RS62437B1 - Trispecifični i/ili trivalentni vezujući proteini za prevenciju ili lečenje hiv infekcije - Google Patents

Description

Opis

UPUĆIVANJE NA POVEZANE PATENTNE PRIJAVE

[0001] Ova patentna prijava zahteva prioritetnu korist Privremene patentne prijave SAD, serijski broj 62/246,113, podnete 25. oktobra 2015, EP prijava br. EP16305211.1, podnete 24. februara 2016, Privremene patentne prijave SAD, serijski broj 62/322,029, podnete 13. aprila, 2016., i Privremene patentne prijave SAD, serijski broj 62/331,169, podnete 03. maja 2016.

[0002] Predmetni pronalazak nastao je u skladu sa Sporazumom o kooperativnom istraživanju i razvoju (NIAID #2014-0038) sa Nacionalnim institutom za zdravlje, agencijom Ministarstva zdravlja i ljudskih usluga. Vlada Sjedinjenih Država ima određena prava na predmetni pronalazak.

PODNOŠENJE SPISKA SEKVENCI NA ASCII TEKSTUALNOJ DATOTECI

[0003] Sadržaj sledećeg podneska u tekstualnoj datoteci ASCII je obrazac čitljiv na računaru (CRF) liste redosleda (naziv datoteke: 183952027041SEQLIST.txt, datum snimanja: 19. oktobar 2016, veličina: 1064 KB).

OBLAST PRONALASKA

[0004] Obelodanjivanje se odnosi na trispecifične i/ili trovalentne vezujuće proteine koji sadrže četiri polipeptidna lanca koji formiraju tri mesta za vezivanje antigena koji specifično vezuju jedan ili više HIV ciljnih proteina, pri čemu prvi par polipeptida koji formiraju vezujući protein poseduje dvostruko varijabilne domene koji imaju ukrštanje orijentacije i pri čemu drugi par polipeptida koji formiraju vezujući protein imaju jedan varijabilni domen. Obelodanjivanje se takođe odnosi na postupke za dobijanje trispecifičnih i/ili trovalentnih vezujućih proteina i na upotrebu takvih vezujućih proteina za lečenje i/ili prevenciju HIV/AIDS-a.

POZADINA

[0005] Jedan od izazova u lečenju HIV/AIDS-a neutralizirajućim antitelima je potencijalna probojna infekcija zbog velike stope mutacije virusa HIV-1. Dodatno, virusološki događaji u prvim nedeljama nakon prenošenja HIV-1 postavili su osnovu za doživotnu hroničnu infekciju koja ostaje neizlečiva sa trenutno dostupnom kombinovanom antiretrovirusnom terapijom (cART). To je, barem delimično, posledica ranog uspostavljanja virusnih rezervoara, uključujući latentno inficirane ćelije, koje opstaju uprkos cART-i, što dovodi do ponovne infekcije kada se lečenje prekine. Novootkrivena antitela za neutralisanje anti-HIV-1 sa poboljšanom širinom i potencijom mogu pružiti više mogućnosti za lečenje i prevenciju HIV/AIDS-a; međutim, probojna infekcija ostaje veliki problem na terenu.

[0006] WO 2012/158948 obelodanjuje izolovano antitelo na HIV. Međutim, WO 2012/158948 ne pruža i ne spominje tri-specifična antitela.

KRATAK REZIME

[0007] U jednom otelotvorenju, obelodanjivanje pruža vezujući protein koji sadrži četiri polipeptidna lanca koji formiraju tri mesta za vezivanje antigena koji specifično vezuju jedan ili više HIV ciljnih proteina, pri čemu prvi polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:

VL2- L1-VL1- L2-CL[I];

drugi polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:

VH1- L3-VH2- L4-CH1[II];

treći polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:

VH3-CH1[III];

treći polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:

VL3-CL[IV];

gde

VL1je prvi varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina;

VL2je drugi varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina;

VL3je treći varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina;

VH1je prvi varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina;

VH2je drugi varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina;

VH3je treći varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina;

CLje konstantni domen lakog lanca imunoglobulina;

CH1je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina CH1; i

L1, L2, L3, i L4jesu aminokiselinski veznici;

i gde polipeptid formule I i polipeptid formule II formiraju ukršteni par lakog lanca i teškog lanca, i gde

(a) VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 500, CDR-L2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 501, i CDR-L3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 274; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 275, CDR-L2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 276, i CDR-L3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 277; VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 266, CDR-L2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 267, i CDR-L3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 268; VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 254, CDR-H2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 255, i CDR-H3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 256; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 257, CDR-H2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 258, i CDR-H3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 259; i VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 248, CDR-H2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 497, i CDR-H3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 250; ili

(b) VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 500, CDR-L2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 501, i CDR-L3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 274; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 275, CDR-L2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 276, i CDR-L3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 277; VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 269, CDR-L2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 270, i CDR-L3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 271; VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 254, CDR-H2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 255, i CDR-H3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 256; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 257, CDR-H2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 258, i CDRH3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 259; i VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 251, CDR-H2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 252, i CDR-H3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 253; ili

(c) VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 275, CDR-L2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 276, i CDR-L3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 277; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 500, CDR-L2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 501, i CDR-L3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 274; VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 269, CDR-L2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 270, i CDR-L3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 271; VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 257, CDR-H2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 258, i CDR-H3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 259; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 254, CDR-H2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 255, i CDR-H3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 256; i VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 251, CDR-H2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 252, i CDR-H3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 253.

[0008] U poželjnom otelotvorenju, vezujući protein predmetnog pronalaska sadrži

(a) VL1sadrži varijabilni domen lakog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 518; VL2sadrži varijabilni domen lakog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 519; VL3sadrži varijabilni domen lakog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 512; VH1sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 504; VH2sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 506; i VH3sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 502; ili (b) VL1sadrži varijabilni domen lakog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 518; VL2sadrži varijabilni domen lakog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 519; VL3sadrži varijabilni domen lakog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 513; VH1sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 504; VH2sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 506; i VH3sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 503; ili (c) VL1sadrži varijabilni domen lakog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 519; VL2sadrži varijabilni domen lakog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 518; VL3sadrži varijabilni domen lakog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 513; VH1sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 506; VH2sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 504; i VH3sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 503.

[0009] U sledećem poželjnom otelotvorenju, vezujući protein predmetnog pronalaska je naznačen time da

(a) CH3domen drugog polipeptidnog lanca sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 354 i 366 humanog IgG1 prema EU indeksu, gde su aminokiselinske supstitucije S354C i T366W; i gde CH3domen trećeg polipeptidnog lanca sadrži supstitucije aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 349, 366, 368 i 407 humanog IgG1 prema EU indeksu, gde su aminokiselinske supstitucije Y349C, T366S, L368A i Y407V; ili

(b) gde CH3domen drugog polipeptidnog lanca sadrži supstitucije aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 349, 366, 368 i 407 humanog IgG1 prema EU indeksu, gde su aminokiselinske supstitucije Y349C, T366S, L368A i Y407V; i gde CH3domen trećeg polipeptidnog lanca sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 354 i 366 humanog IgG1 prema EU indeksu, gde su aminokiselinske supstitucije S354C i T366W.

[0010] U sledećem poželjnom otelotvorenju, CH3domeni drugog i trećeg polipeptidnog lanca sadrže aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 428 i 434 humanog IgG1 prema EU indeksu, gde su aminokiselinske supstitucije M428L i N434S.

[0011] U sledećem poželjnom otelotvorenju, (a) najmanje jedan od L1, L2, L3ili L4je nezavisno 0 aminokiselina po dužini; ili (b) L1, L2, L3ili L4su svaki nezavisno najmanje jednu aminokiselinu po dužini.

[0012] Još poželjnije otelotvorenje, L1, L2, L3i/ili L4sadrže sekvencu Asp-Lis-Thr-His-Thr (SEQ ID NO: 525).

[0013] U drugom otelotvorenju, predmetno obelodanjivanje obezbeđuje vezujući protein koji sadrži prvi polipeptidni lanac, drugi polipeptidni lanac, treći polipeptidni lanac i četvrti polipeptidni lanac gde:

(a) prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4 ili aminokiselinska sekvenca koja je najmanje 95% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 4; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3 ili aminokiselinska sekvenca koja je najmanje 95% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 3; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1 ili aminokiselinska sekvenca koja je najmanje 95% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 1; i četvrti polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2 ili aminokiselinska sekvenca koja je najmanje 95% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2;

(b) prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 12 ili aminokiselinska sekvenca koja je najmanje 95% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 12; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 11 ili aminokiselinska sekvenca koja je najmanje 95% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 11; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9 ili aminokiselinska sekvenca koja je najmanje 95% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 9; i četvrti polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10 ili aminokiselinska sekvenca koja je najmanje 95% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 10;

(c) prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 20 ili aminokiselinska sekvenca koja je najmanje 95% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 20; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 19 ili aminokiselinska sekvenca koja je najmanje 95% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 19; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 17 ili aminokiselinska sekvenca koja je najmanje 95% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 17; i četvrti polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18 ili aminokiselinska sekvenca koja je najmanje 95% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 18.

[0014] U sledećem otelotvorenju, predmetno obelodanjivanje obezbeđuje molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira vezujući protein predmetnog pronalaska

[0015] U drugom otelotvorenju, predmetno obelodanjivanje obezbeđuje ekspresioni vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku.

[0016] U sledećem otelotvorenju, predmetno obelodanjivanje je obezbedilo vektorski sistem koji sadrži jedan ili više vektora koji kodiraju prvi, drugi, treći i četvrti polipeptidni lanac vezujućeg proteina prema predmetnom pronalasku, pri čemu opciono:

(a) vektorski sistem sadrži prvi vektor koji kodira prvi polipeptidni lanac vezujućeg proteina, drugi vektor koji kodira drugi polipeptidni lanac vezujućeg proteina, treći vektor koji kodira treći polipeptidni lanac vezujućeg proteina i četvrti vektor kodirajući četvrti polipeptidni lanac vezujućeg proteina ili

(b) vektorski sistem sadrži prvi vektor koji kodira prvi i drugi polipeptidni lanac vezujućeg proteina, i drugi vektor koji kodira treći i četvrti polipeptidni lanac vezujućeg proteina.

[0017] U drugom otelotvorenju, predmetno obelodanjivanje obezbeđuje izolovanu ćeliju domaćina koja sadrži molekul nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku, ekspresioni vektor predmetnog pronalaska ili vektorski sistem predmetnog pronalaska, pri čemu je opciono ćelija domaćin ćelija sisara ili ćelija insekata.

[0018] U dodatnom otelotvorenju, predmetno obelodanjivanje obezbeđuje postupak za proizvodnju vezujućeg proteina, koji obuhvata:

a) kultivisanje ćelije domaćina prema predmetnom pronalasku pod takvim uslovima da ćelija domaćin eksprimira vezujući protein; i

b) izolovanje vezivnog proteina iz ćelije domaćina.

[0019] U sledećem otelotvorenju, predmetno obelodanjivanje je obezbedilo vezujući protein predmetnog pronalaska za upotrebu u postupku sprečavanja i/ili lečenja HIV infekcije kod pacijenta, koji se sastoji u davanju pacijentu terapeutski efikasne količine vezujućeg proteina, pri čemu se vezujući protein se opciono daje zajedno sa standardnom anti-retrovirusnom terapijom, i gde je pacijent opciono čovek.

[0020] Specifična otelotvorenja pronalaska postaće evidentna iz sledećeg detaljnijeg opisa određenih izvođenja i patentnih zahteva.

[0021] Trebalo bi prihvatiti da se jedno, neka ili sva svojstva različitih otelotvorenja ovde opisanih mogu kombinovati kako bi se formirala druga otelotvorenja prema predmetnom pronalasku. Ovi i drugi aspekti predmetnog pronalaska postaće očigledni stručnjaku iz ove oblasti.

KRATAK OPIS SLIKA

[0022]

SL. 1A-D prikazuju šematski prikaz trispecifičnih vezujućih proteina koji sadrže četiri polipeptidna lanca koji formiraju tri mesta za vezivanje antigena koji specifično vezuju tri različita epitopa na jednom ili više antigena, pri čemu prvi par polipeptida poseduje dvostruko promenljive domene koji imaju unakrsnu orijentaciju formirajući dva mesta vezivanja antigena (koja sadrže VH1-VL1i VH2-VL2) i gde drugi par polipeptida poseduje jedno mesto vezivanja za antigen (koji sadrži VH3-VL3), u skladu sa nekim otelotvorenjima. Sl.1A prikazuje trispecifični vezujući protein koji sadrži modifikaciju "čvorovi-u-rupu", gde je čvor na prvom paru polipeptida. Sl.1B prikazuje trispecifični vezujući protein koji sadrži modifikaciju "čvorovi-u-rupu", gde je čvor na drugom paru polipeptida. Sl.1C prikazuje orijentaciju varijabilnih domena na polipeptidnim lancima, i orijentaciju dugmeta/rupe za vezujuće proteine 1-31 prikazane u Tabelama 1 i 2. "Teški lanac A" (npr., treći polipeptidni lanac ovog otkrića) označava promenljivi domen teškog lanca A. "Laki lanac A" (npr., četvrti polipeptidni lanac predmetnog obelodanjivanja) označava varijabilni domen lakog lanca A. "Teški lanac B" (npr., drugi polipeptidni lanac prema ovom otkriću) označava varijabilni domen 1 i varijabilni domen 2 teškog lanca B. "Laki lanac B" (npr., prvi polipeptidni lanac prema ovom otkriću) označava varijabilni domen 1 i varijabilni domen 2 lakog lanca B. SL.1D prikazuje orijentaciju varijabilnih domena na polipeptidnim lancima, i orijentaciju dugmeta/rupe za vezujuće proteine 32-53 prikazane u Tabelama 1 i 2. "Teški lanac A" (npr., treći polipeptidni lanac ovog otkrića) označava promenljivi domen teškog lanca A. "Laki lanac A" (npr., četvrti polipeptidni lanac predmetnog obelodanjivanja) označava varijabilni domen lakog lanca A. "Teški lanac B" (npr., drugi polipeptidni lanac prema ovom otkriću) označava varijabilni domen 1 i varijabilni domen 2 teškog lanca B. "Laki lanac B" (npr., prvi polipeptidni lanac prema ovom otkriću) označava varijabilni domen 1 i varijabilni domen 2 lakog lanca B.

SL. 2A-B prikazuju prečišćavanje tri trispecifična vezujuća proteina prvo primenom afinitetne hromatografije, a zatim preparativnom hromatografijom za isključivanje veličine. Sl.2A prikazuje profil elucije trispecifičnih vezujućih proteina tokom prečišćavanja pomoću afinitetne hromatografije na proteinu A. Sl.2B prikazuje prečišćavanje monomernih proteina pomoću isključive hromatografije veličine Superdex200.

SL. 3A-B prikazuju prečišćavanje roditeljskih antitela MPER Ab, CD4BS Ab "b" i V1/V2 usmerenih prema Ab "a" prvo pomoću afinitetne hromatografije, a zatim pomoću preparativne hromatografije za isključivanje veličine. Sl.3A prikazuje profil elucije roditeljskih antitela tokom prečišćavanja pomoću afinitetne hromatografije na proteinu A. Sl.3B prikazuje prečišćavanje monomernih proteina pomoću isključive hromatografije veličine Superdex200.

SL. 4A-B prikazuju profile hromatografije za isključivanje veličine bispecifičnih i trispecifičnih vezujućih proteina. Sl.4A prikazuje profile hromatografije isključivanja bispecifičnih vezujućih proteina po veličini. Sl.4B prikazuje profile hromatografije isključivanja trispecifičnih vezujućih proteina po veličini.

Sl. 5 prikazuje Biacore senzograme kinetike vezivanja tri trispecifična vezujuća proteina i roditeljsko MPER Ab antitelo za HIV peptid izveden iz gp41 (mesto vezivanja MPER), prema standardnom kinetičkom testu zasnovanom na Biacore. Sl. 6 prikazuje Biacore senzograme kinetike vezivanja tri trispecifična vezujuća proteina i roditeljsko CD4BS Ab "b" antitelo za rekombinantni HIV gp120, prema standardnom kinetičkom testu zasnovanom na Biacore.

Sl. 7 prikazuje rezultate farmakokinetičke (PK) studije navedenih proteina nakon intravenozne (IV) injekcije u rezus makaki.

SL. 8A-8B prikazuju šematski prikaz trispecifičnih T-ćelija koje su uključene, u skladu sa nekim otelotvorenjima. Vezujuća mesta su označena tačkastim krugovima.

Sl. 9 prikazuje svojstva vezivanja trispecifičnih vezujućih proteina "Vezujući protein 32" i "CD3 x CD28 / CD4BS Ab 'b" "za CD3 (CD3E predstavlja protein CD3epsilon; CD3D predstavlja protein CD3delta), CD28 i protein sa stabilizovanim jezgrom 3 (RSC3) na bazi povrća gp120, kao i negativnu kontrolu (humani IgG).

Sl. 10 prikazuje aktivaciju CD8 T-ćelija korišćenjem trispecifičnih proteina "Vezujući protein 32" i "CD3 x CD28 / CD4BS Ab 'b'" u poređenju sa roditeljskim CD4BS IgG4 antitelom, kao i negativnu kontrolu (Nema mAb).

Sl. 11 prikazuje aktivaciju CD4 T-ćelija korišćenjem trispecifičnih proteina "Vezujući protein 32" i "CD3 x CD28 / CD4BS Ab 'b'" u poređenju sa roditeljskim CD4BS IgG4 antitelom, kao i negativnu kontrolu (Nema mAb).

Sl. 12 prikazuje smanjenje regulacije CD3 T-ćelija korišćenjem trispecifičnih proteina "Vezujući protein 32" i "CD3 x CD28 / CD4BS Ab 'b'" u poređenju sa roditeljskim CD4BS IgG4 antitelom, kao i negativnu kontrolu (Nema mAb).

SL. 13A-C pokazuju rezultate testa citotoksičnosti na bazi fluorescentno aktiviranog sortiranja ćelija (FACS) za trispecifične vezujuće proteine protiv latentno inficiranih HIV-1<+>T ćelija. Sl.13A prikazuje rezultate za trispecifične vezujuće proteine inkubirane sa CEM-BaL ćelijama. Sl.13B prikazuje rezultate za trispecifične vezujuće proteine inkubirane sa ACH2 ćelijama. Sl.13C prikazuje rezultate za trispecifične vezujuće proteine inkubirane sa ćelijama J1.1.

DETALJNI OPIS

[0023] Predmetno obelodanjivanje obezbeđuje trispecifične i/ili trovalentne vezujuće proteine koji sadrže četiri polipeptidna lanca koji formiraju tri mesta za vezivanje antigena koji se specifično vezuju za jedan ili više ciljnih proteina virusa humane imunodeficijencije (HIV) i/ili jedan ili više proteina-receptora T-ćelija, pri čemu prvi par polipeptida koji formiraju vezujući protein poseduju dvostruko varijabilne domene sa unakrsnom orijentacijom i pri čemu drugi par polipeptida koji formiraju vezujući protein imaju jedan varijabilni domen.

