RS62593B1

RS62593B1 - Dijastereoselektivna sinteza derivata fosfata i proleka gemcitabina nuc-1031

Info

Publication number: RS62593B1
Application number: RS20211436A
Authority: RS
Inventors: Mani Bushan Kotala; Venkata Lakshmi Narasimha Rao Dammalapati
Original assignee: NuCana plc; Laurus Labs Ltd
Priority date: 2015-12-11
Filing date: 2016-12-09
Publication date: 2021-12-31
Also published as: AU2016367237A1; SG11201804774YA; CA3007347C; KR20180101370A; MX386478B; WO2017098252A1; JP6889180B2; EA201891391A1; PH12018501224A1; IL259887B; CA3007347A1; LT3386998T; HUE059026T2; CL2018001541A1; CY1124809T1; SI3386998T1; MA43405B1; MA43405A; MY196772A; AU2016367237B2

Description

Opis

STANJE TEHNIKE

[0001] Brojni analozi nukleozida kao što su citarabin, fludarabin, kladribin, kapecitabin, gemcitabin i pentostatin se klinički koriste kao visoko efikasni antineoplastični agensi. Među njima, gemcitabin (2',2'-difluoro-2'-deoksicitidin; na tržištu kao Gemzar™) je od posebnog interesa zbog svoje jedinstvene aktivnosti protiv solidnih tumora. Trenutno je odobren za lečenje karcinoma dojke, nesitnoćelijskog kancera pluća, kancera jajnika i pankreasa i široko se koristi za lečenje niza drugih kancera uključujući bešiku, žučne puteve, kolorektalni i limfom.

[0002] Veruje se da su za aktivnost gemcitabina protiv solidnih tumora odgovorni nekoliko mehanizama koji su jedinstveni za ovaj nukleozidni analog. Difosfatni metabolit gemcitabina inhibira ribonukleotid reduktazu, što dovodi do nižih koncentracija intracelularnog deoksicitidin trifosfata (dCTP) i samim tim, povećane ugradnje trifosfatnog gemcitabin metabolita u DNK, što dovodi do inhibicije sinteze DNK i blokira završetak ciklusa ćelijske deobe. Pored toga, smanjenje koncentracije dCTP ushodno reguliše enzim citidin kinazu, koji je odgovoran za početnu fosforilaciju gemcitabina, što je neophodan korak u inhibiciji sinteze DNK lekom. Konačno, trifosfatni metabolit gemcitabina je inhibitor citidin deaminaze, koja je odgovorna za inaktivaciju gemcitabina pretvaranjem u metabolit uridina. Shodno tome, aditivna priroda gore navedenih faktora može objasniti efikasnost gemcitabina u lečenju solidnih tumora.

[0003] Zbog lipofilne prirode ProTides, ovi molekuli mogu isporučiti nukleozidne monofosfate direktno u netaknutu tumorsku ćeliju. Prethodne studije su karakterisale višestruki mehanizmi ćelijskog transporta za nukleozidne analogne lekove i njihove derivate (za prikaz, videti Balimane et al., Adv. Drug Delivery Rev. 1999, 39, 183-209). Relativno hidrofilno jedinjenje, gemcitabin ima ograničenu sposobnost da prodre kroz plazma membrane putem pasivne difuzije i nekoliko studija je pokazalo da je gemcitabin supstrat za ekvilibrativne i koncentrisane nukleozidne transportere (ENT i CNT). Konkretno, gemcitabin se transportuje ljudskim ENT1, ENT2, CNT1 i CNT3, ali ne i purin-selektivnim koncentrisanim transporterom CNT2 (videti Mackei et al., Cancer Res. 1998, 58, 4349-4357; Mackey et al., J. Natl. Cancer Inst.1999, 91, 1876-1881; i Fang et al., Biochem. J.1996, 317, 457465).

[0004] SAD patent br. 4,808,614 otkriva 2,2'-difluoronukleozide koji su poznati antivirusni i antitumorski agensi, posebno 2',2'-difluoro-2'-deoksicitidin (obično poznat kao gemcitabin).

[0005] SAD patent br. 7,951,787 otkriva fosforamidatne derivate nukleotida kao što je 2'-deoksi-2',2'-difluoro-D-citidin-5'-O-[fenil(benzoksi-L-alaninil)]fosfat (takođe poznat kao gemcitabin-[fenil(benzoksi-L-alaninil)]fosfat ili NUC-1031). Postupci za hemijsku sintezu ovih derivata su otkriveni u ovom patentu reakcijom gemcitabina ili njegovih strukturnih varijanti sa dijastereoizomernom smešom fosfohlorida kao što je fenil-(benzoksi-L-alaninil)-fosforohloridat formule II u prisustvu N-metilimidazola nakon čega sledi prečišćavanje proizvoda hromatografijom na koloni, eluiranjem sa dihlorometanom/metanolom 95:5 da bi se dobio čist proizvod kao bela penasta čvrsta supstanca sa veoma niskim prinosom od 16%.

[0006] NUC-1031 se tipično priprema kao mešavina dva dijastereoizomera, epimernih na fosfatnom centru (Slusarczyk et al., J. of Med. Chem., 2014, 57(4), 1531-1542). Dijastereoizomeri NUC-1031 imaju sledeće strukture:

[0007] NUC-1031 je izuzetno lipofilan i stoga je slabo rastvorljiv u vodi (izračunato: <0,1 mg/mL), a jonizujući delovi imaju izračunate pKas koje se nalaze van pH opsega pogodnog za parenteralnu primenu. U suštini je nerastvorljiv u vodi, bez obzira na sadržaj soli ili pH, i to ima implikacije na razvoj formulacija za isporuku jedinjenja u dovoljno visokim dozama za efikasan tretman. Takođe ima implikacije na razvoj efikasnih proizvodnih postupaka koji će omogućiti da se NUC-1031 proizvodi isplativo.

[0008] Nedavno je otkriveno da (S)-epimer gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-fosfata ima dovoljnu rastvorljivost u smešama većeg broja polarnih organskih rastvarača sa vodom da bi se učinio pogodnim za formulaciju i primenu kao terapeutsko sredstvo. Rastvorljivost (R)-epimera je znatno niža. U određenim smešama rastvarača razlika u rastvorljivosti između (S)-epimera i (R)-epimera je preko 100 puta. Stoga se očekuje da se primenom (S)-epimera mogu razviti klinički efikasniji, praktičniji i prihvatljiviji postupci primene nego što se mogu razviti korišćenjem (R)-epimera ili primenom smeše. Stoga je poželjno da se može obezbediti gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfat u suštinski dijastereoizomerno čistom obliku.

[0009] Niska rastvorljivost NUC-1031 u mnogim rastvaračima, posebno onima koji se obično koriste u razdvajanju jedinjenja korišćenjem HPLC, znači da bi bile potrebne velike količine rastvarača za bilo koje odvajanje zasnovano na HPLC. To znači da bi bilo koji postupak industrijskog odvajanja zasnovanog na HPLC bio visok trošak, trošio bi velike količine energije i materijala i proizvodio velike količine otpada.

[0010] Iako se u vreme podnošenja ove prijave čini poželjnijim da se primenjuje gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-fosfat kao (S)-epimer, takođe se mogu zamisliti razlozi zbog kojih je potrebno nabaviti (R)- epimer u dijastereoizomerno čistom obliku. Ovo bi uključivalo sprovođenje uporednih testova, da bi se (R)-epimer pretvorio u (S)-epimer ili zato što (R)-epimer pruža prednosti u odnosu na (S)-epimer koje prevazilaze njegovu nisku rastvorljivost.

[0011] Zaista je pokazano da (R)-epimer ima poluživot u inkubaciji sa izolovanim ljudskim jetrenim ćelijama koji je četiri puta veći od (S)-epimera. Duži poluživot povezan sa (R)-izomerom ukazuje na niži unutrašnji klirens i trebalo bi da rezultira drugačijim farmakokinetičkim i farmakodinamičkim profilom u odnosu na (S)-izomer što može da ponudi neke prednosti.

[0012] (S)- i (R)-epimeri su terapeutski aktivni.

[0013] WO 2014/076490 otkriva postupak za pripremu nukleozidnih prolekova kao što je gemcitabin-[fenil(benzoksi-L-alaninil)] fosfat reakcijom gemcitabina ili njegovih strukturnih varijanti sa dijastereoizomernom smešom fosfohlorida u prisustvu katalizatora koji sadrži so metala kao što su Cu(OTf)2, CuCI, CuBr, Cul, Cu(OAc)2, CuSO4, Cu(OC(O)CF3)2, Me(OTf)3, Cu(OTf)2, Yb(OTf)3, Fe(OTf)3, La(OTf)3sa prinosom od 45%.

