Deprecated: The each() function is deprecated. This message will be suppressed on further calls in /home/zhenxiangba/zhenxiangba.com/public_html/phproxy-improved-master/index.php on line 456
RS63008B1 - Rešavanje frakcija genoma koristeći brojanje polimorfizma - Google Patents
[go: Go Back, main page]

RS63008B1 - Rešavanje frakcija genoma koristeći brojanje polimorfizma - Google Patents

Rešavanje frakcija genoma koristeći brojanje polimorfizma

Info

Publication number
RS63008B1
RS63008B1 RS20220224A RSP20220224A RS63008B1 RS 63008 B1 RS63008 B1 RS 63008B1 RS 20220224 A RS20220224 A RS 20220224A RS P20220224 A RSP20220224 A RS P20220224A RS 63008 B1 RS63008 B1 RS 63008B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
dna
polymorphisms
polymorphism
fetal
sequencing
Prior art date
Application number
RS20220224A
Other languages
English (en)
Inventor
Richard P Rava
Brian K Rhees
John P Burke
Original Assignee
Verinata Health Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=46001809&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS63008(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Verinata Health Inc filed Critical Verinata Health Inc
Publication of RS63008B1 publication Critical patent/RS63008B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G16B20/10—Ploidy or copy number detection
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G16B20/20—Allele or variant detection, e.g. single nucleotide polymorphism [SNP] detection
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
    • G16B30/10—Sequence alignment; Homology search
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B40/00—ICT specially adapted for biostatistics; ICT specially adapted for bioinformatics-related machine learning or data mining, e.g. knowledge discovery or pattern finding
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B45/00—ICT specially adapted for bioinformatics-related data visualisation, e.g. displaying of maps or networks
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Data Mining & Analysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Databases & Information Systems (AREA)
  • Bioethics (AREA)
  • Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
  • Artificial Intelligence (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Evolutionary Computation (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Software Systems (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Algebra (AREA)

Description

Opis
POZADINA
[0001] Otkrivanje slobodno-cirkulišuće fetalne DNK (ponekad nazvane „DNK bez ćelija“ ili „cfDNK“) u krvi majke omogućava mogućnost otkrivanja hromozomskih abnormalnosti, aneuploidije i aberacija iz uzoraka krvi. Frakciona količina fetalne DNK u krvnoj plazmi majke nije konstantna i varira u zavisnosti od različitih faktora, uključujući rukovanje uzorkom i gestacionu starost.
[0002] Kada koristite sekvenciranje DNK za identifikaciju hromozomskih aberacija ili genetskih defekata, važno je znati relativnu količinu fetalne DNK u ukupnoj populaciji DNK. Na primer, kada je poznata frakcija fetusa, statistička snaga (verovatnoća identifikacije anomalnih slučajeva ili osetljivost) se može izračunati metodom permutacije ili integracijom linearnih kombinacija ili konvolucija ne-centralnih F distribucija od alfa do beskonačnosti gde je alfa kritična tačka za značaj (maksimalna verovatnoća lažnog nazivanja anomalijom) populacije rezultata pod nultom hipotezom da nema aberacije.
[0003] US 7,332,277 podučava postupak za otkrivanje prisustva odsustva fetalne hromozomske abnormalnosti kvantifikacijom odnosa relativne količine alela na heterozigotnom lokusu od interesa.
[0004] Nedostatak postojećih postupaka za detekciju fetalne frakcije je to što one odgovaraju na mere obilja polnih hromozoma (koji se mogu koristiti samo za pouzdano merenje relativne količine DNK muškog embriona) ili sekvence mRNK gena za koje se zna da se različito eksprimiraju između trudnice i embrionalno tkivo (koje je podložno varijabilnosti ekspresije zbog gestacione starosti ili drugih faktora).
[0005] Procena fetalne frakcije može biti teška zbog nekoliko faktora koji smetaju, uključujući: roditeljski etnički diferencijalni parametri genetike populacije i greške sekvenciranja. Zbog toga je poželjno imati robusne postupke u prisustvu ovih i drugih faktora koji se često javljaju.
REZIME
[0006] Pronalazak obezbeđuje postupak za procenu frakcije fetalne DNK u DNK dobijenoj iz telesne tečnosti trudne individue, a postupak obuhvata:
(a) poravnavanje ili na drugi način mapiranje sekvenci segmenata DNK izvedenih sekvenciranjem DNK u telesnoj tečnosti na jedan ili više naznačenih polimorfizama na referentnoj sekvenci, pri čemu se poravnavanje ili na drugi način mapiranje vrši korišćenjem računarskog aparata programiranog da mapira sekvence nukleinskih kiselina u jedan ili više naznačenih polimorfizama;
(b) određivanje frekvencija alela mapiranih sekvenci DNK segmenta za najmanje jedan od naznačenih polimorfizama;
(c) klasifikovanje najmanje jednog naznačenog polimorfizma na osnovu kombinacije zigotnosti trudne individue i zigotnosti fetusa; i
(d) procenu udela fetalne DNK u DNK dobijenoj od trudne individue koristeći frekvencije alela utvrđene u (b) u vezi sa klasifikacijom zigotnosti iz (c),
pri čemu se (b)-(d) izvode na jednom ili više procesora koji rade prema programskim instrukcijama za određivanje, klasifikaciju i procenu; i
pri čemu klasifikacija u (c) klasifikuje najmanje jedan naznačeni polimorfizam u jednu od sledećih kombinacija: (i) trudna individua je homozigotna i fetus je homozigotni, (ii) trudnica je homozigotna i fetus je heterozigotan, (iii) trudnica je heterozigotna i fetus je homozigotni, i (iv) trudna jedinka je heterozigotna i fetus je heterozigotan.
[0007] Pronalazak dalje obezbeđuje aparat za procenu frakcije fetalne DNK u DNK dobijenoj iz telesne tečnosti trudne individue, pri čemu aparat sadrži:
(a) sekvencer konfigurisan da (i) prima DNK ekstrahovanu iz uzorka telesne tečnosti koja sadrži DNK i genoma majke i genoma fetusa, i (ii) sekvencira ekstrahovanu DNK pod uslovima koji proizvode sekvence segmenata DNK koje sadrže jednu ili više naznačenih polimorfizama; i
(b) računarski aparat konfigurisan da daje uputstva jednom ili više procesora
poravnati ili na drugi način mapirati sekvence nukleinske kiseline na jedan ili više naznačenih polimorfizama na referentnoj sekvenci,
određuje frekvencije alela mapiranih sekvenci DNK segmenta za najmanje jedan od naznačenih polimorfizama;
klasifikuje najmanje jednog naznačenog polimorfizma na osnovu kombinacije zigotnosti trudne individue i zigotnosti fetusa;
procentualni udeo fetalne DNK u DNK dobijenoj od trudne individue koristeći frekvencije alela u vezi sa klasifikacijom zigotnosti; i
pri čemu je računarski aparat dalje konfigurisan da uputi jednom ili više procesora da klasifikuju najmanje jedan naznačeni polimorfizam u jednu od sledećih kombinacija: (i) trudna individua je homozigotna i fetus je homozigotni, (ii) trudnica je homozigotna i fetus je heterozigotan, (iii) trudnica je heterozigotna i fetus je homozigotni, i (iv) trudna jedinka je heterozigotna i fetus je heterozigotan.
[0008] Određena obelodanjena otelotvorenja se odnose na računarske postupke pouzdanog merenja relativne količine fetalne slobodno plutajuće DNK sekvenciranjem uzorka krvi majke.
[0009] U specifičnim otelotvorenjima, pronalazak kako je definisan priloženim patentnim zahtevima obezbeđuje postupke pouzdane procene fetalne frakcije iz polimorfizama kao što su male varijacije baze ili umetanja-delecije koje su robusne u odnosu na etničku pripadnost roditelja, pol embriona, gestacionu starost i druge faktore sredine. Mnogi primeri koji su ovde obelodanjeni koriste SNP kao relevantan polimorfizam. Pronalazak se može primeniti kao deo namernog, unapred dizajniranog ispitivanja ponovnog sekvenciranja usmerene protiv poznatih polimorfizama ili može da se koristi u retrospektivnoj analizi varijacija pronađenih slučajnošću u preklapajućim sekvencama generisanim iz majčinske plazme (ili bilo koje druge postavke gde je smeša DNK od nekoliko osoba).
[0010] Ovaj dokument predstavlja tehnike za procenu frakcionog obilja fetalne DNK u uzorcima krvi majke. Određene obelodanjene tehnike koriste uočene frekvencije alela SNP-ova pronađenih slučajno ili pronađenih u panelima prethodno poznatih SNP-ova dizajniranih u svrhu procene fetalne frakcije.
[0011] Ovde opisane tehnike i aparati mogu se koristiti u mnogim slučajevima za procenu frakcije nukleinske kiseline iz jednog genoma u mešavini dva genoma, koji mogu, ali ne moraju biti povezani kao roditeljski i dečji genom.
[0012] Određeni aspekti obelodanjivanja se odnose na postupke procene frakcije fetalne DNK u DNK dobijenoj iz telesne tečnosti trudne individue. Takvi postupci mogu se okarakterisati sledećim operacijama: (a) primanje uzorka telesne tečnosti; (b) ekstrahovanje DNK iz uzorka pod uslovima koji izdvajaju DNK i genoma majke i genoma fetusa koji je prisutan u telesnoj tečnosti; (c) sekvenciranje ekstrahovane DNK sekvencerom nukleinske kiseline pod uslovima koji proizvode sekvence DNK segmenta koji sadrže jedan ili više polimorfizama; (d) mapiranje sekvenci DNK segmenta izvedenih sekvenciranjem DNK u telesnoj tečnosti u jedan ili više naznačenih polimorfizama na referentnoj sekvenci; (e) određivanje frekvencije alela mapiranih sekvenci DNK segmenta za najmanje jedan od naznačenih polimorfizama; (f) klasifikovanje najmanje jednog naznačenog polimorfizma na osnovu kombinacije zigotnosti trudne individue i zigotnosti fetusa; i (g) procenu frakcije fetalne DNK u DNK dobijenoj od trudne individue koristeći frekvencije alela određene u (e) i kombinaciju zigotnosti iz (f).
[0013] Mapiranje se može izvršiti korišćenjem računarskog aparata programiranog da mapira sekvence nukleinskih kiselina na jedan ili više naznačenih polimorfizama. Generalno, bilo koja od operacija (d)-(g) može se izvršiti na jednom ili više procesora koji rade prema programskim instrukcijama.
[0014] U određenim otelotvorenjima, DNK dobijena iz telesne tečnosti trudne individue je DNK bez ćelija dobijena iz plazme individue osobe. Tipično, sekvenciranje se sprovodi bez selektivnog pojačavanja bilo kog od jednog ili više naznačenih polimorfizama.
[0015] U određenim otelotvorenjima, mapiranje segmenata DNK dobijenih iz krvi pojedinca koji nosi fetus obuhvata kompjutersko mapiranje segmenata u bazu podataka polimorfizama. U određenim otelotvorenjima, klasifikacija u (f) klasifikuje najmanje jedan naznačeni polimorfizam u jednu od sledećih kombinacija: (i) trudna individua je homozigotna i fetus je homozigotni, (ii) trudnica je homozigotna i fetus je heterozigotan, (iii) trudnica je heterozigotna i fetus je homozigotni, i (iv) trudna individua je heterozigotna i fetus je heterozigotan.
[0016] Mogu se koristiti različite operacije filtriranja. Ovo uključuje, na primer, uklanjanje iz razmatranja bilo kog polimorfizma klasifikovanog u kombinaciju (i) ili kombinaciju (iv). U drugom primeru, metode dalje uključuju filtriranje najmanje jednog naznačenog polimorfizma da bi se uklonio iz razmatranja svaki polimorfizam koji ima manju frekvenciju alela veću od definisanog praga. U još jednom primeru, postupci uključuju operaciju filtriranja najmanje jednog naznačenog polimorfizma da bi se uklonio iz razmatranja svaki polimorfizam koji ima manju frekvenciju alela manju od definisanog praga.
[0017] Operacija klasifikacije se može primeniti na različite načine. Na primer, može uključiti primenu praga na frekvenciju alela utvrđenu u (e). U drugom primeru, operacija klasifikacije uključuje primenu podataka o frekvenciji alela iz (e), dobijenih za mnoštvo polimorfizama, na model mešavine. U jednoj implementaciji, model mešavine koristi faktorske momente.
[0018] Fetalna frakcija određena kao što je ovde opisano može se koristiti za različite primene. U nekim primerima, postupci opisani ovde uključuju operaciju izvršavanja programskih instrukcija na jednom ili više procesora da bi se automatski snimio deo fetalne DNK kao što je određeno u (g) u medicinskom kartonu pacijenta, uskladištenom na računaru čitljivom medijumu, za trudnu individuu. Medicinski karton pacijenta može da vodi laboratorija, ordinacija lekara, bolnica, organizacija za održavanje zdravlja, osiguravajuća kompanija ili veb stranica lične medicinske dokumentacije. U drugoj aplikaciji, procena frakcije fetalne DNK se koristi za prepisivanje, započinjanje i/ili izmenu tretmana humanog ispitanika od koga je uzet testni uzorak majke. U drugoj aplikaciji, procena frakcije fetalne DNK se koristi za naručivanje i/ili izvođenje jednog ili više dodatnih testova.
[0019] Drugi aspekt obelodanjivanja se tiče aparata za procenu frakcije fetalne DNK u DNK dobijenoj iz telesne tečnosti trudne individue. Takav uređaj se može okarakterisati sledećim karakteristikama: (a) sekvencer konfigurisan da (i) prima DNK ekstrahovanu iz uzorka telesne tečnosti koja sadrži DNK i genoma majke i genoma fetusa, i (ii) sekvencira ekstrahovanu DNK pod uslovima koji proizvode sekvence segmenata DNK koje sadrže jednu ili više naznačenih polimorfizama; i (b) računarski aparat konfigurisan da (npr., programiran da) daje uputstva jednom ili više procesora da izvode različite operacije kao što su one opisane sa dva ili više postupaka opisanih ovde. U nekim otelotvorenjima, računarski aparat je konfigurisan da (i) mapira sekvence nukleinske kiseline na jedan ili više naznačenih polimorfizama na referentnoj sekvenci, (ii) odredi frekvencije alela mapiranih sekvenci DNK segmenta za najmanje jedan od naznačenih polimorfizama, (iii) klasifikovati najmanje jedan označeni polimorfizam na osnovu kombinacije zigotnosti trudne individue i zigotnosti fetusa, i (iv) proceniti udeo fetalne DNK u DNK dobijenoj od trudne individue koristeći frekvencije alela i kombinacija zigotnosti.
