RS62589B1

RS62589B1 - Antitela na pd-1 i njihova upotreba

Info

Publication number: RS62589B1
Application number: RS20211407A
Authority: RS
Inventors: George Robert Mabry Iii; Stephen Sazinsky
Original assignee: Jounce Therapeutics Inc
Priority date: 2016-11-02
Filing date: 2017-11-01
Publication date: 2021-12-31
Also published as: EP3535298B1; AU2017355401A1; RU2761640C2; US11905329B2; CN110392694A; SG11201903857UA; ES2898025T3; WO2018085358A1; JP2022070873A; JP7086066B2; PL3535298T3; LT3535298T; RU2019116653A; TWI781120B; US20230018445A1; US11384147B2; DK3535298T3; MX2019004834A; MD3535298T2; EP3988569A1

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Data su antitela koja se vezuju za proteine programirane smrti-1 (PD-1). Takođe su dati postupci lečenja koji sadrže davanje anti-PD-1 antitela.

STANJE TEHNIKE

[0002] Protein programirane smrti 1 (PD-1) je inhibitorni član receptorske porodice CD28, koja takođe uklјučuje CD28, CTLA-4, ICOS i BTLA. PD-1 se eksprimuje na površini aktiviranih B ćelija, T ćelija i mijeloidnih ćelija. PD-1 sadrži membranski proksimalni imunoreceptorski inh bitorni motiv tirozina (ITIM) i membranski distalni tirozin-bazirani motiv prekidača (ITSM). Iako je strukturno sličan CTLA-4, PD-1 nema motiv MYPPY koji je kritičan za vezivanje B7-1 i B7-2. Osim toga, iako svi CD28, ICOS i CTLA-4 (drugi članovi porodice CD28) imaju neuparen cisteinski ostatak koji omogućava homodimerizaciju, veruje se da PD-1 postoji kao monomer, kome nedostaje neuparen cisteinski ostatak karakterističan za druge članove porodice CD28. PD-1 receptor ima dva liganda, PD-ligand-1 (PD-L1) i PD-L2. Izraz „PD-L1” odnosi se na ligand receptora PD-1 koji je, takođe, poznat kao CD274 i B7H 1. PD-L1 je protein od 290 amino-kiselina sa vanćelijskim domenom sličnim IgV, vanćelijskim domenom sličnim IgC, transmembranskim domenom i visoko očuvanim unutarćelijskim domenom od približno 30 amino-kiselina. PD-L1 se konstitutivno eksprimuje na mnogim ćelijama kao što su ćelije koje predstavlјaju antigen (npr. dendritičke ćelije, makrofagi i B-ćelije) i na hematopoetskim i nehematopoetskim ćelijama (npr. vaskularne endotelne ćelije, Langerhansova ostrvca i mesta imunološke privilegije). Izraz „PD-L2” odnosi se na ligand receptora PD-1, takođe, poznat kao CD273 i B7-DC. PD-L2 ima vanćelijski domen sličan IgV, vanćelijski domen sličan IgC, transmembranski domen i unutarćelijski domen od približno 30 amino-kiselina kod јudi. PD-L2 ima ograničeniju ekspresiju od PD-L1, s tim što je njegova ekspresija uglavnom ograničena na hematopoetske ćel je uklјučujući makrofage, dendritične ćel je, neke podskupove B ćelija i mastocite izvedene iz koštane srži.

[0003] PD-1 funkcioniše kao imunološki kontrolni punkt i sprečava aktivaciju T-ćelija. Antagonisti PD-1 aktiviraju imunološki sistem za napad na tumore i pokazali su uspeh u lečenju raka, a u nekim slučajevima i sa manje toksičnosti od drugih hemoterap jskih tretmana. Antagonisti PD-1 mogu se, takođe, koristiti u kombinovanim režimima sa drugim hemoterapijskim sredstvima. Trenutno odobreni antagonisti PD-1 uk јučuju anti-PD-1 antitela, Opdivo<®>i Keytruda<®>, i anti-PD-L1 antitelo, Tecentriq™.

[0004] WO2016106159 stavlja na uvid javnosti antitela koja se vezuju za PD-1, kompozicije koje sadrže takva antitela, i postupke stvaranja i upotrebe takvih antitela.

[0005] Ostaje potreba za dodatnim antagonistima PD-1 za lečenje raka i drugih bolesti i poremećaja.

KRATAK PRIKAZ

[0006] Obezbeđena su antitela koja vezuju programiranu smrt 1 (PD-1), pri čemu antitela vezuju humani PD-1 i mišji PD-1, i pri čemu antitela blokiraju vezivanje PD-L1 i/ili PD-L2 za PD-1.

[0007] Izolovano monoklono antitelo koje se vezuje za humano programirane smrti 1 (PD-1) je omogućeno, naznačeno time što antitelo sadrži (a) HCDR1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 21; (b) HCDR2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 22; (c) HCDR3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 23; (d) LCDR1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 25; (e) LCDR2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 26; i (f) LCDR3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 27. U nekim realizacijama, obezbeđeno je izolovano monoklono antitelo koje vezuje humani PD-1, koje sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) i varijabilni region lakog lanca (VL), pri čemu:

Je VH najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sekvenci amino-kiseline SEQ ID NO: 20 i VL je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sekvenci amino-kiseline SEQ ID NO: 24. U nekim realizacijama, obezbeđeno je izolovano monoklono antitelo koje vezuje humani PD-1, koje sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) i varijabilni region lakog lanca (VL), pri čemu

VH sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 20 i VL sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 24.U nekim realizacijama, ovde dato antitelo se vezuje za humani PD-1 sa afinitetom (KD) manjim od 5 nM. U nekim realizacijama, antitelo koje je ovde dato se vezuje za mišji PD-1 sa afinitetom (KD) manjim od 10 nM. Afinitet se određuje pomoću bioslojne interferometrije.

[0008] U nekim realizacijama, antitelo koje je ovde dato je humano antitelo, himerno antitelo, ili humanizovano antitelo. U nekim realizacijama, antitelo koje je ovde dato je fragment antitela izabran iz Fab, Fab’, Fv, scFv ili (Fab’)2 fragmenta. U nekim realizacijama, antitelo koje je ovde dato je antitelo pune dužine. U nekim realizac jama, antitelo koje je ovde dato je IgG1 ili IgG4 antitelo.

[0009] U nekim realizacijama, antitelo dato ovde vezuje humani PD-1. U nekim realizacijama, humani PD-1 sadrži amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 382. U nekim realizacijama, ovde dato antitelo inhibira vezivanje PD-1 za PD-L1. U nekim realizacijama, ovde dato antitelo inhibira vezivanje PD-1 za PD-L2. U nekim realizacijama, ovde dato antitelo inhibira vezivanje PD-1 za PD-L1 i inhibira vezivanje PD-1 za PD-L2.

[0010] U nekim realizacijama, primena ovde datog antitela sisaru pojačava imunološki odgovor kod sisara i/ili ima za rezultat aktivaciju T ćelija kod sisara.

[0011] U nekim realizacijama, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja kodira antitelo ovde opisano. U nekim realizacijama, obezbeđena je ćelija domaćin koja proizvodi antitelo ovde opisano. U nekim realizac jama, obezbeđen je postupak za pravljenje anti-PD-1 antitela, koji uključuje kultivaciju ćelije domaćina pod uslovima pogodnim za ekspresiju antitela. U nekim realizacijama, postupak dalјe obuhvata pr kupljanje antitela koje proizvodi ćelija domaćin.

[0012] U nekim realizac jama, obezbeđen je farmaceutska kompozicija, koji sadrži ovde dato antitelo na PD-1 i farmaceutski prihvatlјiv nosač.

[0013] U nekim realizacijama, predmetni pronalazak obezbeđuje upotrebu antitela datog ovde ili farmaceutske kompozicije koja sadrži ovde dato antitelo i farmaceutski prihvatlјiv nosač za lečenje raka u skladu sa patentnim zahtevima. U nekim realizacijama, rak je izabran iz melanoma, nemikrocelularnog raka pluća (NSCLC), karcinoma bubrežnih ćelija (RCC), raka želuca, raka mokraćne bešike, difuznog velikog B-ćelijskog limfoma (DLBCL), Hodžkinovog limfoma, raka jajnika, skvamoznog ćelijskog raka glave i vrata (HNSCC) i trostruko negativnog raka dojke (TNBC). U pojedinim realizacijama, rak je izabran iz melanoma, raka želuca, skvamoznog ćel jskog raka glave i vrata (HNSCC), nemikrocelularnog raka pluća (NSCLC) i trostruko negativnog raka dojke (TNBC).

[0014] U nekim realizacijama, predmetni pronalazak obezbeđuje upotrebu antitela datog ovde ili farmaceutske kompozicije koja sadrži ovde dato antitelo i farmaceutski prihvatlјiv nosač, i najmanje jedno dodatno terapijsko sredstvo, za lečenje raka. U nekim realizacijama, dodatno terapijsko sredstvo je izabrano iz anti-ICOS antitela i anti-CTLA4 antitela. U nekim realizacijama, dodatno terapijsko sredstvo je anti-ICOS antitelo.

[0015] U nekim realizacijama, za uzorak raka sisara je utvrđeno da eksprimuje PD-1. U nekim realizac jama, uzorak pokazuje 1+, 2+ ili 3+ bojenje PD-1 imunohistohemijom (IHC). U nekim realizacijama, za uzorak je utvrđeno da ima povišen nivo PD-L1. U nekim realizac jama, nivoi PD-L1 su određeni pomoću IHC.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0016]

Slika 1 prikazuje koncentracije IFNγ nakon što su T ćel je mišjih splenocita aktivirane sa anti-CD3 i anti-CD28 antitelima u kontaktu sa anti-PD-1 antitelima. Mišji IgG1 i pacovski IgG2a su korišćeni kao kontrole. RMP1-14 je korišćen kao anti-PD-1 antitelo pozitivne kontrole.

Slika 2 pokazuje EC50 povećanja IL-2 u uzorcima cele krvi aktiviran sa stafilokoknim enterotoksinom B (SEB) nakon inkubacije sa anti-PD1 antitelima. nivolumab (Nivo) i pembrolizumab (Pembro) korišćeni su kao kontrolna anti-PD1 antitela. Prikazani su efekti antitela 12228 (28), 13406 (6), 13407 (7), 13408 (8) i 13409 (9).

Slika 3A-3B pokazuju sposobnost ovde opisanih antitela na PD-1 da blokiraju vezivanje mišjih liganda za mišji PD-1. Analiza okteta na instrumentu Forte-Bio korišćena je za procenu efekta antitela na interakciju između mišjeg PD-L1 i mišjeg PD-L2 mišjim PD-1.

Slike 4A-1, 4A-2, 4B-1, 4B-2, i 4C pokazuju sposobnost ovde opisanih antitela na PD-1 da blokiraju vezivanje humanih liganda za humani PD-1. Analiza okteta na instrumentu Forte-Bio korišćena je za procenu efekta antitela na interakciju između humanog PD-L1 i humanog PD-L2 sa humanim PD-1.

Slika 5 prikazuje smanjenje veličine tumora u modelima tumora miša nakon primene ovde opisanog anti-PD-1 antitela. Miševima C57BL6/J su injektirane supkutano u bokove ćelije MC38. Mišji IgG1 (MOPC-21) i pacovski IgG2a (2A3) su korišćeni kao kontrole. RMP1-14 je korišćen kao anti-PD1 antitelo pozitivne kontrole.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

[0017] Antitela koja vezuju PD-1 su obezbeđena. Takođe su obezbeđeni teški lanci i laki lanci antitela koji su sposobni da formiraju antitela koja vezuju PD-1. Pored toga, obezbeđena su antitela, teški i laki lanci koji sadrže jedan ili više određenih regiona koji određuju specifičnu komplementarnost (CDR). Obezbeđeni su polinukleotidi koji kodiraju antitela na PD-1. Takođe su obezbeđeni polinukleotidi koji kodiraju teške lance ili lake lance antitela. Obezbeđeni su postupci za proizvodnju i/ili prečišćavanje antitela na PD-1. Obezbeđena su PD-1 antitela za upotrebu u postupcima lečenja. Takvi postupci uključuju, ali nisu ograničeni na, postupke za lečenja raka. Obezbeđeni su postupci detekcije PD-1. Takvi postupci uključuju postupke za identifikovanje pojedinca koji može imati koristi od lečenja anti-PD-1 antitelom, praćenje lečenja osobe sa anti-PD-1 antitelom i poboljšanje terapijske efikasnosti anti-PD-1 antitela kod pojedinca.

[0018] Zaglavlja odeljaka koja su ovde korišćena su samo u organizacione svrhe i ne treba ih tumačiti kao ograničavanje opisane teme.

[0019] Tehnike i postupci opisani ili navedeni u ovom dokumentu se uopšteno dobro razumeju i uobičajeno se koriste konvencionalnom metodologijom od strane stručnjaka iz oblasti tehnike, kao što su, na primer, široko korišćene opisane metodologije u Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (2003)); serijalu METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); i Cancer: Principles and Practice of Oncology (V. T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993); i njihove ažurirane verzije.

I. Definicije

[0020] Ako nije drugačije definisano, naučni i tehnički pojmovi koji se koriste u vezi sa predmetnim pronalaskom imaju značenja koja su uobičajena za razumevanje od strane stručnjaka u ovoj tehnici. Da je, ukoliko nije drugačije određeno kontekstom ili izričito naznačeno, pojedinačni pojmovi uk jučuju množinu, a izrazi množine uključuju jedninu. Za bilo koji sukob u definicijama između različitih izvora ili referenci, definicija koja je ovde data preovlađuje.

[0021] Podrazumeva se da ovde opisane realizacije predmetnog pronalaska obuhvataju realizacije „koje se sastoje" i/ili „koje se uglavnom sastoje od". Kako je ovde upotrebljen, oblik jednine "a", "an" i "the" (u engleskom jeziku) uključuje množinske reference, osim ako nije drugačije naznačeno. Upotreba izraza „ili" ovde ne podrazumeva da su alternative međusobno isključive.

[0022] U ovoj prijavi, upotreba „ili" znači „i/ili", osim ako se to eksplicitno ne naznači ili to ne razume stručnjak u tehnici. U kontekstu višestruko zavisnog zahteva, upotreba „ili“ se odnosi na više od jednog prethodnog nezavisnog ili zavisnog zahteva.

[0023] Kao što će razumeti stručnjak u tehnici, referenca na „približnu (oko)" vrednost ili parametar ovde sadrži (i opisuje) realizacije koje su usmerene na tu vrednost ili parametar per se. Na primer, opis koji se odnosi na „oko X" uključuje opis „X".

[0024] Izrazi „molekul nukleinske kiseline", „nukleinska kiselina" i „polinukleotid" mogu se upotrebiti naizmenično i odnose se na polimer nukleotida. Takvi polimeri nukleotida mogu da sadrže prirodne i/ili neprirodne nukleotide i uključuju, ali nisu ograničeni na, DNK, RNK i PNK. „Sekvenca nukleinske kiseline" odnosi se na linearne sekvence nukleotida koje sadrže molekul nukleinske kiseline ili polinukleotid.

[0025] Izrazi „polipeptid" i „protein" se naizmenično koriste za označavanje polimera ostataka amino-kiselina i nisu ograničeni na minimalnu dužinu. Takvi polimeri ostataka amino-kiselina mogu da sadrže prirodne ili neprirodne ostataka amino-kiselina i uključuju, ali nisu ograničeni na, peptide, oligopeptide, dimere, trimere i multimere ostataka amino-kiselina. Definicija obuhvata i proteine pune dužine i njihove fragmente. Izrazi, takođe, uključuju postekspresione modifikac je polipeptida, na primer, glikozilaciju, s jalinizac ju, acetilaciju, fosforilaciju i slično. Dalje, u svrhu ovog pronalaska, „polipeptid" se odnosi na protein koji uključuje modifikacije, poput delecija, dodavanja i supstitucija (uglavnom konzervativne prirode), nativnoj sekvenci, sve dok protein zadržava že jenu aktivnost. Ove modifikacije mogu biti namerne, kao putem mutageneze usmerene na lokaciju, ili mogu biti slučajne, poput mutacija domaćina koji proizvode proteine ili greške usled PCR amplifikacije.

[0026] „PD-1” i „programirana smrt 1”, kako se ovde koriste, odnose se na bilo koji nativni PD-1 koji je rezultat ekspresije i obrade PD-1 u ćeliji Izraz uključuje PD-1 iz bilo kojeg izvora kičmenjaka, uključujući sisare poput primata (npr. ljudi i majmuna makaki rakojeda) i glodara (npr. miševa i pacova), osim ako nije drugačije naznačeno. Izraz takođe obuhvata varijante PD-1 koje se javljaju u prirodi, npr. varijante nastale splajsovanjem ili alelne var jante. Sekvenca amino-kiselina primernog humanog prekursorskog proteina PD-1, sa signalnom sekvencom (sa signalnom sekvencom, amino-kiseline 1-20) prikazana je u SEQ ID NO: 1. Sekvenca amino-kiselina primernog zrelog humanog PD-1 prikazana je u SEQ ID NO: 382. Sekvenca amino-kiselina primernog mišjeg prekursorskog proteina PD-1, sa signalnom sekvencom (sa signalnom sekvencom, amino-kiseline 1-20) prikazana je u SEQ ID NO: 2. Sekvenca amino-kiselina primernog zrelog mišjeg PD-1 prikazana je u SEQ ID NO: 383. Sekvenca amino-kiselina primernog prekursorskog proteina PD-1 majmuna makaki rakojeda (sa signalnom sekvencom (signalnom sekvencom, aminokiseline 1-20) prikazana je u SEQ ID NO: 3. Sekvenca amino-kiselina primernog zrelog PD-1 majmuna makaki prikazana je u SEQ ID NO: 384.

[0027] Izraz „posebno se vezuje" za antigen ili epitop je izraz koji je dobro poznat u tehnici, a postupci za određivanje takvog specifičnog vezivanja su, takođe, dobro poznati u tehnici. Za molekul se kaže da pokazuje „specifično vezivanje" ili „preferencijalno vezivanje" ako reaguje ili se povezuje češće, brže, duže vreme i/ili s većim afinitetom sa određenom ćelijom ili supstancom nego sa alternativnim ćelijama ili supstancama. Antitelo se „specifično veže" ili „preferencijalno veže" za ci j ako se veže sa većim afinitetom, avidnošću, spremnije i/ili sa dužim trajanjem nego što se veže za druge supstance. Na primer, antitelo koje se specifično ili preferencijalno vezuje za PD-1 epitop je antitelo koje veže ovaj epitop sa većim afinitetom, avidnošću, spremn je i/ili sa dužim trajanjem nego što se veže za druge PD-1 epitope ili epitope koji nisu PD-1. Takođe se podrazumeva, čitanjem ove definicije da, na primer, antitelo (ili deo ili epitop) koje se specifično ili preferencijalno veže za prvi cilj može ili ne mora specifično ili preferencijalno da se veže za drugi cilj. Kao takvo, „specifično vezivanje“ ili „preferencijalno vezivanje“ ne zahteva nužno (iako može da uključuje) ekskluzivno vezivanje. Uglavnom, ali ne nužno, upućivanje na vezivanje znači preferencijalno vezivanje. „Specifičnost" se odnosi na sposobnost vezujućeg proteina da selektivno vezuje antigen.

[0028] Kao što se ovde koristi, „u osnovi čist" odnosi se na materijal koji je najmanje 50% čist (to jest, bez kontaminanata), poželjnije, najmanje 90% čist, još poželjnije, najmanje 95% čist, a još poželjnije, najmanje 98% čist, i najpoželjnije, najmanje 99% čist.

[0029] Kako je ovde upotrebljen, izraz „epitop" odnosi se na mesto na ciljanom molekulu (na primer, antigen, kao što je protein, nukleinska kiselina, ugljeni hidrat ili lipidi) na koji se veže molekul koji vezuje antigen (na primer, antitelo, fragment antitela ili potporni (scaffold) protein koji sadrži regione za vezivanje antitela). Epitopi često uključuju hemijski aktivnu površinsku grupu molekula kao što su amino-kiseline, polipeptidi ili šećerni bočni lanac i imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakterist ke naelektrisanja. Epitopi se mogu formirati i iz susednih i/ili naspramnih nepovezanih ostataka (na primer, amino-kiselina, nukleotida, šećera, lipidne grupe) ciljnog molekula. Epitopi formirani od susednih ostataka (na primer, amino-kiselina, nukleotida, šećera, lipidne grupe) obično se zadržavaju na izloženosti denaturišućim rastvaračima, dok se epitopi formirani tercijarnim savijanjem obično gube nakon tretmana denaturišućim rastvaračima. Epitop može da sadrži, ali nije ograničen na najmanje 3, najmanje 5 ili 8-10 ostataka (na primer, amino-kiselina ili nukleotida). U nekim primerima, epitop je dužine manje od 20 ostataka (na primer, amino-kiselina ili nukleotida), manje od 15 ostataka ili manje od 12 ostataka. Dva antitela mogu da vezuju isti epitop unutar antigena ako pokazuju konkurentno vezivanje za antigen. U pojedinim realizacijama, epitop se može identif kovati na određenoj minimalnoj udaljenosti od CDR ostatka na molekulu koji vezuje antigen. U pojedinim realizacijama, epitop se može identifikovati na gornjoj uda jenosti i dalje ograničiti na one ostatke koji su uključeni u vezu (na primer, vodoničnu vezu) između ostatka antitela i ostatka antigena. Epitop se, takođe, može identifikovati raznim pretragama, na primer, skeniranje alanina ili arginina može ukazati na jedan ili više ostataka sa kojima molekul koji vezuje antigen može da stupi u interakciju. Ako nije izričito označeno, skup ostataka kao epitop ne isk jučuje ostale ostatke koji su deo epitopa za određeno antitelo. Umesto toga, prisustvo takvog skupa označava minimalnu seriju (ili skup vrsta) epitopa. Stoga, u pojedinim realizac jama, skup ostataka identifikovanih kao epitop označava minimalni epitop od značaja za antigen, a ne ekskluzivnu listu ostataka za epitop na antigenu.

[0030] „Nelinearni epitop" ili „konformacioni epitop" sadrži polipeptide koji nisu susedni, amino-kiseline i/ili šećere unutar antigenog proteina za koji se veže antitelo specifično za epitop. U pojedinim realizacijama, najmanje jedan ostatak neće biti susedan sa ostalim pomenutim ostacima epitopa; međutim, jedan ili više ostataka, takođe, mogu se nastavljati na ostale ostatke.

[0031] „Linearni epitop" sadrži susedne polipeptide, amino-kiseline i/ili šećere unutar antigenog proteina za koji se vezuje antitelo specifično za epitop. Treba napomenuti da u pojedinim realizacijama nije potrebno da se svaki ostatak unutar linearnog epitopa direktno veže (ili da bude uključen u vezu) sa antitelom. U pojedinim realizac jama, linearni epitopi mogu biti od imunizacije peptidom koji se efektivno sastojao od sekvence linearnog epitopa ili iz strukturalnih odeljaka proteina koji su relativno izolovani od ostatka proteina (tako da antitelo može da uzajamno deluje, na najmanje primarno), upravo s tim odeljcima sekvence.

[0032] Izraz „antitelo" se ovde koristi u najširem smislu i obuhvata različite strukture antitela, uključujući, ali ne ograničavajući se na, monoklonska antitela, poliklonska antitela, multispecifična antitela (na primer, bispecifična (kao što su Bi-specifični T-ćelijski pokretači) i trispecifična antitela), i fragmenti antitela sve dok pokazuju željenu aktivnost vezanja antigena.

[0033] Izraz antitelo uključuje, ali n je ograničen na, fragmente koji su sposobni da se vezuju za antigen, kao što je Fv, jednolančani Fv (scFv), Fab, Fab', di-scFv, sdAb (antitelo sa jednim domenom) i (Fab')2 (uključujući hemijski vezan F(ab')2). Papain varenje antitela stvara dva identična fragmenta koji se vezuju za antigen, nazvani „Fab“ fragmentima, svaki sa jednim mestom za vezanje antigena, i rezidualni „Fc“ fragment, čije ime odražava njegovu sposobnost lake kristalizacije. Tretmanom pepsina dobija se F(ab’)2 fragment koji ima dva mesta za kombinovanje antigena i još uvek je sposoban za unakrsno umrežavanje antigena. Izraz antitelo, takođe, obuhvata, ali nije ograničen na, himerna antitela, humanizovana antitela i antitela različitih vrsta, kao što su miš, čovek, majmun makaki rakojed, itd. Dalje, za sve ovde predviđene konstrukte antitela, razmatrane su i varijante koje imaju sekvence drugih organizama. Prema tome, ako je stavljena na uvid javnosti humana verzija antitela, stručnjak će znati kako transformisati antitelo zasnovano na humanoj sekvenci u sekvencu miša, pacova, mačke, psa, konja, itd. Fragmenti antitela, takođe, uključuju bilo orijentaciju jednostrukih lanaca scFv, tandem di-scFv, dijatela, tandem tri-sdcFv, miniantitela, itd. Fragmenti antitela, takođe, uključuju nano antitela (sdAb, antitelo koje ima jedinstven, monomerni domen, kao što je par var jabilnih domena teških lanaca, bez lakog lanca). Fragment antitela može se U pojedinim realizacijama navesti kao specifična vrsta (na primer, humani scFv ili mišji scFv). Ovo označava sekvence barem dela ne-CDR regiona, a ne izvor konstrukta.

