Deprecated: The each() function is deprecated. This message will be suppressed on further calls in /home/zhenxiangba/zhenxiangba.com/public_html/phproxy-improved-master/index.php on line 456
RS62157B1 - Anti-her2 antitelo i njegov konjugat - Google Patents
[go: Go Back, main page]

RS62157B1 - Anti-her2 antitelo i njegov konjugat - Google Patents

Anti-her2 antitelo i njegov konjugat

Info

Publication number
RS62157B1
RS62157B1 RS20210939A RSP20210939A RS62157B1 RS 62157 B1 RS62157 B1 RS 62157B1 RS 20210939 A RS20210939 A RS 20210939A RS P20210939 A RSP20210939 A RS P20210939A RS 62157 B1 RS62157 B1 RS 62157B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
her2
cancer
functional fragments
tumor
Prior art date
Application number
RS20210939A
Other languages
English (en)
Inventor
Jianmin Fang
Changjiang Huang
Jing Jiang
Xuejing Yao
Hongwen Li
Qiaoyu Xu
Zhuanglin Li
Original Assignee
Remegen Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Remegen Co Ltd filed Critical Remegen Co Ltd
Publication of RS62157B1 publication Critical patent/RS62157B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6805—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a vinca alkaloid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6855—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from breast cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
[0001] Predmetna prijava zahteva korist od CN patentne prijave br.201310586326.2 pod nazivom „ANTI-HER2 ANTITELO I NJEGOV KONJUGAT“, podneta 19. novembra 2013.
OBLAST PRONALASKA
[0002] Predmetni pronalazak se odnosi na novo HER2 antitelo ili njegove funkcionalne fragmente, koje se sastoji od konstruisanih teških lakih i lakih lanaca. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na konjugate poboljšanog HER2 antitela sa lekovima malih molekula.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu antitela i konjugata u proizvodnji leka za lečenje tumora.
POZADINA PRONALASKA
1. Suština HER2
[0003] ErbB2, poznat i kao HER2/neu, drugi je član EGFR porodice, koja sa ostala tri člana iz porodice EGFR formira heterodimer, kako bi vršila biološku funkciju. Do danas ligand koji se može direktno vezati za ErbB2 još uvek nije pronađen. Gen neu koji kodira ErbB2 prvo je odvojen od neuroblastoma pacova. Homologni gen neu gena u somatskim ćelijama čoveka, poznat kao HER2, nalazi se na hromozomu 17q21.1. Kodirani proizvod je ErbB2, koji se sastoji od 1255 aminokiselina sa molekulskom masom oko 185 kDa, u kojima položaji 720-987 pripadaju aktivnom domenu tirozin kinaze. Pored igranja uloge kroz signalni put PI3K i MAPK, ErbB2 takođe može smanjiti ekspresiju ciklina D i c-myc, čime smanjuje ekspresiju inhibitora p27kipl zavisne od ciklina kinaze (cdk), što dovodi do proliferacije ćelija proistekle iz inhibicija aktivnosti cdk2 [1].
[0004] Sa ispitivanjima koje se sve više šire i produbljuju, otkriveno je da je HER2 eksprimiran ili prekomerno izražen u različitim tumorima. Do sada je zabeleženo da su pozitivna stopa ekspresije, stopa prekomerne ekspresije HER2 u nekoliko tumora i broj ljudi kod kojih je HER2 prekomerno izražen sledeći: rak jajnika, 45%, 21%, 23316 osoba [2]; rak dojke , 58%, 38%, 223112 osoba [3]; Stoga postoji hitna potreba u kliničkoj praksi za efikasnim lekovima koji ciljaju HER2 za lečenje malignog tumora. Do danas, komercijalno dostupna monoklonska antitela koja ciljaju HER2 uključuju trastuzumab i pertuzumab.2. Trastuzumab i Pertuzumab i druga anti HER2 antitela
[0005] Herceptin® (Trastuzumab), koji je razvio Genentech, je humanizovano monoklonsko antitelo koje cilja HER2. Američka FDA odobrila je 1998. godine trastuzumab u kombinaciji sa paklitakselom kao terapijski režim prve linije za lečenje prekomerno izraženog metastatskog karcinoma dojke HER2/neu ili kao pojedinačni lek za lečenje prekomernog metastatskog karcinoma dojke HER2/neu koji je bio podvrgnut najmanje jednom ciklusu hemoterapije. Trastuzumab ne samo da ima visok afinitet sa HER2 receptorima, već takođe rešava problem imunogenosti izazvane primenom antitela dobijenih iz mišića na ljudsko telo. Rezultati kliničkih ispitivanja pokazuju da upotreba Trastuzumaba ima efektivnu stopu od samo 11,6%∼16%, dok njegova kombinovana terapija sa hemijskim lekovima ima efektivnu stopu i do 50%. U poređenju sa samo hemoterapijom, navedena kombinacija daje pacijentima sa uznapredovalim rekurentnim karcinomom dojke duži životni vek i smanjeni mortalitet.
[0006] Još jedan lek protiv antitela koji cilja HER2 je Pertuzumab [4], koji je takođe razvio Genentech. Pertuzumab se vezuje za region II ekstracelularnog domena HER2 receptora, inhibirajući stvaranje dimera, čime inhibira receptorski posredovani signalni put, dok se trastuzumab (Herceptin) vezuje za region IV vanćelijskog domena HER2 receptora.
Američka FDA odobrila je Pertuzumab 8. juna 2012. godine za lečenje pacijenta sa uznapredovalim metastatskim karcinomom dojke HER2 međunarodna patentna prijava WO 2011/107957 Symphogen AS i američkoj patentnoj prijavi US 2011/217305 Symphogen AS opisuju antitela usmerena protiv HER2 (ErB2). Međunarodna patentna prijava WO 2011/14 7982 Genmab AS opisuje izolovana monoklonska antitela koja se vezuju za HER2.
3. Konjugati antitelo-lek
[0007] Monoklonsko antitelo dobija sve više pažnje zbog svojih karakteristika visoke ciljne specifičnosti, niskog neželjenog dejstva i slično. Međutim, kada se koristi samostalno, njegov terapeutski efekat je ograničen. Sada su najuspešniji lekovi protiv monoklonskih antitela protiv tumora oni protiv limfocitoma kao što je hronični ne-Hodgkinov limfocitom (NHL). Klinička studija faze II Rituksana usmerena na NHL pokazuje da je ukupna stopa odgovora bila samo 6%. Što se tiče Herceptina® protiv metastatskog karcinoma dojke, samo 15% ima odgovor. Zbog toga se većina lekova sa monoklonskim antitelima koristi u kombinaciji sa hemoterapijom. Na primer, Rituksan se koristi u kombinaciji sa standardnom hemoterapijom za lečenje hroničnog limfocitoma, što može povećati efektivnu stopu do 90%. Do danas, glavni način za povećanje terapeutskog efekta monoklonskih antitela su konjugati antitelolek.
[0008] Konjugat antitelo-lek pripada tipu novog antikancerogenog leka "biološki projektil", koji se sastoji od tri dela: antitelo, citotoksin i veznik koji povezuje ta dva dela. Monoklonska antitela se spajaju sa citotoksinom hemijskim spajanjem. Tada konjugat antitelo-lek specifično prepoznaje receptor na površini ćelija karcinoma i vezuje se za receptor ciljanjem monoklonskih antitela, a zatim konjugat ulazi u ćelije i sprečava ćelije raka da se šire i ubija ćelije raka korišćenjem proteaza u ćelijama koje mogu osloboditi citotoksin. Tehnologija spajanja antitela i leka spaja male molekule lekova i bioloških proteina, što može imati prednosti i jednog i drugog i neverovatno povećati snagu lekova, smanjiti neželjene efekte i tako se pretvoriti u novu generaciju terapijskog proizvoda međunarodne patentne prijave 2011/107957 za Symphogen AS i patentnu prijavu SAD US 2011/217305 za Symphogen AS opisuju antitela usmerena na HER2 (ErB2). Međunarodna patentna prijava WO 2011/147982 Genmab AS opisuje izolovana monoklonska antitela koja se vezuju za HER2.
[0009] Prvi uspešan primer u kliničkoj praksi ciljanog konjugata antitelo-lek je Gemtuzumab ozogamicin (Wyeth, trgovačko ime: Mylotarg). Mylotarg je prvi odobreni monoklonski konjugat antitelo-lek. Ovaj lek se sastoji od antitela na CD33, kaliheamicina (lek koji razgrađuje DNK) i hemijskog veznika AcBut. Mylotarg je lek u kome je humanizovani anti-CD33 IgG4 uparen sa antitumorskim lekom Kaliheamicin, za lečenje akutne mijeloidne leukemije [5]. Mylotarg je prva generacija konjugata antitelo-lek, koja ima tri kritična tehnološka nedostatka: prvo, veznik koji se koristi za povezivanje toksina je vrlo nestabilan, čiji je polu-raspad samo dva dana, što dovodi do ozbiljnog pada toksina i visokog toksičnog neželjenog efekta u kliničkoj praksi; drugo, antitelo je povezano sa veznikom kroz amino grupu lizina, bez obzira na to, na površini antitela ima na desetine lizina, a mesta spajanja su slučajna, što delimično utiče na snagu lekova; što je još važnije, s obzirom da tehnologija spajanja u to vreme nije zrela, samo 50% antitela može da se udruži sa lekom, što rezultira nezadovoljavajućom jačinom lekova u kliničkoj praksi; treće, antitelo koje se koristi je IgG4, kome nedostaje citotoksičnost koja zavisi od ćelija (ADCC) i citotoksičnost koja zavisi od komplementa (CDC). Stoga je deset godina nakon stavljanja proizvoda u promet Mylotarg povučen sa tržišta zbog visokog toksičnog neželjenog dejstva i ograničenog terapijskog efekta.
[0010] Drugi uspešan primer u kliničkoj praksi ciljanog konjugata antitelo-lek je novi lek za lečenje Hodgkinovog limfoma. S obzirom da ima veoma dobar terapeutski efekat, odobrila ga je američka FDA 2011. godine, nakon sprovođenja samo faze II kliničkog ispitivanja. Ovaj lek je razvila kompanija Seattle Genetics kao novi ciljani konjugat antitelo-lek (ADC), koji je ciljani tretman za dve vrste pacijenata sa limfomom koji eksprimira CD30 antigen. Ovaj konjugat antitelo-lek, brentuksimab vedotin, sastoji se od monoklonalnih antitela protiv CD30, inhibitora mikrotubula (MMAE) i dipeptidnog hemijskog veznika. Ovaj konjugat antitelo-lek ima karakteristike slabog neželjenog dejstva i efikasne inhibicije limfoma. U pojedinačnom kliničkom ispitivanju faze II, 102 pacijenta od 15 do 77 godina (srednja starost=31) sa ponavljajućim ili refraktornim Hodgkinovim limfomom, primali su brentuksimab vedotin, a srednji tretman obuhvata 9 ciklusa. Kada je srednji kurs lečenja bio 6,7 meseci, ukupna stopa odgovora bila je 73%. Kada je srednji kurs lečenja bio 20,5 meseci, stopa potpunog odgovora bila je 34%; 40% pacijenata koji su lečeni postigli su delimični odgovor [7]. Najčešća neželjena reakcija je lezija perifernog nerva. Uspeh ovog leka sugeriše tehnološku izvodljivost i vrlo svetlu budućnost ciljanog konjugata antitelo-lek.
[0011] Još jedan uspešan primer ciljanog konjugata antitelo-lek je T-DM1 protiv malignog karcinoma dojke koji je razvio Genentech Inc. [8]. Monoklonsko antitelo u ovom konjugatu antitelo-lek je antitelo anti-HER2 (ErbB2) na površini ćelija karcinoma dojke, koje je povezano sa citotoksinom, inhibitorom mikrotubula DM1. Rezultat faze III kliničkog ispitivanja ovog leka pokazuje bolji terapeutski efekat od hemoterapije i niži neželjeni efekat. Pacijenti sa rakom dojke, koji su prethodno primali lekove za hemoterapiju Herceptinom i taksanima, još uvek imaju uznapredovala oboljenja. Međutim, primanje konjugovanog tretmana antitelo-lek može značajno produžiti vreme preživljavanja onih HER2 pozitivnih pacijenata sa rakom dojke pod pretpostavkom da se bolest ne pogoršava [9]. Na osnovu dobrog terapeutskog dejstva ovog leka, američka FDA odobrila je lek 22. februara 2013. godine za lečenje bolesnika sa HER2 pozitivnim uznapredovalim metastatskim karcinomom dojke (videti CN100482281C).
[0012] Iako je Herceptin otkriće u istoriji lečenja HER2-prekomerno izraženog karcinoma dojke u kome su već pokušani različiti tretmani protiv raka, oko 85% ispitanika nema ili ima samo slab odgovor na terapiju Herceptinom [11]. Pokazalo je da je HER2 eksprimiran ili prekomerno izražen u različitim tumorima. Dakle, postoji hitna potreba u kliničkoj praksi za razvojem lekova protiv raka koji ciljaju HER2, za one pacijente sa HER2 prekomerno izraženim tumorima ili drugim relevantnim bolestima izraženim HER2 (ne samo uključujući rak dojke), koji nemaju nikakav ili samo slab odgovor na terapiju Herceptinom.
[0013] Zbog toga postoji hitna potreba u kliničkoj praksi za razvojem leka koji cilja HER2. Predmetni pronalazak pruža tehničko rešenje za zadovoljavanje ove potrebe.
