RS62152B1 - Bakterije oslabljene virulencije za lečenje malignih solidnih tumora - Google Patents

Description

Opis

Oblast tehnike pronalaska

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na rekombinantne Gram-negativne bakterijske sojeve oslabljene virulencije za upotrebu u postupku lečenja malignog solidnog tumora kod subjekta.

Stanje tehnike

[0002] Glavni problem u lečenju malignih solidnih tumora je isporuka terapijskih molekula kancerskim ćelijama u dovoljnim količinama, uz što manje oštećenja ostalih ćelija i tkiva. Najčešći pristupi lečenja kao što su hirurgija, hemoterapija i terapija zračenjem, previše često ne uspevaju da izleče pacijente, a sporedni efekti poput mučnine i dijareje su obimni. Ispitivano je stoga nekoliko drugih terapijskih strategija, uključujući inhibitore angiogeneze i imunoterapije.

[0003] U razmatranjima smanjenja oštećenja tkiva koje nije kancerogeno, od velikog su interesa pristupi koji omogućavaju ciljanu isporuku lekova. Na primer, upotrebljavana su antitela koja prepoznaju površinske strukture tumorskih ćelija i, u optimalnom slučaju, selektivno se vezuju za tumorske ćelije. Da bi se poboljšao mehanizam takvih antitela, ona mogu biti konjugovana sa terapijskim agensima ili sa lipidnim vezikulama u koje su upakovani lekovi. Jedan od izazova kod ovakvih vezikula je pravilno oslobađanje aktivnog reagensa. Još je složenija isporuka terapijskih proteina ili peptida, posebno kada se ciljano deluje na mehanizme unutar ćelije. Da bi se rešio problem isporuke terapijskih proteina u eukariotske ćelije, pokušano je i sa mnogim alternativnim načinima, među kojima su i „peptidi koji prodiru u ćelije“ (CPP) ili slične tehnologije, kao i sa raznim metodologijama zasnovanim na nanočesticama. Nedostatak svih ovih tehnologija je niska efikasnost i visoka verovatnoća da će materijal koga ćelija preuzima putem endocitoze, na kraju biti razgrađen u lizozomima. Štaviše, nesklad između potrebe za stabilnošću nosača/materijala u humanom organizmu i zahteva za destabilizacijom i oslobađanjem unutar ciljne ćelije, predstavlja suštinski problem takvih tehnologija.

[0004] Pokazano je da se razne bakterije umnožavaju unutar maligih solidnih tumora prilikom primene sa udaljenog mesta, uključujući Escherichia coli, Vibrio cholerae, Salmonella enterica, Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa i Bifidobacteria. Trenutno, samo se Klemet-Gerinov bacil (BCG, izveden iz Mycobacterium bovis) upotrebljava u kliničkoj praksi. BCG se primenjuje za lečenje površinskog kancera bešike, dok osnovni molekulski mehanizam ostaje većinom nepoznat. WO02/077249 A2 razmatra mutirane sojeve Yersinia enterocolitica koji nose mutacije u jednom, dva ili tri od efektorskih gena yopH, yopO, yopP, yopE, yopM, yopT. U Primeru 1, ispitivani su generisani mutirani sojevi u pogledu dejstva YopH, YopE i YopT u rezistenciji na fagocitozu makrofagima. Nijedan heterologni protein nije bio isporučen inficiranim makrofagima.

[0005] Optimalan bakterijski soj za lečenje malignih solidnih tumora karakterisaće specifično nakupljanje i proliferacija na mestu tumora, dok će biti potpuno eliminisan na mestima koja nisu relevantna. U tom pogledu, optimalan bakterijski nosač za ciljanu terapiju kancera bi trebao da obezbedi visok stepen nakupljanja na željenom mestu dejstva, uz minimalno prisustvo na mestu koje nije relevantno. Razvoj takvog bakterijskog soja za lečenje malignih solidnih tumora, koji je sposoban da npr. isporuči materijal koji se proizvodi unutar bakterija do mesta njegovog delovanja unutar kancerskih ćelija, tj. izvan bakterija, ostaje glavni izazov.

Suština pronalaska

[0006] Predmetni pronalazak se odnosi na rekombinantne Gram-negativne bakterijske sojeve oslabljene virulencije za upotrebu u postupku lečenja malignog solidnog tumora kod subjekta. U pojedinim primerima izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje rekombinantne Gram-negativne bakterijske sojeve oslabljene virulencije i njihovu upotrebu za lečenje malignog solidnog tumora kod subjekta, pri čemu rekombinantni Gram-negativni bakterijski sojevi oslabljene virulencije omogućava translokaciju raznih efektora tipa III, ali i efektora tipa IV, virusnih proteina i, što je najvažnije, funkcionalnih eukariotskih proteina u ćelije malignog solidnog tumora.

[0007] Prema prvom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije transformisan sa vektorom koji sadrži, u smeru od 5’ ka 3’:

promotor;

prvu DNK sekvencu koja kodira signal za isporuku iz bakterijskog efektorskog proteina, operativno povezanu sa navedenim promotorom; i

drugu DNK sekvencu koja kodira heterologni protein, fuzionisanu sa 3' krajem navedene prve DNK sekvence tako da se zadrži okvir čitanja,

za upotrebu u postupku lečenja malignog solidnog tumora kod subjekta, pri čemu je rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije Yersinia soj deficijentan u proizvodnji siderofora i nakuplja se u malignom solidnom tumoru, pri čemu postupak obuhvata istovremenu primenu navedenog rekombinantnog Gram-negativnog bakterijskog soja oslabljene virulencije sa sideroforom i pri čemu se rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije primenjuje u količini koja je dovoljna za lečenje subjekta.

[0008] Prema daljem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije, pri čemu je rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije Yersinia soj deficijentan u proizvodnji siderofora i pri čemu je rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije deficijentan u proizvodnji najmanje jednog bakterijskog efektorskog proteina koji je virulentan za eukariotske ćelije, ili je deficijentan u proizvodnji najmanje jednog bakterijskog proteina koji je deo mašinerije sistema za sekreciju, za upotrebu u postupku lečenja malignog solidnog tumora kod subjekta, pri čemu se rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije nakuplja u malignom solidnom tumoru, a postupak obuhvata istovremenu primenu navedenog rekombinantanog Gram-negativnog bakterijskog soja oslabljene virulencije sa sideroforom subjektu, pri čemu se rekombinantan Gramnegativan bakterijski soj oslabljene virulencije primenjuje u količini koja je dovoljna za lečenje subjekta.

Kratak opis slika nacrta

[0009]

Sl. 1: Karakterizacija T3SS isporuke proteina. (A) Šematski prikaz sekrecije proteina zavisne od T3SS u okolni medijum (in vitro sekrecija) (leva strana) ili u eukariotske ćelije (desna strana). I: prikazuje sistem sekrecije tipa 3. II ukazuje na proteine izlučene u okolni medijum, III proteine koji se translociraju kroz memebranu u citosol eukariotskih ćelija (VII). VI prikazuje pružanje dve bakterijske membrane u koje je insertovan T3SS i bakterijski citosol ispod. IV je fuzioni protein koji je vezan za YopE1-138fragment N-kraja (V) (B) In-vitro sekrecija I: Y.enterocolitica E40 divlјeg tipa, II: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd ili III: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd pBadSi_2, što je utvrđeno imunoblot analizom ukupnih bakterijskih lizata (IV) i precipitiranih supernatanata kulture ćelija (V) upotrebom anti-YopE antitela.

Sl. 2: Karakterizacija T3SS isporuke proteina u epitelne ćelije. (A) Anti-Myc imunofluorescentno bojenje HeLa ćelija inficiranih sa MOI od 100 tokom jednog sata, sa I: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd ili II: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd pBad_Si2. (B) Kvantifikacija intenziteta anti-Myc imunofluorescentnog bojenja (A) unutar HeLa ćelija. Podaci su objedinjeni za n = 20 mesta, a prikazane greške predstavljaju standardne greške srednjih vrednosti. I: neinficirane ćelije, II: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd ili III: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd pBad_Si2. Na Y osi je predstavljen intenzitet anti-Myc bojenja [proizvolјne jedinice, a.u. od engl. arbitrary unit], dok je na x osi predstavljeno vreme infekcije u minutama (C) Kvantifikacija intenziteta anti-Myc imunofluorescentnog bojenja unutar ćelija. HeLa ćelije su bile inficirane tokom 1 sata sa Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd pBad_Si2, uz MOI naznačen na x-osi. Podaci su objedinjeni za n = 20 mesta, a naznačene greške predstavljaju standardne greške srednjih vrednosti. Na Y osi je predstavljen intenzitet anti-Myc bojenja [a.u.].

Sl.3: Modifikacije isporuke proteina zasnovane na T3SS omogućavaju jedarnu lokalizaciju YopE1-138fuzionog proteina (EGFP). EGFP signal u HeLa ćelijama inficiranim sa I: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd ili II: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd ΔyopB koje su sadržavale plazmide III: YopE1-138-EGFP ili IV: YopE1-138-EGFP-NLS uz MOI od 100. EGFP signal je prikazan pod "a", dok su u svrhu poređenja lokalizacija, obojena jedra prikazana pod "b".

Sl. 4: Modifikacije isporuke proteina zasnovane na T3SS omogućavaju uklanjanje dodatnog YopE1-138sadržaja. HeLa ćelije su inficirane sa dva različita soja Y.enterocolitica u isto vreme, što je postignuto jednostavnim mešanjem dve bakterijske suspenzije. Jedan soj je bio za isporuku TEV proteaze fuzionisane sa YopE1-138, dok je drugi soj isporučivao protein od interesa fuzionisan sa YopE1-138preko linkera koji je sadržavao dvostruko mesto cepanja za TEV proteazu. Nakon isporuke proteina u eukariotsku ćeliju, TEV proteaza iseca dodatni YopE1-138sadržaj iz proteina od interesa (A) Digitoninom lizirane HeLa ćelije koje nisu bile inficirane (II) ili nakon infekcije (MOI od 100) tokom 2 sata sa I: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd i III: pBadSi_2, IV: YopE1-138-2x mesto cepanja za TEV-Flag-INK4C, V: YopE1-138-2x mesto cepanja za TEV-Flag-INK4C, dalјe tretirane preko noći sa prečišćenom TEV proteazom i VI: YopE1-138-2x mesto cepanja za TEV-Flag-INK4C i sa drugim sojem YopE1-138-TEV, analizirane su imunoblot postupkom sa anti-INK4C (prikazano pod "a") na prisustvo YopE1-138-2x mesto cepanja za TEV-Flag-INK4C ili njegovog oblika nastalog cepanjem, Flag-INK4C. Kao kontrola za nanetu količinu proteina u imunoblot analizi, korišćeno je anti-aktinsko antitelo (prikazano pod "b"). U jednom slučaju (V) lizirane ćelije su bile inkubirane preko noći sa prečišćenom TEV proteazom. (B) Kvantifikacija intenziteta anti-INK4C bojenja iz (A), normalizovanog sa aktinom (prikazano kao [a.u.] na y osi), na visini za YopE1-138-2x mesto cepanja za TEV-Flag-INK4C pune dužine, pri čemu je rezultatu za uzorak IV dodeljena vrednost od 100%. I: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd i IV: YopE1-138-2x mesto cepanja za TEV-Flag-INK4C, V: YopE1-138-2x mesto cepanja za TEV-Flag-INK4C i dalјe tretman preko noći sa prečišćenom TEV proteazom i VI: YopE1-138-2x mesto cepanja za TEV-Flag-INK4C i drugi soj YopE1-138-TEV. Podaci su objedinjeni za n = 2 nezavisnih eksperimenata, vrednosti grešaka predstavljaju standardne greške srednjih vrednosti (C) Digitoninom lizirane HeLa ćelije koje nisu bile inficirane (II) ili nakon infekcije (MOI od 100) u trajanju od 2 sata sa I: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd i III: pBadSi_2, IV: YopE1-138-2x mesto cepanja za TEV-ET1-Myc, V: YopE1-138-2x mesto cepanja za TEV-ET1-Myc i dalјe tretman preko noći sa prečišćenom TEV proteazom i VI: YopE1-138-2x mesto cepanja za TEV-ET1-Myc i drugi soj YopE1-138-TEV, analizirani su imunoblot postupkom sa anti-Myc antitelom (prikazano pod "a") na prisustvo YopE1-138- 2x mesto cepanja za TEV - ET1-Myc ili njegovog oblika nastalog cepanjem, ET1-Myc. Kao kontrola za nanetu količinu proteina u imunoblot analizi, korišćen je aktin (prikazano pod "b"). U jednom slučaju (V), lizirane ćelije su bile inkubirane preko noći sa prečišćenom TEV proteazom.

Sl. 5: Isporuka bakterijskih efektorskih proteina u eukariotske ćelije (A) HeLa ćelije su bile inficirane sa I: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd koji je sadržavao II: pBad_Si2 ili III: YopE1-138-SopE, uz MOI od 100, a tokom vremena naznačenih iznad slika (2, 10 ili 60 minuta). Nakon fiksacije, u ćelijama je obojen aktinski citoskelet u (B) HeLa ćelijama koje su ostavljene neinficiranima (II) ili onima inficiranim sa I: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd koji je sadržavao III: YopE1-138-SopE-Myc i u pojedinim slučajevima, ćelijama istovremeno inficiranim sa IV: YopE1-138-SptP, uz MOI koji je naznačen ispod naziva soja (MOI 50; MOI50: MOI50 ili MOI50: MOI100) tokom 1 h. Nakon fiksacije, u ćelijama je obojen aktinski citoskelet (prikazano pod "a"), dok je prisustvo YopE1-138-SopE-Myc fuzionog proteina praćeno anti-Myc bojenjem (prikazano pod "b").

Sl.6: Isporuka bakterijskih efektorskih proteina u eukariotske ćelije (A) Imunoblot analiza fosfop38 ("a"), ukupnog p38 ("b") i aktina ("c") u HeLa ćelijama koje su ostavljene netretiranima (II) ili su bile inficirane tokom 75 min sa I: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd koji je sadržavao III: pBad_Si2 ili IV: YopE1-138-OspF, uz MOI od 100. Ćelije su bile stimulisane sa TNFα tokom poslednjih 30 minuta infekcije, kao što je naznačeno (+ označava dodavanje TNFα, - predstavlјa odsustvo tretmana sa TNFα) (B) Imunoblot analiza fosfo-Akt T308 ("a") i S473 ("b") i aktina ("c") u HeLa ćelijama koje su bile ostavljene netretiranima (II) ili su bile inficirane tokom 22,5 ili 45 min (naznačeno ispod blotova) sa I: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd koji je sadržavao III: pBad_Si2, IV: YopE1-138-SopE ili V: YopE1-138-SopB, uz MOI od 100 (C) nivo cAMP-a (u fmol/bunariću, prikazano na y osi) u HeLa ćelijama koje su ostavljene netretiranima (II) ili su inficirane tokom 2,5 h sa V: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd YopE1-138-BepA, VI: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd YopE1-138-BepAE305-kraj, VII: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd YopE1-138-BepGBidili VIII: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd pBad_Si2, uz MOI od 100. Toksin kolere (CT) je dodavan uzorcima tokom 1 sata kao pozitivna kontrola II (1 µg/ml), III (25 µg/ml) ili IV (50 µg/ml). Podaci su objedinjeni za n = 3 nezavisna eksperimenta, greške predstavljaju standarne greške srednjih vrednosti. Statistička analiza je urađena upotrebom neuparenog dvostranog t-testa (ns ukazuje na odsustvo značajne promene, ** označava p vrednost < 0,01, *** označava p vrednost < 0,001).

Sl. 7: Isporuka humanog tBid u eukariotske ćelije izaziva masovnu apoptozu. (A) Imunoblot analiza peptida p17 koji nastaje cepanjem Kaspaze 3 ("a") i aktina ("b") u HeLa ćelijama koje su ostavljene netretiranima (II) ili su bile inficirane tokom 60 min sa I: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd koji je sadržavao III: pBad_Si2, IV: YopE1-138-Bid ili V: YopE1-138-t-Bid, uz MOI od 100. U pojedinim slučajevima, ćelije su tretirane sa VI: 0,5 µM Staurosporinom ili VII: 1 µM Staurosporinom (B) Digitoninom lizirane HeLa ćelije koje su ostavlјene netretiranima (II) ili su inficirane tokom jednog sata sa I: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd koji je sadržavao III: pBad_Si2, IV: YopE1-138-Bid ili V: YopE1-138-t-Bid, uz MOI od 100, analizirane su imunoblot postupkom sa anti-Bid antitelom , što je omogućilo poređenje endogenih nivoa Bid (označenih sa Z) sa nivoima translociranih YopE1-138-Bid (označenih sa X) ili YopE1-138-tBid (označenih sa Y). Kao kontrola za nanetu količinu proteina u imunoblot analizi je korišćeno anti-aktinsko antitelo (prikazano pod "b"). U pojedinim slučajevima, ćelije su bile tretirane sa VI: 0,5 µM Staurosporinom ili VII: 1 µM Staurosporinom (C) HeLa ćelije su ostavljene netretiranima (I) ili su bile inficirane u toku 1h, uz MOI od 100, sa II: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd pBad_Si2, III: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd YopE1-138-Bid, IV: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd YopE1-138-tBid. U pojedinim slučajevima, ćelije su bile tretirane sa V: 0,5 µM Staurosporinom ili VI: 1 µM Staurosporinom. Nakon fiksacije, u ćelijama je obojen aktinski cistoskelet (sivo).

Sl. 8: Fosfoproteom zavisan od tBiD: HeLa ćelije su bile inficirane tokom 30 minuta sa Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd YopE1-138-t-Bid uz MOI od 100, i sa Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd pBad_Si2 kao kontrolom. (A) Grafički prikaz tBID fosfoproteoma. Proteini koji su sadržavali fosfopeptide i koji su bili značajno regulisani na način koji je zavisan od tBid (sivo) (q-vrednost <0,01), kao i poznati proteini povezani sa apopotozom (tamno sivo) predstavlјeni su u STRING mreži poznatih i predviđenih interakcija tipa protein-protein (visoke pouzdanosti, dobijena vrednost 0,7). U STRING mreži su predstavljeni samo proteini sa najmanje jednom vezom. (B) Konfokalne slike HeLa ćelija inficiranih bilo sa Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd pBad_Si2 (I) ili Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd YopE1-138-t-Bid (II), ukazale su na indukciju apoptotskog fenotipa nakon isporuke tBid. Jedra ćelija su bila obojena sa Hoechst bojom ("a"), F-aktin je bio obojen faloidinom ("b"), za tubulin je bilo upotrebljeno anti-tubulinsko antitelo ("c"), dok su mitohondrije bile obeležene sa mitotrakerom ("d)". Skala - 40 µm.

Sl. 9: Opis alata za isporuku zasnovanog na sekreciji tipa III. (A) Vektorske mape plazmida za kloniranje pBad_Si1 i pBad_Si2 koji su upotrebljavani za generisanje fuzionih konstrukata sa YopE1-138. Fuzionisanje šaperona SycE i YopE1-138je bilo pod regulacijom nativnog promotora Y.enterocolitica. Dva plazmida se razlikuju samo po prisustvu EGFP koji je inducibilan dejstvom arabinoze i prisutan samo na Bad_Si1 (B) Višestruko mesto kloniranja odmah nakon yopE1-138fragmenta na pBad_Si1 i pBad_Si2 plazmidima.

Sl. 10: Karakterizacija T3SS isporuke proteina u raznovrsne ćelijske linije. Anti-Myc imunofluorescentno bojenje Swiss 3T3 fibroblasta ("a"), Jurkat ćelija ("b") i HUVEC ćelija ("c") koje su ostavljene netretiranima (II) ili su inficirane sa Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd pBad_Si2 (I), uz MOI koji su naznačeni iznad slika (MOI 25, 50, 100, 200 i 400 za HUVEC) tokom 1 h.

Sl. 11: Isporuka bakterijskih efektorskih proteina zavisna od T3SS, u eukariotsku ćeliju.

Digitoninom lizirane HeLa ćelije nakon infekcije sa MOI od 100, tokom vremena naznačenih iznad imunoblotova (0, 5, 15, 10, 60 i 120 minuta), sa Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd ΔyopB YopE1-138SopE-Myc (I) ili sa Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd YopE1-138-SopE-Myc (II), analizirane su imunoblot postupkom upotrebom anti-Myc antitela. Veličina koja odgovara YopE1-138-SopE-Myc je obeležena sa "a", dok je veličina endogenog c-Myc proteina obeležena sa "b".

Sl. 12 i 13: Sekrecija zavisna od T3SS za razne druge proteine, u supernatant kulture ćelija.

Eksperiment in vitro sekrecije za I: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd YopE1-138fuzionisan sa proteinom koji je naznačen. Sadržaj proteina ukupnih bakterijskih lizata ("A"), kao i u istaloženim supernatantima kulture ("B"), analiziran je imunoblot postupkom, upotrebom anti-YopE antitela. Brojevi napisani na odgovarajućoj visini označavaju molekulsku težinu u kDa.

Slike 14A do N: Sojevi Y.enterocolitica i S. enterica upotrebljeni u ovoj studiji. Lista sojeva Y.enterocolitica i S. enterica upotrebljenih u ovoj studiji obezbeđuje informacije o matičnim sojevima, plazmidima i proteinima za isporuku zavisnu od T3SS, koji su kodirani na odgovarajućim plazmidima. Dodatno su obezbeđene informacije o oligonukleotidima upotrebljenim za konstruisanje odgovarajućih plazmida, okosnice plazmida i za rezistenciju na antibiotike.

Sl. 15: Isporuka mišjeg tBid, mišjeg Bid BH3 i mišjeg Bax BH3 u B16F10 ćelije izaziva masovnu apoptozu. B16F10 ćelije koje nisu bile inficirane (I) ili nakon infekcije (MOI od 50) tokom 2,5 h sa Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd i II: pBadSi_2, III: YopE1-138-mišji tBid optimizovanih kodona za Y.enterocolitica, IV: YopE1-138-mišji Bid BH3 optimizovanih kodona za Y.enterocolitica ili V: YopE1-138-mišji Bax BH3 optimizovanih kodona za Y.enterocolitica. Nakon fiksacije, u ćelijama su obojeni aktinski citoskelet i jedra (oba siva).

Sl. 16: Isporuka mišjeg tBid, mišjeg Bid BH3 i mišjeg Bax BH3 u D2A1 ćelije izaziva masovnu apoptozu. D2A1 ćelije koje nisu bile inficirane (I) ili nakon infekcije (MOI od 50) tokom 2,5 h sa Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd i II: pBadSi_2, III: YopE1-138-mišji tBid optimizovanih kodona za Y.enterocolitica, IV: YopE1-138-mišji Bid BH3 optimizovanih kodona za Y.enterocolitica ili V: YopE1-138-mišji Bax BH3 optimizovanih kodona za Y enterocolitica. Nakon fiksacije, u ćelijama su obojeni aktinski citoskelet i jedra (oba siva).

Sl. 17: Isporuka mišjeg tBid, mišjeg Bid BH3 i mišjeg Bax BH3 u HeLa ćelije izaziva masovnu apoptozu. HeLa ćelije koje nisu bile inficirane (I) ili nakon infekcije (MOI od 50) tokom 2,5 h sa Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd i II: pBadSi_2, III: YopE1-138-mišji tBid optimizovanih kodona za Y.enterocolitica, IV: YopE1-138-mišji Bid BH3 optimizovanih kodona za Y.enterocolitica ili V: YopE1-138-mišji Bax BH3 optimizovanih kodona za Y.enterocolitica. Nakon fiksacije, u ćelijama su obojeni aktinski citoskelet i jedra (oba siva).

Sl. 18: Isporuka mišjeg tBid, mišjeg Bid BH3 i mišjeg Bax BH3 u 4T1 ćelije izaziva masovnu apoptozu. 4T1 ćelije koje nisu bile inficirane (I) ili nakon infekcije (MOI od 50) tokom 2,5 h sa Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd i II: pBadSi_2, III: YopE1-138-mišji tBid optimizovanih kodona za Y.enterocolitica, IV: YopE1-138-mišji Bid BH3 optimizovanih kodona za Y.enterocolitica ili V: YopE1-138-mišji Bax BH3 optimizovanih kodona za Y.enterocolitica. Nakon fiksacije, u ćelijama su obojeni aktinski citoskelet i jedra (oba siva).

Sl. 19: Isporuka mišjeg tBid u eukariotske ćelije sa S. enterica, gajenom pod SPI-1 T3SS indukujućim uslovima, indukuje apoptozu. Imunoblot analiza p17 dobijenog cepanjem Kaspaze 3 u HeLa ćelijama koje su ostavljene netretiranima (I) ili su bile inficirane tokom 4h sa III: S. enterica aroA koja je sadržavala IV: SteA1-20-t-Bid, V: SteAFL-Bid, VI: SopE1-81-t-Bid ili VII: SopE1-105-t-Bid, uz MOI od 100. Za ovaj eksperiment su svi S. enterica aroA sojevi gajeni pod SPI-1 T3SS uslovima indukcije. U pojedinim slučajevima, ćelije su bile tretirane sa II: 1 µM Staurosporinom. Napisani brojevi označavaju molekulsku težinu u kDa, na odgovarajućoj visini.

Sl. 20: Isporuka mišjeg tBid u eukariotske ćelije sa S. enterica, gajenom pod SPI-2 T3SS indukujućim uslovima, indukuje apoptozu. Imunoblot analiza p17 dobijenog cepanjem Kaspaze 3 u HeLa ćelijama ostavljenim netretiranima (I) ili inficiranima tokom 4h sa III: S. enterica aroA koja je sadržavala IV: SteA1-20-t-Bid, V: SteAFL-Bid, VI: SopE1-81-t-Bid ili VII: SopE1-105-t-Bid, uz MOI od 100. Za ovaj eksperiment, svi S. enterica aroA sojevi su gajeni pod SPI-2 T3SS indukujućim uslovima. U pojedinim slučajevima, ćelije su tretirane sa II: 1 µM Staurosporinom. Napisani brojevi označavaju molekulsku težinu u kDa, na odgovarajućoj visini.

Sl. 21: Sekrecija koja je zavisna od T3SS-a kod S. enterica, za razne proteine ćelijskog ciklusa, u supernatant kulture ćelija. Eksperiment in vitro sekrecije S. enterica aroA bilo SteAFL(I, III, V, VII) ili SopE1-105(II, IV, VI, VIII) fuzionisanih sa proteinima navedenim na na sledeći način. I i II: Ink4a-MycHis; III i IV: Ink4c-MycHis; V i VI: Mad2-MycHis; VII i VIII: Cdk1-MycHis. Sadržaj proteina u istaloženim supernatantima kultura ćelija ("A"), kao i u ukupnim bakterijskim lizatima ("B"), analiziran je imunoblot postupkom, upotrebom anti-myc antitela. Napisani brojevi označavaju molekulsku težinu u kDa, na odgovarajućoj visini.

Sl.22: Sekcija zavisna od T3SS u supernatant kulture ćelija, za razne peptide za koje je poznato da interferiraju sa ćelijskim ciklusom. Eksperiment in vitro sekrecije I: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd pBad_Si2. II-VII: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd YopE1-138fuzionisan sa peptidima navedenim na sledeći način: II: Ink4A84-103; III: p107/RBL1657-662; IV: p21141-160D149A; V: p21145-160D149A; VI: p2117-33; VII: ciklin D2139-147. Sadržaj proteina u istaloženim supernatantima kultura ćelija ("A") i u ukupnim bakterijskim lizatima ("B") analiziran je imunoblot postupkom, upotrebom anti-YopE antitela. Napisani brojevi označavaju molekulsku težinu u kDa, na odgovarajućoj visini.

Sl. 23: Fuzija proteina isporučenog preko T3SS sa ubikvitinom omogućava uklanjanje dodatnog YopE1-138sadržaja. HeLa ćelije su bile inficirane sa sojem koji je isporučivao protein od interesa fuzionisan sa YopE1-138i dalje direktno fuzionisan sa ubikvitinom (YopE1-138-Ubi). Nakon isporuke proteina u eukariotsku ćeliju, endogene proteaze specifične za ubikvitin cepanjem odvajaju dodatni YopE1-138-Ubi sadržaj od proteina od interesa. Digitoninom lizirane HeLa ćelije koje nisu bile inficirane (I) ili nakon infekcije (MOI od 100) u trajanju od 1 sata sa II: Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd YopE1-138-Flag-INK4C-MycHis ili III: YopE1-138-Flag-Ubikvitin-INK4C-MycHis bile su analizirane imunoblot postupkom, upotrebom anti-INK4C antitela da bi se utvrdilo prisustvo IV: YopE1-138-Flag-Ubikvitin-INK4C-MycHis ili V: YopE1-138-Flag-INK4C-MycHis, oblika dobijenog isecanjem VI: INK4C-MycHis i VII: endogenog INK4C.

Sl.24: Plazmid virulencije iz Yersinia enterocolitica W227, pYV. Plazmid virulencije iz Yersinia (pYV) soja W227 od 69'673 bp, nacrtan u skali. Naznačani su T3SS efektorski proteini, mesto početka replikacije i rezistencija na arsen (kodirana genima arsC, B, R i H): I: mesto početka replikacije, II: yopO, III: yopP, IV: yopQ, V: yopT, VI: sycT, VII: yopM, VIII: yopD, IX: yopB, X: sycD, XII: yopH, XIII: sycH, XIV: sycE, XV: yopE, XVI: yadA, XVII-XVXX: arsC, B, R i H.

Sl. 25: Validacija delecije yop, analizom in vitro sekrecije. Analiza in vitro sekrecije I: Y. enterocolitica ΔyopH,O,P,E,M,T asd, II: Y. enterocolitica MRS40 wt, III: Y. enterocolitica ΔyopH,O,P,E,M, T asd p-yopE. Oznake na desnoj strani ukazuju na visinu specifičnih Yop proteina: IV: YopO, V: YopH, VI: YopM, VII: YopE.

Sl.26: Studija eskalacije doze na imunokompetentnim miševima: težina miševa. Težina miševa je određivana svakodnevno, nakon i.v. infekcije bakterijama. I: Dani, II: težina u gramima, III: Y. enterocolitica ΔyopH,O,P,E,M,T asd, IV: S. enterica ΔaroA primenjena i.v. u naznačenim količinama (10<5>, 10<6>, 10<7>, 10<8>cfu po životinji).

Sl. 27: Studija eskalacije doze na imunokompetentnim miševima: broj bakterija u krvi. Broj bakterija u krvi, u vremenima koja su naznačena, utvrđivan je za serijska razblaženja i brojanjem nastalih jedinica formiranja kolonija (CFU). I: Dani, II: CFU po ml, III: Y. enterocolitica ΔyopH,O,P,E,M,T asd, IV: S. enterica ΔaroA primenjena i.v. u naznačenim količinama (10<5>, 10<6>, 10<7>, 10<8>cfu po životinji).

Sl. 28: Studija eskalacije doze na imunokompetentnim miševima: broj bakterija u jetri. Broj bakterija u jetri, u vremenima koja su naznačena, utvrđivan je homogenizacijom organa, serijskim razblaživanjem i brojanjem nastalih jedinica za formiranje kolonija (CFU). I: Dani, II: CFU po g III: Y. enterocolitica ΔyopH,O,P,E,M,T asd, IV: S. enterica ΔaroA primenjena i.v. u naznačenim količinama (10<5>, 10<6>, 10<7>, 10<8>cfu po životinji).

Sl. 29: Studija eskalacije doze na imunokompetentnim miševima: broj bakterija u plućima. Broj bakterija u plućima, u vremenima koja su naznačena, utvrđivan je homogenizacijom organa, serijskim razblaživanjem i brojanjem nastalih jedinica za formiranje kolonija (CFU). I: Dani, II: CFU po g III: Y. enterocolitica ΔyopH,O,P,E,M,T asd, IV: S. enterica ΔaroA primenjena i.v. u naznačenim količinama (10<5>, 10<6>, 10<7>, 10<8>cfu po životinji).

Sl. 30: Studija eskalacije doze na imunokompetentnim miševima: broj bakterija u slezini. Broj bakterija u slezini, u vremenima koja su naznačena, utvrđivan je homogenizacijom organa, serijskim razblaživanjem i brojanjem nastalih jedinica za formiranje kolonija (CFU). I: Dani, II: CFU po g III: Y. enterocolitica ΔyopH,O,P,E,M,T asd, IV: S. enterica ΔaroA primenjena i.v. u naznačenim količinama (10<5>, 10<6>, 10<7>, 10<8>cfu po životinji).

Sl.31: Biodistribucija Y. enterocolitica podvrste palearctica u B16F10 mišjem alografnom modelu melanoma: skor za fizički izgled. I: Dani, II: skor, III: Y. enterocolitica MRS40 wt, IV: Y. enterocolitica ΔyopH,O,P,E,M,T. Strelicom je naznačen dan i.v. infekcije sa 2x10<5>bakterija.

Sl.32: Biodistribucija Y. enterocolitica podvrste palearctica u B16F10 mišjem alografnom modelu melanoma: skor za ponašanje. I: Dani, II: skor, III: Y. enterocolitica MRS40 wt, IV: Y. enterocolitica ΔyopH,O,P,E,M,T. Strelicom je naznačen dan i.v. infekcije sa 2x10<5>bakterija.

Sl.33: Biodistribucija Y. enterocolitica podvrste palearctica u B16F10 mišjem alografnom modelu melanoma: težine miševa. Težina miševa je određivana svakodnevno, nakon i.v. infekcije sa bakterijama. I: Dani, II: telesna težina u gramima, III: Y. enterocolitica MRS40 wt, IV: Y. enterocolitica ΔyopH,O,P,E,M,T. Strelicom je naznačen dan i.v. infekcije sa 2x10<5>bakterija.

Sl.34: Biodistribucija Y. enterocolitica podvrste palearctica u B16F10 mišjem alografnom modelu melanoma: biodistribucija Y. enterocolitica ΔyopH,O,P,E,M,T. Broj bakterija u organima, u naznačenim vremenima, određivan je homogenizacijom organa, serijskim razblaživanjem i brojanjem nastalih jedinica formiranja kolonija (CFU). I: Y. enterocolitica ΔyopH,O,P,E,M,T, II: CFU po gramu tkiva, III: 1. dan, IV: 4. dan, V: krv, VI: slezina, VII: jetra, VIII: pluća, IX'tumor. * označava miša bez vidljivog tumora.

Sl.35: Biodistribucija Y. enterocolitica podvrste palearctica u B16F10 mišjem alografnom modelu melanoma: biodistribucija Y. enterocolitica MRS40 wt Broj bakterija u organima, u naznačenim vremenima, određivan je homogenizacijom organa, serijskim razblaživanjem i brojanjem nastalih jedinica formiranja kolonija (CFU). I: Y. enterocolitica MRS40 wt, II: CFU po gramu tkiva, III: 1. dan, IV: 4. dan, V: krv, VI: slezina, VII: jetra, VIII: pluća, 1X'tumor.