[0024] Sledeći opis prikazuje primere postupaka, parametara i slično.

Definicije

[0025] Kako se koriste u skladu sa predmetnim obelodanjivanjem, sledeći pojmovi, osim ako nije drugačije naznačeno, imaće sledeća značenja. Osim ako kontekst ne zahteva drugačije, termini za jedninu obuhvataju množinu, a termini za množinu uključuju jedninu.

[0026] Termin "polinukleotid", kako se ovde koristi, odnosi se na jednolančane ili dvolančane polimere nukleinskih kiselina dužine najmanje 10 nukleotida. U nekim otelotvorenjima, nukleotidi koji sadrže polinukleotid mogu biti ribonukleotidi ili dezoksiribonukleotidi ili modifikovani oblik bilo koje vrste nukleotida. Takve modifikacije uključuju bazne modifikacije kao što su bromuridin, modifikacije riboze kao što su arabinozid i 2', 3'-dideoksiriboza, i modifikacije internukleotidne veze kao što su fosforotioat, fosforoditioat, fosforoselenoat, fosforodiselenoat, fosforoanilotioat, fosforanilatat i fosforoamidat. Termin "polinukleotid" posebno uključuje jednolančane i dvolančane oblike DNK.

[0027] "Izolovani polinukleotid" je polinukleotid genomskog, cDNK ili sintetičkog porekla ili neke njihove kombinacije, koji: (1) nije povezan sa celim ili delom polinukleotida u kome se izolovani polinukleotid nalazi u prirodi, (2) je povezan sa polinukleotidom sa kojim u prirodi nije vezan, ili (3) se ne javlja u prirodi kao deo veće sekvence.

[0028] "Izolovani polipeptid" je onaj koji: (1) je oslobođen bar nekih drugih polipeptida sa kojima bi se normalno nalazio, (2) je u suštini slobodan od drugih polipeptida iz istog izvora, na primer, iz iste vrste, (3) je izražena ćelijom iz različite vrste, (4) je odvojen od najmanje oko 50 posto polinukleotida, lipida, ugljenih hidrata ili drugih materijala sa kojima je povezan u prirodi, (5) nije povezan (kovalentnom ili nekovalentnom interakcijom) sa delovima polipeptid sa kojim je "izolovani polipeptid" povezan u prirodi, (6) je operativno povezan (kovalentnom ili nekovalentnom interakcijom) sa polipeptidom sa kojim u prirodi nije povezan, ili (7) se ne javlja u prirodi. Takav izolovani polipeptid može biti kodiran genomskom DNK, cDNK, mRNK ili drugom RNK, sintetičkog porekla, ili bilo kojom njihovom kombinacijom. Poželjno je da izolovani polipeptid u suštini ne sadrži polipeptide ili druge zagađivače koji se nalaze u njegovom prirodnom okruženju i koji bi ometali njegovu upotrebu (terapijski, dijagnostički, profilaktički, istraživački ili na drugi način).

[0029] Antitela koja se pojavljuju u prirodi obično sadrže tetramer. Svaki takav tetramer se tipično sastoji od dva identična para polipeptidnih lanaca, od kojih svaki par ima jedan "laki" lanac u punoj dužini (obično ima molekulsku masu od oko 25 kDa) i jedan "teški" lanac u punoj dužini (obično ima molekulsku masu od oko 50-70 kDa). Termini "teški lanac" i "laki lanac" koji se ovde koriste odnose se na bilo koji polipeptid imunoglobulina koji ima dovoljnu sekvencu varijabilnog domena da pruži specifičnost za ciljni antigen. Aminoterminalni deo svakog lakog i teškog lanca tipično uključuje varijabilni domen od oko 100 do 110 ili više aminokiselina koji je tipično odgovoran za prepoznavanje antigena. Karboksiterminalni deo svakog lanca tipično definiše konstantan domen odgovoran za efektorsku funkciju. Tako, u antitelu koje se prirodno javlja, polipeptid imunoglobulina teškog lanca pune dužine uključuje varijabilni domen (VH) i tri konstantna domena (CH1, CH2, i CH3), pri čemu je VHdomen na amino-kraju polipeptida i CH3domen je na karboksilnom kraju, a polipeptid imunoglobulina lakog lanca pune dužine uključuje varijabilni domen (VL) i konstantan domen (CL), pri čemu je VLdomen na amino-kraju polipeptida i CLdomen se nalazi na karboksilnom kraju.

[0030] Humani laki lanci se tipično klasifikuju kao lanci lamda i kapa, a teški lanci čoveka kao mu, delta, gama, alfa ili epsilon i definišu izotip antitela kao IgM, IgD, IgG, IgA i IgE, respektivno. IgG ima nekoliko podklasa, uključujući, ali ne ograničavajući se na IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. IgM ima podrazrede, uključujući, ali ne ograničavajući se na IgM1 i IgM2. IgA se na sličan način deli na podklase uključujući, ali bez ograničenja, IgA1 i IgA2. Unutar lakih i teških lanaca pune dužine, promenljivi i konstantni domeni obično su spojeni sa "J" regionom od oko 12 ili više aminokiselina, pri čemu teški lanac takođe uključuje "D" region sa još oko 10 aminokiselina. Videti npr., FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul, W., ed., Raven Press, 2nd ed., 1989). Varijabilni regioni svakog para lakog/teškog lanca tipično formiraju mesto vezivanja antigena. Varijabilni domeni antitela koja se prirodno pojavljuju tipično pokazuju istu opštu strukturu relativno očuvanih okvirnih regiona (FR) spojenih sa tri hipervarijabilne regije, koje se nazivaju i regioni za određivanje komplementarnosti ili CDR. CDR iz dva lanca svakog para obično su poravnati okvirnim regionima, što može omogućiti vezivanje za određeni epitop. Od amino-kraja do karboksil-kraja, i varijabilni domeni lakog i teškog lanca tipično sadrže domene FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4.

[0031] Termin "CDR set" odnosi se na grupu od tri CDR koja se javljaju u jednom varijabilnom regionu sposobnom da veže antigen. Tačne granice ovih CDR različito su definisane prema različitim sistemima. Sistem koji je opisao Kabat (Kabat i dr., SEKVENCE PROTEINA IMUNOLOŠKOG INTERESA (Nacionalni instituti za zdravlje, Bethesda, Md. (1987) i (1991)) ne samo da pruža nedvosmislen sistem numerisanja ostataka primenljiv na bilo koji varijabilni region antitela, već takođe pruža precizne granice ostataka koji definišu tri CDR. Ovi CDR se mogu nazvati Kabat CDR. Chothia i dr. (Chothia i Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-17; Chothia i dr., 1989, Nature 342: 877-83) otkrili su da određeni pod-delovi unutar Kabat CDR usvajaju gotovo identične konformacije peptidne kičme, uprkos velikoj raznovrsnosti na nivou aminokiselinske sekvence. Ove podklase su označene kao L1, L2 i L3 ili HI, H2 i H3 gde "L" i "H" označavaju regione lakog i teškog lanca, respektivno. Ovi regioni se mogu nazvati Chothia CDR, koji imaju granice koje se preklapaju sa Kabat CDR.

Druge granice koje definišu CDR koji se preklapaju sa Kabat CDR opisao je Padlan, 1995, FASEB J.9: 133-39; MacCallum, 1996, J. Mol. Biol.262(5): 732-45; i Lefranc, 2003, Dev. Comp. Immunol. 27: 55-77. Ostale definicije granica CDR možda neće striktno slediti jedan od ovde navedenih sistema, ali će se ipak preklapati sa Kabat CDR, iako se mogu skratiti ili produžiti u svetlu predviđanja ili eksperimentalnih nalaza koje određeni ostaci ili grupe ostataka ili čak čitavi CDR rade nemaju značajan uticaj na vezivanje antigena. Metode koje se ovde koriste mogu koristiti CDR definisane prema bilo kom od ovih sistema, iako određene realizacije koriste CDR definisane Kabat ili Chothia. Identifikacija predviđenih CDR pomoću aminokiselinske sekvence dobro je poznata u ovoj oblasti, kao što je to u Martin, A.C. "Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains," In Antibody Engineering, Vol.2. Kontermann R., Dübel S., eds. Springer-Verlag, Berlin, p.33-51 (2010). Aminokiselinska sekvenca varijabilnog domena teškog i/ili lakog lanca može se takođe proveriti da bi se identifikovale sekvence CDR drugim konvencionalnim postupcima, na primer, upoređivanjem sa poznatim aminokiselinskim sekvencama drugih varijabilnih regiona teškog i lakog lanca kako bi se odredilo regioni hipervarijabilnosti sekvence.

Numerisane sekvence mogu se poravnati okom ili upotrebom programa za poravnanje, kao što je jedan od CLUSTAL paketa programa, kako je opisano u Thompson, 1994, Nucleic Acids Res. 22: 4673-80. Molekularni modeli se konvencionalno koriste za pravilno ocrtavanje okvira i CDR regiona i na taj način ispravljaju dodeljivanja zasnovana na sekvenci.

[0032] Termin "Fc", kako se ovde koristi, odnosi se na molekul koji sadrži sekvencu fragmenta koji se ne vezuje za antigen koji je rezultat digestije antitela ili je proizveden na drugi način, bilo u monomernom ili multimernom obliku, i može sadržati zglobni region. Originalni izvor imunoglobulina izvornog Fc je poželjno ljudskog porekla i može biti bilo koji od imunoglobulina, iako se preferiraju IgG1 i IgG2. Fc molekuli se sastoje od monomernih polipeptida koji se mogu povezati u dimerne ili multimerne oblike kovalentnom (tj., disulfidnom vezom) i nekovalentnom asocijacijom. Broj međumolekulskih disulfidnih veza između monomernih podjedinica izvornih molekula Fc kreće se od 1 do 4 u zavisnosti od klase (npr., IgG, IgA i IgE) ili podklase (npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgA1 i IgGA2). Jedan primer Fc je dimer vezan disulfidom koji je rezultat digestije IgG papaina. Termin "Fc", kako se ovde koristi, generički je za monomerne, dimerne i multimerne oblike.

[0033] F (ab) fragment tipično uključuje jedan laki lanac i VHi CH1domene jednog teškog lanca, pri čemu deo teškog lanca VH-CH1fragmenta F (ab) ne može formirati disulfidnu vezu sa drugim polipeptidom teškog lanca. Kako se ovde koristi, F (ab) fragment takođe može uključivati jedan laki lanac koji sadrži dva varijabilna domena razdvojena aminokiselinskim veznikom i jedan teški lanac koji sadrži dva varijabilna domena razdvojena aminokiselinskim veznikom i CH1domenom.

[0034] F(ab') fragment tipično uključuje jedan laki lanac i deo jednog teškog lanca koji sadrži više konstantnog regiona (između domena CH1i CH2), tako da se međulančana disulfidna veza može formirati između dva teška lanca kako bi se formirao molekul F(ab')2.

[0035] Termin "vezujući protein", kako se ovde koristi, odnosi se na molekul koji se ne javlja u prirodi (ili rekombinantni ili konstruisani), koji se specifično vezuje za najmanje jedan ciljani antigen, i koji sadrži četiri polipeptidna lanca koji formiraju najmanje tri mesta za vezivanje antigena, pri čemu prvi polipeptidni lanac ima strukturu predstavljenu formulom:

VL2- L1-VL1- L2-CL[I]

1

i drugi polipeptidni lanac ima strukturu predstavljenu formulom:

VH1- L3-VH2- L4-CH1[II]

i treći polipeptidni lanac ima strukturu predstavljenu formulom:

VH3-CH1[III]

i četvrti polipeptidni lanac ima strukturu predstavljenu formulom:

VL3-CL[IV]

gde:

VL1je prvi varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina;

VL2je drugi varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina;

VL3je treći varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina;

VH1je prvi varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina;

VH2je drugi varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina;

VH3je treći varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina;

CLje konstantni domen lakog lanca imunoglobulina;

CH1je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina CH1; i

L1, L2, L3, i L4jesu aminokiselinski veznici;

i gde polipeptid formule I i polipeptid formule II formiraju ukršteni par lakog lanca i teškog lanca.

[0036] "Rekombinantni" molekul je onaj koji je pripremljen, eksprimovan, stvoren ili izolovan rekombinantnim putem.

[0037] Jedno otelotvorenje obelodanjivanja obezbeđuje vezivanje proteina koji imaju biološku i imunološku specifičnost za između jednog i tri ciljna antigena. Drugo otelotvorenje obelodanjivanja obezbeđuje molekule nukleinske kiseline koji sadrže nukleotidne sekvence koje kodiraju polipeptidne lance koji formiraju takve vezujuće proteine. Drugo otelotvorenje obelodanjivanja obezbeđuje ekspresione vektore koji sadrže molekule nukleinske kiseline koji sadrže nukleotidne sekvence koje kodiraju polipeptidne lance koji formiraju takve vezujuće proteine. Još jedno otelotvorenje obelodanjivanja obezbeđuje ćelije domaćine koje eksprimiraju takve vezujuće proteine (tj., sadrže molekule nukleinske kiseline ili vektore koji kodiraju polipeptidne lance koji formiraju takve vezujuće proteine).

[0038] Termin "zamenjivost", kako se ovde koristi, odnosi se na zamenjivost varijabilnih domena unutar formata vezivnog proteina i sa zadržavanjem savijanja i krajnjim afinitetom vezivanja. "Potpuna zamena" odnosi se na mogućnost zamene redosleda oba VH1i VH2domena, a samim tim i redosleda VL1i VL2domena, u polipeptidnom lancu formule I ili polipeptidnom lancu formule II (tj., da obrnu redosled ) uz očuvanje pune funkcionalnosti proteina za vezivanje, što dokazuje zadržavanje afiniteta za vezivanje. Nadalje, treba napomenuti da se oznake VHi VLodnose samo na lokaciju domena na određenom proteinskom lancu u konačnom formatu. Na primer, VH1i VH2mogu biti izvedeni iz domena VL1i VL2u roditeljskim antitelima i smešteni na položaje VH1i VH2u vezujućem proteinu. Isto tako, VL1i VL2mogu biti izvedeni iz domena VH1i VH2u roditeljskim antitelima i smešteni na položaje VH1i VH2u vezujućem proteinu. Tako se oznake VHi VLodnose na sadašnju lokaciju, a ne na originalnu lokaciju u roditeljskom antitelu. VHi VLdomeni su stoga „zamenljivi“.

[0039] Termin "antigen" ili "ciljni antigen" ili "cilj antigena", kako se ovde koristi, odnosi se na molekul ili deo molekula koji je sposoban da bude vezan proteinom za vezivanje, a dodatno je sposoban da se koristi kod životinja za proizvode antitela sposobna da se vežu za epitop tog antigena. Ciljani antigen može imati jedan ili više epitopa. S obzirom na svaki ciljni antigen koji prepoznaje vezujući protein, vezujući protein je sposoban da se takmiči sa netaknutim antitelom koje prepoznaje ciljni antigen.

[0040] Termin "HIV" koji se ovde koristi označava virus humane imunodeficijencije. Kako se ovde koristi, izraz "HIV infekcija" generalno obuhvata infekciju domaćina, posebno humanog domaćina, virusom virusa humane imunodeficijencije (HIV), uključujući, ali bez ograničenja, HIV I, HIV II, HIV III (takođe poznat kao HTLV-II, LAV-1, LAV-2). HIV se ovde može koristiti za upućivanje na bilo koje sojeve, oblike, podtipove, klase i varijacije u porodici HIV-a. Prema tome, lečenje HIV infekcije će obuhvatiti lečenje osobe koja je nosilac bilo koje porodice HIV virusa retrovirusa ili osobe kojoj je dijagnostikovana aktivna SIDA, kao i lečenje ili profilaksu stanja povezanih sa SIDA kod takvih osoba.

[0041] Termina "SIDA", kako se ovde koristi, označava sindrom stečene imunodeficijencije. SIDA je uzrokovana HIV-om.

[0042] Termini "CD4bs" ili "mesto vezivanja CD4" odnose se na mesto vezivanja za CD4 (klaster diferencijacije 4), koji je glikoprotein koji se nalazi na površini imunih ćelija kao što su T pomoćne ćelije, monociti, makrofagi i dendritične ćelije.

[0043] Termin "CD3" je grupa polipeptida faktora diferencijacije 3 i površinski je protein T-ćelije koji je tipično deo kompleksa receptora T ćelija (TCR).

[0044] "CD28" je skup polipeptida 28 za diferencijaciju i površinski je protein T-ćelija koji daje ko-stimulativne signale za aktivaciju i preživljavanje T-ćelija.

[0045] Termin "glikoprotein 160" ili "gp160 protein" odnosi se na omotački glikoproteinski kompleks HIV-a i koji je homotrimer koji se deli na podjedinice gp120 i gp41.

[0046] Termin "MPER" odnosi se na membranski proksimalni spoljni region glikoproteina 41 (gp41), koji je podjedinica proteinskog kompleksa omotača retrovirusa, uključujući HIV.

[0047] Termin "glikan" se odnosi na ugljeni hidratni deo glikokonjugata, kao što je glikoprotein, glikolipid ili proteoglikan. U obelodanjenim vezivnim proteinima, glikan se odnosi na glikoprotein omotača HIV-1 gp120.

[0048] Termin "angažovanje T-ćelija" odnosi se na vezujuće proteine usmerene na imunološki sistem domaćina, tačnije na citotoksično delovanje T ćelija, kao i na ciljani protein HIV-a.

[0049] Termin "trimer apeks" odnosi se na vrh glikoproteina koverte HIV-1 gp120 u ovojnici.

[0050] Termin "monospecifični vezujući protein" odnosi se na vezujući protein koji se specifično vezuje za jednu metu antigena.

[0051] Termin "monovalentni vezujući protein" odnosi se na vezujući protein koji ima jedno mesto za vezivanje antigena.

[0052] Termin "bispecifični vezujući protein" odnosi se na vezujući protein koji se specifično vezuje za dva različita cilja antigena.

[0053] Termin "dvovalentni vezujući protein" odnosi se na vezujući protein koji ima dva mesta vezivanja.

[0054] Termin "trispecifični vezujući protein" odnosi se na vezujući protein koji se specifično vezuje za tri različite mete antigena.

[0055] Termin "trovalentni vezujući protein" odnosi se na vezujući protein koji ima tri mesta vezivanja. U posebnim otelotvorenjima, trovalentni vezujući protein može da se veže za jednu metu antigena. U drugim otelotvorenjima, trovalentni vezujući protein može da se veže za dve mete antigena. U drugim otelotvorenjima, trovalentni vezujući protein može da se veže za tri mete antigena.

