Deprecated: The each() function is deprecated. This message will be suppressed on further calls in /home/zhenxiangba/zhenxiangba.com/public_html/phproxy-improved-master/index.php on line 456
RS62150B1 - Konstrukti varijante sirp-αlfa i njihove upotrebe - Google Patents
[go: Go Back, main page]

RS62150B1 - Konstrukti varijante sirp-αlfa i njihove upotrebe - Google Patents

Konstrukti varijante sirp-αlfa i njihove upotrebe

Info

Publication number
RS62150B1
RS62150B1 RS20210831A RSP20210831A RS62150B1 RS 62150 B1 RS62150 B1 RS 62150B1 RS 20210831 A RS20210831 A RS 20210831A RS P20210831 A RSP20210831 A RS P20210831A RS 62150 B1 RS62150 B1 RS 62150B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
sirp
variant
cancer
binding
seq
Prior art date
Application number
RS20210831A
Other languages
English (en)
Inventor
Laura Deming
Corey Goodman
Jaume Pons
Bang Janet Sim
Marija Vrljic
Original Assignee
Alx Oncology Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from TW104125902A external-priority patent/TWI702228B/zh
Application filed by Alx Oncology Inc filed Critical Alx Oncology Inc
Publication of RS62150B1 publication Critical patent/RS62150B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6815—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6871—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting an enzyme
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
    • C12Y301/03048—Protein-tyrosine-phosphatase (3.1.3.48)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/95—Fusion polypeptide containing a motif/fusion for degradation (ubiquitin fusions, PEST sequence)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)

Description

Opis
STANJE TEHNIKE
[0001] Signal-regulatorni protein α (SIRP-α) je protein široko eksprimiran na membrani mijeloidnih ćelija. SIRP-α interaguje sa CD47, proteinom koji je široko eksprimiran na mnogim tipovima ćelija u telu. Interakcija SIRP-α sa CD47 sprečava apsorpciju sopstvenih ćelija, što bi imuni sistem inače mogao prepoznati. SIRP-α je prvi put otkriven kao agens koji vezuje SHP-2 (SH-2 domen koji sadrži tirozin fosfatazu). CD47 je ranije naznačen kao prekomerno eksprimirani antigen na ćelijama karcinoma jajnika.
[0002] 2000. godine Oldenborg et al. su pokazali da je primena CD47-deficijentnih crvenih krvnih zrnaca (CKZ) u mišijem modelu rezultirala brzim uklanjanjem CKZ iz sistema, što pokazuje da je CD47 "zaštitni" signal na nekim podskupovima sopstvenih ćelija. Naknadno, dalje je istražena potencijalna veza između SIRP-α i kancera. Otkriveno je da je visoko eksprimirani CD47 na ćelijama tumora delovao, u akutnoj mijeloidnoj leukemiji (AML) i nekoliko čvrstih tumora, kao negativni prognostički faktor preživljavanja. Strategije usmerene na narušavanje interakcije između CD47 i SIRP-α, kao što je primena sredstava koja maskiraju bilo CD47 ili SIRP-α, istražene su kao potencijalne terapije protiv kancera.
[0003] WO 2016/023040 opisuje konstrukte varijante SIRP-α i njihovu upotrebu. WO 2010/070047 opisuje rastvorljive polipeptide koji se vezuju za CD47 za upotrebu u lečenju autoimunih i zapaljenskih poremećaja.
[0004] Međutim, uzimajući u obzir ove terapijske strategije, zabrinjavajuće je to što bi SIRP-α mogao da se veže za CD47 na mnogim različitim tipovima ćelija u ljudskom telu. Dakle, postoji potreba za inženjeringom SIRP-α kako bi se preferirano vezivao za CD47 samo na obolelim ćelijama ili na ćelijama na obolelom mestu.
SAŽETAK PRONALASKA
[0005] Pronalazak sadrži konstrukte varijante signal-regulatornog proteina α (SIRP-α). Ovaj pronalazak daje konstrukt varijante signal-regulatornog proteina α (SIRP-α), koji sadrži varijantu SIRP-α vezanu za blokirajući peptid na bazi CD47 pomoću deljivog veznika, pri čemu blokirajući peptid na bazi CD47 ima najmanje 80% identičnosti sekvence sa sekvencom IgSF domena CD47 divljeg tipa (SEQ ID NO: 35) ili njegovog fragmenta koji može da veže varijantu SIRP-α, a gde varijanta SIRP-α sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X
8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRIGX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDDVE X16KSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 13), gde je X1L, I, ili V; X2je V, L, ili, I; X3je A ili V; X4je A, I, ili L; X5je I, T, S, ili F; X6je E, V, ili L; X7je K ili R; X8je E ili Q; X9je H, P, ili R; X10je L, T, ili G; X11je K ili R; X12je N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, ili Y; X13je P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, ili Y; X14je V ili I; X15je F, L, ili V; i X16je F ili V. Konstrukti varijante SIRP-α uključuju SIRP-α varijante. U nekim primerima izvođenja, konstrukti varijante SIRP-α imaju preferiranu aktivnost na obolelom mestu (npr. na mestu tumora u odnosu na ne-obolelom mestu). U određenim primerima izvođenja, konstrukti varijante SIRP-α imaju veći afinitet vezivanja za CD47 na obolelim ćelijama (npr. ćelije tumora). U nekim primerima izvođenja, SIRP-α varijante se vezuju većim afinitetom za CD47 pri kiseloj pH vrednosti (npr. pH manje od oko 7) i/ili pod hipoksičnim uslovima u odnosu na fiziološke uslove. U nekim primerima izvođenja, SIRP-α varijante sadrže jednu ili više supstituisanih aminokiselina ostacima histidina ili drugim aminokiselinama koje omogućavaju preferirano vezivanje konstrukata varijante SIRP-α na obolelom mestu. U nekim primerima izvođenja, sprečava se vezivanje konstrukata varijante SIRP-α za CD47 na ne-obolelom mestu pomoću blokirajućeg peptida. U nekim primerima izvođenja, konstrukti varijante SIRP-α ciljno deluju na obolelo mesto (npr. tumor) ciljanim delom (npr. antitelo usmereno na antigen povezan sa tumorom ili antitelo-vezujući peptid). Pronalazak takođe sadrži farmaceutske kompozicije koje sadrže: a) terapeutski efikasnu količinu konstrukta varijante SIRP-α prema pronalasku i (b) farmaceutski prihvatljiv ekscipijens. Predmet pronalaska dalje obezbeđuje konstrukte varijante SIRP-α ili farmaceutske kompozicije prema pronalasku za upotrebu u postupcima za lečenje različitih bolesti, kao što su kancer, poželjno čvrsti tumor i hematološki kancer.
[0006] U jednom aspektu, pronalazak sadrži konstrukt varijante signal-regulatornog proteina α (SIRP-α), pri čemu se konstrukt varijante SIRP-α preferirano vezuje za CD47 na obolelim ćelijama ili na obolelom mestu u odnosu na ne-obolele ćelije. U nekim primerima izvođenja, konstrukt varijante SIRP-α vezuje se za CD47 na obolelim ćelijama ili na obolelom mestu većim afinitetom nego što vezuje CD47 na ne-obolelim ćelijama.
[0007] U nekim primerima izvođenja, konstrukt varijante SIRP-α uključuje SIRP-α varijantu koja je vezana za blokirajući peptid. U nekim primerima izvođenja, blokirajući peptid se veže većim afinitetom za divlji tip SIRP-α nego za SIRP-α varijantu. U nekim primerima izvođenja, SIRP-α varijanta se veže većim afinitetom za divlji tip CD47 nego za blokirajući peptid.
[0008] Blokirajući peptid je blokirajući peptid na bazi CD47. U nekim primerima izvođenja, blokirajući peptid na bazi CD47 uključuje deo koji ima najmanje 80% identičnosti aminokiselinske sekvence sa sekvencom IgSF domena CD47 divljeg tipa (SEQ ID NO: 35) ili njegovim fragmentom koji se može vezati sa SIRP-α varijantom. U nekim primerima izvođenja, blokirajući peptid na bazi CD47 ima sekvencu SEQ ID NO: 38 ili 40.
[0009] Ovde su dati konstrukti varijante SIRP-α, koji sadrže ovde opisanu SIRP-α varijantu, pri čemu je navedena SIRP-α varijanta vezana za blokirajući peptid ovde opisan korišćenjem najmanje jednog deljivog veznika. U nekim primerima izvođenja, SIRP-α varijanta može sadržati isto mesto vezivanja sa CD47 kao divlji tip SIRP-α. U nekim primerima izvođenja, SIRP-α varijanta može sadržati jednu ili više mutacija ili insercija u poređenju sa divljim tipom SIRP-α. U nekim primerima izvođenja, SIRP-α varijanta može biti skraćeni oblik divljeg tipa SIRP-α. U nekim primerima izvođenja, blokirajući peptid može biti CD47 oponašač, varijanta ili fragment ovde opisan. U nekim primerima izvođenja, blokirajući peptid može pokazati veći afinitet za divlji tip SIRP-α, u poređenju sa SIRP-α varijantom u konstruktu varijante SIRP-α. U nekim primerima izvođenja, blokirajući peptid može biti polipeptid varijanta CD47 koji pokazuje niži afinitet za SIRP-α varijantu u poređenju sa divljim tipom CD47. U nekim primerima izvođenja, veznik između SIRP-α varijante i blokirajućeg peptida može biti najmanje jedan veznik koji se opciono može deliti pomoću jedne ili više proteaza. U nekim primerima izvođenja, veznik opciono takođe sadrži jedan ili više odstojnika.
[0010] SIRP-α varijanta je vezana za blokirajući peptid pomoću deljivog veznika i opciono jednog ili više odstojnika. U nekim primerima izvođenja, deljivi veznik se deli pod kiselim pH i/ili hipoksičnim uslovima. U nekim primerima izvođenja, deljivi veznik se deli enzimom povezanim sa tumorom. U nekim primerima izvođenja, enzim povezan sa tumorom je proteaza. U nekim primerima izvođenja, proteaza se bira iz grupe koja sadrži matriptazu (MTSP1), aktivator plazminogena urinarnog tipa (uPA), legumain, PSA (takođe nazvan KLK3, peptidaza-3 povezana sa kalikreinom), matriks metaloproteinaza-2 (MMP-2), MMP9, humana neutrofilna elastaza (HNE) i proteinaza 3 (Pr3). U nekim primerima izvođenja, proteaza je matriptaza. U nekim primerima izvođenja, deljivi veznik ima sekvencu LSGRSDNH (SEQ ID NO: 47) ili bilo koju od sekvenci navedenih u Tabeli 7. PRFKIIGG, PRFRIIGG, SSRHRRALD, RKSSIIIRMRDVVL, SSSFDKGKYKKGDDA, SSSFDKGKYKRGDDA, IEGR, IDGR, GGSIDGR, PLGLWA, GPLGIAGI, GPEGLRVG, YGAGLGVV, AGLGVVER, AGLGISST, DVAQFVLT, VAQFVLTE, AQFVLTEG, PVQPIGPQ, L/S/G-/R--/S-/D/N/H, - /s/gs/Rk-/rv/-/-/-, SGR-SA, L/S/G-/R--/S-/D/N/H, r/-/-/Rk-/v-/-/g/-, RQAR-VV, r/-/-/Rk/v/-/g, /Kr/RKQ/gAS/RK/A, L/S/G-/R-/S-/D/N/H, -/-/-/N/-/-/-, AAN-L, ATN-L, si/sq/-/yqrs/s/-/-, S/S/K/L/Q, -/p/-/- /li/- /-/-, g/pa/-/gl/-/g/-, G/P/L/G/I/A/G/Q, P/V/G/L/I/G, H/P/V/G/L/L/A/R, -/-/-/viat-/-/-/-, i -/y/y/vta -/-/-/- gde "-" označava bilo koju aminokiselinu (tj. bilo koju aminokiselinu koja se prirodno javlja), veliko početno slovo ukazuje na snažnu preferiranost ka toj aminokiselini, malo slovo ukazuje na manju preferiranost prema toj aminokiselini, a "/" razdvaja položaje aminokiselina u primerima izvođenja gde je više od jedne aminokiseline u susednom položaju „/“ moguće.
[0011] U nekim primerima izvođenja, SIRP-α varijanta je vezana za antitelo-vezujući peptid. U nekim primerima izvođenja, antitelo-vezujući peptid vezuje se za konstantni region antitela reverzibilno ili ireverzibilno. U nekim primerima izvođenja, antitelo-vezujući peptid se vezuje za fragmentni region za vezivanje antigena (Fab) antitela, reverzibilno ili ireverzibilno. U nekim primerima izvođenja, antitelo-vezujući peptid se vezuje za promenljivi region antitela reverzibilno ili ireverzibilno. U nekim primerima izvođenja, antitelo je Cetuksimab. U nekim primerima izvođenja, antitelo-vezujući peptid ima najmanje 75% identičnosti aminokiselinske sekvence sa sekvencom peptida za lokalizaciju bolesti (DLP) (CQFDLSTRRLKC (SEQ ID NO: 64) ili CQYNLSSRALKC (SEQ ID NO: 65)) ili njegovim fragmentom. U nekim primerima izvođenja, antitelo-vezujući peptid ima sekvencu SEQ ID NO: 64.
[0012] U nekim primerima izvođenja, SIRP-α varijanta je vezana za monomer Fc domena. U nekim primerima izvođenja, varijanta SIRP-α je vezana za humani serumski albumin (HSA). U nekim primerima izvođenja, HSA uključuje aminokiselinsku supstituciju C34S i/ili K573P, u odnosu na SEQ ID NO: 67. U nekim primerima izvođenja, HSA ima sekvencu
[0013] U nekim primerima izvođenja, SIRP-α varijanta je vezana za albumin-vezujući peptid. U nekim primerima izvođenja, albumin-vezujući peptid ima sekvencu SEQ ID NO: 2. U nekim primerima izvođenja, SIRP-α varijanta je vezana za polimer, pri čemu je polimer lanac polietilen glikola (PEG) ili lanac polisijalne kiseline.
[0014] U nekim primerima izvođenja, SIRP-α varijanta je vezana za antitelo. U nekim primerima izvođenja, antitelo je antitelo specifično za tumor. U nekim primerima izvođenja, antitelo (npr. antitelo specifično za tumor) izabrano je iz grupe koju čine cetuksimab, pembrolizumab, nivolumab, pidilizumab, MEDI0680, MEDI6469, Ipilimumab, tremelimumab, urelumab, vantictumab, varlilumab, mogamalizumab, anti-CD20 antitelo, anti-CD20 antitelo, anti-CS1 antitelo, herceptin, trastuzumab i pertuzumab. U nekim primerima izvođenja, antitelo (npr. antitelo specifično za tumor) može se vezati za jedno ili više od sledećih: 5T4, AGS-16, ALK1, ANG-2, B7-H3, B7-H4, c-fms, c-Met, CA6, CD123, CD19, CD20, CD22, EpCAM, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD52, CD70, CD74, CD79b, CD98, CEA, CEACAM5, CLDN18.2, CLDN6, CS1, CXCR4, DLL-4, EGFR, EGP-1, ENPP3, EphA3, ETBR, FGFR2, fibronektin, FR-alfa, GCC, GD2, glipikan-3, GPNMB, HER-2, HER3, HLA-DR, ICAM-1, IGF-1R, IL-3R, LIV-1, mezotelin, MUC16, MUC1, NaPi2b, Nektin-4, Notch 2, Notch 1, PD-L1, PD-L2, PDGFR-α, PS, PSMA, SLTRK6, STEAP1, TEM1, VEGFR, CD25, CD27L, DKK-1, i/ili CSF-1 R.
[0015] U nekim primerima izvođenja, SIRP-α varijanta u konstruktu varijante SIRP-α ima najmanje 80% (npr., najmanje 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97%, 98% ili 99%) identičnosti sekvence sa sekvencom bilo koje od SEQ ID NOs: 3-12 i 24-34.
[0016] U nekim primerima izvođenja, SIRP-α varijanta u konstruktu varijante SIRP-α ima sekvencu EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYN QX7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRIGX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKG SPDDVEX16KSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 13), u kojoj X1je L, I, ili V; X2je V, L, ili I; X3je A ili V; X4je A, I, ili L; X5je I, T, S, ili F; X6je E, V, ili L; X7je K ili R; X8je E ili Q; X9je H, P, ili R; X10je L, T, ili G; X11je K ili R; X12je N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, je Y; X13je P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, ili Y; X14je V ili I; X15je F, L, ili V; i X16je F ili V.
[0017] U nekim aspektima, SIRP-α varijanta u konstruktu varijante SIRP-α ima sekvencu EEGX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILHCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQ X7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRIGX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSP DDVEX16KSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 16), u kojoj X1je L, I, ili V; X2je V, L, ili, I; X3je A ili V; X4je A, I, ili L; X5je I, T, S, ili F; X6je E, V, ili L; X7je K ili R; X8je E ili Q; X9je H, P, ili R; X10je L, T, ili G; X11je K ili R; X12je N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, ili Y; X13je P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, ili Y; X14je V ili I; X15je F, L, ili V; i X16je F ili V.
[0018] U nekim aspektima, SIRP-α varijanta u konstruktu varijante SIRP-α ima sekvencu EEEX1QX2IQPDKFVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRIGX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPD DVEX16KSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 17), u kojoj X1je L, I, ili V; X2je V, L, ili, I; X3je A ili V; X4je A, I, ili L; X5je I, T, S, ili F; X6je E, V, ili L; X7je K ili R; X8je E ili Q; X9je H, P, ili R; X10je L, T, ili G; X11je K ili R; X12je N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, ili Y; X13je P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, ili Y; X14je V ili I; X15je F, L, ili V; i X16je F ili V.
[0019] U nekim aspektima, SIRP-α varijanta u konstruktu varijante SIRP-α ima sekvencu EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFPIRIGX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPD DVEX16KSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 18), u kojoj X1je L, I, ili V; X2je V, L, ili, I; X3je A ili V; X4je A, I, ili L; X5je I, T, S, ili F; X6je E, V, ili L; X7je K ili R; X8je E ili Q; X9je H, P, ili R; X10je L, T, ili G; X11je K ili R; X12je N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, ili Y; X13je P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, ili Y; X14je V ili I; X15je F, L, ili V; i X16je F ili V.
[0020] U nekim aspektima, SIRP-α varijanta u konstruktu varijante SIRP-α ima sekvencu EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRISX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDD VEX16KSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 21), u kojoj X1je L, I, ili V; X2je V, L, ili, I; X3je A ili V; X4je A, I, ili L; X5je I, T, S, ili F; X6je E, V, ili L; X7je K ili R; X8je E ili Q; X9je H, P, ili R; X10je L, T, ili G; X11je K ili R; X12je N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, t, V, W, ili Y; X13je P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, ili Y; X14je V ili I; X15je F, L, ili V; I X16je F ili V.
[0021] U nekim aspektima, SIRP-α varijanta u konstruktu varijante SIRP-α ima sekvencu EEEX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILHCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X
8GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDTE X16KSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 14), u kojoj X1je L, I, ili V; X2je V, L, ili, I; X3je A ili V; X4je V, I, ili L; X5je I, T, S, ili F; X6je E, V, ili L; X7je K ili R; X8je E ili Q; X9je H, P, ili R; X10je S, T, ili G; X11je K ili R; X12je N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, ili Y; X13je P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, ili Y; X14je V ili I; X15je F, L, ili V; i X16je F ili V.
[0022] U nekim aspektima, SIRP-α varijanta u konstruktu varijante SIRP-α ima sekvencu EEEX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILLCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDTE X16KSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 15), u kojoj X1je L, I, ili V; X2je V, L, ili, I; X3je A ili V; X4je V, I, ili L; X5je I, T, S, ili F; X6je E, V, ili L; X7je K ili R; X8je E ili Q; X9je H, P, ili R; X10je S, T, ili G; X11je K ili R; X12je N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, ili Y; X13je P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, ili Y; X14je V ili I; X15je F, L, ili V; I X16je F ili V.
[0023] U nekim aspektima, SIRP-α varijanta u konstruktu varijante SIRP-α ima sekvencu EEEX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILHCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X
8GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDTE X16KSGAGTELSVRGKPS (SEQ ID NO: 19), u kojoj X1je L, I, ili V; X2je V, L, ili, I; X3je A ili V; X4je V, I, ili L; X5je I, T, S, ili F; X6je E, V, ili L; X7je K ili R; X8je E ili Q; X9je H, P, ili R; X10je S, T, ili G; X11je K ili R; X12je N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, ili Y; X13je P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, ili Y; X14je V ili I; X15je F, L, ili V; i X16je F ili V.
[0024] U nekim aspektima, SIRP-α varijanta u konstruktu varijante SIRP-α ima sekvencu EEEX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILHCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X
8GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDTE X16KSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 22), u kojoj X1je L, I, ili V; X2je V, L, ili, I; X3je A ili V; X4je V, I, ili L; X5je I, T, S, ili F; X6je E, V, ili L; X7je K ili R; X8je E ili Q; X9je H, P, ili R; X10je S, T, ili G; X11je K ili R; X12je N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, ili Y; X13je P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, ili Y; X14je V ili I; X15je F, L, ili V; i X16je F ili V.
[0025] U nekim aspektima, SIRP-α varijanta u konstruktu varijante SIRP-α ima sekvencu EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDT EX16KSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 20), u kojoj X1je L, I, ili V; X2je V, L, ili, I; X3je A ili V; X4je A, I, ili L; X5je I, T, S, ili F; X6je E, V, ili L; X7je K ili R; X8je E ili Q; X9je H, P, ili R; X10je S, T, ili G; X11je K ili R; X12je N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, ili Y; X13je P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, ili Y; X14je V ili I; X15je F, L, ili V; i X16je F ili V.
[0026] U nekim aspektima, SIRP-α varijanta u konstruktu varijante SIRP-α ima sekvencu EEX1X2QX3IQPDKX4VX5VAAGEX6X7X8LX9CTX10TSLX11PVGPIQWFRGAGPX12RX13LIYNQX14X15GX16FPRVTTVSX17X18TX19RX20NMDFX21IX22IX23X24ITX25ADAGTY YCX26KX27RKGSPDX28X29EX30KSGAGTELSVRX31KPS (SEQ ID NO: 23), u kojoj X1je E ili G; X2je L, I, ili V; X3je V, L, ili, I; X4je S ili F; X5je L ili S; X6je S ili T; X7je A ili V; X8je I ili T; X9je H ili R; X10je A, V, I, ili L; X11je I, T, S, ili F; X12je A ili G; X13je E, V, ili L; X14je K ili R; X15je E ili Q; X16je H, P, ili R; X17je D ili E; X18je S, L, T, ili G; X19je K ili R; X20je E ili N; X21je S ili P; X22je S ili R; X23je S ili G; X24je N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, ili Y; X25je P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, ili Y; X26je V ili I; X27je F, L, V; X28je D ili je odsutan; X29je T ili V; X30je F ili V; i X31je A ili G.
[0027] U nekim aspektima, SIRP-α varijanta u konstruktu varijante SIRP-α ima najmanje 80% (npr., najmanje 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%) identičnosti sekvence sa sekvencom bilo koje od SEQ ID NOs: 13-23.
[0028] U nekim primerima izvođenja, SIRP-α varijanta u konstruktu varijante SIRP-α ne uključuje sekvencu bilo koje od SEQ ID NOs: 3-12 i 24-34.
[0029] U nekim aspektima, SIRP-α varijanta u konstruktu varijante SIRP-α uključuje jednu ili više supstitucija aminokiselinskih ostataka histidinskim ostacima. U nekim aspektima, jedna ili više supstitucija aminokiselinskih ostataka histidinskim ostacima nalaze se na jednom ili više sledećih položaja aminokiselina: 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 52, 53, 54, 66 , 67, 68, 69, 74, 93, 96, 97, 98, 100, 4, 6, 27, 36, 39, 47, 48, 49, 50, 57, 60, 72, 74, 76, 92, 94 , 103, u odnosu na sekvencu bilo koje od SEQ ID NOs: 3-12.
[0030] U nekim primerima izvođenja, konstrukt varijante SIRP-α vezuje se sa najmanje dva, najmanje četiri ili najmanje šest puta većim afinitetom za CD47 na obolelim ćelijama ili na obolelom mestu nego na ne-obolelim ćelijama.
[0031] U nekim primerima izvođenja, konstrukt varijante SIRP-α vezuje se sa najmanje dva, najmanje četiri ili najmanje šest puta većim afinitetom za CD47 pod kiselim pH nego pod neutralnim pH.
[0032] U nekim primerima izvođenja, konstrukt varijante SIRP-α vezuje se sa najmanje dva, najmanje četiri ili najmanje šest puta većim afinitetom za CD47 pod hipoksičnim uslovima nego pod fiziološkim uslovima.
[0033] U nekim primerima izvođenja, obolela ćelija je ćelija kancera bolesti kancera.
[0034] U nekim primerima izvođenja, kiseli pH je pH između oko 4 do oko 7.
[0035] Sa drugog aspekta, pronalazak sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira ovde opisani konstrukt varijante SIRP-α.
[0036] Sa drugog aspekta, pronalazak sadrži vektor koji uključuje molekul nukleinske kiseline koji kodira ovde opisani konstrukt varijante SIRP-α.
[0037] Sa drugog aspekta, pronalazak sadrži ćeliju-domaćina koja eksprimira ovde opisani konstrukt varijante SIRP-α, pri čemu ćelija domaćina uključuje molekul nukleinske kiseline koja kodira ovde opisani konstrukt varijante SIRP-α ili vektor koji uključuje molekul nukleinske kiseline, pri čemu se molekul ili vektor nukleinske kiseline eksprimira u ćeliji domaćina.
[0038] Sa drugog aspekta, pronalazak karakteriše postupak pripreme ovde opisanog konstrukta varijante SIRP-α, pri čemu postupak uključuje: a) obezbeđivanje ćelije domaćina, uključujući molekul nukleinske kiseline koji kodira ovde opisani konstrukt varijante SIRP-α ili vektor koji uključuje molekul nukleinske kiseline; b) eksprimiranje molekula nukleinske kiseline ili vektora u ćeliji domaćina pod uslovima koji omogućavaju stvaranje konstrukta varijante SIRP-α; i c) izdvajanje konstrukta varijante SIRP-α.
[0039] Sa drugog aspekta, pronalazak sadrži farmaceutsku kompoziciju koja uključuje terapeutski efikasnu količinu ovde opisanog konstrukta varijante SIRP-α i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača ili ekscipijenasa.
[0040] Sa drugog aspekta, ovde je opisan postupak za povećanje fagocitoze ciljne ćelije kod subjekta, koji uključuje davanje subjektu ovde opisanog konstrukta varijante SIRP-α ili farmaceutske kompozicije koja uključuje terapeutski efikasnu količinu ovde opisanog konstrukta varijante SIRP-α. U nekim primerima izvođenja, ciljna ćelija je ćelija kancera.
[0041] Sa drugog aspekta, ovde je opisan postupak uklanjanja regulatornih T-ćelija kod subjekta, koji uključuje davanje subjektu ovde opisanog konstrukta varijante SIRP-α ili farmaceutske kompozicije koja uključuje terapeutski efikasnu količinu ovde opisanog konstrukta varijante SIRP-α.
[0042] Sa drugog aspekta, ovde je opisan postupak za ubijanje ćelije kancera, postupak uključuje kontakt ćelije kancera sa ovde opisanim konstruktom varijante SIRP-α ili farmaceutskom kompozicijom koja uključuje terapeutski efikasnu količinu ovde opisanog konstrukta varijante SIRP-α.
[0043] Sa drugog aspekta, ovde je opisan postupak za lečenje bolesti povezane sa SIRP-α i/ili CD47 aktivnošću kod subjekta, postupak uključuje davanje subjektu terapeutski efikasne količine ovde opisanog konstrukta varijante SIRP-α ili farmaceutske kompozicije koja uključuje terapeutski efikasnu količinu ovde opisanog konstrukta varijante SIRP-α.
