RS62766B1 - Sinergijska kompozicija kao promoter autofagije - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na sinergijske kompozicije i njihovu upotrebu kao promotera autofagije u oblasti ishrane, medicinskoj ili kozmetičkoj oblasti.

STANJE TEHNIKE

[0002] Autofagija (ili autofagocitoza) je prirodni, regulisani mehanizam ćelije koji razlaže nepotrebne ili disfunkcionalne komponente. Autofagija omogućava redovnu razgradnju i recikliranje ćelijskih komponenata. U makroautofagiji, ciljani sastojci citoplazme izolovani su od ostatka ćelije unutar vezikula sa dvostrukom membranom, poznate kao autofagozom. Autofagozom se eventualno spaja sa lizozomima i sadržaj se razgrađuje i reciklira. Najčešće su opisana tri oblika autofagije: makroautofagija, mikroautofagija i šaperonom posredovana autofagija (CMA), zajedno sa mitofagijom. Kod bolesti, autofagija se vidi kao adaptivni odgovor na stres, koji unapređuje preživljavanje, dok u drugim slučajevima izgleda da promoviše ćelijsku smrt i morbiditet. U ekstremnim slučajevima izgladnjivanja, razgradnja ćelijskih komponenata unapređuje preživljavanje ćelija održavanjem nivoa energije ćelija. Prema tome, autofagija ima ključnu ulogu u zdravlju, bolesti i starenju, regulišući centralne ćelijske procese kao što su adaptivni odgovori na stres, diferencijacija, razvoj tkiva i homeostaza.

[0003] U Angeleen Fleming et al "Chemical modulators autophagy as biological probes and potential therapeutics", Nature Chemical Biology 7, 9-17 (2011) autori su pokazali da autofagija ima neočekivane pleiotropne funkcije koje favorizuju preživljavanje ćelije, uključujući snabdevanje nutrijentima pri izgladnjivanju, čišćenje unutrašnjosti ćelije, odbranu od infekcije i prezentaciju antigena. Defektivna autofagija je, prema tome, povezana sa raznovrsnim stanjima bolesti, uključujući neurodegeneraciju, kancer i Kronovu bolest.

[0004] Teng Yu et al, "Targeting autophagy in skin diseases, J Mol Med (2015) 93:31-38" proučavali su i prijavili mehanizme autofagije na patogenezu kožnih bolesti. Određenije, prijavili su ulogu autofagije u – autoimunim kožnim poremećajima kao što je psorijaza, sistemski eritemski lupus (SLE) i vitiligo, -infektivnim poremećajima kože, - kanceru kože kao što je karcinom skvamoznih ćelija i melanom.

[0005] Da bi se terapeutski modulirala autofagija za ispitivanje supresora i izazivača autofagije, ispitivani su humani modeli organa.

[0006] Međunarodne prijave patenata WO 2014/016407A1 i WO 03/063851A1 opisuju kompoziciju koja sadrži spermidin i biotin za lečenje gubitka kose.

[0007] Yuval Ramot et al. u "Spermidine promotes Human hair growth and is a novel modulator of human epithelial stem cell functions" Plos One, tom 6, br.7, 27. juli 2011. strana 22564 opisuju upotrebu spermidina u unapređenju rasta kose kod ljudi. WO 2015/063678A1 opisuje upotrebu Galeopsis ekstrakata za lečenje gubitka kose. D. Pinto et al: "209 Galeopsis segetum Necker extracts for the prevention and treatment of hair" u The Journal of Investigative Dermatology: Official journal of the society for investigative dermatology and the European society for dermatological research", tom 136 br. 9, 1. septembar 2016., strana S196, opisuju upotrebu ekstrakata iz Galeopsis segetum Necker za prevenciju i lečenje gubitka kose.

[0008] U Tobias Eiserberg et al, "Induction of autophagy by spermidine promotes longevity" Nature cell biology, tom 11, broj 11, novembar 2009., ispitivani su efekti spermidina, prirodni poliamin, kod kvasca, muva i crva. Autori su prijavili da im je davanje spermidina produžilo život. Osim toga, davanje spermidina potencijalno je inhibiralo oksidativni stres kod ostarelih miševa. Demonstrirano je da je autofagija činila glavni put razgradnje lizozoma za recikliranje oštećenog i potencijalno štetnog ćelijskog materijala.

[0009] Pronalazači su uvideli da kao kompletni, ciklično remodelirani (mini)organi, kultura organa folikula dlake (HF) na ljudskom vlasištu može da obezbedi takav model budući da takve folikule, nakon masivne aktivnosti rasta (anagen), spontano ulaze u involuciju organa izazvanu apoptozom (katagen). Kao što se zna, životni ciklus korena dlake folikule je suštinski predstavljen trima uzastopnim fazama: anagen (rast), katagen (involucija) i telogen (faza mirovanja).

[0010] Iznenađujuće, pronalazači su otkrili da životni ciklus folikule dlake može biti modulisan mehanizmom autofagije i na osnovu modela folikule dlake na ljudskom vlasištu ispitani su agensi za unapređenje.

[0011] Što se tiče ispitivanja, pronalazači su pretpostavili da će HF vlasišta u kasnom stadijumu anagena, čiji epitel matrice dlake proliferira većom brzinom od većine malignih tumora i izložen je brojnim stresorima, verovatno biti pod sve većim pritiskom da bi se održala homeostaza tkiva i mogu zahtevati značajan autofagni fluks da bi održali svoj rast.

[0012] Kao što je poznato, različiti stresori negativno utiču na životni ciklus folikule dlake, čime se utvrđuje smanjenje broja dlaka i njihovo proređivanje.

[0013] Prema tome, predmet ovog pronalaska je kako obezbediti kompoziciju koja je pogodna kao promoter autofagije u ćelijama folikula dlake na ljudskom vlasištu.

[0014] Drugi predmet je, prema tome, kako obezbediti kompoziciju za unapređenje rasta kose i/ili inhibiciju ili odlaganje gubitka kose na ljudskom vlasištu.

