Deprecated: The each() function is deprecated. This message will be suppressed on further calls in /home/zhenxiangba/zhenxiangba.com/public_html/phproxy-improved-master/index.php on line 456
RS62811B1 - Poboljšana isporuka virusnih čestica u strijatum i moždanu koru - Google Patents
[go: Go Back, main page]

RS62811B1 - Poboljšana isporuka virusnih čestica u strijatum i moždanu koru - Google Patents

Poboljšana isporuka virusnih čestica u strijatum i moždanu koru

Info

Publication number
RS62811B1
RS62811B1 RS20220044A RSP20220044A RS62811B1 RS 62811 B1 RS62811 B1 RS 62811B1 RS 20220044 A RS20220044 A RS 20220044A RS P20220044 A RSP20220044 A RS P20220044A RS 62811 B1 RS62811 B1 RS 62811B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
nucleic acid
raav
disease
aav
striatum
Prior art date
Application number
RS20220044A
Other languages
English (en)
Inventor
Lisa M Stanek
Lamya Shihabuddin
Original Assignee
Genzyme Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genzyme Corp filed Critical Genzyme Corp
Publication of RS62811B1 publication Critical patent/RS62811B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0085—Brain, e.g. brain implants; Spinal cord
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2750/14152—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Opis
POZIVANJE NA POVEZANE PRIJAVE
[0001] Predmetna prijava zahteva prioritet za SAD provizornu prijavu br.62/114,544, koja je podnesena 10. februara 2015, i SAD provizornu prijavu br.62/220,997, koja je podnesena 19. septembra 2015.
PODNOŠENJE SPISKA SEKVENCI ASCII TEKSTUALNOJ DATOTECI
[0002] Sadržaj narednog podneska u ASCII tekstualnoj datoteci je kompjuterski čitljiv oblik (RČO) spiska sekvenci (naziv datoteke: 159792012740SEQLIST.txt, datum snimanja: 4. februar 2016, veličina: 1 KB).
OBLAST PRONALASKA
[0003] Predmetni pronalazak se odnosi na isporuku vektora AAV genske terapije u mozak, npr., strijatum i/ili moždanu koru.
SAŽETAK PRONALASKA
[0004] Vektori zasnovani na adeno-povezanim virusima (AAV) postali su poželjni vektorski sistem za neurološku gensku terapiju, sa odličnim sigurnosnim profilom utvrđenim u više kliničkih ispitivanja (Kaplitt i dr., (2007) Lancet 369:2097-2105; Eberling i dr., (2008) Neurology 70:1980-1983; Fiandaca i dr., (2009) Neuroimage 47 Suppl.2:T27-35). Efikasan tretman neuroloških poremećaja ometaju problemi povezani sa isporukom AAV vektora pogođenim ćelijskim populacijama. Ovo pitanje isporuke je posebno problematično za poremećaje koji uključuju koru velikog mozga. Jednostavne injekcije ne distribuiraju AAV vektore efikasno, oslanjajući se na difuziju, koja je efikasna samo u radijusu od 1 do 3 mm. Alternativni postupak, isporuka poboljšana konvekcijom (CED) (Nguyen i dr., (2003) J. Neurosurg. 98:584-590), se klinički koristi u genskoj terapiji (AAV2-hAADC) za Parkinsonovu bolest (Fiandaca i dr., (2008) Exp. Neurol.209:51-57). Osnovni CED princip uključuje pumpanje infuzije u moždani parenhim pod dovoljnim pritiskom da se prevaziđe hidrostatički pritisak intersticijske tečnosti, čime se infuzirane čestice prisiljavaju u bliski dodir sa gustom perivaskulaturom mozga. Pulsacija ovih sudova deluje kao pumpa, distribuirajući čestice na velike udaljenosti kroz parenhim (Hadaczek i dr., (2006) Hum. Gene Ther. 17:291-302). Kako bi se povećali sigurnost i efikasnost CED, kanila otporna na refluks (Krauze i dr., (2009) Methods Enzymol. 465:349-362) može se koristiti zajedno sa isporukom nadgledanom pomoću MRI u realnom vremenu. Nadgledana isporuka omogućava kvantifikaciju i kontrolu aberantnih događaja, kao što su refluks kanile i curenje infuzije u komore (Eberling i dr., (2008) Neurology 70:1980-1983; Fiandaca i dr., (2009) Neuroimage 47 Suppl.2:T27-35; Saito i dr., (2011) Journal of Neurosurgery Pediatrics 7:522-526).
Međutim, i dalje postoji potreba za poboljšanim procedurama za postizanje široko rasprostranjenog eksprimiranja AAV vektora u moždanoj kori i/ili strijatumu.
[0005] Predmetni pronalazak se odnosi na rekombinantnu adeno-povezanu virusnu (rAAV) česticu za upotrebu u postupku isporuke rAAV u centralni nervni sistem (CNS) sisara, gde se rAAV čestica primenjuje u strijatum sisara isporuka poboljšana konvekcijom (CED), gde rAAV čestica sadrži rAAV vektor koji kodira heterolognu nukleinsku kiselinu koja je eksprimirana barem u potiljačnom režnju i/ili sloju IV kore velikog mozga i strijatuma sisara, gde rAAV čestica sadrži AAV serotip 2 (AAV2) kapsid, i gde se rAAV čestica primenjuje na najmanje jedno mesto u kaudalnom jezgru i na dva mesta u putamenu u svakoj hemisferi strijatuma.
[0006] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na rekombinantnu adeno-povezanu virusnu (rAAV) česticu za upotrebu u postupku tretmana poremećaja CNS kod sisara, gde se efikasna količina rAAV čestice primenjuje u strijatum sisara pomoću isporuke poboljšane konvekcijom (CED), gde rAAV čestica sadrži rAAV vektor koji kodira heterolognu nukleinsku kiselinu koja je eksprimirana barem u potiljačnom režnju i/ili sloju IV kore velikog mozga i strijatuma sisara, gde rAAV čestica sadrži AAV2 kapsid, i gde se rAAV čestica primenjuje na najmanje jedno mesto u kaudalnom jezgru i na dva mesta u putamenu u svakoj hemisferi strijatuma.
[0007] U poželjnom otelotvorenju, poremećaj CNS je Hantingtonova bolest, gde opciono heterologna nukleinska kiselina kodira terapeutski polipeptid ili terapeutsku nukleinsku kiselinu koja inhibira eksprimiranje hantingtina (HTT) ili inhibira akumulaciju HTT u ćelijama CNS sisara.
[0008] U daljem poželjnom otelotvorenju, heterologna nukleinska kiselina kodira terapeutsku miRNK koja cilja na hantingtin, gde opciono hantingtin sadrži mutaciju povezanu sa Hantingtonovom bolešću.
[0009] U poželjnom otelotvorenju, poremećaj CNS je Parkinsonova bolest, gde opciono heterologna nukleinska kiselina kodira terapeutski polipeptid, gde opciono terapeutski polipeptid jeste faktor rasta poreklom iz glija (GDNF), faktor rasta poreklom iz mozga (BDNF), tirozin hidroksalaza (TH), GTP-ciklohidrolaza (GTPCH) i/ili dekarboksilaza aminokiselina (AADC).
[0010] U poželjnom otelotvorenju, sisar je čovek.
[0011] U daljem poželjnom otelotvorenju, rAAV čestica se primenjuje na putamen i kaudalno jezgro strijatuma, gde odnos rAAV čestica primenjenih na putamen prema rAAV česticama primenjenim na kaudalno jezgro iznosi najmanje oko 2:1.
[0012] U poželjnom otelotvorenju:
(a) heterologna nukleinska kiselina je eksprimirana u prefrontalnim asocijativnim kortikalnim oblastima, premotornoj kori, primarnim somatosenzornim kortikalnim oblastima, senzornoj motornoj kori, temenom režnju, potiljačnom režnju i/ili primarnoj motornoj kori;
(b) rAAV čestica prolazi kroz retrogradni ili anterogradni transport u kori velikog mozga; i/ili
(c) heterologna nukleinska kiselina je dalje eksprimirana u talamusu, subtalamičkom jezgru, globus palidusu, supstancija nigri i/ili hipokampusu.
[0013] U poželjnom otelotvorenju, rAAV vektor sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu okruženu jednom ili više sekvenci AAV invertovanog terminalnog ponavljanja (ITR), gde opciono:
(a) heterologna nukleinska kiselina je okružena sa dva AAV ITR; i/ili
(b) AAV ITR su AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, kozji AAV, goveđi AAV, ili mišji AAV serotip ITR.
[0014] U daljem poželjnom otelotvorenju:
(a) jedna ili više ITR sekvenci i kapsida rAAV čestice su iz istog AAV serotipa; ili (b) jedna ili više ITR sekvenci i kapsida rAAV virusne čestice su iz različitih AAV serotipova.
[0015] rAAV čestica za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu 1-10, gde je heterologna nukleinska kiselina operativno vezana za promoter, gde opciono:
(a) promoter eksprimira heterolognu nukleinsku kiselinu u ćeliji CNS, gde opciono promoter eksprimira heterolognu nukleinsku kiselinu u ćeliji mozga;
(b) promoter eksprimira heterolognu nukleinsku kiselinu u neuronu i/ili glijalnoj ćeliji, gde je opciono neuron srednji trnast neuron kaudalnog jezgra, srednji trnast neuron putamena, neuron sloja IV moždane kore i/ili neuron sloja V moždane kore;
(c) promoter je CBA promoter, minimalni CBA promoter, CMV promoter ili GUSB promoter; i/ili
(d) promoter je inducibilan.
[0016] U daljem poželjnom otelotvorenju, rAAV vektor sadrži jedan ili više pojačivača, donor splajsovanja/primalac splajsovanja parova, mesta vezivanja matriksa i signal poliadenilacije.
[0017] U daljem poželjnom otelotvorenju, rAAV vektor je samo-komplementaran rAAV vektor, gde opciono vektor sadrži prvu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira heterolognu nukleinsku kiselinu i drugu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira komplement heterologne nukleinske kiseline, gde prva sekvenca nukleinske kiseline može formirati intralančane bazne parove sa drugom sekvencom nukleinske kiseline duž većine ili cele njene dužine; i gde su opciono prva sekvenca nukleinske kiseline i druga sekvenca nukleinske kiseline povezane mutiranim AAV ITR, gde mutirani AAV ITR sadrži brisanje D regiona i sadrži mutaciju sekvence terminalne rezolucije.
[0018] U poželjnom otelotvorenju, heterologna nukleinska kiselina kodira:
(a) terapeutski polipeptid; ili
(b) terapeutsku nukleinsku kiselinu, gde opciono terapeutska nukleinska kiselina jesze siRNK, shRNK, RNKi, miRNK, antisens RNK, ribozim ili DNKzim.
[0019] U daljem poželjnom otelotvorenju:
(a) terapeutski polipeptid je enzim, neurotrofični faktor, polipeptid koji je deficitaran ili mutiran kod pojedinca sa poremećajem povezanim sa CNS, antioksidans, antiapoptotički faktor, anti-angiogeni faktor i anti-inflamatorni faktor, alfa-sinuklein, kisela beta-glukozidaza (GBA), beta-galaktozidaza-1 (GLB1), iduronat 2-sulfataza (IDS), galaktozilkeramidaza (GALC), manozidaza, alfa-D-manozidaza (MAN2B1), betamanozidaza (MANBA), pseudoarilsulfataza A (ARSA), N-acetilglukozamin-1-fosfotransferaza (GNPTAB), kisela sfingomijelinaza (ASM), Niman-Pik C protein (NPC1), kisela alfa-1,4-glukozidaza (GAA), heksozaminidaza beta podjedinica, HEXB, N-sulfoglukozamin sulfohidrolaza (MPS3A), N-alfa-acetilglukozaminidaza (NAGLU), heparin acetil-CoA, alfa-glukozaminidaza N-acetiltransferaza (MPS3C), N-acetilgalaktozamin-6-sulfataza (GNS), alfa-N-acetilgalaktozaminidaza (NAGA), betaglukuronidaza (GUSB), heksosaminidaza alfa podjedinica (HEXA), Hantingtin (HTT), lizozomski kisela lipaza (LIPA), aspartilglukozaminidaza, alfa-galaktozidaza A, palmitoil protein tioesteraza, tripeptidil peptidaza, lizozomski transmembranski protein, cisteinski transporter, kisela keramidaza, kisela alfa-L-fukozidaza, katepsin A, alfa-L-iduronidaza, arilsulfataza B, arilsulfataza A, N-acetilgalaktozamin-6-sulfat, kisela beta-galaktozidaza ili alfa-neuramidaza; ili
(b) terapeutski polipeptid ili terapeutska nukleinska kiselina se koristi za tretman poremećaja CNS, gde opciono:
(i) poremećaj CNS je Hantingtonova bolest, epilepsija, Parkinsonova bolest, Alchajmerova bolest, moždani udar, kortikobazalna degeneracija (CBD), kortikogazalna ganglijska degeneracija (CBGD), frontotemporalna demencija (FTD), multipla sistemska atrofija (MSA), progresivna supranuklearna paraliza (PSP) ili rak mozga; ili
(ii) poremećaj je bolest lizozomskog skladištenja izabrana iz grupe koju čine aspartilgluzoaminurija, fabri, infantilna Batenova bolest (CNL1), klasična kasna infantilna Batenova bolest (CNL2), juvenilna Batenova bolest (CNL3), Baten oblik CNL4, Baten oblik CNL5, Baten oblik CNL6, Baten oblik CNL7, Baten oblik CNL8, cistinoza, farber, fukosidoza, glaktozidozijaldoza, Gošeova bolest tipa 1, Gošeova bolest tipa 2, Gošeova bolest tipa 3, GM1 gangliozidoza, Hanterova bolest, Krabeova bolest, α manosidoza bolest, β manosidoza bolest, mukopolisaharidoza tipa VI (Maroteaux-Lamy), metahromatska leukodistrofija bolest, Morquio A, Morquio B, mukolipidoza II/III bolest, Niman-Pik A bolest, Niman-Pik B bolest, Niman-Pik C bolest, Pompeova bolest, Sandhofova bolest, Sanfilipo A bolest, Sanfilipo B bolest, Sanfilipo C bolest, Sanfilipo D bolest, Šindlerova bolest, Šindler-Kanzaki, sijalidoza, Sly bolest, Tay-Sachs bolest i Volmanova bolest.
[0020] Dalje je poželjno da je rAAV čestica u sastavu, gde je opciono sastav farmaceutski sastav koji sadrži farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.
[0021] Prema narednom poželjnom otelotvorenju:
(a) rAAV čestica je proizvedena trostrukom transfekcijom nukleinske kiseline koja kodira rAAV vektor, nukleinske kiseline koja kodira AAV rep i cap, i nukleinske kiseline koja kodira funkcije AAV pomoćnog virusa u ćeliju domaćina, gde transfekcija nukleinskih kiselina ćelije domaćina stvara ćeliju domaćina sposobnu da proizvodi rAAV čestice; ili (b) rAAV česticu je proizvela proizvodna ćelijska linija koja sadrži jednu ili više od narednog: nukleinske kiseline koje kodiraju rAAV vektor, nukleinska kiselina koja kodira AAV rep i cap, i nukleinska kiselina koja kodira funkcije AAV pomoćnog virusa.
[0022] U takođe poželjnom otelotvorenju, rAAV čestica se isporučuje korišćenjem CED sistema za isporuku.
[0023] U daljem poželjnom otelotvorenju, CED sistem sadrži:
(a) kanilu, gde opciono kanila jeste kanila otporna na refluks ili stepenasta kanila; i/ili (b) pumpu, gde je opciono pumpa:
(i) ručna pumpa;
(ii) osmotska pumpa; ili
(iii) pumpa za infuziju.
KRATAK OPIS SLIKA
[0024]
SLIKA 1 prikazuje telesne težine rezus majmuna, uzete neposredno pre operacije (crno) i u vreme obdukcije (sivo), kod životinja kojima su primenjeni AAV1 i AAV2 vektori napravljeni procesima trostruke transfekcije (TT) i proizvodne ćelijske linije (PCL).
SLIKE 2A-2D prikazuju reprezentativne delove mozga obojene na GFP 30 dana nakon infuzije AAV1-GFP (TT) u kaudat i putamen rezus majmuna. Sekcije na SLIKAMA 2A-2D prostiru se kroz mozak od rostralnog ka kaudalnom pravcu. Na svakom panelu su prikazane sekcije od tri reprezentativne životinje.
SLIKE 3A-3D prikazuju reprezentativne delove mozga koji demonstriraju kortikalno eksprimiranje GFP u čeonom režnju (SLIKE 3A i 3B) i potiljačnom režanju (SLIKE 3C & 3D) u oba astrocita (SLIKE 3A & 3C) i kortikalne neurone (SLIKE 3B & 3D) nakon infuzije AAV1-GFP (TT) u kaudat i putamen rezus majmuna.
SLIKE 4A-4D prikazuju reprezentativne delove mozga obojene na GFP 30 dana nakon infuzije AAV2-GFP (TT) u kaudat i putamen rezus majmuna. Sekcije na SLIKAMA 4A-4D prostiru se kroz mozak od rostralnog ka kaudalnom pravcu. Na svakom panelu su prikazane sekcije od tri reprezentativne životinje.
SLIKE 5A-5D prikazuju reprezentativne delove mozga obojene na GFP 30 dana nakon infuzije AAV1-GFP napravljenog procesima proizvodnih ćelijskih linija (PCL) (SLIKE 5A i 5B) ili trostruke transfekcije (TT) (SLIKE 5C & 5D) u kaudat i putamen rezus majmuna.
SLIKE 6A-6D prikazuju reprezentativne delove mozga obojene na GFP 30 dana nakon infuzije AAV2-GFP napravljenog procesima proizvodnih ćelijskih linija (PCL) (SLIKE 6A i 6B) ili trostruke transfekcije (TT) (SLIKE 6C & 6D) u kaudat i putamen rezus majmuna.
SLIKA 7 prikazuje distribuciju GFP u mozgovima primata koji nisu ljudi (NHP) infuziranih sa AAV1-eGFP i AAV2-eGFP. AAV1-eGFP i AAV2-eGFP vektori su infuzirani bilateralno u strijatum 9 rezus majmuna. Četiri nedelje nakon operacije, mozgovi su obrađeni za imunohistohemiju (IHC) protiv GFP. Kolone prikazuju reprezentativne delove mozga obojene sa GFP iz 4 studijske grupe kojima je infuziran AAV1-eGFP (trostruka transfekcija; TT); AAV1-eGFP (proizvodna ćelijska linija; PCL); AAV2-eGFP (TT); AAV2-eGFP (PCL). Reprezentativni delovi prikazuju različite koronalne ravni mozga kako bi demonstrirali distribuciju eksprimiranja GFP u celom mozgu od čeonog režnja, strijatuma (mesta infuzije), srednjeg mozga, do potiljačnih delova moždane kore. Sve grupe su pokazale robustan GFP signal na mestima injekcije (putamen i kaudalno jezgro), kao i ekstenzivni transport u kortikalne regione i supstancija nigru. Na osnovu IHC bojenja, pokrivenost eksprimiranja GFP u ciljanoj strukturi (strijatum) i kortikalnim regionima izračunata je za svakog majmuna i sažeta je u Tabeli 7.
SLIKA 8 prikazuje odnose primarnih oblasti transdukcije (POT) prema vektorskoj distribuciji (Vd). Primarne oblasti eksprimiranja GFP u strijatumu su ocrtane na snimcima sa preseka obojenih GFP i njihove vrednosti podeljene sa vrednostima dobijenim iz uparivanja MRI skeniranja sa signalom gadolinijuma. Odnosi > 1,0 ukazuju na to da obim eksprimiranja GFP premašuje granice gadolinijumskog signala nakon infuzije. Rezultati kod majmuna koji su dobili AAV vektore pokazali su da se AAV1 bolje širi u moždanom parenhimu od AAV2 (1,21 ± 0,1 naspram 0,74 ± 0,04; p < 0,007 sa 2-repim neuparenim t-testom).
SLIKE 9A-9H prikazuju eksprimiranje GFP u NHP mozgu transduciranom sa AAV1-eGFP i AAV2-eGFP. SLIKA 9A: Veliko uvećanje (40X) kaudalnog jezgra ciljane strukture transduciranog sa AAV1-eGFP (TT) pacijenta broj 1. Tamnosmeđi GFP+ neuroni obojeni sa DAB vidljivi su na gustom obojenoj mreži pozitivnih neuronskih vlakana. Takav robustan signal je detektovan kod svih majmuna kojima je injektiran AAV1-eGFP vektor proizveden i TT i PCL postupcima. SLIKA 9B:
Fragment prefrontalnog režnja pacijenta broj 1 (SLIKA 7) demonstrira masivni transport vektora AAV1-eGFP od mesta injekcije (strijatum) do kortikalnih regiona. Na osnovu morfologije GFP+ ćelija, u moždanoj kori su otkriveni i neuroni i astrociti. SLIKA 9C: Veće uvećanje (40X) okrivra datog na SLICI 9B prikazuje brojne kortikalne neurone koji eksprimiraju GFP. SLIKA 9D: Visoko (40X) uvećanje moždane kore pacijenta broj 1 pokazuje GFP+ ćelije astrocitne morfologije. SLIKA 9E: Veliko uvećanje (40X) ciljane strukture putamena transduciranog sa AAV2-eGFP (TT) pacijenta broj 6. Tamnosmeđi DAB signal pokazuje eksprimiranje GFP u neuronima i njihovoj gusto obojenoj mreži vlakana. SLIKA 9F: Fragment prefrontalnog režnja pacijenta broj 6 (SLIKA 7) demonstrira masivni transport vektora AAV2-eGFP od strijatuma (mesta injekcije) do kortikalnih regiona. Velika većina GFP-pozitivnih ćelija imala je neuronsku morfologiju (uvećanje 2,5X).
SLIKA 9G: Veće uvećanje (40X) okvira datog na SLICI 9F prikazuje brojne kortikalne neurone koji eksprimiraju GFP. SLIKA 9H: Veće uvećanje (20X) unutrašnje kapsule pacijenta broj 6 koje prikazuje GFP+ ćelije sa astrocitnom morfologijom.
SLIKE 10A-10E prikazuju ćelijski tropizam AAV1-eGFP i AAV2-eGFP injektiranih u mozak majmuna. Sekcije mozga majmuna su obrađene za dvostruko imunofluorescentno bojenje protiv GFP i različitih ćelijskih markera kako bi se odredio ćelijski tropizam injektiranih vektora. SLIKA 10A: Sekcija kaudalnog jezgra (ciljana struktura) pacijenta broj 1 obojena antitelima protiv GFP (zeleni kanal za DyLight™ 488 boju; leva kolona) i neuronski marker NeuN (crveni kanal za DyLight™ 549 boju; srednja kolona). Spojene slike (uvećanje 20X; desna kolona) iz oba kanala prikazuju brojne neurone koji eksprimiraju GFP, potvrđujući neuronski tropizam AAV1-eGFP. SLIKA 10B: Isto bojenje je izvedeno za deo iz prefrontalnog režnja pacijenta broj 1 koji pokazuje neuronsku transdukciju u distalnoj moždanoj strukturi koja prima neuronske projekcije iz strijatuma i predstavlja dokaz retrogradnog transporta AAV1-eGFP. SLIKA 10C: Sekcija kaudalnog jezgra (ciljana struktura) pacijenta broj 1 obojena antitelima protiv GFP (zeleni kanal za DyLight™ 488 boju; leva kolona) i astrocitni marker S-100 (crveni kanal za DyLight™ 549 boju; srednja kolona). Spojene slike (uvećanje 20X; desna kolona) sa oba kanala pokazuju brojne astrocite koji eksprimiraju GFP, potvrđujući da AAV1-eGFP takođe transducira astrocite. SLIKA 10D: Sekcija kaudalnog jezgra (ciljana struktura) pacijenta broj 6 obojena antitelima protiv GFP (zeleni kanal za DyLight™ 488 boju; leva kolona) i neuronski marker NeuN (crveni kanal za DyLight™ 549 boju; srednja kolona). Spojene slike (uvećanje 20X; desna kolona) iz oba kanala pokazuju brojne neurone koji eksprimiraju GFP, potvrđujući neuronski tropizam AAV2-eGFP.
SLIKA 10E: Sekcija kaudalnog jezgra (ciljana struktura) pacijenta broj 3 obojena antitelima protiv GFP (zeleni kanal za DyLight™ 488 boju; leva kolona) i mikroglija markera Iba-1 (crveni kanal za DyLight™ 549 boju; srednja kolona). Nedostatak zajedničkog bojenja oba markera na spojenoj slici (uvećanje 20X; desna kolona) ukazuje da AAV1 ne transducira mikrogliju, a to je takođe bio slučaj za AAV2 (podaci nisu prikazani).
SLIKE 11A-11C prikazuju efikasnost neuronske transdukcije u strijatumu NHP injektiranom sa AAV 1-eGFP i AAV2-eGFP. Dvostruko imunofluorescentno bojenje protiv GFP i neuronski marker NeuN sekcija mozga majmuna su izvršeni kako bi se izračunala efikasnost neuronske transdukcije unutar strijatuma (ciljane strukture) i kortikalnih regiona. Za strijatum, efikasnost transdukcije je izračunata u primarnoj oblasti GFP transdukcije (POT) gde je signal bio robustan sa gusto raspoređenim GFP+ neuronima (SLIKA 11A). Neuroni su takođe otkriveni u regionima izvan primarnih oblasti GFP transdukcije (IPOT; SLIKA 11C). Šema za tehniku brojanja GFP+ neurona u POT (unutrašnje senčenje) i IPOT (spoljno senčenje) prikazana je na SLICI 11B. Podaci iz pojedinačnih brojanja za svakog majmuna i strukture mozga prikazani su u Tabeli 8 (POT) i Tabeli 9 (IPOT).
1
SLIKE 12A i 12B prikazuju histološke nalaze vezane za vektore. Nezavisna procena bojenja hematoksilinom i eozinom (H&E) koronalnih preseka iz oblasti primarne transdukcije (POT) otkrila je normalnu gliozu povezanu sa insercijom kanile u svim eksperimentalnim grupama. H&E bojenje je takođe otkrilo perivaskularne ćelijske infiltrate kod svih životinja bez obzira na korišćeni vektor. Incidencija i ozbiljnost perivaskularnih zagušenja je povećana u grupama kojima je injektiran AAV1, posebno kada je vektor pripremljen TT postupkom. SLIKA 12A: H&E obojen presek pacijenta broj 3 pokazuje brojna perivaskularna zagušenja u levom putamenu transduciranom sa AAV1-eGFP (TT). Jedan krvni sud je uvećan (5X) u desnom donjem uglu. SLIKA 12B: H&E obojen presek pacijenta broj 5 prikazuje samo nekoliko lokalizovanih perivaskularnih zagušenja u levom kaudalnom jezgru transduciranom sa AAV1-eGFP (PCL). Nekoliko krvnih sudova je uvećano (5X) u levom donjem uglu.
SLIKE 13A i 13B prikazuju kvantitativnu PCT (QPCR) analizu eksprimiranja mRNK eGFP u uzorcima jetre, slezine, srca, bubrega i pluća 1 mesec nakon injekcije AAV1-eGFP u kaudat i putamen rezus majmuna. (SLIKA 13A) AAV1 i AAV2-eGFP vektori su napravljeni postupkom trostruke transfekcije (TT). (SLIKA 13B) AAV1 i AAV2-eGFP vektori su napravljeni postupkom proizvodne ćelijske linije (PCL).
DETALJAN OPIS
[0025] Kao što je ovde detaljno objašnjeno, pronalazači su otkrili da AAV vektori (npr., AAV1 i AAV2 vektori) efikasno ciljaju i strijatalne i kortikalne strukture u mozgu rezus majmuna kada se isporuče u strijatum (npr., isporukom poboljšanom konvekcijom, CED). Ove studije su takođe procenile dve različite proizvodne platforme, i ove studije pokazuju da AAV generisan trostrukom transfekcijom i proizvodnim ćelijskim linijama cilja i na strijatalne i kortikalne strukture u mozgu rezus majmuna. Intrastrijatalna isporuka rAAV čestica (npr., AAV1 i AAV2 vektori) proizvedenih na obe platforme bila je u stanju da transducira neurone koji se nalaze na znatnoj udaljenosti od mesta infuzije (npr., kortikalne strukture), kao i neurone u strijatumu. Shodno tome, predmetni pronalazak pruža rekombinantnu adeno-povezanu virusnu (rAAV) česticu za upotrebu u postupku isporuke rAAV u centralni nervni sistem (CNS) sisara, gde se rAAV čestica primenjuje u strijatum sisara pomoću isporuke poboljšane konvekcijom (CED), gde rAAV čestica sadrži rAAV vektor koji kodira heterolognu nukleinsku kiselinu koja je eksprimirana barem u potiljačnom režnju i/ili sloju IV kore velikog mozga i strijatuma sisara, gde rAAV čestica sadrži AAV serotip 2 (AAV2) kapsid, i gde se rAAV čestica primenjuje na najmanje jedno mesto u kaudalnom jezgru i na dva mesta u putamenu u svakoj hemisferi strijatuma.
[0026] Pronalazak takođe pruža rekombinantnu adeno-povezanu virusnu (rAAV) česticu za upotrebu u postupku tretmana poremećaja CNS kod sisara, gde se efikasna količina rAAV čestica primenjuje u strijatum sisara pomoću isporuke poboljšane konvekcijom (CED), gde rAAV čestica sadrži rAAV vektor koji kodira heterolognu nukleinsku kiselinu koja je eksprimirana barem u potiljačnom režnju i/ili sloju IV kore velikog mozga i strijatumu sisara, gde rAAV čestica sadrži AAV2 kapsid, i gde se rAAV čestica primenjuje na najmanje jedno mesto u kaudalnom jezgru i na dva mesta u putamenu u svakoj hemisferi strijatuma.
I. Opšte tehnike
[0027] Tehnike i procedure koje su ovde opisane ili navedene su generalno dobro shvaćene i uobičajeno korišćene upotrebom konvencionalne metodologije od strane stručnjaka, kao što su, na primer, široko korišćene metodologije opisane u Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook i dr., 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, i dr. eds., 2003); serijal Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); PCR 2: A Practical Approach (M.J.
MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds., 1995); Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow i Lane, eds., 1988); Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (R.I. Freshney, 6th ed., J. Wiley and Sons, 2010); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, ljudska Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., Academic Press, 1998); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather i P.E. Roberts, Plenum Press, 1998); Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, i D.G. Newell, eds., J. Wiley and Sons, 1993-8); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1996); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller i M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis i dr., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan i dr., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel i dr., eds., J. Wiley and Sons, 2002); Immunobiology (C.A. Janeway i dr., 2004); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd i C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow i D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti i J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); i Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita i dr., eds., J.B. Lippincott Company, 2011).
II. Definicije
[0028] „Vektor“, kako se ovde koristi, odnosi se na rekombinantni plazmid ili virus koji sadrži nukleinsku kiselinu koja se isporučuje u ćeliju domaćina, bilo in vitro ili in vivo.
[0029] Izraz „polinukleotid“ ili „nukleinska kiselina“ kako se ovde koristi odnosi se na polimerni oblik nukleotida bilo koje dužine, bilo ribonukleotida ili dezoksiribonukleotida. Dakle, ovaj izraz uključuje, ali nije ograničen na, jedno-, dvo- ili višelančanu DNK ili RNK, genomsku DNK, cDNK, DNK-RNK hibride, ili polimer koji sadrži purinske i pirimidinske baze, ili druge prirodne, hemijski ili biohemijski modifikovane, neprirodne ili derivatizovane nukleotidne baze. Okosnica polinukleotida može da sadrži šećere i fosfatne grupe (kao što se obično može naći u RNK ili DNK), ili modifikovane ili supstituisane šećerne ili fosfatne grupe. Alternativno, okosnica polinukleotida može da sadrži polimer sintetičkih podjedinica kao što su fosforamidati i stoga može biti oligodezoksinukleozid fosforamidat (P-NH2) ili mešani fosforamidat-fosfodiestar oligomer. Pored toga, dvolančani polinukleotid se može dobiti iz jednolančanog polinukleotidnog proizvoda hemijske sinteze bilo sintezom komplementarnog lanca i kalemljenjem lanaca pod odgovarajućim uslovima, ili sintezom komplementarnog lanca de novo koristeći DNK polimerazu sa odgovarajućim prajmerom.
[0030] Izrazi „polipeptid“ i „protein“ se naizmenično koriste za označavanje polimera aminokiselinskih ostataka i nisu ograničeni na minimalnu dužinu. Takvi polimeri aminokiselinskih ostataka mogu da sadrže prirodne ili ne-prirodne aminokiselinske ostatke, i uključuju, ali nisu ograničeni na, peptide, oligopeptide, dimere, trimere i multimere aminokiselinskih ostataka. Definicijom su obuhvaćeni i proteini pune dužine i njihovi fragmenti. Izrazi takođe uključuju post-ekspresione modifikacije polipeptida, na primer, glikozilaciju, sijalilaciju, acetilaciju, fosforilaciju i slično. Štaviše, za potrebe ovog pronalaska, „polipeptid“ se odnosi na protein koji uključuje modifikacije, kao što su brisanja, dodavanja i supstitucije (generalno konzervativne prirode), na nativnoj sekvenci, sve dok protein održava željenu aktivnost. Ove modifikacije mogu biti namerne, kao kroz mutagenezu usmerenu na mesto, ili mogu biti slučajne, kao što su mutacije domaćina koji proizvode proteine ili greške usled PCR amplifikacije.
1
[0031] „Rekombinantni virusni vektor“ se odnosi na rekombinantni polinukleotidni vektor koji sadrži jednu ili više heterolognih sekvenci (tj. Sekvenca nukleinske kiseline koja nije virusnog porekla). U slučaju rekombinantnih AAV vektora, rekombinantna nukleinska kiselina je okružena sa najmanje jednom invertovanom sekvencom terminalnog ponavljanja (ITR). U nekim otelotvorenjima, rekombinantna nukleinska kiselina je okružena sa dve ITR.
[0032] „Rekombinantni AAV vektor (rAAV vektor)“ se odnosi na polinukleotidni vektor koji sadrži jednu ili više heterolognih sekvenci (tj. sekvence nukleinske kiseline koje nisu AAV porekla) koje su okružene sa najmanje jednom ili dve AAV invertovane sekvence terminalnog ponavljanja (ITR). Takvi rAAV vektori se mogu replikovati i upakovati u infektivne virusne čestice kada su prisutni u ćeliji domaćinu koja je inficirana odgovarajućim pomoćnim virusom (ili koja eksprimira odgovarajuće pomoćne funkcije) i koja eksprimira AAV rep i cap genske proizvode (tj. AAV Rep i Cap proteini). Kada je rAAV vektor ugrađen u veći polinukleotid (npr., u hromozomu ili u drugom vektoru kao što je plazmid koji se koristi za kloniranje ili transfekciju), tada se rAAV vektor može nazvati „pro-vektorom“ koji se može „spasiti“ replikacijom i inkapsidacijom u prisustvu AAV funkcija pakovanja i odgovarajuće pomoćne funkcije. rAAV vektor može biti u bilo kom od brojnih oblika, uključujući, ali ne ograničavajući se na, plazmide, linearne veštačke hromozome, kompleksirane sa lipidima, inkapsulirane unutar lipozoma i inkapsulirane u virusnu česticu; na primer, AAV česticu. rAAV vektor može biti upakovan u kapsid AAV virusa kako bi se stvorila „rekombinantna adeno-povezana virusna čestica (rAAV čestica)“.