[0044] Sa drugog aspekta, ovde je opisan postupak lečenja bolesti povezane sa SIRP-α i/ili CD47 aktivnošću kod subjekta, postupak uključuje: (a) određivanje aminokiselinskih sekvenci SIRP-α subjekta; i (b) davanje subjektu terapeutski efikasne količine ovde opisanog konstrukta varijante SIRP-α, pri čemu SIRP-α varijanta u konstruktu varijante SIRP-α ima
1
istu aminokiselinsku sekvencu kao i SIRP-α subjekta.
[0045] Sa drugog aspekta, ovde je opisan postupak lečenja bolesti povezane sa SIRP-α i/ili CD47 aktivnošću kod subjekta, postupak uključuje: (a) određivanje aminokiselinskih sekvenci SIRP-α subjekta; i (b) davanje subjektu terapeutski efikasne količine ovde opisanog konstrukta varijante SIRP-α; pri čemu varijanta SIRP-α u konstruktu varijante SIRP-α ima minimalnu imunogenost u subjektu.
[0046] Sa drugog aspekta, ovde je opisan postupak lečenja bolesti povezane sa SIRP-α i/ili CD47 aktivnošću kod subjekta, postupak uključuje: davanje subjektu ovde opisanog konstrukta varijante SIRP-α, pri čemu konstrukt varijante SIRP-α preferirano veže CD47 na obolelim ćelijama ili na obolelom mestu u odnosu na CD47 na ne-obolelim ćelijama.
[0047] U nekim primerima izvođenja, bolest je kancer. U nekim primerima izvođenja, kancer se bira između čvrstog tumora, hematološkog kancera, akutne mijeloidne leukemije, hronične limfocitne leukemije, hronične mijeloidne leukemije, akutne limfoblastne leukemije, ne-Hočkinovog limfoma, Hočkinovog limfoma, multiplog mijeloma, kancera bešike, kancera pankreasa, kancera grlića materice, kancera endometrijuma, kancera pluća, kancera bronhija, kancera jetre, kancera jajnika, kancera debelog creva i rektuma, kancera stomaka, kancera želuca, kancera žučne kese, kancera gastrointestinalnog stromalnog tumora, kancera štitaste žlezde, kancera glave i vrata, kancera orofarinksa, kancera jednjaka, melanoma, nemelanomskog kancera kože, kancera Merkelovih ćelija, virusno izazvanog kancera, neuroblastoma, kancera dojke, kancera prostate, kancera bubrega, kancera bubrežnih ćelija, kancera bubrežne karlice, leukemije, limfoma, sarkoma, glioma, tumora na mozgu i karcinoma. U nekim primerima izvođenja, kancer je čvrsti tumor. U nekim primerima izvođenja, kancer je hematološki kancer.
[0048] U nekim aspektima, bolest je imunološka bolest. U nekim aspektima, imunološka bolest je autoimuna bolest ili zapaljenska bolest. U nekim aspektima, autoimuna ili zapaljenska bolest je multipla skleroza, reumatoidni artritis, spondiloartropatija, sistemski eritematozni lupus, inflamatorna ili autoimuna bolest posredovana antitelima, bolest transplantata naspram domaćina, sepsa, dijabetes, psorijaza, ateroskleroza, Sjogrenov sindrom, progresivna sistemska skleroza, skleroderma, akutni koronarni sindrom, ishemijska reperfuzija, Kronova bolest, endometrioza, glomerulonefritis, miastenija gravis, idiopatska plućna fibroza, astma, akutni respiratorni distres sindrom (ARDS), vaskulitis ili inflamatorni autoimunski miozitis.
[0049] Sa drugog aspekta, ovde je opisan postupak za povećanje ugrađivanja hematopoetskih matičnih ćelija kod subjekta, uključujući modulaciju interakcije između SIRP-α i CD47 kod subjekta, davanjem subjektu ovde opisane SIRP-α varijante ili farmaceutske kompozicije koja uključuje terapeutski efikasnu količinu ovde opisane SIRP-α varijante.
[0050] Sa drugog aspekta, ovde je opisan postupak promene imunološkog odgovora kod subjekta koji uključuje davanje subjektu ovde opisanog konstrukta varijante SIRP-α ili farmaceutske kompozicije koja uključuje terapeutski efikasnu količinu konstrukta varijante SIRP-α koji je ovde opisan, čime se menja imunološki odgovor kod subjekta. U nekim aspektima, imunološki odgovor uključuje suzbijanje imunog odgovora.
[0051] U nekim primerima izvođenja, subjekt je sisar, poželjno je da je sisar čovek.
Definicije
[0052] Kako se ovde koristi, termini "obolele ćelije" i "obolelo tkivo" odnose se, na primer, na ćelije i tkivo kancera. Konkretno, kancer može biti čvrst tumor ili hematološki kancer. Na primer, ako je kancer čvrst tumor, obolele ćelije su ćelije čvrstog tumora. Obolele ćelije često žive u uslovima karakterističnim za obolelo mesto, kao što su kiseli pH i hipoksija. „Obolele ćelije“ i „obolelo tkivo“ takođe mogu biti povezani sa drugim bolestima, uključujući, ali ne ograničavajući se na, kancer. „Obolele ćelije“ i „obolelo tkivo“ takođe mogu biti povezani sa imunološkom bolešću ili poremećajem, kardiovaskularnom bolešću ili poremećajem, metaboličkom bolešću ili poremećajem ili proliferativnom bolešću ili poremećajem. Imunološki poremećaj uključuje zapaljensku bolest ili poremećaj i autoimunu bolest ili poremećaj.
[0053] Kako se ovde koristi, termin "ne-obolele ćelije" odnosi se na normalne, zdrave ćelije tela. Ne-obolele ćelije često žive u fiziološkim uslovima, kao što su neutralni pH i odgovarajuća koncentracija kiseonika koji održavaju normalan metabolizam i regulatorne funkcije ćelija.
[0054] Kako se ovde koristi, termin "obolelo mesto" odnosi se na mesto ili područje koje je proksimalno od mesta bolesti u telu. Na primer, ako je bolest čvrsti tumor koji se nalazi u jetri, tada je obolelo mesto, mesto tumora u jetri i područja blizu tumora u jetri. Ćelije na obolelom mestu mogu uključivati obolele ćelije, kao i ćelije koje podržavaju bolest na obolelom mestu. Na primer, ako je obolelo mesto, mesto tumora, ćelije na mestu tumora uključuju i obolele ćelije (npr. tumorske ćelije) i ćelije koje podržavaju rast tumora na mestu tumora. Slično tome, izraz "mesto kancera" odnosi se na mesto kancera u telu.
[0055] Kako se ovde koristi, termin "SIRP-α D1 domen" ili "D1 domen" odnosi se na membranski distalni, vanćelijski domen SIRP-α. SIRP-α D1 domen nalazi se na N-kraju divljeg tipa SIRP-α pune dužine i posreduje u vezivanju za CD47. Aminokiselinske sekvence D1 domena prikazane su u Tabeli 1.
[0056] Kako se ovde koristi, termin "SIRP-α D2 domen" ili "D2 domen" odnosi se na drugi vanćelijski domen SIRP-α. SIRP-α D2 domen uključuje približno aminokiseline 119 do 220 pune dužine SIRP-α divljeg tipa.
[0057] Kako se ovde koristi, termin "SIRP-α D3 domen" ili "D3 domen" odnosi se na treći vanćelijski domen SIRP-α. SIRP-α D3 domen uključuje približno aminokiseline 221 do 320 pune dužine SIRP-α divljeg tipa.
[0058] Kako se ovde koristi, termin "polipeptid SIRP-α" se odnosi na divlji tip SIRP-α, kao i na SIRP-α varijantu, kako je ovde definisan i opisan svaki pojam.
[0059] Kako se ovde koristi, termin "SIRP-α varijanta" odnosi se na polipeptid koji sadrži SIRP-α D1 domen ili CD47-vezujući deo SIRP-α pune dužine. U nekim primerima izvođenja, SIRP-α varijanta ima najmanje 80% (npr., najmanje 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 % ili 99%.) identičnosti sekvence sa sekvencom bilo koje od SEQ ID NOs: 3-12 i 24-34. U nekim primerima izvođenja, varijanta SIRP-α ima veći afinitet prema CD47 od divljeg tipa SIRP-α. U nekim primerima izvođenja, varijanta SIRP-α sadrži deo divljeg tipa humanog SIRP-α (poželjno deo koji veže CD47 divljeg tipa SIRP-α) i/ili ima jednu ili više supstitucija aminokiselina. Na primer, SIRP-α varijanta može sadržati supstituisane jednog ili više (npr. jedan, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset itd., sa najviše 20) aminokiselinskih ostataka u odnosu na divlji tip SIRP-α. Na primer, SIRP-α varijanta može da sadrži supstituente jednog ili više (npr. jedan, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset itd., sa najviše 20) aminokiselinskih ostataka ostacima histidina. U nekim primerima izvođenja, SIRP-α varijante imaju deo koji ima najmanje 80% (npr., najmanje 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97 %, 98% ili 99%) identičnosti aminokiselinske sekvence sa sekvencom divljeg tipa humanog SIRP-α ili sa bilo kojom od ovde opisanih SIRP-α varijanti (npr. sa sekvencom dela humanog SIRP-α divljeg tipa koji se vezuje za CD47). CD47-vezujući deo divljeg tipa SIRP-α uključuje D1 domen divljeg tipa SIRP-α (sekvenca bilo koje od SEQ ID NOs: 3-12).
[0060] Kako se ovde koristi, termin "konstrukt varijante SIRP-α" odnosi se na polipeptid koji sadrži varijantu SIRP-α koja je vezana, na primer, za blokirajući peptid, monomer Fc domena, HSA, albumin-vezujući peptid, polimer, antitelo-vezujući peptid, antitelo. U nekim primerima izvođenja, konstrukt varijante SIRP-α ima preferiranu aktivnost na obolelom mestu. U nekim primerima izvođenja, konstrukti varijante SIRP-α imaju preferiranu aktivnost na obolelom mestu i uključuju varijantu SIRP-α koja ima deo koji ima najmanje 80% (npr. najmanje 85%, 87%, 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%) identičnosti aminokiselinske sekvence sa sekvencom divljeg tipa humanog SIRP-α ili sa bilo kojom od
1
ovde opisanih SIRP-α varijanti (npr. sa sekvencom dela koji vezuje CD47 humanog SIRP-α divljeg tipa).
[0061] Kako se ovde koristi, termin „procenat (%) identičnosti“ odnosi se na procenat ostataka aminokiselina (ili nukleinske kiseline) kandidatske sekvence, npr. SIRP-α varijanta, koji su identični ostacima aminokiselina (ili nukleinske kiseline) referentne sekvence, npr. divljeg tipa humanog SIRP-α ili njegovog CD47-vezujućeg dela, nakon poravnanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalan procenat identičnosti (tj. praznine mogu biti uvedene u jedno ili oba od kandidata i referentne sekvence radi optimalnog poravnanja, a nehomologne sekvence se mogu zanemariti radi poređenja). Poravnanje u svrhu određivanja procenta identičnosti može se postići na različite načine koji su u skladu sa veštinom u tehnici, na primer, korišćenjem javno dostupnog kompjuterskog softvera kao što je BLAST, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softver. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu odrediti odgovarajuće parametre za merenje poravnanja, uključujući sve algoritme potrebne za postizanje maksimalnog poravnanja tokom cele dužine sekvenci koje se upoređuju. U nekim primerima izvođenja, procenat identičnosti sekvence aminokiseline (ili nukleinske kiseline) date sekvence kandidata prema, sa ili naspram date referentne sekvence (koja se alternativno može izraziti kao data sekvenca kandidata koja ima ili uključuje određeni procenat identičnosti sekvence aminokiseline (ili nukleinske kiseline), sa ili naspram date referentne sekvence) izračunava se na sledeći način:
100 x (frakcija A/B)
gde je A broj ostataka aminokiselina (ili nukleinske kiseline) koji su ocenjeni kao identični u poravnanju sekvence kandidata i referentne sekvence i gde je B ukupan broj aminokiselinskih ostataka (ili nukleinske kiseline) u referentnoj sekvenci. U nekim primerima izvođenja gde dužina sekvence kandidata nije jednaka dužini referentne sekvence, procenat identičnosti aminokiselinske sekvence (ili nukleinske kiseline) kandidata u odnosu na referentnu sekvencu ne bi bio jednak procentu identičnosti aminokiselinske sekvence (ili nukleinske kiseline) referentne sekvence u odnosu na sekvencu kandidata.
[0062] U određenim primerima izvođenja, referentna sekvenca poravnata za poređenje sa sekvencom kandidatom može pokazati da kandidatska sekvenca pokazuje identičnost od 50% do 100% u celoj dužini sekvence kandidata ili izabranom delu uzastopnih aminokiselinskih (ili nukleinske kiselina) ostatka sekvence kandidata. Dužina sekvence kandidata koja je poravnata radi poređenja je najmanje 30%, npr. najmanje 40%, npr., najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 100% dužine referentne sekvence. Kada položaj u sekvenci kandidata zauzima isti ostatak aminokiseline (ili nukleinske kiseline) kao odgovarajući položaj u referentnoj sekvenci, tada su molekuli identični na tom položaju.
[0063] Kako se ovde koristi, termin "proteaza povezana sa tumorom" ili "tumorski enzim" odnosi se na enzim, npr. proteazu, koja je prisutna u povećanom nivou u kanceru, npr. čvrstom tumoru. U nekim primerima izvođenja, proteaza povezana sa tumorom može deliti deljivi veznik.
[0064] Kako se ovde koristi, izraz "blokirajući peptid" odnosi se na peptid koji se može vezati za SIRP-α varijantu i blokirati ili "maskirati" CD47-vezujući deo SIRP-α varijante. U konstruktu varijante SIRP-α, blokirajući peptid može biti vezan za varijantu SIRP-α pomoću veznika koji se opciono može odvojiti, i opciono, jednim ili više odstojnika. Blokirajući peptid se može povezati nekovalentnim vezama sa SIRP-α varijantom i odlepiti na obolelom mestu ili oboleloj ćeliji. U nekim primerima izvođenja, blokirajući peptid se može vezati za divlji tip SIRP-α na obolelom mestu ili oboleloj ćeliji. Blokirajući peptid se može koristiti za smanjenje ili minimiziranje vezivanja SIRP-α varijante sa divljim tipom CD47 pod normalnim fiziološkim uslovima ili na ne-obolelom mestu. U nekim primerima izvođenja, blokirajući peptid ima veći afinitet vezivanja za divlji tip SIRP-α od SIRP-α varijante. Blokirajući peptid može se razdvojiti od SIRP-α varijante da bi se vezao za divlji tip SIRP-α, na primer, na obolelom mestu ili pod nefiziološkim uslovima. Primer blokirajućeg peptida je blokirajući peptid na bazi CD47, koji je peptid dobijen iz CD47 ili njegovog fragmenta. U nekim primerima izvođenja, blokirajući peptid na bazi CD47 je vanćelijski, SIRP-α vezujući deo CD47 (tj. IgSF domen CD47). U nekim primerima izvođenja, blokirajući peptid na bazi CD47 uključuje jednu ili više supstitucija, adicija i/ili delecija aminokiselina u odnosu na divlji tip CD47.
[0065] Kako se ovde koristi, termin "deljivi veznik" odnosi se na veznik između dva dela konstrukta varijante SIRP-α. U nekim primerima izvođenja, deljivi veznik može kovalentno da veže blokirajući peptid za SIRP-α varijantu i blokira vezivanje SIRP-α varijante za CD47 pod fiziološkim uslovima. U nekim primerima izvođenja, deljivi veznik može biti instaliran unutar blokirajućeg peptida, koji može biti nekovalentno povezan sa SIRP-α varijantom da bi blokirao vezivanje SIRP-α varijante za CD47 pod fiziološkim uslovima. Veznik koji se može razdvojiti može se odeliti pod određenim uslovima. Ako se deljivi veznik nalazi unutar blokirajućeg peptida, deljenje veznika bi deaktiviralo blokirajući peptid. Deljivi veznik sadrži deo koji deluje na deljenje ili indukovanje deljenja veznika pod uslovima karakterističnim za obolelo mesto, kao što je mesto kancera, npr. unutar čvrstog tumora. Deljivi veznik je stabilan u zdravim fiziološkim uslovima (npr. neutralni pH i odgovarajuća koncentracija kiseonika). Sastav može biti hemijski funkcionalna grupa osetljiva na pH (npr. acetali, ketali,
1
tiomaleamati, hidrazoni, disulfidne veze) koja može da se hidrolizuje pod kiselim pH. Ova grupa takođe može biti hemijski funkcionalna grupa osetljiva na hipoksiju (npr. hinoni, N-oksidi i heteroaromatične nitro grupe) ili aminokiselina koja može da se redukuje pod hipoksičnim uslovima. Deo u deljivom vezniku takođe može biti proteinski supstrat koji je prepoznatljiv i deljen pomoću proteaze povezane sa tumorom, enzima ili peptidaze.
[0066] Kako se ovde koristi, termin "odstojnik" odnosi se na kovalentnu ili nekovalentnu vezu između dva dela konstrukta varijante SIRP-α, kao što je veznik (npr. deljivi veznik) i SIRP-α varijanta, ili antitelo-vezujući peptid i SIRP-α varijanta. Poželjno je da je odstojnik kovalentna veza. Odstojnik može biti jednostavna hemijska veza, npr. amidna veza ili aminokiselinska sekvenca (npr. sekvenca od 3-200 aminokiselina). Aminokiselinski odstojnik je deo primarne sekvence polipeptida (npr. pridružen razmaknutim polipeptidima ili polipeptidnim domenima preko polipeptidnog niza). Odstojnik pruža prostor i/ili fleksibilnost između dva dela. Odstojnik je stabilan u fiziološkim uslovima (npr. neutralni pH i odgovarajuća koncentracija kiseonika), kao i u uslovima karakterističnim za obolelo mesto, npr. kiseli pH i hipoksija. Odstojnik je stabilan na obolelom mestu, kao što je mesto kancera, npr. unutar tumora. Dalje su ovde detaljno dati opisi odstojnika.
[0067] Kako se ovde koristi, termin "antitelo" odnosi se na netaknuta antitela, fragmente antitela, pod uslovom da pokazuju željenu biološku aktivnost, monoklonska antitela, poliklonska antitela, monospecifična antitela i multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela) nastala od najmanje dva netaknuta antitela. Poželjno je da je antitelo specifično za obolelu ćeliju, npr. tumorsku ćeliju. Na primer, antitelo se može specifično vezati za površinski protein ćelije na bolesnoj ćeliji, na primer, tumorskoj ćeliji.
[0068] Kako se ovde koristi, izraz "albumin-vezujući peptid" odnosi se na aminokiselinsku sekvencu od 12 do 16 aminokiselina koja ima afinitet za vezivanje i deluje vezivanjem serumskog albumina. Albumin-vezujući peptid može biti različitog porekla, npr. čovekov, mišiji ili pacovski. U nekim primerima izvođenja ovog pronalaska, konstrukt varijante SIRP-α može sadržati albumin-vezujući peptid, koji je spojen sa C-krajem SIRP-α varijante da bi se povećao polu-život SIRP-α varijante u serumu. Albumin-vezujući peptid se može spojiti direktno ili preko odstojnika sa SIRP-α varijantom.
[0069] Kako se ovde koristi, termin "humani serumski albumin (HSA)" odnosi se na albuminski protein prisutan u ljudskoj krvnoj plazmi. Humani serumski albumin je najzastupljeniji protein u krvi. Čini oko polovine proteina u krvnom serumu. U nekim primerima izvođenja, humani serumski albumin ima sekvencu aminokiselina 25-609 (SEQ ID NO: 67) od UniProt ID NO: P02768. U nekim primerima izvođenja, humani serumski
1
albumin dalje sadrži C34S u odnosu na sekvencu SEQ ID NO: 67.
[0070] Kako se ovde koristi, termin "monomer Fc domena" odnosi se na polipeptidni lanac koji uključuje drugi i treći konstantni domen antitela (CH2 i CH3). U nekim primerima izvođenja, monomer Fc domena takođe uključuje zglobni domen. Monomer Fc domena može biti bilo koji izotip imunoglobulinskih antitela, uključujući IgG, IgE, IgM, IgA ili IgD. Pored toga, monomer Fc domena može biti IgG podtip (npr. IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 ili IgG4). Monomer Fc domena ne uključuje bilo koji deo imunoglobulina koji je sposoban da deluje kao region za prepoznavanje antigena, npr. promenljivi domen ili region koji određuje komplementarnost (CDR). Monomeri Fc domena mogu da uključuju čak deset promena u odnosu na sekvencu monomera Fc domena divljeg tipa (npr. 1-10, 1-8, 1-6, 1-4 supstitucije, adicije ili delecije aminokiselina) koje menjaju interakciju između Fc domena i Fc receptora. Primeri pogodnih promena su poznati u tehnici.
[0071] Kako se ovde koristi, termin "Fc domen" odnosi se na dimer dva monomera Fc domena. U Fc domenu divljeg tipa, dva monomera Fc domena dimerizuju interakcijom između dva konstantna domena CH3 antitela, kao i jednom ili više disulfidnih veza koje se formiraju između zglobnih domena dva dimerizovana monomera Fc domena. U nekim primerima izvođenja, Fc domen može biti mutiran tako da mu nedostaju efektorske funkcije, tipično za „mrtvi Fc domen“. U određenim primerima izvođenja, svaki od monomera Fc domena u Fc domenu uključuje supstituisane aminokiseline u konstantnom domenu CH2 antitela da bi se smanjila interakcija ili vezivanje između Fc domena i Fcγ receptora.
[0072] Kako se ovde koristi, termin "afinitet" ili "sposobnost vezivanja" odnosi se na snagu interakcije vezivanja između dva molekula. Generalno, sposobnost vezivanja odnosi se na snagu ukupnog zbira nekovalentnih interakcija između molekula i njegovog partnera za vezivanje, kao što je SIRP-α varijanta i CD47. Ako nije drugačije naznačeno, sposobnost vezivanja odnosi se na svojstveni afinitet vezivanja, koji odražava interakciju 1:1 između članova veznog para. Afinitet vezivanja između dva molekula obično se opisuje konstantom disocijacije (KD) ili konstantom afiniteta (KA). Dva molekula koji imaju nizak afinitet vezivanja, međusobno se uglavnom polako vezuju, imaju tendenciju da se lako disociraju i pokazuju veliki KD. Dva molekula koja imaju visok afinitet jednog prema drugom se uglavnom lako vežu, imaju tendenciju da ostanu duže vezani i imaju mali KD. KDza dva molekula koji su međusobnoj interakciji može se odrediti korišćenjem dobro poznatih metoda i tehnika, npr. površinske plazmonske rezonance. KDse izračunava kao odnos koff/kon.
[0073] Kako se ovde koristi, termin "ćelija-domaćin" odnosi se na nosač koji uključuje potrebne ćelijske komponente, npr. organele, potrebne za eksprimiranje proteina sa njihovih
1
odgovarajućih nukleinskih kiselina. Nukleinske kiseline su tipično uključene u vektore nukleinske kiseline koji se mogu uvesti u ćeliju-domaćina poznatim konvencionalnim tehnikama (npr. transformacija, transfekcija, elektroporacija, taloženje kalcijum-fosfatom, direktno mikroinjektiranje, itd.). Ćelija-domaćin može biti prokariotska ćelija, npr. bakterijska ćelija ili eukariotska ćelija, npr. ćelija sisara (npr. CHO ćelija). Kao što je ovde opisano, ćelija-domaćin se koristi za eksprimiranje jednog ili više konstrukata varijante SIRP-α.
[0074] Kako se ovde koristi, termin "farmaceutski sastav" odnosi se na lekovitu ili farmaceutsku formulaciju koja sadrži aktivni sastojak kao i ekscipijense i rastvarače kako bi se omogućio aktivni sastojak pogodan za način primene. Farmaceutska kompozicija ovog pronalaska uključuje farmaceutski prihvatljive komponente koje su kompatibilne sa konstruktom varijante SIRP-α. Farmaceutska kompozicija može biti u obliku tableta ili kapsula za oralnu primenu ili u vidu vodene forme za intravensku ili potkožnu primenu.
[0075] Kako se ovde koristi, termin "bolest povezana sa aktivnošću SIRP-α i/ili CD47" odnosi se na bilo koju bolest ili poremećaj koji je uzrokovan i/ili povezan sa aktivnošću SIRP-α i/ili CD47. Na primer, bilo koja bolest ili poremećaj koji su uzrokovani i/ili povezani sa povećanjem i/ili smanjenjem aktivnosti SIRP-α i/ili CD47. Primeri bolesti povezanih sa aktivnošću SIRP-α i/ili CD47, uključuju, ali nisu ograničeni na kancere i imunološke bolesti (npr. autoimune bolesti i zapaljenske bolesti).
[0076] Kako se ovde koristi, termin "terapeutski efikasna količina" odnosi se na količinu konstrukta varijante SIRP-α prema pronalasku ili farmaceutsku kompoziciju koja sadrži konstrukt varijante SIRP-α prema pronalasku, efikasnu u postizanju željenog terapijskog efekta u lečenju pacijenta koji ima bolest, kao što je kancer, npr. čvrsti tumor ili hematološki kancer. Konkretno, terapeutski efikasna količina konstrukta varijante SIRP-α omogućava da se izbegne nastanak neželjenih efekata.
[0077] Kako se ovde koristi, termin "optimizovani afinitet" ili "optimizovani afinitet vezivanja" odnosi se na optimizovanu snagu interakcije vezivanja između SIRP-α varijante i CD47. U nekim primerima izvođenja, konstrukt varijante SIRP-α vezuje se primarno ili sa većim afinitetom za CD47 na ćelijama na obolelom mestu (tj. ćelije kancera) i u suštini se ne vezuje, ili se vezuje manjim afinitetom za CD47 na ćelijama na ne-obolelom mestu (tj. ćelije bez kancera). Afinitet vezivanja između SIRP-α varijante i CD47 je optimizovan tako da interakcija ne izaziva klinički relevantnu toksičnost. U nekim primerima izvođenja, da bi se postigao optimizovani afinitet vezivanja između SIRP-α varijante i CD47, SIRP-α varijanta se može razviti tako da ima manji afinitet vezivanja za CD47 od onoga što je maksimalno dostižno.
1
[0078] Kako se ovde koristi, termin "imunogenost" odnosi se na svojstvo proteina (npr. terapijskog proteina) koji uzrokuje imuni odgovor kod domaćina kao da je strani antigen. Imunogenost proteina može se ispitati in vitro na različite načine, naročito kroz in vitro testove proliferacije T-ćelija (videti, na primer, Jawa et al., Clinical Immunology 149:534-555, 2013), neki od ovih su komercijalno dostupni (videti, na primer, usluge ispitivanja imunogenosti koje nudi Proimmune).
[0079] Kako se ovde koristi, izraz "minimalna imunogenost" odnosi se na imunogenost proteina (npr. terapijskog proteina) koja je modifikovana, supstitucijom aminokiselina, da bude niža (npr. najmanje 10%, 25%, 50% ili 100% niža) nego što je moglo biti pre uvođenja supstituisanih aminokiselina. Protein (npr. terapijski protein) je modifikovan tako da ima minimalnu imunogenost, što znači da ne uzrokuje nikakav ili vrlo mali imunološki odgovor domaćina, iako je strani antigen.
[0080] Kako se ovde koristi, termin "optimizovana farmakokinetika" odnosi se na to da su parametri koji su generalno povezani sa farmakokinetikom proteina poboljšani i modifikovani da bi proizveli optimizovan protein za upotrebu in vitro i/ili in vivo. Parametri koji su povezani sa farmakokinetikom proteina dobro su poznati, uključujući, na primer, KD, valencu i polu-život. U ovom pronalasku, farmakokinetika konstrukta varijante SIRP-α je optimizovana za njegovu interakciju sa CD47 za upotrebu u terapijskom kontekstu.
