Deprecated: The each() function is deprecated. This message will be suppressed on further calls in /home/zhenxiangba/zhenxiangba.com/public_html/phproxy-improved-master/index.php on line 456
RS61856B1 - Supstance antitela za lečenje tumora - Google Patents
[go: Go Back, main page]

RS61856B1 - Supstance antitela za lečenje tumora - Google Patents

Supstance antitela za lečenje tumora

Info

Publication number
RS61856B1
RS61856B1 RS20210618A RSP20210618A RS61856B1 RS 61856 B1 RS61856 B1 RS 61856B1 RS 20210618 A RS20210618 A RS 20210618A RS P20210618 A RSP20210618 A RS P20210618A RS 61856 B1 RS61856 B1 RS 61856B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
amino acid
antigen
binding
human
Prior art date
Application number
RS20210618A
Other languages
English (en)
Inventor
Samuel Davis
Eric Smith
Bindu Varghese
Jessica R Kirshner
Gavin Thurston
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of RS61856B1 publication Critical patent/RS61856B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/66—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a swap of domains, e.g. CH3-CH2, VH-CL or VL-CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
SPISAK SEKVENCI
[0001] Ova prijava obuhvata spisak sekvenci u kompjuterski čitljivom obliku u datoteci pod nazivom A0015WO01-Sequence.txt napravljenog 4. marta 2015. (83.454 bajtova), koja je obuhvaćena ovde datom referencom.
OBLAST PRONALASKA
[0002] Ovaj se pronalazak odnosi na bispecifična antitela, koja ciljaju CD20 i CD3 antigene, i postupke za ubijanje tumora. Opisani su postupci smanjenja i/ili kontrolisanja funkcija efektora koji mogu da nastanu kao rezultat iz Fc vezivanja u vezi sa terapijama antitelima za lečenje tumora.
STANJE TEHNIKE
[0003] Dvostruke strategije ciljanja antitela se primenjuju na složene bolesti gde višefrakciona modulacija ima za cilj da poboljša terapijsku efikasnost. CD20 je neglikosilisani fosfoprotein izražen na membranama ćelije zrelih B ćelija. CD20 se smatra antigenom sa tumorom povezane B ćelije zbog toga što je izražen pomoću više od 95% od sa B ćelijom povezanih ne-Hodžkinovih limfoma (NHL) i drugih maligniteta B ćelije, ali je odsutan na prekursorskim B ćelijama, dendritskim ćelijama i plazma ćelijama. Postupci za lečenje kancera ciljanjem CD20 su poznati u ovoj oblasti. Na primer, himerno anti-CD20 monoklonalno antitelo rituksimab se koristi ili se predlaže njegova upotreba za lečenje kancera kao što je NHL, hronična limfocitna leukemija (CLL) i mali limfocitni limfom (SLL). Veruje se da anti-CD20 antitela ubijaju ćelije tumora sa CD20 ekspresijom putom citotoksičnosti zavisne od komplementa (CDC), citotoksičnosti posredovane ćelijom zavisnom od antitela (ADCC) i/ili indukovanjem apoptoze i senzitizacije na hemoterapiju, iako su neki pacijenti pokazali da razvijaju otpornost na ili ispoljavaju nepotpune odgovore na anti-CD20 terapiju (npr. otpornost na rituksimab).
[0004] CD3 je homodimerni ili heterodimerni antigen izražen na T ćelijama u vezi sa kompleksom receptora T ćelije (TCR) i neophodan je za aktivaciju T ćelije. Funkcionalni CD3 je formiran iz dimerne asocijacije dva od četiri različita lanca: epsilon, zeta, delta i gama. Bispecifična antitela koja su sposobna za vezivanje CD3 i ciljnog antigena, kao što je CD20, su predložena za terapijske upotrebe koje obuhvataju ciljanje odgovora imunog sistema T ćelije na tkiva i ćelije koje izražavaju ciljni antigen.
[0005] Bispecifično antitelo koje ima krak koji vezuje CD20 i krak koji vezuje CD3 može da obezbedi neophodnu transkripciju da poveća aktivnost protiv tumora. Treći modalitet kod takvog bispecifičnog antitela je Fc domen. Modifikacija svojstava Fc vezivanja može dodatno da pojača snagu protiv tumora terapijskog antitela.
[0006] Vezivanje Fc domena imunoglobulina na njegov receptor daje kao rezultat raznovrsne signalne odgovore i odgovore imunog sistema. Ove različite "funkcije efektora", kao što je CDC i ADCC, su rezultati imunoglobulina G klase (IgGs) koji formira kompleks između Fab domena tog IgG i ciljnog antigena, pri čemu se Fc domen IgG veže na Fc receptore na ćelije efektora. Neke funkcije efektora kod IgG su nezavisne od vezivanja antigena i otelovljuju funkcije kao što su nivoi seruma u krvi i sposobnost da prenesu Ig preko barijera. Druge funkcije efektora se smatraju ključnim za upotrebu u terapijama imunoglobulina, kao što su terapije kancera. ADCC mehanizam se specifično smatra primarnim mehanizmima protiv tumora terapijskih antitela koji već postoje na tržištu kao što je rastuzumab (metastazni kancer dojke) i rituksimab (ne-Hodžkinov limfom).
[0007] Sadašnje terapijske strategije obično nagoveštavaju da smanjene funkcije efektora (ili smanjeno vezivanje Fc gama receptora) mogu biti korisne za antitela čiji je cilj da neutrališu ili inhibiraju biološku aktivnost antigena (npr. blokatori ili antagonisti antitela), ili aktiviraju ili iniciraju nizvodno ćelijsko signaliziranje (npr. agonisti antitela). Međutim, konstrukcija antitela koja ciljaju tumor sa smanjenom funkcijom efektora je kontraintuitivna za terapiju tumora, jer se očekuje da smanjena citotoksičnost ciljnih ćelija neće biti efikasna za lečenje te bolesti, tj. uništenje ćelija tumora ili suzbijanje rasta tumora.
[0008] Jedna strategija, opisana ovde, koristi diferencijalno vezivanje Fc receptora kombinovano sa vezivanjem bispecifičnog antigena na specifične ciljne markere tumora kao i da aktiviraju ubijanje T ćelije specifične za tumor. Fc domen antitela je projektovan da pažljivo kontroliše vezivanje Fc receptora da eliminiše ili smanji neželjeno ubijanje ćelija kao što su T ćelije, prirodne ćelije ubice i makrofagi koji nose Fc receptore. Jedinstven obrazac vezivanja kada je reč o interakciji Fc receptora obuhvata interakcije vezivanja FcγRII receptora, ali nedostaju mu interakcije FcγRI ili FcγRIII, nije opisan u ovoj oblasti za Ig terapiju koja cilja tumor.
[0009] Dakle, kombinacija bispecifičnih antitela koja ciljaju B ćeliju i T ćeliju sa smanjenim vezivanjem na Fc receptore daje kao rezultat neočekivana terapijska svojstva. Bispecifična antitela koja vezuju i CD3 i CD20 su specifično korisna u kliničkim okruženjima u kojima je poželjno specifično CD20 ciljanje a ipak i kontrolisana i efikasna citotoksičnost.
[0010] (Stanglmaier et al., International Journal of Cancer, vol.123, no.5, 1 September 2008, pages 1181-1189), opisuje bispecifično antitelo na CD20 i CD3, proizvedeno iz linije ćelije koja nastaje iz fuzije mišje linije ćelije sa pacovskom linijom ćelije, i za koje je objašnjeno da posreduje u ubijanju ćelija limfoma B ćelije. WO 2014/012085 opisuje višestruko specifične heteromultimere koji obuhvataju domen CD3 vezivanja i koji mogu takođe da obuhvate domen CD20 vezivanja. WO 2014/022540 opisuje proteine koji vezuju antigen koji obuhvataju sekvencu aminokiseline CH2 domena humanog IgG4 od pozicija 237 do 340 (EU numeracija) i CH3 domen koji obuhvata humani IgG1 ili sekvencu CH3 domena humanog IgG4 od pozicija 341 do 447 (EU numeracija). WO 2014/121087 opisuje antitela koja obuhvataju himerne konstantne domene i izvesne postupke pravljenja antitela koji obuhvataju himerni region zgloba.
KRATAK OPIS PRONALASKA
[0011] U prvom varijantnom rešenju, ovaj opis obezbeđuje bispecifična antitela sa izmenjenim Fc domenima vezivanja koji vezuju humani CD3 i CD20. Ova antitela prema ovom varijantnom rešenju i opisa su korisna, inter alia, za ciljanje T ćelija sa ekspresijom CD3, i za stimulisanje aktivacije T ćelije, npr. pod okolnostima gde ubijanje posredovano T ćelijom jeste korisno ili poželjno kao deo bispecifičnog antitela koje usmerava sa CD3 posredovanu aktivaciju T ćelije na specifičnim tipovima ćelije kao što su ćelije protiv tumora CD20. Antitela se dodatno projektuju da imaju specifične funkcije efektora koje se ne nalaze u prirodnom repertoaru imunog sistema.
[0012] Primeri anti-CD3/CD20 antitela za upotrebu u ovom pronalasku su navedeni u Tabelama 1 do 8 ovde u tekstu. Tabela 1 iznosi identifikatore sekvence aminokiseline promenljivih regiona teškog lanca (HCVR) i promenljivih regiona lakog lanca (LCVR), kao i regione određivanja komplementarnosti teškog lanca (HCDR1, HCDR2 i HCDR3), i regione određivanja komplementarnosti lakog lanca (LCDR1, LCDR2 i LCDR3) od bispecifičnih antitela uzetih kao primer. Tabela 2 iznosi identifikatore sekvence molekula nukleinske kiseline koji kodiraju HCVR, LCVR, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 od bispecifičnih antitela uzetih kao primer. Tabela 3 iznosi kombinacije identifikatora sekvence aminokiseline od bispecifičnih antitela uzetih kao primer uključujući HCVR, kombinacije konstantnog regiona teškog lanca (CH) i promenljivog regiona lakog lanca (LCVR). Tabela 4 iznosi identifikatore sekvence nukleinske kiseline kombinacija molekula nukleinske kiseline koji kodiraju HCVR, kombinacije konstantnog regiona teškog lanca (CH) i promenljivog regiona lakog lanca (LCVR) od bispecifičnih antitela uzetih kao primer.
[0013] Tabela 5 opisuje identifikatore sekvence aminokiseline za primere teškog lanca, pri čemu to bispecifično antitelo obuhvata promenljivi region teškog lanca (HCVR) koji obuhvata HCDR1, HCDR2 i HCDR3 iz Tabele 5 uparen sa CH iz ovog pronalaska. Tabela 6 zasebno opisuje identifikatore sekvence aminokiseline za primere lakog lanca , pri čemu bispecifično antitelo obuhvata promenljivi region lakog lanca (LCVR) koji obuhvata (regione određivanja lakog lanca) LCDR1, LCDR2 i LCDR3 iz Tabele 6.
[0014] Pronalazak obezbeđuje antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigen te mogu obuhvatiti HCVR koji obuhvata sekvencu aminokiseline izabranu iz HCVR sekvenci aminokiseline navedenih u Tabeli 1, ili njima pretežno slične sekvence koja sa njima ima barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnost sekvence.
[0015] Pronalazak obezbeđuje antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigen te mogu obuhvatiti promenljivi region lakog lanca (LCVR) koji obuhvata sekvencu aminokiseline izabranu iz sekvence aminokiseline promenljivog regiona lakog lanca (LCVR) navedenu u Tabeli 1, ili njima pretežno sličnu sekvencu koja ima sa njima barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnost sekvence.
[0016] Pronalazak obezbeđuje antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigen te mogu obuhvati HCVR i LCVR par sekvenci aminokiseline (HCVR/LCVR) obuhvata par sekvenci aminokiseline sadržan unutar primera anti-CD3/CD20 antitela navedenih u Tabeli 1. U izvesnim izvođenjima, HCVR/LCVR par sekvenci aminokiseline je izabran iz grupe koja obuhvata SEK ID BR: 2/18 i 10/18 (npr. antitelo 1 i antitelo 2).
[0017] Pronalazak obezbeđuje antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigen te mogu obuhvatiti CDR1 teškog lanca (HCDR1) obuhvata sekvencu aminokiseline izabranu iz HCDR1 sekvenci aminokiseline u Tabeli 1 ili njenu pretežno sličnu sekvencu koja ima barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnost sekvence.
[0018] Pronalazak obezbeđuje antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigen te mogu obuhvatiti teški lanac CDR2 (HCDR2) obuhvata sekvencu aminokiseline izabranu iz HCDR2 sekvenci aminokiseline navedenih u Tabeli 1 ili pretežno sličnu sekvencu za nju koja ima barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnost sekvence.
[0019] Pronalazak obezbeđuje antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigen te mogu obuhvatiti CDR3 teškog lanca (HCDR3) obuhvata sekvencu aminokiseline izabranu iz HCDR3 sekvenci aminokiseline navedenih u Tabeli 1 ili njenu pretežno sličnu sekvencu koja ima barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnost sekvence.
[0020] Pronalazak obezbeđuje antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigen te mogu obuhvatiti CDR1 lakog lanca (LCDR1) obuhvata sekvencu aminokiseline izabranu iz LCDR1 sekvenci aminokiseline u Tabeli 1 ili njenu pretežno sličnu sekvencu koja ima barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnost sekvence.
[0021] Pronalazak obezbeđuje antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigen te mogu obuhvatiti CDR2 lakog lanca (LCDR2) obuhvata sekvencu aminokiseline izabranu iz LCDR2 sekvenci aminokiseline u Tabeli 1 ili njenu pretežno sličnu sekvencu koja ima barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnost sekvence.
[0022] Pronalazak obezbeđuje antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigen te mogu obuhvatiti CDR3 lakog lanca (LCDR3) obuhvata sekvencu aminokiseline izabranu iz LCDR3 sekvenci aminokiseline u Tabeli 1 ili njenu pretežno sličnu sekvencu koja ima barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnost sekvence.
[0023] Pronalazak obezbeđuje antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigen te mogu obuhvatiti HCDR3 i LCDR3 par sekvence aminokiseline (HCDR3/LCDR3) obuhvata HCDR3 sekvenci aminokiseline u Tabeli 1 uparen sa bilo kojom od LCDR3 sekvenci aminokiseline navedenih u Tabeli 1, kao što je HCDR3/LCDR3 par sekvence aminokiseline izabran iz grupe koja obuhvata SEK ID BR: 8/16 (npr. antitelo 1 ili antitelo 2).
[0025] Pronalazak takodje obezbeđuje antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigen te mogu obuhvatiti niz od šest CDR (tj., HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) sadržan u Tabeli 1. U izvesnim aspktima, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 niz sekvenci aminokiselina je SEK ID BR: 4-6-8-20-22-24; ili 12-14-16-20-22-24 (npr. antitelo 1 ili antitelo 2).
[0025] U srodnom aspektu, pronalazak obezbeđuje antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigen te mogu mogu da obuhvate niz od šest CDR (tj., HCDR1- HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) sadržanih unutar HCVR/LCVR para sekvence aminokiseline kako je definisano u primerima antitela navedenim u Tabeli 1. Na primer, pronalazak obezbeđuje antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigen te mogu antitela mogu obuhvatiti HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 niz sekvenci aminokiseline sadržanih unutar HCVR/LCVR para sekvenci aminokiseline izabranog iz grupe koja obuhvata SEK ID BR: 2/18 (npr. antitelo 1 ili antitelo 2). Metode i tehnike za identifikovanje CDR unutar HCVR i LCVR sekvenci aminokiseline su dobro poznate u ovoj oblasti moguće ih je koristiti da bi se identifikovali CDR unutar navedenih HCVR i/ili LCVR sekvenci aminokiseline opisanih ovde. Primeri konvencija koje je moguće koristiti da se odrede granice CDR obuhvataju, npr. Kabat definiciju, Hotija definiciju, i AbM definiciju. Uopšteno gledano, Kabat definicija se bazira na promenljivosti sekvence, Hotija definicija je bazirana na lokaciji regiona strukturne petlje, i AbM definicija je kompromis između pristupa Kabat i Hotija. Videti, npr. Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); AI- Lazikani et a/., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); and Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989). Javno dostupne baze podataka su takođe na raspolaganju za identifikovanje CDR sekvenci unutar nekog antitela.
[0026] Konkretno, ovaj pronalazak obezbeđuje bispecifično antitelo koje sadrži prvi domen koji vezuje antigen koji se vezuje za humani CD3, drugi domen koji vezuje antigen koji vezuje humani CD20 i himerni konstantni region teškog lanca vezan za svaki od prvog i drugog domeni koji vežu antigen,
pri čemu prvi domen koji veže antigen (A1) koji se specifično vezuje za humani CD3 sadrži tri regiona za određivanje komplementarnosti teškog lanca (HCDR1, HCDR2, HCDR3) i tri regiona za određivanje komplementarnosti lakog lanca (LCDR1, LCDR2, LCDR3), pri čemu
(i) A1-HCDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID NO: 12;
(ii) A1-HCDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID NO: 14;
(iii) A1-HCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID NO: 16;
(iv) A1-LCDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID NO: 20;
(v) A1-LCDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID NO: 22; i
(vi) A1-LCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID NO: 24,
pri čemu drugi domen za vezujuće antigene (A2) koji se specifično vezuje za humani CD20 sadrži tri regiona za određivanje komplementarnosti teškog lanca (HCDR1, HCDR2, HCDR3) i tri regiona za određivanje komplementarnosti lakog lanca (LCDR1, LCDR2, LCDR3), pri čemu
(i) A2-HCDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID NO: 4;
(ii) A2-HCDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID NO: 6;
(iii) A2-HCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID NO: 8;
(iv) A2-LCDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID NO: 20;
(v) A2-LCDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID NO: 22; i
(vi) A2-LCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID NO: 24,
pri čemu himerni konstantni region teškog lanca sadrži:
(i) aminokiselinske sekvence humanog IgG1 ili humanog IgG4 gornjeg zgloba sa položaja 216 do 227 (EU numeracija);
(ii) aminokiselinsku sekvencu humanog IgG2 donjeg zgloba koja sadrži PCPAPPVA (SEK ID NO: 52) sa položaja 228 do 236 (EU numeracija);
(iii) humani IgG1 CH1 domen i humani IgG1 CH3 domen, ili humani IgG4 CH1 domen i humani IgG4 CH3 domen; i
(iv) aminokiselinska sekvenca humanog IgG4 CH2 domena sa položaja 237 do 340 (EU numeracija); i
pri čemu bispecifično antitelo pokazuje veći afinitet za vezivanje za humanu FcɣRIIA u odnosu na ljudski FcɣRIIB i pokazuje mali ili nikakav detektibilni afinitet za vezivanje za humani FcɣRI i humani FcɣRIII, mereno u testu površinske plazmonske rezonance.
[0027] Ovaj pronalazak takođe specifično obezbeđuje bispecifično antitelo pronalaska za upotrebu u medicini. U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje bispecifično antitelo pronalaska za upotrebu u lečenju ili poboljšanju karcinoma B ćelija kod subjekta. U jednoj realizaciji rak B ćelija je: (a) folikularni limfom; (b) difuzni limfom velikih B ćelija; (c) limfom plaštnih ćelija; ili (d) limfom marginalne zone.
[0028] Ovaj opis takođe obezbeđuje molekule nukleinske kiseline koji kodiraju antitela ili njihove delove, na primer, ovaj opis obezbeđuje molekule nukleinske kiseline koji kodiraju HCVR ili LCVR sekvence aminokiseline navedene u Tabeli 1; molekul nukleinske kiseline može obuhvatiti sekvencu polinukleotida izabranu iz HCVR/LCVR sekvenci nukleinske kiseline navedenih u Tabeli 2, ili njima pretežno sličnoj sekvenci koja ima sa njima barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnost sekvence.
[0029] Ovaj opis takođe obezbeđuje molekule nukleinske kiseline koji kodiraju HCDR1 ili HCDR2 ili HCDR3 sekvence aminokiseline navedene u Tabeli 1; molekul nukleinske kiseline može da obuhvati sekvencu polinukleotida izabranu iz bilo kog od HCDR1 ili HCDR2 ili HCDR3 sekvenci nukleinske kiseline navedenih u Tabeli 2, ili njoj pretežno sličnoj sekvenci koja ima sa njom barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnost sekvence.
[0030] Ovaj opis takođe obezbeđuje molekule nukleinske kiseline koji kodiraju bilo koju od LCDR1 ili LCDR2 ili LCDR3 sekvenci aminokiseline navedenih u Tabeli 1; molekul nukleinske kiseline može da obuhvati sekvencu polinukleotida izabranu iz bilo kog od LCDR1 ili LCDR2 ili LCDR3 sekvenci nukleinske kiseline navedenih u Tabeli 2, ili njoj pretežno sličnoj sekvenci koja ima sa njom barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnost sekvence.
[0031] Ovaj opis takođe obezbeđuje molekule nukleinske kiseline koji kodiraju HCVR, pri čemu HCVR obuhvata niz od tri CDRs (tj., HCDR1-HCDR2-HCDR3), pri čemu HCDR1-HCDR2-HCDR3 niz sekvence aminokiseline jeste kako je definisano u primeru anti-CD3 antitela koja su navedena u Tabeli 1.
[0032] Ovaj opis takođe obezbeđuje molekule nukleinske kiseline koji kodiraju LCVR, pri čemu LCVR obuhvata niz od tri CDR (tj., LCDR1-LCDR2-LCDR3), pri čemu LCDR1-LCDR2-LCDR3 niz sekvence aminokiseline jeste kako je definisano primerom sa anti-CD3 antitelima navedenim u Tabeli 1.
[0033] Ovaj opis takođe obezbeđuje molekule nukleinske kiseline koji kodiraju i HCVR i LCVR, pri čemu HCVR obuhvata sekvencu aminokiseline od HCVR sekvenci aminokiseline navedenih u Tabeli 1, i pri čemu LCVR obuhvata sekvencu aminokiseline od LCVR sekvenci aminokiseline navedenih u Tabeli 1. Molekul nukleinske kiseline može obuhvatiti sekvencu polinukleotida izabranu iz bilo koje od sekvenci promenljivog regiona teškog lanca (HCVR) nukleinske kiseline navedenih u Tabeli 2, ili njima pretežno sličnoj sekvenci koje sa njom imaju barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnost sekvence, i sekvencu polinukleotida izabranu sekvenci promenljivog regiona lakog lanca (LCVR) nukleinske kiseline navedenih u Tabeli 2, ili njima pretežno sličnu sekvencu koja sa njima ima barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnost sekvence. Molekul nukleinske kiseline može da kodira HCVR i LCVR, pri čemu su i HCVR i LCVR izvedeni iz istog anti-CD3 antitela navedenog u Tabeli 1.
[0034] Pronalazak obezbeđuje antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigen te mogu obuhvatiti konstantni region teškog lanca (CH) koji obuhvata sekvencu aminokiseline izabranu iz CH sekvenci aminokiseline navedenih u Tabeli 2 ili njoj pretežno sličnu sekvencu koja ima barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnost sekvence.
[0035] Pronalazak obezbeđuje antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigen te mogu obuhvatiti konstantni region teškog lanca (CH) kodiran sekvencom nukleinske kiseline izabranom iz sekvenci nukleinske kiseline navedenim u Tabeli 2 ili njenu pretežno sličnu sekvencu koja ima barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnost sekvence.
[0036] Ovaj opis takođe obezbeđuje rekombinantne vektore ekspresije koji mogu da ispolje ekspresiju polipeptida sa promenljivim regionom teškog ili lakog lanca anti-CD3 antitela i promenljivim regionom teškog ili lakog lanca anti-CD20 antitela. Na primer, ovaj opis obuhvata rekombinantne vektore ekspresije sa bilo kojim gore pomenutim molekulima nukleinske kiseline, tj., molekulima nukleinske kiseline koji kodiraju bilo koju od HCVR, LCVR, i/ili CDR sekvenci, i/ili CH sekvenci kao što je izneto u Tabeli 1 i Tabeli 2. Takođe su obuhvaćeni ovim obimom iz ovog opisa ćelije domaćini u koje se takvi vektori uvode, kao i postupci proizvodnje antitela ili njihovih delova kultivisanjem ćelija domaćina pod uslovima koji dozvoljavaju proizvodnju antitela ili fragmenata antitela, i oporavljanje tako proizvedenih antitela i fragmenata antitela.
[0037] U drugom varijantnom rešenju, ovaj opis obezbeđuje terapijski delotvornu količinu rekombinantnog humanog antitela ili njegovog fragmenta koji specifično vezuje CD3 i CD20, pri čemu to antitelo obuhvata himerni Fc domen, i farmaceutski prihvatljiv nosač. U srodnom varijantnom rešenju, ovaj opis oslikava supstancu koja je kombinacija anti-CD3/CD20 antitela i drugog terapijskog agensa. Drugi terapijski agens može da bude bilo koji agens koji je pogodno kombinovan sa anti-CD3/CD20 antitelom. Primeri agenasa koje je moguće pogodno kombinovati sa anti-CD3/CD20 antitelom obuhvataju, bez ograničenja, druge agense koji vezuju i/ili aktiviraju CD3 signaliziranje (uključujući druga antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigen, itd.) i/ili agente koji ne vezuju direktno CD3 ali bez obzira na to aktiviraju ili stimulišu aktivaciju ćelije imunog sistema, ili pospešuju ubijanje tumora. Dodatne kombinovane terapije i ko-formulacije koje obuhvataju anti-CD3 antitela opisana ovde su opisane na drugom mestu.
[0038] Prema drugom varijantnom rešenju, ovaj opis obezbeđuje bispecifične molekule koji vezuju antigen koji vezuje CD3 i ciljni antigen, pri čemu taj molekul obuhvata himerni Fc domen koji ima smanjenu funkciju efektora. Molekul može obuhvatati himerni Fc domen kako je ovde opisano. Bispecifični molekuli koji vezuju antigen mogu da vežu CD3 i CD20; takvi bispecifični molekuli koji vezuju antigen se ovde takođe pominju kao "antiCD3/anti-CD20 bispecifični molekuli." Taj anti-CD20 deo od anti-CD3/anti-CD20 bispecifičnog molekula je koristan za ciljanje ćelija tumora koje imaju ekspresiju CD20 (npr. tumori B ćelije), i anti-CD3 deo bispecifičnog molekula je koristan za aktiviranje T ćelija. Istovremeno vezivanje CD20 na ćeliju tumora i CD3 na T ćeliju posreduje direktno ubijanje (ćelijska liza) ciljane ćelije tumora aktiviranjem T ćelije i pojednostavljeno ćelijama efektorima koje vezuju himerni Fc domen. Anti-CD3/anti- CD20 bispecifični molekuli su dakle korisni, inter alia, za lečenje bolesti i poremećaja koji su povezani sa ili prouzrokovani tumorima sa ekspresijom CD20 (npr. tumora limfoma i melanoma).
[0039] Anti-CD3/anti-CD20 bispecifični molekuli iz ovog opisa obezbeđuju dodatni postupak za regresiju CD20-pozitivnih tumora. Ovaj opis samim tim obezbeđuje postupak lečenja kancera B ćelije kod subjekta, taj postupak obuhvata isporuku terapijske količine anti-CD3/anti-CD20 bispecifičnih molekula iz ovog opisa pri čemu je ta količina dovoljna da smanji opterećenje tumorom, proizvede regresiju tumora, ili smanji razvoj tumora kod subjekta.
[0040] Anti-CD3/anti-CD20 bispecifični molekuli iz ovog opisa još obezbeđuju postupak za suzbijanje ili regresiju CD20 pozitivnih melanoma (tj. koji imaju ekspresiju CD20). Ovaj opis samim tim obezbeđuje postupak lečenja CD20 pozitivnog melanoma kod subjekta, pri čemu taj postupak obuhvata isporuku terapijske količine anti-CD3/anti-CD20 bispecifičnih molekula iz ovog opisa pri čemu je ta količina dovoljna da smanji rast tumora, proizvede opterećenje tumorom, ili smanji razvoj tumora kod subjekta.
[0041] Kod drugog subjekta, ovaj opis obezbeđuje upotrebu bispecifičnog antitela za lečenje ili poboljšanje kancera kod subjekta, pri čemu to bispecifično antitelo obuhvata prvi domen koji vezuje antigen koji vezuje humani CD3, drugi domen koji vezuje antigen koji vezuje humani CD20, i himerni Fc domen privezan na svaki od prvih i drugih domena koji vezuju antigen, i lečenje ili poboljšanje kancera obuhvata: (a) suzbijanje rasta tumora kod subjekta, (b) posredovanje lize B ćelije kod subjekta, (c) lečenje kancera B ćelije kod subjekta, (d) lečenje kancera koji je pozitivan za CD20 ekspresiju kod subjekta, ili (e) lečenje kancera CD20 koji ima ekspresiju melanoma kod tog subjekta.
[0042] U drugom varijantnom rešenju, ovaj opis obezbeđuje upotrebu bispecifičnog antitela za suzbijanje rasta tumora kod subjekta, pri čemu to bispecifično antitelo obuhvata prvi domen koji vezuje antigen koji vezuje humani CD3, drugi domen koji vezuje antigen koji vezuje humani CD20, i himerni Fc domen privezan na svaki od prvih i drugih domena koji vezuju antigen. U nekim slučajevima, suzbijanje rasta tumora obuhvata (a) potiskivanje rasta tumora kod subjekta, (b) smanjenje veličine tumora kod subjekta, ili (c) smanjenje broja tumora kod subjekta.
[0043] Kod drugog subjekta, ovaj opis obezbeđuje upotrebu bispecifičnog antitela za posredovanje lize B ćelije kod nekog subjekta, pri čemu to bispecifično antitelo obuhvata prvi domen koji vezuje antigen koji vezuje humani CD3, drugi domen koji vezuje antigen koji vezuje humani CD20, i himerni Fc domen privezan na svaki od domena prvog i drugog domena koji vezuju antigen. U nekim slučajevima B ćelije su pre-B limfociti, zreli B limfociti, ili ćelije ne-Hodžkinovog limfoma B ćelije.
[0044] Kod drugog subjekta, ovaj opis obezbeđuje upotrebu bispecifičnog antitela za lečenje kancera B ćelije kod subjekta, pri čemu to bispecifično antitelo obuhvata prvi domen koji vezuje antigen koji vezuje humani CD3, drugi domen koji vezuje antigen koji vezuje humani CD20, i himerni Fc domen privezan na svaki od prvih i drugih domena koji vezuju antigen. U nekim slučajevima, kancer B ćelije se bira iz grupe koja obuhvata: folikularni limfom, hroničnu limfocitnu leukemiju B ćelije, limfoblastični limfom B ćelije, Hodžkinov limfom, ne-Hodžkinov limfom, difuzni limfom velike B ćelije, limfom marginalne zone, limfom ćelije plašta, leukemija dlakave ćelije i Burkitov limfom. U nekim slučajevima, subjekat je pogođen tumorom koji je otporan na, ili potpuno neosetljiv na dejstvo (a) same monospecifične terapije anti-CD20, ili (b) monoterapije rituksimabom. U nekim slučajevima, subjekat je primio terapiju monospecifičnog antitela anti-CD20 barem 1 dan do 1 godine pre isporuke bispecifičnog antitela. U nekim slučajevima, monospecifična terapija anti-CD20 obuhvata monospecifično antitelo anti-CD20. U nekim slučajevima, anti-CD20 monospecifično antitelo je rituksimab.
[0045] U drugom varijantnom rešenju, ovaj opis obezbeđuje upotrebu bispecifičnog antitela za lečenje kancera B ćelije kod subjekta, koji obuhvata: (a) odabir subjekta koji je pogođen kancerom otpornim na, ili nepotpuno odgovara na samo monospecifičnu terapiju anti-CD20; i (b) isporuku subjektu terapijske količine bispecifičnog antitela koje obuhvata prvi domen koji vezuje antigen koji vezuje humani CD3, drugi domen koji vezuje antigen koji vezuje humani CD20, i himerni Fc domen pripojen na svaki od domena prvi i drugi domen koji vezuje antigen.
[0046] U nekim slučajevima, subjekat je izabran na bazi toga što ima tumor koji je otporan na, nezavisan prema, ili nepotpuno odgovara na monospecifičnu terapiju anti-CD20. U nekim slučajevima, monospecifična terapija anti-CD20 obuhvata monospecifično antitelo anti-CD20. U nekim slučajevima, monospecifično antitelo anti-CD20 je rituksimab. U nekim slučajevima, kancer B ćelije je limfom. U nekim slučajevima, limfom je ne-Hodžkinov limfom (NHL). U nekim slučajevima, kancer B ćelije je hronična limfocitna leukemija (CLL).
[0047] U drugom varijantnom rešenju, ovaj opis obezbeđuje upotrebu bispecifičnog antitela za lečenje kancera B ćelije kod subjekta, pri čemu bispecifično antitelo obuhvata prvi domen koji vezuje antigen koji vezuje humani CD3, drugi domen koji vezuje antigen koji vezuje humani CD20, i himerni Fc domen pripojen na svaki od domena prvi domen koji vezuje antigen i drugi domen koji vezuje antigen, i pri čemu se bispecifično antitelo isporučuje u količini dovoljnoj da smanji opterećenje tumorom, proizvede regresiju tumora, potisne rast tumora ili smanji razvoj tumora kod subjekta.
[0048] U nekim slučajevima, kancer B ćelije se bira iz grupe koja obuhvata: folikularni limfom, hroničnu limfocitnu leukemiju B ćelije, limfoblastični limfom B ćelije, Hodžkinov limfom, ne-Hodžkinov limfom, difuzni limfom velike B ćelije, limfom marginalne zone, limfom ćelije plašta, leukemija dlakave ćelije i Burkitov limfom. U nekim slučajevima, subjekat je pogođen tumorom koji je otporan na, ili potpuno neosetljiv na dejstvo same monospecifične terapije anti-CD20. U nekim slučajevima, subjekat je pogođen tumorom koji je otporan na, ili nepotpuno odgovara na monoterapiju rituksimabom. U nekim slučajevima, subjekat je primio terapiju monospecifičnog antitela anti-CD20 barem 1 dan do 1 godine pre isporuke bispecifičnog antitela. U nekim slučajevima, monospecifična terapija anti-CD20 obuhvata monospecifično antitelo anti-CD20. U nekim slučajevima, anti-CD20 monospecifično antitelo je rituksimab. U nekim slučajevima, količina je dovoljna da se smanji opterećenje tumorom, proizvede regresija tumora, spreči rast tumora ili smanji razvoj tumora kod subjekta je između oko 0,001 mg/kg do oko 1 mg/kg. U nekim slučajevima, količina je dovoljna da se smanji opterećenje tumorom, proizvede regresija tumora, ili smanji razvoj tumora kod subjekta je oko 0,4 mg/kg.
[0049] U jednom drugom varijantnom rešenju, ovaj opis obezbeđuje upotrebu bispecifičnog antitela za lečenje kancera koji je pozitivan na ispoljavanje ekspresije CD20 kod nekog subjekta, i obuhvata: (a) odabir subjekta koji je pogođen kancerom i/ili tumorima; (b) prikupljanje jednog ili više bioloških uzoraka od tog subjekta; (c) identifikovanje kancera koji eksprimuje CD20 ili ćelija tumora u jednom ili više uzoraka; i (b) isporučivanje subjektu terapijske količine bispecifičnog antitela koja obuhvata prvi domen koji veće antigen koji vezuje humani CD3, drugi domen koji vezuje antigen koji vezuje humani CD20, i himerni Fc domen pripojen na svaki od prvog i drugog domena koji vezuju antigen.
[0050] U nekim slučajevima, subjekat je izabran na bazi toga što ima kancer ili tumor koji je otporan na, nezavisan prema, ili nepotpuno odgovara na monospecifičnu terapiju antiCD20. U nekim slučajevima, subjekat se bira na bazi toga što ima zaostali kancer. U nekim slučajevima, terapija anti-CD20 obuhvata ili se sastoji od monospecifičnog antitela anti-CD20. U nekim slučajevima, anti-CD20 monospecifično antitelo je rituksimab. U nekim slučajevima, kancer je limfom ili leukemija. U nekim slučajevima, limfom je izabran iz grupe koja obuhvata folikularni limfom, limfoblastični limfom B ćelije, Hodžkinov limfom, ne-Hodžkinov limfom, difuzni limfom velike B ćelije, limfom marginalne zone, limfom ćelije omotača, leukemiju dlakave ćelije i Burkitov limfom. U nekim slučajevima, leukemija je hronična limfocitna leukemija B ćelije (CLL).
[0051] U drugom varijantnom rešenju, ovaj opis obezbeđuje upotrebu bispecifičnog antitela za lečenje kancera koji eksprimuje CD20 melanoma kod subjekta, obuhvata isporuku terapijske količine bispecifičnog antitela koja obuhvata prvi domen koji vezuje antigen koji vezuje humani CD3, drugi domen koji vezuje antigen koji vezuje humani CD20, i himern Fc domain pripojen na svaki od domena prvi domen koji vezuje antigen i drugi domen koji vezuje antigen, pri čemu je količina dovoljna da smanji opterećenje tumorom, potisne rast tumora ili smanji razvoj tumora kod subjekta.
[0052] Bispecifični molekuli koji vezuju antigen prema ovom varijantnom rešenju ovog opisa obuhvataju prvi domen koji vezuje antigen koji specifično vezuje humani CD3, i drugi domen koji vezuje antigen koji specifično vezuje CD20, i himerni Fc domen. Ovaj opis obuhvata bispecifične molekule protiv CD3/anti-CD20 (npr. bispecifična antitela) pri čemu svaki domen koji vezuje antigen obuhvata promenljivi region teškog lanca (HCVR) uparen sa promenljivim regionom lakog lanca (LCVR). Domen koji vezuje antigen anti-CD3 i domen koji vezuje antigen anti-CD20 mogu svaki da obuhvati različite distinktivne promenljive regione teškog lanca uparene sa uobičajenim promenljivim regionom lakog lanca. Na primer, kako je prikazano u Primeru 2 ovde, bispecifična antitela su konstruisana koja obuhvataju prvi domen koji vezuje antigen koji specifično vezuje CD3, pri čemu prvi domen koji vezuje antigen obuhvata HCVR/LCVR par izveden iz antitela anti-CD3; i drugi domen koji vezuje antigen koji specifično vezuje CD20, pri čemu drugi domen koji vezuje antigen obuhvata HCVR izveden iz antitela anti-CD20 uparenog sa LCVR izvedenog iz antitela anti-CD3 (npr. isti LCVR koji je obuhvaćen u domen koji vezuje antigen anti-CD3). Drugim rečima, u ovde opisanim molekulima datim kao primer, uparivanje HCVR iz antitela anti-CD20 sa LCVR iz antitela anti-CD3 stvara domen koji vezuje antigen koji specifično vezuje CD20 (ali ne vezuje CD3). U takvim primerima, prvi i drugi domeni koji vezuju antigen obuhvataju distinktivne promenjive regione teškog lanca (HCVRRR) anti-CD3 i anti-CD20 ali dele zajednički promenljivi region lakog lanca (LCVR) anti-CD3.
[0053] Ovaj opis obezbeđuje bispecifične molekule anti-CD3/anti-CD20, pri čemu prvi domen koji vezuje antigen koji specifično vezuje CD3 obuhvata bilo koju od sekvenci aminokiseline promenljivog regiona teškog lanca (HCVR) kao što je prikazano u Tabeli 1 ili Tabeli 2. Prvi domen koji vezuje antigen koji specifično vezuje CD3 može takođe da obuhvati bilo koju od sekvenci aminokiseline promenljivog regiona lakog lanca (LCVR) kao što je prikazano u Tabeli 1 ili Tabeli 2. Prvi domen koji vezuje antigen koji specifično vezuje CD3 može da obuhvati bilo koji od parova sekvenci aminokiseline promenljivog regiona teškog lanca (HCVR), odnosno promenljivog regiona lakog lanca (LCVR) kao što je prikazano u Tabeli 1 ili Tabeli 2. Ovaj opis takođe obezbeđuje bispecifične molekule anti-CD3/anti-CD20, pri čemu prvi domen koji vezuje antigen koji specifično vezuje CD3 obuhvata bilo koju od sekvenci aminokiseline CDR1-CDR2-CDR3 teškog lanca kao što je izneto u Tabeli 1 ili Tabeli 2, i/ili bilo koju od sekvenci aminokiseline CDR1-CDR2-CDR3 lakog lanca kao što je izneto u Tabeli 1 ili Tabeli 2.
[0054] 050a] U bispecifičnim antitelima ovog pronalaska, prvi domen koji veže antigen (A1) sadrži tri regiona koji određuju komplementarnost teškog lanca (HCDR1, HCDR2, HCDR3) i tri regiona za određivanje komplementarnosti lakog lanca (LCDR1, LCDR2, LCDR3), pri čemu : (i) A1-HCDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID NO: 12; (ii) A1-HCDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID NO: 14; (iii) A1-HCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID NO: 16; (iv) A1-LCDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID NO: 20; (v) A1-LCDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID NO: 22; i (vi) A1-LCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID NO: 24. U jednom aspektu, prvi domen koji vezuje antigen sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR) koja sadrži SEK ID NO: 10, i sekvenca aminokiselina promenljivog regiona lakog lanca (LCVR) koja sadrži SEK ID NO: 18.
[0055] [050b] U bispecifičnim antitelima ovog pronalaska, drugi domen koji veže antigen (A2) sadrži tri regiona za određivanje komplementarnosti teškog lanca (HCDR1, HCDR2, HCDR3) i tri regiona za određivanje komplementarnosti lakog lanca (LCDR1, LCDR2, LCDR3), pri čemu: (i) A2-HCDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID NO: 4; (ii) A2-HCDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID NO: 6; (iii) A2-HCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID NO: 8; (iv) A2-LCDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID NO: 20; (v) A2-LCDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID NO: 22; i (vi) A2-LCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID NO: 24. U jednoj realizaciji, drugi domen koji vezuje antigen sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR) koja sadrži SEK ID NO: 2, i sekvenca aminokiselina promenljivog regiona lakog lanca (LCVR) koja sadrži SEK ID NO: 18.
[0056] Prema izvesnim primerima, ovaj opis obezbeđuje bispecifične molekule protiv CD3/anti-CD20, kod kojih prvi domen koji vezuje antigen koji specifično vezuje CD3 obuhvata promenljivi region teškog lanca (HCVR) koji ima sekvencu aminokiseline koja obuhvata SEK ID BR: 10 ili njenu pretežno sličnu sekvencu koja ima barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnost sekvence.
[0057] Ovaj opis takođe obezbeđuje bispecifične molekule anti-CD3/anti-CD20, pri čemu prvi domen koji vezuje antigen koji specifično vezuje CD3 obuhvata promenljivi region lakog lanca (LCVR) sa sekvencom aminokiseline koja obuhvata SEK ID BR: 18 ili njenu pretežno sličnu sekvencu koja ima barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnost sekvence.
[0058] Ovaj opis takođe obezbeđuje bispecifične molekule anti-CD3/anti-CD20, pri čemu prvi domen koji vezuje antigen koji specifično vezuje CD3 obuhvata par sekvence aminokiseline promenljivog regiona teškog lanca (HCVR) i sekvence aminokiseline promenljivog regiona lakog lanca (LCVR) (HCVR/LCVR) izabran iz grupe koja obuhvata SEK ID BR: 10/18.
[0059] Ovaj opis takođe obezbeđuje bispecifične molekule anti-CD3/anti-CD20, pri čemu prvi domen koji vezuje antigen koji specifično vezuje CD3 obuhvata domen CDR3 teškog lanca (HCDR3) koji ima sekvencu aminokiseline koja obuhvata SEK ID BR: 16, njoj pretežno sličnu sekvencu sa barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnosti sekvence; i domen CDR3 lakog lanca (LCDR3) sa sekvencom aminokiseline koja obuhvata SEK ID BR: 24 ili njenu pretežno sličnu sekvencu koja ima barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnost sekvence.
[0060] U izvesnim primerima, prvi domen koji vezuje antigen koji specifično vezuje CD3 obuhvata par sekvenci aminokiseline HCDR3/LCDR3 koji obuhvata SEK ID BR: 16/24.
[0061] Ovaj opis takođe obezbeđuje bispecifične molekule koji vezuju antigen anti-CD3/anti-CD20, pri čemu prvi domen koji vezuje antigen koji specifično vezuje CD3 obuhvata domen CDR1 teškog lanca (HCDR1) koji ima sekvencu aminokiseline koja obuhvata SEK ID BR: 12, njoj pretežno sličnu sekvencu sa barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnosti sekvence; i domen CDR2 teškog lanca (HCDR2) sa sekvencom aminokiseline koja obuhvata SEK ID BR: 14, njoj pretežno sličnu sekvencu sa barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnosti sekvence; domen CDR1 lakog lanca (LCDR1) sa sekvencom aminokiseline koja obuhvata SEK ID BR: 20, njoj pretežno sličnu sekvencu sa barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnosti sekvence; i domen CDR2 lakog lanca (LCDR2) sa sekvencom aminokiseline koja obuhvata SEK ID BR: 22, ili njenu pretežno sličnu sekvencu koja ima barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnost sekvence.
[0062] Izvesni neograničavajući, bispecifični molekuli koji vezuju antigen anti-CD3/anti-CD20 iz ovog opisa obuhvataju prvi domen koji vezuje antigen koji specifično vezuje CD3 obuhvata domene HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, prema opisanom redosledu, sa sekvencama aminokiseline izabranim iz grupe koja obuhvata: SEK ID BR: 12-14-16-20-22-24.
[0063] Ovaj opis takođe obezbeđuje bispecifične molekule anti-CD3/anti-CD20, pri čemu drugi domen koji vezuje antigen koji specifično vezuje CD20 obuhvata promenljivi region teškog lanca (HCVR) sa sekvencom aminokiseline koja obuhvata SEK ID BR: 2, ili njenu pretežno sličnu sekvencu koja ima barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnost sekvence.
[0064] Ovaj opis takođe obezbeđuje bispecifične molekule anti-CD3/anti-CD20, pri čemu drugi domen koji vezuje antigen koji specifično vezuje CD20 obuhvata promenljivi region lakog lanca (LCVR) koji ima sekvencu aminokiseline koja obuhvata SEK ID BR: 18 ili njenu pretežno sličnu sekvencu koja ima barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnost sekvence. Ovaj opis takođe obezbeđuje bispecifične molekule anti-CD3/anti-CD20, pri čemu drugi domen koji vezuje antigen koji specifično vezuje CD20 obuhvata promenljivi region lakog lanca (LCVR) sa sekvencom aminokiseline koja obuhvata SEK ID BR: 75 ili njenu pretežno sličnu sekvencu koja ima barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnost sekvence.
[0065] Ovaj opis takođe obezbeđuje bispecifične molekule anti-CD3/anti-CD20, pri čemu drugi domen koji vezuje antigen koji specifično vezuje CD20 obuhvata par sekvence aminokiseline promenljivog regiona teškog lanca (HCVR) i promenljivi region lakog lanca (LCVR)(HCVR/LCVR) SEK ID BR: 2/18, ili SEK ID BR: 2/75.
[0066] Ovaj opis takođe obezbeđuje bispecifične molekule anti-CD3/anti-CD20, pri čemu drugi domen koji vezuje antigen koji specifično vezuje CD20 obuhvata domen CDR3 teškog lanca (HCDR3) koji ima sekvencu aminokiseline od SEK ID BR: 8, njoj pretežno sličnu sekvencu sa barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnosti sekvence; i domen CDR3 lakog lanca (LCDR3) sa sekvencom aminokiseline koja obuhvata SEK ID BR: 24 ili njenu pretežno sličnu sekvencu koja ima barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnost sekvence.
[0067] U izvesnim primerima, drugi domen koji vezuje antigen koji specifično vezuje CD20 obuhvata par sekvence aminokiseline HCDR3/LCDR3 koji obuhvata SEK ID BR: 8/24.
[0068] Ovaj opis takođe obezbeđuje bispecifične molekule koji vezuju antigen anti-CD3/anti-CD20, pri čemu drugi domen koji vezuje antigen koji specifično vezuje CD20 obuhvata domen CDR1 teškog lanca (HCDR1) koji ima sekvencu aminokiseline od SEK ID BR: 4,ili njoj pretežno sličnu sekvencu sa barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnosti sekvence; i domen CDR2 teškog lanca (HCDR2) sa sekvencom aminokiseline koja obuhvata SEK ID BR: 6, njoj pretežno sličnu sekvencu sa barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnosti sekvence; domen CDR1 lakog lanca (LCDR1) sa sekvencom aminokiseline od SEK ID BR: 20, njoj pretežno sličnu sekvencu sa barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnosti sekvence; i domen CDR2 lakog lanca (LCDR2) sa sekvencom aminokiseline od SEK ID BR: 22 ili njenu pretežno sličnu sekvencu koja ima barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnost sekvence.
[0069] Izvesni neograničavajući primeri bispecifičnih molekula koji vezuju antigen anti-CD3/anti-CD20 iz ovog opisa obuhvataju drugi domen koji vezuje antigen koji specifično vezuje CD20 koji obuhvata domene HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, prema opisanom redosledu, sa sekvencama aminokiseline izabranim iz grupe koja obuhvata: SEK ID BR: 4-6-8-20-22-24 (npr. antitelo 1 ili antitelo 2).
[0070] U jednom primeru, bispecifični molekuli koji vezuju antigen anti-CD3/anti-CD20 iz ovog opisa obuhvataju prvi domen koji vezuje antigen (A1) koji specifično vezuje humani CD3 i obuhvata tri regiona određivanja komplementarnosti teškog lanca (A1-HCDR1, A1-HCDR2, A1-HCDR3) i tri regiona određivanja komplementarnosti lakog lanca (A1-LCDR1, A1-LCDR2, A1-LCDR3), i drugi domen koji vezuje antigen (A2) koji specifično vezuje humani CD20 i obuhvata tri regiona određivanja komplementarnosti teškog lanca (A2-HCDR1, A2-HCDR2 i A2-HCDR3) i tri regiona određivanja komplementarnosti lakog lanca (A2-LCDR1, A2-LCDR2 i A2-LCDR3); pri čemu: (a) A1-HCDR1 obuhvata sekvencu aminokiseline od SEK ID BR. 12; (b) A1-HCDR2 obuhvata sekvencu aminokiseline od SEK ID BR: 14; (c) A1-HCDR3 obuhvata sekvencu aminokiseline od SEK ID BR: 16; (d) A1-LCDR1 obuhvata sekvencu aminokiseline od SEK ID BR: 20; (e) A1-LCDR2 obuhvata sekvencu aminokiseline od SEK ID BR: 22; (f) A1-LCDR3 obuhvata sekvencu aminokiseline od SEK ID BR: 24; (g) A2-HCDR1 obuhvata sekvencu aminokiseline od SEK ID BR: 4; (h) A2-HCDR2 obuhvata sekvencu aminokiseline od SEK ID BR: 6; (i) A2HCDR3 obuhvata sekvencu aminokiseline od SEK ID BR: 8; (j) A2-LCDR1 obuhvata sekvencu aminokiseline od SEK ID BR: 20; (k) A2-LCDR2 obuhvata sekvencu aminokiseline od SEK ID BR: 22; i (l) A2-LCDR3 obuhvata sekvencu aminokiseline od SEK ID BR: 24.
[0071] U srodnom primeru, ovaj opis obuhvata bispecifične molekule koji vezuju antigen anti-CD3/anti-CD20 pri čemu drugi domen koji vezuje antigen koji specifično vezuje CD20 obuhvata domene regiona određivanja komplementarnosti (CDR) teškog i lakog lanca sadržane unutar sekvenci promenljivog regiona teškog i lakog lanca (HCVR/LCVR) od SEK ID BR: 2/18.
[0072] U drugom varijantnom rešenju, ovaj opis obezbeđuje molekule nukleinske kiseline koji kodiraju bilo koju od sekvenci promenljivog regiona teškog lanca (HCVR), promenljivog regiona lakog lanca (LCVR) ili sekvenci regiona određivanja komplementarnosti od ovde opisanih bispecifičnih molekula koji vezuju antigen anti-CD3/anti-CD20, uključujući molekule nukleinske kiseline koji obuhvataju sekvence polinukleotida kao što je izneto u Tabelama 2, 7 i 8 ovde u tekstu, kao i molekule nukleinske kiseline koji obuhvataju dve od sekvenci polinukleotida kao što je izneto u Tabelama 2, 7 i 8 u bilo kojoj za njih funkcionalnoj kombinaciji ili rasporedu. Rekombinantni vektori ekspresije koji nose nukleinske kiseline iz ovog opisa, i ćelije domaćina u koje se uvode takvi vektori, su takođe obuhvaćeni ovim opisom, kao postupci proizvodnje antitela kultivisanjem ćelija domaćina pod uslovima koji dozvoljavaju proizvodnju antitela, i oporavljanje proizvedenih antitela.
[0073] Ovaj opis obuhvata bispecifične molekule koji vezuju antigen anti-CD3/anti-CD20 pri čemu se kombinuju bilo koji od gore pomenutih domena koji vezuju antigen koji specifično vezuju CD3, spojene ili na drugi način povezane sa bilo kojim od gore pomenutih domena koji vezuju antigen koji specifično vezuju CD20 da bi formirali bispecifični molekul koji veže antigen koji vezuje CD3 i CD20.
[0074] U drugom varijantnom rešenju, opis obezbeđuje bispecifično antitelo koje obuhvata prvi domen koji vezuje antigen koji vezuje humani CD3, drugi domen koji vezuje antigen koji vezuje humani CD20, i himerni Fc domen privezan na svaki od tih domena prvog i drugog domena koji vezuje antigen. U srodnom varijantnom rešenju, bispecifično antitelo je sposobno za specifično vezivanje na humani FcγRIIA i humani FcγRIIB. Ovaj opis obezbeđuje bispecifične molekule koji vezuju antigen anti-CD3/anti-CD20 koji se poželjno vezuju na humani FcγRIIA i humani FcγRIIB i prikazuju nedovoljan ili nikakav afinitet vezivanja na humani FcγRI ili humani FcγRIII. U jednom varijantnom rešenju, bispecifična antitela su sposobna za specifično vezivanje na humani FcγRIIA sa višim afinitetom nego za vezivanje na humani FcγRIIB, humani FcγRI, i/ili humani FcγRIII, kao što je izmereno u in vitro ogledu. Bispecifična antitela iz ovog opisa su sposobna za specifično vezivanje na humani FcγRIIA i humani FcγRIIB pri višim afinitetima nego antitela koja se vežu na humani FcγRI ili humani FcγRIII, kao što je izmereno u in vitro ogledu. U nekim primerima, gde se antitelo specifično veže na humani FcγRIIA i humani FcyRIIB, i ispolji manje od 1 µM KD afiniteta vezivanja na svaki od humanih FcγRI i FcγRIII, kao što je izmereno u in vitro ogledu. U ovom pronalasku, bispecifično antitelo ispoljava viši afinitet vezivanja za humani FcγRIIA u odnosu na humani FcγRIIB, i ispoljava nedovoljan ili nedektibilan afinitet vezivanja na humani FcγRI i humani FcγRIII, kako je izmereno u ogledu rezonance površinskog plazmona.
[0075] U drugim varijantnim rešenjima, ovaj opis obezbeđuje bispecifično antitelo koje obuhvata polipeptid prvog i drugog teškog lanca pri čemu svaki obuhvata himerni Fc domen, pri čemu polipetid prvog teškog lanca obuhvata domen koji vezuje antigen koji vezuje humani CD3, i pri čemu polipeptid drugog teškog lanca obuhvata drugi domen koji vezuje antigen koji vezuje humani CD20.
[0076] U drugim primerima, antitelo ispoljava viši, tj. jači, afinitet vezivanja za humani FcγRIIA u odnosu na njegovo vezivanje humanog FcγRIIB, kao što je izmereno u in vitro ogledu. U još nekim drugim primerima, antitelo se vezuje na humani FcγRIIA i ispoljava nižu KD vrednost u odnosu na njegovo vezivanje humanog FcγRIIB, kako je izmereno u in vitro ogledu. U nekim primerima, antitelo se vezuje na humani FcγRIIA na 25 °C koja ima KD vrednost između 10 i 30 µM, kao što je izmereno u in vitro ogledu. U nekim primerima, antitelo se vezuje na humani FcγRIIA na 25 °C koja ima KD vrednost između 100 i 250 µM, kao što je izmereno u in vitro ogledu.
[0077] U drugom primeru, antitelo ispoljava nedovoljan ili nedektibilan afinitet vezivanja na humani FcγRI, kako je izmereno u in vitro ogledu. U nekim primerima, antitelo ispoljava nedovoljan ili nedektibilan afinitet vezivanja na humani FcγRIII, kako je izmereno u in vitro ogledu.
[0078] U nekim primerima, in vitro je ogled rezonance površinskog plazmona.
[0079] U nekim primerima, to antitelo ispoljava smanjenu od antitela zavisnu ćelijsku citotoksičnost (ADCC) u poređenju sa antitelom koje obuhvata Fc domen divljeg tipa, kako je izmereno u in vitro ogledu citotoksičnosti;
[0080] U nekim primerima, to antitelo ispoljava zanemarljivu ili nedektibilanu ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC).
[0081] U nekim primerima, to antitelo ispoljava smanjenu citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC) u poređenju sa antitelom koje obuhvata Fc domen divljeg tipa, kako je izmereno u in vitro ogledu citotoksičnosti;