[0033] „Heterologno“ znači izveden iz genotipski različitog entiteta od onog ostatka entiteta sa kojim se poredi ili u koji je uveden ili ugrađen. Na primer, polinukleotid uveden tehnikama genetskog inženjeringa u drugi tip ćelije je heterologni polinukleotid (i, kada se eksprimira, može da kodira heterologni polipeptid). Slično, ćelijska sekvenca (npr., gen ili njegov deo) koja je ugrađena u virusni vektor je heterologna nukleotidna sekvenca u odnosu na vektor. Heterologna nukleinska kiselina može se odnositi na nukleinsku kiselinu izvedenu iz genotipski različitog entiteta od onog ostatka entiteta sa kojim se poredi ili u koji je uvedena ili ugrađena.
[0034] Izraz „heterologna nukleinska kiselina“ se odnosi na polinukleotid koji je uveden u ćeliju i koji je sposoban da se transkribuje u RNK i opciono, translatira i/ili eksprimira pod odgovarajućim uslovima. U nekim aspektima, on daje željeno svojstvo ćeliji u koju je uveden, ili na drugi način dovodi do željenog terapeutskog ili dijagnostičkog ishoda. U drugom aspektu, može se transkribovati u molekul koji posreduje u interferenciji RNK, kao što su miRNK, siRNK ili shRNK.
[0035] „Promoter kokošijeg β-aktina (CBA)“ odnosi se na polinukleotidnu sekvencu izvedenu iz kokošijeg β-aktin gena (npr. Gallus gallus beta aktin, koji predstavlja GenBank Entrez Gene ID 396526). Kako se ovde koristi, „promoter kokošijeg β-aktina“ se može odnositi na promoter koji sadrži element ranog pojačivača citomegalovirusa (CMV), promoter i prvi egzon i intron gena za kokošiji β-aktin, i akceptor za splajsovanje zečjeg betaglobin gena, kao što su sekvence opisane u Miyazaki, J. i dr. (1989) Gene 79(2):269-77. Kako se ovde koristi, izraz „CAG promoter“ može se koristiti naizmenično. Kako se ovde koristi, izraz „rani pojačivač CMV/promoter kokošijeg beta aktina (CAG)“ mogu se koristiti naizmenično.
[0036] Izrazi „čestice genoma (gp),“ „ekvivalenti genoma“ ili „kopije genoma“ kako se koriste u odnosu na virusni titar, odnose se na broj viriona koji sadrže rekombinantni AAV DNK genom, bez obzira na infektivnost ili funkcionalnost. Broj genomskih čestica u određenom vektorskom preparatu može se meriti postupcima kao što su opisani u Primerima ovde, ili na primer, kod Clark i dr. (1999) Hum. Gene Ther., 10:1031-1039; Veldwijk i dr. (2002) Mol. Ther., 6:272-278.
[0037] Izraz „genom vektora (vg)“ kako se ovde koristi može se odnositi na jedan ili više polinukleotida koji sadrže skup polinukleotidnih sekvenci vektora, npr., virusni vektor.
Genom vektora može biti inkapsuliran u virusnoj čestici. U zavisnosti od određenog virusnog vektora, genom vektora može da sadrži jednolančanu DNK, dvolančanu DNK ili jednolančanu RNK ili dvolančanu RNK. Genom vektora može uključivati endogene sekvence povezane sa određenim virusnim vektorom i/ili bilo koje heterologne sekvence umetnute u određeni virusni vektor pomoću rekombinantnih tehnika. Na primer, genom rekombinantnog AAV vektora može uključivati najmanje jednu ITR sekvencu koja prati promoter, sekvencu od interesa (npr., heterologna nukleinska kiselina) i sekvencu poliadenilacije. Kompletan vektorski genom može uključivati kompletan skup polinukleotidnih sekvenci vektora. U nekim otelotvorenjima, titar nukleinske kiseline virusnog vektora može se meriti u smislu vg/mL. Postupci pogodni za merenje ovog titra su
1
poznate u struci (npr., kvantitativni PCR).
[0038] Izrazi „jedinica infekcije (iu),“ „infektivna čestica“ ili „jedinica replikacije“, kako se koriste u vezi sa virusnim titrom, odnose se na broj infektivnih i replikaciono kompetentnih rekombinantnih AAV vektorskih čestica izmerenih od strane infektivnog centra test, takođe poznat kao test centra replikacije, kao što je opisano, na primer, kod McLaughlin i dr. (1988) J. Virol., 62:1963-1973.
[0039] Izraz „transdukciona jedinica (tu)“ kako se koristi u vezi sa virusnim titrom, odnosi se na broj infektivnih rekombinantnih AAV vektorskih čestica koje rezultuju proizvodnjom funkcionalnog heterolognog proizvoda nukleinske kiseline mereno u funkcionalnim testovima kao što je opisano u Primerima ovde, ili na primer, kod Xiao i dr. (1997) Exp. Neurobiol., 144:113-124; ili kod Fisher i dr. (1996) J. Virol., 70:520-532 (LFU assay).
[0040] „Sekvenca invertovanog terminalnog ponavljanja“ ili „ITR sekvenca“ je izraz koji se dobro razume u struci i odnosi se na relativno kratke sekvence pronađene na krajevima virusnih genoma koji su u suprotnoj orijentaciji.
[0041] Sekvenca „AAV invertovanog terminalnog ponavljanja (ITR)“, izraz koji se dobro razume u struci, je sekvenca od približno 145 nukleotida koja je prisutna na oba kraja prirodnog jednolančanog AAV genoma. Najudaljenijih 125 nukleotida ITR može biti prisutno u bilo kojoj od dve alternativne orijentacije, što dovodi do heterogenosti između različitih AAV genoma i između dva kraja jednog AAV genoma. Najudaljenijih 125 nukleotida takođe sadrži nekoliko kraćih regiona samokomplementarnosti (označenih kao A, A', B, B', C, C' i D regioni), omogućavajući intralančano uparivanje baza unutar ovog dela ITR.
[0042] „Sekvenca terminalne rezolucije“ ili „trs“ je sekvenca u D regionu od AAV ITR koju razdvajaju AAV rep proteini tokom replikacije virusne DNK. Mutantna terminalna rezoluciona sekvenca je otporna na cepanje AAV rep proteinima.
[0043] „AAV pomoćne funkcije“ se odnose na funkcije koje omogućavaju da se AAV replikuje i pakuje od strane ćelije domaćina. AAV pomoćne funkcije mogu biti date u bilo kom od brojnih oblika, uključujući, ali ne ograničavajući se na, pomoćne viruse ili pomoćne
1
virusne gene koji pomažu u replikaciji i pakovanju AAV. Druge AAV pomoćne funkcije su poznate u struci kao što su genotoksični agensi.
[0044] „Pomoćni virus“ za AAV se odnosi na virus koji omogućava da AAV (koji je defektni parvovirus) bude replikovan i upakovan od strane ćelije domaćina. Pomoćni virus pruža „pomoćne funkcije“ koje omogućavaju replikaciju AAV. Identifikovan je veliki broj takvih pomoćnih virusa, uključujući adenoviruse, herpesviruse i poksviruse kao što su vakcinija i bakulovirus. Adenovirusi obuhvataju više različitih podgrupa, iako se najčešće koristi Adenovirus tip 5 podgrupe C (Ad5). Poznati su brojni adenovirusi ljudskog porekla, porekla od sisara koji nisu ljudi i ptica, i dostupni su u depozitorijumima kao što je ATCC. Virusi iz porodice herpesa, koji su takođe dostupni u depozitorijumima kao što je ATCC, uključuju, na primer, viruse herpes simpleksa (HSV), Epštajn-Bar viruse (EBV), citomegaloviruse (CMV) i viruse pseudorabije (PRV). Primeri adenovirusnih pomoćnih funkcija za replikaciju AAV uključuju E1A funkcije, E1B funkcije, E2A funkcije, VA funkcije i E4orf6 funkcije.
Bakulovirusi dostupni iz depozitorijuma uključuju Autographa californica virus nuklearne poliedroze.
[0045] Za preparat rAAV se kaže da je „u suštini bez” pomoćnog virusa ako je odnos infektivnih AAV čestica prema česticama infektivnog pomoćnog virusa najmanje oko 10<2>:1; najmanje oko 10<4>:1, najmanje oko 10<6>:1; ili najmanje oko 10<8>:1 ili više. U nekim otelotvorenjima, preparati takođe ne sadrže ekvivalentne količine proteina pomoćnog virusa (tj. proteini koji bi bili prisutni kao rezultat takvog nivoa pomoćnog virusa da su nečistoće čestica pomoćnog virusa koje su gore navedene bile prisutne u poremećenom obliku).
Virusna i/ili ćelijska kontaminacija proteinima se generalno može posmatrati kao prisustvo Coomassie traka za bojenje na SDS gelovima (npr., pojava traka koje nisu one koje odgovaraju AAV kapsidnim proteinima VP1, VP2 i VP3).
[0046] „AAV pomoćne funkcije“ se odnose na funkcije koje omogućavaju da se AAV replikuje i pakuje od strane ćelije domaćina. AAV pomoćne funkcije mogu biti pružene u bilo kom od brojnih oblika, uključujući, ali ne ograničavajući se na, pomoćne viruse ili pomoćne virusne gene koji pomažu u replikaciji i pakovanju AAV. Druge AAV pomoćne funkcije su poznate u struci kao što su genotoksični agensi. „Pomoćni virus“ za AAV se odnosi na virus koji omogućava da AAV (koji je defektni parvovirus) bude replikovan i upakovan od strane ćelije domaćina. Identifikovan je veliki broj takvih pomoćnih virusa,
1
uključujući adenoviruse, herpesviruse i poksviruse kao što je vakcinija. Adenovirusi obuhvataju više različitih podgrupa, iako se najčešće koristi Adenovirus tip 5 podgrupe C (Ad5). Poznati su brojni adenovirusi ljudskog porekla, porekla od sisara koji nisu ljudi i ptica i dostupni su u depozitorijumim kao što je ATCC. Virusi iz porodice herpesa, koji su takođe dostupni u depozitorijumim kao što je ATCC, uključuju, na primer, viruse herpes simpleksa (HSV), Epštajn-Bar viruse (EBV), citomegaloviruse (CMV) i viruse pseudorabije (PRV).
[0047] „Procenat (%) identičnosti sekvence“ u odnosu na referentni polipeptid ili sekvencu nukleinske kiseline je definisan kao procenat aminokiselinskih ostataka ili nukleotida u sekvenci kandidata koji su identični sa aminokiselinskim ostacima ili nukleotidima u referentnom polipeptidu ili nukleinskoj kiselini sekvence, nakon poravnanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, kako bi se postigao maksimalni procenat identičnosti sekvence, ne uzimajući u obzir bilo kakve konzervativne supstitucije kao deo identičnosti sekvence. Usklađivanje u svrhu određivanja procenta identičnosti sekvence aminokiselina ili nukleinske kiseline može se postići na različite načine koji su u okviru stručne spreme, na primer, korišćenjem javno dostupnih kompjuterskih softverskih programa, na primer, onih opisanih u Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel i dr., eds., 1987), Supp.30, odeljak 7.7.18, tabela 7.7.1, uključujući softver BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR). Primer programa za usklađivanje je ALIGN Plus (Scientific and Educational Software, Pensilvanija). Stručnjaci mogu da odrede odgovarajuće parametre za merenje poravnanja, uključujući sve algoritme potrebne za postizanje maksimalnog poravnanja preko cele dužine sekvenci koje se porede. Za potrebe ovde, % identičnosti aminokiselinske sekvence date aminokiselinske sekvence A sa, prema ili u odnosu na datu aminokiselinsku sekvencu B (što se alternativno može navesti kao data aminokiselinska sekvenca A koja ima ili sadrži određeni procenat identičnosti aminokiselinske sekvence sa, prema ili u odnosu na datu aminokiselinsku sekvencu B) izračunava se na naredni način: 100 puta udeo X/Y, gde X predstavlja broj aminokiselinskih ostataka sa identičnim rezultatima postignutim programom poravnanja sekvenci pri poravnanju A i B u tom programu, i gde je Y ukupan broj aminokiselinskih ostataka u B. Razumeće se da kada dužina aminokiselinske sekvence A nije jednaka dužini aminokiselinske sekvence B, % identičnosti aminokiselinske sekvence od A do B neće biti jednak % identičnosti sekvence aminokiselina od B do A. Za potrebe ovde, % identičnosti sekvence nukleinske kiseline date sekvence nukleinske kiseline C prema, sa ili u odnosu na datu sekvencu nukleinsku kiselinu D (što se alternativno može izraziti kao data sekvenca nukleinske kiseline C koja ima ili sadrži određeni % identičnosti sekvence
1
nukleinske kiseline sa, prema ili u odnosu na datu sekvencu nukleinske kiseline D) izračunava se na naredni način: 100 puta udeo W/Z, gde W predstavlja broj nukleotida ocenjen kao identična poklapanja programom za poravnanje sekvence pri poravnanju C i D u tom programu, a Z ukupan broj nukleotida u D. Razumeće se da kad dužina sekvence nukleinske kiseline C nije jednaka dužini sekvenca nukleinske kiseline D, % identičnosti sekvence nukleinske kiseline od C do D neće biti jednak % identičnosti sekvence nukleinske kiseline od D do C.
[0048] „Izolovani“ molekul (npr., nukleinska kiselina ili protein) ili ćelija znači da je identifikovana i odvojena i/ili vraćena iz komponente svog prirodnog okruženja.
[0049] „Efektivna količina“ je količina dovoljna za postizanje korisnih ili željenih rezultata, uključujući kliničke rezultate (npr., ublažavanje simptoma, postizanje kliničkih krajnjih tačaka i slično). Efikasna količina se može primeniti u jednoj ili više primena. U pogledu stanja bolesti, efektivna količina je količina dovoljna da poboljša, stabilizuje ili odloži razvoj bolesti.
[0050] Kako se ovde koristi, izraz „isporuka poboljšana konvekcijom (CED)“ može se odnositi na isporuku terapeutskog agensa u CNS infuzijom brzinom kojom hidrostatički pritisak dovodi do konvektivne distribucije. U nekim otelotvorenjima, infuzija se vrši brzinom većom od 0,5 µL/min. Međutim, može se koristiti bilo koja pogodna brzina protoka tako da se intrakranijalni pritisak održava na odgovarajućim nivoima kako se ne bi povredilo moždano tkivo. CED se može postići, na primer, korišćenjem odgovarajućeg katetera ili kanile (npr., kanila bez refluksa sa postepenim dizajnom) pozicioniranjem vrha kanile najmanje u neposrednoj blizini ciljanog tkiva CNS (na primer, vrh se ubacuje u tkivo CNS). Nakon što je kanila postavljena, ona je povezana sa pumpom koja isporučuje terapeutski agens kroz vrh kanile do ciljanog tkiva CNS. Gradijent pritiska sa vrha kanile može se održavati tokom infuzije. U nekim otelotvorenjima, infuzija se može pratiti pomoću agensa za praćenje koji se može detektovati postupkom snimanja kao što je intraoperativna MRI (iMRI) ili druga tehnika MRI u realnom vremenu i/ili se isporučiti standardnom opremom i tehnikama za stereotaksične injekcije (npr., ClearPoint® sistem od MRI Interventions, Memfis, TN).
[0051] Kako se ovde koristi, izraz „poloksamer“ se može odnositi na blok kopolimer
1
napravljen od lanca polioksipropilena koji je okružen sa dva lanca polioksietilena. Robne marke pod kojima se poloksameri prodaju uključuju, bez ograničenja, PLURONIC® (BASF), KOLLIPHOR® (BASF), LUTROL® (BASF), i SYNPERONIC® (Croda International).
[0052] „Pojedinac“ ili „pacijent“ je sisar. Sisari uključuju, ali nisu ograničeni na, pripitomljene životinje (npr., krave, ovce, mačke, psi i konji), primate (npr., ljudi i primati koji nisu ljudi, kao što su majmuni), zečevi i glodari (npr., miševi i pacovi). U određenim otelotvorenjima, pojedinac ili pacijent je čovek.
[0053] Kako se ovde koristi, „tretman“ je pristup za dobijanje korisnih ili željenih kliničkih rezultata. Za potrebe ovog pronalaska, korisni ili željeni klinički rezultati uključuju, ali nisu ograničeni na, ublažavanje simptoma, smanjenje obima bolesti, stabilizovanje (npr., nepogoršavanje) stanja bolesti, sprečavanje širenja (npr., metastaza) bolesti, odlaganje ili usporavanje progresije bolesti, poboljšanje ili ublažavanje bolesnog stanja i remisija (bilo delimična ili potpuna), bilo da se može detektovati ili se ne može detektovati.
„Tretman“ takođe može značiti produženje preživljavanja u poređenju sa očekivanim preživljavanjem bez tretmana.
[0054] Kako se ovde koristi, izraz „profilaktički tretman“ se odnosi na tretman, kada je poznato ili se sumnja da je pojedinac pod rizikom da razvije poremećaj, ali nije pokazao simptome ili minimalne simptome poremećaja. Pojedinac koji je podvrgnut profilaktičkom tretmanu može se tretirati pre pojave simptoma.
[0055] „Hantingtonova bolest (HB)“ se odnosi na progresivni poremećaj mozga koji je tipično uzrokovan mutacijama u HTT genu (takođe poznat kao hantingtin, HB ili IT15). Može se karakterisati simptomima koji uključuju abnormalne pokrete (nazvane horeja), postepeni gubitak motoričke funkcije, emocionalne ili psihijatrijske bolesti i progresivno oštećenje kognicije. Iako se većina simptoma javlja u 30-im i 40-im godinama, primećeni su i juvenilni oblici bolesti. Za dalji opis HB, pogledati OMIM unos br.143100.
[0056] „Hantingtin (HTT)“ može da se odnosi ili na gen ili na njegov polipeptidni proizvod povezan sa većinom slučajeva Hantingtonove bolesti. Normalna funkcija Hantingtina nije u potpunosti shvaćena. Međutim, poznato je da mutacije u hantingtin genu izazivaju HB. Ove
2
mutacije su obično nasleđene na autozomno dominantan način i uključuju ekspanziju trinukleotidnih CAG ponavljanja u HTT gen, što dovodi do poliglutaminskog (polyQ) trakta u Htt proteinu.
[0057] Kako se ovde koristi, „terapeutski“ agens (npr., terapeutski polipeptid, nukleinska kiselina, transgen ili slično) je onaj koji pruža koristan ili željeni klinički rezultat, kao što su primeri kliničkih rezultata opisani iznad. Kao takav, terapeutski agens se može koristiti u tretmanu kao što je opisano iznad.
[0058] Upućivanje na „oko“ vrednosti ili parametra ovde uključuje (i opisuje) otelotvorenja koja su usmerene na tu vrednost ili parametar sama po sebi. Na primer, opis koji se odnosi na „oko X“ uključuje opis „X“.
[0059] Kako se ovde koristi, oblici jednine uključuje upućivanja na množinu, osim ako nije drugačije naznačeno.
[0060] Podrazumeva se da aspekti i otelotvorenja pronalaska koji su ovde opisani uključuju „obuhvata“, „sastoji se“ i/ili „suštinski se sastoje od“ aspekata i otelotvorenja.
III. Isporuka rAAV čestica
[0061] U nekim aspektima, pronalazak pruža rekombinantnu adeno-povezanu virusnu (rAAV) česticu za upotrebu u postupku isporuke rAAV u centralni nervni sistem (CNS) sisara, gde se rAAV čestica primenjuje u strijatum sisara pomoću isporuke poboljšane konvekcijom (CED), gde rAAV čestica sadrži rAAV vektor koji kodira heterolognu nukleinsku kiselinu koja je eksprimirana barem u potiljačnom režnju i/ili sloju IV kore velikog mozga i strijatumu sisara, gde rAAV čestica sadrži kapsid AAV serotipa 2 (AAV2), i gde se rAAV čestica primenjuje na najmanje jedno mesto u kaudalnom jezgru i na dva mesta u putamenu u svakoj hemisferi strijatuma. Dalji aspekti pronalaska pružaju rekombinantnu adeno-povezanu virusnu (rAAV) česticu za upotrebu u postupku tretmana poremećaja CNS kod sisara, gde se efikasna količina rAAV čestice primenjuje u strijatum sisara pomoću isporuke poboljšane konvekcijom (CED), gde rAAV čestica sadrži rAAV vektor koji kodira heterolognu nukleinsku kiselinu koja je eksprimirana barem u potiljačnom režnju i/ili sloju IV kore velikog mozga i strijatumu sisara, gde rAAV čestica sadrži AAV2 kapsid i gde se rAAV čestica primenjuje na najmanje jedno mesto u kaudalnom jezgru i na dva mesta u putamenu u svakoj hemisferi strijatuma. U još daljim aspektima, pronalazak pruža rAAV česticu za upotrebu za tretman Hantingtonove bolesti kod sisara koji obuhvata primenu rAAV čestice u strijatum, gde rAAV čestica sadrži rAAV vektor koji kodira heterolognu nukleinsku kiselinu koja je eksprimirana barem u kori velikog mozga i strijatumu sisara. U nekim otelotvorenjima, sisar je čovek.
[0062] Određeni aspekti predmetnog obelodanjenja se odnose na primenu rAAV čestice u jedan ili više regiona centralnog nervnog sistema (CNS). U nekim otelotvorenjima, rAAV čestica se primenjuje u strijatum. Strijatum je poznat kao region mozga koji prima ulaze iz kore velikog mozga (izraz „moždana kora“ se ovde može koristiti naizmenično) i šalje izlaze bazalnim ganglijama (strijatum se takođe naziva strijatalno jezgro i neostrijatum). Kao što je opisano iznad, strijatum kontroliše i motoričke pokrete i emocionalnu kontrolu/motivaciju i umešan je u mnoge neurološke bolesti, kao što je Hantingtonova bolest. Nekoliko interesantnih tipova ćelija nalazi se u strijatumu, uključujući, bez ograničenja, trnaste neurone projekcije (takođe poznate kao srednji trnasti neuroni), GABAergične interneurone i holinergičke interneurone. Srednji trnasti neuroni čine većinu strijatalnih neurona. Ovi neuroni su GABAergični i eksprimiraju dopaminske receptore. Svaka hemisfera mozga sadrži strijatum.
[0063] Važne podstrukture strijatuma uključuju kaudalno jezgro i putamen. U nekim otelotvorenjima, rAAV čestica se primenjuje u kaudalno jezgro (izraz „kaudat“ se ovde može koristiti naizmenično). Kaudalno jezgro je poznato kao struktura dorzalnog strijatuma.
Kaudalno jezgro je uključeno u kontrolu funkcija kao što su usmereni pokreti, prostorna radna memorija, pamćenje, akcije usmerene ka cilju, emocije, san, jezik i učenje. Svaka hemisfera mozga sadrži kaudalno jezgro.
[0064] U nekim otelotvorenjima, rAAV čestica se primenjuje na putamen. Zajedno sa kaudalnim jezgrom, putamen je poznat kao struktura dorzalnog strijatuma. Putamen se sastoji od dela lentikularnog jezgra i povezuje koru velikog mozga sa supstancija nigrom i globus palidusom. Visoko integrisan sa mnogim drugim strukturama mozga, putamen je uključen u kontrolu funkcija kao što su učenje, motoričko učenje, motoričke performanse, motorički zadaci i pokreti udova. Svaka hemisfera mozga sadrži putamen.
[0065] rAAV čestice se mogu primeniti na jedno ili više mesta strijatuma. U nekim otelotvorenjima, rAAV čestica se primenjuje na putamen i kaudalno jezgro strijatuma. U nekim otelotvorenjima, rAAV čestica se primenjuje na putamen i kaudalno jezgro svake hemisfere strijatuma. U nekim otelotvorenjima, rAAV čestica se primenjuje na najmanje jedno mesto u kaudalnom jezgru i na dva mesta u putamenu.
[0066] U nekim otelotvorenjima, rAAV čestica se primenjuje u jednu hemisferu mozga. U nekim otelotvorenjima, rAAV čestica se primenjuje u obe hemisfere mozga. Na primer, u nekim otelotvorenjima, rAAV čestica se primenjuje na putamen i kaudalno jezgro svake hemisfere strijatuma. U nekim otelotvorenjima, sastav koji sadrži rAAV čestice se primenjuje u strijatum svake hemisfere. U drugim otelotvorenjima, sastav koji sadrži rAAV čestice se primenjuje na strijatum leve hemisfere ili strijatum desne hemisfere i/ili putamen leve hemisfere ili putamen desne hemisfere. U nekim otelotvorenjima, sastav koji sadrži rAAV čestice se primenjuje na bilo koju kombinaciju kaudalnog jezgra leve hemisfere, kaudalnog jezgra desne hemisfere, putamena leve hemisfere i putamena desne hemisfere.
[0067] U nekim otelotvorenjima, sastav koji sadrži rAAV čestice se primenjuje na više od jednog mesta istovremeno ili uzastopno. U nekim otelotvorenjima, višestruke injekcije sastava koji sadrže rAAV čestice nisu razmaknute više od otprilike jednog sata, dva sata, tri sata, četiri sata, pet sati, šest sati, devet sati, dvanaest sati ili 24 sata. U nekim otelotvorenjima, višestruke injekcije sastava koji sadrži rAAV čestice su u razmaku više od oko 24 sata.
[0068] Generalno, od oko 1 µL do oko 1 mL sastava se može isporučiti (npr., od oko 100 µL do oko 500 µL sastava). U nekim otelotvorenjima, količina sastava koji se isporučuje u putamen je veća od zapremine koja se isporučuje u kaudalno jezgro. U nekim otelotvorenjima, količina sastava koji se isporučuje u putamen je oko dvostruko veća od zapremine koja se isporučuje u kaudalno jezgro. U drugim otelotvorenjima, količina sastava koji se isporučuje u putamen je otprilike bilo koja od 1X, 1,25X, 1,5X, 1,75X, 2X, 2,25X, 2,5X. 2,75X, 3X, 3,5X, 4X, 4,5X, 5X ili 10X (ili bilo koji odnos između njih) zapremine dostavljene kaudalnom jezgru. Na primer, u nekim otelotvorenjima, odnos rAAV čestica primenjenih na putamen i rAAV čestica primenjenih u kaudalno jezgro iznosi najmanje oko 2:1 (npr., oko 30 µL sastava se primenjuje u kaudalno jezgro svake hemisfere i oko 60 µL sastava se primenjuje na putamen svake hemisfere). U nekim otelotvorenjima, oko 20 µL do oko 50 µL sastava (ili bilo koja količina između njih) se primenjuje u kaudalno jezgro svake
2
hemisfere, i oko 40 µL do oko 100 µL sastava (ili bilo koja količina između njih) se primenjuje na putamen svake hemisfere. U nekim otelotvorenjima, zapremina sastava koji se primenjuje u kaudalno jezgro svake hemisfere je manja od bilo koje od narednih zapremina (u µL): 50, 45, 40, 35, 30 ili 25. U nekim otelotvorenjima, zapremina sastava koji se primenjuje na kaudalno jezgro svake hemisfere je veća od bilo koje od narednih zapremina (u µL): 20, 25, 30, 35, 40 ili 45. To jest, zapremina sastava koji se primenjuje na kaudalno jezgro svake hemisfere može biti bilo koji od raspona zapremina koji imaju gornju granicu od 50, 45, 40, 35, 30 ili 25 i nezavisno odabranu donju granicu od 20, 25, 30, 35, 40 ili 45, gde donja granica je manja od gornje granice. U nekim otelotvorenjima, zapremina sastava koji se primenjuje na putamen svake hemisfere je manja od bilo koje od narednih zapremina (u µL): 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50 ili 45. U nekim otelotvorenjima, zapremina sastava koji se primenjuje na putamen svake hemisfere je veća od bilo koje od narednih zapremina (u µL): 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 ili 95. To jest, zapremina sastava koji se primenjuje na putamen svake hemisfere može biti bilo koji od raspona zapremina koji imaju gornju granicu od 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50 ili 45 i nezavisno odabranu donju granicu od 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 ili 95, gde je donja granica manja nego gornja granica.
[0069] U nekim otelotvorenjima, sastav se primenjuje u strijatum brzinom većom od 1 µL/min do oko 5 µL/min. U nekim otelotvorenjima, sastav se primenjuje na kaudalno jezgro i putamen brzinom većom od 1 µL/min do oko 5 µL/min. U nekim otelotvorenjima, sastav se primenjuje u strijatum (kaudalno jezgro i/ili putamen) brzinom većom od bilo koje od 1 µL/min, 2 µL/min, 3 µL/min, 4 µL/min, 5 µL/min, 6 µL/min, 7 µL/min, 8 µL/min, 9 µL/min, ili 10 µL/min. U nekim otelotvorenjima, sastav se primenjuje u strijatum (kaudalno jezgro i/ili putamen) bilo kojom brzinom od 1 µL/min do oko 10 µL/min, oko 1 µL/min do oko 9 µL/min, oko 1 µL/min do oko 8 µL/min, oko 1 µL/min do oko 7 µL/min, oko 1 µL/min do oko 6 µL/min, oko 1 µL/min do oko 5 µL/min, oko 1 µL/min do oko 4 µL/min, oko 1 µL/min do oko 3 µL/min, oko 1 µL/min do oko 2 µL/min, oko 2 µL/min do oko 10 µL/min, oko 2 µL/min do oko 9 µL/min, oko 2 µL/min do oko 8 µL/min, oko 2 µL/min do oko 7 µL/min, oko 2 µL/min do oko 6 µL/min, oko 2 µL/min do oko 5 µL/min, oko 2 µL/min do oko 4 µL/min, oko 2 µL/min do oko 3 µL/min, oko 3 µL/min do oko 10 µL/min, oko 3 µL/min do oko 9 µL/min, oko 3 µL/min do oko 8 µL/min, oko 3 µL/min do oko 7 µL/min, oko 3 µL/min do oko 6 µL/min, oko 3 µL/min do oko 5 µL/min, oko 3 µL/min do oko 4 µL/min, oko 4 µL/min do oko 10 µL/min, oko 4 µL/min do oko 9 µL/min, oko 4 µL/min do oko 8 µL/min, oko 4 µL/min do oko 7 µL/min, oko 4 µL/min do oko 6 µL/min, oko 4 µL/min do oko 5 µL/min, oko 5 µL/min do oko 10 µL/min, oko 5 µL/min do oko 9 µL/min, oko 5 µL/min do oko 8 µL/min, oko 5 µL/min do oko 7 µL/min, oko 5 µL/min do oko 6 µL/min, oko 6 µL/min do oko 10 µL/min, oko 6 µL/min do oko 9 µL/min, oko 6 µL/min do oko 8 µL/min, oko 6 µL/min do oko 7 µL/min, oko 7 µL/min do oko 10 µL/min, oko 7 µL/min do oko 9 µL/min, oko 7 µL/min do oko 8 µL/min, oko 8 µL/min do oko 10 µL/min, oko 8 µL/min do oko 9 µL/min, ili oko 9 µL/min do oko 10 µL/min. U nekim otelotvorenjima, sastav se primenjuje sa inkrementalnim povećanjem brzine protoka tokom isporuke (tj. „koračanje“).
[0070] U nekim otelotvorenjima, primena rAAV čestice se izvodi jednom. U drugim otelotvorenjima, primena rAAV čestice se izvodi više puta. Stručnjak može odrediti koliko puta da izvrši primenu rAAV čestice delimično na osnovu, npr., poremećaja koji se tretira i/ili odgovora pacijenta na tretman.
[0071] U nekim otelotvorenjima, rAAV čestice obuhvataju primenu CNS efektivne količine rekombinantnih virusnih čestica u strijatum, gde rAAV čestica sadrži rAAV vektor koji kodira heterolognu nukleinsku kiselinu koja je eksprimirana barem u kori velikog mozga i strijatumu. U nekim otelotvorenjima, virusni titar rAAV čestica je najmanje bilo koji od 5 × 10<12>, 6 × 10<12>, 7 × 10<12>, 8 × 10<12>, 9 × 10<12>, 10 × 10<12>, 11 × 10<12>, 15 × 10<12>, 20 × 10<12>, 25 × 10<12>, 30 × 10<12>, ili 50 × 10<12>kopija genoma/mL. U nekim otelotvorenjima, virusni titar rAAV čestica je oko 5 × 10<12>to 6 × 10<12>, 6 × 10<12>to 7 × 10<12>, 7 × 10<12>to 8 × 10<12>, 8 × 10<12>to 9 × 10<12>, 9 × 10<12>to 10 × 10<12>, 10 × 10<12>to 11 × 10<12>, 11 × 10<12>to 15 × 10<12>, 15 × 10<12>to 20 × 10<12>, 20 × 10<12>to 25 × 10<12>, 25 × 10<12>to 30 x 10<12>, 30 × 10<12>to 50 × 10<12>, ili 50 × 10<12>to 100 × 10<12>kopija genoma/mL. U nekim otelotvorenjima, virusni titar rAAV čestica je oko 5 × 10<12>to 10 × 10<12>, 10 × 10<12>to 25 × 10<12>, ili 25 × 10<12>to 50 × 10<12>kopija genoma/mL. U nekim otelotvorenjima, virusni titar rAAV čestica je najmanje bilo koji od 5 × 10<9>, 6 × 10<9>, 7 × 10<9>, 8 × 10<9>, 9 × 10<9>, 10 × 10<9>, 11 × 10<9>, 15 × 10<9>, 20 × 10<9>, 25 × 10<9>, 30 × 10<9>, ili 50 × 10<9>transducirajućih jedinica/mL. U nekim otelotvorenjima, virusni titar rAAV čestica je oko 5 × 10<9>to 6 × 10<9>, 6 × 10<9>to 7 × 10<9>, 7 × 10<9>to 8 × 10<9>, 8 × 10<9>to 9 × 10<9>, 9 × 10<9>to 10 × 10<9>, 10 × 10<9>to 11 × 10<9>, 11 × 10<9>to 15 × 10<9>, 15 × 10<9>to 20 × 10<9>, 20 × 10<9>to 25 × 10<9>, 25 × 10<9>to 30 × 10<9>, 30 × 10<9>to 50 × 10<9>ili 50 × 10<9>to 100 × 10<9>transducirajućih jedinica/mL. U nekim otelotvorenjima, virusni titar rAAV čestica je oko 5 × 10<9>to 10 × 10<9>, 10 × 10<9>to 15 × 10<9>, 15 × 10<9>to 25 × 10<9>, ili 25 × 10<9>to 50 × 10<9>transducirajućih jedinica/mL. U nekim
2
otelotvorenjima, virusni titar rAAV čestica je najmanje bilo koji oko 5 × 10<10>, 6 × 10<10>, 7 × 10<10>, 8 × 10<10>, 9 × 10<10>, 10 × 10<10>, 11 × 10<10>, 15 × 10<10>, 20 × 10<10>, 25 × 10<10>, 30 × 10<10>, 40 × 10<10>, ili 50 × 10<10>infektivnih jedinca/mL. U nekim otelotvorenjima, virusni titar rAAV čestica je najmanje bilo koji oko 5 × 10<10>to 6 × 10<10>, 6 × 10<10>to 7 × 10<10>, 7 × 10<10>to 8 × 10<10>, 8 × 10<10>to 9 × 10<10>, 9 × 10<10>to 10 × 10<10>, 10 × 10<10>to 11 × 10<10>, 11 × 10<10>to 15 × 10<10>, 15 × 10<10>to 20 × 10<10>, 20 × 10<10>to 25 × 10<10>, 25 × 10<10>to 30 × 10<10>, 30 × 10<10>to 40 × 10<10>, 40 × 10<10>to 50 × 10<10>, ili 50 × 10<10>to 100 × 10<10>infektivnih jedinca/mL. U nekim otelotvorenjima, virusni titar rAAV čestica je najmanje bilo koji oko 5 × 10<10>to 10 × 10<10>, 10 × 10<10>to 15 × 10<10>, 15 × 10<10>to 25 × 10<10>, ili 25 × 10<10>to 50 × 10<10>infektivnih jedinca/mL.
[0072] U nekim otelotvorenjima, rAAV čestice obuhvataju primenu na CNS efektivne količine rekombinantnih virusnih čestica u strijatum, gde rAAV čestica sadrži rAAV vektor koji kodira heterolognu nukleinsku kiselinu koja je eksprimirana barem u kori velikog mozga i strijatumu. U nekim otelotvorenjima, doza virusnih čestica koja se primenjuje pojedincu je najmanje bilo koja od 1 × 10<8>do oko 1 × 10<13>kopije genoma/kg telesne težine. U nekim otelotvorenjima, doza virusnih čestica koja se primenjuje pojedincu je oko 1 × 10<8>do 1 × 10<13>kopija genoma/kg telesne težine.
[0073] U nekim otelotvorenjima, rAAV čestice obuhvataju primenu na CNS efikasne količine rekombinantnih virusnih čestica u strijatum, gde rAAV čestica sadrži rAAV vektor koji kodira heterolognu nukleinsku kiselinu koja je eksprimirana barem u kori velikog mozga i strijatumu. U nekim otelotvorenjima, ukupna količina virusnih čestica koja se primenjuje pojedincu je najmanje oko 1 × 10<9>do oko 1 × 10<14>kopija genoma. U nekim otelotvorenjima, ukupna količina virusnih čestica koja se primenjuje pojedincu je oko 1 × 10<9>do oko 1 × 10<14>kopija genoma.