REZIME PRONALASKA
[0014] U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo ili njegove funkcionalne fragmente koji se mogu specifično vezati za HER2, pri čemu antitelo sadrži teški i laki lanac, u kojima:
1. (i) teški lanac sadrži tri CDR regiona, od kojih svaki ima aminokiselinsku sekvencu kako je prikazano u SEQ ID NO:1, 2 i 3, respektivno; i
2. (ii) laki lanac sadrži tri CDR regiona, od kojih svaki ima aminokiselinsku sekvencu kako je prikazano u SEQ ID NO:4, 5 i 6, respektivno.
[0015] U poželjnom otelotvorenju, predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo izlučeno iz ćelija hibridoma (deponovano u Kineskom centru za prikupljanje mikrobiološke kulture (smešteno u Institutu za mikrobiologiju, Kineska akademija nauka, br.3, 1. Beichen West Rd., Okrug Chaoyang, Peking 100101, PRChina) 22. avgusta 2013. godine, sa brojem depozita 8102 (CGMCC br.8102)) ili antitelom izvedenim iz njega (datum prenosa na Budimpeštanski ugovor je 29. oktobar 2013). U još jednom poželjnom otelotvorenju, predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo izlučeno iz ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO) (deponovano u Kineskom centru za kolekciju tipičnih kultura (smešteno na Univerzitetu Vuhan, planina Luojia, okrug Vuchang, grad Vuhan, Hubei 430072, PR). Kina) 6. novembra 2013. godine sa brojem depozita C2013170 (CCTCC C2013170)) ili antitelom izvedenim iz njega.
[0016] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovani polinukleotid koji kodira antitelo iz predmetnog pronalaska.
[0017] U daljem aspektu, predmetni pronalazak pruža kombinaciju izolovanih polinukleotida, koji sadrži polinukleotid koji kodira laki lanac antitela iz predmetnog pronalaska ili njegove funkcionalne fragmente, i polinukleotid koji kodira teški lanac antitela iz predmetnog pronalaska ili njihovi funkcionalni fragmenti.
[0018] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje ekspresijski vektor koji sadrži polinukleotid prema predmetnom pronalasku ili kombinaciju polinukleotida prema predmetnom pronalasku, u kome se polinukleotid operativno vezuje za regulatornu sekvencu koja omogućava polipeptid kodiran od polinukleotid za ekspresiju u ćeliji domaćinu ili ekspresijskom sistemu bez ćelija.
[0019] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje konjugat koji sadrži antitelo iz predmetnog pronalaska ili njegove funkcionalne fragmente koji su povezani sa jednim ili više terapeutskih sredstava. Poželjno je da je terapeutsko sredstvo citotoksični lek (kao što su antimetaboliti, antitumorski antibiotici, alkaloidi), imunopotenzatori ili radioaktivni izotopi. Još poželjnije, terapeutsko sredstvo se bira između maitanzinoida (kao što su Ansamitocin ili Mertansin), dolastatina i njegovih derivata. Najpoželjnije je da se terapeutsko sredstvo bira između MMAE (monometil auristatin E) i MMAF (monometil auristatin F). U drugim otelotvorenjima, terapeutsko sredstvo se takođe može izabrati između onih navedenih u Tabeli 1, kao što sledi.
Tabela 1 Lista dostupnih terapijskih sredstava u konjugatima predmetnog pronalaska
[0020] U nekim specifičnim otelotvorenjima, terapeutsko sredstvo je povezano sa navedenim antitelom ili njegovim funkcionalnim fragmentima kroz veznik. Veznik koji se koristi u predmetnom pronalasku može biti povezan sa antitelom na bilo koji način poznat u struci, poželjno povezan preko tiola i/ili amino. U određenom poželjnom otelotvorenju, antitelo predmetnog pronalaska je povezano sa veznikom kroz tiol. Veznik koji se koristi u predmetnom pronalasku može biti cepljivi veznik (to jest, veznik može biti slomljen in vivo milje) ili nedeljivi veznik. U nekim otelotvorenjima, veznik koji se koristi u predmetnom pronalasku odabran je između veznih veznika koji se mogu cepati, poželjno između peptidnih, hidrazonskih i disulfidnih linkera, kao što je maleimidokaproil-valin-citrulin-paminobenziloksikarbonil (u daljem tekstu skraćeno kao mc-vc-pAB ili vc). U drugim otelotvorenjima, veznik koji se koristi u ovom pronalasku je odabran od nedeljivih veznika, kao što je maleimidokaproil (u daljem tekstu skraćeno kao mc). U drugim otelotvorenjima, veznik se takođe može izabrati između onih navedenih u Tabeli 2, kao što sledi.
Tabela 2 Spisak dostupnih povezivača u konjugatima pogodnim za upotrebu u predmetnom pronalasku
[0021] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje konjugat antitelo-lek koji ima opštu formulu Ab-(L-U) n, pri čemu Ab predstavlja antitelo prema predmetnom pronalasku ili njegove funkcionalne fragmente, L predstavlja veznik (na primer, mc-vc-pAB ili mc), U predstavlja terapijsko sredstvo (poželjno je da se terapeutsko sredstvo bira između citotoksičnog leka, imunopotenciotera i radioaktivnih izotopa; još poželjnije, terapeutsko sredstvo se bira između maitanzinoida, dolastatina i njihovih derivata; najpoželjnije je da se terapeutsko sredstvo bira između MMAE i MMAF), a n predstavlja ceo broj od 1 do 8 (na primer, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8). Veznik koji se koristi u predmetnom pronalasku može biti cepljivi veznik (to jest, veznik može biti slomljen in vivo) ili nedeljivi veznik.
[0022] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutski sastav koji sadrži antitelo prema predstavljenom pronalasku ili njegove funkcionalne fragmente i/ili konjugat u skladu sa predmetnim pronalaskom, kao i farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0023] U drugom aspektu, predmetni pronalazak pruža postupak za lečenje ili prevenciju karcinoma (naročito HER2-pozitivnog karcinoma), koji uključuje davanje antitela, polinukleotida, kombinacije polinukleotida, vektora ekspresije, konjugata i/ili farmaceutskog sastava prema predmetnom pronalasku u terapeutski efikasnoj količini za ispitanika kome je to potrebno.
[0024] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje upotrebu antitela, polinukleotida, kombinacije polinukleotida, vektora ekspresije, konjugata i/ili farmaceutske smeše prema predmetnom pronalasku u proizvodnji leka za lečenje ili prevenciju raka.
[0025] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo, polinukleotid, kombinaciju polinukleotida, vektor ekspresije, konjugat i/ili farmaceutsku kompoziciju prema predmetnom pronalasku, koja se koristi za lečenje ili prevenciju raka. Poželjno je da je rak HER2-pozitivan rak. Još poželjnije, rak se bira između karcinoma dojke, raka jajnika ili želuca. Još poželjnije, rak je rak otporan na Lapatinib i/ili Herceptin, kao što je rak dojke otporan na Lapatinib i/ili Herceptin, rak jajnika ili rak želuca.
[0026] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje ćeliju hibridoma koja je deponovana u Kineskom centru za sakupljanje opšte mikrobiološke kulture 22. avgusta 2013. godine sa brojem depozita 8102 (datum prenosa u Budimpeštanski ugovor bio je 29. oktobra 2013. godine).
[0027] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje CHO ćeliju koja je deponovana u
1
Kineskom centru za kolekciju vrsta kulture 6. novembra 2013. godine sa brojem depozita C2013170.
[0028] Konkretno, predmetni pronalazak se odnosi na konjugat antitelo-lek (ADC), koji može lečiti rak. Konjugat sadrži monoklonsko antitelo koje je sposobno da se specifično veže za površinski receptor ćelije karcinoma, lek sa malim molekulom sa citotoksičnim dejstvom, kao i veznik koji može povezati iznad pomenuta dva dela kovalentnom vezom. Predmetni pronalazak se takođe odnosi na upotrebu ovih konjugata u proizvodnji leka za lečenje raka dojke i/ili raka jajnika i/ili raka želuca.
[0029] U nekim specifičnim otelotvorenjima, predmetni pronalazak se odnosi na konjugat antitelo-lek, koji ima opštu formulu Ab-(L-U) n, gde Ab predstavlja monoklonsko antitelo koje cilja HER2, L je odabran od mc-vc-pAB ili mc, U se bira između MMAE ili MMAF, a n predstavlja ceo broj od 1 do 8.
[0030] Naročito, humanizovano antitelo koje cilja HER2, kao što je obelodanjeni u predmetnom pronalasku, je RC48, u kome su CDR regioni teškog lanca prikazani SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO.2 i SEQ ID NO.3, i u kojima su CDR regioni lakog lanca prikazani SEQ ID NO.4, SEQ ID NO.5 i SEQ ID NO.6, respektivno.
[0031] Preciznije, humanizovano antitelo koje cilja HER2, kao što je obelodanjeno u predmetnom pronalasku, je RC48, koji se izlučuje iz ćelija deponovanih u Kineskom centru za kolekciju tipičnih kultura 6. novembra 2013, sa brojem depozita
Tehničke prednosti
[0032] Trastuzumab (Herceptin®) je rekombinantno humanizovano monoklonsko antitelo, selektivno ciljano na vanćelijski domen receptora-2 humanog epidermalnog faktora rasta (HER2), koji se uglavnom koristi za lečenje HER2-pozitivnog karcinoma. Humanizovano antitelo RC48 predmetnog pronalaska je rekombinantno humano antitelo HER2, koje je sposobno da se vezuje za vanćelijski domen HER2 sa velikim afinitetom. U in vitro eksperimentima i in vivo, RC48 monoklonsko antitelo pokazuje visoku sposobnost da inhibira proliferaciju HER2 pre kompresovanih humanih tumorskih ćelija.
[0033] Dva citotoksina malih molekula koji su uključeni u ovaj pronalazak su MMAE (monometil auristatin E) ili MMAF (monometil auristatin F) (videti Sliku 6), koji su dve vrste malih molekula koji inhibiraju ćelijski tubulin. Predmetni pronalazak se takođe odnosi na dve vrste veznika: Maleimidokaproil (u daljem tekstu skraćeno mc) i Maleimido-kaproilvalin-citrulin-p-amino-benziloksi (u daljem tekstu skraćeno mc-vc-pAB, koji je takođe jednostavno predstavljen vc u ime konjugata) (videti Sliku 7); prvi veznik se ne može ukloniti, dok se drugi može cepati, a odgovarajući konjugati pokazuju različitu stabilnost i polu-raspad in vivo. Sledeća tri konjugata antitelo-lek nastaju od RC48 monoklonskog antitela povezanog na veznik preko cisteina: RC48-vc-MMAE (videti Sliku 8), RC48-vc-MMAF (videti Sliku 9) i RC48-mc-MMAF (videti Sliku 10).
[0034] Konjugat predmetnog pronalaska ima uporediv kapacitet vezivanja antigen-antitelo in vitro sa golim antitelom RC48 i T-DM1. U testu održivosti ćelija, njegova citotoksičnost je značajno viša od one za RC48 golo antitelo, Herceptin, T-DM1, u kojem ćelije korišćene u eksperimentu uključuju visok soj ćelija karcinoma dojke SK-BR-3 izražen HER2 (Sl.12) i visok soj ćelija karcinoma jajnika izražen HER2 SK-OV-3 (Sl.13). U eksperimentima na životinjama sa modelom tumora za transplantaciju golih miševa, konjugat ovog pronalaska ima značajan antitumorski efekat na BT474 golog miša koji nosi tumor karcinoma dojke (Sl.
14), a poželjni konjugat pokazuje značajnu antitumorsku aktivnost u odnosu na Herceptin®- i Goli miš otporan na lapatinib koji nosi tumor, sa efektom znatno boljim od lekova za pozitivnu kontrolu (Sl.15); u međuvremenu, konjugat antitela iz predmetnog pronalaska pokazuje neočekivano antitumorski efekat na karcinom jajnika i transplantaciju karcinoma želuca tumorski goli miš (Sl.16 i Sl.17). Kroz eksperiment sa mišem in vivo, utvrđeno je da su maksimalne doze tolerancije prisutnog konjugata sledeće: RC48-mc-MMAF: >150mg/kg, RC48-vc-MMAF: 60mg/kg, RC48-vc-MMAE: 100mg/kg, respektivno. Dalje, test efikasnosti sprovodi se korišćenjem modela tumora za transplantaciju humanog karcinoma jajnika golih miševa i utvrđeno je da je tokom primene leka, posmatranjem promene zapremine tumorskog modela miševa i telesne mase kod miševa per se, snaga konjugata je znatno veća od one nag antitela i T-DM1. Dalje, telesna masa miševa se povećava (Sl.18), pokazujući dobru potenciju sa niskom toksičnošću i visokom efikasnošću. Konjugat pruža novi izbor lekova za lečenje HER2 pozitivnog karcinoma, karcinoma otpornog na lekove HER2, karcinoma rezistentnog na inhibitor tirozin kinaze i drugih relevantnih bolesti.
KRATAK OPIS SLIKA
[0035]
Sl. 1 predstavlja SDS-PAGE figuru prečišćenog humanog rekombinantnog proteina HER2-ECD, koji je obojen Coomassie Brilliant Blue. Svako udubljenje je napunjena sa 10 µg.
Sl. 2 predstavlja brojke SDS-PAGE analize cRC48, RC48, u kojima je svako udubljenje napunjeno sa 2 µg antitela.