[0082] U nekim izvođenjima, antitelo ispoljava manje od 50% citotoksičnosti, kao što je određeno merenjem lize ćelije u ogledu in vitro.
[0083] U nekim primerima, to antitelo ispoljava zanemarljivu ili nedektibilnu citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC).
[0084] U nekim primerima, antitelo indukuje smanjeno T ćelijom posredovano ubijanje ćelija koje nose Fc receptore, kao što su NK ćelije ili makrofagi, u poređenju sa antitelom koje obuhvata Fc domen divljeg tipa.
[0085] U izvesnim primerima, antitelo indukuje smanjeno ubijanje od T ćelija, posredovano ćelijama koje nose Fc receptor, kao što su NK ćelije ili makrofagi, u poređenju sa antitelom koje obuhvata Fc domen divljeg tipa.
[0086] U nekim primerima, antitelo ispoljava afinitet vezivanja na humani FcγRIIA jače nego njegov afinitet vezivanja na humani FcγRIIB, koji je jači od njegovog afiniteta vezivanja na humani FcγRI, koji je jači od njegovog ili ekvivalentan sa njegovim afinitetom vezivanja na humani FcγRIII, kako je utvrđeno merenjem KD u in vitro ogledu. U drugim primerima, to antitelo ispoljava afinitet vezivanja na humani FcγRIIA > humani FcγRIIB > humani FcγRI >= humani FcγRIII, kako je izmereno u in vitro ogledu.
[0087] U nekim primerima, antitelo ispoljava afinitet vezivanja na humani FcγRIIA jače nego njegov afinitet vezivanja na humani FcγRIIB, koji je jači od njegovog afiniteta vezivanja na humani FcγRIII, koji je jači od njegovog ili ekvivalentan sa njegovim afinitetom vezivanja na humani FcγRI, kako je utvrđeno merenjem KD u in vitro ogledu. U drugim primerima, to antitelo ispoljava afinitet vezivanja na humani FcγRIIA > humani FcγRIIB > humani FcγRIII >= humani FcγRI, kako je izmereno u in vitro ogledu.
[0088] U nekim primerima humani FcγRIII je humani FcγRIIIA ili humani FcγRIIIB.
[0089] U nekim primerima, himerni Fc domen obuhvata himerni zglob.
[0090] U drugom varijantnom rešenju, ovaj opis obezbeđuje bispecifično antitelo koje obuhvata prvi domen koji vezuje antigen, drugi domen koji vezuje antigen, i himerni konstantni region teškog lanca (CH), pri čemu (a) prvi domen koji vezuje antigen vezuje CD3, (b) drugi domen koji vezuje antigen vezuje CD20. U izvesnim varijantnim rešenjima himerni CH region se vezuje sa višim, tj. jačim, afinitetom na humani FcγRIIA i humani FcyRIIB, u poređenju sa antitelom koje obuhvata CH region divljeg tipa, kao što se meri u in vitro ogledu. U drugom varijantnom rešenju, himerni CH se vezuje sa nižim, tj. slabijim, ili nepostojećim afinitetom na humani FcγRI i humani FcγRIII, u poređenju sa antitelom koje obuhvata CH region divljeg tipa, kako se meri u in vitro ogledu.
[0091] Ovaj opis obezbeđuje bispecifična antitela koja obuhvataju himerni region zgloba. Kod nekih varijantnih rešenja himerni region zgloba obuhvata ostatke sekvence aminokiseline iz pozicija 216 do 236 (EU numeracija). Konstruisana su bispecifična antitela iz ovog opisa pri čemu himerni zglob obuhvata sekvencu aminokiseline donjeg zgloba humanog IgG2 PCPAPPVA (SEK ID BR: 52) od pozicija 228 do 236 (EU numeracija). U izvesnim primerima, bispecifična antitela iz ovog opisa obuhvataju himerni zglob i gornji deo zgloba himerni zglob obuhvata ostatke aminokiseline iz pozicija 216 do 227 (EU numeracija) iz IgG1 gornjeg zgloba. U izvesnim primerima, bispecifična antitela iz ovog opisa obuhvataju himerni zglob i gornji deo zgloba tog himernog zgloba obuhvata ostatke aminokiseline iz pozicija 216 do 227 (EU numeracija) iz IgG4 gornjeg zgloba .
[0092] U jednom primeru, bispecifično antitelo obuhvata sekvencu aminokiseline himernog zgloba EPKSCDKTHTCP-PCPAPPVA (SEK ID BR: 53). U jednom drugom primeru, bispecifično antitelo obuhvata sekvencu aminokiseline himernog zgloba ESKYGPPCPPCPAPPVA (SEK ID BR: 54). U izvesnim primerima, bispecifično antitelo obuhvata sekvencu aminokiseline CH2 domena humanog IgG4 iz pozicija 237 do 340 (EU numeracija). U drugim primerima, bispecifično antitelo obuhvata CH3 domen izveden iz CH3 domena humanog IgG1 ili CH3 domena humanog IgG4. U još nekim drugim primerima, bispecifično antitelo obuhvata CH1 domen humanog IgG1 i CH3 domen humanog IgG1. U još nekim drugim primerima, bispecifično antitelo obuhvata CH1 domen humanog IgG4 i CH3 domen humanog IgG4.
[0093] Kod bispecifičnih antitela iz ovog pronalaska, bispecifično antitelo obuhvata himerni konstantni region teškog lanca pripojen na svaki od prvog i drugog domena koji vezuje antigen, pri čemu taj himerni konstantni region teškog lanca obuhvata:
<(i)>sekvencu aminokiseline gornjeg zgloba humanog IgG1 ili humanog IgG4 od pozicija 216 do 227 (EU numeracija);
<(ii)>sekvenca aminokiseline donjeg zgloba humanog IgG2 obuhvata PCPAPPVA (SEK ID BR: 52) od pozicija 228 do 236 (EU numeracija);
<(iii)>CH1 domen humanog IgG1 i CH3 domen humanog IgG1, ili CH1 domen humanog IgG4 i CH3 domen humanog IgG4; i
<(iv)>sekvencu aminokiselne CH2 domena humanog IgG4 od pozicija 237 do 340 (EU numeracija).
[0094] Varijantno rešenje iz ovog opisa obezbeđuje postupak pravljenja bispecifičnog antitela koje obuhvata himerni konstantni region teškog lanca, pomenuti postupak obuhvata: (a) transfektovanje ćelije domaćina sa molekulom nukleinske kiseline koji kodira prvi laki lanac koji je sposoban za vezivanje CD3 antigena, pri čemu pomenuti molekul nukleinske kiseline obuhvata sekvencu nukleotida koja kodira VL region prvog i sekvencu nukleotida koja kodira konstantni CL region od Ig, pri čemu su pomenuta sekvenca nukleotida koja kodira VL region izabranog antitela specifičnog za antigen i pomenuta sekvenca nukleotida koja kodira CL region od Ig funkcionalno povezane; (b) transfektovanje ćelije domaćina iz koraka (a) sa molekulom nukleinske kiseline koji kodira prvi teški lanac antitela koje može da veže CD3 antigen, pri čemu pomenuti molekul nukleinske kiseline obuhvata sekvencu nukleotida koja kodira VH region i sekvencu nukleotida koja kodira himerni konstantni CH region od humanog Ig, pri čemu su pomenuta sekvenca nukleotida koja kodira VH region i sekvenca nukleotida koja kodira CH region pomenutog Ig funkcionalno međusobno spojene; pri čemu pomenuti CH region kodira jednu ili više modifikacija u CH3 domenu koji smanjuje ili eliminiše vezivanje drugog CH3 domena na protein A; (c) transfektovanje ćelije domaćina iz koraka (a) sa molekulom nukleinske kiseline koji kodira drugi teški lanac antitela koji može da veže CD20 antigen, pomenuti molekul nukleinske kiseline obuhvata sekvencu nukleotida koja kodira VH region i sekvencu nukleotida koja kodira himerni CH region od humanog Ig, pri čemu su pomenuta sekvenca nukleotida koja kodira VH region i sekvenca nukleotida koja kodira CH region od pomenutog Ig međusobno funkcionalno povezane; i (c) pravljenje pomenutog antitela putem koekspresije molekula nukleinske kiseline iz (a) i (b) u pomenutoj ćeliji domaćinu.
[0095] U jednom primeru, ovaj opis obezbeđuje postupak pravljenja bispecifičnog antitela pomoću: (a) transfektovanja ćelije domaćina sa (i) molekulom nukleinske kiseline koji kodira laki lanac antitela, pri čemu molekul nukleinske kiseline obuhvata sekvencu nukleotida koja kodira LCVR koji obuhvata SEK ID BR:18, i sekvencu nukleotida koja kodira konstantni CL region od nekog Ig, pri čemu pomenuta sekvenca nukleotida koja kodira LCVR region antitela jeste funkcionalno povezana na sekvencu nukleotida koja kodira CL region od Ig; (b) transfektovanje domaćina iz koraka (a) sa (i) molekul nukleinske kiseline koji kodira prvi teški lanac pomenutog antitela, pomenuti molekul nukleinske kiseline obuhvata sekvencu nukleotida koja kodira HCVR koji obuhvata SEK ID BR:10 i sekvencu nukleotida koja kodira himerni CH region od IgG, pri čemu sekvenca nukleotida koja kodira CH region obuhvata sekvencu nukleotida koja kodira SEK ID BR: 26, SEK ID BR: 28, SEK ID BR: 30, ili SEK ID BR: 32, pri čemu je pomenuta sekvenca nukleotida koja kodira HCVR funkcionalno spojena na sekvencu nukleotida koja kodira CH region; i (ii) molekul nukleinske kiseline koji kodira drugi teški lanac pomenutog antitela, pomenuti molekul nukleinske kiseline obuhvata sekvencu nukleotida koja kodira HCVR koji obuhvata SEK ID BR:2 i sekvencu nukleotida koja kodira himerni CH region od IgG, pri čemu sekvenca nukleotida koja kodira CH region obuhvata sekvencu nukleotida koja kodira SEK ID BR: 26, SEK ID BR: 28, SEK ID BR: 30, ili SEK ID BR: 32, pri čemu je pomenuta sekvenca nukleotida koja kodira HCVR funkcionalno spojena na sekvencu nukleotida koja kodira CH region; i (c) pravljenje antitela pomoću koekspresije molekula nukleinske kiseline iz (a) i (b) u pomenutoj ćeliji domaćinu. U nekim slučajevima, postupak još obuhvata korake kultivisanja ćelije domaćina iz koraka (b), u kojoj se antitelo izlučuje u podlogu kulture ćelije; i izolovanje antitela iz podloge kulture ćelije.
[0096] U nekim varijantnim rešenjima, postupak pravljenja bispecifičnog antitela opciono obuhvata transfektovanje ćelije domaćina iz koraka (a) sa molekulom nukleinske kiseline koji kodira drugi laki lanac koji može da veže CD20 antigen, pomenuti molekul nukleinske kiseline obuhvata sekvencu nukleotida koja kodira VL region od drugog lakog lanca i sekvencu nukleotida koja kodira konstantni CL region od Ig, pri čemu su pomenuta sekvenca nukleotida koja kodira VL region drugog lakog lanca i pomenuta sekvenca nukleotida koja kodira CL region od Ig funkcionalno spojene.
[0097] U nekim primerima, prvi teški lanac obuhvata CH3 region koji obuhvata H95R modifikaciju (putem IMGT ekson numeracija; H435R pomoću EU numeracije). U još nekim primerima, prvi teški lanac obuhvata CH3 region koji još obuhvata Y96F modifikaciju (IMGT; Y436F putem EU numeracije). U još nekim primerima, postupak obuhvata izolovanje antitela korišćenjem proteina A.
[0098] U još jednom varijantnom rešenju ovaj opis obezbeđuje bispecifično antitelo koje obuhvata: (a) prvi teški lanac koji obuhvata domen koji vezuje antigen koji je sposoban za prepoznavanje i vezivanje na prvi ciljni antigen, (b) drugi teški lanac obuhvata domen koji vezuje antigen koji je sposoban za prepoznavanje i vezivanje na drugi ciljni antigen, i (c) i zajednički domen koji vezuje antigen lakog lanca koji je sposoban da prepozna i veže na prvi i drugi ciljni antigen, pri čemu teški lanac od (a) ili (b) ili oba, i (a) i (b) obuhvata konstantni region teškog lanca (CH) koji obuhvata himerni region zgloba koji obuhvata sekvencu aminokiseline iz SEK ID BR: 53 ili SEK ID BR: 54.
[0099] U izvesnim primerima, konstantni region teškog lanca (CH) obuhvata sekvencu aminokisleine iz SEK ID BR: 26, SEK ID BR: 28, SEK ID BR: 30, ili SEK ID BR: 32. U nekim primerima, himerna sekvenca nukleotida koji kodira CH obuhvata SEK ID BR: 25, SEK ID BR: 27, SEK ID BR: 29, SEK ID BR: 31, ili SEK ID BR: 33. U drugim primerima, himerna sekvenca nukleotida CH kodira sekvencu aminokiseline iz SEK ID BR: 26, SEK ID BR: 28, SEK ID BR: 30, ili SEK ID BR: 32. U još nekim primerima, sekvenca nukleotida iz CH regiona obuhvata sekvencu nukleotida koja kodira sekvencu aminokiseline iz SEK ID BR: 25, SEK ID BR: 27, SEK ID BR: 29, SEK ID BR: 31 ili SEK ID BR: 33.
[0100] U izvesnim varijantnim rešenjima, bispecifično antitelo obuhvata molekul nukleinske kiseline koji kodira laki lanac koji obuhvata sekvencu aminokiseline od SEK ID BR: 35. U drugim varijantnim rešenjima, bispecifično antitelo obuhvata molekul nukleinske kiseline koja kodira laki lanac koji obuhvata sekvencu nukleotida iz SEK ID BR: 34.
[0101] U izvesnim varijantnim rešenjima, bispecifično antitelo obuhvata molekul nukleinske kiseline koji kodira teški lanac koji obuhvata sekvencu aminokiseline od SEK ID BR: 37. U drugim varijantnim rešenjima, bispecifično antitelo obuhvata molekul nukleinske kiseline koja kodira teški lanac koji obuhvata sekvencu nukleotida od SEK ID BR: 36.
[0102] U izvesnim varijantnim rešenjima, bispecifično antitelo obuhvata molekul nukleinske kiseline koji kodira teški lanac koji obuhvata sekvencu aminokiseline od SEK ID BR: 40. U drugim varijantnim rešenjima, bispecifično antitelo obuhvata molekul nukleinske kiseline koja kodira teški lanac koji obuhvata sekvencu nukleotida od SEK ID BR: 38 ili SEK ID BR: 39.
[0103] U izvesnim varijantnim rešenjima, bispecifično antitelo obuhvata molekul nukleinske kiseline koji kodira teški lanac koji obuhvata sekvencu aminokiseline od SEK ID BR: 42. U drugim varijantnim rešenjima, bispecifično antitelo obuhvata molekul nukleinske kiseline koja kodira teški lanac koji obuhvata sekvencu nukleotida od SEK ID BR: 41.
[0104] U izvesnim varijantnim rešenjima, bispecifično antitelo obuhvata molekul nukleinske kiseline koji kodira teški lanac koji obuhvata sekvencu aminokiseline od SEK ID BR: 44. U drugim varijantnim rešenjima, bispecifično antitelo obuhvata molekul nukleinske kiseline koja kodira teški lanac koji obuhvata sekvencu nukleotida od SEK ID BR: 43.
[0105] Terapijski delotvorna količina bispecifičnog molekula koji vezuje antigen anti-CD3/anti-CD20 kao što je ovde opisano može biti obezbeđena. U srodnom varijantnom rešenju može biti supstanca koja je kombinacija bispecifičnog molekula koji vezuje antigen anti-CDanti-CD3/anti-CD20 i drugi terapijski agens moze biti dobijen . Drugi terapijski agens može da bude bilo koji agens koji je pogodno kombinovan sa bispecifičnim molekulom koji vezuje antigen anti-CD3/anti-CD20. Primeri agenasa koji mogu biti pogodno kombinovani sa bispecifičnim molekulom koji vezuje antigen anti-CD3/anti-CD20 su razmatrani detaljno na drugom mestu.
[0106] U još jednom varijantnom rešenju, ovaj opis obezbeđuje terapijske postupke za ciljanje/ubijanje ćelija tumora koje imaju ekspresiju CD20 upotrebom bispecifičnog molekula koji vezuje antigen anti-CD3/anti-CD20, pri čemu terapijski postupci obuhvataju isporučivanje terapijski delotvorne količine farmaceutske supstance koja obuhvata bispecifični molekul koji vezuje antigen anti-CD3/anti-CD20 iz ovog opisa subjektu kom je potrebno. U nekim slučajevima, taj bispecifični molekul koji vezuje antigen (npr. antitelo) veže humane ćelije koje imaju ekspresiju CD20 ili veže humane B ćelije.
[0107] U još jednom varijantnom rešenju, ovaj opis obezbeđuje bispecifična antitela kod kojih to antitelo: veže humane ćelije kod kojih postoji ekspresija humanog CD3 i ćelije makaki majmuna koje ispoljavaju makaki CD3; veže humane T ćelije ili makaki T ćelije; veže na humane T ćelije koje eksprimuju CD3 sa vrednošću EC50 od između 1x10<-12>M i 1x10<-6>M; veže na humane T ćelije koje imaju ekspresiju CD3 sa vrednošću EC50 od između 1x10<-9>M i 1x10<-8>M; veže na humane B ćelije koje imaju ekspresiju CD20 sa EC50 vrednošću od između 1x10<-12>M i 1x10<-6>M; veže na humane B ćelije koje imaju ekspresiju CD20 sa vrednošću EC50 od između 1x10<-9>M i 1x10<-8>M; ili pospešuje kod humanih B ćelija citotoksičnost posredovanu T ćelijom koje su otporne na ili nezavisan prema citotoksičnosti posredovanoj putem anti-CD20.
[0108] Kod različitih postupaka ili upotreba iz ovog opisa, jedna isporuka bispecifičnog antitela subjektu u dozi od barem oko 0,01 mg/kg prouzrokuje smanjenje u broju B ćelija kod subjekta ispod detektibilnih nivoa za oko 2 dana posle isporuke bispecifičnog antitela tom subjektu. U nekim slučajevima, broj B ćelija ostaje ispod detektibilnih nivoa sve dok barem oko 7 dana posle isporuke pojedinačne doze od barem oko 0,01 mg/kg od bispecifičnog antitela subjektu.
[0109] Ovaj opis obuhvata upotrebu bispecifičnog molekula koji vezuje antigen anti-CD3/anti-CD20 iz opisa za ciljanje/ubijanje ćelija tumora koje imaju ekspresiju CD20, i u proizvodnji leka za lečenje bolesti ili poremećaja srodnih sa ili prouzrokovanih CD20 ekspresijom. U nekim slučajevima, bispecifično antitelo iz ovog opisa se koristi za proizvodnju leka za lečenje ili poboljšanje kancera kod subjekta, pri čemu to bispecifično antitelo obuhvata prvi domen koji vezuje antigen koji vezuje humani CD3, drugi domen koji vezuje antigen koji vezuje humani CD20, i himerni Fc domen privezan na svaki od prvih i drugih domena koji vezuju antigen, i lečenje ili poboljšanje kancera obuhvata: (a) suzbijanje rasta tumora kod subjekta, (b) posredovanje lize B ćelije kod subjekta, (c) lečenje kancera B ćelije kod subjekta, (d) lečenje kancera koji je pozitivan za CD20 ekspresiju kod subjekta, ili (e) lečenje kancera CD20 koji ima ekspresiju melanoma kod tog subjekta.
[0110] Ovaj opis takođe obuhvata bispecifično antitelo koje obuhvata prvi domen koji vezuje antigen, drugi domen koji vezuje antigen, i himerni konstantni region teškog lanca (CH), pri čemu: prvi domen koji vezuje antigen vezuje CD3, drugi domen koji vezuje antigen vezuje CD20, himerni CH region se veže sa višim, tj. jačim, afinitetom na humani FcγRIIA i humani FcγRIIB, u poređenju sa antitelom koje obuhvata CH region divljeg tipa, kao bispecifično antitelo za upotrebu u proizvodnji leka. Ovaj opis obuhvata bispecifično antitelo koje obuhvata prvi domen koji vezuje antigen koji vezuje CD3, drugi domen koji vezuje antigen koji vezuje CD20, i himerni CH region koji se veže sa višim, tj. jačim, afinitetom na humani FcγRIIA nego što veže na humani FcγRIIB, za upotrebu u proizvodnji leka.
[0111] Druga izvođenja će postati očigledno iz pregleda koji obezbeđuje detaljan opis.
KRATAK OPIS SLIKA NACRTA
[ 0112]
Slika 1 prikazuje aminokiseline zgloba korišćene u konstrukciji himernih regiona zgloba i odgovarajuće konvencije za numeraciju aminokiselina.
Slika 2 predstavlja sekvencu aminokiseline iz konstantnog regiona teškog lanca humanog IgG1 uključujući CH1, zglob, CH2 i CH3 domene kako je opisano kao IGHG1 u UniProtKB/SwissProt Accn. br. P01857 (SEK ID BR: 45).
Slika 3 predstavlja sekvencu aminokiseline konstantnog regiona teškog lanca humanog IgG2 uključujući CH1, zglob, CH2 i CH3 domene kao što je opisano kao IGHG2 u UniProtKB/SwissProt Accn. br. P01859 (SEK ID BR: 46).
Slika 4 predstavlja sekvencu aminokiseline konstantnog regiona teškog lanca humanog IgG4 uključujući CH1, zglob, CH2 i CH3 domene kao što je opisana kao IGHG4 u UniProtKB/SwissProt Accn. br. P01861 (SEK ID BR: 47).
Slike 5A i 5B: Krivulja odgovora na dozu prikazuje nedostatak CDC aktivnosti u odnosu na Daudi (SL.5A) i Raji (SL.5B) ćelije u prisustvu antitela koja imaju divlji tip ili himerne CH regione zgloba. ("Kontrola" antitelo 4 = bispecifično Ab sa divljim tipom (wt) IgG1 CH; antitelo 1; antitelo 2; IgG1 izotipna kontrola = nespecifično Ab sa divljim tipom (wt)IgG1 CH.)
Slike 6A i 6B: Krivulje odziva na dozu prikazuju nepostojanje ADCC aktivnosti u odnosu na Daudi (FIG 6A) i Raji (SL.6B) ćelije u prisustvu antitela koja imaju divlji tip ili himerne CH regione zgloba. ("Kontrola" antitelo 4 = bispecifično Ab sa divljim tipom (wt) IgG1 CH; antitelo 1; antitelo 2; IgG1 izotipna kontrola = nespecifično Ab sa wt IgG1 CH.)
Slike 7A-7F pokazuju zapreminu tumora (u mm<3>) tokom vremena kod NSG miševa potkožno implantiranog mešavinom Radži (Raji) ćelija tumora i PBMC (ili bez PBMC kontrole Sl. 7D) pri čemu je CD3xCD20 bilo bispecifično antitelo iz ovog pronalaska (Ab1) ili pomoćno sredstvo ili kontrolno antitelo isporučeno posle implantacije i tretiranja tumora, što je počelo istog dana kada je izvršena i implantacija (dan 0), i izmereno za dužinu studije. Sl.7A: Miševi nisu pokazali inhibiranost rasta tumora kada su tretirani pomoćnim sredstvom; Sl.7B: 1 od 5 (1/5) miševa je pokazalo inhibiranost rasta tumora sa 0,4 mg/kg kontrolna terapija Ab5 (anti-FeID1 Ab); Sl.7C: 5/5 miševa je pokazalo inhibiciju rasta tumora sa terapijom 0,4 mg/kg antitelom 1 (Ab1); Sl.7D: 0/5 miševa je pokazalo inhibiciju rasta tumora pri čemu nije bilo implantacije PBMC i tretirani su sa 0,4 mg/kg Ab1; Sl.7E: 5/5 miševa je pokazalo inhibiciju rasta tumora sa terapijom sa 0,04 mg/kg Ab1; i Sl.7F: 5/5 miševi je pokazalo inhibiciju rasta tumora sa terapijom sa 0,004 mg/kg Ab1.
Slike 8A i 8B pokazuju zapreminu tumora (u mm3) tokom vremena kod NSG miševa implantiranih potkožno sa mešavinom Radži ćelija tumora (Raji) i PBMC, i tretirani sa Ab1 (CD3xCD20-himernimFc) u poređenju sa pomoćnim sredstvom, sa ili bez IgG suplementa (Sl. 8A), ili lečeni sa Ab4 (CD3xCD20-wtFc) u poređenju sa pomoćnim sredstvom, sa ili bez IgG suplementa (Sl. 8B). Oba CD3xCD20 bispecifična antitela pokazuju značajnu potiskivanje rasta tumora sa IgG suplementima na ovom modelu. Kao što se vidi na Sl.8A, CD3xCD20-himernoFc bispecifično antitelo (Ab1) pokazuje potpuno suzbijanje rasta tumora tokom vremenskog perioda testiranog sa ili bez IgG suplementa u ovom eksperimentu.
Slika 9 ilustruje regresiju utvrđenih tumora (-200-400 mm<3>) do 14. dana kod NSG miševa tretiranih sa CD3xCD20 bispecifičnim antitelom. NSG miševima je potkožno implantirana mešavina Radži ćelija tumora i PBMC 15 dana pre lečenja da bi se omogućilo utvrđivanje tumora. Miševi su naknadno tretirani sa 0,4 mg/kg antitelom 1 (CD3xCD20-himerno Fc antitelo), ili 0,4 mg/kg kontrola Ab5 (anti-FeID1 Ab), ili kontrolnim pomoćnim sredstvom jednom nedeljno (7. dana, 14. dana, 21. dana).
Slika 10 ilustruje regresiju utvrđenih tumora (-500-900 mm<3>) do 21. dana kod NSG miševa tretiranih sa CD3xCD20 bispecifičnim antitelom. NSG miševima je potkožno implantirana mešavina Radži ćelija tumora i PBMC 15 dana pre lečenja da bi se omogućilo utvrđivanje tumora. Miševi su tretirani sa 0,4 mg/kg antitelom 1 (CD3xCD20-himerno Fc antitelo), ili 0,4 mg/kg kontrolnim Ab5 (anti-FeID1 Ab) jednom nedeljno (7. dana, 14. dana, 21. dan).
Slike 11A i 11B prikazuju in vivo jačinu isporuke bispecifičnog antitela CD3xCD20 za antitelo 1 i antitelo 4 u poređenju sa isporukom monospecifičnog antitela (rituksimab) merenjem promena u nivoima CD20+ B ćelija ili nivoima CD3+ T ćelija u perifernoj krvi makaki majmuna 7. dana studije. Antitela ili placebo su isporučeni 0. dana. Sl. 11A: nivoi B ćelije u perifernoj krvi su značajno osiromašeni do 2. dana u svim uzorcima izuzev u placebu; Sl.11B: Prelazni gubitak T ćelija je primećen 2. dana i obnovljen do osnovnih nivoa do 4. dana u perifernoj krvi životinja lečenih sa bispecifičnim antitelima. Nije primećen gubitak T ćelija (ispod osnovne linije) u grupama koje su dobijale placebo ili rituksimab (Rituxan).
Slike 12A i 12B prikazuju in vivo jačinu za antitela 1 i antitela 4 CD3xCD20 isporuku bispecifičnog antitela merenjem promena u nivoima CD20+ B ćelija ili nivoima CD3+ T ćelija u perifernoj krvi makaki majmuna u dugoročnoj studiji (3. meseca). Placebo (pomoćno sredstvo) ili bispecifična antitela su isporučeni u količini od 1,0 mg/kg na 0. dan. Sl.12A: nivoi B ćelije u perifernoj krvi su značajno istrošeni do 2. dana i nivoi su preostali osiromašeni tokom trajanja studije kod svih uzoraka izuzev kod placebo grupe; Sl. 12B: Prelazni gubitak T ćelija je primećen 2. dana, zatim su T ćelije oporavljene do osnovnih nivoa do 4. dana, i ostale su oko polazne vrednosti kako je mereno tokom studije (> 80 dana) za životinje lečene sa bispecifičnim antitelima. Nije primećen prelazni gubitak T ćelija kod životinja lečenih placebom.
Slike 13A i 13B prikazuju in vivo jačinu za antitela 1 i antitela 4 CD3xCD20 isporuku bispecifičnog antitela u maloj dozi merenjem promena u nivoima CD20+ B ćelija ili nivoima CD3+ T ćelija u perifernoj krvi makaki majmuna u dugoročnoj studiji (2. meseca). Bispecifična antitela su isporučena kao bilo 0,01 mg/kg ili 0,001 mg/kg (1 µg/kg) 0. dana. Sl.13A: nivoi B ćelije u perifernoj krvi su značajno istrošeni do 2. dana i novi su ostali osiromašeni tokom trajanja studije, slično onome što je primećeno za životinje lečene višim dozama CD3xCD20 bispecifičnih antitela (videti takođe Slike 11A ili 12A); Sl.13B: Životinje su tretirane sa veoma malim dozama (1 µg/kg) bispecifičnih antitela osećaju isti prelazni gubitak T ćelija i oporavak kao što je bio kod životinja tretiranih visokim dozama CD3xCD20 bispecifičnih antitela (videti takođe Slike 11B ili 12B).
Slika 14 pokazuje međusobni odnos gubitka B ćelije sa gubitkom antitela u perifernoj krvi životinja tretiranih sa CD3xCD20-himerinimFc antitelom 1. Kako je izloženost antitelu (otvoreni simboli) u krvotoku životinja osiromašena tokom vremena, populacije B ćelije (puni simboli) počele su da se oporavljaju (npr. kako je primećeno 81. dana za životinju br.106881 (pun krug)).
Slika 15 pokazuje međusobni odnos gubitka B ćelije sa gubitkom antitela u perifernoj krvi životinja tretiranih sa CD3xCD20-himerinimFc antitelom 2. Kako vremenom izloženost antitela (otvoreni simboli) u cirkulaciji životinja osiromaši, populacije B ćelije (puni simboli) počnu da se oporavljaju (npr. kako je primećeno 66. dana za životinju br. 106876 (puni trougao), i 68. dana za životinju br.106877 (puni kvadrat)).
Slika 16 pokazuje međusobni odnos gubitka B ćelije sa gubitkom antitela u perifernoj krvi životinja tretiranih sa (divljim tipom) CD3xCD20-wtFc (Ab 4) bispecifičnog antitela. Kako vremenom izloženost antitela (otvoreni simboli) u cirkulaciji životinja osiromaši, populacije B ćelije (puni simboli) počnu da oporavljaju (npr. kako je primećeno 91 dana za životinju br.106870 (puni trougao), i 64. dana za životinju br.106872 (puni krug)).
Slika 17A i 17B prikazuju osiromašenje tkiva B ćelija u slezini (Sl.17A) ili mezenternim limfnim čvorovima (Sl. 17B) makaki majmuna što nastaje od isporuke CD3xCD20 bispecifičnih antitela u poređenju sa monospecifičnim antitelom anti-CD20, sa mnogo nižim dozama (0,01 do 1,0 mg/kg dozama) isporučenim u bispecifične kohorte. Ovo pražnjenje nije viđeno u bilo kom tkivu životinja u kohorti koje su dobile placebo kontrolno sredstvo. Oba CD3xCD20 bispecifična antitela (Ab1 i Ab 4) su prouzrokovala od doze zavisno osiromašenje B ćelije u limfoidnim organima, i dozama ekvivalentnim ili većim od 0,1 mg/kg, bispecifična antitela osiromašuju B ćelije mnogo delotvornije od rituksimaba.
Slike 18A i 18B prikazuju da CD3xCD20 bispecifična antitela indukuju proliferaciju humanih PBMC ćelija (Sl. 18A) ili PBMC ćelija makaki majmuna (Sl. 18B) u in vitro bioogledu, pri čemu kontrolno antitelo 5 (- - ; nije specifično za CD3xCD20) nije ispoljilo nikakvu aktivnost.
Slike 19A i 19B prikazuju sa CD3xCD20 posredovano ciljano ubijanje Radžijevih ćelija tumora u ogledu citotoksičnosti. Antitelom 1 posredovano ciljano ubijanje ćelije sa reprezentativnim EC50 vrednostima 25,0ρM i 9,10ρM za humane ćelije (Slika 19A) i ćelije makaki majmuna (Slika 19B) T ćelije, prema opisanom redosledu. Antitelom 4 posredovano ciljano ubijanje ćelije sa reprezentativnim EC50 vrednostima 15,7pM i 1,73pM za humane ćelije (Slika 19A) i ćelije makaki majmuna (Slika 19B) T ćelije, prema opisanom redosledu. Nije primećena nikakva aktivnost kontrolnog antitela (- -).
Slike 20A i 20B prikazuju da CD3xCD20 bispecifično antitelo posreduje kod ubijanja ćelija pomoću naivnih T ćelija. Slika 20A pokazuje kao primer dat FACS rasuti dijagram pri najvišoj testiranoj koncentraciji antitela 4. B16F10.9 ćelije divljeg tipa su označene sa CFDA-SE i B16F10.9/CD20 ćelije su označene sa ljubičastim agensom za praćenje ćelijeViolet Cell Tracker. Ćelije efektori nisu označene. Drugi panel sa Sl.
20A pokazuje da se CD20 ekspresija ćeljia eliminiše (donji desni kvadrant) tretiranjem sa anti-CD3xCD20. Slika 20B pokazuje udeo preživljavanja B16F10.9/CD20 ćelija posle 48 sati u prisustvu CD20xCD3 antitela, tj. antitelo 4 (wtFc), antitelo 1(himerno Fc) ili kontrolno Ab 5, i PBMC. Procenat opstanka je utvrđen upoređivanjem procenta B16F10.9/CD20 ćelija prema CD20 negativnim B16F10.9 ćelijama u populaciji živih ćelija. Ab 4 i Ab 1 su specifično usmerili humane T ćelije da bi ubili samo ciljane ćelije koje imaju ekspresiju CD20 (Slika 20B) u mešovitoj populaciji ćelija. Ciljno ubijanje ćelije je primećeno samo u prisustvu bispecifičnih antitela, sa B16F10.9/CD20 ćelijama osiromašenom na dozom uslovljen način antitelom 4 (EC50 12.8ρM) i antitelom 1 (EC50 19.5pM) (Slika 20B). Manje od 5% od ćelija koje imaju CD20 ekspresiju su bile žive u najvišoj testiranoj dozi (10 µg/mL).
Slika 21 pokazuje procenat aktiviranih (CD69+) ćelija od ukupnih CD2+ ćelija efektora u ogledu citotoksičnosti u trajanju od 48 sati ciljanjem B16F10.9/CD20 ćelija, takva aktivacija indukovana bilo CD20xCD3 antitelom, tj. antitelo 4 (wtFc) ili antitelo 1 (himerno Fc).
Slike 22A i 22B prikazuju da je CD3xCD20 bispecifično antitelo indukovalo grupisanje T ćelija sa ciljnim ćelijama (CD20+ćelije) preko njegovih bispecifičnih krakova vezivanja. Ćelije efektori su bojene sa CFSE i CD20+ ćelije su bojene sa ljubičastim agensom za praćenje ćelije Cell Tracker, i usmerene na odvojene kvadrante. Posle inkubacije sa irelevantnim kontrolnim antitelom (Kontrolno antitelo 5), nikakvo grupisanje (dvostruko bojenje) se nije pojavilo u mešavini ćelije (Sl. 22A). Posle inkubacije sa CD3xCD20 bispecifičnim antitelom (Ab 4), grupacije ćelije se pojavljuju jer se boje sa oba agensa i CFSE i ljubičastim Cell Tracker agensom (videti gornji levi kvadrant na prikazu u vidu rasutog dijagrama sa Sl.22B, kako je obojeno podebljanim kvadratom).
Slika 23 pokazuje zapreminu tumora (u mm<3>) studiji kod NSG miševa implantiranih potkožno sa mešavinom Radži (Raji) ćelija tumora i PBMC ćelijama pri čemu CD3xCD20 bispecifično antitelo iz ovog pronalaska (Ab 1) pri 0,4 mg/kg, 2X/nedeljno (i.p), irelevantno antitelo kontrolno Ab 6 pri 0,4 mg/kg, 2X/nedeljno (i.p),, ili pomoćno sredstvo je upoređeno sa rituksimabom, anti-CD20 antitelo u količini od 8 mg/kg, 5X/nedeljno (i.p), i CD19xCD3 BiTE u količini od 0,5 mg/kg, 5X/nedeljno (i.v). (Za CD19xCD3 BiTE, videti Nagorsen D, et al. Pharmacol Ther.2012 Dec;136(3):334-42, 2012.) Tretman je isporučen miševima sa uspostavljenim tumorima (-100-500 mm<3>). Podaci su izraženi kao srednja vrednost (SEM) i podvrgnuti su ANOVA analizi. Ab1, koje je dozirano 2x nedeljno i.p., je bilo uporedivo sa jačinom CD19xCD3 BiTE koje je dozirano 5x/nedeljno i.v. na ovom in vivo modelu.
Slika 24 pokazuje studiju zapremine tumora (u mm<3>) kod NSG miševa implantiranih potkožno sa mešavinom Radži/PBMC, analogno sa Slikom 23, međutim ANOVA analiza je urađena za Ab 1, kontrolno Ab 6, rituksimab i kontrolno pomoćno sredstvo. Ab 1 dozirano 2x nedeljno je bilo superiorno u odnosu na terapiju rituksimabom (doziranu u količini od 8 mg/kg; 5x/nedeljno i.p.) za suzbijanje uspostavljenih Radži (Raji) tumora.
Slike 25A i 25B prikazuju odložen rast tumora kada je terapija pokrenuta istovremeno ili naknadno sa hCD20/B16F10.9 transplantacijom tumora kod humanizovanih miševa tretiranih sa CD3xCD20 bispecifičnim antitelom. Sl.25A: hCD3 miševi su implantirani potkožno sa hCD20-transdukovani B16F10.9 melanoma ćelijama i tretirani istovremeno sa 0,004 mg/kg ili 0,4 mg/kg antitelom 1 (CD3xCD20 himerno Fc antitelo), ili 4 mg/kg kontrolno Ab5 (anti-FeID1 Ab), ili kontrolno pomoćno sredstvo (i.p.2 puta nedeljno). Sl. 25B: hCD3 miševi su implantirani potkožno sa hCD20/B16F10.9 ćelijama melanoma i uspostavljeni tumori su lečeni 10. dana i posle toga sa antitelom 1 (CD3xCD20 himerno Fc antitelo) ili kontrolnim. Miševi su tretirani i.p. dvaput nedeljno sa 0,4 mg/kg ili 4 mg/kg Ab1, ili 0,4 mg/kg kontrolno Ab5 (anti-FeID1 Ab), ili kontrolno pomoćno farmaceutsko sredstvo.
DETALJAN OPIS
[0113] Pre nego što se opiše ovaj pronalazak, treba razumeti da ovaj pronalazak nije ograničen na opisane specifične postupke i eksperimentalne uslove, jer takvi postupci i uslovi mogu da variraju. Takođe, treba razumeti da je ovde korišćena terminologija samo u svrhu opisa određenih izvođenja, i nije predviđena da bude ograničavajuća, jer će obim ovog pronalaska biti ograničen samo pomoću priloženih patentnih zahteva.
[0114] Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni pojmovi korišćeni vode imaju isto značenje kako to obično razume prosečan stručnjak u ovoj oblasti u koju ovaj pronalazak spada. Kako se ovde koristi, pojam "oko," kada se koristi kao referenca na specifičnu navedenu brojčanu vrednost, znači da ta vrednost može da varira od navedene vrednosti za ne više od 1%. Na primer, kako se ovde koristi, izraz "oko 100" obuhvata 99 i 101 i sve vrednosti između (npr.99,1, 99,2, 99,3, 99,4, itd.).
[0115] Iako je postupke i materijale slične ili identične onima koji su opisani ovde moguće koristiti u praksi ili testiranju ovog pronalaska, sada se opisuju preporučeni postupci i materijali.
Definicije
[0116] Izraz "CD3," kako je ovde korišćen, se odnosi na antigen koji je izražen na T ćelijama kao deo multimolekularnog receptora T ćelije (TCR) i koji se sastoji od homodimera ili heterodimera formiranih iz udruživanja dva od četiri lanca receptora: CD3 epsilon, CD3 delta, CD3 zeta, i CD3 gama. Sve reference prema proteinima, polipeptidima i fragmentima proteina ovde su predviđene da se odnose na humanu verziju odgovarajućeg proteina, polipeptida ili fragmenta proteina osim ako nije eksplicitno navedeno kao da potiče od nehumanih vrsta. Dakle, izraz "CD3" znači human CD3 osim ako nije precizirano da potiče od nehumanih vrsta, npr. "mišji CD3," "majmunski CD3," itd.
[0117] Kako je ovde korišćeno, "antitelo koje veže CD3" ili "anti-CD3 antitelo" obuhvata antitela i njihove fragmente koji vezuju antigen koji specifično prepoznaju pojedinačnu CD3 podjedinicu (npr. epsilon, delta, gama ili zeta), kao i antitela i njihove fragmente koji vezuju antigen koji specifično prepoznaju dimerni kompleks dve CD3 podjedinice (npr. gama/epsilon, delta/epsilon, i zeta/zeta CD3 dimere). Antitela i fragmenti ovog pronalaska koji vezuju antigen mogu vezati rastvorljivi CD3 i/ili CD3 ispoljen ili izražen na površini ćelije. Rastvorljiv CD3 obuhvata prirodne CD3 proteine kao i rekombinantne varijante CD3 proteina kao što su, npr. monomerni i dimerni CD3 konstrukti, koji nemaju domen transmembrane ili su na drugi način nepridruženi sa membranom ćelije.
[0118] Kako je ovde korišćen, izraz "CD3 izražen na površini ćelije" znači jedan ili više CD3 protein(a) koji je/su izraženi na površini ćelije in vitro ili in vivo, tako da je barem deo CD3 proteina izložen vanćelijskoj strani membrane te ćelije i dostupan je za deo koji vezuje antigen nekog antitela. "Na površini ćelije izražen CD3" obuhvata CD3 proteine sadržane unutar konteksta funkcionalnog receptora T ćelije u membrani ćelije. Izraz "CD3 izražen na površini ćelije" obuhvata CD3 protein ispoljen kao deo homodimera ili heterodimera na površini ćelije (npr. gama/epsilon, delta/epsilon, i zeta/zeta CD3 dimere). Izraz, "CD3 izražen na površini ćelije" takođe obuhvata CD3 lanac (npr. CD3 epsilon, CD3 delta ili CD3 gamma) koji je izražen sam po sebi, bez drugih CD3 tipova lanca, na površini neke ćelije. "CD3 izražen na površini ćelije" može da obuhvati ili da se sastoji od CD3 proteina izraženog na površini ćelije koja normalno izražava CD3 protein. Alternativno, "na površini ćelije izražen CD3" može obuhvatiti ili sadržati CD3 protein koji je izražen na površini ćelije koja normalno nema ekspresiju humanog CD3 na svojoj površini ali je veštački projektovana da bi ispoljila ekspresiju CD3 na svojoj površini.
[0119] Kako je ovde korišćeno, izraz "antitelo anti-CD3" obuhvata i monovalentna antitela sa pojedinačnom specifičnošću, kao i bispecifična antitela koja obuhvataju prvi krak koji vezuje CD3 i drugi krak koji veže drugi (ciljni) antigen, pri čemu anti-CD3 krak obuhvata bilo koju od HCVR/LCVR ili CDR sekvenci kao što je izneto u Tabeli 1 ili Tabeli 2 ovde. Primeri anti-CD3 bispecifičnih antitela su opisani ovde na drugom mestu. Pojam "molekul koji vezuje antigen" obuhvata antitela i fragmente koji vezuju antigen antitela, uključujući, npr. bispecifična antitela. Primeri anti-CD3 antitela su takođe opisani u US 2007/0280945A1; i u PCT međunarodnoj prijavi br. PCT/US13/60511, podnetoj 19. septembra 2013 i objavljenoj kao WO 2014/047231.
[0120] Pojam "CD20," kako se ovde koristi, se odnosi na humani CD20 protein osim ako nije navedeno da je od nehumanih vrsta (npr. "mišji CD20," "majmunski CD20," itd.). Humani CD20 protein ima sekvencu aminokiseline kao u NCBI referentnoj sekvenci NP_690605.1.
[0121] Kako je ovde korišćen, izraz "anti-CD20 antitelo" obuhvata monovalelntna antitela sa pojedinačnom specifičnošću, kao što je Rituksan (rituksimab), kao što je opisano u US 7,879,984. Primeri anti-CD20 antitela su takođe opisani u US 7,879,984 i u PCT međunarodnoj prijavi br. PCT/US13/60511, podnetoj 19. septembra 2013 i objavljenoj kao WO2014/047231.
[0122] Pojam "antitelo", kako je ovde korišćen, označava bilo koji molekul koji vezuje antigen ili kompleks molekula koji sadrži barem jedan region za određivanje komplementarnosti (CDR) koji se specifično veže na ili reaguje sa nekim specifičnim antigenom (npr. CD3). Pojam "antitelo" obuhvata molekule imunoglobulina koji obuhvataju četiri lanca polipeptida, dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama, kao i njihovi multimeri (npr. IgM). Svaki teški lanac obuhvata promenljivi region teškog lanca (ovde skraćeno kao HCVR ili VH) i konstantni region teškog lanca. Konstantni region teškog lanca obuhvata tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac obuhvata promenljivi region lakog lanca (ovde skraćen kao LCVR ili VL) i konstantni region lakog lanca. Konstantni region lakog lanca obuhvata jedan domen (CL1). Regione promenljivog teškog (VH) i promenljivog lakog (VL) lanca moguće je podeliti u regione hiperpromenljivosti, poznate kao regione određivanja komplementarnosti (CDR), koji su ispreplitani sa regionima koji su očuvaniji (stabilniji), pod naslovom okvirni regioni (FR). Svaki promenljivi teški (VH) i promenljivi laki (VL) se sastoji od tri regiona za određivanje komplementarnosti (CDR) i četiri okvirna regiona (FR), raspoređena od amino-terminusa na karboksi terminus u sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. U različitim realizacijama pronalaksa, FR od anti-CD3 antitela (ili njihov deo koji vezuje antigen) mogu biti identični sa humanim sekvencama klicine linije, ili mogu da budu prirodno ili veštački modifikovani. Konsenzus sekvenca aminokiseline može da bude definisana na osnovu uporedne analize dva ili više CDR.
[0123] Pojam "antitelo", kako se ovde koristi, takođe obuhvata fragmente koji vezuju antigen punih molekula antitela. Pojmovi "deo koji vezuje antigen" nekog antitela, "fragment koji vezuje antigen" nekog antitela, i slični, kao se ovde koriste, obuhvataju bilo prirodno nastao, enzimski dobijen, sintetisan, ili genetski projektovan polipeptid ili glikoprotein koji se specifično veže na antigen da bi se formirao kompleks. Fragmenti koji vezuju antigen mogu da budu izvedeni, npr. iz molekula celog antitela koji koriste bilo koje pogodne standardne tehnike kao što je proteolitska razgradnja ili tehnike rekombinantnog genetskog inženjeringa koje obuhvataju manipulaciju i ekspresiju DNK koja kodira promenljive i opciono konstantne domene antitela. Takva DNK je poznata i/ili je lako dostupna iz, npr. komercijalnih izvora, DNK biblioteka (uključujući, npr. biblioteke antitela prikaza faga), ili ih je moguće sintetisati. Tu DNK je moguće sekvencionirati i manipulisati hemijski ili korišćenjem tehnika molekularne biologije, na primer, da se rasporedi jedan ili više promenljivih i/ili konstantnih domena u pogodnu konfiguraciju, ili da se uvedu kodoni, stvore ostaci cisteina, modifikuju, dodaju ili obrišu aminokiseline, itd.
[0124] Neograničavajući primeri fragmenata koji vezuju antigen su: (i) Fab fragmenti; (ii) F(ab’)2 fragmenti; (iii) Fd fragmenti; (iv) Fv fragmenti; (v) molekuli jednolančanog Fv (scFv); (vi) dAb fragmenti; i (vii) minimalne jedinice prepoznavanja koje obuhvataju ostatke aminokiseline koji oponašaju hiperpromenljivi region antitela (npr., izolovan region određivanja komplementarnosti (CDR) kao što je CDR3 peptid), ili ograničen FR3-CDR3-FR4 peptid. Drugi projektovani molekuli kao što su za domen specifična antitela specifična, antitela pojedinačnog domena, antitela izbrisanog domena, himerna antitela, CDR kalemljena antitela, diatela, triatela, tetratela, minitela, nanotela (npr. monovalentna nanotela, bivalentna nanotela, itd.), mali modularni imunolekovi (SMIP), i promenljivi IgNAR domeni ajkule, su takođe obuhvaćeni izrazom "fragment koji vezuje antigen," kako se ovde koristi.
[0125] Fragment koji vezuje antigen od nekog antitela će uobičajeno obuhvatiti barem jedan promenljiv domen. Promenljivi domen može da bude bilo koje veličine ili sastava aminokiseline i generalno će obuhvatiti barem jedan CDR koji je susedan ili u okviru sa jednom ili više okvirnih sekvenci. Kod fragmenata koji vezuju antigen sa VH domenom povezanim sa VL domenom, VH i VL domeni mogu biti smešteni u odnosu jedan prema drugom u bilo kom pogodnom rasporedu. Na primer, promenljivi region može biti dimerni i sadržati VH-VH, VH-VL ili VL-VL dimere. Alternativno, fragment koji vezuje antigen nekog antitela može obuhvatiti monomerni VH ili VL domen.
[0126] U izvesnim varijantnim rešenjima, fragment koji vezuje antigen nekog antitela može sadržati barem jedan promenljivi domen kovalentno spojen na barem jedan domen konstantnog fragmenta (Fc), ili na drugi način pripojen na Fc domen. Pojam "pripojen na" se odnosi na direktnu vezu preko kovalentne veze, ili linker sekvencu polipeptida, da bi spojio dve komponente kao što je promenljiv domen pripojen na konstantni domen. Dakle, u izvesnim primerima, promenljivi domeni obuhvataju prvi i drugi domen koji vezuje antigen, kao što su oni koji vezuju CD3 i CD20 da bi se formiralo bispecifično antitelo, su svaki direktno povezani (ili pripojeni) preko kovalentne veze ili linker sekvence aminokiseline na, npr. (od N terminusa do C terminusa) pune ili delimične CH1, himerne zglobne, CH2 i CH3 domene. Neograničavajuće, za primer uzete konfiguracije promenljivih i konstantnih domena koje je moguće pronaći unutar fragmenta koji vezuje antigen antitela obuhvataju: (i) VH-CH1-zglob-CH2-CH3; (ii) VH-zglob-CH2-CH3; (iii) VH-CL; (iv) VL-CH1-CH2-CH3; (v) VL-CH2-CH3; i (vi) VL-CL. U bilo kojoj konfiguraciji promenljivih i konstantnih domena, uključujući bilo koju od gore kao primer navedenih konfiguracija, promenljivi i konstantni domeni mogu biti bilo direktno spojeni jedan na drugi ili mogu biti spojeni (pripojeni) punim ili delimičnim himernim zglobom opisanim ovde, ili za pun ili delimični CH1 i himerni zglob. U nekim slučajevima, polipeptidni linker (npr. od 2 do 10 aminokiselina) može da poveže (pripoji) promenljive i Fc domene ili može da obuhvati dodatnu vezu sa punim ili delimičnim himernim zglobom i/ili CH1. Zglobni region može obuhvatiti barem aminokiseline gornjeg i donjeg zgloba što daje kao rezultat fleksibilnu ili polufleksibilnu vezu između susednih promenljivih i/ili konstantnih domena u pojedinačnom molekulu polipeptida. Pored toga, fragment koji vezuje antigen od nekog antitela može obuhvatiti homodimer ili heterodimer (ili drugi multimer) od bilo koje od gore navedenih konfiguracija promenljivog i konstantnog domena u nekovalentnoj vezi jednog sa drugim i/ili sa jednim ili više monomernim VH ili VL domenom (npr. disulfidnom vezom(ama).
[0127] Višestrukospecifični format antitela iz ovog opisa, uključujući ovde opisane kao primer date formate bispecifičnog antitela, obično obuhvataju barem dva promenljiva domena, pri čemu je svaki promenljivi domen sposoban da se specifično veže na odvojeni antigen. Višestrukospecifični formati mogu biti prilagođeni za upotrebu u kontekstu fragmenta koji vezuje antigen nekog antitela upotrebom rutinskih tehnika dostupnih u ovoj oblasti.
[0128] Antitela je moguće modifikovati da bi se dobila smanjena ili eliminisala citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC) ili citotoksičnost posredovana ćelijom zavisna od antitela (ADCC) kako je izmereno in vitro. "Citotoksičnost zavisna od komplementa" (CDC) se odnosi na lizu ćelija sa ekspresijom antigena putem antitela u prisustvu komplementa. "Citotoksičnost posredovana ćelijom zavisna od antitela" (ADCC) se odnosi na reakciju posredovanu ćelijom u kojoj nespecifične citotoksične ćelije sa ekspresijom Fc receptora (FcRs) (npr. ćelije prirodne ubice (NK), neutrofili, i makrofagi) prepoznaju vezano antitelo na ciljnoj ćeliji i time dovode do lize ciljne ćelije. CDC i ADCC mogu biti izmereni upotrebom ogleda koji su dobro poznati i dostupni u ovoj oblasti. (Videti, npr. U.S. Patent Nos. 5,500,362 i 5,821,337, i Clynes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656). Konstantni region teškog lanca (CH) antitela je važan u sposobnosti antitela da fiksira komplement i posreduje citotoksičnost zavisnu od ćelije. Dakle, CH antitela moguće je izabrati na bazi toga da li je, da bi posredovao citotoksičnost, poželjan za to antitelo.
[0129] U izvesnim izvođenjima ovog pronalaska, bispecifična antitela iz ovog pronalaska su humana antitela. Pojam "humano antitelo", kako se ovde koristi, je predviđen da obuhvata antitela koja imaju promenljive i konstantne regione izvedene iz humanih sekvenci imunoglobulina klicine linije. Humana antitela iz ovog pronalaska mogu obuhvatiti ostatke aminokiseline koji nisu kodirani sekvencama imunoglobulina humane klicine linije (npr. mutacije uvedene nasumičnom ili za mesto specifičnom mutagenezom in vitro ili somatskom mutacijom in vivo), na primer u CDR i posebno CDR3. Međutim, pojam "humano antitelo", kako se ovde koristi, nije predviđen da obuhvati antitela u kojima su CDR sekvence izvedene iz klicine linije ili drugih vrsta sisara, kao što je miš, su nakalemljene na humane okvirne sekvence čoveka.
[0130] Antitela iz ovog pronalaska mogu, u nekim izvođenjima, da budu rekombinantna humana antitela. Pojam "rekombinantno humano antitelo", kako se ovde koristi je predviđeno da obuhvati sva humana antitela koja su pripremljena, izražena, stvorena ili izolovana rekombinantnim sredstvima, kao što su antitela izražena upotrebom rekombinantnog vektora ekspresije transfektovanog u ćeliji domaćinu (opisano detaljnije dole u tekstu), antitela su izolovana iz rekombinantne, kombinatorne humane biblioteke antitela (opisano detaljnije dole u tekstu), antitela izolovana iz neke životinje (npr. miša) koji je transgenski za humane gene imunoglobulina (videti npr. Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res.20:6287-6295) ili antitela dobijena, izražena, stvorena ili izolovana bilo kojim drugim sredstvom koje obuhvata splajsovanje humane sekvence gena imunoglobulina na druge DNK sekvence. Takva rekombinantna humana antitela imaju promenljive i konstantne regione izvedene iz humanih sekvenci imunoglobulina klicine linije. U izvesnim izvođenjima, međutim, takva rekombinantna humana antitela su podvrgnuta in vitro mutagenezi (ili, kada se koristi životinja transgenska za humane sekvence Ig, in vivo somatska mutageneza) i saim tim sekvence aminokiseline iz regiona VH i VL rekombinantnih antitela su sekvence koje, iako su izvedene i povezane sa humanim VH i VL sekvencama klicine linije, ne moraju prirodno da postoje unutar humanog repertoara klicine linije antitela in vivo.
[0131] Humana antitela mogu da postoje u dva oblika koji se povezuju sa heterogenošću zgloba. U jednom obliku, molekul imunoglobulina obuhvata stabilni konstrukt četiri lanca od približno 150-160 kDa u kom se dimeri drže zajedno putem međulančane disulfidne veze teškog lanca. U drugom obliku, dimeri koji nisu poveani preko međulančanih disulfidnih veza i molekul od oko 75-80 kDa se formira sastavljen od kovalentno spojenog lakog i teškog lanca (poluantitelo). Ove oblike je previše teško odvojiti, čak i posle afinitetnog prečišćavanja.
[0132] Učestalost pojave drugog oblika u različitim nedirnutim IgG izotipima se javlja, ali bez ograničenja, usled strukturnih razlika povezanih sa izotipom regiona zgloba od tog antitela. Supstitucija pojedinačne aminokiseline u zglobnom regionu humanog IgG4 zgloba može značajno da smanji izgled drugog oblika (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105) do nivoa koji se najčešće primećuju korišćenjem humanog IgG1 zgloba. Antitela mogu imati jednu ili više mutacija u regionu zgloba koje mogu u proizvodnji, na primer, da poboljšaju prinos željenog oblika antitela.
[0133] Antitela mogu da budu izolovana antitela. Kako se ovde koristi, "izolovano antitelo" znači antitelo koje je identifikovano i odvojeno i/ili oporavljeno iz barem jedne komponente svog prirodnog okruženja. Na primer, antitelo koje je odvojeno ili uklonjeno iz barem jedne komponente organizma, ili iz tkiva ili ćelije u kom to antitelo prirodno postoji ili je prirodno proizvedeno, je "izolovano antitelo". Izolovano antitelo takođe obuhvata antitelo in situ unutar rekombinantne ćelije. Izolovana antitela su antitela koja su podvrgnuta barem jednom koraku prečišćavanja ili izolacije. Prema izvesnim izvođenjima, izolovano antitelo može biti pretežno bez drugog ćelijskog materijala i/ili hemikalija.
[0134] Ovde opisani promenljivi regioni anti-CD3 ili anti-CD20 mogu da obuhvate jednu ili više supstitucija aminokiseline, umetaka i/ili brisanje u okvirnim i/ili CDR regionima promenljivih domena teškog i lakog lanca kada se uporedi sa odgovarajućim sekvencama klicine linije iz koje su antitela izvedena. Takve mutacije mogu biti lako ustanovljene upoređivanjem sekvenci aminokiseline opisanih ovde sa sekvencama linije klice koje su dostupne iz, na primer, javno dostupnih baza podataka sekvenci antitela. Antitela, i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, mogu da budu izvedeni iz bilo koje od ovde opisanih sekvenci aminokiseline, pri čemu jedna ili više aminokiselina unutar jednog ili više okvira i/ili CDR regiona se mutira u odgovarajući ostatak sekvence klicine linije iz koje je to antitelo izvedeno, ili na odgovarajućem ostatku druge humane sekvence klicine linije, ili na konzervativnoj supstituciji aminokiseline odgovarajućih ostataka klicine linije (takve promene sekvence se pominju ovde kolektivno kao "mutacije klicine linije"). Prosečan stručnjak u ovoj oblasti, počevši od ovde opisanih sekvenci promenljivog regiona teškog i lakog lanca, može lako da proizvede brojna antitela i fragmente koji vezuju antigen koji obuhvataju jednu ili više pojedinačnih mutacija klicine linije ili njihove kombinacije. U izvesnim primerima, svi od okvirnih i/ili CDR ostataka unutar domena VH i/ili VL mutiraju nazad u ostatke pronađene u originalnoj sekvenci linije klice iz koje je to antitelo izvedeno. U drugim primerima, samo izvesni ostaci mutirani unazad u originalnu sekvencu klicine linije, npr. samo mutirani ostaci pronađeni unutar prvih 8 aminokiselina FR1 ili unutar poslednjih 8 aminokiselina FR4, ili samo mutirani ostaci pronađeni unutar CDR1, CDR2 ili CDR3. U drugim realizacijama, jedan ili više od okvira i/ili CDR ostataka mutiraju u odgovarajuće ostatke različite sekvence linije klice (tj., sekvencu linije klice koja je drugačija od sekvence linije klice iz koje je antitelo originalno izvedeno). Pored toga, ta antitela mogu da obuhvate bilo koju kombinaciju od dve ili više mutacija linije klice unutar okvira i/ili CDR regiona, npr. pri čemu su izvesni pojedinačni ostaci mutirani u odgovarajući ostatak specifične sekvence linije klice pri čemu se zadržavaju izvesni drugi ostaci koji se razlikuju od originalne sekvence linije klice ili se mutiraju odgovarajući ostatak drugačije sekvence linije klice. Pošto se dobiju, antitela, i fragmenti koji vezuju antigen koji obuhvataju jednu ili više mutacija linije klice moguće je lako ispitati za jedno ili više željenih svojstava kao što je, poboljšana specifičnost vezivanja, povećan afinitet vezivanja, poboljšana ili pospešena antagonistička biološka svojstva (kao što može biti slučaj), smanjenu imunogenost, itd. Antitela i fragmenti vezivanja antigena dobijeni na ovaj opšti način su ovde obuhvaćeni opisom.
