RS62995B1 - Kondenzovano imidazo-piperidinsko inhibitorno jedinjenje za jak - Google Patents

Description

Opis pronalaska

STANJE TEHNIKE

Oblast tehnike na koju se pronalazak odnosi

[0001] Pronalazak je usmeren na inhibitorno jedinjenje JAK kinaze korisno za lečenje višestrukih bolesti, prevashodno očnih, kožnih i respiratornih bolesti. Pronalazak je takođe usmeren na kristalne oblike jedinjenja, farmaceutske kompozicije koje sadrže takvo jedinjenje, takvo jedinjenje za upotrebu u lečenju bolesti podložnih lečenju inhibitorom JAK i procese i međuproizvode korisne za pripremu jedinjenja.

Poznato stanje tehnike

[0002] Citokini su međućelijski signalni molekuli koji uključuju hemokine, interferone, interleukine, limfokine i faktor nekroze tumora. Citokini su od presudnog značaja za normalan rast ćelija i imunoregulaciju, ali takođe prouzrokuju bolesti posredovane imunitetom i doprinose rastu malignih ćelija. Pokazano je da su povišeni nivoi mnogih citokina uključeni u patologiju velikog broja bolesti ili stanja, posebno onih bolesti koje karakteriše inflamacija. Mnogi od citokina za koje je pokazano da su u osnovi bolesti, poznato je i da deluju putem signalnih puteva koji su zavisni od Janus familije tirozin kinaza (JAK) u čije signalne puteve su uključeni transkripcioni faktori iz familije Prenosnika signala i aktivatora transkripcije (STAT od engl. Signal Transducer and Activator of Transcription).

[0003] JAK familija se sastoji od četiri člana, JAK1, JAK2, JAK3 i tirozin kinaze 2 (TYK2). Vezivanje citokina za citokinski receptor koji je zavisan od JAK, prouzrokuje dimerizaciju receptora, što dovodi do fosforilacije tirozinskih ostataka na JAK kinazi, čime se i ostvaruje aktivacija JAK. Fosforilisani JAK se, zauzvrat, vezuju za i fosforilišu razne STAT proteine koji se potom dimerizuju, internalizuju u ćelijsko jedro i direktno modulišu gensku transkripciju, dovodeći, između ostalih efekata, do nishodnih efekata koji su povezani sa inflamatornom bolešću. JAK se obično udružuju sa citokinskim receptorima u parovima, u vidu homodimera ili heterodimera. Specifični citokini se udružuju sa specifičnim JAK parovima. Za svakog od četiri člana JAK familije je pokazano da je uključen u signalni put najmanje jednog od citokina udruženog sa inflamacijom.

[0004] Inflamacija ima istaknutu ulogu u mnogih očnim bolestima, uključujući uveitis, dijabetsku retinopatiju, dijabetski makularni edem, bolest suvog oka, senilnu degeneraciju makule, okluziju retinalnih vena i atopijski keratokonjunktivitis. Uveitis obuhvata višestruka intraokularna inflamatorna stanja i često je autoimunski, odnosno nastaje bez poznatog infektivnog pokretača. Procenjuje se da ovo stanje pogađa oko 2 miliona pacijenata u SAD. Kod pojedinih pacijenata, hronična inflamacija koja je udružena sa uveitisom dovodi do uništenja tkiva i peti je vodeći uzrok slepila u SAD. U očima pacijenata sa uveitisom, povišeni citokini čiji signalni putevi uključuju i JAK-STAT put obuhvataju IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-23 i IFN-γ. (Horai i Caspi, J Interferon Cytokine Res, 2011, 31, 733-744; Ooi i saradnici, Clinical Medicine and Research, 2006, 4, 294-309). Postojeće terapije za uveitis su često suboptimalne, a mnogi pacijenti se slabo kontrolišu. Steroide, iako su često efektivni, prate pojava katarakte i povećan intraokularni pritisak/glaukom.

[0005] Dijabetska retinopatija (DR) je prouzrokovana oštećenjem krvnih sudova u mrežnjači. To je najčešći uzrok gubitka vida među ljudima sa dijabetesom. Angiogeni, kao i inflamatorni putevi, sa važnom su ulogom u bolesti. DR često napreduje u dijabetski makularni edem (DME), najčešći uzrok gubitka vida kod pacijenata sa dijabetesom. Procenjuje se da ovo stanje pogađa oko 1,5 milion pacijenata samo u SAD, od kojih je kod oko 20% bolest prisutna u oba oka. Veruje se i da citokini u čiji je prenos signala uključen JAK-STAT put, poput IL-6, kao i drugi citokini, poput IP-10 i MCP-1 (alternativno označenog kao CCL2), čija se proizvodnja delimično inicira JAK-STAT signalnim putem, imaju važnu ulogu u inflamaciji udruženoj sa DR/DME (Abcouwer, J Clin Cell Immunol, 2013, Suppl 1, 1-12; Sohn i saradnici, American Journal of Opthalmology, 2011, 152, 686-694; Owen i Hartnett, Curr Diab Rep, 2013, 13, 476-480; Cheung i saradnici, Molecular Vision, 2012, 18, 830-837; Dong i saradnici, Molecular Vision, 2013, 19, 1734-1746; Funatsu i saradnici, Ophthalmology, 2009, 116, 73-79). Postojeće terapije za DME su suboptimalne: intravitrealni anti-VEGF tretmani su efektivni samo kod jednog dela pacijenata, a primena steroida je povezana sa kataraktom i povećanim intraokularnim pritiskom.

[0006] Bolest suvog oka (DED) je multifaktorski poremećaj koji pogađa oko 5 miliona pacijenata u SAD. Veruje se da zapaljenje površine oka ima važnu ulogu u razvoju i širenju ove bolesti. Povišeni nivoi citokina, poput SL-1, lL-2, lL-4, IL-5, IL-6 i IFN-γ, zabeleženi su u očnim tečnostima pacijenata sa DED. (Stevenson i saradnici, Arch Ophthalmol, 2012, 130, 90-100), dok su nivoi često u korelaciji sa ozbiljnošću oboljenja. Smatra se i da su senilna degeneracija makule i atopijski keratokonjunktivitis takođe povezani sa citokinima zavisnim od JAK.

[0007] Okluzija retinalne vene (RVO) je bolest koja otežava vid visoke prevalencije. Opstrukcija retinalnog krvotoka može dovesti do oštećenja vaskulature mrežnjače, krvarenja i ishemije tkiva. Iako su uzroci RVO multifaktorski, pokazano je da su i vaskularni i inflamatorni medijatori od velike važnosti (Deobhakta i saradnici, International Journal of Inflammation, 2013, ID članka 438412). Povišeni nivoi citokina čiji se signal prenosi preko JAK-STAT puta, poput IL-6 i IL-13, kao i drugi citokini, poput MCP-1, čija se proizvodnja delimično inicira JAK-STAT signalnim putem, detektovani su u očnim tkivima pacijenata sa RVO (Shchuko i saradnici, Indian Journal of Ophthalmology, 2015, 63(12), 905-911). Iako se mnogi pacijenti sa RVO leče fotokoagulacijom, ova terapija suštinski ispoljava razarajuće dejstvo. Koriste se i anti-VEGF sredstva, ali su ona efektivna samo kod jednog dela pacijenata. Pokazano je takođe da lečenje steroidnim lekovima koji smanjuju nivo inflamacije u oku (implanti triamcinolon acetonida i deksametazona) obezbeđuje povoljne rezultate kod pacijenata sa određenim oblicima RVO, ali je pokazano i da prouzrokuju kataraktu i povećavaju intraokularni pritisak/glaukom.

[0008] Atopijski dermatitis (AD) je uobičajena hronična inflamatorna bolest kože za koju je procenjeno da pogađa oko 14 miliona ljudi samo u Sjedinjenim Državama. Procenjuje se i da AD pogađa 10-20% dece i 1-3% odraslih u razvijenim zemljama (Bao i saradnici, JAK-STAT, 2013, 2, e24137), kao i da se prevalencija povećava. Povišenje proinflamatornih citokina koji se oslanjaju na JAK-STAT put, posebno IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 i IFNγ, povezano je sa AD (Bao i saradnici, Leung i saradnici, The Journal of Clinical Investigation, 2004, 113, 651-657). Dodatno, pokazano je da pozitivna regulacija lL-31, drugog citokina koji dejstvo ostvaruje putem uparivanja JAK, ima ulogu u svrabu povezanom sa hroničnim stanjem AD. (Sunkoly i saradnici, Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2006, 117, 411-417)

[0009] Astma je hronična bolest disajnih puteva za koju ne postoje prevencije niti lekovi. Bolest se karakteriše inflamacijom, fibrozom, prekomernom reaktivnošću i remodelovanjem disajnih puteva, što sve doprinosi ograničenju u protoku vazduha. Procenjuje se da 300 miliona ljudi širom sveta pati od astme, a procenjuje se i da će broj ljudi sa astmom porasti za više od 100 miliona do 2025. Iako se kod većine pacijenata može postići kontrola simptoma astme upotrebom inhalacionih kortikosteroida, koji se mogu kombinovati sa modifikatorom leukotriena i/ili dugodelujućim beta agonistom, ostaje podgrupa pacijenata sa teškom astmom čija se bolest ne može kontrolisati konvencionalnim terapijama. Citokini uključeni u inflamaciju astme, a koji svoje efekte ostvaruju preko JAK-STAT signalnog puta uključuju IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-11, IL-13, IL-23, IL-31, IL-27, timusni stromalni limfopoetin (TSLP), interferon-y (IFNγ) i faktor stimulacije rasta granulocitnomakrofagnih kolonija (GM-CSF). Inflamacija disajnih puteva je karakteristika i drugih respiratornih bolesti pored astme. Hronična opstruktivna bolest pluća (HOBP), cistična fibroza (CF), pneumonitis, intersticijske bolesti pluća (uključujući idiopatsku plućnu fibrozu), akutne povrede pluća, sindrom akutnog respiratornog distresa, bronhitis, emfizem, bronhiolitis obliterans i sarkoidoza su takođe bolesti respiratornog trakta za koje se veruje da im je patofiziologija povezana sa citokinima koji deluju preko JAK signalnog puta.

[0010] Imajući u vidu broj citokina koji je povišen u inflamatornim bolestima, kao i da je svaki od citokina povezan sa uparivanjem određenih JAK, hemijski inhibitor sa pan-aktivnošću za sve članove JAK familije mogao bi biti od široko primenljiv za lečenje očnih, kožnih i respiratornih bolesti. Ostaje potreba za potentnim pan-JAK inhibitorom.

KRATKO IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA

[0011] Prema jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje inhibitorno jedinjenje za JAK, za upotrebu u lečenju inflamatorne bolesti.

[0012] Preciznije, prema jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje 1-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroksifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-on formule

u daljem tekstu označen kao Jedinjenje 1, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0013] Pronalazak takođe obezbeđuje kristalne oblike jedinjenja, Oblik 1 i Oblik 2.

[0014] Pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži Jedinjenje 1, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0015] Prema jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje Jedinjenje I za upotrebu u postupku lečenja očne bolesti kod sisara, pri čemu postupak obuhvata primenu Jedinjenja 1, ili farmaceutske kompozicije pronalaska, sisaru. Prema jednom aspektu, očna bolest je uveitis, dijabetska retinopatija, dijabetski makularni edem, bolest suvog oka, senilna degeneracija makule, okluzija retinalne vene i atopijski keratokonjunktivitis. Preciznije, očna bolest je dijabetski makularni edem ili uveitis.

[0016] Prema još jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje Jedinjenje I za upotrebu u postupku lečenja inflamatornog oboljenja kože, prevashodno atopijskog dermatitisa, pri čemu postupak obuhvata nanošenje Jedinjenja 1, ili farmaceutske kompozicije pronalaska, na kožu sisara.

[0017] Prema daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje Jedinjenje I za upotrebu u postupku lečenja respiratorne bolesti kod sisara, pri čemu postupak obuhvata primenu Jedinjenja 1, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, ili farmaceutske kompozicije pronalaska, sisaru.

[0018] Prema odvojenim i jasno različitim aspektima, pronalazak takođe obezbeđuje sintetičke procese i međuproizvode koji su ovde opisani i korisni za dobijanje Jedinjenja 1.

[0019] Pronalazak takođe obezbeđuje Jedinjenje 1, koje je kao što je ovde opisano, za upotrebu u medicinskoj terapiji, kao i upotrebu jedinjenja pronalaska u proizvodnji formulacije ili medikamenta za lečenje očnih bolesti, kožnih bolesti ili respiratornih bolesti kod sisara.

KRATAK OPIS SLIKA NACRTA

[0020] Razni aspekti predmetnog pronalaska su ilustrovani pozivanjem na priložene nacrte.

Slika 1 prikazuje rendgenski difraktogram praha (PXRD) za kristalni Oblik 2 Jedinjenja 1 (u daljem tekstu označen kao Oblik 2).

Slika 2 prikazuje termogram diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC) za kristalni Oblik 2. Slika 3 prikazuje dijagram termalne gravimetrijske analize (TGA) za kristalni Oblik 2.

Slika 4 prikazuje izotermu dinamičke sorpcije vlage (DMS) za kristalni Oblik 2 koja se uočava na temperaturi od oko 25 °C

Slika 5 prikazuje sliku sa polarizovanog svetlosnog mikroskopa za Oblik 2.

Slika 6 prikazuje rendgenski difraktogram praha (PXRD) za kristalni Oblik 1 Jedinjenja 1 (u daljem tekstu označen kao Oblik 1).

Slika 7 prikazuje termogram diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC) za kristalni Oblik 1. Slika 8 prikazuje dijagram termalne gravimetrijske analize (TGA) za kristalni Oblik 1.

Slika 9 prikazuje izotermu dinamičke sorpcije vlage (DMS) za kristalni Oblik 1 koja se uočava na temperaturi od oko 25 °C

Slika 10 prikazuje sliku sa polarizovanog svetlosnog mikroskopa za Oblik 1.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0021] Hemijske strukture su ovde imenovane u skladu sa IUPAC konvencijama koje su i bile implementirane u kompujterski program ChemDraw (PerkinElmer, Inc., Cambridge, MA).

[0022] Štaviše, imidazolni deo tetrahidroimidazopiridinskog ostatka u strukturi predmetnog jedinjenja postoji u tautomernim oblicima. Jedinjenje bi ekvivalentno moglo biti predstavljeno kao

[0023] Prema IUPAC konvenciji, ove reprezentacije dovode do različite numeracije atoma u tetrahidroimidazopiridinskom delu. Prema tome, ova struktura je označena kao 1-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroksifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-3,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2morfolinoetan-1-on. Strukutra može biti označena i kao 1-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroksifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-on.

Podrazumeva se da, iako su strukture prikazane ili imenovane u određenom obliku, pronalazak uključuje i njihov tautomer.

[0024] Jedinjenja pronalaska sadrže nekoliko baznih grupa. Jedinjenja stoga mogu postojati kao oblici slobodnih baza ili u vidu raznih oblka soli, kao što je oblik mono-protonovane soli, oblik diprotonovane soli ili njihove smeše. Svi takvi oblici su uključeni u obim ovog pronalaska, osim ukoliko nije drugačije naznačeno.

[0025] Ovaj pronalazak takođe uključuje izotopski obeležena jedinjenja formule 1, tj. jedinjenja formule 1 u kojima je atom zamenjen ili obogaćen sa atomom koji ima isti atomski broj, ali atomsku masu različitu od atomske mase koja preovlađuje u prirodi. Primeri izotopa koji mogu biti ugrađeni u jedinjenje formule 1 uključuju, ali nisu ograničeni na,<2>H,<3>H,<11>C,<13>C,<14>C,<13>N,<15>N,<15>O,<17>O,<18>O i<18>F. Od posebnog interesa su jedinjenja formule 1 koja su obogaćena tricijumom ili ugljenikom-14, a koja mogu biti upotrebljena, na primer, u studijama distribucije u tkivima. Od posebnog interesa su i jedinjenja formule 1 koja su obogaćena deuterijumom, prevashodno ona u kojima je deuterijum na mestu koje je od značaja za metabolizam, zbog čega se očekuje i da ova jedinjenja imaju veću metaboličku stabilnost. Dodatno, od posebnog interesa su jedinjenja formule 1 obogaćena izotopom koji emituje pozitrone, kao što su to npr.<11>C,<18>F,<15>O i<13>N, pošto ova jedinjenja mogu biti upotrebljena, na primer u studijama pozitronske emisione tomografije (PET).

Definicije

[0026] Kada se opisuje ovaj pronalazak, uključujući njegove razne aspekte i primere izvođenja, sledi [0027] Izraz "terapijski efektivna količina" označava količinu dovoljnu da se lečenje ostvari, kada se ista primenjuje pacijentu kome je lečenje potrebno.

[0028] Termin "lečenje" ili "tretman" označava prevenciju, ublažavanje ili suzbijanje medicinskog stanja, bolesti ili poremećaja koji se leči (npr. respiratorne bolesti) kod pacijenta (posebno čoveka); ili ublažavanje simptoma medicinskog stanja, bolesti ili poremećaja.

[0029] Izraz "farmaceutski prihvatljiva so" označava so koja je prihvatljiva za primenu pacijentu ili sisaru, kao što je čovek (npr. soli koje za dati dozni režim karakteriše prihvatljiva bezbednost kod sisara). Reprezentativne farmaceutski prihvatljive soli uključuju soli sirćetne, askorbinske, benzensulfonske, benzoeve, kamforsulfonske, limunske, etansulfonske, edizilne, fumarne, gentizične, glukonske, glukoronske, glutaminske, hipurne, bromovodonične, hlorovodonične, izetionične, mlečne, laktobionske, maleinske, jabučne, bademove, metansulfonske, galaktarinske, naftalensulfonske, naftalen-1,5-disulfonske, naftalen-2,6-disulfonske, nikotinske, azotne, orotske, pamoinske, pantotenske, fosforne, ćilibarne, sumporne, vinske, p-toluensulfonske i ksinafoične kiseline i sličnih.

[0030] Izraz "njegova so" označava jedinjenje obrazovano kada se vodonik kiseline zameni sa katjonom, kao što je katjon metala ili organski katjon i slično. Na primer, katjon može biti protonovani oblik jedinjenja formule 1, tj. oblik u kome je jedna ili više amino grupa protonovana kiselinom. Uobičajeno je da je so farmaceutski prihvatljiva so, mada to nije neophodno za soli intermedijarnih jedinjenja za koje nije predviđeno da se primenjuju pacijentu.

[0031] Termin "amino-zaštitna grupa" označava zaštitnu grupu pogodnu za sprečavanje neželjenih reakcija na azotu amino grupe. Reprezentativne amino-zaštitne grupe uključuju, ali nisu ograničene na, formil; acil grupe, na primer alkanoilne grupe, kao što su acetil i tri-fluoroacetil; alkoksikarbonilne grupe, kao što je terc butoksikarbonilna (Boc); arilmetoksikarbonilne grupe, poput benziloksikarbonilne (Cbz) i 9-fluorenilmetoksikarbonilne (Fmoc); arilmetilne grupe, kao što su benzilna (Bn), tricilna (Tr) i 1,1-di-(4'-metoksifenil)metilna; sililne grupe, kao što su trimetilsililna (TMS), terc-butildimetilsililna (TBDMS), [2-(trimetilsilil)etoksi]metilna (SEM) grupa; i slične.

[0032] Termin "hidroksilna-zaštitna grupa" označava zaštitnu grupu pogodnu za sprečavanje neželjenih reakcija na hidroksilnoj grupi. Reprezentativne hidroksilne-zaštitne grupe uključuju, ali nisu ograničene na, alkil grupe, kao što su metil, etil i terc-butil; acil grupe, na primer alkanoil grupe, poput acetil; arilmetil grupe, kao što su to benzil (Bn), p-metoksibenzil (PMB), 9-fluorenilmetil (Fm) i difenilmetil (benzhidril, DPM); silil grupe, kao što su trimetilsilil (TMS) i terc-butildimetilsilil (TBS) grupe; i slične.

[0033] Brojne zaštitne grupe, kao i njihovo uvođenje i uklanjanje, opisane su u T. W. Greene i P.G.M. Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, 3. izdanje, Wiley, New York

Opšte sintetičke procedure

[0034] Jedinjenje 1, i njegovi međuproizvodi, mogu biti pripremljeni opštim postucima i procedurama koje slede, upotrebom komercijalno dostupnih ili rutinski pripremljenih početnih materijala i reagenasa. Pored toga, jedinjenja koja sadrže kiseli ili bazni atom ili funkcionalnu grupu, mogu biti upotrebljena ili mogu biti proizvedena u vidu soli, ukoliko nije drugačije naznačeno (u pojedinim slučajevima, upotreba soli u određenoj reakciji će zahtevati prevođenje soli u oblik koji nije so, npr. u slobodnu bazu, upotrebom rutinskih procedura za izvođenje reakcije).

[0035] Iako određeni primer izvođenja predmetnog pronalaska može biti prikazan ili opisan u procedurama koje slede, stručnjacima iz oblasti tehnike će biti očigledno da se drugi primeri izvođenja ili aspekti predmetnog pronalaska mogu takođe pripremati upotrebom takvih procedura ili upotrebom drugih postupaka, reagenasa i početnih materijala koji su poznati stručnjacima iz oblasti tehnike. Preciznije, potrebno je istaći da Jedinjenje 1 može biti pripremljeno raznovrsnim procesnim putevima u kojima se reaktanti kombinuju po različitim redosledima, a da bi se obezbedili različiti međuproizvodi u putu proizvodnje konačnih proizvoda.

[0036] Priprema 1-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroksifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-ona (Jedinjenja 1) je detaljno opisan u priloženim primerima. Ključni koraci su sažeti u Šemi 1

Šema 1

gde je reagens 72,5-dioksopirolidin-1-il 2-morfolinoacetat, tj. promenljiva R<A>predstavlja aktivirajuće sredstvo 2,5-dioksopirolidinil, kao što je opisano u Primeru 1. Alternativno, kao reagens 7 se upotrebljava morfolin-4-il sirćetna kiselina, tj. R<A>predstavlja vodonik, a uslovi reakcije su uobičajeni za uslove obrazovanja amidne veze, kao što je opisano u Primeru 4.

[0037] Međuproizvod 3 može biti pripremljen kao što je opisano u Pripremama 1 i 3 u nastavku teksta. Alternativni postupak pripreme ključnog zaštićenog međuproizvoda 5 je ilustrovan na Šemi 2.

Šema 2

[0038] Bromoindazolni aldehid 8 može reagovati sa iminskim jedinjenjem 2 koje je zaštićeno benzil grupom, da bi se obezbedio međuproizvod 9. Reakcija se obično izvodi u prisustvu natrijum bisulfita, na temperaturi od između oko 130 °C i oko 140 °C, tokom između oko 1 i oko 6 sati, ili dok reakcija nije suštinski završena. Jedinjenje 9 se redukuje upotrebom redukcionog sredstva kao što je natrijum borohidrid, da bi se obezbedilo Jedinjenje 10, koje se kombinuje za zaštićenim feniltrifluoroboratom 11, pod uobičajenim uslovima Suzuki-Mijaura kuplovanja, da bi se obezbedio međuproizvod 5. Reakcija se obično izvodi na povišenoj temperaturi u prisustvu paladijumskog katalizatora. Suzuki partner 11, prikazan na Šemi 2, kao što je trifluoroboratna kalijumova so, može biti pripremljen reakcijom odgovarajućeg boronata (Međuproizvod 1-5 u postupku Pripreme 1 u nastavku teksta) sa kalijum vodonik difluoridom, da bi se obezbedio međuproizvod 11. Alternativno, umesto trifluoroborata 11 može biti upotrebljen boronatni međuproizvod.

[0039] Shodno navedenom i u skladu sa aspektom koji se odnosi na postupke, pronalazak obezbeđuje proces pripreme jedinjenja formule 1 ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, pri čemu proces obuhvata reagovanje jedinjenja formule 6 sa jedinjenjem formule 7, kao što je ilustrovano na Šemi 1, da bi se obezbedilo jedinjenje formule 1 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

[0040] Prema dodatnom aspektu koji se odnosi na postupke, pronalazak obezbeđuje jedinjenje formule 5 i jedinjenje formule 6 koja su korisna u pripremi jedinjenja formule 1.

Kristalni oblici

[0041] Prema sledećem aspektu, pronalazak obezbeđuje 1-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroksifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-on (1) u kristalnom obliku.

Oblik 1

[0042] Kristalni Oblik 1 pronalaska je oblik Jedinjenja 1 koji je oslobođen od kristalnih oblika. Prema jednom aspektu, Oblik 1 karakteriše rendgenski difraktogram praha (PXRD) koji sadrži značajne difrakcione pikove, među ostalim pikovima, na vrednostima 2θ od 8,16±0,20; 8,97±0,20; 15,29±0,20; 16,70±0,20; 18,00±0,20 i 20,18±0,20. Oblik 1 može dalje karakterisati PXRD obrazac koji sadrži dva ili više dodatnih difrakcionih pikova, uključujući tri ili više i četiri ili više dodatnih difrakcionih pikova na vrednostima 2θ izabranim od 7,69±0,20; 10,66±0,20; 11,46±0,20; 11,91,±0,20; 15,80±0,20; 17,02±0,20; 18,83±0,20; 22,39±0,20; 22,98±0,20; 24,89±0,20 i 26,54±0,20. Prema drugom aspektu, Oblik 1 karakteriše PXRD obrazac koji sadrži tri, četiri, pet ili šest difrakcionih pikova na vrednostima 2θ izabranim od 8,16±0,20; 8,97±0,20; 15,29±0,20; 16,70±0,20; 18,00±0,20 i 20,8 ±0,20.

[0043] Kao što je dobro poznato u oblasti rendgenske drifraktometrije praha, pozicije pikova u PXRD obrascu su relativno manje osetljive na eksperimentalne detalje, kao što su detalji pripreme uzorka i geometrije instrumenta, u odnosu na relativne visine pikova. Prema tome, opisano je takođe da kristalni Oblik 1 karakteriše rendgenski difraktogram praha u kome su pozicije pikova suštinski u skladu sa onima prikazanim na Slici 6.

