RS62620B1 - Metode i kompozicije za isporuku cns akrilsulfataze a - Google Patents

Description

Opis

POZADINA

[0001] Terapija zamene enzima (ERT) uključuje sistemsku primenu prirodnih ili rekombinantno dobijenih proteina i/ili enzima subjektu. Odobrene terapije se obično daju subjektima intravenozno i jesu generalno efikasan u lečenju somatskih simptoma osnovnog nedostatka enzima. Kao rezultat ograničenog distribucija intravenozno primenjenog proteina i/ili enzima u ćelije i tkiva centralnog nervnog sistema sistema (CNS), lečenje bolesti koje imaju CNS etiologiju bilo je posebno izazovno jer se intravenozno primenjeni proteini i/ili enzimi ne prolaze adekvatno krvno-moždanu barijeru (BBB).

[0002] Krvno-moždana barijera (BBB) je strukturni sistem koji se sastoji od endotelnih ć elija koji funkcioniše da štiti centralnog nervnog sistema (CNS) od štetnih supstanci u krvotoku, kao što su bakterije, makromolekuli (npr. proteini) i drugi hidrofilni molekuli, ograničavanjem difuzije takvih supstanci preko BBB i u osnovna cerebrospinalna tečnost (CSF) i CNS.

[0003] Postoji nekoliko načina da se zaobiđe BBB kako bi se poboljšala isporuka terapeutskog agensa u mozgu uključujući direktna intrakranijalna injekcija, prolazna permeabilizacija BBB i modifikacija aktivnog agensa radi promene tkiva distribucija. Direktno ubrizgavanje terapeutskog agensa u mo ždano tkivo u potpunosti zaobilazi vaskulaturu, ali pati prvenstveno zbog rizika od komplikacija (infekcija, oštećenje tkiva, imunološki odgovor) izazvanih intrakranijalnim injekcijama i slabu difuziju aktivnog sredstva sa mesta primene. Do danas, direktno davanje proteina u mo ždana supstanca nije postigla značajan terapeutski efekat zbog difuzionih barijera i ograničene zapremine terapeutskog koji se može administrirati. Difuzija potpomognuta konvekcijom je proučavana preko katetera postavljenih u mozak parenhima koristeći spore, dugotrajne infuzije (Bobo, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 91, 2076-2080 (1994); Nguyen, et al. J. Neurosurg. 98, 584-590 (2003)), ali nijedna odobrena terapija trenutno ne koristi ovaj pristup za dugotrajnu terapiju. Pored toga, postavljanje intracerebralnih katetera je veoma invazivno i manje poželjno kao klinička alternativa.

[0004] Intratekalna (IT) injekcija, ili primena proteina u cerebrospinalnu te čnost (CSF), takođe je pokušana ali još nije doneo terapeutski uspeh. Glavni izazov u ovom tretmanu bila je tendencija da aktivni agens da veoma čvrsto veže ependimnu oblogu komore što je sprečilo naknadnu difuziju. Trenutno, ne postoje odobreni proizvodi za lečenje genetskih bolesti mozga davanjem direktno u CSF.

[0005] U stvari, mnogi su verovali da je prepreka difuziji na površini mozga, kao i nedostatak efikasnih I pogodne metode isporuke, bile su prevelika prepreka za postizanje adekvatnog terapijskog efekta u mozgu za bilo koju bolest.

[0006] Mnogi poremeć aji skladištenja lizozoma utiču na nervni sistem i tako pokazuju jedinstvene izazove u lečenju ove bolesti uz tradicionalnu terapiju. Često postoji veliko nakupljanje glikozaminoglikana (GAG) u neuronima I moždane ovojnice pogođenih pojedinaca, što dovodi do različitih oblika simptoma CNS-a. Do danas nema simptoma CNS-a koji su rezultat lizozomski poremećaj je uspešno lečen na bilo koji način.

[0007] Dakle, ostaje velika potreba za efikasnim isporukom terapeutskih agenasa u mozak. Tačnije, tamo je velika potreba za efikasnijom dostavom aktivnih agenasa u centralni nervni sistem za le čenje lizozoma poremećaji skladištenja.

SUŠTINA PRONALASKA

[0008] Ovaj pronalazak obezbeđuje efikasan i manje invazivan pristup za direktnu isporuku terapeutskih agenasa na centralni nervni sistem (CNS). Ovaj pronalazak je delimično zasnovan na neočekivanom otkriću da je zamena enzim (arilsulfataza A (ASA)) za lizozomalnu bolest skladištenja (MLD) može se direktno uneti u cerebrospinalni tečnost (CSF) subjekta kome je potrebno lečenje u visokoj koncentraciji (istoj ili već oj od 10 mg/ml) tako da enzim efikasno i ekstenzivno difunduje preko različitih površina i prodire u različite regione u mozgu, uključujući duboke regije mozga. Još iznenađujuće, sadašnji pronalazači su pokazali da je tako visoka koncentracija proteina isporuka se može obaviti korišćenjem jednostavnih fizioloških rastvora ili formulacija na bazi pufera i bez izazivanja značajnih štetnih efekata efekte, kao što je teški imuni odgovor, kod subjekta. Stoga, ovaj pronalazak obezbeđuje visoko efikasan, klinički poželjan pristup prilagođen pacijentu za direktnu isporuku CNS-a za lečenje raznih bolesti i poremećaja koji imaju komponente CNS-a, posebno, lizozomalne bolesti skladištenja. Ovaj pronalazak predstavlja značajan napredak u oblasti ciljanja na CNS i terapije zamene enzima.

[0009] Kao što je detaljno opisano u nastavku, ovi pronalazači su uspešno razvili stabilne formulacije za efikasne intratekalna (IT) primena proteina arilsulfataze A (ASA) za upotrebu u metodi le čenja metahromatske leukodistrofije Bolest u subjektu. Zaista, mogu se koristiti stabilne formulacije za upotrebu prema ovom pronalasku za CNS isporuku putem intraparenhimalne, intracerebralne, intraventrikularne cerebralne (ICV), intratekalne (npr. IT-Lumbar, Itcisterna magna) primene za injekcije direktno u CNS i/ili CSF.

[0010] Konkretno, pronalazak obezbeđuje formulaciju zasnovanu na fiziološkom rastvoru ili puferu koja sadrži 10 mg/ml ili više aril sulfataze A (ASA) za upotrebu u postupku lečenja metahromatske leukodistrofijske bolesti kod subjekta gde je navedeno postupak obuhvata direktno davanje navedene formulacije u cerebrospinalnu tečnost navedenog subjekta preko intraparenhima, intracerebralna, intraventrikularna cerebralna (ICV) ili intratekalna (IT) primena. U nekim realizacijama, ASA protein je prisutan u ili do koncentracije odabrane od 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 30 mg/ml, 35 mg/ml, 40 mg/ml, 45 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml, ili 300 mg/ml.

[0011] U različitim realizacijama, ovaj pronalazak uključuje formulaciju na bazi slanog rastvora ili pufera bilo kog od ovde opisane realizacije za upotrebu u skladu sa pronalaskom, pri čemu ASA protein sadrži amino kiselinska sekvenca SEQ ID NO: 1. U nekim realizacijama, ASA protein sadrži najmanje aminokiselinsku sekvencu 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 98% identično SEQ ID NO:1. U nekim realizacijama, fiziološki rastvor ili formulacija na bazi pufera bilo koje od ovde opisanih realizacija za upotrebu u skladu sa pronalaskom uključuje NaCl prisutan u koncentraciji u rasponu od približno 0-300 mM (npr. 0-250 mM, 0-200 mM, 0-150 mM, 0-100 mM, 0-75 mM, 0-50 mM ili 0-30 mM). U nekim realizacijama, NaCl je prisutan u koncentraciji u rasponu od približno 137-154 mM. U nekim realizacijama, NaCl je prisutan u koncentraciji od približno 154 mM.

[0012] U različitim realizacijama, ovaj pronalazak uključuje formulaciju na bazi slanog rastvora ili pufera bilo kog od ovde opisane realizacije za upotrebu u skladu sa pronalaskom, pri čemu je polisorbatni surfaktant izabran iz grupe koju čine polisorbat 20, polisorbat 40, polisorbat 60, polisorbat 80 i njihova kombinacija. U nekim realizacijama, polisorbat surfaktant je polisorbat 20. U nekim realizacijama, polisorbat 20 je prisutan u koncentraciji od približno 0,005%.

[0013] U različitim realizacijama, ovaj pronalazak uključuje formulaciju na bazi slanog rastvora ili pufera bilo kog od ovde opisane realizacije za upotrebu u skladu sa pronalaskom, pri čemu formulacija dalje sadrži a puferski agens. U nekim realizacijama, puferski agens se bira iz grupe koju čine fosfat, acetat, histidin, sukcinat, Tris i njihove kombinacije. U nekim realizacijama, puferski agens je fosfat. U nekim u realizaciji, fosfat je prisutan u koncentraciji ne većoj od 50 mM (npr. ne većoj od 45 mM, 40 mM, 35 mM, 30 mM, 25 mM, 20 mM, 15 mM, 10 mM ili 5 mM). U nekim realizacijama, fosfat je prisutan u a

koncentracija ne veća od 20 mM. U različitim aspektima, pronalazak uključuje formulaciju zasnovanu na fiziološkom rastvoru ili puferu bilo koji od ovde opisanih oblika za upotrebu u skladu sa pronalaskom, pri čemu formulacija ima pH od približno 3-8 (npr. približno 4-7,5, 5-8, 5-7,5, 5-6,5, 5-7,0, 5,5-8,0, 5,5-7,7, 5,5-6,5, 6-7,5 ili 6-7,0). U nekim u realizaciji, formulacija ima pH od približno 5,5-6,5 (npr. 5,5, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4 ili 6,5). U nekim u realizaciji, formulacija ima pH od približno 6,0.

[0014] U nekim realizacijama, ovaj pronalazak uključuje formulaciju zasnovanu na fiziološkom rastvoru ili puferu za intratekalno primena za upotrebu u skladu sa pronalaskom koja sadrži protein arilsulfataze A (ASA) u koncentraciji u rasponu od približno 10-300 mg/ml, NaCl u koncentraciji od približno 154 mM, polisorbat 20 u koncentracija od približno 0,005%, i pH od približno 6,0. U nekim realizacijama, ASA protein je na a koncentracija od približno 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml ili 300 mg/ml.

[0015] U različitim aspektima, ovaj pronalazak uključuje kontejner koji sadrži jedan dozni oblik fiziološkog rastvora ili formulacija zasnovana na puferu u različitim varijantama opisanim ovde za upotrebu u skladu sa pronalaskom. U nekim realizacijama, kontejner se bira između ampule, bočice, boce, kertridža, rezervoara, lio-jekta ili prethodno napunjenog špric. U nekim realizacijama, kontejner je unapred napunjen špric. U nekim realizacijama, napunjeni špric je odabrani od špriceva od borosilikatnog stakla sa premazom od pečenog silikona, špriceva od borosilikatnog stakla sa prskanim silikonom, ili plastični špricevi od smole bez silikona. U nekim realizacijama, formulacija zasnovana na fiziolo škom rastvoru ili puferu je prisutna u a zapremine manje od oko 50 ml (npr. manje od oko 45 ml, 40 ml, 35 ml, 30 ml, 25 ml, 20 ml, 15 ml, 10 ml, 5 ml, 4 ml, 3 ml, 2,5 ml, 2,0 ml, 1,5 ml, 1,0 ml ili 0,5 ml). U nekim realizacijama, formulacija zasnovana na fiziološkom rastvoru ili puferu je prisutan u zapremini manjoj od oko 3,0 mL.

[0016] Ovaj pronalazak uključuje metode lečenja metahromatske leukodistrofijske bolesti uključujući korak davanja intratekalne formulacije prema bilo kojoj od realizacija subjektu kome je potrebno le čenje opisano ovde.

[0017] U nekim realizacijama, ovaj pronalazak uključuje formulaciju koja sadrži protein arilsulfataze A (ASA) u koncentraciji u rasponu od približno 10-300 mg/ml, NaCl u koncentraciji od približno 154 mM, polisorbat 20 u koncentraciji od približno 0,005% i pH od približno 6 za upotrebu u skladu sa izum.

[0018] U nekim realizacijama, intratekalna primena ne dovodi do značajnih neželjenih efekata (npr. imuni odgovor) u subjektu. U nekim realizacijama, intratekalna primena ne rezultira zna čajnom adaptacijom Imuni odgovor posredovan T ć elijama kod subjekta.

[0019] U nekim realizacijama, intratekalna primena formulacije dovodi do isporuke arilsulfataze proteina za različita ciljna tkiva u mozgu, kičmenu moždinu i/ili periferne organe. U nekim realizacijama, intratekalna primena formulacije dovodi do isporuke proteina arilsulfataze A u ciljana mo ždana tkiva. U nekim realizacijama, ciljna tkiva mozga obuhvataju belu materiju i/ili neurone u sivoj materiji. U nekim realizacijama, protein arilsulfataze A se isporučuje u neurone, glijalne ćelije, perivaskularne ćelije i/ili meningealne ćelije. U ralizacijama, protein arilsulfataze A se dalje isporučuje neuronima u kičmenoj moždini.

[0020] U nekim realizacijama, intratekalna primena formulacije dalje dovodi do sistemske isporuke ASA protein u perifernim ciljnim tkivima. U nekim realizacijama, periferna ciljna tkiva se biraju izme đu jetre, bubrega, slezine i/ili srca.

[0021] U nekim realizacijama, intratekalna primena formulacije dovodi do lizozomske lokalizacije u mozgu ciljna tkiva, neuroni kičmene moždine i/ili periferna ciljna tkiva. U nekim realizacijama, intratekalna primena formulacije rezultira smanjenjem skladištenja sulfata u ciljnim tkivima mozga, neuronima kičmene moždine i/ili perifernim ciljna tkiva. U nekim realizacijama, skladi štenje sulfata je smanjeno za najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 1 puta, 1,5 puta ili 2 puta u poređenju sa kontrolom (npr. skladištenje GAG pre tretmana kod subjekta). U nekim realizacijama, intratekalna primena formulacije dovodi do smanjene vakuolizacije u neuronima (npr. za najmanje 20%, 40%, 50%, 60%, 80%, 90%, 1 puta, 1,5 puta ili 2 puta u poređenju sa kontrolom). U nekim realizacijama, neuroni obuhvataju Purkinje ćelije.

[0022] U nekim realizacijama, intratekalna primena formulacije dovodi do pove ćanja enzimskog ASA aktivnost u ciljnim tkivima mozga, neuronima kičmene moždine i/ili perifernim ciljnim tkivima. U nekim realizacijama, ASA enzimska aktivnost se poveć ava najmanje 1 puta, 2 puta, 3 puta, 4 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 ili 10 puta kao u poređenju sa kontrolom (npr. endogena enzimska aktivnost pre tretmana kod subjekta). U nekim realizacijama, povećana enzimska aktivnost ASA je najmanje približno 10 nmol/sat/mg, 20 nmol/sat/mg, 40 nmol/sat/mg, 50 nmol/sat/mg, 60 nmol/sat/mg, 70 nmol/sat/mg, 80 nmol/sat/mg, 90 nmol/sat/mg, 100 nmol/sat/mg, 150 nmol/sat/mg, 200 nmol/sat/mg, 250 nmol/sat/mg, 300 nmol/sat/mg, 350 nmol/sat/mg, 400 nmol/sat/mg, 450 nmol/sat/mg, 500 nmol/sat/mg, 55 nmol/sat/mg ili 600 nmol/sat/mg.

[0023] U nekim realizacijama, enzimska aktivnost ASA je povećana u lumbalnoj regiji. U nekim realizacijama, povećana enzimska aktivnost ASA u lumbalnoj regiji je najmanje približno 2000 nmol/hr/mg, 3000 nmol/hr/mg, 4000 nmol/sat/mg, 5000 nmol/sat/mg, 6000 nmol/sat/mg, 7000 nmol/sat/mg, 8000 nmol/sat/mg, 9000 nmol/sat/mg, ili 10,00 nmol/sat/mg.

[0024] U nekim realizacijama, intratekalna primena formulacije rezultira smanjenim intenzitetom, ozbiljnošću, ili učestalost, ili odloženi početak najmanje jednog simptoma ili karakteristike MLD. U nekim realizacijama, najmanje jedan simptom ili karakteristika MLD je kognitivno o šteć enje; lezije bele materije; prošireni perivaskularni prostori u mozgu, parenhim, ganglije, corpus callosum i/ili moždano stablo; atrofija; i/ili ventrikulomegalija.

[0025] U nekim realizacijama, intratekalna primena se odvija jednom u dve nedelje. U nekim realizacijama, intratekalna primena se odvija jednom mesečno. U nekim realizacijama, intratekalna primena traje mesto jednom u dva meseca. U nekim realizacijama, intratekalna primena se koristi zajedno sa intravenskom administracija. U nekim realizacijama, intravenozna primena nije češća od jednom nedeljno. U nekim realizacijama, intravenozna primena nije češća od jednom u dve nedelje. U nekim realizacijama, intravenska primena nije češća od jednom mesečno. U nekim realizacijama, intravenozno administracija nije češća od jednom u dva meseca. U određenim realizacijama, intravenska primena je češća od mesečne administracije, na primer dva puta nedeljno, nedeljno, svake druge nedelje ili dva puta mesečno.

[0026] U nekim realizacijama, intravenske i intratekalne primene se izvode istog dana. U nekim u realizaciji, intravenska i intratekalna administracija se ne izvode u odre đenom vremenskom periodu od jedni druge, na primer ne u roku od najmanje 2 dana, u roku od najmanje 3 dana, u roku od najmanje 4 dana, u roku od najmanje 5 dana, u roku od najmanje 6 dana, u roku od najmanje 7 dana ili u roku od najmanje jedne nedelje. U nekim realizacijama, intravenozno i intratekalno administracije se obavljaju naizmeničnim rasporedom, kao što su naizmenične administracije nedeljno, svake druge nedelje, dva puta mesečno ili mesečno. U nekim realizacijama, intratekalna primena zamenjuje intravensku primenu u rasporedu administracije, kao što je u rasporedu intravenske administracije nedeljno, svake druge nedelje, dva puta mesečno, ili mesečno, svaka treća ili četvrta ili peta primena u tom rasporedu može se zameniti intratekalnim davanje umesto intravenske primene.

[0027] U nekim realizacijama, intravenske i intratekalne primene se izvode uzastopno, kao što je izvođenje prvo intravenske primene (npr. nedeljno, svake druge nedelje, dva puta mese čno ili mesečno doziranje za dve nedelje, mesec, dva meseca, tri meseca, četiri meseca, pet meseci, šest meseci, godinu ili više), a zatim IT davanja (npr. nedeljno, svake druge nedelje, dva puta mese čno ili mesečno doziranje duže od dve nedelje, mesec dana, dva meseca, tri meseca, četiri meseca, pet meseci, šest meseci, godinu ili više). U nekim realizacijama, intratekalno dministracije se prvo obavljaju (npr. nedeljno, svake druge nedelje, dva puta mesečno, mesečno, jednom u dva meseca,jednom u tri meseca doziranje dve nedelje, mesec, dva meseca, tri meseca, četiri meseca, pet meseci, šest meseci, godinu ili više) nakon čega slede intravenske primene (npr. nedeljno, svake druge nedelje, dva puta mesečno ili mesečno doziranje duže od dve nedelje, mesec, dva meseca, tri meseca, četiri meseca, pet meseci, šest meseci, a godine ili više).

[0028] U nekim realizacijama, intratekalna primena se koristi u odsustvu intravenske primene.

[0029] U nekim realizacijama, intratekalna primena se koristi u odsustvu istovremene imunosupresivne terapije.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0030]

Slika 1 ilustruje primere podataka o koncentraciji arilsulfataze A (rhASA) u serumu posle IV primene.

Slika 2 ilustruje primere podataka o koncentraciji rhASA u serumu nakon IT-lumbalne primene.

Slika 3 ilustruje primer koncentracije rhASA u CSF posle IV primene.

Slika 4 ilustruje primer koncentracije rhASA u CSF nakon IT-lumbalne administracije.

Slika 5 ilustruje primer analize uticaja pufera i pH na termičku stabilnost rhASA.

Slika 6 ilustruje primer SDS-PAGE (Coomassie) analize rhASA posle dve nedelje na 4062°C.

Slika 7 ilustruje primer SDS-PAGE (Coomassie) analize rhASA u IT formulacijama nakon 3 meseca na 5 i 25°C.

Slika 8 prikazuje primer leka rhASA i izgled leka nakon 48 sati mešanja (panel A) i tresenje (panel B). Slika 9 prikazuje primer izgleda leka rhASA (bez P20) sa (n=2) i bez prostora (n=1) posle mešanja tokom 48 sati.

Slika 10 ilustruje primere podataka koji demonstriraju kapacitet pufera rhASA lekovite supstance u poređenju sa kontrolom pufera kada se titrira hlorovodoničnom kiselinom.

Slika 11 ilustruje primere podataka koji pokazuju kapacitet puferovanja rhASA lekovite supstance u poređenju sa kontrola pufera kada se titrira sa 1M natrijum hidroksida.

Slika 12 prikazuje primere uzoraka rhASA u fiziološkom rastvoru, pH 6,0 koji varira u zavisnosti od koncentracije.

Slika 13 ilustruje primer SEC-HPLC analize rhASA (pH 5,5 mobilna faza) u 154 mM NaCl, pH 5,9.

Slika 14 ilustruje primer SEC-HPLC analize rhASA (pH 7,0 mobilna faza) u 154 mM NaCl, pH 5,9.

Slika 15 ilustruje primere profila isključenja veličine osnovnih i 11-mesečnih uzoraka stabilnosti za rhASA u 154 mM NaCl, pH 5.

Slika 16 prikazuje primere foto-mikrografije moždanog tkiva, moždanih ovojnica, infiltrata (grupe sa srednjim i visokim dozama, oba pola) nakon tretmana.

Slika 17 prikazuje primerne foto-mikrografije moždanog tkiva, moždanih ovojnica, infiltrata (grupe sa srednjim i visokim dozama, oba pola) nakon tretmana.

Slika 18 prikazuje primere foto-mikrografije moždanog tkiva, perivaskularnih, infiltrata (muškarci srednje doze; visoka doza kod žene) nakon tretmana.

Slika 19 prikazuje primerno Alcian plavo bojenje kičmene moždine imunotolerantnih MLD miševa tretiranih sa rhASA prikazuje primere rezultata koji ilustruju smanjenje sulfatida kao što je određeno alcian plavim bojenjem cervikalne kičmene moždine kod životinja koje su primile intratekalne injekcije rekombinantnog hASA, dana hASA i 22 u dozama od 520 mg/kg težine mozga ili kontrole nosača. Kao što je pokazano, tretman sa intratekalno ubrizganom rekombinantnom hASA rezultiralo je smanjenjem akumulacije sulfata u cervikalnoj kičmenoj moždini.

Slika 20 ilustruje oglednu morfometrijsku analizu delova kičmene moždine obojenih alcian plavom bojom iz imunotolerantnih MLD miševi tretirani rhASA-om, uključujući uzorne rezultate koji ilustruju optičku gustinu Alcian plave u ukupnoj kičmenoj moždini (T-kičmena moždina), ukupnoj sivoj materiji (T-GM), lumbalnoj sivoj materiji (L-GM), cervikalnoj sivoj materiji (C- GM), ukupna bela materija (T-VM), lumbalna bela materija (L-VM) i cervikalna bela materija (C-VM) kako je utvrđeno morfometrijskom analizom. Kao što je pokazano, kod tretiranih životinja primeć eno je statistički značajno smanjenje bojenja Alcian plavom bojom sa rhASA u poređenju sa kontrolom vozila.

Slika 21 prikazuje primer smanjenja LAMP bojenja u beloj materiji (fimbriji) imunotolerantnih MLD mi ševa tretiranih rhASA prikazuje primere rezultata koji ilustruju nivoe LAMP-1 u fimbriji kako je utvr đeno imunohistohemijom. Uveć anje = 20Ks. Kao što je pokazano, tretman sa intratekalno ubrizganom rhASA-om je rezultirao smanjenjem LAMP-1 u beloj materiji mozga.

Slika 22 ilustruje primer morfometrije. Analiza LAMP bojenja mozga imunotolerantnih MLD mi ševa tretiranih rhASA prikazuje primere rezultata koji ilustruju intenzitet bojenja LAMP-1 u corpus colosum (CC), fimbriji (F), cerebelarnoj beloj materiji (CB-WM) (BS) životinja tretiranih sa 20 mg/kg intravenske rhASA, 300 mg/kg težine mozga intratekalni rhASA, 520 mg/kg težine mozga intravenski rhASA, ili kontrola nosača.

Slika 23 ilustruje oglednu koncentraciju rhASA u udarcima u mozak juvenilnog cinomolgusa koji je dozirao vozilo majmuni nakon doziranja EOW IT za 6-mesečnu glavnu nekropsiju.

Slika 24 ilustruje oglednu koncentraciju rhASA u udarcima u mozak juvenilnih cinomolgus majmuna koji slede EOV IT doziranje rhASA od 1,8 mg/dozi tokom 6 meseci - glavna nekropsija.

Slika 25 ilustruje oglednu koncentraciju rhASA u udarcima u mozak maloletnih majmuna cinomolgusa koji slede EOW IT Doziranje rhASA od 6,0 mg/dozi tokom 6 meseci - glavna nekropsija.

Slika 26 ilustruje oglednu koncentraciju rhASA u udarcima u mozak maloletnih majmuna cinomolgusa koji slede EOW IT doziranje rhASA od 18,6 mg/dozi tokom 6 meseci - glavna nekropsija.

Slika 27 ilustruje oglednu koncentraciju ASA u udarcima u mozak mladih majmuna cinomolgus koji slede EOV IT doziranje (PBS-kontrola) za 6 meseci - nekropsija za oporavak.

Slika 28 ilustruje oglednu koncentraciju rhASA u udarcima u mozak juvenilnih cinomolgus majmuna koji slede EOV IT doziranje vozila za 6 meseci - obdukcija za oporavak.

Slika 29 ilustruje oglednu koncentraciju rhASA u udarcima u mozak maloletnih majmuna cinomolgusa koji slede EOW IT doziranje rhASA od 1,8 mg/dozi tokom 6 meseci - nekropsija za oporavak

Slika 30 ilustruje oglednu koncentraciju rhASA u udarcima u mozak mladih majmuna cinomolgusa koji slede EOW IT doziranje rhASA od 6,0 mg/dozi tokom 6 meseci - nekropsija oporavka

Slika 31 ilustruje oglednu koncentraciju rhASA u udarcima u mozak juvenilnog cinomolgusa nakon EOV IT doziranje rhASA od 18,6 mg/dozi tokom 6 meseci - nekropsija oporavka

Slika 32 ilustruje primer koncentracije rhASA u odabranim udarcima sa povr šine mozga za kontrolu uređaja, vehikulum, 1,8 mg, 6,0 mg i 18,6 mg tretirane životinje. (muški i ženski odvojeni, podaci o kontroli uređaja su iz oporavka obdukcija, svi ostali podaci sa glavne obdukcije).

Slika 33 ilustruje primer koncentracije rhASA u odabranim udarcima iz dubokog belog podru čja mozga za uređaj kontrola, nosač, 1,8 mg, 6,0 mg i 18,6 mg tretirane životinje. (muški i ženski odvojeni, podaci o kontroli uređaja su sa obdukcije za oporavak, svi ostali podaci sa glavne obdukcije).

Slika 34 ilustruje primer koncentracije rhASA u odabranim udarcima iz duboko sive oblasti mozga za uređaj kontrola, nosač, 1,8 mg, 6,0 mg i 18,6 mg tretirane životinje. (muški i ženski odvojeni, podaci o kontroli uređaja su sa obdukcije za oporavak, svi ostali podaci sa glavne obdukcije).

Slika 35 ilustruje primer koncentracije rhASA u odabranim udarcima iz različitih regiona u kontroli uređaja, vehikulum, 1,8 mg, 6,0 mg i 18,6 mg tretirane životinje. (muško i žensko kombinovano, podaci o kontroli uređaja su iz nekropsija za oporavak, svi ostali podaci sa glavne obdukcije).

Slika 36 ilustruje primer koncentracije rhASA u delovima kičmene moždine maloletnih cinomolgus majmuna nakon doziranja EOV IT tokom 6 meseci - nekroskopija za oporavak.

Slika 37 ilustruje primer koncentracije rhASA u jetri juvenilnih cinomolgus majmuna nakon EOV IT doziranje za 6 meseci -nekroskopija za oporavak.

Slika 38 ilustruje primere anatomskih lokacija određenih udaraca u mozak.

Slika 39 ilustruje primere anatomskih lokacija određenih udaraca u mozak.

Slika 40 ilustruje primere anatomskih lokacija određenih udaraca u mozak.

Slika 41 ilustruje primere anatomskih lokacija određenih udaraca u mozak.

Slika 42 ilustruje primere anatomskih lokacija određenih udaraca u mozak.

Slika 43 ilustruje primere anatomskih lokacija određenih udaraca u mozak.

Slika 44A-G ilustruje koncentraciju rekombinantne humane arilsulfataze A (rhASA) u ekstrahovanim udarcima tkiva iz moždanog tkiva odraslih i maloletnih cinomolgus majmuna kojima je primenjen vehikulum, 1,8 mg rhASA ili 18,6 mg rhASA. Svaka od slika 44A-G odgovara regionu moždanog tkiva prikazanom na slici 39.

Slike 45A i B ilustruju primerno poređenje koncentracija rekombinantne humane arilsulfataze A (rhASA) otkrivene u dubokoj beloj materiji (Slika 45A) ili u dubokoj sivoj materiji (Slika 45B) mo ždanim tkivima odraslih i maloletnih cinomolgus majmuna koji su bili intra IT) ili intracerebroventrikularno (ICV) primenjena rhASA.

Slika 46A ilustruje koncentracije rhASA detektovane u nekoliko uboda tkiva dobijenih od juvenilnih (<12 meseci starosti) majmuna cinomolgus IT-a kojima je primenjena doza od 18,6 ili 1,8 mg rekombinantne humane arilsulfataze A (rhASA). Kao što je ilustrovano na obe slike 40A-B, koncentracija rhASA isporučenog u tkiva bila je unutar ili je na drugi način premašila ciljnu terapijsku koncentraciju od 2,5 mg/mg proteina. Anatomski regioni moždanog tkiva koji odgovaraju svakom od brojeva udaraca prikazanih na Slici 46A i Slici 46B su: subkortikalna bela materija (1); periventrikularna bela materija i duboka bela materija (2); subkortikalna bela materija (3); subkortikalna bela materija (4); unutra šnja kapsula (5); kaudatno jezgro unutrašnje kapsule (6); duboka bela materija (7); subkortikalna bela materija i korteks (8); putamen (9); temporalna subkortikalna bela materija i korteks (10), duboko siva materija (11), duboko siva materija (12), frontalni periventrikularni i subkortikalni (13); subkortikalna bela materija, povr šinski perifalksijski korteks (14); corpus callosum i perikalosalna subkortikalna bela materija (15); duboka subkortikalna bela materija (16); duboka siva materija (17); duboka siva materija (18); periventrikularna bela materija (19); duboka subkortikalna bela materija (20); hipokampus (21); corpus callosum (22); duboka bela materija (23); subkortikalna bela materija, okcipitalni re žanj (24); a malog mozga belo materija (25).

Slika 47A ilustruje područje dubokog tkiva bele materije ekstrahovanog iz cynomolgus majmuna koji je dat IT 1,8 mg rhASA. Slika 47B ilustruje imunobojenje dubokog tkiva bele materije i otkrivenu distribuciju rhASA u relevantnim ćelijama. Slika 47C ilustruje da je rhASA koju je administrirao IT pokazao kolokalizaciju organela u dubokom tkivu bele materije majmuna cinomolgus, a posebno u lizozomima. Na slici 47C, ASA imunobojenje je ilustrovano u gornjem levom polju.

Slika 48 upoređuje distribuciju 124I-obeležene arilsulfataze A (rhASA) korišćenjem PET skeniranja 24 sata nakon ili IT-ili ICV-davanje tako obeleženog rhASA majmunu cinomolgus.

Slika 49 ilustruje distribuciju 124I-obeleženog ASA odmah nakon primene ICV cinomolgusu majmuna, i upoređuje distribuciju IT-administriranog 124I-obeleženog ASA u roku od 2-5 sati. Kao što je pokazano, IT administracija je isporučila 124I označenu ASA u iste početne odeljke (cisterne i proksimalni kičmeni stub) kao koji je prikazan za ICV administraciju.

Slika 50 prikazuje primer ICV i IT administracije u modelu miša.

Slika 51 prikazuje primer uređaja za intratekalno davanje leka (IDDD).

Slika 52 prikazuje primer PORT-A-CATH® niskog profila intratekalnog implantabilnog sistema pristupa.

Slika 53 prikazuje primer uređaja za intratekalno davanje leka (IDDD).

Slika 54 prikazuje primer intratekalnog uređaja za isporuku leka (IDDD), koji omogućava primenu kod kuće terapije zamene CNS enzima (ERT).

Slika 55 ilustruje i primer dijagrama intratekalnog uređaja za davanje leka (IDDD) sa mehanizmom za pričvršćivanje.