[0020] U određenim otelotvorenjima, aparat takođe uključuje alat za ekstrakciju DNK iz uzorka pod uslovima koji ekstrahuju DNK iz genoma majke i genoma fetusa. U nekim implementacijama, aparat uključuje modul konfigurisan da ekstrahuje DNK bez ćelija dobijenu iz plazme trudne individue za sekvencioniranje u sekvenceru.
[0021] U nekim primerima, aparat uključuje bazu podataka polimorfizama. Računarski aparat može biti dalje konfigurisan da naloži jednom ili više procesora da mapiraju DNK segmente dobijene iz krvi pojedinca koji nosi fetus kompjuterskim mapiranjem segmenata u bazu podataka polimorfizama. Sekvence u bazi podataka su primer referentne sekvence. Drugi primeri referentnih sekvenci su predstavljeni u nastavku.
[0022] U određenim otelotvorenjima, računarski aparat dalje konfigurisan da uputi jednom ili više procesora da klasifikuju najmanje jedan naznačeni polimorfizam u jednu od sledećih kombinacija: (i) trudna individua je homozigotna i fetus je homozigotni, (ii) trudnica je homozigotna i fetus je heterozigotan, (iii) trudnica je heterozigotna i fetus je homozigotni, i (iv) trudna individua je heterozigotna i fetus je heterozigotan. U nekim otelotvorenjima, računarski aparat je dalje konfigurisan da naloži jednom ili više procesora da uklone iz razmatranja svaki polimorfizam klasifikovan u kombinaciju (i) ili kombinaciju (iv).
[0023] U određenim otelotvorenjima, računarski aparat je dalje konfigurisan da naloži jednom ili više procesora da uklone iz razmatranja svaki polimorfizam koji ima manju frekvenciju alela veću od definisanog praga. U određenim otelotvorenjima, računarski aparat je dalje konfigurisan da uputi jednom ili više procesora da filtriraju jedan ili više naznačenih polimorfizama kako bi uklonili iz razmatranja svaki polimorfizam koji ima manju frekvenciju alela manju od definisanog praga. U određenim otelotvorenjima, računarski aparat je dalje konfigurisan da naloži jednom ili više procesora da klasifikuju najmanje jedan naznačeni polimorfizam primenom praga na frekvenciju alela.
[0024] U određenim otelotvorenjima, računarski aparat je dalje konfigurisan da uputi jednom ili više procesora da klasifikuju najmanje jedan naznačeni polimorfizam primenom podataka o frekvenciji alela dobijenih za mnoštvo polimorfizama, na model mešavine. Model mešavine može koristiti faktorske momente.
[0025] U određenim otelotvorenjima, računarski aparat je dalje konfigurisan da naloži jednom ili više procesora da automatski zabeleže deo fetalne DNK u medicinskom kartonu pacijenta, uskladištenom na računarski čitljivom medijumu, za trudnicu. Medicinski karton pacijenta može da vodi laboratorija, ordinacija lekara, bolnica, organizacija za održavanje zdravlja, osiguravajuća kompanija ili veb stranica lične medicinske dokumentacije.
[0026] Drugi aspekt obelodanjivanja se odnosi na postupke procene frakcije fetalne DNK u DNK dobijenoj iz telesne tečnosti trudne individue prema sledećim operacijama: (a) mapiranje segmenata DNK dobijenih iz telesne tečnosti trudne individue u veći broj polimorfističkih sekvenci, pri čemu je DNK sekvencionirana pod uslovima koji identifikuju mnoštvo sekvenci polimorfizma; (b) određivanje frekvencije alela mapiranih nukleinskih kiselina za svaku od niza polimorfnih sekvenci; i (c) primenu frekvencija alela na model mešavine da bi se dobila procena udela fetalne DNK u DNK dobijenoj iz krvi pojedinca koji nosi fetus. Bilo koja ili više operacija (a)-(c) može se izvesti na jednom ili više procesora koji rade prema programskim instrukcijama. U određenim otelotvorenjima, operacija (c) uključuje izvršavanje instrukcija na jednom ili više procesora za rešavanje niza jednačina za faktorske momente podataka o frekvenciji alela za svaku od mnoštva sekvenci polimorfizma. U nekim otelotvorenjima, model mešavine uzima u obzir grešku sekvenciranja.
[0027] U određenim otelotvorenjima, postupci dodatno uključuju kompjutersko uklanjanje frekvencija alela za polimorfizme za koje je identifikovano da su heterozigotni i kod fetusa i kod trudne individue. U nekim implementacijama, pre (c), postupci uključuju operaciju računarskog uklanjanja frekvencija alela za polimorfizme za koje je identifikovano da su homozigotni i kod fetusa i kod trudne osobe. U nekim implementacijama, pre (c), postupci uključuju operaciju kompjuterskog uklanjanja frekvencija alela za polimorfizme za koje je identifikovano da su heterozigotni kod trudne osobe.
[0028] DNK dobijena iz telesne tečnosti trudne osobe može biti DNK bez ćelija dobijena iz plazme trudne osobe. Mapiranje nukleinskih kiselina dobijenih iz telesne tečnosti može se primeniti mapiranjem segmenata u bazu podataka polimorfizama.
[0029] Postupci ovog aspekta obelodanjivanja mogu dalje da obuhvataju sekvenciranje DNK iz telesne tečnosti trudne individue sa sekvencerom nukleinske kiseline pod uslovima koji proizvode sekvence DNK segmenta koji sadrže sekvence polimorfizma.
[0030] U nekim implementacijama, mapiranje u (a) obuhvata identifikaciju množine sekvenci bialelnog polimorfizma. U drugim otelotvorenjima, mapiranje u (a) obuhvata mapiranje segmenata DNK u više unapred definisanih sekvenci polimorfizma.
[0031] U nekim otelotvorenjima, postupci ovog aspekta dodatno uključuju izvršavanje programskih instrukcija na jednom ili više procesora za automatsko snimanje frakcije fetalne DNK kao što je određeno u (c) u medicinskom kartonu pacijenta, uskladištenom na računaru čitljivom mediju, za trudnu individuu. Medicinski karton pacijenta može da vodi laboratorija, ordinacija lekara, bolnica, organizacija za održavanje zdravlja, osiguravajuća kompanija ili veb stranica lične medicinske dokumentacije.
[0032] Na osnovu procene frakcije fetalne DNK, metode ovog aspekta mogu dalje da obuhvataju propisivanje, započinjanje i/ili promenu tretmana ljudskog subjekta od koga je uzet testni uzorak majke. Na osnovu procene frakcije fetalne DNK, metode ovog aspekta mogu dalje uključivati naručivanje i/ili izvođenje jednog ili više dodatnih testova.
[0033] U skladu sa još jednim aspektom obelodanjivanja, obezbeđuju se metode za procenu frakcije fetalne DNK u DNK dobijenoj iz telesne tečnosti trudne individue korišćenjem sledećih operacija: (a) primanje uzorka telesne tečnosti; (b) ekstrahovanje DNK iz uzorka pod uslovima koji izdvajaju DNK i genoma majke i genoma fetusa koji je prisutan u telesnoj tečnosti; (c) sekvenciranje ekstrahovane DNK sa sekvencerom nukleinske kiseline pod uslovima koji proizvode sekvence DNK segmenta; (d) poređenje sekvenci DNK segmenta izvedenih iz telesne tečnosti i iz poređenja identifikujući jedan ili više bialelnih polimorfizama; (e) određivanje frekvencija alela sekvenci DNK segmenta za najmanje jedan od identifikovanih polimorfizama; (f) klasifikovanje najmanje jednog identifikovanog polimorfizma na osnovu kombinacije zigotnosti trudne individue i zigotnosti fetusa; i (g) procenu frakcije fetalne DNK u DNK dobijenoj od trudne individue koristeći frekvencije alela određene u (e) i kombinaciju zigotnosti iz (f).
[0034] Mapiranje se može izvršiti korišćenjem računarskog aparata programiranog da mapira sekvence nukleinskih kiselina na jedan ili više naznačenih polimorfizama. Generalno, bilo koja od operacija (d)-(g) može se izvršiti na jednom ili više procesora koji rade prema programskim instrukcijama.
[0035] U određenim primenama ovog aspekta, sekvence DNK segmenta imaju dužinu između oko 20 parova baza i oko 300 parova baza.
[0036] U određenim otelotvorenjima ovog aspekta, klasifikacija u (f) klasifikuje najmanje jedan identifikovani polimorfizam u jednu od sledećih kombinacija: (i) trudna individua je homozigotna i fetus je homozigotni, (ii) trudnica je homozigotna i fetus je heterozigotan, (iii) trudnica je heterozigotna i fetus je homozigotni, i (iv) trudna individua je heterozigotna i fetus je heterozigotan. Postupci mogu dalje uključivati uklanjanje iz razmatranja bilo kog polimorfizma klasifikovanog u kombinaciju (i) ili kombinaciju (iv).
[0037] U skladu sa različitim otelotvorenjima, postupci ovog aspekta mogu uključivati operacije filtriranja i/ili klasifikacije kao što je ovde opisano u vezi sa drugim aspektima. Na primer, postupci ovog aspekta mogu uključivati filtriranje jednog ili više identifikovanih polimorfizama da bi se uklonio iz razmatranja svaki polimorfizam koji ima manju frekvenciju alela veću od definisanog praga. U nekim slučajevima, klasifikacija najmanje jednog identifikovanog polimorfizma uključuje primenu praga na frekvenciju alela utvrđenu u (e). Upotreba modela mešavine može se, kako je ovde opisano, upotrebiti za klasifikaciju identifikovanih polimorfizama.
[0038] Drugi aspekt obelodanjivanja se tiče aparata za procenu frakcije fetalne DNK i uključuje sledeće elemente: (a) sekvencer konfigurisan za (i) primanje DNK ekstrahovane iz uzorka telesne tečnosti koji sadrži DNK i genoma majke i genoma fetusa, i (ii) sekvenciranje ekstrahovane DNK da bi se proizveli segmenti sekvence DNK; i (b) računarski aparat konfigurisan da uputi jednom ili više procesora da (i) mapiraju segmente sekvence DNK dobijene iz telesne tečnosti trudne individue u mnoštvo sekvenci polimorfizma, (ii) odrede frekvenciju alela za svaku od mnoštvo sekvenci polimorfizma iz mapiranih segmenata sekvence DNK, i (iii) primeniti frekvencije alela na model mešavine da bi se dobila procena frakcije fetalne DNK u DNK dobijenoj iz krvi pojedinca koji nosi fetus.
[0039] Još jedan aparat za procenu frakcije fetalne DNK uključuje sledeće elemente: (a) sekvencer konfigurisan da (i) prima DNK ekstrahovanu iz uzorka telesne tečnosti koja sadrži DNK i genoma majke i genoma fetusa, i (ii) sekvencira ekstrahovanu DNK pod uslovima koji proizvode sekvence DNK segmenta; i (b) računarski aparat konfigurisan da uputi jednom ili više procesora da (i) uporede sekvence segmenata DNK izvedene iz telesne tečnosti i iz
1
poređenja identifikujući jedan ili više bialelnih polimorfizama, (ii) odrede frekvencije alela sekvenci DNK segmenta za najmanje jedan od identifikovanih polimorfizama, (iii) klasifikovati najmanje jedan identifikovani polimorfizam na osnovu kombinacije zigotnosti trudne individue i zigotnosti fetusa, i (iii) proceniti udeo fetalne DNK u DNK dobijeno od trudne individue korišćenjem frekvencija alela i kombinacije zigotnosti.
[0040] Instrukcije i/ili hardver korišćen u aspektima aparata koji su ovde opisani mogu da obezbede izvršenje bilo koje jedne ili više računskih ili algoritamskih operacija aspekata postupaka koji su ovde obelodanjeni, bez obzira da li su takve operacije eksplicitno navedene iznad.
[0041] Ove i druge karakteristike i prednosti obelodanjenih otelotvorenja će biti opisane detaljnije u nastavku sa referencom na povezane crteže.
KRATAK OPIS SLIKA
[0042]
Slika 1 je blok dijagram koji prikazuje klasifikaciju stanja zigotnosti fetusa i majke za datu genomsku poziciju.
Slika 2 je primer toka procesa za implementaciju nekih od obelodanjenih otelotvorenja. Slika 3 predstavlja procene greške sekvencioniranim baznim položajem preko 30 traka podataka Illumina GA2 usklađenih sa ljudskim genomom HG18 korišćenjem Elanda sa podrazumevanim parametrima.
Slika 4 je dijagram manjeg broja alela A u odnosu na pokrivenost D (pod pretpostavkom da nema greške) za slučajeve heterozigotnosti 1 do 4.
Slika 5 prikazuje transformaciju podataka Slučaja 3 u Slučaj 2.
Na Slici 6 prikazani su podaci posle rotacije, u kojima je D1 izabran tako da se Slučaj 1 i Slučajevi 2, 3 ne preklapaju. E1 predstavlja gornju granicu od 99 procenata gornjeg intervala poverenja podataka slučaja 1.
Slika 7 prikazuje poređenje rezultata korišćenjem modela mešavine i poznate frakcije fetusa i procenjene frakcije fetusa.
Slika 8 pokazuje da korišćenje stope mašinske greške kao poznatog parametra smanjuje pristrasnost naviše za jednu tačku.
Na Slici 9 je prikazano da simulirani podaci koji koriste stopu mašinske greške kao poznati parametar, poboljšanje modela greške slučaja 1 i 2 u velikoj meri smanjuje pristrasnost naviše na manje od tačke za frakciju fetusa ispod 0,2.
Slika 10 je šematski prikaz računarskog sistema koji, kada je na odgovarajući način konfigurisan (npr., programiran) ili dizajniran, može poslužiti kao aparat za analizu za obelodanjena otelotvorenja.
Slike 11A i B prikazuju histogram broja varijantnih opservacija (učestalost) na procentu manjeg alela (A/D) za hromozome 1(A) i hromozom 7 kao što je proizvedeno u primeru. Slike 12A i B prikazuju distribuciju alelne frekvencije duž hromozoma 1 (A) i hromozoma 7.
DETALJNI OPIS
Uvod i pregled
[0043] Određena obelodanjena otelotvorenja uključuju analizu DNK uzete iz krvi trudnice i korišćenje analize za procenu frakcije te DNK koja potiče od fetusa. Fetalna frakcija DNK se zatim može koristiti za pripisivanje nekog nivoa poverenja drugom metriku ili karakterizaciji fetusa na osnovu nezavisne analize DNK uzete iz krvi majke. Na primer, uzorak fetalne DNK uzet iz krvi majke može se zasebno analizirati da bi se otkrila aneuploidija u fetusu koji nosi trudna žena. Određivanje aneuploidije izvršeno ovom posebnom analizom može se dati statistički zasnovanim nivoom pouzdanosti zasnovanom na frakcionoj količini fetalne DNK prisutne u DNK uzetoj iz krvi majke. Relativno niske frakcije fetalne DNK u ukupnom komplementu DNK sugerišu nisko poverenje u bilo koju karakterizaciju zasnovanu na fetalnoj DNK.
