RS62645B1 - Upotreba supstrata za povećanje fluorescencije - Google Patents

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na upotrebu nano-strukturiranih površina, koje su posebno pogodne za povećanje fluorescencije pogodnih molekula kada se ti molekuli približe ovim površinama. Ovaj efekat je takođe poznat kao fluorescencija povećana metalom (MEF, "Metal Enhanced Fluorescence") ili površinsko povećanje fluorescencije (SEF, "Surface Enhanced Fluorescence").

[0002] MEF i SEF baziraju se na elektromagnetnoj interakciji upadne (pobudne), uglavnom koherentne (tj. laserske) svetlosti sa plazmom elektrona nano-metalnih struktura. Ovo dovodi do povećanja svetlosnog prinosa fluorescentnih molekula kada se približe (npr. vezuju) površini koja ima takve metalne strukture. Kao rezultat, molekuli vezani za površinu svetle intenzivnije jer je njihova fluorescencija pojačana.

[0003] Povećanjem fluorescencije, molekuli vezani za površinu mogu se meriti u najnižim koncentracijama. Na primer, vezivanje fluorescencijom obeleženog antitela može se pratiti direktno u obliku njegove kinetike vezivanja.

[0004] Obim pojačanja zavisi od oblika, veličine i rastojanja nano-metalnih struktura i od vrste korišćenog metala (npr. Au, Ag, Al itd.). U literaturi, na primer, postoje opisi sfernih (obično koloidi; vidi npr. B Yang et al. Small 6(2010): 1038-43; Corrigan T et al J Fluorescence 15(2005):777-784) trouglastih ili piramidalnih metalnih struktura (vidi npr. Pompa et al. Nature Nanotechnology 1(2006):126 -130; Cade et al. Nanotechnology.15(2009):20(28)) ili metalnih struktura u obliku žice ili šipke, koje nisu povezane i obrazuju takozvana metalna ostrva. Međutim, postignuti faktori pojačanja variraju i nanometalne strukture se u većini slučajeva ne mogu reprodukovati.

[0005] U US 2005/214841 opisani su supstrati koji imaju veći broj udubljenja i najmanje delimično su sa prevlakom metala. Supstrat može da se sastoji od širokog spektra materijala kao što su npr. staklo, keramika ili metal. Na površinu supstrata prema US 2005/214841, naročito u njegova udubljenja, nanose se linkeri koji zahvaljujući funkcionalnim grupama mogu da imobilišu biološke supstance. Ova US prijava ne pominje da bi u njoj opisani supstrati bili pogodni za povećanje fluorescencije molekula.

[0006] U US 6,902,705 opisani su supstrati koji takođe imaju udubljenja i mogu da imaju prevlaku metala (npr. zlato). Površina supstrata je modifikovana da bi se omogućilo vezivanje bioloških supstanci (npr. DNK) za površinu supstrata. Čini se da stvaranje udubljenja na supstratu ima prednost u tome što se merenja fluorescencije mogu izvesti bez prijema ometajućih i interferirajućih signala. Međutim, pojačanje signala fluorescencije ne može se postići sa ovim supstratima.

[0007] U WO 2009/059204 otkriveni su supstrati koji se mogu koristiti za povećanje fluorescencije jednog ili više fluorescentnih molekula. Površina ovih supstrata može da ima udubljenja u koja se mogu uvesti molekuli koji se detektuju.

[0008] U WO 2007/094817 opisani su elementi kojima se može povećati fluorescencija fluorescentnih molekula i koji obuhvataju supstrat prekriven metalnim slojem. Metalni sloj ima najmanje jedno udubljenje i debljinu od približno 100 nm. U ovom dokumentu opisana udubljenja imaju prečnik od približno 200 nm i dubinu od 150 nm.

[0009] U Liu Y et al. (Nanotechn 15(2004):1368-1374) opisani su biosenzori koji imaju udubljenja na svojoj površini i mogu da povećaju fluorescenciju fluorescentnih molekula na svojoj površini Prečnik ovih udubljenja je približno 200 nm, a međusobno rastojanje udubljenja približno 1 µm. Uporedivo sa Liu Y et al. takođe su u Liu Y et al. (Opt Lett 28(2003):507-509), Brolo AG et al. (J Am Chem Soc 127(2005):14936-14941) i Schmidt TM et al. (J Phys Chem 118(2014):2138-2145) navedeni uporedivi supstrati.

[0010] U Gartia MR et al. (Adv Optical Mater 1(2013):68-76) otkriveni su nizovi na čijoj su površini smeštene "nano Likurgove čaše" ("Nano Lycurgus Cups"). Ovi nizovi mogu da se koriste za kolorimetrijsko snimanje plazmonske rezonance ("colorimetric plasmon resonance imaging"). U kasnije objavljenoj publikaciji Seo S et al. (J Phys Chem C 119(2015):18518-18526) napominje se da supstrati opisani u Gartia MR et al. mogu da se koriste za povećanje fluorescencije.

[0011] Ovaj pronalazak odnosi se na upotrebu supstrata za povećanje fluorescencije jednog ili više fluorescentnih molekula, pri čemu supstrat obuhvata čvrsti polimerni nosač sa većim brojem međusobno razdvojenih udubljenja, a taj čvrsti nosač je prevučen najmanje delimično srebrom ili legurama koje obuhvataju srebro, pri čemu su udubljenja na međusobnom rastojanju od 0,2 µm do 2,5 µm i imaju dubinu od 0,1 µm do 5 µm, a metalni sloj na čvrstom nosaču ima debljinu od 10 nm do 60 nm.

[0012] Iznenađujuće je otkriveno da supstrati sa strukturom prema ovom pronalasku mogu da u velikoj meri povećaju prinos fluorescencije (kvantni prinos) nekog fluorescentnog molekula ili nekog fluorofora sa i bez upotrebe koherentne svetlosti, pod uslovom da se najmanje jedan fluorescentni molekul ili fluorofor nalazi u blizini (fluorescencija povećana metalom; MEF). "Prinos fluorescencije" ili "kvantni prinos" predstavlja odnos između broja emitovanih i apsorbovanih fotona.

[0013] Prinos fluorescencije sa tim supstratima čak je višestruko veći od prinosa pri korišćenju već poznatih supstrata, na čijoj su površini obično metalna ostrva. Ovo povećanje prinosa fluorescencije je iznenađujuće, budući da se prethodno smatralo da se MEF-efekat samo može javiti na površinama koje imaju metalna ostrva u obliku deponovanih koloida koji sadrže metal ili druga međusobno izolovana područja sa metalnom prevlakom na površini (Matveeva E. et al., Anal Biochem _334(2004):303-11; Geddes C.D., et al. J Fluoresc 12(2002):121-129). Poznato je da supstrati sa kontinuiranim metalnim slojem ili bez izbočina ne pokazuju ili pokazuju veoma mali MEF-efekat zbog efekta gašenja fluorescencije same metalne površine (Pineda E.C., et al. J. Chem. Phys.83(1985):5330-5337; Barnes W.L., J Mod Opt, 45(1998):661-699). Zbog ovoga, stručnjak u ovoj tehnici, koji nije upoznat sa ovim pronalaskom, odabrao bi čvrsti nosač sa izbočinama a ne nosač sa udubljenjima za nanošenje prevlake metala. Prema ovom pronalasku, supstrat se koristi za povećanje fluorescencije fluorofora. To jest, prema ovom pronalasku, koriste se supstrati uvek kada se želi postići povećanje fluorescencije (tj. povećanje prinosa fluorescencije). Prema tome, supstrat može da se koristi npr. u imunotestovima, bilo kom obliku molekularne dijagnostike pomoću nukleinskih kiselina (PCR, RT-PCR), biotestovima na bazi ćelija (kao što se obično javlja kod High-Throughput-Screening (visokopropusni skrining), histološkim ili celularnim ispitivanjima, multipleksnim testnim sistemima (npr. LUMINEX), pod uslovom da se fluorescencija koristi za detekciju ciljnih molekula.

