RS62959B1

RS62959B1 - Biciklični inhibitori histon-deacetilaze

Info

Publication number: RS62959B1
Application number: RS20220164A
Authority: RS
Inventors: Nathan Oliver Fuller; John A Lowe Iii
Original assignee: Alkermes Inc
Priority date: 2017-01-11
Filing date: 2018-01-11
Publication date: 2022-03-31
Also published as: KR20190104389A; SMT202200131T1; AU2018207402A1; MX2019008302A; US11225479B2; ES2909086T3; BR112019014235A2; MD3570834T2; US10696673B2; TWI770104B; CN110290789A; US20200148678A1; TW201831183A; US10793567B2; JP2020504156A; SI3570834T1; US20210122748A1; ES2875562T3; US10519149B2; IL267953A

Description

Opis

SRODNE PRIJAVE

[0001] Ova prijava ima prioritet na osnovu U.S. privremene prijave br.62/445,022 podnete 11. januara 2017. i U.S. privremene prijave br.62/555,298 podnete 7. septembra 2017.

IZJAVA U VEZI SA ISTRAŽIVANJEM I RAZVOJEM KOJI SE FINANSIRAJU IZ FEDERALNOG BUDŽETA

[0002] Ovaj pronalazak ostvaren je uz podršku vlade u okviru sredstava za istraživanje inovacija malih preduzeća (Small Business Innovation Research, SBIR) 1R43AG048651-01A1, koje je dodelio Nacionalni institut za zdravlje (National Institute of Health, NIH). Vlada polaže određena prava na pronalazak.

OSNOV PRONALASKA

[0003] Pokazano je da inhibitori histon-deacetilaza (histone deacetylases, HDAC) modulišu transkripciju i indukuju zaustavljanje rasta ćelija, diferencijaciju i apoptozu. Isto tako, inhibitori HDAC pojačavaju citotoksične efekte terapijskih sredstava koja se koriste u lečenju kancera, koja uključuju zračenje i hemioterapijske lekove. Marks, P., Rifkind, R. A., Richon, V. M., Breslow, R., Miller, T., Kelly, W. K. Histone deacetylases and cancer: causes and therapies. Nat Rev Cancer, 1, 194-202, (2001); i Marks, P. A., Richon, V. M., Miller, T., Kelly, W. K. Histone deacetylase inhibitors. Adv Cancer Res, 91, 137-168, (2004). Pored toga, nedavni podaci ukazuju na to da deregulacija transkripcije može doprineti molekularnoj patogenezi određenih neurodegenerativnih poremećaja kao što su Huntington-ova bolest, spinalna mišićna atrofija, amiotrofična lateralna skleroza, i ishemija. Langley, B., Gensert, J. M., Beal, M. F., Ratan, R. R. Remodeling chromatin and stress resistance in the central nervous system: histone deacetylase inhibitors as novel and broadly effective neuroprotective agents. Curr Drug Targets CNS Neurol Disord, 4, 41-50, (2005). Nedavni revijski članak sumira dokaze o tome da aberantna aktivnost histon-acetiltransferaze (histone acetyltransferase, HAT) i histondeacetilaza (HDAC) može predstavljati čest mehanizam koji u osnovni doprinosi neurodegeneraciji. Pored toga, koristeći mišji model depresije, Nestler je nedavno istakao terapijski potencijal inhibitora deacetilacije histona (HDAC5) u depresiji. Tsankova, N. M., Berton, O., Renthal, W., Kumar, A., Neve, R. L., Nestler, E. J. Sustained hippocampal chromatin regulation in a mouse model of depression and antidepressant action. Nat Neurosci, 9, 519-525, (2006).

[0004] Poznato je 18 humanih histon-deacetilaza koje su na osnovu strukture svojih sporednih domena grupisane u četiri klase. Klasa jedan uključuje HDAC1, HDAC2, HDAC3, i HDAC8 i one su homologe sa Rpd3 kvasca. HDAC4, HDAC5, HDAC7, i HDAC9 pripadaju klasi IIa i homologe su sa Hda1 kvasca. HDAC6 i HDAC10 sadrže dva katalitička mesta i klasifikuju se kao klasa IIb. Klasa III (sirtuini) uključuje SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, i SIRT7. HDAC11 je još jedan nedavno identifikovan član porodice HDAC, koji u svom katalitičkom centru sadrži konzervirane rezidue zajedničke sa deacetilazama klase I i klase II, i ponekada se svrstava u klasu IV.

[0005] Pokazano je da su HDAC snažni negativni regulatori procesa dugotrajnog pamćenja. Nespecifični inhibitori HDAC povećavaju plastičnost sinapsi i poboljšavaju dugotrajno pamćenje (Levenson et al., 2004, J. Biol. Chem. 279:40545-40559; Lattal et al., 2007, Behav Neurosci 121:1125-1131; Vecsey et al., 2007, J. Neurosci 27:6128; Bredy, 2008, Learn Mem 15:460-467; Guan et al., 2009, Nature 459:55-60; Malvaez et al., 2010, Biol. Psychiatry 67:36-43; Roozendaal et al., 2010, J. Neurosci. 30:5037-5046). Na primer, inhibicija HDAC može transformisati događaje učenja koji ne dovode do dugotrajnog pamćenja u događaje učenja koji rezultuju dugotrajnim pamćenjem (Stefanko et al., 2009, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:9447-9452). Pored toga, inhibicija HDAC može stvoriti oblik dugotrajnog pamćenja koje se održava duže od normalnog pamćenja. Pokazano je da inhibitori HDAC ublažavaju kognitivne deficite u genetičkim modelima Alzheimer-ove bolesti (Fischer et al., 2007, Nature 447:178-182; Kilgore et al., 2010, Neuropsychopharmacology 35:870-880). Ovi podaci sugerišu da modulisanje pamćenja inhibicijom HDAC ima znatan terapijski potencijal u mnogim poremećajima pamćenja i kognicije.

[0006] Uloga pojedinačnih HDAC u dugotrajnom pamćenju ispitivana je u dve nedavne studije. Kilgore et al.2010, Neuropsychopharmacology 35:870-880 pokazali su da nespecifični inhibitori HDAC, kao što je natrijum butirat, inhibiraju HDAC klase I (HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC8) uz mali efekat na članove porodice HDAC klase IIa (HDAC4, HDAC5, HDAC7, HDAC9). Ovo sugeriše da inhibicija HDAC klase I može biti kritična za poboljšanje kognicije koje je zapaženo u mnogim studijama. Zaista, preterana ekspresija HDAC2, ali ne i HDAC1, specifična za prednji mozak i neurone, smanjuje gustinu dendritskih trnića, gustinu sinapsi, plastičnost sinapsi i formiranje pamćenja. (Guan et al., 2009, Nature, 459:55-60).

Nasuprot tome, HDAC2-nokautirani miševi pokazuju porast gustine sinapsi, povećanu plastičnost sinapsi i povećanu gustinu neuronskih dendrita. Ovi HDAC2-deficijentni miševi pokazuju i poboljšano učenje i pamćenje u nizu ponašajnih paradigmi procesa učenja. Ovaj rad pokazuje da je HDAC2 ključni regulator sinaptogeneze i plastičnosti sinapsi. Pored toga, Guan et al. pokazali su da hronični tretman miševa korišćenjem SAHA (inhibitor HDAC 1,2,3,6, 8) reprodukuje efekte koji su viđeni kod miševa sa deficijencijom HDAC2 i uklanja kognitivnu ometenost kod miševa sa preteranom ekspresijom HDAC2.

[0007] Inhibicija HDAC2 (selektivna ili u kombinaciji sa inhibicijom drugih HDAC klase I; kao primarnog cilja ili kao dela kompleksa sa drugim proteinima) privlačan je terapijski cilj. Selektivna inhibicija mogla bi se postići ciljanjem specifičnih izoformi HDAC, na primer HDAC2, izolovane ili kao dela funkcionalnog multiproteinskog kompleksa. Takva inhibicija ima potencijal da poboljša kogniciju i olakša proces učenja putem povećavanja sinaptičke i dendritske gustine u populacijama neuronskih ćelija. Pored toga, inhibicija specifičnih HDAC, na primer HDAC2, takođe može biti terapijski korisna i u lečenju širokog izbora drugih oboljenja i poremećaja.

[0008] WO 2012/149540 opisuje inhibitore HDAC za koje se kaže da su korisni za promociju kognitivne funkcije i poboljšanje učenja i formiranja pamćenja.

[0009] Wagner, F. F. et al, Chem. Sci., 2015, 804-815 opisuju određene inhibitore HDAC2.

SAŽETAK

[0010] Primeri izvođenja pronalaska su kako je definisano u patentnim zahtevima. Objavljena su jedinjenja i njihove farmaceutski prihvatljive soli, i farmaceutske kompozicije, korisni u lečenju stanja udruženih sa aktivnošću HDAC (npr., HDAC2). (Vidi npr., Tabele 1 i 2).

[0011] Objavljena jedinjenja obezbeđuju prednost u poređenju sa ranijim inhibitorima, u vezi sa hematološkom bezbednošću i ukupnom ravnotežom potencije, ADME i PK profila. Na primer, zamena vodonika metil grupom kod Komparatora E odnosno Jedinjenja 2 dovodi do dramatičnog smanjenja inhibicije CYP2D6. Vidi npr., Tabelu 2. Isto tako, ova zamena obezbeđuje izrazite prednosti u vezi sa PK u odnosu na nesupstituisani pirimidinski analog, ispoljavajući duži poluživot, niži klirens, višu bioraspoloživost, i >5-struko višu izloženost u mozgu. Vidi npr., Tabelu 3. Slično tome, dodavanjem jednog dodatnog atoma fluora na poziciji orto ostvaruje se značajna bezbednosna prednost Jedinjenja 1 u odnosu na Komparatora I, prema eritroidnoj i mijeloidnoj progenitorskoj ćelijskoj liniji. Vidi npr., Tabelu 5.

[0012] Opisana jedinjenja dovode i do promena morfologije dendritskih trnića u CA1 regionu dorzalnog hipokampusa kod divljeg tipa miševa. Vidi npr., Tabelu 7. Merenjem morfologije dendritskih trnića mogu se identifikovati farmakološka sredstva koja verovatno promovišu ili invertuju normalnu kognitivnu funkciju i štite od kognitivne ometenosti ili je pogoršavaju.