OPIS SLIKA
[0081]
SLIKA 1 prikazuje deo sukristalizovane strukture CD47: SIRP-α (PDB: 4KJY, 4CMM), N-kraj CD47 postoji kao piro-glutamat i stvara interakcije vodonične veze sa Thr66 SIRP-α varijante ili Leu66 divljeg tipa SIRP-α.
SLIKA 2 prikazuje kompjuterske modele mesta interakcije između CD47 koji ima T102Q i divljeg tipa SIRP-α koji ima A27 (levo) i mesta interakcije između CD47 koji ima T102Q i SIRP-α varijante koja ima I27.
SLIKA 3 prikazuje SDS-PAGE konstrukta varijante SIRP-α (SEQ ID NOs: 48-56).
SLIKA 4A prikazuje SDS-PAGE konstrukta varijante SIRP-α (SEQ ID NO: 54) nakon in vitro deljenja sa uPA i matriptaze.
SLIKA 4B prikazuje SDS-PAGE konstrukta varijante SIRP-α (SEQ ID NO: 54) nakon in vitro deljenja sa različitim količinama matriptaze.
SLIKA 4C prikazuje SDS-PAGE različitih konstrukata varijante SIRP-α (SEQ ID NOs: 57-63) nakon in vitro deljenja sa matriptazom.
SLIKA 5A prikazuje trakasti grafikon koji ilustruje različite sposobnosti vezivanja različitih
1
konstrukata varijanti SIRP-α (SEQ ID NOs: 48-55) za CD47 pre i posle deljenja in vitro matriptazom.
SLIKA 5B prikazuje trakasti grafikon koji ilustruje različite sposobnosti vezivanja različitih konstrukata varijanti SIRP-α (SEQ ID NOs: 52-63) i SIRP-α varijante (SEQ ID NO: 31) sa CD47 pre i posle deljenja in vitro matriptazom.
SLIKA 6 prikazuje senzorski dijagram koji pokazuje da konstrukt varijante SIRP-α (SEQ ID NO: 66) može istovremeno vezati Cetuksimab i CD47.
SLIKA 7A prikazuje šemu kvaternarnog kompleksa koji sadrži EGFR, Cetuksimab, konstrukt varijante SIRP-α (SEQ ID NO: 66) i CD47.
SLIKA 7B prikazuje senzorski dijagram koji prikazuje formiranje kvaternarnog kompleksa prikazanog na SL.7A.
SLIKA 7C je slika senzograma prikazanog na SL.7B.
SLIKA 8 je dijagram rasejanja koji prikazuje fagocitozu indukovanu konstruktom varijante SIRP-α (SEQ ID NO: 66) i varijantom SIRP-α (SEQ ID NO: 31).
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0082] Pronalazak karakterišu konstrukti varijante signal-regulatornog proteina α (SIRP-α) koji imaju preferiranu aktivnost na obolelom mestu (npr. na mestu tumora u odnosu na neobolelom mestu). U određenim primerima izvođenja, konstrukti varijante SIRP-α imaju veći afinitet vezivanja za CD47 na obolelim ćelijama (npr. ćelijama tumora). U nekim primerima izvođenja, SIRP-α varijante mogu sadržati jednu ili više supstitucija aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, aminokiseline mogu biti supstituisane ostacima histidina. U nekim primerima izvođenja, aminokiseline mogu biti supstituisane drugim ne-histidinskim aminokiselinskim ostacima. U nekim primerima izvođenja, konstrukti varijante SIRP-α vezuju se većim afinitetom za CD47 na obolelim ćelijama ili na obolelom mestu nego na neobolelim ćelijama i pod uslovima karakterističnim za obolelo mesto, kao što je mesto kancera, npr. na mestu ili unutar tumora. U nekim primerima izvođenja, konstrukti varijante SIRP-α vezuju se većim afinitetom za CD47 pod kiselim pH (npr. manje od oko pH 7) i/ili u hipoksičnom stanju nego u fiziološkim uslovima. U nekim primerima izvođenja, konstrukti varijante SIRP-α uključuju SIRP-α varijantu i blokirajući peptid; blokirajući peptid sprečava vezivanje za CD47 SIRP-α varijante, osim pod uslovima karakterističnim za obolelo mesto. U nekim primerima izvođenja, SIRP-α varijante su spojene sa monomerom Fc domena, humanim serumskim albuminom (HSA), albumin-vezujućim peptidom ili polimerom (npr. polimerom polietilen glikola (PEG)). U nekim primerima izvođenja, konstrukti varijante
2
SIRP-α imaju svoju imunogenost, afinitet i/ili farmakokinetiku optimizovanu za upotrebu u terapijskom smislu. U nekim primerima izvođenja, konstrukti varijante SIRP-α su prioritetno ciljani na obolela mesta, npr. tumor, putem ciljanog dela, npr. antitela specifičnog za ciljno mesto. Pronalazak se odnosi na postupke i farmaceutske kompozicije koje sadrže konstrukte varijante SIRP-α za lečenje različitih bolesti, poput kancera, poželjno čvrstog tumora ili hematološkog kancera, kao i postupke za ubijanje ćelija kancera i postupke za proizvodnju konstrukata varijanti SIRP-α i farmaceutskih kompozicija koje sadrže takve konstrukte varijante SIRP-α.
[0083] U nekim primerima izvođenja, konstrukt varijante SIRP-α uključuje SIRP-α varijantu koja je vezana za blokirajući peptid. U nekim primerima izvođenja, preferirano vezivanje SIRP-α varijante u konstruktu varijante SIRP-α za CD47 na obolelim ćelijama ili obolelim mestima može se dobiti dodavanjem blokirajućeg peptida na SIRP-α varijantu upotrebom deljivog veznika, koji se deli na obolelim ćelijama ili obolelim mestima. U nekim primerima izvođenja, preferirano vezivanje SIRP-α varijante u konstruktu varijante SIRP-α za CD47 na obolelim ćelijama ili obolelim mestima može se dobiti dodavanjem blokirajućeg peptida na SIRP-α varijantu, pri čemu se blokirajući peptid može odvojiti ili se jednostavno odvojio od SIRP-α varijante na obolelim ćelijama ili obolelim mestima.
I． SIRP-α varijante
[0084] Postoji najmanje deset prirodnih varijanti divljeg tipa ljudskog SIRP-α. Aminokiselinske sekvence D1 domena deset varijanti divljeg tipa ljudskog SIRP-α prikazane su u SEQ ID NOs: 3-12 (videti Tabelu 1). U nekim primerima izvođenja, SIRP-α varijanta ima najmanje 80% (npr., najmanje 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 % ili 99%.) identičnosti sekvence u sekvenci bilo kog od SEQ ID NOs: 3-12. Tabela 2 navodi moguće supstituente aminokiselina u svakoj varijanti D1 domena (SEQ ID NOs: 13-23). U nekim primerima izvođenja, varijanta SIRP-α se vezuje sa optimizovanim afinitetom vezivanja za CD47. U nekim primerima izvođenja, konstrukt varijante SIRP-α, uključujući SIRP-α varijantu, vezuje se primarno ili sa većim afinitetom za CD47 na ćelijama kancera i u suštini se ne veže ili se veže sa manjim afinitetom za CD47 na ćelijama bez kancera. U nekim primerima izvođenja, afinitet vezivanja između konstrukta varijante SIRP-α i CD47 je optimizovan tako da interakcija ne izaziva klinički relevantnu toksičnost. U nekim primerima izvođenja, konstrukt varijante SIRP-α ima minimalnu imunogenost. U nekim primerima izvođenja, SIRP-α varijanta ima iste aminokiseline kao i SIRP-α polipeptid u biološkom uzorku subjekta, osim promena aminokiselina koje su uvedene radi povećanja afiniteta SIRPα varijante. Tehnike i postupci za generisanje SIRP-α varijanti i određivanje njihovih afiniteta vezivanja za CD47 su ovde detaljno opisani. SIRP-α varijanta ima iste aminokiseline kao SIRP-α polipeptid u biološkom uzorku subjekta, osim promena aminokiselina koje su uvedene radi povećanja afiniteta SIRP-α varijante. Tehnike i postupci za generisanje SIRP-α varijanti i određivanje njihovih afiniteta vezivanja za CD47 su ovde detaljno opisani.
[0085] Tabela 2 navodi specifične supstituente aminokiselina u SIRP-α varijanti, u odnosu na svaku sekvencu varijante D1 domena. SIRP-α varijanta može da uključuje jednu ili više (npr. jednu, dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset) supstituenata navedenih u Tabeli 2. U nekim primerima izvođenja, SIRP-α varijanta uključuje najviše deset supstituenata aminokiselina u odnosu na divlji tip D1 domena. U nekim primerima izvođenja, SIRP-α varijanta uključuje najviše sedam aminokiselinskih supstituenata u odnosu na divlji tip D1 domena.
[0086] U nekim primerima izvođenja, SIRP-α varijanta je himerna SIRP-α varijanta koja uključuje deo dve ili više varijanti D1 domena divljeg tipa (npr. deo jedne varijante D1 domena divljeg tipa i deo druge varijante domena divljeg tipa D1). U nekim primerima izvođenja, himerna SIRP-α varijanta uključuje najmanje dva dela (npr. tri, četiri, pet, itd.) varijanti D1 domena divljeg tipa, pri čemu je svaki deo iz druge varijante D1 domena divljeg tipa. U nekim primerima izvođenja, himerna SIRP-α varijanta dalje uključuje jednu ili više supstituenata aminokiselina navedenih u Tabeli 2. U nekim primerima izvođenja, SIRP-α varijanta ima najmanje 80% (npr., najmanje 85%, 87%, 90% , 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%.) identičnosti sekvence u sekvenci bilo koje SEQ ID NOs: 24-34 u Tabeli 3.
Tabela 1. Sekvence divljeg tipa SIRP-α D1 domena
Tabela 2. Supstituenti aminokiselina u SIRP-α varijanti, u odnosu na svaku varijantu D1 domena
2
2
Tabela 3. SEQ ID NOs: 24-34
[0087] Poželjno je prema pronalasku da se konstrukti varijante SIRP-α vezuju sa većim afinitetom za CD47 pod uslovima karakterističnim za obolelo mesto, kao što je mesto
2
kancera, npr. unutar tumora nego pod fiziološkim uslovima (npr. neutralni pH i odgovarajuća koncentracija kiseonika). Uslovi karakteristični za obolelo mesto, kao što je mesto kancera, npr. unutar tumora, su, na primer, kiseli pH i hipoksija. U nekim primerima izvođenja, konstrukti varijante SIRP-α prema pronalasku mogu se projektovati tako da se preferirano vežu za obolele ćelije u odnosu ne-obolele ćelije. Konkretno, ćelije bolesti mogu biti ćelije kancera, npr. čvrsti tumor ili hematološki kancer. Poželjno je da se konstrukti varijante SIRP-α vezuju većim afinitetom za CD47 pod kiselim pH (npr., manje od pH 7) nego pod neutralnim pH, npr. pH 7,4. Poželjno je da se konstrukti varijante SIRP-α vezuju sa većim afinitetom za CD47 pod hipoksičnim uslovima nego pod uslovima sa odgovarajućom koncentracijom kiseonika. U nekim primerima izvođenja, konstrukt varijante SIRP-α uključuje SIRP-α varijantu koja je vezana za blokirajući peptid. U nekim primerima izvođenja, preferirano vezivanje SIRP-α varijante u konstruktu varijante SIRP-α za CD47 na obolelim ćelijama ili obolelim mestima može se dobiti povezivanjem blokirajućeg peptida sa SIRP-α varijantom pomoću deljivog veznika, koji se deli na obolelim ćelijama ili obolelim mestima. U nekim primerima izvođenja, preferirano vezivanje SIRP-α varijante u konstruktu varijante SIRP-α za CD47 na obolelim ćelijama ili obolelim mestima može se dobiti dodavanjem blokirajućeg peptida na SIRP-α varijantu, pri čemu se blokirajući peptid može odvojiti ili se jednostavno odvojio od SIRP-α varijante na obolelim ćelijama ili obolelim mestima.
[0088] U nekim primerima izvođenja, konstrukt varijante SIRP-α uključuje SIRP-α varijantu i blokirajući peptid. U nekim primerima izvođenja, SIRP-α varijanta može biti vezana za blokirajući peptid kroz veznik (npr. deljivi veznik). Blokirajući peptid služi za blokiranje mesta vezivanja CD47 varijante SIRP-α da bi sprečio vezivanje varijante SIRP-α za CD47 pod fiziološkim uslovima (npr. neutralni pH i odgovarajuća koncentracija kiseonika). Deljivi veznik je veznik koji se može deliti samo pod uslovima karakterističnim za obolelo mesto (kao što je mesto raka, npr. unutar tumora), kao što su kiseli pH i hipoksija. U nekim primerima izvođenja, deljivi veznik se deli sa proteazom koja je povezana sa tumorom na obolelom mestu. U nekim primerima izvođenja, veznik se ne deli i blokirajući peptid se jednostavno odvaja od SIRP-α varijante na obolelom mestu tako da se SIRP-α varijanta može slobodno vezati za obližnji CD47 na obolelim ćelijama, npr. ćelijama tumora. Prema tome, samo kada se SIRP-α varijanta nalazi na obolelom mestu, ona će se osloboditi od blokirajućeg peptida i moći će slobodno da se veže za obližnji CD47 na obolelim ćelijama, npr. ćelijama tumora. Blokirajući peptidi i veznici (npr. deljivi veznik) su dalje detaljno opisani.
[0089] U nekim primerima izvođenja, konstrukt varijante SIRP-α uključuje SIRP-α varijantu i
2
ciljni deo. U nekim primerima izvođenja, SIRP-α varijanta može biti vezana za ciljni deo, kao što je antitelo, npr. antitelo specifično za tumor, ili drugi protein ili peptid, npr. antitelovezujući peptid, koji pokazuju afinitet za vezivanje za bolesna ćelija. Posle primene, antitelo specifično za tumor ili antitelo-vezujući peptid služi kao ciljni deo za dovođenje SIRP-α varijante na obolelo mesto, kao što je mesto kancera, npr. unutar čvrstog tumora, gde SIRP-α reaguje specifično sa CD47 na bolesnim ćelijama. U nekim primerima izvođenja, SIRP-α varijanta može se spojiti sa proteinom ili peptidom, npr. antitelo-vezujući peptid, sposobnim da se veže za antitelo (npr. antitelo specifično za tumor), tj. vezujući se za konstantni ili promenljivi region antitela. Dalje su detaljno opisane SIRP-α varijante sposobne da se vežu za jedno ili više antitela. U drugim primerima izvođenja, druge SIRP-α varijante, poput onih opisanih u međunarodnoj objavi br. WO2013109752, mogu biti vezane za antitelo specifično za tumor ili za protein ili peptid, npr. antitelo-vezujući peptid, sposoban da se veže za antitelo specifično za tumor. U nekim primerima izvođenja, SIRP-α varijanta može biti vezana za antitelo bilo in vitro (pre davanja čoveku) ili in vivo (nakon primene).
[0090] U nekim primerima izvođenja, SIRP-α varijanta može dalje da uključuje D2 i/ili D3 domen divljeg tipa humanog SIRP-α. U nekim primerima izvođenja, SIRP-α varijanta može biti vezana za monomer Fc domena, humani serumski albumin (HSA), serum-vezujući protein ili peptid ili organski molekul, npr. polimer (npr. polietilen glikol ( PEG)), u cilju poboljšanja farmakokinetičkih svojstava SIRP-α varijante, na primer, povećanja poluvremena u serumu. Monomeri Fc domena, HSA proteini, serum-vezujući protein ili peptid ili organski molekul kao što je PEG koji služe za povećanje serumskog poluraspada SIRP-α varijanti pronalaska detaljno su dalje opisani ovde. U nekim primerima izvođenja, SIRP-α varijanta ne uključuje sekvencu bilo kog od SEQ ID NOs:3-12 i 24-34.
II． Supstituenti aminokiselina sa ostacima histidina u SIRP-α varijantama
[0091] U nekim primerima izvođenja, pored supstituenata aminokiselina u SIRP-α varijanti nabrojanih u Tabeli 2, SIRP-α varijanta može sadržati jednu ili više aminokiselinskih supstituenata sa ostacima histidina. Konstrukti varijante SIRP-α, uključujući SIRP-α varijantu, vezuju se većim afinitetom za CD47 na obolelim ćelijama ili na obolelom mestu nego na neobolelim ćelijama i pod uslovima karakterističnim za obolelo mesto (npr. kiseli pH, hipoksija) nego pod fiziološkim uslovima. Ostaci aminokiselina koji će biti supstituisani ostacima histidina mogu se identifikovati pomoću mutageneze za skeniranje histidina, kristalnih struktura proteina i kompjuterskog dizajna i metoda modeliranja. Tehnike i postupci koji se mogu koristiti za generisanje SIRP-α varijanti i načini za određivanje njihovih afiniteta
2
vezivanja za CD47 na obolelim i ne-obolelim ćelijama su detaljno opisani dalje ovde. Supstituisani ostaci histidina mogu se nalaziti na interfejsu SIRP-α varijante i CD47 ili mogu biti u unutrašnjim regionima SIRP-α varijante. Poželjno je da se supstituisani ostaci histidina nalaze na interfejsu SIRP-α varijante i CD47. Tabela 4 navodi specifične SIRP-α aminokiseline koje mogu biti supstituisane ostacima histidina. Numerisanje aminokiselina u Tabeli 4 je relativno prema sekvenci SEQ ID NO: 3; jedna ili više aminokiselina na odgovarajućim pozicijama u bilo kojoj od sekvenci SEQ ID NOs: 4-12 mogu takođe biti supstituisane ostacima histidina. Kontaktni ostaci su aminokiseline smeštene na interfejsu SIRP-α varijante i CD47. Jezgreni ostaci su unutrašnje aminokiseline koje nisu direktno uključene u vezivanje između SIRP-α varijante i CD47. SIRP-α varijante mogu da uključuju jedan ili više (npr. jedan, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset itd. ili sve) supstituenata navedenih u Tabeli 4. SIRP-α varijante mogu sadržati najviše 20 supstituenata histidina.
Tabela 4. SIRP-α aminokiselinski supstituenti (numerisanje aminokiselina je relativno prema sekvenci SEQ ID NO: 3)
III． pH zavisno vezivanje
[0092] Studije su pokazale da posredni onkogeni metabolizam tumorskih ćelija generiše veliku količinu mlečne kiseline i protona, što dovodi do smanjenja vanćelijskih vrednosti pH na samo 6 u tumorskom tkivu (Icard et al., Biochim. Biophys. Acta. 1826:423-433, 2012). U nekim primerima izvođenja, konstrukti varijante SIRP-α, uključujući SIRP-α varijantu, projektovani su da se vezuju visokim afinitetom za CD47 pod kiselim pH bolje nego pod neutralnim pH (npr. oko pH 7,4). Dakle, konstrukti varijante SIRP-α prema pronalasku napravljeni su tako da se selektivno vezuju za CD47 na obolelim ćelijama (npr. tumorske ćelije) ili na ćelijama na obolelom mestu (npr. ćelije u tumor mikro-okruženju koji podržavaju rast tumora) preko CD47 na ne-obolelim ćelijama.
[0093] U jednom primeru izvođenja, za konstruisanje pH-zavisnog vezivanja konstrukta varijante SIRP-α iz ovog pronalaska, mutageneza histidina može se izvršiti na SIRP-α varijanti, posebno na regionu SIRP-α koji komunicira sa CD47. Kristalne strukture kompleksa
2
SIRP-α i CD47 (vidi, na primer, PDB ID No. 2JJS) i kompjutersko modelovanje mogu se koristiti za vizuelizaciju trodimenzionalnog mesta vezivanja SIRP-α i CD47. Kompjuterski dizajn i metode modeliranja su korisne u dizajniranju proteina sa svojstvima vezivanja osetljivim na pH su poznati u literaturi i opisani su, na primer, Strauch et al., Proc Natl Acad Sci 111:675-80, 2014. U nekim primerima izvođenja, kompjutersko modelovanje može se koristiti za identifikovanje ključnih kontaktnih ostataka na interfejsu SIRP-α i CD47. Identifikovani ključni ostaci kontakta mogu se supstituisati ostacima histidina pomoću dostupnog softvera za dizajn proteina (npr. RosettaDesign), koji može generisati različite dizajne proteina koji se mogu optimizovati, filtrirati i rangirati na osnovu izračunate energije vezivanja i komplementarnosti oblika. Prema tome, energetski povoljni supstituenti histidina na određenim položajima aminokiselina mogu se identifikovati pomoću kompjuterskih metoda dizajna. Kompjutersko modelovanje se takođe može koristiti za predviđanje promena u trodimenzionalnoj strukturi SIRP-α. Supstituenti histidina koje generišu značajne promene u trodimenzionalnoj strukturi SIRP-α mogu se izbeći.
[0094] Jednom kada se identifikuju energetski i strukturno optimalni supstituenti aminokiselina, aminokiseline mogu sistematski biti supstituisane ostacima histidina. U nekim primerima izvođenja, jedna ili više (npr. jedna, dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, itd., sa najviše 20) aminokiselina SIRP-α mogu biti supstituisane ostacima histidina. Konkretno, aminokiseline smeštene na interfejsu SIRP-α i CD47, poželjno, aminokiseline direktno uključene u vezivanje SIRP-α za CD47, mogu biti supstituisane ostacima histidina. SIRP-α varijanta može da uključuje jednu ili više (npr. jednu, dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset itd., sa najviše 20) supstituisanim ostacima histidina. U drugim primerima izvođenja, histidinski ostaci SIRP-α koji se javljaju u prirodi mogu biti supstituisani drugim aminokiselinskim ostacima. Na primer, supstitucija aminokiselina okruženim prirodnim ostacima histidina sa drugim aminokiselinama može „sahraniti“ prirodni ostatak histidina. U nekim primerima izvođenja, aminokiseline koje nisu direktno uključene u vezivanje sa CD47, tj. unutrašnje aminokiseline (npr. aminokiseline smeštene u jezgru SIRP-α) takođe mogu biti supstituisane ostacima histidina. Tabela 4 navodi specifične SIRP-α aminokiseline koje mogu biti supstituisane ostacima histidina ili ne-histidina. Kontaktni ostaci su aminokiseline smeštene na interfejsu SIRP-α i CD47. Jezgreni ostaci su unutrašnje aminokiseline koje nisu direktno uključene u vezivanje između SIRP-α i CD47. SIRP-α varijante mogu da uključuju jednu ili više (npr. jednu, dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset itd., ili sve) supstitucija navedenih u Tabeli 4.
[0095] SIRP-α varijante koje sadrže jednu ili više (npr. jednu, dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset itd., sa maksimalnim brojem 20) supstituenata ostataka histidina mogu se testirati na njihovo vezivanje za CD47 pod različitim pH uslovima (npr. pri pH 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,4, 8). U nekim primerima izvođenja, prečišćeni CD47 protein može se koristiti za testiranje vezivanja. Razne tehnike koje su poznate mogu se koristiti za merenje konstante afiniteta (KA) ili konstante disocijacije (KD) SIRP-α varijante / CD47 kompleksa pod različitim pH uslovima (npr. pri pH 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,4, 8). U poželjnom primeru izvođenja, sposobnost vezivanja SIRP-α varijante za CD47 može se odrediti korišćenjem površinske plazmonske rezonance (npr. sistem površinske plazmonske rezonance (SPR) Biacore3000™, Biacore, INC, Piscataway NJ). U primernom izvođenju, SIRP-α varijanta sa vezivanjem zavisnim od pH koja specifično vezuje CD47 sa većim afinitetom na pH 6 nego na pH 7,4, pokazuje niži KDna pH 6 nego na pH 7,4.
IV． Vezivanje zavisno od hipoksije
[0096] Hipoksija tumora je stanje u kojem su ćelije tumora lišene kiseonika. Kako tumor raste, njegovo snabdevanje krvlju se neprestano preusmerava na delove tumora koji najbrže rastu, ostavljajući delove tumora sa koncentracijom kiseonika znatno nižom nego u zdravim tkivima.
[0097] U nekim primerima izvođenja, SIRP-α varijanta može biti vezana za prolek koji se aktivira hipoksijom, koji može prouzrokovati povećanje efikasnosti SIRP-α varijante protiv relevantnih obolelih ćelija pod specifično hipoksičnim uslovima. Prolekovi koji se aktiviraju hipoksijom poznati su u literaturi, poput onih koje su opisali Kling et al. (Nature Biotechnology, 30:381, 2012).
V． Vezivanje antitela
[0098] Sledeća strategija za obezbeđivanje selektivne SIRP-α aktivnosti na obolelom mestu u odnosu na ne-obolelo mesto je vezivanje SIRP-α proteina za protein ili peptid koji se može vezati za region antitela. Poželjno je da je antitelo specifično za obolelu ćeliju, npr. tumorsku ćeliju. Na primer, antitelo se može specifično vezati za protein ćelijske površine na bolesnoj ćeliji, na primer, tumorskoj ćeliji. SIRP-α protein može se vezati za antitelo reverzibilno ili ireverzibilno.
Opšte vezivanje antitela
[0099] U nekim primerima izvođenja, za stvaranje SIRP-α proteina koji se može vezati za
1
različita antitela, bez obzira na specifičnost antitela, SIRP-α protein može se spojiti sa proteinom ili peptidom koji prepoznaje konstantni region antitela, npr. CH2 ili CH3 konstantni domen Fc domena antitela. SIRP-α protein je sposoban da veže CD47 i ima najmanje 50% identičnosti aminokiselinske sekvence za sekvencu divljeg tipa SIRP-α (npr. varijanta 1 (SEQ ID NO: 1, prikazana dole)) ili sekvenca dela koji veže CD47 divljeg tipa SIRP-α (npr. sekvenca bilo kog od SEQ ID NOs: 3-12 navedenih u Tabeli 1).
[0100] CD47-vezujući deo divljeg tipa SIRP-α uključuje D1 domen divljeg tipa SIRP-α (npr. sekvenca bilo kog od SEQ ID NOs: 3-12 navedenih u Tabeli 1). Proteini i peptidi koji pokazuju opšte vezivanje za konstantni region antitela poznati su u tehnici. Na primer, bakterijski proteini koji vezuju antitela, npr. proteini A, G i L, vezuju se za konstantne regione antitela. Proteini A i G vezuju se za Fc domene, dok se proteini L vezuju za konstantni region lakog lanca. U primernom ostvarenju, protein A, G ili L mogu biti spojeni sa N- ili C-krajem SIRP-α proteina. Poželjno, u ovom izvođenju, fuzioni protein proteina A, G ili L i SIRP-α protein mogu biti vezani, tj. hemijskom konjugacijom, na antitelo pre administracije kako bi sprečilo vezivanje fuzionog proteina za različita druga antitela u serumu. Proteini A, G ili L takođe mogu da se evoluiraju i pregledaju pomoću konvencionalnih tehnika na terenu (tj. direktne evolucije i opisane literature) radi većeg afiniteta vezivanja za konstantne regione antitela. U nekim primerima izvođenja, SIRP-α protein može biti direktno vezan za antitelo koristeći konvencionalne genetske ili hemijske tehnike konjugacije. U drugim primerima izvođenja, SIRP-α protein takođe može biti vezan za antitelo pomoću odstojnika, što omogućava dodatnu strukturnu i prostornu fleksibilnost proteina. Dalje su ovde detaljno opisani razni odstojnici. U nekim primerima izvođenja, SIRP-α protein može da se veže, bilo direktno ili kroz protein ili peptid koji veže antitela, na antitelo reverzibilno ili nepovratno. Dalje, skrining modifikovanih antitela koja se mogu koristiti u skladu sa ovde prikazanim primerima izvođenja pronalaska može se izvršiti kao što je opisano u, na primer, SAD patentnoj objavi br. US 20100189651.
