Deprecated: The each() function is deprecated. This message will be suppressed on further calls in /home/zhenxiangba/zhenxiangba.com/public_html/phproxy-improved-master/index.php on line 456
RS62677B1 - Ciklična jedinjenja tirozin-tirozina uparena sa antitelom kao modulatori neuropeptidnog y receptora - Google Patents
[go: Go Back, main page]

RS62677B1 - Ciklična jedinjenja tirozin-tirozina uparena sa antitelom kao modulatori neuropeptidnog y receptora - Google Patents

Ciklična jedinjenja tirozin-tirozina uparena sa antitelom kao modulatori neuropeptidnog y receptora

Info

Publication number
RS62677B1
RS62677B1 RS20211419A RSP20211419A RS62677B1 RS 62677 B1 RS62677 B1 RS 62677B1 RS 20211419 A RS20211419 A RS 20211419A RS P20211419 A RSP20211419 A RS P20211419A RS 62677 B1 RS62677 B1 RS 62677B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
peptide
fmoc
seq
cyclic pyy
acid
Prior art date
Application number
RS20211419A
Other languages
English (en)
Inventor
Mark Macielag
Raymond J Patch
Rui Zhang
Martin A Case
Shamina M Rangwala
James N Leonard
Raul C Camacho
Michael J Hunter
Katharine E D'aquino
Wilson Edwards
Ronald V Swanson
Wenying Jian
Yue-Mei Zhang
Mark Wall
Ellen Chi
Original Assignee
Janssen Pharmaceutica Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=62020814&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS62677(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Janssen Pharmaceutica Nv filed Critical Janssen Pharmaceutica Nv
Publication of RS62677B1 publication Critical patent/RS62677B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/57545—Neuropeptide Y
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/2271—Neuropeptide Y
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/26—Glucagons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6845—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a cytokine, e.g. growth factors, VEGF, TNF, a lymphokine or an interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6883—Polymer-drug antibody conjugates, e.g. mitomycin-dextran-Ab; DNA-polylysine-antibody complex or conjugate used for therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A61K49/0032—Methine dyes, e.g. cyanine dyes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0052—Small organic molecules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0056—Peptides, proteins, polyamino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
    • C07K1/061—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using protecting groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/12—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by hydrolysis, i.e. solvolysis in general
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
    • C07K5/0205—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing the structure -NH-(X)3-C(=0)-, e.g. statine or derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Ovaj pronalazak je uopšteno usmeren na nove konjugate sa cikličnim peptidom tirozin tirozin (PYY) vezanim sa antitelom, koji su modulatori neuropeptidnog Y2 receptora. Pronalazak se tako đe odnosi na farmaceutske kompozicije i postupke za njihovu upotrebu. Nova jedinjenja vezana za antitela su korisna za prevenciju, lečenje ili ublažavanje bolesti i poremeć aja, kao što su gojaznost, dijabetes tipa 2, metabolički sindrom, insulinska rezistencija i dislipidemija, između ostalog.
OSVRT NA POVEZANE PRIJAVE
[0002] Ova prijava ima prioritet u odnosu na privremenu US patentnu prijavu br. 62/413,613, podnetu 27. oktobra 2016, i privremenu US patentnu prijavu br. 62/413,586 podnetu 27. oktobra 2016.
REFERENCA NA LISTU SEKVENCI DOSTAVLJENU ELEKTRONSKI
[0003] Ova prijava sadrži listu sekvenci, koja se dostavlja elektronskim putem preko EFS-Web-a kao lista sekvenci u formatu ASCYY sa nazivom datoteke „PRD3436 Sekuence Listing“ i datumom kreiranja 23. oktobra 2017. i veličine je 135kb. Lista sekvenci dostavljena preko EFS-Web-a je deo specifikacije i ovde je u celini uključena referencom. U slučaju bilo kakve nedoslednosti u vezi sa strukturama za SEK ID BR: 1-156 između informacija opisanih ovde i liste sekvenci dostavljene elektronskim putem EFS-Web-a sa nazivom datoteke „PRD3436 lista sekvenci“, informacije iznete ovde će imati prioritet.
STANJE TEHNIKE
[0004] Neuropeptidni Y (NPY) receptori se aktiviraju blisko srodnom grupom peptidnih agonista nazvanih "NPY familija" koji imaju različite afinitete za svaki podtip receptora. NPY, peptid tirozin-tirozin (PYY) i polipeptid pankreasa (PP), dužine svih 36 aminokiselina, su agonisti za porodicu receptora NPY. NPY je neurotransmiter, sintetisan, zajedno uskladišten i oslobođen sa norepinefrinom i epinefrinom. NPY je jedan od najzastupljenijih i najrasprostranjenijih peptida u centralnom nervnom sistemu (CNS) ljudi i glodara i izražen je u delovima mozga koji su povezani sa hranjenjem i stresom. U perifernom nervnom sistemu, neuroni koji sadrže NPY su pretežno simpatički. PYY se pretežno sintetiše i oslobađa u crevnim endokrinim ć elijama. Cepanjem NPY i PYY endotelnom serinproteazom, di-peptidil peptidazom IV (DPP-IV), stvaraju se NPY3-36i PYY3-36koji su selektivni ligandi za Y2 i Y5 podtipove porodice NPY receptora. PP se uglavnom nalazi u ć elijama pankreasa koje se razlikuju od onih koje čuvaju insulin, glukagon ili somatostatin.
[0005] Do danas je identifikovano pet različitih NPY receptora, od kojih se četiri smatraju relevantnim za ljudsku fiziologiju. Receptori Y1, Y2 i Y5 prvenstveno vezuju NPY i PYY, dok receptor Y4 prvenstveno vezuje PP. Y2 i Y5 receptori su takođe snažno aktivirani od strane NPY3-36i PYY3-36. Generalno, NPY familija liganada poseduje promenljivu selektivnost za svaku od izoforma NPY receptora, pri čemu je prethodno navedeno da PYY3-36 ima skromnu do robusnu selektivnost za Y2 izoformu. Svaki od ovih receptora je povezan sa inhibicijom adenilat ciklaze preko Gai osetljivog na pertusis-toksin.
[0006] PYY se luči iz endokrinih L-ć elija kao odgovor na hranu, a posebno nakon uzimanja masti. PYY1-36preovlađuje u stanju natašte, pri čemu je PYY3-36glavni oblik koji se nalazi nakon obroka kod ljudi, sa koncentracijama u plazmi u negativnoj korelaciji sa brojem unesenih kalorija. Pokazalo se da PYY3-36smanjuje unos hrane kod ljudi, majmuna, pacova, zečeva i miševa (Batterham RL et al. Nature 2002, avgust 8; 418(6898):650-4; Batterham RL et al. N Engl J Med 2003 Sep 4, 349(10):941-8, Challis BG et al., Biochem Biophis Res Commun 2003 Nov 28;311(4):915-9). Veruje se da su anoreksigeni efekti PYY3-36 posredovani Y2, na osnovu preferencijalnog vezivanja za ovaj receptor i gubitka efikasnosti hranjenja kod miševa sa nedostatkom Y2 (Batterham RL, et al. Nature 2002, 8. avgusta; 418(6898):650 -4). Intraarkuatna injekcija PYY3-36smanjuje unos hrane kod pacova i miševa (Batterham et al. Nature 2002, 8. avgust; 418(6898):650-4), što sugeriše da angažovanje hipotalamičkih Y2 receptora može posredovati u ovim efektima. Takođe se pokazalo da akutni efekti na hranjenje dovode do efekata zavisnih od doze na telesnu težinu kod ob/ob miševa, DIO miševa i Zucker fa/fa miševa (Pittner RA et al. IntJObes relat Metab Disord 2004. avgust; 28(8):963 -71). Pored toga, pokazalo se da PYY3-36poboljšava odlaganje glukoze posredovano insulinom i osetljivost na insulin kod DIO glodara (Wrang N et al., Am JPhisiol RegulIntegr Comp Phisiol Aug; 291(2):R367-75). Barijatrijska hirurgija dovodi do poveć ane PYY-imunoreaktivnosti u cirkulaciji (le Rouk CV et al., Ann Surg 2006 Jan; 243(1); 108-14), koja izgleda da igra ulogu u postoperativnom gubitku težine.
[0007] Imajuć i u vidu njegovu ulogu u kontroli apetita i unosa hrane, kao i njegove antisekretorne i proapsorptivne efekte u gastrointestinalnog trakta kod sisara, PYY3-36može biti efikasan u lečenju gojaznosti i povezanih stanja, kao i kod brojnih gastrointestinalnih poremeć aja. Međutim, terapeutska korisnost samog PYY3-36kao agensa za lečenje ograničena je njegovim brzim metabolizmom i rezultujuć im kratkim poluživotom u cirkulaciji (Torang et al., Am. J. Phisiol. Regul. Integr. Comp. Phisiol. 310:R866 -R874 (2016)). WO2015/197735 otkriva komplekse PYY-antitela i produženi poluživot peptida.
[0008] Prema tome, poželjno je dobiti PYY analog ili njegov derivat sa poboljšanom metaboličkom stabilnošć u i farmakokinetičkim profilom u odnosu na PYY3-36. Takvi derivati, sa produženim poluživotom in vivo, bi obezbedili modulaciju Y2 receptora sa dužim trajanjem delovanja, što ih čini pogodnim kao terapeutske agense za subjekte kojima je takva modulacija potrebna.
[0009] Prethodna diskusija je predstavljena isključivo da pruži bolje razumevanje prirode problema sa kojima se susreć emo u stanju tehnike i ne bi trebalo da se tumači ni na koji način kao priznanje prethodnog stanja tehnike niti da se citiranje bilo koje reference ovde tuma či kao priznanje da takva referenca predstavlja "prethodno stanje tehnike" u ovoj prijavi.
SUŠTINA PRONALASKA
[0010] U jednom opštem aspektu, pronalazak se odnosi na nova jedinjenja vezana sa cikličnim peptidom tirozin tirozin (PYY), koja su modulatori neuropeptidnog Y2 receptora.
[0011] Ovde su obezbeđeni konjugati koji sadrže monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen povezan sa cikličnim PYY peptidom, pri čemu je ciklični PYY peptid predstavljen Formulom I ili njenm derivatom ili farmaceutski prihvatljivom soli:
pri čemu:
p je 0 ili 1;
m je 0, 1, 2, 3, 4 ili 5;
n je 1, 2, 3 ili 4;
q je 0 ili 1; pod uslovom da je q 1 samo kada je Z30odsutan;
MOST je -Ph-CH2-S-, -triazolil-, -NHC(O)CH2S-, -SCH2C(O)NH-, -(OCH2CH2)2NHC(O)CH2S, -NHC(O)- ili -CH2S -; Z4je K, A, E, S ili R;
Z7je A ili K;
Z9je G ili K;
Z11je DorK;
Z22je AorK;
Z23je SorK;
Z26je AorH;
Z30je L, V, odsutan ili K;
pod uslovom da je Z30odsutan samo kada je q 1;
Z34je
Z35je
pri čemu je derivat jedinjenje Formule I koje je modifikovano jednim ili vi še procesa izabranih iz grupe koju čine amidacija, glikozilacija, karbamilacija, sulfacija, fosforilacija, ciklizacija, lipidacija i pegilacija. U određenim realizacijama, ciklični PYY peptid je jedinjenje Formule I ili derivat cikličnog PYY peptida Formule I koji je modifikovan jednim ili više procesa izabranih iz grupe koja se sastoji od amidacije, lipidacije i pegilacije, ili farmaceutski prihvatljive soli od toga.
[0012] U određenim realizacijama, ciklični PYY peptid je predstavljen Formulom I ili njenim derivatom ili farmaceutski prihvatljivom soli, pri čemu:
p je 0 ili 1;
m je 0, 1, 2, 3, 4 ili 5;
n je 1, 2, 3 ili 4;
q je 0 ili 1; pod uslovom da je q 1 samo kada je Z30odsutan;
MOST je -Ph-CH2-S-, -triazolil-, -NHC(O)CH2S-, -SCH2C(O)NH-, -(OCH2CH2)2NHC(O)CH2S, -NHC(O)- ili -CH2S -; Z4je K, A, E, S ili R;
Z7je A ili K, pri čemu je amino bočni lanac navedenog K opciono supstituisan sa
pri čemu je i ceo broj od 0 do 24, a X = Br, I ili Cl, -C(O)CH2Br, -C(O)CH2I ili -C(O)CH2Cl;
Z9je G ili K, pri čemu je amino bočni lanac navedenog K opciono supstituisan sa
pri čemu je i ceo broj od 0 do 24, a X = Br, I ili Cl, -C(O)CH2Br, -C(O)CH2I ili -C(O)CH2Cl;
Z11je D ili K, pri čemu je amino bočni lanac navedenog K opciono supstituisan sa
pri čemu je i ceo broj od 0 do 24, a X = Br, I ili Cl, -C(O)CH2Br, -C(O)CH2I ili -C(O)CH2Cl; Z22je A ili K, pri čemu je amino bočni lanac pomenutog K opciono supstituisan sa
pri čemu je i ceo broj od 0 do 24, a X = Br, I ili Cl, -C(O)CH2Br, -C(O)CH2I ili -C(O)CH2Cl; Z23je S ili K, pri čemu je amino bočni lanac pomenutog K opciono supstituisan sa
pri čemu je i ceo broj od 0 do 24, a X = Br, I ili Cl, -C(O)CH2Br, -C(O)CH2I ili -C(O)CH2Cl; Z26je AorH;
Z30je L ili K, pri čemu je amino bočni lanac pomenutog K supstituisan sa
Z34je
a Z35je
[0013] U određenim realizacijama, ciklični PYY peptid je predstavljen Formulom I ili njenim derivatom ili farmaceutski prihvatljivom soli, pri čemu:
p je 0 ili 1;
m je 0, 1, 2, 3 ili 5;
n je 1, 2 ili 4;
q je 0 ili 1; pod uslovom da q može biti 1 samo kada je Z30odsutan;
MOST je-Ph-CH2-S-, -triazolil-, -NHC(O)CH2S-, -SCH2C(O)NH-, -(OCH2CH2)2NHC(O)CH2S, -NHC(O)- ili -CH2S -; Z4je K, A, E, S ili R;
Z7je A ili K, pri čemu je amino bočni lanac pomenutog K supstituisan sa
Z9je G ili K,
Z11je D ili K, pri čemu je amino bočni lanac pomenutog K supstituisan sa
-C(O)CH2Br,
Z22je A ili K, pri čemu je amino bočni lanac pomenutog K supstituisan sa
Z23je S ili K, pri čemu je amino bočni lanac pomenutog K supstituisan sa
Z26je AorH,
Z30je L ili K, pri čemu je amino bočni lanac pomenutog K supstituisan sa
Z34je
Z35je
[0014] U određenim realizacijama, ciklični PYY peptid je izabran iz grupe koju čine SEK ID BR: 1, 73-100 i 147-156, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
[0015] U određenim realizacijama, monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen je kovalentno povezan sa cikličnim PYY peptidom na lizinskom ostatku cikličnog PYY peptida preko linkera. Linker može, na primer, da sadrži linker izabran iz grupe koju čine polietilen glikol (PEG)8-triazolil-CH2CH2CO-PEG4, PEG lanac od 2-24 PEG jedinice, alkil lanac koji sadrži 2-10 atoma ugljenika, (Gly4Ser)jpri čemu je j = 1-4, (AlaPro)u pri čemu je u = 1-10, i linker.
[0016] U određenim realizacijama, samo jedan od Z7, Z9, Z11, Z22i Z23u Formuli I je lizin, a lizin je kovalentno vezan za konstruisani cisteinski ostatak monoklonskog antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen preko linkera.
[0017] Takođe su obezbeđeni konjugati koji sadrže monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen povezan sa cikličnim PYY peptidom, pri čemu konjugat sadrži sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEK ID BR: 102-127 ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, pri čemu mAb predstavlja monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, a ]2predstavlja da su 1 ili 2 cikličnog PYY peptida kovalentno konjugovani sa mAb.
[0018] U određenim realizacijama, monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrži region 1 koji određuje komplementarnost teškog lanca (HCDR1), HCDR2, HCDR3 i region 1 koji određuje komplementarnost lakog lanca (LCDR1), LCDR2 i LCDR3, koji ima polipeptidne sekvence SEK ID BR: 141, 142, 143, 144, 145 i 146, respektivno. U određenim realizacijama, izolovano monoklonsko antitelo sadrži varijabilni domen teškog lanca (VH) koji ima polipeptidnu sekvencu SEK ID BR: 137, i varijabilni domen lakog lanca (VL) koji ima polipeptidnu sekvencu SEK ID BR: 139. U određenim rešenjima. izolovano monoklonsko antitelo dalje sadrži region Fc. U određenim realizacijama, izolovano monoklonsko antitelo sadrži teški lanac (HC) koji ima polipeptidnu sekvencu SEK ID BR: 138 i laki lanac (LC) koji ima polipeptidnu sekvencu SEK ID BR: 140.
[0019] Takođe su obezbeđeni konjugati koji sadrže monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen spojen sa cikličnim PYY peptidom, pri čemu monoklonsko antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena sadrži region 1 koji određuje komplementarnost teškog lanca (HCDR1), HCDR2, HCDR3 i region koji određuje komplementarnost lakog lanca 1 (LCDR1), LCDR2 i LCDR3, koji imaju polipeptidne sekvence SEK ID BR: 141, 142, 143, 144, 145 i 146, respektivno, poželjno monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrži varijabilni domen teškog lanca ( VH) koji imaju polipeptidnu sekvencu SEK ID BR: 137, i varijabilni domen lakog lanca (VL) koji ima polipeptidnu sekvencu SEK ID BR: 139, a poželjnije, monoklonsko antitelo teški lanac (HC) koji ima polipeptidnu sekvencu SEK ID BR:138 i laki lanac (LC) koji ima polipeptidnu sekvencu SEK ID BR:140; ciklični PYY peptid sadrži polipeptidnu sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEK ID BR: 1, 73-100 i 147-156, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so; i monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen je konjugovan sa cikli čnim PYY peptidom na ostatku 7, 9, 11, 22 ili 23 cikličnog PYY peptida, poželjno na lizinskom ostatku 11 cikličnog PYY peptida, direktno ili preko linkera.
[0020] Takođe su obezbeđeni postupci za proizvodnju konjugata pronalaska. Postupci obuhvataju reakciju elektrofila, poželjno bromoacetamida ili maleimida, uvedenog na bočni lanac cikličnog PII peptida, poželjno bočnog lanca lizinskog ostatka cikličnog PII peptida, sa sulfhidril grupom cisteinskog ostatka SEK ID BR:143 monoklonskog antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen, čime se stvara kovalentna veza između cikličnog PII peptida i monoklonalnog antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen.
[0021] Takođe su obezbeđene farmaceutske kompozicije koje sadrže konjugate iz pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0022] Takođe su obezbeđene metode za lečenje ili prevenciju bolesti ili poremeć aja kod subjekta kome je to potrebno, pri čemu se navedena bolest ili poremeć aj izabrana iz grupe koju čine gojaznost, dijabetes tipa I ili tipa II, metabolički sindrom, insulinska rezistencija, ošteć enje tolerancija na glukozu, hiperglikemija, hiperinsulinemija, hipertrigliceridemija, hipoglikemija zbog kongenitalnog hiperinzulinizma (CHI), dislipidemija, ateroskleroza, dijabetička nefropatija i drugi kardiovaskularni faktori rizika kao što su hipertenzija i kardiovaskularni faktori rizika, faktori rizika od kardiovaskularne/lipane poremecaja ili smanjeni nivoi rizika od kardiovaskularnih bolesti, nealkoholna masna bolest jetre (NAFLD), nealkoholni steatohepatitis (NASH), bubrežna bolest i ekcem. Postupci obuhvataju davanje subjektu kome je to potrebno efikasne količine farmaceutskih kompozicija pronalaska.
[0023] Takođe su obezbeđene metode za smanjenje unosa hrane kod subjekta kome je to potrebno. Postupci obuhvataju davanje subjektu kome je to potrebno efikasne koli čine farmaceutske kompozicije pronalaska.
[0024] Takođe su obezbeđene metode modulacije aktivnosti Y2 receptora kod subjekta kome je to potrebno. Postupci obuhvataju davanje subjektu kome je to potrebno efikasne koli čine farmaceutske kompozicije pronalaska.
[0025] U određenim realizacijama, farmaceutska kompozicija se primenjuje putem injekcije. U određenim realizacijama, farmaceutska kompozicija se primenjuje u kombinaciji sa najmanje jednim antidijabetičkim agensom. Antidijabetički agens može, na primer, da bude modulator receptora peptida-1 sličan glukagonu. U određenim realizacijama, farmaceutska kompozicija se primenjuje u kombinaciji sa liraglutidom.
[0026] Takođe su obezbeđeni kompleti koji sadrže konjugate pronalaska, poželjno dalje koji sadrže liraglutid i uređaj za injektiranje.
[0027] Takođe su obezbeđeni postupci za proizvodnju farmaceutskih kompozicija pronalaska. Postupci se sastoje od kombinovanja konjugata sa farmaceutski prihvatljivim nosačem da bi se dobila farmaceutska kompozicija.
[0028] Dalji aspekti, karakteristike i prednosti ovog pronalaska bić e bolje shvaćeni nakon čitanja slede ć eg detaljnog opisa pronalaska i patentnih zahteva.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0029] Prethodni rezime, kao i sledeć i detaljni opis poželjnih izvođenja ovog pronalaska, bi ć e bolje razumljivi kada se tumače zajedno sa priloženim slikama. Trebalo bi razumeti, međutim, da primena nije ograničena na precizna ostvarenja prikazana na slikama.
Slika 1: Prikazuje opštu strategiju konjugacije peptid-mAb prema jednoj realizaciji pronalaska. X predstavlja elektrofil uveden na bočni lanac terapeutskog peptida, kao što je bromoacetamid ili maleimid, koji reaguje specifično sa sulfhidril grupom ostatka Cis koji je konstruisan u CDR mAb sa produženim poluživotom, stvarajuć i kovalentnu vezu između peptida i mAb.
Slika 2: Rezime CDR ostataka izabranih za supstituciju u PH9H5_VH (SEK ID BR: 129) i u PH9L3_VL (SEK ID BR: 128). Ostaci zamenjeni sa Cis su podebljani i podvučeni.
Slika 3: Farmakokinetika jedinjenja 1 kod gojaznih miševa izazvanih ishranom (DIO).
Slika 4: Farmakokinetika jedinjenja 1 kod cinomolgus majmuna.
Slika 5: Unos hrane kod DIO miševa tretiranih jedinjenjem 1: akutno doziranje.
Slika 6: Gubitak težine kod DIO miševa tretiranih jedinjenjem 1: akutno doziranje.
Slika 7: Unos hrane kod DIO miševa tretiranih jedinjenjem 1: hronično doziranje.
Slika 8: Gubitak težine kod DIO miševa tretiranih jedinjenjem 1: hronično doziranje.
Slika 9: Gubitak težine kod DIO miševa tretiranih jedinjenjem 1 u kombinaciji sa liraglutidom: hronično doziranje.
Slika 10: Prikazuje grafikon koji pokazuje prosečan nedeljni unos hrane tokom 3 nedelje pre početka primene liraglutida, 1 nedelje lečenja liraglutidom i 2 nedelje nakon primene liraglutida. Indikovano je procentualno smanjenje prosečnog nedeljnog unosa hrane na tretmanu u odnosu na 3-nedeljni prosek.
Slike 11A-11D: Prikazuje grafikone koji pokazuju efekat jedinjenja 1 sa dodatkom liraglutida na glukozu, insulin i trigliceride kod gojaznih rezus makaka. Slika 11A prikazuje grafik koji pokazuje efekat monoterapije jedinjenjem 1 (PYY) i kombinovane terapije liraglutidom (PYY+Lira) na nivoe glukoze. Slika 11B prikazuje grafik koji pokazuje efekat monoterapije jedinjenjem 1 (PYY) i kombinovane terapije liraglutidom (PYY+Lira) na nivoe insulina. Slika 11C prikazuje grafikon koji pokazuje efekat monoterapije jedinjenjem 1 (PYY) i kombinovane terapije liraglutidom i (PYY+Lira) na HOMA-IR. Slika 11D prikazuje grafik koji pokazuje efekat monoterapije jedinjenjem 1 (PYY) i kombinovane terapije liraglutidom (PYY+Lira) na nivoe triglicerida.
Slike 12A-12D: Prikazuje grafikone efekta jedinjenja 1 sa dodatkom liraglutida na holesterol i enzime jetre kod gojaznih rezus makaka. Slika 12A prikazuje grafikon koji pokazuje efekat monoterapije jedinjenjem 1 (PYY) i kombinovane terapije liraglutidom (PII+Lira) na nivoima holesterola. Slika 12B prikazuje grafik koji pokazuje efekat monoterapije jedinjenjem 1 (PYY) i kombinovane terapije liraglutidom (PYY+Lira) na nivoe HDL. Slika 12C prikazuje grafik koji pokazuje efekat monoterapije jedinjenjem 1 (PYY) i kombinovane terapije liraglutidom (PYY+Lira) na nivoe ALT. Slika 12D prikazuje grafik koji pokazuje efekat monoterapije jedinjenjem 1 (PYY) i kombinovane terapije liraglutidom (PYY+Lira) na nivoe AST.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0030] Pronalazak je definisan patentnim zahtevima. Svaki predmet koji ne spada u obim patentnih zahteva je dat samo u informativne svrhe. Sve reference u opisu na metode le čenja odnose se na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove ovog pronalaska za upotrebu u postupku za le čenje ljudskog ili životinjskog tela terapijom.
[0031] Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini korišć eni ovde imaju isto značenje koje se uobičajeno koristi u struci iz oblasti na koju se ovaj pronalazak odnosi. Inače, određeni termini korišć eni ovde imaju značenja koja su navedena u specifikaciji.
[0032] Mora se primetiti da kako se ovde koristi i u priloženim zahtevima, oblici jednine "a", "an" i "the" uključuju referencu u množini osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije.
[0033] Osim ako nije drugačije navedeno, bilo koje numeričke vrednosti, kao što je koncentracija ili opseg koncentracije koji su ovde opisani, treba da se razumeju kao modifikovane u svim slu čajevima terminom "oko". Dakle, numerička vrednost obično uključuje ± 10 % navedene vrednosti. Na primer, koncentracija od 1 mg/mL uključuje 0,9 mg/mL do 1,1 mg/mL. Slično, opseg koncentracije od 1 % do 10 % (tež./zapr.) uključuje 0,9 % (tež./zapr.) do 11 % (tež./zapr.). Kako se ovde koristi, upotreba numeričkog opsega izričito uključuje sve moguć e podopsege, sve pojedinačne numeričke vrednosti unutar tog opsega, uključujuć i cele brojeve unutar takvih opsega i delove vrednosti osim ako kontekst jasno ne ukazuje drugačije.
[0034] Osim ako nije drugačije naznačeno, termin "najmanje" koji prethodi nizu elemenata treba shvatiti da se odnosi na svaki element u nizu. Stručnjaci ć e prepoznati, ili mo ć i da utvrde koriste ć i samo rutinsko eksperimentisanje, mnoge ekvivalente specifičnim realizacijama pronalaska opisanim ovde. Namera je da takvi ekvivalenti budu obuhvać eni pronalaskom.
[0035] Kako se ovde koristi, pojmovi "sadrži", "sadrži", "uključuje", "uključuje", "ima", "ima", "sadrži" ili "sadrži", ili bilo koja druga njihova varijacija ć e se razumeti da impliciraju uklju čivanje navedenog celog broja ili grupe celih brojeva, ali ne i isključivanje bilo kog drugog celog broja ili grupe celih brojeva i imaju za cilj da budu neisključivi ili otvoreni. Na primer, kompozicija, smeša, proces, metoda, artikal ili aparat koji sadrži listu elemenata nije nužno ograničen samo na te elemente, već može uključivati i druge elemente koji nisu izričito navedeni ili svojstveni takvoj kompoziciji, smeši , proces, metod, članak ili aparat. Dalje, osim ako nije izričito navedeno suprotno, "ili" se odnosi na uključivo ili, a ne na isključivu ili. Na primer, uslov A ili B je zadovoljen bilo kojim od sledeć eg: A je istinit (ili prisutan) i B je neta čan (ili nije prisutan), A je netačan (ili nije prisutan) i B je istinit (ili prisutan) , i A i B su tačni (ili prisutni).
[0036] Takođe treba razumeti da izrazi "oko", "približno", "uopšteno", "suštinski" i slični termini, koji se ovde koriste kada se odnose na dimenziju ili karakteristike komponente po željnog pronalaska, ukazuju na to da opisana dimenzija/karakteristika nije stroga granica ili parametar i ne isklju čuje manje varijacije koje su funkcionalno iste ili slične, kao što bi razumeo neko ko ima uobičajeno iskustvo u ovoj oblasti. U najmanju ruku, takve reference koje uključuju numerički parametar bi uključivale varijacije koje, koristeć i matematičke i industrijske principe prihva ć ene u struci (npr. zaokruživanje, merenje ili druge sistematske greške, proizvodne tolerancije, itd.), ne bi varirale ni najmanje.
[0037] Termini "identičan" ili procenat "identiteta", u kontekstu dve ili vi še nukleinskih kiselina ili polipeptidnih sekvenci (npr. ciklične PYY3-36polipeptidne sekvence, laki lanac antitela ili sekvence te škog lanca), odnose se na dve ili više sekvenci ili podsekvence koje su iste ili imaju određeni procenat aminokiselinskih ostataka ili nukleotida koji su isti, kada se uporede i poravnaju za maksimalnu korespondenciju, mereno korišć enjem jednog od slede ć ih algoritama za poređenje sekvenci ili vizuelnom inspekcijom koriš ć enjem metoda poznatih u struci imajući u vidu ovaj pronalazak.
[0038] Za poređenje sekvenci, obično se jedna sekvenca uzima kao referentna sekvenca, sa kojom se porede test sekvence. Kada se koristi algoritam za poređenje sekvenci, testne i referentne sekvence se unose u računar, po potrebi se određuju koordinate podsekvenci i određuju se programski parametri algoritma sekvence. Algoritam za poređenje sekvenci zatim izračunava procenat identiteta sekvence za test sekvencu(e) u odnosu na referentnu sekvencu, na osnovu naznačenih parametara programa.
[0039] Optimalno poravnanje sekvenci za poređenje se može izvesti, npr., algoritmom lokalne homologije Smith & Vaterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), algoritmom za poravnanje homologije od Needleman & Vunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), metodom traženja sličnosti Pearson & Lipman, Proc. Nat’l. Akad. Sci. USA 85:2444 (1988), kompjuterizovanim implementacijama ovih algoritama (GAP, BESTFIT, FASTA i TFASTA u Visconsin Genetics Softvare Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, VI), ili vizuelnom inspekcijom (videti uopšteno, Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., ur., Current Protocols, zajedničko ulaganje između Greene Publishing Associates, Inc. i John Vilei & Sons, Inc., (1995 Supplement) (Ausubel)).
[0040] Primeri algoritama koji su pogodni za određivanje procenta identiteta sekvence i sličnosti sekvence su algoritmi BLAST i BLAST 2.0, koji su opisani u Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 i Altschul et al. (1997) Nukleinske kiseline Res. 25: 3389-3402, respektivno. Softver za izvođenje BLAST analiza je javno dostupan preko Nacionalnog centra za biotehnološke informacije.
[0041] Dalja indikacija da su dve sekvence ili polipeptida nukleinske kiseline su štinski je identična tome da je polipeptid kodiran prvom nukleinskom kiselinom imunološki unakrsno reaktivan sa polipeptidom kodiranim drugom nukleinskom kiselinom, kao što je opisano u nastavku. Dakle, polipeptid je tipično suštinski identičan drugom polipeptidu, na primer, gde se dva peptida razlikuju samo po konzervativnim supstitucijama. Još jedan pokazatelj da su dve sekvence nukleinske kiseline suštinski identične je da se dva molekula hibridizuju jedan sa drugim pod strogim uslovima, kao što je opisano u nastavku.
[0042] Kako se ovde koristi, "subjekt" označava bilo koju životinju, poželjno sisara, najpoželjnije čoveka. Termin "sisar" kako se ovde koristi, obuhvata bilo kog sisara. Primeri sisara uključuju, ali nisu ograničeni na, krave, konje, ovce, svinje, mačke, pse, miševe, pacove, zečeve, zamorce, majmune, ljude, itd., poželjnije čoveka.
[0043] Termin "davanje" u odnosu na metode pronalaska, označava postupak za terapeutsko ili profilaktičko sprečavanje, lečenje ili ublažavanje sindroma, poremeć aja ili bolesti kao što je ovde opisano korišć enjem konjugata pronalaska ili oblika, kompozicije ili njegov lek. Takvi postupci uklju čuju primenu efikasne količine navedenog konjugata, njegovog oblika, kompozicije ili leka u različito vreme tokom terapije ili istovremeno u kombinovanom obliku. Metode pronalaska treba shvatiti kao obuhvatanje svih poznatih terapijskih režima lečenja.
1
[0044] Termin "efikasna količina" označava onu količinu aktivnog konjugata ili farmaceutskog agensa koji izaziva biološki ili medicinski odgovor u tkivnom sistemu, životinjskom ili ljudskom, koji traži istraživač, veterinar, lekar ili drugi kliničar, što uključuje prevenciju, lečenje ili ublažavanje sindroma, poremeć aja ili bolesti koja se leči, ili simptoma sindroma, poremeć aja ili bolesti koja se leči.
[0045] Kako se ovde koristi, termin "kompozicija" treba da obuhvati proizvod koji sadr ži specificirane sastojke u specificiranim količinama, kao i svaki proizvod koji je rezultat, direktno ili indirektno, kombinacijama specificiranih sastojaka u specificiranim količinama.
[0046] Kako se ovde koristi izraz "spregnuti" odnosi se na spajanje ili povezivanje dva ili vi še objekata zajedno. Kada se odnosi na hemijska ili biološka jedinjenja, spojeno se može odnositi na kovalentnu vezu između dva ili više hemijskih ili bioloških jedinjenja. Kao neograničavajuć i primer, antitelo prema pronalasku može biti spojeno sa peptidom od značaja da bi se formirao peptid spojen sa antitelom. Peptid povezan sa antitelom može se formirati kroz specifične hemijske reakcije dizajnirane da konjuguju antitelo sa peptidom. U određenim realizacijama, antitelo pronalaska može biti kovalentno spregnuto sa peptidom pronalaska preko povezivača. Linker može, na primer, biti prvo kovalentno povezan sa antitelom ili peptidom, a zatim kovalentno povezan sa peptidom ili antitelom.
[0047] Kako se ovde koristi, termin "linker" se odnosi na hemijski modul koji sadrži kovalentni ili atomski lanac koji kovalentno vezuje antitelo za peptid. Linker može, na primer, da uključuje, ali nije ograničen na, peptidni linker, ugljovodonični linker, polietilen glikol (PEG) linker, polipropilen glikol (PPG) linker, polisaharidni linker, poliestarski linker, hibridni linker koji se sastoji od PEG-a i ugrađenog heterocikla i ugljovodoničnog lanca.
[0048] Kako se ovde koristi, izraz "konjugat" se odnosi na antitelo ili njegov fragment kovalentno spojen sa farmaceutski aktivnim delom. Izraz "konjugovan sa" odnosi se na antitelo ili njegov fragment pronalaska koji je kovalentno vezan za ili kovalentno povezan sa farmaceutski aktivnim delom, po željno terapeutskim peptidom, direktno ili indirektno preko linkera. Kao neograničavajuć i primer, antitelo može biti monoklonsko antitelo pronalaska, a farmaceutski aktivna grupa može biti terapeutski peptid, kao što je ciklični PYY peptid od značaja.
[0049] Ovde opisane peptidne sekvence su napisane u skladu sa uobičajenom konvencijom pri čemu je N-terminalni region peptida levo, a C-terminalni region desno. Iako izomerni oblici tAko su aminokiseline poznate, predstavljen je L-oblik aminokiseline osim ako nije drugačije izričito naznačeno.
Antitela
[0050] U jednom opštem aspektu, pronalazak se odnosi na novo antitelo, koje je projektovano da ne cilja na metu i da sadrži cisteinski ostatak koji može da se koristi za hemijsku konjugaciju (tj. parovanje) farmaceutski aktivnog dela, kao što je terapeutski peptid (npr. ciklični PYY peptid), na način specifičan za mesto, tako da peptid povezan sa antitelom ima produženo/poveć ano vreme poluraspada u poređenju sa samim peptidom. Kako se ovde koristi, izraz "ne-ciljanje" u kontekstu antitela odnosi se na antitelo koje se ne vezuje specifično ni za jednu metu in vivo. Kako se ovde koristi, antitelo koje se „specifi čno vezuje za metu“ odnosi se na antitelo koje se vezuje za ciljni antigen, sa KD od 1310-8 M ili manje, po željno 5310-9 M ili manje, 1310-9 M ili manje , 5310-10 M ili manje, ili 1310-10 M ili manje. Termin "KD" se odnosi na konstantu disocijacije, koja se dobija iz odnosa Kd prema Ka (tj. Kd/Ka) i izra žava se kao molarna koncentracija (M). Vrednosti KD za antitela mogu se odrediti kori šć enjem metoda u stanju tehnike s obzirom na ovo otkrić e. Na primer, KD antitela se može odrediti koriš ć enjem površinske plazmonske rezonance, kao što je korišć enje biosenzorskog sistema, na primer, Biacore® sistema, ili koriš ć enjem tehnologije interferometrije bio-sloja, kao što je sistem Octet RED96. Što je manja vrednost KD antitela, ve ć i je afinitet koji se antitelo vezuje za ciljni antigen.
[0051] Monoklonska antitela, kompletna ili njihov fragment, mogu se koristiti kao deo koji produ žava poluživot. Monoklonalna antitela su dobro proučeni proteini koji su korišć eni i okarakterisani za upotrebu in vivo, i kao takvi, mehanizmi koji omoguć avaju njihov produženi poluživot in vivo i mehanizmi za njihovu eliminaciju in vivo su dobro shvać eni. Dodatno, prostorno razdvajanje i prezentacija dva "kraka" monoklonskog antitela može biti od prednosti za efikasnu dvovalentnu prezentaciju terapeutskog dela (tj. terapeutskog peptida). Razvijeni su terapeutici u kojima su toksini ili drugi lekovi sa malim molekulima hemijski povezani sa monoklonskim antitelom, ali obično koriste monoklonsko antitelo koje se vezuje za specifični antigen i cilja konjugat antitelo-lek na tkivo/ć eliju od interesa, koje preferentno izra žava antigen, i tipično je lek/mali molekul vezan za antitelo na način koji ne utiče na vezivanje antigena antitela.
[0052] Za terapeutske konjugate peptid-mAb, antigen specifično vezivanje monoklonskim antitelom koje produžava poluživot nije poželjno. Zbog toga, par varijabilnih (V) domena teškog lanca (HC) i lakog lanca (LC) za koje se ne očekuje da ć e se specifično vezati za bilo koju metu se koriste za pripremu monoklonskog antitela pronalaska sa omoguć enim kuplovanjem. Da bi se dobilo monoklonsko antitelo koje nije ciljano, sa omoguć enim kuplovanjem, cisteinski ostatak je projektovan u jedan od regiona koji određuju komplementarnost (CDR) odabranog neciljanog antitela. Farmaceutski aktivni deo (npr. terapeutski peptid/jedinjenje) može da sadrži odgovarajuć i hemijski deo da bi se omogu ć ila konjugacija farmaceutski aktivnog dela sa konstruisanim cisteinskim ostatkom neciljanog monoklonskog antitela. Op šta strategija konjugacije peptid-monoklonsko antitelo prema jednoj realizaciji pronalaska je prikazana na Slici 1.
[0053] Termin "antitela" kako se ovde koristi se misli u širem smislu i uključuje nehumane (npr. mišje, pacove) , humana, humanizovana, humanizovana i himerna monoklonska antitela, fragmenti antitela, bispecifična ili multispecifična antitela, dimerna, tetramerna ili multimerna antitela i jednolan čana antitela.
[0054] Laki lanci antitela bilo koje vrste kičmenjaka mogu se dodeliti jednom od dva jasno različita tipa, naime kapa (κ) i lambda (λ), na osnovu sekvenci amino kiselina njihovih konstantnih domena. Shodno tome, antitela pronalaska mogu da sadrže konstantni domen kapa ili lambda lakog lanca. U skladu sa posebnim aspektima, antitela pronalaska obuhvataju konstantne regione te škog i/ili lakog lanca iz mišjih ili ljudskih antitela. Pored teškog i lakog konstantnog domena, antitela sadrže region koji se vezuje za antigen koji se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca i varijabilnog regiona te škog lanca, od kojih svaki sadrži tri domena (tj. regione koji određuju komplementarnost 1- 3; (CDR1, CDR2 i CDR3)). Domeni varijabilnog regiona lakog lanca se alternativno nazivaju LCDR1, LCDR2 i LCRD3, a domeni varijabilnog regiona teškog lanca se alternativno nazivaju HCDR1, HCRD2 i HCDR3.
[0055] Imunoglobulini se mogu dodeliti pet glavnih klasa, naime IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, u zavisnosti od sekvence aminokiselina konstantnog domena teškog lanca. IgG je najstabilniji od pet tipova imunoglobulina, sa poluživotom u serumu kod ljudi od oko 23 dana. IgA i IgG su dalje podklasifikovani kao izotipovi IgAi, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. Svaka od četiri podklase IgG ima različite biološke funkcije poznate kao efektorske funkcije. Ove efektorske funkcije su generalno posredovane interakcijom sa Fc receptorom (FcyR) ili vezivanjem C1q i fiksiranjem komplementa. Vezivanje za FcyR mo že dovesti do ć elijske citolize zavisne od antitela, dok vezivanje za faktore komplementa mo že dovesti do ć elijske lize posredovane komplementom. Antitelo pronalaska koje se koristi zbog svoje sposobnosti da produ ži poluživot terapeutskog peptida nema efektorsku funkciju ili ima minimalnu funkciju, ali zadr žava svoju sposobnost da veže FcRn, čije vezivanje može biti primarni način pomoć u kojeg antitela imaju produženi in vivo poluživot.
[0056] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na izolovano antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen koji sadrži varijabilni region lakog lanca koji ima potpuno humane sekvence V gena zametne linije i varijabilni region teškog lanca koji ima potpuno humani region. Sekvence V gena Ig zametne linije osim HCDR3 koje imaju aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 143, pri čemu se antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ne vezuje specifično za bilo koji humani antigen in vivo. U određenim realizacijama, pronalazak se odnosi na konjugat koji sadrži izolovano antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen koji sadrži varijabilni region lakog lanca koji ima potpuno humane sekvence V gena zametne linije, i varijabilni region teškog lanca koji ima potpuno humane sekvence V gena zametne linije Ig osim HCDR3 koji imaju aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 143 i farmaceutski aktivan deo (npr. ciklični PII peptid pronalaska) konjugovan sa njim, pri čemu se antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen ne vezuje specifično za bilo koji humani antigen in vivo. U ovom otkrić u, u vezi sa antitelom ili njegovim fragmentom koji se vezuje za antigen u skladu sa realizacijom pronalaska, termin "konjugat koji sadr ži antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen i farmaceutski aktivan deo konjugovan sa njim" se koristi naizmenično sa terminom "antitelo ili njegov antigen vezujuć i fragment konjugovan sa farmaceutski aktivnim delom."
[0057] Kako se ovde koristi, termin "fragment koji se vezuje za antigen" odnosi se na fragment antitela kao što je, na primer, dijatelo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv fragment, disulfid stabilizovani Fv fragment (dsFv), a (dsFv)2, bispecifični dsFv (dsFv-dsFv'), disulfidno stabilizovano dijatelo (ds diabodi), jednolančani molekul antitela (scFv), jedan domen antitelo (sdab) scFv dimer (bivalentno dijatelo), multispecifi čno antitelo formirano od dela antitela koji sadrži jedan ili više CDR-a, kamelizovano jednodomensko antitelo, nanotelo, domensko antitelo, antitelo bivalentnog domena ili bilo koje drugo antitelo fragment koji se vezuje za antigen, ali ne sadrži kompletnu strukturu antitela. Fragment koji se vezuje za antigen je sposoban da se veže za isti antigen za koji se vezuje roditeljsko antitelo ili roditeljski fragment antitela. Prema posebnim realizacijama, fragment koji se vezuje za antigen sadr ži varijabilni region lakog lanca, konstantni region lakog lanca i Fd segment (tj. deo teškog lanca koji je uključen u Fab fragment). Prema drugim posebnim realizacijama, fragment koji se vezuje za antigen sadrži Fab i F(ab’).
[0058] Kako se ovde koristi, termin "jednolančano antitelo" se odnosi na konvencionalno jednolančano antitelo u ovoj oblasti, koje obuhvata varijabilni region te škog lanca i varijabilni region lakog lanca povezane kratkim peptidom od oko 15 do oko 20 aminokiselina. Kako se ovde koristi, termin "jednodomensko antitelo" odnosi se na konvencionalno jednodomensko antitelo u ovoj oblasti, koje sadr ži varijabilni region teškog lanca i konstantni region teškog lanca ili koje sadrži samo varijabilni region teškog lanca.
[0059] Termin "izolovano antitelo ili fragment antitela" odnosi se na antitelo ili fragment antitela koji je suštinski bez drugih antitela koja imaju različite antigene specifičnosti (npr. izolovano antitelo koje specifično vezuje ciljni antigen je u suštini bez antitela koja specifično ne vezuju ciljni antigen). Štaviše, izolovano antitelo ili fragment antitela može biti u suštini bez drugog ć elijskog materijala i/ili hemikalija.
[0060] Varijabilni region antitela se sastoji od "okvirnog" regiona prekinutog sa tri "mesta vezivanja antigena". Mesta vezivanja antigena su definisana kori šć enjem različitih termina: (i) Regioni za određivanje komplementarnosti (CDR), tri u VH (HCDR1, HCDR2, HCDR3) i tri u VL (LCDR1, LCDR2, LCDR3), zasnovani su na varijabilnosti sekvence (Wu i Kabat J Ekp Med 132:211-50, 1970; Kabat et al Sekuences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991). (ii) „Hipervarijabilni regioni“, „HVR“ ili „HV“, tri u VH (HI, H2, H3) i tri u VL (L1, L2, L3), odnose se na regione varijabilnih domena antitela koji su hipervarijabilni po strukturi kako su definisali Chothia i Lesk (Chothia i Lesk Mol Biol 196:901-17, 1987). Ostali termini uključuju "IMGT-CDRs" (Lefranc et al., Dev Comparat Immunol 27:55-77, 2003) i "Specificity Determining Residue Usage" (SDRU) (Almagro Mol Recognit 17:132-43, 2004). Međunarodna baza podataka ImMunoGeneTics (IMGT) (ht-tp://vvv_mgt_org) obezbeđuje standardizovano numerisanje i definiciju mesta za vezivanje antigena. Korespondencija između CDR-ova, HV-a i IMGT razgraničenja je opisana u Lefranc et al., Dev Comparat Immunol 27:55-77, 2003.
