sisare kao što su miševi, pacovi, zečevi, primati različiti od čoveka i ljudi) i/ili biljke.
Suštinski: Kao što se ovde upotrebljava, termin "suštinski" se odnosi na kvalitativni uslov koga opisuje potpun ili gotovo potpun stepen određene karakteristike ili osobine od interesa. Prosečno iskusan stručnjak iz oblasti biologije će razumeti da se biološki i hemijski fenomeni retko, ukoliko ikada, završe i/ili pređu u potpunosti ili postignu ili izbegnu apsolutan rezultat. Termin "suštinski" se stoga ovde koristi za hvatanje potencijalnog nedostatka potpunosti koji je svojstven mnogim biološkim i hemijskim pojavama.
Suštinski jednak: Kao što se ovde upotrebljava, kada se odnosi na vremenske razlike između doza, termin označava plus/minus 2%.
Suštinski istovremeno: Kao što se ovde upotrebljava, kada se odnosi na mnoštvo doza, termin obično označava unutar perioda od oko 2 sekunde.
Bolovati od: Pojedincu koji „boluje od“ oboljenja, poremećaja i/ili stanja je postavljena dijagnoza ili je utvrđeno prisustvo jednog ili više simptoma oboljenja, poremećaja i/ili stanja.
Podložan: Pojedincu koji je „podložan“ oboljenju, poremećaju i/ili stanju, nije postavljena dijagnoza istog i/ili možda neće ispoljavati simptome oboljenja, poremećaja i/ili stanja, ali je sa sklonošću da razvije oboljenje ili njegove simptome. U pojedinim primerima izvođenja, pojedinac koji je podložan bolesti, poremećaju i/ili stanju (na primer, kanceru) se može okarakterisati jednim ili više od sledećeg: (1) genetičkom mutacijom koja je udružena sa razvojem oboljenja, poremećaja i/ili stanja; (2) genetičkim polimorfizmom koji je udružen sa razvojem oboljenja, poremećaja i/ili stanja; (3) povećanjem i/ili smanjenjem ekspresije i/ili aktivnosti proteina i/ili nukleinske kiseline povezane sa oboljenjem, poremećajem i/ili stanjem; (4) navike i/ili način života koji je povezan sa razvojem oboljenja, poremećaja i/ili stanja; (5) porodična istorija oboljenja, poremećaja i/ili stanja; i (6) izlaganje i/ili infekcija sa mikrobom koji je povezan sa razvojem oboljenja, poremećaja i/ili stanja. U pojedinim primerima izvođenja, pojedinac koji je podložan oboljenju, poremećaju i/ili stanju, razviće oboljenje, poremećaj i/ili stanje. U pojedinim primerima izvođenja, pojedinac koji je podložan oboljenju, poremećaju i/ili stanju neće razviti oboljenje, poremećaj i/ili stanje.
Sintetski: Termin „sintetski“ označava proizveden, pripremljen i/ili sintetisan čovečijom rukom. Sinteza polinukleotida ili polipeptida ili drugih molekula predmetnog pronalaska može biti hemijska ili enzimska.
Ciljne ćelije: Kao što se ovde upotrebljava, "ciljne ćelije" se odnosi na bilo koju jednu ili više ćelija od interesa. Ćelije mogu biti pronađene in vitro, in vivo, in situ ili u tkivu ili organu organizma. Organizam može biti životinja, poželjno sisar, poželjnije čovek i najpoželjnije je pacijent.
Ciljno mesto: Termin "ciljno mesto", kako se ovde upotrebljava, se odnosi na region ili područje na koje se ciljano deluje sa jedinjenjem ili kompozicijom pronalaska. Ciljna mesta mogu obuhvatati, ali nisu ograničena na ćelije, tkiva, organe, sisteme organa, niše i slično.
Terapijski agens: Termin "terapijski agens" se odnosi na bilo koji agens koji, kada se primeni subjektu, ima terapijski, dijagnostički i/ili profilaktički efekat i/ili izaziva željeni biološki i/ili farmakološki efekat.
Terapijski efektivna količina: Kao što se ovde upotrebljava, termin "terapijski efektivna količina" označava količinu agensa koja će biti isporučena (npr. nukleinske kiseline, leka, terapijskog agensa, dijagnostičkog agensa, profilaktičkog agensa itd.), a koja je dovoljna da, kada se primeni subjektu koji boluje ili je podložan infekciji, oboljenju, poremećaju i/ili stanju radi lečenja, poboljšava simptome, dijagnozu, sprečava i/ili odlaže početak infekcije, oboljenja, poremećaja i/ili stanja. U pojedinim primerima izvođenja, terapijski efektivna količina se obezbeđuje u jednoj dozi. U pojedinim primerima izvođenja, terapijski efektivna količina se primenjuje prema doznom režimu koji obuhvata mnoštvo doza. Stručnjaci iz oblasti će razumeti da se u pojedinim primerima izvođenja, može smatrati da jedinični dozni oblik sadrži terapijski efektivnu količinu određenog agensa ili entiteta ukoliko sadrži količinu koja je efektivna kada se primeni kao deo takvog doznog režima.
Terapijski efektivna ishod: Kao što se ovde upotrebljava, termin "terapijski efektivan ishod" označava ishod koji je dovoljan kod subjekta koji boluje od ili je podložan infekciji, bolesti, poremećaju i/ili stanju, zarad lečenja, poboljšanje simptoma, dijagnoze, prevencije i/ili odlaganja početka infekcije, oboljenja, poremećaja i/ili stanja.
Ukupna dnevna doza: Kao što se ovde upotrebljava, "ukupna dnevna doza" je količina data ili propisana u periodu od 24 sata. Može biti primenjena kao jednokratna jedinična doza.
Transkripcioni faktor: Kao što se ovde upotrebljava, termin "transkripcioni faktor" se odnosi na protein koji se vezuje za DNK i reguliše transkripciju DNK u RNK, na primer, aktivacijom ili represijom transkripcije. Pojedini transkripcioni faktori utiču na regulaciju transkripcije samostalno, dok drugi deluju zajedno sa drugim proteinima. Pojedini transkripcioni faktori mogu i aktivirati i suprimirati transkripciju pod određenim uslovima. U principu, transkripcioni faktori se vezuju za specifične ciljen sekvence ili za sekvence koje su veoma slične određenoj konsenzusnoj sekvenci u regulatornom regionu ciljnog gena. Transkripcioni faktori mogu regulisati transkripciju ciljnog gena samostalno ili u kompleksu sa drugim molekulima.
Lečenje: Kao što se ovde upotrebljava, termin "lečenje" se odnosi na delimično ili potpuno ublažavanje, smanjenje, umanjenje, olakšavanje, odlaganje početka, inhibiranje progresije, smanjenje ozubiljnost i/ili smanjenje učestalosti jednog ili više simptoma ili karakteristika određene infekcije, bolesti, poremećaja i/ili stanja. Na primer, „lečenje“ kancera se može odnositi na inhibiranje preživljavanja, rasta i/ili širenja tumora. Lečenje se može primeniti kod subjekta koji ne ispoljavaju znake oboljenja, poremećaja i/ili stanja i/ili kod subjekta koji ispoljavaju samo rane znake oboljenja, poremećaja i/ili stanja, a u cilju smanjenja rizika za razvoj patologije povezane sa oboljenjem, poremećajem i/ili stanjem.
Nemodifikovano: Kao što se ovde upotrebljava, "nemodifikovano" se odnosi na bilo koju supstancu, jedinjenje ili molekul pre nego što se promeni na bilo koji način. Nemodifikovano se može odnositi, ali nije uvek tako, na biomolekul ili entitet divljeg tipa ili na njegov nativni oblik. Molekuli ili entiteti mogu biti podvrgnuti serijama modifikacija, pri čemu svaki modifikovani proizvod može poslužiti kao „nemodifikovan“ polazni molekul ili celina za sledeću modifikaciju.
EKVIVALENTI I OBIM PRONALASKA
[0418] Stručnjaci iz oblasti tehnike će prepoznati, ili biti u stanju da utvrde, koristeći ne više od rutinskog eksperimentisanja, mnoštvo ekvivalenata za specifične primere izvođenja koji su u skladu pronalaskom koji je ovde opisan. Nije predviđeno da obim predmetnog pronalaska bude ograničen sa prethodno navedenim Opisom pronalaska, već da prevashodno bude definisan kao što je izloženo u priloženim patentnim zahtevima.
[0419] U patentnim zahtevima, jednine pojmova obuhvataju i množinu, osim ukoliko nije jasno naznačeno suprotno ili je to na drugi način očigledno iz konteksta. Patentni zahtevi ili opisi koji uključuju „ili“ između jednog ili više članova grupe, smatraju se zadovoljenim ukoliko su jedan, više od jednog ili svi članovi grupe prisutni, iskorišeni u ili na neki drugi način relevantni za dati proizvod ili postupak, osim ukoliko nije naznačeno suprotno ili je to na drugi način očigledno iz konteksta. Pronalazak obuhvata primere izvođenja i u kojima je tačno jedan član grupe pristuan, iskorišćen u ili na drugi način relevantan za dati proizvod ili postupak. Pronalazak uključuje i primere izvođenja u kojima je više od jednog ili čitava grupa članova prisutna, iskorišćena u ili na neki drugi način relevantna za dati proizvod ili postupak.
[0420] Potrebno je takođe napomenuti da je predviđeno da termin „sadrži“ bude otvorenog značenja i da dozvoljava, ali ne i da zahteva, uključivanje dodatnih elemenata ili koraka. Kada se ovde upotrebljava termin "sadrži", termin "sastoji se od" je takođe obuhvaćen i opisan.
[0421] Kada su navedeni opseci, krajnje tačke su takođe uključene. Štaviše, podrazumeva se da vrednosti koje su izražene, ukoliko nije drugačije naznačeno ili je na drugi način očigledno iz konteksta ili iz opštih premisa poznatih prosečno iskusnim stučnjacima, mogu poprimiti bilo koju određenu vrednost ili podopseg u navedenim opsezima, u različitim primerima izvođenja pronalaska, do desetine jedinice donje granice opsega, osim ukoliko kontekst jasno ne nalaže drugačije.
[0422] Dodatno, podrazumeva se da bilo koji određeni primer izvođenja predmetnog pronalaska koja potpada u poznato stanje tehnike, može biti izričito isključen iz bilo kog jednog od ovih zahteva ili više njih. S obzirom da se smatra da su takvi primeri izvođenja poznati prosečno iskusnom stručnjaku, oni mogu biti isključeni čak iako izuzeće ovde nije izričito navedeno. Bilo koji poseban primer izvođenja kompozicija pronalaska (npr. bilo koja nukleinska kiselina ili protein koji je njome kodiran; bilo koji način proizvodnje; bilo koji način upotrebe; itd.) mogu biti izuzeti iz bilo kog jednog ili više zahteva iz bilo kog razloga, bilo da su povezani sa postojećim stanjem tehnike ili ne.
[0423] Naslovi odeljaka i tabela nisu ograničeni.
PRIMERI
Primer 1. Sistem ekspresije proteina
[0424] Ekspresija proteina je vršena upotrebom 293E ćelija.293E ćelije su HEK293 ćelije koje stabilno eksprimiraju EBNA1 (nuklearni antigen-1 Epštajn-Barovog virusa). Ove ćelije su humane ćelije koje post-translaciono modifikuju proteine tako da sadrže strukture koje su slične humanim (npr. glikane). Takve ćelije se mogu lako tranfektovati i lako im se može podesiti obim proizvodnje, a sposobne su da rastu u visokim gustinama u kuturama tipa suspenzija. Tokom proizvodnje proteina, 293E ćelije su gajene u medijumu bez seruma da bi se olakšalo nishodno prečišćavanje. Pojedini od proizvedenih proteina sadrže dodatne aminokiseline koje kodiraju jedan ili više obeleživača koji se mogu detektovati, radi prečišćavanja [npr. polihistidinski tag, oligopeptidni tag (DYKDDDDK; SEQ ID NO: 265) itd.] Proteini su N-terminalno obeleženi, C-terminalno obeleženi i/ili biotinizovani.
[0425] Pojedini od proizvedenih proteina sadrže dodatne aminokiseline koje kodiraju jedno ili više mesta cepanja za 3C proteaze (LEVLFQGP; SEQ ID NO: 266) Takva mesta omogućavaju cepanje između ostataka Q i G u okviru 3C proteaznog mesta cepanja nakon tretmana sa 3C proteazom, uključujući, tretman sa rinovirusnom 3C proteazom. Mesta cepanja se uvode da bi se omogućilo uklanjanje obeleživača koji se mogu detektovati iz rekombinantnih proteina.
[0426] Sekvence koje kodiraju rekombinantne proteine predmetnog pronalaska se kloniraju u pTT5 vektore (NRC Biotechnology Research Institute, Montreal, Kvebek.) radi transfekcije u ćelije. Takvi vektori su mali (~4,4 kb), olakšavaju tranzijentnu transfekciju, sadrže snažan CMV promotor za robusnu sintezu proteina i sadrže oriP za epizomsku replikaciju u ćelijama koje eksprimiraju EBNA1.
Primer 2. Generisanje antitela
Antitela proizvedena standardnim generisanjem monoklonskih antitela
[0427] Antitela su generisana kod nokaut miševa kojima nedostaje gen koji kodira željene ciljne antigene. Takvi miševi ne tolerišu ciljne antigene i stoga generišu antitela na takve antigena koja mogu unakrsno reagovati sa humanim i mišjim oblicima antigena. Za proizvodnju monoklonskih antitela, miševi domaćini su imunizovani sa rekombinantnim proteinima, da bi se indukovali limfociti koji se specifično vezuju za takve proteine. Llimfociti se zatim prikupljani i fuzionisani sa imortalizovanim ćelijskim linijama. Dobijene hibridomske ćelije su kultivisane u pogodnom medijumu za kuluturu, uz upotrebu selekcionih agenasa koji podržavaju rast samo fuzionisanih ćelija.
[0428] Željene hibridomske ćelijske linije su zatim identifikovane analizom specifičnosti vezivanja izlučenih antitela za ciljne peptide, a klonovi takvih ćelija su subklonirani procedurama ograničenog razblaživanja i dalje gajenja upotrebom standardnih postupaka. Antitela proizvedena ovakvim ćelijama su dalje izolovana i prečišćena iz medijuma kulture standardnim procedurama za prečišćavanja imunoglobulina
Antitela proizvedena rekombinantno
[0429] Rekombinantna antitela su proizvedena upotrebom prethodno proizvedenih hibridomskih ćelija. Sekvence cDNK varijabilnih regiona teškog i lakog lanca su utvrđene upotrebom standardnih biohemijskih tehnika. Ukupna RNK je ekstrahovana iz hibridomskih ćelija koje proizvode antitela, pa je konvertovana u cDNK dejstvom reverzne transkriptaze (RT), naposredno pre lančane reakcije polimeraze (PCR). PCR amplifikacija je izvođena na dobijenoj cDNK, upotrebom prajmera koji su specifični za amplifikaciju sekvenci teških i lakih lanaca. PCR proizvodi su zatim subklonirani u plazmide radi analize sekvence. Jednom kada su sekvencirane, sekvence koje kodiraju antitela su uvedene u ekspresione vektore. Za humanizaciju su upotrebljene kodirajuće sekvence za humane konstantne domene teškog i lakog lanca, da bi se iste supstituisale sa homolognim mišjim sekvencama. Dobijeni konstrukti su transfektovani u sisarske ćelije sposobne za translaciju u velikom obimu.