[0044] Prema drugom aspektu, kristalni Oblik 1 je okarakterisan njegovim ponašanjem prilikom izlaganja visokoj temperaturi. Kao što je prikazano na Slici 7, zapis diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC) snimljen pri stopi zagrevanja od 10 °C u minuti, karakteriše maksimum u endotermnom protoku toplote, identifikovan kao prelaz rastapanja, u opsegu od oko 210 °C do oko 234 °C ili u opsegu između od oko 215 °C do oko 229 °C ili u opsegu između od oko 220 °C do oko 224 °C. Kristalni Oblik 1 karakteriše zapis diferencijalne skenirajuće kalorimetrije, snimljen pri stopi zagrevanja od 10 °C u minuti, koji karakteriše maksimum u endotermnom protoku toplote na oko 221,7 °C. Zapis termalne gravimetrijske analize (TGA) na Slici 8 ne pokazuje značajan gubitak težine na temperaturama ispod početka raspadanja na oko 293 °C.

[0045] Reprezentativni zapis dinamičke sorpcije vlage (DMS) za Oblik 1 pronalaska oslobođen od kristalnih oblika, prikazan je na Slici 9. Kristalni Oblik 1 je karakterisala mala histereza između dva ciklusa sorpcije i desorpcije. Oblik 1 je karakterisao prirast težine od oko 0,99% u opsegu vlažnosti od 5% do 70% relativne vlažnosti i prirast težine od oko 1,32% u opsegu vlažnosti od 5% do 90% relativne vlažnosti na sobnoj temperaturi, kao što je prikazano na Slici 9. Oblik 1 se smatra blago higroskopnim.

[0046] Pokazano je i da je kristalni Oblik 1 stabilan nakon izlaganja povišenoj temperaturi i vlažnosti. Nakon 36 nedelja u uslovima ubrzanog propadanja od 40 °C i pri relativnoj vlažnosti od 75 %, nisu uočene statistički značajne promene u hemijskoj čistoći.

[0047] Oblik 1 može biti pripremljen rastvaranjem Jedinjenja 1 u etanolu nakon zagrevanja, nakon čega sledi dodavanje acetonitrila, pri čemu je odnos acetonitrila prema etanolu oko 1:1, ili od oko 1:3 do 3:1. Dobijena smeša se zatim zagreva, nakon čega sledi mešanje na temperaturi između oko 20 °C i oko 25 °C, tokom od oko 4 sata do oko 30 sati ili tokom oko 16 sati. Čvrsta supstanca se zatim izdvaja filtriranjem i suši da bi se obezbedio Oblik 1.

[0048] Oblik 1 može takođe biti pripremljen mešanjem Jedinjenja 1 sa etanolom i mešanjem smeše na temperaturi između oko 50 i oko 80 °C, tokom od oko 2 do 30 minuta, ili oko 10 minuta, nakon čega sledi sporo dodavanje acetonitrila na temperaturi između oko 50 i oko 80 °C, pri čemu odnos zapremine acetonitrila prema etanolu iznosi od oko 3:1 do 1:1 ili oko 1,5:1. Mogu se dodavati i klice Oblika 1, kada se reakciona smeša meša na temperaturi od između oko 20 °C i oko 25 °C, tokom između oko 4 sata i oko 30 sati, ili tokom oko 18 sati. Čvrsta supstanca se zatim izdvaja filtriranjem i suši da bi se obezbedio Oblik 1.

Oblik 2

[0049] Kristalni Oblik 2 pronalaska je oblik Jedinjenja 1 koji je oslobođen od kristalnih oblika. Prema jednom aspektu, Oblik 2 karakteriše rendgenski difraktogram praha (PXRD) koji sadrži značajne difrakcione pikove, među ostalim pikovima, na vrednostima 2θ od 10,61±0,20; 11,84±0,20; 14,94±0,20; 18,26±0,20 i 19,06±0,20. Oblik 2 može dalje biti okarakterisan PXRD obrazacem koji sadrži dodatne difrakcione pikove na vrednostima 2θ od 13,32±0,20; 17,69±0,20 i 21,10±0,20. Oblik 2 može karakterisati i PXRD obrazac koji sadrži dva ili više dodatnih difrakcionih pikova, uključujući tri ili više i četiri ili više dodatnih difrakcionih pikova na vrednostima 2θ izabranim od 10,85±0,20; 16,14±0,20; 16,35±0,20; 18,43±0,0,20; 19,20±0,20; 19,49±0,20; 20,72±0,20; 21,94±0,20; 22,64±0,20; 23,64±0,20; 25,19±0,20 i 28,08±0,20.

[0050] Prema drugom aspektu, Oblik 2 karakteriše PXRD obrazac koji sadrži tri, četiri, pet ili šest difrakcionih pikova na vrednostima 2θ izabranim od 10,61±0,20; 11,84±0,20; 13,32±0,20; 14,94±0,20; 17,69±0,20; 18,26±0,20; 19,06±0,20 i 21,10±0,20.

[0051] Kao što je dobro poznato u oblasti rendgenske drifraktometrije praha, pozicije pikova u PXRD obrascu su relativno manje osetljive na eksperimentalne detalje, kao što su detalji pripreme uzorka i geometrije instrumenta, u odnosu na relativne visine pikova. Prema tome, opisano je takođe da kristalni Oblik 2 karakteriše rendgenski difraktogram praha u kome su pozicije pikova suštinski u skladu sa onima prikazanim na Slici 1.

[0052] Struktura kristalnog Oblika 2 je dalje okarakterisana analizom rendgenske difraktaometrije monokristala. Kristali pripadaju ortorombodinom kristalnom sistemu i sa Pbca su prostornom grupom. Dimenzije jedinične ćelije su: α = 9,7245(11) Å, b = 16,8197(14) Å, c = 32,604(4) Å, α= 90°, β=90°, γ= 90°, zapremina=5332,8(10) Å<3>. Izračunata gustina je 1,302 g/cm<3>. Kristali sadrže osam molekula po jediničnoj ćeliji. Struktura potvrđuje da kristali ne sadrže vodu ili druge molekule rastvarača, kao i da je molekulska struktura u skladu sa strukturom jedinjenja iz Primera 1, koje je kao što je ovde prikazano. Pikovi analize rendgenske drifraktometrije praha koji su predviđeni na osnovu izvedenih atomskih pozicija su u dobrom slaganju sa uočenim rezultatima.

[0053] Prema drugom aspektu, kristalni Oblik 2 je okarakterisan i njegovim ponašanjem prilikom izlaganja visokoj temperaturi. Kao što je prikazano na Slici 2, zapis diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC), snimljen pri stopi zagrevanja od 10 °C u minuti, karakteriše maksimum u endotermnom protoku toplote, identifikovan kao prelaz rastapanja, u opsegu od oko 268 °C do oko 277 °C ili u opsegu između od oko 270 °C do oko 275 °C, ili u opsegu između od oko 271 °C do oko 274 °C. Kristalni Oblik 2 karakteriše zapis diferencijalne skenirajuće kalorimetrije, snimljen pri stopi zagrevanja od 10 °C u minuti, koji karakteriše maksimum u endotermnom protoku toplote na oko 272,6±2 °C.

[0054] Zapis termalne gravimetrijske analize (TGA) na Slici 3 ne pokazuje značajan gubitak težine na temperaturama ispod početka raspadanja na oko 269 °C.

[0055] Reprezentativni zapis dinamičke sorpcije vlage (DMS) za Oblik 2 pronalaska koji je oslobođen od kristalnih oblika, prikazan je na Slici 4. Kristalni Oblik 2 je karakterisala mala histereza između dva ciklusa sorpcije i desorpcije, kao i izuzetno mala sklonost ka higroskopnosti. Oblik 2 je karakterisao prirast težine od oko 0,18% u opsegu vlažnosti od 5% do 90% relativne vlažnosti i prirast težine od oko 0,12% u opsegu vlažnosti od 5% do 70% relativne vlažnosti na sobnoj temperaturi, kao što je prikazano na Slici 4. Oblik 2 se smatra nehigroskopnim.

[0056] Oblik 2 može biti pripremljen rastvaranjem Jedinjenja 1 iz primera 1 u DMSO-u (na primer, u odnosu od 1 g Jedinjenja 1 po 1 do 3 mL ili oko 2 mL DMSO-a) na temperaturi između oko 45 i 75 °C, ili na oko 60 °C, nakon čega sledi dodavanje metanola, pri čemu je odnos zapremine metanola prema DMSO-u od oko 1:4 do oko 1:1, ili oko 1:2. Homogena smeša se zatim u kapima dodaje u prethodno pomešani rastvor metanola i vode (gde je odnos metanola prema DMSO-u između 1,5 i 3 prema 1), na temperaturi između oko 60 i oko 90 °C, ili od oko 75 °C, pri čemu je odnos zapremine prethodno pomešanog rastvora metanola i vode od oko 0,5:1 do oko 1:2, ili oko 1:0,9. Smeša se zatim ostavlja da se meša na temperaturi između oko 60 i oko 90 °C, ili od oko 75 °C, tokom od oko 30 minuta do oko 2 sata, ili oko 1 sata. Voda se zatim može polako dodavati na temperaturi između oko 60 i oko 90 °C, ili od oko 75 °C, pri čemu je odnos zapremine vode i metanola između 2 i 4. Dobijena suspenzija se dalje polako hladi do sobne temperature (obično do temperatura između oko 20 i oko 25 °C), uobičajeno tokom od oko 2 do oko 12 sati ili oko 6 sati. Suspenzija se zatim drži na sobnoj temperaturi, a dalje i filtrira, pa pere sa smešom vode i metanola koja sadrži od oko 50 do oko 90%, ili oko 70% vode, da bi se obezbedio Oblik 2,

[0057] Prema jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje postupak pripreme kristalnog Oblika 2 koji obuhvata:

(a) obrazovanje homogene smeše 1-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroksifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-ona u polarnom aprotičnom rastvaraču, ili u polarnom rastvaraču koji se može mešati sa vodom, ili u smeši polarnog aprotičnog rastvarača i polarnog rastvarača koji se može mešati sa vodom, na temperaturi između 45 i 75 °C;

(b) dodavanje homogene smeše u smešu rastvarača koji se može mešati sa vodom i vode, na temperaturi između 60 i 90 °C, da bi se dobila druga smeša;

(c) sporo dodavanje vode u drugu smešu na temperaturi između 60 i 90 °C, da bi se obrazovala suspenzija; i

(d) izolovanje kristalnog oblika iz suspenzije.

[0058] Prema pojedinim aspektima, polarni aprotičan rastvarač iz koraka (a) je izabran iz grupe koja se sastoji od DMSO, DMF, NMP, DMAc i nitrometana, polarni rastvarač koji se može mešati sa vodom iz koraka (a) je izabran iz grupe koja se sastoji od acetonitrila, acetona, metanola, etanola i THF-a, a rastvarač koji se može mešati sa vodom iz koraka (b) je izabran iz grupe koja se sastoji od acetonitrila, acetona, metanola, etanola, n-propanola, izopropanola, n-butanola, THF, DMSO, DMF, NMP, DMAc i nitrometana. Prema pojedinim aspektima, polaran aprotičan rastvarač iz koraka (a) je DMSO, polarni rastvarač koji se može mešati sa vodom iz koraka (a) je metanol, a rastvarač koji se može mešati sa vodom iz koraka (b) je metanol.

[0059] Prema pojedinim aspektima, suspenzija dobijena u koraku (c) se hladi do temperature između oko 20 i 25 °C pre koraka (d).

[0060] Alternativno, Oblik 2 može biti obrazovan mešanjem Jedinjenja 1 koje je dobijeno u primeru 1, u smeši polarnog rastvarača koji se može mešati sa vodom i vode, na temperaturi između 60 i 90 °C. Prema pojedinim aspektima, odnos rastvarača i vode je oko 1:1, ili od 2:1 do 0,5:1. Prema pojedinim aspektima, polaran rastvarač koji se može mešati sa vodom je izabran iz grupe koja se sastoji od acetonitrila, acetona, metanola, etanola, n-propanola, izopropanola, n-butanola, THF, DMSO, DMF, NMP, DMAc i nitrometana.

Farmaceutske kompozicije

[0061] Jedinjenje 1, i njegove farmaceutski prihvatljive soli, obično se upotrebljavaju u obliku farmaceutske kompozicije ili formulacije. Prednost takvih farmaceutskih kompozicija može biti primena pacijentu bilo kojim prihvatljivim putem primene, uključujući, ali ne ograničavajući se na, oralni, inhalacioni, optičkim injeciranjem, topikalni (uključujući transdermalni), rektalni, nazalni i parenteralni način primene.

[0062] Shodno navedenom, prema jednom od aspekata njegovih kompozicija, pronalazak je usmeren na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijens i Jedinjenje 1, gde, kao što je prethodno definisano, "Jedinjenje 1" označava Jedinjenje 1 ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so. Po izboru, takve farmaceutske kompozicije mogu sadržavati druga terapijska i/ili formuliša sredstva, ukoliko je to poželjno. Kada se razmatraju kompozicije i njihove upotrebe, Jedinjenje 1 se ovde može označavati i kao "aktivno sredstvo".

[0063] Prema pojedinim aspektima, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži Jedinjenje 1, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, ili Oblik 1 ili Oblik 2 i farmaceutski prihvatljiv nosač. Prema pojedinim aspektima, farmaceutska kompozicija je pogodna za primenu u oko. Prema pojedinim aspektima, kompozicija je pogodna za injeciranje u oko. Prema pojedinim aspektima, kompozicija je pogodna za intravitrealno injeciranje. Prema pojedinim aspektima, kompozicija je suspenzija. Prema pojedinim aspektima, kompozicija je kristalna suspenzija. Prema pojedinim aspektima, kompozicija je suspenzija Oblika 1 ili Oblika 2.

[0064] Farmaceutske kompozicije pronalaska obično sadrže terapijski efektivnu količinu Jedinjenja 1. Stručnjaci iz oblasti tehnike će, međutim, prepoznati da farmaceutska kompozicija može sadržavati više od terapijski efektivne količine, tj. biti u vidu kompozicije veće mase, ili sadržavati manje od terapijski efektivne količine, tj. biti u vidu pojedinačnih jediničnih doza dizajniranih za višestruku primenu kao način da se postigne terapijski efektivna količina.

[0065] Uobičajeno je da takve farmaceutske kompozicije sadrže od oko 0,01 do oko 95 tež% aktivnog sredstva; uključujući, na primer, od oko 0,05 do oko 30 tež%; i od oko 0,1% do oko 10 tež% aktivnog sredstva.

[0066] U farmaceutskim kompozicijama pronalaska može biti upotrebljen bilo koji konvencionalni nosač ili ekscipijens. Izbor određenog nosača ili ekscipijensa, ili kombinacija nosača ili ekscipijenasa, zavisiće od načina primene koji se upotrebljava za lečenje određenog pacijenta ili od vrste medicinskog stanja ili oboljenja. U tom pogledu, priprema pogodne farmaceutske kompozicije za određeni način primene je u okviru znanja stručnjaka iz oblasti farmaceutske tehnike. Dodatno, nosači ili ekscipijensi koji se upotrebljevaju u farmaceutskim kompozicijama ovog pronalaska su komercijalno dostupni. Dodatna ilustracija ovih primera podrazumeva konvencionalne tehnike formulisanja koje su opisane u Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20. izdanje, Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (2000); i H.C. Ansel i saradnici, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7. izdanje, Lippincott Williams & White, Baltimore, Maryland (1999).

[0067] Reprezentativni primeri materijala koji mogu poslužiti kao farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju, ali nisu ograničeni na, sledeće: šećere, kao što su laktoza, glukoza i saharoza; skrobove, kao što su kukuruzni skrob i skrob krompira; celuloza, kao što je mikrokristalna celuloza, i njeni derivati, kao što su natrijum karboksimetil celuloza, etil celuloza i celulozni acetat; tragakant u prahu; slad; želatin; talk; ekscipijensi, kao što su puter kakaa i voskovi za supozitorije; ulja, kao što su ulje kikirikija, ulje semena pamuka, ulje šafranike, susamovo ulje, maslinovo ulje, kukuruzno ulje i sojino ulje; glikoli, kao što je propilen glikol; polioli, kao što su glicerin, sorbitol, manitol i polietilen glikol; estri, kao što su etil oleat i etil laurat; agar; puferski agensi, kao što su magnezijum hidroksid i aluminijum hidroksid; alginska kiselina; voda oslobođena od pirogena; izotonični fiziološki rastvor; Ringerov rastvor; etil alkohol; rastvori puferisani fosfatima; i druge netoksične kompatibilne supstance koje se koriste u farmaceutskim kompozicijama.

[0068] Farmaceutske kompozicije se uobičajeno pripremaju temeljnim i bliskim mešanjem ili umešavanjem aktivnog sredstva sa farmaceutski prihvatljivim nosačem i sa jednim ili sa više izbornih sastojaka. Dobijena ravnomerno izmešana smeša može zatim biti oblikovana ili upotrebljena za ispunjavanje tableta, kapsula, pilula i sličnog, upotrebom konvencionalnih procedura i opreme.

[0069] Poželjno je da su farmaceutske kompozicije pronalaska upakovane u jedinični dozni oblik. Termin "jedinični dozni oblik" se odnosi na fizički diskretnu jedinicu koja je pogodna za primenu doze pacijentu, tj. svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog sredstva izračunatu tako da se proizvede željeni terapijski efekat, bilo samostalno ili u kombinaciji sa jednom ili sa više dodatnih jedinica. Na primer, takvi jedinični dozni oblici mogu biti kapsule, tablete, pilule i slično, ili jedinična pakovanja pogodna za okularnu ili parenteralnu primenu.

[0070] U jednom primeru izvođenja, farmaceutske kompozicije pronalaska su pogodne za oralnu primenu. Pogodne farmaceutske kompozicije za oralnu primenu mogu biti u obliku kapsula, tableta, pilula, pastila, kašeta, dražeja, prahova, granula; ili u vidu rastvora ili suspenzija u vodenoj ili nevodenoj tečnosti; ili u vidu tečne emulzije tipa ulje-u-vodi ili voda-u-ulju; ili u vidu eliksira ili sirupa; i sličnog; pri čema svaka sadrži unapred određenu količinu Jedinjenja 1 kao aktivan sastojak.

[0071] Kada su namenjene za oralnu primenu u vidu čvrstog doznog oblika (tj. u vidu kapsula, tableta, pilula i sličnog), farmaceutske kompozicije pronalaska obično sadrže aktivno sredstvo i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača. Po izboru, takvi čvrsti dozni oblici mogu sadržavati: ispunjivače ili ekstendere, kao što su skrobovi, mikrokristalna celuloza, laktoza, dikalcijum fosfat, saharoza, glukoza, manitol i/ili silicijumska kiselina; sredstva za povezivanje, kao što su karboksimetilceluloza, alginati, želatin, polivinil pirolidon, saharoza i/ili akacija; ovlaživače, poput glicerola; sredstva za raspadanje, kao što su natrijum kroskarmeloza, agar-agar, kalcijum karbonat, skrob krompira ili tapioke, alginska kiselina, određeni silikati i/ili natrijum karbonat; sredstva za odlaganje rastvaranja, kao što je parafin; ubrzivače apsorpcije, kao što su kvarterna amonijumska jedinjenja; sredstva za vlaženje, kao što je cetil alkohol i/ili glicerol monostearat; apsorbante, kao što su kaolin i/ili bentonit glina; lubrikante, kao što su talk, kalcijum stearat, magnezijum stearat, čvrsti polietilen glikoli, natrijum lauril sulfat, i/ili njihove smeše; boje; i puferske agense.

[0072] Sredstva za oslobađanje, sredstva za vlaženje, sredstva za oblaganje, zaslađivači, arome i mirisi, konzervansi i antioksidansi, takođe mogu biti prisutni u farmaceutskim kompozicijama pronalaska. Primeri farmaceutski prihvatljivih antioksidanasa uključuju: antioksidanse rastvorljive u vodi, kao što su askorbinska kiselina, cistein hidrohlorid, natrijum bisulfat, natrijum metabisulfat, natrijum sulfit i slični; antioksidanse rastvorljive u ulju, kao što su askorbil palmitat, butilovani hidroksianizol, butilovani hidroksitoluen, lecitin, propil galat, alfa-tokoferol i slični; i agensi za helaciju metala, kao što su limunska kiselina, etilendiamin tetrasirćetna kiselina, sorbitol, vinska kiselina, fosforna kiselina i slično. Sredstva za oblaganje tableta, kapsula, pilula i sličnog, uključuju ona koja se koriste za enterične obloge, kao što su celulozni acetat ftalat, polivinilni acetat ftalat, hidroksipropil metilcelulozni ftalat, hidroksipropil metilceluloza, metakrilna kiselina, kopolimeri estara metakrilne kiseline, celulozni acetat trimelitat, karboksimetil etil celuloza, hidroksipropil metil celulozni acetat sukcinat i slično.

[0073] Farmaceutske kompozicije pronalaska mogu takođe biti formulisane tako da obezbede sporo ili kontrolisano oslobađanje aktivnog sredstva, upotrebom, na primer, hidroksipropil metil celuloze u promenljivim proporcijama; ili drugih polimernih matriksa, lipozoma i/ili mikrosfera. Dodatno, farmaceutske kompozicije pronalaska mogu po izboru sadržavati sredstva za opacifikaciju i mogu biti formulisane tako da oslobađaju aktivan sastojak samo, ili prevashodno, u određenom delu gastrointestinalnog trakta, po izboru, na odložen način. Primeri obloga za kompozicije koje mogu biti upotrebljeni obuhvataju polimerne supstance i voskove. Aktivno sredstvo može takođe biti u mikroinkapsuliranom obliku, ukoliko je to pogodno, sa jednim ili sa više ekscipijenasa koji su prethodno opisani.

[0074] Pogodni tečni dozni oblici za oralnu primenu obuhvataju, u vidu ilustracije, farmaceutski prihvatlјive emulzije, mikroemulzije, rastvore, suspenzije, sirupe i eliksire. Tečni dozni oblici obično sadrže aktivno sredstvo i inertan razblaživač poput, na primer, vode ili drugih rastvarača, sredstava za solubilizaciju i emulgatora, kao što su etil alkohol, izopropil alkohol, etil karbonat, etil acetat, benzil alkohol, benzil benzoat, propilen glikol, 1,3-butilen glikol, ulјa (naročito ulje semena pamuka, kikirikija, kukuruza, klica, maslinovo, ricinusovo i susamovo ulјe), oleinska kiselina, glicerol, tetrahidrofurilni alkohol, polietilen glikoli i estri masnih kiselina sorbitana i njihove smeše. Alternativno, određene tečne formulacije mogu biti prevedene, na primer, sušenjem putem raspršivanja, u prah, koji se može upotrebljavati za pripremu čvrstih doznih oblika konvencionalnim procedurama.

[0075] Suspenzije, pored aktivnog sastojka, mogu sadržavati sredstva za resuspendovanje, kao što su, na primer, etoksilovani izostearilni alkoholi, polioksietilen sorbitol i sorbitanski estri, mikrokristalna celuloza, aluminijum metahidroksid, bentonit, agar-agar i tragakant, i njihove smeše.

[0076] Jedinjenje 1 može takođe biti primenjeno parenteralno (npr. intravenskim, subkutanim, intramuskularnim ili intraperitonealnim injeciranjem). Za parenteralnu primenu, aktivno sredstvo se obično meša sa pogodnim nosačem za parenteralnu primenu uključujući, na primer, sterilne vodene rastvore, fiziološki rastvor, alkohole niske molekularne težine kao što su propilen glikol, polietilen glikol, biljna ulja, želatin, estri masnih kiselina poput etil oleata i slično. Parenteralne formulacije mogu takođe sadržavati jedan ili više antioksidanasa, solubilizatora, stabilizatora, konzervanasa, sredstava za vlaženje, emulgatora, puferskih agenasa ili sredstava za dispergovanje. Ove formulacije mogu biti učinjenje sterilnim upotrebom sterilnog medijuma za injeciranje, sredstva za sterilizaciju, kao i filtracijom, zračenjem ili toplotom.

[0077] Jedinjenje 1 može takođe biti formulisano u vidu sterilne vodene suspenzije ili rastvora za injeciranja u oko. Korisni ekscipijensi koji mogu biti uključeni u takvu vodenu formulaciju uključuju polisorbat 80, polimere celuloze kao što su karboksimetilceluloza, hidroksipropil metilceluloza, metilceluloza, kalijum hlorid, kalcijum hlorid, natrijum hlorid, magnezijum hlorid, natrijum acetat, natrijum citrat, histidin, α-α-trehaloza dihidrat, saharoza, polisorbat 20, hidroksipropil-βciklodekstrin, benzalkonijum hlorid, Amberlit iRP-69, polioksietilenski glikolni etri (lauril, stearil i oleil), natrijumova so etilendiamintetrasirćetne kiseline, natrijum tauroholat, saponini i kremofor EL, polikarbofil-cistein, ksantan guma, gelanska guma, hijaluronska kiselina, lipozomi i natrijum fosfat. U formulaciju mogu biti uključeni i pojačivači prodiranja, površinski aktivna sredstva, žučne kiseline, ciklodekstrini kao što je 2-hidroksipropil-β-ciklodekstrin i helatorni agensi. Cilindrični oligonukleotidi sa hidrofilnom spoljašnjom površinom i lipofilnom unutrašnjom površinom, koji imaju sposobnost obrazovanja kompleksa sa aktivnim sredstvom, mogu takođe biti uključeni u formulaciju. Benzil alkohol može poslužiti kao konzervans, a natrijum hlorid može biti uključen da bi se podesila toničnost. Pored toga, hlorovodonična kiselina i/ili natrijum hidroksid mogu biti dodavani u rastvor da bi se podesio pH. Vodene formulacije za očne injekcije mogu biti pripremani i bez konzervanasa.

[0078] Fromulacija za oči može omogućavati i produženo oslobađanje aktivnog sastojka u oko. Očna formulacija može biti formulisana kao emulzija (tipa ulje-u-vodi ili voda-u-ulju), suspenzija ili mast.

Formulacija u vidu suspenzije može sadržavati Jedinjenje 1, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, kao kristalni oblik, na primer Oblik 1 ili Oblik 2, ili isti u amorfnom stanju.