[0015] Neki drugi predmet je kako obezbediti kompoziciju za lečenje stanja posredovanih autofagijom.

SUŠTINA PRONALASKA

[0016] Polazeći od ispitivanja kulture organa folikula dlake (HF) na ljudskom vlasištu, pronalazači su otkrili kombinaciju jedinjenja koja izazivaju autofagiju u ispitivanom modelu i koja pokazuju sinergijski efekat u unapređenju autofagije naročito kod ćelija folikula dlake na ljudskom vlasištu.

[0017] Nakon ispitivanja, kompozicija koja ima sinergijski efekat neočekivano je bio ekstrakt biljke roda Galeopsis kombinovan sa daljim jedinjenjem koje unapređuje autofagiju, naročito u ćelijama ljudskog vlasišta, odabranim od R-N<1>-spermidina ili njegove soli, gde R predstavlja vodonik ili metil, biotina i njihove mešavine.

[0018] Prema tome, prethodno navedeni ciljevi postignuti su sinergijskom kompozicijom koja obuhvata ekstrakt biljke roda Galeopsis i R-N<1>-spermidin ili neku njegovu so, gde R predstavlja vodonik ili metil.

[0019] Alternativno, prethodno navedeni ciljevi postignuti su sinergijskom kompozicijom koja obuhvata ekstrakt biljke roda Galeopsis i biotin.

[0020] U daljem alternativnom načinu ostvarivanja, prethodno navedeni ciljevi postignuti su sinergijskom kompozicijom koja obuhvata ekstrakt biljke roda Galeopsis, biotin i R-N<1>-spermidin ili neku njegovu so, gde R predstavlja vodonik ili metil. Poželjno i iznenađujuće, pronalazači su primetili da nanošenje gornjih kompozicija, ili topikalnim ili oralnim putem primene, unapređuje na sinergijski način autofagiju u ćelijama, naročito folikulama dlake, kod subjekta koji pati od proređivanja kose, na osnovu čega je utvrđeno progresivno zadebljanje na zahvaćenim područjima skalpa.

[0021] U skladu sa daljim aspektom, ovaj pronalazak stoga obezbeđuje kozmetičku upotrebu gornjih kompozicija za stimulisanje fiziološkog rasta dlake kao što je definisano u patentnom zahtevu 16.

[0022] U skladu sa još daljim aspektom, ovaj pronalazak stoga obezbeđuje gornje kompozicije za upotrebu u lečenju bolesti skalpa kao što je definisano u patentnom zahtevu 17.

OPIS NACRTA

[0023]

Fig.1 prikazuje reprezentativne slike U2OS ćelija transdukovanih konstruktom koji eksprimira autofagijski protein LC3 spojen sa crvenim fluorescentnim proteinom (RFP) tretiranih 6 sati naznačenim supstancama. Prethodno okarakterisan izazivač autofagije, spermidin, korišćen je kao pozitivna referenca.

Fig.2 prikazuje reprezentativne slike U2OS ćelija transdukovanih konstruktom koji eksprimira protein SQSTM1/p62 spojen sa crvenim fluorescentnim proteinom (RFP) tretiranih 6 sati naznačenim supstancama. SQSTM1/p62 preokret uglavnom zavisi od procesa razgradnje posredovanog autofagijom.

Fig.3 prikazuje nivoe lipidovanih LC3 i SQSTM1 u humanim U2OS ćelijama tretiranim ekvimolarnim dozama N1-metilspermidina i spermidina kao što je navedeno u Primeru 14.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0024] Ovaj pronalazak stoga se odnosi na sinergijsku kompoziciju kao što je definisana u patentnom zahtevu 1. U poželjnom i povoljnom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak odnosi se na sinergijsku kompoziciju ekstrakta biljke roda Galeopsis, R-N<1>-spermidina ili neke njegove soli, gde R predstavlja vodonik ili metil, i biotina.

[0025] Ekstrakt gornjih kompozicija potiče od biljke koja pripada rodu Galeopsis.

[0026] U nekom načinu ostvarivanja, ekstrakt od Galeopsis je suv ekstrakt posebno od vrsta Galeopsis segetum, obično poznate kao smrdelj, tj. vrste cvetnica iz porodice žalfije, Lamiaceae.

[0027] U nekom drugom načinu ostvarivanja, ekstrakt od Galeopsis je ekstrakt posebno vrsta Galeopsis tetrahit.

[0028] U određenim načinima ostvarivanja, biljni ekstrakt je mešavina ekstrakata iz Galeopsis segetum i Galeopsis tetrahit.

[0029] Ekstrakt ovog pronalaska dobija se ekstrakcijom iz dela biljke, kao što je korenje, listovi, plodovi i cvetovi, poželjno nadzemni delovi biljke. Prema nekim načinima ostvarivanja, biljni ekstrakt ovog pronalaska dobija se ekstrakcijom iz dela biljke ili iz njenog tkiva korišćenjem fiziološki prihvatljivog rastvarača kao što je podloga za ekstrakciju.

[0030] Izraz "fiziološki prihvatljiv rastvarač" znači rastvarač koji ne proizvodi značajne neželjene reakcije kad se unese u ljudsko telo ili nanese na ljudski organizam. Obično, pod pojmom rastvarač podrazumeva se rastvarač korišćen za ekstrakciju biološki aktivnih komponenata iz dela biljke Galeopsis.

[0031] Pogodan rastvarač za dobijanje biljnog ekstrakta je fiziološki prihvatljiva tečnost u kojoj su rastvorljive najmanje neke od biološki aktivnih komponenata izabrane biljke, a u kojoj ne doživljavaju neku promenu koja ih lišava aktivnosti.

[0032] Poželjni morfološki delovi biljke korišćeni za izvođenje ekstrakcije je sistem izadanaka koji uključuje stabljike, listove, behar i cvetove.