[0014] Bruce et al. otkrivaju sintezu dijastereoizomerno čistih nukleotidnih fosforamidata i predlažu upotrebu jednog izomera fosforamidnog reagensa koji se može koristiti za dobijanje željenog nukleozid fosforamidatnog dijastereomera. Pojedinačni dijastereoizomeri fosforamidirajućih reagenasa se izoluju pomoću HPLC, kristalizacije ili superkritične tečne hromatografije (Bruce et al., J. Org. Chem., 2011, 76, 9311-8319). WO 2011/123645 A2 otkriva slične postupke za sintezu sofosbuvira.

[0015] WO 2016/030335 A1 takođe otkriva razdvajanje dijastereoizomera fosforamidirajućeg reagensa putem superkritične tečne hromatografije.

[0016] Cilj određenih primera izvođenja ovog pronalaska je da obezbede postupak za obezbeđivanje gemcitabin-[fenil-(benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfata u suštinski dijastereoizomerno čistom obliku.

[0017] Cilj određenih primera izvođenja ovog pronalaska je da obezbede postupak za obezbeđivanje gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(R)-fosfata u suštinski dijastereoizomerno čistom obliku.

[0018] Cilj određenih primera izvođenja ovog pronalaska je da obezbede postupak za obezbeđivanje (S) i/ili (R)-epimera u značajno dijastereoizomerno čistom obliku (oblicima) koji je prilagodljiv, ekonomičan i/ili efikasan, npr. skalabilniji, ekonomičniji i/ili efikasniji od postupaka koji koriste HPLC. Stoga je cilj određenih primera izvođenja ovog pronalaska da obezbede postupak za obezbeđivanje (S) i/ili (R)-epimera u značajno dijastereoizomerno čistom obliku (oblicima) koji je pogodan za proizvodnju velikih razmera.

[0019] Cilj određenih primera izvođenja ovog pronalaska je da obezbede jednostavan postupak, tj. postupak koji uključuje minimalan broj koraka postupka i/ili reagenasa za obezbeđivanje (S) i/ili (R)-epimera (jesnog ili više) u značajno dijastereoizomerno čistom obliku (oblicima).

[0020] Sledeći cilj određenih primera izvođenja ovog pronalaska je da obezbedi postupak koji obezbeđuje da se odvojeni (S)- ili (R)-epimer obezbede u značajno dijastereoizomerno čistom obliku i da istovremeno ispunjavaju ili premašuju neophodne kriterijume koje propisuju organizacije kao što je US FDA u vezi sa količinama i prirodom bilo kakvih nečistoća u tragovima koje nastaju sintezom i odvajanjem.

[0021] Određeni primeri izvođenja ovog pronalaska zadovoljavaju neke ili sve gore navedene ciljeve.

SUŠTINA PRONALASKA

[0022] Predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za dijastereoizomerno obogaćivanje jedinjenja formule II;

pri čemu R<1>predstavlja grupu koja povlači elektrone i a je ceo broj od 1 do 5,

pri čemu postupak sadrži:

a) suspendovanje ili rastvaranje R-dijastereoizomera jedinjenja formule II; ili smeše (R)- i (S)-dijastereoizomera jedinjenja formule II u rastvaraču (S2);

b) tretiranje rastvora ili suspenzije sa organskom bazom amina ili neorganskom bazom (B2) da bi se dobio (S)-dijastereoizomer u suštinski dijastereomerno čistom obliku; i

c) izolovanje (S)-dijastereoizomera formule II.

[0023] Postupak može biti postupak za pripremu (S)-dijastereoizomera gemcitabin-[fenil (benzoksi-L-alaninil)] fosfata (Formula I) u suštinski dijastereoizomerno čistom obliku:

pri čemu postupak dalje sadrži korak d) i izborno korak e):

d) reagovanje jedinjenja (S)-dijastereoizomera Formule II dobijenog u koraku c) sa jedinjenjem Formule III u prisustvu baze (B1) da bi se dobilo jedinjenje Formule IV u značajno dijastereomerno čistom obliku; pri čemu P<1>, P<2>i P<3>nezavisno predstavljaju vodonik ili zaštitnu grupu; i gde je jedinjenje formule II u suštinski dijastereomerno čistom obliku:

e) gde bilo koji ili više od P<1>, P<2>i P<3>su zaštitne grupe, izborno uklanjajući zaštitne grupe P<1>, P<2>i P<3>iz jedinjenja formule IV da bi se dobio (S)-gemcitabin-[fenil (benzoksi-L-alaninil)] fosfat u značajno dijastereomerno čistom obliku.

[0024] U skladu sa ovim otkrićem dat je postupak za pripremu gemcitabin-[fenil (benzoksi-L-alaninil)] fosfata (Formula I) u značajno dijastereoizomerno čistom obliku:

pri čemu postupak sadrži korak d) i izborno korak e):

d) reagovanje jedinjenja formule II; pri čemu je R<1>predstavlja grupu za povlačenje elektrona i a je ceo broj od 1 do 5, sa jedinjenjem Formule III u prisustvu baze (B1) da bi se dobilo jedinjenje Formule IV u značajno dijastereomerno čistom obliku; pri čemu P<1>, P<2>i P<3>nezavisno predstavljaju vodonik ili zaštitnu grupu; i gde je jedinjenje formule II u značajno dijastereomerno čistom obliku:

e) gde bilo koji ili više od P<1>, P<2>i P<3>su zaštitne grupe, izborno uklanjajući zaštitne grupe P<1>, P<2>i P<3>iz jedinjenja formule IV da bi se dobio gemcitabin-[fenil (benzoksi-L-alaninil)] fosfat u značajno dijastereomerno čistom obliku.

[0025] R<1>može biti izabran iz grupe koja sadrži: halo grupu (npr. odabranu od fluora, broma, hlora ili joda); trifluorometil, cijano i nitro. a je ceo broj između 1 i 5. R<1>može biti u svakom slučaju halo, npr. fluoro. a može biti 5.

[0026] Pomeranje supstituisane fenoksi grupe se odvija uz inverziju stereohemije fosfata. Dakle, (S)-dijastereoizomer prekursora obezbeđuje (S)-dijastereoizomer NUC-1031, a (R)-dijastereoizomer prekursora obezbeđuje (R)-dijastereoizomer NUC-1031.

[0027] Baza (B1) može biti azotna baza. Azotne baze uključuju N-alkilimidazole, (npr. N-metil imidazol (NMI)), imidazol, opciono supstituisane piridine, (npr. kolidin, piridin, 2,6-lutidin) i trialkilamine (npr. trietilamin i diizopropiletilamin). Alternativno, baza (B1) može biti organometalna baza ili metal-hidridna baza (npr. NaH). Dakle, baza može biti Grignardov reagens (tj. alkilmagnezijum halogenid). Primeri Grignardovih reagenasa uključuju tbutilmagnezijum halogenide kao što su tBuMgCl, tBuMgBr. Poželjno, baza je tBuMgCl.

[0028] Postupak za dobijanje (S)-diastereoizomera gemcitabin-[fenil (benzoksi-L-alaninil)] fosfata (Formula I) u suštinski dijastereoizomerno čistom obliku može se izvesti u rastvaraču S1.

[0029] Pronalazači su iznenađujuće otkrili da nakon tretmana jedinjenja formule II sa bazom, ona izomerišu, prvenstveno formirajući (S)-dijastereoizomer u odnosu na (R)dijastereoizomer. Prema tome, (R)-dijastereoizomer se može konvertovati u (S)-dijastereoizomer ili epimerna smeša (R)-dijastereoizomera i (S)-dijastereoizomera može biti konvertovana u (S)-dijastereoizomer. Ovo povećava neto efikasnost bilo koje sintetičke sekvence za pripremu (S)-dijastereoizomera NUC-1031 koji uključuje postupak iz prvog aspekta jer to znači da svo jedinjenje formule II, čak i ono koje je prvobitno formirano kao (R)-dijastereoizomer se može koristiti i ništa od njega se ne odbacuje.

[0030] Može biti da postupak dalje sadrži:

formiranje jedinjenja formule II kao smeše (R)- i (S)-dijastereoizomera; i

da korak a) obuhvata suspendovanje ili rastvaranje smeše (R)- i (S)-dijastereoizomera jedinjenja formule II u rastvaraču (S2).