[0079] Jedinjenje 1 može takođe biti formulisano tako da bude pogodno za primenu doze u vidu kapi za oči ili u vidu intravitrealnog implanta. Implant može omogućavati isporuku konstantnih terapijskih nivoa leka. Implantati sa rezervoarom se obično prave sa peletiranim jezgrom leka koje je okruženo nereaktivnim supstancama kao što su silikon, etilen vinil acetat (EVA) ili polivinil alkohol (PVA); ovi implantati nisu biorazgradivi i mogu isporučivati kontinuirane količine leka tokom više meseci, do godine. Mogu se upotrebljavati i matriksni implanti. Oni se obično upotrebljavaju za isporuku udarne doze, nakon čega sledi postepeno smanjivanje doze leka tokom perioda od 1 dana do 6 meseci. Najčešće se prave od kopolimera poli-mlečne kiseline (PLA) i/ili poli-mlečne-glikolne kiseline (PLGA), koji se razgrađuju do vode i ugljen-dioksida. Može se upotrebljavati i jonoforeza. To je neinvazivna tehnika u kojoj se primenjuje slaba električna struja kako bi se poboljšalo prodiranje jonizovanog leka u tkivo.

[0080] Tehnologija inkapsuliranih ćelija (ECT), što je sistem za isporuku zasnovan na ćelijama, može takođe biti upotrebljen za isporuku terapijskog agensa u oko. Obično su genetički modifikovane ćelije upakovane u šuplju cev od polupropusne membrane, koja sprečava ulazak imunskih ćelija i omogućava hranljivim materijama i terapijskim molekulima da slobodno difunduju kroz membranu. Dva kraja polimerne cevi su zaptivena, a na kraj za usidravanje se postavlja petlja od titanijuma, tako da se implant ugrađuje u pars plana i učvršćuje za skleru.

[0081] Jedinjenje 1 može biti formulisano u bilo kom obliku koji omogućava isporuku u zadnji deo oka. Primeri načina isporuke su poznati u literaturi (Kuno i saradnici, Polymers, 2011, 3, 193-221, del Amo i saradnici, Drug Discovery Today, 2008, 13, 135-143, Short, Toxicologic Pathology, 2008, 36, 49-62). Takvi načini isporuke uključuju, ali nisu ograničeni na, suprahoroidnu isporuku koja omogućava isporuku do horoidee i mrežnjače kroz suprahoroidni prostor, subtenonsku isporuku, periokularnu isporuku, kontaktna sočiva, punktalne čepove i skleralne čepove. Jedinjenje 1 može takođe biti isporučeno periokularnim, supraskleroznim, retrobulbarnim, peribulbarnim ili subkonjunktivnim injeciranjem.

[0082] Jedinjenje 1 može biti isporučeno u vidu emulzije, polimerne mikro ili nanosfere, lipozoma, mikro ili nanočestica, mikrosfera, micela ili dendrimera. Mogu biti upotrebljeni biorazgradivi i biokompatibilni polimeri, kao što su poliaktid i PLGA. Jedinjenje 1 može biti inkapsulirano.

[0083] Dodatno, Jedinjenje 1 može biti formulisano za topikalnu primenu na kožu, kao mast ili krema. Formulacije u vidu masti su polučvrsti preparati sa bazom od uljanog ili masnog materijala koji je uobičajeno bistar. Pogodni uljani materijali za upotrebu u formulacijama masti uključuju vazelin (petrolejski gel), pčelinji vosak, kakao puter, ši-puter i cetil alkohol. Masti mogu, po izboru, dodatno sadržavati emolijense i pojačivače prodiranja, ukoliko je to poželjno.

[0084] Fromulacije u vidu kreme mogu biti pripremane u vidu emulzija koje sadrže uljanu fazu i vodenu fazu, a koja obično uključuje prečišćenu vodu. Komponente formulacije u vidu kreme mogu uključivati: uljane baze, kao što su vazelin, mineralna ulja, biljna i životinjska ulja i trigliceridi; baze kreme, kao što su lanolinski alkoholi, stearinska kiselina i cetostearil alkohol; gel bazu, kao što je polivinil alkohol; rastvarače, kao što su propilen glikol i polietilen glikol; emulgatore, kao što su polisorbati, stearati, poput gliceril stearata, oktilhidroksistearata, polioksil stearata, PEG stearil etara, izopropil palmitata i sorbitan monostearata; stabilizatore, kao što su polisaharidi i natrijum sulfit; emolijense (tj. ovlaživače), kao što su trigliceridi srednje dužine lanca, izopropil miristat i dimetikon; sredstva za učvršćivanje, kao što su cetil alkohol i stearil alkohol; antimikrobna sredstva, kao što su metilparaben, propilparaben, fenoksietanol, sorbinska kiselina, diazolidinil urea i butilovani hidroksianizol; pojačivače prodiranja, kao što su N-metilpirolidon, propilen glikol, polietilen glikol monolaurat i slično; i sredstva za helaciju, kao što je dinatrijum edetat.

[0085] Alternativno, farmaceutske kompozicije pronalaska su formulisane za primenu inhalacijom. Pogodne farmaceutske kompozicije za primenu inhalacijom će obično biti u obliku aerosola ili praha. Takve kompozicije se uglavnom primenjuju upotrebom dobro poznatih uređaja za isporuku, kao što su inhalator sa dozatorom, inhalatori za suvi prah, nebulizator ili sličan uređaj za isporuku.

[0086] Kada se primenjuju inhalacijom, upotrebom spremnika pod pritiskom, farmaceutske kompozicije pronalaska će obično sadržavati aktivni sastojak i pogodan pogonski gas, kao što je dihlorodifluorometan, trihlorofluorometan, dihlorotetrafluoroetan, ugljen-dioksid ili drugi pogodan gas. Pored toga, farmaceutska kompozicija može biti u obliku kapsule ili patrone (napravljene, na primer, od želatina) koji sadrži Jedinjenje 1 i prah pogodan za upotrebu u inhalatoru za prah. Pogodne praškaste baze uključuju, na primer, laktozu ili skrob.

[0087] Neograničavajući primeri koji slede ilustruju reprezentativne farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska.

Oralni čvrsti dozni oblik u vidu tablete

[0088] Jedinjenje 1, ili njegova farmaceutski prihvatlјiva so, pomešani su kao suve supstance sa mikrokristalnom celulozom, polivinil pirolidonom i natrijum kroskarmelozom u odnosu od 4:5:1:, nakon čega je smeša komprimovana u tablete da bi se obezbedio jednični dozni oblik sa, na primer, 5 mg; 20 mg ili 40 mg aktivnog sredstva po tableti.

Oralni čvrsti dozni oblik u vidu kapsule

[0089] Jedinjenje 1, ili njegova farmaceutski prihvatlјiva so, vlažnom granulacijom su spojeni sa mikrokristalnom celulozom, polivinil pirolidonom i natrijum kroskarmelozom u odnosu 4:5:1:1, pa su smešom ispunjavane želatinske ili kapsule od hidroksipropil metilceluloze, da bi se obezbedio jedinični dozni oblik sa, na primer, 5 mg; 20 mg ili 40 mg aktivnog sredstva po kapsuli.

Tečna formulacija

[0090] Tečna formulacija koja sadrži Jedinjenje 1 (0,1 %), vodu (98,9 %) i askorbinsku kiselinu (1,0 %) obrazovana je dodavanjem jedinjenja pronalaska u smešu vode i askorbinske kiseline.

Oralni dozni oblik sa enteričkom oblogom

[0091] Jedinjenje 1 je rastvarano u vodenom rastvoru koji je sadržavao polivinil pirolidon, pa je smeša raspršivanjem naneta na mikrokristalnu celulozu ili granule šećera, u odnosu aktivnog sredstva i granula od 1:5 w/w, nakon čega je primenjeno i 5 % od te dodate težine enteričke obloge koja je sadržavala akrilni kopolimer. Granulama sa enteričkom oblogom su zatim ispunjavane želatinske ili kapsule od hidroksipropil metilceluloze, da bi se obezbedio jedinični dozni oblik sa, na primer, 30 mg aktivnog sredstva po kapsuli.

Oralni dozni oblik sa enteričkim oblogom

[0092] Enterička obloga koja je sadržavala kombinaciju Eudragit-L® i Eudragit-S®, ili hidroksipropil metilcelulozni acetat sukcinat, nanošena je na prethodno opisane tablete kao oralni dozni oblik ili kapsule kao oralni dozni oblik.

Vodena formulacija za injeciranje u oko

[0093] Svaki mL sterilne vodene suspenzije je uključivao od 5 mg do 50 mg Jedinjenja 1, natrijum hlorid za toničnost, 0,99 % (w/v) benzil alkohola kao konzervansa, 0,75 % natrijum karboksimetilceluloze i 0,04 % polisorbata. Mogu biti uključeni i natrijum hidroksid ili hlorovodonična kiselina, da bi se pH podesio na od 5 do 7,5,

Vodena formulacija za injeciranje u oko

[0094] Sterilna vodena suspenzija bez konzervanasa je uključivala od 5 mg/mL do 50 mg/mL Jedinjenja 1 u 10 mM natrijum fosfata, 40 mM natrijum hlorida, 0,03 % polisorbata 20 i 5 % saharoze.

Formulacija u vidu masti za topikalnu primenu

[0095] Jedinjenje 1 je pomešano sa vazelinom, C8-C10trigliceridom, oktilhidroksistearatom i N-metilpirolidonom u odnosu koji obezbeđuje kompoziciju koja sadrži od 0,05% do 5% aktivnog sredstva po težini.

Formulacija u vidu masti za topikalnu primenu

[0096] Jedinjenje 1 je pomešano sa belim vazelinom, propilen glikolom, mono- i di-gliceridima, parafinom, butilovanim hidroksitoluenom i edetat kalcijum dinatrijumom u odnosu koji obezbeđuje kompoziciju koja sadrži od 0,05% do 5% aktivnog sredstva po težini.

Formulacija u vidu masti za topikalnu primenu

[0097] Jedinjenje 1 je pomešano sa mineralnim uljem, parafinom, propilen karbonatom, belim vazelinom i belim voskom, da bi se obezbedila kompozicija koja sadrži od 0,05% do 5% aktivnog agensa po težini.

Formulacija u vidu kreme za topikalnu primenu

[0098] Mineralno ulje je pomešano sa Jedinjenjem 1, propilen glikolom, izopropil palmitatom, polisorbatom 60, cetil alkoholom, sorbitan monostearatom, polioksil 40 stearatom, sorbinskom kiselinom, metilparabenom i propilparabenom, da bi se obrazovala uljana faza, koja je zatim spojena sa prečišćenom vodom uz mešanje sa smicanjem, da bi se obezbedila kompozicija koja sadrži od 0,5 % do 5 % aktivnog sredstva po težini.

Formulacija u vidu kreme za topikalnu primenu

[0099] Formulacija u vidu kreme koja sadrži Jedinjenje 1, benzil alkohol, cetil alkohol, anhidrovanu limunsku kiselinu, mono i di-gliceride, oleil alkohol, propilen glikol, natrijum cetostearil sulfat, natrijum hidroksid, stearil alkohol, trigliceride i vodu, sadržavala je od 0,05% do 5% aktivnog sredstva po težini.

Formulacija u vidu kreme za topikalnu primenu

[0100] Formulacija u vidu kreme koja sadrži Jedinjenje 1, cetostearil alkohol, izopropil miristat, propilen glikol, cetomakrogol 1000, dimetikon 360, limunsku kiselinu, natrijum citrat i prečišćenu vodu, sa imidureom, metilparabenom i propilparabenom kao konzervansima, sadržavala je od 0,05% do 5% aktivnog agensa po težini.

Kompozicija u vidu suvog praha

[0101] Mikronizovano Jedinjenje 1 (1 g) je umešano sa mlevenom laktozom (25 g). Ovako umešanom smešom su zatim ispunjavani pojedinačni blisteri pakovanja sa blisterima koje se može ljuštiti, u količini dovoljnoj da se obezbedi od oko 0,1 mg do oko 4 mg Jedinjenja 1 po dozi. Sadržaj blistera je primenjivan upotrebom inhalatora za suvi prah.

Kompozicija za inhalator sa dozatorom

[0102] Mikronizovano Jedinjenje 1 (10 g) je dispergovano u rastvoru pripremljenom rastvaranjem lecitina (0,2 g) u demineralizovanoj vodi (200 mL). Dobijena suspenzija je osušena raspršivanjem i zatim je mikronizovana da bi se obrazovala mikronizovana kompozicija sa česticama srednjeg prečnika manjeg od oko 1,5 µm. Mikronizovanom kompozicijom su zatim ispunjavane patrone za inhalator sa dozatorom koji je sadržavao 1,1,1,2-tetrafluoroetan pod pritiskom, u količini dovoljnoj da se obezbedi od oko 0,1 mg do oko 4 mg Jedinjenja 1 po dozi prilikom primene jedinjenja sa inhalatorom sa dozatorom.

Kompozicija za nebulizator

[0103] Jedinjenje 1 (25 mg) je rastvarano u rastvoru koji je sadržavao 1,5-2,5 ekvivalenata hlorovodonične kiseline, nakon čega je sledilo dodavanje natrijum hidroksida da bi se pH podesio na od 3,5 do 5,5 i 3 tež% glicerola. Rastvor je dobro mešan dok se sve komponente nisu rastvorile. Rastvor je primenjivan upotrebom uređaja za nebulizaciju da bi se obezbedilo od oko 0,1 mg do oko 4 mg Jedinjenja 1 po dozi.

Korisnost

[0104] Pokazano je da je Jedinjenje 1 potentan inhibitor JAK familije enzima: JAK1, JAK2, JAK3 i TYK2.

Očne bolesti

[0105] Pokazano je da su mnoge očne bolesti udružene sa povišenjima proinflamatornih citokina koji se oslanjaju na JAK-STAT put. Pošto Jedinjenje 1 ispoljava potentnu inhibiciju za sva četiri JAK enzima, očekuje se da snažno inhibira signalne i patogene efekte brojnih citokina (kao što su lL-6, IL-2 i IFN-γ), u čiji je prenos signala uključen JAK, kao i da sprečavaju povećanje drugih citokina (kao što su MCP-1 i IP-10), čija se proizvodnja pokreće JAK-STAT signalnim putem.

[0106] Preciznije, Jedinjenje 1 je ispoljilo pIC50vrednosti od 6,4 ili više (IC50vrednosti od 400 nM ili manje) u pogledu inhibicije IL-6, IL-2 i IFNγ/ signalizacije u ćelijskim ispitivanjima opisanim u Ispitivanjima od 3 do 6, uključujući ispitivanja koji registruju inhibiciju nishodnih efekata povišenja citokina.

[0107] Farmakokinetička studija iz Ispitivanja 7 je ukazala na produženu izloženost u očima zeca nakon jednokratne intravitrealne injekcije, kao i koncentraciju u plazmi koja je bila za najmanje tri reda veličine niža od one uočene u staklastom tkivu.

[0108] Štaviše, pokazano je da intravitrealna primena doze Jedinjenja 1 dovodi do značajne inhibicije pSTAT3 indukovanog sa IL-6, u tkivu retine/horoidee pacova, kao i do značajne i produžene inhibicije IP-10 indukovanog sa IFN-γ u staklastom telu zeca i tkivima retine/horoidee. Kod zeca je pokazano i da intravitrealna primena doze Jedinjenja 1 dovodi do značajne i produžene inhibicije pSTAT1 indukovanog sa IFN-γ.

[0109] Očekuje se da će rezultat produžene okularne inhibicije JAK u odsustvu značajnih sistemskih nivoa biti snažna, lokalna anti-inflamatorna aktivnost u oku, bez sistemski izazvanih neželjenih efekata. Očekuje se stoga da Jedinjenje 1 bude korisno u brojnim očnim bolestima koje uključuju, ali nisu ograničene na, uveitis, dijabetsku retinopatiju, dijabetski makularni edem, bolest suvog oka, senilnu degeneraciju makule, okluziju retinalnih vena i atopijski keratokonjunktivitis.

[0110] Preciznije, uveitis (Horai i Caspi, J Interferon Cytokine Res, 2011, 31, 733-744), dijabetska retinopatija (Abcouwer, J Clin Cell Immunol, 2013, Supl 1, 1-12), dijabetski makularni edem (Sohn i saradnici, American Journal of Opthalmology, 2011, 152, 686-694), bolest suvog oka (Stevenson i saradnici, Arch Ophthalmol, 2012, 130, 90-100), okluzija retinalne vene (Shchuko i saradnici, Indian Journal of Ophthalmology, 2015, 63(12), 905-911) i senilna degeneracija makule (Knickelbein i saradnici, Int Ophthalmol Clin, 2015, 55(3), 63-78) karakterišu povišenje određenih proinflamatornih citokina koji prenose signal putem JAK-STAT puta. Shodno tome, Jedinjenje 1 može biti u stanju da ublaži udruženu inflamaciju oka i da povrati progresiju bolesti ili da obezbedi olakšanje simptoma kod ovih bolesti.

[0111] Prema jednom aspektu, pronalazak stoga obezbeđuje 1-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroksifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-on, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, za upotrebu u postupku lečenja očne bolesti kod sisara, pri čemu postupak obuhvata primenu farmaceutske kompozicije koja sadrži 1-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroksifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-on, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i farmaceutski nosač, u oko sisara. Prema jednom aspektu, očna bolest je uveitis, dijabetska retinopatija, dijabetski makularni edem, bolest suvog oka, senilna degeneracija makule, okluzija retinalne vene ili atopijski keratokonjunktivitis. Prema jednom aspektu, postupak obuhvata primenu Jedinjenja 1 intravitrealnim injeciranjem.

Inflamatorna bolest kože

[0112] Atopijski dermatitis je, na primer, povezan sa povećanjem proinflamatornih citokina koji se oslanjaju na JAK-STAT put, posebno IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 i IFNγ. Pored inhibicije citokina u ćelijskim ispitivanjima koji su prethodno navedena, Jedinjenje 1 je ispoljilo IC50vrednost od 13 nM u pogledu inhibicije IL-13, kao što je opisano u Ispitivanju 2. Štaviše, za model formulacija u vidu kreme i masti Jedinjenja 1 je pokazano da su prisutni produženi dermalni nivoi tokom najmanje 2 dana kod miševa i najmanje 7 dana kod patuljaste svinje, bez izloženosti u plazmi koja se mogla detektovati.

[0113] Očekuje se da rezultat kontinuiranih dermalnih nivoa Jedinjenja 1 u odsustvu značajnih sistemskih nivoa, bude snažna lokalna anti-inflamatorna i aktivnost protiv svraba u koži, bez sistemski izazvanih neželjenih efekata. Prema tome, očekuje se da Jedinjenje 1 bude od koristi u brojnim dermalnim inflamatornim ili stanjima praćenim svrabom koja uključuju, ali nisu ograničena na, alopeciju areatu, vitiligo, kutani T-ćelijski limfom, prurigo nodularis, lihen planus, primarnu lokalizovanu kutanu amiloidozu, bulozni pemfigoid, kožne manifestacije bolesti “kalem-protivdomaćina”, pemfigoid, diskoidni lupus, anularni granulom, hronični lihen simpleks, vulvalni/skrotalni/perianalni svrab, lihen sklerozus, post-herpetični neuralgijski svrab, lihen planopilaris i folikulitis dekalvans. Preciznije, alopeciju areata (Xing i saradnici, Nat Med. 2014 Sep;20(9): 1043-9), vitiligo (Craiglow i saradnici, JAMA Dermatol.2015 Oct; 151(10): 1110-2), kutani T-ćelijski limfom (Netchiporouk i saradnici, Cell Cycle. 2014; 13(21):3331-5), prurigo nodularis (Sonkoly i saradnici, J Allergy Clin Immunol. 2006 Feb; 117(2):411-7), lihen planus (Welz-Kubiak i saradnici, J Immunol Res. 2015;2015:854747), primarna lokalizovana kutana amiloidoza (Tanaka i saradnici, Br J Dermatol. 2009 Dec;161(6):1217-24), bulozni pamfigoid (Feliciani i saradnici, Int J Immunopathol Pharmacol. 1999 Maj-Avg;12(2):55-61) i dermalne manifestacije bolesti “kalemprotiv-domaćina” (Okiyama i saradnici, J Invest Dermatol. 2014 Apr; 134(4): 992-1000) karakteriše povišenje određenih citokina čiji se signal prenosi aktivacijom JAK. Prema tome, Jedinjenje 1 može biti u stanju da ublaže udruženu dermalnu inflamaciju ili svrab izazvan ovim citokinima. Preciznije, očekuje se da Jedinjenje 1 bude korisno za lečenje atopijskog dermatitisa i drugih inflamatornih bolesti kože.

[0114] Prema jednom aspektu, pronalazak stoga obezbeđuje 1-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroksifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-on, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, za upotrebu u postupku lečenja inflamatornog oboljenja kože kod sisara (npr. čoveka), pri čemu postupak obuhvata primenu farmaceutske kompozicije koja sadrži 1-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroksifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-on, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i farmaceutski nosač, na kožu sisara. Prema jednom aspektu, inflamatorna bolest kože je atopijski dermatitis.

[0115] Jedinjenje 1 takođe može biti upotrebljeno u kombinaciji sa gram pozitivnim antibioticima, kao što su mupirocin i fuzidinska kiselina, za lečenje inflamatornih oboljenja kože. Prema jednom aspektu, pronalazak stoga obezbeđuje 1-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroksifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-on, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, za upotrebu u postupku lečenja inflamatornog oboljenja kože kod sisara, pri čemu postupak obuhvata nanošenje Jedinjenja 1 i gram pozitivnog antibiotika na kožu sisara. Prema drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži 1-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroksifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-on, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, gram pozitivni antibiotik i farmaceutski prihvatljiv nosač.

Respiratorne bolesti

[0116] Pokazano je i da su citokini čiji se signal prenosi JAK-STAT putem, posebno IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-11, IL-13, IL-23, IL-31, IL-27, timusni stromalni limfopoetin (TSLP), interferon-y (IFNγ) i faktor stimulacije rasta granulocitnih-makrofagnih kolonije (GM-CSF), uključeni u inflamaciju u astmi i drugim inflamatornim respiratornim bolestima. Kao što je prethodno opisano, pokazano je da je Jedinjenje 1 snažan inhibitor enzima JAK1, JAK2, JAK3 i TYK2, kao i da ispoljava snažnu inhibiciju proinflamatornih citokina u ćelijskim ispitivanjima.

[0117] Anti-inflamatorna aktivnost JAK inhibitora je jasno pokazana u prekliničkim modelima astme (Malaviya i saradnici, Int Immunopharmacol, 2010, 10, 829,-836; Matsunaga i saradnici, Biochem and Biophys Res Commun, 2011, 404, 261-267; Kudlacz i saradnici, Eur J Pharmacol, 2008, 582, 154-161.) Prema tome, očekuje se da Jedinjenje 1 bude korisno za lečenje inflamatornih respiratornih poremećaja, prevashodno astme. Inflamacija i fibroza pluća su karakteristični i za druge respiratorne bolesti pored astme, kao što su hronična opstruktivna bolest pluća (HOBP), cistična fibroza (CF), pneumonitis, intersticijske bolesti pluća (uključujući idiopatsku plućnu fibrozu), akutna povreda pluća, sindrom akutnog respiratornog distresa, bronhitis, emfizem i bronhiolitis obliterans. Očekuje se stoga i da Jedinjenje 1 bude korisno za lečenje hronične opstruktivne bolesti pluća, cistične fibroze, pneumonitisa, intersticijskih bolesti pluća (uključujući idiopatsku plućnu fibrozu), akutne povrede pluća, sindroma akutnog respiratornog distresa, bronhitisa, emfizema, bronhiolitisa obliterans i sarkoidoze.

[0118] Prema jednom aspektu, pronalazak stoga obezbeđuje 1-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroksifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-on, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, za upotrebu u postupku lečenja respiratorne bolesti kod sisara (npr. čoveka), pri čemu postupak obuhvata primenu 1-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroksifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-ona ili njegove farmaceutski prihvatljive soli sisaru.

[0119] Prema jednom aspektu, respiratorna bolest je astma, hronična opstruktivna bolest pluća, cistična fibroza, pneumonitis, hronična opstruktivna bolest pluća (HOBP), cistična fibroza (CF), pneumonitis, intersticijske bolesti pluća (uključujući idiopatsku plućnu fibrozu), akutna povreda pluća, sindrom akutnog respiratornog distresa, bronhitis, emfizem, bronhiolitis obliterans ili sarkoidoza. Prema drugom aspektu, respiratorna bolest je astma ili hronična opstruktivna bolest pluća.

[0120] Prema daljem aspektu, respiratorna bolest je infekcija pluća, infekcija helmintima, plućna arterijska hipertenzija, sarkoidoza, limfangiolejomiomatoza, bronhiektazija ili infiltrativna bolest pluća. Prema još jednom aspektu, respiratorna bolest je pneumonitis indukovan lekovima, pneumonitis indukovan gljivicama, alergijska bronhopulmonarna aspergiloza, pneumonitis hipersenzitivnosti, eozinofilna granulomatoza sa poliangitisom, idiopatska akutna eozinofilna upala pluća, idiopatska hronična eozinofilna upala pluća, hipereozinofilni sindrom, Leflerov sindrom, bronhiolitis obliterans sa upalom pluća u organizaciji ili pneumonitis indukovan inhibitorima imunskih kontrolnih tačaka.

[0121] Pronalazak dalje obezbeđuje 1-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroksifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-on, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, za upotrebu u postupku lečenja astme kod sisara, pri čemu postupak obuhvata primenu farmaceutske kompozicije koja sadrži 1-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroksifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-on, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i farmaceutski prihvatljiv nosač, sisaru.

[0122] Jedinjenje 1, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, mogu takođe biti korisni za lečenje eozinofilnih bolesti pluća. Eozinofilna inflamacija disajnih puteva je karakteristična za bolesti koje se zajednički označavaju eozinofilnim bolestima pluća (Cottin i saradnici, Clin. Chest. Med, 2016, 37(3), 535-56). Eozinofilne bolesti su povezane sa signalnim putevima za IL-4, IL-13 i IL-5. Eozinofilne bolesti pluća uključuju infekcije (posebno infekcije helmintima), pneumonitis izazvan lekovima (indukovan na primer terapijskim lekovima kao što su antibiotici, fenitoin ili l-triptofan), pneumonitis izazvan gljivicama (npr. alergijsku bronhopulmonarnu aspergilozu), pneumonitis hipersenzitivnosti i eozinofilnu granulomatozu sa poliangitisom (ranije poznatu kao Churg-Strauss-ov sindrom). Eozinofilne bolesti pluća nepoznate etiologije uključuju idiopatsku akutnu eozinofilnu upala pluću, idiopatsku hroničnu eozinofilnu upala pluću, hipereozinofilni sindrom i Leflerov sindrom.