Antitela proizvedena upotrebom tehnika skrininga biblioteke sa fragmentima antitela
[0430] Antitela predmetnog pronalaska mogu biti proizvedena upotrebom postupaka opisa sa visokim obimom pregleda. Sintetska antitela su dizajnirana skriningom ciljnih antigena, upotrebom fagnih biblioteka. Fagne biblioteke su sastavljenje od miliona do milijardi fagnih čestica, od kojih svaka eksprimira jedinstveni Fab fragment antitela ili jednolančani varijabilni fragment (scFv) na svom virusnom omotaču. U bibliotekama Fab fragmenata antitela, cDNK koja kodira svaki fragment sadrži istu sekvencu, sa izuzetkom jedinstvene sekvence koja kodira varijabilne petlje regiona koji određuju komplementarnost (CDR). VHlanci CDR su eksprimirani kao fuzioni protein, povezani sa N-krajem virusnog proteina omotača tipa pIII. VLlanac se eksprimira odvojeno i udružuje sa VHlancem u periplazmi pre ugradnje kompleksa u virusni omotač. Ciljni antigeni se inkubiraju in vitro, sa članovima biblioteka za prikaz u fagima, pa se vezane čestice precipitiraju. One cDNK koje kodiraju CDR iz Fab subjedinica koje su vezane, sekvencira se iz vezanog faga. Sekvenca cDNK se zatim direktno ugrađuje u sekvence antitela radi proizvodnje rekombinantnih antitela ili se mutira i koristi za dalju optimizaciju putem in vitro afinitetnog sazrevanja.
Antitela proizvedena upotrebom tehnika afinitetnog sazrevanja
[0431] Fab fragmenti sposobni za vezivanje ciljnih antigena su identifikovana upotrebom prethodno opisanih biblioteka i mutanata sa visokim afinitetom koji su iz njih izvedeni procesom afinitetnog sazrevanja. Tehnologija afinitetnog sazrevanja se upotrebljava za identifikovanje sekvenci koje kodiraju CDR i koje su sa najvećim afinitetom za ciljni antigen. Upotrebom ovakve tehnologije, CDR sekvence koje su izolovane upotrebom procesa selekcije u okviru biblioteke prikaza u fagima koji je prethodno opisan, nasumično se mutiraju u celosti ili na specifičnim ostacima, da bi se kreirali milioni do milijardi varijanti. Ovakve varijante se zatim eksprimiraju u fuzionim proteinima sa Fab fragmentima antitela u biblioteci faga za prikaz i vrši se skrining na osnovu njihove sposobnosti da vezuju ciljni antigen. Izvršeno je nekoliko rundi selekcije, mutacije i ekspresije da bi se identifikovale sekvence fragmenata antitela sa najvećim afinitetom za ciljni antigen. Ove sekvence mogu biti direktno ugrađene u sekvence antitela za proizvodnju rekombinantnih antitela.
Primer 3. Identifikacija i karakterizacija antitela usmerenih na rekombinantne proteine
[0432] Rekombinantni proteini su sintetisani u skladu sa postupkom iz Primera 1 ili su dobijeni iz komercijalnih izvora. Eksprimirani rekombinantni proteini obuhvataju one koji su navedeni u Tabeli 17.
Tabela 17. Rekombinantni proteini
[0433] Eksrpimirane su i humane i izoforme rekombinantnih proteina koje nisu humane (uključujući, ali ne ograničavajući se na, mišje) koje su navedene u Tabeli 17.
[0434] Antitela su generisana u skladu sa postupcima opisanim u Primeru 2, u kojima su najpre vezivana sa eksprimiranim rekombinantnim proteinima, a zatim podvrgnuta skriningu radi identifikovanja antitela sa željenim osobinama vezivanja. ELISA testovi su u početku upotrebljeni za identifikovanje antitela-kandidata koja pokazuju afinitet za željene antigene, pri čemu pokazuju smanjeni ili nikakav afinitet za neželjene antigene.
Identifikacija stabilišućih antitela usmerenih na TGF-β1 GPC
[0435] Antitela usmerena na proTGF-β1 C4S su dobijena skriningom i upotrebom ELISA postupka za detektovanje vezivanja za pozitivne i negativne selekcione antigene. Kod antitela je zatim ispitana njihova celokupna sposobnost da se udruže sa prodomenima (sa ili bez liganda) i da smanje TGF-β signalizaciju. ELISA ploče su oblagane neutravidinom i inkubirane su sa biotinizovanim proTGF-β1 C4S rekombinantnim proteinima. Da bi se identifikovala i eliminisala antitela koja se vezuju za razne elemente (npr. polihistidinske tagove, oktapeptidne tagove i/ili mesta cepanja 3C proteinaza), obložene ELISA ploče se inkubiraju sa humanim ICAM-1 proteinima koji su sadržavali jedan ili više takvih različitih elemenata. Da bi se identifikovala i eliminisala antitela koja se vezuju za slobodan TGF-β1 faktor rasta i/ili LAP, obložene ELISA ploče su inkubirane zatim sa humanim TGF-β1 LAP C4S i/ili TGF-β1 faktorom rasta. Antitela koja mogu biti specifična za mišje verzije, identifikovana su inkubacijom obloženih ELISA ploča sa biotinizovanim muproTGF-β1 C4S. Rekombinantni proteini koji su se vezali za antitela vezana na ELISA pločama, detektovana su upotrebom sekundarnih antitela konjugovanih sa enzimima za detekciju (npr. kolorimetrijsku, fluorimetrijsku), a koja su se vezala za obeleživače koji su se mogli detektovati i bili su prisutni na vezanim rekombinantnim proteinima. Odabir antitela je nastavljen tokom dodatnih ciklusa selekcije ili eliminacije iz pula za testiranje, na osnovu dobijenih rezultata.
[0436] Kod antitela usmerenih na proTGF-β1 C4S dalje je ispitana njihova sposobnosti da stabilizuju TGF-β1 GPC. Ćelije koje eksprimiraju GPC i/ili integrin αvβ6su inkubirane sa odabranim antitelima i rezultujući supernatanti je upotrebljen za tretman kultura ćelija koje su sadržavale reporterske konstrukte za detekciju eksresione aktivnosti gena koja zavisi od slobodnog faktora rasta. Dodatni testovi su izvođeni da bi se okarakterisali regioni prepoznavanja antitela za koje su vezana izabrana antitela, kao i modulacija faktora rasta u određenim tipovima ćelija (npr. fibroblastima i/ili T-ćelijama). Konačno, procene afiniteta vezivanja je vršena upotrebom eksperimenata unakrsnog blokiranja da bi se antitela grupisala, kao i upotrebom instrumenata za analizu afiniteta, uključujući, ali se ne ograničavajući na, Octet® (ForteBio, Menlo Park, CA) porodične instrumente. Antitela su dalje selektovana na osnovu njihove sposobnosti da stabilizuju alternativne TGF-β GPC izoforme (npr. TGF-β1, TGF-β2 i/ili TGF-β3) i TGF-β1 GPC iz drugih vrsta.
Identifikacija oslobađajućih antitela usmerenih na slobodan TGF-β1 LAP
[0437] Prema jednom režimu za generisanje antitela koja oslobađaju TGF-β1 GPC, antitela usmerena na proTGF-β1 LAP C4S su podvrgnuta skriningu upotrebom ELISA postupka, da bi se detektovalo vezivanje za pozitivne i negativne selekcione antigene. Antitelima je najpre sveukupno procenjena njihove sposobnosti da se udružuju sa LAP i da povećaju nivoe slobodnog TGF-β1 faktora rasta i/ili signalizacije. ELISA ploče su oblagane neutravidinom i inkubirane su sa biotinizovanim proTGF-β1 LAP C4S rekombinantnim proteinima. Da bi se identifikovala i eliminisala antitela koja se vezuju za razne druge elemente (npr. polihistidinske tagove, oktapeptidne tagove i/ili mesta cepanja 3C proteinaza), obložene ELISA ploče su inkubirane sa humanim ICAM-1 proteinima koji sadrže jedan ili više takvih različitih elemenata. Da bi se identifikovala i eliminisala antitela koja se vezuju za slobodan TGF-β1 faktor rasta, obložene ELISA ploče su inkubirane dalje sa humanim TGF-β1 faktorom rasta. Da bi se identifikovala i eliminisala antitela koja se vezuju za latentni TGF-β1, obložene ELISA ploče su inkubirane sa humanim TGF-β1 C4S. Antitela koja mogu biti specifična za mišje verzije su identifikovana inkubacijom obloženih ELISA ploča sa biotinizovanim muTGF-β1 LAP C4S. Rekombinantni proteini udruženi sa antitelima vezanim za ELISA ploče, detektovani su upotrebom sekundarnih antitela konjugovanih sa enzimima za detekciju (npr. kolorimetrijsku, fluorimetrijsku), a koja su se vezala za obeleživače koji su prisutni na vezanim rekombinantnim proteinima. Odabir antitela je dalje vršen kroz dodatne cikluse selekcije ili eliminacije iz testova, a na osnovu dobijenih rezultata.
[0438] Kod antitela usmerenih na proTGF-β1 LAP C4S je dalje procenjena njihova sposobnost da oslobode TGF-β1 iz GPC. Ćelije koje eksprimiraju GPC i/ili integrin αvβ6su inkubirane sa odabranim antitelima i rezultujući supernatanti su upotrebljavani za tretman kultura ćelija koje sadrže reporterske konstrukte koji reaguju na TGF-β, a da bi se detektovala aktivnost ekspresije gena koja zavisi od slobodnog faktora rasta. Dodatni testovi su rađeni da bi se okarakterisali regioni prepoznavanja antitela koji su vezani sa selektovanim antitelima, kao i modulacija faktora rasta u određenim tipovima ćelija (npr. fibroblastima i/ili T-ćelijama). Konačno, procene afiniteta vezivanja su izvršene upotrebom eksperimenata unakrsnog blokiranja da bi se antitela grupisala, kao i upotrebom instrumenata za analizu afiniteta, uključujući, ali ne ograničavajući se na, Octet® (ForteBio, Menlo Park, CA) porodične instrumente. Antitela su dalje selektovana na osnovu njihove sposobnosti da podignu nivo slobodnog faktora rasta u odnosu na latentni faktor rasta sa alternativnim TGF-β GPC izoformama (npr. TGF-β1, TGF-β2 i/ili TGF-β3) i TGF-β1 GPC iz drugih vrsta.
Identifikacija stabilišućih antitela usmerenih na TGF-β1 GPC u kontekstu LTBP
[0439] Antitela usmerena na proTGF-β1 u kompleksu sa LTBP1S su podvrgnuta skriningu upotrebom ELISA postupka radi detektovanje vezivanja za pozitivne i negativne selekcione antigene. Kod antitela je najpre procenjena njihove sveukupna sposobnosti da se udruže sa prodomenima i da smanje TGF-β signalizaciju. ELISA ploče su oblagane neutravidinom i inkubirane su sa biotiniziranim proTGF-β1 u kompleksu sa pulovima LTBP1S antitela, nakon čega su inkubirane sa rekombinantnim proteinima koji su sadržavali jedni ili više oznaka koje se mogu detektovati. Da bi se identifikovala i eliminisala antitela koja su se vezala za razne elemente (npr. polihistidinske tagove, oktapeptidne tagove i/ili mesta cepanja 3C proteinaza), obložene ELISA ploče su inkubirane sa humanim ICAM-1 proteinima koji sadrže jedan ili više takvih različitih elemenata. Da bi se identifikovala i eliminisala antitela koja se vezuju za slobodni TGF-β1, obložene ELISA ploče su dalje inkubirane sa humanim faktorom rasta TGF-β1. Antitela koja mogu biti specifična za mišje verzije su identifikovana inkubacijom obloženih ELISA ploča sa muproTGF-β1 u kompleksu sa LTBP1S. Rekombinantni proteini koji su bili vezani sa antitelima vezanim na ELISA pločama, detektovani su upotrebom sekundarnih antitela konjugovanih sa enzimima za detekciju (npr. kolorimetrijsku, fluorimetrijsku), a koja su se vezala za obeleživače koji se mogu detektovati koji su bili prisutni na vezanim rekombinantnim proteinima. Odabir antitela je nastavljen tokom dodatnih krugove selekcija ili eliminacije iz testova, na osnovu dobijenih rezultata.
[0440] Kod antitela usmerenih na proTGF-β1 u kompleksu sa LTBP1S je dalje procenjivana njihova sposobnost da stabilizuju TGF-β1 GPC aktivaciju sa αvβ6koji je bio eksprimiran na ćelijama. Ćelije koje eksprimiraju GPC i/ili αvβ6integrin su inkubirane sa izabranim antitelima i rezultujući supernatanti su upotrebljeni za tretnam kultura ćelija koje sadrže reporterske konstrukte koji reaguju na TGF-β, a da bi se detektovala aktivnost ekspresije gena koja zavisi od slobodnog faktora rasta. Dodatni testovi su izvođeni da bi se okarakterisali regioni prepoznavanja antitela koji su vezani odabranim antitelima, kao i modulacija faktora rasta u određenim tipovima ćelija (npr. fibroblastima i/ili T-ćelijama). Konačno, procene vezivanja afiniteta su vršene upotrebom eksperimenata unakrsnog blokiranja da bi se antitela grupisala, kao i upotrebom instrumenata za analizu afiniteta, uključujući, ali ne ograničavajući se na, Octet® (ForteBio, Menlo Park, CA) porodične instrumente. Antitela su dalje selektovana na osnovu njihove sposobnosti da stabilizuju alternativne TGF-β GPC izoforme (npr. TGF-β1, TGF-β2 i/ili TGF-β3) i TGF-β1 GPC iz drugih vrsta.
Identifikacija oslobađajućih antitela usmerenih na TGF-β1 LAP u kontekstu GARP
[0441] Antitela usmerena na TGF-β1 LAP u kompleksu sa sGARP su podvrgnuta skriningu upotrebom ELISA postupka za detektovanje vezivanja za pozitivne i negativne selekcione antigene. Antitelima je najpre ispitana sveukupna sposobnost da se udružuju sa LAP, ali ne i sa slobodnim GARP i njihova sposobnost da povećaju nivo TGF-β1 slobodnog faktora rasta i/ili signalizacije. ELISA ploče su oblagane neutravidinom, nakon čega je sledila inkubacija sa biotiniziranim TGF-β1 LAP, u kompleksum sa sGARP pulom antitela, pa asu inkubirane sa rekombinantnim proteinima koji su sadržavali jedan ili više obeleživača koji se mogu detektovati. Da bi se identifikovala i eliminisala antitela koja se vezuju za razne elemente (npr. polihistidinske tagove, oktapeptidne tagove i/ili mesta cepanja 3C proteinaza), obložene ELISA ploče su inkubirane sa humanim ICAM-1 proteinima koji sadrže jedan ili više takvih različitih elemenata. Da bi se identifikovala i eliminisala antitela koja se vezuju za slobodni GARP, obložene ELISA ploče su dalje inkubirane sa sGARP. Antitela koja mogu biti specifična za mišje verzije identifikovana su inkubacijom obloženih ELISA ploča sa muTGF-β1 LAP u kompleksu sa sGARP.
Rekombinantni proteini koji su bili povezani sa antitelima vezanim na ELISA pločama, detektovani su upotrebom sekundarnih antitela konjugovanih sa enzimima za detekciju (npr. kolorimetrijsku, fluorimetrijsku), a koja su se vezivala za obeleživače koji se mogu detektovati koji su bili prisutne na vezanim rekombinantnim proteinima. Selekcija antitela je nastavljana dodatnim krugovima selekcije i eliminacije iz testova, na osnovu dobijenih rezultata.
[0442] Kod antitela usmerenih na TGF-β1 LAP u kompleksu sa sGARP je dalje procenjivana njihova sposobnost da oslobađaju TGF-β1 iz GPC. Ćelije koje eksprimiraju GPC i/ili αvβ6integrin su inkubirane sa odabranim antitelima, a dobijeni supernatanti su upotrebljeni za tretman kultura ćelija koje su sadržavale reporterske konstrukte koji reaguju na TGF-β, da bi se detektovala aktivnost ekspresije gena koja zavisi od slobodnog faktora rasta.
[0443] Antitelima je takođe ispitana sposobnost da aktiviraju gensku ekstresiju zavisnu od TGF-β koja je specifična za T-ćelije. FoxP3 je transkripcioni faktor eksprimiran u T-ćelijama, za koga je poznato da je imunomodulatoran. Poznato je i da regulisan sa TGF-β koji je udružen sa GARP na površini T-ćelija. Ćelije koje eksprimiraju GPC, kao i GARP, inkubirane su sa izabranim antitelima i rezultujući supernatanti su upotrebljeni za tretman kultura EL4 ćelija koje sadrže FoxP3 reporterske konstrukte.