[0031] Baza (B2) može biti izabrana iz grupe koju čine organske baze amina (npr. primarni, sekundarni, tercijarni amini, ciklični amin; primeri organskih baza amina uključuju baze koje uključuju N-alkilimidazole, (npr. N-metil imidazol (NMI), imidazol) izborno supstituisane piridine (npr. kolidin, piridin, 2,6-lutidin) i trialkilamine (npr. trietilamin i diizopropiletilamin)) ili neorganske baze (npr. hidroksid alkalnih metala, karbonati alkalnih metala, alkoksidi alkalnih metala, ariloksidi alkalnih metala). Poželjno, B2 je tercijarni amin. Dakle, B2 može biti trialkilamin. Najpoželjnije, B2 je trietilamin.

[0032] Rastvarač S2 može biti izabran iz grupe koja se sastoji od amida, etara, estara, ketona, aromatičnih ugljovodonika, halogenisanih rastvarača, nitrila, sulfoksida, sulfona i njihovih smeša. S2 može biti organski rastvarač. Organski rastvarači uključuju, ali nisu ograničeni na etre (npr. tetrahidrofuran, dioksan, dietil etar); ketone (npr. aceton i metil izobutil keton); halogenisane rastvarače (npr. dihlorometan, hloroform i 1,2-dihloretan); ugljovodonike (npr. cikloheksan, pentan, heksan, heptan), aromatične rastvarače (npr. benzen i toluen), estre (npr. etil acetat) i amide (npr. DMF, NMP); ili njihove smeše. Poželjno, S2 je ugljovodonik ili smeša koja sadrži ugljovodonik. Kada je S2 smeša, to može biti smeša koja sadrži preko 50% (npr. preko 70%) ugljovodonika S2 može biti ugljovodonik. Ugljovodonik može biti heksan. Ugljovodonik može biti heptan. S2 može biti smeša heksana ili heptana i polarnog organskog rastvarača (npr. etar, estar, alkohol ili halogenisani rastvarač). S2 može biti smeša heksana ili heptana i polarnog organskog rastvarača, pri čemu smeša sadrži preko 50% (npr. preko 70% zapremine) heksana ili heptana. S2 može biti smeša heksana ili heptana i etil acetata. S2 može biti smeša heptana i etil acetata. S2 može biti smeša heksana ili heptana i etil acetata, smeša koja sadrži preko 50% (npr. preko 70%) po zapremini heksana ili heptana. S2 može biti smeša heptana i etil acetata, pri čemu smeša sadrži preko 50% (npr. preko 70%) po zapremini heptana.

[0033] Korak b) može uključivati mešanje smeše jedinjenja formule II i baze B2 tokom 2 h ili duže. Korak b) može uključivati mešanje smeše jedinjenja formule II i baze B2 tokom 6 h ili duže. Korak b) može uključiti mešanje smeše jedinjenja formule II i baze B2 tokom 10 h ili duže. Korak b) može uključiti mešanje smeše jedinjenja formule II i baze B2 tokom 16 h ili duže. Korak b) može uključivati mešanje smeše jedinjenja formule II i baze B2 do 36 h.

[0034] Korak b) može uključiti mešanje smeše jedinjenja formule II i baze B2 na temperaturi od 0 do 50°C. Korak b) može uključiti mešanje smeše jedinjenja formule II i baze B2 na temperaturi od 10 do 35°C.

[0035] U određenim specifičnim primerima izvođenja, jedinjenje formule II je jedinjenje izabrano od:

1

*predstavlja hiralni centar [0036] Jedinjenje formule II može biti:

[0037] Jedinjenje formule II može biti:

[0038] Zaštitna grupa za hidroksilnu grupu (npr. P<1>) može biti nezavisno izabrana od izborno supstituisanog -Si(C1-6alkil)3, izborno supstituisanog -C(O)-C1-C6-alkila, izborno supstituisanog -C(O)-arila, izborno supstituisanog -C(O)-OC1-C6-alkila, -C(O)-O-alila, -C(O)-O-CH2-fluorenila, izborno supstituisanog -CH(aril)3, izborno supstituisanog -(C1-C3-alkilen)-arila, izborno supstituisanog -C(O)OCH2-arila i -C1-C4-alkil-O-C1-C4-alkila.

[0039] Zaštitna grupa za amino grupu (npr. P<2>i/ili P<3>) može biti u svakom slučaju nezavisno izabrana od -C(O)OC1-C6-alkila, izborno supstituisanog -C(O)OCH2-arila, -C(O)-O-alila, -C(O)-O-CH2-fluorenila, izborno supstituisanog -CH(aril)3, izborno supstituisanog -(C1-C3-alkilen)-arila, izborno supstituisanog -C(O)-C1-C6-alkila, izborno supstituisanog -C(O)-arila, -S(O)2-C1-C6-alkila, izborno supstituisanog -S(O)2-arila i izborno supstituisanog -Si(C1-

6alkila)3.

[0040] Mnoga zaštićena početna jedinjenja Formule III su poznata u tehnici i/ili se mogu dobiti poznatim postupcima. Na primer, početna jedinjenja Formule III mogu se sintetisati od gemcitabina zaštitom 3'-hidroksi i 4-amino grupa sa odgovarajućim zaštitnim grupama. Zaštitne grupe se obično mogu dodati i ukloniti korišćenjem konvencionalne metodologije zaštitnih grupa, na primer, kao što je opisano u "Protective Groups in Organic Chemistry," edited by J W F McOmie (1973); "Protective Groups in Organic Synthesis," 2nd edition, T W Greene (1991); i "Protecting Groups", 3rd addition P. J Koscienski (1995).

[0041] Tipično će biti neophodno pripremiti jedinjenja zaštićena 3'-hidroksi i 4-amino grupom tako što će se prvo zaštititi 5'-hidroksi grupa gemcitabina sa zaštitnom grupom koja je ortogonalna onima koja će se koristiti za zaštitu 3'-hidroksi i 4-amino grupa (tj. grupa koja se može ukloniti bez uklanjanja željenih 3'-hidroksi i 4-amino grupa). Istovremeno ili naknadno, 3'-hidroksi i 4-amino grupe su zaštićene sa željenom zaštitnom grupom (grupama) i 5'-hidroksi zaštitna grupa može biti uklonjena da bi se dobilo jedinjenje formule III. Određene zaštitne grupe mogu se istovremeno uvesti na 3'-hidroksi i 5'-hidroksi i izborno 4-amino grupe, a zatim selektivno ukloniti sa 5' hidroksilne grupe bez uklanjanja sa 3'-hidroksi i 4-amino grupa.

[0042] Prema nekim primerima izvođenja, P<1>je nezavisno izabran od izborno supstituisanog -Si(C1-6alkila)3, izborno supstituisanog -C(O)-C1-C6-alkila, izborno supstituisanog -C(O)-arila,

1

izborno supstituisanog -C(O)-OC1-C6-alkila, -C(O)-O-alila, -C(O)-O-CH2-fluorenila, izborno supstituisanog -CH(arila)3, izborno supstituisanog -(C1-C3-alkilen)-arila, izborno supstituisanog -C(O)OCH2-arila i -C1-C4-alkil-O-C1-C4-alkila.

[0043] P<1>može biti nezavisno izabran od izborno supstituisanog -Si(C1-6alkila)3, izborno supstituisanog -C(O)-OC1-C6-alkila i izborno supstituisanog -C(O)OCH2-arila, -C(O)-O-alila. Poželjno, P<1>je izabran od -C(O)O-tBu, -C(O)O-benzila i -C(O)OCH2-alila. Dakle, P<1>može biti -C(O)OCH2-aril. P<1>može biti -C(O)O-tBu.

[0044] Alternativno, P<1>može biti nezavisno izabran od izborno supstituisanog -C(O)-C1-C6-alkila i izborno supstituisanog -C(O)-arila, npr. P<1>može biti nezavisno izabran od benzoila i acetila.

[0045] P<2>može biti nezavisno izabran od -C(O)OC1-C6-alkila, izborno supstituisanog -C(O)OCH2-arila, -C(O)-O-alila, -C(O)-O-CH2-fluorenila, izborno supstituisanog -CH(arila)3, izborno supstituisanog -(C1-C3-alkilen)-arila, izborno supstituisanog -C(O)-C1-C6-alkila, izborno supstituisanog -C(O)-arila, -S(O)2-C1-C6-alkila, izborno supstituisanog -S(O)2-arila i izborno supstituisanog -Si(C1-6alkila)3.

[0046] P<2>može biti nezavisno izabran od -C(O)OC1-C6-alkila, izborno supstituisanog -C(O)OCH2-arila, -C(O)-O-alila, izborno supstituisanog -CH(arila)3i izborno supstituisanog -Si(C1-6alkila)3. Poželjno, P<2>je izabran od -C(O)O-tBu, -C(O)O-benzila i -C(O)OCH2-alila. Dakle, P<2>može biti -C(O)OCH2-aril.