[0013] Stanja koja se mogu lečiti objavljenim jedinjenjima uključuju, ali se ne ograničavaju na neurološke poremećaje, poremećaje ili ometenost pamćenja ili kognitivne funkcije, poremećaje gašenja naučenog, gljivična oboljenja ili infekcije, zapaljenska oboljenja, hematološka oboljenja, neoplastična oboljenja, psihijatrijske poremećaje, i gubitak pamćenja.

DETALJAN OPIS

1. Jedinjenja

[0014] U ovom tekstu obezbeđeno je jedinjenje formule:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

2. Definicije

[0015] Kako se koriste u ovom tekstu, izrazi "subjekt" i "pacijent" mogu se upotrebljavati naizmenično, i označavaju sisara kojem je potrebno lečenje, npr., životinje za društvo (npr., psi, mačke i slično), životinje na farmama (npr., krave, svinje, konji, ovce, koze i slično) i laboratorijske životinje (npr., pacovi, miševi, morski prasići i slično). Tipično, subjekt je čovek kojem je potrebno lečenje.

[0016] Uključene su i farmaceustski prihvatljive soli kao i neutralne forme jedinjenja opisanih u ovom tekstu. Za upotrebu u medicini, soli jedinjenja odnose se na netoksične "farmaceutski prihvatljive soli". Farmaceutski prihvatljive slane forme uključuju farmaceutski prihvatljive kisele/anjonske ili bazne/katjonske soli. Farmaceutski prihvatljive bazne/katjonske soli uključuju soli natrijuma, kalijuma, kalcijuma, magnezijuma, dietanolamina, n-metil-D-glukamina, L-lizina, L-arginina, amonijumske soli, soli etanolamina, piperazina i trietanolamina. Farmaceutski prihvatljive kisele/anjonske soli uključuju, npr., acetat, benzensulfonat, benzoat, bikarbonat, bitartrat, karbonat, citrat, dihidrohlorid, glukonat, glutamat, glikolilarsanilat, heksilrezorcinat, hidrobromid, hidrohlorid, malat, maleat, malonat, mezilat, nitrat, salicilat, stearat, sukcinat, sulfat, tartrat, i tozilat.

[0017] Izraz "farmaceutski prihvatljivi nosač" označava netoksični nosač, adjuvans, ili prenosnik koji ne poništava farmakološku aktivnost jedinjenja sa kojim je formulisan. Farmaceutski prihvatljivi nosači, adjuvansi ili prenosnici koji se mogu koristiti u kompozicijama opisanim u ovom tekstu uključuju, ali se ne ograničavaju na izmenjivače jona, aluminijum oksid, aluminijum stearat, lecitin, serumske proteine kao što je humani serumski albumin, puferske supstance kao što su fosfati, glicin, sorbinsku kiselinu, kalijum sorbat, parcijalne gliceridne smeše zasićenih biljnih masnih kiselina, vodu, soli ili elektrolite kao što su protamin sulfat, dinatrijum hidrogen fosfat, kalijum hidrogen fosfat, natrijum hlorid, soli cinka, koloidni silicijum-dioksid, magnezijum trisilikat, polivinil pirolidon, supstance na bazi celuloze, polietilen glikol, natrijum karboksimetilcelulozu, poliakrilate, voskove, polietilenpolioksipropilen-blok polimere, polietilen glikol i lanolin.

[0018] Izrazi "tretman/lečenje", "tretira/leči" i "tretirati/lečiti" označavaju reverziju, ublažavanje, smanjenje verovatnoće razvoja, ili inhibiranje napredovanja bolesti ili poremećaja, ili jednog ili više njihovih simptoma, kako je opisano u ovom tekstu. U nekim primerima izvođenja, tretman se može primeniti posle razvijanja jednog ili više simptoma, tj., terapijski tretman. U drugim primerima izvođenja, tretman se može primeniti u odsustvu simptoma. Na primer, tretman se može primeniti kod suspektne osobe, pre pojave simptoma (npr., u svetlu postojanja istorije simptoma i/ili u svetlu genetičkih ili drugih faktora osetljivosti), tj., profilaktički tretman. Tretman se može nastaviti i posle nestanka simptoma, na primer da bi se sprečilo ili odložilo njihovo ponovno pojavljivanje.

[0019] Izraz "efikasna količina" ili "terapijski efikasna količina" podrazumeva količinu jedinjenja opisanog u ovom tekstu, koja će pobudutu biološki ili medicinski odgovor subjekta.

3. Upotrebe, formulacije i primena

[0020] U nekim primerima izvođenja, jedinjenja i kompozicije opisani u ovom tekstu korisni su u lečenju stanja udruženih sa aktivnošću HDAC. Takva stanja uključuju na primer, ona koja su opisana u nastavku.

[0021] Novija saopštenja detaljno govore o značaju acetilacije histona za funkcije centralnog nervnog sistema (central nervous system, "CNS"), kao što su deferencijacija neurona, formiranje pamćenja, navikavanje na lekove, i depresija (Citrome, Psychopharmacol. Bull.

2003, 37, Suppl. 2, 74-88; Johannessen, CNS Drug Rev. 2003, 9, 199-216; Tsankova et al., 2006, Nat. Neurosci.9, 519-525; Bousiges et al., 2013, PLoS ONE 8(3), e57816). Prema tome, u jednom aspektu, data jedinjenja i kompozicije mogu biti korisni u lečenju neurološkog poremećaja. Primeri neuroloških poremećaja uključuju: (i) hronične neurodegenerativne bolesti kao što su degeneracija frontotemporalnog režnja (frontotemporalna demencija, frontotemporal dementia, FTD), FTD-GRN, porodična i sporadična amiotrofična lateralna skleroza (familial/sporadic amyotrophic lateral sclerosis FALS/ALS), porodična i sporadična Parkinsonova bolest, Parkinson-ova demencija, Huntington-ova bolest, porodična i sporadična Alzheimer-ova bolest, multipla skleroza, mišična distrofija, olivopontocerebelarna atrofija, multipla sistemska atrofija, Wilson-ova bolest, progresivna supranukleusna palsija, difuzna bolest sa Lewy-jevim telima, kortikodentatonigralna degeneracija, progresivna porodična mioklonična epilepsija, striatonigralna degeneracija, torziona distonija, porodični tremor, Down-ov sindrom, Gilles de la Tourette-ov sindrom, Hallervorden-Spatz-ova bolest, dijabetična periferna neuropatija, dementia pugilistica, demencija kod AIDS, demencija povezana sa starenjem, ometeno pamćenje udruženo sa starošću, i neurodegenerativne bolesti povezane sa amiloidozom kao što su one izazvane prionskim proteinom (prion protein, PrP) udruženim sa prenosivom spongiformnom encefalopatijom (Creutzfeldt-Jakob-ova bolest, Gerstmann-Straussler-Scheinker-ov sindrom, grebež, i kuru), i one koje su izazvane akumulacijom cistatina C u višku (nasledna angiopatija sa cistatinom C); i (ii) akutne neurodegenerativne poremećaje kao što su traumatska povreda mozga (npr., povreda mozga povezana sa operacijom), cerebralni edem, oštećenje perifernih nerava, povreda kičmene moždine, Leigh-jeva bolest, Guillain-Barre-ov sindrom, lizozomske bolesti skladištenja kao što je lipofuscinoza, Alpers-ova bolest, sindrom nemirnih nogu, vrtoglavica kao rezultat degeneracije CNS; patologije koje nastaju usled hronične zloupotrebe alkohola ili lekova, uključujući, na primer, degeneraciju neurona u locus coeruleus i malom mozgu, poremećaje pokreta indukovane lekovima; patologije koje nastaju usled starenja uključujući degeneraciju neurona malog mozga i kortikalnih neurona, što dovodi do kognitivne i motorne ometenosti; i patologije koje nastaju usled hronične zloupotrebe amfetamina, koje uključuju degeneraciju neurona bazalnih ganglija koja dovodi do motorne ometenosti; patološke promene koje su rezultat fokalne traume kao što je moždani udar, fokalna ishemija, vaskularna insuficijencija, hipoksemična encefalopatija, hiperglikemija, hipoglikemija ili direktna trauma; patologije koje nastaju usled neželjenih sporednih dejstava terapijskih lekova i tretmana (npr., degeneracija neurona cingulatnog i entorinalnog korteksa u odgovoru na antikonvulzantne doze antagonista NMDA klase glutamatnog receptora) i Wernicke-Korsakoff-ova demencija. Neurološki poremećaji koji zahvataju senzorne neurone uključuju Friedreich-ovu ataksiju, dijabetes, perifernu neuropatiju, i degeneraciju neurona retine. Drugi neurološki poremećaji uključuju povredu ili traumu nerava udruženu sa povredom kičmene moždine. Neurološki poremećaji limbičkog i koritkalnog sistema uključuju cerebralnu amiloidozu, Pick-ovu atrofiju, i Rett-ov sindrom. U drugom aspektu, neurološki poremećaji uključuju poremećaje raspoloženja, na primer afektivne poremećaje i anksioznost; poremećaje socijalnog ponašanja, na primer karakterne nedostatke i poremećaje ličnosti; poremećaje učenja, pamćenja i inteligencije, na primer mentalu retardaciju i demenciju. Prema tome, u jednom aspektu objavljena jedinjenja i kompozicije mogu biti korisni u lečenju šizofrenije, delirijuma, poremećaja pažnje sa hiperaktivnošću (attention deficit hyperactivity disorder, ADHD), šizoafektivnog poremećaja, Alzheimer-ove bolesti, vaskularne demencije, Rubinstein-Taybi-jevog sindroma, depresije, manije, poremećaja pažnje, zavisnosti od lekova, demencije, demencije koja uključuje BPSD manifestacije, agitacije, apatije, anksioznosti, psihoza, poremećaja ličnosti, bipolarnih poremećaja, unipolarnih afektivnih poremećaja, opsesivno-kompulzivnih poremećaja, poremećaja u ishrani, post-traumatskog stresa, iritabilnosti, poremećaja ponašanja adolescenata i deinhibicije. Mogu biti korisni i za spontani, toksični, neoplastični, post-traumatski i postinfektivni tinitus i poremećaje čula mirisa.