Sl. 3 prikazuje afinitet vezivanja između humanizovanog antitela RC48 i HER2-ECD određen ELISA testom, i izračunatu konstantu afiniteta vezivanja Kd. Herceptin i cRC48 se koriste kao kontrola u ovom testu.
Sl. 4A predstavlja analizu kapaciteta vezivanja anti-HER2 humanizovanog antitela RC48 sa HER2+ ćelijama (SK-BR3, BT474) i HER2-ćelijama (MDA-MB468) protočnom citometrijom. Sl.4B prikazuje analizu vezivnog kapaciteta anti-HER2 antitela sa BT474 ćelijskim površinskim antigenom protočnom citometrijom pri različitim koncentracijama antitela. Anti-HER2 antitelo uključuje Herceptin, cRC48, RC48. Analizirano je ukupno 5×10<4>ćelija.
Sl. 5 pokazuje da RC48 pokazuje samo specifični afinitet vezivanja sa HER2, ali ne i sa EGFR, HER3 i HER4.
Sl. 6 prikazuje molekularne strukture antitubulina, MMAE i MMAF.
Sl. 7 prikazuje molekularne strukture hemijskih veziva, mc-vc-pAB i mc.
Sl. 8 prikazuje molekularnu strukturu konjugata RC48 antitelo-lek (RC48-vc-MMAE).
Sl. 9 prikazuje molekularnu strukturu konjugata RC48 antitelo-lek (RC48-vc-MMAF).
Sl. 10 prikazuje molekularnu strukturu konjugata RC48 antitelo-lek (RC48-mc-MMAF).
Sl. 11 prikazuje antitumorski efekat RC48 usmeren na BT474 model tumora transplantacije karcinoma dojke čoveka.
Sl. 12 pokazuje efekat inhibicije rasta konjugata RC48 usmerenog na HER2-pozitivnu ćeliju SK-BR-3.
Sl. 13 pokazuje efekat inhibicije rasta konjugata RC48 usmerenog na HER2-pozitivnu ćeliju SK-OV-3.
Sl. 14 pokazuje antitumorski efekat konjugata RC48 usmeren na model BT474 humanog karcinoma dojke koji nosi model golog miša.
Sl. 15 prikazuje terapeutske efekte RC48-vc-MMAE, T-DM1 usmerene na humani karcinom dojke BT-474/L1.9, otporan na herptin i lapatinib, tumore transplantacije golog miša.
Sl. 16 prikazuje antitumorski efekat konjugata RC48 usmeren na model tumora
1
transplantacije SK-OV-3 humanog karcinoma jajnika.
Sl. 17 prikazuje terapeutske efekte RC48-vc-MMAE, Herceptin, Lapatinib usmerene na humani karcinom želuca NCI-N87 goli transplantacioni mišji tumor.
Sl. 18 prikazuje efekat različitih konjugata antitelo-lek na telesnu masu miša.
OPIS SPECIFIČNIH OTELOTVORENJA
Definicije
[0036] Ukoliko nije drugačije definisano, svi ovde korišćeni tehnološki termini imaju ista značenja kao što ih razumeju stručnjaci u ovoj oblasti. Što se tiče definicija i pojmova u struci, stručnjak može da se pozove na Trenutni protokoli u molekularnoj biologiji (Ausubel) za više detalja. Skraćenica aminokiselinskog ostatka je standardni kod od tri slova i/ili jedno slovo koji se koristi u tehnici, što predstavlja jednu od 20 uobičajenih L-aminokiselina.
[0037] Iako predmetni pronalazak koristi opseg broja i približnu vrednost parametra u širem smislu, broj prikazan u konkretnom primeru izriče se što je tačnije moguće. Međutim, bilo koji broj sam uključuje neizbežno grešku do neke mere, koja je uzrokovana standardnom devijacijom proizvedenom od svakog njihovog merenja. Dalje, svi opsezi kako su otkriveni u ovom pronalasku treba da se razumeju tako da pokrivaju bilo koji i sve pod opsege sadržane u njemu. Na primer, opseg „od 1 do 10“ kako je naveden treba smatrati da sadrži bilo koji i sve pod opsege između minimalne vrednosti 1 i maksimalne vrednosti 10 (uključujući krajnje tačke); to jest, svi pod opsezi počinju od minimalne vrednosti 1 ili od druge veće tačke (kao što je od 1 do 6,1), a pod opsezi se završavaju maksimalnom vrednošću 10 ili druge manje tačke (na primer od 5,5 do 10). Štaviše, bilo koju referencu navedenu kao „ovde ugrađenu“ treba shvatiti kao uključenu u celosti.
[0038] Dalje, treba napomenuti da, kao što se koristi u ovoj specifikaciji, oblik jednine uključuje oblik množine naznačenog ispitanika, osim ako nije jasno i definitivno ograničen na jedan naznačeni predmet. Termin „ili“ može se koristiti naizmenično sa „i/ili“, osim ako to nije jasno naznačeno u kontekstu.
[0039] Termin "farmaceutski sastav", "kombinovani lek" i "kombinacija lekova", kako se ovde koristi, mogu se koristiti naizmenično, što znači kombinaciju za postizanje određene specifične svrhe kombinovanjem najmanje jedne vrste lekova i proizvoljno farmaceutski prihvatljivog nosača ili pomoćnog sredstva zajedno. U nekim otelotvorenjima, farmaceutski sastav uključuje kombinaciju odvojenu na vremenskom i/ili prostornom nivou, sve dok može postići svrhu predmetnog pronalaska zajedničkim radom. Na primer, sastojci sadržani u farmaceutskom sastavu (kao što su antitelo, molekul nukleinske kiseline, kombinacija molekula nukleinske kiseline i/ili konjugat) mogu se davati ispitaniku u potpunosti ili odvojeno. Kada se sastojci sadržani u farmaceutskom sastavu daju odvojeno ispitaniku, sastojci se mogu davati istovremeno ili uzastopno. Poželjno je da je farmaceutski prihvatljiv nosač voda, puferisani vodeni rastvor, izotonični fiziološki rastvor kao što je PBS (rastvor fosfatnog pufera), glukoza, manitol, dekstroza, laktoza, skrob, magnezijum stearat, celuloza, magnezijum karbonat, 0,3% glicerina, hijaluronska kiselina, etanol ili polialkilen glikol kao što je poli (propilen glikol), trigliceridi i slično. Tipovi upotrebljenih farmaceutski prihvatljivih nosača se posebno oslanjaju na to da li je kompozicija prema predmetnom pronalasku formulisana za oralno, nazalno, intrakutano, potkožno, intramuskularno ili intravensko davanje. Sastav prema predstavljenom pronalasku može sadržati vlažne, emulgatorske ili puferske materijale kao aditiv.
[0040] Sastav, vakcina ili farmaceutska formulacija prema predmetnom pronalasku mogu se primenjivati na bilo koji pogodan način, kao što su oralno, nazalno, intrakutano, potkožno, intramuskularno ili intravensko davanje.
[0041] Termin "terapeutsko sredstvo", kako se ovde koristi, označava bilo koji materijal ili celinu koji mogu igrati ulogu u lečenju (na primer, lečenju, sprečavanju, ublažavanju ili inhibiranju bilo kojih bolesti i/ili stanja), uključujući, ali ne ograničavajući se na: hemijsko terapijsko sredstvo, radioaktivno terapijsko sredstvo, imunoterapijsko sredstvo, termički terapeutsko sredstvo i slično.
[0042] "CDR region" ili "CDR", kako se ovde koristi, označava hipervarijabilni region teškog lanca i lakog lanca imunoglobulina, kako su definisali Kabat i dr., (Kabat i dr., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991 i naredne verzije). Postoje tri CDR-a teškog lanca i tri CDR-a lakog lanca. U zavisnosti od situacije, termin "CDR" ili "CDR-ovi", kako se ovde koristi, treba da se odnosi na jedan od ili nekoliko ili čak sve ove regione koji sadrže većinu aminokiselinskih ostataka koji su odgovorni za vezivanje kroz afinitet antitela usmerenog na antigen ili njegov epitop za prepoznavanje.
1
[0043] Pod „uniformnošću“, „identitetom“ ili „sličnošću“ između dve sekvence nukleinskih kiselina ili aminokiselina u predmetnom pronalasku, podrazumeva se procenat identičnih nukleotida ili aminokiselinskih ostataka između dve sekvence koje treba upoređivati, dobijenih nakon najboljeg poravnanja (optimalno poravnanje). Ovaj procenat je čisto statistički i razlike između dve sekvence su nasumično raspoređene i pokrivaju njihovu celu dužinu. Poređenje sekvenci između dve sekvence nukleinskih kiselina ili aminokiselina obično se vrši upoređivanjem ovih sekvenci nakon njihovog optimalnog podudaranja.
Navedeno upoređivanje može se izvršiti kroz segment ili „prozor za upoređivanje“. Pored ručnog izvođenja, optimalno poravnanje za upoređivanje sekvenci može se izvršiti i pomoću lokalnog algoritma homologije od Smith and Waterman (1981) (Ad. pribl. Math.2:482), pomoću lokalnog algoritma homologije od Neddleman and Wunsch (1970) (J. Mol. Biol. 48:443), pomoću postupka pretraživanja sličnosti Pearson and Lipman (1988) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444) i pomoću računarskog softvera koji koriste ove algoritme (GAP, BESTFIT, FASTA i TFASTA u softverskom paketu Visconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, ili pomoću BLAST N ili BLAST P softver za upoređivanje).
[0044] "Terapeutski efikasna količina" ili "efikasna količina", kako se ovde koristi, odnosi se na dozu dovoljnu da pokaže koristi usmerene na ispitanika kome se daje. Stvarna doza, kao i brzina i vremenski tok primene variraće u zavisnosti od samopouzdanja i nivoa ozbiljnosti ispitanika koji se leči. Propis za lečenje (kao što je određivanje doze, itd.) konačno je odgovornost lekara opšte prakse i drugih lekara, a određivanje se vrši na osnovu iznad navedenih faktora. Obično se određivanje uzima u obzir bolesti koja se leči, individualnom stanju pacijenta, mestu davanja, načinu primene i bilo kojim drugim faktorima koji su lekari poznati.
[0045] Termin "ispitanik", kako se ovde koristi, označava sisare kao što je čovek, a takođe mogu biti i druge životinje, poput divljih životinja (kao što su krma, roda, ždral, itd.), stoke (kao što su patka, guska itd.) ili laboratorijske životinje (kao što su šimpanza, majmun, pacov, miš, zec, zamorčić, drvoseča, mlevena veverica itd.).
[0046] Termin "antitelo" označava netaknuto antitelo i bilo koji njegov antigen-vezujući fragment ("deo koji vezuje antigen") ili pojedinačni lanac. "Antitelo pune dužine" označava
1
protein koji sadrži najmanje dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama. Svaki teški lanac sadrži jedan varijabilni region teškog lanca (skraćeno VH) i jedan konstantni region teškog lanca. Konstantni region teškog lanca sadrži tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac sadrži jedan varijabilni region lakog lanca (skraćeno VL) i jedan konstantni region lakog lanca. Konstantni region lakog lanca sadrži jedan domen, CL. VH i VL regioni mogu se dalje podeliti na različite regione sa hipervarijabilnošću, nazvanim region koji određuje komplementarnost (CDR), prošarani raznim regionima koji su očuvaniji, nazvanim okvirnim regionom (FR). Svaki VH i VL je sastavljen od tri CDR-a i četiri FR-a, raspoređena od amino-završecima do karboksi-završetaka sledećim redosledom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Ovi varijabilni regioni teških i lakih lanaca sadrže vezujući domen za interakciju sa antigenom. Konstantni region antitela može da posreduje u vezivanju imunoglobulina za tkiva domaćina ili faktore, uključujući različite ćelije imunog sistema (kao što su efektorske ćelije) i prvu komponentu klasičnog sistema komplementa (C1q). Himerno ili humanizovano antitelo je takođe obuhvaćeno antitelom prema predmetnom pronalasku.
[0047] Termin "humanizovano antitelo" odnosi se na antitelo koje obuhvata CDR region iz antitela koje nije izvedeno iz čoveka, a ostali delovi ovog molekula antitela su iz jednog (ili nekoliko) tipova (vrsta) humanog antitela. Štaviše, u svrhu zadržavanja afiniteta vezivanja, neki ostaci u segmentu okvirnog regiona (FR) mogu se modifikovati (Jones i dr., Nature 321:522-525, 1986; Verhoeyen i dr., Science, 239:1534-1536, 1988; Riechmann i dr., Nature 332:323-327, 1988). Humanizovano antitelo ili njegovi fragmenti prema predmetnom pronalasku mogu se pripremiti pomoću tehnologija koje su poznate stručnjacima (kao što su one opisane u sledećim dokumentima: Singer i dr., J. Immun. 150:2844-2857,
1992; Mountain i dr., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10:1-142, 1992; ili Bebbington i dr., Bio/Technology, 10:169-175, 1992).
[0048] Termin "himerno antitelo" odnosi se na antitelo, u kome je sekvenca varijabilnog regiona jedne vrste, dok je sekvenca konstantnog regiona druge vrste; na primer, sekvenca varijabilnog regiona je od antitela miša, dok je sekvenca konstantnog regiona od antitela čoveka. Himerno antitelo ili njegovi fragmenti prema predmetnom pronalasku mogu se pripremiti upotrebom genske rekombinantne tehnologije. Na primer, himerno antitelo može se proizvesti kloniranjem rekombinantne DNK koja sadrži promotor i sekvencu koja kodira varijabilni region ne-humanog (naročito mišjeg) monoklonskog antitela prema predmetnom pronalasku i sekvencu koja kodira konstantni region humanog antitela. Himerno antitelo
1
predmetnog pronalaska kodirano ovim rekombinantnim genom biće, na primer, mišja i humana himera, koja ima specifičnost određenu varijabilnim regionom izvedenim iz mišje DNK i čiji je izotip određen konstantnim regionom izvedenim iz ljudske DN. Za postupak pripreme himernog antitela, reference se mogu dati, na primer, Verhoeyn i dr. (BioEssays, 8:74, 1988).