[0033] Rastvarač korišćen za izvođenje ekstrakcije može biti fiziološki prihvatljiv rastvarač. Pogodni rastvarači mogu biti nepolarni rastvarači kao što je dietil etar, hloroform, polarni aprotični rastvarači kao što je etil acetat, dihloroetan i polarni protični rastvarači kao što su C1-C6alkoholi i vodeni rastvori koji ih sadrže. Upotreba polarnih protičnih rastvarača je poželjna. Uobičajeni polarni protični rastvarači uključuju vodu, etanol, propanol, izopropil alkohol i njihove mešavine. Poželjni rastvarači su voda, etil alkohol i njihova mešavina.

[0034] U određenim načinima ostvarivanja, nakon ekstrakcije polarnim protičnim rastvaračem, poželjno etanol, ekstrakt se poželjno filtrira, koncentruje i bistri. Dobijeni ekstrakt se zatim poželjno prečišćava. Prečišćavanje se poželjnije izvodi eluiranjem u koloni nekim rastvaračem. Rastvarač može da bude, na primer, voda ili etanol. Prečišćen ekstrakt se zatim poželjno koncentruje i suši. Tako dobijen suv ekstrakt može opciono da se melje i opciono se mogu dodati ekscipijensi da bi se dobio krajnji suv ekstrakt koji će se koristiti u inventivnim kompozicijama. Opcioni ekscipijensi obuhvaćeni u suvom ekstraktu poželjno su odabrani iz grupe koju čine maltodekstrin i koloidni anhidrovani silika gel.

[0035] Da bi se dobio biljni ekstrakt od Galeopsis tetrahit, tehnike čvrsto-tečne ekstrakcije mogu da se koriste za razdvajanje/ekstrakciju jedne ili više biološki aktivnih komponenata iz biljnih tkiva te biljke.

[0036] U određenim načinima ostvarivanja, ekstrakcija jedne ili više biološki aktivnih komponenata izvodi se maceracijom biljnog dela ili matrice od Galeopsis tetrahit u pogodnom rastvaraču kao što je naveden gore.

[0037] Na primer, pogodan ekstrakt može se dobiti potapanjem ili maceracijom dela nadzemnih delova od Galeopsis u mešavini vode i etanola, za vreme pogodno za obogaćivanje rastvarača jedne ili više biološki aktivnih komponenata sadržanih u delu biljke. Pod ovim uslovima, ekstrakcija biološki aktivnih komponenata iz biljnih tkiva izabrane biljke izvodi se, suštinski, difuzijom i/ili osmozom. Vreme maceracije biljnih delova u rastvaraču je promenljivo, na primer od 1 do 48 sati.

[0038] U skladu sa određenim načinima ostvarivanja, suv ekstrakt od Galeopsis može se dobiti sledećim fazama:

- mlevenje najmanje jednog dela biljke Galeopsis;

- ekstrakcija nekim rastvaračem, poželjno fiziološki prihvatljivim rastvaračem;

- filtriranje ekstrakta;

- prečišćavanje filtriranog ekstrakta, poželjno eluiranjem u koloni nekim rastvaračem;

- sušenje prečišćenog ekstrakta;

- mlevenje osušenog prečišćenog ekstrakta.

[0039] U nekim načinima ostvarivanja, faza ekstrakcije može se ponoviti dva ili tri puta.

[0040] Kada se rastvarač ukloni, na primer uparavanjem, čvrst nosač ili ekscipijens može, opciono, da se doda, kao što su, putem neograničavajućeg primera, skrobovi ili maltodekstrini, da bi se dobio ekstrakt u obliku suvog praha. Obično, ekstrakt dobijen iz Galeopsis Tetrahit ili segetum, može biti fluidni, mek ili suv, a poželjno je suv.

[0041] Na primer:

- u fluidnom ekstraktu, 1 ml ekstrakta sadrži biološki aktivne komponente rastvorljive u 1 g biljnog leka;

- u mekom ekstraktu, rastvarač se delimično uparava, posebno sve dok ekstrakt ne navlaži filter papir;

- u suvom ekstraktu, rastvarač se uparava skoro potpuno da bi se dobio prah.

[0042] Moguće je pripremiti ekstrakte od Galeopsis različite polarnosti.

[0043] Na primer, moguće je dobiti ekstrakt visoke polarnosti korišćenjem polarnog rastvarača kao što je hidroalkoholni rastvor, ekstrakt srednjeg polariteta korišćenjem manje polarnog rastvarača kao što je etilacetat ili nepolarni ekstrakt korišćenjem superkritičnog CO2pomoću kojeg je moguće ekstrahovanje frakcija aktivnih fitokompleksa.

[0044] U određenim načinima ostvarivanja, ekstrakcija se izvodi korišćenjem masenog odnosa između rastvarača i biljne matrice koji je u opsegu od 1:10 do 10:1.

[0045] Moguća je ekstrakcija biološki aktivnih biljnih komponenti iz Galeopsis biljke korišćenjem alternativnih tehnika ekstrakcije kao što je, na primer, digestijom, infuzijom, ceđenjem, decokcijom, perkolacijom, protivstrujnom ekstrakcijom, Soxhlet-ovom ekstrakcijom, ekstrakcijom superkritičnim gasovima ili ultrazvucima.

[0046] Pored biljnog ekstrakta, sinergijska kompozicija može da obuhvata R-N<1>-spermidin ili njegovu so, gde R predstavlja vodonik ili metil. Spermidin je poliamin koji se po IUPAC-u naziva N'-(3-aminopropil)butan-1,4-diamin. Spermidin može biti prisutan u kompoziciji u obliku soli, poželjno neke farmaceutski prihvatljive soli, poželjnije u obliku trihidrohlorida.

[0047] Pored biljnog ekstrakta, sinergijska kompozicija može da obuhvata biotin, B-vitamin rastvorljiv u vodi, koji se takođe naziva vitamin B7, a prethodno poznat kao vitamin H ili koenzim R.