[0047] Alternativno, P<2>može biti nezavisno izabran od izborno supstituisanog -C(O)-C1-C6-alkila i izborno supstituisanog -C(O)-arila, npr. P<2>može biti nezavisno izabran od benzoila i acetila.

[0048] U sledećoj alternativi, P<2>je H.

[0049] Isto tako, P<3>može biti nezavisno izabran od H, -C(O)OC1-C6-alkila, izborno supstituisanog -C(O)OCH2-arila, -C(O)-O-alila, -C(O)-O-CH2-fluorenila, izborno supstituisanog -CH(arila)3, izborno supstituisanog -(C1-C3-alkilen)-arila, izborno supstituisanog -C(O)-C1-C6-alkila, izborno supstituisanog -C(O)-arila, -S(O)2-C1-C6-alkila, izborno supstituisanog -S(O)2-arila i izborno supstituisanog -Si(C1-6alkila)3.

[0050] Poželjno, P<3>je H.

[0051] Grupa izborno supstituisanog -Si(C1-6alkila)3može biti -Si(C1-4alkil)3grupa. Grupa je (tj. alkil grupe su) poželjno nesupstituisana. Ilustrativni primeri uključuju trietilsilil i t-butildimetilsilil.

[0052] Grupa izborno supstituisanog -C(O)-C1-C6-alkila može biti -C(O)-C1-C6-alkil grupa. Grupa (tj. alkil grupa) je poželjno nesupstituisana. Ilustrativni primeri uključuju acetil i propionil.

[0053] Grupa izborno supstituisanog -C(O)-arila može biti -C(O)-fenil grupa. Grupa (tj. fenil grupa) je poželjno nesupstituisana. Ilustrativni primeri uključuju benzoil.

[0054] Grupa izborno supstituisanog -C(O)-OC1-C6-alkila može biti -C(O)-OC1-C4-alkil grupa. Grupa (tj. alkil grupa) je poželjno nesupstituisana. Ilustrativni primeri uključuju -C(O)-O-metil i -C(O)-O-etil. Posebno poželjan primer je C(O)OtBu.

[0055] Grupa izborno supstituisanog -(C1-C3-alkilen)-arila je poželjno izborno supstituisana benzil grupa. Ilustrativni primeri uključuju benzil, fenetil, 4-metoksi benzil, 4-nitrobenzil, 4-bromobenzil, 2,3-dimetoksibenzil i 2,4-dimetoksibenzil.

[0056] Grupa izborno supstituisanog -C(O)OCH2-arila je poželjno izborno supstituisana -C(O)Obenzil grupa. Ilustrativni primeri uključuju -C(O)Obenzil i -C(O)O-(4-metoksibenzil).

[0057] Grupa izborno supstituisanog -C1-C4-alkil-O-C1-C4-alkila može biti -C1-C2-alkil-O-C1-C2-alkil grupa. Grupa je (tj. alkil grupe su) poželjno nesupstituisana. Ilustrativni primeri uključuju metoksi-metil (MOM) i 2-metoksi-etoksi-metil (MEM).

[0058] Grupa izborno supstituisanog -S(O)2-C1-C6-alkila može biti -S(O)2-C1-C4-alkil grupa. Grupa (tj. alkil grupa) je poželjno nesupstituisana. Ilustrativni primeri uključuju metansulfonat.

[0059] Grupa izborno supstituisanog -S(O)2-arila može biti -S(O)2-fenil grupa. Ilustrativni primeri uključuju fenilsulfonat, 4-metilfenilsulfonat i 4-nitro fenilsulfonat.

[0060] Grupa izborno supstituisanog -CH(arila)3može biti -CH(fenil)3grupa. Ilustrativni primeri uključuju tritil.

[0061] Tamo gde su dva ili više P<1>, P<2>i P<3>zaštitne grupe, korak uklanjanja zaštite može da sadrži dve ili tri pojedinačne reakcije uklanjanja zaštite. Ovo je slučaj kada se koriste dve ili tri različite zaštitne grupe i gde se te dve ili tri zaštitne grupe ne mogu ukloniti pod istim uslovima.

[0062] Međutim, korak uklanjanja zaštite može da obuhvata jednu reakciju uklanjanja zaštite u kojoj se uklanjaju sve zaštitne grupe. Dakle, može biti da su P<1>i P<2>zaštitne grupe koje se mogu ukloniti pod istim uslovima. Može biti da su P<1>i P<2>isti.

[0063] Može biti da su oba P<1>i P<2>grupa izabrana od izborno supstituisanog -C(O)OC1-C6-alkila, -C(O)-O-alila i izborno supstituisanog -C(O)OCH2-arila. Dakle, oba P<1>i P<2>mogu biti grupa izabrana od C(O)OtBu, -C(O)-O-alila i C(O)O-benzila. U nekim primerima izvođenja, P<1>i P<2>su oba C(O)OtBu grupe.

[0064] Poželjno P<3>je vodonik. Dakle, u posebnom aspektu, P<1>i P<2>su iste grupe i P<3>je vodonik. Dakle, u posebnom aspektu, P<1>i P<2>su oba C(O)OtBu grupe i P<3>je vodonik.

1

[0065] Može biti da svaki P<2>i P<3>su H i P<1>je zaštitna grupa. Može biti da P<2>i P<3>su svaki H i P<1>je zaštitna grupa izabrana između -C(O)O-tBu, -C(O)O-benzil i -C(O)OCH2-alil. Može biti da P<2>i P<3>su svaki H i P<1>je -C(O)O-tBu.

[0066] U ovoj specifikaciji, 'dijastereomerno obogaćeni oblik' i 'u suštini dijastereomerno čisti oblik' označavaju dijastereoizomernu čistoću veću od 95%. 'Dijastereomerno obogaćen oblik' i 'u suštini dijastereomerno čist oblik' mogu značiti dijastereoizomernu čistoću veću od 98%, veću od 99% ili veću od 99,5%.

[0067] Bilo koja od gore navedenih alkil i aril (npr. fenil, uključujući fenil grupe u benzil grupama) grupa je opciono supstituisana, gde je to hemijski moguće, sa 1 do 3 supstituenta koji su svaki nezavisno pri svakom pojavljivanju izabrani iz grupe koja se sastoji od sledećih: okso, =NR<a>, =NOR<a>, halo, nitro, cijano, NR<a>R<a>, NR<a>S(O)2R<a>, NR<a>CONR<a>R<a>, NR<a>CO2R<a>, OR<a>; SR<a>, SOR<a>, SO3R<a>, SO2R<a>, SO2NR<a>R<a>, CO2R<a>, C(O)R<a>, CONR<a>R<a>, C1-C4-alkil, C2-C4-alkenil, C2-C4-alkenil i C1-C4haloalkil; pri čemu je R<a>je nezavisno pri svakom pojavljivanju izabran od H, C1-C4alkila i C1-C4haloalkila.

[0068] Može biti da je bilo koja od gore navedenih alkil grupa nesupstituisana.

[0069] Može biti da je bilo koja od gore navedenih aril grupa (npr. fenil, uključujući fenil grupe u benzil grupama) izborno supstituisana, gde je to hemijski moguće, sa 1 do 3 supstituenta koji su svaki nezavisno pri svakom pojavljivanju izabrani iz grupe koja se sastoji od sledećih: halo, nitro, cijano, NR<a>R<a>, NR<a>S(O)2R<a>, NR<a>CONR<a>R<a>, NR<a>CO2R<a>, OR<a>; SR<a>, SOR<a>, SO3R<a>, SO2R<a>, SO2NR<a>R<a>CO2R<a>, C(O)R<a>, CONR<a>R<a>, C1-C4-alkil, C2-C4-alkenil, C2-C4-alkenil i C1-C4haloalkil; pri čemu je R<a>je nezavisno pri svakom pojavljivanju izabran od H, C1-C4alkila i C1-C4haloalkila.

[0070] Može biti da je bilo koja od gore pomenutih aril (npr. fenil, uključujući fenil grupe u benzil grupama) grupa izborno supstituisana sa 1 do 3 supstituenta koji su svaki nezavisno pri svakom pojavljivanju izabrani iz grupe koja se sastoji od sledećih: halo, nitro, OR<a>; C1-C4-alkil, C1-C4haloalkil; pri čemu je R<a>je nezavisno pri svakom pojavljivanju izabran od H, C1-C4alkila i C1-C4haloalkila.

[0071] Aril grupe imaju od 6 do 20 atoma ugljenika kako bi se zadovoljili zahtevi za valentnost. Aril grupe su karbociklične grupe koje zadovoljavaju Hukelovo pravilo (tj. sadrže karbociklični sistem prstenova koji sadrži 2(2n 1)π elektrona). Aril grupe mogu biti izborno supstituisane fenil grupe, izborno supstituisane bifenil grupe, izborno supstituisane naftalenil grupe ili izborno supstituisane antracenil grupe. Jednako, aril grupe mogu uključivati nearomatične karbociklične delove. Poželjno, aril grupa je izborno supstituisana fenil grupa.