Slika 56 prikazuje primerne lokacije unutar tela pacijenta gde se može postaviti IDDD;

Slika 56B prikazuje različite komponente uređaja za intratekalno davanje leka (IDDD); i

Slika 56C prikazuje primernu lokaciju za umetanje unutar tela pacijenta za IT-lumbalnu injekciju.

DEFINICIJE

[0031] Da bi se ovaj pronalazak lakše razumeo, određeni termini su prvo definisani u nastavku. Dodatni definicije za sledeć e termine i druge termine su izložene u celoj specifikaciji.

[0032] Približno ili otprilike: Kako se ovde koristi, termin "približno" ili "oko", primenjen na jednu ili više vrednosti od interesa, odnosi se na vrednost koja je slična navedenoj referentnoj vrednosti. Izraz "približno" ili "oko" odnosi se na a opseg vrednosti koje spadaju u 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7% , 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% ili manje u bilo kom smeru (već e ili manje od) navedene referentne vrednosti osim ako nije drugačije navedeno ili na drugi način evidentno iz konteksta (osim kada bi takav broj premašio 100% moguć e vrednosti).

[0033] Poboljšanje: Kako se ovde koristi, izraz "poboljšanje" označava prevenciju, smanjenje ili ublažavanje stanja,ili poboljšanje stanja nekog subjekta. Poboljšanje uključuje, ali ne zahteva potpuni oporavak ili potpun prevencija bolesnog stanja. Poboljšanje uključuje poveć anje nivoa relevantnog proteina ili njegove aktivnosti koja je manjkava u relevantnim tkivima bolesti.

[0034] Biološki aktivan: Kako se ovde koristi, fraza "biološki aktivan" odnosi se na karakteristiku bilo kog agensa koji ima aktivnost u biološkom sistemu, a posebno u organizmu. Na primer, agent koji, kada se primeni na organizam, ima biološko dejstvo na taj organizam, smatra se biološki aktivnim. Gde je protein ili polipeptid je biološki aktivan, deo tog proteina ili polipeptida koji deli najmanje jednu biolo šku aktivnost proteina ili polipeptid se tipično može nazvati "biološki aktivnim" delom.

[0035] Sredstvo za poveć anje zapremine: Kako se ovde koristi, termin "sredstvo za pove ć anje zapremine" se odnosi na jedinjenje koje dodaje masu liofilizovanom me šavine i doprinosi fizičkoj strukturi liofilizovanog kolača (npr. olakšava proizvodnju suštinskiujednačeni liofilizovani kolač koji održava strukturu otvorenih pora). Primeri sredstava za poveć anje zapremine uklju čuju manitol, glicin, natrijum hlorid, hidroksietil skrob, laktoza, saharoza, trehaloza, polietilen glikol i dekstran.

[0036] Receptor manoza-6-fosfata nezavisan od katjona (CI-MPR): Kako se ovde koristi, termin „nezavisan od katjona manoza-6-fosfatni receptor (CI-MPR)" odnosi se na ć elijski receptor koji vezuje oznake manoza-6-fosfata (M6P) na prekursori kisele hidrolaze u Goldžijevom aparatu koji su namenjeni za transport do lizozoma. Pored manoze 6-fosfata, CI-MPR takođe vezuje druge proteine uključujuć i IGF-II. CI-MPR je takođe poznat kao "M6P/IGF-II receptor," „CI-MPR/IGF-II receptor“, „IGF-II receptor“ ili „IGF2 receptor“. Ovi termini i njihove skraćenice se koriste naizmenično ovde.

[0037] Istovremena imunosupresivna terapija: Kako se ovde koristi, termin "istovremena imunosupresivna terapija" uključuje bilo koju imunosupresivnu terapiju koja se koristi kao pre-tretman, predkondicioniranje ili paralelno sa metodom lečenja. Slika 56 prikazuje primerne lokacije unutar tela pacijenta gde se može postaviti IDDD; Slika 56B prikazuje različite komponente uređaja za intratekalno davanje leka (IDDD); i Slika 56C prikazuje primer umetanja lokacija u pacijentovom telu za IT-lumbalnu injekciju.

[0038] Razblaživač: Kako se ovde koristi, izraz "razređivač" se odnosi na farmaceutski prihvatljiv (npr. bezbedan i netoksičan za davanje čoveku) supstanca za razblaživanje korisna za pripremu rekonstituisane formulacije. Primeri razblaživača uključuju sterilnu vodu, bakteriostatsku vodu za injekcije (BWFI), pH puferovani rastvor (npr. fiziološki rastvor puferovan fosfatom), sterilni fiziološki rastvor, Ringerov rastvor ili rastvor dekstroze.

[0039] Dozni oblik: Kako se ovde koristi, izrazi "dozni oblik" i "jedinični dozni oblik" odnose se na fizički diskretni jedinica terapijskog proteina za pacijenta koji se le či. Svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog materijala izračunati da proizvedu željeni terapeutski efekat. Razumeće se, međutim, da je ukupna doza kompozicije odlučić e lekar koji se javlja u okviru zdrave medicinske procene.

[0040] Terapija zamene enzima (ERT): Kako se ovde koristi, termin "terapija zamene enzima (ERT)" se odnosi na bilo koja terapijska strategija koja ispravlja nedostatak enzima obezbe đivanjem enzima koji nedostaje Enzim koji nedostaje može obezbediti intratekalnom administracijom. Enzim koji nedostaje može se obezbediti infuzijom u krvnu paru. Jednom primenjen, enzim preuzima ć elije i transportuje se do lizozoma, gde enzim deluje da eliminiše materijal koji se akumulirao u lizozomima usled nedostatka enzima. Tipično, za zamenu lizozomalnih enzima da bi terapija bila efikasna, terapeutski enzim se isporučuje u lizozome u odgovarajuć im ć elijama u ciljnim tkivima gde nedostatak skladi štenja je očigledan.

[0041] Poboljšati, pove ć ati ili smanjiti: Kako se ovde koristi, termini "poboljšati", "poveć ati" ili "smanjiti", ili gramatički ekvivalenti, označavaju vrednosti koje su relativne u odnosu na osnovno merenje, kao što je merenje kod iste osobe pre početka ovde opisanog tretmana, ili merenja kod kontrolne osobe (ili vi še kontrolnih pojedinaca) u odsustvu ovde opisanog tretmana. „Kontrolni pojedinac“ je pojedinac oboleo od istog oblika lizozomalna bolest skladištenja kao pojedinac koji se leči, a koji je otprilike istih godina kao i pojedinac koji se leči (kako bi se osiguralo da su stadijumi bolesti kod tretirane osobe i kontrolne osobe(e) uporedivi).

[0042] Pojedinac, subjekt, pacijent: Kako se ovde koristi, termini "subjekat", "pojedinac" ili "pacijent" odnose se na čoveka ili subjekat sisara koji nije čovek. Pojedinac (koji se takođe naziva "pacijent" ili "subjekt") koji se leči je pojedinac (fetus, novorođenče, dete, adolescent ili odrasla osoba) koji boluje od neke bolesti.

[0043] Intratekalna primena: Kako se ovde koristi, termin "intratekalna primena" ili "intratekalna injekcija" se odnosi do injekcije u kičmeni kanal (intratekalni prostor koji okružuje kičmenu moždinu). Mogu se koristiti različite tehnike uključujući, bez ograničenja, bočnu cerebroventrikularnu injekciju kroz otvor ili cisternalnu ili lumbalnu punkciju ili kao. "Intratekalna primena" ili "intratekalna primena" prema ovom pronalasku može se odnositi na IT administraciju ili isporuku preko lumbalnog područja ili regiona, tj. lumbalna IT administracija ili isporuka. Kako se ovde koristi, termin "lumbalni region" ili "lumbalno područje" odnosi se na područje između treć eg i četvrtog lumbalnog (donjeg) pršljena i, više uključujući L2-S1 region kičme.

[0044] Linker: Kako se ovde koristi, termin "linker" se odnosi na, u fuzionom proteinu, sekvencu aminokiselina koja nije koji se pojavljuje na određenoj poziciji u prirodnom proteinu i generalno je dizajniran da bude fleksibilan ili da umeć e strukturu, kao što je a-heliks, između dva proteinska dela. Linker se takođe naziva odstojnikom.

[0045] Lioprotektant: Kako se ovde koristi, izraz "lioprotektant" se odnosi na molekul koji sprečava ili smanjuje hemikalije i/ili fizička nestabilnost proteina ili druge supstance nakon liofilizacije i naknadnog skladištenja. Primeri lioprotektora uključuju šeć ere kao što su saharoza ili trehaloza; aminokiselina kao što je mononatrijum glutamat ili histidin; ametilamin kao što je betain; liotropna so kao što je magnezijum sulfat: poliol kao što je trihidrični ili viši šeć er alkoholi, npr. glicerin, eritritol, glicerol, arabitol, ksilitol, sorbitol i manitol; propilen glikol; polietilen glikol; Pluronics; i njihove kombinacije. U nekim realizacijama, lioprotektant je šeć er koji ne redukuje, kao što je trehaloza ili saharoza.

[0046] Lizozomalni enzim: Kako se ovde koristi, termin "lizozomalni enzim" se odnosi na bilo koji enzim koji je sposoban da smanjenje akumuliranih materijala u lizozomima sisara ili koji mogu spasiti ili poboljšati jedan ili više lizozoma simptomi bolesti skladištenja. Lizozomalni enzimi uključuju divlje ili modifikovane lizozomalne enzime i mogu biti proizveden rekombinantnim i sinteti čkim metodama ili prečišć en iz prirodnih izvora. Primeri lizozomalnih enzima su navedeni u tabeli 1.

[0047] Nedostatak lizozomalnog enzima: Kako se ovde koristi, "nedostatak lizozomalnog enzima" se odnosi na grupu genetskih poremeć aji koji nastaju usled nedostatka najmanje jednog od enzima koji su potrebni za razbijanje makromolekula (npr.substarte enzima) sve do peptida, aminokiselina, monosaharida, nukleinskih kiselina i masnih kiselina u lizozomima. Kao kao rezultat toga, osobe koje pate od nedostatka lizozomskih enzima akumulirale su materijale u različitim tkivima (npr. CNS, jetra, slezina, creva, zidovi krvnih sudova i drugi organi).

[0048] Lizozomalna bolest skladištenja: Kako se ovde koristi, termin "lizozomalna bolest skladištenja" odnosi se na bilo koju bolest koji nastaju usled nedostatka jednog ili vi še lizozomalnih enzima neophodnih za metabolizam prirodnih makromolekula. Ove bolesti obično dovode do akumulacije nerazgrađenih molekula u lizozomima, što dovodi do poveć anja broj granula za skladištenje (takođe se nazivaju vezikule za skladištenje). Ove bolesti i različiti primeri opisani su detaljnije u nastavku.

[0049] Polipeptid: Kako se ovde koristi, "polipeptid", uopšteno govoreć i, je niz od najmanje dve spojene amino kiseline jedan prema drugom peptidnom vezom. Polipeptid mo že da sadrži najmanje 3-5 aminokiselina, od kojih je svaka vezana za drugi putem najmanje jedne peptidne veze. Oni sa uobi čajenim iskustvom u ovoj oblasti tehnike ć e ponekad ceniti da polipeptidi uključuju "ne-prirodne" aminokiseline ili druge entitete koji su ipak sposobni da se integrišu u polipeptidni lanac, po potrebi.

[0050] Zamenski enzim: Kako se ovdje koristi, izraz "zamjenski enzim" odnosi se na bilo koji enzim koji može djelovati na zameniti bar delimično enzim koji nedostaje ili nedostaje u bolesti koja se leči. Izraz "zamjenski enzim" se odnosi na bilo koji enzim koji može delovati tako da zameni bar delimično nedostajući ili nedostajući lizozomski enzim u lizozomskom skladištu bolest koju treba lečiti. Zamenski enzim je sposoban da smanji akumulirane materijale u lizozomima sisara ili koji mogu da spasu ili poboljšaju jedan ili više simptoma bolesti lizozoma. Enzimi za zamenu pogodni za pronalazak uključuje divlje ili modifikovane lizozomalne enzime i može se proizvesti korišć enjem rekombinantnih i sintetičkih metode ili prečišć eni iz prirodnih izvora. Enzim zamene može biti rekombinantni, sintetički, aktiviran genom ili prirodni enzim.

[0051] Rastvorljiv: Kako se ovde koristi, izraz "rastvorljiv" se odnosi na sposobnost terapeutskog agensa da formira homogenu rešenje. Rastvorljivost terapeutskog agensa u rastvoru u koji se primenjuje i kojim se transportuje na ciljno mesto delovanja (npr. ć elije i tkiva mozga) mo že biti dovoljno da omogu ć i isporuku terapijskog efektivnu količinu terapeutskog agensa do ciljanog mesta delovanja. Nekoliko faktora mo že uticati na rastvorljivost terapeutskih agenasa. Na primer, relevantni faktori koji mogu uticati na rastvorljivost proteina uključuju jonsku snagu, aminokiseline sekvencu i prisustvo drugih sredstava ili soli za ko-rastvaranje (npr. soli kalcijuma). Farmaceutske kompozicije mogu biti formulisani tako da su kalcijumove soli isključene iz takvih kompozicija. Terapeutski agensi mogu biti rastvorljivi unjegov odgovarajući farmaceutski sastav. To ć e biti cenjeno, dok su izotonična rešenja generalno poželjnaza lekove koji se daju parenteralno, upotreba izotoničnih rastvora može ograničiti adekvatnu rastvorljivost nekih terapijskih agensi i, posebno neki proteini i/ili enzimi. Blago hipertoni čni rastvori (npr. do 175 mM natrijum hlorida u 5mM natrijum fosfatu na pH 7,0) i rastvorima koji sadrže šećer (npr. do 2% saharoze u 5mM natrijum fosfatu na pH 7,0) pokazalo se da se dobro podnose kod majmuna. Na primer, naj češć e odobreni CNS formulacija bolusa je fiziološki rastvor (150 mM NaCl u vodi).

[0052] Stabilnost: Kako se ovde koristi, termin "stabilan" se odnosi na sposobnost terapeutskog agensa (npr. rekombinantnog enzim) da bi održao svoju terapijsku efikasnost (npr. svu ili već inu svoje predviđene biološke aktivnosti i/ili fiziohemijske integritet) tokom dužeg vremenskog perioda. Stabilnost terapeutskog agensa i sposobnost farmaceutskog leka sastav za održavanje stabilnosti takvog terapeutskog agensa, može se proceniti tokom dužeg vremenskog perioda (npr. najmanje 1, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36 meseci ili više). Generalno, ovde opisane farmaceutske kompozicije su bile formulisani tako da su sposobni da stabilizuju, ili alternativno uspore ili spreče degradaciju, jednog ili više terapeutskih agenasa formulisanih sa njim (npr. rekombinantni proteini). U kontekstu formulacije stabilan formulacija je ona u kojoj terapeutski agens u suštini zadržava svoj fizički i/ili hemijski integritet i biološka aktivnost pri skladištenju i tokom procesa (kao što su zamrzavanje/odmrzavanje, mehaničko mešanje i liofilizacija). Za stabilnost proteina, može se meriti formiranjem agregata visoke molekulske težine (HMV), gubitkom aktivnosti enzima, generisanje peptidnih fragmenata i pomeranje profila naelektrisanja.

[0053] Subjekt: Kako se ovde koristi, izraz "subjekat" označava bilo kog sisara, uključujuć i ljude. U određenim realizacijama, subjekt je odrasla osoba, adolescent ili beba.

[0054] Značajna homologija: Izraz "suštinska homologija" se ovde koristi da se odnosi na poređenje između sekvence aminokiselina ili nukleinskih kiselina. Kao što ć e razumeti stručnjaci sa uobičajenim iskustvom u ovoj oblasti, dve sekvence su generalno se smatraju "suštinski homolognim" ako sadrže homologne ostatke na odgovarajuć im pozicijama.

[0055] Kao što je dobro poznato u ovoj struci, sekvence aminokiselina ili nukleinskih kiselina mogu se uporediti korišć enjem bilo koje od niza algoritme, uključuju ć i one dostupne u komercijalnim kompjuterskim programima kao što je BLASTN za nukleotidne sekvence I BLASTP, BLAST sa razmakom i PSI-BLAST za sekvence aminokiselina. Primeri takvih programa su opisani u Altschul, et al., Osnovni alat za pretragu lokalnog poravnanja, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzimologi; Altschul, et al., "Gapped BLAST i PSI-BLAST: nova generacija programa za pretragu baze podataka proteina", Nukleinske kiseline Res. 25:3389-3402, 1997; Bakevanis, et al., Bioinformatika: Praktični vodič za analizu gena i proteina, Vilei, 1998; i Misener, et al., (ur.), Bioinformati čke metode i protokoli (Metode u molekularnoj biologiji, Vol. 132), Humana Press, 1999. Pored identifikacije homolognih sekvenci, gore pomenuti programi obično obezbeđuju indikacija stepena homologije. Dve sekvence se mogu smatrati suštinski homolognim ako su barem 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% , 99% ili više njih odgovarajuć i ostaci su homologni preko relevantnog dela ostataka. Relevantni deo može biti kompletan niz. Relevantni deo može biti najmanje 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45,

1

50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 ili više ostataka.

[0056] Suštinski identitet: Izraz "suštinski identitet" se ovde koristi da se odnosi na poređenje između amino sekvence kiselina ili nukleinskih kiselina. Kao što ć e razumeti stručnjaci sa uobičajenim iskustvom u ovoj oblasti, dve sekvence su generalno smatraju se "u suštini identičnim" ako sadrže identične ostatke na odgovarajuć im pozicijama. Kao što je poznato u ovoj oblasti tehnike, sekvence aminokiselina ili nukleinskih kiselina mogu se uporediti korišć enjem bilo kog od različitih algoritama, uključuju ć i one dostupno u komercijalnim kompjuterskim programima kao što su BLASTN za nukleotidne sekvence i BLASTP, gapped BLAST, i PSI-BLAST za sekvence aminokiselina. Primeri takvih programa su opisani u Altschul, et al., Basic local alat za pretragu poravnanja, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzimologi; Altschul et al., Nukleinske kiseline Res. 25:3389-3402, 1997; Bakevanis et al., Bioinformatika: Praktični vodič za analizu gena i proteini, Vilei, 1998; i Misener, et al., (ur.), Bioinformatičke metode i protokoli (Metode u molekularnim Biologi, Vol. 132), Humana Press, 1999. Pored identifikacije identičnih sekvenci, gore pomenuti programi obično daju indikaciju stepena identiteta. Dve sekvence se mogu smatrati suštinski identičnim ako najmanje 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% , 98%, 99% ili više njihovih odgovarajuć ih ostataka je identično na relevantnom delu ostataka. Relevantni deo može biti kompletan niz. Relevantni deo može biti najmanje 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 ili više ostataka.

[0057] Sintetički CSF: Kako se ovde koristi, termin "sintetički CSF" se odnosi na rastvor koji ima pH, sastav elektrolita, sadržaj glukoze i osmalarnost u skladu sa cerebrospinalnom tečnošć u. Sintetički CSF se takođe naziva veštačkim CSF. Sintetički CSF može biti Elliott-ovo B rešenje.

[0058] Pogodno za CNS isporuku: Kao što se ovde koristi, fraza "pogodno za CNS isporuku" ili "pogodno za intratekalno isporuka", što se odnosi na farmaceutske kompozicije ovog pronalaska, generalno se odnosi na stabilnost, podnošljivost, i svojstva rastvorljivosti takvih kompozicija, kao i sposobnost takvih kompozicija da isporuče efikasan količinu terapeutskog agensa sadržanog u njemu do ciljanog mesta isporuke (npr. CSF ili mozak).

[0059] Ciljna tkiva: Kako se ovde koristi, termin "ciljano tkivo" odnosi se na bilo koje tkivo koje je zahvać eno lizozomskim bolest skladištenja koja se leči ili bilo koje tkivo u kome se normalno eksprimuje deficitarni lizozomski enzim. Target tkiva uključuju ona tkiva u kojima postoji detektiva ili abnormalno visoka količina enzimskog supstrata, npr. uskladištene u ćelijskim lizozomima tkiva, kod pacijenata koji boluju ili su podložni bolesti lizozomskog skladištenja. Ciljna tkiva uključuju ona tkiva koja pokazuju patologiju, simptom ili osobinu povezanu sa bolešć u. Ciljna tkiva uključuju ona tkiva u kojima je deficitarni lizozomalni enzim normalno izražen na povišenom nivou. Kako se ovde koristi, ciljno tkivo može biti ciljno tkivo mozga, ciljno tkivo kičmene moždine i/ili periferno ciljno tkivo. Uzorna meta tkiva su detaljno opisana u nastavku.

[0060] Terapijski deo: Kako se ovde koristi, termin "terapeutski deo" odnosi se na deo molekula koji čini terapeutski efekat molekula. Terapeutski deo može biti polipeptid koji ima terapeutsku aktivnost.

[0061] Terapijski efikasna količina: Kako se ovde koristi, termin "terapeutski efikasna količina" odnosi se na količinu terapeutskog proteina (zamjenski enzim ASA) koji daje terapeutski efekat na tretiranog subjekta, na razuman odnos koristi/rizika primenljiv na bilo koji medicinski tretman. Terapeutski efekat mo že biti objektivan (tj. Merljiv nekim testom ili markerom) ili subjektivnom (tj. subjekt daje indikaciju ili oseć a efekat). Konkretno, „terapijski efektivna količina" se odnosi na količinu terapeutskog proteina ili kompozicije koja je efikasna za lečenje, poboljšanje ili sprečavanje željenu bolest ili stanje, ili da pokaže vidljivi terapeutski ili preventivni efekat, kao što je ublažavanje simptoma povezano sa bolešć u, sprečavanje ili odlaganje početka bolesti, i/ili smanjenje težine ili učestalost simptoma bolesti. Terapeutski efikasna količina se obično primenjuje u režimu doziranja koji mogu da sadrže više jediničnih doza. Za bilo koji određeni terapeutski protein, terapeutski efikasna količina (i/ili odgovarajuć a jedinična doza u okviru efektivnog režima doziranja) može varirati, na primer, u zavisnosti od načina primene, u kombinaciji sa drugim farmaceutskim agensima. Takođe, specifična terapeutski efikasna količina (i/ili jedinična doza) za svakog određenog pacijenta može zavisiti od niza faktora uključujuć i poreme ć aj koji se leči i poremećaj težine; aktivnost specifičnog primenjenog farmaceutskog agensa; specifičan sastav koji se koristi; starost, telesna težina, opšte zdravlje, pol i ishrana pacijenta; vreme primene, put primene i/ili dozu izlučivanja ili metabolizma specifičnog korišć enog fuzionog proteina; trajanje lečenja; i slični faktori kakvi jesu dobro poznat u medicinskoj umetnosti.

[0062] Tolerantno: Kako se ovde koristi, izrazi "podnošljiv" i "podnošljivost" odnose se na sposobnost farmaceutskog kompozicije ovog pronalaska da ne izazovu neželjenu reakciju kod subjekta kome je takva kompozicija daju, ili alternativno da ne izazovu ozbiljnu neželjenu reakciju kod subjekta kome se takav preparat primenjuje. Farmaceutske kompozicije mogu dobro da se toleri šu od subjekta kome se takve kompozicije primenjuju.

[0063] Lečenje: Kako se ovde koristi, termin "tretman" (takođe "lečenje" ili "lečenje") odnosi se na bilo koju primenu terapeutski protein (lizozomalni enzim) koji delimično ili potpuno ublažava, poboljšava, ublažava, inhibira, odlaže početak od, smanjuje ozbiljnost i/ili smanjuje učestalost jednog ili više simptoma ili karakteristika određene bolesti, poremeć aja, i/ili stanje. Takav tretman može biti od subjekta koji ne pokazuje znake relevantne bolesti, poremeć aja i/ili stanje i/ili subjekta koji pokazuje samo rane znake bolesti, poremeć aja i/ili stanja. Alternativno ili dodatno, takav tretman mo že biti od subjekta koji pokazuje jedan ili više utvrđenih znakova relevantne bolesti, poremeć aj i/ili stanje.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0064] Ovaj pronalazak obezbeđuje, između ostalog, poboljšane kompozicije za efikasno direktno isporuku a terapeutsko sredstvo za centralni nervni sistem (CNS) za upotrebu u metodi le čenja metahromatske leukodistrofije Bolest. Kao što je gore diskutovano, ovaj pronalazak se zasniva na neočekivanom otkrić u da je ASA protein za lečenje Metahromatska leukodistrofija se može direktno uneti u cerebrospinalnu tečnost (CSF) subjekta u potreba za tretmanom u visokoj koncentraciji bez izazivanja zna čajnih štetnih efekata kod subjekta. Još iznenađujuć e, sadašnji pronalazači su otkrili da se zamenski enzim ASA može isporučiti u jednostavnom fiziološkom rastvoru ili na bazi pufera formulacija, bez upotrebe sintetičkog CSF. Još neočekivanije, intratekalna isporuka prema ovom pronalasku ne rezultira značajnim neželjenim efektima, kao što je teški imuni odgovor, kod subjekta. Stoga, u nekim Intratekalna isporuka prema ovom pronalasku može se koristiti u odsustvu istovremenih imunosupresiva terapija (npr. bez indukcije imunolo ške tolerancije predtretman ili pre-kondicioniranje).

[0065] U nekim realizacijama, intratekalna isporuka u skladu sa ovim pronalaskom dozvoljava efikasnu difuziju kroz različita moždana tkiva što rezultira efikasnom isporukom zamenskog enzima ASA u različita ciljna moždana tkiva u površinskim, plitkim i/ili dubokim regionima mozga. U nekim realizacijama, intratekalna isporuka u skladu sa ovim pronalaskom je rezultirala dovoljnom količinom zamenskih enzima koji su ušli u perifernu cirkulaciju. Kao rezultat toga, u nekim slučajevima, intratekalna isporuka prema ovom pronalasku rezultirala je isporukom zamenskog enzima ASA u perifernom tkiva, kao što su jetra, srce, slezina i bubrezi. Ovo otkriće je neočekivano i može biti posebno korisno za lečenje lizozomalnih bolesti skladištenja koje imaju i CNS i periferne komponente, koje bi obično zahtevale i redovne intratekalna primena i intravenska primena. Predviđeno je da intratekalna isporuka prema ovaj pronalazak može omoguć iti smanjeno doziranje i/ili učestalost iv injekcije bez ugrožavanja terapeutskih efekata u lečenju perifernih simptoma.

[0066] Ovaj pronalazak obezbeđuje različite neočekivane i korisne karakteristike koje omoguć avaju efikasnost i pogodnost isporuka zamenskih enzima različitim ciljnim tkivima mozga, što rezultira efikasnim tretmanom lizozomalnog skladištenja bolesti koje imaju CNS indikacije.

Terapeutski proteini

[0067] U nekim realizacijama, kompozicije obezbeđene ovim pronalaskom se koriste za isporuku arilsulfataze A (ASA) protein u CNS za lečenje metahromatske leukodistrofijske bolesti. Pogodan ASA protein može biti bilo koji molekul ili deo molekula koji može da zameni aktivnost proteina arilsulfataze A (ASA) koja se javlja u prirodi ili spasiti jedan ili više fenotipova ili simptoma povezanih sa nedostatkom ASA. U nekim realizacijama, zamena enzim pogodan za upotrebu u skladu sa pronalaskom je polipeptid koji ima N-kraj i C-kraj I aminokiselinska sekvenca suštinski slična ili identična zrelom humanom ASA proteinu.

[0068] Tipično, humana ASA se proizvodi kao prekursorski molekul koji se obrađuje u zreli oblik. Ovaj proces generalno se javlja uklanjanjem signalnog peptida od 18 aminokiselina. Tipi čno, prekursorski oblik se takođe naziva punim prekursor dužine ili ASA protein pune dužine, koji sadrži 507 aminokiselina. N-terminalnih 18 amino kiselina se cepa, što rezultira zrelim oblikom dužine 489 aminokiselina. Dakle, smatra se da N-terminalnih 18 amino kiselina generalno nije potrebno za aktivnost ASA proteina. Aminokiselinske sekvence zrelog oblika (SEK ID NO: 1) I Prekursor pune dužine (SEQ ID NO:2) tipičnog divljeg tipa ili prirodnog humanog ASA proteina prikazani su u tabeli 1.

TABELA 1. Humana Arvlsulfataza A

[0069] Prema tome, u nekim realizacijama, terapeutski deo pogodan za upotrebu u skladu sa ovim pronalaskom je zreli humani ASA protein (SEQ ID NO:1). U nekim realizacijama, pogodan terapeutski deo može biti homolog ili analog zrelog humanog ASA proteina. Na primer, homolog ili analog zrelog humanog ASA proteina može biti modifikovani zreli humani ASA protein koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, delecija i/ili insercije u poređenju sa divljim tipom ili prirodnim ASA proteinom (npr. SEK ID NO:1), uz zadržavanje značajnog Aktivnost ASA proteina. Stoga, u nekim realizacijama, terapeutski deo pogodan za upotrebu u skladu sa sadašnjim pronalazak je suštinski homologan zrelom humanom ASA proteinu (SEK ID NO: 1). U nekim realizacijama, terapeutski deo pogodan za upotrebu u skladu sa ovim pronalaskom ima sekvencu aminokiselina najmanje 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više homologno SEK ID-u NO:1. U nekim realizacijama, terapeutski deo pogodan za upotrebu u skladu sa ovim pronalaskom je u suštini identičan zrelom humanom ASA proteinu (SEK ID NO:1). U nekim realizacijama, terapeutski deo pogodan za upotrebu u u skladu sa ovim pronalaskom ima sekvencu aminokiselina najmanje 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identično sa SEK ID NO:1. U nekim realizacijama, terapeutski deo pogodan za upotrebu u skladu sa ovim pronalaskom sadrži fragment ili deo zrelog humani ASA protein.

[0070] Alternativno, zamenski enzim pogodan za upotrebu u skladu sa ovim pronalaskom je ASA protein pune dužine. U nekim realizacijama, pogodan zamenski enzim može biti homolog ili analog humanog ASA proteina pune dužine. Na primer, homolog ili analog humanog ASA proteina pune du žine može biti modifikovani humani ASA protein pune dužine koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, delecija i/ili insercija u poređenju divljeg tipa ili prirodnog ASA proteina pune dužine (npr. SEK ID NO:2), zadržavajuć i značajan ASA protein aktivnost. Dakle, U nekim realizacijama, zamenski enzim pogodan za upotrebu u skladu sa ovim pronalaskom je suštinski homologan humanom ASA proteinu pune dužine (SEK ID NO:2). U nekim realizacijama, zamena enzim pogodan za upotrebu u skladu sa ovim pronalaskom ima sekvencu aminokiselina najmanje 50%, 55%, 60%,65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više homologno SEK ID-u NO:2. U nekim realizacijama, zamenski enzim pogodan za upotrebu u skladu sa ovim pronalaskom je suštinski identičan SEQ ID NO:2. U nekim realizacijama, zamenski enzim pogodan za upotrebu u skladu saovaj pronalazak ima sekvencu aminokiselina najmanje 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%,92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identično sa SEK ID NO:2. U nekim realizacijama, zamena enzim pogodan za upotrebu u skladu sa ovim pronalaskom sadrži fragment ili deo čoveka pune dužine ASA protein. Kako se ovde koristi, ASA protein pune dužine tipično sadrži signalnu peptidnu sekvencu.

[0071] U nekim realizacijama, terapeutski protein uključuje ciljni deo (npr. sekvencu ciljanja lizozoma) i/ili peptid koji prodire kroz membranu. U nekim realizacijama, sekvenca ciljanja i/ili penetracija u membranu peptid je suštinski deo terapeutskog dela (npr. preko hemijske veze, preko fuzionog proteina).

1

U nekim realizacijama, ciljana sekvenca sadrži manoza-6-fosfatni deo. U nekim realizacijama, sekvenca ciljanja sadrži IGF-I deo. U nekim realizacijama, ciljana sekvenca sadrži IGF-II deo.

[0072] U nekim realizacijama, zamenski enzim ASA pogodan za upotrebu u skladu sa pronalaskom može imati sekvenca divljeg tipa ili prirodna sekvenca. U nekim realizacijama, zamenski ASA enzim pogodan za upotrebu u skladu sa pronalaskom može imati modifikovanu sekvencu koja ima značajnu homologiju ili se može identifikovati sa divljim tipom ili sekvenca koja se javlja u prirodi (npr. ima najmanje 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% identičnost sekvence sa sekvencom divljeg tipa ili sekvencom koja se javlja u prirodi).

[0073] Zamjenski enzim ASA pogodan za upotrebu u skladu sa ovim pronalaskom može se proizvesti bilo kojim raspoloživa sredstva. Na primer, zamenski enzimi mogu biti proizvedeni rekombinantno kori šć enjem sistema ć elija doma ć ina dizajniran za ekspresiju zamenske nukleinske kiseline koja kodira enzim. Alternativno ili dodatno, zamenski enzimi mogu se proizvesti aktiviranjem endogenih gena. Alternativno ili dodatno, zamenski enzimi mogu biti delimično ili potpuno pripremljen hemijskom sintezom. Alternativno ili dodatno, zamenski enzimi takođe mogu biti prečišć eni prirodni izvori.

[0074] Tamo gde se enzimi proizvode rekombinantno, može se koristiti bilo koji sistem ekspresije. Da navedem samo nekoliko primera, poznati ekspresioni sistemi uključuju, na primer, ć elije jaja, bakulovirusa, biljke, kvasca ili ć elije sisara.