[0044] Obično, iako ne nužno, analizirana DNK u majčinoj krvi je DNK bez ćelija, iako u nekim otelotvorenjima to može biti DNK vezana za ćelije. DNK bez ćelija se uzima iz plazme majke. Količina fetalne DNK u sadržaju DNK bez ćelija uzetom od trudnica uveliko varira u zavisnosti od niza faktora uključujući gestacionu starost fetusa. Za tipične trudne žene, trenutno se veruje da je oko 5-20% DNK bez ćelija fetalna DNK. Međutim, nije neuobičajeno da je fetalna frakcija značajno niža (npr., oko 1% ili niže). U takvim slučajevima, svaka odvojena karakterizacija fetalne DNK može biti inherentno sumnjiva. S druge strane, neki istraživači su prijavili uzorke DNK bez ćelija majke koji imaju frakcije fetalne DNK čak 40% ili 50%.
[0045] U određenim implementacijama koje su ovde opisane, određivanje fetalne frakcije DNK majke oslanja se na višestruka očitavanja sekvence DNK na mestima sekvenci za koja je poznato da sadrže jedan ili više polimorfizama. Tipično, iako ne nužno, takvi polimorfizmi su jednonukleotidni polimorfizmi (SNP). Druge vrste pogodnih polimorfizama uključuju delecije, STR-ove (kratka tandemska ponavljanja), umetanja, indele (uključujući mikroindele), itd. Dodatni primeri su predstavljeni u nastavku. U određenim otelotvorenjima, mesta polimorfizma se nalaze na "referentnoj sekvenci" kao što je opisano u nastavku. U nekim otelotvorenjima, mesta polimorfizma se otkrivaju tokom poravnavanja oznaka sekvence jedna sa drugom i/ili referentnom sekvencom.
[0046] Određeni obelodanjeni postupci koriste činjenicu da sekvence DNK fetusa na mestima polimorfizma koja se razmatraju možda ne odgovaraju onima njegove majke. Na primer, DNK majke na mestu određenog SNP-a može biti homozigotna, dok će fetusova verzija SNP-a biti heterozigotna. Stoga će kolekcija uzoraka sekvenci uzetih za SNP u pitanju biti heterogena sa većinom sekvenci koje sadrže glavni alel, a preostala frakcija sadrži manji alel. Relativna količina glavnih i sporednih alela određena je frakcijom fetalne DNK u uzorku.
[0047] Treba napomenuti da u homozigotnom uzorku obe kopije datog SNP ili drugog polimorfizma sadrže isti alel, dok heterozigotni SNP ili drugi polimorfizam sadrži jednu kopiju glavnog alela i jednu kopiju sporednog alela. Zna se, dakle, da DNK uzeta isključivo od heterozigotne osobe treba da sadrži 50% glavnog alela i 50% manjeg alela. Ovo znanje se može koristiti za razjašnjavanje frakcije fetalne DNK kao što je navedeno u nastavku. Kao što je detaljnije objašnjeno u nastavku, različiti postupci obelodanjeni ovde razmatraju samo polimorfizme u kojima postoje samo dva alela u DNK majke i fetusa, zajedno.
[0048] U nekim implementacijama, DNK uzeta iz krvi majke se čita mnogo puta, pri čemu se ukupan broj čitanja mapiranih na određeno mesto polimorfizma smatra „pokrivanjem“ polimorfizma, a broj čitanja mapiranih na manji alel jer se taj polimorfizam smatra manjim brojem alela. Odnos broja manjih alela i pokrivenosti je važan u različitim primenama.
[0049] Određeni postupci koje su ovde obelodanjeni identifikuju i karakterišu četiri slučaja polimorfizma u DNK uzorcima koji sadrže DNK i majke i fetusa. Slika 1 ispod prikazuje ova četiri slučaja. Konkretno, u prvom slučaju, koji je prilično nezanimljiv, i majka i fetus su homozigotni po konkretnom polimorfizmu koji se razmatra. U tom slučaju, svaka sekvenca u uzorku DNK koja sadrži dotični polimorfizam će sadržati isti alel i ne može se prikupiti
1
nikakva informacija o relativnim količinama DNK od majke i fetusa. Međutim, treba napomenuti da bi ovaj slučaj mogao biti zanimljiv u smislu da omogućava istraživaču ili tehničaru da stekne neku ideju o relativnoj stopi greške aparata za sekvenciranje DNK koji se koristi za generisanje podataka o sekvenci koja se razmatra.
[0050] Drugi slučaj na koji će se analiza susresti je polimorfizam za koji je trudnica homozigotna, a fetus heterozigotan. U ovom slučaju, relativno mali, ali ipak značajan deo detektovanih sekvenci će sadržati manji alel. Konkretno, u ovom drugom slučaju, frekvencija manjeg alela je nominalno data frakcijom fetalne DNK u krvotoku majke podeljenom sa dva.
[0051] U trećem slučaju, polimorfizam koji se razmatra je heterozigotan u DNK majke i homozigotan u DNK fetusa. U ovoj situaciji, frekvencija manjeg alela je nominalno data sa 0,5 minus polovina frakcije fetalne DNK u uzorku DNK.
[0052] Konačno, u četvrtom slučaju, polimorfizam koji se razmatra je heterozigotan i kod majke i kod fetusa. U ovom slučaju, očekuje se da će frekvencija i major i minor alela biti 0,5. Kao i kod prvog slučaja, četvrti slučaj je relativno nezanimljiv za određivanje fetalne frakcije DNK.
[0053] Ako bi istraživač, tehničar ili softver zadužen za određivanje frakcije fetalne DNK u uzorku znao za dati polimorfizam kome od četiri slučaja pripada taj polimorfizam, tada bi se deo fetalne DNK mogao direktno proceniti, pod pretpostavkom da je polimorfizam pod razmatranje spada u slučaj dva ili slučaj tri. U praksi, međutim, stručnjak ne može takvo znanje da ima a priori. Zbog toga je potreban računarski aparat za izvođenje operacija opisanih ovde.
[0054] U određenim otelotvorenjima, opisanim negde drugde, primenjuje se tehnika postavljanja praga da se jedan polimorfizam klasifikuje u jedan od četiri slučaja. Kada se polimorfizam tako klasifikuje i utvrdi da se nalazi u bilo kom slučaju 2 ili 3, može se proceniti fetalna frakcija. U drugim otelotvorenjima, tehnika uzima u obzir višestruke polimorfizme raspoređene po celom ili delu genoma. Kao što je ilustrovano u specifičnim primerima, višestruki različiti SNP-ovi širom genoma mogu se koristiti u ovu svrhu.
[0055] U posebnim otelotvorenjima, frekvencija alela je određena za niz različitih polimorfizama u uzorku DNK uzetom iz uzorka krvi majke. Za ovaj mnoštvo polimorfizama, neka frakcija će odgovarati slučaju zigotnosti 1, druga frakcija će odgovarati slučaju 2, treća frakcija će odgovarati slučaju 3, a konačna frakcija će odgovarati slučaju 4. Ovi razlomci će se zbrati u vrednosti od 1. Model mešavine ili srodna tehnika može se koristiti da bi se otkrilo jedno ili više statističkih svojstava polimorfizama u svakoj od ove četiri kategorije.
Konkretno, model mešavine se može koristiti za određivanje srednje vrednosti i opciono varijanse za svaki od četiri slučaja koji se susreću u uzorku DNK uzetom iz krvi trudnice. U specifičnim otelotvorenjima, ovo je srednja vrednost i varijansa povezana sa učestalošću manjeg alela u odnosu na ukupan broj brojanja za polimorfizam koji se razmatra (pokriće). Kao što je objašnjeno na drugom mestu ovde, srednje vrednosti za svaku od ove četiri kategorije, ili barem za drugu i treću kategoriju, direktno su povezane sa fetalnom frakcijom u DNK uzetoj iz krvi majke.
[0056] U specifičnoj implementaciji koja koristi modele mešavine, jedan ili više faktorskih momenata se izračunavaju za svaku poziciju gde se razmatra polimorfizam. Na primer, faktorski moment (ili kolekcija faktorskih momenata) se izračunava korišćenjem višestrukih SNP pozicija koje se razmatraju u DNK sekvenci. Kao što je prikazano u jednačini 4 ispod, svaki od različitih faktorskih momenata je zbir svih različitih SNP pozicija koje se razmatraju za odnos frekvencije manjeg alela i pokrivenosti za datu poziciju. Kao što je prikazano u jednačini 5 u nastavku, ovi faktorski momenti su takođe povezani sa parametrima povezanim sa svakim od četiri slučaja zigotnosti opisana iznad. Konkretno, oni su se odnosili na verovatnoću za svaki od slučajeva, kao i na relativne količine svakog od četiri slučaja u kolekciji polimorfizama koji se razmatraju. Kao što je objašnjeno, verovatnoća je funkcija frakcije fetalne DNK u DNK bez ćelija u krvi majke. Kao što je detaljnije objašnjeno u nastavku, izračunavanjem dovoljnog broja ovih faktorskih momenata (koji su prikazani u jednačini 4), postupak obezbeđuje dovoljan broj izraza za rešavanje svih nepoznatih.
Nepoznate u ovom slučaju bi bile relativne količine svakog od četiri slučaja u populaciji polimorfizama koji se razmatraju, kao i verovatnoće (i stoga frakcije fetalne DNK) povezane sa svakim od ova četiri slučaja. Videti jednačinu 5. Slični rezultati se mogu dobiti korišćenjem drugih verzija modela mešavine kao što je predstavljeno u jednačinama 7-12 ispod. Ove konkretne verzije koriste samo polimorfizme koji spadaju u slučajeve 1 i 2, pri čemu se polimorfizmi za slučajeve 3 i 4 filtriraju tehnikom granične vrednosti.
[0057] Prema tome, faktorski momenti se mogu koristiti kao deo modela mešavine da bi se identifikovale verovatnoće bilo koje kombinacije od četiri slučaja zigotnosti. I, kao što je
1
pomenuto, ove verovatnoće, ili barem one za drugi i treći slučaj, direktno su povezane sa frakcijom fetalne DNK u ukupnoj DNK bez ćelija u krvi majke.
[0058] Takođe treba napomenuti da se greška sekvenciranja može koristiti da bi se smanjila složenost sistema faktorskih jednačina momenta koji se moraju rešiti. U tom pogledu, treba priznati da greška sekvenciranja zapravo može imati bilo koji od četiri rezultata (koji odgovaraju svakoj od četiri moguće baze na bilo kojoj poziciji polimorfizma).
[0059] U određenim otelotvorenjima, oznake su usklađene sa referentnim hromozomom ili genomom, a bialelni polimorfizmi su identifikovani. Ovi polimorfizmi nisu unapred definisani ili drugačije identifikovani pre poravnanja. Oni se jednostavno identifikuju tokom poravnanja i zatim karakterišu na osnovu njihove zigotnosti i manjeg broja alela kao što je ovde opisano. Ove informacije se koriste za procenu frakcija genoma kako je ovde opisano.
[0060] Dužine oznaka koje se koriste u ovde opisanim realizacijama će generalno biti određene metodom sekvenciranja koja se koristi za generisanje oznaka. Postupci su robusni u širokom rasponu dužina oznaka. U određenim implementacijama, oznake su dužine između 20 i 300 parova baza (ili oko 30 do 100 parova baza).
[0061] Primer toka procesa za implementaciju nekih od otkrivenih izvođenja prikazan je na Slici 2. Kao što je tamo prikazano, proces počinje na 201 prikupljanjem DNK (bez ćelija ili vezanih ćelija) iz krvi majke ili druge telesne tečnosti. Iz ove DNK višestruke sekvence su mapirane u jedan ili više polimorfizama u referentnoj sekvenci. Ovo mapiranje obezbeđuje frekvenciju alela za svaki od polimorfizama. Videti blok 203.
[0062] Tačnije, proces u bloku 203 može uključivati čitanje sekvenci sakupljene DNK na lokacijama višestrukih polimorfizama. U nekim slučajevima, oni mogu biti generisani kao deo procesa za određivanje plodnosti ili drugog određivanja u vezi sa fetalnom DNK. Stoga, u nekim otelotvorenjima, odvojene sekvence ne moraju da se generišu. Čitane sekvence su poravnate sa referentnom sekvencom da bi se maksimalno poravnalo pomoću BLAST-a ili sličnog alata.
[0063] Referentna sekvenca može biti obezbeđena kao baza podataka polimorfizama. U nekim slučajevima, ovo je referentni skup za pretragu alela proizveden kombinatornim proširenjem svih definicija polimorfizma (npr., u slučaju kada su polimorfizmi SNP, sve SNP
1
sekvence). Pogledajte dodatak na primer. U specifičnom primeru, sekvence su dugačke oko 100 do 150 parova baza.
[0064] Vraćajući se na Sliku 2, postupak određuje kombinaciju zigotnosti majke i fetusa za jedan ili više polimorfizama koji se razmatraju u radu bloka 203. Videti blok 205. Model mešavine se može koristiti za ovu svrhu u određenim otelotvorenjima. Kao što je pomenuto, kombinacije su sledeće: M&F homozigot, M homozigot i F heterozigot, M heterozigot i F homozigot, i M&F heterozigot.
[0065] Konačno, kao što je ilustrovano u bloku 207, postupak koristi kombinaciju frekvencije alela slučaja zigotnosti na jednom ili više polimorfizama da bi se procenila frakciona količina fetalne komponente u DNK iz uzorka majke.
Definicije
[0066] Sledeća diskusija je data kao pomoć u razumevanju određenih aspekata i prednosti obelodanjenih otelotvorenja.
[0067] Termin "čitanje" se odnosi na sekvencu očitanu iz dela uzorka nukleinske kiseline. Tipično, iako ne nužno, čitanje predstavlja kratku sekvencu susednih parova baza u uzorku. Očitano može biti simbolično predstavljeno sekvencom para baza (u ATCG) dela uzorka. Može se uskladištiti u memorijskom uređaju i obraditi kako bi se utvrdilo da li odgovara referentnoj sekvenci ili ispunjava druge kriterijume. Očitavanje se može dobiti direktno iz aparata za sekvenciranje ili indirektno iz uskladištenih informacija o sekvenci u vezi sa uzorkom.