[0022] Misli se da je transkripcija ključni korak za formiranje dugotrajnog pamćenja (Alberini, 2009, Physiol. Rev. 89, 121-145). Transkripciju promovišu specifične modifikacije hromatina, na primer acetilacija histona, čime se modulišu interakcije histona i DNK (Kouzarides, 2007, Cell, 128:693-705), kao i interakcije transkripcionih faktora i DNK. Modifikujući enzimi kao što su histon-acetiltransferaze (HAT) i histon-deacetilaze (HDAC), regulišu stanje acetilacije na repovima histona. Uopšteno, acetilacija histona promoviše ekspresiju gena, dok deacetilacija histona dovodi do utišavanja gena, iako tretman inhibitorima HDAC može rezultovati i pozitivnom i negativnom regulacijom nivoa ekspresije specifičnih gena. Brojne studije pokazale su da je potentna HAT, CREB-vezujući protein (cAMP response element-binding protein (CREB)-binding protein (CBP)), neophodna za dugotrajne forme sinaptičke plastičnosti i dugotrajno pamćenje (za pregled, vidi Barrett, 2008, Learn Mem 15:460-467). Prema tome, u jednom aspektu, obezbeđena jedinjenja i kompozicije mogu biti korisni za promovisanje kognitivne funkcije i poboljšanje učenja i formiranja pamćenja.

[0023] Jedinjenja i kompozicije opisani u ovom tekstu mogu se koristiti i za lečenje gljivičnih oboljenja ili infekcija.

[0024] U sledećem aspektu, jedinjenja i kompozicije opisani u ovom tekstu mogu se koristiti za lečenje zapaljenskih oboljenja kao što su moždani udar, reumatoidni artritis, eritemski lupus, ulcerativni kolitis i traumatske povrede mozga (Leoni et al., PNAS, 99(5); 2995-3000(2002); Suuronen et al. J. Neurochem. 87; 407-416 (2003) i Drug Discovery Today, 10: 197-204 (2005).

[0025] U još jednom aspektu, jedinjenja i kompozicije opisani u ovom tekstu mogu se koristiti za lečenje kancera izazvanog proliferacijom neoplastičnih ćelija. Takvi kanceri uključuju npr., solidne tumore, neoplazme, karcinome, sarkome, leukemije, limfome i slično. U jednom aspektu, kanceri koji se mogu lečiti jedinjenjima i kompozicijama opisanim u ovom tekstu uključuju, ali se ne ograničavaju na: kancer srca, kancer pluća, gastrointestinalni kancer, kancer genitourinarnog trakta, kancer jetre, kancer nervnog sistema, ginekološki kancer, hematološki kancer, kancer kože, i kancer nadbubrežne žlezde. U jednom aspektu, jedinjenja i kompozicije opisani u ovom tekstu korisni su za lečenje kancera srca odabranog između sarkoma (angiosarkom, fibrosarkom, rabdomiosarkom, liposarkom), miksoma, rabdomioma, fibroma, lipoma i teratoma. U drugom aspektu, jedinjenja i kompozicije opisani u ovom tekstu korisni su za lečenje kancera pluća odabranog između bronhogenog karcinoma (karcinom pločastih ćelija, nediferencirani sitnoćelijski, nediferencirani krupnoćelijski, adenokarcinom), alveolarnog (bronhiolarnog) karcinoma, bronhijalnog adenoma, sarkoma, limfoma, hondromatoznog hamartoma, i mezotelioma. U jednom aspektu, jedinjenja i kompozicije opisani u ovom tekstu korisni su za lečenje gastrointestinalmog kancera odabranog između ezofagusnog (karcinom pločastih ćelija, adenokarcinom, lejomiosarkom, limfom), želudačnog (karcinom, limfom, lejomiosarkom), pankreasnog (duktusni adenokarcinom, insulinom, glukagonom, gastrinom, karcinoidni tumori, vipom), kancera tankog creva (adenokarcinom, limfom, karcinoidni tumori, Kaposi-jev sarkom, lejomiom, hemangiom, lipom, neurofibrom, fibrom), i kancera debelog creva (adenokarcinom, tubularni adenom, vilusni adenom, hamartom, lejomiom). U jednom aspektu, jedinjenja i kompozicije opisani u ovom tekstu korisni su za lečenje kancera genitourinarnog trakta odabranog između kancera bubrega (adenokarcinom, Wilm-ov tumor [nefroblastom], limfom, leukemija), kancera mokraćne bešike i uretre (karcinom pločastih ćelija, karcinom prelaznih ćelija, adenokarcinom), prostate (adenokarcinom, sarkom), i testisa (seminom, teratom, embrionalni karcinom, teratokarcinom, horiokarcinom, sarkom, karcinom intersticijalnih ćelija, fibrom, fibroadenom, adenomatoidni tumori, lipom). U jednom aspektu, jedinjenja i kompozicije opisani u ovom tekstu korisni su u lečenju kancera jetre odabranog između hepatoma (hepatocelularni karcinom), holangiokarcinoma, hepatoblastoma, angiosarkoma, hepatocelularnog adenoma, i hemangioma.

[0026] U nekim primerima izvođenja, jedinjenja opisana u ovom tekstu povezana su sa lečenjem kancera kosti odabranog između osteogenog sarkoma (osteosarkom), fibrosarkoma, malignog fibroznog histiocitoma, hondrosarkoma, Ewing-ovog sarkoma, malignog limfoma (retikulosarkom), multiplog mijeloma, malignog tumora gigantskih ćelija hordoma, osteohondroma (osteohrskavičava egzostoza), benignog hondroma, hondroblastoma, hondromiksofibroma, osteoidnog osteoma i tumora džinovskih ćelija.

[0027] U jednom aspektu, jedinjenja i kompozicije opisani u ovom tekstu korisni su u lečenju kancera nervog sistema odabranog između kancera lobanje (osteom, hemangiom, granulom, ksantom, osteitis deformans), meningea (meningeom, meningiosarkom, gliomatoza), mozga (astrocitom, meduloblastom, gliom, ependimom, germinom [pinealom], multiformni glioblastom, oligodendrogliom, švanom, retinoblastom, kongenitalni tumori), i kičmene moždine (neurofibrom, meningeom, gliom, sarkom).

[0028] U jednom aspektu, jedinjenja i kompozicije opisani u ovom tekstu korisni su u lečenju ginekološkog kancera odabranog između kancera uterusa (endometrijalni karcinom), cerviksa (cervikalni karcinom, pretumorska cervikalma displazija), ovarijuma (karcinom ovarijuma [serozni cistadenokarcinom, mukozni cistadenokarcinom, neklasifikovani karcinom], tumori granulozatekalnih ćelija, tumori Sertoli-Leydig-ovih ćelija, disgerminom, maligni teratom), vulve (karcinom pločastih ćelija, intraepitelni karcinom, adenokarcinom, fibrosarkom, melanom), vagine (karcinom svetlih ćelija, karcinom pločastih ćelija, botrioidni sarkom (embroonalni rabdomiosarkom), i jajovoda (karcinom).

[0029] U jednom aspektu, jedinjenja i kompozicije opisani u ovom tekstu korisni su u lečenju kancera kože odabranog između malignog melanoma, karcinoma bazalnih ćelija, karcinoma pločastih ćelija, Kaposi-jevog sarkoma, displastičnih mladeža, lipoma, angioma, dermatofibroma, keloida, i psorijaze.

[0030] U jednom aspektu, jedinjenja i kompozicije opisani u ovom tekstu korisni su u lečenju kancera nadbubrežne žlezde odabranog između neuroblastoma.

[0031] U jednom aspektu, jedinjenja i kompozicije opisani u ovom tekstu korisni su u lečenju kancera koji uključuju, ali se ne ograničavaju na: leukemije uključujući akutne leukemije i hronične leukemije kao što su akutna limfocitna leukemija (acute lymphocytic leukemia, ALL), akutna mijeloidna leukemija (acute myeloid leukemia, AML), hronična limfocitna leukemija (chronic lymphocytic leukemia, CLL), hronična mijelogena leukemija (chronic myelogenous leukemia, CML) i leukemija vlatastih ćelija; limfome kao što su limfomi T ćelija kože (cutaneous T-cell lymphomas, CTCL), limfomi perifernih T ćelija, limfomi udruženi sa humanim limfotrofičnim virusom T ćelija (human T-cell lymphotrophic virus, HTLV), na primer leukemija/limfom T ćelija kod odraslih (adult T-cell leukemia/lymphoma, ATLL), Hodgkin-ova bolest i ne-Hodgkin-ovi limfomi, krupnoćelijski limfomi, difuzni krupnoćelijski

1

limfom B ćelija (diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL); Burkitt-ov limfom; mezoteliom, primarni limfom centralnog nervnog sistema (CNS); multipli mijelom; solidne tumore kod dece kao što su tumori mozga, neuroblastom, retinoblastom, Wilm-ov tumor, tumori kosti, i sarkomi mekih tkiva, obične solidne tumore kod odraslih kao što su kanceri glave i vrata (npr., oralni, laringealni i ezofagusni), genitourinarni kanceri (npr., prostate, mokraćne bešike, bubrega, uterusa, ovarijuma, testisa, rektuma i kolona), kancer pluća, kancer dojke, kancer pankreasa, melanom i drugi kanceri kože, kancer želuca, tumori mozga, kancer jetre i kancer tiroidne.žlezde

[0032] U jednom aspektu, jedinjenja i kompozicije opisani u ovom tekstu korisni su u lečenju stanja kod subjekta, odabranih između neuroloških poremećaja, poremećaja ili ometenosti pamćenja ili kognitivne funkcije, poremećaje gašenja naučenog, gljivičnog oboljenja ili infekcije, zapaljenskog oboljenja, hematološkog oboljenja, psihijatrijskih poremećaja, i neoplastičnog oboljenja. U sledećem aspektu, jedinjenja i kompozicije opisani u ovom tekstu korisni su u lečenju stanja odabranih između a) poremećaja ili ometenosti pamćenja ili kognitivne funkcije udruženih sa Alzheimer-ovom bolešću, Huntington-ovom bolešću, napadima indukovanim gubitkom pamćenja, šizofrenijom, Rubinstein-Taybi-jevim sindromom, Rett-ovim sindromom, sindromom fragilnog X hromozoma, demencijom sa Lewy-jevim telima, vaskularnom demencijom, degeneracijom fronto-temporalnog režnja (frontotemporalna demencija, FTD), FTD-GRN, ADHD, disleksijom, bipolarnim poremećajem i socijalnim, kognitivnim poremećajem i poremećajem učenja udruženim sa autizmom, traumatskom povredom glave, poremećajem deficita pažnje, anksioznim poremećajem, stanjem uslovljenog straha, paničnim poremećajem, opsesivno-kompulzivnim poremećajem, post-traumatskim stresnim poremećajem (posttraumatic stress disorder, PTSD), fobijom, poremećajem socijalne anksioznosti, oporavkom od zavisnosti od supstanci, ometenošću pamćenja udruženom sa starenjem (age associated memory impairment, AAMI), slabljenjem kognitivne funkcije udruženim sa starenjem (age related cognitive decline, ARCD), ataksijom, ili Parkinson-ovom bolešću; b) hematološkog oboljenja odabranog između akutne mijeloidne leukemije, akutne promijelocitne leukemije, akutne limfoblastne leukemije, hronične mijelogene leukemije, mijelodisplastičnih sindroma, i anemije srpastih ćelija; c) neoplastičnih oboljenja; i d) poremećaja gašenja naučenog odabranih između poremećaja gašenja straha i post-traumatskog stresa. U jednom aspektu, stanje lečeno jedinjenjima i kompozicijama opisanim u ovom tekstu je Alzheimer-ova bolest, Huntington-ova bolest, fronto-temporalna demencija, Freidreich-ova ataksija, post-traumatski stresni poremećaj (PTSD), Parkinson-ova bolest, depresija, ili oporavak od zavisnosti od supstanci.

