RS62108B1 - Antitelo-lek konjugati na bazi eribulina i postupci primene - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetno obelodanjenje se odnosi na antitelo-lek konjugate (ADC) koji vezuju ljudske onkološke ciljeve antigena kao što je folatni receptor alfa i/ili pružaju aktivnost leka protiv tubulina. Obelodanjenje se dalje odnosi na postupke i sastave korisne u tretmanu i dijagnozi rakova koji eksprimiraju folatni receptor alfa i/ili su podložni tretmanu ometanjem tubulina.

STANJE TEHNIKE

[0002] Rak je među vodećim uzrocima morbiditeta i mortaliteta širom sveta, sa približno 14 miliona novih slučajeva i 8,2 miliona smrtnih slučajeva povezanih sa rakom u 2012. godini. Najčešći uzroci smrti od raka su rakovi: pluća (1,59 miliona smrtnih slučajeva); jetre (745.000 smrtnih slučajeva); stomaka (723.000 smrtnih slučajeva); kolorektalni rak (694.000 smrtnih slučajeva); rak dojke (521.000 smrtnih slučajeva); i jednjaka (400000 smrtnih slučajeva). Očekuje se da će broj novih slučajeva raka porasti za oko 70% u naredne dve decenije, na približno 22 miliona novih slučajeva raka godišnje (World Cancer Report 2014).

[0003] Mikrotubule su dinamični filamentni citoskeletalni proteini koji su uključeni u različite ćelijske funkcije, uključujući unutarćelijsku migraciju i transport, ćelijsku signalizaciju i održavanje ćelijskog oblika. Mikrotubule takođe igraju kritičnu ulogu u podeli mitotičkih ćelija formiranjem mitotičkog vretena potrebnog za razdvajanje hromozoma na dve ćerke ćelije. Biološke funkcije mikrotubula u svim ćelijama regulisane su u velikoj meri njihovom dinamikom polimerizacije, koja se javlja reverzibilnim, nekovalentnim dodavanjem α i β dimera tubulina na oba kraja mikrotubula. Ovo dinamično ponašanje i rezultujuća kontrola dužine mikrotubula je od vitalnog značaja za pravilno funkcionisanje mitotičkog vretena. Čak i manje promene dinamike mikrotubula mogu uključiti kontrolnu tačku vretena, zaustaviti napredovanje ćelijskog ciklusa pri mitozi i posledično dovesti do ćelijske smrti (Mukhtar et al. (2014) Mol. Cancer Ther. 13:275-84). Zbog brze deobe ćelija, ćelije raka su generalno osetljivije na jedinjenja koja se vezuju za tubulin i narušavaju njegovu normalnu funkciju u poređenju sa normalnim ćelijama. Iz tog razloga, inhibitori tubulina i drugi agensi koji ciljaju mikrotubule postali su obećavajuća klasa lekova za tretman raka (Dumontet i Jordan (2010) Nat. Rev. Drug Discov. 9:790-803).

[0004] Alfa receptor za folat (FRA) je membranski protein vezan za glikofosfatidilinozitol (GPI) koji vezuje folat. Iako uloga FRA u biologiji normalnog i kancerogenog tkiva nije u potpunosti shvaćena, ona je izrazito prekomerno eksprimirana kod velikog procenta rakova jajnika epitelnog porekla (O'Shannessy et al. (2013) Int. J. Gynecol. Pathol.32(3):258-68), kao i u procentu raka ne-malih ćelija pluća (Christoph et al. (2014) Clin. Lung Cancer 15(5):320-30). FRA takođe ima ograničeno eksprimiranje u normalnim tkivima. Ova svojstva čine FRA privlačnim ciljem za imunoterapiju raka.

[0005] Diamantis i sar. (2016) Brit. J. Cancer 114: 362-367 otkriva pregled antitelo-lek konjugata, uključujući antiFRA-antitelo konjugate.

SAŽETAK PRONALASKA

[0006] U prvom aspektu, predmetni pronalazak pruža antitelo-lek konjugat Formule (I):

Ab-(L-D)p (I)

gde (i) Ab je internalizujuće antitelo protiv folatnog receptora alfa ili njegov internalizujući fragment koji vezuje antigen koji obuhvata tri regiona za određivanje komplementarnosti teškog lanca (HCDR) koji obuhvataju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:2 (HCDR1), SEQ ID NO:3 (HCDR2), i SEQ ID NO:4 (HCDR3); i tri regiona za određivanje komplementarnosti lakog lanca (LCDR) koji obuhvataju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:7 (LCDR1), SEQ ID NO:8 (LCDR2), i SEQ ID NO:9 (LCDR3), kako je definisano Kabat sistemom numerisanja; ili tri regiona za određivanje komplementarnosti teškog lanca (HCDR) koji obuhvataju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:13 (HCDR1), SEQ ID NO:14 (HCDR2), i SEQ ID NO:15 (HCDR3); i tri regiona za određivanje komplementarnosti lakog lanca (LCDR) koji obuhvataju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:16 (LCDR1), SEQ ID NO:17 (LCDR2), i SEQ ID NO:18 (LCDR3), kako je definisano IMGT sistemom numerisanja; (ii) D je eribulin; (iii) L je razdvojivi veznik koji obuhvata Mal-(PEG)2-Val-CitpAB; i (iv)p je ceo broj od 1 do 8. Antitelo ili fragment koji vezuje antigen mogu da obuhvataju varijabilni region teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:23, i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:24. p može biti ceo broj od 3 do 4. antitelo ili fragment koji vezuje antigen mogu da obuhvataju ljudski IgG1 konstantni domen teškog lanca i ljudski Ig kapa konstantni domen lakog lanca.

[0007] U drugom aspektu, predmetni pronalazak pruža sastav koji sadrži višestruke kopije antitelo-lek konjugata prvog aspekta, gde prosečna vrednost p antitelo-lek konjugata u sastavu iznosi od oko 3,2 do oko 3,8 ili od oko 3,6 do oko 4,4.

[0008] U trećem aspektu, predmetni pronalazak pruža da prvi aspekt ili drugi aspekt mogu biti za upotrebu u tretmanu raka koji eksprimira folatni receptor alfa. Rak je rak želuca, serozni rak jajnika, bistroćelijski rak jajnika, rak ne-malih ćelija pluća, kolorektalni rak, trostruko negativni rak dojke, rak endometrijuma, serozni rak endometrijuma, karcinoid pluća ili osteosarkom.

[0009] U četvrtom aspektu, predmetni pronalazak pruža farmaceutski sastav koji sadrži antitelo-lek konjugat prvog aspekta ili sastav drugog aspekta i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0010] U petom aspektu, predmetni pronalazak pruža postupak za proizvodnju antitelo-lek konjugata prvog aspekta ili sastava drugog aspekta, koji uključuje reagovanje antitela ili fragmenta koji vezuje antigen sa razdvojivim veznikom spojenim sa eribulinom pod uslovima koji omogućavaju konjugaciju.

[0011] U šestom aspektu, predmetni pronalazak pruža postupak određivanja da li će pacijent reagovati na tretman antitelo-lek konjugatom bilo čega od prvog aspekata ili sastava drugog aspekta, koji uključuje pružanje biološkog uzorka od pacijenta i dovođenje u dodir biološkog uzorka sa antitelo-lek konjugatom prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 4 ili sa sastavom prema patentnom zahtevu 5. Biološki uzorak može biti biopsija tumora raka želuca, seroznog raka jajnika, bistroćelijskog raka jajnika, raka ne-malih ćelija pluća, kolorektalnog raka, trostruko negativnog raka dojke, raka endometrijuma, seroznog raka endometrijuma, karcinoida pluća ili osteosarkoma.

[0012] U sedmom aspektu, predmetni pronalazak pruža sastav koji sadrži višestruke kopije antitelo-lek konjugata Formule (I):

Ab-(L-D)p (I)

gde (i) Ab je internalizujuće antitelo protiv folatnog receptora alfa ili njegov internalizujući fragment koji vezuje antigen koji obuhvata tri regiona za određivanje komplementarnosti teškog lanca (HCDR) koji obuhvataju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:2 (HCDR1), SEQ ID NO:3 (HCDR2), i SEQ ID NO:4 (HCDR3); i tri regiona za određivanje komplementarnosti lakog lanca (LCDR) koji obuhvataju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:7 (LCDR1), SEQ ID NO:8 (LCDR2), i SEQ ID NO:9 (LCDR3), kako je definisano Kabat sistemom numerisanja; ili tri regiona za određivanje komplementarnosti teškog lanca (HCDR) koji obuhvataju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 13 (HCDR1), SEQ ID NO:14 (HCDR2), i SEQ ID NO:15 (HCDR3); i tri regiona za određivanje komplementarnosti lakog lanca (LCDR) koji obuhvataju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:16 (LCDR1), SEQ ID NO:17 (LCDR2), i SEQ ID NO:18 (LCDR3), kako je definisano IMGT sistemom numerisanja; (ii) D je eribulin; (iii) L je razdvojivi veznik koji obuhvata Mal-(PEG)2-Val-CitpAB; i (iv)p je prosečan broj -L-D delova po Ab, gde prosečan p antitelo-lek konjugata u sastavu iznosi od oko 3,6 do oko 4,4. antitelo ili fragment koji vezuje antigen mogu da obuhvataju varijabilni region teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:23, i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:24.

[0013] Predmetno obelodanjenje delimično opisuje nova jedinjenja sa biološkom aktivnošću protiv ćelija tumora. Jedinjenja mogu inhibirati rast tumora kod sisara i mogu biti korisna za tretman pacijenata sa rakom koji su ljudi.

[0014] Predmetno obelodanjenje se konkretnije odnosi na jedinjenja antitelo-lek konjugata koja su sposobna da vezuju, internalizuju i ubijaju ćelija tumora (npr. ćelija tumora koje eksprimiraju FRA). Obelodanjena su jedinjenja antitelo-lek konjugata koja sadrže veznik koji vezuje deo leka za deo antitela. Jedinjenja antitelo-lek konjugata (ADC) mogu biti predstavljena Formulom I:

Ab-(L-D)p (I)

gde Ab je internalizujuće antitelo ili njegov internalizujući fragment koji vezuje antigen koji cilja ćeliju tumora;

D je eribulin;

L je razdvojivi veznik koji kovalentno vezuje Ab za D; i

p je ceo broj od 1 do 20.

[0015] Kako je opisano ovde, veznik je stabilan van ćelije, tako da ADC ostaje netaknut kada je prisutan u vanćelijskim uslovima, ali je sposoban da se razdvoji internalizacijom u ćeliji, npr. ćeliji raka. Kako je opisano ovde, deo leka eribulin se odvaja od dela antitela kada ADC uđe u ćeliju koja eksprimiran antigen specifičan za deo antitela od ADC, a razdvajanje oslobađa nemodifikovani oblik eribulina. Kako je opisano ovde, veznik sadrži razdvojivi deo i koji je postavljen tako da nijedan deo veznika ili deo antitela ne ostaje vezan za deo leka eribulina nakon razdvajanja.

[0016] Kako je opisano ovde, razdvojivi deo u vezniku je razdvojivi peptidni deo. Kako je opisano ovde, ADC koji sadrži razdvojivi peptidni deo pokazuje niže nivoe agregacije, poboljšan antitelo:lek odnos, povećano ubijanja ćelija raka na cilju, smanjeno ubijanje ćelija koje nisu ćelije raka van cilja i/ili veće opterećenje lekom (p) u odnosu na ADC koji sadrži alternativni razdvojivi deo. Kako je opisano ovde, dodavanje razdvojivog dela povećava citotoksičnost i/ili potenciju u odnosu na nerazdvojivi veznik. Kako je opisano ovde, povećana potencija i/ili citotoksičnost su kod raka koji eksprimira umereni nivo antigena koji cilja delo antitela od ADC (npr. umereno FRA eksprimiranje). Kako je opisano ovde, razdvojivi peptidni deo može se razdvojiti enzimom, a veznik je enzimom razdvojivi veznik. Kako je opisano ovde, enzim je katepsin, a veznik je katepsinom razdvojivi veznik. Kako je opisano ovde, enzimom razdvojivi veznik (npr. katepsinom razdvojivi veznik) pokazuje jedno ili više gore pomenutih poboljšanih svojstava, u poređenju sa alternativnim mehanizmom razdvajanja.

[0017] Kako je opisano ovde, razdvojivi peptidni deo u vezniku sadrži aminokiselinsku jedinicu. Kako je opisano ovde, aminokiselinska jedinica sadrži valin-citrulin (Val-Cit). Kako je opisano ovde, ADC koji sadrži Val-Cit pokazuje povećanu stabilnost, smanjeno ubijanje ćelija van cilja, povećano ubijanje ćelija na cilju, niže nivoe agregacije i/ili veće opterećenje lekom u odnosu na ADC koji sadrži alternativnu aminokiselinsku jedinicu ili alternativni razdvojivi deo.

[0018] Kako je opisano ovde, veznik sadrži najmanje jednu odstojnu jedinicu koja spaja deo antitela sa razdvojivim delom. Kako je opisano ovde, odstojna jedinica u vezniku može da sadrži najmanje jedan deo polietilen glikola (PEG). PEG deo može, na primer, sadržati -(PEG)m-, gde je m ceo broj od 1 do 10. Kako je opisano ovde, odstojna jedinica u vezniku sadrži (PEG)2. Kako je opisano ovde, ADC koji sadrži kraću odstojnu jedinicu (npr. (PEG)2) pokazuje niže nivoe agregacije i/ili veće opterećenje lekom u odnosu na ADC koji sadrži dužu odstojnu jedinicu (npr. (PEG)8) uprkos kraćoj dužini veznika.

[0019] Kako je opisano ovde, odstojna jedinica u vezniku se vezuje za deo antitela od ADC preko maleimidnog dela (Mal). Kako je opisano ovde, ADC koji sadrži veznik vezan za deo antitela preko Mal pokazuje veće opterećenje lekom u odnosu na ADC koji sadrži veznik vezan za deo antitela preko alternativnog dela. Kako je opisano ovde, Mal u vezniku je reaktivan sa ostatkom cisteina na delu antitela. Kako je opisano ovde, Mal u vezniku je pridružen delu antitela putem ostatka cisteina. Kako je opisano ovde, Mal-odstojna jedinica sadrži PEG deo. Kako je opisano ovde, veznik sadrži Mal-(PEG)m, npr. Mal-(PEG)2. Kako je opisano ovde, veznik sadrži Mal-(PEG)2. Kako je opisano ovde, Mal-odstojna jedinica vezuje deo antitela na razdvojivi deo u vezniku. Kako je opisano ovde, razdvojivi deo u vezniku je razdvojivi peptidni deo, npr. aminokiselinska jedinica. Kako je opisano ovde, veznik sadrži Mal-(PEG)2-Val-Cit.

[0020] Kako je opisano ovde, razdvojivi deo u vezniku je direktno pridružen delu leka eribulina od ADC, i razdvojivi deo je ili direktno povezan sa delom antitela ili povezan preko odstojne jedinice. Kako je opisano ovde, odstojna jedinica takođe vezuje razdvojivi deo u vezniku za deo leka eribulina. Kako je opisano ovde, odstojna jedinica koja vezuje razdvojivi deo u vezniku za deo leka eribulina je samo-imolativna. Kako je opisano ovde, samoimolativni odstojnik je u stanju da oslobodi nemodifikovani eribulin u ciljanoj ćeliji. Kako je opisano ovde, samo-imolativna odstojna jedinica sadrži p-aminobenzil alkohol. Kako je opisano ovde, samo-imolativna odstojna jedinica sadrži p-aminobenziloksikarbonil (pAB). pAB u vezniku, kako je ovde opisano, vezuje razdvojivi deo na deo leka eribulina. Kako je opisano ovde, razdvojivi deo je razdvojivi peptidni deo, npr. aminokiselinska jedinica. Kako je opisano ovde, veznik sadrži Val-Cit-pAB. Kako je opisano ovde, veznik sadrži Val-CitpAB i PEG odstojnu jedinicu koja povezuje veznik sa delom antitela kroz Mal.

[0021] Kako je opisano ovde, p je ceo broj od 1 do 6, od 2 do 5, ili poželjno od 3 do 4. Kako je opisano ovde, p je 4. Kako je opisano ovde, pružen je skup ADC, i prosečan p u skupu je oko 4 (npr.3,5-4,5, kao što je oko 3,8). Kako je opisano ovde, veznik sadrži Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB.. Kako je opisano ovde, veznik sadrži Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB i p je 4. Kako je opisano ovde, pružen je skup ADC, gde svaki ADC sadrži Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB veznik i prosečan p u skupu je oko 4 (npr.3,5-4,5, kao što je oko 3,8).

[0022] Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili internalizujući fragment koji vezuje antigen (Ab ili Ab ostatak) od ADC je antitelo protiv folatnog receptora alfa (FRA) ili internalizujući fragment antitela i može vezati ćelije tumora koje eksprimiraju FRA (tj. ADC cilja ćelije koje eksprimiranju FRA). Kako je opisano ovde, ADC koji sadrži anti-FRA Ab deo i razdvojivi peptidni deo pokazuje niže nivoe agregacije, poboljšan antitelo:lek odnos, povećano ciljanje ubijanja ćelija raka, smanjeno ubijanje ćelija koje nemaju rak van cilja, više opterećenje lekom (p), povećanu citotoksičnost i/ili potenciju u odnosu na nerazdvojivi veznik ili alternativni mehanizam razdvajanja. Kako je opisano ovde, povećana potencija i/ili citotoksičnost je kod raka koji eksprimira umereni nivo antigena ciljanog delom antitela od ADC (npr. umereno FRA eksprimiranje). Kako je opisano ovde, razdvojivi peptidni deo može se razdvojiti enzimom, i veznik je enzimom razdvojivi veznik. Kako je opisano ovde, enzim je katepsin, i veznik je katepsinom razdvojivi veznik. Kako je opisano ovde, enzimom razdvojivi veznik (npr. katepsinom razdvojivi veznik) pokazuje jedno ili više gore pomenutih poboljšanih svojstava, u poređenju sa alternativnim mehanizmom razdvajanja. Kako je opisano ovde, veznik je Mal-(PEG)m-Val-Cit-pAB.

[0023] Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili internalizujući fragment koji vezuje antigen vezuje se za folatni receptor alfa (FRA) i cilja ćelije tumora koje eksprimiraju FRA. Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili internalizujući fragment koji vezuje antigen obuhvata tri regiona za određivanje komplementarnosti teškog lanca (CDR) i tri CDR lakog lanca, gde CDR teškog lanca obuhvata CDR1 teškog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:2, CDR2 teškog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:3, i CDR3 teškog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:4; i tri CDR lakog lanca obuhvataju CDR1 lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:7, CDR2 lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:8, i CDR3 lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:9, kako je definisano Kabat sistemom numerisanja; ili gde CDR teškog lanca obuhvata CDR1 teškog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO: 13, CDR2 teškog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:14, i CDR3 teškog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO: 15; i CDR lakog lanca obuhvata CDR1 lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:16, CDR2 lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO: 17, i CDR3 lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO: 18, kako je definisano IMGT sistemom numerisanja. Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili internalizujući fragment koji vezuje antigen obuhvata ljudske okvirne sekvence. Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili internalizujući fragment koji vezuje antigen obuhvata varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO:23 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO:24. Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili internalizujući fragment koji vezuje antigen obuhvata ljudski IgG1 konstantni domen teškog lanca i Ig kapa konstantni domen lakog lanca. Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili internalizujući fragment koji vezuje antigen nadmeće se za vezivanje i/ili vezuje isti epitop kao antitelo koji obuhvata varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO:23 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO:24. Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili internalizujući fragment koji vezuje antigen vezuje se za epitop koji obuhvata alanin-histadin-lizin-asparaginsku kiselinu (AHKD) (SEQ ID NO:365) (O'Shannessy et al., (2011) Oncotarget 2:1227-43). Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili internalizujući fragment koji vezuje antigen vezuje se za epitop koji obuhvata NTSQEAHKDVSYL (SEQ ID NO:366).

[0024] Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili internalizujući fragment koji vezuje antigen je internalizujuće anti-FRA antitelo ili internalizujući fragment koji vezuje antigen. Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili internalizujući fragment koji vezuje antigen obuhvata tri CDR teškog lanca i tri CDR lakog lanca, gde CDR teškog lanca obuhvata CDR1 teškog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:2, CDR2 teškog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:3, i CDR3 teškog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:4; i tri CDR lakog lanca obuhvataju CDR1 lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:7, CDR2 lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:8, i CDR3 lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:9, kako je definisano Kabat sistemom numerisanja; ili gde CDR teškog lanca obuhvata CDR1 teškog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:13, CDR2 teškog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:14, i CDR3 teškog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:15; i CDR lakog lanca obuhvata CDR1 lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:16, CDR2 lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:17, i CDR3 lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:18, kako je definisano IMGT sistemom numerisanja; linker obuhvata Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB; i p je 4. Kako je opisano ovde, pružen je skup takvih ADC i p je oko 4 (npr., oko 3,8). Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili internalizujući fragment koji vezuje antigen obuhvata varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO:23 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO:24. Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili internalizujući fragment koji vezuje antigen obuhvata ljudski IgG1 konstantni domen teškog lanca i Ig kapa konstantni domen lakog lanca. Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili internalizujući fragment koji vezuje antigen nadmeće se za vezivanje i/ili vezuje isti epitop kao antitelo koji obuhvata varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO:23 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO:24. Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili internalizujući fragment koji vezuje antigen vezuje se za epitop koji obuhvata SEQ ID NO:365. Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili internalizujući fragment koji vezuje antigen vezuje se za epitop koji obuhvata SEQ ID NO:366.

[0025] Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili internalizujući fragment koji vezuje antigen vezuje se za ljudski receptor epidermalnog faktora rasta 2 (her2) i cilja tumorske ćelije koje eksprimiraju her2. Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili internalizujući fragment koji vezuje antigen obuhvata tri regiona za određivanje komplementarnosti teškog lanca (CDR) i tri CDR lakog lanca, gde CDR teškog lanca obuhvata CDR1 teškog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:71 CDR2 teškog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:72, i CDR3 teškog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:73; i tri CDR lakog lanca obuhvataju CDR1 lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:74, CDR2 lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:75, i CDR3 lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:76, kako je definisano Kabat sistemom numerisanja; ili gde CDR teškog lanca obuhvata CDR1 teškog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:191, CDR2 teškog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:192, i CDR3 teškog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:193; i CDR lakog lanca obuhvata CDR1 lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:194, CDR2 lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO: 195, i CDR3 lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:196, kako je definisano IMGT sistemom numerisanja. Kako je opisano ovde, antitelo ili internalizujuće fragment koji vezuje antigen obuhvata ljudske okvirne sekvence. Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili internalizujući fragment koji vezuje antigen obuhvata varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO:27 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO:28. Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili internalizujući fragment koji vezuje antigen obuhvata ljudski IgG1 konstantni domen teškog lanca i Ig kapa konstantni domen lakog lanca. Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili internalizujući fragment koji vezuje antigen nadmeće se za vezivanje i/ili vezuje isti epitop kao antitelo koji obuhvata varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO:27 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO:28.

[0026] Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili internalizujući fragment koji vezuje antigen je internalizujuće anti-her2 antitelo ili internalizujući fragment koji vezuje antigen.

1

Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili internalizujući fragment koji vezuje antigen obuhvata tri CDR teškog lanca i tri CDR lakog lanca, gde CDR teškog lanca obuhvata CDR1 teškog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:71 CDR2 teškog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:72, i CDR3 teškog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:73; i tri CDR lakog lanca obuhvataju CDR1 lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:74, CDR2 lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:75, i CDR3 lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:76, kako je definisano Kabat sistemom numerisanja; ili gde CDR teškog lanca obuhvata CDR1 teškog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:191, CDR2 teškog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:192, i CDR3 teškog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO: 193; i CDR lakog lanca obuhvata CDR1 lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO: 194, CDR2 lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:195, i CDR3 lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:196, kako je definisano IMGT sistemom numerisanja; linker obuhvata Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB; i p je 4. Kako je opisano ovde, pružen je skup takvih ADC i p je oko 4 (npr., oko 3,8). Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili internalizujući fragment koji vezuje antigen obuhvata varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO:27 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO:28. Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili internalizujući fragment koji vezuje antigen obuhvata ljudski IgG1 konstantni domen teškog lanca i Ig kapa konstantni domen lakog lanca. Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili internalizujući fragment koji vezuje antigen nadmeće se za vezivanje i/ili vezuje isti epitop kao antitelo koji obuhvata varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO:27 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO:28.

[0027] Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili internalizujući fragment koji vezuje antigen vezuje se za mezotelin (MSLN) i cilja tumorske ćelije koje eksprimiraju MSLN. Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili internalizujući fragment koji vezuje antigen obuhvata tri regiona za određivanje komplementarnosti teškog lanca (CDR) i tri CDR lakog lanca, gde CDR teškog lanca obuhvata CDR1 teškog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:65 CDR2 teškog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:66, i CDR3 teškog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:67; i tri CDR lakog lanca obuhvataju CDR1 lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:68, CDR2 lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:69, i CDR3 lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:70, kako je definisano Kabat sistemom numerisanja; ili gde CDR teškog lanca obuhvata CDR1 teškog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO: 185, CDR2 teškog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:186, i CDR3 teškog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:187; i CDR lakog lanca obuhvata CDR1 lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:188, CDR2 lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:189, i CDR3 lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:190, kako je definisano IMGT sistemom numerisanja. Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili internalizujući fragment koji vezuje antigen obuhvata varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO:25 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO:26. Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili internalizujući fragment koji vezuje antigen obuhvata ljudski IgG1 konstantni domen teškog lanca i Ig kapa konstantni domen lakog lanca. Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili internalizujući fragment koji vezuje antigen nadmeće se za vezivanje i/ili vezuje isti epitop kao antitelo koji obuhvata varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO:25 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO:26.

[0028] Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili internalizujući fragment koji vezuje antigen je internalizujuće anti-MSLN antitelo ili internalizujući fragment koji vezuje antigen. Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili internalizujući fragment koji vezuje antigen obuhvata tri CDR teškog lanca i tri CDR lakog lanca, gde CDR teškog lanca obuhvata CDR1 teškog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:65 CDR2 teškog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:66, i CDR3 teškog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:67; i tri CDR lakog lanca obuhvataju CDR1 lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:68, CDR2 lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:69, i CDR3 lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:70, kako je definisano Kabat sistemom numerisanja; ili gde CDR teškog lanca obuhvata CDR1 teškog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:185, CDR2 teškog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:186, i CDR3 teškog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO: 187; i CDR lakog lanca obuhvata CDR1 lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO: 188, CDR2 lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:189, i CDR3 lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:190, kako je definisano IMGT sistemom numerisanja; linker obuhvata Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB; i p je 4. Kako je opisano ovde, pružen je skup takvih ADC i p je oko 4 (npr., oko 3,8). Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili internalizujući fragment koji vezuje antigen obuhvata varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO:25 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO:26. Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili internalizujući fragment koji vezuje antigen obuhvata ljudski IgG1 konstantni domen teškog lanca i Ig kapa konstantni domen lakog lanca. Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili internalizujući fragment koji vezuje antigen nadmeće se za vezivanje i/ili vezuje isti epitop kao antitelo koji obuhvata varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO:25 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO:26.

[0029] Takođe su ovde opisani sastavi koji sadrže višestruke kopije bilo kog od opisanih ADC, gde je prosečno opterećenje lekom (prosečan p) ADC u sastavu je između oko 3 i 4, ili oko 3,5 do oko 4,5, ili oko 4. Kako je opisano ovde, prosečna vrednost p je između oko 3,2 i 3,8. Kako je opisano ovde, prosečan p je između oko 3,6 i 4,4.

[0030] Ovde su takođe opisani sastavi koji sadrže -L-D, gde je D eribulin; i L je razdvojivi veznik koji se kovalentno vezuje za D. Kako je opisano ovde, razdvojivi veznik kovalentno vezuje za C-35 amin na eribulinu. Kako je opisano ovde, razdvojivi veznik sadrži Val-Cit. Kako je opisano ovde, razdvojivi veznik sadrži PEG odstojnu jedinicu. Kako je opisano ovde, razdvojivi veznik sadrži Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB.

[0031] Dalje su ovde opisani farmaceutski sastavi koji sadrže ADC i farmaceutski prihvatljiv razblaživač, nosač i/ili pomoćnu supstancu.

[0032] Naredni aspekt predmetnog obelodanjenja uključuje terapijsku i dijagnostičku upotrebu opisanih ADC jedinjenja i sastava, npr. u tretmanu raka. Naredni aspekt uključuje postupke tretmana raka koji eksprimiraju antigen ciljan delom antitela od ADC, kao što je FRA. Kako je opisano ovde, opisani su postupci ubijanja ili inhibiranja proliferacije tumorskih ćelija ili ćelija raka primenom terapeutski efikasne količine i/ili režima bilo kog od opisanih ADC. Naredni aspekt uključuje postupke za detektovanje tumorskih ćelija ili ćelija raka koje eksprimiraju FRA koristeći obelodanjene ADC, i postupke skrininga za pacijente sa rakom koji će reagovati na tretman opisanim ADC. Kako je opisano ovde, rak je rak želuca, serozni rak jajnika, bistroćelijski rak jajnika, rak ne-malih ćelija pluća, kolorektalni rak, trostruko negativni rak dojke, rak endometrijuma, serozni rak endometrijuma, plućni karcinoid ili osteosarkom. Takođe su obelodanjeni postupci za proizvodnju opisanih ADC. KRATAK OPIS SLIKA

[0033]

Slika 1 prikazuje jednu od metodologija korišćenih za pripremu MORAb-003 ADC. U ovom pristupu, neupareni cisteini nastaju delimičnom redukcijom sa ograničenim molarnim ekvivalentima ne-tiol-redukcionog agensa TCEP. Ovaj pristup preferencijalno smanjuje međulančane disulfidne veze koje povezuju laki lanac i teški lanac (jedan par po HL uparivanju) i dva teška lanca u zglobnom regionu (dva para po HH uparivanju u slučaju ljudskog IgG1), dok ostavljaju međulančane disulfidne veze netaknute.

1

Slika 2 prikazuje postupak sinteze maleimid-(PEG)2-Val-Cit-pAB-eribulina (mal-(PEG)2-VCP-eribulin).

Slika 3 prikazuje SDS-PAGE analizu uslova redukcije za MORAb-003. Trake su označene desno od slike. Traka M odgovara proteinskom standardu; traka 1 odgovara netretiranom MORAb-003; traka 2 odgovara 5,3 mg/ml redukovanom u 70,6 µM TCEP; traka 3 odgovara MORAb-003 5,3 mg/ml redukovanom u 141,2 µM TCEP; traka 4 odgovara MORAb-003 1,5 mg/ml redukovanom u 20µM TCEP; a traka 5 odgovara MORAb-003 1,5 mg/ml redukovanom u 40 µM TCEP. Identiteti svake trake naznačeni su na donjem desnom gelu. „H“ označava teški lanac. „L“ označava laki lanac.

Slika 4 prikazuje SDS-PAGE analizu uslova redukcije za MORAb-003. Traka 1 odgovara proteinskom standardu; traka 2 odgovara netretiranom MORAb-003; traka 3 odgovara MORAb-003 tretiranom u MORAb-003:TCEP odnosu od 1:1; traka 4 odgovara MORAb-003 tretiranom u MORAb-003:TCEP odnosu od 1:2; traka 5 odgovara MORAb-003 tretiranom u MORAb-003:TCEP odnosu od 1:3; a traka 6 odgovara MORAb-003 tretiranom u MORAb-003:TCEP odnosu od 1:4.

Slika 5 prikazuje analizu bez redukcije SDS-PAGE odabranih MORAb-003 ADC, uključujući M-MMAE (traka 2), M-DM1 (traka 3), M-0026 (traka 4), M-0260 (traka 5), M-0267 (traka 6), M-0272 (traka 7), M-0285 (traka 8), M-0292 (traka 9), M-027-0381 (traka 10) i M-0284 (traka 11).

Slika 6A prikazuje rezultate ispitivanja posmatrača citotoksičnosti MORAb-003-maleimido-PEG2-Val-Cit-pAB-eribulina (M3-VCP-eribulin ili „MORAb-202“). Slika 6B prikazuje rezultate ispitivanja posmatrača citotoksičnosti MORAb-003-maleimido-(CH2)5-Val-Cit-pAB-ER-001150828 (M3-ER-61318). Slika 6C prikazuje rezultate ispitivanja posmatrača citotoksičnosti za MORAb-003-PEG-pAB-duostatin 3 (M3-027-0285). Informacije prikazane u odgovarajućim legendama sa slika pružaju ćelijsku liniju:testiran agens (kultivisana ćelijska linija/ćelijske linije, gustina sejanja prve/druge ćelijske linije).

Slike 7A i 7B pokazuju distribuciju lek-antitelo odnosa (DAR) za ADC MORAb-003-VCP-eribulin (Slika 7A) i MORAb-003-0285 (Slika 7B) u odnosu na nekonjugovani MORAb-003. Brojevi iznad svakog vrha označavaju DAR pojedinačne vrste.

Slika 8 prikazuje rezultate analize citotoksičnosti - nadmetanja MORAb-003-VCP-eribulina sa nekonjugovanim MORAb-003 (2 µM) u IGROV1 ili SJSA-1 ćelijama. Slika 9 prikazuje kinetiku telesne težine za svaku grupu CD-1 miševa (prosek grupe i SEM) tretiranih jednom intravenskom dozom nosača (PBS) ili MORAb-202 sa 10, 20, 40 ili 80 mg/kg.

Slika 10 prikazuje kinetiku telesne težine za svaku grupu CD-1 miševa (prosek grupe i SEM) koji su intravenski tretirani sa PBS ili eribulinom od 0,4, 0,8, 1,6 ili 3,2 mg/kg, prema režimu doziranja q4dx3 (primenjene doze jednom u četiri dana za ukupno 3 doze).

Slika 11 prikazuje kinetiku rasta tumora za svaku grupu CB17-SCID miševa implantiranih sa hNSCLC NCI-H2110 ćelijama (prosek grupe i SEM) i tretiranih jednom intravenskom dozom PBS, MORAb-003-VCP-eribulina (MORAb-202) na 1, 2,5 ili 5 mg/kg, ili MORAb-003-0285 pri 5 mg/kg.

Slika 12 prikazuje zapreminu tumora pojedinačnih CB17-SCID miševa implantiranih hNSCLC NCI-H2110 ćelijama, kao i prosek grupe i SEM, na dan 17. Grupe su tretirane jednom intravenskom dozom PBS, MORAb-003-VCP-eribulina (MORAb-202) pri 1, 2,5 ili 5 mg/kg, ili MORAb-003-0285 pri 5 mg/kg.

Slika 13 prikazuje kinetiku telesne težine za svaku grupu CB17-SCID miševa implantiranih sa NCI-H2110 (prosek grupe i SEM) tretiranih jednom intravenskom dozom PBS, MORAb-003-VCP-eribulina u 1, 2,5, ili 5 mg/kg, ili MORAb-003-0285 pri 5 mg/kg.

Slika 14 prikazuje kinetiku rasta tumora za svaku grupu CB17-SCID miševa implantiranih sa NCI-H2110 (prosek grupe i SEM) tretiranih intravensko nosačem (PBS) ili eribulinom od 0,5, 0,2, 0,8 ili 1,6 mg/kg, prema na režim doziranja q4dx3. Slika 15 prikazuje zapreminu tumora pojedinačnih CB17-SCID miševa implantiranih sa NCI-H2110, kao i prosek grupe i SEM, na dan 24. Grupe su tretirane intravensko nosačem (PBS) ili eribulinom na 0,5, 0,2, 0,8 ili 1,6 mg/kg, prema režimu doziranja q4dx3.

Slika 16 prikazuje kinetiku promene telesne težine za svaku grupu CB17-SCID miševa implantiranih sa NCI-H2110 (prosek grupe i SEM) koji su intravenski tretirani nosačem (PBS) ili eribulinom od 0,5, 0,2, 0,8 ili 1,6 mg/kg, prema režimu doziranja q4dx3.

Slika 17 prikazuje potenciju MORAb-003-VCP-eribulina (MORAb-202) na IGROV1 ćelijama, OVCAR3, NCI-H2110, A431-A3 i SJSA-1, mereno Crystal Violet analizom citotoksičnosti.

Slika 18 prikazuje kinetiku rasta tumora za svaku grupu CB17-SCID miševa implantiranih sa NCI-H2110 (prosek grupe i SEM) tretiranih jednom intravenskom

1

dozom PBS ili MORAb-003-VCP-eribulina (MORAb-202) u 1, 2,5 ili 5 mg/kg. Slike 19A i 19B prikazuju kinetiku rasta tumora (Slika 19A) i kinetiku promene telesne težine (Slika 19B) za svaku grupu miševa koji nose NSCLC PDx tumore (LXFA-737) (prosek grupe i SEM) tretirane jednom intravenskom dozom nosača (PBS), MORAb-003 pri 5 mg/kg ili MORAb-003-VCP-eribulin (MORAb-202) pri 5 mg/kg.

Slike 20A i 20B prikazuju pojedinačne odnose zapremine tumora (Slika 20A) i kinetiku promene telesne težine (Slika 20B) za svaku grupu miševa koji nose PDx rak endometrijuma (Endo-12961) (prosek grupe i SEM) tretiranih jednom intravenskom dozom PBS, eribulina od 0,1 ili 3,2 mg/kg, ili MORAb-003-VCP-eribulina (MORAb-202) od 5 mg/kg. Slike 20C i 20D prikazuju kinetiku rasta tumora (Slika 20C) i kinetiku promene telesne težine (Slika 20D) za svaku grupu miševa koji nose PDx rak endometrijuma (Endo-10590) (prosek grupe i SEM) tretiranih jednom intravenskom dozom PBS, eribulina od 0,1 ili 3,2 mg/kg, ili MORAb-003-VCP-eribulina (MORAb-202) od 5 mg/kg.

Slika 21A prikazuje imunohistohemijsko (IHC) bojenje tumorskog tkiva kod miševa koji nose TNBC PDx (OD-BRE-0631) tumore sa anti-ljudskim IgG antitelom.

Tumorska tkiva miševa tretiranih jednom intravenskom dozom nosača (desno) ili MORAb-003-VCP-eribulin (MORAb-202) sa 5 mg/kg (levo), sakupljena su i obojena 5 dana posle tretmana. Slika 21B prikazuje IHC bojenje tumorskog tkiva kod miševa koji nose TNBC Pdx (OD-BRE-0631) tumore sa aktin α-glatkih mišića (SMA)-FITC antitelom. Tumorska tkiva netretiranih miševa sakupljena su 2 dana pre tretmana (levo), dok su tumorska tkiva miševa tretiranih jednom intravenskom dozom MORAb-003-VCP-eribulina (MORAb-202) od 5 mg/kg sakupljena 5 dana posle tretmana (desno). Slika 21C prikazuje kinetiku rasta tumora za svaku grupu miševa koji nose TNBC PDx (OD-BRE-0631) tumore (prosek grupe i SEM) tretiranih jednom intravenskom dozom nosača (PBS) ili MORAb-003-VCP-eribulinom (MORAb-202) pri 5 mg/kg.

Slika 22 prikazuje diferencijaciju matičnih ćelija ljudske koštane srži-mezenhimskih matičnih ćelija (BM-MSC) u kulturi sa MKN-74 ćelijama nakon tretmana nosačem (PBS ili etanol), eribulinom, MORAb-003 ili MORAb-003-VCP-eribulinom (MORAb-202), mereno analizom protočne citometrije. Stro-1<+>/CD105<+>, CD34<+>/CD31-, i NG2<+>su markeri MSC, adipocita i pericita, respektivno.

Slika 23 prikazuje analizu vremenskog toka tumorskih tkiva od CB17-SCID miševa

1

implantiranih sa NCI-H2110 tretiranih jednom intravenskom dozom nosača (PBS) ili MORAb-003-VCP-eribulinom (MORAb-202) pri 5 mg/kg, obojeno aktin α-glatkih mišića (SMA)-FITC antitelom. Tumorska tkiva su sakupljena i obojena na dan 0 i na dane 3, 5, 7 i 9 nakon tretmana. Y-osa:% = [izbrojane obojene ćelija/izbrojane ukupne ćelije]<∗>100. X-osa: dan (ukupno izbrojanih ćelija).

DETALJAN OPIS ILUSTRATIVNIH OBELODANJENJA

[0034] Opisani sastavi i postupci mogu se lakše razumeti pozivanjem na naredni detaljan opis uzet u vezi sa pratećim slikama, koje čine deo predmetnog obelodanjenja. Podrazumeva se da opisani sastavi i postupci nisu ograničeni na specifične sastave i postupke koji su ovde opisani i/ili prikazani. Obim pronalaska je definisan patentnim zahtevima.

[0035] Kroz ovaj tekst, opisi se odnose na sastave i postupke upotrebe navedenih sastava. Tamo gde opis opisuje ili tvrdi da je svojstvo ili obelodanjenje povezano sa sastavom, takvo svojstvo ili obelodanjenje podjednako je primenjivo na postupke upotrebe navedenog sastava. Slično tome, tamo gde obelodanjenje opisuje ili zahteva neko svojstvo ili je obelodanjenje povezano sa postupkom upotrebe sastava, takvo svojstvo ili obelodanjenje je podjednako primenjivo na sastav.

[0036] Kada se raspon vrednosti izrazi, uključuje obelodanjenja koja koriste bilo koju određenu vrednost u rasponu. Dalje, referenca na vrednosti navedene u rasponima uključuje svaku vrednost unutar tog raspona. Svi rasponi uključuju svoje krajnje tačke i mogu se kombinovati. Kada se vrednosti izraze kao aproksimacije, upotrebom prethodnika „oko“, razumeće se da određena vrednost čini drugo obelodanjenje. Upućivanje na određenu numeričku vrednost uključuje barem tu određenu vrednost, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije. Upotreba „ili“ će značiti „i/ili„ ukoliko specifični kontekst njegove upotrebe ne nalaže drugačije. Tamo gde se referenca i specifikacija sukobljavaju, specifikacija ima prioritet.

[0037] Treba imati na umu da se određene karakteristike obelodanjenih sastava i postupaka, koje su ovde radi preglednosti opisane u kontekstu zasebnih obelodanjenja, takođe mogu pružiti u kombinaciji u jednom obelodanjenju. Suprotno tome, različite karakteristike obelodanjenih sastava i postupaka koji su, radi jasnoće, opisani u kontekstu pojedinačnog obelodanjenja, takođe mogu biti opisani odvojeno ili u bilo kojoj pod-kombinaciji.

1

Definicije

[0038] Različiti izrazi koji se odnose na aspekte opisa koriste se u celoj specifikaciji i patentnim zahtevima. Takvim izrazima treba dati uobičajeno značenje u struci, ukoliko nije drugačije naznačeno. Ostali posebno definisani izrazi moraju se tumačiti na način koji je u skladu sa ovde opisanim definicijama.

[0039] Kako se ovde koristi, oblici jednine uključuju oblike množine, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije.

[0040] Izrazi „oko“ ili „približno“ u kontekstu numeričkih vrednosti i raspona odnose se na vrednosti ili raspone koji se približavaju ili su blizu navedenim vrednostima ili rasponima tako da obelodanjenje može da deluje kako je predviđeno, kao što je postojanje željene količine nukleinskih kiseline ili polipeptida u reakcionoj smeši, kao što je očigledno stručnjaku iz navoda koji su ovde sadržani. Razlog tome su, barem delimično, različita svojstva sastava nukleinskih kiselina, uzrast, rasa, pol, anatomske i fiziološke varijacije i nedostatak egzaktnosti bioloških sistema. Dakle, ovi izrazi obuhvataju vrednosti izvan onih koje proizilaze iz sistematskih grešaka.

[0041] Izrazi „antitelo-lek konjugat“, „antitelo konjugat“, „konjugat“, „imunokonjugat“ i „ADC“ koriste se naizmenično i odnose se na jedinjenje ili njegov derivat koji je povezan sa antitelom (npr. FRA antitelo) i definisano je generičkom formulom: Ab-(L-D)p (Formula I), gde Ab = deo antitela (tj. antitelo ili fragment koji vezuje antigen), L = deo veznika, D = deo leka i p = broj dela leka po delu antitela.

[0042] Izraz „antitelo“ koristi se u najširem smislu da se odnosi na molekul imunoglobulina koji prepoznaje i specifično se vezuje za cilj, kao što su protein, polipeptid, ugljeni hidrati, polinukleotid, lipid ili kombinacije prethodno navedenog kroz najmanje jedno mesto prepoznavanja antigena unutar varijabilnog regiona molekula imunoglobulina. Teški lanac antitela sastoji se od varijabilnog domena teškog lanca (VH) i konstantnog regiona teškog lanca (CH). Laki lanac se sastoji od varijabilnog domena lakog lanca (VL) i konstantnog domena lakog lanca (CL). Za potrebe ove prijave, zreli varijabilni domeni teškog lanca i lakog lanca sadrže po tri regiona za određivanje komplementarnosti (CDR1, CDR2 i CDR3) u četiri okvirna regiona (FR1, FR2, FR3 i FR4) raspoređenih od N-terminusa a do C-terminusa: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. „Antitelo“ može biti prirodno ili

1

veštačko, kao što su monoklonska antitela proizvedena konvencionalnom tehnologijom hibridoma. Izraz „antitelo“ uključuje monoklonska antitela pune dužine i poliklonska antitela pune dužine, kao i fragmente antitela kao što su Fab, Fab', F (ab')2, Fv i jednolančana antitela. Antitelo može biti bilo koja od pet glavnih klasa imunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, ili njihove potklase (npr. izotipi IgG1, IgG2, IgG3, IgG4). Izraz dalje obuhvata ljudska antitela, himerna antitela, humanizovana antitela i bilo koji modifikovani molekul imunoglobulina koji sadrži mesto za prepoznavanje antigena, sve dok pokazuje željenu biološku aktivnost.

[0043] Izraz „monoklonsko antitelo“, kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. Pojedinačna antitela koja čine populaciju su identična, osim mogućih prirodnih mutacija koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Monoklonska antitela su visoko specifična i usmerena su na jedan antigeni epitop. Suprotno tome, konvencionalni (poliklonski) preparati antitela obično uključuju mnoštvo antitela usmerenih protiv (ili specifičnih za) različite epitope. Modifikator „monoklonski“ ukazuje na karakter antitela koji je dobijen iz suštinski homogene populacije antitela i ne sme se tumačiti kao da zahteva proizvodnju antitela bilo kojim određenim postupkom. Na primer, monoklonska antitela koja će se koristiti u skladu sa predmetnim obelodanjenjem mogu se dobiti postupkom hibridoma koji je prvo opisan od strane Kohler et al. (1975) Nature 256:495, ili se mogu napraviti postupcima rekombinantne DNK (pogledati, npr., SAD patent br. 4,816,567). Monoklonska antitela se takođe mogu izolovati iz biblioteka faga antitela koristeći tehnike opisane kod Clackson et al. (1991) Nature 352:624-8, i Marks et al. (1991) J. Mol. Biol.222:581-97, na primer.

[0044] Ovde opisana monoklonska antitela posebno uključuju „himerna“ antitela, u kojima je deo teškog i/ili lakog lanca identičan ili homologan odgovarajućim sekvencama u antitelima koja potiču od određene vrste ili pripadaju određenoj klasi ili potklasi antitela, dok je ostatak lanca identičan ili homologan odgovarajućim sekvencama u antitelima koja potiču od druge vrste ili pripadaju drugoj klasi ili potklasi antitela, kao i fragmenti takvih antitela, sve dok se specifično vezuju za ciljani antigen i/ili pokazuju željenu biološku aktivnost.

[0045] Izraz „ljudsko antitelo“, kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo proizvedeno od strane čoveka ili antitelo koje ima aminokiselinsku sekvencu antitela proizvedenog od strane čoveka.

1

[0046] Izraz „himerno antitelo“, kako se ovde koristi, odnosi se na antitela gde aminokiselinska sekvenca molekula imunoglobulina potiče od dve ili više vrsta. U nekim slučajevima, varijabilni regioni i teškog i lakog lanca odgovaraju varijabilnim regionima antitela izvedenih iz jedne vrste sa željenom specifičnošću, afinitetom i aktivnošću, dok su konstantni regioni homologni antitelima izvedenim iz druge vrste (npr. čoveka) kako bi se minimizovao imuni odgovor kod drugih vrsta.

[0047] Kako se ovde koristi, izraz „humanizovano antitelo“ odnosi se na oblike antitela koja sadrže sekvence antitela koja nisu ljudska (npr. mišja), kao i ljudskih antitela. Takva antitela su himerna antitela koja sadrže minimalnu sekvencu izvedenu iz imunoglobulina koji nije ljudski. Generalno, humanizovano antitelo će sadržati suštinski sve od najmanje jednog, a tipično dva varijabilna domena, u kojima sve ili suštinski sve hipervarijabilne petlje odgovaraju onima od imunoglobulina koji nisu ljudski i svi ili suštinski svi okvirni (FR) regioni su regioni sekvence ljudskog imunoglobulina. Humanizovano antitelo će opciono takođe sadržati najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično onaj od ljudskog imunoglobulina. Humanizovano antitelo se može dalje modifikovati supstitucijom ostataka, bilo u Fv okvirnom regionu i/ili unutar zamenjenih ostataka koji nisu ljudski, kako bi se poboljšali i optimizovali specifičnost antitela, afinitet i/ili aktivnost.