[0072] Alkil grupe mogu biti ravnolančane ili razgranate. Tako, na primer, C4alkil grupa

1

može biti n-butil, i-butil ili t-butil.

[0073] Korak d) se može izvesti u organskom rastvaraču (S1). Organski rastvarači uključuju, ali nisu ograničeni na etre (npr. tetrahidrofuran, dioksan, dietil etar); ketone (npr. aceton i metil izobutil keton); halogenisane rastvarače (npr. dihlorometan, hloroform i 1,2-dihloretan); i amide (npr. DMF, NMP); ili njihove smeše. Kada se korak d) izvodi u prisustvu Grignardovog reagensa, organski rastvarač je poželjno etar. Najpoželjnije, rastvarač je tetrahidrofuran.

[0074] Kada se korak d) izvodi u prisustvu azotne baze, organski rastvarač je najpoželjnije halogenisani rastvarač ili amid.

[0075] Reakcija se tipično izvodi na pogodnoj temperaturi, npr. od oko -5°C do oko 40°C. Poželjno, reakciona temperatura je oko 25°C do oko 30°C. Reakcija se može ostaviti da se meša tokom vremenskog perioda od oko 15 min do oko 16 h i poželjno od oko 30 min do oko -60 min.

[0076] Dobijeni organski sloj koji sadrži zaštićeni fosforamidat Formule II može se obraditi direktno u istom reakcionom sudu da bi se formirao gemcitabin-[fenil(benzoksi-L-alaninil)]fosfat formule I. Alternativno, rastvarač iz organskog sloja se može koncentrisati da bi se dobio ostatak sirovog proizvoda bilo kojim postupkom poznatim u tehnici, na kraju reakcije, na primer destilacijom, isparavanjem, rotacionim sušenjem (kao što je kod Buchi rotacionog isparivača), sušenjem zamrzavanjem, sušenjem u fluidizovanom sloju, fleš sušenjem, sušenjem centrifugiranjem. Poželjno je da se rastvarač ukloni destilacijom pod vakuumom.

[0077] Postupci pronalaska mogu takođe uključiti uklanjanje zaštite sa hidroksi i amino zaštitnih grupa.

[0078] Može biti da se korak uklanjanja zaštite (korak e)) izvodi bez prečišćavanja proizvoda iz koraka d).

[0079] Tamo gde je zaštitna grupa osetljiva na kiselinu, npr. tritil, C(O)OtBu, MOM, MEM, 2,4-dimetoksibenzil, 2,3-dimetoksibenzil, korak uklanjanja zaštite može da se izvede korišćenjem odgovarajuće kiseline. Kiselina može biti Bronstedova kiselina (npr. TFA, fosforna kiselina, HCl ili mravlja kiselina) ili Luisova kiselina (npr. ZnBr2, CeCl3). Luisove kiseline (npr. ZnBr2) su manje poželjne. HCl je takođe manje poželjna. Poželjno, kiselina je TFA.

[0080] Tamo gde je zaštitna grupa osetljiva na bazu, npr. acetil, benzoil, korak deprotekcije može da se izvede korišćenjem pogodne baze, npr. vodeni rastvor NH3ili vodeni rastvor NaOH. Grupe osetljive na bazu mogu biti manje poželjne.

1

[0081] Tamo gde je zaštitna grupa silil grupa (npr. trietilsilil ili t-butildimetilsilil, korak deprotekcije može da se izvede korišćenjem odgovarajuće kiseline (npr. TFA) ili korišćenjem odgovarajućeg izvora fluora (npr. tetrabutilamonijum fluorid, fluorosilicijumova kiselina, HF).

[0082] Kada je zaštitna grupa benzil grupa ili C(O)Obenzil grupa, korak uklanjanja zaštite može da se izvede korišćenjem H2i odgovarajućeg katalizatora (npr. Pd/C). Takve zaštitne grupe mogu biti manje poželjne.

[0083] Kada je zaštitna grupa 4-metoksi benzil, 2,3-dimetoksibenzil, 2,4-dimetoksibenzil ili C(O)O-(4-metoksibenzil), korak deprotekcije može da se izvede korišćenjem odgovarajućeg oksidacionog sredstva (npr. meta-hloroperbenzojeve kiseline).

[0084] Tamo gde je zaštitna grupa -C(O)-O-alil, korak deprotekcije se može izvesti korišćenjem (PPh3)4Pd.

[0085] Tamo gde je zaštitna grupa -C(O)-O-CH2-fluorenil, korak uklanjanja zaštite može se izvesti korišćenjem piperidina.

[0086] Tamo gde P<1>je C(O)OtBu, uklanjanje zaštite se može postići korišćenjem C1-C4-alkohola i/ili vode. Tamo gde P<1>je C(O)OtBu, uklanjanje zaštite se može postići upotrebom smeše C1-C4-alkohola i vode. Uklanjanje zaštite se može postići upotrebom smeše izopropil alkohola (IPA) i vode.

[0087] Korak uklanjanja zaštite može da se izvede u organskom rastvaraču ili njihovoj smeši. Primeri organskih rastvarača uključuju, ali nisu ograničeni na halogenizovane rastvarače (npr. dihlorometan, hloroform, dihloretan); alkohole (npr. metanol, etanol, izopropanol) i etre (npr. tetrahidrofuran, dietil etar).

[0088] Kada se korak uklanjanja zaštite izvodi u prisustvu kiseline (npr. TFA, organski rastvarač je poželjno halogenisani rastvarač, npr. dihlorometan.

[0089] Reakcija uklanjanja zaštite može da se izvede na temperaturi u opsegu od, na primer, -10°C do oko 30°C, npr. do oko 10°C. Pogodna temperatura za izvođenje reakcije je -5°C do 5°C. Reakcija se može ostaviti da se meša u periodu od oko 15 minuta do oko 16 sati i poželjno od oko 1 sat do oko 4 sata, a poželjnije od oko 2 sata do oko 3 sata.

[0090] Gde se korak e) postiže korišćenjem C1-C4-alkohola i/ili vode (npr. smeše izopropil alkohola (IPA) i vode), reakciona smeša može da se zagreje, npr. na temperaturu od 30°C do 90°C ili na temperaturu od 60°C do 85°C.

[0091] Tamo gde se uklanjanje zaštite vrši u prisustvu kiseline (npr. TFA), izolacija proizvoda dobijenog nakon uklanjanja zaštite se obično vrši gašenjem viška kiseline koja se koristi u koraku uklanjanja zaštite i ekstrahovanjem proizvoda sa organskim rastvaračem koji se ne

1

meša sa vodom i izolacijom proizvoda isparavanjem organskog rastvarača.

[0092] Primeri organskih rastvarača koji se ne mešaju sa vodom korisnih u ekstrakciji obuhvataju estre kao što su etil acetat, metil acetat, izopropil acetat i slično; hlorisane rastvarače kao što su dihlorometan, hloroform i slično; aromatične ugljovodonične rastvarače kao što su toluen, ksilen i slično; poželjno etil acetat.

[0093] Može biti da P<1>i P<2>su oba C(O)OtBu grupe i P<3>je vodonik, korak d) se izvodi u prisustvu tBuMgCl (npr. u THF), a korak e) se izvodi upotrebom TFA (npr. u DCM).

[0094] Može biti da P<1>je C(O)OtBu grupa, P<2>i P<3>su svaki vodonik, korak d) se izvodi u prisustvu tBuMgCl (npr. u THF). Može biti da se korak e) izvodi bez izolovanja proizvoda iz koraka d), npr. dodavanjem smeše IPA i vode u reakcionu smešu iz koraka d) kada se reakcija iz koraka d) završi.

[0095] U određenim primerima izvođenja, još uvek može biti poželjno da se prečisti gemcitabin-[fenil(benzoksi-L-alaninil)] fosfat dobijen iz postupka iz prvog aspekta pronalaska. Slično, još uvek može biti poželjno da se prečisti jedinjenje formule II dobijeno iz postupka drugog aspekta pronalaska. Postupci prečišćavanja su dobro poznati stručnjacima i uključuju hromatografiju (npr. hromatografiju na koloni), rekristalizaciju i destilaciju. U drugim primerima izvođenja, prečišćavanje nije neophodno.

[0096] U ovoj specifikaciji se koriste sledeće skraćenice:

PRIMERI

[0097] Ovaj pronalazak je dalje ilustrovan sledećim primerima 3, 8 i 10, koji su dati samo kao ilustracija i ne bi trebalo da se tumače tako da ograničavaju obim pronalaska kako je definisan u priloženim zahtevima.