[0061] "Okvir" ili "okvirne sekvence" su preostale sekvence varijabilnog regiona osim onih definisana kao mesta vezivanja antigena. Pošto se mesta vezivanja antigena mogu definisati različitim terminima kao što je gore opisano, tačna sekvenca aminokiselina okvira zavisi od toga kako je mesto za vezivanje antigena definisano.
[0062] U jednom aspektu pronalaska, izolovano antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrži varijabilni region lakog lanca koji ima LCDR1, LCDR2 i LCDR3 aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 144, SEK ID BR: 145 i SEK ID BR: 146, respektivno, i varijabilni region teškog lanca koji ima HCDR1, HCDR2 i HCDR3 sekvence aminokiselina SEK ID BR: 141, SEK ID BR: 142 i SEK ID BR: 143, respektivno.
[0063] U drugom aspektu, izolovano antitelo dalje sadrži Fc region izveden iz humanog IgG4 Fc regiona. Ljudski IgG4 Fc region ima smanjenu sposobnost vezivanja FcyR i faktora komplementa u poređenju sa drugim podtipovima IgG. Poželjno, Fc region sadrži ljudski IgG4 Fc region koji ima supstitucije koje eliminišu efektorsku funkciju. Dakle, izolovano antitelo dalje sadrži Fc region koji ima modifikovani ljudski IgG4 Fc region koji sadrži jednu ili više od sledeć ih supstitucija: supstituciju prolina za glutamat na ostatku 233, alanin ili valin za fenilalanin na ostatku 234 i alanin ili glutamat za leucin na ostatak 235 (EU numeracija, Kabat, EA et al. (1991) Sekuences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. US Dept. of Health and Human Services, Bethesda, Md., NIH Publication no. 91-3242). Uklanjanje N-vezanog mesta glikozilacije u IgG4 Fc regionu zamenom Ala za Asn na ostatku 297 (EU numeracija) je jo š jedan način da se osigura da je zaostala efektorska aktivnost eliminisana.
[0064] Poželjno, antitela iz pronalaska postoje kao dimeri spojeni zajedno disulfidnim vezama i raznim nekovalentnim interakcijama. Dakle, Fc deo koristan za antitelo pronalaska mo že biti humani IgG4 Fc region koji sadrži supstituciju, kao što je serin za prolin na poziciji na 228 (EU numeracija), koja stabilizuje formiranje dimera teškog lanca i sprečava formiranje polu-IgG4 Fc lanaca.
[0065] U drugom izvođenju, C-terminalni Lis ostatak u teškom lancu je uklonjen, kao što se obično vidi u rekombinantno proizvedenim monoklonskim antitelima.
[0066] "Ljudsko antitelo" se odnosi na antitelo koje ima varijabilne regione te škog i lakog lanca u kojima su i okvir i mesta vezivanja antigena izvedeni iz sekvenci humanog porekla. Ako antitelo sadr ži konstantni region, konstantni region je takođe izveden iz sekvenci ljudskog porekla.
[0067] Ljudsko antitelo obuhvata varijabilne regione teškog ili lakog lanca koji su "izvedeni iz" sekvenci humanog porekla ako su varijabilni regioni antitela dobijeni iz sistema koji koristi imunoglobulin humane zametne linije ili preuređene imunoglobulinske gene. Takvi sistemi uključuju biblioteke gena humanog imunoglobulina prikazane na fagu i transgene životinje koje nisu humane, kao što su miševi koji nose lokuse humanog imunoglobulina kao što je ovde opisano. „Ljudsko antitelo“ može da sadrži razlike u aminokiselinama u poređenju sa ljudskom zametnom linijom ili preuređenim imunoglobulinskim sekvencama usled, na primer, prirodnih somatskih mutacija ili namernog uvođenja supstitucija u okvir ili mesta vezivanja antigena. Tipično, "ljudsko antitelo" je najmanje oko 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična u aminokiselinskoj sekvenci sa sekvencom aminokiselina kodirane ljudskom zametnom linijom ili rearanžiranim imunoglobulinskim genom. U nekim slučajevima, "ljudsko antitelo" može sadržati konsenzus okvirne sekvence izvedene iz analize sekvence humanog okvira, na primer kako je opisano u Knappik et al., J Mol Biol 296:57-86, 2000), ili sintetički HCDR3 ugrađen u humani imunoglobulinski gen biblioteke prikazane na
1
fagu, na primer kako je opisano u Shi et al., J Mol Biol 397:385-96, 2010 i Intl. Pat. Publ. br. WO2009/085462). Antitela u kojima su mesta vezivanja antigena izvedena iz neljudske vrste nisu uključena u definiciju "ljudskog antitela".
[0068] Izolovana humanizovana antitela mogu biti sintetička. Ljudska antitela, iako su izvedena iz sekvenci humanog imunoglobulina, mogu se generisati korišć enjem sistema kao što je displej faga koji uključuje sintetičke CDR-ove i/ili sintetičke okvire, ili mogu biti podvrgnuta in vitro mutagenezi da bi se poboljšala svojstva antitela, što rezultira antitelima koja prirodno ne postoje unutar repertoar zametne linije ljudskih antitela in vivo.
[0069] Termin "rekombinantno antitelo" kako se ovde koristi obuhvata sva antitela koja su pripremljena, eksprimirana, stvorena ili izolovana rekombinantnim sredstvima, kao što su antitela izolovana od životinje (npr. miša) koja su transgena ili transhromozomska za humani imunoglobulin geni ili hibridomi pripremljeni od njih, antitela izolovana iz ć elije doma ć ina transformisana da eksprimiraju antitela, antitela izolovana iz rekombinantne, kombinatorne biblioteke antitela i antitela pripremljena, eksprimirana, stvorena ili izolovana na bilo koji drugi način koji uključuje spajanje humanog imunoglobulina sekvence gena na druge DNK sekvence, ili antitela koja se generišu in vitro koriš ć enjem razmene Fab kraka.
[0070] Termin "monoklonsko antitelo" kako se ovde koristi odnosi se na pripremu molekula antitela jedne molekularne kompozicije. Monoklonska antitela prema pronalasku mogu biti napravljena hibridomskom metodom, tehnologijom prikaza faga, tehnologijom kloniranja gena jednog limfocita ili metodama rekombinantne DNK. Na primer, monoklonska antitela mogu biti proizvedena hibridomom koji uklju čuje B ć eliju dobijenu od transgene nehumane životinje, kao što je transgeni miš ili pacov, koji ima genom koji sadrži transgen humanog teškog lanca i transgen lakog lanca.
[0071] U određenim realizacijama, termin "mAb" se odnosi na monoklonsko antitelo koje ima sekvencu varijabilnog teškog lanca (VH) koja sadrži SEK ID BR: 137 i sekvencu varijabilnog lakog lanca (VL) koja sadrži SEK ID BR: 139. U određenim varijante mAb je potpuno humano monoklonsko antitelo koje ima sekvencu teškog lanca (HC) koja sadrži SEK ID BR:138 i sekvencu lakog lanca (LC) koja sadrži SEK ID BR:140. U određenim realizacijama, lizinski ostatak na poziciji 446 SEK ID BR: 138 opciono nedostaje.
[0072] Kako se ovde koristi, termin "himerično antitelo" se odnosi na antitelo gde je aminokiselinska sekvenca molekula imunoglobulina izvedena iz dve ili više vrsta. Varijabilni region i lakih i teških lanaca često odgovara varijabilnom regionu antitela dobijenog od jedne vrste sisara (npr. mi š, pacov, zec, itd.) koji ima željenu specifičnost, afinitet i sposobnost, dok konstantna regioni odgovaraju sekvencama antitela izvedenog od druge vrste sisara (npr. čoveka) da bi se izbeglo izazivanje imunološkog odgovora kod te vrste.
[0073] Kako se ovde koristi, termin "multispecifično antitelo" se odnosi na antitelo koje sadrži već i broj sekvenci varijabilnog domena imunoglobulina, pri čemu prva sekvenca varijabilnog domena imunoglobulina iz mnoštva ima specifičnost vezivanja za prvi epitop ili sadrži sekvence zametne linije. kojoj nedostaje bilo kakva poznata specifičnost vezivanja i druga sekvenca varijabilnog domena imunoglobulina iz mnoštva ima specifičnost vezivanja za drugi epitop ili sadrži sekvence zametne linije kojima nedostaje bilo kakva poznata specifičnost vezivanja, i pri čemu prvi i/ili drugi varijabilni domen imunoglobulina opciono uključuju konjugovani farmaceutski aktivan deo (npr. terapeutski peptid). U jednom aspektu, prvi i drugi epitopi su na istom antigenu, npr., istom proteinu (ili podjedinici multimernog proteina). U jednom aspektu, prvi i drugi epitopi se preklapaju ili su štinski preklapaju. U jednom aspektu, prvi i drugi epitopi se ne preklapaju ili se suštinski ne preklapaju. U jednom aspektu, prvi i drugi epitopi su na različitim antigenima, npr., različitim proteinima (ili različitim podjedinicama multimernog proteina). U jednom aspektu, prvi i drugi varijabilni domen imunoglobulina uklju čuju isti konjugovani farmaceutski aktivni deo. U jednom aspektu, prvi i drugi varijabilni domen imunoglobulina uključuju različite farmaceutske proizvode li aktivne grupe. U jednom aspektu, samo prvi varijabilni domen imunoglobulina uključuje konjugovani farmaceutski aktivan deo. U jednom aspektu, samo drugi varijabilni domen imunoglobulina uključuje konjugovani farmaceutski aktivan deo. U jednom aspektu, multispecifično antitelo obuhvata treć i, četvrti ili peti varijabilni domen imunoglobulina. U jednom aspektu, multispecifično antitelo je molekul bispecifičnog antitela, trispecifično antitelo ili molekul tetraspecifičnog antitela.
[0074] Kako se ovde koristi, termin "bispecifično antitelo" se odnosi na multispecifično antitelo koje ne vezuje više od dva epitopa ili dva antigena i/ili sadrži dva konjugovana farmaceutski aktivna dela (npr., isti ili različiti farmaceutski aktivni deo). Bispecifično antitelo karakteriše prva sekvenca varijabilnog domena imunoglobulina koja ima specifičnost vezivanja za prvi epitop ili sadrži sekvence zametne linije kojima nedostaje bilo kakva poznata specifičnost vezivanja i drugu sekvencu varijabilnog domena imunoglobulina koja ima specifičnost vezivanja za drugi epitop ili sadrži sekvence zametne linije. kojima nedostaje bilo kakva poznata specifičnost vezivanja, i pri čemu prvi i/ili drugi varijabilni domen imunoglobulina opciono uključuju konjugovani farmaceutski aktivni deo. U jednom aspektu, prvi i drugi epitopi su na istom antigenu, npr., istom proteinu (ili podjedinici multimernog proteina). U jednoj realizaciji, prvi i drugi epitopi se preklapaju ili suštinski preklapaju. U jednom rešenju, prvi i drugi epitopi su na različitim antigenima, npr., različitim proteinima (ili različitim podjedinicama multimernog proteina). U jednom aspektu, prvi i drugi varijabilni domen imunoglobulina uklju čuju isti konjugovani farmaceutski aktivni deo. U jednom aspektu, prvi i drugi varijabilni domen imunoglobulina uklju čuju različite farmaceutski aktivne delove. U jednom aspektu, samo prvi varijabilni domeni imunoglobulina uključuju konjugovani farmaceutski aktivni deo. U jednom aspektu, samo drugi varijabilni domen imunoglobulina uključuje konjugovani farmaceutski aktivan deo. U jednom aspektu, bispecifi čno antitelo sadrži prvu sekvencu varijabilnog domena teškog lanca i sekvencu varijabilnog domena lakog lanca koje imaju specifičnost vezivanja za prvi epitop ili sadrže sekvence zametne linije kojima nedostaje bilo kakva poznata specifičnost vezivanja i drugu sekvencu varijabilnog domena te škog lanca i laki lanac sekvence varijabilnog domena koje imaju specifičnost vezivanja za drugi epitop ili sadrže sekvence zametne linije kojima nedostaje bilo kakva poznata specifičnost vezivanja, i gde prvi i/ili drugi varijabilni domeni te škog lanca opciono uključuju konjugovani farmaceutski aktivni deo. U jednom aspektu, prvi i drugi varijabilni domen teškog lanca uključuju isti konjugovani farmaceutski aktivni deo. U jednom aspektu, prvi i drugi varijabilni domen teškog lanca uključuju različite konjugovane farmaceutski aktivne delove. U jednom aspektu, samo prvi varijabilni domen teškog lanca uključuje konjugovani farmaceutski aktivan deo. U jednom aspektu, samo drugi varijabilni domen teškog lanca uključuje konjugovani farmaceutski aktivan deo.
[0075] "Antitelo pune dužine" kako se ovde koristi odnosi se na antitelo koje ima dva te ška lanca antitela pune dužine i dva laka lanca antitela pune dužine. Teški lanac antitela pune dužine (HC) se sastoji od dobro poznatih varijabilnih i konstantnih domena te škog lanca VH, CHI, CH2 i CH3. Laki lanac antitela pune dužine (LC) se sastoji od dobro poznatih varijabilnih i konstantnih domena lakog lanca VL i CL. Antitelu pune dužine možda nedostaje C-terminalni lizin (K) u jednom ili u oba te ška lanca.
[0076] Termin "Fab-ruk" ili "pola molekula" se odnosi na jedan par teški lanac-laki lanac koji specifično vezuje antigen.
[0077] Bispecifična antitela pune dužine mogu se generisati na primer korišć enjem razmene Fab kraka (ili razmene pola molekula) između dva monospecifična bivalentna antitela uvođenjem supstitucija na interfejsu teškog lanca CH3 u svakoj polovini molekula da bi se favorizovala formiranje heterodimera dva polumolekula antitela koji imaju različitu specifičnost bilo in vitro u okruženju bez ć elija ili koriš ć enjem koekspresije. Fab reakcija razmene kraka je rezultat reakcije izomerizacije disulfidne veze i disocijacijeasocijacije CH3 domena. Disulfidne veze teškog lanca u zglobnim regionima roditeljskih monospecifičnih antitela su smanjene. Dobijeni slobodni cisteini jednog od roditeljskih monospecifi čnih antitela formiraju disulfidnu vezu između teškog lanca sa cisteinskim ostacima drugog roditeljskog monospecifičnog molekula antitela i istovremeno CH3 domene roditeljskog antitela oslobađaju i reformišu disocijacijomasocijacijom. CH3 domeni Fab krakova mogu biti projektovani tako da favorizuju heterodimerizaciju u odnosu na homodimerizaciju. Dobijeni proizvod je bispecifično antitelo koje ima dva Fab kraka ili pola molekula od kojih svaki može da veže poseban epitop.
[0078] "Homodimerizacija" kako se ovde koristi, u odnosu na antitela, odnosi se na interakciju dva te ška lanca koji imaju identične CH3 aminokiselinske sekvence. "Homodimer" kako se ovde koristi, u odnosu na antitela, odnosi se na antitelo koje ima dva teška lanca sa identičnim sekvencama CH3 aminokiselina.
[0079] "Heterodimerizacija" kako se ovde koristi, u odnosu na antitela, odnosi se na interakciju dva te ška lanca koji imaju neidentične CH3 aminokiselinske sekvence. "Heterodimer" kako se ovde koristi, u odnosu na antitela, odnosi se na antitelo koje ima dva te ška lanca sa neidentičnim CH3 amino kiselinskim sekvencama.
[0080] Strategija tzv. „knob-in-hole” (videti, npr., PCT Intl. Publ. No. WO 2006/028936) može se koristiti za generisanje bispecifičnih antitela pune dužine. Ukratko, odabrane aminokiseline koje formiraju interfejs CH3 domena u humanom IgG mogu biti mutirane na pozicijama koje uti ču na interakcije CH3 domena da bi se promovisalo formiranje heterodimera. Amino kiselina sa malim bo čnim lancem (rupa) se uvodi u teški lanac antitela koje specifično vezuje prvi antigen, a amino kiselina sa velikim bočnim lancem (dugma) se uvodi u teški lanac antitela koje specifično vezuje drugi antigen. Nakon ko-ekspresije dva antitela, heterodimer se formira kao rezultat preferencijalne interakcije te škog lanca sa "rupom" sa teškim lancem sa "kvakom". Primer CH3 supstitucije pa irs koji formiraju dugme i rupu su (izraženi kao modifikovana pozicija u prvom CH3 domenu prvog teškog lanca/modifikovana pozicija u drugom CH3 domenu drugog teškog lanca): T366I/F405A, T366V/F405V, F405V/I407A, T394V/I407T, T394S/I407A, T366V/T394S, F405V/T394S i T366V/T366S_L368A_I407V.
[0081] Druge strategije kao što je promovisanje heterodimerizacije teškog lanca korišć enjem elektrostatičkih interakcija zamenom pozitivno naelektrisanih ostataka na jednoj povr šini CH3 i negativno naelektrisanih ostataka na drugoj površini CH3 mogu se koristiti, kao što je opisano u US Pat. Publ. br. US2010/0015133; US Pat. Publ. br. US2009/0182127; US Pat. Publ. br. US2010/028637 ili US Pat. Publ. br. US2011/0123532. U drugim strategijama, heterodimerizacija se može promovisati sledeć im supstitucijama
1
(izraženim kao modifikovana pozicija u prvom CH3 domenu prvog te škog lanca/modifikovana pozicija u drugom CH3 domenu).
[0082] Pored metoda opisanih iznad, bispecifična antitela se mogu generisati in vitro u okruženju bez ć elija uvođenjem asimetričnih mutacija u CH3 regione dva monospecifična homodimerna antitela i formiranjem bispecifičnog heterodimernog antitela od dva roditeljska monospecifična homodimerna antitela u redukcionom uslovi koji omoguć avaju izomerizaciju disulfidne veze prema metodama opisanim u Intl. Pat. Publ. br. WO2011/131746. U metodama, prvo monospecifično bivalentno antitelo i drugo monospecifično bivalentno antitelo su konstruisani da imaju određene supstitucije u CH3 domenu koje promovišu stabilnost heterodimera; antitela se inkubiraju zajedno u redukcionim uslovima dovoljnim da omoguć e cisteinima u zglobnom regionu da se podvrgnu izomerizaciji disulfidne veze; čime se generiše bispecifično antitelo razmenom Fab ruku. Uslovi inkubacije mogu se optimalno vratiti na neredukcione. Primeri redukcionih agenasa koji se mogu koristiti su 2-merkaptoetilamin (2-MEA), ditiotreitol (DTT), ditioeritritol (DTE), glutation, tris(2-karboksietil)fosfin (TCEP), L-cistein i beta-merkaptoetanol, po željno a redukciono sredstvo izabrano iz grupe koju čine: 2-merkaptoetilamin, ditiotreitol i tris(2-karboksietil)fosfin. Na primer, inkubacija u trajanju od najmanje 90 minuta na temperaturi od najmanje 20°C u prisustvu najmanje 25 mM 2-MEA ili u prisustvu najmanje 0,5 mM ditiotreitola pri pH od 5-8, za može se koristiti na primer pri pH od 7,0 ili pri pH od 7,4.
[0083] Numerisanje aminokiselinskih ostataka u konstantnom regionu antitela u celoj specifikaciji je izvedeno prema EU indeksu kao što je opisano u Kabat et al., Sekuences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Služba javnog zdravlja, Nacionalni institut za zdravlje, Bethesda, Md. (1991), osim ako nije drugačije izričito navedeno.
Konjugati
[0084] U drugom opštem aspektu, pronalazak se odnosi na konjugat koji sadrži antitelo pronalaska kovalentno konjugovano sa farmaceutski aktivnim delom, kao što je sintetički terapeutski peptid (npr. ciklični PYY peptid), na način specifičan za mesto, tako da peptid povezan sa antitelom ima produženo/poveć ano vreme poluživota u poređenju sa samim peptidom. Pronalazak se takođe odnosi na farmaceutske kompozicije i postupke za njihovu upotrebu. Konjugati su korisni za prevenciju, le čenje ili ublažavanje bolesti ili poremeć aja, kao što su gojaznost, dijabetes tipa 2, metabolički sindrom (tj. Sindrom X), insulinska rezistencija, poremeć ena tolerancija glukoze (npr. intolerancija na glukozu), hiperglikemija, hiperinsulinemija, hipertrigliceridemija , hipoglikemija zbog kongenitalnog hiperinzulinizma (CHI), dislipidemija, ateroskleroza, dijabetička nefropatija i drugi kardiovaskularni faktori rizika kao što su hipertenzija i kardiovaskularni faktori rizika koji se odnose na nekontrolisani nivo holesterola i/ili lipida, osteoporoza, zapaljenje likoholnih masti, bolest (NAFLD), nealkoholni steatohepatitis (NASH), bubrežna bolest i ekcem, između ostalog.
[0085] U određenim realizacijama, antitelo pronalaska je modifikovano tako da sadr ži najmanje jednu supstituciju ostatka cisteina koja je sposobna da se konjuguje sa farmaceutski aktivnim delom da bi se produžio/poveć ao poluživot farmaceutski aktivnog dela. U određenim realizacijama, najmanje jedna supstitucija cisteinskog ostatka je sadržana u regionu antitela koji određuje komplementarnost. U određenim realizacijama, najmanje jedna supstitucija cisteinskog ostatka je u regionu koji odre đuje komplementarnost teškog lanca (HCDR). U određenim realizacijama, najmanje jedna supstitucija cisteinskog ostatka je u HCDR3, pri čemu HCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR:143. U određenim realizacijama, antitelo koje sadrži HCDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 143 ima najmanje jednu dodatnu cisteinsku supstituciju koja je sposobna da se konjuguje sa farmaceutski aktivnim delom.
[0086] U određenim realizacijama, farmaceutski aktivna grupa može da sadrži linker. Linker može biti hemijski modifikovan da bi se omoguć ila konjugacija antitela sa farmaceutski aktivnim delom. Linker može, na primer, da uključuje, ali nije ograničen na, peptidni linker, ugljovodonični linker, polietilen glikol (PEG) linker, polipropilen glikol (PPG) linker, polisaharidni linker, poliestarski linker, hibridni linker koji se sastoji od PEG-a i ugrađenog heterocikla, ili ugljovodoničnog lanca. PEG linkeri mogu, na primer, da sadrže 2-24 PEG jedinice.
[0087] U određenim realizacijama, monoklonsko antitelo pronalaska je konjugovano sa jednim, dva, tri, četiri, pet ili šest farmaceutski aktivnih delova (npr. terapeutski peptid(i)) od zna čaja. U poželjnim realizacijama, neciljano monoklonsko antitelo je konjugovano sa dva farmaceutski aktivna dela od značaja. U određenim aspektima gde je monoklonsko antitelo konjugovano sa najmanje dva farmaceutska aktivna dela. Pored aktivnih grupa od značaja, farmaceutski aktivne grupe od značaja mogu biti iste farmaceutski aktivne grupe ili mogu biti različite farmaceutski aktivne grupe.
[0088] Metode konjugovanja antitela pronalaska sa farmaceutski aktivnim delovima pronalaska su poznati u tehnici. Ukratko, antitela prema pronalasku mogu biti redukovana redukcionim agensom (npr. TCEP
1
(tris(2-karboksietil) fosfin), prečišć ena (npr. adsorpcijom proteina A ili gel filtracijom) i konjugovana sa farmaceutski aktivnim delom (npr, obezbeđivanjem liofilizovanog peptida redukovanom antitelu pod uslovima koji omoguć avaju konjugaciju). Posle reakcije konjugacije, konjugat se mo že prečistiti hromatografijom izmene jona ili hromatografijom hidrofobne interakcije (HIC) sa zavr šnim korakom prečišć avanja adsorpcije proteina A. U u određenim realizacijama, antitela pronalaska mogu da se prečiste pre redukcije korišć enjem HIC metoda Za detaljniji opis metoda konjugacije, videti npr. Primer 103 i Dennler et al., Antibodies 4:197-224 (2015).
[0089] Ovde su obezbeđeni konjugati koji sadrže monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen povezan sa cikličnim PYY peptidom, pri čemu je ciklični PYY peptid predstavljen Formulom I ili derivatom ili njenom farmaceutski prihvatljivom soli:
pri čemu
p je 0 ili 1;
m je 0, 1, 2, 3, 4 ili 5;
n je 1, 2, 3 ili 4;
q je 0 ili 1; pod uslovom da je q 1 samo kada je Z30odsutan;
MOST je -Ph-CH2-S-, -triazolil-, -NHC(O)CH2S-, -SCH2C(O)NH-, -(OCH2CH2)2NHC(O)CH2S, -NHC(O)- ili -CH2S -; Z4je K, A, E, S ili R;
Z7je A ili K;
Z9je G ili K;
Z11je DorK;
Z22je AorK;
Z23je SorK;
Z26je AorH;
Z30je L, V, odsutan ili K;
pod uslovom da je Z30odsutan samo kada je q 1;
Z34je
Z35je
1
pri čemu je derivat jedinjenje Formule I koje je modifikovano jednim ili vi še procesa izabranih iz grupe koju čine amidacija, glikozilacija, karbamilacija, sulfacija, fosforilacija, ciklizacija, lipidacija i pegilacija.
[0090] U određenim realizacijama, ciklični PYY peptid je derivat cikličnog PYY peptida Formule I koji je modifikovan jednim ili više procesa izabranih iz grupe koja se sastoji od amidacije, lipidacije i pegilacije, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli .
[0091] U određenim realizacijama, ciklični PYY peptid je predstavljen Formulom I ili njenim derivatom ili farmaceutski prihvatljivom soli, pri čemu:
p je 0 ili 1;
m je 0, 1, 2, 3, 4 ili 5;
nje 1, 2, 3 ili 4;
q je 0 ili 1; pod uslovom da je q 1 samo kada je Z30odsutan;
MOST je -Ph-CH2-S-, -triazolil-, -NHC(O)CH2S-, -SCH2C(O)NH-, -(OCH2CH2)2NHC(O)CH2S, -NHC(O)- ili -CH2S -; Z4je K, A, E, S ili R;
Z7je A ili K, pri čemu je amino bočni lanac navedenog K opciono supstituisan sa
ili
pri čemu je i ceo broj od 0 do 24, a X = Br, I ili Cl, -C(O)CH2Br, -C(O)CH2I ili -C(O)CH2Cl;
Z9je G ili K, pri čemu je amino bočni lanac navedenog K opciono supstituisan sa
pri čemu t je 0, 1 ili 2;
u je 0 ili 1; i
v je 14, 16 ili 18;
1
�
pri čemu je i ceo broj od 0 do 24, a X = Br, I ili Cl, -C(O)CH2Br, -C(O)CH2I ili -C(O)CH2Cl; Z11je D ili K, pri čemu je amino bočni lanac navedenog K opciono supstituisan sa
pri čemu w je 0, 1, 2, ili 4;
x je 0 or 1;
i y je 14, 16, ili 18;
pri čemu i je ceo broj od 0 do 24, i X = Br, I or Cl,
2
-C(O)CH2I, -C(O)CH2Cl or -C(O)CH2Br;
Z22je A ili K, čemu je amino bočni lanac navedenog K opciono supstituisan sa
pri čemu je i ceo broj od 0 do 24, a X = Br, I ili Cl, -C(O)CH2Br, -C(O)CH2I ili -C(O)CH2Cl; Z23je S ili K; pri čemu je amino bočni lanac navedenog K opciono supstituisan sa
pri čemu je i ceo broj od 0 do 24, a X = Br, I ili Cl, -C(O)CH2Br, -C(O)CH2I ili -C(O)CH2Cl;
Z26je AorH;
Z30je L, V, odsutan ili K, pod uslovom da je Z30odsutan samo kada je q 1, pri čemu je amino bočni lanac navedenog K opciono supstituisan sa
pri čemu r je 0, 1, ili 2;
s je 0 ili 1; i q je 14, 16, ili 18; ili
2
Z34je
Z35je
[0092] U određenim realizacijama, ciklični PYY peptid je predstavljen Formulom I ili njenim derivatom ili farmaceutski prihvatljivom soli, pri čemu:
p je 0 ili 1;
m je 0, 1, 2, 3 ili 5;
n je 1, 2 ili 4;
q je 0 ili 1; pod uslovom da je q 1 samo kada je Z30odsutan;
MOST je -Ph-CH2-S-, -triazolil-, -NHC(O)CH2S-, -SCH2C(O)NH-, -(OCH2CH2)2NHC(O)CH2S, -NHC(O)- ili -CH2S -; Z4je K, A, E, S ili R;
Z7je A ili K, pri čemu je amino bočni lanac pomenutog K supstituisan sa
Z9je G ili K, pri čemu je amino bočni lanac pomenutog K supstituisan sa
pri čemu t je 0;
u je 1; i v je 14;
Z11je D ili K, pri čemu je amino bočni lanac pomenutog K supstituisan sa
pri čemu w je 0, ili 4;
x je 1; i y je 14;
2
-C(O)CH2Br,
ili Z22je A ili K, pri čemu je amino bočni lanac pomenutog K supstituisan sa
2
Z23je S ili K, pri čemu je amino bočni lanac pomenutog K supstituisan sa
ili
Z26je AorH;
Z30je L ili K, pri čemu je amino bočni lanac pomenutog K supstituisan sa
2
pri čemu r je 0, ili 2;
s je 1; i q je 14, 16, ili 18; ili
2
Z34je
Z35je
[0093] U određenim realizacijama, konjugat sadrži monoklonsko antitelo ili njegov fragment konjugovan sa cikličnim PYY peptidom, pri čemu je ciklični PYY peptid izabran iz grupe koju čine SEK ID BR: 1-100 i SEK ID BR: 147- 156. U poželjnoj varijanti, konjugat sadrži monoklonsko antitelo ili njegov fragment konjugovan sa cikličnim PYY peptidom, pri čemu je ciklični PYY peptid izabran iz grupe koju čine SEK ID BR: 1, SEK ID BR: 73-100 i SEK ID BR: 147-156.
[0094] U određenim realizacijama, monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen je kovalentno povezan sa cikličnim PYY peptidom na lizinskom ostatku cikličnog PYY peptida preko linkera. Linker može, na primer, da sadrži linker izabran iz grupe koju čine polietilen glikol (PEG)8-triazolil-CH2CH2CO-PEG4, PEG lanac od 2-24 PEG jedinice, alkil lanac koji sadrži 2-10 atoma ugljenika, (Gly4Ser)jpri čemu je j = 1-4, (AlaPro)u pri čemu je u = 1-10, ili linker.
[0095] Monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema jednoj realizaciji pronalaska može biti konjugovan sa cikličnim PYY petidom na jednoj ili više aminokiselinskih pozicija cikličnog PYY, kao što je aminokiselinski ostatak 4, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 30 ili 31 od PYY koristeć i metode poznate u tehnici. Numeracija aminokiselinskih ostataka prati broj hPYY3-36. U određenim realizacijama, samo jedan od Z7, Z9, Z11, Z22i Z23u Formuli I je lizin, a lizin je kovalentno vezan za konstruisan cisteinski ostatak monoklonskog antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen preko linkera. U poželjnom izvođenju, monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen u skladu sa realizacijom pronalaska je konjugovan sa cikličnim PYY petidom na ostatku 11 cikličnog PYY. U drugom poželjnom izvođenju, elektrofil, kao što je bromoacetamid ili maleimid, se uvodi u bočni lanac cikličnog PYY, kao što je amino bočni lanac lizina na ostatku 11 cikličnog PYY, a elektrofil reaguje specifično sa sulfhidrilom. Grupa Cis ostatka je konstruisana u CDR, poželjno HCDR3, monoklonskog antitela ili njegovog fragmenta, čime se stvara kovalentna veza između cikličnog PYY peptida i monoklonskog antitela ili njegovog fragmenta. Poželjnije, ciklični PYY peptid je izabran iz grupe koju čine SEK ID BR: 1, SEK ID BR: 73-100 i SEK ID BR: 147-156. U jednom aspektu, elektrofil se uvodi direktno u bočni lanac cikličnog PYY. U drugom izvođenju, elektrofil se uvodi u bočni lanac cikličnog PYY indirektno preko povezivača.
[0096] Takođe su obezbeđene farmaceutske kompozicije koje sadrže konjugate pronalaska i koje dalje sadrže farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0097] Takođe su obezbeđeni konjugati koji sadrže monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen povezan sa cikličnim PYY peptidom, pri čemu su konjugati predstavljeni Formulom IIIab, IVa-b, Va-b, i/ili VIa-b, redom.
2
�
[0098] U formulama IIIa-b, IVa-b, Va-b i VIa-b,
x može, na primer, biti 1, 2, 3, 4, 5 ili 6, poželjno 2.
veza 1 može, na primer, biti G, bA, -COCH2OCH2CH2OCH2CH2NH-, g-aminobutanoil, GG, -CO(CH2)mSCH2-(pod uslovom da kada je veza 2 = -NH-, m=1, 2) ili veza;
veza 2 može, na primer, biti -CH2-, benzil, etiltriazolil, -NH- ili veza;
n može, na primer, biti 1, 2 ili 3;
x može, na primer, biti -S- ili -CH2-;
Z3može, na primer, biti I ili veza;
Z4može, na primer, biti K, S ili R;
Z30može, na primer, biti L, W, K (mPEG16) ili K (mPEG12);
Z34može, na primer, biti K, pri čemu je navedeni K opciono N-metilovan na alfa-amidnom azotu;
Z35može, na primer, biti R, pri čemu je pomenuti R opciono N-metilovan na alfa-amidnom azotu, ili je R dekarbonilovan što rezultira psi-(Z35Z36) amidnom vezom, ili je R oba N-metilovana na alfa-amidni azot i dekarbonil, što dovodi do psi-(Z35Z36) amidne veze;
Z36može, na primer, biti Y (Tyr), Cha (b-cikloheksilalanin), Aic (2-aminoindan-2-karboksilna kiselina) ili F (Phe), pri čemu je pomenuti F opciono para-supstituisan sa fluorom (4-F -Phe), hloro (4-Cl-Phe), bromo (4-Br-Phe), jod (4-I-Phe), amino (4-NH2-Phe); i
Veza 3 može, na primer, da sadrži bilo koju od sledeć ih amidacija na bočni lanac lizina: (PEG)8-triazolil-CH2CH2CO-PEG4 (uključujuć i
), PEG lanac od 2-24 PEG jedinice (uključujuć i
), alkil lanac koji sadrži 2-10 atoma ugljenika (uključujuć i
), (Gly4Ser)jpri čemu je j = 1-4, (AlaPro)upri čemu je u = 1-10, ili - NH-Link 3- može biti zamenjen vezom.
[0099] Takođe je obezbeđen konjugat koji sadrži monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen (mAb) povezan sa cikličnim PYY peptidom (cPYY) preko linkera (L): cPYY-L]2-mAb, pri čemu konjugat sadrži cikličnu PYY sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEK ID BR: 102-127 ili njena farmaceutski prihvatljiva so, mAb predstavlja monoklonsko antitelo ili njegov antigen vezujuć i fragment u skladu sa jednom realizacijom pronalaska, a ]2 predstavlja da 1 ili 2 cikličnog PYY peptida su kovalentno konjugovani sa mAb.
2
[0100] Ovde su takođe obezbeđeni ciklični analozi PYY sa N-kraja bočnog lanca koji pokazuju najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 95% ili 99% identičnosti sekvence sa humanim PYY3-36(hPYY3-36). Kao primer metode za određivanje identiteta sekvence između dva analoga dva peptida
su usklađeni. Identitet sekvence analoga u odnosu na hPYY3-36je dat ukupnim brojem poređanih ostataka minus broj različitih ostataka (tj. broj poravnatih identičnih ostataka) podeljen ukupnim brojem ostataka u hPYY3-36. U ovom primeru različiti ostaci su D11 koji je zamenjen za supstituisani K11, zatim V31 koji je zamenjen za hC31, i na kraju R35 je dekarbonilovan. Shodno tome, u navedenom primeru identitet sekvence je (34-3)/34 X 100.
Ciklični PYY peptidi
[0101] PYY3-36je endogeni hormon koji luče Lć elije u distalnom crevu i deluje kao agonist Y2 receptora da inhibira unos hrane. S obzirom na njegovu ulogu u kontroli apetita i unosa hrane, kao i anti-sekretorne i pro-apsorpcijske efekte u gastrointestinalnom traktu kod sisara, PYY3-36može biti efikasan u lečenju gojaznosti i povezanih stanja, kao i kod brojnih gastrointestinalnih poremeć aja. Me đutim, terapeutska korisnost samog PYY3-36kao agensa za lečenje ograničena je njegovim brzim metabolizmom i kratkim poluživotom u cirkulaciji. Dakle, ovaj pronalazak je generalno usmeren na modifikovane PYY3-36konjugate, koji produžavaju poluživot PYY3-36peptida i smanjuju metabolizam peptida in vivo.
[0102] U određenim realizacijama pronalaska, modifikovani PYY3-36peptidi su ciklični PYY peptidi. Izrazi "ciklični PYY peptid", "ciklični PYY3-36analog" i "ciklični PYY3-36peptidni analog" mogu se koristiti naizmenično. Primeri cikličkih PYY peptida koji se mogu koristiti u konjugatima opisani su u US patentnoj prijavi br. 62/413,613, podnetoj 27. oktobra 2016., i US patentnoj prijavi pod naslovom „Ciklična peptidna tirozin tirozin jedinjenja kao modulatori neuropeptidnih receptora, " podnet istog dana kada i ova prijava sa brojem prijave PRD3411.
[0103] Kako se ovde koristi, termin "NTSC-PYY" je namenjen da opiše ciklične analoge PYY od N-kraja do bočnog lanca.
[0104] Ovde opisane peptidne sekvence su napisane u skladu sa uobičajenom konvencijom pri čemu je N-terminalni region peptida levo, a C-terminalni region desno. Iako su izomerni oblici aminokiselina poznati, L-oblik aminokiseline je predstavljen osim ako nije drugačije izričito naznačeno. Za praktičnost u opisivanju molekula ovog pronalaska, koriste se konvencionalne i nekonvencionalne skrać enice za razli čite aminokiseline (i jednoslovne i troslovne kodove) i funkcionalne delove. Ove skrać enice su poznate stručnjacima u ovoj oblasti, ali su radi jasnoć e navedene na slede ć i na čin: A = Ala = alanin; R = Arg = arginin; N = Asn = asparagin; D = Asp = asparaginska kiselina? bA = bAla = beta-alanin; C = Cys = cistein; hC = hCys = homocistein; E = Glu = glutaminska kiselina; K = Gln = glutamin; G = Gly = glicin; H = His = histidin; I = Ile = izoleucin; L = Leu = leucin; K = Lys = lizin; Nle = norleucin; F = Phe = fenilalanin; P = Pro = prolin; S = Ser = serin; T = Thr = treonin; V = Trp = triptofan; I = Tyr = tirozin i V = Val = valin.
[0105] Radi pogodnosti, konvencija o naznačenju aminokiselinskih ostataka koja se koristi u naznačenju NTSC-PYY peptida ovog pronalaska sledi onu od hPYY3-36. Specifične supstitucije aminokiselina koje su uvedene u NTSC-PYY peptide, u odnosu na nativne ostatke na odgovarajuć im pozicijama u hPYY3-36, označene su odgovarajuć im kodom amino kiselina, pra ć en položajem supstitucije. Dakle, "S4" u NTSC-PYY peptidu se odnosi na peptid u kome je serin zamenio odgovarajuć i prirodni lis4 ostatak hPYY3-36. Slično, "hC31" u NTSC-PYY peptidu se odnosi na peptid u kome je homocistein zamenio odgovarajuć i prirodni val31 ostatak hPYY3-36. Dodatne supstitucije amino kiselina koje se javljaju unutar NTSC-PYY peptida su opisane u skladu sa ovom konvencijom i kao takve ć e ih prepoznati stručnjak u ovoj oblasti.
[0106] Takođe radi pogodnosti, konvencija o naznačenju koja se koristi za NTSC-PYY peptide ovog pronalaska uključuje amino ostatke uključene u ciklusu zajedno sa veznom(ima) grupom(ama) između njih u smeru sa leva na desno, počevši od N-terminalnog ostatka uključenog u ciklus. U svim slučajevima, N-terminalni aminokiselinski ostatak ciklusa povezuje se putem svoje a-amino funkcionalnosti sa veznom grupom, koja se zauzvrat povezuje sa ostatkom bočnog lanca amino kiseline na poziciji 31 NTSC-PII peptida . Dakle, "ciklo-(Y3-m-COPhCH2-hC31)" se koristi da opiše ciklus NTSC-PYY peptida u kome je aamino funkcionalnost Ile3 acilirana ostatkom meta-toluinske kiseline, čija je metil grupa dalje vezan putem tioetarske veze za bočni lanac hCis31 ostatka. Slično, "ciklo-(K4-CO(CH2)2NHCOCH2-hC31)" se koristi za opisivanje ciklusa NTSC-PYY peptida, u kojem je nativni Ile3 ostatak obrisan i čiji (sada N-terminalni) aamino funkcionalnost lis4 je acilirana 3-acetamidopropanoil grupom, čiji je acetamido metilen ugljenik povezan sa bočnim lancem ostatka hCis31 putem tioetarske veze.
[0107] Ostaci lizina mogu biti ugrađeni na različitim pozicijama sekvence hPYY3-36da bi se obezbedila pogodna funkcionalna ručka za dalju derivatizaciju. Ostaci lizina se mogu modifikovati tako da se direktno ili indirektno vezuju za monoklonsko antitelo. U indirektnom kuplovanju za monoklonsko antitelo, lizinski ostatak može biti modifikovan tako da sadrži linker koji ć e omogu ć iti da se ciklični PYY peptid poveže sa monoklonskim antitelom. Stručnjak u ovoj oblasti ć e prepoznati da se srodni ortolozi takođe mogu efikasno koristiti kao takvi i da su ovde razmatrani.
[0108] Termin, "K(y-Glu)", koji se pojavljuje u peptidnoj sekvenci, predstavlja lizinil ostatak čiji je bočni lanac e-amino grupa acilirana i-karboksilnom grupom glutaminske kiseline.
[0109] Termin, "K(y-Glu-Pal (palmitoil))" predstavlja lizinil ostatak čiji je bočni lanac e-amino grupa acilirana i-karboksilnom grupom N-heksadekan-1-oilglutaminske kiseline.
[0110] Termin, "K(y-Glu-Stear (stearoil))" predstavlja lizinil ostatak čiji je bočni lanac e-amino grupa acilirana i-karboksilnom grupom N-oktadekan-1-oilglutaminske kiseline.
[0111] Termin, "K(y-Glu-Arach (arahidoil))" predstavlja lizinil ostatak čiji je bočni lanac e-amino grupa acilirana i-karboksilnom grupom N-dodekan-1-oilglutaminske kiseline.
[0112] Termin, "K(OEG) (8-amino-3,6-dioksaoktanoil)" predstavlja lizinilni ostatak čiji je bočni lanac eamino grupa acilirana 8-amino-3,6-dioksaoktanskom kiselinom.
[0113] Termin, "(OEG)2" predstavlja dve OEG jedinice povezane zajedno preko amidne veze (tj. 17-amino-10-okso-3,6,12,15-tetraoksa-9-azaheptadekanska kiselina) .
[0114] Termin, "K(OEG)2" predstavlja lizinil ostatak čiji je bočni lanac e-amino grupa acilirana 17-amino-10-okso-3,6,12,15-tetraoksa-9-azaheptadekanskom kiselinom .
[0115] Termin, "K((OEG)2-g-Glu" predstavlja lizinil ostatak čiji je bočni lanac e-amino grupa acilirana pomoć u (22S)-22-amino-10,19-diokso-3,6 ,12,15-tetraoksa-9,18-diazatrikozandioična kiselina preko njene funkcionalnosti 1-karboksilne kiseline.
[0116] Termin, "K((OEG)2-g-Glu-Stear)" predstavlja lizinil ostatak čiji bočni lanac e -amino grupa je acilirana pomoć u (22S)-10,19-diokso-22-stearamido-3,6,12,15-tetraoksa-9,18-diazatrikozandiojeve kiseline preko svoje funkcionalnosti 1-karboksilne kiseline.
[0117] Termin, "K((OEG)2-g-Glu-COC16CO2H)" predstavlja lizinil ostatak čiji je bočni lanac e-amino grupa acilirana pomoć u (21S)-9,18,23-triokso-2, 5,11,14-tetraoksa-8,17,22-triazanonatriakontan-1,21,39-trikarboksilna kiselina preko njene funkcionalnosti 1-karboksilne kiseline.
[0118] Slično, izraz, "K((OEG)2-g-Glu-COC18CO2H)" predstavlja lizinilni ostatak čiji je bočni lanac e-amino grupa acilirana pomoć u (21S)-9,18,23-triokso- 2,5,11,14-tetraoksa-8,17,22-triazahentetrakontan-1,21,41-trikarboksilna kiselina preko njene funkcionalnosti 1-karboksilne kiseline.
[0119] Termin, "K((OEG)2-COC16CO2H)" predstavlja lizinil ostatak čiji je bočni lanac e-amino grupa acilirana sa 10,19-diokso-3,6,12,15-tetraoksa-9, 18-diazaheksatriakontandioična kiselina preko njene funkcionalnosti 1-karboksilne kiseline.
[0120] Termin "K(PEG24-AcBr)" predstavlja lizinilni ostatak čiji je bočni lanac e-amino grupa acilirana pomoć u N-bromacetil-75-amino-4,7,10,13,16,19,22, 25,28,31, 34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73-tetracosaoksapentaheptakontanska kiselina preko svoje funkcionalnosti 1-karboksilne kiseline.
[0121] Termin "K(PEG12-AcBr)" predstavlja liziniski ostatak čiji je bočni lanac e-amino grupa acilirana
4
pomoć u N-bromacetil-39-amino-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31, 34,37-dodekaoksanonatriakontanske kiseline preko svoje 1- funkcionalnosti karboksilne kiseline.