[0048] Izraz „fragment koji vezuje antigen“ ili „deo koji vezuje antigen“ antitela, kako se ovde koristi, odnosi se na jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost specifičnog vezivanja za antigen (npr. FRA). Fragmenti koji vezuju antigen takođe poželjno zadržavaju sposobnost internalizacije u ćeliju koja eksprimira antigen. U nekim obelodanjenjima, fragmenti koji vezuju antigen takođe zadržavaju imuno-efektorsku aktivnost. Pokazano je da fragmenti antitela pune dužine mogu da obavljaju funkciju vezivanja antigena antitela pune dužine. Primeri vezujućih fragmenata obuhvaćenih izrazom „fragment koji vezuje antigen“ ili „deo koji vezuje antigen“ antitela uključuju (i) Fab fragment, monovalentni fragment koji se sastoji od VL, VH, CL, i CH1domena; (ii) F (ab')2fragment, bivalentni fragment koji se sastoji od dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom u zglobnom regionu; (iii) Fd fragment koji se sastoji od VHi CH1domena; (iv) fragment Fv koji se sastoji od VLi VH. domena jednog kraka antitela; (v) fragment dAb, koji sadrži jedan varijabilni domen, npr. VH. domen (pogledati npr. Ward et al. (1989) Nature 341:544-6; and Winter et al., WO 90/05144); i (vi) izolovani region za određivanje

2

komplementarnosti (CDR). Dalje, iako su dva domena Fv fragmenta, VLi VHsu kodirani odvojenim genima, mogu se pridružiti, koristeći rekombinantne postupke, sintetičkim veznikom koji im omogućava da budu napravljeni kao jedan proteinski lanac u kom se VLi VHregioni uparuju i formiraju monovalentne molekule (poznate kao jednolančani Fv (scFv)). Pogledati npr. Bird et al. (1988) Science 242:423-6; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83. Takva jednolančana antitela su takođe predviđena da budu obuhvaćena izrazom „fragment koji vezuje antigen“ ili „deo koji vezuje antigen“ antitela i u struci su poznata kao primeran tip vezujućeg fragmenta koji se nakon vezivanja može internalizovati u ćelije. Pogledati npr. Zhu et al. (2010) 9:2131-41; He et al. (2010) J. Nucl. Med. 51:427-32; and Fitting et al. (2015) MAbs 7:390-402. Kako je opisano ovde, scFv molekuli mogu biti ugrađeni u fuzioni protein. Obuhvaćeni su i drugi oblici jednolančanih antitela, poput dijatela. Dijatela su bivalentna, bispecifična antitela u kojima se VHi VLdomeni eksprimiraju na jednom polipeptidnom lancu, ali koristeći vezu koja je prekratka da omogući uparivanje između dva domena u istom lancu, prisiljavajući na taj način domene da se uparuju sa komplementarnim domenima drugog lanca i stvarajući dva mesta za vezivanje antigena (pogledati na primer, Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-8; i Poljak et al. (1994) Structure 2:1121-3). fragment koji vezuje antigeni se dobijaju konvencionalnim tehnikama poznatim stručnjacima, i vezujući fragmenti se ispituju za korisnost (npr. afinitet vezivanja, internalizacija) na isti način kao i netaknuta antitela.

Fragmenti koji vezuju antigen mogu se pripremiti razdvajanjem netaknutog proteina, na primer, proteazom ili hemijskim razdvajanjem.

[0049] „Internalizujuće“, kako se ovde koristi u smislu antitela ili fragmenta koji vezuje antigen, odnosi se na antitelo ili fragment koji vezuje antigen koji je sposoban da prođe kroz dvoslojnu lipidnu membranu ćelije do unutrašnjeg odeljka (tj. „internalizovano“) nakon vezivanja za ćelije, poželjno u odeljak za razgradnju u ćeliji. Na primer, internalizujuće anti-FRA antitelo je ono koje je sposobno da uđe u ćeliju nakon vezivanja za FRA na ćelijskoj membrani.

[0050] Izraz „folatni receptor alfa“ ili „FRA“, kako se ovde koristi, odnosi se na bilo koji nativni oblik ljudskog FRA. Izraz obuhvata FRA pune dužine (npr. NCBI referentna sekvenca: NP_000793; SEQ ID NO: 19), kao i bilo koji oblik ljudskog FRA koji je rezultat ćelijske obrade. Izraz takođe obuhvata prirodne varijante FRA, uključujući, ali ne ograničavajući se na splajsovane varijante, alelne varijante i izoforme. FRA se može izolovati od čoveka ili se može proizvesti rekombinantno ili sintetičkim postupcima.

[0051] Izraz „anti-FRA antitelo“ ili „antitelo koje se specifično vezuje za FRA“ odnosi se na bilo koji oblik antitela ili njegov fragment koji se specifično vezuje za FRA, i obuhvata monoklonska antitela (uključujući monoklonska antitela pune dužine), poliklonska antitela i fragmente biološki funkcionalnih antitela sve dok se posebno vezuju za FRA. Poželjno je da je anti-FRA antitelo, koje se koristi u ovde obelodanjenim ADC, internalizujuće antitelo ili njegov fragment. MORAb-003 je primer internalizujućeg antitela protiv ljudskog FRA. Kako se ovde koristi, izrazi „specifično“, „specifično se vezuje“ i „specifično vezuje“ odnose se na selektivno vezivanje antitela za ciljani antigen epitop. Antitela se mogu testirati na specifičnost vezivanja upoređivanjem vezivanja za odgovarajući antigen sa vezivanjem za irelevantni antigen ili smešu antigena pod datim nizom uslova. Ako se antitelo vezuje za odgovarajući antigen sa najmanje 2, 5, 7 i poželjno 10 puta više afiniteta nego za irelevantnu smešu antigena ili antigena, onda se smatra specifičnim. Kako je opisano ovde, specifično antitelo je ono koje samo vezuje FRA antigen, ali se ne vezuje (ili pokazuje minimalno vezivanje) za druge antigene.

[0052] Izraz „receptor ljudskog epidermalnog faktora rasta 2“, „her2“ ili „her2/neu“, kako se ovde koristi, odnosi se na bilo koji nativni oblik ljudskog her2. Izraz obuhvata her2 pune dužine (npr. NCBI referentna sekvenca: NP_004439.2; SEQ ID NO: 21), kao i bilo koji oblik ljudske her2 koji je rezultat ćelijske obrade. Izraz takođe obuhvata varijante her2 koje se javljaju u prirodi, uključujući, ali ne ograničavajući se na splajsovane varijante, alelne varijante i izoforme. Her2 se može izolovati od čoveka ili se može dobiti rekombinantno ili sintetičkim postupcima.

[0053] Izraz „anti-her2 antitelo“ ili „antitelo koje se specifično vezuje za her2“ odnosi se na bilo koji oblik antitela ili njegov fragment koji se specifično vezuje za her2, i obuhvata monoklonska antitela (uključujući monoklonska antitela pune dužine), poliklonska antitela i fragmente biološki funkcionalnih antitela sve dok specifično vezuju her2. SAD patent br. 5,821,337 pruža primerne sekvence koje se vezuju za her2, uključujući primerne sekvence anti-her2 antitela. Poželjno je da je anti-her2 antitelo, koje se koristi u ovde obelodanjenim ADC, internalizujuće antitelo ili njegov fragment. Trastuzumab je primer internalizujućeg antitela protiv ljudskog her2.

[0054] Izraz „epitop“ odnosi se na deo antigena koji može biti prepoznat i specifično vezan od strane antitela. Kada je antigen polipeptid, epitopi mogu da se formiraju iz susednih aminokiselina ili nesusednih aminokiselina, suprotstavljenih tercijarnim preklapanjem polipeptida. Epitop vezan antitelom može se identifikovati upotrebom bilo koje tehnike mapiranja epitopa poznate u struci, uključujući rendgensku kristalografiju za identifikaciju epitopa direktnom vizualizacijom antigen-antitelo kompleksa, kao i praćenjem vezivanja antitela za fragmente ili mutirane varijacije antigena, ili nadgledanjem pristupačnosti rastvarača različitim delovima antitela i antigena. Primerne strategije koje se koriste za mapiranje epitopa antitela uključuju, ali nisu ograničene na, skeniranje oligo-peptida zasnovano na nizovima, ograničenu proteolizu, mutagenezu usmerenu na lokaciju, mapiranje mutageneze velike propusnosti, vodonik-deuterijum razmenu i masenu spektrometriju (pogledati, npr. Gershoni et al. (2007) 21:145-56; i Hager-Braun i Tomer (2005) Expert Rev. Proteomics 2:745-56).

[0055] Kompetitivno vezivanje i vezivanje epitopa takođe se mogu koristiti za određivanje antitela koja dele identične ili preklapajuće se epitope. Konkurentno vezivanje se može proceniti pomoću testa unakrsnog blokiranja, kao što je test opisan u „Antibodies, A Laboratory Manual,“ Cold Spring Harbor Laboratory, Harlow i Lane (1st edition 1988, 2nd edition 2014). Kako je opisano ovde, kompetitivno vezivanje se identifikuje kada test antitelo ili vezujući protein smanjuju vezivanje referentnog antitela ili vezujućeg proteina za ciljani antigen kao što su FRA ili her2 (npr. vezujući protein koji sadrži CDR i/ili varijabilne domene odabrane od identifikovanih u Tabelama 2, 4 i 6), za najmanje oko 50% u testu unakrsnog blokiranja (npr.50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 99,5%, ili više ili bilo koji procenat između) i/ili obrnuto. Kako je opisano ovde, kompetitivno vezivanje može nastati usled zajedničkih ili sličnih (npr. delimično preklapajućih) epitopa ili zbog steričke prepreke gde se antitela ili vezujući proteini vezuju za obližnje epitope. Pogledati npr.

Tzartos, Methods in Molecular Biology (Morris, ed. (1998) vol.66, pp.55-66). Kako je opisano ovde, kompetitivno vezivanje se može koristiti za sortiranje grupa vezujućih proteina koji dele slične epitope, npr. oni koji se nadmeću za vezivanje mogu se „skupiti“ kao grupa vezujućih proteina koji se preklapaju ili epitopa u blizini, dok su oni koji se ne nadmeću smešteni u zasebnu grupu veznih proteina koji se ne preklapaju ili epitopa u blizini.

[0056] Izraz „kon“ ili „ka“ odnosi se na konstantu brzine asocijacije antitela sa antigenom kako bi se formirao antitelo/antigen kompleks . Stopa se može odrediti pomoću standardnih

2

testova, kao što su Biacore ili ELISA test.

[0057] Izraz „koff“ ili „kd“ odnosi se na konstantu disocijacije antitela iz antitelo/antigen kompleksa. Brzina se može odrediti pomoću standardnih testova, kao što su Biacore ili ELISA test.

[0058] Izraz „KD“ odnosi se na ravnotežnu konstantu disocijacije određene antitelo-antigen interakcije . KDse izračunava pomoću ka/kd. Stopa se može odrediti pomoću standardnih testova, kao što su Biacore ili ELISA test.

[0059] Izraz „p“ ili „antitelo:lek odnos“ ili „lek-antitelo odnos“ ili „DAR“ odnosi se na broj dela leka po delu antitela, tj. na opterećenje lekom ili na broj -L-D delova po antitelu ili fragmentu koji vezuje antigen (Ab) u ADC Formule I. U sastavima koje sadrže više kopija ADC Formule I, „p“ se odnosi na prosečni broj -L-D delova po antitelu ili fragmentu koji vezuje antigen, takođe označen kao prosečno opterećenje lekom.

[0060] „Veznik“ ili „veznik deo“ je bilo koji hemijski deo koji je sposoban da se kovalentno spoji sa jedinjenjem, obično deo leka kao što je hemoterapijski agens, sa drugim delom kao što je deo antitela. Veznici mogu biti podložni ili suštinski otporni na razdvajanje izazvano kiselinom, razdvajanje indukovano peptidazom, razdvajanje indukovano svetlošću, razdvajanje indukovano estarazom i/ili razdvajanje disulfidne veze, pod uslovima pod kojima jedinjenje ili antitelo ostaju aktivni.

[0061] Izraz „agens“ ovde se koristi za označavanje hemijskog jedinjenja, smeše hemijskih jedinjenja, biološke makromolekule ili ekstrakta napravljenog od bioloških materijala. Izraz „terapeutsko agens“, „lek“ ili „deo leka“ odnosi se na agens koje je sposobno da modulira biološki proces i/ili ima biološku aktivnost.

[0062] Izraz „hemoterapijski agens“ ili „agens protiv raka“ ovde se koristi za označavanje svih hemijskih jedinjenja koja su efikasna u tretmanu raka bez obzira na mehanizam delovanja. Inhibicija metastaza ili angiogeneza je često svojstvo hemoterapijskog agensa. Neograničavajući primeri hemoterapijskih agenasa uključuju alkilirajuće agense, na primer, azotne mustarde, jedinjenja etilenimina i alkil sulfonate; antimetabolite, na primer antagonisti folne kiseline, purina ili pirimidina; anti-mitotičke agensa, na primer, anti-tubulinski agensi kao što su eribulin ili eribulin-mezilat (Halaven™) ili njihovi derivati, vinka alkaloidi i auristatini; citotoksični antibiotici; jedinjenja koja oštećuju ili ometaju eksprimiranje ili replikaciju DNK, na primer, veznici za manje žlebove DNK; i antagonisti receptora faktora rasta. Pored toga, hemoterapijski agensi uključuju antitela, biološke molekule i male molekule. Hemoterapijski agens može biti citotoksičan ili citostatčki agens. Izraz „citostatčki agens“ odnosi se na agens koji inhibira ili suzbija rast ćelija i/ili umnožavanje ćelija.

[0063] Izraz „citotoksični agens“ odnosi se na supstancu koja uzrokuje ćelijsku smrt prvenstveno ometanjem aktivnosti eksprimiranja i/ili funkcionisanja ćelije. Primeri citotoksičnih agenasa uključuju, ali nisu ograničeni na, antimitotičke agense, kao što su eribulin, auristatini (npr. monometil auristatin E (MMAE), monometil auristatin F (MMAF)), maitansinoidi (npr. maitansin), dolastatini, duostatini, kriptoficini, vinka alkaloidi (npr. vinkristin, vinblastin), taksani, taksoli i kolhicini; antraciklini (npr. daunorubicin, doksorubicin, dihidroksiantracindion); citotoksični antibiotici (npr. mitomicini, aktinomicini, duokarmicini (npr. CC-1065), auromicini, duomicini, kaliheamicini, endomicini, fenomicini); agensi za alkilovanje (npr. cisplatin); agensi za interkaliranje (npr. etidijum bromid); inhibitori topoizomeraze (npr. etopozid, tenopozid); radioizotopi, poput At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>ili<213>, P<32>, i radioaktivni izotopi lutecijuma (npr. Lu<177>); i toksini bakterijskog, gljivičnog, biljnog ili životinjskog porekla (npr. ricin (npr. A-lanac ricina), toksin difterije, Pseudomonas egzotoksin A (npr. PE40), endotoksin, mitogelin, kombrestatin, restriktocin, gelonin, alfa-sarcin, abrin (npr. A-lanac abrina), modecin (npr. A-lanac modecina), kuricin, krotin, Sapaonaria officinalis inhibitor, glukokortikoid).

[0064] Izraz „eribulin“, kako se ovde koristi, odnosi se na sintetički analog halihondrina B, makrocikličnog jedinjenja koje je prvobitno izolovano iz morskog sunđera Halichondria okadais. Izraz „deo leka eribulin“ odnosi se na komponentu ADC koja ima strukturu eribulina i koja je vezana za veznik ADC preko svog C-35 amina. Eribulin je inhibitor dinamike mikrotubula, za koji se smatra da vezuje tubulin i izaziva zaustavljanje ćelijskog ciklusa u G2/M fazi inhibiranjem sklopa mitotičkog vretena. Izraz „eribulin mezilat“ odnosi se na mezilatnu sol eribulina, koja se prodaje pod robnom markom Halaven™.

[0065] Izraz „homolog“ odnosi se na molekul koji pokazuje homologiju sa drugim molekulom, na primer, ima nizove hemijskih ostataka koji su isti ili slični na odgovarajućim položajima.

2

[0066] Izraz „inhibiranje“ ili „inhibicija“, kako se ovde koristi, znači smanjenje za merljivu količinu i može uključivati, ali ne zahteva potpunu prevenciju ili inhibiciju.

[0067] Izraz „ciljno negativan“ ili „ciljno antigen negativan“ odnosi se na odsustvo eksprimiranja ciljanog antigena u ćeliji ili tkivu. Izraz „ciljno pozitivan“ ili „ciljno antigen pozitivan“ odnosi se na prisustvo eksprimiranja ciljanog antigena. Na primer, ćelija ili ćelijska linija koja ne eksprimira ciljani antigen može se opisati kao ciljno negativna, dok ćelija ili ćelijska linija koja eksprimira ciljani antigen može biti opisana kao ciljno pozitivna.

[0068] Izraz „ubijanje posmatrača“ ili „efekat posmatrača“ odnosi se na ubijanje ciljno negativnih ćelija u prisustvu ciljno pozitivnih ćelija, gde se ubistvo ciljno negativnih ćelija ne primećuje u odsustvu ciljno pozitivnih ćelija. Dodir između ćelija ili barem blizina ciljno pozitivnih i ciljno negativnih ćelija omogućava ubijanje posmatrača. Ova vrsta ubijanja razlikuje se od „ubijanja van cilja“, što se odnosi na neselektivno ubijanje ciljno negativnih ćelija. „Ubijanje van cilja“ može se posmatrati u odsustvu ciljno pozitivnih ćelija.

[0069] Izraz „rak“ odnosi se na fiziološko stanje sisara u kom populaciju ćelija karakteriše neregulisan rast ćelija. primeri rakova uključuju, ali nisu ograničeni na, rak, limfom, blastom, sarkom i leukemiju. Konkretniji primeri takvih rakova uključuju rak skvamoznih ćelijsa, rak malih ćelija pluća, rak ne-malih ćelija pluća, adenokarcinom pluća, skvamozni rak pluća, rak peritoneuma, hepatocelularni rak, rak gastrointestinalnog trakta, rak pankreasa, glioblastom, rak grlića materice, rak jajnika, rak jetre, rak bešike, hepatom, rak dojke (npr. trostruko negativni rak dojke), osteosarkom, melanom, rak debelog creva, kolorekalni rak, rak endometrijuma (npr. serozni) ili rak materice, rak pljuvačne žlezde, rak bubrega, rak jetre, rak prostate, rak vulve, rak štitne žlezde, rak jetre i različite vrste raka glave i vrata. Trostruko negativni rak dojke odnosi se na rak dojke koji je negativan na eksprimiranje gena za estrogenski receptor (ER), progestaronski receptor (PR) ili Her2/neu.

[0070] Izrazi „tumor“ i „neoplazma“ odnose se na bilo koju masu tkiva koja je rezultat prekomernog rasta ili proliferacije ćelija, bilo benigne ili maligne, uključujući predkancerozne lezije.

[0071] Izrazi „ćelija raka“ i „ćelija tumora“ odnose se na pojedinačne ćelije ili ukupnu

2

populaciju ćelija izvedenih iz tumora, uključujući i ne-tumorogena ćelija i matične ćelije raka. Kako se ovde koristi, izraz „tumorska ćelija“ biće modifikovan izrazom „netumorogena“ kada se odnosi samo na one ćelije tumora kojima nedostaje sposobnost obnavljanja i širenja, kako bi se te ćelije tumora razlikovale od matičnih ćelija raka.

[0072] Izrazi „pojedinac“ i „pacijent“ ovde se koriste naizmenično kako bi se odnosili na bilo koju životinju, kao što je bilo koji sisar, uključujući, ali bez ograničenja, ljude, primate koji nisu ljudi, glodare i slično. Kako je opisano ovde, sisar je miš. Kako je opisano ovde, sisar je čovek.

[0073] Izraz „istovremena primena“ ili primena „u kombinaciji sa“ jednim ili više terapijskih agenasa uključuje istovremeno i uzastopno primenu bilo kojim redosledom.

[0074] „Farmaceutski sastav“ odnosi se na preparat koji je u takvom obliku da omogućava primenu i naknadno pruža predviđenu biološku aktivnost aktivnih sastojaka i/ili postiže terapeutski efekat, i koji ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za pacijenta kom bi se formulacija primenjivala. Farmaceutska sastav može biti sterilan.

[0075] „Farmaceutski ekscipijens“ sadrži materijal kao što su adjuvans, nosač, agensi za podešavanje pH i puferuerovanje, agensi za podešavanje toničnosti, agensi za vlaženje, konzervans i slično.

[0076] „Farmaceutski prihvatljiv“ znači odobren ili može biti odobren od strane regulatorne agencije savezne vlade ili vlade države, ili naveden u U.S. Pharmacopeia ili drugoj opšte priznatoj farmakopeji, za upotrebu kod životinja, i naročito kod ljudi.

[0077] „Efikasna količina“ ADC, kao što je ovde obelodanjena, je količina dovoljna da se izvrši posebno navedena svrha, na primer da se proizvede terapeutski efekat nakon primene, kao što je smanjenje brzine rasta tumora ili zapremine tumora, smanjenje simptoma raka ili neki drugi pokazatelji efikasnosti tretmana. Efektivna količina se može odrediti rutinski u odnosu na navedenu svrhu. Izraz „terapeutski efikasna količina“ odnosi se na količinu ADC efikasnog za tretman bolesti ili poremećaja kod pacijenta. U slučaju raka, terapeutski efikasna količina ADC može smanjiti broj ćelija raka, smanjiti veličinu tumora, inhibirati (npr. usporiti ili zaustaviti) metastazu tumora, inhibirati (npr. usporiti ili zaustaviti) rast tumora i/ili

2

ublažiti jedan ili više simptoma. „Profilaktički efikasna količina“ odnosi se na količinu koja je efikasna, u dozama i tokom potrebnih vremenskih perioda, za postizanje željenog profilaktičkog rezultata. Tipično, pošto se profilaktička doza koristi kod pacijenata pre ili u ranijoj fazi bolesti, profilaktički efikasna količina biće manja od terapeutski efikasne količine.

[0078] Kako se ovde koristi, izraz „za tretman“ ili „terapeutski“ i gramatički srodni izrazi odnose se na svako poboljšanje bilo koje posledice bolesti, kao što je produženo preživljavanje, manji morbiditet i/ili smanjenje neželjenih efekata koji su nusproizvodi alternativnog terapijskog modaliteta. Kao što se u struci lako ceni, potpuno iskorenjivanje bolesti je poželjno, ali iako nije uslov za postupak tretmana. „Tretman“ ili „tretiranje“, kako se ovde koristi, odnosi se na primenu opisanog ADC pojedincu, na primer, pacijentu.

Tretman može biti izlečenje, lečenje, ublažavanje, olakšanje, promena, ispravka, poboljšanje, palijacija, unapređenje ili uticaj na poremećaj, simptome poremećaja ili predispoziciju za poremećaj, npr. rak.

[0079] Kako je opisano ovde, koristi se označeni ADC. Pogodne „oznake“ uključuju radionuklide, enzime, supstrate, kofaktore, inhibitore, fluorescentne delove, hemiluminescentne delove, magnetne čestice i slično.

[0080] Pod „proteinom“, kako se ovde koristi, podrazumevaju se najmanje dve kovalentno vezane aminokiseline. Izraz obuhvata polipeptide, oligopeptide i peptide. Kako je opisano ovde, dve ili više kovalentno vezanih aminokiselina su povezane peptidnom vezom. Protein se može sastojati od aminokiselina i peptidnih veza koje se javljaju u prirodi, na primer kada se protein pravi rekombinantno pomoću sistema eksprimiranja i ćelija domaćina.

Alternativno, protein može da uključuje sintetičke aminokiseline (npr. homofenilalanin, citrulin, ornitin i norleucin) ili peptidomimetičke strukture, tj. „analoge peptida ili proteina“, kao što su peptoidi. Peptoidi su primer klase peptidomimetika čiji su bočni lanci vezani za atom azota u peptidnoj kičmi, a ne za α-ugljenike (kao što su u aminokiselinama), i imaju različite vodonične veze i konformacione karakteristike u poređenju sa peptidima (pogledati, npr. Simon et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367). Kao takvi, peptoidi mogu biti otporni na proteolizu ili druge fiziološke uslove ili uslove skladištenja i efikasni u prožimanju ćelijskih membrana. Takve sintetičke aminokiseline mogu se posebno ugraditi kada se antitelo sintetiše in vitro konvencionalnim postupcima dobro poznatim u struci. Pored toga, može se koristiti bilo koja kombinacija peptidomimetičkih, sintetičkih ostataka/struktura koji

2

se javljaju u prirodi. „Aminokiselina“ takođe uključuje ostatke iminokiselina, kao što su prolin i hidroksiprolin. „R grupa“ ili „bočni lanac“ aminokiseline može biti u (L)- ili (S)-konfiguraciji. Kako je opisano ovde, aminokiseline su u (L)- ili (S)-konfiguraciji.

[0081] „Rekombinantni protein“ je protein napravljen korišćenjem rekombinantnih tehnika primenom bilo kojih tehnika i postupaka poznatih u struci, tj. eksprimiranjem rekombinantne nukleinske kiseline. Postupci i tehnike za proizvodnju rekombinantnih proteina dobro su poznati u struci.

[0082] „Izolovani“ protein nije praćen barem nekim materijalom sa kojim je normalno povezan u svom prirodnom stanju, na primer, koji čini najmanje oko 5%, ili najmanje oko 50% težine ukupnog proteina u datom uzorku. Podrazumeva se da izolovani protein može činiti od 5 do 99,9% težine ukupnog sadržaja proteina u zavisnosti od okolnosti. Na primer, protein može da se dobije u znatno višoj koncentraciji upotrebom inducibilnog promotora ili promotora visokog eksprimiranja, tako da se protein pravi kod povećanih nivoa koncentracije. Definicija uključuje proizvodnju antitela u širokom spektru organizama i/ili ćelija domaćina koji su poznati u struci.

[0083] Za aminokiselinske sekvence, identitet sekvenci i/ili sličnost mogu se odrediti korišćenjem standardnih tehnika poznatih u struci, uključujući, ali ne ograničavajući se na, algoritam identiteta lokalnih sekvenci od Smith i Waterman (1981) Adv. Appl. Math.2:482, algoritam poravnavanja identiteta sekvenci od Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol.

48:443, postupak traženja sličnosti od Pearson i Lipman (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:2444, kompjuterizovane implementacije ovih algoritama (GAP, BESTFIT, FASTA i TFASTA u Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.), Best Fit program najbolje sekvence koji opisuju Devereux et al. (1984) Nucl. Acid Res.12:387-95, poželjno koristeći podrazumevane postavke ili inspekcijom. Poželjno je da FastDB izračunava procenat identičnosti na osnovu narednih parametara: mismatch penalty od 1; gap penalty od 1; gap size penalty od 0,33; i joining penalty od 30 („Current Methods in Sequence Comparison and Analysis,“ Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp.127-149 (1988), Alan R. Liss, Inc).

[0084] Primer korisnog algoritma je PILEUP. PILEUP kreira višestruko poravnanje sekvence

2

iz grupe srodnih sekvenci koristeći progresivno poravnanje u parovima. Takođe može iscrtati stablo koje prikazuje odnose klastera korišćene za kreiranje poravnanja. PILEUP koristi pojednostavljenje postupke progresivnog poravnanja od Feng & Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 35:351-60; postupak je sličan onom koji su opisali Higgins i Sharp (1989) CABIOS 5:151-3. Korisni PILEUP parametri, uključujući podrazumevanu gap weight od 3,00, podrazumevanu gap length weight od 0,10 i ponderisane end gaps.

[0085] Još jedan primer korisnog algoritma je BLAST algoritam, opisan kod: Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol.215:403-10; Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res.25:3389-402; i Karin et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-87. Posebno koristan BLAST program je WU-BLAST-2 program koji je dobijen od Altschul et al. (1996) Methods in Enzymology 266:460-80. WU-BLAST-2 koristi nekoliko parametara pretraživanja, od kojih je većina podešena na podrazumevane vrednosti. Podesivi parametri se podešavaju sa narednim vrednostima: overlap span=1, overlap fraction=0.125, word threshold (T)=II. HSP S i HSP S2 parametri su dinamičke vrednosti i utvrđuje ih sam program u zavisnosti od sastava određene sekvence i sastava određene baze podataka prema kojoj se pretražuje sekvenca od interesa; međutim, vrednosti se mogu prilagoditi kako bi se povećala osetljivost.

[0086] Dodatni korisni algoritam je gapped BLAST kako je objavljeno kod Altschul et al. (1993) Nucl. Acids Res. 25:3389-402. Gapped BLAST koristi BLOSUM-62 rezultate supstitucije; prag T parametra je postavljen na 9; postupak sa dva pogotka za pokretanje proširenja bez gapa, dužine gapa x imaju trošak od 10+k; Xu je postavljen na 16, a Xg na 40 za fazu pretraživanja baze podataka i na 67 za izlaznu fazu algoritama. Poravnanje gapova pokreće se rezultatom koji odgovara oko 22 bita.

[0087] Generalno, homologija, sličnost ili identitet aminokiselina između ovde obelodanjenih proteina i njihovih varijanti, uključujući varijante FRA, varijante her2, varijante sekvenci tubulina i varijante domena antitela (uključujući pojedinačne varijante CDR), su najmanje 80% od sekvenci prikazanih ovde, i još tipičnije sa poželjno rastućim homologijama ili identitetima od najmanje 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 % i skoro 100% ili 100%.

[0088] Na sličan način, „procenat (%) identiteta sekvence nukleinske kiseline“ u odnosu na sekvencu nukleinske kiseline antitela i ostalih ovde identifikovanih proteina definisan je kao procenat nukleotidnih ostataka u kandidovanoj sekvenci koji su identični sa nukleotidnim ostacima u kodirajućoj sekvenci proteina koji vezuje antigen. Određen postupak koristi BLASTN modul WU-BLAST-2 postavljen na podrazumevane parametre, gde su overlap span i overlap fraction postavljeni na 1 i 0,125, respektivno.

[0089] Iako su mesto ili region za uvođenje varijacije aminokiselinske sekvence unapred određeni, mutacija per se ne mora biti unapred određena. Na primer, kako bi se optimizovale performanse mutacije na datom mestu, može se izvršiti slučajna mutageneza na ciljanom kodonu ili regionu i CDR varijante izraženog antigen vezujućeg proteina pregledati za optimalnu kombinaciju željene aktivnosti. Tehnike za pravljenje supstitucionih mutacija na unapred određenim mestima u DNK koja ima poznatu sekvencu su dobro poznate, na primer, MI3 mutageneza prajmera i PCR mutageneza.

Antitelo-lek konjugati

[0090] Jedinjenja predmetnog obelodanjenja uključuju ona koja imaju aktivnost protiv raka. Konkretno, jedinjenja uključuju deo antitela (uključujući njegov fragment koji vezuje antigen) konjugovan (tj. kovalentno vezan veznikom) sa delom leka, gde deo leka kada nije konjugovan sa delom antitela ima citotoksični ili citostatički efekat. Kako je opisano ovde, deo leka pokazuje smanjenu ili nikakvu citotoksičnost kada je vezan u konjugat, ali nastavlja citotoksičnost nakon odvajanja od veznika i dela antitela. Kako je opisano ovde, deo leka pokazuje smanjeno ili nikakvo ubijanje posmatrača kada je vezan u konjugat (npr. korišćenjem nerazdvojivog veznika), ali pokazuje povećano ubijanje posmatrača nakon razdvajanja iz konjugata (npr. konjugat koji ima razdvojiv Val-Cit deo).

[0091] Razvoj i proizvodnja ADC za upotrebu kao ljudski terapijski agens, npr. kao onkološki agens, može zahtevati više od identifikacije antitela sposobnog da se vezuje za željenu metu ili ciljeve i vezuje za lek koji se koristi sam za tretman raka. Povezivanje antitela sa lekom može imati značajne i nepredvidive efekte na aktivnost jednog ili oba od antitela i leka, gde će ti efekti varirati u zavisnosti od odabrane vrste veznika i/ili leka. Kako je opisano ovde, prema tome, komponente ADC su odabrane da (i) zadrže jedno ili više terapeutskih svojstava koja izoluju antitela i lekovi, (ii) održavaju specifična svojstva vezivanja dela antitela; (iii) optimizuju opterećenje lekom i antitelo-lek odnos; (iv) omoguće isporuku, na primer, unutarćelijsku isporuku, dela leka putem stabilnog vezivanja za deo antitela; (v) zadrže ADC stabilnost kao netaknuti konjugat do transporta ili isporuke na ciljano mesto; (vi) minimizuju agregacije ADC pre ili posle primene; (vii) omoguće

1

terapeutski efekat, npr. citotoksični efekat, dela leka nakon razdvajanja u ćelijskom okruženju; (viii) pokažu in vivo efikasnost tretmana protiv raka koja je uporediva ili bolja od izolovanog antitela i leka; (ix) minimizuju ubijanje van cilja od strane dela leka; i/ili (x) pokažu poželjna farmakokinetička i farmakodinamička svojstva, mogućnost formulisanja i toksikološke/imunološke profile. Možda će biti potreban skrining svakog od ovih svojstava kako bi se identifikovao poboljšani ADC za terapijsku upotrebu (Ab et al. (2015) Mol.

Cancer Ther.14:1605-13).

[0092] Kako je opisano ovde, ovde obelodanjeni ADC pokazuju neočekivano povoljna svojstva u nekim ili u svakoj od gore navedenih kategorija. Na primer, kako je ovde opisano, ADC konstrukti koji sadrže Mal vezu za antitelo, PEG odstojnu jedinicu (poželjno kratku PEG odstojnu jedinicu) i/ili peptidni razdvojivi veznik (npr. Val-Cit veznik) pokazuju iznenađujuće povoljno opterećenje lekom, profili agregacije i/ili stabilnost i/ili čuvaju funkciju vezivanja antitela, aktivnost leka i/ili poboljšano ubijanje posmatrača, istovremeno smanjujući ubijanje van cilja, u poređenju sa ADC koji koriste druge strukture koje se mogu razdvojiti ili se ne mogu razdvojiti.

[0093] Kako je opisano ovde, ADC koji sadrži Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB veznik koji spaja eribulin sa antitelom (npr. anti-FRA antitelo kao što je MORAb-003) pokazuje posebno povoljna svojstva u navedenim kategorijama u poređenju sa drugim razdvojivim ili nerazdvojivim veznicima koji eribulin spajaju sa delom antitela. Kako je opisano ovde, ADC koji sadrži Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB veznik koji spaja eribulin sa antitelom (npr. anti-FRA antitelo kao što je MORAb-003) pokazuje posebno povoljna svojstva ubijanja posmatrača u poređenju sa ADC koji se ne može razdvojiti. Kako je opisano ovde, ADC koji sadrži Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB veznik koji spaja eribulin sa antitelom (na primer, anti-FRA antitelo kao što je MORAb-003) pokazuje posebno povoljna svojstva ubijanja posmatrača u poređenju sa ADC koji koristi alternativne strukture koje se mogu razdvojiti.

[0094] Kako je opisano ovde, ADC koji sadrži Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB veznik koji spaja eribulin sa MORAb-003 pokazuje veći i poželjniji lek:antitelo odnos (tj. odnos od oko 3-4) u odnosu na ADC, na primer, sadrži veznik vezan za antitelo preko alternativnog dela (npr. sukcinimidni deo). Kako je opisano ovde, ADC koji sadrži Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB veznik koji spaja eribulin sa MORAb-003 pokazuje veći i poželjniji antitelo:lek odnos i/ili niži nivo agregacije u odnosu na ADC, na primer, sadrži dužu odstojnu jedinicu (npr. (PEG)8). Kako je

2

opisano ovde, ADC koji sadrži Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB veznik koji spaja eribulin sa MORAb-003 pokazuje veći i poželjniji antitelo:lek odnos, niže nivoe agregacije, povećano ubijanje na cilju i/ili smanjeno ubijanje van cilja u odnosu na ADC, npr. sadrži alternativni razdvojivi deo (tj. ne razdvojivi peptidni deo, kao što su razdvojivi disulfid i ili sulfonamid). Kako je opisano ovde, ADC koji sadrži Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB veznik koji spaja eribulin sa MORAb-003 pokazuje povećanu stabilnost, povećano ubijanje na cilju, smanjeno ubijanje van cilja, niže nivoe agregacije i/ili veći i poželjniji antitelo:lek odnos u odnosu na ADC, na primer, koji sadrži alternativnu aminokiselinsku jedinicu (npr. Ala-Ala-Asn) ili alternativni razdvojivi deo (npr. razdvojivi disulfid ili sulfonamid).

[0095] Kako je opisano ovde, neke ili sve poželjne karakteristike opisane iznad za ADC koji sadrže Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB veznik koji spaja eribulin sa MORAb-003 mogu se primetiti kod ADC koji sadrže Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB-eribulin veznik-toksin konjugovan sa antiterom na her2 kao što je trastuzumab ili anti-mezotelin antitelo.

[0096] ADC jedinjenja predmetnog obelodanjenja mogu selektivno da isporuče efikasnu dozu citotoksičnog ili citostatčkog agensa ćelijama raka ili tkivu tumora. Otkriveno je da obelodanjeni ADC imaju snažnu citotoksičnu i/ili citostatičku aktivnost prema ćelijama koje eksprimiraju odgovarajući ciljani antigen (npr. FRA ili her2). Kako je opisano ovde, citotoksična i/ili citostatička aktivnost ADC zavisi od ciljanog nivoa eksprimiranja antigena u ćeliji. Kako je opisano ovde, obelodanjeni ADC su naročito efikasni u ubijanju ćelija raka koje eksprimiraju visok nivo ciljanog antigena, u poređenju sa ćelijama raka koje isti antigen eksprimiraju na niskom nivou. Kako je opisano ovde, obelodanjeni ADC su posebno efikasni u ubijanju ćelija raka koje eksprimiraju ciljani antigen na umerenom nivou, u poređenju sa ćelijama raka koje isti antigen eksprimiraju na niskom nivou. Primerni rakovi sa visokom eksprimiranjem FRA uključuju, ali nisu ograničeni na rak jajnika (npr. serozni rak jajnika, bistroćelijski rak jajnika), karcinoid pluća, trostruko negativni rak dojke, rak endometrijuma i rak ne-malih ćelija pluća (npr. adenokarcinom). Primerni rakovi koji umereno eksprimiranju FRA uključuju, ali nisu ograničeni na rak želuca i rak debelog creva. primeri rakova sa niskim eksprimiranjem FRA uključuju, ali nisu ograničeni na melanom i limfom. primeri rakova sa visokom eksprimiranjem her2 uključuju, ali nisu ograničeni na rak dojke, rak želuca, rak jednjaka, rak jajnika i rak endometrijuma. Primerni rakovi koji umereno eksprimiranju her2 uključuju, ali nisu ograničeni na rak pluća i rak bešike.

[0097] Kako je opisano ovde, razdvajanjem ADC oslobađa se eribulin iz dela antitela i veznika. Kako je opisano ovde, razdvajanjem i oslobađanjem eribulina poboljšava se citotoksičnost ADC. Kako je opisano ovde, ADC koji sadrži razdvojivi veznik je posebno efikasan u ubijanju ćelija raka, uključujući ubijanje posmatrača, u poređenju sa uporedivim tretmanom sa ADC koji sadrži nerazdvojivi veznik. Kako je opisano ovde, ADC koji sadrži razdvojivi veznik (npr. Val-Cit veznik) pokazuje povećano ubijanje ćelija na cilju i/ili smanjeno ubijanje ćelija van cilja u odnosu na ADC koji sadrži nerazdvojivi veznik (npr. može se ukloniti (PEG)2ili (PEG)4veznik), naročito kada ćelije i/ili rak tretirani sa ADC ne eksprimiranju visoke nivoe ciljanog antigena.

[0098] Kako je opisano ovde, obelodanjeni ADC takođe pokazuju aktivnost ubijanja posmatrača, ali malu citotoksičnost van cilja. Bez ograničenja teorijom, aktivnost ubijanja posmatrača od strane ADC može biti naročito korisna tamo gde je njegova penetracija u čvrsti tumor ograničena i/ili je eksprimiranje ciljanog antigena među ćelijama tumora heterogeno. Kako je opisano ovde, ADC koji sadrži razdvojivi veznik je posebno efikasan u ubijanju posmatrača i/ili pokazuje poboljšanu aktivnost ubijanja posmatrača, u poređenju sa uporedivim tretmanom sa ADC koji sadrži nerazdvojivi veznik.

[0099] Ovde su pružena ADC jedinjenja koja sadrže antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen (Ab) koji cilja tumorsku ćeliju, deo leka (D) i deo veznika (L) koji kovalentno vezuje Ab za D. U određenim aspektima, antitelo ili fragment koji vezuje antigen su sposobni da se vezuju za antigen povezan sa tumorom (npr. FRA ili her2) sa visokom specifičnošću i visokim afinitetom. Kako je opisano ovde, antitelo ili fragment koji vezuje antigen se internalizuju u ciljanu ćeliju nakon vezivanja, npr. u odeljak za razgradnju u ćeliji. Stoga su poželjni ADC oni koji se internalizuju nakon vezivanja za ciljanu ćeliju, podvrgavaju se razgradnji i oslobađaju deo leka kako bi ubili ćelije raka. Deo leka se može osloboditi iz antitela i/ili dela veznika ADC enzimskim delovanjem, hidrolizom, oksidacijom ili bilo kojim drugim mehanizmom.

[0100] Primeran ADC ima Formulu I:

Ab-(L-D)p (I)

gde Ab = deo antitela (tj., antitelo ili fragment koji vezuje antigen), L = deo veznika, D = deo

4

leka, i p = broj delova leka po delu antitela.

Antitela

[0101] Deo antitela (Ab) formule I uključuje u svoj raspon bilo koje antitelo ili fragment koji vezuje antigen i koji se specifično vezuju za ciljani antigen na ćeliji raka. Antitelo ili fragment koji vezuje antigen mogu se vezati za ciljani antigen sa konstantom disocijacije (KD) od ≤1 mM, ≤100 nM ili ≤10 nM, ili bilo koji iznos između, mereno, na primer, BIAcore® analizom. Kako je opisano ovde, KDiznosi 1 pM do 500 pM. Kako je opisano ovde, KDje između 500 pM do 1 µM, 1 µM do 100 nM ili 100 mM do 10 nM.

[0102] Kako je opisano ovde, deo antitela je četvorolančano antitelo (koje se takođe naziva imunoglobulin), i sastoji se od dva teška lanca i dva laka lanca. Kako je opisano ovde, deo antitela je dvolančano polutelo (jedan laki lanac i jedan teški lanac) ili fragment imunoglobulina koji vezuje antigen.

[0103] Kako je opisano ovde, deo antitela je internalizujuće antitelo ili njegov internalizujući fragment koji vezuje antigen. Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo se vezuje za ciljani antigen raka eksprimiran na površini ćelije i ulazi u ćeliju nakon vezivanja. Kako je opisano ovde, deo leka od ADC se oslobađa iz dela antitela ADC nakon što ADC uđe i prisutan je u ćeliji koja eksprimira ciljani antigen raka (tj. nakon što je ADC internalizovan).

[0104] Aminokiselinske sekvence sekvence i nukleinskih kiselina primernih antitela predmetnog obelodanjenja izložene su u Tabelama 1-9.

Tabela 1. Antitela

Tabela 2. Aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona mAb

Tabela 3. Sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju varijabilne regione mAb

4

4

Tabela 4. Aminokiselinske sekvence od mAb Kabat CDR

4

4

Tabela 5. Sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju mAb Kabat CDR

4

1

2

Tabela 6. Aminokiselinske sekvence od mAb IMGT CDR

Tabela 7. Sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju mAb IMGT CDR

4

Tabela 8. Aminokiselinske sekvence mAb Ig lanaca pune dužine

1

2

Tabela 9. Sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju mAb Ig lance pune dužine<+>

1

2

4

[0105] Kako je opisano ovde, ovde obelodanjeni ADC može sadržati bilo koji skup varijabilnih domena teškog i lakog lanca navedenih u tabelama iznad (npr. MORAb-003 varijabilni domeni teškog i lakog lanca, ili varijabilni domeni teškog i lakog lanca trastuzumaba), ili skup od šest CDR sekvenci iz skupa teškog i lakog lanca. Kako je opisano ovde, ADC dalje sadrži ljudske konstantne domene teškog i lakog lanca ili njihove fragmente. Na primer, ADC može sadržati ljudski IgG konstantni domen teškog lanca (kao

1

što je IgG1) i ljudski kapa ili lambda laki lanac konstantnog domena. Kako je opisano ovde, deo antitela opisanih ADC sadrži konstantni domen teškog lanca ljudskog imunoglobulina G podtipa 1 (IgG1) sa ljudskim Ig kapa konstantnim domenom lakog lanca.

[0106] Kako je opisano ovde, ciljani antigen raka za ADC je folatni receptor alfa („FRA“).

[0107] Kako je opisano ovde, anti-FRA antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen obuhvata tri CDR teškog lanca i tri CDR lakog lanca kako sledi: CDR1 teškog lanca (HCDR1) se sastoji od SEQ ID NO:2, CDR2 teškog lanca (HCDR2) se sastoji od SEQ ID NO:3, CDR3 teškog lanca (HCDR3) se sastoji od SEQ ID NO:4; CDR1 lakog lanca (LCDR1) se sastoji od SEQ ID NO:7, CDR2 lakog lanca (LCDR2) se sastoji od SEQ ID NO:8, i CDR3 lakog lanca (LCDR3) se sastoji od SEQ ID NO:9, kako je definisano Kabat sistemom numerisanja (Kabat, Sequences od Proteins od Immunological Interest (National Institutes od Health, Bethesda, Md. (1987 i 1991))).

[0108] Kako je opisano ovde, anti-FRA antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen obuhvata tri CDR teškog lanca i tri CDR lakog lanca kako sledi: CDR1 teškog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:13, CDR2 teškog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO: 14, CDR3 teškog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO: 15; CDR1 lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO: 16, CDR2 lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO: 17, i CDR3 lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO: 18, kako je definisano IMGT sistemom numerisanja (International ImMunoGeneTics Information System (IMGT®)).

[0109] Kako je opisano ovde, anti-FRA antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen obuhvata varijabilni region teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:23, i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:24. Kako je opisano ovde, anti-FRA antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen obuhvata aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO:23 i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO:24, ili sekvence koje su najmanje 95% identične gore navedenim sekvencama. Kako je opisano ovde, anti-FRA antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen ima aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja je najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična sa SEQ ID NO:23 i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja je najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična sa SEQ ID

2

NO:24.

[0110] Kako je opisano ovde, anti-FRA antitelo obuhvata ljudski IgG1 konstantni domen teškog lanca sa ljudskim Ig kapa konstantnim domenom lakog lanca.

[0111] Kako je opisano ovde, anti-FRA antitelo obuhvata aminokiselinsku sekvencu teškog lanca SEQ ID NO:1 ili sekvencu koja je najmanje 95% identična sa SEQ ID NO:1, i aminokiselinsku sekvencu lakog lanca SEQ ID NO:6 ili sekvencu koja je najmanje 95% identična sa SEQ ID NO:6. Kako je opisano ovde, antitelo obuhvata aminokiselinsku sekvencu teškog lanca SEQ ID NO:1 i aminokiselinsku sekvencu lakog lanca SEQ ID NO:6, ili sekvence koje su najmanje 95% identične gore navedenim sekvencama. Kako je opisano ovde, anti-FRA antitelo ima aminokiselinsku sekvencu teškog lanca koja je najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična sa SEQ ID NO:1 i/ili aminokiselinsku sekvencu lakog lanca koja je najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična sa SEQ ID NO:6. Kako je opisano ovde, anti-FRA antitelo obuhvata teški lanac kodiran nukleotidnom sekvencom SEQ ID NO:11 (gde nukleotidi kodiraju vodeću sekvencu), ili SEQ ID NO:345 (gde nukleotidi ne kodiraju vodeću sekvencu); i laki lanac kodiran nukleotidnom sekvencom SEQ ID NO:12 (gde nukleotidi kodiraju vodeću sekvencu), ili SEQ ID NO:346 (gde nukleotidi ne kodiraju vodeću sekvencu). Kako je opisano ovde, teškom lancu aminokiselinske sekvence nedostaje C-terminal lizin. Kako je opisano ovde, anti-FRA antitelo ima aminokiselinsku sekvencu antitela proizvedenog od strane ćelijske linije deponovane pod uslovima i u skladu sa Budapest Treaty with American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Blvd., Manassas, Va. 20110-2209) 24. aprila 2006, pod pristupnim br. PTA-7552, ili ili takve sekvence kojima nedostaje teški lanac C-terminalnog lizina. Kako je opisano ovde, anti-FRA antitelo je MORAb-003 (USAN naziv: farletuzumab) (Ebel et al. (2007) Cancer Immunity 7:6), ili njegov fragment koji vezuje antigen.

[0112] Kako je opisano ovde, ciljani antigen raka za ADC je receptor ljudskog epidermalnog faktora rasta 2 („her2“).

[0113] Kako je opisano ovde, anti-her2 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen obuhvata tri CDR teškog lanca i tri CDR lakog lanca kako sledi: CDR1 teškog lanca (HCDR1) se sastoji od SEQ ID NO:71, CDR2 teškog lanca (HCDR2) se sastoji od SEQ ID NO:72, CDR3 teškog lanca (HCDR3) se sastoji od SEQ ID NO:73; CDR1 lakog lanca (LCDR1) se sastoji od SEQ ID NO:74, CDR2 lakog lanca (LCDR2) se sastoji od SEQ ID NO:75, i CDR3 lakog lanca (LCDR3) se sastoji od SEQ ID NO:76, kako je definisano Kabat sistemom numerisanja.

[0114] Kako je opisano ovde, anti-her2 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen obuhvata tri CDR teškog lanca i tri CDR lakog lanca kako sledi: CDR1 teškog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO:191, CDR2 teškog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO: 192, CDR3 teškog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO: 193; CDR1 lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO: 194, CDR2 lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO: 195, i CDR3 lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO: 196, kako je definisano IMGT sistemom numerisanja.

[0115] Kako je opisano ovde, anti-her2 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen obuhvata varijabilni region teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:27, i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:28. Kako je opisano ovde, anti-her2 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen obuhvata aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO:27 i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO:28, ili sekvence koje su najmanje 95% identične gore navedenim sekvencama. Kako je opisano ovde, anti-her2 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen ima aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja je najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična sa SEQ ID NO:27 i/ili aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja je najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična sa SEQ ID NO:28.

[0116] Kako je opisano ovde, anti-her2 antitelo obuhvata ljudski IgG1 konstantni domen teškog lanca i ljudski Ig kapa konstantni domen lakog lanca.

[0117] Kako je opisano ovde, anti-her2 antitelo obuhvata aminokiselinsku sekvencu teškog lanca SEQ ID NO:327 ili sekvencu koja je najmanje 95% identična sa SEQ ID NO:327, i aminokiselinsku sekvencu lakog lanca SEQ ID NO:328 ili sekvencu koja je najmanje 95% identična sa SEQ ID NO:328. Kako je opisano ovde, antitelo obuhvata aminokiselinsku sekvencu teškog lanca SEQ ID NO:327 i aminokiselinsku sekvencu lakog lanca SEQ ID NO:328, ili sekvence koje su najmanje 95% identične gore navedenim sekvencama. Kako je

4

opisano ovde, anti-her2 antitelo ima aminokiselinsku sekvencu teškog lanca koja je najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična sa SEQ ID NO:327 i aminokiselinsku sekvencu lakog lanca koja je najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična sa SEQ ID NO:328. Kako je opisano ovde, anti-her2 antitelo je trastuzumab, ili njegov fragment koji vezuje antigen.