Sl. 36: Biodistribucija Y. enterocolitica podvrste palearctica u 4T1 mišjem alografnom modelu kancera dojke: biodistribucija Y. enterocolitica ΔyopH,O,P,E,M,T. Broj bakterija u organima, 8. dana nakon infekcije, određivan je homogenizacijom organa, serijskim razblaživanjem i brojanjem nastalih jedinica formiranja kolonija (CFU). I: Y. enterocolitica ΔyopH,O,P,E,M,T, II: CFU po gramu tkiva, III: krv, IV: slezina, V: jetra, VI: pluća, VII: tumor.

Sl. 37: Isporuka sintetski povećanih pro-apoptotskih proteina. Isporuka pojedinačnih sintetskih proteina koji su sadržavali jedan ili tandemske ponovke BH3 domena poreklom iz pro-apoptotskih proteina t-BID ili BAX dovodi do pojačane indukcije apoptoze u 4T1 i B16F10 kancerskim ćelijama.

4T1 (I) ili B16F10 (II) ćelije su bile inficirane sa Y. enterocolitica ΔyopHOPEMT koji je kodirao na pBad-MycHisA IV: YopE1-138-prošireni domen tBID BH3, V: YopE1-138-linker-tBID BH3, VI: YopE1-138-tBID BH3, VII: YopE1-138-(tBID BH3)2, VIII: YopE1-138-tBID BH3 - BAX BH3 ili IX: YopE1-138-BAX BH3 - tBID BH3. Za svaki soj je urađena titracija bakterija koje su dodate ćelijama (MOI), određen je broj ćelija i izračunat je IC50, upotrebom nelinearne regresije. Naznačen je IC50 MOI (III).

Sl. 38: Indukcija apoptoze sintetskim pro-apoptotskim proteinima kodiranim sa pYV. Isporuka jednog ili tandemskog ponovka BID BH3 domena kodiranog na pYV dovodi do indukcije apoptoze u 4T1 i B16F10 kancerskim ćelijama.4T1 (I) ili B16F10 (II) ćelije su bile inficirane sa Y. enterocolitica ΔHOPEMT IV: pYV-YopE1-138-BH3 -Bid ili V: pYV-YopE1-138-(BH3-Bid)2ili VI: sa Y. enterocolitica ΔHOPEMT pBad-MycHisA-YopE1-138-(BH3-Bid)2tokom 3 sata. Za svaki soj je urađena titracija bakterija koje su dodate ćelijama (MOI), određen je broj ćelija i izračunat je IC50 (III), upotrebom nelinearne regresije.

Sl. 39: Kolonizacija tumora sa i.v. injeciranim Y. enterocolitica ΔyopH,O,P,E,M,T. u 4T1 mišjem alografnom modelu kancera dojke. Brojevi bakterija u tumorima su navedena u vidu jedinica formiranja kolonija (CFU) po gramu tkiva (III). Broj bakterija je određivan u tumorima 8. dana (I) i 14. dana (II) nakon infekcije. Svaka tačka predstavlja pojedinačnog miša. Horizontalna isprekidana linija označava granicu detekcije.

1

Sl.40: Biodistribucija i.v. injecirane Y. enterocolitica ΔyopH,O,P,E,M,T. u 4T1 mišjem alografnom modelu kancera dojke. Brojevi bakterija u krvi (I), slezini (II), jetri (III), plućima (IV) i tumoru (V) su navedeni u vidu jedinica formiranja kolonija (CFU) po gramu tkiva ili po ml krvi (VI). Broj bakterija je određivan u tumorima 14. dana nakon infekcije. Svaka tačka predstavlja pojedinačnog miša. Horizontalna isprekidana linija označava granicu detekcije. * označava miša sa velikim metastazama pronađenim na plućima.

Sl. 41: Odlaganje progresije tumora kod Balb/C miševa divljeg tipa sa s.c. alograftom 4T1 ćelija kancera dojke. Balb/C miševima divljeg tipa sa s.c. alograftom 4T1 ćelija kancera dojke i.v. putem je injeciran I: PBS ili II: 1<∗>10<7>Y. enterocolitica dHOPEMT pYV-YopE1-138(BH3-Bid)2, kada je tumor dostigao veličinu od 150-250 mm3. Dan i.v. injeciranja bakterija je definisan kao Dan 0. Zapremina tumora je merena tokom sledećih dana (III; od 0. do 9. dana nakon i.v. injeciranja bakterija), upotrebom kalipera. Relativna zapremina tumora, normalizovana u odnosu na zapreminu tumora 0. dana, navedena je (IV) u mm<3>. Srednja vrednost je označena simbolima, dok grešake prikazuju standardnu grešku srednje vrednosti. Statistička značajnost je procenjivana dvofaktorskom ANOVA, * označava p vrednost <0,05, ** p vrednost <0,005.

Sl. 42: Progresija tumora u Balb/C miševima divljeg tipa sa s.c. alograftom 4T1 ćelija kancera dojke. Balb/C miševima divljeg tipa sa s.c. alograftom 4T1 ćelija kancera dojke je i.v. putem injeciran I: PBS ili II: 1<∗>10<7>Y. enterocolitica dHOPEMT, kada je tumor dostigao veličinu od 150-250 mm3. Dan i.v. injeciranja bakterija je definisan kao Dan 0. Zapremina tumora je merena tokom sledećih dana (III; od 0. do 9. dana nakon i.v. injeciranja bakterija), upotrebom kalipera. Relativna zapremina tumora, normalizovana u odnosu na zapreminu tumora 0. dana, navedena je (IV) u mm<3>. Srednja vrednost je označena simbolima, dok grešake prikazuju standardnu grešku srednje vrednosti.

Detaljan opis pronalaska

[0010] Predmetni pronalazak se odnosi na rekombinantne Gram-negativne bakterijske sojeve oslabljene virulencije za upotrebu u postupku lečenja malignog solidnog tumora kod subjekta.

[0011] U svrhu tumačenja ove specifikacije, primenjivaće se definicije koje slede, a kada je to prikladno, termini upotrebljeni u jednini će obuhvatati i množinu pojmova, i obrnuto. Podrazumeva se takođe da je predviđeno da svrha terminologije koja je ovde upotrebljena, bude samo opisivanje određenih primera izvođenja i da nije predviđeno da bude ograničavajuća.

[0012] Izraz "Gram-negativan bakterijski soj", kako se ovde upotrebljava, obuhvata sledeće bakterije: Aeromonas salmonicida, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii, Anaeromyxobacter dehalogenans, Bordetella bronchiseptica, Bordetella parapertussis, Bordetella pertussis, Bradyrhizobium japonicum, Burkholderia cenocepacia, Burkholderia cepacia, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Chlamydia muridarum, Chlamydia trachmoatis, Chlamydophila abortus, Chlamydophila pneumoniae, Chromobacterium violaceum, Citrobacter rodentium, Desulfovibrio vulgaris, Edwardsiella tarda, Endozoicomonas elysicola, Erwinia amylovora, Escherichia albertii, Escherichia coli, Lawsonia intracellularis, Mesorhizobium loti, Myxococcus xanthus, Pantoea agglomerans, Photobacterium damselae, Photorhabdus luminescens, Photorabdus temperate, Pseudoalteromonas spongiae, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas plecoglossicida, Pseudomonas syringae, Ralstonia solanacearum, Rhizobium sp, Salmonella enterica i druge Salmonella sp, Shigellaflexneri i druge Shigella sp, Sodalis glossinidius, Vibrio alginolyticus, Vibrio azureus, Vibrio campellii, Vibrio caribbenthicus, Vibrio harvey, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio tasmaniensis, Vibrio tubiashii, Xanthomonas axonopodis, Xanthomonas campestris, Xanthomonas oryzae, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis. Poželјni Gram-negativni bakterijski sojevi pronalaska su Gram-negativni bakterijski sojevi koje čine familiju Enterobacteriaceae i Pseudomonadaceae. Gram-negativan bakterijski soj predmetnog pronalaska se normalno upotrebljava za isporuku heterolognih proteina sa bakterijskim T3SS u eukariotske ćelije in vitro i/ili in vivo, a poželjno in vivo.

[0013] Termin "rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije koji je genetički transformisan sa vektorom. Koristan vektor predmetnog pronalaska je npr. ekspresioni vektor, vektor za inserciju u hromozom ili plazmid virulencije ili DNK ili RNK fragment za inserciju u ili modifikaciju hromozom ili plazmid virulencije. Virulencija takvog rekombinantnog Gram negativnog bakterijskog soja je obično oslabljena delecijom bakterijskih efektorskih proteina sa virulentnom aktivnošću, a koji se prenose sa jednim ili sa više bakterijskih proteina koji su deo mašinerije sistema za sekreciju. Takvi efektorski proteini se isporučuju mašinerijom sistema za sekreciju u ćelije domaćine, gde ispoljavaju svoju virulentnu aktivnost delovanjem na razne proteine i ćelijske mašinerije domaćina. Poznati su mnogi različiti efektorski proteini koji se prenose raznim tipovima sistema sekrecije i koji ispoljavaju veliki repertoar biohemijskih aktivnosti kojima se modulišu funkcije regulatornih molekula domaćina. Virulencija rekombinantnog Gram-negativnog bakterijskog soja koji se ovde upotrebljava, može biti dodatno oslabljena nedostatkom siderofora koji se normalno ili povremeno proizvodi od strane Gram-negativnog bakterijskog soja, tako da soj ne proizvodi siderofor, npr. deficijentan je u proizvodnji siderofora. Prema tome, u poželjnom primeru izvođenja, u postupcima pronalaska se upotrebljava rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije kome nedostaje siderofor koji se normalno ili povremeno proizvodi od strane Gramnegativnog bakterijskog soja, tako da soj ne proizvodi siderofor, npr. deficijentan je u proizvodnji siderofora, a još je više poželjno da se u postupcima pronalaska upotrebljava Yersinia soj, posebno Y. enterocolitica MRS40 AyopH,O,P,E,M,T kome nedostaje siderofor koji se normalno ili povremeno proizvodi od strane Gram-negativnog bakterijskog soja, tako da soj ne proizvodi siderofor, npr. deficijentan je u proizvodnji siderofora. Rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije upotrebljen u postupcima pronalaska poželjno ne proizvodi najmanje jedan, poželjnije najmanje dva siderofora, npr. deficijentan je u proizvodnji najmanje jednog, poželjno najmanje dva siderofora, a još je poželjnije da rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije upotrebljen u postupcima pronalaska ne proizvodi nikakav siderofor.

[0014] Termini "siderofor", "siderofor gvožđa" ili "helator gvožđa" koji se ovde upotrebljavaju naizmenično, odnose se na jedinjenja sa visokim afinitetom za gvožđe, npr. na mala jedinjenja sa visokim afinitetom za gvožđe.

Siderofori Gram negativnih bakterija su npr. Enterobaktin i dihidroksibenzoilserin koje sintetišu Salmonella, Escherichia, Klebsiella, Shigella, Serratia (ali koje upotrebljavaju sve enterobakterije), Pioverdini koje sintetiše Pseudomonas, Vibriobaktin koga sintetiše Vibrio, Acinetobaktin i Acinetoferin koje sintetiše Acinetobacter, Jersinijabaktin i Aerobaktin koje sintetiše Yersinia, Ornibaktin koga sintetiše Burkholderia, Salmohelin koga sintetiše Salmonela, Aerobaktin koga sintetišu Escherichia, Shigella, Salmonella i Yersinia, Alkaligin koga sintetiše Bordetella, Bisukaberin koga sintetiše Vibrio.

Siderofori uključuju hidroksamat, kateholat i mešovite ligandne siderofore. Do danas je nekoliko siderofora odobreno za upotrebu kod ljudi, uglavnom sa ciljem lečenja preopterećenosti gvožđem. Poželjni siderofori su Deferoksamin (poznat i kao desferioksamin B, desferoksamin B, DFO-B, DFOA, DFB ili desferal), Desferioksamin E, Deferaziroks (Eksjade, Desiroks, Defrijet, Dezifer) i Deferipron (Feriproks).

[0015] Termini "Gram-negativan bakterijski soj sa deficijencijom da proizvede aminokiselinu koja je esencijalna za rast" i "auksotrofni mutant" upotreblјavaju se ovde naizmenično i odnose se na Gramnegativne bakterijske sojeve koji ne mogu da rastu u odsustvu egzogeno obezbeđene najmanje jedne esencijalne aminokiseline ili njenog prekursora. Aminokiselina čija je proizvodnja u soju deficijentna su, npr. aspartat, mezo-2,6-diaminopimelinska kiselina, aromatične aminokiseline ili leucin-arginin [1]. Takav soj može biti generisan npr. delecijom gena za aspartat-beta-semialdehid dehidrogenazu (Δasd). Ovakav auksotrofni mutant takođe ne može rasti u odsustvu egzogene mezo-2,6-diaminopimelinske kiseline [2]. Mutacija, npr. delecija gena za aspartat-beta-semialdehid dehidrogenazu je ovde poželјna za Gram-negativan bakterijski soj predmetnog pronalaska koji je sa deficijencijom da proizvede aminokiselinu koja je esencijalna za rast.

[0016] Termin "Gram-negativan bakterijski soj sa deficijencijom da proizvede adhezione proteine koji se vezuju za površinu eukariotske ćelije ili vanćelijski matriks" odnosi se na mutirane Gram-negativne bakterijske sojeve koji ne eksprimiraju najmanje jedan adhezioni protein u poređenju sa adhezionim proteinima eksprimiranim od strane odgovarajućeg soja divljeg tipa. Adhezioni proteini mogu obuhvatati npr. produžene polimerne adhezione molekule poput adhezina pila/fimbrija ili nefimbrijskih adhezina. Fimbrijski adhezini obuhvataju adhezine pila tipa 1 (kao što su FimH adhezin iz Fim-pila E. coli), P-pila (poput PapG adhezina iz Pap-pila E. coli), pila tipa 4 (poput proteina pilina iz npr. P. aeruginosa) ili tankih agregativnih fimbrija (engl. curli; Csg proteini sa CsgA adhezinom iz S. enterica). Nefimbrijske adhezije obuhvataju trimerne autotransporterske adhezine kao što su YadA iz Y.enterocolitica, BpaA (B. pseudomallei), Hia (H. influenzae), BadA (B. henselae), NadA (N. meningitidis) ili UspA1 (M. catarrhalis), kao i druge autotransporterske adhezine poput AIDA-1 (E. coli) i ostale adhezine/invazine poput InvA iz Y.enterocolitica ili Intimina (E. coli) ili članove Dr-familije ili Afa-familije (E. coli). Termini YadA i InvA, kako se ovde upotrebljavaju, odnose se na proteine iz Y.enterocolitica. Autotransporter YadA [3] se vezuje za različite oblike kolagena, kao i za fibronektin, dok se invazin InvA [4] vezuje za β-integrine u membrani eukariotskih ćelija. Ukoliko je Gram-negativan bakterijski soj Y.enterocolitica soj, poželjno je da je soj deficijentan u InvA i/ili YadA.

[0017] Kao što se ovde upotrebljava, termin "familija Enterobacteriaceae" obuhvata familiju Gramnegativnih, štapićastih, fakultativno anaerobnih bakterija koje se mogu naći u zemlјištu, vodi, bilјkama i životinjama, a koje se često javlјaju i kao patogeni kod kičmenjaka. Bakterije ove familije su sa sličnom fiziologijom i karakterišu ih evolutivno očuvani regioni unutar funkcionalnih elemenata i gena odgovarajućih genoma. Osim što su i negativni na oksidaze, svi članovi ove familije fermentišu glukozu, a većina njih i redukuje nitrate.

Bakterije familije Enterobacteriaceae pronalaska mogu biti bilo koje od bakterija iz ove familije, a posebno obuhvataju, ali nisu ograničene na, bakterije sledećih rodova: Escherichia, Shigella, Edwardsiella, Salmonella, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Proteus, Erwinia, Morganella, Providencia ili Yersinia. U specifičnijim primerima izvođenja, bakterija je vrste Escherichia coli, Escherichia blattae, Escherichia fergusonii, Escherichia hermanii, Escherichia vuneris, Salmonella

1

enterica, Salmonella bongori, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella sonnei, Enterobacter aerogenes, Enterobacter gergoviae, Enterobacter sakazakii, Enterobacter cloacae, Enterobacter agglomerans, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Serratia marcescens, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica, Erwinia amylovora, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Proteus penneri, Proteus hauseri, Providencia alcalifaciens ili Morganella morganii. Poželjno je da je Gram-negativan bakterijski soj izabran iz grupe koja se sastoji od rodova Yersinia, Escherichia, Salmonella, Shigella, Pseudomonas, Chlamydia, Erwinia, Pantoea, Vibrio, Burkholderia, Ralstonia, Xanthomonas, Chromobacterium, Sodalis, Citrobacter, Edwardsiella, Rhizobiae, Aeromonas, Photorhabdus, Bordetella i Desulfovibrio, još poželјnije da je iz grupe koja se sastoji od rodova Yersinia, Escherichia, Salmonella i Pseudomonas, a najpoželјnije iz grupe koja se sastoji od rodova Yersinia i Salmonella.

[0018] Termin "Yersinia", kako se ovde upotrebljava, obuhvata sve vrste roda Yersinia, uklјučujući Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis i Yersinia pestis. Poželjna je Yersinia enterocolitica.

[0019] Termin "Salmonella", kako se ovde upotrebljava, obuhvata sve vrste roda Salmonella, uklјučujući Salmonella enterica i S. bongori. Poželjna je Salmonella enterica.

[0020] "Promotor", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na sekvencu nukleinske kiseline koja reguliše ekspresiju transkripcione jedinice. "Promotorski region" je regulatorni region koji je u ćeliji u stanju da vezuje RNK polimerazu i započne transkripciju nizvodne (3' smer) kodirajuće sekvence. Unutar promotorskog regiona se nalazi mesto otpočinjanja transkripcije (konvencionalno definisano mapiranjem sa nukleazom S1), kao i domeni za vezivanje proteina (konsenzusne sekvence) koje su odgovorne za vezivanje RNA polimeraze, kao što su to putativni -35 region i Pribnow box sekvenca. Izraz "operativno povezan", kada opisuje odnos između dva regiona DNK, jednostavno označava da su oni funcionalno povezani jedan sa drugim i da su locirani na istom fragment nukleinske kiseline. Promotor je operativno povezan sa strukturnim genom ukoliko on kontroliše transkripciju gena i nalazi se na istom fragmentu nukleinske kiseline kao i sam gen. Obično je promotor funkcionalan u navedenom Gram-negativnom bakterijskom soju, tj. promotor je u stanju da eksprimira fuzioni protein predmetnog pronalaska, tj. promotor je u stanju da eksprimira fuzioni protein predmetnog pronalaska bez dodatne potrebe za genetičkim inženjeringom ili ekspresijom dodatnih proteina. Štaviše, funkcionalan promotor ne sme prirodno biti suprotno regulisan sa bakterijskim T3SS.

[0021] Termin "isporuka" koji se ovde upotrebljava, odnosi se na transport proteina iz rekombinantnog Gram-negativnog bakterijskog soja oslabljene virulencije u eukariotsku ćeliju, uklјučujući korake ekspresije heterolognog proteina u rekombinantnom Gram-negativnom bakterijskom soju oslabljene virulencije, sekreciju eksprimiranog proteina/eksprimiranih proteina iz takvog rekombinantnog Gram-negativnog bakterijskog soja oslabljene virulencije i translokaciju sekretovanog proteina/sekretovanih proteina iz takvog rekombinantnog Gram-negativnog bakterijskog soja oslabljene virulencije u citosol eukariotske ćelije. Shodno navedenom, termini „signal za isporuku“ ili „signal sekrecije“, koji se ovde upotrebljavaju naizmenično, odnose se na polipeptidnu sekvencu koja može biti prepoznata sistemom za sekreciju i translokaciju Gram-negativnog bakterijskog soja i koja može usmeriti isporuku proteina iz Gram-negativnog bakterijskog soja u eukariotske ćelije.

[0022] Termin "signal za isporuku iz bakterijskog efektorskog proteina" koji se ovde upotrebljava, odnosi se na signal za isporuku iz bakterijskog efektorskog proteina koji je funkcionalan u rekombinantnom Gram-negativnom bakterijskom soju, tj. koji omogućava da heterologni protein eksprimiran u rekombinantnom Gram-negativnom bakterijskom soju bude izlučen iz takvog rekombinantnog Gram-negativnog bakterijskog soja putem sistema sekrecije, kao što je to npr. sistem sekrecije tipa III, ili da bude translociran takvim rekombinantnim Gram-negativnim bakterijskim sojem u citosol eukariotske ćelije putem sistema sekrecije kao što je npr. sistem sekrecije tipa III. Termin "signal za isporuku iz bakterijskog efektorskog proteina" koji se ovde upotrebljava, takođe obuhvata fragment signala za isporuku iz bakterijskog efektorskog proteina, tj. kraću veziju signala za isporuku, npr. signal za isporuku koji se sastoji od do 10, poželjno do 20, još poželjnije do 50, još više poželjno do 100, a posebno poželjno do 140 aminokiselina iz signala za isporuku, npr. signala za isporuku koji se javlja u prirodi. Tako, nukleotidna sekvenca kao što je npr. sekvenca DNK koja kodira signal za isporuku iz bakterijskog efektorskog proteina, može kodirati signal za isporuku pune dužine ili njegov fragment, pri čemu fragment obično sadrži do 30, poželjno do 60, još poželjnije do 150, još više poželjno do 300 i posebno poželjno do 420 nukleinskih kiselina.

[0023] Kao što se ovde upotrebljava, “sekrecija/izlučivanje" proteina se odnosi na prenos heterolognog proteina ka spolja, preko ćelijske membrane rekombinantnog Gram-negativnog bakterijskog soja oslabljene virulencije. "Translokacija" proteina se odnosi na transport heterolognog proteina iz rekombinantnog Gram-negativnog bakterijskog soja oslabljene virulencije preko plazma membrane eukariotske ćelije, u citosol takve eukariotske ćelije.

[0024] Termin „bakterijski protein, koji je deo mašinerije sistema za sekreciju“, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na bakterijske proteine koji čine osnovne komponente bakterijskog sistema sekrecije tipa 3 (T3SS), sistema sekrecije tipa 4 (T4SS) i sistema sekrecije tipa 6 (T6SS), poželjno T3SS. Bez ovakvih proteina, odgovarajući sistem sekrecije nije funkcionalan u translokaciji proteina u ćelije domaćina, čak i ukoliko su sve ostale komponente sistema sekrecije i bakterijski efektorski protein koji je potrebno translocirati i dalje kodirani i proizvedeni.

[0025] Termin "bakterijski efektorski protein", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na bakterijske proteine koji se transportuju sistemima za sekreciju, npr. bakterijskim proteinima, koji su deo mašinerije sistema za sekreciju u ćelije domaćine. Takvi efektorski proteini se sistemom za sekreciju dopremaju u ćeliju domaćina gde ispoljavaju npr. virulentnu aktivnost dejstvom na razne proteine i ćelijske mašinerije domaćina. Poznati su mnogi različiti efektorski proteini koji se prenose raznim tipovima sistema sekrecije i ispoljavaju veliki repertoar biohemijskih aktivnosti koje modulišu funkcije regulatornih molekula domaćina. Sistem sekrecije uključuje sistem sekrecije tipa 3 (T3SS), sistem sekrecije tipa 4 (T4SS) i sistem sekrecije tipa 6 (T6SS). Pojedini efektorski proteini (kao IpaC iz Shigella flexneri) takođe spadaju u klasu bakterijskih proteina, koji su deo mašinerije sistema za sekreciju i omogućavaju translokaciju proteina. Rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije koji se ovde upotrebljava obično sadrži bakterijske proteine koji čine osnovne komponente bakterijskog sistema sekrecije tipa 3 (T3SS), sistema sekrecije tipa 4 (T4SS) i/ili sistema sekrecije tipa 6 (T6SS), poželjno sistema za sekreciju tipa 3 (T3SS).

[0026] Termin "T6SS efektorski protein" ili "bakterijski T6SS efektorski protein", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na proteine koji se prirodno injeciraju T6S sistemima u citosol eukariotskih ćelija ili bakterija i na proteine koji se prirodno izlučuju T6S sistemima i koji mogu, npr. obrazovati pore za translokaciju u eukariotskoj membrani. Termin "T4SS efektorski protein" ili "bakterijski T4SS efektorski protein", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na proteine koji se prirodno injeciraju T4S

1

sistemima u citosol eukariotskih ćelija i na proteine koji se prirodno izlučuju T4S sistemima i koji mogu, npr. obrazovati pore za translokaciju u eukariotskoj membrani.

Termin "T3SS efektorski protein" ili "bakterijski T3SS efektorski protein", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na proteine koji se prirodno injeciraju T3S sistemima u citosol eukariotskih ćelija, kao i na proteine koji se prirodno izlučuju T3S sistemima i koji mogu npr. obrazovati pore za translokaciju u eukariotskoj membrani (uklјučujući translokatore koji obrazuju pore (kao što su YopB i YopD iz Yersinia) i proteine vrha poput LcrV iz Yersinia). Poželјno se upotrebljavaju proteini koji se prirodno injeciraju T3S sistemima u citosol eukariotskih ćelija. Ovakvi faktori virulencije će paralizovati ili reprogramirati eukariotsku ćeliju u korist patogena. T3S efektore karakteriše veliki repertoar biohemijskih aktivnosti i oni modulišu funkciju klјučnih regulatornih molekula domaćina [5, 6], a obuhvataju AvrA, AvrB, AvrBs2, AvrBS3, AvrBsT, AvrD, AvrD1, AvrPphB, AvrPphC, AvrPphEPto, AvrPpiBPto, AvrPto, AvrPtoB, AvrRpm1, AvrRpt2, AvrXv3, CigR, EspF, EspG, EspH, EspZ, ExoS, ExoT, GogB, GtgA, GtgE, GALA familiju proteina, HopAB2, HopAO1, HopI1, HopM1, HopN1, HopPtoD2, HopPtoE, HopPtoF, HopPtoN, HopU1, HsvB, IcsB, IpaA, IpaB, IpaC, IpaH, IpaH7.8, IpaH9.8, IpgB1, IpgB2, IpgD, LcrV, Map, OspC1, OspE2, OspF, OspG, Ospl, PipB, PipB2, PopB, PopP2, PthXo1, PthXo6, PthXo7, SifA, SifB, SipA/SspA, SipB, SipC/SspC, SipD/SspD, S1rP, SopA, SopB/SigD, SopD, SopE, SopE2, SpiC/SsaB, SptP, SpvB, SpvC, SrfH, SrfJ, Sse, SseB, SseC, SseD, SseF, SseG, SseI/SrfH, SseJ, SseK1, SseK2, SseK3, SseL, SspH1, SspH2, SteA, SteB, SteC, SteD, SteE, TccP2, Tir, VirA, VirPphA, VopF, XopD, YopB, YopD YopE, YopH, YopJ, YopM, YopO, YopP, YopT, YpkA.

[0027] Izrazi "rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije koji se nakuplja u malignom solidnom tumoru" ili "rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije se nakuplja u malignom solidnom tumoru", kako se ovde upotrebljavaju, odnose se na rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije koji se umožava unutar malignog solidnog tumora, povećavajući time broj bakterija ovog rekombinantanog Gram-negativanog bakterijskog soja oslabljene virulencije unutar malignog solidnog tumora. Iznenađujuće, pronađeno je da se rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije nakon primene subjektu specifično nakuplja u malignom solidnom tumoru, tj. da se specifično nakuplja u organu u kome je prisutan maligni tumor, pri čemu je broj bakterija rekombinantanog Gram-negativanog bakterijskog soja oslabljene virulencije u organima u kojima nije prisutan maligni solidan tumor nizak ili se ne može detektovati.

U slučaju bakterija koje borave vanćelijski, poput Yersinia, bakterije se uglavnom nakupljaju u međućelijskom prostoru obrazovanom između tumorskih ćelija. Bakterije koje rastu unutarćelijksi, kao što to čini Salmonella, uglavnom će napadati tumorske ćelije i boraviti unutar takvih ćelija, mada se može javljati i vanćelijska nakupljanja. Brojevi bakterija rekombinantanog Gram-negativanog bakterijskog soja oslabljene virulencije nakupljenog unutar malignog solidnog tumora mogu biti npr. opsega od 10<4>do 10<9>bakterija po gramu tumorskog tkiva.

[0028] Termin "maligni solidan tumor" ili "indikacija malignog solidnog tumora", koji se ovde upotrebljava, odnosi se na abnormalnu masu tkiva koja obično ne sadrži ciste ili tečna područja. Solidni tumori mogu biti benigni (nisu kancer) ili maligni (predstavljaju kancer). Maligni solidni tumori se leče postupcima predmetnog pronalaska. Različiti tipovi malignih solidnih tumora su imenovani prema tipu ćelija koji ih obrazuje. Primeri malignih solidnih tumora su sarkomi, karcinomi i limfomi. Leukemije (kanceri krvi) uglavnom ne obrazuju maligne solidne tumore (definicija prema Nacionalnom institutu

1

za kancer NIH). Maligni solidni tumori obuhvataju, ali nisu ograničeni na, abnormalnu masu ćelija koja može proisteći iz različitih tipova tkiva kao što su jetra, debelo crevo, kolorektum, koža, dojka, pankreas, grlić materice, telo materice, bešika, žučna kesa, bubreg, grkljan, usna, usna šupljina, jednjak, jajnik, prostata, želudac, testis, štitna žlezda ili pluća i stoga obuhvataju maligne solidne tumore jetre, debelog creva, kolorektuma, kože, dojke, pankreasa, grlića materice, tela materice, bešike, žučne kese, bubrega, grkljana, usne, usne duplje, jednjaka, jajnika, prostate, želuca, testisa, štitne žlezde ili pluća. Poželjni maligni solidni tumori koji mogu biti lečeni postupcima predmetnog pronalaska su maligni solidni tumori koji potiču iz kože, dojke, jetre, pankreasa, bešike, prostate i debelog creva i na taj način obuhvataju maligne solidne tumore kože, dojke, jetre, pankreasa, bešike, prostate i debelog creva. Jednako poželjni maligni solidni tumori koji mogu biti lečeni postupcima predmetnog pronalaska su maligni solidni tumori povezani sa kancerom jetre, kao što je hepatocelularni karcinom.

[0029] Termin "bakterijski efektorski protein koji je virulentan za eukariotske ćelije", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na bakterijske efektorske proteine, koji se sistemima sekrecije prenose u ćelije domaćine, gde ispoljavaju svoju virulentnu aktivnost dejstvom na razne proteine i ćelijske mehanizme domaćina. Poznati su mnogi različiti efektorski proteini koji se prenose raznim tipovima sistema sekrecije i koje karakteriše veliki repertoar biohemijskih aktivnosti koje modulišu funkcije regulatornih molekula domaćina. Sistemi sekrecije obuhvataju sistem sekrecije tipa 3 (T3SS), sistem sekrecije tipa 4 (T4SS) i sistem sekrecije tipa 6 (T6SS). Važno je napomenuti da pojedini efektorski proteini virulentni za eukariotske ćelije (kao IpaC iz Shigellaflexneri) takođe pripadaju klasi bakterijskih proteina, koji su deo mašinerije sistema za sekreciju. U slučaju da je bakterijski efektorski protein koji je virulentan za eukariotske ćelije podjednako važan za funkcionisanje mašinerije sistema za sekreciju, takav protein je isključen iz ove definicije. T3SS efektorski proteini koji su virulentni za eukariotske ćelije, odnose se na proteine poput YopE, YopH, YopJ, YopM, YopO, YopP, YopT iz Y. enterocolitica ili OspF, IpgD, IpgB1 iz Shigella flexneri ili SopE, SopB, SptP iz Salmonella enterica ili ExoS, ExoT, ExoU, ExoY iz P. aeruginosa ili Tir, Map, EspF, EspG, EspH, EspZ iz E. coli. T4SS efektorski proteini koji su virulentni za eukariotske ćelije, odnose se na proteine kao što su to a LidA, SidC, SidG, SidH, SdhA, SidJ, SdjA, SdeA, SdeA, SdeC, LepA, LepB, WipA, WipB, YlfA, YlfB, VipA, VipF, VipD, VpdA, VpdB, DrrA, LegL3, LegL5, LegL7, LegLC4, LegLC8, LegC5, LegG2, Ceg10, Ceg23, Ceg29 iz Legionella pneumophila ili BepA, BepB, BepC, BepD, BepE, BepF BepG iz Bartonella henselae ili VirD2, VirE2, VirE3, VirF iz Agrobacterium tumefaciens ili CagA iz H. pylori ili toksin pertusisa iz Bordetella pertussis. Efektorski proteini T6SS koji su virulentni za eukariotske ćelije se odnose na proteine kao što su to VgrG proteini iz Vibrio cholerae (poput VgrG1).

[0030] Izraz "T3SS efektorski protein koji je virulentan za eukariotske ćelije" ili "bakterijski T3SS efektorski protein koji je virulentan za eukariotske ćelije", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na proteine koji se prirodno injeciraju T3S sistemima u citosol eukariotskih ćelija i na proteine koji su prirodno izlučuju T3S sistemima koji mogu, npr. obrazovati pore za translokaciju u eukariotskoj membrani, a koji predstavljaju faktore virulencije za eukariotske ćelije, tj. na proteine koji parališu ili reprogramiraju eukariotsku ćeliju u korist patogena. Efektori ispoljavaju veliki repertoar biohemijskih aktivnosti i modulišu funkciju ključnih regulatornih mehanizama domaćina kao što su npr. fagocitoza i aktinski citoskelet, inflamatorna signalizacija, apoptoza, endocitoza ili sekretorni putevi [5,6], a obuhvataju AvrA, AvrB, AvrBs2, AvrBS3, AvrBsT, AvrD, AvrD1, AvrPphB, AvrPphC, AvrPphEPto, AvrPpiBPto, AvrPto, AvrPtoB, AvrRpm1, AvrRpt2, AvrXv3, CigR, EspF, EspG, EspH, EspZ, ExoS, ExoT, GogB, GtgA, GtgE, GALA family of proteins, HopAB2, HopAO1, HopI1, HopM1, HopN1, HopPtoD2, HopPtoE, HopPtoF, HopPtoN, HopU1, HsvB, IcsB, IpaA, IpaH, IpaH7.8, IpaH9.8, IpgB1, IpgB2, IpgD,

1

LcrV, Map, OspC1, OspE2, OspF, OspG, OspI, PipB, PipB2, PopB, PopP2, PthXo1, PthXo6, PthXo7, SifA, SifB, SipA/SspA,, S1rP, SopA, SopB/SigD, SopD, SopE, SopE2, SpiC/SsaB, SptP, SpvB, SpvC, SrfH, SrfJ, Sse, SseB, SseC, SseD, SseF, SseG, SseI/SrfH, SseJ, SseK1, SseK2, SseK3, SseL, SspH1, SspH2, SteA, SteB, SteC, SteD, SteE, TccP2, Tir, VirA, VirPphA, VopF, XopD, YopE, YopH, YopJ, YopM, YopO, YopP, YopT, YpkA.