[0033] U jednom aspektu, predmetna objava obezbeđuje postupak lečenja stanja opisanog u ovom tekstu, koji uključuje primenu, kod subjekta, efikasne količine jedinjenja ili farmaceutski prihvatljive soli opisane u ovom tekstu, ili kompozicije istog.

[0034] Obezbeđena je i upotreba jednog ili više jedinjenja ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli opisanih u ovom tekstu, ili obezbeđenih kompozicija, za lečenje stanja opisanih u ovom tekstu.

[0035] Obezbeđena je upotreba jednog ili više jedinjenja ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli opisanih u ovom tekstu za izradu leka za lečenje stanja opisanog u ovom tekstu.

[0036] Subjekti se mogu odabrati i na osnovu toga što pre početka lečenja jednim ili više od opisanih jedinjenja, ili farmaceutski prihvatljivih soli ili kompozicija, pate od jednog ili više stanja opisanih u ovom tekstu.

[0037] Predmetna objava obezbeđuje i farmaceutski prihvatljive kompozicije koje uključuju jedinjenje opisano u ovom tekstu, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so; i farmaceutski prihvatljivi nosač. Ove kompozicije mogu da se koriste za lečenje jednog ili više stanja opisanih ranije u ovom tekstu.

[0038] Kompozicije opisane u ovom tekstu mogu se primeniti oralno, parenteralno, inhalacijom spreja, površinski, rektalno, nazalno, bukalno, vaginalno ili putem implantiranog rezervoara. Izraz "parenteralno", kako se koristi u ovom tekstu, uključuje supkutanu, intravensku, intramuskularnu, intra-artikularnu, intrasinovijalnu, intrasternalnu, intratekalnu, intrahepatičnu, intralezionu i intrakranijalnu injekcionu ili infuzionu tehniku. Ovde su uključene i tečne dozne forme, injektabilni preparati, čvrste disperzione forme, i dozne forme za površinsku ili transdermalnu primenu jedinjenja.

[0039] Količina obezbeđenih jedinjenja koja se može kombinovati sa nosačkim materijalima da bi se proizvela kompozicija u vidu pojedinačne dozne forme variraće u zavisnosti od pacijenta koji se leči i određenog načina primene. U nekim primerima izvođenja, obezbeđene kompozicije mogu se formulisati tako da se doza od 0.01 do 100 mg/kg telesne težine/dan datog jedinjenja, npr., 0.1-100 mg/kg telesne težine/dan, može primeniti kod pacijenta koji prima ove kompozicije.

[0040] Isto tako podrazumeva se da će specifična doza i režim lečenja za svakog pojedinačnog pacijenta zavisiti od različitih faktora, uključujući starost, telesnu težinu, opšte zdravstveno stanje, pol, način ishrane, vreme primene, stopu ekskrecije, kombinacije sa drugim lekovima, procenu nadležnog lekara, i jačinu određene bolesti koja se leči. Količina datog jedinjenja u kompoziciji zavisiće i od toga koje je posebno jedinjenje prisutno u kompoziciji.

PRIMERI

[0041] Vizuelizacija mrlja vrši se pomoću UV svetlosti (254 i 365 nm). Prečišćavanje hromatografijom na koloni i "flash"-hromatografijom vrši se korišćenjem silika-gela (200-300 mesh-a). Rastvarački sistemi saopšteni su u vidu odnosa rastvarača.

[0042] NMR spektri se beleže na Bruker 400 (400 MHz) spektrometru.<1>H hemijski pomaci saopšteni su kao δ vrednosti u ppm sa tetrametilsilanom (TMS, = 0.00 ppm) kao unutrašnjim standardom. Vidi, npr., podatke date u Tabeli 1.

[0043] LCMS spektri dobijeni su na masenom spektrometru Agilent 1200 serije 6110 ili 6120 sa ESI (+) modalitetom jonizacije. Vidi, npr., podatke date u Tabeli 1.

Primer 1

[0044]

Sinteza SM-A.

[0045] Smeši 6-hloro-3-nitropiridin-2-amina (4.58 g, 26.4 mmol), 2,4-difluorofenilboronske kiseline (5.00 g, 31.7 mmol) i Cs2CO3(25.73 g, 79.2 mmol) u dioksanu/H2O (100 mL/10 mL)

1

doda se Pd(PPh3)4(1.10 g, 0.95 mmol) u atmosferi N2. Smeša se meša na 100 °C 2 h i zatim koncentruje u vakuumu. Rezidua se rastvori u EtOAc (200 mL) i rastvor se ispere zasićenim rastvorom soli (100 mL × 3). Organski sloj se suši preko anhidrovanog Na2SO4i zatim koncentruje u vakuumu. Rezidua se prečisti hromatografijom na silika-gel koloni (PE : EtOAc = 7 : 1 ∼ 5 : 1) dajući SM-A (4.0 g, 61%) u vidu žute čvrste supstance. MS 252.1 [M H]<+>.

Sinteza SM-B.

[0046] U rastvor koji se meša SM-A (4.0 g, 15.94 mmol) u piridinu (60 mL) doda se fenil karbonohloridat (7.50 g, 47.81 mmol) u kapima na 0 °C. Kada se dodavanje završi, smeša se meša na 50 °C 4 h. Smeša se koncentruje u vakuumu. Rezidua se prečisti hromatografijom na silika-gel koloni (PE : DCM = 3: 2 ∼ 1 : 1) dajući SM-B (7.1 g, 91%) u vidu žute čvrste supstance. MS 492.1 [M H]<+>.

Sinteza 1672-1.

[0047] U rastvor prop-2-in-1-amina (5.0 g, 90.9 mmol) i Et3N (18.4 g, 181.8 mmol) u DCM (100 mL) doda se (Boc)2O (23.8 g, 109.1 mmol) u kapima, dok se reakciona smeša hladi u ledenom kupatilu. Kada se dodavanje završi, dobijena smeša se ukloni iz ledenog kupatila, i zatim se meša na sobnoj temperaturi 16 h. Kada se reakcija završi, smeša se razblaži dodavanjem DCM (200 mL), ispere zasićenim rastvorom soli (100 mL × 3), i organski sloj se suši preko anhidrovanog Na2SO4i zatim koncentruje u vakuumu. Rezidua se prečisti hromatografijom na silika-gel koloni (PE : EtOAc = 100 : 1 ∼ 10 : 1) dajući 1672-1 (10 g, 71%) u vidu bezbojnog ulja. MS 178.3 [M 23]<+>, 100.3 [M - 56]<+>.

Sinteza 1672-2.

[0048] U rastvor 1672-1 (10 g, 64.5 mmol) u DMF (200 mL) doda se NaH (60% u mineralnom ulju) (2.84 g, 71 mmol), polako, u ledenom kupatilu. Dobijena smeša se meša na sobnoj temperaturi 1 h, posle čega se gornjoj smeši doda 3-bromoprop-1-in (9.2 g, 77.4 mmol), i zatim se reakciona smeša meša na sobnoj temperaturi 2 h. Smeša se gasi vodom (500 mL) i zatim ekstrahuje pomoću t-BuOMe (250 mL × 3). Kombinovani organski slojevi se isperu zasićenim rastvorom soli (200 mL × 3), suše preko anhidrovanog Na2SO4i zatim koncentruju u vakuumu. Rezidua se prečisti hromatografijom na silika-gel koloni (PE : EtOAc = 100 : 1 ∼ 10 : 1) dajući 1672-2 (12 g, 96%) u vidu žutog ulja. MS 138.1 [M - 56]<+>.

Sinteza 1672-3.

[0049] U rastvor 2-hloroacetonitrila (3.13 g, 41.4 mmol) i [Cp<∗>RuCl(cod)] (394 mg, 1.0 mmol) u DCE (40 mL) dodaje se rastvor 1672-2 (4.0 g, 20.7 mmol) u DCE (80 mL) u kapima tokom 30 min u atmosferi N2. Dobijena smeša se meša na 40 °C 16 h. Rastvarač se ukloni u vakuumu, i rezidua se prečisti hromatografijom na silika-gel koloni (PE : EtOAc = 10 : 1 ∼ 2 : 1) dajući 1672-3 (2.1 g, 22%) u vidu čvrste supstance kaki-boje. MS 269.3 [M H]<+>.

Sinteza 1672-4.

[0050] U rastvor MeOH (30 mL) doda se NaH (60% u mineralnom ulju) (940 mg, 23.5 mmol) u uslovima ledenog kupatila i meša 30 min. Zatim se u gornju smešu doda 1672-C (2.1 g, 7.8 mmol) i meša na 35 °C 16 h. Smeša se gasi vodom (30 mL), ekstrahuje pomoću DCM (10 mL x 3). Kombinovani organski slojevi se isperu zasićenim rastvorom soli (10 mL × 3), suše preko anhidrovanog Na2SO4i zatim koncentruju u vakuumu. Rezidua se prečisti hromatografijom na silika-gel koloni (PE : EtOAc = 100 : 1 ∼ 10 : 1) dajući 1672-4 (1.8 g, 94%) u vidu čvrste supstance boje kože. MS 265.1 [M H]<+>.