[0118] Kako je opisano ovde, anti-FRA antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen obuhvata tri CDR teškog lanca i tri CDR lakog lanca od MORAb-003 ili gde CDR uključuju ne više od jedne, dve, tri, četiri, pet ili šest aminokiselinskih dodavanja, brisanja ili supstitucija od HCDR1 (SEQ ID NO:2 prema Kabatu, ili SEQ ID NO:13 prema IMGT), HCDR2 (SEQ ID NO:3 prema Kabatu, ili SEQ ID NO:14 prema IMGT), HCDR3 (SEQ ID NO:4 prema Kabatu, ili SEQ ID NO:15 prema IMGT); LCDR1 (SEQ ID NO:7 prema Kabatu, ili SEQ ID NO:16 prema IMGT), LCDR2 (SEQ ID NO:8 prema Kabatu, ili SEQ ID NO:17 prema IMGT), i LCDR3 (SEQ ID NO:9 prema Kabatu, ili SEQ ID NO:18 prema IMGT).

[0119] Kako je opisano ovde, anti-her2 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen obuhvata tri CDR teškog lanca i tri CDR lakog lanca od trastuzumab ili gde CDR uključuju ne više od jedne, dve, tri, četiri, pet ili šest aminokiselinskih dodavanja, brisanja ili supstitucija od HCDR1 (SEQ ID NO:71 prema Kabatu, ili SEQ ID NO: 191 prema IMGT), HCDR2 (SEQ ID NO:72 prema Kabatu, ili SEQ ID NO: 192 prema IMGT), HCDR3 (SEQ ID NO:73 prema Kabatu, ili SEQ ID NO: 193 prema IMGT); LCDR1 (SEQ ID NO:74 prema Kabatu, ili SEQ ID NO: 194 prema IMGT), LCDR2 (SEQ ID NO:75 prema Kabatu, ili SEQ ID NO: 195 prema IMGT), i LCDR3 (SEQ ID NO:76 prema Kabatu, ili SEQ ID NO: 196 prema IMGT).

[0120] Kako je opisano ovde, supstitucije aminokiselina su pojedinačni ostaci. Dodavanja će obično biti reda od oko 1 do oko 20 aminokiselinskih ostataka, mada se mogu tolerisati znatno veća dodavanja sve dok se zadrži biološka funkcija (npr. vezivanje za FRA ili her2). Brisanja se obično kreću od oko 1 do oko 20 aminokiselinskih ostataka, mada u nekim slučajevima brisanja mogu biti mnogo veće. Supstitucije, brisanja, dodavana ili bilo koja njihova kombinacija mogu se koristiti za postizanje konačnog derivata ili varijante.

Generalno se ove promene se rade na nekoliko aminokiselina kako bi se smanjile promene molekula, posebno imunogenost i specifičnost proteina koji vezuje antigen. Međutim, veće promene mogu se tolerisati u određenim okolnostima. Konzervativne supstitucije se uglavnom vrše u skladu sa narednom tabelom prikazanom u Tabeli 10.

Tabela 10

[0121] Značajne promene u funkciji ili imunološkom identitetu se vrše izborom supstitucija koje su manje konzervativne od onih prikazanih u Tabeli 10. Na primer, mogu se izvršiti supstitucije koje značajnije utiču na: strukturu polipeptidne kičme u području promene, na primer alfa-spiralna ili beta-list struktura; naelektrisanje ili hidrofobnost molekula na ciljanom mestu; ili glomazan bočni lanac. Supstitucije za koje se generalno očekuje da će proizvesti najveće promene u svojstvima polipeptida su one kod kojih je (a) hidrofilni ostatak, npr. seril ili treonil, supstituisan za (ili sa) hidrofobnim ostatkom, npr. leucil, izoleucil, fenilalanil, valil ili alanil; (b) cistein ili prolin je supstituisan za (ili sa) bilo kojim drugim ostatkom; (c) ostatak koji ima elektropozitivni bočni lanac, npr. lizil, arginil ili histidil, je supstituisan za (ili sa) elektronegativnim ostatkom, npr. glutamilom ili aspartilom; ili (d) ostatak koji ima glomazan bočni lanac, npr. fenilalanin, je supstituisan za (ili sa) onim koji nema bočni lanac, npr. glicin.

[0122] Kako je opisano ovde, gde se varijantne sekvence antitela koriste u ADC, varijante obično pokazuju istu kvalitativnu biološku aktivnost i izazvaće isti imuni odgovor, mada se varijante takođe mogu odabrati da modifikuju karakteristike proteina koji vezuju antigen po potrebi. Alternativno, varijanta može biti dizajnirana tako da se izmeni biološka aktivnost proteina koji vezuje antigen. Na primer, mesta glikozilacije mogu biti izmenjena ili uklonjena, kao što je ovde diskutovano.

[0123] Različita antitela se mogu koristiti sa ADC koji se ovde koriste za ciljanje ćelija raka. Kao što je prikazano u nastavku, veznik-toksini u ovde obelodanjenim ADC su iznenađujuće efikasni sa različitim antitelima koja ciljaju tumorski antigen. Pogodni antigeni eksprimirani na ćelijama tumora, ali ne i na zdravim ćelijama, ili eksprimirani na ćelijama tumora na višem nivou nego na zdravim ćelijama, poznati su u struci, kao i antitela usmerena protiv njih. Ova antitela se mogu koristiti sa veznicima i toksinima (npr. eribulinom) koji su ovde obelodanjeni. Kako je opisano ovde, deo antitela cilja FRA. Kako je opisano ovde, deo antitela koji cilja FRA je MORAb-003. Kako je opisano ovde, dok su obelodanjeni veznici i toksin (eribulin) iznenađujuće efikasni sa nekoliko različitih antitela koja ciljaju tumor, delovi antitela koji ciljaju FRA kao što je MORAb-003 pružili su posebno poboljšani antitelo:lek odnos, ciljanje tumora, ubijanje posmatrača, efikasnost tretmana, i smanjeno ubijanje van cilja. Može se meriti poboljšana efikasnost tretmana in vitro ili in vivo, i može uključivati smanjenu stopu rasta tumora i/ili smanjenu zapreminu tumora.

[0124] Kako je opisano ovde, koriste se antitela za druge ciljeve antigena i pružaju barem neka od povoljnih funkcionalnih svojstava ADC koji sadrže deo antitela koji cilja FRA, kao što je MORAb-003 (npr. poboljšani lek:antitelo odnos, poboljšana efikasnost tretmana, smanjeno ubijanje van cilja itd.). Kako je opisano ovde, neka ili sva ova povoljna funkcionalna svojstva se primećuju kada su obelodanjeni veznici i toksin (eribulin) konjugovani sa antitelom koji cilja her2, kao što je trastuzumab. Kako je opisano ovde, deo antitela cilja her2. Kako je opisano ovde, deo antitela koji cilja her2 je trastuzumab. Kako je opisano ovde, neka ili sva ova povoljna funkcionalna svojstva se primećuju kada su obelodanjeni veznici i toksin (eribulin) konjugovani sa delom antitela koje cilja MSLN kao što je MORAb-009. Kako je opisano ovde, deo antitela cilja MSLN. Kako je opisano ovde, deo antitela koji cilja MSLN je MORAb-009.

Veznici

[0125] Kako je opisano ovde, veznik u ADC je stabilan van ćelije na dovoljan način da bude terapeutski efikasan. Kako je opisano ovde, veznik je stabilan van ćelije, tako da ADC ostaje netaknut kada je prisutan u vanćelijskim uslovima (npr. pre transporta ili isporuke u ćeliju). Izraz „netaknut“, korišćen u kontekstu ADC, znači da deo antitela ostaje vezan za deo leka. Kako se ovde koristi, „stabilan“, u kontekstu veznika ili ADC koji sadrži veznik, znači da se ne više od 20%, ne više od oko 15%, ne više od oko 10%, ne više od oko 5%, ne više od oko 3%, ili ne više od oko 1% veznika (ili bilo koji procenat između) u uzorku ADC razdvaja (ili u slučaju da celokupni ADC inače nije netaknut) kada je ADC prisutan u vanćelijskim uslovima.

[0126] Da li je veznik stabilan van ćelije može se utvrditi, na primer, uključivanjem ADC u plazmu tokom unapred određenog vremenskog perioda (npr.2, 4, 6, 8, 16 ili 24 sata), i zatim kvantifikovanjem količine slobodnog dela leka prisutnog u plazmi. Stabilnost može dozvoliti ADC da se lokalizuje za ciljanje tumorskih ćelija i spreči preuranjeno oslobađanje leka, što bi moglo smanjiti terapeutski indeks ADC neselektivnim oštećivanjem i normalnih i tumorskih tkiva. Kako je opisano ovde, veznik je stabilan van ciljane ćelije i oslobađa deo leka iz ADC kada se nađe u ćeliji, tako da se deo leka može vezati za svoj cilj (npr. za mikrotubule).

Dakle, efikasan veznik će: (i) održati specifična svojstva vezivanja dela antitela; (ii) omogućiti isporuku, na primer, unutarćelijsku isporuku, dela leka putem stabilnog vezivanja za deo antitela; (iii) ostati stabilan i netaknut dok se ADC ne transportuje ili isporuči na svoje ciljano mesto; i (iv) omogućavaju terapeutski efekat, npr. citotoksični efekat, dela leka nakon razdvajanja.

[0127] Veznici mogu uticati na fizičko-hemijska svojstva ADC. Kako su mnogi citotoksični agensi hidrofobne prirode, njihovo povezivanje sa antitelom sa dodatnim hidrofobnim delom može dovesti do agregacije. ADC agregati su nerastvorljivi i često ograničavaju dostižno opterećenje lekom na antitelu, što može negativno uticati na potenciju ADC. Proteinski agregati bioloških lekova, generalno, takođe su povezani sa povećanom imunogenošću. Kao što je prikazano u nastavku, ovde obelodanjeni veznici rezultuju u ADC sa niskim nivoima agregacije i poželjnim nivoima punjenja leka.

[0128] Veznik može biti „razdvojiv“ ili „nerazdvojiv“ (Ducri and Stump, Bioconjugate Chem. (2010) 21:5-13). Razdvojivi veznici su dizajnirani da oslobađaju lek kada su podvrgnuti određenim faktorima okoline, npr. kada su internalizovani u ciljanu ćeliju, dok se nerazdvojivi veznici uglavnom oslanjaju na razgradnju samog dela antitela.

[0129] Kako je opisano ovde, veznik je nerazdvojivi veznik. Kako je opisano ovde, deo leka od ADC se oslobađa razgradnjom dela antitela. Nerazdvojivi veznici teže da ostanu kovalentno povezani sa najmanje jednom aminokiselinom antitela i leka nakon internalizacije i razgradnje unutar ciljane ćelije. Nerazdvojivi veznici obično uključuju tioetarsku vezu koja se priprema konjugacijom tiolne grupe na leku ili antitelu sa maleimidnom ili haloacetamidnom grupom na antitelu ili leku (Goldmacher et. al., u Cancer Drug Discovery and Development: Antibody-Drug Conjugates and Immunotoxins (G. L. Phillips ed., Springer, 2013)). Primerni nerazdvojivi veznik sadrži tioetar, cikloheksil, N-sukcinimidil 4-(N-maleimidometil) cikloheksan-1 karboksilat (SMCC), N-hidroksisukcinimid (NHS) ili jedan ili više ostataka polietilen glikola (PEG), npr.1, 2, 3, 4, 5 ili 6 PEG dela. Kako je opisano ovde, nerazdvojivi veznik sadrži (PEG)2. Kako je opisano ovde, nerazdvojivi veznik sadrži (PEG)4.

[0130] Kako je opisano ovde, veznik je razdvojivi veznik. Razdvojivi veznik koji se može razdvojiti odnosi se na bilo koji veznik koji sadrži razdvojivi deo. Kako se ovde koristi, izraz „razdvojivi deo“ odnosi se na bilo koju hemijsku vezu koja se može razdvojiti. Pogodne hemijske veze koje se mogu razdvojiti dobro su poznate u struci i uključuju, ali nisu ograničene na, kisele labilne veze, labilne veze proteaze/peptidaze, fotolabilne veze, disulfidne veze i labilne veze estaraze. Veznici koji sadrže razdvojivi deo mogu da omoguće oslobađanje dela leka iz ADC preko razdvajanja na određenom mestu u vezniku. Kako je opisano ovde, razdvajanje antitela od povezanog toksina aktivira ili povećava aktivnost toksina. Kako je opisano ovde, ADC koji sadrži razdvojivi veznik (npr. Val-Cit veznik) pokazuje povećano ubijanje ćelija na cilju i/ili smanjeno ubijanje ćelija van cilja, u poređenju sa ADC koji sadrži nerazdvojivi veznik (npr. nerazdvojivi (PEG)2ili (PEG)4veznik). Kako je opisano ovde, ADC koji sadrži razdvojivi veznik pokazuje poboljšanu efikasnost tretmana u odnosu na ADC koji sadrži nerazdvojivi veznik kada ćelije i/ili rak tretirani sa ADC ne eksprimiranju visoke nivoe ciljanog antigena (npr. FRA ili her2). Kako je opisano ovde, razdvajanje antitela od povezanog toksina potrebno je kako bi se postigla poboljšana efikasnost tretmana ADC, mereno in vitro i/ili in vivo.

[0131] Kako je opisano ovde, veznik se može razdvojiti u unutarćelijskim uslovima, tako da razdvajanje veznika dovoljno oslobađa deo leka iz dela antitela u unutarćelijskoj sredini tako da aktivira lek i/ili učini lek terapeutski efikasnim. Kako je opisano ovde, deo leka se ne odvaja od dela antitela sve dok ADC ne uđe u ćeliju koja eksprimira antigen specifičan za deo antitela od ADC, i deo leka se razdvaja od dela antitela po ulasku u ćeliju. Kako je opisano ovde, veznik sadrži razdvojivi deo koji je postavljen tako da nijedan deo veznika ili deo antitela ne ostaje vezan za deo leka nakon razdvajanja. Primeri vezivanja koji se mogu razdvojiti uključuju veznike koji nisu stabilni na kiselinu, veznike osetljive na proteazu/peptidazu, fotolabilne veze, veznike koji sadrže dimetil, disulfid ili sulfonamid.

[0132] Kako je opisano ovde, veznik je veznik osetljiv na pH i osetljiv je na hidrolizu pri određenim pH vrednostima. Tipično, veznik osetljiv na pH može se razdvojiti pod kiselim uslovima. Ova strategija razdvajanja obično koristi niži pH u endozomskim (pH ∼ 5-6) i lizozomskim (pH ∼ 4,8) unutarćelijskim odeljcima, u poređenju sa citozolom (pH ∼ 7,4), kako bi pokrenuli hidrolizu kisele labilne grupe u veznik, kao što je hidrazon (Jain et al. (2015) Pharm Res 32:3526-40). Kako je opisano ovde, veznik je kiselo labilan i/ili hidrolizujući veznik. Na primer, kiselo labilni veznik koji se hidrolizuje u lizozomu i sadrži kiselu labilnu grupu (npr. hidrazon, semicarbazon, tiosemikarbazon, cis-akonitni amid, ortoestar, acetal, ketal ili slično) može se koristiti. Pogledati npr. SAD patenti br.5,122,368; 5,824,805; 5,622,929; Dubowchik i Walker (1999) Pharm. Therapeutics 83:67-123; Neville et al. (1989) Biol. Chem.264:14653-61. Takvi veznici su relativno stabilni u uslovima neutralnog pH, poput onih u krvi, ali su nestabilni pri pH ispod 5,5 ili 5,0, što je približno pH lizozoma. Kako je opisano ovde, hidrolizujući veznik je tioetarski veznik (kao što je, na primer, tioetar vezan za terapeutski agens preko acilhidrazonske veze). Pogledati npr. SAD patent br.5,622,929.

[0133] Kako je opisano ovde, veznik se može razdvojiti pod redukcionim uslovima. Kako je opisano ovde, veznik se može razdvojiti u prisustvu redukcionog agensa, kao što su glutation ili ditiotreitol. Kako je opisano ovde, veznik je razdvojivi disulfidni veznik ili razdvojivi sulfonamidni veznik.

[0134] Kako je opisano ovde, veznik je razdvojivi disulfidni veznik. U struci su poznati različiti disulfidni veznici, uključujući, na primer, one koji se mogu formirati upotrebom SATA (N-sukcinimidil-5-acetiltioacetat), SPDP (N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio) propionata) SPDB (N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)butirat) i SMPT (N-sukcinimidiloksikarbonil-alfa-metil-alfa-(2-piridil-ditio)toluen), SPDB i SMPT. Pogledati npr. Thorpe et al. (1987) Cancer Res.47:5924-31; Wawrzynczak et al., u Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987). Takođe pogledati SAD patent br.4,880,935. Disulfidni veznici se obično koriste za iskorišćavanje obilja unutarćelijskih tiola, što može olakšati razdvajanje njihovih disulfidnih veza. Unutarćelijske koncentracije najćešćeg unutarćelijskog tiola, redukovanog glutationa, uglavnom se kreću u rasponu od 1-10 nM, što je oko 1.000 puta više od nivoa najzastupljenijeg niskomolekularnog tiola u krvi (tj. csteina) pri oko 5 µM (Goldmacher et. al., u Cancer Drug Discovery and Development: Antibody-Drug Conjugates and Immunotoxins (G. L. Phillips ed., Springer, 2013)). Unutarćelijski enzimi iz porodice proteinskih disulfidnih izomeraza mogu takođe doprineti unutarćelijskom cepanju disulfidnog veznika. Kako se ovde koristi, razdvojivi disulfidni veznik odnosi se na bilo koji veznik koji sadrži razdvojivi disulfidni deo. Izraz „razdvojivi disulfidni deo“ odnosi se na disulfidnu vezu koja se može razdvojiti i/ili redukovati, na primer, tiolom ili enzimom. Kako je opisano ovde, razdvojivi disulfidni deo je disulfidil-dimetil.

[0135] Kako je opisano ovde, veznik je razdvojivi sulfonamidni veznik. Kako se ovde koristi, razdvojivi sulfonamidni veznik odnosi se na bilo koji veznik koji sadrži razdvojivi sulfonamidni deo. Izraz „razdvojivi sulfonamidni deo“ odnosi se na sulfonamidnu grupu, tj. sulfonilnu grupu povezanu sa aminskom grupom, gde se sumpor-azot veza može razdvojiti.

[0136] Kako je opisano ovde, veznik može biti veznik dendritičnog tipa za kovalentno vezivanje više od jednog dela leka za deo antitela kroz razgranati, multifunkcionalni deo veznika. Pogledati npr. Sun et al. (2002) Bioorg. Med. Chem. Lett.12:2213-5; Sun et al. (2003) Bioorg. Med. Chem. 11:1761-8. Dendritički veznici mogu povećati molarni odnos leka prema antitelu, tj. opterećenje lekom, što je povezano sa potencijom ADC. Prema tome, tamo gde deo antitela nosi samo jednu reaktivnu cistein tiol grupu, na primer, mnoštvo delova leka može biti vezano kroz dendritički veznik. Kako je opisano ovde, deo veznika ili vezniklek deo može biti vezan za antitelo putem hemijske redukovanog disulfiddnog premošćavanja ili tehnologije ograničene upotrebe lizina. Pogledati npr. Međ. publ. br. WO2013173391 i WO2013173393.

1

[0137] Kako je opisano ovde, veznik se može razdvojiti agensom za razdvajanje, npr. enzimom, koji je prisutan u unutarćelijskom okruženju (npr. unutar lizozoma ili endozoma ili kaveoleje). Veznik može biti, na primer, peptidni veznik koji se cepa intracelularnim enzimom peptidaze ili proteaze, uključujući, ali bez ograničenja, lizozomsku ili endozomsku proteazu. Kako je opisano ovde, veznik je razdvojivi peptidni veznik. Kako se ovde koristi, razdvojivi peptidni veznik odnosi se na bilo koji veznik koji sadrži razdvojivi peptidni deo. Izraz „razdvojivi peptidni deo“ odnosi se na bilo koju hemijsku vezu koja povezuje aminokiseline (prirodni ili sintetički derivati aminokiselina) koje se mogu razdvojiti agensom koji je prisutan u unutarćelijskoj sredini. Na primer, veznik može sadržati alanin-alaninasparagin (Ala-Ala-Asn) sekvencu ili valin-citrulin (Val-Cit) sekvencu koja se može razdvojiti peptidazom kao što je katepsin, npr. katepsin B.

[0138] Kako je opisano ovde, veznik je enzimom razdvojivi veznik, i razdvojivi peptidni deo u vezniku može se razdvojiti enzimom. Kako je opisano ovde, razdvojivi peptidni deo može se razdvojiti lizozomskim enzimom, npr. katepsinom. Kako je opisano ovde, veznik je katepsinom razdvojivi veznik. Kako je opisano ovde, razdvojivi peptidni deo u vezniku može se razdvojiti lizozomskim cisteinskim katepsinom, kao što su katepsin B, C, F, H, K, L, O, S, V, X ili W. Kako je opisano ovde, razdvojivi peptidni deo razdvaja se katepsinom B.

Primerni dirazdvojivi peptid katepsinom B je valin-citrulin (Val-Cit) (Dubowchik et al. (2002) Bioconjugate Chem. 13:855-69). Kako je opisano ovde, ADC koji sadrži razdvojivi peptidni deo pokazuje niže nivoe agregacije i/ili veće opterećenje lekom (p) u odnosu na ADC koji sadrži alternativni razdvojivi deo (npr. razdvojivi disulfidni deo ili razdvojivi sulfonamidni deo).

[0139] Kako je opisano ovde, veznik ili razdvojivi peptidni deo u vezniku sadrži aminokiselinsku jedinicu. Kako je opisano ovde, aminokiselinska jedinica omogućava razdvajanje veznika proteazom, olakšavajući tako oslobađanje dela leka iz ADC nakon izlaganja jednoj ili više unutarćelijskih proteaza, kao što su jedan ili više lizozomskih enzima (Doronina et al. (2003) Nat. Biotechnol.21:778-84; Dubowchik and Walker (1999) Pharm. Therapeutics 83:67-123). Primeri aminokiselinskih jedinica uključuju, ali nisu ograničeni na, dipeptide, tripeptide, tetrapeptide i pentapeptide. Primeri dipeptida uključuju, ali nisu ograničeni na, valin-citrulin (Val-Cit), alanin-asparagin (Ala-Asn), alanin-fenilalanin (Ala-Phe), fenilalanin-lizin (Phe-Lys), alanin-lizin (Ala-Lys), alanin-valin (Ala-Val), valin-alanin (Val-Ala), valin-lizin (Val-Lys), lizin-lizin (Lys-Lys), fenilalanin-citrulin (Phe-Cit), leucin-

2

citrulin (Leu-Cit), izoleucin-citrulin (Ile-Cit), triptofan-citrulin (Trp-Cit) i fenilalanin-alanin (Phe-Ala). Primeri tripeptida uključuju, ali nisu ograničeni na, alanin-alanin-asparagin (Ala-Ala-Asn), glicin-valin-citrulin (Gly-Val-Cit), glicin-glicin-glicin (Gly-Gly-Gly), fenilalaninfenilalanin-lizin (Phe-Phe-Lys) i glicin-fenilalanin-lizin (Gly-Phe-Lys). Druge primerne aminokiselinske jedinice uključuju, ali nisu ograničene na, Gly-Phe-Leu-Gly, Ala-Leu-Ala-Leu, Phe-N<9>-tozil-Arg i Phe-N<9>-Nitro-Arg, kako je opisano u, npr. SAD patentu br.

6,214,345. Kako je opisano ovde, aminokiselinska jedinica u vezniku sadrži Val-Cit. Kako je opisano ovde, aminokiselinska jedinica u vezniku sadrži Ala-Ala-Asn. Kako je opisano ovde, ADC koji sadrži Val-Cit pokazuje smanjeno ubijanje ćelija van cilja, povećano ubijanje ćelija na cilju, niže nivoe agregacije i/ili veće opterećenje lekom (p) u odnosu na ADC koji sadrži alternativnu aminokiselinsku jedinicu ili alternativni razdvojivi deo. Aminokiselinska jedinica može sadržati aminokiselinske ostatke koji se javljaju prirodno i/ili minorne aminokiseline i/ili analoge aminokiselina koji se ne javljaju u prirodi, kao što je citrulin. Jedinice aminokiselina mogu se dizajnirati i optimizovati za enzimatsko razdvajanje pomoću određenog enzima, na primer, proteaza povezana sa tumorom, lizozomska proteaza kao što su katepsin B, C, D ili S, ili plazmin proteaza.

[0140] Kako je opisano ovde, veznik u bilo kom od ovde obelodanjenih ADC može sadržati najmanje jednu odstojnu jedinicu koja spaja deo antitela sa delom leka. Kako je opisano ovde, odstojna jedinica se pridružuje mestu razdvajanja (na primer, razdvojivom peptidnom delu) u vezniku za deo antitela. Kako je opisano ovde, veznik i/ili odstojna jedinica u vezniku su suštinski hidrofilni. Hidrofilni veznik se može koristiti za smanjenje stepena do kog se lek može ispumpati iz rezistentnih ćelija raka putem višestruke rezistencije na lekove (MDR) ili funkcionalno sličnih transportera. U nekim aspektima, veznik uključuje jedan ili više polietilen glikol (PEG) ostataka, npr.1, 2, 3, 4, 5 ili 6 PEG delova. Kako je opisano ovde, veznik je kraći PEG veznik i pruža poboljšanu stabilnost i smanjenu agregaciju u odnosu na duže PEG veznike.

[0141] Kako je opisano ovde, odstojna jedinica u vezniku sadrži jedan ili više PEG delova. Kako je opisano ovde, odstojna jedinica sadrži -(PEG)m-, i m je ceo broj od 1 do 10. Kako je opisano ovde, m kreće se od 1 do 10; od 2 do 8; od 2 do 6; od 2 do 5; od 2 do 4; ili od 2 do 3. Kako je opisano ovde, m je 8. Kako je opisano ovde, m je 4. Kako je opisano ovde, m je 3. Kako je opisano ovde, m je 2. Kako je opisano ovde, odstojna jedinica sadrži (PEG)2, (PEG)4, (PEG)8, (PEG)9, (PEG)3-triazol-(PEG)3, (PEG)4-triazol-(PEG)3, ili dibenzilciklookten-triazol(PEG)3. Kako je opisano ovde, odstojna jedinica sadrži (PEG)2. Kako je opisano ovde, ADC koji sadrži kraću odstojnu jedinicu (npr. (PEG)2) pokazuje niži nivo agregacije i/ili veće opterećenje lekom (p) u odnosu na ADC koji sadrži dužu odstojnu jedinicu (npr. (PEG)8).

[0142] Kako je opisano ovde, odstojna jedinica u vezniku sadrži alkilni deo. Kako je opisano ovde, odstojna jedinica sadrži -(CH2)n-, i n je ceo broj od 1 do 10 (tj. n može biti 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10). Kako je opisano ovde, n je 5. Kako je opisano ovde, ADC koji sadrži kraću odstojnu jedinicu (npr. (CH2)5) pokazuje niži nivo agregacije i/ili veće opterećenje lekom (p) u odnosu na ADC koji sadrži duži odstojnu jedinicu (npr. (PEG)8).

[0143] Odstojna jedinica se može koristiti, na primer, za vezu antitela sa delom leka, bilo direktno ili indirektno. Kako je opisano ovde, odstojna jedinica direktno povezuje deo antitela sa delom leka. Kako je opisano ovde, deo antitela i deo leka su pričvršćeni preko odstojne jedinice koja sadrži jedan ili više PEG delova (npr. (PEG)2ili (PEG)4). Kako je opisano ovde, odstojna jedinica indirektno povezuje deo antitela sa delom leka. Kako je opisano ovde, odstojna jedinica povezuje deo antitela sa delom leka indirektno preko razdvojivog dela (npr. razdvojivi peptid, razdvojivi disulfid ili razdvojivi sulfonamid) i/ili deo za vezivanje koji spaja odstojnu jedinicu sa delom antitela, npr. maleimidnim delom.

[0144] Odstojna jedinica, kako je ovde opisano, vezuje se za deo antitela (tj. za antitelo ili fragment koji vezuje antigen) preko maleimidnog dela (Mal). Kako je opisano ovde, ADC koji sadrži veznik vezan za deo antitela preko maleimidnog dela pokazuje veće opterećenje lekom (p) u odnosu na ADC koji sadrži veznik vezan za deo antitela preko alternativnog dela za vezivanje, kao što je sukcinimidni deo.

[0145] Odstojna jedinica koja se vezuje za antitelo ili fragment koji vezuje antigen preko Mal ovde se naziva „Mal-odstojna jedinica". Izraz „maleimidni deo“, kako se ovde koristi, označava jedinjenje koje sadrži maleimidnu grupu i koje je reaktivna sa sulfhidrilnom grupom, npr. sulfhidrilnom grupom ostatka cisteina na delu antitela. Ostale funkcionalne grupe koje su reaktivne sa sulfhidrilnim grupama (tioli) uključuju, ali nisu ograničene na, jodoacetamid, bromoacetamid, vinil piridin, disulfid, piridil disulfid, izocijanat i izotiocijanat. Kako je opisano ovde, Mal-odstojna jedinica je reaktivna sa ostatkom cisteina na antitelu ili fragmentu koji vezuje antigen. Kako je opisano ovde, Mal-odstojna jedinica pridružena je antitelu ili fragmentu koji vezuje antigen preko ostatka cisteina. Kako je opisano ovde, Mal-

4

odstojna jedinica sadrži PEG deo. Kako je opisano ovde, Mal-odstojna jedinica sadrži alkilni deo.

[0146] Kako je opisano ovde, veznik sadrži Mal-odstojnu jedinicu i razdvojivi peptidni deo. Kako je opisano ovde, razdvojivi peptidni deo sadrži aminokiselinsku jedinicu. Kako je opisano ovde, aminokiselinska jedinica sadrži Val-Cit. Kako je opisano ovde, aminokiselinska jedinica sadrži Ala-Ala-Asn. Kako je opisano ovde, veznik sadrži Malodstojnu jedinicu i Val-Cit. Kako je opisano ovde, veznik sadrži Mal-(PEG)2i Val-Cit. Kako je opisano ovde, veznik sadrži Mal-(PEG)mi Val-Cit, gde m iznosi 2 do 8 ili 2 do 5, ili 2, 3, 4 ili 5. Kako je opisano ovde, veznik sadrži Mal-(PEG)8i Val-Cit. Kako je opisano ovde, veznik sadrži Mal-(CH2)5i Val-Cit. Kako je opisano ovde, veznik sadrži Mal-odstojnu jedinicu i Ala-Ala-Asn. Kako je opisano ovde, veznik sadrži Mal-(PEG)2i Ala-Ala-Asn.

[0147] Kako je opisano ovde, veznik sadrži Mal-odstojnu jedinicu i razdvojivi disulfidni deo. Kako je opisano ovde, razdvojivi disulfidni deo je disulfidil-dimetil. Kako je opisano ovde, veznik sadrži Mal-odstojnu jedinicu i disulfidil-dimetil. Kako je opisano ovde, veznik sadrži Mal-(PEG)4-triazol-(PEG)3i disulfidil-dimetil.

[0148] Kako je opisano ovde, veznik sadrži Mal-odstojnu jedinicu i razdvojivi sulfonamidni deo. Kako je opisano ovde, veznik sadrži Mal-(PEG)4-triazol-(PEG)3i sulfonamid.

[0149] Kako je opisano ovde, odstojna jedinica se vezuje za antitelo ili fragment koji vezuje antigen preko sukcinimidnog dela (OSu). Odstojna jedinica koja se vezuje za antitelo ili fragment koji vezuje antigen preko OSu ovde se naziva „OSu-odstojna jedinica“. Izraz „sukcinimidni deo“, kako se ovde koristi, označava jedinjenje koje sadrži sukcinimidno jedinjenje koje je reaktivno sa aminskom grupom, npr. aminskom grupom ostatka lizina na delu antitela. Primeran sukcinimidni dio je N-hidroksisukcinimid (NHS). Kako je opisano ovde, OSu-odstojna jedinica je reaktivna sa ostatkom lizina na antitelu ili fragmentu koji vezuje antigen. Kako je opisano ovde, OSu-odstojna jedinica pridružena je antitelu ili fragmentu koji vezuje antigen preko ostatka lizina. Kako je opisano ovde, OSu-odstojna jedinica sadrži PEG deo. Kako je opisano ovde, OSu-odstojna jedinica sadrži alkilni deo.

[0150] Kako je opisano ovde, veznik sadrži OSu-odstojnu jedinicu i razdvojivi peptidni deo Kako je opisano ovde, razdvojivi peptidni deo sadrži aminokiselinsku jedinicu. Kako je opisano ovde, aminokiselinska jedinica sadrži Val-Cit. Kako je opisano ovde, aminokiselinska jedinica sadrži Ala-Ala-Asn. Kako je opisano ovde, veznik sadrži OSuodstojnu jedinicu i Val-Cit. Kako je opisano ovde, veznik sadrži OSu-(PEG)2i Val-Cit. Kako je opisano ovde, veznik sadrži OSu-(PEG)9i Val-Cit. Kako je opisano ovde, veznik sadrži OSu-(CH2)5i Val-Cit. Kako je opisano ovde, veznik sadrži OSu-(PEG)3-triazol-(PEG)3i Val-Cit. Kako je opisano ovde, veznik sadrži OSu-odstojnu jedinicu i Ala-Ala-Asn. Kako je opisano ovde, veznik sadrži OSu-(PEG)2i Ala-Ala-Asn.

[0151] Kako je opisano ovde, veznik sadrži OSu-odstojnu jedinicu i razdvojivi disulfidni deo. Kako je opisano ovde, razdvojivi disulfidni deo je disulfidil-dimetil. Kako je opisano ovde, veznik sadrži OSu-odstojnu jedinicu i disulfidil-dimetil. Kako je opisano ovde, veznik sadrži OSu-(PEG)3-triazol-(PEG)3i disulfidil-dimetil. Kako je opisano ovde, veznik sadrži OSudibenzilciklookten-triazol-(PEG)3i disulfidil-dimetil.

[0152] Kako je opisano ovde, veznik sadrži OSu-odstojnu jedinicu i razdvojivi sulfonamidni deo. Kako je opisano ovde, veznik sadrži OSu-(PEG)3-triazol-(PEG)3i sulfonamid. Kako je opisano ovde, veznik sadrži OSu-dibenzilciklookten-triazol-(PEG)3i sulfonamid.

[0153] Kako je opisano ovde, Mal-odstojna jedinica ili OSu-odstojna jedinica vezuje deo antitela (tj. antitelo ili fragment koji vezuje antigen) za razdvojivi deo u vezniku. Kako je opisano ovde, Mal-odstojna jedinica ili OSu-odstojna jedinica vezuje antitelo ili fragment koji vezuje antigen za razdvojivi peptidni deo. Kako je opisano ovde, razdvojivi peptidni deo sadrži aminokiselinsku jedinicu. Kako je opisano ovde, veznik sadrži Mal-odstojnu jedinicuaminokiselinsku jedinicu ili Osu-odstojnu jedinicu-aminokiselinsku jedinicu. Kako je opisano ovde, Mal-odstojna jedinica ili OSu-odstojna jedinica sadrži PEG deo. Kako je opisano ovde, Mal-odstojna jedinica ili OSu-odstojna jedinica sadrži alkilni deo. Kako je opisano ovde, aminokiselinska jedinica sadrži Val-Cit. Kako je opisano ovde, aminokiselinska jedinica sadrži Ala-Ala-Asn.

[0154] Kako je opisano ovde, veznik sadrži strukturu: Mal-odstojna jedinica-Val-Cit. Kako je opisano ovde, veznik sadrži strukturu: Mal-(PEG)2-Val-Cit. Kako je opisano ovde, veznik sadrži strukturu: Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB. Kako je opisano ovde, veznik sadrži Mal-(PEG)8-Val-Cit. Kako je opisano ovde, veznik sadrži Mal-(CH2)5-Val-Cit. Kako je opisano ovde, veznik sadrži Mal-odstojnu jedinicu-Ala-Ala-Asn. Kako je opisano ovde, veznik sadrži Mal(PEG)2-Ala-Ala-Asn.

[0155] Kako je opisano ovde, veznik sadrži OSu-odstojnu jedinicu-Val-Cit. Kako je opisano ovde, veznik sadrži OSu-(PEG)2-Val-Cit. Kako je opisano ovde, veznik sadrži OSu-(PEG)9-Val-Cit. Kako je opisano ovde, veznik sadrži OSu-(CH2)5-Val-Cit. Kako je opisano ovde, veznik sadrži OSu-(PEG)3-triazol-(PEG)3-Val-Cit. Kako je opisano ovde, veznik sadrži OSuodstojnu jedinicu-Ala-Ala-Asn. Kako je opisano ovde, veznik sadrži OSu-(PEG)2-Ala-Ala-Asn.

[0156] Kako je opisano ovde, Mal-odstojna jedinica ili OSu-odstojna jedinica vezuje antitelo ili fragment koji vezuje antigen za razdvojivi disulfidni deo. Kako je opisano ovde, veznik sadrži Mal-odstojnu jedinicu-disulfid ili OSu-odstojnu jedinicu-disulfid. Kako je opisano ovde, disulfid je disulfidil-dimetil. Kako je opisano ovde, veznik sadrži Mal-odstojnu jedinicu-disulfidil-dimetil. Kako je opisano ovde, veznik sadrži Mal-(PEG)4-triazol-(PEG)3-disulfidil-dimetil. Kako je opisano ovde, veznik sadrži OSu-odstojnu jedinicu-disulfidildimetil. Kako je opisano ovde, veznik sadrži OSu-(PEG)3-triazol-(PEG)3-disulfidil-dimetil. Kako je opisano ovde, veznik sadrži OSu-dibenzilciklookten-triazol-(PEG)3-disulfidildimetil.

[0157] Kako je opisano ovde, Mal-odstojna jedinica ili OSu-odstojna jedinica vezuje antitelo ili fragment koji vezuje antigen na razdvojivi sulfonamidni deo. Kako je opisano ovde, veznik sadrži Mal-odstojnu jedinicu-sulfonamid ili OSu-odstojnu jedinicu-sulfonamid. Kako je opisano ovde, veznik sadrži Mal-(PEG)4-triazol-(PEG)3-sulfonamid. Kako je opisano ovde, veznik sadrži OSu-(PEG)3-triazol-(PEG)3-sulfonamid. Kako je opisano ovde, veznik sadrži OSu-dibenzilciklookten-triazol-(PEG)3-sulfonamid.

[0158] Kako je opisano ovde, razdvojivi deo u vezniku pridružen je direktno delu leka. Kako je opisano ovde, druga odstojna jedinica se koristi za pričvršćivanje razdvojivog dela u vezniku za deo leka. Kako je opisano ovde, deo leka je eribulin. Kako je opisano ovde, eribulin je pričvršćen za razdvojivi deo u vezniku pomoću odstojne jedinice. Kako je opisano ovde, eribulin je pričvršćen za razdvojivi deo u vezniku pomoću samo-imolativne odstojne jedinice. Kako je opisano ovde, eribulin je vezan za razdvojivi deo u vezniku pomoću samoimolativne odstojne jedinice, razdvojivi deo sadrži Val-Cit, a dalja odstojna jedinica koja sadrži PEG spaja razdvojivi deo sa delom antitela. Kako je opisano ovde, eribulin je povezan sa anti-FRA antitelom preko Mal-odstojne jedinice u vezniku povezane sa Val-Cit razdvojivim delom i pAB samo-imolativnom odstojnom jedinicom. Kako je opisano ovde, eribulin je povezan sa anti-her2 antitelom preko Mal-odstojne jedinice u vezniku povezanom sa Val-Cit razdvojivim delom i pAB samo-imolativnom odstojnom jedinicom.

[0159] Odstojna jedinica može biti „samo-imolativna“ ili „ne-samo-imolativna“. „Ne-samoimolativna“ odstojna jedinica je ona u kojoj deo ili cela odstojna jedinica ostaje vezana za deo leka nakon razdvajanja veznika. Primeri ne-samo-imolativnih odstojnih jedinica uključuju, ali nisu ograničeni na, odstojne jedinice glicina i glicin-glicin odstojne jedinice. Ne-samo-imolativne odstojne jedinice mogu se vremenom razgraditi, ali ne oslobađaju povezani nativni lek u potpunosti u ćelijskim uslovima. „Samo-imolativna“ odstojna jedinica omogućava oslobađanje nativnog dela leka pod unutarćelijskim uslovima. „Nativni lek“ je onaj kod kog nijedan deo odstojne jedinice ili druge hemijske modifikacije ne ostaje nakon razdvajanja/razgradnje odstojne jedinice.

[0160] Samo-imolativna hemija je poznata u struci i mogla bi se lako odabrati za obelodanjene ADC. Kako je opisano ovde, odstojna jedinica koja vezuje razdvojivi deo u vezniku za deo leka (npr. eribulin) je samo-imolativna i podvrgava se samo-imolaciji istovremeno ili neposredno pre/posle razdvajanja razdvojivog dela u unutarćelijskim uslovima.

[0161] Kako je opisano ovde, samo-imolativna odstojna jedinica u vezniku sadrži paminobenzilnu jedinicu. Kako je opisano ovde, p-aminobenzil alkohol (pABOH) je vezan za aminokiselinsku jedinicu ili drugi razdvojivi deo u vezniku putem amidne veze, i između pABOH i dela leka nastajeu karbamat, metilkarbamat ili karbonat (Hamann et al. (2005) Expert Opin. Ther. Patents 15:1087-103). Kako je opisano ovde, samo-imolativna odstojna jedinica jeste ili sadrži p-aminobenziloksikarbonil (pAB). Bez vezivanja za teoriju, smatra se da samo-imolacija pAB uključuje spontanu reakciju 1,6-eliminacije (Jain et al. (2015) Pharm Res 32:3526-40).

[0162] Kako je opisano ovde, struktura p-aminobenziloksikarbonila (pAB) koja se koristi u obelodanjenim ADC je prikazana u nastavku:

[0163] Kako je opisano ovde, samo-imolativna odstojna jedinica pričvršćuje razdvojivi deo u vezniku za C-35 amin na eribulinu. Kako je opisano ovde, samo-imolativna odstojna jedinica je pAB. Kako je opisano ovde, pAB vezuje razdvojivi deo u vezniku za C-35 amin na eribulinu. Kako je opisano ovde, pAB se podvrgava samo-imolaciji nakon razdvajanja razdvojivog ostatka, i eribulin se oslobađa iz ADC u svom prirodnom, aktivnom obliku. Kako je opisano ovde, anti-FRA antitelo (npr. MORAb-003) pridruženo je C-35 aminu eribulina pomoću veznika koji sadrži Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB. Kako je opisano ovde, anti-her2 antitelo (npr. trastuzumab) pridruženo je C-35 aminu eribulina pomoću veznika koji sadrži Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB.

[0164] Kako je opisano ovde, pAB se podvrgava samo-imolaciji nakon razdvajanja razdvojivog peptidnog dela u vezniku. Kako je opisano ovde, razdvojivi peptidni deo sadrži aminokiselinsku jedinicu. Kako je opisano ovde, veznik sadrži aminokiselinsku jedinicupAB. Kako je opisano ovde, aminokiselinska jedinica je Val-Cit. Kako je opisano ovde, veznik sadrži Val-Cit-pAB (VCP). Kako je opisano ovde, aminokiselinska jedinica je Ala-Ala-Asn. Kako je opisano ovde, veznik sadrži Ala-Ala-Asn-pAB.

[0165] Kako je opisano ovde, pAB se podvrgava samo-imolaciji nakon razdvajanja disulfidnog razdvojivog dela u vezniku. Kako je opisano ovde, veznik sadrži disulfid-pAB. Kako je opisano ovde, veznik sadrži disulfidil-dimetil-pAB.

[0166] Kako je opisano ovde, pAB se podvrgava samo-imolaciji nakon razdvajanja razdvojivog sulfonamidnog dela u vezniku. Kako je opisano ovde, veznik sadrži sulfonamidpAB.

[0167] Kako je opisano ovde, deo antitela od ADC je konjugovan sa delom leka preko veznika, gde veznik sadrži Mal-odstojnu jedinicu, razdvojivu aminokiselinsku jedinicu i pAB. Kako je opisano ovde, odstojna jedinica sadrži PEG deo. Kako je opisano ovde, odstojna jedinica sadrži alkilni deo. Kako je opisano ovde, veznik sadrži Mal-(PEG)2-aminokiselinsku jedinicu-pAB. Kako je opisano ovde, veznik sadrži Mal-(PEG)2-Val-CitpAB. Kako je opisano ovde, veznik sadrži Mal-(PEG)2-Ala-Ala-Asn-pAB. Kako je opisano ovde, veznik sadrži Mal-(PEG)8-aminokiselinsku jedinicu-pAB. Kako je opisano ovde, veznik sadrži Mal-(PEG)8-Val-Cit-pAB. Kako je opisano ovde, veznik sadrži Mal-(CH2)5-aminokiselinsku jedinicu-pAB. Kako je opisano ovde, veznik sadrži Mal-(CH2)5-Val-CitpAB.

[0168] Kako je opisano ovde, deo antitela od ADC je konjugovan sa delom leka preko veznika, gde veznik sadrži Mal-odstojnu jedinicu-disulfid-pAB. Kako je opisano ovde, odstojna jedinica sadrži PEG deo. Kako je opisano ovde, veznik sadrži Mal-(PEG)4-triazol-(PEG)3-disulfid-pAB. Kako je opisano ovde, veznik sadrži Mal-(PEG)4-triazol-(PEG)3-disulfidil-dimetil-pAB.

[0169] Kako je opisano ovde, deo antitela od ADC je konjugovan sa delom leka preko veznika, gde veznik sadrži Mal-odstojnu jedinicu-sulfonamid-pAB. Kako je opisano ovde, odstojna jedinica sadrži PEG deo. Kako je opisano ovde, veznik sadrži Mal-(PEG)4-triazol-(PEG)3-sulfonamid-pAB.

[0170] Kako je opisano ovde, deo antitela od ADC je konjugovan sa delom leka preko veznika, gde veznik sadrži OSu-odstojnu jedinicu-aminokiselinsku jedinicu-pAB. Kako je opisano ovde, odstojna jedinica sadrži PEG deo. Kako je opisano ovde, odstojna jedinica sadrži alkilni deo. Kako je opisano ovde, veznik sadrži OSu-(PEG)2-aminokiselinsku jedinicu-pAB. Kako je opisano ovde, veznik sadrži OSu-(PEG)2-Val-Cit-pAB. Kako je opisano ovde, veznik sadrži OSu-(PEG)2-Ala-Ala-Asn-pAB. Kako je opisano ovde, veznik sadrži OSu-(PEG)9-aminokiselinsku jedinicu-pAB. Kako je opisano ovde, veznik sadrži OSu-(PEG)9-Val-Cit-pAB. Kako je opisano ovde, veznik sadrži OSu-(CH2)5-aminokiselinsku jedinicu-pAB. Kako je opisano ovde, veznik sadrži OSu-(CH2)5-Val-Cit-pAB. Kako je opisano ovde, veznik sadrži OSu-(PEG)3-triazol-(PEG)3-aminokiselinsku jedinicu-pAB. Kako je opisano ovde, veznik sadrži OSu-(PEG)3-triazol-(PEG)3-Val-Cit-pAB.

[0171] Kako je opisano ovde, deo antitela od ADC je konjugovan sa delom leka preko veznika, gde veznik sadrži OSu-odstojnu jedinicu-disulfid-pAB. Kako je opisano ovde, odstojna jedinica sadrži PEG deo. Kako je opisano ovde, veznik sadrži OSu-(PEG)3-triazol-

1

(PEG)3-disulfid-pAB. Kako je opisano ovde, veznik sadrži OSu-(PEG)3-triazol-(PEG)3-disulfidil-dimetil-pAB. Kako je opisano ovde, veznik sadrži OSu-dibenzilciklookten-triazol-(PEG)3-disulfid-pAB. Kako je opisano ovde, veznik sadrži OSu-dibenzilciklookten-triazol-(PEG)3-disulfidil-dimetil-pAB.

[0172] Kako je opisano ovde, deo antitela od ADC je konjugovan sa delom leka preko veznika, gde veznik sadrži OSu-odstojnu jedinicu-sulfonamid-pAB. Kako je opisano ovde, odstojna jedinica sadrži PEG deo. Kako je opisano ovde, veznik sadrži OSu-(PEG)3-triazol-(PEG)3-sulfonamid-pAB. Kako je opisano ovde, veznik sadrži OSu-dibenzilciklooktentriazol-(PEG)3-sulfonamid-pAB.

[0173] Kako je opisano ovde, veznik je dizajniran da olakša ubijanje posmatrača (ubijanje susednih ćelija) razdvajanjem nakon ćelijske internalizacije i difuzije veznik-lek dela i/ili dela leka samo u susedne ćelije. Kako je opisano ovde, veznik promoviše ćelijsku internalizaciju. Kako je opisano ovde, veznik je dizajniran da minimizuje razdvajanje u vanćelijskom okruženju i na taj način smanji toksičnost za tkivo van cilja (npr nekancerozno tkivo), uz istovremeno očuvanje ADC vezivanja za ciljano tkivo i ubijanje posmatrača u vidu kanceroznog tkiva koje ne eksprimira antigen ciljan delom antitela od ADC, ali okružuje ciljano tkivo raka koji eksprimira taj antigen. Kako je opisano ovde, veznik koji sadrži maleimidni deo (Mal), deo polietilen glikola (PEG), valin-citrulin (Val-Cit ili „vc“) i pAB pruža ove funkcionalne karakteristike. Kako je opisano ovde, veznik koji sadrži Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB je posebno efikasan u pružanju ovih funkcionalnih karakteristika, na primer, kada se pridružuje delu anti-FRA antitela kao što je MORAb-003 i delu leka kao što je eribulin. Kako je opisano ovde, bar neke od ovih funkcionalnih karakteristika mogu se takođe posmatrati bez dela anti-FRA antitela i/ili bez MORAb-003. Na primer, kako je ovde opisano, veznik koji sadrži Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB je efikasan u pružanju nekih ili svih ovih funkcionalnih karakteristika, na primer, kada se pridružuje delu antitela protiv her2 kao što je trastuzumab i delu leka kao što je eribulin.