[0014] Prema nekom poželjnom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, fluorescencija se povećava na rastojanju od 0 do 50 nm, poželjno od 1 do 50 nm, još poželjnije od 1 do 40 nm, još poželjnije od 2 do 40 nm, još poželjnije od 1 do 30 nm, još poželjnije od 2 do 30 nm, još poželjnije od 3 do 30 nm, još poželjnije od 1 do 20 nm, još poželjnije od 2 do 20 nm, još poželjnije od 3 do 20 nm, još poželjnije od 5 do 20 nm, još poželjnije od 5 do 15 nm, u odnosu na metal koji je na površini čvrstog polimernog nosača.

[0015] Prema ovom pronalasku, "fluorescentni molekuli", kao što se ovde koriste, obuhvata molekule koji spontano emituju svetlost nakon što su pobuđeni elektromagnetnim talasima, kao što je npr. svetlost određene talasne dužine. "Fluorofori" je ovde krovni termin i sinonim za takve molekule i, prema tome, obuhvata i molekule koji fluoresciraju ili slabo fluoresciraju, a obično se ne pominju kao fluorofori. Primeri tih molekula su proteini ili nukleinske kiseline čija je fluorescencija ("intrinzična fluorescencija") posredovana aromatičnim strukturama (npr. preko aminokiselina triptofan ili tirozin).

[0016] "Čvrst nosač" prema ovom pronalasku može da se sastoji od bilo kojeg polimernog materijala, pod uslovom da se on može zaštiti nekim metalom i da se mogu proizvesti udubljenja. Na primer, čvrst polimerni nosač obuhvata ili se sastoji od sintetičkih polimera kao što su polistirol, polivinilhlorid ili polikarbonat, ciloolefin, polimetilemtakrilat, polilaktat ili njihove kombinacije. U principu, mogu da se koriste, takođe, nepolimerni nosači kao što su metali, keramike ili staklo, pod uslovom da se može naneti prevlaka metala i da se mogu proizvesti udubljenja.

[0017] Čvrst nosač obuhvata najmanje jedan materijal odabran iz grupe koju čine termoplastični polimeri i polikondenzati.

[0018] Prema nekom poželjnom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, termoplastični polimer odabran je iz grupe koju čine poliolefini, vinilpolimeri, stirolpolimeri, poliakrilat, polivinilkarbazol, poliacetal i fluoroplasti.

[0019] Polikondenzat je poželjno odabran iz grupe koju čine termoplastični polikondenzati, duroplastični polikondenzati i poliadukti.

[0020] Prema nekom naročito poželjnom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, materijal polimernog čvrstog nosača obuhvata organske i/ili neorganske aditive i/ili punioce, pri čemu su poželjno odabrani iz grupe koju čine TiO2, staklo, ugljenični materijal, pigmenti boja, lipidi i voskovi. Supstrat za povećanje fluorescencije fluorofora može se proizvesti postupkom opisanim u skladu sa ovim otkrivanjem. Čvrsti nosači uključujući udubljenja mogu u osnovi da se proizvode različitim postupcima (vidi Fig.15).

(a) Čvrsti nosači, zajedno sa udubljenjima, proizvode se u jednoj fazi (npr. brizganje) (vidi Fig. 15(a))

(b) Udubljenja se izrađuju u postojećem čvrstom nosaču u daljim fazama postupka (npr. vruće izbijanje, litografija elektronskim snopom ili "ekstremna ultraljubičasta" (EUV) u vezi sa reaktivnim jonskim nagrizanjem ili laserskom ablacijom) (vidi Fig.15(b))

(c) Na čvrsti nosač nanosi se tanak, strukturni polimerni sloj u kojem se izrađuju udubljenja kao što je slučaj, na primer, u proizvodnji BD-50 Blu-ray diska (UV litografija nanoutiskivanjem) (vidi Fig.15(c)).

[0021] Posebno pogodna za proizvodnju ovih struktura je takozvana nanoreljefna litografija (Chou S. et al., Nanoimprint lithography, Journal of Vacuum Science & Technology B Volume 14, Nr.6, 1996, S. 4129-4133). Za proizvodnju nanostruktura pomoću nanoreljefne litografije potreban je pozitiv, obično monomer ili polimer, kao i nanostrukturirani pečat ("master"). Sam pečat može se proizvesti nanolitografijom iako se može alternativno proizvesti i bakropisom. Pozitiv se nanosi na supstrat, a zatim se zagreva iznad temperature staklenog prelaza, tj. pre utiskivanja pečat se rastapa. Da bi se postiglo kontrolisano (i kratkotrajno) zagrevanje, često se koristi laser ili UV svetlost. Zbog viskoznosti pozitiva prilikom zagrevanja, on u potpunosti ispunjava pukotine u pečatu. Nakon hlađenja uklanja se pečat ponovo. Pozitiv, koji predstavlja čvrsti nosač supstrata, prevlači se metalom pomoću postupka prskanja.

[0022] Oblikovanje pečata za litografiju može se ponovo izvesti nanoutiskivanjem. Za tu svrhu se kao materijal koristi staklo ili svetlopropusna plastika.

[0023] Naročito je poželjna proizvodnja čvrstog nosača, koji uključuje udubljenja, brizganjem. Umeci kalupa za ovo se obično uklanjaju iz litografski proizvedene Si pločice pomoću Ni galvanizacije.

[0024] Čvrsti nosač može suštinski da ima bilo koji oblik (npr. sferni, ravan), pri čemu je naročito poželjan ravan oblik.

[0025] "Udubljenje" kako se ovde koristi odnosi se na nivo površine čvrstog nosača koji okružuje udubljenje i prostire se u nosaču, a ne van njega kao izbočina ili uzvišenje. Udubljenje u smislu ovog pronalaska ima dno koje je ograničeno bočnim zidovima. Dubina je stoga rastojanje od površine do dna udubljenja. Udubljenja na čvrstom nosaču mogu imati različite oblike (npr. okrugle, ovalne, kvadratne, pravougaone).

[0026] "Veći broj" udubljenja, kao što se ovde koristi, znači da čvrsti nosač ima najmanje jedno, poželjno najmanje dva, još poželjnije najmanje 5, još poželjnije najmanje 10, još poželjnije najmanje 20, još poželjnije najmanje 30, još poželjnije najmanje 50, još poželjnije najmanje 100, još poželjnije najmanje 150, još poželjnije najmanje 200, udubljenja. Ova udubljenja mogu biti obezbeđena na površini čvrstog nosača od 1000 µm<2>, poželjno od 500 µm<2>, još poželjnije od 200 µm<2>, još poželjnije od 100 µm<2>.

Alternativno, udubljenja se mogu prostirati po dužini od poželjno 1000 pm, još poželjnije od 500 µm, još poželjnije od 200 µm, još poželjnije od 100 µm.

[0027] "Međusobno razdvojena udubljenja", kao što se ovde koristi, znači da su udubljenja razdvojena jedno od drugog njihovim bočnim granicama i nemaju nikakve veze jedno sa drugim na površini čvrstog nosača.

[0028] Prema nekom poželjnom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, udubljenja čvrstog nosača imaju neku dužinu i neku širinu, pri čemu je odnos dužine prema širini 2:1 do 1:2, posebno približno 1:1.