[0123] Jedinjenje 1, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, mogu takođe biti korisni za lečenje PAH. Polimorfizam u IL-6 genu je povezan sa povišenim nivoima IL-6 i povećanim rizikom za razvoj plućne arterijske hipertenzije (PAH) (Fang i saradnici, J Am Soc Hypertens., 2017, 11(3), 171-177). Potvrda uloge IL-6 u PAH predstavlja i činjenica da inhibicija IL-6 receptorskog lanca gp130 ublažava bolest u modelu PAH kod pacova (Huang i saradnici, Can J Cardiol, 2016, 32(11), 1356.e1-1356.e10).

[0124] Jedinjenje 1, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, mogu takođe biti korisni za lečenje nealergijskih bolesti pluća kao što su sarkoidoza i limfangiolejomiomatoza. Pokazano je da su citokini kao što su IFNγ, IL-12 i IL-6, uključeni u niz nealergijskih bolesti pluća kao što su sarkoidoza i limfangiolejomiomatoza (El-Hashemite i saradnici, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 2005, 33, 227-230, i El-Hashemite i saradnici, Cancer Res., 2004, 64, 3436-3443).

[0125] Jedinjenje 1, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, mogu takođe biti korisni za lečenje bronhiektazije i infiltrativnih plućnih bolesti koje su bolesti povezane sa hroničnom neutrofilnom inflamacijom. Određeni citokini su povezani sa neutrofilnom inflamacijom (npr. IL-6, IFNγ).

[0126] Patološka aktivacija T-ćelija je ključna u etiologiji višestrukih respiratornih bolesti. Autoreaktivne T-ćelije imaju ulogu u bronhiolitisu obliterans sa upalom pluća u organizaciji (koja se označava i kao COS). Slično kao kod COS, etiologija odbacivanja transplantata pluća je povezana sa aberantnom T-ćelijskom aktivacijom T-ćelija primaoca od strane transplantiranih pluća donora. Odbacivanje transplantata pluća se može javiti rano kao primarna disfunkcija transplantata (PGD), upala pluća u organizaciji (OP), akutno odbacivanje (AR) ili limfocitni bronhiolitis (LB), ili se može javiti godinama nakon transplantacije pluća kao hronična disfunkcija alografta pluća (CLAD). CLAD je ranije bio poznat kao bronhiolitis obliterans (BO), ali se sada smatra sindromom koji može imati različite patološke manifestacije uključujući BO, restriktivni CLAD (rCLAD ili RAS) i neutrofilnu disfunkciju alografta. Hronična disfunkcija alografta pluća (CLAD) je glavni izazov u dugoročnoj kontroli stanja kod primaoca presađenih pluća, pošto prouzrokuje da transplantirana pluća progresivno gube funkcionalnost (Gauthier i saradnici, Curr Transplant Rep, 2016, 3(3), 185-191). CLAD slabo reaguje na lečenje i stoga ostaje potreba za efektivnim jedinjenjima koja su sposobna da spreče ili izleče ovo stanje. Nekoliko JAK-zavisnih citokina, kao što su IFNγ i IL-5, pozitivno su regulisani u CLAD i odbacivanju transplantata pluća (Berastegui i saradnici, Clin Transplant.2017, 31, e12898). Štaviše, visoki nivoi hemokina CXCR3 u plućima, kao što su CXCL9 i CXCL10 koji su nishodno od JAK-zavisne IFN signalizacije, povezani su sa lošijim ishodima kod pacijenata sa transplantatom pluća (Shino i saradnici, PLOS One, 2017, 12 (7), e0180281). Pokazano je i da je inhibicija JAK efektivna u odbacivanju transplantata bubrega (Vicenti i saradnici, American Journal of Transplantation, 2012, 12, 2446-56). Prema tome, Jedinjenje 1 može biti sa potencijalom da bude efektivno u lečenju ili prevenciji odbacivanja transplantata pluća i CLAD. Slični događaji aktivacije T-ćelija koji su opisani kao osnova za odbacivanje transplantata pluća, takođe se smatraju glavnim pokretačem bolesti “kalem-protiv-domaćina” (GVHD) za pluća, koja se može javiti i nakon transplantacije hematopoetskih matičnih ćelija. Slično CLAD-u, GVHD pluća je hronično progresivno stanje sa izuzetno slabim ishodima i trenutno nije odobren nijedan tretman za ovo oboljenje. Retrospektivna, multicentrična studija praćenja 95 pacijenata sa akutnim ili hroničnim GVHD otpornim na steroide, a koji su primali sistemski JAK inhibitor ruksolitinib kao spasonosnu terapiju, pokazala je potpun ili delimičan odgovor na ruksolitinib kod većine pacijenata, uključujući one sa GVHD pluća (Zeiser i saradnici, Leukemia, 2015, 29, 10, 2062-68). U skorije vreme, pneumonitis izazvan inhibitorom imunskih kontrolnih tačaka, drugi tip bolesti pluća koji je posredovan T-ćelijama, pojavio se kao posledica povećane upotrebe inhibitora imunskih kontrolnih tačka. Kod pacijenata sa kancerom koji su lečeni sa ovim sredstvima za stimulaciju T-ćelija, može se naime razviti fatalni pneumonitis. Jedinjenje 1, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, sa potencijalom je da predstavlja novi tretman za ove ozbiljne respiratorne bolesti kojima se nedovoljno posvećuje pažnja.

Gastrointestinalne bolesti

[0127] Kao inhibitor JAK, Jedinjenje 1, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, mogu takođe biti korisni za raznovrsne drugih bolesti. Jedinjenje 1, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, mogu biti korisni za raznovrsne gastrointestinalne inflamatorne indikacije koje uključuju, ali nisu ograničene na, inflamatornu bolest creva, ulcerozni kolitis (proktosigmoiditis, pankolitis, ulcerozni proktitis i levostrani kolitis), Kronovu bolest, kolagenski kolitis, limfocitni kolitis, Behčetovu bolest, celijakiju, kolitis izazvan inhibitorima imunskih kontrolnih tačaka, ileitis, eozinofilni ezofagitis, kolitis povezan sa bolešću “kalem-protiv-domaćina” i infektivni kolitis. Ulcerativni kolitis (Reimund i saradnici, J Clin Immunology, 1996, 16, 144-150), Kronova bolest (Woywodt i saradnici, Eur J Gastroenterology Hepatology, 1999, 11, 267-276), kolagenski kolitis (Kumawat i saradnici, Mol Immunology, 2013, 55, 355-364), limfocitni kolitis (Kumawat i saradnici, 2013), eozinofilni ezofagitis (Weinbrand-Goichberg i saradnici, Immunol Res, 2013, 56, 249-260), kolitis povezan sa bolešću “kalem-protiv-domaćina” (Coghill i saradnici, Blood, 2001, 117, 3268-3276), infektivni kolitis (Stallmach i saradnici, Int J Colorectal Dis, 2004, 19, 308-315), Behčetova bolest (Zhou i saradnici, Autoimmun Rev, 2012, 11, 699-704), celijakija (de Nitto i saradnici, World J Gastroenterol, 2009, 15, 4609-4614), kolitis izazvan inhibitorima imunskih kontrolnih tačaka (npr. kolitis izazvan CTLA-4 inhibitorom; (Yano i saradnici, J Translation Med, 2014, 12, 191), kolitis izazvan PD-1- ili PD-L1-inhibitorom) i ileitis (Yamamoto i saradnici, Dig Liver Dis, 2008, 40, 253-259) karakterišu se povišenjem nivoa određenih proinflamatornih citokina. Kako mnogi proinflamatorni citokini prenose signal putem aktivacije JAK, Jedinjenje 1 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so mogu biti u stanju da ublaže inflamaciju i da obezbede olakšanje simptoma. Preciznije, Jedinjenje 1 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so mogu biti korisni za indukciju i održavanje remisije ulceroznog kolitisa, kao i za lečenje Kronove bolesti, kolitisa izazvanog inhibitorima imunskih kontrolnih tačaka i gastrointestinalnih štetnih efekata kod bolesti “kalem-protiv-domaćina”. Prema jednom aspektu, pronalazak stoga obezbeđuje 1-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroksifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-on, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, za upotrebu u postupku lečenja gastrointestinalne inflamatorne bolesti kod sisara (npr. čoveka), pri čemu postupak obuhvata primenu sisaru, Jedinjenja 1, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, ili farmaceutske kompozicije koja sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač i Jedinjenje 1, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

Ostale bolesti

[0128] Jedinjenje 1, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, mogu takođe biti korisni za lečenje drugih bolesti kao što su druge inflamatorne bolesti, autoimune bolesti ili kanceri.

[0129] Jedinjenje 1, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, mogu biti korisni za lečenje jednog ili više od artritisa, reumatoidnog artritisa, juvenilnog reumatoidnog artritisa, odbacivanja transplantata, kseroftalmije, psorijaznog artritisa, dijabetesa, dijabetesa zavisnog od insulina, bolesti motornih neurona, mijelodisplastičnog sindroma, bola, sarkopenije, kaheksije, septičkog šoka, sistemskog eritematoznog lupusa, leukemije, hronične limfocitne leukemije, hronične mijelocitne leukemije, akutne limfoblasne leukemije, akutne mijelogene leukemije, ankilozirajućeg spondilitisa, mijelofibroze, B-ćelijskog limfoma, hepatocelularnog karcinoma, Hočkinove bolesti, kancera dojke, multiplog mijeloma, melanoma, ne-Hočkinovog limfoma, nesitnoćelijskog kancera pluća, karcinoma svetlih ćelija jajnika, tumora jajnika, tumora pankreasa, policitemije vera, Sjoegren-ovog sindroma, sarkoma mekog tkiva, sarkoma, splenomegalije, T-ćelijskog limfoma i talasemije major.

Kombinovana terapija

[0130] Jedinjenja pronalaska, ili njihova farmaceutski prihvatljiva so, mogu biti upotrebljeni za lečenje bolesti u kombinaciji sa jednim ili sa više sredstava koja deluju istim mehanizmom ili različitim mehanizmima. Različita sredstva mogu biti primenjivana uzastopno ili istovremeno, u odvojenim kompozicijama ili u istoj kompoziciji. Grupu korisnih klasa sredstava za kombinovanu terapiju čine, ali bez ograničenja, antiangiogena, steroidna, anti-inflamatorna sredstva, inhibitor kalikreina u plazmi, inhibitor liganda faktora rasta placente, inhibitor VEGF-A liganda, inhibitor angiopoetinskog liganda-2, inhibitor proteinske tirozin fosfataze beta, stimulator Tek tirozin kinaznog receptora, inhibitor kalcineurina, inhibitor VEGF liganda, inhibitor mTOR kompleksa 1, mTOR inhibitor, antagonista IL-17, modulator kalmodulina, antagonista FGF receptora, antagonista PDGF receptora, antagonista VEGF receptora, inhibitor TNF alfa liganda, vezujuće sredstvo za TNF, stimulator proteoglikana 4, inhibitor VEGF-C liganda, inhibitor VEGF-D liganda, antagonista CD126, inhibitor kaskade komplementa, agonista glukokortikoida, inhibitor C5 faktora komplementa, antagonista kanabinoidnog receptora, modulator sfingozin-1-fosfatnog receptora-1, modulator sfingozin-1-fosfatnog receptora-3, modulator sfingozin-1-fosfatnog receptora-4, modulator sfingozin-1-fosfatnog receptora-5, inhibitor acetaldehidne dehidrogenaze, inhibitor Flt3 tirozin kinaze, inhibitor Kit tirozin kinaze, inhibitor protein kinaze C, ligand adrenokortikotrofičnog hormona, inhibitor liganda faktora 1 poreklom iz stromalnih ćelija, agonista imunoglobulina G1; inhibitor liganda interleukina-1 beta, stimulator mucina; modulator nuklearnog faktora kapa B, stimulator citotoksičnog T-limfocitnog proteina-4, inhibitor CD28 glikoproteina sa površine T-ćelija, stimulator lipoprotein lipaze; agonista PPAR alfa, agonista adenozinskog A3 receptora, antagonista receptora angiotenzina II, antagonista VEGF receptora, ligand interferona beta, modulator SMAD-2; inhibitor liganda TGF beta 1, agonista somatostatinskog receptora, inhibitor alfa subjedinice IL-2 receptora, inhibitor VEGF-B liganda, timozin beta 4 ligand, antagonista angiotenzin II AT-1 receptora, antagonista CCR2 hemokina, inhibitor membranske bakar aminske oksidaze, antagonista CD11a, inhibitor ICAM-1, antagonista faktora rasta slučnog insulinu tipa 1, inhibitor kalikreina, stimulator fukoziltransferaze 6, modulator GDP fukoza sintetaze, inhibitor GHR gena, inhibitor IGF1 gena, antagonista VEGF-1 receptora, agonista albumina, antagonista IL-2, antagonista CSF-1; antagonista PDGF receptora, antagonista VEGF-2 receptora, mTOR inhibitor, agonista PPAR alfa, inhibitor Rho GTPaze, inhibitor protein kinaze povezane sa Rho, inhibitor komplementa C3, inhibitor EGR-1 faktora transkripcije, modulator faktora povezanog sa nuklearnim eritroidom 2, inhibitor nuklearnog faktora kapa B, antagonista integrina alfa-V/beta-3, agonista eritropoetinskog receptora, agonista peptida 1 sličnog glukagonu, stimulator TNFRSF1A gena, inhibitor angiopoetinskog liganda-2, inhibitor alfa-2 antiplazmina, antagonista kolagena, inhibitor fibronektina, antagonista laminina, stimulator plazmina, ligand faktora rasta nerava, antagonista FGF1 receptora, antagonista FGF3 receptora, inhibitor itk tirozin kinaze, inhibitor Lck tirozin kinaze, inhibitor Ltk tirozin kinaznog receptora, antagonista PDGF receptora alfa, antagonista PDGF receptora beta, inhibitor proteinske tirozin kinaze, antagonista VEGF-3 receptora, inhibitor membranske bakar aminske oksidaze, agonista somatostatinskog receptora 2, agonista somatostatinskog receptora 4, agonista somatostatinskog receptora 5, inhibitor protein kinaze C alfa, inhibitor protein kinaze C beta, inhibitor protein kinaze C delta inhibitor protein kinaze C epsilon inhibitor protein kinaze C eta, inhibitor protein kinaze C teta, modulator ankirina, stimulator mucina, agonista P2Y2 purinoceptora, inhibitor alfa-1 proteina gap veze, antagonista CCR3 hemokina; inhibitor eotaksinskog liganda, inhibitor natrijumovog kanala osetljivog na amilorid, antagonista PDGF receptora, inhibitor proteinske tirozin kinaze, inhibitor proteina pigmentnog epitela retine, inhibitor matriksne metaloproteaze, antagonista PDGF receptora, antagonista PDGF receptora beta, inhibitor PDGF-B liganda, antagonista receptora za hormon rasta, inhibitor molekula ćelijske adhezije, mogulator integrina, antagonista hemokina CXCR4, inhibitor proteina koji sadrži uvijene spirale, modulator Hsp 90, inhibitor proteinske kinaze povezane sa Rho, inhibitor VEGF gena, inhibitor endoglina, antagonista hemokina CCR3, modulator maksi K kalijumovog kanala, stimulator maksi K kalijumovog kanala, agonista PGF2 alfa, agonista prostanoidnog receptora, modulator voltažno-zavisnog hloridnog kanala 2, antagonista receptora C5a komplementa, inhibitor inozin monofosfatne dehidrogenaze, inhibitor liganda interleukina 18, stimulator TRP kationskog kanala M8, agonista CNTF receptora, inhibitor TRPV1 gena, stimulator dezoksiribonukleaze I, inhibitor IRS1 gena, inhibitor protein kinaze povezane sa Rho, inhibitor poli ADP ribozne polimeraze 1, inhibitor poli ADP ribozne polimeraze 2, inhibitor poli ADP ribozne polimeraze 3, agonista vaniloid VR1, stimulator NFAT5 gena, stimulator mucina, inhibitor Syk tirozin kinaze, agonista alfa 2 adrenoceptora, inhibitor ciklooksigenaze, inhibitor depozicije amiloidnog proteina, inhibitor glikogen sintazne kinaze-3, stimulator PARP, inhibitor depozicije tau, inhibitor DDIT4 gena, modulator sinteze hemoglobina, inhibitor liganda interleukina-1 beta, TNF antagonista, stimulator KCNQ voltažno-zavisnog kanala za kalijum, antagonista NMDA receptora, inhibitor ciklooksigenaze 1, inhibitor ciklooksigenaze, agonista 5-HT1a receptora, inhibitor kalcijumskih kanala, modulator liganda FGF-2, inhibitor fosfoinozitid 3-kinaze, antagonista CD44, modulator hijaluronidaze, agonista hijaluronske kiseline, antagonista IL-1, antagonista IL-1 receptora tipa I, inhibitor P faktora komplementa, antagonista tubulina, antagonista beta amiloida, stimulator IL2 gena, inhibitor I-kapa B kinaze beta, modulator nuklearnog faktora kapa B, inhibitor aktivatora plazminogena 1, FGF-2 ligand, modulator proteaze i modulator kortikotropina.

[0131] Specifična sredstva koja mogu biti upotrebljena u kombinaciji sa predmetnim JAK inhibitornim jedinjenjem uključuju, ali nisu ograničeni na, lanadelumab, aflibercept, RG-7716, AKB-9778, ciklosporin, bevacizumab, everolimus, sekukinumab, fluocinolon acetonid, RP-101, skvalamin laktat, rekombinantni humani lubricin, OPT-302, sarilumab, deksametazon, ekulizumab, fingolimod, adalimumab, reproksalap, midostaurin, kortikotropin, olaptezed pegol, kanakinumab, rekoflavon, abatacept, fenofibrat, piklidenozon, OpRegen, kandesartan, golimumab, pegaptanib, interferonbeta, dizitertid, oktreotid acetat, anekortav, baziliksimab, suprahoroidni triamcinolon acetonid, RGN-259, difluprednat, HL-036, avacincaptad pegol natrijum, irbesartan, propagermanijum, triamcinolon acetonid, azitromicin, BI-1467335, lifitegrast, loteprednol etabonat, teprotumumab, KVD-001, TZ-101, atezidorsen, Nov-03, bevacizumab, AVA-101, RU-101, voklosporin, vorolanib, sirolimus, holin fenofibrat, VX-210, APL-2, CPC-551, elamipretid, SF-0166, cibinetid, elamipretid, liraglutid, EYS-606, nesvakumab, aflibercept, okriplazmin, filgotinib, cenegermin, adipocel, brolucizumab, ranibizumab, aflibercept, padeliporfinsku fotodinamičku terapiju, pazopanib, ASP-8232, veldoreotid, sotrastaurin, abicipar pegol, dikvafozol tetranatrijum, HCB-1019, konbercept, bertilimumab, SHP-659, THR-317, ALK-001, PAN-90806, interferon alfa-2b, fluocinolon, sunitinib malat, emiksustat, hl-con1, TB-403, minociklin, MA09-hRPE ćelije, pegpleranib natrijum, pegvizomant, luminat, buriksafor, H-1129, karotuksimab, AXP-1275, ranibizumab, izopropil unoproston, tezidolumab, enterično obložen mikofenolat natrijum, tadekinig alfa, triamcinolon acetonid, ciklosporin, ST-266, AVX-012, NT-501-ECT, tivaniziran, verteporfin, dornazu alfa, aganirsen, ripazudil, rukaparib fosfat, zukapsaicin, tetratiomolibdat, diklofenak, LHA-510, AGN-195263, takrolimus, rebamipid, R-348, brimonidin tartrat, vizomitin, T-89, LME-636, BI-1026706, rimeksolon, tobramicin, TOP-1630, talaporfin, bromfenak natrijum, triamcinolon acetonid, davunetid, loteprednol etabonat, XED-60, EG-Mirotin, APD-209, adenovir, PF-04523655, hidroksikarbamid, navamepent, retinalamin, CNTO-2476, ranibizumab, flupirtin, B27PD, S-646240, GLY-230, hidralazin, nepafenak, DexNP, Trehalozu, hijaluronsku kiselinu, deksametazon-Ca depo sa produženim oslobađanjem, naluzotan, hijaluronidazu, natrijum hijaluronat, izunakinru, somatostatin, CLG-561, OC-10X, UCA-002, rekombinantni humani epidermalni faktor rasta, pemirolast, VM-100, MB-11316, mononatrijum alfa luminol, ranibizumab, IMD-1041, LMG-324, HE-10, cinhijaluronat natrijum, BDM-E, mezenhimske prekursorske ćelije, disulfiram, CTC-96, PG-101, Beifušu, himotripsin.

[0132] Ovde je takođe obezbeđena farmaceutska kompozicija koja sadrži Jedinjenje 1, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i jedno ili više drugih terapijskih sredstava. Terapijsko sredstvo može biti izabrano iz klase sredstava koje su precizno navedena prethodno i iz liste specifičnih sredstava koja je prethodno opisana. U pojedinim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija je pogodna za isporuku u oko. U pojedinim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija je tečna ili kompozicija u vidu suspenzije.

[0133] Dodatno, prema aspektu postupaka, pronalazak obezbeđuje Jedinjenje I, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i jedno ili više drugih terapijskih sredstava, za upotrebu u postupku lečenja bolesti ili poremećaja kod sisara koji se sastoji od primene Jedinjenja 1, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, i jednog ili više drugih terapijskih agenasa sisaru.

[0134] Kada se upotrebljavaju u kombinovanoj terapiji, sredstva mogu biti formulisana u jednoj farmaceutskoj kompoziciji, ili sredstva mogu biti obezbeđena u odvojenim kompozicijama koje se primenjuju istovremeno ili u različitim vremenima, istim ili različitim putevima primene. Takve kompozicije mogu biti upakovane odvojeno ili mogu biti upakovane zajedno kao komplet. Dva ili više terapijskih sredstava u kompletu može biti primenjivano istim putem primene ili različitim putevima primene.

PRIMERI

[0135] Primeri sinteze i bioloških efekata koji slede, ponuđeni su da bi ilustrovali pronalazak i ne treba ih tumačiti ograničavajućim za obim pronalaska na bilo koji način. U primerima koji su navedeni ispod, sledeće skraćenice imaju značenja koja slede, osim ukoliko nije drugačije naznačeno. Skraćenice koje nisu definisane u nastavku teksta, sa svojim su opšte prihvaćenim značenjima.

ACN = acetonitrilDCC

DCC = dicikloheksilkarbodiimid

DIPEA = N,N-diizopropiletilamin

DMAc = dimetilacetamid

DMF = N,N-dimetilformamid

DMSO = dimetil sulfoksid

EtOAc = etil acetat

HATU = N,N,N′,N′-tetrametil-0-(7-azabenzotriazol-1-il)uronijum heksafluorofosfat LDA = litijum diizopropilamid

min = minut(i)

MTBE = metil terc-butil etar

NBS = N-bromosukcinitnid

NMP = N-metil-2-pirolidon

ST = sobna temperatura

THF = tetrahidrofuran

bis(pinakolato)diboron = 4,4,5,5,4',4',5',5'-oktametil-[2,2']bi[[1,3,2]dioksaborolanil] Pd(dppf)Cl2-CH2C]2= dihloro(1,1'-bis(difenilfosfino)-ferocen)-dipaladijum(II) kompleks sa dihlorometanom

[0136] Reagensi i rastvarači su nabavlјeni od komercijalnih dobavlјača (Aldrich, Fluka, Sigma itd.) i korišćeni su bez dalјeg prečišćavanja. Progresija reakcionih smeša je praćena tankoslojnom hromatografijom (TLC), analitičkom tečnom hromatografijom visokih performansi (anal. HPLC) i masenom spektrometrijom. Reakcione smeše su obrađivane kao što je precizno opisano u svakoj reakciji; obično su prečišćavane ekstrakcijom i drugim postupcima prečišćavanja, poput kristalizacije zavisne od temperature i rastvarača, kao i taloženja. Dodatno, reakcione smeše su rutinski prečišćavane hromatografijom na koloni ili preparativnim HPLC postupkom, obično upotrebom napakovanih C18 ili BDS kolona i konvencionalnih eluenata. Uobičajeni uslovi preparativnog HPLC postupka su opisani u nastavku teksta.

[0137] Karakterizacija reakcionih proizvoda je rutinski vršena masenom i<1>H-NMR spektrometrijom. Za NMR analizu, uzorci su rastvarani u deuterizovanom rastvaraču (kao što su CD3OD, CDCl3ili d6-DMSO), a<1>H-NMR spektri su snimani upotrebom instrumenta Varian Gemini 2000 (400 MHz), pod standardnim uslovima analize. Identifikacija jedinjenja masenom spektrometrijom je vršena postupkom jonizujućeg elektro-raspršivanja (ESMS) upotrebom API 150 EX instrumenta kompanije Applied Biosystems (Foster City, CA) ili 3100 instrumenta kompanije Waters (Milford, MA), koji su bili kuplovani sa sistemima za samoprečišćavanje.

Uslovi preparativnog HPLC postupka

[0138]

Kolona: C18, 5 µm; 21,2 x 150 mm ili C18, 5 µm 21 x 250 ili C14, 5 µm 21x150 mm

Temperatura kolone: Sobna temperatura

Brzina protoka: 20,0 mL/min

Mobilne faze: A = voda 0,05% TFA

B = ACN 0,05% TFA,

Zapremina injeciranja: (100-1500 µL)

Talasna dužina detektora: 214 nm

[0139] Sirova jedinjenja su rastvarana u smeši vode i sirćetne kiseline odnosa 1:1, do oko 50 mg/mL. Urađeno je i ispitivanje analitičke skale u trajanju od 4 minuta, upotrebom C18 kolone od 2,1 x 50 mm, nakon čega je sledio preparativni ciklus od 15 ili 20 minuta, upotrebom zapremine injeciranja od 100 µL, sa gradijentom zasnovanom na retenciji % B koji je dobijen probnom analizom analitičke skale. Tačni gradijenti su zavisili od tipa uzoraka. Uzorci sa nečistoćama bliskim analiziranim supstancama su proveravani upotrebom 21 x 250 mm C18 kolone i/ili 21 x 150 mm C14 kolone, radi najboljeg razdvajanja. Frakcije koje su sadržavale željeni proizvod su identifikovane masenom spektrometrijskom analizom.