[0075] U nekim realizacijama, enzimi pogodni za upotrebu u skladu sa ovim pronalaskom se proizvode u ć elije sisara. Neograničavajući primeri ćelija sisara koji se mogu koristiti u skladu sa ovim pronalaskom uključuju BALB/c liniju mijeloma miša (NSO/l, ECACC br: 85110503); humani retinoblasti (PER.C6, CruCell, Leiden, Holandija); CV1 linija bubrega majmuna transformisana sa SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); ljudski embrionalni bubreg linija (293 ili 293 ć elije subklonirane za rast u kulturi suspenzije, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59, 1977); ljudski ć elijska linija fibrosarkoma (npr., HT1080); ć elije bubrega bebe hrčka (BHK, ATCC CCL 10); Ć elije jajnika kineskog hrčka /DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216, 1980); mišje sertoli ćelije (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251, 1980); ćelije bubrega majmuna (CV1 ATCC CCL 70); Ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76, ATCC CRL-1587); ć elije humanog karcinoma grlić a materice (HeLa, ATCC CCL 2); ćelije psećeg bubrega (MDCK, ATCC CCL 34); ćelije jetre bivolja pacova (BRL 3A, ATCC CRL 1442); ćelije pluća čoveka (W138, ATCC CCL 75); ćelije ljudske jetre (Hep G2, HB 8065); tumor dojke kod miša (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI ć elije (Mather et al., Annals N.I. Acad. Sci., 383:44-68, 1982); MRC 5 ć elije; FS4 ć elije; i linija humanog hepatoma (Hep G2).

[0076] U nekim realizacijama, formulacije za upotrebu prema ovom pronalasku se koriste za isporuku zamene ASA enzimi proizvedeni iz ljudskih ć elija. U nekim realizacijama, formulacije za upotrebu prema ovom pronalasku se koriste za isporuku zamenskih enzima ASA proizvedenih iz CHO ć elija.

[0077] U nekim realizacijama, zamenski enzimi ASA za upotrebu u skladu sa pronalaskom sadrže deo koji se vezuje za receptor na površini moždanih ć elija da bi olakšao ć elijsko uzimanje i/ili ciljanje lizozoma. Na primer, takav receptor može biti katjono-nezavisni receptor manoza-6-fosfata (CI-MPR) koji vezuje manoza-6-fosfat (M6P) ostaci. Pored toga, CI-MPR takođe vezuje druge proteine uključujući IGF-II. U nekim realizacijama, a zamenski ASA enzim pogodan za upotrebu u skladu sa ovim pronalaskom sadr ži M6P ostatke na površini od proteina. U nekim realizacijama, zamenski ASA enzim pogodan za upotrebu u skladu sa sadašnjošć u pronalazak može da sadrži bis-fosforilisane oligosaharide koji imaju ve ć i afinitet vezivanja za CI-MPR. U nekim varijanti, pogodan enzim sadrži do otprilike u proseku od najmanje 20% bisfosforilovanih oligosaharida po enzimu. U drugim realizacijama, odgovarajuć i enzim mo že sadržati oko 10%, 15%, 18%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% bis-fosforilovanih oligosaharida po enzimu. Dok je takav bis-fosforilovan oligosaharidi mogu biti prirodno prisutni u enzimu, treba napomenuti da enzimi mogu biti modifikovani na poseduju takve oligosaharide. Na primer, pogodni zamenski enzimi mogu biti modifikovani određenim enzimima koji su sposobne da katalizuju transfer N-acetilglukozamin-L-fosfata sa UDP-GlcNAc na 6’ poziciju •1,2- povezane manoze na lizozomskim enzimima. Metode i kompozicije za proizvodnju i upotrebu takvih enzima su opisali, na primer, Canfield et al. u ameri čkom patentu br. br.6,537,785 i U.S. br. 6,534,300.

[0078] U nekim realizacijama, zamenski ASA enzimi za upotrebu u skladu sa ovim pronalaskom mogu biti konjugovan ili fuzionisan sa lizozomskim ciljanim delom koji je sposoban da se veže za receptor na površini moždanih ć elija. Pogodan lizozomski ciljni deo može biti IGF-I, IGF-II, RAP, p97 i varijante, homolozi ili fragmenti (npr. uključujuć i one peptide koji imaju sekvencu najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili 95% identičnu divljem tipu zreli humani IGF-I, IGF-II, RAP, p97 peptidna sekvenca).

[0079] U nekim realizacijama, zamenski ASA enzimi pogodni za upotrebu u skladu sa ovim pronalaskom nisu modifikovani da bi se poboljšala isporuka ili transport takvih agenasa preko BBB-a u CNS.

[0080] U nekim realizacijama, terapeutski protein uključuje ciljni deo (npr., sekvencu ciljanja lizozoma) i/ili peptid koji prodire kroz membranu. U nekim realizacijama, sekvenca ciljanja i/ili penetracija u membranu peptid je suštinski deo terapeutskog dela (npr. preko hemijske veze, preko fuzionog proteina). U nekim realizacijama, ciljana sekvenca sadrži manoza-6-fosfatni deo. U nekim realizacijama, sekvenca ciljanja sadrži IGF-I deo. U nekim realizacijama, ciljana sekvenca sadrži IGF-II deo.

Formulacije

[0081] Vodeni farmaceutski rastvori i kompozicije (tj. formulacije) koji se tradicionalno koriste za isporuku terapeutska sredstva za CNS subjekta uključuju nepuferovani izotonični rastvor soli i Elliott-ov B rastvor, koji je veštački CSF. Poređenje koje prikazuje kompozicije CSF u odnosu na Elliott-ov B rastvor je uključeno u tabelu 3 ispod. Kao prikazano u tabeli 3, koncentracija Elliotovog B rastvora blisko je paralelna onoj u CSF. Međutim, Eliotovo rešenje B sadrži veoma nisku koncentraciju pufera i shodno tome možda neć e obezbediti adekvatan puferski kapacitet potreban za stabilizuju terapeutske agense (npr. proteine), posebno tokom dužeg vremenskog perioda (npr. tokom uslova skladištenja). Štaviše, Elliott-ov B rastvor sadrži određene soli koje mogu biti nekompatibilne sa formulacijama namenjenim isporu čuju neke terapeutske agense, a posebno proteine ili enzime. Na primer, kalcijumove soli prisutne u Elliott's B rastvori su sposobni da posreduju u taloženju proteina i na taj način smanjuju stabilnost formulacije.

[0082] Ovaj pronalazak obezbeđuje vodene formulacije za terapeutsko sredstvo koje je formulisano kao da je sposoban da stabilizuje, ili alternativno uspori ili spreči degradaciju formulisanog terapeutskog agensa sa tim (tj., rekombinantni ASA proteini).

[0083] Kako se ovde koristi, termin "stabilan" se odnosi na sposobnost terapeutskog agensa (tj. rekombinantnog ASA enzima) da održi svoju terapeutsku efikasnost (npr. celokupnu ili već inu predviđene biološke aktivnosti i/ili fiziohemijske integritet) tokom dužeg vremenskog perioda. Stabilnost terapeutskog agensa i sposobnost farmaceutskog leka sastav za održavanje stabilnosti takvog terapeutskog agensa, može se proceniti tokom dužeg vremenskog perioda (npr. poželjno najmanje 1, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36 meseci ili više). U kontekstu formulacije stabilna formulacija je onaj u kome terapeutski agens u su štini zadržava svoj fizički i/ili hemijski integritet i biološku aktivnost pri skladištenju i tokom procesa (kao što su zamrzavanje/odmrzavanje, mehaničko mešanje i liofilizacija). Za stabilnost proteina, to može se meriti formiranjem agregata visoke molekulske težine (HMV), gubitkom aktivnosti enzima, stvaranjem peptida fragmenti i pomeranje profila naelektrisanja.

[0084] Stabilnost terapeutskog agensa je od posebne važnosti u pogledu održavanja specificiranog opseg koncentracije terapeutskog agensa koji je potreban da bi se agens omogu ćio da služi svojoj predviđenoj terapijskoj funkciji. Stabilnost terapeutskog agensa može se dalje proceniti u odnosu na biološku aktivnost ili fizičkohemijski integritet terapeutskog agensa tokom dužeg vremenskog perioda. Na primer, stabilnost u datoj vremenskoj tački se može uporediti protiv stabilnosti u ranijoj vremenskoj tački (npr. na dan formulacije 0) ili protiv neformulisanog terapeutskog agensa I rezultati ovog poređenja izraženi u procentima. Poželjno, farmaceutske kompozicije za upotrebu u skladu sa sa ovim pronalaskom održavaju najmanje 100%, najmanje 99%, najmanje 98%, najmanje 97% najmanje 95%, najmanje 90%, najmanje 85%, najmanje 80%, najmanje 75%, najmanje 70%, najmanje 65%, najmanje 60%, najmanje 55% ili najmanje 50% od biološka aktivnost ili fizičkohemijski integritet terapeutskog agensa tokom dužeg vremenskog perioda (npr. tokom najmanje 6-12 meseci, na sobnoj temperaturi ili pod ubrzanim uslovima skladi štenja).

[0085] Terapeutski agensi su poželjno rastvorljivi u farmaceutskim kompozicijama za upotrebu u skladu sa ovog pronalaska. Izraz "rastvorljiv" jer se odnosi na terapeutske agense za upotrebu u skladu sa ovimpronalazak se odnosi na sposobnost takvih terapeutskih sredstava da formiraju homogeni rastvor. Poželjno je rastvorljivost terapeutsko sredstvo u rastvoru u koji se primenjuje i kojim se transportuje do ciljanog mesta delovanja (npr. ć elije i tkiva mozga) je dovoljna da omogu ć i isporuku terapeutski efikasne količine terapeutsko sredstvo na ciljano mesto delovanja. Nekoliko faktora mo že uticati na rastvorljivost terapeutskih agenasa. Za na primer, relevantni faktori koji mogu uticati na rastvorljivost proteina

1

uključuju jonsku snagu, sekvencu aminokiselina I prisustvo drugih agensa ili soli za ko-solubilizaciju (npr. soli kalcijuma.) U nekim realizacijama, farmaceutske kompozicije su formulisani tako da su kalcijumove soli isključene iz takvih kompozicija.

[0086] Pogodne formulacije mogu sadržati terapeutsko sredstvo u različitim koncentracijama. U nekim realizacijama, formulacije može da sadrži protein ili terapeutsko sredstvo u koncentraciji u opsegu od oko 10 mg/ml do 100 mg/ml. U nekim realizacijama, formulacije za upotrebu prema pronalasku mogu sadržati terapeutsko sredstvo u koncentraciji od približno 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml ili 100 mg/ml.

[0087] Formulacije za upotrebu u skladu sa ovim pronalaskom karakteriše i njihova podnošljivost kao vodeni rastvori ili kao rekonstituisani liofilizovani rastvori. Kako se ovde koristi, termini "podno šljivo" i "podnošljivost" odnose se na sposobnost farmaceutskih kompozicija ovog pronalaska da ne izazovu neželjenu reakciju u subjekt kome se takav preparat daje, ili alternativno da ne izazove ozbiljnu neželjenu reakciju kod subjekta kome se takav sastav primenjuje. U nekim realizacijama, farmaceutske kompozicije za upotrebu u skladu sa sa ovim pronalaskom dobro toleriše subjekt kome se takve kompozicije primenjuju.

[0088] Enzim ASA za upotrebu u skladu sa ovim pronalaskom zahteva kontrolisan pH i specifične ekscipijente da održi svoju rastvorljivost i stabilnost u farmaceutskim kompozicijama za upotrebu u skladu sa ovim pronalaskom. Tabela 4 u nastavku identifikuje tipične aspekte proteinskih formulacija za koje se smatra da održavaju rastvorljivost i stabilnost proteina terapeutska sredstva.

TABELA 4

Puferi

[0089] pH formulacije je dodatni faktor koji može da promeni rastvorljivost terapeutskog agensa (npr. enzim ASA) u vodenoj formulaciji ili za formulaciju pre liofilizacije. Shodno tome formulacije za upotrebu u skladu sa ovim pronalaskom sadrže jedan ili više pufera. U nekim realizacijama vodeni formulacije sadrže količinu pufera dovoljnu za održavanje optimalnog pH pomenute kompozicije između oko 4,0-8,0 (npr. oko 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,2, 6,4, 6,5, 6,6, 6,8, 7,0, 7,5 ili 8,0). U nekim realizacijama, pH formulacije je između oko 5,0-7,5, između oko 5,5-7,0, između oko 6,0-7,0, između oko 5,5-6,0, između oko 5,5-6,5, između oko 5,0-6,0, između oko 5,0-6,5 i između oko 6,0-7,5. Pogodni puferi uključuju, za na primer acetat, citrat, histidin, fosfat, sukcinat, tris(hidroksimetil)aminometan („Tris“) i drugi organski kiseline. Koncentracija pufera i pH opseg farmaceutskih kompozicija za upotrebu u skladu sa ovim pronalazak su faktori u kontroli ili prilagođavanju podnošljivosti formulacije. U nekim realizacijama, puferski agens je prisutan u koncentraciji u rasponu između oko 1 mM do oko 150 mM, ili između oko 10 mM do oko 50 mM, ili između oko 15 mM do oko 50 mM, ili između oko 20 mM do oko 50 mM, ili između oko 25 mM do oko 50 mM. U nekim realizacijama, odgovarajuć i puferski agens je prisutan u koncentraciji od približno 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM 50 mM, 75 mM, 100

1

mM, 125 mM ili 150 mM

Toničnost

[0090] U nekim realizacijama, formulacije takođe sadrže agens izotoničnosti koji održava formulacije izotoničnim. Obično, pod "izotoničnim" se podrazumeva da formulacija od interesa ima u suštini isti osmotski pritisak kao ljudska krv. Izotonični formulacije ć e generalno imati osmotski pritisak od oko 240 mOsm/kg do oko 350 mOsm/kg. Izotoničnost može se meri korišć enjem, na primer, osmometara tipa pritiska pare ili tačke smrzavanja. Primeri sredstava za izotoničnost uključuju, ali nisu ograničeni na, glicin, sorbitol, manitol, natrijum hlorid i arginin. U nekim realizacijama, pogodno izotoni čni agensi mogu biti prisutni u vodenim i/ili pre-liofilizovanim formulacijama u koncentraciji od oko 0,01 -5 % (npr. 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,75, 1,0, 1,25, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 4,0 ili 5,0%) po masi. U nekim realizacijama, formulacije za liofilizaciju sadrže agens izotoničnosti koji zadržava formulacije pre liofilizacije ili rekonstituisane formulacije izotonične.

[0091] Dok su generalno izotonični rastvori poželjniji za parenteralno primenjene lekove, upotreba izotoničnih rastvora može promeniti rastvorljivost nekih terapeutskih agenasa, a posebno nekih proteina i/ili enzima. Blago hipertoničan rastvori (npr. do 175 mM natrijum hlorida u 5 mM natrijum fosfata pri pH 7,0) i rastvori koji sadrže šeć er (npr. do 2% saharoze u 5 mM natrijum fosfata na pH 7,0) se dobro toleri še. Najčešć i odobreni sastav CNS bolus formulacije je fiziološki rastvor (oko 150 mM NaCl u vodi).

Stabilizujuća sredstva

[0092] U nekim realizacijama, formulacije mogu da sadrže stabilizator, ili lioprotektant, za zaštitu proteina. Tipično, pogodno sredstvo za stabilizaciju je šeć er, neredukcioni še ć er i/ili amino kiselina. Primeri šećera uključuju, ali nisu ograničeni na, dekstran, laktozu, manitol, manozu, sorbitol, rafinozu, saharozu i trehalozu. Primer amino kiseline uključuju, ali nisu ograničene na, arginin, glicin i metionin. Dodatni stabilizatori mogu uključivati natrijum hlorid, hidroksietil skrob i polivinilpirolidon. Količina stabilizacionog agensa u liofilizovanoj formulaciji je generalno takav da ć e formulacija biti izotonična. Međutim, hipertonične rekonstituisane formulacije takođe mogu biti pogodne. Pored toga, količina stabilizacionog agensa ne sme biti preniska tako da neprihvatljiva koli čina degradacije/agregacije terapijskog agensa. Primeri koncentracija stabilizacionog agensa u formulaciji mogu biti u rasponu od oko 1 mM do oko 400 mM (npr. od oko 30 mM do oko 300 mM, i od oko 50 mM do oko 100 mM), ili alternativno, od 0,1% do 15% (npr. od 1% do 10%, od 5% do 15%, od 5% do 10%) po težini. U nekim realizacijama, odnos masene količine stabilizacionog agensa i terapeutskog agensa je oko 1:1. U drugim realizacijama, odnos masene količine stabilizacionog agensa i terapeutskog agensa može biti oko 0,1:1, 0,2:1, 0,25:1, 0,4:1, 0,5:1, 1:1, 2:1, 2,6:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10;1 ili 20:1. U nekim realizacijama, pogodno za liofilizaciju, sredstvo za stabilizaciju je takođe lioprotektant.

[0093] U nekim realizacijama, tečne formulacije pogodne za upotrebu u skladu sa ovim pronalaskom sadrže amorfne materijala. U nekim realizacijama, tečne formulacije pogodne za upotrebu u skladu sa ovim pronalaskom sadrže značajnu količinu amorfnih materijala (npr. formulacije na bazi saharoze). U nekim realizacijama, tečnost formulacije pogodne za upotrebu u skladu sa ovim pronalaskom sadrže delimično kristalne/delimično amorfne materijale.

Tzv. Bulking sredstva

[0094] U nekim realizacijama, pogodne formulacije za liofilizaciju mogu dalje da sadr že jedno ili više sredstava za poveć anje zapremine. "Sredstvo za pove ć anje mase" je jedinjenje koje dodaje masu liofilizovanoj smeši i doprinosi fizičkoj strukturi liofilizovanog kolača. Na primer, sredstvo za poveć anje zapremine može poboljšati izgled liofilizovanog kolača (npr. jednolični liofilizovani kolač). Pogodna sredstva za poveć anje zapremine uključuju, ali nisu ograničena na, natrijum hlorid, laktozu, manitol, glicin, saharoza, trehaloza, hidroksietil skrob. Primeri koncentracija agenasa za pove ćanje zapremine su od oko 1% do oko 10% (npr. 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 5,5%, 6,0%, 6,5%, 7,0%, 7,5%, 8,0%, 8,5%, 9,0%, 9,5% i 10,0%).

Surfaktanti

[0095] U nekim realizacijama, poželjno je dodati surfaktant formulacijama. Primeri surfaktanata uključuju nejonske surfaktanti kao što su polisorbati (npr. polisorbati 20 ili 80); poloksameri (npr. poloksamer 188); Triton; natrijum dodecil sulfat (SDS); natrijum laurel sulfat; natrijum oktil glikozid; lauril-, miristil-, linoleil- ili stearil-sulfobetain; lauril-, miristil-, linoleil- ili stearil-sarkozin; linoleil-, miristil- ili cetilbetain; lauroamidopropil-, kokamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropil-, palmidopropil- ili izostearamidopropil-betain (npr. lauroamidopropil); miristamidopropil-, palmidopropil-, ili izostearamidopropil-dimetilamin; natrijum metil kokoil- ili dinatrijum metil eiltaurat; i serija MONAKUAT™

1

(Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.), polietil glikol, polipropil glikol I kopolimeri etilena i propilen glikola (npr. Pluronics, PF68, itd.). Tipično, količina dodanog surfaktanta je tako da smanjuje agregaciju proteina i minimizira stvaranje čestica ili šumenja. Na primer, surfaktant može biti prisutan u formulaciji u koncentraciji od oko 0,001 -0,5% (npr., oko 0,005 -0,05%, ili 0,005 -0,01%). Konkretno, surfaktant može biti prisutan u formulaciji u koncentraciji od približno 0,005%, 0,01%, 0,02%, 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4% ili 0,5% itd. Alternativno, ili kao dodatak, surfaktant se može dodati u liofilizovana formulacija, preliofilizovana formulacija i/ili rekonstituisana formulacija.

[0096] Drugi farmaceutski prihvatljivi nosači, ekscipijenti ili stabilizatori kao što su oni opisani u Remington's Pharmaceutical Sciences 16. izdanje, Osol, A. Ed. (1980) mogu biti uključeni u formulaciju (i/ili liofilizovani formulacija i/ili rekonstituisana formulacija) pod uslovom da ne uti ču negativno na željene karakteristike formulacije. Prihvatljivi nosači, ekscipijenti ili stabilizatori su netoksični za primaoce u dozama i koncentracijama korišć eni i uključuju, ali nisu ograničeni na, dodatne puferske agense; konzervansi; ko-rastvarači; antioksidansi uključujuć i askorbinsku kiselinu i metionin; helatni agensi kao što je EDTA; kompleksi metala (npr. kompleksi Zn-proteina); biorazgradivi polimeri kao što su poliestri; i/ili protivjoni koji stvaraju soli kao što je natrijum.

[0097] Formulacije, bilo u vodenom, pre-liofilizovanom, liofilizovanom ili rekonstituisanom obliku, mogu se proceniti na osnovu analiza kvaliteta proizvoda, vreme rekonstitucije (ako je liofilizovano), kvalitet rekonstitucije (ako je liofilizovan), visoka molekulska težina, vlaga i temperatura prelaska stakla. Tipično, kvalitet proteina i analiza proizvoda uključuju degradaciju proizvoda analiza brzine korišć enjem metoda uključujuć i, ali ne ograničavaju ć i se na, HPLC sa isključenjem veličine (SE-HPLC), katjon-izmenom-HPLC (CEKSHPLC), Difrakcija rendgenskih zraka (KSRD), modulisana diferencijalna skenirajuć a kalorimetrija (mDSC), HPLC reverzne faze (RP-HPLC), rasejanje svetlosti u više uglova (MALS), fluorescencija, ultraljubičasta apsorpcija, nefelometrija, kapilarna elektroforeza (CE), SDS-PAGE i njihove kombinacije. Procena proizvoda može uključivati korak procene izgleda (bilo izgled tečnosti ili kolača).

[0098] Generalno, formulacije (liofilizovane ili vodene) mogu da se čuvaju tokom dužeg vremenskog perioda na sobnoj temperaturi. Temperatura skladištenja obično može da se kreć e od 0 °C do 45 °C (npr. 4 °C, 20 °C, 25 °C, 45 °C itd.). Formulacije mogu biti čuvaju u periodu od nekoliko meseci do nekoliko godina. Vreme skladištenja ć e generalno biti 24 meseca, 12 meseci, 6 meseci, 4.5 meseci, 3 meseca, 2 meseca ili 1 mesec. Formulacije se mogu čuvati direktno u kontejneru koji se koristi za administraciju, eliminisanje koraka prenosa.

[0099] Formulacije se mogu čuvati direktno u posudi za liofilizaciju (ako je liofilizovana), koja takođe može da funkcioniše kao

posudu za rekonstituciju, eliminišuć i korake transfera. Alternativno, mogu se meriti formulacije liofilizovanog proizvoda u manjim koracima za skladištenje. Skladištenje generalno treba izbegavati okolnosti koje dovode do razgradnje proteina, uključujuć i ali ne ograničavaju ć i se na izlaganje sunčevoj svetlosti, UV zračenju, drugim oblicima elektromagnetnog zračenja, prekomernoj toploti ili hladno, brzo termalno i mehanički udar.

Liofilizacija

[0100] Postupci se mogu koristiti za liofilizaciju bilo kog materijala, posebno terapeutskih agenasa. Tipično, pre-liofilizacija formulacija dalje sadrži odgovarajuć i izbor ekscipijenata ili drugih komponenti kao što su stabilizatori, pufer agensi, sredstva za poveć anje zapremine i surfaktanti za spre čavanje razgradnje jedinjenja od interesa (npr. agregacija proteina, deamidacija i/ili oksidacija) tokom su šenja zamrzavanjem i skladištenja. Formulacija za liofilizaciju može uključivati jedan iliviše dodatnih sastojaka uključujuć i lioprotektante ili stabilizatore, pufere, sredstva za pove ć anje mase, agense za izotoni čnost I surfaktanti. Nakon što su supstanca od interesa i sve dodatne komponente pome šane zajedno, formulacija se liofilizuje. Liofilizacija generalno uključuje tri glavne faze: zamrzavanje, primarno sušenje i sekundarno sušenje. Zamrzavanje je neophodno za pretvaranje vode u led ili neke amorfne komponente formulacije u kristalni oblik. Primarno sušenje je proces korak kada se led uklanja iz zamrznutog proizvoda direktnom sublimacijom na niskom pritisku i temperaturi. Sekundarni su šenje je procesni korak kada se vezana voda uklanja iz matrice proizvoda korišć enjem difuzije ostatka vode do površine isparavanja. Temperatura proizvoda tokom sekundarnog sušenja je normalno viša nego tokom primarnog sušenje. Videti, Tang X. et al. (2004) "Dizajn procesa smrzavanja za farmaceutske proizvode: Prakti čni saveti", Pharm. Res., 21:191-200; Nail S.L. et al. (2002) "Osnove sušenja zamrzavanjem", u Razvoj i proizvodnja proteina farmaceutskih proizvoda. Nail S.L. urednik Nev Iork: Kluver Academic/Plenum Publishers, str. 281-353; Vang i dr. (2000) "Liofilizacija i razvoj čvrstih proteinskih farmaceutskih proizvoda", Int. J. Pharm., 203:1-60; Villiams N.A. et al. (1984) "Liofilizacija farmaceutskih proizvoda; Pregled literature." J. Parenteral Sci. Technol, 38:48-59.

1

[0102] Korak žarenja može biti uveden tokom početnog zamrzavanja proizvoda. Korak žarenja se može smanjiti ukupno vreme ciklusa. Bez želje da budemo vezani bilo kakvim teorijama, smatra se da korak žarenja može pomoć i podstiču kristalizaciju ekscipijensa i formiranje ve ć ih kristala leda usled ponovne kristalizacije formiranih malih kristala tokom superhlađenja, što, zauzvrat, poboljšava rekonstituciju. Tipično, korak žarenja uključuje interval ili oscilaciju na temperaturi tokom smrzavanja. Na primer, temperatura smrzavanja može biti -40 °C, a korak žarenja će biti poveć ati temperaturu na, na primer, -10 °C i održavati ovu temperaturu u određenom vremenskom periodu. The žarenje vreme koraka može da se kreć e od 0,5 sati do 8 sati (npr. 0,5, 1,0 1,5, 2,0, 2,5, 3, 4, 6 i 8 sati). Temperatura žarenja može biti između temperature smrzavanja i 0 °C.

[0103] Liofilizacija se može izvesti u kontejneru, kao što je tuba, kesa, boca, poslužavnik, bočica (npr. staklena bočica), špric ili bilo koji drugi odgovarajuć i kontejner. Kontejneri mogu biti za jednokratnu upotrebu. Liofilizacija se takođe može izvesti kod velikih ili malih razmera. U nekim slučajevima, može biti poželjno da se proteinska formulacija liofilizuje u kontejneru u kojoj treba da se izvr ši rekonstitucija proteina kako bi se izbegao korak transfera. Kontejner u ovom slučaju može, na primer, biti bočica od 3, 4, 5, 10, 20, 50 ili 100 cc.

[0104] Mnogo različitih mašina za sušenje zamrzavanjem je dostupno za ovu svrhu, kao što je Hull pilot sušač (SP Industries, SAD), Genesis (SP Industries) laboratorijski sušači zamrzavanjem ili bilo koji uređaj za sušenje zamrzavanjem koji može da kontroliše datu liofilizaciju parametara procesa. Sušenje zamrzavanjem se postiže zamrzavanjem formulacije i naknadnim sublimiranjem leda smrznuti sadržaj na temperaturi pogodnoj za primarno sušenje. Početno zamrzavanje dovodi formulaciju do temperature ispod oko -20 °C (npr. -50 °C, -45 °C, -40 °C, -35 °C, -30 °C, -25 °C, itd.) obično ne više od oko 4 sata (npr. ne više od oko 3 sata, ne više od oko 2,5 sata, ne više od oko 2 sata). Pod ovim uslovom, temperatura proizvoda je tipično ispod eutektičke tačke ili temperature kolapsa formulacije. Obično, temperatura police za primarno sušenjeć e se kretati od oko -30 do 25 °C (pod uslovom da proizvod ostane ispod

tačka topljenja tokom primarnog sušenja) na odgovarajuć em pritisku, u rasponu tipično od oko 20 do 250 mTorr. Formulacija, veličina i vrsta posude u kojoj se nalazi uzorak (npr. staklena bočica) i zapremina tečnosti ć e uglavnom diktirati vreme potrebno za sušenje, koje može trajati od nekoliko sati do nekoliko dana. Faza sekundarnog sušenja se izvodi na oko 0-60°C, u zavisnosti pre svega od vrste i veličine kontejnera i vrste korišć enog terapeutskog proteina. opet, zapremina tečnosti ć e uglavnom diktirati vreme potrebno za sušenje, koje može da se kreć e od nekoliko sati do nekoliko dana.

[0105] Kao opšta tvrdnja, liofilizacija ć e rezultirati liofilizovanom formulacijom u kojoj je sadr žaj vlage od toga je manje od oko 5%, manje od oko 4%, manje od oko 3%, manje od oko 2%, manje od oko 1%, i manje od oko 0,5%.

Rekonstitucija

[0106] Farmaceutske kompozicije za upotrebu u skladu sa ovim pronalaskom su u vodenom obliku po administraciji subjektu. Ako su farmaceutske kompozicije za upotrebu u skladu sa ovim pronalaskom su liofilizovane, takve kompozicije moraju biti rekonstituisane dodavanjem jednog ili vi še razblaživača pre primene subjektu. U željenoj fazi, obično u odgovarajuć e vreme pre davanja pacijentu, liofilizovan formulacija može biti rekonstituisana sa razblaživačem tako da je koncentracija proteina u rekonstituisanoj formulaciji poželjan.

[0107] Mogu se koristiti različiti razblaživači. U nekim realizacijama, pogodan razblaživač za rekonstituciju je voda. Voda koji se koristi kao razblaživač može se tretirati na različite načine uključujuć i reverznu osmozu, destilaciju, dejonizaciju, filtraciju (npr. aktivni ugalj, mikrofiltracija, nanofiltracija) i kombinacije ovih metoda tretmana. Uopšteno, voda treba da bude pogodan za injekcije uključujuć i, ali ne ograničavajuć i se na, sterilnu vodu ili bakteriostatsku vodu za injekcije.

[0108] Dodatni primeri razblaživača uključuju pH puferovani rastvor (npr., fiziološki rastvor puferovan fosfatom), sterilni slani rastvor, Eliotov rastvor, Ringerov rastvor ili rastvor dekstroze. Pogodni razbla živači mogu opciono da sadrže konzervans. Primeri konzervansa uključuju aromatične alkohole kao što su benzil ili fenol alkohol. Količina upotrebljenog konzervansa određuje se procenom različitih koncentracija konzervansa za kompatibilnost sa proteinom i konzervansom testiranje efikasnosti. Na primer, ako je konzervans aromatični alkohol (kao što je benzil alkohol), on može biti prisutan u iznos od oko 0,1-2,0%, od oko 0,5-1,5%, ili oko 1,0-1,2%.

[0109] Pogodni razblaživači mogu uključivati različite aditive, uključujuć i, ali ne ograničavaju ć i se na, pH puferske agense, (npr. Tris, histidin), soli (npr. natrijum hlorid) i drugi aditivi (npr. saharoza) uklju čujući one opisane gore (npr. sredstva, sredstva za izotoničnost).

1

[0110] Liofilizovani protein se može rekonstituisati do koncentracije od najmanje 25 mg/ml (npr. najmanje 50 mg/ml, na najmanje 75 mg/ml, najmanje 100 mg/) iu bilo kom opsegu između njih. U nekim realizacijama, liofilizovana supstanca (protein) se može rekonstituisati do koncentracije u rasponu od oko 10 mg/ml do 100 mg/ml (npr. od oko 10 mg/ml do oko 30 mg/ml, od oko 10 mg/ml do oko 50 mg/ml, od oko 10 mg/ml do oko 75 mg/ml, od oko 10 mg/ml mg/ml do oko 100 mg/ml, od oko 25 mg/ml do oko 50 mg/ml, od oko 25 mg/ml do oko 75 mg/ml, od oko 25 mg/ml do oko 100 mg/ml, od oko 50 mg/ml do oko 75 mg/ml, od oko 50 mg/ml do oko 100 mg/ml). U u nekim aspektima, koncentracija proteina u rekonstituisanoj formulaciji može biti veća od koncentracije u formulaciji pre liofilizacije. U nekim realizacijama, koncentracija proteina u rekonstituisanoj formulaciji mo že biti oko 2-50 puta (npr., oko 2-20, oko 2-10 puta, ili oko 2-5 puta) od pre-liofilizovane formulacije. U nekim realizacijama, koncentracija proteina u rekonstituisanoj formulaciji može biti najmanje oko 2 puta (npr. najmanje oko 3, 4, 5, 10, 20, 40 puta) prethodno liofilizovane formulacije.

[0111] Rekonstitucija se može izvršiti u bilo kom kontejneru. Primeri kontejnera pogodnih za pronalazak uključuju, ali nisu ograničeni na, kao što su tube, bočice, špricevi (npr. jednokomorni ili dvokomorni), kese, boce i tacne. Pogodni kontejneri mogu biti napravljeni od bilo kog materijala kao što su staklo, plastika, metal. Kontejneri mogu biti za jednokratnu ili vi šekratnu upotrebu. Rekonstitucija se takođe može izvršiti u velikom ili malom obimu.