[0049] Termin "monoklonsko antitelo" označava molekularni preparat antitela sa jednom molekularnom konstitucijom. Sastav monoklonskih antitela pokazuje pojedinačnu specifičnost vezivanja i afinitet usmeren na određeni epitop.
[0050] Termin "mRC48 antitelo", kako se ovde koristi, označava, ukoliko nije drugačije naznačeno, anti-HER2 mišje izvedeno monoklonsko antitelo mRC48 dobijeno od pronalazača. Termin "RC48 antitelo", kako se ovde koristi, označava, ukoliko nije drugačije naznačeno, humanizovano anti-HER2 antitelo RC48, koje je izvedeno iz mRC48 antitela humanizovanim inženjeringom.
[0051] CRC48 antitelo kako se ovde koristi označava himerno RC48 antitelo, tj. Humano mišje himerno antitelo, koje sadrži varijabilni region koji potiče od mišića i konstantni region dobijen od čoveka. Razlika između cRC48 antitela i RC48 antitela leži samo u razlici okvirnog regiona u varijabilnom regionu, to jest, okvirni region cRC48 potiče od miša, dok je okvirni humani region RC48.
[0052] Termin "funkcionalni fragment", kako se ovde koristi, naročito označava fragment antitela, kao što su Fv, scFv (sc označava jednolančani lanac), Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc fragmenti ili dijatelo, ili bilo koji fragmenti koji može povećati vreme poluraspada hemijskom modifikacijom ili ugradnjom u lipozom. Navedena hemijska modifikacija uključuje, na primer, dodavanje poli (alkilen) glikola kao što je polietilen glikol („pegilisan“) (nazvan Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')2-PEG ili Fab'-PEG pegilisan fragmenti, "PEG" označava polietilen glikol), a navedeni fragmenti imaju aktivnost vezivanja za EGFR.
Poželjno je da se funkcionalni fragment sastoji ili sadrži delimične sekvence iz teških ili lakih varijabilnih lanaca antitela izvedenih iz njega, delimična sekvenca je dovoljna da zadrži istu specifičnost vezivanja i dovoljan afinitet kao antitelo iz njega izvedeno (za EGFR, poželjno na najmanje jednak 1/100 afiniteta antitela izvedenog iz njega, još poželjnije najmanje jednak 1/10). Ovaj funkcionalni fragment će sadržati najmanje 5 aminokiselina, poželjno 10, 15, 25,
1
50 i 100 kontinuiranih aminokiselina iz njih izvedene sekvence antitela.
[0053] Tipično, u svrhu pripreme monoklonskih antitela ili njihovih funkcionalnih fragmenata, posebno monoklonskih antitela dobijenih iz mišja ili njegovih funkcionalnih fragmenata, referenca se može dati pomoću tehnologija posebno opisanih u priručniku "Antitela" (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp.726, 1988), ili tehnologijama za pripremu iz hibridomskih ćelija kako je opisao Kohler and Milstein (Nature, 256:495-497, 1975).
[0054] Monoklonsko antitelo prema predmetnom pronalasku može se, na primer, prečistiti na afinitetnoj koloni koja je već fiksirana sa HER2 antigenom (npr., HER2-ECD) ili na jednom od fragmenata koji sadrže epitop, a koje monoklonsko antitelo može posebno prepoznati prema na pronalazak unapred. Tačnije, monoklonsko antitelo se može prečistiti na sledeći način: proteinskom A i/ili G hromatografijom, praćen ili ne praćen hromatografijom sa jonskom razmenom čiji je cilj uklanjanje zaostalih zagađivača proteina, kao i DNK i LPS, praćen ili ne isključujućom hromatografijom na gelu Sepharose koja ima za cilj eliminisati potencijalne agregate izazvane dimerom ili drugim polimerima. Na poželjniji način, sve ove tehnologije mogu se koristiti istovremeno ili kontinuirano.
[0055] Termin "dolastatin", kako se ovde koristi, označava polipeptid odvojen od neke vrste morskog organizma Dollabella auricularia, koji uključuje, ali ne ograničavajući se na dolastatin 10 i dolastatin 15. Dolastatin je inhibitor mitoze, pokazujući snažnu antikancerogenu aktivnost, pa se stoga smatra kandidatom za lek protiv raka. Istraživači dalje otkrivaju i sintetišu mnoge derivate dolastatina, poput MMAE i MMAF.
[0056] Termin "veznik", kako se ovde koristi, označava deo koji povezuje antitelo sa lekom u konjugatu antitelo-lek (tj. ADC), koji može biti deljiv ili nedeljiv. Deljivi veznik (tj. lomljivi veznik ili biorazgradivi veznik) može biti slomljen u ili na ciljnim ćelijama i time oslobađa lek. U nekim otelotvorenjima, veznik predmetnog pronalaska ima vrlo dobru stabilnost i u velikoj meri smanjuje oslobađanje leka tokom procesa isporuke do cilja (npr., u krvi), smanjujući tako neželjeni efekat i toksičnost. U nekim određenim otelotvorenjima, veznik predmetnog pronalaska je odabran od veznika koji se može cepati, kao što je veznik zasnovan na disulfidu (koji se selektivno lomi u ćelijama tumora pri većoj koncentraciji tiola), peptidnom linkeru (koji se enzimom cepa u tumorske ćelije) i hidrazonski veznik. U daljim
1
određenim otelotvorenjima, veznik prema predmetnom pronalasku je odabran od nedeljivog veznika, kao što je tio-eterski veznik. Poželjno je da je veznik prikazanog pronalaska odabran između deljivog mc-vc-pAB povezivača i nedeljivog mc veznika.
[0057] Sledeći primeri su dati da bi se demonstrirali i dalje objasnili neka poželjna otelotvorenja i aspekti predmetnog pronalaska, i ne bi ih trebalo tumačiti kao ograničavanje obima dodatih patentnih zahteva koji definišu pronalazak.
Primer 1 Priprema i analiza sekvence monoklonskog antitela mRC48 izvedenog iz mišića
1) Ekspresija i prečišćavanje HER2 antigena
[0058] Prvo, u ovom ispitivanju, rekombinantni humani HER2 protein HER2-ECD koji je sačinio svoj vanćelijski domen (ECD) pripremljen je i korišćen kao antigen za imunizaciju i stvaranje monoklonskih antitela kao i za različite biološke testove.
[0059] Fragment cDNK koji kodira HER2-ECD (aminokiseline Thr23 do Thr652, pristup GenBank M11730) kloniran je u ekspresijski vektor pcDNK3 (Invitrogen Inc.) pomoću PCR.
[0060] Detaljni postupak obuhvata: dobijanje cDNK HER2-ECD kodirajućeg regiona iz soja ćelija HER2<+>SKBR3 (ATCC NO. HTB-30) pomoću RT-PCR postupka (primenjen je komplet sistema ImProm-IITM za obrnutu transkripciju kompanije Promega Inc.). Prajmeri su bili:
P1: 5'CGGGATCCTGCCACCAGCTGTGCGCC (SEQ ID NO:7),
P2: 5'GCTCTAGA TCAGTTGATGGGGCAAGGCT (SEQ ID NO:8); podvučene sekvence su uvedene BamHI, odnosno KsbaI mesta enzima. PCR amplifikacija je izvedena šablonom cDNK reverzno transkribovanog HER2-ECD korišćenjem iznad pomenutih prajmera, pri čemu su uslovi amplifikacije obuhvatali 30 ciklusa denaturiranja na 94°C tokom 30 s, žarenje na 60°C tokom 30 s, protežući se na 72°C tokom 1 min, konačno se protežući na 72°C 10 min. Zatim su PCR fragmenti oporavljeni, digestirani sa BamHI i KsbaI enzimima (NEB) i povezani sa pcDNK3 vektorom. C-terminalu HER2-ECD dodata je polihistidinska oznaka za prečišćavanje. HEK293 ćelije (US ATCC) su transfektovane sa konstruisanim vektorom ekspresije DNK, a rastvorljivi protein HER2-ECD sa His-tag-om je prečišćen iz tečnosti ćelijske kulture pomoću Ni-NTA afinitetne hromatografije (Qiagen). Bojenje SDS-PAGE i Coomassie Brilliant Blue ukazalo je da prečišćeni HER2-ECD proteini
2
imaju homogenost veću od 95%, a rezultat je prikazan na Sl.1. Rastvorljivi HER2-ECD je bio u obliku monomera, sa relativnom molekulskom masom od -75 kDa, koja je bila nešto veća od izračunate molekulske mase (71 kDa), što sugeriše da je protein glikoziliran u ćelijama HEK293. Dobijeni prečišćeni HER2-ECD protein je dalje koncentrovan i prebačen u sterilni PBS pufer (pH 7,4), za naknadnu in vivo i in vitro analizu.
2) Proizvodnja i skrining hibridomskih ćelija
[0061] HER2-ECD, kao što je iznad opisano, korišćen je kao antigen za imunizaciju generacije mišjih i monoklonskih antitela. Imunizacija, fuzija ćelija hibridoma i primarni skrining sprovedeni su u skladu sa standardnim procedurama (referenca: WHO Technical Report Series, No.822, 1992 Annex 3). Četiri miša Balb/c (komercijalno dobijeni od Shanghai Slac Laboratory Animal Co. Ltd.) imunizovani su sa jednakom zapreminom dobro izmešanih 0,25 ml HER2-ECD proteina (50-100 µg) i 0,25 ml Frojdovog kompletnog adjuvanta (Difco Lab). Dve nedelje kasnije, izvršena je druga injekcija sa Frojdovim nepotpunim adjuvansom (Difco Lab) u kojoj je količina antigena bila 25-50 µg/0,5 ml/miša. Tri nedelje kasnije, izvršena je treća injekcija u kojoj je količina bila ista kao u drugoj injekciji. Deset dana nakon treće injekcije izvađena je krv. Serum miševa je otkriven enzimski povezanim imunosorbentskim testom (ELISA) i uzete su slezine dva miša sa najvišim titrom anti-HER2 antitela u serumu, koji su zatim sjedinjeni sa ćelijom mijeloma P3X63Ag8 (ATCC CRL-1580). Spojene ćelije su razređene na deset ploča sa 96 udubljenja, a preliminarni skrining je izveden ELISA postupcima u zavisnosti od kapaciteta vezivanja sa HER2-ECD. U klasičnom ELISA testu, ploča Nunc Makisord sa 96 udubljenja je presvučena HER2-ECD (0,2-1 µg/ml), a zatim inkubirana gradijentom razblaženim mišjim serumom ili supernatantom hibridoma (100 µL). Anti-HER2 antitelo dobijeno iz mišića otkriveno je specifičnim drugim antitelom kozjeg F(ab')2 anti-mišjeg IgG Fc u kombinaciji sa peroksidazom hrena (Invitrogen Inc.).
[0062] Supernatanti 400 sojeva hibridoma ćelija su pregledani pomoću ELISA postupka, od kojih je 36 pokazalo snažan kapacitet vezivanja za HER2-ECD. Izabrano je deset sojeva hibridomskih ćelija sa najjačim kapacitetom vezivanja HER2, a subklonski hibridomski sojevi pregledani su postupkom ograničenog razblaživanja. Afinitet vezivanja sojeva subklonskih hibridoma ćelija sa HER2 određen je suspenzijskom kulturom sojeva subklonskih hibridoma ćelija, prečišćavanjem proteina i ELISA, a kapacitet vezivanja subklonskih hibridomskih ćelijskih mrlja sa HER2 izražen prirodno na površini humanog karcinoma dojke sojevi ćelija su dalje ispitivani protočnim citometrom (BD FACS Calibur) (videti Primer 4 za detaljnije opise). Konačno, soj hibridoma ćelija mRC48 (IgGlk izveden iz mišja) određen je analizom sekvence, koja je posedovala snažan kapacitet vezivanja HER2, a zatim je dalje analizirana pomoću ELISA i ćelijskih eksperimenata. Ćelija hibridoma mRC48 deponovana je u Kineskom centru za sakupljanje opšte mikrobiološke kulture 22. avgusta 2013. godine sa brojem depozita 8102 (datum prenosa u Budimpeštanski ugovor bio je 29. oktobar 2013. godine).
3) Analiza sekvence anti-HER2 hibridomskog ćelijskog klona mRC48
[0063] Varijabilni regioni teškog i lakog lanca hibridomskog ćelijskog klona mRC48 sekvencirani su 5'-krajnjom brzom amplifikacijom pomoću komercijalno dostupnog kompleta SMARTTM RACE cDNK Amplification Kit (Clontech Inc.) prema uputstvu.