[0135] Promenljivi regioni anti-CD3 ili anti-CD20 mogu obuhvatiti varijante bilo koje od ovde opisanih sekvenci aminokiseline od HCVR, LCVR, i/ili CDR koje imaju jednu ili više konzervativnih supstitucija. Na primer, anti-CD3 antitela mogu imati sekvence aminokiseline HCVR, LCVR, i/ili CDR sa, npr. 10 ili manje, 8 ili manje, 6 ili manje, 4 ili manje, itd. konzervativnih supstitucija aminokiseline u odnosu na bilo koje od sekvenci aminokisleine HCVR, LCVR, i/ili CDR iznetih u Tabeli 1 ovde.
[0136] Pojam "epitop" se odnosi na antigeni determinant koji je u interakciji sa specifičnim mestom za vezivanje antigena u promenljivom regionu molekula antitela poznatom kao paratop. Pojedinačni antigen može imati više od jednog epitopa. Dakle, različita antitela mogu da se vezuju na različita područja na antigen i mogu imati različita biološka dejstva. Epitopi mogu biti bilo konformacioni ili linearni. Konformacioni epitop je proizveden pomoću prostorno suprotstavljenih aminokiselina iz različitih segmenata linearnog polipeptidnog lanca. Linearni epitop je proizveden putem susednih ostataka aminokiseline u polipeptidnom lancu. U izvesnim okolonostima, epitop može obuhvatiti delove saharida, fosforili grupa, ili sulfonil grupa antigena.
[0137] Pojam "značajna identičnost" ili "značajno identično," kada se odnosi na nukleinsku kiselinu ili njen fragment, označava da, kada se optimalno poravna sa odgovarajućim umecima ili delecijama nukleotida sa drugom nukleinskom kiselinom (ili njenim komplementarnim lancem), postoji identičnost sekvence nukleotida u barem oko 95%, ili poželjnije barem oko 96%, 97%, 98% ili 99% baza nukleotida, mereno poznatim algoritmom identičnosti sekvence kao što je FASTA, BLAST ili Gap, kako je razmatrano dole u tekstu. Molekul nukleinske kiseline koji ima pretežnu identičnost sa referentnim molekulom nukleinske kiseline može, u izvesnim primerima, da kodira polipetid koji ima istu ili pretežno sličnu sekvencu aminokiseline kao što je polipeptid kodiran referentnim molekulom nukleinske kiseline.
[0138] Kada se primenjuje na polipeptide, pojam "pretežna sličnost" ili "pretežno slično " znači da dve sekvence peptida, kada su optimalno poravnate, kao što je putem programa GAP ili BESTFIT korišćenjem težina zadatih praznina, dele barem 95% identičnosti sekvence, i još poželjnije barem 98% ili 99% identičnosti sekvence. Preporučljivo, pozicije ostataka koje nisu identične se razlikuju konzervativnim supstitucijama aminokiseline. "Konzervativna supstitucija aminokiseline" je ona kod koje je ostatak aminokiseline supstituisan drugim ostatkom aminokiseline sa bočnim lancem (R grupa) sa veoma sličnim hemijskim svojstvima (npr. naelektrisanje ili hidrofobnost). Generalno, konzervativna supstitucija aminokiseline neće u znatnoj meri promeniti funkcionalna svojstva nekog proteina. U slučajevima gde se dve ili više sekvenci aminokiseline razlikuju jedna od druge konzervativnim supstitucijama, procentom ili stepenom identičnosti sekvence može biti podešen prema gore da bi se izvršila korekcija zbog konzervativne prirode supstitucije. Načini da se ova podešavanja izvedu su dobro poznati stručnjaku u ovoj oblasti. Videti, npr. Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Primeri grupa aminokiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim svojstvima obuhvataju 1) alifatne bočne lance: glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; 2) alifatne hidroksilne bočne lance: serin i treonin; 3) bočne lance koji sadrže amid: asparagin i glutamin; 4) aromatične bočne lance: fenilalanin, tirozin, i triptofan; 5) bazne bočne lance: lizin, arginin, i histidin; 6) kiselinske bočne lance: aspartat i glutamat, i 7) bočne lance koji obuhvataju sumpor: cistein i metionin. Preporučene konzervativne supstitucione grupe aminokiseline su: valin-leucin-izoleucin, fenilalanin-tirozin, lizin-arginin, alanin-valin, glutamat-aspartat, i asparagin-glutamin. Alternativno, konzervativna zamena je bilo koja promena koja ima pozitivnu vrednost u PAM250 log matrici verovatnoće što su opisali Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445. "Umereno konzervativna" zamena je bilo koja promena koja ima nenegativnu vrednost u PAM250 log matrici verovatnoće.
[0139] Sličnost sekvence za polipeptide, koja se takođe pominje kao identičnost sekvence, se obično meri korišćenjem softvera za analizu sekvence. Softver za analizu proteina odgovara sličnim sekvencama koje koriste merenje sličnosti dodeljeno različitim supstitucijama, brisanjima i drugim modifikacijama, uključujući konzervativne supstitucije aminokiseline. Na primer, GCG softver koji sadrži programe kao što je Gap i Bestfit koje je moguće koristiti sa zadatim parametrima da bi se utvrdila homologija sekvence ili identičnost sekvence između blisko srodnih polipeptida, kao što su homologni polipeptidi iz različitih vrsta ili organizama ili između proteina divljeg tipa njegovog muteina. Videti, npr. GCG Version 6.1. Sekvencu polipeptida je takođe moguće uporediti korišćenjem FASTA sa zadatim ili preporučenim parametrima, programom u GCG verziji 6.1. FASTA (npr. FASTA2 i FASTA3) omogućava poravnanja i procenat identičnosti sekvence regiona koji se najbolje preklapaju između upoređenih i pretraženih sekvenci (Pearson (2000) supra). Još jedan preporučeni algoritam kada se uporedi sekvenca iz ovog pronalaska sa bazom podataka koja obuhvata veliki broj sekvenci iz različitih organizama je računarski program BLAST, posebno BLASTP ili TBLASTN, korišćenjem zadatih parametara. Videti, npr. Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol.215:403-410 and Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res.25:3389-402.
Bispecifični molekuli koji vezuju antigen
[0140] Antitela iz ovog opisa mogu biti bispecifična, ili višestruko specifična. Antitela iz ovog pronalaska su bispecifična antitela. Višestruko specifična antitela mogu biti specifična za različite epitope jednog ciljnog polipeptida ili mogu obuhvatiti domene koji vezuju antigen specifične za više od jednog ciljnog polipeptida. Videti, npr. Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244. Anti-CD3xCD20 antitela moguće je povezati na ili izraziti zajedno sa drugim funkcionalnim molekulom, npr. još jedan peptid ili protein. Na primer, antitelo ili njegov fragment može biti funkcionalno povezano (npr. hemijskim spajanjem, genetskom fuzijom, nekovalentnom vezom ili drugačije) na jedan ili više drugih molekularnih entiteta, kao što je drugo antitelo ili fragment antitela da bi se proizvelo bispecifično ili višestruko specifično antitelo sa dodatnom specifičnošću vezivanja.
[0141] Dakle, ovaj opis obuhvata bispecifična antitela pri čemu jedan krak imunoglobulina veže humani CD3, i drugi krak imunoglobulina je specifičan za ciljni antigen. Ciljni antigen koji drugi krak CD3 bispecifičnog antitela veže može da bude bilo koji antigen izražen na ili u blizini ćelije, tkiva, organa, mikroorganizma ili virusa, protiv kog se želi ciljani odgovor imunog sistgema. Krak koji vezuje CD3 može obuhvatiti bilo koju od sekvenci aminokiseline HCVR/LCVR ili CDR iznetih u Tabeli 1 ovde u tekstu.
[0142] U kontekstu bispecifičnih antitela iz ovog opisa pri čemu jedan krak antitela vezuje CD3 i drugi krak vezuje ciljni antigen, taj ciljni antigen može da bude antigen povezan sa tumorom. Neograničavajući primeri specifičnih antigena povezanih sa tumorom obuhvataju, npr. AFP, ALK, BAGE proteine, BIRC5 (survivin), BIRC7, β-katenin, brc- abl, BRCA1, BORIS, CA9, karbonska anhidraza IX, kaspaza-8, CALR, CCR5, CD19, CD20 (MS4A1), CD22, CD30, CD40, CDK4, CEA, CTLA4, ciklin-B1, CYP1B1, EGFR, EGFRvlll, ErbB2/Her2, ErbB3, ErbB4, ETV6-AML, EpCAM, EphA2, Fra-1, FOLR1, GAGE proteine (npr. GAGE-1, -2), GD2, GD3, GloboH, glipikan-3, GM3, gp100, Her2, HLA/B- raf, HLA/kras, HLA/MAGE-A3, hTERT, LMP2, MAGE proteine (npr. MAGE-1, -2, -3, -4, -6, i -12), MART-1, mezotelin, ML-IAP, Muc1, Muc2, Muc3, Muc4, Muc5, Muc16 (CA-125), MUM1, NA17, NY-BR1, NY-BR62, NY-BR85, NY- ESO1, OX40, p15, p53, PAP, PAX3, PAX5, PCTA-1, PLAC1, PRLR, PRAME, PSMA (FOLH1), RAGE proteine, Ras, RGS5, Rho, SART-1, SART-3, Steap-1, Steap-2, TAG-72, TGF-β, TMPRSS2, Tompson-nouvelle (Tompsonov novi) antigen (Tn), TRP-1, TRP-2, tirozinaza, i uroplakin-3.
[0143] U kontekstu bispecifičnih antitela iz ovog opisa pri čemu jedan krak antitela vezuje CD3 i drugi krak vezuje ciljni antigen, taj ciljni antigen može da bude antigen povezan sa infektivnom bolešću. Neograničavajući primeri antigena povezanih sa infektivnom bolešću obuhvataju, npr. antigen koji je izražen na površini čestice virusa, ili poželjno izražen na ćeliji koja je inficirana virusom, pri čemu se taj virus bira iz grupe koja obuhvata HIV, hepatitis (A, B ili C), herpes virus (npr. HSV-1, HSV-2, CMV, HAV-6, VZV, Epštajn-Barov virus), adenovirus, virus influence, flavivirus, ehovirus, rinovirus, koksaki virus, koronavirus, respiratorni sincicijalni virus, virus zauški, rotavirus, virus morbila, virus rubeola, parvovirus (mačja kuga kod štenadi), virus vakcinije (vaccinia virus), HTLV, denga (dengue) virus, papilomavirus, molluscum virus, poliovirus, virus besnila (rabies), JC virus, i virus arbovirusnog encefalitisa. Alternativno, ciljni antigen može da bude antigen koji je izražen na površini bakterije, ili poželjno izražen na ćeliji koja je inficirana sa bakterijom, pri čemu se ta bakterija bira iz grupe koja obuhvata hlamidiju, rikeciju, mikobakteriju, stafilokoke, streptokoke, pneumonokoke, meningokoke, gonokoke, klebsielu (bakterija u urinu), proteus, seraciju (enterobakterija karakteristična za bolničke infekcije), pseudomonas, legionela, difterija, salmonela, bacili, holera, tetanus, botulizam, antraks, kuga, leptospira, i bakterija lajmske bolesti. Ciljni antigen može da bude antigen koji je izražen na površini fungusa, ili poželjno izražen na ćeliji koja je inficirana fungusom, pri čemu se fungus bira iz grupe koju čini kandida (Candida) (albicans, krusei, glabrata, tropicalis, itd.), Crytococcus neoformans, Aspergillus (fumigatus, niger, itd.), Mucorales (mucor, absidia, rhizopus, itd.), Sporothrix schenkii, Blastomyces dermatitidis (gljivična infekcija blastomikoza), Paracoccidioides brasiliensis (brazilska parakokcidioidomikoza), Coccidioides immitis (oboljenje bifazne gljivice kokcidiodoza), i Histoplasma capsulatum (oboljenje koje izaziva endemska gljivica histoplazmoza). Ciljni antigen može da bude antigen sa ekspresijom na površini parazita, ili poželjno sa ekspresijom na ćeliji koja je inficirana parazitom, pri čemu je taj parazit izabran iz grupe koja obuhvata Entamoeba histolytica (dizenteričnu amebu), Balantidium coli (protozoalni parazit u debelom crevu čoveka), Naegleriafowleri (protozoe u bazenskoj vodi), Acanthamoeba sp., Giardia lambia (parazit u tankom crevu koji izaziva dijareu, bol u abdomenu, gubitak težine a ređe izaziva povraćanje), Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei (parazit bruceloze uzročnik bolesti spavanja kod kičmenjaka), Trypanosoma cruzi (parazit Šagasove bolesti, sličan brucelozi), Leishmania donovani (parazit ljudske krvi uzročnik lišmenijaze), Toxoplasma gondii (parazit uzročnik toksoplazmoze), Nippostrongylus brasiliensis (valjkasti crvi), Taenia crassiceps (parazit pantljičare), i Brugia malayi (valjkasti crv uzročnik elefantijaze). Neograničavajući primeri specifičnih sa patogenom povezanih antigena obuhvataju, npr. HIV gp120, HIV CD4, hepatitis B glukoprotein L, hepatitis B glukoprotein M, hepatitis B glukoprotein S, hepatitis C E1, hepatitis C E2, protein specifičan za hepatocite, herpes simpleks virus gB, citomegalovirus gB, i protein omota ljudskog T-ćelijskog leukemijskog i limfomnog i virusa (protein omota HTLV).
[0144] Prema izvesnim primerima datim samo kao primer , ovaj opis obuhvata bispecifične molekule koji vezuju antigen koji specifično vezuju CD3 i CD20. Takvi molekuli mogu da se ovde pominju kao, npr. "anti-CD3/anti-CD20," ili "anti- CD3/CD20," ili "anti-CD3xCD20" ili "CD3xCD20" bispecifični moleculi, ili druga slična terminologija.
[0145] Kako je ovde korišćen, izraz "molekul koji vezuje antigen" znači protein, polipeptid ili molekularni kompleks koji obuhvata ili se sastoji od barem jednog regiona određivanja komplementarnosti (CDR) koji se sam, ili u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih regiona određivanja komplementarnosti (CDR) i/ili okvirnih regiona (FR), specifično vezuje na specifičan antigen. Molekul koji vezuje antigen može da bude anitelo ili neki fragment antitela, kako su ti termini ovde definisani na drugom mestu.
[0146] Kako je ovde korišćeno, izraz "bispecifični molekul koji vezuje antigen" znači protein, polipeptid ili molekularni kompleks koji obuhvata barem prvi domen koji vezuje antigen i drugi domen koji vezuje antigen. Svaki domen koji vezuje antigen unutar bispecifičnog molekula koji vezuje antigen obuhvata barem jedan sam region određivanja komplementarnosti (CDR), ili se u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih regiona određivanja komplementarnosti (CDR) i/ili okvirnih regiona (FR), specifično vezuje na specifičan antigen. U kontekstu ovog opisa, prvi domen koji vezuje antigen specifično vezuje prvi antigen (npr. CD3), i drugi domen koji vezuje antigen specifično vezuje drugi, distinktivni antigen (npr. CD20).
[0147] U izvesnim samo kao primer datim primerima iz ovog opisa, bispecifični molekul koji vezuje antigen jeste bispecifično antitelo. Svaki domen koji vezuje antigen nekog bispecifičnog antitela obuhvata promenljivi domen teškog lanca (HCVR) i promenljivi domen lakog lanca (LCVR). U kontekstu bispecifičnog molekula koji vezuje antigen obuhvata prvi i drugi domen koji vezuje antigen (npr. bispecifično antitelo), ti regioni određivanja komplementarnosti (CDR) prvog domena koji vezuje antigen mogu biti označeni sa prefiksom "A1" i regioni određivanja komplementarnosti (CDR) drugog domena koji vezuje antigen mogu biti označeni sa prefiksom "A2". Dakle, regioni određivanja komplementarnosti (CDR) prvog domena koji vezuje antigen mogu da se pominju ovde kao A1-HCDR1, A1-HCDR2, i A1-HCDR3; i regioni određivanja komplementarnosti (CDR) drugog domena koji vezuje antigen mogu ovde da se pominju kao A2-HCDR1, A2-HCDR2, i A2-HCDR3.
[0148] Prvi domen koji vezuje antigen i drugi domen koji vezuje antigen mogu biti direktno ili indirektno povezani jedan na drugi da bi se formirao bispecifični molekul koji vezuje antigen (tj. bispecifični ScFv) koji se dalje vezuje na Fc domen. Alternativno, prvi domen koji vezuje antigen i drugi domen koji vezuje antigen mogu svaki da budu spojeni na odvojeni Fc domen. Bispecifični molekuli koji vezuju antigen će obično da obuhvate dva Fc domena koji su svaki pojedinačno deo odvojenog teškog lanca antitela. Prvi i drugi Fc domeni mogu da budu od iste sekvence, izuzev što imaju mutaciju na CH3 domenu predviđenom da pojednostavi ili olakša prečišćavanje heterodimernih (t.j. bispecifičnih) molekula.
[0149] Bispecifični molekuli koji vezuju antigen mogu da obuhvate prvi CH3 domen i drugi Ig CH3 domen, pri čemu se prvi i drugi Ig CH3 domeni razlikuju jedan od drugog u barem jednoj aminokiselini, i pri čemu razlika barem jedne aminokiseline smanjuje vezivanje bispecifičnog antitela na Protein A u poređenju sa bi-specifičnim antitelom koje nema tu razliku aminokiseline. Prvi Ig CH3 domen može da veže Protein A i drugi Ig CH3 domen može da sadrži mutaciju koja smanjuje ili poništava vezivanje Proteina A kao što je H435R modifikacija (prema EU numeraciji; H95R prema IMGT ekson numeraciji). Drugi CH3 može još da obuhvati Y436F modifikaciju (prema EU numeraciji; Y96F prema IMGT). Dalje modifikacije koje je moguće naći unutar drugog CH3 obuhvataju: D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, i V422I prema EU (D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, i V82I prema IMGT) u slučaju IgG1 CH3 domena; i Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, i V422I prema EU (Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, i V82I prema IMGT) u slučaju IgG4 CH3 domena.
[0150] Druge formate ili tehnologije bispecifičnog antitela moguće je koristiti da bi se napravili bispecifični molekuli koji vezuju antigen. Na primer, antitelo ili njegov fragment koji ima prvu specifičnost vezivanja antigena može da bude funkcionalno povezano (npr. hemijskim spajanjem, genetskom fuzijom, nekovalentnom vezom ili na drugi način) na jedan ili više drugih molekularnih entiteta, kao što je drugo antitelo ili fragment antitela koji ima drugu specifičnost vezivanja antigena da bi se proizveo bispecifični molekul koji vezuje antigen. Specifični primeri bispecifičnih formata koje je moguće koristiti obuhvataju, bez ograničenja, npr. na scFv bazirane formate ili formate bispecifične u formatu diatela, IgG-scFv fuzije, dvostruki promenljivi domen (DVD)-Ig, Kvadroma (Quadroma) tehnologiju, struktura proteinskog savijanja tzv. knobs-into-holes, zajednički laki lanac (npr., zajednički laki lanac sa strukturom proteinskog savijanja, itd.), CrossMab, CrossFab, (SEED)telo ((SEED)body), leucinski patentni zatvarač, duotelo (Duobody), IgG1/IgG2, Fab (DAF)-IgG dvostrukog dejstva, i Mab2 bispecifične formate (videti, npr. Klein et al.2012, mAbs 4:6, 1-11, i ovde citirane reference, za pregled gore pomenutih formata).
[0151] U kontekstu bispecifičnih molekula koji vezuju antigen, Fc domeni mogu da obuhvate jednu ili više promena aminokiselina (npr. umetaka, brisanja ili supstitucija) u poređenju sa specifičnom himernom verzijom Fc domena, bez promene željene funkcionalnosti. Na primer, bispecifični molekuli koji vezuju antigen mogu da obuhvate jednu ili više modifikacija u Fc domenu što kao rezultat daje modifikovan Fc domen koji ima modifikovanu interakciju vezivanja (npr. pospešenu ili prigušenu) između Fc i FcRn. Bispecifični molekul koji vezuje antigen može da obuhvati modifikaciju u CH2 ili CH3 region, pri čemu ta modifikacija povećava afinitet Fc domena na FcRn u kiselom okruženju (npr. u endozomu gde pH varira od oko 5,5 do oko 6,0). Neograničavajući primeri takvih Fc modifikacija obuhvataju, npr. modifikaciju na poziciji 250 (npr. E ili Q); 250 i 428 (npr. L ili F); 252 (npr. L/Y/F/W ili T), 254 (npr. S ili T), i 256 (npr. S/R/Q/E/D ili T); ili modifikaciju na poziciji 428 i/ili 433 (npr. L/R/S/P/Q ili K) i/ili 434 (npr. H/F ili Y); ili modifikaciju na poziciji 250 i/ili 428; ili modifikaciju na poziciji 307 ili 308 (npr. 308F, V308F), i 434. Ta modifikacija može da obuhvati 428L (npr. M428L) i 434S (npr. N434S) modifikaciju; 428L, 259I (npr. V259I), i 308F (npr. V308F) modifikaciju; 433K (npr. H433K) i 434 (npr. 434Y) modifikacija; 252, 254, i 256 (npr. 252Y, 254T, i 256E) modifikaciju; 250Q i 428L modifikacija (npr. T250Q i M428L); i 307 i/ili 308 modifikacija (npr. 308F ili 308P).
Varijante sekvence
[0151] Antitela i bispecifični molekuli koji vezuju antigen mogu obuhvatiti jednu ili više supstitucija aminokiseline, umetaka i/ili delecija u okviru i/ili CDR regionima promenljivih domena teškog i lakog lanca u poređenju sa odgovarajućim sekvencama klicine linije iz kojih su izvedeni pojedinačni domeni koji vezuju antigen. Takve mutacije mogu biti lako biti ustanovljene upoređivanjem sekvenci aminokiseline opisanih ovde sa sekvencama linije klice koje su dostupne iz, na primer, javno dostupnih baza podataka sekvenci antitela. Molekuli koji vezuju antigen, mogu da obuhvate domene koji vezuju antigen koji su izvedeni iz bilo koje od ovde kao primer opisanih sekvenci aminokiseline, pri čemu jedna ili više aminokiselina unutar jednog ili više okvira i/ili CDR regiona mutira u odgovarajući ostatak sekvence klicine linije iz koje je to antitelo izvedeno, ili na odgovarajućem ostatku druge humane sekvence klicine linije, ili na konzervativnoj supstituciji aminokiseline odgovarajućih ostataka klicine linije (takve promene sekvence se pominju ovde kolektivno kao "mutacije klicine linije"). Prosečan stručnjak u ovoj oblasti, počevši od ovde opisanih sekvenci promenljivog regiona teškog i lakog lanca, može lako da proizvede brojna antitela i fragmente koji vezuju antigen koji obuhvataju jednu ili više pojedinačnih mutacija klicine linije ili njihove kombinacije. U izvesnim primerima, svi od okvirnih i/ili CDR ostataka unutar domena VH i/ili VL mutiraju nazad u ostatke pronađene u originalnoj sekvenci linije klice iz koje je originalno izveden taj domen koji vezuje antigen. U drugim primerima, samo izvesni ostaci mutirano unazad u originalnu sekvencu klicine linije, npr. samo mutirani ostaci pronađeni unutar prvih 8 aminokiselina FR1 ili unutar poslednjih 8 aminokiselina FR4, ili samo mutirani ostaci pronađeni unutar CDR1, CDR2 ili CDR3. U drugim primerima, jedan ili više od okvira i/ili CDR ostataka mutiraj u odgovarajuće ostatke različite sekvence linije klice (tj., sekvencu linije klice koja je drugačija od sekvence linije klice iz koje je domen koji je originalno izveden). Pored toga, ti domeni koji vezuju antigen mogu da obuhvate bilo koju kombinaciju od dve ili više mutacija linije klice unutar okvira i/ili CDR regiona, npr. pri čemu su izvesni pojedinačni ostaci mutirani u odgovarajući ostatak specifične sekvence linije klice pri čemu se zadržavaju izvesni drugi ostaci koji se razlikuju od originalne sekvence linije klice ili se mutiraju odgovarajući ostatak drugačije sekvence linije klice. Pošto se dobiju, domene koji vezuju antigen koji obuhvataju jednu ili više mutacija linije klice moguće je lako ispitati za jedno ili više željeno svojstvo kao što je, poboljšana specifičnost vezivanja, povećan afinitet vezivanja, poboljšana ili pospešena antagonistička biološka svojstva (kao što može biti slučaj), smanjenu imunogenost, itd. Ovde su obuhvaćeni bispecifični molekuli koji vezuju antigen obuhvataju jedan ili više domena koji vezuju antigen dobijenih na ovaj opšti način.
[0153] Molekule koji vezuju antigen moguće je dobiti pri čemu jedan ili oba domena koji vezuju antigen obuhvataju varijante bilo koje od ovde opisanih sekvenci aminokiseline od HCVR, LCVR, i/ili CDR koje imaju jednu ili više konzervativnih supstitucija. Na primer, molekuli koji vezuju antigen mogu obuhvatiti domen koji vezuje antigen koji ima sekvence aminokiseline HCVR, LCVR, i/ili CDR sa, npr. 10 ili manje, 8 ili manje, 6 ili manje, 4 ili manje, itd. konzervativnih supstitucija aminokiseline u odnosu na bilo koju od ovde opisanih sekvenci aminokiseline HCVR, LCVR, i/ili CDR. "Konzervativna supstitucija aminokiseline" je ona kod koje je ostatak aminokiseline supstituisan drugim ostatkom aminokiseline sa bočnim lancem (R grupa) sa veoma sličnim hemijskim svojstvima (npr. naelektrisanje ili hidrofobnost). Generalno, konzervativna supstitucija aminokiseline neće u znatnoj meri promeniti funkcionalna svojstva nekog proteina. Primeri grupa aminokiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim svojstvima obuhvataju 1) alifatne bočne lance: glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; 2) alifatne hidroksilne bočne lance: serin i treonin; 3) bočne lance koji sadrže amid: asparagin i glutamin; 4) aromatične bočne lance: fenilalanin, tirozin, i triptofan; 5) bazne bočne lance: lizin, arginin, i histidin; 6) kiselinske bočne lance: aspartat i glutamat, i 7) bočne lance koji obuhvataju sumpor: cistein i metionin. Preporučene konzervativne supstitucione grupe aminokiseline su: valinleucin-izoleucin, fenilalanin-tirozin, lizin-arginin, alanin-valin, glutamat-aspartat, i asparagin-glutamin. Alternativno, konzervativna zamena je bilo koja promena koja ima pozitivnu vrednost u PAM250 log matrici verovatnoće što su opisali Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445. "Umereno konzervativna" zamena je bilo koja promena koja ima nenegativnu vrednost u PAM250 log matrici verovatnoće.
[0154] Sličnost sekvence za polipeptide, koja se takođe pominje kao identičnost sekvence, obično se meri korišćenjem softvera za analizu sekvence. Softver za analizu proteina odgovara sličnim sekvencama koje koriste merenje sličnosti dodeljeno različitim supstitucijama, brisanjima i drugim modifikacijama, uključujući konzervativne supstitucije aminokiseline. Na primer, GCG softver koji sadrži programe kao što je Gap i Bestfit koje je moguće koristiti sa zadatim parametrima da bi se utvrdila homologija sekvence ili identičnost sekvence između blisko srodnih polipeptida, kao što su homologni polipeptidi iz različitih vrsta ili organizama ili između proteina divljeg tipa njegovog muteina. Videti, npr. GCG Version 6.1. Sekvencu polipeptida je takođe moguće uporediti korišćenjem FASTA sa zadatim ili preporučenim parametrima, programom u GCG verziji 6.1. FASTA (npr. FASTA2 i FASTA3) omogućava poravnanja i procenat identičnosti sekvence regiona koji se najbolje preklapaju između upoređenih i pretraženih sekvenci (Pearson (2000) supra). Još jedan preporučeni algoritam kada se uporedi sekvenca iz ovog pronalaska sa bazom podataka koja obuhvata veliki broj sekvenci iz različitih organizama je računarski program BLAST, posebno BLASTP ili TBLASTN, korišćenjem zadatih parametara. Videti, npr. Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol.215:403-410 and Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res.25:3389-402.
Vezivanje zavisno od pH
[0155] Bispecifična antitela anti-CD3/anti-CD20 mogu imati karakteristike vezivanja zavisne od pH. Na primer, antitelo anti-CD3 može da ispolji smanjeno vezivanje na CD3 pri pH vrednosti kiseline u poređenju sa neutralnom pH vrednošću. Alternativno, antitelo anti-CD3 može da ispolji smanjeno vezivanje na CD3 pri pH vrednosti kiseline u poređenju sa neutralnom pH vrednošću. Izraz "pH vrednost kiseline" obuhvata pH vrednosti manju od oko 6.2, npr., oko 6.0, 5.95, 5.9, 5.85, 5.8, 5.75, 5.7, 5.65, 5.6, 5.55, 5.5, 5.45, 5.4, 5.35, 5.3, 5.25, 5.2, 5.15, 5.1, 5.05, 5.0, ili manje. Kako je ovde korišćeno, izraz "neutralna pH vrednost" znači pH vrednost od oko 7.0 do oko 7.4. Izraz "neutralna pH vrednost" obuhvata pH vrednosti od oko 7.0, 7.05, 7.1, 7.15, 7.2, 7.25, 7.3, 7.35, i 7.4.
[0156] U izvesnim primerima, "smanjeno vezivanje ... pri pH vrednosti kiseline u poređenju sa neutralnom pH vrednošću" je izraženo u smislu odnosa KD vrednosti vezivanja antitela na njegov antigen pri pH vrednosti kiseline na KD vrednost vezivanja antitela na njegov antigen pri neutralnoj pH vrednosti (ili vice versa). Na primer, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen može da se posmatra kako ispoljava "smanjeno vezivanje na CD3 na pH vrednosti kiseline u poređenju sa neutralnom pH vrednošću" ako to antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen ispoljava kiselinski/neutralni KD odnos od oko 3,0 ili veći. U izvesnim primerima datim samo kao primer, kiselinski/neutralni KD odnos za antitelo ili fragment koji vezuje antigen može da bude oko 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, 11,0, 11,5, 12,0, 12,5, 13.0, 13.5, 14,0, 14,5, 15,0, 20,0.25,0, 30,0, 40,0, 50,0, 60,0, 70,0, 100,0 ili veći.
[0157] Antitela sa karakteristikama vezivanja zavisnim od pH vrednosti moguće je dobiti, npr. analiziranjem populacije antitela za smanjeno (ili pospešeno) vezivanje na specifični antigen pri pH vrednosti kiseline u poređenju sa neutralnom pH vrednošću. Dodatno, modifikacije domena koji vezuje antigen na nivou aminokiseline mogu dati kao prinos antitela sa karakteristikama zavisnim od pH. Na primer, supstituisanjem jedne ili više aminokiselina domena koji vezuje antigen (npr. unutar CDR) sa ostatkom histidina, moguće je dobiti antitelo sa smanjenim vezivanjem antigena pri pH vrednosti kiseline u odnosu na neutralnu pH vrednost.
Vezivanje Fc receptora
[0158] Dobijaju se bispecifični molekuli koji vezuju antigen i antitela anti-CD3/anti-CD20, iz ovog opisa, koji obuhvataju himerni Fc domen, kao što je konstantni domen zgloba CH2-CH3 od teškog lanca Ig, izveden iz različtih izotipa IgG i koji imaju jedinstvene karakteristike u pogledu vezivanja i aktivacije Fc receptora. Izvesni Fc domeni iz ovog opisa se projektuju da obuhvate himerni zglob. Kod bispecifičnog antitela iz ovog pronalaska, bispecifično antitelo obuhvata himerni konstantni region teškog lanca pripojen na svaki od prvog i drugog domena koji vezuje antigen, pri čemu taj himerni konstantni region teškog lanca obuhvata:
<(i)>sekvence aminokiseline gornjeg zgloba humanog IgG1 ili humanog IgG4 od pozicije 216 do 227 (EU numeracija);
<(ii)>humanu IgG2 sekvencu aminokiseline donjeg zgloba koja obuhvata PCPAPPVA (SEK ID BR: 52) od pozicija 228 do 236 (EU numeracija);
<(iii)>CH1 domen humanog IgG1 i CH3 domen humanog IgG1, ili CH1 domen humanog IgG4 i CH3 domen humanog IgG4; i
<(iv)>sekvencu aminokiseline CH2 domena humanog IgG4 od pozicija 237 do 340 (EU numeracija).
[0159] Pojam "himerni", kako je ovde korišćen, znači sastavljen od delova različitog porekla. Fraza "himerni protein" obuhvata prvi protein aminokiseline povezan na drugi protein aminokiseline koji nije normalno povezan u prirodi. Sekvence aminokiseline mogu normalno da postoje kao odvojeni proteini ili u različitom rasporedu na istom proteinu, i dovode se zajedno u polipeptid fuzije u novom rasporedu. Himerni proteini mogu da budu stvoreni različitim postupcima poznatim u ovoj oblasti, npr. hemijskom sintezom ili stvaranjem polinukleotida koji kodira aminokiseline iz himernog proteina u željenom rasporedu. Primeri himernih proteina obuhvataju himerne sekvence zgloba koje povezuju domene teškog lanca IgG, i proteine fuzije projektovane da se naprave humana antitela i proteini koji vezuju antigen.
[0160] Ovde opisani himerni proteini su projektovani da svedu na minimum stvaranje imunogenih epitopa u čvorištima, npr. upoređeno sa Fc regionom ili domenom IgG divljeg tipa. Projektovani proteini samim tim imaju smanjenu imunogenost, i prikazuju smanjeno vezivanje na Fc receptore, kao i smanjene ili nikakve funkcije efektora.
[0161] Pojam "zglob", kako je ovde korišćeno, je predviđen da obuhvati region uzastopnih ostataka aminokiseline koji spaja C terminus od CH1 na N terminus od CH2 domena imunoglobulina. Nekoliko aminokiselina iz N terminusa od CH2 domena, koji su kodirani putem CH2 eksona, se takođe smatraju delom "donjeg zgloba". Bez ograničavanja na bilo koju teoriju, aminokiseline regiona zgloba od IgG1, IgG2 i IgG4 su karakterisane tako da obuhvataju 12-15 uzastopnih aminokiselina kodiranih distinktivnim eksonom zgloba, i nekoliko aminokiselina N terminala od CH2 domena (kodiranog putem CH2 eksona) (Brekke, O.H., et al. Immunology Today 16(2):85-90 (1995)). Sa druge strane, IgG3 obuhvata region zgloba koji se sastoji od četiri segmenta: jedan gornji segment koji liči na region zgloba od IgG1, i 3 segmenta koji su identična ponavljanja aminokiseline jedinstvene za IgG3.
[0162] Pojam "himerni zglob", kako je ovde korišćeno, je predviđen da obuhvati himerni protein koji obuhvata prvu sekvencu aminokiseline izvedenu iz regiona zgloba od jednog molekula Ig i drugu sekvencu aminokiseline izvedenu iz regiona zgloba različite klase ili podklase Ig molekula. Primeri himernih zglobova obuhvataju prvu sekvencu aminokiseline, ili sekvencu "gornjeg zgloba", izvedenu iz regiona zgloba humanog IgG1 ili regiona zgloba humanog IgG4, i drugu sekvencu aminokiseline, ili sekvencu "donjeg zgloba", izvedenu iz regiona zgloba humanog IgG2. Prva ili sekvenca "gornjeg zgloba" može obuhvatiti ostatke aminokiseline od pozicija 216 do 227 prema EU numeraciji. Druga ili sekvenca "donjeg zgloba" može obuhvatiti ostatke aminokiseline od pozicija 228 do 236 prema EU numeraciji. Kod bispecifičnog antitela iz ovog pronalaska, bispecifično antitelo obuhvata humani IgG1 ili sekvencu aminokiseline gornjeg zgloba humanog IgG4 od pozicija 216 do 227 (EU numeracija) i sekvencu aminokiseline donjeg zgloba humanog IgG2 koja obuhvata PCPAPPVA (SEK ID BR: 52) iz pozicija 228 do 236 (EU numeracija).
[0163] Za potrebe ovog opisa, region "gornjeg zgloba" je predviđen da obuhvata ostatke aminokiseline od pozicija 216 do 227 prema EU numeraciji (ostaci aminokiseline od pozicija 226 do 240 prema Kabat numeraciji) (videti Sliku 1). Region "donjeg zgloba" je predviđen da obuhvati ostatke aminokiseline od pozicija 228 do 236 prema EU numeraciji (ostaci aminokiseline od pozicija 241 do 249 prema Kabat numeraciji) (videti Sliku 1).
[0164] U ovom opisu radi praktičnosti upotrebe pronalaska u praksi od strane stručnjaka, aminokiseline regiona zgloba za humane IgG1, IgG2 i IgG4 ovde su identifikovane sistemom EU numeracije za Kabat (Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological interest. 5th ed. US Department of Health and Human Services, NIH publication No.91-3242 (1991)), takođe poznatom kao "EU numeracija" ili "EU indeks", kako je ažurirano prema IMGT® naučnom grafikonu, IMGT®, međunarodnom informacionom sistemu ImMunoGeneTics information system®, http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html, stvorenom: 17. maja 2001, poslednji put ažuriranom: 10 Jan 2013.
[0165] Podudarnost između EU numeracije za humane IgG1, IgG2 i IgG4 aminokiseline zgloba i konvencija IMGT jedinstvene numeracije domena, IMGT numeracije eksona, i Kabat numeracije (videti takođe Kabat, E.A. et al., 1991, supra) su opisane u Tabelama A do F kao u nastavku:
Tabela A: IgG1 numeracija zgloba
Tabela B: numeracija zgloba C domena IgG1
Tabela C: IgG2 numeracija zgloba
Tabela D: numeracija zgloba C domena IgG2
Tabela E: IgG4 numeracija zgloba
Tabela F<:>numeracija zgoba C domena IgG4
[0166] Pojam "vezivanje" u kontekstu vezivanja antitela, Ig, fragment koji vezuje antitelo, ili Fc koji sadrži protein na bilo, npr. unapred određenom antigenu ili FcγR, se obično odnosi na interakciju ili udruživanje između najmanje dva entiteta, ili molekularne strukture, kao što je interakcija antitelo antigen, ili Fc koji sadrži protein na FcγR.
[0167] Na primer, afinitet vezivanja obično odgovara KD vrednosti od oko 10<-7>M ili manje, kao što je oko 10<-8>M ili manje, kao što je oko 10<-9>M ili manje kada je određen putem, na primer, tehnologije rezonance površinskog plazmona (SPR) u BIAcore 3000 instrumentu sa jezgrom upotrebom antigena ili FcR kao što je ligand i antitelo, Ig, fragment koji veže antitelo, ili Fc koji sadrži protein kao analit (ili antiligand). S tim u skladu, antitelo ili drugi protein vezivanja se vezuje na unapred određen antigen ili receptor sa afinitetom koji odgovara KD vrednosti koja je barem desetostruko niža, kao što je barem 100-struko niža, na primer barem 1.000-struko niža, kao što je barem 10.000- struko niža, na primer barem 100.000 puta niža nego što je afintiet za vezivanje na nespecifični antigen (npr. BSA, kazein).
[0168] Pojam "KD" (M), kako je ovde korišćen, se odnosi na konstantu ravnoteže razdruživanja specifične interakcije antitelo - antigen, ili konstantu ravnoteže razdruživanja antitela, Ig, fragment koji veže antitelo, ili Fc koji sadrži protein na FcyR. Postoji inverzni odnos između KD i afiniteta vezivanja, samim tim je manja KD vrednost, viša, tj. jači, afinitet. Dakle, pojmovi "viši afinitet" ili "jači afinitet" se odnosi na višu sposobnost da se formira interakcija i samim tim manja KD vrednost, i suprotno pojmovi "niži afinitet" ili "slabiji afinitet" se odnose na manju sposobnost da se formira interakcija i samim tim veća KD vrednost. U nekim okolnostima, viši afinitet vezivanja (ili KD) specifičnog molekula (npr. antitelo) na njegov interaktivni partner molekul (npr X receptor) upoređen sa afinitetom vezivanja molekula (npr. antitela) na drugi interaktivni partner molekul (npr. receptor Y) može biti izražen kao odnos vezivanja određen podelom veće KD vrednosti (niži, ili slabiji, afinitet) manjim KD (viši, ili jači, afinitet), na primer izražen kao 5-struko ili 10-struko veći afinitet vezivanja, kao što može biti slučaj.
[0169] Pojam "kd" (sek -1 ili 1/s), kako je ovde korišćen, se odnosi na konstantu ravnoteže odnosa razdruživanja specifične interakcije antitelo - antigen, ili konstantu ravnoteže odnosa razdruživanja antitela, Ig, fragmenta koji veže antitelo, ili Fc koji sadrži protein na FcyR. Pomenuta vrednost se takođe pominje kao vrednost koff (K konstanta; offrazdruživanja).
[0170] Pojam "ka" (M -1 x sec-1 ili 1/M1/s), kako je ovde korišćen, se odnosi na konstantu ravnoteže udruživanja odnosa specifične interakcije antitelo - antigen, ili konstantu ravnoteže odnosa udruživanja antitela, Ig, fragment koji vezuje antitelo, ili Fc koji sadrži protein na FcγR FcyR.
[0171] Pojam "KA" (M-1 ili 1/M), kako je ovde korišćen, se odnosi na konstantu ravnoteže udruživanja specifične interakcije antitelo - antigen, ili konstantu ravnoteže udruživanja antitela, Ig, fragment koji vezuje antitelo, ili Fc koji sadrži protein na FcγR FcyR. Konstanta ravnoteže udruživanja se dobija deljenjem ka sa kd.
[0172] Pojam "EC50" ili "EC50", kako je ovde korišćen, se odnosi na pola maksimalne delotvorne koncentracije, koja obuhvata koncentraciju antitela koja indukuje odgovor na pola puta između polaznog i maksimuma posle preciziranog vremena izloženosti. EC50 u suštini predstavlja koncentraciju antitela gde je primećeno 50% od svog maksimalnog dejstva. Dakle, smanjeno vezivanje je primećeno sa povećanim EC50, ili pola maksimalne delotvorne vrednosti koncentracije.
[0173] U jednom izvođenju, smanjeno vezivanje je moguće definisati kao povećanu EC50 koncentraciju antitela koja omogućava vezivanje na polumaksimalnu količinu ciljanih ćelija.
[0174] Kod nekih izvođenja, smanjenu citotoksičnu aktivnost, kao što je ADCC ili CDC, moguće je definisati kao povećanu EC50 koncentraciju antitela koja omogućava lizu polumaksimalne količine ciljnih ćelija. Citotoksičnost se takođe meri kao procenat citotoksičnosti, ili procenat lize koji je frakcija ukupne populacije ćelija primećenih kao lizovanih u ogledu otpuštanja kalceina ili ekvivalentnom ogledu. Procenat citotoksičnosti je moguće izmeriti kako je opisano u Primeru 6.
[0175] U drugim izvođenjima, smanjenu proliferaciju je moguće definisati kao povećanu EC50 koncentraciju antitela koja omogućava proliferaciju polumaksimalne količine ciljanih ćelija.
[0176] Fraza "funkcije efektora", kako je ovde korišćeno, je predviđena da obuhvati funkcionalne sposobnosti podeljene pomoću Fc koji obuhvata protein posle vezivanja na FcγR. Bez namere da se veže na bilo koju teoriju, formiranje Fc/FcγR kompleksa regrutuje raznovrsne ćelije efektora do mesta vezanog antigena, obično daje kao rezultat različite pojave signaliziranja unutar ćelija i važne naknadne odgovore imunog sistema.
[0177] Himerni Fc koji sadrže proteine koji vezuju antigen i ovde opisana antitela prikazuju izmenjene ili smanjene funkcije efektora u poređenju sa odgovarajućim divljim tipom Fc koji sadrže proteine ili antitela koji vezuju antigen. Videti, npr. PCT objava br. WO 2014/121087, objavljeno 07. avgusta 2014.
[0178] Funkcija efektora koja je smanjena ili promenjena može da bude funkcija citotoksičnog efektora, npr. citotoksičnost, citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC), ili citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC). Funkcija efektora koja je smanjena ili promenjena može da bude citotoksičnost zavisna od komplementa. Funkcija efektora koja je smanjena ili promenjena može da bude citotoksičnost zavisna od antitela. Funkcija efektora koja je smanjena ili promenjena može da bude ćelijska proliferacija ciljnih ćelija.
[0179] Nekoliko funkcija efektora antitela su posredovane barem delimično Fc receptorima (FcRs), koji vežu Fc region antitela u konstantnom domenu (specifično, CH2 i CH3 domen) uobičajenog imunoglobulina. Postoji izvesan broj Fc receptora koji su specifični za različite klase imunoglobulina, tj. IgG, IgE, IgA, IgM, i IgD. Familija Fc receptora humanog IgG se deli u tri grupe: FcγRI (CD64), koji može da veže IgG sa visokim afinitetom, FcγRII (CD32) i FcγRIII (CD16) od kojih su oba receptori niskog afiniteta. Svaka podklasa FcγR se kodira pomoću dva ili tri gena, i alternativno RNK splajsovanje vodi višestrukim transkriptima, otuda, postoji široka raznovrsnost u izoformama FcyR (npr. FcγRIA (CD64; FCGR1A), FcγRIB (CD64; FCRG1B), FcγRIIA (CD32A; FCGR2A), FcγRIIB (CD32B; FCGR2B), FcγRIIC (CD32C; FCGR2C), FcγRIIIA (CD16a; FCGR3A), i FcγRIIIB (CD16b; FCGR3B)). Pored toga, FcRn, ili neonatalni Fc receptor (takođe poznat kao Fc receptor transporter, alfa, ili FCGRT) je sposoban za prenos IgG antitela sa majke do fetusa preko placente. Pored toga, Fc receptori su izraženi na raznovrsnim ćelijama, uključujući, npr. B ćelije, monocite, dendritske ćelije, neutrofile, i izvesne limfocite. Na primer, U937 ćelije, humane linije ćelija monocita, izražavaju i FcγRI i FcγRIIA (videti npr. Jones, et al. J Immunol 135(5):3348-53 (1985); and Brooks, et al. J Exp Med 170:1369-85 (October 1989)). Svaki ovde pomenuti receptor, obuhvata bilo koji poznat funkcionalni oblik receptora, uključujući varijante transkripta, izoforme i polimorfizme.
[0180] Vezivanje Fc imunoglobulina (Ig) na njegov receptor dovodi ove ćelije efektora na mesta vezanog antigena, što daje kao rezultat na kraju raznovrsne odgovore signaliziranja i imunog sistema, uključujući aktivaciju B ćelije, odgovore na zapaljenske procese, citotoksične odgovore, i fagocitne odgovore. Kao takav, smanjeno ili promenjeno vezivanje Fc imunoglobulina (Ig) na njegov receptor može dati kao rezultat smanjene funkcije efektora.
[0181] Fraza "fagocitoza ćelija zavisna od antitela", ili "ADCP", se odnosi na funkciju efektora koja eliminiše (ili ubija) ciljnu ćeliju obuhvatanjem ciljne ćelije pre nego indukovanjem citolize. ADCP može da bude važan in vivo mehanizam za ubijanje ćelija tumora. ADCP je moguće izmeriti postupcima protočne citometrije dvobojnom fluorescencijom, na primer postupci korišćenja, npr. PKH2 (zelene fluorescentne boje) i fikoeritrinon konjugovana (crveno) monoklonalna antitela protiv različitih proteina na površini ćelije da bi se razlikovale testirane ćelije, čime je određena aktivnost fagocita i brzina fagocitoze. ADCP merenja su dobro poznata u ovoj oblasti. Terapijske strategije koje selektivno aktiviraju FcγRIIA u odnosu na FcγRIIB mogu pospešiti fagocitnu aktivnost makrofaga (Richards, JO, et al.2008 Mol Cancer Ther 7(8):2517-27). Himerni proteini i antiela za vezivanje antigena koje sadrži Fc iz ovog opisa se vezuju na i aktiviraju humani FcγRIIA. Proteini i antitela koji vezuju antigen mogu da se vežu na humani FcγRIIA sa višim afinitetom vezivanja nego što su antitela vezana FcγRIIB.
Antitelo može da ispolji afinitet vezivanja na humani FcγRIIA više nego oko 5-struko jače nego njegov afinitet vezivanja na humani FcγRIIB, takve vrednosti afiniteta vezivanja izražene u KD. Antitelo može ispoljiti afinitet vezivanja na humani FcγRIIA više od oko 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 11-, 12-, 13-, 14-, 15-, 16-, 17-, 18-, 19-, ili 20-struko jače nego njegov afinitet vezivanja na humani FcγRIIB. U ovom pronalasku, bispecifično antitelo ispoljava viši afinitet vezivanja na humani FcɣRIIA u odnosu na humani FcɣRIIB, i ispoljava mali ili nikakav afinitet vezivanja na humani FcɣRI i humani FcɣRIII, kako je izmereno u ogledu rezonance površinskog plazmona.
Biološke karakteristike antitela i bispecifičnih molekula koji vezuju antigen
[0182] Ovaj opis obuhvata antitela i njihove fragmente koji vezuju antigen koji vezuju humani CD3 i humani CD20. Na primer, ovaj pronalazak ukljucuje anti-CD3xCD20 antiela vežu Jurkatove ćelije (CD3+) i Radži ćelije (CD20+) sa EC50 vrednošću manjom od oko 60 nM, kako je izmereno pomoću ogleda vezivanja in vitro, npr. upotrebom formata ogleda kako je definisano u Primeru 3 ovde (npr. procenu vezivanja Jurkatovih ćelija ili Radžijevih ćelija na CD3xCD20 antitela), ili značajnije sličan ogled. Antitela ili fragmenti koji vezuju antigen mogu da vežu CD3 ili CD20 na površini ćelija (npr. Jurkatove ćelije i/ili Radžijeva ćelija) sa EC50 vrednost od manje od oko 75 nM, manje od oko 70 nM, manje od oko 65 nM, manje od oko 60 nM, manje od oko 50 nM, manje od oko 40 nM, manje od oko 30 nM, ili manje od oko 25 nM, kako je izmereno in vitro ogledom vezivanja, npr. korišćenjem formata ogleda kako je definisano u Primeru 4 ovde, ili pretežno sličnom ogledu.
[0183] Ovaj opis obuhvata bispecifične molekule koji vezuju antigen (npr. bispecifična antitela, kao što su bispecifična antitela ovog pronalaska) koja su sposobna za istovremeno vezivanje na humani CD3 i humani CD20. Prema izvesnim primerima, bispecifični molekuli koji vezuju antigen iz ovog opisa specifično reaguju uzajamno sa ćelijama koje izražavaju CD3 i/ili CD20. Nivo do kog bispecifično molekul koji vezuje antigen veže ćelije koje izražavaju CD3 i/ili CD20 mogu biti procenjene razvrstavanjem ćelije aktivirane fluorescencijom (FACS), kako je ilustrovano u Primeru 4 ovde. Na primer, ovaj opis obuhvata bispecifične molekule koji vezuju antigen koji specifično vezuju humane linije T ćelije koje izražavaju CD3 (npr. Jurkat), humane linije B ćelije koje izražavaju CD20 (npr. Raji), i T ćelije primata (npr. mononuklearne ćelije periferne krvi makaki majmuna [PBMCs]). Ovaj opis obuhvata bispecifične molekule koji vezuju antigen koji vezuju bilo koju od gore pomenutih ćelija i linija ćelije sa EC50 vrednosti od oko 8,74 x10<-6>do oko 5,99 x10<-8>, ili manje, kako je utvrđeno upotrebom FACS ogleda kao što je izneto u Primeru 4 ili pretežno sličnom ogledu.
[0184] Ovaj opis takođe obuhvata antitela i njihove fragmente koji vezuju antigen koji vezuju humani CD3 i indukuju ubijanje ćelija tumora posredovano T ćelijom. Na primer, ovaj opis obuhvata anti-CD3xCD20 antitela koja indukuju ubijanje ćelija tumora posredovano T ćelijom sa EC50 manjim od oko 60 pM, kao što je izmereno u in vitro T ogledu ubijanja ćelije tumora posredovano T ćelijom, npr. upotrebom formata ogleda kao što je definisano u Primeru 5 ovde u tekstu (npr. procenu nivoa ubijanja ćelije Radži tumora pomoću humanih PBMC u prisustvu anti-CD3 antitela), ili pretežno sličnom ogledu. U izvesnim izvođenjima, antitela ovog pronalaska mogu indukovati ubijanje ćelije tumora posredovano T ćelijom (npr. PBMC-om posredovano ubijanje Radži ćelija) sa EC50 vrednošću manjom od oko 56 pM, manjom od oko 50 pM, manjom od oko 45 pM, manjom od oko 40 pM, manjom od oko 35 pM, manjom od oko 30 pM, manjom od oko 25 pM, manjom od oko 20 pM, manjom od oko 15 pM, manjom od oko 10 pM, manjom od oko 5 pM, ili manjom od oko 1 pM, kao što je izmereno pomoću ogleda ubijanja ćelije tumora posredovanog T ćelijom, npr. upotrebom formata ogleda kako je definisano u Primeru 5 ovde u tekstu, ili pretežno sličnom ogledu.
[0185] Ovaj opis takođe obuhvata antitela i njihove fragmente koji vezuju antigen koji vezuju humani CD3/CD20 i indukuju citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC), iako u manjoj meri nego antitela koja imaju divlji tip Fc domena IgG. Na primer, bispecifično antitelo ovog pronalaska može indukovati CDC ubijanje Radži ili Daudi (sa ekspresijom CD20) ćelija sa procentom toksičnosti (% citotoksičnost ili % liza ćelije) manjom od oko 50%, kako je izmereno u in vitro ogledu ubijanja ćelije tumora posredovano T ćelijom, npr. upotrebom formata ogleda kako je definisano u Primeru 6 ovde (npr. procenu nivoa ubijanja ciljne ćelije (Radži ili Daudi) u prisustvu komplementa i anti-CD3xCD20 antitela), ili pretežno sličnom ogledu. U izvesnim izvođenjima, antitela ovog pronalaska indukuju CDC ubijanje ćelije (npr. ubijanje posredovano komplementom Radži ili Daudi ćelija) sa procentom citotoksičnosti od manje od oko 45%, manje od oko 40%, manje od oko 35%, manje od oko 30%, manje od oko 25%, manje od oko 20%, manje od oko 15%, manje od oko 10%, manje od oko 5%, manje od oko 1%, manje od citotoksičnosti u pozadini, ili bez dektibilne citotoksičnosti kako je izmereno in vitro ogledom ubijanja posredovanog komplementom, npr. upotrebom formata ogleda kako je definisano u Primeru 6 ovde, ili na pretežno sličan način.
[0186] Ovaj opis takođe obuhvata antitela i njihove fragmente koji vezuju antigen koji vezuju humane CD3/CD20 ne indukuju u značajnijoj meri citotoksičnost posredovanu ćelijom zavisno od antitela (ADCC) u poređenju sa antitelima koja imaju Fc domen divljeg tipa IgG. Kod nekih izvođenja, bispecifično antitelo ovog pronalaska je dato bez razumljivog ubijanja Radži ili Daudi (sa ekspresijom CD20) ćelija sa procentom citotoksičnosti (% citotoksičnost ili % lize ćelije) manjom od oko 20% (ili manjom od citotoksičnosti u pozadini), kako je izmereno u in vitro NK ogledu ubijanja ćelije posredovanog NK ćelijom, npr. upotrebom formata ogleda kako je definisano u Primeru 7 ovde (npr., proceni nivoa ubijanja ciljne ćelije (Radži ili Daudi) u prisustvu NK ćelija i anti-CD3xCD20 antitela), ili na pretežno sličan način. Pretežno slični ogledi mogu obuhvatiti prisustvo NK ćelija, makrofaga, neutrofila, eozinofila ili drugih ćelija Fcγ sa RIII ekspresijom, uključujući ćelije sa ekspresijom varijante FcγRIII. U izvesnim primerima, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen ne ispoljavaju detektibilnu ADCC aktivnost (npr. NK ćelija ili Fcγsa RIII posredovano ubijanje Radži ili Daudi ćelija) sa procentom citotoksičnosti manjim od oko 30%, manjim od oko 25%, manjim od oko 20%, manjim od oko 15%, manjim od oko 10%, manjim od oko 5%, manjim od oko 1%, manjim od oko citotoksičnosti u pozadini, ili bez detektibilne citotoksične aktivnost pomoću in vitro ogleda ubijanja ćelije posredstvom FcγRIII, npr. upotrebom formata ogleda kako je definisano u Primeru 7 ovde, ili u pretežno sličnom ogledu.
[0187] Prema izvesnim izvođenjima, bispecifično antitelo ovog pronalaska vezuje humani FcγRIIA (npr. na 25°C) sa KD od manje od oko 23,5 µM kako je izmereno rezonancom površinskog plazmona, npr. upotrebom ogleda kako je definisano u Primeru 8. U izvesnim izvođenjima, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen iz ovog pronalaska vezuju FcγRIIA sa KD manjim od oko 20,5 µM, manjim od oko 20 µM, manjim od oko 19,3 µM, manjim od oko 18 µM, manjim od oko 17 µM, manjim od oko16 µM, manjim od oko 15 µM, manjim od oko 10 µM, manjim od oko 9 µM, manjim od oko 8 µM, manjim od oko 7 µM, manjim od oko 6 µM, manjim od oko 5 µM, manjim od oko 4 µM, manjim od oko 3 µM, manjim od oko 2 µM, manjim od oko 1 µM, manjim od oko 900 nM, manjim od oko 800 nM, ili manjim od oko 700 nM, kako je izmereno rezonancom površinskog plazmona, npr. upotrebom formata ogleda kako je definisano u Primeru 8 ovde (npr. mAb-registrovanje ili format registrovanja antigena), ili pretežno sličnom ogledu.
[0188] Prema izvesnim izvođenjima, bispecifično antitelo ovog pronalaska vezuje humani FcγRIIB (npr. na 25°C) sa KD od manje od oko 233 µM kako je izmereno rezonancom površinskog plazmona, npr. upotrebom ogleda kako je definisano u Primeru 8. U izvesnim izvođenjima, antitela ili fragmenti koji vezuju antigen iz ovog pronalaska vezuju FcγRIIB sa KD manjim od oko 200 µM, manjim od oko 190 µM, manjim od oko 180 µM, manjim od oko 170 µM, manjim od oko 160 µM, manjim od oko 150 µM, manjim od oko 140 µM, manjim od oko 130 µM, manjim od oko 125 µM, manjim od oko 123 µM, manjim od oko 120 µM, manjim od oko 110 µM, manjim od oko 100 µM, manjim od oko 90 µM, manjim od oko 80 µM, manjim od oko 70 µM, manjim od oko 60 µM, manjim od oko 50 µM, ili manjim od oko 40 µM, kako je izmereno rezonancom površinskog plazmona, npr. upotrebom formata ogleda kako je definisano u Primeru 8 ovde (npr. mAb registrovanje ili format registrovanja antigena), ili pretežno sličnom ogledu.