[0031] T3SS efektorski geni iz Yersinia koji su virulentni za eukariotsku ćeliju i mogu biti deletirani/mutirani, iz npr. Y.enterocolitica, su YopE, YopH, YopM, YopO, YopP (takođe označen kao YopJ) i YopT [7]. Odgovarajući efektorski geni koji su virulentni za eukariotsku ćeliju mogu biti deletirani/mutirani iz Shigella flexneri (npr. OspF, IpgD, IpgB1), Salmonella enterica (npr. SopE, SopB, SptP), P. aeruginosa (npr. ExoS, ExoT, ExoU, ExoY) ili E. coli (npr. Tir, Map, EspF, EspG, EspH, EspZ). Sekvence nukleinskih kiselina ovih gena su dostupne stručnjacima iz oblasti tehnike, npr. u Genebank bazi podataka (yopH, yopO, yopE, yopP, yopM, yopT iz NC_002120 GI:10955536; efektorski proteini S. flexneri iz AF386526.1 GI:18462515; efektori S. enterica iz NC_016810.1 GI:378697983 ili FQ312003.1 GI:301156631; efektori P. aeruginosa iz AE004091.2 GI:110227054 ili CP000438.1 GI:115583796 i efektorski proteini E. coli iz NC_011601.1 GI:215485161).

[0032] U svrhu predmetnog pronalaska, geni su označeni malim slovima i kurzivom, da bi se razlikovali od proteina. U slučaju da geni (označeni malim slovima i kurzivom) prate naziv bakterijske vrste (npr. E. coli), oni se odnose na mutaciju odgovarajućeg gena u odgovarajućim bakterijskim vrstama. Na primer, YopE se odnosi na efektorski protein kodiran yopE genom. Y.enterocolitica yopE predstavlјa Y.enterocolitica soj sa mutacijom u yopE genu.

[0033] Kao što se ovde upotrebljava, termini "polipeptid", "peptid", "protein", "polipeptidni" i "peptidni" se upotrebljavaju naizmenično, za označavanje serija aminokiselinskih ostataka koji su povezani jedni sa drugima peptidnim vezama, između alfa-amino i karboksilnih grupa susednih ostataka. Poželјni su proteini čija aminokiselinska sekvenca sadrži najmanje 10 aminokiselina, poželјnije najmanje 20 aminokiselina.

[0034] Prema predmetnom pronalasku, "heterologni protein" uključuje proteine koji se javljaju u prirodi ili njihove delove, a uključuje i veštački konstruisane proteine ili njihove delove. Kao što se ovde upotrebljava, termin "heterologni protein" se odnosi na protein ili na njegov deo koji je drugačiji od T3SS efektorskog proteina ili njegovog fragmenta sa N-kraja sa kojim može biti fuzionisan. Preciznije, heterologni protein, kako se ovde upotrebljava, se odnosi na protein ili njegov deo koji ne pripada proteomu, tj. celokupnom komplementu prirodnih proteina specifičnog rekombinantnog Gramnegativnog bakterijskog soja oslabljene virulencije koji je obezbeđen i upotrebljava se u predmetnom pronalasku, npr. to je protein koji ne pripada proteomu, tj. celokupnom komplementu prirodnih proteina specifičnog bakterijskog soja iz rodova Yersinia, Escherichia, Salmonella ili Pseudomonas. Obično je heterologni protein životinjskog porekla, uključujući humano poreklo. Poželjno je i da je heterologni protein humani protein. Poželjnije je da je heterologni protein izabran iz grupe koja se sastoji od proteina uključenih u apoptozu ili regulaciju apoptoze, od regulatora ćelijskog ciklusa, proteina sa ankirinskim ponovcima, proteina ćelijske signalizacije, reporterskih proteina, transkripcionih faktora, proteaza, malih GTPaza, proteina srodnih GPCR, fuzionih konstrukata nanoantitela i samih nano-antitela, bakterijskih T3SS efektora, bakterijskih T4SS efektora i virusnih proteina. Posebno je poželjno da je heterologni protein izabran iz grupe koja se sastoji od proteina uključenih u apoptozu ili regulaciju apoptoze, od regulatora ćelijskog ciklusa, proteina sa ankirinskim

1

ponovcima, reporterskih proteina, malih GTPaza, proteina srodnih GPCR, fuzionih konstrukata nanoantitela, bakterijskih T3SS efektora, bakterijskih T4SS efektora i virusnih proteina. Još posebnije poželjni su heterologni proteini izabrani iz grupe koja se sastoji od proteina uključenih u apoptozu ili regulaciju apoptoze, regulatora ćelijskog ciklusa i proteina sa ankirinskim ponovcima. Najpoželjniji su proteini uključeni u apoptozu ili regulaciju apoptoze, poput životinjskih, poželjnije humanih heterolognih proteina uključenih u apoptozu ili regulaciju apoptoze

U pojedinim primerima izvođenja, vektor Gram-negativnog bakterijskog soja predmetnog pronalaska sadrži dve druge DNK sekvence koje kodiraju identične ili dva različita heterologna proteina koji su fuzionisani, nezavisno jedan od drugog, sa 3' krajem navedene prve DNK sekvence tako da se zadrži okvir čitanja.

U pojedinim primerima izvođenja, vektor Gram-negativnog bakterijskog soja predmetnog pronalaska sadrži tri druge DNK sekvence koje kodiraju identične ili tri različita heterologna proteina koji su fuzionisani, nezavisno jedan od drugog, sa 3' krajem navedene prve DNK sekvence tako da se zadrži okvir čitanja.

[0035] Heterologni protein eksprimiran od strane rekombinantnog Gram-negativnog bakterijskog soja oslabljene virulencije je obično molekulske težine od između 1 i 150 kD, poželjno između 1 i 120 kD, još poželjnije između 1 i 100 kDa, a najpoželjnije između 15 i 100 kDa.

[0036] U pojedinim primerima izvođenja, vektor Gram-negativnog bakterijskog soja predmtenog pronalaska sadrži ponovljene domene heterolognog proteina ili dva ili više domena različitih heterolognih proteina koji su fuzionisani sa 3' krajem navedene prve DNK sekvence tako da se zadrži okvir čitanja.

[0037] Termin "heterologni proteini koji pripadaju istoj funkcionalnoj klasi proteina", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na heterologne proteine koji imaju istu funkciju, npr. heterologne proteine koji su sa enzimskom aktivnošću, heterologne proteine koji deluju u istom signalnom putu, kao što je npr. regulacija ćelijskog ciklusa, ili kojima je zajednička specifična osobina kao npr. da pripadaju istoj klasi bakterijskih efektorskih proteina. Funkcionalne klase proteina su npr. proteini uključenih u apoptozu ili regulaciju apoptoze, proteini koji deluju kao regulatori ćelijskog ciklusa, proteini sa ankirinskim ponovcima, proteini ćelijske signalizacije, reporterski proteini, transkripcioni faktori, proteaze, male GTPaze, proteini srodni GPCR, fuzioni konstrukti nano-antitela i sama nano-antitela, bakterijski T3SS efektori, bakterijski T4SS efektori i virusni proteini koji zajednički deluju u biološkom procesu uspostavljanja virulencije kod eukariotskih ćelija.

[0038] Prema predmetnom pronalasku, „domen heterolognog proteina“ obuhvata domene proteina koji se javljaju u prirodi, a takođe obuhvata domene veštački konstruisanih proteina. Kao što se ovde upotrebljava, termin "domen heterolognog proteina" se odnosi na domen heterolognog proteina koji je drugačiji od domena T3SS efektorskog proteina ili na domen koji je drugačiji od domena koji sadrži njegov N-terminalni fragment, a sa kojim on može biti fuzionisan da bi se ostvarilo dobijanje fuzionog proteina. Precizinije, domen heterolognog proteina, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na domen heterolognog proteina koji ne pripada proteomu, tj. celokupnom komplementu prirodnih proteina specifičnog rekombinantnog Gram-negativnog bakterijskog soja koji je obezbeđen i upotrebljava se u predmetnom pronalasku, npr. proteina koji ne pripada proteomu, tj. celokupnom komplementu prirodnih proteina specifičnog bakterijskog soja iz rodova Yersinia, Escherichia, Salmonella ili

1

Pseudomonas. Obično je domen heterolognog proteina životinjskog porekla, uklјučujući humano poreklo. Poželjno je da je domen heterolognog proteina domen humanog proteina. Poželjnije je i da je domen heterolognog proteina zapravo domen proteina izabranog iz grupe koja se sastoji od proteina uklјučenih u apoptozu ili regulaciju apoptoze, od regulatora ćelijskog ciklusa, proteina sa ankirinskim ponovcima, proteina ćelijske signalizacije, reporterskih proteina, transkripcionih faktora, proteaza, malih GTPaza, proteina srodnih GPCR, fuzionih konstrukata nano-antitela i samih nanoantitela, bakterijskih T3SS efektora, bakterijskih T4SS efektora i virusnih proteina. Posebno je poželjno da domen heterolognog proteina predstavlja domen proteina izabranog iz grupe koja se sastoji od proteina uklјučenih u apoptozu ili regulaciju apoptoze, regulatora ćelijskog ciklusa, proteina sa ankirinskim ponovcima, reporterskih proteina, malih GTPaza, proteina srodnih GPCR, fuzionih konstrukata nano-antitela, bakterijskih T3SS efektora, bakterijskih T4SS efektora i virusnih proteina. Čak su još više poželjni domeni heterolognih proteina izabranih iz grupe koja se sastoji od proteina uključenih u apoptozu ili regulaciju apoptoze, od regulatora ćelijskog ciklusa i proteina sa ankirinskim ponovcima. Najpoželјniji su domeni proteina uključenih u apoptozu ili regulaciju apoptoze, poput životinjskih proteina uključenih u apoptozu ili regulaciju apoptoze, a poželјno su to domeni humanih heterolognih proteina uključenih u apoptozu ili regulaciju apoptoze.

[0039] Termin "ponovljeni domeni heterolognog proteina", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na fuzioni protein koji se sastoji od nekoliko ponavljanja domena heterolognog proteina, pri čemu ovi domeni mogu biti bilo direktno fuzionisani jedni sa drugima ili gde između domena može biti uveden vrijabilni linker npr. linker od između 1 i 30, poželjno između 2 i 15, još poželjnije između 3 i 10 aminokiselina. Poželjno je da budu upotrebljeni identični ponovljeni domeni ili ponovljeni domeni koji su sa aminokiselinskim sekvencama identičnim u više od 80%, obično više od 85%, poželjno više od 90%, još poželjnije više od 95%, posebno poželjno više od 96%, još posebnije poželjno više od 97%, još više poželjno, više od 98%, a najpoželjnije više od 99%. Takođe su poželjni identični domeni kod kojih su aminokiselinske sekvence identične 100%. Poželjno je i da se fuzioni protein koji je ovde naznačen sastoji od dva ponovljena domena, poželjnije dva ponovljena identična domena ili dva ponovljena domena sa aminokiselinskim sekvencama koje su identične više od 90%, poželjno više od 95%, najpoželjnije 100%. Više od dva, npr. tri, četiri, pet ili šest ponovljenih domena, takođe se razmatraju predmetnim pronalaskom.

[0040] Termin "dva ili više domena različitih heterolognih proteina", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na fuzioni protein koji se sastoji od jednog ili nekoliko ponavljanja najmanje dva domena različitih heterolognih proteina, npr. najmanje dva domena heterolognih proteina sa aminokiselinskim sekvencama koje su identične 80% ili manje, poželjno 60% ili manje, najpoželjnije 40% ili manje, pri čemu ovakvi različiti domeni mogu biti bilo fuzionisani direktno jedan sa drugim ili između domena može biti uveden varijabilni linker, npr. linker od između 1 i 30, poželjno od između 2 i 15, još poželjnije od između 3 i 10 aminokiselina. Poželjno je i da dva domena različitih heterolognih proteina budu sadržana u fuzionom proteinu, kao što je to ovde naznačeno. Više od dva, npr. tri, četiri, pet ili šest domena različitih heterolognih proteina, takođe se razmatraju predmetnim pronalaskom.

[0041] Domen heterolognog proteina koga eksprimira rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj obično je molekulske težine od između 1-50 kDa, poželjno između 1-30 kDa, još poželjnije između 1-20 kDa, najpoželjnije između 1-10 kDa.

2

[0042] Prema predmetnom pronalasku, "proteini uklјučeni u apoptozu ili regulaciju apoptoze" obuhvataju, ali nisu ograničeni na, Bad, Bcl2, Bak, Bmt, Bax, Puma, Noxa, Bim, Bcl-xL, Apafl, Kaspazu 9, Kaspazu 3, Kaspazu 6, Kaspazu 7, Kaspazu 10, DFFA, DFFB, ROCK1, APP, CAD, ICAD, CAD, EndoG, AIF, HtrA2, Smac/Diablo, Arts, ATM, ATR, Bok/Mtd, Bmf, Mcl-1(S), IAP familiju, LC8, PP2B, 14-3-3 proteine, PKA, PKC, PI3K, Erk1/2, p90RSK, TRAF2, TRADD, FADD, Daxx, Kaspazu8, Kaspazu2, RIP, RAIDD, MKK7, JNK, FLIP, FKHR, GSK3, CDK i njihove inhibitore poput INK4-familije (p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d)) i Cip1/Wafl/Kip1-2-familije (p21(Cip1/Waf1), p27(Kip1), p57(Kip2). Poželjno se upotrebljavaju Bad, Bmt, Bcl2, Bak, Bax, Puma, Noxa, Bim, Bcl-xL, Kaspaza9, Kaspaza3, Kaspaza6, Kaspaza7, Smac/Diablo, Bok/Mtd, Bmf, Mcl-1(S), LC8, PP2B, TRADD, Daxx, Kaspaza8, Kaspaza2, RIP, RAIDD, FKHR, CDK i njihovi inhibitori poput INK4-familije (p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d)), a poželjnije BIM, Bid, skraćeni Bid, FADD, Kapsaza 3 (i njene subjedinice), Bax, Bad, Akt, CDK i njihovi inhibitori poput INK4-familije (p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d)) [8-10]. Dodatno, proteini uklјučeni u apoptozu ili regulaciju apoptoze obuhvataju DIVA, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bid i tBid, Egl-1, Bcl-Gs, Citohrom C, Beklin, CED-13, BNIP1, BNIP3, Bcl-B, Bcl-W, Ced-9, A1, NR13, Bfl-1, Kaspazu 1, Kaspazu 2, Kaspazu 4, Kaspazu 5, Kaspazu 8. Proteini uklјučeni u apoptozu ili regulaciju apoptoze su izabrani iz grupe koja se sastoji od pro-apoptotskih proteina, anti-apoptotskih proteina, inhibitora puteva prevencije apoptoze i inhibitora signalizacije ili signalnih puteva za preživlјavanje. Pro-apoptotski proteini obuhvataju proteine izabrane iz grupe koja se sastoji od Bax, Bak, Diva, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bmf, Noxa, Puma, Bim, Bad, Bid i tBid, Bok, Apafl, Smac/Diablo, BNIP1, BNIP3, Bcl-Gs, Beklina 1, Egl-1 i CED13, Citohroma C, FADD, familije Kaspaza i CDK i njihovih inhibitora poput INK4-familije (p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d)) ili proteine izabrane iz grupe koja se sastoji od Bax, Bak, Diva, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bmf, Noxa, Puma, Bim, Bad, Bid i tBid, Bok, Egl-1, Apafl, Smac/Diablo, BNIP1, BNIP3, Bcl-Gs, Beklina 1, Egl-1 i CED-13, Citohroma C, FADD i familije Kaspaza. Poželjni su Bax, Bak, Diva, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bmf, Noxa, Puma, Bim, Bad, Bid i tBid, Bok, Egl-1, Apafl, BNIP1, BNIP3, Bcl-G, Beklin 1, Egl-1 i CED-13, Smac/Diablo, FADD, familija Kaspaza, CDK i njihovi inhibitori poput INK4-familije (p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d)). Podjednako su poželjni Bax, Bak, Diva, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bmf, Noxa, Puma, Bim, Bad, Bid i tBid, Bok, Apafl, BNIP1, BNIP3, Bcl-Gs, Beklin 1, Egl-1 i CED-13, Smac/Diablo, FADD, familija Kaspaza.

Anti-apoptotski proteini obuhvataju proteine izabrane iz grupe koja se sastoji od

Bcl-2, Bcl-Xl, Bcl-B, Bcl-W, Mcl-1, Ced-9, A1, NR13, IAP familije i Bfl-1. Poželjni su Bcl-2, Bcl-Xl, Bcl-B, Bcl-W, Mcl-1, Ced-9, A1, NR13 i Bfl-1.

Inhibitori puteva prevencije apoptoze obuhvataju proteine izabrane iz grupe koja se sastoji od Bad, Noxa i Cdc25A. Poželjni su Bad i Noxa.

Inhibitori signalizacije ili signalnih puteva za preživlјavanje obuhvataju proteine izabrane iz grupe koja se sastoji od PTEN, ROCK, PP2A, PHLPP, JNK, p38. Poželјni su PTEN, ROCK, PP2A i PHLPP.

[0043] U pojedinim primerima izvođenja, heterologni proteini uklјučeni u apoptozu ili regulaciju apoptoze su izabrani iz grupe koja se sastoji od proteina koji sadrže samo BH3 domen, kaspaza i unutarćelijskih signalnih proteina receptora smrti za kontrolu apoptoze. Proteini koji sadrže samo BH3 domen (engl. BH3-only) su poželjni. Proteini koji sadrže samo BH3 domen obuhvataju proteine izabrane iz grupe koja se sastoji od Bad, BIM, Bid i tBid, Puma, Bik/Nbk, Bod, Hrk/Dp5, BNIP1, BNIP3, Bmf, Noxa, Mcl-1, Bcl-Gs, Bekina 1, Egl-1 i CED-13. Poželjni su Bad, BIM, Bid i tBid, a posebno tBid.

Kaspaze obuhvataju proteine izabrane iz grupe koja se sastoji od Kaspaze 1, Kaspaze 2, Kaspaze 3, Kaspaze 4, Kaspaze 5, Kaspaze 6, Kaspaze 7, Kaspaze 8, Kaspaze 9, Kaspaze 10. Poželjne su Kaspaza 3, Kaspaza 8 i Kaspaza 9.

Unutarćelijski signalni proteini receptora smrti za kontrolu apoptoze obuhvataju proteine izabrane iz grupe koja se sastoji od FADD, TRADD, ASC, BAP31, GULP1/CED-6, CIDEA, MFG-E8, CIDEC, RIPK1/RIP1, CRADD, RIPK3/RIP3, Crk, SHB, CrkL, DAXX, 14-3-3 familije, FLIP, DFF40 i 45, PEA-15, SODD. Poželјni su FADD i TRADD. U pojedinim primerima izvođenja, dva heterologna proteina uklјučena u apoptozu ili regulaciju apoptoze su sadržani u Gram-negativnom bakterijskom soju i/ili vektoru predmetnog pronalaska, pri čemu je jedan protein pro-apoptotski protein, a drugi protein je inhibitor puteva prevencije apoptoze, ili pri čemu je jedan protein pro-apoptotski protein, a drugi protein je inhibitor signalizacije ili signalnih puteva za preživlјavanje.

Pro-apoptotski proteini obuhvaćeni predmetnim pronalaskom su obično sa strukturom alfa-heliksa, poželjno hidrofobnog heliksa okruženog amfipatičnim heliksima, a obično sadrže i najmanje jedan od BH1, BH2, BH3 ili BH4 domena, pri čemu je poželjno da sadrže najmanje jedan BH3 domen. Obično su pro-apoptotski proteini obuhvaćeni predmetnim pronalaskom bez enzimske aktivnosti.

Anti-apoptotski proteini obuhvaćeni predmetnim pronalaskom su obično sa strukturom alfa-heliksa, poželjno hidrofobnog heliksa okruženog amfipatičnim heliksima i obično sadrže kombinaciju različitih BH1, BH2, BH3 i BH4 domena, poželjno kombinaciju različitih BH1, BH2, BH3 i BH4 domena gde je prisutan BH1 i BH2 domen, a još poželjnije su to BH4-BH3-BH1-BH2, BH1-BH2, BH4-BH1-BH2 ili BH3-BH1-BH2 (od N- ka C-kraju). Dodatno, obuhvaćeni su i proteini koji sadrže najmanje jedan BIR domen.

Inhibitori puteva za prevenciju apoptoze obuhvaćeni predmetnim pronalaskom su obično sa strukturom alfa-heliksa, poželjno hidrofobnog heliksa okruženog amfipatičnim heliksima i obično sadrže jedan BH3 domen.

Svaki od BH1, BH2, BH3 ili BH4 domena je obično dužine između od oko 5 do oko 50 aminokiselina. Prema tome, u pojedinim primerima izvođenja, heterologni proteini uključeni u apoptozu ili regulaciju apoptoze su izabrani iz grupe koja se sastoji od heterolognih proteina uključenih u apoptozu ili regulaciju apoptoze koji su dužine od oko 5 do oko 200, poželjno od oko 5 do oko 150, još poželjnije od oko 5 do oko 100, a najpoželjnijeod oko 5 do oko 50 i posebno poželjno od oko 5 do oko 25 aminokiselina.

[0044] U pojedinim primerima izvođenja Gram-negativan bakterijski soj predmetnog pronalaska je transformisan sa dva domena heterolognih proteina koji su uključeni u apoptozu ili regulaciju apoptoze, poželjno sa dva ponovljena, još poželjnije dva identična ponovljena domena proteina uključenih u apoptozu ili regulaciju apoptoze, ili sa dva domena različitih proteina uključenih u apoptozu ili regulaciju apoptoze, pri čemu je najpoželjnije da to budu dva identična ponovljena domena proteina uključenih u apoptozu ili regulaciju apoptoze. U pojedinim primerima izvođenja Gram-negativan bakterijski soj predmetnog pronalaska je transformisan sa dva domena heterolognih proteina koji su uključeni u apoptozu ili regulaciju apoptoze, pri čemu je jedan domen pro-apoptotskog proteina, dok je drugi domen iz proteina koji je inhibitor puteva za prevenciju apoptoze ili pri čemu je jedan domen pro-apoptotskog proteina, a drugi domen je domen proteina koji je inhibitor signalizacije ili signalnih puteva za preživlјavanje.

[0045] Posebno poželjan domen je BH3 domen induktora apoptoze tBID, preciznije BH3 domen koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 217, 218, 219 i 220, a poželjno SEQ ID NO: 219 ili SEQ ID NO: 220.

Jednako poželjan je BH3 domen regulatora apoptoze BAX, preciznije BAX domen koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 221, 222, 223 i 224, a poželjno SEQ ID NO: 223 ili SEQ ID NO: 224. Sekvence čoveka i glodara su navedene u SEQ ID NO 217-224, ali su podjednako uključeni BH3 domeni tBID i BAX iz svih ostalih vrsta.

U pojedinim primerima izvođenja, ponovljeni domeni heterolognih proteina su BH3 domen, poželjno ponovljeni BH3 domeni induktora apoptoze tBID, još poželjnije ponovljeni BH3 domeni induktora apoptoze tBID koje čine SEQ ID NO: 219 ili SEQ ID NO: 220 ili SEQ ID NO: 202, još poželjnije dva ponovljena BH3 domena induktora apoptoze tBID, najpoželjnije dva ponovljena BH3 domena induktora apoptoze tBID koji čine SEQ ID NO: 219 ili SEQ ID NO: 220 ili SEQ ID NO: 202, posebno dva ponovljeni BH3 domeni induktora apoptoze tBID koje čine sekvence SEQ ID NO: 202. Stoga, u poželjnom primeru izvođenja, Gram-negativan bakterijski soj i/ili vektor predmetnog pronalaska sadrži drugu DNK sekvencu koja kodira dva ponovljena domena iz BH3 domena, još poželjnije dva ponovljena BH3 domena induktora apoptoze tBID. Dva ponovljena domena mogu biti povezana linkerom dužine 1-30 aminokiselina, poželjno 2-15 aminokiselina, poželjnije 3-10 aminokiselina.

U pojedinim primerima izvođenja, dva ili više domena različitih heterolognih proteina su domeni heterolognih proteina koji pripadaju istoj funkcionalnoj klasi proteina, a poželjno različiti heterologni proteini dva ili više domena predstavljaju različite heterologne proteine iz klase proteina uključenih u apoptozu ili regulaciju apoptoze. U poželjnom primeru izvođenja, dva ili više domena različitih heterolognih proteina su BH3 domen induktora apoptoze tBID i BH3 domen regulatora apoptoze BAX, posebno fuzionisani BH3 domeni koje čine sekvence SEQ ID NO: 203 i 211. Dva domena različitih heterolognih proteina mogu biti povezani linkerom dužine 1-30 aminokiselina, poželjno 2-15 aminokiselina, poželjnije 3-10 aminokiselina.

[0046] U pojedinim primerima izvođenja, heterologni protein je konvertujući enzim koji deluje na prolekove. U ovim primerima izvođenja, rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije eksprimira, a poželjno eksprimira i izlučuje, konvertujuće enzima prolekova. Konvertujući enzim za prolekove, kao što je ovde naznačeno, obuhvata enzime koji konvertuju netoksične prolekove u toksičan lek, poželjno enzime izabrane iz grupe koja se sastoji od citozin deaminaze, purinske nukleozidne fosforilaze, timidin kinaze, beta-galaktozidaze, karboksiesteraze, nitroreduktaze, karboksipeptidaze i beta-glukoronidaze, još poželjnije enzime izabrane iz grupe koja se sastoji od citozin deaminaze, purinske nukleozidne fosforilaze, timidin kinaze i beta-galaktozidaze.

[0047] Termin "mesto cepanja za proteazu, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na specifičan aminokiselinski motiv unutar aminokiselinske sekvence, npr. unutar aminokiselinske sekvence proteina ili fuzionisanog proteina, koga cepa specifična proteaza koja prepoznaje aminokiselinski motiv. Za revijski pregled pogledati [11]. Primeri mesta cepanja proteazama su aminokiselinski motivi koji se cepaju dejstvom proteaza izbranih iz grupe koja se sastoji od enterokinaze (lakog lanca), enteropeptidaze, presizicione proteaze, humane rinovirusne proteaze (HRV 3C), TEV proteaze, TVMV proteaze, proteaze Faktora Xa i trombina.

Aminokiselinske motive koji slede prepoznaju odgovarajuće proteaze:

2

- Asp-Asp-Asp-Asp-Lys: Enterokinaza (lakog lanca) / Enteropeptidaza

- Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln/Gly-Pro: Presiziona proteza/humana Rinovirusna proteaza (HRV 3C) - Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Ser i modifikovani motivi zasnovani na Glu-X-X-Tyr-X-Gln-Gly/Ser (gde je X bilo koja aminokiselina) koje prepoznaje TEV proteaza (proteaza virusa mozaične bolesti duvana) - Glu-Thr-Val-Arg-Phe-Gln-Ser: TVMV proteaza

- Ile-(Glu ili Asp)-Gly-Arg: proteaza FaktoraXa

- Leu-Val-Pro-Arg/Gly-Ser: trombin.

Obuhvaćen mestima cepanja proteazom, kako se ovde upotrebljava, je i ubikvitin. Prema tome, u pojedinim poželјnim primerima izvođenja, ubikvitin se upotrebljava kao mesto cepanja proteazom, tj. treća DNK sekvenca kodira ubikvitin kao mesto cepanja proteazom, a koje može biti isečeno dejstvom specifičnih proteaza za obradu ubikvitina na N-terminalnom mestu, npr. koje može biti isečeno specifičnim proteazama za obradu ubikvitina koje se nazivaju Deubikvitinacionim enzimima za mesto na N-kraju, i to endogeno u ćeliji u koju je fuzioni protein isporučen. Ubikvitin podleže obradi i na svom C-kraju, grupom endogenih C-terminalnih protaza specifičnih za ubikvitin (deubikvitinacionih enzima, DUB). Za cepanje ubikvitina sa DUB se pretpostavlja da se odvija na samom C-kraju ubikvitina (nakon G76).

[0048] „Pojedinac“, „subjekat“ ili „pacijent“ je kičmenjak. U određenim primerima izvođenja, kičmenjak je sisar. Sisari obuhvataju, ali nisu ograničeni na, primate (uklјučujući humane i primate različite od čoveka) i glodare (npr. miševe i pacove). U poželjnim primerima izvođenja, sisar je čovek.

[0049] Termin "mutacija" se ovde upotrebljava kao opšti termin, i obuhvata promene i jednog baznog para i višestrukih baznih parova. Takve mutacije mogu podrazumevati supstitucije, mutacije tipa pomeraja okvira čitanja, delecije, insercije i obrazovanja skraćenih formi.

[0050] Termin "signal jedarne lokalizacije", kako se ovde upotrebljava, se odnosi na aminokiselinsku sekvencu koja obeležava protein za unos u jedro eukariotske ćelije i poželјno uklјučuje virusni signal jedarne lokalizacije, kao što je NLS izveden iz velikog T-antigena SV40 (PPKKKRKV).

[0051] Termin "mesto višestrukog kloniranja", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na kratku DNK sekvencu koja sadrži nekoliko restrikcionih mesta za cepanje restrikcionim endonukleazama kao što su to AclI, HindIII, SspI, MluCI, Tsp509I, PciI, Agel, BspMI, BfuAI, SexAI, MluI, BceAI, HpyCH4IV, HpyCH4III, BaeI, BsaXI, AflIII, SpeI, BsrI, BmrI, BglII, AfeI, AluI, StuI, Scal, ClaI, BspDI, PI-SceI, Nsil, AseI, SwaI, CspCI, MfeI, BssSI, BmgBI, PmlI, DraIII, AleI, EcoP15I, PvuII, AlwNI, BtsIMutI, TspRI, Ndel, NlaIII, CviAII, FatI, MslI, FspEI, XcmI, BstXI, PflMI, BccI, Ncol, BseYI, FauI, SmaI, XmaI, TspMI, Nt.CviPII, LpnPI, AciI, SacII, BsrBI, MspI, HpaII, ScrFI, BssKI, StyD4I, BsaJI, BslI, Btgl, NciI, AvrII, MnlI, BbvCI, Nb.BbvCI, Nt.BbvCI, Sbfl, Bpu10I, Bsu36I, EcoNI, HpyAV, BstNI, PspGI, StyI, BcgI, PvuI, BstUI, EagI, RsrII, BsiEI, BsiWI, BsmBI, Hpy99I, MspA1I, MspJI, SgrAI, BfaI, BspCNI, XhoI, Earl, AcuI, PstI, BpmI, DdeI, SfcI, AflII, BpuEI, SmlI, AvaI, BsoBI, MboII, BbsI, XmnI, BsmI, Nb.BsmI, EcoRI, HgaI, AatII, ZraI, Tth111I PflFI, PshAI, AhdI, DrdI, Eco53kI, SacI, BseRI, PleI, Nt.BstNBI, MlyI, HinfI, EcoRV, MboI, Sau3AI, DpnII BfuCI, DpnI, BsaBI, TfiI, BsrDI, Nb.BsrDI, BbvI, BtsI, Nb.BtsI, BstAPI, SfaNI, SphI, NmeAIII, NaeI, NgoMIV, BglI, AsiSI, BtgZI, HinP1I, HhaI, BssHII, NotI, Fnu4HI, Cac8I, MwoI, NheI, BmtI, SapI, BspQI, Nt.BspQI, BlpI, TseI, ApeKI, Bsp1286I, AlwI, Nt.AlwI, BamHI, FokI, BtsCI, HaeIII, Phol, FseI, SfiI, Narl, KasI, SfoI, PluTI, AscI, EciI, BsmFI, ApaI, PspOMI, Sau96I, NlaIV, KpnI, Acc65I, BsaI, HphI, BstEII, AvaII, BanI, BaeGI, BsaHI, BanII, RsaI, CviQI, BstZ17I, BciVI, SalI, Nt.BsmAI, BsmAI, BcoDI, ApaLI, BsgI, AccI, Hpy166II, Tsp45I, HpaI, PmeI, HincII, BsiHKAI, ApoI, NspI, BsrFI, BstYI, HaeII, CviKI-1, EcoO109I, PpuMI, I-CeuI, SnaBI, I-SceI, BspHI, BspEI, MmeI, TaqαI, NruI, Hpy188I, Hpy188III, XbaI, BclI, HpyCH4V, FspI, PI-PspI, MscI, BsrGI, MseI, PacI, PsiI, BstBI, DraI, PspXI, BsaWI, BsaAI, EaeI, poželjno Xhol, XbaI, HindIII, NcoI, NotI, EcoRI, EcoRV, BamHI, NheI, SacI, SalI, BstBI. Termin "mesto višestrukog kloniranja", kako se ovde upotrebljava, dodatno se odnosi na kratku DNK sekvencu koja se upotrebljava za rekombinacione događaje kao što je to, npr., u Gateway strategiji kloniranja ili u postupcima poput Gibbson-ovog udruživanje ili topo kloniranja.

[0052] Termin "soj divljeg tipa" ili "Gram-negativnan bakterijski soj divljeg tipa", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na varijantu koja je javalja u prirodi ili varijatnu koja se javlja u prirodi i sadrži genetičke modifikacije koje omogućavaju upotrebu vektora, kao što su delecione mutacije u genima za restrikcione endonukleaze ili rezistenciju na antibiotike. Takvi sojevi sadrže hromozomsku DNK kao i, u pojedinim slučajevima, (npr. u Y. enterocolitica, S. flexneri) nemodifikovan virulentni plazmid.

[0053] Termin "Yersinia soj divlјeg tipa", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na varijantu koja se javlja u prirodi (poput Y.enterocolitica E40) ili na varijantu koja se javlja u prirodi i sadrži genetičke modifikacije koje omogućavaju upotrebu vektora, kao što su mutacije tipa delecija u genima restrikcionih endonukleaza ili za rezistenciju na antibiotike (poput Y.enterocolitica MRS40, derivata Y.enterocolitica E40 koji je osetlјiv na ampicilin) Ovakvi sojevi sadrže hromozomsku DNK, kao i nemodifikovan plazmid virulencije (nazvan pYV).

Y. enterocolitica podvrsta palearctica se odnosi na slabo patogene sojeve Y. enterocolitica, koji su u suprotnosti sa više virulentnim sojevima podvrsta enterocolitica [12,13]. Kod Y. enterocolitica podvrste palearctica nedostaje, u poređenju sa Y. enterocolitica podvrste enterocolitica, ostrvo visoke patogenosti (HPI). Ovakav HPI kodira siderofor gvožđa nazvan jersinijabaktin [14]. Nedostatak jersiniabaktina u Y. enterocolitica podvrste palearctica čini ovu podvrstu manje patogenom i zavisnom od indukovanog, sistemski dostupnog gvožđa za perzistentnu infekciju u npr. jetri ili slezini [14]. Gvožđe se može učiniti dostupnim za bakterije kod pojedinca, npr. prethodnim tretmanom sa deferoksaminom, helatorom gvožđa koji se upotrebljava za lečenje preopterećenja gvožđem kod pacijenata [15].