[0064] Ukupna RNK je ekstrahovana iz ćelija hibridoma pomoću RNApure Tissue Kit (Beijing Kangveishiji Biological Technologi Co. Ltd.), a obrnuta transkripcija ukupne RNK je izvedena pomoću SMART™ RACE cDNK Amplification Kit, koristeći ukupnu RNK kao obrazac , koristeći početnike u kompletu, dodajući reverznu transkriptazu SMARTScribeTM reverznu transkriptazu i dobijajući RACE-spremnu cDNK prvog lanca kroz reverznu transkripciju u skladu sa koracima kako je predviđeno u kompletu, a zatim pokretanje dve runde PCR u kojima: prvi krug PCR je izveden upotrebom dobijene cDNK kao šablona, UPM je u kompletu dat kao 5'-krajnji prajmer, a mRC48-VL-1/mRC48-VH-1 kao 3'-krajnji prajmer. Uslovi PCR reakcije su uključivali predenaturaciju na 94°C tokom 5 minuta, 25 ciklusa pojačavanja (denaturiranje na 94°C tokom 30 s, žarenje na 68°C tokom 30 s, produžavanje na 72°C tokom 2 minuta), konačno produžavanje na 72°C tokom 10 minuta.
[0065] Drugi krug PCR je izveden korišćenjem proizvoda prvog kruga PCR kao obrasca, NUP koji je u kompletu dat kao 5'-krajni prajmer i mRC48-VL-2/mRC48-VH-2 kao 3'-krajnji bukvar. Uslovi PCR reakcije su uključivali: pred-denaturaciju na 94°C tokom 5 minuta, 25 ciklusa pojačavanja (denaturiranje na 94°C tokom 30 s, žarenje na 68°C tokom 30 s, produžavanje na 72°C tokom 2 minuta), konačno produžavanje na 72°C tokom 10 minuta. Na ovaj način su dobijeni promenljivi regioni teškog i lakog lanca iznad navedenog hibridomskog ćelijskog klona mRC48.
[0066] PCR proizvodi su prečišćeni elektroforezom u agaroznom gelu i subklonirani u pCR2.1TOPO klon vektor (Invitrogen Inc.). PCR-om je dobijena DNK iz 10 nezavisnih kloniranih plazmida, koja je dalje sekvencirana upotrebom M13 naprednog i reverznog prajmera. Analiza DNK sekvence je pokazala da svih ovih 10 klonova poseduju cDNK koja kodira isti VH ili VL polipeptid. Aminokiselinska sekvenca regiona za određivanje komplementarnosti (CDR) definisana je Kabat kodom i navedena u Tabeli 3. Analiza upoređivanja sekvenci pokazala je da se CDR anti-HER2 mRC48 značajno razlikuje od onih kod poznatih HER2 antitela, uključujući Herceptin (Trastuzumab).
Tabela 3 Aminokiselinske sekvence CDR-a anti-HER2 monoklonskog antitela mRC48
Primer 2 Humanizacija anti-HER2 monoklonskog antitela mRC48
[0067] Humanizovali smo mišje monoklonsko anti-HER2 antitelo mRC48 kalemljenjem njegovog CDR-a lakog lanca ili teškog lanca u humani IgG1k okvirni region.
[0068] Prema objavljenim postupcima, znamo da je humani IgG1k bio visoko homologan mišjem antitelu RC48 (mRC48). Stoga smo dizajnirali varijabilni region lakog lanca humanizovanog RC48 antitela (RC48-VL) i varijabilni region humanizovanog RC48 antitela (RC48-VH) teškog lanca, kombinujući ih sa humanizovanim anti-HER2 antitelom: RC48. Ukupna sekvenca RC48-VH imala je sličnost od 84% sa humanim IgG1 VH genom. RC48 antitelo je sadržalo promenljivi region lakog lanca RC48-VL i varijabilni region teškog lanca RC48-VH.
[0069] Humanizovano anti-HER2 monoklonsko antitelo RC48 dobijeno je metodom CDR transplantacije, u kojem je promenljivi region teškog ili lakog lanca sintetizovao direktno
2
GenScript (Nanjing) Co. Ltd., a sintetisani varijabilni region sadržao je Kozakov konsenzus sekvencu, inicijativni kodon, signalni peptid teškog ili lakog lanca, okvirni region izveden od čoveka i CDR izveden iz mišića, koji je povezan sa humanim konstantnim regionom IgG1k da bi se formirao kompletan fragment postupkom preklapanja PCR produženja.
[0070] Prajmeri preklapanja produžnog PCR-a su obuhvatali:
Teški lanac:
CL1: 5'CGTACTGTGGCTGCACCAT 3' (SEQ ID NO:19)
CL2:5'CCGGAATTCACACTCTCCCCTGTTGAAGC3' (SEQ ID NO:20).
[0071] Pojačanje teškog lanca izvedeno je na sledeći način: prvo je koristio sintetizovani promenljivi region kao obrazac, a VH1 i VH2 kao prajmer za pojačavanje varijabilnog regiona teškog lanca; koristio je konstantni region teškog lanca humanog IgG1k kao obrazac i CH1 i CH2 kao prajmer za pojačavanje konstantnog regiona teškog lanca. Uslovi amplifikacije obuhvatali su 30 ciklusa denaturiranja na 94°C tokom 30 s, žarenje na 60°C tokom 30 s, produžavanje na 72°C tokom 1 minuta, konačno produžavanje na 72°C tokom 10 minuta. Zatim je sekvenca teškog lanca RC48 pojačana upotrebom dva PCR proizvoda kao šablona i VH1 i CH2 kao prajmera. Uslovi amplifikacije obuhvatali su 30 ciklusa denaturiranja na 94°C tokom 30 s, žarenje na 60°C tokom 30 s, produžavanje na 72°C tokom 2 minuta, konačno produžavanje na 72°C tokom 10 minuta.
[0072] Pojačanje lakog lanca izvedeno je na sledeći način: prvo je koristio sintetizovani promenljivi region kao obrazac, a VL1 i VL2 kao prajmer za pojačavanje varijabilnog regiona lakog lanca; koristio je konstantni region lakog lanca humanog IgG1k kao obrazac i CL1 i CL2 kao prajmer za pojačavanje konstantnog regiona lakog lanca. Uslovi amplifikacije obuhvatali su 30 ciklusa denaturiranja na 94°C tokom 30 s, žarenje na 60°C tokom 30 s, produžavanje na 72°C tokom 1 minuta, konačno produžavanje na 72°C tokom 10 minuta. Zatim je sekvenca lakog lanca pojačana upotrebom dva PCR proizvoda kao šablona i VL1 i CL2 kao prajmera. Uslovi amplifikacije obuhvatali su 30 ciklusa denaturiranja na 94°C tokom 30 s, žarenje na 60°C tokom 30 s, produžavanje na 72°C tokom 2 minuta, konačno produžavanje na 72°C tokom 10 minuta.
[0073] Zbog toga smo dobili humanizovano anti-HER2 monoklonsko antitelo RC48, u kome je RC48 sadržao konstantni region teškog lanca teškog lanca humanog Ig i varijabilni region teškog lanca RC48-VH, i konstantni region lakog lanca IgG1k i varijabilni region lakog lanca RC48-VL.
[0074] Mišije himerno antitelo cRC48 takođe je dobijeno istim postupcima, u kojima je varijabilni region mišića povezan sa humanim IgG1k konstantnim regionom da bi se formirao kompletan fragment kroz preklapanje produžene PCR.
[0075] Svaki od pojačanih fragmenata subkloniran je u ekspresijski vektor pcDNK3.0.
Različiti konstruisani plazmidi su transformisani u suspendovane CHO ćelije (Invitrogen), za generisanje različitih rekombinantnih antitela, prečišćavanje je sprovedeno proteinom A i izvršene su naknadne karakteristične analize. Himerni anti-HER2 RC48 (nazvan cRC48) sastojao se od mišje-humanog himernog cRC48 teškog lanca i lakog lanca. RC48 sadrži humanizovani teški lanac RC48-VH i humanizovani laki lanac RC48-VL. cRC48 i RC48 su mogli da se izraze, a antitela su sakupljena iz supernatanta ćelije CHO, prečišćena proteinom A i analizirana SDS-PAGE testom pod reduktivnim i ne reduktivnim uslovima (videti Sl.2). Iznad pomenute CHO ćelije koje luče RC48 antitelo (to jest, CHO ćelije transfektovane humanim IgG1k konstantnim regionom teškog lanca i varijabilnim regionom teškog lanca RC48-VH, i humanim konstantnim regionom lakog lanca IgG1k i promenljivim regionom lakog lanca RC48-VL) su deponovane na kineski Centar za kolekciju tipske kulture 6. novembra 2013. godine sa brojem depozita C2013170.
Primer 3 Analiza karakterizacije anti-HER2 RC48 antitela
[0076] Konstante afiniteta za HER2-vezujuće vezivanje (Kd) himernog cRC48 i humanizovanog RC48 antitela (RC48) određene su ELISA metodom, a detaljna metoda se može naći u Primeru 1, odnosno ploča sa 96 udubljenja je presvučena rastvorljivim HER2-ECD protein, zatim inkubiran sa razblaženim antitelima (Herceptin i himerni cRC48 kao kontrole), i relevantna antitela na HER2-ECD (svi oblici humanog IgG1κ) otkrili su koza
2
F(ab')2 anti-čovek povezan sa HRP IgG Fc specifično drugo antitelo (invitrogen). Nacrtana je kriva vezivanja, a vrednost konstante afiniteta površinskog vezivanja (Kd) je dalje izračunata za svako anti-HER2 antitelo pomoću nelinearne jednačine specifične za vezivanje za jedno mesto (Journal of Immunological Methods, 270:155-162, 2002) (Sl.3 je pokazao tipičnu HER2-vezujuću krivu dobijenu iz 3 nezavisna ELISA testa). Rezultati ELISA testa prikazani su na Sl.3.
[0077] Kao što je poznato iz 3 nezavisna testa, u poređenju sa cRC48 (prosečna konstanta afiniteta od 77 pM) i Herceptinom (prosečna konstanta afiniteta od 97 pM), humanizovano anti-HER2 antitelo RC48 imalo je veći afinitet za vezivanje za HER2-ECD, sa prosečnom konstantom afiniteta od 44 pM. Rezultat je prikazan u Tabeli 4.
Tabela 4 Poređenje prosečne konstante afiniteta između antitela predmetnog pronalaska i
Herceptina
Primer 4 Kapacitet vezivanja humanizovanog antitela RC48 sa HER2
1) Eksperimenti vezivanja afiniteta za RC48 antitelo sa HER2
[0078] Kapacitet vezivanja humanizovanog anti-HER2 antitela RC48 sa HER2 koje je endogeno eksprimirano u humanim ćelijama karcinoma dojke otkriveno je protočnim citometrom, a rezultat je prikazan na Sl.3. 6 mg humanog IgG (kontrolna grupa), Herceptin, cRC48, RC48 ko-inkubirani su sa dve vrste ćelijskih linija HER2<+>ćelije humanog karcinoma dojke SK-BR-3, BT474 i HER2-ćelija MDA-MBA468 (2×10<7>ćelija) na leda 30-45 minuta, respektivno. Posle 2 puta temeljitog ispiranja sa 4 ml hladnog PBS, antitela koja se vezuju za ćelijsku površinu detektovana su pomoću R-PE spregnutog kozjeg anti-humanog IgG Fc drugog antitela (15 µl, 25 µg/ml), a zatim analizirana protočnim citometrom (BD FACSCalibur). Nije otkriveno vezivanje između humanog IgG1 (kontrolna grupa) i tri vrste ćelija karcinoma. Suprotno tome, postojalo je snažno vezivanje između Herceptina, cRC48, RC48 sa dve vrste HER2 pozitivnih ćelija, dok nije bilo vezivanja za HER2 negativne ćelije, što sugeriše da je ovo vezivanje specifično za HER2 (kao što je prikazano na Sl.4a).
2
Upoređivanjem prosečnog intenziteta fluorescencije kontrolne grupe za izotip, utvrđeno je da u poređenju sa Herceptinom i cRC48, RC48 pokazuje veći afinitet vezivanja. Titriranjem koncentracije anti-HER2 antitela i analizom broja ćelija u protočnoj citometriji, dobijena je ćelijska kriva vezivanja anti-HER2 antitela sa HER2 na površini ćelije, a rezultat je prikazan na Sl.4b. Humanizovano anti-HER2 antitelo RC48 pokazalo je značajan afinitet vezivanja, koje je imalo afinitet vezivanja (Kd) sa HER2 na površini ćelije BT474 od 4nM, dok su afiniteti vezivanja za Herceptin i cRC48 bili 10nM, odnosno 5nM, a rezultati su prikazani u Tabeli 5.
Tabela 5 Afinitet vezivanja antitela predmetnog pronalaska sa HER2 na površini ćelije
BT474
2) Eksperiment specifičnosti vezivanja antigena
[0079] Kapaciteti vezivanja Herceptina, cRC48, RC48 sa različitim površinskim antigenima EGFR, HER2, HER3 i HER4 određeni su ELISA postupkom. ELISA postupak se može naći u Primeru 1. Ploča sa 96 udubljenja je presvučena antigenima EGFR, HER2, HER3, HER4, od kojih je svako udubljenje napunjeno sa 20 ng, i inkubirana sa različitim anti-HER2 antitelima, tj. Herceptinom, cRC48, RC48 antitelima, a zatim ih je otkrio ren vezano za peroksidazu hrena F(ab')2 anti-mišje IgG Fc specifično drugo antitelo (Invitrogen Inc.).
Rezultat je prikazan na Sl. 5, ukazujući na to da antitela na Herceptin, cRC48, RC48 gotovo da nisu imala kapacitet vezivanja za EGFR, HER3 i HER4, ali da su imala snažan kapacitet vezivanja za HER2, što sugeriše da je Herceptin, RC48 visoko specifično vezivanje za HER2.