[0189] Bispecifično antitelo ovog pronalaska može da veže CD3xCD20 sa poluvekom razdruživosti (t1/2) većim od oko 8 dana kako je izmereno rezonancom površinskog plazmona na 25°C ili 37°C, npr. upotrebom formata ogleda kako je definisano u Primeru 9 ovde, ili pretežno sličnom ogledu. U izvesnim izvođenjima, antitela ispoljavaju t1/2 od više od oko 5 dana, ili više od oko 6 dana, ili više od oko 7 dana, ili više od oko 8 dana, ili više od oko 9 dana, ili više od oko 10 dana, ili više od oko 11 dana, ili više od oko 12 dana, ili više od oko 13 dana, ili više od oko 14 dana, ili više od oko 15 dana, ili više od oko 20 dana, kako je izmereno rezonancom površinskog plazmona na 25°C ili 37°C, npr. upotrebom formata ogleda kako je definisano u Primeru 9 ovde (npr. mAb registrovanje ili format registrovanja antigena), ili nekim pretežno sličnim ogledom.
[0190] U nekim primerima, ovde opisani bispecifični molekuli koji vezuju antigen anti-CD3/anti-CD20 ne ispoljavaju značajniju aktivnost u jednom ili više ogleda izabranih iz grupe koja obuhvata: (a) uvođenje PBMC proliferacije in vitro; (b) CDC citotoksičnost (videti, npr. Primer 6 ovde); (d) ADCC (videti, npr. Primer 7 ovde).
[0191] Bispecifično antitelo ovog pronalaska može ispoljiti znatniju aktivnost u jednom ili više ogleda izabranih iz grupe koja obuhvata: (a) osiromašivanje B ćelija (npr. CD45+/CD20+ B ćelija) kod makaki majmuna (videti, npr. Primere 10 i 11 ovde u tekstu); (b) smanjenje zapremine tumora B ćelije (npr. zapremina Radži tumora) na modelima miša slabijeg imuniteta (videti, npr. Primer 12A); i (c) regresija tumora na modelima miša sa uspostavljenim tumorima (videti., Primer 12B).
[0192] Ovaj opis obuhvata bispecifične molekule koji vezuju antigen anti-CD3/anti-CD20 koji su sposobni za osiromašivanje B ćelija kod subjekta (videti, npr. Primer 10). Na primer, prema izvesnim izvođenjima, ovde su dati bispecifični molekuli koji vezuju antigen anti-CD3/anti-CD20, pri čemu pojedinačna isporuka bispecifičnog molekula koji vezuje antigen na subjekat (npr. u dozi od oko 1 mg/kg, od oko 0,9 mg/kg, od oko 0,8 mg/kg, od oko 0,7 mg/kg, od oko 0,6 mg/kg, od oko 0,5 mg/kg, od oko 0,4 mg/kg, od oko 0,3 mg/kg, od oko 0,2 mg/kg, oko 0,1 mg/kg, oko 0,08 mg/kg, oko 0,06 mg/kg oko 0,04 mg/kg, oko 0,03 mg/kg, oko 0,02 mg/kg, oko 0,01 mg/kg, ili manje) prouzrokuje smanjenje broja B ćelija kod subjekta (npr. u uzorku krvi uzetom od subjekta) ispod detektibilnih nivoa. Kod izvesnih izvođenja, jedna isporuka anti-CD3/anti-CD20 bispecifičnog molekula koji vezuje antigen u dozi od oko 0,1 mg/kg prouzrokuje smanjenje broja B ćelija kod subjekta ispod detektibilnih nivoa do oko 7. dana, oko 6. dana, oko 5. dana, oko 4. dana, oko 3. dana, oko 2. dana, ili oko 1 dan posle isporuke bispecifičnog molekula koji vezuje antigen subjektu. Prema izvesnim izvođenjima, jedna isporuka bispecifičnog molekula koji veže anti-CD3/anti-CD20 iz ovog pronalaska, u dozi od oko 0,01 mg/kg, prouzrokuje da broj B ćelija ostane ispod detektibilnih nivoa sve dok barem oko 7 dana, 8 dana, 9 dana, 10 dana, 11 dana, 12 dana, 13 dana, 14 dana, 15 dana, 16 dana, 17 dana ili više, posle isporuke. Kako je ovde korišćen, izraz "ispod detektibilnih nivoa" znači da nije moguće direktno ili indirektno detektovati B ćelije u uzorku krvi uzetom od subjekta upotrebom standardnih ogleda detekcije B ćelije, npr. FACS ogled za markere B ćelije, kako je izneto u Primeru 10, ovde.
[0193] Ovaj opis takođe obezbeđuje bispecifične molekule koji vezuju antigen anti-CD3/anti-CD20 koji, kada se isporuče subjektu, prouzrokuju ne više od prelaznog smanjenja u T ćelijama. Na primer, ovde su obezbeđeni bispecifični molekuli vezivanja antigena anti-CD3/anti-CD20, kada se isporuče subjektu u dozi od oko 0,01 mg/kg, ili oko 0,1 mg/kg, ili oko 1 mg/kg prouzrokuju izvestan broj T ćelija da bi se smanjio 1 dana posle isporuke, ali pri čemu se broj T ćelija po mikrolitru krvi ponovo vezuje u vremenskim tačkama posle toga (npr. do oko 2. dana, 4. dana, 7. dana, 14. dana, 28. dana ili kasnije posle isporuke). Na primer, moguće je obezbediti bispecifični molekul koji vezuje antigen anti-CD3/anti-CD20, pri čemu je broj T ćelija po mikrolitru krvi uzete iz subjekta oko 4. dana sve do oko 7. dana posle isporuke molekula koji vezuje antigen subjektu u dozi od oko 0,01 mg/kg ili oko 0,1 mg/kg, ili oko 1 mg/kg ekvivalentan ili veći od broja T ćelija po mikrolitru krvi uzete iz subjekta pre isporuke bispecifičnog molekula koji vezuje antigen, kako je detektovano upotrebom standardnog ogleda detekcije T ćelije, npr. FACS ogleda za markere T ćelije, kao što je izneto u Primeru 10, ovde u tekstu.
Mapiranje epitopa i srodne tehnologije
[0194] Epitop na CD3 ili na CD20 na koje se molekuli koji vezuju antigen iz ovog pronalaska vezuju mogu da se sastoje od jedne dodirne sekvence od 3 ili više (npr.3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili više) aminokiselina od CD3 proteina. Alternativno, epitop može da obuhvati više nedodirnih aminokiselina (ili sekvenci aminokiselina) od CD3 ili CD20. Antitela iz ovog pronalaska mogu da međusobno reaguju sa aminokisleinama sadržanim unutar jednog CD3 lanca (npr. CD3-epsilon, CD3-delta ili CD3-gama), ili mogu da međusobno reaguju sa aminokiselinama na dva ili više različitih CD3 lanaca. Pojam "epitop," kako je ovde korišćen, se odnosi na antigenski determinant koji reaguje međusobno sa specifičnim mestom za vezivanje antigena u promenljivom regionu molekula antitela poznatom kao paratop. Pojedinačni antigen može imati više od jednog epitopa. Dakle, različita antitela mogu da se vezuju na različita područja na antigen i mogu imati različita biološka dejstva. Epitopi mogu biti bilo konformacioni ili linearni. Konformacioni epitop se proizvodi prostorno suprotstavljeni aminokiselinama iz različitih segmenata linearnog polipeptidnog lanca. Linearni epitop je onaj koji je proizveden susednim ostacima aminokiseline u polipeptidnom lancu. U izvesnim okolonostima, epitop može obuhvatiti delove saharida, fosforili grupa, ili sulfonil grupa na antigenu.
[0195] Različite tehnike poznate osobama prosečne stručnosti u ovoj oblasti moguće je koristiti da bi se odredilo da li je domen koji vezuje antigen nekog antitela "u interakciji sa jednom ili više aminokiselina" unutar polipeptida ili proteina. Primeri tehnika obuhvataju, npr. rutinski ogled unakrsnog blokiranja kao što su to Harlou i Lejn opisali u Antitelima (Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY)), alanin analiza za skeniranje mutacije, analize blotova peptida (Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248:443-463), i analiza cepanja peptida. Pored toga, mogu biti korišćeni postupci kao što je ekscizija epitopa, ekstrakcija epitopa i hemijska modifikacija antigena (Tomer, 2000, Protein Science 9: 487-496). Drugi postupak koji je moguće koristiti da bi se identifikovale aminokiseline unutar polipeptida sa kojima domen koji vezuje antigen nekog antitela reaguje međusobno je izmena vodonika/deuterijuma koja je detektovana masenom spektrometrijom. U opštem smislu, postupak izmene vodonika/deuterijuma obuhvata označavanje deuterijumom proteina od interesa, posle čega sledi vezivanje antitela na protein označen deuterijumom. Dalje, kompleks protein/antitelo se prenosi na vodu da bi se omogućilo da dođe do izmene vodonika-deuterijuma na svim ostacima izuzev za ostatke zaštićene antitelom (koji preostanu označeni kao deuterijum). Posle razdruživanja antitela, ciljni protein se podvrgava cepanju proteaze i analize masenom spektrometrijom, pri čemu se otkriva da ostaci označeni deutrijumom koji odgovaraju specifičnim aminokiselinama sa kojima antitelo međusobno reaguje. Videti, npr. Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen and Smith (2001) Anal. Chem.
73:256A-265A. Rendgenska kristalografija kompleksa antigen/antitelo može biti korišćena i u svrhe mapiranja epitopa.
[0196] Ovaj opis još obuhvata anti-CD3 antitela koja se vezuju na isti epitop kao bilo koja od specifičnih antitela uzetih kao primer opisanih ovde (npr. antitela koja obuhvataju bilo koju od sekvenci aminokiseline kako je izneto u Tabeli 1 ovde). Isto tako, ovaj opis još obuhvata anti-CD3 antitela koja se takmiče za vezivanje na CD3 sa bilo kojim od specifičnih antitela uzetih kao primer opisanih ovde (npr. antitela koja obuhvataju bilo koju od sekvenci aminokiseline kako je izneto u Tabeli 1 ovde).
[0197] Ovaj opis takođe obuhvata bispecifične molekule koji vezuju antigen koji obuhvataju prvi domen koji vezuje antigen koji specifično vezuje humani CD3, i drugi domen koji vezuje antigen koji specifično vezuje humani CD20, pri čemu se prvi domen koji vezuje antigen vezuje na isti epitop na CD3 kao specifični za primer uzeti ovde opisani za CD3 specifični domeni koji vezuju antigen, i/ili pri čemu se drugi domen koji vezuje antigen vezuje na isti epitop na CD20 kao specifični primeri ovde opisanih za CD20 specifičnih domena koji vezuju antigen.
[0198] Takođe, ovaj opis takođe obuhvata bispecifične molekule koji vezuju antigen koji obuhvataju prvi domen koji vezuje antigen koji specifično vezuje humani CD3, i drugi domen koji vezuje antigen koji specifično vezuje humani CD20, pri čemu se prvi domen koji vezuje antigen takmiči da se veže na CD3 sa bilo kojim specifičnim za primer uzetim ovde opisanim za CD3 specifičnim domenima koji vezuju antigen, i/ili pri čemu se drugi domen koji vezuje antigen takmiči da se veže na CD20 sa bilo kojim od specifičnih kao primer uzetih ovde opisanih za CD20 specifičnih domena koji vezuju antigen.
[0199] U jednom varijantnom rešenju, ovaj opis obuhvata bispecifično antitelo u kom se prvi domen koji vezuje antigen takmiči za vezivanje na humani CD3 sa referentnim proteinom koji vezuje antigen, koji obuhvata tri regiona određivanja komplementarnosti teškog lanca (A1-HCDR1, A1-HCDR2 i A1-HCDR3) i tri regiona određivanja komplementarnosti lakog lanca (A1-LCDR1, A1-LCDR2 i A1-LCDR3), pri čemu (i) A1-HCDR1 obuhvata sekvencu aminokiseline iz SEK ID BR: 12; (ii) A1-HCDR2 obuhvata sekvencu aminokiseline od SEK ID BR: 14; (iii) A1-HCDR3 obuhvata sekvencu aminokiseline od SEK ID BR: 16; (iv) A1-LCDR1 obuhvata sekvencu aminokiseline od SEK ID BR: 20; (v) A1-LCDR2 obuhvata sekvencu aminokiseline od SEK ID BR: 22; i (vi) A1-LCDR3 obuhvata sekvencu aminokiseline od SEK ID BR: 24. U nekim slučajevima, bispecifično antitelo obuhvata prvi domen koji vezuje antigen koji se takmiči za vezivanje na humani CD3 sa referentnim proteinom koji vezuje antigen koji obuhvata (i) promenljivi region teškog lanca (HCVR) sekvence aminokiseline koja ima SEK ID BR: 10, i (ii) promenljivi region lakog lanca (LCVR) sekvence aminokiseline iz SEK ID BR: 18.
[0200] U jednom drugom varijantnom rešenju, ovaj opis obuhvata bispecifično antitelo u kom se drugi domen koji vezuje antigen takmiči za vezivanje na humani CD20 sa referentnim proteinom koji vezuje antigen koji obuhvata tri regiona određivanja komplementarnosti teškog lanca (A2-HCDR1, A2-HCDR2 i A2-HCDR3) i tri regiona određivanja komplementarnosti lakog lanca (A2-LCDR1, A2-LCDR2 i A2-LCDR3), pri čemu (i) A2-HCDR1 obuhvata sekvencu aminokiseline iz SEK ID BR: 4; (ii) A2-HCDR2 obuhvata sekvencu aminokiseline od SEK ID BR: 6; (iii) A2-HCDR3 obuhvata SEK ID BR: 8; (iv) A2-LCDR1 obuhvata sekvencu aminokiseline od SEK ID BR: 20; (v) A2-LCDR2 obuhvata sekvencu aminokiseline od SEK ID BR: 22; i (vi) A2-LCDR3 obuhvata sekvencu aminokiseline od SEK ID BR: 24. U nekim slučajevima, bispecifično antitelo obuhvata drugi domen koji vezuje antigen koji se takmiči za vezivanje na humani CD20 sa referentnim proteinom koji vezuje antigen koji obuhvata (i) promenljivi region teškog lanca (HCVR) koji ima sekvencu aminokiseline koja ima SEK ID BR: 2, i (ii) promenljivi region lakog lanca (LCVR) koji ima sekvencu aminokiseline iz SEK ID BR: 18.
[0201] U drugom varijantnom rešenju, ovaj opis obuhvata bispecifično antitelo koje ima prvi domen koji vezuje antigen koji se takmiči za vezivanje na humani CD3 sa referentnim proteinom koji vezuje antigen koji obuhvata (i) promenljivi region teškog lanca (HCVR) koji ima sekvencu aminokiseline iz SEK ID BR: 10, i (ii) promenljivi region lakog lanca (LCVR) koji ima sekvencu aminokiseline iz SEK ID BR: 18; i ima drugi domen koji vezuje antigen koji se takmiči za vezivanje na humani CD20 sa referentnim proteinom koji vezuje antigen koji obuhvata (iii) promenljivi region teškog lanca (HCVR) koji ima sekvencu aminokiseline iz SEK ID BR:2, i promenljivi region lakog lanca (LCVR) koji obuhvata sekvencu aminokiseline iz SEK ID BR: 18.
[0202] Stručnjak može lako da utvrdi da li specifični molekul koji vezuje antigen (npr. antitelo) ili njegov domen koji vezuje antigen vezuje na isti epitop kao, ili se takmiči za vezivanje sa, referentnim molekulom koji vezuje antigen upotrebom rutinskih postupaka poznatih u ovoj oblasti. Na primer, da bi se utvrdilo da li se antitelo koje se testira vezuje na isti epitop na CD3 (ili CD20) kao referentni bispecifični molekul koji vezuje antigen, referentni bispecfični molekul se prvo pusti da se veže na CD3 protein (ili CD20 protein). Dalje, procenjivana je sposobnost antitela koje se testira, da se veže na CD3 (ili CD20) molekul. Ako antitelo koje se testira može da se veže na CD3 (ili CD20) posle zasićenja usled vezivanja sa referentnim bispecifičnim molekulom antitela, može da se zaključi da se antitelo koje se testira vezuje na drugačiji epitop od CD3 (ili CD20) nego što je referentni bispecifični molekul koji vezuje antigen. Sa druge strane, ako antitelo koje se testira ne može da se veže na CD3 (ili CD20) molekul posle vezivanja usled zasićenja sa referentnim bispecifičnim molekulom koji vezuje antigen, onda antitelo koje se testira može da se veže na isti epitop od CD3 (ili CD20) kao epitop vezan referentnim bispecifičnim molekulom koji vezuje antigen. Dodatno rutinsko eksperimentisanje (npr. analize mutacije peptida i vezivanja) mogu zatim da budu izvedeni da bi se potvrdilo da li će primećen nedostatak vezivanja testiranog antitela zapravo da bude usled vezivanja na isti epitop kao referentni bispecifični molekul koji vezuje antigen ili da li je sterično blokiranje (ili drugi fenomen) odgovoran za izostanak primećenog vezivanja. Eksperimente ove vrste je moguće izvesti korišćenjem ELISA, RIA, Biacore, protočne citometrije ili bilo kog drugog kvantitativnog ili kvalitativnog ogleda koji vezuje antitelo dostupnog u ovoj oblasti. U skladu sa izvesnim izvođenjima ovog pronalaska, dva proteina koji vezuju antigen se vezuju na isti (ili preklapajući) epitop ako, npr.1-, 5-, 10-, 20- ili 100-struko prekoračenje jednog proteina koji vezuje antigen inhibira vezivanje drugog putem barem 50% ali preporučjivo 75%, 90% ili čak 99% kako se meri u ogledu konkurentnog vezivanja (videti, npr. Junghans et al., Cancer Res.1990:50:1495-1502). Alternativno, smatra se da se dva proteina koja vezuju antigen vezuju na isti epitop ako se u suštini sve mutacije aminokiseline u antigenu koji smanjuje ili eliminiše vezivanje jednog proteina koji vezuje antigen smanjuju ili eliminišu vezivanje drugog. Smatra se da dva proteina koja se vezuju na antigen imaju "preklapanje epitopa" ako samo podskup mutacija aminokiseline koje smanjuju ili eliminišu vezivanje jednog proteina koji vezuje antigen smanjuju ili eliminišu vezivanje drugog.
[0203] Da bi se utvrdilo da li neko antitelo ili njegov domen koji vezuje antigen takmiči za vezivanje sa referentnim molekulom koji vezuje antigen, gore opisana metodologija vezivanja se izvodi u dve orijentacije: U prvoj orijentaciji, referentnom molekulu koji vezuje antigen je dozvoljeno da se veže na CD3 protein (ili CD20 protein) pod uslovima zasićenja posle čega sledi procena vezivanja antitela koje se testira na CD3 (ili CD20) molekul. U drugoj orijentaciji, antitelo koje se testira se ostavi da se veže na CD3 (ili CD20) molekul pod uslovima zasićenja posle čega sledi procena vezivanja referentnog molekula koji vezuje antigen na CD3 (ili CD20) molekul. Ako, u obe orijentacije, samo prvi (saturacioni) molekul koji vezuje antigen može da se veže na CD3 (ili CD20) molekul, onda se zaključuje da se antitelo koje se testira i referentni molekul koji vezuje antigen takmiče za vezivanje na CD3 (ili CD20). Kao što će uvideti prosečan stručnjak u ovoj oblasti, antitelo koje se takmiči za vezivanje sa referentnim molekulom koji vezuje antigen ne mora neophodno da se vezuje na identični epitop kao to referentno antitelo, ali može sterično da blokira vezivanje referentnog antitela vezivanjem preklapanja ili susednog epitopa.
Dobijanje domena koji vezuju antigen i konstrukcija bispecifičnih molekula
[0204] Domeni koji vezuju antigen specifični za specifične antigene mogu biti pripremljeni pomoću bilo koje u ovoj oblasti poznate tehnologije za proizvodnju antitela. Pošto se dobiju, dva različita domena koja vezuju antigen, specifična za dva različita antigena (npr. CD3 i CD20), mogu biti prikladno raspoređeni jedan u odnosu na drugi da bi se proizveo bispecifičan molekul koji vezuje antigen upotrebom rutinskih postupaka. (Diskusija primera formata bispecifičnog antitela koje je moguće koristiti da bi se konstruisali bispecifični molekuli koji vezuju antigen je data ovde na drugom mestu). U izvesnim primerima, jedna ili više pojedinačnih komponenata (npr. teški i laki lanci) višestruko specifičnih molekula koji vezuju antigen su izvedeni iz himernih, humanizovanih ili potpuno humanih antitela. Postupci za pravljenje takvih antitela su dobro poznati u ovoj oblasti. Na primer, jedan ili više od teških i/ili lakih lanaca bispecifičnih molekula koji vezuju antigen moguće je pripremiti upotrebom VELOCIMMUNE™ tehnologije. Upotreba VELOCIMMUNE™ tehnologije (ili bilo koje druge tehnologije za proizvodnju humanog antitela), visokoafinitetna himerna antitela na specifični antigen (npr. CD3 ili CD20) su prvobitno izolovani tako da imaju humani promenljivi region i mišji konstantni region. Antitela se karakterišu i biraju po poželjnim karakteristikama, uključujući afinitet, selektivnost, epitop, itd. Mišji konstantni regioni su zamenjeni željenim humanim konstantnim regionom da bi se generisali potpuno humani teški i/ili laki lanci koje je moguće ugraditi u bispecifične molekule ovog pronalaska koji vezuju antigen.
[0205] Životinje dobijene genetičkim inženjeringom moguće je koristiti da bi se napravili humani bispecifični molekuli koji vezuju antigen. Na primer, može biti korišćen genetički modifikovan miš koji je nesposoban za preraspoređivanje i ekspresiju endogene mišje promenljive sekvence lakog lanca imunoglobulina, pri čemu miš izražava ekspresijom samo jedan ili dve humana promenljiva domena lakog lanca kodirana humanim sekvencama imunoglobulina koje su funkcionalno povezane na mišji kapa konstantni gen na endogenom mišjem kapa lokusu. Takve genetski modifikovane miševe je moguće koristiti da bi se proizveli humani bispecifični molekuli koji vezuju antigen koji obuhvataju dva različita teška lanca koja se povezuju sa identičnim lakim lancem koji obuhvata promenljivi domen izveden iz jednog od dva različita humana segmenta gena promenljivog regiona lakog lanca. (Videti, npr. US 2011/0195454 za detaljnu diskusiju takvih genetskim inženjeringom dobijenih miševa i njihovu upotrebu da bi se proizveli bispecifični molekuli koji vezuju antigen).
Bioekvivalenti
[0206] Ovaj opis obuhvata molekule koji vezuju antigen sa sekvencama aminokisleine koje variraju od onih iz ovde opisanih kao primer datih molekula ali koji zadržavaju sposobnost da vežu CD3 i/ili CD20. Takvj varijantni molekuli mogu da obuhvate jedan ili više dodataka, delecija, ili supstitucija aminokiselina kada se uporede sa roditeljskom sekvencom, ali ispoljavaju biološku aktivnost koja je u suštini ekvivalentna sa aktivnošću opisanih bispecifičnih molekula koji vezuju antigen.
[0207] Ovaj opis obuhvata molekule koji vezuju antigen koji su bioekvivalentni sa bilo kojim od ovde datih kao primer molekula koji vezuju antigen. Dva proteina, ili antitela koja vezuju antigen, se smatraju bioekvivalentnim ako su, na primer, farmaceutski ekvivalenti ili farmaceutske alternative čija brzina i nivo apsorpcije ne pokazuju značajnu razliku kada se isporuče u istoj molarnoj dozi pod sličnim eksperimentalnim uslovima, bilo kao jedna doza ili kao više doza. Neki proteini koji vezuju antigen će se smatrati ekvivalentima ili farmaceutskim alternativama ako su ekvivalentna u meri njihove apsorpcije ali ne u brzini njihove apsorpcije i ipak se mogu smatrati bioekvivalentom zbog toga što su takve razlike u brzini apsorpcije namerne i odražavaju se u označavanju, nisu ključne za dobijanje delotvornih koncentracija leka za organizam pri, npr. hroničnoj upotrebi, i smatraju se medicinski beznačajnim za specifični proučavani proizvod u obliku leka.
[0208] U jednom primeru, dva proteina koja vezuju antigen su bioekvivalenti ako ne postoje klinički značajne razlike za njihovu bezbednost, čistoću i jačinu.
[0209] U jednom primeru, dva proteina koja vezuju antigen su bioekvivalentni ako pacijent može da se prebaci jednom ili više puta između referentnog proizvoda i biološkog proizvoda a da se ne očekuje povećanje u riziku od neželjenih dejstava, uključujući klinički značajnu promenu imunogenosti, ili smanjenu delotvornost, u poređenju sa neprekidnom terapijom bez takvog prebacivanja.
[0210] U jednom primeru, dva proteina koja vezuju antigen su bioekvivalentni ako oba deluju putem zajedničkog mehanizma ili mehanizama delovanja za uslov (stanje) ili uslove (stanja) upotrebe, do mere da su takvi mehanizmi poznati.
[0211] Bioekvivalenti mogu biti prikazani putem in vivo i in vitro metoda. Bioekvivalentne mere obuhvataju, npr. (a) in vivo test na ljudima ili drugim sisarima, kod kojih se meri koncentracija antitela ili njegovih metabolita meri u krvi, plazmi, serumu, ili drugom biološkom fluidu kao funkcija vremena; (b) in vitro test koji je doveden u vezu sa i koji je opravdano predvidiv za humane in vivo podatke biodostupnosti; (c) in vivo test kod ljudi i drugih sisara kod kojih se odgovarajuće akutno farmakološko dejstvo tog antitela (ili njegovog cilja) meri kao funkcija vremena; i (d) u dobro kontrolisanom kliničkom ispitivanju koje uspostavlja bezbednost, efikasnost, ili biodostupnost ili bioekvivalentnost proteina koji vezuje antigen.
[0212] Bioekvivalentne varijante za primer uzetih bispecifičnih molekula koji vezuju antigen iznete ovde mogu biti tumačene, na primer, različitim supstitucijama ostataka ili sekvenci ili brisanjem terminalnih ili internih ostataka ili sekvenci koji za biološku aktivnost nisu potrebni. Na primer, ostatke cisteina koji nisu ključni za biološku aktivnost moguće je izbrisati ili zameniti sa drugim aminokiselinama da bi se sprečilo formiranje bespotrebnih ili pogrešnih intramolekularnih disulfidnih mostova posle renaturacije. U drugim kontekstima, bioekvivalentni proteini koji vezuju antigen mogu da obuhvate varijante kao primer uzetih bispecifičnih molekula koji vezuju antigen iznetih ovde koji obuhvataju promene aminokiseline koje modifikuju karakteristike glikosilacije tih molekula, npr. mutacije koje eliminišu ili uklanjaju glikosilaciju.
Selektivnost vrsta i unakrsna reaktivnost vrsta
[0213] Prema izvesnim izvođenjima ovog pronalaska, bispecifična antitela koja se vezuju na humani CD3 ali ne na CD3 iz drugih vrsta. Prema izvesnim izvođenjima ovog pronalaska, bispecifično antitelo se veže na humani CD20 ali ne na CD20 iz drugih vrsta.
Prema izvesnim izvođenjima ovog pronalaska, bispecifično antitelo se veže na humani CD3 i na CD3 od jedne ili više nehumanih vrsta; i/ili se veže na humani CD20 i na CD20 od jedne ili više nehumanih vrsta.
[0214] Prema izvesnim kao primer uzetim izvođenjima iz ovog opisa, molekuli koji vezuju antigen su dati koji se vezuju na humani CD3 i/ili humani CD20 i mogu da se vežu ili da se ne vežu, zavisno od slučaja, na jedan ili više CD3 i/ili CD20 miša, pacova, morskog praseta, hrčka, skočimiša, svinje, mačke, psa, zeca, koze, ovce, krave, konja, kamile, makaki, marmoseta, rezusa ili šimpanze. Na primer, bispecifični molekuli koji vezuju antigen mogu da obuhvate prvi domen koji vezuje antigen koji vezuje humani CD3 i CD3 makaki majmuna, i drugi domen koji vezuje antigen koji specifično vezuje humani CD20.
Imunokonjugati
[0215] Bispecifična antitela ovog pronalaska moguće je spregnuti (konjugovati) na terapijski deo ("imunokonjugovati"), kao što je citotoksin, hemoterapijski lek, imunosupresant ili radioizotop. Citotoksični agensi obuhvataju bilo koji agens koji je štetan za ćelije. Primeri pogodnih agenasa citotoksina i hemoterapijskih agenasa za formiranje imunokonjugata su poznati u ovoj oblasti, (videti na primer, WO 05/103081).
Terapijska formulacija i isporuka
[0216] Kako je ovde korišćeno, pojmovi "delotvorna količina" i "terapijski delotvorna količina" se odnosi na količinu aktivnog terapijskog agensa dovoljnog da se da kao prinos željeni terapijski odgovor bez bespotrebnih neželjenih pratećih dejstava kao što je toksičnost, iritacija, ili alergijski odgovor. Specifična "delotvorna količina" će, očigledno varirati sa takvim činiocima kao što je specifično stanje koje se leči, fizičko stanje pacijenta, tip životinje koja se leči, trajanje terapije, priroda istovremene terapije (ako postoji), i specifične formulacije korišćene i struktura jedinjenja ili njegovih derivata. U ovom slučaju, količina će se smatrati terapijski delotvornom ako daje kao rezultat jedno ili više od, ali bez ograničenja na, sledećeg: (a) inhibiciju rasta tumora (npr. kancer B ćelije); i (b) vraćanje procesa ili stabilizacija kancera B ćelije.
[0217] Ta doza molekula koji vezuje antigen koja se isporuči pacijentu može da varira zavisno od starosti i veličine pacijenta, ciljne bolesti, stanja, rute isporuke, i sličnog. Preporučena doza je obično izračunata prema telesnoj težini ili području površine tela.
Kada se bispecifični molekul koji vezuje antigen iz ovog pronalaska koristi za terapijsku upotrebu kod odraslog pacijenta, može biti prednost da se intravenozno isporuči bispecifični molekul koji vezuje antigen iz ovog pronalaska normalno u jednoj dozi od oko 0,01 do oko 20 mg/kg telesne težine, još poželjnije oko 0,02 do oko 7, oko 0,03 do oko 5, ili oko 0,05 do oko 3 mg/kg telesne težine. Zavisno od ozbiljnosti stanja, učestalost učestalost i trajanje terapije je moguće podesiti. Delotvorne doze i rasporedi za isporuku bispecifičnog molekula koji vezuje antigen moguće je odrediti empirijski; na primer, napredak pacijenta je moguće nadgledati periodičnim procenama, i dozu prilagoditi sa tim u skladu. Pored toga, određivanje razmere doza između vrsta moguće je izvesti upotrebom dobro poznatih postupaka u ovoj oblasti (npr. Mordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res.8:1351).
[0218] Različiti sistem isporuke su poznati moguće ih je koristiti da bi se isporučila farmaceutska supstanca, npr. enkapsulacija lipozoma, mikročestica, mikrokapsula, rekombinantne ćelije koje su sposobne da izraze mutant viruse, receptorom posredovana endocitoza (videti, npr. Wu et al., 1987, J. Biol. Chem.262:4429-4432). Metode uvođenja obuhvataju, ali se ne ograničavaju na, intradermalnu, intramuskularnu, intraperitonealnu, intravenoznu, potkožnu, intranazalnu, epiduralnu, i druge rute. Supstancu je moguće isporučiti bilo kojom prikladnom rutom, na primer infuzijom ili bolusnom injekcijom, apsorpcijom kroz obloge epitela ili sluzokože (npr. oralna sluzokoža, sluzokoža rektuma i sluzokoža creva, itd.) i moguće ih je isporučiti zajedno sa drugim biološki aktivnim agensima. Isporuka može biti sistemska ili lokalna.
[0219] Farmaceutsku supstancu je moguće isporučiti potkožno ili intravenozno sa standardnom iglom i špricem. Pored toga, u vezi sa potkožnom isporukom, uređaj za isporuku u vidu olovke ima gotove primene za isporuku farmaceutske supstance. Takav uređaj za isporuku u vidu olovke može biti ponovo korišćen ili za jednokratnu upotrebu. Uređaj za isporuku u vidu olovke za ponovnu upotrebu generalno koristi zamenjivu patronu koja sadrži farmaceutsku supstancu. Pošto se cela farmaceutska supstanca u patroni isporuči i patrona se isprazni, prazna patrona može lako da se baci i zameni novom patronom koja sadrži tu farmaceutsku supstancu. Uređaj za isporuku u vidu olovke moguće je ponovo koristiti. Kod uređaja za isporuku u vidu olovke za jednokratnu upotrebu, ne postoji patrona koju je moguće zameniti. Pored toga, uređaj za isporuku u vidu olovke za jednokratnu upotrebu se isporučuje prethodno napunjen sa farmaceutskom supstancom držanom u rezervoaru sa uređajem. Pošto se iz rezervoara isprazni farmaceutska supstanca, ceo uređaj se odloži u smeće.
[0220] Brojni uređaji u vidu olovke za ponovnu upotrebu i uređaji za isporuku u vidu autoinjektora imaju primene u potkožnoj isporuci farmaceutske supstance iz ovog pronalaska. Primeri obuhvataju, ali se ne ograničavaju na AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), DISETRONIC™ olovku (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Switzerland), HUMALOG MIX 75/25™ olovku, HUMA- LOG™ olovku, HUMALIN 70/30™ olovku (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN™ I, II i III (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), BD™ olovku (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™, olovku OPTICLIK™ (sanofi-aventis, Frankfurt, Germany) da pomenemo samo neke. Primeri uređaja za jednokratnu isporuku kao što su olovke ili koji imaju primenu u potkožnoj isporuci farmaceutske supstance obuhvataju, ali se ne ograničavaju na SOLOSTAR™ olovku (sanofi-aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk), i KWIKPEN™ (Eli Lilly), SURECLICK™ Autoinjector (Amgen, Thousand Oaks, CA), PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Germany), EPIPEN (Dey, L.P.), i HUMIRA™ Pen (Abbott Labs, Abbott Park, IL) da pomenemo samo neke.
[0221] U izvesnim situacijama, farmaceutsku supstancu moguće je isporučiti u sistemu sa kontrolisanim ispuštanjem. U jednom izvođenju, moguće je koristiti pumpu (videti Langer, supra; Sefton (1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng.14:201). U drugom izvođenju, moguće je koristiti polimerne materijale; videti, Medical Applications of Controlled Release (Medicinske primene kontrolisanog otpuštanja), Langer and Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida. U još jednom izvođenju, sistem sa kontrolisanim otpuštanjem moguće je postaviti u blizinu cilja te supstance, čime se zahteva samo frakcija sistemske doze (videti, npr. Goodson, 1984, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138). Drugi sistemi sa kontrolisanim otpuštanjem u pregledu koji je dao Langer (Other controlled release systems are discussed in the review by Langer, 1990, Science 249:1527-1533).
[0222] Preparati koje je moguće ubrizgati mogu obuhvatiti oblike doze za intravenozne, potkožne, intrakutane i intramuskularne injekcije, infuzije kap po kap, itd. Ovi preparati koje je moguće ubrizgati moguće je dobiti opšte poznatim metodama. Na primer, preparate koje je moguće ubrizgati moguće je pripremiti, npr. rastvaranjem, suspendovanjem ili emulzifikovanjem antitela ili njegove soli opisane gore u sterilnoj vodenoj podlozi ili u uljnoj podlozi koja se uobičajeno koristi za injekcije. Kao podloga vodenog rastvora za injekcije, postoje, na primer, fiziološki slani rastvor, izotonični rastvor koji sadrži glukozu i druge pomoćne agense, itd., koje je moguće koristiti u kombinaciji sa odgovarajućim agensom za rastvaranje kao što je alkohol (npr. etanol), polialkohol (npr. propilen glikol, polietilen glikol), nejonski surfaktant [npr. polisorbat 80, HCO-50 (polioksietilen (50 mol) adukt hidrogenisanog ricinusovog ulja)], itd. Kao uljna podloga, koriste se, npr. susamovo ulje, ulje zrna soje, itd., koje je moguće koristiti u kombinaciji sa agensom rastvaranja kao što je benzil benzoat, benzil alkohol, itd. Injekcija se dakle priprema poželjno napunjena u odgovarajućoj ampuli.
[0223] Kao pogodnost, farmaceutske supstance za oralnu i parenteralnu upotrebu opisane gore u tekstu se dobijaju u doziranim oblicima u jediničnoj dozi pogodnoj da odgovara dozi aktivnih sastojaka. Takvi oblici doze u jediničnoj dozi obuhvataju, na primer, tablete, pilule, kapsule, injekcije (ampule), supozitorije, itd. Količina gore pomenutog antitela sadržanog je generalno oko 5 do oko 500 mg po obliku doze u jediničnoj dozi; posebno u obliku injekcije, gore pomenuto antitelo je sadržano u oko 1 do oko 100 mg, u oko 10 do 250 mg druge oblike doze.
Terapijske upotrebe molekula koji vezuju antigen
[0224] Ovaj opis obuhvata postupke koji obuhvataju isporuku subjektu kom je potrebno terapijske supstance koja obuhvata antitelo anti-CD3 ili bispecifični molekul koji vezuje antigen koji specifično vezuje CD3 i ciljni antigen (npr. CD20). Terapijska supstanca može obuhvatiti bilo koje od antitela ili bispecifičnih molekula koji vezuju antigen kako je ovde opisano i farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač. Kako je ovde korišćeno, izraz "subjekat kom je potrebno" znači humanu ili nehumanu životinju koja ispoljava jedan ili više simptoma ili indikacija kancera (npr. subjekat koji izražava ekspresiju tumora ili boluje od bilo kog od ovde dole u tekstu opisanih kancera), ili koji bi na drugi način osetio poboljšanje od inhibicije ili smanjenja aktivnosti CD20 ili osiromašenja CD20+ B ćelija ili regresije tumora CD20+B ćelije.
[0225] Antitela i bispecifični molekuli koji vezuju antigen i koji su ovde opisani (i terapijske supstance koje obuhvataju iste) su korisni, između ostalog, za lečenje bilo koje bolesti ili poremećaja za koje bi bili korisni stimulisanje, aktivacija i/ili ciljanje odgovora imunog sistema. Specifično, bispecifični molekuli koji vezuju antigen anti-CD3/anti-CD20 ovog pronalaska mogu biti korišćeni za lečenje, sprečavanje i/ili poboljšanje bilo koje bolesti ili poremećaja povezanog sa ili posredovanog CD20 ekspresijom ili aktivnošću ili proliferacijom CD20+ B ćelija. Mehanizam dejstva kojim je terapijske postupke iz ovog pronalaska moguće postići obuhvata ubijanje ćelija koje imaju ekspresiju CD20 u prisustvu ćelija efektora, na primer, apoptozom, fagocitozom, ili kombinacijom dva ili više ovih mehanizama ili sličnim citotoksičnim mehanizmima. Ćelije koje eksprimuju CD20 koje je moguće inhibirati ili ubiti upotrebom bispecifičnih molekula koji vezuju antigen iz ovog pronalaska obuhvataju, na primer, tumorogene B ćelije.
[0226] Smanjenje opterećenosti tumorom ili regresije tumora obuhvata delimični ili potpuni nestanak tumora ili više tumora kod nekog subjekta. Jasno je da regresija tumora predstavlja trend prema nižoj opterećenosti tumorom ili manje ozbiljnom stanju bolesti. Kao takva, regresija je progresivna eliminacija smanjenja merljivih maligniteta u organizmu, uključujući pad u veličini tumora i/ili smanjenje u broju tumora. Smanjenje razvoja tumora obuhvata delimičnu ili potpunu inhibiciju ili potiskivanje daljeg ili novog rasta tumora.
[0227] Molekuli koji vezuju antigen iz ovog pronalaska mogu biti korišćeni da ciljaju ili leče, npr. primarne i/ili metastazirane tumore koji nastaju u mozgu i moždanim opnama, orofarinksu, plućima i bronhijalnom stablu, gastrointestinalnom traktu, muškom i ženskom reproduktivnom traktu, mišiću, kosti, koži i izraslinama, vezivnom tkivu, slezini, imunom sistemu, ćelijama koje formiraju krv i koštanu srži, jetri i urinarnom traktu, i specijalnim senzornim organima kao što je oko. U izvesnim izvodjenjima, bispecifični molekuli koji vezuju antigen iz ovog pronalaska se koriste da leče jedan ili više od sledećih kancera: karcinom renalne ćelije, pankreasni karcinom, kancer dojke, kancer glave i vrata, kancer prostate, maligni gliomi, osteosarkomi, kolorektalni kancer, gastritični kancer (npr. gastični kancer sa pojačanjem prelaza mezenhimnog epitela (MET)), maligni mezoteliom, višestruki mijelom, kancer jajnika, sitnoćelijski kancer pluća, nesitnoćelijski kancer pluća, sinovijalni sarkom, kancer tiroide, ili melanom. Prema određenim primerima izvođenja, bispecifični molekuli koji vezuju antigen iz ovog pronalaska se koriste za lečenje kancera B ćelije kod subjekta (npr. Hodžkinov limfom, ne-Hodžkinov limfom [NHL], limfoblastična leukemija/limfom prekursora B ćelije, neoplazme zrele B ćelije, limfocitna leukemija/mali limfocitni limfom hronične B ćelije, prolimfocitna leukemija, limfoplazmacitni limfom, limfom ćelije plašta, folikularni limfom, limfom centra folikule kože, limfom B ćelije marginalne zone, leukemija dlakave ćelije, difuzni limfom velike B ćelije, Burkitov (Burkitt) limfom, plazmacitom, mijelom ćelije plazme, limfoproliferativni poremećaj posle transplantacije, Valdenstromova (Waldenstrom) makroglobulinemija, i anaplastični limfom velike ćelije).
[0228] Bispecifični molekuli koji vežu antigen anti-CD3/anti-CD20 ovog pronalaska su isporučeni u količini dovoljnoj da se smanji opterećenje tumorom, proizvede regresija tumora, inhibira rast tumora ili smanji razvoj tumora kod subjekta. U drugim primerima izvodjenja, isporučena količina je između oko 0,001 mg/kg do oko 1 mg/kg. Isporučena količina je oko 0,4 mg/kg. Isporučena količina može je oko 0,04 mg/kg. Isporučena količina je oko 0,004 mg/kg.
[0229] Prema izvesnim izvođenjima ovog pronalaska, bispecifični molekuli koji vezuju antigen se koriste za lečenje pacijenat pod uticajem limfoma B ćelije (npr. NHL) koja je otporna na, ili nepotpuno odgovara na terapiju sa anti-CD20 (npr. otporna je na terapiju rituksimabom). Prema drugim srodnim izvođenjima iz ovog pronalaska, obezbeđeni su postupci koji uključuju primenu anti-CD3 / anti-CD20 bispecifičnog molekula koji veže antigen, kao što je ovde opisano, na pacijenta koji je pogođen sa limfomom B ćelije (npr. NHL) koji je neosetljiv na anti-CD20 terapiju (npr. pacijent sa tumorom neosetljivim na rituksimab ili sa relapsom ili neosetljivim limfomom B ćelije). Analitički/dijagnostički postupci poznati u ovoj oblasti, kao što je skeniranje tumora, itd. mogu biti korišćeni da bi se uverili da pacijent ima tumor koji je otporan na, nepotpuno odgovara na, ili je neosetljiv na samo jednu terapiju anti-CD20.
[0230] Ovaj opis takođe obuhvata postupke za lečenje rezidualnog kancera kod subjekta. Kako je ovde korišćen, pojam "rezidualni kancer" znači postojanje ili upornost jedne ili više ćelija kancera kod subjekta posle lečenja terapijom protiv kancera.
[0231] Prema izvesnim varijantnim rešenjima, ovaj opis obezbeđuje postupke za lečenje bolesti ili poremećaja povezanog sa CD20 ekspresijom (npr. limfom B ćeije) koji obuhvata isporuku jednog ili više bispecifičnih molekula koji vezuju antigen opisane ovde na drugom mestu subjektu pošto je subjekat primio anti-CD20 mono-terapiju (npr. posle isporuke farmaceutske supstance koja obuhvata anti-CD20 antitelo kao što je rituksimab). Na primer, ovaj opis obuhvata postupke za lečenje limfoma B ćelije koji obuhvata isporuku bispecifičnog molekula koji vezuje antigen anti-CD3/anti-CD20 pacijentu 1. dana, 2. dana, 3. dana, 4. dana, 5. dana, 6. dana, 1. nedelje, 2. nedelje, 3. nedelje ili 4. nedelje, 2. meseca, 4. meseca, 6. meseci, 8. meseci, 1. godine, ili više pošto je subjekat primio anti-CD20 mono-terapiju (npr., terapija rituksimabom ili terapiju njegovim ekvivalentom).
Kombinovane terapije i formulacije
[0232] Ovaj opis obezbeđuje postupke koji obuhvataju isporuku farmaceutske supstance koja obuhvata bilo koje od kao primer datih antitela i bispecifične molekule koji vezuju antigen opisane ovde u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapijskih agenasa.
Primeri dodatnih terapijskih agenasa koje je moguće kombinovati sa ili isporučiti u kombinaciji sa molekulom koji vezuje antigen iz ovog pronalaska obuhvataju, npr., EGFR antagonist (npr., anti-EGFR antitelo [npr., cetuksimab ili panitumumab] ili inhibitor malog molekula EGFR [npr., gefitinib ili erlotinib]), antagonist nekog drugog člana EGFR familije kao što je Her2/ErbB2, ErbB3 ili ErbB4 (npr., anti-ErbB2, anti- ErbB3 ili anti-ErbB4 antitelo ili inhibitor malog molekula od ErbB2, ErbB3 ili ErbB4 aktivnost), antagonist od EGFRvIII (npr., antitelo koje specifično veže EGFRvlll), cMET anagonist (npr., anti-cMET antitelo), IGF1R antagonist (npr., anti-IGF1R antitelo), B-raf inhibitor (npr., vemurafenib, sorafenib, GDC-0879, PLX-4720), PDGFR-α inhibitor (npr., anti-PDGFR-α antitela), PDGFR-β inhibitor (npr., anti-PDGFR-β antitelo), VEGF antagonist (npr., VEGF-Trap, videti, npr., US 7,087,411 (ovde se takođe pominje kao "protein fuzije koji inhibira VEGF"), anti-VEGF antitelo (npr., bevacizumab), inhibitor kinaze malog molekula od VEGF receptora (npr., sunitinib, sorafenib ili pazopanib)), DLL4 antagonist (npr., anti-DLL4 antitelo je opisano u US 2009/0142354), Ang2 antagonist (npr., anti-Ang2 antitelo opisano u US 2011/0027286 kao što je H1H685P), FOLH1 antagonist (npr., anti-FOLH1 antitelo), PRLR antagonist (npr., anti-PRLR antitelo), STEAP1 ili STEAP2 antagonist (npr., anti-STEAP1 antitelo ili anti-STEAP2 antitelo), TMPRSS2 antagonist (npr., anti-TMPRSS2 antitelo), MSLN antagonist (npr., anti- MSLN antitelo), CA9 antagonist (npr., anti-CA9 antitelo), uroplakin antagonist (npr., anti-uroplakin antitelo), anti-CTLA4 antitelo (npr., ipilimumab (MDX-010)), monovalentni CD20 antagonist (npr., monovalentno anti-CD20 antitelo kao što je rituksimab), itd.
[0233] Drugi agensi koje je moguće korisno isporučiti u kombinaciji sa molekulima koji vezuju antigen iz ovog pronalaska obuhvataju aktivatore ili inhibitore imunog sistema. Izvesni aktivatori ili inhibitori imunog sistema su aktivatori citokina ili inhibitori, uključujući jedinjenja i antitela malog molekula koji se vežu na citokine kao što su IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, ili na njihove odgovarajuće receptore. Farmaceutske supstance (npr. farmaceutske supstance koje obuhvataju kao što je ovde opisano bispecifčni molekul koji vezuje antigen anti-CD3/anti-CD20) mogu takođe da budu isporučeni kao deo terapijskog režima koji obuhvata jednu ili više terapijskih kombinacija izabranih iz "ICE": ifosfamida (npr. Ifex®), karboplatina (npr. Paraplatin®), etopozida (npr. Etopophos®, Toposar®, VePesid®, VP-16); "DHAP": deksametazon (npr. Decadron®), citarabin (npr. Cytosar-U®, citozin arabinozid, ara-C), cisplatin (npr. Platinol®-AQ); i "ESHAP": etopozid (npr. Etopophos®, Toposar®, VePesid®, VP-16), metilprednizolon (npr. Medrol®), citarabin u visokoj dozi, cisplatin (npr. Platinol®-AQ).
[0234] Ovaj pronalazak takođe obuhvata terapijske kombinacije koje obuhvataju bispecifično antitelo iz ovog pronalaska i inhibitor jednog ili više od VEGF, Ang2, DLL4, EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4, EGFRvlll, cMet, IGF1R, B-raf, PDGFR-α, PDGFR-β, FOLH1, PRLR, STEAP1, STEAP2, TMPRSS2, MSLN, CA9, uroplakina, ili bilo koji od gore pomenutih citokina, pri čemu je taj inhibitor aptamer, antisens molekul, ribozim, siRNK, peptitelo, nanotelo ili fragment antitela (npr. Fab fragment; F(ab’)2 fragment; Fd fragment; Fv fragment; scFv; dAb fragment; ili drugi molekuli dobijeni genetskim inženjeringom, kao što su diatela, triatela, tetratela, minitela i minimalne jedinice prepoznavanja). Molekule koji vezuju antigen iz ovog pronalaska je takođe moguće isporučiti i/ili koformulisati u kombinaciji sa antivirusnim lekovima, antibioticima, analgeticima, kortikosteroidima i/ili NSAID. Molekuli koji vezuju antigen iz ovog pronalaska mogu takođe da budu isporučeni kao deo režima lečenja koji takođe obuhvata terapiju zračenja i/ili uobičajenu hemoterapiju.
[0235] Dodatne terapijski aktivne komponente moguće je isporučiti neposredno pre, istovremeno sa, ili kratko posle isporuke molekula koji vezuje antigen iz ovog pronalaska (za potrebe ovog opisa, takvi režimi isporuke se smatraju isporukom molekula koji vezuje antigen "u kombinaciji sa" dodatnom terapijski aktivnom komponentom).
[0236] Ovaj pronalazak obuhvata farmaceutske supstance u kojima je bispecfifično antitelo iz ovog pronalaska koformulisano sa jednom ili više dodatnih aktivnih komponenata kako je opisano ovde na drugom mestu.
Režimi isporuke
[0237] Prema izvesnim primerima, više doza molekula koji vezuje antigen (npr. anti-CD3 antitelo ili bispecifični molekul koji vezuje antigen koji se specifično veže CD20 i CD3) može biti isporučen subjektu tokom definisanog vremenskog toka. Postupci prema ovom varijantnom rešenju obuhvataju sekvencijalnu isporuku subjektu više doza molekula koji vezuje antigen. Kako je ovde korišćeno, "isporučivanje u sledu" znači da se svaka doza molekula koji vezuje antigen isporuči subjektu u različitoj tački u vremenu, npr. različitim danima odvojenim unapred utvrđenim intervalom (npr., sati, dani, nedelje ili meseci). Ovaj pronalazak uključuje postupke koji obuhvataju isporuku u sledu pacijentu jedne početne doze molekula koji vezuje antigen, posle čega sledi jedna ili više sekundarnih doza molekula koji vezuje antigen, i opciono sledi jedna ili više tercijarnih doza molekula koji vezuje antigen.
[0238] Pojmovi "inicijalna doza," "sekundarne doze," i "tercijarne doze," se odnosi na privremenu sekvencu isporuku molekula koji vezuje antigen ovog pronalaska. Dakle, "početna doza" je doza koja se isporučuje na početku režima terapije (takođe se pominje kao "polazna doza"); ili "sekundarne doze" su doze koje se isporučuju posle početne doze; i "tercijarne doze" su doze koje se isporučuju posle sekundarnih doza. Početna, sekundarna, i tercijarna doza mogu sve da sadrže istu količinu molekula koji vezuje antigen, ali generalno mogu da se razlikuju jedna od druge u smislu učestalosti isporuke. Kod izvesnih primera, međutim, količina molekula koji vezuje antigen sadržanog u početnoj, drugoj i/ili tercijarnoj dozi se razlikuje jedna od drugog (npr. podešena na veću ili manju kako je prikladno) tokom lečenja. U izvesnim primerima, dve ili više (npr.2, 3, 4, ili 5) doza se isporučuje na početku režima lečenja kao "udarne doze" posle čega slede naknadne doze koje se isporučuju nešto slabijom učestalošću (npr. "doze održavanja").
[0239] U jednom primeru datom samo kao primer, svaka sekundarna i/ili tercijarna doza se isporučuje 1 do 26 (e.g., 1, 11/2, 2, 21/2, 3, 31/2, 4, 41/2, 5, 51/2, 6, 61/2, 7, 71/2, 8, 81/2, 9, 91/2, 10, 101/2, 11, 111/2, 12, 121/2, 13, 131/2, 14, 141/2, 15, 151/2, 16, 161/2, 17, 171/2, 18, 181/2, 19, 191/2, 20, 201/2, 21, 211/2, 22, 221/2, 23, 231/2, 24, 241/2, 25, 251/2, 26, 261/2, ili više nedelja posle neposredno prethodne doze. Fraza," neposredno prethodna doza,'' kako se ovde koristi, znači, u nizu više isporuka, dozu molekula koji veže antitelo koje se isporučuje pre tehnike isporuke prve sledeće doze u sekvenci bez interventnih doza.
[0240] Postupci prema ovom varijantnom rešenju iz ovog opisa mogu da obuhvate isporuku pacijentu izvesnog broja sekundarnih i/ili tercijarnih doza molekula koji vezuje antigen (npr. bispecifičnog molekula koji vezuje antigen koji specifično veže CD20 i CD3). Na primer, u izvesnim slučajevima, pacijentu se isporučuje samo jedna sekundarna doza. U drugim primerima, dve ili više (npr. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ili više) sekundarnih doza se isporučuje pacijentu. Slično, u izvesnim izvođenjima, samo jedna tercijarna doza se isporučuje pacijentu. U drugim primerima, dve ili više (npr. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ili više) tercijarnih doza se isporučuje pacijentu.
[0241] U primerima koji obuhvataju više sekundarnih doza, svaku sekundarnu dozu moguće je isporučiti istom učestalošću kao druge sekundarne doze. Na primer, svaku sekundarnu dozu moguće je isporučiti pacijentu 1 do 2 nedelje posle neposredno prethodne doze. Slično, u primerima koji obuhvataju tercijarne doze, svaku tercijarnu dozu moguće je isporučiti istom učestalošću kao druge tercijarne doze. Na primer, svaku tercijarnu dozu moguće je isporučiti pacijentu 2 do 4 nedelje posle neposredno prethodne doze. Alternativno, učestalost kojom se sekundarne i/ili tercijarne doze isporučuju pacijentu mogu varirati tokom režima terapije. Učestalost isporuke, može da podesi lekar tokom terapije, zavisno od individualnih potreba pacijenta posle kliničkog ispitivanja.
Dijagnostičke upotrebe antitela
[0242] Anti-CD3xCD20 antitela iz ovog pronalaska moguće je takođe koristiti da bi se detektovale i/ili izmerile ćelije koje eksprimuju CD3, ili CD3 u nekom uzorku, npr. za dijagnostičke svrhe. Na primer, anti-CD3xCD20 antitelo, ili njegov fragment, moguće je koristiti da bi se dijagnostikovalo stanje ili bolest koju karakteriše nepravilna ekspresija (npr. prekomerna ekspresija, nedovoljna ekspresija, nedostatak ekspresije, itd.) CD3. Primeri dijagnostičkih ogleda za CD3 mogu obuhvatiti, npr. dovođenje u kontakt uzorka, dobijenog od pacijenta, sa anti-CD3xCD20 antitelom iz ovog opisa, pri čemu je to antitelo označeno sa detektibilnom oznakom ili reporter molekulom. Alternativno, neoznačeno anti-CD3xCD20 antitelo je moguće koristiti u dijagnostičkim primenama u kombinaciji sa sekundarnim antitelom koje je samo detektibilno označeno. Detektibilna oznaka ili molekul reporter može biti radioizotop, kao što je<3>H,<14>C,<32>P,<35>S, ili<125>I; fluorescentni ili hemiluminescentni deo, kao što je fluorescein izotiocijanat, ili rodamin; ili enzim kao što je alkalna fosfataza, beta-galaktozidaza, peroksidaza rena, ili luciferaza. Specifični ogledi uzeti kao primer koje je moguće koristiti da bi se detektovao ili izmerio CD3 u uzorku obuhvataju sa enzimom povezan ogled imunosorbensa (ELISA), radioimunotest (RIA), razvrstavanje ćelija aktiviranih fluorescencijom (FACS).
[0243] Anti-CD3xCD20 antitela iz ovog opisa moguće je takođe koristiti da bi se detektovao i/ili izmerio CD20, ili CD20 koji eksprimuju ćelije u nekom uzorku, ili da bi se dijagnostikovalo stanje ili bolest koju karakteriše nepravilna ekspresija (npr. prekomerna ekspresija, nedovoljna ekspresija, odsustvo ekspresije, itd.) CD20, analogno.
[0244] Uzorci koje je moguće koristiti u CD3 ili CD20 dijagnostičkim ogledima prema ovom opisu obuhvataju bilo koji uzorak tkiva ili fluida koji je moguće dobiti od pacijenta koji sadrži količine CD3 i/ili CD20 proteina, Ili njihove fragmente koje je, pod normalnim ili patološkim uslovima, moguće detektovati. Generalno, nivoi CD3 ili CD20 u specifičnom uzorku dobijenom od zdravog pacijenta (npr. pacijent koji nije pogođen bolešću ili stanjem povezanim sa nenormalnim nivoima ili aktivnošću CD3 ili CD20) će biti izmereni da bi se početno uspostavio polazni, ili standardni nivo CD3 ili CD20. Ovaj nivo polazne vrednosti CD3 ili CD20 moguće je, zatim, uporediti naspram nivoa CD3 izmerenih u uzorcima dobijenim od pojedinaca za koje se sumnja da imaju sa CD3 ili CD20 srodnu bolest ili stanje.
PRIMERI