[0122] Termin "K(PEG6-AcBr)" predstavlja lizinilni ostatak čiji je bočni lanac e-amino grupa acilirana pomoć u N-bromacetil-3-[(17-amino-3,6,9,12,15- pentaoksaheptadek-1-il)oksi]-propanoične kiseline preko njene funkcije 1-karboksilne kiseline.
[0123] Termin "K(PEG8-triazolil-CH2CH2CO-PEG4-AcBr)" predstavlja lizinilni ostatak čiji je bočni lanac eamino grupa acilirana sa 27-[4-[2-[3-[2-[2] -[3-(N-bromacetilamino) propoksi] etoksi] etoksi] propilaminokarbonil]etil]tetrazol-1-il]-4,7,10,13,16,19,22,25-oktaoksaheptakozanoična kiselina preko svoje 1- funkcionalne karboksilne kiseline.
[0124] Termin "K(mPEG16) predstavlja lizinilni ostatak čiji je bočni lanac e-amino grupa acilirana sa 4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49-heksadekaoksapentakontanska kiselina preko njene funkcionalnosti 1-karboksilne kiseline.
[0125] Termin "K(mPEG12)" predstavlja lizinilni ostatak čiji je bočni lanac e-amino grupa acilirana sa 4,7,10,13 ,16,19,22,25,28,31,34,37-dodekaoksaoktatriakontanska kiselina preko njene funkcionalnosti 1-karboksilne kiseline.
[0126] Termin, "VitE" predstavlja a-tokoferolil jedinicu u molekulu.
[0127] Termin, "AcVitE" predstavlja a-tokoferolil jedinicu čija fenolna grupa nosi etrom povezanu metilenil-karboksi funkcionalnost.
[0128] Termin, K-g-Glu-AcVitE" predstavlja lizinil ostatak čiji je bočni lanac e-amino grupa acilirana pomoć u (2-(((2R)-2,5,7,8-tetrametil-2-((4R,8R)-4,8,12-trimetiltridecil)hroman-6-il)oksi)acetil)-L-glutaminska kiselina preko njene funkcionalnosti g-karboksilne kiseline.
[0129] Mnoga od jedinjenja/konjugata ovog pronalaska uključuju smanjenu amidnu vezu između C-terminalnog ostatka sekvence, Y36, i njenog susednog ostatka, R35. Ova redukovana amidna veza je predstavljena terminom "psi-(R35,Y36)".
[0130] Različiti aminokiselinski ostaci koji sadrže određene sekvence ovog pronalaska sadrže a-amino grupe koje su metilovane. Dakle, termini, "N-Me-K34" ili "N-Me-R35" predstavljaju a-N-metilovani glutamin na poziciji 34 sekvence, i a-N-metilovani arginin na poziciji 35 sekvence, respektivno.
[0131] Termin, "N-Me-K34, psi-(R35,Y36)" u opisu sekvence odnosi se na sekvencu koja sadrži i a-metil glutamin ostatak na poziciji 34, kao i smanjenu amidnu vezu između ostataka R35 i Y36.
[0132] Slično, termin, "N-Me-R35, psi-(R35,Y36)" u opisu sekvence se odnosi na sekvencu koja sadrži i ametil argininski ostatak na poziciji 35, kao i redukovanu amidnu vezu između ovog ostatka i Y36.
Komponente koje produžavaju poluživot
[0133] Pored antitela iz ovog pronalaska ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen, konjugati pronalaska mogu da inkorporišu jedan ili više drugih delova za produženje poluživota farmaceutski aktivnog dela (npr. ciklični PYY peptid) , na primer preko kovalentne interakcije. Primeri drugih delova koji produžavaju poluživot uključuju, ali nisu ograničeni na, albumin, varijante albumina, proteine i/ili domene koji se vezuju za albumin, transferin i njihove fragmente i analoge. Dodatni delovi koji produžavaju poluživot koji se mogu ugraditi u konjugate pronalaska uključuju, na primer, molekule polietilen glikola (PEG), kao što su PEG5000 ili PEG20,000, masne kiseline i estre masnih kiselina različite dužine lanca, na primer laurat , miristat, stearat, arahidat, behenat, oleat, arahidonat, oktandioi čna kiselina, tetradekandioična kiselina, oktadekandioična kiselina, dokozandijeva kiselina, i slično, polilizin, oktan, ugljeni hidrati (dekstran, celuloza, poželjna svojstva oligoakarda). Ovi delovi mogu biti direktne fuzije sa sekvencama koje kodiraju proteinske skele i mogu se generisati standardnim tehnikama kloniranja i ekspresije. Alternativno, dobro poznate metode hemijskog kuplovanja mogu se koristiti za vezivanje ostataka na rekombinantno i hemijski proizvedene konjugate pronalaska.
[0134] Pegil deo se može, na primer, dodati peptidnim molekulima pronalaska ugrađivanjem cisteinskog ostatka na C-terminusu molekula i vezivanjem pegil grupe za cistein kori šć enjem dobro poznatih metoda.
[0135] Molekuli peptida pronalaska koji uključuju dodatne delove mogu se porediti u pogledu funkcionalnosti pomoć u nekoliko dobro poznatih testova. Na primer, biolo ške ili farmakokinetičke aktivnosti terapeutskog peptida od značaja, samog ili u konjugatu prema pronalasku, mogu se ispitati korišć enjem poznatih in vitro ili in vivo testova i uporediti.
Farmaceutske kompozicije
[0136] U drugom opštem aspektu, pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju, koja sadrži konjugate i jedinjenja pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosa č. Termin "farmaceutska kompozicija" kako se ovde koristi označava proizvod koji sadrži konjugat pronalaska zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Konjugati i jedinjenja pronalaska i kompozicije koje ih sadr že su takođe korisni u proizvodnji lekova za terapeutske primene navedene ovde.
[0137] Kako se ovde koristi, termin "nosač" se odnosi na bilo koji ekscipijens, razblaživač, punilo, so, pufer, stabilizator, solubilizator, ulje, lipid, vezikulu koja sadrži lipide, mikrosferu, lipozomalnu inkapsulaciju ili drugi materijal dobro poznat u tehnici za upotrebu u farmaceutskim formulacijama. Podrazumeva se da ć e karakteristike nosača, ekscipijensa ili razblaživača zavisiti od puta primene za određenu primenu. Kako se ovde koristi, izraz "farmaceutski prihvatljiv nosač" odnosi se na netoksičan materijal koji ne ometa efikasnost kompozicije prema pronalasku ili biolo šku aktivnost kompozicije prema pronalasku. U skladu sa posebnim aspektima, s obzirom na ovo otkrić e, bilo koji farmaceutski prihvatljiv nosač pogodan za upotrebu u farmaceutskoj kompoziciji antitela može se koristiti u pronalasku.
[0138] Farmaceutski prihvatljive kisele/anjonske soli za upotrebu u pronalasku uključuju, ali nisu ograničene na acetat, benzensulfonat, benzoat, bikarbonat, bitartrat, bromid, kalcijum edetat, kamzilat, karbonat, hlorid, citrat, dihidrohlorid, edetat, edizilat, estolat, esilat, fumarat, gliceptat, glukonat, glutamat, glikolilarsanilat, heksilresorcinat, hidrabamin, hidrobromid, hidrohlorid, hidroksinaftoat, jodid, izetionat malaktionat, muški malato-etil hidrat metilnitrat, metilsulfat, mukat, napsilat, nitrat, pamoat, pantotenat, fosfat/difosfat, poligalakturonat, salicilat, stearat, subacetat, sukcinat, sulfat, tanat, tartrat, teolat, tozilat. Organske ili neorganske kiseline takođe obuhvataju, ali nisu ograničene na, hidrohidrovodnu, perhlornu, sumpornu, fosfornu, propionsku, glikolnu, metansulfonsku, hidroksietansulfonsku, oksalnu, 2-naftalensulfonsku, p-toluensulfonsku, cikloheksanfluornu kiselinu, trikloheksan.
[0139] Farmaceutski prihvatljive bazične/katjonske soli uključuju, ali nisu ograničene na aluminijum, 2-amino-2-hidroksimetil-propan-1,3-diol (takođe poznat kao tris(hidroksimetil)aminometan, trometan ili "TRIS" ), amonijak, benzatin, t-butilamin, kalcijum, hloroprokain, holin, cikloheksilamin, dietanolamin, etilendiamin, litijum, L-lizin, magnezijum, meglumin, N-metil-D-glukamin, piperidin, kalijum natrijum, trietanolamin ili cink.
[0140] U nekim realizacijama pronalaska, obezbeđene su farmaceutske formulacije koje sadrže konjugate pronalaska u količini od oko 0,001 mg/ml do oko 100 mg/ml, od oko 0,01 mg/ml do oko 50 mg/ml, ili od oko 0,1 mg/ml do oko 25 mg/ml. Farmaceutska formulacija može imati pH od oko 3,0 do oko 10, na primer od oko 3 do oko 7, ili od oko 5 do oko 9. Formulacija može dalje da sadrži najmanje jedan sastojak izabran iz grupe koju čine pufer sistem, konzervans(i), agens(i) toničnosti, helat(i), stabilizator(i) i surfaktant(i).
[0141] Formulacija farmaceutski aktivnih sastojaka sa farmaceutski prihvatljivim nosa čima je poznata u tehnici, npr. Remington: Nauka i praksa farmacije (npr. 21. izdanje (2005), i bilo koja kasnija izdanja). Neograničavajuć i primeri dodatnih sastojaka uključuju: pufere, razblaživače, rastvarače, agense za regulisanje toničnosti, konzervanse, stabilizatore i helate. Jedan ili vi še farmaceutski prihvatljivih nosača može da se koristi u formulisanju farmaceutskih kompozicija pronalaska.
[0142] U jednom aspektu pronalaska, farmaceutska kompozicija je tečna formulacija. Poželjan primer tečne formulacije je vodena formulacija, tj. formulacija koja sadr ži vodu. Tečna formulacija može da sadrži rastvor, suspenziju, emulziju, mikroemulziju, gel i slično. Vodena formulacija tipično sadrži najmanje 50% v/v vode, ili najmanje 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili najmanje 95% v/v vode.
[0143] U jednom aspektu, farmaceutska kompozicija može biti formulisana kao injekcija koja se može ubrizgati, na primer, putem uređaja za injekcije (npr. šprica ili infuzione pumpe). Injekcija se može primeniti subkutano, intramuskularno, intraperitonealno ili intravenozno, na primer.
[0144] U drugom aspektu, farmaceutska kompozicija je čvrsta formulacija, na primer, kompozicija stvorena zamrzavanjem, sušena ili osušena raspršivanjem, koja se može koristiti takva kakva jeste, ili kojoj lekar ili pacijent dodaju rastvarače, i/ili razblaživače pre korišćenja. Čvrsti dozni oblici mogu uključivati tablete, kao što su komprimovane tablete, i/ili obložene tablete, i kapsule (npr. tvrde ili meke želatinske kapsule). Farmaceutski preparat takođe može biti u obliku kesica, dražeja, praha, granula, pastila ili praha za rekonstituciju, na primer.
[0145] Oblici doze mogu biti sa trenutnim oslobađanjem, u kom slučaju mogu sadržati nosač rastvorljiv u vodi ili disperzibilan, ili mogu biti sa odloženim oslobađanjem, produženim oslobađanjem ili modifikovanim oslobađanjem, u kom slučaju mogu sadržati polimere nerastvorljive u vodi koji regulišu brzinu rastvaranja doznog oblika u gastrointestinalnom traktu.
[0146] U drugim realizacijama, farmaceutska kompozicija može biti administrirana intranazalno, intrabukalno ili sublingvalno.
[0147] pH u vodenoj formulaciji može biti između pH 3 i pH 10. U jednom aspektu pronalaska, pH formulacije je od oko 7,0 do oko 9,5. U drugom aspektu pronalaska, pH formulacije je od oko 3,0 do oko 7,0.
[0148] U drugom aspektu pronalaska, farmaceutska kompozicija sadrži pufer. Neograničavajuć i primeri pufera uključuju: arginin, asparaginsku kiselinu, bicin, citrat, dinatrijum hidrogen fosfat, fumarnu kiselinu, glicin, glicilglicin, histidin, lizin, maleinsku kiselinu, jabučnu kiselinu, natrijum acetat, natrijum dihidrat, natrijum dihidrat, natrijum fosfat, sukcinat, vinska kiselina, tricin i tris(hidroksimetil)-aminometan, i njihove smeše. Pufer može biti prisutan pojedinačno ili u agregatu, u koncentraciji od oko 0,01 mg/ml do oko 50 mg/ml, na primer od oko 0,1 mg/ml do oko 20 mg/ml. Farmaceutske kompozicije koje sadrže svaki od ovih specifičnih pufera predstavljaju alternativna ostvarenja pronalaska.
[0149] U drugom aspektu pronalaska, farmaceutska kompozicija sadrži konzervans. Neograničavajuć i primeri pufera uključuju: benzetonijum hlorid, benzojevu kiselinu, benzil alkohol, bronopol, butil 4-hidroksibenzoat, hlorobutanol, hlorokrezol, hloroheksidin, hlorfenezin, o-krezol, m-krezol, p-krezol, etil benzo-4 - durea, metil 4-hidroksibenzoat, fenol, 2-fenoksietanol, 2-feniletanol, propil 4-hidroksibenzoat, natrijum dehidroacetat, tiomerosal i njihove smeše. Konzervans može biti prisutan pojedinačno ili u agregatu, u koncentraciji od oko 0,01 mg/ml do oko 50 mg/ml, na primer od oko 0,1 mg/ml do oko 20 mg/ml. Farmaceutske kompozicije koje sadrže svaki od ovih specifičnih konzervansa predstavljaju alternativna ostvarenja pronalaska.
[0150] U drugom aspektu pronalaska, farmaceutska kompozicija sadrži izotonični agens. Neograničavajuć i primeri realizacije uključuju so (kao što je natrijum hlorid), aminokiselinu (kao što je glicin, histidin, arginin, lizin, izoleucin, asparaginska kiselina, triptofan i treonin), alditol (kao što je glicerol, 1 ,2-propandiol propilenglikol), 1,3-propandiol i 1,3-butandiol), polietilenglikol (npr. PEG400) i njihove sme še. Drugi primer izotoničnih agensa uključuje šeć er. Neograničavaju ć i primeri še ć era mogu biti mono-, di- ili polisaharidi ili glukani rastvorljivi u vodi, uključujuć i na primer fruktozu, glukozu, manozu, sorbozu, ksilozu, maltozu, laktozu, saharozu, trehalozu, dekstran, pululan, dekstrin, ciklodekstrin, alfa i beta-HPCD, rastvorljivi skrob, hidroksietil skrob i natrijum karboksimetilceluloza. Drugi primer izotoničnog agensa je šeć erni alkohol, gde je izraz "še ć erni alkohol" definisan kao C(4-8) ugljovodonik koji ima najmanje jednu -OH grupu. Neograničavajuć i primeri še ć ernih alkohola uključuju manitol, sorbitol, inozitol, galaktitol, dulcitol, ksilitol i arabitol. Farmaceutske kompozicije koje sadr že svaki izotonični agens naveden u ovom paragrafu predstavljaju alternativna ostvarenja pronalaska. Izotoni čni agens može biti prisutan pojedinačno ili u agregatu, u koncentraciji od oko 0,01 mg/ml do oko 50 mg/ml, na primer od oko 0,1 mg/ml do oko 20 mg/ml. Farmaceutske kompozicije koje sadrže svaki od ovih specifičnih izotoničnih agenasa predstavljaju alternativna ostvarenja pronalaska.
[0151] U drugom aspektu pronalaska, farmaceutska kompozicija sadrži helatni agens. Neograničavajuć i primeri helatnih sredstava uključuju limunsku kiselinu, asparaginsku kiselinu, soli etilendiamintetrasirć etne kiseline (EDTA) i njihove smeše. Helatni agens može biti prisutan pojedinačno ili u agregatu, u koncentraciji od oko 0,01 mg/ml do oko 50 mg/ml, na primer od oko 0,1 mg/ml do oko 20 mg/ml. Farmaceutske kompozicije koje sadrže svaki od ovih specifičnih helatnih agenasa predstavljaju alternativna ostvarenja pronalaska.
[0152] U drugom aspektu pronalaska, farmaceutska kompozicija sadrži stabilizator. Neograničavajuć i primeri stabilizatora uključuju jedan ili više inhibitora agregacije, jedan ili više inhibitora oksidacije, jedan ili više surfakanata i/ili jedan ili više inhibitora proteaze.
[0153] U drugom aspektu pronalaska, farmaceutska kompozicija sadrži stabilizator, gde je navedeni stabilizator karboksi-/hidroksiceluloza i njeni derivati (kao što su HPC, HPC-SL, HPC-L i HPMC), ciklodekstrine, 2-metiltioetanol, polietilen glikol (kao što je PEG 3350), polivinil alkohol (PVA), polivinil pirolidon, soli (kao što je natrijum hlorid), supstance koje sadrže sumpor kao što je monotioglicerol) ili tioglikolna kiselina. Stabilizator može biti prisutan pojedinačno ili u agregatu, u koncentraciji od oko 0,01 mg/ml do oko 50 mg/ml, na primer od oko 0,1 mg/ml do oko 20 mg/ml. Farmaceutske kompozicije koje sadrže svaki od ovih specifičnih stabilizatora predstavljaju alternativna ostvarenja pronalaska.
[0154] U daljim realizacijama pronalaska, farmaceutska kompozicija sadrži jedan ili više surfaktanata, poželjno surfaktant, najmanje jedan surfaktant ili dva različita surfaktanta. Termin "surfaktant" se odnosi na bilo koji molekul ili jone koji se sastoje od dela rastvorljivog u vodi (hidrofilnog) i dela rastvorljivog u masti (lipofilnog). Surfaktant može, na primer, biti izabran iz grupe koju čine anjonski surfaktanti, katjonski surfaktanti, nejonski surfaktanti i/ili cviterjonski surfaktanti. Surfaktant mo že biti prisutan pojedinačno ili u agregatu, u koncentraciji od oko 0,1 mg/ml do oko 20 mg/ml. Farmaceutske kompozicije koje sadrže svaki od ovih specifičnih surfaktanata predstavljaju alternativna ostvarenja pronalaska.
[0155] U sledeć oj varijanti pronalaska, farmaceutska kompozicija sadrži jedan ili više inhibitora proteaze, kao što je, na primer, EDTA, i/ili benzamidin hlorovodonična kiselina (HCl). Inhibitor proteaze može biti prisutan pojedinačno ili u agregatu, u koncentraciji od oko 0,1 mg/ml do oko 20 mg/ml. Farmaceutske kompozicije koje sadrže svaki od ovih specifičnih inhibitora proteaze predstavljaju alternativna ostvarenja pronalaska.
[0156] Farmaceutska kompozicija pronalaska može da sadrži količinu aminokiselinske baze dovoljnu da smanji formiranje agregata polipeptida tokom skladištenja kompozicije. Izraz "baza aminokiselina" odnosi se na jednu ili više amino kiselina (kao što su metionin, histidin, imidazol, arginin, lizin, izoleucin, asparaginska kiselina, triptofan, treonin) ili njihove analoge. Bilo koja amino kiselina mo že biti prisutna ili u obliku slobodne baze ili u obliku soli. Može biti prisutan bilo koji stereoizomer (tj. L, D ili njihova smeša) baze amino kiseline. Aminokiselinska baza može biti prisutna pojedinačno ili u kombinaciji sa drugim bazama amino kiselina, u koncentraciji od oko 0,01 mg/ml do oko 50 mg/ml, na primer od oko 0,1 mg/ml do oko 20 mg/ml. Farmaceutske kompozicije koje sadrže svaku od ovih specifičnih aminokiselinskih baza predstavljaju alternativna ostvarenja pronalaska.
[0157] Stručnjaku je takođe očigledno da ć e terapeutski efikasna doza za konjugate ovog pronalaska ili njihove farmaceutske kompozicije varirati u skladu sa željenim efektom. Prema tome, stručnjak za ovu oblast može lako odrediti optimalne doze koje se primenjuju i one ć e varirati u zavisnosti od odre đenog korišć enog konjugata, načina primene, jačine preparata i napredovanja bolesti. Pored toga, faktori povezani sa određenim subjektom koji se leči, uključujuć i starost subjekta, težinu, ishranu i vreme primene, rezultirać e potrebom da se doza prilagodi na odgovaraju ć i terapeutski nivo.
[0158] Za sve indikacije, konjugati pronalaska se poželjno daju periferno u dozi od oko 1 mg do oko 5 mg dnevno u pojedinačnim ili podeljenim dozama (npr. pojedinačna doza se može podeliti na 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 poddoza), ili na oko 0,01 mg/kg do oko 500 mg/kg po dozi, poželjnije oko 0,05 mg/kg do oko 250 mg/kg, najpoželjnije ispod oko 50 mg/kg. Doze u ovim rasponima ć e varirati u zavisnosti od jačine svakog agonista, naravno, i lako ih odredi neko iskusan u ovoj oblasti. Gore navedene doze su stoga primer prosečnog slučaja. Naravno, mogu postojati pojedinačni slučajevi gde su prisutni viši ili niži rasponi doza, takvi su u okviru ovog pronalaska.
[0159] U određenim realizacijama, konjugati pronalaska se daju u dozi od oko 1 mg do oko 5 mg, ili u dozi od oko 0,01 mg/kg do oko 500 mg/kg, poželjnije u dozi od oko 0,05 mg/kg do oko 250 mg/kg, najpoželjnije u dozi ispod oko 50 mg/kg sa dozom drugog terapeutskog agensa (npr. liraglutida) u dozi od oko 1 mg do oko 5 mg, ili u doza od oko 0,01 mg/kg do oko 500 mg/kg, poželjnije u dozi od oko 0,05 mg/kg do oko 250 mg/kg, najpoželjnije u dozi ispod oko 50 mg/kg.
[0160] Farmaceutski prihvatljive soli konjugata pronalaska uključuju konvencionalne netoksične soli ili kvaternarne amonijumove soli koje su formirane od neorganskih ili organskih kiselina ili baza. Primeri takvih kiselinskih aditivnih soli uključuju acetat, adipat, benzoat, benzensulfonat, citrat, kamforat, dodecilsulfat, hidrohlorid, hidrobromid, laktat, maleat, metansulfonat, nitrat, oksalat, pivalat, propionat, sukcinat, sulfat i bazne soli uključuju soli amonijuma, soli alkalnih metala kao što su natrijumove i kalijumove soli, soli zemnoalkalnih metala kao što su soli kalcijuma i magnezijuma, soli sa organskim bazama kao što su dicikloheksilamino soli i soli sa amino kiselinama kao što je arginin. Takođe, osnovne grupe koje sadrže azot mogu biti kvaternizovane sa, na primer, alkil halogenidima.
[0161] Farmaceutske kompozicije pronalaska mogu se davati na bilo koji način koji postižu njihovu predviđenu svrhu. Primeri uključuju davanje parenteralnim, subkutanim, intravenskim, intramuskularnim, intraperitonealnim, transdermalnim, bukalnim ili okularnim putevima. Primena mo že biti oralnim putem. Pogodne formulacije za parenteralnu primenu obuhvataju vodene rastvore aktivnih konjugata u obliku rastvorljivom u vodi, na primer, soli rastvorljive u vodi, kiseli rastvori, alkalni rastvori, rastvori dekstroze i vode, izotonični rastvori ugljenih hidrata i inkluzivni kompleksi ciklodekstrina.
[0162] Predmetni pronalazak takođe obuhvata metodu pravljenja farmaceutske kompozicije koja obuhvata mešanje farmaceutski prihvatljivog nosača sa bilo kojim od konjugata ovog pronalaska. Dodatno, ovaj pronalazak uključuje farmaceutske kompozicije napravljene mešanjem jednog ili više farmaceutski prihvatljivih nosača sa bilo kojim od konjugata ovog pronalaska.
[0163] Štaviše, konjugati ovog pronalaska mogu imati jedan ili više polimorfnih ili amorfnih kristalnih oblika i kao takvi su namenjeni da budu uključeni u obim pronalaska. Pored toga, konjugati mogu da formiraju solvate, na primer sa vodom (tj., hidrati) ili uobičajenim organskim rastvaračima. Kako se ovde koristi, izraz "solvat" označava fizičku povezanost konjugata iz ovog pronalaska sa jednim ili više molekula rastvarača. Ova fizička povezanost uključuje različite stepene jonske i kovalentne veze, uključujuć i vodoničnu vezu. U određenim slučajevima, solvat ć e biti sposoban za izolaciju, na primer kada je jedan ili više molekula rastvarača ugrađeno u kristalnu rešetku kristalne čvrste supstance. Termin "solvat" treba da obuhvati i solvate u fazi rastvora i solvate koji se mogu izolovati. Neograničavajuć i primeri pogodnih solvata uključuju etanolate, metanolate i slično.
[0164] Predviđeno je da ovaj pronalazak uključi u svoj obim polimorfe i solvate konjugata ovog pronalaska. Prema tome, u postupcima lečenja, termin "davanje" ć e obuhvatiti sredstva za lečenje, ublažavanje ili prevenciju sindroma, poremeć aja ili bolesti opisanih ovde sa konjugatima ovog pronalaska ili njihovim polimorfom ili solvatom.
[0165] U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na konjugate pronalaska za upotrebu kao lek.
[0166] Generalno, prolekovi ć e biti funkcionalni derivati konjugata koji se in vivo lako mogu konvertovati u traženi konjugat. Prema tome, u metodama lečenja, termin "davanje" ć e obuhvatiti lečenje različitih poremeć aja opisanih sa konjugatom koji je posebno otkriven ili sa konjugatom koji mo žda nije posebno otkriven, ali koji se konvertuje u navedeni konjugat in vivo nakon primene. Konvencionalne procedure za izbor i pripremu pogodnih derivata prolekova opisane su, na primer, u "Design of Prodrugs", Ed. H. Bundgaard, Elsevier, 1985.
[0167] Dalje, predviđeno je da u okviru ovog pronalaska, svaki element, posebno kada je pomenut u vezi sa konjugatima pronalaska, obuhvata sve izotope i mešavine izotopa pomenutog elementa, bilo prirodnog ili sintetičkog proteina, bilo u prirodnom obliku ili u izotopski obogać enom obliku. Na primer, referenca na vodonik obuhvata u okviru svog opsega<1>H,<2>H (D) i<3>H (T). Slično tome, reference na ugljenik i kiseonik obuhvataju u svom opsegu<12>C,<13>C i<14>C i<16>O i<18>O. Izotopi mogu biti radioaktivni ili neradioaktivni. Radioaktivno obeleženi konjugati pronalaska mogu da sadrže radioaktivni izotop izabran iz grupe od<3>H,<11>C,<18>F,<122>I,<123>I,<125>I,<131>I,<75>Br,<76>Br,<77>Br i<82>Br. Poželjno, radioaktivni izotop je izabran iz grupe od<3>H,<11>C i<18>F.
[0168] Neki konjugati ovog pronalaska mogu postojati kao atropizomeri. Atropizomeri su stereoizomeri koji nastaju usled ometane rotacije oko pojedinačnih veza gde je barijera sterične deformacije za rotaciju dovoljno visoka da omoguć i izolaciju konformera. Podrazumeva se da su svi takvi konformeri i njihove smeše obuhvać eni obimom ovog pronalaska.
[0169] Kada konjugati prema ovom pronalasku imaju najmanje jedan stereo centar, oni prema tome mogu postojati kao enantiomeri ili dijastereomeri. Podrazumeva se da su svi takvi izomeri i njihove sme še obuhvać eni obimom ovog pronalaska.
[0170] Tamo gde procesi za dobijanje konjugata prema pronalasku dovode do me šavine stereoizomera, ovi izomeri se mogu razdvojiti konvencionalnim tehnikama kao što je preparativna hromatografija. Konjugati se mogu pripremiti u racemskom obliku, ili pojedinačni enantiomeri mogu biti pripremljeni ili enantiospecifičnom sintezom ili razdvajanjem. Konjugati mogu, na primer, da se razdvoje u svoje sastavne enantiomere standardnim tehnikama, kao što je formiranje dijastereomernih parova formiranjem soli sa optički aktivnom kiselinom, kao što je (-)-di-p-toluoil-D-vinska kiselina i /ili (+)-di-p-toluoil-L-vinska kiselina nakon čega sledi frakciona kristalizacija i regeneracija slobodne baze. Konjugati se tako đe mogu razdvojiti formiranjem dijastereomernih estara ili amida, nakon čega sledi hromatografsko odvajanje i uklanjanje hiralne pomoć ne supstance. Alternativno, konjugati mogu da se razdvoje kori š ć enjem hiralne kolone putem tečne hromatografije visokih performansi (HPLC) ili SFC. U nekim slučajevima mogu postojati rotameri konjugata koji se mogu posmatrati pomoć u 1H NMR što dovodi do kompleksnih multipleta i integracije vrha u 1H NMR spektru.
[0171] Tokom bilo kog od procesa za pripremu konjugata iz ovog pronalaska, može biti neophodno i/ili poželjno da se zaštite osetljive ili reaktivne grupe na bilo kom od dotičnih molekula. Ovo se može postić i pomoć u konvencionalnih zaštitnih grupa, kao što su one opisane u Protective Groups in Organic Chemistry, ed. J.F.V. McOmie, Plenum Press, 1973; i T.V. Greene & P.G.M. Vuts, Protective Groups in Organic Sinthesis, John Vilei & Sons, 1991. Zaštitne grupe mogu biti uklonjene u pogodnoj sledeć oj fazi kori š ć enjem metoda poznatih u tehnici.
Metode upotrebe
[0172] Ovaj pronalazak je usmeren na metod za prevenciju, lečenje ili ublažavanje sindroma, poremeć aja ili bolesti posredovanog I2 receptorom kod subjekta kome je to potrebno, koji obuhvata davanje subjektu kome je to potrebno efikasne količine konjugata, jedinjenja ili farmaceutske kompozicije pronalaska.
[0173] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje metod za prevenciju, lečenje, odlaganje početka ili ublažavanje poremeć aja, bolesti ili stanja ili bilo kog ili više simptoma pomenutog poreme ć aja, bolesti ili stanja kod subjekta kome je to potrebno, koji obuhvata davanje subjektu kome je to potrebno efikasne količine konjugata, jedinjenja ili farmaceutske kompozicije pronalaska.
[0174] Prema određenim realizacijama, bolest ili stanje se bira iz grupe koju čine gojaznost, dijabetes tipa I ili II, metabolički sindrom (tj. Sindrom X), insulinska rezistencija, poremeć ena tolerancija glukoze (npr. intolerancija na glukozu), hiperglikemija, hiperinsulinemija, hipertrigliceridemija, hipoglikemija zbog urođenog hiperinzulinizma (CHI), dislipidemija, ateroskleroza, dijabetička nefropatija i drugi kardiovaskularni faktori rizika kao što su hipertenzija i kardiovaskularni faktori rizika koji se odnose na osteoporozu ili nivoi nemanaflamatornog holesterola - macija, nealkoholna masna bolest jetre (NAFLD), nealkoholni steatohepatitis (NASH), bolest bubrega i/ili ekcem.
[0175] Prema određenim aspektima, terapeutski efikasna količina se odnosi na količinu terapije koja je dovoljna da se postigne jedan, dva, tri, četiri ili više od sledeć ih efekata: (i) smanjenje ili ublažavanje težine bolesti, poremeć aja, ili stanja koje treba lečiti ili simptom povezan sa tim; (ii) smanjiti trajanje bolesti, poremeć aja ili stanja koje treba lečiti, ili simptoma koji su s tim povezani; (iii) sprečiti progresiju bolesti, poremeć aja ili stanja koje treba lečiti, ili simptoma povezanih sa tim; (iv) izazvati regresiju bolesti, poremeć aja ili stanja koje treba lečiti, ili simptoma koji su sa tim povezani; (v) sprečiti razvoj ili početak bolesti, poremeć aja ili stanja koje treba lečiti, ili simptoma povezanih sa tim; (vi) sprečiti ponovnu pojavu bolesti, poremeć aja ili stanja koje treba lečiti, ili simptoma povezanih sa tim; (vii) smanjiti hospitalizaciju subjekta koji ima bolest, poremeć aj ili stanje koje treba le čiti, ili simptom povezan sa tim; (viii) smanjiti dužinu hospitalizacije subjekta koji ima bolest, poremeć aj ili stanje koje treba lečiti, ili simptom povezan sa tim; (ix) poveć anje preživljavanja subjekta sa boleš ć u, poreme ć ajem ili stanjem koje treba lečiti, ili sa simptomom povezanim sa tim; (xi) inhibiranje ili smanjenje bolesti, poremeć aja ili stanja koje treba lečiti, ili simptoma povezanog sa tim kod subjekta; i/ili (xii) pobolj šati ili pospešiti profilaktički ili terapeutski efekat(e) druge terapije.
[0176] Terapijski efikasna količina ili doza može da varira u zavisnosti od različitih faktora, kao što su bolest, poremeć aj ili stanje koje treba lečiti, način primene, ciljno mesto, fiziološko stanje subjekta (uključujuć i, na primer, starost, telesnu težinu, zdravlje), da li je subjekt čovek ili životinja, drugi primenjeni lekovi i da li je tretman profilaktički ili terapijski. Doze za lečenje su optimalno titrirane da bi se optimizovala bezbednost i efikasnost.
[0177] Kako se ovde koristi, svi izrazi "lečenje", "lečenje" i "tretman" imaju za cilj da se odnose na poboljšanje ili preokret najmanje jednog merljivog fizičkog parametra koji se odnosi na bolest, poremeć aj ili stanje, koji nije nužno uočljiv u subjektu, ali može biti uočljiv u subjektu. Izrazi "lečenje", "lečenje" i "lečenje" takođe se mogu odnositi na izazivanje regresije, sprečavanje progresije ili u najmanjem usporavanje progresije bolesti, poremeć aja ili stanja. U posebnom izvođenju, "lečenje", "lečenje" i "tretman" se odnose na ublažavanje, prevenciju razvoja ili početka, ili smanjenje trajanja jednog ili više simptoma povezanih sa bolešć u, poreme ć ajem ili stanjem. U posebnom izvođenju, "lečenje", "lečenje" i "tretman" se odnose na prevenciju ponovnog pojavljivanja bolesti, poremeć aja ili stanja. U posebnom izvođenju, "lečenje", "lečenje" i "tretman" se odnose na poveć anje preživljavanja subjekta koji ima bolest, poremeć aj ili stanje. U posebnom izvođenju, "lečenje", "lečenje" i "tretman" se odnose na eliminaciju bolesti, poremeć aja ili stanja kod subjekta.
[0178] U jednoj realizaciji, pronalazak obezbeđuje metod za prevenciju, lečenje, odlaganje pojave ili ublažavanje gojaznosti, ili bilo kog jednog ili više simptoma gojaznosti kod subjekta kome je to potrebno, a postupak obuhvata davanje subjektu kada je to potrebno, efikasna koli čina konjugata, jedinjenja ili farmaceutske kompozicije pronalaska. U nekim realizacijama, telesna te žina subjekta je smanjena, na primer, između oko 0,01 % do oko 0,1 %, između oko 0,1 % do oko 0,5 %, između oko 0,5 % do oko 1 %, između oko 1 % do oko 5 %, između oko 2 % do oko 3 %, između oko 5 % do oko 10 %, između oko 10 % do oko 15 %, između oko 15 % do oko 20 %, između oko 20 % do oko 25 %, između oko 25 % do oko 30 %, između oko 30 % do oko 35 %, između oko 35 % do oko 40 %, između oko 40 % do oko 45 %, ili između oko 45 % do oko 50 %, u odnosu na telesnu težinu subjekta pre davanja bilo kog od konjugata, jedinjenja, farmaceutskih kompozicija, oblika ili lekova pronalaska koji su ovde opisani, ili u poređenju sa kontrolnim subjektima koji ne primaju nijedan od konjugata, kompozicija, oblika, lekova ili kombinacija pronalaska opisanih ovde.
[0179] U nekim realizacijama, smanjenje telesne težine se održava oko 1 nedelje, oko 2 nedelje, oko 3 nedelje, oko 1 mesec, oko 2 meseca, oko 3 meseca, oko 4 meseca, za oko 5 meseci, oko 6 meseci, oko 7 meseci, oko 8 meseci, oko 9 meseci, oko 10 meseci, oko 11 meseci, oko 1 godine, oko 1,5 godine, oko 2 godine, za oko 2,5 godine, oko 3 godine, oko 3,5 godine, oko 4 godine, oko 4,5 godine, oko 5 godina, oko 6 godina, oko 7 godina, oko 8 godina, oko 9 godina, za oko 10 godina, oko 15 godina, ili oko 20 godina, na primer.
[0180] Ovaj pronalazak obezbeđuje metod prevencije, lečenja, odlaganja početka ili ublažavanja sindroma, poremeć aja ili bolesti, ili bilo kog ili više simptoma pomenutog sindroma, poreme ć aja ili bolesti kod subjekta kome je to potrebno. , pri čemu je pomenuti sindrom, poremeć aj ili bolest izabran iz grupe koju čine gojaznost, dijabetes tipa I ili tipa II, metabolički sindrom (tj. sindrom X), insulinska rezistencija, poremeć ena tolerancija glukoze (npr. intolerancija na glukozu), hiperglikemija, hiperinsulinemija, hipertrigliceridemija, hipoglikemija zbog kongenitalnog hiperinsulinizma (CHI), dislipidemija, ateroskleroza, dijabetička nefropatija i drugi kardiovaskularni faktori rizika kao što su hipertenzija i kardiovaskularni faktori rizika koji se odnose na nekontrolisani holesterol i/ili nivoi masti u osteoporozi, nivoi ne-oteo-koporoze bolest jetre (NAFLD), nealkoholni steatohepatitis (NASH), bubre žna bolest i ekcem, koji obuhvata davanje efektivne količine subjektu kome je to potrebno konjugata, jedinjenja ili farmaceutske kompozicije pronalaska.
[0181] Kako se ovde koristi, metabolički sindrom se odnosi na subjekta koji ima jedno ili više od sledeć eg: visok šeć er u krvi (npr. visok še ć er u krvi natašte), visok krvni pritisak, abnormalni nivoi holesterola (npr. nizak nivo HDL), abnormalni nivoi triglicerida (npr. visoki trigliceridi), veliki struk (tj. obim struka), poveć ana masno ć a u predelu stomaka, insulinska rezistencija, netolerancija na glukozu, povi šen nivo C-reaktivnog proteina (tj. proinflamatorno stanje) i poveć an plazminogen u plazmi nivo inhibitora aktivatora-1 i fibrinogena (tj. protrombotično stanje).
[0182] Predmetni pronalazak obezbeđuje metod smanjenja unosa hrane kod subjekta kome je to potrebno, metod koji obuhvata davanje subjektu kome je to potrebno efikasne koli čine konjugata, jedinjenja ili farmaceutske kompozicije pronalaska. U nekim realizacijama, unos hrane kod subjekta je smanjen, na primer, između oko 0,01% do oko 0,1%, između oko 0,1% do oko 0,5%, između oko 0,5% do oko 1%, između oko 1% do oko 5 %, između oko 2% do oko 3%, između oko 5% do oko 10%, između oko 10% do oko 15%, između oko 15% do oko 20%, između oko 20% do oko 25%, između oko 25 % do oko 30%, između
4
oko 30% do oko 35%, između oko 35% do oko 40%, između oko 40% do oko 45%, ili između oko 45% do oko 50%, u odnosu na unos hrane subjekta pre primene bilo kog od konjugata, jedinjenja, kompozicija, oblika, lekova ili kombinacija pronalaska opisanih ovde, ili u poređenju sa kontrolnim subjektima koji ne primaju nijedan od konjugata, jedinjenja, kompozicija, oblika, lekova ili kombinacija pronalaska opisanih ovde.
[0183] U nekim realizacijama, smanjenje unosa hrane se održava oko 1 nedelju, oko 2 nedelje, oko 3 nedelje, oko 1 mesec, oko 2 meseca, oko 3 meseca, oko 4 meseca, za oko 5 meseci, oko 6 meseci, oko 7 meseci, oko 8 meseci, oko 9 meseci, oko 10 meseci, oko 11 meseci, oko 1 godine, oko 1,5 godine, oko 2 godine, za oko 2,5 godine, oko 3 godine, oko 3,5 godine, oko 4 godine, oko 4,5 godine, oko 5 godina, oko 6 godina, oko 7 godina, oko 8 godina, oko 9 godina, za oko 10 godina, oko 15 godina, ili oko 20 godina, na primer.
[0184] Predmetni pronalazak obezbeđuje metodu redukcije glikovanog hemoglobina (A1C) kod subjekta kome je to potrebno, a postupak obuhvata davanje subjektu kome je to potrebno efikasne koli čine konjugata, jedinjenja ili farmaceutske kompozicije pronalaska. U nekim realizacijama, A1C subjekta je smanjen, na primer, između oko 0,001% i oko 0,01%, između oko 0,01% i oko 0,1%, između oko 0,1% i oko 0,2%, između oko 0,2% i oko 0,3% između oko 0,3% i oko 0,4%, između oko 0,4% i oko 0,5%, između oko 0,5% i oko 1%, između oko 1% i oko 1,5%, između oko 1,5% i oko 2%, između oko 2% i oko 2,5%, između oko 2,5% i oko 3%, između oko 3% i oko 4%, između oko 4% i oko 5%, između oko 5% i oko 6%, između oko 6% i oko 7%, između oko 7% i oko 8%, između oko 8% i oko 9%, ili između oko 9% i oko 10% u odnosu na A1C subjekta pre davanja bilo kog od konjugata, jedinjenja, kompozicije, forme, lekove ili kombinacije pronalaska opisane ovde, ili upoređene sa kontrolnim subjektima koji ne primaju nijedan od konjugata, jedinjenja, kompozicija, oblika, lekova ili kombinacija pronalaska opisanih ovde.
[0185] U drugim realizacijama, obezbeđeni su postupci za smanjenje nivoa glukoze u krvi natašte kod subjekta kome je to potrebno, metode koje se sastoje od davanja subjektu kome je to potrebno efikasne količine konjugata, jedinjenja ili farmaceutske kompozicije pronalaska. . Nivo glukoze u krvi nata šte može biti smanjen na manje od oko 140 do oko 150 mg/dL, manje od oko 140 do oko 130 mg/dL, manje od oko 130 do oko 120 mg/dL, manje od oko 120 do oko 110 mg/dL dL, manje od oko 110 do oko 100 mg/dL, manje od oko 100 do oko 90 mg/dL, ili manje od oko 90 do oko 80 mg/dL, u odnosu na nivo glukoze u krvi subjekta natašte pre primene leka bilo koji od konjugata, jedinjenja, kompozicija, oblika, lekova ili kombinacija pronalaska opisanih ovde, ili upoređenih sa kontrolnim subjektima koji ne primaju nijedan od konjugata, jedinjenja, kompozicija, oblika, lekova ili kombinacija pronalaska opisanih ovde.
[0186] Predmetni pronalazak obezbeđuje metod modulacije aktivnosti Y2 receptora kod subjekta kome je to potrebno, metod koji obuhvata davanje subjektu kome je to potrebno efikasne koli čine konjugata, jedinjenja ili farmaceutske kompozicije pronalaska. Kako se ovde koristi, "modulacija" se odnosi na poveć anje ili smanjenje aktivnosti receptora.
[0187] U nekim realizacijama, efikasna količina konjugata ili jedinjenja pronalaska ili njegovog oblika, kompozicije ili leka se daje subjektu kome je to potrebno jednom dnevno, dva puta dnevno, tri puta dnevno, četiri puta dnevno, pet puta dnevno, šest puta dnevno, sedam puta dnevno ili osam puta dnevno. U drugim realizacijama, efikasna količina konjugata ili jedinjenja pronalaska ili njegovog oblika, kompozicije ili leka se daje subjektu kome je to potrebno jednom svaki drugi dan, jednom nedeljno, dva puta nedeljno, tri puta nedeljno, četiri puta. puta nedeljno, pet puta nedeljno, šest puta nedeljno, dva puta mesečno, tri puta mesečno ili četiri puta mesečno.
[0188] Još jedna realizacija pronalaska obuhvata metod prevencije, le čenja, odlaganja početka ili ublažavanja bolesti, poremeć aja ili sindroma, ili jednog ili vi še simptoma bilo koje od navedenih bolesti, poremeć aja ili sindroma kod subjekta kome je potrebna od toga, postupak koji obuhvata davanje subjektu kome je to potrebno efikasne količine konjugata, jedinjenja ili farmaceutske kompozicije pronalaska u kombinovanoj terapiji. U određenim realizacijama, kombinovana terapija je drugi terapeutski agens. U određenim rešenjima, kombinovana terapija je hirurška terapija.
[0189] Kako se ovde koristi, termin "u kombinaciji", u kontekstu primene dve ili vi še terapija subjektu, odnosi se na upotrebu više od jedne terapije.
[0190] Kako se ovde koristi, kombinovana terapija se odnosi na davanje subjektu kome je to potrebno jednog ili više dodatnih terapeutskih agenasa, ili jedne ili vi še hirurških terapija, istovremeno sa efikasnom količinom konjugata ili jedinjenja pronalaska ili oblika, kompozicije ili njegov lek. U nekim realizacijama, jedan ili više dodatnih terapeutskih agenasa ili hirurških terapija mogu se davati istog dana kao efikasna količina konjugata pronalaska, au drugim realizacijama, jedan ili vi še dodatnih terapeutskih agenasa ili hirurških terapija se mogu primeniti u istoj nedelji ili istom mesecu kao efektivna koli čina konjugata ili jedinjenja pronalaska.
[0191] U određenim realizacijama, gde je bolest ili poremeć aj izabran iz grupe koju čine gojaznost, dijabetes tipa II, metabolički sindrom, insulinska rezistencija i dislipidemija, drugi terapeutski agens mo že biti antidijabetički agens. U određenim realizacijama, antidijabetički agens može biti modulator receptora peptida-1 (GLP-1) sličan glukagonu.