Primer 5 Test za inhibiciju tumora RC48 prema modelu tumora za transplantaciju humanog karcinoma dojke BT474
[0080] Model tumora za transplantaciju golog miša kod golog miša kod čoveka BT474 uspostavljen je inokuliranjem subkutanih ćelija BT474 u golog miša. Nakon kontinuiranog rasta in vivo tokom 3 generacije, tumorsko tkivo koje je snažno raslo uzeto je i presečeno na oko 1,5 mm3 i potkožno inokulirano u desni pazuh golog miša (obezbedio Shanghai Slac Laboratori Animal Co. Ltd., sa sertifikatom Br.2007000540582 i dozvole br. SCXK (hu) 2012-0002) pod sterilnim uslovima. Prečnik tumora za transplantaciju golog miša izmeren je
2
nonijusom. Životinje su grupisane nasumično dok tumor nije narastao na 100∼300 mm3. Primenjeni su testirani lekovi huIgG1, Herceptin, RC48 (svaki 10 mg/kg), i nedelju dana kasnije dozirani su drugi put, a druge dve nedelje kasnije dozirani su treći put, odnosno lekovi su davani u potpunosti tri puta.
[0081] Rezultat je prikazan na Sl.11. Nakon primene huIgG1, tumor nije bio inhibiran i čiji je obim i dalje kontinuirano rastao. Posle primene Herceptina i RC48, tumori BT474 su inhibirani. U poređenju sa Herceptinom, RC48 je imao značajno bolji tumorski inhibitorni efekat.
Primer 6 Priprema konjugata leka za antitela
1) Prečišćavanje monoklonskog antitela RC48
[0082] RC48 monoklonsko antitelo je zahvaćeno iz CHO ćelijske kulture proteinom A, koji je zatim podvrgnut SDS-PAGE elektroforezi, sa čistoćom do 95% ili većom SEC analizom. Dobijeni proteini antitela su ultrafiltracijom dijalizovani u PBS pufer upotrebom 30KD membranskog pakovanja, koncentrovani, a koncentracija je kalibrisana ultraljubičastim spektrometrom, za dalju reakciju kuplovanja.
2) Spajanje monoklonskih antitela RC48 sa molekulom leka
[0083] Reduktivno sredstvo i zaštitno sredstvo formulisani su sa PBS puferom na sledeći način: 1∼20mmol/L TCEP (Tris-2-karboksietil-fosfin), 1∼20mmol/L DTPA (Dietilen triamin pentacetatna kiselina) osnovni rastvor, reduktivno sredstvo koje se može dodati u određenom opsegu koncentracija u zavisnosti od količine potreban odnos antitela na lek, pomešan sa monoklonskim antitelom u određenoj koncentraciji (npr., 5∼30mg/ml) sa određenim zapreminskim odnosom (npr.1:1), u kome je molarni odnos konačne koncentracije TCEP prema antitelu bio 0,5∼6,0 : 1, i reakcija je izvedena uz mešanje tokom 2 sata na 25°C. Koncentracija slobodnog tiola je detektovana na 412 nm DTNB metodom i izračunat je broj slobodnog tiola sa molarnim odnosom antitela. Reduktivna reakcija sa TCEP imala je vrlo dobru ponovljivost, a broj slobodnog tiola mogao bi da dostigne 1,0-8,0 nakon redukcije.
[0084] Posle redukcije TCEP, antitelo se može direktno podvrgnuti naknadnom konjugaciji. Lekovi (vc-MMAE, vc-MMAF, mc-MMAF) (kupljeni od Shanghai Haoyuan Chemexpress Co. Ltd.) u određenoj koncentraciji (10 mM) rastvoreni su u 25% DMSO (dimetil
2
sulfoksidu), za koji su lekovi dodavani polako u molarnom odnosu leka prema tiolu od 0,3∼2,8 : 1, i reakcija je izvedena uz mešanje tokom 2 sata na 25°C. Koncentracija slobodnog tiola (blizu nule) otkrivena je na 412nm DTNB metodom, zaostali nereagovani lekovi i slobodni mali molekuli kao što je DMSO uklonjeni su prečišćavanjem Sephadek G-25, a uslovi spajanja su određeni SDS-PAGE elektroforezom, obrnuto -fazne metode tečne hromatografije visokih performansi (R-HPLC) i hidrofobne metode tečne hromatografije visokih performansi (HIC-HPLC).
Primer 7 Analiza afiniteta za ADC
Analiza afiniteta ELISA postupkom
[0085] ELISA ploča je preko noći obložena rekombinantnim proteinom HER2-ECD (sa koncentracijom od 0,5 mg/ml), na 2-8°C. Ploča je isprana 3 puta sa vodom za ispiranje. Na 37°C, 3% rastvor BSA-PBST je korišćen za blokiranje tokom 2 sata. Ploča je isprana 3 puta sa vodom za ispiranje. Uzorci su učitani na sledeći način: na 37°C, 11 tačaka je gradijentno razređeno od 1000 ng/ml (standardna linija) rastvorom PBST, 100 µl/udubljenju, tokom 2 sata. Ploča je isprana 3 puta sa vodom za ispiranje. Drugo antitelo (kozji anti-humani IgG-Fc-HRP) razblaženo je 5000 puta rastvorom PBST. Reagens za razvijanje boje TMB je dodat za razvijanje boje 8-10 minuta dalje od svetlosti na sobnoj temperaturi. Reakcija je zaustavljena sa 2M H2SO4, i očitana na 450/655nm u instrumentu obeleženom enzimom. Rezultat je prikazan u Tabeli 6.
Tabela 6 Poređenje afiniteta između konjugata i T-DM1
[0086] Kao što je poznato iz rezultata, afiniteti sa HER2-ECD RC48-vc-MMAE, RC48-vc-MMAF i RC48-mc-MMAF su uporedivi sa afinitetima T-DM1.
Primer 8 Inhibitorni efekat RC48 ADC na tumorske ćelije
[0087] Dobro odrasle ćelije su digestirane tripsinom (kupljeno od Sigme), nakon čega su HER2 pozitivna ćelija karcinoma dojke SK-BR-3, HER2 pozitivna ćelija karcinoma jajnika
2
SK-OV-3 resuspendovane sa DMEM medijem koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma , McCoy medijum 5A (oba medijuma su kupljena od Gibco-a), inokuliran je u ploču sa 96 udubljenja gustine 5000, 4000 ćelija/udubljenju i inkubiran u inkubatoru na 37°C, u 5% CO2za 24h. RC48, Herceptin, RC48-vc-MMAE, RC48-vc-MMAF, RC48-mc-MMAF i T-DM1 (sami napravljeni) razblaženi su sredinom koja sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma u koncentracijama kao što je prikazano na sledećoj slici pre dodavanja u ploču sa 96 udubljenja. Nakon inkubacije u inkubatoru na 37°C, u 5% CO2tokom 72 sata, detekcija je izvršena pomoću CCK-8 kompleta (kupljen od DOJINDO), a dobijeni podaci su podvrgnuti statističkoj analizi pomoću softvera Prism.
[0088] Rezultati su prikazani na Sl.12 do Sl.13, kao što je poznato iz kojih je ADC lek predmetnog pronalaska imao značajno jači inhibitorni efekat na različite ćelije od leka golog antitela u istoj koncentraciji, a brzina inhibicije usmerena na proliferaciju ćelija može se povećati za polovinu. ADC lek uparen sa MMAF prema predstavljenom pronalasku imao je snažniji inhibitorni efekat usmeren na ćelije SK-BR-3, SK-OV-3 od ADC leka uparen sa MMAE u skladu sa predmetnim pronalaskom, a oba su imala značajno bolji efekti od pozitivne kontrole T-DM1.
Primer 9 Antitumorska aktivnost konjugata leka antitela usmerena na rak dojke
1) Antitumorski eksperiment RC48 konjugata usmeren na BT474 model golog miša koji nosi tumor raka dojke
[0089] Pet miliona ćelija BT474 suspendovano je u PBS i inokulirano na pazuh golog miša BALB/c (obezbedio Shanghai Slac Laboratori Animal Co. Ltd., sa sertifikatom br.
2007000540582 i licencom br. SCKSK (hu) 2012-0002 ). Nakon formiranja tumora, uzeto je tumorsko tkivo koje je snažno poraslo i presečeno na oko 1,5 mm<3>i subkutano inokulirano u desni pazuh golog miša pod sterilnim uslovima. Prečnik tumora za transplantaciju golog miša izmeren je nonijusom. Životinje su grupisane nasumično dok tumor nije narastao na 100∼300 mm3. Davani su testirani lekovi RC48 10 mg/kg, RC48-vc-MMAE 10 mg/kg, RC48-vc-MMAF 10 mg/kg i RC48-mc-MMAF 10 mg/kg, a lekovi su primenjeni u potpunosti tri puta; negativnoj kontrolnoj grupi je data jednaka količina fiziološkog rastvora soli.
[0090] Kao što je prikazano na Sl.14, 37 dana nakon doziranja, zapremina tumora negativne kontrolne grupe dostigla je 485 mm<3>, dok je zapremina tumora RC48 grupe 83% od kontrolne grupe, što ukazuje da je RC48 donekle imao inhibitorni efekat na rast tumora BT474. Sva tri konjugata antitela testirana u ovom eksperimentu (RC48-vc-MMAE, RC48-vc-MMAF, RC48-mc-MMAF) mogu značajno da inhibiraju rast tumora BT474, a 37 dana nakon doziranja, zapremine tumora se smanjuju na 13-19% kontrolne grupe. Tokom 37-dnevnog eksperimenta, u kontrolnoj grupi su bila 3 mrtva miša, dok su svi miševi u grupi RC48-vc-MMAE preživeli.
2) Antitumorski eksperiment RC48-vc-MMAE usmeren na model BT-474/L1.9 otporan na Herceptin® i Lapatinib BT-474/L1.9 model tumora subkutanog transplantacionog tumora golog miša
[0091] BT474/L1.9 je BT-474 ćelija koja je dugo bila tretirana Herceptinom® i Lapatinibom, a takođe je rezistentna na Herceptin® i Lapatinib.
[0092] Goli miševi BALB/c na nivou SPF inokulirani su subkutano sa određenom količinom tumorskih ćelija BT-474/L1.9, a nakon rasta tumora na 100-200 mm3, životinje su nasumično grupisane. Doza je naznačena u legendama: za RC48-vc-MMAE, Kadcyla™ (kupljeno od kompanije Roche Pharmaceuticals), doziranje jednom nedeljno, ukupno 2 puta; za Herceptin® (kupljen od Roche Pharmaceuticals), doziranje jednom nedeljno, potpuno 3 puta; za Lapatinib (kupljen od GSK), svakodnevno doziranje. Zapremina tumora izmerena je 2 puta nedeljno. Masa miša je ponderisana i uočena je otpornost mišića koji nose tumore prema lekovima. Podaci su zabeleženi. Zapremina tumora i stopa inhibicije tumora svakog miša koji je nosio tumor izračunati su u različitim vremenskim tačkama posmatranja.
[0093] Kao što je prikazano na Sl.15, stopa inhibicije tumora Herceptin® (10 mg/kg) prema BT474/L1.9 tumoru subkutane transplantacije golog miša iznosila je 51%; stopa inhibicije tumora Lapatiniba (200 mg/kg) prema BT474/L1,9 bila je 45%; nagoveštava da je rak dojke BT474/L1.9 bio otporan i na Herceptin® i na Lapatinib. RC48-vc-MMAE (1,5, 5 mg/kg) inhibirao je rast BT474/L1,9 golog subkutanog transplantacionog tumora miša na način koji zavisi od doze, sa stopom inhibicije tumora od 38% i 91%; stopa inhibicije tumora referentnog leka Kadcyla™ (5 mg/kg) prema BT474/L1.9 tumoru subkutane transplantacije golog miša iznosila je 58%, što ukazuje da je BT474/L1.9 takođe bio otporan na Kadcyla™. Miševi koji su nosili tumor bili su dobro otporni na sve gore navedene lekove.
[0094] U zaključku, ADC predmetnog pronalaska pokazuje značajnu antitumorsku aktivnost prema modelu tumora subkutane transplantacije golog miša BT474/L1.9, koji je značajno jači od Herceptina i Lapatiniba (p<0,01); u poređenju sa Kadcyla™ sa istom dozom od 5 mg/kg,
1
tumorski inhibitorni efekat RC48-vc-MMAE ovog pronalaska ima očiglednu prednost (p < 0,01), sa stopom inhibicije tumora od 91%: 58%.
Primer 10 Antitumorska aktivnost leka konjuguje prema raku jajnika
1) Eksperiment inhibitornog tumora RC48 konjugata prema modelu tumora za transplantaciju karcinoma humanog SK-OV-3
[0095] Model tumora ljudskog karcinoma jajnika SK-OV-3 golog miša uspostavljen je inokulacijom ćelija SK-OV-3 u golog miša (obezbedio Shanghai Slac Laboratory Animal Co. Ltd., sa sertifikatom br.2007000540582 i licencom br. SCXK( hu)2012-0002) podkožno. Životinje su grupisane nasumično dok tumor nije narastao 100∼300 mm<3>. Testirani lekovi RC48 10 mg/kg, T-DM110 mg/kg, RC48-vc-MMAE 3 mg/kg, RC48-vc-MMAE 10 mg/kg, RC48-vc-MMAF 3 mg/kg, RC48-vc-MMAF 10 mg/kg , Primenjeni su RC48-mc-MMAF 3 mg/kg i RC48-mc-MMAF 10 mg/kg, doziranje jednom nedeljno, potpuno doziranje 3 puta; paklitaksel 10 mg/kg, 3 puta nedeljno, ukupno 3 nedelje; u međuvremenu, negativna kontrola je administrirana sa jednakom količinom fiziološkog rastvora soli.