[0056] "Izolovani" vezujući protein je onaj koji je identifikovan i odvojen i/ili oporavljen od komponente svog prirodnog okruženja. Zagađujuće komponente njegovog prirodnog okruženja su materijali koji bi ometali dijagnostičku ili terapeutsku upotrebu vezivnog proteina i mogu uključivati enzime, hormone i druge proteinske ili ne-proteinske rastvore. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein će biti prečišćen: (1) do više od 95 mas.% antitela kako je određeno Lovrijevom metodom, a najpoželjnije više od 99 mas.%, (2) do stepena dovoljnog da se dobije najmanje 15 ostataka N-terminalne ili unutrašnje aminokiseline sekvencu upotrebom sekvenatora za predenje čaša, ili (3) do homogenosti pomoću SDS-PAGE pod uslovima redukcije ili smanjenja upotrebom Kumasi plave ili, poželjno, srebrne boje. Izolovani vezujući proteini uključuju vezujući protein in situ unutar rekombinantnih ćelija jer najmanje jedna komponenta prirodnog okruženja vezivnog proteina neće biti prisutna.

[0057] Termini "suštinski čist" ili "znatno prečišćen" kako se ovde koriste odnose se na jedinjenje ili vrstu koja je dominantna prisutna vrsta (tj., na molarnoj osnovi je brojnija od bilo koje druge vrste u sastavu). U nekim otelotvorenjima, znatno prečišćena frakcija je kompozicija u kojoj vrsta sadrži najmanje oko 50% (na molarnoj osnovi) svih prisutnih makromolekularnih vrsta. U drugim otelotvorenjima, suštinski čisti sastav će sadržati više od oko 80%, 85%, 90%, 95%ili 99%svih makromolarnih vrsta prisutnih u sastavu. U još nekim otelotvorenjima, vrsta je prečišćena do bitne homogenosti (vrste zagađivača se ne mogu detektovati u sastavu konvencionalnim postupcima detekcije) gde se sastav u osnovi sastoji iz jedne makromolekularne vrste.

[0058] "Neutralizujući" vezujući protein koji se ovde koristi odnosi se na molekul koji je u stanju da blokira ili značajno smanji efektorsku funkciju ciljnog antigena za koji se vezuje. Kako se ovde koristi, "značajno smanjenje" znači najmanje oko 60%, poželjno najmanje oko 70%, poželjnije najmanje oko 75%, još poželjnije najmanje oko 80%, još poželjnije najmanje oko 85%, najpoželjnije najmanje oko 90% smanjenja efektorske funkcije ciljnog antigena.

1

[0059] Termin "epitop" uključuje bilo koju odrednicu, poželjno polipeptidnu odrednicu, sposobnu za specifično vezivanje za imunoglobulin ili T-ćelijski receptor. U nekim otelotvorenjima, determinante epitopa uključuju hemijski aktivne površinske grupe molekula kao što su aminokiseline, bočni lanci šećera, fosforilne grupe ili sulfonilne grupe, i, u nekim otelotvorenjima, mogu imati specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike i/ili specifične karakteristike naelektrisanja. Epitop je region antigena koji je vezan antitelom ili vezujućim proteinom. U nekim otelotvorenjima, za vezivni protein se kaže da specifično vezuje antigen kada preferencijalno prepozna svoj ciljni antigen u složenoj smeši proteina i/ili makromolekula. U nekim otelotvorenjima, za vezivni protein se kaže da specifično vezuje antigen kada je ravnotežna konstanta disocijacije ≤ 10<-8>M, poželjnije kada je ravnotežna konstanta disocijacije ≤ 10<-9>M, a najpoželjnije kada je konstanta disocijacije ≤ 10<-10>M.

[0060] Konstanta disocijacije (KD) vezujućeg proteina može se odrediti, na primer, površinskom plazmonskom rezonancom. Generalno, analiza površinske plazmonske rezonance meri interakcije vezivanja u realnom vremenu između liganda (ciljnog antigena na matrici biosenzora) i analita (vezujući protein u rastvoru) površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) koristeći BIAcore sistem (Pharmacia Biosensor; Piscataway, NJ).

Površinska analiza plazmona se takođe može izvesti imobilizacijom analita (vezujući protein na biosenzorskoj matrici) i predstavljanjem liganda (ciljnog antigena). Termin "KD", kako se ovde koristi, odnosi se na konstantu disocijacije interakcije između određenog vezujućeg proteina i ciljnog antigena.

[0061] Izraz "specifično vezuje" kako se ovde koristi odnosi se na sposobnost vezujućeg proteina ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen da se veže za antigen koji sadrži epitop sa Kd od najmanje oko 1 x 10<-6>M, 1 x 10<-7>M, 1 x 10<-8>M, 1 x 10<-9>M, 1 x 10<-10>M, 1 x 10<-11>M, 1 x 10<-12>M, ili više, i/ili da se vezuje za epitop sa afinitet koji je najmanje dva puta veći od njegovog afiniteta za nespecifičan antigen.

[0062] Termin "veznik", kako se ovde koristi, odnosi se na jedan ili više aminokiselinskih ostataka umetnutih između domena imunoglobulina kako bi se obezbedila dovoljna pokretljivost za domene lakih i teških lanaca da se presavijaju u unakrsni imunoglobuline sa dvostrukim varijabilnim regionom. Veznik se ubacuje na prelazu između varijabilnih domena ili između varijabilnih i konstantnih domena na nivou sekvence. Prelaz između domena može se identifikovati jer se približna veličina domena imunoglobulina dobro razume. Tačna lokacija prelaska domena može se odrediti lociranjem peptidnih rastezanja koja ne tvore sekundarne strukturne elemente, poput beta-listova ili alfa-heliksa, što je pokazano eksperimentalnim podacima ili kako se može pretpostaviti tehnikama modeliranja ili predviđanja sekundarne strukture. Ovde opisani veznici se nazivaju L1, koji se nalazi na lakom lancu između C-kraja VL2i N-kraja VL1domena; i L2, koji se nalazi na lakom lancu između C-kraja VL1i N-terminalu CLdomena. Veznici teškog lanca su poznati kao L3, koji se nalazi između C-terminala VH1i N-kraja VH2domena; i L4, koji se nalazi između C-terminala VH2i N-kraja CH1domena.

[0063] Termin "vektor" kako se ovde koristi odnosi se na bilo koji molekul (npr., nukleinsku kiselinu, plazmid ili virus) koji se koristi za prenos kodirajućih informacija u ćeliju domaćina. Termin "vektor" uključuje molekul nukleinske kiseline koji je sposoban da transportuje drugu nukleinsku kiselinu za koju je povezan. Jedna vrsta vektora je "plazmid", koji se odnosi na kružni dvolančani molekul DNK u koji se mogu ubaciti dodatni segmenti DNK. Druga vrsta vektora je virusni vektor, gde se dodatni segmenti DNK mogu umetnuti u virusni genom. Određeni vektori su sposobni za autonomnu replikaciju u ćeliji domaćina u koju su uvedeni (npr., bakterijski vektori koji imaju bakterijsko poreklo replikacije i epizomalni vektori sisara). Drugi vektori (npr., ne-epizomalni vektori sisara) mogu biti integrisani u genom ćelije domaćina nakon uvođenja u ćeliju domaćina i na taj način se repliciraju zajedno sa genom domaćina. Osim toga, određeni vektori su sposobni da usmere ekspresiju gena za koje su operativno vezani. Takvi vektori se ovde pozivaju kao "rekombinantni ekspresijski vektori" (ili jednostavno, "ekspresioni vektori"). Uopšteno, ekspresijski vektori korisnosti u tehnikama rekombinantne DNK često su u obliku plazmida. Termini "plazmid" i "vektor" mogu se ovde koristiti naizmenično, jer je plazmid najčešće korišćeni oblik vektora.

Međutim, ovo otkriće ima za cilj da uključi i druge oblike ekspresionih vektora, kao što su virusni vektori (npr., replikatorni defektni retrovirusi, adenovirusi i adeno-povezani virusi), koji služe ekvivalentnim funkcijama.

[0064] Termin "rekombinantna ćelija domaćin" (ili "ćelija domaćin") kako se ovde koristi odnosi se na ćeliju u koju je uveden rekombinantni ekspresioni vektor. Rekombinantna ćelija domaćin ili ćelija domaćin ne odnosi se samo na određenu ćeliju subjekta, već i na potomstvo takve ćelije. Budući da se određene modifikacije mogu dogoditi u narednim generacijama zbog mutacije ili uticaja okoline, takvo potomstvo u stvari ne mora biti identično matičnoj ćeliji, ali su takve ćelije i dalje uključene u opseg izraza "ćelija domaćin" koji se ovde koristi. Širok spektar ekspresionih sistema ćelija domaćina može se koristiti za ekspresiju vezivnih proteina, uključujući bakterijske, kvasne, bakulovirusne i sisteme ekspresije sisara (kao i ekspresione sisteme za prikaz faga). Primer pogodnog vektora bakterijske ekspresije je pUC19. Da bi rekombinantno eksprimirali vezujući protein, ćelija domaćin se transformiše ili transficira sa jednim ili više rekombinantnih ekspresionih vektora koji nose fragmente DNK koji kodiraju polipeptidne lance vezujućeg proteina tako da se polipeptidni lanci eksprimiraju u ćeliji domaćinu i, poželjno, izlučuju u medijum u kome se kultivišu ćelije domaćini, iz kog medijuma se može izvući vezivni protein.

[0065] Termin "transformacija" koji se ovde koristi odnosi se na promenu genetskih karakteristika ćelije, a ćelija je transformisana kada je modifikovana tako da sadrži novu DNK. Na primer, ćelija se transformiše tamo gde je genetski modifikovana iz svog prirodnog stanja. Nakon transformacije, DNK koja se transformiše može se rekombinovati sa onom ćelije fizičkom integracijom u hromozom ćelije, ili se može prolazno održavati kao epizomalni element bez replikacije, ili se može nezavisno replicirati kao plazmid. Smatra se da je ćelija stabilno transformisana kada se DNK replicira podelom ćelije. Termin "transfekcija", kako se ovde koristi, odnosi se na usvajanje strane ili egzogene DNK u ćeliji, a ćelija je "transficirana" kada je egzogena DNK uvedena unutar ćelijske membrane. Brojne tehnike transfekcije su dobro poznate u tehnici. Takve tehnike se mogu koristiti za uvođenje jednog ili više egzogenih molekula DNK u odgovarajuće ćelije domaćine.

[0066] Termin "prirodno prisutan" koji se ovde koristi i primenjuje na objekat odnosi se na činjenicu da se predmet može naći u prirodi i da njime nije manipulisao čovek. Na primer, polinukleotid ili polipeptid koji je prisutan u organizmu (uključujući viruse) koji se može izolovati iz izvora u prirodi i koji čovek nije namerno modifikovao prirodno se javlja. Slično, "neprirodni" koji se ovde koristi odnosi se na predmet koji se ne nalazi u prirodi ili koji je strukturno modifikovan ili sintetizovan od strane čoveka.

[0067] Kako se ovde koristi, dvadeset konvencionalnih aminokiselina i njihove skraćenice slede uobičajenu upotrebu. Stereoizomeri (npr., D-aminokiseline) od dvadeset konvencionalnih aminokiselina; neprirodne aminokiseline i analozi kao što su a-, adisupstituisane aminokiseline, N-alkil aminokiseline, mlečna kiselina i druge

1

nekonvencionalne aminokiseline takođe mogu biti pogodne komponente za polipeptidne lance vezujućih proteina. Primeri nekonvencionalnih aminokiselina uključuju: 4-hidroksiprolin, g-karboksiglutamat, ε-N,N,N-trimetillizin, ε-N-acetillizin, O-fosfoserin, N-acetilserin, N-formilmetionin, 3-metilhistidin, 5-hidroksilzin, σ-N-metilarginin, i druge slične aminokiseline i imino kiseline (npr., 4-hidroksiprolin). U notaciji polipeptida koja se ovde koristi, levi smer je amino terminalni smer, a desni smer je karboksil-terminalni smer, u skladu sa standardnom upotrebom i konvencijom.

[0068] Prirodni ostaci mogu se podeliti u klase na osnovu zajedničkih svojstava bočnog lanca:

(1) hidrofobnost: Met, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Tyr, Pro;

(2) polarna hidrofilnost: Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Lys, Ser, Thr ;

(3) alifatičnost: Ala, Gly, Ile, Leu, Val, Pro;

(4) alifatična hidrofobnost:: Ala, Ile, Leu, Val, Pro;

(5) neutralna hidrofilnost: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(6) kiselost: Asp, Glu;

(7) bazičnost: His, Lys, Arg;

(8) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: Gly, Pro;

(9) aromatičnost: His, Trp, Tyr, Phe; i

10. (10) aromatična hidrofobnost:: Phe, Trp, Tyr.

[0069] Konzervativne supstitucije aminokiselina mogu uključivati razmenu člana jedne od ovih klasa sa drugim članom iste klase. Nekonzervativne zamene mogu uključivati zamenu člana jedne od ovih klasa za člana iz druge klase.

[0070] Iskusni majstor će moći da odredi pogodne varijante polipeptidnih lanaca vezujućih proteina koristeći dobro poznate tehnike. Na primer, stručnjak u ovoj oblasti tehnike može identifikovati pogodna područja polipeptidnog lanca koja se mogu promeniti bez uništavanja aktivnosti ciljanjem na regione za koje se ne veruje da su važni za aktivnost. Alternativno, stručnjak u ovoj oblasti može identifikovati ostatke i delove molekula koji su konzervirani među sličnim polipeptidima. Osim toga, čak i područja koja mogu biti važna za biološku aktivnost ili za strukturu mogu biti podložna konzervativnim supstitucijama aminokiselina bez uništavanja biološke aktivnosti ili bez štetnog uticaja na strukturu polipeptida.

[0071] Termin "pacijent" kako se ovde koristi uključuje ljudske i životinjske ispitanike.

[0072] Termini "lečenje" ili "lečenje" koji se ovde koriste odnose se i na terapeutski tretman i na profilaktičke ili preventivne mere. Oni kojima je potrebno lečenje uključuju one koji imaju poremećaj, kao i one koji su skloni poremećaju ili one kod kojih se poremećaj treba sprečiti. U posebnim otelotvorenjima, proteini koji se vezuju mogu se koristiti za lečenje ljudi zaraženih HIV, ili ljudi osetljivih na HIV infekciju, ili za poboljšanje HIV infekcije kod humanog subjekta zaraženog HIV. Vezujući proteini se takođe mogu koristiti za sprečavanje HIV kod humanih pacijenata.

[0073] Treba shvatiti da lečenje ljudi zaraženih HIV uključuje one ispitanike koji su u bilo kojoj od nekoliko faza progresije HIV infekcije, koji, na primer, uključuju sindrom akutne primarne infekcije (koji može biti asimptomatski ili povezan sa gripom sličnim bolesti sa groznicom, malaksalošću, dijarejom i neurološkim simptomima poput glavobolje), asimptomatskom infekcijom (koja je dug latentni period sa postepenim smanjenjem broja cirkulišućih CD4<+>T ćelija) i SIDA (koji je definisan ozbiljnijom bolesti koju definiše SIDA

1

bolesti i/ili pad broja cirkulišućih CD4 ćelija na nivo koji je kompatibilan sa efikasnom imunološkom funkcijom). Osim toga, lečenje ili sprečavanje HIV infekcije takođe će obuhvatati lečenje sumnje na infekciju HIV nakon sumnje na prethodno izlaganje HIV, na primer, kontaktom sa krvlju zaraženom HIV, transfuzijom krvi, razmenom telesnih tečnosti, „nebezbednim“ seksom sa zaraženom osobom, slučajnim ubod iglom, primanje tetovaže ili akupunkture sa kontaminiranim instrumentima ili prenos virusa sa majke na bebu tokom trudnoće, porođaja ili nedugo nakon toga.

[0074] Termini "farmaceutski sastav" ili "terapeutski sastav" kako se ovde koriste odnose se na jedinjenje ili sastav sposobne da izazovu željeni terapeutski efekat kada se pravilno daju pacijentu.

[0075] Termin "farmaceutski prihvatljiv nosač" ili "fiziološki prihvatljiv nosač", kako se ovde koristi, odnosi se na jedan ili više materijala za formulaciju pogodnih za postizanje ili povećanje isporuke vezujućeg proteina.

[0076] Termini "efikasna količina" i "terapeutski efikasna količina" kada se koriste u odnosu na farmaceutski sastav koji sadrži jedan ili više vezujućih proteina odnose se na količinu ili dozu dovoljnu za postizanje željenog terapijskog rezultata. Preciznije, terapeutski efikasna količina je količina vezivnog proteina dovoljna da, tokom nekog vremenskog perioda, inhibira jedan ili više klinički definisanih patoloških procesa povezanih sa stanjem koje se leči. Efikasna količina može da varira u zavisnosti od specifičnog vezujućeg proteina koji se koristi, a takođe zavisi od različitih faktora i stanja vezanih za pacijenta koji se leči i ozbiljnosti poremećaja. Na primer, ako se vezujući protein primenjuje in vivo, faktori kao što su starost, masa i zdravlje pacijenta, kao i krive odgovora na dozu i podaci o toksičnosti dobijeni tokom pretkliničkog rada na životinjama bili bi među tim faktorima koji se uzimaju u obzir. Određivanje efikasne količine ili terapeutski efikasne količine datog farmaceutskog sastava je unutar sposobnosti stručnjaka u ovoj oblasti.

[0077] Jedno otelotvorenje obelodanjivanja obezbeđuje farmaceutski sastav koji sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač i terapeutski efikasnu količinu vezujućeg proteina.

Trispecifični i/ili trovalentni proteini za vezivanje

[0078] U jednom otelotvorenju, vezujući protein iz predmetnog obelodanjivanja je trispecifičan i/ili trovalentni vezujući protein koji sadrži četiri polipeptidna lanca koji formiraju tri mesta za vezivanje antigena koji specifično vezuju jedan ili više (npr., tri različita) HIV ciljna proteina, pri čemu prvi polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:

VL2- L1-VL1- L2-CL[I]

i drugi polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:

VH1- L3-VH2- L4-CH1[II]

i treći polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:

VH3-CH1[III]

treći polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:

1

VL3-CL[IV]

gde:

VL1je prvi varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina;

VL2je drugi varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina;

VL3je treći varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina;

VH1je prvi varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina;

VH2je drugi varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina;

VH3je treći varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina;

CLje konstantni domen lakog lanca imunoglobulina;

CH1je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina CH1; i

L1, L2, L3i L4jesu aminokiselinski veznici;

i gde polipeptid formule I i polipeptid formule II formiraju ukršteni par lakog lanca i teškog lanca, i gde

(a) VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 500, CDR-L2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 501, i CDR-L3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 274; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 275, CDR-L2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 276, i CDR-L3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 277; VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 266, CDR-L2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 267, i CDR-L3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 268; VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 254, CDR-H2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 255, i CDR-H3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 256; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 257, CDR-H2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 258, i CDR-H3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 259; i VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 248, CDR-H2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 497, i CDR-H3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 250; ili

(b) VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 500, CDR-L2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 501, i CDR-L3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 274; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 275, CDR-L2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 276, i CDR-L3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 277; VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 269, CDR-L2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 270, i CDR-L3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 271; VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 254, CDR-H2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 255, i CDR-H3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 256; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 257, CDR-H2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 258, i CDR-H3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 259; i VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 251, CDR-H2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 252, i CDR-H3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 253; ili

(c) VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 275, CDR-L2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 276, i CDR-L3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 277; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 500, CDR-L2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 501, i CDR-L3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 274; VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 269, CDR-L2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 270, i CDR-L3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 271; VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 257, CDR-H2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 258, i CDR-H3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 259; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 254, CDR-H2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 255, i CDR-H3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 256; i VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 251, CDR-H2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 252, i CDR-H3 koji

1

sadrži sekvencu SEQ ID NO: 253.