[0444] Da bi se okarakterisali regioni prepoznavanja antitela koji su vezani izabranim antitelima, urađeni su dodatni testovi, kao i modulacija faktora rasta u određenim tipovima ćelija (npr. fibroblastima i/ili T-ćelijama). Konačno, procene vezivanja afiniteta su rađene upotrebom eksperimenata unakrsnog blokiranja da bi se antitela grupisala, kao i upotrebom instrumenata za analizu afiniteta, uključujući, ali ne ograničavajući se na, Octet® (ForteBio, Menlo Park, CA) porodične instrumente. Odabir antitela je nastavljen na osnovu njihove sposobnosti da podignu nivo slobodnog faktora rasta u odnosu na latentni faktor rasta sa alternativnim TGF-β GPC izoformama (npr. TGF-β1, TGF-β2 i/ili TGF-β3) i TGF-β1 GPC iz drugih vrsta.
Identifikacija stabilišućih antitela usmerenih na TGF-β1 GPC u kontekstu GARP
[0445] Antitela usmerena na proTGF-β1 u kompleksu sa sGARP su podvrgnuta skriningu upotrebom ELISA za detektovanje vezivanja za pozitivne i negativne selekcione antigene. Antitelima je najpre ispitivanj njihova celokupna sposobnost da se povežu sa prodomenima i smanje TGF-β signalizaciju. ELISA ploče su oblagane neutravidinom, nakon čega je sledila inkubacija sa biotiniziranim proTGF-β1 u kompleksu sa sGARP pulovima antitela, pa su inkubirane sa rekombinantnim proteinima koji su sadržavali jedan ili više obeleživača koji se mogao detektovati. Da bi se identifikovala i eliminisala antitela koja se vezuju za razne elemente (npr. polihistidinske tagove, oktapeptidne tagove i/ili mesta cepanja 3C proteinaza), obložene ELISA ploče su inkubirane sa humanim ICAM-1 proteinima koji sadrže jedan ili više takvih različitih elemenata.Da bi se identifikovala i eliminisala antitela koja se vezuju za slobodni GARP, obložene ELISA ploče su inkubirane sa humanim sGARP. Antitela koja mogu biti specifična za mišje verzije, identifikovana su inkubacijom obloženih ELISA ploča sa muproTGF-β1 u kompleksu sa sGARP. Rekombinantni proteini koji su bili poveazni sa antitelima vezanim na ELISA ploče, detektovani su upotrebom sekundarnih antitela konjugovanih sa enzimima za kolorimetrijsku detekciju (npr. peroksidazom rena), a koja su se vezala za obeleživače koji se mogu detektovati koji su bili prisutni na vezanim rekombinantnim proteinima. Odabir antitela je nastavljen dodatnim ciklusima selekcije ili eliminacije testova, na osnovu dobijenih rezultata.
[0446] Antitelima usmerenim na proTGF-β1 u kompleksu sa sGARP, dalje je procenjivana njihova sposobnosti da stabilizuju TGF-β1 GPC. Ćelije koje eksprimiraju GPC su inkubirane sa izabranim antitelima, a dobijeni supernatant je upotrebljen za tretman kultura ćelija koje su sadržavale reporterske kontrukte koji reaguju na TGF-β, da bi se detektovala aktivnost ekspresije gena koja zavisi od slobodnog faktora rasta.
[0447] Kod antitela je ispitana i sposobnost smanjenja ekspresije gena zavisne od TGF-β koja je specifična za T-ćelije. Ćelije koje su eksprimirale GPC, kao i GARP, inkubirane su sa odabranim antitelima, a dobijeni supernatanti je upotrebljen za tretman kultura EL4 ćelija koje su sadržavale FoxP3 reporterske konstrukte. Urađeni su i dodatni testovi da bi se okarakterisali regioni prepoznavanja antitela za koja su odabrana antitela vezana, kao i modulacija faktora rasta u određenim tipovima ćelija (npr. fibroblastima i/ili T-ćelijama). Konačno, procenivan je afinitet vezivanj, upotrebom eksperimenata unakrsnog blokiranja da bi se antitela grupisala, kao i upotrebom instrumenata za analizu afiniteta, uključujući, ali ne ograničavajući se na, Octet® (ForteBio, Menlo Park, CA) porodične instrumente. Antitela se dalje selektovana na osnovu njihove sposobnosti da stabilizuju alternativne TGF-β GPC izoforme (npr. TGF-β1, TGF-β2 i/ili TGF-β3) i TGF-β1 GPC iz drugih vrsta.
Primer 4. Dizajn himernih proteina upotrebom poravnanja sekvenci
[0448] Za dizajn himernih proteina, konstruisana su poravnanja članova TGF-β familije da bi se identifikovale očuvane strukturne karakteristike i stepen očuvanosti ovih karakteristika (Slika 8.) Poređenje između sekvenci N-terminalnih regiona je ukazalo na visoke nivoe očuvanosti među N-terminalnim regionima prodomena. Na osnovu ovog poravnanja sekvence i strukturnih karakteristika ovih proteinskih modula, usvojena je generička strategija himernog dizajna za članove TGF-β familije, tako da su himere konstruisane tamo gde se zamenjuju ARM domeni (ili ceo ARM domen, ili podskupovi ARM domena, kao što je naznačeno) među članovima familije.
[0449] Preciznije, radi generisanja himera koje sadrže proteinske module iz TGF-β1, TGF-β2 i/ili TGF-β3, urađeno je poravnanje ova tri modula, upotrebom standardnih pristupa, pa su ova poravnanja sekvenci upotrebljen za kreiranje modela homologije koji upoređuje TGF-β2 i TGF-β3 sa kristalnom strukturom TGF-β1 svinje (Shi M. i saradnici, Latent TGFbeta structure and activation. Nature. 2011 Jun 15;474(7351):343-9.) Ukratko, napravljen je model sekvence TGF-β2 ili TGF-β3 na osnovu strukture matrice i poravnanja sekvenci, zajedno sa zadovoljavanjem standardnih prostornih ograničenja, upotrebom standardnih procedura. Ovakvi trodimenzionalni modeli su analizirani da bi se vizualizovalo kako predložene himerne kombinacije mogu obuhvatati regioni steričkog sukoba. Kao što se ovde upotrebljava, termin "sterički sukob" se odnosi na interakciju između dva ili više entiteta i/ili ostataka koja narušava oblik i/ili konformaciju svakog entiteta, svakog ostatka ili entiteta koji čine dva ili više ostatka koji učestvuju u interakciji. Trodimenzionalno modeliranje je ukazalo na moguće steričke sukobe između petlje latencije iz TGF-β2 i zrelog TGF-β1faktora rasta. Preciznije, petlja latencije u TGF-β2 sadrži aminokiselinsku sekvencu D-Y-P, čiji se bočni lanci mogu preklapati sa regionima TGF-β1 faktora rasta.
Primer 5. Himerni protein TGF-β1 sa okidačkom petljom TGF-β2
[0450] Mehanizam aktivacije TGF-β2 nije u potpunosti razjašnjen. Aktivacija može zavisiti od jedne ili više asocijacija između TGF-β2 pokretačke petlje i α9β1integrina. Da bi se procenio ovaj mehanizam aktivnosti TGF-β2, sintetisani su himerni proteini koji su sadržavali GPC sa TGF-β1 u kome su proteinski moduli koji sadrže sekvencu SGRRGDLATI (SEQ ID NO: 242) zamenjeni proteinskim modulima koji sadrže pokretačke petlje TGF-β2 koje sadrže sekvencu GTSTYTSGDQKTIKSTRKK ( SEQ ID NO: 180) Mehanizam aktivacije ovih himernih proteina (TGF-β1<Pokretačka petlja (kratka) β2>himerni proteini) ispitivana je testom zasnovanim na ćelijama. Ćelije (HEK293 ili Sw-480 ćelije) su transfektovane sa ili bez α9β1integrina uz GPC koji je sadržavao bilo TGF-β2, GPC sa TGF-β1 β1<Pokretačka petlja (kratka) β2>i/ili GPC sa mutiranim TGF-β2 (kao neaktivne kontrole), pri čemu su pokretačke petlje sadržavale mutacije Y240A, D245A i/ili Q246A. Reporterske ćelijske linije su upotrebljene za detektovanje oslobađanja faktora rasta.
Primer 6. Procena vezivanja α9β1-TGF-β2 i oslobađanja faktora rasta
[0451] Vezivanje između α9β1i TGF-β2, kao i naknadno oslobađanje faktora rasta nisu dobro razjašnjenji u oblasti tehnike. Ukoliko ne mogu biti utvrđeni ostaci koji su uključeni u ovakvo udruživanje, mogu se razviti antitela dizajnirana tako da poremete udruživanje α9β1i TGF-β2 koja zatim mogu biti upotrebljena za ciljano delovanje na oslobađanja TGF-β2 faktora rasta.
[0452] Mutirani konstrukti, kao i himere koje su sadržavale izmenjene oblike TGF-β2, ispitivane su u testovima aktivacije da bi se mapiralo mesto vezivanja α9β1na TGF-β2. Navedeno je postignuto generisanjem TGF-β1/TGF-β2 himera sa delecijama i/ili mutacijom aminokiselinskih ostataka u ili oko pokretačke petlje (u pojedinim primerima izvođenja, uključujući aminokiselinsku sekvencu FAGIDGTSTYTSGDQKTIKSTRKKNSGKTP; SEQ ID NO: 65) ili sa specifičnim mutacijama ostataka u u alanin. U pojedinim slučajevima, TGF-β1 ili TGF-β3 su mogli ili nisu mogli poslužiti kao negativne kontrole za α9β1vezivanje. U pojedinim primerima izvođenja, rekombinantni proteini upotrebljeni za mapiranje mesta vezivanja α9β1mogu obuhvatati one navedena u Tabeli 18. Tu spadaju proTGF-β2-M1, proTGF-β2-M2, proTGF-β2-M3, proTGF-β2-M4 i proTGF-β2-M5 koji sadrže delecije aminokiselina unutar pokretačke petlje. Takođe je uključen proTGF-β2-M6 koji sadrži mutaciju dva ostatka, Ile-Asp, u Phe-Thr. Konačno, uključen je i himerni protein koji je sadržavao TGF-β2 u kome je deo pokretačke petlje bio supstituisan sa delom pokretačke petlje iz TGF-β1.
Tabela 18. Rekombinantni protein za mapiranje mesta vezivanja α9β1
[0453] Mehanizam aktivacije tri rekombinantna proteina je ispitan testom koji je zasnovan na ćelijama. Ćelije (HEK293 ili Sw-480 ćelij) su transfektovane sa ili bez β1 integrina pored ili GPC-a koji se sastoji iz TGF-β2, GPC-a se sastoje iz mutacija zamene alanina za svaki ostatak u regionu pokretačkih petlji (pri čemu svaki isšitani GPC sadrži jednu zamenu,) jedan od rekombinantnih proteina koji se navode u Tabeli 18 i/ili GPC-i koji se sastoje iz inaktivnih mutanata TGF-β2 (kao neaktivne kontrole). Reporterske ćelijske linije su korišćene za detekciju oslobađanja faktora rasta u uzorcima medijuma koji su uzeti iz transfektovanih ćelija. Rezultati su korišćeni da bi se odredilo koji su ostaci u regionu pokretačkih petlji potrebni za α9β1-zavisno oslobađanje TGF-β2 faktora rasta.
Primer 7. Poravnanje sekvence
[0454] Više poravnanja sekvenci članova familije TGF-β je usvojeno od Shi et. al.2011 (Shi, M. et al., Latent TGF-beta structure and activation. Nature.2011 Jun 15;474(7351):343-9.) Sekvence humanog TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, GDF-11, Inhibina Beta A, Inhibina Alpha A, BMP9, BMP2, BMP4, BMP7, BMP6, BMP8A, Lefty 1, i mišjeg TGF-β1, GDF11, GDF8 i makaki majmuna TGF-β1, i GDF8 su dodate u poravnanje upotrebom standardnih postupaka, i sekvence su uključivale proteine pune dužine (isključujući signalne peptidne sekvence) (Slika 8.)
Prime 8. Test proliferacije miostatina
[0455] C2C12mišji mioblasti (ATCC, Manassas, VA) su kultivisani u Dulbekovom modifikovanom esencijalnom medijumu (DMEM; Life Technologies, Carlsbad, CA) sa 10% serumom iz fetusa govečeta (FBS; Life Technologies, Carlsbad, CA) pre izvođenja testa. Procenat FBS se razlikovao i/ili je bio zamenjen sa albuminom iz seruma govečeta (BSA) u različitim koncentracijama. Testovi ćelijske proliferacije su izvedeni u neobloženim pločama sa 96-bunarića. C2C12kulture su zasejane na 1000 ćelija po bunariću. Nakon što je ćelijama omogućeno da se vežu tokom 16 h, dodat je medijum za ispitivanje miostatina. Rekombinantni humani miostatin (R&D Systems, Minneapolis, MN) je korišćen za dobijanje standardne krive. Za eksperimentalne sisteme, dodat jesupernatant iz ćelija 293E koje miostatin eksprimiraju u višku, zatim sledi tretman sa ekperimentalnim antitelima. Svi uzorci su naneti u replikatima od 8. Ploče su inkubirane 72 h u atmosferi na 37°C i 5% CO2. Proliferacija je ispitana korišćenjem CellTiter-Glo® Luminescentnog testa za ispitivanje ćelijske vijabilnosti (Promega BioSciences, LLC, Madison, WI) u kome ćelijska liza generiše luminiscentni signal koji je proporcionalan količini pristunog ATP-a, koji je direktno proporcionalan broju ćelija prisutnih u kulturi (Thomas, M. et al., Myostatin, a negative regulator of muscle growth, functions by inhibiting myoblast proliferation.
2000.275(51):40235-43.)
Primer 9. GPC imobilizacija sa biotinilacijom i detekcijom oslobađanja faktora rasta posredovano sa integrinom
[0456] Rekombinantni GPC-i iz predmetnog pronalaska su N-terminalno biotinilovani i inkubirani su na površinama kultira koje su obložene sa streptavidinom/avidinom. Ćelije koje eksprimiraju različite integrine su dodate na površine ćelijske kulture i kultivisane su tokom 24 h. Medijumi su uklonjeni i dodati su u kulture reporterskih ćelija faktora rasta koje eksprimiriaju luciferazu u odgovoru na aktivnost faktora rasta. Nakon 24 h, ćelije su isprane, lizirane i analizirane za aktivnost luciferaze.
Primer 10. Prečišćavanje proteina sa Ni-NTA
[0457] Ćelije (293-6E ćelije) koje eksprimiraju His-obeležene proteine su kultivisane u medijumu bez seruma (FreeStyle F17 medijum, Life Technologies, Carlsbad, CA) dopunjenim sa 4 mM glutaminom, 0.1% Pluronic F68 i 25 µg/ml G418. Jednom kada je njihova vijabilnost pala ispod 50%, supernatant kulture tkiva je sakupljen i izbistren je centifugiranjem 10 minuta na gravitaciji od 200 x na 4°C. Supernatant je nakon toga proceđen prolaskom kroz filter sa veličinom pora 0.22 ili 0.45 µm. Proceđeni supernatant je kombinovan sa Tris, NaCl i NiCl2za konačnu koncentraciju od 50 mM Tris pH 8.0, 500 mM NaCl i 0.5 mM NiCl2.1 ml podešenog rastvora je sakupljeno za kasniju analizu na SDS-poli akrilamidnoj gel elektroforezi (PAGE) ili „Western“ blotu, dok je drugi deo podešenog rastvora kombinovan a zatim ispran sa Ni-NTA smolom (Life Technologies, Carlsbad, CA) u koncentraciji od 5-10 ml Ni-NTA smole po 300 ml podešenog rastvora. Ovaj kombinovani rastvor je nakon toga mešan na 4°C upotrebom suspendovane magnetne mešalice (da bi se sprečilo mlevenje Ni-NTA agaroze.) Ni-NTA smola je nakon toga sakupljena centrifugiranjem na gravitaciji 200 x na 4°C tokom 10 minuta.