[0054] Termin "obuhvata" se uglavnom upotrebljava u smislu uklјučivanja, odnosno, moglo bi se reći da dozvolјava prisustvo jedne ili više karakteristika ili komponenti.

[0055] Termin "oko" se odnosi na opseg vrednosti od ± 10% u odnosu na naznačenu vrednost. Na primer, izraz „oko 200“ uključuje ± 10% od 200, ili od 180 do 220.

[0056] Prema jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije koji je transformisan sa vektorom koji sadrži, u smeru od 5’ ka 3’:

promotor;

prvu DNK sekvencu koja kodira signal za isporuku iz bakterijskog efektorskog proteina, operativno povezanu sa navedenim promotorom;

drugu DNK sekvencu koja kodira heterologni protein, fuzionisanu sa 3' krajem a navedene prve DNK sekvence tako da se zadrži okvir čitanja,

za upotrebu u postupku lečenja malignog solidnog tumora kod subjekta, pri čemu je rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije Yersinia soj deficijentan u proizvodnji siderofora i nakuplja se u malignom solidnom tumoru, pri čemu postupak obuhvata

2

istovremenu primenu navedenog rekombinantnog Gram-negativnog bakterijskog soja oslabljene virulencije sa sideroforom subjektu i pri čemu se rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije primenjuje u količini koja je dovoljna za lečenje subjekta.

[0057] Prema daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije, pri čemu je rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije Yersinia soj deficijentan u proizvodnji siderofora, pri čemu je rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije deficijentan u proizvodnji najmanje jednog bakterijskog efektorskog proteina koji je virulentan za eukariotske ćelije ili je deficijentan u proizvodnji najmanje jednog bakterijskog proteina koji je deo mašinerije sistema za sekreciju, za upotrebu u postupku lečenja malignog solidnog tumora kod subjekta, pri čemu se rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije nakuplja u malignom solidnom tumoru, a postupak obuhvata istovremenu primenu rekombinantanog Gram-negativnog bakterijskog soja oslabljene virulencije sa sideroforom subjektu, i pri čemu se rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije primenjuje u količini koja je dovoljna za lečenje subjekta. Poželjan je rekombinantan Gramnegativan bakterijski soj oslabljene virulencije, pri čemu je rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije Yersinia soj deficijentan u proizvodnji siderofora, pri čemu je rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije deficijentan u proizvodnji najmanje jednog bakterijskog efektorskog proteina koji je virulentan za eukariotske ćelije, za upotrebu u postupku lečenja malignog solidnog tumora kod subjekta, pri čemu se rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije nakuplja u malignom solidnom tumoru, a postupak obuhvata istovremenu primenu navedenog rekombinantne virulencije oslabljene Gram-negativne bakterijske vrste sa sideroforom i pri čemu se rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije primenjuje u količini koja je dovoljna za lečenje subjekta.

[0058] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije koji je deficijentan u proizvodnji najmanje jednog bakterijskog efektorskog proteina koji je virulentan za eukariotske ćelije ili koji je deficijentan u proizvodnji najmanje jednog bakterijskog proteina koji je deo mašinerije sistema za sekreciju je transformisan sa vektorom koji sadrži, u smeru od 5’ ka 3’:

promotor;

prvu DNK sekvencu koja kodira signal za isporuku iz bakterijskog efektorskog proteina, operativno povezanu sa navedenim promotorom;

drugu DNK sekvencu koja kodira heterologni protein, fuzionisanu sa 3’ krajem navedene prve DNK sekvence tako da se zadrži okvir čitanja.

[0059] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije ili rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije koji je deficijentan u proizvodnji najmanje jednog bakterijskog efektorskog proteina koji je virulentan za eukariotske ćelije ili koji je deficijentan u proizvodnja najmanje jednog bakterijskog proteina koji je deo mašinerije sistema za sekreciju, transformisan je vektorom koji sadrži, u smeru od 5’ ka 3’:

prvu DNK sekvencu koja kodira signal za isporuku ili njegov fragment iz bakterijskog efektorskog proteina;

2

drugu DNK sekvencu koja kodira heterologni protein, fuzionisanu sa 3’ krajem navedene prve DNK sekvence tako da se zadrži okvir čitanja. Poželjno je da, bočno u odnosu na 3’ kraj DNK sekvence koja kodira heterologni protein, bude DNK sekvenca homologna DNK sekvenci 3’ kraja signala za isporuku iz bakterijskog efektorskog proteina u okviru hromozoma ili endogenog plazmida virulencije, ili da bude homologna njenom fragmentu. Još je poželjnije da ova DNK sekvenca koja se nalazi bočno u odnosu na homologni protein, na njegovom 3' kraju, bude homologna DNK sekvenci i nalazi se unutar 10 kbp na 3' kraju signala za isporuku iz bakterijskog efektorskog proteina u okviru hromozoma ili endogenog plazmida virulencije, ili da bude homologna njenom fragmentu. Preciznije, ova nukleotidna sekvenca koja se nalazi bočno u odnosu na homologni protein, na njegovom 3' kraju, homologna je DNK sekvenci i nalazi se unutar istog operona na hromozomu ili na endogenom plazmidu virulencije kao signal za isporuku iz bakterijskog efektorskog proteina ili njegov fragment. U ovom primeru izvođenja, transformacija se obično izvodi tako da se fuzionisane prva i druga DNK sekvenca insertuju homolognom rekombinacijom u endogeni plazmid virulencije ili hromozom, poželjno na endogeni virulentni plazmid, rekombinantnog Gram-negativanog bakterijskog soja oslabljene virulencije, i tako da su fuzionisane prva i drugua DNK sekvenca operativno povezane sa promotorom endogenog plazmida virulencije ili hromozoma, npr. hromozomskog ostrva patogenosti. Poželjno je i da su fuzionisana prva i druga DNK sekvenca operativno povezane sa promotorom endogenog plazmida virulencije. U ovom primeru izvođenja, prva DNK sekvenca sadrži signal za isporuku ili njegov fragment iz bakterijskog efektorskog proteina, poželjno njegov fragment, koji obezbeđuje homolognu rekombinaciju na homolognom mestu u hromozomu ili na endogenom plazmidu virulencije, da bi rezultat bio da druga DNK sekvenca bude smeštana na 3' kraj signala za isporuku u okviru hromozoma ili endogenog plazmida tako da se zadrži okvir čitanja i da bude operativno povezana sa endogenim promotorom.

[0060] U daljem primeru izvođenja predmetnog pronalaska, rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije ili rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije koji je deficijentan u proizvodnji najmanje jednog bakterijskog efektorskog proteina koji je virulentan za eukariotske ćelije, ili koji je deficijentan u proizvodnji najmanje jednog bakterijskog proteina koji je deo mašinerije sistema za sekreciju, transformisan je sa nukleotidnim molekulom, poželjno DNK nukleotidnim molekulom, koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira heterologni protein i sa nukleotidnom sekvencom koja je homologna ili identična nukleotidnoj sekvenci koja kodira signal za isporuku iz bakterijskog efektorskog proteina, ili koja je homologna ili identična nukleotidnoj sekvenci koja kodira fragment signala za isporuku iz bakterijskog efektorskog proteina, pri čemu je signal za isporuku iz bakterijskog efektorskog proteina kodiran na hromozomu ili na endogenom plazmidu virulencije rekombinantnog Gram-negativnog bakterijskog soja oslabljene virulencije. Poželjno je da se nukleotidna sekvenca koja je homologna ili identična nukleotidnoj sekvenci signala za isporuku iz bakterijskog efektorskog proteina, ili njegovog fragmenta, nalazi na 5' kraju nukleotidne sekvence koja kodira heterologni protein. Poželjnije je da se bočno u odnosu na 3' kraj nukleotidne sekvence koja kodira heterologni protein nalazi nukleotidna sekvenca homologna DNK sekvenci hromozoma ili endogenog plazmida virulencije sa 3' kraja signala za isporuku iz bakterijskog efektorskog proteina ili njegovog fragmenta. Još je poželjnije da je ova nukleotidna sekvenca, koja se nalazi bočno u odnosu na 3' kraj nukleotidne sekvence koja kodira heterologni protein, homologna DNK sekvenci koja se nalazi u okviru 10 kbp na hromozomu ili endogenom plazmidu virulencije sa 3' kraja signala za isporuku bakterijskog efektorskog proteina ili njenom fragmentu. Preciznije, ova nukleotidna sekvenca koja se nalazi bočno u odnosu 3' kraj homolognog proteina je homologna DNK

2

sekvenci koja se nalazi unutar istog operona na hromozomu ili na endogenom plazmidu virulencije kao signal za isporuku iz bakterijskog efektorskog proteina ili njegov fragment. U ovom primeru izvođenja, transformacija se obično izvodi tako da se nukleotidna sekvenca koja kodira heterologni protein insertuje u endogeni plazmid virulencije ili hromozom rekombinantnog Gram-negativnog bakterijskog soja oslabljene virulencije, na 3' kraj signala za isporuku iz bakterijskog efektorskog proteina koji je kodiran hromozomom ili endogenim plazmidom virulencije, pri čemu se heterologni protein koji je fuzionisan sa signalom za isporuku eksprimira i izlučuje.

[0061] U slučaju da je rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije Yersinia soj, endogeni plazmid virulencije za inserciju je pYV (plazmid Yersinia Virulence). U slučaju da je rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije Salmonella soj, endogena lokacija za inserciju je jedan od genskih klastera nazvanih Spil ili SpiII (od ostrvo patogenosti iz Salmonella), odnosno pozicija na kojoj je efektorski protein negde drugde kodiran, ili je to alternativno jedan od plazmida virulencije iz Salmonela (SVP).

[0062] Poželjno je da su prva i druga DNK sekvenca ili nukleotidni molekul insertovani u endogeni plazmid virulencije na nativnom mestu bakterijskog efektorskog proteina, npr. na nativnom mestu faktora virulencije, poželjno, u slučaju kada je rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije Yersinia soj, na nativnom mestu YopE ili drugog Yop (YopH, YopO, YopP, YopM, YopT), a poželjno na nativno mesto YopE ili, u slučaju da je rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije soj Salmonella, na nativnom mestu efektorskog proteina kodiranog unutar SpiI, SpiII ili kodiranog negde drugo, poželjno na nativnom mestu efektorskog proteina kodiranog unutar Spil ili SpiII, poželjnije na nativnom mestu SopE ili SteA. Poželjno je i da su prva i druga DNK sekvenca ili nukleotidni molekul operativno povezani sa nativnim promotorom bakterijskog efektorskog proteina koji je prisutan na endogenom plazmidu virulencije, npr. u slučaju kada je rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije Yersinia soj, sa nativnim promotorom iz Yersinia virulonskog gena, kao što je u kratkim crtama navedeno u nastavku teksta, pri čemu je još poželjnije da to bude veza sa nativnim YopE promotorom ili promotorom drugog Yop (YopH, YopO, YopP, YopM, YopT), a poželjno sa nativnim YopE promotorom, ili u slučaju kada je rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije soj Salmonella, sa nativnim promotorom iz SpiI ili Spill ostrva patogenosti ili iz efektorskog proteina koji je kodiran na nekom drugom mestu, kao što je u kratkim crtama navedeno u nastavku teksta, a još poželjnije sa nativnim SopE, InvB ili SteA promotorom.

[0063] Poželjno je da je rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije Yersinia enterocolitica soj. Najpoželjnija je Yersinia enterocolitica E40 (O:9, biotipa 2) [16] ili njene izvedene linije osetljive na ampicilin, poput Y. enterocolitica MRS40 (takođe nazvane Y. enterocolitica podvrste palearctica MRS40) kao što je opisano u [17]. Y. enterocolitica E40 i njena izvedena linija Y. enterocolitica MRS40 koja je opisana u [17] identične su sa Y. enterocolitica podvrste palearctica E40 i njenom izvedenom linijom Y. enterocolitica podvrste palearctica MRS40 je kao što je opisano u [12,14,18]. Poželjno je i da je rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije Salmonella soj, još poželjnije soj Salmonella enterica. Najpoželjniji je Salmonella enterica Serovar Typhimurium SL1344 koji je opisan u Kolekciji kultura javnog zdravlja Engleske (NCTC 13347).

[0064] U pojedinim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije je soj koji ne proizvodi siderofore, npr. deficijentan je u proizvodnji

2

bilo kog siderofora. Takav soj je na primer Y. enterocolitica podvrste palearctica MRS40 kao što je opisano u [14,17], koji ne proizvodi jersinijabaktin i koji je poželjan.

[0065] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska signal za isporuku iz bakterijskog efektorskog proteina sadrži bakterijski efektorski protein ili njegov N-teminalni fragment.

U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, signal za isporuku iz bakterijskog efektorskog proteina je bakterijski T3SS efektorski protein koji obuhvata bakterijski T3SS efektorski protein ili njegov N-terminalni fragment, pri čemu T3SS efektorski protein ili njegov N-terminalni fragment mogu sadržavati mesto vezivanja šaperona. T3SS efektorski protein ili njegov N-terminalni fragment koji sadrži mesto vezivanja šaperona je posebno koristan kao signal za isporuku u predmetnom pronalasku. Poželjni T3SS efektorski proteini ili njihovi N-terminalni fragmenti su izabrani iz grupe koju čine SopE, SopE2, SptP, YopE, ExoS, SipA, SipB, SipD, SopA, SopB, SopD, IpgB1, IpgD, SipC, SifA, SseJ, Sse, SrfH, YopJ, AvrA, AvrBsT, YopT, YopH, YpkA, Tir, EspF, TccP2, IpgB2, OspF, Map, OspG, OspI, IpaH, SspH1, VopF, ExoS, ExoT, HopAB2, XopD, AvrRpt2, HopAO1, HopPtoD2, HopU1, GALA familija proteina, AvrBs2, AvrD1, AvrBS3, YopO, YopP, YopE, YopM, YopT, EspG, EspH, EspZ, IpaA, IpaB, IpaC, VirA, IcsB, OspC1, OspE2, IpaH9.8, IpaH7.8, AvrB, AvrD, AvrPphB, AvrPphC, AvrPphEPto, AvrPpiBPto, AvrPto, AvrPtoB, VirPphA, AvrRpm1, HopPtoE, HopPtoF, HopPtoN, PopB, PopP2, AvrBs3, XopD i AvrXv3. Poželjniji T3SS efektorski proteini ili njihovi N-terminalni fragmenti su izabrani iz grupe koja se sastoji od SopE, SptP, YopE, ExoS, SopB, IpgB1, IpgD, YopJ, YopH, EspF, OspF, ExoS, YopO, YopP, YopE, YopM, YopT, pri čemu su najpoželjniji T3SS efektorski proteini ili njihovi N-terminalni fragmenti izabrani iz grupe koja se sastoji od IpgB1, SopE, SopB, SptP, OspF, IpgD, YopH, YopO, YopP, YopE, YopM, YopT, a posebno su to YopE ili njegov N-terminalni fragment.

Jednako poželjni T3SS efektorski proteini ili njihovi N-terminalni fragmenti su izabrani iz grupe koja se sastoji od SopE, SopE2, SptP, SteA, SipA, SipB, SipD, SopA, SopB, SopD, IpgB1, IpgD, SipC, SifA, SifB, SseJ, Sse, SrfH, YopJ, AvrA, AvrBsT, YopH, YpkA, Tir, EspF, TccP2, IpgB2, OspF, Map, OspG, OspI, IpaH, VopF, ExoS, ExoT, HopAB2, AvrRpt2, HopAO1, HopU1, GALA familije proteina, AvrBs2, AvrD1, YopO, YopP, YopE, YopT, EspG, EspH, EspZ, IpaA, IpaB, IpaC, VirA, IcsB, OspC1, OspE2, IpaH9.8, IpaH7.8, AvrB, AvrD, AvrPphB, AvrPphC, AvrPphEPto, AvrPpiBPto, AvrPto, AvrPtoB, VirPphA, AvrRpm1, HopPtoD2, HopPtoE, HopPtoF, HopPtoN, PopB, PopP2, AvrBs3, XopD i AvrXv3. Jednako poželjniji T3SS efektorski proteini ili njihovi N-terminalni fragmenti su izabrani iz grupe koja se sastoji od SopE, SptP, SteA, SifB, SopB, IpgB1, IpgD, YopJ, YopH, EspF, OspF, ExoS, YopO, YopP, YopE, YopT, od kojih su jednako najpoželjniji T3SS efektorski proteini ili njihovi N-terminalni fragmenti izabrani iz grupe koja se sastoji IpgB1, SopE, SopB, SptP, SteA, SifB, OspF, IpgD, YopH, YopO, YopP, YopE, and YopT, a posebno su to SopE, SteA ili YopE ili njihovi N-terminalni fragmenti, preciznije SteA ili YopE ili njihov N-terminalni fragment, a posebno YopE ili njegov N-terminalni fragment.

U pojedinim primerima izvođenja signal za isporuku iz bakterijskog T3SS efektorskog proteina kodiranog prvom DNK sekvencom sadrži bakterijski T3SS efektorski protein ili njegov N-terminalni fragment, pri čemu njegov N-terminalni fragment sadrži najmanje prvih 10, poželjno najmanje prvih 20, poželjnije najmanje prvih 100 aminokiselina bakterijskog T3SS efektorskog proteina.

U pojedinim primerima izvođenja signal za isporuku iz bakterijskog T3SS efektorskog proteina kodiranog prvom DNK sekvencom sadrži bakterijski T3SS efektorski protein ili njegov N-terminalni fragment, pri čemu bakterijski T3SS efektorski protein ili njegov N-terminalni fragment sadrži mesto vezivanja šaperona.

2

Poželjni T3SS efektorski proteini ili njihov N-terminalni fragment, koji sadrže mesto vezivanja šaperona, sadrže sledeće kombinacije mesta vezivanja šaperona i T3SS efektorskog proteina ili njegovog N-terminalnog fragmenta: SycE-YopE, InvB-SopE, SicP-SptP, SycT-YopT, SycO-YopO, SycN/YscB-YopN, SycH-YopH, SpcS-ExoS, CesF-EspF, SycD-YopB, SycD-YopD. Poželjniji su SycE-YopE, InvB-SopE, SycT-YopT, SycO-YopO, SycN/YscB-YopN, SycH-YopH, SpcS-ExoS, CesF-EspF. Najpoželjniji je YopE ili njegov N-terminalni fragment koji sadrži SycE mesto vezivanja šaperona, kao što je N-terminalni fragment YopE efektorskog proteina koji sadrži 138 aminokiseline YopE efektorskog proteina sa N-kraja, ovde označen kao YopE1-138, a koji je kao što je prikazano u SEQ ID NO.2 ili SopE ili njegov N-terminalni fragment koji sadrži InvB mesto vezivanja chaperona kao što je to N-terminalni fragment SopE efektorskog proteina koji sadrži 81 ili 105 aminokiselina SopE efektorskog proteina sa N-kraja, označen ovde kao SopE1-81ili SopE1-105, tim redom, a kao što je prikazano u SEQ ID NO.: 142 ili 143.

[0066] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije je Yersinia soj i signal za isporuku iz bakterijskog T3SS efektorskog proteina kodiranog prvom DNK sekvencom sadrži YopE efektorski protein ili njegov N-terminalni deo, a poželjno je Y. enterocolitica YopE efektorski protein ili njegov N-terminalni deo. Poželjno je da se SycE mesto vezivanja nalazi unutar N-terminalnog dela YopE efektorskog proteina koji je ovde označen kao YopE1-138, a kao što je prikazano u SEQ ID NO. 2, ili unutar SopE ili njegovog N-terminalnog fragmenta, koji sadrži mesto vezivanja InvB šaperona, kao što je N-terminalni fragment SopE efektorskog proteina koji sadrži N-terminalnih 81 ili 105 aminokiselina SopE efektorskog proteina koji su ovde označeni kao SopE1-81ili SopE1-105, tim redom, a kao što je prikazano u SEQ ID NO.: 142 ili 143.

[0067] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije je Yersinia soj i signal za isporuku iz bakterijskog T3SS efektorskog proteina kodiranog prvom DNK sekvencom sadrži YopE efektorski protein ili N-terminalni deo, poželjno YopE efektorski protein ili njegov N-terminalni deo iz Y. enterocolitica. Poželjno je i da se SycE mesto vezivanja nalazi unutar N-terminalnog dela YopE efektorskog proteina. S tim u vezi, N-terminalni fragment YopE efektorskog proteina može sadržavati 12, 16, 18, 52, 53, 80 ili 138 aminokiselina N-kraja [19-21]. Najpoželjniji je N-terminalni fragment YopE efektorskog proteina koji sadrži 138 N-terminalnih aminokiselina YopE efektorskog proteina, npr. kao što je to opisano u Forsberg i Wolf-Watz-u [22], a koji je ovde označen kao YopE1-138i koji je prikazan u SEQ ID NO.: 2.

[0068] Stručnjak iz oblasti tehnike je upoznat sa postupcima identifikovanja polipeptidnih sekvenci efektorskog proteina koje su u stanju da isporuče protein. Na primer, jedan takav postupak su opisali Sory i saradnici [16]. Ukratko, polipeptidne sekvence iz npr. raznih delova Yop proteina mogu biti fuzionisane sa reporterskim enzimom kao što je adenilat ciklazni domen koji se aktivira kalmodulinom (ili Cya) iz ciklolizina Bordetella pertussis, a tako da se zadrži okvir čitanja. Na isporuku Yop-Cya hibridnog proteina u citosol eukariotskih ćelija ukazuje pojava aktivnosti ciklaze u inficiranim eukariotskim ćelijama, što dovodi do nakupljanja cAMP-a. Korišćenjem takvog pristupa, stručnjak iz oblasti tehnike može utvrditi, ukoliko je to potrebno, zahtev za minimalnom sekvencom, tj. kontinuiranom aminokisleinskom sekvencom najkraće dužine koja je u stanju da isporuči protein, pogledati, npr. [16]. Prema tome, poželjni signali za isporuku predmetnog pronalaska se sastoje od najmanje minimalne sekvence aminokiselina T3SS efektorskog proteina koja je u stanju da isporuči protein.

[0069] U pojedinim primerima izvođenja, rekombinantni Gram-negativni bakterijski sojevi oslabljene virulencije su deficijentni u proizvodnji najmanje jednog, poželjno najmanje dva, poželjnije najmanje tri, još poželjnije najmanje četiri, a posebno poželjno najmanje pet, još više poželjno najmanje šest i najpoželjnije svih bakterijskih efektorskih proteina koji su virulentni za eukariotske ćelije, tj. rekombinantni Gram-negativni bakterijski sojevi oslabljene virulencije su oni koji su deficijentni u proizvodnji najmanje jednog, poželjno najmanje dva, poželjnije najmanje tri, još poželjnije najmanje četiri, a posebno poželjno najmanje pet, još više poželjno najmanje šest i najpoželjnije svih bakterijskih efektorskih proteina koji su virulentni za eukariotske ćelije, tako da rezultujući rekombinantan Gramnegativan bakterijski soj oslabljene virulencije proizvodi manje bakterijskih efektorskih proteina ili proizvodi bakterijske efektorske proteine u manjem obimu u poređenju sa rekombinantnim Gramnegativnim bakterijskim sojem koji nije oslabljene virulencije, tj. u poređenju sa Gram-negativnim bakterijskim sojem divljeg tipa koji normalno proizvodi bakterijske efektorske proteine, ili je rezultujući rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije takav da više ne proizvodi bilo kakve funkcionalne bakterijske efektorske proteine koji su virulentni za eukariotske ćelije.

U pojedinim primerima izvođenja, rekombinantni Gram-negativni bakterijski sojevi oslabljene virulencije za upotrebu u postupku lečenja malignog solidnog tumora kod subjekta su deficijentni u proizvodnji svih efektorskih proteina koji su virulentni za eukariotske ćelije, a signal za isporuku iz bakterijskog efektorskog proteina je signal za isporuku iz bakterijskog T3SS efektorskog proteina i heterologni protein je izabran iz grupe koja se sastoji od proteina uključenih u apoptozu ili regulaciju apoptoze.

[0070] Prema predmetnom pronalasku, takav mutiran Gram-negativan bakterijski soj, tj. takav rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije koji je deficijentan u proizvodnji najmanje jednog bakterijskog efektorskog proteina i virulentan je za eukariotske ćelije je npr. takav mutant Yersinia soja koji može biti generisan uvođenjem najmenje jedne mutacije u najmanje jedan od gena koji kodiraju efektore. Poželjno je da takvi geni koji kodiraju efektor obuhvataju YopE, YopH, YopO/YpkA, YopM, YopP/YopJ i YopT, kada se razmatra Yersinia soj. Poželjno je i da takvi geni koji kodiraju efektor uključuju AvrA, CigR, GogB, GtgA, GtgE, PipB, SifB, SipA/SspA, SipB, SipC/SspC, SipD/SspD, SlrP, SopB/SigD, SopA, SpiC/SsaB, SseB, SseC, SseD, SseF, SseG, SseI/SrfH, SopD, SopE, SopE2, SspH1, SspH2, PipB2, SifA, SopD2, SseJ, SseK1, SseK2, SseK3, SseL, SteC, SteA, SteB, SteD, SteE, SpvB, SpvC, SpvD, SrfJ, SptP, kada se razmatra Salmonela soj. Najpoželjnije je ipak da su svi geni koji kodiraju efektor deletirani. Iskusan stručnjak može koristiti bilo koji broj standardnih tehnika za generisanje mutacija u ovim T3SS efektorskim genima. Sambrook i saradnici opisuju uopšteno ovakve tehnike. Pogledati Sambrook i saradnici [23].

U skladu sa predmetnim pronalaskom, mutacija može biti generisana u promotorskom regionu gena koji kodira efektor, tako da se ukida ekspresija takvog efektorskog gena. Mutacija takođe može biti generisana u kodirajućem regionu gena koji kodira efektor tako da se ukine katalitička aktivnost kodiranog efektorskog proteina. "Katalitička aktivnost" efektorskog proteina se odnosi normalno na funkciju efektorskog proteina u kontektu dejstva na ciljne ćelije, tj. toksičnost. Takva aktivnost je regulisana katalitičkim motivima u katalitičkom domenu efektorskog proteina. Pristupi za identifikovanje katalitičkog domena i/ili katalitičkih motiva efektorskog proteina su dobro poznati stručnjacima iz oblasti tehnike. Pogledati, na primer, [24,25].

1

Shodno navedenom, jedna poželјna mutacija predmetnog pronalaska je delecija celokupnog katalitičkog domena. Druga poželjna mutacija je mutacija tipa pomeraja okvira čitanja u genu koji kodira efektor, tako da katalitički domen nije prisutan u proteinskom proizvodu eksprimiranom sa takvog gena sa “pomerenim okvirom čitanja”. Najpoželјnija mutacija je mutacija sa delecijom celokupnog kodirajućeg regiona efektorskog proteina. Predmetni pronalazak takođe razmatra ostale mutacije, kao što su male delecije ili supstitucije baznih parova, koje se uvode u katalitičke motive efektorskog proteina i vode poništavanju katalitičke aktivnosti datog efektorskog proteina.

Mutacije koje su generisane u genima funkcionalnih bakterijskih efektorskih proteina, mogu biti uvedene u određen soj putem brojnih postupaka. Jedan takav postupak uključuje kloniranje mutiranog gena u vektor za "samoubistvo" koji je u stanju da uvede mutiranu sekvencu u soj putem alelske izmene. Primer takvog vektora za “samoubistvo” je opisan u [26].

Na ovaj način, mutacije generisane u višestrukim genima mogu biti sukcesivno uvedene u Gramnegativan bakterijski soj čime se stvara polimutant, npr. šesterostruko mutiran rekombinantni soj. Redosled uvođenja ovih mutiranih sekvenci nije od važnosti. U pojedinim okolnostima, može biti poželjno da se mutira samo neki, ali ne svi od efektorskih gena. Prema tome, predmetni pronalazak dalјe razmatra polimutanta Yersinia koji je drugačiji od šesterostrukog mutanta Yersinia, npr. dvostruko mutirane, trostruko mutirane, četvorostruko mutirane i petostruko mutirane sojeve. U cilju isporuke proteina, sistem sekrecije i translokacije datog mutiranog soja mora ostati intaktan.

Poželјan rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije predmetnog pronalaska je šestostruki mutant Yersinia soja, u kome su mutirani svi geni koji kodiraju efektore, tako da je rezultat Yersinia soj koji više ne proizvodi nijedan od funkcionalanih efektorskih proteina. Takav šestostruko mutiran Yersinia soj je označen kao ΔyopH,O,P,E,M,T za Y.enterocolitica. Kao jedan od primera može poslužiti činjenica da takav šestostruki mutant može biti proizveden iz Y.enterocolitica MRS40 soja čime se dobija Y.enterocolitica MRS40 ΔyopH,O,P,E,M,T, (ovde takođe nazvan Y. enterocolitica podvrste palearctica MRS40 ΔyopH,O,P,E,M,T) koji je poželjan. Jednako poželjan je i Y. enterocolitica MRS40 ΔyopH,O,P,E,M,T Δasd (ovde takođe nazvan Y. enterocolitica podvrste palearctica MRS40 ΔyopH,O,P,E,M,T Δasd).

[0071] Vektori koji mogu biti upotrebljeni prema pronalasku za transformisanje Gram-negativnog bakterijskog soja, zavise od vrste Gram-negativnih bakterijskih sojeva koji se upotrebljava, kao što je poznato stručnjaku. Promotor, heterologni protein i mesto cepanja proteaze koji su ovde opisani, mogu biti upotrebljeni za vektor rekombinantnog Gram-negativnog bakterijskog soja oslabljene virulencije. Vektori koji mogu biti upotrebljeni prema pronalasku obuhvataju ekspresione vektore (uključujući sintetske ili na drugi način proizvedene modifikovane verzije endogenih plazmida virulencije), vektore za inserciju u hromozome ili plazmide virulencije i fragmente DNK za inserciju u hromozome ili plazmide virulencije. Ekspresioni vektori koji su korisni za npr. Yersinia, Escherichia, Salmonella ili Pseudomonas soj su npr. pUC, pBad, pACYC, pUCP20 i pET plazmidi. Vektori za inserciju u hromozome ili plazmide virulencije koji su korisni za npr. Yersinia, Escherichia, Salmonella ili Pseudomonas soj su oni poput npr. pKNG101. Fragmenti DNK za inserciju u hromozome ili plazmide virulencije se odnose na postupke upotrebljene za npr. Yersinia, Escherichia, Salmonella ili Pseudomonas soj, kao što je npr. genetički inženjering sa lambda-crvenim. Vektori za inserciju u hromozome ili plazmide virulencije, ili fragmenti DNK za inserciju u hromozome ili plazmide virulencije, mogu insertovati prvu, drugu i/ili treću DNK sekvencu predmetnog pronalaska tako da je prva, druga

2

i/ili treća DNK sekvenca operativno povezana sa endogenim promotorom rekombinantnog Gramnegativnog bakterijskog soja oslabljene virulencije. Stoga, ukoliko se upotrebljava vektor za inserciju u hromozome ili plazmide virulencije, ili DNK fragment za inserciju u hromozome ili plazmide virulencije, endogeni promotor može biti kodiran na endogenoj bakterijskoj DNK (hromozomskoj ili plazmidnoj DNK) i samo će prva i druga DNK sekvenca biti obezbeđene konstruisanim vektorom za inserciju u hromozome ili plazmide virulencije, ili će biti obezbeđen fragment DNK za inserciju u hromozome ili plazmide virulencije. Alternativno, ukoliko se upotrebljava vektor za inserciju u hromozome ili plazmide virulencije, ili nukleotidni molekul kao što je npr. DNK sekvenca za inserciju u hromozome ili plazmide virulencije, endogeni promotor i signal za isporuku iz bakterijskog efektorskog proteina mogu biti kodirani na endogenoj bakterijskoj DNK (hromozomskoj ili plazmidnoj DNK) i samo će nukleotidni molekul, kao što je npr. DNK sekvenca koja kodira heterologni protein, biti obezbeđena vektorom za inserciju u hromozome ili plazmide virulencije ili sa nukleotidnim molekulom kao što npr. DNK sekvenca za inserciju u hromozome ili plazmide virulencije. Prema tome, nije neophodno da promotor bude sadržan u vektoru koji se upotrebljava za trasformaciju rekombinantnih Gramnegativnih bakterijskih sojeva oslabljene virulencije, tj. rekombinantni Gram-negativan bakterijski sojevi oslabljene virulencije predmetnog pronalaska mogu biti transformisani vektorom koji ne sadrži promotor.

U poželjnom primeru izvođenja, vektor predmetnog pronalaska sadrži, u smeru od 5’ ka 3’:

prvu DNK sekvencu koja kodira signal za isporuku ili njegov fragment iz bakterijskog efektorskog proteina;

drugu DNK sekvencu koja kodira heterologni protein fuzionisan sa 3' krajem navedene prve sekvence DNK tako da se zadrži okvir čitanja.

[0072] Poželјan vektor, npr. poželjan ekspresioni vektor za Yersinia soj je izabran iz grupe koja se sastoji od pBad_Si_1 i pBad_Si_2. pBad_Si2 je konstruisan kloniranjem SycE-YopE1-138fragmenta koji sadrži endogene promotore za YopE i SycE iz prečišćenog pYV40, u KpnI/HindIII mesto pBad-MycHisA (Invitrogen). Dodatne modifikacije podrazumevaju uklanjanje NcoI/BglII fragmenta iz pBad-MycHisA digestijom, tretman Klenovim fragmentom i ponovnu ligaciju. Dodatno, na 3’ kraj YopE1-138mogu biti dodata sledeća mesta za cepanje: XbaI-XhoI-BstBI-(HindIII). pBad_Si1 je jednak pBad_Si2, ali kodira EGFP amplifikovan iz pEGFP-C1 (Clontech) na NcoI/BglII mestu, pod kontrolom promotora koji se indukuje arabinozom. Podjednako poželjna je upotreba modifikovanih vezija endogenog plazmida virulencije pYV iz Yersinia, koji kodira heterologne proteine kao fuzije sa T3SS signalnom sekvencom. Poželјan vektor, npr. poželjan ekspresioni vektor za Salmonella soj je izabran iz grupe koja se sastoji od pSi_266, pSi_267, pSi_268 i pSi_269. Plazmidi pSi_266, pSi_267, pSi_268 i pSi_269 koji sadrže odgovarajući endogeni promotor i SteA1-20fragment (pSi _266), SteA sekvencu pune dužine (pSi_267), SopE1-81fragment (pSi_268) ili SopE1-105fragment (pSi_269), amplifikovani su iz genomske DNK S. enterica SL1344 i klonirani su u NcoI/KpnI mesto pBad-MycHisA (Invitrogen).