[0174] Kako je opisano ovde, deo antitela je konjugovan sa delom leka preko veznika koji sadrži maleimidni deo (Mal), polietilen glikol (PEG) deo, valin citrulin (Val-Cit ili „vc“) i pAB. Kako je opisano ovde, maleimidni deo kovalentno vezuje ostatak veznog leka za deo antitela, i pAB deluje kao samo-imolativna odstojna jedinica. Takav veznik se može označiti kao „m-vc-pAB“ veznik, „Mal-VCP“ veznik, „Mal-(PEG)2-VCP“ veznik ili „Mal-(PEG)2-

1 1

Val-Cit-pAB“ veznik. Kako je opisano ovde, deo leka je eribulin. Struktura Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB-eribulina je dat u Tabeli 46. pAB od Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB veznika je vezan za C-35 amin na eribulinu.

[0175] Otkriveno je da ADC koji sadrži Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB-eribulin pokazuje određenu kombinaciju poželjnih svojstava, posebno kada je uparen sa anti-FRA antitelom kao što je MORAb-003 ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen. Ova svojstva uključuju, ali nisu ograničena na, efikasne nivoe opterećenja lekom (p ∼ 4), nizak nivo agregacije, stabilnost u uslovima skladištenja ili u cirkulaciji u telu (npr. stabilnost u serumu), zadržani afinitet prema ćelijama koje eksprimiranju cilj u poređenju sa nekonjugovanim antitelima, potentna citotoksičnost prema ćelijama koje eksprimiraju cilj, nizak nivo ubijanja ćelija van cilja, visok nivo ubijanja posmatrača i/ili efikasna in vivo antikancerogena aktivnost, sve u poređenju sa ADC koji koriste druge vezne toksine i/ili antitela. Iako su brojne tehnike povezivanja i kombinacije odstojnika i mesta razdvajanja poznate u struci i mogu pružiti određene koristi u jednoj ili više ovih funkcionalnih kategorija, posebna kombinacija Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB veznika koji spaja eribulin sa delom antitela kao što je anti-FRA antitelo (npr. MORAb-003) može pružiti dobra ili superiorna svojstva u čitavom spektru poželjnih funkcionalnih svojstava za terapeutski ADC. Kako je opisano ovde, dobra ili superiorna funkcionalna svojstva pružena određenom kombinacijom Mal-(PEG)2-Val-CitpAB veznika koji spaja eribulin sa delom antitela može se posmatrati sa ovim vezniktoksinom konjugovanim sa, na primer, anti-her2 antitelom kao što je trastuzumab.

[0176] Kako je opisano ovde, ADC obuhvata Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB-eribulin i deo antitela koji obuhvata internalizujuće antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji zadržava sposobnost da cilja i internalizuje se u ćeliji tumora. Kako je opisano ovde, ADC obuhvata Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB-eribulin i internalizujuće antitelo ili njegov internalizujući fragment koji vezuje antigen koji cilja ćeliju tumora koja eksprimira FRA. Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili njegov internalizujući fragment koji vezuje antigen koji cilja ćeliju tumora koja eksprimira FRA obuhvata tri regiona za određivanje komplementarnosti teškog lanca (HCDR) koji obuhvataju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:2 (HCDR1), SEQ ID NO:3 (HCDR2), i SEQ ID NO:4 (HCDR3); i tri regiona za određivanje komplementarnosti lakog lanca (LCDR) koji obuhvataju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:7 (LCDR1), SEQ ID NO:8 (LCDR2), i SEQ ID NO:9 (LCDR3), kako je definisano Kabat sistemom numerisanja; ili tri regiona za određivanje komplementarnosti

1 2

teškog lanca (HCDR) koji obuhvataju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 13 (HCDR1), SEQ ID NO:14 (HCDR2), i SEQ ID NO: 15 (HCDR3); i tri regiona za određivanje komplementarnosti lakog lanca (LCDR) koji obuhvataju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 16 (LCDR1), SEQ ID NO:17 (LCDR2), i SEQ ID NO: 18 (LCDR3), kako je definisano IMGT sistemom numerisanja. Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili njegov internalizujući fragment koji vezuje antigen koji cilja ćeliju tumora koja eksprimira FRA obuhvata varijabilni region teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:23, i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:24. Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili njegov internalizujući fragment koji vezuje antigen koji cilja ćeliju tumora koja eksprimira FRA obuhvata ljudski IgG1 konstantni domen teškog lanca i Ig kapa konstantni domen lakog lanca.

[0177] Kako je opisano ovde, ADC ima Formulu I:

Ab-(L-D)p(I)

gde:

(i) Ab je internalizujuće antitelo protiv folatnog receptora alfa (FRA) ili njegov internalizujući fragment koji vezuje antigen koji obuhvata tri regiona za određivanje komplementarnosti teškog lanca (HCDR) koji obuhvataju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:2 (HCDR1), SEQ ID NO:3 (HCDR2), i SEQ ID NO:4 (HCDR3); i tri regiona za određivanje komplementarnosti lakog lanca (LCDR) koji obuhvataju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:7 (LCDR1), SEQ ID NO:8 (LCDR2), i SEQ ID NO:9 (LCDR3), kako je definisano Kabat sistemom numerisanja; ili tri regiona za određivanje komplementarnosti teškog lanca (HCDR) koji obuhvataju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 13 (HCDR1), SEQ ID NO:14 (HCDR2), i SEQ ID NO:15 (HCDR3); i tri regiona za određivanje komplementarnosti lakog lanca (LCDR) koji obuhvataju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:16 (LCDR1), SEQ ID NO:17 (LCDR2), i SEQ ID NO:18 (LCDR3), kako je definisano IMGT sistemom numerisanja;

(ii) D je eribulin;

(iii) L je razdvojivi veznik koji obuhvata Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB; i

(iv) p je ceo broj od 1 do 20.

[0178] Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili njegov internalizujući fragment koji

1

vezuje antigen obuhvata varijabilni region teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:23, i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:24. Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo je MORAb-003. Kako je opisano ovde, p je od 1 do 8, ili 1 do 6. Kako je opisano ovde, p je od 2 do 8, ili 2 do 5. Kako je opisano ovde, p je od 3 do 4. Kako je opisano ovde, p je 4.

[0179] Kako je opisano ovde, ADC obuhvata Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB-eribulin i internalizujuće antitelo ili njegov internalizujući fragment koji vezuje antigen koji cilja tumorsku ćeliju koja cilja her2. Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili njegov internalizujući fragment koji vezuje antigen koji cilja tumorsku ćeliju koja cilja her2 obuhvata tri regiona za određivanje komplementarnosti teškog lanca (HCDR) koji obuhvataju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:71 (HCDR1), SEQ ID NO:72 (HCDR2), i SEQ ID NO:73 (HCDR3); i tri regiona za određivanje komplementarnosti lakog lanca (LCDR) koji obuhvataju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:74 (LCDR1), SEQ ID NO:75 (LCDR2), i SEQ ID NO:76 (LCDR3), kako je definisano Kabat sistemom numerisanja; ili tri regiona za određivanje komplementarnosti teškog lanca (HCDR) koji obuhvataju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:191 (HCDR1), SEQ ID NO:192 (HCDR2), i SEQ ID NO:193 (HCDR3); i tri regiona za određivanje komplementarnosti lakog lanca (LCDR) koji obuhvataju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:194 (LCDR1), SEQ ID NO:195 (LCDR2), i SEQ ID NO:196 (LCDR3), kako je definisano IMGT sistemom numerisanja. Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili njegov internalizujući fragment koji vezuje antigen koji cilja tumorsku ćeliju koja cilja her2 obuhvata varijabilni region teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:27, i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:28. Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili njegov internalizujući fragment koji vezuje antigen koji cilja tumorsku ćeliju koja cilja her2 obuhvata ljudski IgG1 konstantni domen teškog lanca i Ig kapa konstantni domen lakog lanca.

[0180] Kako je opisano ovde, ADC ima Formulu I:

Ab-(L-D)p(I)

gde:

(i) Ab je internalizujuće antitelo protiv ljudskog receptora epidermalnog faktora rasta 2

1 4

(her2) ili njegov internalizujući fragment koji vezuje antigen koji obuhvata tri regiona za određivanje komplementarnosti teškog lanca (HCDR) koji obuhvataju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:71 (HCDR1), SEQ ID NO:72 (HCDR2), i SEQ ID NO:73 (HCDR3); i tri regiona za određivanje komplementarnosti lakog lanca (LCDR) koji obuhvataju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:74 (LCDR1), SEQ ID NO:75 (LCDR2), i SEQ ID NO:76 (LCDR3), kako je definisano Kabat sistemom numerisanja; ili tri regiona za određivanje komplementarnosti teškog lanca (HCDR) koji obuhvataju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:191 (HCDR1), SEQ ID NO:192 (HCDR2), i SEQ ID NO: 193 (HCDR3); i tri regiona za određivanje komplementarnosti lakog lanca (LCDR) koji obuhvataju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 194 (LCDR1), SEQ ID NO: 195 (LCDR2), i SEQ ID NO:196 (LCDR3), kako je definisano IMGT sistemom numerisanja;

(ii) D je eribulin;

(iii) L je razdvojivi veznik koji obuhvata Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB; i

(iv) p je ceo broj od 1 do 20.

[0181] Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili njegov internalizujući fragment koji vezuje antigen obuhvata varijabilni region teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:27, i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:28. Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo je trastuzumab. Kako je opisano ovde, p je od 1 do 8, ili 1 do 6. Kako je opisano ovde, p je od 2 do 8, ili 2 do 5. Kako je opisano ovde, p je od 3 do 4. Kako je opisano ovde, p je 4.

[0182] Kako je opisano ovde, ADC obuhvata Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB-eribulin i internalizujuće antitelo ili njegov internalizujući fragment koji vezuje antigen koji cilja tumorsku ćeliju koja eksprimira mezotelin (MSLN). Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili njegov internalizujući fragment koji vezuje antigen koji cilja tumorsku ćeliju koja eksprimira MSLN obuhvata tri regiona za određivanje komplementarnosti teškog lanca (HCDR) koji obuhvataju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:65 (HCDR1), SEQ ID NO:66 (HCDR2), i SEQ ID NO:67 (HCDR3); i tri regiona za određivanje komplementarnosti lakog lanca (LCDR) koji obuhvataju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:68 (LCDR1), SEQ ID NO:69 (LCDR2), i SEQ ID NO:70 (LCDR3), kako je definisano Kabat sistemom numerisanja; ili tri regiona za određivanje komplementarnosti teškog lanca (HCDR) koji obuhvataju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 185 (HCDR1), SEQ ID NO:186 (HCDR2), i SEQ ID NO:187 (HCDR3); i tri regiona za određivanje komplementarnosti lakog

1

lanca (LCDR) koji obuhvataju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:188 (LCDR1), SEQ ID NO:189 (LCDR2), i SEQ ID NO:190 (LCDR3), kako je definisano IMGT sistemom numerisanja. Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili njegov internalizujući fragment koji vezuje antigen koji cilja tumorsku ćeliju koja eksprimira MSLN obuhvata varijabilni region teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:25, i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:26. Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili njegov internalizujući fragment koji vezuje antigen koji cilja tumorsku ćeliju koja eksprimira MSLN obuhvata ljudski IgG1 konstantni domen teškog lanca i Ig kapa konstantni domen lakog lanca.

[0183] Kako je opisano ovde, ADC ima Formulu I:

Ab-(L-D)p(I)

gde:

(i) Ab je internalizujuće anti-mezotelin antitelo ili njegov internalizujući fragment koji vezuje antigen koji obuhvata tri regiona za određivanje komplementarnosti teškog lanca (HCDR) koji obuhvataju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:65 (HCDR1), SEQ ID NO:66 (HCDR2), i SEQ ID NO:67 (HCDR3); i tri regiona za određivanje komplementarnosti lakog lanca (LCDR) koji obuhvataju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:68 (LCDR1), SEQ ID NO:69 (LCDR2), i SEQ ID NO:70 (LCDR3), kako je definisano Kabat sistemom numerisanja; ili tri regiona za određivanje komplementarnosti teškog lanca (HCDR) koji obuhvataju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 185 (HCDR1), SEQ ID NO:186 (HCDR2), i SEQ ID NO:187 (HCDR3); i tri regiona za određivanje komplementarnosti lakog lanca (LCDR) koji obuhvataju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:188 (LCDR1), SEQ ID NO:189 (LCDR2), i SEQ ID NO:190 (LCDR3), kako je definisano IMGT sistemom numerisanja;

(ii) D je eribulin;

(iii) L je razdvojivi veznik koji obuhvata Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB; i

(iv) p je ceo broj od 1 do 20.

[0184] Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo ili njegov internalizujući fragment koji vezuje antigen obuhvata varijabilni region teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:25, i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku

1

sekvencu SEQ ID NO:26. Kako je opisano ovde, internalizujuće antitelo je MORAb-003, MORAb-009, ili trastuzumab. Kako je opisano ovde, p je od 1 do 8, ili 1 do 6. Kako je opisano ovde, p je od 2 do 8, ili 2 do 5. Kako je opisano ovde, p je od 3 do 4. Kako je opisano ovde, p je 4.

Delovi leka

[0185] Ovde opisani deo leka (D) od ADC može biti bilo koji hemoterapijski agens. Korisne klase hemoterapijskih agenasa uključuju, na primer, anti-tubulinske agense. Kako je opisano ovde, deo leka je agens protiv tubulina. Primeri anti-tubulinskih agenasa uključuju kriptoficin i eribulin. Poželjni deo leka za upotrebu u opisanim ADC je eribulin.

[0186] Kako je opisano ovde, deo leka je eribulin. Kako je opisano ovde, veznik od ADC je vezan preko C-35 amina na eribulinu.

[0187] Kako je opisano ovde, dole je prikazan prirodni oblik eribulina koji se koristi za spajanje na veznik i deo antitela:

[0188] Kako je opisano ovde, intermedijer, koji je prekursor veznika, reaguje sa delom leka pod odgovarajućim uslovima. Kako je opisano ovde, reaktivne grupe se koriste na leku i/ili intermedijeru ili vezniku. Proizvod reakcije između leka i intermedijera, ili derivatizovani lek, posle toga reaguje sa antitelom ili fragmentom koji vezuje antigen pod odgovarajućim uslovima. Alternativno, veznik ili intermedijer mogu prvo da reaguju sa antitelom ili derivatizovanim antitelom, a zatim sa lekom ili derivatizovanim lekom.

[0189] Dostupno je više različitih reakcija za kovalentno vezivanje lekova i/ili veznika za deo antitela. To se često postiže reakcijom jednog ili više aminokiselinskih ostataka molekula antitela, uključujući aminske grupe lizina, grupe slobodnih karboksilnih kiselina glutaminske kiseline i asparaginske kiseline, sulfhidrilne grupe cisteina i različite delove aromatičnih

1

aminokiselina. Na primer, nespecifično kovalentno vezivanje može se preduzeti korišćenjem karbodiimidne reakcije za povezivanje karboksi (ili amino) grupe u jedinjenju sa amino (ili karboksi) grupom na delu antitela. Pored toga, bifunkcionalni agensi poput dialdehida ili imidoestara takođe se mogu koristiti za povezivanje amino grupe u jedinjenju sa amino grupom na delu antitela. Takođe je za vezivanje lekova dostupna Schiffova bazna reakcija. Ovaj postupak uključuje perjodatnu oksidaciju leka koji sadrži glikol ili hidroksi grupe, čime se formira aldehid koji zatim reaguje sa vezujućim agensom. Vezivanje se javlja formiranjem Schiffove baze sa amino grupama vezujućeg agenssa. Izotiocijanati se takođe mogu koristiti kao agensi za spajanje za kovalentno vezivanje lekova za agense za vezivanje. Ostale tehnike su poznate stručnjaku i u okviru su predmetnog obelodanjenja.

Opterećenje lekom

[0190] Opterećenje lekom je predstavljeno kao p, i ovde se takođe naziva antitelo-lek odnosom (DAR). Opterećenje lekom može se kretati od 1 do 20 delova leka po delu antitela. Kako je opisano ovde, p je ceo broj od 1 do 20. Kako je opisano ovde, p je ceo broj od 1 do 10, 1 do 9, 1 do 8, 1 do 7, 1 do 6, 1 do 5, 1 do 4, 1 do 3 ili 1 do 2. Kako je opisano ovde, p je ceo broj od 2 do 10, 2 do 9, 2 do 8, 2 do 7, 2 do 6, 2 do 5, 2 do 4 ili 2 do 3. Kako je opisano ovde, p je ceo broj od 3 do 4. Kako je opisano ovde, p je 1, 2, 3, 4, 5 ili 6, poželjno 3 ili 4.

[0191] Opterećenje lekom može biti ograničeno brojem mesta vezivanja na delu antitela. Kako je opisano ovde, deo veznika (L) od ADC vezuje se na deo antitela kroz hemijski aktivnu grupu na jednom ili više aminokiselinskih ostataka na delu antitela. Na primer, veznik može biti vezan za deo antitela putem slobodne amino, imino, hidroksilne, tiolne ili karboksilne grupe (npr. za N- ili C-terminus, za epsilon amino grupu jednog ili više lizinskih ostataka, za slobodnu grupu karboksilne kiseline jednog ili više ostataka glutaminske kiseline ili asparaginske kiseline, ili na sulfhidrilnu grupu jednog ili više ostataka cisteina). Mesto na koje je vezan veznik može biti prirodni ostatak u aminokiselinskoj sekvenci dela antitela ili se može uneti u deo antitela, npr. DNK rekombinantnom tehnologijom (npr. uvođenjem ostatka cisteina u aminokiselinsku sekvencu) ili biohemijom proteina (npr. redukcijom, podešavanjem pH ili hidrolizom).

[0192] Kako je opisano ovde, broj dela leka koji mogu biti konjugovani sa delom antitela ograničen je brojem slobodnih ostataka cisteina. Na primer, tamo gde je veza cistein tiol grupa, antitelo može imati samo jednu ili nekoliko cistein tiol grupa, ili može imati samo jednu ili nekoliko dovoljno reaktivnih tiol grupa kroz koje se može vezati veznik. Generalno,

1

antitela ne sadrže mnogo slobodnih i reaktivnih cistein tiol grupa koje mogu biti povezane sa delom leka. Zapravo, većina cistein tiol ostataka u antitelima postoji u vidu disulfidnih mostova. Prekomerno vezivanje veznik-toksina za antitelo može destabilizovati antitelo smanjenjem ostataka cisteina koji su dostupni kako bi se formirali disulfidni mostovi. Prema tome, optimalan antitelo:lek odnos treba da poveća snagu ADC (povećanjem broja povezanih delova leka po antitelu) bez destabilizacije dela antitela. Kako je opisano ovde, optimalni odnos može biti oko 3-4.

[0193] Kako je opisano ovde, veznik vezan za deo antitela kroz Mal deo daje odnos od oko 3-4. Kako je opisano ovde, veznik vezan za deo antitela preko alternativnog dela (npr. OSu deo) može da pruži manje optimalan odnos (npr. niži odnos, kao što je oko 0-3). Kako je opisano ovde, veznik koji sadrži kratku odstojnu jedinicu (npr. kratku PEG odstojnu jedinicu kao što su (PEG)2ili (PEG)4, ili kratku alkilnu odstojnu jedinicu kao što je (CH2)5) pruža odnos od oko 3-4. Kako je opisano ovde, veznik koji sadrži dužu odstojnu jedinicu (npr. (PEG)8) može pružiti manje optimalan odnos (npr. niži odnos, kao što je oko 0-3). Kako je opisano ovde, veznik koji sadrži razdvojivi peptid pruža odnos od oko 3-4. Kako je opisano ovde, veznik koji sadrži alternativni razdvojivi deo (npr. razdvojivi disulfid ili razdvojivi sulfonamid) može pružiti manje optimalan odnos (npr. niži odnos, kao što je oko 0-3). Kako je opisano ovde, ADC koji sadrži Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB-eribulin pridružen antitelu kao što je anti-FRA antitelo (npr. MORAb-003) ima odnos od oko 3-4. Kako je opisano ovde, odnos od oko 3-4 se primećuje kod ADC koji sadrži Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB-eribulin pridružen drugom antitelu, kao što je anti-her2 antitelo (npr. trastuzumab). Kako je opisano ovde, optimalni odnos primećen kod ADC koji sadrže Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB-eribulin veznik-toksin nije zavisan od antitela.

[0194] Kako je opisano ovde, deo antitela je izložen redukcionim uslovima pre konjugacije kako bi se stvorio jedan ili više slobodnih ostataka cisteina. Antitelo, kako je ovde opisano, može se redukovati redukcionim agensom kao što su ditiotreitol (DTT) ili tris (2-karboksietil) fosfin (TCEP), pod delimičnim ili potpunim redukcionim uslovima, kako bi se stvorile reaktivne cistein tiol grupe. Neupareni cisteini mogu se generisati delimičnom redukcijom sa ograničenim molarnim ekvivalentima TCEP, što preferencijalno smanjuje međulančane disulfidne veze koje povezuju laki lanac i teški lanac (jedan par po H-L uparivanju) i dva teška lanca u zglobnom regionu (dva para po H-H uparivanju u slučaju ljudskog IgG1), dok intra-lančane disulfidne veze ostaju netaknute (Stefano et al. (2013) Methods Mol. Biol.

1

1045:145-71). Kako je opisano ovde, disulfidne veze unutar antitela se elektrohemijski redukuju, na primer, primenom radne elektrode koja primenjuje naizmenični redukcioni i oksidacioni napon. Ovaj pristup može omogućiti on-line uparivanje redukcije disulfidne veze sa analitičkim uređajem (npr. uređajem za elektrohemijsko detektovanje, NMR spektrometrom ili masenim spektrometrom) ili uređajem za hemijsko razdvajanje (npr. tečnim hromatografom (npr. HPLC)) ili uređajem za elektroforezu (pogledati npr. SAD publ. br. 20140069822))). Kako je opisano ovde, antitelo je podvrgnuto uslovima denaturacije kako bi se otkrile reaktivne nukleofilne grupe na aminokiselinskim ostacima, kao što su lizin ili cistein.

[0195] Opterećenje leka za ADC može se kontrolisati na različite načine, npr., na naredni način: (i) ograničavanjem molarnog viška lek-veznik intermedijera ili veznik reagensa u odnosu na antitelo; (ii) ograničavanje vremena reakcije konjugacije ili temperature; (iii) delimični ili ograničavajući reduktivni uslovi za modifikaciju cistein tiola; i/ili (iv) konstruisanje rekombinantnim tehnikama aminokiselinske sekvence antitela tako da se broj i položaj ostataka cisteina modifikuje za kontrolu broja i/ili položaja veznik-lek spojeva.

[0196] Kako je opisano ovde, ostaci slobodnog cisteina se uvode u aminokiselinsku sekvencu dela antitela. Na primer, mogu se pripremiti antitela konstruisana cisteinom u kojima se jedna ili više aminokiselina matičnog antitela zamenjuju cisteinskom aminokiselinom. Bilo koji oblik antitela može biti tako konstruisan, tj. mutiran. Na primer, matični Fab fragment antitela može biti konstruisan da formira Fab konstruisan cisteinom, koji se naziva „ThioFab“. Na sličan način, matično monoklonsko antitelo može biti konstruisano da formira „ThioMab“. Mutacija na jednom mestu daje jedan konstruisani ostatak cisteina u ThioFab, dok mutacija na jednom mestu daje dva konstruisana ostatka cisteina u ThioMab, zbog dimerne prirode IgG antitela. DNK koja kodira varijantu aminokiselinske sekvence matičnog polipeptida može se pripremiti različitim postupcima poznatim u struci (pogledati, na primer, postupke opisane u WO2006/034488). Ovi postupci uključuju, ali nisu ograničeni na, pripremu mutagenezom usmerenom na mesto (ili posredstvom oligonukleotida), PCR mutagenezom i kasetnom mutagenezom ranije pripremljene DNK koja kodira polipeptid. Varijante rekombinantnih antitela se takođe mogu konstruisati manipulacijom restrikcionim fragmentima ili preklapanjem produženog PCR sa sintetičkim oligonukleotidima. ADC Formule I uključuju, ali nisu ograničeni na, antitela koja imaju 1, 2, 3 ili 4 konstruisane cisteinske aminokiseline (Lyon et al. (2012) Methods Enzymol.502:123-38). Kako je

11

opisano ovde, jedan ili više slobodnih ostataka cisteina već su prisutni u delu antitela, bez upotrebe konstruisanja, u kom slučaju se postojeći ostaci slobodnog cisteina mogu koristiti za konjugaciju dela antitela sa delom leka.

[0197] Kako je opisano ovde, visoko opterećenje lekom (npr. p > 5) može prouzrokovati agregaciju, nerastvorljivost, toksičnost ili gubitak ćelijske propustljivosti određenih antitelolek konjugata. Veće opterećenje lekom takođe može negativno uticati na farmakokinetiku (npr. klirens) određenih ADC. Kako je opisano ovde, niže opterećenje lekom (npr. p <3) može smanjiti snagu određenih ADC protiv ćelija koje eksprimiranju cilj i/ili ćelija posmatrača. Kako je opisano ovde, opterećenje lekom za ADC predmetnog obelodanjenja kreće se od 1 do oko 8; od oko 2 do oko 6; od oko 2 do oko 5; od oko 3 do oko 5; ili od oko 3 do oko 4.

[0198] Tamo gde više od jedne nukleofilne grupe reaguje sa lek-veznik intermedijerom ili reagensom dela veznika, a zatim sa reagensom dela leka, u reakcionoj smeši koja sadrži višestruke kopije dela antitela i dela veznika, tada rezultujući proizvod može biti smeša ADC jedinjenja sa distribucijom jednog ili više delova leka prikačenih za svaku kopiju dela antitela u smeši. Kako je opisano ovde, opterećenje lekom u ADC smeši koje je rezultat reakcije konjugacije kreće se u rasponu od 1 do 20 dela leka vezanih po delu antitela. Prosečan broj dela leka po delu antitela (tj. prosečno opterećenje lekom ili prosečno p) mogu se izračunati bilo kojim konvencionalnim postupkom poznatim u struci, npr. masenom spektrometrijom (npr. LC-MS reverzne faze) i/ili tečnom hromatografijom visokih performansi (npr. HIC-HPLC). Kako je opisano ovde, prosečni broj dela leka po delu antitela određuje se hidrofobnom interakcionom hromatografijom-tečnom hromatografijom visokih performansi (HIC-HPLC). Kako je opisano ovde, prosečni broj dela leka po delu antitela određuje se tečnom hromatografijom reverzne faze-masenom spektrometrijom (LC-MS). Kako je opisano ovde, prosečan broj dela leka po delu antitela je od oko 3 do oko 4; od oko 3,1 do oko 3,9; od oko 3,2 do oko 3,8; od oko 3,2 do oko 3,7; od oko 3,2 do oko 3,6; od oko 3,3 do oko 3,8; ili od oko 3,3 do oko 3,7. Kako je opisano ovde, prosečan broj dela leka po delu antitela je od oko 3,2 do oko 3,8. Kako je opisano ovde, prosečan broj dela leka po delu antitela je oko 3,8. Kako je opisano ovde, prosečan broj dela leka po delu antitela je od 3 do 4; od 3,1 do 3,9; od 3,2 do 3,8; od 3,2 do 3,7; od 3,2 do 3,6; od 3,3 do 3,8; ili od 3.3 do 3.7. Kako je opisano ovde, prosečan broj dela leka po delu antitela je od 3,2 do 3,8. Kako je opisano ovde, prosečan broj dela leka po delu antitela je 3,8.

[0199] Kako je opisano ovde, prosečan broj dela leka po delu antitela je od oko 3,5 do oko 4,5; od oko 3,6 do oko 4,4; od oko 3,7 do oko 4,3; od oko 3,7 do oko 4,2; ili od oko 3,8 do oko 4,2. Kako je opisano ovde, prosečan broj dela leka po delu antitela je od oko 3,6 do oko 4,4. Kako je opisano ovde, prosečan broj dela leka po delu antitela je oko 4,0. Kako je opisano ovde, prosečan broj dela leka po delu antitela je od 3,5 do 4,5; od 3,6 do 4,4; od 3,7 do 4,3; od 3,7 do 4,2; ili od 3,8 do 4,2. Kako je opisano ovde, prosečan broj dela leka po delu antitela je od 3,6 do 4,4. Kako je opisano ovde, prosečan broj dela leka po delu antitela je 4,0.

[0200] Kako je opisano ovde, izraz „oko“, kako se koristi u odnosu na prosečan broj dela leka po delu antitela, znači /- 10%.

[0201] Pojedinačna ADC jedinjenja, ili „vrste“, mogu se identifikovati u smeši masenom spektroskopijom i razdvojiti pomoću UPLC ili HPLC, npr. hidrofobnom interakcionom hromatografijom (HIC-HPLC). Kako je opisano ovde, homogeni ili skoro homogeni ADC sa jednom vrednošću opterećenja može se izolovati iz smeše konjugacije, na primer, elektroforezom ili hromatografijom.

[0202] Kako je opisano ovde, opterećenje lekom i/ili prosečno opterećenje lekom od oko 4 pruža korisna svojstva. Kako je opisano ovde, opterećenje lekom i/ili prosečno opterećenje lekom manje od oko 4 može rezultovati neprihvatljivo visokim nivoom nekonjugovanih vrsta antitela, koje se mogu nadmetati sa ADC za vezivanje za ciljani antigen i/ili pružiti smanjenu efikasnost tretmana. Kako je opisano ovde, opterećenje lekom i/ili prosečno opterećenje lekom više od oko 4 može rezultovati neprihvatljivo visokim nivoom heterogenosti proizvoda i/ili agregacije ADC. Opterećenje lekom i/ili prosečno opterećenje lekom više od oko 4 takođe može uticati na stabilnost ADC, usled gubitka jedne ili više hemijskih veza potrebnih za stabilizaciju dela antitela.

[0203] Kako je opisano ovde, ADC ima Formulu I:

Ab-(L-D)p(I)

gde:

(i) Ab je internalizujuće antitelo protiv folatnog receptora alfa ili njegov fragment koji vezuje antigen koji obuhvata varijabilni region teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:23, i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:24;

(ii) D je eribulin;

(iii) L je razdvojivi veznik koji obuhvata Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB; i

(iv) p je ceo broj od 3 do 4.

[0204] Kako je opisano ovde, ADC ima Formulu I:

Ab-(L-D)p(I)

gde:

(i) Ab je internalizujuće anti-ljudski receptor epidermalnog faktora rasta 2 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji obuhvata varijabilni region teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:27, i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:28;

(ii) D je eribulin;

(iii) L je razdvojivi veznik koji obuhvata Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB; i

(iv) p je ceo broj od 3 do 4.

[0205] Kako je opisano ovde, p je 4.

[0206] Predmetno obelodanjenje uključuje postupke za proizvodnju opisanih ADC. Ukratko, ADC sadrže antitelo ili fragment koji vezuje antigen kao deo antitela, deo leka i veznik koji spaja deo leka i deo antitela. Kako je opisano ovde, ADC se mogu pripremiti upotrebom veznika koji ima reaktivne funkcionalnosti za kovalentno vezivanje za deo leka i deo antitela. Na primer, kako je ovde opisano, cistein tiol dela antitela može da formira vezu sa reaktivnom funkcionalnom grupom veznika ili veznik-lek intermedijeraa (npr. maleimidni deo) kako bi se stvorio ADC. Generisanje ADC može se postići bilo kojom tehnikom poznatom stručnjaku.

[0207] Kako je opisano ovde, ADC se proizvodi dodirom dela antitela sa veznikom i dela leka na sekvencijalni način, tako da je deo antitela prvo kovalentno vezan za veznik, a zatim prethodno formirani antitelo-veznik intermedijer reaguje sa delom leka. Antitelo-veznik intermedijer može ali ne mora biti podvrgnut koraku prečišćavanja pre nego što se dovede u dodir sa delom leka. Kako je opisano ovde, ADC se proizvodi dodirom dela antitela sa veznik

11

leka jedinjenjem prethodno formiranim reakcijom veznika sa delom leka. Prethodno formirano veznik-lek jedinjenje može ali ne mora biti podvrgnuto koraku prečišćavanja pre nego što se dovede u dodir sa delom antitela. Kako je opisano ovde, deo antitela dovodi u dodir veznik sa delom leka u jednoj reakcionoj smeši, omogućavajući istovremeno stvaranje kovalentnih veza između dela antitela i veznika, i između veznika i dela leka. Ovaj postupak za dobijanje ADC može da uključuje reakciju, gde se deo antitela dovodi u dodir sa delom antitela pre dodavanja veznika u reakcionu smešu, i obrnuto. Kako je opisano ovde, ADC se proizvodi reakcijom dela antitela sa veznikom povezanim sa delom leka, kao što je Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB-eribulin, pod uslovima koji omogućavaju konjugaciju.

[0208] ADC pripremljeni prema gore opisanim postupcima mogu se podvrgnuti koraku prečišćavanja. Korak prečišćavanja može uključivati bilo koje biohemijske postupke poznate u struci za prečišćavanje proteina ili bilo koju njihovu kombinaciju. To uključuje, ali se ne ograničava na, tangencijalnu protočnu filtraciju (TFF), afinitetnu hromatografiju, jonoizmenjivačku hromatografiju, bilo koju naelektrisanu ili izoelektričnu hromatografiju na bazi tačke, mešovitu hromatografiju, npr. CHT (keramički hidroksiapatit), hidrofobnu interakcionu hromatografiju, hromatografija isključenja veličine, dijalizu, filtraciju, selektivno taloženje ili bilo koju njihovu kombinaciju.

Terapeutska upotreba i sastavi

[0209] Ovde su obelodanjeni postupci korišćenja obelodanjenih ADC u tretmanu pacijenta od poremećaja, npr. onkološkog poremećaja. ADC se mogu primenjivati sami ili u kombinaciji sa drugim terapijskim agensom i mogu se primenjivati u bilo kojoj farmaceutski prihvatljivoj formulaciji, doziranju i režimu doziranja. Efikasnost ADC tretmana može se proceniti na toksičnost, kao i indikatore efikasnosti i prilagoditi u skladu s tim. Mere efikasnosti uključuju, ali nisu ograničene na, primećeni citostatčki i/ili citotoksični efekat in vitro ili in vivo, smanjenu zapreminu tumora, inhibiciju rasta tumora i/ili produženo preživljavanje.

[0210] Poznati su postupci određivanja da li ADC vrši citostatički i/ili citotoksični efekat na ćeliju. Na primer, citotoksična ili citostatička aktivnost ADC može se meriti: izlaganjem ćelija sisara koji eksprimiraju ciljani protein ADC u medijumu ćelijske kulture; kultivisanje ćelija u periodu od oko 6 sati do oko 5 dana; i merenje održivosti ćelija. In vitro testovi na bazi ćelijama se takođe mogu koristiti za merenje održivosti (proliferacije), citotoksičnosti i indukcije apoptoze (aktivacija kaspaze) za ADC.

[0211] Kako bi se utvrdilo da li antitelo-lek konjugat vrši citostatčki efekat, može se koristiti test ugradnje timidina. Na primer, ćelije raka koje eksprimiraju ciljani antigen sa gustinom od 5.000 ćelija/komorica ploče sa 96 komorica mogu se kultivisati tokom 72 sata i biti izložene 0,5 µCi<3>H-timidina tokom poslednjih 8 sati perioda od 72 sata. Uključivanje<3>H-timidina u ćelijama kulture meri se u prisustvu i odsustvu ADC.

[0212] Za određivanje citotoksičnosti mogu se meriti nekroza ili apoptoza (programirana ćelijska smrt). Nekrozu tipično prati povećana propustljivost plazmatske membrane; bubrenje ćelije i pucanje plazmatske membrane. Apoptozu tipično karakterišu blebing membrane, kondenzacija citoplazme i aktiviranje endogenih endonukleaza. Utvrđivanje bilo kog od ovih efekata na ćelijama raka ukazuje na to da je ADC koristan u tretmanu raka.

[0213] Održivost ćelija može se meriti, npr. određivanjem u ćeliji unosa boje kao što su neutralna crvena, tripan plava, Crystal Violet ili ALAMAR™ plava (pogledati, npr. Page et al. (1993) Intl. J. Oncology 3:473-6). U takvom testu, ćelije se inkubiraju u medijumu koji sadrži boju, ćelije se isperu, i preostala boja, koja odražava ćelijski unos boje, meri se spektrofotometrijski. Kako je opisano ovde, in vitro potencija pripremljenih ADC procenjuje se pomoću Crystal Violet testa. Crystal Violet je triarilmetanska boja koja se akumulira u jedru održivih ćelija. U ovom testu, ćelije su izložene ADC ili kontrolnim agensima tokom određenog vremenskog perioda, nakon čega se ćelije boje sa Crystal Violet, obilno ispiraju vodom, a zatim se rastvaraju sa 1% SDS i očitavaju spektrofotometrijski. Sulforhodamin B boja koja vezuje protein (SRB) takođe se može koristiti za merenje citotoksičnosti (Skehan et al. (1990) J. Natl. Cancer Inst.82:1107-12).

[0214] Apoptoza se može kvantifikovati, na primer, merenjem fragmentacije DNK. Dostupni su komercijalni fotometrijski postupci za kvantitativno in vitro određivanje fragmentacije DNK. Primeri takvih testova, uključujući TUNEL (koji detektuje ugradnju označenih nukleotida u fragmentiranu DNK) i testove zasnovane na ELISA, opisani su u Biochemica (1999) No.2, pp.34-37 (Roche Molecular Biochemicals).

[0215] Apoptoza se takođe može utvrditi merenjem morfoloških promena u ćeliji. Na primer, kao i kod nekroze, gubitak integriteta plazmatske membrane može se odrediti merenjem uzimanja određenih boja (npr. fluorescentne boje kao što je, na primer, akridin narandža ili etidijum bromid). Postupak za merenje broja apoptotičnih ćelija opisan je kod Duke i Cohen,

11

Current Protocols in Immunology (Coligan et al., eds. (1992) pp.3.17.1-3.17.16). Ćelije takođe mogu biti označene DNK bojom (npr. akridin narandžasta, etidijum bromid ili propidijum jodid) i ćelijama za koje se primećuje kondenzacija i marginacija hromatina duž unutrašnje membrane jedra. Druge morfološke promene koje se mogu izmeriti za određivanje apoptoze uključuju, npr., citoplazmatsku kondenzaciju, pojačan blebing membrane i ćelijsko skupljanje.

[0216] Obelodanjeni ADC se takođe mogu proceniti na osnovu aktivnosti ubijanja posmatrača. Aktivnost ubijanja posmatrača može se odrediti, npr. testom koji koristi dve ćelijske linije, jednu pozitivnu za ciljani antigen i jednu negativnu za ciljani antigen. Ćelijske linije su poželjno označene kako bi se razlikovale. Na primer, IGROV1 ćelije (FRA+) označene sa Nuclight™ Green (NLG) i HL-60 (FRA-) označene sa Nuclight™ Red (NLR) mogu se zajednički kultivisati, tretirati sa anti-FRA ADC praćeno posmatranjem citotoksičnosti. Ubijanje ciljanih antigen negativnih ćelija kada se pomešaju sa ciljanim antigen pozitivnim ćelijama ukazuje na ubijanje posmatrača, dok ubijanje ciljanih antigen negativnih ćelija u odsustvu ciljanih antigen pozitivnih ćelija ukazuje na ubijanje van cilja.

[0217] U nekim aspektima, predmetno obelodanjenje sadrži postupak ubijanja, inhibiranja ili modulacije rasta ili ometanja metabolizma ćelije ili tkiva raka ometanjem tubulina. Postupak se može koristiti sa bilo kojim pacijentom kod kog ometanje tubulina pruža terapeutsku korist. Pacijenti koji mogu imati koristi od ometanja tubulina uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji imaju ili su pod rizikom da razviju rak želuca, rak jajnika (npr. serozni rak jajnika), rak pluća (npr. rak ne-malih ćelija pluća), rak dojke (npr. trostruko negativni rak dojke), rak endometrijuma (npr. serozni rak endometrijuma), osteosarkom, Kaposijev sarkom, rak germ ćelija testisa, leukemija, limfom (npr. Hodžkinova bolest, ne-Hodžkinov limfom), mijelom, rak glave i vrata, rak jednjaka, rak pankreasa, rak prostate, rak mozga (npr. glioblastom), rak štitne žlezde, rak debelog creva i/ili rak kože (npr. melanom) ili bilo koje njegove metastaze (Dumontet and Jordan (2010) Nat. Rev. Drug Discov.9:790-803). Kako je opisano ovde, obelodanjeni ADC se mogu primeniti u bilo kojoj ćeliji ili tkivu koji eksprimiraju FRA, kao što su ćelija ili tkivo raka koji eksprimiraju FRA. Primerno obelodanjenje uključuje postupak inhibicije ćelijske signalizacije posredovane sa FRA ili postupak ubijanja ćelije. Postupak se može koristiti sa bilo kojom ćelijom ili tkivom koji eksprimiraju FRA, poput ćelije raka ili metastatske lezije. Neograničavajući primeri rakova koji eksprimiranju FRA uključuju rak želuca, serozni rak jajnika, bistroćelijski rak jajnika,

11

rak ne-malih ćelija pluća, kolorektalni rak, trostruko negativni rak dojke, rak endometrijuma, serozni rak endometrijuma, karcinoid pluća i osteosarkom. Neograničavajući primeri ćelija koje eksprimiraju FRA uključuju IGROV1 i OVCAR3 ćelije ljudskog raka jajnika, NCI-H2110 ćelije ljudskog raka ne-malih ćelija pluća i ćelije koje sadrže rekombinantnu nukleinsku kiselinu koja kodira FRA ili njen deo.

[0218] Kako je opisano ovde, obelodanjeni ADC se mogu primeniti u bilo kojoj ćeliji ili tkivu koji eksprimiraju her2, kao što je ćelija ili tkivo raka koji eksprimiraju her2. Primerno obelodanjenje obuhvata postupak inhibiranja signalizacije ćelija posredovane sa her2 ili postupak ubijanja ćelije. Postupak se može koristiti sa bilo kojom ćelijom ili tkivom koji eksprimiraju her2, kao što je ćelija raka ili metastatska lezija. Neograničavajući primeri rakova koji eksprimiraju her2 uključuju rak dojke, rak želuca, rak bešike, rak urotelijalnih ćelija, rak jednjaka, rak pluća, rak grlića materice, rak endometrijuma i rak jajnika (English et al. (2013) Mol. Diagn. Ther.17:85-99). Neograničavajući primeri ćelija koje eksprimiraju her2 uključuju NCI-N87-luc ćelije ljudskog raka želuca, ZR75 i BT-474 duktalne ćelije ljudskog raka dojke i ćelije koje sadrže rekombinantnu nukleinsku kiselinu koja kodira her2 ili njegov deo.

[0219] Kako je opisano ovde, obelodanjeni ADC se mogu primeniti u bilo kojoj ćeliji ili tkivu koji eksprimiraju mezotelin (MSLN), kao što su ćelija ili tkivo raka koji eksprimira MSLN. Primerno obelodanjenje uključuje postupak inhibiranja MSLN-posredovane ćelijske signalizacije ili postupak ubijanja ćelije. Postupak se može koristiti sa bilo kojom ćelijom ili tkivom koji eksprimiraju MSLN, kao što je ćelija raka ili metastatska lezija.

Neograničavajući primeri rakova koji eksprimiranju MSLN uključuju mezoteliom, rak pankreasa (npr. adenokarcinom pankreasa), rak jajnika i rak pluća (npr. adenokarcinom pluća) (Wang et al. (2012) PLoS ONE 7:e33214). Neograničavajući primeri ćelija koje eksprimiraju MSLN uključuju OVCAR3 ćelije ljudskog raka jajnika, HEC-251 ćelije ljudskog endometroida, H226 ćelije ljudske skvamozne ćelije pluća ćelije mezotelioma i ćelije koje sadrže rekombinantnu nukleinsku kiselinu koja kodira MSLN ili njegov deo.

[0220] Primerni postupci uključuju korake dovođenja u dodir ćelije sa ADC, kako je ovde opisano, u efikasnoj količini, tj. dovoljnoj količini da ubije ćeliju. Postupak se može koristiti na ćelijama u kulturi, npr. in vitro, in vivo, ex vivo, ili in situ. Na primer, ćelije koje eksprimiraju FRA, her2 i/ili MSLN (npr. ćelije prikupljene biopsijom tumora ili metastatske

11

lezije; ćelije sa utvrđene ćelijske linije raka ili rekombinantne ćelije), mogu da se gaje in vitro u medijumu za kulturu i korak dovođenja u dodir može se izvršiti dodavanjem ADC u medijum za kulturu. Postupak će rezultovati ubijanjem ćelija koje eksprimiraju FRA, her2 i/ili MSLN, uključujući naročito ćelije tumora koje eksprimiraju FRA, her2 i/ili MSLN. Alternativno, ADC se može primenjivati pacijentu bilo kojim pogodnim načinom primene (npr. intravenski, potkožni ili direktan dodir sa tumorskim tkivom) kako bi imao in vivo efekat.

[0221] In vivo efekat obelodanjenog ADC terapeutskog sastava može se proceniti na pogodnom životinjskom modelu. Na primer, mogu se koristiti ksenogeni modeli raka, gde se eksplantati raka ili prevučena tkiva ksenografta uvode u imunološki ugrožene životinje, kao što su goli ili SCID miševi (Klein et al. (1997) Nature Med.3:402-8). Efikasnost se može predvideti pomoću testova koji mere inhibiciju formiranja tumora, regresiju tumora ili metastaze i slično.

[0222] In vivo mogu se koristiti i testovi koji procenjuju promociju apoptoze. Kako je opisano ovde, ksenografti miševa koji nose tumore tretirani terapeutskom sastavom mogu se ispitati za prisustvo apoptotičnih žarišta i uporediti sa netretiranim kontrolnim miševima koji nose ksenografte. Obim u kom se apoptotična žarišta pronađu u tumorima tretiranih miševa daje indikaciju terapijske efikasnosti smeše.

[0223] Ovde su dalje opisani postupci za tretman raka. Ovde obelodanjeni ADC mogu se primeniti sisaru koji nije čovek ili ljudskom pacijentu u terapeutske svrhe. terapeutski postupci podrazumevaju primenu sisarima koji imaju tumor biološki efikasne količine ADC koja sadrži izabrani hemoterapijski agens (npr. eribulin) povezan sa ciljanim antitelom koje se vezuje za eksprimirani antigen, koji je dostupan za vezivanje ili je lokalizovan na površini ćelije raka. Primerno obelodanjenje je postupak isporuke hemoterapijskog agensa u ćeliju koja eksprimira FRA, koji uključuje konjugaciju hemoterapijskog agensa sa antitelom koje se imunospecifično vezuje za FRA epitop i izlaganje ćelije ADC. Primeri tumorskih ćelija koje eksprimiraju FRA za koje su indikovani ADC predmetnog obelodanjenja uključuju ćelije raka želuca, seroznog raka jajnika, raka ne-malih ćelija pluća, kolorektalnog raka, raka dojke (npr. trostruko negativni rak dojke), karcinoida pluća, osteosarkoma, raka endometrijuma i raka endometrijuma sa seroznom histologijom.

11

[0224] Naredno primerno obelodanjenje je postupak isporuke hemoterapijskog agensa u ćeliju koja eksprimira her2, koji uključuje konjugaciju hemoterapijskog agensa sa antitelom koje se imunospecifično vezuje za her2 epitop i izlaganje ćelije ADC. Primeri tumorskih ćelija koje eksprimiraju her2 za koje su indikovani ADC predmetnog obelodanjenja uključuju ćelije raka dojke, raka želuca, raka bešike, raka urotelijalnih ćelija, raka jednjaka, raka pluća, raka grlića materice, raka endometrijuma i raka jajnika.

[0225] Naredno primerno obelodanjenje je postupak isporuke hemoterapijskog agensa u ćeliju koja eksprimira MSLN, koji uključuje konjugaciju hemoterapijskog agensa sa antitelom koje se imunospecifično vezuje za MSLN epitop i izlaganje ćelije ADC. Primeri tumorskih ćelija koje eksprimiraju MSLN za koje su indikovani ADC predmetnog obelodanjenja uključuju ćelije iz mezotelioma, raka pankreasa (npr. adenokarcinom pankreasa), raka jajnika i raka pluća (npr. adenokarcinom pluća).

[0226] Naredno primerno obelodanjenje je postupak tretmana pacijenta koji ima ili je pod rizikom da razvije rak koji eksprimira ciljani antigen za deo antitela od ADC, kao što su FRA, her2 ili MSLN, koji uključuje primenu pacijentu terapeutski efikasne količine ADC predmetnog obelodanjenja. Kako je opisano ovde, pacijent ne reaguje ili slabo reaguje na tretman anti-FRA antitelom kada se primenjuje samostalno, i/ili na tretman delom leka (npr. eribulin) kada se primenjuje samostalno. Kako je opisano ovde, pacijent ne reaguje ili slabo reaguje na tretman anti-her2 antitelom kada se primenjuje samostalno, i/ili tretman delom leka (npr. eribulin) kada se primenjuje samostalno. Kako je opisano ovde, pacijent ne reaguje ili slabo reaguje na tretman anti-MSLN antitelom kada se primenjuje samostalno, i/ili tretman delom leka (npr. eribulin) kada se primenjuje samostalno. Kako je opisano ovde, pacijent je netolerantan na tretman delom leka (npr. eribulin) kada se primenjuje samostalno. Na primer, pacijentu mogu biti potrebne doze eribulina za tretman raka koje dovode do sistemske toksičnosti, i koje se prevazilaze ciljanom isporukom raku koji eksprimira ciljani antigen dela antitela od ADC kao što su FRA, her2 ili MSLN, čime se smanjenje ubijanje van cilja.

[0227] Naredno primerno obelodanjenje je postupak smanjenja ili inhibiranja rasta ciljanog tumora koji eksprimira antigen (npr. tumor koji eksprimira FRA, tumor koji eksprimira her2 ili tumor koji eksprimira MSLN), koji uključuje primenu terapeutski efikasne količine ADC. Kako je opisano ovde, tretman je dovoljan da smanji ili inhibira rast tumora pacijenta, smanji broj ili veličinu metastatskih lezija, smanji opterećenje tumora, smanji primarno opterećenje

11

tumora, smanji invazivnost, produži vreme preživljavanja i/ili održi ili poboljša kvalitet života. Kako je opisano ovde, tumor je otporan ili refraktoran na tretman anti-FRA antitelom kada se primenjuje samostalno i/ili na tretman delom leka (npr. eribulin) kada se primenjuje samostalno. Kako je opisano ovde, tumor je otporan ili refraktoran na tretman anti-her2 antitelom kada se primenjuje samostalno, i/ili na tretman delom leka (npr. eribulin) kada se primenjuje samostalno. Kako je opisano ovde, tumor je otporan ili refraktoran na tretman anti-MSLN antitelom kada se primenjuje samostalno, i/ili na tretman delom leka (npr. eribulin) kada se primenjuje samostalno.