[0458] Sledeće, kolona je isprana sa zapreminama od 15 kolona (CV) pufera za pranje (20 mM Tris, pH 8.0, 500 mM NaCl i 20 mM imidazola.) Alikvot poslednjeg ispiranja je sakupljen za analizu. Kolona je nakon toga eluirana sa 3 CV pufera za eluiranje (20 mM Tris, pH 8.0, 500 mM NaCl i 300 mM imidazol) i 1/3 zapremina frakcija kolone su sakupljene za analizu.
[0459] Apsorbacija na 280 nm je merena u svakoj od eluiranih sakupljenih frakcija i upoređena je sa apsorbancijom na 280 nm blanka pufera za eluiranje. Ranije dobijene frakcije obično imaju negativnu apsorciju zbog gradijenta imidazola; međutim, frakcije koje sadrže veće količine proteina imaju pozitivne vrednosti. Sakupljene frakcije su nakon toga nanete na SDSPAGE za analizu i relevantne frakcije su sakupljene za dalje prečišćavanje.
Primer 11. Dizajn GDF-8/GDF-11/aktivin himera
[0460] Poravnanje zasnovano na strukturi članova familije TGF-β je korišćeno da bi se napravili tridimenzioni modeli potencijalnih himernih proteina koji se sastoje iz kombinacija modula iz GDF-8 i GDF-11 korišćenje Schrodinger Bioluminate softvera. Himerni modela GDF-8 se sastoji iz regiona kraka GDF-11 (SEQ ID NO:216) je otkrio region potencijalnog sternog ometanja koji uključuje ostatak F95 GDF-11. Prema modelu, F95 iz GDF-11 kraka uzrokuje destabilizaciju α2 zavojnice himernog GPC. Prema tome, GDF8/GDF11/Aktivin himere su dizajnirane tako da regiona kraka himere sadrži α2 zavojnicu.
Primer 12. ELISA analiza
[0461] Analiza enzimom-povezanog imunosorbentnog testa (ELISA) je izvedena kako bi se ispitivalo vezivanje antitela. ELISA ploče sa 96-bunarića su obložene sa neutravidinom, deglikozilovanom verzijom streptavidina sa neutralnijom pI. Ciljni proteini su obeleženi sa ili bez obeleživača histidina (His) i izloženi su biotinilaciji. Biotinilovani ciljni proteini su inkubirani sa pločama ELISA testa koje su obložene neutravidinom u trajanju od dva sata na sobnoj temperaturi i nevezani proteini su uklonjeni ispiranjem tri puta sa puferom za pranje (25 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1% BSA, 0.05% TWEEN®-20.) Primarna antitela koja se ispituju su dodavana u svaki bunarić i omogućena je inkubacija na sobnoj temperaturi u trajanju od 1 h ili više. Nevezano antitelo je nakon toga uklonjeno ispiranjem tri puta sa puferom za pranje. Sekundarna antitela koja su sposobna da se vežu za primarna antitela koja se ispituju i koja su konjugovana sa detektabilnim obeleživačem su nakon toga inkubirana u svakom bunariću 30 minuta na sobnoj temperaturi. Nevezana sekundarna antitela su uklonjena ispiranjem tri puta sa puferom za pranje. Konačno, vezana sekundarna antitela su detektovana enzimskom reakcijom, detekcijom fluorescencije i/ili detekcijom luminiscencije, u zavisnosti detektabilnog obeleživača koji se nalazi na sekundarnom antitelu koje se detektuje.
Primer 13. Identifikacija antitela pomoću selekcije faga
[0462] Programi skrininga su izvedeni da bi se dobili paneli antitela koji vezuju ciljne antigene. Raynolikost panela antitela je merena razlikama u epitopima za razliku od raznolikosti u sekvencama aniteela. Korišćene su obe strategije obogaćenja, obogaćenje fagom u čvrstoj fazi kao i obogaćenje u tečnoj fazi.
[0463] Ciljni antigeni (oba, i za obogaćenje u čvrstoj fazi i tečnoj fazi) su pre upotrebe izloženi biofizičkoj karakterizaciji, uključujući redukujuću i ne-redukujuću SDS-PAGE da bi se uspostavila čistoća i ekskluzionu hromatografiju za razdvajanje po veličini (SEC) da bi se uspostavili prihvatljivi nivoi nakupljanja. Dodatno, funkcionalni testovi su izvedeni da bi se verifikovala bioaktivnost ciljnog antigena.
[0464] 2-3 runde obogaćivanja su izvedene sa očekivanjem da će samo tri runde biti neophodne. Alkvote faga iz selekcionih rundi 2-4 su sačuvane za kasniju upotrebu. Nakon obogaćivanja, slučajno izabrani klonovi su ispitani sa ELISA da bi se ispitalo vezivanje sa ciljnim antigenima kao i antigenima koji nisu ciljni. Na osnovu ovih analiza, do 500 klonova je izabrano za nukleotidno sekvenciranje i analizu broja različitih antitela kao i učestalost izolovanja i broja različitih VHi VLregiona. Na osnovu ovih analiza koje slede, do 100 klonova je izabrano za vezivanje epitopa sa srodnim epitopomkorišćenjem tehnologije površinske plazmonske rezonancije (ili ekvivalentnog pristupa.) Konstante disocijacije (kdis) su određivane za svaki i do 50 klonova je izabrano za dalju karakterizaciju.
[0465] Finalni kandidati su eksprimirani kao konstrukti bivalentnih antitela, prečišćeni su i za svaki su određivane kdisvrednosti. Funkcionalni testovi zasnovani na ćelijama su korišćeni da bi se karakterisala prečićena bivalentna antitela.
Primer 14. Identifikacija antitela koja blokiraju aktivaciju proGDF-8
[0466] Proizvodnja raznih panela antitela je izvedena kako bi se identifikovala antitela koja se vezuju proGDF-8 i blokiraju oslobađanje zrelog faktora rasta. Dobijanje antitela je izvedeno prema postupcima prikazanim u Primeru 12 gde je rekombinantni proGDF-8 korišćen za obogaćenje čvrste faze i biotinilovan proGDF-8 je korišćen za obogaćenje faze rastvora.Antigenski preparati su ispitani za nivoe nakupljanja da bi se osiguralo da su >95% vrste dimera. U ELISA analizi obogaćenih klonova, ispitano je vezivanje za šest antigena (proGDF-8, GDF-8 prodomen, GDF-8 faktor rasta, mišji proGDF-8, proGDF-11 i proTGF-β1 C4S.) Klonovi izabrani na osnovu ELISA analize su sekvencirani i antitela su razvijena prema postupcima prikazanim u Primeru 12.
Primer 15. Identifikacija antitela koja aktiviraju oslobađanje GDF-11 faktora rasta iz latentnog GPC
[0467] Proizvodnja raznih panela antitela je izvedena kako bi se identifikovala antitela koja se vezuju za prodomen GDF-11 i aktiviraju oslobađanje zrelog faktora rasta. Dobijanje antitela je izvedeno prema postupcima prikazanim u Primeru 12 gde je rekombinantni prodomen GDF-11 korišćen za obogaćenje čvrste faze i biotinilovan prodomen GDF-11 je korišćen za obogaćenje faze rastvora. Antigenski preparati su ispitani za nivoe nakupljanja da bi se osiguralo da su >95% vrste monomera. U ELISA analizi obogaćenih klonova, ispitano je vezivanje za šest antigena (GDF-11 prodomen, proGDF-11, GDF-11 faktor rasta, GDF-8 prodomen, mišji GDF-11 prodomen i proTGF-β1 C4S.) Klonovi izabrani na osnovu ELISA analize su sekvencirani i antitela su razvijena prema postupcima prikazanim u Primeru 12.
Primer 16. Identifikacija antitela koja aktiviraju oslobađanje TGF-β1 iz proTGF-β1/GARP kompleksa
[0468] Proizvodnja raznih panela antitela je izvedena kako bi se identifikovala antitela koja se vezuju za TGF-β1 LAP koji se nalazi u kompleksu sa sGARP (TGF-β1 LAP-sGARP) i aktiviraju oslobađanje zrelog faktora rasta. Dobijanje antitela je izvedeno prema postupcima prikazanim u Primeru 12 gde je rekombinantni biotinilovan TGF-β1 LAP-sGARP korišćen za obogaćenje čvrste faze i biotinilovan TGF-β1 LAP-sGARP je korišćen za obogaćenje faze rastvora. Antigenski preparati su ispitani za nivoe nakupljanja da bi se osiguralo da >95% vrsta obrazuje dimerni TGF-β1 LAP u kompleksu sa monomernim sGARP. U ELISA analizi obogaćenih klonova, ispitano je vezivanje za osam antigena (TGF-β1 LAPsGARP, proTGFb1-sGARP, sGARP, TGF-β1 LAP C4S, proTGF-β1 C4S, LTBP1-proTGFb1, ICAM-1 N-His, ICAM-1 CHis,.) Klonovi izabrani na osnovu ELISA analize su sekvencirani i antitela su razvijena prema postupcima prikazanim u Primeru 12.
Primer 17. Identifikacija antitela koja blokiraju oslobađanje zrelog faktora rasta od proTGF-β1/GARP kompleksa
[0469] Proizvodnja raznih panela antitela je izvedena kako bi se identifikovala antitela koja se vezuju za kompleks koji obrazuju proTGF-β1 i GARP (proTGF-β1-GARP) i inhibiraju oslobađanje zrelog faktora rasta. Dobijanje antitela je izvedeno prema postupcima prikazanim u Primeru 12 gde je rekombinantni biotinilovan proTGF-β1-sGARP korišćen za obogaćenje čvrste faze i biotinilovan proTGF-β1-GARP je korišćen za obogaćenje faze rastvora. Antigenski preparati su ispitani za nivoe nakupljanja da bi se osiguralo da >95% vrsta obrazuje dimerni proTGF-β1 u kompleksu sa monomernim sGARP. U ELISA analizi obogaćenih klonova, ispitano je vezivanje za osam antigena (proTGF-β1-GARP, TGF-β1 LAP, proTGF-β1 C4S, proTGF-β1/LTBP1S kompleks, TGF-β1 LAP-sGARP, sGARP, ICAM-1 C-His, ICAM-1 N-His.) Klonovi izabrani na osnovu ELISA analize su sekvencirani i antitela su razvijena prema postupcima prikazanim u Primeru 12.
Primer 18. Identifikacija antitela koje blokiraju oslobađanje TGF-β1 od proTGF-β1 kompleksiranog sa LTBP1S
[0470] Proizvodnja različitih panela antitela je izvedena da se identifikuju antitela koja vezuju proTGF-β1 kompleksiran sa LTBP1S (proTGF-β1-LTBP1S) i inhibiraju oslobađanje zrelog faktora rasta . Generacija antitela je izvedena prema postupcima iz primera 12 gde rekombinantni pro TGF-β1-LTBP1S je korišćen za obogaćivanje čvrste faze i biotinilovani pro TGF-β1-LTBP1S je korišćen za obogaćivanje faze rastvarača. Preparati antigena su testirani na nivoe agregacije da se osigura da >95% vrsta sadrže dimerni proTGF-β1 kompleksiran sa monomernim LTBP1S. U ELISA analizi obogaćenih klonova, procenjivano je vezivanje za osam antigena (proTGF-β1-LTBP1S, TGF-β1 LAP, TGF-β1 faktor rasta, proTGF-β1 C4S, mišji proTGF-β1-LTBP1S, LTBP1S, GDF-8 prodomen i proTGF-β2.) Klonovi izabrani na osnovu ELISA analiza su sekvencirani i antitela su razvijena prema postupcima iz primera 12.
Primer 19. Identifikacija pan-specifičnih antitela koja blokiraju oslobađanje TGF-β1 sa proTGF-β1
[0471] Proizvodnja različitih panela antitela je izvedena da se identifikuju antitela koja vezuju proTGF-β1 i inhibiraju oslobađanje zrelog faktora rasta . Izvedena je generacija antitela prema postupcima iz primera 12 gde rekombinantni proTGF-β1 je korišćen za obogaćivanje čvrste faze i biotinilovani proTGF-β1 je korišćen za obogaćivanje faze rastvarača. Preparati antigena su testirani na nivoe agregacije da se osigura da >95% su dimerne vrste. U ELISA analizi obogaćenih klonova, procenjivano je vezivanje za sedam antigena (TGF-β1 LAP, TGF-β1 faktor rasta, proTGF-β1C4S, mišjie proTGF-β1 C4S, GDF-8 prodomain i proTGF-β2.) Klonovi izabrani na ELISA analizama su sekvencirani i antitela su razvijena prema postupcima primera 12.
Primer 20. Identifikacija pan-specifičnih antitela koja aktiviraju oslobađanje TGF-β1 sa proTGF-β1
[0472] Proizvodnja različitih panela antitela je izvedena da se identifikuju antitela koja vezuju TGF-β1 LAP i aktiviraju oslobađanje zrelog faktora rasta. Izvedena je generacija antitela prema postupcima primera 12 gde rekombinantni TGF-β1 LAP C4S jje korišćen za obogaćivanje čvrste faze i biotinilovani TGF-β1 LAP C4S je korišćen za obogaćivanje faze rastvarača. Preparati antigena su testirani na nivoe agregacije da se osigura da >95% su dimerne vrste. U ELISA analizi obogaćenih klonova, procenjivano je vezivanje za sedam antigena (TGF-β1 LAP C4S, proTGF-β1 C4S, mišji proTGF-β1 C4S, TGF-β1 zreli faktor rasta , proGDF-8 i proTGF-β2.) Klonovi izabrani na osnovu ELISA analiza su sekvencirani i razvijena su antitela prema postupcima iz primera 12.
Primer 21. Imunizacija TGF-β1 ’knockout’ miševa
[0473] Neonatalni miševi su imunizirani prema postupcima Oida et al (Oida, T. et al., TGF-β induces surface LAP expression on Murine CD4 T cells independent of FoxP3 induction. PLOS One. 2010.
5(11):e15523.) TGF-β-deficijentni neonatalni miševi su primili galektin-1 injekcije da produže preživljavanje (tipično 3-4 nedelje posle rođenja kod ovih miševa.) Ćelije stabilno proizvode antigene proteine (npr. proTGF-β1-GARP ili TGF-β1 LAP-GARP; 1-4 x 106 ćelije u 10-25 μlPBS) ili prečišćeni antigeni proteini su korišćeni za imunizaciju miševa svakog drugog dana intraperitonealnom injekcijom u toku 10 dana sa početkom 8-og dana posle rođenja. Ćelije slezine su sakupljene dana 22 posle rođenja. Sakupljene ćelije slezine su spojene sa SP 2/0 ćelijama mijeloma. Dobijene ćelije hibridoma su procenjivane na uspešnu proizvodnju anti-proTGF-β1 antitela.
Primer 22. Ekspresija TGF-β1 kompleksa i analiza proteina .
[0474] proTGF-β1 ekspresija je izvedena sa ili bez His-obeleženog LTBP1S ili sGARP prema postupku iz primera 10. proTGF-β1 eksprimovan bez LTBP1S ili sGARP sadržao je C4S mutaciju da spreči asocijaciju prodomena sa ovim faktorima i N-terminalnim His tagom. Prečišćeni proteinu su analizirani sa SDS-PAGE pod ili redukujućim ili neredukujućim uslovima (da se održe proteinski dimeri ili kompleksi). Slika 11 prikazuje rezultate koju ukazuju na uspešnu ekspresiju ovih proteina i proteinskih .