[0245] Primeri u nastavku su izneti da bi se prosečnom stručnjaku u ovoj oblasti dao potpuno objašnjenje i opis kako da pravi i koristi postupke i supstance iz ovog pronalaska, i nisu predviđeni da ograniče obim predmeta koji ovi pronalazači smatraju svojim pronalaskom. Nastojalo se da se postigne preciznost u pogledu korišćenih brojeva (npr. količina, temperature, itd.) ali neke eksperimentalne greške i odstupanja treba uzeti u obzir. Osim ako nije drugačije navedeno, delovi su delovi prema težini, molekularna težina je prosečna molekularna težina, temperatura se smatra da je u stepenima Celzijusove skale, i pritisak je na ili blizu atmosferskog.
Primer 1. Generisanje anti-CD3 i anti-CD20 antitela
[0246] Nekoliko postupaka je poznato za izolovanje anti-CD3 ili anti-CD20 antitela. Potpuno humana anti-CD3 antitela korišćena u sledećim primerima su izolovana direktno iz na antigen pozitivnih B ćelija bez fuzije na ćelije mijeloma, kako je opisano u US 2007/0280945A1.
[0247] Dodatne primere anti-CD3 antitela je moguće koristiti u ovim postupcima, i opis takvih antitela i biološka svojstva takvih anti-CD3 antitela su opisana u PCT međunarodnoj prijavi br. PCT/US13/60511, podnetoj 19. septembra 2013. i objavljenoj kao WO2014/047231. Primeri anti-CD20 antitela i bioloških svojstava takvih anti-CD20 antitela su opisani u US 7,879,984 i PCT međunarodnoj prijavi br. PCT/US13/60511, podnetoj 10. septembra 2013. i objavljenoj kao WO2014/047231.
[0248] Anti-CD20 antitelo i njegov postupak pravljenja antitela korišćen da se konstruišu bispecifična antitela iz ovog primera je kao što je opisano u US 7,879,984.
[0249] Identifikatori sekvence aminokiseline promenljivih regiona teškog i lakog lanca i CDR korišćenih da se konstruiše anti-CD3 krak koji vezuje antigen i anti-CD20 krak vezivanja bispecifičnih antitela iz ovog pronalaska su izneti u Tabeli 1. Odgovarajući identifikatori sekvence nukleinske kiseline su izneti u Tabeli 2.
Tabela 1: Identifikatori sekvence aminokiseline (SEK ID BR)
Tabela 2: Identifikatori sekvence nukleinske kiseline (SEK ID BR)
Primer 2. Generisanje bispecifičnih antitela koja vezuju CD3 i CD20
[0250] Bispecifična antitela obuhvataju anti-CD3 specifični domen vezivanja i anti-CD20 specifični domen vezivanja su konstruisani sa gornjim sekvencama upotrebom standardnih metodologija pri čemu su teški lanac i poznati laki lanac iz anti-CD3 antitela kombinovani sa teškim lancem iz anti-CD20 antitela.
[0251] Kao takva, bispecifična antitela kreirana u skladu sa ovim primerom obuhvataju dva odvojena domena koja vezuju antigen (tj., krake vezivanja). Prvi domen koji vezuje antigen obuhvata promenljivi region teškog lanca izveden iz anti-CD20 antitela ("CD20-VH"), uparenog sa promenljivim regionom lakog lanca iz anti-CD3 antitela ("CD3-VL"). CD20-VH/CD3-VL uparivanje stvara domen koji vezuje antigen koji specifično prepoznaje CD20. Drugi domen koji vezuje antigen obuhvata promenljivi region teškog lanca izveden iz anti-CD3 antitela ("CD3-VH"), uparenog sa promenljivim regionom lakog lanca iz anti-CD3 antitela ("CD3-VL"). CD3-VH/CD3-VL uparivanje stvara domen koji vezuje antigen koji specifično prepoznaje CD3. Isti CD20-VH je korišćen u svim bispecifičnim antitelima stvorenim u ovom uzorku i označen je "CD20-VH-A".
[0252] Konstantni domen teškog lanca divljeg tipa (CH) za svaki teški lanac je zamenjen himernim CH rekombinantnim tehnikama. CH jednog kraka vezivanja (npr. anti-CD3 krak vezivanja) sadrži mutaciju u CH3 regionu CH koja olakšava izolaciju bispecifičnog.
[0253] Sažet pregled delova komponenata različitih bispecifičnih antitela napravljenih u skladu sa ovim primerom je iznet u Tabeli 3 i Tabeli 4.
Tabela 3: Identifikatori sekvence aminokiseline
T l 4: I nifik ri kv n n kl in k ki lin
[0254] Tabele 5 i 6 daju identifikatore sekvence aminokiseline za različite promenljive regione teškog lanca (Tabela 5) i promenljive regione lakog lanca (Tabela 6) sa njihovim odgovarajućim CDR bispecifičnih antitela iz ovog primera.
Tabela 5: Identifikatori sekvence aminokiseline teškog lanca
T l : I nifik ri kv n min ki lin l k l n
[0255] Pored toga, Tabele 7 i 8 daju identifikatore sekvence za sekvence nukleotida koje kodiraju različite promenljive regione teškog lanca (Tabela 7), konstantnog regiona teškog lanca, i promenljivog regiona lakog lanca (Tabela 8) sa za njih odgovarajućim CDR bispecifičnih antitela iz ovog primera.
Tabela 7: Identifikatori sekvence nukleinske kiseline teškog lanca
Tabela 8: Identifikatori sekvence nukleinske kiseline lakog lanca
[0256] Pored gore u tekstu opisanih bispecifičnih antitela, sledeća kontrolna antitela su takođe korišćena u izvesnim eksperimentima iznetim u primerima koji slede:
[0257] Kontrolno antitelo 1: Monoklonsko antitelo "OKT-3" naspram antigena na površini humane T ćelije iznetih u US 4,361,549 i dostupnih iz hibridoma CRL-8001 (American Type Culture Collection, Manassas, VA).
[0258] Kontrolno antitelo 2: Antitelo "SP34" reaktivno protiv epsilon lanca od T3 kompleksa na humanim T limfocitnim ćelijama, dostupnim iz BD Pharmagen, kat # 55052.
[0259] Kontrolno antitelo 3: Anti-CD20 terapijsko antitelo, sa sekvencama teškog i lakog lanca od Rituxan® (Rituksimab) kako je opisano u US 5,736,137.
[0260] (Kontrolno) Antitelo 4: Takođe poznato kao CD3xCD20 antitelo divljeg tipa Fc (wtFc), ovo antitelo je napravljeno analogno gornjim postupcima koji imaju anti-CD20 krak koji obuhvata HCVR/LCVR par sekvence aminokiseline od SEK ID BR: 2/18 (HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 sekvenci aminokiseline koje imaju SEK ID BR: 4-6-8-20-22-24), i divlji tip IgG1 CH regiona (SEK ID BR: 45); i anti-CD3 krak koji obuhvata HCVR/LCVR par sekvence aminokiseline iz SEK ID BR: 10/18 (HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 sekvenci aminokiseline koje imaju SEK ID BR: 12-14-16-20-22-24), i CH region IgG1 divljeg tipa sa 2 modifikacije aminokiseline (SEK ID BR: 48) u CH3 domenu radi lakše izolacije. CD3xCD20 antitelo-wtFc (antitelo 4) je moguće pomenuti kao odgovarajuće kontrolno antitelo koje ima Fc domen IgG1 divljeg tipa (tj. odgovara domenima koji vezuju antigen od CD3xCD20- himernih Fc antitela iz ovog pronalaska), u svrhe poređenja funkcija efektora anitela, ili druga svojstva, na antitela koja imaju drugačiji Fc domen sekvence ili strukture.
[0261] Kontrolno antitelo 5: Anti-FelD1 monoklonalno antitelo veže mačji antigen bez unakrsne reaktivnosti sa humanim CD20 ili CD3. Ova kontrola IgG1 nespecifičnog antitela je dobijena postupcima opisanim u PCT objavi br. WO2013/166236, objavljenoj 7. novembra 2013.
[0262] Kontrolno antitelo 6: Anti-FelD1 domen koji veže antigen, kao što je opisano u PCT objavi br. WO2013/166236, je projektovano kako je ovde opisano da bi sadržalo Fc domen himernog IgG4 analogno sa Ab 1. Kontrolno Ab 6 nema unakrsnu reaktivnost sa humanim CD20 ili CD3, ali ima sličnu funkciju efektora kao Ab 1.
Primer 3. Konstrukcija himernog teškog lanca
[0263] Generisanje himernih teških lanaca, na primer himerni CH IgG4 (SEK ID BR: 26) i himerni CH IgG1 (SEK ID BR: 30), je urađeno upotrebom standardnih tehnika kloniranja. Prvo, himerni IgG4 CH je generisan kroz dvostepeni postupak PCR amplifikacije. Dva PCR fragmenta, fragment 1 i 2, su pojačani upotrebom početnog konstrukta vektora pR001 koji obuhvata divlji tip hIgG4 CH DNK upotrebom parova početnica prirubnih CH regionu, P1-P2 i P3-P4, prema opisanom redosledu. Videti Tabelu 9 dole u tekstu.) Početnice su uvele i poželjnu IgG2 sekvencu donjeg zgloba (koja kodira SEK ID BR: 52) i prirubna restrikciona mesta u te fragmente. Ova dva fragmenta su zatim spojena korišćenjem PCR početnica P2 i P4. Sekvenca dobijena kao rezultat je umetnuta u pR001 preko Xho1-Not1 mesta restrikcije koja generišu konstrukt vektora pR002 koji sadrži himerni IgG4 CH koji ima sekvencu donjeg zgloba IgG2. Sekvenca je potvrđena upotrebom početnica P10 i P11.
[0264] Pored toga, CH himerni IgG1 je generisan kroz PCR amplifikacije iz više koraka. Fragment 1a je generisan upotrebom početnica P2 i P5 (videti Tabelu 9 dole u tekstu) iz uzorka pR85503 (koji sadrži divlji tip DNK CH humanog IgG1). Fragment 2a je pojačan sa početnicama P6 i P8 upotrebom pR002 (koja obuhvata DNK CH himernog IgG4) kao šablon. Fragment 3 je napravljen upotrebom početnica P7 i P9 iz šablona pR003 (DNK CH divlji tip hIgG1; SEK ID BR: 45). Fragmenti 1a i 2a su spojeni upotrebom početnica P2 i P8, koje su generisale Fragment 4. Spajanje fragmenata 2a i 3 upotrebom početnica P6 i P9 je stvorilo Fragment 5. Fragment 4 i 5 su zatim spojeni fuzijom upotrebom početnica P2 i P9. Sekvenca dobijena kao rezultat je umetnuta u pR001 preko Xho1-Not1 mesta restrikcije generisala konstrukt pR004 koji ima IgG1 konstantni region sa IgG2 donjim zglobom IgG2 i CH2 domenom IgG4. Sekvenca je potvrđena upotrebom početnica P10 i P11.
Tabela 9: Početnice za PCR generisanje himernih konstukata nukleinske kiseline CH
Primer 4. CD20 x CD3 bispecifična antitela selektivno vezuju Jurkat, Radži i majmunske T ćelije u poređenju sa monospecifičnim antitelima
[0265] CD3xCD20 antitelo-wtFc (kontrolno antitelo 4) je upoređeno sa monospecifičnim kontrolnim antitelima, kako je izneto u Primeru 2, preko FACS postupka vezivanja za njihovu sposobnost da se vežu na Jurkat (CD3+, CD20 - liniju humane T ćelije), Raji (CD3-, CD20+ liniju humane B ćelije), ili PBMC makaki ćelije ("mkT ćelije").
[0266] FACS podaci su usvojeni upotrebom sledećeg protokola: Ćelije na 2x10<5>po pregradi su inkubirane sa serijski razblaženim antitelima za 30 min na ledu. Posle inkubacije, ćelije su oprane i odgovarajuća sekundarna (Jurkat, RADŽI ćelije) ili koktel sekundarnih antitela (za makaki PBMC) je dodat i inkubiran tokom dodatnih 30 minuta. Posle inkubacije, ćelije su oprane, vraćene u suspenziju u hladnom PBS koji obuhvata 1% BSA i analizirani protočnom citometrijom na BD FACS Canto II. Jurkat i Radži ćelije su usmerene na rasipače bočno i napred dok su T ćelije makaki majmuna takođe usmerene kao populacija CD2+CD4+. EC50 vrednosti za titraciju vezivanja ćelije su određene upotrebom softvera Prism sa vrednostima izračunatim upotrebom 4-parametarske nelinearne regresione analize. Rezultati su prikazani u Tabeli 10.
Tabela 10. EC50 vrednosti vezivanja (molarne) za monospecifična i CD3xCD20 bispecifična antitela
[0267] Kao što je prikazano u Tabeli 10, panel testiranih antitela je pokazao opseg afiniteta vezivanja na različitim linijama ćelija, zavisno od njihovih specifičnosti. Bispecifično kontrolno antitelo 4 je pokazalo sposobnost da veže i humane i makaki ciljne linije. Kontrolno antitelo 4 obuhvata iste anti-CD3xCD20 promenljive regione sa antitelom 1 i antitelom 2 iz ovog pronalaska, međutim ima region CH IgG1 divljeg tipa. Anti-CD3 kontrola 1 (OKT3), anti-CD3 kontrola 2 (SP34), i anti-CD20 kontrola 3 su se vezale na Jurkat ćelije, T ćelije makaki majmuna, i RAJI ćelije, prema opisanom redosledu.
Primer 5. CD20 x CD3 bispecifična antitela sa CH divljeg tipa indukuju citotoksičnost na Raji ćelijama u prisustvu aktiviranih T ćelija
[0268] Sposobnost CD20 x CD3 bispecifičnih antitela da preusmere T ćelijom posredovano ubijanje na Raji ćelije koje eksprimuju CD20 je testirano u in vitro ogledu citotoksičnosti. Pored toga, sposobnost i bispecifičnih i roditeljskih anti-CD3 antitela da ubiju U937 ćelije preko Fc/FcR interakcija je takođe proučavana.
[0269] Ogledi ubijanja kalceina su izvedeni upotrebom sledećeg protokola: Humane i makaki PBMC ćelije su izolovane iznad podloge ficoll-Plaque ili preko Lympholyte Mammal podloge za odvajanje ćelija, prema opisanom redosledu. Izolovane PBMC ćelije su aktivirane tokom nekoliko dana sa podlogom koja sadrži rekombinantne humane IL-2 (30 U/ml) i perlice za aktivaciju T ćelije (anti-CD3/CD28 za humani PBMC, anti-CD2/CD3/CD28 za PBMC ćelije makaki majmuna).
[0270] Ciljne ćelije (Raji za ubijanje posredovano CD20 ćelijama i U937 za sa FcR posredovano ubijanje) su označene sa kalceinom, i inkubirane sa aktiviranim T ćelijama u odnosu od 10:1 efektora: cilju upotrebom 3-strukih serijskih razblaženja antitela tokom 3 sata na 37°C. Posle inkubacije, ploče su centrifugirane i supernatanti su preneti na providnu crnu ploču sa bistrim dnom za analizu fluorescencijom. EC50 vrednosti su definisane kao molarna koncentracija bispecifičnog antitela koja indukuje 50% citotoksičnost je utvrđena upotrebom Prism. Vrednosti su izračunate upotrebom 4-parametarske nelinearne regresione analize. Rezultati su pregledno prikazani u Tabeli 10.
Tabela 11. EC50 vrednosti za CD20 x CD3-indukovanu citotoksičnost na Raji i U937 ćelijama
[0271] Kao što je poznato u Tabeli 11, bispecifično CD20 x CD3 antitelo koje sadrži anti-CD3 krake specifičane za čoveka i unakrsno reaktivne za makaki majmuna, i CH region IgG1 divljeg tipa, je mogao da specifično preusmeri citotoksičnost na Raji ćelije u prisustvu humanih aktiviranih T ćelija. U prisustvu aktiviranih T ćelija makaki majmuna, Raji su ubijene kada su bili inkubirane sa Kontrolnim Ab 4 bispecifičnim antitelom koje ima anti-CD3 krak koji aktiviraju T ćelije majmuna. I bispecifično antitelo kao i Kontrolno Ab 1 (anti-CD3 mAb) su pokazali aktivnost u U937 Fc/FcR zavisan ogled ubijanja. Ovu aktivnost bi bilo moguće blokirati dodavanjem blokirajućeg nespecifičnog humanog IgG u reakciju (Pocaci nisu prikazani).
Primer 6. CD20 x CD3 bispecifična antitela koja obuhvataju himerne CH regione pokazuju smanjenu funkciju efektora u CDC ogledu
[0272] CD20xCD3 bispecifična antitela sa himernim CH regionima (antitelo 1 i antitelo 2), kako je opisano gore u tekstu u Primeru 2, su projektovani da bi promenili ili smanjili funkciju efektora. Upoređeno sa antitelima koja obuhvataju konstantni region teškog lanca divljeg tipa od IgG1 izotipa (kontrolno Ab 4), supstitucije aminokiseline u CH regionu mogu da spreče sposobnost Ig Fc da se veže na njegov(e) receptor(e). Zato je i moguće promeniti signalni odgovor i odgovor imunog sistema, kao što je aktivacija ili fagocitoza. Ispitano je dejstvo modifikacija aminokiseline u CH regionu na citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC) (u ovom primeru) i citotoksičnost posredovanu ćelijom zavisnu od antitela (ADCC) funkciju efektora (videti Primer 7).
[0273] Da bi se ispitalo dejstvo antitela 1 i antitela 2 na CDC funkciju efektora, ćelije koje eksprimuju CD20 Raji (ciljne) ćelije (5000/pregradi) ili Daudi ćelije su bile raspoređene u pregrade u prisustvu 5% komplementa humanog seruma. Serijska razblaženja antitela 1, antitela 2 i kontrolnih antitela, počevši od 100nM, su dodavana u ćelije tokom 4 sata na 37°C. Liza ciljne ćelije je određena korišćenjem CytoTox Glo™ kompleta (Promega) i izračunat je procenat citotoksičnost.
[0274] Procenat citotoksičnosti je izračunat korišćenjem jednačine: % citotoksičnost = ((Ls - LSR)/(LMR-LSR))*100% pri čemu je LSR polazna vrednost luminiscencije ciljne ćelije i LMR je maksimalno otpuštanje kalceina iz ćelija lizovanih dgitoninom. EC50 za citotoksičnost je određena korišćenjem Prism softvera (GraphPad). Vrednosti su izračunate korišćenjem 4-parametarske nelinearne regresione analize i prikazane su u Tabeli 12, i na Slikama 5A i 5B.
[0275] CDC aktivnost antitela 1 i antitela 2 protiv Daudi i Raji ćelija je značajno smanjena kada se uporedi sa odgovarajućim antitelom koje ima konstantni region teškog lanca divljeg tipa. Videti Tabela 12, i Slike 5A/B. Primećena je nekakva CDC aktivnost sa antitelom 1 protiv Raji ćelija, međutim, ukupni rezultati pokazuju da himerna antitela montiraju slabije odgovore efektora nego Fc kontrolna antitela IgG1 divljeg tipa.
Tabela 12: CD20xCD3 bispecifična antitela koja obuhvataju himerne CH regione prikazuju smanjenu aktivnost u CDC ogledima koji mere funkciju efektora
Primer 7. CD3xCD20 bispecifična antitela koja obuhvataju himerne CH regione pokazuju smanjenu funkciju efektora u ADCC ogledu
[0276] Da bi se ispitalo dejstvo antitela 1 i antitela 2 naspram bispecifičnog antitela sa CH regionima divljeg tipa (i identičnim promenljivim regionima) na funkciju efektora ADCC, sveže izolovane nestimulisane CD56 pozitivne NK ćelije ili NK92 ćelije projektovane da izraze viši afinitet V alela od FcγRIIIA su raspoređene u pregrade sa kalceinom označenim CD20-pozitivnim Raji ili Daudi ćelijama u prisustvu himernih CH-antitela (antitelo 1 i antitelo 2) i kontrolnim antitelom CH divljeg tipa (Kontrolno antitelo 4). Nadgledano je ispuštanje kalceina iz ciljnih ćelija i utvrđen je procenat citotoksičnosti. Procenat citotoksičnosti i EC50 su izračunate kako je opisano za CDC ogled, gore u tekstu. Rezultati su prikazani u Tabeli 13 i na Slikama 6A i 6B.
[0277] Himerna CH antitela, antitelo 1 i antitelo 2, ne posreduju u ADCC aktivnosti (Tabela 13) protiv Raji ili Daudi ćelija.
Tabela 13: CD3 x CD20 bispecifična antitela koja obuhvataju himerne CH regione prikazuju smanjenu aktivnost u ADCC ogledima koji mere funkciju efektora
Primer 8. Afiniteti vezivanja izvedeni rezonancom površinskog plazmona i kinetičkim konstantama himernih antitela
[0278] Anti-CD3 x anti-CD20 bispecifična antitela koja imaju himerno antitelo 1 i antitelo 2 konstantnog regiona teškog lanca su analizirana tehnologijom rezonance površinskog plazmona (SPR) (Biacore) da bi se odredili njihovi kinetički parametri vezivanja na Fcγ receptore čoveka i makaki majmuna. Izotipne kontrole divljeg tipa, naime wt-IgG1 izotip kontrola i CPPC izotip kontrola wt-IgG4 su testirane na sličan način.
[0279] Ukratko, SPR eksperimenti su izvedeni na 25°C na Biacore T200 instrumentu koji koristi čip obložen karboksimetil dekstranom (CM-5). Mišje monoklonalno anti-pentahistidin antitelo (GE Healthcare) je imobilisano na površini čipa CM-5 senzora upotrebom reakcije pripajanja aminom.140RU-376RU od sa His oznakom FcγR proteina čoveka ili majmuna su registrovani na CM-5 čipu pripajanja anti-penta-histidin aminom i koncentrovani rastvori antitela su ubrizgani na 20 µl/min tokom 2,5 min iznad registrovanih proteina. Odgovor vezivanja mAb je nadgledan i, za receptore slabog afiniteta, izračunata je ravnoteža vezivanja u postojanom stanju. Konstante brzine kinetičkog udruživanja (ka) i razdruživanja (kd) su određene preradom i postavljanjem podataka u model vezivanja 1:1 upotrebom softvera za prilagođavanje krivulje Scrubber 2.0. Konstante ravnoteže (KD) razdruživanja vezivanja i poluživoti razdruživanja (t1/2) su izračunati iz konstanti kinetičke brzine kao: KD (M) = kd / ka; i t1/2 (min) = (In2/(60*kd).
Tabela 14: Parametri kinetičkog vezivanja za divlji tip antitela teškog lanca (wt) i himerna antitela teškog lanca
[0280] Kao što prikazuju rezultati u Tabeli 14, bispecifična antitela antitelo 1 i antitelo 2 ne pokazuju nikakvo vezivanje na humani FcγRI, u poređenju sa antitelima koja imaju divlji tip (wt) hIgG1 ili hIgG4-CPPC CH region, u SPR ogledu. Himerna bispecifična antitela teškog lanca obično prikazuju slabo do nikakvo vezivanje za nekoliko FcRγ humana receptora niskog afiniteta (npr. slabo vezivanje na humani FcRγIIA, FcRγIIB, i nikakvo vezivanje nije detektovano na humanom FcRγI, FcRγIIIA, ili FcRγIIIB) u poređenju sa antitelima sa divljim tipom hIgG1 ili hIgG4-CPPC Fc sekvencom (Tabela 15, dole u tekstu).
Primer 9. Farmakokinetički profil himernih antitela
[0281] Toksikokinetički profil antitela 1 i antitela 2 je procenjen dobijanjem uzoraka krvi iz mužjaka makaki majmuna (3 životinje/terapijskoj grupi) koje su primale jednu 30-minutnu IV infuziju, posle čega je usledio period posmatranja od 12 nedelja. Uzorci krvi za toksikokinetičku analizu ukupnih koncentracija leka u serumu su prikupljeni 5 minuta pre doze i posle doze, i 5, 24, 48, 72 i 168 sati pre doze i posle doze, i 14-og, 21-og, 35-og, 49-og, 66-og i 84-og dana pre doze i posle doze. Uzorci seruma dobijeni kao rezultat su analizirani direktnim sa enzimom povezanih imunosorbensnim ogledom (ELISA) da bi se utvrdilo da je ukupna koncentracija leka od Ab 1 ili Ab 2. Toksikokinetika testiranih artikala je procenjena upotrebom nekompartmentalne analize (Phoenix WinNonLin) da bi se utvrdili farmakokinetički parametri. Rezultati su prikazani u Tabeli 16 (AUC = područje pod koncentracijom vs. krivulja vremena; Cmaks = primećena maksimalna koncentracija u serumu).
Tabela 16: Farmakokinetički profil himernih antitela u serumu makaki majmuna posle jedne intravenozne infuzije makaki majmunima
[0282] Posle jedne intravenozne doze od 1,0 mg/kg od Ab 1 i Ab 2 makaki majmunima, primećene su srednje koncentracije vršne vrednosti (Cmaks) od 33,4 i 26,0 µg/mL, prema opisanom redosledu, i srednje AUC0-168sati vrednosti od 100 i 61,1 dan*ug/mL, prema opisanom redosledu. Očigledni krajnji poluvek je, procenjeno je, između 8,14-14,0 dana od ova dva molekula. Podaci pokazuju da je kontinualno izlaganje Ab 1 i Ab 2 održano kod svih životinja za veći deo perioda posmatranja u trajanju od 12-nedelja i izloženost je bila uporediva u svim tretiranim grupama. Nije primećena nikakva očigledna imunogenost kod ispitanih artikala. Ukupni farmakokinetički profili Ab 1 i Ab 2 su tipični za monoklonalna antitela koja su dozirana makaki majmunima.
Primer 10. CD3 x CD20 bispecifična antitela mogu da osiromaše CD20+ B ćelije kod makaki majmuna sa nižim dozama nego monospecifično antitelo
[0283] Da bi se utvrdila in vivo jačina antitela 1 i kontrolnog antitela 4 CD3xCD20 bispecifična isporuka antitela, promene nivoa CD20+ B ćelija u perifernoj krvi makaki majmuna su ispitane preko FACS posle isporuke anti-CD3xCD20 bispecifičnog antitela u poređenju sa monospecifičnim anti-CD20 antitelom (Kontrolno Ab 3). Studija je izvedena na mužjacima makaki majmunima (Macaca fascicularis) organizovanim u osam doznih grupa od po 3 životinje po doznoj grupi u prema sledećem toku: Grupa 1 je bila placebo grupa (isporuka kontrolnog pomoćnog sredstva); Grupa 2 je primila monospecifično antitelo (Kontrolno Ab 3; rituksan) na 30 mg/kg (30 mg/kg kod majmuna je ekvivalentna humanoj dozi od 375 mg/m2 koja se smatra maksimalnom kliničkom dozom); Grupa 3 je bispecifično CD3xCD20 kontrolno antitelo 4 sa 0,01 mg/kg; Grupa 4 - antitelo 4 sa 0,1 mg/kg; Grupa 5 - antitelo 4 sa 1 mg/kg; Grupa 6 - antitelo 1 sa 0,01 mg/kg; Grupa 7 -antitelo 1 sa 0,1 mg/kg; i Grupa 8 - antitelo 1 sa 1 mg/kg. Krv je uzeta pre doziranja životinja i to -7. dana i -4. dana (pre isporuke određene doze životinjama). Doze leka antitela ili pomoćnog sredstva (placebo) su isporučene putem i.v. infuzije i krv je uzeta posle doziranja 2, 4, i 7 dana. Uzorci krvi su analizirani pomoću FACS za B ćeliju (CD20; Tabela 17) i T ćeliju (CD3, videti dole u tekstu) markeri i apsolutni broj ovih tipova ćelija je utvrđen.
[0284] Ukratko, 100 µl krvi je inkubirano sa 1,5 ml RBC liznim puferskim sredstvom u epruvetama Eppendorf tokom tri minuta. Ćelije su centrifugirane tokom minuta na 0,4xg, oprane 2x sa FACS oprane (PBS+3%FBS), i blokirane tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi sa Fc reagensom za blokiranje. Ćelije su zatim inkubirane tokom 30 minuta na 4°C sa direktno konjugovanim antitelima na hCD45 i CD20 fluorescentnim reagensima. Kvantitativno određivanje podskupova B ćelija (CD20) ili podskupova T ćelije (CD3) je prvo izvedeno korišćenjem heterogenog usmeravanja strategije od CD45 fluorescentnog bojenja i za bočno rasipanje karakterističnu (SSC) demarkaciju (CD45brightSSCdim) da bi se iscrtale populacije belih krvnih ćelija (WBC). Zatim su populacije B ćelije identifikovane kroz upotrebu odgovarajućih fluorescentno označenih antitela (CD20 APC-Cy7). Posle bojenja, ćelije su oprane dva puta pre nego što su preuzele FACS pomoću FACSCanto merača ćelije i analizirane sa softverom FlowJo. Rezultati su prikazani u Tabeli 17 i na Slikama 11A i 11B.
Tabela 17: Broj cirkulišućih CD45, CD20 pozitivnih ćelija u perifernoj krvi majmuna posle terapije
[0285] Kao što je prikazano u Tabeli 17 i na Slici 11A, isporuka bispecifičnih antitela CD3xCD20 i monospecifičnih antitela anti-CD20 je dala kao rezultat osiromašenje nivoa polaznih vrednosti B ćelija u krvi do prve vremenske tačke merenja (2. dan). Ovo osiromašenje nije uočeno kod kohorte životinja koja je dobijala placebo kontrolno sredstvo. Osiromašenje B ćelijom u bispecifičnim kohortama je zadržano tokom 1 nedelje posle 1 mg/kg doziranja bispecifičnih antitela, i osiromašenje B ćelije je zadržano u 0,01 i 0,10 mg/kg dozi bispecifičnih kohorti takođe.
[0286] Nivoi T ćelije (CD3+) su takođe nadgledani u ovom eksperimentu pomoću fluorescentno označenih anti-CD3 antitela. Prelazni gubitak T ćelija u krvi je primećen 2 dana posle doze u bispecifičnim kohortama antitela (Ab 4 i Ab 1; sve doze). Nije primećen nikakav gubitak T ćelija (ispod polazne vrednosti) u grupama koje su dobijale pomoćno kontrolno sredstvo (Placebo) ili kontrolno Ab 3 (Rituxan) u vremenskim tačkama merenja. Nivoi T ćelije su se vratili na nivoe početnih vrednosti u kohortama sa bispecifičnim antitelom do dana 4 vremenske tačke i zadržani na nivoima polazne vrednosti sve do kraja eksperimenta (Videti Sliku 11B).
[0287] In vivo jačina bispecifičnih antitela CD3xCD20 antitela 1 i antitela 4 je izmerena u perifernoj krvi makaki majmuna u dugoročnoj studiji (3 meseca) koja je merila promene u nivoima CD20+ B ćelija ili nivoima CD3+ T ćelija, analogno gore opisanoj studiji. Placebo (pomoćno sredstvo) ili bispecifična antitela su isporučena u količini od 1,0 mg/kg na 0. dan. Nivoi B ćelije u perifernoj krvi su značajno istrošeni do 2. dana u obe kohorte bispecifičnog antitela i preostali nivoi su osiromašeni tokom trajanja studije kod svih uzoraka izuzev kod placebo grupe (videti Sl.12A). Prelazni gubitak T ćelija je primećen 2. dana u bispecifičnim kohortama, zatim su T ćelije oporavljene do osnovnih nivoa do 4. dana, i ostale su oko polazne vrednosti kako je mereno tokom studije (> 80 dana) za životinje lečene sa bispecifičnim antitelima (Fig. 12B). Nije primećen prelazni gubitak T ćelija kod životinja lečenih placebom.
[0288] Da bi se detaljnije izmerila in vivo jačina antitela 1 i antitela 4 CD3xCD20 bispecifično antitelo na niskim dozama isporuke, promene u nivoima CD20+ B ćelije ili nivoima CD3+ T ćelije su izmerene u perifernoj krvi makaki majmuna u dugoročnoj (2 meseca) studiji, analogno sa gornjim eksperimentima. Bispecifična antitela su isporučena kao bilo 0,01 mg/kg ili 0,001 mg/kg (1 µg/kg) 0. dana. Nivoi B ćelije u perifernoj krvi su znatno osiromašeni do 2. dana i preostali nivoi su osiromašeni tokom trajanja studije za obe kohorte CD3xCD20 (Sl.13A), slično primećenom za životinje lečene višim dozama CD3xCD20 bispecifičnih antitela (kao što se vidi u Tabeli 17 i na Slikama 11A ili 12A). Životinje tretirane sa veoma niskim dozama (1 µg/kg) bispecifičnih antitela oseća isti prelazni gubitak T ćelija i oporavak kao što je bio kod životinja tretiranih visokim dozama bispecifičnih antitela CD3xCD20 (videti takođe Slike 11B ili 12B).
[0289] Gubitak B ćelije kako je primećeno u opisanim studijama je doveden u vezu sa gubitkom antitela u krvi u perifernoj krvi životinja lečenih sa CD3xCD20 Fc himernim antitelom 1 (videti Sliku 14). Kako je izloženost antitelu u krvotoku životinja osiromašena tokom vremena, populacije B ćelije počinju da se oporavljaju (npr. kako je primećeno 81. dana za životinju br.106881).
[0290] Međusobna uslovljenost gubitka B ćelije sa gubitkom antitela u krvi u perifernoj krvi je viđena kod životinja lečenih sa CD3xCD20-himernim Fc antitelom 2 (videti Sliku 15), pri čemu je izloženost antitelu u krvotoku životinja osiromašena vremenom, zatim su populacije B ćelije počele da se oporavljaju npr. kako je primećeno 66 dana za životinju br. 106876, i 68. dana za životinju br.106877. Slična međusobna povezanost je takođe viđena kod životinja lečenih sa CD3xCD20-wtFc (Ab 4) bispecifičnog antitela (videti Sliku 16). Kako izloženost antitela u krvotoku životinja opadne tokom vremena, populacije B ćelije počnu da se oporavljaju (videti Sliku 16, npr. kako je primećeno 91. dana za životinju br. 106870, i 64. dana za životinju br. I06872).
Primer 11. CD3 x CD20 bispecifična antitela mogu da osiromaše CD20+ B ćelije u limfoidnim tkivima makaki majmuna sa nižim dozama nego monospecifično antitelo
[0291] Promene u nivoima CD20+ B ćelije u limfoidnim tkivima makaki majmuna su ispitane preko FACS posle isporuke anti-CD3xCD20 bispecifičnog antitela (antitelo 1 ili antitelo 4) u poređenju sa monospecifičnim anti-CD20 antitelom (Kontrolno Ab 3-Rituksan). Studija je izvedena na mužjacima makaki majmuna (Macaca fascicularis) organizovanim u osam doznih grupa od 3 životinje prema sledećem toku, analogno grupama 1-8 kao što je izneto u Primeru 10, gore u tekstu. Doze antitela ili pomoćnog farmaceutskog sredstva su isporučene i.v. infuzijom i životinje su žrtvovane i tkiva su prikupljena 7 dana posle doziranja. Uzorci tkiva su analizirani pomoću FACS za bela krvna zrnca (CD45+), i specifično B ćelije (CD20+), markere, zatim je određen % zapremine B ćelija.
[0292] Populacije B ćelije su identifikovane upotrebom relevantnih fluorescentno označenih antitela (CD20 APC-Cy7) i FACS preuzimanjem, analogno postupku opisanom gore za Primer 10. Rezultati su prikazani u Tabeli 18 i na Slikama 17A i 17B.
Tabela 18: Procenat CD20 pozitivnih ćelija u mezenternom limfnom čvoru i slezini majmuna posle terapije
[0293] Kao što je prikazano u Tabeli 18 i na Slici 17A, isporuka CD3xCD20 bispecifičnih antitela u poređenju sa anti-CD20 monospecifičnim antitelom je dala kao rezultat osiromašenje tkiva B ćelija u slezini u mnogo nižim dozama (doza od 0,01 do 1,0 mg/kg) za bispecifične kohorte. Ovo osiromašenje nije uočeno kod kohorte životinja koja je dobijala placebo kontrolno sredstvo.
[0294] Kao što je prikazano u Tabeli 18 i na Slici 17B, isporuka CD3xCD20 bispecifičnih antitela u poređenju sa anti-CD20 monospecifičnim antitelom je dala kao rezultat osiromašenje tkiva B ćelija u mezenternim limfnim čvorovima u mnogo nižim dozama (doza od 0,01 do 1,0 mg/kg) za bispecifične kohorte, sa dozom od 0,1 mg/kg i dozom od 1 mg/kg bispecifičnog antitela dobija se kao rezultat mnogo efikasnije osiromašenje nego u monospecifičnoj kohorti. Ovo osiromašenje nije uočeno kod kohorte životinja koja je dobijala placebo kontrolno sredstvo. Posle imunohistohemijskog bojenja za CD20 (podaci nisu prikazani), zaostale B ćelije su detektovane u limfnim čvorovima monospecifičnom terapijom lečene (Rituksan® 30mg/kg) kohorte. Nisu detektovane zaostale B ćelije u tkivima prikupljenim iz kohorti lečenim dozama od 0,1 do 1,0 mg/kg bispecifičnog anti-CD3xCD20 antitela. Ovi podaci pokazuju da Ab1 i Ab1 imaju dubinu ubijanja B ćelija koja je jača od Ab3.
Primer 12. Lečenje tumora sa CD3 x CD20 bispecifičnim antitelom
A. Lečenje sa CD20 x CD3 bispecifičnim antitelom potiskuje rast Radži (Raji) tumora kod NSG miševa
[0294] Da bi se procenila efikasnost izabranih bispecifičnih antitela anti-CD3xCD20 za smanjenje rasta Radži tumora, NSG miševima (NOD/LtSz-scid/IL2Rγ<nulti>miševi) kupljenim od Džekson laboratorija (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA) su potkožno koimplantirane 2x10<6>ćelije Radži tumora i 5x10<5>humanih PBMCs (0. dan). Istog dana su miševi lečeni sa intraperitonealnom dozom 0,4, 0,04 ili 0,004 mg/kg po mišu (N=5 miševi su po terapijskoj grupi) bilo antitela 1 ili kontrolnog antitela 5 (IgG1 antitelo na irelevantnom cilju), ili kontrolnom pomoćnom sredstvu. Počevši od 0. dana, miševi su tretirani dva puta nedeljno sa intraperitonealnom dozom leka ili pomoćnog sredstva za ostatak studije. Veličina tumora je izmerena dva puta nedeljno upotrebom kalibarskih klešta, i veličina tumora je izračunata kao zapremina = (dužina x širina<2>)/2. Statističke analize su izvedene korišćenjem GraphPad softvera Prism 5.0 (Macintosh verzija).
[0296] Statistički značaj je određen dvosmernom ANOVA sa višestrukim Takijevim (Tukey) poređenjima posle testa. Podaci od svakog od očitavanja su upoređeni u terapijskim grupama. Prag vrednosti p<0,05 je smatran statistički značajnim.
Rezultati su prikazani na Slikama 7A-7F. Ovi rezultati pokazuju da antitelo 1 (CD3xCD20-himernoFc) cilja Radži tumore kod miševa koji imaju koimplantirane humane imune ćelije, što daje kao rezultat potpuno suzbijanje rasta tumora u testiranim dozama (SL.7C: 0,4 mg/kg Ab1; SL.7E: 0,04 mg/kg Ab1; SL.7F: 0,004 mg/kg Ab1). Ovaj primer pokazuje da je lečenje sa CD3xCD20 bispecifičnim antitelom 1 bilo delotvorno za suzbijanje rasta tumora počevši u vreme implantacije tumora. Rast Radži tumora je ostao potpuno suzbijen sve do 23 dana posle implantacije kod miševa kojima su date doze od 0,4, 0,04 ili 0,004 mg/kg antitelo 1, u odnosu na kontrolno. Takođe je primećeno da niti antitelo 1 niti kontrolno antitelo nisu imali značajno dejstvo na telesnu težinu miša tokom te studije (podaci nisu prikazani).
[0297] Antitumorsko dejstvo bispecifičnih antitela CD3xCD20 je dalje testirano na sličnom NSG modelu miša (kao što je opisano gore u tekstu), međutim svaki NSG miš je doziran sa 1 mg mišjeg IgG (mlgG2a Fc) na dan -1, i jednom nedeljno u nedelji posle toga. Rezultati su prikazani na Slikama 8A-8B.
[0298] Ovaj eksperiment pokazuje da je lečenje bilo CD3xCD20 bispecifičnim antiteliom 1 (CD3xCD20-himernimFc) ili CD3xCD20 bispecifičnim antitelom 4 (CD3xCD20-divlji tip (wt)Fc) bilo delotvorno za suzbijanje rasta tumora počevši od vremena implantacije tumora u dozama bispecifičnog Ab testiranog u prisustvu IgG u krvi (Slike 8A-8B). Kao što se vidi na Sl. 8A, antitelo 1 (CD3xCD20-himerno Fc bispecifično antitelo) pokazuje potpuno sprečavanje rasta tumora tokom testiranog perioda sa ili bez IgG dopune u ovom eksperimentu.
B. Lečenje sa CD3 x CD20 bispecifičnim antitelom skuplja uspostavljene tumore u NSG miševima
[0299] Procenjena je efikasnost izabranih anti-CD3xCD20 bispecifičnih antitela za smanjivanje uspostavljenih tumora kod NSG miševa. NSG miševi (NOD/LtSzscid/IL2Rγ<nulti>miševi) su kupljeni od Džekson laboratorija (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA) i potkožno su im koimplantirane ćelije sa HLA poklapajuće (humani leukocitni gen) Radži tumora (2x10<6>) i human PBMC (5x10<5>)(-15. dan). Tumori su ostavljeni da se uspostave u domaćinu tokom 15 dana pre terapije. Jednog dana pre isporuke leka (- 1. dan), svakom mišu su dozirani suplementi od 5 mg mlgG2a Fc. Miševima je naknadno data doza od mlgG2a Fc na 5 mg po mišu jednom nedeljno tokom dužine eksperimenta (7. dana, 14. dana, itd.). Miševi su odvojeni u 2 eksperimentalne grupe pre isporuke leka prema veličini tumora: Grupa 1: ∼200-400 mm<3>ili Grupa 2: ∼500-900 mm<3>.
[0300] Posle terapije lekom, veličina tumora je nadgledana i zabeležena za svakog miša i to 0, 3, 6, 10, 14, 17, 21. i 28. dana. Veličina tumora je izmerena dva puta nedeljno upotrebom kalibarskih klešta, i veličina tumora je izračunata kao zapremina = (dužina x širina 2)/2. Prisustvo tumora je takođe utvrđeno opipavanjem. Statističke analize su izvedene korišćenjem GraphPad softvera Prism 5.0 (Macintosh verzija). Podaci od svakog od očitavanja su upoređeni u terapijskim grupama. Rezultati su prikazani na Slikama 9 i 10.
a. Grupa 1: ∼200-400 mm<3>tumora. Počevši od 0. dana, nekoliko kohorti od 4 ili 5 miševa u svakoj je tretirano sa naznačenom dozom leka ili pomoćnog sredstva jednom nedeljno (tj.7. dana, 14. dana, itd.) kao u nastavku:
i. Kontrola: samo pomoćno farm. sredstvo
ii. Kontrolno antitelo 5, 0,4 mg/kg
iii. Antitelo 1 (CD20xCD3-himerno Fc), 0,4 mg/kg
b. Grupa 2: ∼500-900 mm<3>tumora. Počevši od 0. dana, nekoliko kohorti od 4 miševa u svakoj je tretirano sa naznačenom dozom leka jednom nedeljno (tj.7. dana, 14. dana, itd.) kao u nastavku:
i. Kontrolno antitelo 5, 0,4 mg/kg
ii. Antitelo 1 (CD20xCD3-himernoFc), 0,4 mg/kg
[0301] Tumori su potpuno vraćeni u kohortu kojoj je isporučeno 0,4 mg/kg antitela 1 (CD20xCD3-himernoFc) do 14. dana. Videti Sliku 9.
[0302] Na modelu sa većim uspostavljenim tumorima (tj. Grupa 2, ∼500-900 mm<3>), terapija antitelom 1 (CD20xCD3-himerno Fc) (0,4 mg/kg) je kao rezultat dala potpunu ablaciju primećenih tumora kod miševa do 21 dana. Videti Sliku 10, koja pokazuje delotvornost Ab1 za lečenje miševa koji imaju velike limfomske mase (tj. tumore pozitivne za CD20 ekspresiju) veće od 0,5 cm i do 0,9 cm zapremine.
Primer 13. CD3xCD20 bispecifična antitela indukuju PBMC proliferaciju in vitro
[0303] Sposobnost odabranih CD3xCD20 bispecifičnih antitela i kontrolnih konstrukata da stimulišu mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i da indukuju proliferaciju je procenjena upotrebom ATP katalizovane kvantifikacije (CellTiter Glo®). Aktivacija PBMC daje kao rezultat otpuštanje citokina koji pogone ćelijsku proliferaciju.
[0304] Podaci proliferacije su usvojeni upotrebom sledećeg protokola: PBMC izvedene iz humanih ili makaki majmuna (5x10<5>/ pregradi su inkubirane sa serijskim razblaženjima od CD3xCD20 bispecifična antitela ili kontrolno antitelo i komercijalno anti-CD28 antitelo (humani: 200 ng/mL, makaki: 500 ng/mL) tokom 72 sata na 37°C. Ćelije su kvantifikovane upotrebom ćelijskog titra Cell Titer Glo® i luminiscencije kako su očitane za održivost ćelije je izmerena upotrebom čitača ploče VICTOR X5 sa više oznaka (Perk- inElmer) da bi se detektovale žive ćelije. Održivost ćelije (indukcija prevoja stimulisanih naspram nestimulisanih ćelija) je određena podelom luminiscencije stimulisanih ćelija polaznom vrednošću luminiscencije nestimulisanih ćelija i grafički prikazana upotrebom Prism softvera. Rezultati su prikazani u Tabeli 19 i na Slikama 18A i 18B.
Tabela 19. EC50 za humanu i makaki majmuna PBMC proliferaciju je indukovan pomoću anti-CD3x CD20 bispecifičnih antitela
[0305] Kao što je prikazano u Tabeli 19 i na Slikama 18A-18B, oba CD20 x CD3 bispecifična antitela iz ovog pronalaska su indukovala proliferaciju humanih ili makaki majmunskih PBMC. Antitelo 1 je indukovalo proliferaciju i humanih i makaki majmunskih PBMC sa približno jednakom jačinom. Kontrolno Ab 5 nije ispoljilo nikakvu aktivnost.
Primer 14. CD20 x CD3 bispecifični posreduju ubijanje ćelije aktiviranim T ćelijama in vitro
[0306] Humane ili makaki majmunske PBMC su izolovane iznad ploče Ficoll-Paque ili korišćenjem podloge za odvajanje ćelija sisara Limfolit (Lympholyte), prema opisanom redosledu. Izolovane PBMC ćelije (1x10<6>ćelija/mL humane PBMC ili 5x10<6>ćelije/mL makaki majmuna PBMC) su aktivirane za 7. i 21. dan, prema opisanom redosledu, u potpunoj podlozi (RPMI suplementirane sa 10% FBS, 100 U/mL penicilinom, 100 µg/mL streptomicina, 292 µg/mL L-glutamina) koji sadrži rekombinantne humane IL-2 (30 U/mL za humane PBMC, 100 U/mL za makaki majmunske PBMC) i perlice za aktivaciju T ćelije (anti-CD3/CD28 za humane PBMC, anti-CD2/CD3/CD28 za makaki majmunske PBMC). CD20 ekspresija Radži ćelija (2x10<6>ćelija/mL) su označene sa 8 µM Calcein-AM tokom 30 minuta na 37°C i oprane 3 puta sa podlogama. Kalceinom označene ciljne ćelije (10.000-20.000 ćelija/pregradi) su raspoređene u ploče u 200 µL sa aktiviranim T ćelijama (efektor/ciljna ćelija u odnosu 10:1) i serijska razblaženja antitela 1, Ab 4 ili kontrolno Ab 5 (humani opseg koncentracije: 2nM do 0,00003nM; opseg koncentracije za makaki majmunska: 6,6 nM do 0,002pM) u potpunoj podlozi tokom 2 sata na 37°C. Posle inkubacije, ploče su centrifugirane i supernatanti su preneti na providnu crnu ploču sa bistrim dnom za analizu fluorescencijom. Procenat citotoksičnosti je izračunat korišćenjem jednačine:
kada je FS kalcein otpušta iz probne pregrade, FSR je spontano otpuštanje kalceina i FMR je maksimalno otpuštanje kalceina iz ćelija lizovanih pomoću Triton-X.
[0307] EC50 održivost ćelija (ATP katalizovana kvantifikacija) je određena korišćenjem softvera Prism. Ćelijska liza (citotoksičnost) je izmerena otpuštanjem kalceina kao frakcije maksimalnog otpuštanja. Procenat citotoksičnosti je izračunat kako je primećeno otpuštanje upoređeno sa maksimalnim otpuštanjem i EC50 vrednosti su određene. Rezultati su prikazani u Tabeli 20 i na Slikama 19A (humane T ćelije) i 19B (majmunske T ćelije).
Tabela 20. EC50 vrednosti za CD3xCD20 indukovanu citotoksičnost na Radži ćelijama
[0308] Kako je prikazano u Tabeli 20, antitelom 1 posredovano ciljano ubijanje ćelije sa reprezentativnim EC50 vrednostima 25,0ρM i 9,10ρM za humane ćelije (Slika 19A) i ćelije makaki majmuna (Slika 19B) T ćelije, prema opisanom redosledu. Antitelom 4 posredovano ciljano ubijanje ćelije sa reprezentativnim EC50 vrednostima 15,7pM i 1,73pM za humane ćelije (Slika 19A) i ćelije makaki majmuna (Slika 19B) T ćelije, prema opisanom redosledu. Nije primećena nikakva aktivnost za kontrolno.
[0309] Da bi se nadgledalo specifično ubijanje ciljnih ćelija koje nose CD20 protočnom citometrijom, B16F10.9 roditeljske mišje ćelije mijeloma (koje ne izražavaju CD20) i B16F10.9 ćelija projektovanih da stabilno izraze humani CD20 (B16F10.9/CD20) su označene sa 1µM fluorescentno praćenje bojom karboksifluorescein diacetat sukcinimidil estar (CFDA-SE) i ljubičastim agensom za praćenje ćelije (Cell Tracker), prema opisanom redosledu. Posle označavanja, ćelije su pomešane u odnosu 1:1, i raspoređene na ploče tokom noći na 37°C. Odvojeno, humane PBMC su raspoređene u suplementirane RPMI podloge na 1x10<6>ćelija/mL i inkubirane tokom noći na 37°C da bi se obogatili limfociti osiromašenjem vezanih makrofaga, dendritskih ćelija i nekih monocita. Idućeg dana, ciljne ćelije su ko-inkubirane sa vezanim ćelijama osiromašenim naivnim PBMC (efektorska ćelija/Ciljna ćelija u odnosu 4:1) i serijsko razblaženje testiranih CD3xCD20 bispecifičnih antitela ili IgG1 kontrolnog antitela 5 (opseg koncentracije: 66,7nM do 0,25pM) tokom 48 sati na 37°C. Ćelije su uklonjene iz ploča za kulturu ćelije korišćenjem puferskog sredstva za razdruživanje ćelije bez enzima, i analizirane pomoću FACS. Za FACS analizu, ćelije su obojene mrtvim/živim intenzivno crvenim agensom za praćenje ćelije (far red cell tracker) (Invitrogen). Za procenu specifičnosti ubijanja, ćelije su usmerene na žive ljubičasto i CFDA-SE označene populacije. Procenat svake populacije je prijavljen za izračunavanje podešenog opstanka kao u nastavku: Podešeni opstanak=(R1/R2)*100, pri čemu R1=[(B16F10.9/CD20) / bajstender ćelije (B16F10.9)]*100 u odsustvu antitela, i R2=isti odnos ali u prisustvu testiranog antitela.
Tabela 21. EC50 vrednosti za ciljano specifično ubijanje u B16F10.9/CD20 ćelije
[0310] Oba antitela, i CD3xCD20-himerno Fc (antitelo 1) i CD3xCD20-wtFc (antitelo 4) specifično usmerili humane T ćelije da bi se ubile samo ciljne ćelije koje eksprimuju CD20 (Slike 20A-B) u mešovitoj populaciji ćelija. Ciljno ubijanje ćelije je primećeno samo u prisustvu bispecifičnog antitela, sa B16F10.9/CD20 ćelijama osiromašenom na od doze zavistan način antitelom 1 (EC5019.5ρpM) i antitelom 4 (EC5012.8pM) (Slika 20B). Manje od 5% od ćelija koje imaju CD20 ekspresiju su bile žive u testiranoj najvišoj dozi (10 µg/mL) (Slika 20B). Nije primećen dokaz o smrti ćelije kod roditeljske populacije ćelije B16F10.9 ili u populaciji B16F10.9/CD20 sa kontrolnim Ab 5, IgG1 kontrolno antitelo.
Primer 15. CD3xCD20 bispecifično antitelo pojačava marker rane aktivacije CD69 na T ćelijama u in vitro ogledu koji traje 20 sati FACS
[0311] CD69+ je jedan od najranijih induktibilnih markera na površini ćelije koji ukazuje da su T ćelije aktivirane. Aktivaciju T ćelije je moguće utvrditi ispitivanjem pojačavanja specifičnih markera na površini ćelije, kao što je CD69.
[0312] Sposobnost CD3xCD20 bispecifičnog antitela da pojača marker rane aktivacije CD69 na humanim ili makaki majmunskim T ćelijama u celoj krvi je određena 20 satnim in vitro FACS ogledom. Ukratko, aktivacija T ćelije je procenjena inkubiranjem sveže izolovane humane cele krvi ili cele krvi makaki majmuna (100 µL) u pločama sa 96 pregrada ravnog dna sa 5-strukim (humanim) ili 10-strukim serijskim razblaženjima (makaki majmuna) antitelo 1, antitelo 4 ili kontrolno Ab 5 (opseg koncentracije 50nM do 0,0006nM) u RPMI+L-glutamatu u finalnoj zapremini od 200 µL tokom 20 sati na 37°C. Posle inkubacije, ploče su vrtložene tokom 5 minuta na 1000 ob/min i plazma je uklonjena. Da bi se izmerila CD69 pojačana regulacija na T ćelije, fenotipni koktel koji sadrži direktno konjugovana antitela na CD2 i CD69, kao i CD45, CD4, CD8, i bilo CD19 (humani) ili CD16 (makaki) je dodat direktno u krv tokom 30 minuta na 4°C. Crvene krvne ćelije su lizovane tokom 15 minuta sa 1,5 mL PharmLyse puferskim sredstvom prema uputstvima proizvođača. Ćelije su oprane dva puta, vraćene u suspenziju u 200 µL hladan PBS 1% FBS, i analizirane protočnom citometrijom korišćenjem BD FACSCanto citometra (merača ćelija). CD4+ T ćelije su identifikovane prvim usmeravanjem na održive male CD45+ limfocite i zatim usmeravanjem na CD19-/CD2+/CD4+ T ćelije (humane) ili CD16-/CD2+/CD4+ T ćelije (makaki majmuna).
[0313] Registrovan je procenat aktiviranih (CD69+) T ćelija od ukupnih ćelija CD2+ efektora. Videti Tabelu 22 i takođe Sliku 21. Rezultati pokazuju da su CD3xCD20 bispecifična antitela značajno aktivirala T ćelije kao što je detektovano pomoću CD69 markera rane aktivacije.
Tabela 22. EC50 vrednosti za ciljano specifično ubijanje u B16F10.9/CD20 ćelije
Primer 16. CD3xCD20 bispecifična antitela indukuju grupisanje T ćelija sa ciljnim ćelijama
[0314] Format grupisanja ćelije je korišćen da bi se utvrdilo da li CD3xCD20 bispecifične antitelom premošćuju T ćelije sa ciljnim ćelijama (CD20+ ćelije) preko njegovih bispecifičnih kraka. Efektorske ćelije su prethodno obojene sa CFSE, i CD20+ ćelije su prethodno obojene sa ljubičastim sredstvom za praćenje ćelije Cell Tracker tokom 24 sata, i usmerene na odvojene kvadrante posle inkubacije sa irelevantnim kontrolnim antitelom (kontrolno antitelo 5, irelevantno IgG1 izotipsko antitelo). Videti Sliku 22A, koja ne prikazuje grupisanje (dvostruko bojenje) u mešavini ćelije za lečenje irelevantnog antitela. Posle inkubacije sa CD3xCD20 bispecifičnim antitelom, čini se da se ćelije grupišu zbog bojenja i sa CFSE i ljubičastim sredstvom za praćenje ćelije (Violet Cell Tracker) (videti Sliku 22B, u gornjem levom kvadrau na rasutom dijagramu kako je prikazano potamnjenim kvadratom).
Primer 17. Ekspresija inhibitornih Tim-3 i PD-1 markera na CD3+ ćelijama
[0315] Disfunkcija, ili iscrpljivanje T ćelije, nastaje u domaćinima koji nose tumor. Tim-3 i PD-1 receptori su identifikovani kao markeri iscrpljenih T ćelija u stanjima hroničnog oboljenja. Prema istraživačima Sakuishi, K. et al. (J. Exp. Med.207(10):2187-2194, 2010), limfociti koji infiltriraju tumor (TILs) koji su pozitivni na Tim-3 i PD-1 (Tim-3+PD-1+TILs) ispoljavaju najozbiljnije iscrpljen fenotip kako je definisano zato što nemaju proliferaciju i proizvodnju IL-2, TNF, i IFN-γ.
[0316] CD3 pozitivne ćelije su ekstrahovane iz krvi i tumora NSG miševa koji su potkožno koimplantirani sa ćelijama Raji tumora koje imaju HLA poklapanje i humanim PBMC - videti Primer 12B, ovde gore u tekstu. Ukratko, tumori su ostavljeni da se uspostave u domaćinu tokom 15 dana pre lečenja i miševi su odvojeni u dve grupe lečenja na osnovu veličine tumora (videti Primer 12B). Krv je ekstrahovana iz lečenih (bispecifično Ab) i nelečenih miševa 9. dana iz svake studijske grupe, tj. Grupa 1, ∼200-400 mm<3>ili Grupa 2, ∼500-900 mm<3>. Miševi koji su bili netretirani (pomoćno sredstvo ili kontrolno Ab) koji su imali tumore koji su dostizali 1500 mm<3>su žrtvovani na kraju studije i ovi tumori su testirani za ekspresiju PD1 i Tim-3.
[0317] Za eksperimente sa T ćelijama u krvi, održive CD45+CD3+ T ćelijske frakcije su izabrane za identifikaciju markera upotrebom direktno označenih antitela na bilo Tim-3 ili PD-1 (komercijalno dostupni iz Biolegend). Tim-3+PD-1+ ćelije su bile preovladavajuća frakcija T ćelija u krvotoku u krvi životinja koje nisu lečene. Međutim, T ćelije u krvi CD20xCD3 bispecifičnim antitelom (Ab 1) lečenih životinja su pokazale niže frakcije Tim-3+PD-1+ ćelija.
[0318] Ćelije tumora iz nelečenih domaćina su odvojene i bojene za održivost. FACS analiza je urađena za održive pojedinačne ćelije da bi se razvrstale CD45+CD3+ ćelijske frakcije, koje su zatim testirane za Tim-3 ili PD-1 ekspresiju.
[0319] Utvrdili smo da su inhibitorni receptori Tim-3 i PD-1 bili eksprimovani na CD3+ TIL u limfomima NSG B ćelije nelečenih miševa tokom eksperimenata opisanih u Primeru 12B, i da su Tim-3+PD-1+ ćelije bile preovladavajuća frakcija tumora koji infiltriraju T ćeliju.
Primer 18. Terapija sa CD3 x CD20 bispecifičnim antitelom je delotvornija nego anti-CD20+ antitelo kod NSG miševa sa uspostavljenim Radži tumorima
[0320] Procenjena je efikasnost izabranih anti-CD3xCD20 bispecifičnih antitela za smanjivanje uspostavljenih tumora kod NSG miševa. NSG miševi (NOD/LtSzscid/IL2Rγnulti miševi; Jackson Laboratories) su potkožno koimplantirani sa ćelijama Radži tumora (2x106) i humanim PBMC (5x10<5>)(-14. dana) (slično sa gore gore u tekstu navedenom u Primeru 12B).
[0321] CD20xCD3 bispecifično Ab1 (dozirano u količini od 0,4 mg/kg; 2x/nedeljno i.p.) je bilo uporedivo sa CD19xCD3 BiTE (dozirano u količini od 0,5 mg/kg; 5x/nedeljno i.v.) (Slika 23) i bolje nego terapija rituksimabom (doziran u količini od 8 mg/kg; 5x/nedeljno i.p.) (Slika 24) za potiskivanje uspostavljenih Radži tumora, čime se pokazuje da je Ab1 bilo delotvorno za lečenje sisara sa limfomima mase veće od 0,5 cm u zapremini.
Primer 19. Lečenje CD20+ melanoma sa CD3 x CD20 bispecifičnim antitelom
[0322] Istraživači su utvrdili da izvesne podpopulacije melanomskih kancera kod pacijenata, kao što su CD20+ ćelije melanomskog tumora, mogu predstavljati karakteristike koje pokreću tumor i viši rizik od ponovne pojave bolesti (Pinc et al. Mol Ther.
20(5):1056-1062, 2012, epub 2012 Feb 21). CD20xCD3 bispecifično antitelo Ab1 je pokazalo snažnu aktivnost protiv B16F10.9 ćelija tumora koje eksprimuju CD20, jer je značajno odložio hCD20-transdukovan B16F10.9 (B16F10.9/CD20) rast tumora kod imunokompetentnih miševa.
[0323] Miševi su humanizovani za CD3 (humanizovani CD3γε miševi) su humanizovani na CD20 lokusu tako da su miševi eksprimovali oba humanizovana proteina. Humanizovanim CD3/CD20 miševima su potkožno implantirane 2x10<5>B16F10.9 ćelija melanomskog tumora (K. Peters/Charles Lin; Duke University) transdukovani sa humanim CD20. Počevši od 0. dana (dana transplantacije tumora), miševi su lečeni intraperitonealno 2 puta nedeljno sa bilo kojim pomoćnim farmaceutskim sredstvom (PBS; n=5), 0,4 mg/kg kontrolno Ab5 (kontrolno antitelo prema irelevantnom antigenu; n=5), 0,4 mg/kg od Ab1 (N=5), ili 0,004 mg/kg Ab1 (n=5). Zapremine tumora su izmerene kako je naznačeno na Sl.25A. Miševi su žrtvovani kada su tumori dostigli zapreminu veću od 1500 mm<3>. Kako je pokazano na Sl.25A, lečenje sa Ab1 je odložilo rast tumora kada je lečenje pokrenuto istovremeno sa transplantacijom tumora.
[0324] U odvojenom eksperimentu, testirana je i sposobnost Ab1 da inhibira rast tumora u već uspostavljenom tumoru (Sl. 25B). Humanizovanim CD3/CD20 miševima je potkožno implantirano 2x10<5>B16F10.9 ćelija melanomskog tumora koje eksprimuju humani CD20.10. dana posle implantacije tumora, miševi su nasumično raspoređeni na osnovu veličine tumora i organizovani u sledeće terapijske grupe, 5 miševa u svakoj grupi: pomoćno farmaceutsko sredstvo (PBS), 4 mg/kg kontrolno Ab5 (kontrolno antitelo na irelevantni antigen), 4 mg/kg od Ab1, ili 0,4 mg/kg Ab1. Svi miševi su tretirani i.p.2 puta nedeljno. Miševi su žrtvovani kada su tumori dostigli zapreminu veću od 1500 mm<3>. Kao što je prikazano na Sl.25B, tretiranje sa Ab1 je odložilo rast tumora u slučajevima gde su tumori već uspostavljeni, pokazujući da je Ab1 prikazao snažnu aktivnost protiv ćelija B16F10.9 melanoma koje eksprimuju CD20.