[0101] Ostali proteini ili peptidi koji su sposobni da se vezuju za konstantni region antitela i postupci skrininga za takve proteine ili peptide opisani su u SAD patentnoj objavi
2
br. US20120283408.
Specifično vezivanje antitela
[0102] U nekim primerima izvođenja, kako bi se obezbedilo selektivno ciljanje SIRP-α varijanti na obolelom mestu i kako bi se stvorila SIRP-α varijanta sposobna da se veže za određeno antitelo, npr. antitelo specifično za tumor, konstrukt varijante SIRP-α može uključivati SIRP-α varijantu i protein ili peptid specifičan za antitelo. SIRP-α varijanta može se spojiti sa proteinom ili peptidom specifičnim za antitelo (npr. antitelo-vezujući peptid). Poželjno je da se protein ili peptid specifično vežu za antitelo specifično za tumor. U nekim primerima izvođenja, fuzioni protein SIRP-α varijante i antitelo-vezujući protein ili peptid mogu se davati istovremeno sa antitelom specifičnim za tumor u kombinovanoj terapiji. U drugim primerima izvođenja, fuzioni protein i antitelo specifično za tumor mogu se primenjivati odvojeno, tj. u roku od nekoliko sati, poželjno je da se prvo daje antitelo. U još jednom izvođenju, pre primene, fuzioni protein može biti kovalentno vezan za antitelo specifično za tumor koristeći genetske ili hemijske metode koje su uobičajeno poznate u tehnici.
[0103] Primeri antitelo-vezujućeg peptida uključuju usled bolesti lokalizovan peptid (DLP) (SEQ ID NO: 64 ili 65), mali peptid koji se može vezati za centar fragmenta antigenvezujućeg (Fab) regiona Cetuksimaba (vidi, npr. Donaldson et al., Proc Natl Acad Sci USA.
110: 17456-17461, 2013). Cetuksimab je IgG1 antitelo protiv receptora epidermalnog faktora rasta (EGFR). Antitelo-vezujući peptidi koji se mogu spojiti sa SIRP-α varijantom takođe uključuju, ali nisu ograničeni na, peptide koji imaju najmanje 75% identičnosti aminokiselinske sekvence sa sekvencom DLP (SEQ ID NO: 64 ili 65) ili njegovim fragmentom. U nekim primerima izvođenja, antitelo-vezujući peptid ima sekvencu SEQ ID NO: 64.
[0104] U nedavnoj studiji je pokazano da SIRP-α pojačava in vitro fagocitozu DLD-1 ćelija u kombinaciji sa antitelom Cetuksimab ((Weiskopf et al., Science 341: 88-91, 2013). U nekim primerima izvođenja, SIRP-α varijanta može se spojiti sa određenim antitelo-vezujućim peptidom, npr. DLP koji ima sekvencu SEQ ID NO: 64. U ovim primerima izvođenja, konstrukt varijante SIRP-α koji uključuje varijantu SIRP-α i DLP može da usmeri svoju aktivnost ka EGFR-eksprimirajućim tumorima koji se vezuju za Cetuksimab. Ovo zauzvrat može dalje poboljšati isporuku konstrukta varijante SIRP-α, uključujući SIRP-α varijantu i DLP i Cetuksimab, pacijentima koji reaguju na EGFR. Primer konstrukta varijante SIRP-α koji uključuje SIRP-α varijantu i DLP, prikazan je u SEQ ID NO: 66, u kojoj jednom podvučeni deo označava DLP, a podebljani deo označava varijantu SIRP-α. Sekvenca SIRP-α varijante (podebljani deo) u SEQ ID NO: 66 može biti zamenjena sekvencom bilo koje SIRP-α varijante koja je ovde opisana. Ostali antitelo-vezujući peptidi takođe mogu biti spojeni sa SIRP-α varijantom. Takvi antitelo-vezujući peptidi uključuju, ali nisu ograničeni na, peptide koji se mogu specifično vezati za antitela kao što su cetuksimab, pembrolizumab, nivolumab, pidilizumab, MEDI0680, MEDI6469, Ipilimumab, tremelimumab, urelumab, vantictumab, varlilumab, mogamalizuma anti-CD20 antitelo, anti-CD19 antitelo, anti-CS1 antitelo, herceptin, trastuzumab i/ili pertuzumab.
[0105] U nekim primerima izvođenja, konstrukt varijante SIRP-α koji uključuje SIRP-α varijantu i DLP može se dalje kombinovati sa ovde opisanim blokirajućim peptidom na bazi CD47 da bi se blokiralo vezivanje konstrukta varijante SIRP-α pre nego što struktura stigne do obolelog mesta na kome se deljivi veznik može podeliti. U ovim primerima izvođenja, terapijski opseg se može proširiti kao konstrukt varijante SIRP-α koja sadrži SIRP-α varijantu, blokirajući peptid na bazi CD47 i DLP koji se akumulira na obolelom mestu i aktivan je na obolelom mestu nakon deljenja veznika indukovanog proteazom (npr. tumor specifične proteaze) ili drugim karakteristikama obolelog mesta (npr. kiseli pH, hipoksija).
[0106] U nekim primerima izvođenja, proteini ili peptidi sposobni da se vežu za antitela specifična za tumor mogu se identifikovati upotrebom tehnika koje se uobičajeno koriste u tehnici, kao što su direktna evolucija i opis literature, npr. faga. Postupci i tehnike usmereni na identifikovanje proteina i peptida koji se mogu vezati za antitela specifična za tumor poznati su u tehnici, poput onih koje su opisali Donaldson et al. (Proc Natl Acad Sci 110:17456-61, 2013). Kod faga opisanih u literaturi, potencijalni protein ili peptid specifičan za antitela tipično je kovalentno povezan sa slojem proteina bakteriofaga. Veza je rezultat prevođenja nukleinske kiseline koja kodira protein ili peptid koji je spojen sa omotačem proteina. Bakteriofag koji prikazuje peptid može se uzgajati i sakupljati koristeći standardne metode pripreme faga, npr. ove fage koje se prikazuju mogu se zatim podvrgnuti skriningu u odnosu na druge proteine, npr. antitela specifičnih za tumor, kako bi se otkrila interakcija između prikazanog proteina i antitela specifičnih za tumor. Kada se identifikuje protein ili peptid specifičan za tumor, nukleinska kiselina koja kodira odabrani protein ili peptid specifičan za tumor može se izolovati iz ćelija zaraženih odabranim fagima ili iz samog faga, nakon
4
amplifikacije. Mogu se odabrati pojedinačne kolonije ili plakovi, a nukleinska kiselina može izolovati i sekvencirati. Nakon identifikovanja i izolovanja proteina ili peptida specifičnog za antitela, protein ili peptid mogu se spojiti na N- ili C-kraj SIRP-α varijante. U nekim primerima izvođenja, SIRP-α varijanta može biti direktno vezana za antitelo specifično za tumor koristeći konvencionalne genetske ili hemijske tehnike konjugacije. U drugim primerima izvođenja, SIRP-α varijanta takođe se može vezati za antitelo specifično za tumor pomoću odstojnika, što omogućava dodatnu strukturnu i prostornu fleksibilnost proteina. Dalje su ovde detaljno opisani razni odstojnici. U nekim primerima izvođenja, SIRP-α varijanta može da se veže, bilo direktno ili kroz protein ili peptid koji veže antitela, za antitelo reverzibilno ili ireverzibilno.
[0107] U drugim izvođenjima, divlji tip SIRP-α ili ekstracelularni D1 domen divljeg tipa SIRP-α (npr. sekvenca bilo kog od SEQ ID NOs: 3-12 navedenih u Tabeli 1) može biti vezan za antitelo specifično za tumor. Poželjno je da je D1 domen SIRP-α vezan za antitelo specifično za tumor. Antitelo specifično za tumor služi kao ciljni deo za dovođenje SIRP-α ili D1 domena divljeg tipa na obolelo mesto, npr. mesto kancera, npr. unutar čvrstog tumora, gde divlji tip SIRP-α ili D1 domen može da komunicira sa CD47 na obolelim ćelijama. U nekim primerima izvođenja, divlji tip SIRP-α ili ekstracelularni D1 domen divljeg tipa SIRP-α može biti direktno vezan za antitelo specifično za tumor koristeći konvencionalne genetske ili hemijske tehnike konjugacije u tehnici. U drugim primerima izvođenja, divlji tip SIRP-α ili ekstracelularni D1 domen divljeg tipa SIRP-α takođe mogu biti prikačeni na antitelo specifično za tumor pomoću odstojnika, što omogućava dodatnu strukturnu i prostornu fleksibilnost proteina. Dalje su ovde detaljno opisani razni odstojnici. U drugim primerima izvođenja, divlji tip SIRP-α ili ekstracelularni D1 domen divljeg tipa SIRP-α mogu se spojiti sa gore pomenutim proteinom ili peptidom sposobnim da se vežu za antitelo specifično za tumor. U još nekim primerima izvođenja, drugi SIRP-α polipeptidi, kao što su oni opisani u međunarodnoj publikaciji br. WO2013109752, mogu biti vezani za antitelo specifično za tumor ili za protein ili antitelo-vezujući peptid specifičan za tumor. U nekim primerima izvođenja, divlji tip SIRP-α ili D1 domen mogu da se vežu, bilo direktno ili kroz antitelovezujući peptid ili protein, za antitelo reverzibilno ili ireverzibilno.
VI． Blokirajući peptidi
[0108] Blokirajući peptid može biti vezan za SIRP-α varijantu pomoću deljivog veznika. U nekim primerima izvođenja, blokirajući peptid takođe može biti nekovalentno vezan za SIRP-α varijantu. Blokirajući peptid deluje blokirajući mesto vezivanja CD47 varijante SIRP-α tako da se varijanta SIRP-α ne može vezati za CD47 na ćelijskoj površini ne-obolelih ćelija pod fiziološkim uslovima (npr. neutralni pH i odgovarajuća koncentracija kiseonika). U abnormalnim uslovima (tj. kiselo i/ili hipoksično okruženje ili okruženje sa povećanim eksprimiranjem proteaze) na obolelom mestu, kao što je mesto kancera, npr. unutar tumora, deljivi veznik može da se podeli i oslobodi SIRP-α varijanta od blokirajućeg peptida. Tada bi SIRP-α varijanta mogla slobodno da se veže za CD47 na obližnjim ćelijama tumora. Primeri deljivog veznika detaljno su dalje opisani.
[0109] U nekim primerima izvođenja, blokirajući peptid ima veći afinitet prema divljem tipu SIRP-α nego projektovanoj SIRP-α varijanti. Jednom kada se veznik odvoji, blokirajući peptid se disocira od SIRP-α varijante i može se vezati za divlji tip SIRP-α. Blokirajući peptid sa različitim afinitetima vezivanja za varijantu divljeg tipa SIRP-α i SIRP-α može se identifikovati korišćenjem metoda i tehnika koje su uobičajeno poznate u tehnici, npr. direktna evolucija i opisa literature (npr. prikaz faga ili kvasca). U jednom primernom ostvarenju, nukleotid koji kodira SIRP-α vezujući region CD47 ili nukleotid koji kodira promenljivi region anti-SIRP-α antitelo može mutirati i/ili rekombinovati nasumično da bi stvorila velika biblioteka varijanti gena koristeći tehnike kao što su, na primer, PCR-sklona greškama i premeštanje DNK. Jednom kada se kreira genetska biblioteka, mutantni peptidi kodirani nukleotidima mogu biti pregledani radi njihove sposobnosti da se vežu za varijante SIRP-α i SIRP-α divljeg tipa koristeći, na primer, prikaz faga ili kvasca. Identifikovani peptidi koji se mogu vezati i za varijantu divljeg tipa SIRP-α i za SIRP-α mogu se podvrgnuti drugom procesu skrininga tako da proteini koji se vežu sa većim afinitetom za divlji tip SIRP-α nego za SIRP-α varijantu mogu biti izolovani. Identifikovani peptidi, jednom vezani za varijantu divljeg tipa SIRP-α ili SIRP-α, trebalo bi da spreče vezivanje CD47 za varijantu divljeg tipa SIRP-α ili SIRP-α. Razne tehnike poznate stručnjacima mogu se koristiti za merenje konstante afiniteta (KA) ili konstante disocijacije (KD) SIRP-α varijante/blokirajućeg peptidnog kompleksa ili divljeg tipa SIRP-α/blokirajućeg peptidnog kompleksa. Blokirajući peptid može da se veže sa najmanje tri puta većim afinitetom za divlji tip SIRP-α nego za varijantu SIRP-α.
Blokirajući peptidi na bazi CD47
[0110] Blokirajući peptid može biti CD47 imitirani polipeptid ili CD47 fragment koji može da veže SIRP-α varijantu ovde opisanu. Neki blokirajući peptidi mogu da vežu SIRP-α varijantu na mestu koje se razlikuje od mesta vezivanja CD47. Neki blokirajući peptidi mogu da vežu SIRP-α varijantu na način koji se razlikuje od CD47. U nekim primerima izvođenja blokirajući peptid može sadržati najmanje jednu stabilizujuću disulfidnu vezu. Blokirajući peptid može sadržati polipeptidnu sekvencu CERVIGTGWVRC, ili njegov fragment ili varijantu. Varijanta blokirajućeg peptida može sadržati jednu ili više konzervativnih ili nekonzervativnih modifikacija. U nekim primerima izvođenja varijanta blokirajućeg peptida može sadržati modifikacije cisteina u serin i/ili jednu ili više modifikacija asparagina u glutamin. Blokirajući peptid se može vezati za SIRP-α varijantu na istom mestu kao i peptid koji sadrži polipeptidnu sekvencu CERVIGTGWVRC, ili njegovu varijantu ili fragment. Blokirajući peptid može sadržati polipeptidnu sekvencu GNYTCEVTELTREGETIIELK, ili njegov fragment ili varijantu. Blokirajući peptid može da se veže za SIRP-α varijantu na istom mestu kao i peptid koji sadrži polipeptidnu sekvencu GNYTCEVTELTREGETIIELK, ili njegovu varijantu ili fragment. U nekim primerima izvođenja blokirajući peptid može sadržati polipeptidnu sekvencu EVTELTREGE ili njegov fragment ili varijantu. Blokirajući peptid može da se veže za SIRP-α varijantu na istom mestu kao i peptid koji sadrži polipeptidnu sekvencu EVTELTREGE, ili njegovu varijantu ili fragment. U nekim primerima izvođenja blokirajući peptid može sadržati polipeptidnu sekvencu CEVTELTREGEC, ili njegov fragment ili varijantu. Blokirajući peptid može se vezati za SIRP-α varijantu na istom mestu kao i peptid koji sadrži polipeptidnu sekvencu CEVTELTREGEC, ili njegovu varijantu ili fragment.
[0111] Ovde su prikazani konstrukti varijante SIRP-α, koji sadrže SIRP-α varijantu i blokirajući peptid, pri čemu blokirajući peptid može sadržati polipeptidnu sekvencu SEVTELTREGET, ili njegov fragment ili varijantu. Blokirajući peptid može da se veže za SIRP-α varijantu na istom mestu kao i peptid koji sadrži polipeptidnu sekvencu SEVTELTREGET, ili njegovu varijantu ili fragment. U nekim primerima izvođenja blokirajući peptid može sadržati polipeptidnu sekvencu GQYTSEVTELTREGETIIELK, ili njegov fragment ili varijantu. Blokirajući peptid se može vezati za SIRP-α varijantu na istom mestu kao i peptid koji sadrži polipeptidnu sekvencu GQYTSEVTELTREGETIIELK, ili njegovu varijantu ili fragment.
[0112] U nekim primerima izvođenja blokirajući peptid može biti polipeptid varijante CD47, koji pokazuje veći afinitet prema divljem tipu SIRP-α, u poređenju sa SIRP-α varijantom. U poređenju sa CD47 divljeg tipa, blokirajući polipeptid može sadržati najmanje jednu od sledećih mutacija: T102Q, T102H, L101Q, L101H i L101Y. U poređenju sa CD47 divljeg tipa, blokirajući polipeptid može sadržati uvođenje dodatnog ostatka glicina na ili blizu N-kraja. Glicin se može uvesti pored glutamina i/ili leucina na ili blizu N-kraja CD47. U nekim primerima izvođenja blokirajući peptid može biti polipeptid varijante CD47 koji pokazuje niži afinitet za SIRP-α varijantu u poređenju sa divljim tipom CD47. Takvi polipeptidi u varijanti CD47 lako se identifikuju i testiraju pomoću ovde opisanih metoda.
[0113] Ovde su prikazani konstrukti varijante SIRP-α, koji sadrže ovde opisanu varijantu SIRP-α, pri čemu je navedena SIRP-α varijanta povezana sa ovde opisanim blokirajućim peptidom primenom najmanje jednog veznika. SIRP-α varijanta može sadržati isto mesto vezivanja CD47 kao divlji tip SIRP-α. SIRP-α varijanta može sadržati jednu ili više mutacija ili umetaka u poređenju sa divljim tipom SIRP-α. SIRP-α varijanta može biti skraćeni oblik divljeg tipa SIRP-α. Blokirajući peptid je možda ovde CD47 oponašač, varijanta ili fragment. Blokirajući peptid može pokazivati veći afinitet za divlji tip SIRP-α, u poređenju sa SIRP-α varijantom u konstruktu varijante SIRP-α. Blokirajući peptid može biti polipeptid varijante CD47 koji pokazuje niži afinitet za SIRP-α varijantu u poređenju sa divljim tipom CD47. Veznik može biti najmanje jedan veznik koji se opciono može deliti pomoću jedne ili više proteaza, a opciono takođe sadrži jedan ili više odstojnika. Deljivi veznik može sadržati sekvencu LSGRSDNH. Odstojnici mogu sadržati jednu ili više jedinica odstojnika glicinserina, od kojih svaka jedinica može sadržavati sekvencu GGGGS.
[0114] U nekim primerima izvođenja, blokirajući peptid koji je vezan za SIRP-α varijantu pomoću deljivog veznika je SIRP-α-vezujući peptid izveden iz CD47 (tj. blokirajući peptid na bazi CD47). U nekim primerima izvođenja, blokirajući peptid na bazi CD47 je izveden iz dela za vezanje SIRP-α CD47. Deo CD47 koji se veže za SIRP-α često se naziva domenom superporodice imunoglobulina (IgSF) CD47, čiji je sled prikazan u nastavku (SEQ ID NO: 35; Ref. NP_0017681).
SEQ ID NO: 35: IgSF domen humanog CD47, divljeg tipa
[0115] U nekim primerima izvođenja, blokirajući peptid na bazi CD47 sadrži IgSF domen CD47 pune dužine (SEQ ID NO: 35) ili njegov fragment. U nekim primerima izvođenja, blokirajući peptid na bazi CD47 sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstituenata, delecija i/ili dodataka u odnosu na divlji tip, IgSF domen CD47 (SEQ ID NO: 35) ili njegov fragment. U nekim primerima izvođenja, blokirajući peptid na bazi CD47 ima najmanje 80% (npr.83%, 86%, 90%, 93%, 96%, itd.) identičnosti aminokiselinske sekvence sa sekvencom divljeg tipa, IgSF domena CD47 (SEQ ID NO: 35) ili njegov fragment.
[0116] U nekim primerima izvođenja, supstituenti aminokiselina, delecije i/ili dodaci u blokirajućem peptidu na osnovu CD47 rezultiraju blokirajućim peptidom na bazi CD47, koji ima nizak afinitet vezivanja za SIRP-α varijantu i relativno veći afinitet vezivanja za divljeg tipa SIRP-α. U nekim primerima izvođenja, supstituenti aminokiselina u blokirajućem peptidu na bazi CD47 nalaze se na interfejsu CD47 i SIRP-α. Na primer, supstitucija aminokiselina T102Q u CD47 IgSF domenu sterično se sukobljava sa aminokiselinskom supstitucijom A27I u SIRP-α varijanti, dok se divlji tip SIRP-α koji ima A27 ne bi sterično sukobljavao sa aminokiselinskom supstitucijom T102Q (vidi sl. 2). Prema tome, blokirajući peptid na bazi CD47 koji ima T102Q bi se sa većim afinitetom vezao za divlji tip SIRP-α koji ima A27 nego za varijantu SIRP-α koja ima A27I. Primeri supstitucija aminokiselina u blokirajućem peptidu na bazi CD47 koji mogu stvoriti steričke sukobe sa određenim aminokiselinama u SIRP-α varijanti navedeni su u Tabeli 5. Svaki od ovih aminokiselinskih supstituenata u blokirajućem peptidu na bazi CD47 može smanjiti afinitet vezivanja blokirajućeg peptida na osnovu CD47 prema SIRP-α varijanti, u zavisnosti od specifične aminokiseline u SIRP-α varijanti na mestu interakcije SIRP-α-CD47.
Tabela 5: Primeri supstituenata aminokiselina u blokirajućem peptidu na bazi CD47, koji mogu stvoriti steričke sukobe sa određenim aminokiselinama u SIRP-α varijanti Supstitucija aminokiselina u blokirajućem Aminokiselina u SIRP-α varijanti peptidu na bazi CD47 (numerisanje (numerisanje aminokiselina je relativno aminokiselina je relativno prema SEQ ID NO: prema bilo kojoj od SEQ ID NO: 13-23)
[0117] Pored stvaranja steričnih sukoba između blokirajućeg peptida na bazi CD47 i SIRP-α varijante, supstitucije aminokiselina, dodavanja i/ili delecije mogu se takođe koristiti za razbijanje specifičnih nekovalentnih interakcija između blokiranja na bazi CD47 peptidu i SIRP-α varijanti, čime se smanjuje afinitet vezivanja blokirajućeg peptida na osnovu CD47 za SIRP-α varijantu. U nekim primerima izvođenja, proširivanje N-kraja blokirajućeg peptida na bazi CD47 za jednu ili više aminokiselina (npr. jednu aminokiselinu), bilo dodavanjem jedne ili više aminokiselina direktno na N-kraj i/ili umetanjem jedne ili više aminokiselina između ostalih aminokiselina na N-kraju, prekida nekovalentne interakcije (npr. interakcije vodoničnog vezivanja) između N-kraja blokirajućeg peptida na bazi CD47 i SIRP-α varijante. Na primer, dodavanje aminokiselina, npr. dodavanje glicina, na N-kraju blokirajućeg peptida na bazi CD47 sprečiće ciklizaciju glutamina u piroglutamat na N-kraju, a takođe će stvoriti neželjene kontakte i interakcije koje će verovatno poremetiti interakcije vodonične veze između N-kraja piroglutamata blokirajućeg peptida na bazi CD47 i aminokiseline L66 u divljem tipu SIRP-α ili supstitucije aminokiseline L66T u SIRP-α varijanti (videti takođe Primer 5). U nekim primerima izvođenja, aminokiselinski ostatak, npr. Glicin, dodaje se na N-kraj blokirajućeg peptida na bazi CD47, tako da se N-kraj CD47 menja iz QLLFNK u GQLLFNK ili QGLLFNK. Izbor aminokiselinskih supstituenata, delecija i/ili dodataka u blokirajućem peptidu na bazi CD47 zavisio bi od specifičnih supstituenata aminokiselina u SIRP-α varijanti.
[0118] Dalje, spajanje N-kraja blokirajućeg peptida na bazi CD47 sa C-krajem SIRP-α varijante preko deljivog veznika i opciono jednog ili više odstojnika takođe utiče na interakcije vezivanja između blokirajućeg peptida na bazi CD47 i SIRP-α varijante i smanjuje afinitet vezivanja blokirajućeg peptida na bazi CD47 za SIRP-α varijantu. U nekim primerima izvođenja, u konstruktu varijante SIRP-α, N-kraj blokirajućeg peptida na bazi CD47 je spojen sa C-krajem SIRP-α varijante pomoću deljivog veznika i opciono jednog ili više odstojnika. U nekim primerima izvođenja, u konstruktu varijante SIRP-α, C-kraj blokirajućeg peptida na bazi CD47 je spojen sa N-krajem SIRP-α varijante pomoću deljivog veznika i opciono jednog ili više odstojnika.
[0119] Primerni blokirajući peptidi na bazi CD47 prikazani su u Tabeli 6. U nekim primerima izvođenja blokirajući peptid na bazi CD47 ima ili uključuje sekvencu SEVTELTREGET (SEQ ID NO: 38). U nekim primerima izvođenja, blokirajući peptid na bazi CD47 ima ili uključuje sekvencu GQYTSEVTELTREGETIIELK (SEQ ID NO: 40).
Tabela 6
4
SEQ ID Blokirajući peptidi na bazi CD47 Deo CD47 IgSF domena
VII. Deljivi veznici
[0120] U nekim primerima izvođenja, konstrukt varijante SIRP-α uključuje SIRP-α varijantu koja je vezana za blokirajući peptid. U nekim primerima izvođenja, konstrukt varijante SIRP-α uključuje divlji tip SIRP-α vezan za blokirajući peptid. Veznik koji se koristi za spajanje SIRP-α varijante ili divljeg tipa SIRP-α i blokirajućeg peptida može biti deljivi veznik ili nedeljivi veznik. U nekim primerima izvođenja, preferirano vezivanje SIRP-α varijante u konstruktu varijante SIRP-α za CD47 na obolelim ćelijama ili obolelim mestima može se dobiti dodavanjem blokirajućeg peptida na SIRP-α varijantu upotrebom deljivog veznika, koji se deli na obolelim ćelijama ili obolelim mestima.
[0121] U nekim primerima izvođenja, deljivi veznik se koristi između SIRP-α varijante i blokirajućeg peptida. U nekim primerima izvođenja, deljivi veznik može biti instaliran unutar blokirajućeg peptida, koji može biti nekovalentno povezan sa SIRP-α varijantom da blokira vezivanje SIRP-α varijante za CD47 pod fiziološkim uslovima. Deljivi veznik može se deliti pod određenim uslovima. Ako se deljivi veznik nalazi unutar blokirajućeg peptida, deljenje veznika bi deaktiviralo blokirajući peptid. U uslovima karakterističnim za bolesno mesto, kao što je mesto kancera, npr. unutar tumora, veznik se deli da oslobodi SIRP-α varijantu iz blokirajućeg peptida tako da se SIRP-α varijanta može vezati za obližnji CD47 na ćelijskoj površini obolelih ćelija, npr. tumorskih ćelija. Na taj način, u SIRP-α struktura koja uključuje SIRP-α varijantu i blokirajući peptid, SIRP-α varijanta može se vezati samo za CD47 na obolelim ćelijama (npr. ćelije tumora) ili ćelijama na obolelom mestu (npr. ćelije u mikrookruženju tumora koji podržavaju rast tumora), i nije sposoban da se veže za CD47 na neobolelim ćelijama pod fiziološkim uslovima, jer deljivi veznik ostaje stabilan u fiziološkim uslovima, a mesto vezivanja CD47 na SIRP-α varijanti će biti blokirano blokirajućim peptidom. Deljivi veznik koji se može deliti može uključivati aminokiseline, organske male molekule ili kombinaciju aminokiselina i organskih malih molekula koji dele ili indukuju deljenje veznika pod uslovima karakterističnim za obolelo mesto, kao što su kiseli pH, hipoksija i povećano eksprimiranje proteaze. Deljivi veznici su stabilni u fiziološkim uslovima (npr. neutralni pH i odgovarajuća koncentracija kiseonika). U nekim primerima izvođenja, deljivi veznik se možda neće deliti i blokirajući peptid se može jednostavno odvojiti od SIRP-α varijante na obolelom mestu tako da se SIRP-α varijanta može slobodno vezati za obližnji CD47 na obolelim ćelijama, npr. ćelijama tumora . U ovim primerima izvođenja, SIRP-α varijante mogu biti projektovane tako da imaju pH-zavisno vezivanje za CD47, čiji su detalji prethodno opisani. Prema tome, blokirajući peptid (npr. blokirajući peptid na bazi CD47 ili domen CD47 IgSF blokirajućeg peptida) može da se odvojiti od SIRP-α varijante pod kiselim pH obolelog mesta. U nekim primerima izvođenja, za projektovanje pH zavisnog vezivanja SIRP-α varijante za CD47 na obolelom mestu, histagenom mutagenezom može se dejstvovati na SIRP-α, posebno u regionu SIRP-α koji komunicira sa CD47.
pH-zavisni deljivi veznici
[0122] Jedna od karakteristika mesta kancera, npr. unutar tumora, je kiseli pH. U nekim primerima izvođenja, veznik se može deliti pod kiselim pH (npr. ispod pH 7). Veznik osetljiv na kiselu sredinu je stabilan pri fiziološkom pH (npr. oko pH 7,4). Deljenje pri kiselom pH može se vršiti pomoću kisele hidrolize ili pomoću proteina prisutnih i aktivnih pri kiselom pH obolelog mesta, kao što je mesto kancera, npr. unutar tumora. Kiselo osetljivi veznici mogu da sadrže ostatak, kao što je hemijska funkcionalna grupa ili jedinjenje, koji hidrolizuju pod kiselim pH. Hemijske funkcionalne grupe i jedinjenja osetljiva na kiseline uključuju, ali nisu ograničene na, na primer, acetale, ketale, tiomaleamate, hidrazone i disulfidne veze. Kiselo osetljivi veznici, kao i hemijske grupe i jedinjenja osetljiva na kiseline, koja se mogu koristiti u strukturi kiselinski osetljivih veznika, dobro su poznata u tehnici i opisana su u SAD patentima br. 8,748,399 , 5,306,809 ,i 5,505,931 , Laurent et al., (Bioconjugate Chem. 21:5-13, 2010), Castaneda et al. (Chem. Commun.49:8187-8189, 2013), i Ducry et al. (Bioconjug. Chem. 21:5-13, 2010). U jednom primeru izvođenja, disulfidna veza može se instalirati u deljivi veznik pomoću sintetizera peptida i/ili konvencionalnih tehnika hemijske sinteze. U još jednom izvođenju, veznik tiomaleaminske kiseline (Castaneda et al. Chem. Commun.