Primer 23. Ćelijski zasnovana ekspresija antigena TGF-β1/GARP kompleksa
[0475] Razvijena je ćelijska linija pro B-ćelijskog limfoma koja stabilno eksprimuje oba (membranski vezan) GARP i proTGF-β1 ili TGF-β1 LAP. GARP u asocijaciji sa mebranom je kloniran u pYD7 vektor (NRC Canada, Ottawa, CA) dok proTGF- β1 i TGF-β1 LAP su klonirani u pcDNA3.1 vektore (Life Technologies, Carlsbad, CA.) Ovi vektori su omogućili selekciju na osnovu blasticidina i G418 tim redom. Ćelije koje su izvedene iz pre-B-ćelijskog limfoma iz BALB/c švajcarskih miševa (koje se ovde nazivaju 300.19 ćelije) su transfektovane sa praznim kontrolnim vektorom ili GARP sa koekspresijom ili proTGF-β1 ili TGF-β1 LAP i izabrani sa G418 plus blasticidinom. Otporne ćelije su subklonirane i izabrane su pojedinačne kolonije. Ćelije su kultivisane iz dobijenih ćeliskih linija su ispitivane na antitela (konjugovana sa fluorescentnim česticama) koja se odnose na eksprimovane proteine i ispitivane protočnom citometrijom na intenzitet fluorescence . Slika 12 pokazuje podatke intenzitea fluorescence sakupljene iz dobijenih ćelija. Vrednosti osnovih linija u vezi sa ćelijama transfektovanih sa praznim kontrolnim vektorom su prikazane na slici 12A, dok pojačani intenzitet fluorescence na slikama 12B i 12C ukazuje na ekspresiju površinskih ćelija GARP kompleksa. Kvantifikacija površinski eksprimovanih proteina je izvedena kroz dodatne analize u kojima su isto fluorescento obeležene ćelije korišćene da se dobiju prikazani podaci na slici 12, ispitivane protočnom citometrijom zajedno sa zrncima sa definisanim kapacitetom vezivanja antitela za dobijanje standarne krive. Ova zrnca su obeležena sa istim antitelima korišćenim za obeležavanje ćelija i fluorescentih vrednosti za dobijanje broja antitela vezanih za površinu eksprimovanih proteina.300.19 ćelije koje eksprimuju proTGF-β1-GARP je određeno da eksprimuju oko 83,000 kopija/ćeliji, dok 300.19 ćelije koje eksprimuju TGF-β1 LAP-GARP je određene da eksprimuju oko 66,000 kopija/celiji.
[0476] Zatim su ćelijske linije testirane na TGF-β1 aktivnost u prisustvu ćelija koje eksprimuju αvβ6 integrine, poznato da oslobađaju TGF-β1 faktor rasta sa latentnog GPCs. Kondicionirani medijum sa ovih zajedničkih kultura je korišćen za lečenje reporterskih ćelija koje čine TGF-β receptori kao i gena luciferaze, pokretanog sa promoterom koji reaguje na TGF-β , PAI-1. Ovo je učinjeno u prisustvu ili odsustvu neutralizujućeg antitela, anti-TGF-β, klona 1D11. Dobijena luciferazna aktivost je procenjivana luminometrijom. Rezultati pokazuju da kondicionirani medijum iz ćelija koje eksprimuju prazan vektor i TGF- β1 LAP-GARP komplekse nisu bili u stanju da indukuju ekspresiju luciferaze u odnosu na osnovnu liniju, dok kondicionirani medijum iz ćelija koje eksprimuju proTGF-β1-GARP pokazao je poboljšanju sposobnost indukovanja ekspresije luciferaze (videti sliku 12D.)
Primer 24. Ćelijski zasnovana ekspresija antigena proTGF-β1-LTBP1
[0477] NIH 3T3 mišji fibroblasti su razvijeni koji stabilno eksprimuju proTGF-β1-LTBP1. Ovi izlučeni proteini vezuju se da ćelijsku površinu ili su deponovani na ekstracelularnom matriksu .
Primer 25. LTBP3 Ekspresija
[0478] Rekombinantni LTBP3 proteni su eksprimovani sa ili bez različitih modula, fragmenata, sekvenci N-terminalnih sekrecionih signala (npr. SEQ ID NO: 257) i/ili N- ili C-terminalnih histidinskih obeleživača. Moduli uključeni u neke ekspresione ptotine uključuju one date u tabeli Table 19.
Tabela 19. LTBP3 moduli
[0479] LTBP3 fragmenti uključeni u neke eksprimovene protein uključuju one prikazane u tabeli 20.
Tabela 20. LTBP3 fragmenti
(nastavak)
[0480] Drugi eksprimovani proteini uključuju one prikazane u tabeli 21.
Tabelae 21. LTBP3 rekombinantni proteini
(nastavak)
Primer 26.293T CAGA-luciferazni test za GDF-8 aktivnost
[0481] CAGA-luciferazni testovi su izvedeni da bi se testirala antitela koja moduliraju GDF-8 aktivnost. Rastvor 50 μg/ml fibronektina je dobijen i dodato je 100 μl u svaki bunarčić ploče sa 96-bunarčića . Ploče su inkubirane u toku 30 min na sobnoj temperaturi pre nego je slobodan fibronektin ispran pomoću PBS.293T Ćelije koje sadrže trenutnu ili stabilnu ekspresiju pGL4 (Promega, Madison, WI) pod kontrolom kontrolnog promotera ili promotera koje sadrže CAGA sekvence koje reaguju na smad1/2 su zatim korišćene za zasejavanjenje u bunarčićima obloženim fibronektinom (2 x 10<4>ćelije/bunarčiću u kompletnom medijumu za rast.) Sledećeg dana, ćelije su isprane sa 150 μl/bunarčiću medijuma ćelijske kulture sa 0.1% goveđim albuminom iz seruma (BSA) pre tretmana sa GDF-8 sa ili bez testiranog antitela. Ćelije su inkubirane na 37° u toku 6 sati pre detektovanja luciferazne ekspresije korišćenjem BRIGHT-GLO™ reagensa (Promega, Madison, WI) prema uputstvima proizvođača.
Primer 27. Detekcija ekspresije miogenina od strane FACS
[0482] 257384 Lonza ćelije (Lonza, Basel, Switzerland) su nanete na ploče sa 24-bunarčića pri 4 x 10<4>ćelija/bunarčiću. Sledećeg dana, ćelijski medijum je zamenjen sa medijumom za diferencijaciju [dulbecco’s modified eagle medium (DMEM)/F12 sa 2% konjskog seruma.] Različite koncentracije GDF-8 su takođe uključene u medijum za diferencijaciju u prisustvu ili odsustvu testiranih antitela. Zatim je omogućeno da ćelije diferenciraju utoku 3 dana .
[0483] Posle perioda od 3 dana, status diferencijacije svakog bunara je analiziran pomoću analize nivoa ekspresije miogenina . Ćelije iz svake tretirane grupe su sakupljene i podvrgnute tretmanu korišćenjem kompleta Transcription Factor Buffer Set odm BD Pharmingen (BD Biosciences, Franklin Lakes, New Jersey), broj proizvoda 562574 prema uputstvu proizvođača. Posle fikascije i permeacbilizacije , 5 μl fikoeritrina (PE)-miogenina ili 1.25 μl PE-kontrole je dodato u ćelije i inkubirano na 4°C u toku 50 min. Ćelije su zatim spran i resuspendovane u FACS puferu pre analize ćelijske fluorescence sa FACS.
Primer 28. Test HT2 ćelijske proliferacije
[0484] Antitela su testirana na sposobnost da modulišu TGF-β aktivnost pomoću testa HT2 ćelijske proliferacije. HT2 ćelijska proliferacija u medijum koji sadrži IL-4 je smanjena u prisustvu slobodnog TGF-β faktora rasta. Antitela sa sposobnošću da modulišu nivoe slobodnog faktora rasta stabilizovanjem TGF-β GPCs ili pokretanjem oslobađanja i/ili akumulacije slobodnog faktora rasta mogu biti testirani pomoću ovde opisanog sistema HT2 kulture. Ćelije koje eksprimuju proTGF-β su zajedno kultivisane sa ćelijama koje ekspeimuju αvβ6 integrine. Kulture su tretirane sa različitim koncentracijama testiranih jedinejnja, prečišćenim TGF-β1 (kao pozitivnim kontrolom) ili anti-TGF-β antitelom 1D11 (R&D Systems, Minneapolis, MN) kao negativnom kontrolom.
[0485] HT2 ćelije su kultivisane u medijumu za rast (RPMI 1640, 10%FBS, 1% P/S, 4mM Gln, 50mM beta-merkaptoetanol i 10 ng/mL IL-2) pri 1.5 x 10<5>ćelija/ml da se osigura da ćelije su u log fazi rasta sledećeg dana. Sledećeg dana, ćelijski supernatanti koji su bili testirani su razblaženi u HT2 medijumu za testiranje (RPMI 1640, 10%FBS, 1% P/S, 4mM Gln, 50mM betamerkaptoetanol i 7.5 ng/mL IL-4.) Medijum za rast je uklonjen iz HT2 ćelijskih kultura i ćelije su isprane sa medijumom bez citokina . Razblaženi suspernatanti su dodat u svaki bunarčić HT2 ćelijske kulture i HT2 ćelije su kultivisane u toku 48 sati na 37°C i 5% CO2. Ćelijska vijabilnost u HT2 ćelijskim kulturama je zatim određena pomoću CELL-TITER GLO® reagensa (Promega, Madison, WI) prema uputstvima proizvođača. Dobijeni su rezultati kao relativne svetlosne jedinice (RLUs) koje su u korelaciji sa vijabilnošću ćelija .
Primer 29. Analaiza rekombinatno eksprimovanog GDF-8
[0486] Histidinski obeleženi proGDF-8 je eksprimovan prema postupacima iz primera 10. Prečišćeni proteini su analizirani SDS-PAGE pod ili redukujućim ili neredukujućim uslovima (da se održe proteinski dimeri). Slika 13 prekazuje rezultate koji ukazuju na uspešnu ekspresiju ovih proteina i proteinskih kompleksa .
Primer 30. TGF-β2 himere
[0487] Himerni proteini su sintetizovani koji sadrže TGF-β2 sa supstitucijama u regionu kraka od TGF-β1 i TGF- β3. Himerni proteini takođe sadrže N-terminalne C5S mutacije. Ovi eksprimovani himerni proteini (dati u tabeli 22) imaju poboljšanu stablnost u odnosu na neke druge himerne proteine .
Tabela 22. TGF-β2 himerni proteini.

Claims (21)

Patentni zahtevi
1. Antitelo koje je sposobno za vezivanje sa rekombinantnim antigenom koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence predstavljene u SEQ ID NO: 1 ili
kompleksa faktora rasta- prodomen (GPC) koji se sastoji iz SEQ ID NO: 38;
gde pomenuto antitelo modulira oslobađanje TGF-β1 iz GPC;
pri čemu pomenuti rekombinanti antigen po potrebi je proteinski kompleks koji se sastoji iz:
i. proteina izabranog iz grupe koja se sastoji iz latentnog TGF-β vezujućeg proteina 1S (LTBP1S), glikoproteina A sa preovlađujućim ponavljanjima (GARP), LTBP1, LTBP2, LTBP3, LTBP4, fibrilina-1, fibrilina-2, fibrilina-3, fibrilina-4, proteina 33 koji sadrži ponovke bogate leucinom (LRRC33), perlekana, dekorina, elastina i kolagena, i/ili
ii. proteina koji se sastoji iz jedne ili više aminokiselinskih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs: 156, 159, 143-155, 157, 158, 160, 161, 286-294 i kombinacije ili njihovog fragmenta.
2. Antitelo prema zahtevu 1, pri čemu pomenuto antitelo je stabilizujuće antitelo koje smanjuje ili sprečava oslobađanje faktora rasta iz GPC-a i/ili oslobađanje GPC iz jedne ili više proteinskih interakcija.
3. Antitelo prema zahtevu 1, pri čemu pomenuto antitelo je oslobađajuće antitelo koje pojačava oslobađanje faktora rasta iz GPC-a i/ili oslobađanje GPC iz jedne ili više proteinskih interakcija.
4. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1-3, pri čemu pomenuto antitelo je monoklonsko antitelo, gde je antitelo po potrebi humano ili humanizovano.
5. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1-4, koje se vezuje za petlju latencije TGF-β1, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 58.
6. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1-5 za upotrebu u postupku modulacije aktivnosti faktora rasta u biološkom sistemu koji obuhvata dovođenje u kontakt pomenutog biološkog sistema sa antitelom.
7. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1-6 koje selektivno vezuje jedan ili više kombinatornih epitopa između GARP i proTGF-β1.
8. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1-6 koje vezuje epitop koji zavisi od konformacije na GPC, po potrebi gde antitelo selektivno aktivira ili inhibira aktivnost TGF-β1 faktora rasta u zavisnosti od indentiteta vezanog proteina.
9. Farmaceutska kompozicija koja se sastoji iz antitela prema bilo kom od zahteva 1-8 i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv ekscipijent.
10. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 9 za upotrebu u postupku za lečenje TGF-β-povezane indikacije kod subjekta koji obuhvata dovođenje u kontakt pomenutog subjekta sa pomenutom kompozicijom, gde po potrebi pomenuta TGF-β-povezana indikacija obuhvata
(a) fibroznu indikaciju izabranu iz grupe koja se sastoji iz fibroze pluća, fibroze bubrega, fibroze jetre, kardiovaskularne fibroze, fibroze kože, i fibroze koštane srži; ili
(b) mijelofibroze; ili
(c) jedan ili više tipova kancera ili stanja koja su povezana sa kancerom, kao što su limfomi/leukemije, karcinomi i sarkomi, i kanceri ili tumori koji se nalaze u anusu, bešici, žučnom kanalu, kostima, mozgu, dojci, cerviksu, debelom crevu/rektumu, endometrijumu, jednjaku, oku, žućnoj kesi, glavi i vratu, jetri, bubregu, larinksu, plućima, mediastinumu, ustima, ovarijumima, pankreasu, penisu, prostati, koži, tankom crevu, stomaku, kostnoj srži, repnoj kosti, testisima, tiroidei i uterusu;
pri čemu pomenuti jedan ili više tipova kancera ili stanja povezanih sa kancerom su dalje po potrebi izabrani od grupe koja se sastoji iz kancera debelog creva, kancera bubrega, kancera dojke, malignog melanoma i glioblastoma; ili
(d) jednog ili više mišićnog poremećaja i/ili povreda;
pri čemu dalje po potrebi pomenuti jedan ili više mišićni poremećaj i/ili povrede su izabrani iz grupe koja se sastoji iz kaheksije, mišićne distrofije, hronične opstruktivne bolesti pluća (COPD), bolesti motornog neurona, traume, neurodegenerativne bolesti, infekcije, reumatoidnog artritisa, imobilizacije, atrofije diskusa, sarkopenije, miozitisa inkluzionog tela i dijabetesa; ili
(e) jednog ili više imunog i/ili autoimunog poremećaja.
11. Komplet koji se sastoji iz farmaceutske kompozicije prema zahtevu 9 i uputstvima za njenu upotrebu.
12. Postupak za dobijanje antitela kao što je definisano u bilo kom od zahteva 1-8, pri čemu je antitelo dobijeno korišćenjem rekombinantnog antigena koji se sastoji iz SEQ ID NO: 1 ili njenog fragmenta, ili rekombinantnog antigena koji se sastoji iz kompleksa prodomen- faktora rasta (GPC) koji se sastoji iz SEQ ID NO: 38.
13. Postupak prema zahtevu 12, pri čemu pomenuti se rekombinantni antigen sastoji ili je u kompleksu sa:
i. proteinom izabranim iz grupe koja se sastoji iz latentnog TGF-β vezujućeg proteina (LTBP1S), glikoproteina A sa preovlađujućim ponavljanjima (GARP), LTBP1, LTBP2, LTBP3, LTBP4, fibrilina-1, fibrilina-2, fibrilina-3, fibrilina-4, proteina 33 koji je sadrži ponovke bogate leucinom (LRRC33), perlekana, dekorina, elastina i kolagena, i/ili
ii. proteina koji se sastoji iz jedne ili više aminokiselinske sekvence koja je izabrana iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs: 156, 159, 143-155, 157, 158, 160, 161, 286-294 ili kombinacije ili njihovog fragmenta.