[0112] U nekim slučajevima, može biti poželjno da se proteinska formulacija liofilizuje u posudi u kojoj se rekonstituiše proteina treba sprovesti kako bi se izbegao korak transfera. Kontejner u ovom slu čaju može, na primer, biti bočica od 3, 4, 5, 10, 20, 50 ili 100 cc. U nekim realizacijama, pogodan kontejner za liofilizaciju i rekonstituciju je a špric sa dve komore (npr. Lyo-Ject,® (Vetter) špricevi). Na primer, špric sa dve komore može da sadrži oba liofilizovana supstanca i razblaživač, svaki u posebnoj komori, odvojeni čepom (videti Primer 5). da rekonstituišem, klip se može pričvrstiti na čep na strani razblaživača i pritisnuti da pomeri razređivač u komoru za proizvod tako da razblaživač može da dođe u kontakt sa liofilizovanom supstancom i rekonstitucija se može odvijati kako je ovde opisano (videti Primer 5).

CNS isporuka

[0113] Smatra se da su različite formulacije zasnovane na slanom rastvoru ili puferu koje su ovde opisane generalno pogodne za CNS isporuka terapeutskog sredstva. Formulacije na bazi fiziolo škog rastvora ili pufera prema ovom pronalasku mogu biti koristi se za isporuku CNS-a različitim tehnikama i putevima uključujuć i intraparenhimalne, intracerebralne, intraventrikularne cerebralne (ICV), intratekalne (npr. IT-Lumbar, IT-cisterna magna) primene za injekcije direktno ili indirektno u CNS i/ili CSF.

Intratekalna isporuka

[0114] Intratekalna primena se može koristiti za isporuku ASA proteina u CSF. Kako se ovde koristi, intratekalno primena (takođe se naziva intratekalna injekcija) odnosi se na injekciju u ki čmeni kanal (intratekalni prostor okružujuć i kičmenu moždinu). Mogu se koristiti različite tehnike uključuju ć i, bez ograničenja, lateralnu cerebroventrikularnu injekcija kroz otvor ili cistemalnu ili lumbalnu punkciju ili slično. Primeri metoda su opisani u Lazorthesu et al. Napredak u sistemima za isporuku lekova i primenama u neurohirurgiji, 143-192 i Omaia et al., Lek protiv raka isporuka, 1: 169-179.

[0115] Prema ovom pronalasku, enzim ASA se može ubrizgati u bilo koji region oko kičmenog kanala. U nekim realizacijama, enzim ASA se ubrizgava u lumbalni deo ili cisternu magna ili intraventrikularno u prostor moždane komore. Kako se ovde koristi, termin "lumbalni region" ili "lumbalna oblast" odnosi se na oblast između treć i i četvrti lumbalni (donji deo leđa) pršljen i, još više, L2-S1 region kičme. Tipično, intratekalno injekcija preko lumbalnog regiona ili područja drveta se takođe naziva "lumbalna IT isporuka" ili "lumbalna IT administracija". Termin "cisterna magna" se odnosi na prostor oko i ispod malog mozga preko otvora između lobanje I vrh kičme. Tipično, intratekalna injekcija preko cisterne magne se takođe naziva „isporuka cisterne magne“. Termin "moždanska komora" odnosi se na šupljine u mozgu koje su kontinuirane sa centralnim kanalom kičme gajtan. Obično se injekcije kroz šupljine cerebralne komore nazivaju intraventrikularna cerebralna (ICV) isporuka.

[0116] U nekim realizacijama, "intratekalna primena" ili "intratekalna isporuka" prema ovom pronalasku odnosi se na lumbalnu IT administraciju ili isporuku, na primer, isporu čena između treć eg i četvrtog lumbalnog dela (donji deo leđa) pršljenova i, još više, L2-S1 region kičme. Predviđeno je da lumbalna IT administracija ili isporuka razlikuje isporuku u cisternu magna u toj lumbalnoj IT administraciji ili isporuci prema našem pronalasku bolja i efikasnija isporuka do distalnog kičmenog kanala, dok cisterna magna isporuka, između ostalog, obično ne isporučuje dobro u distalni kičmeni kanal.

Uređaj za intratekalnu isporuku

2

[0117] Različiti uređaji se mogu koristiti za intratekalnu isporuku u skladu sa ovim pronalaskom. U nekim realizacijama, uređaj za intratekalnu primenu sadrži port za pristup tečnosti (npr. port za injektiranje); šuplje telo (npr. Kateter) ima prvi otvor za protok u tečnoj komunikaciji sa priključkom za pristup tečnosti i drugi otvor za protok konfigurisan za umetanje u kičmenu moždinu; i mehanizam za osiguranje za umetanje šupljeg tela u kičmenu moždinu. Kao ne- ograničavajući primer prikazan na slici 62, odgovarajući mehanizam za pričvršćivanje sadrži jedan ili više čvorova postavljenih na površinu šupljeg tela i ušivenog prstena koji se može podesiti preko jednog ili više čvorova kako bi se sprečilo šuplje telo (npr. Kateter) od iskliznuć a iz kičmene moždine. U različitim realizacijama, otvor za pristup tečnosti sadrži rezervoar. U nekim U realizaciji, priključak za pristup tečnosti sadrži mehaničku pumpu (npr. pumpu za infuziju). U nekim realizacijama, implantirani kateter je povezan ili sa rezervoarom (npr. za bolus) ili sa infuzionom pumpom. Otvor za pristup tečnosti mogu biti implantirani ili eksterni.

[0118] U nekim realizacijama, intratekalna primena se može izvršiti bilo lumbalnom punkcijom (tj. sporim bolusom) ili preko sistema za isporuku port-katetera (tj. infuzija ili bolus). U nekim realizacijama, kateter je umetnut između lamine lumbalnih pršljenova i vrh se provlače u tekalni prostor do željenog nivoa (obično L3-L4) (Slika 63).

[0119] U odnosu na intravensku primenu, zapremina pojedinačne doze pogodna za intratekalnu primenu je tipično mali. Tipično, intratekalna isporuka prema ovom pronalasku održava ravnotežu kompozicije CSF kao i intrakranijalni pritisak subjekta. U nekim realizacijama, intratekalna isporuka se izvodi u odsustvu odgovarajuć e uklanjanje CSF od subjekta. U nekim realizacijama, pogodna zapremina pojedina čne doze može biti npr. manje od oko 10 ml, 8 ml, 6 ml, 5 ml, 4 ml, 3 ml, 2 ml, 1,5 ml, 1 ml ili 0,5 ml. U nekim realizacijama, pogodan singl zapremina doze može biti oko 0,5-5 ml, 0,5-4 ml, 0,5-3 ml, 0,5-2 ml, 0,5-1 ml, 1-3 ml, 1-5 ml, 1,5-3 ml, 1-4 ml, ili 0,5-1,5 ml. U nekim realizacijama, intratekalna isporuka prema ovom pronalasku uključuje korak uklanjanja željenog prvo količinu CSF. U nekim realizacijama, manje od oko 10 ml (npr. manje od oko 9 ml, 8 ml, 7 ml, 6 ml, 5 ml, 4 ml, 3 ml, 2 ml, 1 ml) CSF se prvo uklanja pre IT primene. U tim slučajevima, odgovarajuć a zapremina pojedinačne doze možebiti, na primer, više od oko 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 7 ml, 8 ml, 9 ml, 10 ml, 15 ml ili 20 ml.

[0120] Različiti drugi uređaji mogu da se koriste da bi se izvršila intratekalna primena terapeutske kompozicije. Na primer, formulacije koje sadrže željene enzime mogu se davati korišć enjem Ommaia rezervoara koji se uobičajeno koristi za intratekalno davanje lekova za karcinomatozu meningea (Lancet 2: 983-84, 1963). Tačnije, u ovoj metodi, a ventrikularna cev se ubacuje kroz rupu formiranu u prednjem rogu i povezuje se sa Ommaia rezervoarom koji je instaliran ispod kože glave, a rezervoar se potkožno probuši da bi se intratekalno isporučio određeni enzim koji zamenjen, koji se ubrizgava u rezervoar. Drugi uređaji za intratekalnu primenu terapeutskih kompozicija ili formulacije za pojedinca su opisane u U.S. br.

6,217,552. Alternativno, lek se može dati intratekalno, na primer, jednom injekcijom ili kontinuiranom infuzijom. Trebalo bi razumeti da tretman doziranja može biti u u obliku primene jedne doze ili višestrukih doza. Za injekcije, formulacije za upotrebu u skladu sa pronalaskom su formulisane u te čnim rastvorima. Dodatno, enzim se može formulisati u čvrstom obliku i ponovo rastvoriti ili suspendovati neposredno pre upotrebe. Liofilizovani oblici takođe su uključeni. Injekcija može biti, na primer, u obliku bolus injekcije ili kontinuirane infuzije (npr. infuzione pumpe) enzima.

[0122] U jednom aspektu pronalaska, enzim se primenjuje lateralnom cerebro ventrikularnom injekcijom u mozak subjekta. Injekcija se može napraviti, na primer, kroz rupu napravljenu u lobanji subjekta. U drugom varijanta, enzim i/ili druga farmaceutska formulacija se primenjuje kroz hirur ški umetnut šant u moždanu komoru subjekta. Na primer, injekcija se može izvršiti u bočne komore, koje su već i. U nekim realizacijama, takođe se može izvršiti injekcija u treć u i četvrtu manju komoru.

[0123] U još jednom izvođenju, farmaceutske kompozicije koje se koriste u ovom pronalasku se daju injekcijom u cisternu magna, ili lumbalni deo subjekta.

[0124] U drugom aspektu, formulacija za upotrebu u skladu sa pronalaskom, farmaceutski prihvatljiva formulacija obezbeđuje produženu isporuku, na primer, "sporo oslobađanje" enzima ASA ili druge farmaceutske kompozicije koji se koristi u ovom pronalasku, subjektu najmanje jednu, dve, tri, četiri nedelje ili duži vremenski period nakon farmaceutski prihvatljiva formulacija se daje subjektu.

[0125] Kako se ovde koristi, izraz "odložena isporuka" se odnosi na kontinuiranu isporuku farmaceutske formulacije za upotreba u skladu sa pronalaskom in vivo tokom vremenskog perioda nakon primene, poželjno najmanje nekoliko dana, nedelje ili nekoliko nedelja. Trajna isporuka kompozicije mo že se demonstrirati, na primer, nastavkom terapijski efekat enzima tokom vremena (npr. produ žena isporuka enzima može se demonstrirati kontinuiranim smanjena količina skladišnih granula u subjektu). Alternativno, može se pokazati produžena isporuka enzima otkrivanjem prisustva enzima in vivo tokom vremena.

Dostava do ciljanih tkiva

[0126] Kao što je gore diskutovano, jedna od iznenađujuć ih i važnih karakteristika ovog pronalaska je da zamena ASA enzim koji se primenjuje u skladu sa ovim pronalaskom je u stanju da efikasno i ekstenzivno difunduje preko površine mozga i prodiru u različite slojeve ili regione mozga, uključujući duboke regione mozga. Pored toga, formulacije za upotrebu u skladu sa ovim pronalaskom efikasno isporučuju enzim ASA u različita tkiva, neurone ili ć elije kičmene moždine, uključuju ć i lumbalni region, koji je teško pogoditi postojeć im metodama isporuke CNS-a kao npr. ICV injekcija. Štaviše, formulacije za upotrebu u skladu sa ovim pronalaskom daju dovoljnu količinu an ASA enzim u krvotok i razne periferne organe i tkiva.

[0127] Prema tome, u nekim realizacijama, enzim ASA se isporučuje u centralni nervni sistem subjekta. U nekim ASA enzim se isporučuje u jedno ili više ciljnih tkiva mozga, kičmene moždine i/ili perifernih organa. Kako se ovde koristi, termin "ciljna tkiva" odnosi se na bilo koje tkivo koje je zahvać eno bole š ć u lizozoma koje treba lečiti ili bilo koje tkivo u kome je normalno izražen deficitarni lizozomski enzim. U nekim realizacijama, cilj tkiva uključuju ona tkiva u kojima postoji detektiva ili abnormalno visoka količina enzimskog supstrata, npr. uskladištene u ćelijskim lizozomima tkiva, kod pacijenata koji boluju ili su podložni bolesti lizozomskog skladištenja. U nekim realizacijama, ciljna tkiva uključuju ona tkiva koja pokazuju patologiju, simptom ili odlika. U nekim realizacijama, ciljna tkiva uklju čuju ona tkiva u kojima je deficit lizozomalnog enzima normalno izraženo na povišenom nivou. Kako se ovde koristi, ciljno tkivo može biti ciljno tkivo mozga, ciljno tkivo kičmene moždine i/ili periferno ciljno tkivo. Primeri ciljnih tkiva su detaljno opisani u nastavku.

Ciljna tkiva mozga

[0128] Uopšteno, mozak se može podeliti na različite regione, slojeve i tkiva. Na primer, meningealno tkivo je sistem membrana koji obavija centralni nervni sistem, uključujuć i mozak. Moždane ovojnice sadrže tri slojeva, uključujuć i dura materiju, arahnoidnu materiju i materiju pia. Generalno, primarna funkcija moždane ovojnice i od cerebrospinalna tečnost treba da štiti centralni nervni sistem. U nekim realizacijama, terapeutski protein u skladu sa sa ovim pronalaskom se isporučuje u jedan ili više slojeva moždane ovojnice.

[0129] Mozak ima tri primarne podele, uključujući cerebrum, mali mozak i moždano stablo. Cerebralni hemisfere, koje se nalaze iznad već ine drugih moždanih struktura i prekrivene su kortikalnim slojem. Ispod cerebrum leži moždano stablo, koje podseć a na stabljiku na kojoj je veliki mozak pričvrš ć en. Na zadnjem delu mozga, ispod velikog mozga i iza moždanog stabla nalazi se mali mozak.

[0130] Dencefalon, koji se nalazi blizu srednje linije mozga i iznad mezencefalona, sadr ži talamus, metatalamus, hipotalamus, epitalamus, prettalamus i pretektum. Mesencephalon, tako đe tzv srednji mozak, sadrži tektum, tegumentum, ventrikularnu mezoceliju i cerebralne peduncele, crveno jezgro I jezgro III kranijalnog nerva. Mezencefalon je povezan sa vidom, sluhom, kontrolom motora, spavanjem/budnošć u, budnoš ć u, i regulacija temperature.

[0131] Regioni tkiva centralnog nervnog sistema, uključujuć i mozak, mogu se okarakterisati na osnovu dubine od tkiva. Na primer, tkiva CNS (npr. mozga) mogu se okarakterisati kao povr šinska ili plitka tkiva srednje dubine tkiva i/ili duboka tkiva.

[0132] Prema ovom pronalasku, terapeutski protein (zamena ASA enzima) može biti isporučen u bilo koje odgovarajuće ciljno tkivo(a) mozga povezano sa određenom bolešću koja se leči kod subjekta. U nekim realizacijama, terapeutski protein (zamena ASA enzima) u skladu sa ovim pronalaskom se isporu čuje na površinu ili plitko ciljno tkivo mozga. U nekim realizacijama, terapeutski protein u skladu sa ovim pronalaskom je isporučuje se u ciljno tkivo mozga srednje dubine. U nekim realizacijama, terapeutski protein u skladu sa sadašnjim pronalazak se isporučuje u duboko ciljno tkivo mozga. U nekim realizacijama, terapeutski protein u skladu sa ovaj pronalazak se isporučuje na kombinaciju površinskog ili plitkog ciljanog tkiva mozga, ciljanog tkiva mozga srednje dubine, i/ili duboko ciljno tkivo mozga. U nekim realizacijama, terapeutski protein u skladu sa ovim pronalaskom isporučuje se u duboko moždano tkivo najmanje 4 mm, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, 10 mm ili više ispod (ili unutrašnjeg do) spoljašnja površina mozga.

[0133] U nekim realizacijama, terapeutsko sredstvo (ASA enzim) se isporučuje na jednu ili više površina ili plitkih tkiva velikog mozga. U nekim realizacijama, ciljana površina ili plitka tkiva velikog mozga se nalaze unutar 4 mm od površine velikog mozga. U nekim realizacijama, ciljana površina ili plitka tkiva velikog mozga se biraju između tkiva pia mater, cerebralnog kortikalnog trakastog tkiva, hipokampusa, Virchov Robinovog prostora, krvnih sudova unutar VR prostora, hipokampus, delovi hipotalamusa na donjoj povr šini mozga, optički nervi i trakti, mirisna lukovica i izbočine i njihove kombinacije.

[0134] U nekim realizacijama, terapeutsko sredstvo (ASA enzim) se isporučuje u jedno ili više dubokih tkiva cerebrum. U nekim realizacijama, ciljana povr šina ili plitka tkiva velikog mozga nalaze se na 4 mm (npr. 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm ili 10 mm) ispod (ili unutrašnje od) površine velikog mozga. U nekim realizacijama, ciljano duboka tkiva velikog mozga uključuju cerebralnu kortikalnu traku. U nekim realizacijama, ciljana duboka tkiva veliki mozak uključuje jedan ili više diencefalona (npr. hipotalamus, talamus, prettalamus, subtalamus, itd.), metencephalon, sočiva jezgra, bazalni gangliji, kaudat, putamen, amigdala, globus pallidus i kombinacije od toga.

[0135] U nekim realizacijama, terapeutsko sredstvo (npr., ASA enzim) se isporučuje u jedno ili više tkiva malog mozga. U određenim realizacijama, ciljano jedno ili više tkiva malog mozga se biraju iz grupe koji se sastoji od tkiva molekularnog sloja, tkiva Purkinjeovog ćelijskog sloja, tkiva granularnog ćelijskog sloja, malog mozga peteljke i njihova kombinacija. U nekim realizacijama, terapeutsko sredstvo (ASA enzim) se isporučuje jednom ili dublja tkiva malog mozga uključujuć i, ali ne ograničavaju ć i se na, tkiva Purkinjeovog ć elijskog sloja, tkiva granularnog ć elijski sloj, duboko cerebelarno tkivo bele materije (npr. duboko u odnosu na sloj granularnih ć elija) i duboka jezgra malog mozga tkiva.

[0136] U nekim realizacijama, terapeutsko sredstvo (ASA enzim) se isporučuje u jedno ili više tkiva moždanog stabla. U nekim realizacijama, ciljano jedno ili vi še tkiva moždanog stabla uključuju tkivo bele materije moždanog stabla i/ili tkivo jezgara moždanog stabla.

[0137] U nekim realizacijama, terapeutsko sredstvo (ASA enzim) se isporučuje u različita moždana tkiva uključujući, ali ne ograničeno na, sivu materiju, belu materiju, periventrikularna podru čja, pia-arahnoid, moždane ovojnice, neokorteks, mali mozak, duboka tkiva u moždanoj kori, molekularnom sloju, kaudatom/putamen regionu, srednjem mozgu, dubokim regionima ponsa ili medule i kombinacijama od toga.

[0138] U nekim realizacijama, terapeutsko sredstvo (ASA enzim) se isporučuje u različite ć elije u mozgu uključujuć i, ali nije ograničeno na, neurone, glijalne ć elije, perivaskularne ć elije i/ili meningealne ć elije. U nekim realizacijama, terapeutski protein isporučuje se u oligodendrocite duboke bele materije.

Kičmena moždina

[0139] Generalno, regioni ili tkiva kičmene moždine mogu se okarakterisati na osnovu dubine tkiva. Za na primer, tkiva kičmene moždine mogu se okarakterisati kao površinska ili plitka tkiva, tkiva srednje dubine i/ili duboka tkiva.

[0140] U nekim realizacijama, terapeutsko sredstvo (ASA enzim) se isporučuje na jedno ili više površinskih ili plitkih tkiva kičmene moždine. U nekim realizacijama, ciljana površina ili plitko tkivo kičmene moždine nalazi se unutar 4 mm sa površine kičmene moždine. U nekim realizacijama, ciljana površina ili plitko tkivo kičmene moždine sadrži pia materija i/ili trakti bele materije.

[0141] U nekim realizacijama, terapeutsko sredstvo (ASA enzim) se isporučuje u jedno ili više dubokih tkiva kičmenog stuba gajtan. U nekim realizacijama, ciljano duboko tkivo kičmene moždine nalazi se unutra na 4 mm od površine kičmenu moždinu. U nekim realizacijama, ciljano duboko tkivo kičmene moždine sadrži sivu materiju kičmene moždine i/ili ependimne ćelije.

[0142] U nekim realizacijama, terapeutsko sredstvo (ASA enzim) se isporučuje u neurone kičmene moždine.

Periferna ciljna tkiva

[0143] Kako se ovde koristi, periferni organi ili tkiva se odnose na bilo koji organ ili tkiva koji nisu deo centralnog nervni sistem (CNS). Periferna ciljna tkiva mogu uključivati, ali nisu ograničena na, krvni sistem, jetru, bubrege, srce,endotel, ć elije izvedene iz koštane srži i koštane srži, slezina, plu ć a, limfni čvor, kost, hrskavica, jajnik i testis. U nekim realizacijama, terapeutski protein (zamena enzima ASA) u skladu sa ovim pronalaskom je isporučuje se u jedno ili više perifernih ciljnih tkiva.

Biodistribucija i biodostupnost

[0144] U različitim realizacijama, kada se jednom dostavi u ciljno tkivo, enzim ASA je lokalizovan intracelularno. Za na primer, terapeutsko sredstvo (ASA enzim) može biti lokalizovano na eksone, aksone, lizozome, mitohondrije ili vakuole ciljne ć elije (npr. neurona kao što su Purkinje ć elije). Na primer, u nekim realizacijama se daje intratekalno enzimi pokazuju dinamiku translokacije tako da se enzim kreć e unutar perivaskularnog prostora (npr. konvektivni mehanizmi potpomognuti pulsiranjem). Pored toga, aktivni aksonalni transportni mehanizmi koji se odnose na asocijaciju primenjenog proteina ili enzima sa neurofilamentima takođe može doprineti ili na drugi način olakšati distribuciju intratekalno primenjenih

2

proteina ili enzima u dublja tkiva centralnog nervnog sistema.

[0145] U nekim realizacijama, enzim ASA koji se isporučuje u skladu sa ovim pronalaskom može postić i terapeutski ili klinički efikasni nivoi ili aktivnosti u različitim ciljnim tkivima opisanim ovde. Kako se ovde koristi, terapeutski iliklinički efikasan nivo ili aktivnost je nivo ili aktivnost dovoljna da pruži terapeutski efekat u ciljnom tkivu. Terapeutski efekat može biti objektivan (tj. merljiv nekim testom ili markerom) ili subjektivan (tj. subjekt daje indikaciju ili oseć a efekat). Na primer, terapeutski ili klini čki efikasan nivo ili aktivnost može biti enzimski nivo ili aktivnost koja je dovoljna da ublaži simptome povezane sa bolešć u u ciljnom tkivu (npr. skladištenje GAG-a).

[0146] U nekim realizacijama, terapeutsko sredstvo (zamena ASA enzima) isporučeno u skladu sa sadašnjim pronalazak može postić i enzimski nivo ili aktivnost koja iznosi najmanje 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% normalnog nivoa ili aktivnosti odgovarajuć eg lizozomalnog enzima u ciljnom tkivu. U nekim realizacijama, terapeutsko sredstvo (zamena ASA enzima) isporu čeno u skladu sa ovim pronalaskom može postić i enzimsko nivo ili aktivnost koja je pove ć ana najmanje 1 puta, 2 puta, 3 puta, 4 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 ili 10 puta kao u poređenju sa kontrolom (npr. endogeni nivoi ili aktivnosti bez tretmana). U nekim realizacijama, terapeutski lek agens (npr. zamenski enzim ASA) koji se isporučuje u skladu sa ovim pronalaskom može postić i pove ć anu enzimsku nivo ili aktivnost najmanje približno 10 nmol/sat/mg, 20 nmol/sat/mg, 40 nmol/sat/mg, 50 nmol/sat/mg, 60 nmol/sat/mg, 70 nmol/sat/mg, 80 nmol/sat/mg, 90 nmol/sat/mg, 100 nmol/sat/mg, 150 nmol/sat/mg, 200 nmol/sat/mg, 250 nmol/sat/mg, 300 nmol/sat/mg nmol/sat/mg, 350 nmol/sat/mg, 400 nmol/sat/mg, 450 nmol/sat/mg, 500 nmol/sat/mg, 550 nmol/sat/mg ili 600 nmol/sat/mg u meti tkiva.

[0147] U nekim realizacijama, formulacije za upotrebu prema ovom pronalasku su posebno korisne za ciljanje lumbalni region. U nekim realizacijama, terapeutsko sredstvo (zamena ASA enzima) isporu čeno prema ovaj pronalazak može postić i pove ć an enzimski nivo ili aktivnost u lumbalnoj regiji od najmanje približno 500 nmol/sat/mg, 600 nmol/sat/mg, 700 nmol/sat/mg, 800 nmol/sat/mg, 900 nmol/sat/mg, 1000 nmol/sat/mg, 1500 nmol/sat/sat 2000 nmol/sat/mg, 3000 nmol/sat/mg, 4000 nmol/sat/mg, 5000 nmol/sat/mg, 6000 nmol/sat/mg, 7000 nmol/sat/mg, 8000 nmol/sat/mg, 9000 nmol/sat/mg ili 10 000 nmol/sat/mg.

[0148] Generalno, terapeutski agensi (zamjenski ASA enzimi) koji se isporučuju prema ovom pronalasku imaju dovoljno dugo poluvreme u CSF i ciljnim tkivima mozga, kičmene moždine i perifernih organa. U nekim realizacijama, terapeutsko sredstvo (zamena ASA enzima) isporučeno u skladu sa ovim pronalaskom može imati poluživot od najmanje približno 30 minuta, 45 minuta, 60 minuta, 90 minuta, 2 sata, 3 sata, 4 sata, 5 sati, 6 sati, 7 sati, 8 sati, 9 sati, 10 sati, 12 sati, 16 sati, 18 sati, 20 sati, 25 sati, 30 sati, 35 sati, 40 sati, gore do 3 dana, do 7 dana, do 14 dana, do 21 dana ili do mesec dana. U nekim realizacijama, u nekim realizacijama, terapeutski agens (zamena ASA enzima) koji se isporučuje u skladu sa ovim pronalaskom može zadržati detektabilno nivo ili aktivnost u CSF ili krvotoku nakon 12 sati, 24 sata, 30 sati, 36 sati, 42 sata, 48 sati, 54 sata, 60 sati, 66 sati, 72 sata, 78 sati, 84 sata, 90 sati, 96 sati, 102 sata ili nedelju dana nakon primene. Nivo ili aktivnost koja se može detektovati može se odrediti korišć enjem različitih metoda poznatih u tehnici.

[0149] U određenim realizacijama, terapeutsko sredstvo (zamena ASA enzima) isporučeno u skladu sa sadašnjim pronalazak postiže koncentraciju od najmanje 30 mg/ml u CNS tkivima i ć elijama subjekta nakon primene (npr. jedna nedelja, 3 dana, 48 sati, 36 sati, 24 sata, 18 sati, 12 sati, 8 sati, 6 sati, 4 sata, 3 sata, 2 sata, 1 sat, 30 minuta ili manje, nakon intratekalne primene farmaceutske kompozicije subjektu). U određene realizacije, terapeutsko sredstvo (zamena ASA enzima) isporučeno u skladu sa ovim pronalaskom postiže koncentraciju od najmanje 20mg/ml, najmanje 15mg/ml, najmanje 10mg/ml, najmanje 7,5mg/ml, najmanje 5mg/ml, na najmanje 25 mg/ml, najmanje 1,0 mg/ml ili najmanje 0,5 mg/ml u ciljanim tkivima ili ć elijama subjekta (npr. moždano tkivo ili neurona) nakon davanja takvom subjektu (npr. jedna nedelja, 3 dana, 48 sati, 36 sati, 24 sata, 18 sati, 12 sati sati, 8 sati, 6 sati, 4 sata, 3 sata, 2 sata, 1 sat, 30 minuta ili manje nakon intratekalne primjene takve farmaceutske kompozicije subjektu).

Lečenje bolesti metahromatske leukodistrofije (MLD)

[0150] Metahromatska leukodistrofija (MLD), je autozomno recesivni poremećaj koji je rezultat nedostatka enzima arilsulfateaze A (ASA). ASA, koju kod ljudi kodira ARSA gen, je enzim koji se razbija cerebrozid 3-sulfat ili sfingolipid 3-O-sulfogalaktozilceramid (sulfatid) u cerebrozid i sulfat. U odsustvo enzima, sulfatidi se akumuliraju u nervnom sistemu (npr. mijelinske ovojnice, neuroni i glijalne ćelije) I u manjoj meri u visceralnim organima. Posledica ovih molekularnih i ć elijskih događaja je progresivna demijelinizacijai gubitak aksona u CNS i PNS, što je klinički prać eno teškom motoričkom i kognitivnom disfunkcijom.

[0151] Definišuć a klinička karakteristika ovog poreme ć aja je degeneracija centralnog nervnog sistema (CNS), što dovodi do kognitivno ošteć enje (npr. mentalna retardacija, nervni poreme ć aji i slepilo, izme đu ostalog).

[0152] MLD se može manifestovati kod male dece (kasno-infantilni oblik), gde obolela deca obi čno počinju da pokazuju simptomi neposredno nakon prve godine života (na primer, oko 15-24 meseca), i generalno ne prežive posle 5 godina godine. MLD se može manifestovati kod dece (juvenilni oblik), gde obolela deca obično pokazuju kognitivno ošteć enjedo starosti od 3-10 godina, a životni vek može da varira (npr. u rasponu od 10-15 godina nakon pojave simptoma). MLD može se manifestovati kod odraslih (oblik sa početkom u odrasloj dobi) i može se pojaviti kod osoba bilo kog uzrasta (npr. obično u dobi od 16 godina i kasnije) i napredovanje bolesti može veoma da varira.

[0153] Formulacije za upotrebu u skladu sa ovim pronalaskom se koriste za efikasno lečenje pojedinaca koji pate od ili podložni MLD. Termini, "tretman" ili "tretman", kako se ovde koriste, odnose se na poboljšanje jednog ili više simptome povezane sa bolešću, prevenciju ili odlaganje pojave jednog ili vi še simptoma bolesti, i/ili smanjenje težine ili učestalosti jednog ili više simptoma bolesti. Primeri simptoma uključuju, ali jesu nije ograničeno na, intrakranijalni pritisak, hidrocefalus ek vacuo, akumulirani sulfatni glikolipidi u mijelinskim omotačima u centralnog i perifernog nervnog sistema i visceralnih organa, progresivna demijelinizacija i gubitak aksona unutar CNS i PNS, i/ili motorna i kognitivna disfunkcija.

[0154] U nekim realizacijama, lečenje se odnosi na delimično ili potpuno ublažavanje, poboljšanje, olakšanje, inhibiciju, odlaganje početak, smanjenje težine i/ili incidencije neuroloških ošteć enja kod pacijenata sa MLD. Kako se ovde koristi, termin "neurolo ško ošteć enje" uključuje različite simptome povezane sa ošteć enjem centralnog nervnog sistema (npr. mozak i kičmena moždina). U nekim realizacijama, različiti simptomi MLD su povezani sa ošteć enjem periferni nervni sistem (PNS). U nekim realizacijama, karakteriše se neurološko oštećenje kod pacijenata sa MLD padom grube motoričke funkcije. Bić e cenjeno da se gruba motorička funkcija može proceniti bilo kojim odgovaraju ć im metodom. Na primer, u nekim realizacijama, bruto motorička funkcija se meri kao promena u odnosu na osnovnu liniju motoričke funkcije korišć enjem ukupnog sirovog rezultata Gross Motor Function Measure-88 (GMFM-88).

[0155] U nekim realizacijama, tretman se odnosi na smanjenu akumulaciju sulfata u razli čitim tkivima. U nekim realizacijama, tretman se odnosi na smanjenu akumulaciju sulfata u ciljnim tkivima mozga, neuronima kičmene moždine i/ili periferna ciljna tkiva. U određenim rešenjima, akumulacija sulfata je smanjena za oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% ili više kao u poređenju sa a kontrola. U nekim realizacijama, akumulacija sulfata je smanjena za najmanje 1 puta, 2 puta, 3 puta, 4 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 ili 10 puta u poređenju sa kontrolom. Biće cenjeno da se može proceniti skladištenje sulfata bilo kojim odgovarajućim metodom. Na primer, u nekim realizacijama, skladištenje sulfata se meri bojenjem alcijan plavim.U nekim realizacijama, skladištenje sulfata se meri LAMP-1 bojenjem.

[0156] U nekim realizacijama, tretman se odnosi na smanjenu vakuolizaciju u neuronima (npr. neuroni koji sadrže Purkinje ćelije). U određenim aspektima, vakuolizacija u neuronima je smanjena za oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% ili više u poređenju sa kontrolom. U nekim varijantama, vakuolizacija je smanjena najmanje 1 puta, 2 puta, 3 puta, 4 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta ili 10 puta u poređenju sa kontrolom.