1

Referentni primer 1:

Priprema dijastereoizomerne smeše benzil estra 2-[(2,3,4,5,6-pentafluorofenoksi)-fenoksi-fosforil amino] propionske kiseline (Formula IIa)

[0098]

[0099] U mešanu smešu L-alanin benzil estra hidrohlorida (100 g) u metilen hloridu (1 l) dodat je fenil dihlorfosfat (77 ml) na 25-35°C i dobijena smeša je ohlađena na -70°C do -78°C, dodat je trietilamin (130,5 ml) i mešana je 1 sat na istoj temperaturi. Temperatura reakcione mase je podignuta na 25-35°C i ostavljena da se meša 2 sata. Nakon završetka reakcije, reakciona masa je koncentrovana pod vakuumom na ispod 35°C da bi se dobio ostatak. Dobijenom ostatku je dodat diizopropil etar (2 l) na 25-35°C i mešan 30 min na istoj temperaturi. Reakciona masa je filtrirana i isprana diizopropil etrom (500 ml), a zatim je filtrat koncentrovan pod vakuumom na ispod 35°C da bi se dobio fenil-(benzoksi-L-alaninil)-fosforohloridat. Dobijeno jedinjenje je rastvoreno u metilen hloridu (1 l) na 25-35°C i ohlađeno na -5°C do -10°C. Reakcionoj masi Pentafluorofenola (85,5 g), dodat je trietilamin (65,2 ml) na istoj temperaturi i mešan 2 sata. Nakon završetka reakcije, reakciona masa je koncentrovana pod vakuumom na ispod 35°C i napunjena etil acetatom (1 l) na 25-35°C i

2

mešana 30 min na istoj temperaturi. Čvrste materije su filtrirane i isprane etil acetatom (1 l). Filtratu je dodata voda (1 l), ispran je 10% natrijum karbonatom (2x1 l), fiziološkim rastvorom (1 l) i organski sloj je osušen sa anhidrovanim natrijum sulfatom, koncentrovan pod vakuumom na 35-45°C da bi se dobila dijastereoizomerna smeša naslovljeno jedinjenje kao belo obojena polučvrsta materija.

Prinos: 210 g

Hiralna čistoća prema HPLC (% površine): 33,74:66,26% (RP: SP)

Referentni primer 2:

Razdvajanje Sp-dijastereoizomera benzil estra 2-[(2,3,4,5,6-pentafluorofenoksi)-fenoksifosforil amino] propionske kiseline (Formula IIa)

[0100]

[0101] U gore dobijenu dijastereoizomernu smešu formule IIa (RP: SP- 33,74:66,26%) dodat je 20% etil acetat u heksanu (1,2 l) na 25-35°C i mešan 1 sat. Čvrste materije su filtrirane i isprane sa 20% etil acetatom u heksanu (300 ml) da bi se dobila smeša jedinjenja formule IIa. Prinos: 112 g

Hiralna čistoća prema HPLC (% površine): 22,13:77,87% (RP: SP)

Filtrat je koncentrovan pod vakuumom da bi se dobila dijastereoizomerna smeša Formule IIa (75 g; RP: SP-65.43:34.57%).

[0102] U gore dobijenu dijastereoizomernu smešu formule IIa (RP: SP- 22,13:77,87%) dodat je 20% etil acetat u heksanu (1,2 l) na 25-35°C i mešan 1 sat. Čvrsta supstanca je filtrirana i isprana sa 20% etil acetatom u heksanu (300 ml) da bi se dobio čist Sp-dijastereoizomer jedinjenja formule IIa.

Prinos: 80 g

Hiralna čistoća pomoću HPLC (% površine): 0,20:99,80% (RP: SP)

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6): 7,18-7,41 (m, 10H), 6,91-6,99 (d, 1H), 5,10 (s, 2H), 4,01-4,11 (m, 1H), 1,30-1,32 (d, 3H)

ESI-MS (m/z): 524 (M+1)

Filtrat je koncentrovan pod vakuumom da bi se dobila dijastereoizomerna smeša Formule IIa (28 g; RP: SP-80.77:19.23%).

Primer 3:

Izomerizacija 2-[(2,3,4,5,6-pentafluorofenoksi)-fenoksi-fosforilamino]benzil estra propionske kiseline (Formula IIa)

[0103] U mešani rastvor gore dobijenog benzil estra 2-[(2,3,4,5,6-pentafluorofenoksi)-fenoksi-fosforil amino] propionske kiseline Formule IIa (75 g; RP: SP- 65,43:34,57%) u 20% etil acetatu u heksanu (1,1 l), dodat je trietilamin (7,5 ml) na 25-35°C i mešan 6 sati na istoj temperaturi. Nakon završetka reakcije, reakciona masa je ugašena u vodi (750 ml) i ekstrahovana sa etil acetatom (750 ml). Organski sloj je osušen anhidrovanim natrijum sulfatom i koncentrovan pod vakuumom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova kao čvrsta supstanca.

Prinos: 45 g

Hiralna čistoća prema HPLC (% površine): 91,29: 8,71% (SP: RP)

[0104] Gore dobijena Rpi Sp-dijastereoizomerna smeša benzil estra 2-[(2,3,4,5,6-pentafluorofenoksi)-fenoksi-fosforil amino] propionske kiseline formule IIa (45 g; RP: SP-8,71:91,29%) je suspendovana u 20% etil acetatu u heksanu (1,1 l) na 25-30°C i mešana 1 h na istoj temperaturi. Čvrsta supstanca je filtrirana i isprana sa 20% etil acetatom u heksanu (225 ml) da bi se dobio Sp-dijastereoizomer jedinjenja iz naslova kao čvrsta supstanca.

Prinos: 19 g

Hiralna čistoća prema HPLC (% površine): 99,92: 0,08% (SP: Rp)

Referentni primer 4:

Priprema Sp-dijastereoizomera NUC-1031 (upotrebom Sp-dijastereoizomera formule IIa)

[0105]

[0106] U mešanu smešu 3'-O-(terc-butoksikarbonil)gemcitabina (5 g) u tetrahidrofuranu (75 ml) dodat je terc-butil magnezijum hlorid (15,2 ml 2,0 M u tetrahidrofuranu) i Sp-dijastereoizomer benzil estra 2-[(2,3,4,5,6-pentafluorofenoksi)-fenoksi-fosforil amino] propionske kiseline formule IIa (8,3 g razblažen u 50 ml tetrahidrofurana)) na 0°C do -5°C i temperatura je podignuta na 25-30°C i mešana 30 min na istoj temperaturi. Nakon završetka reakcije, reakciona masa je ugašena u 0,5 N hlorovodonične kiseline (50 ml) i ekstrahovana etil acetatom (2x75 ml). Organskom sloj je redom ispiran sa 10% natrijum karbonatom (2x50 ml), fiziološkim rastvorom (50 ml). Organski sloj je odvojen, osušen iznad natrijum sulfata i koncentrovan pod vakuumom da bi se dobio ostatak.

[0107] Dobijeni ostatak je stavljen u metilen hlorid (50 ml) i dodata je trifluorosirćetna kiselina (18,5 ml) na 0°C do 5°C. Održavana je reakciona masa na 25-35°C tokom 2 sata i ugašena do 20% rastvora natrijum karbonata (125 ml). Ekstrahovan sa etil acetatom (165 ml),

2

organski sloj je osušen preko natrijum sulfata i uparen pod vakuumom na 40-45°C. Dobijeni ostatak je suspendovan u smeši 50% etil acetata u heptanu (150 ml) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova.