14. Postupak za dobijanje antitela koje modulira oslobađanje TGF-β1 iz kompleksa faktor rasta – prodomena (GPC) koji obuhvata sledeće korake:
a) odabir antitela iz skupa dva ili više kandidata antitela na osnovu sposobnosti da se veže za antigen, pri čemu antigen sadrži GPC, koji sadrži TGF-β1 prodomen i TGF-β1 faktor rasta; i
b) odabir antitela iz skupa dva ili više kandidata antitela na osnovu sposobnosti da moduliraju nivoe TGF-β1 faktora rasta i/ili aktivnost.
15. Postupak prema zahtevu 12, pri čemu antigen iz koraka pod (a) dalje sadrži:
i. protein koji je izabran iz grupe koja se sastoji iz LTBP1S, GARP, LTBP1, LTBP2, LTBP3, LTBP4, fibrilina-1, fibrilina-2, fibrilina-3, fibrilina-4, proteina koji sadrži ponovke bogate leucinom (LRRC33), perlekana, dekorina, elastina i kolagena, i/ili
ii. protein koji se sastoji iz jedne ili više aminokiselinskih sekvenci koje su izabrane iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs: 156, 159, 143-155, 157, 158, 160, 161, 286-294 i kombinacije ili njihovog fragmenta.
16. Postupak prema zahtevu 14 ili zahtevu 15, pri čemu korak pod (b) obuhvata korišćenje testa za oslobađanje faktora rasta zasnovanog na ćelijama da bi se izabralo antitelo koje ima sposobnost da modulira oslobađanje faktora rasta iz GPC.
17. Postupak prema bilo kom od zahteva 14-16, pri čemu odabrano antitelo je stabilizujće antitelo koje smanjuje ili sprečava oslobađanje faktora rasta iz GPC-a.
18. Postupak prema bilo kom od zahteva 15-16, pri čemu antitelo koje je odabrano je oslobađajuće antitelo koje pojačava oslobađanje faktora rasta iz GPC-a.
19. Postupak prema zahtevu 12 ili zahtevu 13, ili postupak prema bilo kom od zahteva 14-18, pri čemu je antitelo dobijeno korišćenjem postupka prema zahtevu 12 ili zahtevu 13, koji se sastoji iz imunizacije domaćina sa rekombinantnim antigenom, pri čemu po potrebi, rekombinantni antigen je antigen koji je zasnovan na ćeliji.
20. Postupak prema bilo kom od zahteva 12-19, pri čemu je antitelo dobijeno korišćenjem ćelija hibridoma.
21. Postupak prema bilo kom od zahteva 12-20, pri čemu je antitelo dobijeno korišćenjem postupaka visoko propusnog skrininga prikaza bibloteka, po potrebi korišćenjem tehnologije prikaza faga.
RS20201467A 2013-05-06 2014-05-06 Kompozicije i postupci za modulaciju faktora rasta RS61778B1 (sr)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361819840P 2013-05-06 2013-05-06
US201361823552P 2013-05-15 2013-05-15
US201361900438P 2013-11-06 2013-11-06
EP14795041.4A EP2981822B1 (en) 2013-05-06 2014-05-06 Compositions and methods for growth factor modulation
PCT/US2014/036933 WO2014182676A2 (en) 2013-05-06 2014-05-06 Compositions and methods for growth factor modulation

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS61778B1 true RS61778B1 (sr) 2021-06-30

Family

ID=51867850

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20201467A RS61778B1 (sr) 2013-05-06 2014-05-06 Kompozicije i postupci za modulaciju faktora rasta

Country Status (19)

Country Link
US (14) US9758576B2 (sr)
EP (3) EP3816625B1 (sr)
JP (6) JP2016521283A (sr)
AU (5) AU2014262843B2 (sr)
CA (1) CA2911514A1 (sr)
CY (1) CY1123907T1 (sr)
DK (1) DK2981822T3 (sr)
ES (2) ES2837042T3 (sr)
HR (2) HRP20201914T1 (sr)
HU (1) HUE052232T2 (sr)
IL (4) IL301607B2 (sr)
LT (1) LT2981822T (sr)
PL (2) PL2981822T4 (sr)
PT (1) PT2981822T (sr)
RS (1) RS61778B1 (sr)
SG (3) SG10201913751RA (sr)
SI (1) SI2981822T1 (sr)
SM (1) SMT202100008T1 (sr)
WO (1) WO2014182676A2 (sr)

Families Citing this family (117)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20080064155A (ko) 2005-10-14 2008-07-08 어플라이드 리써치 어쏘시에이츠 뉴질랜드 리미티드 표면 특징을 모니터링하는 방법 및 장치
CN104761637B (zh) 2006-03-31 2021-10-15 中外制药株式会社 调控抗体血液动力学的方法
ES2595638T3 (es) 2007-09-26 2017-01-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Método para modificar el punto isoeléctrico de un anticuerpo mediante la sustitución de aminoácidos en una CDR
KR102057826B1 (ko) 2008-04-11 2019-12-20 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 복수 분자의 항원에 반복 결합하는 항원 결합 분자
EP2647706B1 (en) 2010-11-30 2023-05-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
US9179844B2 (en) 2011-11-28 2015-11-10 Aranz Healthcare Limited Handheld skin measuring or monitoring device
US10322949B2 (en) 2012-03-15 2019-06-18 Flodesign Sonics, Inc. Transducer and reflector configurations for an acoustophoretic device
US9745548B2 (en) 2012-03-15 2017-08-29 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic perfusion devices
US10689609B2 (en) 2012-03-15 2020-06-23 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic bioreactor processes
US9950282B2 (en) 2012-03-15 2018-04-24 Flodesign Sonics, Inc. Electronic configuration and control for acoustic standing wave generation
US10967298B2 (en) 2012-03-15 2021-04-06 Flodesign Sonics, Inc. Driver and control for variable impedence load
US9752113B2 (en) 2012-03-15 2017-09-05 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic perfusion devices
US10704021B2 (en) 2012-03-15 2020-07-07 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic perfusion devices
US9458450B2 (en) 2012-03-15 2016-10-04 Flodesign Sonics, Inc. Acoustophoretic separation technology using multi-dimensional standing waves
US10737953B2 (en) 2012-04-20 2020-08-11 Flodesign Sonics, Inc. Acoustophoretic method for use in bioreactors
WO2014030750A1 (ja) 2012-08-24 2014-02-27 中外製薬株式会社 マウスFcγRII特異的Fc抗体
SG10201709559PA (en) 2012-08-24 2017-12-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Fcγriib-specific fc region variant
CN105246914B (zh) 2013-04-02 2021-08-27 中外制药株式会社 Fc区变体
RS61778B1 (sr) 2013-05-06 2021-06-30 Scholar Rock Inc Kompozicije i postupci za modulaciju faktora rasta
ES2860952T3 (es) * 2013-08-01 2021-10-05 Univ Catholique Louvain Proteína anti-garp y usos de la misma
US9745569B2 (en) 2013-09-13 2017-08-29 Flodesign Sonics, Inc. System for generating high concentration factors for low cell density suspensions
WO2015105955A1 (en) 2014-01-08 2015-07-16 Flodesign Sonics, Inc. Acoustophoresis device with dual acoustophoretic chamber
US10827945B2 (en) * 2014-03-10 2020-11-10 H. Lee. Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. Radiologically identified tumor habitats
US10588980B2 (en) 2014-06-23 2020-03-17 Novartis Ag Fatty acids and their use in conjugation to biomolecules
US9744483B2 (en) 2014-07-02 2017-08-29 Flodesign Sonics, Inc. Large scale acoustic separation device
KR20170066515A (ko) * 2014-09-30 2017-06-14 우니베르지타이트 겐트 관절 질환의 치료 방법
AR102198A1 (es) 2014-10-09 2017-02-08 Regeneron Pharma Proceso para reducir partículas subvisibles en una formulación farmacéutica
US10603359B2 (en) * 2014-10-30 2020-03-31 Acceleron Pharma Inc. Methods and compositions using GDF15 polypeptides for increasing red blood cells
EP3215175A4 (en) 2014-11-06 2018-06-27 Scholar Rock, Inc. Anti-pro/latent-myostatin antibodies and uses thereof
WO2016073906A2 (en) * 2014-11-06 2016-05-12 Scholar Rock, Inc. Transforming growth factor-related immunoassays
KR101860280B1 (ko) 2014-12-19 2018-05-21 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항-마이오스타틴 항체, 변이체 Fc 영역을 함유하는 폴리펩타이드, 및 사용 방법
WO2016115345A1 (en) 2015-01-14 2016-07-21 The Brigham And Women's Hospital, Treatment of cancer with anti-lap monoclonal antibodies
WO2016125017A1 (en) * 2015-02-03 2016-08-11 Universite Catholique De Louvain Anti-garp protein and uses thereof
KR102605798B1 (ko) 2015-02-05 2023-11-23 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 이온 농도 의존적 항원 결합 도메인을 포함하는 항체, Fc 영역 개변체, IL-8에 결합하는 항체, 및 그들의 사용
US11021699B2 (en) 2015-04-29 2021-06-01 FioDesign Sonics, Inc. Separation using angled acoustic waves
US11377651B2 (en) 2016-10-19 2022-07-05 Flodesign Sonics, Inc. Cell therapy processes utilizing acoustophoresis
US11708572B2 (en) 2015-04-29 2023-07-25 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic cell separation techniques and processes
WO2016186575A1 (en) * 2015-05-15 2016-11-24 Agency For Science, Technology And Research Native protein purification technology
WO2017015622A2 (en) * 2015-07-22 2017-01-26 Scholar Rock, Inc Gdf11 binding proteins and uses thereof
US11474085B2 (en) 2015-07-28 2022-10-18 Flodesign Sonics, Inc. Expanded bed affinity selection
US11459540B2 (en) 2015-07-28 2022-10-04 Flodesign Sonics, Inc. Expanded bed affinity selection
US11578110B2 (en) 2015-08-25 2023-02-14 Histide Ag Compounds for inducing tissue formation and uses thereof
HRP20211081T1 (hr) * 2015-09-15 2021-10-15 Scholar Rock, Inc. Anti-pro/latentna miostatinska protutijela i njihove uporabe
DK3349778T3 (da) * 2015-09-17 2021-11-22 Histide Ag Farmaceutisk association af vækstfaktorreceptoragonist og adhæsionsproteininhibitor til omdannelse af en neoplastisk celle til en ikke-neoplastisk celle og anvendelser deraf
WO2017046229A1 (en) * 2015-09-17 2017-03-23 Histide Ag Pharmaceutical association of growth factor receptor agonist and adhesion protein inhibitor for converting a neoplastic cell into a non-neoplastic cell and uses thereof
WO2017046226A2 (en) * 2015-09-17 2017-03-23 Histide Ag Pharmaceutical association for converting a neoplastic cell into a non-neoplastic cell and uses thereof.
AU2016323407A1 (en) * 2015-09-17 2018-04-19 Histide Ag Pharmaceutical association of growth factor receptor agonist and adhesion protein inhibitor for converting a neoplastic cell into a non-neoplastic cell and uses thereof
WO2017088027A1 (en) * 2015-11-26 2017-06-01 Prince Henry's Institute Of Medical Research Trading As The Hudson Institute Of Medical Research Inhibin analogs
AR107078A1 (es) * 2015-12-18 2018-03-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo antimiostatina, polipéptidos que contienen regiones fc variantes así como métodos de uso
WO2017110981A1 (en) 2015-12-25 2017-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies and methods of use
CN115814077A (zh) * 2016-01-08 2023-03-21 供石公司 抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体及其使用方法
CA3055555A1 (en) * 2016-03-11 2017-09-14 Scholar Rock, Inc. Tgf.beta.1-binding immunoglobulins and use thereof
EP3436480A4 (en) 2016-03-30 2019-11-27 Musc Foundation for Research Development METHOD FOR THE TREATMENT AND DIAGNOSIS OF CANCER BY TARGETING GLYCOPROTEIN A REPETITION PREDOMINANT (GARP) AND FOR EFFECTIVE IMMUNOTHERAPY ALONE OR IN COMBINATION
US10013527B2 (en) 2016-05-02 2018-07-03 Aranz Healthcare Limited Automatically assessing an anatomical surface feature and securely managing information related to the same
US11085035B2 (en) 2016-05-03 2021-08-10 Flodesign Sonics, Inc. Therapeutic cell washing, concentration, and separation utilizing acoustophoresis
US11214789B2 (en) 2016-05-03 2022-01-04 Flodesign Sonics, Inc. Concentration and washing of particles with acoustics
NZ789269A (en) 2016-06-13 2026-01-30 Scholar Rock Inc Use of myostatin inhibitors and combination therapies
CN110049773A (zh) * 2016-07-14 2019-07-23 供石公司 TGFβ抗体、方法和用途
EP3494991A4 (en) 2016-08-05 2020-07-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha COMPOSITION FOR THE PROPHYLAXIS OR TREATMENT OF IL-8 RELATED DISEASES
US11020686B2 (en) 2016-08-16 2021-06-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for quantitating individual antibodies from a mixture
WO2018057522A1 (en) * 2016-09-20 2018-03-29 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Harnessing protein-based drugs comprising an anchor domain for use on the ocular surface
WO2018075830A1 (en) 2016-10-19 2018-04-26 Flodesign Sonics, Inc. Affinity cell extraction by acoustics
JP7102401B2 (ja) 2016-10-25 2022-07-19 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド クロマトグラフィーデータ解析のための方法およびシステム
EP3532494A4 (en) * 2016-10-26 2020-06-03 The Children's Medical Center Corporation METHOD AND COMPOSITIONS FOR MODULATING TRANSFORMATION GROWTH FACTOR BETA-REGULATED FUNCTIONS
NZ754161A (en) 2016-11-10 2025-11-28 Keros Therapeutics Inc Activin receptor type iia variants and methods of use thereof
US11116407B2 (en) 2016-11-17 2021-09-14 Aranz Healthcare Limited Anatomical surface assessment methods, devices and systems
US20200031895A1 (en) * 2016-12-16 2020-01-30 Biogen Ma Inc. Stabilized proteolytically activated growth differentiation factor 11
EP3366306B1 (en) * 2016-12-23 2021-09-29 Istanbul Üniversitesi Rektörlügü Use of some peptides in diagnosis and treatment of diabetes, obesity and metabolic diseases associated thereto
BR112019013908A2 (pt) * 2017-01-06 2020-02-04 Scholar Rock, Inc. inibidores de tgfss1 isoforma-específicos, contexto-permissivos, e seus usos
EP4218817A3 (en) 2017-01-06 2023-09-06 Scholar Rock, Inc. Methods for treating metabolic diseases by inhibiting myostatin activation
PT3565592T (pt) 2017-01-06 2023-05-31 Scholar Rock Inc Tratamento de doenças metabólicas através da inibição da ativação da miostatina
TWI832600B (zh) 2017-01-20 2024-02-11 美商健臻公司 骨靶向抗體
TWI787230B (zh) 2017-01-20 2022-12-21 法商賽諾菲公司 抗ＴＧＦ-β抗體及其用途
US10900786B2 (en) 2017-03-31 2021-01-26 International Business Machines Corporation Refining an ecological niche model
EP4183328A1 (en) 2017-04-04 2023-05-24 Aranz Healthcare Limited Anatomical surface assessment methods, devices and systems
PT3621694T (pt) 2017-05-09 2023-10-09 Scholar Rock Inc Inibidores de lrrc33 e sua utilização
GB201707561D0 (en) 2017-05-11 2017-06-28 Argenx Bvba GARP-TGF-beta antibodies
US20210087240A1 (en) * 2017-07-19 2021-03-25 Musc Foundation For Research Development Blocking garp cleavage and methods of use thereof
AU2018306149B2 (en) * 2017-07-26 2021-09-16 Ftf Pharma Private Limited Liquid dosage forms of imatinib
MA49690A (fr) 2017-07-28 2021-05-19 Scholar Rock Inc Inhibiteurs spécifiques du complexe ltbp de tgf-bêta 1 et leurs utilisations
CA3073935A1 (en) 2017-09-19 2019-03-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of reducing particle formation and compositions formed thereby
EP3694552A1 (en) 2017-10-10 2020-08-19 Tilos Therapeutics, Inc. Anti-lap antibodies and uses thereof