[0079] U poželjnom otelotvorenju, vezujući protein predmetnog pronalaska sadrži

(a) VL1sadrži varijabilni domen lakog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 518; VL2sadrži varijabilni domen lakog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 519; VL3sadrži varijabilni domen lakog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 512; VH1sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 504; VH2sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 506; i VH3sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 502; ili (b) VL1sadrži varijabilni domen lakog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 518; VL2sadrži varijabilni domen lakog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 519; VL3sadrži varijabilni domen lakog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 513; VH1sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 504; VH2sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 506; i VH3sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 503; ili (c) VL1sadrži varijabilni domen lakog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 519; VL2sadrži varijabilni domen lakog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 518; VL3sadrži varijabilni domen lakog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 513; VH1sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 506; VH2sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 504; i VH3sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 503.

[0080] U sledećem poželjnom otelotvorenju, vezujući protein predmetnog pronalaska je naznačen time da

(a) CH3domen drugog polipeptidnog lanca sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 354 i 366 humanog IgG1 prema EU indeksu, gde su aminokiselinske supstitucije S354C i T366W; i gde CH3domen trećeg polipeptidnog lanca sadrži supstitucije aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 349, 366, 368 i 407 humanog IgG1 prema EU indeksu, gde su aminokiselinske supstitucije Y349C, T366S, L368A i Y407V; ili

(b) gde CH3domen drugog polipeptidnog lanca sadrži supstitucije aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 349, 366, 368 i 407 humanog IgG1 prema EU indeksu, gde su aminokiselinske supstitucije Y349C, T366S, L368A i Y407V; i gde CH3domen trećeg polipeptidnog lanca sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 354 i 366 humanog IgG1 prema EU indeksu, gde su aminokiselinske supstitucije S354C i T366W.

[0081] U sledećem poželjnom otelotvorenju, CH3domeni drugog i trećeg polipeptidnog lanca sadrže aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 428 i 434 humanog IgG1 prema EU indeksu, gde su aminokiselinske supstitucije M428L i N434S.

[0082] U sledećem poželjnom otelotvorenju, (a) najmanje jedan od L1, L2, L3ili L4je nezavisno 0 aminokiselina po dužini; ili (b) L1, L2, L3ili L4svaki nezavisno najmanje jednu aminokiselinu po dužini.

[0083] Još poželjnije otelotvorenje, L1, L2, L3i/ili L4sadrže sekvencu Asp-Lis-Thr-His-Thr (SEQ ID NO: 525).

[0084] U drugom otelotvorenju, predmetno obelodanjivanje obezbeđuje vezujući protein koji sadrži prvi polipeptidni lanac, drugi polipeptidni lanac, treći polipeptidni lanac i četvrti

1

polipeptidni lanac gde:

(a) prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4 ili aminokiselinska sekvenca koja je najmanje 95% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 4; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3 ili aminokiselinska sekvenca koja je najmanje 95% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 3; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1 ili aminokiselinska sekvenca koja je najmanje 95% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 1; i četvrti polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2 ili aminokiselinska sekvenca koja je najmanje 95% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2;

(b) prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 12 ili aminokiselinska sekvenca koja je najmanje 95% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 12; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 11 ili aminokiselinska sekvenca koja je najmanje 95% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 11; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9 ili aminokiselinska sekvenca koja je najmanje 95% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 9; i četvrti polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10 ili aminokiselinska sekvenca koja je najmanje 95% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 10;

(c) prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 20 ili aminokiselinska sekvenca koja je najmanje 95% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 20; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 19 ili aminokiselinska sekvenca koja je najmanje 95% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 19; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 17 ili aminokiselinska sekvenca koja je najmanje 95% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 17; i četvrti polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18 ili aminokiselinska sekvenca koja je najmanje 95% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 18.

[0085] U nekim otelotvorenjima, prvi polipeptidni lanac i drugi polipeptidni lanac imaju unakrsnu orijentaciju koja formira dva različita mesta vezivanja za antigen. U nekim otelotvorenjima, VH1i VL1formiraju vezujući par i formiraju prvo mesto vezivanja antigena. U nekim otelotvorenjima, VH2i VL2formiraju vezujući par i formiraju drugo mesto vezivanja antigena. U nekim otelotvorenjima, treći polipeptid i četvrti polipeptid čine treće mesto vezivanja za antigen. U nekim otelotvorenjima, VH3i VL3formiraju vezujući par i formiraju treće mesto vezivanja antigena.

[0086] U posebnim otelotvorenjima, zamenjuju se redosled domena VH1i VH2, a samim tim i red domena VL1i VL2, u polipeptidnom lancu formule I ili polipeptidnom lancu formule II (tj., da bi se obrnuo redosled).

Ciljani proteini

[0087] U jednom otelotvorenju, proteini koji se vezuju specifično se vezuju za jedan ili više HIV ciljnih proteina. U nekim otelotvorenjima, vezujući proteini su trispecifični i specifično se vezuju za MPER proteina HIV-1 gp41, mesto vezivanja CD4 proteina HIV-1 gp120, glikan u V3 petlji proteina HIV-1 gp120, trimer vrh proteina HIV-1 gp120 ili gp160. U drugim otelotvorenjima, vezujući proteini se specifično vezuju za jedan ili više HIV ciljnih proteina i jedan ili više ciljnih proteina na T-ćeliji, uključujući kompleks receptora T ćelija.

2

Ovi proteini koji vezuju T-ćelije sposobni su da regrutuju T ćelije prolazno u ciljne ćelije i, istovremeno, aktiviraju citolitičku aktivnost T ćelija. Trispecifična antitela koja uključuju T-ćelije mogu se koristiti za aktiviranje rezervoara HIV-1 i preusmeravanje/aktiviranje T ćelija za lizu latentno inficiranih HIV-1<+>T ćelija. Primeri ciljnih proteina na T ćelijama su, između ostalog, CD3 i CD28. U nekim otelotvorenjima, trispecifični vezujući proteini mogu se generisati kombinovanjem domena koji vezuju antigen dva ili više monospecifičnih antitela (roditeljska antitela) u jedno antitelo. Vidi međunarodne patentne objave br. WO 2011/038290 A2, WO 2013/086533 A1, WO 2013/070776 A1, WO 2012/154312 A1, i WO 2013/163427 A1. Vezujući proteini iz predmetnog mogu se pripremiti korišćenjem domena ili sekvenci dobijenih ili izvedena iz bilo kog ljudskog ili ne-humanog antitela, uključujući, na primer, humana, mišja ili humanizovana antitela.

[0088] U nekim otelotvorenjima obelodanjivanja, trovalentni vezujući protein je sposoban da vezuje tri različite mete antigena. U jednom otelotvorenju, vezujući protein je trispecifičan i jedan par lakog lanca sa teškim lancem je sposoban da vezuje dve različite antigenske mete ili epitope, a jedan par lakog lanca i teškog lanca je sposoban da vezuje jednu metu ili epitop antigena. U drugom otelotvorenju, vezujući protein je sposoban da veže tri različite mete antigena HIV koje se nalaze na strukturi glikoproteina omotača HIV sastavljenoj od podjedinica gp120 i gp41. U drugim otelotvorenjima, vezujući protein je sposoban da inhibira funkciju jednog ili više antigenih ciljeva.

[0089] U nekim otelotvorenjima, vezujući protein prema predmetnom obelodanjivanju vezuje jedan ili više proteina ciljanih na HIV. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein je sposoban da specifično vezuje tri različita epitopa na jedan HIV ciljani protein. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein je sposoban da vezuje dva različita epitopa na prvom HIV ciljnom proteinu i jedan epitop na drugom HIV ciljnom proteinu. U nekim otelotvorenjima, prvi i drugi HIV ciljani protein su različiti. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein je sposoban da specifično vezuje tri različita HIV ciljna proteina. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više HIV ciljnih proteina su jedan ili više glikoproteina 120, glikoproteina 41 i glikoproteina 160.

[0090] U nekim otelotvorenjima, vezujući protein prema predmetnom obelodanjivanju vezuje jedan ili više HIV ciljnih proteina i jedan ili više ciljnih proteina T ćelija. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein je sposoban da specifično vezuje jedan ciljni protein HIV i dva različita epitopa na jednom ciljnom proteinu T ćelije. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein je sposoban da specifično veže jedan ciljni protein HIV i dva različita ciljna proteina T ćelije (npr., CD28 i CD3). U nekim otelotvorenjima, vezujući protein je sposoban da specifično vezuje jedan ciljni protein T ćelije i dva različita epitopa na jednom ciljnom HIV proteinu. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein je sposoban da specifično vezuje jedan ciljni protein T ćelije i dva različita HIV ciljana proteina. U nekim otelotvorenjima, prvi i drugi polipeptidni lanac vezujućeg proteina formira dva mesta za vezivanje antigena koja specifično ciljaju na dva ciljana proteina T ćelije, a treći i četvrti polipeptidni lanac vezujućeg proteina formiraju mesto za vezivanje antigena koji se specifično vezuje za HIV cilj protein. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više HIV ciljnih proteina su jedan ili više glikoproteina 120, glikoproteina 41 i glikoproteina 160. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više ciljnih proteina T ćelija su jedan ili više CD3 i CD28.

Veznici

[0091] U nekim otelotvorenjima, veznici L1, L2, L3, i L4se kreću u rasponu od bez aminokiselina (dužina=0) do oko 100 aminokiselina dužine ili manje od 100, 50, 40, 30, 20 ili 15 aminokiselina ili manje. Veznici takođe mogu biti dugački 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ili 1 aminokiseline. L1, L2, L3, i L4u jednom vezujućem proteinu svi mogu imati istu aminokiselinsku sekvencu ili svi mogu imati različite aminokiselinske sekvence.

[0092] Primeri pogodnih veznika uključuju pojedinačni glicin (Gly) ostatak; diglicin peptid (Gly-Gly); tripeptid (Gly-Gly-Gly); peptid sa četiri ostatka glicina (Gly-Gly-Gly-Gly; SEQ ID NO: 285); peptid sa pet ostatka glicina (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly; SEQ ID NO: 286); peptid sa šest ostatka glicina (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly; SEQ ID NO: 287); peptid sa sedam ostatka glicina (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly; SEQ ID NO: 288); peptid sa osam ostatka glicina (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly; SEQ ID NO: 289). Mogu se koristiti i druge kombinacije aminokiselinskih ostataka, poput peptida Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 290), peptid Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 291) i peptid Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 292). Drugi pogodni veznici uključuju pojedinačni Ser i Val ostatak; dipeptid Arg-Thr, Gln-Pro, Ser-Ser, Thr-Lys, i Ser-Leu; Thr-Lys-Gly-Pro-Ser (SEQ ID NO: 293), Thr-Val-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO: 294), Gln-Pro-Lys-Ala-Ala (SEQ ID NO: 295), Gln-Arg-Ile-Glu-Gly (SEQ ID NO: 296); Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Pro-Ser (SEQ ID NO: 297), Arg-Thr-Val-Ala-Ala-Pro-Ser (SEQ ID NO: 298), Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO: 299), i His-Ile-Asp-Ser-Pro-Asn-Lys (SEQ ID NO: 300). Pokazalo se da su veznici koji sadrže nasumično odabrane aminokiseline izabrane iz grupe koju čine valin, leucin, izoleucin, serin, treonin, lizin, arginin, histidin, aspartat, glutamat, asparagin, glutamin, glicin i prolin pogodni za vezivanje proteina.

[0093] Identitet i redosled aminokiselinskih ostataka u vezniku mogu varirati u zavisnosti od vrste sekundarnog strukturnog elementa koji je neophodan za postizanje u vezniku. Na primer, glicin, serin i alanin su najbolji za veznike koji imaju maksimalnu fleksibilnost. Neka kombinacija glicina, prolina, treonina i serina je korisna ako je neophodan čvršći i produženi veznik. Bilo koji aminokiselinski ostatak može se smatrati veznikom u kombinaciji sa drugim aminokiselinskim ostacima za konstrukciju većih peptidnih veznika prema potrebi u zavisnosti od željenih svojstava.

[0094] U nekim otelotvorenjima, dužina L1je najmanje dvostruko veća od dužine L3. U nekim otelotvorenjima, dužina L2je najmanje dvostruko veća od dužine L4. U nekim otelotvorenjima, dužina L1je najmanje dvostruko veća od dužine L3, a dužina L2je najmanje dvostruko veća od dužine L4. U nekim otelotvorenjima, L1je 3 do 12 aminokiselinskih ostataka po dužini, L2je 3 do 14 aminokiselinskih ostataka po dužini, L3je 1 do 8 aminokiselinskih ostataka po dužini, a L4je 1 do 3 aminokiselinska ostatka po dužini. U nekim otelotvorenjima, L1je 5 do 10 aminokiselinskih ostataka po dužini, L2je 5 do 8 aminokiselinskih ostataka po dužini, L3je 1 do 5 aminokiselinskih ostataka po dužini, a L4je 1 do 5 aminokiselinska ostatka po dužini. U nekim otelotvorenjima, L1je 7 aminokiselinskih ostataka po dužini, L2je 5 aminokiselinskih ostataka po dužini, L3je 1 aminokiselinskih ostataka po dužini, a L4je 2 aminokiselinska ostatka po dužini.

[0095] U nekim otelotvorenjima, L1, L2, L3, i/ili L4sadrže sekvencu Asp-Lys-Thr-His-Thr (SEQ ID NO: 525). U nekim otelotvorenjima, L1sadrži sekvencu Asp-Lys-Thr-His-Thr (SEQ ID NO: 525). U nekim otelotvorenjima, L3sadrži sekvencu Asp-Lys-Thr-His-Thr (SEQ ID NO: 525).

[0096] U nekim otelotvorenjima, L1, L2, L3, i/ili L4sadrže sekvencu Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO: 299). U nekim otelotvorenjima, L1sadrže sekvencu Gly-Gln-Pro-LysAla-Ala-Pro (SEQ ID NO: 299). U nekim otelotvorenjima, L1sadrže sekvencu Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO: 299), L2sadrže sekvencu Thr-Lys-Gly-Pro-Ser-Arg (SEQ ID NO: 526), L3sadrže sekvencu Ser, i L4sadrže sekvencu Arg-Thr. U nekim otelotvorenjima, L3sadrže sekvencu Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO: 299). U nekim otelotvorenjima, L1sadrži sekvencu Ser, L2sadrži sekvencu Arg-Thr, L3sadrži sekvencu Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO: 299) i L4sadrže sekvencu Thr-Lys-Gly-Pro-Ser-Arg (SEQ ID NO: 526).

Fc regioni i konstantni domeni

[0097] U nekim otelotvorenjima, vezujući protein prema predmetnom obelodanjivanju sadrži drugi polipeptidni lanac koji dalje sadrži Fc region vezan za CH1, Fc region koji obuhvata zglobni region imunoglobulina i konstantne domene teškog lanca CH2i CH3imunoglobulina. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein prema predmetnom obelodanjivanju sadrži treći polipeptidni lanac koji dalje sadrži Fc region vezan za CH1, Fc region koji obuhvata zglobni region imunoglobulina i konstantne domene teškog lanca CH2i CH3imunoglobulina. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein prema predmetnom obelodanjivanju sadrži drugi polipeptidni lanac koji dalje sadrži Fc region vezan za CH1, Fc region koji obuhvata zglobni region imunoglobulina i konstantne domene teškog lanca imunoglobulina CH2i CH3, a treći polipeptidni lanac koji dalje sadrži Fc region vezan za CH1, Fc region koji obuhvata zglobni region imunoglobulina i konstantne domene teškog lanca imunoglobulina CH2i CH3.

[0098] Da bi se poboljšali prinosi vezujućih proteina, u nekim otelotvorenjima, domeni CH3mogu se promeniti tehnologijom "čvor-u-rupi" koja je detaljno opisana sa nekoliko primera u, na primer, Međunarodnoj patentnoj objavi br. WO 96/027011, Ridgway i dr., 1996, Protein Eng. 9: 617-21; i Merchant i dr., 1998, Nat. Biotechnol.16: 677-81. Konkretno, površine interakcije dva CH3domena su promenjene kako bi se povećala heterodimerizacija oba teška lanca koji sadrže ova dva CH3domena. Svaki od dva CH3domena (od dva teška lanca) može biti "čvor", dok je drugi "rupa". Uvođenje disulfidnog mosta dodatno stabilizuje heterodimere (Merchant i dr., 1998; Atwell i dr., 1997, J. Mol. Biol.270: 26-35) i povećava prinos. U posebnim otelotvorenjima, čvor se nalazi na drugom paru polipeptida sa jednim varijabilnim domenom. U drugim otelotvorenjima, čvor se nalazi na prvom paru polipeptida koji ima unakrsnu orijentaciju. U još nekim otelotvorenjima, CH3domeni ne uključuju čvor u rupi.

[0099] U nekim otelotvorenjima, vezujući protein prema predmetnom obelodanjivanju sadrži "čvor" mutaciju na drugom polipeptidnom lancu i "rupu" mutaciju na trećem polipeptidnom lancu. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein prema predmetnom obelodanjivanju sadrži "čvor" mutaciju na trećem polipeptidnom lancu i "rupu" mutaciju na drugom polipeptidnom lancu. U nekim otelotvorenjima, mutacija "čvor" sadrži supstitucije na položajima koji odgovaraju pozicijama 354 i 366 humanog IgG1 prema EU Indeksu. U nekim otelotvorenjima, aminokiselinske supstitucije su S354C i T366W. U nekim otelotvorenjima, mutacija "rupa" sadrži supstitucije na položajima koji odgovaraju pozicijama 349, 366, 368, i 407 humanog IgG1 prema EU Indeksu. U nekim otelotvorenjima, aminokiselinske supstitucije su Y349C, T366S, L368A, i Y407V U nekim otelotvorenjima, drugi polipeptidni lanac dalje sadrži prvi Fc region vezan za CH1, prvi Fc region koji sadrži zglobni region imunoglobulina i konstantne domene teškog lanca imunoglobulina CH2i CH3, pri čemu prvi Fc region sadrži aminokiselinske supstitucije na položajima koji odgovaraju pozicije 354 i 366 humanog IgG1 prema EU indeksu, gde su aminokiselinske supstitucije S354C i T366W; i gde treći polipeptidni lanac dalje sadrži drugi Fc region vezan za CH1, drugi Fc region koji sadrži zglobni region imunoglobulina i konstantne domene teškog lanca imunoglobulina CH2i CH3, pri čemu drugi Fc region sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje

2

odgovaraju pozicijama 349 , 366, 368 i 407 humanog IgG1 prema EU indeksu, gde su aminokiselinske supstitucije Y349C, T366S, L368A i Y407V. U nekim otelotvorenjima, drugi polipeptidni lanac dalje sadrži prvi Fc region vezan za CH1, prvi Fc region koji sadrži zglobni region imunoglobulina i konstantne domene teškog lanca imunoglobulina CH2i CH3, pri čemu prvi Fc region sadrži aminokiselinske supstitucije na položajima koji odgovaraju pozicije 349, 366, 368, i 407 humanog IgG1 prema EU indeksu, gde su aminokiselinske supstitucije Y349C, T366S, L368A, i Y407V; i gde treći polipeptidni lanac dalje sadrži drugi Fc region vezan za CH1, drugi Fc region koji sadrži zglobni region imunoglobulina i konstantne domene teškog lanca imunoglobulina CH2i CH3, pri čemu drugi Fc region sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 354 i 366 humanog IgG1 prema EU indeksu, gde su aminokiselinske supstitucije S354C i T366W.