[0068] Termin "oznaka" se takođe odnosi na kratke sekvence iz uzorka nukleinske kiseline. Tipično, oznaka sadrži povezane informacije kao što je lokacija sekvence u genomu. Za neke svrhe, termini pročitani i oznaka su ovde zamenljivi. Tipično, međutim, čitanja sekvenci su usklađena sa referentnom sekvencom, a čitanja te mape na samo jednom mestu na referentnom genomu nazivaju se tagovima. „Segmentna sekvenca“ se ponekad ovde koristi naizmenično sa „oznakom“.
[0069] Često se ovde „čitanja“ opisuju kao sekvence nukleinskih kiselina koje su dugačke 36 parova baza (36 mera). Naravno, obelodanjena otelotvorenja nisu ograničena na ovu veličinu.
1
Manja i veća očitavanja su pogodna za mnoge primene. Za aplikacije koje usklađuju čitanja sa humanim genomom, očitavanje veličine 30 parova baza ili više se generalno smatra dovoljnim za mapiranje uzorka na jedan hromozom. Mnogo veće oznake/čitanja su pogodne za neke aplikacije. Sa sekvenciranjem celog genoma, može se koristiti očitavanje reda od 1000 parova baza ili više. U određenim otelotvorenjima, očitavanje može imati dužinu između oko 20 i 10.000 parova baza, ili između oko 30 i 1000 parova baza, ili između oko 30 i 50 parova baza.
[0070] "Referentna sekvenca" je sekvenca biološkog molekula, koji je često nukleinska kiselina kao što je hromozom ili genom. Obično su višestruka čitanja članovi date referentne sekvence. U određenim otelotvorenjima, čitanje ili oznaka se upoređuje sa referentnom sekvencom da bi se utvrdilo da li referentna sekvenca sadrži pročitanu sekvencu. Ovaj proces se ponekad naziva poravnanjem.
[0071] U različitim otelotvorenjima, referentna sekvenca je značajno veća od čitanja koja su usklađena sa njom. Na primer, može biti najmanje oko 100 puta veći, ili najmanje oko 1000 puta veći, ili najmanje oko 10.000 puta veći, ili najmanje oko 10<5>puta veći, ili najmanje oko 10<6>puta veći, ili najmanje oko 10<7>puta veći.
[0072] U jednom primeru, referentna sekvenca je ona humanog genoma pune dužine. Takve sekvence se mogu nazvati genomskim referentnim sekvencama. U drugom primeru, referentna sekvenca je ograničena na specifični ljudski hromozom kao što je hromozom 13. Takve sekvence se mogu nazvati hromozomskim referentnim sekvencama. Drugi primeri referentnih sekvenci uključuju genome drugih vrsta, kao i hromozome, subhromozomske regione (kao što su lanci), itd. bilo koje vrste.
[0073] U različitim otelotvorenjima, referentna sekvenca je konsenzusna sekvenca ili druga kombinacija izvedena od više pojedinaca. Međutim, u određenim aplikacijama, referentna sekvenca može biti preuzeta od određene osobe.
[0074] Termin "poravnanje" se odnosi na proces poređenja pročitane ili oznake sa referentnom sekvencom i na taj način određivanje da li referentna sekvenca sadrži pročitanu sekvencu. Ako referentna sekvenca sadrži pročitano, pročitano može biti mapirano na referentnu sekvencu ili, u određenim otelotvorenjima, na određenu lokaciju u referentnoj
1
sekvenci. U nekim slučajevima, poravnanje jednostavno govori da li je čitanje član određene referentne sekvence (tj., da li je čitanje prisutno ili odsutno u referentnoj sekvenci). Na primer, poravnanje očitavanja sa referentnom sekvencom za ljudski hromozom 13 će reći da li je pročitano prisutno u referentnoj sekvenci za hromozom 13. Alat koji pruža ove informacije može se nazvati tester članstva skupa. U nekim slučajevima, poravnanje dodatno ukazuje na lokaciju u referentnoj sekvenci na koju se čita čitanje ili oznaka. Na primer, ako je referentna sekvenca cela sekvenca ljudskog genoma, poravnanje može da ukaže na to da je očitavanje prisutno na hromozomu 13, i može dalje da ukaže da je očitavanje na određenom lancu hromozoma 13.
[0075] „Mesto“ je jedinstvena pozicija u referentnoj sekvenci koja odgovara čitanju ili oznaci. U određenim otelotvorenjima, on određuje identitet hromozoma (npr., hromozom 13), lanac hromozoma i tačnu poziciju u hromozomu.
[0076] "Polimorfno mesto" je lokus na kome dolazi do divergencije nukleotidne sekvence. Lokus može biti mali kao jedan bazni par. Ilustrativni markeri imaju najmanje dva alela, od kojih se svaki javlja sa učestalošću većom od 1%, a tipičnije većom od 10% ili 20% odabrane populacije. Polimorfno mesto može biti samo jedan par baza. Termini "polimorfni lokus" i "polimorfno mesto" se ovde koriste naizmenično.
[0077] "Polimorfna sekvenca" se ovde odnosi na sekvencu nukleinske kiseline, npr. DNK sekvenca, koja sadrži jedno ili više polimorfnih mesta, npr. jedan SNP ili tandem SNP.
Polimorfne sekvence prema sadašnjoj tehnologiji mogu se koristiti za specifično razlikovanje između majčinih i ne-majčinskih alela u uzorku majke koji sadrži mešavinu fetalnih i majčinih nukleinskih kiselina.
Detaljna otelotvorenja
[0078] Obično, ovde opisani procesi koriste referentnu sekvencu koja obuhvata jedan ili više polimorfizama i povezana je sa DNK koja se uzorkuje. Referentna sekvenca može biti, na primer, humani genom, hromozom ili region u hromozomu. Jedan ili više polimorfizama može se odrediti u svrhu procene frakcije fetalne DNK. Polimorfizmi koji su predviđeni za upotrebu u određivanju fetalne frakcije su polimorfizmi koji su unapred poznati. Na primer, sveobuhvatan spisak referenci, činjenica i informacija o sekvenci o već poznatim STR-ovima i srodnim podacima o populaciji se sastavljaju u STRBase, kojoj se može pristupiti preko
1
interneta na ibm4.carb.nist.gov:8800/dna/home.htm. Informacije o sekvenci sa GenBank®-a (http://www2.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/genbank) za najčešće korišćene STR lokuse su takođe dostupne preko STRBase. Informacijama o već poznatim SNP-ovima može se pristupiti putem dostupnih iz javno dostupnih baza podataka uključujući, ali ne ograničavajući se na bazu podataka ljudskih SNP-a na internet adresi wi.mit.edu, NCBI dbSNP početnu stranicu na veb adresi ncbi.nlm.nih.gov, svetska veb adresa lifesciences.perkinelmer.com, Applied Biosystems bi Life Technologies™ (Karlsbad, Kalifornija) na svetskoj veb adresi applibiosistems.com, Celera Human SNP baza podataka na adresi celera.com, SNP baza podataka Grupe za Analizu Genoma (GAN) na veb adresi gan.iarc.fr. U jednom otelotvorenju, SNP-ovi koji su određeni za određivanje fetalne frakcije su izabrani iz grupe od 92 pojedinačna identifikaciona SNP-a (IISNP) koje je opisao Pakstis el al. (Pakstis et el. Hum Genet 127:315-324 [2010]), za koje se pokazalo da imaju veoma malu varijaciju u učestalosti među populacijama (Fst < 0,06), i da su visoko informativne širom sveta sa prosečnom heterozigotnošću ≥ 0,4. SNP koji su od koristi u postupku pronalaska uključuju povezane i nepovezane SNP. Da bi se odredile odgovarajuće tandemske SNP sekvence, može se pretraživati baza podataka Međunarodnog HapMap konzorcijuma (The International HapMap Project, Nature 426:789-796 [2003]). Baza podataka je dostupna na svetskoj mreži na hapmap.org.
[0079] Polimorfizmi koji se tako koriste mogu biti paneli unapred poznatih polimorfizama namenjenih za određivanje frakcije fetalne DNK ili se mogu slučajno naći u analizi DNK majke za druge svrhe, kao što je mapiranje uzoraka DNK oznaka u hromozome.
[0080] U određenim otelotvorenjima, postupak obuhvata sekvencioniranje DNK u uzorku korišćenjem mešavine genoma, npr. uzorak majke koji sadrži DNK bez ćelija fetusa i majke, da bi se obezbedio veći broj oznaka sekvence koje se mapiraju na sekvence koje sadrže unapred poznata polimorfna mesta na referentnom genomu, i koristeći oznake mapirane na unapred poznatim mestima za određivanje fetalne frakcije kao što je detaljno opisano u nastavku. Alternativno, nakon sekvenciranja DNK, oznake sekvence koje se dobijaju tehnologijom sekvenciranja, npr. NGS, mapirani su u referentni genom, npr. hg19, i oznake sekvence koje se mapiraju na mesta na kojima se polimorfizmi javljaju slučajno, tj. nisu unapred poznati, koriste se za određivanje fetalne frakcije.
[0081] Referentna sekvenca na koju se oznake sekvence mapiraju na unapred poznata
2
polimorfna mesta, može biti objavljeni referentni genom ili može biti veštačka baza podataka ili druga unapred definisana kolekcija sekvenci za polimorfizme koji se razmatraju. Svaka od sekvenci baze podataka obuhvata jedan ili više nukleotida povezanih sa polimorfizmom. Kao jedan primer, pogledajte listu sekvenci polimorfizma predstavljenu ispod u „Dodatku 1“.
[0082] U različitim realizacijama, broj polimorfizama koji se koristi za procenu frakcije fetalne DNK je najmanje 2 polimorfizma, a tačnije za svaki od najmanje oko 10 polimorfizama, a poželjnije za svaki od najmanje oko 100 polimorfizama.
[0083] U jednom primeru, pokrivenost SNP i frekvencija alela se određuju poravnavanjem generisanih sekvenci sa referentnim genomom konstruisanim iz kombinatorne ekspanzije definicija SNP. Baza podataka amplikona sadrži informacije o bialelnim varijacijama okružene, na primer, sa najmanje oko 50 baza bočne sekvence. Na primer, amplikon sa nizom informacija o varijaciji „[g/c]“ (koji predstavlja alternativne alele „g“ i „c“ može izgledati ovako:
atcg.....accg[g/c]ccgt....
[0084] U nekim slučajevima, procedura za unos baze podataka amplikona i generisanih sekvenci i izlaznog broja SNP/alela je sledeća.
1. Kreirajte referentni skup za pretragu alela iz kombinatornog proširenja SNP definicija. Za svaku sekvencu u bazi podataka amplikona, za svaki alel u nizu informacija o varijaciji, kreirajte sekvencu alela sa nizom informacija o varijaciji zamenjenim alelom. a. Na primer, uzimajući u obzir gornji primer sekvence amplikona, stvorile bi se dve sekvence: 1) atcg.....accgGccgt.... I 2) atcg.....accgCccgt....
b. Primer kompletnog referentnog skupa za pretragu alela može se naći u listi sekvenci baze podataka za pretragu alela.
2. Mapirajte sekvence u referentni skup za pretragu alela, zadržavajući samo mapiranja koja odgovaraju samo jednoj sekvenci u skupu za pretragu.
3. Broj alela se određuje prebrojavanjem broja sekvenci koje odgovaraju njegovoj sekvenci alela.
[0085] Postupci obelodanjeni ovde pretpostavljaju „normalnu“ trudnoću, tj. trudnoću u kojoj majka nosi samo jedan fetus, a ne blizance, trojke, itd. Stručnjaci će ceniti modifikacije koje uzimaju u obzir nenormalne trudnoće, posebno one u kojima je poznat broj fetusa.
[0086] Kao što je naznačeno, prilikom određivanja frakcije fetusa, postupak sekvencira DNK u uzorku iz krvi majke i broji oznake sekvence koje se mapiraju na svaku sekvencu polimorfizma (polimorfizama) koji se razmatra. Za svaki polimorfizam, postupak zbraja ukupan broj čitanja koja se na njega mapiraju (pokrivenost) i broj oznaka sekvence povezanih sa svakim alelom (alel se računa). U jednostavnom primeru, polimorfizam koji ima pokrivenost od 5, može imati 3 čitanja alela B i 2 čitanja alela A. U ovom primeru, alel A se smatra manjim alelom, a alel B se smatra glavnim alelom.
[0087] U nekim otelotvorenjima, ova operacija koristi alate za veoma brzo sekvencioniranje kao što su alati za masovno paralelno sekvencioniranje DNK. Primeri takvih alata su detaljnije opisani u nastavku. U nekim slučajevima, hiljade ili milioni sekvenci oznaka se čitaju za jedan uzorak. Poželjno je da se sekvenciranje izvodi na način koji omogućava brzo i direktno dodeljivanje sekvencirane DNK određenim unapred definisanim sekvencama koje sadrže polimorfizme koji se razmatraju. Generalno, postoji dovoljno informacija za ovu svrhu u oznakama veličine 30 parova baza ili više. Oznake ove veličine mogu se nedvosmisleno mapirati u sekvence od interesa. U specifičnoj varijanti, sekvence oznaka koje se koriste u procesu imaju dužinu od 36 parova baza.
[0088] Oznake se mapiraju na referentni genom ili na sekvence u bazi podataka sekvenci alela (npr., videti Dodatak 1 kao što je prethodno pomenuto) i određuje se broj tako mapiranih oznaka. Ovo će obezbediti i pokrivenost i manji broj alela za svaki polimorfizam koji se razmatra. U nekim slučajevima, ovo se može uraditi istovremeno sa mapiranjem svake oznake na jedan od 23 humana hromozoma i određivanjem broja mapiranih oznaka po hromozomu.
[0089] Kao što je pomenuto, pokrivenost je ukupan broj pročitanih sekvenci koje se mapiraju na dati polimorfizam u referentnoj sekvenci. Broj alela u ukupnom broju pročitanih sekvenci koje se preslikavaju na takav polimorfizam koji imaju alel. Zbir svih broja alela mora biti jednak pokrivenosti. Alel sa najvećim brojem je glavni alel, a alel sa najmanjim brojem je manji alel. U određenim otelotvorenjima, jedina informacija potrebna za procenu frakcije fetalne DNK je pokrivenost i manji broj alela za svaki od mnoštva polimorfizama. U nekim otelotvorenjima, takođe se koristi stopa greške pri pozivanju baze u aparatu za sekvencioniranje DNK.