[0228] Štaviše, antitela predmetnog obelodanjenja mogu se primeniti kod sisara koji nisu ljudi koji eksprimiraju antigen sa kojim je ADC sposoban da se vezuje u vetarinarske svrhe ili kao životinjski model ljudske bolesti. Što se tiče drugog, takvi životinjski modeli mogu biti korisni za procenu terapijske efikasnosti obelodanjenih ADC (npr. ispitivanje doza i vremenskih tokova primene).

[0229] Ovde su dalje opisane terapeutske upotrebe obelodanjenih ADC. Primerno obelodanjenje je upotreba ADC u tretmanu raka koji eksprimira ciljani antigen (npr. rak koji eksprimira FRA, rak koji eksprimira her2 ili rak koji eksprimira MSLN). Takođe su obelodanjeni ADC za upotrebu u tretmanu raka koji eksprimira ciljani antigen (npr. rak koji eksprimira FRA, rak koji eksprimira her2 ili rak koji eksprimira MSLN). Postupci za identifikovanje pacijenata koji imaju rak koji eksprimira FRA, her2 i/ili MSLN poznati su u struci i mogu se koristiti za identifikovanje pogodnih pacijenata za tretman obelodanjenim ADC.

[0230] Naredno primerno obelodanjenje je upotreba ADC u postupku proizvodnje leka za tretman raka koji eksprimira ciljani antigen (npr. rak koji eksprimira FRA, rak koji eksprimira her2 ili rak koji eksprimira MSLN).

[0231] Terapeutski sastavi korišćeni u praksi prethodnih postupaka mogu se formulisati u farmaceutske sastave koji sadrže farmaceutski prihvatljiv nosač pogodan za željeni postupak isporuke. Primerno obelodanjenje je farmaceutski sastav koji sadrži ADC predmetnog obelodanjenja i farmaceutski prihvatljiv nosač. Pogodni nosači uključuju bilo koji materijal koji, kada se kombinuje sa terapeutskom sastavom, zadržava anti-tumorsku funkciju terapeutskog sastava i generalno ne reaguje na imuni sistem pacijenta. Farmaceutski

12

prihvatljivi nosači uključuju bilo koji rastvarač, disperzioni medijum, obloge, antibakterijske i antifungalne agensa, izotonične agense i agense za usporavanje apsorpcije i slično koji su fiziološki kompatibilni. Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača uključuju jedan ili više od vode, fiziološkog rastvora, fiziološkog rastvora u puferu sa fosfatom, dekstroze, glicerola, etanola, mezilatne soli i slično, kao i njihove kombinacije. U mnogim slučajevima bi bilo poželjno da se u sastav uključe izotonični agensi, na primer, šećeri, polialkoholi poput manitola, sorbitola ili natrijum hlorida. Farmaceutski prihvatljivi nosači mogu dalje sadržati manje količine pomoćnih supstanci kao što su agensi za vlaženje ili emulgovanje, konzervansi ili puferi, koji povećavaju rok trajanja ili efikasnost ADC.

[0232] Terapeutske formulacije mogu se rastvoriti i primeniti na bilo koji način koji može da isporuči terapeutski sastav na mesto tumora. Potencijalno efikasni putevi primene uključuju, ali nisu ograničeni na, intravenski, parenteralni, intraperitonealni, intramuskularni, intratumorski, intradermalni, intraorganski, ortotopični i slično. Terapeutski proteinski preparati mogu se liofilizovati i čuvati kao sterilni prah, poželjno pod vakuumom, i zatim rekonstituisati u bakteriostatskoj vodi (koja sadrži, na primer, benzil alkohol konzervans) ili u sterilnoj vodi pre injekcije. Terapeutske formulacije mogu sadržati ADC ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, na primer, mezilatnu so.

[0233] Ovde obelodanjeni ADC mogu se primeniti u dozi u rasponu od oko 0,2 mg/kg do oko 10 mg/kg pacijentu koji ima potrebu za tim. Kako je opisano ovde, ADC se primenjuje pacijentu svakodnevno, dvomesečno ili bilo koji vremenski period između. Doze i protokoli primene za tretman raka korišćenjem gore navedenih postupaka variraće u zavisnosti od postupke i ciljanog raka, i generalno će zavisiti od niza drugih faktora koji su poznati u struci.

[0234] Poznati su različiti sistemi isporuke koji se mogu koristiti za primenu jednog ili više ADC predmetnog obelodanjenja. Postupci primene ADC uključuju, ali nisu ograničeni na, parenteralnu primenu (npr. intradermalnu, intramuskularnu, intraperitonealnu, intravensku i potkožnu), epiduralnu primenu, intratumoralnu primenu i primenu putem sluzokože (npr. intranazalni i oralni put). Pored toga, plućna primena se može izvesti, na primer, upotrebom inhalatora ili nebulizatora i formulacije sa aerosolizujućim agensom. Pogledati npr. sastave i postupke za plućnu primenu opisane u SAD patentima br.6,019,968, 5,985,320, 5,985,309, 5,934,272, 5,874,064, 5,855,913, 5,290,540, i 4,880,078; i PCT publ. br. WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346, i WO 99/66903. ADC se mogu primeniti na bilo koji pogodan način, na primer, infuzijom ili bolus injekcijom, ili apsorpcijom kroz epitelne ili mukokutane obloge (npr. oralna sluzokoža, rektalna i crevna sluzokoža, itd.). Primena može biti sistemska ili lokalna.

[0235] Ovde obelodanjeni terapeutski sastavi mogu biti sterilni i stabilni pod uslovima proizvodnje i skladištenja. Kako je opisano ovde, jedan ili više ADC ili farmaceutskih sastava isporučuju se u obliku suvog sterilisanog liofilizovanog praha ili koncentrata bez vode u hermetički zatvorenom kontejneru i mogu se rekonstituisati (npr. vodom ili fiziološkim rastvorom) u odgovarajuću koncentraciju za primenu pacijentu. Poželjno je da se jedan ili više profilaktičkih ili terapijskih agenasa ili farmaceutskih sastava isporučuje u obliku suvog sterilnog liofilizovanog praha u hermetički zatvorenom kontejneru u jediničnoj dozi od najmanje 5 mg, najmanje 10 mg, najmanje 15 mg, najmanje 25 mg, najmanje 35 mg, najmanje 45 mg, najmanje 50 mg, najmanje 75 mg ili najmanje 100 mg, ili u bilo kojoj količini između. Kako je opisano ovde, liofilizovani ADC ili farmaceutski sastavi se čuvaju na temperaturi između 2°C i 8°C u originalnom kontejneru. Kako je opisano ovde, jedan ili više ADC ili ovde opisanih farmaceutskih sastava isporučuju se u tečnom obliku u hermetički zatvorenom kontejneru, npr. U kontejneru koji označava količinu i koncentraciju agensa. Kako je opisano ovde, tečni oblik primenjenog sastava se isporučuje u hermetički zatvorenom kontejneru od najmanje 0,25 mg/ml, najmanje 0,5 mg/ml, najmanje 1 mg/ml, najmanje 2,5 mg/ml, najmanje 5 mg/ml, najmanje 8 mg/ml, najmanje 10 mg/ml, najmanje 15 mg/ml, najmanje 25 mg/ml, najmanje 50 mg/ml, najmanje 75 mg/ml ili najmanje 100 mg/mL ADC. Tečni oblik se može čuvati na temperaturi između 2°C i 8°C u originalnom kontejneru.

[0236] Kako je opisano ovde, obelodanjeni ADC se mogu ugraditi u farmaceutsku sastav pogodan za parenteralnu primenu. Rastvor za injekcije može se sastojati od tečnog ili liofilizovanog oblika doziranja u bočici od kremena ili ćilibara, ampuli ili napunjenom špricu ili u drugom poznatom uređaju za isporuku ili skladištenje.

[0237] Ovde opisani sastavi mogu biti u različitim oblicima. Tu spadaju, na primer, tečni, polučvrsti i čvrsti oblici doziranja, kao što su tečni rastvori (npr. rastvori za injekcije i infuzije), disperzije ili suspenzije, tablete, pilule, praškovi, lipozomi i supozitorijumi. Poželjni oblik zavisi od predviđenog načina primene i terapeutske upotrebe.

[0238] Kako je opisano ovde, tretman uključuje jednokratni bolus ili ponovljenu primenu ADC preparata prihvatljivim putem primene.

[0239] Pacijenti se mogu proceniti na nivoe ciljanog antigena u datom uzorku (npr. nivoi ćelija koje eksprimiraju ciljani antigen) kako bi se pomoglo u određivanju najefikasnijeg režima doziranja, itd. Primerno obelodanjenje je postupak utvrđivanja da li će pacijent reagovati na tretman ADC predmetnog obelodanjenja, i obuhvata pružanje biološkog uzorka od pacijenta i dovođenje u dodir biološkog uzorka sa ADC. Primeri bioloških uzoraka uključuju tkivo ili telesnu tečnost, kao što su inflamatorni eksudat, krv, serum, crevna tečnost, uzorak stolice ili biopsija tumora (npr. biopsija tumora izvedena od pacijenta koji ima ili je pod rizikom da razvije rak koji eksprimira ciljani antigen, npr. rak koji eksprimira FRA, rak koji eksprimira her2 ili rak koji eksprimira MSLN). Kako je opisano ovde, uzorak (npr. tkivo i/ili telesna tečnost) može se dobiti od pacijenta, i pogodan imunološki postupak može se koristiti za detektovanje i/ili merenje eksprimiranja proteina ciljanog antigena (npr. FRA, her2, ili MSLN). Takve procene se takođe koriste u svrhu praćenja tokom čitave terapije i korisne su za procenu terapijskog uspeha u kombinaciji sa procenom drugih parametara.

[0240] Kako je opisano ovde, efikasnost ADC može se proceniti dovođenje u dodirm uzorka tumora od osobe sa ADC i procenom brzine ili zapremine rasta tumora. Kako je opisano ovde, kada se utvrdi da je ADC efikasan, on se može primeniti pacijentu.

[0241] Gore navedeni terapijski pristupi mogu se kombinovati sa bilo kojim od širokog spektra dodatnih hirurških, hemoterapijskih ili radioterapijskih režima.

[0242] Ovde su takođe obelodanjene upotrebe jednog ili više obelodanjenih ADC u proizvodnji leka za tretman raka, npr. prema gore opisanim postupcima. Kako je opisano ovde, ovde obelodanjeni ADC se koriste za tretman raka, na primer, prema gore opisanim postupcima.

[0243] Kako je opisano ovde, ovde opisani kompleti za upotrebu u laboratorijskim i terapijskim primenama su u okviru predmetnog obelodanjenja. Takvi kompleti mogu sadržati nosač, pakovanje ili kontejner koji je pregrađen da primi jedan ili više kontejnera, kao što su bočice, epruvete i slično, gde svaki od kontejnera koji sadrži jedan od zasebnih elemenata koji će se koristiti u ovde obelodanjenom postupku, zajedno sa oznakom ili umetkom koji sadrže uputstva za upotrebu, kao što je ovde opisana upotreba. Kompleti mogu sadržati

12

kontejner koji sadrži deo leka. Predmetno obelodanjenje takođe opisuje jedan ili više ADC ili njihove farmaceutske sastave, upakovane u hermetički zatvoren kontejneru, kao što su ampula ili vrećica, naznačujući količinu agensa.

[0244] Kompleti mogu sadržati gore opisani kontejner i jedan ili više povezanih kontejnera koji sa njima sadrže materijale poželjne sa komercijalne i korisničke tačke gledišta, uključujući pufere, razređivače, filtere, igle, špriceve; oznake na nosaču, pakovanju, kontejneru, bočici i/ili cevi sa spiskom sadržaja i/ili uputstava za upotrebu i umetke u paketu sa uputstvima za upotrebu.

[0245] Oznaka može biti prisutna na ili sa posudom kako bi se naznačilo da se sastav koristi za određenu terapiju ili ne-terapeutsku primenu, kao što je prognostička, profilaktička, dijagnostička ili laboratorijska primena. Oznaka takođe može označavati uputstva za bilo koju od in vivo ili in vitro upotrebe, kao što je ovde opisano. Uputstva i/ili druge informacije takođe mogu biti uključene u umetak ili oznaku, koji se nalaze u kompletu ili na njemu. Nalepnica može biti na kontejneru ili povezana sa njim. Oznaka može biti na kontejneru kada su slova, brojevi ili drugi znaci koji čine oznaku oblikovani ili urezani u sam kontejner.

Oznaka može biti povezana sa kontejnerom kada je prisutna u posudi ili nosaču koji takođe drži kontejner, na primer, kao umetak u paketu. Oznaka može ukazivati na to da se sastav koristi za dijagnozu ili tretman stanja, kao što je ovde opisani rak.

PRIMER 1

1. Materijali i postupci

[0246] MORAb-003 koji se koristi za pripremu ADC je iz serije #AA0312.

1.1 Citotoksini

[0247] Strukture citotoksina koji se mogu konjugovati prikazane su u Tabeli 11.

Tabela 11. Citotoksini koji se mogu konjugovati

12

12

12

1.2 Antitelo-lek konjugacija

1.2.1 Delimična redukcija koristeći TCEP

[0248] Uslovi delimične redukcije za MORAb-003 uspostavljeni su varijabilnom koncentracijom ne-tiol-redukcionog agensa tris(2-karboksietil)fosfina (TCEP), koncentracijom antitela i vremenom redukcije. MORAb-003 je zamenjen puferom u Dulbekovom fiziološkom rastvoru puferisanom fosfatom (DPBS) koji sadrži 1 mM etilendiamintetrasirćetne kiseline (EDTA), zatim koncentrovan na 10 mg/mL upotrebom centrifugalne koncentracije sa centrifugalnim filterima odsečene molekulske težine 10 kD (MWCO). Antitela su razblažena do odgovarajuće koncentracije i dodat je TCEP u naznačenoj krajnjoj koncentraciji i lagano mešan tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. TCEP je uklonjen desaltizacijom korišćenjem 5 ili 10 ml Zeba™ kolona za desaltizaciju sa DPBS/1 mM EDTA kao puferom (Thermo Fisher, 40 kD MWCO), prema protokolu proizvođača. Uzorci su analizirani za sadržaj slobodnog tiola korišćenjem Thiol fluorometrijskog kvantifikacionog kompleta (Abeam), prema protokolu proizvođača. SDS-PAGE analiza pod redukcionim uslovima izvedena je kako bi se utvrdili obim i mesto prekida disulfidne veze, kao što je opisano u odeljku 1.3.3. U nekim slučajevima, desalinizovani MAb su dovedeni do 1-2 mg/mL razblaživanjem u DPBS i podvrgnuti biotinilaciji kako bi se utvrdili sposobnost konjugovanja i antitelo-lek odnos (DAR).10 mM maleimido-PEG2-biotina (Thermo Fisher) u dimetilsulfoksidu (DMSO) dodato je antitelu (mAb) u molarnom odnosu 10:1 i inkubirano na sobnoj temperaturi tokom 4 sata uz blago mešanje. Nakon konjugacije, nereagovano jedinjenje je uklonjeno desaltizacijom pomoću Zeba™ kolona za desaltizaciju (Thermo Fisher). Zatim su uzorci analizirani pomoću LC-MS za određivanje DAR, kao što je detaljno opisano u odeljku 1.3.4.

1.2.2 Konjugacija citotoksina

[0249] Delimično redukovano antitelo je dovedeno na 2,5 mg/ml u 0,5X DPBS, 0,5 mM EDTA i temeljno pomešano. Organski ko-rastvarači, ako su korišćeni, zatim su dodati i

12

temeljno pomešani. Ispitivani su ko-rastvarači propilen glikol (20% i 50% konačne koncentracije), dimetilsulfoksid (DMSO) (10%), N,N-dimetilformamid (20%), N,N-dimetilacetamid (20%) i N,N-dimetilpropionamid (20%). Maleimido-modifikovani citotoksin (6 mM u DMSO) je dodat antitelima u molarnom odnosu 1:6 (mAb:jedinjenje) i temeljno je pomešan. Konjugacija je nastavljena na sobnoj temperaturi tokom 3,5 sata, uz lagano mešanje. 50% propilen glikol pri 50% izabran je kao konačni organski modifikator i korišćen je u svim narednim reakcijama konjugacije.

1.2.3 Prečišćavanje

[0250] Konjugovano antitelo je prečišćeno pomoću 26/10 HiTrap® kolona za desaltizaciju (GE Healthcare) hromatografijom izvedenom na brzoj proteinskoj tečnoj hromatografiji (FPLC) (GE Healthcare), kako bi se uklonili nereagovani maleimido-citotoksin i propilen glikol. MORAb-003 ADC, uključujući MORAb-003-mal-VCP-eribulin (MORAb-202), formulisani su u DPBS (pufer za formulaciju je korišćen kao pufer za punjenje tokom FPLC hromatografije).

1.3 Biofizička karakterizacija

1.3.1 BCA test

[0251] Pripremljeni reagens za bikinoninsku kiselinu (BCA) (200 µL) je dodat u 25 µL serijski razblaženog ADC ili goveđeg gama globina (Thermo Fisher) standarda od 2 mg/ml, i uzorci su temeljno pomešani. Uzorci su inkubirani na 37°C tokom 20 minuta. Ploče su očitane na 595 nm na čitaču ploča SpectraMax® M5 (Molecular Devices). Podaci su analizirani pomoću SoftMax® Pro (ver.3.2) sa modelom uklapanja sa 4 parametra.

1.3.2 SEC-HPLC analiza

[0252] Agregacija antitela je analizirana tečnom hromatografijom visokih performansi sa isključivanjem veličine (SEC-HPLC), koristeći Agilent 1100. mAb je razblažen na 1 mg/ml u DPBS. Antitelo (20 µL) je injektirano u zaštitnu kolonu TSKgel® SuperSW (4,6 mm x 3,5 cm, veličina pora 4 μm, Tosoh Bioscience), praćeno kolonom TSKgel® SuperSW3000 (4,6 mm x 30 cm, veličina pora 4 µm), eluirano iz kolone sa 0,1 M natrijum fosfata koji sadrži 0,15 M NaCl i 0,05% NaN3, pri pH 7,4, pri brzini protoka od 0,3 ml/min tokom 20 min. Svi podaci su analizirani pomoću softvera Agilent ChemStation. Procenat agregacije izračunat je kao [PAagregat/PAukupno]<∗>100, gde PA = integralna površina vrha.

1.3.3 SDS-PAGE analiza

[0253] Uzorci proteina (0,1-10 µg) dovedeni su do IX pomoću pufera za uzorak litijum dodecilsulfata (LDS). Za ne-redukovane uzorke, inkubacija je izvršena na sobnoj temperaturi

12

10 minuta pre elektroforeze. Za redukovane uzorke dodat je ditiotreitol (DTT) do krajnje koncentracije od 20 mM i uzorci su zagrevani na 95°C tokom 10 minuta i stavljeni na led pre elektroforeze. Uzorci su stavljeni na Bis-Tris SDS-PAGE gelove sa 10, 12 ili 15 komorica (Thermo Fisher) sa IX MOPS ili IX MES kao tekućim puferom. Elektroforeza je vršena na 185 V (konstantni napon) tokom 1 sata. Gelovi su obojeni rastvorom za bojenje InstantBlue (Expedeon) i zadržani u vodi. Dokumentacija je izvedena na UltraLum gel sistemu za dokumentaciju koristeći narandžaste filtere od 600 nm.

1.3.4 UPLC/ESI-MS analiza lek-antitelo odnosa (DAR)

[0254] ADC su deglikozilirani upotrebom PNGase F (New England BioLabs). G7 pufer (10 µL) i PNG-faza F (2 µL) dodati su u mAb (90 µL, 1 mg/mL u DPBS). Reakcija je inkubirana u Discover mikrotalasnoj pećnici (CEM) tokom dva ciklusa: (1) mikrotalasna potencija 10 W, 37°C, 10 min, praćena pauzom od 5 minuta; (2) mikrotalasna potencija 2 W, 37°C, 10 min. Deo uzorka je redukovan dodavanjem DTT do krajnje koncentracije od 20 mM, praćeno inkubacijom na 60°C tokom 3 min. Uzorci su zatim analizirani pomoću Waters Acquity tečne hromatografije ultra performansi (UPLC) i četvoropolnog vremena leta (Q-Tof) Premier masenog spektrometra. Uzorci (po 0,5-2 µg svaki) injektirani su u MassPrep™ kolonu za mikro desalinizaciju na 65°C, eluirani iz kolone 5-minutnom ravnotežom u 95% mobilne faze A, gradijent od 10 minuta (5-90% B), i 10 min ponovne ravnoteže u 95% mobilne faze A, pri 0,05 ml/min. Mobilna faza A bila je 0,1% mravlja kiselina u vodi. Mobilna faza B bila je 0,1% mravlja kiselina u acetonitrilu. Maseni spektrometar Q-Tof je pokrenut u pozitivnom jonu, V-modu sa detektovanjem u rasponu od 500-4000 m/z. Parametri izvora bili su naredni: kapilarni napon, 2,25 kV (netaknuto antitelo)-2,50 kV (redukovano antitelo); napon konusa za uzorkovanje, 65,0 V (netaknuto antitelo) ili 50,0 V (redukovano antitelo); temperatura izvora, 100°C; temperatura rastvaranja, 250°C; protok gasa za rastvaranje, 550 L/sat. Vrh proteina je dekonvoluisan upotrebom funkcije MassLynx® MaxEnt 1. Relativni intenziteti svake nekonjugovane, pojedinačno konjugovane i višestruko konjugovane mase teškog i lakog lanca kombinovani su za izračunavanje ukupnog DAR koristeći formulu:

gde je ILC+1intenzitet mase lakog lanca konjugovanog sa jednim citotoksinom, ILC+2je intenzitet mase lakog lanca konjugovanog sa dva citotoksina, itd. IHCsu intenziteti iz odgovarajućih konjugovanih teških lanaca, i ∑ILCtot i ∑IHCtot su kombinovani intenziteti svih nekonjugovanih i konjugovanih lakih i teških lanaca.

1

1.3.5 HIC-HPLC DAR analiza

[0255] Pored DAR analize pomoću analize UPLC/jonizacija elektrosprejom (ESI)-MS, analizirani su i MORAb-003-vcp-eribulin DAR i MORAb-003-0285 DAR primenom hidrofobne HPLC interakcije (HIC-HPLC). Uzorci su injektirani na TSKgel® Ether-5 PW, 7,5 mm ID x 7,5 cm, veličina pora 10 µM, i eluirani iz kolone sa 3 min ravnoteže u 100% mobilne faze A, gradijent od 15 minuta (0-100 % B), zadržavanje od 5 minuta u 100% B, promena od 1 minuta na 100% A i ponovna ravnoteža od 5 minuta u 100% mobilne faze A, pri 0,7 ml/min. Mobilna faza A bila je 25 mM natrijum fosfata, 1,5 M amonijum sulfata, pH 7,0. Mobilna faza B bila je 25 mM natrijum fosfata, 25% izopropanola, pH 7,0. Detektovanje je izvršenao na 280 nm (referentna 320 nm). DAR je određen formulom:

gde je AUC+1je površina ispod krive za vrh mAb koji odgovara ADC konjugovanom sa jednim citotoksinom, AUC+2je površina ispod krive za vrh mAb koji odgovara ADC konjugovanom sa dva citotoksina, itd. ∑AUCtotje kombinovana površina ispod krive za sve vrhove.

1.4 Analize citotoksičnosti

1.4.1 Crystal Violet analiza

[0256] IGROV1 (FR<hi>) i SJSA-1 (FR<neg>) ćelije su sub-kultivisane i posejane sa 10.000 ćelija po komorici u kompletnom medijumu za rast na pločama za kulturu tkiva sa 96 komorica, inkubirane na 37°C, 5% CO2preko noći (16 sati). Tipično, ispitivani reagensi su serijski razređivani 1:4 u 2 mL ploče za razblaživanje u dubokoj komorici, počevši od 1 µM (ukupno 10 razblaženja).100 µL razblaženih uzoraka je dodato na ćelijske ploče (početna koncentracija test uzoraka na 500 nM). Ploče su inkubirane na 37°C, 5% CO2tokom dodatnih 48 sati. Medijum je odbačen, ploče su isprane jednom sa 200 µL DPBS, obojene sa 50 µL 0,2% Crystal Violet rastvora na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta, i zatim oprane obilno vodom iz slavine. Ploče su osušene na vazduhu, i Crystal Violet je rastvoren sa 200 µL 1% rastvora SDS. Ploče su očitane na 570 nm. Podaci su analizirani pomoću GraphPad Prism 6. Analize su izvedene primenom gustine sejanja od 1.000 ćelija po komorici, i izloženost jedinjenja je iznosila ukupno 5 dana. Kada je bila poželjna kratkotrajna izloženost, medijum koji sadrži citotoksične agense uklonjen je nakon 4 sata i zamenjen svežim medijem za rast pre 5-odnevne inkubacije. Za OVCAR3, CaOV3 i NCI-H2110, ćelije su posejane sa 3.000 ćelija po komorici i inkubirane 5 dana sa ADC. Za eksperimente nadmetanja, titrirani ADC su prethodno inkubirani sa 2 µM (konačnog) nekonjugovanog MORAb-003 pre

1 1

inkubacije sa ćelijama.

1.4.2 Analiza ubijanja posmatrača

[0257] Dan pre početka studije, Nuclight™ Green (NLG) IGROV1 ćelije su posejane sa 5.000 ćelija/komorica u ploče sa okruglim dnom sa 96 komorica, nakon čega je sledilo centrifugiranje pri 1.000 obrtaja u minuti tokom 3 minuta na sobnoj temperaturi kako bi se osiguralo stvaranje ćelijskog peleta. Ploča je stavljena u posudu od Incucyte Zoom® (EssenBio science) i inkubirana na 37°C/5% CO2preko noći. Program je bio postavljen za prikupljanje slika rasta ćelija i za određivanje ukupnog broja nuklearno zelenih i nuklearno obojenih ćelija, kao i faznu konfluenciju ćelija svaka dva sata. Na dan eksperimenta, MORAb-003 ADC ili slobodni lek razblaženi su u kompletnom RPMI medijumu i serijski razređeni, počevši od 400 nM. 50 µL rastvora citotoksina je dodato NLG-IGROV1 ćelijama i inkubirano 30 minuta. Tokom perioda inkubacije, Nuclight™ Red (NLR) HL-60 () ćelije su razblažene do 2x10<5>, 1x10<5>ili 5x10<4>ćelija/ml sa svežim medijumom. U komorice NLG-IGROV1 FRneg dodato je 50 µL NLR-HL60 ćelijske suspenzije ili medijuma, nakon čega je usledilo centrifugiranje na 1.000 o/min tokom 3 min na sobnoj temperaturi kako bi se osiguralo ponovno formiranje ćelijskog peleta. Ploča je vraćena u posudu od Incucyte Zoom (EssenBio science) i inkubirana na 37°C/5% CO2do 5 dana. Relativni rast NLG-IGROV1 ćelija određen je poređenjem sa uzorcima bez dodatih ADC ili samog slobodnog leka korišćenjem broja zelenih ćelija. Relativni ćelijski rast HL60 urađen je slično, osim što je određen broj crvenih ćelija. Određivanje IC50vrednosti i za NLG-IGROV1 i za NLR-HL-60 izvedeno je pomoću Prism (GraphPad).

1.4.3 Analiza stabilnosti u serumu

[0258] 20 µL MORAb-003 ADC je temeljno pomešan sa 80 µL DPBS, normalnim objedinjenim ljudskim serumom (Bioreclamation, serija BRH552911) ili normalno objedinjenim mišjim serumom (Bioreclamation, serija MSE152591) i inkubiran na 37°C okom 0, 4, 24 i 48 sati. Nakon inkubacije, uzorci su zamrznuti i čuvani na -20°C do procene citotoksičnosti i testova vezivanja. Za analize citotoksičnosti, uzorci su procenjeni na IGROV1 i SJSA-1 ćelijama, kao što je detaljno opisano u odeljku 1.4.1. Za procenu vezivanja, uzorci su ocenjeni pomoću MSD ECL testa na bazi rastvora. Uzorci su inkubirani sa biotiniliranim folatnim receptorima alfa i sulfo-tag anti-MORAb-003 pre hvatanja na streptavidinskoj ploči i obelodanjeni elektrohemiluminescensijom sa MSD Sector Imager 2400.

2. Rezultati

1 2

2.1 Priprema MORAb-003 ADC

[0259] Kako bi se izabrala najbolja kombinacija veznika i citotoksina za konjugaciju sa MORAb-003, ADC su pripremljeni primenom tri metodologije. Prema strategiji konjugacije prikazanoj na Slici 1, neupareni cisteini se generišu delimičnom redukcijom sa ograničenim molarnim ekvivalentima ne-tiol-redukcionog agensa TCEP. Ova strategija preferencijalno redukuje međulančane disulfidne veze koje povezuju laki lanac i teški lanac (jedan par po HL uparivanju) i dva teška lanca u zglobnom regionu (dva para po HH uparivanju u slučaju ljudskog IgG1), dok ostavljaju unutarlančane disulfidne veze netaknute.

[0260] Druga strategija konjugacije za pripremu MORAb-003 ADC koristila je hemiju redukovanog disulfidnog premošćavanja. Hemija redukovanog disulfidnog premošćavanja premošćuje slobodne tiole ostataka cisteina koji se oslobađaju tokom delimičnog procesa redukcije, oponašajući ulogu disulfidne veze i zadržavajući tako stabilnost i funkciju ADC.

[0261] Treća strategija konjugacije za pripremu MORAb-003 ADC koristila je ograničenu iskorišćenost lizina. Ograničena iskorišćenost lizina rezultuje konjugacijom vrlo ograničenog broja procenjenih 70+ lizina izloženih rastvaraču koji su dostupni na tipičnom ljudskom molekulu IgG, i potencijalno mogu pružiti smeše ADC proizvoda sa nižom homogenošću u odnosu na strategije koje uključuju modifikaciju cisteina.

2.1.1 Priprema VCP-eribulina za MORAb-003 ADC

[0262] Eribulin (1) (10 mg, 14 µmol) (Slika 2) je rastvoren u N,N-dimetilformamidu (DMF) (1mL), i dobro promešan. N,N-diizopropiletilamin (Hunigova baza ili iPr2NEt) (3,6 µL, 21 µmol) i Fmoc-Val-Cit-para-aminobenzil-para-nitrofenol (Fmoc-VCP-PNP) (2) (16 mg, 21 µmol, Concortis Biosystems, kat#VC1003) su dodati. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 4-16 sata, praćeno korišćenjem ninhidrin test kompleta (Anaspec, kat#25241) dok reakcije nije završena. Dietilamin (Et2NH) (0,014 mL, 0,14 mmol) je zatim dodat reakcionoj smeši, mešan tokom 2 sata na 18-25°C kako bi se uklonila Fmoc zaštitna grupa. Reakcija je praćena korišćenjem ninhidrin test kompleta. Nakon završetka, rastvarač je isparen pod vakuumom kako bi se dobio sirov VCP-eribulin (3) (16 mg), prečišćen koristeći ZOBAX SB-C18 kolona (5 µm veličina pora, 9,4 x 150mm) na Waters Alliance e2695 HPLC sistemu u mobilnoj fazi H2O-CH3CN koja sadrži 0,1% mravlju kiselinu, kroz gradijent od 15-70%B. VCP-eribulin (3) (16 mg) je rastvoren u DMF (1 mL). Hunigova baza (7,2 µL, 41 µmol) i maleimido-PEG2-NHS (4) (9,7 mg, 27 µmol) su dodati. Reakciona smeša je mešana na 18-25°C tokom 3 sata. Reakciona smeša je prečišćen sa HPLC (H2O-CH3CN) koji sadrži

1

0,1% mravlju kiselinu) kroz gradijent od 15-70%B. Rastvarač je uklonjen liofilizacijom kako bi se dobio mal-(PEG)2-Val-Cit-p-aminobenziloksikarbonil (pAB)-eribulin (mal-(PEG)2-VCP-eribulin) (5).

2.1.2 Optimizacija redukcionih uslova

[0263] MORAb-003 ADC su pripremljeni generisanjem neuparenih cisteina delimičnom redukcijom sa ograničenim molarnim ekvivalentima ne-tiolnog redukcionog agensa tris(2-karboksietil)fosfin (TCEP). Prvo ispitivanje je izvršeno na MORAb-003, gde su koncentracija antitela, koncentracija TCEP i vreme inkubacije varirali, sa ciljem da se generišu prosečno 4 konjugovana mesta po molekulu antitela. Broj slobodnih mesta tiola određen je korišćenjem fluorometrijskog testa kvantitatacije tiola. Rezultati ove analize prikazani su u Tabeli 12. Obim prekida H-H i H-L veze nakon inkubacije od 10 min, 30 min, 60 min ili 120 min takođe je analiziran pomoću SDS-PAGE (Slika 3). Za ovu analizu, neredukovani i redukovani uzorci su stavljeni na SDS-PAGE gel i elektroforeza je izvršena na 185 V tokom 1 sata. Na Slici 3, traka M odgovara proteinskom standardu. Traka 1 odgovara netretiranom, neredukovanom MORAb-003. Traka 2 odgovara MORAb-003 (5,3 mg/ml) redukovanom u 70,6 µM TCEP. Traka 3 odgovara MORAb-003 (5,3 mg/ml redukovanom) u 141,2 µM TCEP. Traka 4 odgovara MORAb-003 (1,5 mg/ml) redukovanom u 20 µM TCEP. Traka 5 odgovara MORAb-003 (1,5 mg/ml) redukovanom u 40 µM TCEP. Identiteti svake trake naznačeni su na donjem desnom gelu. „H“ označava teški lanac, dok „L“ označava laki lanac.

Tabela 12. Optimizacija redukcionih uslova za MORAb-003

[0264] SDS-PAGE analiza i sadržaj tiola sugerisali su da je inkubacija od 5,3 mg/ml mAb u

1 4

trajanju od 60 minuta pri četvorostrukom molarnom odnosu TCEP prema mAb pružila razumnu polaznu osnovu, jer se činilo da postoji ograničeno smanjenje intramolekularnih disulfida (kako je utvrđeno sadržajem slobodnog tiola), i ostalo je vrlo malo neredukovanog mAb (neredukovani mAb će delovati kao konkurentni inhibitor u in vitro i in vivo studijama koje koriste pripremljene ADC). Dalja ispitivanja su sprovedena sa MORAb-003 u početnim koncentracijama od 5,0 mg/ml kako bi se potvrdio ovaj optimizovani molarni odnos TCEP prema mAb koristeći SDS-PAGE analizu (Slika 4). Na Slici 4, traka 1 odgovara proteinskom standardu. Traka 2 odgovara netretiranom, neredukovanom MORAb-003. Traka 3 odgovara MORAb-003 tretiranom u MORAb-003:TCEP odnosu od 1:1. Traka 4 odgovara MORAb-003 tretiranom u MORAb-003:TCEP odnosu od 1:2. Traka 5 odgovara MORAb-003 tretiranom u MORAb-003:TCEP odnosu od 1:3. Traka 6 odgovara MORAb-003 tretiranom u MORAb-003:TCEP odnosu od 1:4. Konjugacija upotrebom maleimido-PEG2-biotina je takođe izvedena nakon redukcije i uklanjanja TCEP, kako bi se simulirala konjugacija citotoksina za pripremu ADC. DAR analiza je izvedena primenom LC-MS. Rezultati ovih studija dati su u Tabeli 13.

Tabela 13. Optimizacija redukcionih uslova za MORAb-003 -nivoi konjugacije sa maleimido-PEG2-biotinom

[0265] Nakon konjugacije biotina, analiza slobodnog tiola pokazala je da u MORAb-003-biotinu nije bilo slobodnog tiola. Ovo je ukazivalo da se, posle smanjenja disulfidnih veza, konjugacija tipično javlja kod oba generisana tiola, i da je svaki nekonjugovani, redukovani disulfid podvrgnut ponovnoj oksidaciji kako bi se transformisale disulfidne veze. Konačni uslovi izabrani za redukciju za stvaranje ADC bili su koncentracija antitela od 5,0 mg/ml, koncentracija TCEP od 110 µM i vreme inkubacije od 60 min. To dovodi do mAb sa DAR od 4 nakon konjugacije.

1

2.1.3 ADC optimizacija konjugacije

[0266] Kako je prvi citotoksin koji se koristio za pripremu ADC bio kriptoficin, koji je hidrofobno jedinjenje, izvedeni su početni eksperimenti za optimizaciju konjugacije sa „surogat“ anti-ljudskim antitelom na mezotelin sa dva neuparena cisteina na raspolaganju za konjugaciju (jedan po lakom lancu) na određenim lokacijama. Ovo u velikoj meri olakšava analizu efikasnosti konjugacije masenom spektrometrijom, jer treba analizirati samo laki lanac. Izvršena je titracija propilen glikola tokom konjugacije maleimido-LL3-kriptoficina na surogat antitelo, praćena analizom efikasnosti konjugacije lakog lanca pomoću LC-MS (Tabela 14).

Tabela 14. Optimizacija koncentracije propilen glikola u reakciji konjugacije

[0267] 50% propilen glikol je rezultovao potpunim zauzimanjem dostupnih mesta i odabran je kao konačna koncentracija koja će se koristiti. Nije primećen gubitak vezivanja mAb nakon konjugacije (podaci nisu prikazani), što ukazuje da propilen glikol nije imao štetne efekte na antitelo. Stoga, krajnji izabrani uslovi reakcije konjugacije su 2,5 mg/mL mAb, 6:1 konačni molarni maleimido-veznik-citotoksin:mAb odnos u 0,5X DPBS (konačna koncentracija nakon dodavanja propilen glikola), 0,5 mM EDTA, 50% propilen glikol, pH 7,2 tokom 3,5-4 sata na sobnoj temperaturi. U ovim reakcijama se dodaje propilen glikol pre dodavanja maleimido-veznik-citotoksina.

2.1.4 Priprema ADC i biofizička karakterizacija

[0268] Uspostavljeni uslovi redukcije i konjugacije, opisani u odeljku 2.1.2, korišćeni su za pripremu prvih 10 MORAb-003 ADC navedenih u Tabeli 15. Preostali ADC su pripremljeni bilo redukovanim disulfidnim premošćavanjem ili ograničenom iskorišćenošću lizina, sa izuzetkom M-MMAE i M-DM1. M-MMAE i M-DM1 su pripremljeni od strane Concortis Biosystems, Inc., i primljeni su u konjugovanom obliku.

[0269] Hemija redukovanog disulfidnog premošćavanja preko slobodnih tiola proizvedea je tokom procesa delimične redukcije, dajući jedan citotoksin po disulfidu. U teoriji, antitelo sa

1

DAR = 4 trebalo bi da premosti i H-L i zglobne disulfide, pružajući ADC povećanu stabilnost i homogenost u odnosu na tradicionalne pristupe konjugaciji. Ograničena iskorišćenost lizina rezultuje konjugacijom vrlo ograničenog broja procenjenih 70+ lizina izloženih rastvaraču koji su dostupni na tipičnom ljudskom IgG molekulu. MORAb-003 konjugati pripremljeni ovim postupkom rezultovali su DAR od 2,0, što sugeriše da je korišćen jedan lizin po H-L paru.

[0270] Svi ADC su prečišćeni sa HiPrep 26/10 hromatografijom za desaltizaciju i formulisani u DPBS. DAR analiza je izvedena na svim pripremljenim ADC pomoću LC-MS i nivoi agregacije su određeni pomoću SEC-HPLC. Rezultati ovih analiza DAR i agregacije navedeni su u Tabeli 15 pored odgovarajućeg ADC.

Tabela 15. Biofizičke analize za MORAb-003 ADC

1

[0271] DAR vrednosti za sve ADC bile su u unapred određenom rasponu (DAR između 3 i 4). Agregatni nivoi za ADC na bazi kriptoficina bili su znatno veći od željenog (> 10%), dok su na bazi eribulina (VCP-eribulin) i maleimido-veznik-citotoksini na bazi maitansina (ER-001161318, ER-001161319 i M-MMAE) svi pokazali prihvatljive agregatne nivoe.

Istraživanje drugih organskih ko-rastvarača izvršeno je u reakcijama konjugacije sa MORAb-003 korišćenjem VCP-kriptoficina. Ispitivani su rastvarači DMSO (10%), N,N-dimetilformamid (20%), N,N-dimetilacetamid (20%) i N,N-dimetilpropionamid (20%). Svi agregatni nivoi nakon konjugacije upotrebom ovih ko-rastvarača bili su jednaki ili veći od 50% propilen glikola.

[0272] Ne-redukujuća SDS-PAGE analiza izvedena je na podskupu ADC (Slika 5). Kako je utvrđeno da DAR za sve ove ADC iznosi 4, smatralo se da bi ovi ADC trebali da migriraju kao netaknuti IgG od ∼ 160 kD, jer bi i H-L i oba zglobna disulfida trebalo da budu premošćeni. Ovaj podskup ADC obuhvatao je M-MMAE (traka 2), M-DM1 (traka 3), M-0026 (traka 4), M-0260 (traka 5), M-0267 (traka 6), M-0272 (traka 7), M-0285 (traka 8), M-292 (traka 9), M-027-0381 (traka 10) i M-0384 (traka 11) (Slika 5). Na Slici 5, traka 1

1

odgovara proteinskom standardu.

[0273] Iz ove analize je jasno da, za hemiju redukovanog disulfidnog premošćavanja ADC (trake 4-9, 11), pored netaknutog ADC postoje značajne H-L monovalentne vrste (80 kD). To ukazuje na to da postoji značajno premošćavanje disulfida unutar lanca, pored međulančanog zglobnog premošćavanja. Analiza SEC-HPLC ukazuje na to da ADC migriraju kao jedan netaknuti IgG, ukazujući da su za one ADC sa unutarlančanim H-H premošćavanjem teški lanci nekovalentno povezani u konačnom ADC.

2.2 In vitro analize potencije za MORAb-003 ADC

2.2.1 Citotoksičnost na IGROV1 i SJSA-1 ćelijama

[0274] In vitro potencija pripremljenih ADC procenjena je korišćenjem Crystal Violet testa kako je detaljno opisano u odeljku 1.4.1.

[0275] Početni skrining svih MORAb-003 ADC je izvršen na IGROV1 (FR<hi(+++)>) i SJSA-1 (FR<neg(-)>) ćelijama. IGROV1 ćelije potiču od epitelnog raka jajnika i eksprimiranju visok nivo folatnog receptora alfa (FR), ciljanog antigena od MORAb-003. SJSA-1 ćelije su ljudske ćelijske linije tumora osteosarkoma koje su negativne na folatni receptor alfa.

Skrining odabranih ADC je takođe izvršen na CaOV3 (ljudski rak jajnika, FR<med(++)>), NCI-H2110 (ljudski rak ne-malih ćelija pluća, FR<med(++)>), i/ili OVCAR3 (ljudski rak jajnika, FR<med(++)>) ćelijama. Rezultati ovog skrininga dati su u Tabeli 16.

Tabela 16. Skrining citotoksičnosti (IC50) za MORAb-003 ADC na različitim linijama tumorskih ćelija

1

[0276] VCP-eribulin ADC je bio potentan (54 pM) na IGROV1 ćelijama i imao je malo

14

ubijanja na SJSA-1 ćelijama. Za ove ćelijske linije, VCP-eribulin ADC pokazao je veću potenciju i specifičnost u odnosu na ADC sa ekvivalentnim DAR vrednostima, kao što su M-MMAE i M-DM1. VCP-eribulin ADC takođe je pokazao snažnu citotoksičnost na dodatnim ćelijskim linijama tumora jajnika (CaOV3 i OVCAR3) i raka ne-malih ćelija pluća (NC-H2110) koje eksprimiraju FR.

[0277] ADC VCP-eribulin, LL2-kriptoficin, LL3-kriptoficin, VCP-kriptoficin, ER-001161318, ER-001161319 i ER-001159200 pokazali su specifičnu citotoksičnost (> 2-log specifičnosti) u CaOV3 (FR<med(++)>) ćelije. Određeni broj ovih ADC pokazao je subnanomolarnu potenciju. Konjugati kriptoficina su takođe pokazali visok nivo potencije (23 pM - 86 pM) u IGROV1 ćelijama, ali su, sa izuzetkom VCP-kriptoficina, takođe pokazali merljivu citotoksičnost na SJSA-1 ćelijama. Razdvojivi konjugati maitansina ER-001161318 i ER-001161319 imali su srednju potenciju na IGROV1 (0,26 nM i 0,49 nM) i malo ubijanja van cilja kod SJSA-1 ćelija.

[0278] Svi konjugati ograničene upotrebe lizina nisu pokazali nikakvu specifičnost i nisu dalje ispitivani. Razdvojivi konjugati su primenom tehnologije redukovanog disulfidnog premošćavanja za duostatin-3 (M-0285), duostatin-5 (M-0115) i duostatin-14 (M-292 i M-0026) pokazali su specifičnu citotoksičnost na IGROV1 ćelijskoj liniji, sa malu citotoksičnost na SJSA-1 ćelijskoj liniji. Duostatin-3 i duostatin-5 konjugati, derivati auristatina, imali su nešto višu potenciju od duostatin-14 konjugata, koji je derivat maitansina. Potencije i specifičnosti bili su uporedivi sa kontrolnim M-MMAE konjugatom, koji koristi Val-Cit-pAB (VCP) veznik vezan za monometil E. Svim nerazdvojivim konjugatima hemije redukovanih disulfida nedostajali su ili dovoljna potencija ili specifičnost, i nisu dalje analizirani.

2.2.2 Citotoksičnost na ljudskoj ćelijskoj liniji raka jajnika CaOV3 koja eksprimira folatni receptor

[0279] Potencija odabranih MORAb-003 ADC takođe je određena na ćelijskim linijama tumora ljudskog jajnika OVCAR3 i CaOV3, kao i na ljudskim ćelijskim linijama NSCLC NCI-H2110 (Tabela 16). Na ljudskoj ćelijskoj liniji jajnika CaOV3, konjugati kriptoficina pokazali su merljivo veću potenciju od VCP-eribulin konjugata, za razliku od one primećene za IGROV1 ćelije. Ovo je možda zbog nižeg nivoa eksprimiranja folatnog receptora alfa na CaOV3 ćelijama u poređenju sa IGROV1, ili veće potencije kriptoficina na ovim ćelijama, u poređenju sa eribulinom. Konjugati ER-001161318, ER-001161319 i ER-001159200 na bazi maitansinu su svi imali potenciju sličnu VCP-eribulinu ili nižu od nje.

2.3 Ubijanje posmatrača za VCP-eribulin, ER-001161318 i M-0285

[0280] Kako bi se procenila aktivnost ubijanja posmatrača, postavljen je test pomoću dve označene ćelijske linije. U ovom testu, ćelije IGROV1 (FR<hi>) označena sa Nuclight™ Green i HL-60 (FR<neg>) označene sa Nuclight™ Red su kultivisane u različitim odnosima broja ćelija i tretirane titracijama MORAb-003 ADC VCP-eribulina, ER-001161318 ili M-0285. VCP-eribulin je ADC na bazi eribulina i sadrži maleimido-PEG2-Val-Cit-pAB razdvojivi veznik, dok je ER-001161318 ADC na bazi maitansina i sadrži maleimido-(CH2)5-Val-Cit-pAB razdvojivi veznik, i M-0285 je ADC na bazi duostatina i sadrži PEG-pAB razdvojivi veznik. Citotoksičnost je nadgledana pomoću Incucyte Zoom® uređaja za snimanje ćelija. Rezultati ovog testa citotoksičnosti posmatrača prikazani su u Tabeli 17 i na Slikama 6A-C.

Tabela 17. Aktivnost ubijanja posmatrača za VCP-eribulina na zajedničkoj kulturi FR-pozitivnih i FR-negativnih ćelijskih linija

[0281] Kada su HL-60 (FR<neg>) ćelije su kultivisane u odnosu 2:1 sa IGROV1 (FR<hi>) ćelijama, tretman sa MORAb003-VCP-eribulinom rezultovao je 2-log povećanjem ubijanja HL-60 ćelija, u poređenju sa samim HL-60 ćelijama (Tabela 17 i Slika 6A). Ovi podaci sugerišu da ciljno negativne ćelije folatnog receptora alfa (FR) ubijaju MORAb003-VCP-eribulin kada se zajednički kultivišu sa FR ciljno pozitivnim ćelijama, što se ovde naziva ubijanjem posmatrača. Ubijanje posmatrača razlikuje se od ubijanja van cilja, koje se definiše kao ubijanje samih ciljno negativnih ćelija, u odsustvu i nezavisno od zajedničkog kultivisanja sa ciljno pozitivnim ćelijama. Uočeni porast ubijanja posmatrača takođe je bio gotovo identičan porastu primećenom nakon tretmana HL-60 ćelija sa slobodnim eribulinom, što ukazuje na potencijalni mehanizam efekta posmatrača. Bez želje da se vežemo bilo kojom teorijom, MORAb003-VCP-eribulin može da se razdvaja u ili blizu FR-pozitivnih IGROV1 ćelija, koje takođe prolaze apoptozu i oslobađaju slobodni eribulin u kulturu. Oslobođeni citotoksin može da ubije FR-negativne HL-60 ćelije.

[0282] Suprotno tome, primećen je samo blagi pomak za MORAb003-ER-001161318 (Slika 6B), i nije zabeležen nikakav pomak kod MORAb003-0285 (Slika 6C). Kada je odnos HL-60:IGROV1 smanjen sa 2:1 na 1:2, primećeno je merljivo ubijanje HL-60 ćelija, u odnosu na same HL-60 ćelije, za MORAb003-ER-001161318, dok je efekat posmatrača i dalje ostao nizak, iako prepoznatljiv, za MORAb003-0285. Ovi podaci sugerišu da se u pogledu ubijanja posmatrača procenjeni ADC MORAb-003 mogu rangirati kao VCP-eribulin > ER-001161318 > M-0285.