[0157] U nekim realizacijama, lečenje se odnosi na povećanu aktivnost enzima ASA u različitim tkivima. U nekim realizacijama, tretman se odnosi na povećanu aktivnost enzima ASA u ciljnim tkivima mozga, neuronima kičmene moždine i/ili perifernim ciljna tkiva. U nekim realizacijama, aktivnost ASA enzima je poveć ana za oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% , 600%, 700%, 800%, 900% 1000% ili više u poređenju sa kontrolom. U nekim realizacijama, aktivnost ASA enzima je poveć ana za at najmanje 1 puta, 2 puta, 3 puta, 4 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 ili 10 puta u poređenju sa kontrolom. U nekim realizacijama, poveć ana enzimska aktivnost ASA je najmanje približno 10 nmol/sat/mg, 20 nmol/sat/mg, 40 nmol/sat/mg, 50 nmol/sat/mg, 60 nmol/sat/mg, 70 nmol/sat/mg, 80 nmol/sat/mg, 90 nmol/sat/mg, 100 nmol/sat/mg, 150 nmol/sat/mg, 200 nmol/sat/mg, 250 nmol/sat/mg, 300 nmol/sat/mg, 350 nmol/sat/mg, 400 nmol/sat/mg, 450 nmol/sat/mg, 500 nmol/sat/mg, 55 nmol/sat/mg, 600 nmol/sat/mg ili više. U nekim realizacijama, enzimska aktivnost ASA je poveć ana u lumbalnoj regiji. U nekim realizacijama, poveć ana enzimska aktivnost ASA u lumbalnoj regiji je najmanje pribli žno 2000 nmol/h/mg, 3000 nmol/sat/mg, 4000 nmol/sat/mg, 5000 nmol/sat/mg, 6000 nmol/sat/mg, 7000 nmol/sat/mg, 8000 nmol/sat/mg, 9000 nmol/sat/mg, 10.000 nmol/sat/mg ili više.

[0158] U nekim realizacijama, lečenje se odnosi na smanjenu progresiju gubitka kognitivne sposobnosti. U

2

određenim realizacijama, progresija gubitka kognitivnih sposobnosti se smanjuje za oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% ili više u poređenju sa kontrolom. U nekim realizacijama, lečenje se odnosi na smanjenje kašnjenja u razvoju. U određenim realizacijama, kašnjenje u razvoju je smanjeno za oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% , 90%, 95%, 100% ili više u poređenju sa kontrolom.

[0159] U nekim realizacijama, tretman se odnosi na poveć ano preživljavanje (npr. vreme preživljavanja). Na primer, lečenje može rezultiraju produženjem životnog veka pacijenta. U nekim realizacijama, tretman rezultira produženim životnim vekom pacijenta za više od oko 5%, oko 10%, oko 15%, oko 20%, oko 25%, oko 30%, oko 35%, oko 40%, oko 45%, oko 50%, oko 55%, oko 60%, oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95%, oko 100%, oko 105%, oko 110%, oko 115%, oko 120%, oko 125%, oko 130%, oko 135%, oko 140%, oko 145%, oko 150%, oko 155%, oko 160%, oko 165%, oko 170%, oko 175%, oko 180%, oko 185%, oko 190%, oko 195%, oko 200% ili više, u poređenju sa prosečnim životnim vekom jedne ili više kontrolnih pojedinaca sa sličnom bolešću bez lečenja. U nekim realizacijama, tretman dovodi do poveć anja očekivani životni vek pacijenta za više od oko 6 meseci, oko 7 meseci, oko 8 meseci, oko 9 meseci, oko 10 meseci, oko 11 meseci, oko 12 meseci, oko 2 godine, oko 3 godine, oko 4 godine, oko 5 godina, oko 6 godina, oko 7 godina, oko 8 godina, oko 9 godina, oko 10 godina ili vi še, u poređenju sa prosečnim životnim vekom jedna ili više kontrolnih osoba sa sličnom bolešć u bez lečenja. U nekim realizacijama, tretman rezultira dugim rok preživljavanja pacijenta. Kako se ovde koristi, izraz "dugotrajno preživljavanje" odnosi se na duže vreme preživljavanja ili očekivani životni vek od oko 40 godina, 45 godina, 50 godina, 55 godina, 60 godina ili duže.

[0160] Termini, "poboljšati", "poveć ati" ili "smanjiti", kako se ovde koriste, označavaju vrednosti koje se odnose na kontrolu. A odgovarajuća kontrola može biti osnovno merenje, kao što je merenje kod iste osobe pre početka merenja tretman opisan ovde, ili merenje kod kontrolne osobe (ili vi še kontrolnih pojedinaca) u odsustvu ovde opisani tretman. „Kontrolni pojedinac“ je osoba obolela od istog oblika MLD (npr. kasno infantilno, maloletna ili odrasla osoba), koja je otprilike istog uzrasta i/ili pola kao i osoba koja se leči (da bi se osiguralo da stadijumi bolesti kod tretirane osobe i kontrolne osobe(e) su uporedivi).

[0161] Pojedinac (koji se takođe naziva "pacijent" ili "subjekt") koji se leči je pojedinac (fetus, novorođenče, dete, adolescent ili odrasla osoba) koji imaju MLD ili imaju potencijal da razviju MLD. Pojedinac može imati ostatke endogena ekspresija i/ili aktivnost ASA, ili bez merljive aktivnosti. Na primer, osoba koja ima MLD može imaju nivoe ekspresije ASA koji su manji od oko 30-50%, manje od oko 25-30%, manje od oko 20-25%, manje od oko 15-20%, manje od oko 10-15%, manje od oko 5-10%, manje od oko 0,1-5% normalnih nivoa ekspresije ASA.

[0162] U nekim realizacijama, pojedinac je pojedinac kome je nedavno dijagnostikovana bolest. Obi čno je rani tretman (tretman započeti što je pre moguće nakon dijagnoze) važan da bi se smanjio efekte bolesti i maksimiziranje koristi od lečenja.

Imunska tolerancija

[0163] Generalno, intratekalna primena terapeutskog agensa (zamena ASA enzima) prema ovaj pronalazak ne dovodi do ozbiljnih štetnih efekata kod subjekta. Kako se ovde koristi, teški neželjeni efekti izazivaju, ali nisu ograničeni na, značajan imuni odgovor, toksičnost ili smrt. Kako se ovde koristi, termin "značajna imunost odgovor" odnosi se na teške ili ozbiljne imune odgovore, kao što su adaptivni imuni odgovori T-ćelija.

[0164] Dakle, u mnogim realizacijama, formulacija za upotrebu prema ovom pronalasku ne uklju čuje istovremene imunosupresivna terapija (tj. bilo koja imunosupresivna terapija koja se koristi kao pretretman/pre-kondicioniranje ili paralelno na metodu). U nekim realizacijama, takva upotreba ne uključuje indukciju imunološke tolerancije kod subjekta tretirani. U nekim realizacijama, takva upotreba ne uključuje prethodni tretman ili predkondicioniranje subjekta kori šć enjem T- ć elija imunosupresivno sredstvo.

[0165] U nekim realizacijama, intratekalna primena terapeutskih agenasa mo že izazvati imuni odgovor protiv ovi agenti. Stoga, u nekim realizacijama, može biti korisno da se subjektu učini da prima zamenski enzim tolerantna na terapiju zamene enzima. Imunska tolerancija se mo že indukovati korišćenjem različitih metoda poznatih u umetnost. Na primer, početni režim od 30-60 dana imunosupresivnog agensa T-ć elija kao što je ciklosporin A (CsA) I antiproliferativno sredstvo, kao što je azatioprin (Aza), kombinovano sa nedeljnim intratekalnim infuzijama niskih doza može se koristiti željeni zamenski enzim.

[0166] Bilo koji imunosupresivni agens poznat stručnjaku može se koristiti zajedno sa kombinacijom terapija. Takvi imunosupresivi uključuju, ali nisu ograničeni na ciklosporin, FK506, rapamicin, CTLA4-Ig, i anti-TNF agensi kao što je etanercept (videti npr. Moder, 2000, Ann. Allergi Asthma Immunol. 84, 280-284;

2

Nevins, 2000, Curr. Opin. Pediatr. 12, 146-150; Kurlberg et al., 2000, Scand. J. Immunol. 51, 224-230; Ideguchi et al., 2000, Neuroscience 95, 217-226; Potteret al., 1999, Ann. NJ akad. Sci. 875, 159-174; Slavik et al., 1999, Immunol. Res. 19, 1-24; Gaziev et al., 1999, Transplantacija koštane srži. 25, 689-696; Henri, 1999, Clin. Transplant. 13, 209-220; Gummert et al., 1999, J. Am. Soc. Nephrol. 10, 1366-1380; Ki et al., 2000, Transplantation 69, 1275-1283). Anti-IL2 receptor (a-podjedinica) antitela daclizumab (npr. Zenapax.TM), za koje je pokazano da je efikasan kod pacijenata sa transplantacijom, mo že se koristiti i kao imunosupresiv (videti npr. Wiseman et al., 1999, Drugs 58, 1029-1042; Beniaminovitz et al., 2000, N. Engl J. Med. 342, 613-619; Ponticelli et al., 1999, Drugs R.D. 1, 55-60; Berard et al., 1999, Farmakoterapija 19, 1127-1137; Eckhoffet al., 2000, Transplantacija 69, 1867-1872; Ekberg et al., 2000, Transpl. Int.13, 151-159). Dodatni imunosupresivi uključuju, ali nisu ograničeni na anti-CD2 (Branco et al., 1999, Transplantation 68, 1588-1596; Przepiorka et al., 1998, Blood 92, 4066-4071), anti-CD4 (Marinova-Mutafchieva et al., 2000, Arthritis Rheum. 43, 638-644; Fishwild et al., 1999, Clin. Immunol. 92, 138-152), i anti-CD40 ligand (Hong et al., 2000, Semin. Nephrol. 20, 108-125; Chirmule et al., 2000, J. Virol. 74, 3345-3352; Ito et al., 2000, J. Immunol. 164, 1230-1235).

Administracija

[0167] Pojedinačna ili višestruka primena terapeutski efikasne količine terapeutskog agensa (zamena ASA enzim). Terapeutski agens (zamena ASA enzima) se može primeniti na u redovnim intervalima, u zavisnosti od prirode, težine i stepena stanja subjekta. U nekim realizacijama, a terapeutski efikasna koli čina terapeutskog agensa (zamena ASA enzima) ovog pronalaska može biti davati intratekalno periodično u redovnim intervalima (npr. jednom godišnje, jednom u šest meseci, jednom u pet meseci, jednom u tri meseca, dvomesečno (jednom u dva meseca), mesečno (jednom mesečno), dvonedeljno (jednom svake dve nedelje), nedeljno).

[0168] U nekim realizacijama, intratekalna primena se može koristiti zajedno sa drugim putevima primene (npr. intravenozno, subkutano, intramuskularno, parenteralno, transdermalno ili transmukozno (npr. oralno ili nazalno)). U nekim realizacijama, ti drugi putevi davanja (npr. intravenozna primena) se mogu izvesti bez češć e nego dvonedeljno, mesečno, jednom u dva meseca, jednom u tri meseca, jednom u četiri meseca, jednom svakih pet meseci, jednom u šest meseci, godišnje administracija.

[0169] Kako se ovde koristi, termin "terapeutski efikasna količina" se u velikoj meri određuje na osnovu ukupne količine terapeutsko sredstvo sadržano u farmaceutskim kompozicijama ovog pronalaska. Generalno, terapeutski efektivna količina je dovoljna da se postigne značajna korist za subjekta (npr. lečenje, modulacija, lečenje, prevencija i/ili poboljšanje osnovne bolesti ili stanja). Na primer, terapeutski efikasna količina može biti neka količina dovoljna da se postigne željeni terapeutski i/ili profilaktički efekat, kao što je količina dovoljna za modulaciju receptore lizozomalnih enzima ili njihovu aktivnost da na taj način leče takvu lizozomalnu bolest skladištenja ili njene simptome (npr. smanjenje ili eliminisanje prisustva ili incidencije "tela zebre" ili ć elijske vakuolizacije nakon davanje preparata ovog pronalaska subjektu). Generalno, količina terapijskog agensa (npr., rekombinantni ASA enzim) koji se daje subjektu kome je to potrebno zavisić e od karakteristika predmet. Takve karakteristike uklju čuju stanje, težinu bolesti, opšte zdravlje, starost, pol i telesnu težinu predmet. Stručnjak sa uobičajenim iskustvom u tehnici će lako moći da odredi odgovarajuće doze u zavisnosti od ovih i drugi srodni faktori. Pored toga, i objektivni i subjektivni testovi mogu se opciono koristiti za identifikaciju optimalnog rasponi doza.

[0170] Terapeutski efikasna količina se obično primenjuje u režimu doziranja koji može da sadrži više jedinične doze. Za bilo koji određeni terapeutski protein, terapeutski efikasna količina (i/ili odgovarajuć a jedinična doza u okviru efektivnog režima doziranja) mogu varirati, na primer, u zavisnosti od načina primene, od kombinacije sa drugi farmaceutski agensi. Takođe, specifična terapeutski efikasna količina (i/ili jedinična doza) za bilo koju pojedinu pacijent može zavisiti od niza faktora uključujuć i poreme ć aj koji se leči i težinu poremeć aja; aktivnost specifičnog primenjenog farmaceutskog agensa; specifičan sastav koji se koristi; starost, telesna težina, opšte zdravlje, pol i ishrana pacijenta; vreme primene, put primene i/ili brzina izlučivanja ili metabolizma specifičnog korišć enog fuzionog proteina; trajanje lečenja; i slični faktori kao što je dobro poznato u medicinskoj umetnosti.

[0171] U nekim realizacijama, terapeutski efikasna doza se kreće od oko 0,005 mg/kg težine mozga do 500 mg/kg težine mozga, npr. od oko 0,005 mg/kg težine mozga do 400 mg/kg težine mozga, od oko 0,005 mg/kg mozga težine do 300 mg/kg težine mozga, od oko 0,005 mg/kg težine mozga do 200 mg/kg težine mozga, od oko 0,005 mg/kg težine mozga do 100 mg/kg težine mozga, od oko 0,005 mg/kg težine mozga do 90 mg/kg težine mozga, od oko 0,005 mg/kg težine mozga do 80 mg/kg težine mozga, od oko 0,005 mg/kg težine mozga do 70 mg/kg težine mozga, od oko 0,005 mg/kg težine mozga do 60 mg/kg težine mozga, od oko 0,005 mg/kg težine mozga do 50 mg/kg težine mozga, od oko 0,005 mg/kg težine mozga do 40 mg/kg težine mozga, od oko 0,005 mg/kg težine mozga do 30 mg/kg mozga težina, od oko 0,005 mg/kg

2

težine mozga do 25 mg/kg težine mozga, od oko 0,005 mg/kg težine mozga do 20 mg/kg težina mozga, od oko 0,005 mg/kg težine mozga do 15 mg/kg težine mozga, od oko 0,005 mg/kg težine mozga do 10 mg/kg težine mozga.

[0171] U nekim realizacijama, terapeutski efikasna doza se kreće od oko 0,005 mg/kg težine mozga do 500 mg/kg težine mozga, npr. od oko 0,005 mg/kg težine mozga do 400 mg/kg težine mozga, od oko 0,005 mg/kg mozga težine do 300 mg/kg težine mozga, od oko 0,005 mg/kg težine mozga do 200 mg/kg težine mozga, od oko 0,005 mg/kg težine mozga do 100 mg/kg težine mozga, od oko 0,005 mg/kg težine mozga do 90 mg/kg težine mozga, od oko 0,005 mg/kg težine mozga do 80 mg/kg težine mozga, od oko 0,005 mg/kg težine mozga do 70 mg/kg težine mozga, od oko 0,005 mg/kg težine mozga do 60 mg/kg težine mozga, od oko 0,005 mg/kg težine mozga do 50 mg/kg težine mozga, od oko 0,005 mg/kg težine mozga do 40 mg/kg težine mozga, od oko 0,005 mg/kg težine mozga do 30 mg/kg mozga težina, od oko 0,005 mg/kg težine mozga do 25 mg/kg težine mozga, od oko 0,005 mg/kg težine mozga do 20 mg/kg težina mozga, od oko 0,005 mg/kg težine mozga do 15 mg/kg težine mozga, od oko 0,005 mg/kg težine mozga do 10 mg/kg težine mozga.

[0172] U nekim realizacijama, terapeutski efikasna doza je već a od oko 0,1 mg/kg težine mozga, ve ć a od oko 0,5 mg/kg težine mozga, već e od oko 1,0 mg/kg težine mozga, ve ć e od oko 3 mg/kg težine mozga, veći od oko 5 mg/kg težine mozga, veći od oko 10 mg/kg težine mozga, veći od oko 15 mg/kg mozga težina, već a od oko 20 mg/kg težine mozga, ve ć a od oko 30 mg/kg težine mozga, ve ć a od oko 40 mg/kg težine mozga, već e od oko 50 mg/kg težine mozga, ve ć e od oko 60 mg/kg težine mozga, ve ć e od oko 70 mg/kg težine mozga, već e od oko 80 mg/kg težine mozga, ve ć e od oko 90 mg/kg težine mozga, ve ć a od oko 100 mg/kg težine mozga, već a od oko 150 mg/kg težine mozga, ve ć a od oko 200 mg/kg težina mozga, veća od oko 250 mg/kg težine mozga, veća od oko 300 mg/kg težine mozga, veća od oko 350 mg/kg težine mozga, već e od oko 400 mg/kg težine mozga, ve ć e od oko 450 mg/kg težine mozga, ve ć e od oko 500 mg/kg težine mozga.

[0173] U nekim realizacijama, terapeutski efikasna doza takođe može biti definisana mg/kg telesne težine. Kao jedno Stručnjak u ovoj oblasti bi cenio, težine mozga i telesne težine mogu biti u korelaciji. Dekaban AS. "Promene u težine mozga tokom trajanja ljudskog života: odnos težine mozga sa visinom i telesnom težinom", Ann Neurol 1978; 4:345-56. Stoga, u nekim realizacijama, doze se mogu konvertovati kao što je prikazano u Tabeli 5.

TABELA 5

[0174] U nekim realizacijama, terapeutski efikasna doza takođe može biti definisana kao mg/15 cc CSF. Stručnjak u ovoj oblasti ć e ceniti, terapeutski efikasne doze zasnovane na te žini mozga i telesnoj težini mogu biti pretvoreno u mg/15 cc CSF. Na primer, zapremina CSF kod odraslih ljudi je pribli žno 150 mL (Johanson CE, et al. „Mnogostrukost funkcija cerebrospinalne tečnosti: novi izazovi u zdravlju i bolesti“, Cerebrospinal Fluid Res. 200814. maj; 5:10). Prema tome, pojedinačna doza injekcija od 0,1 mg do 50 mg proteina odraslima bi bila približno 0,01 mg/15 cc CSF (0,1 mg) do 5,0 mg/15 cc CSF (50 mg) doze kod odraslih.

[0175] Dalje treba razumeti da za bilo kog određenog subjekta, specifični režimi doziranja treba da se podese preko vreme prema individualnim potrebama i profesionalnoj proceni lica koje upravlja ili nadgleda primena terapije zamene enzima i da su ovde navedeni rasponi doza samo primeri.

Kompleti

[0176] Dalje su obezbeđeni kompleti ili drugi proizvodni artikli koji sadrže formulaciju za upotrebu prema prema ovom pronalasku i daju uputstva za njegovu rekonstituciju (ako je liofilizovana) i/ili upotrebu. Kompleti ili drugi artikli od proizvodnja može uključivati kontejner, IDDD, kateter i sve druge artikle, uređaje ili opremu korisne u intertekalna administracija i pridru žena hirurgija. Odgovarajuć i kontejneri uključuju, na primer, boce, bočice, špriceve (npr. napunjeni špricevi), ampule, kertridži, rezervoari ili liojekti. Kontejner se može formirati od različitih materijala kao što su staklo ili plastika. U nekim

2

realizacijama, kontejner je unapred napunjen špric. Odgovarajuć i napunjeni špricevi uključuju, ali nisu ograničeni na, špricevi od borosilikatnog stakla sa pečenim silikonskim premazom, špricevi od borosilikatnog stakla sa prskanim silikonski, ili plastični špricevi od smole bez silikona.

[0177] Tipično, kontejner može da sadrži formulacije i etiketu na, ili povezanu sa kontejnerom koji mo že navesti uputstva za rekonstituciju i/ili upotrebu. Na primer, etiketa mo že ukazivati da je formulacija rekonstituisana na koncentracije proteina kao što je gore opisano. Oznaka može dalje da ukazuje na to da je formulacija korisna ili namenjena za, na primer, IT administraciju. U nekim realizacijama, kontejner može da sadrži jednu dozu fiziološkog rastvora ili pufera- bazirana formulacija koja sadrži terapeutsko sredstvo (zamena ASA enzima). U različitim realizacijama, jedna doza formulacije na bazi fiziolo škog rastvora ili pufera je prisutna u zapremini manjoj od oko 15 ml, 10 ml, 5,0 ml, 4,0 ml, 3,5 ml, 3,0 ml, 2,5 ml, 2,0 ml, 1,5 ml, 1,0 ml ili 0,5 ml. Alternativno, kontejner u kome se nalazi formulacija može biti višenamenska bočica, što omoguć ava ponovljene administracije (npr. od 2-6 administracija) formulacije. Kompleti ili drugi proizvodni artikli može dalje da sadrži drugi kontejner koji sadrži odgovarajuć i razblaživač (npr. BVFI, fiziološki rastvor, puferovani slani rastvor). Na mešanjem razblaživača i formulacije, konačna koncentracija proteina u rekonstituisanoj formulaciji ć e generalno biti najmanje 1 mg/ml (npr. najmanje 5 mg/ml, najmanje 10 mg/ml, najmanje 25 mg/ml, najmanje 50 mg/ml, najmanje 75 mg/ml, na najmanje 100 mg/ml). Kompleti ili drugi proizvodni artikli mogu dalje uključivati druge materijale poželjne iz reklame i stanovište korisnika, uključujuć i druge pufere, razblaživače, filtere, igle, IDDD, katetere, špriceve i umetke za pakovanja sa uputstvom za upotrebu.

[0178] Pronalazak će biti potpunije shvaćen pozivanjem na sledeće primere. Oni, međutim, ne bi trebalo da može se tumačiti kao ograničavajuć i obim pronalaska.

PRIMERI

PRIMJER 1: TOKSIKOLOGIJA PRIMJENE ARILSULFATAZA A

[0179] Da se proceni sposobnost drugih rekombinantnih enzima koji se primenjuju intratekalno da se distribuiraju u ćelije I tkiva CNS-a, GLP studija je sprovedena da bi se procenila ponovljena intratekalna (IT) primena rekombinantno pripremljenih humana arilsulfataza A (rhASA) iz toksikolo ške i bezbednosne farmakološke perspektive tokom jednog meseca period kod juvenilnih (manje od 12 meseci starosti) cinomolgus majmuna. Formulacija rhASA je pripremljena I formulisan u nosaču od 154 mM NaCl, 0,005% polisorbata 20 pri pH od 6,0.

[0180] Da bi se ovo postiglo, devet mužjaka i devet ženki maloletnih cinomolgus majmuna nasumično je dodeljeno po telu težine jednoj od tri grupe za tretman kao što je prikazano u sledeć oj tabeli 6. Životinje (sa izuzetkom 1 mužjaka životinja za dozu 1) primila je 0,6 mL kratkotrajne IT infuzije od 0, 3 ili 31 mg/mL rhASA (ukupna doza od 0, 1,8 ili 18,6 mg) svake druge nedelje za ukupno tri doze po životinji. Telesna težina, klinička posmatranja, neurološka i fizička prać eni su pregledi, klinička patologija, oftalmološki pregledi i toksikokinetičko uzorkovanje. Sve od životinje su podvrgnute nekropsiji 29., 30. ili 31. dana (•24 sata nakon poslednje IT doze). Odabrana tkiva su sakupljena, sačuvana i mikroskopski pregledan.

TABELA 6

[0181] Koncentracije rhASA detektovane u CNS tkivima cynomolgus majmuna su analizirane ELISA-om i u poređenju sa terapijskim ciljem od 10% normalne koncentracije rhASA kod ljudi, što odgovara približno 2,5 ng/mg tkiva. Uzorci tkiva ili udarci su ekstrahovani iz različitih oblasti mozga cinomolgusa majmuna i dalje analiziran na prisustvo rhASA. Slika 24 ilustruje tkiva od kojih su napravljeni udarci izvu čeni. Probušeni uzorci tkiva odražavaju poveć anje koncentracije rhASA, kao što je prikazano na slikama 25A-G, sa gradijentom taloženja od cerebralnog korteksa do duboke bele materije i duboke sive materije.

2

[0182] Koncentracije rhASA detektovane korišćenjem istog udarca sa oba IT i ICV načina davanja za šest majmuna kojima je primenjena doza rhASA od 18,6 mg, ilustrovane su na slikama. 26A-B. Koncentracije rhASA otkrivena u dubokoj beloj materiji (Slika 25A) iu dubokoj sivoj materiji (Slika 26B) mo ždanim tkivima odraslih I juvenilni cinomolgus majmuni koji su intratekalno (IT) ili intracerebroventrikularno (ICV) primali rhASA bili su uporedivi.

[0183] Uzorci izbušenog tkiva ekstrahovani iz mozga odraslih i maloletnih cinomolgus majmuna su zatim analizirane da bi se odredile koncentracije rhASA deponovane u ekstrahovanom uzorku tkiva i da bi se uporedile koncentracije do terapijske ciljne koncentracije od 2,5 ng rhASA po mg proteina ( što odgovara 10% od normalna koncentracija rhASA kod zdravog subjekta). Kao što je ilustrovano na Slici 27A, u svakom analiziranom uzorku tkiva doza od 18,6 mg rhASA primenjene IT dovela je do koncentracije rhASA koja je premašila ciljnu terapijsku koncentracija od 2,5 ng/mg proteina. Slično, kada je doza od 1,8 mg rhASA IT-primenjena mladom cinomolgusu majmuna, svaki analizirani uzorak tkiva pokazao je koncentraciju rhASA unutar ili iznad terapeutska koncentracija od 2,5 ng/mg proteina i srednja koncentracija rhASA bila je iznad terapijskih meta za sve testirane udarce tkiva (Slika 27B).

[0184] Da bi se utvrdilo da li se rhASA primenjena IT distribuira relevantnim ćelijama, analizirano je tkivo iz duboka bela materija majmuna cinomolgus koji je IT-primenjen 1,8 mg ASA, iz oblasti ilustrovane na slici 28A. Imunološko bojenje dubokog tkiva bele materije otkrilo je distribuciju rhASA kod cinomolgus majmuna u oligodendrocitima ć elije, kao što je ilustrovano na Slici 28B. Slično, slika 28C ilustruje da je rhrASA koju je administrirao IT pokazao ko-lokalizacija u dubokim tkivima bele materije cinomolgus majmuna. Konkretno, pod kolokalizacijom bojenja u ciljnim organelama, kao što je lizozom, je evidentno (Slika 28C), što podržava zaključak da je rhASA primenjena IT je sposoban da se distribuira u relevantne ć elije, tkiva i organele CNS-a, uključuju ć i lizozome oligodendrocita. Prethodno navedeno ide u prilog zaključku da je utvrđena i razlika između ICV i IT isporuke minimalno za isporuku rhASA.

PRIMER 2: BIODISTRIBUCIJA SA RADIO OBELEŽENIM PROTEINOM

[0185] rhASA obeležena pozitronskim emiterom 124I je pripremljena i formulisana u vehiklu od 154 mM NaCl, 0,005% polisorbat 20 pri pH od 6,0. Zapremina formulacije je ekvivalentna 3 mg rhASA (što odgovara približno 38 mg/kg mozga) je dato odraslim majmunima cinomolgus preko intracerebroventrikularnog (ICV) i intratekalnog (IT) putevi primene. Cinomolgus majmuni su bili predmet studija PET skeniranja visoke rezolucije (microPET P4) za određivanje distribucije primenjene rhASA obeležene sa 124I.

[0186] Podaci o PET imidžingu (Slika 29) ilustruju da rhASA označena sa 124I efektivno daje i ICV i IT. distribuiraju u tkiva CNS-a, a posebno rhASA označenu sa 124I koja se primenjuje preko IT-lumbalnog katetera odmah i ravnomerno rasprostranjena u cerebrospinalnoj te čnosti (CSF) po dužini kičme. Konkretno, kao što je prikazano na Sl. 29, nakon primene ICV-a i IT-a, terapijske koncentracije rhASA obeležene sa 124I su otkrivene u CNS tkiva majmuna cinomolgus, uključujuć i mozak, kičmenu moždinu i CSF. Koncentracije rhASA otkrivena u takvim CNS tkivima, a posebno u tkivima mozga, prema šila je terapeutsku ciljnu koncentraciju od 2,5 ng/mg proteina.

[0187] Dok je distribucija rhASA proteina bila uporediva i za IT i za ICV put davanja, ICV je rezultirao u znatno manjem taloženju unutar kičmenog stuba, kao što pokazuje Slika 29.

[0188] Dvadeset četiri sata nakon primene formulacije, 124I-obeležene i ICV- i IT-primenjene ASA se efikasno distribuira u tkiva CNS-a. Konkretno, dvadeset četiri sata nakon IT administracije 12,4% primenjene doze je bilo u predelu lobanje, u poređenju sa 16,7% doze primenjene ICV. Shodno tome, the koncentracije rhASA otkrivene u takvim CNS tkivima, a posebno u tkivima mozga, kada je rhASA primenjeni IT približio se onim koncentracijama otkrivenim nakon primene iste doze ICV.

[0189] ICV injekcija 124I-obeleženog rhASA rezultira Injekcija ICV rezultira trenutnim prenosom ubrizganog zapremine do cisterne magna, cisterne pontis, cisterne interpeduncularis i proksimalne ki čme, kao što je ilustrovano na slici 30. Kao što je takođe ilustrovano na slici 30, u roku od 2-5 sati IT administracija je isporučila rhASA označenu sa 124I istom početnom odeljke (cisterne i proksimalni deo kičme) kao što je prikazano za primenu ICV. Dvadeset četiri sata nakon obe isporuke ICV i IT administracije rhASA ozna čene sa 124I bila je uporediva, kao što je ilustrovano na slici 31. Shodno tome, za razliku od lekova sa malim molekulima, prethodni rezultati sugerišu da ICV-primena nudi minimalne prednosti u odnosu na IT-administracija rhASA.

[0190] Ovi rezultati potvrđuju da rhASA može biti isporučena subjektu koristeć i manje invazivni IT put administracije i time postižu terapeutske koncentracije u ciljnim ć elijama i tkivima.

[0191] Lizozomske bolesti skladištenja predstavljaju porodicu genetskih poremeć aja uzrokovanih nedostajuć im ili defektnim enzimima koje rezultiraju abnormalnom akumulacijom supstrata. Dok se periferni simptomi povezani sa nekoliko od ovih bolesti mogu efikasno ublažiti intravenskom primenom rekombinantnih enzima, ne očekuje se da će intravenska primena takvih rekombinantnih enzima značajno uticati na CNS manifestacije povezane sa većinom od lizozomalne bolesti skladištenja. Na primer, rekombinantna humana iduronat-2-sulfataza (idursulfaza, Elaprase®; Shire Human Genetic Therapies, Inc. Lekington, MA) je odobren za lečenje somatskih simptoma Huntera sindrom, ali ne postoji farmakolo ška terapija za lečenje neuroloških manifestacija koje mogu uključivati odložen razvoj i progresivna mentalna ošteć enja. Ovo je delimično zbog prirode I2S, koji je veliki, visokoglikoziliran enzim sa molekulskom težinom od približno 76 kD i koji ne prolazi kroz krvno-moždanu barijeru nakon intravenske primene.

[0192] Sadašnji pronalazači su stoga preduzeli program za istraživanje intratekalne (IT) isporuke intratekalnog formulacije rekombinantnih humanih enzima, kao što su, na primer, iduronat-2-sulfataza (I2S), arilsulfataza A (rhASA) i alfa-N-acetilglukozaminidaza (Naglu). Rezultati koji su ovde predstavljeni su prvi koji pokazuju da IT-lumbalna primena rekombinantnih lizozomalnih proteina dovodi do isporuke značajnog dela davanja proteina u mozak i posebno rezultiraju široko rasprostranjenim taloženjem takvih proteina u neuronima mozga i kičmene moždine i kod majmuna i kod pasa cinomolgus. Imunohistohemijske analize CNS tkiva su pokazale da je protein usmeren na lizozom, mesto patolo ške akumulacije glikozaminoglikana u poremeć aji skladištenja lizozoma. Štaviše, morfološka poboljšanja demonstrirana u IKO modelu miša Hunterov sindrom, model miša sa nedostatkom Naglu-a, Sanfilippo sindrom tipa B, i ASA nokaut model miša metahromatske leukodistropije (MLD) pojačava zapažanje da se enzim koji se primenjuje IT distribuira u odgovarajuća tkiva i transportuju u odgovarajuće ćelijske odeljke i organele.

[0193] Sličnosti uočene u obrascima distribucije u mozgu otkrivenim nakon IT-lumbalne i ICV primene I2S ukazuje na masovni protok i aktivno remiksovanje CSF. Dakle, u kliničkom okruženju, i IT i ICV administracija putevi su potencijalno izvodljivi, međutim, primeć eno taloženje I2S u kičmenoj moždini nakon IT administracije pruža jasnu prednost u rešavanju kičmenih posledica i komponenti lizozomalnih bolesti skladištenja kao što su Hunter sindrom. Štaviše, portovi za injekcije u kičmu su manje invazivni i očekuje se da ć e biti pogodniji za hroničnu upotrebu, posebno kod pedijatrijskih predmeta.