Claims (15)

Patentni zahtevi
1. Bispecifično antitelo koje obuhvata prvi domen vezivanja antigena koji vezuje humani CD3, drugi domen vezivanja antigena koji vezuje humani CD20, i himerni konstantni region teškog lanca pripojen na svaki od prvog i drugog domena vezivanja antigena, pri čemu prvi domen vezivanja antigena (A1) koji specifično vezuje humani CD3 obuhvata tri regiona određivanja komplementarnosti teškog lanca (HCDR1, HCDR2, HCDR3) i tri regiona određivanja komplementarnosti lakog lanca (LCDR1, LCDR2, LCDR3), pri čemu
(i) A1-HCDR1 obuhvata sekvencu aminokiseline od SEK ID BR: 12;
(ii) A1-HCDR2 obuhvata sekvencu aminokiseline od SEK ID BR: 14;
(iii) A1-HCDR3 obuhvata sekvencu aminokiseline od SEK ID BR: 16;
(iv) A1-LCDR1 obuhvata sekvencu aminokiseline od SEK ID BR: 20;
(v) A1-LCDR2 obuhvata sekvencu aminokiseline iz SEK ID BR: 22; i
(vi) A1-LCDR3 obuhvata sekvencu aminokiseline iz SEK ID BR: 24,
pri čemu drugi domen vezivanja antigena (A2) koji specifično vezuje humani CD20 obuhvata tri regiona određivanja komplementarnosti teškog lanca (HCDR1, HCDR2, HCDR3) i tri regiona određivanja komplementarnosti lakog lanca (LCDR1, LCDR2, LCDR3), pri čemu
(i) A2-HCDR1 obuhvata sekvencu aminokiseline od SEK ID BR: 4;
(ii) A2-HCDR2 obuhvata sekvencu aminokiseline od SEK ID BR: 6;
(iii) A2-HCDR3 obuhvata sekvencu aminokiseline od SEK ID BR: 8;
(iv) A2-LCDR1 obuhvata sekvencu aminokiseline od SEK ID BR: 20;
(v) A2-LCDR2 obuhvata sekvencu aminokiseline od SEK ID BR: 22; i
(vi) A2-LCDR3 obuhvata sekvencu aminokiseline od SEK ID BR: 24,
pri čemu himerni konstantni region teškog lanca obuhvata:
(i) sekvencu amino kiseline gornjeg zgloba humanog IgG1 ili humanog IgG4 od pozicija 216 do 227 (EU numeracija);
(ii) sekvencu aminokiseline donjeg zgloba humanog IgG2 koja obuhvata PCPAPPVA (SEK ID BR: 52) od pozicija 228 do 236 (EU numeracija);
(iii) CH1 domen humanog IgG1 i CH3 domen humanog IgG1, ili CH1 domen humanog IgG4 i CH3 domen humanog IgG4; i
(iv) sekvencu amino kiseline CH2 domena humanog IgG4 od pozicija 237 do 340 (EU numeracija); i
pri čemu bispecifično antitelo ispoljava viši afinitet vezivanja za humani FcyRIIA u odnosu na humani FcyRIIB, i ispoljava mali ili nedektibilan afinitet vezivanja na humani FcyRI i humani FcyRIII, kako je izmereno u ogledu rezonance površinskog plazmona.
2. Bispecifično antitelo iz patentnog zahteva 1, pri čemu to bispecifično antitelo:
(a) ispoljava smanjenu od antitela zavisnu ćelijsku citotoksičnost (ADCC) u poređenju sa antitelom koje obuhvata Fc domen divljeg tipa, kako je izmereno u in vitro ogledu citotoksičnosti;
(b) ispoljava zanemarljiv ili nedektibilan ADCC;
(c) ispoljava smanjenu od komplementa zavisnu citotoksičnost (CDC) u poređenju sa antitelom koje obuhvata Fc domen divljeg tipa, kao što je izmereno u in vitro ogledu citotoksičnosti;
(d) ispoljava manje od 50% citotoksičnosti, kako je detektovano merenjem lize ćelije u in vitro ogledu;
(e) ispoljava zanemarljiv ili nedektibilan CDC;
(f) indukuje smanjeno ubijanje posredovano T ćelijom ćelija koje nose Fc receptore, kao što su NK ćelije ili makrofagi, u poređenju sa antitelom koje obuhvata Fc domen divljeg tipa; ili
(g) indukuje smanjeno ubijanje T ćelijama posredovano ćelijama koje nose Fc receptor, kao što su NK ćelije ili makrofagi, u poređenju sa antitelom koje obuhvata Fc domen divljeg tipa.
3. Bispecifično antitelo iz patentnog zahteva 1 ili 2, pri čemu to bispecifično antitelo obuhvata:
(a) himernu sekvencu aminokiseline zgloba EPKSCDKTHTCPPCPAPPVA (SEK ID BR: 53); ili
(b) himernu sekvencu aminokiseline zgloba ESKYGPPCPPCPAPPVA (SEK ID BR: 54).
4. Bispecifično antitelo iz patentnog zahteva 3, pri čemu konstantni region himernog teškog lanca obuhvata CH1 domen humanog IgG1, ta himerna sekvenca aminokiseline zgloba od SEK ID BR: 53, CH2 domena humanog IgG4, i CH3 domena humanog IgG1.
5. Bispecifično antitelo iz patentnog zahteva 3, pri čemu konstantni region himernog teškog lanca obuhvata CH1 domen humanog IgG4, ta himerna sekvenca aminokiseline zgloba od SEK ID BR: 54, CH2 domena humanog IgG4, i CH3 domena humanog IgG4.
6. Bispecifično antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 5, pri čemu prvi domen koji vezuje antigen koji specifično vezuje humani CD3 obuhvata promenljivi region teškog lanca (HCVR) sekvence aminokiseline koja obuhvata SEK ID BR: 10 i promenljivi region lakog lanca (LCVR) sa sekvencom aminokiseline SEK ID BR: 18.
7. Bispecifično antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 6, pri čemu drugi domen koji vezuje antigen koji specifično vezuje humani CD20 obuhvata promenljivi region teškog lanca (HCVR) sekvence aminokiseline koja obuhvata SEK ID BR: 2 i promenljivi region lakog lanca (LCVR) sa sekvencom aminokiseline SEK ID BR: 18.
8. Bispecifično antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 3 ili 5 do 7, pri čemu to bispecifično antitelo obuhvata konstantni region himernog teškog lanca koji obuhvata sekvencu aminokiseline iz SEK ID BR:26.
9. Bispecifično antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 3 ili 5 do 7, pri čemu bispecifično antitelo obuhvata konstantni region himernog teškog lanca koji obuhvata sekvencu aminokiseline iz SEK ID BR: 28.
10. Bispecifično antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 4, 6 ili 7, pri čemu bispecifično antitelo obuhvata konstantni region himernog teškog lanca koji obuhvata sekvencu aminokiseline iz SEK ID BR: 30.
11. Bispecifično antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 4, 6 ili 7, pri čemu to bispecifično antitelo obuhvata konstantni region himernog teškog lanca koji obuhvata sekvencu aminokiseline iz SEK ID BR: 32.
12. Bispecifično antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 3 ili 5 do 7, pri čemu bispecifično antitelo obuhvata prvi konstantni region teškog lanca koji obuhvata sekvencu aminokiseline od SEK ID BR: 26 i drugi konstantni region teškog lanca koji obuhvata sekvencu aminokiseline iz SEK ID BR: 28.
13. Bispecifično antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 4, 6 ili 7, pri čemu to bispecifično antitelo obuhvata prvi konstantni region teškog lanca koji obuhvata sekvencu aminokiseline iz SEK ID BR: 30 i drugi konstantni region teškog lanca koji obuhvata sekvencu aminokiseline iz SEK ID BR: 32.
14. Bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 13 za upotrebu u medicini.
15. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 12 ili 13 za upotrebu u lečenju ili poboljšanju kancera B ćelije kod subjekta; opciono pri čemu:
(a) kancer B ćelije je folikularni limfom;
(b) kancer B ćelije je difuzni limfom velike B ćelije;
(c) kancer B ćelije je limfom omotača ćelije; ili
(d) kancer B ćelije je limfom marginalne zone.
RS20210618A 2014-03-19 2015-03-18 Supstance antitela za lečenje tumora RS61856B1 (sr)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461955663P 2014-03-19 2014-03-19
US201461981641P 2014-04-18 2014-04-18
US201462007385P 2014-06-03 2014-06-03
US201462033460P 2014-08-05 2014-08-05
EP19188693.6A EP3594238B1 (en) 2014-03-19 2015-03-18 Antibody compositions for tumor treatment