[0192] Ovaj pronalazak takođe razmatra prevenciju, lečenje, odlaganje početka ili ublažavanje bilo koje od bolesti, poremeć aja, sindroma ili simptoma opisanih ovde kod subjekta kome je to potrebno sa kombinovanom terapijom koja obuhvata davanje subjektu kome je to potrebno. od toga efikasna koli čina konjugata, jedinjenja ili farmaceutske kompozicije pronalaska, u kombinaciji sa bilo kojim od sledeć ih terapeutskih agenasa: inhibitorom dipeptidil peptidaze-4 (DPP-4) (npr. , sitagliptin, saksagliptin, linagliptin, alogliptin, itd.); agonisti GLP-1 receptora (npr. agonisti GLP-1 receptora kratkog dejstva kao što su eksenatid i liksisenatid; agonisti GLP-1 receptora srednjeg dejstva kao što je liraglutid; agonisti GLP-1 receptora dugog dejstva kao što je eksenatid sa produženim oslobađanjem, albiglutid, dulaglutid); inhibitori ko-transportera natrijum-glukoze-2 (SGLT-2) (npr. kanaglifozin, dapaglifozin, empaglifozin, itd.); sekvestranti žučne kiseline (npr. kolesevelam, itd.); agonisti dopaminskog receptora (npr. bromokriptin sa brzim oslobađanjem); bigvanidi (npr. metformin, itd.); insulin; oksintomodulin; sulfoniluree (npr. hlorpropamid, glimepirid, glipizid, gliburid, glibenklamid, glibornurid, glisoksepid, gliklopiramid, tolazamid, tolbutamid, acetoheksamid, karbutamid, itd.); i tiazolidindioni (npr. pioglitazon, rosiglitazon, lobeglitazon, ciglitazon, darglitazon, englitazon, netoglitazon, rivoglitazon, troglitazon, itd.). U nekim realizacijama, doza dodatnog(ih) terapeutskog sredstva(a) se smanjuje kada se daje u kombinaciji sa konjugatom ili jedinjenjem pronalaska. U nekim realizacijama, kada se koristi u kombinaciji sa konjugatom ili jedinjenjem pronalaska, dodatni terapeutski agens(a) se mo že koristiti u nižim dozama nego kada se svako koristi pojedinačno.
[0193] U određenim realizacijama, gde je bolest ili poremeć aj izabran iz grupe koju čine gojaznost, dijabetes tipa I ili tipa II, metabolički sindrom (tj. sindrom X), insulinska rezistencija, poremeć ena tolerancija glukoze (npr. intolerancija glukoze), hiperglikemija, hiperinsulinemija, hipertrigliceridemija, hipoglikemija zbog kongenitalnog hiperinzulinizma (CHI), dislipidemija, ateroskleroza, dijabeti čka nefropatija i drugi kardiovaskularni faktori rizika kao što su hipertenzija i kardiovaskularni faktori rizika koji se odnose na nekontrolisane nivoe/ili porozole holesterola, nekontrolisane nivoe holesterola u lipidima alkoholna masna bolest jetre (NAFLD), nealkoholni steatohepatitis (NASH), bolest bubrega i ekcem, drugo terapeutsko sredstvo može biti liraglutid.
[0194] Ovaj pronalazak razmatra prevenciju, lečenje, odlaganje početka ili ublažavanje bilo koje od bolesti, poremeć aja, sindroma ili simptoma opisanih ovde kod subjekta kome je to potrebno, kombinovanom terapijom koja obuhvata davanje subjektu kome je to potrebno efikasne koli čine konjugata, jedinjenja ili farmaceutske kompozicije pronalaska u kombinaciji sa hirur škom terapijom. U određenim realizacijama, hirurška terapija može biti barijatrijska hirurgija (npr., operacija gastrične bajpasa, kao što je Roux-en-Y operacija gastrične bajpasa; gastrektomija rukava; operacija podesivog želučanog traka; biliopankreasna diverzija sa duodenalnim prekidačem; intragastrični balon; želučana plikacija; i njihove kombinacije).
[0195] U realizacijama u kojima se jedan ili više dodatnih terapeutskih agenasa ili hirurških terapija daju istog dana kao efikasna količina konjugata ili jedinjenja pronalaska, konjugat ili jedinjenje pronalaska se može primeniti pre, posle , ili istovremeno sa dodatnim terapijskim sredstvom ili hirur škom terapijom. Upotreba izraza "u kombinaciji" ne ograničava redosled kojim se terapije primenjuju na subjekta. Na primer, prva terapija (npr. ovde opisana kompozicija) se može primeniti pre (npr. 5 minuta, 15 minuta, 30 minuta, 45 minuta, 1 sat, 2 sata, 4 sata, 6 sati, 12 sati, 16 sati). sati, 24 sata, 48 sati, 72 sata, 96 sati, 1 nedelja, 2 nedelje, 3 nedelje, 4 nedelje, 5 nedelja, 6 nedelja, 8 nedelja ili 12 nedelja ranije), istovremeno sa ili nakon (npr. 5 minuta, 15 minuta, 30 minuta, 45 minuta, 1 sat, 2 sata, 4 sata, 6 sati, 12 sati, 16 sati, 24 sata, 48 sati, 72 sata, 96 sati, 1 nedelja, 2 nedelje, 3 nedelje 4 nedelje, 5 nedelja, 6 nedelja, 8 nedelja ili 12 nedelja nakon) primene druge terapije subjektu.
PRIMERI
SINTEZA
[0196] Jedinjenja ili konjugati ovog pronalaska mogu se sintetizovati u skladu sa op štim sintetičkim metodama poznatim onima koji su stručnjaci u ovoj oblasti. Sledeć i opis sinteze služi kao primer i ni na koji način ne predstavlja ograničenje pronalaska.
[0197] NTSC ciklični PYY (NTSC-PYY) analozi ili derivati ovog pronalaska mogu biti sintetizovani razli čitim poznatim, konvencionalnim procedurama za formiranje uzastopnih peptidnih veza izme đu amino kiselina, a prvenstveno se izvode sintezom peptida u čvrstoj fazi. (SPPS), kao što je generalno opisao Merrifield (J. Am. Chem. Soc., 1963, 85, 2149-2154), koristeć i automatizovani peptidni sintetizator, tradicionalnu ben č sintezu, ili kombinaciju oba pristupa. Konvencionalni postupci za sintezu peptida uklju čuju kondenzaciju između slobodne amino grupe jednog aminokiselinskog ostatka, čije su druge reaktivne funkcionalnosti na odgovarajuć i način zašti ć ene, i slobodne karboksilne grupe druge amino kiseline, čije su reaktivne funkcionalnosti takođe na odgovarajuć i način zašti ć ene. Primeri sredstava za kondenzaciju koji se obično koriste za formiranje peptidne veze uključuju diizopropilkarbodiimid (DIC) sa ili bez 1-hidroksibenztriazola (HOBT) ili etil cijano(hidroksiimino)acetat (Oxima Pure), 2-(1H-benzotriazol-1-il)- 1,1,3,3-tetrametilaminijum heksafluorofosfat (HBTU), 2-(1H-7-azabenztriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilaminijum heksafluorofosfat (HATU), 2-(6-hloro -1H-benztriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilaminijum heksafluorofosfat (HCTU), 1-cijano-2-etoksi-2-oksoetilidenaminooksi-tris-pirolidino-fosfonijum heksafluorofosfat (2-(1H), -benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilaminijum tetrafluoroborat (TBTU) bromo-tris-pirolidino-fosfonijum heksafluorofosfat (Py-BroP) i slično.
[0198] Metodologija automatske sinteze peptida može se izvesti na sobnoj temperaturi ili na povišenim temperaturama, poželjno primenom mikrotalasnog zagrevanja, kao što je opisao Iu (J. Org. Chem., 1992, 57, 4781- 4784) i kao što je nedavno precizirao Palasek (J. Pept. Sci., 2007, 13, 143-148).
[0199] Jedinjenja ovog pronalaska (C-terminalni amidi) mogu se pogodno pripremiti kori šć enjem N-a-FMOC (9-fluroenilmetiloksikarbonil) zaštić ene aminokiselinske metodologije, pri čemu je karboksi kraj odgovarajuć e zašti ć enog N-a-FMOC zašti ć ene aminokiseline je spojen na konvencionalnu smolu u čvrstoj fazi korišć enjem odgovaraju ć eg sredstva za spajanje. Odgovaraju ć e konvencionalne, komercijalno dostupne smole čvrste faze uključuju Rink amid MBHA smolu, Rink amid AM smolu, Tentagel S RAM smolu, FMOC-PAL-PEG PS smolu, SpheriTide Rink amid smolu, ChemMatrik Rink smolu, Sieber amid smolu, TG Sieber smolu i slično. FMOC-amino kiselina vezana za smolu se zatim može ukloniti izlaganjem 20 % piperidina u N,N-dimetilformamidu (DMF) ili 1-metil-2-pirolidonu (NMP), čiji tretman služi za selektivno uklanjanje FMOC zaštitna grupa. Dodatne FMOC-zaštić ene aminokiseline se zatim spajaju i uklanjaju zaštitu sekvencijalno, čime se stvara željeni zaštić eni peptid vezan za smolu. U određenim slučajevima, može biti neophodno da se koristi ortogonalno reaktivna zaštitna grupa za drugi amin u peptidnoj sekvenci koji bi izdržao uslove deprotekcije FMOC. Zaštitne grupe kao što su 4-metiltritil (Mtt) ili 4-metoksitritil (Mmt), obe koje se mogu ukloniti tretmanima sa 1 % trifluorosirć etnom kiselinom (TFA)/dihlorometanom (DCM), ili poželjno aliloksikarbonil (alok; može se ukloniti pomoć u Pd(PPh3)4 (tetraxy) trifenilfosfin)paladijum(0))/PhSiH3 (fenilsilan) tretman), 1-(4,4-dimetil-2,6-dioksocikloheks-1-iliden)etil (Dde; može se ukloniti tretmanom sa 2-3 % hidrazina/DMF) i 1-(4,4-dimetil-2,6-dioksocikloheks-1-iliden)-3-metilbutil (ivDde; koji se može ukloniti tretmanom sa 2-3% hidrazina/DMF) mogu se efikasno koristiti u takvim slučajevima.
[0200] U konvencionalnim sintetičkim metodologijama peptida, reaktivni bočni lanci alfa aminokiselina su generalno zaštić eni tokom sinteze sa odgovaraju ć im zaštitnim grupama da bi ih učinili inertnim prema protokolima spajanja i uklanjanja zaštite. Dok su višestruke zaštitne grupe za bočne lance amino kiselina poznate u tehnici, ovde su sledeć e zaštitne grupe najpoželjnije: terc-butil (t-Bu) za serin, treonin, glutaminsku kiselinu, asparaginsku kiselinu i tirozin; tritil (Trt) za asparagin, glutamin, cistein, homocistein i histidin; terc-butiloksikarbonil (Boc) za triptofan i e-amino grupu lizina; i 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonil (Pbf) za arginin. Ove zaštitne grupe se uklanjaju nakon tretmana jakom kiselinom, kao što je visoka koncentracija trifluorosirć etne kiseline (TFA).
[0201] Po završetku SPPS-a, za smolu vezan peptid zaštić en bočnim lancem se uklanja zaštita i istovremeno se odvaja od smole korišć enjem koktela za cepanje koji se sastoji pretežno od (TFA) zajedno sa različitim kombinacijama hvatača karbokatjona, kao što je triizopropil SAVETI), voda, fenol i anisol. Sirovi čvrsti peptid se zatim izoluje precipitacijom peptida/koktel filtrata sa hladnim etrom. U posebnom slučaju zaštić enih peptida vezanih za Sieber smolu, cepanje zašti ć enog peptida od smole može se povoljno izvršiti nakon ponovljenog tretmana sa 1-2% TFA u DCM bez izazivanja uklanjanja zaštite bočnog lanca. Jednom izolovan, dalje manipulacije zaštić enim peptidom mogu se sprovesti u reakcijama u fazi rastvora. Konačno, zaštić eni peptid se može globalno ukloniti zaštitnim slojem koriš ć enjem odvojenog tretmana sa koktelom za cepanje i istaložiti kao što je gore opisano. Tako dobijeni sirovi peptid se zatim rastvori u niskoj koncentraciji (ca., < 4 mg/mL) u pretežno vodenom (qk) sistemu rastvarača koji sadrži organski korastvarač kao što je acetonitril ili etanol. Nakon podizanja pH rastvora na > 5, peptid zatim prolazi kroz reakciju intramolekularne ciklizacije da bi se formirao odgovarajuć i sirovi NTSC PYY analog ovog pronalaska. Ovako formirani NTSC PYY analozi mogu se prečistiti korišć enjem tehnika prečiš ć avanja koje su opšte poznate u tehnici. Poželjni metod prečišć avanja peptida koji se ovde koristi je tečna hromatografija visokih performansi reverzne faze (HPLC). Prečišć eni peptidi se zatim karakterišu tečnom hromatografijom/masenom spektrometrijom (LC/MS).
[0202] Podrazumeva se da su sledeć i primeri i realizacije opisani ovde samo u ilustrativne svrhe i da ć e različite modifikacije ili promene u njihovom svetlu biti sugestivne za osobe koje su verzirane u ovoj oblasti i treba da budu uključene u duh i delokrug ove prijave i obim priloženih patentnih zahteva. Sve publikacije, patenti i patentne prijave koje se ovde citiraju su u celini inkorporirane kao referenca za sve svrhe.
4
OPŠTE ŠEME
[0203] Opšti sintetički postupak za sintezu C-terminalnih amidnih NTSC-PYY peptida je opisan u US patentnoj prijavi br. 62/413,613, podnetoj 27. oktobra 2016. i US patentnoj prijavi br. _______, pod naslovom „Ciklični peptid tirozin tirozin jedinjenja kao modulatori neuropeptidnih receptora“, podneta istog dana kada i ova prijava sa brojem PRD3411. Sadržaj obe prijave je ovim u celini inkorporiran kao referenca.
Primer 1: Sinteza cikličkog PYY analognog SEK ID BR:1
[0204]
1. Sinteza Fmoc-psi-[Arg(Pbf)-(N-Boc)Tyr(tBu)]-OH
A. Sinteza H2N-Tyr(tBu)-OAll
[0205] U ledom hlađen rastvor Fmoc-Tyr(tBu)-O (69 g, 150,15 mmol) i K2CO3(62 g, 445,36 mmol) u DMF (500 mL) dodat je alilbromid (72 g, 595,16 mmol) i dobijena smeša je mešana 3 h. Zatim je dodat led/voda (1L) i smeša je ekstrahovana sa EtOAc. Kombinovani organski ekstrakti su osušeni (Na2S04) i koncentrovani pod sniženim pritiskom da bi se dobio Fmoc-Tyr(tBu)-OAll kao žuto ulje. U ledom hlađen rastvor Fmoc-Tyr(tBu)-OAll (70 g, 140.1 mmol) u DMF (600 mL) dodat je piperidin (150 mL) u kapima tokom perioda od 20 min. Posle 3 h reakcioni rastvor je sipan u vodu/led (1 L), i ekstrahovan sa EtOAc (2 x 2 L). Kombinovani organski ekstrakti su osušeni (Na2S04) i koncentrovani pod sniženim pritiskom. Tako dobijeni ostatak je prečišć en hromatografijom na silika gelu, eluiranjem sa EtOAc/petrolej etrom (10:1) da bi se dobilo 34 g H2N-Tir(tBu)-OAll kao žuto ulje.
B. Sinteza F Sinteza Fmoc-Arg(Pbf)-N(Me)OMe (2)
[0206] U ledom hlađenu smešu Fmoc-Arg(Pbf)-OH (1) (64,8 g, 99,88 mmol), N,O-dimetilhidroksilamin hidrohlorida (20 g, 206,2 mmol) i HATU (57 g, 149,91 mmol) u DCM (500 mL) je dodat DIEA (52 g, 402,2 mmol) u kapima tokom perioda od 10 min, i dobijena smeša je ostavljena da se meša na sobnoj temperaturi preko noć i. Reakcija je zatim sipana u vodu/led (1 L) i ekstrahovana sa DCM (1 L). Organski ekstrakti su osušeni (Na2S04) i koncentrovani pod sniženim pritiskom da bi se dobilo 70 g sirovog Fmoc-Arg(Pbf)-N(Me)OMe (2) kao žuta čvrsta supstanca, koja je korišć ena bez daljeg prečiš ć avanja.
C. Sinteza Fmoc-Arg(Pbf)-CHO (3)
[0207] U ohlađeni (-78 °C) rastvor LAH u THF (1M, 107 mL, 0,107 mmol) u inertnoj atmosferi azota dodat je kroz kanilu ohlađen (-50 °C) rastvor Fmoc-Arg (Pbf)-N(Me)OMe (2) (50 g, 72,3 mmol) u THF (100 mL) kap po kap tokom perioda od 1 h. Posle mešanja na -78 °C tokom 5 h, smeša je sipana u 1N rastvor HCl (300 mL), pa je dodato još 1N HCl po potrebi da se pH podesi na 4, a zatim ekstrahovana sa EtOAc (2 x 2L). Kombinovani organski ekstrakti su osušeni (Na2S04) i koncentrovani pod sniženim pritiskom da bi se dobilo 45 g sirovog Fmoc-Arg(Pbf)-CHO (3) kao žuta čvrsta supstanca, koja je korišć ena bez daljeg prečiš ć avanja. D. Sinteza Fmoc-psi-[Arg(Pbf)-Tyr(tBu)]-OAll (4)
[0208] U ledom hlađen rastvor Fmoc-Arg(Pbf)-CHO (3) iz koraka C (45 g, 71,12 mmol) i H2N-Tyr(tBu)-OAll iz koraka A (32 g, 115,37 mmol) u THF (200 mL), MeOH (200 mL) i HOAc (15 mL) dodat je natrijum cijanoborhidrid (18,0 g, 286,4 mmol) u porcijama tokom perioda od 30 minuta, a dobijeni rastvor je me šan na sobnoj temperaturi preko noć i . Reakcija je uga šena dodavanjem zasi ć enog vodenog rastvora NaHC03(500 mL) i smeša je ekstrahovana sa EtOAc (2 x 2L). Kombinovani organski ekstrakti su osušeni (Na2S04) i koncentrovani pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišć en hromatografijom na silika gelu eluiranjem sa EtOAc/petrolej etrom (10:1) da bi se dobilo 40 g Fmoc-psi-[Arg(Pbf)-Tyr(tBu)]-OAll (4) kao žuta čvrsta supstanca.
E. Sinteza Fmoc-psi-[Arg(Pbf)-N(Boc)Tyr(tBu)]-OAll (5)
[0209] Za rastvor Fmoc-psi-[Arg(Pbf)-Tyr(tBu)- OAll] (4) (53 g, 59,28 mmol) u MeCN (240 mL) je dodat diterc-butil dikarbonat (20 g, 91,3 mmol), a dobijeni rastvor je mešan na 50 °C preko noć i. Smeša je zatim koncentrovana pod sniženim pritiskom, a ostatak je prečišć en hromatografijom na silika gelu eluiranjem sa EtOAc/petroleterom (1:1) da bi se dobilo 32 g Fmoc-psi-[Arg(Pbf)-N(Boc)Tyr(tBu)]-OAll (5) kao žuta čvrsta supstanca.
F. Sinteza Fmoc-psi-[Arg(Pbf)-N(Boc)Tyr(tBu)]-OH (6)
[0210] U ohlađeni (-30 °C) rastvor Fmoc-psi-[Arg(Pbf)-N(Boc)Tyr(tBu)]-OAll (5) (32 g, 32 mmol) u DCM (600 mL ) u inertnoj atmosferi azota dodat je Pd(PPh3)4(3,0 g, 4,33 mmol), a zatim je u kapima dodavan N-metilanilin (10 g, 93 mmol) tokom perioda od 30 min. Dobijena smeša je mešana na sobnoj temperaturi 2 h, a zatim koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišć en hromatografijom na silika gelu eluiranjem sa EtOAc/petroleterom (1:1) da bi se dobilo 26,8 g Fmoc-psi-[Arg(Pbf)-N(Boc)Tyr(tBu)]-OH (6)
4
kao žuć kasta čvrsta supstanca. 1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ 7,75-7,77 (2H, m), 7,59-7,60 (2H, m), 7,32-7,33 (4H, m), 7,09-7,11 (2H, m), 6,87-7,000 (2H, m), 7,32-7,33 (4H, m), 6,87-7,00 , m), 4,27-4,50 (3H, m), 3,30-3,50 (4H, m), 3,02-3,23 (3H, m), 2,75- 2,98 (3H, m), 2,57 (3H, s), 2,48 (3H , s), 2,00 (3H, s), 1,31-1,41 (28H, m). LC/MS (ES, m/z): masa izrač. za C52H67N5O10S: 953,46, nađeno: 954,55 [M+H]+.
2. Ubacivanje dipeptida Fmoc-psi-(R35-N(Boc)-Y36) na Siber smolu
[0211] U reakcionom sudu za mikrotalasnu peć nicu (isporučio CEM Corporation), NovaSin TG Sieber smola (isporučio Novabiochem) (0,2 mmol) je tretirana sa 20 % piperidina u DMF (10 mL) i zagrevana na 50 °C tokom 2,5 min u CEM mikrofon talasnom reaktoru. Reakcija je isceđena i smola je isprana sa DMF i ponovo tretirana sa 20 % piperidina u DMF na 50 °C tokom 5 minuta u CEM mikrotalasnom reaktoru. Nakon odvodnjavanja i pranja smole sa DMF-om, tretman deprotekcije je ponovljen jo š jednom. Smola je zatim tretirana rastvorom Fmoc-psi-[Arg(Pbf)-(N-Boc)Tyr(tBu)]-OH dobijenim od onog napred (3-5 ekv.), HATU (2,75 - 4,8 ekv.) i DIEA (6 - 10 ekv.) u DMF (4 mL) i mešani na sobnoj temperaturi 6 do 24 h. Smeša je oceđena i smola je opsežno isprana sa DMF, a zatim zatvorena tretmanom sa 20 % Ac2O u DMF (5 mL) u mikrotalasnim uslovima na 50 °C tokom 5 min. Reakcija je isceđena i smola je intenzivno isprana sa DMF i DCM.
3. Sinteza Fmoc-βA-IKPEAPGEK(Alloc)ASPEELNRYYASLRHYLNL(hC) TRQ(psi-R35Y36) - Siber smola [0212] Proširenja aminokiselina na prethodno napunjenu (psi-R35, I36)-Siber smolu (0,2 mmol) izvedena su na CEM Liberty Blue Microwave peptidnom sintetizatoru. Standardne a-Fmoc-za štić ene aminokiseline su dvostruko spregnute u 3,8-strukom višku u odnosu na početno punjenje smolom na 50 °C tokom 15 minuta koristeć i HBTU/DIEA kao sredstva za spajanje. Fmoc-Arg(Pbf)-OH je dvostruko spregnut koriš ć enjem dvostepenog protokola: 25 min na sobnoj temperaturi, zatim 15 min na 50 °C, a Fmoc-His(Trt)-OH je dvostruko spregnut korišć enjem dvostepenog protokol: 4 min na sobnoj temperaturi, a zatim 8 min na 50 °C.
4. Sinteza Fmoc-βA-IKPEAPGEK(NH2)ASPEELNRYYASLRHYLNL(hC) TRQ(psi-R35Y36) -Siber smola: uklanjanje alocirane zaštite
[0213] Dobijena smola kako je napred navedeno je tretirana rastvorom fenilsilana (25 ekv.) u deoksigenovanom DCM (10 mL). Posle mešanja od ∼ 2 min, dodat je rastvor Pd(PPh3)4(0,5 ekv.) u DCM (10 mL) i smeša smole je mešana 30 min pod argonom. Reakcija je isceđena i smola je isprana deoksigenisanim DCM. Uklanjanje zaštite je ponovljeno sa svežim reagensima, nakon čega je reakcija isceđena i smola je opsežno isprana sa DCM i DMF.
5. Sinteza Fmoc-βA-IKPEAPGEK(NH-dPEG12-NHFmoc)ASPEELNRYY ASL- RHYLNL(hC)TRQ(psi-R35Y36) -Siber smola: spajanje N-Fmoc dPEG12karboksilnih kiselina na 11K
[0214] Sieber smola kako je napred opisana je tretirana rastvorom N-Fmoc-dPEG12-karboksilne kiseline (5 ek), HBTU (4,8 ek.) i DIEA (10 ek.) u DMF (7 mL). ) u CEM mikrotalasnom reaktoru na 50 °C tokom 15 minuta, do kada je reakcija pokazala negativan Kajzerov test. Reakcija je isce đena i smola je opsežno isprana sa DMF i DCM.
6. Sinteza BrCH2COHN-βA-IKPEAPGEK(NH-dPEG12-NHCOCH2Br)ASPEEL NRYYASL- RHYLNL(hC)TRQ(psi-R35Y36)-Siber smola: bis-bromoacetilacija na b12i dPEG
[0215] Gornja smola je podvrgnuta uklanjanju zaštite od Fmoc upotrebom svežeg 20 % piperidina u DMF-u na 50 °C tokom 5 minuta u CEM mikrotalasnom reaktoru. Skidanje zaštite je ponovljeno dva puta. Ovako dobijena peptidna smola bez Fmoc-a je tretirana rastvorom bromosirć etnog anhidrida (20 ekv.) u DMF (5 mL) u CEM mikrotalasnom reaktoru na 50 °C tokom 10 minuta, do kada je reakcija pokazala negativan Kajzerov rezultat. test. Reakcija je oceđena, a smola je opsežno isprana sa DMF i DCM, a zatim osušena.
7. SintezaBrCH2COHN-βA-IKPEAPGEK(NH-dPEG12-NHCOCH2Br)ASPEELNRYYASL-RHYLNL(hC)TRQ(psi-R35Y36)-CONH2 :odvajanje od smole i globalno uklanjanje zaštite
[0216] Osušena smola je tretirana rastvorom 1,5 % TFA u DCM (10 mL) i mešana 5 do 10 min, a zatim filtrirana. Ovaj tretman je ponovljen još 9 puta koristeć i svež koktel za svaki tretman. Kombinovani filtrati su zatim kombinovani i koncentrovani da bi se dobio sirovi za štić eni peptid kao žuta pena. Ova pena je
4
tretirana sa 20 mL koktela za cepanje (TFA/fenol/H2O/TIPS = 88/5/5/2) na sobnoj temperaturi tokom 2,5 h, a zatim koncentrovana pod strujom azota do zapremine od ∼ 2,5 mL, hladno etar (40 mL) je zatim dodat da se istaloži peptid. Smeša je centrifugirana (5 min; 5000 rpm) i dekantirana. Ovaj proces je ponovljen još 2 puta da bi se dobio sirovi peptid u obliku prljavo belog praha.
[0217] Alternativno, smola je tretirana koktelom za cepanje bez prethodnog tretmana sa 1-2 % TFA u DCM da bi se dobio peptid sa potpuno deprotekcijom.
8. Ciklični PYY analogni SEK ID BR: 1: postupak ciklizacije A i prečišć avanje
[0218] Sirovi peptid je rastvoren u deoksigenisanom 50 % MeCN/voda (5-10 mg/mL), EDTA (1 mM) je dodat opciono. pH reakcionog rastvora je zatim podignut na oko 8 dodavanjem 7,5 v/v % rastvora NaHC03. Dobijeni rastvor je mešan na sobnoj temperaturi 0,5 do 2,5 h, a zatim zakiseljen do pH < 1 dodavanjem TFA. Rastvor je zatim koncentrovan pod sniženim pritiskom na sobnoj temperaturi do oko polovine prvobitne zapremine (∼ 24 mL). Dobijeni rastvor je prečišć en preparativnom HPLC sa reverznom fazom. Prečišć avanja su izvedena na Gilson HPLC 2020 Personal Purification System koriste ć i Varian Pursuit XRs C18 kolonu (30 x 250 mm, 100A, 5 mm). Mobilna faza se sastojala od gradijenta eluiranja pufera A (0,1 % TFA u vodi) i pufera B (0,1 % TFA u MeCN) u rasponu od početna koncentracija od 20 % B do konačne koncentracije od 50 % B tokom 36 min. UV detekcija je prać ena na 220 i 254 nm. Frakcije koje sadr že proizvod su analizirane analitičkom HPLC na Agilent 1100 HPLC sistemu korišć enjem istog tipa kolone kao gore (4,6 x 250 mm, 5 mm). Čiste frakcije su kombinovane, a zatim liofilizovane da bi se dobio proizvod kao čvrsta supstanca nalik pamuku. LCMS: 1225,5 (M+4H)/4, 1633,4 (M+3H)/3 i 2450,0 (M+2H)/2 za pik proizvoda na 12,27 min (LC: Atlantis T3 C18 kolona, 5 um, 4,6 x 250 mm , 1,0 mL/min, 15-60 % gradijent)
Primer 2: Sinteza cikličkog PYY analognog SEK ID BR:2
1. Sinteza H2N-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNL(hC) TRQRY-PAL-PEG smole
[0219] Zaštić ena peptidilna smola je sintetizovana koriš ć enjem Fmoc strategije kao što je napred opisano na CEM Liberty Blue mikrotalasnom peptidnom sintetizatoru kori šć enjem Rink amidnih smola niskog optereć enja, poželjno, Fmoc-PAL-PEG PS smole (oko, 0,16 - 0,2 mek/g, isporučuje Applied Biosystems) na skali od 0,1 mmol, kao što je prikazano na Šemi 1. Standardne Fmoc-zaštić ene aminokiseline su spojene u 5-strukom višku u odnosu na punjenje smolom korišć enjem DIC/Oxima kao agensa za spajanje i reakcione temperature od oko 90 °C tokom 4 min. Fmoc-Arg(Pbf)-OH je dvostruko spojen na 90 °C tokom 4 minuta svaki i Fmoc-His(Trt)-OH je kuplovan korišć enjem dvostepenog protokola: 4 min na sobnoj temperaturi, a zatim 8 minuta na 50 °C. Pojedinačne Fmoc deprotekcije su sprovedene korišć enjem 20 % piperidina u DMF (rastvor za uklanjanje zaštite) na 90 °C tokom 1,5 min.
2. Sinteza m-BrCH2PhCOHN-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNL(hC) TRQRY-PAL-PEG smole
[0220] Peptidna smola bez Fmoc-a (0,1 mmol) je tretirana rastvorom m-bromometil-benzojeve kiseline (20 ekv.) i DIC (10 ekv.) u DMF (4 mL) u mikrotalasnom reaktoru na 75 °C tokom 15 min, do kada je u opštem utvrđeno da je reakcija završena, prema Kaiser ninhidrinskom testu (Kaiser, et al., Anal. Biochem., 1970, 34, 595-598). U slučajevima kada se utvrdi da je kuplovanje nepotpuno, kuplovanje je ponovljeno sa svežim reagensima. Reakcija je isceđena, a smola je opsežno isprana sa DMF i DCM.
3. Sinteza m-BrCH2PhCOHN-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNL(hC) TRQRY-CONH2: uklanjanje zaštite i odvajanje od smole
[0221] Smola je zatim tretirana koktelom za cepanje (10 mL / 0,1 mmol skale) koji se sastoji od TFA/voda/fenol/TIPS (88:5:5:2) i zagrejana u mikrotalasnom reaktoru na 38 °C 40 min, a zatim filtriran. Smola je isprana sa TFA i kombinovani filtrati su koncentrovani u struji azota do zapremine od ca. 2,5 mL i peptid je istaložen dodatkom hladnog dietil etra (40 mL). Suspenzija peptid/etar je centrifugirana i etarski sloj je dekantiran. Pelet je ponovo suspendovan u etru, centrifugiran i dekantovan, a ovaj proces je ponovljen treć i put. Tako dobijeni sirovi peptid je osušen pod blagim strujanjem azota.
4. Ciklični PYY analogni SEK ID BR:2: postupak ciklizacije A i prečišć avanje
[0222] Gore navedeni sirovi peptid je rastvoren u deoksigeniranom MeCN/vodi (60 % MeCN) u koncentraciji od ≤ 4 mg/mL. pH rastvora peptida je zatim podignut na ca. 7 - 9 dodavanjem ak. NH4OAc
4
(200 mM, pH 8,4) i dobijeni rastvor je mešan na sobnoj temperaturi dok se ciklizacija ne završi, prema LCMS (obično, 3-4 h). Reakciona smeša ciklizacije je zakiseljena do pH 1,5 - 3 dodavanjem TFA, a rastvor je koncentrovan da bi se uklonio već i deo organskog korastvarača do tačke gde je došlo do blagog zamuć enja. Minimalna količina MeCN je dodata po potrebi da bi se smeša učinila homogenom i dobijeni rastvor je zatim prečišć en direktno preparativnom HPLC u višestrukim injekcijama koriš ć enjem kolone C18 Varian Pursuit XRs C18 (21x250 mm, 100A, 5 mm). Mobilna faza se sastojala od gradijenta eluiranja pufera A (0,1 % TFA u vodi) i pufera B (0,1 % TFA u MeCN) u rasponu od početne koncentracije od 20 % B do konačne koncentracije od 40 % B tokom 45 minuta. UV detekcija je prać ena na 220 i 254 nm. Frakcije koje sadrže proizvod su analizirane analitičkom HPLC na Agilent 1100 HPLC sistemu korišć enjem odgovaraju ć e kolone. Čiste frakcije su kombinovane, koncentrovane da se ukloni već i deo organske faze, a zatim liofilizovane.
Primer 3: Sinteza cikličkog PYY analoga SEK ID BR: 3
1. Sinteza (H2N)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNL-(azido-norLeu)-TRQRYPAL-PEG smole
[0223] Peptid vezan za smolu je pripremljen na skali od 0,1 mmol u skladu sa metodom opisanom u Primeru 2, korak 1, zamenom Fmoc-azidonorLeu-OH umesto Fmoc-hCis(trt)-OH na poziciji 31.
2. Sinteza (HCCH(CH2)2CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNL-(azido-norLeu)-TRQRYPAL-PEG smole [0224] 4-pentinoična kiselina je kuplovana na gornju smolu u mikrotalasnim uslovima korišć enjem DIC/HOBT protokola (75 °C, 10 min). Reakcija je isceđena i smola je opsežno isprana sa DMF i DCM.
3. Sinteza (HCCH(CH2)2CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNL-(azido-norLeu)-TRQRYPAL- CONH2[0225] Gornja smola je tretirana sa 10 mL koktela za cepanje koji se sastoji od TFA/DODT/H2O/TIS (92,5:2,5:2,5:2,5) u mikrotalasnim uslovima (38 °C, 40 min). Reakcija je isceđena i smola je isprana sa TFA (10 mL). Kombinovani filtrat je zatim koncentrovan pod strujom azota do zapremine od ∼ 2,5 mL. Hladni etar (40 mL) je zatim dodat da se istaloži peptid i smeša je centrifugirana (5 min; 5000 rpm) i dekantirana. Ovaj proces je ponovljen još 2 puta da bi se dobio sirovi peptid u obliku prljavo belog praha.
4. Ciklični PYY analog SEK ID BR: 3
[0226] Pripremiti 7 mg CuSO4u 2 mL deoksigenisane H2O. Pripremite 30 mg TBTA u 5,4 mL EtOH i 0,6 mL MeCN. Prethodno pomešati 0,94 mL rastvora CuSO4i 4,8 mL rastvora TBTA. Pripremiti 30 mg Na askorbata u 3 mL deoksigenirane H2O.
[0227] U rastvor sirovog peptida koji sadrži azido iz Koraka 3 (100 mg) u 20 mL deoksigenisane vode dodat je prethodno mešani rastvor CuSO4/TBTA, a zatim 2,4 mL rastvora Na askorbata (rastvor je odmah postao mlečan). Smeša je zagrejana do 40 °C i mešana 1,5 h, za koje vreme LCMS analiza je pokazala potpunu reakciju. Smeša je razblažena do ~40 mL sa vodom (0,1% TFA); smeša je centrifugirana, a supernatant je prečišć en preparativnom HPLC reverzne faze. Prečiš ć avanja su izvedena koriš ć enjem Varian Pursuit XRs C18 kolone (21 x 250 mm, 100 A, 5 mm) na 35 °C. Mobilna faza se sastojala od gradijenta eluiranja pufera A (0,1 % TFA u vodi) i pufera B (0,1 % TFA u MeCN) u rasponu od početne koncentracije od 10 % B do srednje koncentracije od 18 % B (21 mpm) i zatim do konačne koncentracije od 33 % B (10,5 mpm) tokom 35 min. UV detekcija je prać ena na 220 i 254 nm. Frakcije koje sadrže proizvod su analizirane analitičkom HPLC na Agilent 1100 HPLC sistemu korišć enjem istog tipa kolone kao gore (4,6 x 250 mm, 5 mm). Čiste frakcije su kombinovane, a zatim liofilizovane da bi se dobio proizvod kao čvrsta supstanca nalik pamuku.
Primer 4: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 4
1. Sinteza (Dde)K(NH2)ASPEELNRYYASLRHYLNL(hC) TRQRY-PAL-PEG smole
[0228] Peptid vezan za smolu je pripremljen korišć enjem metode opisane u Primeru 2, korak 1.
2. Sinteza (Dde)K(NH-Glu-(OtBu)NH2)ASPEELNRYYASLRHYLNL(hC) TRQRY-PAL-PEG smole
[0229] Fmoc-Glu-OtBu (5 ekv.) je kuplovan na gornju smolu u mikrotalasnim uslovima korišć enjem DIC/Okima metoda spajanja (90°C, 6 min; dc). Smola je oceđena i isprana sa DMF. Fmoc deprotekcija je zatim sprovedena korišć enjem 20 % piperidina u DMF-u koriš ć enjem 3-stepenog protokola (75°C tokom 0,5
4
min; 75°C tokom 3 min; 75°C tokom 3 min) sa ispiranjem DMF-a u svakoj fazi.
3. Sinteza (Dde)K(NH-Glu-(OtBu)NH-Pal)ASPEELNRYYASLRHYLNL(hC) TRQRY-PAL-PEG smole [0230] Palmitinska kiselina (5 ekv.) je spojena na gornju smolu u mikrotalasnim uslovima kori šć enjem DIC/Oxima metode (90°C, 5 min). Smola je oceđena i isprana u velikoj meri sa DMF i DCM.
4. Sinteza (H2N)K(NH-Glu-(OtBu)NH-Pal)ASPEELNRYYASLRHYLNL(hC) TRQRY-PAL-PEG smole
[0231] Nakon ispiranja gornje smole sa DMF-om, ona je tretirana rastvorom 2 % hidrazina u DMF-u (6 mL / 0,1 mmol smole) na sobnoj temperaturi 5 min, zatim oceđen i ispran sa DMF. Tretman je ponovljen još 5 puta.
5. Sinteza (H2N)IKPEAPGEK(NH-Glu-(OtBu)NH-Pal)ASPEELNRYYASLRHYLNL(hC) TRQRY-PAL-PEG smole [0232] Preostala spajanja amino kiselina su izvedena korišć enjem metode opisane u Primeru 2, korak 1.
6. Ciklični PYY analog SEK ID BR: 4
[0233] Ostatak sinteze je izveden korišć enjem metoda opisanih u Primeru 2, koraci 2-4. Prečiš ć avanje proizvoda je izvedeno korišć enjem Varian Pursuit XRS C18 kolone (21 x 250 mm, 100 A, 5 mm) na sobnoj temperaturi. Mobilna faza se sastojala od gradijenta eluiranja pufera A (0,1 % TFA u vodi) i pufera B (0,1 % TFA u MeCN) u rasponu od 23 % B do srednje koncentracije od 33 % B (21 mpm) tokom 5 minuta, i zatim do konačne koncentracije od 48 % B (10,5 mpm) tokom 55 min.
Primer 5: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 5
[0234] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema proceduri kako je opisano u Primeru 4 zamenom a-Tokoferiloksisirć etne kiseline (AcVitE) (8) umesto palmitinske kiseline u koraku 3. Prečiš ć avanje proizvoda je izvedeno korišć enjem Agilent 300SB C8 kolone ( 21 x 250 mm, 100A, 5 mm). Mobilna faza se sastojala od gradijenta eluiranja pufera A (0,1 % TFA u vodi) i pufera B (0,1 % TFA u MeCN) u rasponu od po četne koncentracije od 35 % B do srednje koncentracije od 45 % B (21 mpm) preko 5 min, a zatim do kona čne koncentracije od 60 % B (10,5 mpm) tokom 60 min.
Primer 6: Sinteza cikličkog PYY analoga SEK ID BR: 6
1. Sinteza (HCCH(CH2)2CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNK(Dde)-(azido-norLeu)-TRQRY-PAL- PEG smole
[0235] Peptid vezan za smolu je pripremljen kao što je opisano u Primeru 3, korak 1, zamenom Fmoc-Lis(Dde)-OH umesto Fmoc-Leu-OH na poziciji 30 i ugradnjom 4-pentinske kiseline (dvostruko spregnute) u ovom koraku na poziciji 2, nakon Fmoc-Ile-OH na poziciji 3.
2. Sinteza (HCCH(CH2)2CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNK(NH2)-(azido-norLeu)-TRQRY-PAL- PEG smole
[0236] Gorenavedena smola je tretirana sa 3 % hidrazina u DMF-u (8 mL / 0,1 mmol skala) tokom 5 min na sobnoj temperaturi, a zatim je smeša oceđena i isprana sa DMF. Ovaj postupak je ponovljen cca. 5 puta, nakon čega je smola opsežno isprana sa DMF, a zatim DCM.
3. Sinteza (HCCH(CH2)2CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNK(NH-γ-Glu-AcVitE)-(azido-nor- Leu)-TRQRY-PAL-PEG smole
[0237] Fmoc-Glu-OtBu je spojen na gornju smolu korišć enjem protokola kuplovanja opisanog u Primeru 2, korak 1 sa vremenom kuplovanja od 5 minuta. Zaštita smole je uklonjena tretmanom sa 20 % piperidina u DMF-u korišć enjem 3-stepenog mikrotalasnog protokola (75 °C, 0,5 min; 75 °C, 3 min; 75 °C, 3 min), nakon čega je smola temeljno isprana sa DMF i DCM. a-Tokoferiloksisirć etna kiselina (AcVitE) (8) je zatim spojena na smolu koristeć i isti postupak koji se koristi za kuplovanje Fmoc-Glu-OtBu.
4
4. Sinteza (HCCH(CH2)2CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNK(NH-γ-Glu-AcVitE)-(azido-nor-Leu)-TRQRY-CONH2
[0238] Cepanje i taloženje peptida iz gornje smole izvedeno je korišć enjem procedure opisane u Primeru 3, korak 3.
5. Ciklični PYY analog SEK ID BR: 6
[0239] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno korišć enjem procedure opisane u Primeru 3, korak 4. Prečišć avanje proizvoda je izvedeno na Varian Pursuit XRs C8 kolone (21 x 250 mm, 100 A, 5 mm) na 35 °C. Mobilna faza se sastojala od gradijenta eluiranja pufera A (0,1% TFA u vodi) i pufera B (0,1% TFA u MeCN) u rasponu od početne koncentracije od 35 % B do srednje koncentracije od 48 % B (21 mpm) preko 5 min, a zatim do konačne koncentracije * od 63 % B (10.5 mpm) preko 40 min.
Primer 7: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 7
[0240] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno u skladu sa procedurom opisanom u Primeru 4 sa ostatkom K(NH-g-Glu-Pal) instaliranim na poziciji 9 umesto na poziciji 11. Pre čišć avanje proizvoda je izvedeno korišć enjem Agilent 300SB C8 kolone ( 21 x 250 mm, 100A, 5 mm). Mobilna faza se sastojala od gradijenta eluiranja pufera A (0,1 % TFA u vodi) i pufera B (0,1 % TFA u MeCN) u rasponu od po četne koncentracije od 23 % B do srednje koncentracije od 43 % B (21 mpm) i zatim do konačne koncentracije od 43 % B (10,5 mpm) tokom 40 min. Frakcije koje sadrže nečisti proizvod su ponovo prečišć ene na Waters T3 C18 koloni (250 x 19 mm, 100A, 5 mm) na sobnoj temperaturi koristeć i gradijent od početne koncentracije od 25 % B do srednje koncentracije od 35 % B (21 mpm). ) a zatim do konačne koncentracije od 45 % B (10,5 mpm) tokom 80 min.
Primer 8: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 8
[0241] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema proceduri opisanoj u Primeru 4 sa ostatkom K(NH-g-Glu-Pal) instaliranim na poziciji 30 umesto na poziciji 11. Prečišć avanje proizvoda je izvedeno korišć enjem Agilent 300SB C8 kolone ( 21 x 250 mm, 100A, 5 mm) na 35 °C. Mobilna faza se sastojala od gradijenta eluiranja pufera A (0,1 % TFA u vodi) i pufera B (0,1 % TFA u MeCN) u rasponu od po četne koncentracije od 21 % B do srednje koncentracije od 31 % B (21 mpm) i zatim do konačne koncentracije od 41 % B (10,5 mpm) tokom 40 min. Frakcije koje sadrže nečisti proizvod su ponovo prečišć ene na Waters T3 C18 koloni (250 x 19 mm, 100A, 5 mm) na sobnoj temperaturi koristeć i gradijent od početne koncentracije od 21% B do srednje koncentracije od 31 % B (21 mpm ) a zatim do konačne koncentracije od 40 % B (10,5 mpm) tokom 80 min.
Primer 9: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 9
1. Sinteza H2N-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNL(hC) TRQ(psi-R35Y36)-Siber smole
[0242] Produženja aminokiselina na prethodno napunjenu (psi-R35, Y36)-Sieber smolu iz Primera 1, korak 2 (0,1 mmol) su izvedeni kao što je opisano u Primeru 1, korak 3 uz modifikaciju korišć enja 5-struke viška zaštić enih aminokiselina.
2. Sinteza m-BrCH2PhCOHN-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNL(hC) TRQ(psi-R35Y36)-Siber smole [0243] m-bromometilbenzojeva kiselina je spojena na gornju smolu u skladu sa procedurom opisanom u Primeru 1, korak, sa modifikacijom da je spajanje izvedeno na 50 °C umesto na 75 °C.
3. Ciklični PYY analog SEK ID BR: 9
[0244] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno od gornje smole prateć i procedure opisane u Primeru 1, koraci 7 i 8. Prečišć avanje proizvoda je izvedeno koriš ć enjem Varian Pursuit XRs C18 kolone (21 x 250 mm, 100A, 5 mm) na 35° C. Mobilna faza se sastojala od gradijenta eluiranja pufera A (0,1 % TFA u vodi) i pufera B (0,1 % TFA u MeCN) u rasponu od početne koncentracije od 10 % B do srednje koncentracije od 18 % B (21 mpm) preko 10 min, a zatim do konačne koncentracije od 33 % B (10,5 mpm) tokom 35 min.