Priprema 1: 2-(4-(Benziloksi)-2-etil-5-fluorofenil)-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan (1-5)

[0140]

(a) 2-(Benziloksi)-4-bromo-1-fluorobenzen (1-2)

[0141] Dve reakcije su izvedene paralelno i potom su smeše spojene radi daljeg obrade. Smeša 5-bromo-2-fluorofenola (1-1) (850 g; 4,5 mol), benzil bromida (837 g; 4,9 mol) i kalijum karbonata (923 g; 6,7 mol) u ACN-u (5 L) mešana je na 20 °C tokom 12 h. Reakcione smeše su zatim spojene i koncentrovane, pa razblažene vodom (8 L) i ekstrahovane sa EtOAc (3 × 3 L). Organski sloj je zatim izdvojen, ispran slanim rastvorom (3 L), osušen upotrebom natrijum sulfata i koncentrovan. Sirovi proizvod je prečišćen kroz sloj silika gela (elucija sa 3:1 petrolej etrom:EtOAc) da bi se dobio međuproizvod iz naslova (1,83 kg; prinos 73%) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,38-7,46 (m, 5H), 7,15 (dd, J = 7,6; 2,0 Hz, 1H), 6,98-7,15 (m, 1H), 5,12 (s, 2H).

(b) 2-(Benziloksi)-4-etil-1-fluorobenzen (1-3)

[0142] Šest reakcija je je izvedeno paralelno i potom su smeše spojene radi dalje obrade. U rastvor proizvoda iz prethodnog koraka (200 g; 711 mmol), u THF-u (100 mL), dodat je kalijum karbonat (197 g; 1,4 mol). Reakciona smeša je zatim produvavana azotom 3 puta, nakon čega je sledilo dodavanje Pd(dppf)Cl2-CH2Cl2(11,6 g; 14,2 mmol). Reakciona smeša je dalje ohlađena na 0 °C, u kapima je dodat dietilcink (1 M, 107 L) i reakciona smeša je mešana na 70 °C tokom 1 h. Reakcione smeše su spojene, ohlađene na 20 °C i polako presute u vodu (7 L). U smešu je zatim dodat vodeni rastvor 4 M HCl do pH 6. Organski sloj je zatim izdvojen, a vodena faza je ekstrahovana sa EtOAc (3 × 2 L). Organski slojevi su spojeni, isprani slanim rastvorom (5 L), osušeni upotrebom natrijum sulfata, koncentrovani i prečišćeni kroz sloj silika gela (elucija sa 50:1 petrolej etra:EtOAc)) da bi se dobio međuproizvod iz naslova (900 g; prinos 92%) kao svetlo žuto ulje.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,29-7,43 (m, 5H), 6,94-6,97 (m, 1H), 6,82 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,70 (m, 1H), 5,09 (s, 2H), 2,52-2,58 (m, 2H), 117 (t, J = 7,6 Hz, 3H).

(c) 1-(Benziloksi)-4-bromo-5-etil-2-fluorobenzen (1-4)

[0143] Četiri reakcije su izvedene paralelno i potom su smeše spojene. U rastvor 2-(benziloksi)-4-etil-1-fluorobenzena (1-3) (293 g; 1,3 mol) u ACN-u (1 L), u porcijama je na 20 °C dodat NBS (249 g; 1,4 mol). Reakciona smeša je zatim mešana na 20 °C tokom 2 h. Reakcione smeše su spojene i koncentrovane. Ostatak je razblažen vodom (5 L) i ekstrahovan sa EtOAc (2 × 5 L). Organska faza je isprana slanim rastvorom (4 L), osušena upotrebom anhidrovanog natrijum sulfata, profiltrirana i koncentrovana in vacuo. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na silika gelu (elucija sa petrolej etrom:EtOAc 100:1-10:1) da bi se dobio međuproizvod iz naslova (1,4 kg; prinos 89%) kao svetlo žuto ulje.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,29-7,38 (m, 5H), 7,2 (d, J = 10,4 Hz, 1H), 6,8 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 5,06 (s, 2H), 2,6 (q, J = 7,6 Hz, 2 H), 1,1 (t, J = 7,6 Hz, 3H).

(d) 2-(4-(Benziloksi)-2-etil-5-fluorofenil)-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan (1-5)

[0144] Sedam reakcija je izvedeno paralelno i potom su smeše spojene radi dalje obrade. U rastvor proizvoda iz prethodnog koraka (200 g; 647 mmol), u dioksanu (2 L), pod azotom su dodati kalijum acetat (190 g; 1,9 mol), bis(pinakolato)diboron (181 g; 712 mmol) i Pd(dppf)C]2-CH2Cl2(10,6 g; 12,9 mmol), na 20 °C. Smeša je zatim mešana na 120 °C tokom 2 h. Reakcione smeše su dalje spojene, koncentrovane, razblažene vodom (5 L) i ekstrahovane sa EtOAc (3 × 4 L). Spojena organska faza je osušena sa anhidrovanim natrijum sulfatom, profiltrirana i koncentrovana in vacuo. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na silika gelu (elucija sa petrolej etrom:EtOAc 1:0 - 5:1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (1,35 kg; prinos 84%) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,33-7,51 (m, 6H), 6,82 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 5,17 (s, 2H), 2,85 (q, J = 7,6 Hz, 2H), 1,33 (s, 12H), 1,15 (t, J = 7,6 Hz, 3H).

Priprema 2: 1-Benzil-4-imino-1,4-dihidropiridin-3-amin (2)

[0145]

[0146] U rastvor piridin-3,4-diamina (400 g; 3,67 mol) u ACN-u (3 L), u porcijama je na 0 °C dodat benzil bromid (596 g; 3,49 mol), nakon čega je reakciona smeša mešana tokom 30 min, a zatim i na 20 °C tokom 12 h, i profiltrirana. Filterski kolač je ispran sa ACN (500 mL) i osušen da bi se dobila HBr so jedinjenja iz naslova (600 g; 2,14 mol; prinos 58%) kao beli prah.<1>H NMR (400 MHz, MeOD) δ 7,83 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 7,64 (s, 1H), 7,32-7,40 (m, 5H), 6,76 (d, J = 6,8 Hz, 1H), 5,28 (s, 2H).

Priprema 3: 6-(4-(Benziloksi)-2-etil-5-fluorofenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-karbaldehid (3)

[0147]

(a) 1-(4-Bromo-2,6-difluorofenil)-2,2-dietoksietan-1-on (3-1)

[0148] Devet reakcija je izvedeno paralelno i potom su smeše spojene radi dalje obrade. Rastvor 1-bromo-3,5-difluorobenzena (100 g; 518 mmol), u THF-u (700 mL), najpre je degasiran i produvavan azotom tri puta. Zatim je dodat 2 M LDA (311 mL) na -70 °C i reakciona smeša je mešana na -70 °C tokom 0,5 h pod azotom. U kapima je dalje dodat rastvor etil 2,2-dietoksiacetata (96 g; 544 mmol) u THF-u (200 mL), na -70 °C pod azotom, i reakciona smeša je mešana tokom 1 h. Smeše su zatim spojene i u porcijama presute u ledeno hladan zasićeni amonijum hlorid (10 L), nakon čega su ekstrahovane sa EtOAc (3 × 3 L). Organski sloj je izdvojen, ispran slanim rastvorom (5 L), osušen upotrebom natrijum sulfata, koncentrovan i prečišćen hromatografijom na silika gelu (elucija sa petrolej etrom EtOAc 1:0 - 100:1) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (1,26 kg; prinos 84%) kao žuto ulje.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,12 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 5,15 (s, 1H), 3,61-3,7 (m, 4H), 1,2 (t, J = 7,2 Hz, 6H).

(b) 1-(4'-(Benziloksi)-2'-etil-3,5,5'-trifluoro-[1,1'-bifenil]-4-il)-2,2-dietoksietan-1-on (3-2)

[0149] Pet reakcija je izvedeno paralelno i potom su smeše spojene radi dalje obrade. U smešu 1-(4-bromo-2,6-difluorofenil)-2,2-dietoksietan-1-ona (3-1) (189 g; 586 mmol), u etanolu (150 mL) i toluenu (1,5 L), dodati su voda (150 mL), natrijum karbonat (84,8 g; 800 mmol) i 2-(4-(benziloksi)-2-etil-5-fluorofenil)-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan (1-5) (190 g; 533 mmol), na 20 °C. Suspenzija je zatim degasirana pod vakuumom i produvavana azotom nekoliko puta. Dalje je dodat Pd(dppf)Cl2-CH2Cl2(13 g; 16 mmol) i reakciona smeša je produvavana azotom nekoliko puta, nakon čega je mešana na 120 °C tokom 2 h. Reakcione smeše su zatim spojene, ohlađene do 20 °C, presute u vodu (5 L) i ekstrahovane sa EtOAc (3 × 4 L). Spojeni organski slojevi su isprani slanim rastvorom (5 L), osušeni upotrebom natrijum sulfata, profiltrirani, koncentrovani i prečišćeni hromatografijom na silika gelu (elucija sa petrolej etrom:EtOAc 100:1 - 5:1) da bi se dobio međuproizvod iz naslova (880 g; prinos 70%) kao žuto ulje.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,36-7,48 (m, 5H), 6,94-6,96 (m, 2H), 6,86-6,92 (m, 2H), 5,29 (s, 1H), 5,19 (s, 2H), 3,67-3,77 (m, 4H), 2,52 (q, J = 7,6 Hz, 2H), 1,25 (t, J = 6,8 Hz, 6H), 1,07 (t, J = 7,2 Hz, 3H).

(c) 6-(4-(Benziloksi)-2-etil-5-fluorofenil)-3-(dietoksimetil)-4-fluoro-1H-indazol (3-3)

[0150] Četiri reakcije su izvedene paralelno i potom su smeše spojene radi dalje obrade. U rastvor proizvoda iz prethodnog koraka (220 g; 466 mmol), u THF-u (2 L), na 20 °C je dodat hidrazin monohidrat (47,6 g; 931 mmol). Reakciona smeša je zatim mešana na 100 °C tokom 12 h. Četiri reakcione smeše su dalje spojene i ohlađene na 20 °C, pa koncentrovane. Ostatak je rastvoren u EtOAc (5 L) i ispran sa 0,1 M HCl (2 × 1,5 L). Spojeni organski slojevi su isprani slanim rastvorom (1,5 L), osušeni upotrebom natrijum sulfata, profiltrirani i koncentrovani, da bi se dobio međuproizvod iz naslova (900 g; sirov) kao žuta guma, koja je direktno upotrebljena u sledećem koraku.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,36-7,48 (m, 5H), 6,94-6,96 (m, 2H), 6,86-6,92 (m, 2H), 5,29 (s, 1H), 5,19 (s, 2H), 3,67-3,77 (m, 4H), 2,52 (q, J = 7,6 Hz, 2H), 1,25 (t, J = 6,8 Hz, 6H), 1,07 (t, J = 7,2 Hz, 3H).

(d) 6-(4-(Benziloksi)-2-etil-5-fluorofenil)-4-huoro-177-indazol-3-karbaldehid (3)

[0151] Tri reakcije su izvedene paralelno i potom su smeše spojene radi dalje obrade. U rastvor proizvoda iz prethodnog koraka (300 g; 643 mmol) u acetonu (1,5 L), u kapima je dodata 4 M HCl (16 mL) na 20 °C i reakciona smeša je mešana na 20 °C tokom 0,17 h. Reakcione smeše su zatim spojene, koncentrovane, razblažene sa MTBE (1 L) i profiltrirane. Filterski kolač je ispran sa MTBE (2 × 300 mL) i osušen pod sniženim pritiskom, da bi se dobio međuproizvod iz naslova (705 g; sirov) kao žuta čvrsta supstanca, koja je direktno upotrebljena u sledećem koraku. (m/z): [M+H]<+>izračunato za C23H18F2N2O2393,13; utvrđeno 393,1.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 14,51 (s, 1H), 10,17 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 7,50 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 7,40-7,42 (m, 4H), 7,24 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,15 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 7,06 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 5,25 (s, 2H), 2,52-2,53 (m, 2H), 1,03 (t, J = 7,6 Hz, 3H).

Priprema 4: 5-Benzil-2-(6-(4-(benziloksi)-2-etil-5-fluorofenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-5H-imidazo[4,5-c]piridin (4)

[0152]

[0153] Četiri reakcije su izvedene paralelno i potom su smeše spojene radi dalje obrade. U rastvor 6-(4-(benziloksi)-2-etil-5-fluorofenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-karbaldehida (3), proizvoda iz Pripreme 3 (172 g; 440 mmol) u DMF-u (1,1 L), dodati su natrijum bisulfit (68,6 g; 659 mmol) i 1-benzil-4-imino-1,4-dihidropiridin-3-amin (2) (136 g; 484 mmol), na 20 °C, i reakciona smeša je mešana na 150°C tokom 2 h. Četiri smeše su zatim spojene i dobijena reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je presut u vodu (10 L) i profiltriran. Filterski kolač je osušen pod sniženim pritiskom da bi se dobio međuproizvod iz naslova (990 g; sirov) kao žuta čvrsta supstanca, koja je dalje direktno upotrebljena bez prečišćavanja, (m/z): [M+H]<+>izračunato za C35H27F2N5O 572,2; utvrđeno 572,3.

Priprema 5: 5-Benzil-2-(6-(4-(benziloksi)-2-etil-5-fluorofenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-1H-imidazo[4,5-elpiridin (5)

[0154]

[0155] Tri reakcije su izvedene paralelno i potom su smeše spojene radi dalje obrade. U smešu 5-benzil-2-(6-(4-(benziloksi)-2-etil-5-fluorofenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-5H-imidazo[4,5-c]piridina (4), proizvoda iz Pripreme 4 (330 g; 577 mmol) u metanolu (1,5 L) i THF-u (1 L), u porcijama je dodat natrijum borohidrid (267 g; 6,9 mol), na 20 °C, i reakciona smeša je mešana na 20 °C tokom 24 h. Tri smeše su zatim spojene i dobijena reakciona smeša je dodata u vodu (10 L), mešana tokom 10 min i profiltrirana. Filtrat je ekstrahovan sa EtOAc (2 × 5 L), a spojena organska faza je osušena sa anhidrovanim natrijum sulfatom, profiltrirana i koncentrovana pod vakuumom. Sirovi proizvod je razblažen sa EtOAc (2 L), nakon čega je mešan tokom 30 min i profiltriran. Filterski kolač je ispran sa MTBE (3 × 200 mL) da bi se dobio međuproizvod iz naslova (275 g; prinos 28%) kao svetlo žuta čvrsta supstanca. (m/z): [M+H]<+>izračunato za C35H31F2N5O 576,25; utvrđeno 576,3.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,50-7,52 (m, 2H), 7,35-7,43 (m, 7H), 7,23-7,25 (m, 3H), 7,15 (d, J = 12,0 Hz, 1H), 6,81 (d, J = 12,0 Hz, 1H), 5,25 (s, 2H), 3,72 (s, 2H), 3,43 (br. s, 2H), 2,78 (br. s, 2H), 2,66 (br. s, 2H), 2,55 (q, 2H), 1,04 (t, J = 7,6 Hz, 3H).

Priprema 6: 5-Etil-2-fluoro-4-(4-fluoro-3-(4,5,6,7-tetrahidro-1)H-imidazo[4,5-c]piridin-2-i))-1H-indazol-6-il)fenol (6)

[0156]

[0157] Pet reakcija je izvedeno paralelno i potom su smeše spojene radi dalje obrade. U smešu 5-benzil-2-(6-(4-(benziloksi)-2-etil-5-fluorofenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-1H-imidazo[4,5-c]piridina (5), proizvoda iz Pripreme 5 (55 g; 95,5 mmol) u THF-u (500 mL) i metanolu (500 mL), dodati su paladijum na ugljeniku (15 g; 9,6 mmol) i vodeni rastvor 12 M HCl (10 mL). Suspenzija je zatim degasirana pod vakuumom, produvavana vodonikom nekoliko puta i mešana pod vodonikom (50 psi) na 50 °C tokom 12 h. Smeše su potom spojene i dobijena reakciona smeša je profiltrirana. Filtrat je koncentrovan pod vakuumom da bi se dobila HCl so međuproizvoda iz naslova (150 g; sirovo) kao beličasta čvrsta supstanca, (m/z): [M+H]<+>izračunato za C21H19F2N5O 396,16; utvrđeno 396,2.<1>H NMR (400 MHz, MeOD) δ 7,43 (s, 1H), 7,07 (d, J = 11,6 Hz, 1H), 6,97 (d, J = 11,6 Hz, 1H), 6,91 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 4,57 (s, 2H), 3,74 (s, 2H), 3,24 (s, 2H), 2,55 (q, J = 7,6 Hz, 2H), 1,08 (t, J = 7,6 Hz, 3H).

Priprema 7: 2,5-Dioksopinolidin-1-il 2-morfolinoacetat (7')

[0158]

(a) terc-Butil 2-morfolinoacetat (7-1)

[0159] U smešu morfolina (160 g; 1,84 mol) i kalijum karbonata (381 g; 2,76 mol) u THF-u (3 L), polako je na 0 °C dodat terc-butil 2-bromoacetat (341 g; 1,75 mol). Reakciona smeša je najpre mešana tokom 30 min, a zatim na 20 °C tokom 12 h, pa je koncentrovana. Dodata je dalje voda (1,5 L) i reakciona smeša je ekstrahovana sa EtOAc (3 × 1 L). Organski sloj je izdvojen, ispran slanim rastvorom (500 mL), osušen upotrebom natrijum sulfata i koncentrovan, da bi se dobio međuproizvod iz naslova (300 g; prinos 81%) kao žuto ulje.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3,74 (t, J = 4,8 Hz, 4H), 3,10 (s, 2H), 2,57 (t, J = 4,8 Hz, 4H), 1,46 (s, 9H).

(b) 2-Morfolinosirćetna kiselina (7")

[0160] Smeša proizvoda iz prethodnog koraka (7-1) (300 g; 1,49 mol), u 3 M HCl u dioksanu (2,0 L), mešana je na 20 °C tokom 12 h, nakon čega je koncentrovana da bi se dobila HCl so jedinjenja iz naslova (270 g; prinos 99%) kao bleda čvrsta supstanca, koja je direktno upotrebljena u sledećem koraku<1>H NMR (400 MHz, MeOD) δ 4,13 (s, 2H), 3,93 (br. s, 4H), 3,64 (br. s, 4H).

(c) 2,5-Dioksopirolidin-1-il 2-morfolinoacetat (7')

[0161] Smeša proizvoda iz prethodnog koraka (150 g; 826 mmol), 1-hidroksipirolidin-2,5-diona (95 g; 826 mmol), DCC (256 g; 1,24 mol) i DIPEA (160 g; 1,24 mol ), u DCM-u (2 L), mešana je na 15 °C tokom 12 h, pa je profiltrirana. Filtrat je koncentrovan i ispran sa EtOAc (800 mL). Čvrsta supstanca je prikupljena filtracijom, nakon čega je koncentrovana da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (150 g; prinos 75%) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 3,68 (s, 2H), 3,58 (t, J = 4,8 Hz, 4H), 2,82 (s, 4H), 2,57 (t, J = 5,2 Hz, 4H).

Primer 1: 1-(2-(6-(2-Etil-5-fluoro-4-hidroksifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-on (1)

[0162]

[0163] Smeša 5-etil-2-fluoro-4-(4-fluoro-3-(4,5,6,7-tetrahidro-1)H-imidazo[4,5-c]piridin-2-il)-1H-indazol-6-il)fenola (6) 2 HCl (100 g; 214 mmol), 2,5-dioksopirolidin-1-il 2-morfolinoacetata (7') (67,2 g; 278 mmol) i DIPEA (69 g; 534 mmol), u DMF-u (600 mL), mešana je na 15 °C tokom 12 h, pa je profiltrirana. Rastvor je zatim prečišćen reverzno-faznom hromatografijom (instrument FLEXATM FS-1L, Agela; 2 kg Agela C18 DAC kolona; 200 g uzorka rastvorenog u DMF-u (900 mL); brzina protoka 300 mL/min; rastvarač A voda, rastvarač B ACN; gradijent (% 13, vreme (min): 0/15, 0-40/45, 40/50), da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (50,0 g; prinos 44,8%) kao svetlo žuta čvrsta supstanca. (m/z):

[M+H]<+>izračunato za C27H28F2N6O3523,22; utvrđeno 523,0.<1>H NMR (400 MHz, MeOD) δ 7,22 (s, 1H), 6,80-6,96 (m, 3H), 4,68-4,78 (m, 2H), 3,96 (s, 2H), 3,65-3,95 (m, 4H), 3,35-3,38 (m, 2H), 2,77-2,92 (m, 2H), 2,52-2,56 (m, 6H), 1,06 (t, J = 7,6 Hz, 3H).

Primer 2: Kristalni 1-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroksifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1,4,6,7-tetralidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-on (1) Oblik 1

[0164] U laboratorijski balon od 250 mL su dodati 1-(2-(6-(2-etil-5-tluoro-4-hidroksifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-on (1), proizvod iz Primera 1 (5 g), i etanol (50 mL) i reakciona smeša je mešana na 50-80 °C tokom 10 min, nakon čega su na 50-80 °C polako dodati ACN (75 mL) i potom klice iz Primera 3. Reakciona smeša je zatim mešana na 20-25 °C tokom 18 h. Dobijena čvrsta supstanca je prikupljena filtracijom i sušena je na 50 °C pod vakuumom 18 h, da bi se obezbedilo jedinjenje iz naslova kao Oblik 1 (3,6 g; prinos 72%).

Primer 3: Kristalni 1-(2-(6-(2-etil-5-fhioro-4-hidroksifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-on (1) Oblik 1

[0165] Jedinjenje 1, proizvod iz Primera 1, (1 g) dodato je u etanol (10 mL) i rastvor je grejan do rastvaranja. Dodat je zatim acetonitril (10 mL) i reakciona smeša je mešana i grejana, pa mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 h, nakon čega je profiltrirana i sušena na 50 °C pod vakuumom tokom 18 h, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova, Oblik 1 (0,23 g).

Primer 4: 1-(2-(6-(2-Etil-5-fluoro-4-hidroksifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-on (1)

[0166]

[0167] N,N-diizopropiletilamin (0,298 mL; 1,707 mmol) je dodat u rastvor 5-etil-2-fluoro-4-(4-fluoro-3-(4,5,6,7-tetrahidro-1H-imidazo[4,5-c]piridin-2-il)-1H-indazol-6-il)fenola (135 mg; 0,341 mmol) (6), HATU (156 mg; 0,410 mmol) i 2-morfolinosirćetne kiseline (7") (54,5 mg; 0,376 mmol) u DMF-u (0,5 mL) i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 24 h. Dodat je zatim litijum hidroksid (49,1 mg; 2,049 mmol) i reakciona smeša je mešana na 65 °C tokom 1 h, nakon čega je koncentrovana in vacuo da bi se dobila bistra žuta tečnost. Sirova tečnost je dalje prečišćena preparativnim HPLC postupkom, da bi se dobila TFA so jedinjenja iz naslova (142 mg; 0,223 mmol; prinos 65,3 %) kao čvrsta supstanca bež boje.

Primer 5: Kristalni 1-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroksifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-on (1) Oblik 2

[0168] Jedinjenje 1 iz Primera 1 (2,5 g) je rastvoreno u DMSO-u (5 mL) na 60 °C. Jednom kada je dobijen homogeni rastvor, u rastvor je dodat MeOH (2,5 mL). Homogena smeša je zatim u kapima dodavana tokom 30 min u prethodno pomešani rastvor MeOH (12,75 mL) i H2O (11,25 mL) na 75 °C. Kada je smeša u potpunosti dodata, spojena smeša je ostavljena da se meša na 75 °C tokom 1 h, dok se nije obrazovala kristalna suspenzija. Dalje je u kapima dodavana H2O (36 mL), tokom 2 h na 75 °C. Nakon što je dodavanje H2O u potpunosti završeno, suspenzija je mešana na 75 °C tokom 1 h, nakon čega je polako hlađena do 20 °C tokom 6 h. Suspenzija je držana na 20 °C tokom dodatnih 10 h pre nego što je profiltrirana, pa je isprana sa 70% H2O/MeOH (10 mL) i sušena na 50 °C pod vakuumom tokom 18 h, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova, Oblik 2 (2,13 g).

Osobine čvrstih oblika pronalaska

[0169] Uzorci dva anhidrovana Oblika. Oblik 1 i Oblik 2 1-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroksifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-ona (1) iz Primera 2 i 5, tim redum, analizirani su rendgenskom difraktometrijom praha (PXRD), diferencijalnom skenirajućom kalorimetrijom ( DSC), termogravimetrijskom analizom (TGA), dinamičkom sorpcijom vlage (DMS) i snimanjem na polarizovanom svetlosnom mikroskopu. Oblik 2 je takođe analiziran rendgenskom difraktometrijom monokristala.

Primer 6: Rendgenska difraktometrija praha

[0170] Rendgenski difraktogrami praha na Slikama 1 i 6 su dobijeni upotrebom D8-Advance rendgenskog difraktometra kompanije Bruker, upotrebom Cu-Kα zračenja (λ = 1,54051Å), u uslovima izlaznog napona od 45 kV i sa strujom od 40 mA. Instrument je bio u režimu rada tipa Bragg-Brentano geometrije sa incidencom, divergencijom i prorezima rasejanja podešenim tako da se maksimalno intenzivira dejstvo na uzorak. Radi merenje, mala količina praha (5-25 mg) je nežno pritisnuta na držač uzorka, da bi se obrazovala glatka površina, i isti je izložen X-zracima. Uzorci su skenirani pri režimu 2θ-2θ od 2°do 35°, sa stepenom koraka 2θ od 0,02° i sa stopom skeniranja od 0,30° sekundi po koraku. Prikuplјanje podataka je kontrolisano kompjuterskim programom DiffracSuite kompanije Bruker, a analiza je urađena kompjuterskim programom Jade (verzija 7.5.1). Instrument je kalibrisan korundnim standardom, unutar ±0,02°od dvostrukog teta ugla. Utvrđene pozicije pikova u PXRD za dva-teta i d-razmaci su prikazani u Tabelama 1 i 2, tim redom, za kristalni Oblik 1 i kristalni Oblik 2.