[0074] Sastavi (npr., rAAV čestice) se mogu koristiti ili sami ili u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapeutskih agenasa za tretman bilo kog ili svih poremećaja opisanih ovde. Interval između uzastopnih primena može biti u periodima od najmanje (ili, alternativno, manje od) minuta, sati ili dana.
IV. Konstrukti eksprimiranja
[0075] U nekim aspektima, pronalazak pruža isporuku rAAV čestica u CNS sisara primenom rAAV čestica u strijatum. U nekim otelotvorenjima, rAAV čestice sadrže rAAV vektor.
2
rAAV vektor može kodirati heterolognu nukleinsku kiselinu, (npr., heterologna nukleinska kiselina eksprimirana barem u kori velikog mozga i strijatumu). rAAV vektori su detaljnije opisani infra.
[0076] U nekim otelotvorenjima, rAAV vektor kodira heterolognu nukleinsku kiselinu. U nekim otelotvorenjima, heterologna nukleinska kiselina može da kodira terapeutski polipeptid ili terapeutsku nukleinsku kiselinu. Terapeutski polipeptid ili terapeutska nukleinska kiselina mogu se koristiti, na primer, za ublažavanje simptoma, sprečavanje ili odlaganje progresije i/ili pružanje tretmana poremećaja (npr., ovde opisani poremećaj). U nekim otelotvorenjima, terapeutski polipeptid ili terapeutska nukleinska kiselina se koriste za tretman poremećaja CNS, kao što je detaljnije opisano u nastavku.
[0077] Heterologna nukleinska kiselina može biti eksprimirana u jednom ili više regiona od interesa u CNS. Na primer, u nekim otelotvorenjima, heterologna nukleinska kiselina je eksprimirana barem u kori velikog mozga i strijatumu. Heterologna nukleinska kiselina može biti sposobna za eksprimiranje svuda u CNS, ili može biti eksprimirana u podskupu ćelija CNS.
[0078] U nekim otelotvorenjima, heterologna nukleinska kiselina je eksprimirana u čeonom režnju, potiljačnom režnju i/ili sloju IV sisara. Moždana kora je poznata kao spoljašnji sloj mozga sisara važan za jezik, svest, pamćenje, pažnju i svest. Moždana kora je podeljena na više različitih komponenti i regiona zbog svoje opsežne anatomije i složenih funkcija. Može se podeliti na levu i desnu hemisferu. Pored toga, sadrži četiri gruba režnja: čeoni, temeni, slepoočni i potiljačni. Čeona moždana kora se može odnositi na čeoni režanj moždane kore i poznato je da pruža širok spektar neuroloških funkcija koje se odnose na pamćenje koje nije zasnovano na zadacima, društvene interakcije, donošenje odluka i druge složene kognitivne funkcije. Potiljačna moždana kora se može odnositi na potiljačni režanj moždane kore i poznato je da je uključen u vizuelnu obradu. Temena moždana kora se može odnositi na temeni režanj moždane kore i poznato je da je uključen u obradu jezika, propriocepciju i senzorne inpute vezane za dodir. Slepoočna moždana kora se može odnositi na slepoočni režanj moždane kore i poznato je da je uključen u jezik, pamćenje i emocionalne veze.
[0079] Pored toga, opisana su tri opšta tipa oblasti moždane kore: senzorna, motorička i asocijativna. One se mogu podeliti na 5 funkcionalnih podpodela: primarna motorna kora
2
(uključena u kontrolu mišića), premotorna kora (motorne oblasti višeg reda koja upravljaju primarnim motornim oblastima), asocijativne oblasti (npr., temeno-slepoočno-potiljačno ili prefrontalno; ove oblasti su uključene u planiranje, pamćenje, pažnju i druge više kognitivne zadatke i zauzimaju veći deo ljudske moždane kore), oblasti višeg reda (senzorna obrada) i primarna senzorne oblasti (npr., slušni, vizuelni i somatosenzorni). U nekim otelotvorenjima, heterologna nukleinska kiselina je eksprimirana u prefrontalnim asocijativnim kortikalnim oblastima, premotornoj koro, primarnim somatosenzornim kortikalnim oblastima, senzornoj motornoj kori, temenom režnju, potiljačnom režnju i/ili primarnoj motornoj kori.
[0080] Pored toga, kora velikog mozga se može podeliti na različite kortikalne slojeve (krećući se od površinskih ka dubokim), od kojih svaki sadrži karakterističan obrazac neuronskih veza i tipova ćelija. Ovi slojevi se mogu podeliti na supragranularne slojeve (slojevi I-III), unutrašnje granularne (IV) i infragranularne (V i VI). Supragranularni slojevi se obično projektuju na druge kortikalne slojeve, dok infragranularni slojevi primaju ulaz od supragranularnih slojeva i šalju izlaz strukturama izvan moždane kore (npr., motorički, senzorni i talamički regioni). Sloj V sadrži piramidalne neurone sa aksonima koji se povezuju sa subkortikalnim strukturama poput bazalnih ganglija. Neuroni sloja V u primarnoj motornoj kori takođe formiraju kortikospinalni trakt koji je kritičan za dobrovoljnu motoričku kontrolu. Sloj IV prima ulaze iz talamusa i povezuje se sa ostatkom kolone, pružajući tako kritične funkcije vezane za integraciju talamusa i moždane kore. Karakteristične ćelije sloja IV uključuju zvezdaste ćelije (npr., trnaste zvezdaste ćelije) i piramidalne neurone.
[0081] U nekim otelotvorenjima, rAAV čestica se podvrgava retrogradnom ili anterogradnom transportu u cerebralnom korteksu. Retrogradni transport se odnosi na pojavu kojom se teret (npr., rAAV čestice) pomera iz neuronskog procesa (npr., akson) do tela ćelije. Anterogradni transport se odnosi na kretanje od tela ćelije do ćelijske membrane (npr., sinapsa). Smatra se da se retrogradni transport AAV čestica dešava internacionalizacijom posredovanom receptorom na terminalu aksona, nakon čega sledi transport posredovan mikrotubulama do jezgra (pogledati, npr., Kaspar i dr., (2002) Mol. Ther.5:50-56; Boulis i dr., (2003) Neurobiol. Dis.14:535-541; Kaspar i dr., (2003) Science 301:839-842). Poznato je da strijatum sadrži projekcije iz drugih regiona mozga, kao što su regioni moždane kore. I anterogradni i retrogradni transport mogu omogućiti distribuciju rAAV čestica po mozgu, kao što je između moždane kore i talamusa (pogledati, npr., Kells, A.P. i dr. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci.106:2407-2411). Stoga, bez želje da se vežemo za teoriju, smatra se da je injekcija
2
AAV čestica u jedan region mozga (npr., strijatum, kaudalno jezgro i/ili putamen) može omogućiti da se AAV čestice isporuče u drugu oblast mozga (npr., moždana kora) retrogradnim transportom.
[0082] U nekim otelotvorenjima, heterologna nukleinska kiselina je dalje eksprimirana u talamusu, supstancija nigri i/ili hipokampusu. Kao što je gore opisano, mehanizmi kao što su anterogradni i/ili retrogradni transport mogu dozvoliti da se rAAV čestice injektirane u koru velikog mozga i/ili strijatum distribuiraju u druge regione mozga, posebno one koji se povezuju sa korom. Talamus se nalazi između kore i srednjeg mozga, šalje signale (npr., senzorne i motoričke) do kore iz subkortikalnih oblasti, i igra ulogu u budnosti i snu. Talamus se takođe povezuje sa hipokampusom, delom limbičkog sistema i kritičnim posrednikom konsolidacije dugoročne memorije. Deo bazalnih ganglija, supstancija nigra sadrži mnogo dopaminergičkih neurona i važna je za kretanje i nagradu. Poremećaji CNS poput Parkinsonove bolesti povezani su sa gubitkom dopaminergičkih neurona u supstancija nigri. Ona dalje pruža dopamin strijatumu koji je kritičan za pravilnu funkciju strijatuma.
[0083] U nekim aspektima, obelodanjenje pruža rAAV vektore za upotrebu u prevenciji ili tretmanu jednog ili više genskih defekata (npr., nasledni genski defekti, somatske promene gena i slično) kod sisara, kao što je, na primer, defekt gena koji dovodi do nedostatka polipeptida ili viška polipeptida kod pacijenta, ili za tretman ili smanjenje težine ili obima nedostatka kod pacijenta koji manifestuje poremećaj povezan sa CNS povezan sa nedostatkom takvih polipeptida u ćelijama i tkivima. Neka otelotvorenja uključuju primenu rAAV vektora koji kodira jedan ili više terapeutskih peptida, polipeptida, funkcionalnih RNK, inhibitornih nukleinskih kiselina, shRNK, mikroRNK, antisens nukleotida, itd. u farmaceutski prihvatljivom nosaču za pacijenta u količini i tokom vremenskog perioda koji su dovoljni za tretman poremećaja povezanog sa CNS kod pacijenta koji ima ili se sumnja da ima takav poremećaj.
[0084] rAAV vektor može da sadrži kao transgen nukleinsku kiselinu koja kodira protein ili funkcionalnu RNK koja modulira ili tretira poremećaj povezan sa CNS. Sledi neograničavajuća lista gena povezanih sa poremećajima povezanim sa CNS: inhibitorni protein neuronske apoptoze (NAIP), faktor rasta nerava (NGF), faktor rasta koji potiče od glija (GDNF), faktor rasta koji potiče iz mozga (BDNF), cilijarni neurotrofični faktor (CNTF), tirozin hidroksalaza (TM, GTP-ciklohidrolaza (GTPCH), aspartoacilaza (ASPA),
2
superoksid dismutaza (SOD1) i aminokiselinska dekarboksilaza (AADC). Na primer, koristan transgen u tretmanu Parkinsonove bolesti kodira TH, koji je enzim koji ograničava brzinu u sintezi dopamina. Transgen koji kodira GTPCII, koji generiše kofaktor TII tetrahidrobiopterin, takođe se može koristiti u tretmanu Parkinsonove bolesti. Transgen koji kodira GDNF ili BDNF, ili AADC, koji olakšava konverziju L-Dopa do DA, takođe se može koristiti za tretman Parkinsonove bolesti. Za tretman ALS, koristan transgen može da kodira: GDNF, BDNF ili CNTF. Takođe za tretman ALS, koristan transgen može da kodira funkcionalnu RNK, npr., shRNK, miRNK, koje inhibiraju eksprimiranje SOD1. Za tretman ishemije koristan transgen može da kodira NAIP ili NGF. Transgen koji kodira betaglukuronidazu (GUS) može biti koristan za tretman određenih lizozomskih bolesti skladištenja (npr., Mukopolisaharidoza tipa VII (MPS VII)). Transgen koji kodira gen za aktivaciju proleka, npr., HSV-timidin kinaza koja pretvara ganciklovir u toksični nukleotid koji remeti sintezu DNK i dovodi do smrti ćelije, može biti korisna za tretman određenih karcinoma, npr., kada se primenjuje u kombinaciji sa prolekom. Transgen koji kodira endogeni opioid, kao što je β-endorfin, može biti koristan za tretman bola. Drugi primeri transgena koji se mogu koristiti u rAAV vektorima pronalaska biće očigledni stručnjaku (pogledati, npr., Costantini LC, i dr., Gene Therapy (2000) 7, 93-109).
[0085] U nekim otelotvorenjima, heterologna nukleinska kiselina može da kodira terapeutsku nukleinsku kiselinu. U nekim otelotvorenjima, terapeutska nukleinska kiselina može uključivati bez ograničenja siRNK, shRNK, RNKi, miRNK, antisens RNK, ribozim ili DNKzim. Kao takva, terapeutska nukleinska kiselina može kodirati RNK koja kada se transkribuje iz nukleinskih kiselina vektora može tretirati poremećaj (npr., poremećaj CNS) ometanjem translacije ili transkripcije abnormalnog ili viška proteina povezanog sa poremećajem. Na primer, nukleinske kiseline mogu da kodiraju RNK koja tretira poremećaj visoko specifičnom eliminacijom ili redukcijom mRNK koja kodira abnormalne proteine i/ili višak proteina. Terapeutske RNK sekvence uključuju RNKi, malu inhibitornu RNK (siRNK), mikro RNK (miRNK) i/ili ribozime (kao što su ribozimi glave čekića i ukosnice) koji mogu da tretiraju poremećaje visoko specifičnom eliminacijom ili redukcijom iRNK koja kodira abnormalne proteine i/ili višak proteina.
[0086] U nekim otelotvorenjima, heterologna nukleinska kiselina može da kodira terapeutski polipeptid. Terapeutski polipeptid može, npr., pružiti polipeptidnu i/ili enzimsku aktivnost koja je odsutna ili prisutna pri smanjenom nivou u ćeliji ili organizmu. Alternativno, terapeutski polipeptid može da pruži polipeptidnu i/ili enzimsku aktivnost koja indirektno deluje protiv neravnoteže u ćeliji ili organizmu. Na primer, terapeutski polipeptid za poremećaj povezan sa nagomilavanjem metabolita uzrokovan nedostatkom metaboličkog enzima ili aktivnosti može pružiti nedostajući metabolički enzim ili aktivnost, ili može pružiti alternativni metabolički enzim ili aktivnost koja dovodi do smanjenja metabolita. Terapeutski polipeptid se takođe može koristiti za smanjenje aktivnosti polipeptida (npr., onaj koji je prekomerno eksprimiran, aktiviran mutacijom dobijanja funkcije ili čija je aktivnost na drugi način pogrešno regulisana) delovanjem, npr., kao dominantno-negativni polipeptid.
[0087] U nekim otelotvorenjima, terapeutski polipeptid ili terapeutska nukleinska kiselina se koristi za tretman poremećaja CNS. Bez želje da se vežemo za teoriju, smatra se da se terapeutski polipeptid ili terapeutska nukleinska mogu može koristiti da smanje ili eliminišu eksprimiranje i/ili aktivnost polipeptida čije je povećanje funkcije povezano sa poremećajem, ili za poboljšanje eksprimiranja i/ili aktivnosti polipeptida kako bi se dopunio nedostatak koji je povezan sa poremećajem (npr., mutacija u genu čije eksprimiranje pokazuje sličnu ili srodnu aktivnost). Neograničavajući primeri poremećaja CNS koji se mogu tretirati terapeutskim polipeptidom ili terapeutskom nukleinskom kiselinom (primeri gena koji mogu biti ciljani ili isporučeni dati su u zagradi za svaki poremećaj) uključuju naredno: moždani udar (npr. kaspaza-3, Beclinl, Ask1, PAR1, HIF1α, PUMA, i/ili bilo koji od gena opisanih kod Fukuda, A.M. and Badaut, J. (2013) Genes (Basel) 4:435-456), Hantingtonova bolest (mutant HTT), epilepsija (npr. SCN1A, NMDAR, ADK, i/ili bilo koji od gena opisanih kod Boison, D. (2010) Epilepsia 51:1659-1668), Parkinsonova bolest (alfa-sinuklein), Lu Gerigova bolest (poznata i kao amiotrofična lateralna skleroza; SOD1), Alchajmerova bolest (tau, amiloidni prekursor protein), kortikobazalna degeneracija ili CBD (tau), kortikosalna ganglionska degeneracija ili CBGD (tau), čeonoslepoočna demencija ili FTD (tau), progresivna supranuklearna paraliza ili PSP (tau), multipla sistemska atrofija ili MSA (alfasinuklein), rak mozga (npr., mutantni ili prekomerno eksprimirani onkogen koji je umešan u rak mozga) i lizozomske bolesti skladištenja (LSD). Poremećaji mogu uključivati one koji uključuju velike površine moždane kore, npr., više od jedne funkcionalne oblasti kore, više od jednog režnja kore i/ili celu koru. Drugi neograničavajući primeri poremećaja koji se mogu tretirati terapeutskim polipeptidom ili terapijskom nukleinskom kiselinom uključuju traumatske povrede mozga, poremećaje enzimske disfunkcije, psihijatrijske poremećaje (uključujući posttraumatski stresni sindrom), neurodegenerativne bolesti i kognitivne poremećaje (uključujući demencije, autizam i depresiju). Poremećaji enzimske disfunkcije
1
uključuju, bez ograničenja, leukodistrofije (uključujući Kanavanovu bolest) i bilo koju od lizozomskih bolesti skladištenja opisanih u nastavku.
[0088] U nekim otelotvorenjima, terapeutski polipeptid ili terapeutska nukleinska kiselina se koristi za tretman bolesti lizozoma. Kao što je opšte poznato u struci, lizozomske bolesti skladištenja su retki, nasledni metabolički poremećaji koji se karakterišu defektima u lizozomskoj funkciji. Takvi poremećaji su često uzrokovani nedostatkom enzima potrebnog za pravilan metabolizam mukopolisaharida, glikoproteina i/ili lipida, što dovodi do patološke akumulacije ćelijskih materijala uskladištenih u lizozomima. Neograničavajući primeri bolesti lizozomskog skladištenja koje se mogu tretirati terapeutskim polipeptidom ili terapeutskom nukleinskom kiselinom (primer gena koji mogu biti ciljani ili isporučeni dati su u zagradi za svaki poremećaj) uključuju naredno: Gošeova bolest tip 2 ili tip 3 (kiselina betaglukozidaza, GBA), GM1 gangliozidoza (beta-galaktozidaza-1, GLB1), Hanterova bolest (iduronat 2-sulfataza, IDS), Krabeova bolest (galaktozilkeramidaza, GALC), bolest manozidoze (manozidaza, kao što je alfa-D-manozidaza, MAN2B1), bolest β manozidoze (beta-manozidaza, MANBA), bolest metahromatske leukodistrofije (pseudoarilsulfataza A, ARSA), bolest mukolipidoze II/III (N-acetilglukozamin-1-fosfotransferaza, GNPTAB), Niman-Pik A bolest (kisela sfingomijelinaza, ASM), Niman-Pik C bolest (Niman-Pik C protein, NPC1), Pompeova bolest (kiselina alfa-1,4-glukozidaza, GAA), Sandhofova bolest (heksosaminidaza beta podjedinica, HEXB), Sanfilipo A bolest (N-sulfoglukozamin sulfohidrolaza, MPS3A), Sanfilipo B bolest (N-alfa-acetilglukozaminidaza, NAGLU), Sanfilipo C bolest (heparin acetil-CoA:alfa-glukozaminidaza N-acetiltransferaza, MPS3C), Sanfilipo D bolest (N-acetilglukozamin-6-sulfataza, GNS), Šindlerova bolest (alfa-N-acetilgalaktozaminidaza, NAGA), Sly bolest (beta-glukuronidaza, GUSB), Tay-Sachsova bolest (heksozaminidaza alfa podjedinica, HEXA), i Volmanova bolest (lizozomska kisela lipaza, LIPA).
[0089] Dodatne lizozomske bolesti skladištenja, kao i defektni enzim povezan sa svakom bolešću, navedeni su u Tabeli 1 u nastavku. U nekim otelotvorenjima, bolest navedena u tabeli u nastavku se tretira terapeutskim polipeptidom ili terapeutskom nukleinskom kiselinom koja dopunjuje ili na drugi način kompenzuje odgovarajući enzimski defekt.
Tabela 1. Poremećaji lizozomskog skladištenja i povezani defektni enzimi.
2
[0090] Stoga, u nekim otelotvorenjima, terapeutski polipeptid je kaspaza-3, Beclin1, Ask1, PAR1, HIF1α, PUMA, SCN1A, NMDAR, ADK, alfa-sinuklein, SOD1, kisela betaglukozidaza (GBA), beta-galaktozidaza-1 (GLB1), iduronat 2-sulfataza (IDS), galaktozilkeramidaza (GALC), manozidaza, alfa-D-manozidaza (MAN2B1), betamanozidaza (MANBA), pseudoarilsulfataza A (ARSA), N-acetilglukozamin-1-fosfotransferaza (GNPTAB), kisela sfingomijelinaza (ASM), Niman-Pik C protein (NPC1), kisela alfa-1,4-glukozidaza (GAA), heksozaminidaza beta podjedinica, HEXB, N-sulfoglukozamin sulfohidrolaza (MPS3A), N-alfa-acetilglukozaminidaza NAGLU), heparin acetil-CoA, alfa-glukozaminidaza N-acetiltransferaza (MPS3C), N-acetilglukozamin-6-sulfataza (GNS), alfa-N-acetilgalaktozaminidaza (NAGA), beta-glukuronidaza (GUSB), heksosaminidaza akfa oidhedubuca (HEXA), hantingtin (HTT) ili lizozomska kisela lipaza (LIPA). Terapeutski polipeptid može povećati ili smanjiti funkciju ciljanog polipeptida kod pacijenta (npr., može pružiti nedostajuću funkciju kod bolesti lizozomskog skladištenja ili smanjiti nivo alfa-sinukleina kod MSA, kao što je blokiranje njegove funkcije ili disfunkcije). U nekim otelotvorenjima, terapeutska nukleinska kiselina je kaspaza-3, Beclin1, Ask1, PAR1, HIF1α, PUMA, SCN1A, NMDAR, ADK, alfa-sinuklein, SOD1, kisela betaglukozidaza (GBA), beta-galaktozidaza-1 (GLBB1), iduronat 2-sulfataza (IDS), galaktozilkeramidaza (GALC), mannosidaza, alfa-D-manozidaza (MAN2B1), betamanozidaza (MANBA), pseudoarilsulfataza A (ARSA), N-acetilglukozamin-1-fosfotransferaza (GNPTAB), kisela sfingomijelinaza (ASM), Niman-Pik C protein (NPC1), kisela alfa-1,4-glukozidaza (GAA), heksosaminidaza beta podjedinica, HEXB, N-sulfoglukozamin sulfohidrolaza (MPS3A), N-alfa-acetilglukozaminidaza (NAGLU), heparin acetil-CoA, alfa-glukozaminidaza N-acetiltransferaza (MPS3C), N-acetilglukozamin-6-sulfataza (GNS), alfa-N-acetilgalaktozaminidaza (NAGA), beta-glukuronidaza (GUSB), heksosaminidaza alfa podjedinica(HEXA), ili lizozomske kisele lipaze (LIPA). Terapeutska
4
nukleinska kiselina može povećati ili smanjiti funkciju ciljanog polipeptida kod pacijenta (npr., može pružiti nedostajuću funkciju u bolesti lizozomskog skladištenja ili smanjiti nivo alfa-sinukleina kod MSA, kao što je RNKi).
[0091] Primer bolesti za koju eksprimiranje AAV u moždanoj kori i strijatumu može biti korisno je Hantingtonova bolest (HB). Hantingtonova bolest je uzrokovana mutacijom ekspanzije CAG ponavljanja koji kodira izduženo ponavljanje poliglutamina (polyQ) u mutantnom hantingtin proteinu (mHTT). HB je posebno atraktivna meta za terapije zasnovane na DNK i RNK jer je autozomno dominantna bolest koja je rezultat mutacije na jednom alelu. AAV vektori pružaju idealan sistem za isporuku terapeutika nukleinskih kiselina i omogućavaju dugotrajno i kontinuirano eksprimiranje ovih molekula za snižavanje hantingtina u mozgu. Kako bi se postigla maksimalna klinička efikasnost u HB, verovatno će biti potrebna isporuka i u strijatum i u koru. Postmortalna analiza mozga pacijenata sa HB otkrila je ekstenzivni gubitak srednjeg trnastog neurona u strijatumu, pored gubitka piramidalnih neurona u kori velikog mozga i hipokampusu. Nedavno je pokazano korišćenjem uslovnih transgenih mišjih modela HB da genetsko smanjenje eksprimiranja mHTT u neuronskim populacijama u strijatumu i kori pruža značajno veću efikasnost od smanjenja mHTT na bilo kom samom mestu (Wang i dr., (2014) Nature medicine 20:536-541). Zajedno, ovi dokazi sugerišu da isporuka agenasa za gensku terapiju i u strijatalne i u kortikalne regione može biti idealna za maksimalnu terapijsku efikasnost.
[0092] Upotreba vektora genske terapije za isporuku bioloških lekova u kritične regione mozga koji su uključeni u patogenezu Hantingtonove bolesti predstavljala je izazov, velikim delom zbog fizičkih ograničenja efikasnog dostavljanja vektora specifično u strijatum i koru velikog mozga. Iako višestruke direktne infuzije mogu biti efikasne u mozgovima malih životinja, kako se struktura i zapremina moždanog tkiva povećavaju kod primata, postaje teže postići široko rasprostranjeno strijatalnu i kortikalnu primenu putem infuzije na jednom mestu. Stoga, otkriće pronalazača da strijatalna primena može postići široku distribuciju rAAV, uključujući moždanu koru i strijatum, ima koristi u tretmanu Hantingtonove bolesti.
[0093] Shodno tome, određeni aspekti se odnose na rAAV česticu za tretman Hantingtonove bolesti kod sisara, koji obuhvata primenu rAAV čestice u strijatum, gde rAAV čestica sadrži rAAV vektor koji kodira heterolognu nukleinsku kiselinu koja je eksprimirana barem u koriu velikog mozga i strijatumu sisara. HB karakterišu progresivni simptomi povezani sa ukupnim kretanjem i motoričkom kontrolom, spoznajom i mentalnim zdravljem. Dok se precizna priroda i obim simptoma razlikuju među pojedincima, simptomi generalno napreduju tokom vremena. U većini slučajeva, simptomi počinju da se pojavljuju između 30. i 40. godine života sa suptilnim poremećajima u motoričkim veštinama, spoznajama i ličnosti.
Vremenom, oni napreduju u trzave, nekontrolisane pokrete i gubitak kontrole mišića, demenciju i psihijatrijske bolesti kao što su depresija, agresija, anksioznost i opsesivnokompulsivno ponašanje. Smrt se obično javlja 10-15 godina nakon pojave simptoma. Manje od 10% slučajeva HB uključuje juvenilni oblik bolesti, koji karakteriše brža progresija bolesti. Smatra se da otprilike 1 od 10.000 Amerikanaca ima HB.
[0094] Većina slučajeva HB je povezana sa ekspanzijom CAG ponavljanja trinukleotida u HTT genu. Broj CAG ponavljanja u HTT genu je u snažnoj korelaciji sa manifestacijom HB. Na primer, osobe sa 35 ili manje ponavljanja obično ne razvijaju HB, ali osobe sa između 27 i 35 ponavljanja imaju veći rizik da imaju potomstvo sa HB. Pojedinci sa između 36 i 40-42 ponavljanja imaju nepotpunu penetraciju HB, dok pojedinci sa više od 40-42 ponavljanja pokazuju potpunu penetraciju. Slučajevi HB sa juvenilnim početkom mogu biti povezani sa CAG ponavljanjem od 60 ili više.
[0095] PolyQ-prošireni Htt protein koji je rezultat ove ekspanzije CAG ponavljanja povezan je sa ćelijskim agregatima ili inkluzionim telima, poremećajima homeostaze proteina i transkripcionom disregulacijom. Iako ovi toksični fenotipovi mogu biti povezani sa nekoliko delova tela, oni su najčešće povezani sa smrću neuronskih ćelija. HB pacijenti često pokazuju stanjivanje kore i upečatljiv, progresivan gubitak strijatalnih neurona. Čini se da je strijatum najranjiviji region mozga na HB (naročito strijatalni srednji trnasti neuroni), sa ranim efektima koji se vide u putamenu i kaudalnom jezgru. Smrt ćelija u strijatalnim trnastim neuronima, povećan broj astrocita i aktivacija mikroglije primećeni su u mozgu pacijenata sa HB. HB može takođe uticati na određene regione hipokampusa, cerebralne kore, talamusa, hipotalamusa i malog mozga.
[0096] Životinjski modeli HB mogu se koristiti za testiranje potencijalnih terapijskih strategija, kao što su sastavi predmetnog obelodanjenja. Mišji modeli za HB su poznati u struci. To uključuje mišje modele sa fragmentima mutantnog HTT kao što su R6/1 i N171-82Q HB miševi (Harper i dr., (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:5820-5825, Rodriguez-Lebron i dr., (2005) Mol. Ther.12:618-633, Machida i dr., (2006) Biochem. Biophys. Res.
Commun. 343:190-197). Još jedan primer mišjeg modela HB koji je ovde opisan je mišji model YAC128. Ovaj model nosi veštački hromozom kvasca (YAC) koji eksprimira mutantni ljudski HTT gen sa 128 CAG ponavljanja, a YAC128 miševi pokazuju značajno i široko rasprostranjeno nakupljanje Htt agregata u strijatumu do uzrasta od 12 meseci (Slow i dr., (2003) Hum. Mol. Genet.12:1555-1567, Pouladi i dr., (2012) Hum. Mol. Genet.
21:2219-2232).
[0097] Mogu se koristiti i drugi životinjski modeli za HB. Na primer, opisani su modeli transgenog pacova (von Horsten, S. i dr. (2003) Hum. Mol. Genet.12:617-24) i rezus majmuna(Yang, S.H. i dr. (2008) Nature 453:921-4). Poznati su i negenetski modeli. Oni najčešće uključuju upotrebu ekscitotoksičnih jedinjenja (kao što su hinolinska kiselina ili kainska kiselina) ili mitohondrijalnih toksina (kao što su 3-nitropropionska kiselina i malonska kiselina) kako bi izazvali smrt strijatalnih neurona kod glodara ili primata koji nisu ljudi (za više opisa i reference, pogledati Ramaswamy, S. i dr. (2007) ILAR J.48:356-73).
[0098] U nekim aspektima, obelodanjenje pruža rAAV česticu koja sadrži rAAV vektor koji kodira heterolognu nukleinsku kiselinu koja je eksprimirana barem u kori velikog mozga i strijatumu za upotrebu za ublažavanje simptoma HB, uključujući primenu rAAV čestice koja sadrži rAAV vektor za strijatum. U nekim otelotvorenjima, simptomi HB uključuju, ali nisu ograničeni na naredno: horeja, ukočenost, nekontrolisane pokrete tela, gubitak kontrole mišića, nedostatak koordinacije, nemir, usporene pokrete očiju, abnormalno držanje, nestabilnost, ataksičan hod, abnormalno eksprimiranje lica, problemi sa govorom, poteškoće sa žvakanjem i/ili gutanjem, poremećaj sna, napadi, demencija, kognitivni deficiti (npr., smanjene sposobnosti vezane za planiranje, apstraktno mišljenje, fleksibilnost, usvajanje pravila, interpersonalnu osetljivost, samokontrolu, pažnju, učenje i pamćenje), depresija, anksioznost, promene ličnosti, agresija, kompulsivno ponašanje, opsesivno-kompulsivno ponašanje, hiperseksualnost, psihoza, apatija, razdražljivost, samoubilačke misli, gubitak težine, atrofija mišića, srčana insuficijencija, smanjena tolerancija na glukozu, atrofija testisa i osteoporoza.
[0099] U nekim aspektima, obelodanjenje pruža rAAV česticu za upotrebu da spreči ili odloži napredovanje HB. Autozomno dominantna HB je genetska bolest koja se može genotipizirati. Na primer, broj CAG ponavljanja u HTT može se odrediti određivanjem veličine ponavljanja na osnovu PCR. Ova vrsta dijagnoze može se izvršiti u bilo kojoj fazi života direktnim testiranjem maloletnika ili odraslih (npr., zajedno sa prezentacijom kliničkih simptoma), prenatalnim skriningom ili prenatalnim testiranjem isključenja (npr., uzorkovanjem horionskih resica ili amniocentezom), ili preimplantacionim skriningom embriona. Pored toga, HB se može dijagnostikovati snimanjem mozga, tražeći skupljanje kaudalnih jezgara i/ili putamena i/ili uvećanih komora. Ovi simptomi, u kombinaciji sa porodičnom istorijom HB i/ili kliničkim simptomima, mogu ukazivati na HB.
[0100] Načini za određivanje ublažavanja simptoma HB poznati su u struci. Na primer, Unified Huntington's Disease Rating Scale (UHDRS) može se koristiti za procenu motoričke funkcije, kognitivne funkcije, abnormalnosti u ponašanju i funkcionalnog kapaciteta (pogledati, npr., Huntington Study Group (1996) Movement Disorders 11:136-42). Ova skala ocenjivanja je razvijena da pruži jednoobrazan, sveobuhvatan test za više aspekata patologije bolesti, uključujući elemente iz testova kao što su HB skala aktivnosti i svakodnevnog života, Marsdenova i Kvinova skala ozbiljnosti horeje, skale fizičkog invaliditeta i nezavisnosti, HB skala motoričke ocene (HDMRS), HB skala funkcionalnog kapaciteta (HDFCS) i kvantitativni neurološki pregled (QNE). Drugi testovi korisni za određivanje ublažavanja HB simptoma mogu uključivati, bez ograničenja, Montrealsku kognitivnu procenu, snimanje mozga (npr., MRI), Test tečnosti u kategorijama, Test pravljenja staze, Pretraga mapa, Stroop test čitanja reči, zadatak ubrzanog tapkanja i test modaliteta cifara simbola.
[0101] U nekim aspektima, rAAV čestice se koriste za tretman ljudi sa HB. Kao što je gore opisano, HB se nasleđuje na autozomno dominantan način i uzrokovana je ekspanzijom CAG ponavljanja u HTT genu. rAAV čestice mogu uključivati, npr., heterolognu nukleinsku kiselinu koja kodira terapeutski polipeptid ili nukleinsku kiselinu koja cilja HTT. HB sa juvenilnim početkom najčešće se nasleđuje sa očeve strane. Fenotipovi slični Hantingtonovoj bolesti su takođe u korelaciji sa drugim genetskim lokusima, kao npr HDL1, PRNP, HDL2, HDL3, i HDL4. Smatra se da drugi genetski lokusi mogu modifikovati manifestaciju HB simptoma, uključujući mutacije u GRIN2A, GRIN2B, MSX1, GRIK2, i APOE genima.
[0102] U nekim otelotvorenjima, isporuka rekombinantnih virusnih čestica je injekcijom virusnih čestica u strijatum. Intrastrijatalna primena isporučuje rekombinantne virusne čestice u deo mozga, strijatum (uključujući putamen i kaudalno jezgro), koji je visoko zahvaćen od strane HB. Osim toga, i bez želje da se vežemo za teoriju, smatra se da se rekombinantne virusne čestice (npr., rAAV čestice) injektirane u strijatum mogu takođe dispergovati (npr., kroz retrogradni transport) u druge oblasti mozga, uključujući bez ograničenja oblasti projekcije (npr., kora velikog mozga). U nekim otelotvorenjima, rekombinantne virusne čestice se isporučuju isporukom poboljšanom konvekcijom (npr., isporuka u strijatum poboljšana konvekcijom).
[0103] U nekim otelotvorenjima, transgen (npr., heterologna nukleinska kiselina koja je ovde opisana) je operativno vezana za promoter. Primeri promotera uključuju, ali nisu ograničeni na, neposredni rani promoter citomegalovirusa (CMV), GUSB promoter, RSV LTR, MoMLV LTR, promoter fosfoglicerat kinaze-1 (PGK), promoter virusa majmuna 40 (SV40) i CK6 promoter, transtiretin promoter (TTR), TK promoter, responsivni promoter tetraciklina (TRE), HBV promoter, hAAT promoter, LSP promoter, himerni promoteri specifični za jetru (LSP), E2F promoter, promoter telomeraze (hTERT); pojačivač citomegalovirusa/kokošiji beta-aktin/promoter zečjeg β-globina (CAG promoter; Niwa i dr., Gene, 1991, 108(2):193-9) i promoter faktora elongacije 1-alfa (EFl-alfa) (Kim i dr., Gene, 1990, 91(2):217-23 and Guo i dr., Gene Ther., 1996, 3(9):802-10). U nekim otelotvorenjima, promoter sadrži ljudski βglukuronidazni promoter ili pojačivač citomegalovirusa vezan za promoter kokošijeg β-aktina (CBA). Promoter može biti konstitutivni, inducibilni ili represivni promoter. U nekim otelotvorenjima, obelodanjenje pruža rekombinantni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira heterolognu nukleinsku kiselinu predmetnog obelodanjenja koja je operativno povezana sa CBA promoterom. U nekim otelotvorenjima, promoter je CBA promoter, minimalni CBA promoter, CMV promoter ili GUSB promoter.