[0194] Dokazi iz perivaskularnog bojenja ć elija i dinamike translokacije proteina uo čene od strane prethodnog PET-a Studije imidžinga pokazuju da se enzim kreć e unutar perivaskularnog prostora, verovatno konvektivnim pomoć u pulsacije mehanizama. Dodatni mehanizam transporta sugeri še uočena povezanost I2S sa neurofilamentima, ukazuje na aktivni transport aksona. Ovo poslednje po činje verovatno interakcijom proteina sa neuronskim manoza-6 fosfatom (M6P) receptori, koji su široko eksprimirani na ć elijama kičmene moždine i mozga i koji se direktno primena moždanog parenhima može dovesti do toga da ciljne ć elije lako apsorbuju enzim I2S. (Beglei, et al., Curr Pharm Des (2008) 14: 1566-1580).

[0195] Dok se aksonski transport lizozomalnih enzima ranije podrazumevao indirektnim metodama in vivo i snimanje in vitro, trenutne studije pružaju prve direktne dokaze o aksonskom transportu nevirusnih ili ekspresiranih enzimi koji se isporučuju preko CSF. Dakle, isporuka proteina iz CSF do površine mozga i dublje u mozak izgleda da tkiva zavise od aktivnih procesa prenosa, od kojih nijedan nije prethodno opisan ili razjašnjen dostava proteina ili enzima u ćelije, tkiva i organele mozga.

[0196] Suprotno preovlađujuć em stanovištu da bi dinamika protoka intersticijuma parenhima i CSF-a sprečavaju distribuciju proteina koji se daju IT-lumbalom u belu materiju mozga, jasno je u ovom trenutku pokazuju da IT isporuka lizozomalnog enzima dovodi do distribucije i akumulacije proteina u svim moždanim tkivima i taloženje u lizozomskom odeljku ciljnih ć elija koje su mesto patološke akumulacije glikozaminoglikana. (Vidi, npr., Fenstermacher et al., Ann N I Acad Sci (1988) 531:29-39 i DiChiro et al., Neurologi (1976) 26:1-8.) Zajedno sa manje invazivnom prirodom IT-lumbalnog porođaja, ovaj put nudi klinički relevantan način isporuku bioloških terapijskih sredstava u mozak, posebno kod dece.

PRIMJER 3: FORMULACIJE ARILSULFATAZA A ZA PRIMJENU IT

[0197] Ovaj primer sumira rad na uspostavljanju tečnog doznog oblika visoke koncentracije rhASA (arilsulfaze A) i formulaciju lekovite supstance i leka za lečenje metahromatske leukodistrofije (MLD) preko intratekalni (IT) način primene.

[0198] Podaci o stabilnosti pokazuju da fiziološka formulacija lekovite supstance i leka (bez PBS 20) je stabilan posle 18 meseci na < -65 stepeni C i 18 meseci na 2-8 stepeni C. Tokom farmaceutskog razvoja ovog proteina, ispitivana je rastvorljivost i stabilnost rhASA pod ograničenim uslovima pufera i ekscipijensa zbog njegovu nameravanu isporuku u CNS. Ranije su sprovedene studije razvoja formulacije za razvoj intravenoznog (IV) formulacija. Na osnovu rezultata ovih eksperimenata, formulacija koja sadr ži 30 mg/ml rhASA u 10 mM citrat-fosfatni pufer, pH 5,5 sa 137 mM NaCl i 0,15% poloksomera 188 je odabran kao olovna

1

IV formulacija. rhASA je takođe formulisana za IT isporuku u tri formulacije, a podaci o stabilnosti za ovaj protein su istraživani pod ove uslove. Korišć ene su partije rhASA dobijene od uzvodnog materijalnog proizvoda na jednom mestu. Rezultati su pokazali da je rhASA bila stabilna u 154 mM rastvoru natrijum hlorida sa 0,005% polisorbata 20 (P20), pH 6,0 tokom najmanje 18 meseci na 2-8 stepeni C. Pored toga, sprovedene su studije kako bi se pokazala stabilnost prema zamrzavanju-odmrzavanje I degradacija izazvana agitacijom.

[0199] Razvojne serije su prečišć ene, ultrafiltrirane i dijafiltrirane (UF/DF) u 10 mM citrat/fosfat, 137 mM NaCl, pH 5,5 sa naknadnim UF/DF u konačni fiziološki rastvor u koncentraciji od približno 40 mg/mL. UF/DF operacije su sumirane u tabeli 7.

TABELA 7: Izabrane formulacije za UF/DF izvedene operacije Xcellerex

rhASA

[0200] rhASA formulisana sa 40 mg/mL rhASA u 10 mM citrat natrijum fosfata sa 137 mM NaCl, pri pH 5,6 je bila dijalizovan u pet formulacija koje su korišć ene za IT preformulacione studije (Tabela 8).

TABELA 8: Odabrani puferi za IT kompatibilni skrining formulacija

Metode

[0201] Za određivanje temperature topljenja (Tm) pomoću diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC), kapilarni DSC mikrokalorimetar (MicroCal) je korišćen pri brzini skeniranja od 60°C/h i temperaturnom opsegu od 10-110°C. Baferske osnovne linije su oduzeti od skeniranja proteina. Skeniranje je normalizovano za koncentraciju proteina u svakom uzorku (mereno apsorbancijom ultraljubi častog zračenja na 280 nm i korišć enjem koeficijenta ekstinkcije od 0,69 (mg/mL)-1.cm-1). Za početno kratkoročni eksperimenti stabilnosti, rhASA lekovita supstanca je bila podvrgnuta ili dve nedelje na 40°C ili mesec dana na Nočʹ u 40°C. Dodatni uzorci su stavljeni na kratkoročnu stabilnost na 2-8 °C tokom 3 meseca. Uzorci su filtrirani (Millipore, P/N SLGV033RS) i alikvoti od 0,5 mL su raspoređeni u 2 mL sa 13 mm Flurotec čepovima.

2

[0202] Uticaj kompozicije formulacije (Tabela 8) na Tm (srednja tačka temperature termički indukuje denaturacija) je ispitivana pomoć u DSC. Vrednosti Tm za različite kompozicije formulacije prikazane su na slici 5. Tm vrednosti su pokazale slične temperature odvijanja za već inu formulacija, osim što su niske vrednosti Tm bile primećeno za rhASA formulisanu ili u 5mM natrijum fosfatu sa 154mM NaCl pri pH 7,0 ili 1mM natrijum fosfatu sa 2mM CaCl2 i 137mM NaCl na pH 7.0.

[0203] Efekat termički izazvane degradacije rhASA u pet odabranih formulacija (Tabela 8) je tako đe istražen. Uzorci su čuvani ili 2 nedelje ili mesec dana na 40 °C ili 3 meseca na 2-8 °C. SDS-PAGE (Coomassie) analiza uzoraka čuvanih 2 nedelje na 40 °C otkrila je fragmentaciju rhASA formulisanog u 5 mM natrijum fosfata sa 154 mM NaCl pri pH 7,0 kao i u 1 mM natrijum fosfatu sa 2 mM CaCl2 i 137 mM NaCl pri pH 7,0 (Slika 6). Takva degradacija nije primeć ena za druge formulacije.

[0204] Prisustvo proizvoda razgradnje je u skladu sa nižim procentom glavnog pika koji je primeć en pomoć u RP-HPLC za iste vremenske tačke (tabela 10). Takođe je prime ć eno da rhASA formulisana u 1 mM PBS sa 2 mM CaCl2 pri pH 7,0 nije održavala pH na početku i nakon kratkotrajnog izlaganja uslovima toplotnog stresa.

[0205] Vaters HPLC sistemi su korišć eni za analizu isključivanja veličine i HPLC analize obrnute faze. Za početni SEC-HPLC analize, 50 mg rhASA je ubrizgano na Agilent Zorbak GF-250 kolonu (4,6 mm k 250 mm) i pokrenuto izokratski pri 0,24 mL/min koristeć i mobilnu fazu od 100 mM natrijum citrata pH 5,5 (detekcija oktomera) sa talasnom dužinom detekcije od 280 nm. Analize su ponovljene korišć enjem uslova mobilne faze od 100 mM natrijum citrata, pH 7,0 (detekcija dimera).

[0206] Sve studije razmene pufera i koncentracije su izvedene kori šć enjem Centricon-Plus 20 (Millipore, 10 kDa MVCO).

Preformulacione skrining studije - Efekat puferskih vrsta i pH

[0207] Zbog ograničenog broja odobrenih kompozicija rastvora koji se koriste za primenu CNS, samo pet izotoničnih kompozicije rastvora, kao što je navedeno u Tabeli 8, su odabrane za skrining.

pH memorija

[0208] Pre izbora pufera za dugoročnu stabilnost, obavljena su dva eksperimenta "pH memorije" da bi se istražila ako je proteinski pufer zamenjen u slani rastvor bio sposoban da odr ži pH originalnog pufera. U početni eksperiment, rhASA na približno 8 mg/mL, prvo je dijalizovan u 10 mM citrat-fosfat sa 137 mM NaCl, na pH vrednosti od 5,5 ili 7,0, nakon čega sledi druga dijaliza u fiziološki rastvor. U drugom eksperimentu, rhASA je dijalizovan u 10 mM citrat-fosfat sa 137 mM NaCl, na bilo pH vrednosti od 5,5 ili 7,0 i zatim pufer zamenjen i koncentrovan u slane rastvore do približno 35 mg/mL.

[0209] Kada je rhASA formulisana u 10 mM citrat-fosfata sa 137 mM NaCl pri pH vrednostima od 5,5 ili 7,0 bila je dijalizovan u slani rastvor, nije primeć eno pove ć ano zamu ć enje. pH kona čnog fiziološkog rastvora bio je sličan pH prethodnog citrat-fosfatnog pufera kome je bio izložen. Kada je rhASA formulisana na bazi citrata-fosfata puferi na pH vrednostima od 5,5 ili pH 7,0 su dijalizovani u fiziolo ški rastvor, a zatim koncentrovani do približno 35 mg/mL korišć enjem Centricon-a, pH fizioloških rastvora proteina se pomerio sa pH 5,5 na 5,8 ili sa pH 7,0 na 6,8, respektivno. Oba koncentrovana rastvora rhASA u fiziološkom rastvoru bila su blago opalescentna i imala su vrednosti OD320 u opsegu od 0,064 (pH 6,8) do 0,080 (pH 5,5).

[0209] Kada je rhASA formulisana u 10 mM citrat-fosfata sa 137 mM NaCl pri pH vrednostima od 5,5 ili 7,0 bila je dijalizovan u slani rastvor, nije primeć eno pove ć ano zamu ć enje. pH kona čnog fiziološkog rastvora bio je sličan pH prethodnog citrat-fosfatnog pufera kome je bio izložen. Kada je rhASA formulisana na bazi citrata-fosfata puferi na pH vrednostima od 5,5 ili pH 7,0 su dijalizovani u fiziolo ški rastvor, a zatim koncentrovani do približno 35 mg/mL korišć enjem Centricon-a, pH fizioloških rastvora proteina se pomerio sa pH 5,5 na 5,8 ili sa pH 7,0 na 6,8, respektivno. Oba koncentrovana rastvora rhASA u fiziološkom rastvoru bila su blago opalescentna i imala su vrednosti OD320 u opsegu od 0,064 (pH 6,8) do 0,080 (pH 5,5).

Izbor pomoć nih supstanci

[0210] Polisorbat 20 (P20) je uključen u svih pet odabranih kompozicija rastvora u konačnoj koncentraciji od 0,005%. Izbor surfaktanta je napravljen na osnovu prethodnog iskustva in vivo podno šljivosti P20 na 0,005% za CNS isporuku drugih proteina Shire. Pripremljen je rastvor 5% P20 (v/v) i svakom proteinu je dodat odgovarajuć i volumen formulaciju da bi se dobila konačna koncentracija od 0,005%.

Studije robusnosti formulacije - Studija stabilnosti

[0211] Na osnovu početnih rezultata dobijenih skriningom različitih pufera i pH vrednosti, tri sastava rastvora su odabrani za dugoročne studije stabilnosti (priprema uzorka kao u tabeli 8. Jednogodi šnja studija je započeta u predložene formulacije (Tabela 9). Uzorci stabilnosti u svakoj vremenskoj tački analizirani su pomoć u SEC-HPLC, RP-HPLC, OD320, koncentracija proteina, pH, specifi čna aktivnost, SDS-PAGE (Coomassie) i izgled.

4

[0212] Za uzorke stresa nije primeć ena značajna promena u specifičnoj aktivnosti (Tabela 10). Analiza po veličini HPLC za isključivanje je otkrio određenu degradaciju za 2 nedelje termički napregnutog uzorka formulisanog u 5 mM natrijum fosfata sa 154 mM NaCl na pH 7,0. Degradacija je bila očiglednija pomoć u SEC-HPLC koristeć i uslove mobilne faze pH 5,5 koji indukuje asocijaciju rhASA na oktamer. Pod ovim uslovima mobilne faze, rhASA je formulisana na pH 7,0 u 1mM PBS sa 2mM CaCl2 takođe je pokazao značajnu degradaciju.

[0213] Posle izlaganja 1 mesec na 40°C, uzorci formulisani u 5mM PBS, pH 7,0 i 1mM PBS, pH 7,0 sa 2 mM CaCl2 pokazali su fragmentaciju pomoću SDS-PAGE (podaci nisu prikazani). U skladu sa ovim zapažanjem, smanjenje procenta glavnog pika je takođe primeć eno pomo ć u RP-HPLC i SEC-HPLC za uzorke uskladištene u ove dve formulacije pH 7 (Tabela 11). Smanjenje specifične aktivnosti, međutim, primeć eno je samo za rhASA formulisanu u 5 mM PBS, pH 7,0.

[0214] Posle 3 meseca skladištenja na 2-8°C, rhASA je zadržala svoju aktivnost u svim formulacijama (Tabela 12). Pored toga, rhASA održava >99,8% svoje glavne površine pika kako je procenjeno pomoću SEC-HPLC u oba uslova mobilne faze. Stabilnost podaci za 3 meseca na 2-8°C su sumirani u tabeli 12.

TABELA 12: STABILNOST ODABRANIH IT PUFERA NAKON 3 MESECA NA 2-8°C

[0215] RhASA formulisana u fiziološkom rastvoru, pH 7,0 i 1 mM PBS, pH 7,0 sa 2 mM CaCl2 takođe je procenjena nakon 3 meseci skladištenja na ubrzanom stanju od 25°C. Kao što je prikazano na slici 7, rhASA prolazi kroz malu količinu fragmentacije u ovim formulacijama (sa intenzitetom pribli žno intenzitetom od 0,5% BSA nečistoć e).

[0216] Zajedno, studije preformulacije su pokazale da se stabilnost rhASA održava na pH vrednostima u opseg od 5,5 do 6,0. U svim studijama koje su koristile rastvore formulacije na pH 7,0, rhASA je pokazala fragmentaciju kao jedan njegovih puteva degradacije. Rezultati termi čkog stresa dobijeni za kandidate za IT formulaciju pri pH 7,0 bili su slični na rezultate termičkog stresa dobijene za IV formulacije (10 mM natrijum citrat-fosfat sa 137 mM NaCl) na pH 7,0, gde je takođe primeć ena fragmentacija. Na osnovu ovih studija, tri sledeć e formulacije, kao u tabeli 9, odabrani su za dugoročne studije stabilnosti.

Studije zamrzavanja-odmrzavanja

[0217] Eksperimenti zamrzavanja-odmrzavanja su sprovedeni izvođenjem tri ciklusa kontrolisanog zamrzavanja-odmrzavanja, od ambijentalnog do -50°C na 0,1°C/min na policama Vertis Genesis 35EL liofilizatora. Formulisani alikvoti od jednog mL lekovite supstance na 30 mg/mL u svakoj od pet kompozicija rastvora (Tabela 8) su raspoređeni u staklene bočice od 3 mL za ovu studiju.

[0218] Supstanca leka (386 4 mg/mL) je korišć ena za sve studije zamrzavanja-odmrzavanja. Za zamrzavanje sa kontrolisanom stopom malog obima- eksperimentima odmrzavanja, alikvoti od 2 mL lekovite supstance su raspoređeni u staklene bočice od 5 mL sa 20 mm Flurotec čepovima. Eksperimenti sa stresom smrzavanja i odmrzavanja su sprovedeni ili na policama Virtis Genesis 35EL liofilizatora ili na police zamrzivača sa kontrolisanom brzinom (Tennei Jr Upright Test Chamber, Model: TUJR-A-VERV). Tri ciklusa zamrzavanja do -50°C i odmrzavanje na 25°C obavljeno je bilo pri brzini smrzavanja i odmrzavanja od 0,1°C/min (koristeći kontrolisanu brzinu zamrzavanja) ili brzinom smrzavanja od 0,1°C/min i brzinom odmrzavanja od 0,03°C/min (koristeć i liofilizator). Za masovne studije zamrzavanja-odmrzavanja, 90 mL lekovite supstance je stavljen u polikarbonatne boce od 250 mL. Za studije zamrzavanja-odmrzavanja na suvom ledu, 3 mL lekovita supstanca je stavljena u bočice od 5 mL polikarbonata (Biotainer P/N 3500-05) sa i bez polipropilena zatvarači. Uzorci su zamrznuti preko noć i na ≤ -65°C, a zatim stavljen na suvi led u zatvorenoj kanti. Za ove eksperimentima, staklene bočice sa čepom koje sadrže istu zapreminu uzorka su korišć ene kao kontrola studije. Za zamrzavanje-odmrzavanje studije razblažene lekovite supstance, alikvoti od 1 mL od 1 i 5 mg/mL su raspoređeni u polipropilenske epruvete od 2 mL i zamrznuti su na ≤ -65°C. Zamrznuti uzorci su naknadno odmrznuti na klupi. Ciklus se ponovio do 10 puta da bi se imitirao potencijalni stres koji se može pojaviti pri rukovanju referentnim standardnim alikvotima.

[0219] Određen je efekat zamrzavanja-odmrzavanja na kvalitet rhASA u predloženim formulacijama sa 0,005% P20 nakon 3 ciklusa kontrolisanog zamrzavanja i odmrzavanja (0,1°C/min). Nije primeć ena promena u izgledu rhASA i nisu identifikovani rastvorljivi agregati ili degradanti kori šć enjem SEC ili RP-HPLC metoda. Dodatno, ne trake fragmentacije ili agregacije su prime ćene u smanjenoj SDS-PAGE analizi (podaci nisu prikazani). Tabela 13 sumira rezultate ovih studija.

TABELA 13: Uticaj zamrzavanja-odmrzavanja malih razmera na kvalitet supstance leka rhASA

[0220] Rezultati studija malog obima kontrolisane brzine zamrzavanja-odmrzavanja izvedene u tri primerka na alikvotima od 2 mL lekovite supstance su sažete u tabeli 14. Nije primeć ena promena u kvalitetu lekovite supstance. Pojava smrznute i odmrznute lekovite supstance bilo je uporedivo sa izgledom osnovnog uzorka. Ne primeć eno je smanjenje koncentracije proteina ili čisto ć e materijala.

TABELA 14: EFEKAT ZAMRZAVANJA-ODmrzavanja MALIH RAZMERA NA KVALITET RHASA LEKOVE

SUPSTANCE

[0221] Svi eksperimenti su pokazali da rhASA zadržava svoje atribute kvaliteta nakon zamrzavanjaodmrzavanja. Trebalo bi pribeležiti da je primeć en mali trend smanjenja aktivnosti i procenta obrnute faze glavnog pika za 1 mg/mL rhASA uzorci nakon deset ciklusa zamrzavanja-odmrzavanja kao što je prikazano u tabeli 15.

TABELA 15: EFEKAT ZAMRZAVANJA-ODmrzavanja malih razmjera NA RHASA LJEKOVE SUPSTANCE

RAZREĐENU NA 1 MG/ML

Studije agitacije

[0222] Alikvoti od 1,0 mL sterilnog filtriranog proteina formulisanog sa 30 mg/mL u svakoj od pet odabranih kompozicija rastvora (Tabela 8) sa P20 su raspoređeni u staklene bočice od 3 mL sa 13 mm Flurotec čepovima. Bočice su stavljene na njihovu stranu na Labline orbital shaker i mu ćkati 24 sata na 100 o/min. Postavka je zatim povećana na 200 o/min za sledeće Period protresanja 24 sata.

[0223] Da bi se procenila osetljivost rhASA na agitaciju, studije protresanja i me šanja su sprovedene za oba lekovita supstanca i lek u koncentracijama od 35,4 i 30 mg/mL, respektivno. Za ove studije, 1,0 mL alikvoti lekovite supstance su raspoređeni u staklene bočice od 3 mL sa 13 mm Flurotec čepom. Uzburkane bočice su bile pregledati svaki drugi sat prvih 8 sati, a zatim u 24 i 48 sati. Bočice su prvo uklonjene znak oblačnosti i analizira. Izgled uzoraka je dokumentovan i uzorci su analizirani kori šćenjem pH, SEC-HPLC, specifična aktivnost i OD320. Studije mešanja leka su sprovedene u tri primerka (u 154 mM NaCl, pH 6,0 sa 0,005% P20) i upoređen sa jednom replikom lekovite supstance (u 154 mM NaCl, pH 6,0). Shaking studije su takođe ponovljene bez uključivanja P20 u fiziološku formulaciju. Za ove studije, alikvoti od 1 mL ili 3 mL leka od 30 mg/mL su raspoređeni u bočice od 3 mL da bi se ispitao efekat muć kanja, kao i prostor oko glave obim o kvalitetu rhASA. Za ove studije protresanja korišć ena je brzina od 220 o/min.

[0224] Inicijalne studije protresanja rhASA za IV studije razvoja formulacije koje su sprovedene pokazale su potencijal prednost za prisustvo surfaktanta. Za razvoj IT formulacije odabrano je i uklju čeno 0,005% P20 formulacije za studije potresanja. Nakon 15-24 sata muć kanja na 100 obrtaja u minuti, nisu primeć ene nikakve vizuelne promene za bilo koji formulacija i brzina mu ć kanja je pove ć ana na 200 rpm. Nema promene u izgledu potresenog uzoraka u predloženim formulacijama kandidata posmatrano je nakon ukupno 48 sati mućkanja na 100 i 200 o/min. Uzorci su analizirani nakon ovog perioda i rezultati su sumirani u tabeli 16. Nisu uočene nikakve promene. bilo kojim od testova. SDS-PAGE Coomassie takođe nije pokazao nikakve dodatne trake visoke ili niske molekularne težine za potreseni uzorci (podaci nisu prikazani).

TABELA 16: REZULTATI STUDIJA MUĆKANJA IZABRANIH FORMULACIJA

[0225] Nije primećena promena u izgledu lekovite supstance (u 154 mM NaCl pri pH 6,0) ili proizvoda leka (u 154 mM NaCl, pH 6,0, sa 0,005 % P20) tokom prva 4 sata mešanja. Posle 6 sati mešanja, i lekovita supstanca i lek su postali blago zamućeni (podaci nisu prikazani). Zamućenost je bila izraženija nakon 48 sati mešanja kada u formulaciji nije bilo P20. Pored toga, lekovita supstanca i lek koji su bili izlo ženi mućenju postali su mutni nakon 24 sata. Slika 8 pokazuje zapažanja agitacije nakon 48 sati.

[0226] Tabela 17 i Tabela 18 sumiraju zapažanja studije agitacije.

TABELA 17: IZGLED RHASA LEKOVE SUPSTANCE I LEKOVA (SA P20) NAKON MEŠANJA

TABELA 18:IZGLED RHASA LEKOVE SUPSTANCE I LEKOVA (SA P20) NAKON MUĆKANJA

[0227] Uzorci pod pritiskom su takođe analizirani pomoću OD320, pH, specifične aktivnosti, RP-HPLC i SEC-HPLC. Rezultati su predstavljeni u Tabeli 19 i Tabeli 20. Sve u svemu, nije primećena značajna promena u kvalitetu rhASA nakon mešanja i mućkanja, sa izuzetkom izgleda.

TABELA 19:EFEKAT 48 ČASOVNOG MUĆKANJA NA SUPSTANCE LEKOVA I PROIZVODE LEKOVA

[0228] Nakon mešanja leka nakon 6 sati, sa 0,005 % P20, jedan od tri uzorka je postao mutan. Ovaj uzorak je uklonjen, a druga dva uzorka su mešana do 48 sati. Tabela 20 pokazuje prosečne podatke za duple uzorke.

4

TABELA 20: EFEKAT 48 SATI MEŠANJA NA SUPSTANCE LEKOVA I PROIZVODE LEKOVA

[0229] Na osnovu rezultata i vizuelnih zapažanja, lekovita supstanca i proizvod leka nisu lako podložni razgradnji izazvanoj agitacijom, jer je bilo potrebno ~4 sata neprekidnog me šanja (pri podešavanju broj 5) i 8 sati neprekidnog snažnog mućkanja (na 220 rpm) da bi došlo do promene izgleda.

[0230] Studije mućkanja su ponovljene sa proizvodom leka u odsustvu P20. Za ove studije, svaka bočica je napunjena sa 1 mL ili 3 mL leka kako bi se istražio efekat mućkanja, kao i zapremina prostora u glavi na kvalitet rhASA. Za 1 mL punjenja u bočicama od 3 mL, nije primećena promena u izgledu leka tokom 8 sati mućkanja na 220 rpm (n=2, podaci nisu prikazani). Bočice bez prostora za glavu (n=1) su pokazale stvaranje malih pahuljica, nekoliko vlakana i flokulantne materije br že u poređenju sa bočicama sa većim prostorom za glavu. Posmatranja u trajanju od 48 sati prikazana su na slici 9.

[0231] Vizuelni rezultati su takođe sumirani u Tabeli 21 i Tabeli 22.

TABELA 21: IZGLED LEKOVA U ODSUSTVU POLISORBATA 20 NAKON 48 SATI MUĆKANJA SA 1 ML

PUNJENJA U BOČICI OD 3 ML

TABELA 22: IZGLED LEKOVA U ODSUSTVU POLISORBATA 20 NAKON 48 SATI MUĆKANJA SA 3 ML

PUNJENJA U BOČICI OD 3 ML

TABELA 23: REZULTATI 48 SATI MUĆKANJA LEKOVA U ODSUSTVU POLISORBATA 20 SA 1 ML PUNJENJEM

BOČICE OD 3 ML

TABELA 24: REZULTATI 48 SATI MUĆKANJA LEKOVA U ODSUSTVU POLISORBATA 20 SA 3 ML PUNJENJEM

BOČICE OD 3 ML

Studije puferskog kapaciteta

[0232] Za određivanje puferskog kapaciteta rhASA, proizvod je titriran u tri primerka, bilo sa razbla ženom kiselinom ili razblaženom bazom. Alikvoti od 10 mL lekovite supstance sa 38 ili 30 mg/mL (poslednji da bi oponašali lek) su stavljeni u staklenu bočicu od 20 mL u koju je dodata šipka za mikro mešanje. Alikvoti od 1 mL 1N hlorovodonične kiseline (HCl) su dodati u rastvor proteina, sadržaj je pomešan i pH je zabeležen. Eksperiment je nastavljen dodavanjem 1 uL HCl, bez ispiranja pH sonde između merenja da bi se izbeglo bilo kakvo razblaživanje, sve dok se ne postigne približni pH od 5,5. Eksperiment je izveden u tri primerka i 5 mM fosfatnog pufera koji sadrži 150 mM natrijum hlorida, pH 6,0, titriran je jedan pored drugog radi poređenja. Slično, lekovita supstanca u obe koncentracije je titrirana sa 1M natrijum hidroksidom (NaOH) dok se ne postigne konačni pH od približno 6,5. Da bi se istražilo prisustvo bilo kakvog rezidualnog fosfata u rhASA, lekovita supstanca je analizirana induktivno spregnutom plazma masenom spektroskopijom (ICP-MS). Kapacitet pufera razblažene rhASA lekovite supstance je takođe istražen da bi se osiguralo da se pH vrednost rastvora ne promeni pri razblaženju proteinskog rastvora. Razblaženi uzorci u rasponu od 30 mg/mL do 1 mg/mL pripremljeni su u ependorfovim epruvetama od 1,5 mL, a pH vrednosti su merene na početku razblaživanja i posle jedne nedelje čuvanja na 2-8°C.

[0233] Rezultati studija titracije razblažene kiseline i razblažene baze pokazali su adekvatan puferski kapacitet rastvora rhASA. Za studije titracije korišćenjem HCl, u početku dodavanje približno 2 mL 1 M kiseline nije promenilo pH ni lekovite supstance ni kontrole pufera. Međutim, povećanje zapremine kiseline pokazalo je dramatičan pad pH pufera u poređenju sa rhASA lekovitom supstancom. Nakon dodavanja 13 mL 19 M HCl, pH kontrole pufera je bio za više od 2 pH jedinice niži od pH supstance leka. Koncentracija lekovite supstance od 30 mg/mL je takođe uključena u ovaj eksperiment da bi se oponašala koncentracija leka. Slika 10 ilustruje kapacitet pufera rhASA lekovite supstance u pore đenju sa 5 mM natrijum fosfatnim puferom, pH 6,3 sa 150 mM natrijum hlorida kada se titrira kiselinom.

[0234] Titracija lekovite supstance rhASA sa natrijum hidroksidom pokazala je relativno različite rezultate (Slika 11) u pogledu održavanja pH. Brzina promene pH se nije značajno razlikovala između lekovite supstance i kontrole pufera.

[0235] Na osnovu uočenih rezultata, i bez želje da budemo vezani bilo kakvom teorijom, verovatno je da rhASA doprinosi puferskom kapacitetu rastvora pošto asparaginska kiselina, glutaminska kiselina i bočni lanci histidina imaju sposobnost da deluju kao akceptori i/ili donori protona u cilju odr žavanja pH rastvora. Kapacitet pufera ovog proteina je takođe ranije primećen tokom studija preformulacije kada je otkriven efekat "pH memorije". Zadržavanje pH je nekoliko puta pokazano kako u laboratorijskoj skali tako iu operacijama velikih razmera. Zajedno, rezultati ova dva eksperimenta sugeri šu da je puferski kapacitet rhASA u fiziološkom rastvoru preovlađujući u kiselom pravcu. Prema literaturi, kapacitet pufera za niže pH vrednosti je direktna indikacija većeg broja ostataka asparaginske kiseline i glutaminske kiseline unutar datog proteina u poređenju sa ostacima histidina. Iako ne želimo da budemo vezani bilo kakvom teorijom, ovo zaista može biti slučaj sa arilsulfatazom A gde postoji ukupno 45 ostataka glutaminske kao i asparaginske kiseline u poređenju sa 18 ostataka histidina.

[0236] Kapacitet puferovanja lekovite supstance se takođe može pripisati zaostalom vezanom fosfatu za koji se pokazalo da je prisutan u lekovitoj supstanci korišćenjem ICP-MS. Tabela 25 pokazuje količinu rezidualnog fosfata prisutnog u tri različite serije LSDL lekovitih supstanci. Ovi podaci takođe potvrđuju konzistentnost koraka ultrafiltracije i dijafiltracije za proces pilot skale.

TABELA 25: REZIDUALNA KOLIČINA FOSFATA U SUPSTANCI LEKA PROIZVODENOJ U LSDL-u

[0237] Da bi se dalje razumeo kapacitet pufera ovog proteina, takođe je istražen efekat razblaženja na pH. Nakon razblaživanja rhASA lekovite supstance fiziološkim rastvorom do nižih koncentracija proteina, nije primećena promena pH vrednosti lekovite supstance. Nakon toga, razblažene lekovite supstance su čuvane na 2-8°C nedelju dana, nakon čega su zabeležena pH merenja. Tabela 26 sumira podatke. Rezultati pokazuju da razblaživanje i skladištenje na 2-8°C nemaju uticaja na pH vrednosti razblažene lekovite supstance. Ova zapažanja dalje podržavaju zaključak studija titracije kiseline i baze koje su pokazale adekvatan puferski kapacitet rhASA lekovite supstance formulisane u fiziolo škom rastvoru.

TABELA 26: PH VREDNOSTI SUPSTANCE LEKA RAZREĐENE RHASA

[0238] Tokom istraživanja razblaženja i pH rhASA, primećeno je da pojava razblaženih uzoraka pokazuje smanjenje opalescencije zavisno od koncentracije, tj. jasan izgled. Slika 12 pokazuje uo čeni izgled razblažene rhASA. Rastvor rhASA od 1 mg/mL pokazao je izgled sličan vodi, dok je procenjeno da je izgled od 30 mg/mL između referentnih suspenzija II i III ili III i IV.