[0034] Izraz „monoklono antitelo" odnosi se na antitelo suštinski homogene populacije antitela, to jest, pojedinaöna antitela koja obuhvataju populaciju su identična, osim mogućih mutacija koje se javljaju u prirodi a koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Monoklona antitela su visoko specifična i usmerena su protiv jednog antigenskog mesta. Pored toga, za razliku od preparata poliklonih antitela, koji obično uključuju različita antitela usmerena protiv različitih determinanti (epitopi), svako monoklono antitelo je usmereno protiv jedne odrednice antigena. Prema tome, uzorak monoklonih antitela može da se veže za isti epitop na antigenu. Modifikator „monokloni“ označava karakter antitela koje je dobijeno iz uglavnom homogene populac je antitela i ne treba ga tumačiti kao da zahteva proizvodnju antitela bilo kojim određenim postupkom. Na primer, monoklona antitela se mogu proizvesti metodom hibridoma koju su prvo opisali Kohler i Milstein, 1975, Nature 256: 495, ili se mogu proizvesti rekombinantnim DNK metodama, kao što je opisano u US patentu br. No. 4,816,567. Monoklona antitela se, takođe, mogu izolovati iz biblioteka faga generisanih korišćenjem tehn ka opisanih u McCafferty et al., 1990, Nature 348: 552-554, na primer.

[0035] Izraz „CDR" označava region koji određuje komplementarnost kao što je definisano najmanje jednim načinom identifikacije stručnjaku u tehnici. U pojedinim realizacijama, CDR se mogu definisati u skladu sa bilo kojom od Chothia shema numerisanja, Kabat shemom numerisanja, kombinacijom Kabata i Chothia, AbM definicijom, definicijom kontakta i/ili kombinacijom Kabat, Chothia, AbM i/ili definicije kontakta. Primeri CDR-ova (CDR-L1, CDRL2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3) javljaju se u ostacima amino-kiselina 24-34 od L1, 50-56 od L2, 89-97 od L3, 31-35B H1, 50-65 H2, i 95-102 H3. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Definicija AbM može da uključuje, na primer, CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3) u ostacima amino-kiselina 24-34 od L1, 50-56 od L2, 89-97 od L3, H26-H35B od H1, 50-58 od H2, i 95-102 od H3. Definicija kontakta može obuhvatati, na primer, CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3) sa ostacima amino-kiselina 30-36 od L1, 46-55 od L2, 89-96 od L3, 30-35 od H1, 47-58 od H2, i 93-101 od H3. Definicija Chothia može da uk jučuje, na primer, CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3) sa ostacima amino-kiselina 24-34 od L1, 50-56 od L2, 89-97 od L3, 26-32...34 od H1, 52-56 od H2, i 95-102 od H3. CDR se, takođe, mogu dobiti kao što je prikazano na bilo kojoj, jednoj ili više, pratećih slika. Sa izuzetkom CDR1 u VH,, CDR obično sadrže ostatke amino-kiselina koji formiraju hipervarijabilne pet je. Različiti CDR unutar antitela mogu se označiti odgovarajućim brojem i vrstom lanca, uključujući, bez ograničenja: a) CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, i CDR-H3; b) CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2, i CDRH3; c) LCDR-1, LCDR-2, LCDR-3, HCDR-1, HCDR-2, i HCDR-3; ili d) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, i HCDR3;; itd. Izraz „CDR" je ovde upotreb jen da obuhvati takođe HVR ili „hiper varijabilni region", uključujući hipervarijabilne petlje. Primeri hipervarijabilnih pet ji nastaju na ostacima amino-kiselina 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) i 96-101 (H3). (Chothia i Lesk, J. Mol. Biol.196:901-917 (1987).)

[0036] Izraz „varijabilni region teškog lanca" kako se ovde koristi odnosi se na region koji sadrži najmanje tri CDR teškog lanca. U pojedinim realizacijama, varijabilni region teškog lanca uključuje tri CDR-a i najmanje FR2 i FR3. U pojedinim realizacijama, varijabilni region teškog lanca uključuje najmanje HCDR1 teškog lanca, okvir (FR) 2, HCDR2, FR3 i HCDR3. U pojedinim realizacijama, varijabilni region teškog lanca, takođe, sadrži najmanje deo FR1 i/ili najmanje deo FR4.

[0037] Izraz „konstantni region teškog lanca" kako se ovde koristi odnosi se na region koji sadrži najmanje tri konstantna domena teškog lanca, CH1, CH2, i CH3. Naravno, brisanja i izmene koje ne menjaju funkc je unutar domena su obuhvaćene unutar obima izraza „konstantni region teškog lanca“, osim ako nije drugačije određeno. Neograničavajući primeri konstantnih regiona teškog lanca uključuju γ, δ i α. Neograničavajući primeri konstantnih regiona teškog lanca, takođe, uključuju ε i μ. Svaki konstatni region teškog lanca odgovara izotipu antitela. Na primer, antitelo koje sadrži γ konstantni region je IgG antitelo, antitelo koje sadrži δ konstantni region je IgD antitelo, a antitelo koje sadrži α konstantni region je IgA antitelo. Dalje, antitelo koje sadrži μ konstantni region je IgM antitelo, a antitelo koje sadrži ε konstantni region je IgE antitelo. Određeni izotipovi se mogu da je podeliti u podklase. Na primer, IgG antitela uključuju, ali nisu ograničena na, IgG1 (koja sadrži γ1 konstantni region), IgG2 (koja sadrži γ2 konstantni region), IgG3 (koja sadrži γ3 konstantni region) i IgG4 (sadrži γ4 konstantni region) antitela; IgA antitela uključuju, ali nisu ograničena na, IgA1 (koja sadrži α1 konstantni region) i IgA2 (koja sadrži α2 konstantni region) antitela; i IgM antitela uključuju, ali nisu ograničena na, IgM1 i IgM2.

[0038] Izraz „teški lanac", kako se ovde koristi, odnosi se na polipeptid koji sadrži najmanje varijabilni region teškog lanca, sa ili bez vodeće sekvence. U pojedinim realizacijama, teški lanac sadrži najmanje deo konstantnog regiona teškog lanca. Izraz „teški lanac pune dužine" koji se ovde koristi odnosi se na polipeptid koji sadrži varijabilni region teškog lanca i konstantni region teškog lanca, sa ili bez vodeće sekvence.

[0039] Izraz „varijabilni region lakog lanca" kako se ovde koristi odnosi se na region koji sadrži najmanje tri CDR lakog lanca. U pojedinim realizacijama, varijabilni region lakog lanca uključuje tri CDR-a i najmanje FR2 i FR3. U pojedinim realizacijama, varijabilni region lakog lanca uključuje najmanje laki lanac LCDR1, okvir (FR) 2, LCDR2, FR3 i LCDR3. Na primer, varijabilni region lakog lanca može da sadrži CDR1 lakog lanca, okvir (FR) 2, CDR2, FR3 i CDR3. U pojedinim realizacijama, var jabilni region lakog lanca, takođe, sadrži najmanje deo FR1 i/ili najmanje deo FR4.

[0040] Izraz „konstantni region lakog lanca" kako se ovde koristi odnosi se na region koji sadrži konstantni domen lakog lanca, CL. Neograničavajući primeri konstantnih regiona lakog lanca uključuju λ and κ. Naravno, brisanja i izmene koje ne menjaju funkcije unutar domena su obuhvaćene unutar obima izraza „konstantni region lakog lanca“, osim ako nije drugačije naznačeno.

[0041] Izraz „laki lanac", kako se ovde koristi, odnosi se na polipeptid koji sadrži najmanje promen jiv varijabilni region lakog lanca, sa ili bez vodeće sekvence. U pojedinim realizacijama, laki lanac sadrži najmanje deo konstantnog regiona lakog lanca. Izraz „laki lanac pune dužine", kao što je ovde korišćen, odnosi se na polipeptid koji sadrži varijabilni region lakog lanca i konstantni region lakog lanca, sa ili bez vodeće sekvence.

[0042] „Akceptorski humani okvir" u smislu u kome je ovde jeste okvir koji sadrži sekvencu amino-kiselina okvira varijabilnog domena lakog lanca (VL) ili okvira varijabilnog domena teškog lanca (VH) koji potiče iz okvira humanog imunoglobulina ili okvira humanog konsenzusa, kao što je definisano u daljem tekstu. Akceptorski humani okvir izveden iz okvira humanog imunoglobulina ili okvira humanog konsenzusa može sadržati iste njegove sekvence amino-kiselina ili može sadržati promene sekvenci amino-kiselina. U pojedinim realizacijama broj promena aminokiselina je 10 ili manji, 9 ili manji, 8 ili manji, 7 ili manji, 6 ili manji, 5 ili manji, 4 ili manji, 3 ili manji, ili 2 ili manji. U pojedinim realizacijama, akceptorski humani okvir VL identičan je u sekvenci sa sekvencom VL humanog imunoglobulina ili sekvencom humanog konsenzusa.

[0043] „Afinitet" se odnosi na jačinu zbira ukupnih nekovalentnih interakcija između jednog mesta vezanja molekula (na primer, antitela) i njegovog vezujućeg partnera (na primer, antigena). Afinitet molekula X za njegovog partnera Y obično može biti predstavljen konstantom disocijacije (KD). Afinitet se može meriti uobičajenim postupcima poznatim u tehnici (kao što su, na primer, ELISA KD, KinExA, bioslojna interferometrija (BLI) i/ili uređaji za površinsku plazmonsku rezonancu (kao što je BIAcore® uređaj), uključujući one ovde opisane).

[0044] Izraz “KD”, kako se ovde koristi, odnosi se na konstantu ravnotežne disocijacije interakcije antitelo-antigen.

[0045] U pojedinim realizacijama, vrednost „KD,” „Kd, „Kd" ili „Kd vrednost“ antitela se meri korišćenjem testova površinskih rezonantnih plazmona pomoću BIACORE<®>-2000 or a BIACORE<®>-3000 (BIAcore, Inc., Piscatawai, N.J.) na 25°C sa imobilisanim antigen CM5 čipovima na ∼10 jedinica odgovora (RU). Ukratko, biosenzorni čipovi karboksimetilovanog dekstrana (CM5, BIACORE, Inc.) se aktiviraju sa N-etil-N'- (3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohloridom (EDC) i N-hidroksisukcinimidom (NHS) prema uputstvima dobavljača. Antigen je razblažen sa 10 mM natrijum acetata, pH 4,8, do 5 μg/ml (∼0,2 μM) pre ubrizgavanja brzinom protoka od 5 μl/minut da bi se postiglo približno 10 jedinica odziva (RU) uparenog proteina. Nakon ubrizgavanja antigena, ubrizgava se 1 M etanolamina koji blokira nereagovane grupe. Za kinetička merenja, serijska razblaženja polipeptida, na primer, antitela pune dužine, ubrizgavaju se u PBS sa 0,05% surfaktanata TWEEN-20<TM>(PBST) na 25 °C, sa brzinom protoka od oko 25 µL/min. Stope pridruživanja (kon) i stope disocijac je (koff) izračunavaju se korišćenjem jednostavnog Langmuir vezivnog modela jedan na jedan (BIACORE<®>Evaluacijski softver verzija 3.2) istovremeno uklapajući senzorske dijagrame asoc jacije i disocijacije. Ravnotežna konstanta disocijacije (Kd) izračunava se kao odnos koff/kon. Vidi, na primer, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Ako on brzina prekoračuje 10<6>M<-1>s<-1>testom površinske plazmonske rezonance gore, tada on brzina može biti određena korišćenjem fluorescentne tehn ke gašenja koja meri povećanje ili smanjenje intenziteta emisije fluorescencije (ekscitacija = 295 nm; emis ja = 340 nm, 16 nm opsega) na 25 °C od 20 nM anti-antigen antitela u PBS, pH 7,2, u prisustvu povećanih koncentracija antigena izmerenih u spektrometru, kao što je spektrofometar opremljen stop-protokom (Aviv Instruments) ili spektrofotometar SLM-AMINCO<TM>serije 8000 (ThermoSpectronic) sa mešanom kivetom.

[0046] U pojedinim realizacijama, razlika između pomenute dve vrednosti (na primer, vrednosti Kd ) je u osnovi ista, na primer, manja od oko 50%, manja od oko 40%, manja od oko 30%, manja od oko 20%, i/ili manja od oko 10%, u zavisnosti od referentne / uporedne vrednosti.

[0047] U pojedinim realizacijama, razlika između pomenute dve vrednosti (na primer, vrednosti Kd) je bitno drugačija, na primer, veća od oko 10 %, veća od oko 20%, veća od oko 30%, veća od oko 40%, i/ili veća od oko 50%, kao funkcija vrednosti za referentni/uporedni molekul.

[0048] „Površinska plazmonska rezonanca“ označava optički fenomen koji omogućava analizu biospecifičnih interakcija u realnom vremenu otkrivanjem promena u koncentraciji proteina unutar matrice biosenzora, na primer korišćenjem BIAcore<TM>sistema (BIAcore International AB, a GE Healthcare company, Uppsala, Švedska i Piscataway, N.J.). Za dodatne opise vidi Jonsson et al. (1993) Ann. Biol. Clin.51:19-26.

[0049] „Bioslojna interferometr ja" se odnosi na optičku analitičku tehniku koja analizira interferencijski obrazac svetlosti koji se reflektuje iz sloja imobilisanog proteina na vrhu biosenzora i unutrašnjem referentnom sloju. Promene u broju molekula vezanih za vrh biosenzora uzrokuju pomake u interferencijskom obrascu koji se mogu meriti u realnom vremenu. Neograničavajući primer uređaj za bioslojnu interferometriju je sistem ForteBio Octet® RED96 (Pall Corporation). Vidi, npr. Abdiche et al., 2008, Anal. Biochem.377: 209-277.

[0050] Izraz “kon”, kako se ovde koristi, odnosi se na konstantu brzine za pridruživanje antitela antigenu. Konkretno, konstante brzine (kon i koff) i konstante ravnoteže disocijacije se mere koristeći IgG (bivalentno) sa monovalentnim PD-1 antigenom. „Kon", „kon", „konstanta brzine pridruživanja", ili „ka", ovde se koriste naizmenično. Vrednost ukazuje na brzinu vezivanja proteina za njegov ciljni antigen ili brzinu stvaranja kompleksa između antitela i antigena, prikazanu jednačinom: Antitelo("Ab")+Antigen("Ag")�Ab-Ag. Izraz „koff", kako se ovde koristi, odnosi se na konstantu brzine za disocijaciju antitela iz kompleksa antitelo/antigen. koff takođe se označava kao „Koff" ili „konstanta brzine disocijacije". Ova vrednost ukazuje na brzinu disoc jacije antitela od njegovog ci janog antigena ili odvajanje Ab-Ag kompleksa tokom vremena na slobodno antitelo i antigen, kao što je prikazano jednačinom:

Ab+Ag�Ab-Ag.

[0051] Izraz „biološka aktivnost" odnosi se na bilo koje jedno ili više bioloških svojstava molekula (bilo da je prirodno onako kako je pronađeno in vivo, ili obezbeđeno ili omogućeno rekombinantnim sredstvima). Biološka svojstva uključuju, ali nisu ograničena na, vezivanje receptora, indukovanje ćelijske proliferacije, inhibiranje rasta ćelija, indukovanje drugih citokina, indukovanje apoptoze i enzimatsku aktivnost. U nekim realizacijama, biološka aktivnost proteina PD-1 uklјučuje, na primer, promovisanje apoptoze u antigen-specifičnim T ćelijama, smanjenje apoptoze u regulatornim T (Treg) ćel jama, inhibiranje aktivacije T ćelija, inhibiranje proliferacije T ćelija i olakšavanje anergije ili iscrplјivanja T ćel ja.

[0052] Antitelo „sazrelo zbog afiniteta" odnosi se na antitelo sa jednom ili više izmena u jednom ili više CDR-a u poređenju sa matičnim antitelom koje nema takve izmene, a takve promene rezultiraju poboljšanjem afiniteta antitela za antigen.

[0053] „Himerno antitelo" kao što se ovde koristi odnosi se na antitelo u kojem deo teškog i/ili lakog lanca potiče iz određenog izvora ili vrste, dok najmanje deo ostatka teškog i/ili lakog lanca potiče iz drugog izvora ili vrste. U pojedinim realizacijama, himerno antitelo se odnosi na antitelo koje sadrži najmanje jedan varijabilni region prve vrste (poput miša, pacova, majmuna makaki rakojeda, itd.) i najmanje jedan konstantni region iz druge vrste (kao što su ljudi, majmuni makaki rakojedi, etc.). U pojedinim realizacijama, himerno antitelo sadrži najmanje jedan varijabilni region miša i najmanje jedan humani konstantni region. U pojedinim realizac jama, himerno antitelo sadrži najmanje jedan varijabilni region makaki rakojeda i najmanje jedan humani konstantni region. U pojedinim realizacijama, svi varijabilni regioni himernog antitela su iz prve vrste, a svi konstantni regioni himernog antitela su iz druge vrste. Himerni konstrukt, takođe, može biti funkcionalni fragment, kao što je gore navedeno.

[0054] „Humanizovano antitelo" kako se ovde koristi odnosi se na antitelo u kome je najmanje jedna amino-kiselina u okvirnom regionu nehumanog varijabilnog regiona zamenjena odgovarajućom amino-kiselinom iz humanog varijabilnog regiona. U pojedinim realizacijama, humanizovano antitelo sadrži najmanje jedan humani konstantni region ili njegov fragment. U pojedinim realizac jama, humanizovano antitelo je fragment antitela, kao što je Fab, scFv, (Fab')2, itd. Izraz humanizovan, takođe, označava obl ke nehumanih (na primer, mišjih) antitela koja su himerni imunoglobulini, imunoglobulinski lanci ili njihovi fragmenti (kao što su Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ili druge podsekvence antitela koje vežu antigen) koji sadrže minimalnu sekvencu nehumanog imunoglobulina. Humanizovana antitela mogu da uključuju humane imunoglobuline (antitelo primaoca) u kojima su ostaci iz komplementarnog determinišućeg regiona (CDR) primaoca supstituisani ostacima iz CDR vrste koja nije čovek (antitelo donora), kao što su miš, pacov ili zec koji ima željenu specifičnost, afinitet i sposobnost. U nekim slučajevima, ostaci Fv okvirnog regiona (FR) humanog imunoglobulina zamenjuju se odgovarajućim nehumanim ostacima. Pored toga, humanizovano antitelo može sadržati ostatke koji se ne nalaze ni u antitelu primaocu ni u uveženim CDR ili okvirnim sekvencama, ali su uključeni radi daljeg rafiniranja i optimizacije performansi antitela. Uopšteno, humanizovano antitelo može sadržati uglavnom sve najmanje jednog a obično dva varijabilna domena, u kojima sve ili suštinski svi CDR regioni odgovaraju onima nehumanog imunoglobulina i svi ili suštinski svi regioni FR su oni iz humane imunoglobulinske konsenzusne sekvence. U pojedinim realizacijama, humanizovano antitelo, takođe, može da sadrži bar deo imunoglobulinskog konstantnog regiona ili domena (Fc), obično humanog imunoglobulina. Ostali oblici humanizovanih antitela imaju jedan ili više CDR-ova (CDR L1, CDR L2, CDR L3, CDR H1, CDR H2 i/ili CDR H3) koji su izmenjeni u odnosu na originalna antitela, koja se takođe nazivaju jednim ili više CDR „izvedenim iz" jednog ili više CDR iz originalnog antitela. Kao što se podrazumeva, humanizovana sekvenca može se identifikovati po njenoj primarnoj sekvenci i ne označava nužno postupak kojim je antitelo stvoreno.

[0055] „CDR-graftovano antitelo" kako se ovde koristi odnosi se na humanizovano antitelo u kome jedan ili više regiona koji određuju komplementarnost (CDR) prve vrste (koja n je čovek) je graftovan u okvirne regione (FR) druge (ljudske) vrste.

[0056] „Humano antitelo" kako se ovde koristi obuhvata antitela proizvedena kod ljudi, antitela proizvedena kod nehumanih životinja koja sadrže humane imunoglobulinske gene, kao što su XenoMouse<®>miševi, i antitela odabrana pomoću in vitro metode, kao što je prikaz faga (Vaughan et al., 1996, Nature Biotechnology, 14: 309-314; Sheets et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95: 6157-6162; Hoogenboom i Vinter, 1991, J. Mol. Biol., 227: 381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222: 581), pri čemu se repertoar antitela zasniva na sekvenci humanog imunoglobulina. Izraz „humano antitelo" označava rod sekvenci koje su humane sekvence. Prema tome, izraz nije označavanje procesa kojim je antitelo stvoreno, već rod sekvenci koje su relevantne.

[0057] „Funkcionalni Fc region" poseduje „efektorsku funkciju" nativne sekvence Fc regiona. Primeri „efektorske funkcije" uključuju vezivanje Fc receptora; C1q vezivanje; CDC; ADCC; fagocitozu; smanjivanje regulisanja ćelijskih površinskih receptora (na primer B ćelijskog receptora; BCR), itd. Takve efektorske funkc je obično zahtevaju da se Fc region kombinuje sa vezujućim domenom (na primer, varijabilnim domenom antitela) i može se proceniti korišćenjem različitih testova.

[0058] „Prirodna sekvenca Fc regiona" sadrži sekvencu amino-kiselina identičnu sekvenci amino-kiselina Fc regiona koja se nalazi u prirodi. Nativne sekvence humanih Fc regiona uključuju nativnu sekvencu Fc regiona humanog IgG1 (ne-A i A alotipi); nativnu sekvencu Fc regiona humanog IgG2; nativnu sekvencu humanog IgG3 Fc regiona; i nativnu sekvencu Fc regiona humanog IgG4, kao i njhove prirodne var jante.

[0059] „Varijanta Fc regiona" sadrži sekvencu amino-kiselina koja se razlikuje od one nativne sekvence Fc regiona na osnovu najmanje jedne modifikacije amino-kiselina. U pojedinim realizacijama, „varijanta Fc regiona" sadrži sekvencu amino-kiselina koja se razlikuje od nativne sekvence Fc regiona na osnovu najmanje jedne modifikacije amino-kiselina, ali zadržava najmanje jednu efektorsku funkciju nativne sekvence Fc regiona. U pojedinim realizacijama, var janta Fc regiona ima najmanje jednu supstituciju amino-kiselina u poređenju sa nativnom sekvencom Fc regiona ili sa Fc regionom matičnog polipeptida, na primer, od oko jedne do oko deset supstitucija amino-kiselina, i pože jno, od oko jedne do oko pet supstituc ja amino-kiselina u nativnoj sekvenci Fc regiona ili u Fc regionu matičnog polipeptida. U pojedinim realizacijama, var janta Fc regiona ovde će imati najmanje oko 80% identiteta sekvence sa matičnom sekvencom Fc regionom i/ili sa Fc regionom matičnog polipeptida, sa najmanje oko 90% identiteta sekvence, sa najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, ili najmanje oko 99% identiteta sekvence sa njima.

[0060] „Fc receptor" ili „FcR" opisuje receptor koji se vezuje za Fc region antitela. U pojedinim realizacijama, FcγR je nativni humani FcR. U pojedinim realizac jama, FcR je onaj koji vezuje IgG antitelo (gama receptor) i uključuje receptore FcγRI, FcγRII i FcγRIII potklasa, uključujući alelne varijante i alternativno splajsovane oblike tih receptora. FcγRII receptori uključuju FcγRIIA („aktivirajući receptor") i FcγRIIB („receptor koji inhibira"), koji imaju slične sekvence amino-kiselina koje se prvenstveno razlikuju u njihovim citoplazmatskim domenima. Aktiviranje receptora FcγRIIA sadrži motiv aktivacije na osnovu imunoreceptora tirozin (ITAM) u citoplazmatskom domenu. Inhibitorski receptor FcγRIIB sadrži motiv inhibicije na bazi imunoreceptora tirozina (ITIM) u svom citoplazmatskom domenu. (videti, na primer, Daeron, Annu. Rev. Immunol.15: 203-234 (1997)). FcR su opisani, na primer, u Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); and de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Ostali FcR, uključujući one koji će se identifikovati u budućnosti, obuhvaćeni su ovde izrazom „FcR".

[0061] Izraz „Fc receptor" ili „FcR", takođe, uključuje neonatalni receptor, FcRn, koji je odgovoran za prenos majčinih IgG na fetus (Guier et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) i Kim et al., J. Immunol.24: 249 (1994)) i regulaciju homeostaze imunoglobulina. Poznati su postupci merenja vezivanja za FcRn (vidi, na primer, Ghetie and Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem.279(8):6213-6216 (2004); WO 2004/92219 (Hinton et al.).

[0062] „Efektorske funkcije" odnose se na biološke aktivnosti koje se mogu pripisati Fc regionu antitela, a koje se razlikuju u zavisnosti od izotipa antitela. Primeri funkcija efektorskih antitela uključuju: Clq vezivanje i citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC); vezanje Fc receptora; ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC); fagocitozu; regulaciju smanjenja ćelijskih površinskih receptora (na primer B ćelijskih receptora); i aktivaciju B ćelija.