[0104] Primeri konstitutivnih promotera uključuju, bez ograničenja, LTR promoter retrovirusnog Rous sarkoma virusa (RSV) (opciono sa pojačivačem RSV), promoter citomegalovirusa (CMV) (opciono sa CMV pojačivačem) [pogledati, npr., Boshart i dr., Cell, 41:521-530 (1985)], SV40 promoter, promoter dihidrofolat reduktaze, promoter 13-aktina, promoter fosfoglicerol kinaze (PGK) i promoter EFla [Invitrogen].
[0105] Inducibilni promoteri omogućavaju regulaciju eksprimiranja gena i mogu se regulisati egzogenim jedinjenjima, faktorima sredine kao što su temperatura ili prisustvo specifičnog fiziološkog stanja, npr., akutna faza, određeno stanje diferencijacije ćelije ili samo u ćelijama koje se replikuju. Inducibilni promoteri i inducibilni sistemi su dostupni iz različitih komercijalnih izvora, uključujući, bez ograničenja, Invitrogen, Clontech i Ariad. Mnogi drugi sistemi su opisani i stručnjak može lako da ih izabere. Primeri inducibilnih promotera regulisanih egzogeno dostavljenim promoterima uključuju promoter ovčijeg metalotionina (MT) inducibilnog cinkom, promoter virusa tumora dojke miša inducibilnog deksametazonom (Dex) (MMTV), sistem promotera T7 polimeraze (WO 98/10088); promoter ekdizona insekata (No i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996)), tetraciklin-represivni sistem (Gossen i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)), sistem koji se indukuje tetraciklinom (Gossen i dr., Science, 268:1766-1769 (1995), takođe pogledati Harvey i dr., Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998)), RU486-inducibilni sistem (Wang i dr., Nat. Biotech., 15:239-243 (1997) i Wang i dr., Gene Ther., 4:432-441 (1997)) i rapamicin-inducibilni sistem (Magari i dr., J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)). Drugi tipovi inducibilnih promotera koji mogu biti korisni u ovom kontekstu su oni koji su regulisani specifičnim fiziološkim stanjem, npr., temperatura, akutna faza, određeno stanje diferencijacije ćelije ili samo u ćelijama koje se replikuju.
[0106] U drugom aspektu, koristiće se nativni promoter, ili njegov fragment. Nativni promoter može biti poželjniji kada se želi da eksprimiranje transgena oponaša nativnu eksprimiranje. Nativni promoter se može koristiti kada eksprimiranje transgena mora biti regulisano vremenski ili razvojno, ili na tkivno-specifičan način, ili kao odgovor na specifične transkripcione stimuluse. U narednom otelotvorenju, drugi elementi kontrole nativnog eksprimiranja, kao što su pojačivači, mesta poliadenilacije ili Kozak konsenzus sekvence, takođe mogu da se koriste da oponašaju nativno eksprimiranje.
[0107] U nekim otelotvorenjima, regulatorne sekvence daju sposobnost eksprimiranja gena specifičnog za tkivo. U nekim slučajevima, tkivno specifične regulatorne sekvence vezuju faktore transkripcije specifične za tkivo koji indukuju transkripciju na tkivno specifičan način. Takve tkivno specifične regulatorne sekvence (npr., promoteri, pojačivači, itd.) su dobro poznati u struci. Primeri tkivno specifičnih regulatornih sekvenci uključuju, ali nisu ograničeni na naredne tkivno specifične promotere: neuronski kao što je promoter neuronspecifične enolaza (NSE) (Andersen i dr., Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993)), promoter gena neurofilamentnog lakog lanca (Piccioli i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991)), i neuronski specifičan promoter vgf gena (Piccioli i dr., Neuron, 15:373-84 (1995)). U nekim otelotvorenjima, tkivno-specifični promoter je promoter gena odabran od narednog: neuronska jezgra (NeuN), glijalni fibrilarni kiseli protein (GFAP), adenomatozna polipozna koli (APC) i kalcijum-vezujući jonizovani adapterski molekul 1 (Iba-1). Stručnjaku će biti očigledni drugi odgovarajući promoteri specifični za tkivo. U nekim otelotvorenjima,
4
promoter je promoter kokošijeg beta-aktina.
[0108] U nekim otelotvorenjima, promoter eksprimira heterolognu nukleinsku kiselinu u ćeliji CNS. Kao takvi, u nekim otelotvorenjima, terapeutski polipeptid ili terapeutska nukleinska kiselina mogu se koristiti za tretman poremećaja CNS. U nekim otelotvorenjima, promoter eksprimira heterolognu nukleinsku kiselinu u moždanoj ćeliji. Moždana ćelija se može odnositi na bilo koju ćeliju mozga poznatu u struci, uključujući bez ograničenja neuron (kao što je senzorni neuron, motorni neuron, interneuron, dopaminergički neuron, srednji trnast neuron, holinergički neuron, GABAergični neuron, piramidalni neuron, itd.), glijalne ćelije (kao što su mikroglija, makroglija, astrociti, oligodendrociti, ependimalne ćelije, radijalna glija, itd.), ćelija moždanog parenhima, mikroglijalnu ćeliju, ependimalnu ćeliju i/ili Purkinjeovu ćeliju. U nekim otelotvorenjima, promoter eksprimira heterolognu nukleinsku kiselinu u neuronu i/ili glijalnoj ćeliji. U nekim otelotvorenjima, neuron je srednji trnast neuron kaudalnog jezgra, srednji trnasti neuron putamena, neuron sloja IV moždane kore i/ili neuron sloja V moždane kore.
[0109] Različiti promoteri koji eksprimiraju transkripte (npr., heterologni transgen) u CNS ćelijama, moždanim ćelijama, neuronima i glijalnim ćelijama su poznati u struci i ovde su opisani. Takvi promoteri mogu da sadrže kontrolne sekvence koje su normalno povezane sa odabranim genom ili heterologne kontrolne sekvence. Često korisne heterologne kontrolne sekvence uključuju one izvedene iz sekvenci koje kodiraju gene sisara ili virusa. Primeri uključuju, bez ograničenja, SV40 rani promoter, LTR promoter virusa tumora mlečne žlezde miša, kasni promoter adenovirusa (Ad MLP), promoter virusa herpes simpleksa (HSV), promoter citomegalovirusa (CMV), kao što je CMV region neposrednog ranog promotera (CMVIE), promoter virusa rous sarkoma (RSV), sintetički promoteri, hibridni promoteri i slično. Pored toga, mogu se koristiti i sekvence izvedene iz nevirusnih gena, kao što je mišji metalotioneinski gen. Takve promoterske sekvence su komercijalno dostupne od, npr., Stratagene (San Dijego, CA). Mogu se koristiti CNS-specifični promoteri i inducibilni promoteri. Primeri CNS-specifičnih promotera obuhvataju bez ograničenja one izolovane iz CNS-specifičnih gena kao što su bazični protein mijelina (MBP), protein glijalne fibrilarne kiseline (GFAP) i neuron specifična enolaza (NSE). Primeri inducibilnih promotera uključuju elemente koji reaguju na DNK za ekdizon, tetraciklin, metalotionein i hipoksiju, između ostalog.
[0110] Ovde je otkrivena upotreba rekombinantnog virusnog genoma za uvođenje jedne ili više sekvenci nukleinske kiseline koje kodiraju za heterolognu nukleinsku kiselinu ili pakovanja u AAV virusnu česticu. Rekombinantni virusni genom može uključivati bilo koji element za uspostavljanje eksprimiranja heterolognog transgena, na primer, promoter, heterolognu nukleinsku kiselinu, ITR, ribozom vezujući element, terminator, pojačivač, selekcioni marker, intron, polyA signal i/ili poreklo replikacije. U nekim otelotvorenjima, rAAV vektor sadrži jedan ili više pojačivača, donor splajsovanja/primalac splajsovanja parova, mesta vezivanja matriksa ili signala poliadenilacije.
[0111] U nekim otelotvorenjima, primena efikasne količine rAAV čestica koje sadrže vektor koji kodira terapeutsku nukleinsku kiselinu ili polipeptid transducira ćelije (npr., CNS ćelije, moždane ćelije, neuroni i/ili glijalne ćelije) na ili blizu mesta primene (npr. strijatum i/ili moždana kora) ili distalnije od mesta primene. U nekim otelotvorenjima, više od oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% ili 100% neurona je transducirano. U nekim otelotvorenjima, oko 5% do oko 100%, oko 10% do oko 50%, oko 10% do oko 30%, oko 25% do oko 75%, oko 25% do oko 50%, ili oko 30% do oko 50% neurona je transducirano. Postupci za identifikaciju neurona transduciranih rekombinantnim virusnim česticama koje eksprimiraju miRNK su poznati u struci; na primer, imunohistohemija, detektovanje RNK (npr., QPCR, Northern blotting, RNK-seq, in situ hibridizacija i slično) ili upotreba ko-eksprimiranog markera kao što je pojačani zeleni fluorescentni protein može se koristiti za detektovanje eksprimiranja.
[0112] U nekim aspektima, obelodanjenje pruža virusne čestice koje sadrže rekombinantni samo-komplementaran genom (npr., samo-komplementaran rAAV vektor). AAV virusne čestice sa samo-komplementaranim vektorskim genomima i postupci upotrebe samokomplementaranih AAV genoma su opisane u SAD patentima br.6,596,535; 7,125,717; 7,465,583; 7,785,888; 7,790,154; 7,846,729; 8,093,054; i 8,361,457; i Wang Z., i dr., (2003) Gene Ther 10:2105-2111. rAAV koji sadrži samo-komplementarani genom će brzo formirati dvolančani DNK molekul zahvaljujući svojim delimično komplementarnim sekvencama (npr., dopunjujući kodirajuće i nekodirajuće niti heterologne nukleinske kiseline). U nekim otelotvorenjima, vektor sadrži prvu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira heterolognu nukleinsku kiselinu i drugu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira komplement nukleinske kiseline, gde prva sekvenca nukleinske kiseline može formirati bazne parove unutar lanca sa drugom sekvencom nukleinske kiseline duž većine ili celom svojom dužinom.
[0113] U nekim otelotvorenjima, prva heterologna sekvenca nukleinske kiseline i druga heterologna sekvenca nukleinske kiseline su povezane mutiranim ITR (npr., pravi ITR). U nekim otelotvorenjima, ITR sadrži polinukleotidnu sekvencu 5'-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCC GGGCGACCAAAGGTCGCCCACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCG - 3' (SEQ ID NO:1). Mutirani ITR sadrži brisanje D regiona koji sadrži sekvencu terminalne rezolucije. Kao rezultat toga, prilikom replikacije AAV virusnog genoma, rep proteini neće cepati virusni genom na mutiranom ITR i, stoga, rekombinantni virusni genom koji sadrži naredno u redosledu od 5' do 3' biće upakovan u virusni kapsid: AAV ITR, prva heterologna polinukleotidna sekvenca koja uključuje regulatorne sekvence, mutirani AAV ITR, drugi heterologni polinukleotid u obrnutoj orijentaciji u odnosu na prvi heterologni polinukleotid i treći AAV ITR.
V. Virusne čestice i postupci proizvodnje virusnih čestica
rAAV virusne čestice
[0114] Obelodanjenje pruža sisteme za primenu rAAV čestica. U nekim otelotvorenjima, rAAV čestica sadrži rAAV vektor. U nekim otelotvorenjima, virusna čestica je rekombinantna AAV čestica koja sadrži nukleinsku kiselinu koja sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu okruženu jednim ili dva AAV invertovana terminalna ponavljanja (ITR). Nukleinska kiselina je inkapsulirana u AAV čestici. AAV čestica takođe sadrži kapsidne proteine. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina sadrži kodirajuće sekvence od interesa (npr., heterologna nukleinska kiselina) operativno povezane komponente u pravcu transkripcije, kontrolne sekvence uključujući sekvence inicijacije i terminacije transkripcije, čime se formira kaseta eksprimiranja. Kaseta eksprimiranja je okružena na 5' i 3' kraju sa najmanje jednom funkcionalnom AAV ITR sekvencom. Pod „funkcionalnom AAV ITR sekvencom“ podrazumeva se da ITR sekvenca funkcioniše onako kako je predviđeno za spasavanje, replikaciju i pakovanje AAV viriona. Pogledati Davidson i dr., PNAS, 2000, 97(7)3428-32; Passini i dr., J. Virol., 2003, 77(12):7034-40; and Pechan i dr., Gene Ther., 2009, 16:10-16. Za praktikovanje nekih aspekata, rekombinantni vektori obuhvataju najmanje sve sekvence AAV bitne za inkapsidaciju i fizičke strukture za infekciju od strane rAAV. AAV ITR za upotrebu u vektorima ne moraju imati nukleotidnu sekvencu divljeg tipa (npr., kao što je opisano u Kotin, Hum. Gene Ther., 1994, 5:793-801), i mogu biti izmenjeni umetanjem, brisanjem ili supstitucijom nukleotida ili AAV ITR mogu biti izvedeni iz bilo
4
kog od nekoliko AAV serotipova. Trenutno je poznato više od 40 serotipova AAV, a novi serotipovi i varijante postojećih serotipova se još uvek identifikuju. Pogledati Gao i dr., PNAS, 2002, 99(18): 11854-6; Gao i dr., PNAS, 2003, 100(10):6081-6; and Bossis i dr., J. Virol., 2003, 77(12):6799-810. Upotreba bilo kog AAV serotipa se smatra u okviru ovog pronalaska. U nekim otelotvorenjima, rAAV vektor je vektor izveden iz AAV serotipa, uključujući bez ograničenja, AAV ITR su AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, kozji AAV, goveđi AAV ili mišji AAV ili slično. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina u AAV ITR je AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV1, AAV2AV7, goveđi AAV ili mišji AAV serotip ITR ili slično. U određenim otelotvorenjima, nukleinska kiselina u AAV sadrži AAV2 ITR.
[0115] U nekim otelotvorenjima, vektor može uključivati nukleinsku kiselinu za punjenje. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina za punjenje može da kodira zeleni fluorescentni protein. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina za punjenje može biti locirana između promotera i nukleinske kiseline koja kodira RNKi.
[0116] U daljim otelotvorenjima, rAAV čestice sadrže AAV1 kapsid, AAV2 kapsid, AAV3 kapsid, AAV4 kapsid, AAV5 kapsid, AAV6 kapsid (npr., AAV6 kapsid divljeg tipa, ili varijanta AAV6 kapsida kao što je ShH10, kao što je opisano u SAD PG publikaciji.
2012/0164106), AAV7 kapsid, AAV8 kapsid, AAVrh8 kapsid, AAVrh8R kapsid, AAV9 kapsid (npr., AAV9 kapsid divljeg tipa ili modifikovani AAV9 kapsid kao što je opisano u SAD PG publikaciji.2013/0323226), AAV10 kapsid, AAVrh10 kapsid, AAV11 kapsid, AAV12 kapsid, mutant kapsida tirozina, mutant kapsida koji se vezuje za heparin, AAV2R471A kapsid, AAVAAV2/2-7m8 kapsid, AAV DJ kapsid (npr., AAV-DJ/8 kapsid, AAV-DJ/9 kapsid ili bilo koji drugi kapsid opisan u SAD PG publikaciji.2012/0066783), AAV2 kapsid N587A, AAV2 E548A kapsid, AAV2 N708A kapsid, AAV V708K kapsid, kapsid kozjeg AAV, himerni AAV1/AAV2 kapsid, goveđi AAV kapsid, mišji AAV kapsid, AAV1/HAV2 himerni kapsid, ili AAV kapsid opisan u SAD patentu br.8,283,151 ili Međunarodnoj prijavi br. WO/2003/042397. U nekim otelotvorenjima, mutantni kapsidni protein održava sposobnost da formira AAV kapsid. U nekim otelotvorenjima, rAAV čestica sadrži AAV5 tirozin mutantni kapsid (Zhong L. i dr., (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105(22):7827-7832. U daljim otelotvorenjima, rAAV čestica sadrži kapsidne proteine od AAV serotipa iz kladusa A-F (Gao, i dr., J. Virol.2004, 78(12):6381). U nekim otelotvorenjima, rAAV čestica sadrži AAV1 kapsidni protein ili njegov mutant. U drugim otelotvorenjima, rAAV čestica sadrži AAV2 kapsidni protein ili njegov mutant. U nekim otelotvorenjima, AAV serotip je AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10 ili AAVrh10. U nekim otelotvorenjima, rAAV čestica sadrži kapsid AAV serotipa 1 (AAV1). U nekim otelotvorenjima, rAAV čestica sadrži kapsid AAV serotipa 2 (AAV2).
[0117] Različiti AAV serotipovi se koriste za optimizaciju transdukcije određenih ciljanih ćelija ili za ciljanje specifičnih tipova ćelija unutar određenog ciljanog tkiva (npr., CNS tkivo). rAAV čestica može da sadrži virusne proteine i virusne nukleinske kiseline izvedene iz istog serotipa ili različitih serotipova (npr., mešoviti serotip). Na primer, u nekim otelotvorenjima rAAV čestica može da sadrži AAV1 kapsidne proteine i najmanje jedan AAV2 ITR ili može da sadrži AAV2 kapsidne proteine i najmanje jedan AAV1 ITR. Bilo koja kombinacija AAV serotipova za proizvodnju rAAV čestice je ovde data kao da je svaka kombinacija ovde izričito navedena. U nekim otelotvorenjima, obelodanjenje pruža rAAV čestice koje sadrže AAV1 kapsid i rAAV vektor predmetnog obelodanjenja (npr., kaseta eksprimiranja koja sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu), okruženu najmanje jednim AAV2 ITR. U nekim otelotvorenjima, obelodanjenje pruža rAAV čestice koje sadrže AAV2 kapsid. U nekim otelotvorenjima, ITR i kapsid su izvedeni iz AAV2. U nekim otelotvorenjima, ITR je izveden iz AAV2, i kapsid je izveden iz AAV1.
Proizvodnja AAV čestica
[0118] U struci su poznati brojni postupci za proizvodnju rAAV vektora, uključujući transfekciju, proizvodnju stabilne ćelijske linije i sisteme za proizvodnju infektivnih hibridnih virusa koji uključuju adenovirus-AAV hibride, herpesvirus-AAV hibride (Conway, JE i dr., (1997) J. Virology 71(11):8780-8789) i bakulovirus-AAV hibride. Sve rAAV kulture za proizvodnju za proizvodnju rAAV virusnih čestica zahtevaju; 1) pogodne ćelije domaćine, uključujući, na primer, ćelijske linije ljudskog porekla kao što su HeLa, A549 ili 293 ćelije, ili ćelijske linije dobijene od insekata kao što je SF-9, u slučaju sistema proizvodnje bakulovirusa; 2) odgovarajuću pomoćnu funkciju virusa, koju pruža adenovirus divljeg tipa ili mutant (kao što je temperaturno osetljiv adenovirus), virus herpesa, bakulovirus ili plazmidni konstrukt koji pruža pomoćne funkcije; 3) AAV rep i cap geni i genski proizvodi; 4) nukleinsku kiselinu (kao što je terapeutska nukleinska kiselina) okruženu najmanje jednom
4
AAV ITR sekvencom; i 5) odgovarajući medijumi i komponente medijuma za podršku proizvodnje rAAV. U nekim otelotvorenjima, proizvodi AAV rep i cap gena mogu biti iz bilo kog AAV serotipa. Uopšteno govoreći, ali ne i obavezno, proizvod AAV rep gena je istog serotipa kao ITR od genoma rAAV vektora sve dok proizvodi rep gena mogu da funkcionišu da se replikuju i pakuju rAAV genom. Pogodni medijumi poznati u struci mogu se koristiti za proizvodnju rAAV vektora. Ovi medijumi uključuju, bez ograničenja, medijume koje proizvode Hyclone Laboratories i JRH uključujući modifikovani Iglov medijum (MEM), Dulbekov modifikovani Iglov medijum (DMEM), prilagođene formulacije kao što su one opisane u SAD patentu br.6,566,118i Sf-900 II SFM medijum kao što je opisano u SAD patentu br.6,723,551, posebno u pogledu prilagođenih formulacija medijuma za upotrebu u proizvodnji rekombinantnih AAV vektora. U nekim otelotvorenjima, AAV pomoćne funkcije pružaju adenovirus ili HSV. U nekim otelotvorenjima, AAV pomoćne funkcije su pružene od strane bakulovirusa, i ćelija domaćina je ćelija insekata (npr., Spodoptera frugiperda (Sf9) ćelije).
[0119] U nekim otelotvorenjima, rAAV čestice se mogu proizvesti postupkom trostruke transfekcije, kao što je primer trostruke transfekcije pružen infra. Ukratko, plazmid koji sadrži rep gen i kapsid gen, zajedno sa pomoćnim adenovirusnim plazmidom, može biti transficiran (npr., primenom postupka kalcijum fosfata) u ćelijsku liniju (npr., HEK-293 ćelije), i virus se može prikupiti i opciono prečistiti. Stoga, u nekim otelotvorenjima, rAAV čestica je proizvedena trostrukom transfekcijom nukleinske kiseline koja kodira rAAV vektor, nukleinske kiseline koja kodira AAV rep i cap, i nukleinske kiseline koja kodira fukcije AAV pomoćnog virusa u ćeliji domaćina, gde transfekcija nukleinskih kiselina u ćelije domaćina stvara ćeliju domaćina sposobnu da proizvodi rAAV čestice.
[0120] U nekim otelotvorenjima, rAAV čestice mogu da se proizvedu postupkom proizvodne ćelijske linije, kao što je primerna postupka proizvodne ćelijske linije pružena infra (pogledati takođe (navedeno kod Martin i dr., (2013) Human Gene Therapy Methods 24:253-269). Ukratko, ćelijska linija (npr., HeLa ćelijska linija) može biti stabilno transficirana sa plazmidom koji sadrži rep gen, kapsid gen i sekvencu nukleinske kiseline koja je promoter heterologna. Ćelijske linije se mogu pregledati kako bi se odabrao vodeći klon za proizvodnju rAAV, koji se zatim može proširiti na proizvodni bioreaktor i inficirati adenovirusom (npr., adenovirus divljeg tipa) kao pomoćnik za pokretanje proizvodnje rAAV. Virus se može naknadno sakupiti, adenovirus može biti inaktiviran (npr., toplotom) i/ili uklonjen, i rAAV
4
čestice se mogu prečistiti. Stoga, u nekim otelotvorenjima, rAAV čestica je proizvedena od strane proizvodne ćelijske linije koja sadrži jednu ili više nukleinskih kiselina koje kodiraju rAAV vektor, nukleinsku kiselinu koja kodira AAV rep i cap, i nukleinsku kiselinu koja kodira funkcije AAV pomoćnog virusa.
[0121] U nekim aspektima, pružen je postupak za proizvodnju bilo koje rAAV čestice kako je ovde obelodanjeno i obuhvata (a) kultivisanje ćelije domaćina pod uslovom da se proizvode rAAV čestice, gde ćelija domaćin sadrži (i) jedan ili više AAV gena za pakovanje, gde svaki navedeni AAV gen za pakovanje kodira AAV protein za replikaciju i/ili enkapsulaciju; (ii) rAAV pro-vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira heterolognu nukleinsku kiselinu kao što je ovde opisano uz najmanje jedan AAV ITR, i (iii) AAV pomoćnu funkciju; i (b) obnavljanje rAAV čestica koje proizvodi ćelija domaćin. U nekim otelotvorenjima, navedeni najmanje jedan AAV ITR je izabran iz grupe koju čine AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, kozji AAV, goveđi AAV ili mišji AAV serotip ITR ili slično. U nekim otelotvorenjima, navedeni enkapsulacioni protein je izabran iz grupe koju čine AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, kozji AAV, AAV1/AAV2 himera, goveđi AAV ili mišji AAV kapsid rAAV2/HBoV1 serotip kapsidni proteini ili mutanti. U nekim otelotvorenjima, enkapsidacioni protein je AAV5 kapsidni protein uključujući AAV5 kapsidne proteine koji imaju mutacije tirozin kapsida. U nekim otelotvorenjima, enkapsidacioni protein je AAV5 kapsidni protein uključujući AAV5 kapsidne proteine koji imaju mutacije tirozinskog kapsida i ITR je AAV2 ITR. U daljim otelotvorenjima, rAAV čestica sadrži kapsidne proteine AAV serotipa iz klada A-F. U nekim otelotvorenjima, rAAV čestice sadrže AAV1 kapsid i rekombinantni genom koji sadrži AAV2 ITR, mutantni AAV2 ITR i nukleinsku kiselinu koja kodira terapeutski transgen/nukleinsku kiselinu. U nekim otelotvorenjima, AAV ITR su AAV ITR su AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, goveđi AAV ili mišji AAV serotip ITR. U određenim otelotvorenjima, AAV ITR su AAV2 ITR.
[0122] Pogodni medijumi za proizvodnju rAAV kulture mogu biti dopunjeni serumom ili rekombinantnim proteinima dobijenim iz seruma pri nivou od 0,5%-20% (zap./zap. ili
4
tež./zap.). Alternativno, kao što je poznato u struci, rAAV vektori mogu biti proizvedeni pod uslovima bez seruma koji se takođe mogu nazvati medijumima bez proizvoda životinjskog porekla. Stručnjak može shvatiti da komercijalni ili prilagođeni medijumi dizajnirani da podrže proizvodnju rAAV vektora mogu takođe biti dopunjeni jednom ili više komponenti ćelijske kulture poznatih u struci, uključujući bez ograničenja glukozu, vitamine, aminokiseline i/ili faktore rasta, u cilju povećanja titra rAAV u proizvodnim kulturama.
[0123] Kulture za proizvodnju rAAV mogu se uzgajati pod različitim uslovima (u širokom temperaturnom rasponu, tokom različitih dužina vremena i slično) pogodnim za određenu ćeliju domaćina koja se koristi. Kao što je poznato u struci, kulture za proizvodnju rAAV uključuju kulture zavisne od vezivanja koje se mogu uzgajati u odgovarajućim posudama zavisnim od vezivanja, kao što su, na primer, boce sa valjkom, filteri sa šupljim vlaknima, mikronosači i bioreaktori sa upakovanim ili fluidizovanim slojem. Kulture za proizvodnju rAAV vektora mogu takođe uključivati ćelije domaćine prilagođene suspenziji, kao što su HeLa, 293 i SF-9 ćelije koje se mogu uzgajati na različite načine uključujući, na primer, bočice, bioreaktore sa mešanjem i sisteme za jednokratnu upotrebu kao što su Wave sistem vreća.
[0124] Čestice rAAV vektora mogu se sakupiti iz rAAV proizvodnih kultura lizom ćelija domaćina kulture za proizvodnju ili sakupljanjem istrošenog medijuma iz kulture za proizvodnju, pod uslovom da su ćelije kultivisane pod uslovima poznatim u struci da izazovu oslobađanje rAAV čestica u medijum iz netaknutih ćelija, kako je potpunije opisano u SAD patentu br.6,566,118). Pogodni postupci lize ćelija su takođe poznati u struci i uključuju na primer višestruke cikluse zamrzavanja/odmrzavanja, sonikaciju, mikrofluidizaciju i tretman hemikalijama, kao što su deterdženti i/ili proteaze.
[0125] U daljem otelotvorenju, rAAV čestice se prečišćavaju. Izraz „prečišćen“ kako se ovde koristi uključuje pripremu rAAV čestica lišenih bar nekih drugih komponenti koje takođe mogu biti prisutne tamo gde se rAAV čestice prirodno javljaju ili su prvobitno pripremljene. Tako, na primer, izolovane rAAV čestice mogu biti pripremljene korišćenjem tehnike prečišćavanja da se obogate iz izvorne smeše, kao što je lizat kulture ili supernatant kulture za proizvodnju. Obogaćivanje se može meriti na različite načine, kao što je, na primer, proporcija čestica otpornih na DNazu (DRP) ili kopija genoma (gc) prisutnih u rastvoru, ili infektivnošću, ili se može meriti u odnosu na druge, potencijalno interferirajuće supstance
4
prisutne u izvornoj smeši, kao što su zagađivači, uključujući zagađivače kulture za proizvodnju ili zagađivače u procesu, uključujući pomoćni virus, komponente medijuma i slično.
[0126] U nekim otelotvorenjima, proizvod kulture za proizvodnju rAAV je razbistren kako bi se uklonili ostaci ćelija domaćina. U nekim otelotvorenjima, proizvod kulture za proizvodnju je razbistren filtriranjem kroz seriju dubinskih filtera uključujući, na primer, stepen DOHC Millipore Millistak+ HC Pod filtera, stepen A1HC Millipore Millistak+ HC Pod filtera i 0,2 µm Filter Opticap XL1O Millipore Express SHC Hydrophilic Membrane filtera. Pojašnjenje se takođe može postići nizom drugih standardnih tehnika poznatih u struci, kao što je centrifugiranje ili filtracija kroz bilo koji celulozni acetatni filter veličine pora od 0,2 µm ili više, kako je poznato u struci.
[0127] U nekim otelotvorenjima, proizvod kulture za proizvodnju rAAV se dalje tretira sa Benzonase® kako bi se digestirala DNK bilo koje visoke molekularne težine prisutna u kulturi za proizvodnju. U nekim otelotvorenjima, digestija Benzonase® se izvodi pod standardnim uslovima poznatim u struci uključujući, na primer, konačnu koncentraciju od 1-2,5 jedinica/ml Benzonase® na temperaturi u rasponu od ambijentalne do 37°C tokom perioda od 30 minuta do nekoliko sati.
[0128] rAAV čestice se mogu izolovati ili prečistiti korišćenjem jednog ili više od narednih koraka prečišćavanja: ravnotežno centrifugiranje; protočno filtriranje anjonske razmene; filtracija tangencijalnog protoka (TFF) za koncentrisanje rAAV čestica; hvatanje rAAV apatitnom hromatografijom; toplotna inaktivacija pomoćnog virusa; hvatanje rAAV hromatografijom hidrofobne interakcije; razmena pufera hromatografijom isključivanja veličine (SEC); nanofiltracija; i hvatanje rAAV hromatografijom anjonske razmene, hromatografijom katjonske razmene ili afinitetnom hromatografijom. Ovi koraci se mogu koristiti sami, u različitim kombinacijama ili različitim redosledom. U nekim otelotvorenjima, postupak obuhvata sve korake po redosledu kao što je opisano u nastavku. Postupci za prečišćavanje rAAV čestica nalaze se, na primer, kod Xiao i dr., (1998) Journal of Virology 72:2224-2232; SAD patentnim brojevima 6,989,264 i 8,137,948; i WO 2010/148143.
[0129] U nekim otelotvorenjima, rAAV čestica je u farmaceutskom sastavu. Farmaceutski
4
sastavi mogu biti pogodni za bilo koji način primene koji je ovde opisan. Farmaceutski sastav rekombinantne virusne čestice koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira terapeutski transgen/nukleinsku kiselinu može se uvesti u CNS (npr., strijatum i/ili moždana kora).
[0130] U nekim otelotvorenjima, rAAV čestica je u farmaceutskom sastavu koji sadrži farmaceutski prihvatljiv ekscipijens. Kao što je dobro poznato u struci, farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi su relativno inertne supstance koje olakšavaju primenu farmakološki efikasne supstance i mogu se isporučiti kao tečni rastvori ili suspenzije, kao emulzije, ili kao čvrsti oblici pogodni za rastvaranje ili suspenziju u tečnosti pre upotrebe.. Na primer, ekscipijens može dati oblik ili konzistenciju, ili delovati kao razblaživač. Pogodni ekscipijensi uključuju, ali nisu ograničeni na, stabilizatore, agense za vlaženje i emulgovanje, soli za promenljivu osmolarnost, agense za kapsuliranje, pH puferske supstance i pufere. Takvi ekscipijensi uključuju bilo koji farmaceutski agens pogodan za direktnu isporuku u oko koji se može primeniti bez nepotrebne toksičnosti. Farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi uključuju, ali nisu ograničeni na, sorbitol, bilo koje od različitih TWEEN jedinjenja i tečnosti kao što su voda, fiziološki rastvor, glicerol i etanol. Farmaceutski prihvatljive soli mogu biti uključene u to, na primer, soli mineralnih kiselina kao što su hidrohloridi, hidrobromidi, fosfati, sulfati i slično; i soli organskih kiselina kao što su acetati, propionati, malonati, benzoati i slično. Detaljna diskusija o farmaceutski prihvatljivim ekscipijensima je dostupna u REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J.1991).
[0131] U nekim otelotvorenjima, primena sastava uključuje rAAV čestice i poloksamer. Izraz „poloksamer“ može da obuhvati mnoga jedinjenja jer se različite dužine za polioksipropilenske i polioksietilenske lance mogu koristiti u kombinaciji. Na primer, poloksamer može imati hemijsku formulu HO(C2H40)n(C3H60)m(C2H40)nH, gde n (tj. dužina polioksietilenskog lanca) ima vrednost od oko 60 do oko 150, a m (tj. dužina polioksipropilenskog lanca) ima vrednost od oko 25 do oko 60.
[0132] U nekim otelotvorenjima, poloksamer je poloksamer 188 (npr., CAS br.9003-11-6). Poloksameri se mogu opisati sistemom numerisanja koji označava njihovu približnu molekulsku težinu i procenat sadržaja polioksietilena. Ove vrednosti se često odnose na prosečnu vrednost u sastavu poloksamera, pre nego na apsolutnu vrednost svakog molekula poloksamera u sastavu. Prema ovoj metodologiji, prve dve cifre se množe sa 100 kako bi se dobila približna molekulska težina polioksipropilenskog bloka, a treća cifra se množi sa 10 kako bi se dobio težinski procenat polioksietilenskog bloka. Na primer, poloksamer 188 se može odnositi na poloksamer sa n koji ima vrednost od oko 80 i sa m koji ima vrednost od oko 27 kao u formuli prikazanoj iznad. Poloksamer 188 može imati prosečnu molekulsku težinu od oko 7680 do oko 9510 g/mol.