Sinteza 1672-5.

[0051] U rastvor 1672-4 (120 mg, 0.45 mmol) u DCM (6 mL) ohlađen u ledenom kupatilu doda se TFA (2 mL) u kapima. Dobijena reakciona smeša meša se na sobnoj temperaturi 1 h, posle čega se rastvarač ukloni u vakuumu dajući 1672-5 u vidu sirovog proizvoda koji se koristi u sledećem koraku bez dodatnog prečišćavanja. MS 165.1 [M H]<+>.

Sinteza 1672-6.

[0052] U smešu 1672-5 (0.45 mmol, sirovi proizvod iz prethodnog koraka) i SM-B (150 mg, 0.30 mmol) u DMSO (10 mL) doda se Na2CO3(259 mg, 3.44 mmol), i dobijena reakciona smeša se meša na 25 °C 2 h. Smeša se zatim razblaži vodom (30 mL) i ekstrahuje pomoću EtOAc (20 mL × 3). Kombinovani organski slojevi se isperu zasićenim rastvorom soli (10 mL × 3), suše preko anhidrovanog Na2SO4i zatim koncentruju u vakuumu. Rezidua se prečisti hromatografijom na silika-gel koloni (DCM : MeOH = 100 : 1 ∼ 30 : 1) dajući 1672-6 (120 mg, 89%) u vidu žute čvrste supstance. MS 442.1 [M H]<+>.

Sinteza Jedinjenja 1.

[0053] Smeša 1672-6 (120 mg, 0.27 mmol) i Pd/C (120 mg) u MeOH (10 mL) meša se na sobnoj temperaturi 1 h u atmosferi H2. Zatim se Pd/C ukloni filtracijom kroz celit. Filtrat se

1

koncentruje i rezidua prečisti korišćenjem Prep-TLC (DCM : MeOH = 15 : 1) dajući Jedinjenje 1 (70 mg, 70%) vidu žute čvrste supstance. MS 412.1 [M H]<+>, 434.1 [M 23]<+>.

Primer 2

[0054]

Sinteza 156-A.

[0055] Smeši 6-hloro-3-nitropiridin-2-amina (10.00 g, 57.6 mmol), tiofen-2-ilboronske kiseline (8.12 g, 63.4 mmol) i Cs2CO3(37.56 g, 115.2 mmol) u dioksanu/H2O (200 mL/20 mL) doda se Pd(PPh3)4(2.44g, 2.88 mmol) u atmosferi N2. Smeša se meša na 95 °C 2 h i zatim koncentruje u vakuumu. Rezidua se rastvori u EtOAc (200 mL) i rastvor se ispere zasićenim rastvorom soli (100 mL × 3). Organski sloj se suši preko anhidrovanog Na2SO4i zatim koncentruje u vakuumu. Rezidua se prečisti hromatografijom na silika-gel koloni (PE : EtOAc = 5 : 1 ∼ 3 : 1) dajući 156-A (10.0 g, 79%) u vidu žute čvrste supstance.

1

Sinteza 156-B.

[0056] U mešani rastvor 156-A (1.30 g, 5.88 mmol) u piridinu (20 mL) doda se fenil karbonohloridat (2.29 g, 14.7 mmol) u kapima. Kada se dodavanje završi, smeša se greje do 50 °C i meša 4 h. Smeša se zatim koncentruje u vakuumu, i rezidua se prečisti hromatografijom na silika-gel koloni (PE : EtOAc = 8: 1 ∼ 3 : 1) dajući 156-B (2.4 g, 89%) u vidu žute čvrste supstance.

Sinteza 213-A.

[0057] Rastvor tert-butil 3-oksopirolidin-1-karboksilata (150.0 g, 809.8 mmol) i DMF-DMA (289.5 g, 2.4 mol) u THF (1500 mL) meša se na 70 °C 16 h. Rastvor se koncentruje u vakuumu dajući 213-A u vidu sirovog proizvoda koji se koristi direktno u sledećem koraku bez dodatnog prečišćavanja.

Sinteza 213-B.

[0058] U rastvor 213-A (809.8 mmol, sirovi proizvod iz prethodnog koraka) u EtOH (1000 mL) dodaju se Et3N (409.7 g, 4.0 mol) i acetimidamid hidrohlorid (306.2 g, 3.2 mol). Dobijeni rastvor se meša na 80 °C 24 h. Pošto se ohladi na sobnu temperaturu, smeša se razblaži vodom (500 mL) i ekstrahuje pomoću DCM (500 mL × 3). Kombinovani organski slojevi se isperu zasićenim rastvorom soli (500 mL × 3), suše preko anhidrovanog Na2SO4i zatim koncentruju u vakuumu. Rezidua se prečisti hromatografijom na silika-gel koloni (PE : DCM = 10 : 1 ∼ 1 : 2) dajući 213-B (105.0 g, 55%) u vidu čvrste supstance braon boje.

Sinteza 213-C.

[0059] U rastvor 213-B (105.0 g, 446.3 mmol) u DCM (1000 mL) doda se TFA (333 mL) u kapima. Reakciona smeša meša se na sobnoj temperaturi 1 h, posle čega se rastvor koncentruje u vakuumu dajući 213-C u vidu sirovog proizvoda koji se koristi direktno u sledećem koraku bez dodatnog prečišćavanja.

Sinteza 213-D.

[0060] Smeša 213-C (325.1 mmol, sirovi proizvod iz prethodnog koraka) i 156-B (75.0 g, 162.5 mmol) u DMSO (750 mL) meša se na sobnoj temperaturi 10 min, zatim se doda Na2CO3(137.8 g, 1.3 mol) i reakciona smeša se meša na sobnoj temperaturi 2 h. Smeša se zatim razblaži vodom (1000 mL) i ekstrahuje pomoću EtOAc (500 mL × 3). Kombinovani organski slojevi se isperu zasićenim rastvorom soli (500 mL × 3), suše preko anhidrovanog Na2SO4i

1

zatim koncentruju u vakuumu. Rezidua se prečisti hromatografijom na slika-gel koloni (PE : EA = 10 : 1 ∼ 1 : 2) dajući 213-D (44.0 g, 71%) u vidu žute čvrste supstance.

Sinteza Jedinjenja 2.

[0061] Smeša 213-D (44.0 g, 115.1 mmol) i Pd/C (22.0 g) u MeOH (250 mL) i DCM (250 mL) meša se na sobnoj temperaturi 1 h u atmosferi H2. Pd/C se ukloni filtracijom kroz celit. Filtrat se koncentruje u vakuumu i rezidua se prečisti hromatografijom na slika-gel koloni (DCM : MeOH = 50 : 1 ∼ 15 : 1) dajući Jedinjenje 2 (26.0 g, 64%) u vidu svetložute čvrste supstance.

Tabela 1. Spektrometrijski podaci za Jedinjenja

Br. Struktura MS MS<1>H NMR podaci (400 MHz,

Opšti postupci testiranja

Enzimski test HDAC2 i HDAC1

[0062] Sledi opis protokola testa za merenje deacetilacije peptidnog supstrata enzimima HDAC2 ili HDAC1.

1

[0063] Sve rekombinantne humane HDAC nabavljaju se od BPS Bioscience. Supstrat, FAM-TSRHK(AC)KL-CONH, sintetiše NanoSyn. Finalne reakcione smeše za test sadržale su 100 mM HEPES (pH 7.5), 50 mM KC1, 0.1% BSA, 0.01% Triton X-100, 1% DMSO, 1 uM supstrat i 5 nM enzim HDAC. Enzim i jedinjenja se preinkubiraju na 25°C 5 sati i reakcije se iniciraju dodavanjem supstrata. 10 uL reakcione smeše inkubira se 17 sati na 25°C i reakcija se završava dodavanjem 40 uL pufera koji sadrži 100 mM HEPES (pH 7.5), 0.1% BSA, 0.01% Triton X-100 i 0.05% SDS. Supstratni i proizvedeni peptidi prisutni u svakom uzorku razdvajaju se elektroforetski uz korišćenje LabChip 3000 instrumenta za kapilarnu elektroforezu. Promena pikova relativnog intenziteta fluorescencije supstrata i proizvoda odraz je enzimske aktivnosti. Odvijanje reakcije određuje se kao odnos proizvoda prema zbiru (product to sum ratio, PSR): P/(S+P), gde je P visina pika proizvedenog peptida, a S je visina pika supstratnog peptida. Reakcije se izvode u duplikatu za 12 koncentracija, (3X serijska razblaženja počevši od 30 uM). IC50vrednosti zračunavaju se korišćenjem četvoroparametarskog logističkog modela.

Test enzimske inhibicije HDAC2 u lizatu SY5Y ćelija, sa HDAC-Glo2 supstratom

Ćelijska kultura i tretmani inhibitorom

[0064] SH-SY5Y ćelije (Sigma) gaje se u Eagle-ovom modifikovanom esencijalnom medijumu koji je dopunjen 10% fetalnim goveđim serumom i pen/strep. Dvadeset četiri sata pre doziranja jedinjenja, 20 uL ćelija zaseje se na bele ploče sa 384 bunarčića pri gustini od 1,500 ćelija/bunarčiću. Jedinjenja se serijski razblaže u čistom DMSO, a zatim se razblažuju 1:100 v/v u medijumu bez FBS i mešaju. Iz zasejanih ćelija ukloni se medijum i jedinjenja razblažena u medijumu koji ne sadrži serum (1% v/v finalni DMSO) dodaju se i inkubiraju na 37°C pet sati. Zatim se doda deset uL HDAC-Glo 2 reagensa sa 0.1% Triton X-100, ploča se izmeša i ostavi se da se razvija na sobnoj temperaturi 100 minuta. Ploče se zatim očitavaju pomoću Spectramax LMax luminometra uz korišćenje vremena integracije od 0.4 s. Kriva doznog odgovora konstruiše se posle normalizovanja podataka, pri čemu se CI-994 na 100 uM definiše kao 100% inhibicije i DMSO sam kao 0% inhibicije.

CFU test za eritroidnu i mijeloidnu liniju

[0065] Korišćenjem testova formiranja ćelijskih kolonija, jedinjenja se testiraju da bi se evaluirali potencijalni efekti na humane eritroidne i mijeloidne progenitore. Klonogeni progenitori humane eritroidne (CFU-E, BFU-E), granulocitno-monocitne (CFU-GM) i multipotentne (CFU-GEMM) linije procenjuju se u polučvrstom medijumu baziranom na

1

metilcelulozi, formulisanom da sadrži rhIL-3 (10 ng/mL), rhGM-SCF (10 ng/mL), rhSCF (50 ng/mL) i Epo (3 U/mL).