2.4 Analiza stabilnosti u serumu

[0283] S obzirom na dug poluživot u cirkulaciji in vivo ADC i potencijalne toksičnosti ako se citotoksini puste u cirkulaciju, ADC treba da pokažu stabilnost u serumu. MORAb-003 ADC VCP-eribulin, ER-001161319 i M-0285 su prethodno inkubirani u serumu čoveka ili miša na 37°C do 48 sati, i zatim procenjeni u testu citotoksičnosti sa IGROV1 i SJSA-1 ćelijama. ER-001161319 je ADC zasnovan na maitansinu koji sadrži isti razdvojivi veznik kao VCP-eribulin, maleimido-PEG2-Val-Cit-pAB. Uključene su PBS i kontrole seruma kako bi se ispravili bilo kakvi efekti seruma na performanse testa. Rezultati ove studije prikazani su u Tabeli 18.

14

Dok su VCP-eribulin i M-0285 bili stabilni najmanje 48 sati u oba seruma, ER-001161319 je pokazao značajan pad potencije nakon 48 sati. Ovo je možda zbog aziridino-karbamatne veze sa maitansinom, koja prethodno nije opisana u literaturi. Oblik oslobođenog jedinjenja možda nije visoko potentan, jer nije primećen porast citotoksičnosti na SJSA-1 ćelijama.

2.5 In vitro studije sa MORAb003-VCP-eribulinom

2.5.1 HIC-HPLC analiza DAR i heterogenosti proizvoda

[0284] MORAb003-VCP-eribulin i MORAb003-0285 analizirani su pomoću HIC-HPLC kako bi se alternativnim postupkom procenio DAR i ispitala heterogenost proizvoda i sadržaj nekonjugovanih antitela (konkurent). Pokazano je da MORAb003-VCP-eribulin ima DAR vrste 0, 2, 4 i 6, što je u skladu sa postupkom koja se koristi za redukciju i konjugaciju (Slika 7A). Primećene su vrlo male količine DAR = 0 vrsta. Ukupni DAR, zasnovan na AUC proračunima iznosio je 3,80, u skladu sa vrednostima utvrđenim LC-MS. MORAb003-0285 je migrirao kao jedan vrh pomoću HIC-HPLC, ukazujući na jednu DAR vrstu (Slika 7B). Ovo je dodeljeno kao DAR 4.0.

2.5.2 Specifičnost ispitivanjem nadmetanja

[0285] Specifičnost antigena za MORAb-003-VCP-eribulin citotoksičnost prikazana je za VCP-eribulin konjugat korišćenjem formata ispitivanja nadmetanja (Slika 8). U ovom eksperimentu, titracije MORAb-003-VCP-eribulina (početna koncentracija 100 nM) su inkubirane sa 2 µM nekonjugovanog MORAb-003. Nekonjugovani MORAb-003 je omogućio pomeranje potencije IGROV1 ćelija za 2-log, slično rezultatima dobijenim sa IMGN853, anti-ljudskim folatni receptor alfa-maitansin ADC od Imunogen, koji je sada u kliničkim ispitivanjima Faze II, na KB ćelijama (Moore et al., 2015 American Society of Clinical Oncology (ASCO) Annual Meeting, Abstract 5518).

2.5.3 Citotoksičnost na NCI-H2110 NSCLC ćelijama

[0286] Citotoksičnost i za MORAb003-VCP-eribulin i za MORAb003-0285 na ljudskoj NSCLC ćelijskoj liniji NCI-H2110 izvedena je korišćenjem Crystal Violet testa. Rezultati ovog ispitivanja prikazani su u Tabeli 16. MORAb003-VCP-eribulin je imao IC50od 0,73 nM, dok je MORAb003-0285 imao IC50od 14 nM.

2.6 In vivo studije

2.6.1 Maksimalno tolerisana doza (MTD) MORAb-003-VCP-eribulina (MORAb-202) u CD-1 mišjem soju

[0287] Naivnim CD-1 miševima je intravenski injektirano 200 µL MORAb-202 prema rasporedu u Tabeli 19. Telesna težina je izmerena pre doze na dan doziranja, 24 sata posle doze, i tri puta nedeljno nakon toga. Tokom trajanja ispitivanja životinje su posmatrane za kliničko blagostanje. Dve nedelje nakon doziranja, izmerena je i zabeležena krajnja telesna težina. Eutanazirani miševi na kraju studije (i ako je bilo koji miš bio eutanaziran ili pronađen mrtav tokom studije) procesuirani su za obdukciju. Organi su ispitani za znake oštećenja tkiva.

Tabela 19. Dizajn studije

[0288] Nije zabeležen značajan gubitak telesne težine ni u jednoj od tretiranih grupa u poređenju sa kontrolnom grupom tretiranom sa PBS, niti bilo koji klinički nalaz koji ukazuje na toksičnost tokom tretmana. Telesna težina pojedinačnih miševa prikazana je u Tabeli 20, i prosek grupe i SEM prikazani su u Tabeli 21. Kinetika promene telesne težine za svaku grupu (prosek grupe i SEM) prikazani su na Slici 9. MORAb-202 u dozama do 80 mg/kg bolus intravenskom primenom nije proizveo toksičnost. Stoga je MTD iznad 80 mg/kg.

Tabela 20

14

Tabela 21

2.6.2 Maksimalno tolerisana doza eribulina kod CD-1 miševa

[0289] Naivnim CD-1 miševima je intravenski injektirano 200 µL eribulina prema rasporedu u Tabeli 22. Telesna težina je merena tri puta nedeljno, uključujući pre doze svakog dana doziranja i 24 sata nakon svake doze. Kliničko blagostanje životinja je praćeno tokom trajanja studije (dve nedelje nakon poslednje doze). Izmerena je i zabeležena terminalna

14

telesna težina. Eutanazirani miševi na kraju studije (i ako je bilo koji miš bio eutanaziran ili pronađen mrtav tokom studije) procesuirani su za obdukciju. Organi su pregledani za znake oštećenja tkiva.

Tabela 22. Dizajn studije

[0290] Nije došlo do značajnog gubitka telesne težine ili kliničkih nalaza koji ukazuju na toksičnost primećenu kod životinja kojima je primenjivan eribulin u dozama do 1,6 mg/kg, koristeći režim doziranja q4dx3 (jednom u četiri dana za ukupno 3 doze). Primena 3,2 mg/kg istim rasporedom izazvala je piloerekciju kod sva tri miša nakon druge doze. Primećen je ozbiljan gubitak težine (23% gubitka kod jednog miša, #552, nakon druge doze; 17% i 8% kod ostatka, #551 i #552, nakon treće doze), u poređenju sa kontrolom tretiranom sa PBS. Nisu primećene grube promene na organima miševa tokom obdukcije. Telesna težina pojedinačnih miševa prikazana je u Tabeli 23, a prosek grupe i SEM u Tabeli 24. Kinetika promene telesne težine za svaku grupu (prosek grupe i SEM) prikazana je na Slici 10.

[0291] Eribulin u dozama do 1,6 mg/kg, koristeći režim doziranja q4dx3, nije proizveo toksičnost, dok je 3,2 mg/kg izazvalo ozbiljan gubitak težine. Stoga MTD eribulina u ovoj studiji iznosi 1,6 mg/kg, q4dx3.

Tabela 23

14

Tabela 24

14

2.6.3 Procena minimalne efikasne doze MORAb003-VCP-eribulina (MORAb-202) u hNSCLC NCI-H2110 modelu kod CB17-SCID miševa

[0292] Ljudske NSCLC, NCI-H2110 ćelije, prolaz 47, potkožno su implantirane u 30 CB17 SCID miševa (ženke, stare 5 do 6 nedelja, težine 20 grama). 14 dana nakon implantacije, miševi su randomizovani u pet grupa. Prosečna zapremina tumora u svakoj grupi na dan tretmana (Dan 0) kretala se između 154-175 mm<3>(Tabela 27). Upisani miševi su tretirani sa MORAb003-VCP-eribulinom (MORAb-202) (serija #NB2900-87E 10/07/15) u količini od 1, 2,5 ili 5 mg/kg, sa MORAb-003-0285 (serija #042- 150-002) kao kontrola od 5 mg/kg ili sa PBS, prema dizajnu studije (Tabela 25). Svaka grupa je uklonjena iz studije kada je zapremina tumora bilo koje životinje u grupi iznosila > 2000 mm<3>. Poslednja grupa je prekinuta na Dan 61.

Tabela 25. Dizajn studije

14

[0293] Količine tumora kod pojedinačnih miševa prikazane su u Tabeli 26, a prosek grupe i SEM prikazani su u Tabeli 27. Kinetika rasta tumora za svaku grupu (prosek grupe i standardna greška srednje vrednosti, SEM) prikazani su na Slici 11, a tumor zapremine kod pojedinačnih miševa, kao i prosek grupe i SEM, prikazani su na Slici 12. Na osnovu zapremina tumora na dan 17 (kada je zapremina prvog tumora > 2000 mm<3>primećena), MORAb-202 je izazvao inhibiciju rasta tumora (TGI) od 47% pri 1 mg/kg (p = 0,002 u odnosu na fiziološki rastvor), TGI od 96% u 2,5 mg/kg (p <0,0001 u odnosu na fiziološki rastvor). Međutim, regresirani tumori su se povukli jednu do dve nedelje nakon završetka tretmana. Nije otkriven tumor kod miševa tretiranih sa 5 mg/kg MORAb-202. Ovi miševi su ostali bez tumora duže od 60 dana

[0294] Telesna težina pojedinačnih miševa prikazana je u Tabeli 28, a prosek grupe i SEM u Tabeli 29. Kinetika promene telesne težine za svaku grupu (prosek grupe i SEM) prikazana je na Slici 13.

[0295] Nijedan značajni gubitak telesne težine nije primećen ni u jednoj od tretiranih grupa u poređenju sa kontrolom.

[0296] MORAb-202 je pokazao značajan efekat na rast NCI-H2110 tumora. Regresija tumora postignuta je bolus tretmanom od 2,5 mg/kg sa TGI od 94% (u odnosu na PBS). Prema tome, minimalna efikasna doza MORAb-202 je 2,5 mg/kg, testirana na ovom modelu. Potpuna eradikacija tumora postignuta je jednom dozom od 5 mg/kg. Tokom 60 dana nije primećen rast tumora.

1

Tabela 27

11

12

Tabela 29

1

14

2.6.4 Procena minimalne efikasne doze eribulina u modelu hNSCLC NCI-H2110 kod CB17-SCID miševa

[0297] Ljudske NSCLC, ćelije H2110, prolat 46, implantirane su potkožno u 30 CB17 SCID miševa (ženke, stare 5 do 6 nedelja, težine 20 grama). 11 dana nakon implantacije, miševi su randomizovani u pet grupa. Izuzeto je pet životinja čija zapremina tumora najviše odstupa od proseka. Prosečna zapremina tumora u svakoj grupi na dan tretmana (Dan 0) kretala se između 87,6-89,4 mm<3>(Tabela 32). Upisani miševi su tretirani eribulinom (serija #N1201193) u količini od 0,05, 0,2, 0,8 ili 1,6 mg/kg, ili PBS, u skladu sa dizajnom studije (Tabela 30). Svaka grupa je prekinuta, kada je zapremina tumora > 2000 mm<3>prvi put primećena u grupi. Studija je prekinuta na dan 38 (30 dana nakon poslednje doze).

Tabela 30. Dizajn studije

[0298] Količine tumora kod pojedinačnih miševa prikazane su u Tabeli 31, a prosek grupe i SEM prikazani su u Tabeli 32. Kinetika rasta tumora za svaku grupu (prosek grupe i SEM)

1

prikazani su na Slici 14, i zapremine tumora kod pojedinačnih miševa, kao kao i prosek grupe i SEM na dan 24 (kada je zapremina tumora > 2000 mm<3>primećena kod miševa tretiranih sa PBS), prikazani su na Slici 15. Eribulin je izazvao TGI od 50,5% (bez primećene regresije tumora) pri 0,05 mg/kg (p = 0,0026 u odnosu na fiziološki rastvor); TGI od ∼ 99% pri 0,2, 0,8 ili 1,6 mg/kg (vrednosti p bile su < 0,0001 za sve 3 grupe u poređenju sa fiziološkim rastvorom). Minimalna efikasna doza koja je izazvala regresiju tumora je 0,2 mg/kg.

Međutim, većina regresiranih tumora kod ovih miševa (3/5 u grupi od 0,2 mg/kg, 4/5 u grupi od 0,8 mg/kg i 2/5 u grupi od 1,6 mg/kg) ponovo je porasla ili je ostala merljiva tokom trajanje studije (30 dana nakon poslednje doze).

[0299] Telesna težina pojedinačnih miševa prikazana je u Tabeli 33, a prosek grupe i SEM prikazani su u Tabeli 34. Kinetika promene telesne težine za svaku grupu (prosek grupe i SEM) prikazani su na Slici 16.

[0300] Nije primećen značajan gubitak telesne težine ni u jednoj od tretiranih grupa u poređenju sa kontrolnom grupom koja je tretirana fiziološkim rastvorom. Nisu primećeni klinički nalazi koji ukazuju na toksičnost tokom tretmana.

[0301] Eribulin, od 0,2 mg/kg i više, primenjen q4dX3 i.v., pokazao je značajan efekat na rast H2110 tumora. Postignuta je regresija tumora. Kada je primenjena niža doza (od 0,05 mg/kg), nije postignuta regresija tumora. Stoga je minimalna efikasna doza testirana u ovoj studiji 0,2 mg/kg.

1

� Tabela 32

1

� Tabela 34

PRIMER 2

1. Materijali i postupci

[0302] MORAb003-VCP-eribulin (MORAb-202) sintetisan je konjugacijom MORAb-003 (humanizovani anti-ljudski folatni receptor alfa) sa jedinjenjem MAL-PEG2-Val-Cit-PAB-eribulina (ER-001159569) opisanim u odeljku 1.1. Primera 3. Postupak konjugacije je opisan u odeljku 1.4.1 Primera 4.

1.1 Modeli tumora

[0303] Ćelijske linije ljudskog tumora korišćene u dodatnim in vitro procenama MORAb-202 uključuju IGROV1 (ljudski rak jajnika, FR<hi (+++)>), OVCAR3 (ljudski rak jajnika, FR<med(++)>), NCI-H2110 (ljudski rak ne-malih ćelija pluća, FR<med(++)>), A431-A3 (A431 matična ćelijska linija stabilno transficirana ljudskim mezotelinom, FR<lo(+/-)>), SJSA-1 (ljudski osteosarkom, FR<neg(-)>) i HL-60 (ljudska leukemija, FR<neg(-)>). Sve ove ćelijske linije su dobijene direktno od

1

American Type Culture Collection (ATCC). Za in vivo studije, modeli raka ne-malih ćelija pluća, trostruko negativnog raka dojke i modeli endeno-mišićnih ksenografta izvedeni od pacijenata uspostavljeni su i održavani u Oncotest GmbH (Freiburg, Nemačka), Oncodesign (Dijon, Francuska) i EPO Berlin-Buch GmbH (Berlin, Nemačka).

1.2 In vitro analize citotoksičnosti

1.2.1 Crystal Violet analiza

[0304] IGROV1 (FR<hi (+++)>), A431-A3 (FR<lo(+/-)>) i SJSA-1 (FR<neg(-)>) ćelije su sub-kultivisane i posejane sa 10.000 ćelija po komorici u kompletnom medijumu za rast na pločama za kulturu tkiva sa 96 komorica, inkubirane na 37°C, 5% CO2preko noći (16 sati). Tipično, ispitivani reagensi su serijski razblaživani 1:4 u 2 ml ploče za razblaživanje u dubokoj komorici, počevši od 1 µM (ukupno 10 razblaženja).100 µL razblaženih uzoraka je dodato na ploče sa ćelijama (početna koncentracija test uzoraka na 100 nM). Ploče su inkubirane na 37°C, 5% CO2tokom dodatnih 48 sati. Medijum je odbačen, ploče su isprane jednom sa 200 µL DPBS, obojene sa 50 µL 0,2% Crystal Violet rastvora na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta, i zatim oprane obilno vodom iz slavine. Ploče su osušene na vazduhu, i Crystal Violet je rastvoren sa 200 µL 1% SDS rastvora. Ploče su očitane na 570 nm. Podaci su analizirani pomoću GraphPad Prism 6. Za OVCAR3 (FR<med(++)>) i NCI-H2110 (FR<med(++)>), ćelije su posejane sa 3.000 ćelija po komorici i inkubirane 5 dana sa MORAb-202.

1.3 In vivo studije

1.3.1 NCI-H2110 model ksenografta

[0305] Priprema životinja: CB17 SCID miševi (ženke, stare 6 nedelja) su smeštene 5 miševa po provetrenom kavezu. Sterilizovani peleti i flaša sa vodom bili su dostupni životinjama. Životinje su aklimatizovane 5-7 dana pre implantacije tumora.

[0306] Ćelijska kultura: Ljudske NCI-H2110 ćelije su odmrznute iz smrznute zalihe (NB2813-65) i kultivisane u RPMI-1640 medijumu dopunjenom sa 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) u 5% CO2na 37°C. Posle dva prolaza, nakon dostizanja konfluencije pri približno 70%, ćelije su sakupljene rastvorom ćelijske disocijacije, isprane dva puta sa medijumom bez seruma i prebrojane.

[0307] Implantacija tumora: Suspenzija ćelija u medijumu bez seruma pomešana je sa ledeno hladnim matrigelom pri 1:1 (zap.:zap.) do krajnje koncentracije 1,0 x 10<8>ćelija/ml. Svakom

1 1

mišu je potkožno injektirano 100 µL smeše pri 1,0 x 10<7>ćelija/miš. Za sve injekcije korišćena je igla od 27G. Miševi su praćeni za kliničko blagostanje i tumori su mereni digitalnim šestarom tri puta nedeljno, počev od Dana 3 nakon implantacije. Zapremina tumora (mm<3>) izračunata je pomoću formule: Š (mm) × D (mm) × V (mm) × π/6. Kada su tumori dostigli ∼100 mm<3>(u proseku > 70 do ∼130 mm<3>), životinje su randomizovane na 4-5 po grupi. Izuzeto je 5 životinja sa zapreminom tumora koja je najviše odstupala od proseka.

[0308] Dizajn studije: Upisani eksperimentalni miševi injektirani su intravenski sa 200 µL nosača ili MORAb-202 u količini od 1,0, 2,5 i 5 mg/kg, prema dizajnu studije (Tabela 35), na dan randomizacije. Telesna težina je izmerena pre doze i dva puta nedeljno tokom studije. Na kraju studije izmerena je i zabeležena terminalna telesna težina. Životinje su eutanazirane kada je pojedinačna zapremina tumora premašila 2000 mm<3>. Kriterijumi za rani prekid pre dostizanja maksimalno dozvoljene zapremine tumora obuhvatali su: (1) ulceraciju tumora veću od 50% tumora (zap.:zap.); (2) paralizu; (3) gubitak telesne težine > 20%; i (4) 50% životinja unutar grupe je dostiglo terminaciju. Bilo koji miš koji je eutanaziran ili pronađen mrtav tokom studije je procesuiran prema gore opisanom terminalnom postupku.

Tabela 35. Dizajn studije

1.3.2 Modeli ksenografta dobijeni od pacijenta (PDx)

1.3.2.1 Rak ne-malih ćelija pluća (NSCLC) PDx model: LXFA-737 (Oncotest)

[0309] Implantacija tumora: Fragmenti NSCLC tumora dobijeni su od ksenografta tumora LXFA-737 koji su serijski pređeni kod golih miševa. Nakon uklanjanja sa donatorskih miševa, tumori su isečeni na fragmente (dužina ivice 3-4 mm) i stavljeni u fiziološki rastvor puferisan fosfatom (PBS) koji sadrži 10% penicilina/streptomicina. Životinje primaoci su anestezirane inhalacijom izoflurana i primile su unilateralne ili bilateralne tumorske implantate potkožno u bok. Ksenografti tumora implantirani su sa jednim ili dva tumora po mišu sa stopom unosa <65%. U slučaju obostranog unosa, jedan od ovih tumora je

1 2

eksplantiran pre randomizacije. Životinje i tumorski implantati praćeni su svakodnevno sve dok rast solidnog tumora nije bio detektovan na dovoljnom broju životinja. Randomizacijom je određena zapremina rastućih tumora. Životinje koje ispunjavaju kriterijume randomizacije (tj. nose tumore od 50-250 mm<3>, poželjno 80-200 mm<3>) su raspoređene u eksperimentalne grupe koje su se sastojale od 5-6 životinja po grupi, sa ciljem da se uporedi medijana i srednja zapremina tumora u grupi od približno 100-120 mm<3>. Životinje koje nisu korišćene za eksperimente su eutanazirane. Dan randomizacije označen je kao Dan 0 eksperimenta.

[0310] Dizajn studije: Upisani eksperimentalni miševi injektirani su intravenski sa nosačem, MORAb-003 sa 5 mg/kg, ili MORAb-202 sa 5 mg/kg, prema dizajnu studije (Tabela 36), na dan randomizacije. Telesna težina je izmerena pre doze svakog dana doziranja i dva puta nedeljno tokom studije. Na kraju studije izmerena je i zabeležena terminalna telesna težina. Životinje su eutanazirane kada je pojedinačna zapremina tumora premašila 2000 mm<3>..

Tabela 36. Dizajn studije

1.3.2.2 Trostruko negativni rak dojke (TNBC) PDx model: OD-BRE-0631 (Oncodesign)

[0311] Implantacija tumora: Devet ženki SWISS golih miševa injektirano je potkožno u desni bok fragmentima TNBC tumora izvedenih od pacijenta. Miševi koji nose tumore su eutanazirani kada je zapremina tumora dostigla 500-1000 mm<3>, i tumori su hirurški izrezani. Fragmenti tumora (30-50 mg) ortotopski su implantirani u predeo dojki 34 ženki SWISS golih miševa 24 do 72 sata nakon ozračivanja celog tela gama izvorom (2 Gi, 60Co, BioMEP, Francuska). Kada su tumori dostigli srednju zapreminu od 200-300 mm<3>, 24 od ukupno 34 životinje su randomizovane u dve grupe (n=12 životinja) prema njihovoj individualnoj zapremini tumora pomoću Vivo Manager® softvera (Biosystemes, Couternon, Francuska). Za procenu homogenosti među grupama izveden je statistički test (analiza varijanse). Dan randomizacije označen je kao Dan 0 eksperimenta.

[0312] Dizajn studije: Na Dan 1 (jedan dan nakon randomizacije i dva dana pre tretmana), 3 miša iz svake od dve netretirane grupe su prekinuta. Preostalim eksperimentalnim miševima

1

je intravenski injektiran nosač ili MORAb-202 u dozi od 5 mg/kg, prema dizajnu studije (Tabela 37), na Dan 3. Na Dan 8 (pet dana nakon tretmana) po 3 miša od svake od dva tretirane grupe su prekinuta. Odmah nakon prekida, tkivo tumora je sakupljeno i fiksirano u 4% neutralnom puferisanom formalinu tokom 24 do 48 sati, i zatim ugrađeno u parafin (Histosec®, Merck, Darmstadt, Nemačka). Uzorak ugrađen u parafin čuvan je na sobnoj temperaturi radi naknadne imunohistohemijske analize.

Tabela 37. Dizajn studije

[0313] Analiza imunohistohemije (IHC): IHC bojenje tumorskih tkiva fiksiranih formalinom, parafinom ugrađenih, izvršeno je kako bi se procenilo eksprimiranje fibroblasta povezano sa MORAb-202 i rakom. Pre bojenja, slajdovi su deparafinirani i antigen je izvučen u Lab Vision™ PT Module (Thermo Scientific), u citratnom puferu (pH 6,0) prethodno zagrejanom na 85°C, koristeći naredni program: zagrejati na 97°C; inkubirati na 97°C 30 minuta; i ohladiti na 60°C. Zatim su slajdovi premešteni u dvostruko destilovanu vodu na sobnoj temperaturi tokom 5 minuta. Bojenje je izvedeno u Lab Vision™ Autostainer 360 (Thermo Scientific). Ukratko, slajdovi su isprani dva puta u 1X fiziološkog rastvora sa Trispuferom/Tween-20 (TBST) tokom 6 minuta po pranju. Zatim su delovi tkiva inkubirani u puferu za blokiranje (300 µL) (10% kozjeg seruma (Jackson Immunoresearch Laboratory Inc., Bat. Br.005-000-121) razređenog u 3% goveđeg serumskog albumina (BSA) - fosfat puferisanog fiziološkog rastvora (PBS)) tokom 1 sata, inkubirano u konjugovanom antitelu (200 µL) (Tabela 38) tokom 1 sata, i isprano pet puta u 1X TBST tokom 6 minuta/pranje. Slajdovi su obojeni sa DAPI u medijima za montiranje, i slajdovi sa prekrivenim poklopcima su ostavljeni da se stvrdnu tokom 30 minuta. Slajdovi su obrađeni na Panoramic MIDI skeneru (3DHISTECH), i IHC slike su analizirane pomoću Halo softvera(Indica Labs).

Antitela korišćena u ovoj analizi ciljala su na aktin α-glatkih mišića (SMA), koji je specifičan

1 4

marker za fibroblaste povezane sa rakom, i ljudski IgG, koji mogu da otkriju prisustvo MORAb-202.

Tabela 38. IHC antitela

1.3.2.3 PDx modeli raka endometrijuma: Endo-12961 i Endo-10590 (EPO Berlin)

[0314] Implantacija tumora: Fragmenti tumora raka endometrijuma dobijeni su iz serijski prevučenih Endo-12961 i Endo-10590 ksenografta tumora, i čuvani kao zaliha u tečnom azotu. Fragmenti tumora implantirani su potkožno u levi bok 40 NMRI nu/nu ženki miševa i praćena je zapremina tumora. Miševi sa zapreminom tumora od 100-160 mm<3>su randomizovani u jednu od četiri grupe (Grupe A-D, Tabela 39). Satelitski miševi za randomizaciju su uključeni u petu grupu (Grupa E, Tabela 39). Svaka grupa se sastojala od 8 životinja. Dan randomizacije označen je kao Dan 0 eksperimenta.

[0315] Dizajn studije: Upisani eksperimentalni miševi injektirani su intravenski sa PBS, eribulinom sa 3,2 mg/kg ili 0,1 mg/kg, ili MORAb-202 sa 5 mg/kg, prema dizajnu studije (Tabela 39), na dan randomizacije. Rast tumora je procenjen merenjem dva normalna prečnika dva puta nedeljno, i izračunate su zapremine tumora (TV), relativne zapremine tumora (RTV) i obrađene/kontrolne (T/C) vrednosti. Telesna težina je takođe procenjena dva puta nedeljno kao parametar za toksičnost, uz izračunavanje telesne težine po grupi i promene

1

telesne težine (BWC) u odnosu na početak tretmana. Životinje su žrtvovane kada je pojedinačna zapremina tumora prešala 1 cm<3>, ili na kraju studije.

Tabela 39. Dizajn studije

1.4 Mehanizam dejstva

1.4.1 Trodimenzionalni (3D) sistem zajedničke kulture u zPredicta

[0316] Svi eksperimenti sa 3D kulturom koji sadrže mezenhimalne matične ćelije (MSC) sprovedeni su u zPredicta, koristeći 3D sistem vanćelijske matrice specifičan za organ kao što je rStomach™. Mezenhimske matične ćelije koštane srži (BM-MSC) u rStomach™ kultivisane su zajedno sa Nuc Red Light MKN-74 ćelijskom linijom raka želuca u četiri primerka u 48 komorica tokom 12 dana. Prethodno je pokazano da MKN-74 ćelije eksprimiranju dovoljno folatnog receptora alfa (FR) za MORAb-202 tretman da izazovu ćelijsku apoptozu. Pre kultivisanja, BM-MSC su procenjivani na eksprimiranje ciljanog antigena i na markere diferencijacije MSC (Tabela 40) protočnom citometrijom.

Tabela 40. Markeri MSC diferencijacije

[0317] rStomach™ kulture su tretirane bilo sa MORAb-202, nekonjugovanim MORAb-003 antitelom, eribulinom ili kontrolom, kao što je opisano u Tabeli 41. Kontrole su uključivale

1

netretirane i nosačem tretirane (PBS i DMSO) kulture. MSC diferencijacija praćena je svetlosnom mikroskopijom. Jednom kada je uočena vidljiva diferencijacija, uzorci su sakupljeni za bojenje i analizu protočne citometrije.

Tabela 41. Tretmani zajedničke kulture

1.4.2 Analiza vremenskog toka efekta MORAb-202 na fibroblaste povezane sa rakom [0318] Miševi koji nose potkožne H2110 tumore ksenografta pripremljeni su kako je opisano u odeljku 1.3.1. Uzorci tumora su sakupljeni na Dane 0, 3, 5, 7 i 9 nakon primene nosača ili MORAb-202 u dozi od 5 mg/kg. Prikupljeni uzorci tumora obrađeni su na slajdovima, i eksprimiranje fibroblasta povezanih sa rakom analizirano je pomoću IHC, kao što je opisano u odeljku 1.3.2.2.

2. Rezultati

2.1 In vitro analize citotoksičnosti

2.1.1 Citotoksičnost za MORAb-202

[0319] In vitro potencija MORAb-202 procenjena je korišćenjem Crystal Violet testa, kako je detaljno opisano u odeljku 1.2.1. Skrining je izvršen na IGROV1 (FR<hi (+++)>), OVCAR3 (FR<med(++)>), NCI-H2110 (FR<med(++)>), A431-A3 (FR<lo(+/-)>) i SJSA-1 (FR<neg(-)>) ćelijama. Rezultati ovog skrininga dati su na Slici 17 i u Tabeli 42.

Tabela 42. Skrining citotoksičnost (EC50) za MORAb-202 na različitim ćelijskim linijama tumora

1

[0320] MORAb-202 je pokazivao citotoksičnost zavisnu od eksprimiranja folatnog receptora alfa protiv ćelijskih linija tumora i nizak nivo ubijanja van cilja. MORAb-202 je pokazao najviši nivo potencije (0,01 nM) na IGROV1 ćelijama, sa malom citotoksičnošću (> 100 nM) na SJSA-1 ćelijama negativnim na folatni receptor alfa. Intermedijarna potencija je primećena u OVCAR3 i NCI-H2110 ćelijama (0,16 nM i 0,74 nM).

2.2 In vivo studije

2.2.1 Efikasnost MORAb-202 u NC1-H2110 modelu ksenografta

[0321] Miševi koji nose potkožne H2110 tumore injektirani su intravenski sa nosačem ili MORAb-202 u dozi od 1, 2,5 i 5 mg/kg. Značajna regresija tumora primećena je nakon pojedinačne doze MORAb-202 u dozi od 5 mg/kg (Slika 18 i Tabela 43). Korišćenjem ovog modela ksenografta sa visokom eksprimiranjem folatnog receptora alfa i primenom pojedinačne doze, pokazalo se da terapeutski prozor za MORAb-202 iznosi 1 mg/kg za odlaganje rasta tumora (sa stabilnom bolešću) i ≥ 2,5 mg/kg za regresiju tumora. U ovoj studiji, MORAb-202 u dozi od 2,5 mg/kg rezultovao je delimičnim odgovorom, a MORAb-202 u dozi od 5 mg/kg potpunim odgovorom.

Tabela 43. Anti-tumorska aktivnost MORAb-202 u NC1-H2110 modelu ksenografta

2.2.2 Efikasnost MORAb-202 u NSCLC PDx modelu: LXFA-737

[0322] Miševi koji nose potkožni NSCLC PDx tumor injektirani su intravenski sa nosačem, MORAb-003 pri 5 mg/kg, ili MORAb-202 pri 5 mg/kg. Jedna doza MORAb-202 (5 mg/kg)

1

rezultovala je značajnom regresijom tumora u ovom modelu, za razliku od pojedinačne doze nekonjugovanog MORAb-003 antitela (5 mg/kg), koja nije pokazala značajnu anti-tumorsku aktivnost (Slika 19A). Pet od ukupno šest miševa tretiranih sa MORAb-202 smatrano je bez tumora na Dan 32 studije (Tabela 44), a četiri su ostala bez tumora do Dana 74 (završetak studije). Pored toga, nije primećen značajan gubitak telesne težine u grupi koja je tretirana u poređenju sa kontrolnom grupom tretiranom nosačem, što ukazuje da nije bilo toksičnosti tokom tretmana (Slika 19B).

Tabela 44. anti-tumorska aktivnost MORAb-202 u NSCLC PDx modelu

2.2.3 Relativna efikasnost MORAb-202 i eribulina u PDx modelima raka endometrijuma: Endo-12961 i Endo-10590

[0323] Endo-12961 i Endo-10590 ksenografti eksprimiranju visok nivo alfa receptora. Miševi sa potkožnim PDx tumorom endometrijuma injektirani su intravenski sa PBS, eribulinom od 3,2 mg/kg ili 0,1 mg/kg, ili MORAb-202 od 5 mg/kg. Maksimalna tolerisana doza (MTD) eribulina u ovom modelu je 3,2 mg/kg, dok je 0,1 mg/kg ekvivalentno dozi eribulina pruženoj sa MORAb-202 primenom od 5 mg/kg. Tokom početka studije, primećena je značajna antitumorska aktivnost nakon tretmana sa MORAb-202 (5 mg/kg) i MTD doze eribulina (3,2 mg/kg) na oba životinjska modela, dok nije bilo značajne primećene anti-tumorske aktivnosti nakon tretmana sa eribulinom od 0,1 mg/kg (Slike 20A i 20C). Međutim, regresirani tumori kod miševa tretiranih eribulinom od 3,2 mg/kg počeli su ponovo da rastu tokom trajanja studije, dok nije zabeležen značajniji ponovni rast tumora kod miševa tretiranih sa MORAb-202. U ovoj studiji je utvrđeno da je MORAb-202 znatno efikasniji od eribulina. Tretman eribulinom takođe je privremeno uticao na telesnu težinu u prvoj nedelji nakon tretmana (Slike 20B i 20D). Suprotno tome, nije primećen gubitak telesne težine kod životinja tretiranih sa MORAb-202.

1

2.3 Mehanizam delovanja MORAb-202

2.3.1 IHC i efikasnost MORAb-202 u TNBC PDx modelu: OD-BRE-0631

[0324] Miševi koji nose potkožne TNBC PDx tumore su intravenski injektirani sa nosačem ili MORAb-202 u dozi od 5 mg/kg. Tumorsko tkivo je prikupljeno od miševa u svakoj grupi pre tretmana (Dan 1) i nakon tretmana (Dan 8). IHC analize prikupljenih tumorskih tkiva otkrile su da MORAb-202 okupira ćelije tumora koje eksprimiraju folatni receptora alfa pet dana nakon tretmana (Dan 8), nakon primene na Dan 3 u obliku pojedinačne doze (5 mg/kg). Okupacija ćelija je procenjena pomoću anti-ljudskog IgG antitela (Slika 21A). Takođe je pokazano da tretman sa MORAb-202 umanjuje strukturu fibroblasta povezanih sa rakom, kao što je prikazano IHC bojenjem antitelom protiv aktina α-glatkih mišića (SMA)-FITC (Slika 21B). U pogledu efikasnosti, tretman sa MORAb-202 rezultovao je maksimalnom regresijom tumora 11 dana posle tretmana, mereno relativnom zapreminom tumora (RTV) od 0,62 (Slika 21C).

2.3.2 Efekat MORAb-202, MORAb-003 i eribulina na 3D sistem zajedničke kulture [0325] Mezenhimske matične ćelije koštane srži (BM-MSC) u rStomach™ (zPredicta) su 12 dana zajednički kultivisane sa ćelijskom linijom MKN-74 raka želuca. Pre kulture, BM-MSC su procenjivani na eksprimiranje folatnog receptora alfa i na markere MSC diferencijacije protočnom citometrijom. rStomach™ kulture su zatim tretirane bilo sa MORAb-202, nekonjugovanim MORAb-003 antitelom, eribulinom ili kontrolom. Jednom kada je vidljiva MSC diferencijacija uočena svetlosnom mikroskopijom, uzorci su sakupljeni za bojenje i analizu protočne citometrije. Rezultati ovih analiza prikazani su na Slici 22.

[0326] Ukupno trajanje tretmana od 7 dana, sa dopunjavanjem tretmana tokom ovog perioda, bilo je dovoljno da proizvede merljiv efekat na diferencijaciju ljudskih BM-MSC u kulturi sa MKN-74 ćelijama. U odnosu na kontrolu nosača, tretman sa MORAb-202 (10 nM) rezultovao je povećanjem broja MSC i populacija adipocita i smanjenjem populacija pericita (Tabela 45). Ovi podaci ukazuju na to da MORAb-202 može imati značajan uticaj na mikrookolinu tumora.

Tabela 45. Efekat MORAb-202, MORAb-003 i eribulina na 3D sistem zajedničke kulture

1

2.3.3 Analiza vremenskog toka efekta MORAb-202 na fibroblaste povezane sa rakom [0327] Uzorci tumora su sakupljeni od miševa koji nose potkožne H2110 tumore ksenografta na Dane 0, 3, 5, 7 i 9 dana nakon primene nosača, ili MORAb-202 pri 5 mg/kg. Sakupljeni uzorci tumora obrađeni su na slajdovima, i eksprimiranje fibroblasta (CAF) povezano sa rakom analizirano je pomoću IHC. Struktura CAF mreže, kako je procenjena i kvantifikovana bojenjem sa antitelom protiv aktina α-glatkih mišića (SMA)-FITC, bila je istaknuta na Dane 3 i 5, nakon primene pojedinačne doze MORAb-202 pri dozi od 5 mg/kg (Slika 23).

Međutim, do Dana 7, većina ove strukture je značajno umanjena.

PRIMER 3

1. Materijali i postupci

[0328] Jedinjenja eribulina koja se mogu konjugivati i koja imaju strukture prikazane u Tabeli 46 sintetisana su prema narednim postupcima i korišćena u pripremi ADC (Primer 4).

[0329] Svi rastvarači korišćeni u reakcijama sinteze su bezvodnog kvaliteta (EMD Millipore). Svi rastvarači korišćeni za obradu ili prečišćavanje bili su tečne hromatografije visokih performansi (HPLC) (EMD Millipore). Ako nije drugačije naznačeno, sve hemikalije su bile komercijalno dostupne. Hromatografija na koloni je izvedena korišćenjem Biotage® SP4. Uklanjanje rastvarača izvršeno je pomoću rotacionog isparivača (Büchi Labortechik AG) ili centrifugalnog isparivača (Genevac, SP Scientific). Preparativna tečna hromatografijamasena spektrometrija (LC/MS) sprovedena je korišćenjem Waters AutoPurification System i XTerra MS C18 kolone (5 um, 19 mm x 100 mm) u uslovima kisele mobilne faze. Spektri nuklearne magnetne rezonance (NMR) su uzeti uz pomoć deuterisanog hloroforma (CDCl3), osim ako nije drugačije naznačeno, i snimljeni su na 400 ili 500 MHz pomoću Varian instrumenta (Agilent Technologies). Maseni spektri su uzeti uz pomoć Waters Acquity Ultra Performance LC/MS. Kako se ovde koristi, izraz „inertan“ odnosi se na zamenu vazduha u reaktoru (npr. reakciona posuda, boca, stakleni reaktor) sa inertnim gasom koji suštinski ne sadrži vlagu, kao što su azot ili argon. Eksperimenti u više primeraka se označavaju pomoću

1 1

narednih skraćenica: s=singlet, d=dublet, t=triplet, q=kvartet, kvint=kvintet, sxt=sekstet, m=multiplet, dd=dublet dubleta, ddd=dublet dubleta dubleta, dt=dublet trileta, br s=široki singlet.

Tabela 46. Jedinjenja eribulina koja se mogu konjugovati

1 2

NHS-PEG3-triazol-PEG3-Val-Cit-PAB-eribulin (ER-001243700)

1

Azide-PEG3-disulfid-PAB-eribulin (ER-001237508)

1 4

1 Mal-PEG4-triazol-PEG3-sulfonamid-PAB-eribulin (ER-001237505)

Azido-PEG2-eribulin

1

1

[0331] Eribulin (ER-000086526) (61,5 mg, 0,074 mmol) je rastvoren u N,N-dimetilformamidu (DMF) (6,0 mL) i zatim pomešan sa Hunigovom bazom (0,027 mL, 0,156 mmol) i Fmoc-Val-Cit-PAB-PNP (86 mg, 0,112 mmol). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 18 sati dok uparivanje nije završeno, kako je određeno analizom tečne hromatograije visokih performansi (HPLC). Dietilamin (0,078 mL, 0,745 mmol) je dodat smeši, i smeša je mešana tokom dodatna 2 sata dok reakcija nije završena. Rastvarač je uklonjen isparavanjem, i ostatak je prečišćen fleš hromatografijom kako bi se dobio Val-Cit-PAB-eribulin (ER-001228950) kao bela čvrsta supstanca (60 mg, 71% prinos).<1>HNMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 7,56 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,32 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 5,14 (s, 1H), 5,06 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 5,03 (s, 1H), 5,01 (d, J= 12,4 Hz, 1H), 4,87 (s, 1H), 4,83 (s, 1H), 4,71 (t, J = 4,4 Hz, 1H), 4,62 (t, J = 4,4 Hz, 1H), 4,57 (dd, J = 4,8, 8,8 Hz, 1H), 4,47 (d, J = 10,8 Hz, 1H), 4,32-4,27 (m, 2H), 4,18 (dd, J = 4,8, 6,4 Hz, 1H), 4,13-4,07 (m, 2H), 3,98 (t, J = 10,4 Hz, 1H), 3,88-3,82 (m, 3H), 3,76-3,70 (m, 4H), 3,60 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 3,38 (s, 3H), 3,26-3,10 (m, 3H), 2,93 (dd, J = 2,0, 11,2 Hz, 1H), 2,91-2,84 (m, 1H), 2,75-2,64 (m, 2H), 2,44-2,29 (m, 5H), 2,21-1,97 (m, 8H), 1,93-1,83 (m, 3H), 1,79-1,72 (m, 5H), 1,68-1,29 (m, 8H), 1,11 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 1,07-1,01 (m, 1H), 1,06 (d, J = 7,2 Hz, 3H), 1,02 (d, J= 7,2 Hz, 3H). LCMS (M+H)=1135,7.

[0332] Val-Cit-PAB-eribulin (ER-001228950) (16 mg, 14 µmol) je rastvoren u DMF (1 mL). N,N-diizopropiletilamin (7,2 µL, 41 µmol) i Mal-PEG2-NHS (9,7 mg, 27 µmol) su zatim dodati ovom rastvoru na sobnoj temperaturi, i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Nakon završetka reakcije, sirova smeša je prečišćen obrnutom fazom HPLC koristeći acetonitril-voda mobilnu fazu koja sadrži 0,1% mravlju kiselinu.

Prikupljeni fragmenti su koncentrovani pod vakuumom na sobnoj temperaturi u nezagrejanoj vodenoj kadi kako bi se dobio Mal-PEG2-Val-Cit-PAB-eribulin (ER-001159569) (7,1 mg, 5,2 µmol, 38% prinos).<1>HNMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 7,59 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,31 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 6,81 (s, 2H), 5,13 (s, 1H), 5,06 (d, J= 12,4 Hz, 1H), 5,02 (s, 1H), 5,01 (d, J= 12,4 Hz, 1H), 4,87 (s, 1H), 4,82 (s, 1H), 4,71 (t, J = 4,0 Hz, 1H), 4,61 (t, J = 4,4 Hz, 1H), 4,50 (dd, J = 5,2, 9,2 Hz, 1H), 4,47 (d, J= 10,8 Hz, 1H), 4,32-4,27 (m, 2H), 4,19 (dd, J= 6,8, 11,6 Hz, 1H), 4,13-4,07 (m, 2H), 3,98 (t, J= 10,4 Hz, 1H), 3,88-3,82 (m, 3H), 3,76-3,64 (m, 6H), 3,62-3,51 (m, 6H), 3,38 (s, 3H), 3,22-3,08 (m, 4H), 2,93 (dd, J = 2,4, 9,6 Hz, 1H), 2,92-2,84 (m, 1H), 2,76-2,63 (m, 2H), 2,52 (t, J = 6,0 Hz, 2H), 2,44-2,29 (m, 5H), 2,21-1,97 (m, 8H), 1,93-1,83 (m, 3H), 1,80-1,66 (m, 5H), 1,66-1,28 (m, 10H), 1,11 (d, J = 6,4 Hz, 3H), 1,07-1,01 (m, 1H), 0,99 (d, J= 6,8 Hz, 3H), 0,97 (d, J= 6,4 Hz, 3H). LCMS (M+H)=1374,9.

1

1.2 Priprema NHS-PEG2-Val-Cit-PAB-eribulina (ER-001236940)

[0333]

[0334] Val-Cit-PAB-eribulin (ER-001228950) (45 mg, 0,04 mmol) i bis(2,5-dioksopirolidin-1-il) 3,3'-(etan-1,2-diilbis(oksi))dipropanoat (79 mg, 0,198 mmol) su pomešani u DMF (1,5 mL), i Et3N (44,2 µl, 0,317 mmol) je zatim dodat. Smeša je mešana tokom 18 sati dok reakcija nije završena, kako je određeno HPLC analizom. Rastvarač je isparen i ostatak je prečišćen fleš hromatografijom kako bi se dobio NHS-PEG2-Val-Cit-PAB-eribulin (ER-001236940) kao bela čvrsta supstanca (38 mg, 68% prinos).<1>HNMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 7,58 (d, J= 8,4 Hz, 2H), 7,33 (d, J= 8,4 Hz, 2H), 5,14 (s, 1H), 5,05 (d, J= 12,4 Hz, 1H), 5,03 (s, 1H), 5,01 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 4,87 (s, 1H), 4,83 (s, 1H), 4,71 (t, J = 4,4 Hz, 1H), 4,62 (t, J = 4,4 Hz, 1H), 4,51 (dd, J = 4,8, 8,8 Hz, 1H), 4,50-4,47 (m, 1H), 4,32-4,27 (m, 2H), 4,21 (dd, J = 4,8, 6,4 Hz, 1H), 4,14-4,08 (m, 2H), 3,99 (t, J = 10,4 Hz, 1H), 3,88-3,82 (m, 3H), 3,78-3,70 (m, 4H), 3,62 (s, 2H), 3,62-3,58 (m, 1H), 3,50-3,46 (m, 2H), 3,39 (s, 4H), 3,36 (s, 3H), 3,22-3,08 (m, 3H), 2,93 (dd, J = 2,0, 11,2 Hz, 1H), 2,91-2,87 (m, 1H), 2,84 (s, 2H), 2,80 (s, 2H), 2,75-2,64 (m, 2H), 2,59-2,52 (m, 2H), 2,44-2,29 (m, 5H), 2,21-1,97 (m, 10H), 1,93-1,83 (m, 3H), 1,79-1,72 (m, 5H), 1,68-1,29 (m, 8H), 1,11 (d, J= 6,8 Hz, 3H), 1,08-0,98 (m, 1H), 1,00 (d, J = 7,2Hz, 3H), 0,98 (d, J = 7,2 Hz, 3H). LCMS (M+H)=1421,0.

1.3 Priprema NHS-(CH2)5-Val-Cit-PAB-eribulin (ER-001236941)

[0335]

1

[0336] Heptandionska kiselina (1,6 g, 9,99 mmol) je rastvorena u tetrahidrofuranu (THF) (100 mL), i 1-hidroksipirolidin-2,5-dion (2,299 g, 19,98 mmol) je zatim dodat, praćeno dodavanjem DCC (4,12 g, 19,98 mmol). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 18 sati dok HPLC analiza nije ukazala na završetak reakcije. Čvrsta materija je uklonjena filtriranjem kroz podlogu od celita, i oprana sa THF (3 x 2 mL). Kombinovani filtrat je koncentrovan i prečišćen fleš hromatografijom kako bi se dobio bis(2,5-dioksopirolidin-1-il) heptandioat (ER-001236140) kao bela čvrsta supstanca (2,5 g, 71% prinos).<1>HNMR (400 MHz) δ ppm 2,83 (s, 8H), 2,64 (t, J = 7,6 Hz, 4H), 1,80 (dt, J= 7,6 Hz, 4H), 1,59-1,51 (m, 2H). LCMS (M+H)=355,2.

[0337] NHS-(CH2)5-Val-Cit-PAB-eribulin (ER-001236941) je pripremljen (8,5 mg, 47% prinos) od VCP-eribulina (ER-001228950) i bis(2,5-dioksopirolidin-1-il) heptandioatA (ER-001236140) koristeći istu proceduru kako je opisano iznad za pripremu NHS-PEG2-Val-Cit-PAB-eribulina (ER-001236940).<1>HNMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 7,56 (d, J= 8,4 Hz, 2H), 7,30 (d, J= 8,4 Hz, 2H), 5,13 (s, 1H), 5,04 (d, J= 12,0 Hz, 1H), 5,01 (s, 1H), 5,00 (d, J= 12,4 Hz, 1H), 4,86 (s, 1H), 4,82 (s, 1H), 4,70 (t, J= 4,4 Hz, 1H), 4,60 (t, J= 4,4 Hz, 1H), 4,50 (dd, J= 4,8, 8,8 Hz, 1H), 4,46 (d, J = 10,8 Hz, 1H), 4,36-4,25 (m, 2H), 4,17 (dd, J = 4,8, 6,4 Hz, 1H), 4,13-4,06 (m, 2H), 3,97 (t, J= 10,4 Hz, 1H), 3,87-3,80 (m, 3H), 3,74-3,68 (m, 2H), 3,37 (s, 3H), 3,20-3,06 (m, 4H), 2,94 (dd, J = 2,0, 11,2 Hz, 1H), 2,90-2,82 (m, 1H), 2,82 (s,

1

4H), 2,74-2,65 (m, 2H), 2,61 (t, J= 8,0 Hz, 2H), 2,46-2,26 (m, 7H), 2,24-1,81 (m, 13H), 1,78-1,28 (m, 19H), 1,10 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 1,06-0,96 (m, 1H), 0,97 (d, J = 7,2 Hz, 3H), 0,95 (d, J= 7,2 Hz, 3H). LCMS (M+H)=1375,1.