[0090] Korisno je razmotriti matematičke ili simboličke osnove određenih postupaka koji su ovde obelodanjeni. Kao što je pomenuto, u različitim primerima, sekvence generisane iz krvi majke su usklađene (superponirane tako da se identične baze maksimiziraju) prema referentnom genomu ili drugoj sekvenci nukleinske kiseline. Uzimajući u obzir genomsku poziciju, j, i skup sekvenci usklađenih sa referencom, neka broj pojavljivanja svake od četiri baze DNK ("a","t","g" i "c", takođe nazvan " alela"), među poređanim sekvencama biti w(j,1), w(j,2), w(j,3) i w(j,4) respektivno. Za potrebe ove diskusije može se pretpostaviti bez gubitka opštosti da su sve varijacije bialelne. Stoga se mogu koristiti sledeće oznake:
Broj major alela na genomskoj poziciji j as
kao statistika prvog reda brojanja na poziciji j (Glavni alel, b, je odgovarajući argmax.
Subskriptovi se koriste kada se razmatra više od jednog SNP-a.),
Broj minor alela na poziciji j as
kao statistika drugog reda brojanja (tj. drugi najveći broj alela) na poziciji j, Pokrivenost na poziciji j kao D ≡ Dj= {di} = Aj+ Bj, i
Stopa greške mašine za sekvenciranje je označena e.
[0091] Kada je kontekst jasan, oznake se koriste naizmenično radi pogodnosti; na primer, A, Ai ili {ai} se mogu koristiti naizmenično za manji alel ili manji broj alela. Subskriptovi se mogu ili ne moraju koristiti u zavisnosti od toga da li se razmatra više od jednog SNP. (SNP-ovi se koriste samo kao primer. Drugi tipovi polimorfizama se mogu koristiti kao što je diskutovano na drugom mestu u tekstu.).
[0092] Na Slici 1 prikazana je osnova za četiri stanja zigotnosti polimorfizma. Kao što je ilustrovano, majka može biti homo ili heterozigotna na datom polimorfizmu. Slično, beba može biti ili heterozigotna ili homozigotna na istoj poziciji. Kao što je ilustrovano, slučajevi 1 i 2 su slučajevi polimorfizma u kojima je majka homozigotna. Ako su i beba i majka homozigotni, polimorfizam je polimorfizam slučaja 1. Kao što je iznad navedeno, ova situacija obično nije posebno interesantna. Ako je majka homozigotna, a beba heterozigotna, fetalna frakcija, f, nominalno je data dvostrukim odnosom manjeg alela i pokrivenosti. U slučaju polimorfizma gde je majka heterozigotna, a beba homozigotna (slučaj 3 na Slici 1), fetalna frakcija je nominalno jedan minus dva puta veći odnos malog alela i pokrivenosti.
2
Konačno, u slučaju kada su i majka i fetus heterozigotni, manja frakcija alela uvek treba da bude 0,5, osim greške. Fetalna frakcija se ne može izvesti za polimorfizme koji spadaju u slučaj 4.
[0093] Četiri slučaja će sada biti dodatno razrađena.
Slučaj 1: Homozigotni majka i beba
[0094]
U ovom slučaju, bez greške u sekvenciranju ili kontaminacije, ne treba primetiti razlike. E(min. frekvencija alela) = E(A) = 0.
U praksi A ∼ (raspodela je kao) binomna raspodela koja je dobro aproksimirana Poasonovom raspodelom za mali np. Parametar stope distribucije za Binom ili Poason povezan je sa stopom greške sekvenciranja, e i pokrivenošću D. Slika 3 prikazuje frekvencije neusklađenosti generisanih sekvenci od 36 mera koje su usklađene sa ljudskim referentnim genomom.
Ovaj slučaj ne sadrži informacije o frakciji fetusa.
[0095] Slika 3 predstavlja procene greške sekvencioniranim baznim položajem preko 30 traka podataka Illumina GA2 usklađenih sa Humanim Genomom HG18 korišćenjem Elanda sa podrazumevanim parametrima.
Slučaj 2: Homozigotna majka i heterozigotna beba
[0096]
U ovom slučaju, za malu frakciju fetusa (f), posmatrane frekvencije alela će biti značajno različite. Sa glavnim alelom koji se obično javlja na frekvenciji nekoliko puta većoj od sporednog alela.
Greška zabrane, s obzirom na jednu SNP poziciju (D,A), E(A) = Df/2 i nepristrasna procena za f je 2A/D
Greška zabrane, A ∼ Binomni(f/2,D). Srednja vrednost Df/2, Varijansa (1-f/2)Df/2. [Približno normalno rastojanje ako je D>15].
Slučaj 3: Heterozigotna majka i homozigotna beba
[0097]
U ovom slučaju, posmatrane frekvencije za glavne i male alele su bliske i A/D je nešto ispod 0,5.
Greška zabrane, E( A ) = D(1-f)/2, i E( 1 - (2A/D)) = f
Greška zabrane, A ∼ Binomni((1-f)/2,D). Srednja vrednost D((1-f)/2), varijansa D/4(1-f^2).
Slučaj 4: Heterozigotna majka i heterozigotna beba
[0098] Imajte na umu da, osim greške, postoje dva podslučaja za ovo.
Slučaj 4.1: Alel od oca se razlikuje od alela majke
[0099] Ovo bi uvelo treći alel koji bi bio manji alel sa E(A) = Df/2. Ovi slučajevi ne bi trebalo da utiču na procene za f jer će procedura za dodeljivanje sekvenci amplikonima filtrirati ove slučajeve kada su referentni SNP bialelni.
Slučaj 4.2: Alel od oca odgovara jednom od alela majke
[0100]
U ovom slučaju, osim greške, dva alela bi se pojavila u proporciji 1:1, tako da ovaj slučaj nije koristan za procenu frakcije fetusa.
Greška zabrane, E( A ) = 0,5, i A ∼ Binomni(0,5,D) skraćen na 0,5.
[0101] Slika 4 predstavlja dijagram manjeg broja alela A u odnosu na pokrivenost D (pod pretpostavkom da nema greške) za slučajeve heterozigotnosti 1 do 4.
[0102] U različitim otelotvorenjima, postupak se u velikoj meri odnosi na analizu frekvencije alela na jednom ili više SNP (ili drugih polimorfizama) da bi se polimorfizmi klasifikovali kao u slučaju 2 i/ili slučaja 3. Koristeći frekvenciju alela u vezi sa klasifikacijom, postupak može proceniti fetalnu frakciju.
[0103] U nekim slučajevima, s obzirom na manji broj alela A i pokrivenost D, drugim rečima, jednu tačku (D,A), za pojedinačnu SNP poziciju omogućava metodama da naprave procenu jedne tačke. Na primer, određeni postupci klasifikuju SNP sa brojem alela (D,A) u jedan slučaj i izvode procenu fetalne frakcije na sledeći način:
ES1.1 Jednostavni pragovi za odlučivanje slučaja
S obzirom na individualnu poziciju (SNP),
2
1. Odlučite se za slučaj 1 sa funkcijom odlučivanja kao što je 2A/D < e ili definisanom kritičnom vrednošću Binoma(e,D) ili Poasona(De). Takođe se može koristiti alternativna distribucija kao što je ovde obelodanjeno). Nema procene fetalne frakcije (f).
2. Odlučite se za slučaj 4 ako je 2A/D > (0,5-e) ili neka kritična vrednost binoma (0,5,D), (ili druga pogodna aproksimirajuća distribucija). Ne koristite poziciju za procenu f.
3. U suprotnom, odlučite se za slučaj 2 ako je 2A/D < 0,25 (ili neki drugi ručno podešeni ili automatski procenjeni prag). Fetalna frakcija f procenjena kao 2A/D
4. Inače slučaj 3. Koristite procenu fetalne frakcije f = (1-2A/D).
[0104] Preciznost se može postići kombinovanjem informacija o broju alela iz nekoliko SNP da bi se procenila fetalna frakcija.
Postupak EM1: Kombinujte više SNP osrednjavanjem.
[0105] Uzmite srednju vrednost, medijanu, drugo centralno merenje (na primer: Tukey bimasa, M-procenjivači, itd...). Takođe se mogu koristiti osrednjene mase. Za primer kako se mase mogu definisati videti EM2.4 ispod. Dodatno se mogu koristiti robusne mere centra.
Postupak EM2 Simultana procena iz slučaja 2 i slučaja 3 transformacijom
[0106] Za slučajeve gde je f manje od X% slučaj 3 tačke (D,A) se mogu transformisati da se poklapaju sa slučajem 2 tačke. Iz ove linije može se izračunati zajednički nagib putem regresije kroz ishodište (videti Sliku 5).
[0107] Jedan teorijski nedostatak postupaka zasnovanih na transformaciji je da će binomne distribucije u slučaju 2 i 3 imati različit oblik. Na tipičnim nivoima fetalne frakcije (< 10%) podaci slučaja 2 će imati distribuciju blizu Poasonove nagnutu udesno, a slučaj 3 će imati distribuciju blisku normalnoj.
[0108] Slika 5 prikazuje transformaciju podataka Slučaja 3 u Slučaj 2. Sada jedna regresija može proceniti f iz oba slučaja istovremeno.
Postupak za izračunavanje EM2.3:
[0109]
Korak 1 : Izbacite podatke iz Slučaja 4
Za svaku tačku podataka (D,A) ako je A > (0,5D-T1) onda isključite (D,A) iz dalje analize.
2
T1(D,A) funkcija sa realnom vrednošću.
Korak 2: Transformišite podatke Slučaja 3
Videti Sliku 6. Za svaku tačku podataka (D,A) nije pravilo da bude 4, ako je A > T2*D transformišite u tačke na nove koordinate (D1,A1). T2(D,A) funkcija sa realnom vrednošću.
Korak 3: Uspostaviti prag DT za smanjenje zagađenja iz podataka slučaja 1
Zanemarite sve tačke podataka ispod T2(D,A) funkcije realne vrednosti.
Korak 4: Procena regresije za preostale transformisane podatke slučaja 2 i 3.
Primenite regresiju kroz poreklo na preostale tačke. Procena fetalne frakcije je dvostruko veća od nagiba regresije.
[0110] Imajte na umu da postoji mnogo klasa transformacija koje se mogu konstruisati da bi se postigla ista podudarnost podataka slučaja 2 i 3. Primeri uključuju trigonometriju, transformaciju ili upotrebu rotacionih matrica. Ova odstupanja treba da budu uključena u obim ovog obelodanjivanja. Štaviše, mnoge klase regresije (L2, L1, .... ) ili se može koristiti optimizacija. Zamena algoritma optimizacije je trivijalna promena i obuhvaćena je obimom ovog obelodanjivanja.
[0111] Slika 6 predstavlja podatke posle rotacije. Odabirom D1 tako da se slučaj 1 i slučajevi 2 i 3 ne preklapaju. E1 predstavlja gornju granicu od 99 procenata gornjeg intervala poverenja podataka slučaja 1.
Postupak EM3 Ponderisani najmanji kvadrati
[0112] Postupak regresije iz EM2.3 pretpostavlja da sve prevedene tačke podataka imaju jednaku varijansu. Prikladnije je uzeti u obzir heteroskedastičnost različitih izvora podataka, pa čak i tačaka iz istog obrasca heterozigotnosti.
[0113] Koraci od 1 do 3 su identični EM2.3.
Korak 4: Regresija
[0114] U regresiji iz EM2.3, tačke iz podataka slučaja 2 će imati varijansu v2(f,D) = [0,5*Df -
2
0,25*Df^2] a tačke iz podataka slučaja 3 će imati varijansu v3(f,D)=[0,25D(1 - f^2)]. Pod pretpostavkom da svakoj tački dajemo drugačiju težinu, v, kao u EM2.3, nastojimo da minimiziramo
[0115] Postavljanje prvih izvoda na nulu i rešavanje za s:
[0116] Ovaj postupak teži sa inverznom varijansom svake tačke, procenjenom kao v2(2A/D,D) ili v3(2A/D,D) prema potrebi. Procena fetalne frakcije je 2*s.
[0117] U određenim otelotvorenjima, model mešavine može da se koristi da se klasifikuje kolekcija polimorfizama u dva ili više slučajeva zigotnosti i da se istovremeno proceni frakcija fetalne DNK iz srednjih frekvencija alela za svaki od ovih slučajeva. Generalno, model mešavine pretpostavlja da je određena zbirka podataka sastavljena od mešavine različitih tipova podataka, od kojih svaki ima svoju očekivanu distribuciju (npr., normalnu distribuciju). Proces pokušava da pronađe srednju vrednost i eventualno druge karakteristike za svaki tip podataka. U otelotvorenjima koja su ovde obelodanjena, postoje do četiri različita tipa podataka (slučajevi zigotnosti) koji čine podatke o učestalosti manjeg alela za polimorfizme koji se razmatraju.
[0118] Jedna implementacija modela mešavine je predstavljena u sledećem odeljku. U ovoj varijanti, frekvencija manjeg alela A je zbir četiri člana kao što je prikazano u jednačini 3. Svaki od pojmova odgovara jednom od četiri slučaja zigotnosti. Svaki termin je proizvod
2
frakcije polimorfizma a i binomne distribucije frekvencije manjeg alela. αs su delovi polimorfizama koji spadaju u svaki od četiri slučaja. Svaka binomna distribucija ima pridruženu verovatnoću, p, i pokrivenost, d. Verovatnoća manjeg alela za slučaj 2, na primer, data je sa f/2.
[0119] Obelodanjena otelotvorenja koriste "faktorske momente" za podatke o frekvenciji alela koji se razmatraju. Kao što je poznato, srednja vrednost distribucije je prvi trenutak. To je očekivana vrednost frekvencije manjeg alela. Varijanca je drugi trenutak. Izračunava se iz očekivane vrednosti frekvencije alela na kvadratu.
[0120] Podaci o frekvenciji alela u svim polimorfizmima mogu se koristiti za izračunavanje faktorskih momenata (prvi faktorijalni momenat, drugi faktorijalni momenat, itd.) kao što je prikazano u jednačini 4. Kao što pokazuju ove jednačine, faktorski momenti su zbir pojmova preko i, pojedinačnih polimorfizama u skupu podataka, gde postoji n takvih polimorfizama u skupu podataka. Termini koji se sumiraju su funkcije broja manjih alela, aii pokrivenosti di.
[0121] Korisno je da faktorski momenti imaju veze sa vrednostima aii pi kao što je ilustrovano u jednačini 5. Iz verovatnoća, pi, može se odrediti fetalni udeo, f. Na primer, p2= f/2 i p3je 1 - f/2. Dakle, odgovorna logika može da reši sistem jednačina koje povezuju nepoznate as i ps sa faktorskim momentima izraza za manje frakcije alela u višestrukim polimorfizmima koji se razmatraju. Naravno, postoje i druge tehnike za rešavanje modela mešavine u okviru ovog pronalaska.