Primer 10: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 10
[0245] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema proceduri kako je opisano u Primeru 4 zamenom Dde-Lis(Fmoc)-OH umesto Fmoc-Leu-OH na poziciji 30 i a-Tokoferiloksisirć etne kiseline (AcVitE) (8) na mestu palmitinske kiseline u koraku 3. Prečišć avanje proizvoda je izvedeno koriš ć enjem Agilent 300SB C8 kolone (21 x 250 mm, 100A, 5 mm) na sobnoj temperaturi. Mobilna faza se sastojala od gradijenta eluiranja pufera A (0,1 % TFA u vodi) i pufera B (0,1 % TFA u MeCN) u rasponu od početne koncentracije od 30 % B do srednje koncentracije od 40 % B (21 mpm) preko 10 min, a zatim do konačne koncentracije od 55 % B (21 mpm) tokom 35 min. Frakcije koje sadrže nečist proizvod su ponovo prečišć ene koriš ć enjem modifikovanog gradijenta od početne koncentracije od 35 % B do srednje koncentracije od 43 % B (21 mpm) tokom 5 minuta, a zatim do konačne koncentracije od 58 % B (10,5 mpm). ) preko 40 min.
Primer 11: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 11
1. Sinteza (Alloc)K(NH2)-(hC)-TRQ(psi-R35Y36)-Sieber smole
[0246] Gornja smola je pripremljena prema proceduri opisanoj u Primeru 9, korak 1 kori šć enjem Alloc-Lis(Fmoc)-OH umesto Fmoc-Leu-OH na poziciji 30.
2. Sinteza (Alloc)K(NH-γ-Glu-AcVitE)-(hC)-TRQ(psi-R35Y36)-Sieber smole
[0247] Fmoc-Glu-OtBu i a-tokoferiloksisirć etna kiselina (AcVitE) (8) (svaka po 5 ekv.) su uzastopno spojeni iznad smole koristeć i spojnice posredovane HBTU/DIEA u mikrotalasnim uslovima na 50 °C tokom 15 - 20 min.
3. Sinteza H2N-K(NH-γ-Glu-AcVitE)-(hC)-TRQ(psi-R35Y36)-Sieber smole
[0248] Alox zaštitna grupa je uklonjena prate ć i proceduru opisanu u Primeru 1, korak 4.
4. Ciklični PYY analog SEK ID BR: 11
[0249] Naslovljeno jedinjenje je pripremljeno od gornje smole prema postupcima opisanim u Primeru 9, koraci 1-3, uz modifikaciju da je 1M TRIS/HCl pufer, pH 7,5 korišć en umesto NH4OAc pufera da bi se izvršila ciklizacija. Prečišć avanje proizvoda je izvedeno koriš ć enjem Varian Pursuit XRs C18 kolone (21 x 250 mm, 100 A, 5 mm) na 35 °C. Mobilna faza se sastojala od gradijenta eluiranja pufera A (0,1 % TFA u vodi) i pufera B (0,1 % TFA u MeCN) u rasponu od početne koncentracije od 10 % B do srednje koncentracije od 18 % B (21 mpm) preko 10 min, a zatim do konačne koncentracije od 33 % B (10,5 mpm) tokom 35 min.
Primer 12: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 12
[0250] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema proceduri kako je opisano u Primeru 2 zamenom Fmoc-N-Me-Arg(pbf)-OH umesto Fmoc-Arg(pbf)-OH na poziciji 35 u koraku 1 i sa modifikacija da je 1M NaHCO3pufer korišć en umesto NH4OAc pufera da bi se izvršila ciklizacija. Prečišć avanje proizvoda je izvedeno korišć enjem Varian Pursuit XRs C18 kolone (30 x 250 mm, 100 A, 5 mm) na sobnoj temperaturi. Mobilna faza se sastojala od gradijenta eluiranja pufera A (0,1 % TFA u vodi) i pufera B (0,1 % TFA u MeCN) u rasponu od 10 – 60 % B (30 mpm) tokom 36 min.
Primer 13: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 13
[0251] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno u skladu sa procedurama opisanim u Primeru 11, korišć enjem palmitinske kiseline umesto a-tokoferiloksisir ć etne kiseline (AcVitE) (8) u koraku 2, i sa modifikacijama da je 60 % EtOH/H2O korišć eno kao rastvarač umesto MeCN/H2O i zasić eni ak. NaHC03je korišć en umesto NH4OAc pufera da bi se izvršila ciklizacija. Prečišć avanje proizvoda je izvedeno korišć enjem Waters XBridge C18 OBD kolone (50 x 250 mm, 5 mm) na sobnoj temperaturi. Mobilna faza se sastojala od gradijenta eluiranja pufera A (10 mM NH4OH u vodi, pH ∼ 9) i pufera B (MeCN) u rasponu od početne koncentracije od 15 % B do srednje koncentracije od 20 % B (100 mpm) preko 5 min, a zatim do konačne koncentracije od 35 % B (100 mpm) tokom 40 min.
1
Primer 14: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 14
[0252] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema proceduri opisanoj u Primeru 4 sa Lys(NH-g-Glu-Pal) ostatkom instaliranim na poziciji 30 umesto pozicije 11 i sa Fmoc-N-Me-Arg(pbf)-OH umesto Fmoc-Arg(pbf)-OH na poziciji 35 u koraku 1 i sa modifikacijom da je 1M NaHCO3pufer korišć en umesto NH4OAc pufera u koraku 6, da bi se izvršila ciklizacija. Prečišć avanje proizvoda je izvedeno koriš ć enjem Varian Pursuit XRs C18 kolone (30 x 250 mm, 100 A, 5 mm) na sobnoj temperaturi. Mobilna faza se sastojala od gradijenta eluiranja pufera A (0,1 % TFA u vodi) i pufera B (0,1 % TFA u MeCN) u rasponu od 20 – 70 % B (30 mpm) tokom 36 min. Nečiste frakcije su ponovo prečišć ene na Varian Pursuit XRs difenil koloni (30 x 100 mm, 100A, 5 mm) na sobnoj temperaturi koristeć i gradijent od 30 - 50 % B (30 mpm) tokom 25 min.
Primer 15: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 15
[0253] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema proceduri opisanoj u Primeru 4 sa Lys(NH-g-Glu-Pal) ostatkom instaliranim na poziciji 30 umesto pozicije 11, zamenjujuć i Fmoc-bAla-OH umesto Fmoc- Ile-OH spajanje na poziciji 3, i sa modifikacijama da je 1M NaHCO3pufer korišć en umesto NH4OAc pufera za efekat ciklizacije, i kuplovanje sa bromosirć etnim anhidridom je kori š ć eno umesto m-bromometilbenzoeve kiseline u koraku 6 (korak 2 iz Primera 2) korišć enjem slede ć e procedure: Fmoc-deprotecirana peptidna smola (0,1 mmol) je tretirana rastvorom bromosirć etne kiseline anhidrida (10 ekv.) u DMF (5 mL) u mikrotalasnom reaktoru na 50 °C tokom 5-10 min, do kada je u opštem utvrđeno da je reakcija završena prema Kaiser ninhidrin testu. U slučajevima kada se utvrdi da je kuplovanje nepotpuno, kuplovanje je ponovljeno sa svežim reagensima. Prečišć avanje proizvoda je izvedeno koriš ć enjem Varian Pursuit XRs C18 kolone (30 x 250 mm, 100 A, 5 mm) na sobnoj temperaturi. Mobilna faza se sastojala od gradijenta eluiranja pufera A (0,1 % TFA u vodi) i pufera B (0,1 % TFA u MeCN) u rasponu od 20 – 60 % B (30 mpm) tokom 36 min. Nečiste frakcije su ponovo prečišć ene na Varian Pursuit XRs difenil koloni (30 x 100 mm, 100A, 5 mm) na sobnoj temperaturi koristeć i gradijent od 30 - 50 % B (30 mpm) tokom 25 min.
Primer 16: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 16
[0254] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema proceduri kako je opisano u Primeru 4 sa Lys(NH-g-Glu-Pal) ostatkom instaliranim na poziciji 30 umesto na poziciji 11, izostavljajuć i Fmoc-Ile-OH spajanje na poziciji 3 i korišć enjem p-bromometilbenzoeve kiseline umesto m-bromometilbenzoeve kiseline u koraku 6 (korak 2 iz Primera 2). Dodatno, 1M NaHCO3pufer je korišć en umesto NH4OAc pufera, da bi se izvršila ciklizacija. Prečišć avanje proizvoda je izvedeno koriš ć enjem Varian Pursuit XRs C18 kolone (30 x 250 mm, 100 A, 5 mm) na sobnoj temperaturi. Mobilna faza se sastojala od gradijenta eluiranja pufera A (0,1% TFA u vodi) i pufera B (0,1 % TFA u MeCN) u rasponu od 20 – 70 % B (30 mpm) tokom 36 min. Nečiste frakcije su ponovo prečišć ene na Varian Pursuit XRs difenil koloni (30 x 100 mm, 100A, 5 mm) na sobnoj temperaturi koristeć i gradijent od 30 - 50 % B (30 mpm) tokom 25 min.
Primer 17: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 17
[0255] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno u skladu sa procedurom opisanom u Primeru 4 sa Lys(NH-g- Glu-Pal) ostatkom instaliranim na poziciji 30 umesto pozicije 11 i Fmoc-Ala-OH kori šć enim umesto Fmoc- Lys(Boc)-OH na poziciji 4 u koraku 1. TRIS/HCl pufer (1M, pH 7,5) je korišć en umesto NH4OAc pufera u koraku 6 da bi se izvršila ciklizacija. Prečišć avanje proizvoda je izvedeno koriš ć enjem Agilent Polaris C18-A kolone (30 x 250 mm, 100 A, 5 mm) na sobnoj temperaturi. Mobilna faza se sastojala od gradijenta eluiranja pufera A (0,1 % TFA u vodi) i pufera B (0,1 % TFA u MeCN) u rasponu od početne koncentracije od 20 % B do srednje koncentracije od 35 % B (40 mpm) preko 5 min, a zatim do konačne koncentracije od 45 % B (40 mpm) tokom 40 min.
Primer 18: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 18
[0256] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema proceduri kako je opisano u Primeru 4 sa Lys(NH-g-Glu-Pal) ostatkom instaliranim na poziciji 30 umesto pozicije 11 i Fmoc-Glu(OtBu)-OH kori šć enim na mestu Fmoc-Lys(Boc)-OH na poziciji 4 u koraku 1. TRIS/HCl pufer (1M, pH 7,5) je korišć en umesto NH4OAc pufera u koraku 6 da bi se izvršila ciklizacija. Prečišć avanje proizvoda je izvedeno koriš ć enjem Agilent Polaris C18-A kolone (30 x 250 mm, 100 A, 5 mm) na sobnoj temperaturi. Mobilna faza se sastojala od gradijenta eluiranja pufera A (0,1 % TFA u vodi) i pufera B (0,1 % TFA u MeCN) u rasponu od početne koncentracije od
2
20 % B do srednje koncentracije od 35 % B (40 mpm) preko 5 min, a zatim do konačne koncentracije od 45 % B (40 mpm) tokom 40 min.
Primer 19: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 19
[0257] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema proceduri kako je opisano u Primeru 4 sa Lys(NH-g-Glu-Pal) ostatkom instaliranim na poziciji 30 umesto pozicije 11, Fmoc-N-Me-Arg(pbf)- OH umesto Fmoc-Arg(pbf)-OH na poziciji 35 u koraku 1, Fmoc-Cys(trt)-OH umesto Fmoc-hCys(trt)-OH, i korišć enjem pbromometilbenzoeve kiseline umesto m- bromometilbenzoeve kiseline u koraku 6 (korak 2 iz Primera 2).
[0258] Sledeć a modifikacija je napravljena u koraku 6 (koraci 3 i 4 iz Primera 2): Sirovi peptid dobijen pre ciklizacije je prečišć en koriš ć enjem Varian Pursuit XRs C18 kolone (30 x 250 mm, 100A, 5 mm) na sobnoj temperaturi . Mobilna faza se sastojala od gradijenta eluiranja pufera A (0,1 % TFA u vodi) i pufera B (0,1 % TFA u MeCN) u rasponu od 20 – 70 % B (30 mpm) tokom 36 min. Frakcije koje sadrže proizvod su kombinovane i tretirane čvrstim NaHC03da bi se pH podigao na ~7-8; dobijeni rastvor je mešan na sobnoj temperaturi 4 h, zatim zakiseljen do pH 4 sa TFA. Rastvor je koncentrovan do zapremine od 5-10 mL i dodat je MeCN da bi se rastvorio bilo koji talog. Prečišć avanje proizvoda je izvedeno kao gore, sa gradijentom od 20 - 60 % B (30 mpm) tokom 36 min.
Primer 20: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 20
[0259] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema proceduri opisanoj u Primeru 4 sa Lys(NH-g-Glu-Pal) ostatak instaliran na poziciji 30 umesto pozicije 11, Fmoc-N-Me-Arg(pbf)-OH umesto Fmoc-Arg(pbf)-OH na poziciji 35 u koraku 1 i Fmoc-Cys(trt) -OH umesto Fmoc-hCys(trt)-OH. Sirovi linearni peptid je prečišć en i ciklizovan u skladu sa modifikacijom opisanom u Primeru 19. Prečiš ć avanje krajnjeg proizvoda je izvedeno korišć enjem gradijenta od 20 - 60 % B (30 mpm) tokom 36 min.
Primer 21: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 21
[0260] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema proceduri kako je opisano u Primeru 4 sa Lys(NH-g-Glu-Pal) ostatkom instaliranim na poziciji 30 umesto pozicije 11, Fmoc-Ala-OH je kori šć en umesto Fmoc-His(trt)-OH na poziciji 26 i Fmoc-Ala-OH korišć eni umesto Fmoc-Lys(Boc)-OH na poziciji 4 u koraku 1. TRIS/HCl pufer, (1M, pH 7,5) je korišć en umesto NH4OAc pufer u koraku 6 da bi se izvršila ciklizacija. Prečišć avanje proizvoda je izvedeno koriš ć enjem Agilent Polaris C18-A kolone (30 x 250 mm, 100 A, 5 mm) na sobnoj temperaturi. Mobilna faza se sastojala od gradijenta eluiranja pufera A (0,1 % TFA u vodi) i pufera B (0,1 % TFA u MeCN) u rasponu od početne koncentracije od 20 % B do srednje koncentracije od 35 % B (40 mpm) preko 5 min, a zatim do konačne koncentracije od 45 % B (40 mpm) tokom 40 min.
Primer 22: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 22
[0261] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema proceduri kako je opisano u Primeru 4 sa Lys(NH-g-Glu-Pal) ostatkom instaliranim na poziciji 30 umesto pozicije 11, Fmoc-Ala-OH je kori šć en umesto Fmoc-His(trt)-OH na poziciji 26 i Fmoc-Glu(OtBu)-OH korišć eni umesto Fmoc-Lys(Boc)-OH na poziciji 4 u koraku 1. Korišć en je TRIS/HCl pufer, (1M, pH 7,5) umesto NH4OAc pufera u koraku 6 da bi se izvršila ciklizacija. Prečišć avanje proizvoda je izvedeno koriš ć enjem Agilent Polaris C18-A kolone (30 x 250 mm, 100 A, 5 mm) na sobnoj temperaturi. Mobilna faza se sastojala od gradijenta eluiranja pufera A (0,1 % TFA u vodi) i pufera B (0,1 % TFA u MeCN) u rasponu od početne koncentracije od 20 % B do srednje koncentracije od 33 % B (40 mpm) preko 5 min, a zatim do konačne koncentracije od 43 % B (40 mpm) tokom 40 min.
Primer 23: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 23
[0262] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno u skladu sa procedurama opisanim u Primeru 11, korišć enjem oktadekandiojeve kiseline, mono-terc-butil estra (dostupnog od AstaTech, Inc.) umesto atokoferiloksisirć etne kiseline (AcVitE) (8), a protokol spajanja koji koristi HATU/DIEA na 50 °C tokom 30 minuta i NMP kao rastvarač umesto DMF-a u koraku 2, i spajanje dve jedinice Fmoc-OEG-OH u tandemu pre spajanja Fmoc-Glu-OtBu, u koraku 2. Sirovi linearni peptid je prečišć en i ciklizovan u skladu sa modifikacijom opisanom u Primeru 19, koristeć i gradijent od 20 - 60 % B. Prečiš ć avanje krajnjeg proizvoda je izvedeno korišć enjem gradijenta od 20 - 70 % B (30 mpm) tokom 36 min.
Primer 24: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 24
[0263] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema procedurama opisanim u Primeru 23, kori šć enjem 20-(terc-butoksi)-20-oksoikozanske kiseline (dostupne od Key Organics, Inc.) umesto oktadekandijeve kiseline, mono-terc-butil estar. Sirovi linearni peptid je pre čišć en i ciklizovan u skladu sa modifikacijom opisanom u Primeru 19, koristeć i gradijent od 20 - 60 % B. Prečiš ć avanje krajnjeg proizvoda je izvedeno korišć enjem gradijenta od 20 - 60 % B (30 mpm) tokom 36 min.
Primer 25: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 25
[0264] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema procedurama opisanim u Primeru 11, kori šć enjem stearinske kiseline umesto a-tokoferiloksisirć etne kiseline (AcVitE) (8), protokolom spajanja koji koristi HATU/DIEA na 50 °C tokom 30 minuta i NMP kao rastvarač umesto DMF u koraku 2. Sirovi linearni peptid je prečišć en i ciklizovan u skladu sa modifikacijom opisanom u Primeru 19, koriste ć i gradijent od 20 - 80 % B. Prečišć avanje krajnjeg proizvoda je izvedeno koriš ć enjem gradijenta od 20 - 80 % B (30 mpm) tokom 36 min.
Primer 26: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 26
[0265] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema procedurama opisanim u Primeru 11, kori šć enjem arahidinske kiseline umesto a-tokoferiloksisirć etne kiseline (AcVitE) (8), protokolom spajanja koji koristi HATU/DIEA na 50 °C tokom 30 minuta i NMP kao rastvarač umesto DMF-a u koraku 2. Sirovi linearni peptid je prečišć en i ciklizovan u skladu sa modifikacijom opisanom u Primeru 19, koriste ć i gradijent od 20 - 90 % B. Prečišć avanje krajnjeg proizvoda je izvedeno koriš ć enjem gradijenta od 20 - 90 % B (30 mpm) tokom 36 min.
Primer 27: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 27
[0266] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno u skladu sa procedurama opisanim u Primeru 23, ali izostavljajuć i kuplovanje Fmoc-Glu-OtBu posle tandemskog spajanja Fmoc-OEG-OH. Sirovi linearni peptid je prečišć en i ciklizovan u skladu sa modifikacijom opisanom u Primeru 19, koriste ć i gradijent od 20 - 60 % B. Prečišć avanje krajnjeg proizvoda je izvedeno koriš ć enjem gradijenta od 20 - 60 % B (30 mpm) tokom 36 min.
Primer 28: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 28
[0267] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema procedurama opisanim u Primeru 11, kori šć enjem palmitinske kiseline umesto a-tokoferiloksisirć etne kiseline (AcVitE) (8), izostavljaju ć i spajanje Fmoc-Ile-OH na poziciji 3, i korišć enjem p -bromometilbenzoeve kiseline umesto m-bromometilbenzoeve kiseline u koraku 4 (Primer 9, korak 2). Sirovi linearni peptid je prečišć en i ciklizovan u skladu sa modifikacijom opisanom u Primeru 19, koristeć i gradijent od 20 - 60 % B. Prečiš ć avanje krajnjeg proizvoda je izvedeno korišć enjem gradijenta od 20 - 60 % B (30 mpm) tokom 36 min.
Primer 29: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 29
[0268] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema procedurama opisanim u Primeru 11, kori šć enjem palmitinske kiseline umesto a-tokoferiloksisirć etne kiseline (AcVitE) (8), zamenom Fmoc-bAla-OH umesto Fmoc-Ile-OH na poziciji 3, i kuplovanje bromosirć etnog anhidrida umesto m-bromometilbenzoeve kiseline u koraku 4 (Primer 9, korak 2), korišć enjem modifikacije opisane u Primeru 15. Sirovi linearni peptid je prečišć en i ciklizovan u skladu sa modifikacijom opisanom u Primeru 19, koriš ć enjem gradijent od 20 - 60 % B. Završno prečišć avanje proizvoda je izvedeno koriš ć enjem gradijenta od 20 - 60 % B (30 mpm) tokom 36 min.
Primer 30: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 30
[0269] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema procedurama opisanim u Primeru 11, kori šć enjem palmitinske kiseline umesto a-tokoferiloksisirć etne kiseline (AcVitE) (8), zamenom Fmoc-Aby-OH umesto Fmoc-Ile-OH na poziciji 3, i kuplovanje bromosirć etnog anhidrida umesto m-bromometilbenzoeve kiseline u koraku 4 (Primer 9, korak 2), korišć enjem modifikacije opisane u Primeru 15. Sirovi linearni peptid je prečišć en i ciklizovan u skladu sa modifikacijom opisanom u Primeru 19, koriš ć enjem gradijent od 20 - 60 % B. Prečišć avanje krajnjeg proizvoda je izvedeno koriš ć enjem gradijenta od 20 - 60 % B (30 mpm) tokom 36 min.
4
Primer 31: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 31
[0270] Jedinjenje iz naslova je pripremljeno u skladu sa procedurama opisanim u Primeru 23, kori šć enjem stearinske kiseline umesto oktadekandiojeve kiseline, mono-terc-butil estra. Sirovi linearni peptid je prečišć en i ciklizovan u skladu sa modifikacijom opisanom u Primeru 19, koriste ć i gradijent od 20 - 60 % B. Prečišć avanje krajnjeg proizvoda je izvedeno koriš ć enjem gradijenta od 20 - 60 % B (30 mpm) tokom 36 min.
Primer 32: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 32
[0271] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema procedurama opisanim u Primeru 11, kori šć enjem palmitinske kiseline umesto a-tokoferiloksisirć etne kiseline (AcVitE) (8) u koraku 2, Fmoc-Ala-OH je korišć en umesto Fmoc-His( trt)-OH na poziciji 26 i Fmoc-Ala-OH koriš ć eni umesto Fmoc-Lys(Boc)-OH na poziciji 4 u koraku 4 (Primer 9, korak 1). TRIS/HCl pufer, (1M, pH 7,5) je korišć en umesto NH4OAc pufera u koraku 6 da bi se izvršila ciklizacija. Prečišć avanje proizvoda je izvedeno koriš ć enjem Agilent Polaris C18-A kolone (30 x 250 mm, 100 A, 5 mm) na sobnoj temperaturi. Mobilna faza se sastojala od gradijenta eluiranja pufera A (0,1% TFA u vodi) i pufera B (0,1% TFA u MeCN) u rasponu od početne koncentracije od 20% B do srednje koncentracije od 35% B (40 mpm) preko 5 min, a zatim do konačne koncentracije od 45 % B (40 mpm) tokom 40 min.
Primer 33: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 33
[0272] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno u skladu sa procedurama opisanim u Primeru 11, korišć enjem palmitinske kiseline umesto a-tokoferiloksisir ć etne kiseline (AcVitE) (8) u koraku 2 i Fmoc-N(Me)-Gln(trt)-OH umesto Fmoc-Gln(trt)-OH na poziciji 34 u koraku 4 (Primer 9, korak 1). U ovom slučaju, kuplovanje je izvedeno na sobnoj temperaturi korišć enjem NMP kao rastvarača i HATU/DIEA protokola (1 h, jedno spajanje); Fmoc-N(Me)-Gln(trt)-OH i Fmoc-Arg(pbf)-OH su dvostruko spregnuti. Dvostepeni protokol deprotekcije Fmoc je korišć en tokom celog rada (20% piperidina u DMF; sobna temperatura; 10 min, 15 min). Kriva linearni peptid je prečišć ena i ciklizovana u skladu sa modifikacijom opisanom u Primeru 19, koristeć i gradijent od 20 - 70 % B. Prečiš ć avanje krajnjeg proizvoda je izvedeno koriš ć enjem gradijenta od 20 - 70 % B (30 mpm) tokom 36 min.
Primer 34: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 34
[0273] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema procedurama opisanim u Primeru 11, kori šć enjem palmitinske kiseline umesto a-tokoferiloksisirć etne kiseline (AcVitE) (8), zamenom Fmoc-Cys(trt)-OH umesto Fmoc-hCys( trt)-OH na poziciji 31, 6-Fmoc-aminoheksanska kiselina umesto Fmoc-Ile-OH na poziciji 3, i kuplovanje bromosirć etnog anhidrida umesto m-bromometilbenzoeve kiseline u koraku 4 (Primer 9, korak 2), koristeć i modifikacija opisana u Primeru 15. NaHC03(2N) je korišć en umesto NH4OAc pufera da bi se izvršila ciklizacija. Prečišć avanje proizvoda je izvedeno koriš ć enjem Varian Pursuit XRs C18 kolone (30 x 250 mm, 100 A, 5 mm) na sobnoj temperaturi. Mobilna faza se sastojala od gradijenta eluiranja pufera A (0,1% TFA u vodi) i pufera B (0,1% TFA u MeCN) u rasponu od 20 - 70% B (30 mpm) tokom 36 min.
Primer 35: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 35
[0274] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema procedurama opisanim u Primeru 9, sa sledeć im modifikacijama: Fmoc-psi-[N-Me-Arg(Pbf)-N(Boc)Tir(tBu)]-OH, pripremljen od Fmoc-N-Me-Arg(pbf)-OH umesto Fmoc-Arg(Pbf)-OH, u skladu sa procedurom opisanom u Primeru 1, korak 1, korišć en je umesto Fmoc-psi-[Arg(Pbf) -N(Boc)Tir(tBu)]-OH (6) za pripremu napunjene Sieber smole koja se ovde koristi; Fmoc-Lis(Pal-Glu-OtBu)-OH (iz aktivnog peptida) je korišć en umesto Leu na poziciji 30; mhlorometilbenzojeva kiselina je korišć ena umesto m-bromometilbenzojeve kiseline u koraku 2; kuplovanje je izvedeno na sobnoj temperaturi korišć enjem NMP kao rastvarača i koriš ć en je HATU/DIEA protokol (1 h, jedno kuplovanje); Fmoc-Arg(pbf)-OH je dvostruko spregnut. Dvostepeni protokol deprotekcije Fmoc je korišć en tokom celog perioda (20 % piperidina u DMF; sobna temperatura; 10 min, 15 min). Sirovi linearni peptid je prečišć en i ciklizovan u skladu sa modifikacijom opisanom u Primeru 19, koriste ć i gradijent od 20 - 70 % B. Prečišć avanje finalnog proizvoda je izvedeno koriš ć enjem gradijenta od 20 - 70 % B (30 mpm) tokom 36 min.
Primer 36: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 36
[0275] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema procedurama opisanim u Primeru 35, zamenom Fmoc-bAla-OH umesto Fmoc-Ile-OH na poziciji 3, i kuplovanjem bromosirć etnog anhidrida umesto mbromometilbenzoeve kiseline u koraku 4 ( Primer 9, korak 2), koristeć i modifikaciju opisanu u Primeru 15. Modifikovana obrada Primera 19 je izostavljena. Fmoc-bAla-OH je spojen u mikrotalasnim uslovima na 50 ° C tokom 20 min. NaHC03je korišć en umesto NH4OAc pufera da bi se izvršila ciklizacija. Prečišć avanje proizvoda je izvedeno korišć enjem Varian Pursuit XRs C18 kolone (30 x 250 mm, 100 A, 5 mm) na sobnoj temperaturi. Mobilna faza se sastojala od gradijenta eluiranja pufera A (0,1% TFA u vodi) i pufera B (0,1% TFA u MeCN) u rasponu od 20 - 70% B (30 mpm) tokom 36 min.
Primer 37: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 37
[0276] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno u skladu sa procedurama opisanim u Primeru 9, zamenom Fmoc-Cys(trt)-OH umesto Fmoc-hCys(trt)-OH na poziciji 31 i Fmoc-Lys(Pal-Glu-OtBu)-OH (iz aktivnog peptida) umesto Fmoc-Leu-OH na poziciji 30. Pored toga, Fmoc-Abu-OH je dodat na sekvencu na poziciji 2, u koraku 1, i kuplovanje sa bromosirć etnim anhidridom je koriš ć eno na mestu m-bromometilbenzoeve kiseline u koraku 2, koristeć i modifikaciju opisanu u Primeru 15. NaHC03je korišć en umesto NH4OAc pufera u koraku 3 da bi se izvršila ciklizacija. Prečišć avanje proizvoda je izvedeno koriš ć enjem Varian Pursuit XRs C18 kolone (30 x 250 mm, 100 A, 5 mm) na sobnoj temperaturi. Mobilna faza se sastojala od gradijenta eluiranja pufera A (0,1 % TFA u vodi) i pufera B (0,1 % TFA u MeCN) u rasponu od 20 – 70 % B (30 mpm) tokom 36 min.
Primer 38: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 38
[0277] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno u skladu sa procedurama opisanim u Primeru 35, sa sledeć im modifikacijama: Fmoc-bAla-OH je dodat na sekvencu na poziciji 2, posle koraka 1 kori š ć enjem mikrotalasnih uslova na 50 °C tokom 20 minuta, i kuplovanje sa bromosirć etnim anhidridom je kori š ć eno umesto m-bromometilbenzoeve kiseline u koraku 2, korišć enjem modifikacije opisane u Primeru 15. NaHC03je korišć en umesto NH4OAc pufera da bi se izvršila ciklizacija. Prečišć avanje proizvoda je izvedeno korišć enjem Varian Pursuit XRs C18 kolone (30 x 250 mm, 100 A, 5 mm) na sobnoj temperaturi. Mobilna faza se sastojala od gradijenta eluiranja pufera A (0,1 % TFA u vodi) i pufera B (0,1 % TFA u MeCN) u rasponu od 20 – 80 % B (30 mpm) tokom 36 min.
Primer 39: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 39
[0278] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema procedurama opisanim u Primeru 11, kori šć enjem arahidinske kiseline umesto a-tokoferiloksisirć etne kiseline (AcVitE) (8) u koraku 2. Fmoc-Ser(tBu)-OH je korišć en umesto Fmoc-Lys(Boc)-OH na poziciji 4 u koraku 4 (Primer 9, korak 1) i m-hlorometilbenzoeva kiselina su korišć eni umesto m-bromometilbenzoeve kiseline u koraku 4 (Primer 9, korak 2). 60% EtOH/H2O je korišć en kao rastvarač umesto MeCN/H2O i zasić en vodenim rastvorom. NaHC03je korišć en umesto NH4OAc pufera u koraku 4 da bi se izvršila ciklizacija. Prečišć avanje proizvoda je izvedeno koriš ć enjem Waters XBridge C18 OBD kolone (50 x 250 mm, 5 mm) na sobnoj temperaturi. Mobilna faza se sastojala od gradijenta eluiranja pufera A (10 mM NH4OH u vodi, pH ∼ 9) i pufera B (MeCN) u rasponu od početne koncentracije od 20 % B do srednje koncentracije od 25 % B (100 mpm) preko 5 min, a zatim do kona čne koncentracije od 40 % B (100 mpm) tokom 40 min.
Primer 40: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 40
1. Sinteza (HCCH(CH2)2CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNK(Dde)-(azido-norLeu)-TRQ(psi-R35Y36)-Siber smole
[0279] Proširenja aminokiselina na prethodno napunjenu (psi-R35, I36)-Siber smolu iz Primera 1, korak 2 (0,1 mmol) su izvedena na sobnoj temperaturi koristeć i NMP kao rastvarač, 5-struki višak zašti ć enih amino kiselina i HATU/DIEA protokol (1 h, jedno spajanje); Fmoc-Arg(pbf)-OH i Fmoc-His(trt)-OH su dvostruko spregnuti. Dvostepeni protokol deprotekcije Fmoc je korišć en tokom celog rada (20 % piperidina u DMF; sobna temperatura; 10 min, 15 min).
2. Sinteza (HCCH(CH2)2CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNK(NH2)-(azido-norLeu)-TRQ(psi-R35Y36)-Siber smole
[0280] Gorenavedena smola je tretirana sa 2 % hidrazina u DMF-u (12 mL / 0,2 mmol skala) tokom 2 minuta na sobnoj temperaturi, a zatim je smeša isceđena. Ovaj postupak je ponovljen 4 puta, nakon čega je smola opsežno isprana sa DMF, a zatim DCM.
3. Sinteza (HCCH(CH2)2CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNK((OEG)2-γ-Glu-Pal)-(azido-nor-Leu)-TRQ(psi-R35Y36)-Siber smole
[0281] Gorenavedena smola je spojena sa (S)-10,19-diokso-22-palmitamido-3,6,12,15-tetraoksa-9,18-diazatrikosandijevom kiselinom (5 ekv.) [pripremljena prema postupak opisan za sintezu intermedijera 3, zamenom palmitinske kiseline umesto 18-terc-butoksi-18-oksooktadekanske kiseline u koraku G], korišć enjem HBTU/DIEA protokola na sobnoj temperaturi tokom 1,5 h. Smola je oceđena i opsežno isprana sa DMF i DCM.
4. Sinteza (HCCH(CH2)2CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNK((OEG)2-γ-Glu-Pal)-(azido-nor-Leu)-TRQ(psi-R35Y36)-CONH2
[0282] Osušena smola je tretirana rastvorom 2 % TFA u DCM (20 mL) i mešana 20 min, a zatim filtrirana. Ovaj tretman je ponovljen još 2 puta koristeć i svež koktel za svaki tretman. Kombinovani filtrati su zatim kombinovani i koncentrovani da bi se dobio sirovi zaštić eni peptid kao žuta pena. Ova pena je tretirana sa 20 mL koktela za cepanje (TFA/H2O/TIPS = 95/2,5/2,5) na sobnoj temperaturi tokom 2,5 h i zatim koncentrovana u struji azota do zapremine od oko 2,5 mL. Hladni etar (40 mL) je zatim dodat da se istaloži peptid i smeša je centrifugirana (5 min; 5000 rpm) i dekantirana. Ovaj proces je ponovljen jo š 2 puta da bi se dobio sirovi peptid u obliku prljavo belog praha.
[0283] Alternativno, smola je tretirana koktelom za cepanje bez prethodnog tretmana sa 1-2 % TFA u DCM-u, da bi se direktno dobio potpuno uklonjen peptid. Sirovi peptid je pre čišć en preparativnom HPLC reverzne faze korišć enjem Varian Pursuit XRs C18 kolone (30 x 250 mm, 100 A, 5 mm). Mobilna faza se sastojala od gradijenta eluiranja pufera A (0,1 % TFA u vodi) i pufera B (0,1 % TFA u MeCN) u rasponu od 20 – 70 % B tokom 36 minuta. UV detekcija je prać ena na 220 i 254 nm. Frakcije koje sadrže proizvod su analizirane analitičkom HPLC na Agilent 1100 HPLC sistemu korišć enjem istog tipa kolone kao gore (4,6 x 250 mm, 5 mm). Čiste frakcije su kombinovane, a zatim liofilizovane da bi se dobio proizvod kao čvrsta supstanca nalik pamuku. LCMS: 1211,8 (M+4H)/4, 1615,4 (M+3H)/3 i 2422,9 (M+2H)/2 za pik proizvoda na 16,87 min (LC: kolona Atlantis T3 C18, 5 mm, 4,6 x 250 mm 1,0 mL/min, 30-60 % gradijent).
5. Ciklični PYY analog SEK ID BR: 40
[0284] Pripremiti 5,1 mg CuSO4u 1 mL H2O. Pripremiti 10,4 mg TBTA u 3 mL EtOH. Premešati 400 mL CuSO4rastvora i 3 mL rastvora TBTA. Pripremiti 13 mg Na askorbata u 2 mL H2O.
[0285] U rastvor prečišć enog peptida koji sadrži azido iz Koraka 4 (37 mg) u 4 mL HEPES (0,1 M, pH 7,4) dodato je 1,7 mL prethodno mešanog rastvora CuSO4/TBTA, a zatim 1 mL rastvora Na Askorbat . Podesiti odnos EtOH/H2O dok reakcioni rastvor ne postane bistar. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi i prać ena HPLC. Posle 30 min, reakcija je završena. Smeša je podešena na pH 4 i prečišć ena preparativnom HPLC reverzne faze. Prečišć avanja su izvedena koriš ć enjem Varian Pursuit XRs C18 kolone (30 x 250 mm, 100 A, 5 mm). Mobilna faza se sastojala od gradijenta eluiranja pufera A (0,1 % TFA u vodi) i pufera B (0,1 % TFA u MeCN) u rasponu od 20 – 60 % B tokom 36 min. UV detekcija je prać ena na 220 i 254 nm. Frakcije koje sadrže proizvod su analizirane analitičkom HPLC na Agilent 1100 HPLC sistemu korišć enjem istog tipa kolone kao gore (4,6 x 250 mm, 5 mm). Čiste frakcije su kombinovane, a zatim liofilizovane da bi se dobio proizvod kao čvrsta supstanca nalik pamuku.
Primer 41: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 41
[0286] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema proceduri opisanoj u Primeru 40, zamenom L-glutaminske kiseline, N-(1-oksoheksadecil)-, 1-(1,1-dimetiletil) estra umesto (S)-10 ,19-diokso-22-palmitamido-3,6,12,15-tetraoksa-9,18-diazatrikozandioična kiselina, u koraku 3.
Primer 42: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 42
[0287] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema proceduri opisanoj u Primeru 40, zamenom (S)-22-(terc-butoksikarbonil)-43,43-dimetil-10,19,24,41-tetraokso-3,6,12,15,42-pentaoksa-9,18,23-triazatetratetrakontan-1-oična kiselina (16) (intermedijer 2) umesto (S)-10,19-diokso-22-palmitamido-3,6,12, 15-tetraoksa-9,18-diazatrikozandioična kiselina, u koraku 3.
Primer 43: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 43
1. Sinteza (Alloc)Lys((OEG)2-γ-Glu-NH2)-(hC)-TRQ(psi-R35Y36)-Siber smole
[0288] Proširenja aminokiselina na prethodno napunjenu (psi-R35, I36)-Siber smolu iz Primera 1, korak 2 (0,1 mmol) su izvedena na sobnoj temperaturi koristeć i NMP kao rastvarač, 5-struki višak zašti ć enih amino kiselina i HATU/DIEA protokol (1 h, jedno spajanje); Fmoc-Arg(pbf)-OH je dvostruko spregnut. Dvostepeni protokol deprotekcije Fmoc je korišć en tokom celog rada (20 % piperidina u DMF; sobna temperatura; 10 min, 15 min).
2. Sinteza (Alloc)Lys((OEG)2-γ-Glu-Pal)-(hC)-TRQ(psi-R35Y36)-Sieber smole
[0289] Palmitinska kiselina je spojena na smolu iz koraka 1, korišć enjem mikrotalasnih uslova primenom HATU/DIEA na 50 °C 20 - 30 min i NMP kao rastvarač.
3. Sinteza (H2N)Lys((OEG)2-γ-Glu-Pal)-(hC)-TRQ(psi-R35Y36)-Sieber smole
[0290] Alox zaštitna grupa gornje smole je uklonjena prema proceduri opisanoj u Primeru 1,korak 4.
4. Ciklični PYY analog SEK ID BR: 43
[0291] Naslovljeno jedinjenje je pripremljeno od gornje smole prateć i procedure opisane u Primeru 9, koraci 1-3, korišć enjem m-hlorometilbenzoeve kiseline umesto m-bromometilbenzoeve kiseline u koraku 2. Sirovi linearni peptid je prečišć en i ciklizovan prema na modifikaciju opisanu u Primeru 19, koriste ć i gradijent od 20 - 60 % B. Prečišć avanje krajnjeg proizvoda je izvedeno koriš ć enjem gradijenta od 20 - 60 % B (30 mpm) tokom 36 min.
Primer 44: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 44
[0292] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno u skladu sa procedurama opisanim u Primeru 43, modifikovanim tako da su tandem Fmoc-OEG-OH jedinice i Fmoc-Glu-OtBu jedinica ugra đene u korak 2 umesto u korak 1. Oktadakandioična kiselina, mono-terc-butil estar (AstaTech, Inc.) je kori šć ena umesto palmitinske kiseline u koraku 2 i sekvenca linker-lipida je instalirana na poziciji 11 umesto na poziciji 30. Sirovi linearni peptid je prečišć en i ciklizovan prema modifikacija opisana u Primeru 19, kori š ć enjem gradijenta od 20 - 70 % B. Prečišć avanje finalnog proizvoda je izvedeno koriš ć enjem gradijenta od 20 - 70 % B (30 mpm) tokom 36 min.
Primer 45: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 45
[0293] Naslovljeno jedinjenje je pripremljeno prema procedurama opisanim u Primeru 43, modifikovano tako da je Fmoc-dPEG24-karboksilna kiselina korišć ena umesto tandem Fmoc-OEG-OH jedinica i da je, zajedno sa palmitinskom kiselinom, ugrađena u korak 2. Linker-lipid sekvenca je instalirana na poziciji 11 umesto na poziciji 30. Sirovi linearni peptid je prečišć en i ciklizovan u skladu sa modifikacijom opisanom u Primeru 19, koristeć i gradijent od 20 - 90 % B. Prečiš ć avanje finalnog proizvoda je izvedeno koriš ć enjem gradijent od 20 - 90 % B (30 mpm) tokom 36 min.
Primer 46: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 46
[0294] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema procedurama opisanim u Primeru 9, kori šć enjem Fmoc-Lys(Pal-Glu-OtBu)-OH (iz aktivnog peptida) umesto Leu na poziciji 30. Pored toga, Fmoc-bAla- OH je dodat na sekvencu na poziciji 2, posle koraka 1 koristeć i uslove mikrotalasne pe ć nice na 50 °C tokom 20 minuta, a kuplovanje sa bromosirć etnim anhidridom je kori š ć eno umesto m-bromometilbenzoeve kiseline u koraku 2, koristeć i modifikaciju opisanu u Primeru 15. Čvrsti Sirovi linearni peptid je prečiš ć en i ciklizovan u skladu sa modifikacijom opisanom u Primeru 19, koristeć i gradijent od 20 - 70 % B. Prečišć avanje konačnog proizvoda je izvedeno koriš ć enjem gradijenta od 20 - 70 % B (30 mpm) tokom 36 min.
Primer 47: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 47
[0295] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema procedurama opisanim u Primeru 44, instaliranjem sekvence linker-lipid na poziciju 7 umesto na poziciju 11. Prečišć avanje proizvoda je izvedeno koriš ć enjem Varian Pursuit XRs C18 kolone (30 x 250 mm, 100A, 5 mm) na st. Sirovi linearni peptid je prečišć en i ciklizovan u skladu sa modifikacijom opisanom u Primeru 19, koristeć i gradijent od 20 - 60 % B. Prečišć avanje krajnjeg proizvoda je izvedeno koriš ć enjem gradijenta od 20 - 60 % B (30 mpm) tokom 36 min.
Primer 48: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 48
[0296] Naslovljeno jedinjenje je pripremljeno prema procedurama opisanim u Primeru 43, kori šć enjem oktadekandiojeve kiseline, mono-terc-butil estra (AstaTech, Inc.) umesto palmitinske kiseline u koraku 2 sa vremenom kuplovanja od 30 min, i postavljanje sekvence linker-lipid na poziciju 22 umesto na poziciju 30. Sirovi linearni peptid je prečišć en i ciklizovan u skladu sa modifikacijom opisanom u Primeru 19, koristeć i gradijent od 20 - 70 % B. Prečiš ć avanje krajnjeg proizvoda je izvedeno koriš ć enjem gradijenta od 20 - 70 % B (30 mpm) tokom 36 min.
Primer 49: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 49
[0297] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema procedurama opisanim u Primeru 11, zamenom 16-tetrahidropiran-2-iloksipalmitinske kiseline umesto a-tokoferiloksisirć etne kiseline (AcVitE) (8) u koraku 2, i korišć enjem m-hlorometil- benzojeve kiseline umesto m-bromometilbenzojeve kiseline u koraku 4 (Primer 9, korak 2). 60 % EtOH/H2O je korišć en kao rastvarač umesto MeCN/H2O i zasić en vodenim rastvorom. NaHC03je korišć en umesto NH4OAc pufera u koraku 4 da bi se izvršila ciklizacija. Prečišć avanje proizvoda je izvedeno korišć enjem Waters XBridge C18 OBD kolone (50 x 250 mm, 5 mm) na sobnoj temperaturi. Mobilna faza se sastojala od gradijenta eluiranja pufera A (10 mM NH4OH u vodi, pH ∼ 9) i pufera B (MeCN) u rasponu od početne koncentracije od 20 % B do srednje koncentracije od 10 % B (100 mpm) preko 5 min, a zatim do konačne koncentracije od 30 % B (100 mpm) tokom 40 min.
Primer 50: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 50
[0298] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno u skladu sa procedurama opisanim u Primeru 48, i instaliranjem sekvence linker-lipida na poziciji 23 umesto na poziciji 30.
Primer 51: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 51
[0299] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno u skladu sa procedurama opisanim u Primeru 9, korišć enjem Fmoc-Lys(Pal-Glu-OtBu)-OH (iz aktivnog peptida) umesto Fmoc-Leu-OH na poziciji 30 i Fmoc-Ser (tBu)-OH umesto Fmoc-Lys(Boc)-OH na poziciji 4, u koraku 1. 60 % EtOH/H2O je korišć eno kao rastvarač umesto MeCN/H2O i zasić eno vodenim rastvorom. NaHC03je korišć en umesto NH4OAc pufera u koraku 4 da bi se izvršila ciklizacija. Prečišć avanje proizvoda je izvedeno koriš ć enjem Waters XBridge C18 OBD kolone (50 x 250 mm, 5 mm) na sobnoj temperaturi. Mobilna faza se sastojala od gradijenta eluiranja pufera A (10 mM NH4OH u vodi, pH ∼ 9) i pufera B (MeCN) u rasponu od početne koncentracije od 10 % B do srednje koncentracije od 20 % B (100 mpm) preko 5 min, a zatim do konačne koncentracije od 30 % B (100 mpm) tokom 40 min. Nečiste frakcije su ponovo hromatografisane korišć enjem gradijenta koji se sastoji od početne koncentracije od 10 % B do srednje koncentracije od 20 % B (100 mpm) tokom 5 minuta, a zatim do konačne koncentracije od 30 % B (100 mpm) tokom 60 min.
Primer 52: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 52
[0300] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema procedurama opisanim u Primeru 43, kori šć enjem Fmoc-dPEG12-karboksilne kiseline umesto tandem Fmoc-OEG-OH jedinica i ugradnjom zajedno sa Fmoc-Glu-OtBu i palmitinskom kiselinom u koraku 2. Linker-lipid sekvenca je instalirana na poziciji 11 umesto pozicije 30. Sirovi linearni peptid je prečišć en i ciklizovan u skladu sa modifikacijom opisanom u Primeru 19, koristeć i gradijent od 20 - 70 % B. Prečiš ć avanje finalnog proizvoda je izvedeno koriš ć enjem gradijent od 20 - 70 % B (30 mpm) tokom 36 min.