[0048] Biotin se sastoji od ureido prstena spojenog sa tetrahidrotiofenskim prstenom, koji se po IUPAC-u naziva 5-[(3aS,4S,6aR)-2-oksoheksahidro-1H-tieno[3,4-d]imidazol-4-il]pentanska kiselina (CAS broj 58-85-5).

[0049] Pronalazači su prvi put otkrili svojstvo biotina kao promotera autofagije u humanim ćelijama, određenije ćelijama folikula dlake na ljudskom vlasištu.

[0050] Prema tome, ovo otkrivanje odnosi se na biotin ili kompoziciju koja sadrži biotin prema bilo kom od načina ostvarivanja opisanih gore, za kozmetičku ili nutricionističku ili medicinsku upotrebu kao promotera autofagije u lečenju bolesti modulisanih autofagijom.

[0051] Bolesti modulisane autofagijom su, na primer, odabrane iz grupe koju čine neurodegeneracija, kancer, Kronova bolest i kožne bolesti. Određenije među kožnim bolestima mogu se navesti autoimuni poremećaji kože kao što su psorijaza, sistemski eritemski lupus (SLE) i vitiligo, - infektivni poremećaji kože, - poremećaji kože u vezi sa kancerom kao što su karcinom skvamoznih ćelija i melanom.

[0052] Prvi put, ekstrakt roda Galeopsis, poželjno od vrsta Galeopsis segetum i Galeopsis tetrahit koristi se kao promoter autofagije u lečenju kožnih bolesti.

[0053] Poželjno i iznenađujuće, pronalazači su primetili da davanje gornjih kompozicija, obično ili topikalnim ili oralnim putem primene, unapređuje, na sinergijski način, autofagiju u ćelijama folikula dlake na ljudskom vlasištu kod subjekta koji pati od proređivanja kose, čime je utvrđeno progresivno zadebljanje na zahvaćenim područjima skalpa.

[0054] Obično, kompozicija ovog pronalaska obuhvata fiziološki i/ili farmaceutski prihvatljivi nosač, razblaživač ili ekscipijens.

[0055] Fiziološki ili farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijens može se odabrati na osnovu načina davanja kojem je namenjena farmaceutska kompozicija koja se dobija. Bilo koji nosač i/ili ekscipijens pogodan za željeni oblik pripreme za davanje razmatra se u upotrebama biljnog ekstrakta ili aktivnih sastojaka opisanih ovde.

[0056] Unutar obima ovog pronalaska, pojam "nosač" odnosi se na ekscipijens, vehikulum, razblaživač ili adjuvans, koji može da bude prisutan u kompoziciji ovog pronalaska.

[0057] Kompozicija ovog pronalaska može da se formuliše u obliku za topikalno nanošenje ili u obliku za oralno davanje.

[0058] U nekim načinima ostvarivanja, kompozicija je za topikalno nanošenje. U ovoj primeni, kompozicija ovog pronalaska može da se nanese, u efektivnoj količini, direktno na vlasište ili kožu ljudskih bića.

[0059] Na primer, u lečenju oblika gubitka ili proređivanja kose, kozmetički/fiziološki aktivna količina kompozicije može se nanositi direktno na vlasište, jedanput ili više puta dnevno pogodno za cikluse koji traju 2-3 meseca, naizmenično sa periodima odsustva tretiranja.

[0060] Prema ovim aspektima, postupak za kozmetičko tretiranje opisan je ovde i obuhvata nanošenje, na vlasište ili njegov deo, efektivne količine kompozicije prema jednom ili više opisanih načina ostvarivanja i/ili za koju se traži zaštita.

[0061] Količina suvog ekstrakta od Galeopsis, poželjno u obliku od vrsta Galeopsis segetum ili Galeopsis tetrahit, u topikalnoj formulaciji kompozicija ovog pronalaska je u opsegu od 0.0003mas.% do 0.01mas.% računato na ukupnu masu formulacije.

[0062] Količina biotina u topikalnoj formulaciji kompozicija ovog pronalaska je u opsegu od 0.0006mas.% do 0.075mas.% računato na ukupnu masu formulacije.

[0063] U topikalnom obliku, kompozicija obuhvata poželjno N<1>-metilspermidin. U topikalnom obliku, N<1>-metil spermidin ili spermidin je poželjno obuhvaćen u opsegu od 0.0005-0.1 mas.% računato na ukupnu masu formulacije.

[0064] Među uobičajenim ekscipijensima u topikalnoj formulaciji za kozmetičku upotrebu ili za farmaceutsku upotrebu mogu se navesti konzervansi, baktericidna sredstva, emulgatori, puferi, lubrikanti, sredstva za vlaženje, sredstva za kondicioniranje i sredstva za bojenje.

[0065] Kompozicija za topikalno nanošenje može biti u čvrstom, polučvrstom ili fluidnom obliku.

Pogodne formulacije u čvrstom obliku uključuju kreme, gelove, masti, paste, sredstva za mazanje.

[0066] U drugim načinima ostvarivanja, formulacija za lokalno nanošenje je u fluidnom obliku, na primer u obliku losiona, gelova, šampona, suspenzija, emulzija.

[0067] U slučaju fluidnog ili polu-fluidnog oblika formulacija, biljni ekstrakt može da se razblaži u nekom nosaču u obliku fiziološki prihvatljive tečnosti kao što je voda, alkohol, hidroalkoholni ili glicerinski rastvor ili umeša sa drugim tečnostima pogodnim za lokalnu primenu.

[0068] Primera radi, kompozicije ovog pronalaska u tečnom obliku mogu se pripremiti rastvaranjem komponenata u vodi i/ili alkoholi. Tečna kompozicija može da se puferuje da bi se postigao pH opseg povoljno odabran od 5 do 7 koji bi bio kompatibilan sa pH vlasišta, a zatim filtrira i pakuje u odgovarajuće kontejnere kao što su bočice ili fiolice.