[0029] Udubljenja na čvrstom nosaču mogu u suštini biti bilo kog oblika. Međutim, naročito su poželjna udubljenja koja imaju odnos dužine prema širini od 2:1 do 1:2, poželjno 1,8:1, poželjno 1,6:1, poželjno 1,5:1, poželjno 1,4:1, poželjno 1,3:1, poželjno 1,2:1, poželjno 1,1:1, poželjno 1:1,8, poželjno 1:1,6, poželjno 1:1,5, poželjno 1:1,4, poželjno 1:1,3, poželjno 1:1,2, poželjno 1:1,1, naročito 1:1.

[0030] Prema nekom daljem poželjnom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, dužina i širina udubljenja iznose 0,1 µm do 2 µm, poželjno 0,2 µm do 2 µm, poželjno 0,3 µm do 2 µm, poželjno 0,1 µm do 1,8 µm, poželjno 0,2 µm do 1,8 µm, poželjno 0,3 µm do 1,8 µm, poželjno 0,1 µm do 1,5 µm, poželjno 0,2 µm do 1,5 µm, poželjno 0,3 µm do 1,5 µm, poželjno 0,1 µm do 1,2 µm, poželjno 0,2 µm do 1,2 µm, poželjno 0,2 µm do 1,2 µm, poželjno 0,1 µm do 1 µm, poželjno 0,2 µm do 1 µm, poželjno 0,3 µm do 1 µm, poželjno 0,1 µm do 0,8 µm, poželjno 0,2 µm do 0,8 µm, poželjno 0,3 µm do 0,8 µm, poželjno 0,1 µm do 0,6 µm, poželjno 0,2 µm do 0,6 µm, poželjno 0,3 µm do 0,6 µm, najpoželjnije 0,2 µm do 0,6 µm.

[0031] Naročito poželjno, udubljenja čvrstog nosača su suštinski okruglog oblika, pri čemu "suštinski okrugao" takođe uključuje ovalne i elipsoidne oblike. Oblik udubljenja može se videti u prikazu površine čvrstog nosača odozgo.

[0032] Udubljenja imaju dubinu od 0,1 µm do 5 µm, poželjno od 0,1 µm do 4 µm, poželjno od 0,1µm do 3 µm, poželjno od 0,1 pm do 2 pm, poželjno od 0,1 pm do 1,5 pm, poželjno od 0,1 pm do 1,2 pm, poželjno od 0,1 pm do 1 pm, poželjno od 0,1 pm do 0,9 pm, poželjno od 0,1 pm do 0,8 pm, poželjno od 0,2 pm do 5 pm, poželjno od 0,2 pm do 4 pm, poželjno od 0,2 pm do 3 pm, poželjno od 0,2 pm do 2 pm, poželjno od 0,2 pm do 1,5 pm, poželjno od 0,2 pm do 1,2 pm, poželjno od 0,2 pm do 1 pm, poželjno od 0,2 pm do 0,9 pm, poželjno od 0,2 pm do 0,8 pm, poželjno od 0,3 pm do 5 pm, poželjno od 0,3 pm do 4 pm, poželjno od 0,3 pm do 3 pm, poželjno od 0,3 pm do 2 pm, poželjno od 0,3 pm do 1,5 pm, poželjno od 0,3 pm do 1,2 pm, poželjno od 0,3 pm do 1 pm, poželjno od 0,3 pm do 0,9 pm, poželjno od 0,3 pm do 0,8 pm. Dubina udubljenja je rastojanje od gornje površine čvrstog nosača sa prevlakom metala istaloženog naparavanjem do dna udubljenja.

[0033] Prema nekom poželjnom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, udubljenja imaju međusobno rastojanje ("period") od 0,3 pm do 1,4 pm, poželjno od 0,4 pm do 1,3 pm. U nekom daljem poželjnom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, udubljenja su na međusobnom rastojanju od 0,2 pm do 2 pm, poželjno od 0,2 pm do 1,8 pm, poželjno od 0,2 pm do 1,6 pm, poželjno od 0,2 pm do 1,5 pm, poželjno od 0,2 pm do 1,4 pm, poželjno od 0,2 pm do 1,3 pm, poželjno od 0,3 pm do 2,5 pm, poželjno od 0,3 pm do 2 pm, poželjno od 0,3 pm do 1,8 pm, poželjno od 0,3 pm do 1,6 pm, poželjno od 0,3 pm do 1,5 pm, poželjno od 0,3 pm do 1,3 pm, poželjno od 0,4 pm do 2,5 pm, poželjno od 0,4 pm do 2 pm, poželjno od 0,4 pm do 1,8 pm, poželjno od 0,4 pm do 1,6 pm, poželjno od 0,4 pm do 1,5 pm, poželjno od 0,4 pm do 1,4, poželjno od 0,5 pm do 2,5 pm, poželjno od 0,5 pm do 2 pm, poželjno od 0,5 pm do 1,8 pm, poželjno od 0,5 pm do 1,6 pm, poželjno od 0,5 pm do 1,5 pm, poželjno od 0,5 pm do 1,4 pm, poželjno od 0,5 pm do 1,3 pm, poželjno od 0,6 pm do 2,5 pm, poželjno od 0,6 pm do 2 pm, poželjno od 0,6 pm do 1,8 pm, poželjno od 0,6 pm do 1,6 pm, poželjno od 0,6 pm do 1,5 pm, poželjno od 0,6 pm do 1,4 pm, poželjno od 0,6 µm do 1,3 pm, poželjno od 0,7 µm do 2,5 pm, poželjno od 0,7 im do 2 µm, poželjno od 0,5 im do 1,8 pm, poželjno od 0,7 pm do 1,6 µm, poželjno od 0,7 pm do 1,5 µm, poželjno od 0,7 im do 1,4 pm, poželjno od 0,7 µm do 1,3 pm, pri čemu su udubljenja najpoželjnije na međusobnom rastojanju od 0,2 µm do 1,4 pm ili 0,3 µm do 1,3 µm. Rastojanje između udubljenja ("period") mereno je od centra udubljenja.

[0034] Prema nekom daljem poželjnom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, metalni sloj na čvrstom nosaču ima debljinu od 10 nm do 50 nm, poželjno od 15 nm do 60 nm, poželjno od 15 nm do 50 nm, poželjno od 20 nm do 60 nm, poželjno od 20 nm do 50 nm. Prema ovom pronalasku, čvrst polimerni nosač je "najmanje delimično" prevučen najmanje jednim metalom. "Najmanje delimično", kao što se ovde koristi, znači da je to područje čvrstog nosača u kojem su smeštena udubljenja najmanje 20%, poželjno najmanje 30%, još poželjnije najmanje 40%, još poželjnije najmanje 50%, još poželjnije najmanje 60%, još poželjnije najmanje 70%, još poželjnije najmanje 80%, još poželjnije najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95%, još poželjnije najmanje 98%, naročito 100%, prevučeno srebrom ili legurama koje obuhvataju srebro. Budući da MEF-efekat zahteva metalnu površinu, naročito je poželjno da površina čvrstog nosača, najmanje u području udubljenja, bude zaštićena najmanje jednim metalom. Pri tom, čvrsti nosač može da obuhvata i više (npr. najmanje dva, najmanje tri, najmanje četiri ili najmanje pet) metalnih slojeva izvedenih jedan na drugom i izrađenih od istog ili različitih metala. Jedna prednost korišćenja više slojeva metala na čvrstom nosaču je da prvi metalni sloj (npr. hrom), koji je direktno nanet na nosač, može da poboljša adheziju daljih metalnih slojeva.

[0035] Izraz "izvedeni jedan na drugom", kao što se ovde koristi, znači da je metalni sloj izveden direktno ili indirektno na drugom metalnom sloju. Ovo rezultira višeslojnim sistemom metalnih slojeva od istog metala ili različitih metala.