Prinos: 4,8 g

Hiralna čistoća prema HPLC (% površine): 99,4% (Sp-dijastereoizomer)

Referentni primer 5:

Priprema dijastereoizomerne smeše benzil estra 2-[(4-nitrofenoksi)-fenoksifosforilamino] propionske kiseline Formule IIb

[0108]

[0109] U mešanu smešu L-alanin benzil estra hidrohlorida (50 g) u metilen hloridu (500 ml) dodat je fenil dihlorfosfat (54 g) na 25-35°C i dobijena smeša je ohlađena na -70°C do -78°C, dodat je trietilamin (65,2 ml) i mešana je 1 sat na istoj temperaturi. Temperatura reakcione mase je podignuta na 25-35°C i ostavljena da se meša 2 sata. Nakon završetka reakcije, reakciona masa je koncentrovana pod vakuumom na ispod 35°C da bi se dobio ostatak. Dobijenom ostatku je dodat diizopropil etar (1 litar) na 25-35°C i mešan 30 min na istoj temperaturi. Reakciona masa je filtrirana i isprana diizopropil etrom (250 ml), a zatim je filtrat koncentrovan pod vakuumom na ispod 35°C da bi se dobio fenil-(benzoksi-L-alaninil)-fosforohloridat. Dobijeno jedinjenje je rastvoreno u metilen hloridu (500 ml) na 25-35°C i ohlađeno na -5°C do -10°C. U reakcionu masu paranitrofenola (27,5 g), dodat je trietilamin (65,2 ml) na istoj temperaturi i mešan 2 sata. Nakon završetka reakcije, reakciona masa je koncentrovana pod vakuumom na ispod 35°C i napunjena etil acetatom (500 ml) na 25-35°C i mešana 30 min na istoj temperaturi. Čvrste materije su filtrirane i isprane etil acetatom (500 ml). Filtrat je ispiran vodom (500 ml), 10% natrijum karbonatom (2x500 ml), fiziološkim rastvorom (500 ml), a organski sloj je osušen anhidrovanim natrijum sulfatom, koncentrovan pod vakuumom na 35-40°C da bi se dobila dijastereoizomerna smeša jedinjenja iz naslova kao gusta uljasta tečnost.

Prinos: 90 g

Hiralna čistoća prema HPLC (% površine): 45,6: 54,94% (RP: SP)

[0110] Gore dobijena dijastereoizomerna smeša benzil estra 2-[(4-nitrofenoksi)-fenoksifosforilamino] propionske kiseline formule IIb (40 g; Rp: Sp- 45,6: 54,94%) izdvojena je u čiste Spi Rpdijastereoizomere preparativnom HPLC i čiste frakcije su koncentrovane pod vakuumom da bi se dobili Spi Rpdijastereoizomeri odvojeno.

Prinos: Sp-dijastereoizomer: 8 g,

<1>H NMR (300 MHz, CDCl3):- 8,15-8,19 (d, 2H), 7,15-8,37 (m, 12H), 5,12 (s, 2H), 4,02-4,24 (m, 2H), 1,39-1,42 (d, 3H)

ESI-MS (m/z): - 479 (M+Na)

Rp-dijastereoizomer: 6 g,

<1>H NMR (300 MHz, CDCl3):- 8,08-8,13 (d, 2H), 7,15-7,34 (m, 12H), 5,10 (s, 2H), 4,48-4,56 (m, 1H), 4,11-4,20 (m, 1H), 1,39-1,41 ( d, 3H)

ESI-MS (m/z): -457 (M+1)<+>

Sp& Rp- dijastereoizomerna smeša: 20 g

Referentni primer 6:

Priprema Sp-dijastereoizomera NUC-1031 (upotrebom Sp-dijastereoizomera formule IIb)

[0111]

2

[0112] U mešanu smešu 3'-O-(terc-butoksikarbonil) gemcitabina (2 g) u tetrahidrofuranu (30 ml), dodat je N-metil piridin (2 ml), terc-butil magnezijum hlorid (5,5 ml 2,0 M u tetrahidrofuranu) i Sp-dijastereoizomer benzil estra 2-[(4-nitrofenoksi)-fenoksi-fosforilamino] propionske kiseline formule IIb (4 g razblaženo u 20 ml tetrahidrofurana) na 0°C do -5°C i temperatura je podignuta na 25-30°C i mešana 30 min na istoj temperaturi. Nakon završetka reakcije, reakciona masa je ugašena u 0,5 N hlorovodonične kiseline (20 ml) i ekstrahovana sa etil acetatom (2x30 ml). Organski sloj je ispiran 10% natrijum karbonatom (2x20 ml), fiziološkim rastvorom (20 ml) uzastopno. Organski sloj je odvojen, osušen iznad natrijum sulfata i koncentrovan pod vakuumom da bi se dobio ostatak.

[0113] Dobijeni ostatak je stavljen u metilen hlorid (20 ml) i dodata je trifluorosirćetna kiselina (7,4 ml) na 0°C do 5°C. Reakciona masa je održavana na 25-35°C tokom 2 sata i ugašena u do 20% rastvoru natrijum karbonata (30 ml). Ekstrahovana je etil acetatom (66 ml), organski sloj je osušen preko natrijum sulfata i uparen pod vakuumom na 40-45°C. Dobijeni ostatak (3 g; Sp- 85,98%) je prečišćen postupkom hromatografije na koloni eluiranjem sa 2-10% izopropanola u smeši metilen hlorida. Frakcije koje sadrže proizvod su sakupljene i koncentrovane pod vakuumom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova kao čvrsta supstanca. Prinos: 1,1 g

Hiralna čistoća prema HPLC (% površine): 97,88: 0,48% (Sp: Rp)

2

Uporedni primer 7:

Priprema Rp-dijastereoizomera gemcitabin-[fenil (benzoksi-L-alaninil)] fosfata formule I (upotrebom Rp-dijastereoizomera formule IIb)

[0114]

[0115] U mešanu smešu 3'-O-(terc-butoksikarbonil) gemcitabina (2 g) u tetrahidrofuranu (30 ml), dodat je N-metil piridin (2 ml), terc-butil magnezijum hlorid (5,5 ml 2,0 M u tetrahidrofuranu) i Rp-dijastereoizomer benzil estra 2-[(4-nitrofenoksi)-fenoksi-fosforilamino] propionske kiseline formule IIb (4 g razblaženo u 20 ml tetrahidrofurana) na 0°C do -5°C i temperatura je podignuta na 25-30°C i mešana je 30 min na istoj temperaturi. Nakon završetka reakcije, reakciona masa je ugašena u 0,5 N hlorovodonične kiseline (20 ml) i ekstrahovana sa etil acetatom (2x30 ml). Organski sloj je redom ispiran sa 10% natrijum karbonatom (2x20 ml), fiziološkim rastvorom (20 ml). Organski sloj je odvojen, osušen iznad natrijum sulfata i koncentrovan pod vakuumom da bi se dobio ostatak.

[0116] Dobijeni ostatak je stavljen u metilen hlorid (20 ml) i dodata je trifluorosirćetna kiselina (7,4 ml) na 0°C do 5°C. Reakciona masa je održavana na 25-35°C tokom 2 sata i ugašena u do 20% rastvoru natrijum karbonata (30 ml). Ekstrahovana je etil acetatom (66 ml), organski sloj je osušen preko natrijum sulfata i uparen pod vakuumom na 40-45°C. Dobijeni

2

ostatak (2,9 g; Rp-84,05%) je prečišćen postupkom hromatografije na koloni eluiranjem sa 2-10% izopropanolom u smeši metilen hlorida. Frakcije koje sadrže proizvod su sakupljene i koncentrovane pod vakuumom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova kao čvrsta supstanca. Prinos: 1,4 g

Hiralna čistoća prema HPLC (% površine): 97,99: 0,86% (Rp: Sp)

Primer 8:

Priprema Sp-dijastereoizomera gemcitabin-[fenil (benzoksi-L-alaninil)] fosfata formule I (upotrebom izomerizovanog Sp-dijastereoizomera formule IIa iz primera-3)

[0117]

[0118] U mešanu smešu 3'-O-(terc-butoksikarbonil) gemcitabina (5 g) u tetrahidrofuranu (75 ml) dodat je terc-butil magnezijum hlorid (15,2 ml 2,0 M u tetrahidrofuranu) i Sp-dijastereoizomer benzil estra 2-[(2,3,4,5,6-pentafluorofenoksi)-fenoksi-fosforil amino] propionske kiseline formule IIa (8,3 g iz Primera-3 (99,92%); razblažen u 50 ml tetrahidrofurana) na 0°C do -5°C i temperatura je podignuta na 25-30°C i mešana 30 min na istoj temperaturi. Nakon završetka reakcije, reakciona masa je ugašena u 0,5 N hlorovodonične kiseline (50 ml) i ekstrahovana etil acetatom (2x75 ml). Organski sloj je

2

redom ispiran 10% natrijum karbonatom (2x50 ml), fiziološkim rastvorom (50 ml). Organski sloj je odvojen, osušen iznad natrijum sulfata i koncentrovan pod vakuumom da bi se dobio ostatak.

[0119] Dobijeni ostatak je stavljen u metilen hlorid (50 ml) i dodata je trifluorosirćetna kiselina (18,5 ml) na 0°C do 5°C. Reakciona masa je održavana na 25-35°C tokom 2 sata i ugašena u do 20% rastvoru natrijum karbonata (125 ml). Ekstrahovana sa etil acetatom (165 ml), organski sloj je osušen preko natrijum sulfata i uparen pod vakuumom na 40-45°C. Dobijeni ostatak je suspendovan u smeši 50% etil acetata u heptanu (150 ml) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova.