[0069] U nekim načinima ostvarivanja, kompozicije ovog pronalaska mogu da obuhvataju ekscipijense koji se obično koriste u formulisanju kozmetičkih ili farmaceutskih preparata za lokalnu upotrebu, kao što su konzervansi, baktericidna sredstva, stabilizatori, emulgatori, puferi, sredstva za vlaženje, boje i drugi ekscipijensi koji se obično koriste u tehnikama pripremanja.

[0070] U jednom načinu ostvarivanja, formulacija za lokalnu primenu je u obliku emulzije koja sadrži ekstrakt nošen u odgovarajućem ekscipijensu. U nekim načinima ostvarivanja, kompozicija za topikalno nanošenje obuhvata ekscipijens hidroksimetilceluloznog tipa i/ili koji se želira sa HLB pogodnim za formulaciju i supstance.

[0071] Prema drugim načinima ostvarivanja, kompozicija ovog pronalaska je u obliku za oralno davanje. U ovim slučajevima, kompozicija sadrži komponente kao što su prethodno definisane i jedan ili više vehikuluma ili ekscipijenasa pogodnih za oralno davanje.

[0072] Količina ekstrakta od Galeopsis, poželjno u obliku od vrsta Galeopsis segetum ili Galeopsis tetrahit, u oralnoj formulaciji kompozicija ovog pronalaska je u opsegu od 0.1 mg do 20mg po jednoj dozi.

[0073] Količina biotina u oralnoj formulaciji kompozicija ovog pronalaska je u opsegu od 0.03 mg do 0.08 mg po jednoj dozi.

[0074] U oralnom obliku, kompozicija obuhvata poželjno spermidin ili neku njegovu so, poželjnije spermidin je u obliku soli.

[0075] U oralnom obliku, N<1>-metilspermidin (ili njegova so), ili spermidin (ili njegova so) je poželjno obuhvaćen u opsegu od 0.3 mg do 0.8 mg po jednoj dozi.

[0076] Primera radi, pogodni ekscipijensi za oralno davanje uključuju derivate celuloze kao što su hidroksimetilceluloza, hidroksipropil metilceluloza, metilceluloza, hidroksipropil celuloza, hidroksietil celuloza, karboksietil celuloza, etilhidroksietil celuloza, celulozni acetat butirat, celulozni acetat ftalat i njihove mešavine.

[0077] Dalji primeri pogodnih ekscipijenasa uključuju polimere koji pripadaju laktamskoj porodici kao što su pirolidon i njegovi derivati, na primer polivinilpirolidon, polivinilpolipirolidon i njihove mešavine, neorganske soli kao što su kalcijumfosfat ili dikalcijumfosfat, lubrikanti kao što su magnezijum stearat, triacilgliceroli, i njihove mešavine.

[0078] Kompozicije za oralno davanje mogu biti u čvrstom ili tečnom obliku. Uobičajene kompozicije u čvrstom obliku uključuju tablete, kapsule, praškove, granule, pilule. Primeri kompozicija u tečnom obliku uključuju rastvore, emulzije, suspenzije, sirupe. Kompozicije mogu takođe biti u obliku sa kontrolisanim oslobađanjem aktivnih komponenata sadržanih u njima.

[0079] Tablete uopšteno obuhvataju pogodan nosač ili ekscipijens u kojem je biljni ekstrakt dispergovan, obično u suvom obliku.

[0080] Među uobičajenim ekscipijensima ili nosačima za oralno davanje, u formulaciji kompozicije mogu biti uključena sredstva za dezintegraciju, punila, konzervansi. U određenim načinima ostvarivanja, kompozicija ovog pronalaska je nutritivni proizvod, dijetetski proizvod ili nutricionistički proizvod.

[0081] Pojam nutritivni suplement znači proizvod koji poboljšava nutritivni status i može da se koristi da podupre ili poboljša funkcionalnu aktivnost jednog ili više organa ili funkcionalnost ljudskog tela unutar fizioloških granica. Kompozicije ovog pronalaska koje su promoteri autofagije su, prema tome, nutricionistička i kozmetička sredstva koja podstiču rast kose.

[0082] U skladu sa daljim aspektom, ovaj pronalazak, prema tome, obezbeđuje kozmetičku upotrebu gorepomenutih sinergijskih kompozicija kao što su definisane u patentnom zahtevu 16. U skladu sa daljim specifičnim aspektom, ovde je opisana upotreba topikalne ili oralne formulacije koja obuhvata gorepomenute kompozicije za stimulisanje fiziološkog rasta kose.

[0083] U skladu sa još daljim aspektom, ovaj pronalazak, prema tome, obezbeđuje gorepomenute sinergijske kompozicije za upotrebu u lečenju kao što je definisano u patentnom zahtevu 17.

[0084] U skladu sa daljim specifičnim aspektom, ovaj pronalazak, prema tome, obezbeđuje kozmetičku upotrebu topikalne ili oralne formulacije koja obuhvata prethodne kompozicije za unapređenje rasta kose ili za lečenje ili prevenciju gubitka kose.

[0085] Veza između unapređenja autofagije i gorepomenutih aktivnosti kompozicija ovog pronalaska dokazana je testovima opisanim u Primeru 13 koji sledi. Posebno, naučni članak od Chiara Parodi et al.: "Autophagy is essential for maintaining the growth of a human (mini)organ: Evidence from scalp hair

1

follicle organ culture" objavljen na PLOS Biology vol.16(3), 2018, 28. Mar:

10.1371/journal.pbio.2002864 pokazuje da je test izveden na humanim epitelnim ćelijama osteosarkoma kosti ustanovljen model za dokazivanje efikasnosti kompozicije na stimulaciju rasta kose.

[0086] Eksperimenti pokazuju sinergizam u stimulaciji autofagije kod potvrđenog in vitro modela. Podaci i publikacija pokazuju da je autofagija od suštinskog značaja za rast folikule dlake. Kompozicija ovog pronalaska stimuliše autofagiju i, zbog toga, je delotvorna u stimulisanju rasta kose.