[0100] U nekim otelotvorenjima, vezujući protein prema predmetnom obelodanjivanju sadrži jednu ili više mutacija za poboljšanje poluvremena seruma (Videti npr., Hinton, P.R. i dr. (2006) J. Immunol.176(1):346-56). U nekim otelotvorenjima, mutacija sadrži supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 428 i 434 humanog IgG1 prema EU indeksu, gde su aminokiselinske supstitucije M428L i N434S. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein sadrži drugi polipeptidni lanac koji dalje sadrži prvi Fc region vezan za CH1, prvi Fc region koji sadrži zglobni region imunoglobulina i konstantne domene teškog lanca imunoglobulina CH2i CH3, a treći polipeptidni lanac koji dalje sadrži drugi Fc region vezan za CH1, drugi Fc region koji sadrži zglobnu regiju imunoglobulina i konstantne domene teškog lanca CH2i CH3imunoglobulina, pri čemu prva i druga Fc regija sadrže aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 428 i 434 humanog IgG1 prema EU Indeks, gde su aminokiselinske supstitucije M428L i N434S. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein prema predmetnom obelodanjivanju sadrži mutacije rupica i rupa i jednu ili više mutacija za poboljšanje poluvremena seruma.

[0101] U nekim otelotvorenjima, CH1, CH2, CH3i CLovde opisanih trispecifičnih vezujućih proteina mogu sadržati bilo koju od CH1, CH2, CH3i CLsekvenci vezujućih proteina 1-53. Nukleinske kiseline

[0102] Standardne metodologije rekombinantne DNK se koriste za konstrukciju polinukleotida koji kodiraju polipeptide koji formiraju vezujuće proteine, ugrađuju ove polinukleotide u rekombinantne ekspresione vektore i uvode takve vektore u ćelije domaćine. Videti npr., Sambrook i dr., 2001, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd ed.). Enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja mogu se izvesti prema specifikacijama proizvođača, uobičajeno postignutim u tehnici, ili kako je ovde opisano. Ako nisu date posebne definicije, nomenklatura korišćena u vezi sa i laboratorijskim procedurama i tehnikama analitičke hemije, sintetičke organske hemije i lekarske i farmaceutske hemije opisane ovde su one koje su dobro poznate i uobičajeno se koriste u nauci. Slično, konvencionalne tehnike se mogu koristiti za hemijske sinteze, hemijske analize, farmaceutske preparate, formulacije, isporuku i lečenje pacijenata.

[0103] Ostali aspekti predmetnog obelodanjivanja odnose se na izolovane molekule nukleinske kiseline koji sadrže nukleotidnu sekvencu koja kodira bilo koji od vezujućih proteina koji su ovde opisani. U nekim otelotvorenjima, izolovana nukleinska kiselina je operativno povezana sa heterolognim promotorom radi direktne transkripcije sekvence nukleinske kiseline koja kodira vezujući protein. Promoter se može odnositi na sekvence kontrole nukleinske kiseline koje usmeravaju transkripciju nukleinske kiseline. Prva sekvenca nukleinske kiseline je operativno povezana sa drugom sekvencom nukleinske kiseline kada je prva sekvenca nukleinske kiseline stavljena u funkcionalni odnos sa drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, promoter je operativno vezan za kodirajuću sekvencu vezujućeg proteina ako promoter utiče na transkripciju ili ekspresiju kodirajuće sekvence. Primeri promotera mogu uključivati, ali nisu ograničeni na, promotere dobijene iz genoma virusa (poput polioma virusa, virusa peradi, adenovirusa (kao što je adenovirus 2), goveđi papiloma virus, virus ptičjeg sarkoma, citomegalovirus, retrovirus, hepatitis -B virus, Simian Virus 40 (SV40) i slično), od heterolognih eukariotskih promotera (kao što je promoter aktina, promotor imunoglobulina, od promotora toplotnog šoka i slično), CAG-promotora (Niwa i dr., Gene 108(2):193-9, 1991), promotor fosfoglicerat kinaze (PGK), promotor indukovan tetraciklinom (Masui i dr., Nucleic Acids Res.33: e43, 2005), lac sistem, trp sistem, tac sistem, trc sistem, glavni operativni i promotorski regioni fag lambda, promoter 3-fosfoglicerat kinaze, promotori kvasne kisele fosfataze i promotor faktora parenja kvasca. Polinukleotidi koji kodiraju vezujuće proteine predmetnog obelodanjivanja mogu biti pod kontrolom konstitutivnog promotora, inducibilnog promotera ili bilo kog drugog pogodnog promotora opisanog u ovom tekstu ili drugog pogodnog promotora koji će lako prepoznati stručnjak u ovoj oblasti.

[0104] U nekim otelotvorenjima, izolovana nukleinska kiselina je inkorporirana u vektor. U nekim otelotvorenjima, vektor je ekspresioni vektor. Ekspresioni vektori mogu uključivati jednu ili više regulatornih sekvenci koje su operativno povezane sa polinukleotidom koji treba eksprimirati. Termin "regulatorna sekvenca" uključuje promotere, pojačivače i druge elemente za kontrolu ekspresije (npr., signale poliadenilacije). Primeri pogodnih pojačivača mogu uključivati, ali nisu ograničeni na, sekvence pojačivača iz gena sisara (kao što su globin, elastaza, albumin, α-fetoprotein, insulin i slično), i sekvence pojačivača iz virusa eukariotskih ćelija (kao što je pojačivač SV40 na kasnoj strani izvora replikacije (bp 100-270), pojačivač ranog promotera citomegalovirusa, pojačivač polioma na kasnoj strani izvora replikacije, pojačivači adenovirusa i slično). Primeri pogodnih vektora mogu uključivati, na primer, plazmide, kozmide, epizome, transpozone i virusne vektore (npr., adenovirusni, virus vakcinije, virus Sindbis, ospice, virus herpesa, lentivirusni, retrovirusni, adeno-povezani virusni vektori itd.). Ekspresioni vektori se mogu koristiti za transfekciju ćelija domaćina, kao što su, na primer, ćelije bakterija, ćelije kvasca, ćelije insekata i ćelije sisara. Biološki funkcionalni virusni i plazmidni DNK vektori sposobni za ekspresiju i replikaciju u domaćinu poznati su u tehnici i mogu se koristiti za transfekciju bilo koje ćelije od interesa.

[0105] Ostali aspekti predmetnog obelodanjivanja odnose se na vektorski sistem koji sadrži jedan ili više vektora koji kodiraju prvi, drugi, treći i četvrti polipeptidni lanac bilo kog od ovde opisanih vezujućih proteina. U nekim otelotvorenjima, vektorski sistem sadrži prvi vektor koji kodira prvi polipeptidni lanac vezujućeg proteina, drugi vektor koji kodira drugi polipeptidni lanac vezujućeg proteina, treći vektor koji kodira treći polipeptidni lanac vezujućeg proteina i četvrti vektor kodirajući četvrti polipeptidni lanac vezujućeg proteina. U nekim otelotvorenjima, vektorski sistem sadrži prvi vektor koji kodira prvi i drugi polipeptidni lanac vezujućeg proteina, i drugi vektor koji kodira treći i četvrti polipeptidni lanac vezujućeg proteina. U nekim otelotvorenjima, vektorski sistem sadrži prvi vektor koji kodira prvi i treći polipeptidni lanac vezujućeg proteina, i drugi vektor koji kodira drugi i četvrti polipeptidni lanac vezujućeg proteina. U nekim otelotvorenjima, vektorski sistem sadrži prvi vektor koji kodira prvi i četvrti polipeptidni lanac vezujućeg proteina, i drugi vektor koji kodira drugi i treći polipeptidni lanac vezujućeg proteina. U nekim otelotvorenjima, vektorski sistem sadrži prvi vektor koji kodira prvi, drugi, treći i četvrti polipeptidni lanac vezujućeg proteina. Jedan ili više vektora vektorskog sistema mogu biti bilo koji od ovde opisanih vektora. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više vektora su

2

ekspresioni vektori.

Ćelije domaćini

[0106] Drugi aspekti predmetnog obelodanjivanja se odnose na ćeliju domaćina (npr., izolovanu ćeliju domaćina) koja sadrži jedan ili više izolovanih polinukleotida, vektora i/ili vektorskih sistema koji su ovde opisani. U nekim otelotvorenjima, izolovana ćelija domaćin prema predmetnom obelodanjivanju je kultivisana in vitro. U nekim otelotvorenjima, ćelija domaćin je bakterijska ćelija (npr., ćelija E. coli). U nekim otelotvorenjima, ćelija domaćin je ćelija kvasca (npr. ćelija S. cerevisiae). Ćelija domaćin može biti ćelija insekta. Primeri ćelija domaćina insekata mogu uključivati, na primer, ćelije Drosophila (npr., S2 ćelije), ćelije Trichoplusia ni (npr., Ćelije High Five™) i ćelije Spodoptera frugiperda (npr., ćelije Sf21 ili Sf9). Ćelija domaćin može biti ćelija sisara. Primeri ćelija domaćina sisara mogu uključivati, na primer, ćelije bubrega humanog embriona (npr., 293 ili 293 ćelije subklonirane za rast u kulturi suspenzije), ćelije Expi293 ™, ćelije CHO, ćelije bubrega beba hrčka (npr., BHK, ATCC CCL 10) , ćelije miša sertoli (npr., ćelije TM4), ćelije bubrega majmuna (npr., CV1 ATCC CCL 70), ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (npr. VERO-76, ATCC CRL-1587), ćelije karcinoma grlića materice čoveka (npr. HELA, ATCC CCL 2), ćelije bubrega pasa (npr. MDCK, ATCC CCL 34), ćelije jetre bivolja pacova (npr., BRL 3A, ATCC CRL 1442), ćelije pluća čoveka (npr. W138, ATCC CCL 75), ćelije jetre čoveka (npr. Hep G2, HB 8065), tumorske ćelije dojke miša (npr., MMT 060562, ATCC CCL51), TRI ćelije, MRC 5 ćelije, FS4 ćelije, linija humanog hepatoma (npr., Hep G2) i ćelije mijeloma (npr., ćelije NS0 i Sp2/0).

[0107] Ostali aspekti predmetnog obelodanjivanja se odnose na postupak proizvodnje bilo kog od ovde opisanih vezujućih proteina. U nekim otelotvorenjima, postupak uključuje a) kultivisanje ćelije domaćina (npr., bilo koje od ćelija domaćina opisanih ovde) koje sadrže izolovanu nukleinsku kiselinu, vektorski i/ili vektorski sistem (npr., bilo koju od izolovanih nukleinskih kiselina, vektora i /ili vektorski sistemi opisani ovde) pod takvim uslovima da ćelija domaćin eksprimira vezujući protein; i b) izolovanje vezivnog proteina iz ćelije domaćina. Postupci uzgoja ćelija domaćina pod uslovima za ekspresiju proteina dobro su poznati prosečnim stručnjacima u ovoj oblasti. Postupci izolovanja proteina iz kultivisanih ćelija domaćina su dobro poznati prosečnom stručnjaku u ovoj oblasti tehnike, uključujući, na primer, afinitetnom hromatografijom (npr., dvostepenu afinitetnu hromatografiju koja uključuje afinitetnu hromatografiju proteina A, nakon čega sledi hromatografija sa isključenom veličinom).

Upotreba za vezujuće proteine

[0108] Vezujući proteini se mogu koristiti u bilo kom poznatom postupku ispitivanja, kao što su testovi konkurentnog vezivanja, direktni i indirektni sendvič testovi i imunoprecipitacioni testovi za detekciju i kvantifikaciju jednog ili više ciljnih antigena. Vezujući proteini će vezati jedan ili više ciljnih antigena sa afinitetom koji je odgovarajući za postupak analize koja se koristi.

[0109] Za dijagnostičke primene, u nekim realizacijama, proteini koji se vezuju mogu biti obeleženi detektovanjem. Detektovani deo može biti bilo koji je sposoban da proizvede, direktno ili indirektno, detektujući signal. Na primer, detektovani deo može biti radioizotop, kao što su<3>H,<14>C,<32>P,<35>S,<125>I,<99>Tc,<111>In, ili<67>Ga; fluorescentno ili hemiluminiscentno jedinjenje, kao što je fluorescein izotiocijanat, rodamin ili luciferin; ili enzim, kao što je alkalna fosfataza, β-galaktozidaza ili peroksidaza od hrena.

2

[0110] Vezujući proteini su takođe korisni za in vivo snimanje. Vezujući protein obeležen otkrivenim delom može se primeniti na životinju, na primer, u krvotok, a prisustvo i mesto obeleženog antitela u domaćinu se ispitaju. Vezujući protein se može označiti bilo kojim delom koji se može detektovati kod životinje, bilo nuklearnom magnetnom rezonancom, radiologijom ili nekim drugim načinom detekcije poznatim u tehnici.

[0111] Obelodanjivanje se takođe odnosi na komplet koji sadrži vezujući protein i druge reagense korisne za otkrivanje ciljnih nivoa antigena u biološkim uzorcima. Takvi reagensi mogu uključivati oznaku koja se može otkriti, serum za blokiranje, uzorke pozitivne i negativne kontrole i reagense za detekciju. U nekim otelotvorenjima, komplet sadrži sastav koji sadrži bilo koji vezujući protein, polinukleotid, vektor, vektorski sistem i/ili ćeliju domaćina koji su ovde opisani. U nekim otelotvorenjima, komplet sadrži ambalažu i etiketu ili umetak (umetke) pakovanja na ili povezan sa kontejnerom. Pogodne ambalaže uključuju, na primer, boce, bočice, špriceve, vrećice sa IV rastvorom, itd. ambalaže mogu da se formiraju od različitih materijala kao što su staklo ili plastika. Ambalaža sadrži smešu koja je sama po sebi ili kombinovana sa drugim sastavom efikasnim za lečenje, sprečavanje i / ili dijagnostikovanje npr., stanja (HIV infekcije) poremećaja i može imati sterilni pristupni otvor (na primer, kontejner može biti vrećica za intravenski rastvor ili bočica sa čepom koji se može probiti pomoću igle za injektiranje). U nekim otelotvorenjima, oznaka ili umetak na pakovanju označavaju da se kompozicija koristi za sprečavanje, dijagnostikovanje i/ili lečenje stanja po izboru. Alternativno, ili dodatno, proizvodni proizvod ili oprema može dalje sadržavati drugi (ili treći) kontejner koji sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fiziološki puferni fosfatni rastvor, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Takođe može da obuhvata i druge materijale poželjne sa komercijalnog i korisničkog stanovišta, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.

[0112] Terapeutski ili farmaceutski sastavi koji sadrže vezujuće proteine su u okviru obelodanjivanja. Takvi terapeutski ili farmaceutski sastavi mogu da sadrže terapeutski efikasnu količinu vezujućeg proteina, ili konjugata vezujućeg proteina-leka, u mešavini sa farmaceutski ili fiziološki prihvatljivim sredstvom za formulaciju koji je odabran za prikladnost sa načinom davanja.

[0113] Prihvatljivi materijali za formulaciju nisu toksični za primaoce u upotrebljenim dozama i koncentracijama.

[0114] Farmaceutski sastav može da sadrži materijale za formulaciju za modifikovanje, održavanje ili očuvanje, na primer, pH, osmolarnosti, viskoziteta, bistrine, boje, izotoničnosti, mirisa, sterilnosti, stabilnosti, brzine rastvaranja ili otpuštanja, adsorpcije ili penetracije sastava. Pogodni materijali za formulaciju uključuju, ali nisu ograničeni na, aminokiseline (kao što su glicin, glutamin, asparagin, arginin ili lizin), antimikrobna sredstva, antioksidanse (kao što su askorbinska kiselina, natrijum sulfit ili natrijum vodonik-sulfit), pufere (npr. kao borat, bikarbonat, Tris-HCl, citrati, fosfati ili druge organske kiseline), agenti za povećanje mase (poput manitola ili glicina), helatni agensi (kao što je etilendiamin tetrasirćetna kiselina (EDTA)), agensi za kompleksiranje (kao što su kofein, polivinilpirolidon (beta-ciklodekstrin ili hidroksipropil-beta-ciklodekstrin), punila, monosaharidi, disaharidi i drugi ugljeni hidrati (kao što su glukoza, manoza ili dekstrini), proteini (poput serumskog albumina, želatina ili imunoglobulina), boje, arome i sredstva za razređivanje, emulgatori, hidrofilni polimeri (kao što je polivinilpirolidon), polipeptidi niske molekulske mase, kontra joni koji stvaraju so (poput natrijuma), konzervansi (kao što su benzalkonijum hlorid, benzoeva kiselina, salicilna kiselina, timerosal, fenetil alkohol, metilparaben, propilparaben, hlorheksidin, sorbinska

2

kiselina ili vodonik -peroksid), rastvarači (kao što su glicerin, propilen glikol ili polietilen glikol), šećerni alkoholi (kao što su manitol ili sorbitol), sredstva za suspendovanje, tenzidi ili sredstva za vlaženje (kao što su pluronika; PEG; sorbitan estri; polisorbati kao što je polisorbat 20 ili polisorbat 80; triton; trometamin; lecitin; holesterol ili tiloksapal), sredstva za poboljšanje stabilnosti (kao što su saharoza ili sorbitol), sredstva za povećanje toničnosti (kao što su halogenidi alkalnih metala - npr., natrijum ili kalijum hlorid - ili manitol sorbitol), nosači za razređivanje, pomoćne supstance i/ili farmaceutski dodaci (videti, npr., REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (18. izdanje, AR Gennaro, ur., Mack Publishing Compani 1990) i naredna izdanja istih.

[0115] Optimalni farmaceutski sastav će odrediti stručnjak u zavisnosti od, na primer, nameravanog puta primene, formata isporuke i željene doze. Takve sastave mogu uticati na fizičko stanje, stabilnost, brzinu in vivo oslobađanja i brzinu in vivo klirensa vezivnog proteina.