[0063] „Humane efektorske ćelije" su leukociti koji eksprimuju jedan ili više FcR i obav jaju efektorske funkcije. U pojedinim realizacijama, ćelije eksprimuju najmanje FcγRIII i obavljaju ADCC efektorske funkcije. Primeri humanih leukocita koji posreduju ADCC uk jučuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC), prirodne ćelije ubice (NK), monocite, citotoksične T ćel je i neutrofile. Efektorske ćelije mogu biti izolovane iz nativnog izvora, na primer, iz krvi.

[0064] „Ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela" ili „ADCC" odnosi se na oblik citotoksičnosti u kojem se izlučeni Ig vezan na Fc receptore (FcR) prisutne na određenim citotoksičnim ćelijama (na primer, NK ćelije, neutrofili i makrofagi) omogućava ovim citotoksičnim efektorskim ćelijama da se specifično vežu za ciljnu ćeliju koja nosi antigen i posle toga ubiju ciljnu ćeliju citotoksima. Primarne ćel je za posredovanje ADCC, NK ćelije, eksprimuju samo FcγRIII, dok monociti eksprimuju FcγRI, FcγRII i FcγRIII. Ekspresija FcR na hematopoetskim ćelijama sumirana je u Tabeli 3 na strani 464 od Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Za procenu ADCC aktivnosti molekula od interesa, in vitro ADCC test, kakav je opisan u SAD Pat. Nos.5,500,362 or 5,821,337 ili SAD Pat. No. 6,737,056 (Presta), se može sprovesti. Korisne efektorske ćelije za takve testove uključuju PBMC i NK ćelije. Alternativno, ili dodatno, ADCC aktivnost molekula od interesa može se proceniti in vivo, na primer, na životinjskom modelu kakav je onaj opisan u Clynes et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (SAD) 95:652-656 (1998). Dodatne varijante polipeptida sa izmenjenim sekvencama amino-kiselina Fc regiona (polipeptidi sa varijantom Fc regiona) i povećanom ili smanjenom ADCC aktivnošću su opisane, na primer, u SAD Pat. No. 7,923,538, i SAD Pat. No.

7,994,290.

[0065] „Citotoksičnost zavisna od komplementa" ili „CDC" odnosi se na lizu ciljne ćelije u prisustvu komplementa. Aktivacija klasičnog puta komplementa započinje vezanjem prve komponente sistema komplementa (C1q) na antitela (odgovarajuće potklase), koja su vezana za njihov kognatni antigen. Za procenu aktivacije komplementa, CDC test, na primer, kao što je opisano u Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Metods 202: 163 (1996), može se izvesti. Vari jacije polipeptida sa izmenjenim sekvencama amino-kiselina Fc regiona (polipeptidi sa var jantom Fc regiona) i povećanom ili smanjenom sposobnošću vezanja C1k opisane su, na primer, u SAD Pat. No.6,194,551 B1, SAD Pat. No. 7,923,538, SAD Pat. No. 7,994,290 i WO 1999/51642. Vidi takođe, na primer, Idusogie et al., J. Immunol.164: 4178-4184 (2000).

[0066] Polipeptidna varijanta sa „izmenjenim" afinitetom vezivanja FcR ili ADCC aktivnošću je ona koja ima ili pojačanu ili smanjenu aktivnost vezivanja FcR i/ili ADCC aktivnost u poređenju sa matičnim polipeptidom ili polipeptidom koji sadrži Fc regiona nativne sekvence. Polipeptidna varijanta koja „pokazuje povećano vezivanje“ za FcR veže bar jedan FcR sa boljim afinitetom od matičnog polipeptida. Polipeptidna varijanta koja „pokazuje smanjeno vezivanje“ za FcR, veže bar jedan FcR sa nižim afinitetom od matičnog polipeptida. Takve varijante koje pokazuju smanjeno vezivanje za FcR mogu imati malo ili nimalo primetno vezivanje za FcR, na primer, 0-20% vezivanja za FcR u poređenju sa nativnom sekvencom IgG Fc regiona.

[0067] Polipeptidna varijanta koja „efikasnije posreduje ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC) u prisustvu ćelija humanog efektora“ nego matično antitelo je ona koja je in vitro ili in vivo ef kasnija u posredovanju ADCC-a, kada su količine polipeptidne varijante i roditeljskog antitela korišćene u testu suštinski iste. Uglavnom, takve var jante će biti identifikovane upotrebom in vitro ADCC testa kao što je ovde stavljeno na uvid, ali se razmatraju drugi testovi ili postupci za određivanje ADCC aktivnosti, na primer na životinjskom modelu, itd.

[0068] Izraz „suštinski sličan" ili „suštinski isti", kako je ovde korišćen, označava dovoljno visok stepen sličnosti dve ili više numeričkih vrednosti, tako da bi stručnjak u tehnici smatrao da razlika između dve ili više vrednosti ima malo ili n kakvo biološko i/ili statističko značenje u kontekstu biološke karakteristike merene pomenutom vrednošću. U pojedinim realizacijama, dve ili više suštinski sličnih vrednosti razlikuju se ne više od oko bilo kojih od 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, ili 50%.

[0069] Izraz „bitno drugačiji", kako se ovde koristi, označava dovoljno visok stepen razlike između dve numeričke vrednosti da bi stručnjak u tehnici uzeo u obzir razliku između dve vrednosti kao statistički značajnu u kontekstu biološke karakteristike merene pomenutim vrednostima. U pojedinim realizac jama, dve bitno različite numeričke vrednosti se razl kuju za više od oko bilo kojih od 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80% , 90% ili 100%.

[0070] Izraz „značajno smanjen", kako se ovde koristi, označava dovoljno visok stepen smanjenja između numeričke vrednosti i referentne numeričke vrednosti tako da bi stručnjak u tehnici uzeo u obzir da razlika između dve vrednosti ima statistički značaj u kontekstu biološke karakteristike merene pomenutim vrednostima. U pojedinim realizacijama, značajno smanjene numeričke vrednosti su smanjene za više od oko bilo kojih od 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80% , 90% ili 100% u odnosu na referentnu vrednost.

[0071] Izraz „vodeća sekvenca" odnosi se na sekvencu ostataka amino-kiselina smeštenih na N-kraju polipeptida koja olakšava sekreciju polipeptida iz ćelije sisara. Vodeća sekvenca se može odcepiti izvozom polipeptida iz ćelije sisara, formirajući zreli protein. Vodeće sekvence mogu biti prirodne ili sintetičke, i mogu biti heterologne ili homologne proteinu na koji su vezane.

[0072] Polipeptid „nativne sekvence" sadrži polipeptid koji ima istu sekvencu amino-kiselina kao polipeptid koji se nalazi u prirodi. Stoga, polipeptid nativne sekvence može imati sekvencu amino-kiselina prirodnog polipeptida od bilo kojeg sisara. Takav polipeptid nativne sekvene može biti izolovan iz prirode ili se može proizvesti rekombinantnim ili sintetičkim načinom. Izraz polipeptid „nativne sekvence" posebno obuhvata skraćene ili izlučene oblike polipeptida (na primer, ekstracelularne sekvence domena) koji se javljaju u prirodi, varijantne oblike koji se javljaju u prirodi (na primer, alternativno spojeni oblici) i alelne varijante polipeptida koje se javljaju u prirodi.

[0073] Polipeptidna „varijanta“ znači biološki aktivni polipeptid koji ima najmanje oko 80% identiteta sekvence amino-kiselina sa matičnim polipeptidom nativne sekvence nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalni procenat identiteta sekvence i ne uzimajući u obzir konzervativne supstitucije kao deo identiteta sekvence. Takve varijante uključuju, na primer, polipeptide gde se jedan ili više ostataka aminokiselina dodaje ili briše na N- ili C-kraju polipeptida. U pojedinim realizacijama, varijanta će imati najmanje oko 80% identiteta sekvence amino-kiselina. U pojedinim realizac jama, varijanta će imati najmanje oko 90% identiteta sekvence amino-kiselina. U pojedinim realizacijama, varijanta će imati najmanje oko 95% identiteta sekvence aminokiselina sa polipeptidom nativne sekvence.

[0074] Kao što se ovde koristi, „Procenat (%) identiteta sekvenci amino-kiselina" i „homolog ja" u odnosu na sekvencu peptida, polipeptida ili antitela su definisani kao procenat ostataka amino-kiselina u kandidatskoj sekvenci koji su identični sa ostacima amino-kiselina u specifičnoj peptidnoj ili polipeptidnoj sekvenci, nakon poravnanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalni procenat identiteta sekvence i ne uzimajući u obzir bilo kakve konzervativne supstitucije kao deo identiteta sekvence. Poravnanje radi određivanja procenta identiteta sekvence amino-kiselina može se postići na različite načine koji su poznati u tehnici, na primer, korišćenjem javno dostupnog računarskog softvera, poput softvera BLAST, BLAST-2, ALIGN or MEGALIGN<TM>(DNASTAR). Stručnjaci u tehnici mogu odrediti odgovarajuće parametre za merenje poravnanja, uključujući bilo koje algoritme potrebne za postizanje maksimalnog poravnanja po celoj dužini sekvence koja se upoređuje.

[0075] Supstitucija amino-kiselina može uključivati, ali nije ograničena na, zamenu jedne amino-kiseline u polipeptidu drugom amino-kiselinom. Primeri supstitucija prikazani su u Tabeli 1. Zamene amino-kiselina mogu se uvesti u antitelo od interesa a proizvodi su skenirani na željenu aktivnost, na primer, zadržavanje / poboljšanje vezivanja antigena, smanjena imunogenost ili poboljšani ADCC ili CDC.

[0076] Amino-kiseline mogu biti grupisane prema zajedničkim svojstvima bočnog lanca:

(1) hidrofobne: Norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) neutralne hidrofilne: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) acidične: Asp, Glu;

(4) osnovne: His, Lys, Arg;

(5) ostatke koji utiču na orijentaciju lanca: Gly, Pro;

(6) aromatične: Trp, Tyr, Phe.

[0077] Nekonzervativne supstitucije podrazumevaće razmenu člana jedne od ovih klasa sa drugom klasom.

[0078] Izraz „vektor" koristi se za opisivanje polinukleotida koji se može konstruisati tako da sadrži klonirani polinukleotid ili polinukleotide koji se mogu razmnožavati u ćeliji domaćinu. Vektor može da sadrži jedan ili više sledećih elemenata: poreklo replikacije, jednu ili više regulatornih sekvenci (kao što su, na primer, promotori i/ili pojačivači) koji regulišu ekspresiju polipeptida od interesa i/ili jedan ili više selektivnih marker geni (kao što su, na primer, geni za rezistenc ju na antibiotike i geni koji se mogu koristiti u kolorimetrijskim testovima, na primer, β -galaktozidaza). Izraz „ekspresioni vektor" odnosi se na vektor koji se koristi da eksprimuje polipeptid od interesa u ćeliji domaćinu.

[0079] „Ćelija domaćin" odnosi se na ćeliju koja može biti ili je primalac vektora ili izolovanog polinukleotida. Ćelije domaćini mogu biti prokariotske ćelije ili eukariotske ćelije. Primerne eukariotske ćelije uključuju ćelije sisara, kao što su životinjske ćelije primata ili neprimata; ćelije g jivica, poput kvasca; biljne ćelije; i ćelije insekata. Neograničavajuće primerne ćelije sisara uključuju, ali nisu ograničene na, NSO ćelije, PER.C6® ćelije (Crucell), i 293 i CHO ćelije, i njihove derivate, kao što su 293-6E i DG44 ćelije, respektivno. Ćelije domaćina uključuju potomstvo jedne ćelije domaćina, a potomstvo ne mora nužno biti potpuno identično (u morfolog ji ili u genomskom DNK komplementu) sa izvornom matičnom ćel jom zbog prirodne, slučajne ili namerne mutacije. Ćelija domaćina uk jučuje ćelije koje su transfektovane in vivo s polinukleotidom(ima) ovde obezbeđenim.

[0080] Izraz „izolovan" kako se ovde koristi odnosi se na molekul koji je odvojen od bar nekih komponenti sa kojima se obično nalazi u prirodi ili proizvodi. Na primer, polipeptid se naziva „izolovan“ kada je odvojen od bar nekih komponenata ćelije u kojoj je proizveden. Tamo gde polipeptid izlučuje ćelija posle ekspres je, fizičko odvajanje supernatanta koji sadrži polipeptid od ćel je koja ga je proizvela smatra se „izolovanjem" polipeptida. Slično tome, polinukleotid se naziva „izolovan“ kada n je deo većeg polinukleotida (kao što je, na primer, genomska DNK ili mitohondrijska DNK, u slučaju DNK polinukleotida), a koji se obično nalazi u prirodi, ili je odvojen od barem nekih komponenti ćelije u kojoj je proizveden, na primer, u slučaju RNK polinukleotida. Prema tome, DNK polinukleotid koji se nalazi u vektoru unutar ćelije domaćina može se nazvati „izolovanim“.

[0081] Izrazi „pojedinac" ili „subjekt" ovde se naizmenično koriste za označavanje životinje; na primer sisara. U nekim ralizacijama, obezbeđeni su postupci lečenja sisara, uključujući, ali ne ograničavajući se na ljude, glodare, simijane, mačke, pse, kopitere, goveda, svinje, ovce, koze, laboratorijske sisare, sisare sa farmi, sportske sisare i sisare kućne jubimce. U nekim primerima, „pojedinac" ili „subjekt" odnosi se na pojedinca ili subjekt kome je potrebno lečenje bolesti ili poremećaja. U pojedinim realizacijama, subjekt koji treba da dobije tretman može biti pacijent, ističući činjenicu da je subjekt identifikovan kao onaj koji ima poremećaj od značaja za lečenje (tretman) ili da ima adekvatan rizik da razvoj poremećaja.

[0082] „Bolest" ili „poremećaj" kako se ovde koristi odnosi se na stanje u kome je lečenje potrebno i/ili poželjno.

[0083] „Rak" i „tumor", kao što se ovde koristi, su uzajamno zamenljivi izrazi koji se odnose na bilo kakav nenormalan rast ćelija ili tkiva ili proliferac ju životinje. Kako se ovde koriste, izrazi „rak“ i „tumor“ obuhvataju čvrste i hematološke/limfne karcinome i, takođe, obuhvataju zloćudni, premaligni i benigni rast, kao što je displaz ja. Primeri raka uključuju, ali nisu ograničeni na, karcinom, limfom, blastom, sarkom i leukemiju. Konkretn ji neograničavajući primeri takvih kancera uključuju skvamozni ćelijski karcinom, mirkocelularni karcinom pluća, rak hipofize, rak jednjaka, astrocitom, sarkom mekog tkiva, nemirkocelularni karcinom pluća, adenokarcinom pluća, skvamozni karcinom pluća, rak peritoneuma, hepatocelularni karcinom, rak gastrointestinalnog trakta, rak pankreasa, glioblastom, rak grlića maternice, rak jajn ka, rak jetre, rak mokraćne bešike, hepatom, rak dojke, rak debelog creva, kolorektalni karcinom, karcinom endometrijuma ili materice, rak pljuvačne žlezde, rak bubrega, renalni karcinom, rak jetre, rak prostate, rak vulve, rak štitne žlezde, hepatocelularni karcinom, rak mozga, rak endometrijuma, rak testisa, holangiokarcinom, karcinom žučne kesice, rak želuca, melanom i razne vrste raka glave i vrata.

[0084] Kao što je ovde korišćeno, „lečenje“ je pristup za dobijanje korisnih ili željenih kliničkih rezultata. „Lečenje“, kao što je ovde korišćeno, obuhvata svako davanje ili primenu terap je za bolest kod sisara, uključujući čoveka. U svrhu ovog pronalaska, korisni ili željeni klinički rezultati uključuju, ali nisu ograničeni na, bilo koji ili više od sledećeg: ublažavanja jednog ili više simptoma, smanjenja obima bolesti, sprečavanja ili odlaganja širenja (na primer, metastaze, na primer, metastaza u pluća ili limfni čvor) bolesti, sprečavanje ili odlaganje recidiva bolesti, odlaganje ili usporavanje napredovanja bolesti, poboljšanje stanja bolesti, inhibiranje bolesti ili napredovanja bolesti, inhibiranje ili usporavanje bolesti ili njenog napredovanja, zaustavljanje njenog razvoja i remisiju (bilo delimičnu ili ukupnu). Takođe „lečenje“ obuhvata i smanjenje patoloških posledica proliferativne bolesti. Ovde prikazani postupci razmatraju bilo koji od ili više ovih aspekata lečenja. U skladu sa gore navedenim, izraz lečenje/tretman ne zahteva stopostotno uklanjanje svih aspekata poremećaja.

[0085] „Ublažavanje“ znači smanjivanje ili poboljšanje jednog ili više simptoma u poređenju sa ne davanjem anti-PD-1 antitela. „Ublažavanje“, takođe, uključuje skraćenje ili smanjenje trajanja simptoma.

[0086] U kontekstu raka, izraz „lečenje“ uključuje bilo koje od ili sve: inhibiranje rasta ćelija raka, inhibiranje repl kacije ćelija raka, smanjenje ukupnog opterećenja tumora i ublažavanje jednog ili više simptoma povezanih sa bolešću.

[0087] Izraz „biološki uzorak“ označava količinu materije iz žive ili ranije žive stvari. Takve materije uključuju, ali nisu ograničene na, krv (na primer, cela krv), plazmu, serum, urin, amniotsku tečnost, sinovijalnu tečnost, endotelne ćelije, leukocite, monocite, druge ćelije, organe, tkiva, koštanu srž, limfne čvorove i slezinu.

[0088] Uzorak koji ima „povišeni nivo PD-1" ili „eksprimuje povišeni nivo PD-1" ili je „PD-1<HIGH>" znači da nivo PD-1 je takav da bi stručnjak u tehnici mogao da zaključi da se rak može lečiti PD-1 terapijom, kao što je ovde obezbeđeno antitelo. U pojedinim realizacijama, „povišen nivo PD-1“ je onaj u kome 1% ćelija unutar uzorka tumora pokazuje obojenje za PD-1. U pojedinim realizacijama, „visok nivo" u pogledu PD-1 je 1% ili više obojenja, na primer, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ili 100% ćelija unutar uzorka tumora pokazuju obojenje. U pojedinim realizacijama, nivoi PD-1 se mogu meriti hromogenim IHC ili imunofluorescentnim IHC (Aqua bodovanje).

[0089] Uzorak koji „eksprimuje PD-1" ili ima „pozitivno obojenje za PD-1" ili je „PD-1 pozitivan" znači da 1% ili više ćelija imaju obojenje membrane na PD-1. U pojedinim realizacijama, uzorak koji je pozitivan na PD-1 pokazuje najmanje slabo, umereno i/ili jako ćelijsko bojenje (zasnovano na membranskoj ekspres ji PD-1). Uzorak sa umerenim ili jakim obojenjem ćelija na PD-1 takođe se smatra „PD-1<HIGH>."

[0090] Uzorak koji ima „nizak nivo PD-L1“ ili eksprimuje „PD-L1 na niskom nivou“ ili je „PD-L1<LOW>" znači da je nivo PD-L1 ispod nivoa ekspres je praga za rak koji je normalno indikovan za lečenje PD-1 terapijom. U pojedinim realizacijama, „nizak nivo PD-L1" je onaj u kome manje od 5% ćelija u tumoru pokazuje obojenje membrane na PD-L1. U pojedinim realizacijama, „nizak nivo" u pogledu PD-L1 je manji od 5% obojenja, na primer, 4%, 3%, 2%, 1% ili 0% ćelija tumora pokazuju obojenje. U pojedinim realizacijama, nivoi PD-L1 se mogu meriti hromogenim IHC ili imunofluorescentnim IHC (Aqua bodovanje). Za uzorak koji ne pokazuje PD-L1 koji se može detektovati se, takođe, može reći da „eksprimuje nizak nivo PD-L1." Prema tome, nijedan PD-L1 koji se može otkriti nije obuhvaćen terminom „nizak“.

[0091] Uzorak koji ima „povišeni nivo PD-L1" ili „eksprimuje povišeni nivo PD-L1" ili je „PD-L1<HIGH>" znači da nivo PD-L1 je takav da bi stručnjak u tehnici mogao da zaključi da se rak može lečiti PD-1 terapijom. U nekim realizacijama, „povišeni nivo PD-L1“ je onaj u kome 50% ćelija u tumoru ili više imaju membransko bojenje PD-L1, na primer, 50, 60, 70, 80, 90 ili 100% ćelija tumora pokazuju membransko bojenje. U pojedinim realizacijama, nivoi PD-L1 se mogu meriti hromogenim IHC ili imunofluorescentnim IHC (Aqua bodovanje).

[0092] Uzorak koji „eksprimuje PD-L1" ili ima „pozitivno obojenje za PD-L1" ili je „PD-L1 pozitivan" znači da 1% ili više ćelija imaju obojenje membrane na PD-L1. U pojedinim realizacijama, uzorak koji je pozitivan na PD-L1 pokazuje najmanje slabo, umereno i/ili jako ćelijsko bojenje (zasnovano na membranskoj ekspresiji PD-L1).

[0093] Uzorak kome „nedostaje PD-L1 ekspresija“ ili ima „negativno bojenje za PD-L1“ ili je „PD-L1 negativan“ znači da IHC-om ne može da se prepozna PD-L1 eksprimovanje na površinu ćelija uzorka, kao što je hromogenim IHC ili imunofluorescentnim IHC (Aqua bodovanje). PD-L1 negativni uzorak se takođe smatra „PD-L1<LOW>."

[0094] U pojedinim realizacijama, može se koristiti bilo koji postupak za merenje nivoa PD-L1. U pojedinim realizacijama, ovo može uključivati korišćenje PD-L1 IHC 22C3 pharmDx testa (Dako Inc., Carpinteria, Kaliforn ja), koji je klinički potvrđen i odobren od FDA test za procenu PD-L1 ekspresije u NSCLC. PD-L1 IHC 22C3 pharmDx je kvalitativni imunohistohem jski test koji koristi monoklono mišje anti-PD-L1 antitelo (klon 22C3), koje se može koristiti u detekciji PD-L1 proteina u formalin-fiksnom uronjenom u parafin (FFPE) tkivu nemirkocelularnog raka pluća (NSCLC). Ispitivanje se može obaviti na sistemu Autostainer Link 48 i vizualizovati korišćenjem EnVision FLEX sistema. PD-L1 ekspresija proteina je kvalifikovana korišćenjem Skora tumorske proporcije - Tumor Proportion Score (TPS), koji je procenat održivih tumorskih ćelija koje pokazuju delimično ili potpuno obojenje membrane. U pojedinim realizacijama, uzorak se smatra PD-L1 pozitivnim ako TPS ≥ 1% održivih ćelija tumora pokazuje obojenje membrane bilo kojim intenzitetom. U pojedinim realizacijama, uzorak se smatra PD-L1<HIGH>ako TPS ≥ 50% održivih ćelija tumora pokazuje obojenje membrane bilo kojim intenzitetom. PD-L1 IHC 22C3 pharmDx je prikazan kao pomoć u identif kovanju bolesnika sa NSCLC za lečenje KEYTRUDA® (pembrolizumab). Dodatni detalji o sistemu bodovanja i odgovoru na pembrolizumab opisani su u članku Garon et al. (N Engl J Med 2015; 372: 2018-28).

[0095] Izraz „kontrola" odnosi se na kompozic ju za koju se zna da ne sadrži analit („negativna kontrola") ili da sadrži analit („pozitivna kontrola"). Pozitivna kontrola može sadržavati poznatu koncentraciju analita. „Kontrola,"„pozitivna kontrola" i „kalibrator" mogu se ovde koristiti naizmenično da bi se odnosili na kompoziciju koja sadrži poznatu koncentraciju analita. „Pozitivna kontrola" se može koristiti za utvrđivanje karakteristika performansi testa i predstavlja koristan pokazatelj integriteta reagenasa (na primer, analita).

[0096] „Predodređeni presek" i „unapred određeni nivo" generalno se odnose na vrednost preseka testa koja se koristi za procenu rezultata dijagnostičke/prognostičke/terapeutske efikasnosti, upoređujući rezultate ispitivanja sa prethodno određenim presekom/nivom, gde je unapred određeni prese/ nivo već umrežen ili povezan sa različitim kliničkim parametrima (na primer, težinom bolesti, napredovanjem/nenapredovanjem/poboljšanjem, itd.). Iako ovo otkriće može pružiti primere unapred definisanih nivoa, dobro je poznato da vrednosti preseka mogu varirati u zavisnosti od prirode imunoprobe (na primer, korišćenih antitela, itd.). Dalje je na stručnjaku u tehnici da prilagodi ovaj pronalazak za druge imunoprobe kako bi se postigle vrednosti preseka specifične za imunoprobu za te druge imunoprobe na osnovu ovog pronalaska. Dok precizna vrednost unapred određenog preseka / nivoa može varirati između ispitivanja, korelacije kao što su ovde opisane (ako postoje) mogu biti generalno primenljive.