49:8187-8189, 2013) može se koristiti kao deljivi veznik. U ovom slučaju, za umetanje veznika tiomaleaminske kiseline između SIRP-α varijante i blokirajućeg peptida, jedna od dve tiolne grupe veznika tiomaleaminske kiseline (videti, na primer, šemu 2, Castaneda et al.) može biti pričvršćena na C-kraj SIRP-α varijante, dok estarska grupa tiomaleminskog veznika može biti vezana za N-kraj blokirajućeg peptida.
Deljivi veznici zavisni od hipoksije
[0123] U nekim primerima izvođenja, veznik se može deliti pod hipoksičnim uslovima, što je još jedna karakteristika mesta kancera, npr. unutar tumora. SIRP-α varijanta koja je pričvršćena na blokirajući peptid pomoću veznika osetljivog na hipoksiju sprečava vezivanje za CD47 na ne-obolelim ćelijama, dok veznik ostaje stabilan u fiziološkim uslovima (npr. neutralni pH i odgovarajuća koncentracija kiseonika). Jednom kada se fuzioni protein nalazi na mestu kancera, npr. unutar tumora, gde je koncentracija kiseonika znatno niža nego u zdravim tkivima, veznik se deli da bi se oslobodila SIRP-α varijanta iz blokirajućeg peptida, koji se zatim može vezati za ćeliju površinski CD47 na ćelijama tumora. Veznik osetljiv na hipoksiju može da sadrži ostatak, npr. aminokiselinu ili hemijsku funkcionalnu grupu, koja se može deliti pod hipoksičnim uslovima. Neki primeri hemijskih delova koji se mogu deliti, tj. deliti redukcijom, pod hipoksičnim uslovima, uključuju, ali nisu ograničeni na, hinone, N-okside i heteroaromatične nitro grupe. Ovi hemijski delovi mogu se ugraditi u deljivi veznik
4
koristeći konvencionalne hemijske tehnike i tehnike sinteze peptida. Primeri aminokiselina osetljivih na hipoksiju su takođe poznati u tehnici, poput onih koje su opisali Shigenaga et al. (European Journal of Chemical Biology 13:968-971, 2012).
[0124] U poželjnom ostvarenju, aminokiselina osetljiva na hipoksiju koju su opisali Shigenaga et al. (European J. Chem, Biol.13:968-971, 2012) može se umetnuti između SIRP-α varijante i blokirajućeg peptida. Na primer, amino grupa aminokiseline osetljive na hipoksiju može biti vezana za C-kraj SIRP-α varijante pomoću peptidne veze, a slično tome, grupa karboksilne kiseline aminokiseline osetljive na hipoksiju može biti vezana za N-kraj blokirajućeg peptida kroz peptidnu vezu. Pod hipoksičnim uslovima, redukcija nitro grupe indukuje deljenje peptidne veze između aminokiseline osetljive na hipoksiju i N-kraja blokirajućeg peptida, čime se uspešno oslobađa SIRP-α varijanta iz blokirajućeg peptida. Tada se SIRP-α varijanta može vezati za CD47 na ćelijama tumora.
[0125] U još jednom izvođenju, osetljiva na hipoksiju 2-nitroimidazol grupa koju su opisali Duan et al. (J. Med. Chem.51:2412-2420, 2008) može se umetnuti između SIRP-α varijante i blokirajućeg peptida ili ugraditi u deljivi veznik umetnut između SIRP-α varijante i blokirajućeg peptida. Pod hipoksičnim uslovima, redukcija nitro grupe indukuje dalje smanjenje, što na kraju dovodi do uklanjanja 2-nitroimidazolne grupe iz njenog vezivanja, npr. SIRP-α varijanta, blokirajući peptid ili deljivi veznik.
Deljivi veznici zavisni od enzima povezanog sa tumorom
[0126] U drugim primerima izvođenja, konstrukt varijante SIRP-α može sadržati SIRP-α varijantu koja je vezana na blokirajući peptid pomoću veznika (npr. deljivi veznik koji se može deliti) i opciono jedan ili više odstojnika (primeri odstojnika su opisani detaljnije ovde). U nekim primerima izvođenja, veznik (npr. deljivi veznik) može se deliti enzimom povezanim sa tumorom. U nekim primerima izvođenja, veznik, koji se može deliti enzimom povezanim sa tumorom, može biti sadržan u blokirajućem peptidu, koji može biti nekovalentno vezan za SIRP-α varijantu. Jednom kada se fuzioni protein nalazi na mestu kancera, npr. unutar tumora, veznik se deli enzimom povezanim sa tumorom da bi oslobodio SIRP-α varijantu iz blokirajućeg peptida, koji se zatim može vezati za ćelijsku površinu CD47 na ćelijama tumora. Veznik osetljiv na enzim povezan sa tumorom može sadržati ostatak, npr. proteinski supstrat, koji se može posebno deliti enzimom, npr. proteazom, koja je prisutna samo na mestu kancera, npr. unutar tumora. Sastav se može odabrati na osnovu vrste enzima, npr. proteaze, prisutne na mestu kancera, npr. unutar tumora. Primer deljivog veznika koji se može deliti enzimom povezanim sa tumorom je LSGRSDNH (SEQ ID NO: 47), koji se može deliti višestrukim proteazama, npr. matriptazom (MTSP1), aktivatorom plazminogena urinarnog tipa (uPA), legumainom, PSA (takođe nazvan KLK3, peptidaza-3 povezana sa kalikreinom), matrična metaloproteinaza-2 (MMP-2), MMP9, humana neutrofilna elastaza (HNE) i proteinaza 3 (Pr3). Dostupni su i drugi deljivi veznici koji su podložni deljenju enzimima (npr. proteaze). Pored gore pomenutih proteaza, drugi enzimi (npr. proteaze) koji mogu da dele deljivi veznik uključuju, ali nisu ograničeni na, urokinazu, tkivni aktivator plazminogena, tripsin, plazmin i drugi enzim koji ima proteolitičke aktivnosti. Prema nekim primerima izvođenja ovog pronalaska, SIRP-α varijanta ili divlji tip SIRP-α je vezan za blokirajući peptid pomoću veznika (npr. deljivi veznik) koji je podložan deljenju enzimima koji imaju proteolitičke aktivnosti, poput kao urokinaza, tkivni aktivator plazminogena, plazmin ili tripsin.
[0127] U nekim primerima izvođenja, sekvence deljivih veznika mogu se izvesti i odabrati spajanjem nekoliko sekvenci na osnovu različitih preferiranih enzima. Neograničeni primeri nekoliko potencijalnih proteaza i odgovarajućih mesta proteaza prikazani su u Tabeli 7. U Tabeli 7, „-“ označava bilo koju aminokiselinu (tj. bilo koju aminokiselinu koja se prirodno javlja), glavni slučaj ukazuje na snažnu sklonost toj aminokiselini , malim slovima ukazuje na manju preferiranost za tu aminokiselinu, a „/“ razdvaja položaje aminokiselina u primerima izvođenja kada je moguće više od jedne aminokiseline na susednom položaju „/“. Ostale sekvence koje se mogu deliti uključuju, ali nisu ograničene na, sekvence iz lanca kolagena ljudske jetre (α1 (III) (npr. GPLGIAGI (SEQ ID NO: 100))), sekvencu iz humanog PZP (npr. YGAGLGVV (SEQ ID NO: 101), AGLGVVER (SEQ ID NO: 102), ili AGLGISST (SEQ ID NO: 103)) i druge sekvence koje su autolitičke (npr. VAQFVLTE (SEQ ID NO: 104), AQFVLTEG (SEQ ID NO: 105), ili PVQPIGPQ (SEQ ID NO: 106)).
Tabela 7
4
[0128] U literaturi postoje izveštaji o povećanom nivou enzima koji imaju poznate supstrate u različitim vrstama kancera, npr. čvrstim tumorima. Videti, na primer, La Rocca et al., Brit. J. Cancer 90:1414-1421 i Ducry et al., Bioconjug. Chem. 21:5-13, 2010. Enzimi povezani sa tumorom takođe se mogu identifikovati pomoću konvencionalnih tehnika poznatih u tehnici, npr. imunohistohemija tumorskih ćelija. U jednom primernom izvođenju, enzimski osetljivi deo u vezniku može biti supstrat matrične metaloproteinaze (MMP), koji se može deliti MMP-om koji je prisutan na mestu kancera, npr. unutar tumora. U još jednom primernom ostvarenju, enzim osetljiv deo u vezniku može biti dipeptidni veznik koji sadrži maleimido (vidi, na primer, Tabelu 1 u Ducry et al.), koji se može deliti protealizom proteazama (npr. katepsin ili plazmin) prisutnim na povišenom nivou u određenim tumorima Koblinski et al.,
4
Chim. Acta 291:113-135, 2000). U ovom ostvarenju, maleimidna grupa dipeptidnog veznika koji sadrži maleimido može biti konjugovana sa cisteinskim ostatkom SIRP-α varijante, a grupa karboksilne kiseline na C-kraju dipeptidnog veznika koji sadrži maleimido može biti konjugovana sa amino grupom na N-kraju blokirajućeg peptida. Slično tome, maleimidna grupa dipeptidnog veznika koji sadrži maleimido može biti konjugovana sa cisteinskim ostatkom blokirajućeg peptida i grupa karboksilne kiseline na C-kraju dipeptidnog veznika koji sadrži maleimido može biti konjugovana sa amino grupom na N-kraju SIRP-α varijante. Masena spektrometrija i druge raspoložive tehnike u polju proteomike mogu se koristiti za potvrđivanje deljenja deljivih veznika zavisnih od enzima povezanih sa tumorom. Ostali delovi osetljivi na enzime opisani su u SAD patentu br. 8,399,219. U nekim primerima izvođenja, ostatak osetljiv na enzim povezan sa tumorom, npr. proteinski supstrat, može se ubaciti između SIRP-α varijante i blokirajućeg peptida koristeći konvencionalnu molekularnu ćelijsku biologiju i tehnike hemijske konjugacije dobro poznate u tehnici.
VIII. Serumski albumin
[0129] Spajanje sa serumskim albuminima može poboljšati farmakokinetiku proteinskih lekova, a posebno, ovde opisana SIRP-α varijanta može se pridružiti serumskom albuminu. Serumski albumin je globularni protein koji je najzastupljeniji protein krvi u sisara. Serumski albumin se proizvodi u jetri i čini oko polovine proteina krvnog seruma. Monomerna je i rastvorljiva u krvi. Neke od najvažnijih funkcija serumskog albumina uključuju transport hormona, masnih kiselina i drugih proteina u telu, puferisanje pH i održavanje osmotskog pritiska potrebnog za pravilnu raspodelu telesnih tečnosti između krvnih sudova i telesnih tkiva. . U nekim primerima izvođenja, SIRP-α varijanta može se spojiti sa serumskim albuminom. U poželjnim primerima izvođenja, serumski albumin je humani serumski albumin (HSA). U nekim primerima izvođenja ovog pronalaska, N-kraj HSA je povezan sa C-krajem SIRP-α varijante da bi se povećao serumski polu-život SIRP-α varijante. HSA se može pridružiti, direktno ili preko veznika na C-kraj SIRP-α varijante. Spajanje N-kraja HSA sa C-krajem SIRP-α varijante zadržava N-kraj SIRP-α varijante slobodnim za interakciju sa CD47 i proksimalnim krajem C-kraja HSA za interakciju sa FcRn. HSA koji se mogu koristiti u ovde opisanim postupcima i sastavima su opšte poznati u tehnici. U nekim primerima izvođenja, HSA uključuje aminokiseline 25-609 (SEQ ID NO: 67) sekvence UniProt ID NO: P02768. U nekim primerima izvođenja, HSA uključuje jedan ili više supstituenata aminokiselina (npr. C34S i/ili K573P), u odnosu na SEQ ID NO: 67. U nekim primerima izvođenja, HSA ima sekvencu SEQ ID NO: 68.
4
IX. Albumin-vezujući peptidi
[0130] Vezivanje za serumske proteine može poboljšati farmakokinetiku proteinskih farmaceutskih proizvoda, a posebno ovde opisane SIRP-α varijante mogu se spojiti sa serumom protein-vezujući peptidima ili proteinima. U nekim primerima izvođenja, SIRP-α varijanta može se spojiti sa albumin-vezujućim peptidom koji pokazuje aktivnost vezivanja za serumski albumin da bi povećao vreme poluraspada SIRP-α varijante. Albumin-vezujući peptidi koji se mogu koristiti u ovde opisanim metodama i sastavima su opšte poznati u tehnici. Videti, na primer, Dennis et al., J. Biol. Chem. 277:35035-35043, 2002 i Miyakawa et al., J. Pharm. Sci. 102:3110-3118, 2013. U jednom ostvarenju, albumin-vezujući peptid uključuje sekvencu DICLPRWGCLW (SEQ ID NO: 2). Albumin-vezujući peptidi može se genetski spojiti sa SIRP-α varijantom ili povezati sa SIRP-α varijantom hemijskim sredstvima, npr. hemijskom konjugacijom. Ako se želi, može se umetnuti odstojnik između SIRP-α varijante i albumin-vezujućeg peptida kako bi se omogućila dodatna strukturna i prostorna fleksibilnost fuzionog proteina. Specifični odstojnici i njihove aminokiselinske sekvence su ovde detaljno opisani. U nekim primerima izvođenja, albumin-vezujući peptid može biti spojen sa N- ili C-krajem SIRP-α varijante. U jednom primeru, C-kraj albuminvezujućeg peptida može se direktno spojiti sa N-krajem SIRP-α varijante preko peptidne veze. U drugom primeru, N-kraj albumin-vezujućeg peptida može se direktno spojiti sa C-krajem SIRP-α varijante preko peptidne veze. U još jednom primeru, karboksilna kiselina na C-kraju albumin-vezujućeg peptida može se spojiti sa unutrašnjim aminokiselinskim ostatkom, tj. amino-grupom bočnog lanca ostatka lizina u SIRP-α varijanti koristeći konvencionalne tehnike hemijske konjugacije. Bez vezivanja za teoriju, očekuje se da spajanje albuminvezujućeg peptida sa SIRP-α varijantom može dovesti do produženog zadržavanja terapijskog proteina njegovim vezivanjem za serumski albumin.
X. Fc domeni
[0131] U nekim primerima izvođenja, konstrukt varijante SIRP-α može sadržati SIRP-α varijantu i monomer Fc domena. U nekim primerima izvođenja, SIRP-α varijanta može biti spojena sa monomerom Fc domena imunoglobulina ili fragmentom monomera Fc domena. Kao što je uobičajeno poznato u tehnici, Fc domen je struktura proteina koja se nalazi na C-kraju imunoglobulina. Fc domen uključuje dva monomera Fc domena koji su umanjeni interakcijom između konstantnih domena CH3 antitela. Fc domen divljeg tipa formira minimalnu strukturu koja se vezuje za Fc receptor, npr. FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa,
4
FcγRIIIb, FcγRIV. U ovom pronalasku, monomer Fc domena ili fragment Fc domena spojen sa SIRP-α varijantom da bi se povećao polu-život SIRP-α u serumu može sadržati dimer dva monomera Fc domena ili monomer Fc domena, pod uslovom da se monomer Fc domena može vezati za Fc receptor (npr. FcRn receptor). Dalje, Fc domen ili fragment Fc domena spojen sa SIRP-α varijantom da bi povećali serumski polu-život SIRP-α varijante ne indukuju bilo kakav odgovor vezan za imuni sistem. U nekim primerima izvođenja, Fc domen može biti mutiran tako da mu nedostaju efektorske funkcije, tipično za "mrtvi" Fc domen. Na primer, Fc domen može uključivati specifične supstituente aminokiselina za koje je poznato da minimiziraju interakciju između Fc domena i Fcγ receptora. U nekim realizacijama, monomer Fc domena ili fragment Fc domena može se spojiti sa N- ili C-krajem SIRP-α varijante konvencionalnim genetskim ili hemijskim sredstvima, na primer, hemijskom konjugacijom. Po želji se veznik (npr. odstojnik) može umetnuti između SIRP-α varijante i monomera Fc domena.
Heterodimerizacija monomera Fc domena
[0132] U nekim primerima izvođenja, svaki od dva monomera Fc domena u Fc domenu uključuje supstituente aminokiselina koje pospešuju heterodimerizaciju dva monomera. Heterodimerizacija monomera Fc domena može se promovisati uvođenjem različitih, ali kompatibilnih supstituenata u dva monomera Fc domena, kao što su parovi ostataka "dugme u otvor" i parovi ostataka naelektrisanja. Upotrebu parova ostataka "dugme u otvor" opisali su Carter i saradnici (Ridgway et al., Protein Eng. 9:617-612, 1996 ; Atwell et al., J Mol Biol.
270:26-35, 1997 ; Merchant et al., Nat Biotechnol. 16:677-681, 1998). Interakcija dugmeta i rupe favorizuje stvaranje heterodimera, dok dugme-dugme i otvor-otvor interakcija ometaju stvaranje homodimera zbog steričkog sukoba i brisanja povoljnih interakcija. Tehnika „dugme u otvor“ takođe je otkrivena u Objavi SAD patentne prijave br. 8,216,805 , Merchant et al., Nature Biotechnology 16:677-681, 1998,i Merchant et al., Proc Natl Acad Sci USA.
110:E2987-E2996, 2013. Otvor je praznina koja nastaje kada se originalna aminokiselina u proteinu zameni drugom aminokiselinom koja ima manju zapreminu bočnog lanca. Dugme je ispupčenje koje nastaje kada se originalna aminokiselina u proteinu zameni drugom aminokiselinom koja ima veću zapreminu bočnog lanca. Konkretno, aminokiselina koja se zamenjuje nalazi se u konstantnom domenu CH3 antitela monomera Fc domena i uključena je u dimerizaciju dva monomera Fc domena. U nekim primerima izvođenja, otvor u jednom konstantnom domenu CH3 antitela je stvoren da primi dugme u drugom konstantnom domenu CH3 antitela, tako da dugme i aminokiseline u otvoru deluju da promovišu ili favorizuju
4
heterodimerizaciju dva monomera Fc domena. U nekim primerima izvođenja stvara se otvor u jednom konstantnom domenu CH3 antitela da bi se bolje prilagodila originalnoj aminokiselini u drugom konstantnom domenu CH3 antitela. U nekim primerima izvođenja, dugme u jednom konstantnom domenu antitela na CH3 je stvoreno da formira dodatne interakcije sa originalnim aminokiselinama u drugom konstantnom domenu antitela na CH3.
[0133] Otvor se može napraviti zamenom aminokiselina koje imaju veće bočne lance kao što su tirozin ili triptofan, aminokiselinama koje imaju manje bočne lance kao što su alanin, valin ili treonin, kao što je Y407V mutacija u konstantnom domenu CH3 antitela. Slično tome, dugme se može konstruisati zamenom aminokiselina koje imaju manje bočne lance aminokiselinama koje imaju veće bočne lance, kao što je mutacija T366W u konstantnom domenu CH3 antitela. U poželjnom izvođenju, jedan monomer Fc domena uključuje mutaciju dugmeta T366W, a drugi monomer Fc domena uključuje mutacije otvora T366S, L358A i Y407V. SIRP-α D1 varijanta pronalaska može se spojiti sa monomerom Fc domena, uključujući mutaciju dugmeta T366W da bi se ograničilo neželjeno stvaranje homodimera dugme-dugme. Primeri parova aminokiselina dugme u otvor dati su, bez ograničenja, u Tabeli 8.
Tabela 8
[0134] Pored strategije dugme u otvor, strategija elektrostatičkog upravljanja takođe se može koristiti za kontrolu dimerizacije monomera Fc domena. Elektrostatičko upravljanje je korišćenje povoljnih elektrostatičkih interakcija između suprotno naelektrisanih aminokiselina u peptidima, protein domenima i proteinima za kontrolu formiranja viših uređenih molekula proteina. . Konkretno, za kontrolu dimerizacije monomera Fc domena koristeći elektrostatičko upravljanje, jedan ili više aminokiselinskih ostataka koji čine CH3-CH3 interfejs zamenjuju se pozitivno ili negativno naelektrisanim aminokiselinskim ostacima, tako da interakcija postaje elektrostatički povoljna ili nepovoljna u zavisnosti od uvedenih specifičnih naelektrisanih aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, pozitivno naelektrisana aminokiselina u interfejsu, poput lizina, arginina ili histidina, zamenjuje se negativno naelektrisanom aminokiselinom kao što je asparaginska kiselina ili glutaminska kiselina. U nekim primerima izvođenja, negativno naelektrisana aminokiselina u interfejsu zamenjuje se pozitivno naelektrisanom aminokiselinom. Naelektrisane aminokiseline mogu se uvesti interakcijom u jedan od konstantnih domena CH3 antitela, ili u oba. Uvođenje naelektrisanih aminokiselina u interaktivne konstantne domene CH3 antitela dva monomera Fc domena može promovisati selektivno stvaranje heterodimera monomera Fc domena pod kontrolom upravljanja elektrostatičkih efekata koji su rezultat interakcije između naelektrisanih aminokiselina. Tehnika elektrostatičkog upravljanja takođe je otkrivena u Objavi SAD patentne prijave br. 20140024111 , Gunasekaran et al., J Biol Chem. 285:19637-46, 2010, i Martens et al., Clin Cancer Res. 12:6144-52, 2006. Primeri elektrostatičkih parova aminokiselina dati su, bez ograničenja, u Tabeli 9.
Tabela 9
XI. Polietilen glikol (PEG) polimer
[0135] U nekim primerima izvođenja, SIRP-α varijanta takođe može biti spojena sa polimerom, npr. polietilen glikolom (PEG). Vezivanje polimera za proteinski farmaceutski preparat može maskirati farmaceutski protein iz imunološkog sistema domaćina (Milla et al., Curr Drug Metab. 13:105-119, 2012). Pored toga, određeni polimeri, na primer, hidrofilni polimeri, takođe mogu da obezbede rastvorljivost u vodi hidrofobnih proteina i lekova (Gregoriadis et al., Cell Mol. Life Sci. 57:1964-1969, 2000; Constantinou et al., Bioconjug. Chem. 19:643-650, 2008). Različiti polimeri, poput PEG, lanca polisijalne kiseline (Constantinou et al., Bioconjug. Chem. 19:643-650, 2008) i PAS lanca (Schlapschy et al., Protein Eng. Des. Sel. 26:489-501, 2013), poznati su u tehnici i mogu se koristiti u ovom
1
pronalasku. U nekim primerima izvođenja, polimer, npr. PEG može biti kovalentno vezan supstitucijom ili dodavanjem cisteina u SIRP-α varijantu. Supstitucija cisteina u SIRP-α varijanti može biti I7C, A16C, S20C, T20C, A45C, G45C, G79C, S79C, ili A84C, u odnosu na sekvencu bilo kog od SEQ ID NOs: 13-23. Dodatak ostatka cisteina u SIRP-α varijanti može se uvesti primenom konvencionalnih tehnika u tehnici, npr. sinteze peptida, genetske modifikacije i/ili molekularnog kloniranja. Polimer, npr. PEG, može biti vezan za ostatak cisteina primenom cistein-maleimid konjugacije, dobro poznatoj u ovoj oblasti.
[0136] Pored gore opisanih izvođenja, dostupne su i druge tehnologije produženja poluvremena koje se mogu koristiti u ovom pronalasku za povećanje serumskog poluraspada SIRP-α varijanti. Tehnologije produženja poluraspada uključuju, ali nisu ograničene na EXTEN (Schellenberger et al., Nat. Biotechnol. 27:1186-1192, 2009) i Albu tag (Trussel et al., Bioconjug Chem. 20:2286-2292, 2009).
XII. Odstojnici
[0137] U nekim primerima izvođenja, odstojnici se mogu koristiti u konstruktu varijante SIRP-α. Na primer, konstrukt varijante SIRP-α može sadržati SIRP-α varijantu koja je vezana za blokirajući peptid pomoću veznika (npr. deljivi veznik koji se može deliti). U takvim SIRP-α strukturama, odstojnik se može umetnuti između SIRP-α varijante i veznika (npr. deljivi veznik) i/ili između veznika (npr. deljivi veznik) i blokirajućeg peptida. Da bi se optimizovao razmak između SIRP-α varijante i veznika i/ili razmak između veznika i blokirajućeg peptida, može se koristiti bilo koji ili više odstojnika opisanih u nastavku. U nekim primerima izvođenja konstrukt varijante SIRP-α koji uključuje SIRP-α varijantu koja je pričvršćena na blokirajući peptid pomoću veznika (npr. deljivi veznik), odstojnik služi za pozicioniranje deljivog veznika dalje od jezgra SIRP-α varijante i blokirajućeg peptida tako da je deljivi veznik pristupačniji enzimu odgovornom za deljenje. Treba razumeti da vezivanje dva elementa u konstruktu varijante SIRP-α, na primer, SIRP-α varijante i veznika (npr. deljivi veznik) u konstruktu varijante SIRP-α koji uključuje (npr. ovim redom) SIRP-α varijantu, veznik i blokirajući peptid ne mora da bude određeni način vezivanja ili da se ostvari putem određene reakcije. Bilo koja reakcija koja obezbeđuje konstrukt varijante SIRP-α odgovarajuće stabilnosti i biološke kompatibilnosti je prihvatljiva.
[0138] Odstojnik se odnosi na vezu između dva elementa u konstruktu varijante SIRP-α, npr. SIRP-α varijante i veznika (npr. deljivi veznik) u konstruktu varijante SIRP-α, uključujući (npr. ovim redom) SIRP-α varijantu, veznik i blokirajući peptid, veznik (npr. deljivi veznik) i blokirajući peptid u konstruktu varijante SIRP-α, uključujući (npr. ovim redosledom) SIRP-α
2
varijantu i serumski protein-vezujući peptid ili protein, npr. albumin-vezujući peptid. Odstojnik se takođe može odnositi na vezu koja se može umetnuti između SIRP-α varijante ili divljeg tipa SIRP-α i antitela, npr. antitela specifičnog za tumor ili antitelo-vezujući peptid. Odstojnik može pružiti dodatnu strukturnu i/ili prostornu fleksibilnost konstruktu varijante SIRP-α. Razmak može biti jednostavna hemijska veza, npr. amidna veza, mali organski molekul (npr. lanac ugljovodonika), aminokiselinska sekvenca (npr. sekvenca od 3-200 aminokiselina) ili kombinacija malih, organskih molekula (npr. lanac ugljovodonika) i aminokiselinska sekvenca (npr. sekvenca od 3-200 aminokiselina). Odstojnik je stabilan u fiziološkim uslovima (npr. neutralni pH i odgovarajuća koncentracija kiseonika), kao i u uslovima karakterističnim za obolelo mesto, npr. kiseli pH i hipoksija. Razmak je stabilan na obolelom mestu, kao što je mesto kancera, npr. unutar tumora.