[0116] Primarno sredstvo za prenošenje ili nosač u farmaceutskom sastavu može biti vodene ili nevodene prirode. Na primer, pogodan nosač ili nosač može biti voda za injektiranje, fiziološki rastvor ili veštačka cerebrospinalna tečnost, možda dopunjena drugim materijalima uobičajenim u sastavima za parenteralno davanje. Neutralni fiziološki rastvor ili fiziološka otopina pomešani sa albuminom u serumu su još primer uzorka. Drugi primeri farmaceutskih sastava sadrže Tris pufer od oko pH 7,0-8,5 ili acetatni pufer od oko pH 4,0-5,5, koji dalje može uključivati sorbitol ili odgovarajuću zamenu. U jednom aspektu obelodanjivanja, proteinski sastavi koji se vezuju mogu se pripremiti za skladištenje mešanjem izabranog sastava sa željenim stepenom čistoće sa opcionim sredstvima za formulaciju u obliku liofilizovane pogače ili vodenog rastvora. Dalje, vezujući protein se može formulisati kao liofilizat koristeći odgovarajuće ekscipijense kao što je saharoza.

[0117] Farmaceutski sastavi iz predmetnog obelodanjivanja mogu se izabrati za parenteralnu primenu ili potkožno. Alternativno, sastavi se mogu odabrati za inhalaciju ili za isporuku kroz digestivni trakt, kao što je oralno. Priprema takvih farmaceutski prihvatljivih sastava je u okviru veštine tehnike.

[0118] Komponente formulacije su prisutne u koncentracijama koje su prihvatljive za mesto davanja. Na primer, puferi se koriste za održavanje sastava na fiziološkom pH ili na nešto nižem pH, tipično u opsegu pH od oko 5 do oko 8.

[0119] Kada se razmišlja o parenteralnoj primeni, terapeutski preparati za upotrebu mogu biti u obliku parenteralno prihvatljivog vodenog rastvora bez pirogena koji sadrži željeni vezujući protein u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Naročito pogodno sredstvo za parenteralno ubrizgavanje je sterilna destilovana voda u kojoj je vezujući protein formulisan kao sterilni, izotonični rastvor, pravilno očuvan. Još jedan preparat može uključivati formulaciju željenog molekula sa sredstvom, kao što su injekcione mikrosfere, bio-erodirajuće čestice, polimerna jedinjenja (kao što su polilaktična kiselina ili poliglikolna kiselina), kuglice ili lipozomi, koji obezbeđuju kontrolisano ili produženo oslobađanje proizvoda koji se zatim može isporučiti putem depo injekcije. Takođe se može koristiti hijaluronska kiselina, a to može uticati na produženje trajanja u cirkulaciji. Drugi pogodni načini za uvođenje željenog molekula su implantabilni uređaji za isporuku leka.

[0120] U jednom otelotvorenju, farmaceutski sastav se može formulisati za inhalaciju. Na primer, vezujući protein može biti formulisan kao suvi prah za inhalaciju. Rastvori za

2

inhalaciju vezujućih proteina se takođe mogu formulisati sa pogonskim gorivom za isporuku aerosola. U još jednom otelotvorenju, rastvori se mogu raspršiti.

[0121] Takođe se razmatra da se određene formulacije mogu davati oralno. U jednom otelotvorenju obelodanjivanja, vezujući proteini koji se primenjuju na ovaj način mogu se formulisati sa ili bez onih nosača koji se uobičajeno koriste u sastavljanju čvrstih oblika doziranja kao što su tablete i kapsule. Na primer, kapsula može biti dizajnirana da oslobađa aktivni deo formulacije na mestu u gastrointestinalnom traktu gde je bioraspoloživost povećana, a pred-sistemska degradacija smanjena. Mogu se uključiti dodatna sredstva koja olakšavaju apsorpciju vezujućeg proteina. Takođe se mogu koristiti razblaživači, arome, voskovi sa niskom tačkom topljenja, biljna ulja, maziva, sredstva za suspendovanje, sredstva za raspadanje tableta i veziva.

[0122] Drugi farmaceutski sastav može uključivati efikasnu količinu proteina za vezivanje u smeši sa netoksičnim ekscipijensima koji su pogodni za proizvodnju tableta. Rastvaranjem tableta u sterilnoj vodi ili drugom odgovarajućem nosaču, rastvori se mogu pripremiti u obliku jedinične doze. Pogodni ekscipijensi uključuju, ali nisu ograničeni na, inertne razblaživače, kao što su kalcijum karbonat, natrijum karbonat ili bikarbonat, laktoza ili kalcijum fosfat; ili vezujuća sredstva, kao što su skrob, želatin ili bagrem; ili sredstva za podmazivanje kao što su magnezijum stearat, stearinska kiselina ili talk.

[0123] Dodatni farmaceutski sastavi iz predmetnog obelodanjivanja biće očigledni stručnjacima u ovoj oblasti, uključujući formulacije koje uključuju vezujuće proteine u formulacijama sa produženom ili kontrolisanom isporukom. Tehnike za formulisanje niza drugih sredstava za kontinuiranu ili kontrolisanu isporuku, kao što su nosači lipozoma, bioerodibilne mikročestice ili porozne perle i depo injekcije, takođe su poznate stručnjacima u ovoj oblasti. Dodatni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju polupropusne polimerne matrice u obliku oblikovanih predmeta, npr. filmovi ili mikrokapsule. Matrice sa produženim oslobađanjem mogu uključivati poliestere, hidrogelove, polilaktide, kopolimere L-glutaminske kiseline i gama etil-L-glutamata, poli(2-hidroksietil-metakrilat), etilen vinil acetat ili poli-D(-)-3-hidroksimaslačnu kiselinu. Sastavi sa odloženim oslobađanjem mogu takođe da uključuju lipozome koji se mogu dobiti bilo kojim od nekoliko postupaka poznatih u struci.

[0124] Farmaceutski sastavi koji se koriste za in vivo primenu obično moraju biti sterilni. Ovo se može postići filtracijom kroz sterilne membrane za filtriranje. Gde je sastav liofilizovan, sterilizacija pomoću ovog postupka može se sprovesti pre ili posle liofilizacije i rekonstitucije. Sastavi za parenteralno davanje mogu se čuvati u liofilizovanom obliku ili u rastvoru. Dodatno, parenteralni sastavi se generalno stavljaju u ambalažu koja ima sterilni otvor za pristup, na primer, vreću za intravenski rastvor ili bočicu koja ima čep koji se može probosti iglom za hipodermijsku injekciju.

[0125] Jednom kada je farmaceutski sastav formulisan, može se čuvati u sterilnim bočicama kao rastvor, suspenzija, gel, emulzija, čvrsta supstanca ili kao dehidrirani ili liofilizovani prah. Takve formulacije se mogu skladištiti ili u obliku spremnom za upotrebu ili u obliku (npr., liofilizovanom) koji zahteva rekonstituciju pre primene.

[0126] Obelodanjivanje takođe obuhvata komplete za proizvodnju jedinice za jednokratno davanje. Svaka od ovih garnitura može sadržati i prvu posudu koja ima osušeni protein i drugu posudu koja ima vodenu formulaciju. U opseg predmetnog obelodanjivanja su takođe

2

uključeni kompleti koji sadrže jedno napunjene i višekomorne napunjene špriceve (npr., špriceve za tečnost i lio-špriceve).

[0127] Efikasna količina vezivnog proteinskog farmaceutskog sastava koji će se koristiti terapeutski zavisiće, na primer, od terapijskog konteksta i ciljeva. Stručnjak u ovoj oblasti shvatiće da će odgovarajući nivoi doziranja za lečenje stoga varirati u zavisnosti, delimično, od isporučenog molekula, indikacije za koju se koristi vezujući protein, načina davanja i veličine (telesne težine), telesna površina ili veličina organa) i stanje (starost i opšte zdravstveno stanje) pacijenta. U skladu sa time, kliničar može titrirati doziranje i modifikovati način davanja kako bi postigao optimalni terapeutski efekat.

[0128] Učestalost doziranja zavisiće od farmakokinetičkih parametara vezivnog proteina u formulaciji koja se koristi. Tipično, kliničar će davati sastav sve dok se ne postigne doza koja postiže željeni efekat. Sastav se stoga može primenjivati kao pojedinačna doza, kao dve ili više doza (koje mogu ili ne moraju sadržati istu količinu željenog molekula) tokom vremena, ili kao kontinuirana infuzija preko implantacionog uređaja ili katetera. Dalje usavršavanje odgovarajuće doze rutinski obavljaju stručnjaci u oblasti tehnike i to je u okviru zadataka koje oni rutinski obavljaju. Odgovarajuće doze se mogu utvrditi korišćenjem odgovarajućih podataka o dozi i odgovoru.

[0129] Način davanja farmaceutskog sastava je u skladu sa poznatim postupcima, na primer, oralno; injekcijom intravenoznim, intraperitonealnim, intracerebralnim (intraparenhimskim), intracerebroventrikularnim, intramuskularnim, intraokularnim, intraarterijskim, intraportalnim ili intralesionalnim putem; sistemima za produženo oslobađanje; ili pomoću implantacionih uređaja. Po želji, sastavi se mogu davati bolus injekcijom ili kontinuirano infuzijom ili implantacionim uređajem.

[0130] Sastav se takođe može primeniti lokalno implantacijom membrane, sunđera ili drugog odgovarajućeg materijala na koji je željeni molekul apsorbovan ili inkapsuliran. Tamo gde se koristi uređaj za implantaciju, uređaj se može implantirati u bilo koje pogodno tkivo ili organ, a isporuka željenog molekula može biti putem difuzije, bolusa sa vremenskim otpuštanjem ili kontinuirane primene.

[0131] Farmaceutski sastavi se mogu koristiti za sprečavanje i/ili lečenje HIV infekcije.

Farmaceutski sastavi mogu se koristiti kao samostalna terapija ili u kombinaciji sa standardnom anti-retrovirusnom terapijom.

[0132] U nekim otelotvorenjima, predmetno obelodanjivanje se odnosi na vezujući protein predmetnog pronalaska za upotrebu u postupku sprečavanja i/ili lečenja HIV infekcije kod pacijenata. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein za upotrebu prema predmetnom pronalasku obuhvata davanje pacijentu terapijski efikasne količine najmanje jednog od ovde opisanih vezujućih proteina. U nekim otelotvorenjima, najmanje jedan vezujući protein se primenjuje u kombinaciji sa anti-retrovirusnom terapijom (npr., anti-HIV terapija). U nekim otelotvorenjima, najmanje jedan vezujući protein se primenjuje pre anti-retrovirusne terapije. U nekim otelotvorenjima, najmanje jedan vezujući protein se primenjuje istovremeno sa antiretrovirusnom terapijom. U nekim otelotvorenjima, najmanje jedan vezujući protein se primenjuje nakon anti-retrovirusne terapije. U nekim otelotvorenjima, najmanje jedan vezujući protein se daje zajedno sa bilo kojom standardnom anti-retrovirusnom terapijom poznatoj u tehnici. U nekim otelotvorenjima, davanje najmanje jednog vezujućeg proteina dovodi do neutralizacije jednog ili više HIV viriona. U nekim otelotvorenjima, davanje najmanje jednog vezujućeg proteina dovodi do uklanjanja jedne ili više latentno i/ili hronično HIV-inficiranih ćelija kod pacijenta. U nekim otelotvorenjima, primena najmanje jednog vezujućeg proteina dovodi do neutralizacije jednog ili više HIV viriona i dovodi do eliminacije jedne ili više latentno i/ili hronično HIV-inficiranih ćelija kod pacijenta. U nekim otelotvorenjima, ispitanik je čovek.

PRIMERI

[0133] Primeri koji slede ilustruju specifična otelotvorenja obelodanjivanja i njihove različite upotrebe.

Primer 1: proizvodnja trispecifičnih vezujućih proteina koji ciljaju na HIV-1 Env glikoprotein.

[0134] Glikoprotein ovojnice HIV-1 (Env/gp160) nalazi se na površini čestice virusa i sastoji se od homo-trimera koji se sastoji od tri nekovalentno povezana transmembranska kompleksa gp41 i gp120. Env omogućava ulazak virusa u ciljne ćelije vezivanjem gp120 za glavni receptor HIV (CD4) i ko-receptor (CCR5 ili CXCR4), nakon čega sledi indukcija fuzije virusne/ćelijske membrane olakšana konformacionim promenama u gp41, što rezultira ulaskom virusni kapsid i isporuka virusnog genoma u ćeliju domaćina. Dodatno, Env se eksprimira na površini inficiranih ćelija.

[0135] Env deluje kao jedina meta za neutralisanje antitela na HIV-1 virion. Vezivanje neutralizujućih antitela na virusni Env inhibira vezivanje/ulazak virusa. Štaviše, vezivanje neutralizujućih antitela za HIV-1 inficirane ćelije koje eksprimiraju Env dovodi do njihovog uništenja citotoksičnošću zavisnom od ćelija zavisnom od ćelija (ADCC) i komplementarno zavisnom citotoksičnošću (CDC), što rezultira smanjenjem latentnog virusnog rezervoara. Stoga su neutralizirajuća antitela koja ciljaju na Env privlačno područje za razvoj antivirusne terapije. Međutim, zbog velike raznolikosti sekvenci i stope mutacije virusa HIV-1, razvoj neutralizirajućih antitela koja ciljaju na Env pokazao se izazovnim zbog velike verovatnoće da određenom soju HIV-1 nedostaje epitop bilo kojeg neutralizirajućeg antitela, ili soj je razvio mutaciju da postane otporan na antitela. Moraju se razviti strategije za ublažavanje prodora virusnih sojeva pri razvoju novih neutralizirajućih antitela usmerenih na HIV-1. Ovde opisana ispitivanja istražuju razvoj novih trispecifičnih vezujućih proteina koji sadrže četiri polipeptida koji formiraju tri mesta za vezivanje antigena koji specifično vezuju tri različita epitopa na HIV Env glikoprotein, i upotrebu ovih novih trispecifičnih vezujućih proteina u neutralisanju HIV-1.

Postupci

Povezivanje proizvodnje i prečišćavanje proteina

[0136] Vektori koji eksprimiraju trispecifične vezujuće proteine konstruisani su umetanjem projektovanih gena teškog i lakog lanca u ekspresijski vektor sisara. Odgovarajuće uparivanje teških i lakih lanaca dogodilo se spontano, a formiranje heterodimera je promovisano mutacijama Čvor-u-Rupi projektovanim u Fc regionu.

[0137] Vezujući proteini su proizvedeni u ćelijama Expi293 kotransfekcijom četiri ekspresiona plazmida (Life Technologies, Expi293 ™ Ekpression Sistem Kit, Kat. br.

A14635). Vezući proteini su prečišćeni pomoću šeme prečišćavanja u dva koraka. Prvo su vezujući proteini uhvaćeni na afinitetnoj hromatografskoj smoli za protein A, isprani, a zatim eluirani u glicinu na pH 3,0. Eluirani proteini su zatim dijalizovani u PBS, koncentrovani i filtrirani. Filtrirana antitela su dalje prečišćena korišćenjem Superdex 200 SEC kolone da bi

1

se dobili monomerni proteini koji se vezuju.

Merenje afiniteta vezujućih proteina

[0138] Afiniteti vezivanja anti-HIV trispecifičnih vezujućih proteina mereni su površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) pomoću instrumenta Biacore3000 (GE Healthcare).

Korišćen pufer za ispitivanje bio je HBS-EP (GE Healthcare).

[0139] Afinitet navedenih proteina za mesto vezivanja MPER na HIV-1 proteinu gp41 meren je analizom površinske plazmonske rezonance (SPR) pomoću Biacore instrumenta na sledeći način: vezujući proteini su prvo uhvaćeni na CM5 čipu spregnutom sa anti-humanim Fc antitelom, nakon čega je usledio protok kroz različite koncentracije (100 nM-6,25 nM) MPER vezujućeg peptida (Acetil-RRRNEQELLELDKWASLWNWFDITNWLWYIRRR-Ttds-Lys- (Biotin)-NH2) (SEQ ID NO: 284) pri 30 µL u minuti, a vezivanje je detektovano merenjem asocijacije 240 sekundi i disocijacije 300 sekundi na Biacore 3000 na 25°C. HBS-EP pufer je korišćen za razblaživanje uzoraka, kao i pufer za pokretanje. Regeneracija čipa je izvršena sa 3 M MgCl2pri 30 µL u minuti. Za analizu podataka korišćen je softver BIAevaluation v.4.1 (GE Healthcare). Podaci su globalno usklađeni korišćenjem Langmuirovog modela 1:1 sa prenosom mase. Nakon prilagođavanja krive zasnovane na softveru, reakcije ON i OFF pri svakoj koncentraciji MPER vezujućeg peptida su izračunate i korišćene za dobijanje afiniteta za vezivanje za svaki vezujući protein.

[0140] Afinitet navedenih proteina za mesto vezivanja CD4BS na HIV-1 proteinu gp120 meren je SPR-om na sledeći način: rekombinantni protein HIV-1 gp120 (Thr27-Arg498) (HIV-1/klasa B /C (CN54), ARCO Biosystems (kat. # GP4 -V15227)) je uhvaćen na CM5 čipu, nakon čega je usledio protok kroz različite koncentracije (100 nM - 6,25 nM) vezujućih proteina, a vezivanje je otkriveno merenjem asocijacije tokom 240 sekundi, a disocijacija 300 sekundi na a Biacore 3000 na 25°C. HBS-EP pufer je korišćen za razblaživanje uzoraka, kao i pufer za pokretanje. Regeneracija čipa je izvršena sa 3 M MgCl2pri 30 µL u minuti. Za analizu podataka korišćen je softver BIAevaluation v.4.1 (GE Healthcare). Podaci su globalno usklađeni korišćenjem Langmuirovog modela 1:1 sa prenosom mase. Nakon prilagođavanja krive zasnovane na softveru, reakcije ON i OFF pri svakoj koncentraciji Vezujućeg proteina su izračunate i korišćene za dobijanje afiniteta za vezivanje za svaki vezujući protein.

Testovi konformacione stabilnosti i agregacije

[0141] Konformaciona stabilnost trispecifičnih vezujućih proteina je procenjena određivanjem tačke topljenja Tmi temperature početka agregacije (Tagg).

[0142] Merenja tačke topljenja Tm izvedena su diferencijalnom skenirajućom fluorimetrijom (DSF). Uzorci su razblaženi u D-PBS puferu (Invitrogen) do krajnje koncentracije od 0,2 µg/µL uključujući 4X rastvor koncentracije SIPRO-Narandžaste boje (Invitrogen, 5000X zaliha u DMSO) u D-PBS-u u beloj ploči sa polu-skutima sa 96 udubljenja (BIORAD). Sva merenja su obavljena u dva primerka pomoću MyiQ2 PCR instrumenta u realnom vremenu (BIORAD). Negativne krive prve derivacije (-d(RFU)/dT) kriva topljenja generisane su u softveru iQ5 v2.1 (BIORAD). Podaci su zatim izvezeni u programu Excel radi određivanja Tmi grafičkog prikaza.