Primer 53: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 53
[0301] Naslovljeno jedinjenje je pripremljeno u skladu sa procedurama opisanim u Primeru 52, korišć enjem četiri jedinice Fmoc-OEG-OH u tandemu umesto Fmoc-dPEG12-karboksilne kiseline.
Primer 54: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 54
[0302] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema procedurama opisanim u Primeru 53, instaliranjem dve jedinice od Fmoc-OEG-OH u tandemu umesto dva.
Primer 55: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 55
[0303] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno u skladu sa procedurama opisanim u Primeru 43, postavljanjem sekvence linker-lipid na poziciju 23 umesto na poziciju 30. Sirovi linearni peptid je prečišć en i ciklizovan u skladu sa modifikacijom opisanom u Primeru 19, koriste ć i gradijent od 20 - 70 % B. Završno prečišć avanje proizvoda je izvedeno koriš ć enjem gradijenta od 20 - 70 % B (30 mpm) tokom 36 min.
Primer 56: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 56
[0304] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno korišć enjem metoda opisanih u Primeru 11, zamenom (4'-hlorobifenil-4-il)-sirć etne kiseline umesto a-tokoferiloksisir ć etne kiseline (AcVitE) (8) u koraku 2, i korišć enjem m -hlorometilbenzoeve kiseline umesto m-bromometilbenzoeve kiseline u koraku 4 (Primer 9, korak 2). 60% EtOH/H2O je korišć en kao rastvarač umesto MeCN/H2O i zasić en vodenim rastvorom. NaHC03je korišć en umesto NH4OAc pufera u koraku 4 da bi se izvršila ciklizacija. Prečišć avanje proizvoda je izvedeno korišć enjem Waters XBridge C18 OBD kolone (50 x 250 mm, 5 mm) na sobnoj temperaturi. Mobilna faza se sastojala od gradijenta eluiranja pufera A (10 mM NH4OH u vodi, pH ∼ 9) i pufera B (MeCN) u rasponu od 10 - 28 % B (100 mpm) tokom 40 min.
Primer 57: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 57
[0305] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema procedurama opisanim u Primeru 11, zamenom 3-[(2,4-dihlorofenoksi)fen-4-il]propionske kiseline umesto a-tokoferiloksisirć etne kiseline (AcVitE) (8) u koraku 2, i korišć enjem m-hlorometilbenzoeve kiseline umesto m-bromometilbenzoeve kiseline u koraku 4 (Primer 9, korak 2). 60 % EtOH/H2O je korišć en kao rastvarač umesto MeCN/H2O i zasić en vodenim rastvorom. NaHC03je korišć en umesto NH4OAc pufera u koraku 4 da bi se izvršila ciklizacija. Prečišć avanje proizvoda je izvedeno korišć enjem Waters XBridge C18 OBD kolone (50 x 250 mm, 5 mm) na sobnoj temperaturi. Mobilna faza se sastojala od gradijenta eluiranja pufera A (10 mM NH4OH u vodi, pH ∼ 9) i pufera B (MeCN) u rasponu od 10 - 30 % B (80 mpm) tokom 40 min. Frakcije koje sadrže proizvod su kombinovane, zakiseljene sa TFA, koncentrovane i ponovo hromatografisane na Agilent Polaris C18-A koloni (30 x 250 mm, 100 A, 5 mm) na sobnoj temperaturi. Mobilna faza se sastojala od gradijenta eluiranja pufera A (0,1 % TFA u vodi) i pufera B (0,1 % TFA u MeCN) u rasponu od početne koncentracije od 20 % B do srednje koncentracije od 15% B (40 mpm) do konačne koncentracije od 45 % B (40 mpm) tokom 45 min.
Primer 58: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 58
[0306] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema procedurama opisanim u Primeru 11, zamenom 11-(4-fluorofenil}undekanske kiseline umesto a-tokoferiloksisirć etne kiseline (AcVitE) (8) u koraku 2, i korišć enjem m-hlorometilbenzojeve kiseline kiselina umesto m-bromometilbenzoeve kiseline u koraku 4 (Primer 9, korak 2). 60 % EtOH/H2O je korišć en kao rastvarač umesto MeCN/H2O i zasić eni vodeni NaHCO3je korišć en umesto NH4OAc pufera u koraku 4 da bi se izvršila ciklizacija. Prečišć avanje proizvoda je izvedeno korišć enjem Waters XBridge C18 OBD kolone (50 x 250 mm, 5 mm) na sobnoj temperaturi. Mobilna faza se sastojala od gradijenta eluiranja pufera A (10 mM NH4OH u vodi, pH ∼ 9) i pufera B (MeCN) u rasponu od 15 - 35 % B (100 mpm) tokom 40 min.
Primer 59: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 59
[0307] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema procedurama opisanim u Primeru 43, izostavljajuć i korak 2 i ugrađivanjem spajanja palmitinske kiseline u korak 1. Sekvenca linker-lipida je instalirana na poziciji 22 umesto na poziciji 11. Sirovi linearni peptid je bio pre čišć en i ciklizovan u skladu sa modifikacijom opisanom u Primeru 19, koristeć i gradijent od 20 - 70 % B. Prečiš ć avanje krajnjeg proizvoda je izvedeno korišć enjem gradijenta od 20 - 70 % B (30 mpm) tokom 36 min.
Primer 60: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 60
[0308] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno u skladu sa procedurama opisanim u Primeru 53, uključujuć i dve FMOC-OEG-OH jedinice u tandemu umesto četiri i instaliranjem sekvence linker-lipida bila je na poziciji 7 umesto pozicije 11. Sirovi linearni peptid je pre čišć en i ciklizovan u skladu sa modifikacijom opisanom u Primeru 19, koristeć i gradijent od 20 - 80 % B. Prečiš ć avanje krajnjeg proizvoda je izvedeno korišć enjem gradijenta od 20 - 80 % B (30 mpm) tokom 36 min.
Primer 61: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 61
[0309] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema procedurama opisanim u Primeru 11, zamenom 11-[(4-trifluorometil)fenil]undekanske kiseline umesto a-tokoferiloksisirć etne kiseline (AcVitE) (8) u koraku 2, i korišć enjem m- hlorometilbenzoeve kiseline umesto m-bromometilbenzoeve kiseline u koraku 4 (Primer 9, korak 2). 60 % EtOH/H2O je korišć en kao rastvarač umesto MeCN/H2O i zasić en vodenim rastvorom. NaHC03je korišć en umesto NH4OAc pufera u koraku 4 da bi se izvršila ciklizacija. Prečišć avanje proizvoda je izvedeno korišć enjem Waters XBridge C18 OBD kolone (50 x 250 mm, 5 mm) na sobnoj temperaturi. Mobilna faza se sastojala od gradijenta eluiranja pufera A (10 mM NH4OH u vodi, pH ∼ 9) i pufera B (MeCN) u rasponu od 15 - 35 % B (100 mpm) tokom 40 min.
Primer 62: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 62
[0310] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema procedurama opisanim u Primeru 11, zamenom 11,11,11-trifluorundekanske kiseline umesto a-tokoferiloksisirć etne kiseline (AcVitE) (8) u koraku 2, i korišć enjem m-hlorometilbenzoeve kiseline na mestu m-bromometilbenzoeve kiseline u koraku 4 (Primer 9, korak 2). 60 % EtOH/H2O je korišć en kao rastvarač umesto MeCN/H2O i zasić en vodenim rastvorom. NaHC03je korišć en umesto NH4OAc pufera u koraku 4 da bi se izvršila ciklizacija. Prečišć avanje proizvoda je izvedeno korišć enjem Waters XBridge C18 OBD kolone (50 x 250 mm, 5 mm) na sobnoj temperaturi. Mobilna faza se sastojala od gradijenta eluiranja pufera A (10 mM NH4OH u vodi, pH ∼ 9) i pufera B (MeCN) u rasponu od 10 - 28 % B (100 mpm) tokom 40 min.
Primer 63: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 63
[0311] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema procedurama opisanim u Primeru 11, zamenom 15,15,15-trifluoropentadekanske kiseline umesto a-tokoferiloksisirć etne kiseline (AcVitE) (8) u koraku 2, i korišć enjem m-hlorometilbenzojeve kiseline umesto m-bromometilbenzojeve kiseline u koraku 4 (Primer 9, korak 2). 60 % EtOH/H2O je korišć en kao rastvarač umesto MeCN/H2O i zasić en vodenim rastvorom. NaHC03je korišć en umesto NH4OAc pufera u koraku 4 da bi se izvršila ciklizacija. Prečišć avanje proizvoda je izvedeno korišć enjem Waters XBridge C18 OBD kolone (50 x 250 mm, 5 mm) na sobnoj temperaturi. Mobilna faza se sastojala od gradijenta eluiranja pufera A (10 mM NH4OH u vodi, pH ∼ 9) i pufera B (MeCN) u rasponu od 15 - 30 % B (100 mpm) tokom 40 min.
Primer 64: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 64
[0312] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema procedurama opisanim u Primeru 11, zamenom 16-etoksipalmitinske kiseline umesto a-tokoferiloksisirć etne kiseline (AcVitE) (8) u koraku 2, i kori š ć enjem mhlorometilbenzojeve kiseline umesto m -bromometilbenzoeva kiselina u koraku 4 (Primer 9, korak 2). 60 % EtOH/H2O je korišć en kao rastvarač umesto MeCN/H2O i zasić en vodenim rastvorom. NaHC03je korišć en umesto NH4OAc pufera u koraku 4 da bi se izvršila ciklizacija. Prečišć avanje proizvoda je izvedeno korišć enjem Waters XBridge C18 OBD kolone (50 x 250 mm, 5 mm) na sobnoj temperaturi. Mobilna faza se sastojala od gradijenta eluiranja pufera A (10 mM NH4OH u vodi, pH∼ 9) i pufera B (MeCN) u rasponu od 15
1
– 30 % B (100 mpm) preko 40 min.
Primer 65: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 65
[0313] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema procedurama opisanim u Primeru 11, zamenom 13,13,14,14,15,15,16,16,16-D9-palmitinske kiseline (Cambridge Isotopes) umesto a-tokoferiloksisirć etne kiseline (AcVitE) (8) u koraku 2, i korišć enjem m-hlorometilbenzoeve kiseline umesto mbromometilbenzoeve kiseline u koraku 4 (Primer 9, korak 2). 60 % EtOH/H2O je korišć en kao rastvarač umesto MeCN/H2O i zasić en vodenim rastvorom. NaHC03je korišć en umesto NH4OAc pufera u koraku 4 da bi se izvršila ciklizacija. Prečišć avanje proizvoda je izvedeno koriš ć enjem Waters XBridge C18 OBD kolone (50 x 250 mm, 5 mm) na sobnoj temperaturi. Mobilna faza se sastojala od gradijenta eluiranja pufera A (10 mM NH4OH u vodi, pH ∼ 9) i pufera B (MeCN) u rasponu od 15 - 20 % B (100 mpm) tokom 5 minuta, a zatim do 35 % B ( 100 mpm) tokom 40 min.
Primer 66: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 66
[0314] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema procedurama opisanim u Primeru 11, zamenom 11-[(2,4-bis(trifluorometil)fenil]undekanske kiseline umesto a-tokoferiloksisirć etne kiseline (AcVitE) (8) u koraku 2, i korišć enje m-hlorometilbenzoeve kiseline umesto m-bromometilbenzoeve kiseline u koraku 4 (Primer 9, korak 2). 60 % EtOH/H2O je korišć en kao rastvarač umesto MeCN/ H2O i zasić eni vodeni NaHCO3je korišć en na mestu NH4OAc pufera u koraku 4 da bi se izvršila ciklizacija. Prečišć avanje proizvoda je izvedeno korišć enjem Waters XBridge C18 OBD kolone (50 x 250 mm, 5 mm) na sobnoj temperaturi. Mobilna faza se sastojala od gradijenta eluiranja pufera A (10 mM NH4OH u voda, pH ∼ 9) i pufer B (MeCN) u rasponu od 15 - 35 % B (100 mpm) tokom 40 min.
Primer 67: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 67
[0315] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema procedurama opisanim u Primeru 11, zamenom 11-[(3,5-bis(trifluorometil)fenil]undekanske kiseline umesto a-tokoferiloksisirć etne kiseline (AcVitE) (8) u koraku 2, i korišć enje m-hlorometilbenzoeve kiseline umesto m-bromometilbenzoeve kiseline u koraku 4 (Primer 9, korak 2). 60 % EtOH/H2O je korišć en kao rastvarač umesto MeCN/H2O i zasić eni vodeni NaHCO3je korišć en na mestu pufera NH4OAc u koraku 4 da bi se izvršila ciklizacija. Prečišć avanje proizvoda je izvedeno korišć enjem Waters XBridge C18 OBD kolone (50 x 250 mm, 5 mm) na sobnoj temperaturi. Mobilna faza se sastojala od gradijenta eluiranja pufera A (10 mM NH4OH u voda, pH ∼ 9) i pufer B (MeCN) u rasponu od 15 - 35 % B (100 mpm) tokom 40 min.
Primer 68: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 68
1. Sinteza (Fmoc)-βA-IKPEAPGEK(Alloc)ASPEELNRYY ASLRHYLNCVTRQ(psi-R35Y36)-Siber smole [0316] Proširenja aminokiselina na prethodno napunjenu (psi-R35, I36)-Siber smolu iz Primera 1, korak 2 (0,1 mmol) su izvedena na sobnoj temperaturi koristeć i DMF kao rastvarač, 6-struki višak zašti ć enih amino kiselina i HATU/DIEA protokol (10 min, dvostruko spajanje). Dvostepeni protokol deprotekcije Fmoc je korišć en tokom celog rada (20 % piperidina u DMF; sobna temperatura; 10 min, 15 min).
2. Sinteza (Fmoc)-βA-IKPEAPGEK((OEG)2-γ-Glu-NHCO(CH2)16CO2tBu)-ASPEELNRYYASLRHYL- NCVTRQ(psi-R35Y36)-Siber smole
[0317] Uklanjanje zaštite sa gornje smole je sprovedeno prema postupku opisanom u Primeru 1, korak 4, koristeć i modifikovano vreme reakcije od 10 min za svaki tretman. Smola je zatim spojena sa intermedijerom 2 (15) (5 ekv.), korišć enjem HATU/DIEA protokola u DMF (1 h, sobna temperatura).
3. Sinteza (BrAc)-βA-IKPEAPGEK((OEG)2-γ-Glu-NHCO(CH2)16CO2tBu)-ASPEELNRYYASLRHYL- NCVTRQ(psi-R35Y36)-Siber smole
[0318] Posle Fmoc deprotekcije (20 % piperidin/DMF), gornja smola je tretirana sa bromosirć etnim anhidridom (10 ekv.; sobna temperatura, 30 min) da bi se dobila bromoacetilisana smola.
4. Sinteza (BrAc)-βA-IKPEAPGEK((OEG)2-γ-Glu-NHCO(CH2)16CO2tBu)-ASPEELNRYYASLRHYL- NCVTRQ(psi-R35Y36)-CONH2
2
[0319] Gorenavedena smola je tretirana koktelom za cepanje koji se sastoji od TFA/H2O/TIPS (95:2,5:2,5) tokom 1,5 h na sobnoj temperaturi. Sirovi peptid je precipitiran etrom prema proceduri opisanoj u Primeru 1, korak 7.
5. Ciklični PYY analog SEK ID BR: 68
[0320] Gore dobijeni sirovi peptid je rastvoren u koncentraciji od 10 mg/mL u 10 % MeCN/H2O, i dodat je TEA da bi se pH rastvora poveć ao na 8-9. Posle mešanja na sobnoj temperaturi oko 20 min, TFA je dodat da bi se pH snizio na 2, a rastvor je prečišć en direktno preparativnom HPLC na Kinetics C18 Evo koloni (30 x 100 mm, 100 A, 5 mm). Mobilna faza se sastojala od gradijenta eluiranja pufera A (0,1% TFA u vodi) i pufera B (0,1% TFA u MeCN) u rasponu od 20 - 60% B tokom 22 min. UV detekcija je prać ena na 220 i 254 nm. Čiste frakcije su kombinovane, a zatim liofilizovane da bi se dobio proizvod kao čvrsta supstanca nalik pamuku.
Primer 69: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 69
1. Sinteza (Boc)-G-ISPEAPGEK(dde)ASPEELNRYYASLRHYLNLE(OAllyl)TRQ(psi-R35Y36)-Siber smole [0321] Proširenja aminokiselina na prethodno napunjenu (psi-R35, I36)-Siber smolu iz Primera 1, korak 2 (0,1 mmol) su izvedena na sobnoj temperaturi koristeć i DMF kao rastvarač, 6-struki višak zašti ć enih amino kiselina i HATU/NMM protokol (10 min, dvostruko spajanje). Dvostepeni protokol deprotekcije Fmoc je korišć en tokom celog rada (20% piperidina u DMF; sobna temperatura; 10 min, 15 min).
2. Sinteza (Boc)-G-ISPEAPGEK(dde)ASPEELNRYYASLRHYLNLE(NHS)TRQ(psi-R35Y36)-Siber smole [0322] Alikox deprotekcija gornje smole je izvedena prema metodi opisanoj u Primeru 1, korak 4, koristeć i modifikovano vreme reakcije od 10 min za svaki tretman. Smola je zatim spojena sa NHS (10 ekv.), korišć enjem HATU/DIEA protokola u DMF (1 h, sobna temperatura, dvostruko spajanje).
3. Sinteza (NH2)-G-ISPEAPGEK(dde)ASPEELNRYYASLRHYLNLE(NHS)TRQ(psi-R35Y36)
[0323] Gornja smola je tretirana koktelom za cepanje koji se sastoji od TFA/H2O/TIPS (95:2,5:2,5) tokom 1,5 h na sobnoj temperaturi. Sirovi peptid je precipitiran etrom prema proceduri opisanoj u Primeru 1, korak 7.
4. Ciklični PYY analog SEK ID BR: 69
[0324] Gore dobijeni sirovi peptid je rastvoren u koncentraciji od 80 mg/mL u DMSO, i dodat je TEA (25 ekv.) da bi se izvršila laktamizacija. Posle mešanja na sobnoj temperaturi oko 30 min, reakcija je razblažena 10 puta sa 10 % MeCN/vode, pH je podešen na 2 i sirovi peptid je prečišć en direktno preparativnom HPLC na Kinetics C18 Evo koloni (30 x 100 mm, 100A , 5 mm). Mobilna faza se sastojala od gradijenta pufera A (0,1% TFA u vodi) i pufera B (0,1% TFA u MeCN) u rasponu od 10 - 60% B tokom 22 min. UV detekcija je prać ena na 220 i 254 nm. Čiste frakcije su kombinovane, a zatim liofilizovane da bi se dobio K(Dde)-zaštić eni peptid. Dde zaštitna grupa je uklonjena upotrebom 2 % hidrazin/DMF (10 mg peptida/ml), 30 minuta na sobnoj temperaturi. Reakcija je razblažena 10 puta sa 10 % MeCN/voda, a pH je podešen na 2 sa TFA i sirovi rastvor peptida je prečišć en kao što je gore navedeno da bi se dobio proizvod kao čvrsta supstanca nalik pamuku.
Primer 70: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 70
[0325] Naslovljeno jedinjenje je pripremljeno prema proceduri iz Primera 69, zamenom Fmoc-E(OAll)-OH za Fmoc-Leu-OH na poziciji 30 i zamenu Fmoc-Val-OH za Fmoc-E(OAll)-OH na poziciji 31.
Primer 71: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 71
1. Sinteza (Boc)-G-ISPEAPGEK(dde)ASPEELNRYYASLRHYLN E(OAllyl)VTRQ(N-Me-R)Y-NovaSyn TGR smole [0326] Proširenja aminokiselina na NovaSin TGR smolu (0,1 mmol) su izvedena korišć enjem procedure opisane u Primeru 69, korak 1.
2. Ciklični PYY analog SEK ID BR: 71
[0327] Naslovljeno jedinjenje je pripremljeno od gornje smole prema procedurama opisanim u Primeru 69, koraci 2-4.
Primer 72: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 72
1. Sinteza (S)-22-(tert-butoxycarbonyl)-43,43-dimethyl-10,19,24,41-tetraoxo-3,6,12,15,42-pentaoxa-9,18,23- - triazatetratetrakontan-1-oična N-hidroksisukcinimid estar
[0328] U rastvor (S)-22-(terc-butoksikarbonil)-43,43-dimetil-10,19,24,41-tetraokso-3,6,12,15,42-pentaoksa-9,18 ,23-triazatetratetrakontan-1-ova kiselina (Intermedijer 2 (16)) (54,0 mg, 0,063 mmol), N-hidroksisukcinimid (14,6 mg, 0,127 mmol) i HATU (24,1 mg, 0,063 mmol) u DMF1 dodata je DIEA (0,022 ml, 0,127 mmol) i smeša je mešana 30 minuta na sobnoj temperaturi i direktno upotrebljena u sledeć em koraku bez daljeg prečišć avanja.
2. Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 72
[0329] U rastvor [ciklo-(G2-E30), S4, K11, psi-(R35,I36)]-PII2-36 (pripremljen u Primeru 70) (4 mg, 0,96 mmol) u DMF (0,2 mL ) je dodato 24 mL rastvora N-hidroksi estra (pripremljenog u koraku 1), i TEA (0,66 mL; 5 ekv.) i smeša je mešana preko noć i na sobnoj temperaturi. Reakcija je razblažena 10 puta sa 10 % MeCN/voda, pH je podešen na 2 sa TFA i sirovi peptid je prečišć en direktno preparativnom HPLC na koloni Kinetics C18 Evo (30 x 100 mm, 100 A, 5 mm). Mobilna faza se sastojala od gradijenta eluiranja pufera A (0,1% TFA u vodi) i pufera B (0,1% TFA u MeCN) u rasponu od 10 - 60% B tokom 22 min. UV detekcija je prać ena na 220 i 254 nm. Čiste frakcije su kombinovane, a zatim liofilizovane da bi se dobio peptid zaštić en t-butil estarom. Zaštitne grupe t-butil estra su uklonjene koriš ć enjem smeše TFA/H2O/TIPS (95:2,5:2,5) tokom 1,5 h na sobnoj temperaturi. Smeša je koncentrovana i peptid je prečišć en kao što je gore navedeno da bi se dobio proizvod kao čvrsta supstanca nalik pamuku.
Primer 73: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 73
[0330] Naslovljeno jedinjenje je pripremljeno prema proceduri opisanoj u Primeru 1 zamenom N-FmocdPEG6-karboksilna kiselina za N-Fmoc-dPEG12-karboksilnu kiselinu u koraku 5.
Primer 74: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 74
[0331] Naslovljeno jedinjenje je pripremljeno u skladu sa procedurom opisanom u Primeru 1, ali preskakanjem PEG korak spajanja linkera 5.
Primer 75: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 75
[0332] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema proceduri kako je opisano u Primeru 1 zamenom Fmoc-C(trt)-OH za Fmoc-hC(trt)-OH na poziciji 31, i preskakanje koraka spajanja Fmoc-bA-OH u koraku 3.
Primer 76: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 76
[0333] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema proceduri kako je opisano u Primeru 1 sa modifikovanim korakom 3 i korakom 4. U koraku A, Fmoc-K(Alloc)-OH i Fmoc-K(dde)-OH su korišć eni za poziciju 30 i pozicija 11, respektivno. Nakon što je Alkox na poziciji 30 uklonjen sa Pd(PPh3)4-fenilsilanom, mPEG16-karboksilna kiselina je spojena sa HATU-DIPEA. U koraku 4, dde na poziciji 11 je uklonjen sa 2 % hidrazina u DMF.
Primer 77: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 77
[0334] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema proceduri kako je opisano u Primeru 76 zamenom mPEG12-karboksilne kiseline za mPEG16-karboksilnu kiselinu u koraku A, i preskakanjem koraka kuplovanja Fmoc-dPEG12-karboksilne kiseline u koraku 5.
4
Primer 78: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 79
[0335] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema proceduri opisanoj u Primeru 1, zamenom Fmoc-N-Me-K(trt)-OH za Fmoc-K(trt)-OH u koraku 3.
Primer 79: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 79
[0336] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema proceduri kako je opisano u Primeru 1 zamenom Fmoc-N-Me-R(pbf)-OH za Fmoc-R(pbf)-OH u koraku 1B.
Primer 80: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 80
[0337] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema proceduri opisanoj u Primeru 79 zamenom Fmoc-R(pbf)-OH za Fmoc-K(Boc)-OH na poziciji 4, i zamena Fmoc-V(Boc)-OH za Fmoc-L-OH na poziciji 30 u koraku 3.
Primer 81: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 81
[0338] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema proceduri opisanoj u Primeru 80 zamenom Fmoc-C(trt)-OH za Fmoc-hC(trt)-OH na poziciji 31, i zamena Fmoc-g-aminobutanske kiseline za Fmoc-bA-OH u koraku 3.
Primer 82: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 82
[0339] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema proceduri kako je opisano u Primeru 1 zamenom Fmoc-PEG2-karboksilne kiseline za Fmoc-bA-OH i Fmoc-C(trt)-OH za Fmoc-hC(trt)-OH na poziciji 31, kao i preskakanje spajanja Fmoc-Ile-OH u koraku 3.
Primer 83: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 83
[0340] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema proceduri kako je opisano u Primeru 1 zamenom Fmoc-K(N3)-OH za Fmoc-hC(trt)-OH na poziciji 31, zamenom pent-4-inoične kiseline za Fmoc-bA -OH u koraku 3, i prateć i postupak ciklizacije B kao u nastavku.
[0341] Procedura ciklizacije B: U rastvor potpuno deprotektovanog peptida sa PEG12-AcBr instaliranim na poziciji 11 (38 mg, 0,0067 mmol) u 2 mL HEPES-a (pH 7,4) dodato je 1,7 mL prethodno mešanog rastvora CuSO4/TBTA rastvor je pripremljen mešanjem rastvora od 2,2 mg CuSO4u vodi (0,4 mL) sa rastvorom 11 mg TBTA u EtOH), a zatim dodavanjem 7 mg natrijum-askorbata u vodi (1 mL). Bistri reakcioni rastvor je ostavljen da se meša na sobnoj temperaturi i prać en pomo ć u HPLC. Posle 30 minuta, reakcija je zavr šena, a reakciona smeša je podešena na pH 4 korišć enjem TFA i podvrgnuta HPLC prečiš ć avanju (Pursuit XRS 5 250x30 mm C18 kolona, radni pri 30 mpm protoka, prać enje 214 nM talasne dužine, sa gradijentom u rasponu od 20-60 % ACN-voda/voda oba sa 0,1 % TFA tokom 36 minuta). Željena frakcija je sakupljena i liofilizovana.
Primer 84: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 84
[0342] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema proceduri kako je opisano u Primeru 1 preskakanjem koraka spajanja Fmoc-bA-OH, zamenom N3-PEG8-karboksilne kiseline za Fmoc-dPEG12-karboksilnom kiselinom u koraku 5, i zamenom 3-( kuplovanje bromometil)benzojeve kiseline sa DIC-om za acilaciju bromosirć etnog anhidrida u koraku 3, i prate ć i postupak ciklizacije C kao u nastavku.
[0343] Postupak ciklizacije C: U rastvor potpuno deprotektovanog peptida (20 mg, 0,0035 mmol) u 5 mL degazirane vode, dodat je rastvor NaHC03da bi se reakciona smeša podesila na pH 6,4 ili više. Posle 20 minuta, LCMS je pokazao da je reakcija završena, a reakciona smeša je podešena na pH 4 korišć enjem TFA i podvrgnuta HPLC prečišć avanju (Pursuit XRS 5 250x30 mm C18 kolona, protok pri 30 mpm, pra ć enje talasne dužine od 214 nM, sa gradijentom u rasponu od 10-60 % ACN-voda/voda oba sa 0,1 % TFA tokom 36 minuta). Željena frakcija je sakupljena i liofilizovana.
[0344] Nakon ciklizacije, ciklizovani intermedijer je podvrgnut pro širenju linkera pomoć u hemije klika prateć i proceduru ciklizacije B sa N-(1-bromo-2-okso-7,10,13-trioksa-3-azaheksadekan-16-il )pent-4-inamid, koji je pripremljen kuplovanjem N-Boc-PEG4-NH2sa pent-4-inoinskom kiselinom korišć enjem HATU-DIPEA, nakon čega je usledila deprotekcija Boc sa TFA i acilovanje sa bromosirć etnim anhidridom u prisustvu TEA.
Primer 85: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 85
[0345] Naslovljeno jedinjenje je pripremljeno prema proceduri kako je opisano u Primeru 1 sa PEG12-AcBr linkerom instaliranim na poziciji 23 umesto na poziciji 11.
Primer 86: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 86
[0346] Naslovljeno jedinjenje je pripremljeno prema proceduri opisanoj u Primeru 1 sa PEG12-AcBr linkerom instaliranim na poziciji 22 umesto na poziciji 11.
Primer 87: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 87
[0347] Naslovljeno jedinjenje je pripremljeno prema proceduri opisanoj u Primeru 1 sa PEG12-AcBr linkerom instaliranim na poziciji 7 umesto na poziciji 11.
Primer 88: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 88
[0348] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema proceduri kako je opisano u Primeru 1 zamenom Fmoc-V-OH za Fmoc-hC(trt)-OH na poziciji 31, zamenom Fmoc-C(trt)-OH za Fmoc-L- OH na poziciji 30, i zamenom Fmoc-G-OH za Fmoc-bA-OH u koraku 3.
Primer 89: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 89
[0349] Jedinjenje iz naslova je pripremljeno u skladu sa procedurom kako je opisano u Primeru 88 preskakanjem koraka 1 da bi se napravio redukovani dipeptid, i zamenom punjenja Fmoc-I(tBu)-OH nakon čega sledi kuplovanje sa Fmoc-(N-Me)R-OH za punjenje Fmoc-psi-(R35-N(Boc)-Y36)-OH u koraku 2.
Primer 90: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 90
[0350] Naslovljeno jedinjenje je pripremljeno prema proceduri kako je opisano u Primeru 89 zamenom Fmoc-bA-OH za Fmoc-G-OH u koraku 3.
Primer 91: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 91
[0351] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema proceduri kako je opisano u Primeru 89, zamenom Fmoc-hC(trt)-OH za Fmoc-C(trt)-OH na poziciji 30 u koraku 3.
Primer 92: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 92
[0352] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema proceduri opisanoj u Primeru 90 zamenom FmochC(trt)-OH za Fmoc-V-OH na poziciji 31, i zamena Fmoc-L-OH za Fmoc-C(trt)-OH na poziciji 30 u koraku 3.
Primer 93: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 93
[0353] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema proceduri kako je opisano u Primeru 1 zamenom Fmoc-V-OH za Fmoc-hC(trt)-OH na poziciji 31, zamenom Fmoc-C(trt)-OH za Fmoc-L- OH na poziciji 30, i zamenom Fmoc-G-OH za Fmoc-bA-OH na N-kraju u koraku 3.
Primer 94: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 94
[0354] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema proceduri kako je opisano u Primeru 1 zamenom Fmoc-V-OH za Fmoc-hC(trt)-OH na poziciji 31 i zamenom Fmoc-C(trt)-OH za Fmoc-L-OH na poziciji 30 u koraku 3.
Primer 95: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 95
[0355] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno (skala od 0,05 mmol) prema procedurama opisanim u Primeru 1 zamenom Fmoc-V-OH za Fmoc-hC(trt)-OH na poziciji 31, zamenom Fmoc-Glu(OAlloc)-OH za Fmoc-L-OH na poziciji 30, zamenu Fmoc-Lis(dde)-OH za Fmoc-Lis(Alloc)-OH na poziciji 11, zamenu Fmoc-Ser(tBu)-OH za Fmoc- K(Boc)-OH na poziciji 4 i zamena Boc-G-OH za Fmoc-bA-OH na N-kraju u koraku 3.
[0356] U rezultujuć u smolu odozgo dodat je deoksigenovani DCM (10 mL), fenilsilan (10 ekv.) i rastvor Pd(PPh3)4(0,2 ekv.) u DCM (1 mL) i smeša je mešana tokom 10 min. Reakcija je isceđena i smola je isprana deoksigenisanim DCM i uklanjanje zaštite je ponovljeno jednom.
[0357] U rezultujuć u smolu odozgo je dodat DMF (10 ml), HATU (5 ek) i DIEA (10 ekv.) i smeša mešana 5 min, zatim je dodat rastvor N-hidroksisukcinimida (10 ekv.) u DMF i me šano je dodatnih 20 min. Smola je filtrirana i postupak je ponovljen jednom.
[0358] Sa gornje smole je uklonjena zaštita tokom 2 sata na sobnoj temperaturi u TFA/TIPS/vodi (95/2,5/2,5) (10 ml). Koktel je koncentrisan na pribl. 1 ml i zatim dodat u 40 ml etra. Dobijeni precipitat je sakupljen centrifugiranjem i osušen pod N2.
[0359] Dobijeni materijal je rastvoren u 9 mL DMSO kome je dodato 10 ekv. TEA i reakcija je ostavljena da teče 3 sata na sobnoj temperaturi. Dobijeni rastvor je razblažen do 30 ml sa vodom, pH je podešen na 2 i prečišć en RP-HPLC na 30 mm x 250 mm na C18 koloni eluiranjem sa linearnim gradijentom od 20-40 % ACN u vodi (0,1 % TFA) u 30 min. Frakcije koje sadrže proizvod su liofilizovane.
[0360] Dobijeni materijal je zatim tretiran sa 1-2 % hidrazin/DMF (1 mL) da bi se uklonio Dde iz lizina. Dobijena smeša je razblažena do 10 ml sa vodom, pH je podešen na 2 i zatim prečišć en pomo ć u RP-HPLC kao što je gore navedeno.
[0361] Dobijeni proizvod je zatim rastvoren u 10 % ACN/voda, pH je podešen na 10 i dodat je rastvor bromosirć etnog N-hidroksisukcinimid estra (3 ekv. 0,1M/DMF rastvora) i reakcija je ostavljena da te če tokom 10 minuta na RT. Dobijena smeša je razblažena do 10 ml sa vodom, pH je podešen na 2 i zatim prečišć en pomo ć u RP-HPLC kao što je napred navedeno da bi se dobio proizvod iz pronalaska.
Primer 96: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 96
[0362] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema proceduri opisanoj u Primeru 1 zamenom N-FmocdPEG24-karboksilne kiseline za N-Fmoc-dPEG12-karboksilnu kiselinu u koraku 5.
Primer 97: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 97
[0363] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno prema proceduri kako je opisano u Primeru 1 zamenom Fmoc-G-OH za Fmoc-bA-OH u koraku 3.
Primer 98: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 98
[0364] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno u skladu sa procedurom opisanom u Primeru 89, ali preskakanjem koraka kuplovanja Fmoc-dPEG12-karboksilne kiseline u koraku 5.
Primer 99: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 99
[0365] Jedinjenje iz pronalaska je pripremljeno u skladu sa procedurom opisanom u Primeru 90, ali preskakanjem koraka spajanja Fmoc-dPEG12-karboksilne kiseline u koraku 5.
Primer 100: Sinteza cikličnog PYY analoga SEK ID BR: 100
[0366] Jedinjenje iz naslova je pripremljeno u skladu sa procedurom opisanom u Primeru 94, ali preskakanjem koraka spajanja Fmoc-dPEG12-karboksilne kiseline u koraku 5.
Primer 101: Identifikacija i proizvodnja mAb MSCB97
Izbor PH9L3 VL i PH9H5 VH kao početnih V regiona za inženjering
[0367] Varijabilni region lakog lanca antitela (VL) označen kao PH9L3 (SEK ID BR: 128) (Tepliakov et al., "Structural diversity in a human antibody germline library" mAbs Aug-Sep 8(6):1045-63) (2016)) i varijabilni region teškog lanca antitela (VH) označen kao PH9H5 (SEK ID BR: 129) (Tepliakov et al., „Structural diversity in a human antibody germline library,“ mAbs avgust-septembar 8(6):1045 -63 (2016)) izabrani su kao početni varijabilni regioni iz kojih ć e se konstruisati mAb omogu ć eno za konjugaciju peptida. PH9L3 se u potpunosti sastoji od sekvenci V gena zametne linije humanog Ig i kao takav ne sadr ži nikakve mutacije sekvence iz procesa sazrevanja afiniteta in vivo koje bi rezultirale visokim afinitetom, antigen-specifi čnim vezivanjem. CDR3 PH9H5 je jedini segment koji se ne sastoji od sekvenci V gena humane zametne linije u tom VH. CDR3 PH9H5 je iz anti-humanog CCL2 antitela, CNTO 888 i obezbeđen je od SEK ID BR: 130. Generisan je Fab koji sadrži PH9H5/PH9L3 VH/VL par.
[0368] Sekvence V-regije i J-regije PH9L3, PH9H5 i humane Ig zametne linije kojima su one najsli čnije su poređane da bi se odredio identitet sekvence ili sličnost sa sekvencama zametne linije. PH9H5 je usklađen sa konkatenacijom (SEK ID BR:131) gena zametne linije humanih Ig IGHV3-23*01 (PubMed ID: M99660) (SEK ID BR:132) i humanog IGHJ1*01 (PubMed ID: J00256) (SEK ID: J00256) BR: 133), sa jedinom razlikom između PH9H5 aminokiseline sekvenca i spojena humana IGHV3-23*01-IGHJ1*01 sekvenca je na VH CDR3, što je SEK ID BR:130 za PH9H5.
[0369] PH9L3 je usklađen sa konkatenacijom (SEK ID BR:134) gena zametne linije humanih Ig IGKV3-11*01 (PubMed ID: X01668) (SEK ID BR:135) i IGKJ1*01 (PubMed ID2: J0 SEK ID BR: 136), sa jedinom razlikom što je jedno odstupanje u spoju V gen/J gen.
Dizajn i generisanje Cys supstituisanih varijanti PH9H5 i PH9L3
[0370] Varijante PH9H5 VH koje sadrže jednu Cys supstituciju na odabranim CDR ostacima u sva tri CDR-a V regiona su dizajnirane, generisane i klonirane kao kompletni te ški lanci sa konstantnim regionom humanog IgG1 u vektor ekspresije domać ina sisara. PH9H5/PH9L3 Fab struktura je koriš ć ena da pomogne u odabiru CDR ostataka za supstituciju koji izgledaju pristupačniji za konjugaciju i u nekim varijantama, dodatni ostaci glicina (Gli) su umetnuti sa obe strane uvedenog Cys ostatka da bi se potencijalno poveć ala dostupnost od Cys za konjugaciju. Slične varijante PH9L3 VL su dizajnirane i generisane osim što su klonirane kao kompletni laki lanci sa humanim kapa konstantnim regionom u ekspresioni vektor. Generisano je ukupno 24 ekspresiona konstrukta PH9H5 pojedinačnih Cys varijanti i 22 ekspresiona konstrukta PH9L3 pojedinačnih Cys varijanti. Ostaci odabrani za supstituciju unutar PH9H5_VH (SEK ID BR: 129) i unutar PH9L3_VL (SEK ID BR: 128) su sumirani na slici 2.
[0371] Generisani ekspresioni konstrukti su korišć eni za ekspresiju Cys varijanti prolaznom kotransfekcijom svakog HC Cys varijantnog konstrukta zasnovanog na PH9H5 sa divljim tipom PH9L3 LC konstruktom ili kotransfekcijom svake LC Cys varijante zasnovane na PH9L3 sa divljim tipom PH9H5 HC. Inicijalne testne transfekcije su koristile Expi293 izveden iz HEK-a kao domać ina ekspresije i bile su na skali od 20 ml. Već ina HC i LC Cys varijanti se dobro ekspresira na osnovu kvantitacije proteina varijanti iz supernatanta kulture.
[0372] Pet početnih HC Cys varijanti, MSCB33-MSCB37, eksprimovano je u Expi293 na skali od 750 ml i varijantni proteini su prečišć eni. Prinos prečiš ć avanja i svojstva kvaliteta prečiš ć enih varijanti bili su prilično slični i dovoljni za korišć enje prečiš ć enih proteina u početnim reakcijama konjugacije peptida.
Procena konjugacije peptida sa HC Cys varijantama zasnovanim na PH9H5
[0373] Analitičko određivanje mase MSCB33 proteina i drugih varijantnih proteina pokazalo je prisustvo cisteinskih adukata u Cys konstruisanom za konjugaciju, sa dva po mAb, kao i uklanjanje HC C-terminalnog Lys ostatka, što se obično vidi u rekombinantnim proizvedena mAbs. Da bi se varijanta mAb pripremila za konjugaciju, adukti su uklonjeni redukcionim procesom razvijenim da bi se odr žale prirodne disulfidne veze unutar mAb (videti Primer 103). Inicijalne test konjugacije sa analogom humanog oksintomodulin (OXM) peptida (GCG Ayb2, Glu16,24, Arg20, Leu27, Lys30-e-(PEG12)-NH2) su urađene korišć enjem maleimidne hemije na svih pet HC Cys varijanti mAb. Efikasnost konjugacije se razlikovala izme đu varijanti mAb, što je kvalitativno procenjeno proizvodima reakcije konjugacije i relativnim procentom svake od njih. Najveć a efikasnost, merena najve ć im procentom homodimernog proizvoda, prime ć ena je sa MSCB33, u poređenju sa drugim varijantama Y102C koje sadrže bočne Gly ostatke, a mala ili nikakva konjugacija je primeć ena sa Y103C varijantama MSCB35 ili MSCB37.
[0374] Nekoliko drugih HC i LC Cys varijanti, sa projektovanim supstitucijama cisteina u razli čitim CDR-ovima (supstitucija T28C, S30C i S54C u PH9H5_VH (SEK ID BR: 129), i supstitucije S30C i S92C u PHpL3_VL (SEK ID BR: 128)) su izražene u velikom obimu u Expi293. Uklanjanje Cys adukata iz ovih prečišć enih proteina redukcijom je bilo izazovno i ove varijante se nisu dalje bavile. Zbog izazova uo čenih kod već ine Cys varijanti i početne dobre efikasnosti konjugacije uočene sa Y102C PH9H5 varijantom mAb, MSCB33, razvoj procesa i dalji inženjerski napori fokusirani su na ovu konkretnu varijantu.
Fc inženjering MSCB33
[0375] MSCB33 je rekonstruisan da sadrži tihi, ljudski IgG4_PAA Fc da bi se smanjila funkcija Fc in vivo. Humani IgG4_PAA ima mutacije S228P/F234A/L235A na humanom IgG4 alotipu nG4m(a) (zasnovano na alelu IGHG4*01 kako je definisano u IMGT). Ekspresioni konstrukt sa VH MSCB33 spojenim sa IgG4_PAA Fc je generisan i korišć en zajedno sa istom konstrukcijom ekspresije LC koja se koristi za ekspresiju MSCB33 za proizvodnju IgG4_PAA varijante MSCB33, koja je označena kao MSCB97. Aminokiselinske sekvence MSCB97 VH, HC, VL i LC date su od SEK ID BR: 137, 138, 139 i 140, respektivno.
[0376] Test ekspresija MSCB97 je urađena prolazno na skali od 20 ml u Expi293 ć elijama i ova varijanta mAb se dobro eksprimirala. MSCB97 je prečišć en iz velike ekspresije Expi293. Prinos prečiš ć avanja MSCB97 bio je 264,53 mg/L, a kvalitet je određen na 85 % monomera vrste. Naknadne ekspresije velikih razmera i prečišć avanja su bile slične ili bolje u prinosu i kvalitetu i ukazale su na konzistentnost sa kojom se ovaj mAb mogao proizvesti.
Procena konjugacije peptida sa MSCB97 i skalabilnosti reakcije konjugacije
[0377] LC-HC disulfidna povezanost se razlikuje između izotipova IgG1 i IgG4, tako da je testirana redukcija i konjugacija maleimida i potvrđeno je da se mogu prevesti sa IgG1 mAb MSCB33 na IgG4_PAA mAb MSCB97 korišć enjem TCEPgmade redukcije i konjugacije ODM testom peptida opisanim gore. Poznato je da je veza nastala konjugacijom maleimida potencijalno reverzibilna, tako da je hemija konjugacije bromoacetamida, koja proizvodi stabilniju vezu, usvojena i uspe šno primenjena na skali od 10 mg na osnovu početnog MSCB97.
[0378] MSCB97 konjugat OXM analoga GCG Aib2, Glu16,24, Arg20, Leu27, Lys30-e-(PEG12)-NH2(MSCB97-OKSM1) generisan hemijom bromoacetamida je ispitan na GLP-1 R i GLP-1R in vitro potencije. Potencije u odnosu na referentne peptide i referentne nestrukturirane polipeptidne konjugate bile su razumne i sli čne onoj konjugata generisanog sa istim peptidom prema MSCB33 (IgG1). Ovo je pokazalo da pojedina čna razlika između MSCB97 (IgG4_PAA) i MSCB33 (IgG1), koji je izotip, nije imala uticaj na potenciju konjugata koji sadrže isti peptid. Pored toga, ovi podaci su pokazali da se poželjne in vitro potencije mogu zadržati u konjugatu peptid-mAb generisanom hemijom bromoacetamida koji proizvodi vezu koja je stabilna in vivo. Drugi OXM analozi su takođe konjugovani sa MSCB97 i in vitro potencije ovih konjugata su analizirane. Ovi konjugati su imali slične GLP-1R i GCGR potencije kao MSCB97-OXM1, naglašavajuć i sposobnost konjugacije različitih peptida sa MSCB97, zadržavajuć i peptidnu mo ć .
Procena vezivanja konjugata peptida-MSCB97 za humani CCL2
[0379] Dok je MSCB97 odabran i konstruisan zbog nedostatka specifičnog vezivanja antigena, najverovatniji antigen za koji bi ovo mAb moglo da se vezuje, ako postoji, je humani CCL2na osnovu porekla VH CDR3. Da li MSCB97 pokazuje bilo kakvo specifično vezivanje CCL2procenjeno je korišć enjem dva konjugata peptid-MSCB97, sa OXM peptidnim analogom ili PYY peptidnim analogom.