4

Studije stabilnosti

[0239] Za studije stabilnosti, lekovita supstanca je formulisana na 3864 mg/mL u 154 mM NaCl, pH 6,0, a proizvod leka je formulisan na 3063 mg/mL u 154 mM NaCl, pH 6,0 u prisustvu i odsustvu 0,005 % polisorbata. Alikvoti od 1 mL lekovite supstance su raspoređeni u polikarbonatne boce od 5 mL sa polipropilenskim zatvaračima na navoj i čuvani na ≤ -65°C, -15°C do -25°C i 2-8°C. Alikvoti od 1,0 do 1,1 mL leka su raspoređeni u staklene bočice od 3 mL sa 13 mm Flurotec čepovima i čuvani na 2-8°C, 2562°C i 4062°C. Bočice sa lekovima su uskladištene u uspravnoj orijentaciji za početne studije stabilnosti i promenjene u obrnutu orijentaciju za poslednje studije kori šćenjem leka bez P20. U svakoj vremenskoj tački, uzorci stabilnosti su testirani pomoću SEC-HPLC, RP-HPLC, OD320, koncentracija proteina, pH, specifična aktivnost, SDS-PAGE (Coomassie) i izgled. Peptidna mapa, glikanska mapa i procenat formilglicina rađeni su godišnje. Pored toga, poslednji testovi su takođe izvedeni za stresne i ubrzane uslove. Zajedno, rezultati studija preformulisanja, zamrzavanja-odmrzavanja i me šanja sugerišu da su samo tri formulacije bile pogodne za dalji razvoj. Studije dugoročne stabilnosti su započete u ove tri formulacije u prisustvu 0,005 % P20. Tabela 27, Tabela 28 i Tabela 29 sumiraju podatke o stabilnosti za tri formulacije u odabranim vremenskim tačkama.

TABELA 27: DUGOTRAJNA STABILNOST NA 2-8°C ZA RHASA U 154 MM NACL, PH 5,9

TABELA 28: DUGOTRAJNA STABILNOST NA 2-8°C ZA RHASA U 154 MM NACL, PH 7.0

TABELA 29: DUGOTRAJNA STABILNOST NA 2-8°C ZA RHASA U 154 MM NACL, PH 6.0

[0240] Studije stabilnosti, sprovedene do 11 meseci na 2-8°C, sugerišu da se kvalitet rhASA održava u formulacijama prototipa. Reprezentativni HPLC profili rhASA sa isključenjem veličine u fiziološkom rastvoru, pH 5,9 su prikazani na slikama 13 i 14. HPLC sa isključenjem veličine nije otkrio nikakve značajne promene u asocijacijskom stanju rhASA posle 11 meseci skladištenja na 2-8°C.

[0241] Sve u svemu, kvalitet leka u sve tri formulacije kandidata je održan nakon 11 meseci skladištenja na 2-8°C

PRIMER 4 – TOKSIKOLOGIJA

[0242] Ovaj primer ilustruje intratekalnu (IT) primenu rhASA ponovljene doze iz perspektive toksikologije i farmakologije bezbednosti tokom perioda od šest meseci. Članak o IT testu za ovu studiju bio je rhASA. Trideset šest mužjaka i 36 ženki cinomolgus majmuna nasumično je raspoređeno u pet grupa za tretman. Životinje u Grupi 1 su bile netretirane kontrole implantata (priklju čak i kateter) i nisu bile dozirane sa vehikulumom ili ispitnim artiklom; međutim, ovim životinjama je dozirano 0,6 mL PBS-a prema rasporedu koji odgovara rasporedu doziranja proizvoda za testiranje. Životinje u grupama 2-5 primale su 0,6 mL IT infuzije od 0, 3, 10 ili 31 mg/mL rhASA (ukupna doza od 0, 1,8, 6,0 ili 18,6 mg) svake druge nedelje (tj. ukupno 12 doza) . Životinje su podvrgnute nekropsiji nakon 6 meseci (24 sata nakon poslednje IT doze), a preostale 4 životinje/pola/grupe su obdukovane na kraju 4-nedeljnog perioda oporavka. Odabrana tkiva su sakupljena, sačuvana i mikroskopski pregledana.

[0243] Generalno, promene u vezi sa test člankom mogu se kategorisati u dva glavna tipa i bile su prisutne na svim nivoima doze (1,8, 6,0 i 18,6 mg/dozi). Povećanje infiltrata (belih krvnih zrnaca, obično sa izraženom eozinofilnom komponentom) u moždanim ovojnicama, moždanom parenhimu, parenhimu kičmene moždine, trigeminalnom gangliju i povremeno u korenima/ganglijima kičmenog nerava (ili epineurijumu koji okružuje te strukture). Bez želje da budemo vezani bilo kakvom teorijom, ovo povećanje je protumačeno kao posledica prisustva ispitivanog proizvoda (proteina) u intratekalnom prostoru i u tkivima nervnog sistema. Blago, fokalno povećanje mikroglijalnih ćelija u kičmenoj moždini i mozgu kod povremenih životinja (mikroglioza nije primećena ni kod jedne životinje sa visokim dozama).

4

Bez želje da budemo vezani bilo kakvom teorijom, obe kategorije morfolo ških promena su protumačene kao odgovor na prisustvo testnog članka. Nije bilo dokaza o neuronskoj nekrozi ni kod jedne životinje. Nijedna od promena u vezi sa člankom za testiranje nije bila povezana sa bilo kakvim biološkim neželjenim reakcijama u mozgu, kičmenoj moždini, korenima kičmenog nerava ili ganglijama. Konkretno, nije bilo dokaza o neuronskoj nekrozi ili biološki važnom glijalnom odgovoru. Nije bilo lezija u vezi sa ispitivanim člankom u tkivima nervnog sistema.

[0244] Posle jednomesečnog perioda oporavka (period bez doziranja), promene u vezi sa ispitivanim člankom su se ili u potpunosti rešile ili su bile ograničene na ostatke prethodnog povećanja inflamatornog odgovora povezanog sa prisustvom test artikla. Nije bilo štetnih morfoloških efekata kod životinja koje su se oporavile. Na osnovu slepog mikroskopskog pregleda kojim se dodeljuje semi-kvantitativni rezultat bojenja, imunohistohemijsko bojenje za arilsulfatazu A (rhASA; testni članak) je povećano u mozgu i kičmenoj moždini u različitim tipovima ćelija, osim neurona, za sve grupe tretirane testnim člankom na krajnja žrtva. Ovo povećanje je takođe bilo očigledno u Kupferovim ćelijama jetre. Nakon 1-mesečnog perioda oporavka, bojenje rhASA kod životinja koje su tretirane ispitivanim člankom (sve dozne grupe) se vratilo na kontrolne nivoe (kontrola uređaja i/ili nosača). Kod jednog mužijaka koji se oporavlja od niske doze, bilo je više žarišta astrocitoze i gubitka neurona, što ukazuje na višestruka područja prethodne ishemije, u moždanoj kori. Iako tačna patogeneza ovih lezija kod ove životinje nije bila očigledna, nedostatak sličnih lezija kod bilo koje druge životinje tretirane testnim artiklom, uključujući životinje sa visokim dozama koje su primile 10 X veću dozu, ukazuje da ove lezije nisu povezane sa ispitivanim artiklom.

[0245] IT test članak za ovu studiju je bio rhASA. Trideset šest mužjaka i 36 ženki cinomolgus majmuna nasumično je raspoređeno u pet grupa za tretman. Životinje u Grupi 1 su bile netretirane kontrolnim implantatom (priključak i kateter) i nisu bile dozirane sa vehikulumom ili ispitnim artiklom; međutim, ovim životinjama je dozirano 0,6 mL PBS-a prema rasporedu koji odgovara rasporedu doziranja proizvoda za testiranje. Životinje u grupama 2-5 primale su 0,6 mL IT infuzije od 0, 3, 10 ili 31 mg/mL rhASA (ukupna doza od 0, 1,8, 6,0 ili 18,6 mg) svake druge nedelje (tj. ukupno 12 doza). Životinje su podvrgnute nekropsiji nakon 6 meseci (24 sata nakon poslednje IT doze), a preostale 4 životinje/pola/grupe su obdukovane na kraju 4-nedeljnog perioda oporavka. Odabrana tkiva su sakupljena, sa čuvana i mikroskopski ispitana. Tabela u nastavku odražava dizajn studije kako se odnosio na patološki aspekt ove studije.

[0246] U vreme žrtvovanja, mozak je isečen u moždanu matricu na približno 3 mm debljine koronalnog preseka. Prvi i svaki drugi presek nakon toga su fiksirani u formalinu radi histopatolo ške evaluacije i imunohistohemijske analize. Mozak je obrađen kao puni koronalni presek. Ovi delovi su uključivali najmanje sledeće regione mozga.

• Neokorteks (uključujući frontalni, parijetalni, temporalni i okcipitalni korteks): delovi mozga 1 do 8 (i presek 9 kada su prisutni)

• Paleokorteks (olfaktorne lukovice i/ili piriformni režanj): delovi mozga 1 do 3

• Bazalni gangliji (uključujući kaudat i putamen): delovi mozga 3 i 4

• Limbički sistem (uključujući hipokampus i cingularni vijug): delovi mozga 4 i 5

• Talamus/hipotalamus i regioni srednjeg mozga uključujući supstanciju nigru: delovi mozga 4 i 5

• Mali mozak, most i produžena moždina: delovi mozga 6 do 8 (i presek 9 kada su prisutni).

[0247] Sekcije mozga su navedene u tabelama podataka kao sekcije 1 do 8/9 (odeljak 9 je obezbedila ustanova za testiranje za neke životinje). Sekcije su se neznatno razlikovale među životinjama. Gore navedeni delovi mozga (1 do 8/9) bili su približna lokacija različitih anatomskih oblasti. Sekcije mozga su navedene u tabelama podataka kao pojedinačni delovi, sa dijagnozama koje se odnose na taj odeljak, kako bi se olakšao potencijalni, budući dodatni pregled slajdova (ako ga ima). Tokom interpretacije podataka, pojedinačne anatomske lokacije mozga (kao što je gore navedeno) su upoređene da bi se identifikovali bilo koji jedinstveni efekti testnog članka (tj. jedinstveni za određeni region mozga). Na TPS-u, svi delovi mozga svih životinja su ugrađeni u parafin, presečeni na 5 mikrona, obojeni hematoksilinom i eozinom (H&E) i pregledani mikroskopski. Pored toga, mozgovi kontrolnih i životinja sa visokim dozama su obojeni Fluoro-Jade B (mrlja koja povećava osetljivost mozga za procenu neuronske degeneracije) i Bielschowskyjevom srebrnom mrljom (procedura koja omogućava direktnu vizualizaciju aksona, dendrita i neuronske filamente) i pregledao.

[0248] Kičmena moždina (cervikalna, grudna i drvena) je isečena na delove od jednog centimetra. Prvi i svaki drugi presek nakon toga su fiksirani u formalinu za histopatološko ispitivanje i imunohistohemijsku analizu. Odseci kičmene moždine (cervikalni, torakalni (uključujući vrh katetera) i lumbalni) kod svih životinja su isečeni na približno 5 mikrona, obojeni H&E i pregledani poprečnim i kosim presecima uzetim na svakom nivou. Serijski delovi kičmene moždine iz kontrolne grupe i grupe sa visokim dozama dodatno

4

su obojeni srebrnom bojom Bielšovskog i anti-GFAP (imunohistohemijska boja koja omogućava direktnu vizualizaciju astrocita i njihovih procesa).

[0249] Koreni i ganglije dorzalnih kičmenih nerava (uzeti na sredini cervikalnog, srednjeg torakalnog i srednjeg lumbalnog dela) su ugrađeni u parafin, sa serijskim presecima obojenim H&E. Pored toga, serijski delovi iz kontrolne grupe i grupe sa visokim dozama su obojeni srebrnom bojom Bielshovskog.

[0250] Za preseke išijadičnog, tibijalnog i suralnog nerva kod svih životinja: Uzdužni presek svakog nerva je ugrađen u parafin, presečen na približno 5 mikrona i obojen H&E. Poprečni presek svakog nerva je naknadno fiksiran u osmijumu, ugrađen u Spurovu smolu, presečen na približno 1 do 2 mikrona i obojen plavim toluidinom. Post-fiksacija osmijuma i ugrađivanje smole obezbeđuju superiorno očuvanje mijelina u perifernim nervima i samim tim detaljnije ispitivanje nerva.

[0251] Sva prikupljena tkiva i velike lezije sakupljene na obdukciji od svih životinja su takođe umetnute u parafin, obojene H&E i pregledane mikroskopski. Histopatološka obrada i evaluacije i imunohistohemijske analize su obavljene TPS-om.

Bojenje arilsulfatazom A (rhASA).

[0252] Pozitivne kontrolne slajdove je obezbedio sponzor studije. Slajdovi su bili delovi jetre mi ševa kojima je ubrizgana rhASA. Svi slajdovi pozitivne kontrole su pokazali dovoljno dokaza o rhASA u Kupferovim ćelijama (sinusoidni makrofagi) u jetri. Slajdovi pozitivne kontrole se čuvaju sa ostalim slajdovima iz ove studije. Sve procene rhASA obojenih preseka su prvobitno sprovedene slepe u odnosu na tretiranu grupu životinja. Ovo je postignuto tako što je patolog u početku pročitao rhASA obojene slajdove sa zamagljenim brojem životinje na etiketi (od strane asistenta koji poznaje stvarnu životinju koja se procenjuje), diktirao je rezultat (ocenu težine) tokom evaluacije i imao istog asistenta odmah zapi šite rezultat bojenja (stepen ozbiljnosti) u tabele sa podacima. ID životinje su zatim verifikovali i neuropatolog studije i asistent da bi se garantovao tačan unos podataka. Ovaj postupak je sproveden tako da se ne unese bilo kakva pristrasnost u procenjivanje ukupnog intenziteta bojenja imunohistohemijskom bojom za detekciju intracelularne rhASA. Relativni stepen bojenja neurona, meningealnih makrofaga, perivaskularnih makrofaga i glijalnih ćelija (astrociti i mikroglijalne ćelije, ali verovatno pretežno mikroglijalne ćelije) je ocenjen u svim delovima mozga i kičmene moždine. Prosečni rezultati ozbiljnosti na svakom nivou mozga i kičmene moždine za svaku grupu su zbrojeni (po grupi) i zabeleženi kao zbir pod naslovom tkiva Mozak, opšte, rhASA bojenje i kičmena moždina, opšte, rhASA bojenje.

[0253] Generalno, rhASA bojenje u neuronima mozga je bila mera neurona u mo ždanoj kori i druge nuklearne oblasti u mozgu. rhASA bojenje u meningealnim makrofagima je dokaz preuzimanja ispitivanog proizvoda od strane meningealnih makrofaga i/ili endogenog rhASA u meningealnim makrofagima. rhASA bojenje perivaskularnih makrofaga je bila mera preuzimanja rhASA od strane makrofaga u mozgu/kičmenoj moždini (ili endogeni rhASA), mada treba napomenuti da je perivaskularni prostor u mozgu i kičmenoj moždini (Virhow-Robinsov prostor) kontinuiran sa moždanim opnama. Uopšteno govoreći, ocenjivanje rhASA bojenja u glijalnim ćelijama je pretežno bila mera uzimanja testnog proizvoda/prodiranja testnog proizvoda u sivu i/ili belu materiju, posebno u koru velikog mozga (corona radiata je bela materija ispod kore velikog mozga). Činilo se da je rhASA bojenje u beloj materiji u astrocitima i mikroglijalnim ćelijama.

[0254] Sledeća šema ocenjivanja je korišćena da se oceni stepen bojenja rhASA različitih tipova ćelija (neuroni, glijalne ćelije, makrofagi).

Objašnjenje ocene (% mogućih obojenih ćelija)

[0255]

1 Manje od 10 %

2 Veće od 10 do 25 %

3 Veće od 25 do 50 %

4 Veće od 50 do 75 %

5 Više od 75 %

[0256] Treba imati na umu da ova šema nije striktno kvantitativna. Korišćena je kao efikasna, polukvantitativna metoda za procenu mozga i kičmene moždine za stepen bojenja sa rhASA. Studijski neuropatolog je primetio da nisu sve neuronske oblasti imale jednako rhASA bojenje. Tako đe je primećeno da postoji endogeno neuronsko bojenje kod nekih kontrolnih životinja i da ćelije horoidnog pleksusa i neurona ganglija dorzalnog korena imaju tendenciju da se jako boje na rhASA čak i kod kontrolnih životinja. Bojenje horoidnog pleksusa i ganglija dorzalnog korena nije ocenjeno, ali je neuropatolog

4

studije primetio da je istaknuto, čak i kod kontrolnih životinja.

[0257] Napomena: Sve grupe doza: Niska doza = 1,8 mg/doza; Srednja doza = 6,0 mg/doza; Visoka doza = 18,6 mg/doza. Nije bilo lezija u vezi sa ispitivanim člankom u tkivima nervnog sistema osim pojačanog bojenja rhASA u jetri svih doznih grupa (muškaraca i žena; videti dole).

Krajnje žrtvovane životinje (6 meseci EOW doziranja): preseci obojeni rhASA

[0258] Došlo je do povećanja bojenja rhASA u sledećim tipovima tkiva/ćelija. Prilikom razmatranja uticaja proizvoda za testiranje na stepen bojenja rhASA u određenom tipu ćelija u određenoj dozi, nivoi bojenja u istovremenoj kontroli nosača i kontroli uređaja (žrtvovani sa žrtvovanim životinjama) uzeti su u obzir za poređenje.

[0259] Mozak, moždane ovojnice, makrofagi (sve grupe doza, mužijaci i ženke)

• Mozak, perivaskularni, makrofagi (sve dozne grupe, mužijaci i ženke)

• Mozak, glijalne ćelije (sve dozne grupe, mužijaci i ženke)

• Kičmena moždina, moždane ovojnice, makrofagi (sve dozne grupe, mužijaci i ženke)

• Kičmena moždina, perivaskularni, makrofagi (sve dozne grupe, mužijaci i ženke)

• Kičmena moždina, glijalne ćelije (srednje i visoke doze za mužijaci i ženke)

• Jetra, Kupferove ćelije (sve dozne grupe, mužijaci i ženke)

[0260] Zbog endogenog bojenja, nivoe bojenja rhASA u neuronima mozga i ki čmene moždine bilo je najteže specifično definisati. Bojenje rhASA pokazalo je konstantno povećane nivoe rhASA u perivaskularnim makrofagima mozga/kičmene moždine, kao i unutar glijalnih ćelija. Nije bilo uočljivih razlika u bojenju rhASA u neuronima između životinja koje su kontrolno tretirane i ispitivane supstance.

Oporavak žrtvovanih životinja (6 meseci EOW doziranja nakon čega sledi 1 mesec bez doziranja)

[0261] Generalno, promene u vezi sa ispitivanim člankom bile su ili potpuno otklonjene ili su značajno smanjene kod onih životinja koje su dozvoljavale jednomesečni period bez doziranja pre nekropsije. Sledeće mikroskopske promene su bile prisutne po učestalosti i/ili ozbiljnosti koje su ukazivale na moguću vezu sa ispitivanim artiklom.

[0262] Mikroskopske promene u vezi sa člankom o testiranju (životinje za oporavak)

• Mozak, moždane ovojnice, infiltrati (grupe sa srednjim i visokim dozama, oba pola) (Slike 16 i 17) • Mozak, moždane ovojnice, infiltrati, % eozinofila (srednja doza kod mužijaka; visoka doza kod ženki) • Mozak, perivaskularni, infiltrati (srednja doza kod mužijaka; visoka doza kod ženki) (Slika 18)

• Mozak, perivaskularni, infiltrati, % eozinofila (srednja doza mužijaka; visoka doza kod ženki)

• Mozak, siva materija, infiltrati (sve dozne grupe, oba pola)

• Mozak, infiltrati sive materije, % eozinofila (mala doza kod mužijaka)

• Mozak, siva materija, eozinofili, nekroza (mala doza kod mužijaka)

• Kičmena moždina, moždane ovojnice, infiltrati (srednje i visoke doze kod mužijaka; niske i visoke doze kod ženki)

• Kičmena moždina, moždane ovojnice, infiltrati, % eozinofila (srednja doza mužijaka;; mala doza kod ženki)

• Kičmena moždina, siva materija, infiltrati (male doze kod ženki)

• Kičmena moždina, siva materija, infiltrati, % eozinofila (male doze kod ženki)

• Ganglion dorzalnog korena i koreni, epineurijum, infiltrati (srednje doze kod ženki)

• Koreni i ganglije kičmenog nerava, infiltrati, eozinofili (srednje i visoke doze kod mužijaka; sve doze, kod ženki)

• Trigeminalne ganglije, infiltrati, eozinofili (srednja doza kod mužijaka i ženki)

[0263] Sve ove promene su tumačene kao ostaci pojačanih inflamatornih promena zabeleženih kod krajnjih žrtvovanih životinja. Kao i kod krajnjih žrtvovanih životinja, nije bilo dokaza da povećanje inflamatornih ćelijskih infiltrata i dalje prisutnih kod nekih životinja koje su se oporavile predstavlja morfološke promene koje su izazivale bilo kakve neželjene efekte. Nije bilo lezija u vezi sa ispitivanim člankom u tkivima nervnog sistema.

Oporavak žrtvovanih životinja (6 meseci EOW doziranja praćeno 1 mesecom bez doziranja): rhASA bojenje

[0264] Nije bilo indikacija povećanog bojenja rhASA kod mužijaka ili ženki oporavljenih u poređenju sa

4

kontrolama uređaja i/ili nosača. U mozgu mužijaka koji su primili niske, srednje i visoke doze, zapravo je postojala indikacija smanjenog bojenja rhASA u nekim tipovima ćelija (ovo je variralo među grupama koje su tretirane) u poređenju sa kontrolama uređaja i/ili nosača. Razlog za to, uključujući da li je ovo bio stvarni efekat ili ne, nije bio očigledan. Jedno od mogućih objašnjenja bi bilo da primena egzogene rhASA može izazvati izvesno smanjenje proizvodnje endogene rhASA. Sličan nalaz nije bio prisutan u kičmenoj moždini mužijaka. Kod mužijaka i ženki u oporavku, bojenje u jetri je bilo slično onom zabeleženom u kontrolama.

[0265] Generalno, promene u vezi sa test člankom mogu se kategorisati u dva glavna tipa i bile su prisutne na svim nivoima doze (1,8, 6,0 i 18,6 mg/dozi).

[0266] Povećanje infiltrata (belih krvnih zrnaca, obično sa izraženom eozinofilnom komponentom) u moždanim ovojnicama, moždanom parenhimu, parenhimu kičmene moždine, trigeminalnoj gangliji i povremeno u korenima/ganglijima kičmenog nerva (ili epineurijumu koji okružuje te strukture). Ovo povećanje je protumačeno kao posledica prisustva ispitivanog artikla (proteina) u intratekalnom prostoru i u tkivima nervnog sistema.

[0267] Blago, fokalno povećanje mikroglijalnih ćelija u kičmenoj moždini i mozgu kod životinja (mikroglioza nije primećena ni kod jedne životinje sa visokim dozama). Obe kategorije morfoloških promena su protumačene kao odgovor na prisustvo testnog članka. Nije bilo dokaza o neuronskoj nekrozi ni kod jedne životinje. Nijedna od promena u vezi sa člankom za testiranje nije bila povezana sa bilo kakvim biološkim neželjenim reakcijama u mozgu, kičmenoj moždini, korenima kičmenog nerva ili ganglijama. Konkretno, nije bilo dokaza o neuronskoj nekrozi ili biolo ški važnom glijalnom odgovoru. Nije bilo lezija u vezi sa ispitivanim člankom u tkivima nervnog sistema. Nakon jednomesečnog perioda oporavka (period bez doziranja), promene u vezi sa ispitivanim člankom su se ili u potpunosti odstranile ili su bile ograničene na ostatke prethodnog povećanja inflamatornog odgovora povezanog sa prisustvom testnog proizvoda. Nije bilo štetnih morfoloških efekata kod životinja koje su se oporavile.

[0268] Na osnovu slepog mikroskopskog pregleda kojim se dodeljuje polukvantitativni rezultat bojenja, imunohistohemijsko bojenje za arilsulfatazu A (rhASA; test članak) je povećano u mozgu i kičmenoj moždini u različitim tipovima ćelija, osim neurona, za sve grupe tretirane testnim člankom. Ovo povećanje je takođe bilo očigledno u Kupferovim ćelijama jetre. Nakon 1-mesečnog perioda oporavka, bojenje rhASA kod životinja koje su tretirane ispitivanim člankom (sve dozne grupe) se vratilo na kontrolne nivoe (kontrola uređaja i/ili nosača). Kod jednog mužijaka koji se oporavlja od niske doze, bilo je više žarišta astrocitoze i gubitka neurona, što ukazuje na višestruka područja prethodne ishemije, u moždanoj kori. Iako tačna patogeneza ovih lezija kod ove životinje nije bila očigledna, nedostatak sličnih lezija kod bilo koje druge životinje tretirane testnim artiklom, uključujući životinje sa visokim dozama koje su primile 10 X veću dozu, ukazuje da ove lezije nisu povezane sa ispitivanim artiklom. Striktno na osnovu grubih i mikroskopskih nalaza (hematoksilinom i eozinom obojenim presecima) u ovoj studiji, nivo bez uočenih štetnih efekata (NOAEL) bio je 18,6 mg.

PRIMER 5 – FARMAKINETIČKI PODACI

6-mesečni podaci o životinjama

[0269] Ovaj primer pruža interpretativnu analizu za serumske i CSF koncentracije rhASA i anti-rhASA serumskih antitela iz Northern Biomedical Research, Inc.

[0270] Cilj primera je bio da se proceni intratekalno (IT) davanje rhASA ponovljene doze iz toksikolo ške i bezbednosne farmakološke perspektive kod juvenilnih (< 12 meseci starosti) majmuna cinomolgus. Ukupno je dato 12 doza u periodu od šest meseci. Životinje su obdukovane 24 sata ili mesec dana nakon poslednje doze. Dizajn studije je prikazan u tabeli 30.

4

TABELA 30: Dizajn studije

[0271] Kvantifikacija anti-rhASA antitela u serumu i CSF od cynomolgus majmuna je sprovedena korišćenjem validirane metode. Ukratko, test počinje blokiranjem ploče obložene MSD streptavidinom, nakon čega sledi inkubacija sa rhASA obeleženom biotinom. Posle koraka ispiranja, razblaženi uzorci, kalibratori i QC se dodaju na ploču i inkubiraju. Posle dodatnog koraka ispiranja, lek označen SULFO TAG se dodaje i inkubira. Izvodi se poslednji korak ispiranja i dodaje se MSD pufer za čitanje. Ploče se odmah očitavaju. Podaci o signalu u jedinicama relativne luminiscencije (RLU) se analiziraju kori šćenjem SOFTMax Pro šablona.

Koncentracija seruma i CSF

[0272] Kvantifikacija rhASA u serumu i CSF od cynomolgus majmuna je sprovedena kori šćenjem validirane metode. Metoda je zasnovana na tehnologiji ELISA (enzyme-linked Immunosorbent Assay). Ukratko, mikrotitarska ploča je obložena zečjim poliklonskim antitelom (SH040) podignutim nasuprot rekombinantne humane arilsulfataze A (ASA). Nakon inkubacije sa ASA referentnim standardima i test uzorcima, vezani ASA protein se detektuje pomoću monoklonskog antitela protiv ASA konjugovanog peroksidazom (HRP) (klon 19-16-3). Ploča se zatim inkubira sa supstratom za HRP, TMB peroksidaza. Ova reakcija enzim-supstrat se zaustavlja dodavanjem 2N sumporne kiseline (H2SO4) i meri se apsorpcija svakog bazenčića na talasnoj dužini apsorbancije 450 nm sa referentnom talasnom dužinom od 655 nm. Koncentracije ASA u uzorcima su izračunate korišćenjem rhASA kalibracione krive na istoj ploči.

[0273] Rezime serumskih koncentracija rhASA, CSF koncentracija rhASA, Referentni izvor nije pronađen.

Koncentracije anti-rhASA serumskih antitela, koncentracije anti-rhASA CSF antitela i u čestalost antitela po grupi su predstavljeni u niže navedenim Tabelama 33-39.

TABELA 33: Rezime koncentracije rhASA u serumu kod Cinomolgus majmuna

TABELA 33 (nastavak): Rezime koncentracije rhASA u serumu kod Cinomolgus majmuna

1

TABELA 33 (nastavak): Rezime koncentracije rhASA u serumu kod Cinomolgus majmuna

2

TABELA 34: Rezime koncentracija CSF kod Cinomolgus majmuna

nastavak

TABELA 34 (nastavak): Rezime koncentracija CSF kod Cinomolgus majmuna

(nastavak)

4

TABELA 34 (nastavak): Rezime koncentracija CSF kod Cinomolgus majmuna

TABELA 35: Rezime koncentracije anti-rhASA antitela u serumu

(nastavak)

TABELA 36: Rezime koncentracije anti-rhASA antitela u CSF

TABELA 36 (nastavak): Rezime koncentracije anti-rhASA antitela u CSF

TABELA 37: Koncentracije rhASA u serumu i likvoru, kombinovano kod mužijaka i ženki (ng/mL)

(nastavak)

TABELA 37 (nastavak) : Koncentracije rhASA u serumu i likvoru, kombinovano kod mužijaka i ženki

(ng/mL)

TABELA 37 (nastavak) : Koncentracije rhASA u serumu i likvoru, kombinovano kod mužijaka i ženki

(ng/mL)

TABELA 38: Serum i CSF anti-rhASA antitelo, kombinovano kod mužijaka i ženki (ng/mL)

TABELA 38 (nastavak): Serum i CSF anti-rhASA antitelo, kombinovano kod mužijaka i ženki (ng/mL)

1

TABELA 38 (nastavak): Serum i CSF anti-rhASA antitelo, kombinovano kod mužijaka i ženki (ng/mL)

2

[0274] Granica kvantitacije za rhASA u serumu majmuna cinomolgusa je 39,1 ng/mL, a svi uzorci seruma iz Grupe 1 i 2 bili su ispod kvantitativne granice (BQL), videti tabelu 33. Nivoi rhASA u serumu su testirani pre i na 24. sati nakon doza 2, 4, 6, 8, 10 i 12 (6-mesečna obdukcija), na polovini perioda oporavka, i pre obdukcije za oporavak. Nivoi rhASA nisu bili detektovani u Grupi 3 (1,8 mg/dozi), Grupi 4 (6,0 mg/dozi) i Grupi 5 (18,6 mg/dozi) pre doza 2, 4, 6, 8, 10 i 12, posle doze 12, sredinom perioda oporavka, i pre obdukcije za oporavak. Nakon doze 2, nivoi rhASA u serumu su bili povezani sa dozom. Posle doze 4 (Grupa 3), Doze 6 (Grupe 3 i 4) i Doze 8 i 10 (Grupe 3 i 4 i Grupa 5 muškaraca), nivoi rhASA nisu bili detektovani. Nivoi rhASA u serumu su opali u Grupi 4 (6,0 mg/dozi) posle doze 4 i u Grupi 5 (18,6 mg/dozi) posle doza 4 i 6 za muškarce i doze 4, 6, 8 i 10 za žene. Ovaj očigledan pad nivoa rhASA u serumu može biti povezan sa poveć anjem koncentracije anti-rhASA antitela. Nije bilo o čiglednih polnih razlika u serumskim nivoima rhASA, s obzirom na varijabilnost uzorka i broj malih grupa u ovoj studiji.

[0275] Granica kvantitacije za rhASA u CSF cinomolgus majmuna je 19,5 ng/mL, a svi uzorci CSF iz Grupa 1 i 2 su bili BQL, videti tabelu 34. rhASA je bila detektovana u CSF pre i posle doza 2, 4, 6, 8, 10 i 12 (6-mesečna nekropsija) u svim doziranim grupama. Nivoi su bili viši posle doze (otprilike 24 sata posle doze) i bili su povezani sa dozom. Nivoi u CSF bili su mnogo već i od onih u serumu. Nije bilo o čiglednih polnih razlika u nivoima rhASA u CSF-u, s obzirom na varijabilnost uzorka i broj malih grupa u ovoj studiji. rhASA nije bila detektovana na sredini perioda oporavka i pre obdukcije oporavka u svim doziranim grupama. Nivoi likvora u kolekcijama doze 12 (nekropsija) za grupe tretirane rhASA bili su niži od nivoa nakon doze 8 i 11. Potencijalni razlozi za niže nivoe rhASA na obdukciji uključuju već u uzetu zapreminu ( ∼ 2,25 mL ukupno za broj ć elija, hemiju, rhASA i anti -rhASA antitelo) na obdukciji u odnosu na one uzeti u intervalu doziranja tokom života (do 0,5 mL pre ili posle doze za koncentraciju rhASA). Pored toga, neke životinje nisu imale patentirane katetere na nekropsiji, a uzorci su uzeti preko CM slavine, a ne preko katetera. Ovaj put je dosledno davao niže koncentracije rhASA u poređenju sa uzorkovanjem preko katetera. Ovo je verovatno zbog ograničenog rostrokaudalnog pravca protoka mase CSF-a za koji se priznaje da se javlja kod vertikalno orijentisanih životinja poput majmuna i čoveka (na primer, dobro je poznato da sastojci CSF-a pokazuju izražene rostrokaudalne gradijente tokom celog života pojedinca).

[0276] Anti-rhASA antitela u serumu su otkrivena kod svake životinje tretirane rhASA u nekom vremenskom trenutku, videti tabelu 35. Životinje su definisane kao pozitivne na anti-rhASA antitela ako je nivo anti-rhASA antitela bio iznad granice kvantifikacije (78,1 ng/mL). Životinje su ostale pozitivne na anti-rhASA antitela nakon što su serokonvertovale. Nijedna životinja nije bila pozitivna na anti-rhASA antitela u vremenskoj tački pre doze 2. Sve rhASA životinje osim mužjaka br. 026 (Grupa 4; 6,0 mg/dozi) bile su pozitivne na serumska anti-rhASA antitela u vremenskoj tački pre doze 4. Muškarac br. 026 je bio pozitivan na serum antitela u vremenskoj tački pre doze 6. U Grupi 5 (18,6 mg/kg), uzorci antitela na nekropsiji imali su niže nivoe antitela. Ovo očigledno smanjenje može biti posledica prisustva rhASA koji ometa test. Titar je generalno bio viši u grupama sa srednjim i visokim dozama (6,0 i 18,6 mg/dozi) nego kod životinja sa niskim dozama (1,8 mg/dozi). Prisustvo anti-rhASA antitela je očekivani rezultat tretmana cinomolgus majmuna rekombinantnim humanim proteinima. S obzirom na varijabilnost u rezultatima, nije bilo očiglednih polnih razlika.