Vektori predmetnog pronalaska mogu sadržavati druge elemente sekvenci, kao što je sekvenca 3’ terminacije (uklјučujući stop-kodon i poli A sekvencu), ili gen koji obezbeđuje rezistenciju na lek, a što omogućava selekciju tranformisanih bakterija koje su primile predmetni vektor. Vektori predmetnog pronalaska mogu biti transformisani u rekombinantne Gram-negativne bakterijske sojeve oslabljene virulencije brojnim poznatim postupcima. Za svrhe predmetnog pronalaska, postupci transformacije za uvođenje vektora obuhvataju, ali nisu ograničeni na, elektroporaciju, transformaciju posredovanu kalcijum fosfatom, konjugaciju ili njihove kombinacije. Na primer, vektor može biti transformisan u prvi bakterijski soj standardnom procedurom elektroporacije. Nakon toga, takav vektor može biti prebačen iz prvog bakterijskog soja u željeni soj konjugacijom, procesom koji se takođe naziva "mobilizacija". Transformisan soj (tj. Gram-negativni bakterijski sojevi koji su preuzeli vektor) može biti selektovan, npr. sa antibioticima. Ovakve tehnike su dobro poznate u oblasti tehnike. Pogledati, na primer, [16].

[0073] U skladu sa predmetnim pronalaskom, promotor ekspresionog vektora rekombinantnog Gramnegativnog bakterijskog soja oslabljene virulencije pronalaska može biti nativan promotor T3SS efektorskog proteina odgovarajućeg soja ili kompatibilnog bakterijskog soja, ili to može biti promotor koji se upotrebljava u ekspresionim vektorima koji su korisni za npr. Yersinia, Escherichia, Salmonella ili Pseudomonas soj npr. pUC i pBad. Takvi promotori su T7 promotor, Plac promotor ili Ara-bad promotor koji se može indukovati arabinozom.

Ukoliko je rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije Yersinia soj, promotor može biti iz virulonskog gena Yersinia. "Virulonski gen Yersinia " se odnosi na gene pYV plazmida iz Yersinia, čija je ekspresija pod kontrolom i temperature i kontakta sa cilјanom ćelijom. Takvi geni obuhvataju gene koji kodiraju elemente mašinerije za sekreciju (Ysc gene), gene koji kodiraju translokatore (YopB, YopD i LcrV), gene koji kodiraju kontrolne elemente (YopN, TyeA i LcrG), gene koji kodiraju T3SS efektorske šaperone (SycD, SycE, SycH, SycN, SycO i SycT) i gene koji kodiraju efektore (YopE, YopH, YopO/YpkA, YopM, YopT i YopP/YopJ), kao i druge proteine kodirane sa pYV, kao što su VirF i YadA.

U poželјnom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, promotor je nativni promotor gena koji kodira funkcionalan T3SS efektor. Ukoliko je rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije Yersinia soj, promotor je izabran od bilo kog od promotora iz YopE, YopH, YopO/YpkA, YopM i YopP/YopJ. Poželјnije je da je promotor iz YopE ili SycE.

Ukoliko je rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije Salmonella soj, promotor može biti iz SpiI ili SpiII ostrva patogenosti ili iz efektorskog proteina koji je kodiran negde drugde. Takvi geni obuhvataju gene koji kodiraju elemente mašinerije za sekreciju, gene koji kodiraju translokatore, gene koji kodiraju kontrolne elemente, gene koji kodiraju T3SS efektorske šaperone i gene koji kodiraju efektore, kao i druge proteine kodirane sa SPI-1 ili SPI-2. U poželјnom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, promotor je nativni promotor gena koji kodira funkcionalan T3SS efektor. Ukoliko je rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije Salmonella soj, promotor je izabran od bilo kog od promotora efektorskih proteina. Poželјnije je da je promotor iz SopE, InvB ili SteA.

[0074] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, vektor, npr. ekspresioni vektor, sadrži DNK sekvencu koja kodira mesto cepanja za proteazu. Generisanje funkcionalnog i generalno primenjivog mesta cepanja omogućava isecanje signala za isporuku nakon translokacije. Pošto signal za isporuku može ometati ispravnu lokalizaciju i/ili funkciju translociranog proteina unutar cilјnih ćelija, uvođenje mesta cepanja za proteaze između signala za isporuku i proteina od interesa obezbeđuje, po prvi put, isporuku gotovo nativnih proteina u eukariotske ćelije. Poželјno mesto cepanja proteaze je aminokiselinski motiv koji se iseca proteazom ili njenim katalitičkim domenima, izabran iz grupe koja se sastoji od enterokinaze (lakog lanca), enteropeptidaze, presizicione proteaze, humane rinovirusne proteaze 3C, TEV proteaze, TVMV proteaze, proteaze FaktoraXa i trombina, a

4

poželјnije je to aminokiselinski motiv koji se cepa TEV proteazom. Jednako poželјno mesto cepanja proteazom je aminokiselinski motiv koji se cepa proteazom ili njenim katalitičkim domenima izabranim iz grupe proteaza koja se sastoji od enterokinaze (lakog lanca), enteropeptidaze, presizicione proteaze, humane rinovirusne proteaze 3C, TEV proteaze, TVMV proteaze, proteaze FaktoraXa, proteaze za obradu ubikvitina, nazvane deubikvitinacionim enzimima, i trombina. Najpoželјniji je aminokiselinski motiv koji se cepa TEV proteazom ili proteazom obrade ubikvitina.

Tako, u dodatnom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, heterologni protein se odvaja od signala za isporuku iz bakterijskog T3SS efektorskog proteina dejstvom proteaze. Poželјni postupci cepanja su postupci gde:

a) proteaza se transportuje u eukariotsku ćeliju rekombinantnim Gram-negativnim bakterijskim sojem oslabljene virulencije, kao što je ovde opisano, koji eksprimira fuzionisani protein koji sadrži signal za isporuku bakterijskog T3SS efektorskog proteina i proteazu kao heterologni protein; ili

b) proteaza se konstitutivno ili tranzientno eksprimira u eukariotskoj ćeliji.

Obično su rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije koji se upotrebljava za isporuku želјenog proteina u eukariotsku ćeliju, i rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije koji prenosi proteazu u eukariotsku ćeliju, različiti.

[0075] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, vektor sadrži dodatnu DNK sekvencu koja kodira molekul obeleživača, ili akceptorsko mesto za molekul obeleživača. Dodatna DNK sekvenca koja kodira molekul obeleživača, ili akceptorsko mesto za molekul obeleživača, obično se fuzioniše sa 5’ krajem ili aa 3' krajem druge DNK sekvence. Poželјan molekul za obeležavanje, ili akceptorsko mesto za molekul obeleživača, izabrani su iz grupe koja se sastoji od zelenog fluorescentnog proteina pojačane fluorescencije (EGFP), kumarina, akceptorskog mesta za kumarin ligazu, rezorufina, akceptorskog mesta za rezorufin ligazu, tetra-cisteinskog motiva pri upotrebi FlAsH/ReAsH boje (Life technologies). Najpoželјniji su rezorufin i akceptorsko mesto za rezorufin ligazu ili EGFP. Upotreba molekula obeleživača ili akceptorskog mesta za molekul obeleživača će dovesti do vezivanja molekula obeleživača za heterologni protein od interesa, koji će tada biti isporučen kao takav u eukariotsku ćeliju i što će omogućiti praćenje proteina npr. ćelijskom mikroskopijom uživo.

[0076] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, vektor sadrži dodatnu DNK sekvencu koja kodira peptidni tag. Dodatna DNK sekvenca koja kodira peptidni tag je obično fuzionisana sa 5’ krajem ili 3' krajem druge DNK sekvence. Poželјan peptidni tag je izabran iz grupe koja se sastoji od Myc-taga, His-taga, Flag-taga, HA taga, Strep-taga ili V5 taga ili kombinacije dva ili više tagova iz ove grupe. Najpoželјniji su Myc-tag, Flag-tag, His-tag i kombinacija Myc- i His-tagova. Upotreba peptidnog taga će dovesti do mogućnosti praćenja tag-obeleženog proteina, npr. imunofluorescencijom ili imunoblot analizom, upotrebom antitela na tag-obeleživač. Nadalјe, upotreba peptidnog taga omogućava afinitetno prečišćavanje želјenog proteina, bilo nakon sekrecije u supernatant kulture ćelija ili nakon translokacije u eukariotske ćelije, u oba slučaja upotrebom postupka prečišćavanja koji je pogodan za odgovarajući tag (npr. metal-helatno afinitetnog prečišćavanja pri upotrebi prečišćavanja zasnovanog na His-tagu ili anti-Flag antitelu prilikom upotrebe Flag-taga).

[0077] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, vektor sadrži dodatnu DNK sekvencu koja kodira signal lokalizacije u jedro (NLS). Dodatna DNK sekvenca koja kodira signal lokalizacije u jedro (NLS) se obično fuzioniše sa 5'-krajem ili 3'-krajem druge DNK sekvence, pri čemu navedena dodatna DNK sekvencija kodira signal lokalizacije u jedro (NLS). Poželјni NLS je izabran iz grupe koju čine NLS velikog T-antigena iz SV40 i njegovi derivati [27], kao i drugi virusni NLS. Najpoželјniji su NLS iz velikog T-antigena SV40 i njegovi derivati.

[0078] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, vektor sadrži mesto višestrukog kloniranja. Mesto višestrukog kloniranja se obično nalazi na 3’ kraju prve DNK sekvence i/ili na 5' kraju ili 3' kraju druge DNK sekvence. Vektor može sadržavati jedno ili više od mesta višestrukog kloniranja. Poželјno mesto višestrukog kloniranja je izabrano iz grupe mesta za restrikcione enzime koji podrazumevaju mesta za XhoI, XbaI, HindIII, NcoI, NotI, EcoRI, EcoRV, BamHI, NheI, SacI, SalI, BstBI. Najpoželјnije je upotreba XbaI, XhoI, BstBI i HindIII.

[0079] Fuzioni protein eksprimiran sa prve i druge, a opciono i treće DNK sekvence vektora takođe se označava kao "fuzioni protein" ili "hibridni protein", tj. fuzioni je protein ili hibrid signala za isporuku i heterolognog proteina. Fuzioni protein može takođe sadržavati npr. signal za isporuku i dva ili više različitih heterolognih proteina.

[0080] Predmetni pronalazak razmatra postupke za isporuku heterolognih proteina, kao što je ovde prethodno opisano, u ćelije malignih solidnih tumora. Proteini mogu biti isporučeni, tj. translocirani u ćeliju malignog solidnog tumora u vreme primene rekombinantnog Gram-negativnog bakterijskog soja oslabljene virulencije subjektu ili mogu biti isporučeni, tj. translocirani u ćeliju malignog solidnog tumora kasnije, npr. nakon što je rekombinantan Gram-negativni bakterijski soj oslabljene virulencije stigao do mesta malignog solidnog tumora i/ili stigao do mesta malignog solidnog tumora i umnožio se, kao što je prethodno opisano. Vreme isporuke može biti regulisano, npr. promotorom upotrebljenim da se heterologni proteini eksprimiraju u rekombinantnom Gram-negativnom bakterijskom soju oslabljene virulencije. U prvom slučaju, bilo konstitutivni promotor ili, još poželjnije, endogeni promotor bakterijskog efektorskog proteina može pokrenuti ekspresiju heterolognog proteina. U slučaju odložene isporuke proteina, veštački inducibilan promotor, kao što je to promotor koji se indukuje arabinozom, može pokrenuti ekspresiju heterolognog proteina. U ovom slučaju, arabinoza će biti primenjena subjektu nakon što bakterije stigne i akumulira se na željenom mestu. Arabinoza će tada indukovati bakterijsku ekspresiju proteina koga je potrebno isporučiti.

[0081] Shodno navedenom, u jednom primeru izvođenja, postupak za isporuku heterolognih proteina u ćelije malignog solidnog tumora obuhvata

i) kultivisanje rekombinantnog Gram-negativnog bakterijskog soja oslabljene virulencije kao što je ovde opisano;

ii) dovođenje ćelije malignog solidnog tumora u kontakt sa rekombinantnim Gram-negativnim bakterijskim sojem oslabljene virulencije iz i), pri čemu se fuzioni protein, koji sadrži signal za isporuku iz bakterijskog efektorskog proteina i heterologni protein, eksprimira od strane rekombinantnog Gram-negativnog bakterijskog soja oslabljene virulencije i translocira se u ćeliju malignog solidnog tumora; i opciono

iii) cepanje fuzionog proteina tako da se heterologni protein isecanjem odvaja od signala za isporuku iz bakterijskog efektorskog proteina unutar ćelije malignog solidnog tumora.

[0082] U pojedinim primerima izvođenja, najmanje dva fuziona proteina, od kojih svaki sadrži signal za isporuku iz bakterijskog efektorskog proteina i heterologni protein, eksprimirani su od strane rekombinantnog Gram-negativnog bakterijskog soja oslabljene virulencije i translokacijom se prebacuju u eukariotsku ćeliju postupcima predmetnog pronalaska.

[0083] Rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije može biti kultivisan tako da se eksprimira fuzioni protein koji sadrži signal za isporuku bakterijskog efektorskog proteina i heterologni protein, u skladu sa postupcima poznatim u oblasti tehnike (npr. FDA, Bacteriological Analytical Manual (BAM), poglavlјe 8: Yersinia enterocolitica). Poželјno, rekombinantan Gramnegativan bakterijski soj oslabljene virulencije može biti kultivisan u BHI medijumu (od engl. Brain Heart infusion broth), npr. na 28°C. Za indukciju ekspresije T3SS i npr. gena koji su uslovljeni sa YopE/SycE promotorom, bakterije mogu biti gajene na 37°C.

[0084] U jednom primeru izvođenja, ćelija malignog solidnog tumora se dovodi u kontakt dva rekombinantna Gram-negativna bakterijska soja oslabljene virulencije iz i), pri čemu prvi rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije eksprimira prvi fuzioni protein koji sadrži signal za isporuku iz bakterijskog T3SS efektorskog proteina i prvi heterologni protein, dok drugi rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije eksprimira drugi fuzioni protein koji sadrži signal za isporuku iz bakterijskog efektorskog proteina i drugi heterologni protein, tako da se prvi i drugi fuzioni protein translokacijom premeštaju u ćeliju malignog solidnog tumora. Ovakav primer izvođenja obezbeđuje istovremenu infekciju, npr. ćelije malignog solidnog tumora, sa dva bakterijska soja, kao validan postupak za isporuku npr. dva različita hibridna proteina u pojedinačne ćelije, a da bi se ispitala njihova fukcionalna interakcija.

[0085] Stručnjaci iz oblasti tehnike takođe mogu upotrebiti brojne testova za određivanje da li je isporuka fuzionog proteina uspešna. Na primer, fuzioni protein može biti detekovan imunofluorescencijom, upotrebom atitela koja prepoznaju fuzionisani tag (poput Myc-taga). Testovi takođe mogu biti zasnovani na enzimskoj aktivnosti proteina koji se isporučuje, npr. kao što je test opisan u [16].

[0086] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije, za upotrebu u postupku lečenja malignog solidnog tumora kod subjekta, pri čemu se rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije nakuplja u malignom solidnom tumoru.

[0087] Rekombinantne Gram-negativne bakterije oslabljene virulencije se mogu kombinovati sa drugim agensima radi pogodne i efektivne primene, u količini koja je dovoljna za lečenje subjekta, u vidu farmaceutske kompozicije sa pogodnim farmaceutski prihvatljivim nosačem. Jedinični dozni oblik rekombinantnih Gram-negativnih bakterija oslabljene virulencije ili farmaceutske kompozicije koja će se primeniti može, na primer, sadržavati rekombinantne Gram-negativne bakterije oslabljene virulencije u količini od oko 10<5>do oko 10<9>bakterija po ml, poželjno od oko 10<6>do oko 10<8>bakterija po ml, poželjnije od oko 10<7>do oko 10<8>bakterija po ml i najpoželjnije oko 10<8>bakterija po ml.

[0088] Pod "količinom koja je dovoljna za lečenje subjekta" ili "efektivnom količinom", koje se ovde upotrebljavaju naizmenično, podrazumeva se količina bakterije ili bakterija koja je dovoljno visoka da značajno pozitivno modifikuje stanje koje je potrebno lečiti, ali i da je dovoljno mala da se izbegnu ozbiljna sporedna dejstva (sa razumnim odnosom koristi/rizika), u skaldu sa dobrom medicinksom procenom. Efektivna količina bakterije će varirati u zavisnosti od određenog cilja koji se želi postići, starosti i fizičkog stanja subjekta koji se leči, trajanja lečenja, prirode istovremene terapije i specifične bakterije koja se upotrebljava. Efektivna količina bakterije će tako biti minimalna količina koja će obezbediti željeni efekat. Količina koja se primenjuje subjektu obično iznosi od oko 10<5>do oko 10<9>bakterije npr. od oko 10<5>do oko 10<9>bakterija/m<2>površine tela, poželjno od oko 10<6>do oko 10<8>bakterija npr. od oko 10<6>do oko 10<8>bakterija/m<2>površine tela, poželjnije od oko 10<7>do oko 10<8>bakterija npr. od oko 10<7>do oko 10<8>bakterija/m<2>površina tela, najpoželjnije 10<8>bakterije npr. 10<8>bakterija/m<2>površine tela.

[0089] Jedna doza rekombinantnog Gram-negativnog bakterijskog soja oslabljene virulencije za primenu kod subjekta, npr. čoveka, za lečenje malignog solidnog tumora obično iznosi od oko 10<4>do oko 10<10>bakterija npr. od oko 10<4>bakterija/m<2>površine tela do oko 10<10>bakterija/m<2>površine tela, poželjno od oko 10<5>do oko 10<9>bakterija npr. od oko 10<5>do oko 10<9>bakterija/m<2>površine tela, poželjnije od oko 10<6>do oko 10<8>bakterija npr. od oko 10<6>do oko 10<8>bakterija/m<2>površine tela, još poželjnije od oko 10<7>do oko 10<8>bakterija npr. od oko 10<7>do oko 10<8>bakterija/m<2>površina tela i najpoželjnije 10<8>bakterije npr. 10<8>bakterija/m<2>površine tela od ukupnih rekombinantnih Gramnegativnih bakterija oslabljene virulencije.

[0090] Primeri supstanci koje mogu da posluže kao farmaceutski nosači su šećeri, poput laktoze, glukoze i saharoze; skrobovi poput kukuruznog i skroba krompira; celuloza i njeni derivati poput natrijum karboksimeticeluloze, etilceluloze i celuloznih acetata; tragankant u prahu; slad; želatin; talk; stearinske kiseline; magnezijum stearat; kalcijum sulfat; kalcijum karbonat; biljna ulja, kao što su ulja kikirikija, ulje semenki pamuka, susamovo ulje, maslinovo ulje, kukuruzno ulje i ulje teobroma; polioli kao što su propilen glikol, glicerin, sorbitol, manitol i polietilen glikol; agar; alginske kiseline; voda oslobođena pirogena; izotoničan fiziološki rastvor; ekstrakti brusnice i fosfatom puferisan fiziološki rastvor; obrano mleko u prahu; kao i druge netoksične kompatibilne supstance koje se upotrebljavaju u farmaceutskim formulacijama poput vitamina C, estrogena i ehinacee, na primer. Takođe mogu biti prisutni sredstva za vlaženje i lubrikanti, kao što je natrijum lauril sulfat, kao i agensi za boju, arome, lubrikanti, eksipijensi, agensi za tabletiranje, stabilizatori, antioksidansi i konzervansi.

[0091] Načini primenje rekombinantnih Gram-negativnih bakterija oslabljene virulencije subjektu mogu biti izabrani iz grupe koja se sastoji od intravenske, intratumorske, intraperitonealne i per-oralne primene. Iako nije predviđeno da predmetni pronalazak bude ograničen na bilo koji određeni način primene, poželjna je intravenska ili intratumorska primena bakterija ili farmaceutskih kompozicija.

U zavisnosti od puta primene, može biti potrebno da aktivni sastojci koji sadrže bakterije budu obloženi materijalom da bi se navedeni organizmi zaštitili od delovanja enzima, kiselina i drugih prirodnih uslova koji mogu inaktivirati navedene organizme. Da bi se bakterije primenjivale drugačije od parenteralne primene, one bi trebale biti obložene, ili da budu primenjivane sa materijalom koji bi sprečio inaktivaciju. Na primer, bakterije mogu biti istovremeno primenjene sa inhibitorima enzima ili u lipozomima. Inhibitori enzima obuhvataju inhibitore tripsina pankreasa, diizopropilfluorofosfat (DFP) i trazilol. Lipozomi uključuju P40 emulzije tipa voda-u-ulju-u-vodi, kao i konvencionalne i posebno dizajnirane lipozome koji transportuju bakterije, poput Lactobacillus-a, ili njihove nusproizvode, do unutrašnjeg ciljnog mesta subjekta domaćina. Jedna bakterija može biti primenjena samostalno ili zajedno sa drugom, različitom bakterijom. Bilo koji broj različitih bakterija može biti upotrebljen zajedno. Pod izrazom „zajedno sa“ se podrazumeva zajednička, suštinski simultana ili sekvencijalna primena. Kompozicije mogu takođe biti primenjene u obliku tablete, pilule ili kapsule, na primer, kao što je to liofilizovana kapsula koja sadrži bakterije ili farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska, ili kao smrznuti rastvor bakterija ili farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska koje sadrže DMSO ili glicerol. Drugi poželjan oblik primene uključuje pripremu liofilizovane kapsule bakterija ili farmaceutskih kompozicija predmetnog pronalaska. Još jedan poželjan oblik primene uključuje pripremu toplotom osušene kapsule bakterija ili farmaceutskih kompozicija predmetnog pronalaska.

[0092] Rekombinantne Gram-negativne bakterije oslabljene virulencije ili farmaceutska kompozicija koju je potrebno primeniti, mogu biti primenjene injeciranjem. Oblici pogodni za upotrebu injeciranjem uključuju sterilne vodene rastvore (kada su rastvorljivi u vodi) ili disperzije, kao i sterilne praškove za pravovremenu pripremu sterilnih injekcionih rastvora ili disperzije. U svim slučajevima, oblik mora biti sterilan i mora biti tečan do obima kojim je omogućena laka primena špricem. Oblik mora biti i stabilan u uslovima proizvodnje i skladištenja. Nosač može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol, tečni polietilen glikol i slično), njihove odgovarajuće smeše i biljna ulja. Odgovarajuća fluidnost se može održavati, na primer, upotrebom premaza kao što je lecitin, kao i održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije. U mnogim slučajevima bi bilo poželjno uključiti izotonične agense, na primer, šećere ili natrijum hlorid. Produžena apsorpcija kompozicija za injeciranje se može postići upotrebom sredstava koja u kompozicijama odlažu apsorpciju, na primer, aluminijum monostearata i želatina.

[0093] U pojedinim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije se primenjuje subjektu istovremeno sa sideroforom. Ovakvi primeri izvođenja su poželjni. Siderofori koji mogu biti istovremeno primenjeni su siderofori koji uključuju hidroksamat, kateholat i mešovite ligandne siderofore. Poželjni siderofori su Deferoksamin (poznat i kao desferioksamin B, desferoksamin B, DFO-B, DFOA, DFB ili desferal), Desferioksamin E, Deferaziroks (Eksjade, Deziroks, Defrijet, Dezifer) i Deferipron (Feriproks), mada je poželjniji Deferoksamin. Deferoksamin je bakterijski siderofor koga proizvodi Aktinobacterija Streptomices pilosus, a komercijalno je dostupan od npr. kompanije Novartis Pharma Schweiz AG (Švajcarska).

Istovremena primena sa sideroforom može podrazumevati primenu pre, istovremeno sa ili nakon primene rekombinantanog Gram-negativnog bakterijskog soja oslabljene virulencije. Poželjno je da se siderofor primenjuje pre primene rekombinantnog Gram-negativnog bakterijskog soja oslabljene virulencije, a poželjnije je da se primenjuje najmanje 1 sat, poželjno najmanje 6 sati, još poželjnije najmanje 12 sati i posebno poželjno najmanje 24 sata pre primene rekombinantanog Gramnegativnog bakterijskog soja oslabljene virulencije subjektu. U posebnom primeru izvođenja, subjekat se prethodno, 24 sata pre infekcije sa rekombinantnim Gram-negativnim bakterijskim sojem oslabljene virulencije,, tretira desfreoksaminom, da bi se omogućio rast bakterija. Siderofor se obično primenjuje istovremeno, u jednoj dozi od oko 0,5x10<-5>Mol do oko 1x10<-3>Mol, poželjnije od oko 1x10<-5>Mol do oko 1x10<-4>Mol, još poželjnije od oko 3,5x10<-5>Mol do oko 1,1x10<-4>Mol po kg telesne težine. Desferoksamin se pak obično primenjuje istovremeno u jednoj dozi od oko 20 mg do oko 60 mg, poželjno od oko 20 mg do oko 60 mg po kg telesne težine.

Dozni režimi primene rekombinantnog Gram-negativnog bakterijskog soja oslabljene virulencije, ili farmaceutske kompozicije koja je vode opisana, variraće u zavisnosti od određenog cilja koji se želi postići, starosti i fizičkog stanja subjekta koji se leči, trajanja lečenja, prirode istovremene terapije i specifične bakterije koja se upotrebljava, kao što je to poznato stručnjaku. Rekombinantan Gramnegativan bakterijski soj oslabljene virulencije se obično primenjuje subjektu prema doznom režimu koji se sastoji od jedne doze na svakih 2-20 dana, poželjno na svakih 6-10 dana, poželjnije na svakih 7-9 dana, i poželjno prema doznom režimu koji se sastoji od primene jedne doze na svakih 2-8 nedelja, poželjno na svakih 2-6 nedelja, još poželjnije na svake 3-4 nedelje. Period primene je obično oko 20 do oko 60 dana, poželjno oko 30-40 dana. Alternativno, period primene je obično oko 8 do oko 32 nedelje, poželjno oko 8 do oko 24 nedelje, još poželjnije oko 12 do oko 16 nedelja.

[0094] U daljem primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje komplet za lečenje malignih solidnih tumora, poželjno kod ljudi. Takvi kompleti će generalno sadržavati rekombinantan Gramnegativan bakterijski soj oslabljene virulencije ili farmaceutsku kompoziciju koji su ovde opisani, kao i uputstva za upotrebu kompleta. U pojedinim primerima izvođenja, kompleti sadrže nosač, pakovanje ili kontejner koji je pregrađen tako da prima jednu ili više posuda kao što su bočice, epruvete i slično, a svaka od posuda sadrži jedan od razdvojenih elemenata koji će biti upotrebljeni u postupku koji je ovde opisan. Pogodne posude obuhvataju, na primer, boce, bočice, špriceve i epruvete. U drugim primerima izvođenja, posude su napravljene od različitih materijala poput stakla ili plastike.

Primeri

Primer 1:

A) Materijali i metode

[0095] Sojevi bakterija i uslovi rasta. Sojevi upotrebljavani u ovoj studiji su navedeni u vidu liste na Slikama od 14A do N. E. coli Top10, upotrebljavana za prečišćavanje i kloniranje plazmida, i E. coli Sm10 λ pir, upotrebljavana za konjugaciju, kao i E. coli BW19610 [28], upotrebljavana za propagaciju pKNG101, rutinski su gajene na LB agaroznim podlogama i u LB bujonu na 37°C. Ampicilin je upotrebljavan u koncentraciji od 200 µg/ml (Yersinia) ili 100 µg/ml (E. coli), da bi se selektovali ekspresioni vektori. Streptomicin je upotrebljavan u koncentraciji od 100 µg/ml da bi se selektovali vektori za “samoubistvo”. Y.enterocolitica MRS40 (O:9, biotipa 2) [17], derivat E40 koji nije rezistentan na ampicilin [16] i sojevi koji su izvedeni iz njega, rutinski su gajeni na BHI podlozi (Difco), na sobnoj temperaturi. Svim sojevima Y.enterocolitica je zatim dodata nalidiksična kiselina (35 µg/ml), a svim Y.enterocolitica asd sojevima je dodatno, u vidu suplementa, dodato po 100 µg/ml mezo-2,6-diaminopimelinske kiseline (mDAP, Sigma Aldrich). S. enterica SL1344 su rutinski gajene na LB agaroznoj podlozi i u LB bujonu na 37°C. Ampicilin je upotrebljavan u koncentraciji od 100 µg/ml da bi se selektovali ekspresioni vektori u S. enterica.

[0096] Genetičke manipulacije za Y.enterocolitica. Genetičke manipulacije za Y.enterocolitica su prethodno opisane [29, 30]. Ukratko, mutatori za modifikaciju ili deleciju gena u pYV plazmidima ili na hromozomu su konstruisani upotrebom PCR postupka sa 2 preklapajuća fragmenta, upotrebom prečišćenog pYV40 plazmida ili genomske DNK kao matrice, što je dovelo do obrazovanja uokvirujućih sekvenci od po 200-250 bp na oba kraja dela odgovarajućeg deletiranog ili mogifikovanog gena. Dobijeni fragmenti su klonirani u pKNG101 [26] u E. coli BW19610 [28]. Plazmidi verifikovane sekvence su transformisani u E. coli Sm10 λ pir, odakle su plazmidi prebačeni u odgovarajući soj Y.enterocolitica. Mutanti koji su sadržavali integrisan vektor su propagirani tokom nekoliko generacija bez primene selekcionog pritiska. Potom je za selekciju klonova koji su izgubili vektor upotrebljena saharoza.

4

Konačno, mutanti su identifikovani PCR postupkom za detekciju kolonija. Specifični mutatori (pSi_408, pSi_419) su navedeni u vidu liste u Tabeli III.

[0089] Konstrukcija plazmida. Plazmid pBad_Si2 ili pBad_Si1 (Slika 9) upotrebljen je za kloniranje fuzionih proteina sa 138 aminokiselina N-kraja YopE (SEQ ID No. 2). pBad_Si2 je konstruisan kloniranjem SycE-YopE1-138fragmenta koji je sadržavao endogene promotore za YopE i SycE iz prečišćenog pYV40, u KpnI/HindIII mesto pBad-MycHisA (Invitrogen). Dodatne modifikacije su obuhvatale uklanjanje NcoI/BglII fragmenta iz pBad-MycHisA, digestijom, a potom i tretman Klenovim fragmentom i ponovnu ligaciju. Bidirekciona sekvenca terminacije transkripcije (BBa_B1006; iGEM foundation) je klonirana u mesto isečeno sa KpnI i tretirano sa Klenovim fragmentom (pBad_Si2), ili u mesto isečeno sa BglII (pBad_Si1). Dalјe su na 3’ kraj YopE1-138dodata sledeća mesta cepanja: XbaI-XhoI-BstBI-(HindIII) (Sl. 9 B). pBad_Si1 je jednak pBad_Si2, ali kodira EGFP amplifikovan iz pEGFP-Cl (Clontech), i to u NcoI/BglII mesto, pod kontrolom promotora koji je se može indukovati arabinozom. Plazmidi pSi_266, pSi_267, pSi_268 i pSi_269 koji su sadržavali odgovarajući endogeni promotor i SteA1-20fragment (pSi_266), SteA sekvencu pune dužine (pSi_267), SopE1-81fragment (pSi_268) ili SopE1-105fragment (pSi_269), amplifikovani su iz genomske DNK S. enterica SL1344, pa su klonirani u NcoI/KpnI mesto pBad-MycHisA (Invitrogen).

[0098] Geni pune dužine, ili njihovi fragmenti, amplifikovani su sa specifičnim prajmerima koji su navedeni ispod, u Tabeli I, nakon čega su klonirani kao fuzije sa YopE1-138u plazmid pBad_Si2, ili u slučaju z-BIM (SEQ ID No.21), u pBad_Si1 (pogledati ispod, Tabela II). Za fuziju sa SteA ili SopE, sintetski DNK konstrukti su podvrgnuti cepanju sa KpnI/HindII, nakon čega su klonirani u pSi_266, pSi_267, pSi_268 ili pSi_269, tim redom. U slučaju gena bakterijskih vrsta, upotrebljavana je prečišćena genomska DNK kao matrica (S. flexneri M90T, Salmonella enterica podvrste enterica serovar Typhimurium SL1344, Bartonella henselae ATCC 49882). Za humane gene je upotrebljavana univerzalna cDNK biblioteka (Clontech), ukoliko nije drugačije naznačeno (Slike od 14A do N), dok su geni zebra-ribica amplifikovani iz cDNK biblioteka (ljubazan poklon M. Affolter). Ligacijom povezani plazmidi su klonirani u E. coli Top 10. Sekvencirani plazmidi su elektroporacijom uvedeni u želјeni Y.enterocolitica ili S. enterica soj, upotrebom uslova koji su standardni za elektroporaciju E. coli.

Tabela I (Prajmer br. Si_: Sekvenca)

4

Tabela II: Klonirani fuzioni proteini

4

4

4

4 Tabela III: Mutirajuće supstance za genetičku modifikaciju

[0099] Sekrecija Yop. Indukcija yop regulona je vršena premeštanjem kulture na 37°C u BHI-Ox (uslove koji su permisivni za sekreciju) [31]. Glukoza (4 mg/ml) je dodata kao izvor uglјenika.

Ukupne ćelije i frakcije supernatanta su razdvojene centrifugiranjem na 20800 g tokom 10 min, na 4°C. Talog ćelija je uzet kao ukupna ćelijska frakcija. Proteini u supernatantu su istaloženi sa trihlorsirćetnom kiselinom u finalnoj koncentraciji od 10% (w/v), tokom 1 h na 4°C. Nakon centrifugiranja (20800 g tokom 15 minuta) i uklanjanja supernatanta, dobijeni talog je ispiran ledeno hladnim acetonom preko noći. Uzorci su zatim ponovo centrifugirani, nakon čega je supernatant odbačen, a talog je osušen na vazduhu i resuspendovan u 1x boji sa SDS-om za nanošenje uzoraka.

Izlučeni proteini su analizirani SDS-PAGE postupkom; u svakom od slučajeva, u svaki bunarić/traku su nanošeni proteini koje je izlučilo 3 × 10<8>bakterija. Detekcija specifičnih sekretovanih proteina je vršena imunoblot postupkom, upotrebom SDS-PAGE gelova od 12,5%. Za detekciju proteina u ukupnim ćelijama, u bunariće je nanošen sadržaj za 2 × 10<8>bakterija, ukoliko nije drugačije naznačeno, nakon čega su proteini razdvojeni na 12,5% SDS-PAGE gelovima, pre detekcije imunoblotovanjem.