[0122] Korisno je dalje razmotriti matematičke ili simboličke osnove otelotvorenja modela mešavine koja su ovde obelodanjena. Četiri gore opisana slučaja heterozigotnosti sugerišu sledeći model binomne mešavine za distribuciju ai u tačkama (ai,di):
[0123] U nastavku su opisani različiti modeli za povezivanje pi sa frakcijom fetusa i stope grešaka u sekvenciranju. Parametri ai se odnose na parametre specifične za populaciju i sposobnost da se ove vrednosti puste da „plutaju“ daju ovim postupcima dodatnu robusnost u
2
odnosu na faktore kao što su etnička pripadnost i potomstvo roditelja.
[0124] Za različite slučajeve heterozigotnosti gornja jednačina se može rešiti za fetalnu frakciju. Možda je najlakši postupak za rešavanje fetalne frakcije putem postupka faktorskih momenata u kojoj se parametri smeše mogu izraziti u terminima koji se lako mogu proceniti iz posmatranih podataka.
[0125] Dati n SNP pozicije, faktorski momenti su definisani na sledeći način:
[0127] Rešenje se može identifikovati rešavanjem za {αi,pi} u sistemu jednačina izvedenih iz gornje relacije Jednačina 5 kada je n > 2* (broj parametara koji treba proceniti). Očigledno, problem postaje mnogo teži matematički za veće g jer je potrebno proceniti više {αi,pi}.
[0128] Obično nije moguće precizno razlikovati podatke slučaja 1 i 2 (ili slučaja 3 i 4) jednostavnim pragovima na nižim frakcijama fetusa. Na sreću za korišćenje smanjenih modela slučaja, podaci slučaja 1/2 se lako odvajaju od podataka slučaja 3/4 diskriminacijom u tački (2A/D)=T. Utvrđeno je da je upotreba T=0,5 bila zadovoljavajuća.
[0129] Imajte na umu da metod modela mešavine koji koristi jednačine 4 i 5 koristi podatke za sve polimorfizme, ali ne uzima odvojeno u obzir grešku sekvenciranja. Odgovarajuće metode koje razdvajaju podatke za prvi i drugi slučaj od podataka za treći i četvrti slučaj mogu objasniti grešku u sekvenciranju.
[0130] U daljim primerima, skup podataka koji se daje modelu mešavine sadrži podatke samo za polimorfizme slučaja 1 i slučaja 2. To su polimorfizmi za koje je majka homozigotna. Tehnika praga se može koristiti za uklanjanje polimorfizama slučaja 3 i 4. Na primer, polimorfizmi sa manjim frekvencijama alela većim od određenog praga se eliminišu pre upotrebe modela mešavine. Koristeći odgovarajuće filtrirane podatke i faktorske momente svedene na jednačine 7 i 8, može se izračunati fetalna frakcija, f, kao što je prikazano u jednačini 9. Imajte na umu da je jednačina 7 ponavljanje jednačine 3 za ovu implementaciju modela mešavine. Takođe imajte na umu da u ovom konkretnom primeru greška sekvenciranja povezana sa mašinskim očitavanjem nije poznata. Kao posledica toga, sistem jednačina mora zasebno da rešava grešku, e.
[0131] Slika 7 prikazuje poređenje rezultata korišćenjem ovog modela mešavine i poznate frakcije fetusa (x osa) i procenjene frakcije fetusa. Ako je model mešavine savršeno predvideo frakciju fetusa, ucrtani rezultati bi pratili isprekidanu liniju. Ipak, procenjene frakcije su izuzetno dobre, posebno imajući u vidu da je veliki deo podataka eliminisan pre primene modela mešavine.
[0132] Da bismo dalje razradili, dostupno je nekoliko drugih postupaka za procenu parametara modela iz Jednačine 3 U nekim slučajevima rastvora može se naći postavljanjem derivata na nulu Hi-kvadrat statistike. U slučajevima kada se direktnom diferencijacijom ne može naći lako rešenje, proširenje binoma PDF ili drugih aproksimativnih polinoma može biti efikasno. Poznato je da su minimalni chi-kvadrat procenitelji efikasni.
[0133] Gde je Pi broj tačaka i. Alternativni postupak iz Le Cam ["On the Asymptotic Theory of Estimation and Testing Hypotheses" Proceedings of the Third Berkeley Symposium on
1
Mathematical Statistics and Probability, Volume 1 Berkeley CA: University of CA Press, 1956, str.129-156] koristi Ralph-Newton iteraciju funkcije verovatnoće. Postupak momenata rastvora iz jednačine 5 može se koristiti kao polazna tačka za iteraciju.
[0134] U okviru druge primene razmatra se postupak rešavanja modela mešavine koji uključuje postupke maksimizacije očekivanja koje rade na mešavinama aproksimativnih Beta distribucija.
Slučajevi modela (1+2), greška sekvenciranja nepoznata
[0135] Razmotrite redukovani model koji uzima u obzir samo slučajeve heterozigotnosti 1 i 2. U ovom slučaju raspodela smeše se može napisati kao
je rešeno za e (stopa greške sekvencioniranja), alfa (proporcija slučaja 1 poena) i f (frakcija fetusa). Gde su Fi definisani kao u Jednačini 4 iznad. Za pravo rešenje izabrano je zatvoreno rešenje za fetalnu frakciju
koje je između 0 i 1.
[0137] Da bi se procenio učinak procenjivača, konstruisan je simulirani skup podataka Hardi-Vajnbergovih tačaka ravnoteže (ai,di) sa frakcijom fetusa dizajniranom da bude {1%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20% i 25%} i konstantnu stopu greške sekvenciranja od 1%. Stopa greške od 1% je trenutno prihvaćena stopa za mašine za sekvenciranje i protokole koje koristimo i u
2
skladu je sa grafikonom podataka Illumina Genome analizatora II prikazanim na Slici 3 iznad. Jednačina 9 je primenjena na podatke i nađeno je, sa izuzetkom pristrasnosti od četiri tačke naviše, opšte slaganje sa „poznatom“ fetalnom frakcijom. Zanimljivo je da je stopa greške sekvenciranja, e, procenjena na nešto iznad 1%.
[0138] U sledećem primeru modela mešavine, postavljanje praga ili druga tehnika filtriranja se ponovo koristi za uklanjanje podataka za polimorfizme koji spadaju u slučajeve 3 i 4.
Međutim, u ovom slučaju, greška sekvenciranja je poznata. Ovo pojednostavljuje rezultujući izraz za frakciju fetalne DNK, f, kao što je prikazano u jednačinama 10. Slika 8 pokazuje da je ova verzija modela mešavine dala poboljšane rezultate u poređenju sa pristupom korišćenim sa jednačinom 9.
[0139] Sličan pristup je prikazan u jednačinama 11 i 12. Ovaj pristup prepoznaje da samo neke greške sekvenciranja dodaju manji broj alela. Umesto toga, samo jedna od svake četiri greške sekvenciranja bi trebalo da poveća broj manjih alela. Slika 9 pokazuje izuzetno dobro slaganje između stvarnih i procenjenih frakcija fetusa korišćenjem ove tehnike.
Slučajevi modela (1+2), greška sekvenciranja poznata
[0140] Pošto je stopa greške sekvencioniranja mašina koje se koriste u velikoj meri poznata, pristrasnost i složenost proračuna mogu se smanjiti eliminisanjem e kao promenljive koju treba rešiti. Tako dobijamo sistem jednačina
za fetalnu frakciju f da se dobije rešenje:
[0141] Slika 8 pokazuje da korišćenje stope mašinske greške kao poznatog parametra smanjuje pristrasnost naviše za jednu tačku.
Slučajevi modela (1+2), poznata greška u sekvenciranju, poboljšani modeli grešaka
[0142] Da bismo poboljšali pristrasnost u modelu, proširili smo model greške gornjih jednačina kako bismo uzeli u obzir činjenicu da svaki događaj greške sekvenciranja neće dodati manji broj alela A=ai u slučaju heterozigotnosti 1. Štaviše, dozvoljavamo činjenicu da događaji greške sekvenciranja mogu doprineti brojanju heterozigotnosti u slučaju 2. Otuda određujemo fetalnu frakciju F rešavanjem sledećeg sistema faktorskih momentalnih odnosa:
[0143] Na Slici 9 je prikazano da simulirani podaci koji koriste stopu mašinske greške kao poznati parametar, poboljšanje modela greške slučaja 1 i 2 u velikoj meri smanjuje pristrasnost naviše na manje od tačke za frakciju fetusa ispod 0,2.
Opcije implementacije
UZORCI
[0144] Uzorci koji se koriste u otelotvorenjima koja su ovde obelodanjena sadrže genomsku DNK koja je ćelijska ili bez ćelija. Ćelijska DNK se dobija iz celih ćelija ručnim ili mehaničkim izdvajanjem genomske DNK iz celih ćelija iste ili različite genetske sastave. Ćelijska DNK može biti izvedena na primer, iz celih ćelija istog genetskog sastava dobijenih od jednog ispitanika, iz mešavine celih ćelija različitih ispitanika, ili iz mešavine celih ćelija koje se razlikuju po genetskom sastavu koje potiču od jednog ispitanika. Postupci za ekstrakciju genomske DNK iz celih ćelija su poznate u tehnici i razlikuju se u zavisnosti od prirode izvora.
[0145] U nekim slučajevima, može biti korisno fragmentirati ćelijsku genomsku DNK.
Fragmentacija može biti nasumična, ili može biti specifična, kako se postiže, na primer, korišćenjem digestije restrikcionom endonukleazom. Postupci za slučajnu fragmentaciju su dobro poznate u tehnici i uključuju, na primer, ograničenu digestiju DNK-aze, alkalni tretman i fizičko smicanje. U određenim otelotvorenjima, uzorci nukleinskih kiselina su podvrgnuti fragmentaciji u fragmente od približno 500 ili više baznih parova, i na koje se mogu lako primeniti postupci sekvenciranja sledeće generacije (NGS). U jednom otelotvorenju, uzorci
4
nukleinskih kiselina se dobijaju iz cfDNK, koja nije podvrgnuta fragmentaciji.
[0146] DNK bez ćelija je genomska DNK koja se prirodno javlja kao mešavina genomskih fragmenata koji se tipično nalaze u biološkim tečnostima, npr. krv, ispitanika. Genomska mešavina može biti izvedena iz ćelija koje prirodno pucaju da bi oslobodile svoj genomski sadržaj biološkim procesima, npr., apoptozom. Uzorak cfDNK može da sadrži cfDNK dobijenu iz mešavine ćelija različitih subjekata iste vrste, iz mešavine ćelija jednog subjekta koje se razlikuju po genetskom sastavu, ili iz mešavine ćelija različitih vrsta, npr. predmet.
[0147] Nukleinske kiseline bez ćelija, uključujući DNK bez ćelija, mogu se dobiti različitim postupcima poznatim u tehnici iz bioloških uzoraka uključujući, ali ne ograničavajući se na plazmu, serum i urin (Fan i dr., ProcNatlAcadSci 105:16266-16271 [2008]; Koide i dr., Prenatal Diagnosis 25:604-607 [2005]; Chen i dr., Nature Med.2: 1033-1035 [1996]; Lo i dr., Lancet 350: 485-487 [1997]; Botezatu i dr., Clin Chem.46: 1078-1084, 2000; i Su i dr., J Mol. Diagn.6: 101-107 [2004]). Da bi se cfDNK odvojila od ćelija, mogu se koristiti frakcionisanje, centrifugiranje (npr., centrifugiranje u gradijentu gustine), precipitacija specifično za DNK ili postupke sortiranja i/ili razdvajanja ćelija visoke propusnosti. Dostupni su komercijalno dostupni kompleti za ručno i automatizovano odvajanje cfDNK (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, Qiagen, Valencia, CA, Macherey-Nagel, Duren, DE).
[0148] Uzorak koji sadrži mešavinu nukleinskih kiselina na koju se primenjuju postupci opisani ovde može biti biološki uzorak kao što je uzorak tkiva, uzorak biološke tečnosti ili uzorak ćelije. U nekim otelotvorenjima, smeša nukleinskih kiselina se prečišćava ili izoluje iz biološkog uzorka bilo kojim od poznatih postupaka. Uzorak može biti prečišćeni ili izolovani polinukleotid. Biološka tečnost uključuje, kao neograničavajući primer, krv, plazmu, serum, znoj, suze, sputum, urin, sputum, protok uha, limfu, pljuvačku, cerebrospinalnu tečnost, pustoš, suspenziju koštane srži, vaginalni tok, transcervikalno ispiranje, mozak tečnost, ascites, mleko, sekreti respiratornog, crevnog i genitourinarnog trakta, uzorci amnionske tečnosti i leukoforeze. U nekim otelotvorenjima, uzorak je uzorak koji se lako može dobiti neinvazivnim procedurama, npr. krv, plazma, serum, znoj, suze, sputum, urin, sputum, tok uha, pljuvačka ili izmet. Poželjno, biološki uzorak je uzorak periferne krvi, ili frakcije plazme i seruma. U drugim otelotvorenjima, biološki uzorak je bris ili premaz, uzorak biopsije ili ćelijska kultura. U drugom otelotvorenju, uzorak je mešavina dva ili više bioloških uzoraka, npr. biološki uzorak može da sadrži dva ili više uzoraka biološke tečnosti, uzorak tkiva i uzorak ćelijske kulture. Kako se ovde koristi, termini "krv", "plazma" i "serum" izričito obuhvataju njihove frakcije ili prerađene delove. Slično, kada se uzorak uzima iz biopsije, premaza, brisa, itd., „uzorak“ izričito obuhvata obrađenu frakciju ili deo dobijen iz biopsije, premaza, brisa, itd.
[0149] U nekim otelotvorenjima, uzorci se mogu dobiti iz izvora, uključujući, ali ne ograničavajući se na, uzorke različitih pojedinaca, različite razvojne faze istih ili različitih pojedinaca, različite bolesne osobe (npr., osobe sa rakom ili za koje se sumnja da imaju genetski poremećaj), normalne osobe, uzorci dobijeni u različitim stadijumima bolesti kod pojedinca, uzorci dobijeni od pojedinca koji je bio podvrgnut različitim tretmanima od bolesti, uzorci pojedinaca podvrgnutih različitim faktorima životne sredine, ili pojedinci sa predispozicijom za patologiju, ili pojedinci koji su bili izloženi uzročniku zarazne bolesti (npr., HIV).