[0143] Tačka topljenja Tmi početna temperatura agregacije (Tagg) takođe su mereni statičkim rasejavanjem svetlosti (SLS) pomoću Unit instrumenta (Unchained Labs).9 µL svakog uzorka natovareno je nerazređeno u niz sa više kaveza. Uzorci su zatim zagrevani od 20°C do

2

95°C pri brzini zagrevanja od 0,3°C/minuti. Baricentrična sredina (BCM) triptofanovih fluorescentnih spektara korišćena je za merenje krive topljenja proteina i određivanje vrednosti Tm.266 nm signal statičkog rasejanja svetlosti (SLS) korišćen je za merenje krive agregacije i određivanje Tagg. Analiza podataka izvedena je pomoću softvera Unit analisis v2.1.

Rezultati

[0144] Razvijena je nova strategija za poboljšanje efikasnosti neutraliziranja antitela protiv HIV-1, istovremeno ograničavajući verovatnoću prodora virusa zbog velike raznolikosti sekvenci i/ili virusne mutacije. Ova strategija je uključivala stvaranje trispecifičnih vezujućih proteina koji sadrže četiri polipeptida koji su formirali tri mesta za vezivanje antigena koji specifično vezuju tri različita epitopa na HIV Env glikoprotein (Sl.1). Svako mesto za vezivanje antigena sadržavalo je VHi VLdomen iz različitog antitela za neutralisanje HIV-1 koje je ciljalo različit epitop na Env glikoprotein. Trispecifični vezujući proteini sadržali su prvi par polipeptida koji su posedovali dvostruko promenljive domene sa unakrsnom orijentacijom formirajući dva različita mesta za vezivanje antigena (nazvana CODV Ig format), i drugi par polipeptida, svaki sa jednim varijabilnim domenom koji je formirao treće mesto vezivanja antigena (Sl.1A i 1B).

[0145] Prvi par polipeptida (koji je posedovao dvostruko promenljive domene) sastojao se od prvog polipeptida sa strukturom konstantnog domena lakog lanca VL2-Veznik-VL1-Veznik-Imunoglobulin, i drugog polipeptida sa strukturom VH1-Veznik-VH2-Veznik-imunoglobulin CH1, šarke, CH2i CH3konstantni domeni teškog lanca, što je rezultiralo parom polipeptida koji su imali ukrštenu orijentaciju i formirali dva različita mesta za vezivanje antigena: VH1-VL1i VH2-VL2(Sl.1C i 1D, pogledajte lake i teške lance B). Drugi par polipeptida (od kojih je svaki imao jedan promenljivi domen) sastojao se od prvog polipeptida sa strukturom VH3-imunoglobulina CH1, šarki, CH2i CH3konstantnih domena teškog lanca, i drugog polipeptida sa strukturom VL3-konstante lakog imunoglobulina domena, što je rezultiralo parom polipetpida koji su formirali treće mesto za vezivanje antigena: VH3-VL3(Sl.1C i 1D, vidi lake i teške lance A). Osim toga, trispecifični vezujući proteini su konstruisani tako da uključuju mutaciju LS. Nadalje, trispecifični vezujući proteini su konstruisani tako da unutar jednog vezujućeg proteina jedan CH3domen uključuje mutaciju čvora, a drugi CH3domen uključuje mutaciju rupe kako bi se olakšala heterodimerizacija teških lanaca (Sl.1).

[0146] Korišćenjem iznad opisanog pristupa za dizajn trovalentnog vezujućeg proteina, generisana su tri trispecifična vezujuća proteina (vezujući proteini 2, 3 i 24). Ovi trispecifični vezujući proteini stvoreni su kalemljenjem na okvir trispecifičnog vezujućeg proteina VHi VLdomene izolovane iz antitela koja ciljaju na tri različita epitopa na HIV-1 Env glikoproteinu: MPER Ab (cilja MPER epitop na gp41), CD4BS Ab "b" (cilja CD4 vezivno mesto na gp120), a V1/V2 usmerava Ab "a" (cilja domen V1/V2 na gp120). Vezujući protein 2 je konstruisan tako da je prvi par polipeptida (koji su formirali dva mesta za vezivanje antigena) ciljao epitope glikoproteina HIV-1 Env glikoproteina MPER i V1/V2, a drugi par polipeptida (koji su činili jedno mesto za vezivanje antigena) ciljao je epitop glikoproteina HIV-1 Env CD4BS (vezujući protein 2 = MPER x V1/V2 / CD4BS). Vezujući protein 3 je konstruisan tako da je prvi par polipeptida (koji su formirali dva mesta za vezivanje antigena) ciljao epitope glikoproteina HIV-1 Env glikoproteina V1/V2 i MPER, a drugi par polipeptida (koji su činili jedno mesto za vezivanje antigena) ciljao je epitop glikoproteina HIV-1 Env CD4BS (vezujući protein 3 = V1/V2 x MPER / CD4BS). Vezujući protein 24 je konstruisan tako da je prvi par polipeptida (koji su formirali dva mesta za vezivanje antigena) ciljao epitope glikoproteina HIV-1 Env glikoproteina V1/V2 i CD4BS, a drugi par polipeptida (koji su činili jedno mesto za vezivanje antigena) ciljao je epitop glikoproteina HIV-1 Env MPER (vezujući protein 24 = V1/V2 x CD4BS / MPER). Tri trispecifična vezujuća proteina, kao i njihova roditeljska antitela, prečišćena su preko afinitetne smole za protein A (Sl.2A i 3A) nakon čega sledi hromatografija sa isključenjem veličine (Sl.2B i 3B) za dobijanje monomernih proteina pogodnih za dalju karakterizaciju. Sva tri trispecifična vezujuća proteina bila su stabilna i stvarala su monomere na visokoj frekvenciji.

[0147] Da bi se testirao potencijal za razvoj vezujućih proteina koji ciljaju na dva različita HIV-1 Env proteinska epitopa (umesto na tri), bispecifični vezujući proteini su dizajnirani na osnovu iznad opisanog CODV Ig formata (videti WO 2012/135345), koristeći dva različita VHi VLdomene iz istih roditeljskih antitela koja se koriste za stvaranje trispecifičnih vezujućih proteina. Međutim, bispecifični vezujući proteini sa ovim specifičnim varijabilnim domenima nisu se prečistili dobro kao monomeri, pokazujući značajno povećano stvaranje agregata u poređenju sa odgovarajućim trispecifičnim vezivnim proteinima (Sl.4A i 4B).

[0148] Zatim je izmeren afinitet vezivanja pročišćenih trispecifičnih vezujućih proteina (i njihovih roditeljskih antitela) za epitope glikoproteina HIV-1 Env na gp41 i gp120. Prvo, afinitet vezivanja za gp41 je meren za tri trispecifična vezujuća proteina, kao i roditeljsko MPER antitelo, Biacore testom koristeći MPER vezujući peptid (Sl.5). Izračunato je da je afinitet vezivanja za MPER antitelo 18,7 nM. Iznenađujuće, sva tri trispecifična vezujuća proteina su imala veći afinitet za MPER vezujući peptid nego roditeljsko antitelo (Tabela 3), pri čemu vezujući protein 2 ima približno 3,1 puta veći afinitet od MPER antitela (6,05 nM naspram 18,7 nM, redom).

Tabela 3: Meren e afiniteta za MPER vezu ući e tid

[0149] Slično, afinitet vezivanja za mesto vezivanja CD4 na gp120 je izmeren za tri trispecifična vezujuća proteina, kao i za roditeljsko CD4BS antitelo, Biacore testom (Sl.6).

Sva tri trispecifična vezujuća proteina su imala sličan afinitet za mesto vezivanja za CD4 u poređenju sa roditeljskim antitelom (Tabela 4).

Tabela 4: Merenje afiniteta za CD4BS vezujuće mesto

4

[0150] Tako su trispecifični vezujući proteini bili u stanju da vežu oba testirana ciljna epitopa na HIV-1 Env glikoprotein (Tabela 5). Štaviše, sva tri trispecifična vezujuća proteina vezuju ciljne epitope sa afinitetima približno jednakim ili većim od njihovih roditeljskih antitela. Afinitet vezivanja V1/V2 usmerenih Ab "a", kao ni V1/V2 usmerenih Ab "a" vezanih mesta unutar tri trispecifična vezujuća proteina 2, 3 i 24 nije mogao da se utvrdi Biacore analizom jer je to zahtevalo specifični gp120 proteinski antigen koji nije bio dostupan.

Tabela 5: Sažetak sposobnosti vezivanja testiranih vezujućih proteina

j p

[0151] Biofizička svojstva su ispitana za trispecifične vezujuće proteine i roditeljska antitela (Tabela 6). Svi testirani proteini imali su sličnu stabilnost i ograničene sklonosti ka stvaranju agregata.

Tabela 6: Konformaciona stabilnost/agregacija vezujućih proteina

[0152] Ovi eksperimenti su pokazali da se stabilni, monomerni, trispecifični vezujući proteini koji ciljaju tri različita epitopa na HIV-1 Env glikoproteinu mogu konstruisati i efikasno prečistiti. Nadalje, trispecifični vezujući proteini zadržali su sposobnost da vezuju svoje ciljne epitope, imajući sličan ili poboljšan afinitet u odnosu na njihova roditeljska antitela.

Konačno, trispecifični vezujući proteini su imali odgovarajuća biofizička svojstva i pokazali su značajno manje agregacije od odgovarajućih bispecifičnih vezujućih proteina.

Primer 2: naznačavanje vezujućih proteina

[0153] Zbog uspeha u razvoju tri trispecifična vezujuća proteina sa odgovarajućim biofizičkim svojstvima i sposobnostima vezivanja (kao što je opisano u Primeru 1), razvijen je i testiran 21 dodatni trispecifični vezujući protein. Ovde opisani eksperimenti istraživali su sposobnost 24 trispecifična vezujuća proteina da neutrališu HIV-1 in vitro, i farmakokinetička svojstva određenog broja ovih trispecifičnih vezujućih proteina in vivo.

[0154] Neutralizacijski testovi su izvedeni korišćenjem TZM-bl testa koji meri neutralizaciju u funkciji smanjenja ekspresije reporterskog gena luciferaze svica (Luc) regulisane HIV-1 Tat-om nakon jedne runde infekcije sa Env-pseudotipiziranim virusima. Testovi su izvedeni kako je opisano u Marcella Sarzotti-Kelsoe i dr., J. Immunological Methods, 409:131-146 (2014). Rezultati neutralizacije različitih antitela prikazani su u

Tabelama 8-10.

Postupci

Proizvodnja Env-pseudotipiziranih virusa

[0155] Zalihe enzimsko-pseudotipiziranih virusa proizvedene su u ćelijama 293T/17 kotransfekcijom sa dva plazmida: plazmid za ekspresiju Env i plazmid koji eksprimira ceo HIV-1 genom osim za Env. Ko-transfekcija ovih plazmida proizvela je zarazne čestice pseudovirusa koje su mogle isporučiti gen Tat u ciljne ćelije, ali infekcije ovim pseudovirionima nisu mogle same proizvesti zarazno virusno potomstvo.

Test neutralizacije virusa

[0156] Neutralizacija HIV infekcije korišćenjem TZM-b1 ćelija (poznatih i kao ćelije JC53BL-13) izvedena je kao što je prethodno opisano (Marcella Sarzotti-Kelsoe i dr., J. Immunological Methods, 409:131-146 (2014)). Ukratko, jedna runda infekcije korišćenjem viriona HIV-1 sa pseudotipiziranim Env izvedena je u ćelijama TZM-b1 (klon ćelije HeLa pozitivan na CXCR-4). Ćelije TZM-b1 su projektovane da eksprimiraju CD4 i CCR5, i da sadrže integrisane reporterske gene za luciferazu svica i β-galaktozidazu E. coli pod kontrolom dugotrajnog ponavljanja HIV. Ekspresija gena reportera indukovana je in trans virusom Tat proteina (isporučen pseudotipiziranim virusima) ubrzo nakon infekcije u jednom ciklusu. Aktivnost luciferaze je kvantifikovana kao jedinice relativne luminiscencije (RLU), i bila je direktno proporcionalna broju zaraznih čestica virusa prisutnih u početnom inokulumu u širokom opsegu vrednosti. Neutralizacija je merena kao funkcija smanjene ekspresije reporterskog gena luciferaze svica (Luc) regulisane Tat nakon davanja različitih koncentracija navedenih vezujućih proteina. Neutralizacijski titri identifikovani su kao razblaživanje proteina pri kome su RLU smanjeni za 80% u poređenju sa udubljenjima za kontrolu virusa nakon oduzimanja pozadinskih RLU. Test je izveden u pločama sa 96 udubljenja za visok kapacitet propusnosti, a dobro okarakterisani referentni sojevi su korišćeni za uniformnost u svim ispitivanjima.

Farmakokinetička (PK) merenja

[0157] Ženke indijskog rezus makaka težine između 3 i 6 kg nasumično su raspoređene u grupe prema telesnoj težini (dva makaka po grupi) i intravenozno su im injektirane sa naznačenom koncentracijom proteina za vezivanje. Krv je uzeta od životinja pre injekcije na dan 0, i 30 minuta, 6 sati, 1 dan, 2 dana, 4 dana, 7 dana, 14 dana, 21 dan i 28 dana nakon injekcije. Koncentracija svakog vezujućeg proteina u serumu je kvantifikovana u plazmi iz prikupljene krvi korišćenjem ELISA testa zasnovanog na RSC3.

Rezultati

[0158] 21 dodatni trispecifični vezujući protein koji cilja na tri različita HIV-1 Env glikoproteinska epitopa je generisan i prečišćen kao što je opisano u Primeru 1. Ovih 21 dodatnih trispecifičnih vezujućih proteina (Vezujući proteini 1 i 4-23) nastalo je kalemljenjem na okvir trispecifičnog vezujućeg proteina VHi VLdomena izolovanih iz antitela koja ciljaju različite epitope HIV-1 na HIV-1 Env glikoproteinu: antitela na MPER MPER Ab "a" i MPER Ab "b" (ciljaju na MPER epitop na gp41), antitela na CD4BS CD4BS Ab "a" i CD4BS Ab "b" (ciljaju na mesto vezivanja CD4 na gp120) , anti-V1/V2 antitela V1/V2 usmerena Ab "a" i V1/V2 usmerena Ab "b" (ciljajući V1/V2 domen na gp120), i anti-V3 antitelo V3 usmereno Ab (ciljajući petlju V3 na gp120) (Tabela 7).

Tabela 7: sastav vezu uće mesta tris ecifičnih vezu ućih roteina

[0159] Sposobnosti neutralizacije virusa pet trispecifičnih vezujućih proteina (i njihovih roditeljskih antitela) u različitim koncentracijama testirane su na panelu od 208 različitih HIV-1 Env-pseudotipiziranih virusa (Tabela 8). Neutralizacija pseudotipiziranih izolata HIV-1 posredovana vezujućim proteinom merena je pomoću TZM-b1 gena reportera luciferaze. Inhibitorna doza za svaki vezujući protein je izračunata za svaki pseudotipizirani virus kao razblaženje koje je izazvalo 80% smanjenje luminiscencije (IC80) nakon infekcije. Iznenađujuće, geometrijska sredina IC80izračunata za svaki od testiranih trispecifičnih vezujućih proteina bila je niža od roditeljskih antitela, što sugeriše da su ti trispecifični vezujući proteini bili moćniji u neutralisanju pseudotipiziranog HIV-1 od njihovih roditeljskih neutralizujućih antitela.

Tabela 8: IC80 meren a iz testa neutralizaci e virusa

[0160] Zatim, sposobnosti neutralisanja virusa veće grupe trispecifičnih vezujućih proteina (i njihovih roditeljskih antitela) u različitim koncentracijama testirane su protiv 20 pseudotipiziranih virusa koji predstavljaju 10 različitih klasa HIV-1 (Tabela 9). Trispecifični vezujući proteini pružali su snažnu zaštitu od infekcije sa ovih 20 virusa (Tabela 10).

Tabela 10: ICso merenja iz testa neutralizacije virusa 20 reprezentativnih virusa

4

[0161] Konačno, farmakokinetika (PK) podskupa trispecifičnih vezujućih proteina i roditeljskih antitela je testirana na rezus makaki. Ukratko, 10 ili 20 mg/kg proteina je intravenozno ubrizgano u ženske rezus makake, a ELISA testovi su izvedeni na plazmi iz uzoraka krvi uzetih pre injekcije, i na plazmi iz uzoraka krvi uzetih u mnogim vremenskim tačkama nakon injekcije (do 42 dana) (SL.

7). 7). Svi trispecifični vezujući proteini mogli su se otkriti najmanje 14 dana nakon IV primene, pri čemu je vezujući protein 1 preostao detektovan najmanje 35 dana nakon injekcije, pokazujući da su vezujući proteini stabilni in vivo.

[0162] Uzeti zajedno, ovi podaci sugerišu da se mogu široko konstruisati neutrališući trispecifični vezujući proteini koji ciljaju tri različita epitopa na HIV-1 Env glikoprotein. Ovi vezujući proteini su pokazali sličnu ili povećanu moć/znatno poboljšane sposobnosti neutralizacije (širinu) u odnosu na roditeljska neutralizirajuća antitela. Štaviše, činilo se da se ovi trispecifični vezujući proteini dobro podnose in vivo. Bez želje da budu vezani za teoriju, razvoj široko neutralizirajućih trispecifičnih vezivnih proteina koji ciljaju na više epitopa na HIV može omogućiti poboljšanu antivirusnu terapiju u odnosu na monospecifična ili bispecifična antitela, jer je manje verovatno da će virusne čestice HIV biti otporne na sva tri antigena vezujuća mesta na neutralizirajućim trispecifičnim vezivnim proteinima nego pojedinačna ili dvostruka vezujuća mesta za antigene na monospecifičnim ili bispecifičnim neutralizirajućim antitelima.

Primer 3: naznačavanje angažovanih T-ćelija.

[0163] Kao što je iznad napomenuto, Env se eksprimira na površini ćelija zaraženih HIV-om. Zbog toga, Env može delovati kao meta antitela za identifikaciju inficiranih ćelija i indukovati citotoksičnost zavisnu od ćelija zavisnu od ćelija (ADCC) i citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC), što rezultira smanjenjem latentnog rezervoara virusa. Ispitivanja koja su ovde opisana istražuju razvoj novih trispecifičnih vezujućih proteina (nazvanih "angažovanje T ćelija") koji sadrže tri mesta za vezivanje antigena koja ciljaju na tri različita antigena (HIV-1 Env glikoprotein, CD3 i CD28). Ovi novi proteini ne uključuju samo mesta za vezivanje antigena iz neutralizujućih antitela, već i sposobnost vezivanja efektorskih T ćelija, dovodeći ih u neposrednu blizinu inficiranih ciljnih ćelija, čime se indukuje liza ćelija zaraženih HIV.

Postupci

Vezujuća svojstva T-ćelijskog angažovanja

[0164] Svojstva vezivanja T-ćelijskih interaktora merena su ELISA testom koristeći anti-Fab sondu konjugovanu sa peroksidom hrena da se detektuje vezivanje T-ćelija za površinu ELISA ploča obloženih CD3, CD28 ili Resurfaced Stabilized Core 3 (RSC3) protein gp120.