[0096] Tumor-inhibitorni efekti RC48 povezani sa različitim veznicima i terapijskim sredstvima na SK-OV-3 sugerišu da: u poređenju sa golim antitelom RC48 koje nije spregnuto, svi ADC predmetnog pronalaska imaju dobre inhibitorne efekte tumora; u poređenju sa T-DM1 u istoj dozi od 10 mg/kg, tumorsko-inhibitorni efekti RC48 konjugata predmetnog pronalaska imaju očigledne prednosti. Detaljni rezultati prikazani su na Sl.16.
Primer 11 Eksperiment inhibitornog tumora na konjugatima lekova prema HER2 pozitivnom NCI-N87 humanom ćelijskom karcinomu želuca ćelijski miš subkutani transplantacioni tumor
[0097] Ćelije NCI-N87 humanog karcinoma želuca visoko su eksprimirale HER2 i EGFR, koji su bili otporni na Herceptin®, a model je uspostavljen istom metodom kao Primer 9. Rezultat je prikazan na Sl. 17.
[0098] Kao što je prikazano na slici 17, pojedinačna intravenska injekcija RC48-vc-MMAE (2,5, 5, 10 mg/kg) mogla bi značajno da inhibira rast HER2 visoko eksprimiranog humanog karcinoma želuca NIC-N87 golog miša subkutanog transplantacionog tumora sa tumoromstopa inhibicije od 133%, 193% i 200%. Grupa sa malim dozama izazvala je delimičnu regresiju tumora kod 6/6 miševa; grupa srednjih doza izazvala je delimičnu regresiju tumora kod 1/6 miša i potpunu regresiju kod 5/6 miševa; grupa sa visokim dozama izazvala je
2
potpunu regresiju tumora kod svih (6/6) miševa, koji se nisu ponovili dok se eksperiment nije završio (D21). Referentni lek Herceptin® (10 mg/kg, doziranje jednom nedeljno, 3 puta) može da inhibira rast tumora subkutane transplantacije golog miša NCI-N87, sa stopom inhibicije tumora od samo 49%; još jedan referentni lek, mali molekul EGFR/HER2 inhibitor Lapatinib (200 mg/kg, doziranje jednom nedeljno, tokom 21 dana) imao je efekat na tumor potkožne transplantacije golog miša NCI-N87, sa stopom inhibicije tumora od 78%. Miševi koji su nosili tumor bili su otporni na sve gore navedene lekove i nisu se pojavili simptomi kao što je gubitak telesne mase.
[0099] Ovaj rezultat istraživanja ukazuje na: 1) pojedinačna intravenska injekcija RC48-vc-MMAE (2,5, 5, 10 mg/kg) može značajno inhibirati rast HER2 visoko izraženog humanog karcinoma želuca NIC-N87 golog miša subkutanog transplantacionog tumora, uzrokujući delimičnu ili čak potpunu regresiju tumora; 2) terapeutski efekat RC48-vc-MMAE prema NCI-N87 tumoru potkožne transplantacije golog miša očigledno je jači od učinka referentnih lekova Herceptin® i Lapatinib (p <0,01).
Primer 12: Test tolerancije na miš na konjugate RC48
[0100] Muški i ženski KM miševi koji su prošli karantinski pregled podeljeni su nasumično u sledeće dozne grupe prema telesnoj masi: MMAE 2mg/kg, MMAF 50mg/kg, RC48-vc-MMAE 25mg/kg (odgovarajuća doza MMAE je bila 0,5mg/kg) ∼ 200mg (MMAE doza je 4,0mg/kg), RC48-vc-MMAF 50mg/kg (MMAF doza je 1,0mg/kg) ∼ 450mg/kg (MMAF doza je bila 9,0mg/kg) i RC48-mc-MMAF 50mg/kg ( MMAF doza je bila 1,0mg/kg) ∼ 450mg/kg (MMAF doza je bila 9,0ml/kg), u kojima je bilo 13 grupa različitih doza, sa polovinom mužjaka i pola ženki, i odgovarajuće tečnosti leka su intravenozno ubrizgane. Grupe miševa u istoj šarži su korišćene kao kontrolne grupe, kojima su davane 0,9% injekcije NaCl iste zapremine kroz repnu venu. Posle doziranja, telesna masa se ponderisala svaki drugi dan, sve do 16. dana. Kriva povećanja telesne mase MMAE ili MMAF serijskih miševa može se naći na Sl.18, respektivno.
[0101] Rezultati eksperimenta ukazuju na: pod uslovima ovog eksperimenta, toksičnost RC48-vc-MMAE je niža od nepariranog MMAE pri istoj dozi. Maksimalna tolerantna doza miša prema RC48-vc-MMAE je između 100 mg/kg (doza MMAE je 2,0 mg/kg) i 150 mg/kg (doza MMAE je 3,0 mg/kg).
[0102] Toksičnost RC48-vc-MMAF je očigledno veća od toksičnosti RC48-mc-MMAF u istoj dozi. Maksimalna tolerantna doza miša prema RC48-vc-MMAF je između 50 mg/kg (doza MMAF je 1,0 mg/kg) i 100 mg/kg (doza MMAF je 2,0 mg/kg). MTD miša prema RC48-mc-MMAF je između 150 mg/kg (doza MMAF je 3,0 mg/kg) i 450 mg/kg (doza MMAF je 9,0 mg/kg).
Primer 13 Eksperiment toksičnosti konjugata leka prema SD pacovu doziranom pojedinačnom intravenskom infuzijom
[0103] SD pacovi na nivou SPF (broj sertifikata je SCXK (jing) 2012-0001) kupljeni od Beijing Vital River Laboratories Animal Technologi Co, Ltd. su nasumično podeljeni u 7 grupa prema polu, u kojima je bilo 10 pacova u grupi sa pola mužjaka i pola ženki. Ovih 7 grupa su uključivale fiziološku negativnu kontrolnu grupu fiziološkog rastvora, kontrolnu grupu od 0,48 mg/kg MMAE, kontrolnu grupu golih antitela od 40 mg/kg RC48 i seriju doznih grupa RC48-vc-MMAE, kojima su pacovima dozirane infuzija repne vene i eksperimentalni period posmatranja bio je 21 dan. Mase tela su ponderisane na D1 (preddoziranje), D8, D15 i D22. Nakon perioda posmatranja, životinje su eutanazirane i izvršile su opšte patološko anatomsko posmatranje, a abnormalna tkiva ili organi zabeleženi opštim anatomskim posmatranjem podvrgnuti su histološkom pregledu.
[0104] Uslovi smrti životinja: Tokom eksperimenata pronađeno je 9/10 životinja (MMAE kontrolna grupa), 1/10 životinja (RC48-vc-MMAE, grupa od 30 mg/kg) i 2/10 životinja (RC48-vc-MMAE, grupa od 40 mg/kg), dok preostale grupe životinja nisu pronađene mrtve niti u agonalnom stanju.
[0105] Pod uslovima ovog eksperimenta, smrtonosna doza RC48-vc-MMAE prema pacovu bila je 30 mg/kg, a maksimalna tolerantna doza bila je veća ili jednaka 24 mg/kg (odgovarajuća spregnuta doza MMAE bila je 0,48 mg/kg ). Golo antitelo RC48 dato je SD pacovu u dozi od 40 mg/kg pojedinačnom intravenskom infuzijom i nije bilo evidentnog simptoma odgovora na toksičnost, što sugeriše da je maksimalna tolerantna doza pacova veća ili jednaka 40 mg/kg. Ovaj rezultat je pokazao da je, čak i ako je konjugat predmetnog pronalaska korišćen u dozi mnogo većoj od doze nekonjugovanog leka MMAE (40 mg/kg vs 0,48 mg/kg), i dalje pokazivao toksičnost mnogo nižu od one konjugovanog leka. MMAE, pokazujući da se nakon formiranja ADC spajanjem MMAE sa antitelom, toksičnost značajno smanjila.
4
Reference
[0106]
[1] Nahta, R.and F.J.Esteva(2007). Trastuzumab triumphs and tribulations. Oncogene 6(25) 3637-43.
[2]Chen, Y.Z. i dr. Expressions and Significance of HER2/neu protein in Epithelial Ovarian Carcinoma and its Metastatic lesions. Chinese General Practice, 2009, 12:1268-1271. (Kineski)
[3]Huang, X.E. The Study on the expression of HER2 and its correlation with the prognosis of breast carcinoma. Clinical Research, 2008, 49:39-40. (Kineski)
[4] de Bono JS, Bellmunt J, Attard G, Droz JP, Miller K, Flechon A, Sternberg C, Parker C, Zugmaier G, Hersberger-Gimenez V, Cockey L, Mason M, Graham J Open-label phase II study evaluating the efficacy and safety of two doses of pertuzumab in castrate chemotherapy-naive patients with hormone-refractory prostate cancer. J Clin Onco, 2007, Jan 20;25 (3) :257-62
[5] Petersdorf SH, Kopecky KJ, Slovak M, Willman C, Nevill T, Brandwein J, Larson RA, Erba HP, Stiff PJ, Stuart RK, Walter RB, Tallman MS, Stenke L, Appelbaum FR. A phase III study of gemtuzumab ozogamicin during induction and post-consolidation therapy in younger patients with acute myeloid leukemia. Blood.2013 Apr 16.
[6]de Vries JF, Zwaan CM, De Bie M, Voerman JS, den Boer ML, van Dongen JJ, van der Velden VH. The novel calicheamicin-conjugated CD22 antibody inotuzumab ozogamicin (CMC-544) effectively kills primary pediatric acute lymphoblastic leukemia cells. Leukemia. 2012 Feb;26(2):255-64.
[7] Katz J, Janik JE, Younes A. 2011 Brentuximab Vedotin (SGN-35).Clin Cancer Res.
2011 Oct 15;17(20):6428-36.
[8] Girish S, Gupta M, Wang B i dr. Clinical pharmacology of trastuzumab emtansine (T-DM1): an antibody-drug conjugate in development for the treatment of HER2-positive cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology 2012; 69:1229-40.
[9] Lewis Phillips GD, Li G, Dugger DL i dr. Targeting HER2-Positive Breast Cancer with Trastuzumab-DMl, an Antibody-Cytotoxic Drug Conjugate. Cancer Research 2008; 68:9280-90.
[10] Krop IE, Beeram M, Modi S i dr. Phase I Study of Trastuzumab-DMl, an HER2 Antibody-Drug Conjugate, Given Every 3 Weeks to Patients With HER2-Positive Metastatic Breast Cancer. Journal of Clinical Oncology 2010; 28:2698-2704.
[11] Baselga J. Treatment of HER2-overexpressing breast cancer. Annals of Oncology 2010; 21:vii36-vii40.
[12] Joseph A. Francisco, Charles G. Cerveny, Damon L. Meyer, Bruce J. Mixan, Kerry Klussman, Dana, F. Chace, Starr X. Rejniak, Kristine A. Gordon, Ron DeBlanc, Brian E. Toki, Che-Leung Law, Svetlana O. Doronina, Clay B. Siegall, Peter D. Senter i Alan F. Wahl. 2003 cAC10-vcMMAE, an anti-CD30-monomethyl auristatin E conjugate with Potent and selective antitumor activity. Blood.2003 102: 1458-1465.
[13] Dosio F P. Brusa and L Cattel.2011 Immunotoxins and anticancer drugs conjugate assemblies: the role of the linkage between components. Toxins 3:848-883.
[14] Concortis Biosystems Corp. USA www.concortisbiosystems.com
[15] CN1993146A

Claims (9)

Patentni zahtevi
1. Antitelo ili njegovi funkcionalni fragmenti koji se mogu specifično vezivati za HER2, gde antitelo sadrži teški i laki lanac, u kojima:
(i) teški lanac sadrži tri CDR regiona, gde CDR regioni imaju aminokiselinske sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 1, 2 i 3, respektivno;
(ii) laki lanac sadrži tri CDR regiona, gde CDR regioni imaju aminokiselinske sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 4, 5 i 6, respektivno.
2. Antitelo ili njegovi funkcionalni fragmenti prema patentnom zahtevu 1, gde je antitelo ili njegovi funkcionalni fragmenti izvedeno iz antitela izlučenog iz ćelija hibridoma koje su deponovane u Kineskom sakupljačkom centru za opštu mikrobiološku kulturu 22. avgusta 2013. godine, sa brojem depozita od CGMCC br.8102.
3. Antitelo ili njegovi funkcionalni fragmenti prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je antitelo humanizovano antitelo, a poželjno je da je antitelo antitelo izlučeno iz CHO ćelija koje su deponovane u Kineskom centru za kolekciju vrsta kulture 6. novembra.
2013, sa brojem depozita CCTCC C2013170.
4. Izolovani polinukleotid, koji kodira antitelo ili njegove funkcionalne fragmente prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva.
5. Kombinacija izolovanih polinukleotida koja sadrži: Polinukleotid koji kodira laki lanac antitela ili njegovih funkcionalnih fragmenata prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3 i polinukleotid koji kodira teški lanac antitela ili njegovih funkcionalnih fragmenata prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3.