[0036] Metalni slojevi su poželjno kontinuirani i bez prekida. Prema ovom pronalasku, međutim, otkriveno je da metalni sloj ili metalni slojevi na čvrstom polimernom nosaču mogu i da imaju prekide, a da se, pri tom, ne pogorša efekat povećanja fluorescencije. Prekinuti metalni sloj može se izvesti, na primer, merenjem provodljivosti površine supstrata prema ovom pronalasku. Ako je mala provodljivost ili je nema znači da su metalni sloj(evi) na površini supstrata sa prekidima. Prekinuti metalni slojevi mogu se proizvesti, na primer, dovođenjem supstrata, koji je suštinski u potpunosti prekriven metalom, u kontakt sa rastvorom koji poželjno sadrži soli, kao što je, na primer, 10mM fosfatni pufer sa 150mM NaCl tokom određenog vremenskog perioda (10-90 minuta).

[0037] Čvrsti nosač je najmanje prevučen srebrom ili legurom koja obuhvata srebro. Poželjno, metalni sloj obuhvata najmanje dva, još poželjnije najmanje tri, još poželjnije najmanje četiri, još poželjnije najmanje pet, različitih metala. Metali se mogu naneti na čvrsti nosači pomoću postupaka poznatih u stanju tehnike, pri čemu se poželjno koriste prskanje (katodno prskanje) ili termičko naparavanje, naparavanje korišćenjem elektronskog snopa, naparavanje korišćenjem laserskog snopa, naparavanje sa katodnim lukom, epitaksija molekularnih zraka, taloženje potpomognutog jonskim snopom i jonska obloga.

[0038] Dodatni metal može da bude odabran iz grupe koju čine zlato, aluminijum, hrom, indijum, bakar, nikl, paladijum, platina, cink, kalaj i legure koje obuhvataju jedan ili više ovih metala.

[0039] Ovi metali ili njihove legure mogu se koristiti za izradu prevlake na čvrstom nosaču. Prema ovom pronalasku, prevlačenje čvrstog nosača srebrom ili legurama koje obuhvataju srebro, jer srebro ili njegove legure pokazuju naročito veliko pojačanje. Naročito je poželjna legura koja obuhvata srebro, indijum i kalaj. Legure koje sadrže srebro poželjno imaju sadržaj srebra veći od 10%, još poželjnije veći od 30%, još poželjnije veći od 50%, još poželjnije veći od 70%, još poželjnije veći od 80%, još poželjnije veći od 90%.

[0040] Nakon prevlačenja čvrstog nosača najmanje jednim metalom ili pre upotrebe supstrata ili čvrstog nosača, čvrsti nosač ili supstrat se poželjno obrađuje vodenom kompozicijom koja obuhvata najmanje jednu kiselinu ili jednu so halogena odabranih iz grupe koju čine fluor, hlor, brom i jod.

[0041] Pokazalo se da povećanje fluorescencije može da se poboljša ponovo prethodnom obradom supstrata ili čvrstog nosača vodenim rastvorom (npr. pufer) koji obuhvata najmanje jednu kiselinu nekog halogena ili neku njenu so. Prema tome, naročito je poželjno da se prethodno obradi čvrsti nosač ili supstrat rastvorom kiseline ili soli.

[0042] Alternativno, za tu svrhu može da se koristi i vodeni rastvor (npr. pufer) koji obuhvata najmanje jednu kiselinu ili neku so halogena tokom merenja umesto drugih rastvora.

[0043] Prema ovom pronalasku, pogodne su sve kiseline grupe halogena ili njihove soli , pri čemu radioaktivni halogeni nisu poželjni u praksi. Prema tome, naročito je poželjno da se koriste kiseline ili soli halogena fluora, hlora, broma i joda, najpoželjnije hloridi, posebno metalni hloridi. Kiseline ili soli korišćene prema ovom pronalasku naročito su poželjno soli alkalnih metala ili zemnoalkalnih metala, posebno soli natrijuma, kalijuma ili litijuma.

[0044] Prema nekom naročito poželjnom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, vodena kompozicija obuhvata najmanje jednu kiselinu ili so odabranu iz grupe koju čine HCl, HF, HBr, HJ, NaCl, NaF, NaBr, NaJ, KCl, KF, KBr i KJ.

[0045] Vodena kompozicija koja obuhvata najmanje jednu kiselinu nekog halogena ili neku njenu so može, pored najmanje jedne kiseline ili njene soli, da obuhvata druge supstance kao što su npr. druge kiseline ili soli. Naročito su poželjne supstance koje ispunjavaju funkciju pufera (npr. dinatrijumhidrogenfosfat, kalijumdihidrogenfosfat, karbonati).

[0046] Prema nekom daljem poželjnom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, čvrsti nosač tretira se vodenom kompozicijom tokom najmanje 1, poželjno tokom najmanje 2, još poželjnije tokom najmanje 5, još poželjnije tokom najmanje 10, još poželjnije tokom najmanje 20 minuta.

[0047] Pokazalo se prema ovom pronalasku da je efekat povećanja fluorescencije nosača prevučenog najmanje srebrom ili nekom legurom koja obuhvata srebro, naročito visok, ako se čvrsti nosač inkubira tokom najmanje 1 minuta sa vodenom kompozicijom koja obuhvata najmanje jednu kiselinu nekog halogena ili njenu so, poželjno na sobnoj temperaturi (22°C). Ako se inkubacija izvodi na višim temperaturama (npr. između 30°C i 40°C), vreme inkubacije može se shodno tome skratiti (npr. najmanje 30 sekundi). Međutim, ako se inkubacija izvodi na nižim temperaturama (npr. između 10°C i 20°C), vreme inkubacije se može produžiti shodno tome (npr. najmanje 2 minuta).

[0048] Prema poželjnom načinu ostvarivanja, supstrat je deo kapilarne cevi, mikrotitarske ploče, mikrofluidnog čipa, test trake (za "ispitivanja bočnog protoka"), nosača (npr. nosač predmeta) za fluorescentnu mikroskopiju, naročito za postupak visoke rezolucije kao što je konfokalna laserska mikroskopija prema principu tačkastog skenera, kao i 4Pi-mikroskop i STED (stimulisano smanjenje emisije)-mikroskop, niza senzora ili drugog optičkog polja detektora.

[0049] Naročito je poželjna upotreba supstrata u mikrotitarskim pločama, pri čemu je moguće da mikrotitarske ploče obuhvataju 6, 12, 24, 48, 96, 384 ili 1536 bunarčića. Mikrotitarske ploče koriste se za širok spektar merenja i testova, u kojima se obično meri fluorescencija uzoraka. Obezbeđivanjem supstrata u bunarčićima mikrotitarskih ploča može da se značajno pojača prinos fluorescencije uzoraka. Supstrati mogu da se poželjno uvedu i fiksiraju u bunarčićima pomoću širokog spektra postupaka.

Poželjno se supstrati fiksiraju u bunarčićima pomoću lepljenja, tehnika zavarivanja (npr. lasersko zavarivanje) i termičkog spajanja.

[0050] Prema nekom naročito poželjnom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, čvrsti nosač obuhvata ili se sastoji od ciklo-olefin kopolimera ili ciklo-olefin polimera i deo je mikrotitarske ploče ili je deo bunarčića mikrotitarske ploče. Kao naročito pogodan pokazao se COP 1060R (ZeonorⓇ 1060R). Nosač je poželjno sa prevlakom metala (npr. srebro) od 10 do 60 nm, poželjno do 40 nm.