Humani CD3ge-hIgG4 (KIH) (Kat. Br: 03-01-0051) iz Cambridge Biologics, MA, SAD; Humani CD28-hIgG4 (Kat. Br: 03-01-0303) iz Cambridge Biologics, MA, SAD.

Test T-ćelijske aktivacije

[0165] Aktivacija CD4 i CD8 T ćelija merena je na sledeći način: mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) obogaćene su premazima dobijenim od naivnih davalaca (NIH banka krvi) pomoću magnetnih perli (Miltenyi Biotec). Ove ćelije su kultivisane 14-16 sati sa neinficiranim ili HIV-1 inficiranim CEM ćelijama u prisustvu rastućih koncentracija vezivnih proteina (0,01-1,0 µg/mL) sa brefeldinom A. Ćelije su zatim obojene za površinu ekspresija markera T-ćelija (CD3, CD4 i CD8) i markera aktivacije (CD25 i CD69), nakon čega sledi intraćelijsko bojenje za citokine (IFN-γ, TNF-α i IL-2) korišćenjem fluorescentno konjugovanih antitela (BD Biosciences, eBiosciences, Biolegend). Broj CD4 i CD8 T ćelija koje izražavaju svaki citokin ili aktivacioni marker određen je pokretanjem uzoraka na protočnom citometru LSRII i analizom podataka pomoću softvera Flowjo (Treeestar).

Smanjenje regulacije CD3

[0166] Niža regulacija CD3 nakon aktivacije T ćelija od strane T-ćelijskih aktivatora merena je bojenjem aktiviranih PBMC sa ne konkurentnim mišjim anti-humanim antitelom na CD3 i kvantifikovano korišćenjem protočne citometrije.

Analiza citotoksičnosti

[0167] Citotoksičnost T-ćelija vezanih za ćelije CEM-BaL, ACH2 i J1.1 praćena je protočnom citometrijom na sledeći način: latentne ćelijske linije (ACH2, J1.1, OM10) dobijene su iz NIH programa za reagense protiv SIDE. Aktivacija ovih ćelija izvedena je kultivisanjem ćelija u prisustvu ili odsustvu TNF-α (10 ng/mL) tokom 14-16 sati. Aktivacija je merena određivanjem ekspresije glikoproteina na ovojnici ćelijske ovojnice HIV protočne citometrije korišćenjem anti-HIV Env antitela konjugovanog sa alofikocijaninom (2G12). Ćelije CEM-IIIb, ACH2, J1.1 i OM10 su obeležene membranskom bojom PKH-26 (Sigma) i korišćene kao ciljne ćelije u testu citotoksičnosti. Ove obeležene ciljne ćelije su zajedno kultivisane 14-16 sati u odnosu E:T od 10:1 sa obogaćenim ljudskim T ćelijama kao efektorskim ćelijama u prisustvu sve većih količina vezivnih proteina. Stepen ćelijske lize u ciljnim ćelijama određen je bojenjem živim/mrtvim ćelijskim markerom (Life technologies) i merenjem broja mrtvih ćelija u obeleženoj populaciji ciljnih ćelija pokretanjem uzoraka na protočnom citometru LSRII, nakon čega je usledila analiza pomoću Softver Flowjo (Treestar).

Rezultati

[0168] Istražen je kapacitet razvoja T-ćelija koje deluju na mesta vezivanja antigena, ciljajući na površinske proteine T-ćelija i neutrališući epitope na HIV-1. Konstruisani su antagonisti T ćelija koji sadrže dva mesta za vezivanje antigena koja ciljaju dva različita receptora na površini T ćelije (CD3 i CD28), i treće mesto vezivanja antigena koje cilja na HIV-1 Env glikoprotein (Sl.8A i 8B). Pored toga, konstruktori za uključivanje T ćelija su konstruisani tako da uključuju mutaciju LS. Nadalje, uključivači T-ćelije su konstruisani tako da unutar jednog vezujućeg proteina jedan CH3domen uključuje mutaciju čvora, a drugi CH3domen uključuje mutaciju rupe kako bi se olakšala heterodimerizacija teških lanaca (Sl.8A i 8B).

[0169] Korišćenjem ovog pristupa, konstruisana su dva T-ćelijska aktera koji ciljaju i na površinske proteine T-ćelije i na HIV-1 Env glikoprotein (vezujući protein 32 i CD3 x CD28 / CD4BS "b" Ab). Ova dva uključivača T ćelija su stvorena kalemljenjem na trispecifičan vezujući proteinski okvir, VHi VLdomene izolovane iz roditeljskih antitela koja ciljaju na

4

površinske proteine T ćelija CD3 i CD28, i anti-HIV-1 antitelo CD4BS Ab "b" (ciljajući na Vezivanje CD4 na gp120). Vezujući protein 32 je konstruisan tako da je prvi par polipeptida (koji su formirali dva mesta za vezivanje antigena) ciljao na površinske receptore T ćelija CD28 i CD3, a drugi par polipeptida (koji su činili jedno mesto za vezivanje antigena) ciljao je na HIV-1 antigen CD4BS (vezujući protein 32 = CD28 x CD3 / CD4BS). CD3 x CD28 / CD4BS "b" Ab trispecifični vezujući protein je konstruisan tako da je prvi par polipeptida (koji su formirali dva mesta za vezivanje antigena) ciljao na površinske receptore T ćelija CD3 i CD28, a drugi par polipeptida (koji su formirali jedno mesto vezivanja za antigen) ciljano na antigen HIV-1 CD4BS (Tabela 11).

Tabela 11: Format angažovanih T-ćelija

g

[0170] Sposobnost dva uključivača T ćelija da se vežu za svaki od svoja tri ciljna antigena testirana je ELISA testom. Angažman T ćelija bio je sposoban da veže i površinske proteine CD3 i CD28 T ćelije sa mestima za vezivanje antigena CD3 i CD28 u bilo kojoj orijentaciji u bispecifičnim krakovima angažovanih T ćelija (tj. CD3 x CD28 za CD3 x CD28 / CD4BS Ab "b" ili CD28 x CD3 za vezujući protein 32). Oba aktivatora T ćelija su takođe sposobna da se vezuju za gp120 (mereno korišćenjem HIV-1 RSC3 proteina, varijanti gp120 kojoj nedostaju varijabilni regioni V1, V2 i V3) (Sl.9).

[0171] Uticaj na aktivnost T ćelija je zatim testiran za oba aktera T ćelija. Inkubacija T ćelija uključenih u monocite otkrila je da je uključivanje T ćelija indukovalo snažnu aktivaciju CD8<+>T ćelija (Sl.10). Slično, angažovani T ćelije bili su sposobni da indukuju značajnu aktivaciju CD4<+>T ćelija samo na PBMC, ili PBMC inkubiranim sa bilo kojom od HIV-1 inficiranih T ćelijskih linija CEM-NKr ćelijama ili CEM-BaL ćelijama (Sl.11). Dodatno, oba T ćelijska zahvata smanjuju ekspresiju CD3 na ćelijskoj površini na aktiviranim T ćelijama (Sl. 12).

[0172] Konačno, ispitana je sposobnost angažovanih T ćelija da izazovu lizu ćelija zaraženih HIV. Angažman T ćelija (i bispecifični vezujući proteini pozitivne i negativne kontrole koji ciljaju CD3 i HIV antigen) inkubirani su sa HIV-1 inficiranim T ćelijskim linijama CEM-BaL ćelija. Inkubacija T ćelija sa zahvaćenim inficiranim ćelijama izazvala je snažnu ćelijsku lizu u širokom opsegu koncentracija (Sl.13A). Slično, inkubacija ovih T-ćelijskih inhibitora izazvala je lizu latentno inficiranih ACH2 ćelija T -ćelijske linije (Sl.13B), kao i ćelije J1.1 (Sl. 13C). Iznenađujuće, aktivisti T ćelija pokazali su uporedivu ili bolju citotoksičnu aktivnost protiv hroničnih i latentnih HIV-inficiranih ćelijskih linija u poređenju sa bispecifičnim vezivnim proteinima.

[0173] Uzeti zajedno, ovde opisani novi aktivisti T ćelija koji su opisani zadržali su sposobnost svojih roditeljskih antitela da vežu svoje ciljne antigene na HIV-1 Env glikoprotein gp120 na ćelije inficirane HIV-om, kao i proteine T ćelija izložene površini ćelije CD3 i CD28. Angažman T ćelija indukovao je snažnu aktivaciju CD4<+>i CD8<+>T ćelija i smanjio površinsku ekspresiju CD3. Konačno, ovi akteri T ćelija izazvali su značajnu lizu HIV-1 inficiranih T ćelija. Bez želje da budu vezani za teoriju, ovi učesnici T ćelija mogu pružiti novu strategiju za antivirusne terapije smanjenjem/uklanjanjem latentnog virusnog rezervoara angažovanjem T ćelija kod pacijenata sa HIV/AIDS.

[0174] Svako ovde opisano otelotvorenje može se kombinovati sa bilo kojim drugim otelotvorenjem ili otelotvorenjima, osim ako nije jasno naznačeno suprotno. Konkretno, bilo koje obeležje ili izvođenje naznačeno kao poželjno ili povoljno može se kombinovati sa bilo kojim drugim svojstvom ili karakteristikama ili otelotvorenjem ili otelotvorenjima koja su označena kao poželjna ili povoljna, osim ako nije jasno naznačeno suprotno.

SEKVENCE

[0175]

Tabela 1: SEQ ID NO teškog i lakog lanca za vezivanje proteina 1-53 i ciljnih antigena na koje su vezani proteini usmereni.

4

Vezujući protein SEQ ID NOs Cilj

24 188, 187, 185, 186 V1/V2 usmeren x CD4BS / MPER

4

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

11

��

�

��

�

�

�

�

�

11

11

11

11

11

11

11

��

��

��

��

��

��

��

�

11

��

�

��

�

�

�

�

�

��

��

��

��

��

��

��

�

11

��

�

��

�

�

�

�

�

�

11

��

�

��

�

T l B DR k n r i l kih ni l

1

Tabela C: Sekvence varijabilnih domena roditeljskih antitela

1

1

1

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

2

21

22

2

24

2

2

�

2

2

21

21

21

21

21

21

21

22

22

22

22

22

22

22

2

21

22

2

24

2

2

2

2

2

24

24

24

24

24

24

24

2

21

22

2

24

2

2

2

2

2

2

21

22

2

24

2

2

2

2

2

2

21

22

2

24

2

2

2

�

2

2

21

22

2

24

2

2

2

2

2

2

21

22

2

24

2

2

2

2

2

1

2

4

1

11

12

�

14

1

1

1

1

�

2

21

22

2

24

2

2

2

2

2

1

2

4

4

41

42

4

44

4

4

4

4

4

1

2

4

1

2

4

1

2

4

1

2

4

1

2

4

4

41

42

4

44

4

4

4

4

4

41

41

41

41

41

41

41

42

42

42

42

42

42

42

4

41

42

4

44

4

4

4

4

�

44

44

44

44

44

44

44

4

41

42

4

44

4

4

4

4

4

4

41

42

4

44

4

4

4

4

4

4

41

42

4

44

4

4

4

4

4

�

41

42

4

44

4

4

4

4

4

4

41

42

4

44

4

4

4

4

4

1

2

Claims (13)

Patentni zahtevi

1. Vezujući protein koji sadrži četiri polipeptidna lanca koji formiraju tri mesta za vezivanje antigena koji specifično vezuju jedan ili više HIV ciljnih proteina, pri čemu prvi polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:

VL2- L1-VL1- L2-CL[I]

i drugi polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:

VH1- L3-VH2- L4-CH1-zglob-CH2-CH3[II]

i treći polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:

VH3-CH1-zglob-CH2-CH3[III]

treći polipeptidni lanac sadrži strukturu predstavljenu formulom:

VL3-CL[IV]

gde:

VL1je prvi varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina;

VL2je drugi varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina;

VL3je treći varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina;

VH1je prvi varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina;

VH2je drugi varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina;

VH3je treći varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina;

CLje konstantni domen lakog lanca imunoglobulina;

CH1je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina CH1;

CH2je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina CH2;

CH3je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina CH3;

zglob je zglobni region imunoglobulina koja povezuje domene CH1i CH2; i

L1, L2, L3i L4jesu aminokiselinski veznici;

i gde polipeptid formule I i polipeptid formule II formiraju ukršteni par lakog lanca i teškog lanca, i

gde:

(a) VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 500, CDR-L2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 501, i CDR-L3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 274; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 275, CDR-L2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 276, i CDR-L3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 277; VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 266, CDR-L2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 267, i CDR-L3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 268; VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 254, CDR-H2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 255, i CDR-H3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 256; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 257, CDR-H2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 258, i CDR-H3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 259; i VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 248, CDR-H2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 497, i CDR-H3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 250; ili

(b) VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 500, CDR-L2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 501, i CDR-L3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 274; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 275, CDR-L2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 276, i CDR-L3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 277; VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 269, CDR-L2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 270, i CDR-L3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 271; VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 254, CDR-H2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 255, i CDR-H3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 256; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 257, CDR-H2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 258, i CDR-H3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 259; i VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 251, CDR-H2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 252, i CDR-H3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 253; ili

(c) VL1sadrži CDR-L1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 275, CDR-L2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 276, i CDR-L3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 277; VL2sadrži CDR-L1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 500, CDR-L2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 501, i CDR-L3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 274; VL3sadrži CDR-L1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 269, CDR-L2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 270, i CDR-L3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 271; VH1sadrži CDR-H1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 257, CDR-H2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 258, i CDR-H3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 259; VH2sadrži CDR-H1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 254, CDR-H2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 255, i CDR-H3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 256; i VH3sadrži CDR-H1 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 251, CDR-H2 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 252, i CDR-H3 koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 253.

2. Vezujući protein prema patentnom zahtevu 1, gde:

(a) VL1sadrži varijabilni domen lakog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 518; VL2sadrži varijabilni domen lakog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 519; VL3sadrži varijabilni domen lakog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 512; VH1sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 504; VH2sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 506; i VH3sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 502; ili (b) VL1sadrži varijabilni domen lakog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 518; VL2sadrži varijabilni domen lakog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 519; VL3sadrži varijabilni domen lakog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 513; VH1sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 504; VH2sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 506; i VH3sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 503; ili (c) VL1sadrži varijabilni domen lakog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 519; VL2sadrži varijabilni domen lakog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 518; VL3sadrži varijabilni domen lakog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 513; VH1sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 506; VH2sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 504; i VH3sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 503.

3. Vezujući protein prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, gde:

(a) CH3domen drugog polipeptidnog lanca sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 354 i 366 humanog IgG1 prema EU indeksu, gde su aminokiselinske supstitucije S354C i T366W; i gde CH3domen trećeg polipeptidnog lanca sadrži supstitucije aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 349, 366, 368 i 407 humanog IgG1 prema EU indeksu, gde su aminokiselinske supstitucije Y349C, T366S, L368A i Y407V; ili

4

(b) gde CH3domen drugog polipeptidnog lanca sadrži supstitucije aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 349, 366, 368 i 407 humanog IgG1 prema EU indeksu, gde su aminokiselinske supstitucije Y349C, T366S, L368A i Y407V; i gde CH3domen trećeg polipeptidnog lanca sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 354 i 366 humanog IgG1 prema EU indeksu, gde su aminokiselinske supstitucije S354C i T366W.

4. Vezujući protein prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, pri čemu CH3domeni drugog i trećeg polipeptidnog lanca sadrže supstitucije aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 428 i 434 humanog IgG1 prema EU indeksu, gde aminokiselinske supstitucije su M428L i N434S.

5. Vezujući protein prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, gde:

(a) najmanje jedan od L1, L2, L3ili L4je nezavisno 0 aminokiselina po dužini; ili (b) L1, L2, L3ili L4svaki nezavisno najmanje jednu aminokiselinu po dužini.

6. Vezujući protein patentnog zahteva 5, L1, L2, L3, i/ili L4sadrže sekvencu Asp-Lys-Thr-His-Thr (SEQ ID NO: 525).

7. Vezujući protein koji sadrži prvi polipeptidni lanac, drugi polipeptidni lanac, treći polipeptidni lanac i četvrti polipeptidni lanac gde:

(a) prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4 ili aminokiselinska sekvenca koja je najmanje 95% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 4; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3 ili aminokiselinska sekvenca koja je najmanje 95% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 3; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1 ili aminokiselinska sekvenca koja je najmanje 95% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 1; i četvrti polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2 ili aminokiselinska sekvenca koja je najmanje 95% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2;

(b) prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 12 ili aminokiselinska sekvenca koja je najmanje 95% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 12; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 11 ili aminokiselinska sekvenca koja je najmanje 95% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 11; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9 ili aminokiselinska sekvenca koja je najmanje 95% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 9; i četvrti polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10 ili aminokiselinska sekvenca koja je najmanje 95% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 10;

(c) prvi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 20 ili aminokiselinska sekvenca koja je najmanje 95% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 20; drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 19 ili aminokiselinska sekvenca koja je najmanje 95% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 19; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 17 ili aminokiselinska sekvenca koja je najmanje 95% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 17; i četvrti polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18 ili aminokiselinska sekvenca koja je najmanje 95% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 18.

8. Izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira vezujući protein prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7.

9. Vektor ekspresije koji sadrži molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 8.

10. Vektorski sistem koji sadrži jedan ili više vektora koji kodiraju prvi, drugi, treći i četvrti polipeptidni lanac vezujućeg proteina prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7, pri čemu opciono:

(a) vektorski sistem sadrži prvi vektor koji kodira prvi polipeptidni lanac vezujućeg proteina, drugi vektor koji kodira drugi polipeptidni lanac vezujućeg proteina, treći vektor koji kodira treći polipeptidni lanac vezujućeg proteina i četvrti vektor kodirajući četvrti polipeptidni lanac vezujućeg proteina ili

(b) vektorski sistem sadrži prvi vektor koji kodira prvi i drugi polipeptidni lanac vezujućeg proteina, i drugi vektor koji kodira treći i četvrti polipeptidni lanac vezujućeg proteina.

11. Izolovana ćelija domaćin koja sadrži molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 8, ekspresioni vektor prema patentnom zahtevu 9 ili vektorski sistem prema patentnom zahtevu 10, gde je opciono ćelija domaćin ćelija sisara ili ćelija insekata.

12. Postupak proizvodnje vezivnog proteina, koji obuhvata:

a) kultivisanje ćelije domaćina prema patentnom zahtevu 11 pod takvim uslovima da ćelija domaćin eksprimira vezujući protein; i

b) izolovanje vezivnog proteina iz ćelije domaćina.

13. Vezujući protein prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7 za upotrebu u postupku sprečavanja i/ili lečenja HIV infekcije kod pacijenta, koji se sastoji u davanju pacijentu terapeutski efikasne količine vezujućeg proteina, pri čemu je vezivni protein opciono zajednički daje sa standardnom anti-retrovirusnom terapijom, i gde je pacijent opciono čovek.