[0133] Poloksameri koji se prodaju pod trgovačkim imenom kao što je PLURONIC® mogu biti imenovani prema drugoj metodologiji. Za označavanje fizičkog stanja može se koristiti slovo (npr., F za čvrsto, P za pastu ili L za tečnost). Za označavanje hemijskih svojstava može se koristiti broj od 2 ili 3 cifre. Prva jedna ili dve cifre se množe sa 300 kako bi se dobila približna molekulska težina polioksipropilenskog bloka, a treća cifra se množi sa 10 kako bi se dobio težinski procenat polioksietilenskog bloka. Na primer, PLURONIC® ili LUTROL® F68 se mogu odnositi na čvrsti poloksamer sa n koji ima vrednost od oko 80 i sa m koji ima vrednost od oko 27 kao u formuli prikazanoj iznad. Stoga, u nekim otelotvorenjima, poloksamer 188 može biti PLURONIC® F68 ili LUTROL® F68.
[0134] U nekim otelotvorenjima, koncentracija poloksamera u sastavu se kreće od oko 0,0001% do oko 0,01%. U nekim otelotvorenjima, koncentracija poloksamera u sastavu je manja od bilo kog od narednih procenata: 0,01, 0,005, 0,001 ili 0,0005. U nekim otelotvorenjima, koncentracija poloksamera u sastavu je veća od bilo kog od narednih procenata: 0,0001, 0,0005, 0,001 ili 0,005. To jest, koncentracija poloksamera u sastavu može biti bilo koja od raspona procenata koji imaju gornju granicu od 0,01, 0,005, 0,001 ili 0,0005 i nezavisno odabranu donju granicu od 0,0001, 0,0005, 0,001 ili 0,005, gde je donja granica manja od gornje granice. U određenim otelotvorenjima, koncentracija poloksamera u sastavu iznosi oko 0,001%.
[0135] U nekim otelotvorenjima, sastav dalje sadrži natrijum hlorid. U nekim otelotvorenjima, koncentracija natrijum hlorida u sastavu se kreće od oko 100 mM do oko 250 mM. U nekim otelotvorenjima, koncentracija natrijum hlorida u sastavu je manja od bilo koje od narednih koncentracija (u mM): 250, 225, 200, 175, 150 ili 125. U nekim otelotvorenjima, koncentracija natrijum hlorida u sastavu je veća od bilo koje od narednih koncentracija (u mM): 100, 125, 150, 175, 200 ili 225. To jest, koncentracija natrijum hlorida u sastavu može biti bilo koja od niza koncentracija (u mM) koji imaju gornju granicu od 250, 225, 200, 175, 150 ili 125 i nezavisno odabranu donju granicu od 100, 125, 150, 175, 200 ili 225, gde je donja granica manja od gornje granice. U određenim otelotvorenjima,
1
koncentracija natrijum hlorida u sastavu iznosi oko 180 mM.
[0136] U nekim otelotvorenjima, sastav dalje sadrži natrijum fosfat. Natrijum fosfat se može odnositi na bilo koju pojedinačnu vrstu natrijum fosfata (npr., monobazni natrijum fosfat, dvobazni natrijum fosfat, trobazni natrijum fosfat i tako dalje), ili se može odnositi na natrijum fosfatni pufer, mešavinu jednobaznog i dvobaznog rastvora natrijum fosfata. Recepti za pufere natrijum fosfata u rasponu pH vrednosti mogu se naći u raznim standardnim protokolima molekularne biologije, kao što su Promega Protocols & Applications Guide, „Buffers for Biochemical Reactions,“ Appendix B part C.
[0137] U nekim otelotvorenjima, koncentracija natrijum fosfata u sastavu se kreće od oko 5 mM do oko 20 mM. U nekim otelotvorenjima, koncentracija natrijum fosfata u sastavu je manja od bilo koje od narednih koncentracija (u mM): 20, 15 ili 10. U nekim otelotvorenjima, koncentracija natrijum fosfata u sastavu je veća od bilo koje od narednih koncentracija (u mM): 5, 10 ili 15. To jest, koncentracija natrijum fosfata u sastavu može biti bilo koja od raspona koncentracija (u mM) koja ima gornju granicu od 20, 15 ili 10 i nezavisno odabranu donju granicu od 5, 10 ili 15, gde je donja granica manja od gornje granice. U određenim otelotvorenjima, koncentracija natrijum fosfata u sastavu je oko 10 mM.
[0138] U nekim otelotvorenjima, pH natrijum fosfata u sastavu iznosi oko 7,0 do oko 8,0. Na primer, u nekim otelotvorenjima, pH natrijum fosfata u sastavu iznosi oko 7,0, oko 7,2, oko 7,4, oko 7,5, oko 7,6, oko 7,8 ili oko 8,0. U određenim otelotvorenjima, pH natrijum fosfata u sastavu iznosi oko 7,5. Bilo koja od pH vrednosti za natrijum fosfat opisana ovde može da se kombinuje sa bilo kojom od vrednosti koncentracije za natrijum fosfat opisane iznad. Na primer, u nekim otelotvorenjima, koncentracija natrijum fosfata u sastavu je oko 10 mM, i pH je oko 7,5.
[0139] U nekim otelotvorenjima, farmaceutski sastav koji sadrži ovde opisanu rAAV česticu i farmaceutski prihvatljiv nosač je pogodan za primenu na ljudima. Takvi nosači su dobro poznati u struci (pogledati, npr., Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Edition, pp. 1035-1038 and 1570-1580). U nekim otelotvorenjima, farmaceutski sastav dalje sadrži poloksamer (npr., poloksamer 188, kao što su PLURONIC® ili LUTROL® F68). U nekim otelotvorenjima, farmaceutski sastav koji sadrži opisan ovde rAAV i farmaceutski prihvatljiv nosač je pogodan za injekciju u CNS sisara.
2
[0140] Takvi farmaceutski prihvatljivi nosači mogu biti sterilne tečnosti, kao što su voda i ulje, uključujući one naftnog, životinjskog, biljnog ili sintetičkog porekla, kao što je ulje od kikirikija, sojino ulje, mineralno ulje i slično. Slani rastvori i vodeni rastvori dekstroze, polietilen glikola (PEG) i glicerola se takođe mogu koristiti kao tečni nosači, posebno za rastvore za injekcije. Farmaceutski sastav može dalje da sadrži dodatne sastojke, na primer konzervanse, pufere, agense toničnosti, antioksidanse i stabilizatore, nejonske agense za vlaženje ili bistrenje, agense za povećanje viskoziteta i slično. Ovde opisani farmaceutski sastavi mogu biti upakovani u pojedinačne jedinične doze ili u višedozne oblike. Sastavi su generalno formulisani kao sterilni i suštinski izotonični rastvori.
VI. Sistemi za isporuku rAAV čestica
[0141] Takođe su pruženi sistemi za eksprimiranje heterologne nukleinske kiseline u cerebralnom korteksu i strijatumu sisara, koji obuhvataju (a) sastav koji sadrži rAAV čestice, gde rAAV čestice sadrže rAAV vektor koji kodira heterolognu nukleinsku kiselinu; i (b) uređaj za isporuku rAAV čestica u strijatum. Sistemi i uređaji se mogu koristiti za isporuku bilo koje od rAAV čestica opisanih ovde u CNS (npr., strijatum) sisara. Kao što je opisano iznad, rAAV čestica dostavljena u strijatum može se koristiti za uvođenje rAAV vektora koji kodira heterolognu nukleinsku kiselinu za eksprimiranje u kori velikog mozga i strijatumu.
[0142] U nekim otelotvorenjima, rAAV čestica se isporučuje isporukom poboljšanom konvekcijom (CED). CED se zasniva na pumpanju infuzata (npr., sastav koji sadrži rAAV česticu) u CNS pod pritiskom pri kom se prevazilazi hidrostatički pritisak intersticijalne tečnosti. Ovo dovodi infuzat u dodir sa perivaskulaturom CNS, koja se koristi kao pumpa za distribuciju infuzata kroz konvekciju i povećava obim njegove isporuke (pogledati, npr., Hadaczek i dr., (2006) Hum. Gene Ther.17:291-302; Bankiewicz i dr., (2000) Exp. Neurol.
164:2-14; Sanftner, LM i dr., (2005) Exp. Neurol.194(2):476-483; Forsayeth, JR i dr., (2006) Mol. Ther.14(4):571-577; SAD patente br.6,953,575; SAD patentne prijave br.
2002/0141980; SAD patentne prijave br.2007/0259031; WO 99/61066; i WO 2010/088560).
[0143] Kao što je ovde opisano, prednost upotrebe CED je poboljšana distribucija infuzata kroz mozak. CED može dovesti do poboljšanja isporuke na mestu injekcije u mozgu (npr., strijatum, kaudalno jezgro i/ili putamen). Pored toga, isporuka u druge regione mozga (npr., kora velikog mozga, čeoni režanj, prefrontalna asocijativne kortikalne oblasti, premotorna kora, primarne somatosenzorne kortikalne oblasti i/ili primarna motorna kora) mogu se postići kroz CED. Bez želje da se vežemo za teoriju, takođe se smatra da se rekombinantne virusne čestice (npr., rAAV čestice) injektirane u strijatum takođe mogu dispergovati (npr., kroz retrogradni transport) u druge oblasti mozga, uključujući bez ograničenja oblasti projekcije (npr., moždana kora).
[0144] U nekim otelotvorenjima, rAAV čestica se isporučuje korišćenjem CED sistema za isporuku. CED može isporučiti AAV čestice (pogledati, npr., WO 99/61066). Kao što je ovde opisano, CED se može postići korišćenjem bilo kog od ovde opisanih sistema. Uređaji za CED (npr., za isporuku sastava uključujući rAAV čestice) su poznati u struci i generalno koriste pumpu (npr., osmotska i/ili infuziona pumpa, kao što je opisano u nastavku) i uređaj za injekcije (npr., kateter, kanila, itd.). Opciono, tehnika snimanja se može koristiti za vođenje uređaja za injekciju i/ili praćenje isporuke infuzata (npr., sastav koji uključuje rAAV čestice). Uređaj za injekciju se može umetnuti u tkivo CNS pacijenta. Stručnjak je u stanju da odredi odgovarajuće koordinate za pozicioniranje uređaja za injekciju u ciljano tkivo CNS. U nekim otelotvorenjima, pozicioniranje se postiže preko anatomske mape dobijene na primer pomoću CT i/ili MRI snimanja mozga pacijenta kako bi se uređaj za injekciju usmerio do ciljanog tkiva CNS. U nekim otelotvorenjima, mogu se izvesti iMRI i/ili snimanje porođaja u realnom vremenu. U nekim otelotvorenjima, uređaj se koristi za primenu rAAV čestica sisarima.
[0145] U nekim otelotvorenjima, mogu se izvesti intraoperativna magnetna rezonanca (iMRI) i/ili slikanje porođaja u realnom vremenu. U nekim otelotvorenjima, uređaj se koristi za primenu rAAV čestica sisarima. iMRI je poznat u struci kao tehnika za snimanje pacijenata zasnovano na MRI tokom operacije, što pomaže da se potvrdi uspešan hirurški zahvat (npr., za isporuku rAAV čestica u CNS) i smanjuje rizik od oštećenja drugih delova tkiva (za dalje opise pogledati, npr., Fiandaca i dr., (2009) Neuroimage 47 Suppl.2:T27-35). U nekim otelotvorenjima, agens za praćenje (npr., MRI agens za poboljšanje kontrasta) se može isporučiti zajedno sa infuzijom (npr., sastav koji uključuje rAAV čestice) kako bi se pružilo praćenje distribucije infuzata u tkivu u realnom vremenu. Pogledati na primer Fiandaca i dr., (2009) Neuroimage 47 Suppl. 2:T27-35; SAD PG publikacijilikaciju 2007/0259031; i SAD patent br.7,922,999. Upotreba agensa za praćenje može dovesti do prekida isporuke. Za praćenje distribucije infuzata mogu se koristiti i drugi agensi za praćenje i snimanje poznati u struci.
4
[0146] U nekim otelotvorenjima, rAAV čestice se mogu primenjivati standardnom stereotaksičnom injekcijom korišćenjem uređaja i postupaka poznatih u struci za isporuku rAAV čestica. Generalno, ove postupci mogu koristiti uređaj za injekcije, sistem planiranja za prevođenje regiona tkiva ciljanog za isporuku u niz koordinata (npr., parametri duž laterolateralne, dorzo-ventralne i rostro-kaudalne ose) i uređaj za stereotaksične lokalizacije prema planiranim koordinatama (stereotaktički uređaj, opciono uključuje sondu i strukturu za fiksiranje glave na mestu u skladu sa koordinatnim sistemom). Neograničavajući primer sistema koji može biti koristan za MRI-navođene operacije i/ili stereotaksične injekcije je ClearPoint® sistem (MRI Interventions, Memfis, Tenesi).
[0147] U nekim otelotvorenjima, uređaj za isporuku poboljšanu konvekcijom sadrži pumpu (npr., osmotska pumpa i/ili infuziona pumpa). Osmotske i/ili infuzione pumpe su komercijalno dostupne (npr., od ALZET® Corp., Hamilton Corp., ALZA Inc. u Palo Altu, Kalifornija). Sistemi pumpi se mogu implantirati. Primeri sistema pumpi se mogu naći, npr., u SAD patentima br.7,351,239; 7,341,577; 6,042,579; 5,735,815; i 4,692,147. U nekim otelotvorenjima, pumpa je ručna pumpa. Primeri uređaja za CED, uključujući kanile otporne na refluks i stepenaste kanile, mogu se naći u WO 99/61066 i WO 2006/042090.
[0148] U nekim otelotvorenjima, uređaj za isporuku poboljšanu konvekcijom sadrži kanilu otpornu na refluks (npr., kanila sa stepenastim dizajnom bez refluksa). Dalji opisi i primeri kanila otpornih na refluks mogu se naći, na primer, kod Krauze i dr., (2009) Methods Enzymol. 465:349-362; u SAD PG publikaciji 2006/0135945; SAD PG publikaciji 2007/0088295; i PCT/US08/64011. U nekim otelotvorenjima, koristi se samo jedna kanila. U drugim otelotvorenjima, koristi se više od jedne kanile. U nekim otelotvorenjima, uređaj za isporuku sa poboljšanom konvekcijom sadrži kanilu otpornu na refluks povezanu sa pumpom koja proizvodi dovoljan pritisak da izazove protok infuzije kroz kanilu do ciljanog tkiva kontrolisanom brzinom. Bilo koja odgovarajuća brzina protoka može se koristiti tako da se intrakranijalni pritisak održava na odgovarajućim nivoima kako se ne bi povredilo moždano tkivo.
[0149] U nekim otelotvorenjima, kanila je stepenasta kanila. kao što je opisano, npr., u WO 2006/042090, stepenasta kanila ima nekoliko koraka (npr., četiri na Slici 1 od WO 2006/042090). Koraci najbliži distalnom kraju kanile su oni koji prvi ulaze u ciljano tkivo i, shodno tome, broj koraka koji ulaze u ciljano tkivo (npr., strijatum) će zavisiti od dubine penetracije potrebne da se dođe do te mete u pacijentu. Što se tiče isporuke u mozak, operater može lako da odredi odgovarajuću dubinu penetracije, uzimajući u obzir i veličinu pacijenta koji se tretira i lokaciju u mozgu koja je ciljana.
[0150] Kanila se može povezati sa pumpom kroz sistem cevi. Cev se proteže kroz lumen kanile i infuzat se može isporučiti kroz ovu cev. U otelotvorenjima koje sadrže cev, cev može biti u ravni sa distalnim krajem kanile. Alternativno, cev se proteže od distalnog kraja kanile, u takvim otelotvorenjima, količina koju se cev proteže može da varira u zavisnosti od primene. Generalno, cev će se protezati od oko 1 mm do oko 1 cm od kanile (ili bilo koja dužina između njih), npr., od oko 1 do oko 50 mm (ili bilo koja dužina između njih), ili od oko 1 mm do oko 25 mm (ili bilo koje dužine između njih, uključujući, ali ne ograničavajući se na, 1 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, 10 mm, 11 mm, 12 mm, 13 mm, 14 mm, 15 mm, 16 mm, 17 mm, 18 mm, 19 mm, 20 mm, 21 mm, 22 mm, 23 mm, 24 mm ili 25 mm), kao što je 10 mm iza njegovog distalnog kraja.
[0151] Cev koja se proteže kroz kanilu može imati premaz ili okolni materijal u jednom ili više regiona, na primer da zaštiti cev u dodiru sa infuzatom. Dakle, u određenim otelotvorenjima, cevi (npr., FEP (teflonska) cev) štiti deo cevi od spojenog silicijum dioksida koji se proteže izvan proksimalnog kraja kanile od nerđajućeg čelika. Cev od fuzionisanog silicijum-dioksida može se povezati sa špricem na bilo koji pogodan način, uključujući, ali ne ograničavajući se na, Luer kompresioni priključak, a špric se pokreće pomoću pumpe za špric (ručna, elektronska i/ili kompjuterizovana). Očigledno je da operater može izabrati veličinu šprica kako bi isporučio odgovarajuću količinu proizvoda. Tako se mogu koristiti špricevi od 1 mL, 2,5 mL, 5 mL ili čak i veći.
[0152] Stepenaste kanile mogu biti napravljene od raznih materijala koji su fiziološki prihvatljivi, uključujući bez ograničenja nerđajući čelik (npr., 316SS ili 304SS), metal, metalne legure, polimeri, organska vlakna, neorganska vlakna i/ili njihove kombinacije.
[0153] Opciono, površina za dodir sa infuzijom (npr., cev ili obloga) može da se proteže kroz lumen kanile. Različiti materijali se takođe mogu koristiti za površinu u dodiru sa infuzatom, uključujući ali bez ograničenja na metale, metalne legure, polimere, organska vlakna, neorganska vlakna i/ili njihove kombinacije. U nekim otelotvorenjima, površina dodira sa proizvodom nije od nerđajućeg čelika. U takvim otelotvorenjima, spoljna kanila i dalje može biti napravljena od materijala fiziološki kompatibilnog sa ciljanim tkivom, ali pošto nema dodira sa proizvodom, ne mora biti kompatibilna sa biološki aktivnim agensom ili formulacijom proizvoda.
[0154] U nekim otelotvorenjima, penetracija infuzata je dodatno povećana upotrebom agensa za olakšavanje. Agens za olakšavanje je sposoban da dodatno olakša isporuku infuzata u ciljano tkivo (npr., ciljano tkivo CNS). Neograničavajući primer agensa za olakšavanje je heparin niske molekulske težine (pogledati, npr., SAD patent br.7,922,999).
[0155] Pogodna pakovanja za ovde opisane farmaceutske sastave su poznata u struci i uključuju, na primer, bočice (kao što su zapečaćene bočice), sudove, ampule, boce, tegle, fleksibilna pakovanja (npr., zapečaćene milar ili plastične kese) i slično. Ovi proizvodi mogu dalje biti sterilisani i/ili zapečaćeni.
[0156] Ovde su dalje pružene rAAV čestice za upotrebu u tretmanu poremećaja CNS kod sisara koji obuhvata primenu rAAV čestice sisaru kao što je ovde opisano. Dalje su pružene rAAV čestice za upotrebu za tretman Hantingtonove bolesti kod sisara koji obuhvata primenu rAAV čestice sisaru kao što je ovde opisano korišćenjem sistema kao što je ovde opisano.
[0157] Ovde su opisani i kompleti za primenu ovde opisanih rAAV čestica sisaru. Kompleti mogu da sadrže bilo koju od rAAV čestica ili sastava rAAV čestica. Na primer, kompleti mogu da sadrže rAAV čestice sa rAAV vektorom koji kodira heterolognu nukleinsku kiselinu koja je eksprimirana barem u kori velikog mozga i strijatumu sisara. U nekim otelotvorenjima, kompleti dalje sadrže bilo koji od uređaja ili sistema opisanih iznad.
[0158] U nekim otelotvorenjima, kompleti dalje uključuju uputstva za isporuku u CNS (npr., isporuka u strijatum sisara) sastava rAAV čestica. Ovde opisani kompleti mogu dalje da obuhvataju druge materijale poželjne sa komercijalnog i korisničkog stanovišta, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle, špriceve i umetke za pakovanje sa uputstvima.
Odgovarajući materijali za pakovanje takođe mogu biti uključeni i mogu biti bilo koji materijali za pakovanje poznati u struci, uključujući, na primer, bočice (kao što su zapečaćene bočice), posude, ampule, boce, tegle, fleksibilno pakovanje (npr., zapečaćene milar ili plastične kese) i slično. Ovi proizvodi mogu dalje biti sterilisani i/ili zapečaćeni. U nekim otelotvorenjima, kompleti sadrže uputstva za tretman ovde opisanih poremećaja CNS korišćenjem bilo koje od ovde opisanih rAAV čestica. Kompleti mogu uključivati farmaceutski prihvatljiv nosač pogodan za injekciju u CNS pojedinca i jedan ili više od: pufera, razblaživača, filtera, igle, šprica i uloška za pakovanje sa uputstvima za sprovođenje injekcija u strijatum sisara.
[0159] U nekim otelotvorenjima, kompleti dalje sadrže jedan ili više ovde opisanih pufera i/ili farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa (npr., kao što je opisano u REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J.1991). U nekim otelotvorenjima, kompleti uključuju jedan ili više od ovde opisanih farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa, nosača, rastvora i/ili dodatnih sastojaka. Ovde opisani kompleti mogu biti upakovani u pojedinačne jedinične doze ili u višedoznim oblicima. Sadržaj kompleta je generalno formulisan kao sterilan i može biti liofilizovan ili pružen kao suštinski izotonični rastvor.
PRIMERI
[0160] Pronalazak će biti potpunije shvaćen pozivanjem na naredne primere.
Primer 1: Široko rasprostranjeno GFP eksprimiranje posle intrastrijatalne AAV1 vektorske isporuke
[0161] Procenjena je sposobnost AAV1 da efikasno cilja i strijatalne i kortikalne strukture u mozgu rezus majmuna kada se isporučuje pomoću isporuke poboljšane konvekcijom (CED). AAV vektori koji sadrže GFP cDNK pod kontrolom pojačivača citomegalovirusa/kokošijeg promotera beta-aktina (CBA) infuzirani su u kaudat i putamen kod 9 odraslih mužjaka rezus majmuna koristeći CED (pogledati, npr., Bankiewicz i dr., (2000) Exp. Neurol.164:2-14 i WO 2010/088560).
Postupci
Hirurška isporuka
[0162] Devet odraslih mužjaka rezus majmuna (Macaca mulatta; 8.9 - 11,9 kg) uključeni su u ovu studiju. Sve životinje su primile infuziju AAV vektora bilateralno u kaudalno jezgro i putamen pomoću MRI-navođenog CED (Richardson, R.M. i dr. (2011) Neurosurgery 69:154-163; Richardson, R.M. i dr. (2011) Stereotact. Funct. Neurosurg.89:141-151; Richardson, R.M. i dr. (2011) Mol. Ther.19:1048-1057). Neposredno pre operacije, životinje su anestezirane pomoću ketamin HCL (10 mg/kg), izmerene, intubirane i držane na 1-5% izoflurana. Glava je postavljena na stereotaksični okvir, i životinja je transportovana na MRI (Siemens 3.0 T Trio MR jedinica) radi skeniranja planiranja sa ponderisanim T1. Nakon skeniranja, životinje su prebačene u operacionu salu i glava je pripremljena za proceduru implantacije, i za infuziju je korišćena keramička kanila od silicijum dioksida otporna na refluks, sa stepenastim vrhom od 3 mm. Privremena kanila za vođenje implantirana je bilateralno (jedna po hemisferi) standardnim postupcima.
[0163] Životinje su primile bilateralne infuzije u kaudalno jezgro i putamen vektora AAV1-eGFP ili AAV2-eGFP dobijenih sa 2 različita postupka proizvodnje: trostruka transfekcija (TT) ili proizvodna ćelijska linija (PCL). Koncentracije vektora i doze su opisane u Tabeli 5. Životinje su testirane na prisustvo anti-AAVl i anti-AAV2 neutralizujućih antitela kao što je prethodno opisano i smatrane su seronegativnima jer su imale titre antitela < 1:32 (Bevan, A.K. i dr. (2011) Mol. Ther.19:1971-1980). Vreme preživljavanja je bilo 1 mesec nakon isporuke AAV za sve životinje.
[0164] Svaka životinja je primila do tri mikroinjekcije po hemisferi za ciljanje kaudata i putamena (prekomisuralne i postkomisuralne) regione, kao što je prikazano u Tabeli 2. Kako bi se vizuelizovala distribucija infuzata tokom MRI, Prohance (2 mM gadoteridol) je dodat u virus. Približno 30 µl AAV je dato u kaudat i 60 µl u putamen koristeći postupak isporuke poboljšane konvekcijom (CED) (tj.90 µL po hemisferi). Brzina infuzije je povećana do maksimalno 5 µL/min.
Tabela 2. Zapremine parenhimske doze po mestu
[0165] Prva kohorta životinja je dobila 1,7 x 10<11>vg od AAV1-eGFP (TT) (n=3) ili AAV2-eGFP (TT) (n=2) po hemisferi. Druga kohorta životinja je dobila 1,7 x 10<11>vg od AAV1-eGFP (PCL) (n=2), ili 1,3 x 10<11>vg od AAV2-eGFP (PCL) (n=2). Serijski MRI je nabavljen za praćenje distribucije infuzije unutar svake ciljane lokacije i pružanje povratnih informacija timu u realnom vremenu. Neposredno nakon postupka intraparenhimskog doziranja, životinje su prebačene u operacionu salu, uklonjena je kanila za vođenje, i mesto rane zatvoreno u anatomskim slojevima. Svi eksperimenti su izvedeni u skladu sa National Institutes of Health smernicama i sa protokolima koje je odobrio institucionalni Animal Care and Use Committee. Odmah nakon operacije, životinje su prebačene u MRI odeljenje za procedure AAV doziranja. Komentari u vezi sa procedurom doziranja za svakog od pacijenta prikazanih u Tabeli 2 dati su u nastavku.
Procedura doziranja-Tretman grupa 2 (AAV1-eGFP TT)
[0166] Pacijent broj 1. Približno 60 µL infuzata je primenjeno po hemisferi koristeći dve putanje (30 µL/depozit) u svaki putamen. Koronalne slike iz infuzije u prednji putamen pokazale su većinu signala gadolinijuma unutar svake od ciljanih struktura. U desnoj hemisferi primećen je blagi perivaskularni transport u ventralnom putamenu i distribucija u prednju komisuru.
[0167] Pacijent broj 2. T1 MRI je dobijen nakon 0,127 mL infuzije u putamen i 0,207 mL u talamus. Nakon infuzije T1 MRI je pokazao ekstenzivnu distribuciju infuzije unutar desnog talamusa veličine približno 1 cm u anteriorno-posteriornom pravcu i 1 cm u dorzoventralnom pravcu. Koronalni T1 je pokazao distribuciju gadolinijuma unutar ciljanog mesta koja se protezala medijalno prema unutrašnjoj kapsuli i superiorno prema dorzalnom putamenu. Većina infuzata se nalazila unutar putaminalnih ivica; međutim, transport preko perivaskularnog prostora je takođe bio prisutan u traktovima bele materije unutrašnje kapsule i prednje komisure. Analiza je pokazala da je odnos zapremine infuzije gadolinijuma (Vi) i zapremine distribucije (Vd) u talamusu i putamenu iznosio 1:2.
Zapažanja
[0168] Detaljna zapažanja zdravlja životinja i neuroloških simptoma vršena su dnevno u periodu od 5 dana nakon doziranja; nakon toga, detaljna posmatranja su vršena jednom nedeljno do završetka studije. Vršene su opservacije i dnevne provere mortaliteta. Procene
1
telesne težine vršene su pre intrakranijalnog doziranja, u vreme procedura uzimanja krvi i obdukcije. Nije primećena značajna razlika u telesnoj težini između tretiranih grupa pre operacije ili u vreme obdukcije (SLIKA 1). Cela krv, krvni serum i cerebrospinalna tečnost (CSF) su prikupljeni za hematologiju, hemiju seruma, test na AAV1 i AAV2 kapsid antitela i analizu eGFP mRNK nivoa.
Sakupljanje i obrada krvi
[0169] Krv (približno 5 mL) je sakupljena pre injekcije, otprilike 72 sata nakon injekcije, i na obdukciji u skladu sa Rasporedom uzimanja uzoraka krvi (pogledati Tabelu 3 u nastavku). Približno 0,5-1,0 mL pune krvi je sakupljeno u EDTA epruvete za hematološku analizu. Približno 2,0 mL pune krvi je sakupljeno u epruvete za odvajanje seruma (sa gelom, BD Microtainer) i obrađeno u serum kako bi se dobio približno serum za hemijsku analizu i analizu AAV1 i AAV2 kapsid antitela.
Tabela 3. Raspored uzimanja uzoraka krvi
Prikupljanje i obrada CSF
[0170] CSF je sakupljen u dve odvojene vremenske tačke: pre intrakranijalnog doziranja i prilikom obdukcije. Sakupljanje likvora je obavljeno pod anestezijom cervikalnom kičmenom kapom sa životinjom postavljenom u ležećem položaju. Pre primene test artikla, sakupljeno je 1-2 mL CSF, zamrznuto na suvom ledu i čuvano na ≤-60°C. Prilikom obdukcije (pre
2
perfuzije PBS) sakupljeno je 2-4 mL CSF, filtrirano kroz filter šprica od 0,8 mikrona u obeleženu epruvetu za sakupljanje i prebačeno u duplikatu (1 mL alikvot za analizu kapsid antitela i 2-4 mL alikvot za GFP analizu) u ependorf epruvete, odmah zamrznuto na suvom ledu i čuvano na ≤-60°C.
Nekropsija i sakupljanje tkiva
[0171] Sve životinje su eutanazirane otprilike 30 dana nakon postupka intrakranijalnog doziranja. Svaka životinja je eutanazirana korišćenjem intravenske primene natrijum pentobarbitala. Nakon eutanazije i prikupljanja krvi i likvora, telo je transkardijalno perfuzirano sa PBS (u uslovima bez RNKaze), nakon čega je usledila perfuzija sa PFA. Descendentna aorta je stegnuta kako bi se smanjila fiksacija perifernih tkiva. Ova procedura je korišćena za prikupljanje fiksnog moždanog tkiva pored svežih uzoraka perifernog tkiva za GFP analizu pomoću QPCR. Tabela za prikupljanje tkiva navodi tkiva koja su sakupljena (Tabela 4). Tokom perfuzije PBS (pre početka perfuzije 4% PFA) uzorci biopsije (0,5 - 1,0 cm<3>) odabranih tkiva (takođe navedenih u tabeli za sakupljanje tkiva) sakupljeni su u uslovima bez RNKaze sa sterilnim skalpelima za jednokratnu upotrebu (novi skalpel za svaku pojedinačnu biopsiju) u epruvete bez RNKaze i čuvani zamrznuti na ≤-60°C.
Tabela 4. Zbirka tkiva
Obrada mozga i kičmene moždine
[0172] Čitav mozak je pažljivo uklonjen sa životinje i fotografisan pored lenjira radi merenja. Kada je uklonjen iz lobanje, mozak je stavljen u moždanu matricu i koronalno isečen na blokove od 6 mm. Koronalni blokovi su stavljeni u PFA i obrađeni za histologiju. Relevantni blokovi koji sadrže čeoni režanj i regione srednjeg mozga podeljeni su na slobodno plutajuće delove od 40 mikrona. Čitava kičmena moždina je pažljivo uklonjena sa životinje. Segmenti kičmene moždine su uskladišteni u PFA i obrađeni za histologiju. Reprezentativni segment iz cervikalnog, torakalnog i lumbalnog regiona podeljen je na slobodno plutajuće delove od 40 mikrona.
[0173] Nakon perfuzije sa PBS-heparinom, praćeno sa 4% puferisanog paraformaldehida (PFA), mozak svake životinje je isečen na blokove od 6 mm (koronalna ravan) korišćenjem sečiva za jednokratnu upotrebu i matrice mozga majmuna. Uzastopni blokovi (11-12 moždanih ploča po životinji) postavljeni su horizontalno na belu tablu i fotografisani uzastopno dodeljenim slovima. Svi moždani blokovi su zatim naknadno fiksirani u 4% puferisanom PFA tokom 24 sata. Kvalitet fiksacije za svaki blok je vizuelno pregledan (u blokovima nije primećena ružičasta boja). Nakon PFA-postfiksacije, svaki blok mozga je obrađen za slobodno plutajuće sekcije ispiranjem 3X u PBS i uranjanjem u 30% saharoze (krioprezervacija) pre nego što je isečen na 40-µm slobodno plutajuće delove.
Proizvodnja AAV vektora
[0174] Pre kliničke procene, AAV vektori se obično proizvode pomoću standardnih postupaka trostruke transfekcije (TT) u kojoj se ćelije HEK293 ko-transficiraju sa dva ili tri plazmida koji kodiraju cis (genom vektora) i trans (AAV rep i cap geni; adenovirusni pomoćnik geni E2A, E4 i VA) elemente potrebne za pakovanje vektora (Hauck i dr., (2009) Mol. Ther.17:144-152). Pošto se unos plazmidne DNK može lako i brzo modifikovati, ovaj postupak omogućava procenu vektora na osnovu različitih serotipova i sadrži različite kasete eksprimiranja. Uprkos svojoj fleksibilnosti i relativno brzom vremenu preokreta, postupak transfekcije predstavlja izazov u pogledu skalabilnosti, što ograničava prikladnost ovog postupka za proizvodnju rAAV vektora velikih razmera za kliničku upotrebu.
[0175] U ovom trenutku, rAAV kliničkog stepena se generiše u velikim razmerama pomoću pomoćnog postupka prolazne transfekcije bez virusa, proizvodnih sistema baziranih na rekombinantnom bakulovirusu ili herpes simpleks virusu, ili pakovanja/proizvodnih ćelijskih
4
linija (Ayuso i dr., (2010) Curr. Gene Ther.10:423-436). Adeno-povezane virusne proizvodne ćelijeske linije (PCL) su efikasan postupak za proizvodnju velikih razmera AAV vektora kliničkog stepena. U ovom sistemu, jedan plazmid koji sadrži tri komponente, vektorsku sekvencu, AAV rep i cap gene, i selektabilni markerski gen se stabilno transficira u HeLaS3 ćelije. Međutim, poželjno je utvrditi da li je AAV vektor izveden iz ćelijskih linija proizvođača ekvivalentan po snazi vektoru generisanom drugim postupcima, na primer, standardnim postupkom prolazne transfekcije.
[0176] AAV virusni vektori su generisani za ovu studiju korišćenjem dva različita proizvodna postupka: trostruka transfekcija (TT) i proizvodna ćelijska linija (PCL). Rekombinantni AAV vektori AAV1-GFP (TT) i AAV2-GFP (TT) su proizvedeni trostrukom transfekcijom (koristeći kalcijum fosfat) ćelija ljudskog embrionalnog karcinoma bubrega 293 (HEK- 293) (navedeno kod Xiao i dr., (1998) Journal of Virology 72:2224-2232). Ukratko, za proizvodnju AAV vektora prolaznom transfekcijom, HEK293 ćelije su transficirane korišćenjem polietilenimina (PEI) i odnosa 1:1:1 tri plazmida (ITR vektor, AAV2rep/cap2 ili AAV2rep/cap1 i pAd pomoćni plazmid). ITR vektorski plazmid je kodirao cDNK za EGFP nizvodno od pojačivača citomegalovirusa/kokošijeg beta aktina - hibridnog promotera (CBA). PAd pomoćnik je bio pHelper (Stratagene/Agilent Technologies, Santa Klara, Kalifornija).