[0087] U određenim aspektima, ovaj pronalazak obezbeđuje gornju kompoziciju za upotrebu u lečenju poremećaja rasta kose kao što je u slučaju androgenetske alopecije ili defluvijuma.

[0088] U nekom daljem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje upotrebu gornjih kompozicija kao promotera autofagije kao što je definisano u patentnim zahtevima 18 i 19.

[0089] Pronalazači su takođe otkrili da je kompozicija koja obuhvata N<1>-metilspermidin i biotin pogodna kao promoter autofagije u lečenju kožnih bolesti.

[0090] Date količine i učestalost primene kompozicije zavisiće od vrste i ozbiljnosti bolesti koje se leče.

[0091] U nastavku će ovaj pronalazak biti detaljno objašnjen upućivanjem na specifične načine ostvarivanja koji prikazuju rezultate sinergije koji se postižu kompozicijama ovog pronalaska, ali ne treba ih tumačiti kao ograničavajuće. Naznačene količine komponenata izražene su kao maseni procenti (mas.%) ili u mg po jednoj dozi davanja.

EKSPERIMENTALNI DELOVI

Primer 1

Priprema ekstrakta iz Galeopsis segetum

[0092] Priprema suvog ekstrakta iz Galeopsis segetum izvedena je ekstrakcijom 40% etanolom, praćeno prečišćavanjem u koloni. Faze su opisane u stavovima koji slede.

Ekstrakcija

[0093] Samleveni isušeni nadzemni delovi G. segetum ekstrahovani su dva puta na 50°C tokom 2 sata 40% etanolom. Čvrsta materija i tečnost razdvojeni su pomoću dekantera.

[0094] Lužni rastvori su filtrirani, koncentrovani pod vakuumom i zatim izbistreni centrifugiranjem.

Prečišćavanje

[0095] Kolona je napunjena jonoizmenjivačkom XAD7HP sorbirajućom smolom koja je prethodno natopljena u 95% etanolu i održavan je kontakt tokom 10 sati. Napunjena kolona je zatim isprana vodom, nastavljajući sve dok provodljivost eluata nije dostigla istu vrednost napunjene vode.

[0096] Prečišćavanje ekstrakta izvedeno je na koloni napunjenoj sa XAD7HP eluiranjem na početku vodom, a zatim 70% etanolom.

[0097] Prikupljeni eluati su koncentrovani pod vakuumom.

[0098] Etanol je dodat koncentrovanom rastvoru i zatim je rastvor zagrejan na 70-75°C tokom 30 minuta da bi se smanjio nivo bioopterećenja.

[0099] Rastvor je ponovo koncentrovan pod vakuumom, osušen na 50°C tokom 24 sata i zatim samleven i umešan sa ekscipijensima (maltodekstrin i koloidni anhidrovani silika gel 90/10) da bi se dobio krajnji proizvod.

Primer 2

Priprema ekstrakta iz Galeopsis tetrahit

[0100] Priprema suvog ekstrakta iz Galeopsis tetrahit izvedena je prema potpuno istoj proceduri opisanoj u prethodnim stavovima za ekstrakciju iz Galeopsis segetum.

Primer 3

[0101]

Revitalizujući šampon

Primer 4

[0102]

Ojačavajući šampon

1

Primer 5

[0103]

Losion

Primer 6

[0104]

Kondicioner za jačanje

1

Primer 7

[0105]

Kondicioner za jačanje

1

1 Primer 8

[0106]

Gel za jačanje

Primer 9

[0107]

Krema

1

Primer 10

[0108]

Tablete

1

Primer 11

[0109]

Tablete

2 Primer 12

[0110]

Tablete

Primer 13

Materijali i postupci

Analiza imunoblotom.

[0111] U2OS uzgajane su do 80% konfluencije u Dulbecco-ovoj modifikovanoj Eagle-ovoj podlozi sa visokim sadržajem glukoze (4.5 g/ID-glukoze) koja sadrži 4mM L-glutamin, 10% fetalni goveđi serum (FBS) i tretirane su spermidinom (Lot.2010112716), sa Galeopsis segetum (IDN 6781), biotinom (Lot. 2014124160) ili njihovim kombinacijama. Uzorci proteina su ekstrahovani u RIPA puferu kako je ranije objavljeno (De Mei C, Ercolani L, Parodi C, Veronesi M, Vecchio CL, Bottegoni G, et al. Dual inhibition of REV-EPBβ and autophagy as a novel pharmacological approach to induce cytotoxicity in cancer cells. Oncogene.2015;34(20):2597-608). p62/SQSTM1 i GAPDH nivoi analizirani su pomoću anti-p62/SQSTM1 i anti-GADPH specifičnih antitela. Imunoblot eksperimenti izvedeni su u TBS-T puferu koji sadrži 5% goveđi serum albumin (BSA). Anti-LC3B i anti-GAPDH antitela razblažena su 1:1000 i 1:50000, tim redom. Komplementarna HPR-konjugovana sekundarna antitela su razblažena 1:10000. Nakon reakcije sa ECL Western blotting reagensom za detekciju, hemiluminescentni signali dobijeni su pomoću LAS-4000 luminescentnih analizatora slika i optička gustina određenog trakastog signala je izračunata pomoću Photoshop softvera za analizu slika. GAPDH usvojen je kao kontrola opterećenja, a GAPDH signali korišćeni su za normalizaciju nivoa p62 proteina među različitim uzorcima.

[0112] Imunoblotovi ponovljeni su najmanje 4 puta da bi se vrednost izrazila kao srednja vrednost ± SEM.

Fluorescentna analiza inhibicije autofagije.

[0113] U2OS ćelije su zasejane 3000 ćelija/bunarčić u pločama sa 48 bunarčića, br.1.5 nepremazano pokrovno staklo, prečnik stakla od 6 mm, prethodno premazanim rastvorom želatina, i transdukovanih sa 0.2µl baculovirusa/10000 ćelija koje sadrže himerni protein p62-crveni fluorescentni protein (p62-RFP).48 h nakon transdukcije, ćelije su tretirane spermidinom, biotinom, sa Galeopsis ili vehikulumom i praćene tokom 24h pomoću NIKON mikroskopa za snimanje živih ćelija.