1.4 Priprema Mal-(CH2)5-Val-Cit-PAB-eribulina (ER-001235638)

[0338]

[0339] Eribulin (ER-000086526) (10 mg, 0,012 mmol) je rastvoren u DMF (1 mL), i pomešan sa MC-Val-Cit-PAB-PNP (9,02 mg, 0,012 mmol) i Hunigovom bazom (4,44 µL, 0,025 mmol). Smeša je zatim mešana na sobnoj temperaturi tokom 12 sati dok HPLC analiza nije ukazala na završetak reakcije. Reakciona smeša je koncentrovana i prečišćena fleš hromatografijom kako bi se dobio Mal-(CH2)5-Val-Cit-PAB-eribulin (ER-001235638) kao bela čvrsta supstanca (11,3 mg, 63% prinos).<1>HNMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 7,57 (d, J= 8,4 Hz, 2H), 7,31 (d, J= 8,4 Hz, 2H), 6,79 (s, 2H), 5,13 (s, 1H), 5,05 (d, J= 12,4 Hz, 1H), 5,02 (s, 1H), 5,00 (d, J= 12,4 Hz, 1H), 4,87 (s, 1H), 4,83 (s, 1H), 4,71 (t, J= 4,4 Hz, 1H), 4,61 (t, J= 4,4 Hz, 1H), 4,56-4,46 (m, 3H), 4,35-4,27 (m, 2H), 4,20-4,07 (m, 4H), 3,98 (t, J= 10,8 Hz, 1H), 3,87-3,83 (m, 3H), 3,73-3,70 (m, 2H), 3,48 (t, J= 7,6 Hz, 2H), 3,38 (s, 3H), 3,20-3,08 (m, 4H), 2,93 (dd, J = 1,6, 9,6 Hz, 1H), 2,89-2,85 (m, 1H), 2,69 (dt, J = 11,2, 16,8 Hz, 2H), 2,44-2,33 (m, 5H), 2,27-1,83 (m, 13H), 1,78-1,68 (m, 5H), 1,66-1,27 (m, 14H), 1,11 (d, J = 7,2 Hz, 3H), 1,07-0,98 (m, 1H), 0,98 (d, J = 7,2 Hz, 3H), 0,96 (d, J = 7,2 Hz, 3H).

1 1

LCMS (M+H)=1328,9.

1.5 Priprema Mal-PEG8-Val-Cit-PAB-eribulina (ER-001242287)

[0340]

[0341] VCP-eribulin (ER-001228950) (10 mg, 8,808 µmol) i 2,5-dioksopirolidin-1-il 1-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)-3-okso-7,10,13,16,19,22,25,28-oktaoksa-4-azahentriakontan-31-oat (6,07 mg, 8,808 µmol) su pomešani u DMF (1 mL), praćeno dodavanjem Et3N (9,82 µl, 0,07 mmol). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 18 sati dok HPLC analiza nije ukazala na završetak reakcije. Rastvarač je uklonjen isparavanjem, i ostatak je prečišćen fleš hromatografijom kako bi se dobio Mal-PEG8-Val-Cit-PAB-eribulin (ER-001242287) kao bela čvrsta supstanca (3,0 mg, 20% prinos).<1>HNMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 7,58 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,29 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 6,80 (s, 2H), 5,12 (s, 1H), 5,04 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 5,01 (s, 1H), 4,99 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 4,85 (s, 1H), 4,80 (s, 1H), 4,69 (t, J = 4,4 Hz, 1H), 4,59 (t, J = 4,4 Hz, 1H), 4,50-4,42 (m, 2H), 4,32-4,24 (m, 2H), 4,20-4,14 (m, 2H), 4,12-4,04 (m, 3H), 3,96 (t, J = 10,4 Hz, 1H), 3,86-3,80 (m, 3H), 3,76-3,57 (m, 4H), 3,48 (t, J = 6,0 Hz, 1H), 3,36 (s, 3H), 3,20-3,08 (m, 3H), 2,91 (dd, J = 2,0, 11,2 Hz, 1H), 2,90-2,82 (m, 1H), 2,74-2,60 (m, 2H), 2,44-2,29 (m, 5H), 2,21-1,97 (m, 10H), 1,93-1,83 (m, 3H), 1,79-1,20 (m, 19H), 1,09 (d, J= 6,8 Hz, 3H), 1,04-0,98 (m, 1H), 0,99 (d, J= 7,2 Hz, 3H), 0,97 (d, J= 7,2 Hz, 3H). LCMS (M+H)=1711,6.

1.6 Priprema NHS-PEG9-Val-Cit-PAB-eribulina (ER-001242288)

[0342]

1 2

[0343] NHS-PEG9-Val-Cit-PAB-eribulin (ER-001242288) je pripremljen (13 mg, 85% prinos) od VCP-eribulina (ER-001228950) i BisNHS-PEG9 koristeći istu proceduru kako je opisano iznad za pripremu NHS-PEG2-Val-Cit-PAB-eribulina (ER-001236940).<1>HNMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 7,61 (d, J= 8,4 Hz, 2H), 7,32 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 5,16 (s, 1H), 5,06 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 5,01 (s, 1H), 5,00 (d, J= 12,4 Hz, 1H), 4,87 (s, 1H), 4,82 (s, 1H), 4,71 (t, J= 4,4 Hz, 1H), 4,61 (t, J= 4,4 Hz, 1H), 4,52-4,45 (m, 2H), 4,34-4,26 (m, 2H), 4,20-4,19 (m, 1H), 4,14-4,06 (m, 2H), 3,98 (t, J= 10,4 Hz, 1H), 3,88-3,80 (m, 3H), 3,76-3,70 (m, 4H), 3,66-3,58 (m, 37H), 3,38 (s, 3H), 3,24-3,10 (m, 3H), 2,93 (dd, J = 2,0, 11,2 Hz, 1H), 2,91-2,84 (m, 1H), 2,84 (s, 4H), 2,76-2,64 (m, 2H), 2,58-2,50 (m, 4H), 2,46-2,28 (m, 5H), 2,22-1,96 (m, 8H), 1,91-1,82 (m, 3H), 1,79-1,68 (m, 5H), 1,64-1,24 (m, 8H), 1,11 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 1,08-0,96 (m, 1H), 0,99 (d, J= 7,2 Hz, 3H), 0,97 (d, J= 7,2 Hz, 3H). LCMS (M+H)=1729,7.

1.7 Priprema NHS-PEG3-triazol-PEG3-Val-Cit-PAB-eribulina (ER-001243700)

[0344]

1

[0345] VCP-eribulin (ER-001228950) (25 mg, 0,022 mmol) je rastvoren u DMF (2,5 mL), i zatim pomešan sa Et3N (24,55 µl, 0,176 mmol) i Azid-PEG3-NHS (8,34 mg, 0,024 mmol). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 18 sati dok HPLC analiza nije ukazala na završetak reakcije. Smeša je koncentrovana pod vakuumom, i ostatak je prečišćen koristeći prep-HPLC (MeCN i voda sa 0,1% mravljom kiselinom). Fragmenti koji sadrže azid-PEG3-Val-Cit-PAB-eribulin su ekstrahovani sa dihlorometanom (CH2Cl2) (3 x 20 mL), i CH2Cl2je

1 4

isparen kako bi se dobio azid-PEG3-Val-Cit-PAB-eribulin (ER-001243116) kao bela čvrsta supstanca (18,9 mg, 63% prinos).<1>HNMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 7,58 (d, J= 8,4 Hz, 2H), 7,30 (d, J= 8,4 Hz, 2H), 5,14 (s, 1H), 5,04 (d, J= 12,4 Hz, 1H), 5,03 (s, 1H), 5,01 (d, J= 12,4 Hz, 1H), 4,85 (s, 1H), 4,81 (s, 1H), 4,70 (t, J = 4,4 Hz, 1H), 4,61 (t, J = 4,4 Hz, 1H), 4,52-4,48 (m, 2H), 4,31-4,25 (m, 2H), 4,20-4,15 (m, 1H), 4,13-4,07 (m, 2H), 3,99 (t, J = 10,4 Hz, 1H), 3,84-3,79 (m, 3H), 3,77-3,65 (m, 4H), 3,64-3,56 (m, 13H), 3,38 (s, 3H), 3,20-3,05 (m, 3H), 2,95-2,80 (m, 2H), 2,75-2,60 (m, 2H), 2,55-2,50 (m, 2H), 2,43-2,25 (m, 5H), 2,21-1,97 (m, 8H), 1,93-1,83 (m, 3H), 1,79-1,72 (m, 5H), 1,68-1,29 (m, 10H), 1,08 (d, J= 6,8 Hz, 3H), 1,05-0,95 (m, 1H), 0,98 (d, J= 7,2 Hz, 3H), 0,95 (d, J = 7,2 Hz, 3H). LCMS (M+H)=1365,1.

[0346] Azid-PEG3-VCP-eribulin (ER-001243116) (9,6 mg, 7,035 µmol) i 2,5-dioksopirolidin-1-il 3-(2-(2-(prop-2-in-1-iloksi)etoksi)etoksi)propanoat (6,61 mg, 0,021 mmol) su pomešani u vodi (0,6 mL) i t-Butanol (1,8 mL). Smeša je penušana sa N2je tokom 45 minuta. Bakar jodid na amberlistu-21 (1,23 mmol/g, 10 mg) je dodat smeši i N2je penušan kroz smešu tokom dodatnih 30 minuta. Reakciona smeša je zatim mešana na sobnoj temperaturi tokom 72 sata do potpune potrošnje početnog materijala. Nije primećen neželjeni NHS estarski proizvod LCMS analizom, samo hidrolizovana karboksilna kiselina. Smeša je filtrirana kroz kratku podlogu od celita kako bi se uklonila CuI smola. Filtrat je koncentrovan u vakuumu, i rezultujući ostatak je prečišćen preparativnom hromatografijom tankog sloja (prep-TLC) (20% MeOH/CH2Cl2) kako bi se dobio kiseli-PEG3-triazol-PEG3-Val-Cit-PAB-eribulin (ER-001243701) kao bela čvrsta supstanca (3,7 mg, 33% prinos). LCMS (ES) (M+H)=1581,2.

[0347] Kiseli-PEG3-triazol-PEG3-Val-Cit-PAB-eribulin (ER-001243701) (3,0 mg, 1,898 µmol) je rastvoren u DMF (200 µL) i 1-hidroksipirolidin-2,5-dion (0,437 mg, 3,796 µmol) je dodat, praćeno dodavanjem 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimida (EDC) (0,728 mg, 3,796 µmol). Reakcija je otprilike 50% završena nakon mešanja na sobnoj temperaturi tokom 18 sati. EDC (1,46 mg, 7,8 µmol) je dodat, i smeša je mešana tokom dodatnih 18 sati dok HPLC analiza nije pokazala >95% konverzije do NHS-PEG3-triazol-PEG3-Val-Cit-PAB-eribulina. Smeša je koncentrovana u vakuumu, i ostatak je prečišćen koristeći prep-TLC (15% MeOH/CH2Cl2) kako bi se dobio NHS-PEG3-triazol-PEG3-Val-Cit-PAB-eribulin (ER-001243700) kao bela čvrsta supstanca (2,2 mg, 69% prinos).<1>HNMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 8,00 (s, 1H), 7,59 (d, J= 8,0 Hz, 2H), 7,31 (d, J= 8,4 Hz, 2H), 5,13 (s, 1H), 5,04 (d, J=

1

12,4 Hz, 1H), 5,02 (s, 1H), 5,00 (d, J= 12,4 Hz, 1H), 4,87 (s, 1H), 4,83 (s, 1H), 4,71 (t, J= 4,0 Hz, 1H), 4,63 (s, 2H), 4,61 (t, J= 4,4 Hz, 1H), 4,57-4,55 (m, 2H), 4,51-4,45 (m, 1H), 4,32-4,28 (m, 2H), 4,21-4,17 (m, 2H), 4,13-4,10 (m, 2H), 3,98 (t, J = 10,8 Hz, 1H), 3,88-3,80 (m, 5H), 3,75-3,70 (m, 4H), 3,68-3,55 (m, 18H), 3,45-3,40 (m, 2H), 3,38 (s, 3H), 3,20-3,08 (m, 4H), 2,93-2,80 (m, 2H), 2,75-2,50 (m, 2H), 2,68 (s, 4H), 2,48-2,30 (m, 7H), 2,28-1,92 (m, 10H), 1,90-1,68 (m, 8H), 1,65-1,27 (m, 8H), 1,11 (d, J= 6,8 Hz, 3H), 1,05-0,95 (m, 1H), 0,99 (d, J= 7,2 Hz, 3H), 0,97 (d, J= 6,8 Hz, 3H). LCMS (M+H)=1678,3.

1,8 Priprema Mal-PEG2-Ala-Ala-Asn-PAB-eribulin (ER-001231679) i Mal-PEG2-(Ala-Ala-Asn-PAB)2-eribulina (ER-001231690)

[0348]

1

[0349] Eribulin (ER-000086526) (10 mg, 0,014 mmol) je rastvoren u DMF (0,5 mL), i pomešan sa Hunigovom bazom (3,59 µL, 0,021 mmol). (9H-fluoren-9-il)metil ((S)-1-(((S)-1-(((S)-4-amino-1-((4-((((4-nitrofenoksi)karbonil)oksi)metil)fenil)amino)-1,4-dioksobutan-2-il)amino)-1-oksopropan-2-il)amino)-1-oksopropan-2-il)karbamat (15,76 mg, 0,021 mmol) je zatim dodat, i rezultujući žuti rastvor je mešan na sobnoj temperaturi tokom 3 dana dok HPLC analiza nije pokazala završenu potrošnju početnog materijala. Dietilamin (14,23 µL, 0,137 mmol) je dodat reakcionoj smeši, koja je zatim mešana na sobnoj temperaturi tokom dodatna 2 sata dok nije došlo do 100% razdvajanja Fmoc zaštite. Reakciona smeša je koncentrovana kako bi se uklonio dietilamin, i ostatak je ponovo rastvoren u DMF (1,5 mL). Et3N (0,015 mL, 0,11 mmol) je dodat na sobnoj temperaturi, praćeno dodavanjem 2,5-dioksopirolidin-1-il 3-(2-(2-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)etoksi)etoksi)propanoata (9,71 mg, 0,027 mmol). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 sati dok reakcija nije završena, kako je određeno LCMS analizom. Smeša je koncentrovana pod visokim vakuumom, i prečišćena fleš hromatografijom kako bi se dobili Mal-PEG2-Ala-Ala-Asn-PAB-eribulin (ER-001231679) (9,2 mg, 49% prinos) i Mal-PEG2-(Ala-Ala-Asn-PAB)2-eribulin (ER-001231690) (6,0 mg, 18% prinos) kao bezbojna ulja.

[0350] Mal-PEG2-Ala-Ala-Asn-PAB-eribulin (ER-001231679):<1>HNMR (400 MHz) δ ppm 9,23 (s, 1H), 8,00 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,61 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,38 (d, J= 6,8 Hz, 1H), 7,24 (d, J= 8,4 Hz, 2H), 7,13 (d, J= 7,2 Hz, 1H), 6,68 (s, 2H), 6,30 (br s, 1H), 6,04-6,00 (m, 1H), 5,77 (br s, 1H), 5,42 (br s, 1H), 5,07 (s, 1H), 5,06-4,98 (m, 2H), 4,93 (s, 1H), 4,88 (s, 1H), 4,90-4,82 (m, 1H), 4,80 (s, 1H), 4,69 (t, J = 4,0 Hz, 1H), 4,60 (t, J = 4,0 Hz, 1H), 4,49-4,42 (m, 1H), 4,38-4,25 (m, 4H), 4,19 (t, J= 4,8 Hz, 1H), 4,15-4,08 (m, 1H), 4,03 (t, J= 4,8 Hz, 1H), 3,97-3,85 (m, 3H), 3,83-3,50 (m, 12H), 3,41 (s, 3H), 3,50-3,10 (m, 3H), 3,02-2,64 (m, 6H), 2,52-2,30 (m, 7H), 2,30-1,65 (m, 14H), 1,65-1,20 (m, 12H), 1,10 (d, J= 6,8 Hz, 3H), 1,13-1,05 (m, 1H). LCMS (M+Na)=1396,6.

[0351] Mal-PEG2-(Ala-Ala-Asn-PAB)2-eribulin (ER-001231690):<1>HNMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 7,65 (d, J= 8,4 Hz, 2H), 7,60 (d, J= 8,4 Hz, 2H), 7,28 (d, J= 8,8 Hz, 2H), 7,23 (d, J= 8,4 Hz, 2H), 6,79 (s, 2H), 5,13 (s, 1H), 5,02 (s, 1H), 5,06-4,98 (m, 4H), 4,87 (s, 1H), 4,82 (s, 1H), 4,85-4,72 (m, 2H), 4,71 (t, J= 4,8 Hz, 1H), 4,61 (t, J = 4,4 Hz, 1H), 4,47 (d, J= 11,2 Hz, 1H), 4,30-4,06 (m, 9H), 3,97 (t, J= 4,8 Hz, 1H), 3,89-3,80 (m, 3H), 3,75-3,48 (m, 12H), 3,38 (s, 3H), 3,17 (d, J= 6,8 Hz, 2H), 2,94-2,62 (m, 8H), 2,50-2,28 (m, 7H), 2,22-

1

1,65 (m, 14H), 1,58-1,30 (m, 18H), 1,10 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 1,06-0,97 (m, 1H). LCMS (M+Na)=1802,8.

1.9 Priprema NHS-PEG2-Ala-Ala-Asn-PAB-eribulina (ER-001231691)

[0352]

[0353] Ala-Ala-Asn-PAB-eribulin (ER-001231678) je pripremljen (15 mg, kvantitativni prinos) od eribulina (ER-000086526) i Fmoc-Ala-Ala-Asn-PAB-PNP koristeći istu proceduru kako je opisano iznad za pripremu Val-Cit-PAB-eribulina (ER-001228950). LCMS (M+H)=1135,5.

[0354] NHS-PEG2-Ala-Ala-Asn-PAB-eribulin (ER-001231691) je pripremljen (12,4 mg, 64% prinos) od Ala-Ala-Asn-PAB-eribulina (ER-001231678) i BisNHS-PEG2 koristeći istu proceduru kako je opisano iznad za pripremu NHS-PEG2-Val-Cit-PAB-eribulina (ER-001236940).<1>HNMR (400 MHz) δ ppm 9,21 (s, 1H), 7,95 (d, J= 8,0 Hz, 1H), 7,62 (d, J= 8,8

1

Hz, 2H), 7,58-7,52 (m, 1H), 7,28 (br s, 1H), 7,24 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,10 (br s, 1H), 6,29 (d, J= 12,4 Hz, 1H), 5,83 (br s, 1H), 5,38 (br s, 1H), 5,07 (s, 1H), 5,05-4,95 (m, 2H), 4,93 (s, 1H), 4,88 (s, 1H), 4,90-4,83 (m, 1H), 4,81 (s, 1H), 4,69 (t, J= 4,4 Hz, 1H), 4,60 (t, J= 4,4 Hz, 1H), 4,46-4,41 (m, 1H), 4,36-4,25 (m, 4H), 4,19 (dd, J= 4,8, 6,0 Hz, 1H), 4,15-4,09 (m, 1H), 4,03 (dd, J= 4,8, 6,0 Hz, 1H), 3,99-3,89 (m, 3H), 3,85-3,50 (m, 10H), 3,41 (s, 3H), 3,40-3,10 (m, 3H), 3,01-2,60 (m, 10H), 2,60-2,35 (m, 7H), 2,35-1,65 (m, 14H), 1,65-1,20 (m, 14H), 1,10 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 1,15-1,03 (m, 1H). LCMS (ES) (M+H)=1442,7.

1.10 Priprema azid-PEG3-disulfid-PAB-eribulina (ER-001237508)

[0355]

1

[0356] 4-(((terc-butildimetilsilil)oksi)metil)benzoeva kiselina (1,0 g, 3,754 mmol) je rastvoren u dihlorometan (DCM) (25 mL) ohlađenom do 0°C. Trietilamin (0,549 mL, 3,941 mmol) je zatim dodat, praćeno difenil fosforazidatom (1,085 mg, 3,941 mmol). Reakciona smeša je polako zagrejana do sobne temperature i mešana tokom 14 sata. Sirova smeša je razređena sa etil acetatom (EtOAc)/Hep (1:1, 100 mL), i provučena kroz kratki čep od silicijum dioksida eluiranjem sa EtOAc/Hep (50%). Rastvarač je uklonjen pod vakuumom kako bi se dobilo 1,10 g od 4-(((terc-butildimetilsilil)oksi)metil)benzoil azid (ER-001131970).<1>H NMR (400 MHz) δ ppm 7,98 (d, 2 H, J = 8,0 Hz), 7,40 (d, 2 H, J = 8,0 Hz), 4,79 (s, 2 H), 0,94 (s, 9 H), 0,10 (s, 6 H).

[0357] 4-(((terc-butildimetilsilil)oksi)metil) benzoil azid (ER-001131970) (1,1 g, 3,775 mmol), rastvoren u toluenu (20 mL), je zagrejan na 110°C tokom 3 sata. Iako proizvod nije pokazao pojedinačnu tačku, analiza hromatografije tankog sloja (TLC) je pokazala da je početni materijal potrošen. Reakciona smeša je zatim ohlađena do sobne temperature, i prebačena u bocu zapečaćenu pod azotom i čuvana kao rastvor u toluenu (1 mL = 32,6 mg) na -20°C.

[0358] Trietilamin (0,099 mL, 0,709 mmol) je dodat rastvoru terc-butil((4-izocijanatobenzil)oksi)dimetilsilana (165 mg, 0,626 mmol) u toluenu (5 mL), praćeno alkoholom (90,0 mg, 0,591 mmol), i reakciona smeša je mešana tokom 6 sati na 36°C.

Napredak reakcije je praćen pomoću UPLC/MS. Zasićeni rastvor natrijum hidrogen karbonata (NaHCO3) (10 mL) je zatim dodat, ekstrahovan sa EtOAc/Hep (1:1, 60 mL), opran sa rasolom, osušen preko natrijum sulfata, i koncentrovan. Sirov materijal je prečišćen fleš hromatografijom (EtOAc/Hep 10% do 40%) kako bi se dobilo 215 mg 2-metil-2-(metildisulfanil)propil(4-(((terc-butildimetilsilil) oksi)metil)fenil)karbamata (ER-001131973).<1>H NMR (400 MHz) δ ppm 7,34 (d, 2 H, J= 8,4 Hz), 7,26 (d, 2 H, J= 7,6 Hz), 6,63 (br s, 1 H), 4,69 (s, 2 H), 4,17 (s, 2 H), 2,42 (s, 3 H), 1,35 (s, 6 H), 0,93 (s, 9 H), 0,08 (s, 6 H).

[0359] 2-metil-2-(metildisulfanil)propil (4-(((terc-butildimetilsilil)oksi)metil)fenil)karbamat (ER-001131973) (198 mg, 0,476 mmol) i 2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etil 4-metilbenzenesulfonat (325 mg, 0,87 mmol) su rastvoreni u DMF (6,6 mL). Cezijum karbonat (621 mg, 1,905 mmol) je zatim dodat, praćen tetrabutilamonijumjodidom (45 mg, 0,122

1

mmol), i reakciona smeša je mešana tokom 15 sati na 36°C. Napredak reakcije je praćen pomoću UPLC/MS. Zasićeni rastvor NH4Cl (30 mL) je zatim dodat, ekstrahovan sa EtOAc/Hep (2:1, 150 mL), opran sa rasolom (10 mL), osušen preko natrijum sulfata, i koncentrovan pod vakuumom. Sirov materijal je prečišćen fleš hromatografijom (EtOAc/Hep 20% do 50%) kako bi se dobilo 248 mg 2-metil-2-(metildisulfanil)propil (2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi) etoksi)etil)(4-(((terc-butildimetilsilil)oksi)metil)fenil)karbamata (ER-001140141).<1>H NMR (400 MHz) δ ppm 7,28 (d, 2 H, J= 8,4 Hz), 7,20 (d, 2 H, J= 8,0 Hz), 4,73 (s, 2 H), 4,06 (br s, 2 H), 3,83 (dd, 2 H, J = 6,4, 5,6 Hz), 3,68- 3,56 (m, 12 H), 3,37 (dd, 2 H, J = 5,6, 5,2 Hz), 2,33 (s, 3 H), 1,14 (br s, 6 H), 0,93 (s, 9 H), 0,09 (s, 6 H).

[0360] 2-metil-2-(metildisulfanil)propil (2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etil)(4-(((tercbutildimetilsilil)oksi)metil)fenil)karbamat (ER-001140141) (81 mg, 0,131 mmol) je rastvoren u smeši metanola (5 mL) i vode (0,5 mL). Sirćetna kiselina (0,5 mL, 8,734 mmol) je zatim dodata reakcionoj smeši, i mešana tokom 14 sati na 38°C. Reakciona smeša je ohlađena do sobne temperature, i rastvarač je uklonjen pod vakuumom. Ostatak je razređen sa EtOAc (30 mL), opran sa vodom (2 X 5 mL), NaHCO3, i rasolom (3 mL), osušen preko natrijum sulfata, i koncentrovan pod vakuumom. Sirov materijal je prečišćen fleš hromatografijom (EtOAc/Hep 30% do 90%) kako bi se dobilo 61,0 mg 2-metil-2-(metildisulfanil)propil (2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi) etil)(4-(hidroksimetil)fenil)karbamata (ER-001140549).<1>H NMR (400 MHz) δ ppm 7,34 (d, 2 H, J = 8,8 Hz), 7,26 (d, 2 H, J = 8,0 Hz), 4,69 (d, 2 H, J= 4,4 Hz), 4,06 (br s, 2 H), 3,84 (dd, 2 H, J = 6,2, 6,2 Hz), 3,66-3,56 (m, 12 H), 3,37 (dd, 2 H, J = 5,2, 5,2 Hz), 2,33 (s, 3 H), 1,74 (br s, 1 H), 1,14 (br s, 6 H).

[0361] 2-metil-2-(metildisulfanil)propil (2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etil)(4-(hidroksimetil)fenil)karbamat (ER-001140549) (60 mg, 0,119 mmol) je rastvoren u DCM (2 mL) i Py (0,019 mL, 0,239 mmol) ohlađenom do 0°C.4-nitrofenil karbonohloridat (38,5 mg, 0,191 mmol) u DCM (2 mL) i dimetilaminopiridin (DMAP) (2,9 mg, 0,024 mmol) su zatim dodati, i reakciona smeša je mešana tokom 30 minuta na 0°C. Reakciona smeša je polako zagrejana do sobne temperature, i mešan dok početni materijal nije potrošen (otprilike 2,5 sata). Rastvarač je zatim uklonjen pod vakuumom, i ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (EtOAc/Hep 10% do 35%) kako bi se dobio 78 mg 2-metil-2-(metildisulfanil)propil (2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi) etil)(4-((((4-nitrofenoksi)karbonil)oksi)metil)fenil)karbamat (ER-001140550).<1>H NMR (400 MHz) δ ppm 8,27 (dd, 2 H, J= 6,8, 2,4 Hz), 7,41 (d, 2 H, J= 8,8 Hz), 7,37 (dd, 2 H, J= 7,2, 2,4 Hz), 7,33(d, 2 H, J= 8,8 Hz), 5,27 (s, 2 H), 4,08 (br s, 2

1 1

H), 3,85 (dd, 2 H, J = 5,8, 5,8 Hz), 3,66- 3,57 (m, 12 H), 3,36 (dd, 2 H, J = 5,2, 5,2 Hz), 2,33 (br s, 3 H), 1,19 (br s, 6 H).

[0362] 2-metil-2-(metildisulfanil)propil (2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etil)(4-((((4-nitrofenoksi)karbonil)oksi)metil)fenil)karbamat (ER-001140550) (30 mg, 0,045 mmol) u DCM (3 mL, 46,625 mmol) je smešten u 25-ml bocu pod azotom, i ohlađen do 0°C. Amin (40,8 mg, 0,049 mmol) u DCM (2 mL) i Hunigova baza (0,024 mL, 0,135 mmol) su dodati, praćeno sa DMAP (1,4 mg, 0,011 mmol). Reakciona smeša je zatim polako zagrejana do sobne temperature, mešana tokom 3 sata, koncentrovana pod vakuumom, i prečišćen fleš hromatografijom (EtOAc/Hep 50% do 100%, praćeno sa MeOH/EtOAc 3% do 8%) kako bi se dobilo 45,0 mg čistog azid-PEG3-disulfid-PAB-eribulina (ER-001237508).<1>H NMR (400 MHz) δ ppm 7,32 (d, 2 H, J= 8,0 Hz), 7,25 (d, 2 H, J = 7,2 Hz), 5,28 (dd, 1 H, J = 5,6, 5,6 Hz), 5,11-5,04 (m, 3 H), 4,93 (s, 1 H), 4,88 (s, 1 H), 4,81 (s, 1 H), 4,69 (dd, 1 H, J= 4,4, 4,4 Hz), 4,60 (dd, 1 H, J = 4,2, 4,2 Hz), 4,36 (br s, 1 H), 4,33(dd, 1 H, J = 4,0, 2,0), 4,29 (ddd, 1 H, J = 9,6, 4,4, 4,4 Hz), 4,18 (dd, 1 H, J = 6,4, 4,4 Hz), 4,14-4,04 (m, 3 H), 4,03 (dd, 1 H, J = 6,4, 4,4 Hz), 3,97-3,89 (m, 3 H), 3,84-3,78 (m, 3 H), 3,67-3,56 (m, 14 H), 3,42 (s, 3 H), 3,40-3,35 (m, 1 H), 3,37 (dd, 2 H, J = 5,2, 5,2 Hz), 3,27 (d, 1 H, J = 3,2 Hz), 3,20 (ddd, 1 H, J= 12,8, 6,0, 6,0 Hz), 2,91-2,83 (m, 2 H), 2,70 (dd, 1 H, J= 16,0, 10,0 Hz), 2,52-2,40 (m, 3 H), 2,35-2,13 (m, 9 H), 2,10-2,06 (m, 1 H), 2,01-1,89 (m, 4 H), 1,78-1,64 (m, 4 H), 1,60-1,52 (m, 4 H), 1,49-1,28 (m, 5 H), 1,22-1,07 (m, 6 H), 1,09 (d, 3 H, J= 6,0 Hz).

1.11 Priprema Mal-PEG4-triazol-PEG3-disulfid-PAB-eribulina (ER-001237504)

[0363]

1 2

[0364] Smeša azid (9,0 mg, 7,151 µmol) i 3-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)-N-(3,6,9,12-tetraoksapentadek-14-in-1-il)propanamida (6,8 mg, 0,018 mmol) u terc-butanolu (1,5 mL) i vodi (0,5 mL) je degazirana tokom 45 minuta. Bakar jodid na amberlistu-21 (1,23 mmol/g, 10 mg) je zatim dodat, i degaziran tokom dodatnih 30 minuta. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 18 sati, i praćena pomoću UPLC/MS. Većina početnog materijala je potrošena, i željeni proizvod se pokazao kao značajni vrh. Smeša je zatim razdvojena od smole, i prečišćena na HPLC (acetonitril/voda sa 0,05 % mravljom kiselinom) kako bi se dobilo 1,5 mg Mal-PEG4-triazol-PEG3-disulfid-PAB-eribulina (ER-001237504).

<1>H NMR (400 MHz) δ ppm 7,74 (s, 1 H), 7,32 (d, 2 H, J= 8,4 Hz), 7,27-7,25 (m, 2 H), 6,69 (br s, 2 H), 5,43 (dd, 1 H, J = 5,6, 5,6 Hz), 5,14-5,06 (m, 3 H), 4,95 (s, 1 H), 4,89 (s, 1 H), 4,82 (s, 1 H), 4,70 (dd, 1 H, J = 4,4, 4,4 Hz), 4,66 (s, 2 H), 4,62 (dd, 1 H, J = 4,4, 4,4 Hz), 4,52(dd, 1 H, J = 5,2, 5,2 Hz), 4,38-4,31 (m, 2 H), 4,30 (ddd, 1 H, J = 10,4, 4,0, 4,0 Hz), 4,20 (dd, 1 H, J = 6,4, 4,4 Hz), 4,16-4,05 (m, 3 H), 4,04 (dd, 1 H, J = 6,4, 4,4 Hz), 3,99-3,91 (m, 3 H), 3,87-3,80 (m, 6 H), 3,70-3,59 (m, 22 H), 3,53 (dd, 2 H, J= 5,2, 5,2 Hz), 3,44 (s, 3 H), 3,43-3,36 (m, 3 H), 3,29 (d, 1 H, J = 2,8 Hz), 3,18 (ddd, 1 H, J = 12,9, 6,2, 6,2 Hz), 2,92-2,84 (m, 2 H), 2,72 (dd, 1 H, J = 16,0, 10,0 Hz), 2,54-2,42 (m, 5 H), 2,37-1,90 (m, 19 H), 178-1,52 (m, 3 H), 1,50-1,14 (m, 16 H), 1,10 (d, 3 H, J= 6,0 Hz). LCMS (M+H)=1642,1.

1.12 Priprema NHS-PEG3-triazol-PEG3-disulfid-PAB-eribulina (ER-001244129)

[0365]

1

[0366] Smeša azida (9 mg, 7,151 µmol) i 2,5-dioksopirolidin-1-il 3-(2-(2-(prop-2-in-1-iloksi)etoksi)etoksi)propanoata (4,5 mg, 14,30 µmol) u terc-butanolu (1 mL) i vodu (0,5 mL) je degazirana tokom 45 minuta. Bakar jodid na amberlistu-21 (1,23 mmol/g, 10 mg, 7,151 µmol) je zatim dodat, i degaziran tokom dodatnih 30 minuta. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 18 sati, i praćena pomoću UPLC/MS. Većina početnog materijala je potrošena, i željeni proizvod se pokazao kao značajni vrh. Smeša je zatim razdvojena od smole filtriranjem, ekstrahovana sa DCM (15 mL), oprana sa rasolom (3 X 3 mL), osušena preko natrijum sulfata, i koncentrovan pod vakuumom. Ostatak (5 mg, 3,39 µmol) je azeotropovan sa toluenom, rastvoren u THF (1 mL), i ohlađen do 0°C. DCC (4,2 mg, 0,02 mmol) je dodat, praćeno sa 1-hidroksipirolidin-2,5-dionom (2,2 mg, 0,019 mmol), i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 18 sati. Većina početnog materijala je potrošena, i željeni proizvod se pokazao kao značajni vrh, kako je određeno koristeći UPLC/MS. Reakciona smeša je zatim koncentrovana i prečišćena na preparativnoj TLC (DCM/i-propanol, 8%) kako bi se dobilo 2,5 mg NHS-PEG3-triazol-PEG3-disulfid-PAB-eribulin (ER-001244129) kao bezbojno ulje.<1>H NMR (400 MHz, CD2Cl2) δ ppm 7,72 (s, 1 H), 7,32 (d, 2 H, J= 8,8 Hz), 7,25 (d, 2 H, J= 8,8 Hz), 5,08-5,04 (m, 3 H), 4,93 (s, 1 H), 4,85 (s, 1 H), 4,78 (s, 1 H), 4,64 (dd, 1 H, J= 4,4, 4,4 Hz), 4,58 (s, 2 H), 4,55 (dd, 1 H, J = 4,4, 4,4 Hz), 4,48 (dd, 2 H, J = 5,0, 5,0 Hz), 4,32 (d, 1 H, J = 6,6 Hz), 4,27-4,22 (m, 2 H), 4,14 (dd, 1 H, J = 6,6, 4,8 Hz), 4,10-4,01 (m, 3 H), 4,00 (dd, 1 H, J = 6,8, 4,4 Hz), 3,92-3,78 (m, 9 H), 3,65-3,53 (m, 19 H), 3,44-3,39 (m, 4 H), 3,37 (s, 3 H), 3,26 (d, 1 H, J = 3,2 Hz), 3,13 (ddd, 1 H, J = 12,4, 6,0, 6,0 Hz), 2,91-2,73 (m, 11 H), 2,70-2,64 (m, 2 H), 2,54-2,41 (m, 3 H), 2,38-1,80 (m, 16 H), 1,74-1,52 (m, 3 H), 1,41-1,13 (m, 10 H), 1,07 (d, 3 H, J= 6,4 Hz). LCMS (M+H)=1572,3.

1.13 Priprema azid-PEG3-sulfonamid-PAB-eribulina (ER-001138856)

[0367]

1 4

[0368] 4-(((terc-butildimetilsilil)oksi)metil)anilin (315 mg, 1,327 mmol) je rastvoren u DCM (10 mL) ohlađenom do 0° C. Piridin (0,268 mL, 3,317 mmol) je zatim dodat, praćeno sa 5-cijanopiridin-2-sulfonil hloridom (365 mg, 1,801 mmol) u DCM (10 mL) tokom 15 minuta. Reakciona smeša je polako zagrejana do sobne temperature tokom 1 sata, i mešana tokom 2 sata. Reakciona smeša je razređena sa EtOAc (50 mL), oprana sa rasolom, osušena preko natrijum sulfata, i koncentrovana pod vakuumom kako bi se dobilo 610 mg (103%) N-(4-(((terc-butildimetilsilil)oksi)metil)fenil)-5-cijanopiridin-2-sulfonamida (ER-001137670).

1

Sirov proizvod je prilično čist, iako je obojen.<1>H NMR (400 MHz) δ ppm 8,94 (dd, 1 H, J = 1,8, 0,6 Hz), 8,10 (dd, 1 H, J = 8,4, 2,0 Hz), 7,99 (dd, 1 H, J = 8,0, 0,8 Hz), 7,18 (d, 2 H, J = 8,2 Hz), 7,15 (br s, 1 H), 7,11 (dd, 2 H, J= 6,8, 0,8 Hz), 4,64 (s, 2 H), 0,90 (s, 9 H), 0,05 (s, 6 H).

[0369] N-(4-(((terc-butildimetilsilil)oksi)metil)fenil)-5-cijanopiridin-2-sulfonamid (ER-001137670) (105,0 mg, 0,26 mmol) i 2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etil 4-metilbenzenesulfonat (143 mg, 0,383 mmol) su rastvoreni u DMF (4 mL). Kalijum karbonat (K2CO3) (144 mg, 1,041 mmol) je zatim dodat, praćen sa tetrabutilamonijum jodidom (19,2 mg, 0,052 mmol), i reakciona smeša je mešana tokom 36 sati na 50°C. Napredak reakcije je praćen pomoću UPLC/MS. Zasićeni rastvor NH4Cl (10 mL) je dodat, ekstrahovan sa EtOAc/Hep (2:1, 30 mL), opran sa rasolom, osušen preko natrijum sulfata, i koncentrovan. Sirov materijal je prečišćen fleš hromatografijom (EtOAc/Hep 25% do 80%) kako bi se dobilo 118,0 mg N-(2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etil)-N-(4-(((tercbutildimetilsilil)oksi)metil)fenil)-5-cijanopiridin-2-sulfonamida (ER-001138452) (75%).<1>H NMR (400 MHz) δ ppm 8,99 (dd, 1 H, J = 1,8, 0,6 Hz), 8,08 (dd, 1 H, J = 8,2, 2,2 Hz), 7,86 (dd, 1 H, J = 8,0, 0,8 Hz), 7,24 (d, 2 H, J = 10 Hz), 7,09 (d, 2 H, J = 8,8 Hz), 4,69 (s, 2 H), 4,06 (dd, 2 H, J = 6,0, 6,0 Hz), 3,67 (dd, 2 H, J = 5,2, 5,2 Hz), 3,65 - 3,62 (m, 4 H), 3,58 (dd, 2 H, J = 6,2, 6,2 Hz), 3,56 - 3,53 (m, 4 H), 3,38 (dd, 2 H, J = 5,2, 5,2 Hz), 0,93 (s, 9 H), 0,08 (s, 6 H).

[0370] N-(2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etil)-N-(4-(((tercbutildimetilsilil)oksi)metil)fenil)-5-cijanopiridin-2-sulfonamid (ER-001138452) (150 mg, 0,248 mmol) je rastvoren u metanolu (6 mL). Voda (0,60 mL) je zatim dodata, praćeno sa sirćetnom kiselinom (AcOH) (0,60 mL, 10,481 mmol). Reakciona smeša je polako zagrejana do 38°C, i mešana tokom 14 sati. Većina rastvarača je uklonjen pod vakuumom. Ostatak je razređen sa EtOAc (30 mL), opran sa vodom (2 X 5 mL), NaHCO3, i rasolom, osušen preko natrijum sulfata, i koncentrovan pod vakuumom. Sirov materijal je prečišćen fleš hromatografijom (EtOAc/Hep 35% do 90%) kako bi se dobilo 105,0 mg N-(2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etil)-5-cijano-N-(4-(hidroksimetil)fenil)piridin-2-sulfonamida (ER-001138455) (84%).<1>H NMR (400 MHz) δ ppm 8,99 (d, 1 H, J = 1,2 Hz), 8,09 (dd, 1 H, J = 8,4, 2,0 Hz), 7,88 (dd, 1 H, J = 8,4, 0,8 Hz), 7,30 (d, 2 H, J = 8,8 Hz), 7,15 (d, 2 H, J = 8,4 Hz), 4,67 (s, 2 H), 4,06 (dd, 2 H, J = 6,2, 6,2 Hz), 3,66 (dd, 2 H, J = 5,0, 5,0 Hz), 3,65 - 3,58 (m, 6 H), 3,55 - 3,51 (m, 4 H), 3,38 (dd, 2 H, J = 5,2, 5,2 Hz.

1

[0371] N-(2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etil)-5-cijano-N-(4-(hidroksimetil)fenil)piridin-2-sulfonamid (ER-001138455) (45 mg, 0,092 mmol) je rastvoren u DCM (3 mL), i ohlađen do 0°C nakod dodavanja piridina (0,015 mL, 0,183 mmol).4-nitrofenil karbonohloridat (20,3 mg, 0,101 mmol) u DCM (2 mL) i DMAP (2,3 mg, 0,018 mmol) je zatim dodat. Reakciona smeša je polako zagrejana do sobne temperature i mešana tokom 2 sata. UPLC/MS je pokazala da je nešto početnog materijala preostalo. Reakciona smeša je zatim koncentrovana pod vakuumom, i prečišćena fleš hromatografijom (EtOAc/Hep 12% do 40%) kako bi se dobilo 35 mg 4-((N-(2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etil)-5-cijanopiridin)-2-sulfonamido)benzil (4-nitrofenil) karbonata (ER-001235286) (58%), i 20 mg početnog materijala.<1>H NMR (400 MHz) δ ppm 8,99 (d, 1 H, J = 0,8 Hz), 8,27 (dd, 2 H, J = 9,2, 2,0 Hz), 8,12 (dd, 1 H, J = 7,6, 2,0 Hz), 7,92 (d, 1 H, J = 8,4 Hz), 7,38 (d, 4 H, J = 9,6 Hz), 7,26 (d, 2 H, J = 8,8 Hz), 5,45 (s, 2 H), 4,06 (dd, 2 H, J = 5,8, 5,8 Hz), 3,67 - 3,58 (m, 8 H), 3,58 - 3,50 (m, 4 H), 3,38 (dd, 2 H, J = 6.1.6,1 Hz).

[0372] 4-(N-(2-(2-(2-(2-azidoetoksi)etoksi)etoksi)etil)-5-cijanopiridin-2-sulfonamido)benzil (4-nitrofenil) karbonat (ER-001235286) (35,0 mg, 0,053 mmol) je smešten u 25-mL bocu pod azotom, i ohlađen do 0°C. Amin (48,5 mg, 0,059 mmol) u DCM (3 mL, 46,625 mmol) i Hunigova baza (0,037 mL, 0,214 mmol) su zatim dodati, praćeno sa DMAP (2,61 mg, 0,021 mmol). Reakciona smeša je mešana tokom 30 minuta na 0°C, i zatim mešana tokom dodatnih 6 sati na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom, i prečišćena fleš hromatografijom (EtOAc/Hep 50% do 100%, praćeno sa MeOH/EtOAc 3% do 8%) kako bi se dobilo 61,0 mg čistog azid-PEG3-sulfonamid-PAB-eribulina (ER-001138856).<1>H NMR (400 MHz) δ ppm 8,98 (d, 1 H, J = 1,2 Hz), 8,10 (dd, 1 H, J = 8,2, 1,8 Hz), 7,87 (d, 1 H, J = 8,0 Hz), 7,26 (d, 2 H, J = 6,8 Hz), 7,13 (d, 2 H, J = 8,4 Hz), 5,29 (dd, 1 H, J = 5,6, 5,6 Hz), 5,08-5,00 (m, 3 H), 4,92 (s, 1 H), 4,87 (s, 1 H), 4,80 (s, 1 H), 4,68 (dd, 1 H, J = 4,6, 4,6 Hz), 4,59 (dd, 1 H, J = 4,6, 4,6 Hz), 4,38-4,30 (m, 2 H), 4,28 (ddd, 1 H, J= 10,4, 4,0, 4,0, Hz), 4,17 (dd, 1 H, J= 6,2, 4,6 Hz), 4,13-4,01 (m, 4 H), 3,97-3,88 (m, 3 H), 3,82-3,78 (m, 1 H), 3,67-3,50 (m, 15 H), 3,41 (s, 3 H), 3,40-3,33 (m, 1 H), 3,37 (dd, 2 H, J = 4,8, 4,8 Hz), 3,27 (d, 1 H, J = 3,2 Hz), 3,15 (ddd, 1 H, J = 12,8, 6,4, 6,4 Hz), 2,90-2,82 (m, 2 H), 2,70 (dd, 1 H, J = 16,0, 10,0 Hz), 2,51-2,40 (m, 3 H), 2,34-2,13 (m, 7 H), 2,10-2,05 (m, 1 H), 1,99-1,88 (m, 4 H), 1,78-1,64 (m, 5 H), 1,62-1,52 (m, 2 H), 1,50-1,29 (m, 4 H), 1,08 (d, 3 H, J= 6,8 Hz).

1.14 Priprema Mal-PEG4-triazol-PEG3-sulfonamid-PAB-eribulina (ER-001237505) [0373]

1

[0374] Smeša azida (10 mg, 8,023 µmol) i 3-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)-N-(3,6,9,12-tetraoksapentadek-14-in-1-il)propanamida (9,20 mg, 0,024 mmol) u terc-butanolu (2,1 mL) i vodi (0,7 mL) je degazirana tokom 45 minuta. Bakar jodid na amberlistu-21 (1,23 mmol/g, 15 mg) je zatim dodat, i degaziran tokom dodatnih 30 minuta. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 18 sati, i praćena je pomoću UPLC/MS. Većina početnog materijala je potrošena, i željeni proizvod se pokazao kao značajni vrh. Reakciona smeša je zatim razdvojena od smole, i prečišćena na preparativnoj TLC (DCM/metanol, 7%) kako bi se dobilo 5,5 mg Mal-PEG4-triazol-PEG3-sulfonamid-PAB-eribulina (ER-001237505).<1>H NMR (400 MHz, CD2Cl2) δ ppm 9,01 (s, 1 H), 8,15 (dd, 1 H, J = 8,0, 1,8 Hz), 7,87 (d, 1 H, J = 8,0 Hz), 7,75 (s, 1 H), 7,28 (d, 2 H, J = 8,0 Hz), 7,14 (d, 2 H, J = 8,4 Hz), 6,68 (s, 2 H), 6,47 (br s, 1 H), 5,44 (br s, 1 H), 5,10-5,02 (m, 3 H), 4,94 (s, 1 H), 4,86 (s, 1 H), 4,80 (s, 1 H), 4,68 (dd, 1 H, J = 4,4, 4,4 Hz), 4,59 (s, 2 H), 4,56 (dd, 1 H, J = 4,4, 4,4 Hz), 4,51(dd, 2 H, J = 5,2, 5,2, Hz), 4,34(d, 1 H, J = 7,6, Hz), 4,30-4,23 (m, 2 H), 4,19 - 4,14 (m, 2 H), 4,08 (dd, 1 H, J = 4,0, 4,0 Hz), 4,03 - 3,98 (m, 2 H), 3,94 - 3,72 (m, 8 H), 3,68 -3,46 (m, 28 H), 3,38 (s, 3 H), 3,38 - 3,33 (m, 3 H), 3,27 (d, 1 H, J = 3,2 Hz), 3,16 - 3,02 (m, 2 H), 2,90 - 2,81 (m, 2 H), 2,68 (dd, 1 H, J= 16,2, 9,8 Hz), 2,54-2,40 (m, 7H), 2,40-1,8 (m, 11 H), 1,80-1,50 (m, 3 H), 1,48-1,25 (m, 3 H), 1,09 (d, 3 H, J = 6,4 Hz). LCMS (M+H)=1630,0.

1.15 Priprema NHS-PEG3-triazol-PEG3-sulfonamid-PAB-eribulina (ER-001244623) [0375]

1

[0376] Smeša azida (14 mg, 0,011 mmol) i 2,5-dioksopirolidin-1-il 3-(2-(2-(prop-2-in-1-iloksi)etoksi)etoksi)propanoata (8,80 mg, 0,028 mmol) u terc-butanolu (2 mL) i vodi (1 mL) je degazirana tokom 45 minuta. Bakar jodid na amberlistu-21 (1,23 mmol/g , 20 mg) je zatim dodat, i degaziran tokom dodatnih 30 minuta. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 18 sati, i praćen je pomoću UPLC/MS. Većina početnog materijala je potrošena, i željeni proizvod se pokazao kao značajni vrh. Reakciona smeša je zatim razdvojena od smole ekstrahovanjem sa DCM (2 x 10 mL). DCM sloj je opran sa rasolom (4 x 5 mL), osušen preko natrijum sulfata, i koncentrovan do željenog proizvoda (koji je u narednom koraku korišćen bez daljeg prečišćavanja).

[0377] Sirova kiselina (15,0 mg, 10,255 µmol) je rastvorena u THF (1,5 mL), i ohlađena do 0°C. DCC (15,2 mg, 0,074 mmol) je zatim dodat, praćeno sa 1-hidroksipirolidin-2,5-dionom (8,3 mg, 0,072 mmol). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 18 sati. UPLC/MS je pokazala da je većina početnog materijala potrošena, i željeni proizvod se pokazao kao značajni vrh. Reakciona smeša je koncentrovana, i prečišćena na preparativnoj TLC (DCM/i-propanol, 8%) kako bi se dobilo 2,5 mg NHS-PEG3-triazol-PEG3-sulfonamid-PAB-eribulina (ER-001244623).<1>H NMR (400 MHz, CD2Cl2) δ ppm 9,00 (s, 1 H), 8,12 (d, 1 H, J= 8,4 Hz), 8,00 (d, 1 H, J = 8,0 Hz), 7,72 (s, 1 H), 7,26 (d, 2 H, J = 8,0 Hz), 7,12 (d, 2 H, J = 8,0 Hz), 5,37 (br s, 1 H), 5,08-5,02 (m, 3 H), 4,93 (s, 1 H), 4,85 (s, 1 H), 4,78 (s, 1 H),

1

4,66-4,62 (m, 1 H), 4,58-4,56 (m, 4 H), 4,33 (d, 1 H, J = 10,8 Hz), 4,29-4,21 (m, 2 H), 4,10-3,96 (m, 4 H), 3,93-3,76 (m, 6 H), 3,74-3,44 (m, 27 H), 3,36 (s, 3 H), 3,34-3,24 (m, 2 H), 3,15-3,06 (m, 1 H), 2,97 (br s, 1 H), 2,90-2,78 (m, 8 H), 2,74-2,08 (m, 13 H), 2,05 -1,78 (m, 5 H), 1,73-1,50 (m, 2 H), 1,41-1,25 (m, 4 H), 1,07 (d, 3 H, J = 6,0 Hz). LCMS (M+H)=1560,0.