[0150] U jednom otelotvorenju, uzorak je uzorak majke koji je dobijen od trudne žene, na primer trudnice. U ovom slučaju, uzorak se može analizirati korišćenjem postupaka opisanih ovde da bi se obezbedila prenatalna dijagnoza potencijalnih hromozomskih abnormalnosti kod fetusa. Uzorak majke može biti uzorak tkiva, uzorak biološke tečnosti ili uzorak ćelije. Biološka tečnost uključuje, kao neograničavajući primer, krv, plazmu, serum, znoj, suze, sputum, urin, sputum, protok uha, limfu, pljuvačku, cerebrospinalnu tečnost, pustoš, suspenziju koštane srži, vaginalni tok, transcervikalno ispiranje, mozak tečnost, ascites, mleko, sekreti respiratornog, crevnog i genitourinarnog trakta, i uzorke leukoforeze. U drugom otelotvorenju, majčin uzorak je mešavina dva ili više bioloških uzoraka, npr. biološki uzorak može da sadrži dva ili više uzoraka biološke tečnosti, uzorak tkiva i uzorak ćelijske kulture. U nekim otelotvorenjima, uzorak je uzorak koji se lako može dobiti ne-invazivnim procedurama, npr. krv, plazma, serum, znoj, suze, sputum, urin, sputum, tok uha, pljuvačka i izmet. U nekim otelotvorenjima, biološki uzorak je uzorak periferne krvi, ili frakcije plazme i seruma. U drugim otelotvorenjima, biološki uzorak je bris ili premaz, uzorak biopsije ili ćelijska kultura.
[0151] Uzorci se takođe mogu dobiti iz in vitro kultivisanih tkiva, ćelija ili drugih izvora koji sadrže polinukleotide. Uzgajani uzorci mogu biti uzeti iz izvora uključujući, ali ne ograničavajući se na, kulture (npr. tkivo ili ćelije) koje se održavaju u različitim medijima i uslovima (npr., pH, pritisak ili temperatura), kulture (npr., tkivo ili ćelije) koje se održavaju za različiti periodi dužine, kulture (npr., tkivo ili ćelije) tretirane različitim faktorima ili reagensima (npr., kandidat za lek ili modulator), ili kulture različitih tipova tkiva ili ćelija. Postupci izolovanja nukleinskih kiselina iz bioloških izvora su dobro poznate i razlikovaće se u zavisnosti od prirode izvora kao što je iznad objašnjeno.
POLIMORFIZMI ZA UPOTREBU U IDENTIFIKOVANJU GENOMSKIH FRAKCIJA
[0152] Kao što je objašnjeno, polimorfizmi se mogu koristiti za procenu fetalne frakcije. U proceni se koristi frakcija alela i zigotnost jednog ili više polimorfizama. Primeri korisnih polimorfizama uključuju, bez ograničenja, polimorfizme pojedinačnih nukleotida (SNP), tandemske SNP, male delecije ili umetanja sa više baza, nazvane IN-DELS (koji se takođe nazivaju polimorfizmi umetanja delecije ili DIP), polimorfizmi više nukleotida (MNP), kratka tandemska ponavljanja (STR), polimorfizmi dužine restrikcionih fragmenata (RFLP), delecije, uključujući mikrodelecije, umetanja, uključujući mikroinsercije, duplikacije, inverzije, translokacije, umnožavanja, složene varijante na više mesta, varijacije broja kopija (CNV) i polimorfizme koji se sastoje od svaka druga promena sekvence u hromozomu.
[0153] U nekim otelotvorenjima, polimorfizmi koji se koriste u opisanim postupcima uključuju SNP i/ili STR. SNP polimorfizmi mogu biti pojedinačni SNP, tandem SNP.
Pojedinačni SNP-ovi uključuju pojedinačne SNP-ove i SNP-ove oznake, tj. SNP-ove prisutne u haplotipu i/ili bloku haplotipa. U nekim otelotvorenjima, koriste se kombinacije polimorfizama. Na primer, razlike u broju kopija mogu se otkriti upoređivanjem kombinacije polimorfnih sekvenci koje sadrže jedan ili više SNP i jedan ili više STR.
[0154] Uopšteno govoreći, bilo koje polimorfno mesto koje može biti obuhvaćeno očitavanjima generisanim ovde opisanim postupcima sekvenciranja može se koristiti za identifikaciju genomske frakcije u uzorcima koji sadrže DNK različitih genoma. Polimorfne sekvence korisne za praktikovanje postupaka pronalaska su dostupne iz raznih javno dostupnih baza podataka, koje se kontinuirano proširuju. Na primer, korisne baze podataka uključuju bez ograničenja Human SNP Database na svetskoj veb adresi wi.mit.edu, NCBI dbSNP početnu stranicu na svetskoj veb adresi ncbi.nlm.nih.gov, svetsku veb adresu lifesciences.perkinelmer.com, Celera Humana SNP baza podataka na svetskoj veb adresi celera.com, SNP baza podataka Grupe za analizu genoma (GAN) na svetskoj veb adresi gan.iarc.fr, ATCC baza podataka kratkih tandemskih ponavljanja (STR) na svetskoj veb adresi atcc.org, i HapMap bazu podataka na svetskoj veb adresi hapmap.org.
[0155] Broj polimorfizama koji se mogu koristiti u proceni fetalne frakcije može biti najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 ili više. Na primer, procenjuje se da humani genom obuhvata najmanje oko 10 miliona SNP. Stoga, broj dostupnih polimorfizama koji se mogu genotipizirati u uzorku od ljudskog ispitanika može biti najmanje oko 10 miliona SNP-a, kao i mnoge druge vrste polimorfizama koji su prisutni u bilo kom ljudskom genomu. U nekim otelotvorenjima, identifikacija jednog ili više polimorfizama u prvom genomu uzorka koji sadrži mešavinu DNK, npr. cfDNK, prvog i drugog genoma se izvodi sekvenciranjem celog genoma korišćenjem NGS postupka kao što je ovde opisano. U nekim otelotvorenjima, postupak sekvenciranja celog genoma je NGS metoda koja identifikuje polimorfne sekvence masovnim paralelnim sekvenciranjem klonalno amplifikovanih molekula nukleinske kiseline ili masovnim paralelnim sekvenciranjem pojedinačnih molekula nukleinske kiseline, tj. sekvenciranjem jednog molekula.
PRIMENE
[0156] Frakcija nukleinske kiseline koja potiče iz svakog od dva različita genomska izvora u uzorku može se koristiti u različite svrhe. U različitim ovde opisanim otelotvorenjima, frakcija fetalne DNK u DNK bez ćelija uzorka materijala se koristi da bi se olakšala prenatalna dijagnoza i da se pomogne u donošenju odluka u vezi sa lečenjem trudnoća. U drugim otelotvorenjima, genomi koji se razmatraju nisu majčinski i fetalni. Različiti primeri genomskih izvora za određivanje frakcionog prisustva genoma su predstavljeni u nastavku.
[0157] Fetalna DNK i RNK bez ćelija koje cirkulišu u majčinoj krvi mogu se koristiti za ranu neinvazivnu prenatalnu dijagnozu (NIPD) sve većeg broja genetskih stanja, kako za upravljanje trudnoćom, tako i za pomoć pri donošenju odluka u vezi sa reprodukcijom. Male količine cirkulišuće fetalne DNK prisutne su u krvotoku majke tokom trudnoće (Lo i dr., Lancet 350:485-487 [1997]). Za koje se smatra da potiče od umirućih ćelija placente, pokazalo se da se fetalna DNK bez ćelija sastoji od kratkih fragmenata koji su tipično duži od 200 bp Chan i dr., ClinChem 50:88-92 [2004]), što se može uočiti već ranije kao 4 nedelje gestacije (Illanes i dr., Early Human Dev 83:563-566 [2007]), i poznato je da se uklanja iz krvotoka majke u roku od nekoliko sati nakon porođaja (Lo i dr., Am J Hum Genet 64:218224 [1999]). Pored cfDNK, fragmenti fetalne RNK bez ćelija (cfRNK) takođe se mogu uočiti u krvotoku majke, poreklom iz gena koji se transkribuju u fetusu ili placenti. Ekstrakcija i naknadna analiza ovih fetalnih genetskih elemenata iz uzorka krvi majke nudi nove mogućnosti za NIPD.
[0158] Kao što je objašnjeno, obelodanjeni postupci određuju deo drugog genoma u biološkom uzorku. Postupci opciono određuju prisustvo ili odsustvo određenog broja poremećaja u uzorku krvi koji sadrži mešavinu DNK (kao što je cfDNK) prvog i drugog genoma. U nekim otelotvorenjima, određivanje fetalne frakcije može da obuhvata (a) sekvenciranje genoma najmanje dela mešavine cfDNK da bi se dobio veći broj oznaka sekvence; (b) određivanje prisustva ili odsustva višestrukih polimorfizama u mnoštvu oznaka sekvence, i (c) povezivanje višestrukih polimorfizama sa prvim i/ili drugim genomom u smeši. U poželjnim otelotvorenjima, smeša je neobogaćena za višestruke polimorfizme.
Identifikacija višestrukih polimorfizama u mešavini DNK se vrši upoređivanjem sekvence mapiranih oznaka dobijenih metodom sekvenciranja celog genoma sa višestrukim referentnim polimorfizmima, kao što je ovde opisano.
[0159] U iznad obelodanjenom otelotvorenju, prvi genom je fetalni genom, a drugi genom je genom majke. U drugom otelotvorenju, prvi genom je genom ćelije koja nije pogođena, a drugi genom je genom zahvaćene ćelije, npr. ćelija raka. U nekim otelotvorenjima, zahvaćene i nezahvaćene ćelije potiču od istog subjekta. Na primer, zahvaćena ćelija može biti ćelija čiji je genom izmenjen zbog poremećaja. U nekim otelotvorenjima poremećaj je monogeni poremećaj. U drugim otelotvorenjima, poremećaj je poligeni poremećaj. Poremećaji se mogu identifikovati jednim polimorfizmom, npr. oznaka SNP, ili višestrukim polimorfizmima prisutnim u haplotipu. U nekim otelotvorenjima, višestruki polimorfizmi identifikovani prema ovom postupku su prisutni u bloku haplotipa.
[0160] Poremećaji koji se mogu identifikovati uz pomoć ovog postupka su genetski poremećaji, koji su bolesti uzrokovane barem delimično abnormalnostima u genima ili hromozomima. Poznavanje frakcije fetusa u uzorku može pomoći u identifikaciji takvih poremećaja u prenatalnom kontekstu. Poremećaji identifikovani ovim metodom uključuju monogene, tj. pojedinačni gen, poremećaje i poligene, tj. kompleksne poremećaje. Poremećaji pojedinačnih gena uključuju autozomno dominantne, autozomno recesivne, X-vezane dominantne, X-vezane recesivne i Y-vezane.
[0161] Kod autozomno dominantnih poremećaja, samo jedna mutirana kopija gena biće neophodna da bi osoba bila pogođena poremećajem. Tipično, pogođeni ispitanik ima jednog zahvaćenog roditelja i postoji 50% šanse da će potomstvo naslediti mutirani gen. Stanja koja su autozomno dominantna ponekad imaju smanjenu penetraciju, što znači da iako je potrebna samo jedna mutirana kopija, ne razviju bolest sve osobe koje naslede tu mutaciju. Primeri autozomno dominantnih poremećaja koji se mogu identifikovati ovim metodom uključuju, bez ograničenja, porodičnu hiperholesterolemiju, naslednu sferocitozu, Marfanov sindrom, neurofibromatozu tip 1, nasledni nepolipozni kolorektalni karcinom i nasledne višestruke egzostoze i Hantingtonovu bolest.
[0162] Autosomalno recesivni poremećaji otkriveni primenom ovog postupka uključuju anemiju srpastih ćelija, cističnu fibrozu, Tay-Sachsovu bolest, Tay-Sachsovu bolest, mukopolisaharidoze, bolesti skladištenja glikogena i galaktozemiju. X-vezani poremećaji otkriveni ovim postupkom uključuju Dišenovu mišićnu distrofiju i hemofiliju. Kod autosomalno recesivnih poremećaja, dve kopije gena moraju biti mutirane da bi subjekt bio pogođen autozomno recesivnim poremećajem. Pogođeni ispitanik obično ima roditelje koji nisu pogođeni od kojih svaki nosi po jednu kopiju mutiranog gena (i nazivaju se nosiocima). Dve netaknute osobe koje nose po jednu kopiju mutiranog gena imaju 25% šanse da u svakoj trudnoći imaju dete pogođeno poremećajem. Primeri ovog tipa poremećaja koji se mogu identifikovati ovim postupkom su cistična fibroza, bolest srpastih ćelija, Tay-Sachsova bolest, Niemann-Pickova bolest, spinalna mišićna atrofija i Robertsov sindrom. Određeni drugi fenotipovi, kao što je vlažni naspram suvog ušnog voska, takođe se određuju na autosomalno recesivan način. Dominantni poremećaji povezani sa X su uzrokovani mutacijama gena na X hromozomu. Samo nekoliko poremećaja ima ovaj obrazac nasleđivanja, a najbolji primer je hipofosfatemijski rahitis povezan sa X. I muškarci i žene su pogođeni ovim poremećajima, pri čemu su muškarci obično teže pogođeni od žena. Neka dominantna stanja vezana za X, kao što su Retov sindrom, incontinentia pigmenti tip 2 i Aikardijev sindrom su obično fatalni kod muškaraca, i stoga se pretežno primećuju kod žena. Izuzeci od ovog nalaza su izuzetno retki slučajevi u kojima dečaci sa Klinefelterovim sindromom (47,XXY) takođe nasleđuju X-vezano dominantno stanje i ispoljavaju simptome sličnije onima kod žena u smislu ozbiljnosti bolesti. Šansa za prenošenje dominantnog poremećaja povezanog sa X razlikuje se između muškaraca i žena. Sinovi muškarca sa dominantnim X-povezanim poremećajem neće biti pogođeni (pošto dobiju očev Y hromozom), a sve njegove ćerke će naslediti ovo stanje. Žena sa dominantnim X-povezanim poremećajem ima 50% šanse da ima zahvaćeni fetus u svakoj
4
trudnoći, iako treba napomenuti da su u slučajevima kao što je incontinentia pigmenti samo žensko potomstvo generalno održivo. Pored toga, iako ovi uslovi ne menjaju plodnost per se, osobe sa Retovim ili Aikardijevim sindromom retko se razmnožavaju.
[0163] Ovaj postupak takođe može olakšati identifikaciju polimorfizama povezanih sa X-povezanim poremećajima. Recesivna stanja vezana za X su takođe uzrokovana mutacijama u genima na X hromozomu. Muškarci su češće pogođeni nego žene, a šansa za prenošenje poremećaja se razlikuje između muškaraca i žena. Sinovi čoveka sa X-vezanim recesivnim poremećajem neće biti pogođeni, a njegove ćerke će nositi jednu kopiju mutiranog gena. Žena koja je nosilac X-povezanog recesivnog poremećaja (X<R>X<r>) ima 50% šanse da će imati sinove koji su pogođeni i 50% šanse da će imati ćerke koje nose jednu kopiju mutiranog gena i stoga su nosioci. X-povezana recesivna stanja uključuju bez ograničenja ozbiljne bolesti hemofiliju A, Dišenovu mišićnu distrofiju i Leš-Nijanov sindrom, kao i uobičajena i manje ozbiljna stanja kao što su ćelavost kod muškaraca i crveno-zeleno slepilo za boje. Recesivna stanja povezana sa X-om se ponekad mogu manifestovati kod žena zbog iskrivljene X-inaktivacije ili monozomije X (Turnerov sindrom).