[0051] Određena merenja sa fluorescentnim supstancama kao što su fluorofori izvode se u kapilarnim cevima. Za tu svrhu poželjno je da se supstrati obezbede u kapilarnim cevima. Primer primene je citometrija ili protočna citometrija, kojom se određuje broj ili, takođe, tip fluorescentnih ćelija ili fluorescencijom obeleženih ćelija merenjem fluorescencije.

[0052] Brojne primene za merenje fluorescencije odvijaju se u mikrofluidnim čipovima (npr. kao "Labon-a-chip" primena), pri čemu je moguće da supstrati prema ovom pronalasku mogu da se obezbede u području detekcije takvih čipova.

[0053] Takođe se supstrati prema ovom pronalasku mogu obezbediti u konvencionalnim kivetama. Kao rezultat, prinos fluorescencije se može značajno povećati u merenjima fluorescencije, tako da najmanje količine fluorescentnih supstanci mogu da se izmere u nekom uzorku. Prema ovom pronalasku, može da se koristi bilo koji oblik kivete.

[0054] U sistemima test traka ("ispitivanja bočnog protoka"), koji se koriste za brze testove ili terenske testove (Point of Care), za merenje može da se koristi supstrat prema ovom pronalasku (npr. u području detekcije ("Detection Line") da bi se povećala fluorescencija obeleženog analita (npr. fluorescencijom obeleženog antitela) i, pri tom, da bi se poboljšala osetljivost testa.

[0055] U dalje poželjnom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, supstrati se nanose na mikroskopske pločice kao što se koriste u mikroskopiji, posebno u fluorescentnoj mikroskopiji. Fluorescencija fluorofora korišćenih za obeležavanje ćelijskih struktura može se tako selektivno povećati, a optička rezolucija postupka se može drastično poboljšati, budući da je potreban manji intenzitet svetlosti koji bi optimizovao odnos signal/šum. Oblasti primene mogu biti postupci visoke rezolucije kao što su konfokalna laserska mikroskopija prema principu tačkastog skenera kao i 4Pi-mikroskopi i STED (stimulisano smanjenje emisije)-mikroskopi.

[0056] Prema nekom daljem poželjnom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, metalna prevlaka na površini supstrata najmanje delimično obuhvata molekule za direktno i/ili indirektno vezivanje fluorescentnih molekula.

[0057] Supstrati mogu da pojačaju fluorescenciju fluorescentnih molekula ili fluorofora, ako su fluorofori u neposrednoj blizini (poželjno manje od 20 nm) supstrata. Fluorofori ili fluorescentne supstance mogu slobodno da se kreću u tečnoj sredini, pri čemu se povećanje fluorescencije javlja samo kada ovi fluorofori ili fluorescentni molekuli priđu supstratu. Da bi se povećala verovatnoća približavanja fluorofora ili fluorescentnih molekula supstratu, od posebne je prednosti ako se molekuli nepovratno ili reverzibilno vežu za površinu supstrata (tj. za metalnu prevlaku), koji su ili fluorofor ili sam fluorescentni

1

molekul ("direktno vezivanje") ili molekul za koji je vezan neki fluorofor ili fluorescentni molekul (npr. fluorescencijom obeležena antitela; "indirektno vezivanje"). Postupci za vezivanje takvih molekula za metalne strukture dobro su poznati. U najjednostavnijem slučaju, vezivanje se izvodi fizičko-hemijskom adsorpcijom (posredovanom jonskim i hidrofobnim interakcijama) proteina na metalnoj površini (npr. Nakanishi K. et al. J Biosci Bioengin 91(2001):233-244). Kovalentni postupci za imobilizaciju proteina nakon izrade metalnih površina takođe su poznati (npr. GB Sigal et al. Anal Chem 68(1996):490-7).

[0058] Molekuli za direktno i/ili indirektno vezivanje fluorescentnih molekula ili fluorofora su poželjno odabrani iz grupe koju čine antitela, fragmenti antitela, poželjno Fab, F(ab)'2 ili scFv fragmenti, nukleinske kiseline, enzimi, lipidi, virusne čestice, aptameri i njihove kombinacije.

[0059] Ovi molekuli, s druge strane, mogu direktno da vezuju fluorofore ili fluorescentne molekule (npr. antitela i njihovi fragmenti, nukleinske kiseline, enzimi), a, s druge strane, ovi molekuli mogu i da vezuju druge molekule koji su obezbeđeni sa nekim fluoroforom ili nekom fluorescentnom supstancom.

[0060] "Fluorescentni supstrat za enzim", kao što se ovde koristi, je supstrat koji može da se veže za ili na aktivni centar enzima, pri čemu supstrat može da dobije fluorescentna svojstva. Naravno, supstrat može takođe da ima fluorescentna svojstva pre vezivanja za enzim.

[0061] Čvrsti nosači sa udubljenjima, kao što su prethodno definisani, zatim se prevlače sa jednim ili više metala (npr. dva, tri, četiri ili pet metala). Postupak za nanošenje prevlake metala na čvrste nosače dobro je poznat u tehničkoj oblasti, pri čemu se naročito poželjno koriste PVD-postupak (PVD; "Physical Vapor Deposition) kao i postupak prskanja ili postupak taloženja naparavanjem. Najmanje jedan metal može da se nanese postupkom prskanja ili termičkog naparavanja, naparavanja korišćenjem elektronskog snopa, naparavanja korišćenjem laserskog snopa, naparavanja sa katodnim lukom, epitaksije molekularnih zraka, taloženja potpomognutog jonskim snopom ili jonske obloge ili nekim drugim postupkom prema trenutnom stanju tehnike na površinu čvrstog nosača.

[0062] Da bi se omogućilo direktno i/ili indirektno vezivanje fluorofora ili drugih fluorescentnih supstanci na površini supstrata, molekuli za direktno i/ili indirektno vezivanje fluorofora putem adsorptivne ili kovalentne hemijske derivatizacije površine se najmanje delimično nanose na metalnu prevlaku na površini supstrata.

[0063] "Najmanje delimično", kao što se ovde koristi, znači da je najmanje 10%, poželjno najmanje 30%, još poželjnije najmanje 50%, još poželjnije najmanje 70%, još poželjnije najmanje 90%, još poželjnije najmanje 90%, naročito 100%, čvrstog nosača sa prevlakom metala obezbeđeno molekulima za direktno i/ili indirektno vezivanje fluorofora.

[0064] Prema nekom poželjnom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, molekuli za direktno i/ili indirektno vezivanje fluorofora odabrani su iz grupe koju čine antitela, fragmenti antitela, poželjno Fab, F(ab)'2 ili scFv fragmenti, nukleinske kiseline, enzimi, lipidi, virusne čestice, aptameri i njihove kombinacije.

[0065] Neki dalji aspekt ovog pronalaska odnosi se na postupak za određivanje ili za kvantifikovanje najmanje jednog analita u nekom uzorku, koji obuhvata faze:

a) opcionog direktnog ili indirektnog obeležavanja najmanje jednog analita najmanje jednim fluoroforom,

b) nanošenja najmanje jednog obeleženog analita iz faze a) ili nekog fluorescentnog analita na supstrat prema ovom pronalasku,

c) pobuđivanja najmanje jednog fluorofora zračenjem supstrata svetlošću odgovarajuće talasne dužine, i

d) merenja fluorescencije za određivanje prisustva najmanje jednog analita u uzorku.

[0066] Supstrat, koji može da značajno poveća prinos fluorescencije fluorofora i drugih fluorescentnih molekula ili supstanci, može da se koristi za postupke u kojima treba da se meri fluorescencija uzoraka. Upotreba supstrata prema ovom pronalasku u takvim postupcima omogućava da se poveća osetljivost tih postupaka, tako da ne samo da može da se odredi prisustvo najmanjih količina analita, već se i kvantifikovanje (male količine) analita može preciznije izvesti.