[0097] Izrazi „inhibicija" ili „inhibiraju" odnose se na smanjenje ili prestanak bilo koje fenotipske karakteristike ili na smanjenje ili prestanak učestalosti, stepena ili verovatnoće te karakterist ke. „Smanjiti" ili „inhibirati" znači da se smanji, umanji ili zaustavi aktivnost, funkcija i/ili količina u poređenju sa referentnom vrednošću. U pojedinim realizacijama, pod „smanjenjem" ili „inhibicijom" podrazumeva se sposobnost izazivanja ukupnog smanjenja od 20% ili više. U pojedinim realizacijama, pod „smanjenjem" ili „inhibicijom" podrazumeva se sposobnost izazivanja ukupnog smanjenja od 50% ili više. U pojedinim realizacijama, pod „smanjenjem" ili „inh bicijom" podrazumeva se sposobnost izazivanja ukupnog smanjenja od 75%, 85%, 90%, 95% ili više. U pojedinim realizacijama, gore navedena količina se inhibira ili smanjuje tokom vremena, u odnosu na kontrolnu dozu (kao što je placebo) tokom istog perioda. „Referenca" koja se ovde koristi odnosi se na bilo koji uzorak, standard ili nivo koji se koristi za svrhe poređenja. Referenca se može dobiti iz zdravog i/ili ne obolelog uzorka. U nekim primerima, referenca se može dobiti iz netretiranog uzorka. U nekim primerima, referenca se dobija od neobolelog pojedinca na nelečenom uzorku. U nekim primerima, referenca se dobija od jedne ili više zdravih osoba koje nisu subjekt ili pacijent.

[0098] Kao što je ovde korišćeno, „odlaganje razvoja bolesti" znači odlaganje, ometanje, usporavanje, stabilizovanje, suzb janje i/ili odlaganje razvoja bolesti (poput raka). Ovo odlaganje može biti za različito vreme, zavisno od istorije bolesti i/ili pojedinca koji se leči. Kao što je očigledno stručnjaku u tehnici, dovoljno ili značajno odlaganje može, u stvari, obuhvatiti prevenciju, tako da pojedinac ne razvije bolest. Na primer, rak u kasnoj fazi, poput razvoja metastaza, može da se odloži.

[0099] „Sprečavanje", kako se ovde koristi, uk jučuje obezbeđivanje profilakse u vezi sa pojavom ili ponavljanjem bolesti kod subjekta koji može biti predisponiran za bolest, ali još uvek mu n je bio d jagnostikovana bolest. Ako nije drugačije određeno, izrazi „smanjiti“, „inhibirati“ ili „sprečiti“ ne označavaju ili ne zahtevaju potpunu prevenciju sve vreme.

[00100] Kao što se ovde koristi, „suzbijanje“ funkcije ili aktivnosti je smanjenje funkc je ili aktivnosti u poređenju sa inače istim uslovima, osim uslova ili parametra od interesa, ili alternativno, u poređenju sa drugim uslovom. Na primer, antitelo koje suzbija rast tumora smanjuje brzinu rasta tumora u poređenju sa brzinom rasta tumora u odsustvu antitela.

[00101] „Terapeutski efikasna količina" supstance/molekula, agonista ili antagonista može varirati u zavisnosti od faktora kao što su stanje bolesti, starost, pol i težina pojedinca, i sposobnosti supstance/molekula, agonista ili antagonista da izazove željeni odgovor kod pojedinca. Terapeutski efikasna količina je, takođe, ona u kojoj bilo koji toksični ili štetni efekti supstance/molekula, agonista ili antagonista su nadmašeni terapeutski korisnim dejstvom. Terapeutski ef kasna količina može se isporučiti u jednoj ili više primena. Terapeutski efikasna količina odnosi se na količinu koja je efikasna u dozama i tokom potrebnog perioda da bi se postigao željeni terapeutski i/ili profilaktički rezultat.

[00102] „Profilaktički efikasna količina" odnosi se na količinu koja je efikasna, u dozama i tokom potrebnog perioda, za postizanje željenog profilaktičkog rezultata. Obično, ali ne i nužno, pošto se profilaktička doza koristi kod subjekata pre ili u ranijem stadijumu bolesti, profilaktički efikasna količina biće manja od terapeutski ef kasne količine.

[00103] Izrazi „farmaceutska formulacija" i „farmaceutska kompozicija" odnose se na preparat koji je u takvom obliku koji omogućava da biološka aktivnost aktivnog(-ih) sastojka bude ef kasna i koji ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za subjekt kome bi se formulacija dala. Takve formulacije mogu biti sterilne.

[00104] „Farmaceutski prihvatljiv nosač" odnosi se na netoksična čvrsta, polučvrsta ili tečna punila, razblaživače, kapsulirajuće materijale, pomoćne formulacije ili nosače uobičajene u tehnici za upotrebu sa terapeutskim agensom koji zajedno sadrže „farmaceutsku kompoziciju" za davanje subjektu. Farmaceutski prihvatljiv nosač nije toksičan za primaoce u korišćenim dozama i koncentracijama i kompatibilan je sa ostalim sastojcima formulacije. Farmaceutski prihvatljiv nosač je pogodan za korišćenu formulaciju.

[00105] „Sterilna" formulacija je aseptična ili suštinski bez živih mikroorganizama i njihovih spora.

[00106] Izraz „IDO inhibitor" odnosi se na sredstvo koje može da inhibira aktivnost indoleamin 2,3-dioksigenaze (IDO) i na taj način preokrene IDO-posredovanu imunosupres ju. IDO inhibitor može inhibirati IDO1 i/ili IDO2 (INDOL1). IDO inhibitor može biti reverzibilni ili nepovratni IDO inhibitor. „Reverzibilni IDO inhibitor" je jedinjenje koje reverzibilno inhibira aktivnost enzima IDO ili na katalitičkom mestu ili na nekatalitičkom mestu, a „nepovratni IDO inhibitor" je jedinjenje koje nepovratno inhibira aktivnost enzima IDO formirajući kovalentnu vezu sa enzimom. Neograničavajući primeri IDO inh bitora uključuju Indoximod (New Link Genetics), INCB024360 (Incyte Corp), 1-metil-D-triptofan (New Link Genetics), i GDC-0919 (Genentech, Inc.).

[00107] „Himerna terapija receptora antigena T ćelija“ ili „CAR-T terapija“ odnosi se na terapeutsko sredstvo koje sadrži T ćeliju genetski modifikovanu da eksprimuje receptor koji prepoznaje antigen eksprimovan po tumorskoj ćeliji. Antigen može biti antigen koji se specifično eksprimuje tumorom ili antigen eksprimovan i ćelijama raka i zdravim tkivom. U pojedinim realizacijama, CAR-T terapija je usvojna CAR-T terapija, u kojoj se T ćelije pacijenta uklanjaju i modifikuju da bi se eksprimovao himerni receptor antigena, a zatim se vraćaju pacijentu. Vidi, npr. Dai et al., 2016, J Natl Cancer Inst, 108 (7): djv439, doi: 10.1093/jnci/djv439; Gill et al., 2015, Blood Rev, pii: S0268-960X(15)00080-6, doi: 10.1016/j.blre.2015.10.003; Gill et al., 2015, Immunol Rev, 263(1):68-89. doi: 10.1111/imr.12243.

[00108] Davanje „u kombinaciji sa" jednim ili više dodatnih terapeutskih sredstava uključuje istovremeno (uporedno) i uzastopno ili sekvencijalno davanje bilo kojim redosledom.

[00109] Izraz „istovremeno" se ovde koristi da označi davanje dva ili više terapeutskih sredstava, pri čemu se bar deo primene preklapa u vremenu ili gde davanje jednog terapeutskog sredstva je u kratkom vremenskom period u odnosu na davanje drugog terapeutskog sredstva. Na primer, dva ili više terapeutskih sredstava se daju sa vremenskim odvajanjem ne dužim od približno navedenog (određenog) broja minuta.

[00110] Izraz „sekvenc jalno" se ovde koristi da označi davanje dva ili više terapeutskih sredstava, gde se davanje jednog ili više sredstava nastavlja posle prekida davanja jednog. ili više drugih sredstava, ili pri čemu davanje jednog ili više sredstava počinje pre primene jednog ili više drugih sredstava. Na primer, davanje dva ili više terapeutskih sredstava se sprovodi sa vremenskim odvajanjem većim od oko određenog broja minuta.

[00111] Kao što je ovde korišćeno, „u kombinaciji sa" odnosi se na primenu jednog načina tretmana pored drugog načina tretmana. Kao takav, „u kombinac ji sa" odnosi se na primenu jednog načina lečenja pre, tokom ili posle primene drugog načina lečenja kod pojedinca.

[00112] Izraz „uložak za pakovanje" koristi se za upućivanje na uputstva koja se obično uključuju u komercijalna pakovanja terapijskih proizvoda, a koja sadrže informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, primeni, kombinovanoj terapiji, kontraindikacijama i/ili upozorenjima u vezi sa upotrebom takvih terapeutskih proizvoda.

[00113] „Proizvod" je svaka proizvodnja (na primer, paket ili ambalaža) ili komplet koji sadrži najmanje jedan reagens, na primer, lek za lečenje bolesti ili poremećaja (na primer, raka), ili sonda za posebno otkrivanje biomarkera ovde opisanog. U pojedinim realizacijama, proizvodnja ili set se promoviše, distribuira ili prodaje kao jedinica za izvođenje ovde opisanih postupaka.

[00114] Izrazi „oznaka" i „detektibilna oznaka" označavaju deo vezan za antitelo ili njegov analit koji izazva reakciju (na primer, vezivanje) između članova specifičnog veznog para, a koji se može prepoznati. Označeni element specifičnog veznog para naziva se „uoč jivo označen". Prema tome, izraz „označeni vezujući protein " odnosi se na protein sa oznakom koja obezbeđuje identifikaciju vezujućeg proteina. U pojedinim realizacijama, oznaka je marker koji se može otkriti i koji može proizvesti signal koji se može prepoznati vizuelnim ili instrumentalnim sredstvima, na primer, ugradnjom radioaktivno obeležene amino-kiseline ili vezanošću za polipeptid biotinil grupa koji se mogu otkriti obeleženim avidinom (na primer, streptavidin koji sadrži fluorescentni marker ili enzimska aktivnost koja se može otkriti optičkim ili kolorimetrijskim metodama). Primeri oznaka za polipeptide uključuju, ali nisu ograničeni na, sledeće: radioizotope ili radionuklide (na primer,<3>H,<14>C,<35>S,<90>Y,<99>Tc,<111>In,<125>I,<131>I,<177>Lu,<166>Ho, ili<153>Sm); hromogene, fluorescentne oznake (na primer, FITC, rodamin, lantanid fosfor), enzimske oznake (na primer, peroksidaza rena, luciferaza, alkalna fosfataza); hemiluminiscentni markeri; biotinil grupe; unapred određeni polipeptidni epitopi prepoznati od strane sekundarnog reportera (na primer, sekvence para leucinskog zatvarača, mesta vezivanja za sekundarna antitela, domeni za vezivanje metala, oznake epitopa); i magnetna sredstva, kao što su gadolinijum helati. Reprezentativni primeri oznaka koje se obično koriste u imunološkom ispitivanju uključuju delove koji proizvode svetlost, na primer, akridin jumska jedinjenja, i delove koji proizvode fluorescenciju, na primer, fluorescein. S tim u vezi, sama grupa (deo) možda neće biti detektabilno označen, ali može postati vidljiv reakcijom sa drugom grupom.

[00115] Izraz „konjugat" odnosi se na antitelo koje je hemijski povezano sa drugom hem jskom grupom, poput terapeutskog ili citotoksičnog sredstva. Izraz „sredstvo" uključuje hem jsko jedinjenje, smešu hemijskih jedinjenja, biološku makromolekulu ili ekstrakt napravljen od bioloških materijala. U pojedinim realizacijama, terapeutski ili citotoksični agensi uključuju, ali nisu ograničeni na, pertusis toksin, taksol, citohalazin B, gramicidin D, etidijum bromid, emetin, mitomicin, etopozid, tenopozid, vinkristin, vinblastin, kolhicin, doksorubicin, daunorubicin, dihidroksi antracin dion, mitoksantron, mitramicin, aktinomicin D, 1-dehidrotestosteron, glukokortikoide, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol i puromicin i njihove analozi ili homologe. Kada se koristi u kontekstu imunološkog testa, konjugirano antitelo može biti detektabilno označeno antitelo koje se koristi kao antitelo za otkrivanje.

II. Anti-PD-1 Antitela

[00116] Obezbeđena su nova izolovana monoklonalna antitela usmerena protiv humanog PD-1. Anti-PD-1 antitela uključuju, ali nisu ograničena na, humana antitela i antitela koja sadrže CDR teškog i/ili lakog lanca koja su ovde razmatrani. U nekim realizac jama, anti-PD-1 antitelo je antagonističko antitelo na PD-1. U nekim realizacijama, anti-PD-1antitelo ovde dato inhibira vezivanje PD-1 za PD-L1 i/ili PD-L2. U nekim realizacijama, ovde dato anti-PD-1antitelo inhibira vezivanje PD-1 za PD-L1. U nekim realizacijama, ovde dato anti-PD-1antitelo inhibira vezivanje PD-1 za PD-L1 i PD-L2. U nekim realizacijama, davanje ovde opisanih antitela na PD-1 pojačava imunološki odgovor kod subjekta i/ili povećava aktivaciju T ćelija kod subjekta.

[00117] Anti-PD-1 antitelo sadrži (a) HCDR1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 21; (b) HCDR2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 22; (c) HCDR3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 23; (d) LCDR1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 25; (e) LCDR2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 26; i (f) LCDR3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 27.

[00118] U nekim realizacijama, anti-PD-1 antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca. U nekim realizacijama, anti-PD-1 antitelo sadrži najmanje jedan teški lanac koji sadrži varijabilni region teškog lanca i najmanje deo konstantnog regiona teškog lanca, i najmanje jedan laki lanac koji sadrži varijabilni region lakog lanca i najmanje deo konstantnog regiona lakog lanca. U nekim realizacijama, anti-PD-1 antitelo sadrži dva teška lanca, pri čemu svaki teški lanac sadrži var jabilni region teškog lanca i najmanje deo konstantnog regiona teškog lanca, i dva laka lanca, pri čemu svaki laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca i najmanje deo konstantnog regiona lakog lanca. Kako se ovde koristi, jednolančani Fv (scFv) ili bilo koje drugo antitelo koje sadrži, na primer, jedan polipeptidni lanac koji sadrži svih šest CDR-a (tri CDR-a teškog lanca i tri CDR-a lakog lanca) smatra se da ima težak lanac i laki lanac. U nekim realizacijama, teški lanac je region anti-PD-1 antitela koji sadrži tri CDR-a teškog lanca. U nekim realizacijama, laki lanac je region anti-PD-1 antitela koja sadrži tri CDR-a lakog lanca.

[00119] U nekim realizacijama, anti-PD-1 antitelo sadrži sve tri VH CDR sekvence izabrane između (a) HCDR1 koja sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 21; (b) HCDR2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 22; i (c) HCDR3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 23; i,

[00120] antitelo sadrži sve tri VL CDR sekvence izabrane između (a) LCDR1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 25; (b) LCDR2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO:26; i (c) LCDR3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 27.

[00121] U nekim realizacijama anti-PD-1 antitelo sadrži (I) VH domen koji sadrži sve tri VH CDR sekvence izabrane između (a) HCDR1 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 21; (b) HCDR2 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 22; i (c) HCDR3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 23; i (II) VL domen koji sadrži sve tri VL CDR sekvence izabrane između (d) LCDR1 koji sadrže sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 25; (e) LCDR2 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 26; i (f) LCDR3 koji sadrži sekvencu amino-kiselina SEQ ID NO: 27.

[00122] U pojedinim realizacijama, anti-PD-1 antitelo sadrži sekvencu varijabilnog domena teškog lanca (VH) koja ima najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identitet sekvence prema sekvenci amino-kiselina SEQ ID NO: 20. U nekim realizacijama, VH sekvenca koja ima najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sadrži supstitucije (na primer, konzervativne supstitucije), umetanja (inserc je) ili brisanja (delecije) u odnosu na referentnu sekvencu, ali anti-PD-1 antitelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost da se veže za PD-1. U nekim realizacijama, ukupno 1 do 10 amino-kiselina je supstituisano, umetnuto i/ili izbrisano u SEQ ID NO: 20. U nekim realizacijama se supstitucije, umetanja ili brisanja dešavaju u regionima izvan CDR-a (to jest u FR). Opcionalno, anti-PD-1 antitelo sadrži VH sekvencu u SEQ ID NO: 20, uključujući posttranslacione modifikacije te sekvence.

[00123] U pojedinim realizacijama obezbeđeno je anti-PD-1 antitelo, pri čemu antitelo sadrži varijabilni domen lakog lanca (VL) koji ima najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identiteta sekvence prema sekvenci amino-kiselina SEQ ID NO: 24. U nekim realizacijama VL sekvenca koja ima najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sadrži supstitucije (na primer, konzervativne supstitucije), umetanja ili brisanja u odnosu na referentnu sekvencu, ali anti-PD-1 antitelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost da se veže za PD-1. U nekim realizacijama, ukupno 1 do 10 amino-kiselina je supstituisano, umetnuto i/ili izbrisano u SEQ ID NO: 24. U nekim realizacijama se supstitucije, umetanja ili brisanja dešavaju u regionima izvan CDR-a (to jest u FR).

[00124] U pojedinim realizacijama, anti-PD-1 antitelo sadrži sekvencu varijabilnog domena teškog lanca (VH) koja ima najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identiteta sekvence prema sekvenci amino-kiselina SEQ ID NO: 20 i var jabilni domen lakog lanca (VL) koji ima najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identiteta sekvence prema sekvenci amino-kiselina SEQ ID NO: 24. U nekim realizacijama, VH sekvenca koja ima najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sadrži supstitucije (na primer, konzervativne supstitucije), umetanja (insercije) ili brisanja (delec je) u odnosu na referentnu sekvencu, i VL sekvenca koja sadrži najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta sadrži supstitucije (na primer, konzervativne supstitucije), umetanja (insercije) ili brisanja (delecije) u odnosu na referentnu sekvencu, ali anti-PD-1 antitelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost da se veže za PD-1.

[00125] U nekim realizacijama, antitelo sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO: 20 i SEQ ID NO: 24, respektivno, uklјučujući post-translacione modifikac je tih sekvenci. Takođe su otkrivena i antitela koja se nadmeću sa anti-PD-1antitelima ovde datim u vezivanju za PD-1. Takva antitela se nadmeću sa anti-PD-1 antitelima koja su ovde data za vezivanje na epitop na PD-1.

[00126] U nekim realizacijama, konkurentski testovi se mogu koristiti za identifikac ju monoklonog antitela koje se nadmeće sa ovde opisanim antitelom na PD-1 (kao što je 12228, 13406, 13407, 13408 i 13409) za vezivanje za PD-1. Konkurentski testovi se mogu koristiti za određivanje da li se dva antitela vežu za isti epitop prepoznavanjem identičnih ili sterično preklapajućih epitopa ili jedno antitelo konkurentno inhibira vezivanje drugog antitela na antigen. U nekim realizacijama, takvo konkurentno antitelo se veže za isti epitop koji je vezan antitelom opisanim ovde. Eksperimentalni konkurentski testovi uk jučuju, ali nisu ograničeni na, rutinske testove, kao što su oni dati u Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Njujork) Detaljni primeri postupaka za mapiranje epitopa na koje se antitelo vezuje su dati u Morris (1996), "Epitope Mapping Protocols," u Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, N. J.). U nekim realizacijama se kaže da se dva antitela vežu na isti epitop ako svako blokira vezivanje drugog za 50% ili više. U nekim realizacijama, antitelo koje se nadmeće sa anti-PD-1 antitelom opisanim ovde je himerno, humanizovano ili humano antitelo. U nekim realizacijama je obezbeđeno antitelo koje se nadmeće sa himernim, humanizovanim ili humanim anti-PD-1 antitelom kako je ovde opisano.

[00127] U nekim realizacijama, obezbeđena su antitela koja se vezuju za bilo jedan ili više epitopa za koja su ovde data antitela. U nekim realizacijama, obezbeđena su antitela koja se vezuju i prekrivaju epitop za koji se predmetna antitela vezuju. U nekim realizacijama, obezbeđeno je antitelo koje se nadmeće sa najmanje jednim ovde navedenim antitelom. U nekim realizacijama, obezbeđeno je antitelo koje se nadmeće sa najmanje dve antitela koja su ovde data. U nekim realizacijama, obezbeđeno je antitelo koje se nadmeće sa najmanje tri antitela koja su ovde data. U nekim realizacijama, antitelo se vezuje za prekrivajući epitop kao antitelo opisano u ovde navedenim primerima. U nekim realizacijama, ceo epitop je vezan i/ili ometen od strane konkurentskog antitela. U nekim realizacijama, deo epitopa je vezan i/ili ometan od strane konkurentskog antitela. U nekim realizacijama, paratop konkurentskog antitela se vezuje za barem deo epitopa antitela koje je ovde dato. U nekim realizacijama, paratop konkurentskog antitela veže cilj, a drugi odeljak strukture konkurentskog antitela ometa barem deo epitopa antitela koje je ovde dato.

Primeri himernih antitela

[00128] U pojedinim realizacijama, antitela koja su ovde data su himerna antitela. Određena himerna antitela su opisana, na primer, u U.S. Patent No.4,816,567; and Morrison et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. SAD, 81 :6851-6855 (1984)). U jednom primeru, himerno antitelo sadrži nehumani varijabilni region (na primer, varijabilni region dob jen od miša, pacova, hrčka, zeca ili primata koji nije čovek, poput majmuna) i humani konstantni region. U sledećem primeru, himerno antitelo je antitelo „zamenjene klase“ u kome je klasa ili potklasa promenjena od grupe matičnog antitela. Himerna antitela uključuju njihove fragmente koji vezuju antigen.

[00129] Primeri neograničavajućih himernih antitela uk јučuju himerna antitela koja obuhvataju varijabilne regione teškog i/ili lakog lanca antitela izabranog iz, na primer, antitela 13407. Dodatni neograničavajući primeri himernnih antitela uklјučuju himerna antitela koja sadrže CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca i/ili CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca antitela izabranog iz antitela 13407 U nekim realizacijama, himerno anti-PD-1 antitelo obuhvata gore opisane varijabilne regione i veže se za PD-1. U nekim realizacijama, himerno anti-PD-1 antitelo sadrži gore opisane varijabilne regione, vezuje se za PD-1 i inhibira vezivanje PD-1 za PD-L1 i/ili PD-L2. U nekim realizacijama, anti-PD-1antitelo sadrži gore opisane varijabilne regione, vezuje se za PD-1 i inhibira vezivanje PD-1 za PD-L1. U nekim realizacijama, anti-PD-1antitelo sadrži gore opisane varijabilne regione, vezuje se za PD-1 i inhibira vezivanje PD-1 za PD-L1 i PD-L2. U nekim realizacijama, anti-PD-1antitelo sadrži gore opisane varijabilne regione, vezuje se za PD-1 i pojačava imunološki odgovor subjekta, i/ili povećava aktivac ju T ćelija kod subjekta nakon davanja antitela subjektu. U nekim realizacijama, davanje ovde opisanih antitela na PD-1 stimuliše aktivnost imune ćelije, smanjuje modulaciju imunološke ćelije ili povećava odgovor T ćelija kod subjekta.

[00130] U nekim realizacijama, himerno anti-PD-1 antitelo sadrži teški lanac koji sadrži sekvencu varijabilnog regiona koja je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%ili najmanje 99% identična sekvenci izabranoj iz SEQ ID NO: 20, pri čemu se antitelo vezuje za PD-1. U nekim realizac jama, himerno anti-PD-1 antitelo sadrži laki lanac koji sadrži sekvencu varijabilnog regiona koja je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identična sekvenci izabranoj iz SEQ ID NO: 24, pri čemu se antitelo vezuje za PD-1. U pojedinim realizacijama, himerno anti-PD-1 antitelo sadrži teški lanac koji sadrži sekvencu varijabilnog regiona koja je najmanje 95% , najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična sekvenci odabranoj iz SEQ ID NO: 20; i laki lanac koji sadrži sekvencu varijabilnog regiona koja je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97% , najmanje 98% ili najmanje 99% identična sekvenci odabranoj iz SEQ ID NO: 24; pri čemu se antitelo vezuje za PD-1. Primeri himernih anti-PD-1 antitela, takođe, uključuju himerna antitela koja se nadmeću za vezivanje za PD-1 sa antitelom ili njegovim fragmentom koji je ovde opisan. Tako je u nekim realizacijama obezbeđeno himerno anti-PD-1 antitelo koje se nadmeće za vezivanje za PD-1 sa antitelom izabranim iz antitela 13407. U nekim realizacijama, himerno antitelo opisano ovde sadrži jedan ili više humanih konstantnih regiona. U nekim realizacijama, humani konstantni region teškog lanca je od izotipa odabranog iz IgA, IgG i IgD. U nekim realizacijama, humani konstantni region lakog lanca je od izotipa odabranog iz κ i λ. U pojedinim realizacijama, himerno antitelo opisano ovde sadrži konstantni region humanog IgG. U pojedinim realizacijama, himerno antitelo opisano ovde sadrži konstantni region humanog IgG4 teškog lanca. U nekim realizacijama, himerno antitelo opisano ovde sadrži konstantni region humanog IgG4 i humani κ laki lanac.