[0139] Odstojnik može da sadrži 3-200 aminokiselina. Pogodni odstojnici za peptide su poznati u tehnici i uključuju, na primer, peptidne veznike koji sadrže fleksibilne aminokiselinske ostatke, poput glicina i serina. U određenim primerima izvođenja, odstojnik može sadržati motive, npr. višestruke ili ponavljajuće motive, GS, GGS, GGGGS, GGSG ili SGGG. U određenim primerima izvođenja, odstojnik može sadržati 2 do 12 aminokiselina, uključujući motive GS, npr. GS, GSGS, GSGSGS, GSGSGSGS, GSGSGSGSGS ili GSGSGSGSGSGS. U nekim drugim primerima izvođenja, odstojnik može sadržati 3 do 12 aminokiselina, uključujući motive GGS, npr. GGS, GGSGGS, GGSGGSGGS i GGSGGSGGSGGS. U još jednom primeru izvođenja, odstojnik može sadržati 4 do 12 aminokiselina, uključujući motive GGSG, npr. GGSG, GGSGGGSG ili GGSGGGSGGGSG. U drugim primerima izvođenja odstojnik može sadržati motive (GGGGS)n, pri čemu je n ceo broj od 1 do 10. U drugim izvođenjima odstojnik može sadržati i aminokiseline, osim glicina i serina, npr. GENLYFQSGG, SACYCELS, RSIAT, RPACKIPNDLKQKVMNH, GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG, AAANSSIDLISVPVDSR, ili GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS. U nekim primerima izvođenja ovog pronalaska, jedan ili više peptidnih odstojnika od 12 ili 20 aminokiselina mogu se koristiti u konstruktu varijante SIRP-α. Peptidni odstojnici od 12 i 20 aminokiselinskih mogu da sadrže sekvence GGGSGGGSGGGS, odnosno SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više peptidnih odstojnika od 18 aminokiselina koji sadrže sekvencu GGSGGGSGGGSGGGSGGS mogu se koristiti u konstruktu varijante SIRP-α.
[0140] U nekim primerima izvođenja, odstojnik takođe može imati opštu strukturu
gde je W - NH ili CH2, Q je aminokiselina ili peptid, a n je ceo broj od 0 do 20.
XIII. Spajanje blokirajućeg peptida sa SIRP-α varijantom
[0141] Blokirajući peptid (npr. blokirajući peptid na bazi CD47 koji ima sekvencu bilo kog od SEQ ID NOs: 36-46 u Tabeli 6) može se spojiti sa N- ili C-krajem SIRP-α varijante putem veznika, npr. deljivim veznikom (npr. LSGRSDNH (SEQ ID NO: 47)), i opciono jednim ili više odstojnika (npr. (GGGGS)n, genetski spojenih na N- ili C-kraj veznika, pri čemu je n ceo broj od 1 do 10). Primeri sekvenci konstrukata varijanti SIRP-α koji uključuju blokirajući peptid na bazi CD47, spojen sa SIRP-α varijantom pomoću deljivog veznika i jednog ili više odstojnika, prikazani su u sekvencama SEQ ID NOs: 48-63. Dužina odstojnika može se promeniti kako bi se postiglo najoptimalnije vezivanje između blokirajućeg peptida na bazi CD47 i SIRP-α varijante.
XIV. Postupci za dobijanje konstrukata varijante SIRP-α
[0142] Konstrukti varijante SIRP-α prema pronalasku mogu nastati iz ćelije domaćina. Ćelija domaćin se odnosi na nosač koji uključuje potrebne ćelijske komponente, npr. organele, potrebne za eksprimiranje polipeptida i ovde opisanih struktura iz njihovih odgovarajućih nukleinskih kiselina. Nukleinske kiseline mogu biti uključene u vektore nukleinske kiseline koji se mogu uvesti u ćeliju domaćina konvencionalnim tehnikama poznatim u tehnici (npr. transformacija, transfekcija, elektroporacija, taloženje kalcijum fosfata, direktno mikroinjektiranje, infekcija, itd.). Izbor vektora nukleinske kiseline delom zavisi od ćelija domaćina koje će se koristiti. Generalno, poželjne ćelije domaćina su ili prokariotskog (npr. bakterijskog) ili eukariotskog (npr. sisara) porekla.
Struktura vektora nukleinske kiseline i ćelije domaćina
[0143] Polinukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu konstrukta varijante SIRP-α može se pripremiti različitim metodama poznatim u tehnici. Ovi postupci uključuju, ali nisu ograničeni na, oligonukleotidom posredovanu mutagenezu (ili usmeren na položaj) i PCR mutagenezu. Polinukleotidni molekul koji kodira konstrukt varijante SIRP-α prema pronalasku može se dobiti korišćenjem standardnih tehnika, npr. sinteze gena. Alternativno, polinukleotidni molekul koji kodira divlji tip SIRP-α može biti mutiran tako da sadrži specifične supstituente histidina koristeći standardne tehnike, npr. QuikChange™
4
mutagenezu. Polinukleotidi se mogu sintetisati primenom sintetizatora nukleotida ili PCR tehnikama.
[0144] Polinukleotidne sekvence koje kodiraju konstrukte varijante SIRP-α mogu se umetnuti u vektor sposoban za replikaciju i eksprimiranje polinukleotida u prokariotskim ili eukariotskim ćelijama domaćina. Mnogi vektori su dostupni u tehnici i mogu se koristiti u svrhu pronalaska. Svaki vektor može sadržati različite komponente koje se mogu prilagoditi i optimizovati za kompatibilnost sa određenom ćelijom domaćina. Na primer, vektorske komponente mogu da uključuju, ali nisu ograničene na, poreklo replikacije, selektivni marker gen, promotor, mesto vezivanja ribozoma, signalnu sekvencu, polinukleotidnu sekvencu koja kodira konstrukt varijante SIRP-α pronalaska i sekvencu završetka transkripcije. U nekim primerima izvođenja, vektor može da sadrži unutrašnje mesto za ulazak ribozoma (IRES) koje omogućava eksprimiranje višestrukih konstrukata varijante SIRP-α. Neki primeri bakterijskih vektora ekspresije uključuju, ali nisu ograničeni na, pGEX seriju vektora (npr. pGEX-2T, pGEX-3X, pGEX-4T, pGEX-5X, pGEX-6P), pET seriju vektora (npr. pET-21, pET-21a, pET-21b, pET-23, pET-24), pACYC seriju vektora (npr., pACYDuet-1), pDEST seriju vektora (npr. pDEST14, pDEST15, pDEST24, pDEST42) i pBR322 i njegovih derivata (videti npr. SAD Patent br.5,648,237). Neki primeri sisarskih vektora ekspresije uključuju, ali nisu ograničeni na, pCDNA3, pCDNA4, pNICE, pSELECT i pFLAG-CMV. Druge vrste vektora nukleinskih kiselinu uključuju virusne vektore za eksprimiranje proteina u ćeliji (npr. ćelija subjekta). Takvi virusni vektori uključuju, ali nisu ograničeni na, retrovirusne vektore, adenovirusne vektore, poksvirusne vektore (npr. virusne vektore vakcinija, kao što je modifikovana vakcinija Ankara (MVA)), adeno povezane virusne vektore i alfavirusne vektore.
[0145] U nekim primerima izvođenja, ćelije E. coli se koriste kao ćelije domaćina za pronalazak. Primeri sojeva E. coli 294 (ATCC® 31,446), E. coli λ 1776 (ATCC® 31,537, E. coli BL21 (DE3) (ATCC® BAA-1025) i E. coli RV308 (ATCC® 31,608). U drugim primerima izvođenja, ćelije sisara se koriste kao ćelije domaćini za pronalazak. Primeri tipova ćelija sisara uključuju, ali nisu ograničeni na, ćelije humanog embrionalnog bubrega (HEK), jajnik kineskog hrčka (CHO) ćelije, HeLa ćelije, PC3 ćelije, Vero ćelije i MC3T3 ćelije. Različite ćelije domaćina imaju karakteristične i specifične mehanizme za post-translacionu obradu i modifikaciju proteinskih proizvoda. Odgovarajuće ćelijski nizovi ili sistemi domaćina mogu biti izabrani kako bi se osigurala tačna modifikacija i obrada eksprimiranog proteina. Gore opisani vektori ekspresije mogu se uvesti u odgovarajuće ćelije domaćina koristeći konvencionalne tehnike, npr. transformaciju, transfekciju, elektroporaciju, taloženje kalcijum fosfata i direktno mikroinjektiranje. Jednom kada su vektori uvedeni u ćelije domaćina za proizvodnju proteina, ćelije domaćini se uzgajaju u konvencionalnim hranljivim medijumima modifikovanim po potrebi za indukciju promotora, odabir transformanta ili pojačavanje gena koji kodiraju željene sekvence.
Proizvodnja, oporavak i prečišćavanje proteina
[0146] Ćelije domaćina korišćene za proizvodnju konstrukata varijante SIRP-α prema pronalasku mogu se uzgajati u medijima poznatim u tehnici i pogodnim za kultivisanje odabranih ćelija domaćina. Primeri pogodnih medijuma za bakterijske ćelije domaćina uključuju čorbu Luria (LB) plus neophodne dodatke, kao što je selektivno sredstvo, npr. ampicilin. Primeri pogodnih medijuma za ćelije domaćina sisara uključuju minimalni esencijalni medijum (MEM), Dulbecco-modifikovani Eagle-ov medijum (DMEM), DMEM sa dopunjenim fetalnim goveđim serumom (FBS) i RPMI-1640.
[0147] Ćelije domaćini se gaje na pogodnim temperaturama, od oko 20 °C do oko 39 °C, npr. od 25 °C do 37 °C. pH sredine je generalno oko 6,8 do 7,4, npr. 7,0, uglavnom u zavisnosti od organizma domaćina. Ako se koristi inducibilni promotor u vektoru ekspresije pronalaska, eksprimiranje proteina se indukuje pod uslovima pogodnim za aktivaciju promotora.
[0148] Izdvajanje proteina obično uključuje razaranje ćelije domaćina, generalno takvim sredstvima kao što su osmotski šok, ultrazvuk ili liza. Jednom kada se ćelije razore, ostaci ćelija mogu se ukloniti centrifugiranjem ili filtriranjem. Proteini se mogu dalje prečišćavati, na primer, afinitetnom hromatografijom. Mogu se primeniti standardne metode prečišćavanja proteina poznate u tehnici. Sledeći postupci su primeri odgovarajućih postupaka prečišćavanja: frakcionisanje na imunoafinitetnim ili jonoizmenjivačkim kolonama, taloženje etanola, HPLC reverzne faze, hromatografija na silicijum-dioksidu ili na katjon-izmenjivačkoj smoli, SDS-PAGE i gel filtracija.
[0149] Alternativno, konstrukti varijante SIRP-α mogu da budu proizvedeni od strane ćelija subjekta (npr. čoveka), npr. u kontekstu terapije, primenom vektora (npr. retrovirusni vektor, adenovirusni vektor, poksvirusni vektor (npr. virusni vektor vakcinija, kao što je modifikovana vakcinija Ankara (MVA)), adeno-povezani virusni vektor i alfavirusni vektor) koji sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira konstrukt varijante SIRP-α. Vektor će, kada se nađe u ćeliji subjekta (npr. transformacijom, transfekcijom, elektroporacijom, taloženjem kalcijum-fosfata, direktnom mikroinjekcijom, infekcijom itd.) podsticati eksprimiranje konstrukta varijante SIRP-α, koji se zatim izlučuje iz ćelije.
XV. Farmaceutske kompozicije i preparati
[0150] U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija prema pronalasku može da sadrži jedan ili više konstrukata varijante SIRP-α pronalaska kao terapeutske proteine. Pored terapeutske količine proteina, farmaceutska kompozicija može sadržati farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijens, koji se može formulisati postupcima koji su poznati stručnjacima. U drugim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija prema pronalasku može sadržati molekule nukleinske kiseline koji kodiraju jedan ili više konstrukata varijante SIRP-α pronalaska (npr. u vektoru, kao što je virusni vektor). Molekul nukleinske kiseline koji kodira konstrukt varijante SIRP-α može se klonirati u odgovarajući vektor ekspresije, koji se može isporučiti poznatim metodama u genskoj terapiji.
[0151] Prihvatljivi nosači i ekscipijensi u farmaceutskim kompozicijama nisu toksični za primaoce u upotrebljenim dozama i koncentracijama. Prihvatljivi nosači i ekscipijensi mogu uključivati pufere kao što su fosfat, citrat, HEPES i TAE, antioksidansi kao što su askorbinska kiselina i metionin, konzervansi kao što su heksametonijum hlorid, oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid, rezorcinol i benzalkonijum hlorid, proteini kao što je albumin humanog seruma, dekstran i imunoglobulini, hidrofilni polimeri poput polivinilpirolidona, aminokiseline kao što su glicin, glutamin, histidin i lizin i ugljeni hidrati kao što su glukoza, manoza, saharoza i sorbitol. Farmaceutske kompozicije prema pronalasku mogu se primenjivati parenteralno u obliku injekcione formulacije. Farmaceutska kompozicija za injekcije može se formulisati koristeći sterilni rastvor ili bilo koju farmaceutski prihvatljivu tečnost kao nosač. Farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju, ali nisu ograničeni na, sterilnu vodu, fiziološki rastvor i medijum za ćelijske kulture (npr. Dulbecco-modifikovani Eagle-ov medijum (DMEM), α-modifikovani Eagle-ov medijum (α-MEM), F-12 medijum).
[0152] Farmaceutske kompozicije pronalaska mogu se pripremiti u mikrokapsulama, kao što su hidroksilmetilceluloza ili želatin-mikrokapsula i poli-(metilmetakrilat) mikrokapsula. Farmaceutske kompozicije prema pronalasku mogu se takođe pripremiti u drugim sistemima za isporuku lekova kao što su liposomi, mikrosfere albumina, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule. Takve tehnike su opisane u Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20. izdanje (2000). Farmaceutske kompozicije koje se koriste za in vivo primenu moraju biti sterilne. To se lako postiže filtracijom kroz sterilne membrane.
[0153] Farmaceutske kompozicije prema pronalasku mogu se takođe pripremiti kao formulacija sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju polupropusne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koji sadrže konstrukte varijante SIRP-α prema pronalasku. Primeri matrica sa produženim oslobađanjem uključuju poliestere, hidrogelove, poliaktide (SAD patent br. 3,773,919), kopolimeri L-glutaminske kiseline i γ etil-L-glutamata, nerazgradivi etilen-vinil acetat, razgradivi kopolimeri mlečne kiseline i glikolne kiseline kao što su LUPRON DEPOT™ i poli-D-(-)-3-hidroksibuterna kiselina. Neke formulacije sa produženim oslobađanjem omogućavaju oslobađanje molekula tokom nekoliko meseci, npr. jedan do šest meseci, dok druge formulacije oslobađaju farmaceutske kompozicije prema pronalasku u kraćim vremenskim periodima, npr. danima do nedelja.
[0154] Farmaceutska kompozicija se može formirati u obliku jedinične doze po potrebi. Količina aktivne komponente, npr. konstrukta varijante SIRP-α prema pronalasku, koja je uključena u farmaceutske preparate, je takva da se obezbedi odgovarajuća doza unutar naznačenog opsega (npr. doza u rasponu od 0,01-100 mg/kg telesne težine).
[0155] Farmaceutska kompozicija za gensku terapiju može biti u prihvatljivom rastvaraču ili može sadržati matricu sa sporim oslobađanjem u koju je ugrađen nosač za isporuku gena. Vektori koji se mogu koristiti kao in vivo nosači gena uključuju, ali nisu ograničeni na, retrovirusne vektore, adenovirusne vektore, poksvirusne vektore (npr. virusne vektore vakcinija, kao što je modifikovana vakcinija Ankara (MVA)), virusne vektore povezane sa adeno virusom i alfavirusne vektore. U nekim primerima izvođenja, vektor može da sadrži unutrašnje mesto za ulazak ribozoma (IRES) koje omogućava eksprimiranje većeg broja konstrukata varijante SIRP-α. Ostali nosači i postupci za isporuku gena opisani su u SAD patentima br.5,972,707, 5,697,901, i 6,261,554.
[0156] Drugi postupci za proizvodnju farmaceutskih sastava opisani su, na primer, u SAD patentima br.5,478,925, 8,603,778, 7,662,367, i 7,892,558.
XVI. Načini, doziranje i vreme primene
[0157] Farmaceutske kompozicije pronalaska koje sadrže jedan ili više konstrukata varijante SIRP-α kao terapeutske proteine mogu se formulisati za parenteralnu primenu, subkutanu primenu, intravensku primenu, intramuskularnu primenu, intraarterijsku primenu, intratekalnu primenu ili intraperitonealnu primenu. Farmaceutska kompozicija takođe može biti formulisana za primenu ili nazalno, kao sprej, oralno, aerosolno, rektalno ili vaginalno. Postupci davanja terapijskih proteina poznati su u tehnici. Videti, na primer, SAD patente br.
6,174,529, 6,613,332, 8,518,869, 7,402,155, i 6,591,129, i Objave SAD patentnih prijava br. US20140051634, WO1993000077 i US20110184145. Jedan ili više ovih postupaka mogu se koristiti za davanje farmaceutskog sastava prema pronalasku koja sadrži jedan ili više konstrukata varijante SIRP-α. Za injekcione formulacije, u tehnici su poznati različiti efikasni farmaceutski nosači. Videti, na primer, Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J. B. Lippincott Company, Philadelphia, Pa., Banker and Chalmers, eds., pages 238-250 (1982) i ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4th ed., pages 622-630 (1986).
[0158] Doziranje farmaceutskih kompozicija prema pronalasku zavisi od faktora, uključujući način primene, bolesti koja se leči i fizičke karakteristike, na primer, starost, težina, opšte zdravstveno stanje subjekta. Tipično, količina konstrukta varijante SIRP-α pronalaska sadržana u jednoj dozi može biti količina koja efikasno leči bolest bez indukovanja značajne toksičnosti. Farmaceutska kompozicija pronalaska može da uključuje dozu konstrukta varijante SIRP-α u rasponu od 0,001 do 500 mg (npr.0,05, 0,01, 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,7, 0,8, 1 mg, 2 mg, 3 mg , 4 mg, 5 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg, 30 mg, 50 mg, 100 mg, 250 mg ili 500 mg) i, u konkretnijem primeru izvođenja, oko 0,1 do oko 100 mg i, u konkretnijem primeru izvođenja, od oko 0,2 do oko 20 mg. Doziranje može da prilagodi kliničar u skladu sa konvencionalnim faktorima kao što su obim bolesti i različiti parametri subjekta.
[0159] Farmaceutska kompozicija prema pronalasku može se primenjivati u količini od oko 0,001 mg do oko 500 mg/kg/dan (npr.0,05, 0,01, 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,7, 0,8, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg, 30 mg, 50 mg, 100 mg, 250 mg ili 500 mg/kg/dan). Farmaceutska kompozicija pronalaska koja sadrži konstrukt varijante SIRP-α može se davati subjektu kome je to potrebno, na primer, jedan ili više puta (npr. 1-10 puta ili više) dnevno, nedeljno, mesečno, dva puta godišnje, jednom godišnje, ili po potrebi. Doziranja se mogu dati u pojedinačnom ili višestrukom režimu doziranja. Na primer, u nekim primerima izvođenja, efektivna količina je doza koja se kreće od oko 0,1 do oko 100 mg/kg/dan, od oko 0,2 mg do oko 20 mg konstrukta varijante SIRP-α dnevno, oko 1 mg do oko 10 mg konstrukta varijante SIRP-α dnevno, od oko 0,7 mg do oko 210 mg konstrukta varijante SIRP-α, oko 1,4 mg do oko 140 mg konstrukta varijante SIRP-α nedeljno, oko 0,3 mg do oko 300 mg konstrukta varijante SIRP-α svaka tri dana, oko 0,4 mg do oko 40 mg konstrukta varijante SIRP-α svaki drugi dan, i oko 2 mg do oko 20 mg konstrukta varijante SIRP-α svaki drugi dan. Vreme između primena može se smanjiti kako se zdravstveno stanje poboljšava ili povećava kako zdravlje pacijenta opada.
XVII. Metode lečenja
[0160] Pronalazak obezbeđuje konstrukte varijante SIRP-α i farmaceutske kompozicije za upotrebu u postupcima za lečenje i koji se mogu koristiti za lečenje pacijenata koji pate od bolesti i poremećaja povezanih sa aktivnošću SIRP-α i/ili CD47, kao što su kanceri i imunološke bolesti. U nekim primerima izvođenja, ovde opisani konstrukti varijante SIRP-α mogu se primeniti na subjekta u postupku povećanja fagocitoze ciljne ćelije (npr. ćelije kancera) kod subjekta. U nekim primerima izvođenja, konstrukti varijante SIRP-α mogu se primeniti na subjekta u postupku uklanjanja regulatornih T-ćelija u subjektu. U nekim primerima izvođenja, konstrukti varijante SIRP-α mogu se primeniti na subjekta u postupku za ubijanje ćelija kancera kod subjekta. U nekim primerima izvođenja, konstrukti varijante SIRP-α mogu se primeniti na subjekta u postupku lečenja bolesti povezane sa aktivnošću SIRP-α i/ili CD47 kod subjekta, pri čemu konstrukti varijante SIRP-α preferirano veže CD47 na obolele ćelije ili na obolelom mestu preko CD47 u odnosu ne-obolele ćelije. U nekim primerima izvođenja, SIRP-α varijante mogu se primeniti kod subjekta u postupku povećanja ugrađivanja hematopoetskih matičnih ćelija kod subjekta, pri čemu postupak uključuje modulaciju interakcije između SIRP-α i CD47 kod subjekta. U nekim primerima izvođenja, konstrukti varijante SIRP-α mogu se primeniti na subjekta u postupku izmene imunog odgovora (tj. suzbijanja imunog odgovora) kod subjekta.
[0161] U nekim primerima izvođenja, pre lečenja bolesti (npr. kancera) kod subjekta, određuju se aminokiselinske sekvence SIRP-α kod subjekta, na primer, iz svakog od dva dela koji kodiraju SIRP-α gen. U ovom postupku pronalaska, postupak uključuje određivanje aminokiselinske sekvence SIRP-α polipeptida u biološkom uzorku od subjekta, a zatim primenu kod subjekta terapeutski efikasne količine konstrukta varijante SIRP-α. U ovom postupku, varijanta SIRP-α u konstruktu varijante SIRP-α ima istu aminokiselinsku sekvencu kao i SIRP-α polipeptid u biološkom uzorku subjekta, osim promena aminokiselina koje su uvedene da povećaju afinitet varijante SIRP-α. Konstrukt varijante SIRP-α ima minimalnu imunogenost kod subjekta nakon što se primeni.
[0162] Konstrukti varijante SIRP-α i farmaceutske kompozicije prema pronalasku mogu se koristiti u različitim terapijama kancera. Kanceri podložni lečenju prema pronalasku uključuju, ali nisu ograničeni na, čvrsti tumor, hematološki kancer, akutnu mijeloidnu leukemiju, hroničnu limfocitnu leukemiju, hroničnu mijeloidnu leukemiju, akutnu limfoblastnu leukemiju, ne-Hočkinov limfom, Hočkinov limfom, multipli mijelom, kancer bešike, kancer pankreasa, kancer grlića materice, kancer endometrijuma, kancer pluća, kancer bronhija, kancer jetre, kancer jajnika, kancer debelog creva i rektuma, kancer želuca, kancer želuca, kancer žučne kese, gastrointestinalni stromalni kancer, kancer štitaste žlezde, kancer glave i vrata, kancer orofarinksa, kancer jednjaka, melanom, nemelanomski kancer kože, kancer Merkelovih ćelija, virusno izazvani kancer, neuroblastom, kancer dojke, kancer prostate, kancer bubrega, kancer bubrežnih ćelija, kancer bubrežne karlice, leukemija, limfom, sarkom, gliom, tumor na mozgu i karcinom. U nekim primerima izvođenja, kanceri podložni lečenju prema pronalasku uključuju metastatske kancere. U nekim primerima izvođenja kancer podložan lečenju prema pronalasku je čvrsti tumor ili hematološki kancer.
[0163] Konstrukti varijante SIRP-α i farmaceutske kompozicije prema pronalasku mogu se koristiti u raznim terapijama za lečenje imunoloških bolesti. U nekim primerima izvođenja, imunološka bolest je autoimuna bolest ili zapaljenska bolest, kao što su multipla skleroza, reumatoidni artritis, spondiloartropatija, sistemski eritematozni lupus, inflamatorna ili autoimuna bolest posredovana antitelima, bolest transplantata naspram domaćina, sepsa, dijabetes, psorijaza, ateroskleroza, Sjogrenov sindrom, progresivna sistemska skleroza, skleroderma, akutni koronarni sindrom, ishemijska reperfuzija, Kronova bolest, endometrioza, glomerulonefritis, miastenija gravis, idiopatska plućna fibroza, astma, akutni respiratorni distres sindrom (ARDS), vaskulitis ili inflamatorni autoimunski miozitis.
PRIMERI
Primer 1 – Metode
Proizvodnja konstrukata varijante SIRP-α
[0164] Svi strukturni geni su generisani korišćenjem sinteze gena i kodona optimizovanog za eksprimiranje u ćelijama sisara (DNA2.0). Geni se kloniraju u sisarske vektore ekspresije i eksprimiraju pomoću CMVa-intron promotora. Na N-kraju konstrukta ubačena je vodeća sekvenca kako bi se osigurala odgovarajuća signalizacija i obrada za sekreciju. Eksprimiranje fuzionih proteina SIRP-α vrši se pomoću ćelija Expi293F™ (Life Technologies). Ova ćelijska linija je prilagođena suspenzionoj kulturi velike gustine bez seruma u medijumu za ekspresiju Expi293F™ i sposobna je da proizvede visok nivo rekombinantnih proteina. Postupci transfekcije izvedeni su prema uputstvu proizvođača. Supernatant se obično sakuplja 5-7 dana nakon transfekcije. Proteinske strukture su dizajnirane da nose afinitetnu oznaku 6xhistidin i to omogućava prečišćavanje afinitetnom hromatografijom. Kolona je prvo uravnotežena sa 5 mM imidazola, 100 mM Tris HCl (pH 8), 500 mM NaCl. Klarifikovani medijumi koji eksprimiraju različite konstrukte varijante SIRP-α nanose se na afinitetnu smolu Hi-Trap Ni sefaroza na Avant 25 (GE Healthcare). Izvodi se još jedan korak uravnoteženja. Posle toga, kolona se ispere sa 40 mM imidazola, 100 mM Tris, 500 mM NaCl, a zatim eluira sa 250 mM imidazola, 100 mM Tris, 500 mM NaCl. Eluirane frakcije koje sadrže konstrukte varijante SIRP-α se objedinjuju i nakon toga pufer zamenjuje u 1X PBS.