[0177] Rekombinantni AAV vektori AAV1-GFP (PCL) i AAV2-GFP (PCL) su proizvedeni korišćenjem procesa ćelije proizvođača AAV (naveden kod Thorne i dr., (2009) Human Gene Therapy 20:707-714 i Martin i dr., (2013) Human Gene Therapy Methods 24:253-269). Ukratko, proizvodno-specifične ćelijske linije su generisane stabilnom transfekcijom Hela-S3 ćelija (ATCC CCL-2.2) sa plazmidom koji sadrži rep gen iz serotipa 2 i kapsid gen iz bilo serotipa 1 ili 2, promoter-heterolognu sekvencu nukleinske kiseline, vektorski genom okružen AAV2 invertovanim terminalnim ponavljanjima (ITR) i gen otpornosti na puromicin. Genom vektora sadržao je cDNK za EGFP nizvodno od pojačivača citomegalovirusa/kokošijeg beta aktin-hibridnog promotera, CBA. Transficirane ćelije su uzgajane u prisustvu puromicina kako bi se izolovali stabilni integranti. Generisane ćelijske linije su pregledane kako bi se izabrao vodeći klon. Ćelijski klon specifičan za proizvod je kasnije proširen na proizvodni bioreaktor i inficiran divljim tipom Adenovirusa kao pomoćnikom za pokretanje proizvodnje AAV. Virus je sakupljen 72 sata nakon infekcije, adenovirus je inaktiviran toplotom i uklonjen postupcima razmene anjona.
[0178] Prečišćavanje AAV sa obe proizvodne platforme je izvedeno kao što je prethodno opisano (Qu, G. i dr. (2007) J. Virol. Methods 140:183-192). Dobijeni titri svih AAV1 i AAV2-GFP vektora su prikazani u Tabeli 5. Svi vektori su pripremljeni u vodi koja sadrži 180 mM natrijum hlorida; 10 mM natrijum fosfata (5 mM NaH2PO4· 2 H2O 5 mM Na2HPO4·H2O); i 0,001% poloksamera 188 (Lutrol F68), pH 7,5.
Tabela 5. Tabela dizajna studije i predmeta studije
Imunohistohemija
[0179] Imunobojenje antitelima protiv GFP (1:500, AB3080; Chemicon) je izvedeno na Zamboni fiksiranim 40 µm koronalnim presecima koji pokrivaju ceo čeoni režanj i koji se protežu u posteriornom pravcu do nivoa strijatuma. Lokalizacija GFP imunopozitivnih neurona je analizirana s obzirom na The Rhesus Monkey Brain in Stereotactic Coordinates (Paxinos, G.H.X. and Toga, A.W. (2000) San Diego, CA: Academic Press) kako bi se identifikovale specifične oblasti imunološkog bojenja u moždanoj kori i strijatumu.
[0180] GFP bojenje 3,3'-diaminobenzidinom (DAB): Sekcije (3 po svakom bloku od 6 mm: razdvajanje od 2 mm) su isprane 3 puta u PBST po 5 minuta nakon čega je usledio tretman sa 1% H2O2tokom 20 min. Sekcije su inkubirane u Sniper rastvoru za blokiranje (dostupno online na biocare.net/product/background-sniper/) tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi, nakon čega je usledila inkubacija preko noći sa primarnim anti-GFP antitelom (dostupno online na www.lifetechnologies.com/) razblažen 1:1000 u Da Vinci Green Diluent (dostupno online na biocare.net/). Nakon 3 ispiranja u PBS koji sadrži 0,1% Tween-20 (PBST) u trajanju od po 5 minuta, sekcije su inkubirane u Mach 2 HRP polimeru (http://biocare.net/) tokom 1 sata, nakon čega su usledila 3 ispiranja i kolorimetrijski razvoj (DAB).
Imunoobojeni delovi su obojeni krezil ljubičastim i postavljeni na slajdove i zapečaćeni sa Citoseal® (dostupno online na www.thermoscientific.com/).
[0181] Proračun pokrivenosti GFP eksprimiranja u mozgu primata koji nisu ljudi (NHP): GFP bojenje iz odgovarajućih serijskih preseka obojenih sa IHC je projektovano na pojedinačne odgovarajuće MRI skenove svakog mozga majmuna (T1-ponderisane MR slike u koronalnoj ravni). Distribucija/pokrivanje GFP eksprimiranja je izvršeno sa OsiriX Imaging Software verzije 3.1 (The OsiriX Foundation, Ženeva, Švajcarska).
[0182] Dvostruka imunofluorescencija za vektorski tropizam i efikasnost neuronske transdukcije: Za dvostruko fluorescentno imunobojenje različitih ćelijskih markera (NeuN, S-100, Iba1) sa GFP, kombinacija primarnih antitela je primenjena na preseke kao koktel primarnih antitela inkubacijom preko noći na sobnoj temperaturi u PBST sa 20% konjskog seruma. Primarna korišćena antitela su kako sledi: anti-GFP antitelo (1:500, kao iznad); anti-NeuN (1:500, dostupno online na www.emdmillipore.com/); anti-S-100 (1:300, dostupno online na biocare.net/), anti-Ibal (1:500, dostupno online na biocare.net/); anti-Olig2 (1:50, dostupno online na www.emdmillipore.com/). Nakon 3 ispiranja u PBST, primarna antitela su vizualizovana inkubacijom u mraku tokom 2 sata sa odgovarajućim sekundarnim antitelima konjugovanim sa fluorohromom: kozji anti-miš DyLight 549 i kozji anti-zečji DyLight 488 (dostupno online na www.biocare.net/). Sva sekundarna antitela su razblažena 1:1.000 u fluorescentnom razblaživaču antitela (dostupno online na biocare.net/). Pored toga, kako bi se ugasila autofluorescencija, sekcije su inkubirane u 0,1% rastvoru sudanske crne (70% etanol). Nakon završnog pranja u PBS, sekcije su prekrivene sa Vectashield Hard Set Mounting Medium for Fluorescence (dostupno online na www.vectorlabs.com/). Kontrolni delovi su obrađeni bez primarnih antitela, i nije primećeno značajno imunološko bojenje u ovim uslovima.
[0183] Zeiss Axioskop fluorescentni mikroskop (dostupno online na www.zeiss.com/) opremljen CCD video kamerom u boji i sistemom za analizu slike (Axiovision Software, dostupno online na www.zeiss.com/) korišćen je za određivanje prisustva dvostruko obeleženih ćelija (pozitivan i na crvenom i na zelenom kanalu). Mikrofotografije za dvostruko obeležene delove su dobijene spajanjem slika sa dva odvojena kanala (crveni i zeleni; ko-lokalizacija je žuta) bez promene položaja sekcija ili fokusa (cilj X 20). Za GFP/NeuN dvostruko bojenje, 3 preseka od svakog majmuna u intervalima od ∼4 mm su odabrana sa mesta vektorske infuzije. Za procenu efikasnosti neuronske transdukcije pomoću AAV1-eGFP ili AAV2-eGFP vektora unutar ciljanih oblasti mozga (kaudat i putamen), 5 okvira za brojanje (700 µm x 550 µm) je nasumično postavljeno u GFP+ oblast. Primarna oblast transdukcije (POT) je definisana kao GFP-pozitivna oblast („oblak“) koja je pokrivala više od 40% ciljane strukture. Slično tome, kako bi se procenila efikasnost neuronske transdukcije, izvan POT (IPOT), 5 okvira za brojanje (700 µm x 550 µm) iz svake sekcije je izabrano izvan jasnih margina GFP-pozitivnog „oblaka“ u ciljanim strukturama (kaudat i putamen) ili u moždanoj kori (SLIKA 10C). Kako bi se odredio udeo GFP/NeuN-pozitivnih ćelija, svaki okvir za brojanje je prebrojan dva puta, prvo sa crvenim kanalom za broj NeuN+ ćelija, a zatim sa kombinovanim crvenim i zelenim kanalom za broj obojenih ćelija (GFP+ i NeuN+). Najmanje 1.500 NeuN+ ćelija je izbrojano za svaki od 3 izabrana odeljka (5 okvira za brojanje po sekciji). Konačno, određen je procenat GFP+/NeuN+ prema ukupnom NeuN+. Svi proračuni za strijatum su napravljeni dodavanjem rezultata iz obe hemisfere svake životinje i kombinovanjem vrednosti iz putamena i kaudalnog jezgra, pošto je srednja efikasnost transdukcije bila identična u obe strukture svake životinje.
Kvantitativni PCR u realnom vremenu (TakMan)
[0184] Nivoi GFP mRNK su mereni koristeći kvantitativni PCR u realnom vremenu. Za sve RT-PCR analize korišćeni su uzorci jetre, srca, pluća, bubrega i slezine. Ukupna RNK je ekstrahovana korišćenjem QIAGEN miRNeasy mini kompleta, i zatim reverzno transkribovana i amplifikovana korišćenjem kompleta za reverznu transkripciju cDNK visokog kapaciteta (Applied Biosystems) prema uputstvima proizvođača. Kvantitativne RT-PCR reakcije su sprovedene i analizirane na QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Svaki uzorak je rađen u duplikatu i relativna eksprimiranje gena je određeno korišćenjem standardne krive.
Analiza podataka MR snimanja
[0185] Semi-kvantitativne analize (Digitalni MRI Vd/Vi): Analiza zapremine distribucije (Vd) je izvršena sa OsiriX Imaging softver verzije 3.1 (The OsiriX Foundation, Ženeva, Švajcarska). Mesta infuzije, tragovi kanile i vrh kanile identifikovani su na T1-ponderisanim MR snimcima u koronalnoj ravni. Regije od interesa (ROI) su ocrtane kako bi se ocrtali T1 gadolinijumski signali i ciljana mesta (tj. putamen i kaudalno jezgro). Trodimenzionalne volumetrijske rekonstrukcije serije slika i ROI su analizirane kako bi se procenio volumen distribucije (Vd) infuzije i odnos prema zapremini infuzata (Vi).
[0186] Histološka analiza eksprimiranja transgena: Kako bi se procenilo eksprimiranje transgena, delovi mozga su obrađeni za imunohistohemijsku analizu (IHC). Životinje su duboko anestezirane natrijum pentobarbitalom (25 mg/kg i.v.) i eutanazirane 4 nedelje nakon primene vektora. Mozak je uklonjen i koronalno podeljen na blokove od 6 mm. Blokovi su naknadno fiksirani u puferisanom paraformaldehidu (4%) tokom 24 sata, kratko isprani u PBS i podešeni u 30% rastvoru saharoze/PBS za krioprezervaciju. Blokovi mozga fiksirani formalinom su isečeni na koronalne delove od 40 µm u kriostatu. Slobodno plutajući delovi koji obuhvataju ceo mozak sakupljeni su u serijama i držani u rastvoru antifriza za dalju analizu IHC.
Rezultati
[0187] I AAV1-GFP i AAV2-GFP vektori su doveli do obilnog eksprimiranja GFP iz transduciranih neurona kao što je vizuelizovano imunohistohemijom. Nakon infuzije AAV1 u kaudat i putamen pomoću CED, obelodanjeno je opsežno GFP imunobojenje u kaudatu i putamenu (SLIKE 2C&D), kao i supstancije nigra (SLIKA 2D). Pored strijatuma, transduciran je i veliki broj kortikalnih regiona mozga rezus majmuna (SLIKE 2A-D).
eksprimiranje kortikalnog GFP bilo je najočiglednije u prefrontalnim asocijativnim kortikalnim oblastima, premotornoj kori, primarnim somatosenzornim kortikalnim oblastima i primarnoj motornoj kori, kao i ekstenzivnim regionima potiljačne kore (SLIKE 2A-D).
[0188] Velika većina GFP-pozitivnih neurona unutar moždane kore morfološki je identifikovana kao piramidalni neuroni locirani u kortikalnoj lamini IV, sa aksonalnim projekcijama u slojevima iznad. Gustina GFP-pozitivnih neurona bila je posebno visoka u čeonom (SLIKE 3A&B) i potiljačnom režnju (SLIKE 3C&D), gde je veliki broj neurona (SLIKE 3B&D) pored astrocita (SLIKE 3A&C) bio transduciran.
Primer 2: Široko rasprostranjeno GFP eksprimiranje posle intrastrijatalne AAV2 vektorske isporuke.
[0189] Procenjena je sposobnost AAV2 da efikasno cilja i strijatalne i kortikalne strukture u mozgu rezus majmuna kada se isporučuje pomoću isporuke poboljšane konvekcijom (CED). AAV vektori koji sadrže GFP cDNK pod kontrolom pojačivača citomegalovirusa/promotera kokošijeg beta-aktina (CBA) su infuzirani u kaudat i putamen 8 odraslih rezus majmuna koristeći CED prema postupcima opisanim u Primeru 1 iznad.
[0190] Infuzija AAV2 u strijatum pomoću CED je rezultovala je eksprimiranjem GFP u injektiranim regionima (kaudat i putamen) (SLIKA 4C), supstancija nigri (SLIKA 4D), i velikom broju kortikalnih regiona mozga rezus majmuna (SLIKE 4A-D). Eksprimiranje GFP u strijatumu životinja injektiranih sa AAV2 izgledalo je nešto ograničenije i lokalizovanije u poređenju sa strijatalnim pokrivanjem sa AAV1 vektorima. Eksprimiranje GFP unutar NHP strijatuma bilo je sveobuhvatno, ali relativno sadržano u granicama sive materije ciljanog regiona, bez dokaza o značajnom curenju ili refluksu AAV2-GFP vektora u susednim neciljanim oblastima povezanim sa infuzijom. Eksprimiranje kortikalnog GFP bilo je očigledno u istim regionima primećenim za AAV1. Kortikalne oblasti prefrontalne asocijacije, premotorna kora, primarne somatosenzorne kortikalne oblasti i primarna motorna kora, kao i ekstenzivni regioni potiljačne kore su dobro transducirani (SLIKE 4A-D).
Primer 3: Uporedivost GFP eksprimiranja nakon intrastrijatalnih AAV1 i AAV2 vektora napravljenih trostrukom transfekcijom ili procesom proizvodne ćelijske linije.
[0191] Do danas, većina pretkliničkih studija koristi AAV vektore napravljene trostrukom transfekcijom nakon čega sledi prečišćavanje korišćenjem gradijenata cezijum hlorida ili hromatografije na koloni. Dakle, kako bi se procenio uticaj proizvodnje vektora na biodistribuciju in vivo, upoređena su dva postupka proizvodnje vektora, trostruka transfekcija (TT) ili proizvodna ćelijska linija (PCL). AAV1 i AAV2 vektori generisani od strane ove dve različite proizvodne platforme primenjeni su preko CED i upoređena je njihova distribucija u mozgu rezus majmuna.
[0192] Infuzija AAV1-GFP vektora napravljenih trostrukom transfekcijom dala je ekvivalentnu GFP distribuciju i pokrivenost u poređenju sa AAV1-GFP vektorima napravljenim postupkom proizvodne ćelijske linije. GFP distribucija je bila uporediva između AAV1-GFP (TT) (SLIKE 5C&D) i AAV1-GFP (PCL) (SLIKE 5A&B) vektora 30 dana nakon injekcije u strijatum rezus majmuna.
[0193] Slični rezultati su primećeni sa AAV2-GFP vektorima. GFP distribucija je bila slična i uporediva između AAV2-GFP (TT) (SLIKE 6C&D) i AAV2-GFP (PCL) (SLIKE 6A&B) injektiranih mozgova.
[0194] Za merenje performansi infuzije, AAV1-eGFP (TT); AAV2-eGFP (TT); AAV1-eGFP (PCL); i AAV2-eGFP (PCL) je infuziran u svaki strijatum (60 µl u putamen i 30 µl u kaudalno jezgro), koristeći 90 µl svakog vektora pomešanog sa kontrastnim agensom gadolinijuma (2 mM Prohance; Bracco Diagnostics, Inc.). Snimci magnetne rezonance (MRI) iz svake infuzije su potvrdile da je pozicioniranje svake kanile bilo precizno i da je infuzija pokrivala ciljano područje. Sve infuzije su bile dobro sadržane u ciljanoj strukturi.
Trodimenzionalne rekonstrukcije distribucije infuzata generisane iz signala gadolinijuma na MR snimcima su pokazale da su i postavljanje i distribucija infuzata bili veoma konzistentni kod svih životinja. Pored toga, za svaku isporuku je izračunat odnos (Vd/Vi) između zapremine distribucije (Vd) i zapremine infuzije (Vi), i podaci su bili konzistentni u svim infuzijama. Vd je bio približno 3 puta veći (raspon 2,1 - 4,6) od Vi (Tabele 6 i 7).
Tabela 6. Infuzija vektora i stepen distribucije u mozgu 4 nedelje nakon transdukcije (srednja vrednost ± st. dev.).
1
Tabela 7. Infuzija vektora i stepen distribucije u mozgu 4 nedelje nakon transdukcije (individualne vrednosti).
2
[0195] Nakon bilateralne injekcije i AAV1-eGFP i AAV2-eGFP (pripremljenih pomoću oba postupka proizvodnje, TT i PCL) u strijatum NHP, robusno eksprimiranje eGFP je bilo evidentno kroz obe ciljane strukture (putamen i kaudalno jezgro) kao i regione projekcije (spoljni i unutrašnji globus palidus - GPe i GPi, supstancija nigra - SN, subtalamičko jezgro -STN, kortikalni regioni - neuronski slojevi IV i V) regioni (SLIKA 7).
[0196] Kako bi se procenila uloga gadolinijuma (Gd) kao markera vektorske distribucije, izračunat je odnos površine eksprimiranja GFP (iz histoloških preseka) i površine signala gadolinijuma na odgovarajućim MR skeniranjima. Za majmune kojima je infuziran serotip AAV1, ovaj odnos iznosio je 1,21 ± 0,10, dok je za AAV2 iznosio 0,74 ± 0,04 (SLIKA 8).
Odnos od 1,0 ukazuje na savršeno podudaranje između eksprimiranja GFP i vektorske distribucije kao što je određeno pomoću MRI. Ova razlika ukazuje na to da se vektor AAV1 distribuira izvan Gd signala i postiže bolje širenje u primarnoj oblasti transdukcije od AAV2.
[0197] Kako bi se procenila distribucija infuziranih AAV vektora u mozgu, reprezentativni slobodno plutajući delovi mozga (3 po svakom bloku; debljine 40 µm) od svake životinje su obojeni zečjim anti-GFP antitelom (Millipore; Kat. br.3850, razblaženje 1:500).
Imunohistohemijska procena je otkrila tamno braon DAB signal unutar injektiranih ciljeva (desni i levi putameni i kaudati), kao i višestruke oblasti projektovana iz injektiranih oblasti (kortikalni regioni).
[0198] Projektovanjem obima GFP eksprimiranja na MR skeniranje mozga svakog majmuna, izračunat je procenat pokrivenosti za kortikalne regione (polja mozga relevantno za HB) (pogledati Tabelu 6 za sažetak i Tabelu 7 za dodatne detalje). Kod svih majmuna, u proseku je transducirano 24% strijatuma, što je rezultovalo značajnim eksprimiranjem GFP u moždanij kori (SLIKA 7). Stepen eksprimiranja GFP u moždanoj kori nije bio u korelaciji sa korišćenim AAV serotipom (AAV1 naspram AAV2) ili postupkom proizvodnje vektora (TT
4
naspram PCL). Čini se da je šira distribucija infuzata unutar mesta infuzije (strijatum) bila ključni pokretač obima transdukcije u moždanoj kori. Jedan NHP (pacijent br.1; AAV1-eGFP [TT]) pokazao je posebno snažno širenje eksprimiranja GFP u kortikalne regione (sloj IV i V) čitavog mozga (i čeonog i potiljačnog - pogledati SLIKU 7). Druge životinje su pokazale varijabilnost u kortikalnom eksprimiranju povezanu sa varijacijama kako u obimu tako i u lokalizovanim anatomskim regionima unutar kaudata i putamena. Pošto su bili ciljani pre- i komisuralni regioni strijatuma, GFP je detektovan više u čeonim i temenim kortikalnim regionima, a manje u potiljačnom režnju. Histološka analiza za svaku životinju je sažeta u nastavku (grupisana prema grupi tretmana).
Tretman grupa 2 (ssAAV2/1-CBA-eGFP TT)
[0199] Imunohistohemijska evaluacija eksprimiranja eGFP u celom mozgu otkrila je snažan signal na ciljanim mestima (i putamen i kaudalna jezgra) i projektovane strukture (globus palidus, supstancija nigra, talamus, subtalamičko jezgro i kortikalni regioni).
[0200] Pacijent broj 1. Pacijent je pokazao posebno snažno širenje GFP eksprimiranja na kortikalne regione (sloj 4 i 5) celog mozga (i čeoni i potiljačni). Morfologija GFP-pozitivnih ćelija je podrazumevala i neuronsku i astrocitnu transdukciju, što je kasnije potvrđeno dvostrukim imunofluorescentnim bojenjem (pogledati u nastavku). Proračun pokrivenosti GFP eksprimiranja je pokazao da je 91% celokupne kore (pogledati Tabelu 7) transducirano (ovaj proračun je urađen projektovanjem raspona GFP signala na MRI skeniranje analiziranog mozga majmuna).
[0201] Pacijent broj 2. Pacijent je pokazao robusnu transdukciju u putamenima i kaudalnim jezrgima, kao i globus palidusu i supstancija nigri obe hemisfere. Projekcija GFP eksprimiranja na moždanu koru bila je manje eksprimirana nego kod pacijenta broj 1 i primećena je uglavnom u čeonim predelima kore. Iako je GFP signal takođe detektovan u potiljačnom režnju, gustina GFP-pozitivnih ćelija bila je značajno niža. Pokrivenost kortikalnog GFP eksprimiranja iznosila je 50% (Tabela 7). Slično kao i kod pacijenta broj 1, GFP-pozitivne ćelije su imale i neuronsku i astrocitnu morfologiju, što je potvrđeno dvostrukom imunofluorescencijom.
[0202] Pacijent broj 3. Pacijent je pokazao snažno eksprimiranje GFP u putamenima i kaudalnim jezgrima, kao i svim projektovanim strukturama (globus palidus, supstancija nigra, subtalamičko jezgro, talamus i kora). Iako je GFP signal jasno detektovan u nekim regionima kore, eksprimiranje GFP je činilo samo 41% njegove ukupne kortikalne pokrivenosti (najniže kod svih testiranih majmuna; pogledati Tabelu 7). Transducirani su i neuroni i astrociti. Veliki deo desne prednje korona radijate je takođe pokazao GFP-pozitivan signal, najverovatnije kao rezultat izlivanja vektora iz kanile koja prodire u strijatum.
Tretman grupa 3 (ssAAV2/2-CBA-eGFP TT)
[0203] Pacijent broj 6. Pacijent je pokazao snažan GFP signal u obe ciljane strukture (putamen i kaudalno jezgro). U oba ta regiona detektovane su gusto rasute pozitivne ćelije. Eksprimiranje GFP se proširilo i na čeone kortikalne regione, globus palidus, supstancija nigru, subtalamičko jezgro i neke delove talamusa. Pokrivenost GFP eksprimiranjem u moždanoj kori iznosila je 75% (Tabela 7). GFP-pozitivne ćelije su imale uglavnom neuronsku morfologiju, što je kasnije potvrđeno dvostrukom imunofluorescencijom. GFP-pozitivne ćelije oblika astrocita detektovane su u unutrašnjoj kapsuli, kao i u nekoliko kortikalnih tačaka i usko susednih oblasti bele materije sa jasno vidljivim tragovima infuzionih kanila.
[0204] Pacijent broj 7. Pacijent je pokazao GFP-pozitivan signal unutar desnog i levog strijatuma (i putamen i kaudalno jezgro). Njegova distribucija je bila prilično loša, i obrazac je izgledao „pjegav“, i ne ujednačen u poređenju sa drugim majmunima na infuziji. Shodno tome, GFP signal u svim projektovanim strukturama mozga takođe je bio slabiji. Pokrivenost GFP eksprimiranjem u moždanoj kori iznosila je 47% (Tabela 7). GFP-pozitivne ćelije su imale uglavnom neuronsku morfologiju, što je kasnije potvrđeno dvostrukom imunofluorescencijom. GFP-pozitivne ćelije oblika astrocita otkrivene su u unutrašnjoj kapsuli, kao i u nekoliko kortikalnih tačaka i usko susednih oblasti bele materije sa jasno vidljivim tragovima infuzionih kanila.
Tretman grupa 4 (ssAAV2/1-CBA-eGFP PCL)
[0205] Pacijent broj 4. Pacijent je pokazao vrlo robusno eksprimiranje GFP u ciljanim strukturama, putamenu i kaudalnom jezgru. GFP-pozitivni signal je takođe detektovan u globus palidusu, supstancija nigri, subtalamičkom jezgru, talamusu i kortikalnim regionima. Pokrivenost GFP eksprimiranjem u moždanoj kori iznosila je 61% (Tabela 7). Prednji deo korone radijate je takođe pokazao GFP-pozitivan signal, uglavnom kao rezultat izlivanja vektora iz kanila koji prodiru u strijatum. Pozitivne ćelije su imale i neuronsku i astrocitnu morfologiju, što je kasnije potvrđeno dvostrukom imunofluorescencijom.
[0206] Pacijent broj 5. Pacijent je pokazao robusno eksprimiranje GFP u strijatumu (i putamen i kaudalno jezgro). GFP-signal je takođe detektovan u projektovanim strukturama (globus palidus, supstancija nigra, subtalamičko jezgro, talamus i kortikalni regioni).
Pokrivenost GFP eksprimiranjem u moždanoj kori iznosila je 68% (Tabela 7). Prednji deo korone radijate je takođe pokazao GFP-pozitivan signal, uglavnom kao rezultat izlivanja vektora iz kanila koji prodiru u strijatum. Pozitivne ćelije su imale i neuronsku i astrocitnu morfologiju.
Tretman grupa 5 (ssAAV2/2-CBA-eGFP PCL)
[0207] Pacijent broj 9. Pacijent je pokazao veoma robusno eksprimiranje GFP u strijatumu (i putamen i kaudalno jezgro). GFP signal je takođe detektovan u projektovanim strukturama (globus palidus, supstancija nigra, subtalamičko jezgro, talamus i kortikalni regioni).
Pokrivenost GFP eksprimiranjem u moždanoj kori iznosila je 73% (Tabela 7). GFP-pozitivne ćelije su imale uglavnom neuronsku morfologiju iako su GFP-pozitivne ćelije oblika astrocita takođe detektovane unutar trakta bele materije (unutrašnja kapsula) i u neposrednoj blizini tragova kanile.
[0208] Pacijent broj 8. Pacijent je pokazao robusno eksprimiranje GFP u strijatumu i projektovanim strukturama (globus palidus, supstancija nigra, subtalamičko jezgro, talamus i kortikalni regioni). Pokrivenost GFP eksprimiranjem u moždanoj kori iznosila je 50% (Tabela 7). GFP-pozitivne ćelije su imale uglavnom neuronsku morfologiju, iako su GFP+ ćelije oblika astrocita takođe otkrivene unutar trakta bele materije (unutrašnja kapsula, korona radijata) i u neposrednoj blizini tragova kanile.
Dvostruka imunofluorescencija
[0209] Za obe grupe NHP transduciranih AAV1-eGFP vektorima (TT i PCL), morfologija GFP-pozitivnih ćelija sugeriše i neuronsku i astrocitnu transdukciju (SLIKE 9A-9D). Ovo je potvrđeno dvostrukim imunofluorescentnim bojenjem kombinacijom antitela protiv GFP i NeuN (neuronski marker) ili GFP i S-100 (astrocitni marker) (SLIKE 10A-10C). Nasuprot tome, AAV2-eGFP (i TT i PCL) je usmeravao pretežno neuronsku transdukciju (SLIKE 9E-9G i 10D). GFP-pozitivne ćelije astrocitnog soja su takođe detektovane u unutrašnjoj kapsuli (SLIKA 9H) kao i u kortikalnim predelima bele materije gde su bili vidljivi tragovi kanile za infuziju.
[0210] Na osnovu dvostruke imunofluorescencije, izračunata je efikasnost neuronske transdukcije u strijatum i kortikalni region (u koronalnoj ravni mesta infuzije) za sve NHP. SLIKA 11A sumira nalaze u strijatumu. Pojedinačni proračuni za svaku životinju prikazani su u Tabeli 8 u nastavku.
Tabela 8. Efikasnost neuronske transdukcije pomoću vektora AAV1-eGFP i AAV2-eGFP unutar strijatalnih primarnih oblasti transdukcije (POT) i kore mozga primata koji nije čovek.
[0211] Strijatalna neuronska transdukcija u regionima primarne transdukcije, na koju ukazuje MRI, kretala se od 50% do 65%. Najveća efikasnost transdukcije primećena je kod NHP infuziranih sa AAV1-eGFP (TT) sa prosekom od 64,2 ± 5,9%, a najniža u grupi AAV2-eGFP (TT) sa prosekom od 46,6 ± 11,7% (p < 0,05; 2-strana ANOVA). Ovo sugeriše da serotip AAV1 ima ∼ 18% veću efikasnost u transdukciji neurona od AAV2. AAV1-eGFP koji proizvodi PCL pokazao je slabiji trend (p> 0,05; 2-smerna ANOVA) ka transduciranju više neurona (59,7±8,1%) nego AAV2-eGFP (50,1±5,8%).
[0212] Gornji proračuni su izvedeni iz oblasti jake GFP transdukcije kao što je definisano pomoću MRI, (primarna oblast transdukcije - POT). Pored toga, izračunata je efikasnost neuronske strijatalne transdukcije u regionima izvan POT kako bi se videlo da li se GFP-pozitivne ćelije takođe mogu detektovati izvan jasne granice jakog GFP signala („izvan primarne oblasti transdukcije“- IPOT), što sugeriše možda da se svi testirani vektori šire na isti način. Šema kako su ove oblasti izabrane (slučajni izbor od 5 okvira za brojanje) je ilustrovana na SLICI 11B. Uočena je dramatična razlika u proceni efikasnosti transdukcije u IPOT između serotipova AAV1 i AAV2 (SLIKA 11C), sa AAV1 koji transducira mnogo više neurona od AAV2 (8,1 ± 3,8% naspram 0,74 ± 0,25% za TT grupe i 7,2 ± 3,5% naspram 2,16 ± 1,8% za PCL grupe; p<0,05 u oba poređenja 2-vai ANOVA;). Pojedinačni proračuni za svaku životinju prikazani su u Tabeli 9 u nastavku.
Tabela 9. Efikasnost neuronske transdukcije pomoću AAV1-eGFP i AAV2-eGFP vektora unutar strijatuma, ali izvan primarnih oblasti transdukcije (IPOT) mozga primata koji nije čovek.
[0213] Pored toga, izračunata je efikasnost transdukcije u kortikalnim regionima koji se projektuju na strijatum. Pošto je stepen kortikalne pokrivenosti varirao među životinjama, slučajne kortikalne oblasti su prebrojane u presecima sa susednim GFP-pozitivnim strijatumom. Uočena je evidentna razlika među životinjama (Tabela 8) bez jasne korelacije sa korišćenim serotipom. Srednja efikasnost neuronske transdukcije za AAV1 iznosila je 13,6 ± 8,3 % naspram 13,4 ± 9,0 % za AAV2 (p > 0,97).
[0214] Kao što je navedeno iznad, AAV1-eGFP je transducirao mnogo više astrocita (S-100 marker) nego neurona. GFP-pozitivni astrociti su detektovani na mestima primarne transdukcije (strijatum) kao i u kortikalnim regionima koji se projektuju u strijatum. Primeri GFP-transduciranih astrocita su prikazani na SLICI 10C. Za AAV2-eGFP vektore, samo sporadični GFP+ astrociti mogu biti detektovani oko staze infuzionih kanila. Kako bi se utvrdilo da li su vektori transducirali druge ćelije koje predstavljaju antigen u mozgu, reprezentativni delovi mozga svih majmuna su obojeni antitelima protiv GFP i Iba-1, specifičnih za mikrogliju. Nijedna životinja nije pokazala dvostruko obeležene ćelije, isključujući ovu mogućnost (SLIKA 10E). Zauzvrat, kod svih testiranih majmuna, bojenje na Olig-2, marker za oligodendrocite, pokazalo je samo nekoliko ćelija pozitivnih i na GFP i na Olig-2. Te retke ćelije su detektovan uglavnom u blizini tragova kanile (podaci nisu prikazani).
[0215] Sekcije mozga su obojene hematoksilin-eozinom (H&E) kako bi se utvrdilo da li su ovi vektori izazvali neuroinflamaciju. Preseci su uglavnom ispitivani na prisustvo perivaskularnih zagušenja - akumulacije limfocita ili plazma ćelija u gustoj masi oko krvnih sudova. Iako su različiti stepeni takvih infiltrata detektovani kod svih majmuna, nisu primećeni drugi histološki nalazi vezani za vektor/transgen. Međutim, primećeno je da AAV1 izaziva nešto eksprimiraniju infiltraciju makrofaga i limfocita unutar primarnih oblasti transdukcije nego AAV2. (SLIKE 12A i 12B). Takođe, činilo se da vektori proizvedeni trostrukom transfekcijom izazivaju opsežnija perivaskularna zagušenja nego vektori generisani procesom proizvodne ćelijske linije. Treba napomenuti da nisu detektovani infiltrati u projektivanim oblastima transdukcije (kortikalni regioni).
Primer 4: Odsustvo primetnog eksprimiranja GFP u perifernom tkivu izvan centralnog nervnog sistema (CNS).
[0216] Tkiva perifernih organa, uključujući bubrege, jetru, pluća, srce i slezinu, sakupljena su na obdukciji kako bi se procenilo da li se eksprimiranje AAV-GFP transgena primenjenog putem CED može detektovati van CNS.
Rezultati
[0217] Ni u jednom od prikupljenih organa nisu detektovani primetni nivoi GFP. I AAV-GFP (TT) (SLIKA 13A) i AAV-GFP (PCL) (SLIKA 13B) vektori nisu pokazali primetno periferno eksprimiranje GFP. Mišje moždano tkivo injektirano AAV2/1-GFP (TT) vektorima je korišćeno kao pozitivna kontrola za ovaj test.
1
Zaključci
[0218] Efikasna isporuka terapijskih proteina u mozak ostaje ozbiljna prepreka za postizanje kliničke efikasnosti uz minimizovanje neželjenih efekata. Razvoj u isporuci gena pružio je priliku da se uspostavi proizvodnja bioloških lekova unutar moždanog parenhima. Ovaj napredak je doveo do pokretanja višestrukih kliničkih ispitivanja u kojima su AAV vektori postali poželjni vektorski sistem za tretman neuroloških poremećaja. Iako se fokalno ciljanje specifičnog jezgra može pouzdano postići stereotaktičnom neurohirurškom infuzijom, ekstenzivni zakrivljeni raspored ljudske moždane kore nije lako ciljati direktnom infuzijom virusnih vektora. Poteškoće u bezbednom postizanju široko rasprostranjenog eksprimiranja gena u mozgu ometale su razvoj potencijalnih tretmana za neurološke bolesti koje zahtevaju kortikalnu isporuku.
[0219] Kao što je ovde opisano, AAV vektori (npr. AAV1 i AAV2) su u stanju da pruže ekstenzivnu isporuku celom strijatumu primata (kaudat i putamen), kao i da isporuče značajan broj ćelija unutar cerebralne kore (uključujući čeoni režanj, potiljačni režanj i sloj IV), talamusa i hipokampusa. GFP, reporterski protein bez poznate funkcije u cerebralnom korteksu, korišćen je u studijama o kojima se ovde govori. AAV 1 i AAV2-GFP injektirani u kaudat i putamen korišćenjem CED postupka isporuke rezultovali su visokim nivoom eksprimiranja GFP u kaudatu i putamenu, kao i u nekoliko regiona moždane kore. GFP-pozitivni neuroni u čeonom režnju locirani su >20 mm od mesta infuzije AAV-GFP, pokazujući na taj način aksonalni transport GFP proteina i AAV vektora. Bez želje da se vežemo teorijom, pošto GFP ostaje citoplazmatski i nije izlučeni protein, smatra se da prisustvo GFP u moždanoj kori ukazuje na direktnu ćelijsku transdukciju i aktivni transport AAV2 vektora duž pojedinačnih aksonalnih projekcija. Hantingtonova bolest je tipična bolest za koju strijatalna isporukaAAV (npr., CED strijatalna isporuka) može biti korisna.
Hantingtonova bolest pogađa i strijatalne i kortikalne regione i stoga je terapijska strategija koja cilja na obe oblasti idealna.
[0220] Nalazi objavljeni ovde naglašavaju potencijal za isporuku AAV vektora (npr., AAV1 i AAV2) za transdukciju neurona koji se nalaze na znatnoj udaljenosti od mesta strijatalne infuzije. Intrastrijatalna primena AAV vektora (npr., AAV1 i AAV2) je stoga idealna za upotrebu u tretmanu poremećaja CNS koji zahtevaju isporuku terapeutskih molekula u strijatum i koru, uključujući, ali ne ograničavajući se na, Hantingtonovu bolest. Pored toga,
2
pošto AAV vektori generisani postupkom trostruke transfekcije i postupkom proizvodne ćelijske linije pokazuju uporedive obrasce eksprimiranja transgena i nivoe transdukcije, postupci trostruke transfekcije i proizvodne ćelijske linije za generisanje AAV vektora su pogodne za upotrebu u predmetnom pronalasku.