[0067] U prvoj fazi, analiti koji treba da se odrede ili kvantifikuju u nekom uzorku obeležavaju se direktno ili indirektno nekim fluoroforom ili nekom fluorescentnom supstancom. U slučaju direktnog obeležavanja analita, najmanje jedan fluorofor ili najmanje jedna fluorescentna supstanca vezuje se kovalentno ili nekovalentno (npr. vodonična veza, elektrostatička veza, Van der Valsove sile, hidrofobne interakcije) za analit koji treba da se odredi ili kvantifikuje. U slučaju indirektnog vezivanja, fluorescencijom obeleženi molekuli (npr. antitela ili njihovi fragmenti) koji mogu da se vežu za analit uvode se u uzorak. Ova prva faza postupka je opciona, budući da neki analiti koji treba da se odrede ili kvantifikuju već mogu da fluoresciraju kada se pobude na odgovarajući način. Uzorci koji obuhvataju takve analite mogu da se nanesu na supstrat direktno ili nakon pripreme uzorka (vidi fazu b) u postupku prema ovom pronalasku).

[0068] Nakon nanošenja najmanje jednog obeleženog analita iz faze a) ili fluorescentnog analita na supstrat, fluorofor ili fluorescentna supstanca ili fluorescentni analit postaje pogodniji za emisiju fluorescencije zračenjem supstrata koherentnom ili nekoherentnom svetlošću (npr. laser ili ksenon-blic lampa) odgovarajuće talasne dužine.

[0069] "Svetlost odgovarajuće talasne dužine", kao što se ovde koristi, znači da svetlost korišćena u postupku prema ovom pronalasku ima talasnu dužinu koja je pogodna da indukuje emisiju fluorescencije supstance kada dođe u kontakt. Na primer, svetlost talasne dužine od 485 pogodna je za indukovanje emisije fluorescencije fluorescein izotiocijanata (FITC).

[0070] Nakon ekscitacije fluorescentnih supstanci svetlošću, ove supstance emituju svetlost (fluorescencija) određene talasne dužine. Ova emitovana svetlost definisane talasne dužine meri se i može da se koristi za kvantifikovanje ili za određivanje prisustva analita u nekom uzorku. Emitovana svetlost može se meriti pomoću detektora (npr. fotomultiplikator). Dostupni su komercijalno dostupni čitači mikrotitarskih ploča (Tecan F200pro, BioTek Synergy, Molecular Devices FilterMax ili SpectraMax Reihe itd.), ravni fluorescentni skeneri (npr. Tecan LS-Reloaded, fluorescentni mikroskopi ili bilo koji drugi odgovarajući sistem za analizu (Roche COBAS, Abbot AxSYM, Behring Opus Plus), ako je integrisan odgovarajući detektor fluorescencije).

[0071] Prema nekom poželjnom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, najmanje jedan fluorofor ima talasnu dužinu ekscitacije u opsegu od 360 do 780 nm, poželjno od 490 do 680 nm.

[0072] Prema nekom daljem poželjnom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, najmanje jedan fluorofor ima talasnu dužinu emisije u opsegu od 410 do 800 nm, poželjno od 510 do 710 nm.

[0073] Najmanje jedan fluorofor je poželjno odabran iz grupe koju čine metoksikumarin, aminokumarin, Cy2, Alexa Fluor 488, fluorescein izotiocijanat (FITC), Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 532, Cy3, Alexa Fluor 555, 5-TAMRA, Alexa Fluor 546, fikoeritrin (PE), tetrametil rodamin izotiocijanat (TRITC), Cy3.5, rodamin, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Cy5, Alexa Fluor 660, Cy5.5, Alexa Fluor 680 i Cy7, poželjno iz grupe koju čine fluorescein izotiocijanat (FITC), Cy3, fikoeritrin (PE), tetrametil rodamin izotiocijanat (TRITC), Cy5 i Alexa Fluor 680.

[0074] Prema nekom poželjnom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, indirektno obeležavanje analita najmanje jednim fluoroforom izvodi se pomoću fluoroforom obeleženog molekula koji se vezuje za analit.

[0075] Prema nekom daljem poželjnom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, molekul koji se vezuje za analit izabran je iz grupe koju čine antitela, fragmenti antitela, poželjno Fab, F(ab)'2 ili scFv fragmenti, nukleinske kiseline, enzimi, lipidi, virusne čestice, aptameri i njihove kombinacije.

[0076] Ovaj pronalazak je detaljnije objašnjen na osnovu slika i primera u nastavku, a da, pri tom, nije ograničen na njih.

Fig.1 prikazuje trodimenzionalni AFM ("Atomic Force Microscope"; mikroskop atomskih sila) prikaz ravnog čvrstog nosača sa prevlakom metala (vidi primer 1).

Fig.2 prikazuje MEF-efekat kao funkciju vrste fluorofora i debljine sloja srebra od 0, 20 i 50 nm Ag. MEF-efekat manifestuje se u primećenom "relativnom pojačanju", takođe, odnosu signala na kraju vremena merenja nakon 600 sekundi (t600) prema signalu na početku merenja t(0).

1

Relativno pojačanje od 1,0 znači da nema promene signala i pri tom nema MEF. Što je veće relativno pojačanje, to je jači MEF-efekat. Opšti trend ka većem MEF sa povećanjem debljine metalnog sloja može se primetiti, a što varira od fluorofora do fluorofora.

Fig.3 prikazuje zavisnost MEF od debljine sloja srebra u koracima od po 5 nm za AlexaFlour 680 (vidi primer 2). Značajan porast MEF-efekta može se primetiti iz debljine sloja od 5 nm.

Fig.4 i 5 prikazuju AFM snimke supstrata/struktura koje obuhvataju udubljenja različitih perioda.

Fig.6 prikazuje zavisnost MEF-efekta od perioda (0,8 do 2,2 pm) struktura.

Fig.7 prikazuje zavisnost MEF od dubine struktura.

Fig.8 i 9 prikazuju dobijene faktore MEF-pojačanja u odnosu na površine zaštićene koloidom i MEF površine iz stanja tehnike (Fa. PLASMONIX; Quanta-Wells 2; "uporedna struktura").

Fig.10 prikazuje MEF-kinetike na nano-stubovima (nano-kolone, elevacije) i obrnute nanostubove (udubljenja).

Fig.11 prikazuje implementaciju anti-zečjih IgG fluorescentnih imunotestova korišćenjem supstrata.

Fig.12 prikazuje supstrat koji obuhvata čvrsti nosač koji je pokriven metalnim slojem. Čvrsti nosač ima udubljenja sa nekom dubinom, nekom širinom i nekom dužinom. Udubljenja su izvedena na čvrstom nosaču na određenom međusobnom rastojanju (period).

Fig.13 prikazuje pogled odozgo (A) i poprečni presek (B) čvrstog nosača. Udubljenja na čvrstom nosaču karakterišu se širinom, dužinom i dubinom i imaju određeno međusobno rastojanje (period).

Fig.14 prikazuje MEF-efekat kada se koriste različiti puferi.

Fig.15 prikazuje različite postupke kojima se mogu proizvesti čvrsti nosači koji uključuju udubljenja.