[00131] Kao što je gore napomenuto, da li je efektorska funkc ja poželjna ili ne može zavisiti od određenog postupka lečenja namenjenog antitelu. Prema tome, u pojedinim realizacijama, kada je efektorska funkcija poželjna, bira se anti-PD-1 antitelo koje sadrži konstantni region teškog lanca humanog IgG1 ili konstantni region teškog lanca humanog IgG3. U pojedinim realizacijama, kada efektorska funkcija nije pože jna, odabrano je himerno anti-PD-1 antitelo koje sadrži konstantni region teškog lanca humanog IgG4 ili IgG2.

Primer humanizovanih antitela

[00132] U pojedinim realizacijama su obezbeđena humanizovana antitela koja vezuju PD-1. Humanizovana antitela su korisna kao terapeutski molekuli zato što humanizovana antitela smanjuju ili eliminišu humani imuni odgovor u poređenju sa nehumanim antitelima, što može rezultirati imunološkim odgovorom na terapeutsko antitelo (kao što je odgovor humanog anti-mišjeg antitela (HAMA)) i smanjenom efikasnošću terapije.

[00133] U pojedinim realizacijama, himerno antitelo je humanizovano antitelo. Tipično, nehumano antitelo se humanizuje da bi se smanjila imunogenost za jude, zadržavajući specifičnost i afinitet matičnog nehumanog antitela. Uopšteno, humanizovano antitelo sadrži jedan ili više varijabilnih domena u kojima su CDR-i (ili njihovi delovi) izvedeni iz nehumanih antitela, a FR (ili njihovi delovi) su izvedeni iz sekvenci humanih antitela. Humanizovano antitelo opciono će, takođe, sadržati bar deo humanog konstantnog regiona. U pojedinim realizacijama, neki FR ostaci u humanizovanom antitelu su supstituisani odgovarajućim ostacima iz nehumanog antitela (na primer, antitela iz kojih su izvedeni CDR ostaci), na primer, radi obnavljanja ili poboljšanja specifičnosti ili afiniteta antitela.

[00134] Humanizovana antitela i postupci za njihovo pravljenje su navedeni, na primer, u Almagro and Fransson, (2008) Front. Biosci. 13: 1619-1633, i dalje su opisani, na primer, u Riechmann et al., (1988) Nature 332:323-329; Queen et al., (1989) Proc. Natl Acad. Sci. SAD 86: 10029-10033; SAD patenti br.5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321, i 7,087,409; Kashmiri et al., (2005) Methods 36:25-34; Padlan, (1991) Mol. Immunol. 28: 489-498 (opisuje „ponovnu obradu površine"); Dall'Ackua et al., (2005) Metode 36: 43-60 (opisuje „mešanje FR"); i Osbourn et al., (2005) Metode 36: 61-68 i Klimka et al., (2000) Br. J. Cancer, 83: 252-260 (opisuje pristup „vođene selekcije" za FR mešanje).

[00135] Humani okvirni regioni koji se mogu koristiti za humanizaciju uključuju, ali nisu ograničeni na: okvirne regione odabrane metodom „najbolje odgovara" ((videti, na primer(, Sims et al. (1993) J. Immunol. 151: 2296); okvirne regione izvedene iz konsenzusne sekvence humanih antitela određene podgrupe varijabilnih regiona lakog ili teškog lanca ((videti, na primer(, Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285; i Presta et al. (1993) J. Immunol, 151:2623); zrele humane (somatski mutirani) okvirne regione ili humane okvirne regione zametnih linija ((videti, na primer(, Almagro i Fransson, (2008) Front. Biosci.13: 1619-1633); i okvirne regione izvedene iz skrining FR biblioteka ((videti, na primer(, Baca (et al(., (1997) J. Biol. Chem.272: 10678-10684 i Rosok et al., (1996) J. Biol. Chem.271 :22611-22618).

[00136] Primer humanizovanih anti-PD-1 antitela, takođe, uključuje antitela koja se nadmeću za vezivanje za PD-1 sa antitelom ili njegovim fragmentom koji je ovde opisan. Tako je u nekim realizac jama obezbeđeno humanizovano anti-PD-1 antitelo koje se nadmeće za vezivanje za PD-1 sa antitelom ili njegovim fragmentom izabranim iz antitela 13407.

Primer humanih antitela

[00137] U pojedinim realizacijama, anti-PD-1 antitelo obezbeđeno ovde je humano antitelo. Humana antitela se mogu proizvesti korišćenjem različitih tehn ka poznatih u tehnici. Humana antitela su uglavnom opisana u van Dijk and van de Winkel, (2001) Curr. Opin. Pharmacol.5:368-374 i Lonberg, (2008) Curr. Opin. Immunol.20:450-459. U pojedinim realizac jama, humano antitelo nije antitelo koje se prirodno pojavljuje. U pojedinim realizacijama, humano antitelo je monoklono antitelo; prema tome, u pojedinim realizacijama, svako humano antitelo u setu može da se veže za isti epitop na antigenu.

[00138] Humana antitela se mogu pripremiti davanjem imunogena transgenoj životinji koja je modifikovana tako da proizvodi netaknuta ljudska antitela ili netaknuta antitela sa humanim varijabilnim regionima kao odgovor na antigeni izazov. Takve životinje obično sadrže ceo ili deo humanog imunoglobulinskog lokusa, koji zamenjuje endogene imunoglobulinske lokuse, ili koji su prisutni ekstrahromozomski ili nasumično integrisani u životinjske hromozome. Kod takvih transgenih miševa, endogeni lokusi imunoglobulina su uglavnom neaktivirani. Za pregled metoda za dob janje humanih antitela od transgenih životinja, videti Lonberg, (2005) Nat. Biotech.23: 1117-1125. Takođe videti, na primer, SAD patente br. 6,075,181 i 6,150,584 koji opisuju XENOMOUSE™ tehnologiju; SAD patent br.

5,770,429 koji opisuje HUMAB® tehnolog ju; SAD patent br. 7,041,870 koji opisuje K-M MOUSE® tehnologiju i američku patentnu prijavu br. US 2007/0061900, koja opisuje VELOCIMOUSE® tehnologiju). Humani var jabilni regioni iz netaknutih antitela koje generišu takve životinje mogu se dalje modifikovati, na primer, kombinovanjem sa drugim humanim konstantnim regionom.

[00139] Humana antitela se, takođe, mogu proizvesti metodama zasnovanim na h bridomima. Opisane su ćelijske linije humanog mijeloma i miš-čovek heteromijeloma za proizvodnju humanih monoklonskih antitela. ((Vidi, na primer(, Kozbor (1984) J. Immunol, 133: 3001; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Njujork, 1987); i Boerner et al, (1991) J. Immunol., 147:86). Humana antitela koja su generisana putem tehnologije hibridoma humane B-ćelijske takođe su opisana u Li et al., (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. SAD, 103:3557-3562. Dodatne metode uključuju one opisane, na primer, u SAD patentu br.

7,189,826 (koji opisuje proizvodnju monoklonskih humanih IgM antitela iz hibridomskih ćelijskih lin ja) i Ni, (2006) Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (koji opisuje čovek-čovek hibridome). Tehnologija humanih hibridoma (tehnologija trioma) takođe je opisana u Vollmers and Brandlein, (2005) Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) i u Vollmers and Brandlein, (2005) Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-191.

[00140] Humana antitela se, takođe, mogu generisati izolovanjem sekvenci klonskih varijabilnih domena Fv odabranih iz biblioteka faga izvedenih iz čoveka. Takve sekvence varijabilnih domena mogu se zatim kombinovati sa željenim humanim konstantnim domenom. Tehnike odabira humanih antitela iz biblioteka antitela su opisane u daljem tekstu.

[00141] Antitela se mogu izolovati skrinigom kombinatornih biblioteka na antitela sa željenom aktivnošću ili aktivnostima. Na primer, u tehnici su poznati razni postupci za generisanje biblioteka faga za pr kaz i skrining takvih biblioteka na antitela koja imaju željene karakteristike vezivanja. Takvi postupci su prikazani, na primer, u Hoogenboom et al. u Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O'Brien et al., Ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) i dalje je opisano, na primer, u McCafferty et al, (1990) Nature 348:552-554; Clackson et al, (1991) Nature 352: 624-628; Marks et al, (1992) J. Mol. Biol 222: 581-597; Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248: 161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al, (2004) J. Mol. Biol.338(2): 299-310; Lee et al., (2004) J. Mol. Biol.340(5): 1073-1093; Fellouse, (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 101(34): 12467-12472; i Lee et al, (2004) J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 i PCT publication WO 99/10494.

[00142] U određenim metodama pr kazivanja faga, repertoari V(H( i V(L( gena odvojeno se kloniraju lančanom reakcijom polimeraze (PCR) i rekombinuju nasumično u bibliotekama faga, a zatim se mogu pregledati na antigenvezujući fag kako je opisano u Winter et al., (1994) Ann. Rev. Immunol., 12:433-455. Fage obično prikazuju fragmente antitela, bilo kao jednolančane Fv (scFv) fragmente ili kao Fab fragmente. B blioteke iz imunizovanih izvora obezbeđuju antitela visokog afiniteta na imunogen bez potrebe za stvaranjem hibridoma. Alternativno, naivni repertoar može biti kloniran (na primer, od čoveka) da bi se dobio jedan izvor antitela za širok spektar neauto i takođe auto-antigena bez imunizac je kao što su opisali Griffiths et al., (1993) EMBO J 12:725-734. Konačno, naivne biblioteke se, takođe, mogu napraviti sintetičkim kloniranjem nepreraspoređenih segmenata V gena iz matičnih ćelija i korišćenjem PCR prajmera koji sadrže nasumičnu sekvencu za kodiranje visoko varijabilnih CDR3 regiona i za postizanje preuređenja in vitro, kako su opisali Hoogenboom and Winter (1992), J. Mol. Biol, 227:381-388. Patentne objave koje opisuju biblioteke faga humanih antitela uključuju, na primer: SAD patent br. 5,750,373 i američke patentne objave br. 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 i 2009/0002360.

[00143] U nekim slučajevima, humano anti-PD-1 antitelo se vezuje za polipeptid koji ima sekvencu SEQ ID NO: 1, 2, 3, 382, 383, ili 384. U nekim realizac jama, humano anti-PD-1 antitelo se vezuje za PD-1 i inhibira vezivanje PD-1 za PD-L1 i/ili PD-L2. U nekim realizacijama, humano anti-PD-1 antitelo se vezuje za PD-1 i inh bira vezivanje PD-1 za PD-L1. U nekim realizac jama, humano anti-PD-1 antitelo se vezuje za PD-1 i inhibira vezivanje PD-1 za PD-L1 i PD-L2. U nekim realizacijama, humano anti-PD-1 antitelo se vezuje za PD-1 i pojačava imunološki odgovor subjekta, i/ili povećava aktivaciju T ćelija kod subjekta nakon davanja antitela subjektu.

[00144] Primer humanih anti-PD-1 antitela, takođe, uključuje antitela koja se nadmeću za vezivanje za PD-1 sa humanim antitelom ili njegovim fragmentom koji je ovde opisan. Tako je u nekim realizacijama obezbeđeno humano anti-PD-1 antitelo koje se nadmeće za vezivanje za PD-1 sa antitelom ili njegovim fragmentom izabranim iz antitela 13407. U nekim realizac jama, humano anti-PD-1 antitelo se nadmeće za vezivanje za PD-1 sa ovde opisanim antitelom i inhibira vezivanje PD-1 za PD-L1 i/ili PD-L2. U nekim realizacijama, humano anti-PD-1 antitelo se nadmeće za vezivanje za PD-1 sa ovde opisanim antitelom i inh bira vezivanje PD-1 za PD-L1. U nekim realizacijama, humano anti-PD-1 antitelo se nadmeće za vezivanje za PD-1 sa ovde opisanim antitelom i inhibira vezivanje PD-1 za PD-L1 i PD-L2. U nekim realizacijama, humano anti-PD-1 antitelo se nadmeće za vezivanje za PD-1 sa ovde opisanim antitelom i pojačava imunološki odgovor subjekta, i/ili povećava aktivaciju T ćelija kod subjekta nakon davanja antitela subjektu.

[00145] U nekim realizacijama je obezbeđeno himerno humano anti-PD-1 antitelo, gde antitelo sadrži varijabilni region iz humanog antitela koje vezuje PD-1 i konstantni region iz drugog humanog antitela. U nekim realizacijama je obezbeđeno himerno humano anti-PD-1 antitelo, gde antitelo sadrži CDR iz humanog antitela koje vezuje PD-1 i okvir iz drugog humanog antitela. U pojedinim realizacijama, antitelo nije humano antitelo koje se prirodno pojavljuje.

[00146] U nekim slučajevima, humano anti-PD-1 antitelo sadrži jedan ili više humanih konstantnih regiona. U nekim realizacijama, humani konstantni region teškog lanca je od izotipa odabranog iz IgA, IgG i IgD. U nekim realizacijama, humani konstantni region lakog lanca je od izotipa odabranog iz κ i λ. U pojedinim realizacijama, humano antitelo opisano ovde sadrži konstantni region humanog IgG. U pojedinim realizacijama, humano antitelo opisano ovde sadrži konstantni region humanog IgG4. U nekim realizacijama, humano antitelo opisano ovde sadrži konstantni region humanog IgG4 i humani κ laki lanac.

[00147] U pojedinim realizacijama, kada je efektorska funkcija poželjna, bira se humano anti-PD-1 antitelo koje sadrži konstantni region teškog lanca humanog IgG1 ili konstantni region teškog lanca humanog IgG3. U pojedinim realizacijama, kada efektorska funkcija nije pože jna, odabrano je humano anti-PD-1 antitelo koje sadrži konstantni region teškog lanca humanog IgG4 ili IgG2.

[00148] Kao što je ovde napomenuto, izraz „humano antitelo" označava rod mogućih sekvenci konstrukta antitela, a ne izvor antitela.

Primeri konstantnih regiona antitela

[00149] U nekim realizacijama, antitelo opisano ovde sadrži jedan ili više humanih konstantnih regiona. U nekim realizacijama, humani konstantni region teškog lanca je od izotipa odabranog iz IgA, IgG i IgD. U pojedinim realizacijama, antitelo opisano ovde sadrži konstantni region humanog IgG. U pojedinim realizacijama, kada je efektorska funkcija poželjna, bira se anti-PD-1 antitelo koje sadrži konstantni region teškog lanca humanog IgG1 ili konstantni region teškog lanca humanog IgG3. U pojedinim realizacijama, kada efektorska funkcija nije pože jna, odabrano je anti-PD-1 antitelo koje sadrži konstantni region teškog lanca humanog IgG4 ili IgG2. U nekim realizacijama, humani konstantni region lakog lanca je od izotipa odabranog iz κ i λ. U pojedinim realizacijama, antitelo opisano ovde sadrži konstantni region teškog lanca humanog IgG4. U nekim realizacijama, antitelo opisano ovde sadrži konstantni region humanog IgG4 i humani κ laki lanac.

[00150] Kroz predmetnu specifikaciju i zahteve, osim ako je izričito navedeno ili poznato stručnjaku u tehnici, numerisanje ostataka u teškom lancu imunoglobulina je kao ono u EU indeksu kao u Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), izričito ovde uk jučeno referencom. „EU indeks kao u Kabatu" odnosi se na numerisanje ostataka humanog IgG1 EU antitela.

[00151] Kao što je gore napomenuto, da li je efektorska funkc ja poželjna ili ne može zavisiti od određenog postupka lečenja namenjenog antitelu. Prema tome, u pojedinim realizacijama, kada je efektorska funkcija poželjna, bira se anti-PD-1 antitelo koje sadrži konstantni region teškog lanca humanog IgG1 ili konstantni region teškog lanca humanog IgG3. U pojedinim realizacijama, kada efektorska funkc ja nije poželjna, odabrano je anti-PD-1 antitelo koje sadrži konstantni region teškog lanca humanog IgG4 ili IgG2.

[00152] U nekim realizacijama, antitelo sadrži varijantu Fc regiona koja ima najmanje jednu supstituciju aminokiselina u poređenju sa Fc regionom IgG div jeg tipa ili divljim tipom antitela. U nekim realizacijama, varijanta Fc regiona ima dve ili više supstitucija amino-kiselina u Fc regionu antitela divljeg tipa. U nekim realizacijama, varijanta Fc regiona ima tri ili više supstitucija amino-kiselina u Fc regionu antitela divljeg tipa. U nekim realizacijama, varijanta Fc regiona ima najmanje jednu, dve ili tri ili više supstitucija amino-kiselina u Fc regionu koje su ovde opisane. U nekim realizacijama, ovde će varijanta Fc regiona imati najmanje oko 80% homologije sa nativnom sekvencom Fc regiona i/ili sa Fc regionom matičnog polipeptida. U nekim realizacijama, ovde će varijanta Fc regiona imati najmanje oko 90% homologije sa nativnom sekvencom Fc regiona i/ili sa Fc regionom matičnog polipeptida. U nekim realizacijama, ovde će varijanta Fc regiona imati najmanje oko 95% homologije sa nativnom sekvencom Fc regiona i/ili sa Fc regionom matičnog polipeptida. U nekim realizacijama, konstantnom regionu teškog lanca nedostaje C-terminalni ostatak lizina (K). U nekim takvim realizac jama, teški lanac ili konstantni region teškog lanca može se nazvati „desK”. U nekim realizacijama, konstantan region teškog lanca kome nedostaje C-terminalni lizin je IgG, kao što je IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4.

[00153] U nekim realizacijama, antitelo dato ovde je izmenjeno da bi povećao ili smanjio stepen do koga je antitelo glikozilirano. Dodavanje ili brisanje mesta gl kozilacije u antitelu može se prikladno izvršiti promenom sekvence amino-kiselina tako da se stvori ili ukloni jedno ili više mesta glikozilacije.

[00154] Gde antitelo sadrži Fc reg ju, ugljovodonik zakačen na nju može biti izmenjen. Nativna antitela proizvedena od ćelija sisara obično sadrže razgranati biantenarni oligosaharid koji je uglavnom vezan N-vezom na Asn297 domena CH2 regiona Fc. Vidi, na primer, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). Oligosaharid može da obuhvata različite ugljovodonike, na primer, manozu, N-acetil glukozamin (GlcNAc), galaktozu i sijalinsku kiselinu, kao i fukozu vezanu za GlcNAc u „stabljici“ biantenarne oligosaharidne strukture. U nekim realizac jama, modifikacije oligosaharida u antitelu mogu biti načinjene da bi se stvorile varijante antitela sa određenim poboljšanim svojstvima.

[00155] U nekim realizacijama, obezbeđene su varijante antitela koja imaju ug jovodoničnu strukturu kojoj nedostaje fukoza vezana (direktno ili indirektno) na Fc region. Na primer, količina fukoze u takvom antitelu može biti od 1% do 80%, od 1% do 65%, od 5% do 65% ili od 20% do 40%. Količina fukoze se određuje izračunavanjem prosečne količine fukoze u lancu šećera na Asn297, u odnosu na zbir svih glikostruktura vezanih za Asn 297 (na primer, složene, h bridne i visoke strukture manoze) merene MALDI-TOF masenom spektrometrijom, kao što je opisano, na primer, u WO 2008/077546. Asn297 se odnosi na ostatak asparagina koji se nalazi na oko 297. poziciji u Fc regionu (EU numerisanje ostataka Fc regiona); međutim, Asn297 se, takođe, može nalaziti oko 3 amino-kiselina ushodno ili nishodno od pozic je 297, ,to jest između pozicija 294 i 300, zbog manjih varijacija sekvenci u antitelima. Takve varijante fukozilacije mogu poboljšati ADCC funkciju. Videti, na primer, američke patente br. US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Primeri objava koje se odnose na „defukozilirane“ ili „fukozno-deficitarne“ varijante antitela uključuju: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng.87: 614 (2004). Primeri ćelijskih lin ja sposobnih da proizvode defukozovana antitela uk jučuju Lec13 CHO ćelije koje imaju nedostatak fukozilac je proteina (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); SAD patentna prijava br. US 2003/0157108 A1, Presta, L; i WO 2004/056312 A1, Adams et al., posebno u primeru 11), i ćelijskih linija za izbacivanje, kao što je alfa-1,6-fukoziltransferaza gen, FUT8, CHO ćelije za izbacivanje (nokaut ćelije) (videti , na primer, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng.87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); i WO2003/085107).

[00156] Var jante antitela se dalje obezbeđuju razdvojenim oligosaharidima, na primer, u kojem je biantenarni oligosaharid vezan za Fc region antitela razdvojen od GlcNAc. Takve varijante antitela mogu imati smanjenu fukosilaciju i/ili poboljšanu ADCC funkc ju. Primeri takvih varijanti antitela opisani su, na primer, u WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); SAD patent br. 6,602,684 (Umana et al.); i US 2005/0123546 (Umana et al.). Takođe su obezbeđene varijante antitela sa najmanje jednim ostatkom galaktoze u oligosaharidu vezanim za Fc region. Takve varijante antitela imaju poboljšanu CDC funkciju. Takve varijante antitela su opisane, na primer, u VO 1997/30087 (Patel i dr.); VO 1998/58964 (Raju, S.); i VO 1999/22764 (Raju, S.).

[00157] Var jante antitela su takođe snabdevene amino-terminalnim vodećim ekstenzijama. Na primer, jedan ili više ostataka amino-kiselina amino-terminalne vodeće sekvence su prisutni na amino-kraju bilo kojeg ili više teških ili lakih lanaca antitela. Primer ekstenzije amino-terminalne vodeće sekvence sadrži ili se sastoji od tri ostataka aminokiselina, VHS, prisutna na jednom ili na oba laka lanca var jante antitela.

[00158] In-vivo ili serumski poluživot humanih FcRn polipeptida visokog afiniteta vezivanja može se testirati, na primer, kod transgenih miševa, ljudi ili primata koji nisu ljudi kojima se daju polipeptidi sa varijantom Fc regiona. Vidi, na primer, Petkova et al. International Immunology 18(12):1759-1769 (2006).

[00159] U nekim realizacijama, varijanta antitela posreduje ADCC u prisustvu humanih efektorskih ćelija efikasnije od matičnog antitela. U nekim realizacijama, varijanta antitela je značajno ef kasnija u posredovanju ADCC in vitro, kada su količine polipeptidne varijante i matičnog antitela korišćene u testu suštinski iste. U nekim realizac jama, varijanta antitela je značajno efikasnija u posredovanju ADCC in vivo, kada su količine polipeptidne varijante i matičnog antitela korišćene u testu suštinski iste. Uglavnom, takve varijante će biti identif kovane upotrebom in vitro ADCC testa kao što je ovde stavljeno na uvid, ali se razmatraju drugi testovi ili postupci za određivanje ADCC aktivnosti, na primer na životinjskom modelu, itd.

Primeri konjugata antitela

[00160] U pojedinim realizacijama, anti-PD-1 antitelo je konjugovano na drugi molekul. U nekim realizacijama, dodatni molekul može biti detektabilni marker, kao što je oznaka. U nekim realizacijama, dodatni molekul može biti terapeutski molekul, kao što je citotoksično sredstvo. U nekim realizacijama, oznaka i/ili citotoksično sredstvo može se konjugovati na antitelo. Kako se ovde koristi, oznaka je deo (grupa) koji olakšava detekciju antitela i/ili olakšava detekciju molekula za koji se antitelo vezuje. Neograničavajući primeri oznaka uključuju, ali nisu ograničeni na, radioizotope, fluorescentne grupe, enzimske grupe, hemiluminescentne grupe, biotin, epitopske oznake, oznake za vezivanje metala, itd. Stručnjak u tehnici može izabrati pogodnu oznaku u skladu sa specifičnom primenom.

[00161] Kako se ovde koristi, citotoksično sredstvo je deo koji smanjuje proliferativni kapacitet jedne ili više ćelija. Ćelija ima smanjeni proliferativni kapacitet kada ćelija postane manje sposobna da se razmnožava, na primer, zato što ćelija prolazi apoptozu ili na neki drugi način umre, ćelija ne uspeva prođe kroz ćelijski ciklus i/ili se ne deli, ćelija se diferencira, itd. Neograničavajući primeri citotoksičnih lekova uključuju, ali nisu ograničeni na, radioizotope, toksine i hemoterapijska sredstva. Stručnjak u tehnici može izabrati pogodan citotoksin u skladu sa nameravanom primenom. U nekim realizacijama, citotoksično sredstvo je najmanje jedan od antimetabolita, alkilacionog sredstva, antibiotika, faktora rasta, citokina, antiangiogenog sredstva, antititotičkog sredstva, antraciklina, toksina ili apoptotičkog sredstva.

[00162] U nekim realizac jama, oznaka i/ili citotoksično sredstvo je konjugirano na antitelo korišćenjem hemijskih postupaka in vitro. Neograničavajući primeri hemijskih metoda konjugacije su poznati u tehnici i uključuju usluge, postupke i/ili reagense koji su komerc jalno dostupni od, na primer, Thermo Scientific Life Science Research Produces (formerly Pierce; Rockford, Ill.), Prozyme (Hayward, Calif.), SACRI Antibody Services (Calgary, Canada), AbD Serotec (Raleigh, N.C.), itd. U nekim Ill, kada je oznaka i/ili citotoksično sredstvo polipeptid, oznaka i/ili citotoksično sredstvo može se eksprimovati iz istog ekspresionog vektora sa najmanje jednim lancem antitela da se dob je polipeptid koji sadrži oznaku i/ili citotoksično sredstvo spojeno (fuzionisano) sa lancem antitela. Stručnjak u tehnici može da odabere pogodan postupak za konjugaciju oznake i/ili citotoksičnog sredstva sa antitelom prema predviđenoj primeni.