CA3082146A1 (en) 2017-11-09 2019-05-16 Keros Therapeutics, Inc. Activin receptor type iia variants and methods of use thereof
KR102439221B1 (ko) 2017-12-14 2022-09-01 프로디자인 소닉스, 인크. 음향 트랜스듀서 구동기 및 제어기
IL320014A (en) 2018-01-12 2025-06-01 Keros Therapeutics Inc Activin receptor type iib variants and methods of use thereof
JP2021516966A (ja) * 2018-03-09 2021-07-15 ユニバーシティ オブ ピッツバーグ − オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケイション 組織への生物学的薬物の送達
KR20250133994A (ko) 2018-05-09 2025-09-09 케로스 테라퓨틱스, 인크. 액티빈 수용체 유형 iia 변이체 및 그의 사용 방법
TWI853823B (zh) 2018-07-02 2024-09-01 美商里珍納龍藥品有限公司 自混合物製備多肽之系統及方法
MA53125A (fr) 2018-07-11 2021-05-19 Scholar Rock Inc Inhibiteurs de tgf?1 sélectifs selon l'isoforme à affinité élevée
US20210340238A1 (en) 2018-07-11 2021-11-04 Scholar Rock, Inc. TGFß1 INHIBITORS AND USE THEREOF
SI3677278T1 (sl) 2018-07-11 2022-01-31 Scholar Rock, Inc. Izoformno selektivni zaviralci TGFBETA1 in uporaba le-teh
CN113164780A (zh) 2018-10-10 2021-07-23 泰洛斯治疗公司 抗lap抗体变体及其用途
CN113677711B (zh) 2019-01-30 2025-05-30 供石公司 TGFβ的LTBP复合特异性抑制剂及其用途
EA202192422A1 (ru) 2019-03-05 2021-12-09 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Человеческий сывороточный альбумин в составах
US12039726B2 (en) 2019-05-20 2024-07-16 Aranz Healthcare Limited Automated or partially automated anatomical surface assessment methods, devices and systems
GB201908012D0 (en) * 2019-06-05 2019-07-17 Io Biotech Aps TGF-Beta vaccine
JP7350242B2 (ja) * 2019-07-19 2023-09-26 国立研究開発法人理化学研究所 ヒトＴＧＦ－βのＬＡＰ断片に対する抗体及びその利用
CN114729370B (zh) 2019-08-28 2025-03-21 中外制药株式会社 跨物种抗潜伏TGF-β1抗体和使用方法
US20220372135A1 (en) * 2019-09-27 2022-11-24 Disc Medicine, Inc. Methods for treating myelofibrosis and related conditions
EP4041243A4 (en) * 2019-09-27 2023-10-18 Disc Medicine, Inc. METHODS OF TREATMENT OF ANEMIA OF CHRONIC DISEASE
CN111072764A (zh) * 2019-12-13 2020-04-28 东莞市东阳光生物药研发有限公司 一种重组人Activin A的制备方法
TW202135862A (zh) 2020-01-11 2021-10-01 美商供石公司 TGFβ抑制劑及其用途
CA3166328A1 (en) 2020-01-11 2021-07-15 Scholar Rock, Inc. Tgf-beta inhibitors and use thereof
WO2021167703A1 (en) 2020-02-19 2021-08-26 Nammi Therapeutics, Inc. Formulated and/or co-formulated liposome compositions containing tgfb antagonist prodrugs useful in the treatment of cancer and methods thereof
WO2021189006A1 (en) * 2020-03-20 2021-09-23 Keros Therapeutics, Inc. Methods of using activin receptor type iia variants
WO2021189010A1 (en) * 2020-03-20 2021-09-23 Keros Therapeutics, Inc. Methods of using activin receptor type iib variants
WO2021189019A1 (en) 2020-03-20 2021-09-23 Keros Therapeutics, Inc. Activin receptor type ii chimeras and methods of use thereof
KR20230012539A (ko) 2020-05-13 2023-01-26 디스크 메디슨, 인크. 골수섬유증을 치료하기 위한 항-헤모주벨린 (hjv) 항체
US20230192867A1 (en) 2020-05-15 2023-06-22 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to garp
WO2022204581A2 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Scholar Rock, Inc. Tgf-beta inhibitors and use thereof
EP4348260A2 (en) 2021-06-03 2024-04-10 Scholar Rock, Inc. Tgf-beta inhibitors and therapeutic use thereof
CA3221555A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Kimberly LONG A myostatin pathway inhibitor in combination with a glp-1 pathway activator for use in treating metabolic disorders
EP4370148A1 (en) 2021-07-14 2024-05-22 Scholar Rock, Inc. Ltbp complex-specific inhibitors of tgf beta1 and uses thereof
GB202203269D0 (en) * 2022-03-09 2022-04-20 Argenx Iip Bv TGF-Beta antibodies
US20250152670A1 (en) * 2022-04-28 2025-05-15 Wenzhou Prarucom Bio-Chemical Technology Co. Method for alleviating pulmonary fibrosis using epidermal growth factor
EP4638496A1 (en) 2022-12-22 2025-10-29 Scholar Rock, Inc. Selective and potent inhibitory antibodies of myostatin activation
WO2025049960A1 (en) * 2023-08-30 2025-03-06 University Of Cincinnati Enhancing the production of anti-mullerian hormone through modification of its prodomain

Family Cites Families (201)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4444887A (en) 1979-12-10 1984-04-24 Sloan-Kettering Institute Process for making human antibody producing B-lymphocytes
US4474893A (en) 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
US4714681A (en) 1981-07-01 1987-12-22 The Board Of Reagents, The University Of Texas System Cancer Center Quadroma cells and trioma cells and methods for the production of same
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4716111A (en) 1982-08-11 1987-12-29 Trustees Of Boston University Process for producing human antibodies
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US5262319A (en) 1985-04-19 1993-11-16 Oncogene Science, Inc. Method for obtaining bone marrow free of tumor cells using transforming growth factor β3
EP0206448B1 (en) 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5001225A (en) 1986-12-08 1991-03-19 Georgetown University Monoclonal antibodies to a pan-malarial antigen
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5024947A (en) 1987-07-24 1991-06-18 Cetus Corporation Serum free media for the growth on insect cells and expression of products thereby
US5266683A (en) 1988-04-08 1993-11-30 Stryker Corporation Osteogenic proteins
US4925648A (en) 1988-07-29 1990-05-15 Immunomedics, Inc. Detection and treatment of infectious and inflammatory lesions
US5601819A (en) 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
EP0436597B1 (en) 1988-09-02 1997-04-02 Protein Engineering Corporation Generation and selection of recombinant varied binding proteins
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
ES2096590T3 (es) 1989-06-29 1997-03-16 Medarex Inc Reactivos biespecificos para la terapia del sida.
US5413923A (en) 1989-07-25 1995-05-09 Cell Genesys, Inc. Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
JPH03180192A (ja) * 1989-12-07 1991-08-06 Kirin Brewery Co Ltd 遺伝子組換えによるヒトプロＴＧＦ―β１の製造
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5780225A (en) 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
AU7247191A (en) 1990-01-11 1991-08-05 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
DE69120146T2 (de) 1990-01-12 1996-12-12 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
WO1996033735A1 (en) 1995-04-27 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
DK0553244T4 (da) 1990-10-05 2005-08-01 Celldex Therapeutics Inc Målrettet immunostimulering med bispecifikke reagenser
WO1992008802A1 (en) 1990-10-29 1992-05-29 Cetus Oncology Corporation Bispecific antibodies, method of production, and uses thereof
CA2095633C (en) 1990-12-03 2003-02-04 Lisa J. Garrard Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
KR0178542B1 (ko) 1991-01-30 1999-05-15 모찌즈끼 노부히꼬 디티오카르밤산의 염류, 그 제조방법 및 그 디티오카르밤산의 염류를 사용하는 이소티오시아네이트류의 제조방법
ATE414768T1 (de) 1991-04-10 2008-12-15 Scripps Research Inst Bibliotheken heterodimerer rezeptoren mittels phagemiden
CA2108451A1 (en) 1991-04-26 1992-10-27 Beverley J. Randle Novel antibodies, and methods for their use
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
ATE207080T1 (de) 1991-11-25 2001-11-15 Enzon Inc Multivalente antigen-bindende proteine
US5932448A (en) 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
PT1024191E (pt) 1991-12-02 2008-12-22 Medical Res Council Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos
JP3452946B2 (ja) 1992-02-19 2003-10-06 協和醗酵工業株式会社 抗ＴＧＦ−βマスキングプロテインモノクローナル抗体
PT627940E (pt) 1992-03-05 2003-07-31 Univ Texas Utilizacao de imunoconjugados para o diagnostico e/ou terapia de tumores vascularizados
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
EP0563475B1 (en) 1992-03-25 2000-05-31 Immunogen Inc Cell binding agent conjugates of derivatives of CC-1065
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
WO1994009812A1 (en) 1992-10-26 1994-05-11 Kirin Brewery Company, Limited METHOD FOR PRODUCING LARGE LATENT TRANSFORMING GROWTH FACTOR-β COMPLEXES AND LARGE LATENCY ASSOCIATED PEPTIDE
US5951983A (en) 1993-03-05 1999-09-14 Universite Catholique De Louvain Methods of inhibiting T cell mediated immune responses with humanized LO-CD2A-specific antibodies
DK0690873T3 (da) 1993-03-19 2003-09-29 Univ Johns Hopkins Med Vækstdifferentieringsfaktor-8
US7393682B1 (en) 1993-03-19 2008-07-01 The Johns Hopkins University School Of Medicine Polynucleotides encoding promyostatin polypeptides
US5994618A (en) 1997-02-05 1999-11-30 Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8 transgenic mice
US6465239B1 (en) 1993-03-19 2002-10-15 The John Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8 nucleic acid and polypeptides from aquatic species and non-human transgenic aquatic species
US5874239A (en) 1993-07-30 1999-02-23 Affymax Technologies N.V. Biotinylation of proteins
WO1995015982A2 (en) 1993-12-08 1995-06-15 Genzyme Corporation Process for generating specific antibodies
DE69534347T2 (de) 1994-01-31 2006-05-24 Trustees Of Boston University, Boston Bibliotheken aus Polyklonalen Antikörpern
WO1995026203A1 (en) 1994-03-29 1995-10-05 The Victoria University Of Manchester Wound healing
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
US5541087A (en) 1994-09-14 1996-07-30 Fuji Immunopharmaceuticals Corporation Expression and export technology of proteins as immunofusins
US5786464C1 (en) 1994-09-19 2012-04-24 Gen Hospital Corp Overexpression of mammalian and viral proteins
US5919652A (en) 1994-11-09 1999-07-06 The Regents Of The University Of California Nucleic acid molecules comprising the prostate specific antigen (PSA) promoter and uses thereof
US5616561A (en) 1995-03-31 1997-04-01 Regents Of The University Of California TGF-β antagonists as mitigators of radiation-induced tissue damage
WO1996034096A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5967979A (en) 1995-11-14 1999-10-19 Verg, Inc. Method and apparatus for photogrammetric assessment of biological tissue
JP2978435B2 (ja) 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法
EP0894004B2 (en) 1996-03-22 2007-02-21 Curis, Inc. Method for enhancing functional recovery of motor coordination, speech or sensory perception after central nervous system ischemia or trauma
US6114148C1 (en) 1996-09-20 2012-05-01 Gen Hospital Corp High level expression of proteins
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
US6348584B1 (en) 1996-10-17 2002-02-19 John Edward Hodgson Fibronectin binding protein compounds
CA2722378C (en) 1996-12-03 2015-02-03 Amgen Fremont Inc. Human antibodies that bind tnf.alpha.
BRPI9809391B8 (pt) 1997-04-14 2021-05-25 Amgen Res Munich Gmbh processo para a produção de um receptor de antígeno anti-humano, anticorpo humano e composição farmacêutica
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
EP1958962A3 (en) 1997-06-12 2013-05-01 Novartis International Pharmaceutical Ltd. Artificial antibody polypeptides
AU756620B2 (en) 1997-07-14 2003-01-16 University Of Liege Mutations in the myostation gene cause double-muscling in mammals
US6891082B2 (en) * 1997-08-01 2005-05-10 The Johns Hopkins University School Of Medicine Transgenic non-human animals expressing a truncated activintype II receptor
US6656475B1 (en) * 1997-08-01 2003-12-02 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor receptors, agonists and antagonists thereof, and methods of using same
EP1015616A2 (en) 1997-09-19 2000-07-05 Dana Farber Cancer Institute, Inc. Intrabody-mediated control of immune reactions
JP4544742B2 (ja) 1998-05-06 2010-09-15 メタモーフイクス・インコーポレーテツド Ｇｄｆ−８の阻害による糖尿病の処置法
CA2345024C (en) 1998-10-07 2009-05-19 Stryker Corporation Modified tgf-.beta. superfamily proteins
MXPA01007366A (es) 1999-01-21 2002-06-04 Metamorphix Inc Inhibidores de factores de crecimiento y diferenciacion y usos de los mismos.
GB2344886B (en) 1999-03-10 2000-11-01 Medical Res Council Selection of intracellular immunoglobulins
AU4676600A (en) 1999-04-30 2000-11-17 Curis, Inc. Morphogen-induced enhancement of fertility
US6492497B1 (en) 1999-04-30 2002-12-10 Cambridge Antibody Technology Limited Specific binding members for TGFbeta1
US6784999B1 (en) 1999-05-17 2004-08-31 The Florida International University Board Of Trustees Surface plasmon resonance detection with high angular resolution and fast response time
TR200400621T2 (tr) 1999-07-20 2004-08-23 Pharmexa A/S GDF-8 aktivitesinin aşağı doğru düzenlenmesi için bir yöntem.
US7358056B1 (en) 1999-08-30 2008-04-15 Signal Pharmaceuticals Methods for modulating signal transduction mediated by TGF-β and related proteins
IT1317922B1 (it) 2000-10-24 2003-07-15 S I S S A Scuola Internaz Supe Metodo per identificare in vivo epitopi intracellulari.
US20030104402A1 (en) 2001-01-23 2003-06-05 University Of Rochester Methods of producing or identifying intrabodies in eukaryotic cells
DE10108240B4 (de) 2001-02-21 2018-06-28 Leica Microsystems Cms Gmbh Verfahren zur Abbildung und Vermessung mikroskopischer dreidimensionaler Strukturen
US20040047891A1 (en) 2001-02-26 2004-03-11 Sabina Glozman Systems devices and methods for intrabody targeted delivery and reloading of therapeutic agents
GB0108165D0 (en) 2001-03-31 2001-05-23 Univ Manchester Intracellular analysis
EP1406931A2 (en) 2001-07-19 2004-04-14 Universität Zürich Modification of human variable domains
AU2002355477B2 (en) 2001-08-03 2008-09-25 Medical Research Council Method of identifying a consensus sequence for intracellular antibodies
US7320789B2 (en) 2001-09-26 2008-01-22 Wyeth Antibody inhibitors of GDF-8 and uses thereof
US7241444B2 (en) 2002-01-18 2007-07-10 Pierre Fabre Medicament Anti-IGF-IR antibodies and uses thereof
GB0201611D0 (en) 2002-01-24 2002-03-13 Grosveld Frank Transgenic animal
WO2003077945A1 (en) 2002-03-14 2003-09-25 Medical Research Council Intracellular antibodies
GB0226727D0 (en) 2002-11-15 2002-12-24 Medical Res Council Intrabodies
GB0226723D0 (en) 2002-11-15 2002-12-24 Medical Res Council Antibodies for in vitro use
JP2006508638A (ja) 2002-05-22 2006-03-16 エスバテック・アーゲー 細胞内環境において向上した安定性を示す免疫グロブリンフレームワークおよびそれを同定する方法
MXPA05002968A (es) 2002-09-16 2005-09-08 Univ Johns Hopkins Activacion de miostatina por metaloproteasa, y metodos de modular la actividad de miostatina.