[0277] Sve životinje sa detektabilnim anti-rhASA antitelima u CSF takođe su imale detektabilna rhASA antitela u serumu, sa izuzetkom ženki br. 049 (Grupa 3; 1,8 mg/doza) i 057 (Grupa 4; 6,0 mg/doza). Varijabilnost koncentracije i incidencije antitela onemoguć ava odre đivanje odgovora na dozu. Životinje se definišu kao pozitivne na anti-rhASA antitela ako je nivo anti-rhASA antitela bio iznad granice kvantifikacije (78,1 ng/mL).

[0278] Kombinovane vrednosti za muškarce i žene za nivoe rhASA u serumu i CSF i za anti-rhASA antitela su prikazane u Tabeli 36 i Tabeli 37. Kombinovani rezultati za mužijake i ženkee su slični pojedinačnim polovima, o kojima se raspravljalo napred.

PRIMER 6 – EFIKASNOST

[0279] U ovom primeru, 11 kontrolnih miševa divljeg tipa (mASA /+ hASA -/-) je dodeljeno Grupi A i nije bilo tretirano. Trideset četiri (34) miša hASAC69S/ASA -/- dodeljena su svakoj od 5 doznih grupa i primali su nosač (Grupa B) ili rhASA (rhASA) u dozama od 20 mg/kg (intravenozno [IV]; Grupa C) ili 0,04, 0,12 i 0,21 mg (grupe D, E i F, respektivno) 1., 9., 15/16. i 22. dana. Sve IV doze davane su preko repne vene. Sve intratekalne (IT) doze su davane kao infuzija u zapremini od 12 mL u pribli žnom opsegu od 2 mL/20 sekundi (Tabela 40).

4

TABELA 40: DIZAJN STUDIJE

[0280] ASA miš hASAC69S/ASA(-/-) je prihvaćen model MLD i korišćen je za testiranje potencijalnih tretmana za ovu bolest. Intratekalni put je predviđeni put primene kod ljudi. Intravenski put primene je testiran za ovo jedinjenje i slično jedinjenje kod MLD miševa. Dodata je intravenska kontrolna grupa kao pozitivna kontrola za očekivane histološke promene u perifernim organima. Životinje su primale 100, 300 ili 520 mg/kg težine mozga (0,04, 0,12, 0,21 mg, respektivno) rhASA. Nivoi doze normalizovani na težinu mozga odabrani za ovu studiju odgovaraju dozama koje su planirane za upotrebu kod ljudi ili su kori šćene u toksikološkim studijama ili u prethodnim modelima efikasnosti lizozomalnih bolesti skladi štenja. Nije se očekivalo da će ove doze imati nikakvu toksičnost.

Primalac

[0281]

Vrste Miševi (Mus musculus)

Bojenje hASAC69S/ASA (-/-) miševi i kontrole divljeg tipa

Starost Približno 14-17 meseci po dolasku

Broj grupa 6

Broj životinja 34 ASA nokaut miševa 11 kontrola divljeg tipa

[0282] Po dolasku, svaka životinja je pregledana da bi se procenio zdravstveni status.

Smeštanje

[0283] Životinje su bile smeštene u grupama u kavezima od polikarbonatnog filtera visoke temperature, sa CareFresh papirnom posteljinom i bocama za vodu. Svaki kavez je bio jasno obele žen karticom kaveza sa naznakom projekta, grupa i brojeva životinja i pola. Svaka životinja je jedinstveno identifikovana korišć enjem sistema za bušenje uha. Životinje su tretirane u skladu sa saveznim smernicama.

[0284] Ciljani uslovi za životno okruženje i fotoperiod su bili sledeć i:

Temperatura 22°C ± 3°C

Vlažnost 50 % ± 20 %

Svetlosni ciklus 12 sati na svetlosti i 12 sati u mraku

[0285] Tokom i nakon primene doze, fotoperiod je možda bio privremeno prekinut za planirane aktivnosti. Smatra se da takvi prekidi ne utiču na ishod ili kvalitet ovog istraživanja. Sve dostupne životinje divljeg tipa (11) dodeljene su grupi A i numerisane su brojevima od 35 do 45. ASA (-/-) hASA (+/-) životinjama su dodeljeni uzastopni brojevi (1 do 34) kako bi bile uklonjene iz kaveza, vagane i kako bi im bilo probu šeno uho tokom aklimatizacije. Životinje su zatim 3. januara 2011. dodeljene grupama za tretman koristeć i Research Randomizer (vvv.randomizer.org). sledeć ih 5 u Grupu E, a poslednjih 10 u Grupu F. Životinje su dodeljene na sledeć i način u tabeli 41:

TABELA 41: DODELJENE ŽIVOTINJE

Testirani element i nosač

Testni element

[0286]

Identitet rhASA

Opis ljudska rekombinantna arilsulfataza A (rhASA)

Uslovi skladištenja Približno 4°C

Nosač

Identitet rhASA nosača (154 mM NaCl, 0,005% polisorbat 20, pH∼ 6,0)

Uslovi skladištenja Približno 4°C

Priprema nosača

[0287] Nosač je korišćen kako je predviđeno. Nosač je zagrejan na klupi (ambijent). Kada je nosač zagrejan, materijal je pomešan nežnim vrtenjem i okretanjem. Boce nisu vorteksirane ili protresene. Boca je osušena pre pristupa materijalu. Preostali nosač je vrać en u frižider (1C - 8C).

Priprema formulacije doze

[0288] rhASA je razblažena sa nosačem da bi se postigle potrebne koncentracije. Testni element je zagrejan na klupi (ambijent). Jednom kada se testni element zagreje, materijal je pome šan nežnim okretanjem i okretanjem. Boce nisu vorteksirane ili protresene.

Boje za prać enje injekcija:

[0289] Infracrvena boja (kao što je IRDye®, LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) je korišćena za praćenje injekcija.

Boje poput ove su korišć ene u intratekalnim injekcijama kao postupaku preživljavanja nakon intratekalne primene. Boja je pomešana sa ispitivanim elementom pre primene; 1 nmol boje je dodat u 1 mL testnoh elementa. Pored infracrvene boje, 1 mL FD&C blue #1 (0,25 %) je korišć en za pra ć enje injekcija. Ova plava boja je uobičajeni aditiv za hranu i generalno se smatra bezbednom i netoksičnom.

Lumbosakralna IT injekcija rhASA ili nosač

[0290] Životinje u grupama B, D, E i F primile su intratekalne injekcije 1, 9, 15. ili 16. i 22. dana.

[0291] Odrasli miševi su anestezirani upotrebom 1,25 % 2,2,2 tribromoetanola (Avertin) na 200-300 mL/10 grama telesne težine (250-350 mg/kg) intraperitonealnom injekcijom. Dorzalna dlaka je uklonjena između osnove repa i lopatica pomoć u makaza. Obrijano područje je očišćeno pilingom povidina/betadina, a zatim izopropil alkoholom. Preko lumbosakralne kičme napravljen je mali srednji rez kože (1-2 cm) i identifikovan je presek dorzalne srednje linije i kranijalnog aspekta krila ilea (singularni ileum). Mi šić u ilijačnoj rupi (gluteus medius) je mišić u obliku srca. Dve strane vrha "srca" približne su lokaciji krila ilea. Igla kalibra 32 pričvršć ena za gasno nepropusni Hamilton špric od 10-20 mL koji je ubačen sve dok se ne oseti otpor kosti ispod. Injekcija 10 mL testnog elementa, 1 mL infracrvene boje i 1 mL FD&C blue #1 (ukupna zapremina injekcije od 12 mL) izvedena je približnom brzinom od 2 mL/20 sekundi (12 mL/2 minuta). Rez kože je zatvoren pomoć u klipova za ranu. Uspeh injekcije je procenjen na osnovu snimanja kako bi se utvrdilo da li se infracrvena boja distribuirala kroz CNS, kao i vidljiva plava boja. Nakon snimanja, životinji je dozvoljeno da se oporavi u komori za oporavak.

Intravenska injekcija rhASA

[0292] Životinje u Grupi C primile su intravenske injekcije 1., 9., 15. i 22. dana.

[0293] Za IV injekcije, životinje su anestezirane korišć enjem izoflurana, ako je potrebno, i stavljene su u držač. Repna vena je proširena zagrevanjem nežnim udarcem prsta po repu. Mesto injekcije je zatim obrisano sa 70 % etanolom. Alternativno, životinja je stavljena u toplu komoru (40°C) na 1-1,5 minuta. Za ubrizgavanje ispitnog materijala korišć ena je igla od 28 do 30. Zapremina injekcije bila je 5-10 mL/kg.

[0294] Približno 24 sata nakon četvrte doze, životinje u grupama B-F su eutanazirane. Životinje su podvrgnute različitim procedurama prikupljanja tkiva, kao što je detaljno opisano u nastavku. Životinje u grupi A nisu tretirane; međutim, oni su eutanazirani 27. ili 28. januara 2011. i podvrgnuti procedurama prikupljanja tkiva, kao što je detaljno opisano u nastavku.

Serum (sve životinje)

[0295] Terminalni uzorak krvi (približno 0,5 mL) je sakupljen od svih životinja (Grupe A-F) retroorbitalnom punkcijom pod anestezijom izofluranom. U orbitu je postavljena staklena cev, koja je ne žno prodirala u područje iza oka i tako poremetila vensku drenažu koja se nalazi iza oka. Krv je sakupljena kapilarnim delovanjem i/ili gravitacionim tokom. Nakon uzimanja krvi, pritisak je primenjen na orbitu da bi se zaustavilo krvarenje.

[0296] Uzorci cele krvi su obrađeni u serum i zamrznuti na < -80°C. Serum je čuvan na -80°C i analiziran na antitela.

Tkiva za svetlosnu mikroskopiju (grupe A-F; 5 miševa po grupi)

[0297] Nakon uzimanja krvi, životinje su eutanazirane gušenjem CO2. Isečak repa je sakupljen pre perfuzije i zamrznut radi moguć e genotipizacije. Izložena je perikardna šupljina. Tri (3) miša po grupi su transkardijalno perfundirana sa heparinizovanim fiziološkim rastvorom (1 U/mL natrijum heparina u 0,9 % NaCl, sterilno filtriran) ohlađenim, ledeno hladnim, a zatim sa 4 % paraformaldehidom na približno 4°C. Mozak je uklonjen, a stomak je presečen da bi se unutrašnji organi dodatno otkrili. Mozak i trup su stavljeni u paraformaldehid, osim reza repa koji je bio zamrznut.

Tkiva za analizu lipida (grupe A, B i F; 6, 4 i 5 životinja, respektivno)

[0298] Nakon uzimanja krvi, životinje su eutanazirane gušenjem CO2. Isečak repa je sakupljen pre perfuzije i zamrznut radi moguć e genotipizacije. Izložena je perikardna šupljina. Za analizu lipida, 4-6 miševa po grupi je transkardijalno perfuzirano sa heparinizovanim fiziolo škim rastvorom (1 U/mL natrijum heparina u 0,9 % NaCl, sterilno filtriran) ohlađenim, ledeno hladnim. Primeri tkiva prikupljenih za analizu lipida predstavljeni su u tabeli 42.

TABELA 42: TKIVA PRIKUPLJENA ZA ANALIZU LIPIDA

[0299] Nakon sakupljanja, tkiva su izmerena i zatim zamrznuta, bilo na suvom ledu ili stavljanjem u zamrzivač na -80°C. Mozak je podeljen na levu i desnu hemisferu. Desna se koristi MS za analizu lipida. Leva ć e biti korišćena za mogu ć u analizu N-acetil-L-aspartata (NAA). Tkiva su čuvana na -80°C do analize (videti tabelu 43).

TABELA 43: USLOVI ČUVANJA UZORAKA

[0300] rhASA je smanjila skladištenje sulfata u kičmenoj moždini MLD miševa, posebno u beloj masi. Slika 19. Morfometrijska analiza kičmene moždine je pokazala da je optička gustina bojenja alcijanskom plavom bila statistički značajno smanjena nakon doziranja rhASA, Slika 20. MLD miševi tretirani rhASA takođe su pokazali smanjenu lizozomalnu aktivnost u mozgu, Slika 21. Ovo smanjenje je bilo statistički značajno u grupi sa visokim dozama (0,21 mg-520 mg/kg težine mozga) u poređenju sa životinjama tretiranim nosačem, Slika 22.

[0301] Imunotolerantni MLD miševi (hASAC69S/ASA(-/-)) stariji od 1 godine primali su intratekalnolumbalnu primenu rhASA jednom nedeljno tokom 4 nedelje (ukupno 4 doze). Doze su bile tretitane nosačem (154 mM NaCl, 0,005 % polisorbat 20, pH ∼ 6,0), 0,04, 0,12, 0,21 mg/dozi (normalizovane doze su bile 100, 300 i 520 mg/kg težine mozga, respektivno). U terminalnim vremenskim tačkama, efikasnost je procenjena imunohistohemijskom procenom klirensa sulfata i aktivnosti lizozoma u mozgu i ki čmenoj moždini. Sekcije kičmene moždine i mozga su obojene korišć enjem alcijanske plave boje koja cilja sulftatide u tkivima. Sekcije mozga su takođe obojene na prisustvo membranskog proteina povezanog sa lizozomima (LAMP), indikatora lizozomalnih procesa. Dodatno, urađena je morfometrijska analiza na delovima kičmene moždine (cervikalni, torakalni i lumbalni) i mozga obojenim alcijanskim plavim i LAMP-om.

[0302] Ovi preliminarni rezultati pokazuju efikasnost intratekalne lumbalne primene rhASA. U pore đenju sa kontrolnim miševima sa nosačem, MLD miševi tretirani rhASA pokazuju dokaze poboljšanja u okviru histoloških markera bolesti, kao što je smanjeno skladištenje sulfata (primeć eno bojenjem alcian plavim) i lizozomalna aktivnost u mozgu. Ove histopatološke promene su primeć ene u blizini mesta primene (kičmena moždina) kao i u distalnim delovima mozga.

PRIMER 7 – BIODISTRIBUCIJA 2

Pregled

[0303] U ovoj studiji, 36 mužjaka i 36 ženki maloletnih cinomolgus majmuna (< 12 meseci na početku) dodeljeno je svakoj od 5 doznih grupa i primalo rhASA (rhASA) u dozama od 0 (kontrola uređaja; životinjama je dato 0,6 mL PBS), 0 (kontrola vozila), 1,8, 6,0 ili 18,6 mg (grupe 1, 2, 3, 4 i 5, respektivno) svake druge nedelje tokom 6 meseci za ukupno 12 doza. Sve doze su davane kao infuzija u zapremini od 0,6 mL, nakon čega je usledilo ispiranje sa 0,5 mL PBS-a datog tokom približno 10 minuta (Tabela 44 ).

TABELA 44: DIZAJN STUDIJE

Materijal i metode

Prikupljanje tkiva

[0304] Mozgovi su isečeni u moždanu matricu na debljini koronalnog preseka debljine 3 mm. Svaki mozak je podeljen na pune koronalne kriške uključujuć i: neokorteks (uključuju ć i frontalni, parijetalni, temporalni i okcipitalni korteks), paleokorteks (olfaktorne lukovice i/ili piriformni re žanj), bazalne ganglije (uključujuć i kaudat i putamen), limbički sistem (uključuju ć i nilski konj cingulate gyri), talamus/hipotalamus, regioni srednjeg mozga (uključujući supstanciju nigru), mali mozak, most i produženu moždinu. Lokacije sa kojih su dobijeni pojedinačni uzorci tkiva (preko 4 mm biopsijskog probijača) prikazani su na slikama 32 - 37. Slike 32 - 37 su sa Univerziteta u Wiskonsinu i države Mičigen uporedne kolekcije mozga sisara (takođe iz Nacionalnog Muzeja zdravlja i medicine). Ubod broj 22 nije prikupljen, jer ova struktura nije bila prisutna tokom obdukcije. Svi uzorci mozga su zamrznuti i čuvani na -60°C ili niže pre analize na rhASA korišć enjem enzimskog imunosorbentnog testa.

[0305] Prvi isečak mozga i svaki drugi presek nakon toga su fiksirani u formalinu radi histopatolo ške evaluacije i imunohistohemije. Drugi deo mozga i svaki drugi deo nakon toga su zamrznuti za analizu koncentracije testnog artikla. Pre zamrzavanja, uzorci mozga su uzeti iz desnog dela parnih, testnih materijala analize moždanih kriški za analizu biodistribucije. Lokacija uzoraka mozga je fotografisana na obdukciji i zabeležen je broj preseka mozga. Uzorci su dobijeni kružnim udarcem od 4 mm ili isečeni skalpelom da bi se optimizovala količina sakupljene bele mase. Svi proboji su zamrznuti i čuvani na -60°C ili ispod za analizu testnog materijala. Ostatak moždanog dela je zamrznut i čuvan na -60°C ili niže radi moguć e analize testnog materijala. Lokacije proboja su prikazane u Dodatku B.

[0306] Kičmena moždina (cervikalni, grudni i lumbalni) je isečena na delove od jednog centimetra. Prvi i svaki drugi presek nakon toga su fiksirani u formalinu radi histopatolo ške i imunohistohemijske analize. Druga kriška kičmene moždine i svaka druga kriška nakon toga su zamrznuti i čuvani na -60°C ili niže za analizu testnog materijala. Raspodela rezova je podešena tako da je presek sa vrhom intratekalnog katetera (Slice 0) fiksiran u formalinu i analiziran na histopatologiju.

Priprema ekstrakta mozga, jetre i kičme i određivanje koncentracije rhASA

[0307] Uzorci moždanih udara, kičmene moždine i jetre su analizirani korišć enjem validirane metode u skladu sa propisima o dobroj laboratorijskoj praksi (GLP) američke administracije za hranu i lekove (GLP) 21 CFR, deo 58 i sa važeć im operativnim standardom Midvest BioResearch procedure. Uzorci tkiva su homogenizovani u puferu za lizu, centrifugirani da bi se uklonili ostaci tkiva i čuvani na -80°C do analize. Koncentracija rhASA u rastvorljivim frakcijama homogenata je određena pomoću ELISA koristeći poliklonsko zečje antitelo SH040 kao antitelo za hvatanje i HRP (peroksidaza hrena) konjugovano anti-ASA monoklonsko antitelo 19-16-3 kao detekciono antitelo. Nakon koraka ispiranja da bi se uklonili nevezani materijali, rastvor supstrata tetrametilbenzidina (TMB) je reagovao sa peroksidom u prisustvu HRP-konjugovanog antitela da bi proizveo kolorimetrijski signal koji je bio proporcionalan koli čini ASA vezanog anti-ASA antitela u početnom koraku. Dobijena količina rhASA u svakom homogenatu tkiva je interpolirana iz standardne krive.

[0308] Uzorci su takođe analizirani testom određivanja proteina bicinhoninske kiseline (BCA) da bi se dobila koncentracija proteina u nepoznatom uzorku. Koncentracija proteina za svaki uzorak je odre đena interpolacijom standardne krive albumina. Rezultati koncentracije rhASA su zatim normalizovani na ukupni protein u ekstraktima tkiva, kao što je određeno testom bicinhoninske kiseline.

[0309] Nivoi ASA svih proboja za nosač, 1,8 mg/dozi, 6,0 mg/dozi i 18,6 mg/dozi grupe su prikazani na Slici 23, Slici 24, Slici 25 i Slici 26, respektivno. Nivoi ASA svih proboja za životinje za oporavak za kontrolu uređaja, nosač, 1,8 mg/dozi, 6,0 mg/dozi i 18,6 mg/dozi grupe su prikazani na slici 27, slici 28, slici 29, slici 30 i slici 31, respektivno.

[0310] Nivoi ASA za odabrane proboje koji su uzeti blizu površine (meninge) mozga prikazani su na slici 32. Nivoi ASA za odabrane proboje za koje se smatra da sadrže uglavnom duboku belu moždanu masu prikazani su na slici 33. Bela masa sastoji se od snopova mijelinizovanih procesa nervnih ć elija (ili aksona). Odabrani proboji koji uglavnom sadrže materijal iz duboko sive moždane mase prikazani su na slici 34. Siva masa sadrži tela nervnih ć elija, za razliku od bele mase. Vrednosti ASA u odabranim probojima sa površine, tamnobele i duboko sive su prikazane za svaku grupu doza na slici 35.

[0311] Podaci o koncentraciji kičmene moždine su prikazani na slici 36.

[0312] Podaci o koncentraciji u jetri su prikazani na Slici 37.

[0313] Nivoi koncentracije ASA u jetri, kičmenoj moždini i mozgu u kontrolnim grupama koje su dozirale uređaj i nosač su u nekim slučajevima bili merljivi. Nivoi u jetri i kičmenoj moždini bili su niži od bilo koje grupe tretirane rhASA (Slika 23, Slika 32 i Slika 33). Nivo rhASA izmeren u kontrolnim uređajima i životinjama koje su dozirane nosačem predstavlja unakrsnu reaktivnost između anti-rhASA antitela korišć enog u ELISA testu sa prirodnim proteinom majmuna cinomolgus. Prijavljene vrednosti u kontrolnom aparatu i tkivima nosača ne predstavljaju kvantitativne vrednosti za rhASA cinomolgus majmuna u tkivima, jer stepen unakrsne reaktivnosti između antitela i cinomolgus ASA nije poznat, kao i činjenica da standardi testa koriste humanu ASA. Međutim, bez želje da budemo vezani bilo kakvom teorijom, varijacije u nivoima ASA otkrivene između kontrole uređaja i tkiva doziranih nosačem mogu se tumačiti kao pokazana varijabilnost u relativnim količinama cinomolgus ASA u različitim tkivima i anatomskim regionima.

[0314] Nivoi ASA u rezovima kičmene moždine kretali su se u rasponu od 160-2352, 1081-6607 i 1893-9252 ng/mg proteina kod mužijaka i 0-3151, 669-6637 i 1404-16424 ng/mg proteina kod ženki za protein grupe od 1,8, 6,0 i 18,6 mg/dozi, respektivno (Slika 32). Nivoi ASA su bili viši u lumbalnoj regiji kičme nego u cervikalnom regionu. Nivoi ASA proteina otkriveni u jetri su bili osetljivi na dozu u grupama koje su tretirane rhASA i bile su veoma niske u grupi sa nosačem. Srednji nivoi ASA bili su 88, 674 i 2424 kod mužijaka i 140, 462 i 1996 ng/mg proteina kod ženki za grupe od 1,8, 6,0 i 18,6 mg/dozi, respektivno (Slika 33).

[0315] Sve u svemu, činilo se da je nivo ASA zavisan od doze u uzorcima pripremljenim od rezova kičmene moždine i jetre grupa koje su primale rhASA. Mnogi od testiranih regiona mozga pokazali su jasnu vezu doze između nivoa ASA i primene rhASA, dok su drugi bili dvosmisleniji. Generalno, nivoi ASA u mozgu su se poveć ali sa dozom rhASA.

Primer 8: STUDIJA FARMAKOKINETIKE I BIODITRIBUCIJE

[0316] Cilj ove studije je da proceni farmakokinetičku (PK) i biodistribuciju različitih terapijskih zamenskih enzima posle intratekalne (IT) i intravenske (IV) primene kod cinomolgus majmunima.

[0317] U ovoj studiji, ukupno dvanaest mužjaka i dvanaest ženki cinomolgus majmuna sa patentiranim intratekalno-lumbalnim (IT-L) i intratekalnim-cisterna magna (IT-CM) kateterima je nasumi čno raspoređeno prema telesnoj težini u četiri grupe tretmana za fazu 1a (davanje IS2) i faza 1b (davanje ASA).

[0318] Krv i CSF (iz IT-CM katetera) su sakupljeni u određenim intervalima posle doziranja za obe faze. Nakon što su poslednji uzorci sakupljeni iz Faze 1a, životinjama je omoguć en period ispiranja od 7 dana pre početka Faze 1b.

[0319] Nakon što su poslednji uzorci sakupljeni iz Faze 1b, životinjama ć e biti dozvoljen period ispiranja od 7 dana između početka Faze 2. Ukupno 12 mužjaka i ženki cinomolgus majmuna iz Faze 1b nasumično je raspoređeno prema telesnoj težini u 12 grupe tretmana IS2 (grupe 1a-6a) i ASA (grupe 1b-6b).

[0320] Apsolutna bioraspoloživost ASA u serumu nakon primene IT-L je ∼ 30 do 40 %. Nasuprot tome, samo 0,5 % IV doze je bioraspoloživo u CSF.

[0321] Izloženost ASA u serumu se poveć ava na više nego proporcionalan način nakon primene IT-L.

[0322] Nakon primene IT-L, izloženost ASA u CSF se poveć ava na manje nego proporcionalan način sa povećanjem doze. Rezime PK parametara rhASA u serumu, PK parametara rhASA u serumu u CSF i bioraspoloživosti prikazani su u tabelama 45-47.

TABELA 45 - REZIME PK PARAMETARA ASA U SERUMU CINOMOLGUS MAJMUNA

TABELA 46 - REZIME PK PARAMETARA ASA U CSF CINOMOLGUS MAJMUNA

1

TABELA 47 – BIODOSTUPNOST ASA U SERUMU I CSF

[0323] Bioraspoloživost ASA u serumu nakon primene IT-L je ∼ 30-40 %. Nasuprot tome, samo 0,5 % primenjene doze IV je bioraspoloživo u CSF. Podela seruma CSF je prikazana u tabeli 48.

TABELA 48 – CSF:PODELA SERUMA

PRIMER 9 – LEČENJE MLD PACIJENATA

[0324] Direktna primena CNS-a preko, na primer, IT isporuke može se koristiti za efikasno lečenje pacijenata sa MLD. Ovaj primer ilustruje multicentričnu studiju eskalacije doze dizajniranu da proceni bezbednost do 3 nivoa doze svake druge nedelje (EOV) za ukupno 40 nedelja rhASA primenjenog preko intratekalnog uređaja za isporuku leka (IDDD) pacijentima sa kasnim infantilnim MLD. Različiti primeri uređaja za intratekalno davanje leka pogodnih za lečenje ljudi su prikazani na slikama 45-48.

[0325] Do 20 pacijenata ć e biti upisano:

Kohort 1: 5 pacijenata (najniža doza)

Kohort 2: 5 pacijenata (srednja doza)

Kohort 3: 5 pacijenata (najviša doza)

5 pacijenata ć e biti randomizirano bez tretmana.

[0326] Pacijenti se biraju za studiju na osnovu sledeć ih kriterijuma: (1) pojava prvih simptoma pre 30 meseci starosti; (2) ambulantan u vreme skrininga (definisano kao sposobnost da se ustane sam i hoda napred 10 koraka sa jednom rukom); (3) prisustvo neuroloških znakova u vreme skrininga. Obično je isključena istorija transplantacije hematopoetskih matičnihć elija kod pacijenata.

[0327] Utvrđena je bezbednost rastuć ih doza rhASA primenjenih IT injekcijom tokom 40 nedelja kod dece sa kasnim infantilnim BLAG. Pored toga, procenjuje se klinička aktivnost rhASA na grubu motoričku funkciju i farmakokinetika pojedinačne i ponovljene doze u serumu i koncentracije u cerebrospinalnoj tečnosti (CSF).

[0328] Dok su određena jedinjenja, kompozicije i metode opisane ovde opisane sa specifi čnošć u u skladu sa određenim realizacijama, primeri služe samo da ilustruju jedinjenja pronalaska i nemaju za cilj da ih ograniče.

[0329] Članovi "a" i "an" kako se ovde koriste u specifikaciji i patentnim zahtevima, osim ako nije jasno naznačeno suprotno, treba shvatiti da uključuju množinu reference. Tamo gde su elementi predstavljeni u ovom opisu kao liste (npr. u Markush grupi ili sličnom formatu), treba razumeti da je svaka podgrupa elemenata takođe otkrivena, i da se bilo koji element(i) može ukloniti iz grupe. Trebalo bi razumeti da, uopšteno govoreći, kada se pronalazak ili aspekti pronalaska pominju kao da sadrže određene elemente, karakteristike itd., određene realizacije pronalaska ili aspekate pronalaska od kojih se sastoje, ili se u suštini sastoje od takvih elemenata, karakteristika, itd. Radi jednostavnosti ove realizacije nisu u svakom slučaju posebno izložene u toliko mnogo reči ovde.

2

�

Claims (15)

Patentni zahtevi

1. Formulacija na bazi fiziološkog rastvora ili pufera koja sadrži 10 mg/ml ili više arilsulfataze A (ASA) za upotrebu u metodi lečenja metahromatske leukodistrofijske bolesti kod subjekta pri čemu navedeni metod obuhvata direktno administriranje navedene formulacije u cerebrospinalnu te čnost navedenog subjekta putem intraparenhimalne, intracerebralne, intraventrikularne cerebralne (ICV) ili intratekalne (IT) administracije.

2. Formulacija na bazi fiziološkog rastvora ili pufera za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu formulacija na bazi fiziološkog rastvora ili pufera dalje sadrži pufersko sredstvo izabrano iz grupe koju čine fosfat, acetat, histidin, sukcinat, citrat, Tris i njihove kombinacije.

3. Formulacija na bazi fiziološkog rastvora ili pufera za upotrebu prema patentnom zahtevu 2, pri čemu je pufersko sredstvo fosfat, opciono pri čemu je fosfat prisutan u koncentraciji:

(i) ne ve ć oj od 50 mM, i/ili

(ii) ne već oj od 20 mM.

4. Formulacija na bazi fiziološkog rastvora ili pufera za upotrebu prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je ASA protein prisutan u koncentraciji izabranoj od 10 mg/ml, 30 mg/ml, 50 mg/ml ili 100 mg/ml.

5. Formulacija na bazi fiziološkog rastvora ili pufera za upotrebu prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu ASA protein sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR:1.

6. Formulacija na bazi fiziološkog rastvora ili pufera za upotrebu prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je ASA protein proizveden od:

(i) ljudske ć elijske linije, ili

(ii) CHOć elija.

7. Formulacija na bazi fiziološkog rastvora ili pufera za upotrebu prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu što sadrži NaCl u koncentraciji u rasponu od 0-300 mM, npr. 137-154 mM, opciono pri čemu je koncentracija NaCl približno 154 mM.

8. Formulacija na bazi fiziološkog rastvora ili pufera za upotrebu prema patentnom zahtevu 7, pri čemu što dalje sadrži polisorbatni surfaktant.

9. Formulacija na bazi fiziološkog rastvora ili pufera za upotrebu prema patentnom zahtevu 8, pri čemu je polisorbat surfaktant izabran iz grupe koju čine polisorbat 20, polisorbat 40, polisorbat 60, polisorbat 80 i njihova kombinacija, opciono pri čemu je polisorbat surfaktant polisorbat 20, opciono pri čemu je polisorbat 20 prisutan u koncentraciji u rasponu od 0-0,2 %, opciono približno 0,005 %.

10. Formulacija na bazi fiziološkog rastvora ili pufera za upotrebu prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu formulacija ima pH od 5,5-6,5, opciono pri čemu formulacija ima pH od približno 6,0.

11. Formulacija na bazi fiziološkog rastvora ili pufera za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 10, pri čemu je formulacija rekonstituisana iz liofilizovane formulacije sa razblaživačem.

12. Formulacija na bazi fiziološkog rastvora ili pufera za upotrebu prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu formulacija dalje sadrži sredstvo za stabilizaciju izabrano iz grupe koju čine šeć er, neredukcioni še ć er i/ili aminokiselina.

13. Formulacija na bazi fiziološkog rastvora ili pufera za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 12, pri čemu se intratekalna administracija odvija:

(i) jednom u dve nedelje.

(ii) jednom mesečno, ili

(iii) jednom u dva meseca.

14. Formulacija na bazi fiziološkog rastvora ili pufera za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 13, pri čemu intratekalna administracija koristi

(a) u vezi sa intravenskom administracijom, opciono pri čemu intravenska administracija nije češć a od:

(i) jednom mesečno, ili

(ii) jednom u dva meseca; ili

(b) u odsustvu intravenske administracije; i/ili

(c) u odsustvu istovremene imunosupresivne terapije.

15. Formulacija na bazi fiziološkog rastvora ili pufera za upotrebu prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je formulacija na bazi fiziološkog rastvora ili pufera obezbeđena u posudi koja sadrži jedan dozni oblik, opciono pri čemu

(a) posuda se bira između ampule, bočice, kertridža, rezervoara, lio-jekta ili prethodno napunjenog šprica, opciono pri čemu se napunjeni špric bira između špriceva od borosilikatnog stakla sa pečenim silikonskim premazom, špriceva od borosilikatnog stakla sa prskanim silikonom ili plastičnih špriceva od smole bez silikona; i/ili

(b) formulacija na bazi fiziološkog rastvora ili pufera je prisutna u zapremini manjoj od:

(i) oko 50,0 mL, ili

(ii) oko 3,0 mL.