Claims (19)

Patentni zahtevi
1. Rekombinantna adeno-povezana virusna (rAAV) čestica za upotrebu u postupku isporuke rAAV u centralni nervni sistem (CNS) sisara, gde se rAAV čestica primenjuje na strijatum sisara pomoću isporuke poboljšane konvekcijom (CED), gde rAAV čestica sadrži rAAV vektor koji kodira heterolognu nukleinsku kiselinu koja je eksprimirana barem u potiljačnom režnju i/ili sloju IV kore velikog mozga i strijatumu sisara, gde rAAV čestica sadrži AAV serotip 2 (AAV2) kapsid, i gde se rAAV čestica primenjuje na najmanje jedno mesto u kaudalnom jezgru i na dva mesta u putamenu u svakoj hemisferi strijatuma.
2. Rekombinantna adeno-povezana virusna (rAAV) čestica za upotrebu u postupku tretmana poremećaja CNS kod sisara, gde se efikasna količina rAAV čestice primenjuje na strijatum sisara pomoću isporuke poboljšane konvekcijom (CED), gde rAAV čestica sadrži rAAV vektor koji kodira heterolognu nukleinsku kiselinu koja je eksprimirana barem u potiljačnom režnju i/ili sloju IV kore velikog mozga i strijatumu sisara, gde rAAV čestica sadrži AAV2 kapsid, i gde se rAAV čestica primenjuje na najmanje jedno mesto u kaudalnom jezgru i na dva mesta u putamenu u svakoj hemisferi strijatuma.
3. rAAV čestica za upotrebu prema patentnom zahtevu 2, gde je poremećaj CNS Hantingtonova bolest, gde opciono heterologna nukleinska kiselina kodira terapeutski polipeptid ili terapeutsku nukleinsku kiselinu koja inhibira eksprimiranje hantingtina (HTT) ili inhibira akumulaciju HTT u ćelijama CNS sisara.
4. rAAV čestica za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, gde heterologna nukleinska kiselina kodira terapeutsku miRNK koja cilja na hantingtin, i gde opciono hantingtin sadrži mutaciju povezanu sa Hantingtonovom bolešću.
5. rAAV čestica za upotrebu prema patentnom zahtevu 2, gde je poremećaj CNS Parkinsonova bolest, i gde opciono heterologna nukleinska kiselina kodira terapeutski polipeptid, gde je opciono terapeutski polipeptid faktor rasta koji potiče od glija (GDNF), faktor rasta koji potiče iz mozga (BDNF), tirozin hidroksalaza (TH), GTP-ciklohidrolaza (GTPCH) i/ili dekarboksilaza aminokiselina (AADC).
4
6. rAAV čestica za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu 1-5, gde je sisar čovek.
7. rAAV čestica za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu 1-5, gde se rAAV čestica primenjuje na putamen i kaudalno jezgro strijatuma, gde odnos rAAV čestica primenjenih na putamen naspram rAAV čestica primenjenih na kaudalno jezgro iznosi najmanje oko 2:1.
8. rAAV čestica za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu 1-7, gde:
(a) heterologna nukleinska kiselina je eksprimirana u prefrontalnim asocijativnim kortikalnim oblastima, premotornoj kori, primarnim somatosenzornim kortikalnim oblastima, senzornoj motornoj kori, temenom režnju, potiljačnom režnju i/ili primarnoj motornoj kori;
(b) rAAV čestica prolazi kroz retrogradni ili anterogradni transport u kori velikog mozga; i/ili
(c) heterologna nukleinska kiselina je dalje eksprimirana u talamusu, subtalamičkom jezgru, globus palidusu, supstancija nigri i/ili hipokampusu.
9. rAAV čestica za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu 1-8, gde rAAV vektor sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu okruženu jednom ili više sekvenci AAV invertovanog terminalnog ponavljanja (ITR), gde opciono:
(a) heterologna nukleinska kiselina je okružena sa dva AAV ITR; i/ili
(b) AAV ITR su AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, kozji AAV, goveđi AAV, ili mišji AAV serotip ITR.
10. rAAV čestica za upotrebu prema patentnom zahtevu 9, gde:
(a) jedna ili više ITR sekvenci i kapsida od rAAV čestice su iz istog AAV serotipa; ili (b) jedna ili više ITR sekvenci i kapsida od rAAV virusne čestice su iz različitih AAV serotipova.
11. rAAV čestica za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu 1-10, gde je heterologna nukleinska kiselina operativno vezana za promoter, gde opciono:
(a) promoter eksprimira heterolognu nukleinsku kiselinu u ćeliji CNS, gde opciono promoter eksprimira heterolognu nukleinsku kiselinu u ćeliji mozga;
(b) promoter eksprimira heterolognu nukleinsku kiselinu u neuronu i/ili glijalnoj ćeliji, gde je opciono neuron srednji trnast neuron kaudalnog jezgra, srednji trnast neuron putamena, neuron sloja IV moždane kore i/ili neuron sloja V moždane kore; (c) promoter je CBA promoter, minimalni CBA promoter, CMV promoter ili GUSB promoter; i/ili
(d) promoter je inducibilan.
12. rAAV čestica za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu 1-11, gde rAAV vektor sadrži jedan ili više pojačivača, donor splajsovanja/primalac splajsovanja parova, mesta vezivanja matriksa i signala poliadenilacije.
13. rAAV čestica za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu 1-12, gde je rAAV vektor samo-komplementaran rAAV vektor, gde opciono vektor sadrži prvu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira heterolognu nukleinsku kiselinu i drugu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira komplement heterologne nukleinske kiseline, gde prva sekvenca nukleinske kiseline može da formira intralančane bazne parove sa drugom sekvencom nukleinske kiseline duž većine ili cele svoje dužine; i gde su opciono prva sekvenca nukleinske kiseline i druga sekvenca nukleinske kiseline povezane mutiranim AAV ITR, gde mutirani AAV ITR sadrži brisanje D regiona i sadrži mutaciju sekvence terminalne rezolucije.
14. rAAV čestica za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu 1-2 i 6-13, gde heterologna nukleinska kiselina kodira:
(a) terapeutski polipeptid; ili
(b) terapeutsku nukleinsku kiselinu, gde opciono terapeutska nukleinska kiselina jeste siRNK, shRNK, RNKi, miRNK, antisens RNK, ribozim ili DNKzim.
15. rAAV čestica za upotrebu prema patentnom zahtevu 14, gde:
(a) terapeutski polipeptid je enzim, neurotrofični faktor, polipeptid koji je deficitaran ili mutiran kod pojedinca sa poremećajem povezanim sa CNS, antioksidans, antiapoptotički faktor, anti-angiogeni faktor i anti-inflamatorni faktor, alfa-sinuklein, kisela beta-glukozidaza (GBA), beta-galaktozidaza-1 (GLB1), iduronat 2-sulfataza (IDS), galaktozilkeramidaza (GALC), manozidaza, alfa-D-manozidaza (MAN2B1), beta-manozidaza (MANBA), pseudoarilsulfataza A (ARSA), N-acetilglukozamin-1-fosfotransferaza (GNPTAB), kisela sfingomijelinaza (ASM), Niman-Pik C protein (NPC1), kisela alfa-1,4-glukozidaza (GAA), heksozaminidaza beta podjedinica, HEXB, N-sulfoglukozamin sulfohidrolaza (MPS3A), N-alfa-acetilglukozaminidaza (NAGLU), heparin acetil-CoA, alfa-glukozaminidaza N-acetiltransferaza (MPS3C), N-acetilglukozaminidaza (NAGLU), heparin acetil-CoA, alfa-glukozaminidaza N-acetiltransferaza (MPS3C), N-acetilglukozamin-6-sulfataza (GNS), alfa-N-acetilglukozaminidaza (NAGA),, beta-glukuronidaza (GUSB), heksosaminidaza alfa podjedinica (HEXA), hantingtin (HTT), lizozomska kisela lipaza (LIPA), aspartilglukozaminidaza, alfa-galaktozidaza A, palmitoil protein tioesteraza, tripeptidil peptidaza, lizozomski transmembranski protein, cisteinski transporter, kisela keramidaza, kisela alfa-L-fukozidaza, katepsin A, alfa-L-iduronidaza, arilsulfataza B, arilsulfataza A, N-acetilgalaktozamin-6-sulfat, kisela betagalaktozidaza ili alfa-neuramidaza; ili
(b) terapeutski polipeptid ili terapeutska nukleinska kiselina se koristi za tretman poremećaja CNS, gde opciono:
(i) poremećaj CNS je Hantingtonova bolest, epilepsija, Parkinsonova bolest, Alchajmerova bolest, moždani udar, kortikobazalna degeneracija (CBD), kortikogazalna ganglijska degeneracija (CBGD), frontotemporalna demencija (FTD), višestruka sistemska atrofija (MSA), progresivna supranuklearna paraliza (PSP) ili rak mozga; ili
(ii) poremećaj je bolest lizozomskog skladištenja izabrana iz grupe koju čine aspartilgluzoaminurija, fabri, infantilna Batenova bolest (CNL1), klasična kasna infantilna Batenova bolest (CNL2), juvenilna Batenova bolest (CNL3), Baten oblik CNL4, Baten oblik CNL5, Baten oblik CNL6, Baten oblik CNL7, Baten oblik CNL8, cistinoza, farber, fukosidoza, glaktozidozijaldoza, Gošeova bolest tipa 1, Gošeova bolest tipa 2, Gošeova bolest tipa 3, GM1 gangliozidoza, Hanterova bolest, Krabeova bolest, α manosidoza bolest, β manosidoza bolest, mukopolisaharidoza tipa VI (Maroteaux-Lamy), metahromatska leukodistrofija bolest, Morquio A, Morquio B, mukolipidoza II/III bolest, Niman-Pik A bolest, Niman-Pik B bolest, Niman-Pik C bolest, Pompeova bolest, Sandhofova bolest, Sanfilipo A bolest, Sanfilipo B bolest, Sanfilipo C bolest, Sanfilipo D bolest, Šindlerova bolest, Šindler-Kanzaki, sijalidoza, Sly bolest, Tay-Sachs bolest i Volmanova bolest.
16. rAAV čestica za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu 1-15, gde je rAAV čestica u sastavu, gde opciono sastav jeste farmaceutski sastav koji sadrži farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.
17. rAAV čestica za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu 1-16, gde:
(a) rAAV čestica je proizvedena trostrukom transfekcijom nukleinske kiseline koja kodira rAAV vektor, nukleinske kiseline koja kodira AAV rep i cap, i nukleinske kiseline koja kodira funkcije AAV pomoćnog virusa u ćeliju domaćina, gde transfekcija nukleinskih kiselina ćelije domaćina stvara ćeliju domaćina sposobnu da proizvodi rAAV čestice; ili
(b) rAAV česticu je proizvela proizvodna ćelijska linija koja sadrži jedno ili više od narednog: nukleinske kiseline koje kodiraju rAAV vektor, nukleinska kiselina koja kodira AAV rep i cap, i nukleinska kiselina koja kodira funkcije AAV pomoćnog virusa.
18. rAAV čestica za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu 1-17, gde se rAAV čestica isporučuje korišćenjem CED sistema za isporuku.
19. rAAV čestica za upotrebu prema patentnom zahtevu 18, gde CED sistem sadrži naredno:
(a) kanila, gde je kanila opciono kanila otporna na refluks ili stepenasta kanila; i/ili (b) pumpa, gde je pumpa opciono:
(i) ručna pumpa;
(ii) osmotska pumpa; ili
(iii) pumpa za infuziju.
RS20220044A 2015-02-10 2016-02-09 Poboljšana isporuka virusnih čestica u strijatum i moždanu koru RS62811B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562114544P 2015-02-10 2015-02-10
US201562220997P 2015-09-19 2015-09-19
EP16714066.4A EP3256594B1 (en) 2015-02-10 2016-02-09 Enhanced delivery of viral particles to the striatum and cortex
PCT/US2016/017210 WO2016130591A2 (en) 2015-02-10 2016-02-09 Enhanced delivery of viral particles to the striatum and cortex