[0100] Imunoblotovanje je rađeno upotrebom pacovskih monoklonskih antitela na YopE (MIPA193 -13A9; 1:1000, [32]). Antiserum je prethodno dva puta apsorbovan preko noći sa Y.enterocolitica ΔHOPEMT asd, da bi se smanjilo bojenje pozadine. Detekcija je rađena sa sekundarnim antitelom usmerenim na antitela pacova, a koja su bila konjugovana sa peroksidazom rena (1:5000; Southern biotech), pre razvijanja sa ECL hemiluminescentnim supstratom (LumiGlo, KPM).

[0101] Ćelijska kultura i infekcije. HeLa Ccl2, Swiss 3T3 ćelije fibroblasta, 4T1, B16F10 i D2A1 su gajene u Eagle-ovom medijumu modifikovanom po Dulbecco-u (DMEM) u koje je bilo dodato 10% FCS-a i 2 mM L-glutamina (cDMEM). HUVEC ćelije su izolovani i gajene kao što je opisano [33]. Jurkat i 4T1 ćelije su gajene u RPMI 1640 medijumu u koji je bilo dodato 10% FCS-a i 2 mM L-glutamina. Y.enterocolitica su gajene u BHI sa aditivima, preko noći na ST, nakon čega su ćelije razblaživane u svežem BHI do OD600od 0,2 i ostavljane da rastu tokom 2 sata na ST, a pre nego što je temperatura promenjena na 37°C, premeštanjem u vodeno kupatilo sa klackalicom, gde su ćelije inkubirane tokom narednih 30 minuta ili jednog sata, u slučaju isporuke EGFP-a. Konačno, bakterije su prikuplјene centrifugiranjem (6000 rcf, 30 s) i jedan put su isprane sa DMEM-om u koji su bili dodati 10 mM HEPES i 2 mM L-glutamin. S. enterica su gajene u LB sa aditivima, preko noći na 37°C, ili su razblaživane u odnosu od 1:40 u svežem LB i gajene tokom 2,5 h na 37°C (Spil T3SS uslovi indukcije) ili je prekonoćna kultura dalјe inkubirana na 37°C (SpiIl T3SS uslovi indukcije). Konačno, bakterije su prikuplјene centrifugiranjem (6000 rcf, 30 s) i isprane jednom sa DMEM-om u koji su bili dodati 10 mM HEPES i 2 mM L-glutamin. Ćelije su potom

4

zasejavane u mikrotitar ploče sa 96 bunarića (za imunofluorescenciju) ili sa 6 bunarića (za imunoblot analizu), pa su inficirane sa naznačenim MOI, u DMEM-u u koji su bili dodati 10 mM HEPES i 2 mM L-glutamin. Nakon dodavanja bakterija, ploče su centrifugirane tokom 1 min na 1750 obrtaja/min, nakon čega su prebačene na 37°C i inkubirane tokom naznačenih vremenskih perioda. Bakterije van ćelija su ubijene gentamicinom (100 mg/ml), ukoliko je tako naznačeno. U slučaju imunofluorescentne analize, testovi sa infekcijom su zaustavlјeni fiksacijom sa 4% PFA. Za imunoblot analizu, ćelije su isprane dva puta sa ledenim PBS-om, pa je dodat pufer za lizu pogodan za sprečavanje gubitka fosfo grupa (Phospho-safe; Novagen), da bi se ćelije lizirale. Nakon inkubacije na ledu, ćelije su centrifugirane (16 000 rcf, 25 min, 4°C). Supernatanti su prikuplјeni i analiziran je ukupan sadržaj proteina Bradford BCA testom (Pierce), pre SDS PAGE i imunoblot analize upotrebom anti-fosfo-Akt (Ser473 i T308, oba do kompanije Cell Signaling), anti-aktin (Millipore), Anti-Bid (Cell Signaling), anti-Myc (Santa Cruz), antip38 (Cell Signaling), anti-fosfo-p-38 (Thr180/Tyr182; Cell Signaling), anti-p17 Kaspaze-3 (Cell Signaling) i anti-Ink4C (Cell Signaling) antitela.

[0102] Imunoblot analiza proteina translociranih sa T3SS iz inficiranih ćelija. HeLa ćelije u pločicama sa 6 bunarića su inficirane sa MOI od 100, kao što je prethodno opisano. U slučaju koinfekcije sa sojem Y.enterocolitica kojim se translocira TEV proteaza, podešeni su OD600sojeva i dve suspenzije bakterija su pomešane u epruveti u odnosu od 1:1 (ukoliko nije drugačije naznačeno) pre dodavanja ćelijama. Na kraju infekcije, ćelije su isprane dva puta ledeno hladnim PBS-om, pa su grebanjem odlepljene sa podloge i prikupljene u malu količini ledeno hladnog PBS-a. Nakon centrifugiranja (16000 rcf, 5 min, 4°C), talog je rastvoren u 0,002% digitoninu u koji je bio dodat koktel proteaznih inhibitora (Roche complete, Roche). Rastvoreni talozi su inkubirani tokom 5 minuta na ledu, pa su centrifugirani (16000 rcf, 25 min, 4°C). Supernatanti su prikuplјeni i analiziran je ukupan sadržaj proteina Bradford BCA testom (Pierce), pre SDS PAGE i imunoblot analize, upotrebom anti-Myc (Santa Cruz, 9E11) ili anti-Ink4C antitela (Cell Signaling).

[0103] Imunofluorescencija. Ćelije, zasejane u pločama sa 96 bunarića (Corning), bile su inficirane kao što je prethodno opisano, a nakon fiksacije sa 4% PFA, ćelije su isprane tri puta sa PBS-om. Bunarići su zatim blokirani tokom 1 h na ST, upotrebom 5% seruma koze u PBS-u, sa 0,3% Tritona X-100. Primarno antitelo (anti-Myc, Santa Cruz, 1:100) je razblaženo u PBS-u sa 1% BSA i 0,3% Tritonom X-100, pa su ćelije inkubirane preko noći na 4°C. Ćelije su zatim isprane 4 puta sa PBS-om, pre dodavanja sekundarnog antitela (anti-mišji AF 488, Life technologies, 1:250) koje je bilo razblaženo u PBS-u sa 1% BSA i 0,3% Tritona X-100. Ukoliko je bilo potrebno, uklјučeno je bojenje DNK Hoechst bojom (Life technologies, 1:2500) i/ili bojenje aktina (Dy647-Faloidin, DyeOmics). U pojedinim slučajevima, samo su DNK ili boja za aktin direktno primenjivane nakon ispiranja PFA. Ćelije su zatim inkubirane tokom 1h na ST, pa su ispirane tri puta sa PBS-om i analizirane automatizovanom analizom slike, kao što je opisano u nastavku teksta.

[0104] Automatizovana mikroskopija i analiza slike. Slike su snimane automatski, upotrebom ImageXpress Micro sistema (Molecular devices, Sunnyvale, SAD). Kvantifikacija intenziteta anti-Myc bojenja je urađena upotrebom MetaX-press kompjuterskog programa (Molecular devices, Sunnyvale, SAD). Regioni unutar ćelija, isklјučujući regione jedara i regione koji su sadržavali bakterije, selektovani su ručno (krugovi površine od 40 piksela) i određivane su prosečne vrednosti intenziteta bojenja.

[0105] Stimulacija sa TNFa i imunoblot analiza fosfo-p38. HeLa ćelije, zasejane u ploče sa 6 bunarića, inficirane su sa MOI od 100, kao što je prethodno opisano. Zatim je, 30 min nakon infekcije (p.i.) dodat gentamicin, dok je 45 min p.i. dodat i TNFa (10 ng/ml). Nakon 1 h 15min p.i., ćelije su isprane dva puta sa ledenim PBS-om i dodat je Phospho-safe pufer za lizu (Novagen), da bi se ćelije lizirale. Nakon inkubacije na ledu, ćelije su centrifugirane (16 000 rcf, 25 min, 4°C). Supernatanti su prikuplјeni i analiziran je ukupan sadržaj proteina Bradford BCA testom (Pierce), pre SDS PAGE i imunoblot analize, upotrebom anti-fosfo-p38, antitela za ukupni p38 (Cell Signaling) i antitela za aktin (Millipore).

[0106] Određivanje nivoa cAMP u inficiranim HeLa ćelija. HeLa ćelije, zasejane u ploče sa 96 bunarića, inficirane su kao što je prethodno opisano. Zatim je, 30 min pre infekcije, cDMEM promenjen sa DMEM koji je sadržavao 10 mM HEPES-a i 2 mM L-glutamina, kao i 100 µM 3-Izobutil-1-metilksantina (IBMX, Sigma Aldrich). Gentamicin je dodavan 60 min p.i., nakon čega su ćelije inkubirane na 37°C tokom dodatnih 90 min. Određivanje cAMP-a je vršeno upotrebom kompetitivnog ELISA testa, prema uputstvima proizvođača (Amersham, cAMP Biotrak, RPN225). Kao pozitivna kontrola su upotrebljene ćelije kojima je dodavana naznačena količina toksina kolere (C8052, Sigma Aldrich), a koja je dalje inkubirana tokom 1 h u DMEM-u koji je sadržavao 10 mM HEPES i 2 mM L-glutamin i 100 µM IBMX.

[0107] Priprema uzorka za fosfoproteomiku. Za potrebe analize svih uslova, HeLa CCL-2 ćelije su gajene do konfluentnosti u dve ploče sa 6 bunarića. Ćelije su zatim inficirane tokom 30 minuta kao što je prethodno opisano. U naznačenim vremenskim tačkama, ploče su stavlјane na led, nakon čega su isprane dva puta sa ledenim PBS-om. Uzorci su prikupljeni u rastvor uree [8 M urea (AppliChem), 0,1 M amonijumibikarbonat (Sigma), 0,1% RapiGest (Waters), 1× PhosSTOP (Roche)]. Uzorci su dalje kratko vorteksovani, sonikovani na 4°C (Hielscher), mućkani tokom 5 minuta u termomikseru (Eppendorf) i centrifugirani tokom 20 minuta na 4°C i 16'000g. Supernatanti su prikuplјeni i čuvani na -80°C do dalje obrade. BCA test za proteine (Pierce) je upotrebljen za merenje koncentracije proteina.

[0108] Obogaćivanje fosfopeptidima. Disulfidne veze su redukovane sa tris(2-karboksietil)fosfinom u finalnoj koncentraciji od 10 mM, na 37°C tokom 1 h. Slobodni tioli su alkilovani sa 20 mM jodoacetamidom (Sigma), na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta i u mraku. Reakcija viška jodoacetamida je zaustavljena sa N-acetil cisteinom u finalnoj koncentraciji od 25 mM, tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim je dodata Lys-C endopeptidaza (Wako), tako da je finalni odnos enzima i proteina iznosio 1:200 (w/w), nakon čega je sve inkubirano još 4 sata na 37°C. Rastvor je potom razblažen sa 0,1 M amonijumibikarbonatom (Sigma), do finalne koncentracije uree ispod 2 M, nakon čega je sledila digestija preko noći na 37°C, sa modifikovanim tripsinom koji je bio stepena čistoće za sekvenciranje (Promega) – odnos proteina i enzima je iznosio 50:1. Peptidi su desalinizovani na C18 Sep-Pak koloni (Waters), nakon čega su osušeni pod vakuumom. Fosfopeptidi su izolovani iz 2 mg ukupne peptidne mase sa TiO2, kao što je prethodno opisano [34]. Ukratko, osušeni peptidi su rastvoreni u rastvoru 80% acetonitrila (ACN) i 2,5% trifluorosirćetne kiseline (TFA) koji je bio zasićen sa ftalnom kiselinom. Peptidi su zatim dodati istoj količini ekvilibrisanog TiO2(veličina granula 5-µm, GL Sciences) i sve je naneto na blokiranu Mobicol kolonu (kompanie MoBiTec) koja je inkubirana tokom 30 min, uz rotacije sa kraja na kraj. Kolona je dalje isprana dva puta sa zasićenim rastvorom ftalne kiseline, potom i dva puta sa 80% ACN i 0,1% TFA, a konačno i dva puta sa 0,1% TFA. Peptidi su na kraju eluirani sa 0,3 M rastvorom NH4OH. pH eluata je podešen da iznosi ispod 2,5, sa 5% rastvorom TFA i 2 M HCl. Fosfopeptidi su ponovo desalinizovani upotrebom mikrospin C18 kolona (Harvard Apparatus).

[0109] LC-MS/MS analiza. Hromatografsko razdvajanje peptida je urađeno upotrebom EASY nano-LC sistema (Thermo Fisher Scientific), opremlјenog sa zagrejanom RP-HPLC kolonom (75 µm x 45 cm) koja

1

je bila napakovana interno, u laboratoriji, sa C18 smolom od 1,9 µm ((Reprosil-AQ Pur, Dr. Maisch). Alikvoti od po 1 µg ukupnog uzorka fosfopeptida su analizirani u svakom LC-MS/MS koraku, upotrebom linearnog gradijenta koji je bio opsega od 98% rastvarača A (0,15% mravlјe kiseline) i 2% rastvarača B (98% acetonitril, 2% voda, 0,15% mravlјa kiselina) do 30% rastvarača B, tokom 120 minuta, pri brzini protoka od 200 nl/min. Analiza masene spektrometrije je rađena na LTQ-Orbitrap masenom spektrometru dvostrukog pritiska koji je bio opremlјen nanoelektrosprej jonskim izvorom (oba kompanije Thermo Fisher Scientific). Svako MS1 skeniranje (dobijeno u Orbitrap-u) je bilo praćeno disocijacijom izazvanom sudarom (CID, dobijeno u LTQ) za 20 najzastupljenijih prekusorskih jona, uz dinamičko isključivanje na 30 sekundi. Zarad fosfopeptidne analize, 10 najzastupljenijih prekusorskih jona je podvrgnuto CID uz omogućenu višestepenu aktivaciju. Ukupno vreme ciklusa je iznosilo približno 2 s. Za MS1, u Orbitrap ćeliji je prikupljeno 10<6>jona tokom maksimalnog vremena od 300 ms, pa je urađeno skeniranje sa rezolucijom od 60000 FWHM (na 400 m/z). MS2 skeniranja su dobijena upotrebom normalnog režima skeniranja i ciljne postavke za 10<4>jona, kao i uz vreme akumulacije od 25 ms. Jednostruko naelektrisani joni i joni sa neutvrđenim stanjem naelektrisanja su isklјučeni iz opcije pokretanja MS2 događaja. Normalizovana energija sudara je podešena na 32%, a za dobijanje svakog spektra je vršeno po jedno mikroskeniranje.

[0110] Kvantifikacija bez obeležavanja i pretraživanje baza podataka. Snimljene, neobrađene datoteke su unete u kompjuterski programski dodatak Progenesis ((Nonlinear Dynamics, verzija 4.0) radi kvantifikacije bez obeležavanja, upotrebom zadatih parametara. MS2 spektri su eksportovani direktno iz Progenesis programa u mgf formatu, pa su pretraženi upotrebom MASCOT algoritma (Matrix Science, verzija 2.4) u bazi “mamaca” [35] koja je sadržavala normalne i reverzne sekvence predviđenih unosa iz SwissProt baze podataka za Homo sapiens (www.ebi.ac.uk, datum objave 16.05.2012.), kao i kontaminanata koji se obično javljaju (ukupno 41,250 sekvenci) koje su dobijene upotrebom SequenceReverser dodatka kompjuterskog programa MaxQuant (verzija 1.0.13.13). Da bi se identifikovali proteini koji potiču iz Y.enterocolitica, u istoj bazi podataka su pretraženi i uzorci koji nisu bili obogaćeni fosfopeptidom, uklјučujući predviđene unose iz SwissProt baze za Y.enterocolitica (www.ebi.ac.uk, datum objave 15.08.2013.). Tolerancija za prekursorski jon je podešena na 10 ppm, a tolerancija na jone fragmenta je podešena na 0,6 Da. Kriterijumi pretrage su postavljeni na sledeći način: bila je potrebna potpuna tripsinska specifičnost (cepanje nakon ostataka lizina ili arginina ukoliko nisu praćeni prolinom), bila su dozvolјena 2 propuštanja predviđenih cepanja, a kao fiksna modifikacija je podešena karbamidometilacija (C), dok su fosforilacija (S, T, Y) ili oksidacija (M) podešene kao varijabilne modifikacije za uzorke obogaćene ili one koji nisu bili obogaćeni sa TiO2, tim redom. Konačno, rezultati pretraživanja baza podataka su eksportovani u vidu xml-datoteke i ponovo su uneti u Progenesis kompjuterski program radi dodele MS1 funkcija. Za kvantifikaciju fosfopeptida, eksportovana je i csv-datoteka koja je sadržavala zastupljenosti MS1 pikova za sve detektovane osobine, dok je za neobogaćene uzorke generisana csv-datoteka koja je sadržavala sva proteinska merenja zasnovana na zbirnim karakteristikama intenziteta svih identifikovanih peptida po proteinu. Važno je napomenuti da je Progenesis kompjuterski program bio podešen tako da se proteini koji su identifikovani kao oni koji su slični, grupišu zajedno, kao i da su za kvantifikaciju proteina upotrebljavani samo peptidi koji se nisu preklapali sa specifičnim sekvencama za pojedinačne proteine u bazi podataka. Obe datoteke su dalјe obrađene upotrebom interno razvijenog SafeQuant v1.0 R skripta (neobjavlјeni podaci, dostupni na https://github.com/eahrne/SafeQuant/). Ukratko, kompjuterski program postavlјa identifikacioni nivo Stope pogrešne procene od 1% (na osnovu broja pogodaka proteinskih sekvenci “mamaca”) i normalizuje identifikovane zastupljenosti MS1 pikova

2

(ekstrahovan jonski hromatogram, XIC) duž svih uzoraka, tj. sumirani XIC svih pouzdano idetnifikovanih peptidnih karakteristika su svedeni na jednake vrednosti za sve LC-MS analize. Dodatno su svim kvantifikovanim fosfopeptidima/proteinima dodeljene stope zastupljenosti za svaku vremensku tačku, na osnovu medijana XIC po vremenskoj tački. Statistička značajnosti svake stope je izražena kao njegova q-vrednost (stopa pogrešne procene podešena prema p-vrednostima) koja je dobijena izračunavanjem modifikovanih t-statističkih p-vrednosti [36] i prilagođavanjem za višestruka testiranja [37]. MASCOT je automatski dodeljivao lokaciju fosforiliranih ostataka (ocena> 10). Svi naznačeni spekteri, zajedno sa korišćenim sirovim MS-datotekama i parametrima pretrage će biti deponovani u konzorcijum ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) putem partnerskog repozitorijuma PRIDE [38].

Poravnanje sekvenci je rađeno upotrebom EMBL-EBI mreže za višestruko poravnavanje sekvenci, programa ClustalW2 sa internet adrese http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/.

Studija eskalacije doze

[0111] Svi eksperimenti na životinjama su odobreni (licenca 1908; Kantonales Veterinäramt Basel-Stadt) i izvedeni u skladu sa lokalnim smernicama (Tierschutz-Verordnung, Basel-Stadt) i Švajcarskim zakonom o zaštiti životinja (Tierschutz-Gesetz). C57Bl/6 i BALB/c miševi stari 6 nedelja su naručeni iz kompanije Janvier Labs. Nakon najmanje jedne nedelje navikavanja, miševi su inficirani sa Y. enterocolitica MRS40 ΔHOPEMT ili S. typhimurium ΔaroA, injeciranjem u repnu venu. Tokom eksperimenta, kod miševa je utvrđivan skor za ponašanje i fizički izgled, a izmerena je i površinska temperatura, kao i telesna težina. Inokulum, i.v. primenjen miševima, validiran je zasejavanjem u serijskim razblaženjima. Ogovarajućih dana nakon infekcije, miševi su žrtvovani udisanjem CO2. Uzorak krvi je odmah izolovan aspiracijom iz srca. Izolovani su dalje jetra, slezina, pluća i tumor i određena njihova težina. Organi i tumor su homogenizovani. CFU u svakom uzorku je određivan tačkastim zasejavanjem serijskih razblaženja na LB agarnim podlogama koje su sadržavale nalidiksičnu kiselinu (35 ug/ml).

Biodistribucija u B16-F10 i 4T1 alograftnim mišjim modelima tumora

[0112] Svi eksperimenti na životinjama su odobreni (licenca 1908; Kantonales Veterinäramt Basel-Stadt) i izvedeni u skladu sa lokalnim smernicama (Tierschutz-Verordnung, Basel-Stadt) i Švajcarskim zakonom o zaštiti životinja (Tierschutz-Gesetz). C57Bl/6 i BALB/c miševi stari 6 nedelja su naručeni iz kompanije Janvier Labs. Nakon najmanje jedne nedelje prilagođavanja, miševi su anestezirani upotrebom izoflurana, nakon čega je po 100 ul 4T1 ćelija (1x10<5>-1x10<6>ćelija) supkutano ubrizgano u bok C57Bl/6 i BALB/c miševa. Tokom eksperimenta, kod miševi je rađen skor za ponašanje i fizički izgled, a izmereni su i površinska temperatura, kao i telesna težina.

[0113] Jednom kada su se tumori razvili, miševima je primenjivano po 8 mg/ml rastvora desferala (10 ml/kg) putem i.p. injekcija. Sledećeg dana, miševi su inficirani sa Y. enterocolitica MRS40 ili Y. enterocolitica MRS40 ΔHOPEMT (2x10<5>, 1x10<6>ili 1x10<7>bakterija), injeciranjem u repnu venu. Inokulum koji je bio primenjen miševima i.v., validiran je zasejavanjem u razblaženjima. U pojedinim eksperimentima, progresija tumora je praćena svakodnevnim merenjima dužine i širine tumora, upotrebom digitalnih kalipera. Zapremina tumora je određivana kao 0,523xdužinaxširina<2>. Odgovarajućih dana nakon infekcije, miševi su žrtvovani udisanjem CO2. Uzorak krvi je odmah izolovan, aspiracijom iz srca. Izolovane su i jetra, slezina, pluća i tumor i određena je njihova težina. Organi i tumor su homogenizovani. CFU je u svakom uzorku određivan tačkastim zasejavanjem serijskih razblaženja na LB agarnim podlogama koje su sadržavale nalidiksičnu kiselinu (35 ug/ml).

B) REZULTATI

Sistem za isporuku proteina zasnovan na sekreciji tipa 3 za YopE fuzione proteine

[0114] Iako sam N-kraj T3SS efektorskog YopE iz Y.enterocolitica (SEQ ID No. 1) sadrži signal za sekreciju koji je dovolјan za translokaciju heterolognih proteina [19], mesto vezanja šaperona (CBS) za njegov šaperon (SycE) nije uklјučeno [39]. Odabrali smo da 138 aminokiselina N-kraja YopE (SEQ ID No.2) bude fuzionisano sa proteinom koje će biti isporučen, pošto je za isto pokazano da daje najbolјe rezultate u slučaju translokacija drugih heterolognih T3S supstrata [21]. Kako ovih 138 aminokiselina N-kraja YopE sadrže CBS, dalje smo se odlučili za koekspresiju SycE. SycE-YopE1-138fragment koji je kloniran iz prečišćenog Y.enterocolitica pYV40 plazmida virulencije, sadrži endogene promotore YopE i njegovog šaperone SycE (Sl. 9). Stoga, fuzioni protein SycE i bilo kog YopE1-138se indukuje brzom promenom temperature za rast sa ST na 37°C. Vreme gajenja kulture na 37°C će uticati na količinu fuzionog proteina koji je prisutan u bakterijama. Višestruko mesto kloniranja (MCS) je dodato na 3’ kraj YopE1-138(Sl.9 B), a nakon njega su sledili Myc i 6xHis tag i Stop kodon.

Matični soj je pažlјivo selektovan. Najpre, da bi se ograničila translokacija endogenih efektora, upotrebili smo soj Y.enterocolitica kome su delecijom bili uklonjeni svi poznati efektori, Yop H, O, P, E, M i T (nazvan je ΔHOPEMT) [40]. Dodatno, povremeno smo upotrebljavali auksotrofnog mutanta koji ne može da raste u odsustvu egzogeno dodate mezo-2,6-diaminopimelinske kiseline [41]. Ovaj soj je bio sa delecijom gena za aspartat-beta-semialdehid dehidrogenazu (Δasd) i klasifikovan je kao soj Nivoa bezbednosti 1 od strane Švajcarske agencije za bezbednost (amandman na A010088/2). Dodatno, delecijom smo uklonili i adhezioni protein YadA i/ili InvA, da bi se obezbedio veći izbor matičnih sojeva. Iako je upotreba yadA ili yadA/invA sojeva smanjiila indukovan prenos signala u pozadini [42], utvrđen je i uticaj na količinu isporučenog proteina [43].

Karakterizacija isporuke YopE fuzionog proteina u eukariotske ćelije

[0115] U in vitro analizi sekrecije (pogledati Sl. 1 A), sekrecija proteina u okolnu tečnost je veštački indukovana. Nakon taloženja proteina zasnovanog na TCA, urađena je imunoblot analiza sa anti-YopE antitelom, da bi se odredile izlučene količine proteina (Slika 1B). Dok je wt soj izlučivao YopE pune dužine, ΔHOPEMT asd sojevi to nisu. Prisustvom YopE-a1-138-Myc-His (u daljem tekstu označenog kao YopE1-138-Myc; SEQ_ID_No._3) postala je vidljiva manja YopE traka (Sl.1 B). Otuda, YopE1-138fragment se dobro izlučivao u postavci koja je ovde opisana. Da bi se analizirala homogenost translokacije proteina u eukariotske ćelije, inficirali smo HeLa ćelije sa sojem koji kodira YopE1-138-Myc, pa su IF postupkom obojeni Myc tagovi (Sl.2A i B). Iako su u početku bile obojene samo bakterije, 30 minuta nakon infekcije (p.i.) obrisi ćelija su postajali vidlјivi, što se pojačavalo sa povećanjem vremena infekcije (Sl.2 B). Ovakav trend dobro odražava intenzitet bojenja Myc taga unutar HeLa ćelija (Sl.2A i B). YopE1-138-Myc može biti detektovan svuda u ćelijama (Sl.2 A), osim u jedrima [44]. Izuzetno je i što se ovim pristupom postiglo da bude obojena većina, ako ne i sve ćelije, na uporediv način. Kako je poznato da Y.enterocolitica inficira mnoge različite tipove ćelija [45], pratili smo dalje isporuku YopE1-138-Myc u različite ćelijske linije. Isto homogeno anti-Myc IF bojenje je uočeno kod inficiranih mišjih fibroblasta,

4

Jurkat ćelija i HUVEC (Sl. 11). Štaviše, podešavanje MOI naviše ili naniže je omogućilo modulisaje količine isporučenih proteina (Sl.2 C), pri čemu je ciljano dejstvo kod većine ćelija zadržano. Nizak broj bakterija neće dovesti do razultata da u nekoliko ćelija bude puno isporučenog proteina, već da većina ćelija sadrži nisku količinu isporučenog proteina (Sl.2 C).

Preusmeravanje proteina isporučenih putem T3SS u jedro

[0116] Kako sam YopE lokalizuje u citoplazmu (Sl.2 A), od posebnog je interesa ispitati da li YopE1-138fragment sprečava lokalizaciju jedarnih fuzionih proteina. Stoga smo dodali NLS iz SV40 na C-kraj (slični rezultati i za N-kraj) YopE1-138-EGFP-a (SEQ ID No.39 i SEQ ID No.38, tim redom). Dok je YopE1-138-EGFP (SEQ ID No. 37) doveo je do slabog bojenja citoplazme, YopE1-138-EGFP-NLS je doveo do jakog EGFP signala u jedru inficiranih HeLa ćelija (Sl.3). Navedeno ukazuje da je YopE1-138fragment kompatibilan sa upotrebom NLS. Iako se mCherry boja već upotrebljavala sa bilјnim patogenima [46], navedeni razultat ukazuje na uspešnu isporuku proteina sličnog GFP-u putem humanih ili životinjskih patogenih bakterija koje kodiraju T3SS. Navedeno zapravo potvrđuje da je strategija koja je zavisna od SycE i YopE1-138vrlo obećavajuća za isporuku mnogih proteina od izbora.

Uklanjanje dodatnog YopE1-138sadržaja nakon translokacije fuzionog proteina u eukariotsku ćeliju

[0117] Dok je za bakterijsku isporuku od velike koristi YopE1-138fragment, on može ometati funkciju i/ili lokalizaciju fuzionih proteina. Prema tome, optimalno je njegovo uklanjanje nakon isporuke proteina. U ovu svrhu, između YopE1-138i fuzionog partnera (transkripcionog regulatora ET1-Myc (SEQ ID No.36 i 41) [50] i humanog INK4C (SEQ ID No.40 i SEQ ID No.43)) su uvedena dva mesta cepanja za TEV proteazu (ENLYFQS) [47-49]. Da bi se održala prednost predstavljenog postupka, dodatno smo fuzionisali TEV proteazu (varijanta S219V; [51]) sa YopE1-138(SEQ ID No. 42) u drugom soju Y.enterocolitica. HeLa ćelije su odjednom inficirane sa oba soja. Da bi se omogućila analiza samo translocirane frakcije proteina, inficirane HeLa ćelije su lizirane 2 h p.i. (Sl.4) sa Digitoninom, za koga je poznato da ne lizira bakterije ([52]; za kontrolu, pogledati Sliku 11). Imunoblot analiza je ukazala na prisustvo YopE1-138-2xTEV-mesto cepanja-ET1-Myc ili YopE1-138-2xTEV-mesto cepanja-Flag-INK4C-Myc, samo kada su ćelije bile inficirane sa odgovarajućim sojem (Sl.4A i C). Nakon digestije ovih lizata preko noći sa prečišćenom TEV proteazom, mogao se uočiti pomeraj pozicije specifične trake (Sl.4A i C). Ova traka odgovara ET1-Myc (Sl. 4 C) ili Flag-INK4C (Sl. 4 A) sa ostacima mesta cepanja za TEV N-kraja, najverovatnije samo jednog Serina. Nakon istovremene infekcije ćelija sa sojem koji isporučuje TEV proteazu, postao je vidlјiv isti isečeni fragment ET1-Myc ili Flag-INK4C, što ukazuje da je TEV proteaza koja je isporučena preko T3SS funkcionalna i da su pojedinačne ćelije bile inficirane sa oba bakterijska soja (Sl.4 A i C). Iako cepanje nije bilo završeno, većina translociranog proteina se cepala već 2 sata nakon infekcije, a čak ni digestija preko noći sa prečišćenom TEV proteazom nije dovela do većeg stepena cepanja (Slika 4 B). Kao što je prijavljeno, moguće je da je za cepanje zavisno od TEV proteaze potrebna optimizacija koja će zavisiti od fuzionog proteina [53, 54]. Uklanjanje dodatnog YopE1-138sadržaja nakon translokacije, koje je zavisno od TEV protease, stoga po prvi put obezbeđuje T3SS proteinsku isporuku za gotovo nativne heterologne proteine, izmenom sastava aminokiselina sa samo jednom aminokiselinom sa N-kraja.

Alternativan pristup cepanju YopE fragmenta koje je zavisno od TEV proteaze podrazumeva ugradnju ubikvitina u fuzioni protein od interesa. Zaista, ubikvitin se na svom C-kraju obrađuje grupom endogenih C-terminalnih proteaza koje su specifične za ubikvitin (deubikvitinacionim enzimima, DUB).

Pošto bi cepanje trebalo da se dogodi na samom C-kraju ubikvitina (nakon G76), protein od interesa bi trebao da bude bez dodatnih aminokiselinskih sekvenci. Ovakav postupak je ispitan na fuzionom proteinu YopE1-138-Ubikvitin-Flag-INK4C-MycHis. U kontrolnim ćelijama inficiranim sa bakterijama koje eksprimiraju YopE1-138-Flag-INK4C-MycHis, utvrđena je traka koja odgovara YopE1-138-Flag-INK4C-MycHis, što ukazuje na efikasnu translokaciju fuzionisanog proteina (Slika 23). Kada su ćelije bile inficirane tokom 1 sata sa bakterijama koje eksprimiraju YopE1-138-Ubikvitin-Flag-INK4C-MycHis, postala je vidljiva dodatna traka koja po veličini odgovara Flag-INK4C-MycHis, što ukazuje da je deo fuzionisanog proteina uklonjen isecanjme. Ovakav rezultat pokazuje da uvođenje ubikvitina u fuzioni protein omogućava isecanje YopE1-138 fragmenta bez potrebe za egzogenom proteazom.

Translokacija bakterijskih efektora tipa III i IV

[0118] SopE iz Salmonella enterica je dobro okarakterisan faktor izmene guaninskih nukleotida (GEF) koji interaguje sa Cdc42 i pospešuje remodelovanje aktinskog citoskeleta [55]. Dok je translokacija YopE1-138-Myc u HeLa ćelije bila bez efekta, translokacija YopE1-138-SopE (SEQ ID No. 5 i 135) je prouzrokovala dramatične promene u aktinskoj mreži (Sl. 5 A). Slični rezultati su dobijeni sa drugim GEF efektorskim proteinom, IpgB1 iz Shigella flexneri (SEQ ID No.4). Izuzetno je značajno da su prve promene u aktinskom citoskeletu bile primećene već 2 minuta p.i. (Sl. 5 A). Prema tome, može se zaključiti da se isporuka proteina zavisna od T3SS događa odmah nakon što je infekcija započeta centrifugiranjem. Da bi se dokazao isključivi transport koji je zavisan od T3SS, delecijom je uklonjen jedan od T3SS proteina koji obrazuje poru za translokaciju na membrani eukariotskih ćelija (YopB, pogledati [56]) (Sl.11).

[0119] Tokom infekcije sa Salmonelom, nakon translokacije SopE sledi translokacija SptP-a, koji deluje kao protein koji aktivira GTPazu (GAP) za Cdc42 [57]. Dok translokacija YopE1-138-SopE-Myc (SEQ ID No.

135) samostalno pokreće masivno preuređivanje F-aktina, istovremena infekcija sa bakterijama koje eksprimiraju YopE1-138-SptP (SEQ ID No.8) poništava ovaj efekat na način koji zavisi od doze (Sl.5 B). Anti-Myc bojenje je ukazalo da ova inhibicija nije posledica smanjenog nivoa YopE1-138-SopE-Myc translokacije (Sl.5 B). Ovi rezultati su zajedno pokazali da je koinfekcija ćelija sa dva bakterijska soja validan postupak za isporuku dva različita efektora u pojedinačne ćelije da bi se ispitala njihova funkcionalna interakcija.

[0120] Efektor tipa III OspF iz S. flexneri deluje kao fosfotreoninska liaza koja dovodi do defosforilacije MAP kinaza p38 i ERK [58]. Da bi se ispitala funkcionalnost translociranog YopE1-138-OspF (SEQ ID No.