Tabela 1: PXRD podaci za Kristalni Oblik I

Tabela 2: PXRD podaci za Kristalni Oblik 2

Primer 7: Termička analiza

[0171] Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija (DSC) je urađena upotrebom Model Q-100 modula kompanije TA Instruments sa regulatorom tipa Thermal Analyst. Podaci su prikuplјeni i analizirani upotrebom kompjuterskog programa Thermal Analysis kompanije TA Instruments. Uzorak svakog kristalnog oblika je precizno odmeren u aluminijsku posudu sa poklopcem. Nakon perioda dostizanja izotermske ravnoteže tokom 5 minuta na 5 °C, uzorak je grejan od 0 °C do 300 °C upotrebom linearnog regulatora zagrevanja za stopu od 10 °C/min.

[0172] Reprezentativni DSC termogram za Oblik 1 pronalaska oslobođen od kristalnih oblika, prikazan je na Slici 7. Zapis diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC), snimljen pri stopi zagrevanja od 10 °C u minuti, karakterisao je maksimum u endotermnom protoku toplote, identifikovan kao prelaz rastapanja, u opsegu između od oko 210 °C do oko 234 °C, ili u opsegu između od oko 215 °C do oko 229 °C, ili u opsegu između od oko 220 °C do oko 224 °C. Kristalni oblik je karakterisao i zapis diferencijalne skenirajuće kalorimetrije, snimljen pri stopi zagrevanja od 10 °C u minuti, koji je pokazivao maksimum u endotermnom protoku toplote sa pikom na oko 221,7 °C ili na 221,7±3 °C.

[0173] Reprezentativni DSC termogram za Oblik 2 pronalaska koji je oslobođen od kristalnih oblika, prikazan je na Slici 2. Zapis diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC), snimljen pri stopi zagrevanja od 10 °C u minuti, karakterisao je maksimum u endotermnom protoku toplote, identifikovan kao prelaz rastapanja, u opsegu od oko 268 °C do oko 277 °C, ili u opsegu između od oko 270 °C do oko 275 °C, ili u opsegu između od oko 271 °C do oko 274 °C. Kristalni oblik je karakterisao i zapis diferencijalne skenirajuće kalorimetrije, snimljen pri stopi zagrevanja od 10 °C u minuti, koji je pokazivao maksimumom u endotermnom protoku toplote sa pikom na oko 272,6 °C ili na 212,6+2 °C.

[0174] Merenja termogravimetrijske analize (TGA) su vršena upotrebom Model Q-50 modula kompanije TA Instruments, sa dodatnim uređajem sa sposobnošću visoke rezolucije. Podaci su prikuplјeni upotrebom programa Thermal Analysis kompanije TA Instruments, pa su analizirani upotrebom kompjuterskog programa Universal Analysis kompanije TA Instruments. Izmereni uzroak je stavljan u posudu od platine i skeniran je pri stopi zagrevanja od 10 °C, polazeći od temperature okoline pa do 300-350 °C. Komore za balans i peći su tokom upotrebe produvavane strujom azota.

[0175] Reprezentativni TGA zapis za Oblik 1 pronalaska oslobođen od kristalnih oblika, prikazan je na Slici 8. Zapis termalne gravimetrijske analize (TGA) na Slici 8 ne pokazuje značajan gubitak težine na temperaturama ispod početka raspadanja na oko 293 °C.

[0176] Reprezentativni TGA zapis za Oblik 2 pronalaska oslobođen od kristalnih oblika, prikazan je na Slici 3. Zapis termalne gravimetrijske analize (TGA) na Slici 3 ne pokazuje značajan gubitak težine na temperaturama ispod početka raspadanja na oko 269 °C.

Primer 8: Procena dinamičke sorpcije vlage

[0177] Merenje dinamičke sorpcije vlage (DMS) je rađeno upotrebom atmosferske mikro-vage, SGA-100 sistema kompanije VTI (VTI Corp., Hialeah, FL 33016). Upotrebljavan je izmeren uzorak, a na početku analize, vlažnost je bila najmanje moguće vrednosti (blizu relativne vlažnosti (RV) od 0%). DMS analiza se sastojala od početnog koraka sušenja (0% RV) od 120 minuta i zatim od dva ciklusa sorpcije i desorpcije, pri čemu je stopa skeniranja iznosila 5% RV/koraku u okviru opsega vlažnosti od 5% RV do 90% RV. DMS analiza je izvedena izotermno na 25 °C.

[0178] Reprezentativni DMS zapis za Oblik 1 pronalaska koji je oslobođen od kristalnih oblika, prikazan je na na Slici 9.

[0179] Kristalni Oblik 1 je karakterisala mala histereza između dva ciklusa sorpcije i desorpcije. Oblik 1 je ispoljio prirast težine od oko 0,99% u opsegu vlažnosti od 5% do 70% relativne vlažnosti i prirast težine od oko 1,32% u opsegu vlažnosti od 5% do 90% relativne vlažnosti na sobnoj temperaturi, kao što je prikazano na Slici 9. Oblik 1 se smatra blago higroskopnim.

[0180] Reprezentativni DMS zapis za Oblik 2 pronalaska koji je oslobođen od kristalnih oblika, prikazan je na Slici 4. Kristalni Oblik 2 nije karkaterisala histereza između dva ciklusa sorpcije i desorpcije i ispoljio je izuzetno nisku sklonost ka higroskopnosti. Oblik 2 je ispoljio prirast težine od oko 0,12% u opsegu vlažnosti od 5% do 70% relativne vlažnosti i prirast težine od oko 0,18% u opsegu vlažnosti od 5% do 90% relativne vlažnosti na sobnoj temperaturi, kao što je prikazano na Slici 4. Oblik 2 se smatra nehigroskopnim.

Primer 9: Rendgenska difraktometrija monokristala za Oblik 2

[0181] Podaci su prikupljeni upotrebom Rigaku Oxford Diffraction Supernova Dual Source, Cu at Zero, Atlas CCD difraktometra opremljenog sa Cobra rashladnim uređajem kompanije Oxford Cryosystems. Podaci su prikupljeni upotrebom Cu Kα zračenja. Struktura je rešena i utačnjena upotrebom kristalografskog kompjuterskog programa AXS SHELXTL suite kompanije Bruker. Svi detalji se mogu pronaći u CIF. Ukoliko nije drugačije navedeno, atomi vodonika vezani za ugljenik su postavljeni geometrijski i dozvoljeno je da se njihova pozicija preciznije podesi pomoću parametra izotropnog pomeraja. Atomi vodonika vezani za heteroatome su locirani u različitoj Furijeovoj mapi i dozvoljeno je da se njihova pozicija slobodno podesi shodno parametru izotropnog pomeraja.

Tabela 3: Podaci analize dobijene rendgenskom difraktometrijom monokristala za Oblik 2

Primer 10: Procena stabilnosti čvrstog stanja za Oblik 1

[0182] Uzorci Oblika 1 pronalaska oslobođenog od kristalnih oblika čuvani su na 25°C i pri relativnoj vlažnosti (RV) od 60%, kao i na 40°C i RV od 75%, u dve konfiguracije posuda a) otvorenoj staklenoj bočici i b) zatvorenoj staklenoj bočici, koje su bile smeštene unutar HDPE boce koja je sadržavala desikans. HDPE boca je bila indukciono zaptivena. U određenim intervalima, sadržaj reprezentativnog uzorka je uklanjan i analiziran HPLC postupkom da bi se utvrdila hemijska čistoća (u nastavku je prikazana kao HPLC čistoća (% a/a)).

Tabela 4: Studija stabilnosti za Kristalni Oblik 1

Primer 11: Slika sa polarizovanog svetlosnog mikroskopa (PLM) za Oblik 1 i Oblik 2

[0183] Uzorci Oblika 1 i Oblika 2 su ispitivani i pod optičkim mikroskopom (Olympus BX51) sa unakrsno polarizovanim svetlosnim filterom. Slike su snimane upotrebom PaxCam kamere koja je bila pod kontrolom PaxIt programa za slikanje (verzija 6.4). Uzorci su pripremani na pokrovnim stakalcima, upotrebom lakog mineralnog ulja kao imerzionog medijuma. U zavisnosti od veličine čestica, za uvećanje su korišćena sočiva objektiva od 4×, 10× ili 20×.

Priprema 8: terc-Butil 2-jodo-1-((2-(trimetilsilil)etoksi)metil)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-karboksilat (C-5)

[0184]

[0185] U rastvor Jedinjenja C-22 (25 g; 135,86 mmol), u 0,01 M HCl (500 mL), dodat je dimetoksimetan (21,64 mL; 244,54 mmol). Dobijeni rastvor je mešan na 100°C tokom 18 h. Rastvarač je zatim uklonjen pod vakuumom, a ostatak je triturisan dva puta sa dietil etrom i etanolom, profiltriran i osušen da bi se dobilo Jedinjenje C-21 (25,2 g; prinos 94,6%).

[0186] U rastvor Jedinjenja C-21 (25,0 g; 127,55 mmol), u metanolu (250 mL), dodata je DIPEA (57,23 mL; 318,87 mmol), nakon čega je usledilo dodavanje (Boc)2O (68,23 mL; 318,87 mol) i reakcija je mešana na ST tokom 18 h. Dobijena reakciona smeša je zatim razblažena vodom (150 mL) i ekstrahovana upotrebom etil acetata (3x200 mL). Spojeni organski sloj je osušen upotrebom anhidrovanog natrijum sulfata, pa je dekantovan i koncentrovan pod sniženim pritiskom, da bi se dobio sirovi proizvod C-20 koji je bez daljeg prečišćavanja prosleđen u sledeći korak.

[0187] U rastvor ovog sirovog Jedinjenja C-20 (40,0 g; 123.8 mmol), u metanolu (500 mL), dodat je 1M rastvor NaOH (200 mL) i dobijeni rastvor je mešan na ST tokom 18 h. Rastvarač je zatim izdvojen destilacijom pod vakuumom, a dobijeni sirovi proizvod je razblažen vodom (200 mL) i ekstrahovan upotrebom etil acetata (3×300 mL). Spojeni organski sloj je zatim osušen upotrebom anhidrovanog natrijum sulfata, nakon čega je koncentrovan pod sniženim pritiskom, da bi se dobio sirovi proizvod koji je prečišćen hromatografijom na koloni (100-200 silika gel), uz eluciju sa 5-10% MeOH: DCM, da bi se dobio željeni proizvod C-19 (20 g; prinos 72,4%).

[0188] U rastvor Jedinjenja C-19 (20 g; 89,68 mmol), u THF-u (400 mL), dodat je NIS (30,26 g; 134,52 mmol) na ST i dobijeni rastvor je mešan tokom 2 sata na istoj temperaturi. Reakciona smeša je zatim razblažena vodom (200 mL) i ekstrahovana u etil acetatu (2×300 mL), nakon čega je organski sloj ispran sa 10% vodenim rastvorom natrijum tiosulfata (3x100 mL), a zatim i slanim rastvorom, i dalje osušen upotrebom anhidrovanog natrijum sulfata, pa koncentrovan pod sniženim pritiskom, da bi se dobio sirovi proizvod C-18 koji je upotrebljen u sledećem koraku bez dodatnog prečišćavanja.

[0189] U mešani rastvor Jedinjenja C-18 (15,0 g; 42,97 mmol), u THF-u (150 mL), u porcijama je dodat NaH (1,8 g 45,11 mmol) na 0°C i reakciona smeša je mešana tokom 1 sata na ST. Zatim je na 0°C u kapima dodat SEM hlorid (8,18 mL; 45,11 mmol). Reakciona smeša je zatim mešana tokom 6 sati na ST. Napredak reakcije je praćen TLC postupkom, pa je reakcija zaustavljena ledenom vodom (200 mL) na 0°C i smeša je ekstrahovana etil acetatom (2×200 mL). Organski slojevi su spojeni, isprani slanim rastvorom i osušeni upotrebom anhidrovanog natrijum sulfata. Organski sloj je potom profiltriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom, da bi se dobio sirovi proizvod koji je prečišćen hromatografijom na koloni (100-200) sa silikom (elucija sa 10-15% EtOAc: heksanom), da bi se dobio željeni proizvod C-5 kao viskozna tečnost (11g, 55%).

Priprema 9: 2-(2-etil-5-fluoro-4-metoksifenil)-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan (C-12)

[0190]

[0191] U mešanu suspenziju Jedinjenja C-17 (347,6 g; 973,14 mmol) u anhidrovanom THF-u (1000 mL), koja je bila ohlađena na -40°C, dodat je n-butil litijum (2,5 M u heksanu, 362,6 mL; 905,02 mmol) tokom 50 minuta, pri čemu je ostala karakteristična žuta boja fosfor ilida. Reakciona smeša je zatim zagrejana do -10°C, nakon čega je mešana tokom 1 h i dalje ohlađena do -30°C, pa je tokom 30 minuta dodavan rastvor Jedinjenja R-1 (50 g; 324,38 mmol) u anhidrovanom THF-u (200 mL). Dobijena smeša je zatim zagrejana do sobne temperature i mešana preko noći. Napredak reakcije je praćen TLC postupkom. Po završetku, reakcija je zaustavljena postepenim dodavanjem vode (500 mL), nakon čega je smeša ekstrahovana dietil etrom (3×500 mL). Organski slojevi su spojeni, isprani vodom (2×500 mL), slanim rastvorom (250 mL), pa su osušeni upotrebom (anhidrovanog Na2SO4) i koncentrovani pod sniženim pritiskom da bi se dobilo sirovo Jedinjenje. Dobijeni sirovi proizvod C-16 je upotrebljen u sledećem koraku bez prečišćavanja.

[0192] U rastvor sirovog C-16 (110 g; 723,39 mmol) u etanolu (1000 mL) dodat je 10% Pd/C (50 g). Postavljen je zatim balon gasovitog vodonika i reakciona smeđa je izlagana vakuumu i ponovo punjena vodonikom tri puta. Reakciona smeša je zatim mešana pod atmosferom vodonika preko noći, na sobnoj temperaturi. Nakon mešanja na ST preko noći, reakcija je završena. Smeša je profiltrirana kroz jastuče od Celita, pa je koncentrovana in vacuo da bi se obezbedilo sirovo jedinjenje, koje je dalje prečišćeno hromatografijom na koloni (100-200) sa silika gelom, uz eluciju sa 3-5% etil acetatom/heksanom, da bi se dobio željeni proizvod C-15 kao bezbojna tečnost (24g, 48% u 2 koraka).

[0193] U rastvor Jedinjenja C-15 (24,0 g; 155,84 mmol), u MeCN (200 mL), dodat je rastvor NBS (28,0 g; 157,40 mmol) u MeCN-u (100 mL). Dobijeni rastvor je mešan na sobnoj temperaturi tokom 18 h. Rastvarač je zatim uklonjen in vacuo, a ostatak je razblažen dietil etrom (100 mL). Uočena je precipitacija, koja je uklonjena filtracijom, nakon čega je filtrat ispran vodenim rastvorom natrijum sulfita (200 mL) i slanim rastvorom (100 mL), pa osušen upotrebom anhidrovanog natrijum-sulfata i koncentrovan in vacuo da bi se dobio željeni proizvod C-14 kao žuto ulje (35,0 g; prinos 97%).

[0194] U rastvor Jedinjenja C-14 (20g; 85,836 mmol) u dioksanu (400 mL) dodati su zatim Jedinjenje R-2 (32,69 g; 128,755 mmol) i KOAc (25,27 g; 257,508 mmol). Reakciona smeša je degasirana azotom tokom 15 minuta, pa je dodat paladijumski katalizator (3,5 g; 4,29 mmol). Reakciona smeša je dalje mešana i grejana na 110°C tokom 3 sata. Reakciona smeša je zatim profiltrirana kroz jasuče Celita i isprana etil acetatom. Filtrat je razblažen etil acetatom (200 mL) i ispran vodom (2 x 200 mL)) i slanim rastvorom (100 mL), pa je osušen upotrebom natrijum sulfata i koncentrovan pod vakuumom. Dobijeni sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni (100-200 silika gel), elucijom sa 3-5% EtOAc: heksanom, da bi se dobio željeni proizvod C-12 (20g, prinos 83%).

Priprema 10: 3-(Dimetil-stanil)-6-(2-etil-5-fluoro-4-metoksifenil)-1-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-1H-indazol (C-6)

[0195]

[0196] Smeša Jedinjenja C-13 (25 g; 126,84 mmol), 3,4-dihidro-2H-pirana (134,5 mL; 1471,5 mL) i p-TSA (5,57 g; 29,18 mmol) rastvorena je u THF-u (700 mL) i grejana na 60°C preko noći. Reakciona smeša je zatim presuta u ledenu vodu i vodena faza je ekstrahovana etil acetatom. Organski sloj je osušen upotrebom natrijum sulfata i profiltriran. Filtrat je uparen pod sniženim pritiskom, a ostatak je prečišćen upotrebom kolone sa silika gelom (230-400) (elucija sa 1-2% etil acetatom u heksanu), da bi se dobilo željeno Jedinjenje C-11 (23,5g; prinos 67%).

[0197] Rastvor Jedinjenja C-11 (13,3 g; 47,5 mmol), Jedinjenja C-12 (15,96 g; 57,0 mmol) i K3PO4(30,21 g; 142,5 mmol) u DMF:H2O (396:99 mL) degasiran je azotom tokom 15 minuta, nakon čega je dodat paladijumski katalizator (1,6 g; 2,37 mmol) i reakciona smeša je produvavana azotom tokom 5 minuta. Dobijena reakciona smeša je zatim grejana na 100°C tokom 12 h uz neprekidno mešanje.

Reakciona smeša je dalje proiltrirana kroz jasuče Celita i isprana etil acetatom. Filtrat je razblažen etil acetatom (200 mL), ekstrahovan sa EtOAc (2x100 mL) i ispran hladnom vodom (100 mL) i slanim rastvorom (50 mL), nakon čega je osušen upotrebom natrijum sulfata i koncentrovan pod vakuumom da bi se dobio sirovi proizvod koji je prečišćen fleš hromatografijom (100-200 silika gel), uz eluciju sa 10% EtOAc:heksanom, da bi se dobio C-10 (14g; prinos 91,4%)).

[0198] U rastvor Jedinjenja C-10 (52 g; 146,89 mmol) u metanolu (600 mL), dodata je koncentrovana HCl (50 mL) i dobijeni rastvor je grejan na 60°C preko noći. Reakciona smeša je zatim ohlađena do ST i koncentrovana pod vakuumom. Ostatak je razblažen sa EtOAc (200 mL) i ispran sa zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3(2×150 mL). Organski sloj je osušen upotrebom Na2SO4i zatim koncentrovan, da bi se dobio željeni proizvod C-9 (35g; prinos 88,9%).

[0199] U rastvor Jedinjenja C-9 (17,5 g; 64,81 mmol) u DMF-u (100 mL) dodat je KOH (14,5 g; 259,54 mmol) i smeša je mešana tokom 15 minuta. Polako je zatim dodat rastvor joda (32,7 g; 129,62 mmol) u DMF-u (50 mL), na 0°C, i reakciona smeša je mešana na ST tokom 30 min. Napredak reakcije je praćen TLC postupkom, pa je reakciona smeša razblažena vodom (200 mL) i ekstrahovana etil acetatom (2×200 mL). Organski sloj je ispran zasićenim vodenim rastvorom natrijum metabisulfita (2×150 mL) i vodom (3×100 mL), osušen upotrebom Na2SO4i koncentrovan pod vakuumom, da bi se dobio sirovi proizvod C-8 (21g).

[0200] U rastvor C-8 (21,0 g; 53,02 mmol) u DCM-u (230 mL) dodat je p-TsOH (1,8 g; 10,60 mmol) i smeša je ohlađena do 0°C. U gornji rastvor je zatim u kapima dodato Jedinjenje R-3 (7,04 mL; 79,54 mmol) i reakciona smeša je mešana na ST preko noći. TLC praćenje je ukazalo na završetak reakcije. Reakciona smeša je zatim razblažena sa DCM (2×150 mL) i isprana sa zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3(200 mL) i slanim rastvorom (200 mL). Organski sloj je osušen upotrebom anhidrovanog Na2SO4i koncentrovan in vacuo, da bi se dobio sirovi proizvod koji je prečišćen fleš hromatografijom da bi se dobio C-7.

[0201] Rastvor C-7 (10,0 g; 20,83 mmol) u toluenu (200 mL) je degasiran azotom tokom 20 minuta, nakon čega je sledilo dodavanje R-4 (4,89 mL; 22,91 mmol) i Pd(PPh3)4(1.2 g; 1,04 mmol). Reakciona smeša je zatim produvavana azotom dodatnih 5 minuta, pa je mešana na 100°C. Nakon 2 h, TLC postupak je ukazao na završetak reakcije. Reakciona smeša je zatim ohlađena do sobne temperature, pa je profiltrirana kroz jasuče Celita i ostatak je ispran etil acetatom. Koncentrovani filtrat je prečišćen hromatografijom na koloni (neutralna alumina), uz eluciju sa 2-5% EtOAc:heksanom, da bi se dobio proizvod C-6 (6,4 g; prinos 57,6%).

Priprema 11: 2-(6-(2-Etil-5-fluoro-4-metoksifenil)-1H-indazol-3-il)-4,5,6,7-tetrahidro-1H-imidazo[4,5-c]piridin (C-3)

[0202]

[0203] U rastvor Jedinjenja C-6 (6,4 g; 12,37 mmol) u toluenu (100 mL), dodato je Jedinjenje C-5 (5,9 g; 12,37 mmol). Reakciona smeša je zatim degasirana azotom tokom 20 minuta, nakon čega je sledilo dodavanje bakar (I) jodida (470 mg; 2,47 mmol) i Pd(PPh3)4(714 mg; 1,237 mmol) i mešanje na 100°C tokom 12h. Napredak reakcije je praćen TLC postupkom. Reakciona smeša je zatim ohlađena do ST, pa je profiltrirana kroz jasuče Celita, a ostatak je ispran etil acetatom. Organski sloj je razblažen vodom, nakon čega je izdvojen i organski deo je ispran slanim rastvorom, osušen upotrebom Na2SO4i profiltriran. Filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobio sirovi proizvod koji je prečišćen hromatografijom na koloni (silka veličine 100-200 mesh-a), uz eluciju sa 20% EtOAc: heksanom, da bi se dobio C-4 (4g; 45,9%).

[0204] U rastvor Jedinjenja C-4 (4,0 g; 5,6 mmol), u dioksanu (30 mL), dodata je koncentrovana HCl (30 mL). Reakciona smeša je zatim mešana na 70°C tokom 16 h. Napredak reakcije je praćen LCMS postupkom. Reakciona smeša je dalje ohlađena do ST, nakon čega je koncentrovana in vacuo, triturisana dietil etrom i prečišćen preparativnim HPLC postupkom, da bi se dobilo željeno Jedinjenje C-3 (0,65g, 29,5%).

Primer 12: 1-(2-(6-(2-Etil-5-fluoro-4-hidroksifenil)-1H-indazol-3-il)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-on (C-1)

[0205]

[0206] U smešu C-3 (180 mg; 0,460 mmol) u DCM-u (0,5 ml), na sobnoj temperaturi je dodat boron tribromid, 1m u DCM-u [100 ml) (2,299 ml; 2,299 mmol). Dobijena smeša je zatim mešana tokom 30 minuta, pre nego što je koncentrovana. Dobijeni ostatak je istovremeno uparen sa MeOH (3x3,0 mL), nakon čega je ponovo rastvoren u 1:1 smeši AcOH:H2O (3.0 mL), profiltriran i prečišćen reverznofaznim HPLC postupkom. Željene frakcije su spojene i osušene zamrzavanjem, da bi se dobio C-2 ((5-etil-2-fluoro-4-(3-(4,5,6,7-tetrahidro-1H-imidazo[4,5-c]piridin-2-il)-1H-indazol-6-il fenol) kao TFA so.

[0207] U smešu C-2, TFA (15 mg; 0,031 mmol) i 7" (2 ekvivalenta, 0,061 mmol), u DMF-u (0,5 ml), na ST su dodati HATU (25,5 mg; 0,067 mmol) i DIEA (0,043 ml; 0,244 mmol). Dobijena smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Reakciona smeša je zatim razblažena sa MeOH (0,5000 ml) i vodom (0,500 ml). Dodat je potom i LiOH (2,193 mg; 0,092 mmol). Dobijena smeša je grejana na 65°C tokom 1 sata. Smeša je zatim koncentrovana i dobijeni ostatak je tretiran mešavinom DCM-a (0,500 ml) i TFA (0,500 ml), na ST tokom 30 minuta, nakon čega je koncentrovan, ponovo rastvoren u 1:1 smeši AcOH:H2O (1.5 mL), profiltriran i prečišćen reverzno-faznim prep HPLC postupkom, da bi se dobilo Jedinjenje C-1 kao TFA so. (m/z): [M+H]<+>izračunato za C27H29FN6O3504,23; utvrđeno 505,2.

Biološka ispitivanja

[0208] Jedinjenje 1 je okarakterisano u jednom ili u više bioloških ispitivanja koja su navedena u tekstu koji sledi.

Ispitivanje 1: Biohemijska JAK kinazna ispitivanja

[0209] Panel od četiri JAK biohemijska ispitivanja pod nazivom LanthaScreen (za JAK1, 2, 3 i Tyk2) urađen je u uobičajenom kinaznom reakcionom puferu (50 mM HEPES, pH 7,5; 0,01% Brij-35, 10 mM MgCl2i 1 mM EGTA). Rekombinantni JAK enzimi obeleženi sa GST, kao i supstrati STAT1 petpida obeleženi sa zelenim fluorescentnim proteinom (GFP), nabavljeni su od kompanije Life Technologies.