PRIMERI:

Primer 1 (nije deo ovog pronalaska) : Proizvodnja supstrata

[0077] Na osnovu poznatog stanja tehnike (vidi, između ostalog. Pompa et al. Nature Nanotechnology 1(2006):126-130; Cade et al. Nanotechnology.15(2009):20(28),US 2009/0262640) izvedeni su pokušaji da se proizvedu najviše moguće, vitke, stubaste strukture u obliku tornja ("nano-stubovi"), da bi se postigao dobar odnos (1:2 do 1:3) prečnika osnove prema visini strukture ("odnos širine i visine") za stanjivanje metalnog sloja tokom naparavanja, a time za obrazovanje strukture metalnih ostrva potrebnih za MEF-efekat prema literaturi. Prema tome proizvode se "stubovi" (kolone; elevacije) različitih prečnika osnove (250-550nm) i različitih visina (250-850nm).

[0078] Za proizvodnju supstrata korišćen je specijalni oblik brizganja, naime kompresijsko brizganje. U kompresijskom brizganju, rastop termoplastične plastike uvodi se u blago otvoren alat uz istovremeno presovanje (=utiskivanje). Nanostrukturirani pečat za brizganje oljušten je pomoću galvanizacije niklom od litografski proizvedenog silicijumskog mastera. Silicijumski master predstavlja ovde silicijumsku pločicu sa pozitivnim lakom, koji je izložen "laserskoj litografiji", a potom je razvijen.

[0079] Iznenađujuće, samo čvrsti nosači sa metalnom prevlakom sa udubljenjima (INP) pokazuju jasan MEF-efekat, dok supstrati na bazi čvrstih nosača sa elevacijama ne pokazuju ili pokazuju samo minimalan MEF-efekat (vidi Fig.10). Prema tome, INP strukture dalje su ispitivane.

Primer 2: Uticaj debljine metalnog sloja

[0080] Da bi se ispitao uticaj debljine metalnog sloja na površini čvrstog nosača sa udubljenjima prečnika od približno 450 nm, izvedene su različite debljine slojeva srebra taloženjem naparavanjem.

[0081] Direktna adsorpcija fluorescencijom obeleženih antitela na površini je najjednostavniji način poređenja različito strukturiranih površina s obzirom na osetljivost i faktor pojačanja. MEF-efekat prikazan je s činjenicom da se, nasuprot površini bez MEF, kinetike vezivanja ("MEF-kinetika") antitela mogu direktno pratiti u stvarnom vremenu. Ovo je postalo moguće zahvaljujući činjenici da samo molekuli blizu površine sijaju jače, ali ne i udaljeniji, vezani molekuli. Rastvor sa fluorescencijom obeleženim antitelima je kapao na odgovarajuću nanostrukturiranu površinu i promena signala tokom vremena je praćena odgovarajućim uređajem za merenje fluorescencije (Tecan 200F pro).

[0082] Pored parametra "MEF-kinetike", može se definisati faktor pojačavanja poređenjem signala određene koncentracije fluorescencijom obeleženog antitela na površini sa nano-metalnom strukturom sa signalom istog antitela na površini bez ove strukture. Samo je potrebno da se osigura da su iste efektivne gustine pokrivenosti, odnosno stvarna količina antitela.

[0083] Ovo se može jednostavno izvesti detektovanjem vezanog antitela (kozji anti-zečiji FITC) sa obeleženim sekundarnim antitelom (magareća anti-kozja antitela obeležena alkalnom fosfatazom) i ne rezultuje nikakvim značajnim razlikama u gustini pokrivenosti testiranih površina antitelima.

[0084] U slučaju proizvedenih varijanti debljine metalnog sloja, pokazalo se da se MEF-efekat značajno povećava u opsegu od 0-50 nm Ag, bez obzira na ispitivani fluorofor (vidi Fig.2; relativno pojačanje od 1 znači da nema MEF-efekta).

[0085] Fig.3 prikazuje da je najmanja debljina sloja od 5 nm neophodna da bi se dobio MEF. Fig.3 takođe prikazuje da će se, ako se debljina metalnog sloja poveća u koracima od po 5 nm, primetiti kontinuirano pojačanje MEF-efekta.

1

Primer 3: Uticaj perioda strukture

[0086] Međusobno rastojanje udubljenja ("period") može da ima uticaj na MEF-efekat supstrata prema ovom pronalasku. Prema tome, različiti čvrsti nosač sa različitim periodima prevučeni su na primer srebrom:

[0087] Fig.4 i 5 prikazuju, svaka, AFM snimak dva supstrata prema ovom pronalasku sa periodom od 0,8 pm ili 2,2 pm i debljinom sloja srebra od 50 nm.

[0088] Da bi se demonstrirao MEF-efekat, MEF-kinetike od AlexaFlour 680 (13nM u 10mM PBS, pH 7,4) kreirane su za sva polja 1 do 7 (vidi Fig.6). Pri tom je otkriveno da je MEF-efekat najveći za period od 0,8 i 1,0 pm. Od perioda od 1,2 um, MEF-efekat je bio značajno niži, ali i dalje prisutan.

[0089] Sledeća tabela prikazuje relativna pojačanja (signal t=300s / signal t=0s) MEF-kinetičkih merenja različitih fluorescencijom obeleženih antitela za polje 1 (0,8um) i 2 (1,0). Debljina sloja srebra na INP bila je 20nm za ova merenja, pri čemu je korišćeno kozje antitelo obeleženo odgovarajućim fluoroforom usmereno protiv zečijeg IgG (razblaženo u 10mM PBS pH 7,4; c =13nM):

1

[0090] MEF-efekat na INP, prema tome, može da se demonstrira za različite fluorofore u opsegu talasnih dužina Ex/Em od 485/520 (FITC) do 680/720 (AlexaFlour 680). Primena INP nije ograničena na određene fluorofore.

Primer 4: Uticaj dubine udubljenja na MEF-efekat

[0091] Da bi se ispitao uticaj dubine udubljenja (obrnuti nano-stubovi; INP), proizvedeni su čvrsti nosači sa udubljenjima različitih dubina (60 nm, 240 nm, 550 nm, 755 nm i 874 nm) i sa prevlakom srebra (debljina sloja od 20 nm).

[0092] Testovi adsorpcije sa fluorescencijom obeleženim antitelima ("MEF-kinetike") pokazali su da MEF-efekat takođe raste sa porastom dubine udubljenja. U slučaju čvrstih nosača sa udubljenjima dubine manje od 60 nm, otkriven je MEF-efekat, ali on je bio značajno manji u odnosu na ostale nosače (vidi Fig.7).

Primer 5: Uporedni eksperimenti

[0093] Supstrati prema ovom pronalasku pokazuju poboljšan MEF-efekat u odnosu na uobičajeno korišćene strukture. Da bi se ovo dokazalo, pripremljene su mikrotitarske ploče postupkom koji je poznat iz literature (Direct monitoring of molecular recognition processes using fluorescence enhancement at colloidcoated microplates., C Lobmaier et al Jul 2001; 14(4): 215-22), prevučene su koloidnim rastvorom srebra i određeni su njihovi faktori pojačanja (definisani kao odnos signala na površini nezaštićenih i zaštićenih koloidnim rastvorom srebra sa istom površinskom koncentracijom antitela) u odnosu na supstrate prema ovom pronalasku sa udubljenjima (20nm Ag, period od 0.8 pm). Pored toga, ispitan je još samo komercijalni sistem mikrotitarske ploče baziran na MEF prema instrukcijama proizvođača (kompanija PLASMONIX; Quant-Wells 2).

[0094] Faktori pojačanja supstrata prema ovom pronalasku bili su, kao što je prikazano na Fig.9, oko 10x veći nego kod koloid-ploča ili na pločama od PLASMONIX. Osim znatno nižih faktora pojačanja mikrotitarske ploče od PLASMONIX takođe nisu pokazale tipičnu MEF-kinetiku (vidi Fig.9 u poređenju sa Fig.7).