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62811B1 true RS62811B1 (sr) 2022-02-28

Family

ID=56614902

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20220044A RS62811B1 (sr) 2015-02-10 2016-02-09 Poboljšana isporuka virusnih čestica u strijatum i moždanu koru

Country Status (27)

Country Link
US (3) US20190111157A1 (sr)
EP (3) EP3256594B1 (sr)
JP (4) JP6928558B2 (sr)
KR (2) KR102625784B1 (sr)
CN (2) CN107530447A (sr)
AU (3) AU2016219398A1 (sr)
BR (1) BR112017017037A2 (sr)
CA (1) CA2976082A1 (sr)
CL (1) CL2017002028A1 (sr)
CR (1) CR20170407A (sr)
DK (1) DK3256594T3 (sr)
EA (1) EA201791803A1 (sr)
ES (1) ES2904504T3 (sr)
HU (1) HUE057272T2 (sr)
IL (4) IL313840A (sr)
LT (1) LT3256594T (sr)
MX (2) MX388264B (sr)
NZ (1) NZ772772A (sr)
PH (1) PH12017501436A1 (sr)
PL (1) PL3256594T3 (sr)
PT (1) PT3256594T (sr)
RS (1) RS62811B1 (sr)
SG (3) SG10201907399RA (sr)
SI (1) SI3256594T1 (sr)
TN (1) TN2017000353A1 (sr)
TW (1) TWI730952B (sr)
WO (1) WO2016130591A2 (sr)

Families Citing this family (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3151866B1 (en) 2014-06-09 2023-03-08 Voyager Therapeutics, Inc. Chimeric capsids
RU2716991C2 (ru) 2014-11-05 2020-03-17 Вояджер Терапьютикс, Инк. Полинуклеотиды aadc для лечения болезни паркинсона
WO2016077687A1 (en) 2014-11-14 2016-05-19 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als)
KR20230145206A (ko) 2014-11-14 2023-10-17 보이저 테라퓨틱스, 인크. 조절성 폴리뉴클레오티드
US11697825B2 (en) 2014-12-12 2023-07-11 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the production of scAAV
CN107530447A (zh) * 2015-02-10 2018-01-02 建新公司 病毒颗粒至纹状体和皮质的增强递送
TWI707951B (zh) 2015-04-08 2020-10-21 美商健臻公司 過大腺相關載體之製造
EP3285788B1 (en) 2015-04-23 2024-12-18 University of Massachusetts Modulation of aav vector transgene expression
GB201508025D0 (en) 2015-05-11 2015-06-24 Ucl Business Plc Fabry disease gene therapy
TW202446416A (zh) 2015-09-24 2024-12-01 美商拜奧馬林製藥公司 腺相關病毒因子viii載體、相關病毒粒子及包含其之治療調配物
US11299751B2 (en) 2016-04-29 2022-04-12 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
EP3448874A4 (en) 2016-04-29 2020-04-22 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS FOR TREATING A DISEASE
KR102427379B1 (ko) 2016-05-18 2022-08-02 보이저 테라퓨틱스, 인크. 헌팅톤 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법
KR20240056729A (ko) 2016-05-18 2024-04-30 보이저 테라퓨틱스, 인크. 조절성 폴리뉴클레오티드
WO2018044933A1 (en) 2016-08-30 2018-03-08 The Regents Of The University Of California Methods for biomedical targeting and delivery and devices and systems for practicing the same
US11338046B2 (en) 2016-09-30 2022-05-24 Esteve Pharmaceuticals, S.A. Adenoassociated virus vectors for the treatment of mucopolysaccharidoses
CN118813559A (zh) * 2017-03-31 2024-10-22 北京三诺佳邑生物技术有限责任公司 shRNA表达框、携带其的多核苷酸序列及其应用
US10898585B2 (en) 2017-04-14 2021-01-26 Ptc Therapeutics .Inc. Gene therapy for AADC deficiency
JP2020518259A (ja) * 2017-05-05 2020-06-25 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドＶｏｙａｇｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． ハンチントン病治療組成物および方法
JP2020518258A (ja) 2017-05-05 2020-06-25 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドＶｏｙａｇｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 筋萎縮性側索硬化症（ａｌｓ）治療組成物および方法
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
CA3070087A1 (en) 2017-07-17 2019-01-24 Voyager Therapeutics, Inc. Trajectory array guide system
EP3808849A1 (en) 2017-08-03 2021-04-21 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for delivery of aav
AU2018338728B2 (en) 2017-09-29 2025-01-02 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Rescue of central and peripheral neurological phenotype of Friedreich's Ataxia by intravenous delivery
TW202413649A (zh) 2017-10-16 2024-04-01 美商航海家醫療公司 肌萎縮性脊髓側索硬化症(als)之治療
EP3697908A1 (en) 2017-10-16 2020-08-26 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als)
CN112203697A (zh) 2018-04-13 2021-01-08 马萨诸塞大学 编码氨基己糖苷酶alpha和beta亚基的双顺反子AAV载体及其用途
KR20210019996A (ko) 2018-05-15 2021-02-23 보이저 테라퓨틱스, 인크. 파킨슨병의 치료를 위한 조성물 및 방법
CN113528510A (zh) * 2018-06-29 2021-10-22 武汉纽福斯生物科技有限公司 治疗遗传性视神经病变的组合物和方法
EP3856762A1 (en) 2018-09-28 2021-08-04 Voyager Therapeutics, Inc. Frataxin expression constructs having engineered promoters and methods of use thereof
US12448629B2 (en) 2018-10-05 2025-10-21 University Of Massachusetts rAAV vectors for the treatment of GM1 and GM2 gangliosidosis
BR112021009370A2 (pt) * 2018-11-14 2021-08-17 Regenxbio Inc. método de tratamento da doença de batten cln2, composição farmacêutica e kit
BR112021015817A2 (pt) * 2019-02-22 2021-10-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Vírus adeno-associado recombinante para tratamento de neurodegeneração com início na idade adulta associado a grn
EP3983077A4 (en) * 2019-06-17 2023-12-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. DELIVERY OF OLIGONUCLEOTIDES TO THE STRIATUM
WO2021007382A1 (en) * 2019-07-09 2021-01-14 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of parkinson's disease
WO2021016505A1 (en) * 2019-07-24 2021-01-28 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating huntington's disease
US12442017B2 (en) 2020-03-02 2025-10-14 National University Corporation Gunma University Microglial selective gene expression vector
CA3174928A1 (en) * 2020-03-11 2021-09-16 Remotor Therapeutics, Inc. Methods and materials for disseminating a protein throughout the central nervous system
AU2021302954A1 (en) * 2020-06-30 2023-02-16 Seqirus UK Limited Cold filtration of oil-in-water emulsion adjuvants
AU2022212922A1 (en) * 2021-01-27 2023-08-17 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Materials and methods for the treatment of lysosomal acid lipase deficiency (lal-d)
WO2023113806A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Affinia Therapeutics, Inc. Recombinant aav for treatment of neural disease
EP4323531A1 (en) 2021-04-12 2024-02-21 Affinia Therapeutics Inc. Recombinant aav for treatment of neural disease
WO2023108507A1 (en) * 2021-12-15 2023-06-22 National Institute Of Biological Sciences, Beijing Recombinant aav vectors and use thereof
WO2023109911A1 (en) * 2021-12-15 2023-06-22 National Institute Of Biological Sciences, Beijing Microglia having car and use thereof
CN119256090A (zh) * 2022-03-25 2025-01-03 阿斯克肋匹奥生物制药公司 用于治疗帕金森病的方法和组合物
WO2024086747A1 (en) 2022-10-19 2024-04-25 Affinia Therapeutics Inc. Recombinant aavs with improved tropism and specificity
WO2025151454A1 (en) * 2024-01-08 2025-07-17 AskBio Inc. Method or system of infusing and/or predicting an infusate volume
WO2025227063A1 (en) 2024-04-26 2025-10-30 Affinia Therapeutics Inc. Recombinant aavs with improved tropism and specificity

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4692147A (en) 1980-04-02 1987-09-08 Medtronic, Inc. Drug administration device
US5735815A (en) 1993-07-26 1998-04-07 Sentinel Medical, Inc. Method of using fluid jet surgical cutting tool
EP0931158A1 (en) 1996-09-06 1999-07-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania An inducible method for production of recombinant adeno-associated viruses utilizing t7 polymerase
US6042579A (en) 1997-04-30 2000-03-28 Medtronic, Inc. Techniques for treating neurodegenerative disorders by infusion of nerve growth factors into the brain
US6989264B2 (en) 1997-09-05 2006-01-24 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
US6566118B1 (en) 1997-09-05 2003-05-20 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
WO1999061066A2 (en) * 1998-05-27 1999-12-02 Avigen, Inc. Convection-enhanced delivery of aav vectors
CA2379166C (en) 1999-08-09 2013-03-26 Targeted Genetics Corporation Enhancement of expression of a single-stranded, heterologous nucleotide sequence from recombinant viral vectors by designing the sequence such that it forms instrastrand base pairs
ATE318923T1 (de) 2000-06-01 2006-03-15 Univ North Carolina Doppelsträngige parvovirus-vektoren
EP1402043A1 (en) 2001-07-03 2004-03-31 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Methods of administering vectors to synaptically connected neurons
US6723551B2 (en) 2001-11-09 2004-04-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of adeno-associated virus in insect cells
MX359371B (es) 2001-11-13 2018-09-25 Univ Pennsylvania Un metodo para detectar y/o identificar secuencias del virus adeno-asociado y aislamiento de secuencias novedosas identificadas de ese modo.
GB2389791B (en) 2002-04-30 2006-12-13 Steven Gill Implantable drug delivery pump
US7261544B2 (en) 2003-05-21 2007-08-28 Genzyme Corporation Methods for producing preparations of recombinant AAV virions substantially free of empty capsids
MX2007003850A (es) * 2004-10-05 2007-11-21 Genzyme Corp Canula escalonada.
WO2006119432A2 (en) 2005-04-29 2006-11-09 The Government Of The U.S.A., As Rep. By The Sec., Dept. Of Health & Human Services Isolation, cloning and characterization of new adeno-associated virus (aav) serotypes
JP5829372B2 (ja) 2005-05-02 2015-12-09 ジェンザイム・コーポレーション 神経代謝性疾患のための遺伝子治療
EP1928557B1 (en) * 2005-08-23 2018-06-06 The Regents of The University of California Reflux resistant cannula and system for chronic delivery of therapeutic agents using convection-enhanced delivery
US7588772B2 (en) 2006-03-30 2009-09-15 Board Of Trustees Of The Leland Stamford Junior University AAV capsid library and AAV capsid proteins
DK2019683T4 (da) 2006-04-25 2022-08-29 Univ California Indgivelse af vækstfaktorer til behandling af CNS-lidelser
US20070259031A1 (en) 2006-04-26 2007-11-08 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for convection enhanced delivery of high molecular weight neurotherapeutics
WO2008144585A1 (en) 2007-05-17 2008-11-27 Medgenesis Therapeutix Inc. Convection-enhanced delivery catheter with removable stiffening member and method for using same
JP2012516357A (ja) 2009-01-29 2012-07-19 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 神経学的障害を治療するための皮質全体に亘る高レベルの治療薬の分布方法
KR20180000341A (ko) 2009-06-16 2018-01-02 젠자임 코포레이션 재조합 ａａｖ 벡터에 대한 개선된 정제 방법
US8663624B2 (en) 2010-10-06 2014-03-04 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
WO2012109667A1 (en) * 2011-02-12 2012-08-16 University Of Iowa Research Foundation Therapeutic compounds
TR201908020T4 (tr) 2011-02-17 2019-06-21 Univ Pennsylvania Doku özgüllüğünü değiştirmek ve aav9-aracılı gen transferini geliştirmek için bileşimler ve yöntemler.
LT3137497T (lt) * 2014-05-02 2021-07-26 Genzyme Corporation Aav vektoriai, skirti tinklainės ir cns genų terapijai
CN107530447A (zh) * 2015-02-10 2018-01-02 建新公司 病毒颗粒至纹状体和皮质的增强递送
CN111417231A (zh) 2019-01-04 2020-07-14 青岛海尔股份有限公司 电磁波发生系统及具有该电磁波发生系统的加热装置

Also Published As

Publication number Publication date
EP4023758A1 (en) 2022-07-06
DK3256594T3 (da) 2022-01-24
SG10201912926VA (en) 2020-02-27
JP2018506585A (ja) 2018-03-08
SG10201907399RA (en) 2019-09-27
HK1246340A1 (zh) 2018-09-07
WO2016130591A3 (en) 2016-11-10
EP3256594B1 (en) 2021-10-20
EP4219728A2 (en) 2023-08-02
IL285060B2 (en) 2023-02-01
US20190111157A1 (en) 2019-04-18
KR20170110718A (ko) 2017-10-11
BR112017017037A2 (pt) 2018-04-10
MX2021004294A (es) 2021-06-04
CN107530447A (zh) 2018-01-02
TWI730952B (zh) 2021-06-21
NZ735290A (en) 2023-10-27
CN116019934A (zh) 2023-04-28
NZ772772A (en) 2024-12-20
IL285060A (en) 2021-08-31
KR20240010539A (ko) 2024-01-23
AU2022204583A1 (en) 2022-07-21
CA2976082A1 (en) 2016-08-18
KR102625784B1 (ko) 2024-01-15
JP2021178861A (ja) 2021-11-18
ES2904504T3 (es) 2022-04-05
CL2017002028A1 (es) 2018-04-13
JP2023058630A (ja) 2023-04-25
MX2017010370A (es) 2017-12-14
JP2025060823A (ja) 2025-04-10
MX388264B (es) 2025-03-19
LT3256594T (lt) 2022-02-10
PL3256594T3 (pl) 2022-02-14
TN2017000353A1 (en) 2019-01-16
IL253894B (en) 2021-08-31
WO2016130591A2 (en) 2016-08-18
US12465657B2 (en) 2025-11-11
KR102863734B1 (ko) 2025-09-25
US20220395586A1 (en) 2022-12-15
IL296466B2 (en) 2024-11-01
SG11201706445SA (en) 2017-09-28
PT3256594T (pt) 2022-01-18
IL285060B (en) 2022-10-01
EP4219728A3 (en) 2023-08-23
IL296466B1 (en) 2024-07-01
HUE057272T2 (hu) 2022-04-28
AU2025201381A1 (en) 2025-03-20
AU2016219398A1 (en) 2017-09-28
CR20170407A (es) 2017-11-14
IL253894A0 (en) 2017-10-31
IL313840A (en) 2024-08-01
JP6928558B2 (ja) 2021-09-01
IL296466A (en) 2022-11-01
TW201642909A (zh) 2016-12-16
EP3256594A2 (en) 2017-12-20
SI3256594T1 (sl) 2022-07-29
US20260048149A1 (en) 2026-02-19
EA201791803A1 (ru) 2017-11-30
PH12017501436A1 (en) 2018-01-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12465657B2 (en) Enhanced delivery of viral particles to the striatum and cortex
JP7682142B2 (ja) 網膜およびｃｎｓ遺伝子治療用ａａｖベクター
HK40097464A (en) Enhanced delivery of viral particles to the striatum and cortex
HK1246340B (en) Enhanced delivery of viral particles to the striatum and cortex
NZ735290B2 (en) Enhanced delivery of viral particles to the striatum and cortex
WO2025160452A1 (en) Methods for fus-based delivery of viral particles to the brain
HK1234076B (en) Aav vectors for retinal and cns gene therapy