[0380] Potencijalno vezivanje CCL2je direktno mereno površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) u kojoj su konjugati površinski imobilisani korišć enjem metode hvatanja anti-Fc. Komercijalno dostupno anti- CCL2mišje mAb služilo je kao pozitivna kontrola, a dva nespecifična humana antitela, CNTO 9412 i HH3B33, služila su kao negativne kontrole. Sve kontrole su na sličan način bile površinski imobilisane, a rekombinantni humani CCL2je pretočen preko imobilizovanih konjugata i kontrola u koncentracijama do 400 nM. Na osnovu unapred utvrđenih kriterijuma analize, akumulacija CCL2, koja ukazuje na specifično vezivanje antigena, primeć ena je kod pozitivne kontrole, ali ne i kod negativnih kontrola niti kod bilo kog konjugata peptid-MSCB97. Ovo je potvrdilo da MSCB97, u relevantnom terapeutskom obliku konjugata peptid-mAb, nema vezivanje za humani CCL2.
Primer 102: Ekspresija i prečišć avanje mAb
[0381] Potpuno ljudsko monoklonsko antitelo (mAb) može se rekombinantno eksprimirati u ekspresijskom domać inu sisara i prečistiti iz supernatanta ć elijske kulture koriš ć enjem standardnih metoda koje su poznate u ovoj oblasti. Na primer, cDNK sekvenca koja kodira lake (LC) i te ške lance (HC) mAb, od kojih svaki uključuje odgovarajuć i signalni peptid za omogu ć avanje sekrecije, mo že biti klonirana u zasebne vektore ekspresije sisara ili u jedan ekspresioni vektor korišć enjem standardne molekularne biologije metode. Ekspresioni vektori koji se koriste mogu biti bilo koji od onih komercijalno dostupnih kao što su pEE12.4, pcDNATM3.1(+) ili pIRESpuro3 ili bilo koji prilagođeni ekspresioni vektor sa sličnim funkcijama. U takvim vektorima transkripciju teških i lakih lanaca mAb pokreć e bilo koji od poznatih efikasnih promotera kao što je hCMV-MIE promoter. Plazmid DNK stepena transfekcije je pripremljen za odvojene LC i HC ekspresione konstrukte ili jedan konstrukt koji eksprimuje i LC i HC korišć enjem standardnih metoda kao što je QIAGEN Plasmid Midi Kit.
[0382] Prečišć ena plazmidna DNK se priprema za transfekciju pomo ć u reagensa za transfekciju na bazi lipida kao što je FreestileTM Max transfekcioni reagens, prateć i uputstva proizvođača, a zatim se transfektuje u standardnu ć elijsku liniju doma ć ina ekspresije sisara, kao što je CHO-S ili HEK 293- F. Ako su mAb LC i HC kodirani odvojenim ekspresionim konstruktima, dva konstrukta se simultano transfektuju. Pre i posle transfekcije, ć elije sisara se kultivišu za održavanje ili za ekspresiju mAb prate ć i standardne metode ć elijske kulture pri čemu se gustina ć elija kre ć e u opsegu za održavanje, medijum za kulturu koji treba da se koristi i drugi uslovi ć elijske kulture koji se slede određuju specifična ć elija doma ć ina sisara. iskorišć ena linija. Ove parametre obično dokumentuje prodavac od koga je ć elijska linija dobijena ili u naučnoj literaturi. Na primer, CHO-S ć elije se održavaju u medijumu CHO FreestileTM u suspenziji, trese se pri 125 RPM u vlažnom inkubatoru postavljenim na 37°C i 8 % CO2i podeli kada je koncentracija ć elija između 1,5 i 2,0 x 10<6>ć elija po ml.
[0383] Supernatanti ć elijske kulture iz prolazno transfektovanih ć elija sisara koje eksprimiraju mAb se sakupljaju nekoliko dana nakon transfekcije, bistre se centrifugiranjem i filtriraju. Trajanje ekspresije za CHO-S ć elije je tipično četiri dana, ali se može podesiti i može se razlikovati za različite ć elijske linije domać ina sisara. Transfekcije velikih razmera ( >10 litara) se koncentri šu 10 puta koriste ć i koncentrator kao što je Centramate. mAb se prečišć ava iz bistrenog supernatanta koriš ć enjem afinitetne kolone za protein A, kao što je HyTrap MabSelect Sure, koristeć i standardne metode za vezivanje mAb za protein A smolu, ispiranje smole i eluiranje proteina korišć enjem pufera sa niskim pH. Proteinske frakcije se odmah neutrališu eluiranjem u epruvete koje sadrže pufer pH 7, a vršne frakcije se sakupe, filtriraju i dijaliziraju protiv fiziološkog rastvora puferovanog fosfatom (PBS), pH 7,2 preko noć i na 4°C. Posle dijalize, mAb se ponovo filtrira (0.2m filter) i koncentracija proteina se određuje apsorbancijom na 280nm. Kvalitet prečišć enog mAb proteina je procenjen elektroforezom na SDS-poliakrilamidnom gelu (PAGE) i analiti čkom HPLC isključenjem veličine i nivoi endotoksina su mereni korišć enjem testa limulus amebocitnog lizata (LAL). Prečišć eno mAb se čuva na 4°C.
Ekspresija i prečišć avanje MSCB97 iz prolazno transfektovanih CHO ć elija
[0384] MSCB97 je eksprimiran u ExpiCHO-STM ć elijama (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA; Cat # A29127) prolaznom transfekcijom ć elija sa prečiš ć enom plazmidnom DNK ekspresione konstrukcije MSCB97 prema preporukama proizvođača. Ukratko, ExpiCHO-STM ć elije su održavane u suspenziji u ekspresionom medijumu ExpiCHOTM (ThermoFisher Scientific, Cat # A29100) u inkubatoru za muć kanje postavljenom na 37°C, 8 % CO2i 125 RPM. Ć elije su pasirane tako da se na dan transfekcije može posti ć i razblaživanje do 6,0 x 10<6>ć elija po ml, održavaju ć i vitalnost ć elija na 98 % ili bolje. Prolazne transfekcije su urađene korišć enjem kompleta za transfekciju ExpiFectamineTM CHO (ThermoFisher Scientific Cat # A29131). Za svaki ml razblaženih ć elija koje treba transfektovati, koristi se jedan mikrogram plazmidne DNK i razbla ži u medijumu za kompleksiranje OptiPROTM SFM. ExpiFectamineTM CHO reagens se koristi u odnosu 1:3 (v/v, DNK:reagens) i takođe se razblažuje u OptiPROTM. Razblažena DNK i reagens za transfekciju su kombinovani jedan minut, omoguć avaju ć i formiranje kompleksa DNK/lipida, a zatim dodati ć elijama. Posle inkubacije preko noć i, ć elijama su dodati ExpiCHOTM hrana i Expi-FectamineTM CHO poja čivač. Ć elije su kultivisane uz mu ć kanje na 32°C pet dana pre sakupljanja supernatanata kulture.
[0385] Supernatanti kulture iz prolazno transfektovanih ExpiCHO-STM ć elija su sakupljeni bistrenjem kroz centrifugiranje (30 min, 6000 rpm) prać eno filtracijom (0,2 m PES membrana, Corning). Transfekcije velikih razmera (5 do 20 litara) su prvo koncentrisane 10 puta korišć enjem Pall Centramate sistema za filtriranje tangencijalnog protoka. 10 x DPBS (Dulbekov fiziološki pufer sa fosfatom), pH7,2 je dodat u supernatant do 1 x konačne koncentracije pre stavljanja na ekvilibrisanu (DPBS, pH 7,2) HyTrap MabSelect Sure Protein A kolonu (GE Healthcare; Little Chalfont, Ujedinjeno Kraljevstvo) na relativnu koncentraciju od ∼ 20 mg proteina po ml smole, korišć enjem AKTA FPLC sistema za hromatografiju. Posle punjenja, kolona je isprana sa 10 zapremina kolone DPBS, pH 7,2. Protein je eluiran sa 10 zapremina kolone 0,1 M Na-acetata, pH 3,5. Proteinske frakcije su odmah neutralisane eluiranjem u epruvete koje sadr že 2,0 M Tris, pH 7 na 20 % zapremine eluacione frakcije. Pik frakcije su objedinjene i pH je pode šen na ~5,5 sa dodatnim Tris, ako je potrebno. Prečišć eni protein je filtriran (0,2 m) i koncentracija je određena apsorbancijom na 280 nm na BioTex SinergiHTTM spektrofotometru. Kvalitet pre čišć enog proteina je procenjen pomoć u SDS-PAGE i analitičke HPLC isključivanja veličine (Dionex HPLC sistem). Nivo endotoksina je meren korišć enjem turbidometrijskog LAL testa (Pirotell®-T, Associates of Cape Cod).
Primer 103: Konjugacija mAb i cikličkog PYY analoga
Metod A: Delimična redukcija mAb sa TCEP
[0386] Rastvor mAb od 10 mg/mL u tris-acetatnom puferu (20 mL, 1 mM u EDTA) tretiran je sa 3 ekvivalenta TCEP. Rastvor je podešen na pH 6 i posle 1 h na sobnoj temperaturi tečne hromatografije visokog pritiska sa masenim spektrometrom (LCMS) je pokazala da su disulfidni adukti na poziciji C102 potpuno redukovani. Redukovano mAb je prečišć eno adsorpcijom proteina A i eluiranjem (4 CV 100 mM sirć etne kiseline) da bi se dobilo 180 mg redukovanog mAb.
Konjugacija redukovanog mAb i cikličnog PYY analoga
[0387] Liofilizovani peptid (5 ekv. vs mAb) je dodat u redukovano mAb opisano iznad. EDTA je dodat do krajnje koncentracije od 1 mM i pH je podešen na 7. Koncentracija je podešena na 8 mg/mL i reakcija je ostavljena da se odvija uz lagano mešanje tokom 16 h na sobnoj temperaturi. Dodan je TCEP (0,5 ekv. naspram mAb) i reakcija je ostavljena da teče dalje 4 sata na sobnoj temperaturi uz lagano mešanje, nakon čega su vrste visoke molekularne težine (MT) smanjene na manje od 3 %.
[0388] Reakciona smeša je podešena na pH 5,5 i prečišć ena jonoizmenjivačkom hromatografijom na CaptoSP smoli koristeć i gradijent 100 % A (100 mM TRIS-acetat, pH 5,5) do 100 % B (100 mM TRIS-acetat, pH 5,5; 0,5 M); NaCl) preko 20 CV. Frakcije koje sadrže željeni konjugat su objedinjene i 140 mg konjugata je dobijeno, uz koeluaciju sa mala količina neizreagovanog peptida. Završno prečišć avanje je bilo adsorpcijom proteina A i eluiranjem (4 CV 100 mM sirć etne kiseline). pH proizvoda je pode šen na 6 da bi se dobilo 120 mg konjugata (60 % prinos) sa > 90 % čistoć e sa < 3% vrsta visoke MT.
Metod B
Prečišć avanje mAb hidrofobnom interakcijskom hromatografijom (HIC).
[0389] Rastvor mAb od 20 mg/mL u tris-acetatnom puferu je napunjen na kolonu za hidrofobnu interakciju (TOSOH TSKgel fenil 7,5k21 cm) i eluiran linearnim gradijentom (0-70% B/A, rastvarač A: 5% iPrOH, 1M (NH4)2SO4, 100 mM fosfatni pufer, pH 6,0; rastvarač B: 20 % iPrOH, 100 mM fosfatni pufer). Pikovi monomera mAb su spojeni, koncentrovani (5-10 mg/mL) i dijalizovani protiv pufera 3-(N-morfolino) propansulfonske kiseline (MOPS) (100 mM, pH 5,5).
Delimična redukcija sa TCEP i konjugacija redukovanog mAb sa cikličnim PYY analogom
[0390] U prečišć eno mAb (27 mL, 9,28 mg/mL) dodato je 4 ekv. TCEP pra ć en EDTA (1 mM). Posle 2 sata na sobnoj temperaturi LCMS je pokazao da su disulfidni adukti na poziciji C102 potpuno redukovani. Redukovano mAb je tretirano Zebra centrifugiranom kolonom za desalinizaciju (7x10mL, 7K MWCO, preekvilibrijum sa MOPS 100mM pH 5,5) da bi se uklonili oslobođeni cisteini/GSH. Kombinovanim frakcijama redukovanog mAb (28 mL) dodat je rastvor PYY peptida u vodi Milli Q (6,5 ekv. u odnosu na mAb, 15-20 mg/mL), a zatim EDTA (1 mM). pH reakcije je podešen na 7,2 do 7,4 dodavanjem u kapima u NaOH. Reakcija je ostavljena da teče 18 h na sobnoj temperaturi uz lagano mešanje. Reakcija je nastavljena još 12 h nakon dodavanja dodatnih 0,5 ekv. TCEP da bi se smanjio dimer mAb-mAb formiran tokom reakcije i omoguć ila konverzija u željeni homodimer mAb. pH reakcije je snižen na pH 5,5 dodavanjem 2 M sir ć etne kiseline i sirovi konjugat je prečišć en hromatografijom hidrofobne interakcije i eluiran linearnim gradijentom (0-100 % B/A, rastvarač A: 5 % iPrOH, 1M (NH4)2SO4, 100 mM fosfatni pufer, pH 6,0, rastvarač B: 20 % iPrOH, 100 mM fosfatni pufer). Završno prečišć avanje je obavljeno adsorpcijom proteina A (PBS) i eluiranjem (NaOAc, pH 3,5). pH proizvoda je podešen na 6 i dijalizovan u odnosu na PBS da bi se dobio konačni uzorak (56 %).
[0391] Alternativno, mAb je redukovano sa GSH i/ili Cys. Posle uklanjanja redukcionog agensa pomoć u filtracije tangencijalnog protoka (TFF), višak peptida je dodat redukovanom mAb opciono u prisustvu 0,2-0,5 ekvivalenata TCEP.
Primer 104: Karakterizacija konjugata mAb
[0392] Analitička karakterizacija PYY-mAb konjugata je izvedena korišć enjem (i) hromatografije hidrofobne interakcije (HIC), (ii) merenja intaktne mase pomoć u LC-ESIMS, (iii) hromatografije sa isključenjem po veličini (SEC). Rezultati analitičke karakterizacije konjugata PYY-mAb i metoda konjugacije prikazani su u tabeli 1.
1
Tabela 1: Analitički podaci za konjugate PYY-mAb.
Primer 105: in vitro testovi
[0393] Jedinjenje 1 je procenjeno na osnovu njegove sposobnosti da aktivira NPY receptore in vitro u klonalnim ć elijama (HEK ili CHO) koje eksprimiraju Y2 receptore ljudi, pacova, mi ša i rezus majmuna i humane Y1, Y4 i Y5 receptore. PYY3-36, NPY i PP su uključeni u ove testove kao kontrole studije.
Ćelijske linije
[0394] Stabilne transfektovane klonalne ć elijske linije koje eksprimiraju NPY receptore su razvijene za upotrebu u cAMP testovima. Ukratko, ć elijske linije HEK293 su transfektovane kori š ć enjem kompleta Lipofectamine 2000 (Invitrogen) u skladu sa njegovim protokolom sa ekspresionim plazmidima koji nose
2
kodirajuć e sekvence za humani Y2 receptor (pristupni broj: NM_000910.2), ljudski Y5 receptor (pristupni br. : NM_006174.2), mišji Y2 receptor (pristupni broj: NM_008731) i receptor Y2 rezus majmuna (pristupni broj: NM_001032832). Četrdeset osam sati nakon transfekcije, ć elije su ponovo obložene sa selekcijskim medijumom (DMEM visoka glukoza sa 10 % fetalnog goveđeg seruma (FBS), 50 IU penicilina, 50 mg/ml streptomicina, 2 mM L-glutamina, 1 mM natrijum piruvata i 600 mg/ml G418). Ć elije su držane u medijumu za selekciju 2 nedelje pre nego što su pojedinačni klonovi odabrani korišć enjem metode ograničenog razblaživanja. Transfektovane ć elije su potom održavane kultivisanjem u medijumu sa visokim sadržajem glukoze DMEM (Cellgro) sa dodatkom 10 % fetalnog goveđeg seruma, 1 % L-glutamina, 1 % natrijum piruvata, 1 % penicilina/streptomicina i 600 mg/ml G418.
[0395] Pored toga, CHO-K1 ć elijske linije su dobijene od Discoverx Corporation, koje eksprimiraju humani Y1 receptor (kataloški broj: 93-0397C2) i humani Y4 receptor (kataloški broj: 95-0087C2). Discoverx ć elije kultivisane u F12 medijumu (Gibco) sa dodatkom 10 % FBS i pod selekcijom G418 (800 mg/mL). Y2 receptor pacova je eksprimiran u Glo-Sensor CHO-K1 liniji dobijenoj od Promega Corporation. Ove ć elije su transfektovane sa pGloSensorTM-23F cAMP plazmidom za luminiscentni cAMP test, ali su testirane i validirane za upotrebu sa Perkin-Elmer LANCE cAMP testom. Y2 ć elije pacova su uzgajane u F12 medijumu (Gibco) sa dodatkom 10 % FBS i 800 mg/ml G418.
[0396] Sveć elijske linije su složene u bočice (4 x 10<6>ć elija/bočici) i čuvane u tečnom azotu do upotrebe. Dan pre testa, bočice su odmrznute i dodate u 15 ml odgovarajuć eg medijuma. Ć elije su centrifugirane na 450 x g tokom 5 min, supernatanti su aspirirani i ć elije su ponovo suspendovane u medijumu bez G418 pri gustini od 0,2 x 10<6>ć elija/ml. Ć elije su raspoređene (25 ml/bunari ć u) u Biocoat kolagenom obložene bele ploče sa 384 bunarčić a do konačne gustine od 5000 ć elija/bunari ć u. Ć elijske ploče su inkubirane preko noć i u vlažnom inkubatoru za kulturu tkiva na 37°C u atmosferi 5 % CO2/90 % O2.
Eksperimentalni protokol
[0397] cAMP test je bio isti za različite testove receptora. LANCE cAMP komplet (Perkin Elmer Corporation; Waltham, MA) je korišć en u svim eksperimentima za kvantitativno određivanje intracelularnog cAMP nivoa. Na dan testa, ć elijski medijum je dekantovan iz ć elija i 6 ml peptida (2 x koncentracija) je dodato u bazenčić e. Peptidi su napravljeni kao odgovor na dozu od 11 tačaka (počevši od 100 nM ili 10 mM sa serijskim razblaženjima 1:3) u puferu za stimulaciju. Stimulacioni pufer se sastoji od 5 mM HEPES (4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansulfonske kiseline), 500 mM IBMX i 0,1 % goveđeg serumskog albumina (BSA) u HBSS (Hankov balansirani rastvor soli). Sledeć ih 6 ml stimulacionog pufera koji sadr ži forskolin (2x, 5 mM konačna koncentracija) i LANCE cAMP antitelo (1:100) je dodato ć elijama. Posle inkubacije od 25 minuta na sobnoj temperaturi, u svaki bunar je dodato 12 ml me šavine za detekciju testa. Mešavina za detekciju je pripremljena razblaživanjem biotin-cAMP (1:750) i Europium-W8044 (1:2250) u puferu za detekciju kao što je obezbeđeno sa LANCE cAMP kompletom. Ploča je inkubirana 2 sata na sobnoj temperaturi, a zatim očitana kao TR-FRET test na Envision čitaču ploča (ekscitacija 320 nm, emisija 615 nm i 665 nm). Fluorescencija kanala 1 (relativne fluorescentne jedinice na 615 nm) i fluorescencija kanala 2 (relativne fluorescentne jedinice na 665 nm) zajedno sa njihovim odnosom su isporučene u Excel datoteku.
Analiza podataka
[0398] Podaci iz Envision čitača ploča su izraženi kao relativne jedinice fluorescencije (RFU) izračunate kao (615 nm/665 nm) x 10,000. Svi uzorci su mereni u tri primerka. Podaci su analizirani kori šć enjem internog softvera za analizu podataka Crucible, koji je dizajnirao Eudean Shav. Nepoznate koncentracije cAMP unutar svakog ležišta su interpolirane iz referentnih standarda poznatih koncentracija cAMP uključenih u svaku ploču. Parametri kao što su EC50, Log(ECso), HyllSlope (nH), vrh i dno, izvedeni su grafikom vrednosti koncentracije cAMP preko koncentracija jedinjenja opremljenih 4-P modelom korišć enjem nelinearne ponderisane primene najmanjih kvadrata unutar R okru ženja (Open Source http://cran.us.r-project.org/) koji implementira Odeljenje za nekliničku statistiku i računarstvo u Janssen R&D.
Tabela 2: in vitro podaci
Tabela 3: in vitro izoforma čoveka i ukrštene vrste EC50
4
Primer 106: In vivo test stabilnosti miša
[0399] Mužjaci C57BL/6N miševa (9-12 nedelja starosti) su dobijeni iz Taconic Laboratory. Mi ševi su smešteni po jedan miš po kavezu sa AlphaDry posteljinom u prostoriji sa kontrolisanom temperaturom sa ciklusom svetlosti/mraka od 12 sati. Miševima je dozvoljen ad libitum pristup vodi i održavani su na ishrani (5001, Lab Diet).
[0400] Miševima je subkutano dozirano 1 mg/kg jedinjenja. Približno 100 mL krvi od 3 životinje je sakupljeno na t=4, 24 i 48 sati putem reza repa. Krv (približno 600 mL) od 2-3 životinje po vremenskoj tački je takođe sakupljena na t=4, 24 i 48 sati putem punkcije srca. Uzorci krvi su sakupljeni u K3E (EDTA) epruvete koje sadrže 4 % rastvora kompletnog rastvora inhibitora proteaze i 1 % DPPIV inhibitora. Uzorci krvi su stavljeni na vlažni led pre nego što su centrifugirani na 10.000 obrtaja u minuti tokom 10 minuta u frižideru (∼ 5°C) za uklanjanje ć elija u roku od 30 minuta nakon sakupljanja u svakoj vremenskoj ta čki i sva dostupna plazma je prebačena na ploču sa 96 bunarčića. Ploča sa bunarima je čuvana u zamrzivaču na -80°C. Nivoi jedinjenja su mereni korišć enjem LCMS metode opisane u nastavku. Podaci su prikazani u tabeli 4.
Testovi masene specifikacije za određivanje % preostalog intaktnog konjugata
[0401] Uzorci plazme su obrađeni hvatanjem imuno-afiniteta korišć enjem anti-humanog Fc antitela, nakon čega je usledila reverzna faza LC-visoke rezolucije pune skenirane MS analize na trostrukom TOF (Time-of-Flight) masenom spektrometru. Sirovi MS spektri su dekonvoluirani da bi se razjasnile molekulske težine komponenti u ubrizganim uzorcima. Pik molekulskog jona intaktnog konjugata je kori šć en za kvantifikaciju nepromenjenog intaktnog konjugata. U posebnom testu, uzorci plazme su obra đeni imunoafinitetnim hvatanjem korišć enjem anti-humanog Fc antitela, nakon čega je usledila digestija tripsinom i LC-MSMS analiza obrnute faze na trostrukom kvadrupolnom masenom spektrometru. Peptid koji se nalazi na Fc mAb je prać en za kvantifikaciju ukupnog mAb. Za oba testa, uzorci standardne krive i kontrole kvaliteta pripremljeni su ubacivanjem referentnog standarda u plazmu i obra đeni koristeć i istu proceduru u isto vreme kao i dobijeni uzorci. Izračunato je da je odnos koncentracije intaktnog konjugata i ukupnog mAb % preostalog.
Tabela 4: Podaci o stabilnosti miša in vivo
(nastavak)
Primer 107: Farmakokinetika (PK)
PK DIO miša
[0402] Mužjaci DIO C57BL/6N miševa (20 nedelja starosti, 14 nedelja na ishrani sa visokim sadržajem masti) dobijeni su iz Taconic Laboratori. Miševi su smešteni po jedan miš po kavezu sa AlphaDri posteljinom u prostoriji sa kontrolisanom temperaturom sa ciklusom svetlosti/mraka od 12 sati. Mi ševima je dozvoljen ad libitum pristup vodi i održavani su na dijeti sa visokim sadržajem masti (D12492, Istraživačka dijeta).
[0403] Miševima je subkutano (s.c.) dozirano 1 mg/kg jedinjenja 1, 3 životinje su žrtvovane u svakoj vremenskoj tački i krv je sakupljena na t=4, 8, 24, 48, 72, 120 i 168 sati. Prikupljena je i krv od 3 nezrele životinje. Otprilike 300 mL krvi iz svake životinje je sakupljeno preko jugularne vene nakon dekapitacije u gasnoj anesteziji indukovanoj mešavinom od 70 % CO2i 30 % O2. Uzorci krvi (približno 300 mL) su sakupljeni u K3E (EDTA) obloženim Sarstedt Microvette® epruvetama koje sadrže 12 ml (odnos 4 %) kompletnog rastvora inhibitora proteaze i 3 mL (odnos 1 %) inhibitora DPP-IV. Uzorci krvi su stavljeni na vlažni led pre nego što su centrifugirani na 10.000 obrtaja u minuti u trajanju od ~4 minuta u fri žideru (∼ 5°C) za uklanjanje ć elija u roku od 30 minuta nakon sakupljanja u svakoj vremenskoj tački i sva dostupna plazma je prebačena u 96 bunarčić a na ploči. Ploča bunara je čuvana na suvom ledu sve dok nije stavljena u zamrzivač na -80°C. Podaci su prikazani u tabeli 5 i na slici 3.
PK pacov
[0404] Jedinjenje 1 je davano subkutano i intravenozno mužjacima Sprague-Davley pacova (Charles River Laboratories, Vilmington, MA) u nivou doze od 1,0 mg/kg u PBS, (pH 7,0-7,6). Približno 500 mL krvi je sakupljeno od tri životinje po vremenskoj tački preko safene vene (t=1, 4, 24, 48, 72, 96, 168 i 240 sati nakon doze). Uzorak krvi nakon 336 sati nakon doze je sakupljen preko jugularne vene nakon dekapitacije u gasnoj anesteziji indukovanoj mešavinom od 70 % CO2i 30 % O2. Uzorci krvi su sakupljeni u K3E (EDTA) obloženim Sarstedt Microvette® epruvetama koji sadrži 20 ml (odnos 4 %) kompletnog rastvora inhibitora proteaze i 5 mL (odnos 1 %) inhibitora DPPIV. Uzorci krvi su stavljeni na vlažni led pre nego što su centrifugirani na 10.000 obrtaja u minuti u trajanju od ~4 minuta u fri žideru (∼ 5°C) radi uklanjanja ć elija u roku od 60 minuta nakon sakupljanja u svakoj vremenskoj tački i sva dostupna plazma je prebačena u 96 bunarčić a na ploči. Nivoi jedinjenja 1 su mereni koriš ć enjem LCMS metode opisane u nastavku. Podaci su prikazani u tabeli 6.
PK Cinomolgus majmuni (Cino)
[0405] Sve životinje su gladovane najmanje osam sati pre doziranja i tokom prva četiri sata uzimanja uzoraka krvi. Tri životinje su primile jednu IV dozu od 1 mg/kg jedinjenja 1, a tri životinje su dobile jednu SC dozu od 1 mg/kg jedinjenja 1. Krv je sakupljena pre doze i na 1, 6, 10, 24, 36, 48, 72, 120, 168, 240, 336, 432 i 504 sata nakon doze. Dodatni uzorak je sakupljen 0,5 sati nakon doze za IV grupu. Približno 1 ml krvi iz svake životinje sakupljeno je u K3E (EDTA) obložene Sarstedt Microvette® epruvete koje sadrže 4 % odnos kompletnog rastvora inhibitora proteaze i 1 % odnos inhibitora DPPIV. Uzorci krvi su stavljeni na vlažni led pre nego što su centrifugirani u roku od 30 minuta nakon sakupljanja u svakoj vremenskoj tački, a rezultujuć a plazma je podeljena na tre ć ine i prebačena u trostruku ploču sa 96 jažica. Ploča je čuvana na suvom ledu sve dok nije stavljena u zamrzivač na -80°C. Podaci su prikazani u tabeli 7 i na slici 4.
Intaktni test masene specifikacije za određivanje nivoa plazme
[0406] Uzorci plazme su obrađeni hvatanjem imunoafiniteta korišć enjem anti-humanog Fc antitela, nakon čega je usledila reverzna faza LC-visoke rezolucije pune skenirane MS analize na trostrukom TOF (time-offlight) masenom spektrometru. Sirovi MS spektri su dekonvoluirani da bi se razjasnile molekulske te žine komponenti u ubrizganim uzorcima. Za kvantifikaciju je kori šć en vrh molekulskog jona intaktnog konjugata. Uzorci standardne krive i kontrole kvaliteta pripremljeni su ubacivanjem referentnog standarda u plazmu i obrađeni po istom postupku u isto vreme kao i dobijeni uzorci. PK podaci za DIO mi ša, pacova i cino prikazani su u tabeli 5. Tabela 6, odnosno tabela 7. PK podaci za DIO mi ša i Cino takođe su prikazani na slikama 3 i 4, respektivno.
Primer 108: Studije efikasnosti in vivo
Gubitak težine kod gojaznih (DIO) miševa izazvanih ishranom: akutno doziranje
[0407] Jedinjenje 1 je procenjeno na osnovu njegove sposobnosti da smanji unos hrane i telesnu te žinu kod mužjaka DIO C57B1/6 miševa posle jedne doze. Mužjaci DIO C57BL/6N miševa (20 nedelja starosti, 14 nedelja na ishrani sa visokim sadržajem masti) dobijeni su iz Taconic Laboratory. Miševi su smešteni po jedan miš po kavezu sa AlphaDry posteljinom u prostoriji sa kontrolisanom temperaturom sa ciklusom svetlosti/mraka od 12 sati. Miševima je dozvoljen ad libitum pristup vodi i održavani su na dijeti sa visokim sadržajem masti (D12492, Istraživačka dijeta). Životinje su aklimatizovane u objektu najmanje nedelju dana pre početka eksperimenta.
[0408] Dan pre doziranja, miševi su grupisani u kohorte od osam životinja na osnovu individualne telesne težine. At 15:00-16:00 sledeć eg dana, životinje su izmerene i tretirane sa nosačem (dPBS, pH 7,2), jedinjenjem 1 u dozi od 0,1, 0,3, 1,0, 3,0 ili 7,5 nmol/kg ili dulaglutidom u 0,3 nmol/kg putem subkutane (sc) primene. Telesna težina i unos hrane mereni su 24 h, 48 h i 72 h nakon doziranja i izračunati su procenti gubitka težine i smanjenja unosa hrane. Statističke analize su obavljene korišć enjem dvosmerne ponovljene mere ANOVA sa Tukeijevim post-testom u Prizmi. Svi podaci su predstavljeni kao srednja vrednost 6 SEM (Slika 5 i Slika 6).
Gubitak težine kod gojaznih miševa izazvanih ishranom: hronično doziranje
[0409] Jedinjenje 1 je procenjeno na osnovu njegove sposobnosti da smanji unos hrane i telesnu te žinu i poboljša homeostazu glukoze pri ponovljenom doziranju kod mužjaka DIO C57B1/6 miševa tokom perioda od 8 dana. Mužjaci DIO C57BL/6N miševa (20 nedelja starosti, 14 nedelja na ishrani sa visokim sadržajem masti) dobijeni su iz Taconic Laboratory. Miševi su smešteni po jedan miš po kavezu sa AlphaDry posteljinom u prostoriji sa kontrolisanom temperaturom sa ciklusom svetlosti/mraka od 12 sati. Mi ševima je dozvoljen ad libitum pristup vodi i održavani su na dijeti sa visokim sadržajem masti (D12492, Istraživačka dijeta). Životinje su aklimatizovane u objektu najmanje nedelju dana pre po četka eksperimenta.
[0410] Dan pre doziranja, miševi su grupisani na osnovu individualne telesne težine. U 15:00 - 16:00 za svaki od narednih 8 dana, merene su životinje i unos hrane. Životinje su tretirane nosačem (dPBS, pH 7,2) ili dulaglutidom u dozi od 0,3 nmol/kg supkutanom primenom svaki dan ili jedinjenjem 1 u dozama od 0,1, 0,3, 1,0, 3,0 nmol/kg putem subkutane primene svaka tri dana. Posle 8 dana, miševi gladuju 5 sati, a zatim se oralno daje bolus glukoze od 2 g/kg pri t=0. Na t=0, 30, 60, 90 i 120 minuta nakon izazivanja glukoze meri se glukoza u krvi, a na t=0, 30 i 90 minuta uzima se krv za merenje insulina u plazmi. Statističke analize su obavljene korišć enjem jednosmerne ANOVA ili dvosmerne ponovljene mere ANOVA sa Tukeijevim post-testom u Prizmi. Svi podaci su predstavljeni kao srednja vrednost 6 SEM (Slika 7, Slika 8 i Tabele 8-11).
Tabela 8: Efekat jedinjenja 1 na telesnu težinu (g) tokom 8 dana lečenja
Gubitak težine kod gojaznih miševa izazvanih ishranom u kombinaciji sa liraglutidom: hronično doziranje
[0411] Jedinjenje 1 je procenjeno na osnovu njegove sposobnosti da smanji unos hrane i telesnu te žinu i poboljša homeostazu glukoze u kombinaciji sa dugodelujuć im GLP-1 agonistom, liraglutidom, pri ponovljenom doziranju kod mužjaka DIO C57B1/6 miševa tokom perioda od 9 dana.
[0412] Mužjaci DIO C57BL/6N miševa (20 nedelja starosti, 14 nedelja na ishrani sa visokim sadržajem masti) dobijeni su iz Taconic Laboratory. Miševi su smešteni po jedan miš po kavezu sa AlphaDry posteljinom u prostoriji sa kontrolisanom temperaturom sa ciklusom svetlosti/mraka od 12 sati. Mi ševima je dozvoljen ad libitum pristup vodi i održavani su na dijeti sa visokim sadržajem masti (D12492, Istraživačka dijeta). Životinje su aklimatizovane u objektu najmanje nedelju dana pre po četka eksperimenta.
[0413] Dan pre doziranja, telesni sastav je izmeren MRI i miševi su grupisani na osnovu individualne telesne težine. Dana 0 u 15:00 - 16:00, merene su životinje i unos hrane. Životinje u grupama sa pojedinačnim tretmanom tretirane su vehikulumom (dPBS, pH 7,2) ili liraglutidom u dozi od 10 nomol/kg subkutanom primenom svakog dana ili jedinjenjem 1 u dozama od 0,1 ili 1,0 nmol/kg supkutanom primenom svaka tri dana. Životinje u kombinovanim grupama primale su liraglutid (10 nmol/kg) dnevno i jedinjenje 1 u dozama od 0,1 ili 1,0 nmol/kg svaka tri dana. Osmog dana MR je izmerena kompozicija tela. Devetog dana, miševi su gladni 5 sati i mereni su glukoza u krvi i insulin natašte. Statističke analize su obavljene korišć enjem jednosmerne ANOVA ili dvosmerne ponovljene mere ANOVA sa Tukeijevim posttestom u Prizmi. Svi podaci su predstavljeni kao srednja vrednost 6 SEM (slika 9 i tabele 12-17).
1
Tabela 12: Efekat jedinjenja 1, liraglutida i kombinacije jedinjenja 1 i liraglutida na dnevni unos hrane (g) tokom 9 dana lečenja.
Tabela 13: Efekat jedinjenja 1, liraglutida i kombinacije jedinjenja 1 i liraglutida na telesnu težinu (g) tokom 9 dana lečenja.
2
Tabela 14: Poređenje ko-doziranog jedinjenja 1 i liraglutida u procentima promene telesne težine u odnosu na zbir procenta promene telesne težine jedinjenja 1 ili liraglutida doziranog samostalno 9.
dana.
Tabela 15: Efekat jedinjenja 1, liraglutida i kombinacije jedinjenja 1 i liraglutida na glukozu u krvi (mg/dL), insulin i HOMA-IR posle 9 dana lečenja.
Tabela 16: Efekat jedinjenja 1, liraglutida i kombinacije jedinjenja 1 i liraglutida na telesni sastav (g) meren MRI posle 8 dana tretmana.
Tabela 17: Efekat jedinjenja 1, liraglutida i kombinacije jedinjenja 1 i liraglutida na telesni sastav (%) mereno MRI posle 8 dana tretmana.
Primer 109: Uticaj jedne doze jedinjenja 1 na unos hrane i telesnu težinu kod Sprague-Dawley pacova
[0414] Jedinjenje 1 je procenjeno na osnovu njegove sposobnosti da smanji unos hrane i telesnu te žinu u Sprague-Dawley nakon jedne doze. Životinje su dobijene iz Charles River Labs (Vilmington, MA) sa 200-225 g telesne težine i korišć ene u roku od jedne nedelje od porođaja. Bili su smešteni po jedan po kavezu na alfa suvoj posteljini i plastičnoj cevi za obogać ivanje u prostoriji sa kontrolisanom temperaturom sa 12-satnim ciklusom svetlo/mrak. Dozvoljen im je pristup vodi ad libitum i hranjeni su hranom za laboratorijske glodare; Ozračena sertifikovana PicoLab® dijeta za glodare 20, 5K75* (isporučuje se iz Purina Mills, St. Louis, MO preko ASAP Kuakertovn, PA). Težine životinja su uzete i zabeležene za svakog pacova pre doziranja.
[0415] Dan pre doziranja, pacovi su grupisani u kohorte od osam životinja na osnovu individualne telesne težine. Sledeć eg dana, životinje su izmerene i tretirane sa nosačem (dPBS, pH 7,2), jedinjenjem 1 u dozi od 0,1, 0,3, 1,0 ili 3,0 nmol/kg, ili dulaglutidom sa 0,3 nmol/kg putem subkutane primene. Telesna težina i unos hrane su mereni 1, 2 i 3 dana nakon doziranja i izračunati su procenti gubitka težine i smanjenja unosa hrane. Statističke analize su obavljene korišć enjem dvosmerne ponovljene mere ANOVA sa Tukeijevim post-testom u Prizmi. Svi podaci su predstavljeni kao srednja vrednost 6 SEM (Tabele 18-20).
Tabela 18: Uticaj jedne doze jedinjenja 1 na dnevni unos hrane i ukupnu potrošnju hrane tokom tri dana kod Sprague-Dawley pacova.
4
Tabela 19: Efekat jedne doze jedinjenja 1 na apsolutnu telesnu težinu tokom tri dana kod Sprague-Dawley pacova.
Tabela 20: Uticaj jedne doze jedinjenja 1 na promenu telesne težine tokom tri dana kod Sprague-Dawley pacova.
Primer 110: Efekti jedinjenja 1, samog ili u kombinaciji sa liraglutidom, kod gojaznih rezus makaka
[0416] Jedinjenje 1 je procenjeno zbog njegove sposobnosti da smanji unos stopala kod gojaznih rezus makaka. Takođe je procenjena dodatna efikasnost primeć ena kada se liraglutid primenjuje zajedno sa efikasnom dozom jedinjenja 1. Prvo, sprovedena je skrać ena studija o rasponu doza da bi se odredila doza liraglutida koja ć e se koristiti tokom istovremene primene. Šest životinja je primalo jednokratnu dnevnu sc primenu fiziološkog rastvora tokom tri nedelje. Unos hrane je meren dnevno, a osnovni unos hrane je postavljen kao prosečan dnevni unos tokom tri nedelje tretmana vehikulom. Šest životinja je zatim podeljeno u dve grupe; 0,01 mg/kg (n=3) i 0,02 mg/kg (n=3). Svako je primao dnevnu subkutanu dozu liraglutida tokom jedne nedelje da bi se odredili efekti na unos hrane u odnosu na po četnu vrednost i da bi se identifikovala maksimalna podnošljiva doza. Unos hrane je takođe meren dve nedelje nakon prekida terapije liraglutidom. Svi podaci su predstavljeni kao srednji sedmični unos hrane 6 SEM (Slika 10).
[0417] Deset (10) gojaznih rezus makaka je korišć eno za procenu efikasnosti jedinjenja 1. Posle 2-nedeljnog osnovnog perioda, jedinjenje 1 je dato s.c. dnevno tokom 4 nedelje. Životinje su dobijane 7 dana u dozi od 0,01 mg/kg, zatim 7 dana u dozi od 0,03 mg/kg, zatim 9 dana u dozi od 0,015 mg/kg i na kraju 5 dana istovremenog doziranja jedinjenja 1 od 0,015 mg/kg u kombinaciji sa liraglutidom na 0,01 mg/kg. Unos hrane je prać en dnevno, a telesna težina je merena nedeljno. Nivoi glukoze, insulina, ukupnog holesterola, HDL, LDL, ALT i AST su procenjeni na početku, nakon tretmana jedinjenjem 1 i posle kombinovanog tretmana. Svi podaci su predstavljeni kao srednja vrednost 6 SEM (tabele 21-22 i slike 11 i 12).
Tabela 21: Uticaj jedinjenja 1 sa dodatkom liraglutida na unos hrane kod gojaznih rezus makaka
Tabela 22: Uticaj jedinjenja 1 sa dodatkom liraglutida na telesnu težinu kod gojaznih rezus makaka
[0418] Jednosmerna ANOVA RM, Dunetov test višestrukog poređenja.