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS61856B1 true RS61856B1 (sr) 2021-06-30

Family

ID=52808172

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210618A RS61856B1 (sr) 2014-03-19 2015-03-18 Supstance antitela za lečenje tumora
RS20191516A RS59642B1 (sr) 2014-03-19 2015-03-18 Supstance antitela za lečenje tumora

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20191516A RS59642B1 (sr) 2014-03-19 2015-03-18 Supstance antitela za lečenje tumora

Country Status (30)

Country Link
US (3) US10550193B2 (sr)
EP (3) EP3594238B1 (sr)
JP (2) JP6559697B2 (sr)
KR (1) KR102435081B1 (sr)
CN (2) CN106459214B (sr)
AU (1) AU2015231295C1 (sr)
CA (1) CA2943084C (sr)
CY (3) CY1122315T1 (sr)
DK (2) DK3119808T3 (sr)
EA (1) EA035164B1 (sr)
ES (2) ES2868330T3 (sr)
FI (1) FIC20240044I1 (sr)
FR (1) FR25C1001I2 (sr)
HR (1) HRP20192170T1 (sr)
HU (3) HUE046505T2 (sr)
IL (2) IL247845B (sr)
LT (3) LT3119808T (sr)
MA (1) MA55629A (sr)
ME (1) ME03544B (sr)
MX (2) MX373927B (sr)
NL (1) NL301302I2 (sr)
NO (1) NO2024056I1 (sr)
PL (2) PL3119808T3 (sr)
PT (2) PT3119808T (sr)
RS (2) RS61856B1 (sr)
SI (2) SI3119808T1 (sr)
SM (2) SMT201900662T1 (sr)
TW (2) TWI701042B (sr)
WO (1) WO2015143079A1 (sr)
ZA (1) ZA201606597B (sr)