In vitro deljenje SIRP-α proteina
[0165] Rekombinantna humana uPA i matriptaza se kupuju od R&D sistema. 3 µM SIRP-α proteina se dodaje odgovarajućim količinama uPA i matriptaze (0,1 do 44 ng) u 50 mM Tris HCl (pH 8,5), 0,01% Tween-a kako je opisano. Reakcije digestije se obično inkubiraju 18-24
1
sata na 37 °C. Da bi se zaustavila reakcija, u reakciju se dodaje boja za nanošenje uzoraka na SDS-PAGE i zagreva na 95 °C tokom 3 minuta. Da bi se procenilo deljenje, digestirani uzorci se razdvajaju na 4-20% Tris-Glicin SDS-PAGE.
Primer 2 - Dizajn konstrukata varijante SIRP-α koje će se posebno aktivirati u tkivu tumora
[0166] Cilj je da se dizajniraju konstrukti varijante SIRP-α koji će ostati inertni dok se lokalno ne aktiviraju kako bi se vezali za CD47 u tkivu tumora. Ovo će ograničiti vezivanje SIRP-α za CD47 na ćelijskoj površini ne-obolelih ćelija i sprečiti neželjenu toksičnost „na meti“ „van tkiva“. Da bi se generisali takvi konstrukti varijante SIRP-α, blokirajući peptidi (npr. blokirajući peptid na bazi CD47) genetski su spojeni sa SIRP-α varijantom pomoću deljivog veznika. Istraženi blokirajući peptidi bazirani su na mestima interakcije CD47 sa SIRP-α, a sekvence su opisane u nastavku (odeljci (a) - (c)). Odstojnici koji sadrže ponovljene jedinice GGGGS dizajnirani su tako da oiviče deljivi veznik, koji često kodira mesto za prepoznavanje proteaze. U nekim primerima izvođenja, izabrano mesto deljenja proteazom je LSGRSDNH, ali su moguća i mnoga druga. Mesto deljenja proteazom LSGRSDNH odabrano je zbog njegove osetljivosti na brojne proteaze koje su ushodno regulisane u različitim karcinomima kod čoveka, na primer, matriptazu (MTSP1), aktivator plazminogena urinarnog tipa (uPA), legumain, PSA (takođe nazvan KLK3, kalikrein-povezana peptidaza-3), matričnu metaloproteinazu-2 (MMP-2), MMP9, humanu neutrofilnu elastazu (HNE) i proteinazu 3 (Pr3) (Ulisse et al., Curr. Cancer Drug Targets 9:32-71, 2009; Uhland et al., Cell. Mol. Life Sci. 63:2968-2978, 2006; LeBeau et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110:93-98, 2013; Liu et al., Cancer Res.63:2957-2964, 2003).
(a) Blokiranje SIRP-α blokirajućim peptidima na bazi CD47
[0167] Blokirajući peptidi na bazi CD47 su prethodno opisani. Ovi peptidi vezuju SIRP-α sa različitim afinitetima i blokiraju njegovu funkciju. N-kraj CD47 je važan za interakciju sa SIRP-α, stoga je strukturnom analizom predviđeno spajanje SIRP-α sa C-krajem CD47. Da bi se bolje razumeli rezultati, istražuje se spajanje N-kraja i C-kraja sa različitim dužinama odstojnika. Različiti blokirajući peptidi na bazi CD-47 (npr. peptidi navedeni u Tabeli 6) spojeni su na N- ili C-kraj SIRP-α varijante sa deljivim veznikom i jednim ili više odstojnika. Primeri sekvenci fuzionih proteina koji sadrže blokirajući peptid na bazi CD47 spojen sa SIRP-α varijantom pomoću deljivog veznika i jednog ili više odstojnika prikazani su u sekvencama SEQ ID NOs: 48-56, u kojoj jednom podvučeni deo označava blokirajući peptid na bazi CD47, dvostruko podvučeni deo označava deljivi veznik, a podebljani deo označava SIRP-α varijantu. Sekvence SEQ ID NOs: 48-51 sadrže blokirajuće peptide na bazi CD47 koji
2
uključuju 12 ili 21 aminokiselinu i odstojnike od 2-3 ponavka GGGGS. Sekvence SEQ ID NOs: 52-56 sadrže blokirajuće peptide na bazi CD47 koji uključuju domen CD47 IgSF (skraćen na VVS) koji ima C15S supstituciju i odstojnike od 2-5 ponavaka GGGGS ili 3-6 ponavaka GGS. Pored toga, u nekim primerima izvođenja, HSA može biti spojen sa C-krajem bilo koje od sekvenci SEQ ID NOs: 48-56. Dalje, u nekim primerima izvođenja, monomer Fc domena ili HSA (SEQ ID NO: 68) mogu se spojiti bilo sa N- ili C-krajem bilo kog od fuzionih proteina navedenih u Tabeli 10.
(b) Blokiranje SIRP-α varijante CD47 mutantom niskog afiniteta koji ima produženi N-kraj
[0168] Zbog visokog afiniteta SIRP-α varijante za CD47, postoji šansa da se posle deljenja veznika fuzioni protein ne razdvoji i SIRP-α varijanta može ostati blokirana. Da bismo to rešili, proučavali smo strukturu SIRP-α-CD47 kompleksa i dizajnirali CD47 mutante sa niskim afinitetom vezivanja za SIRP-α varijantu u odnosu na afinitet vezivanja za divlji tip SIRP-α. Dakle, nakon deljenja proteazom na vezniku, CD47 mutant će se odvojiti od SIRP-α varijante. Dizajnirani CD47 mutanti su opisani u nastavku. Početni eksperimenti će se izvoditi spajanjem SIRP-α varijante sa divljim tipom CD47. Ovi konstrukti varijante SIRP-α koji uključuju varijantu SIRP-α i CD47 divljeg tipa ili CD47 mutant, dele se in vitro, analiziraju na SDS-PAGE kako bi se osiguralo deljenje i mere Biacoreom da bi se videla njihova sposobnost vezivanja za CD47 (tj. vezivanje SIRP-α varijante za CD47 divljeg tipa nakon što se CD47 mutant razdvoji od SIRP-α varijante). Ako su eksprimirani početni konstrukti varijante SIRP-α koji sadrže SIRP-α varijantu spojenu sa divljim tipom CD47, sposobni da blokiraju vezivanje CD47 pre deljenja proteazom i sposobni da vežu CD47 nakon deljenja proteazom, CD47 mutanti možda neće biti potrebni. Ako su ovi početni konstrukti varijante SIRP-α neaktivni (tj. mogu se deliti, ali ne vezuju CD47 nakon deljenja proteazom zbog izostanka disocijacije), tada će drugi fuzijski proteini koji sadrže SIRP-α varijantu spojenu sa CD47 mutantima sa niskim afinitetom biti testirani.
[0169] U ko-kristalizovanoj strukturi CD47: SIRP-α (PDB: 4KJY, 4CMM), N-kraj CD47 postoji kao piro-glutamat i stvara interakcije preko vodoničnih veza sa Thr66 SIRP-α varijante i Leu66 SIRP-α divljeg tipa (SLIKA 1). Pretpostavlja se da će produženje N-kraja CD47 dodavanjem aminokiseline, npr. glicina, sprečiti ciklizaciju glutamina u piroglutamat i takođe stvoriti druge neželjene kontakte i interakcije koje će verovatno poremetiti vodonične veze sa Thr66 ili Leu66, a samim tim i poremetiti vezivanje CD47 za SIRP-α. Sekvence fuzionih proteina koji sadrže mutant CD47 IgSF domena sa niskim afinitetom i SIRP-α varijantu prikazani su u SEQ ID NOs: 57-59 u Tabeli 11, u kojima jednom podvučeni deo označava mutant CD47 IgSF domena sa niskim afinitetom koji sadrži aminokiseline 1-118 i C15S, u odnosu na SEQ ID NO: 46 u Tabeli 6, dvostruko podvučeni deo označava deljivi veznik, a podebljani deo označava SIRP-α varijantu. SEQ ID NOs: x10-x12 takođe uključuju odstojnike od 3-5 ponavaka GGGGS. Mogu biti dizajnirane i eksprimirane sekvence slične SEQ ID NOs: x10-x12 u kojima je mutant CD47 IgSF domena sa niskim afinitetom spojen sa C-krajem SIRP-α varijante pomoću deljivog veznika i jednog ili više odstojnika.
4
(c) Blokiranje SIRP-α mutantom CD47 IgSF domena sa niskim afinitetom koji ima supstituente aminokiselina
[0170] CD47 se vezuje za duboki džep za SIRP-α (PDB kod: 4KJY i 4CMM). Izvršeno je kompjutersko modeliranje za identifikovanje aminokiselinskih ostataka u regionu džepa CD47, koji bi, kada mutiraju, smanjili afinitet vezivanja CD47 za SIRP-α varijantu, ali zadržali afinitet vezivanja CD47 za divlji tip SIRP-α. Identifikovani CD47 ostaci su L101Q, L101H, L101Y, T102Q, i T102H. Pretpostavlja se da će mutant CD47 IgSF domena sa niskim afinitetom koji sadrži jednu od ovih supstitucija moći da efikasno blokira SIRP-α varijantu u vezanom režimu. Međutim, po dolasku na mesto tumora i lokalnom deljenju proteazama na vezniku, mutant CD47 IgSF domena sa niskim afinitetom razdvojiće se od SIRP-α varijante da bi se vezao za divlji tip SIRP-α, ostavljajući varijantu SIRP-α slobodnom da veže CD47 na ćelijskoj površini tumorskih ćelija. Disocirani mutant CD47 IgSF domena sa niskim afinitetom sada može da blokira aktivnost divljeg tipa SIRP-α. To će potencijalno rezultirati pojačanom dvostrukom blokirajućom aktivnošću oslobođenog mutanta CD47 IgSF domena sa niskim afinitetom i varijante SIRP-α. Da bi se ilustrovalo kako se biraju aminokiselinski ostaci i princip kako to može rezultirati diferencijalnim blokiranjem varijanti divljeg tipa SIRP-α i SIRP-α, prikazan je primer koji koristi Ala27 divljeg tipa SIRP-α (sl.2). Na primer, Ala27 divljeg tipa SIRP-α je manji ostatak od IIe27 u SIRP-α varijanti. Prema tome, mutacijom Thr102 u divljem tipu CD47 u veću aminokiselinu kao što je Gln102, Gln102 u mutantu CD47 IgSF domena sa niskim afinitetom može rezultirati steričkim smetnjama sa IIe27 u SIRP-α varijanti na odgovarajućem mestu interakcije. Međutim, interakcija između CD47 mutanta koji ima supstituciju Thr102Gln i divljeg tipa SIRP-α koji ima Ala27 bi bila očuvana. Shodno tome, CD47 mutant bi imao nizak afinitet vezivanja za SIRP-α varijantu i relativno veći afinitet vezivanja za divlji tip SIRP-α. Sekvence nekih primernih mutanata CD47 IgSF domena sa niskim afinitetom prikazane su u SEQ ID NOs: 41-45 u Tabeli 6. Sekvence konstrukata varijante SIRP-α koji sadrže mutant CD47 IgSF domena sa niskim afinitetom sa supstituisanim aminokiselinama i SIRP-α varijantu su prikazane u SEQ ID NOs: 60-63 u Tabeli 12, u kojoj jednom podvučeni deo ukazuje na mutant CD47 IgSF domena sa niskim afinitetom koji sadrži supstituisanu aminokiselinu L101Q, L101Y, T102Q, odnosno T102H, dvostruko podvučeni deo označava deljivi veznik, a podebljani deo označava SIRP-α varijantu. SEQ ID NOs: 60-63 takođe uključuju odstojnike od 3-5 ponavaka GGGGS. Mogu biti dizajnirane i eksprimirane sekvence slične SEQ ID NOs: 60-63 u kojima je mutant CD47 IgSF domena sa niskim afinitetom spojen sa C-krajem SIRP-α varijante pomoću deljivog veznika i jednog ili više odstojnika.
Primer 3 - Eksprimiranje i proizvodnja konstrukata varijante SIRP-α za studije in vitro [0171] Razni konstrukti varijante SIRP-α (SEQ ID NOs: 48-56) koji uključuju SIRP-α varijantu i blokirajući peptid na bazi CD47, eksprimirani su u ćelijama sisara Expi293-F. Sve strukture su dizajnirane sa vodećom sekvencom koja je omogućavala njihovo eksprimiranje kao proteina koji se izlučuju u medijum. Svi konstrukti su eksprimirani u rastvorljivom obliku i prečišćeni primenom IMAC izolacije u jednom koraku do visokog stepena čistoće (slike 3A i 3B). SLIKA 3A prikazuje redukcioni SDS-PAGE gel konstrukata varijante SIRP-α SEQ ID NOs: 48-56 i SL. 3B prikazuje neredukujući SDS-PAGE gel konstrukata varijante SIRP-α. Podaci dobijeni ekskluzionom hromatografijom ukazuju na to da konstrukti varijante SIRP-α nisu agregirani (podaci nisu prikazani).
Primer 4 - In vitro deljenje fuzionih proteina SIRP-α i CD47
[0172] Da bi se utvrdilo da li će se konstrukti varijante SIRP-α (npr. SEQ ID NOs: 48-63) specifično deliti in vivo na tkivima tumora, izvedeni su in vitro eksperimenti primenom proteaza uPA i matriptaze, za koje je poznato da su ushodno regulisane kod kancera, za deljenje konstrukata varijante SIRP-α. Početni eksperimenti su izvedeni korišćenjem konstrukata varijante SIRP-α (SEQ ID NO: 54) da bi se utvrdila deljivost proteazom i optimizovali uslovi deljenja. Slika 4A pokazuje rezultate ispitivanja deljivosti pomoću uPA i matriptaze. 3 µM konstrukta varijante SIRP-α (SEQ ID NO: 54) je inkubirano 18 sati na 37 °C upotrebom viška uPA ili matriptaze. Traka 1 sa Sl.4A prikazuje kontrolni eksperiment bez dodavanja proteaze, a trake 2 i 3 pokazuju inkubaciju konstrukta varijante SIRP-α (SEQ ID NO: 54) sa uPA, odnosno matriptazom. Podaci dobijeni kao što je prikazano na sl. 4A jasno pokazuju da konstrukt varijante SIRP-α (SEQ ID NO: 54) može da se deli i oslobodi in vitro digestiranjem konstrukta varijante SIRP-α sa viškom uPA i matriptaze tokom 18 sati na 37 °C. Odvojena SIRP-α varijanta migrira kao traka od ~17 KDa molekulske težine. Odvojeni CD47 migrira dajući razmazane trake, najverovatnije zbog glikozilacije, oko 36-40 kDa. Upoređivanjem količine neskraćenog konstrukta varijante SIRP-α u trakama 2 i 3 sa Sl. 4A, čini se da je postignuto potpunije deljenje upotrebom matriptaze u poređenju sa upotrebom uPA.
[0173] Stoga je dalja optimizacija uslova deljenja izvedena samo uz upotrebu matriptaze i rezultati su prikazani na sl.4B. Ispitivane su različite količine matriptaze i deljenje je izvršeno 18 sati na 37 °C. Traka 1 sa Sl.4B prikazuje kontrolni eksperiment bez dodavanja matriptaze, a trake 2-4 pokazuju deljenje izvedeno sa 44 ng, 0,44 ng, odnosno 0,167 ng matriptaze. Dobijeni podaci pokazuju da je 0,44 ng enzima dovoljno za potpuno deljenje u trenutnim uslovima. Zatim smo testirali deljenje preostalih konstrukata varijante SIRP-α koristeći optimizovane uslove deljenja. Kao primer, prikazan na sl. 4C, odgovarajući konstrukti varijante SIRP-α (SEQ ID NOs: 57-63) uspešno su deljeni in vitro pomoću matriptaze, upotrebom optimizovanih uslova deljenja. Trake 1-7 sa sl. 4C odgovaraju nepodeljenim fuzionim proteinima SEQ ID NOs: 57-63, respektivno. Trake 8-14 sa Sl. 4C odgovaraju fuzionim proteinima SEQ ID NOs: 57-63, redom, deljenim matriptazom.
Primer 5 - Afiniteti vezivanja konstrukata varijante SIRP-α
[0174] Vezivanje humanog CD47-hFc (R & D Systems, kataloški broj 4670-CD) za konstrukte varijante SIRP-α analizirano je na instrumentu Biacore T100 (GE Healthcare) koristeći fiziološki rastvor puferisan fosfatom (pH 7,4) dopunjen sa 0,01% Tween-20 kao pufera za elektroforezu.
[0175] 370 Rezonantnih jedinica (RU) CD47-hFc imobilizovane su na protočnoj ćeliji 2 CM4 senzorskog čipa (GE Healthcare) standardnim aminskim kuplovanjem. Protočna ćelija 1 aktivirana je sa EDC/NHS i blokirana (etanolaminom) da služi kao referenca. Svi konstrukti varijante SIRP-α ubrizgavani su na 50 nM ili 100 nM tokom dva minuta pri brzini protoka od 30 µL/min, a zatim je usledilo deset minuta vremena za disocijaciju. Posle svakog ubrizgavanja, površina se regeneriše pomoću smeše Pierce IgG pufera za eluciju (Life Technologies, kataloški broj 21004) i 4 M NaCl u razmeri 2:1. Potpuna regeneracija površine potvrđena je ubrizgavanjem SIRP-α varijanti na početku i na kraju eksperimenta. Svi senzorski dijagrami su dvostruko referencirani koristeći protočnu ćeliju 1 i ubrizgavanje pufera.
[0176] Za sve uzorke je određen signal vezivanja na 100 nM nakon 50 sekundi pridruživanja, normalizovan molekulskom težinom konstrukta varijante SIRP-α i eksprimiran kao procenat maksimalnog odgovora vezivanja. Vezivanje SIRP-α varijante (SEQ ID NO: 31) na 100 nM normalizovano njenom MT je korišćeno kao maksimalni odgovor na vezivanje. Rezultati na Sl. 5A pokazuju da konstrukti varijante SIRP-α (SEQ ID NOs: 48-51) ne sprečavaju vezivanje SIRP-α varijanti za CD47 na čipu. Nakon deljenja veznika, aktivnost vezivanja se umereno povećala. Konstrukti varijante SIRP-α (SEQ ID NOs: 52-54) efikasno su blokirali vezivanje varijante SIRP-α za CD47 na čipu. Međutim, nakon deljenja veznika, aktivnost vezivanja SIRP-α varijante za CD47 na čipu samo se umereno povećala, što sugeriše da visok afinitet interakcije između SIRP-α varijante i IgSF domena CD47 održava kompleks na okupu i stoga IgSF domen CD47 nastavlja da blokira SIRP-α varijantu čak i nakon što je veznik odvojen. Iznenađujuće, kada se IgSF domen CD47 spoji sa C-krajem SIRP-α (SEQ ID NO: 55), netaknuti konstrukt varijante SIRP-α efikasno je blokiran za vezivanje za CD47 na čipu (isto kao fuzijski proteini SEQ ID NOs: 52-54), ali deljenjem veznika se vraća 100% vezivanja SIRP-α varijante za CD47 na čipu, što sugeriše da se IgSF domen CD47 odvojio od SIRP-α varijante nakon deljenja veznika, tako da se SIRP-α varijanta može slobodno vezati za CD47 na čipu. Još jedan konstrukt sa CD47 spojenim za C-kraj SIRP-α varijante ispitivan je kasnije (vidi Sliku 5B). Ovaj konstrukt (SEQ ID NO: 56), koji sadrži duži odstojnik, takođe je oporavio aktivnost nakon deljenja, potvrđujući opšti pristup povezivanja N-kraja blokirajućeg peptida na bazi CD47 sa C-krajem SIRP-α varijante pri čemu će dobiti SIRP-α konstrukti u kojima blokirajući peptid na bazi CD47 efikasno blokira SIRP-α varijantu i disocira nakon odvajanja deljivog veznika.
[0177] Da bi se dalje ispitao afinitet vezivanja konstrukata varijante SIRP-α, konstrukti varijante SIRP-α sekvenci SEQ ID NOs: 52-63 su analizirani na instrumentu Biacore prema istom protokolu koji je prethodno opisan. Konstrukti varijante SIRP-α SEQ ID NOs: 52-54 sadrže CD47 IgSF domen koji ima aminokiseline 1-117 i C15S, u odnosu na CD47 divljeg tipa (SEQ ID NO: 35) spojen sa N-krajem SIRP-α varijante (SEQ ID NO: 31) preko deljivog veznika LSGRSDNH i više odstojnika različitih dužina. Konstrukti varijante SIRP-α sekvenci SEQ ID NOs: 55 i 56 sadrže CD47 IgSF domen koji ima aminokiseline 1-117 i C15S u odnosu na CD47 divljeg tipa (SEQ ID NO: 35) spojen sa C-krajem SIRP-α varijante (SEQ ID NO: 31) preko deljivog veznika LSGRSDNH i više odstojnika različitih dužina. Konstrukti varijante SIRP-α sekvenci SEQ ID NOs: 57-59 sadrže CD47 IgSF domen koji ima aminokiseline 1-118 i C15S, u odnosu na SEQ ID NO: 46 u Tabeli 6, spojen sa N-krajem SIRP-α varijante (SEQ ID NO: 31) preko deljivog veznika LSGRSDNH i više odstojnika različitih dužina. Konstrukti varijante SIRP-α sekvenci SEQ ID NOs: 60-63 sadrže CD47 IgSF domen koji sadrži aminokiseline 1-117 SEQ ID NOs: 41, 42, 44, odnosno 45 u Tabeli 6, spojen sa N-krajem SIRP-α varijante (SEQ ID NO: 31) preko deljivog veznika LSGRSDNH i više odstojnika različitih dužina.
[0178] SLIKA.5B pokazuje da su konstrukti varijante SIRP-α SEQ ID NOs: 55 i 56 efikasno blokirani za vezivanje za CD47 na čipu pre deljenja veznika, ali deljenje veznika vraća 100% aktivnosti vezivanja. Slični rezultati su primećeni za konstrukte varijante SIRP-α sa SEQ ID NOs: 57-63. Primetili smo da je produženjem N-kraja blokirajućeg peptida na bazi CD47 jednim ostatkom glicina generisan konstrukt varijante SIRP-α koji je efikasno blokiran pre nego što je veznik deljen i naknadno oporavljen na blizu 100% aktivnosti vezivanja CD47 nakon tretmana proteazom (SEQ ID NOs: 57-59), demonstrirajući disocijaciju blokirajućeg peptida na bazi CD47 od SIRP-α varijante nakon deljenja veznika.
[0179] Ovaj rezultat sugeriše da SIRP-α varijanta spojena sa N-krajem blokirajućeg peptida na bazi CD47 preko deljivog veznika i odstojnika dobro funkcioniše. Deljivi veznik stabilizuje spojeni kompleks i jednom kada je odvojen, produženi N-kraj blokirajućeg peptida na bazi CD47, koji uključuje fragment deljivog veznika vezan za N-kraj blokirajućeg peptida na bazi CD47, sprečava vezivanje blokirajućeg peptida na bazi CD47 za SIRP-α varijantu. Isti efekat se postiže spajanjem blokirajućeg peptida na bazi CD47 koji ima jednu ili više adicija aminokiselina, npr. jedan dodatak glicina (npr. sekvence SEQ ID NOs: 46 u Tabeli 6), na N-kraju blokirajućeg peptida na bazi CD47 na C-kraju SIRP-α varijante pomoću deljivog veznika i jednog ili više odstojnika. Isti efekat se takođe primećuje spajanjem blokirajućeg peptida na bazi CD47 koji ima jednu ili više supstitucija aminokiselina, npr. L101Q, L101Y, L101H, T102Q, ili T102H (npr. sekvence SEQ ID NOs: 41-45 u Tabeli 6), na C-kraju SIRP-α varijante pomoću deljivog veznika i jednog ili više odstojnika. Pokazali smo da blokirajući peptidi na bazi CD47 mogu biti spojeni sa C-krajem SIRP-α varijante i mogu blokirati vezivanje SIRP-α varijante za CD47 pre deljenja veznika i osloboditi SIRP-α varijantu nakon deljenja veznika (vidi, npr. SEQ ID NO: 55 na Slici 5A i SEQ ID NOs: 55 i 56 na Slici 5B).
[0180] Na osnovu ovih informacija, možemo stvoriti fuzione proteine CD47-blokiranih SIRP-α varijanti, tj. spajanjem monomera Fc domena ili HSA sa SIRP-α varijantom, izborom orijentacije (npr. N- ili C- kraj spajanja) koja daje bolje rezultate u farmakokinetici, efikasnosti, sigurnosti, proizvodnji i stabilnosti proizvoda.
Primer 6 - Specifično ciljno delovanje na SIRP-α varijante preko antitelo-vezujućeg peptida
[0181] Prvo smo koristili Cetuksimab, za koji je poznato da sadrži mesto vezivanja za DLP koji ima sekvencu SEQ ID NO: 64, da bismo proverili da li konstrukt varijante SIRP-α koji uključuje varijantu SIRP-α i DLP, može da se koncentriše na vezanom antitelu. Imobilisali smo Cetuksimab koristeći EDC/NHS hemiju na CM4 biacore čipu (2000RU) i ulivali konstrukt varijante SIRP-α (SEQ ID NO: 66) pri 100 nM i 50 nM korišćenjem PBS 0,01% P20 kao pufera za elektroforezu i pufera za nanošenje uzoraka pri 30 µL/min na čip (biacore T100). SLIKA 6 prikazuje vezivanje konstrukta varijante SIRP-α, ali ne i same SIRP-α varijante na čip. Zatim smo ubrizgali CD47-ECD i videli vezivanje CD47 u slučaju kada je korišćen konstrukt varijante SIRP-α, demonstrirajući da konstrukt varijante SIRP-α može istovremeno da se veže EGFR i CD47 (slika 6). Prema tome, konstrukt varijante SIRP-α koji uključuje SIRP-α varijantu i DLP koji se ubrizgava pacijentu sa kancerom koncentrovao bi se na mestu gde se akumulira terapijsko antitelo (npr. Cetuksimab), povećavajući efikasnost i smanjujući toksičnost.
[0182] Drugo, pokazali smo da konstrukt varijante SIRP-α koji uključuje SIRP-α varijantu i DLP može prvo da veže Cetukimab koji je vezan za EGFR, a zatim da veže CD47. Šema vezivnog kompleksa prikazana je na sl. 7A. Imobilizovali smo 3000 RUs hrEGFR-Fc (R&D Systems) na CM4 čip koristeći EDC/NHS hemiju. Koristeći PBS 0,01% P20 kao pufera za elektroforezu i pufera za nanošenje uzoraka pri 30 µL/min (biacore T100), ubrizgali smo
1
različite koncentracije (4, 20 i 100 nM) Cetuksimaba. Primećeno je vezivanje Cetuksimaba za imobilizovani hrEGFR-Fc. Zatim smo ubrizgali konstrukt varijante SIRP-α (SEQ ID NO: 66) pri 100 nM i primetili vezivanje. Vezivanje nije primećeno kada je SIRP-α varijanta ubrizgana sama. Zatim smo ubrizgali CD47-ECD na 100 nM i posmatrali vezivanje. Podaci su prikazani na sl. 7B i 7C. Stoga smo pokazali da je moguće formiranje kvaternarnog kompleksa EGFR-Cetukimab-konstrukt varijante SIRP-α sekvence SEQ ID NO: 66-CD47. Konstrukt varijante SIRP-α koji uključuje varijantu SIRP-α i DLP, sposoban je da veže i inhibira CD47 kada se konstrukt prethodno koncentriše na obolelom mestu vezujući se specifično za antitelo specifično za tumor (npr. Cetuksimab). Dalje, sledeći isti koncept, konstrukt varijante SIRP-α koji uključuje SIRP-α varijantu, DLP i blokirajući peptid na bazi CD47 takođe je u stanju da veže i inhibira CD47 kada se konstrukt prethodno koncentriše na obolelom mestu specifičnim vezivanjem za antitelo specifično za tumor (npr. Cetuksimab).