6. Vektor ekspresije, koji sadrži polinukleotid prema patentnom zahtevu 4 ili kombinaciju izolovanih polinukleotida prema patentnom zahtevu 5, gde se polinukleotid operativno vezuje za regulatornu sekvencu koja omogućava polipeptidu kodiranom polinukleotidom da se ekspresuje u ćeliji domaćinu ili sistemu ekspresije bez ćelija.
7. Farmaceutski sastav, koji sadrži antitelo ili njegove funkcionalne fragmente prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, kao i farmaceutski prihvatljiv nosač.
8. Antitelo ili njegovi funkcionalni fragmenti prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, polinukleotid prema patentnom zahtevu 4, kombinacija izolovanih polinukleotida prema patentnom zahtevu 5, ekspresijski vektor prema patentnom zahtevu 6 ili farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 7 za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka.
9. Antitelo ili njegovi funkcionalni fragmenti prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, polinukleotid prema patentnom zahtevu 4, kombinacija izolovanih polinukleotida prema patentnom zahtevu 5, ekspresijski vektor prema patentnom zahtevu 6 ili farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 7 za upotrebu prema patentnom zahtevu 8, gde je rak HER2-pozitivan rak, gde je rak poželjno rak dojke ili jajnika ili rak želuca, poželjnije rak dojke otporni na Lapatinib i/ili Herceptin ili rak jajnika ili rak želuca.
RS20210939A 2013-11-19 2014-11-18 Anti-her2 antitelo i njegov konjugat RS62157B1 (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310586326 2013-11-19
EP18204950.2A EP3480215B8 (en) 2013-11-19 2014-11-18 Anti-her2 antibody and conjugate thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62157B1 true RS62157B1 (sr) 2021-08-31

Family

ID=53178934

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210939A RS62157B1 (sr) 2013-11-19 2014-11-18 Anti-her2 antitelo i njegov konjugat

Country Status (20)

Country Link
US (1) US10087260B2 (sr)
EP (2) EP3480215B8 (sr)
JP (2) JP6326137B2 (sr)
KR (3) KR101936697B1 (sr)
CN (3) CN109320612B (sr)
AU (1) AU2014352475B2 (sr)
CA (1) CA2919359C (sr)
CY (1) CY1124651T1 (sr)
DK (2) DK3072907T3 (sr)
ES (1) ES2879799T3 (sr)
HR (1) HRP20211023T1 (sr)
HU (1) HUE055269T2 (sr)
LT (1) LT3480215T (sr)
PL (1) PL3480215T3 (sr)
PT (1) PT3480215T (sr)
RS (1) RS62157B1 (sr)
RU (1) RU2656161C1 (sr)
SI (1) SI3480215T1 (sr)
SM (1) SMT202100394T1 (sr)
WO (1) WO2015074528A1 (sr)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101936697B1 (ko) * 2013-11-19 2019-01-10 레메젠 리미티드 항-her2 항체 및 이의 접합체
KR101796277B1 (ko) 2016-04-12 2017-11-13 앱클론(주) 안정성이 개선된 ｈｅｒ２에 특이적으로 결합하는 항체
IL277049B2 (en) 2018-03-13 2024-02-01 Zymeworks Bc Inc Conjugates of biparatopic anti-HER2 antibody and drug and methods of use
US20200289663A1 (en) * 2018-08-29 2020-09-17 Remegen, Ltd Use of anti-her2 antibody-drug conjugate in treating urothelial carcinoma
BR112021005320A2 (pt) 2018-12-17 2021-06-15 Remegen Co., Ltd. ligante para conjugados de anticorpo-fármaco e seu uso
CN109498816A (zh) * 2019-01-07 2019-03-22 合肥瀚科迈博生物技术有限公司 一种抗体偶联药物的制备方法
EP3842460A1 (en) * 2019-03-01 2021-06-30 RemeGen Co., Ltd. Antibody for her2 concomitant diagnosis immunohistochemical detection and application thereof
CA3094194A1 (en) * 2019-03-26 2020-09-26 Remegen Co., Ltd. Pharmaceutical formulations of her2 antibody-drug conjugate
CN111939267B (zh) * 2019-05-17 2024-12-20 百奥泰生物制药股份有限公司 抗体-药物偶联物制剂、制备方法及应用
EP4058024A1 (en) 2019-11-15 2022-09-21 Seagen Inc. Methods of treating her2 positive breast cancer with tucatinib in combination with an anti-her2 antibody-drug conjugate
JP2023511403A (ja) * 2020-01-23 2023-03-17 バイオアトラ インコーポレイテッド 条件的に活性な抗ｈｅｒ２抗体、抗体断片、それらの免疫コンジュゲート、およびそれらの使用
CN112353947A (zh) * 2020-11-23 2021-02-12 荣昌生物制药(烟台)股份有限公司 一种含二甲双胍和抗体药物偶联物的药物组合物及其应用
CN112402616A (zh) * 2020-11-23 2021-02-26 荣昌生物制药(烟台)股份有限公司 一种含环丙沙星和抗体药物偶联物的药物组合物及其应用
CN114796519A (zh) * 2021-01-27 2022-07-29 南开大学 一种蛋白质偶联小分子药物的制备和应用
WO2022174775A1 (en) * 2021-02-18 2022-08-25 Remegen Co., Ltd. Use of antibody-drug conjugate targeting her2 in treatment of specific breast cancer
CN115845078A (zh) * 2021-09-24 2023-03-28 沃肽生物科技(山东)有限公司 基于相分离的肿瘤靶向药物递送系统
US11814394B2 (en) * 2021-11-16 2023-11-14 Genequantum Healthcare (Suzhou) Co., Ltd. Exatecan derivatives, linker-payloads, and conjugates and thereof
CN114736300B (zh) * 2022-06-09 2022-08-19 苏州百道医疗科技有限公司 一种抗her2重组兔单克隆抗体及其应用
EP4676543A1 (en) 2023-03-10 2026-01-14 Seagen Inc. Methods of treating cancer using anti-her2 antibody-drug conjugates and her2 kinase inhibitors
CN118725124B (zh) * 2023-03-29 2025-09-16 东莞市朋志生物科技有限公司 抗胃蛋白酶原ⅱ抗体、检测胃蛋白酶原ⅱ的试剂和试剂盒
WO2025038638A1 (en) 2023-08-14 2025-02-20 Seagen Inc. Methods of treating cancer using anti-her2 antibody-drug conjugates
WO2025054918A1 (en) * 2023-09-14 2025-03-20 Remegen Co., Ltd. Methods of treating cancer using anti-her2 antibody-drug conjugates and anti-pd-1 antibodies
WO2025054916A1 (en) * 2023-09-14 2025-03-20 Remegen Co., Ltd. Methods of treating cervical cancer using anti-her2 antibody-drug conjugates
WO2025123287A1 (en) * 2023-12-14 2025-06-19 Remegen Co., Ltd. Methods of treating breast cancer using anti-her2 antibody-drug conjugates and other therapeutic agents
WO2025130905A1 (zh) * 2023-12-18 2025-06-26 山东先声生物制药有限公司 抗FGFR2b抗体-药物缀合物及其应用
WO2026025013A2 (en) 2024-07-26 2026-01-29 Pfizer Inc. Combination therapy using cdk4 inhibitors for cancer treatments
WO2026077405A1 (zh) * 2024-10-11 2026-04-16 烟台蓝纳成生物技术股份有限公司 一种抗her2抗体、抗体核素偶联物及其应用

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100340575C (zh) 1999-06-25 2007-10-03 杰南技术公司 人源化抗ErbB2抗体及其在制备药物中的应用
BR0012196A (pt) 1999-06-25 2002-03-19 Genentech Inc Método de tratamento de um tumor em mamìferos através do uso de conjugados de maitansinóide e anticorpo receptor anti-erbb e artigo industrializado
US20040132101A1 (en) * 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
NZ579482A (en) * 2004-06-01 2011-02-25 Genentech Inc Antibody drug conjugates and methods
CN109045307A (zh) 2004-06-01 2018-12-21 健泰科生物技术公司 抗体-药物偶联物和方法
DK1771482T3 (da) 2004-07-22 2014-10-20 Genentech Inc HER2-antistofsammensætning
CL2008001334A1 (es) * 2007-05-08 2008-09-22 Genentech Inc Anticuerpo anti-muc16 disenado con cisteina; conjugado que lo comprende; metodo de produccion; formulacion farmaceutica que lo comprende; y su uso para tratar el cancer.
CN101143902B (zh) 2007-05-18 2010-06-02 中国医学科学院医药生物技术研究所 抗HER2单链抗体-力达霉素强化融合蛋白HER2(Fv-LDM)
US20090258005A1 (en) * 2007-05-29 2009-10-15 Trubion Pharmaceuticals Inc. Therapeutic compositions and methods
EP2260111B2 (en) 2008-03-14 2022-03-23 Genentech, Inc. Genetic variations associated with drug resistance
DK2644194T3 (en) * 2008-03-18 2017-07-03 Genentech Inc Combinations of an anti-HER2 antibody-drug conjugate and docetaxel
US8750701B2 (en) * 2008-09-19 2014-06-10 Telefonaktiebolaget L M Ericsson (Publ) Protection mechanism for a communications network
CN102030827B (zh) 2009-09-25 2014-09-24 上海抗体药物国家工程研究中心有限公司 一种高亲和力的抗her2单克隆抗体
EP2513148B1 (en) 2009-12-16 2016-08-31 AbbVie Biotherapeutics Inc. Anti-her2 antibodies and their uses
CN102167742B (zh) * 2010-02-25 2014-05-14 上海百迈博制药有限公司 一种全人源抗her2单克隆抗体、其制备方法及用途
US8609095B2 (en) * 2010-03-04 2013-12-17 Symphogen A/S Anti-HER2 antibodies and compositions
CN102884084B (zh) * 2010-03-04 2016-12-07 西福根有限公司 抗her2抗体及组合物
CA2800769C (en) 2010-05-27 2021-11-02 Genmab A/S Monoclonal antibodies against her2 epitope
EP2576621B1 (en) 2010-05-27 2019-04-10 Genmab A/S Monoclonal antibodies against her2
US9193791B2 (en) * 2010-08-03 2015-11-24 City Of Hope Development of masked therapeutic antibodies to limit off-target effects
WO2013164689A2 (en) 2012-05-02 2013-11-07 Lantto, Johan Humanized pan-her antibody compositions
KR101936697B1 (ko) * 2013-11-19 2019-01-10 레메젠 리미티드 항-her2 항체 및 이의 접합체

Also Published As

Publication number Publication date
RU2656161C1 (ru) 2018-05-31
BR112016002752A2 (pt) 2017-11-21
KR20160065972A (ko) 2016-06-09
JP2018138034A (ja) 2018-09-06
WO2015074528A1 (zh) 2015-05-28
KR101854443B1 (ko) 2018-06-15
PL3480215T3 (pl) 2021-12-13
PT3480215T (pt) 2021-07-05
CN110240655A (zh) 2019-09-17
JP2016528902A (ja) 2016-09-23
DK3480215T3 (da) 2021-07-05
CN110240655B (zh) 2023-05-16
SI3480215T1 (sl) 2021-12-31
KR101936697B1 (ko) 2019-01-10
JP6326137B2 (ja) 2018-05-16
EP3072907B1 (en) 2019-02-20
CA2919359A1 (en) 2015-05-28
HRP20211023T1 (hr) 2021-09-17
SMT202100394T1 (it) 2021-09-14
CY1124651T1 (el) 2022-07-22
EP3480215B1 (en) 2021-06-23
RU2016106339A (ru) 2017-12-25
US10087260B2 (en) 2018-10-02
DK3072907T3 (en) 2019-04-01
EP3480215B8 (en) 2021-07-28
DK3480215T5 (da) 2021-08-16
CN105008398A (zh) 2015-10-28
CA2919359C (en) 2019-01-15
HUE055269T2 (hu) 2021-11-29
EP3072907A1 (en) 2016-09-28
ES2879799T3 (es) 2021-11-23
BR112016002752A8 (pt) 2023-02-28
US20160304621A1 (en) 2016-10-20
CN109320612A (zh) 2019-02-12
EP3072907A4 (en) 2017-06-14
KR20180050423A (ko) 2018-05-14
KR20190002716A (ko) 2019-01-08
EP3480215A1 (en) 2019-05-08
AU2014352475B2 (en) 2017-08-17
CN109320612B (zh) 2020-10-27
KR101993136B1 (ko) 2019-06-26
JP6728264B2 (ja) 2020-07-22
CN105008398B (zh) 2018-10-16
LT3480215T (lt) 2021-08-25
AU2014352475A1 (en) 2016-02-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6728264B2 (ja) 抗ｈｅｒ２抗体及びその結合体
KR101529810B1 (ko) 항체-약물 접합체
TWI767139B (zh) 抗ｈｅｒ２抗體藥物偶聯物在治療尿路上皮癌中的用途
CN112175082B (zh) 抗叶酸受体α抗体、其缀合物及其用途
WO2025131054A1 (en) Antibody drug conjugates targeting to b7-h3 and egfr and the use thereof
HK1226744B (en) Anti-her2 antibody and conjugate thereof
HK1226744A1 (en) Anti-her2 antibody and conjugate thereof
BR112016002752B1 (pt) Anticorpo ou seus fragmentos funcionais que pode especificamente se ligar ao her2, conjugados, composição farmacêutica, e, uso do anticorpo ou seus fragmentos funcionais, do conjugado ou da composição farmacêutica