Ćelije

[0066] Normalne humane ćelije kostne srži, male gustine, poreklom iz normalne kostne srži (NorCal Biologics, California) i kvalifikovane pri ReachBio, držane su u gasovitoj fazi tečnog azota (-152°C) do korišćenja u testu. Na dan eksperimenta, ćelije se brzo odmrznu, sadržaj svake fiole se razblaži u 10 mL Dulbecco-vog medijuma modifikovanog po Iscove-u, koji sadrži 10% fetalni goveđi serum (IMDM 10% FBS) i isperu centrifugiranjem (približno 1200 r.p.m.

10 minuta, sobna temperatura). Supernatant se odlije i ćelijski peleti se resuspenduju u poznatoj zapremini IMDM 10% FBS. Za uzorak kostne srži, vrši se procena broja (3% glacijalna sirćetna kiselina) i vijabilnosti ćelija (test isključivanja tripan plavog).

Jedinjenja

[0067] Na dan eksperimenta, jedinjenja se rastvore u DMSO do stok-koncentracije od 10 mM. Od stok-koncentracije naprave se serijska razblaženja da se dobiju koncentracije od 2 i 0.4 mM. Kada se doda medijum na bazi metilceluloze u odnosu 1:1000 (v/v), dobijaju se finalne testne koncentracije od 10, 2 i 0.4 µM. Dodatno, 5-FU evaluira se pri koncentracijama od 1.0, 0.1 i 0.01 µg/mL.

Kratak opis postupka

[0068] Klonogeni progenitori humane eritroidne (CFU-E i BFU-E) i mijeloidne (CFU-GM) linije postave se u formulacije medijuma na bazi metilceluloze, kako je opisano ranije u ovom tekstu. U medijum se dodaju sva jedinjenja tako da se dobiju željene finalne koncentracije (10, 2 i 0.4 µM). Kao pozitivna kontrola za proliferaciju progenitora (inhibicija rasta kolonija) koristi se 5-fluorouracil (Sigma Aldrich) i uvodi se u kulture humane kostne srži u koncentracijama od 1.0, 0.1, i 0.01 µg/mL. Kulture za kontrolu rastvarača (ne sadrže jedinjenje nego 0.1% DMSO) kao i standardne kontrole (ne sadrže ni jedinjenje ni DMSO) takođe se iniciraju.

[0069] Testovi humanih mijeloidnih i eritroidnih progenitora iniciraju se na 2.0 × 10<4>ćelija po kulturi. Posle 14 dana u kulturi, mijeloidne i eritroidne kolonije procenjuju se mikroskopski i ocenjuje ih iskusna osoba. Na osnovu veličine i morfologije, kolonije se dele na sledeće kategorije: CFU-E, BFU-E, CFU-GM i CFU-GEMM.

2

Statistička analiza broja CFC

[0070] Srednja vrednost ± jedna standardna devijacija tri ponovljene kulture izračunava se za progenitore svake kategorije (CFU-E, BFU-E, itd.). Dvosmerni t-testovi vrše se da bi se procenilo da li ima razlike u broju nastalih kolonija između kontrole sa rastvaračem i tretiranih kultura. Zbog potencijalne subjektivnosti prilikom brojanja kolonija, značajnom se smatra p vrednost manja od 0.01. Da bi se izračunala koncentracija 50% inhibicije rasta kolonija (ICso) za svako jedinjenje, konstruiše se kriva doznog odgovora nanošenjem log koncentracije jedinjenja u odnosu na procenat rasta kontrolnih kolonija, korišćenjem XLfit softvera (IDBS). Koncentracija 50% inhibicije rasta kolonija (IC50) izračunava se na osnovu podešavanja sigmoidne krive, uz korišćenje formule doznog odgovora, po one-site modelu: y = A [(B -A)/(1 ((C/x) ^ D))], gde A = početna vrednost (bazalni odgovor), B = maksimalni odgovor, C = centar (koncentracija leka koja izaziva odgovor koji je na polovini između A i B) i D = nagib krive na srednjoj tački. Pored toga, konstruišu se dodatni dijagrami i krive dozne zavisnosti, uz korišćenje GraphPad Prism 7.0.

Morfološka procena kolonija

[0071] Prave se fotografije reprezentativnih kolonija poreklom od hematopoetskih progenitora iz različitih linija, koje ilustruju kolonije u prisustvu kontrolnog rastvarača kao i u prisustvu testnih jedinjenja.

[0072] Obučena osoba broji eritroidne (CFU-E i BFU-E), mijeloidne (CFU-GM) i multipotentne (CFU-GEMM) kolonije. Analizira se distribucija tipova kolonija kao i opšta morfologija kolonija i ćelija. Za statističku analizu, broj kolonija u kulturama tretiranim jedinjenjem upoređuju se sa brojem u kulturama tretiranim rastvaračem kao kontrolom. U ovim testovima, 5-FU koristi se kao pozitivna kontrola za toksičnost, a inhibitorni efekti dobijeni za ova jedinjenja bili su upravo onakvi kako je očekivano. Eksperiment je upotrebljen za evaluaciju potencijalnog efekta testnih jedinjenja na proliferaciju humanih eritroidnih i mijeloidnih progenitora u medijumu na bazi metilceluloze. ICso vrednosti izračunavane su iz XLfit. Krive doznog odgovora za eritroidnu i mijeloidnu toksičnost konstruisane su pomoću XLfit. Na kraju, podešavanje nelinearne regresione krive i ICsos ± 95% CI, izračunavaju se pomoću Prism 7.0.-GEMM.

Test inhibicije CYP

[0073] Jedinjenja su testirana da bi se evaluirao njihov inhibitorni potencijal na CYP2D6 i CYP3A4 (midazolam), uz korišćenje mikrozoma jetre čoveka. Mikrozomi jetre čoveka dobijeni su od BD Gentest, i svako jedinjenje je ispitivano u duplikatu.

[0074] Testna jedinjenja i referentni inhibitori (hinidin za 2D6, ketokonazol za 3A4) stave se u ploču sa 96 bunarčića prenošenjem 8 µL 10 mM stok-rastvora jedinjenja u DMSO u 12 µL acetonitrila. Pojedinačni rastvori inhibitora, poznate koncentracije, pripremaju se za CYP2D6 i CYP3A4 (8 µL DMSO stoka dodati u 12 µL acetonitrila). Zatim dodati 400 µL 0.2 mg/mL HLM u testne bunarčiće i zatim dodati 2 µL 400 x testnog jedinjenja, u naznačene bunarčiće, na ledu. Zatim, dodati 200 µL 0.2 mg/mL HLM u testne bunarčiće i zatim dodati 1 µL referentnih inhibitornih rastvora, u naznačene bunarčiće. Sledeći rastvori dodati su (u duplikatu) u testne ploče sa 96 bunarčića, na ledu: Testna jedinjenja i referentni inhibitori (hinidin za 2D6, ketokonazol za 3A4) testirani su korišćenjem sledeće eksperimentalne procedure:

1. Pripremiti testno jedinjenje i referentne inhibitore (400 ×) u ploči sa 96 bunarčića: 1.1. Preneti 8 µL 10 mM testnih jedinjenja u 12 µL ACN.

1.2. Pripremiti pojedinačne rastvore inhibitora poznate koncentracije za CYP3A4, CYP2D6: 8 µL DMSO stoka u 12 µL ACN.

2. Pripremiti 4 × NADPH kofaktor (66.7 mg NADPH u 10 mL 0.1 M K-pufera, pH 7.4 ) 3. Pripremiti 4 × supstrat (2 mL za svaku izoformu) kako je navedeno u tabeli u nastavku (dodati HLM kada je potrebno, na ledu).

4. Pripremiti 0.2 mg/mL HLM rastvora (10 µL 20 mg/mL u 990 µL 0.1 M K-pufera) na ledu.

5. Dodati 400 µL 0.2 mg/mL HLM u testne bunarčiće i zatim dodati 2 µL 400 x testnog jedinjenja u označene bunarčiće, na ledu.

6. Dodati 200 µL 0.2 mg/mL HLM u testne bunarčiće i zatim dodati 1 µL referentnog inhibitornog rastvora u označene bunarčiće na ledu.

7. Dodati sledeće rastvore (u duplikatu) u testnu ploču sa 96 bunarčića, na ledu:

7.1. Dodati 30 µL 2 × testnog jedinjenja i referentnog jedinjenja u 0.2 mg/mL HLM rastvora;

7.2. Dodati 15 µL 4× supstratnog rastvora.

8. Preinkubirati testnu ploču sa 96 bunarčića i rastvor NADPH na 37°C 5 minuta. 9. Dodati 15 µL prethodno zagrejanog 8 mM rastvora NADPH u testne ploče da se inicira reakcija

10. Inkubirati testnu ploču na 37 °C.5 min za 3A4, 10 min za 2D6.

11. Zaustaviti reakciju dodavanjem 120 µL ACN koji sadrži unutrašnji standard. Za CYP3A4, unutrašnji standard je 1'OH-midazolam-D4(10 µM rastvor razblažen do finalne koncentracije od 0.1 µM dodavanjem 100 µL stok-rastvora unutrašnjeg standarda u 10 mL ACN). Za CYP2D6, unutrašnji standard je 1-OH-bufuralol-maleat-[D9] (49 µM rastvor razblažen do finalne koncentracije od 0.1 µM dodavanjem 20 µL stok-rastvora unutrašnjeg standarda u 10 mL ACN).

12. Posle prekidanja reakcije, promućkati ploče na vibratoru (IKA, MTS 2/4) 10 min (600 rpm/min) i zatim centrifugirati na 5594 g 15 min (Thermo Multifuge × 3R).

13. Preneti 50 µL supernatanta iz svakog bunarčića u uzoračku ploču sa 96 bunarčića koja sadrži 50 µL ultra-čiste vode (Millipore, ZMQS50F01) za LC/MS analizu.