Sinergijska aktivnost spermidina. G. segetum i biotina u izazivanju autofagije u humanim ćelijama

[0114] Da bi se ocenilo da li biotin i/ili ekstrakt iz Galeopsis segetum može da deluje na autofagiju, pronalazači su pratili akumulaciju autofagozoma u kultivisanim U2OS ćelijama fluorescentnom mikroskopijom živih ćelija (Klionsky DJ, Abdelmohsen K, Abe A, Abedin MJ, Abeliovich H, Acevedo Arozena A, et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy.

Autophagy.2016; 12(1): 1-222). Prema tome, ćelije su transdukovane konstruktom koji sadrži protein autofagije, LC3, spojen sa crvenim fluorescentnim proteinom (RFP). Zatim, akumulacija LC3 fluorescentnih tačaka nakon dodavanja biotina (200ng/ml) ili suvog ekstrakta od Galeopsis (100ng/ml) praćena je dobijanjem slika svakih 30 min tokom 6 h. Spermidin (10 µM) je usvojen kao pozitivna kontrola jedinjenja izazivača autofagije (Pietrocola F, Lachkar S, Enot D, Niso-Santano M, Bravo-San Pedro J, Sica V, et al. Spermidine induces autophagy by inhibiting the acetyltransferase EP300. Cell Death & Differentiation.2015;22(3):509-16).

[0115] Analiza je otkrila izraženu akumulaciju LC3 fluorescentnih tačaka i kod biotinom tertiranih i kod Galeopsis-tretiranih ćelija (vidi reprezentativne slike na Fig.1). Kao što se može videti na Fig.1 tretiranje spermidinom dovelo je do izražene akumulacije LC3 fluorescentnih tačaka (tj. akumulacije autofagozoma). I biotin i suv ekstrakt iz Galeopsis segetum proizveli su sličnu akumulaciju LC3-crvenih tačaka.

[0116] Zato što se LC3-RFP tačke mogu takođe akumulisati nakon blokade autofagnog fluksa, tako je praćena razgradnja SQSTM1/p62 proteina zavisna od autofagije (Klionsky DJ, Abdelmohsen K, Abe A, Abedin MJ, Abeliovich H, Acevedo Arozena A, et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy. Autophagy.2016; 12(1): 1-222). p62 služio je kao linker između LC3 i ubikvitiniranih supstrata (Pankiv S, Clausen TH, Lamark T, Brech A, Bruun J-A, Outzen H, et al. p62/SQSTM1 binds directly to Atg8/LC3 to facilitate degradation of ubiquitinated protein aggregates by autophagy. Journal of Biological Chemistry.2007;282(33):24131-45). p62 i p62-vezani poliubikvitinirani proteini postali su ugrađeni u gotov autofagozom i razgrađeni su u autolizozomima, na taj način služeći kao indeks autofagijske razgradnje (Klionsky DJ, Abdelmohsen K, Abe A, Abedin MJ, Abeliovich H, Acevedo Arozena A, et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy. Autophagy.2016; 12(1): 1-222).

[0117] Prema tome, delovanja biotina i Galeopsis na p62 razgradnju posredovanu autofagijom ocenjena su analiziranjem broja p62-RFP autofagozoma fluorescentnom mikroskopijom živih. Prema tome, ćelije su transdukovane konstruktom koji eksprimira p62 protein spojen sa RFP. Zatim su p62 fluorescentne tačke praćene nakon dodavanja biotina, Galeopsis, spermidina ili vehikuluma. U potpunosti podržavajući da su i biotin i Galeopsis delovali kao izazivači autofagije, drastično smanjenje p62-RFP tačaka primećeno je u tretiranim ćelijama u odnosu na vehikulum (vidi reprezentativne slike na Fig.2).

[0118] Kao što se vidi na Fig.2, tretiranje prethodno okarakterisanim izazivačem autofagije, spermidinom, značajno je smanjilo p62 fluorescentne tačke i fluorescentne signale, time ukazujući da i biotin i ekstrakt iz Galeopsis segetum deluju kao izazivači autofagije, pri čemu su ova tretiranja proizvela snažno smanjenje p62 fluorescentnih signala.

[0119] Nakon što je potvrđeno da aktivnost biotina i Galeopsis izaziva autofagiju, i potvrdom upotrebe p62 kao pogodnog markera u procesu autofagije, efekti kombinacija jedinjenja na nivoe p62 proteina ocenjeni su analizom imunoblotom sa specifičnim anti-p62 antitelima (De Mei C, Ercolani L, Parodi C, Veronesi M, Vecchio CL, Bottegoni G, et al. Dual inhibition of REV-EPBβ and autophagy as a novel pharmacological approach to induce cytotoxicity in cancer cells. Oncogene.2015;34(20):2597-608).

[0120] Ova analiza je ukazala na značajne sinergijske efekte između spermidina, biotina i Galeopsis u izazivanju razgradnje p62 posredovane autofagijom (Tabela 1).

Tabela 1

2

[0121] Zaista, kombinacija spermidina (0.5 µM) i biotina (19.91 ng/ml) dovela je do p62 smanjenja skoro dvostruko većeg od smanjenja očekivanog aditivnim efektima (45% vs 26%). Slični rezultati dobijeni su za kombinaciju spermidina i Galeopsis (7.9 ng/ml) (51% VS 29%) i biotin/Galeopsis mešavina (67% vs 45%). Konačno, kombinacija sva tri jedinjenja (0.5 µM spermidin 7.9 ng/ml Galeopsis 19.91 ng/ml biotina) dovela je do izuzetnog 78% smanjenja nivoa p62 proteina.