Primer 6: Anti-zečiji IgG fluorescentni imunotest

[0095] Površine supstrata prema ovom pronalasku, koloidom prevučene mikrotitarske ploče (MTP) i standardne mikrotitarske ploče kompanije Greiner kao što se koriste u stanju tehnike za imunotestove, obrađene su dovođenjem u kontakt sa rastvorom zečijeg IgG (2pg/ml) u PBS (10mM fosfatni pufer sa 150mM NaCl pH 7,4) tokom 2h na sobnoj temperaturi. Zatim je rastvor uklonjen, površina je isprana sa

1

PBS koji sadrži 0,1% Triton X-100 i dovedena u kontakt sa 5% rastvorom polivinilpirolidona radi blokiranja nespecifičnog vezivanja tokom 1h. Nakon naknadnog ispiranja sa PBS/Triton X100, izvedena je inkubacija sa biotinom obeleženim anti-zečijim IgG antitelima različitih koncentracija tokom 1h na ST. Vezivanje ovog anti-zečijeg IgG antitela konačno je detektovano nakon poslednjeg ispiranja merenjem MEF-kinetike sa Cy3-obeleženim streptavidinom tokom vremenskog perioda od 600 sekundi (vidi Fig. 11). Jasno se može videti da nema MEF-kinetike na standardnoj mikrotitarskoj ploči i, prema tome, ni imunotest se ne može izvesti. Mikrotitarska ploča prevučena koloidom prikazuje samo slabu, dok supstrat prema ovom pronalasku vrlo jasno pokazuje izraženu MEF-kinetiku, a pri tom je i imunotest sa značajno strmijom kalibracionom krivom tj. značajno većom osetljivošću.

[0096] Supstrat prema ovom pronalasku korišćen u ovom primeru pokazuje električnu provodljivost pre njegovog prekrivanja antitelima. Nakon merenja MEF-kinetike, nije se mogla odrediti električna provodljivost supstrata. Ovo bi moglo da bude zbog obrazovanja srebrohlorida pri kontaktu sa PBS puferom.

Primer 7: MEF efekat u zavisnosti od korišćenog pufera

[0097] Da bi se ispitala zavisnost MEF efekta korišćenog pufera, posmatrana je MEF-kinetika izazvana adsorpcijom fluorescencijom obeleženog antitela (kozje anti-zečije antitelo, obeleženo sa Cy5) kao u primeru 3, pri čemu je korišćen čist fosfatni pufer (PB; 10mM fosfatni pufer) umesto PBS pufera, 1 mas./vol.% vodeni rastvor natrijumcitrata i diH20. Testovi su izvedeni na supstratima sa periodom od 1um (što odgovara polju 2, vidi primer 3). Kao što se može videti na Fig.14, adsorpcija iz PBS obezbedila je najveće relativno pojačanje signala, ali jasni signali takođe su primećeni kod adsorpcije antitela iz drugih rastvora. Ovo bi mogla da bude posledica mogućeg obrazovanja sloja srebrohlorida, takođe opisano u primeru 6, koje ima pozitivan efekat na efekat pojačanja.

1

Claims (14)

Patentni zahtevi

1. Upotreba supstrata za povećanje fluorescencije jednog ili više fluorescentnih molekula, naznačena time, što supstrat obuhvata čvrsti polimerni nosač sa većim brojem međusobno razdvojenih udubljenja i što je čvrst nosač najmanje delimično prevučen srebrom ili legurama koje obuhvataju srebro, pri čemu su udubljenja na međusobnom rastojanju od 0,2 µm do 2,5 µm i imaju dubinu od 0,1 µm do 5 µm, a gde metalni sloj na čvrstom nosaču ima debljinu od 10 nm do 60 nm.

2. Upotreba prema zahtevu 1, naznačena time, što udubljenja čvrstog nosača imaju neku dužinu i neku širinu, pri čemu odnos dužine prema širini iznosi 2:1 do 1:2, posebno 1:1.

3. Upotreba prema zahtevu 1 ili 2, naznačena time, što udubljenja čvrstog nosača imaju neku dužinu i neku širinu, pri čemu dužina i širina udubljenja iznose 0,1 µm do 2 µm.

4. Upotreba prema bilo kom od zahteva 1 do 3, naznačena time, što su udubljenja suštinski okruglog oblika.

5. Upotreba prema bilo kom od zahteva 1 do 4, naznačena time, što čvrsti nosač obuhvata najmanje jedan materijal odabran iz grupe koju čine termoplastični polimeri i polikondenzati.

6. Upotreba prema zahtevu 5, naznačena time, što materijal polimernog čvrstog nosača obuhvata organske i/ili neorganske aditive i/ili punioce, pri čemu su oni poželjno odabrani iz grupe koju čine TiO2, staklo, ugljenični materijal, pigmenti boja, lipidi i voskovi.

7. Upotreba prema bilo kom od zahteva 1 do 6, naznačena time, što je supstrat deo kapilarne cevi, mikrotitarske ploče, mikrofluidnog čipa, test trake, nosača za fluorescentnu mikroskopiju, niza senzora ili optičkog polja detektora.

8. Upotreba prema bilo kom od zahteva 1 do 7, naznačena time, što metalna prevlaka na površini supstrata najmanje delimično obuhvata molekule za direktno i/ili indirektno vezivanje fluorescentnih molekula.

9. Postupak za određivanje ili za kvantifikovanje najmanje jednog analita u nekom uzorku, koji obuhvata faze:

a) opcionog direktnog ili indirektnog obeležavanja najmanje jednog analita sa najmanje jednim fluoroforom,

b) nanošenja najmanje jednog obeleženog analita iz faze a) ili nekog fluorescentnog analita na supstrat kao što je definisano u bilo kom od zahteva 1 do 8,

c) pobuđivanja najmanje jednog fluorofora zračenjem supstrata svetlošću odgovarajuće talasne dužine, i

d) merenja fluorescencije za određivanje prisustva ili za kvantifikovanje najmanje jednog analita u uzorku.

10. Postupak prema zahtevu 9, naznačen time, što najmanje jedan fluorofor ima talasnu dužinu ekscitacije u opsegu od 360 do 780 nm, poželjno od 490 do 680 nm.

11. Postupak prema zahtevu 9 ili 10, naznačen time, što najmanje jedan fluorofor ima talasnu dužinu emisije u opsegu od 410 do 800 nm, poželjno od 510 do 710 nm.

12. Postupak prema bilo kom od zahteva 9 do 11, naznačen time, što je najmanje jedan fluorofor odabran iz grupe koju čine metoksikumarin, aminokumarin, Cy2, Alexa Fluor 488, fluorescein izotiocijanat (FITC), Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 532, Cy3, Alexa Fluor 555, 5-TAMRA, Alexa Fluor 546, fikoeritrin (PE), tetrametil rodamin izotiocijanat (TRITC), Cy3.5, rodamin, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Cy5, Alexa Fluor 660, Cy5.5, Alexa Fluor 680 i Cy7, poželjno iz grupe koju čine fluorescein izotiocijanat (FITC), Cy3, fikoeritrin (PE), tetrametil rodamin izotiocijanat (TRITC), Cy5 i Alexa Fluor 680.

13. Postupak prema bilo kom od zahteva 9 do 12, naznačen time, što se indirektno obeležavanje analita sa najmanje jednim fluoroforom izvodi pomoću fluoroforom obeleženog molekula koji se vezuje za analit.

14. Postupak prema zahtevu 13, naznačen time, što je molekul koji se vezuje za analit odabran iz grupe koju čine antitela, fragmenti antitela, poželjno Fab, F(ab)'2 ili scFv fragmenti, nukleinske kiseline, enzimi, lipidi, virusne čestice, aptameri i njihove kombinacije.