[00163] U nekim realizacijama, konjugacija može biti kovalentna. U nekim realizac jama, konjugac ja može biti nekovalentna. U nekim realizac jama, konjugacija može biti posredstvom specifične interakcije vezivanja, na primer, kroz vezivanje sekundarnih antitela.

Primeri vodećih sekvenci

[00164] Da bi se neki izlučeni proteini eksprimovali i izlučili u velikim količinama, vodeća sekvenca iz heterolognog proteina može biti poželjna. U nekim realizac jama, korišćenje heterolognih vodećih sekvenci može biti korisno u tome što dobijeni zreli polipeptid može ostati nepromenjen jer se vodeća sekvencija uklanja u ER tokom procesa sekrecije. Dodavanje heterologne vodeće sekvence može biti korisno za eksprimovanje i izdvajanje nekih proteina.

[00165] Određeni primeri liderskih sekvenci opisani su, na primer, u online Internet baza podataka o vodećim sekvencama koju održava Odeljenje za biohemiju, Nacionalnog univerziteta u Singapuru. Vidi Choo et al., BMC Bioinformatics, 6: 249 (2005); i PCT objavu br. WO 2006/081430.

III. Eksprimovanje i proizvodnja antitela

Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju anti-PD-1 antitela

[00166] Molekuli nukleinske kiseline koji sadrže polinukleotide koji kodiraju jedan ili više lanaca anti-PD-1 antitela su ovde dati. U nekim realizacijama, molekul nukleinske kiseline sadrži polinukleotid koji kodira teški ili laki lanac anti-PD-1 antitela. U pojedinim realizacijama, molekul nukleinske kiseline sadrži i polinukleotid koji kodira teški lanac i polinukleotid koji kodira laki lanac, anti-PD-1 antitela. U pojedinim realizacijama, prvi molekul nukleinske kiseline sadrži prvi polinukleotid koji kodira teški lanac, a drugi molekul nukleinske kiseline sadrži drugi polinukleotid koji kodira laki lanac.

[00167] U pojedinim realizacijama, teški i laki lanac su eksprimovani iz jednog molekula nukleinske kiseline ili iz dva odvojena molekula nukleinske kiseline, kao dva odvojena polipeptida. U pojedinim realizacijama, kao što je kada je antitelo scFv, jedan polinukleotid kodira jedan polipeptid koji sadrži i teški i laki lanac zajedno.

[00168] U pojedinim realizacijama, polinukleotid koji kodira teški ili laki lanac anti-PD-1 antitela sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira najmanje jedan od CDR-ova koji su ovde obezbeđeni. U pojedinim realizacijama, polinukleotid koji kodira teški ili laki lanac anti-PD-1 antitela sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira najmanje 3 CDR-ova koji su ovde obezbeđeni. U pojedinim realizac jama, polinukleotid koji kodira teški ili laki lanac anti-PD-1 antitela sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira najmanje 6 CDR-ova koji su ovde obezbeđeni. U nekim realizacijama, polinukleotid koji kodira teški ili laki lanac anti-PD-1 antitela sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira vodeću sekvencu, koja se, kada je transkribovana, nalazi na N kraju teškog ili lakog lanca. Kao što je gore diskutovano, vodeća sekvenca može biti prirodna sekvenca vođa teškog ili lakog lanca, ili može biti druga heterologna vodeća sekvenca.

[00169] U nekim realizacijama, nukleinska kiselina je ona koja kodira za bilo koju sekvencu amino-kiselina za antitela u Tabeli sekvenci ovde datoj. U nekim realizacijama, nukleinska kiselina je ona koja je najmanje 80% identična nukleinskoj kiselini koja kodira bilo koju sekvencu amino-kiselina za antitela u Tabeli sekvenci, na primer, najmanje 80, 85, 90, 91, 92 , 93, 94, 95, 96, 97, 98 ili 99% identična. U nekim realizacijama, nukleinska kiselina je ona koja hibridizuje na bilo koju jednu ili više sekvenci nukleinskih kiselina koje su ovde date. U nekim realizac jama, hibridizacija je pod umerenim uslovima. U nekim realizacijama, hibridizacija je pod veoma strogim uslovima, kao što su: najmanje oko 6X SSC i 1% SDS na 65°C, sa prvim ispiranjem u trajanju od 10 minuta na oko 42°C sa oko 20% (v/v) formamida u 0,1X SSC, i sa sledećim ispiranjem sa 0,2 X SSC i 0,1% SDS na 65°C.

[00170] Molekuli nukleinske kiseline mogu se konstruisati koristeći rekombinantne DNK tehnike uobičajene u tehnici. U pojedinim realizacijama, molekul nukleinske kiseline je ekspresioni vektor koji je pogodan za eksprimovanje u izabranu ćeliju domaćina.

[00171] Omogućeni su vektori koji sadrže polinukleotide koji kodiraju anti-PD-1 teške lance i/ili anti-PD-1 lake lance. Takođe su obezbeđeni vektori koji sadrže polinukleotide koji kodiraju anti-PD-1 teške lance i/ili anti-PD-1 lake lance. Takvi vektori uk jučuju, ali nisu ograničeni na, DNK vektore, vektore faga, virusne vektore, retrovirusne vektore, itd. U pojedinim realizacijama, vektor sadrži prvu polinukleotidnu sekvencui koja kodira teški lanac i drugu polinukleotidnu sekvencu koja kodira laki lanac U nekim realizacijama, teški lanac i laki lanac su ekspirmovani iz vektora kao dva odvojena polipeptida. U nekim realizacijama, teški i laki lanac su eksprimovani kao deo jednog polipeptida, kao što je, na primer, kada je antitelo scFv.

[00172] U nekim realizacijama, prvi vektor sadrži polinukleotid koji kodira teški lanac, a drugi vektor sadrži polinukleotid koji kodira laki lanac. U nekim realizacijama, prvi i drugi vektor se transfektuju u ćelije domaćina u sličnim količinama (kao što su slične molarne količine ili slične masne količine). U nekim realizacijama, odnos mola ili mase između 5:1 i 1:5 prvog vektora i drugog vektora se transfektuje u ćel je domaćina. U nekim realizacijama se koristi maseni odnos između 1:1 i 1:5 za vektor koji kodira teški lanac i vektor koji kodira laki lanac. U nekim realizacijama se koristi masni odnos 1:2 za vektor koji kodira teški lanac i vektor koji kodira laki lanac.

[00173] U nekim realizacijama, odabran je vektor koji je optimizovan za ekspres ju polipeptida u CHO ili ćelijama izvedenim iz CHO, ili u NSO ćelijama. Primeri takvih vektora opisani su, na primer, u Running Deer et al., Biotechnol. Prog.20:880-889 (2004).

Ćelije domaćina

[00174] U nekim realizacijama, teški lanci anti-PD-1 antitela i/ili laki lanci anti-PD-1 antitela mogu se eksprimovati u prokariotskim ćelijama, kao što su bakterijske ćelije; ili u eukariotskim ćelijama, poput gljivičnih ćelija (poput kvasca), biljnih ćelija, ćelija insekata i ćelija sisara. Takva ekspresija se može sprovesti, na primer, u skladu sa procedurama poznatim u tehnicima. Primeri eukariotskih ćelija koje se mogu koristiti za eksprimovanje polipeptida uključuju ali nisu ograničene na, COS ćelije, uključujući COS 7 ćelije; 293 ćel je, uključujući 293-6E ćelije; CHO ćelije, uključujući CHO-S, DG44. Lec13 CHO ćelije, i FUT8 CHO ćelije; PER.C6® ćel je (Crucell); i NSO ćelije. U nekim realizac jama, teški lanci anti-PD-1 antitela i/ili laki lanci anti-PD-1 antitela mogu biti eksprimovani u kvascu. Vidi, na primer, SAD objavu br. US 2006/0270045 A1. U nekim realizacijama se određena eukariotska ćelija domaćina bira na osnovu njene sposobnosti da izvrši željene posttranslacione modifikacije teških lanaca anti-PD-1 antitela i/ili lakih lanaca anti-PD-1 antitela. Na primer, u nekim realizacijama CHO ćel je proizvode polipeptide koji imaju viši nivo s jalilacije od istog polipeptida proizvedenog u 293 ćelijama.

[00175] Uvođenje jedne ili više nukleinskih kiselina u željenu ćeliju domaćina može se izvesti bilo kojim postupkom, uključujući, ali ne ograničavajući se na, transfekc ju kalcijum-fosfatom, transfekciju posredovanu DEAE-dekstranom, katijonsku transfekciju posredovanu lipidom, elektroporaciju, transdukciju, infekciju, etc. Neograničavajući primeri postupaka su opisani, na primer, u Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3<rd>ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001). Nukleinske kiseline mogu se prolazno ili stabilno transfekftovati u željenim ćelijama domaćina, prema bilo kojem pogodnom postupku.

[00176] Ćelije domaćini koje sadrže bilo koji od ovde opisanih polinukleotida ili vektora su takođe obezbeđene. U pojedinim realizacijama je obezbeđena ćelija domaćina koja sadrži anti-PD-1 antitelo. Bilo koje ćelije domaćina sposobne da prekomerno eksprimuju heterolognu DNK mogu se koristiti u svrhu izolacije gena koji kodiraju antitelo, polipeptid ili protein od interesa. Neograničavajući primeri ćelija domaćina sisara uključuju ali nisu ograničeni na COS, HeLa i CHO ćelije. Vidi takođe PCT objavu br. WO 87/04462. Pogodne ćelije domaćini koje nisu od sisara uključuju prokariote (kao što su E. coli ili B. subtillis) i gljivice (kao što su S. cerevisae, S. pombe; ili K. lactis).

Prećišćavanje antitela

[00177] Anti-PD-1 antitela mogu se prečistiti bilo kojim pogodnim postupkom. Takvi postupci uključuju, ali nisu ograničeni na, upotrebu matrica afiniteta ili hidrofobne interaktivne hromatografije. Pogodni afinitetni ligandi uključuju ROR1 ECD i ligande koji vezuju konstantne regione antitela. Na primer, protein A, protein G, protein A/G ili afinitetna kolona antitela mogu se koristiti za vezivanje konstantnog regiona i prečišćavanje anti-PD-1 antitela. Hidrofobna interaktivna hromatografija, na primer, butil ili fenil kolona, takođe, može biti pogodna za prečišćavanje nekih polipeptida, kao što su antitela. Jonizmenjivačka hromatografija (na primer, anjonska izmenjivačka hromatografija i/ili katjonska izmenjivačka hromatografija), takođe, može biti pogodna za prečišćavanje nekih polipeptida, kao što su antitela. Hromatografija u mešovitom režimu (na primer, reverzna faza/anjonska razmena, reverzna faza/katjonska razmena, hidrofilna interakc ja/anjonska razmena, hidrofilna interakcija/katjonska razmena, itd.) takođe može biti pogodna za prečišćavanje nekih polipeptida kao što su antitela. Mnogi postupci prečišćavanja polipeptida su poznati u stanju tehnike.

Proizvodnja antitela bez ćelija

[00178] U nekim realizacijama, anti-PD-1 antitelo se proizvodi u sistemu bez ćelija. Neograničavajući primeri sistema bez ćelija opisani su, na primer, u Sitaraman et al., Methods Mol. Biol. 498: 229-44 (2009); Spirin, Trends Biotechnol.22: 538-45 (2004); Endo et al., Biotechnol. Adv.21: 695-713 (2003).

Kompozicije

[00179] U nekim realizacijama, obezbeđena su antitela pripremljena postupcima gore opisanim. U nekim realizacijama, antitelo je pripremljeno u ćeliji domaćinu. U nekim realizac jama, antitelo je pripremljeno u sistemu bez ćelija. U nekim realizacijama, antitelo je prečišćeno. U nekim realizacijama, antitelo pripremljeno u ćeliji domaćinu ili u sistemu bez ćelija je himerno antitelo. U nekim realizacijama, antitelo pripremljeno u ćeliji domaćinu ili u sistemu bez ćelija je humanizovano antitelo. U nekim realizacijama, antitelo pripremljeno u ćeliji domaćinu ili u sistemu bez ćelija je humano antitelo. U nekim realizacijama je obezbeđen medijum ćelijske kulture koji sadrži anti-PD-1 antitelo. U pojedinim realizacijama, obezbeđena je kultura ćelije domaćina koja sadrži anti-PD-1 antitelo.

[00180] U nekim slučajevima su obezbeđene kompozicije koje sadrže antitela pripremljena gore opisanim postupcima. U nekim realizacijama, kompozicija sadrži antitelo pripremljeno u ćeliji domaćinu. U nekim realizac jama, kompozicija sadrži antitelo pripremljeno u sistemu bez ćelija. U nekim realizacijama, kompozicija sadrži prečišćeno antitelo. U nekim realizacijama, kompozicija sadrži himerno antitelo pripremljeno u ćeliji domaćinu ili u sistemu bez ćelija. U nekim realizacijama, kompozicija sadrži humizovano antitelo pripremljeno u ćeliji domaćinu ili u sistemu bez ćelija. U nekim realizacijama, kompozicija sadrži humano antitelo pripremljeno u ćeliji domaćinu ili u sistemu bez ćelija.

[00181] U nekim realizacijama, obezbeđena je kompozicija koja sadrži anti-PD-1 antitelo u koncentraciji većoj od bilo koje od 10 mg/mL, 20 mg/mL, 30 mg/mL, 40 mg/mL, 50 mg/mL, 60 mg/mL, 70 mg/mL, 80 mg/mL, 90 mg/mL, 100 mg/mL, 125 mg/mL, 150 mg/mL, 175 mg/mL, 200 mg/mL, 225 mg/mL ili 250 mg/mL. U nekim realizac jama, kompozicija sadrži himerno antitelo pripremljeno u ćeliji domaćinu ili u sistemu bez ćelija. U nekim realizac jama, kompozicija sadrži humizovano antitelo pripremljeno u ćeliji domaćinu ili u sistemu bez ćelija. U nekim realizacijama, kompozicija sadrži humano antitelo pripremljeno u ćeliji domaćinu ili u sistemu bez ćelija.

IV. Terapeutske kompozicije i postupci

Postupci za lečenje bolesti korišćenjem anti-PD-1 antitela

[00182] Antitela i kompozicije koje sadrže antitela obezbeđeni su za upotrebu u postupcima lečenja ljudi ili životinja. Neograničavajući primeri bolesti koje se mogu lečiti anti-PD-1 antitelima uključuju, ali nisu ograničene na rak.

[00183] U nekim realizacijama je obezbeđeno je antitelo u skladu sa patentnim zahtevima za upotrebu u postupku lečenja raka, gde ćelije unutar uzorka tumora eksprimuju PD-L1. U nekim takvim realizacijama, može se smatrati da je tumor pozitivan na PD-L1 ili da eksprimuje PD-L1. Ekspresija PD-L1 može se odrediti IHC-om, npr. kao što je ovde navedeno. U pojedinim realizac jama, smatra se da tumor eksprimuje PD-L1 kada uzorak tumora pokazuje 1+, 2+ ili 3+ obojenje PD-L1 od strane IHC. U pojedinim realizacijama, uzorak tumora pokazuje 2+ ili 3+ obojenje PD-L1 od strane IHC. U nekim realizacijama, uzorak tumora subjekta analizira se na ekspresiju PD-L1 i subjekt je izabran za lečenje antitelom opisanim ovde, ako uzorak tumora pokazuje ekspresiju PD-L1. U nekim realizacijama, subjekt je izabran ako uzorak tumora pokazuje povišenu ekspresiju PD-L1.

[00184] U pojedinim realizacijama, subjekt je izabran za lečenje anti-PD-1 antitelom ovde obezbeđenim ako je tumor subjekta PD-L1<HIGH>. U pojedinim realizacijama, subjekt je izabran za lečenje anti-PD-1 antitelom ovde obezbeđenim ako je tumor subjekta PD-L1<LOW>. U pojedinim realizacijama, subjekt je izabran za lečenje anti-PD-1 antitelom ovde obezbeđenim ako je tumor subjekta PD-1<HIGH>/PD-L1<LOW>. U pojedinim realizacijama, subjekt je izabran za lečenje anti-PD-1 antitelom ovde obezbeđenim ako je tumor subjekta PD-1<HIGH>/PD-L1<HIGH>.

[00185] Anti-PD-1 antitelo može se davati subjektima po potrebi. Utvrđivanje učestalosti davanja mogu izvršiti stručnjaci u tehnici, kao što je dežurni lekar na osnovu razmatranja stanja koje se leči, starosti subjekta koji se leči, težine stanja koje se leči, opšteg zdravstvenog stanja subjekta koji se leči i slično. U pojedinim realizac jama, efikasna doza anti-PD-1 antitela se daje subjektu jednom ili više puta. U nekim realizacijama, efikasna doza anti-PD-1 antitela se daje subjektu jednom mesečno, manje od jednom mesečno, kao što su, na primer, svaka dva meseca ili svaka tri meseca. U nekim realizacijama, efikasna doza anti-PD-1 antitela daje se manje od jednom mesečno, kao što je, na primer, jednom u tri nedelje, jednom u dve nedelje ili jednom svake nedelje. Efektivna doza anti-PD-1 antitela se daje subjektu najmanje jedanput. U nekim realizacijama, efikasna doza anti-PD-1 antitela može se davati više puta, uključujući periode od najmanje mesec dana, najmanje šest meseci ili najmanje godinu dana.

[00186] U nekim realizacijama, farmaceutske kompozicije se daju u količini koja je efikasna za lečenje (uključujući profilaksu) raka. Terapeutski efikasna količina obično zavisi od težine subjekta koji se leči, njegovog fizičkog ili zdravstvenog stanja, opsežnosti stanja koje se tretira ili starosti subjekta koji se leči. Generalno, anti-PD-1antitela mogu se davati u količini u rasponu od oko 10 μg/kg telesne mase do oko 100 mg/kg telesne mase po dozi. U nekim realizacijama, anti-PD-1 antitela mogu se davati u količini u rasponu od oko 50 mg/kg telesne mase do oko 5 mg/kg telesne mase po dozi. U nekim realizacijama, anti-PD-1 antitela mogu se davati u količini u rasponu od oko 10 μg/kg telesne mase do oko 100 mg/kg telesne mase po dozi. U nekim realizacijama, anti-PD-1 antitela mogu se davati u količini u rasponu od oko 100 μg/kg telesne mase do oko 20 mg/kg telesne mase po dozi. U nekim realizac jama, anti-PD-1 antitela mogu se davati u količini u rasponu od oko 0,5 mg/kg telesne mase do oko 20 mg/kg telesne mase po dozi.

[00187] Farmaceutske kompozic je se daju u količini efikasnoj za pojačavanje imunološkog odgovora i/ili povećanje aktivacije T ćelija kod subjekta.

[00188] Terapeutski efikasna količina obično zavisi od težine subjekta koji se leči, njegovog fizičkog ili zdravstvenog stanja, opsežnosti stanja koje se tretira ili starosti subjekta koji se leči. Generalno, anti-PD-1 antitela mogu se davati u količini u rasponu od oko 10 μg/kg telesne mase do oko 100 mg/kg telesne mase po dozi. U nekim realizacijama, anti-PD-1 antitela mogu se davati u količini u rasponu od oko 50 μg/kg telesne mase do oko 5 mg/kg telesne mase po dozi. U nekim realizacijama, anti-PD-1 antitela mogu se davati u količini u rasponu od oko 10 μg/kg telesne mase do oko 100 mg/kg telesne mase po dozi. U nekim realizacijama, anti-PD-1 antitela mogu se davati u količini u rasponu od oko 100 μg/kg telesne mase do oko 20 mg/kg telesne mase po dozi. U nekim realizacijama, anti-PD-1 antitela mogu se davati u količini u rasponu od oko 0,5 mg/kg telesne mase do oko 20 mg/kg telesne mase po dozi.

Farmaceutske kompozicije

[00189] U nekim realizacijama, kompozicije koje sadrže anti-PD-1 antitela obezbeđene su u formulacijama sa širokim spektrom farmaceutski prihvatljivih nosača (videti, na primer, Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons: Drugfacts Plus, 20th ed. (2003); Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7th ed., Lippencott Williams and Wilkins (2004); Kibbe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd ed., Pharmaceutical Press (2000)). Na raspolaganju su različiti farmaceutski prihvatljivi nosači, koji uključuju nosače, adjuvanse i razblaživače. Pored toga, takođe su dostupne i razne farmaceutski prihvatljive pomoćne supstance, kao što su sredstva za podešavanje pH i puferiranje, sredstva za podešavanje toničnosti, stabilizatori, sredstva za vlaženje i slično. Neograničavajući primeri nosača uključuju fiziološki rastvor, puferisani fiziološki rastvor, dekstrozu, vodu, glicerol, etanol i njihove kombinacije.

[00190] U nekim realizacijama, obezbeđena je farmaceutska kompozic ja koja sadrži jednoanti-PD-1 antitelo. U nekim realizacijama, farmaceutska kompozicija sadrži himerno antitelo. U nekim realizacijama, farmaceutska kompozicija sadrži humanizovano antitelo. U nekim realizacijama, farmaceutska kompozicija sadrži antitelo pripremljeno u ćeliji domaćinu ili sistemu bez ćelija kako je ovde opisano. U nekim realizacijama, farmaceutska kompozicija sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač.

[00191] U nekim realizacijama, farmaceutske kompozicije se daju u količini koja je efikasna za lečenje (uključujući profilaksu) raka. Terapeutski efikasna količina obično zavisi od težine subjekta koji se leči, njegovog fizičkog ili zdravstvenog stanja, opsežnosti stanja koje se tretira ili starosti subjekta koji se leči. Generalno, anti-PD-1 antitela mogu se davati u količini u rasponu od oko 0,05 mg/kg telesne mase do oko 100 mg/kg telesne mase po dozi. U nekim realizacijama, anti-PD-1 antitela mogu se davati u količini u rasponu od oko 10 μg/kg telesne mase do oko 100 mg/kg telesne mase po dozi. U nekim realizacijama, anti-PD-1 antitela mogu se davati u količini u rasponu od oko 50 μg/kg telesne mase do oko 5 mg/kg telesne mase po dozi. U nekim realizacijama, anti-PD-1 antitela mogu se davati u količini u rasponu od oko 100 μg/kg telesne mase do oko 10 mg/kg telesne mase po dozi. U nekim realizacijama, anti-PD-1 antitela mogu se davati u količini u rasponu od oko 100 μg/kg telesne mase do oko 20 mg/kg telesne mase po dozi. U nekim realizacijama, anti-PD-1 antitela mogu se davati u količini u rasponu od oko 0,5 mg/kg telesne mase do oko 20 mg/kg telesne mase po dozi. U nekim realizacijama, anti-PD-1 antitela mogu se davati u količini u rasponu od oko 0,5 mg/kg telesne mase do oko 10 mg/kg telesne mase po dozi. U nekim realizacijama, anti-PD-1 antitela mogu se davati u količini u rasponu od oko 0,05 mg/kg telesne mase do oko 20 mg/kg telesne mase po dozi. U nekim realizacijama, anti-PD-1 antitela mogu se davati u količini u rasponu od oko 0,05 mg/kg telesne mase do oko 10 mg/kg telesne mase po dozi. U nekim realizacijama, anti-PD-1 antitela mogu se davati u količini u rasponu od oko 5 mg/kg telesne mase ili nižoj, na primer manjoj od 4, manjoj od 3, manjoj od 2 ili manjoj od 1 mg/kg antitela.

[00192] U nekim realizacijama, anti-PD-1 antitela mogu biti prisutna u količini u rasponu od oko 50 μg/kg telesne mase do oko 5 mg/kg telesne mase po dozi. Na primer, u nekim realizacijama, doza za osobu od 20kg može biti u rasponu od oko 1 mg do oko 100 mg. U nekim realizacijama, doza može biti u opsegu od 2 mg do 200 mg anti-PD-1 antitela. U nekim realizacijama, doza može biti u opsegu od 10 mg do 400 mg anti-PD-1 antitela.

Putevi primene

[00193] U nekim realizac jama, anti-PD-1 antitela mogu se davati in vivo različitim načinima, uključujući, ali ne ograničavajući se na, intravenski, intraarterijski, parenteralno, intratumoralno, intraperitonealno ili supkutano. Odgovarajuća formulacija i put primene mogu se izabrati u skladu sa planiranom primenom

Kombinovana terapija

[00194] Anti-PD-1 antitela mogu se davati samostalno ili sa drugim oblicima lečenja. Ona se mogu obezbediti pre, u značajnoj meri istovremeno sa i/ili posle drugih načina lečenja, na primer, hirurgije, hemoterapije, terapije zračenjem ili primenom biološkog leka, kao što je drugo terapeutsko antitelo. U pojedinim realizacijama, anti-PD-1 antitelo se daje u kombinaciji sa drugim sredstvom protiv raka.