[0419] Primeri cikličnih PYY sekvenci ili njihovih konjugata pronalaska uključuju:
SEK ID BR: 1
Naziv: [Ciklo-(bA2-COCH2-hC31), K(PEG12-AcBr)11, psi-(35R,36Y)]-PYY2-36 Struktura:
SEK ID BR: 2
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31)]-PYY3-36
Struktura:
SEK ID BR: 3
Naziv: [Ciklo-(I3-CO(CH2)2triazolyl-Nle31)]-PYY3-36
Struktura:
SEK ID BR: 4
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-Pal)11]-PYY3-36 Struktura:
SEK ID BR: 5
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-AcVitE)11]-PYY3-36 Struktura:
SEK ID BR: 6
Naziv: [Ciklo-(I3-CO(CH2)2triazolyl-Nle31), K(γ-Glu-AcVitE)11]-PYY3-36 Struktura:
SEK ID BR: 7
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-Pal)9]-PYY3-36 Struktura:
SEK ID BR: 8
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-Pal)30]-PYY3-36 Struktura:
SEK ID BR: 9
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31), psi-(R35Y36)]-PYY3-36 Struktura:
SEK ID BR: 10
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-AcVitE)30]-PYY3-36 Struktura:
SEK ID BR: 11
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-AcVitE)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Struktura:
SEK ID BR: 12
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31), (N-Me-R35)]-PYY3-36 Struktura:
SEK ID BR: 13
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-Pal)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Struktura:
SEK ID BR: 14
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-Pal)30, (N-Me-R35)]-PYY3-36 Struktura:
SEK ID BR: 15
Naziv: [Ciklo-(K4-CO(CH2)2NHCOCH2-hC31), K(γ-Glu-Pal)30]-PYY4-36 Struktura:
1
SEK ID BR: 16
Naziv: [Ciklo-(K4-p-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-Pal)30]-PYY4-36 Struktura:
SEK ID BR: 17
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31), A4, K(γ-Glu-Pal)30]-PYY3-36 Struktura:
SEK ID BR: 18
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31), E4, K(γ-Glu-Pal)30]-PYY3-36 Struktura:
2
SEK ID BR: 19
Naziv: [Ciklo-(I3-p-COPhCH2-C31), K(γ-Glu-Pal)30, (N-Me-R35)]-PYY3-36 Struktura:
SEK ID BR: 20
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-C31), K(γ-Glu-Pal)30, (N-Me-R35)]-PYY3-36 Struktura:
SEK ID BR: 21
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31), A4, A26, K(γ-Glu-Pal)30]-PYY3-36 Struktura:
SEK ID BR: 22
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31), E4, A26, K(γ-Glu-Pal)30]-PYY3-36
Struktura:
SEK ID BR: 23
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31), K((OEG)2-γ-Glu-COC16CO2H)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Struktura:
4
SEK ID BR: 24
Naziv: [Ciklo -(I3-m-COPhCH2-hC31), K((OEG)2-γ-Glu-COC18CO2H)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Struktura:
SEK ID BR: 25
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-Stear)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Struktura:
SEK ID BR: 26
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-Arach)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Struktura:
SEK ID BR: 27
Naziv:[Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31), K((OEG)2-COC16CO2H)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Struktura:
SEK ID BR:28
Naziv: [Ciklo-(K4-p-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-Pal)30, psi-(R35,Y36)]-PYY4-36 Struktura:
SEK ID BR:29
Naziv: [Ciklo-(K4-CO(CH2)2NHCOCH2-hC31), K(γ-Glu-Pal)30, psi-(R35,Y36)]-PYY4-36 Struktura:
SEK ID BR:30
Naziv: [Ciklo-(K4-CO(CH2)3NHCOCH2-C31), K(γ-Glu-Pal)30, psi-(R35,Y36)]-PYY4-36 Struktura:
SEK ID BR:31
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31), K((OEG)2-γ-Glu-Stear)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Struktura:
SEK ID BR:32
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31), A4, A26, K(γ-Glu-Pal)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Struktura:
SEK ID BR:33
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-Pal)30, (N-Me-Q34), psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Struktura:
SEK ID BR:34
Naziv: [Ciklo-(K4-CO(CH2)5NHCOCH2-C31), K(γ-Glu-Pal)30, psi-(R35,Y36)]-PYY4-36 Struktura:
SEK ID BR:35
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-Pal)30, (N-Me-R35), psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Struktura:
SEK ID BR:36
Naziv: [Ciklo-(K4-CO(CH2)2NHCOCH2-hC31), K(γ-Glu-Pal)30, (N-Me-R35), psi-(R35,Y36)]-PYY4-36 Struktura:
SEK ID BR:37
Naziv: [Ciklo-(I3-CO(CH2)3NHCOCH2-C31), K(γ-Glu-Pal)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Struktura:
SEK ID BR:38
Naziv: [Ciklo-(I3-CO(CH2)2NHCOCH2-hC31), K(γ-Glu-Pal)30, (N-Me-R35), psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Struktura:
SEK ID BR:39
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31), S4, K(γ-Glu-Arach)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Struktura:
SEK ID BR:40
Naziv: [Ciklo-(I3-CO(CH2)2triazolyl-Nle31), K((OEG)2-γ-Glu-Pal)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Struktura:
1
SEK ID BR:41
Naziv: [Ciklo-(I3-CO(CH2)2triazolyl-Nle31), K(γ-Glu-Pal)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
Struktura:
SEK ID BR:42
Naziv: [Ciklo-(I3-CO(CH2)2triazolyl-Nle31), K((OEG)2-γ-Glu-COC16CO2H)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Struktura:
SEK ID BR:43
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31), K((OEG)2-γ-Glu-Pal)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Struktura:
1 1
SEK ID BR:44
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31), K((OEG)2-γ-Glu- COC16CO2H)11, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Struktura:
SEK ID BR:45
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(COCH2CH2(OCH2CH2)24NH-γ-Glu-Pal)11, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Struktura:
SEK ID BR:46
Naziv: [Ciklo-(I3-CO(CH2)2NHCOCH2-hC31), K(γ-Glu-Pal)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
Struktura:
1 2
SEK ID BR:47
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31), K((OEG)2-γ-Glu-COC16CO2H)7, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Struktura:
SEK ID BR:48
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31), K((OEG)2-γ-Glu-COC16CO2H)22, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Struktura:
SEK ID BR:49
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-(Pal-16-OH))30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Struktura:
1
SEK ID BR:50
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31), K((OEG)2-γ-Glu-COC16CO2H)23, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Struktura:
SEK ID BR: 51
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31), S4, K(γ-Glu-Pal)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
Struktura:
SEK ID BR: 52
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(COCH2CH2(OCH2CH2)12NH-γ-Glu-Pal)11, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Struktura:
1 4
SEK ID BR: 53
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31), K((OEG)4-γ-Glu-Pal)11, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Struktura:
SEK ID BR: 54
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31), K((OEG)2-γ-Glu-Pal)11, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Struktura:
SEK ID BR: 55
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31), K((OEG)2-γ-Glu-Pal)23, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Struktura:
1
SEK ID BR: 56
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-COCH2Ph-(4-ClPh)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
Struktura:
SEK ID BR: 57
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-CO(CH2)2PhO-(2,4-Cl2Ph)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Struktura:
SEK ID BR: 58
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-CO(CH2)10-(4-F-Ph))30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Struktura:
1
SEK ID BR: 59
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31), K((OEG)2-γ-Glu-Pal)22, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Struktura:
SEK ID BR: 60
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31), K((OEG)2-γ-Glu-Pal)7, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Struktura:
SEK ID BR: 61
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-CO(CH2)10-(4-F3C-Ph))30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Struktura:
1
SEK ID BR: 62
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-CO(CH2)10-CF3)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Struktura:
SEK ID BR: 63
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2- hC31), K(γ-Glu-CO(CH2)13-CF3)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Struktura:
SEK ID BR: 64
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-(Pal-16-OEt))30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Struktura:
1
SEK ID BR: 65
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-CO(CH2)11(CD2)3CD3)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Struktura:
SEK ID BR: 66
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-CO(CH2)10-(2,4-(CF3)2-Ph))30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Struktura:
SEK ID BR: 67
Naziv: [Ciklo-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-CO(CH2)10-(3,5-(CF3)2-Ph))30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Struktura:
1
SEK ID BR: 68
Naziv: [Ciklo-(I3-CO(CH2)2NHCOCH2-C30), K((OEG)2-γ-Glu-COC16CO2H)11, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Struktura:
SEK ID BR: 69
Naziv: [Ciklo-(G2-E31), S4, K11, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
Struktura:
SEK ID BR: 70
Naziv: [Ciklo-(G2-E30), S4, K11, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
Struktura:
11
SEK ID BR: 71
Naziv: [Ciklo-(G2-E30), S4, K11, (N-Me-R35)]-PYY3-36
Struktura:
SEK ID BR: 72
Naziv: [Ciklo-(G2-E30), S4, K((OEG)2-γ-Glu-COC16CO2H)11, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 Struktura:
SEK ID BR: 73
Naziv: [Ciklo-(βA2-COCH2-hC31), K(PEG6-AcBr)11, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 Struktura:
SEK ID BR: 74
Naziv: [Ciklo-(βA2-COCH2-hC31), K(AcBr)11, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
Struktura:
SEK ID BR: 75
Naziv: [Ciklo-(I3-COCH2-C31), K(PEG12-AcBr)11, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
Struktura:
SEK ID BR: 76
Naziv: [Ciklo-(βA2-COCH2-hC31), K(PEG12-AcBr)11, K(mPEG16)30, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 Struktura:
SEK ID BR: 77
Naziv: [Ciklo-(βA2-COCH2-hC31), K(AcBr)11, K(mPEG12)20, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 Struktura:
SEK ID BR: 78
Naziv: [Ciklo-(βA2-COCH2-hC31), K(PEG12-AcBr)11, (N-Me)Q34, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 Struktura:
SEK ID BR: 79
Naziv: [Ciklo-(βA2-COCH2-hC31), K(PEG12-AcBr)11, N-Me-R35, psi-(R35,36Y)]-PYY2-36 Struktura:
SEK ID BR: 80
Naziv: [Ciklo-(βA2-COCH2-hC31), R4, K(PEG12-AcBr)11, W30, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 Struktura:
SEK ID BR: 81
Naziv: [Ciklo-(3I-COCH2CH2CH2NHCOCH2-C31), R4, K(PEG12-AcBr)11, W30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Struktura:
11
SEK ID BR: 82
Naziv: [Ciklo-(K4-OEG-COCH2-C31), K(PEG12-AcBr)11, psi-(R35,Y36)]-PYY4-36
Struktura:
SEK ID BR: 83
Naziv: [Ciklo-(I3-COCH2CH2triazolylNle31), K(PEG12-AcBr)11, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
Struktura:
SEK ID BR: 84
Naziv: : [Ciklo-(I3-m-CO-benzyl-hC31), K(PEG8-triazolyl-CH2CH2CO-PEG4-AcBr)11, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Struktura:
SEK ID BR: 85
Naziv: [Ciklo-(βA2-COCH2-hC31), K(PEG12-AcBr)23, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36, Struktura:
SEK ID BR: 86
Naziv: [Ciklo-(βA2-COCH2-hC31), K(PEG12-AcBr)22, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 Struktura:
SEK ID BR: 87
Naziv: [Ciklo-(βA2-COCH2-hC31), K(PEG12-AcBr)7, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 Struktura:
11
SEK ID BR: 88
Naziv: [Ciklo-(G2-COCH2-C30), K(PEG12-AcBr)11, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 Struktura:
SEK ID BR: 89
Naziv: [Ciklo-(G2-COCH2-C30), K(PEG12-AcBr)11, N-Me-R35]-PYY2-36 Struktura:
SEK ID BR: 90
Naziv: [Ciklo-(βA2-COCH2-C30), K(PEG12-AcBr)11, N-Me-R35]-PYY2-36 Struktura:
11
SEK ID BR: 91
Naziv: [Ciklo-(G2-COCH2-hC30), K(PEG12-AcBr)11, N-Me-R35]-PYY2-36 Struktura:
SEK ID BR: 92
Naziv: [Ciklo-(βA2-COCH2-hC31), K(PEG12-AcBr)11, N-Me-R35]PYY2-36 Struktura:
SEK ID BR: 93
Naziv: [Ciklo-(G2-COCH2-hC30), K(PEG12-AcBr)11, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 Struktura:
11
SEK ID BR: 94
Naziv: [Ciklo-(βA2-COCH2-C30), K(PEG12-AcBr)11, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 Struktura:
SEK ID BR: 95
Naziv: [Ciklo-(G2-E30), S4, K(AcBr)11, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 Struktura:
SEK ID BR: 96
Naziv: [Ciklo-(βA2-COCH2-hC31), K(PEG24-AcBr)11, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 Struktura:
11
SEK ID BR: 97
Naziv: [Ciklo-(G2-Ac-hC31), K(PEG12-AcBr)11, psi-(R35-Y36)]-PYY2-36 Struktura:
SEK ID BR: 98
Naziv: [Ciklo-(G2-COCH2-C30), K(AcBr)11, N-Me-R35]-PYY2-36 Struktura:
SEK ID BR: 99
Naziv: [Ciklo-(βA2-COCH2-C30), K(AcBr)11, N-Me-R35]-PYY2-36 Struktura:
SEK ID BR: 100
Naziv: [Ciklo-(βA2-COCH2-C30), K(AcBr)11, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 Struktura:
11
SEK ID BR: 101
hPYY3-36
Struktura:
SEK ID BR: 102
Naziv: [Ciklo-(βA2-COCH2-hC31), K(PEG12)11, psi-(35R,36Y)]-PYY2-36 mAb homodimer konjugat (Jedinjenje 1)
Struktura:
SEK ID BR: 103
Naziv: [Ciklo-(βA2-COCH2-hC31), K(PEG6)11, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 mAb homodimer konjugat (Jedinjenje 2)
Struktura:
SEK ID BR: 104 Naziv: [Ciklo-(βA2-COCH2-hC31), K11, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 mAb homodimer konjugat (Jedinjenje 3)
Struktura:
12
SEK ID BR: 105
Naziv: [Ciklo-(I3-COCH2-C31), K(PEG12)11, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 mAb homodimer konjugat (Jedinjenje 4)
Struktura:
SEK ID BR: 106
Naziv: [Ciklo-(βA2-COCH2-hC31), K(PEG12)11, K(mPEG16)30, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 mAb homodimer konjugat (Jedinjenje 5)
Struktura:
SEK ID BR: 107
Naziv: [Ciklo-(βA2-COCH2-hC31), K11, K(mPEGI2)20, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 mAb homodimer konjugat (Jedinjenje 6)
Struktura:
SEK ID BR: 108
Naziv: [Ciklo-(βA2-COCH2-hC31), K(PEG12)11, (N-Me)Q34, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 mAb homodimer konjugat (Jedinjenje 7)
Struktura:
SEK ID BR: 109
Naziv: [Ciklo-(βA2-COCH2-hC31), K(PEG12)11, N-Me-R35, psi-(R35,36Y)]-PYY2-36 mAb homodimer konjugat (Jedinjenje 8)
Struktura:
SEK ID BR: 110
Naziv: [Ciklo-(βA2-COCH2-hC31), R4, K(PEG12)11, W30, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 mAb homodimer konjugat (Jedinjenje 9)
Struktura:
SEK ID BR: 111
Naziv: [Ciklo-(3I-COCH2CH2CH2NHCOCH2-C31), R4, K(PEG12)11, W30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 mAb homodimer konjugat (Jedinjenje 10)
Struktura:
SEK ID BR: 112
Naziv: [Ciklo-(K4-OEG-COCH2-C31), K(PEG12)11, psi-(R35,Y36)]-PYY4-36 mAb homodimer konjugat (Jedinjenje 11)
Struktura:
SEK ID BR: 113 Naziv: [Ciklo-(I3-COCH2CH2triazolilNle31), K(PEG12)11, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 mAb homodimer konjugat (Jedinjenje 12)
Struktura:
12
SEK ID BR: 114
Naziv: [Ciklo-(I3-m-CO-benzyl-hC31), K(PEG8-triazolil-CH2CH2CO-PEG4)11, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 mAb homodimer konjugat (Jedinjenje 13)
Struktura:
SEK ID BR: 115
Naziv: [Ciklo-(βA2-COCH2-hC31), K(PEG12)23, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 mAb homodimer conjugate (Compound 14)
Struktura:
SEK ID BR: 116 Naziv: [Ciklo-(βA2-COCH2-hC31), K(PEG12)22, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 mAb homodimer konjugat (Jedinjenje 15)
Struktura:
SEK ID BR: 117
Naziv: [Ciklo-(βA2-COCH2-hC31), K(PEG12)7, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 mAb homodimer konjugat (Jedinjenje 16)
Struktura:
SEK ID BR: 118
Naziv: [Ciklo-(G2-COCH2-C30), K(PEG12)11, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 mAb homodimer konjugat (Jedinjenje 17)
Struktura:
SEK ID BR: 119 Naziv: [Ciklo-(G2-COCH2-C30), K(PEG12)11, N-Me-R35]-PYY2-36 mAb homodimer konjugat (Jedinjenje 18)
Struktura:
SEK ID BR: 120
Naziv: [Ciklo-(βA2-COCH2-C30), K(PEG12)11, N-Me-R35]-PYY2-36 mAb homodimer konjugat (Jedinjenje 19) Struktura:
12
SEK ID BR: 121
Naziv: [Ciklo-(G2-COCH2-hC30), K(PEG12)11, N-Me-R35]-PYY2-36 mAb homodimer konjugat (Jedinjenje 20) Struktura:
SEK ID BR: 122
Naziv: [Ciklo-(βA2-COCH2-hC31), K(PEG12)11, N-Me-R35]PYY2-36 mAb homodimer konjugat (Jedinjenje 21)
Struktura:
SEK ID BR: 123
Naziv: [Ciklo-(G2-COCH2-hC30), K(PEGI2)11, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 mAb homodimer konjugat (Jedinjenje 22)
Struktura:
SEK ID BR: 124
Naziv: [Ciklo-(βA2-COCH2-C30), K(PEG12)11, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 mAb homodimer konjugat (Jedinjenje 23)
Struktura:
12
SEK ID BR: 125
Naziv: [Ciklo-(G2-E30), S4, K11, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 homodimer konjugat (Jedinjenje 24) Struktura:
SEK ID BR: 126
Naziv: [Ciklo-(βA2-COCH2-hC31), K(PEG24)11, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 mAb homodimer konjugat (Jedinjenje 25)
Struktura:
SEK ID BR: 127 Naziv: [Ciklo-(G2-Ac-hC31), K(PEG12)11, psi-(R35-Y36)]-PYY2-36 mAb homodimer konjugat (Jedinjenje 26)
Struktura:
SEK ID BR: 147
Naziv: [Ciklo-(βA2-COCH2-hC31), psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
Struktura:
12
SEK ID BR: 148
Naziv: [Ciklo-(βA2-COCH2-hC31), K11, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 Struktura:
SEK ID BR: 149
Naziv: [Ciklo-(G2-E30), S4, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 Struktura:
SEK ID BR: 150
Naziv: [Ciklo-(G2-E30), S4,K11, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 Struktura:
SEK ID BR: 151
Naziv: [Ciklo-(G2-COCH2-C30), N-Me-R35]-PYY2-36 Struktura:
12
SEK ID BR: 152
Naziv: [Ciklo-(G2-COCH2-C30), K11, N-Me-R35]-PYY2-36 Struktura:
SEK ID BR: 153
Naziv: [Ciklo-(βA2-COCH2-C30), N-Me-R35]-PYY2-36 Struktura:
SEK ID BR: 154
Naziv: [Ciklo-(βA2-COCH2-C30), K11, N-Me-R35]-PYY2-36 Struktura:
SEK ID BR: 155
Naziv: [Ciklo-(βA2-COCH2-C30), psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 Struktura:
12
SEK ID BR: 156
Naziv: [Ciklo-(βA2-COCH2-C30), K11, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 Struktura:
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
14
14
14
14
14
14
14
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
21
21
21
21
21
21
21
22
22
22

Claims (20)

  1. Patentni zahtevi 1. Konjugat koji sadrži monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen povezan sa cikličnim PYY peptidom, pri čemu je ciklični PYY peptid predstavljen Formulom I ili njenim derivatom ili njenom farmaceutski prihvatljivom soli:
    pri čemu p je 0 ili 1; 22 m je 0, 1, 2, 3, 4 ili 5; n je 1, 2, 3 ili 4; q je 0 ili 1; pod uslovom da je q 1 samo kada je Z30odsutan; MOST je -Ph-CH2-S-, -triazolil-, -NHC(O)CH2S-, -SCH2C(O)NH-, -(OCH2CH2)2NHC(O)CH2S, -NHC(O)- ili -CH2S -; Z4je K, A, E, S ili R; Z7je A ili K; Z9je G ili K; Z11je D ili K; Z22je A ili K; Z23je S ili K; Z26je A ili H; Z30je L, W, odsutan ili K; pod uslovom da je Z30odsutan samo kada je q 1; Z34je
    Z35je
    pri čemu je derivat jedinjenje Formule I koje je modifikovano jednim ili više procesa izabranih iz grupe koju čine amidacija, glikozilacija, karbamilacija, sulfacija, fosforilacija, ciklizacija, lipidacija i pegilacija.
  2. 2. Konjugat prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je ciklični PYY peptid jedinjenje Formule I ili derivat cikličnog PYY peptida Formule I koji je modifikovan jednim ili više procesa izabranih iz grupe koja se sastoji od amidacije, lipidacije i pegilacije, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
  3. 3. Konjugat prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je ciklični PYY peptid predstavljen Formulom I ili njenim derivatom ili farmaceutski prihvatljivom soli, pri čemu: p je 0 ili 1; m je 0, 1, 2, 3, 4 ili 5; n je 1, 2, 3 ili 4; q je 0 ili 1; pod uslovom da je q 1 samo kada je Z30odsutan; MOST je -Ph-CH2-S-, -triazolil-, -NHC(O)CH2S-, -SCH2C(O)NH2-, -(OCH2CH2)2NHC(O)CH2S, -NHC(O)-ili -CH2S -; Z4je K, A, E, S ili R; Z7je A ili K, pri čemu je amino bočni lanac navedenog K opciono supstituisan sa
    pri čemu je i ceo broj od 0 do 24, i X = Br, I ili Cl, -C(O)CH2Br, -C(O)CH2I ili -C(O)CH2Cl; Z9je G ili K, pri čemu je amino bočni lanac navedenog K opciono supstituisan sa
    pri čemu je i ceo broj od 0 do 24, i X = Br, I ili Cl, -C(O)CH2Br, -C(O)CH2I ili -C(O)CH2Cl; Z11je D ili K, pri čemu je amino bočni lanac navedenog K opciono supstituisan sa
    pri čemu je i ceo broj od 0 do 24, i X = Br, I ili Cl, -C(O)CH2Br, -C(O)CH2I ili -C(O)CH2Cl; Z22je A ili K, pri čemu je amino bočni lanac navedenog K opciono supstituisan sa
    pri čemu je i ceo broj od 0 do 24, i X = Br, I ili Cl, -C(O)CH2Br, -C(O)CH2I ili -C(O)CH2Cl; 22 Z23je S ili K, pri čemu je amino bočni lanac navedenog K opciono supstituisan sa
    pri čemu je i ceo broj od 0 do 24, i X = Br, I ili Cl, -C(O)CH2Br, -C(O)CH2I ili -C(O)CH2Cl; Z26je A ili H; Z30je L ili K, pri čemu je amino bočni lanac navedenog K supstituisan sa
    Z34je
    i Z35je
  4. 4. Konjugat prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je ciklični PYY peptid predstavljen Formulom I ili njenim derivatom ili farmaceutski prihvatljivom soli, pri čemu: p je 0 ili 1; m je 0, 1, 2, 3 ili 5; n je 1, 2 ili 4; q je 0 ili 1; pod uslovom da q može biti 1 samo kada je Z30odsutan; 22 MOST je -Ph-CH2-S-, -triazolil-, -NHC(O)CH2S-, -(OCH2CH2)2NHC(O)CH2S, -NHC(O)- ili -CH2S-; Z4je K, A, E, S ili R; Z7je A ili K, pri čemu je amino bočni lanac navedenog K supstituisan sa
    Z9je G ili K, Z11je D ili K, pri čemu je amino bočni lanac navedenog K supstituisan sa
    -C(O)CH2Br, Z22je A ili K, pri čemu je amino bočni lanac navedenog K supstituisan sa
    Z23je S ili K, pri čemu je amino bočni lanac navedenog K supstituisan sa
    Z26je A ili H, Z30je L ili K, pri čemu je amino bočni lanac navedenog K supstituisan sa
    2 Z34je
    Z35je
  5. 5. Konjugat prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je ciklični PYY peptid izabran iz grupe koju čine SEK ID BR: 1, 73-100 i 147-156, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
  6. 6. Konjugat prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 5, pri čemu je monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen kovalentno vezan za ciklični PYY peptid na lizinskom ostatku cikličnog PYY peptida preko linkera; opciono pri čemu linker sadrži jedan od izabranih iz grupe koju čine polietilen glikol (PEG)8-triazolil-CH2CH2CO-PEG4, PEG lanac od 2-24 PEG jedinice, alkil lanac koji sadrži 2-10 atoma ugljenika, (Gly4Ser)j pri čemu j = 1-4, (AlaPro)upri čemu je u = 1-10, i veza.
  7. 7. Konjugat prema patentnom zahtevu 6, pri čemu je samo jedan od Z7, Z9, Z11, Z22i Z23u Formuli I lizin, i lizin je kovalentno vezan za konstruisani cisteinski ostatak monoklonskog antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen preko linkera.
  8. 8. Konjugat koji sadrži molekul prema sledec ́oj formuli: cPYY-L]2-mAb pri čemu: cPYY je ciklična PYY peptidna sekvenca izabrana iz grupe koju čine SEK ID BR: 102-127 ili njena farmaceutski prihvatljiva so; L je linker; mAb je monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen povezan sa cikličnim PYY peptidom preko linkera; i ]2predstavlja da su 1 ili 2 cikličnog PYY peptida kovalentno konjugovani sa mAb.
  9. 9. Konjugat prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 8, pri čemu monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrži region 1 koji određuje komplementarnost teškog lanca (HCDR1), HCDR2, HCDR3 i region 1 koji određuje komplementarnost lakog lanca (LCDR1), LCDR2 i LCDR3, koji imaju polipeptidne sekvence SEK ID BR: 141, 142, 143, 144, 145 i 146, respektivno, opciono pri čemu izolovano monoklonsko antitelo sadrži varijabilni domen teškog lanca (VH) koji ima polipeptidnu sekvencu od SEK ID BR:137, i varijabilni domen lakog lanca (VL) koji ima polipeptidnu sekvencu SEK ID BR:139. 2 1
  10. 10. Konjugat prema patentnom zahtevu 9, koji dalje sadrži Fc deo, opciono koji sadrži teški lanac (HC) koji ima polipeptidnu sekvencu SEK ID BR:138 i laki lanac (LC) koji ima polipeptidnu sekvencu SEK ID BR:140.
  11. 11. Konjugat koji sadrži monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen povezan sa cikličnim PYY peptidom, pri čemu: monoklonsko antitelo ili njegov deo koji se vezuje za antigen sadrži region 1 koji određuje komplementarnost teškog lanca (HCDR1), HCDR2, HCDR3 i region 1 koji određuje komplementarnost lakog lanca (LCDR1), LCDR2 i LCDR3, koji ima polipeptidne sekvence SEK ID BR: 141, 142, 143, 144, 145 i 146, respektivno, poželjno monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrži varijabilni domen teškog lanca (VH) koji ima polipeptidnu sekvencu SEK ID BR: 137 i varijabilni domen lakog lanca (VL) koji ima polipeptidnu sekvencu SEK ID BR:139, i poželjnije, monoklonsko antitelo sadrži teški lanac (HC) koji ima polipeptidnu sekvencu SEK ID BR:138 i laki lanac (LC) koji ima polipeptidnu sekvencu od SEK ID BR:140; ciklični PYY peptid sadrži polipeptidnu sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEK ID NO: 1, 73-100 i 147-156, ili njenu farmaceutski prihvatljivu so; i monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen konjugovan sa cikličnim PYY peptidom na ostatku 7, 9, 11, 22 ili 23 cikličnog PYY peptida, poželjno na ostatku lizina 11 cikličnog PYY peptida, direktno ili preko linkera.
  12. 12. Postupak za proizvodnju konjugata prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 11, koji obuhvata reakciju elektrofila, poželjno bromoacetamida ili maleimida, uvedenog na bočni lanac cikličnog PYY peptida, poželjno bočnog lanca lizinskog ostatka cikličnog PYY peptida sa sulfhidrilnom grupom cisteinskog ostatka SEK ID BR: 143 monoklonskog antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen, č ime se stvara kovalentna veza između cikličnog PYY peptida i monoklonskog antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen.
  13. 13. Farmaceutska kompozicija koja sadrži konjugat bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 11 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
  14. 14. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 13 za upotrebu u postupku za lečenje ili prevenciju bolesti ili poremećaja kod subjekta kome je to potrebno, pri č emu je navedena bolest ili poremećaj izabran iz grupe koju čine gojaznost, dijabetes tipa I ili tipa II, metabolički sindrom, insulinska rezistencija, poremec ́ena tolerancija glukoze, hiperglikemija, hiperinsulinemija, hipertrigliceridemija, hipoglikemija zbog kongenitalnog hiperinzulinizma (CHI), dislipidemija, ateroskleroza, dijabetička nefropatija i drugi faktori rizika od kardiovaskularnih bolesti kao što su faktori rizika koji nisu povezani sa kardiovaskularnim bolestima nivoom holesterola i/ili lipida, osteoporoze, upale, nealkoholne bolesti masne jetre (NAFLD), nealkoholnog steatohepatitisa (NASH), bubrežne bolesti i ekcema, postupak koji obuhvata davanje subjektu kome je to potrebno efikasne količine farmaceutske kompozicije.
  15. 15. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 13 za upotrebu u postupku smanjenja unosa hrane kod subjekta kome je to potrebno, postupak koji obuhvata davanje subjektu kome je to potrebno efikasne količine farmaceutske kompozicije.
  16. 16. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 13 za upotrebu u postupku modulacije aktivnosti Y2 receptora kod subjekta kome je to potrebno, pri čemu postupak obuhvata davanje subjektu kome je to potrebno efikasne količine farmaceutske kompozicije.
  17. 17. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva od 14 do 16, pri čemu se farmaceutska kompozicija administrira putem injekcije i/ili u kombinaciji sa najmanje jednim antidijabetičkim agensom.
  18. 18. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 17, pri čemu je navedeni antidijabetički agens modulator receptora peptida-1 sličan glukagonu ili se farmaceutska kompozicija administrira u kombinaciji sa liraglutidom.
  19. 19. Komplet koji sadrži konjugat prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 11, poželjno dalje sadrži liraglutid i uređaj za injekciju. 2 2
  20. 20. Postupak za proizvodnju farmaceutske kompozicije koja sadrži konjugat prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 11, koji obuhvata kombinovanje konjugata sa farmaceutski prihvatljivim nosačem da bi se dobila farmaceutska kompozicija. 2
RS20211419A 2016-10-27 2017-10-26 Ciklična jedinjenja tirozin-tirozina uparena sa antitelom kao modulatori neuropeptidnog y receptora RS62677B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662413586P 2016-10-27 2016-10-27
US201662413613P 2016-10-27 2016-10-27
EP17864112.2A EP3532486B8 (en) 2016-10-27 2017-10-26 Antibody-coupled cyclic peptide tyrosine tyrosine compounds as modulators of neuropeptide y receptors
PCT/US2017/058455 WO2018081370A1 (en) 2016-10-27 2017-10-26 Antibody-coupled cyclic peptide tyrosine tyrosine compounds as modulators of neuropeptide y receptors

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62677B1 true RS62677B1 (sr) 2021-12-31

Family

ID=62020814

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20211419A RS62677B1 (sr) 2016-10-27 2017-10-26 Ciklična jedinjenja tirozin-tirozina uparena sa antitelom kao modulatori neuropeptidnog y receptora

Country Status (40)

Country Link
US (15) US10968265B2 (sr)
EP (5) EP3532092B1 (sr)
JP (8) JP7387431B2 (sr)
KR (6) KR102704251B1 (sr)
CN (4) CN109890410A (sr)
AU (6) AU2017348175B2 (sr)
BR (3) BR112019008351A2 (sr)
CA (3) CA3041674A1 (sr)
CL (3) CL2019001110A1 (sr)
CO (3) CO2019003938A2 (sr)
CR (3) CR20190210A (sr)
CY (1) CY1124732T1 (sr)
DK (1) DK3532486T3 (sr)
DO (3) DOP2019000107A (sr)
EC (3) ECSP19029942A (sr)
ES (2) ES2897480T3 (sr)
HR (1) HRP20211626T1 (sr)
HU (1) HUE056442T2 (sr)
IL (6) IL266202B2 (sr)
JO (3) JOP20190095A1 (sr)
LT (1) LT3532486T (sr)
MA (3) MA46718A (sr)
MD (1) MD3532486T2 (sr)
MX (6) MX2019004954A (sr)
MY (2) MY199666A (sr)
NI (2) NI201900043A (sr)
NZ (1) NZ752396A (sr)
PE (3) PE20190917A1 (sr)
PH (3) PH12019500723A1 (sr)
PL (1) PL3532486T3 (sr)
PT (1) PT3532486T (sr)
RS (1) RS62677B1 (sr)
SA (3) SA519401647B1 (sr)
SG (4) SG11201902873RA (sr)
SI (1) SI3532486T1 (sr)
SM (1) SMT202100647T1 (sr)
TW (4) TWI773699B (sr)
UY (3) UY37455A (sr)
WO (3) WO2018081367A1 (sr)
ZA (1) ZA202200648B (sr)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10513546B2 (en) 2013-12-18 2019-12-24 President And Fellows Of Harvard College CRP capture/detection of gram positive bacteria
JOP20190095A1 (ar) 2016-10-27 2019-04-28 Janssen Pharmaceutica Nv مركبات ببتيد تيروسين-تيروسين الحلقية كمعدلات لمستقبلات الببتيد العصبي y
US11780900B2 (en) 2018-04-25 2023-10-10 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Glucagon like peptide 1 (GLP-1) fusion peptide coupled cyclic peptide tyrosine tyrosine conjugates and uses thereof
TWI847981B (zh) 2018-04-25 2024-07-11 比利時商健生藥品公司 類升糖素肽1 (glp-1)融合肽偶合環狀酪酪肽接合物及其用途
KR20210141600A (ko) * 2019-03-19 2021-11-23 엔진 바이오사이언스 리미티드 글루카곤 유사 펩티드-1(glp-1) 수용체 작용제 및 이의 유사물의 제조 방법
CN111944055B (zh) * 2019-05-16 2022-08-02 浙江道尔生物科技有限公司 一种治疗代谢疾病的融合蛋白
WO2020262590A1 (ja) * 2019-06-28 2020-12-30 味の素株式会社 環状ペプチドの製造方法
CR20220206A (es) 2019-11-11 2022-06-16 Boehringer Ingelheim Int Agonistas del receptor npy2
MX2022006861A (es) * 2019-12-04 2022-07-11 Scripps Research Inst Agonistas del receptor glp2 y metodos de uso.
CN111494606B (zh) * 2020-04-24 2021-12-14 广州医科大学 神经肽y的新应用
JP7661478B2 (ja) 2020-08-07 2025-04-14 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 可溶性ｎｐｙ２受容体アゴニスト
EP4288078A4 (en) * 2021-02-03 2024-12-11 Sun Pharmaceutical Industries Ltd READY-TO-USE OXYTOCIN DOSAGE FORM
CN115073556A (zh) * 2021-03-12 2022-09-20 上海天慈生命科学发展有限公司 一类阿片/神经肽ff受体多靶点环肽分子及其制备和应用
IL309341A (en) * 2021-06-14 2024-02-01 Darbix Llc GLP-1 receptor agonists with improved pharmacological properties and drug delivery
KR20230004135A (ko) * 2021-06-30 2023-01-06 한미약품 주식회사 글루카곤, glp-1 및 gip 수용체 모두에 활성을 갖는 삼중 활성체를 포함하는 조합물의 치료학적 용도
WO2023097363A1 (en) * 2021-11-30 2023-06-08 Garvan Institute Of Medical Research Improved binding proteins and uses thereof
CN115028551B (zh) * 2022-07-15 2024-01-05 成都普康生物科技有限公司 一种叠氮-九甘醇-丙酸的制备方法
CN116098987A (zh) * 2023-02-09 2023-05-12 华东医院 甘丙肽在制备治疗非酒精性脂肪性肝病药物中的用途
WO2025252023A1 (en) * 2024-06-03 2025-12-11 Fortvita Biologics Inc. Modulators for gipr, glp1r and/or gcgr and uses thereof

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2434149A1 (fr) 1978-06-22 1980-03-21 Parcor Nouveaux derives de la l-cysteine
US5393669A (en) 1993-02-05 1995-02-28 Martek Biosciences Corp. Compositions and methods for protein structural determinations
US7166575B2 (en) 2002-12-17 2007-01-23 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Compositions and methods for enhanced mucosal delivery of peptide YY and methods for treating and preventing obesity
US8603969B2 (en) * 2004-02-11 2013-12-10 Amylin Pharmaceuticals, Llc Pancreatic polypeptide family motifs and polypeptides comprising the same
EP1718671A2 (en) * 2004-02-23 2006-11-08 Rheoscience A/S Peptide yy analogues
EA011860B1 (ru) 2004-03-17 2009-06-30 7ТиЭм ФАРМА А/С Селективные агонисты рецептора y2 для терапевтического воздействия
WO2006028936A2 (en) 2004-09-02 2006-03-16 Genentech, Inc. Heteromultimeric molecules
DK1791565T3 (en) * 2004-09-23 2016-08-01 Genentech Inc Cysteingensplejsede antibodies and conjugates
AU2006232287B2 (en) 2005-03-31 2011-10-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
DE102005028778A1 (de) 2005-06-22 2006-12-28 SUNJÜT Deutschland GmbH Mehrlagige Folie mit einer Barriere- und einer antistatischen Lage
CA2638800A1 (en) 2006-02-22 2007-09-07 Merck & Co., Inc. Oxyntomodulin derivatives
WO2007109354A2 (en) 2006-03-21 2007-09-27 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Peptide-peptidase inhibitor conjugates and methods of using same
JP2009541275A (ja) 2006-06-22 2009-11-26 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 二重特異性抗体の生産
CA2665808A1 (en) 2006-10-05 2008-05-22 Centocor Ortho Biotech Inc. Ccr2 antagonists for treatment of fibrosis
JP2008169195A (ja) * 2007-01-05 2008-07-24 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd キャリア物質を用いたインスリン分泌ペプチド薬物結合体
EP2527369A3 (en) * 2007-09-13 2012-12-19 University Of Zurich Prorektorat Forschung Monoclonal amyloid beta (abeta)-specific antibody and uses thereof
AU2008343589A1 (en) 2007-12-19 2009-07-09 Centocor Ortho Biotech Inc. Design and generation of human de novo pIX phage display libraries via fusion to pIX or pVII, vectors, antibodies and methods
CN102272151B (zh) 2008-11-04 2014-08-20 詹森药业有限公司 Crhr2肽激动剂及其用途
CN102202681A (zh) * 2008-11-05 2011-09-28 霍夫曼-拉罗奇有限公司 神经肽-2受体(y-2r)激动剂及其用途
WO2010129304A2 (en) 2009-04-27 2010-11-11 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
AU2010272944B2 (en) 2009-07-13 2015-11-19 Zealand Pharma A/S Acylated glucagon analogues
WO2011033068A1 (en) 2009-09-18 2011-03-24 Novo Nordisk A/S Long-acting y2 receptor agonists
CN104147611A (zh) 2009-09-30 2014-11-19 葛兰素集团有限公司 具有延长的半衰期的药物融合体和缀合物
EP2552951A1 (en) * 2010-03-26 2013-02-06 Novo Nordisk A/S Novel glucagon analogues
HRP20241208T1 (hr) 2010-04-20 2024-11-22 Genmab A/S Heterodimerni proteini koji sadrže fc fragment protutijela i postupci za njihovu proizvodnju
US8906649B2 (en) * 2010-09-27 2014-12-09 Janssen Biotech, Inc. Antibodies binding human collagen II
ES2757857T3 (es) 2010-09-27 2020-04-30 Janssen Biotech Inc Anticuerpos de unión a colágeno II humano
ES2758994T3 (es) 2010-11-05 2020-05-07 Zymeworks Inc Diseño anticuerpo heterodimérico estable con mutaciones en el dominio Fc
SG192117A1 (en) * 2011-01-28 2013-08-30 Sanofi Sa Human antibodies to pcsk9 for use in methods of treating particular groups of subjects
RU2607365C2 (ru) 2011-06-17 2017-01-10 Ханми Сайенс Ко., Лтд. Конъюгат, содержащий оксинтомодулин и фрагмент иммуноглобулина, и его применение
BR112014010580B1 (pt) 2011-11-04 2021-01-12 Zymeworks, Inc. constructo de fc heteromultimérico isolado, composição, uso de um constructo de fc heteromultimérico isolado, composição de ácido nucléico e método para expressar o constructo de fc heteromultimérico isolado
RU2684595C2 (ru) * 2012-07-04 2019-04-09 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Ковалентно связанные конъюгаты антиген-антитело
WO2014073842A1 (en) * 2012-11-06 2014-05-15 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Liquid formulation of protein conjugate comprising the oxyntomodulin and an immunoglobulin fragment
HK1210713A1 (en) 2012-12-27 2016-05-06 Sanofi Anti-lamp1 antibodies and antibody drug conjugates, and uses thereof
EP2943512A4 (en) 2013-01-11 2016-06-01 California Inst Biomedical Res BOVINE FUSION ANTIBODY
AU2014261111B2 (en) 2013-05-02 2017-03-16 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Therapeutic peptides
JP6685924B2 (ja) * 2014-04-11 2020-04-22 メディミューン，エルエルシー システイン操作抗体を含むコンジュゲート化合物
AR100978A1 (es) * 2014-06-26 2016-11-16 Hoffmann La Roche LANZADERAS CEREBRALES DE ANTICUERPO HUMANIZADO ANTI-Tau(pS422) Y USOS DE LAS MISMAS
AU2015296640B2 (en) 2014-07-30 2020-05-21 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods of use for treating metabolic disorders
EA201891084A1 (ru) 2015-11-02 2019-10-31 Антитела к il1rap, биспецифические антигенсвязывающие молекулы, которые связываются с il1rap и cd3, и их применение
JOP20190095A1 (ar) * 2016-10-27 2019-04-28 Janssen Pharmaceutica Nv مركبات ببتيد تيروسين-تيروسين الحلقية كمعدلات لمستقبلات الببتيد العصبي y
TWI847981B (zh) * 2018-04-25 2024-07-11 比利時商健生藥品公司 類升糖素肽1 (glp-1)融合肽偶合環狀酪酪肽接合物及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
AU2017348172A1 (en) 2019-04-18
ECSP19029995A (es) 2019-05-31
KR20240046290A (ko) 2024-04-08
TWI773699B (zh) 2022-08-11
SA519401646B1 (ar) 2021-12-26
AU2017348172B2 (en) 2021-10-07
WO2018081367A1 (en) 2018-05-03
US20200283491A1 (en) 2020-09-10
EP4574166A3 (en) 2025-09-03
TW201829455A (zh) 2018-08-16
SMT202100647T1 (it) 2022-01-10
KR20240046621A (ko) 2024-04-09
IL314808A (en) 2024-10-01
ES3025907T3 (en) 2025-06-10
ES2897480T3 (es) 2022-03-01
IL266204B2 (en) 2025-01-01
CL2019001110A1 (es) 2019-07-05
US20180127476A1 (en) 2018-05-10
JP2019534283A (ja) 2019-11-28
ECSP19029942A (es) 2019-05-31
BR112019008417A2 (pt) 2019-09-03
SA519401642B1 (ar) 2022-03-07
MX2019004952A (es) 2019-06-24
UY37455A (es) 2018-04-30
PH12019500749A1 (en) 2019-11-11
EP3532486A1 (en) 2019-09-04
IL266206A (en) 2019-06-30
DOP2019000106A (es) 2019-09-30
AU2017348175A1 (en) 2019-04-18
AU2021269420B2 (en) 2023-11-23
EP3988123A1 (en) 2022-04-27
IL266202B2 (en) 2023-09-01
EP3532092B1 (en) 2026-04-29
AU2021269420A1 (en) 2021-12-16
IL314808B1 (en) 2026-04-01
US20190345214A1 (en) 2019-11-14
PH12019500723A1 (en) 2019-11-11
IL266204A (en) 2019-06-30
US10858413B2 (en) 2020-12-08
BR112019008500A2 (pt) 2019-07-09
CR20190208A (es) 2019-05-27
UY37456A (es) 2018-04-30
US11767354B2 (en) 2023-09-26
US20180117170A1 (en) 2018-05-03
CN110099692A (zh) 2019-08-06
MA46665B1 (fr) 2021-09-30
TWI794189B (zh) 2023-03-01
PE20191079A1 (es) 2019-08-20
KR102653381B1 (ko) 2024-04-02
AU2017348175B2 (en) 2021-08-26
EP4574166A2 (en) 2025-06-25
CR20190209A (es) 2019-08-21
KR20190072615A (ko) 2019-06-25
JOP20190097A1 (ar) 2019-04-28
PL3532486T3 (pl) 2022-01-31
MX2023014354A (es) 2023-12-15
WO2018081375A1 (en) 2018-05-03
TW202304972A (zh) 2023-02-01
MX2024001845A (es) 2024-03-06
US20190298849A1 (en) 2019-10-03
JP2020510606A (ja) 2020-04-09
EP3532486A4 (en) 2020-06-24
IL301843B1 (en) 2025-09-01
ECSP19029835A (es) 2019-05-31
EP3532092A1 (en) 2019-09-04
JOP20190095A1 (ar) 2019-04-28
JP2025131599A (ja) 2025-09-09
US11591379B2 (en) 2023-02-28
US10428134B2 (en) 2019-10-01
IL266202A (en) 2019-06-30
US11732019B2 (en) 2023-08-22
JP2023012467A (ja) 2023-01-25
MA46672A (fr) 2019-09-04
LT3532486T (lt) 2021-11-10
US20230365644A1 (en) 2023-11-16
HUE056442T2 (hu) 2022-02-28
HRP20211626T1 (hr) 2022-02-04
JP2025102780A (ja) 2025-07-08
PT3532486T (pt) 2021-11-19
PH12019500906A1 (en) 2020-01-20
NI201900043A (es) 2019-10-25
AU2022200089B2 (en) 2023-11-16
UY37457A (es) 2018-04-30
CN110099692B (zh) 2024-03-12
US10787495B2 (en) 2020-09-29
SA519401647B1 (ar) 2022-01-26
MD3532486T2 (ro) 2022-01-31
IL266206B1 (en) 2024-09-01
JP2019534281A (ja) 2019-11-28
EP3532092A4 (en) 2020-07-01
MA46665A (fr) 2019-09-04
KR102704251B1 (ko) 2024-09-06
SG11201902886SA (en) 2019-05-30
CA3041046A1 (en) 2018-05-03
JP7090077B2 (ja) 2022-06-23
KR20230129194A (ko) 2023-09-06
MY199666A (en) 2023-11-15
US20210094998A1 (en) 2021-04-01
DOP2019000178A (es) 2020-02-16
CR20190210A (es) 2019-05-27
EP3534928A1 (en) 2019-09-11
ZA202200648B (en) 2024-02-28
JP2024020405A (ja) 2024-02-14
DK3532486T3 (da) 2021-10-18
AU2017348180A1 (en) 2019-04-18
US20240018208A1 (en) 2024-01-18
NZ752396A (en) 2025-12-19
WO2018081370A1 (en) 2018-05-03
US12134636B2 (en) 2024-11-05
NZ793477A (en) 2025-09-26
EP3532486B8 (en) 2022-01-12
IL301843A (en) 2023-06-01
JP7231539B2 (ja) 2023-03-01
CL2019001129A1 (es) 2019-07-05
JOP20190096B1 (ar) 2023-09-17
US10961293B2 (en) 2021-03-30
US20190367577A1 (en) 2019-12-05
CY1124732T1 (el) 2022-07-22
PE20190916A1 (es) 2019-06-26
PE20190917A1 (es) 2019-06-26
EP3534928A4 (en) 2020-08-12
CL2019001136A1 (es) 2019-07-05
CN118085061A (zh) 2024-05-28
US10968264B2 (en) 2021-04-06
IL266202B1 (en) 2023-05-01
US20190263879A1 (en) 2019-08-29
JP2022137031A (ja) 2022-09-21
JP7724196B2 (ja) 2025-08-15
IL266206B2 (en) 2025-01-01
IL314935A (en) 2024-10-01
KR20190073492A (ko) 2019-06-26
NZ752576A (en) 2025-09-26
CO2019004186A2 (es) 2019-05-10
AU2022200089A1 (en) 2022-02-03
US11401315B2 (en) 2022-08-02
US20180125998A1 (en) 2018-05-10
US10640544B2 (en) 2020-05-05
US20250026803A1 (en) 2025-01-23
NI201900044A (es) 2019-09-09
TW201827456A (zh) 2018-08-01
MA46718A (fr) 2019-09-11
BR112019008351A2 (pt) 2019-10-01
CA3041672A1 (en) 2018-05-03
CO2019004203A2 (es) 2019-05-10
IL301843B2 (en) 2026-01-01
US20210163566A1 (en) 2021-06-03
MX2019004954A (es) 2019-06-24
EP3988123C0 (en) 2025-02-26
US20210206822A1 (en) 2021-07-08
MY199449A (en) 2023-10-30
JOP20190096A1 (ar) 2019-04-28
CO2019003938A2 (es) 2019-04-30
JP7387431B2 (ja) 2023-11-28
EP3988123B1 (en) 2025-02-26
SG10202107777XA (en) 2021-08-30
US20200385439A1 (en) 2020-12-10
MX2019004955A (es) 2019-06-24
MX2023005465A (es) 2023-05-22
KR20190072616A (ko) 2019-06-25
SI3532486T1 (sl) 2021-12-31
CN109890410A (zh) 2019-06-14
SG11201902879SA (en) 2019-05-30
AU2025201677A1 (en) 2025-03-27
DOP2019000107A (es) 2019-09-30
US10968265B2 (en) 2021-04-06
KR102653376B1 (ko) 2024-04-02
EP3532486B1 (en) 2021-09-22
SG11201902873RA (en) 2019-05-30
AU2017348180B2 (en) 2024-12-12
TWI781118B (zh) 2022-10-21
CA3041674A1 (en) 2018-05-03
IL266204B1 (en) 2024-09-01
CN110036022A (zh) 2019-07-19
TW201827081A (zh) 2018-08-01
KR102573684B1 (ko) 2023-09-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11767354B2 (en) Antibody-coupled cyclic peptide tyrosine tyrosine compounds as modulators of neuropeptide Y receptors
EP3784265A2 (en) Thioether cyclic peptide amylin receptor modulators
HK40073399B (en) Antibody-coupled cyclic peptide tyrosine tyrosine compounds as modulators of neuropeptide y receptors
HK40073399A (en) Antibody-coupled cyclic peptide tyrosine tyrosine compounds as modulators of neuropeptide y receptors
EA044997B1 (ru) Конъюгат антител, связанный с циклическим пептидом, фармацевтическая композиция и набор, содержащие конъюгат, способы их получения и применения
HK40012539B (en) Antibody-coupled cyclic peptide tyrosine tyrosine compounds as modulators of neuropeptide y receptors
HK40012539A (en) Antibody-coupled cyclic peptide tyrosine tyrosine compounds as modulators of neuropeptide y receptors