Prinos: 4,9 g

Hiralna čistoća prema HPLC (% površine): 99,72% (Sp-dijastereoizomer)

Referentni primer 9:

Priprema Sp-dijastereoizomera NUC-1031 (upotrebom Sp-dijastereoizomera Formule IIb) upotrebom IPA/vode za uklanjanje zaštite

[0120]

[0121] U mešanu smešu 3'-O-(terc-butoksikarbonil) gemcitabina (100 g) u tetrahidrofuranu (1

2

L), dodati su terc-butil magnezijum hlorid (292 mL 2,0 M u tetrahidrofuranu) i Sp-dijastereoizomer benzil estra 2-[(4-nitrofenoksi)-fenoksi-fosforilamino] propionske kiseline formule IIb (166 g razblaženo u 700 mL tetrahidrofurana) na -5°C do -0°C i temperatura je podignuta na 25- 30°C i mešana 3 h na istoj temperaturi. Nakon završetka reakcije, reakciona smeša je ugašena u 0,5 N hlorovodoničnoj kiselini (1 L) i ekstrahovana etil acetatom. Organski sloj je uzastopno ispran sa 10% natrijum karbonatom, vodom i fiziološkim rastvorom. Organski sloj je odvojen i koncentrovan pod vakuumom da bi se dobio ostatak. Ostatku su dodati izopropil alkohol (IPA; 850 mL) i voda (2,5 L) i smeša je zagrevana na 75°C tokom 3 sata pre nego što je dodato još vode (2,5 L) i smeša je ohlađena na 25°C i filtrirana. Dobijena čvrsta supstanca je isprana etil acetatom i osušena. Dobijeno je 124 g proizvoda (78%). Hiralna čistoća prema HPLC (% površine): 99,95% (Sp-dijastereoizomer)

Primer 10 - Priprema benzil estra (Sp)-2-[(2,3,4,5,6-pentafluorofenoksi)-fenoksi-fosforil amino] propionske kiseline (Formula IIa)

[0122]

[0123] U mešanu smešu L-alanin benzil estra. HCl (100 g) u 1000 mL metilen dihlorida dodat je fenil dihlorfosfat (97,8 g) u reakcionu masu na 30°C. Smeša je ohlađena na -20°C i polako je dodat trietilamin (93,8 g), održavajući temperaturu na -20°C. Reakcija je mešana 1 h na 20°C, zatim zagrejana na 10°C (10±5) i mešana još 1,5 h.

[0124] Rastvor pentafluorofenola (85,3 g) u 100 mL metilen dihlorida je polako dodat na 10°C, a zatim je polako dodavan trimetilamin (46,8 g), održavajući temperaturu na 10°C. Polako dodati 46,9 g trietilamina u reakcionu masu na 10°C (10±5) u atmosferi azota. Smeša je mešana 2 h na 10°C pre nego što je ugašena sporim dodavanjem 0,5 N rastvora HCl, održavajući temperaturu na 10°C. Nakon zagrevanja na sobnu temperaturu, smeša je odvojena i organski deo je ispran zasićenim rastvorom bikarbonata, destilovanom vodom i fiziološkim rastvorom pre nego što je koncentrovan u vakuumu.

[0125] Sirova smeša je suspendovana u 1500 mL 20% etil acetata u n-heptanu na 25°C. Dodat je trietilamin (12,2 g) i smeša je mešana na 25°C. Smeša je filtrirana i čvrsta supstanca je rastvorena u 2500 mL etil acetata koji je ispran vodom i fiziološkim rastvorom i koncentrovana u vakuumu. Čvrsta supstanca je suspendovana u 1200 mL 20% etil acetata u nheptanu, mešana 45-60 min i filtrirana. Materijal je osušen pod vakuumom da bi se dobio željeni proizvod. Prinosi su u rasponu od 40 do 80 %, a dijastereoizomerna čistoća je preko 99%.

1

Claims

Patentni zahtevi 1. Postupak za dijastereoizomerno obogaćivanje jedinjenja formule II;

naznačen time što R<1>predstavlja grupu koja povlači elektrone i a je ceo broj od 1 do 5, pri čemu postupak sadrži: a) suspendovanje ili rastvaranje R-dijastereoizomera jedinjenja formule II; ili smeše (R)- i (S)-dijastereoizomera jedinjenja formule II u rastvaraču (S2); b) tretiranje rastvora ili suspenzije sa organskom bazom amina ili neorganskom bazom (B2) da bi se dobio (S)-dijastereoizomer u značajno dijastereomerno čistom obliku; i c) izolovanje (S)-dijastereoizomera formule II.
2. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time što postupak dalje sadrži formiranje jedinjenja formule II kao smeše (R)- i (S)-dijastereoizomera; i pri čemu korak a) sadrži suspendovanje ili rastvaranje smeše (R)- i (S)-dijastereoizomera jedinjenja formule II u rastvaraču (S2).
3. Postupak prema zahtevu 1 ili zahtevu 2, naznačen time što B2 je organska baza amina.
4. Postupak prema zahtevu 3, naznačen time što, organska baza amina je organska primarna, sekundarna, tercijarna ili ciklična baza amina; poželjno pri čemu, organska baza amina je trietilamin.
5. Postupak prema zahtevu 3, naznačen time što organska baza amina je N-alkilimidazol, imidazol, izborno supstituisani piridin ili trialkilamin. 2
6. Postupak prema zahtevu 1 ili zahtevu 2, naznačen time što B2 je neorganska baza; poželjno pri čemu, neorganska baza je hidroksid alkalnog metala, karbonat alkalnog metala, alkoksid alkalnog metala ili ariloksid alkalnog metala.
7. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 6, naznačen time što, S2 je ugljovodonik ili smeša koja sadrži ugljovodonik.
8. Postupak prema zahtevu 7, naznačen time što, S2 je heksan ili heptan; ili pri čemu, S2 je smeša heksana ili heptana i polarnog organskog rastvarača, pri čemu smeša sadrži preko 50 zapreminskih % heksana ili heptana; poželjno pri čemu S2 je smeša heptana ili heksana i etil acetata, pri čemu smeša sadrži preko 50 zapreminskih % heptana ili heksana.
9. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 8, naznačen time što korak b) sadrži mešanje smeše jedinjenja formule II i baze B2 tokom 6 h ili duže; i/ili, što korak b) sadrži mešanje smeše jedinjenja formule II i baze B2 na temperaturi od 0 do 50°C.
10. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 9, naznačen time što jedinjenje formule II je jedinjenje izabrano od:

�

*predstavlja hiralni centar
11. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 9, naznačen time što jedinjenje formule II je:
12. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 9, naznačen time što jedinjenje formule II je:
13. Postupak prema bilo kom zahtevu 1 do 12, naznačen time što postupak je postupak za pripremu (S)-dijastereoizomera gemcitabin-[fenil (benzoksi-L-alaninil)] fosfata (Formula I) u značajno dijastereoizomerno čistom obliku:

pri čemu postupak dalje sadrži korak d) i opciono korak e): d) reagovanje jedinjenja (S)-dijastereoizomera Formule II dobijenog u koraku c) sa jedinjenjem Formule III u prisustvu baze (B1) da bi se dobilo jedinjenje Formule IV u značajno dijastereomerno čistom obliku; pri čemu P<1>, P<2>i P<3>nezavisno predstavljaju vodonik ili zaštitnu grupu; i gde je jedinjenje formule II u značajno dijastereomerno čistom obliku:

; i e) gde bilo koji ili više od P<1>, P<2>i P<3>su zaštitne grupe, izborno uklanjajući zaštitne grupe P<1>, P<2>i P<3>iz jedinjenja formule IV da bi se dobio (S)-gemcitabin-[fenil (benzoksi-L-alaninil)] fosfat u značajno dijastereomerno čistom obliku.
14. Postupak prema zahtevu 13, naznačen time što P<1>je -C(O)OC1-C6-alkil ili izborno supstituisani -C(O)OCH2-aril; poželjno pri čemu P<1>je -C(O)O<t>Bu; a poželjno i dalje gde se korak e) postiže reakcijom proizvoda iz koraka d) sa smešom C1-C4-alkohola i vode.
15. Postupak prema bilo kom od zahteva 13 do 14, naznačen time što P<2>je H; i/ili pri čemu P<3>je H.
16. Postupak prema bilo kom od zahteva 13 do 15, naznačen time što B1 je Grignardov reagens; poželjno pri čemu B1 je<t>BuMgCl.
17. Postupak prema bilo kom od zahteva 13 do 16, naznačen time što se korak d) izvodi u etarskom rastvaraču; poželjno pri čemu se korak d) izvodi u THF. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5