[00195] U nekim realizacijama anti-PD-1 antitelo davano je istovremeno sa drugim terapeutskim sredstvom. Na primer, dva ili više terapeutskih sredstava se primenjuju sa vremenskim odvajanjem ne dužim od oko 60 minuta, kao što je ne više od oko 30, 15, 10, 5, ili 1 minuta. U nekim realizacijama, anti-PD-1 antitelo se daje sekvencijalno sa drugim terapeutskim agensom. Na primer, primena dva ili više terapeutskih sredstava se daje sa vremenskim odvajanjem dužim od oko 15 minuta, kao što je otpril ke bilo koje od 20, 30, 40, 50, ili 60 minuta, 1 dan, 2 dana, 3 dana, 1 nedelja, 2 nedelje ili 1 mesec ili duže.

[00196] U pojedinim realizacijama, anti-PD-1 antitelo se daje drugom terapijskom metodom za lečenje. Prema tome, davanje antitela koje je ovde dato može biti u kombinaciji sa drugim sistemom lečenja.

[00197] U pojedinim realizacijama, anti-PD-1 antitelo obezbeđeno ovde se daje sa anti-ICOS terapijom. U pojedinim realizacijama, anti-PD-1 antitelo obezbeđeno ovde se daje sa antitelom koje veže inducibilni kostimulator T-ćelije (ICOS). U nekim realizacijama, obezbeđeno ovde anti-PD-1antitelo se daje sa izolovanim antitelom koje vezuje ICOS, pri čemu je anti-ICOS antitelo agonist CD4+ T ćelija (kao što su CD4+ T efektorske (Teff) ćelije). U nekim realizacijama, antitelo koje vezuje ICOS je agonist CD4+ T ćelija (poput CD4+ Teff ćelija) i iscrpljuje T regulatorne (Treg) ćelije. U nekim realizacijama, antitelo koje se vezuje za ICOS iscrplјuje Treg ćelije, ali ne iscrplјuje Teff ćelije. U nekim realizacijama, antitelo koje se vezuje za ICOS indukuje pAKT signalizaciju na CD4+ T ćelijama. U nekim realizacijama izolovano antitelo koje vezuje ICOS indukuje pAKT signalizaciju na CD4+ T ćelijama i iscrp juje Treg ćelije. U nekim realizacijama, izolovano antitelo vezuje ICOS u skladu sa patentnim zahtevima. Antitelo koje se vezuje za ICOS može da sadrži:

(a) HCDR1 koji sadrži sekvencu amino-kiseline SEQ ID NO: 326; (b) HCDR2 koji sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO: 327; (c) HCDR3 koji sadrži sekvencu amino-kiseline SEQ ID NO: 328; (d) LCDR1 koji sadrži sekvencu amino-kiseline SEQ ID NO: 329; (e) LCDR2 koji sadrži sekvencu amino-kiseline SEQ ID NO: 330; i (f) LCDR3 koji sadrži sekvencu amino-kiseline SEQ ID NO: 331; ili

(a) HCDR1 koji sadrži sekvencu amino-kiseline SEQ ID NO: 334; (b) HCDR2 koji sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO: 335; (c) HCDR3 koji sadrži sekvencu amino-kiseline SEQ ID NO: 336; (d) LCDR1 koji sadrži sekvencu amino-kiseline SEQ ID NO: 337; (e) LCDR2 koji sadrži sekvencu amino-kiseline SEQ ID NO: 338; i (f) LCDR3 koji sadrži sekvencu amino-kiseline SEQ ID NO: 339; ili

(a) HCDR1 koji sadrži sekvencu amino-kiseline SEQ ID NO: 342; (b) HCDR2 koji sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO: 343; (c) HCDR3 koji sadrži sekvencu amino-kiseline SEQ ID NO: 344; (d) LCDR1 koji sadrži sekvencu amino-kiseline SEQ ID NO: 345; (e) LCDR2 koji sadrži sekvencu amino-kiseline SEQ ID NO: 346; i (f) LCDR3 koji sadrži sekvencu amino-kiseline SEQ ID NO: 347; ili

(a) HCDR1 koji sadrži sekvencu amino-kiseline SEQ ID NO: 350; (b) HCDR2 koji sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO: 351; (c) HCDR3 koji sadrži sekvencu amino-kiseline SEQ ID NO: 352; (d) LCDR1 koji sadrži sekvencu amino-kiseline SEQ ID NO: 353; (e) LCDR2 koji sadrži sekvencu amino-kiseline SEQ ID NO: 354; i (f) LCDR3 koji sadrži sekvencu amino-kiseline SEQ ID NO: 355; ili

(a) HCDR1 koji sadrži sekvencu amino-kiseline SEQ ID NO: 358; (b) HCDR2 koji sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO: 359; (c) HCDR3 koji sadrži sekvencu amino-kiseline SEQ ID NO: 360; (d) LCDR1 koji sadrži sekvencu amino-kiseline SEQ ID NO: 361; (e) LCDR2 koji sadrži sekvencu amino-kiseline SEQ ID NO: 362; i (f) LCDR3 koji sadrži sekvencu amino-kiseline SEQ ID NO: 363; ili

(a) HCDR1 koji sadrži sekvencu amino-kiseline SEQ ID NO: 366; (b) HCDR2 koji sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO: 367; (c) HCDR3 koji sadrži sekvencu amino-kiseline SEQ ID NO: 368; (d) LCDR1 koji sadrži sekvencu amino-kiseline SEQ ID NO: 369; (e) LCDR2 koji sadrži sekvencu amino-kiseline SEQ ID NO: 370; i (f) LCDR3 koji sadrži sekvencu amino-kiseline SEQ ID NO: 371; ili

(a) HCDR1 koji sadrži sekvencu amino-kiseline SEQ ID NO: 374; (b) HCDR2 koji sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO: 375; (c) HCDR3 koji sadrži sekvencu amino-kiseline SEQ ID NO: 376; (d) LCDR1 koji sadrži sekvencu amino-kiseline SEQ ID NO: 377; (e) LCDR2 koji sadrži sekvencu amino-kiseline SEQ ID NO: 378; i (f) LCDR3 koji sadrži sekvencu amino-kiseline SEQ ID NO: 379.

[00198] U nekim realizac jama, obezbeđeno je antitelo koje se vezuje za ICOS, pri čemu antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) i varijabilni region lakog lanca (VL), pri čemu:

VH je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sekvenci aminokiseline SEQ ID NO: 324 i VL je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sekvenci amino-kiseline SEQ ID NO: 325; ili

VH je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sekvenci aminokiseline SEQ ID NO: 332 i VL je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sekvenci amino-kiseline SEQ ID NO: 333; ili

VH je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sekvenci aminokiseline SEQ ID NO: 340 i VL je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sekvenci amino-kiseline SEQ ID NO: 341; ili

VH je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sekvenci aminokiseline SEQ ID NO: 348 i VL je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sekvenci amino-kiseline SEQ ID NO: 349; ili

VH je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sekvenci aminokiseline SEQ ID NO: 356 i VL je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sekvenci amino-kiseline SEQ ID NO: 357; ili

VH je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sekvenci aminokiseline SEQ ID NO: 364 i VL je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sekvenci amino-kiseline SEQ ID NO: 365; ili

VH je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sekvenci aminokiseline SEQ ID NO: 372 i VL je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sekvenci amino-kiseline SEQ ID NO: 373.

[00199] Generalno, anti-ICOSantitela mogu se davati u količini u rasponu od oko 10 μg/kg telesne mase do oko 100 mg/kg telesne mase po dozi. U nekim realizacijama, anti-ICOS antitela mogu se davati u količini u rasponu od oko 50 μg/kg telesne mase do oko 5 mg/kg telesne mase po dozi. U nekim realizacijama, anti-ICOS antitela mogu se davati u količini u rasponu od oko 100 μg/kg telesne mase do oko 10 mg/kg telesne mase po dozi. U nekim realizacijama, anti-ICOS antitela mogu se davati u količini u rasponu od oko 100 μg/kg telesne mase do oko 20 mg/kg telesne mase po dozi. U nekim realizacijama, anti-ICOS antitela mogu se davati u količini u rasponu od oko 0,5 mg/kg telesne mase do oko 20 mg/kg telesne mase po dozi.

[00200] U nekim realizacijama, anti-PD-1 antitelo dato ovde se primenjuje sa agonističkim anti-OX40 antitelom (poput Medi6469, Medlmmune; MOXR0916/RG7888, Roche). U pojedinim realizacijama, anti-PD-1 antitelo dato ovde je primenjeno sa anti-CTLA4 antitelom (kao što je ipilimumab, YERVOY®, BMS).

[00201] U pojedinim realizacijama, dodatno terapeutsko sredstvo je hemoterapijsko sredstvo. Primeri hemoterapijskih sredstava koja se mogu kombinovati sa anti-PD-1 antitelima ovde obezbeđenim mogu da uključuju, ali nisu ograničena na kapektiabine, ciklofosfamid, dakarbazin, temozolomid, c klofosfamid, docetaksel, doksorubicin, daunorubicin, cisplatin, karboplatin, epirubicin, er bulin, 5-FU, gemcitabin, irinotekan, iksabepilon, metotreksat, mitoksantron, oksaliplatin, paklitaksel, nab-paklitaksel , ABRAXANE® (protein vezani paklitaksel), pemetreksed, vinore bin i vinkristin. U nekim realizacijama, ovde obezbeđeno anti-PD-1 antitelo se daje sa najmanje jednim inhibitorom kinaze Neograničavajući primeri inhibitora kinaze uključuju erlotinib, afatinib, gefitinib, crizotinib, dabrafenib, trametinib, vemurafenib i cobimetan b.

[00202] U pojedinim realizacijama, dodatno terapeutsko sredstvo je IDO inh bitor. Neograničavajući primeri IDO inhibitora su opisani, npr., U US 2016/0060237; i SAD 2015/0352206. Neograničavajući primeri IDO inhibitora uključuju Indoximod (New Link Genetics), INCB024360 (Incyte Corp), 1-metil-D-triptofan (New Link Genetics), i GDC-0919 (Genentech).

[00203] U nekim realizacijama, anti-PD-1 antitelo obezbeđeno ovde se daje u kombinaciji sa lekom koji modifikuje imunitet (IMiD). Neograničavajući primer IMiD-a uključuje talidomid, lenalidomid i pomalidomid.

[00204] U pojedinim realizacijama, dodatno terapeutsko sredstvo je vakcina protiv raka. Vakcine protiv raka ispitivane su kao potenc jalni pristup prenošenju antigena i aktiviranju dendričnih ćel ja. Konkretno, vakcinacija u kombinaciji sa imunološkim kontrolnim tačkama ili agonistima za kostimulativne puteve pokazala je dokaze prevazilaženja tolerancije i generisanja povećanog antitumorskog odgovora. Ispitan je niz vakcina protiv raka koje koriste različite pristupe za promociju imunološkog odgovora protiv tumora (videti, npr. Emens LA, Expert Opin Emerg Drugs 13(2): 295-308 (2008)). Pristupi su dizajnirani da poboljšaju odgovor B ćelija, T ćelija ili profesionalnih antigena koji predstavljaju ćelije protiv tumora. Primeri vrsta vakcina protiv raka uključuju, ali nisu ograničeni na, vakcine na bazi peptida koje upotrebljavaju ciljanje različitih tumorskih antigena, koji se mogu isporučiti kao peptidi / proteini ili kao genetski napravljeni DNK vektori, virusi, bakterije ili slično; i ćel jske biološke pristupe, na primer, za razvoj vakcine protiv raka protiv manje definisanih ciljeva, uključujući, ali ne ograničavajući se na, vakcine razvijene iz dendričnih ćelija dobijenih od pacijenta, autolognih ćelija tumora ili lizata tumorskih ćelija, alogenih ćelija tumora i slično .

[00205] Prema tome, u pojedinim realizacijama, anti-PD-1 antitela data ovde mogu se koristiti u kombinac ji sa vakcinom protiv raka. Primerne vakcine protiv raka uključuju, ali nisu ograničene na, vakcine protiv dendritskih ćelija, onkolitičke viruse, vakcine protiv ćelija tumora, itd. U pojedinim realizacijama, takve vakcine uvećavaju antitumorski odgovor. Primeri vakcina protiv raka koji se mogu koristiti u kombinaciji sa anti-PD-1 antitelima koja su ovde data, uključuju, ali nisu ograničeni na, vakcinu MAGE3 (npr. za melanom i rak mokraćne bešike), MUC1 vakcinu (npr. za rak dojke), EGFRv3 (takvu kao Rindopepimut, npr. za rak mozga, uključujući multiformni glioblastom) ili ALVAC-CEA (npr. za CEA+ kancere).

[00206] Neograničavajuće primerne vakcine protiv raka, takođe, uključuju Sipuleucel-T, koja je izvedena iz autolognih mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) koje uk jučuju ćel je koje predstav jaju antigen (videti, npr., Kantoff PW et al(., N Engl J Med 36(3:411-22 (2010)). U generaciji Sipuleucel-T, pacijentovi PBMC se aktiviraju ex vivo sa PA2024, rekombinantnim fuzionim proteinom prostatične kisele fosfataze (antigenom prostate) i faktorima koji stimulišu koloniju granulocita i makrofaga (aktivator imunoćelija). Drugi pristup vakcini protiv raka je generisanje imunog odgovora na specifične peptide mutirane u tumorskom tkivu, poput melanoma (vidi, npr. Carreno BM et al., Science 348:6236 (2015)). Tako mutirani peptidi mogu, u pojedinim realizacijama, biti nazvani neoantigenima. Kao neograničavajući primer upotrebe neoantigena u tumorskim vakcinama, neoantigeni u tumoru za koji se predviđa da će vezati glavni proteinski kompleks histokompatibilnosti HLA-A*02:01 identifikovani su za pojedinačne pacijente sa rakom, kao što je melanom. Dendritske ćel je pacijenta su sazrelile ex vivo, a potom su inkubirane sa neoantigenom. Aktivirane dendritske ćelije su onda date pacijentu. U pojedinim realizac jama, nakon davanja vakcine protiv raka, robusni imunitet T-ćel ja protiv neoantigena je detektabilan.

[00207] U pojedinim takvim realizacijama, vakcina protiv raka je razvijena korišćenjem neoantigena. U pojednim realizacijama, vakcina protiv raka je DNK vakcina. U pojedinim realizacijama, vakcina protiv raka je inžinjeringom stvoren virus koji sadrži antigen raka, kao što je PROSTVAC (rilimogen galvacirepvec/rilimogen glafolivec). U pojedinim realizac jama, vakcina protiv raka sadrži napravljene ćelije tumora, kao što je GVAX, koja je vakcina protiv tumorskih ćelija sa transfektovanim faktorskim genom za stimulac ju kolon ja granulocita i makrofaga (GMCSF) (videti npr. Nemunaitis, 2005, Expert Rev Vaccines, 4: 259-74).

[00208] U nekim realizacijama, ovde opisano anti-PD-1 antitelo se daje pre, istovremeno i/ili posle vakcine protiv raka. U pojedinim realizacijama, vakcine protiv raka razvijene korišćenjem neoantigena koriste se u kombinaciji sa anti-PD-1 antitelima koja su ovde opisana. U nekim takvim realizacijama, kombinacija se koristi za lečenje karcinoma sa velikim mutacijskim teretom, kao što su melanom, rak pluća, bešike ili kolorektalni karcinom.

[00209] U nekim realizacijama, anti-PD-1 antitelo obezbeđeno ovde se primenjuje u kombinaciji sa terapijom himernim antigenima T ćelijskih receptora (CAR-T terapija).

Dijagnostičke upotrebe

[00210] Ovde su opisane metode upotrebe anti-PD-1 antitela, polipeptida i polinukleotida za otkrivanje, dijagnostiku i praćenje bolesti, poremećaja ili stanja povezanih sa eksprimovanjem epitopa anti-PD-1 antitela (ili povećana ili smanjena u odnosu na normalan uzorak, i/ili neprimerena ekspresija, kao što je prisustvo ekspresije u tkivima i/ili ćelijama kojima normalno nedostaje ekspresija epitopa). Ovde su opisane metode određivanja da li će pacijent odgovoriti na terapiju anti-PD-1 antitelom.

[00211] U nekim realizacijama, metoda obuhvata otkrivanjeda li pacijent ima ćelije koje eksprimuju PD-1 koristeći anti-PD-1 antitelo. U nekim realizacijama, metoda detekcije uključuje kontakt uzorka sa antitelom, polipeptidom ili polinukleotidom i utvrđivanje da li se nivo vezivanja razlikuje od nivoa referentnog ili uporednog uzorka (kao što je kontrola). U nekim realizacijama, metoda može biti korisna za utvrđivanje da li su antitela ili polipeptidi ovde opisani odgovarajući tretman za subjekta.

[00212] U nekim realizacijama ćelije ili lizat ćelije/tkiva dolaze u kontakt sa anti-PD-1 antitelom i utvrđuje se vezivanje između antitela i ćelije. Kada testne ćelije prikažu aktivnost vezivanja u poređenju sa referentnom ćel jom istog tipa tkiva, to može ukazivati na to da će subjekt imati koristi od lečenja anti-PD-1 antitelom. U pojedinim realizacijama, testne ćelije su iz humanih tkiva. U nekim realizacijama, ćelije za testiranje su iz lјudske krvi.

[00213] Različite metode poznate u tehnici da detekciju specifičnih antitelo-antigen vezivanja se mogu koristiti. Primeri imunoloških ispitivanja koja se mogu sprovesti obuhvataju imunološki test fluorescentne polarizacije (FPIA), fluorescentni imuno test (FIA), enzimski imuno test (EIA), imunološki test nefelometrijske inhibicije (NIA), ispitivanje imunosorbensa vezanog za enzim (ELISA) i radioimunoanalizu (RIA). Indikatorska grupa ili grupa za označavanje može se prik jučiti na predmetna antitela a izabrana je tako da zadovolji potrebe različitih upotreba postupka koje često diktiraju dostupnost opreme za analizu i kompatibilnih postupaka imunog ispitivanja. Odgovarajuće oznake uključuju, bez ograničenja, radionuklide (na primer<125>I,<131>I,<35>S,<3>H, or<32>P), enzime (na primer, alkalna fosfataza, renova peroksidaza, luciferaza ili β -glaktozidaza), fluorescentne grupe ili proteine (na primer, fluorescein, rodamin, fikoetrin, GFP ili BFP ), ili luminescentne grupe (na primer, Qdot<TM>nanočestice koje obezbeđuje Quantum Dot Corporation, Palo Alto, Calif.). Opšte tehnike koje će se koristiti u izvođenju različitih imunoloških testova pomenutih gore su poznate stručnjacima u tehnici.

[00214] U svrhu dijagnoze, polipeptid koji uključuje antitela može biti obeležen detektabilnim delom koji uključuje, ali ne ograničava se na, radioizotope, fluorescentne oznake, i razne oznake enzim-supstrat poznate u tehnici. Postupci za konjugaciju oznaka na antitelo su poznati u tehnici.

[00215] U nekim realizac jama anti-PD-1 antitela ne moraju da budu obeležena, i njihovo prisustvo može biti otkriveno korišćenjem drugog obeleženog antitela koje se vezuje za prvo anti-PD-1antitelo.

[00216] U nekim realizac jama, anti-PD-1 antitelo može se upotrebiti u bilo kojoj poznatoj metodi ispitivanja, kao što su konkurentski testovi vezivanja, direktni i indirektni sendvič testovi i imunoprecipitacioni testovi. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc.1987).

[00217] Anti-PD-1 antitela i polipeptidi se, takođe, mogu koristiti za in vivo dijagnostičke testove, kao što je in vivo snimanje. Generalno, antitelo ili polipeptid je obeležen radionuklidom (poput<111>In,<99>Tc,<14>C,<131>I,<125>I,<3>H, ili bilo koje druge oznake radionuklida, uključujući one ovde navedene), tako da ćelije ili tkivo od interesa mogu biti lokalizovani pomoću imunoscintiografije.

[00218] Antitelo se može, takođe, koristiti kao reagens za pojenje u patologiji, korišćenjem tehnika koje su dobro poznate u tehnici.

[00219] U pojedinim realizac jama, prvo antitelo se koristi za dijagnostiku, a drugo antitelo se koristi kao terapeutik. U pojedinim realizacijama, prva i druga antitela su različita. U pojedinim realizacijama, prvo antitelo je od životinje koja nije čovek, dok je terapeutik humani. U pojedinim realizacijama, prva i druga antitela se mogu oba vezivati za antigen istovremeno, vezivanjem za odvojene epitope.

Setovi/artikli proizvodnje

[00220] Ovde su obezbeđeni takođe kompleti (setovi), lekovi, kompozicije i jedinični oblici doziranja za upotrebu u bilo kojem od ovde opisanih postupaka.

[00221] Setovi mogu da sadrže jednu ili više ambalaža koje sadrže anti-PD-1 antitelo (ili jedinične oblike doziranja i/ili proizvode). U nekim realizacijama, obezbeđena je jedinična doza pri čemu jedinična doza sadrži unapred određenu količinu smeše koja sadrži anti-PD-1 antitelo, sa ili bez jednog ili više dodatnih sredstava. U nekim se realizacijama, takva jedinična doza obezbeđena je u napunjenom špricu za jednokratnu upotrebu za injekcije. U nekim realizacijama, kompozicija sadržana u jediničnoj dozi može da sadrži fiziološki rastvor, saharozu ili slično; pufer, poput fosfata ili slično; i/ili da bude formulisana u stabilnom i efikasnom rasponu pH. U nekim realizac jama, kompozicija se može dobiti kao liofilizovani prah koji se može rekonstituisati dodatkom odgovarajuće tečnosti, na primer, sterilne vode. U nekim realizacijama, kompozicija sadrži jednu ili više supstanci koje inhibiraju agregaciju proteina, uključujući, ali ne ograničavajući se na saharozu i arginin. U nekim realizacijama, kompozic ja sadrži heparin i/ili proteoglikan.

[00222] U nekim realizacijama, količina anti-PD-1 antitela koja se koristi u jediničnoj dozi može biti bilo koja od ovde obezbeđenih količina za različite opisane postupke i/ili kompozicije.

[00223] U nekim realizac jama, setovi dalje sadrže uputstva za upotrebu u lečenju raka u skladu sa bilo kojom od ovde opisanih metoda. Set može dalje da sadrži opis odabira pojedinca koji je pogodan ili tretmana. Uputstva isporučena u setovima su obično napisana uputstva na nalepnici ili ulošku za pakovanje (na primer, list papira koji je uključen u set), ali su i mašinski čitljiva uputstva (na primer, uputstva na magnetnom ili optičkom disku za skladištenje) takođe prihvatljiva. U nekim realizacijama, set dalje sadrži dodatno terapeutsko sredstvo. U nekim realizacijama, dodatno terapijsko sredstvo je anti-ICOS antitelo, na primer, kao što je ovde opisano, ili anti-CTLA4 antitelo.

[00224] Setovi su u pogodnom pakovanju. Pogodno pakovanje uključuje, ali nije ograničeno na, bočice, boce, tegle, fleksibilno pakovanje (na primer, zapečaćene Mylar ili plastične vrećice) i slično. Kompleti mogu da pružaju dodatne komponente kao što su puferi i informacije tumačenja. Ova prijava, takođe, obezbeđuje proizvode koji uključuju bočice (kao što su zatvorene bočice), boce, tegle, fleksibilno pakovanje i slično.

PRIMERI

[00225] Primeri o kojima je reč u daljem tekstu su čisto primeri ovog pronalaska i ne treba smatrati da na bilo koji način ograničavaju pronalazak. Primeri nisu namijenjeni da predstavljaju da su eksperimenti u nastavku svi ili jedini eksperimenti koji se izvode. Uloženi su napori da se osigura tačnost u odnosu na korišćene brojeve (na primer, količine, temperaturu, itd.), ali treba uzeti u obzir i neke eksperimentalne greške i odstupanja. Ako nije drugačije naznačeno, delovi su težinski delovi, molekularna težina je prosečna molekulska masa, temperatura je u stepenimaa Celzijusa, a pritisak je atmosferski ili blizu njemu.