7), pratili smo fosforilaciju p38 nakon stimulacije sa TNFα. U neinficiranim ćelijama ili ćelijama koje su bile inficirane sa bakterijama koje eksprimiraju YopE1-138-Myc, TNFα je indukovao fosforilaciju p38. Nasuprot tome, nakon translokacije YopE1-138-OspF, fosforilacija indukovana sa TNFa je bila poništena, što pokazuje da isporučeni OspF aktivno deluje na p38 (Sl.6 A).

Tokom infekcije sa Salmonella bakterijama, SopB efektor tipa III štiti epitelne ćelije od apoptoze stalnom aktivacijom Akt [59]. Dok je translokacija YopE1-138-Myc ili YopE1-138-SopE bila bez efekta na Akt, translokacija YopE1-138-SopB (SEQ ID No.6) je indukovala snažnu fosforilaciju Akt na T308 i S473, što je odraz prisustva aktivnog oblika (Sl. 6 B). Slični rezultati su dobijeni sa SopB-homologom iz S. flexneri (IpgD, SEQ ID No.9). Sveukupno, naši rezultati pokazuju da sistem isporuke zasnovan na YopE1-18funkcioniše kod svih do sada ispitanih T3S efektora, kao i da omogućava ispitivanje proteina uklјučenih u kontrolu centralnih ćelijskih funkcija, uklјučujući organizaciju citoskeleta, inflamaciju i ćelijsko preživlјavanje.

[0121] Brojne bakterije, uklјučujući Agrobacterium tumefaciens, Legionella pneumophila i Bartonella henselae, koristite sekreciju tipa IV za injeciranje efektora u ćelije. Ispitali smo da li efektor tipa IV, BepA iz B. henselae, može biti translociran u HeLa ćelije upotrebom našeg pristupa. BepA pune dužine (SEQ ID No.10) i BepAE305-kraj(SEQ ID No.11) koji sadrži Bid domen C-kraja, klonirani su, nakon čega su ćelije inficirane odgovarajućim sojevima. Kako se pokazalo da BepA indukuje proizvodnju cikličnog AMP-a (cAMP) [60], nakon infekcije je izmeren nivo cAMP-a u HeLa ćelijama. Dok translokacija Bid domena BepG efektora iz B. henselae (SEQ ID No. 136) nije uspela da indukuje cAMP, BepA pune dužine i BepAE305-krajsu započeli proizvodnju cAMP-a u očekivanim količinama [60] (Sl. 6 C). Ovaj rezultat pokazuje da efektori tipa IV takođe mogu biti efikasno isporučeni u ciljne ćelije domaćine putem sistema za isporuku zasnovanog na YopE1-138, kao i da su oni funkcionalni.

Translokacija eukariotskih proteina u epitelne ćelije

[0122] Da bi pokazali da se humani proteini mogu translocirati sekrecijom tipa III, fuzionisali smo induktore humane apoptoze sa YopE1-138radi isporuke sa Y.enterocolitica ili sa SteA1-20, SteA, SopE1-81ili SopE1-105, u slučaju isporuke sa S. enterica. Zatim smo pratili translokaciju agoniste humanog domena smrti koji interaguje sa BH3 (BID, SEQ ID No. 24), koji je pro-apoptotski član Bcl-2 familije proteina. Ovaj protein je posrednik oštećenja mitohondrija indukovanih sa kaspazom-8 (CASP8). CASP8 cepa BID, a skraćeni BID (tBID, SEQ ID No.25) prelazi u mitohondrije gde pokreće oslobađanje citohroma c. Poslednjenavedeno dovodi do aktivacije kaspaze 3 (CASP3) unutrašnjim putem, a čime se ona cepa na podjedinice od 17 i 12 kDa [61]. Iako infekcija tokom 1 sata sa Y.enterocolitica koje eksprimiraju YopE1-138-Myc ili YopE1-138-BID nije uspela da indukuje apoptozu, translokacija humanog tBID je pokrenula ćelijsku smrt u većem obimu od dobro okarakterisanog induktora apoptoze, staurosporina (slike 7 A i C). Kao što se očekivalo, translokacija tBID-a je dovela do proizvodnje p17 subjedinice CASP3, čak u većim količinama nego prilikom upotrebe Staurosporina (Sl.7 A). Da bi mogli da uporedimo količine translociranog proteina sa endogenim Bid, HeLa ćelije su lizirane Digitoninom i analizirane imunoblot postupkom, upotrebom anti-Bid antitela (Sl.7 B). YopE1-138-tBID koji je isporučen putem T3SS-a je u HeLa ćelijama dostigao nivo blizak nivou endogenog Bid, dok je isporučen YopE1-138-BID bio prisutan u još većim količinama (2,5 puta) (Sl.7 B). Detaljnim proteomskim i transkriptomskim mapiranjem HeLa ćelija je ustanovljeno da je po jednoj ćeliji prisutno 4,4 puta 10<5>kopija BID-a [62]. Prema tome, može se zaključiti da isporuka humanih proteina koja zavisi od T3SS dostiže nivo id 10<5>do 10<6>proteina po ćeliji. Ovi brojevi odgovaraju kopijama nano-antitela po ćeliji koja su translocirana putem T3SS-a E. coli [63]. Pod pretpostavkom da izravnavanje za faktor 10 za MOI i za trajanje infekcije, za faktor 3,2 za vremensku tačku dodavanja antibiotika i za vreme kultivisanja na 37°C pre infekcije, isporučene proteinske kopije/ćeliji mogu biti fino podešene od nekih 1000 kopija/ćeliji do nekih 10<6>kopija/ćeliji. Sveukupno, ovi rezultati ukazuju da je translociran tBID funkcionalan i da se isporučuje u relevantnim nivoima. Navedeno dodatno potvrđuje validnost pristupa ovakve translokaciju u cilju proučavanja uloge proteina u regulaciji apoptoze, centralnog aspekta ćelijske biologije.

Dodatno smo fuzionisali mišji tBID (optimizovanih kodona za Y.enterocolitica; SEQ ID No.194) ili BH3 domene mišjeg tBID ili mišjeg BAX (u oba slučaja optimizovanih kodona za Y.enterocolitica; SEQ ID No.

138 i 139) sa YopE1-138radi isporuke od strane Y.enterocolitica. Iako je infekcija tokom 2,5 h sa Y.enterocolitica ΔHOPPEM asd bila bez isporuke proteina ili takva da YopE1-138-Myc nije uspeo da indukuje apoptozu, translokacija mišjeg tBID (optimizovanih kodona za Y.enterocolitica, SEQ ID No.

194) je izazvala ćelijsku smrt u B16F10 (Sl. 15), D2A1 (Sl. 16), HeLa (Sl. 17) i 4T1 (Sl. 18) ćelijama. Utvrđeno je takođe da translokacija BH3 domena mišjeg BID koji je bio optimizovanih kodona za Y.enterocolitica (SEQ ID 138) ili mišjeg BAX koji je bio optimizovanih kodona za Y.enterocolitica (SEQ ID 139) indukuje masovnu ćelijsku smrt u B16F10 (Sl. 15), D2A1 (Sl. 16), HeLa (Sl. 17) i 4T1 (Sl. 18) ćelijama. Dodatne verzije su uključivale tandemske ponovke BH3 domena mišjeg BID optimizivanih kodona za Y.enterocolitica koji su bili fuzionisani sa YopE1-138(SEQ ID 202) ili su povezivali BH3 domen mišjeg BID optimizivanih kodona za Y.enterocolitica sa BH3 domenom mišjeg BAX optimizivanih kodona za Y.enterocolitica, fuzionisanim sa YopE1-138(SEQ ID 203).

Iako infekcija tokom 4 h sa S. enterica aroA bakterijama nije uspela da indukuje apoptozu, translokacija mišjeg tBID je pokrenula apoptozu, pošto translokacija mišjeg tBID dovodi do proizvodnje p17 subjedinice CASP3 (Sl.19 i 20). Stepen indukcije apoptoze za SopE fuzione proteine je bio veći prilikom upotrebe SpiI T3SS uslova indukcije (Sl.19), što odražava transport SopE isklјučivo sa SpiI T3SS. Mišji tBID koji je bio fuzionisan sa SteA1-20nije uspeo da indukuje apoptozu, vrlo verovatno pošto signal sekrecije unutar 20 aminokiselina N-kraja SteA nije dovolјan da omogući isporuku fuzionisanog proteina (Sl.19 i 20). Mišji tBID fuzionisan sa SteA pune dužine je doveo do indukcije apoptoze u HeLa ćelijama (Sl.19 i 20), kako u SpiI tako i u SpiII T3SS indukujućim uslovima, što odražava sposobnost prenošenja SteA sa oba T3SS mehanizma. Potrebno je naglastiti da se čak i pod Spill T3SS indukujućim uslovima očekuje delimična aktivnost SpiI T3SS, što se vidi iz aktivnosti SopE fuzionisanih proteina u uslovima indukcije sa SpiII T3SS (Sl.20).

[0123] Pored translociranih eukariotskih proteina koji su ovde funkcionalno ispitivani, upotrebom pristupa koji je ovde opisan je bilo izlučeno nekoliko drugih eukariotskih proteina. Navedeno obuhvata, za isporuku sa Y.enterocolitica (Sl. 12, 13 i 22), proteine uključene u regulaciju ćelijskog ciklusa (Mad2 (SEQ ID No.15), CDK1 (SEQ ID No.14), INK4A (SEQ ID No.16), INK4B (SEQ ID No.17) i INK4C (SEQ ID No.18)) kao i njihove delove (INK4A 84-103 (SEQ ID No.158), p107657-662 (SEQ ID No.

159), p21141-160 (SEQ ID No.160), p21145-160 (SEQ ID No.161), p2117-33 (SEQ ID No.162) i ciklina D2139-147 (SEQ ID No 163)), proteine povezane sa apoptozom (Bad (SEQ ID No.29), FADD (SEQ ID No.28) i p17 Kaspaze 3 (SEQ ID No.22), kao i p12 (SEQ ID No.23), Bid zebra-ribica (SEQ ID No.19) i t-Bid (SEQ ID No. 20)) kao i njihove delove (tBid BH3 (SEQ ID No. 138), Bax BH3 (SEQ ID No. 139)), signalne proteine (mišji TRAF6 (SEQ ID No.12), TIFA (SEQ ID No.13)), GPCR Gα subjedinicu (GNA12, najkraća izoforma, (SEQ ID No. 30)), nano-antitelo (vhhGFP4, (SEQ ID No. 31)) i fuzione konstrukte nano-antitela za ciljanu razgradnju proteina (Slmb-vhhGFP4; (SEQ_ID_No.32, 33, 34) [64]) (Sl.12 i 13), kao i male GTPaze (Rac1 Q61E (SEQ ID No.26 i 137), pa i RhoA Q63L (SEQ ID No.27) i dalje domene homologne Plekstrinu iz humanog Akt-a (SEQ ID No. 35). Pored funkcionalno ispitanih proteina povezanih sa apoptozom (mišjeg tBID, SEQ ID No.144-147), navedeno dalјe obuhvata, za isporuku sa S. enterica (Sl.21), proteine iz regulacije ćelijskog ciklusa (Mad2 (SEQ ID No.168-169), CDK1 (SEQ ID No. 170-171), INK4A (SEQ ID No. 164-165) i INK4C (SEQ ID No. 166-167)). Iako ovi proteini nisu funkcionalno validirani, mogućnost T3SS zavisne sekrecije različitih eukariotskih proteina u kombinaciji sa mogućim uklanjanjem dodatnog YopE sadržaja otvara nove vidove široke primenlјivosti T3SS u ćelijskoj biologiji i terapijskim primenama, posebno za lečenje malignih solidnih tumora.

Fosfoproteomika ukazuje na opšti uticaj translociranih proteina na fosforilaciju proteina

[0124] Fosforilacija je široko rasprostranjena post-translaciona modifikacija koja može bilo aktivirati ili inaktivirati biološke procese i stoga je pogodan ciljni proces u proučavanju signalnih događaja [65]. Uprkos tome, danas nije dostupna analiza fosforilacije tokom procesa apoptoze na sistemskom nivou. Da bismo analizirali uticaj humanog tBid-a koji je isporučen u HeLa ćelije, upotrebili smo fosfoproteomski pristup bez obeležavanja, upotrebom LC-MS/MS postupka. U tri nezavisna eksperimenta, ćelije su ili ostavljene netretiranima ili su inficirane sa ΔHOPEMT asd YopE1-138-Myc ili sa ΔHOPEMT asd YopE1-138-tBid tokom 30 minuta. Ćelije su zatim lizirane, nakon čega su sledili enzimska digestija, obogaćivanje fosfopeptidima i kvantifikacija, a dalje i identifikacija individualnih fosfpeptida. Uporedili smo ćelije inficirane sa ΔHOPEMT asd YopE1-138-Myc sa ćelijama inficiranim sa ΔHOPEMT asd YopE1-138-tBid, što nam je omogućilo da identifikujemo 363 događaja fosforilacije koji su bili zavisni od tBid. Porast u fosforilaciji je pokazan za 286 fosfopeptida, dok je 77 bilo manje fosforilirano nakon isporuke tBid, što ukupno odgovara broju od 243 različita proteina koji smo definisali kao tBid fosfoproteom. Za obrazovanje mreže protein-proteinskih interakcija tBid fosfoproteoma upotrebljena je STRING baza podataka [66] (Sl.8 A). U mrežu je dodato još 27 proteina za koje je poznato da su povezani sa ulogom mitohondrija u apoptozi, čime je izgrađen centralni klaster. Zanimlјivo je da je samo nekoliko proteina iz tBid fosfoproteoma bilo povezano sa ovim centralnim klasterom, što ukazuje da promenama u fosforilaciji podležu mnogi od proteina koji do sada nisu bili direktno povezani sa apoptotskim proteinima. Da bi se okarakterisale biološke funkcije obuhvaćene fosfoproteomom tBid, uradili smo analizu genske ontologije, upotrebom funkcionalnog alata za označavanje iz Baze podataka za označavanje, vizualizaciju i integrisano otkrivanje (DAVID, http://david.abcc.ncifcrf.gov/) [67, 68]. Identifikovane biološke funkcije pokazuju da tBid utiče na raznovrstne ćelijske procese. Mnogi proteini koji su uklјučeni u preuređivanje hromatina i regulaciju transkripcije podležu promeni u fosforilaciji (tj. CBX3, CBX5, TRIM28, HDAC1). HDAC1 je, na primer, histon deacetilaza koja ima ulogu u regulaciji transkripcije. Pokazano je i da HDAC1 može modulisati transkripcionu aktivnost NF-kB, proteina koji takođe učestvuje u apoptozi. Dodatno smo identifikovali klaster proteina uklјučenih u obradu RNK, a za koje je prethodno pokazano da imaju važnu ulogu u regulaciji apoptoze [69]. Na primer, HNRPK posreduje u odgovoru p53/TP53 na oštećenje DNK i neophodan je za indukciju apoptoze [70]. Štaviše, utvrđen je uticaj i na fosforilaciju proteina uklјučenih u translaciju proteina. Nekoliko eukariotskih faktora inicijacije (tj. EIF4E2, EIF4B, EIF3A, EIF4G2) se podvrgava promeni u statusu fosforilacije, što je u skladu sa zapažanjem da je ukupna sinteza proteina u apoptotskim ćelijama smanjena. Zanimlјivo je i da se fosforilacija mnogih proteina koji su uklјučeni u remodelovanje citoskeleta (npr. PXN, MAP1B9 menja nakon isporuke tBid. Navedeno je takođe u skladu sa zapažanjem da se morfologija ćelija dramatično menja nakon isporuke tBid (slika 8 B). Na smanjenje zapremine ćelija i gubitak kontakta ukazuje i činjenica da smo uočili fosforilaciju proteina povezanih sa adhezijom, kao što su to ZO2 i Paksilin. Slično tome, smanjenje zapremine jedara prati fosforilacija laminarnih proteina, poput Lamina A/C i Lamina B1. Sveukupno, isporuka tBID izaziva brz apoptotski odgovor koji se uočava i kroz narušavanje integriteta mitohondrija (Sl.8 B). Pokazali smo dodatano da apoptoza izazvana sa tBid utiče na stotine događaja fosforilacije koji učestvuju u različitim ćelijskim procesima. Iako su mnogi identifikovani proteini povezani sa apoptozom, samo za nekoliko je poznato da se fosforilišu po indukciji apoptoze. Fosfoproteomski pristup omogućava stoga koristan izvor za dalјe studije apoptoze.

Translokacija eukariotskih heterolognih fuzionih proteina koji se sastoje od ponovljenih identičnih ili varijabilnih proteinskih domena u epitelne ćelije

[0125] Da bismo pokazali da heterologni fuzioni proteini koji se sastoje od ponovljenih identičnih ili varijabilnih proteinskih domena mogu biti translocirani preko sistema sekrecije tipa III, fuzionisali smo mišje induktore apoptoze sa YopE1-138,radi isporuke sa Y. enterocolitica. Kao kontrola je poslužila fuzija mišjeg tBID (optimizovanih kodona za Y. enterocolitica; SEQ ID No.194) ili BH3 domena ili mišjeg BAX (u oba slučaja optimizovanih kodona za Y. enterocolitica; SEQ ID No. 200 i 201) sa YopE1-138, u cilju isporuke sa Y. enterocolitica. Heterologni fuzioni protein se sastojao u jednom slučaju od mišjeg BH3 domena iz tBID koji je bio fuzionisan sa samim sobom, a rezultat toga je bio YopE1-138-(tBID-BH3)2(SEQ ID No.202). U drugom slučaju, heterologni fuzioni proteini su se sastojali od BH3 domena iz mišjeg tBID koji je bio fuzionisan sa BH3 domenom iz mišjeg BAX, čime je nastao YopE1-138-(tBID-BH3)-(BAX-BH3) (SEQ ID No.203). U slučaju mišjeg tBID i mišjeg BAX, kodon je optimizovan za Y. enterocolitica.

[0126] Iako infekcija u trajanju od 4 sata sa Y. enterocolitica ΔHOPEMT asd za isporuku YopE1-138-Myc nije dovela do indukcije apoptoze, translokacija BH3 domena mišjeg tBID (optimizovanih kodona za Y. enterocolitica, SEQ ID No.194) pokrenula je ćelijsku smrt u B16F10 i 4T1 ćelijama, sa jasnim doznim odgovorom na povećanje multipliciranosti infekcije (MOI). Zanimljivo je i da je utvrđeno da su isporučen YopE1-138-(tBID-BH3)-(BAX-BH3) ili YopE1-138-(tBID-BH3)2bili aktivniji u odnosu na YopE1-138-(tBID-BH3) pri niskim MOI. Navedeno ukazuje da nakon isporuke ponovljenih identičnih domena ili kombinacije različitih proteinskih domena može biti povećan uticaj na željeni ćelijski put poput onog uključenog u apoptozu.

Smanjenje virulucije delecijom/mutacijom bakterijskih efektorskih proteina sa virulentnom aktivnošću za eukariotske ćelije

[0127] U slučaju Y. enterocolitica, virulencija je bila smanjena delecijom šest endogenih efektorskih proteina, nazvanih „spoljni proteini Yersinia“ (Yops), preciznije YopH, O, P, E, M, T (MRS40 pIML421 [yopHΔ1-352, yopOΔ65-558, yopP23, yopE21, yopM23, yopT135]) [40]. Ovi Yop su kodirani na „Yersinia plazmidu virulencije" (pYV), plazmidu veličine oko 70kbp, kojim je kodiran i kompletan sistem za sekreciju tipa 3 (T3SS), kao i drugi učenici virulencije (Sl.24). YopH, O, P, E, M i T su šest efektorskih proteina, koji se bakterijskim sistemom sekrecije tipa tri dostavljaju ćelijama domaćinima da bi modulisao i prigušio imuni sistem. Svaki Yop karakteriše specifična biohemijska aktivnost u ćeliji domaćinu. YopT cepanjem odvaja C-terminalni cistein Rho GTPaza i time uklanja isporenilnu grupu kojom se GTPaze usidravaju na membrani. Ovakvom inaktivacijom Rho, usled pogrešne lokalizacije, izbegava se fagocitoza od strane imunih ćelija poput makrofaga i neutrofila [71]. Na isti način, YopE deluje kao aktivirajući protein GTPaze (GAP) za Rho GTPaze, čime ih deaktivira. Rezultat navedenog je smanjenje fagocitoze i inhibicija oslobađanja IL-1 beta od strane imunih ćelija [71]. Dalje, YopO deluje kao inhibitor disocijacije guanidinskih nukleotida (GDI), time što deaktivira Rho GTPaze. YopO dodatno sadrži serin/treoninski kinazni domen koji deluje na na aktinski citoskelet, načinom koji još uvek nije definisan [71]. YopH je tirozinska fosfataza koja deluje na fokalne adhezione proteine poput Fokalne adhezione kinaze (Fak), paksilina i drugih, čime snažno sprečava fagocitozu od strane makrofaga i neutrofila [71]. Utvrđeno je i da YopP, označen i kao YopJ u Y. pseudotuberculosis ili Y. pestis, inaktivira MAPK/NFkB signalni put u imunskim ćelijama, sprečavajući oslobađanje TNFa i IL-8 iz imunskih ćelija stimulisanih prisustvom bakterija. Dodatno, utvrđeno je da YopP indukuje apoptozu u imunskim ćelijama, što bi moglo biti povezano sa dejstvom na MAPK signalni put, koji u svom aktiviranom stanju štiti ćelije od apoptoze [71]. Uloga YopM još uvek nije potpuno jasna, ali je utvrđeno da je povezana sa ribozomskom S6 kinazom 1 (RSK1) i protein kinazom sličnom C tipa 2 (PRK2). Deluje da bi YopM mogao stimulisati fosforilaciju RSK1 i tako uticati na nishodne ciljne procese, kao što je npr. progresija ćelijskog ciklusa [71]. Delecijom jednog ili nekoliko od ovih Yop, dramatično biva pogođen odbrambeni mehanizam bakterija protiv imunog sistema [72]. Mutacija odgovarajućih yop je potvrđena PCR postupkom za odgovarajući region, kao i analizom in vitro sekrecije (Sl.25). Analiza in vitro sekrecije, upotrebom SDS-PAGE postupka i bojenja sa Coomassie-plavim je potvrdila odsustvo YopH,O,M i YopE pune dužine.

[0128] Štaviše, konstruisan je i soj Y. enterocolitica sa delecijama u asd (aspartat semialdehid dehidrogenazi). Mutacija u asd dovodi do potpunog gubitka sposobnosti rasta bez dodavanja mezodiamino-pimelične kiseline. Ovo omogućava stvaranje sistema za održavanje plazmida bez antibiotika koji je zasnovan na prisustvu asd na odgovarajućem plazmidu. Na sličan način, mogu biti upotrebljeni i drugi auksotrofni mutanti.

Studija eskalacije doze na zdravim miševima

[0129] Da bi se procenila akutna toksičnost, sprovedena je studija eskalacije doze na zdravim imunokompetentnim miševima (C57BL/6). U ovim eksperimentima, Y. enterocolitica podvrste palearctica MRS40 ΔyopH,O,P,E,M,T Δasd (sa deficijentnom replikacijom usled Δasd i dalje oslabljenom virulencijom usled ΔyopH,O,P,E,M,T, upoređivana je sa S. typhimurium ΔaroA (umanjene sposobnosti rasta usle ΔaroA, kao što je upotrebljavano od strane drugih [73-75]). Akutna toksičnost nakon infekcije je ispitivana na osnovu prirasta ili gubitka težine miševa nakon i.v. injeciranja bakterija. Dodatno, utvrđen je i broj bakterija u različitim organima, homogenizacijom organa, serijskim razblaživanjem i zasejavanjem. Kako akutna toksičnost i rast bakterija nisu bili od glavnog interesa, nije primenjivan prethodan tretman sa desferoksaminom. Ispitivane su četiri različite koncentracije bakterija za svaki soj (10<5>, 10<6>, 10<7>, 10<8>cfu po životinji). Y. enterocolitica podvrste palearctica MRS40 ΔyopH,O,P,E,M,T Δasd nije doveo do smanjenja težine u dve niže doze (10<5>, 10<6>cfu) (Sl.26). U dozi od 10<7>bakterija, težina je opala za oko 6% u prva 24 sata, pre stabilizacije i nastavka porasta. Kod najveće doze, utvrđeno je da je težina pala za 7,5%, 48 sati nakon infekcije (Sl. 26). Pošto Y. enterocolitica podvrste palearctica MRS40 ΔyopH,O,P,E,M,T Δasd ne može uspostaviti infekciju, čak i više u odsustvu prethodnog tretmana sa desferoksaminom, očekivalo se da će broj bakterija brzo opasti, što je i utvrđeno (Sl. 27 - 30). Ipak, jaka akutna toksičnost usled npr. endotoksičnog šoka nije zapažena, čak ni kod najveće primenjene doze Y. enterocolitica. Navedeno je u suprotnosti sa rezultatima dobijenim za S. typhimurium ΔaroA koja je kompetentna za rast i infekciju i koja je mnogo puta upotrebljavana u istraživanjima na mišima od strane drugih [73-75], dok su dvostruki mutanti aroA i aroD ispitivani čak i u kliničkim studijama (NCT01099631). Određivanje skora fizičkog izgleda i ponašanja nas je podstaklo da žrtvujemo sve miševe koji su bili inficirani sa najvišom dozom S. typhimurium ΔaroA, 1. dana nakon infekcije i 4. dana za dozu od 10<7>cfu. Utvrđeno je progresivno smanjenje težine za tri najviše doze (Sl.

26), dok je za najnižu dozu utvrđeno da indukuje samo trajno blag gubitak težine (Sl. 26). Čak i kod najniže ispitivane doze, S. typhimurium ΔaroA je pronađen u jetri, slezini i plućima do 8. dana nakon infekcije (Sl. 27 - 30). Navedeno bi moglo odražavati neoptimalnu biodistribuciju S. typhimurium ΔaroA, a koju su primetili i drugi [76].

[0130] U eksperimentima ekskalacije doze radi ispitivanja akutne toksičnosti, koji su urađeni na imunokompetentnim miševima, pokazano je da se Y. enterocolitica ΔyopH,O,P,E,M,T Δasd nakon i.v.

1

primene bezbedno toleriše do 10<8>bakterija po mišu. Takva doza može biti upotrebljena i u kliničkim ispitivanjima na ljudima [77], sa težinskom razlikom kod miša u odnosu na čoveka od nekoliko hiljada puta. Kako je poznato da miševi osećaju gram-negativne bakterije na isti način kao i ljudi, posredstvom TLR4, kao i da su sa tendencijom da reaguju na isti stimulus lipida A [78], početna toksičnost usled septičkog šoka prouzrokovana lipidom A kod humanih pacijenata je malo verovatna sa bakterijskim koncentracijma koje su do sada upotrebljavane u kliničkim ispitivanjima [77]. Štaviše, predloženo je da je nedostatak normalnog imuno-stimulirajućeg lipida A važan za odstupanja koja su uočena u kliničkim testovima sa S. enterica VNP20009 [79]. Moglo bi stoga biti povoljnije da se smanji inicijalna koncentracija bakterija koja se primenjuje pacijentu, uz zadržavanje strukture lipida A divljeg tipa, a da bi se postigla optimalna kolonizacija tumora, gde se veća opterećenja mogu dobiti replikacijom bakterija.

[0131] Na mestu prisustva bakterija u organizmu, pokrenuće se imunski odgovor u svrhu borbe protiv bakterija. Nakon akumulacije i rasta bakterija na mestu solidnih tumora [76,80-82]), imuni sistem će, nakon početnog širenja bakterija, biti aktiviran na mestu tumora. Iako se septički šok i akutna toksičnost kod pacijenata moraju izbegavati smanjenjem početnog bakterijskog opterećenja i/ili smanjenjem endotoksičnosti bakterija putem modifikacija lipida A, stimulacija imunog sistema na mestu tumora je veoma poželjna, pošto pomaže u klirensu kancerskog tkiva (imunoterapijom, imunosenzitizacijom). Aktuelna faza II kliničnog pilot eksperimenta (EudraCT br.2005-005775-15) sa S. enterica, nadovezuje se na ovakav imunoterapijski efekat i prirodnu toksičnost bakterija [83]. Imunosenzitizacija je jedan od ključnih mehanizama dejstva genetički neizmenjene bakterija Salmonella na tumore, kao što se npr. Salmonella choleraesuis nakuplja u tumorima i izaziva infiltraciju neutrofila i antitumorski imuni odgovor [84]. Dodatno, pokazano je i da aktivacija imunog sistema na mestu tumora ne sprečava višestruku primenu bakterija u onkoterapiji [85].

Sumarno, imuni odgovor pokrenut bakterijskim terapeuticima za kancer moraju biti podeljeni na neželjenu aktunu fazu, koju je potrebno održavati niskom, i željenu aktivaciju u kasnijoj fazi, a koja pomaže u iskorenjivanju tumora. Navedeno se može postići primenom visokih doza nižih endotoksičnih bakterija ili primenom nižih nivoa normalno endotoksičnih bakterija, koje su sa povećanim kapacitetom da kolonizuju i da se replikuju u solidnim tumorima [79].

Studije biološke raspodele na mišjem modelu melanoma

[0132] Da bi se potvrdilo da gram-negativne bakterije sa mutacijom(mutacijama) u ključnim determinantama virulencije kao što su T3SS efektori, mogu poslužiti kao nosači koji su specifični za tumor, urađena je studija sa mišjim alografnim tumorom, upotrebom dobro uspostavljenog B16F10 modela melanoma ([86], ATCC br. CRL-6475). Kada su s.c. tumori dostigli određenu veličinu (oko 100-200 mm<3>), miševima su bili inficirani i.v. sa 2x10<5>cfu Y. enterocolitica podvrste palearctica MRS40 ili Y. enterocolitica podvrste palearctica MRS40 ΔyopH,O,P,E,M,T. Da bi se omogućio rast bakterija, miševi su prethodno tretirani, 24 sata pre infekcije, sa desfreoksaminom. Kod miševa inficiranih sa sojem Y. enterocolitica podvrste palearctica MRS40 divljeg tipa utvrđeni su povećan skor za fizički izgled i ponašanje (Sl. 31-32) i došlo je do značajnog gubitka telesne težine tokom prvih 48 infekcije (Sl. 33), što nas je potaklo da žrtvujemo sve miševe iz ove grupe već drugog dana nakon infekcije. Nasuprot tome, kod miševa inficiranih sa sojem Y. enterocolitica podvrste palearctica MRS40 ΔyopH,O,P,E,M,T oslabljene virulencije nije pokazan značajan gubitak težine, a skor za fizički izgled i ponašanje su 4. dana nakon infekcije još uvek bili normalani (Sl.31-33). Kod miševa inficiranih sa sojem

2

divljeg tipa (Y. enterocolitica podvrste palearctica MRS40) žive bakterije su detektovane u svim ispitivanim organima, a dodatno i u krvi (Sl. 35). Dok je prisustvo bakterija divljeg tipa utvrđeno u malignom solidnom tumoru, podjednako visok ili veći broj je pronađen i u drugim organima, sa najvećim brojem u slezini (Sl.35). U opštroj suprotnosti je bio nalaz da su kod miševa inficiranih sa Y. enterocolitica podvrste palearctica MRS40 ΔyopH,O,P,E,M,T žive bakterije bile uglavnom pronađene u malignom solidnom tumoru 1. dana nakon infekcije, sa malim brojem bakterija koji se mogao uočiti u slezini, jetri i plućima. Značajno je da se, 4. dana nakon infekcije, broj bakterija u solidnom malignom tumoru povećao za neki red veličine (dostižući više od 10<8>cfu/g tumorskog tkiva), dok je u svim ostalim organima ispitivanje broja bakterija ukazalo na pad ispod granice detekcije (Sl.34). Na mestu malignog solidnom tumora je zapravo, 4. dana nakon infekcije, došlo do nakupljanja Y. enterocolitica podvrste palearctica MRS40 ΔyopH,O,P,E,M,T sa odnosom koji je bio za oko (minimalno) milion puta veći u poređenju sa slezinom ili jetrom (kada je odnos računat u odnosu na granicu detekcije).

Navedeni rezultati potvrđuju da ova strategija za ublažavanje virulencije, sa mutacijom ključnih determinanti virulencije, generiše bakterijski nosač koji specifično ciljano deluje na maligni solidni tumor.

Studije biološke raspodele na mišjem modelu kancera dojke

[0133] Da bi se potvrdilo da gram-negativne bakterije sa mutacijom(mutacijama) u ključnim determinantama virulencije, kao što su T3SS efektori, mogu poslužiti kao nosači koji su specifični za tumor, urađena je studija i sa mišjim alografnim tumorom upotrebom dobro uspostavljenog 4T1 modela kancera dojke (ATCC br. CRL-2539). Kada su s.c. tumori dostigli određenu veličinu (oko 100-200 mm<3>), miševima su bili inficirani i.v. sa 2x10<5>cfu Y. enterocolitica podvrste palearctica MRS40 ΔyopH,O,P,E,M,T. Da bi se omogućio rast bakterija, miševi su prethodno tretirani, 24 sata pre infekcije, sa desfreoksaminom. Kod miševa inficiranih sa sojem Y. enterocolitica podvrste palearctica MRS40 ΔyopH,O,P,E,M,T oslabljene virulencije nije pokazan značajan gubitak težine i skor za fizički izgled i ponašanje je 8. dana nakon infekcije još uvek bio normalan. Kod ovih miševa inficiranih sa Y. enterocolitica podvrste palearctica MRS40 ΔyopH,O,P,E,M,T, žive bakterije su pronađene isključivo u malignom solidnom tumoru 8. dana nakon infekcije (Sl.36). Na mestu malignog solidnom tumora je, 8. dana nakon infekcije, zapravo došlo do nakupljanja Y. enterocolitica podvrste palearctica MRS40 ΔyopH,O,P,E,M,T sa odnosom koji je bio od oko (minimalno) nekoliko 10000 puta veći u poređenju sa slezinom ili jetrom (kada je odnos računat u odnosu na granicu detekcije).

Navedeni rezultati takođe potvrđuju da ova strategija za ublažavanje virulencije, sa mutacijom ključnih determinanti virulencije, generiše bakterijski nosač koji specifino ciljano deluje na maligni solidni tumor.

Generisanje pojačanih pro-apoptotskih bakterija

[0134] U prethodno navedenim eksperimentima je pokazano da isporuka pro-apoptotskih proteina, zasnovana na T3SS (npr. t-BID (SEQ ID No.25) ili BIM (SEQ ID No.21)) efikasno indukuje ćelijsku smrt i u ćelijama glodara i humanim ćelijama, uključujući kancerske ćelije, ali i da ovakvo dejstvo može biti povećano prilikom upotrebe mišjeg t-BID koji je optimizovan za upotrebu bakterijskih kodona (SEQ ID No.138). Navedeno povećanje ubijanja ćelija vrlo verovatno odražava povećanu količinu proizvodnje proteina, nakon koje sledi isporuka putem T3SS usled prisustva optimizovanih kodona koji su upotrebljeni.