[0210] Serijski razblažena jedinjenja su prethodno inkubirana sa svakim od četiri JAK enzima i sa supstratom, u belim mikrotitarskim pločama sa 384 bunarića (Corning), na temperaturi okruženja, tokom 1 sata. Zatim je dodat ATP, da bi se inicirale reakcije kinaza, u ukupnoj zapremini od 10 µL, sa 1% DMSO. Finalne koncentracije JAK1, 2, 3 i Tyk2 enzima su iznosile 4,2 nM, 0,1 nM, 1 nM i 0,25 nM, tim redom; odgovarajuće Km za upotrebljene koncentracije ATP-a su iznosile 25 µM, 3 µM, 1,6 µM i 10 µM; dok je koncentracija supstrata u sva četiri ispitivanja iznosila 200 nM. Dopušteno je da se reakcije kinaza odvijaju tokom 1 sata na sobnoj temperaturi, nakon čega su dodati po 10 µL EDTA (finalna koncentracija 10mM) i Tb-anti-pSTAT1 (pTyr701) antitelo (Life Technologies, finalna koncentracija 2nM) koji su bili pripremljeni u TR-FRET puferu za razblaživanje (Life Technologies). Ploče su zatim ostavlјene da se inkubiraju na sobnoj temperaturi tokom 1 sata, pa su očitane na EnVision čitaču (Perkin Elmer). Snimljen je odnos signala emisije (520 nm/495 nm) koji je upotrebljen za izračunavanje procenta inhibicije na osnovu podataka dobijenih za DMSO i kontrolu za signal šuma.

[0211] Radi analize doznog odgovora, podaci procenta inhibicije su unošeni na grafik, u odnosu na koncentracije jedinjenja, pa su vrednosti IC50određivane 4-parametarskim robusnim modelom ekstrapolacije, upotrebom kompjuterskog programa Prism (GraphPad Software). Rezultati su izraženi kao pIC50(negativni logaritam od IC50) i naknadno su prevedeni u pKi (negativni logaritam konstante disocijacije, Ki), upotrebom Cheng-Prusoff-ove jednačine.

[0212] Jedinjenje 1 je ispoljilo sledeću enzimsku potenciju.

Tabela 5

Ispitivanje 2: Ispitivanje ćelijske JAK potencije: Inhibicija IL-13

[0213] Analiza JAKI ćelijske potencije pod nazivom AlphaScreen, urađena je merenjem fosforilacije STAT6 koja je indukovana interleukinom-13 (IL-13, R&D Systems), u BEAS-2B humanim epitelnim ćelijama pluća (ATCC). Anti-STAT6 antitelo (Cell Signaling Technologies) konjugovano je sa AlphaScreen akceptorskim granulama (Perkin Elmer), dok je anti-pSTAT6 (pTyr641) antitelo (Cell Signaling Technologies) bilo biotinizovano upotrebom EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin reagensa (Thermo Scientific).

[0214] BEAS-2B ćelije su gajene na 37°C, u vlažnom inkubatoru sa 5% CO2, u 50% DMEM/50% F-12 medijumu (Life Technologies) u koji su bili dodati 10% FBS (Hyclone), 100 U/mL penicilina, 100 µg/mL streptomicina (Life Technologies) i 2 mM GlutaMAX rastvor (Life Technologies). Prvog dana ispitivanja, ćelije su zasađene u gustini od 7,500 ćelija/bunariću, u bele ploče sa 384 bunarića koje su bile obložene poli-D-lizinom (Corning), u po 25 µL medijuma, pa su ostavljene u inkubatoru preko noći da bi se zalepile za podlogu. Drugog dana ispitivanja, medijum je uklonjen i zamenjen sa 12 µL pufera za analizu (Hank-ov balansirani rastvor soli/HBSS, 25mM HEPES i goveđi serumski albumin/BSA koncentracije 1 mg/ml) koji je sadržavao različite doze ispitivanog jedinjenja potrebne za dobijanje doznog odgovora. Jedinjenja su serijski razblaživana u DMSO-u, a zatim su razblaživana još 1000 puta u medijumu, da bi se postigla finalna koncentracija DMSO-a od 0,1%. Ćelije su inkubirane 1 h sa ispitivanim jedinjenjima na 37°C, nakon čega je sledilo dodavanje 12 µL prethodno zagrejanog IL-13 (80 ng/ml, u puferu za analizu) radi stimulacije. Nakon inkubacije na 37°C tokom 30 minuta, pufer za analizu (koji je sadržavao jedinjenje i IL-13) je uklonjen, pa je dodato po 10 µL pufera za liziranje ćelija (25 mM HEPES, 0,1% SDS, 1% NP-40, 5 mM MgCl2, 1,3 mM EDTA, 1 mM EGTA i dodatak u vidu proteaznih inhibitora tipa Complete Ultra mini i PhosSTOP reagensa kompanije Roche Diagnostics). Ploče su mućkane na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta, pre dodavanja reagenasa za detekciju. Najpre je dodata smeša biotin-anti-pSTAT6 i anti-STAT6 konjugovanih granula, koja je inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata, nakon čega su dodate donorske granule konjugovane sa streptavidinom (Perkin Elmer). Nakon najmanje 2h inkubacije, ploče za analizu su očitane na EnVision čitaču mikrotitar ploča. Signali AlphaScreen luminiscencije su snimani i upotrebljeni za izračunavanja vrednosti procenata inhibicije na osnovu vrednosti dobijenih za DMSO i kontrolu za signal šuma.

[0215] Radi analize doznog odgovora, grafički su predstavljeni podaci procenta inhibicije u odnosu na koncentracije jedinjenja, dok su vrednosti IC50određivane 4-parametarskim robusnim modelom ekstrapolacije, upotrebom kompjuterskog programa Prism. Rezultati mogu takođe biti izraženi kao negativan logaritam IC50vrednost, pIC50. Jedinjenje 1 je u ovom ispitivanju karakterisala vrednost pIC50od 7,9.

Ispitivanje 3: Ispitivanje ćelijske JAK potencije: Inhibicija IFNγ stimulisanog sa IL-2/anti-CD3 u humanim PBMC

[0216] Potencija ispitivanog jedinjenja da inhibira interferon gama (IFNγ) stimulisan sa interleukinom-2 (IL-2)/anti-CD3, merena je u humanim mononuklearnim ćelijama periferne krvi (PBMC) izolovanim iz pune ljudske krvi (Stanford Blood Center). Pošto IL-2 signalizacija uključuje JAK, ova analiza obezbeđuje meru JAK ćelijske potencije.

(1) Humane mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su izolovane iz humane pune krvi zdravih davalaca upotrebom fikolnog gradijenta. Ćelije su gajene na 37 °C, u vlažnom inksubatoru sa 5% CO2, u RPMI medijumu (Life Technologies) koji je sadržavao 10% fetalnog goveđeg seruma inaktiviranog toplotom (FBS, Life Technologies), 2 mM Glutamax rastvor (Life Technologies), 25 mM HEPES (Life Technologies) i IX Pen/Strep (LifeTechnologies). Ćelije su zasejavane u gustini od 200 000 ćelija/bunariću, u medijumu (50 µL), pa su inkubirane tokom 1 h. Jedinjenje je serijski razblaživano u DMSO-u, nakon čega je razblaživano i sa medijumom dodatnih 500 puta (do finalne koncentracije za ispitivanja od 2x). Razblaženja ispitivanog jedinjenja (100 uL/bunariću) su dodata zatim ćelijama i ćelije su inkubirane na 37 °C, u 5% CO2tokom 1 h, nakon čega su sledili dodavanje IL-2 (R&D Systems; finalna koncentracija 100 ng/mL) i anti-CD3 (BD Biosciences; finalna koncentracija 1 µg/mL) u prethodno zagrejan medijum za ispitivanje (50 µL) i inkubacija tokom 24 h.

(2) Nakon stimulacije citokinima, ćelije su centrifugirane na 500 g tokom 5 minuta i supernatanti su uklonjeni i zamrznuti na -80 °C. Da bi se utvrdila inhibitorna potencija ispitivanih jedinjenja u odgovoru na IL-2/anti-CD3, koncentracije IFNγ u supernatantu su merene putem ELISA postupka (R&D Systems). IC50vrednosti su određivane analizom krive inhibicije za koncentraciju IFNγ u odnosu na koncentraciju jedinjenja. Podaci su izraženi kao pIC50(negativni dekadni logaritam IC50) vrednosti. Jedinjenje 1 je u ovom ispitivanju ispoljilo pIC50vrednost od oko 6,7.

Ispitivanje 4: Ispitivanje ćelijske JAK potencije: Inhibicija pSTAT5 stimulisanog sa IL-2 u CD4+ T-ćelijama

[0217] Potencija ispitivanog jedinjenja da inhibira STAT5 fosforilaciju stimulisanu interleukinom-2 (IL-2)/anti-CD3, merena je u CD4-pozitivnim (CD4+) T-ćelijama iz populacije humanih mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) koja je bila izolovana iz pune ljudske krvi (Stanford Blood Center) upotrebom protočne citometrije. Pošto IL-2 signalizacija uključuje JAK, ova analiza obezbeđuje meru JAK ćelijske potencije.

[0218] CD4+ T-ćelije su identifikovane upotrebom anti-CD4 antitela konjugovanog sa fikoeritrobilinom (PE) (klon RPA-T4, BD Biosciences), dok je anti-pSTAT5 antitelo konjugovano sa Alexa Fluor 647 bojom (pY694, klon 47, BD Biosciences) upotrebljeno za detekciju fosforilacije STAT5. (1) Praćen je protokol iz Ispitivanje 3, stavka (1), uz izuzetak što je stimulacija citokina vršena sa IL-2/anti-CD3 tokom 30 minuta umesto 24 sata.

(2) Nakon stimulacije citokinima, ćelije su fiksirane sa prethodno zagrejanim rastvorom za fiksiranje (200 µL; BD Biosciences) tokom 10 minuta, na 37 °C i u 5% CO2, pa su isprane dva puta sa DPBS puferom (1 mL; Life Technologies) i resuspendovane u ledeno hladnom Perm puferu III (1000 µL, BD Biosciences), tokom 30 minuta na 4 °C. Ćelije su dalje isprane dva puta sa 2% FBS u DPBS-u (FACS pufer), a zatim su resuspendovane u FACS puferu (100 µL) koji je sadržavao anti-CD4 PE (razblaženje od 1:50) i anti-CD3 anti-CD3-Alexa Fluor 647 (razblaženje od 1:5) i inkubirane su tokom 60 min na sobnoj temperaturi u mraku. Nakon inkubacije, ćelije su dva puta isprane u FACS puferu i potom su analizirane upotrebom LSRII protočnog citometra (BD Biosciences). Da bi se odredila inhibitorna potencija ispitivanog jedinjenja u odgovoru na IL-2/anti-CD3, srednji intenzitet fluorescencije (MFI) za pSTAT5 je meren u CD4+ T-ćelijama. IC50vrednosti su određivane analizom krivih inhibicije koje su predstavljale odnos MFI i koncentracija jedinjenja. Podaci su izraženi kao pIC50(negativni dekadni logaritam IC50) vrednosti. U ovom ispitivanju, jedinjenje 1 je karakterisala pIC50vrednost od oko 7,7.

Ispitivanje 5: Ispitivanje ćelijske JAK potencije: Inhibicija CCL2 (MCP-1) stimulisanog sa IL-6 u humanim PBMC

[0219] Potencija ispitivanog jedinjenja da inhibira proizvodnju CCL2 (MCP-1) stimulisanu sa interleukinom-6 (IL-6), merena je u humanim mononuklearnim ćelijama periferne krvi (PBMC) izolovanim iz pune ljudske krvi (Stanford Blood Center). Pošto IL-6 signalizacija uključuje JAK, ova analiza obezbeđuje meru JAK ćelijske potencije.

(1) Praćen je protokol za Ispitivanje 3, stavka (1), do inkubacije sa ispitivanim jedinjenjima. U ovom ispitivanju, nakon što su ispitivana jedinjenja dodata u bunarće i inkubirana, u prethodno zagrejan medijum za ispitivanje (50 µL) je dodat IL-6 (R&D Systems; finalna koncentracija 10 ng/ml).

(2) Nakon stimulacije citokinom tokom 48 h, ćelije su centrifugirane na 500 g tokom 5 minuta, nakon čega su supernatanti uklonjeni i zamrznuti na -80 °C. Da bi se odredila inhibitorna potencija ispitivanog jedinjenja u odgovoru na IL-6, koncentracije CCL2 (MCP-1) u supernatantima su merene ELISA postupkom (R&D Systems). IC50vrednosti su određivane analizom krivih inhibicije koje su predstavljale odnos CCL2/MCP-1 i koncentracija jedinjenja. Podaci su izraženi kao pIC50(negativni dekadni logaritam IC50) vrednosti. U ovom ispitivanju, Jedinjenje 1 je ispoljilo pIC50vrednost od oko 6,4.

Ispitivanje 6: Ispitivanje ćelijske JAK potencije: Inhibicija pSTAT1 indukovanog sa IFNγ

[0220] Potencija ispitivanog jedinjenja da inhibira fosforilaciju STAT1 stimulisanu sa interferonom gama (IFNγ), merena je u CD14-pozitivnim (CD14+) monocitima dobijenim iz pune ljudske krvi (Stanford Blood Center) upotrebom protočne citometrije. Pošto IFNγ signalizacija uključuje JAK, ova analiza obezbeđuje meru JAK ćelijske potencije.

[0221] Monociti su identifikovani upotrebom anti-CD 14 antitela konjugovanog sa fluorescein izotiocijanatom (FITC) (klon RM052, Beckman Coulter), dok je anti-pSTAT1 antitelo konjugovano sa Alexa Fluor 647 bojom (pY701, klon 4a, BD Biosciences) upotrebljeno za detektovanje STAT1 fosforilacije.

[0222] Humane mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su izolovane iz pune ljudske krvi zdravih davalaca, upotrebom fikolnog gradijenta. Ćelije su kultivisane na 37 °C, u vlažnom inksubatoru sa 5% CO2, u RPMI medijumu (Life Technologies) koji je sadržavao 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS, Life Technologies), 2 mM Glutamax rastvor (Life Technologies), 25 mM HEPES (Life Technologies) i 1X Pen/Strep (LifeTechnologies). Ćelije su bile zasejavane u gustini od 250 000 ćelija/bunariću u medijumu (200 µL) i kultivisane su tokom 2 h, nakon čega su resuspendovane u medijumu za analizu (50 μl) (RPMI medijum sa 0,1% goveđeg serumskog albumina (Sigma), 2 mM Glutamax rastvorom, 25 mM HEPES-om i 1×Penstrep) koji je sadržavao različite koncentracije ispitivanih jedinjenja. Jedinjenja su serijski razblaživana u DMSO-u, nakon čega su razblaživana sa medijumom dodatnih 1000 puta da bi se finalna koncentracija DMSO-a podesila do 0,1 %. Razblaženja ispitivanog jedinjenja su inkubirana sa ćelijama na 37 °C, u 5% CO2tokom 1 h, nakon čega su sledili dodavanje prethodno zagrejanog IFNγ (R&D Systems) u medijumu (50 µL), u finalnoj koncentraciji od 0,6 ng/mL, i inkubacija tokom 30 min. Nakon stimulacije citokinom, ćelije su fiksirane prethodno zagrejanim rastvorom za fiksiranje (100 µL) (BD Biosciences) tokom 10 minuta na 37 °C, 5% CO2, pa su isprane dva puta sa FACS puferom (1 mL) (1% BSA u PBS-u) i dalje resuspendovane u odnosu od 1:10 sa anti-CD14 FITC:FACS puferom (100 µL) i inkubirane na 4 °C tokom 15 min. Ćelije su zatim jednom isprane i potom resuspendovane u ledeno hladnom Perm puferu III (BD Biosciences) (100 µL), pa inkubirane tokom 30 minuta na 4 °C. Ćelije su zatim isprane dva puta sa FACS puferom i resuspendovane u odnosu od 1:10 sa anti-pSTAT1 Alexa Fluor 647:FACS puferom (100 µL) i inkubirane tokom 30 minuta na ST u mraku, ponovo isprane dva puta u FACS puferu i analizirane upotrebom LSRII protočnog citometra (BD Biosciences).

[0223] Da bi se odredila inhibitorna potencije ispitivanog jedinjenja, u CD14+ monocitima je meren srednji intenzitet fluorescencije (MFI) za pSTAT1. IC50vrednosti su određene analizom krivih inhibicije koje su predstavljale odnos MFI i koncentracija jedinjenja. Podaci su izraženi kao pIC50(negativni dekadni logaritam IC50) vrednosti. Jedinjenje 1 je u ovom ispitivanju karakterisala pIC50vrednost od oko 7,1.

Ispitivanje 7: Farmakokinetički parametri u očima zeca

[0224] Cilj ovog ispitivanja je bio da se odrede farmakokinetike ispitivanog jedinjenja u očnim tkivima zeca.

Formulacija u vidu rastvora

[0225] 1-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroksifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-on (1), pripremljen u Primeru 2, rastvoren je u 2% 2-hidroksipropil-β-ciklodekstrinu da bi se postigla ciljna koncentracija od 1 mg/mL. Bilateralna intravitrealna injekcija (50 µL/oku) rastvora ispitivanog jedinjenja je primenjivana novozelandskim belim zečevima (50 µg/oku). Koncentracija ispitivanog jedinjenja je merena u očnim tkivima: staklastom telu, očnoj vodici, mrežnjači/horoidei i irisu-cilijarnom telu, u unapred određenim vremenskim tačkama nakon injeciranja (30 min, 4 h, 1 d, 3 d, 7 d, 14 d). Za svaku vremensku tačku, doza je primenjivana kod dva zeca (u četiri oka). U tkivu staklastog tela, Jedinjenje 1 je ispoljilo dvofazno smanjenje koncentracije koje je karakterisao i početni pad u koncentraciji, sa poluživotom od približno 9 sati i konačnim terminalnim poluživotom od približno 2 dana. Utvrđeno je da se jedinjenje brzo distribuira u retinalni i horoidni region, kao i da ga karakteriše sličan farmakokinetički profil kao u tkivu staklastog tela.

Formulacija u vidu suspenzije

[0226] Formulacija u vidu suspenzije je pripremana kombinovanjem Jedinjenja 1 iz Primera 2 (Oblika 1), sa 0,5% hidroksipropil metilcelulozom (HPMC E5) 0,02% Tween-om 80, u normalnom fiziološkom rastvoru, da bi se postigla ciljna koncentracija od 5 mg/mL, 20 mg/mL i 80 mg/mL za doze od 0,25 mg/oku, 1 mg/oku i 4 mg/oku, tim redom. Bilateralna intravitrealna injekcija (50 μL/oku) suspenzije ispitivanog jedinjenja je primenjivana novozelandskim belim zečevima. Koncentracija ispitivanog jedinjenja je merena u očnim tkivima kao u ispitivanju za formulaciju u vidu rastvora, nakon 30 min, 4 h, 24 h, 72 h, 7 d, 14 d, 28 d, 56 d i 84 d nakon injeciranja. Iz grupe kojoj je primenjena doza od 4 mg/oku, prikupljeno je tkivo i u dodatnoj vremenskoj tački od 168 d nakon injeciranja. U svim doznim grupama je uočena merljiva koncentracija leka u oku do poslednje ispitivane vremenske tačke u ovoj studiji. Uočeno je i robustno produženo izlaganje za sve doze nakon 12 nedelja (84 dana). Produženo izlaganje je uočeno i nakon 24 nedelje (84 dana) u grupi tretiranoj dozom od 4 mg/oku. Jedinjenje je karakterisao linearni pad u koncentraciji leka u tkivu staklastog tela od 30 minuta do 24 nedelje, pri čemu je stopa klirensa leka iznosila približno od 5 do 10 µg/mL/dan. Stopa klirensa je u skladu sa rastvorljivošću Jedinjenja 1 u nosaču i farmakokinetičkim ponašanjem u oku koje je zapaženo za formulaciju u vidu rastvora. Sve dozne grupe je karakterisala merljiva koncentracija leka u oku do poslednje vremenske tačke koja je ispitivana u ovoj studiji. Prema tome, verovatno je da je izlaganje leku duže od onog koje je uočeno u ovoj studiji. Izmerena je i koncentracija leka u plazmi i utvrđeno je da je ista za najmanje 3 reda veličine niža od koncentracije u tkivu staklastog tela, za sve tri koncentracije.

[0227] Formulacija u vidu suspenzije je pripremana kombinovanjem Jedinjenja 1 iz Primera 5 (Oblika 2), sa 0,5% hidroksipropil metilcelulozom (HPMC E5) 0,02% Tween-om 80, u normalnom fiziološkom rastvoru, da bi se postigla ciljna koncentracija od 0,4 mg/mL, 1 mg/mL, 2mg/mL i 20 mg/mL, za doze od 0,02 mg/oku, 0,05 mg/oku, 0,1 mg/oku i 1 mg/oku, tim redom. Bilateralna intravitrealna injekcija (50 μL/oku) suspenzije ispitivanog jedinjenja je primenjivana holandskim Belted zečevima. Koncentracija ispitivanog jedinjenja je merena u staklastom telu, očnoj vodici, irisucilijarnom telu, mrežnjači, retinalnim pigmentnim epitelnim/horoidnim ćelijama i plazmi nakon 30 min, 7d, 14d, 28d, 42d i 56d od injeciranja. Jedinjenje je karakterisalo veoma postepeno smanjenje koncentracije leka u tkivu staklastog tela od nakon 30 minuta do poslednje ispitivane vremenske tačke (28d za dozu od 0,02mg/oku, 42d za doze od 0,05mg/oku i 1mg/oku i 56d za dozu od 0,1mg/oku). Sve dozne grupe je karakterisala merljiva koncentracija leka u oku do poslednje vremenske tačke koja je ispitivana u ovoj studiji. Prema tome, verovatno je da je izlaganje leku duže od onog koje je uočeno u ovoj studiji. Izmerena je i koncentracija leka u plazmi i utvrđeno je da je ista za najmanje 3 reda veličine niža od koncentracije u tkivu staklastog tela za sve tri koncentracije. Tri reda veličine odgovaraju logaritamskoj skali (tj.1000 na nelogaritamskoj skali).

Ispitivanje 8: Farmakodinamičko ispitivanje: Inhibicija pSTAT3 indukovanog sa IL6 kod pacova

[0228] Sposobnost jednokratne intravitrealne primene ispitivanog jedinjenja da inhibira pSTAT3 indukovan sa IL-6, merena je u homogenatima retine/horoidee pacova.

[0229] Formulacija u vidu suspenzije je pripremana kombinovanjem Jedinjenja 1 iz Primera 2, sa 0,5% hidroksipropil metilcelulozom (HPMC E5 LV), 0,02% Tween-om 80 i 9 mg/mL natrijum hlorida u prečišćenoj vodi, da bi se postigla ciljna koncentracija od 10 mg/mL.

[0230] Ženkama pacova Lewis soja je intravitrealno (IVT) primenjena formulacija u vidu suspenzije (5 µL po oku). Tri dana kasnije, intravitrealno su primeni IL-6 (Peprotech; 0,1 mg/mL; 5 µL po oku) ili nosač, da bi se indukovao pSTAT3. Očna tkiva su disekovana jedan sat nakon druge IVT injekcije sa IL-6. Tkiva retine/horoidee su homogenizovana i nivoi pSTAT3 su izmereni upotrebom ELISA postupka (Cell Signaling Technology). Procenat inhibicije pSTAT3 indukovanog sa IL-6 je izračunat poređenjem grupa nosač/nosač i nosač/IL-6. Inhibicija veća od 100% odražava smanjenje nivoa pSTAT3 do nivoa koji je ispod onog uočenog u grupi nosač/nosač.

[0231] Pretretman Jedinjenjem 1 u dozi od 50 µg, 3 dana pre primene IL-6 i u okviru formulacije u vidu suspenzije, inhibirala je pSTAT3 indukovan sa IL-6 za 116% u tkivima retine/horoidee.

Ispitivanje 9: Farmakodinamičko ispitivanje: Inhibicija IP-10 indukovanog sa IFNγ u očima zeca

[0232] Sposobnost jednokratne intravitrealne primene ispitivanog jedinjenja da inhibira proteinske nivoe IP-10 indukovanog sa interferonom-gama (IFNγ), merena je u staklastom telu i tkivima retine/horoidee zeca.

[0233] Formulacija u vidu suspenzije je pripremana kombinovanjem Jedinjenja 1 iz Primera 2 (Oblika 1), sa 0,5% hidroksipropil metilcelulozom (HPMC E5), 0,02% Tween-om 80 i 9 mg/mL natrijum hlorida u prečišćenoj vodi, da bi se postigla ciljna koncentracija od 20 mg /mL.

[0234] Za studije su upotrebljavani mužjaci novozelandskih belih zečeva (Liveon Biolabs, Indija). Životinje su aklimatizovane po dolasku u istraživačke centre (Jubilant Biosys Ltd., Indija). Svakom zecu je dato ukupno dve intravitrealne (IVT) injekcije sa ukupnom zapreminom doze od 50 µL po oku. Prvom IVT injekcijom (45 µL po oku) isporučeno je 0,9 mg ispitivanog jedinjenja ili nosača. Nedelju dana kasnije, drugom IVT injekcijom (5 µL po oku) isporučeni su lFNγ (1 µg/oku; osnovni rastvor 1 mg/mL; Kingfisher Biotech) ili nosač, zarad indukcije IP-10. Na dan injeciranja, zečevi su anestezirani intramuskularnom injekcijom ketamina (35 mg/kg) i ksilazina (5 mg/kg). Jednom duboko anestezirano, svako oko je isprano sterilnim fiziološkim rastvorom i IVT injekcije su primenjene upotrebom insulinskog šprica od 0,5 mL (50 jedinica = 0,5 mL) sa iglom od 31 godža, ubodom u supranazalnu stranu oba oka i označavanjem pozicije sa Braunstein-ovim fiksnim kaliperom (23/4"), 3,5 mm od rektusnog mišića i 4 mm od limbusa.

[0235] Tkiva su prikupljana 24 sata nakon druge IVT injekcije sa IFNγ. Prikupljeni su i homogenizovani staklasto telo (VH) i tkiva retine/horoidee (R/C), a proteinski nivoi IP-10 su mereni upotrebom ELISA kompleta za zečiji CXCL10 (IP-10) (Kingfisher Biotech). Procenat inhibicije IP-10 indukovan sa IFNγ je izračunat poređenjem grupa nosač/nosač i nosač/IFNγ.