Primer 7 - Analiza fagocitoze
[0183] Konstrukt varijante SIRP-α (SEQ ID NO: 66), koji uključuje SIRP-α varijantu vezanu za DLP preko odstojnika, i SIRP-α varijanta (SEQ ID NO: 31) su testirani u testu fagocitoze na DLD1 ćelijama (SLIKA 8). Analiza fagocitoze izvedena je kako je opisano u, na primer, Weiskofp et al, Science 341:88-91, 2013. Eksperimentalni protokol je opisan u nastavku. Konstrukt varijante SIRP-α (SEQ ID NO: 66) pokazao je veću potenciju od same SIRP-α varijante (SEQ ID NO: 31), verovatno zbog veće akumulacije na obolelim ćelijama.
[0184] Slojevi staloženih leukocita i trombocita su dobijeni od Stanford Blood Center od anonimnih davalaca, a mononuklearne ćelije periferne krvi obogaćene su centrifugiranjem sa gradijentom gustine preko Ficoll-Pakue Premium (GE Healthcare). Monociti su prečišćeni pomoću Macs Miltenyi Biotec Monocyte Isolation Kit II prema uputstvima proizvođača. Ovo je sistem indirektnog magnetnog obeležavanja za izolaciju monocita iz ljudskih PBMCs. Izolovani monociti se diferenciraju u makrofage kultivisanjem u RPMI 1640 medijumu dopunjenom sa 10% termički inaktiviranog humanog AB seruma i 1% GlutaMax-om i 1% penicilinom i streptomicinom (GIBCO Life Technologies) tokom 6-10 dana. Za analizu fagocitoze, 100.000 GFP DLD-1 ćelija je zasejano u bunarčiće ploče sa 96 bunarčića sa U dnom i ultra niskim vezivanjem (Corning 7007). Ćelijama tumora DLD-1 dodaje se 50 µL/bunarčiću 4 µg/ml IgG1k kontrole izotipa ili 4 µg/ml Cetuksimaba (Absolute Antibody, Ab00279-10.0) i pre-inkubira 30 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon toga, dodaju se SIRP-α varijante od 50 µL/bunarčiću i u svaki bunarčić se dodaje i 50 µL/bunarčiću makrofaga (1 x 10<6>/ml) (50.000 makrofaga). Konačno razblaženje uzoraka antitela i SIRP-α konstrukta je 1: 4. Krajnja koncentracija cetuksimaba je 1µg/ml. Zajedničko uzgajanje makrofaga, tumorskih
2
ćelija, antitela i konstrukata varijante SIRP-α izvodi se 2 sata na 37 °C. Za analizu, uzorci ćelija su fiksirani, obojeni i analizirani pomoću BD FACS Canto. Primarni humani makrofagi su identifikovani protočnom citometrijom koristeći anti-CD14, anti-CD45 ili anti-CD206 antitela (BioLegend). Mrtve ćelije su izuzete iz analize bojanjem sa DAPI (Sigma). Fagocitoza je procenjena kao procenat GFP+ makrofaga i normalizovana na maksimalan odgovor svakog nezavisnog davaoca protiv svake ćelijske linije.
Primer 8 - Modeliranje pH zavisnog vezivanja SIRP-α varijanti za CD47
[0185] Za konstruisanje vezivanja zavisnog od pH SIRP-α varijante pronalaska, mutageneza histidina može se izvršiti na SIRP-α, posebno na regionu SIRP-α koji je u interakciji sa CD47. Kristalne strukture kompleksa SIRP-α i CD47 (vidi, na primer PDB ID No. 2JJS) i kompjutersko modelovanje mogu se koristiti za vizuelizaciju trodimenzionalnog mesta vezivanja SIRP-α i CD47. Računarski dizajn i metode modelovanja korisne u dizajniranju proteina sa svojstvima vezivanja osetljivim na pH poznati su u literaturi i opisani su, na primer, u Strauch et al., Proc Natl Acad Sci 111:675-80, 2014, koji je ovde uključen referencom u celosti. U nekim primerima izvođenja, kompjutersko modelovanje se može koristiti za identifikovanje ključnih kontaktnih ostataka na dodirnoj površini SIRP-α i CD47. Identifikovani ključni kontaktni ostaci mogu se zameniti ostacima histidina pomoću dostupnog softvera za dizajn proteina (npr. RosettaDesign), koji može generisati različite dizajne proteina koji se mogu optimizovati, filtrirati i rangirati na osnovu izračunate energije vezivanja i komplementarnosti oblika. Prema tome, energetski povoljne zamene histidina na određenim položajima aminokiselina mogu se identifikovati pomoću kompjuterskih metoda dizajniranja. Kompjutersko modelovanje se takođe može koristiti za predviđanje promene u trodimenzionalnoj SIRP-α strukturi. Zamene histidina koje generišu značajne promene u trodimenzionalnoj SIRP-α strukturi mogu se izbeći.
[0186] Jednom kada se identifikuju energetski i strukturno optimalne aminokiselinske supstitucije, aminokiseline mogu sistematski biti supstituisane ostacima histidina. U nekim primerima izvođenja, jedna ili više (npr. jedna, dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, itd., i najviše 20) aminokiselina SIRP-α mogu biti zamenjene ostacima histidina. Konkretno, aminokiseline smeštene na dodirnoj površini SIRP-α i CD47, poželjno aminokiseline direktno uključene u vezivanje SIRP-α za CD47, mogu biti supstituisane ostacima histidina. SIRP-α varijante pronalaska mogu da uključuju jednu ili više (npr. jednu, dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, itd., i najviše 20) zamena ostataka histidina. U drugim primerima izvođenja, histidinski ostaci SIRP-α koji se javljaju u prirodi mogu biti supstituisani drugim aminokiselinskim ostacima. U sledećim primerima izvođenja, jedna ili više aminokiselina SIRP-α mogu biti supstituisane ne-histidinskim ostacima kako bi uticale na vezivanje prirodnih ili supstituisanih histidinskih ostataka sa CD47. Na primer, supstitucija aminokiselina koje okružuju prirodni ostatak histidina drugim aminokiselinama može „sahraniti“ prirodni ostatak histidina. U nekim primerima izvođenja, aminokiseline koje nisu direktno uključene u vezivanje sa CD47, tj. unutrašnje aminokiseline (npr. aminokiseline smeštene u jezgru SIRP-α) takođe mogu biti supstituisane ostacima histidina. Tabela 4 navodi specifične SIRP-α aminokiseline koje mogu biti supstituisane ostacima histidina. Kontaktni ostaci su aminokiseline smeštene na dodirnoj površini SIRP-α i CD47. Jezgreni ostaci su unutrašnje aminokiseline koje nisu direktno uključene u vezivanje između SIRP-α i CD47. SIRP-α varijante pronalaska mogu da uključuju jednu ili više (npr. jednu, dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset itd., ili sve) supstitucija navedenih u Tabeli 4.
Primer 9 - Generisanje i skrining SIRP-α varijanti sa pH-zavisnim vezivanjem za CD47
[0187] SIRP-α varijante koje sadrže jednu ili više (npr. jednu, dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, itd., i najviše 20) supstituisanih aminokiselina ostacima histidina mogu se generisati upotrebom konvencionalnih tehnika molekularnog kloniranja i eksprimiranja proteina. Molekul nukleinske kiseline koji kodira SIRP-α varijantu pronalaska može se klonirati u vektor optimizovan za eksprimiranje u bakterijama koristeći dobro poznatih tehnika molekularne biologije. Tada se vektor može transformisati u ćelije bakterija (npr. ćelije E. coli), koje se mogu uzgajati do optimalne gustine pre indukcije eksprimiranja proteina. Nakon indukcije eksprimiranja proteina (tj. korišćenjem IPTG), bakterijskim ćelijama se može dozvoliti da rastu dodatnih 24 sata. Ćelije se mogu sakupljati i eksprimirani protein SIRP-α varijante može se prečistiti iz supernatanta ćelijske kulture korišćenjem, na primer, afinitetne hromatografije na koloni. Prečišćena SIRP-α varijanta može se analizirati pomoću SDS-PAGE praćenog bojenjem Coomassie Blue da bi se potvrdilo prisustvo proteinskih traka očekivane veličine.
[0188] Prečišćene SIRP-α varijante mogu se podvrgnuti skriningu za pH-zavisno vezivanje za CD47 korišćenjem raspoloživih tehnika u ovoj oblasti, kao što su fagni prikaz, prikaz na kvascu, površinska plazmonska rezonanca, testovi blizine scintilacije, ELISA, ORIGEN imunološki test (IGEN), gašenje fluorescencije i/ili prenos fluorescencije. Vezivanje se takođe može pregledati pomoću odgovarajućeg biotesta. Željena SIRP-α varijanta vezuje se sa većim afinitetom za CD47 pod kiselim pH (npr., manjim od pH 7 (npr. pH 6)) nego pod neutralnim pH (npr. pH 7,4). KDkompleksa SIRP-α/CD47 pri pH 6 bio bi niži od KDkompleksa SIRP-α/CD47 pri pH 7,4.
Primer 10 - Ispitivanje SIRP-α varijanti sa pH-zavisnim vezivanjem za CD47 na
4
miševima
[0189] Genetski konstruisani mišji modeli različitih kancera, npr. čvrstog tumora i hematološkog kancera, mogu se koristiti za ispitivanje pH zavisnog vezivanja SIRP-α varijanti pronalaska za CD47 na obolelom mestu na mišijem modelu. SIRP-α varijanta može se direktno ili indirektno ubrizgati na obolelo mesto kod miša, koje se kasnije može secirati da bi se otkrilo prisustvo kompleksa SIRP-α varijante i CD47 na obolelom mestu. U detekciji se mogu koristiti antitela specifična za SIRP-α varijantu ili CD47.
1
2
4
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
11
11
11
11
11
11
11
12
12
12
12
12
12
12
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
14
14
14
14
14
14
��
1
11
��
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1

Claims (17)

Patentni zahtevi
1. Konstrukt varijante signal-regulatornog proteina α (SIRP-α), koji sadrži SIRP-α varijantu vezanu za blokirajući peptid na bazi CD47 pomoću deljivog veznika,
naznačen time što blokirajući peptid na bazi CD47 ima najmanje 80% identičnosti sekvence sa sekvencom divljeg tipa IgSF domena CD47 (SEQ ID NO: 35) ili njegovog fragmenta koji može da veže varijantu SIRP-α, i
pri čemu varijanta SIRP-α sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5VGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRIGX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDDVEX1
6KSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 13), gde je X1L, I, ili V; X2je V, L, ili, I; X3je A ili V; X4je A, I, ili L; X5je I, T, S, ili F; X6je E, V, ili L; X7je K ili R; X8je E ili Q; X9je H, P, ili R; X10je L, T, ili G; X11je K ili R; X12je N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, ili Y; X13je P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, ili Y; X14je V ili I; X15je F, L, ili V; i X16je F ili V.
2. Konstrukt varijante SIRP-α prema zahtevu 1, naznačen time, što varijanta SIRP-α ima najmanje 80% identičnosti sekvence sa sekvencom u skladu sa bilo kojom od SEQ ID NOs: 3-12 i 24-34.
3. Konstrukt varijante SIRP-α prema zahtevu 1 ili zahtevu 2, naznačen time što blokirajući peptid na bazi CD47 ima sekvencu u skladu sa bilo kojom od SEQ ID NOs: 36-46.
4. Konstrukt varijante SIRP-α prema bilo kom od zahteva 1-3, naznačen time što deljivi veznik sadrži jedan ili više odstojnika.
5. Konstrukt varijante SIRP-α prema bilo kom od zahteva 1-4, naznačen time što deljivi veznik može da se odvoji pod kiselim pH i/ili pod hipoksičnim uslovima.
6. Konstrukt varijante SIRP-α prema bilo kom od zahteva 1-5, naznačen time što deljivi veznik može da se odvoji enzimom povezanim sa tumorom, opciono gde je enzim povezan sa tumorom proteaza izabrana iz grupe koja se sastoji od matriptaze (MTSP1), aktivatora plazminogena urinarnog tipa (uPA), legumaina, PSA (takođe nazvan KLK3, peptidaza-3 povezana sa kalikreinom), metaloproteinaze-2 matrice (MMP-2), MMP9, humane neutrofilne elastaze (HNE) i proteinaze 3 (Pr3), poželjno matriptaze (MTSP1).
7. Konstrukt varijante SIRP-α prema bilo kom od zahteva 1-4, naznačen time što deljivi veznik sadrži sekvencu prikazanu u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 47 ili 69-99, poželjno LSGRSDNH (SEQ ID NO: 47).
8. Konstrukt varijante SIRP-α prema bilo kom od zahteva 1-7, naznačen time, što konstrukt varijante SIRP-α ima sekvencu u skladu sa bilo kojom od SEQ ID NOs: 48-63.
9. Konstrukt varijante SIRP-α prema bilo kom od zahteva 1-8, naznačen time, što je SIRP-α varijanta vezana za antitelo-vezujući peptid, opciono gde antitelo-vezujući peptid ima najmanje 75% identičnosti aminokiselinske sekvence sa sekvencom peptida za lokalizaciju bolesti (DLP) (SEQ ID NO: 64 ili 65) ili njegovim fragmentom.
10. Konstrukt varijante SIRP-α prema bilo kom od zahteva 1-9, naznačen time, što je navedena varijanta SIRP-α vezana za monomer Fc domena.
11. Farmaceutska kompozicija, koja sadrži: a) terapeutski efikasnu količinu konstrukta varijante SIRP-α prema bilo kom od zahteva 1-10, i b) farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.
12. Konstrukt varijante SIRP-α prema bilo kom od zahteva 1-10 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 11, za upotrebu kao lek.
13. Konstrukt varijante SIRP-α prema bilo kom od zahteva 1-10 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 11, za upotrebu u lečenju kancera, opciono pri čemu je navedeni kancer odabran od kancera čvrstog tumora, hematološkog kancera, akutne mijeloidne leukemije, hronične limfocitne leukemije, hronične mijeloidne leukemije, akutne limfoblastne leukemije, ne-Hočkinovog limfoma, Hočkinovog limfoma, multiplog mijeloma, kancera bešike, kancera pankreasa, kancera grlića materice, kancera endometrijuma, kancera pluća, kancera bronhija, kancera jetre, kancera jajnika, kancera debelog creva i rektuma, kancera stomaka, kancera želuca, kancera žučne kese, kancera gastrointestinalnog stromalnog tumora, kancera štitaste žlezde, kancera glave i vrata, kancera orofarinksa, kancera jednjaka, melanoma, nemelanomskog kancera kože, kancera Merkelovih ćelija, virusno izazvanog kancera, neuroblastoma, kancera dojke, kancera prostate, kancera bubrega, kancera bubrežnih ćelija, kancera bubrežne karlice, leukemije, limfoma, sarkoma, glioma, tumora na mozgu i karcinoma.
14. Nukleinska kiselina koja kodira konstrukt varijante SIRP-α prema bilo kom od zahteva 1-10.
15. Vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu prema zahtevu 14.
16. Ćelija domaćin koja sadrži nukleinsku kiselinu prema zahtevu 14 ili vektor prema zahtevu 15.
17. Postupak izrade konstrukta varijante SIRP-α prema bilo kom od zahteva 1-10, naznačen time, što sadrži:
(a) kultivisanje ćelije domaćina prema zahtevu 16 pod uslovima u kojima se konstrukt
1
proizvodi, i;
(b) izdvajanje konstrukta proizvedenog od strane ćelije domaćina.
1
RS20210831A 2015-08-07 2016-08-08 Konstrukti varijante sirp-αlfa i njihove upotrebe RS62150B1 (sr)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562202775P 2015-08-07 2015-08-07
US201562202772P 2015-08-07 2015-08-07
US201562202779P 2015-08-07 2015-08-07
TW104125902A TWI702228B (zh) 2014-08-08 2015-08-10 信號調節蛋白α（ｓｉｇｎａｌ-ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ α， ＳＩＲＰ-α）變體構築物及其用途
US14/971,931 US20160319256A9 (en) 2014-08-08 2015-12-16 Sirp-alpha variant constructs and uses thereof
EP16183261.3A EP3128005B1 (en) 2015-08-07 2016-08-08 Sirp-alpha variant constructs and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62150B1 true RS62150B1 (sr) 2021-08-31

Family

ID=57624246

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210831A RS62150B1 (sr) 2015-08-07 2016-08-08 Konstrukti varijante sirp-αlfa i njihove upotrebe

Country Status (24)

Country Link
EP (2) EP3128005B1 (sr)
JP (2) JP6901834B2 (sr)
KR (1) KR102675219B1 (sr)
AU (2) AU2016210755B2 (sr)
BR (1) BR102016018074A2 (sr)
CO (1) CO2016000671A1 (sr)
CY (1) CY1124272T1 (sr)
DK (1) DK3128005T3 (sr)
EA (1) EA034582B1 (sr)
ES (1) ES2872528T3 (sr)
HR (1) HRP20211079T1 (sr)
HU (1) HUE055605T2 (sr)
IL (2) IL247114B (sr)
LT (1) LT3128005T (sr)
MX (2) MX2020011759A (sr)
NZ (1) NZ722947A (sr)
PH (1) PH12016000277A1 (sr)
PL (1) PL3128005T3 (sr)
PT (1) PT3128005T (sr)
RS (1) RS62150B1 (sr)
SG (2) SG10201912880PA (sr)
SI (1) SI3128005T1 (sr)
SM (1) SMT202100400T1 (sr)
ZA (2) ZA201605435B (sr)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2769769C2 (ru) 2017-01-05 2022-04-05 Кахр Медикал Лтд. СЛИТЫЙ БЕЛОК SIRPα-4-1BBL И СПОСОБЫ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ
KR102233993B1 (ko) * 2017-07-24 2021-03-31 한국과학기술원 면역 회피성 박테리오파지
US20210040219A1 (en) * 2018-03-13 2021-02-11 Trillium Therapeutics Inc. Improvements in cd47 blockade therapy by egfr antibody
EP3820887A4 (en) 2018-07-11 2022-04-20 KAHR Medical Ltd. Pd1-4-1bbl variant fusion protein and methods of use thereof
KR102945860B1 (ko) 2018-07-11 2026-03-31 카 메디컬 리미티드 SIRPalpha-4-1BBL 변이체 융합 단백질 및 이의 사용 방법
US20210347848A1 (en) * 2018-08-31 2021-11-11 ALX Oncology Inc. Decoy polypeptides
CN109535263B (zh) * 2018-12-04 2022-06-17 江苏东抗生物医药科技有限公司 SIRPα突变体及其融合蛋白
CN111763261B (zh) * 2019-04-02 2022-08-09 杭州尚健生物技术有限公司 一种融合蛋白及其用途
CN121243368A (zh) 2019-11-27 2026-01-02 Alx肿瘤生物技术公司 用于治疗癌症的组合疗法
US20210301019A1 (en) * 2020-03-26 2021-09-30 Aetio Biotherapy, Inc. Bi-specific fusion proteins for depletion of regulatory t cells
CN114057888A (zh) * 2020-07-30 2022-02-18 三生国健药业（上海）股份有限公司 一种SIRPα-Fc融合蛋白
JP2024520902A (ja) 2021-05-13 2024-05-27 エーエルエックス オンコロジー インコーポレイテッド がんを治療するための併用療法
CN116178561B (zh) * 2021-11-26 2025-07-18 杭州尚健生物技术有限公司 包含SIRPα突变体的融合蛋白
KR20250172692A (ko) 2021-12-21 2025-12-09 에프비디 바이올로직스 리미티드 조작된 SIRPα 변이체 및 이의 사용 방법
EP4490201A4 (en) 2023-05-31 2026-03-11 Fbd Biologics Ltd CD47/PD-L1 Targeted Protein Complex and Its Methods of Use

Family Cites Families (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US5697901A (en) 1989-12-14 1997-12-16 Elof Eriksson Gene delivery by microneedle injection
JPH04334377A (ja) 1990-12-31 1992-11-20 Akzo Nv 酸−不安定性リンカー分子
DK0590060T3 (da) 1991-06-21 1998-05-11 Univ Cincinnati Oralt indgivelige terapeutiske proteiner samt fremgangsmåde til fremstilling
US6613332B1 (en) 1991-06-21 2003-09-02 The University Of Cincinnati Oral administration of therapeutic proteins
IL99120A0 (en) 1991-08-07 1992-07-15 Yeda Res & Dev Multimers of the soluble forms of tnf receptors,their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US7018809B1 (en) 1991-09-19 2006-03-28 Genentech, Inc. Expression of functional antibody fragments
US5505931A (en) 1993-03-04 1996-04-09 The Dow Chemical Company Acid cleavable compounds, their preparation and use as bifunctional acid-labile crosslinking agents
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
CA2224907A1 (en) 1995-07-25 1997-02-13 Introgene B.V. Methods and means for targeted gene delivery
DE69733815T2 (de) 1996-02-15 2006-06-08 Biosense Webster, Inc., Diamond Bar Sonde zur exkavation
JP2000514440A (ja) 1996-07-09 2000-10-31 ザ ジョーンズ ホプキンス ユニバーシティー 遺伝子輸送システム
US6613026B1 (en) 1999-12-08 2003-09-02 Scimed Life Systems, Inc. Lateral needle-less injection apparatus and method
US7662367B2 (en) 2000-03-02 2010-02-16 Xencor, Inc. Pharmaceutical compositions for the treatment of TNF-α related disorders
TWI334439B (en) 2001-08-01 2010-12-11 Centocor Inc Anti-tnf antibodies, compositions, methods and uses
EP1900753B1 (en) 2002-11-08 2017-08-09 Ablynx N.V. Method of administering therapeutic polypeptides, and polypeptides therefor
AU2005220156B2 (en) 2004-02-27 2011-06-02 Vaxconsulting Peptides of IL1 beta and TNF alpha and method of treatment using same
WO2005092362A2 (de) 2004-03-29 2005-10-06 Hallstroem Seth Pharmazeutisches kombinationspräparat enthaltend ein therapeutisches protein
US8377448B2 (en) * 2006-05-15 2013-02-19 The Board Of Trustees Of The Leland Standford Junior University CD47 related compositions and methods for treating immunological diseases and disorders
JP6157046B2 (ja) 2008-01-07 2017-07-05 アムジェン インコーポレイテッド 静電的ステアリング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｓｔｅｅｒｉｎｇ）効果を用いた抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための方法
WO2010070047A1 (en) * 2008-12-19 2010-06-24 Novartis Ag Soluble polypeptides for use in treating autoimmune and inflammatory disorders
RU2636046C2 (ru) 2009-01-12 2017-11-17 Сайтомкс Терапьютикс, Инк Композиции модифицированных антител, способы их получения и применения
AU2010215761B2 (en) 2009-02-23 2017-04-06 Cytomx Therapeutics, Inc Proproteins and methods of use thereof
KR20120097481A (ko) * 2009-07-20 2012-09-04 내셔날 쳉쿵 유니버시티 사람 혈청 알부민(ＨＳＡ)의 변이체와 컨쥬게이션된 αｖβ3 인테그린에 대해 선택적인 폴리펩타이드 및 이의 약제학적 용도
KR101632312B1 (ko) 2009-11-03 2016-06-21 삼성전자주식회사 항체 불변 영역에 특이적으로 결합하는 융합 단백질, 그의 제조 방법 및 이를 이용한 항체 분리 방법
BR112012017164A2 (pt) * 2009-12-22 2019-09-24 Novartis Ag proteína de fusão de região constante de anticorpo-cd47 tetravalente
JP6157352B2 (ja) * 2010-10-08 2017-07-05 シティ・オブ・ホープＣｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ メディトープ（Ｍｅｄｉｔｏｐｅ）のためのモノクローナル抗体フレームワーク結合インターフェース、メディトープ送達系、およびその使用法
US8609621B2 (en) 2010-11-15 2013-12-17 E I Du Pont De Nemours And Company Acid-cleavable linkers exhibiting altered rates of acid hydrolysis
WO2012109267A2 (en) * 2011-02-07 2012-08-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Novel peptides and methods using same
BR112013031762A2 (pt) * 2011-06-16 2016-09-13 Novartis Ag proteínas solúveis para utilização como terapêuticos
WO2013063076A1 (en) * 2011-10-25 2013-05-02 Indiana University Research & Technology Corporation Compositions for and methods of modulating complications, risks and issues with xenotransplantation
ES2816647T3 (es) * 2012-01-17 2021-04-05 Univ Leland Stanford Junior Reactivos SIRP-alfa de alta afinidad
US9428553B2 (en) * 2012-02-10 2016-08-30 City Of Hope Meditopes and meditope-binding antibodies and uses thereof
EP2863948B1 (en) * 2012-06-22 2018-10-24 Cytomx Therapeutics Inc. Anti-jagged 1/jagged 2 cross-reactive antibodies, activatable anti-jagged antibodies and methods of use thereof
PL3575326T3 (pl) * 2012-12-17 2022-07-11 Pf Argentum Ip Holdings Llc Leczenie komórek chorobowych cd47+ z użyciem fuzji sirp alfa-fc
WO2014121093A1 (en) * 2013-01-31 2014-08-07 Thomas Jefferson University Fusion proteins that facilitate cancer cell destruction
US9562073B2 (en) * 2014-01-31 2017-02-07 Cytomx Therapeutics, Inc. Matriptase and u-plasminogen activator substrates and other cleavable moieties and methods of use thereof
WO2016023040A1 (en) * 2014-08-08 2016-02-11 Alexo Therapeutics International Sirp-alpha variant constructs and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
EP3128005A1 (en) 2017-02-08
IL247114B (en) 2021-12-01
DK3128005T3 (da) 2021-06-28
JP2017060462A (ja) 2017-03-30
CY1124272T1 (el) 2022-07-22
HUE055605T2 (hu) 2021-12-28
IL247114A0 (en) 2016-12-29
MX2020011759A (es) 2022-01-06
ZA201902673B (en) 2024-04-24
CO2016000671A1 (es) 2018-02-09
NZ722947A (en) 2022-12-23
IL287825A (en) 2022-01-01
IL287825B2 (en) 2023-04-01
EA201691384A3 (ru) 2017-03-31
IL287825B (en) 2022-12-01
MX377080B (es) 2025-03-07
AU2016210755A1 (en) 2017-02-23
LT3128005T (lt) 2021-07-12
SG10201912880PA (en) 2020-02-27
KR102675219B1 (ko) 2024-06-14
ES2872528T3 (es) 2021-11-02
HRP20211079T1 (hr) 2021-10-01
JP6901834B2 (ja) 2021-07-14
JP2021166521A (ja) 2021-10-21
AU2016210755B2 (en) 2021-05-13
SI3128005T1 (sl) 2021-09-30
BR102016018074A2 (pt) 2021-11-16
KR20170017846A (ko) 2017-02-15
AU2021215151A1 (en) 2021-09-02
EP3913050A1 (en) 2021-11-24
MX2016010259A (es) 2017-04-25
EA201691384A2 (ru) 2017-02-28
SMT202100400T1 (it) 2021-09-14
EP3128005B1 (en) 2021-04-14
PH12016000277A1 (en) 2018-02-12
ZA201605435B (en) 2020-12-23
PT3128005T (pt) 2021-06-02
EA034582B1 (ru) 2020-02-21
PL3128005T3 (pl) 2021-11-29
AU2021215151B2 (en) 2023-05-18
SG10201606520SA (en) 2017-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20250011737A1 (en) Sirp-alpha variant constructs and uses thereof
AU2021215151B2 (en) SIRP-alpha variant constructs and uses thereof
CA2710040C (en) A soluble tumor necrosis factor receptor mutant
KR20230159855A (ko) 다가 단백질 및 스크리닝 방법
WO2022115963A1 (en) Heterodimeric iga fc constructs and methods of use thereof
US20260036590A1 (en) Multivalent proteins and screening methods
HK40062676A (en) Sirp-alpha variant constructs and uses thereof
CA2938180C (en) Sirp-alpha variant constructs and uses thereof
HK1234097B (en) Sirp-alpha variant constructs and uses thereof
HK1234097A1 (en) Sirp-alpha variant constructs and uses thereof
HK40119423A (zh) 改善的folr1蛋白酶可活化的t细胞双特异性抗体