Families Citing this family (199)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10851178B2 (en) 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
US12466897B2 (en) 2011-10-10 2025-11-11 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
JOP20200236A1 (ar) 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US9701759B2 (en) 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
KR102211837B1 (ko) 2013-01-14 2021-02-03 젠코어 인코포레이티드 신규한 이형이량체 단백질
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
TWI635098B (zh) * 2013-02-01 2018-09-11 再生元醫藥公司 含嵌合恆定區之抗體
AR095196A1 (es) 2013-03-15 2015-09-30 Regeneron Pharma Medio de cultivo celular libre de suero
US10106624B2 (en) 2013-03-15 2018-10-23 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10519242B2 (en) 2013-03-15 2019-12-31 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
EP2970486B1 (en) 2013-03-15 2018-05-16 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
IL263466B2 (en) 2013-12-17 2023-10-01 Genentech Inc Anti-CD3 antibodies and methods of using them
TWI681969B (zh) 2014-01-23 2020-01-11 美商再生元醫藥公司 針對ｐｄ-１的人類抗體
TWI680138B (zh) 2014-01-23 2019-12-21 美商再生元醫藥公司 抗ｐｄ-ｌ１之人類抗體
TWI701042B (zh) * 2014-03-19 2020-08-11 美商再生元醫藥公司 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物
EP3699195A3 (en) 2014-03-28 2020-11-04 Xencor, Inc. Bispecific antibodies that bind to cd38 and cd3
MA40579A (fr) 2014-09-12 2016-03-17 Genentech Inc Anticorps anti-cll-1 et immunoconjugués
KR102614189B1 (ko) * 2014-11-17 2023-12-18 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. Cd3xcd20 이특이적 항체를 이용한 종양의 치료 방법
RU2726446C2 (ru) 2014-11-24 2020-07-14 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Не относящиеся к человеку животные, экспрессирующие гуманизированный комплекс cd3
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
EP3223907A2 (en) 2014-11-26 2017-10-04 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cd38
PE20171324A1 (es) 2014-11-26 2017-09-11 Xencor Inc Anticuerpos heterodimericos que se unen a cd3 y a antigenos tumorales
WO2016105450A2 (en) 2014-12-22 2016-06-30 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
US10544220B2 (en) 2015-01-08 2020-01-28 Genmab A/S Bispecific antibodies against CD3 and CD20
US10227411B2 (en) 2015-03-05 2019-03-12 Xencor, Inc. Modulation of T cells with bispecific antibodies and FC fusions
WO2016161010A2 (en) 2015-03-30 2016-10-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Heavy chain constant regions with reduced binding to fc gamma receptors
EA039429B1 (ru) * 2015-05-13 2022-01-26 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Способы лечения опухолей с применением биспецифического антитела cd3xcd20
DK3310814T5 (da) 2015-06-16 2024-10-07 Hoffmann La Roche Humaniserede og affinitetsmodnede antistoffer mod FcRH5 og fremgangsmåder til anvendelse
US10501545B2 (en) 2015-06-16 2019-12-10 Genentech, Inc. Anti-CLL-1 antibodies and methods of use
EP3916018A1 (en) 2015-06-16 2021-12-01 Genentech, Inc. Anti-cd3 antibodies and methods of use
JP6837436B2 (ja) * 2015-07-10 2021-03-03 中外製薬株式会社 内因性ｃｄ３遺伝子をヒトｃｄ３遺伝子に置換した非ヒト動物
JOP20160154B1 (ar) * 2015-07-31 2021-08-17 Regeneron Pharma أجسام ضادة مضاد لل psma، وجزيئات رابطة لمستضد ثنائي النوعية الذي يربط psma و cd3، واستخداماتها
TWI870789B (zh) 2015-08-04 2025-01-21 美商再生元醫藥公司 補充牛磺酸之細胞培養基及用法
AU2016325630B2 (en) 2015-09-23 2022-11-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Optimized anti-CD3 bispecific antibodies and uses thereof
CA3007030A1 (en) 2015-12-07 2017-06-15 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and psma
AU2016378573A1 (en) * 2015-12-22 2018-07-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Bispecific anti-CD20/anti-CD3 antibodies to treat acute lymphoblastic leukemia
LT3394103T (lt) * 2015-12-22 2023-09-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antikūnų prieš pd-1 ir bispecifinių antikūnų prieš cd20/cd3 derinys, skirtas vėžiui gydyti
EP3402825A1 (en) 2016-01-12 2018-11-21 Crescendo Biologics Limited Molecules that bind prostate specific membrane antigen (psma)
SG11201807885PA (en) 2016-04-20 2018-10-30 Regeneron Pharma Compositions and methods for making antibodies based on use of expression-enhancing loci
BR112018071285A2 (pt) 2016-04-20 2019-02-12 Regeneron Pharma célula, conjunto de vetores, vetor, sistema, e, método
GB201607968D0 (en) 2016-05-06 2016-06-22 Crescendo Biolog Ltd Chimeric antigen receptor
TWI910495B (zh) 2016-05-13 2026-01-01 美商再生元醫藥公司 藉由投予pd-1抑制劑治療皮膚癌之方法
WO2017210485A1 (en) * 2016-06-01 2017-12-07 Xencor, Inc. Bispecific antibodies that bind cd20 and cd3 for use in the treatment of lymphoma
JP7010854B2 (ja) 2016-06-14 2022-01-26 ゼンコア インコーポレイテッド 二重特異性チェックポイント阻害剤抗体
KR20250175345A (ko) * 2016-06-21 2025-12-16 테네오바이오, 인코포레이티드 Cd3 결합 항체
CN109715663B (zh) 2016-06-28 2022-11-25 Xencor股份有限公司 结合生长抑素受体2的异源二聚抗体
WO2018038046A1 (ja) 2016-08-22 2018-03-01 中外製薬株式会社 ヒトｇｐｃ３ポリペプチドを発現する遺伝子改変非ヒト動物
EP3504328A1 (en) 2016-08-24 2019-07-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Host cell protein modification
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
PE20241349A1 (es) * 2016-09-14 2024-07-03 Teneobio Inc Anticuerpos de union a cd3
JP7066690B2 (ja) * 2016-09-23 2022-05-13 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 抗ｍｕｃ１６（ムチン１６）抗体
MY203000A (en) 2016-10-14 2024-06-01 Xencor Inc Il15/il15r� heterodimeric fc-fusion proteins
JP7784795B2 (ja) * 2016-11-15 2025-12-12 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３二重特異性抗体による処置のための投与
IL317134A (en) 2016-12-21 2025-01-01 Teneobio Inc An antibody containing only heavy chains that binds a human B-cell maturation antigen, a pharmaceutical composition containing the same, its use in the treatment of B-cell disorders and a method for its preparation
EP3565841A1 (en) 2017-01-06 2019-11-13 Crescendo Biologics Limited Single domain antibodies to programmed cell death (pd-1)
MA47604A (fr) 2017-02-21 2020-01-01 Regeneron Pharma Anticorps anti-pd-1 pour le traitement du cancer du poumon
US11603407B2 (en) 2017-04-06 2023-03-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Stable antibody formulation
JOP20190222A1 (ar) * 2017-04-11 2019-09-24 Zymeworks Inc الأجسام المضادة ثنائية النوعية المضادة لـ pd-l1 والمضادة لـ tim-3
CN110945026B (zh) 2017-06-20 2024-03-19 特纳奥尼股份有限公司 仅有重链的抗bcma抗体
KR20250007003A (ko) 2017-06-20 2025-01-13 테네오바이오, 인코포레이티드 항-bcma 중쇄-단독 항체
AR112257A1 (es) 2017-06-21 2019-10-09 Gilead Sciences Inc Anticuerpos multiespecíficos dirigidos al vih-1 gp120 y cd3 humana, composiciones que los comprende, ácido nucleico, vector y célula huésped relacionados, método para producirlos, método para detectar células que expresan gp120 y cd3, kit de anticuerpos, fragmentos de anticuerpo que se une a gp120 y método para producirlos
WO2019006472A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Xencor, Inc. TARGETED HETETRODIMERIC FUSION PROTEINS CONTAINING IL-15 / IL-15RA AND ANTIGEN-BINDING DOMAINS
BR112020000127A2 (pt) 2017-07-06 2020-07-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. método para selecionar um hidrolisado de soja, e, glicoproteína
GB201711068D0 (en) 2017-07-10 2017-08-23 Crescendo Biologics Ltd Therapeutic molecules binding PSMA
TWI799432B (zh) * 2017-07-27 2023-04-21 美商再生元醫藥公司 抗ctla-4抗體及其用途
WO2019022671A1 (en) * 2017-07-28 2019-01-31 National University Of Singapore BIOMOLECULAR COMPOSITES COMPRISING MODIFIED CELLULAR PHANTOMS
KR102794369B1 (ko) 2017-08-01 2025-04-15 에이비 테라퓨틱스 인코퍼레이티드 이중특이 항체 및 그의 용도
JP2021502100A (ja) 2017-11-08 2021-01-28 ゼンコア インコーポレイテッド 新規抗ｐｄ−１配列を用いた二重特異性および単一特異性抗体
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
EP3710478A1 (en) 2017-11-13 2020-09-23 Crescendo Biologics Limited Molecules that bind to cd137 and psma
IL275426B2 (en) 2017-12-19 2025-03-01 Xencor Inc Engineered il-2 fc fusion proteins
MX2020006639A (es) 2017-12-22 2020-09-14 Regeneron Pharma Sistema y metodo para caracterizar las impurezas de un producto farmaceutico.
CN111683966B (zh) 2017-12-22 2023-07-11 特尼奥生物股份有限公司 与cd22结合的重链抗体
BR112020013336A2 (pt) 2018-01-31 2020-12-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. produto farmacêutico proteico, métodos para caracterizar as impurezas do produto farmacêutico proteico de alto peso molecular intermediário, para produção de um anticorpo, e para caracterizar as impurezas de fármaco com variação de carga, anticorpo, e, sistema para caracterizar impurezas de fármaco de alto peso molecular intermediário.
TW202311746A (zh) 2018-02-02 2023-03-16 美商再生元醫藥公司 用於表徵蛋白質二聚合之系統及方法
IL325995A (en) 2018-02-08 2026-03-01 Genentech Inc Bispecific antigen binding molecules and methods of use
GB201802573D0 (en) 2018-02-16 2018-04-04 Crescendo Biologics Ltd Therapeutic molecules that bind to LAG3
WO2019168774A1 (en) 2018-02-28 2019-09-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Systems and methods for identifying viral contaminants
IL277049B2 (en) 2018-03-13 2024-02-01 Zymeworks Bc Inc Conjugates of biparatopic anti-HER2 antibody and drug and methods of use
US12259355B2 (en) 2018-03-19 2025-03-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Microchip capillary electrophoresis assays and reagents
HUE065344T2 (hu) 2018-03-19 2024-05-28 Regeneron Pharma Mikrochip kapilláris elektroforézis assay-k és reagensek
US12253490B2 (en) 2018-03-19 2025-03-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Microchip capillary electrophoresis assays and reagents
CA3096052A1 (en) 2018-04-04 2019-10-10 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
EP3781598A1 (en) 2018-04-18 2021-02-24 Xencor, Inc. Tim-3 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and tim-3 antigen binding domains
SG11202010163QA (en) 2018-04-18 2020-11-27 Xencor Inc Pd-1 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and pd-1 antigen binding domains and uses thereof
TW202016125A (zh) 2018-05-10 2020-05-01 美商再生元醫藥公司 用於定量及調節蛋白質黏度之系統與方法
EP3569617A1 (en) * 2018-05-18 2019-11-20 Trion Research GmbH Pharmaceutical preparation for use in treating epstein- barr virus positive patients with reactivation phenomenon- associated diseases
CN110540593B (zh) * 2018-05-29 2022-05-17 上海药明生物技术有限公司 新型的抗cd3/抗cd20双特异性抗体
TW202504917A (zh) 2018-06-21 2025-02-01 美商再生元醫藥公司 用雙特異性抗CD3xMUC16抗體及抗PD-1抗體治療癌症之方法
CN119264211A (zh) 2018-08-27 2025-01-07 瑞泽恩制药公司 拉曼光谱在下游纯化中的应用
JP7511542B2 (ja) 2018-08-30 2024-07-05 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド タンパク質複合体を特徴づけるための方法
CA3110513A1 (en) 2018-08-31 2020-03-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Dosing strategy that mitigates cytokine release syndrome for cd3/c20 bispecific antibodies
AU2019355971B2 (en) 2018-10-03 2025-05-08 Xencor, Inc. IL-12 heterodimeric Fc-fusion proteins
CN109836502B (zh) * 2018-11-12 2021-09-07 浙江大学 一种双特异性抗体及其应用
WO2020150491A1 (en) 2019-01-16 2020-07-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for characterizing disulfide bonds
US12463463B2 (en) 2019-01-28 2025-11-04 Ab Therapeutics, Inc. Bispecific antibodies and uses thereof
CN111484555B (zh) * 2019-01-28 2022-07-08 正大天晴药业集团股份有限公司 新型双特异性cd3/cd20多肽复合物
WO2020156405A1 (en) * 2019-01-28 2020-08-06 Wuxi Biologics (Shanghai) Co. Ltd. Novel bispecific cd3/cd20 polypeptide complexes
KR20210126641A (ko) 2019-02-12 2021-10-20 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 보체 및 표적 항원에 결합하기 위해 이중 특이적 항체를 사용하는 조성물 및 방법
CA3132185A1 (en) 2019-03-01 2020-09-10 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind enpp3 and cd3
WO2020206330A1 (en) 2019-04-05 2020-10-08 Teneobio, Inc. Heavy chain antibodies binding to psma
WO2020231992A1 (en) 2019-05-13 2020-11-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Improved competitive ligand binding assays
CR20210622A (es) 2019-06-14 2022-06-27 Teneobio Inc Anticuerpos multiespecíficos de cadena pesada que se unen a cd22 y cd3
JP6881658B2 (ja) 2019-07-05 2021-06-02 小野薬品工業株式会社 Ｐｄ−１／ｃｄ３二重特異性タンパク質による血液がん治療
WO2021061790A1 (en) 2019-09-24 2021-04-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Systems and methods for chromatography use and regeneration
US12297451B1 (en) 2019-10-25 2025-05-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cell culture medium
CA3158119A1 (en) 2019-11-25 2021-06-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Sustained release formulations using non-aqueous emulsions
WO2021119505A1 (en) 2019-12-13 2021-06-17 Genentech, Inc. Anti-ly6g6d antibodies and methods of use
CN115398236B (zh) 2020-01-21 2024-06-11 瑞泽恩制药公司 用于糖基化的蛋白质的电泳的去糖基化方法
IL297601A (en) 2020-04-29 2022-12-01 Teneobio Inc Multispecific heavy chain antibodies with modified heavy chain constant regions
KR20230005936A (ko) 2020-05-01 2023-01-10 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 치료 단백질에 대한 중화 항체 검정
MX2022013797A (es) 2020-05-08 2022-11-30 Genmab As Anticuerpos biespecificos contra cd3 y cd20.
WO2021231976A1 (en) 2020-05-14 2021-11-18 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (psma) and cd3
CA3217391A1 (en) 2020-07-27 2022-02-03 Youwei ZHU Formulation of novel bispecific anti-cd3/cd20 polypeptide complex
CA3192204A1 (en) 2020-08-19 2022-02-24 Xencor, Inc. Anti-cd28 and/or anti-b7h3 compositions
WO2022047108A1 (en) 2020-08-31 2022-03-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Asparagine feed strategies to improve cell culture performance and mitigate asparagine sequence variants
CA3189883A1 (en) 2020-09-10 2022-03-17 Brian Elliott Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating follicular lymphoma
CA3190376A1 (en) 2020-09-10 2022-03-17 Brian Elliott Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating follicular lymphoma
US20240034812A1 (en) 2020-09-10 2024-02-01 Genmab A/S Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating diffuse large b-cell lymphoma
KR20230066040A (ko) 2020-09-10 2023-05-12 젠맵 에이/에스 만성 림프구성 백혈병을 치료하기 위한 cd3 및 cd20에 대한 이중특이적 항체
CN116782933A (zh) 2020-09-10 2023-09-19 健玛保 用于治疗弥漫性大b细胞淋巴瘤的联合疗法中的针对cd3和cd20的双特异性抗体
JP2023544164A (ja) * 2020-10-02 2023-10-20 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド サイトカイン放出症候群の低減を伴うがんを治療するための抗体の組合せ
TWI874719B (zh) 2020-11-04 2025-03-01 美商建南德克公司 用抗cd20/抗cd3雙特異性抗體進行治療之給藥
AU2021374594B2 (en) 2020-11-04 2026-03-05 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies and anti-cd79b antibody drug conjugates
JP7716473B2 (ja) 2020-11-04 2025-07-31 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３二重特異性抗体の皮下投薬
WO2022115588A1 (en) 2020-11-25 2022-06-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Sustained release formulations using non-aqueous membrane emulsification
KR20230121854A (ko) 2020-12-17 2023-08-21 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 단백질-캡슐화 마이크로겔의 제작
MX2023008527A (es) 2021-01-20 2023-07-28 Regeneron Pharma Metodos para mejorar el valor proteico en cultivo celular.
AU2022214319A1 (en) 2021-01-28 2023-08-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating cytokine release syndrome
JP2024512299A (ja) 2021-03-03 2024-03-19 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド タンパク質の粘度を定量及び変更するためのシステム及び方法
US11739144B2 (en) 2021-03-09 2023-08-29 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and CLDN6
EP4305065A1 (en) 2021-03-10 2024-01-17 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and gpc3
MX2023010567A (es) 2021-03-12 2023-09-21 Genmab As Variantes de anticuerpos no activadoras.
AU2022243005A1 (en) 2021-03-26 2023-10-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for developing mixing protocols
CA3213632A1 (en) 2021-04-30 2022-11-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Dosing for combination treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibody and anti-cd79b antibody drug conjugate
EP4337330A1 (en) 2021-05-14 2024-03-20 Genentech, Inc. Methods for treatment of cd20-positive proliferative disorder with mosunetuzumab and polatuzumab vedotin
BR112023024984A2 (pt) 2021-06-01 2024-02-20 Regeneron Pharma Tampão de amostra de eletroforese aquosa, método para identificar contaminantes ou impurezas em uma amostra de droga proteica, e, kit
US12227574B2 (en) 2021-06-17 2025-02-18 Amberstone Biosciences, Inc. Anti-CD3 constructs and uses thereof
US20230077710A1 (en) 2021-09-08 2023-03-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. HIGH-THROUGHPUT AND MASS-SPECTROMETRY-BASED METHOD FOR QUANTITATING ANTIBODIES AND OTHER Fc-CONTAINING PROTEINS
CA3232463A1 (en) 2021-09-20 2023-03-23 Philip Mellors Methods of controlling antibody heterogeneity
CA3230984A1 (en) 2021-10-07 2023-04-13 Ross BROWNE Systems and methods of ph modeling and control
WO2023059803A1 (en) 2021-10-07 2023-04-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ph meter calibration and correction
TW202330104A (zh) 2021-10-26 2023-08-01 美商再生元醫藥公司 用於產生實驗室用水及分配不同溫度之實驗室用水的系統及方法
EP4437003A1 (en) 2021-11-24 2024-10-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating cancer with bispecific anti-cd3 x muc16 antibodies and anti-ctla-4 antibodies
US20230312718A1 (en) 2022-01-07 2023-10-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc Methods of Treating Recurrent Ovarian Cancer with Bispecific Anti-MUC16 x Anti-CD3 Antibodies Alone or in Combination with Anti-PD-1 Antibodies
IL315405A (en) 2022-03-17 2024-11-01 Regeneron Pharma Methods for treating recurrent epithelioid sarcoma using bispecific anti-MUC16 and anti-CD3 antibodies alone or in combination with anti-PD-1 antibodies
KR20240164561A (ko) 2022-03-18 2024-11-19 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 폴리펩타이드 변종을 분석하기 위한 방법 및 시스템
EP4507790A1 (en) 2022-04-11 2025-02-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for universal tumor cell killing
US11958906B2 (en) 2022-04-13 2024-04-16 Genentech, Inc. Pharmaceutical compositions of mosunetuzumab and methods of use
AU2022456952A1 (en) 2022-05-02 2024-11-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Biochemical assays for therapeutic proteins
EP4522657A1 (en) 2022-05-12 2025-03-19 Genmab A/S Binding agents capable of binding to cd27 in combination therapy
WO2023224912A1 (en) 2022-05-16 2023-11-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating metastatic castration-resistant prostate cancer with bispecific anti-psma x anti-cd3 antibodies alone or in combination with anti-pd-1 antibodies
US20230416396A1 (en) 2022-05-18 2023-12-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multispecific antigen binding molecules that bind cd38 and 4-1bb, and uses thereof
IL318426A (en) 2022-08-02 2025-03-01 Regeneron Pharma Methods for treating metastatic castration-resistant prostate cancer using bispecific antibodies against PSMA and CD28 in combination with anti-PD-1 antibodies
WO2024040206A2 (en) * 2022-08-19 2024-02-22 Eli Lilly And Company Pd-1 agonist antibodies and methods of treating autoimmune diseases with a pd-1 agonist antibody
TW202435942A (zh) 2022-12-16 2024-09-16 美商里珍納龍藥品有限公司 評估層析管柱完整性的方法及系統
EP4655595A1 (en) 2023-01-25 2025-12-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mass spectrometry-based characterization of antibodies co-expressed in vivo
US20240245779A1 (en) 2023-01-25 2024-07-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modeling liquid protein composition stability
WO2024163708A1 (en) 2023-02-01 2024-08-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Asymmetrical flow field-flow fractionation with mass spectrometry for biomacromolecule analysis
CN120857940A (zh) 2023-02-17 2025-10-28 瑞泽恩制药公司 对cd3/taa双特异性抗体有反应的诱导型nk细胞
EP4669963A2 (en) 2023-02-22 2025-12-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. SYSTEM FITNESS PARAMETERS AND COLUMN AGING
CU20250022A7 (es) * 2023-03-10 2026-04-09 Biocad Joint Stock Co Anticuerpo biespecífico que se une específicamente al cd3 y al antígeno tumoral
US20240366471A1 (en) 2023-05-01 2024-11-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multidose antibody drug products using phenol or benzyl alcohol
KR20260049559A (ko) 2023-08-02 2026-04-14 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 이중특이적 항-PSMA x 항-CD28 항체를 이용한 투명 세포 신세포 암종의 치료 방법
IL325956A (en) 2023-08-02 2026-03-01 Regeneron Pharma Methods for treating metastatic castration-resistant prostate cancer using bispecific antibodies against PSMA and CD28
WO2025054406A1 (en) 2023-09-08 2025-03-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for assessing chromatographic column integrity
US20250095773A1 (en) 2023-09-18 2025-03-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for developing chromatography protocols
US20250109905A1 (en) 2023-09-29 2025-04-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Lyophilization using controlled nucleation
US20250129117A1 (en) 2023-10-18 2025-04-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Rapid purification of monoclonal antibody from in-process upstream cell culture material
US20250145662A1 (en) 2023-11-02 2025-05-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for reducing lipase activity using stress
TW202539732A (zh) 2023-11-29 2025-10-16 美商再生元醫藥公司 以雙特異性抗muc16×抗cd28抗體與抗pd-1抗體之組合或與雙特異性抗muc16×抗cd3抗體之組合治療復發性卵巢癌及子宮內膜癌之方法
TW202542187A (zh) 2023-12-12 2025-11-01 美商再生元醫藥公司 以雙特異性抗muc16x抗cd3抗體單獨或與抗pd-1抗體組合治療子宮內膜癌之方法
US20250242018A1 (en) 2024-01-26 2025-07-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Combination immunosuppression for inhibiting an immune response and enabling immunogen administration and re-administration
WO2025160324A2 (en) 2024-01-26 2025-07-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for using plasma cell depleting agents and/or b cell depleting agents to suppress host anti-aav antibody response and enable aav transduction and re-dosing
WO2025166281A1 (en) 2024-02-01 2025-08-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Platform for charge-detection mass spectrometry analysis of aavs
WO2025171124A1 (en) 2024-02-07 2025-08-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating prostate cancer with bispecific anti-psma x anti-cd3 antibodies and bispecific anti-psma x anti-cd28 antibodies
WO2025175164A1 (en) 2024-02-16 2025-08-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of producing concentrated formulated drug substances comprising proteins, and concentrated formulated drug substance made by the methods
US20250276092A1 (en) 2024-03-01 2025-09-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for re-dosing aav using anti-cd40 antagonistic antibody to suppress host anti-aav antibody response
TW202602489A (zh) 2024-03-15 2026-01-16 美商再生元醫藥公司 作為經穩定的蛋白質調配物之賦形劑的聚山梨醇酯及聚氧乙烯山梨糖醇酐
WO2025240287A1 (en) 2024-05-13 2025-11-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating light chain amyloidosis with bispecific bcma x cd3 antibodies
WO2025244973A1 (en) 2024-05-20 2025-11-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating multiple myeloma with bispecific bcma x cd3 antibodies
WO2025259840A1 (en) 2024-06-13 2025-12-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for scaled chromatography
WO2026006492A2 (en) 2024-06-25 2026-01-02 Ypsilon Therapeutics, Inc. Anti-prame/hla-a2 antibodies and uses thereof
WO2026006495A1 (en) 2024-06-25 2026-01-02 Alloy Therapeutics, Inc. Anti-wt1/hla-a2 antibody and uses thereof
WO2026015612A1 (en) 2024-07-10 2026-01-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating smarcb1-deficient cancers
WO2026025028A1 (en) 2024-07-26 2026-01-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of making ultra-high concentrated protein formulations using lyophilization
WO2026059917A1 (en) 2024-09-10 2026-03-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating multiple myeloma with bcma inhibitors in combination with proteasome inhibitors
WO2026059919A1 (en) 2024-09-10 2026-03-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating multiple myeloma with bcma inhibitors in combination with cd38 inhibitors
WO2026059923A1 (en) 2024-09-10 2026-03-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating multiple myeloma with bcma inhibitors in combination with an immunomodulator
WO2026059920A1 (en) 2024-09-10 2026-03-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating multiple myeloma with bcma inhibitors in combination with pd1/pd-l1 inhibitors
WO2026059921A1 (en) 2024-09-10 2026-03-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating multiple myeloma with bcma inhibitors in combination with lag3 inhibitors
WO2026060350A1 (en) 2024-09-13 2026-03-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of improving photo stability and controlling formation of hmw species in biologic formulations, and biologic formulations produced by the methods
WO2026076201A2 (en) 2024-10-03 2026-04-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Systems and methods for producing therapeutic proteins using single pass tangential flow filtration for in-line concentration and volume reduction of production pools
WO2026080597A1 (en) 2024-10-08 2026-04-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Sustained delivery of biologics and non-aqueous manufacture of same

Family Cites Families (140)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4361549A (en) 1979-04-26 1982-11-30 Ortho Pharmaceutical Corporation Complement-fixing monoclonal antibody to human T cells, and methods of preparing same
FR2593830B1 (fr) 1986-02-06 1988-04-08 Snecma Superalliage a matrice a base de nickel notamment elabore en metallurgie des poudres et disque de turbomachine constitue en cet alliage
US6893625B1 (en) 1986-10-27 2005-05-17 Royalty Pharma Finance Trust Chimeric antibody with specificity to human B cell surface antigen
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
WO1989007142A1 (en) 1988-02-05 1989-08-10 Morrison Sherie L Domain-modified constant region antibodies
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
MX9204374A (es) 1991-07-25 1993-03-01 Idec Pharma Corp Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion.
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
DK0752248T3 (da) 1992-11-13 2000-11-13 Idec Pharma Corp Terapeutisk anvendelse af kimæriske og radioaktivt mærkede antistoffer mod humant B-lymfocytbegrænset differentieringsantig
US6180377B1 (en) 1993-06-16 2001-01-30 Celltech Therapeutics Limited Humanized antibodies
US6750334B1 (en) 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
EP0826696B1 (de) 1996-09-03 2002-05-29 GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH Verwendung bi-und trispezifischer Antikörper zur Induktion einer Tumorimmunität
HUP0100813A3 (en) 1998-02-25 2003-08-28 Lexigen Pharmaceuticals Corp L Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US7112324B1 (en) 1998-04-21 2006-09-26 Micromet Ag CD 19×CD3 specific polypeptides and uses thereof
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
PT1974747E (pt) 1998-08-11 2012-09-05 Biogen Idec Inc Terapias de combinação para linfomas de células b compreendendo a administração de anticorpo anti-cd20
US6224866B1 (en) 1998-10-07 2001-05-01 Biocrystal Ltd. Immunotherapy of B cell involvement in progression of solid, nonlymphoid tumors
US7183387B1 (en) 1999-01-15 2007-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
PL209392B1 (pl) 1999-01-15 2011-08-31 Genentech Inc Przeciwciało, komórka gospodarza, sposób wytwarzania przeciwciała oraz zastosowanie przeciwciała
CA2704600C (en) 1999-04-09 2016-10-25 Kyowa Kirin Co., Ltd. A method for producing antibodies with increased adcc activity
WO2000067796A1 (en) 1999-05-07 2000-11-16 Genentech, Inc. Treatment of autoimmune diseases with antagonists which bind to b cell surface markers
US7087411B2 (en) 1999-06-08 2006-08-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fusion protein capable of binding VEGF
ITMI991299A1 (it) 1999-06-11 2000-12-11 Consiglio Nazionale Ricerche Uso di anticorpi contro antigeni di superficie per il trattamento della malattia trapianto contro ospite
US7396917B2 (en) 2000-12-05 2008-07-08 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Rationally designed antibodies
AU2002250293B2 (en) 2001-03-09 2007-10-11 Arnason, Barry G. Mr Polymeric immunoglobulin fusion proteins that target low-affinity FCGammaReceptors
WO2003026490A2 (en) 2001-09-28 2003-04-03 Elusys Therapeutics, Inc. Methods and compositions for prevention, diagnosis, and treatment of cancer using bispecific molecules
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
WO2003068821A2 (en) 2002-02-14 2003-08-21 Immunomedics, Inc. Anti-cd20 antibodies and fusion proteins thereof and methods of use
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US8673589B2 (en) 2002-05-29 2014-03-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Inducible eukaryotic expression system
EP1400534B1 (en) 2002-09-10 2015-10-28 Affimed GmbH Human CD3-specific antibody with immunosuppressive properties
US7820166B2 (en) 2002-10-11 2010-10-26 Micromet Ag Potent T cell modulating molecules
BRPI0315295C1 (pt) 2002-10-17 2021-05-25 Genmab As anticorpo monoclonal humano isolado, célula hospedeira procariótica, composição farmacêutica, molécula biespecífica, usos de um anticorpo, métodos in vitro de detectar a presença de antígeno de cd20 ou uma célula que expressa cd20 em uma amostra, kit, e, vetor de expressão
US7608260B2 (en) 2003-01-06 2009-10-27 Medimmune, Llc Stabilized immunoglobulins
US7960512B2 (en) 2003-01-09 2011-06-14 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
CA2512729C (en) 2003-01-09 2014-09-16 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant fc regions and methods of using same
US8084582B2 (en) 2003-03-03 2011-12-27 Xencor, Inc. Optimized anti-CD20 monoclonal antibodies having Fc variants
CN1802388B (zh) 2003-05-09 2011-01-05 杜克大学 Cd20特异抗体及使用它们的方法
AR044388A1 (es) 2003-05-20 2005-09-07 Applied Molecular Evolution Moleculas de union a cd20
JP2007501021A (ja) 2003-05-30 2007-01-25 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 遺伝子操作された定常領域を含む、抗体および融合タンパク質
DK1629011T3 (da) 2003-05-31 2010-05-03 Micromet Ag Humane anti-humane-DC3-bindingsmolekyler
RU2005137325A (ru) 2003-05-31 2006-09-10 Микромет Аг (De) Фармацевтическая композиция, содержащая конструкт, специфичный к ерсам
NZ544924A (en) 2003-06-27 2009-03-31 Biogen Idec Inc Modified binding molecules comprising connecting peptides
MXPA06002134A (es) 2003-08-29 2006-05-31 Genentech Inc Terapia de trastornos oculares.
US8399618B2 (en) 2004-10-21 2013-03-19 Xencor, Inc. Immunoglobulin insertions, deletions, and substitutions
MXPA06004035A (es) 2003-10-16 2006-08-31 Micromet Ag Aglutinantes cd3 de-inmunizados multi-especificos.
KR20060107555A (ko) 2003-12-19 2006-10-13 제넨테크, 인크. 이식 거부에서 ｃｄ20의 검출
EP1737890A2 (en) 2004-03-24 2007-01-03 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the fc region
PT1737891E (pt) 2004-04-13 2013-04-16 Hoffmann La Roche Anticorpos anti p-selectina
US7850962B2 (en) 2004-04-20 2010-12-14 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against CD20
ZA200608982B (en) 2004-05-05 2008-06-25 Genentech Inc Preventing autoimmune disease by using an anti-CD20 antibody
CA2569509C (en) 2004-06-03 2014-08-12 Novimmune S.A. Anti-cd3 antibodies and methods of use thereof
MXPA06014067A (es) 2004-06-04 2007-02-15 Genentech Inc Metodo para tratar lupus.
BRPI0516297A (pt) 2004-10-05 2008-09-02 Genentech Inc métodos de tratamento de vasculite e artigos de fabricação
AR051836A1 (es) 2004-11-30 2007-02-14 Centocor Inc Antagonistas de receptor 3 simil toll metodos y usos
US20120189643A1 (en) 2004-11-30 2012-07-26 Carton Jill M Toll Like Receptor 3 Antagonists, Methods and Uses
WO2006074399A2 (en) 2005-01-05 2006-07-13 Biogen Idec Ma Inc. Multispecific binding molecules comprising connecting peptides
US7700099B2 (en) 2005-02-14 2010-04-20 Merck & Co., Inc. Non-immunostimulatory antibody and compositions containing the same
TW200714289A (en) 2005-02-28 2007-04-16 Genentech Inc Treatment of bone disorders
AR053579A1 (es) 2005-04-15 2007-05-09 Genentech Inc Tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal (eii)
ZA200708857B (en) 2005-04-22 2009-01-28 Genentech Inc Method for treating dementia or alzheimer's disease with a CD30 antibody
JP2008541758A (ja) 2005-06-02 2008-11-27 アストラゼネカ エービー Ｃｄ２０に対する抗体およびその使用
EP2500355A3 (en) 2005-08-19 2012-10-24 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
NZ612578A (en) 2005-08-19 2014-11-28 Abbvie Inc Dual variable domain immunoglobin and uses thereof
EP1940881B1 (en) 2005-10-11 2016-11-30 Amgen Research (Munich) GmbH Compositions comprising cross-species-specific antibodies and uses thereof
KR20080073293A (ko) 2005-10-14 2008-08-08 메디뮨 엘엘씨 항체 라이브러리의 세포 디스플레이
SG10201400426XA (en) 2006-01-12 2014-07-30 Alexion Pharma Inc Antibodies to ox-2/cd200 and uses thereof
EP1820513A1 (en) 2006-02-15 2007-08-22 Trion Pharma Gmbh Destruction of tumor cells expressing low to medium levels of tumor associated target antigens by trifunctional bispecific antibodies
US20090220508A1 (en) 2006-03-15 2009-09-03 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Treatment Of Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria Patients By An Inhibitor Of Complement
JP4294082B2 (ja) 2006-03-23 2009-07-08 協和発酵キリン株式会社 ヒトトロンボポエチン受容体に対するアゴニスト抗体
JP5307708B2 (ja) 2006-06-02 2013-10-02 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ヒトｉｌ−６受容体に対する高親和性抗体
RU2448979C2 (ru) 2006-12-14 2012-04-27 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Антитела человека к дельта-подобному лиганду-4 человека
ES2593484T3 (es) 2007-03-29 2016-12-09 Genmab A/S Anticuerpos biespecíficos y métodos de producción de los mismos
RS53008B2 (sr) 2007-04-03 2022-12-30 Amgen Res Munich Gmbh Interspecijski specifičan cd3-epsilon vezujući domen
MX2009010611A (es) 2007-04-03 2010-03-26 Micromet Ag Enlazadores biespecificos, especificos para especies.
EP2158318A2 (en) 2007-05-14 2010-03-03 Biogen Idec MA, Inc. Single-chain fc (scfc) regions, binding polypeptides comprising same, and methods related thereto
ES2623925T3 (es) 2007-05-30 2017-07-12 Postech Academy-Industry- Foundation Proteínas de fusión de inmunoglobulina
JP6071165B2 (ja) 2007-05-31 2017-02-01 ゲンマブ エー／エス 安定なＩｇＧ４抗体
JP5511654B2 (ja) 2007-05-31 2014-06-04 ゲンマブ エー／エス 分子操作により得られた組換え非グリコシル化一価半抗体
US20110077383A1 (en) 2007-07-03 2011-03-31 Medimmune, Llc Hinge domain engineering
MX2010000970A (es) * 2007-07-31 2010-03-09 Regeneron Pharma Anticuerpos humanos contra cd20 humano y metodo para utilizarlos.
MX2010001395A (es) 2007-08-10 2010-03-10 Regeneron Pharma Anticuerpos humanos de alta afinidad de factor de crecimiento de nervio humano.
AU2008295140A1 (en) 2007-09-05 2009-03-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy with type I and type II anti-CD20 antibodies
MX2010003329A (es) 2007-09-26 2010-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti-receptor de il-6.
KR101680906B1 (ko) 2007-09-26 2016-11-30 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항체 정상영역 개변체
RU2010138612A (ru) 2008-02-20 2012-03-27 Джи2 ИНФЛЕММЕЙШН ПТИ ЛТД (AU) ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ C5аR
WO2009106096A1 (en) 2008-02-27 2009-09-03 Fresenius Biotech Gmbh Treatment of resistant tumors with trifunctional antibodies
EP2356154A4 (en) 2008-11-06 2012-12-19 Alexion Pharma Inc DEVELOPMENT OF REDUCED IMMUNOGENICITY ANTIBODIES AND METHODS OF MANUFACTURING THEREOF
PL2918604T3 (pl) 2008-11-07 2018-05-30 Amgen Research (Munich) Gmbh Leczenie pediatrycznej ostrej białaczki limfoblastycznej
AR074438A1 (es) 2008-12-02 2011-01-19 Pf Medicament Proceso para la modulacion de la actividad antagonista de un anticuerpo monoclonal
AU2009324092A1 (en) 2008-12-03 2011-06-23 Genmab A/S Antibody variants having modifications in the constant region
JP2012515556A (ja) 2009-01-23 2012-07-12 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド 低下したエフェクタ機能を有する安定化Ｆｃポリペプチドおよび使用方法
JP5717624B2 (ja) 2009-03-19 2015-05-13 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
EP2826789A1 (en) 2009-03-19 2015-01-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
MY192182A (en) * 2009-06-26 2022-08-04 Regeneron Pharma Readily isolated bispecific antibodies with native immunoglobulin format
JO3182B1 (ar) 2009-07-29 2018-03-08 Regeneron Pharma مضادات حيوية بشرية عالية الالفة مع تولد الاوعية البشرية - 2
US10150808B2 (en) 2009-09-24 2018-12-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant regions
US8961967B2 (en) 2009-11-30 2015-02-24 Janssen Biotech, Inc. Antibody Fc mutants with ablated effector functions
CA2785907A1 (en) 2009-12-29 2011-07-28 Emergent Product Development Seattle, Llc Ron binding constructs and methods of use thereof
US20130129723A1 (en) 2009-12-29 2013-05-23 Emergent Product Development Seattle, Llc Heterodimer Binding Proteins and Uses Thereof
SMT202600080T1 (it) 2010-02-08 2026-03-09 Regeneron Pharma Topo con catena leggera comune
CN102167741B (zh) * 2010-02-25 2014-05-14 上海百迈博制药有限公司 一种全人源抗TNF-α单克隆抗体、其制备方法及用途
WO2011108714A1 (ja) 2010-03-04 2011-09-09 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
JP2013528357A (ja) 2010-03-29 2013-07-11 ザイムワークス，インコーポレイテッド 強化又は抑制されたエフェクター機能を有する抗体
BR112012027917A2 (pt) 2010-04-30 2017-11-28 Alexion Pharma Inc anticorpos que apresentam reduzida imunogenicidade em um indivíduo humano
GB201014033D0 (en) 2010-08-20 2010-10-06 Ucb Pharma Sa Biological products
KR101871008B1 (ko) 2010-09-16 2018-06-25 발리오팜 아게 항-huTNFR1 항체
PT3434767T (pt) * 2010-11-30 2026-01-23 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agente terapêutico indutor de citotoxicidade
ES2623912T3 (es) 2010-12-23 2017-07-12 Janssen Biotech, Inc. Mutantes FC de anticuerpo activo resistente a proteasa
PT2673373T (pt) 2011-02-08 2018-12-05 Medimmune Llc Anticorpos que ligam especificamente a toxina alfa de staphylococcus aureus e métodos de utilização
ES2692268T5 (en) 2011-03-29 2025-02-26 Roche Glycart Ag Antibody fc variants
AU2012245116A1 (en) * 2011-04-20 2013-11-07 Genmab A/S Bispecific antibodies against HER2 and CD3
WO2013012733A1 (en) 2011-07-15 2013-01-24 Biogen Idec Ma Inc. Heterodimeric fc regions, binding molecules comprising same, and methods relating thereto
WO2013026839A1 (en) 2011-08-23 2013-02-28 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies specific for t-cell activating antigens and a tumor antigen and methods of use
WO2013112986A1 (en) 2012-01-27 2013-08-01 Gliknik Inc. Fusion proteins comprising igg2 hinge domains
JO3820B1 (ar) 2012-05-03 2021-01-31 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية لـ fel d1وطرق لاستخدامها
MX2014014891A (es) 2012-06-05 2015-06-17 Regeneron Pharma Metodos para hacer anticuerpos biespecificos completamente humanos usando una cadena ligera comun.
AU2013289883B2 (en) * 2012-07-13 2018-11-01 Zymeworks Bc Inc. Bispecific asymmetric heterodimers comprising anti-CD3 constructs
US20150203591A1 (en) * 2012-08-02 2015-07-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mutivalent antigen-binding proteins
JOP20200236A1 (ar) * 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
HUE042040T2 (hu) 2012-09-27 2019-06-28 Merus Nv Bispecifikus IGG antitestek mint T-sejt kapcsolók
US9714291B2 (en) 2012-10-05 2017-07-25 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Heterodimer protein composition
RU2015117393A (ru) 2012-10-08 2016-12-10 Роше Гликарт Аг Лишенные fc антитела, содержащие два Fab-фрагмента, и способы их применения
TWI635098B (zh) 2013-02-01 2018-09-11 再生元醫藥公司 含嵌合恆定區之抗體
ME03675B (me) * 2013-07-05 2020-10-20 Genmab As Humanizovana ili himerna anтi-cd3 antiтela
WO2015006749A2 (en) * 2013-07-12 2015-01-15 Zymeworks Inc. Bispecific cd3 and cd19 antigen binding contructs
IL263466B2 (en) * 2013-12-17 2023-10-01 Genentech Inc Anti-CD3 antibodies and methods of using them
EP3083696B1 (en) 2013-12-20 2018-02-14 F.Hoffmann-La Roche Ag Bispecific her2 antibodies and methods of use
TWI681969B (zh) 2014-01-23 2020-01-11 美商再生元醫藥公司 針對ｐｄ-１的人類抗體
TWI701042B (zh) * 2014-03-19 2020-08-11 美商再生元醫藥公司 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物
KR102614189B1 (ko) 2014-11-17 2023-12-18 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. Cd3xcd20 이특이적 항체를 이용한 종양의 치료 방법
WO2016161010A2 (en) 2015-03-30 2016-10-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Heavy chain constant regions with reduced binding to fc gamma receptors
GB201506407D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
AU2016325630B2 (en) 2015-09-23 2022-11-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Optimized anti-CD3 bispecific antibodies and uses thereof
AU2016378573A1 (en) 2015-12-22 2018-07-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Bispecific anti-CD20/anti-CD3 antibodies to treat acute lymphoblastic leukemia
LT3394103T (lt) * 2015-12-22 2023-09-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antikūnų prieš pd-1 ir bispecifinių antikūnų prieš cd20/cd3 derinys, skirtas vėžiui gydyti
JP7784795B2 (ja) 2016-11-15 2025-12-12 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３二重特異性抗体による処置のための投与
CA3110513A1 (en) * 2018-08-31 2020-03-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Dosing strategy that mitigates cytokine release syndrome for cd3/c20 bispecific antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
RS59642B1 (sr) 2020-01-31
MA55629A (fr) 2022-05-04
ME03544B (me) 2020-07-20
AU2015231295A1 (en) 2016-10-20
MX373927B (es) 2020-07-10
CA2943084C (en) 2023-03-21
US11434300B2 (en) 2022-09-06
IL272572A (en) 2020-03-31
FR25C1001I2 (fr) 2026-01-02
ES2752156T3 (es) 2020-04-03
SI3119808T1 (sl) 2019-11-29
EP3594238B1 (en) 2021-02-24
HUE054397T2 (hu) 2021-09-28
US20230220101A1 (en) 2023-07-13
IL272572B (en) 2020-11-30
CN113045669A (zh) 2021-06-29
EP3119808B1 (en) 2019-09-04
MX2020004410A (es) 2020-08-06
DK3119808T3 (da) 2019-10-28
AU2015231295B2 (en) 2020-05-21
PT3594238T (pt) 2021-03-03
LT3119808T (lt) 2019-10-10
PL3594238T3 (pl) 2021-09-13
TWI701042B (zh) 2020-08-11
SI3594238T1 (sl) 2021-07-30
NO2024056I1 (no) 2024-12-12
NL301302I2 (nl) 2025-01-20
FR25C1001I1 (fr) 2025-02-28
JP2017509643A (ja) 2017-04-06
EP3119808A1 (en) 2017-01-25
TWI754319B (zh) 2022-02-01
TW202041234A (zh) 2020-11-16
EA035164B1 (ru) 2020-05-08
SMT202100297T1 (it) 2021-07-12
TW201622745A (zh) 2016-07-01
JP6831426B2 (ja) 2021-02-17
PL3119808T3 (pl) 2020-02-28
AU2015231295C1 (en) 2020-10-08
US20150266966A1 (en) 2015-09-24
ZA201606597B (en) 2019-04-24
JP6559697B2 (ja) 2019-08-14
SMT201900662T1 (it) 2020-01-14
CA2943084A1 (en) 2015-09-24
WO2015143079A1 (en) 2015-09-24
IL247845B (en) 2020-02-27
EA201691858A1 (ru) 2017-02-28
HUS2500001I1 (hu) 2025-01-28
CN106459214B (zh) 2021-05-04
FIC20240044I1 (fi) 2024-12-12
US20200115464A1 (en) 2020-04-16
CY1124090T1 (el) 2022-05-27
HRP20192170T1 (hr) 2020-02-21
CY2024035I2 (el) 2026-02-25
EP3848395A1 (en) 2021-07-14
KR102435081B1 (ko) 2022-08-24
ES2868330T3 (es) 2021-10-21
US10550193B2 (en) 2020-02-04
KR20160127143A (ko) 2016-11-02
CN113045669B (zh) 2024-09-20
CN106459214A (zh) 2017-02-22
EP3594238A1 (en) 2020-01-15
IL247845A0 (en) 2016-11-30
MX2016012094A (es) 2016-12-16
DK3594238T3 (da) 2021-04-19
JP2019196377A (ja) 2019-11-14
PT3119808T (pt) 2019-10-18
CY2024035I1 (el) 2026-02-25
LT3594238T (lt) 2021-03-25
CY1122315T1 (el) 2021-01-27
HUE046505T2 (hu) 2020-03-30
LTPA2024540I1 (sr) 2025-01-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230220101A1 (en) Methods and Antibody Compositions for Tumor Treatment
EP3221359B1 (en) Methods for tumor treatment using cd3xcd20 bispecific antibody
RS64378B1 (sr) Anti-cd3 antitela, bispecifični molekuli koji vezuju antigen koji vezuju cd3 i cd20, i njihove upotrebe
HK40055813A (en) Antibody compositions for tumor treatment
HK40020082A (en) Antibody compositions for tumor treatment
HK40020082B (en) Antibody compositions for tumor treatment
HK40034502A (en) Methods for tumor treatment using cd3xcd20 bispecific antibody
HK40034502B (en) Methods for tumor treatment using cd3xcd20 bispecific antibody
HK1233665B (en) Antibody compositions for tumor treatment
HK1233665A1 (en) Antibody compositions for tumor treatment
EA042263B1 (ru) Композиции антител для лечения опухолей
HK1244293B (en) Methods for tumor treatment using cd3xcd20 bispecific antibody