[0075] Na osnovu rezultata testa, procena inhibicije CYP izoforme je sledeća: procenat inhibicije CYP veći od 50%, ukazuje na potentnu inhibiciju; procenat inhibicije CYP između 30 i 50%, ukazuje na blagu inhibiciju; procenat inhibicije CYP manji od 30%, ukazuje na blagu inhibiciju ili odsustvo inhibicije. Procenat inhibicije CYP manji od -30% ukazuje da jedinjenje može imati neku vrstu aktivacije ove izoforme.

Merenje kinetike rastvorljivosti u vodi

[0076] Jedinjenja se evaluiraju u pogledu kinetike rastvorljivosti u puferu ili vodi. Alikvoti od 8 µL stok-rastvora referentnog i testnog jedinjenja (10 mM u DMSO) dodaju se u 792 µL 100 mM fosfatnog pufera (0.1 M NaPO4, pH 7.4). Finalna koncentracija DMSO je 1%. Epruvete sa uzorcima mućkaju se 1 sat (1000 rpm) na sobnoj temperaturi. Kalibraciona kriva se priprema korišćenjem 300 µM rastvora poznate koncentracije (spiking solution, SS) u MeOH/ACN(4:1) (SS = dodati 6 µL 10 mM jedinjenja u 194 µL MeOH/ACN(4:1)). Uzorci se centrifugiraju 10 min (12000 rpm) da se precipitiraju nerastvorljive čestice, i supernatanti se prenesu u novu epruvetu ili ploču. Supernatanti se 100 mM puferom razblaže 10 puta i 100 puta. Uzorci se zatim pripreme za analizu pomoću LC-MS/MS (Dodati 5 µL uzoraka jedinjenja (nerazblaženog, 10 puta razblaženog i 100 puta razblaženog) i uzoraka standardne krive u 95 µL ACN koji sadrži unutrašnji standard. Korišćeni unutrašnji standardi su propranolol, ketokonazol, i tamoksifen.

Procena izloženosti jedinjenja u mozgu i plazmi posle intravenske (IV) i oralne (PO) primene kod miševa

2

[0077] Jedinjenja se daju miševima u dozi od 10 mg/kg ili 30 mg/kg PO, i 1 mg/kg IV. Za sakupljanje plazme posle ispuštanja krvi, u svakoj vremenskoj tački koriste se po tri životinje, i to na 0.25, 0.5, 1, 4, 12 i 24 h. Terminalno ispuštanje krvi za dobijanje plazme i uzoraka mozga na 0.25, 0.5, 1, 4,12 i 24 h (takođe tri životinje po grupi za svaku vremensku tačku, za izloženost u mozgu). Ukupno šest vremenskih tačaka za plazmu i šest vremenskih tačaka za mozak.

Sakupljanje uzoraka:

[0078] Plazma: Životinja se fiksira manuelno, u određenim vremenskim tačkama, retroorbitalnom ili srčanom punkcijom približno 150 µL krvi/vremenskoj tački uzima se u epruvetu sa K2EDTA, pod anestezijom izofluranom. Uzorak krvi se centrifugira (2000 g, 4°C, 5 min) da se dobije plazma, u roku od 30 min posle uzimanja krvi.

[0079] Mozak: U određenim vremenskim tačkama, napravi se incizija po središnjoj liniji glave životinje i koža se povuče. Malim sekačem i rongerom ukloni se deo lobanje koji prekriva mozak. Mozak se izvadi špatulom i ispere se hladnim slanim rastvorom. Mozak se stavi u epruvete sa navojnim zatvaračem i epruvete se drže na -70°C do analize.

Određene prednosti Jedinjenja 1 i 2

[0080] Sa stanovišta otkrića lekova, važno je da jedinjenja imaju prihvatljive, leku slične profile za niz parametara. Jedinjenja se tipično profilišu ne samo u vezi sa in vitro potencijom, nego i radi prediktivnih studija apsorpcije, distribucije, ekskrecije i metabolizma (absorption, distribution, excretion and metabolism, ADME) in vitro, i u farmakokinetičkim (pharmacokinetic, PK) eksperimentima in vivo. U nekim slučajevima, jedinjenja se profilišu i u prediktivnim studijama bezbednosti in vitro. Sakupljanje podataka o ADME i bezbednosti in vitro, zajedno sa PK podacima, pomaže da se identifikuju koristi od određenih strukturnih odlika, i dopušta optimizovanje odnosa strukture i aktivnosti (structure activity relationship, SAR) da se dizajniraju jedinjenja sa optimizovanim, leku sličnim profilima za profilisanje in vivo. Predmetna jedinjenja ne samo da pružaju prednost u pogledu hematološke bezbednosti, nego obezbeđuju i ukupnu ravnotežu potencije, ADME i PK profila.

[0081] Aminoanilin urea-jedinjenja, kao što su Komparator A i Komparator B u Tabeli 2, opisana su ranije u WO 2017/007755 i WO 2017/007756. Kada se vrši skrining u in vitro testu formiranja kolonija (colony forming unit, CFU) na ćelijama kostne srži čoveka, u potrazi za eritroidnim i mijeloidnim progenitorskim ćelijama (prediktivno za neutropeniju), i vrši poređenje sa odgovarajućim aminopiridin urea-jedinjenjem, Komparatorom B, promena jednog atoma u središtu diaminopiridin uree, Komparatora B dovodi do značajnog poboljšanja u predviđenoj bezbednosti i u eritroidnoj i u mijeloidnoj liniji, u odnosu na ureu aminoanilinskog skafolda Komparatora A. Vidi Tabelu 2. Dalje, kada se 4-fluorofenil grupa Komparatora B zameni tiofenskom grupom (Komparator C), ali pirolopirazinska komponenta uree ostane ista, postiže se slično poboljšanje predviđenog bezbednosnog profila u odnosu na aminoanilin ureu, Komparator A. Ovo dokazuje da su uree diaminopiridinskih jedinjenja sa identičnim pirolidin urea komponentama bezbednije od odgovarajućih aminoanilin urea.

[0082] Iako su pirolopirazin urea jedinjenja, Komparator B i Komparator C, pokazala dobru potenciju u in vitro testovima potencije, vrednosti iz in vitro CFU testa zahtevaju dodatna poboljšanja. ICso >5 µM za mijeloidnu liniju (grubo odgovara >30% preostalih na 10 µM) prediktivna je za nisku verovatnoću kliničke neutropenije, pa predstavlja ciljni prag prihvatljive bezbednosti (Reference: Pessina et al. Toxicological Sciences 2003, 75, 355-367; Clarke et al. Gen. Eng. & Biotech. News 2010, 14-15.). Nađeno je da se promenom pirolopirazina u pirolopirimidin postiže značajno poboljšanje profila bezbednosti in vitro. Upoređivanjem odgovarajućeg para Komparator B (pirolopirazin) i Komparator D (pirolopirimidin), zapaža se značajno poboljšanje CFU eritroidnih i mijeloidnih progenitorskih ćelija. Ovo važi i za odgovarajuće parove aminopiridin urea koji imaju tiofensku unutrašnju šupljinu, Komparator C (pirolopirazin) i Komparator E (pirolopirimidin). Iako je pirimidin poboljšao bezbednosni profil, oba nesupstituisana pirimidinska jedinjenja, Komparator D i Komparator E pokazuju značajnu inhibiciju CYP2D6 pri 10 µM. Međutim, supstituisano na pirimidinskom prstenu na poziciji između azotovih atoma, Jedinjenje 2 (metil-supstituisani pirolopirimidin) ne pokazuje značajnu inhibiciju CYP2D6 ili CYP3A4 pri 10 µM.

[0083] Ovi rezultati dokazuju da blage hemijske modifikacije kao što su uvođenje atoma azota na poziciju u prstenu u Komparatorima B i D i zamena vodonika metilom (Komparator E i Jedinjenje 2) dovode do dramatičnog porasta bezbednosti.

2

Tabela 2. Upoređivanje in vitro profila Jedinjenja 2 i većeg broja komparatora.

Komp. Struktura HDAC2 enzimski test % CYP CFU % preostalih od

2

Komp. Struktura HDAC2 enzimski test % CYP CFU % preostalih od

[0084] Pored supstitucije između atoma azota pirimidina, koja poboljšava profil inhibicije CYP pirolopirimidinskih jedinjenja, PK profil Jedinjenja 2 poboljšan je i u odnosu na nesupstituisani Komparator E. Vidi Tabelu 3. Metilpirimidinsko Jedinjenje 2 obezbeđuje jasnu prednost u vezi sa PK, u poređenju sa nesupstituisanim pirimidinskim analogom, pokazujući duži poluživot, niži klirens, veću bioraspoloživost, i >5 puta veću izloženost u mozgu. Ovi rezultati dokazuju da blage hemijske modifikacije proizvode znatne prednosti u vezi sa PK.

2

Tabela 3. Poređenje PK profila para nesupstituisani pirimidin i metil-supstituisani pirimidin.

[0085] Slične prednosti utvrđene su ispitivanjem efekata regioizomera i obrazaca supstitucije na pirolopiridin ureama diaminopiridina. Na primer, iako pirolopiridinsko jedinjenje Komparator F pokazuje dobru in vitro potenciju, ono pokazuje visoke nivoe inhibicije CYP2D6 i izuzetno nisku rastvorljivost. Vidi Tabelu 4. Nađeno je da pomeranje piridinskog azota pirolopiridina (Komparator G) poboljšava rastvorljivost. Međutim, CYP2D6 i CYP3A4 bili su inhibirani pri visokim nivoima. Nađeno je da dodavanje metil supstituenta pored piridinskog azota pirolopiridina poboljšava profil inhibicije CYP prema 2D6 i 3A4 donekle, uz održavanje potencije i rastvorljivosti (Komparator H). Elektron-povlačeća metoksimetil supstitucija pored piridinskog azota (Komparator H) još više poboljšava profil inhibicije CYP 2D6 i 3A4, opet uz zadržavanje željenog profila potencije i rastvorljivosti. Slični rezultati nađeni su za mono-fluoro i di-fluoro analoge Komparator I i Jedinjenje 1, pri čemu Jedinjenje 1 pokazuje blago smanjenje rastvorljivosti. Vidi Tabelu 4.

[0086] Međutim, Jedinjenje 1 u velikoj meri prevazilazi Komparator I u pogledu bezbednosti in vitro, uprkos razlici u samo jednom atomu halogena. Vidi Tabelu 5. Značajna prednost ostvaruje se i u eritroidnoj i u mijeloidnoj progenitorskoj ćelijskoj liniji posle tretmana 2,4-difluoro supstituisanim Jedinjenjem 1, u poređenju sa Komparatorom I.