Primer 1: Generisanje anti-PD-1 antitela

[00226] Osam naivnih b blioteka humanog sintetičkog kvasca svaka od ~10<9>raznolikosti je dizajnirano, generisano i propagirano kao što je prethodno opisano (vidi, npr . WO2009036379; WO2010105256; WO2012009568; Xu et al., Protein Eng Des Sel.2013 Oct;26(10):663-70). Za prva 2 kruga selekcije, izvedena je tehn ka magnetno aktiviranog sortiranja pomoću sistema Miltenyi MACs, u suštini kako je opisano (Siegel et al., J Immunol Methods. 2004 Mar;286(1-2):141-53). Ukratko, ćelije kvasca (~10<10>ćelije/biblioteka) inkubirane su sa 3 ml 10 nM biotinilovanog humanog PD-1-Fc fuzionog antigena tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi u FACS puferu za ispiranje PBS sa 0,1% BSA (biotinilacije su urađene korišćenjem EZ-Link Sulfo-NHS-seta za biotinilaciju, Thermo Scientific, kat. #21425). Nakon ispiranja jednom sa 50 ml ledeno hladnog pufera, ćelije su resuspendovane u puferu za ispiranje od 40 ml, a 500 µl Streptavidin m kro kuglica (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany, kat. # 130-048-101) je dodato kvascu i inkubirano 15 minuta na 4°C. Zatim je kvasac granuliran, resuspendovan u puferu za ispiranje od 5 mL i nanet na kolonu MACS LS (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany, Cat. # 130-042-401). Nakon što je napunjeno 5 ml, kolona je isprana 3 puta sa 3 ml FACS pufera za ispiranje. Kolona je zatim uklonjena iz magnetnog polјa, a kvasac je eluiran sa 5 mL medijuma za rast, i zatim uzgajan preko noći. Sledeća tri kruga sortiranja izvedena su protočnom citometrijom. Približno 1×10<8>kvasca se peletira, ispere tri puta sa puferom za ispiranje i inkubira sa 200, 100 ili 10 nM biotinilovanog humanog PD-1 ili 10 nM ili 1 nM biotinilovanog humanog PD-1-Fc fuzionog antigena u trajanju od 10 minuta do 2 sata na sobnoj temperaturi. Vreme inkubac je varira u zavisnosti od koncentracije antigena. Kvasac je zatim dva puta ispran i obojen kozjim anti-humanim F(ab’)2 kappa-FITC razblaženim 1:100 (Southern Biotech, Birmingham, Alabama, kat. # 2062-02) i bilo streptavidin-Alexa Fluor 633 (Life Technologies, Grand Island, NY, kat. # S21375) razblaženim 1:500, ili Ekstravidin-fikoertirinom (Sigma-Aldrich, St Louis, kat. # E4011) razblaženim 1:50, sekundarnim reagensom tokom 15 minuta na 4°C. Nakon dva puta ispiranja sa ledeno hladnim puferom za ispiranje, ćelijske pelete su resuspendovane u 0,4 mL pufera za ispiranje i prebačene u epruvete za sortiranje sa zatvaračem. Sortiranje je izvedeno pomoću FACS ARIA sortera (BD Biosciences) i kapije za sortiranje su postavljene da odabiraju samo klonove koji vezuju PD-1 za dva kruga. U zavisnosti od populacije, treći krug je bio negativano storiranje za smanjenje veziva reagensa ili dalјe pozitivno obogaćivanje. Nakon poslednje runde sortiranja, kvasci su stavljeni na pločice i pojedinačne kolonije su odabrane radi karakterizacije.

[00227] Populacija vezivanja 5. kruga ili 6. kruga korišćena je za diverzifikaciju lakog lanca. Plazmidi teškog lanca su ekstrahovani i transformisani u b blioteku lakih lanaca sa diverzitetom od 1 x 10<6>. Selekcije su izvedene kao što je gore opisano sa jednim krugom MACS sortiranja i tri kruga FACS sortiranja korišćenjem različitih koncentracija biotinilovanog antigena.

Sazrevanje afiniteta

[00228] Optimizacija vezivanja naivnih i serijskih klonova lakih lanaca izvedena je korišćenjem diverzifikacije CDRH1 i CDRH2.

[00229] Selekcija CDRH1 i CDRH2: CDRH3 iz klonova izabranih iz postupka diverzifikacije lakog lanca (serijski klonovi lakih lanaca) su rekombinovani u unapred pripremlјenu biblioteku sa varijantama CDRH1 i CDRH2 raznovrsnosti 1 x 10<8>a selekcija je izvršena korišćenjem PD-1 antigena, kao što je gore opisano. Pritisci afiniteta primenjeni su titrac jom biotinilovanog antigena do sub-nanomolarnih koncentracija i inkubiranjem sa kvascem koji predstavlјa antitela.

Proizvodnja i prečišćavanje antitela

[00230] Klonovi kvasca su uzgajani do zasićenja i zatim indukovani 48 sati na 30°C uz mućkanje. Nakon indukcije, ćelije kvasca su peletirane i supernatanti su sakuplјeni radi prečišćavanja. IgG su prečišćeni upotrebom proteina A kolone i eluirani sirćetnom kiselinom, pH 2,0. Fab fragmenti su generisani digestijom papaina i prečišćeni preko KappaSelect-a (GE Healthcare LifeSciences, Cat. # 17-5458-01).

Merenje afiniteta antitela na PD-1

[00231] Afinitet antitela na PD-1 određen je merenjem njihovog KD putem ForteBio ili MSD-SET-a. Merenja ForteBio afiniteta su generalno izvedena kao što je prethodno opisano (Estep et al., MAbs. 2013 Mar-Apr;5(2):270-8). Ukratko, merenja ForteBio afiniteta izvedena su punjenjem IgG na mreži na AHK senzore. Senzori su ekvilibrirani van mreže u puferu za testiranje 30 minuta, a zatim su nadzirani na mreži tokom 60 sekundi radi utvrđivanja početne linije. Senzori sa napunjenim IgG su bili izloženi 100 nM antigenu 5 minuta, nakon toga su prebačeni u pufer za ispitivanje 5 minuta radi merenja van brzine. Kinetika je analizirana korišćenjem modela vezivanja 1:1.

[00232] Merenje ravnotežnog afiniteta izvedeno je kako je prethodno opisano (Estep et al., 2013). Ravnotežne titracije rastvora (SET) izvedene su u PBS 0,1% BSA bez IgG (PBSF) sa antigenom održavanim konstantno na 50 pM i inkubiranim sa 3 do 5 puta serijskim razblaženjima antitela počevši od 10 nM. Antitela (20 nM u PBS) su naneta na standardne vezane MSD-ECL ploče preko noći na 4°C ili na sobnoj temperaturi 30 min. Ploče su zatim blokirane 30 minuta uz mućkanje pri 700 rpm, nakon čega su usledila tri ispiranja puferom za ispiranje (PBSF 0,05% Tween 20). Primenjeni su uzorci SET i inkubirani na pločama 150 sekundi uz mućkanje pri 700 rpm, nakon čega je usledilo jedno ispiranje. Antigen uhvaćen na ploči detektovan je sa 250ng/mL sulfptag-obeleženog streptavidina u PBSF inkubacijom na ploči tokom 3 min. Ploče su isprane tri puta puferom za ispiranje, a zatim su očitane na instrumentu MSD Sector Imager 2400 koristeći 1xk pufer za očitavanje T sa surfaktantom. Procenat slobodnog antigena iscrtan je kao funkcija titrovanog antitela u Prizmi i odgovara kvadratnoj jednačini za ekstrakciju KD. Za pobolјšanje protoka, roboti za rukovanje tečnošću su korišćeni tokom eksperimenata MSD-SET, uklјučujući i pripremu SET uzorka. Tabela 1 prikazuje rezultate merenja ForteBio afiniteta.

Tabela 1

Primer 2: Odgovor mišjih aktiviranih splenocita na anti-PD-1 antitela

[00233] Kada se mišje T ćel je izvedene iz splenocita aktiviraju sa anti-CD3 i anti-CD28 antitelima, one eksprimuju molekul ćelijske površine i izlučuju rastvorlјivi molekul interferon-gama (IFNγ). Blokirajuća antitela na PD-1 uzrokuju povećanje proizvodnje IFNγ. Mišji splenociti su dobijeni i inkubirani sa rastvorlјivim anti-CD3 i anti-CD28 antitelima. Posle 5 dana, pomešani su sa jednakim brojem T ćelija prečišćenih iz sveže pripremlјenih splenocita i anti-PD-1 antitela u različitim koncentracijama. Pozitivna i negativna antitela RMP1-14, 2A3 i C1.18.4 su nabavlјena od BioXCell-a. Posle 24 sata, supernatanti su sakuplјeni i koncentracije IFNγ su izmerene CBA testom. Ovde opisana antitela na PD-1 su bila u stanju da povećaju proizvodnju IFNγ na sličan način kao referentna antitela. Videti Sliku 1. Najmanje antitela 12191, 13396, 13398, 13399, 12195, 13406, 13407, 13408 i 13409 značajno su povećala eksprimovanje IFNγ. Antitela 13396, 13399, 12195, 13406, 13407 i 13408 izazvala su najveći porast eksprimovanja IFNγ.

Primer 3: Humane periferne mononuklearne krvne ćelije koje reaguju na anti-PD-1 antitela

[00234] Pokazalo se da uzorci cele krvi aktivirani stafilokoknim enterotoksinom B (SEB) reaguju na blokadu imunološke kontrolne tačke upotrebom antitela na PD-1, mereno povećanjem sekrecije IL-2 (vidi npr. , EP2170959B1). Anti-PD-1 antitela su pripremlјena u različitim koncentracijama i dodata u ležišta ploča sa 96 ležišta. Puna krv od četiri davaoca razblažena je 1:10 u potpunom RPMI, i dodata u ista ležišta. Ploče su inkubirane na sobnoj temperaturi 30 minuta pre dodavanja 50 µl SEB po ležištu u koncentraciji od 40 µg/ml za konačnu koncentraciju od 10 µg/ml. Ploče su inkubirane na 37<o>C tokom 4 dana, a supernatanti su sakuplјeni za merenje izlučenog IL-2 pomoću CBA testa. Ovde otkrivena anti-PD-1 antitela mogla su povećati proizvodnju IL-2 iz ovih kultura na isti nivo kao i referentna anti-PD-1 antitela. Sl ka 2 prikazuje EC50 ovog povećanja za svako testirano antitelo, kod četiri uzorka zdravih davalaca.

Primer 4: Blokiranje antitela vezivanja mišjeg PD-L1 i mišjeg PD-L2 za mišji PD-1

[00235] PD-L1 i PD-L2 su dva prirodna liganda za PD-1 i interakc ja bilo kog liganda sa PD-1 može smanjiti regulaciju aktivirajućeg odgovora u T ćelijama. Dokazano je da odobrena terapeutska antitela, kao što su nivolumab i pembrolizumab, blokiraju ovu interakciju i snižavaju reakcije humanih T ćelija, iako se ni jedno antitelo ne vezuje za mišji PD-1 niti blokira interakciju mišjeg PD-1 sa mišjim PD-L1 ili mišjim PD-L2. Analiza okteta na instrumentu Forte-Bio korišćena je za procenu efekta ovde opisanih anti-PD-1 antitela na interakc ju između mišjeg PD-L1 i mišjeg PD-1 i između mišjeg PD-L2 i mišjeg PD-1. Antitela su razblažena na 10 µg/mL, uklјučujući i antitelo za kontrolu izotipa za upotrebu u oduzimanju pozadine. Fuzija mišjeg PD-1-Fc je razblažena do želјenih koncentrac ja (npr. 100 nM). Rastvorlјivo mišje izotipsko antitelo, koje će se koristiti kao reagens za blokiranje, razblaženo je na 250 µg/mL. Mišji PD-1 je premazan na senzore, praćen humanim Fc. Dodata su anti-PD-1 antitela i na kraju je izmereno vezivanje bilo mišjeg PD-L1 ili mišjeg PD-L2. Slika 3 pokazuje da su testirana anti-PD-1 antitela sposobna da blokiraju vezivanje oba mišja liganda za mišji PD-1. Nasuprot tome, ni pembrolizumab ni nivolumab nisu vezani za mišji PD-1 niti blokirali vezivanje mišjeg liganda za mišji PD-1.

Primer 5: Blokiranje antitelom vezivanja humanog PD-L1 i humanog PD-L2 za humani PD-1

[00236] PD-L1 i PD-L2 su dva prirodna liganda za PD-1 i interakc ja bilo kog liganda sa PD-1 može smanjiti regulaciju aktivirajućeg odgovora u T ćelijama. Dokazano je da odobrena terapijska antitela, kao što su nivolumab i pembrolizumab, blokiraju ovu interakciju i snižavaju reakcije humanih T ćel ja. Analiza okteta, na instrumentu Forte-Bio, korišćena je za procenu efekta ovde opisanih anti-PD-1 antitela na interakciju između humanog PD-L1 i humanog PD-1 i humanog PD-L2 i humanog PD-1. Antitela su razblažena na 10 µg/mL, uklјučujući i antitelo za kontrolu izotipa za upotrebu u oduzimanju pozadine. Fuzija humanog PD-1-Fc je razblažena do želјenih koncentracija (npr.100 nM). Rastvorlјivi humani Fc, koji će se koristiti kao reagens za blokiranje, razblažen je na 250 µg/mL. Humani-PD-1 je premazan na senzore, a zatim humani Fc. Dodata su anti-PD-1 antitela i na kraju je izmereno vezivanje humanog PD-L1 ili humanog PD-L2. Slika 4 pokazuje da su testirana anti-PD-1 antitela sposobna da blokiraju vezivanje oba humana liganda za humani PD-1, slično kao pembrolizumab i nivolumab.

Primer 6: In vivo izazivanje tumora

[00237] Sposobnost anti-PD-1 antitela da smanje rast tumora na mišjim modelima ispitana je ubrizgavanjem MC38 ćelija supkutano u bokove miševa C57BL6/J. Miševi su randomizovani u grupe sa približno 100 mm<3>prosečnom veličinom tumora, 11. dana i intraperitonealno im je injektirano 200 µg anti-PD-1 antitela 13407. Ponovlјene doze su davane 14, 18. i 21. dana. Kontrolna antitela, mišji IgG1 (MOPC-21), pacovski IgG2a (2A3), i pozitivna kontrola pacovskog anti-mišjeg PD-1 (RMP1-14) su kuplјeni od BioXcell-a. Veličine tumora su merene dva puta nede јno i eksperiment je završen nakon 24 dana. Težina tumora na kraju eksperimenta prikazana je na slici 5 i ukazuje na to da je anti-PD-1 antitelo 13407 smanjilo rast tumora kod miševa u sličnoj meri kao referentno anti-PD-1 antitelo.

Primer 7: Mapiranje epitopa antitela

[00238] Geni koji kodiraju različite varijante PD-1, PD-L1, PD-L2 i Fab fragmente antitela su sintetizovani i kodonom optimizovani od strane Atum inc. Humana laka kappa signalna sekvenca (MGTPAQLLFLLLLWLPDTTG; SEQ ID NO: 400) je uklјučena na 5’ kraju svih gena. Geni su klonirani u ekspresioni vektor sisara i sekvenca je verifikovana pre eksprimovanja proteina.

[00239] Rekombinantni proteini su eksprimovani u Expi293™ ekspresionom sistemu (Thermo Fisher Scientific) korišćenjem kompleta proizvođača za medijum, reagens za transfekciju, punjenje i ćelije. Ćelije su transfektovane u odnosu 1 µg/mL plazmidne DNK prema medijumu koristeći Expifectamine™ prema protokolu proizvođača. Ćelije su kultivisane u Erlenmajerovim bocama u inkubatoru na 37°C i sa 5% CO2. Posle 5 dana kulture su sakuplјene centrifugiranjem na 3000 rcf tokom 15 minuta, nakon čega je usledilo filtriranje pomoću filtera od 0,2 µm.

[00240] Prikupljeni supernatanti su podvrgnuti afinitetnom prečišćavanju. Proteini su ili sadržali heksa-histidinsku oznaku ili Fc oznaku, što je omogućilo ili prečišćavanje prema Ni afinitetu ili prečišćavanje prema afinitetu prema proteinu A.

[00241] Prečišćavanje prema Ni afinitetu izvedeno je na HisTrap™ Excel IMAC kolonama (GE Healthcare Life Sciences) korišćenjem 43 mM natrijum fosfata, 0,5 M natrijum hlorida, pH 7,4 kao vezujućeg pufera. Vezani protein je ispran vezujućim puferom, a zatim vezujućim puferom koji sadrži 20 mM imidazola. Eluiranje u koracima je izvedeno sa puferom za vezivanje koji sadrži 90 mM, 150 mM i 250 mM imidazola. Afinitetna prečišćavanja prema proteinu A su izvedena na kolonama HiTrap MabSelect Sure (GE Healthcare Life Sciences) korišćenjem PBS, pH 7,4 kao vezujućeg pufera. Eluiranje u koracima je izvedeno da se eluira vezani protein korišćenjem 0,1 M citratnog pufera pri pH 4,0, pH 3,5 i pH 2,0. Sve kisele elucione frakcije su neutralizovane sa 1M Tris, pH 9,0 koristeći odnos 20% v/v. Sve elucione frakc je su analizirane pomoću SEC-HPLC da bi se odredile frakcije iznad cilјne čistoće (> 90% monomerne). Za prečišćavanje koje n je dalo frakcije iznad cilјne čistoće, urađena je preparativna hromatografija isklјučiva po veličini pomoću kolone za hromatograf ju Superdex200 da bi se postigla cilјna čistoća. Pre zamrzavanja, prečišćenim proteinima je zamenjen pufer u konačni pufer (ili 20mM histidina, 150mM NaCl, pH6,0, ili 20mM HEPES, 150mM NaCl, pH7,5), držeći ih na pH najmanje 1 jedinicu dalјe od predviđenog pI cilјnog proteina.

[00242] Sve proteinske interakcije su procenjene na instrumentu ForteBio OctetRED96. Proteini su razblaženi u formulaciji kinetičkog pufera (PBS 0,1% BSA, 0,02% Tveen20, 0,05% natrijum azida) sa zapreminom uzorka od 220 µl/ležištu. Koncentracije liganda su normalizovane na 10 µg/ml, a koncentracije analita na 100 nM. Blokirajući reagens je korišćen u koncentraciji od 250 ug/ml. Vreme uravnoteženja senzora je podešeno na 60 sekundi, a vreme punjenja uzorka na 300 sekundi. Vreme blokiranja humanog Fc postavlјeno je na 300 sekundi. Analiza vremena asocijacije postavlјena je na 300s, a vreme disocijacije na 600s.

[00243] Za ovu metodu, antitela od interesa su orijentisana i uhvaćena na biosenzorima derivatizovanim antihumanim (ili anti-mišjim) Fc antitelima. Zatim se analizira vezivanje cilјnih proteina od interesa, u rastvoru, za senzore napunjene antitelima.

[00244] Za interakcije u kojima proteini sadrže Fc domene sličnih vrsta, uklјučen je dodatni korak blokiranja kako bi se smanjilo direktno vezivanje cilјnog proteina za biosenzor nezavisno od uhvaćenog antitela.

[00245] Događaji vezivanja su potvrđeni sa Y (da) ako je afinitet za varijantu PD-1 ili PD-1 druge vrste bio unutar približno 5 puta u poređenju sa afinitetom za humani PD-1 divlјeg tipa. Afiniteti koji su smanjeni za >10 puta i <100 puta označeni su kao smanjeni. Afiniteti smanjeni za >100 puta označeni su kao N (ne). Interakcije koje nisu procenjene navedene su kao ND (nisu utvrđene).

[00246] Var jante humanog PD-1 su proizvedene kao Fc fuzije vanćelijskog domena (ECD) sa C-terminalnim His6 oznakama i koriste se za analizu vezivanja PD-1 liganda, kao i Fab fragmenata nivolumaba, pembrolizumaba i 13407. Rezultati su prikazani u Tabeli 2.

T l 2: ž k k v ziv n PD-1

[00247] Zamene amino-kiselina za koje se izveštava da utiču na vezivanje pembrolizumaba procenjene su za vezivanje za panel molekula (Na et al., 2017, Cell Res., 27: 147-150). Vezivanje pembrolizumaba za PD-1 je ablirano sa supstitucijom D85G, dok vezivanje nivoalumaba i 13407 n je pogođeno. Vezivanje nivolumaba za PD-1 je takođe smanjeno kada se proceni u odnosu na varijantu N33-K167 sa skraćenim N-terminalnim krajem. Ovi rezultati ukazuju da 13407 kontaktira amino-kiseline koje se značajno razlikuju od onih koje kontaktiraju pembrolizumab i nivolumab.

[00248] Generisane su dodatne varijante koje su prethodno procenjene za ligande PD-L1 i PD-L2 (Lázár-Molnár et al., 2008, PNAS, 105: 10483-10488). Ove supstitucije amino-kiselina nisu uveliko uticale na vezivanje nivolumaba i pembrolizumaba, dok je afinitet vezivanja 13407 značajno smanjen supstitucijama I126A, L128A i E136A i eliminisan sa supstitucijama A132L i I134A. Podaci otkrivaju sličan profil vezivanja za 13407 kao kod PD-L1.

[00249] Panel Fab fragmenata je takođe procenjen za vezivanje za dodatne vrste PD-1. Pembrolizumab i nivolumab se ne vezuju za PD-1 miša, pacova ili psa. Nasuprot tome, 13407 se vezuje za PD-1 miša. Iznenađujuće, 13407 ne uspeva da se veže za PD-1 pacova uprkos visokoj homologiji između PD-1 pacova i miša. Generisana je varijanta miša PD-1 u kojoj je ostatak 129 zamenjen odgovarajućim ostatkom iz pacovske sekvence (H129P) i ustanovlјeno je da ablira vezivanje 13407. Kada je recipročna mutac ja, P129H, uvedena u sekvencu pacova, 13407 se vezao na varijantu. Primetno je da sekvenci PD-1 psa, za koju se 13407 ne veže, nedostaje prolin na ovoj poziciji.

[00250] Ukratko, 13407 vezuje epitop PD-1 koji se razlikuje od epitopa vezanih nivolumabom i pembrolizumabom.

Tabela sekvenci

Claims

Patentni zahtevi

1. Izolovano monoklono antitelo koje se veže za humani programirane smrti 1 (PD-1), naznačeno time što antitelo sadrži a) HCDR1 koji sadrži sekvencu amino-kiseline SEQ ID NO: 21; (b) HCDR2 koji sadrži sekvencu amino-kiseline SEQ ID NO: 22; (c) HCDR3 koji sadrži sekvencu amino-kiseline SEQ ID NO: 23; (d) LCDR1 koji sadrži sekvencu amino-kiseline SEQ ID NO: 25; (e) LCDR2 koji sadrži sekvencu amino-kiseline SEQ ID NO: 26; i (f) LCDR3 koji sadrži sekvencu amino-kiseline SEQ ID NO: 27.

2. Izolovano monoklono antitelo prema zahtevu 1, koje sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) i varijabilni region lakog lanca (VL), naznačeno time što VH je najmanje 95% identično sekvenci amino-kiseline SEQ ID NO: 20 i VL je najmanje 95% identično sekvenci amino-kiseline SEQ ID NO: 24.

3. Izolovano monoklono antitelo prema zahtevu 1, koje sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) i varijabilni region lakog lanca (VL), naznačeno time što VH sadrži sekvencu amino-kiseline SEQ ID NO: 20, a VL sadrži sekvencu amino-kiseline SEQ ID NO: 24.

4. Izolovano monoklono antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačeno time što se antitelo vezuje za humani PD-1 sa afinitetom (KD) manjim od 5 nM kako je utvrđeno korišćenjem bioslojne interferometr je.

5. Izolovano monoklono antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačeno time što se antitelo vezuje za mišji PD-1 sa afinitetom (KD) manjim od 10 nM kako je utvrđeno korišćenjem bioslojne interferometrije.

6. Izolovano monoklono antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačeno time što je antitelo humano antitelo.

7. Izolovano monoklono antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačeno time što je antitelo fragment antitela izabran iz Fab, Fab’, Fv, scFv or (Fab’)2 fragmenata.

8. Izolovano monoklono antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 6, naznačeno time što je antitelo, antitelo pune dužine.

9. Izolovano monoklono antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačeno time što antitelo inhibira vezivanje PD-1 za PD-L1 i/ili inhibira vezivanje PD-1 za PD-L2.

10. Izolovana nukleinska kiselina koja kodira antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva.

11. Ćelija domaćina koja proizvodi antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 9.

12. Postupak za pravljenje anti-PD-1 antitela, koji obuhvata kultivaciju ćelije domaćina prema zahtevu 11 pod uslovima pogodnim za ekspresiju antitela i opcionalno oporavak antitela.

13. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 9 i farmaceutski prihvatlјiv nosač.

14. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 9 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 13 za upotrebu u lečenju raka.

15. Antitelo ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 14, naznačeno time što je karcinom izabran iz melanoma, nemikrocelularnog raka pluća (NSCLC), karcinoma bubrežnih ćelija (RCC), raka želuca, raka mokraćne bešike, difuznog velikog B-ćelijskog limfoma (DLBCL), Hodžkinovog limfoma, raka jajnika, skvamoznog ćelijskog raka glave i vrata (HNSCC), mezotelioma i trostruko negativnog raka dojke (TNBC).

16. Antitelo ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 15, naznačeno time što je karcinom izabran iz melanoma, raka želuca, skvamoznog ćelijskog raka glave i vrata (HNSCC), nemikrocelularnog raka pluća (NSCLC) i trostruko negativnog raka dojke (TNBC).

17. Antitelo ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 14 do 16, naznačeni time što lečenje obuhvata davanje najmanje jednog dodatnog terap jskog sredstva.

18. Antitelo ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 17, naznačeni time što je dodatno terapijsko sredstvo odabrano od anti-ICOS antitela i anti-CTLA4 antitela.

19. Antitelo ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 14 do 18, naznačeno time što je za uzorak raka utvrđeno da eksprimuje PD-1, opciono time što uzorak pokazuje 1+, 2+ ili 3+ bojenje PD-1 imunohistohemijom (IHC); ili naznačeno time što je za uzorak utvrđeno da ima povišen nivo PD-L1, opciono time što se nivoi PD-L1 određuju pomoću IHC.