AR047392A1 (es) 2002-10-22 2006-01-18 Wyeth Corp Neutralizacion de anticuerpos contra gdf 8 y su uso para tales fines
US20040223966A1 (en) 2002-10-25 2004-11-11 Wolfman Neil M. ActRIIB fusion polypeptides and uses therefor
EP1565495A2 (en) 2002-11-15 2005-08-24 Medical Research Council Anti-activated ras antibodies
GB0226729D0 (en) 2002-11-15 2002-12-24 Medical Res Council Intracellular antibodies
EP1482309A1 (en) 2003-05-07 2004-12-01 Institut Curie Means for detecting protein conformation and applications thereof
RU2322261C2 (ru) 2003-06-02 2008-04-20 Уайт Применение ингибиторов миостатика (gdf8) в сочетании с кортикостероидами для лечения нервно-мышечных заболеваний
WO2005010049A2 (en) 2003-07-09 2005-02-03 Eli Lilly And Company Tgf-beta1 ligands
WO2005016254A2 (en) * 2003-07-16 2005-02-24 The Ohio State University Research Foundation Methods and reagents for treating inflammation and fibrosis
WO2005013915A2 (en) 2003-08-08 2005-02-17 The Regents Of The University Of California Novel indications for transforming growth factor-beta regulators
US7803553B2 (en) * 2003-09-04 2010-09-28 Riken Methods of use of antibodies which recognize a protease cleavage site of an LAP fragment of TGF-β
WO2005037232A2 (en) 2003-10-17 2005-04-28 Joslin Diabetes Center, Inc. Methods and compositions for modulating adipocyte function
KR100500610B1 (ko) 2003-10-29 2005-07-11 한국전기연구원 형광 현미경 및 이를 사용한 관측 방법
AU2004309373A1 (en) 2003-12-22 2005-07-14 Amgen Inc. Methods for identifying functional antibodies
EP1699820A2 (en) 2003-12-31 2006-09-13 Schering-Plough Ltd. Neutralizing epitope-based growth enhancing vaccine
EP3006039B1 (en) 2004-03-02 2021-01-06 Acceleron Pharma Inc. Alk7 polypeptides for use in promoting fat loss
ATE557042T1 (de) 2004-03-23 2012-05-15 Lilly Co Eli Anti-myostatin-antikörper
JP2008500373A (ja) 2004-05-27 2008-01-10 アクセルロン ファーマ インコーポレーテッド ケルベロス（Ｃｅｒｂｅｒｕｓ）／ココ（Ｃｏｃｏ）誘導体およびそれらの使用
AU2005272646A1 (en) 2004-08-12 2006-02-23 Wyeth Combination therapy for diabetes, obesity, and cardiovascular diseases using GDF-8 inhibitors
JP4974892B2 (ja) 2004-09-15 2012-07-11 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 臍帯血由来のｔ調節性細胞の単離および増殖の方法
WO2006036834A2 (en) 2004-09-24 2006-04-06 Amgen Inc. MODIFIED Fc MOLECULES
EP1799709B1 (en) 2004-09-30 2012-04-04 ORICO Limited Myostatin isoform
CA2585717A1 (en) 2004-10-27 2006-05-04 Medimmune Inc. Modulation of antibody specificity by tailoring the affinity to cognate antigens
CA2594276A1 (en) 2004-12-30 2006-07-13 Schering-Plough Ltd. Neutralizing epitope-based growth enhancing vaccine
NZ538097A (en) 2005-02-07 2006-07-28 Ovita Ltd Method and compositions for improving wound healing
TR201901929T4 (tr) 2005-02-08 2019-03-21 Genzyme Corp TGFBeta'ya antikorlar.
JPWO2006106599A1 (ja) 2005-03-01 2008-09-11 国立大学法人京都大学 細胞外ドメインシェディングの異常亢進に起因する疾患の予防及び／又は治療のための医薬
WO2006103639A2 (en) 2005-03-31 2006-10-05 Case Western Reserve University Methods and reagents for identifying/isolating t regulatory (treg) cells and for treating individuals
BRPI0608376A8 (pt) 2005-04-22 2018-10-16 Lilly Co Eli composição de ligação, método de uso de uma composição de ligação, e, kit de detecção
EP1877075A4 (en) 2005-04-25 2008-07-30 Pfizer ANTIBODY TO MYOSTATIN
PL2407486T3 (pl) 2005-08-19 2018-05-30 Wyeth Llc Przeciwciała antagonistyczne względem GDF-8 i zastosowania w leczeniu ALS i innych zaburzeń związanych z GDF-8
EP1951756B1 (en) * 2005-10-06 2015-01-07 Eli Lilly And Company Anti-myostatin antibodies
UA92504C2 (en) 2005-10-12 2010-11-10 Эли Лилли Энд Компани Anti-myostatin monoclonal antibody
EP2862867A3 (en) 2005-10-25 2015-08-05 The Johns Hopkins University Methods and compositions for the treatment of Marfan syndrome and associated disorders
RU2008141912A (ru) 2006-03-23 2010-04-27 Новартис АГ (CH) Противоопухолевые лекарства на основе антител к клеточным антигенам
BRPI0716249A2 (pt) 2006-09-05 2013-09-03 Lilly Co Eli anticorpos antimiostatina
JP2008102117A (ja) 2006-09-21 2008-05-01 Fujifilm Corp 表面プラズモン増強蛍光センサおよび蛍光検出方法
MX2009003518A (es) 2006-10-03 2009-08-25 Genzyme Corp Uso de antagonistas de tgf-beta para tratar a los infantes en riesgo de desarrollar displasia brocopulmonar.
WO2009018438A1 (en) 2007-07-31 2009-02-05 Cornell Research Foundation, Inc. Protein discovery using intracellular ribosome display
KR100988471B1 (ko) 2007-07-06 2010-10-18 전자부품연구원 실시간 세포 분석 장치 및 이를 이용한 세포의 대사 측정방법
WO2009014702A2 (en) 2007-07-25 2009-01-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Cd74 for use in the treatment of cancer and liver toxicity
CN103223165B (zh) 2007-08-24 2015-02-11 学校法人庆应义塾 肿瘤细胞所导致的免疫抑制的解除剂及使用该解除剂的抗肿瘤剂
PE20091163A1 (es) 2007-11-01 2009-08-09 Wyeth Corp Anticuerpos para gdf8
JP5634272B2 (ja) * 2008-03-14 2014-12-03 ヒューマンザイム リミテッド ヒト細胞発現系を用いる真正ヒトタンパク質の組換え生産
GB0809592D0 (en) 2008-05-27 2008-07-02 Imp Innovations Ltd Biomaterials
EP2143735A1 (en) 2008-07-10 2010-01-13 Institut Pasteur Variable domains of camelid heavy-chain antibodies directed against glial fibrillary acidic proteins
US20100009424A1 (en) 2008-07-14 2010-01-14 Natasha Forde Sonoporation systems and methods
UY32341A (es) 2008-12-19 2010-07-30 Glaxo Group Ltd Proteínas de unión antígeno novedosas
US8669085B2 (en) 2009-02-05 2014-03-11 Ut-Battelle, Llc Transformation of gram positive bacteria by sonoporation
KR20120049214A (ko) 2009-06-08 2012-05-16 악셀레론 파마 인코포레이티드 발열성 지방세포를 증가시키는 방법
US8399625B1 (en) 2009-06-25 2013-03-19 ESBATech, an Alcon Biomedical Research Unit, LLC Acceptor framework for CDR grafting
US8815779B2 (en) 2009-09-16 2014-08-26 SwitchGear Genomics, Inc. Transcription biomarkers of biological responses and methods
AU2010315245B2 (en) 2009-11-03 2016-11-03 Acceleron Pharma Inc. Methods for treating fatty liver disease
US8956828B2 (en) 2009-11-10 2015-02-17 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted disruption of T cell receptor genes using engineered zinc finger protein nucleases
EP3332796A1 (en) 2009-11-17 2018-06-13 Acceleron Pharma Inc. Actriib proteins and variants and uses therefore relating to utrophin induction for muscular dystrophy therapy
US8637637B2 (en) 2010-01-12 2014-01-28 Bill Nai-Chau Sun Fc fusion proteins of human growth hormone
WO2011102483A1 (ja) 2010-02-19 2011-08-25 独立行政法人理化学研究所 ヒトTGF-βのLAPに結合する抗体
JO3340B1 (ar) 2010-05-26 2019-03-13 Regeneron Pharma مضادات حيوية لـعامل تمايز النمو 8 البشري
AR081556A1 (es) 2010-06-03 2012-10-03 Glaxo Group Ltd Proteinas de union al antigeno humanizadas
EP2407487A1 (en) 2010-07-14 2012-01-18 F-Star Biotechnologische Forschungs - und Entwicklungsges. M.B.H. Multispecific modular antibody
SG187867A1 (en) 2010-08-16 2013-03-28 Amgen Inc Antibodies that bind myostatin, compositions and methods
JP6157352B2 (ja) 2010-10-08 2017-07-05 シティ・オブ・ホープＣｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ メディトープ（Ｍｅｄｉｔｏｐｅ）のためのモノクローナル抗体フレームワーク結合インターフェース、メディトープ送達系、およびその使用法
JP5963746B2 (ja) 2011-03-30 2016-08-03 国立大学法人富山大学 形質細胞または形質芽細胞の選択方法、目的抗原特異的な抗体の製造方法、新規モノクローナル抗体
CN103732623B (zh) * 2011-06-03 2017-09-29 佐马技术有限公司 对TGF‑β具有特异性的抗体
US9505763B2 (en) 2011-07-25 2016-11-29 Vanderbilt University Cancer treatment using BMP inhibitor
CA2845391C (en) 2011-08-18 2021-01-19 Affinity Biosciences Pty Ltd Soluble polypeptides
US10071129B2 (en) 2011-08-30 2018-09-11 Whitehead Institute For Biomedical Research Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Method for identifying bromodomain inhibitors
CN114634572A (zh) 2011-10-10 2022-06-17 希望之城公司 中间位和中间位结合抗体及其用途
DK2780368T3 (en) 2011-11-14 2018-02-05 Regeneron Pharma COMPOSITIONS AND PROCEDURES FOR INCREASING MUSCLE MASS AND MUSCLE STRENGTH BY SPECIFIC ANTAGONIZATION OF GDF8 AND / OR ACTIVIN A
HUE033245T2 (hu) 2011-12-19 2017-11-28 Synimmune Gmbh Bispecifikus ellenanyag molekula
KR101704893B1 (ko) 2012-06-15 2017-02-08 화이자 인코포레이티드 Gdf-8에 대한 개선된 길항물질 항체 및 그의 용도
WO2014030780A1 (en) 2012-08-22 2014-02-27 Mogam Biotechnology Research Institute Screening and engineering method of super-stable immunoglobulin variable domains and their uses
ES2984405T3 (es) 2012-09-13 2024-10-29 Bristol Myers Squibb Co Proteínas de dominio de andamio basadas en fibronectina que se unen a la miostatina
JP2016500704A (ja) 2012-11-06 2016-01-14 スカラー ロック インコーポレイテッドＳｃｈｏｌａｒ Ｒｏｃｋ，Ｉｎｃ． 細胞シグナル伝達を変調するための組成物及び方法
WO2014093531A1 (en) 2012-12-11 2014-06-19 Los Angeles Biomedical Research Institute At Harbor-Ucla Medical Center Modulation of myofiber repair by anti-myostatin in strategies with stem cells
CN105530959B (zh) 2013-03-15 2021-09-17 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 多聚化技术
RS61778B1 (sr) 2013-05-06 2021-06-30 Scholar Rock Inc Kompozicije i postupci za modulaciju faktora rasta
EP2832747A1 (en) 2013-08-01 2015-02-04 Université Catholique de Louvain Anti-GARP protein and uses thereof
ES2860952T3 (es) 2013-08-01 2021-10-05 Univ Catholique Louvain Proteína anti-garp y usos de la misma
EP3139957A4 (en) 2014-05-06 2018-04-25 Scholar Rock, Inc. Compositions and methods for growth factor modulation
EP3215175A4 (en) 2014-11-06 2018-06-27 Scholar Rock, Inc. Anti-pro/latent-myostatin antibodies and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
US11827698B2 (en) 2023-11-28
US9580500B2 (en) 2017-02-28
US10981981B2 (en) 2021-04-20
EP2981822A4 (en) 2017-02-15
JP2021050201A (ja) 2021-04-01
PL2981822T3 (pl) 2021-07-12
JP7819158B2 (ja) 2026-02-24
AU2017203611A1 (en) 2017-06-15
AU2019203834A1 (en) 2019-06-20
US20260109757A1 (en) 2026-04-23
JP2016521283A (ja) 2016-07-21
US20180022798A1 (en) 2018-01-25
US20160289318A1 (en) 2016-10-06
IL281549A (en) 2021-05-31
SI2981822T1 (sl) 2021-08-31
IL301607B1 (en) 2025-04-01
US20150361175A1 (en) 2015-12-17
US20170210798A1 (en) 2017-07-27
US12454570B2 (en) 2025-10-28
US20210284722A1 (en) 2021-09-16
AU2017203611C1 (en) 2021-12-23
AU2017203611B2 (en) 2019-03-07
AU2021204415B2 (en) 2024-11-21
AU2021204415A1 (en) 2021-07-29
ES2837042T3 (es) 2021-06-29
IL281549B2 (en) 2023-08-01
EP4674866A2 (en) 2026-01-07
AU2014262843A1 (en) 2015-11-19
EP3816625B1 (en) 2025-09-17
EP3816625A1 (en) 2021-05-05
US9399676B2 (en) 2016-07-26
US20180016332A1 (en) 2018-01-18
SG10201913751RA (en) 2020-03-30
JP2017200915A (ja) 2017-11-09
SMT202100008T1 (it) 2021-03-15
US20150361421A1 (en) 2015-12-17
EP2981822A2 (en) 2016-02-10
PT2981822T (pt) 2020-12-07
US9758577B2 (en) 2017-09-12
JP2023156328A (ja) 2023-10-24
IL301607A (en) 2023-05-01
US20170190767A1 (en) 2017-07-06
PL2981822T4 (pl) 2021-07-12
HRP20201914T1 (hr) 2021-01-22
HUE052232T2 (hu) 2021-04-28
IL301607B2 (en) 2025-08-01
JP6796695B2 (ja) 2020-12-09
LT2981822T (lt) 2020-12-28
IL242193B (en) 2021-04-29
WO2014182676A3 (en) 2015-02-05
US20160031980A1 (en) 2016-02-04
HRP20251426T1 (hr) 2026-01-02
JP2025179097A (ja) 2025-12-09
IL319092A (en) 2025-04-01
EP4674866A3 (en) 2026-03-11
US12577296B2 (en) 2026-03-17
DK2981822T3 (da) 2020-12-07
WO2014182676A2 (en) 2014-11-13
IL281549B1 (en) 2023-04-01
ES3053907T3 (en) 2026-01-27
US20200131259A1 (en) 2020-04-30
AU2014262843B2 (en) 2017-06-22
US9573995B2 (en) 2017-02-21
US20150337034A1 (en) 2015-11-26
US9758576B2 (en) 2017-09-12
AU2025201228A1 (en) 2025-05-08
PL3816625T3 (pl) 2026-01-26
US20240368261A1 (en) 2024-11-07
US20190085067A1 (en) 2019-03-21
SG10201800800YA (en) 2018-03-28
EP2981822B1 (en) 2020-09-02
SG11201508681QA (en) 2015-11-27
CY1123907T1 (el) 2022-03-24
JP2020062007A (ja) 2020-04-23
CA2911514A1 (en) 2014-11-13
US10597443B2 (en) 2020-03-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12454570B2 (en) Compositions and methods for growth factor modulation
US20170073406A1 (en) Compositions and methods for growth factor modulation
HK40048816A (en) Compositions and methods for growth factor modulation