2

Tabela 4. Upoređivanje in vitro profila Jedinjenja 1 i većeg broja komparatora. Kmp. Struktura HDAC2 enzimski test % CYP Rastvorljivost

2

Kmp. Struktura HDAC2 enzimski test % CYP Rastvorljivost

Tabela 5. Podaci in vitro CFU testa za Jedinjenje 10 i Komparator I

[0087] Tabela 6 u nastavku prikazuje rezultate za izloženost u mozgu i plazmi, posle intravenske (IV) i oralne (PO) primene jedinjenja, kod miševa.

Tabela 6

Efekti 14-dnevnog oralnog tretmana niskim dozama jedinjenja na morfologiju dendritskih trnića u dorzalnom hipokampusu (CA1) divljeg tipa miševa

[0088] Jedinjenjasu evaluirana da bi se odredilo da li subhronični tretmana može da proizvede promene u morfologiji dendritskih trnića u CA1 regionu dorzalnog hipokampusa u divljem tipu (wild type, WT) miševa. Jedinjenja se primenjuju oralno kod divljeg tipa miševa, jednom dnevno tokom 14 dana. Doze se biraju na osnovu farmakokinetičkih podataka, izloženosti u mozgu, i potencije. Zatim se evaluiraju efekti tretmana jedinjenjima na morfologiju dendritskih trnića u CA1 regionu dorzalnog hipokampusa.

Postupci: Na živim životinjama

[0089] Mužjaci C57BL/6J miševa (stari 7-8 nedelja, n=7 po grupi) dozirani su oralno Rodinjedinjenjima ili prenosnikom (20% HPßCD) jednom dnevno tokom 14 dana. Doze jedinjenja

1

odabrane su na osnovu podataka o izloženosti iz farmakokinetičkih eksperimenata. Doze nekih jedinjenja bile su odabrane radi određivanja neefikasnih doza, kao produžetak ranijih izučavanja koja su pokazala porast gustine dendritskih trnića posle tretmana Jedinjenjem 2 (u dozama od 1, 3, 6 i 20 mg/kg/dan), Jedinjenjem 1 (10 mg/kg/dan). Miševi su žrtvovani 24 sata posle poslednje doze, i podvrgnuti su transkardijalnoj perfuziji za pripremanje uzoraka mozga.

Postupak perfuzije i uzimanja uzoraka mozga

[0090] Miševi se anesteziraju hloral hidratom (4% hloral hidrat u slanom rastvoru, 10 ml/kg) pre nego što se podvrgnu transkardijalnoj perfuziji sa 4% PFA u IX PBS (pH7.4, sobna temperatura) brzinom od 20 mL/min u trajanju od 54 sekunde. Odmah posle perfuzije, miševi se dekapituju i izoluju im se mozgovi. Mozgovi se postfiksiraju u scincilacionim fiolama koje sadrže 4% PFA (5-10 ml), 4 min. Mozgovi se seku korišćenjem tkivnog vibratoma (Leica VT1000) da se dobiju preseci (debljine 300 µm) od prednje do zadnje površine svakog mozga.

Balističko obeležavanje bojom i mikroskopija

[0091] Superrezoluciona laser-skenirajuća konfokalna mikroskopija (Zeiss LSM880, Airyscan) izvodi se korišćenjem objektiva 63X (1.42 NA) da bi se pri visokoj rezoluciji skenirali individualno obeleženi neuroni (rezolucija skeniranja = 0.06 um µm/piksel; aksijalna rezolucija = 0.06 um µm/fokalnom koraku). Ciljni neuroni se identifikuju u regionu mozga od interesa epifluorescentnom navigacijom, korišćenjem anatomske lokacije i ćelijske morfologije. Mikroskopija se vrši "na slepo" u odnosu na eksperimentalne uslove. Najmanje 7 miševa testira se za svaki eksperimentalni uslov. Najmanje 5 uzoraka po mišu (raspon = 5-6) meri se za svaki segment.

ESP analiza dendritskih trnića i procena integriteta membrane dendrita.

[0092] Slepa dekonvolucija (AutoQuant) primenjuje se na grubim trodimenzionalnim digitalnim slikama sa kojih zatim obučeni analitičari analiziraju gustinu i morfologiju trnića. Pojedinačnim trnićima ručno se meri (a) dijametar glave, (b) dužina, i (c) debljina vrata sa Z-paketa slika uz korišćenje po posebno izrađenog Afraxis ESP softvera. Svaki dendrit analiziraju 3 (u proseku) nezavisna analitičara. Softver automatski nasumično dodeljuje slike analitičarima i obezbeđuje da svaki analitičar izvrši merenje približno jednakog broja dendrita po grupi. Analitičari nisu obavešteni o eksperimentalnim uslovima (koji uključuju tretman, region mozga, i tip ćelija). Statistička analiza varijabilnosti među analitičarima za svaki dendrit ispituje se "on-

2

line" i koristi za eliminisanje dendrita koji nisu ispunili kriterijume pouzdanosti među analitičara: za gustinu trnića i morfološku klasifikaciju trnića, podaci dobijenih od svih analitičara se uprosečavaju da bi se saopštili podaci za svaki dendrit.

Pozicije uzorkovanja dendrita:

[0093] dHIPP, CA1 apikalno 2° (0 - 50 µm):

Region mozga: Dorzalni hipokampus (dHIPP)

Tip ćelija: CA1 piramidalni neuron (CA1)

Tip ogranka: Apikalni

Red ogranka: Sekundarni (2°)

Pozicija uzorka: 0 - 50 µm od mesta grananja

[0094] Svakom identifikovanom dendritskom trniću meri se (a) dužina trnića, (b) dijametar glave trnića, i (c) širina vrata. Populacione distribucije svake mere sabiraju se za svaki uzorak dendrita i objedinjuju po grupi. Sirove morfometrijske vrednosti za dendritske trniće (dužina trnića, dijametar glave, širina vrata) sklapaju se u šemu koja se koristi za opisivanje klasičnih fenotipova trnića (npr. pečurkast, zdepast, itd.). Ukupna gustina spinova izražava se kao zbir gustina svih potklasa.

Rezultati:

[0095] Opšta zapažanja. Procesovanje tkiva nije pokazalo upadljive patološke indikacije, uključujući abnormalna oštećenja somatskih membrana, mehuranje dendrita, ili abnormalne modifikacije dijametara dendrita za ciljni tip ćelije ili druge tipove ćelija u ispitivanim regionima mozga. Za adekvatno upoređivanje između studija, podaci o ukupnoj gustini trnića normalizuju se na % nivoa prenosnika

[0096] Podaci se zatim izražavaju kao srednja vrednost /- SEM ukupne gustine trnića (% porasta u odnosu na prenosnik). Rezultati su saopšteni u Tabeli 7.

Tabela 7. Efekti na morfologiju trnića kod WT miševa posle 14 dana doziranja.

[0097] Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni izrazi upotrebljeni u ovom tekstu imaju uobičajeno značenje opštepoznato prosečno obučenim stručnjacima u oblasti.

4

Claims

PATENTNI ZAHTEVI 1. Jedinjenje formule:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
2. Jedinjenje iz Patentnog zahteva 1, naznačeno time, što je jedinjenje formule:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
3. Jedinjenje iz Patentnog zahteva 1, naznačeno time, što je jedinjenje formule:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
4. Farmaceutska kompozicija, naznačena time, što sadrži jedinjenje iz bilo kojeg od Patentnih zahteva 1 do 3, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so; i farmaceutski prihvatljivi nosač.
5. Jedinjenje iz bilo kojeg od Patentnih zahteva 1 do 3, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, ili farmaceutska kompozicija iz Patentnog zahteva 4, za upotrebu u lečenju stanja udruženih sa aktivnošću HDAC.
6. Jedinjenje iz bilo kojeg od Patentnih zahteva 1 do 3, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, ili farmaceutska kompozicija iz Patentnog zahteva 4, za upotrebu u lečenju stanja koja se biraju između neurološkog poremećaja, poremećaja ili ometenosti pamćenja ili kognitivne funkcije, poremećaja gašenja naučenog, gljivičnog oboljenja ili infekcije, zapaljenskog oboljenja, hematološkog oboljenja, psihijatrijskih poremećaja i neoplastičnog oboljenja.
7. Jedinjenje ili kompozicija za upotrebu u Patentnom zahtevu 6, naznačeno time, što je stanje: a. poremećaj ili ometenost kognitivne funkcije udruženi sa Alzheimer-ovom bolešću, Huntington-ovom bolešću, napadima indukovanim gubitkom pamćenja, šizofrenijom, Rubinstein-Taybi-jevim sindromom, Rett-ovim sindromom, depresijom, sindromom fragilnog X hromozoma, demencijom sa Lewy-jevim telima, vaskularnom demencijom, degeneracijom fronto-temporalnog režnja (frontotemporalna demencija, FTD), FTD-GRN, ADHD, disleksijom, bipolarnim poremećajem i socijalnim, kognitivnim i poremećajima učenja udruženim sa autizmom, traumatskom povredom glave, poremećajem deficita pažnje, anksioznim poremećajem, stanjem uslovljenog straha, paničnim poremećajem, opsesivno-kompulzivnim poremećajem, post-traumatskim stresnim poremećajem (PTSD), fobijom, poremećajem socijalne anksioznosti, oporavkom od zavisnosti od supstanci, poremećajem pamćenja udruženim sa starenjem (AAMI), slabljenjem kognitivne funkcije udruženim sa starenjem (ARCD), ataksijom, ili Parkinson-ovom bolešću; ili b. hematološko oboljenje odabrano između akutne mijeloidne leukemije, akutne promijelocitne leukemije, akutne limfoblastne leukemije, hronične mijelogene leukemije, mijelodisplastičnih sindroma, i anemije srpastih ćelija; ili c. neoplastično oboljenje; ili d. poremećaj gašenja naučenog odabran između poremećaja gašenja straha i post-traumatskog stresnog poremećaja.
8. Jedinjenje ili kompozicija za upotrebu u Patentnom zahtevu 7, naznačeno time, što je stanje Alzheimer-ova bolest, Huntington-ova bolest, frontotemporalna demencija, Freidreich-ova ataksija, post-traumatski stresni poremećaj (PTSD), Parkinson-ova bolest, ili oporavak od zavisnosti od supstanci. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5