[0236] Pretretman Jedinjenjem 1 nedelju dana pre primene IFNγ, u okviru formulacije u vidu suspenzije, inhibirao je IP-10 indukovan sa IFNγ za 81% i 80% u staklastom telu i tkivima retine/horoidee, tim redom. Slična efikasnost je uočena i prilikom pretretmana sprovedenog 1 mesec pre primene IFNγ.

Ispitivanje 10: Dermalna farmakokinetika u koži miša i patuljaste svinje

[0237] Cilj ovog ispitivanja je bio da se odrede epidermalna, dermalna i farmakokinetika u plazmi za ispitivano jedinjenje, nakon 24-časovnog izlaganja intaktne kože miša ili patuljaste svinje.

[0238] 1-(2-(6-(2-Etil-5-fluoro-4-hidroksifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-on (1), formulisan je u vidu 0,5% (w/w) kreme ili masti kao što je opisano i dodatno predstavljeno u vidu Formulacije A ili Formulacije B, tim redom, u Tabeli 6.

[0239] Dvadeset četiri sata pre primene leka, obrijana je dlaka sa leđa mužjaka miševa Balb/c soja težine 25 g, tako da je bila izložena površina od najmanje 6 cm<2>(oko 10% površine tela), dok je u posebnom eksperimentu, kod patuljastih svinja soja Gottingen od 10 kg, izlagana površina od najmanje 450 cm<2>(oko 10% površine tela). U nultom vremenu, nakon anestezije izofluranom, na leđa miševa ili patuljastih svinja je primenjeno ispitivano jedinjenje u dozi od 25 µL/cm<2,>Koža je zatim bila prekrivana lepljivom trakom, da bi se sprečio gubitak jedinjenja usled boravka u kavezu ili otiranja o šušku.

[0240] Nakon izlaganja od 24 sata, leđa su nežno oprane sapunom i vodom da bi se uklonio neapsorbovani lek, pa je površina osušena tapkanjem. Odmah nakon ovog pranja, punkcijom srca je uzorkovana krv iz miševa, dok je kod patuljastih svinja krv uzorkovana punkcijom vene. Skidanjem lepljive trake je zatim uklonjena spoljašnja koža (stratum corneum). Nakon izlaganja epidermisa, uzeta je tačkasta biopsija veličine 0,5 cm. Epidermis i dermis su brzo razdvojeni, izmereni i trenutno zamrznuti. Slični uzorci su dobijeni 48 h nakon primene doza kod miševa i 48 h, 94 h i 168 h (7 dana) nakon primene doza kod patuljastih svinja.

[0241] Uzorci epidermisa i dermisa su homogenizovani u vodi u odnosu od 1:10 (w/v), upotrebom ultrazvučnog homogenizatora kompanije Covaris. Uzorci su ekstrahovani u 3 zapremine acetonitrila i kvantifikovani u odnosu na standardnu krivu, upotrebom LC-MS postupka. Kao što ukazuju farmakokinetički parametri AUC0-t. za plazmu, epidermis i dermis, prikazani u Tabeli 7 u nastavku, značajna izloženost jedinjenju je bila prisutna u slojevima epidermis i dermisa, dok je izloženost plazme bila zanemarljiva kod miševa kojima je primenjivana Formulacija A, ispod granice kvantifikacije kod miševa kojima je primenjivana Formulacija B i za obe formulacije kod patuljastih svinja.

Tabela 6

Tabela 7

Ispitivanje 11: Farmakokinetički parametri u plućima i plazmi miševa

[0242] Koncentracije Jedinjenja 1 u plazmi i plućima i njihovi odnosi su određivani na sledeći način. U ispitivanju su upotrebljavani BALB/c miševi iz kompanije Charles River Laboratories. Jedinjenje 1 Oblika 1 iz primera 2 je formulisano u 0,01% Tween-u 80, u normalnom fiziološkom rastvoru (0,9% natrijum hlorid u vodi), u koncentraciji od 0,1 mg/mL, kao suspenzija. Po 50 µL formulacije u vidu suspenzije je uvedeno u traheju miša oralnom aspiracijom. U različitim vremenskim tačkama (0,083; 1, 4, 24, 48, 72 i 96 sati). nakon primene doze, uzorkovana je krv putem srčane punkcije i iz miševa su disekovana intaktna pluća. Uzorci krvi su centrifugirani (centrifuga kompanije Eppendorf, 5804R) tokom 4 minuta na približno 12,000 rpm, na 4°C, da bi se izdvojila plazma. Pluća su osušena tapkanjem, izmerena i homogenizovana uz razblaženje do 1:3 u sterilnoj vodi. Koncentracije Jedinjenja 1 u plazmi i plućima su određivane LC-MS analizom u odnosu na analitičke standarde unete u standarnu krivu za ispitivanu matricu. Uvrđena je dobra izloženost u plućima sa AUC (0-96 sati) za pluća od 360 µg h/g. Izračunato poluvreme eliminacije iz pluća je iznosilo približno 40 sati. Odnos koncnetracija u plućima u odnosu na plazmu, određen je kao odnos AUC za pluća u µg h/g prema AUC u plazmi, u µg h/mL (gde je AUC konvencionalno definisan kao površina ispod krive zavisnosti koncentracije ispitivanog jedinjenja u odnosu na vreme). Odnos AUC za pluća i plazmu je iznosio 1780, što ukazuje na veoma nisku izloženost u plazmi.

Ispitivanje 12: Farmakodinamičko ispitivanje: Inhibicija pSTAT1 indukovanog sa IFNγ u očima zeca

[0243] Sposobnost jednokratne intravitrealne primene ispitivanog jedinjenja da inhibira fosforilaciju STAT1 proteina (pSTAT1) indukovanu sa interferonom-gama (IFNγ), merena je u tkivu retine/horoidee zeca.

[0244] Formulacija u vidu suspenzije je pripremana kombinovanjem Jedinjenja 1 iz Primera 2 (Oblika 1), sa 0,5% hidroksipropil metilcelulozom (HPMC E5), 0,02% Tween-om 80 i 9 mg/mL natrijum hlorida u prečišćenoj vodi, da bi se postigla ciljna koncentracija od 20 mg /mL.

[0245] Za studije su upotrebljavani mužjaci novozelandskih belih zečeva (Liveon Biolabs, Indija). Životinje su aklimatizovane po dolasku u istraživačke centre (Jubilant Biosys Ltd., Indija). Svakom zecu je dato ukupno dve intravitrealne (IVT) injekcije sa ukupnom zapreminom doze od 50 µL po oku. Prvom IVT injekcijom (45 µL po oku) je isporučeno 0,9 mg ispitivanog jedinjenja ili nosača. Nedelju dana kasnije, drugom IVT injekcijom (5 µL po oku) isporučeni su lFNγ (1 µg/oku; osnovni rastvor 1 mg/mL; Kingfisher Biotech) ili nosač, zarad indukcije IP-10. Na dan injeciranja, zečevi su anestezirani intramuskularnom injekcijom ketamina (35 mg/kg) i ksilazina (5 mg/kg). Jednom duboko anestezirano, svako oko je isprano sterilnim fiziološkim rastvorom i IVT injekcije su primenjene upotrebom insulinskog šprica od 0,5 mL (50 jedinica = 0,5 mL) sa iglom od 31 godža, ubodom u supranazalnu stranu oba oka i označavanjem pozicije sa Braunstein-ovim fiksnim kaliperom (23/4"), 3,5 mm od rektusnog mišića i 4 mm od limbusa.

[0246] Tkiva su prikupljena 2 sata nakon druge IVT injekcije sa IFNγ. Retina/horoidna tkiva (R/C) su prikupljena i homogenizovana, a nivoi pSTAT1 su izmereni kvantitativnim imunoblotom postupkom, upotrebom WES instrumenta kompanije ProteinSimple. Procenat inhibicije pSTAT1 indukovanog sa IFNγ je izračunat poređenjem grupa nosač/nosilac i nosač/IFNγ.

[0247] Pretretman Jedinjenjem 1, u okviru formulacije u vidu suspenzije, nedelju dana pre primene IFNγ, inhibirao je pSTAT1 indukovan sa IFNγ za 85%. Nakon pretretmana jednokratnom dozom formulacije u vidu suspenzije, 3 meseca pre primene IFNγ, formulacija u vidu suspenzije Jedinjenja 1 je inhibirala pSTAT1 indukovan sa IFNγ za 76%.

[0248] Formulacija u vidu suspenzije je pripremana kombinovanjem Jedinjenja 1 iz Primera 5 (Oblika 2), sa 0,5 % hidroksipropil metilcelulozom (HPMC E5) 0,02 % Tween-om 80, u normalnom fiziološkom rastvoru, da bi se postigla ciljna koncentracija od 11,1; 3,3 i 1,1 mg/mL.

[0249] Za studije su upotrebljavani mužjaci novozelandskih belih zečeva (Liveon Biolabs, Indija). Životinje su aklimatizovane po dolasku u istraživačke centre (Jubilant Biosys Ltd., Indija). Svakom zecu je dato ukupno dve intravitrealne (IVT) injekcije sa ukupnom zapreminom doze od 50 µL po oku. Prvom IVT injekcijom (45 µL po oku) su isporučeni 500μg, 150μg ili 50μg ispitivanog jedinjenja ili nosač. Dve nedelje kasnije, drugom IVT injekcijom (5 µL po oku) isporučeni su lFNγ (1 µg/oku; osnovni rastvor 1 mg/mL; Kingfisher Biotech) ili nosač, zarad indukcije IP-10. Na dan injeciranja, zečevi su anestezirani intramuskularnom injekcijom ketamina (35 mg/kg) i ksilazina (5 mg/kg). Jednom duboko anestezirano, svako oko je isprano sterilnim fiziološkim rastvorom i IVT injekcije su primenjene upotrebom insulinskog šprica od 0,5 mL (50 jedinica = 0,5 mL) sa iglom od 31 godža, ubodom u supranazalnu stranu oba oka i označavanjem pozicije sa Braunstein-ovim fiksnim kaliperom (23/4"), 3,5 mm od rektusnog mišića i 4 mm od limbusa.

[0250] Tkiva su prikupljana 2 sata nakon druge IVT injekcije sa IFNγ. Retina/horoidna tkiva (R/C) su prikupljena i homogenizovana, a nivoi pSTAT1 su izmereni kvantitativnim imunoblotom postupkom, upotrebom WES instrumenta kompanije ProteinSimple. Procenat inhibicije pSTAT1 indukovanog sa IFNγ je izračunat poređenjem grupa nosač/nosilac i nosač/IFNγ.

[0251] Pretretman Jedinjenjem 1, u okviru formulacije u vidu suspenzije, 2 nedelje pre primene IFNγ, inhibirao je pSTAT1 indukovan sa IFNγ za 79% primenom doze od 500µg, za 58% primenom doze od 150µg i 61% primenom doze od 50µg.

Ispitivanje 13: Pretraga kinoma i GINI koeficijent

[0252] Jedinjenja 1 i C-1 su ispitivana skriningom i u pogledu delovanja na druge kinaze, da bi se procenio njihov profil selektivnosti.

[0253] Sojevi T7 faga sa označenim kinazama su paralelno gajeni u pločama sa 24 bunara, u E. coli izvedenoj iz soja BL21 kao domaćinu. E. coli je gajena do log-faze rasta, nakon čega je inficirana sa T7 fagom iz zamrznutog materijala (multiplicitet infekcije = 0,4) i dalje inkubirana uz mućkanje na 32°C do lize (90-150 minuta). Lizati su centrifugirani (6 000 × g) i profiltrirani (0,2 µm) da bi se uklonili ćelijski ostaci. Preostale kinaze su proizvedene u HEK-293 ćelijama i naknadno su obeležene sa DNK radi detekcije qPCR postupkom.

[0254] Magnetne kuglice obložene streptavidinom su tretirane biotinizovanim ligandima tipa malih molekula tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi, da bi se generisale afinitetne smole za ispitivanja kinaza. Granule sa ligandom su blokirane viškom biotina i zatim su isprane puferom za blokiranje (SeaBlock (Pierce), 1 % BSA, 0,05 % Tween 20, 1 mM DTT) da bi se uklonio nevezani ligand i da bi se smanjilo nespecifično vezivanje faga. Reakcije vezivanja su obrazovane kombinovanjem kinaza, afinitetnih granula sa ligandom i ispitivanog jedinjenja u 1x puferu za vezivanje (20% SeaBlock, 0,17x PBS, 0,05% Tween 20, 6 mM DTT). Ispitivanja jedinjenja su pripremana kao koncentrovani rastvori od 40x u 100% DMSO-a, pa su direktno razblaživana u ispitivanju. Sve reakcije su izvođene u polipropilenskim pločama sa 384 bunarća, u finalnoj zapremini od 0,04 ml. Ploče za ispitivanje su inkubirane na sobnoj temperaturi uz mućkanje tokom 1 sata, a afinitetne granule su zatim isprane sa puferom za pranje (1x PBS, 0,05 % Tween 20). Granule su zatim ponovo resuspendovane u puferu za eluciju (1× PBS, 0,05 % Tween 20, 0,5 µM ne-biotinilovani afinitetni ligand) i inkubirane na sobnoj temperaturi uz mućkanje tokom 30 minuta. Koncentracija kinaza u eluatima je izmerena qPCR postupkom.

[0255] Jedinjenja su ispitivnan skriningom doze od 1 µM, a rezultati za primarni skrining interakcija vezivanja koji je prikazan u Tabeli 8 i 9 su prikazani kao "% inhibicije" (=100-((signal za ispitivano jedinjenje-signal pozitivne kontrole)/((signal negativne kontrole)-(signal pozitivne kontrole))X100), gde je negativna kontrola DMSO, a pozitivna kontrola je kontrolno jedinjenje.

Tabela 8

Tabela 9

[0256] Utvrđeno je da Jedinjenje 1 ispoljava značajno nižu inhibiciju vezivanja za CDK7 i CDK9 od Jedinjenja C-1. Jedinjenje 1 je takođe karakterisala niža inhibicija vezivanja za nekoliko drugih kinaza.

[0257] Dejsvo oba Jedinjenja 1 i C-1 je ispitivano skiningom 35 različitih kinaza. Za oba jedinjenja je određen Gini koeficijent. Jedinjenje 1 je imalo GINI koeficijent od 0,62, dok je Jedinjenje C-1 bilo sa GINI koeficijentom od 0,46. Gini koeficijent se upotrebljava za izražavnje selektivnost jedinjenja u odnosu na panel kinaza (Graczyk, J. Med. Chem, 2007, 50, 5773-5779). Veći broj odgovara selektivnijem jedinjenju.

[0258] Jedina strukturna razlika između Jedinjenja 1 i Jedinjenja C-1 je prisustvo fluoro grupe u jezgru. Pokazano je da ova strukturna razlika ima važan uticaj na kinomsku selektivnost jedinjenja.

Ispitivanje 14: Ispitivanje citotoksičnosti

[0259] Analiza ćelijske vijabilnosti/citotoksičnosti luminiscentnim CellTiter-Glo ragensom, urađena je sa BEAS-2B humanim epitelnim ćelijama pluća (ATCC), u normalnim uslovima rasta.

[0260] Ćelije su gajene na 37°C, u vlažnom inkubatoru sa 5% CO2, u 50% DMEM/50 % F-12 medijumu (Life Technologies) u koji su bili dodati 10% FBS (Hyclone), 100 U/mL penicilina, 100 µg/mL streptomicina ( Life Technologies) i 2 mM GlutaMAX rastvora (Life Technologies). Prvog dana analize, ćelije su zasejane u gustini od 500 ćelija/bunariću, u bele ploče za kulturu sa 384 bunarića (Corning), u po 25 µL medijuma, nakon čega su ostavljene u inkubatoru preko noći da bi se zalepile za podlogu. Drugog dana analize, dodato je po 5 µL medijuma koji je sadržavao razne doze ispitivanog jedinjenja radi određivanje doznog odgovora, pa je sve inkubirano 48 sati na 37 °C. Zatim je dodato po 30 µl rastvora za detekciju iz komercijalnog paketa CellTiter-Glo (Promega), sve je mešano na orbitalnoj mešalici tokom 5 minuta i dodatno inkubirano 10 min, pa je ploča očitana na čitaču mikroploča tipa EnVision. Luminescentni signali su snimljeni i izračunat je procenat za kontrolu sa DMSO-om.

[0261] Za analizu doznog odgovora, procentualni podaci za DMSO kontrolu su uneti u grafik, u odnosu na koncentracije jedinjenje, da bi se izvela kriva dozne zavisnosti spajanjem svake tačke podataka u jednu liniju. Koncentracija u kojoj svaka kriva prelazi prag inhibicije od 15% definisana je kao CC15.

[0262] Očekuje se da ispitivana jedinjenja koja karakteriše niža CC15vrednost u ovoj analizi, budu sa većom verovatnoćom da prouzrokuju citotoksičnost.

[0263] Jedinjenje 1 je karakterisao CC15od 3,16μM, dok je Jedinjenje C-1 karakterisao CC15od 630nM. Prema tome, na osnovu ovog ispitivanja se može zaključiti da je značajno manje verovatno da će Jedinjenje 1 prouzrokovati citotoksičnost od Jedinjenja C-1.

[0264] Jedina strukturna razlika između Jedinjenja 1 i Jedinjenja C-1 je prisustvo fluoro grupe u jezgru. Pokazano je takođe da ova strukturna razlika ima važan uticaj na citotoksičnost jedinjenja.

Claims (30)

1. Patenti zahtevi 1. Jedinjenje formule:
2. ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. 2. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, formule:
3. 3. Kristalni oblik jedinjenja prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, formule:

   pri čemu je kristalni oblik naznačen time, što rendgenski difraktogram praha sadrži difrakcione pikove na vrednostima 2θ od 10,61±0,20; 11,84±0,20; 14,94±0,20; 18,26±0,20 i 19,06±0,20.
4. 4. Kristalni oblik prema patentnom zahtevu 3, pri čemu je rendgenski difraktogram praha dalje naznačen time, što sadrži dodatne difrakcione pikove na vrednostima 2θ od 13,32±0,20; 17,69±0,20 i 21,10±0,20.
5. 5. Kristalni oblik prema patentnom zahtevu 4, pri čemu je rendgenski difraktogram praha dalje naznačen time, što sadrži dva ili više dodatnih difrakcionih pikova na vrednostima 2θ izabranim od 10,85±0,20; 16,14±0,20; 16,35±0,20; 18,43±0,20; 19,20±0,20; 19,49±0,20; 20,72±0,20; 21,94±0,20; 22,64±0,20; 23,64±0,20; 25,19±0,20 i 28,08±0,20.
6. 6. Kristalni oblik prema patentnom zahtevu 4, pri čemu je rendgenski difraktogram praha dalje naznačen time, što sadrži dodatne difrakcione pikove na vrednostima 2θ izabranim od 10,85±0,20; 16,14±0,20; 16,35±0,20; 18,43±0,20; 19,20±0,20; 19,49±0,20; 20,72±0,20; 21,94±0,20; 22,64±0,20, 23,64±0,20; 25,19±0,20 i 28,08±0,20.
7. 7. Kristalni oblik prema patentnom zahtevu 3, pri čemu je kristalni oblik naznačen time, što zapis diferencijalne skenirajuće kalorimetrije, snimljen pri stopi zagrevanja od 10 °C po minuti, pokazuje maksimum u endotermnom protoku toplote na temperaturi između 268 °C i 277 °C.
8. 8. Kristalni oblik prema patentnom zahtevu 3, pri čemu je kristalni oblik naznačen time, što zapis diferencijalne skenirajuće kalorimetrije, snimljen pri stopi zagrevanja od 10 °C po minuti, pokazuje maksimum u endotermnom protoku toplote sa pikom na 272,6±2 °C.
9. 9. Kristalni oblik jedinjenja prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, formule:

   pri čemu je kristalni oblik naznačen time, što rendgenski difraktogram praha sadrži difrakcione pikove na vrednostima 2θ od 8,16±0,20; 8,97±0,20; 15,29±0,20; 16,70±0,20; 18,00±0,20 i 20,18±0,20.
10. 10. Kristalni oblik prema patentnom zahtevu 9, pri čemu je rendgenski difraktogram praha dalje naznačen time, što sadrži dva ili više dodatnih difrakcionih pikova na vrednostima 2θ izabranim od 7,69±0,20; 10,66±0,20; 11,46±0,20; 11,91±0,20; 15,80±0,20; 17,02±0,20; 18,83±0,20; 22,39±0,20; 22,98±0,20; 24,89±0,20 i 26,54±0,20.
11. 11. Kristalni oblik prema patentnom zahtevu 9, pri čemu je rendgenski difraktogram praha dalje naznačen time, što sadrži dodate difrakcione pikove na vrednostima 2θ izabranim od 7,69±0,20; 10,66±0,20; 11,46±0,20; 11,91±0,20; 15,80±0,20; 17,02±0,20; 18,83±0,20; 22,39±0,20; 22,98±0,20; 24,89±0,20 i 26,54±0,20.
12. 12. Kristalni oblik prema patentnom zahtevu 9, pri čemu je kristalni oblik naznačen time, što zapis diferencijalne skenirajuće kalorimetrije, snimljen pri stopi zagrevanja od 10 °C u minuti, pokazuje maksimum u endotermnom protoku toplote na temperaturi između 215 °C i 229 °C.
13. 13. Kristalni oblik prema patentnom zahtevu 9, pri čemu je kristalni oblik naznačen time, što zapis diferencijalne skenirajuće kalorimetrije, snimljen pri stopi zagrevanja od 10 °C u minuti, pokazuje maksimum u endotermnom protoku toplote sa pikom na 221,7±3 °C.
14. 14. Farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje prema patentnom zahtevu 1 ili 2 ili kristalni oblik prema bilo kom od patentnih zahteva od 3 do 13 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
15. 15. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 14, pri čemu je kompozicija pogodna za primenu u oko.
16. 16. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 15, pri čemu je kompozicija pogodna za intravitrealno injeciranje.
17. 17. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 16, pri čemu je kompozicija suspenzija.
18. 18. Postupak za pripremu jedinjenja formule 1

    ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, pri čemu postupak obuhvata: (a) reagovanje jedinjenja formule 6:

    sa jedinjenjem formule 7:

    pri čemu je R<A>vodonik ili 2,5-dioksopirolidinil, i (b) po izboru, pripremanje farmaceutski prihvatljive soli tako da se obezbedi jedinjenje formule 1 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
19. 19. Jedinjenje formule 6:

    ili njegova so.
20. 20. Postupak za pripremu kristalnog oblika prema patentnom zahtevu 3, koji obuhvata: (a) obrazovanje homogene smeše 1-(2-(6-(2-etil-5-fluoro-4-hidroksifenil)-4-fluoro-1H-indazol-3-il)-1,4,6,7-tetrahidro-5H-imidazo[4,5-c]piridin-5-il)-2-morfolinoetan-1-ona u polarnom aprotičnom rastvaraču, ili u polarnom rastvaraču koji se može mešati sa vodom, ili u smeši polarnog aprotičnog rastvarača i polarnog rastvarač koji se može mešati sa vodom, na temperaturi između 45 i 75 °C; (b) dodavanje homogene smeše u smešu rastvarača koji se može mešati sa vodom i vode, na temperaturi između 60 i 90 °C, da bi se dobila druga smeša; (c) sporo dodavanje vode u drugu smešu na temperaturi između 60 i 90 °C da bi se obrazovala suspenzija; i (d) izolovanje kristalnog oblika iz suspenzije.
21. 21. Postupak prema patentnom zahtevu 20, pri čemu je polarni aprotični rastvarač iz koraka (a) izabran iz grupe koja se sastoji od DMSO, DMF, NMP, DMAc i nitrometana, polarni rastvarač koji se može mešati sa vodom iz koraka (a) je izabran iz grupe koji se sastoji od acetonitrila, acetona, metanola, etanola i THF, a rastvarač koji se može mešati sa vodom iz koraka (b) je izabran iz grupe koja se sastoji od acetonitrila, acetona, metanola, etanola, n-propanola, izopropanola, nbutanola, THF, DMSO, DMF, NMP, DMAc i nitrometana.
22. 22. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1 ili 2, ili kristalni oblik prema bilo kom od patentnih zahteva od 3 do 13, za upotrebu u lečenju očne bolesti kod sisara.
23. 23. Jedinjenje ili kristalni oblik za upotrebu prema patentnom zahtevu 22, pri čemu je bolest oka uveitis, dijabetska retinopatija, dijabetski makularni edem, bolest suvog oka, senilna makularna degeneracija, okluzija retinalne vene ili atopijski keratokonjunktivitis.
24. 24. Jedinjenje ili kristalni oblik za upotrebu prema patentnom zahtevu 23, pri čemu je očna bolest uveitis.
25. 25. Jedinjenje ili kristalni oblik za upotrebu prema patentnom zahtevu 23, pri čemu je očna bolest dijabetski makularni edem.
26. 26. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1 ili 2, ili kristalni oblik prema bilo kom od patentnih zahteva od 3 do 13, za upotrebu u lečenju inflamatorne bolesti kože kod sisara.
27. 27. Jedinjenje ili kristalni oblik za upotrebu prema patentnom zahtevu 26, pri čemu je inflamatorna bolest kože atopijski dermatitis.
28. 28. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1 ili 2, ili kristalni oblik prema bilo kom od patentnih zahteva od 3 do 13, za upotrebu u lečenju respiratorne bolesti kod sisara.
29. 29. Jedinjenje ili kristalni oblik za upotrebu prema patentnom zahtevu 28, pri čemu je respiratorna bolest astma, hronična opstruktivna plućna bolest, cistična fibroza, pneumonitis, idiopatska plućna fibroza, akutna povreda pluća, sindrom akutnog respiratornog distresa, bronhitis, emfizem, odbacivanje transplantata pluća, primarna disfunkcija transplantata, pneumonija u organizaciji, akutno odbacivanje transplantata pluća, limfocitni bronhiolitis, hronična disfunkcija alografta pluća, restriktivna hronična disfunkcija alografta pluća, disfunkcija alografta sa neutrofilima ili bronhiolitis obliterans.
30. 30. Jedinjenje ili kristalni oblik za upotrebu prema patentnom zahtevu 29, pri čemu je respiratorna bolest astma, hronična disfunkcija alografta pluća ili hronična opstruktivna bolest pluća.