Da bi se optimizovala isporuka ili pro-apoptotskih proteina, generisani su sojevi koji su transformisani sa različitim propoptotskim proteinima, u skladu sa podacima navedenim u Tabeli IV.

Tabela IV: Sojevi transformisani sa različitim propoptotskim proteinima

[0121] Skraćivanje isporučenih proteina na esencijalne domene potrebne za signalizaciju (npr. BH3 domen t-BID (SEQ ID No.138 ili 200)) može povećati efikasnost ubijanja ćelija (Sl. 37). Bez vezivanja za teoriju, ovo povećanje u efikasnosti je verovatno povezano sa povećanom količinom proizvodnje proteina nakon koje sledi isporuka putem T3SS, usled manje veličine isporučenog proteina. Uvođenje linkera između YopE dela i BH3 domena tBID (SEQ ID No.210) je smanjilo efikasnost, ali je i produžilo BH3 domen za još 4 dodatne aminokiseline (SEQ ID No.209) (Sl.37).

Dodatno, generisani su i sintetski tereti sa ponovcima takvih esencijalnih domena (npr. BH3 domena t-BID (SEQ ID No. 202)) ili kombinacije ovih esencijalnih domena (npr. BH3 domena iz t-BID i BH3 domena iz BAX (SEQ ID No. 203 i 211)). Iznenađujuće, utvrđeno je da tandemski ponovci istih ili različitih BH3 domena rezultuju u pojačanoj indukciji apoptoze kod kancerskih ćelijskih linija (uključujući 4T1 i B16F10 ćelije, Sl. 37). Utvrđeno je da je IC50 (polovina maksimalne inhibitorne koncentracije), koji se odnosi na broj bakterija po eukariotskoj ćeliji (MOI), a koji je potreban da bi se ubilo 50% takvih ćelija, bio smanjen nakon isporuke tandemskih ponovaka tBID BH3 domena u

4

poređenju sa jednim tBID BH3 domenom (Sl. 37). Navedeni nalaz je bio iznenađujuć, pošto se fuzionisanjem drugog BH3 domena t-BID povećava veličina proteina. Usled toga, mogli bi se očekivati smanjeni nivoi ekspresije i isporuke YopE1-138-(tBID BH3)2(SEQ ID No.202) u poređenju sa YopE1-138-tBID BH3 (SEQ ID No. 138 ili 200), kao i brzo dostizanje maksimalnih ekvivalentnih nivoa. Da bi se postiglo povećanje aktivnosti ubijanja ćelija, fuzionisani tBID BH3 domeni moraju istovremeno delovati jedan pored drugog nakon isporuke u eukariotske ćelije sa T3SS. U slučaju da je samo jedan tBID BH3 domen u YopE1-138-(tBID BH3)2konstruktu bio funkcionalan, u najboljem slučaju bi se mogla očekivati ista efikasnot kao kod YopE1-138-tBID BH3.

U cilju povećanja genetičke stabilnosti YopE1-138-(tBID BH3)2(SEQ ID No.202) za in vivo studije, klonirali smo YopE1-138-(tBID BH3)2(SEQ ID No. 202), homolognom rekombinacijom na Yersinia plazmidu virulencije pYV, na nativnom mestu YopE i pod kontrolom nativnog YopE promotora (upotrebom mutirajućih plamida pSI_408 i pSI_419). Takvi mutirajući materijali su sadržavali DNK sekvencu koja kodira željeni protein, sa čije obe bočne strane su se nalazile sekvence sa 200-250 bp koje su odgovarale mestu odgovarajućeg gena gde će se izvršiti integracija. Ovakvi plazmidi su transformisani u E. coli Sm10 λ pir, odakle su plazmidi mobilisani u odgovarajući soj Y. enterocolitica. Mutanti sa integrisanim vektorom su dalje propagirani na isti način tokom nekoliko generacija, bez primene selektivnog pritiska. Zatim je za odabir klonova koji su izgubili vektor upotrebljena saharoza. Konačno, mutanti su identifikovani PCR postupkom za detekciju kolonija. Endogeni proteini za transport sa T3SS (nazvani „spoljni proteini Yersinia", Yop) su kodirani sa Y. enterocolitica na ovom plazmidu od 70kb, nazvanom plazmid virulencije iz Yersinia (pYV), a koji dodatno kodira T3SS aparat. Sojevi Yersinia koji kodiraju YopE1-138-(tBID BH3) (SEQ ID No. 138 ili 200) ili YopE1-138-(tBID BH3)2(SEQ ID No. 202) na Yersinia plazmidu virulencije pYV, na nativnom mestu YopE i pod kontrolom nativnog YopE promotora, ispitivani su dalje u pogledu njihovog kapaciteta da indukuju apoptozu u kancerskim ćelijama (uključujući 4T1 i B16F10 ćelije, Sl. 38). Utvrđeno je da je IC50 (polovina maksimalne inhibitorne koncentracije), koji se odnosi na broj bakterija po eukariotskoj ćeliji (MOI) potreban da bi se ubilo 50% takvih ćelija, smanjen nakon isporuke tandemskih ponovaka tBID BH3 domena u poređenju sa isporukom jednog tBID BH3 domena, kada su oba proteina bila kodirana na Yersinia plazmidu virulencije pYV, na nativnom mestu YopE i pod kontrolom nativnog YopE promotora (Sl.38). Navedeno se slaže sa nalazima dobijenim nakon isporuke ovih proteina putem proizvodnje sa ekspresionih plazmida (Sl. 37). Ponovo, nalaz je bio iznenađujuć, pošto se fuzionisanjem BH3 domena t-BID povećava veličina proteina. Usled toga, mogli bi se očekivati smanjeni nivoi ekspresije i isporuke YopE1-138-(tBID BH3)2(SEQ ID No.202) u poređenju sa YopE1-138-tBID BH3 (SEQ ID No.138 ili 200), kao i da bi se brzo mogli dostići maksimalni ekvivalentni nivoi. Da bi se postiglo povećanje aktivnosti ubijanja ćelija, nakon isporuke u eukariotske ćelije sa T3SS, fuzionisani tBID BH3 domeni moraju istovremeno delovati jedan pored drugog. U slučaju da je samo jedan tBID BH3 domen u YopE1-138-(tBID BH3)2konstruktu bio funkcionalan, u najboljem slučaju bi se mogla očekivati ista efikasnot kao kod YopE1-138-tBID BH3. Štaviše, sojevi Yersinia koji kodiraju YopE1-138-(tBID BH3)2(SEQ ID No. 202) na Yersinia plazmidu virulencije pYV, na nativnom mestu YopE i pod kontrolom nativnog YopE promotora, upoređivani su u pogledu njihovog kapaciteta da indukuju apoptozu u kancerskim ćelijama sa isporukom YopE1-138-(tBID BH3)2koja je vršena ekspresionim plazmidom (zasnovanom na pBad-MycHisA). U skladu sa većim brojem kopija pBad-MycHisA (20-25 kopija) u poređenju sa pYV (prijavljeno je 1-6 kopija), rezultat isporuke YopE1-138-(tBID BH3)2(SEQ ID No.202) zasnovane na pBad-MycHisA, bilo je blago smanjenje IC50 vrednosti kod 4T1 i B16F10 ćelija (Sl.38).

Validacija rasta specifičnog za tumor in vivo, do 14. dana nakon primene bakterija

[0136] Eksperiment kolonizacije tumora sa genetički modifikovanim Y. enterocolitica je ponovljen na singenom mišjem alograftnom modelu (4T1 model kancera dojke), a kolonizacija bakterija je praćena tokom dve nedelje. Ovaj put, miševi su bili inficirani sa 1<∗>10<6>jedinica formiranja kolonija (CFU) Y. enterocolitica ΔyopH,O,P,E,M,T. Iako su dobijeni slični rezultati kao kod B16F10 modela u ranim danima nakon infekcije, mogli smo dodatno pokazati da se kolonizacija tumora konstantno uočava i 8. dana i do 14. dana nakon infekcije (Sl.39). Pored toga, kolonizacija ostaje visoko specifična sa samo malim brojem bakterija koji je detektovan u svim ostalim ispitivanim organima (Sl. 40). Ovi nalazi ukazuju da je Y. enterocolitica ΔyopH,O,P,E,M,T u stanju da uspostavi trajnu kolonizaciju tumora, sprečavajući time klirens imunim sistemom.

Efikasnost Y. enterocolitica ΔHOPEMT u odlaganju progresije tumora

[0137] Da bi se ispitao uticaj YopE1-138-(tBID BH3)2(SEQ ID No.202) isporučenog tumorskim ćelijama in vivo, sproveli smo i studije na Balb/C miševima divljeg tipa kojima je s.c. transplantiran alograft sa 4T1 ćelijama kancera dojke. Cilj nam je bio da ispitamo soj Y. enterocolitica ΔHOPEMT koji kodira YopE1-138-(tBID BH3)2(SEQ ID No. 202) na Yersinia plazmidu virulencije pYV, i to na nativnom mestu YopE i pod kontrolom nativnog YopE promotora. Miševi su bili i.v. injecirani sa PBS-om ili sa 1<∗>10<7>Y. enterocolitica ΔHOPEMT pYV-YopE1-138-(tBID BH3)2, a nakon što je tumor dostigao veličinu od 150-250 mm<3>. Dan kada su bakterije i.v. injecirane je definisan je kao Dan 0. Zapremina tumora je merena tokom nekoliko sledećih dana (od 0. dana do 9. dana nakon i.v. injeciranja bakterija) upotrebom kalipera. Zapremina tumora je normalizovana u odnosu na zapreminu tumora na Dan 0, da bi se kompenzovala bilo kakva početna heterogenost u veličini tumora. Tretman sa Y. enterocolitica ΔHOPEMT pYV-YopE1-138-(tBID BH3)2je pokazao uticaj na napredovanje zapremine tumora, sa statistički značajnim smanjenjem tumora 8., 9. i 10. dana nakon primene bakterija (Sl. 41). Važno je napomenuti i da nije utvrđeno da je Y. enterocolitica ΔHOPEMT samostalno uticala na progresiju tumora u 4T1 mišjem modelu kancera (Sl. 42). Navedeni nalazi ističu da navedene bakterije i njihov T3SS mogu biti iskorišćeni za ometanje progresije tumora.

Spisak referenci

[0138]

1 Hoffman, R. M. Tumor-seeking Salmonella amino acid auxotrophs. Curr Opin Biotechnol 22, 917-923, doi:10.10161j.copbio.2011.03.009 (2011).

2 Hoang, T. T., Williams, S., Schweizer, H. P. & Lam, J. S. Molecular genetic analysis of the region containing the essential Pseudomonas aeruginosa asd gene encoding aspartate-betasemialdehyde dehydrogenase. Microbiology 143 (Pt 3), 899-907 (1997).

3 Skurnik, M. & Wolf-Watz, H. Analysis of the yopA gene encoding the Yop1 virulence determinants of Yersinia spp. Mol Microbiol 3, 517-529 (1989).

4 Isberg, R. R., Voorhis, D. L. & Falkow, S. Identification of invasin: a protein that allows enteric bacteria to penetrate cultured mammalian cells. Cell 50, 769-778 (1987).

5 Cornelis, G. R. The type III secretion injectisome. Nat Rev Microbiol 4, 811-825, doi:nrmicro1526 [pii]10.1038/nrmicro1526 (2006).

6 Mota, L. J. & Cornelis, G. R. The bacterial injection kit: type III secretion systems. Ann Med 37, 234-249, doi:R673752030212825 [pii]10.1080/07853890510037329 (2005).

7 Trosky, J. E., Liverman, A. D. & Orth, K. Yersinia outer proteins: Yops. Cell Microbiol 10, 557-565, doi:10.1111/j.1462-5822.2007.01109.x (2008).

8 Brenner, D. & Mak, T. W. Mitochondrial cell death effectors. Curr Opin Cell Biol 21, 871-877, doi:S0955-0674(09)00160-4 [pii]10.1016/j.ceb.2009.09.004 (2009).

9 Chalah, A. & Khosravi-Far, R. The mitochondrial death pathway. Adv Exp Med Biol 615, 25-45, doi:10.1007/978-1-4020-6554-5_3 (2008).

10 Fuchs, Y. & Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell 147, 742-758, doi:S0092-8674(11)01283-9[pii]10.1016/j.cell.2011.10.033 (2011).

11 Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. Protein Expr Purif 80, 283-293, doi:S1046-5928(11)00203-8 [pii]10.1016/j.pep.2011.08.005 (2011).

12 Howard, S. L. i saradnici. Application of comparative phylogenomics to study the evolution of Yersinia enterocolitica and to identify genetic differences relating to pathogenicity. J Bacteriol 188, 3645-3653, doi:10.1128/JB.188.10.3645-3653.2006 (2006).

13 Thomson, N. R. i saradnici. The complete genome sequence and comparative genome analysis of the high pathogenicity Yersinia enterocolitica strain 8081. PLoS Genet 2, e206, doi:10.1371/journal.pgen.0020206 (2006).

14 Pelludat, C., Hogardt, M. & Heesemann, J. Transfer of the core region genes of the Yersinia enterocolitica WA-C serotype O:8 high-pathogenicity island to Y. enterocolitica MRS40, a strain with low levels of pathogenicity, confers a yersiniabactin biosynthesis phenotype and enhanced mouse virulence. Infect Immun 70, 1832-1841 (2002).

15 Mulder, B., Michiels, T., Simonet, M., Sory, M. P. & Cornelis, G. Identification of additional virulence determinants on the pYV plasmid of Yersinia enterocolitica W227. Infect Immun 57, 2534-2541 (1989).

16 Sory, M. P. & Cornelis, G. R. Translocation of a hybrid YopE-adenylate cyclase from Yersinia enterocolitica into HeLa cells. Mol Microbiol 14, 583-594 (1994).

17 Sarker, M. R., Neyt, C., Stainier, I. & Cornelis, G. R. The Yersinia Yop virulon: LcrV is required for extrusion of the translocators YopB and YopD. J Bacteriol 180, 1207-1214 (1998).

18 Neubauer, H., Aleksic, S., Hensel, A., Finke, E. J. & Meyer, H. Yersinia enterocolitica 16S rRNA gene types belong to the same genospecies but form three homology groups. Int J Med Microbiol 290, 61-64, doi:10.1016/S1438-4221(00)80107-1 (2000).

19 Feldman, M. F., Muller, S., Wuest, E. & Cornelis, G. R. SycE allows secretion of YopE-DHFR hybrids by the Yersinia enterocolitica type III Ysc system. Mol Microbiol 46, 1183-1197, doi:3241 [pii] (2002).

20 Ramamurthi, K. S. & Schneewind, O. A synonymous mutation in Yersinia enterocolitica yopE affects the function of the YopE type III secretion signal. J Bacteriol 187, 707-715, doi:10.1128IJB.187.2.707-715.2005 (2005).

21 Wolke, S., Ackermann, N. & Heesemann, J. The Yersinia enterocolitica type 3 secretion system (T3SS) as toolbox for studying the cell biological effects of bacterial Rho GTPase modulating T3SS effector proteins. Cell Microbiol 13, 1339-1357, doi:10.1111/j.1462-5822.2011.01623.x (2011).

22 Forsberg, A. & Wolf-Watz, H. Genetic analysis of the yopE region of Yersinia spp.: identification of a novel conserved locus, yerA, regulating yopE expression. J Bacteriol 172, 1547-1555 (1990).

23 Sambrook, J. (ed David W. Russell) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. E., 2001).

24 Alto, N. M. & Dixon, J. E. Analysis of Rho-GTPase mimicry by a family of bacterial type III effector proteins. Methods Enzymol 439, 131-143, doi:S0076-6879(07)00410-7 [pii]10.1016/S0076-6879(07)00410-7 (2008).

25 Alto, N. M. i saradnici. Identification of a bacterial type III effector family with G protein mimicry functions. Cell 124, 133-145, doi:S0092-8674(05)01229-8 [pii]10.1016/j.cell.2005.10.031 (2006).

26 Kaniga, K., Delor, I. & Cornelis, G. R. A wide-host-range suicide vector for improving reverse genetics in gram-negative bacteria: inactivation of the blaA gene of Yersinia enterocolitica. Gene 109, 137-141, doi:0378-1119(91)90599-7 [pii] (1991).

27 Yoneda, Y. i saradnici. A long synthetic peptide containing a nuclear localization signal and its flanking sequences of SV40 T-antigen directs the transport of IgM into the nucleus efficiently. Exp Cell Res 201, 313-320 (1992).

28 Metcalf, W. W., Jiang, W. & Wanner, B. L. Use of the rep technique for allele replacement to construct new Escherichia coli hosts for maintenance of R6K gamma origin plasmids at different copy numbers. Gene 138, 1-7 (1994).

29 Diepold, A. i saradnici. Deciphering the assembly of the Yersinia type III secretion injectisome. Embo J 29, 1928-1940, doi:emboj201084[pii]10.1038/emboj.2010.84 (2010).

30 Iriarte, M., Stainier, I. & Cornelis, G. R. The rpoS gene from Yersinia enterocolitica and its influence on expression of virulence factors. Infect Immun 63, 1840-1847 (1995).

31 Cornelis, G., Vanootegem, J. C. & Sluiters, C. Transcription of the yop regulon from Y. enterocolitica requires trans acting pYV and chromosomal genes. Microb Pathog 2, 367-379, doi:0882-4010(87)90078-7[pii] (1987).

32 Grosdent, N., Maridonneau-Parini, I., Sory, M. P. & Cornelis, G. R. Role of Yops and adhesins in resistance of Yersinia enterocolitica to phagocytosis. Infect Immun 70, 4165-4176 (2002).

33 Dehio, C., Meyer, M., Berger, J., Schwarz, H. & Lanz, C. Interaction of Bartonella henselae with endothelial cells results in bacterial aggregation on the cell surface and the subsequent engulfment and internalisation of the bacterial aggregate by a unique structure, the invasome. J Cell Sci 110 (Pt 18), 2141-2154 (1997).

34 Bensimon, A. i saradnici. ATM-dependent and -independent dynamics of the nuclear phosphoproteome after DNA damage. Sci Signal 3, rs3, doi:10.11261scisignal.200103431151/rs3 [pii] (2010).

35 Perkins, D. N., Pappin, D. J., Creasy, D. M. & Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis 20, 3551-3567, doi:10.1002/(SICI)1522-2683(19991201)20:18<3551::AID-ELPS3551>3.0.CO;2-2 [pii]10.1002/(SICI)1522-2683(19991201)20:18<3551::AID-ELPS3551>3.0.CO;2-2 (1999).

36 Smyth, G. K. Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments. Stat Appl Genet Mol Biol 3, Article3, doi:10.220211544-6115.1027 (2004).

37 Ting, L. i saradnici. Normalization and statistical analysis of quantitative proteomics data generated by metabolic labeling. Mol Cell Proteomics 8, 2227-2242, doi:10.1074/mcp.M800462-MCP200M800462-MCP200 [pii] (2009).

38 Vizcaino, J. A. i saradnici. The PRoteomics IDEntifications (PRIDE) database and associated tools: status in 2013. Nucleic Acids Res 41, D1063-1069, doi:10.1093/nar/gks1262gks1262 [pii] (2013).

39 Boyd, A. P., Lambermont, I. & Cornelis, G. R. Competition between the Yops of Yersinia enterocolitica for delivery into eukaryotic cells: role of the SycE chaperone binding domain of YopE. J Bacteriol 182, 4811-4821 (2000).

40 Iriarte, M. & Cornelis, G. R. YopT, a new Yersinia Yop effector protein, affects the cytoskeleton of host cells. Mol Microbiol 29, 915-929 (1998).

41 Kudryashev, M. i saradnici. In situ structural analysis of the Yersinia enterocolitica injectisome. Elife 2, e00792, doi:10.7554/eLife.0079200792 [pii] (2013).

42 Schulte, R. i saradnici. Yersinia enterocolitica invasin protein triggers IL-8 production in epithelial cells via activation of Rel p65-p65 homodimers. FASEB J 14, 1471-1484 (2000).

43 Mota, L. J., Journet, L., Sorg, I., Agrain, C. & Cornelis, G. R. Bacterial injectisomes: needle length does matter. Science 307, 1278, doi:307/5713/1278 [pii]10.11261science.1107679 (2005).

44 Isaksson, E. L. i saradnici. The membrane localization domain is required for intracellular localization and autoregulation of YopE in Yersinia pseudotuberculosis. Infect Immun 77, 4740-4749, doi:IAI.00333-09 [pii]10.1128/IAI.00333-09 (2009).

45 Denecker, G. i saradnici. Effect of low- and high-virulence Yersinia enterocolitica strains on the inflammatory response of human umbilical vein endothelial cells. Infect Immun 70, 3510-3520 (2002).

46 Sharma, S. i saradnici. Deployment of the Burkholderia glumae type III secretion system as an efficient tool for translocating pathogen effectors to monocot cells. Plant J 74, 701-712, doi:10.1111/tpj.12148 (2013).

47 Carrington, J. C. & Dougherty, W. G. A viral cleavage site cassette: identification of amino acid sequences required for tobacco etch virus polyprotein processing. Proc Natl Acad Sci USA 85, 3391-3395 (1988).

48 Kapust, R. B., Tozser, J., Copeland, T. D. & Waugh, D. S. The P1' specificity of tobacco etch virus protease. Biochem Biophys Res Commun 294, 949-955, doi:10.10161S0006-291X(02)00574-0S0006-291X(02)00574-0 [pii] (2002).

49 Liang, H., Gao, H., Maynard, C. A. & Powell, W. A. Expression of a self-processing, pathogen resistance-enhancing gene construct in Arabidopsis. Biotechnol Lett 27, 435-442, doi:10.1007/s10529-005-1884-9 (2005).

50 Weber, W. i saradnici. Macrolide-based transgene control in mammalian cells and mice. Nat Biotechnol 20, 901-907, doi:10.1038/nbt731nbt731 [pii] (2002).

51 Kapust, R. B. i saradnici. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Eng 14, 993-1000 (2001).

52 Lee, V. T., Anderson, D. M. & Schneewind, O. Targeting of Yersinia Yop proteins into the cytosol of HeLa cells: one-step translocation of YopE across bacterial and eukaryotic membranes is dependent on SycE chaperone. Mol Microbiol 28, 593-601 (1998).

53 Gray, D. C., Mahrus, S. & Wells, J. A. Activation of specific apoptotic caspases with an engineered small-molecule-activated protease. Cell 142, 637-646, doi:S0092-8674(10)00783-X[pii]10.1016/j.cell.2010.07.014 (2010).

54 Henrichs, T. i saradnici. Target-directed proteolysis at the ribosome. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 4246-4251, doi:102/12/4246[pii]10.1073/pnas.0408520102 (2005).

55 Hardt, W. D., Chen, L. M., Schuebel, K. E., Bustelo, X. R. & Galan, J. E. S. typhimurium encodes an activator of Rho GTPases that induces membrane ruffling and nuclear responses in host cells. Cell 93, 815-826, doi:S0092-8674(00)81442-7 [pii] (1998).

56 Hakansson, S. i saradnici. The YopB protein of Yersinia pseudotuberculosis is essential for the translocation of Yop effector proteins across the target cell plasma membrane and displays a contact-dependent membrane disrupting activity. Embo J 15, 5812-5823 (1996).

57 Stebbins, C. E. & Galan, J. E. Structural mimicry in bacterial virulence. Nature 412, 701-705, doi:10.1038/3508900035089000 [pii] (2001).

58 Li, H. i saradnici. The phosphothreonine lyase activity of a bacterial type III effector family. Science 315, 1000-1003, doi:31515814/1000[pii]10.11261science.1138960 (2007).

59 Norris, F. A., Wilson, M. P., Wallis, T. S., Galyov, E. E. & Majerus, P. W. SopB, a protein required for virulence of Salmonella dublin, is an inositol phosphate phosphatase. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 14057-14059 (1998).

60 Pulliainen, A. T. i saradnici. Bacterial effector binds host cell adenylyl cyclase to potentiate Galphas-dependent cAMP production. Proc Natl Acad Sci U S A 109, 9581-9586, doi:1117651109 [pii]10.10731pnas.1117651109 (2012).

61 Li, H., Zhu, H., Xu, C. J. & Yuan, J. Cleavage of BID by caspase 8 mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis. Cell 94, 491-501, doi:S0092-8674(00)81590-1 [pii] (1998).

62 Nagaraj, N. i saradnici. Deep proteome and transcriptome mapping of a human cancer cell line. Mol Syst Biol 7, 548, doi:msb201181 [pii]10.1038/msb.2011.81 (2011).

63 Blanco-Toribio, A., Muyldermans, S., Frankel, G. & Fernandez, L. A. Direct injection of functional single-domain antibodies from E. coli into human cells. PLoS One 5, e15227, doi:10.1371/journal.pone.0015227 (2010).

64 Caussinus, E., Kanca, O. & Affolter, M. Fluorescent fusion protein knockout mediated by anti-GFP nanobody. Nat Struct Mol Biol 19, 117-121, doi:nsmb.2180 [pii]10.1038/nsmb.2180 (2011).

65 Schmutz, C. i saradnici. Systems-Level Overview of Host Protein Phosphorylation During Shigella flexneri Infection Revealed by Phosphoproteomics. Mol Cell Proteomics 12, 2952-2968, doi:M113.029918 [pii]10.1074/mcp.M113.029918 (2013).

66 Szklarczyk, D. i saradnici. The STRING database in 2011: functional interaction networks of proteins, globally integrated and scored. Nucleic Acids Res 39, D561-568, doi:gkq973 [pii]10.1093/nar/gkq973 (2011).

67 Huang da, W., Sherman, B. T. & Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res 37, 1-13, doi:gkn923 [pii]10.1093/nar/gkn923 (2009).

68 Huang da, W. i saradnici. DAVID gene ID conversion tool. Bioinformation 2, 428-430 (2008). 69 Schwerk, C. & Schulze-Osthoff, K. Regulation of apoptosis by alternative pre-mRNA splicing. Mol Cell 19, 1-13, doi:S1097-2765(05)01375-4 [pii]10.1016/j.molcel.2005.05.026 (2005).

70 Papagiannakopoulos, T., Shapiro, A. & Kosik, K. S. MicroRNA-21 targets a network of key tumorsuppressive pathways in glioblastoma cells. Cancer Res 68, 8164-8172, doi:68/19/8164[pii]10.1158/0008-5472.CAN-08-1305 (2008).

71 Aepfelbacher, M., Trasak, C. & Ruckdeschel, K. Effector functions of pathogenic Yersinia species. Thromb Haemost 98, 521-529 (2007).

72 Trulzsch, K., Sporleder, T., Igwe, E. I., Russmann, H. & Heesemann, J. Contribution of the major secreted yops of Yersinia enterocolitica O:8 to pathogenicity in the mouse infection model. Infect Immun 72, 5227-5234, doi:10.1128/IAI.72.9.5227-5234.2004 (2004).

73 Cao, H. D. i saradnici. Attenuated Salmonella typhimurium carrying TRAIL and VP3 genes inhibits the growth of gastric cancer cells in vitro and in vivo. Tumori 96, 296-303 (2010).

74 Massa, P. E., Paniccia, A., Monegal, A., de Marco, A. & Rescigno, M. Salmonella engineered to express CD20-targeting antibodies and a drug-converting enzyme can eradicate human lymphomas. Blood 122, 705-714, doi:10.1182/blood-2012-12-474098 (2013).

75 Yoon, W. S., Chae, Y. S., Hong, J. & Park, Y. K. Antitumor therapeutic effects of a genetically engineered Salmonella typhimurium harboring TNF-alpha in mice. Appl Microbiol Biotechnol 89, 1807-1819, doi:10.1007/s00253-010-3006-4 (2011).

76 Forbes, N. S., Munn, L. L., Fukumura, D. & Jain, R. K. Sparse initial entrapment of systemically injected Salmonella typhimurium leads to heterogeneous accumulation within tumors. Cancer Res 63, 5188-5193 (2003).

77 Toso, J. F. i saradnici. Phase I study of the intravenous administration of attenuated Salmonella typhimurium to patients with metastatic melanoma. J Clin Oncol 20, 142-152 (2002).

78 Miller, S. I., Ernst, R. K. & Bader, M. W. LPS, TLR4 and infectious disease diversity. Nat. Rev. Microbiol.3, 36-46, doi:nrmicro1068 [pii]10.10381nrmicro1068 (2005).

79 Zhang, M., Swofford, C. A. & Forbes, N. S. Lipid A controls the robustness of intratumoral accumulation of attenuated Salmonella in mice. Int J Cancer 135, 647-657, doi:10.1002/ijc.28700 (2014).

80 Clairmont, C. i saradnici. Biodistribution and genetic stability of the novel antitumor agent VNP20009, a genetically modified strain of Salmonella typhimurium. J Infect Dis 181, 1996-2002, doi:10.10861315497 (2000).

81 Lee, C. H., Wu, C. L. & Shiau, A. L. Endostatin gene therapy delivered by Salmonella choleraesuis in murine tumor models. J Gene Med 6, 1382-1393, doi:10.1002/jgm.626 (2004).

82 Zheng, L. M. i saradnici. Tumor amplified protein expression therapy: Salmonella as a tumorselective protein delivery vector. Oncol Res 12, 127-135 (2000).

83 Forbes, N. S. Engineering the perfect (bacterial) cancer therapy. Nat Rev Cancer 10, 785-794, doi:nrc2934 [pii]10.1038/nrc2934 (2010).

84 Lee, C. H., Wu, C. L. & Shiau, A. L. Salmonella choleraesuis as an anticancer agent in a syngeneic model of orthotopic hepatocellular carcinoma. Int J Cancer 122, 930-935, doi:10.1002/ijc.23047 (2008).

85 Thamm, D. H. i saradnici. Systemic administration of an attenuated, tumor-targeting Salmonella typhimurium to dogs with spontaneous neoplasia: phase I evaluation. Clin Cancer Res 11, 4827-4834, doi:1O.1158/1078-0432. CCR-04-2510 (2005).

86 Fidler, I. J. Biological behavior of malignant melanoma cells correlated to their survival in vivo. Cancer Res 35, 218-224 (1975).

1

2

4

1

2

�

1

�

4

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

11

11

11

11

11

11

11

12

12

12

12

12

12

12

�

11

12

1

14

�

1

1

1

1

14

14

14

14

14

14

14

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

1

11

12

1

��

1

�

1

1

1

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

1

11

12

1

14

1

1

1

�

1

1

11

12

1

14

1

�

�

1

1

2

21

22

2

24

2

2

�

2

2

21

21

21

21

21

21

21

22

Claims (11)

Patentni zahtevi

1. Rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije transformisan sa vektorom koji sadrži, u smeru od 5’ ka 3’:

promotor;

prvu DNK sekvencu koja kodira signal za isporuku iz bakterijskog efektorskog proteina, operativno povezanu sa navedenim promotorom;

drugu DNK sekvencu koja kodira heterologni protein, fuzionisanu sa 3’ krajem navedene prve DNK sekvence tako da se zadrži okvir čitanja,

za upotrebu u postupku lečenja malignog solidnog tumora kod subjekta, pri čemu je rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije Yersinia soj deficijentan u proizvodnji siderofora i nakuplja se u malignom solidnom tumoru, pri čemu postupak obuhvata istovremenu primenu navedenog rekombinantnog Gram-negativnog bakterijskog soja oslabljene virulencije sa sideroforom subjektu i pri čemu se rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije primenjuje u količini koja je dovoljna za lečenje subjekta.

2. Rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije deficijentan u proizvodnji najmanje jednog bakterijskog efektorskog proteina koji je virulentan za eukariotske ćelije.

3. Rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije deficijentan u proizvodnji svih bakterijskih efektorskih proteina koji su virulentni za eukariotske ćelije.

4. Rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije mutant Yersinia soja u kome su svi geni koji kodiraju efektore oni koji kodiraju bakterijske efektorske proteine virulentne za eukariotske ćelije i mutirani su, tako da rezultujuća Yersinia više ne proizvodi nijedan od funkcionalnih efektorskih proteina koji su virulentni za eukariotske ćelije.

5. Rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije za upotrebu prema patentnom zahtevu 4, pri čemu je mutant Yersinia soja Y enterocolitica i signal za isporuku iz bakterijskog efektorskog proteina je signal za isporuku iz bakterijskog T3SS efektorskog proteina, pri čemu signal za isporuku iz bakterijskog T3SS efektorskog proteina sadrži 138 N-terminalnih aminokiselina YopE efektorskog proteina iz Y. enterocolitica.

6. Rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5, pri čemu je heterologni protein izabran iz grupe koja se sastoji od proteina uključenih u apoptozu ili regulaciju apoptoze, regulatora ćelijskog ciklusa, proteina sa ankirinskim ponovcima, proteina ćelijske signalizacije, reporterskih proteina, transkripcionih faktora, proteaza, malih GTPaza, proteina srodnih GPCR, fuzionih konstukata nano-antitela i nanoantitela, bakterijskih T3SS efektora, bakterijskih T4SS efektora i virusnih proteina.

7. Rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije, pri čemu je Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije Yersinia soj deficijentan u proizvodnji siderofora i pri čemu je rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije deficijentan u proizvodnji najmanje jednog bakterijskog efektorskog proteina koji je virulentan za eukariotske ćelije ili je deficijentan u proizvodnji najmanje jednog bakterijskog proteina koji je deo mašinerije sistema za sekreciju, za upotrebu u postupku lečenja malignog solidnog tumora kod subjekta, pri čemu se rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije nakuplja u malignom solidnom tumoru, a postupak obuhvata istovremenu primenu rekombinantanog Gramnegativnog bakterijskog soja oslabljene virulencije sa sideroforom subjektu, pri čemu se rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije primenjuje u količini koja je dovoljna za lečenje subjekta.

8. Rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije za upotrebu prema patentnom zahtevu 7, pri čemu je rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije deficijentan u proizvodnji svih efektorskih proteina koji su virulentni za eukariotske ćelije i rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije eksprimira konvertujući enzim za prolekova.

9. Rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-8, pri čemu se subjektu primenjuje oko 10<5>do oko 10<9>bakterija rekombinantnog Gram-negativnog bakterijskog soja oslabljene virulencije.

10. Rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9, pri čemu se rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije primenjuje subjektu prema doznom režimu koji se sastoji od jedne doze na svakih 2-20 dana, u periodu od oko 20-60 dana.

11. Rekombinantan Gram-negativan bakterijski soj oslabljene virulencije za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-10, pri čemu je broj bakterija rekombinantnog Gram-negativnog bakterijskog soja oslabljene virulencije, u organima u kojima maligni solidan tumor nije prisutan, ispod granice detekcije nakon najmanje četiri dana od poslednjeg primene rekombinantnog Gramnegativnog bakterijskog soja oslabljene virulencije subjektu.