1,16 Priprema Mal-PEG2-eribulina

[0378] Eribulin (5 mg, 7 µmol) je rastvoren u DMF (0,5 mL), i pomešan sa maleimido-PEG2-NHS (5 mg, 14 µmol; Broadpharm, Kat. Br. BP-21680) i Hunigovom bazom (2,4 µL, 14 µmol). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Reakciona smeša je zatim prečišćena sa HPLC (voda-acetonitril gradijent 30-70% koji sadrži 0,1% mravlju kiselinu). Eluent je prikupljen masovno, i liofilizovan do suvoće. Konačni prinos je 3,7 mg (3,8 µmol, 54%). Predviđena tačna masa je 968,5 Da. Izmerena masa je 969,6 Da [M+H].

1.17 Priprema Mal-PEG4-eribulina

[0379] Eribulin (5 mg, 7 µmol) je rastvoren u DMF (0,5 mL), i pomešan sa maleimido-PEG4-NHS (6,2 mg, 14 µmol; Broadpharm, Kat. Br. BP-20554) i Hunigovom bazom (2,4 µL, 14 µmol). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Reakciona smeša je zatim prečišćena sa HPLC (voda-acetonitril gradijent 30-70% koji sadrži 0,1% mravlju kiselinu). Eluent je prikupljen masovno, i liofilizovan do suvoće. Konačni prinos je 3,7 mg (3,5 µmol, 50%). Predviđena tačna masa je 1056,5 Da. Izmerena masa je 1057,7 Da [M+H].

1.18 Priprema azido-PEG2-eribulina

[0380] Eribulin (5 mg, 7 µmol) je rastvoren u DMF (0,5 mL), i pomešan sa azido-PEG2-NHS (4,2 mg, 14 µmol; Broadpharm, Kat. Br. BP-20524) i Hunigovom bazom (2,4 µL, 14 µmol). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Reakciona smeša je zatim prečišćena sa HPLC (voda-acetonitril gradijent 30-70% koji sadrži 0,1% mravlju kiselinu). Eluent je prikupljen masovno, i liofilizovan do suvoće. Konačni prinos je 2,2 mg (2,4 µmol, 34%). Predviđena tačna masa je 914,5 Da. Izmerena masa je 915,7 Da [M+H].

1.19 Priprema azido-PEG4-eribulina

[0381] Eribulin (5 mg, 7 µmol) je rastvoren u DMF (0,5 mL), i pomešan sa azido-PEG4-NHS (5,5 mg, 14 µmol; Broadpharm, Kat. Br. BP-20518) i Hunigovom bazom (2,4 µL, 14 µmol). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Reakciona smeša je zatim prečišćena sa HPLC (voda-acetonitril gradijent 30-70% koji sadrži 0,1% mravlju kiselinu). Eluent je prikupljen masovno, i liofilizovan do suvoće. Konačni prinos je 3,0 mg (3,0 µmol, 43%). Predviđena tačna masa je 1002,5 Da. Izmerena masa je 1003,7 Da [M+H].

1.20 Priprema azido-PEG4-Val-Cit-PAB-eribulina

2

[0382] Eribulin (15 mg, 21 µmol) je rastvoren u DMF (1,5 mL), i dobro promešan. Hunigova baza (5,5 µL, 32 µmol) i Fmoc-VCP-PNP (24 mg, 22 µmol; Levena Biopharma, Kat. Br. VC1003) su zatim dodati. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći (16 sati). Nakon završetka reakcije, dietilamin (20 µL, 0,21 mmol) je dodat reakcionoj smeši, i mešan tokom 2 sata na sobnoj temperaturi kako bi se uklonila Fmoc zaštitna grupa. Reakcija uklanjanja zaštite je praćena korišćenjem Waters SQD masenog spektrometra. Nakon završetka reakcije, reakciona smeša je prebačena u unapred izmerenu 1,5mL cev za mikrocentrifugu. Rastvarač je isparen pod vakuumom koristeći ohlađeni Centrivap koncentrator sa temperaturom podešenom na 30°C. Prinos je 16 mg (14 µmol) sirovog NH2-Val-Cit-pAB-eribulina (tačna masa 1134,6 Da, 67% prinos).

[0383] NH2-Val-Cit-pAB-eribulin (16 mg, 14,1 µmol) je rastvoren u DMF (1,5 mL).

Hunigova baza (7,2 µL, 41 µmol) i azido-PEG4-NHS (11 mg, 28,2 µmol) su zatim dodati. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 3 sata. Reakciona smeša je zatim prečišćena sa HPLC (voda-acetonitril gradijent 48-72% koji sadrži 0,1% mravlju kiselinu). Eluent je prikupljen na m/z 1409, i liofilizovan kako bi se dobio azido-PEG4-Val-Cit-PAB-eribulin (tačna masa 1407,7 Da).13 mg (9,2 µmol) azido-PEG4-Val-Cit-PAB-eribulina je dobijeno (65% prinos koraka, 44% ukupno).

PRIMER 4

1. Materijali i postupci

[0384] Svi korišćeni reagensi dobijeni su od komercijalnih dobavljača i istraživačkog su ili višeg nivoa, osim ako nije drugačije naznačeno.

1.1 Antitela

[0385] MORAb-003 (humanizovano protiv ljudskog folatnog receptora alfa, 25 mg/ml) i MORAb-009 (mišji-ljudski himerni anti-ljudski mezotelin, 25 mg/ml) korišćeni u narednim studijama su iz serije #NB02962-19 i serije #030A14, respektivno. Trastuzumab je nabavljen komercijalno (Clingen) i bio je iz serije #503345.

[0386] Zečja-ljudska himerna i humanizovana anti-ljudska mezotelin antitela koja imaju neupareni cistein na LCcys80 (Tabela 1) eksprimirana su u 293F ćelijama privremeno ili kao stabilno odabrani bazeni. Kondicionirani medijum je prečišćen i decisteinilovan kako je opisano u odeljku 1.4.1.2.1.

1.2 Citotoksini

2 1

[0387] Konjugovana jedinjenja eribulina su sintetisana kako je opisano u Primeru 3 (Tabela 46). Zalihe (10 mM) su pripremljene u DMSO i čuvane na -20°C do upotrebe.

1.3 Ćelijske linije tumora

[0388] Ljudske ćelijske linije tumora korišćene u analizama MORAb-003, MORAb-009 i trastuzumab ADC pripremljena sa maleimido/sukcinimid (Osu)/azido-veznik-eribulin jedinjenjima (Tabela 46) uključuju IGROV1 (rak ljudskog jajnika, FR<hi>, MSLN<neg>), NCI-H2110 (ljudski rak ne-malih ćelija pluća, FR<med>, MSLN<med>), A431 (FR<neg>, MSLN<neg>), NCI-N87-luc (ljudski rak želuca, FR<neg>, MSLN<med>, her2<hi>), NUGC3 (ljudski adenokarcinom želuca, FR<neg>, MSLN<neg>, her2<neg>), ZR75 (ljudski duktalni rak dojke, FR<neg>, MSLN<neg>, her2<med>) i BT-474 (ljudski duktalni rak dojke, FR<neg>, MSLN<neg>, her2<hi>). Ljudske ćelijske linije tumora korišćene u zečje-ljudskih himernih i humanizovanih anti-ljudskih mezotelin LCcys80 antitela konjugovanih sa MAL-PEG2-Val-Cit-PAB-eribulinom (ER-001159569) bile su A3 (A431 stabilno transficirane ljudskim mezotelinom, MSLN<hi>), OVCAR3 (ljudski rak jajnika, MSLN<hi>), HEC-251 (ljudski endometroid, MSLN<med>), H226 (ljudski mezoteliom skvamoznih ćelija pluća, MSLN<lo>) i A431 matični (MSLN<neg>). Sve korišćene ćelijske linije dobijene su direktno od American Type Culture Collection (ATCC), sa izuzetkom IGROV1 (dobijen od National Cancer Institute, uz dozvolu) i A3 (generisani kod Morphotek od matičnog A431).

1.4 Antitelo-lek konjugacija

1.4.1 Konjugacija na bazi cisteina upotrebom maleimida

1.4.1.1 Konjugacija sa međulančanim disulfidima

1.4.1.1.1 Delimična redukcija

[0389] MORAb-003 i MORAb-009 su puferski razmenjeni u Dulbekovom fiziološkom rastvoru puferisanom fosfatom (DPBS), i zatim koncentrovani na 20 mg/ml upotrebom centrifugalne koncentracije. Dodata je jednaka zapremina od 270 µM tris (2-karboksietil) fosfina (TCEP) u 1X DPBS sa 2 mM EDTA i redukcija je sprovedena laganim mešanjem tokom 80 minuta na sobnoj temperaturi. Trastuzumab je delimično redukovan na sličan način, osim što je redukcija sprovedena laganim mešanjem tokom 40 minuta na sobnoj temperaturi.

1.4.1.1.2 Konjugacija

[0390] Maleimido-veznik-eribulin jedinjenje (u DMSO) je konjugovano sa delimično redukovanim antitelima u molarnom odnosu 1:6 (mAb:jedinjenje). Jedinjenje je dodato 50%

2 2

propilen glikolu u DPBS i dobro je pomešano. Zatim se doda jednaka zapremina delimično redukovanog antitela i nežno se meša (konačna koncentracija propilen glikola od 25%). Konjugacija je trajala 3,5 do 4 sata na sobnoj temperaturi.

1.4.1.2 Konjugacija do LCcys80

1.4.1.2.1 Decisteinilacija

[0391] Koristeći ÄKTA Ekplorer (GE Healthcare), A kolona proteina (GE Healthcare) uravnotežena je sa 10 zapremina kolona (CV) 20 mM natrijum fosfata, 10 mM EDTA, pH 7,2 (pufer za uravnoteženje). Zatim se napuni kondicionirani medijum, nakon čega sledi pranje nevezanog materijala sa 10 CV pufera za uravnoteženje. Kolona je isprana sa 16 CV 20 mM natrijum fosfata, 10 mM EDTA, 5 mM cisteina, pH 7,2 na 0,5 ml/min tokom 16 sati kako bi se uklonila ograničavajuća grupa. Kolona je zatim isprana sa 60 CV 20 mM Tris, pH 7,5 na 0,5 ml/min tokom 60 sati. Decisteinilovano antitelo je eluirano upotrebom 5 CV 0,1 M glicina, pH 2,9 i odmah neutralisano upotrebom 5% zapremine 2 M Tris, pH 9,0. Fragmenti koji sadrže antitela su objedinjeni i dijalizovani u DPBS upotrebom MWCO 20K Slide-A-Lyzer (Thermo Fisher).

1.4.1.2.2 Konjugacija

[0392] Decisteinilirano antitelo je dovedeno na 5,0 mg/mL u DPBS, 1 mM EDTA, i 50% propilen glikol je pripremljen u DPBS, ImM EDTA. MAL-PEG2-Val-Cit-PAB-eribulin (ER-001159569) (12 mM u DMSO) je dodat u 50% propilen glikol i temeljno pomešan. Zatim je dodata jednaka zapremina decisteinilovanog antitela u molarnom odnosu 1:4 (mAb:jedinjenje) i mešano je nežno. Konjugacija je trajala 3,5 do 4 sata na sobnoj temperaturi.

1.4.2 Konjugacija na bazi amina pomoću sukcinimida

1.4.2.1 Konjugacija

[0393] Antitelo (MORAb-003 ili MORAb-009, neredukovano) je dovedeno na 10,0 mg/ml u 0,1 M natrijum bikarbonatu, pH 8,3.50% propilen glikol je pripremljen u 0,1 M natrijum bikarbonatu, pH 8,3. Sukcinimid (OSu)-veznik-eribulin (u DMSO) je dodat u 50% propilen glikol i temeljno pomešan. Zatim je dodata jednaka zapremina antitela u molarnom odnosu 1:4 (mAb:jedinjenje), i temeljno pomešana. Konjugacija je nastavljena 1 sat na sobnoj temperaturi. Reakcija konjugacije je ugašena dodavanjem 1:20 zapremine 1 M Tris, pH 8.0, i ADC je prečišćen kako je opisano u odeljku 1.4.4.

1.4.3 Konjugacija na bazi amina iz dva koraka primenom alkin-azidne hemije

2

promovisanog soja (SPAAC)

1.4.3.1 Derivatizacija dibenzilciklooktina (DBCO)

[0394] Antitelo (MORAb-003 ili MORAb-009, neredukovano) je dovedeno na 10,0 mg/ml u 0,1 M natrijum bikarbonatu, pH 8,3.50% propilen glikol je pripremljen u 0,1 M natrijum bikarbonatu, pH 8,3. NHS-PEG4-DBCO (Click Chemistry Tools, 50 mM u DMSO) je dodat u 50% propilen glikol i temeljno pomešan. Zatim je dodata jednaka zapremina antitela u molarnom odnosu 1:4 (mAb:jedinjenje), i temeljno pomešana. Konjugacija je nastavljena 1 sat na sobnoj temperaturi. Nereagovani NHS-PEG4-DBCO je uklonjen, kao što je opisano u odeljku 1.4.4.

1.4.3.2 Konjugacija

[0395] 50% propilen glikol je pripremljen u DPBS. Azido-veznik-eribulin jedinjenja dodata su u 50% propilen glikol i temeljno pomešana. Zatim je smeši dodata jednaka zapremina modifikovanog DBCO MORAb-003 ili MORAb-009 u molarnom odnosu 1:4 (mAb:jedinjenje), i temeljno pomešana. SPAAC konjugaciji je dozvoljeno da se nastavi preko noći na sobnoj temperaturi. Nereagovani NHS-PEG4-DBCO je uklonjen, kao što je opisano u odeljku 1.4.4.

1.4.4 Prečišćavanje

[0396] Konjugovana antitela su prečišćena korišćenjem HiTrap kolona za desaltizaciju (GE Healthcare). Hromatografija je izvedena na brzoj proteinskoj tečnoj hromatogafiji (FPLC) (GE Healthcare), koristeći IX DPBS kao pufer za punjenje, kako bi se uklonili maleimido/OSu/azido-veznik-eribulin i propilen glikol. Konačni sadržaj proteina je određen BCA testom, kao što je opisano u odeljku 1.3.1 Primera 1.

1.5 Biofizička karakterizacija

1.5.1 SEC-HPLC analiza

[0397] Agregacija ADC je analizirana tečnom hromatografijom visokih performansi sa isključivanjem veličine (SEC-HPLC), koristeći Agilent 1260 HPLC. ADC je razblažen na 1 mg/ml u DPBS. ADC (10 µL) je zatim injektiran u Advanced SEC 300A zaštitnu kolonu (4,6 mm x 3,5 cm, veličina pora 2,7 µm, Agilent), praćenu AdvancedBio 300A kolonom (4,6 mm x 30 cm, veličina pora 2,7 µm). ADC je eluiran iz kolone sa 0,1 M natrijum fosfata koji sadrži 0,15 M NaCl i 5% IPA, pH 7,4 pri brzini protoka od 0,25 ml/min tokom 28 min. Svi podaci su analizirani pomoću Agilent ChemStation softvera. Procenat agregacije izračunat je kao [PAagregat/PAukupno]∗100, gde je PA = integrisana površina vrha.

2 4

1.5.2 HIC-HPLC analiza lek-antitelo odnosa (DAR)

[0398] DAR je analiziran korišćenjem hidrofobne HPLC interakcije (HIC-HPLC). Uzorci su injektirani u TSKgel® Butil-NP5, 4,6 mm ID x 3,5 cm, 2,5 µM neporozne kolone (Tosoh Bioscience) i eluirani sa 3 minuta ravnoteže u 100% mobilne faze A, gradijent od 15 minuta (0- 100% B), zadržavanje od 5 minuta u 100% B, promena od 1 minuta na 100% A i ponovna ravnoteža od 5 minuta u 100% mobilne faze A, pri 0,7 ml/min. Mobilna faza A bila je 25 mM natrijum fosfata, 1,5 M amonijum sulfata, pH 7,0. Mobilna faza B bila je 25 mM natrijum fosfata, 25% izopropanola, pH 7,0. Detekcija je izvedena na 280 nm (referentni 320 nm). DAR je određen formulom:

gde je AUC+1je površina ispod krive za vrh antitela koja odgovara ADC konjugovanom sa jednim citotoksinom, AUC+2je površina ispod krive za vrh antitela koja odgovara ADC konjugovanom sa dva citotoksina, itd. ∑AUCtotje kombinovana površina ispod krive za sve vrhove.

1.5.3 LC-MS DAR analiza

[0399] DAR je takođe analiziran upotrebom LC-MS postupka sa HPLC kompanije Waters Alliance sa SQD/PDA detektovanjem. Uzorci su injektirani u Proteomix RP-1000 kolonu(5 µM, 1000A, 4,6 mm x 15 cm, Sepax) na 65°C i eluirani sa 3 minuta ravnoteže u 25% B, 27 minuta linearni gradijent od 25% - 55% B, zadržavanje od 5 minuta na 55% B, promena od 1 minuta na 90% B, zadržavanje od 5 minuta na 90% B, promena od 1 minuta nazad na 25% B i ponovna ravnoteža od 5 minuta pri 25% B. Mobilna faza A bila je 0,1% TFA u vodi, i mobilna faza B 0,1% TFA u acetonitrilu. Eluat je zatim podeljen (10:1) na PDA i SQD detektore. SQD detektor postavljen je kao ES pozitivan, kapilarni napon na 3,2 kV, napon konusa na 40 V, ekstraktor na 3 V i RF sočivo na 0,2 V, temperatura izvora na 150°C i temperatura rastvaranja na 250°C. Podaci o masi prikupljani su pri 200-2000m/z tokom 40 min, režim kontinuuma, vreme skeniranja 1 sekunda. Podaci su analizirani i dekonvoluisani van mreže koristeći MassLynx i MaxEnt1. DAR je izračunat po formuli:

gde je AUCLC+1je površina ispod krive vrha lakog lanca konjugovanog sa jednim citotoksinom, AUCLC+2je površina ispod krive vrha lakog lanca konjugovanog sa dva citotoksina itd. AUCHCje površina ispod krive odgovarajućih teških lanaca, a ∑AUCLCtot i ∑AUCHCtot su kombinovana površina ispod krive svih nekonjugovanih i konjugovanih lakih

2

i teških lanaca.

1.5.4 UPLC/ESI-MS DAR analiza za LCcys80 ADC

[0400] ADC (1 mg/ml) je redukovan dodavanjem DTT do krajnje koncentracije od 20 mM, praćeno inkubacijom na 60°C tokom 3 minuta. Uzorci su zatim analizirani pomoću Waters Acquity tečne hromatografije ultra performansi i Q-Tof Premier masenog spektrometra.

Uzorci (po 0,5-2 µg svaki) injektirani su u MassPrep kolonu za mikro desalinizaciju na 65°C, eluirani iz kolone sa 5 minuta ravnoteže u 95% mobilne faze A, gradijent od 10 minuta (5-90% B) i 10 minuta ponovne ravnoteže u 95% mobilne faze A, na 0,05 ml/min. Mobilna faza A bila je 0,1% mravlje kiseline u vodi. Mobilna faza B bila je 0,1% mravlja kiselina u acetonitrilu. Maseni spektrometar Q-Tof je pokrenut u pozitivnom jonu, V-modu sa detektovanjem u rasponu od 500-4000 m/z. Izvorni parametri bili su naredni: kapilarni napon, 2,25 kV (netaknuto antitelo)-2,50 kV (redukovano antitelo); napon konusa za uzorkovanje, 65,0 V (netaknuto antitelo) ili 50,0 V (redukovano antitelo); temperatura izvora, 105°C; temperatura rastvaranja, 250°C; protok gasa za rastvaranje, 550 L/sat. Vrh proteina lakog lanca je dekonvoluisan upotrebom MassLynx MaxEnt 1 funkcije. Relativni intenziteti nekonjugovanih i pojedinačno konjugovanih masa lakih lanaca korišćeni su za izračunavanje ukupnog DAR koristeći formulu:

gde LC+1je maseni intenzitet lakog lanca konjugovanog sa jednim citotoksinom, a ∑LCtotje kombinovani intenzitet nekonjugovanog i konjugovanog lakog lanca.

1.6 Karakterizacija vezivanja

1.6.1 BIAcore

[0401] Koncentracije antitela su podešene na 2 µg/mL u HBS-P+ puferu (GE Healthcare). Nemodifikovana antitela, ili ADC, injektirana su preko anti-ljudskog IgG senzora na BIAcore T100 (GE Healthcare) tokom 1 minuta pri protoku od 10 µL/min. Kako bi se zabeležila povezanost antigena sa zarobljenim antitelom, injektirana je serija rastućih koncentracija antigena tokom 300 sekundi pri brzini protoka od 30 µL/min. Za anti-mezotelin antitela, raspon koncentracija je bio 10 nM - 0,041 nM. Za MORAb-003 i MORAb-009 ADC, raspon koncentracija je bio 100 nM - 0,41 nM. Disocijacija antigena praćena je 30 minuta pri istoj brzini protoka. Površina senzora je obnovljena injektiranjem 3 M MgCl2tokom 2 x 30 sek pri protoku od 30 µL/min. Sensogrami su analizirani pomoću softvera za procenu Biacore T100 koristeći 1:1 Langmuir model vezivanja.

1.6.2 ELISA – Folatni receptor alfa

2

[0402] Rekombinantni ljudski folatni receptor alfa je razblažen na 115 ng/mL u puferu za oblaganje (50 mM karbonat-bikarbonat pufer, pH 9,6) i presvučen na Maxisorp crne ploče sa 96 komorica (Thermo, kat. Br.43711, 100 µL/komorica) na 4°C, preko noći. Rastvor za oblaganje je odbačen i ploče su isprane tri puta upotrebom IX PBS sa 0,05% Tween-20 (PBST) pufera. Ploče su blokirane u puferu za blokiranje od 300 µL (1% BSA u PBST) na sobnoj temperaturi tokom 2 sata na orbitalnom šejkeru. MORAb-003 i MORAb-003 ADC su razblaženi do 1000 ng/ml u puferu za blokiranje, zatim serijski razblaženi dvostruko kako bi se dobio raspon od 1000 ng/ml do 0,98 ng/ml. Pufer za blokiranje je odbačen i na pločice je dodato 100 µL/komorica razblaženog antitela. Ploče su inkubirane na sobnoj temperaturi 2 sata na orbitalnom šejkeru. Rastvor antitela je odbačen i ploče su isprane tri puta pomoću PBST. Na pločice je dodato 100 µL/komorica rastvora kozjeg-anti-ljudskog IgG (H+L)-HRP (1:10.000 razblaženja u puferu za blokiranje), i ploče su inkubirane na sobnoj temperaturi tokom1 sata u orbitalnom šejkeru. Sekundarni rastvor antitela je odbačen i ploče su isprane tri puta pomoću PBST. Na ploče je dodato 100 µL/komorica QuantaBlu radnog rastvora supstrata fluorogene peroksidaze (Thermo, kat. Br.15169) i ploče su inkubirane na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. Fluorescencija je očitana pri ekscitaciji 325 nm/emisija 420 nm primenom SpectraMax M5 (Molecular Devices). Podaci su analizirani pomoću SoftMaxPro 5.4.2 softvera sa 4-parametarskim uklapanjem.

1.6.3 ELISA - Mezotelin

[0403] Rekombinantni ljudski mezotelin je razblažen na 1 µg/mL u puferu za oblaganje (50 mM pufer karbonat-bikarbonat, pH 9,6) i presvučen na Maxisorp crne ploče sa 96 komorica (Thermo, kat. Br.43711, 100 µL/komorica) na 4°C, preko noći. Rastvor za oblaganje je odbačen i ploče su isprane tri puta upotrebom IX PBS sa 0,05% Tween-20 (PBST) pufera. Ploče su blokirane u puferu za blokiranje od 300 µL (1% BSA u PBST) na sobnoj temperaturi tokom 2 sata na orbitalnom šejkeru. MORAb009 i MORAb-009 ADC su razblaženi na 1000 ng/ml u puferu za blokiranje, zatim serijski razblaženi 2,5 puta kako bi se dobio raspon od 1000 ng/ml do 0,105 ng/ml. Pufer za blokiranje je odbačen i na pločice je dodato 100 ul/komorica razblaženog antitela. Ploče su inkubirane na sobnoj temperaturi 2 sata na orbitalnom šejkeru. Rastvor antitela je odbačen i ploče su isprane tri puta pomoću PBST. Na pločice je dodato 100 µL/komorica rastvora koujeg-anti-ljudskog IgG (H+L)-HRP (1:10.000 razblaženja u puferu za blokiranje), i ploče su inkubirane na sobnoj temperaturi tokom 1 sata u orbitalnom šejkeru. Sekundarni rastvor antitela je odbačen i ploče su isprane tri puta pomoću PBST. Na ploče je dodato 100 µL/komorica QuantaBlu radnog rastvora supstrata fluorogene peroksidaze (Thermo, kat. Br.15169) i ploče su inkubirane na sobnoj

2

temperaturi tokom 30 minuta. Fluorescencija je očitana pri ekscitaciji 325 nm/emisija 420 nm primenom SpectraMax M5 (Molecular Devices). Podaci su analizirani pomoću SoftMaxPro 5.4.2 softvera sa 4-parametarskim uklapanjem.

1.7 Analize citotoksičnosti

1.7.1 Analiza kristalne ljubičice

[0404] IGROV1 (FR<hi>, MSLN<neg>), NCI-H2110 (FR<med>, MSLN<med>) i A431 (FR<neg>, MSLN<neg>) ćelije su sub-kultivisane i posejane pri 5000 ćelija/komorica u kompletnom medijumu za rast na pločama za kulturu tkiva sa 96 komorica, inkubirane na 37°C, 5% CO2preko noći (16 sati). Ispitivani reagensi su serijski razblaženi 1:3 u 2 mL pločama za razblaživanje sa dubokim komoricama, počevši od 200 nM (ukupno 10 razblaženja). Razređeni uzorci (100 µL) dodati su na ćelijske ploče (početna koncentracija test uzoraka na 100 nM). Ploče su inkubirane na 37°C, 5% CO2dodatnih 5 dana. Medijum je tada odbačen. Ploče su isprane jednom sa 200 µL DPBS, obojene sa 50 µL 0,2% kristalno ljubičastog rastvora na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta, i zatim oprane vodom iz slavine. Ploče su osušene na vazduhu, i Crystal Violet je rastvoren sa 200 µL 1% SDS rastvora. Ploče su očitane na 570 nm. Podaci su analizirani pomoću GraphPad Prism 6.

2. Rezultati

2.1 Biofizička karakterizacija MORAb-003, MORAb-009 i trastuzumab ADC [0405] MORAb-003 (humanizovani anti-ljudski folatni receptor alfa), MORAb-009 (mišjeljudski himerni anti-ljudski mezotelin) i trastuzumab (humanizovani anti-ljudski her2) ADC su pripremljeni koristeći konjugovana jedinjenja eribulina navedena u Tabeli 46 prema jednom od tri postupka konjugacije, uključujući: (1) delimičnu redukciju međulančanih disulfida antitela korišćenjem ne-tiol-redukcionog TCEP, praćeno konjugacijom pomoću tiolreaktivnih maleimido-odstojnik-veznik-eribulin konstrukata; (2) direktnu konjugaciju na ostatke lizina antitela koristeći sukcinimid (Osu)-odstojnik-veznik-eribulin konstrukte; i (3) konjugaciju sa lizinskim ostacima antitela primenom pristupa iz dva koraka, gde je OSu-PEG4-dibenzilciklooktin prvo konjugovan sa ostacima lizina, a zatim je izvršena ortogonalna konjugacija azido-odstojnih-veznik-eribulin konstrukata koristeći SPAAC.

[0406] Nakon prečišćavanja, nivoi agregacije za sve MORAb-003, MORAb-009, i trastuzumab ADC su određeni SEC-HPLC i analiziran je antitelo-lek odnos (DAR) korišćenjem LC-MS reverzne faze i/ili HIC-HPLC. DAR za sve ADC zasnovane na

2

maleimidu je analiziran koristeći LC-MS reverzne faze i HIC-HPLC. Tipično je uočena razlika u DAR vrednostima manja od 0,3 između dva postupka. Suprotno tome, DAR za sve ADC pripremljene konjugacijom kroz ostatke lizina analiziran je samo pomoću LC-MS, jer visok stepen heterogenosti ovih ADC sprečava rastvaranje pojedinih DAR vrsta pomoću HIC-HPLC. Vezivanje za ciljani antigen takođe je analizirano upotrebom ELISA, za MORAb-003 i MORAb-009 ADC. Rezultati DAR i agregacione analize prikazani su u Tabeli 47 pored odgovarajućeg ADC.

2

21

21

21

21

2.1.1 MORAb-003, MORAb-009 i trastuzumab ADC

[0407] Nisu primećene značajne razlike između MORAb-003, MORAb-009 i trastuzumaba, u pogledu efikasnosti konjugacije i biofizičkih parametara. Svi ADC pokazali su slične DAR vrednosti i nivoe formiranja agregata.

21

2.1.2 ADC na bazi maleimida

[0408] Za ADC na bazi maleimida, i pentil i PEG2odstojnici upareni sa val-cit-pAB mestom razdvajanja i PEG2odstojnik uparen sa ala-ala-asn-pAB mestom razdvajanja, pružili su DAR vrednosti između 3,5 i 4,0 reverznom fazom LC-MS i HIC-HPLC, pored niskih (<5%) agregatnih nivoa. Međutim, kada je odstojnik produžen na PEG (uparen sa val-cit-pAB mestom razdvajanja), nivoi agregata su se povećali (11-18%), a efikasnost konjugacije se smanjila, što je rezultovao DAR vrednostima između 1,1 i 2,3. Pogledati npr. procenat agregacije i DAR vrednosti za MORAb003/MORAb009-ER-001159569 (kratki PEG veznik) i MORAb003/MORAb009-1242287 (dugački PEG veznik) u Tabeli 47.

[0409] Za ADC, pripremljene sa disulfidil-pAB mestom razdvajanja, primećene su niske DAR vrednosti (1,0-1,6), zajedno sa relativno visokim nivoima agregata (10-14%). Značajno niže DAR vrednosti primećene su kada su ovi ADC analizirani pomoću LC-MS nego pomoću HIC-HPLC (pogledati, na primer, LAR-LC-MS/HIC-HPLC vrednosti za MORAb003/MORAb009-ER1237504 i MORAb003/MORAb009-ER1237505 u Tabeli 47). Ovaj rezultat sugeriše da mesto razdvajanja veznika pokazuje pH nestabilnost, jer je mobilna faza LC-MS analize približno 3,0, dok je mobilna faza HIC-HPLC analize neutralna.

[0410] Za ADC, pripremljene sa mestom razdvajanja sulfonamida, primećeni su niski (<5%) agregatni nivoi. Slično sa disulfidil-pAB ADC, primećene su niže DAR vrednosti kada se analiziraju pomoću LC-MS (1,8-2,3) nego kod HIC-HPLC (3,9), što opet ukazuje da mesto razdvajanja veznika pokazuje pH nestabilnost.

[0411] Za PEG2i PEG4nerazdvojive veznike, primećena je efikasna konjugacija, što je rezultovao DAR vrednostima između 4,0 i 4,7. MORAb-009 ADC sa ovim nerazdvojivim veznicima takođe su pokazali nizak nivo agregacije (<2%), dok su nešto viši nivoi agregacije primećeni za odgovarajuće MORAb-003 ADC (4% i 10% za PEG2i PEG4, respektivno).

2.1.3 ADC na bazi sukcinimida

[0412] Svi ADC pripremljeni primenom sukcinimida uparnim sa odstojnik-veznikeribulinom rezultovali su DAR vrednostima <1,0. Kako bi se potvrdilo da ova manja efikasnost konjugacije (u odnosu na maleimide) nije posledica samog postupka konjugacije, ovi ADC su prepravljeni upotrebom većeg jedinjenje:antitelo odnosa i ponovo analizirani koristeći iste postupke DAR analize. Dobijeni su slični rezultati, koji sugerišu, bez ograničenja teorijom, da su niže DAR vrednosti inherentno svojstvo kombinacije sukcinimida

21

i eribulina i da se maleimidi mogu efikasnije konjugovati. Efikasnost konjugacije sukcinimida povećana je primenom postupka iz dva koraka, gde je DBCO najpre dodat antitelu upotrebom NHS-DBCO, praćen dodavanjem azido jedinjenja. Ovaj pristup rezultuje višim DAR vrednostima, izmerenim HPLC analizom reverzne faze, u poređenju sa konjugacijom direktno na ostatke lizina antitela. Za ADC na bazi sukcinimida koji imaju sulfonamid (razdvojiv), val-cit-PAB (razdvojiv) ili PEG2/ PEG4(nerazdvojivi) veznike, DAR vrednosti koje su rezultat konjugacije iz dva koraka bile su slične onima utvrđenim za ADC na bazi maleimida koji imaju mesto razdvajanja sulfonamida. Bez ograničavanja teorijom, ovaj rezultat ponovo sugeriše da su niže DAR vrednosti za sukcinimid-odstojnik-veznikeribulin reakcije konjugacije inherentno svojstvo kombinacije sukcinimida i eribulina.

2.2 Karakterizacija vezivanja za MORAb-003 i MORAb-009 ADC

[0413] Za MORAb-003 ADC, nisu primećene značajne razlike između nerazdvojivih veznikeribulina ADC na bazi maleimida i matičnog MORAb-003 u pogledu vezivanja ciljanog antigena. Za ostale veznik-eribulin MORAb-003 ADC na bazi maleimida, tipično je ELISA analizom primećen 2 do 3 puta gubitak u vezivanju ciljanog antigena u odnosu na matični MORAb-003. Međutim, nije bilo očigledne korelacije između dužine veznika ili sastava veznika i niže EC50vrednosti. Slično tome, za veznik-eribulin MORAb-003 ADC na bazi sukcinimida, generalno je primećen 0 do 3 puta gubitak u vezivanju ciljanog antigena u odnosu na nekonjugovani MORAb-003. Opet, nema očigledne korelacije između dužine veznika ili sastava veznika i niže EC50vrednosti. Za MORAb-009 ADC, svi ADC su imali manje od dvostrukog smanjenja EC50vrednosti, u odnosu na matični MORAb-009.

2.3 In vitro analize citotoksičnosti za MORAb-003, MORAb-009 i trastuzumaba ADC [0414] In vitro potencija pripremljenih MORAb-003, MORAb-009 i trastuzumaba ADC procenjena je korišćenjem testa citotoksičnosti zasnovanog na Crystal Violet ćelijama.

Ćelijske linije odabrane za skrining MORAb-003 i MORAb-009 ADC bile su IGROV1, NCI-H2110 i A431. IGROV1 ćelije su poreklom od ljudskog epitelnog raka jajnika i eksprimiranju visok nivo folatnog receptora alfa, ali ne i mezotelina (tj. MORAb-003-reaktivan). NCI-H2110 ćelije su poreklom od ljudskog raka ne-malih ćelija pluća i eksprimiranju umereni nivo i folatnog receptora alfa i mezotelina (tj. MORAb-003- i MORAb-009-reaktivni). A431 kontrolne ćelije su porekla od ljudskog epidermalnog raka i ne eksprimiraju ni ciljani antigen. Rezultati ovog skrininga prikazani su u Tabeli 48. MORAb-003, MORAb-009 i trastuzumab ADC koji sadrže veznik-toksin maleimido-PEG2-val-citpAB-eribulin (VCP-eribulin) takođe su procenjeni u dodatnim ćelijskim linijama raka želuca i raka dojke, uključujući NCI-N87 (FR<neg>, MSLN<med>, her2<hi>), BT-474 (FR<neg>, MSLN<neg>,

21

her2<hi>), ZR-75 (FR<neg>, MSLN<neg>, her2<med>) i NUGC3 (FR<neg>, MSLN<neg>, her2<neg>). Rezultati ovog skrininga prikazani su u Tabeli 49.

22

22

22

22

22

22

22

2

21

22

2

24

2

2.1.1

2.3.1 Citotoksičnost ADC na bazi maleimida

[0415] Svi MORAb-003 i MORAb-009 ADC na bazi maleimida pokazali su specifičnu citotoksičnost na IGROV1 ćelijama, sa razlikom u snazi od 2-3 reda veličine uočene između antitela. AD-val-cit-pAB-eribulin MORAb-003 pokazali su veću efikasnost na IGROV1 ćelijskoj liniji nego bilo koji PEG2ili PEG4nerazdvojivi MORAb-003 ADC, ali specifičnost savijanja nije promenjena. Slični trendovi su primećeni za MORAb-009 ADC, sa nerazdvojivim MORAb-009 ADC koji pokazuju nižu citotoksičnost na IGROV1 ćelijama u odnosu na val-cit-pAB-eribulin MORAb-009 ADC.

2

[0416] MORAb-009 ADC na bazi maleimida sa veznicima na bazi disulfidil- i sulfonamida pokazali su veću efikasnost na NCI-H2110 ćelijskoj liniji od IGROV1 ćelijske linije. Ovo je možda zbog potencijalne nestabilnosti veznika u kulturi, kao što je opisano u nastavku.

Moćna citotoksičnost je takođe primećena sa odgovarajućim MORAb-003 ADC. Nasuprot tome, MORAb-003 i MORAb-009 ADC na bazi maleimida sa nerazdvojivim veznicima pokazali su relativno nisku efikasnost na NCI-H2110 ćelijama. Bez ograničavanja teorijom, ovaj rezultat sugeriše da sa nižim eksprimiranjem cilja, efikasno razdvajanje i oslobađanje korisnog tereta mogu poboljšati citotoksičnost.

[0417] ADC sa val-cit-pAB enzimski razdvojivim veznikom ili nerazdvojivim veznikom pokazali su nizak nivo ubijanja van cilja na A431 kontrolnim ćelijama (IC50> 100 nM), dok su ADC sa ala-ala-asn-pAB enzimski razdvojivim veznikom pokazali slabo, ali uočljivo ubijanje ovih kontrolnih ćelija. Ovo ukazuje na to da val-cit-pAB enzimski razdvijivi veznici mogu biti stabilniji u kulturi ala-ala-asn-pAB-enzimski razdvojivih veznika. Pored toga, MORAb-009 ADC sa kraćim PEG2odstojnikom pokazao je veću citotoksičnost u IGROV1 ćelijama od odgovarajućih ADC sa dužim PEG8odstojnikom. Isti trend je primećen u NCI-H2110 ćelijama i za MORAb-003 i za MORAb-009 ADC, sa kraćim dužinama odstojnika što je rezultovao većom citotoksičnošću.

[0418] ADC sa veznicima na bazi sulfonamida generalno pokazuju veće DAR vrednosti i niže nivoe agregata od odgovarajućih ADC sa veznicima na bazi disulfidila. Međutim, primećeno je ubijanje A431 kontrolnih ćelija na nM nivou u obe ove kategorije ADC, što sugeriše da su veznici na disulfidil- i sulfonamid- bazi bili manje stabilni u kulturi od enzimski razdvojivih veznika u ispitivanim uslovima.

[0419] Specifični veznik-toksin maleimido-PEG2-val-cit-pAB-eribulin (VCP-eribulin) je dalje ispitivan radi specifičnosti i potencije na različitim ćelijskim linijama raka želuca i raka dojke. VCP-eribulin je konjugovan sa MORAb-003 i MORAb-009, pored anti-ljudskog her2 antitela trastuzumaba. MORAb-003-VCP-eribulin pokazao je slabo, ali specifično ubijanje na NCI-N87 ćelijama, koje eksprimiranju nizak nivo receptora alfa (FR), i malo ubijanja na preostale tri FR-negativne ćelijske linije. MORAb-009-VCP-eribulin je takođe pokazao snažnu citotoksičnost na NCI-N87 ćelijama, koje eksprimiranju umereni nivo mezotelina. Trastuzumab-VCP-eribulin je bio veoma potentan (3 - 6 pM, IC50) na NCI-N87 i BT-474 ćelijama, dve ćelijske linije koje eksprimiranju visok nivo her2, i takođe potentan na ZR-75

2

ćelijama raka dojke, koje je samo umereno eksprimiraju her2. MORAb-003, MORAb-009 i trastuzumab VCP-eribulin ADC su pokazali nisku citotoksičnost na NUGC3 ćelijama, uz nedostatak eksprimiranja FR, mezotelina ili her2, odgovarajućih ciljanih antigena.

2.3.2 citotoksičnost ADC na bazi sukcinimida

[0420] Trendovi u citotoksičnosti ADC na bazi sukcinimida bili su slični ADC na bazi maleimida za IGROV1 ćelije, gde PEG8odstojnik ADC koji pokazuju nisku citotoksičnost pored niskih DAR vrednosti. Niža citotoksičnost i na IGROV1 i na NCI-H2110 ćelijama generalno je primećena za ADC na bazi sukcinimida sa enzimima koji se mogu razdvojiti u poređenju sa odgovarajućim ADC na bazi maleimida, što je najverovatnije posledica njihovih nižih DAR vrednosti. Takođe je primećeno ubijanje A431 ćelija van cilja pomoću veznika na disulfidil- i sulfonamid- bazi, slično odgovarajućim ADC na bazi maleimida. Ovo ukazuje na povećanu nestabilnost koja potencijalno može nastati na mestu razdvajanja, umesto na hemiji konjugacije.

[0421] Kada je izvedena konjugaciju iz dva koraka, primećene su veće DAR vrednosti u odnosu na one dobijene pristupom direktne sukcinimidne konjugacije. Ove veće DAR vrednosti korelirale su sa većom potencijom. Za VCP-eribulin MORAb-003 ADC, primećena je snažna citotoksičnost i na IGROV1 i na NCI-H2110 ćelijama. Iako su nerazdvojivi MORAb-003 ADC pokazali potenciju na IGROV1 ćelijama (1–4 nM), oni su i dalje bili manje potentni od VCP-eribulin MORAb-003 ADC pripremljenog ovom postupkom (38 pM), iako su DAR vrednosti bile uporedive. Pored toga, nerazdvojivi MORAb-003 ADC pripremljeni postupkom iz dva koraka bili su nešto manje potentni od odgovarajućih ADC na bazi maleimida na IGROV1 ćelijskoj liniji, što može biti zbog njihovih nižih DAR vrednosti. Slično njihovim pandanima na bazi maleimida, nerazdvojivi ADC pripremljeni postupkom iz dva koraka takođe su izgubili gotovo svu citotoksičnost na ćelijama NCI-2110.

2.4 Biofizička karakterizacija ADC protiv ljudskog mezotelina (LCcys80)

[0422] MAL-PEG2-Val-Cit-PAB-eribulin (ER-001159569) je konjugovan sa osam različitih antitela protiv ljudskog mezotelina (Tabela 1). Afiniteti vezivanja matičnih antitela određeni su BIAcore analizom, kao što je opisano iznad u odeljku 1.6.1. Nivoi agregacije za sve ADC protiv ljudskog mezotelina određeni su pomoću SEC-HPLC i DAR su analizirani pomoću HIC-HPLC. In vitro potencija je procenjena korišćenjem Crystal Violet testa citotoksičnosti na bazi ćelija u A3 (A431 stabilno transficiran ljudskim mezotelinom (MSLN), MSLN<hi>), OVCAR3 (ljudski jajnik, MSLN<hi>), HEC-251 (ljudski endometroid, MSLN<med>), H226 (ljudski mezoteliom skvamoznih ćelija pluća, MSLN<lo>) i A431 matične (MSLN<neg>) ćelije.

2

Rezultati analize DAR, agregacije i citotoksičnosti prikazani su u tabeli 50.

Tabela 50. Biofizička karakterizacija ADC protiv ljudskog mezotelina (LCcys80)

2

[0423] Svi ADC protiv ljudskog mezotelina zadržali su nizak nivo agregacije (<10% agregata) i pokazali visoku efikasnost na ciljanim ćelijskim linijama. Visoka potencija je primećena na A3 i OVCAR3, dok su HEC-251 i H226 ćelije bile relativno otporne na ADC citotoksičnost.

24

Odabrane sekvence:

[0424]

24

24

24

��

24

24

�

21

22

2

24

2

2

2

2

2

�

21

22

�

24

2

2

2

2

2

2

21

22

2

24

2

2

2

2

2

2

21

22

2

24

2

2

2

2

2

2

21

22

2

24

2

2

2

2

2

1

2

4

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

2

21

22

2

24

2

2

2

2

2

1

2

4

4

41

42

4

44

4

4

4

4

4

1

2

4

�

2

�

1

2

4

1

�

4

1

2

4

4

41

42

4

44

Claims (13)

Patentni zahtevi

1. Antitelo-lek konjugat Formule (I):

Ab-(L-D)p(I)

gde

(i) Ab je internalizujuće antitelo protiv folatnog receptora alfa ili njegov internalizujući fragment koji vezuje antigen koji obuhvata tri regiona za određivanje komplementarnosti teškog lanca (HCDR) koji obuhvataju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:2 (HCDR1), SEQ ID NO:3 (HCDR2), i SEQ ID NO:4 (HCDR3); i tri regiona za određivanje komplementarnosti lakog lanca (LCDR) koji obuhvataju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:7 (LCDR1), SEQ ID NO:8 (LCDR2), i SEQ ID NO:9 (LCDR3), kako je definisano Kabat sistemom numerisanja; ili tri regiona za određivanje komplementarnosti teškog lanca (HCDR) koji obuhvataju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:13 (HCDR1), SEQ ID NO:14 (HCDR2), i SEQ ID NO:15 (HCDR3); i tri regiona za određivanje komplementarnosti lakog lanca (LCDR) koji obuhvataju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:16 (LCDR1), SEQ ID NO:17 (LCDR2), i SEQ ID NO:18 (LCDR3), kako je definisano IMGT sistemom numerisanja;

(ii) D je eribulin;

(iii) L je razdvojivi veznik koji obuhvata Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB; i

(iv) p je ceo broj od 1 do 8.

2. Antitelo-lek konjugat prema patentnom zahtevu 1, gde antitelo ili fragment koji vezuje antigen sadrže varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 23, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO : 24.

3. Antitelo-lek konjugat prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, gde je p ceo broj od 3 do 4.

4. Antitelo-lek konjugat prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 3, gde antitelo ili fragment koji vezuje antigen obuhvata ljudski IgG1 konstantni domen teškog lanca i ljudski Ig kapa konstantni domen lakog lanca.

4

5. Sastav koji sadrži višestruke kopije antitelo-lek konjugata prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 4, gde prosek p antitelo-lek konjugata u sastavu iznosi od oko 3,2 do oko 3,8 ili od oko 3,6 do oko 4,4.

6. Antitelo-lek konjugat prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 4 ili sastav prema patentnom zahtevu 5, za upotrebu u tretmanu raka koji eksprimira folatni receptor alfa.

7. Antitelo-lek konjugat za upotrebu prema patentnom zahtevu 6, gde je rak rak želuca, serozni rak jajnika, bistroćelijski rak jajnika, rak ne-malih ćelija pluća, kolorektalni rak, trostruko negativni rak dojke, rak endometrijuma, serozni rak endometrijuma, karcinoid pluća ili osteosarkom.

8. Farmaceutski sastav koji sadrži antitelo-lek konjugat prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 4 ili sastav prema patentnom zahtevu 5, i farmaceutski prihvatljiv nosač.

9. Postupak za proizvodnju antitelo-lek konjugata prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 4 ili sastava prema patentnom zahtevu 5, koji obuhvata reagovanje antitela ili fragmenta koji vezuje antigen sa razdvojivim veznikom spojenim za eribulin pod uslovima koji omogućavaju konjugaciju.

10. Postupak određivanja da li će pacijent reagovati na tretman antitelo-lek konjugatom prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 4 ili smešom prema patentnom zahtevu 5, koji obuhvata uzimanje biološkog uzorka od pacijenta i dovođenje biološkog uzorka u dodir sa antitelo-lek konjugatom prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 4 ili sastavom prema patentnom zahtevu 5.

11. Postupak prema patentnom zahtevu 10, gde je biološki uzorak biopsija tumora raka želuca, seroznog raka jajnika, bistroćelijskog raka jajnika, raka ne-malih ćelija pluća, kolorektalnog raka, trostrukog negativnog raka dojke, raka endometrijuma, seroznog raka endometrijuma, karcinoida pluća ili osteosarkoma.

12. Sastav koji sadrži više kopija antitelo-lek konjugata Formule (I):

4

Ab-(L-D)p(I)

gde

(i) Ab je internalizujuće antitelo protiv folatnog receptora alfa ili njegov internalizujući fragment koji vezuje antigen koji obuhvata tri regiona za određivanje komplementarnosti teškog lanca (HCDR) koji obuhvataju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:2 (HCDR1), SEQ ID NO:3 (HCDR2), i SEQ ID NO:4 (HCDR3); i tri regiona za određivanje komplementarnosti lakog lanca (LCDR) koji obuhvataju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:7 (LCDR1), SEQ ID NO:8 (LCDR2), i SEQ ID NO:9 (LCDR3), kako je definisano Kabat sistemom numerisanja; ili tri regiona za određivanje komplementarnosti teškog lanca (HCDR) koji obuhvataju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:13 (HCDR1), SEQ ID NO:14 (HCDR2), i SEQ ID NO:15 (HCDR3); i tri regiona za određivanje komplementarnosti lakog lanca (LCDR) koji obuhvataju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:16 (LCDR1), SEQ ID NO:17 (LCDR2), i SEQ ID NO:18 (LCDR3), kako je definisano IMGT sistemom numerisanja;

(ii) D je eribulin;

(iii) L je razdvojivi veznik koji obuhvata Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB; i

(iv) p je prosečan broj -L-D delova po Ab, gde prosečan p antitelo-lek konjugata u sastavu iznosi od oko 3,6 do oko 4,4.

13. Sastav prema patentnom zahtevu 12, gde antitelo ili fragment koji vezuje antigen obuhvataju varijabilni region teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:23, i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:24.

4