Primer 14

[0122] Ocenjeni su nivoi lipidovanih LC3 i SQSTM1 u humanim U2OS ćelijama tretiranim sa ekvimolarnim dozama N1-metilspermidina i spermidina. Kao rezultat, u poređenju sa vehikulumom oba jedinjenja povećala su nivoe lipidovanog LC3-II oblika i stimulisala su razgradnju SQSTM1 posredovanu autofagijom. Specifično kultivisane humane U2OS ćelije tretirane su 6 h vehikulumom ili ekvimolarnim dozama spermidina i N<1>-metilspermidina (100 µM). Nivoi lipidovanih LC3 (LC3-II) i SQSTM1 zatim su procenjeni analizom imunoblotingom kao u primeru 13 specifičnim antitelom. Signali aktina usvojeni su kao kontrola opterećenja. Analiza denzitometrijom signala proteina prijavljena je kao relativni nivoi proteina normalizovani pomoću AKTINA. Vrednost uzorka vehikuluma podešena je na 1. Prikazana kao srednja vrednost ± SEM,n=3. *P<0.05 i *P<0.01, jedinjenja versus vehikulum. Rezultati su dati na Fig.3 (A i B) Ovi rezultati potvrđuju da N<1>-metilspermidin zadržava aktivnost da izazove autofagiju, kao njegov dezmetilovan analog.

Claims (19)

Patentni zahtevi

1. Sinergijska kompozicija koja obuhvata ekstrakt biljke roda Galeopsis i jedinjenje koje unapređuje autofagiju odabrano od R-N<1>-spermidina ili neke njegove soli, gde R predstavlja vodonik ili metil, biotina i njihovih mešavina.

2. Sinergijska kompozicija prema zahtevu 1, kod koje je ekstrakt biljke roda Galeopsis odabran od vrsta Galeopsis segetum i Galeopsis tetrahit i njihovih mešavina.

3. Sinergijska kompozicija prema zahtevu 2, kod koje ekstrakt biljke roda Galeopsis predstavlja suv ekstrakt koji se može dobiti u postupku koji obuhvata sledeće faze:

- mlevenje najmanje jednog dela biljke roda Galeopsis;

- ekstrakcija nekim rastvaračem, poželjno nekim fiziološki prihvatljivim rastvaračem;

- filtriranje ekstrakta;

- prečišćavanje filtriranog ekstrakta, poželjno eluiranjem u koloni nekim rastvaračem;

- sušenje prečišćenog ekstrakta;

- mlevenje osušenog prečišćenog ekstrakta; i

- opciono, dodavanje ekscipijenasa.

4. Sinergijska kompozicija prema zahtevu 3, kod koje ekscipijensi obuhvataju maltodekstrin i/ili koloidni anhidrovani silika gel.

5. Sinergijska kompozicija prema bilo kom od zahteva 1-4, kod koje je spermidin prisutan u kompoziciji u obliku trihidrohlorida.

6. Topikalna formulacija koja obuhvata sinergijsku kompoziciju prema bilo kom od zahteva 1-5 i najmanje jedan ekscipijens pogodan za topikalno nanošenje.

7. Topikalna formulacija prema zahtevu 6, kod koje je količina ekstrakta biljke roda Galeopsis u opsegu od 0.0003mas.% do 0.01mas.% računato na ukupnu masu kompozicije.

8. Topikalna formulacija prema zahtevu 6 ili zahtevu 7, kod koje je količina biotina u opsegu od 0.0006mas.% do 0.075mas.% računato na ukupnu masu kompozicije.

2

9. Topikalna formulacija prema bilo kom od zahteva 6-8, pri čemu kompozicija obuhvata R-N<1>-spermidin ili neku njegovu so, gde R predstavlja metil ili vodonik, u opsegu od 0.0005-0.1mas.% računato na ukupnu masu kompozicije.

10. Topikalna formulacija prema bilo kom od zahteva 6-9, pri čemu je formulacija u obliku odabranom iz grupe koju čine šampon, gel, kondicioner, losion, balzam, emulzija, pena, šminka i krema.

11. Oralna formulacija koja obuhvata sinergijsku kompoziciju prema bilo kom od zahteva 1-5 i najmanje jedan ekscipijens pogodan za oralno davanje.

12. Oralna formulacija prema zahtevu 11, kod koje je količina suvog ekstrakta biljke roda Galeopsis u oralnoj formulaciji u opsegu od 0.1 mg do 20 mg po jednoj dozi.

13. Oralna formulacija prema zahtevu 11 ili 12, kod koje je količina biotina u oralnoj formulaciji u opsegu od 0.03 mg do 0.08 mg po jednoj dozi.

14. Oralna formulacija prema zahtevu 11 ili 12, pri čemu kompozicija obuhvata R-N<1>-spermidin ili neku njegovu so, gde R predstavlja metil ili vodonik, u opsegu od 0.3 mg do 0.8 mg po jednoj dozi.

15. Oralna formulacija prema bilo kom od zahteva 11-14, pri čemu formulacija predstavlja čvrstu formulaciju odabranu iz grupe koju čine tableta, kapsula, praškovi, granule i pilula.

16. Kozmetička upotreba sinergijske kompozicije prema bilo kom od zahteva 1-5 ili topikalne formulacije prema bilo kom od zahteva 6-10 ili oralne formulacije prema bilo kom od zahteva 11-15 u unapređenju rasta kose i/ili sprečavanju gubitka kose.

17. Sinergijska kompozicija prema bilo kom od zahteva 1-5 ili topikalna formulacija prema bilo kom od zahteva 6-10 ili oralna formulacija prema bilo kom od zahteva 11-15 za upotrebu u lečenju androgenetske alopecije ili defluvijuma.

18. Sinergijska kompozicija prema bilo kom od zahteva 1-5 za upotrebu kao promotera autofagije u lečenju bolesti modulisane autofagijom.

19. Sinergijska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 18, pri čemu su bolesti modulisane autofagijom odabrane iz grupe koju čine neurodegeneracija, kancer, Kronova bolest i kožne bolesti.