[0164] Poremećaji vezani za Y su uzrokovani mutacijama na Y hromozomu. Pošto muškarci nasleđuju Y hromozom od svojih očeva, svaki sin pogođenog oca će biti pogođen. Pošto žene nasleđuju X hromozom od svojih očeva, žensko potomstvo obolelih očeva nikada nije pogođeno. Pošto je Y hromozom relativno mali i sadrži vrlo malo gena, postoji relativno malo Y-povezanih poremećaja. Često simptomi uključuju neplodnost, koja se može zaobići uz pomoć nekih tretmana plodnosti. Primeri su muška neplodnost i hipertrihoza pinnae.
[0165] Kao što je objašnjeno, obelodanjeni postupci za detekciju genomskih frakcija u uzorku mogu se koristiti za olakšavanje detekcije aneuploidije iz uzoraka materijala. U nekim otelotvorenjima, aneuploidija je potpuna hromozomska trizomija ili monozomija, ili delimična trizomija ili monozomija. Delimične aneuploidije su uzrokovane gubitkom ili dobijanjem dela hromozoma i obuhvataju hromozomske neravnoteže koje su rezultat neuravnoteženih translokacija, neuravnoteženih inverzija, delecija i umetanja. Daleko najčešća poznata aneuploidija kompatibilna sa životom je trizomija 21, odnosno Daunov sindrom (DS), koji je uzrokovan prisustvom dela ili celog hromozoma 21. Retko, DS može biti uzrokovan naslednim ili sporadičnim defektom pri čemu se dodatna kopija celog ili dela hromozoma 21 vezuje za drugi hromozom (obično hromozom 14) i formira jedan aberantni hromozom. DS je povezan sa intelektualnim oštećenjem, teškim poteškoćama u učenju i prekomernom smrtnošću uzrokovanom dugotrajnim zdravstvenim problemima kao što su bolesti srca. Druge aneuploidije sa poznatim kliničkim značajem uključuju Edvardov sindrom (trizomija 18) i Patauov sindrom (trizomija 13), koji su često fatalni u prvih nekoliko meseci života. Abnormalnosti povezane sa brojem polnih hromozoma su takođe poznate i uključuju monozomiju X npr. Tarnerov sindrom (XO), i trostruki X sindrom (XXX) kod rađanja žena i Klinefelterov sindrom (XXY) i XYY sindrom kod muških porođaja, koji su svi povezani sa različitim fenotipovima uključujući sterilitet i smanjenje intelektualnih veština. Monozomija X [45,X] je čest uzrok ranog gubitka trudnoće i čini oko 7% spontanih pobačaja. Na osnovu učestalosti živorođenih 45,X (takođe nazvan Tarnerov sindrom) od 1-2/10,000, procenjuje se da će manje od 1% od 45,X koncepta preživeti do kraja. Oko 30% pacijenata sa Tarnersovim sindromom je mozaično sa 45,X ćelijskom linijom i 46,XX ćelijskom linijom ili onom koja sadrži preuređeni X hromozom (Hook i Warburton 1983). Fenotip kod živorođenog deteta je relativno blag s obzirom na visoku embrionalnu smrtnost i pretpostavljeno je da verovatno sve živorođene ženke sa Tarnerovim sindromom nose ćelijsku liniju koja sadrži dva polna hromozoma. Monozomija X se može javiti kod žena kao 45,X ili kao 45,X/46XX a kod muškaraca kao 45,X/46XY. Generalno se sugeriše da su autozomne monozomije kod ljudi nekompatibilne sa životom; međutim, postoji veliki broj citogenetskih izveštaja koji opisuju potpunu monozomiju jednog hromozoma 21 kod živorođene dece (Vosranovali dr., Molecular Cytogen. 1:13 [2008]; Joosten i dr., Prenatal Diagn.17:271-5 [1997]. Postupak pronalaska se može koristiti za pomoć u dijagnozi ovih i drugih hromozomskih abnormalnosti prenatalno.
[0166] Prema nekim otelotvorenjima, fetalna frakcija može biti korisna u određivanju prisustva ili odsustva hromozomskih trizomija bilo kog od hromozoma 1-22, X i Y. Primeri hromozomskih trizomija koji se mogu detektovati u skladu sa ovim postupkom uključuju bez ograničenja trizomiju 21 (T21; Daunov sindrom), trizomija 18 (T18; Edvardov sindrom), trizomija 16 (T16), trizomija 20 (T20), trizomija 22 (T22; Sindrom mačjeg oka), trizomija 15 (T15; Prader Willi sindrom), trizomija 13 (T13; Patau sindrom), trizomija 8 (T8; Varkani sindrom), trizomija 9, i XXY (Kleinefelterov sindrom), XYY ili XXX trizomije. Potpune trizomije drugih autozoma koje postoje u ne mozaičnom stanju su smrtonosne, ali mogu biti kompatibilne sa životom kada su prisutne u mozaičnom stanju. Razumljivo je da se različite potpune trizomije, bilo da postoje u mozaičnom ili ne-mozaičnom stanju, i parcijalne trizomije mogu odrediti u fetalnoj cfDNK prema ovom postupku. Postupak pronalaska se može koristiti za pomoć u određivanju ovih i drugih hromozomskih abnormalnosti prenatalno.
[0167] Neograničavajući primeri delimičnih trizomija koji se mogu odrediti ovim postupkom uključuju, ali nisu ograničeni na, delimičnu trizomiju 1q32-44, trizomiju 9 p, trizomiju 4 mozaicizam, trizomiju 17p, delimičnu trizomiju 4q26-qter, delimična trizomija 2p tris delimična trizomija 1q, i/ili delimična trizomija 6p/monozomija 6q.
[0168] Postupci koji su ovde obelodanjeni takođe se mogu koristiti da pomognu u određivanju hromozomske monozomije X, hromozomske monozomije 21 i parcijalnih monozomija kao što su monozomija 13, monozomija 15, monozomija 16, monosomija 21 i monosomija 22, za koje se zna da su pogrešni slučajevi uključeni u trudnoću. Delimična monozomija hromozoma koji su tipično uključeni u potpunu aneuploidiju takođe se može odrediti ovim postupkom. Postupak pronalaska se može koristiti za pomoć u određivanju ovih i drugih hromozomskih abnormalnosti prenatalno. Neograničavajući primeri sindroma delecije koji se mogu odrediti prema ovom postupku uključuju sindrome uzrokovane delimičnim brisanjem hromozoma. Primeri delimičnih delecija koje se mogu odrediti u skladu sa postupkom uključuju, bez ograničenja, delimične delecije hromozoma 1, 4, 5, 7, 11, 18, 15, 13, 17, 22 i 10, koje su opisane u nastavku. Postupak pronalaska se može koristiti za pomoć u određivanju ovih i drugih hromozomskih abnormalnosti prenatalno.
[0169] Sindrom delecije 1w21.1 ili (rekurentna) mikrodelecija 1w21.1 je retka aberacija hromozoma 1. Pored sindroma delecije, postoji i sindrom duplikacije 1w21.1. Dok postoji deo DNK koji nedostaje sa sindromom delecije na određenom mestu, postoje dve ili tri kopije sličnog dela DNK na istom mestu sa sindromom duplikacije. Literatura se odnosi i na brisanje i na dupliranje kao varijacije broja kopija 1q21.1 (CNV). Delecija 1q21.1 može biti povezana sa TAR sindromom (trombocitopenija sa odsutnim radijusom).
[0170] Wolf-Hirschhorn sindrom (WHS) (OMIN #194190) je sindrom kontinualne delecije gena povezan sa hemizigotnom delecijom hromozoma 4p16.3. Wolf-Hirschhorn sindrom je sindrom kongenitalne malformacije koji karakteriše nedostatak pre- i post-natalnog rasta, smetnje u razvoju promenljivog stepena, karakteristične kraniofacijalne crte (izgled nosa „grčki ratnički šlem”, visoko čelo, istaknuta glabela, hipertelorizam, visoko zakrivljene obrve, izbočene oči, epikantalni nabori, kratak filtrum, izrazita usta sa spuštenim uglovima i mikrognatija) i poremećaj epileptičkih napada.
[0171] Delimično brisanje hromozoma 5, takođe poznato kao 5p- ili 5p minus, i nazvano
4
sindromom mačijeg kašlja (OMIN#123450), uzrokovano je brisanjem kratkog kraka (p kraka) hromozoma 5 (5p15.3-p15.2). Bebe sa ovim stanjem često imaju piskav plač koji zvuči kao mačji. Poremećaj se karakteriše intelektualnim invaliditetom i odloženim razvojem, malom veličinom glave (mikrocefalija), malom porođajnom masom i slabim mišićnim tonusom (hipotonija) u detinjstvu, karakterističnim crtama lica i mogućim srčanim manama.
[0172] Williams-Beuren sindrom poznat i kao sindrom delecije hromozoma 7q11.23 (OMIN 194050) je sindrom susedne delecije gena koji rezultira multisistemskim poremećajem izazvanim hemizigotnom delecijom od 1,5 do 1,8 Mb na hromozomu 7q11, koji sadrži približno 2.2 gena.
[0173] Jakobsenov sindrom, takođe poznat kao poremećaj delecije 11q, je redak urođeni poremećaj koji je rezultat brisanja terminalnog regiona hromozoma 11 koji uključuje traku 11q24.1. Može izazvati intelektualne smetnje, karakterističan izgled lica i razne fizičke probleme uključujući srčane mane i poremećaj krvarenja.
[0174] Delimična monosomija hromozoma 18, poznata kao monosomija 18p je redak hromozomski poremećaj u kome je cela ili deo kratkog kraka (p) hromozoma 18 izbrisan (monozomski). Poremećaj se obično karakteriše niskim rastom, promenljivim stepenom mentalne retardacije, kašnjenjem u govoru, malformacijama lobanje i facijalnog (kraniofacijalnog) regiona i/ili dodatnim fizičkim abnormalnostima. Pridruženi kraniofacijalni defekti mogu se značajno razlikovati po opsegu i ozbiljnosti od slučaja do slučaja.
[0175] Stanja uzrokovana promenama u strukturi ili broju kopija hromozoma 15 uključuju Angelmanov sindrom i Prader Willi sindrom, koji uključuju gubitak genske aktivnosti u istom delu hromozoma 15, regionu 15q11-q13. Biće cenjeno da nekoliko translokacija i mikrodelecija mogu biti asimptomatski kod roditelja nosioca, ali mogu izazvati veliku genetsku bolest kod potomaka. Na primer, zdrava majka koja nosi mikrodeleciju 15q11-q13 može da rodi dete sa Angelmanovim sindromom, teškim neurodegenerativnim poremećajem. Dakle, ovaj postupak se može koristiti za identifikaciju takve delimične delecije i drugih delecija u fetusu. Postupak pronalaska se može koristiti za pomoć u identifikaciji ovih i drugih hromozomskih abnormalnosti prenatalno.
[0176] Delimična monozomija 13q je redak hromozomski poremećaj koji nastaje kada nedostaje deo dugačkog kraka (q) hromozoma 13 (monozomski). Deca rođena sa delimičnom monozomijom 13q mogu imati malu porođajnu masu, malformacije glave i lica (kraniofacijalni region), skeletne abnormalnosti (posebno šake i stopala) i druge fizičke abnormalnosti. Mentalna retardacija je karakteristična za ovo stanje. Stopa mortaliteta u detinjstvu je visoka među osobama rođenim sa ovim poremećajem. Skoro svi slučajevi delimične monozomije 13q javljaju se nasumično bez očiglednog razloga (sporadično).
[0177] Smith-Magenisov sindrom (SMS - OMIM #182290) je uzrokovan brisanjem ili gubitkom genetskog materijala na jednoj kopiji hromozoma 17. Ovaj dobro poznati sindrom je povezan sa zaostajanjem u razvoju, mentalnom retardacijom, urođenim anomalijama kao što su defekti srca i bubrega, i neurobihejvioralnim abnormalnostima kao što su teški poremećaji sna i samopovređivanje. Smith-Magenisov sindrom (SMS) je u većini slučajeva (90%) uzrokovan intersticijskom delecijom od 3,7 Mb u hromozomu 17p11.2.
[0178] Sindrom delecije 22q11.2, takođe poznat kao Didžordžov sindrom, je sindrom uzrokovan brisanjem malog dela hromozoma 22. Delecija (22 q11.2) se dešava blizu sredine hromozoma na dugom kraku jednog od para hromozoma. Karakteristike ovog sindroma se veoma razlikuju, čak i među članovima iste porodice, i utiču na mnoge delove tela.
Karakteristični znaci i simptomi mogu uključivati urođene mane kao što su urođene srčane bolesti, defekti na nepcu, najčešće povezani sa neuromišićnim problemima sa zatvaranjem (velofaringealna insuficijencija), smetnje u učenju, blage razlike u crtama lica i ponavljajuće infekcije. Mikrodelecije u hromozomskom regionu 22q11.2 su povezane sa 20 do 30 puta povećanim rizikom od šizofrenije.
[0179] Delecije na kratkom kraku hromozoma 10 su povezane sa fenotipom poput Didžordžovog sindroma. Delimična monozomija hromozoma 10p je retka, ali je primećena kod dela pacijenata koji pokazuju karakteristike Didžordžovog sindroma.
[0180] U jednom otelotvorenju, postupak se koristi za određivanje delimičnih monozomija uključujući ali bez ograničenja na delimičnu monozomiju hromozoma 1, 4, 5, 7, 11, 18, 15, 13, 17, 22 i 10, npr. delimična monozomija 1q21.11, delimična monozomija 4p16.3, delimična monozomija 5p15.3-p15.2, delimična monozomija 7q11.23, delimična monozomija 11q24.1, delimična monozomija 18p, delimična monozomija 1-q15 (deo hromozomije 1-q15) monozomija 13q, delimična monozomija 17p11.2, delimična monozomija hromozoma 22
4
(22q11.2) i delimična monozomija 10p takođe se mogu odrediti korišćenjem postupka.
Postupak pronalaska se može koristiti za pomoć u određivanju ovih i drugih hromozomskih abnormalnosti prenatalno.
[0181] Druge parcijalne monozomije koje se mogu odrediti prema postupku uključuju neuravnoteženu translokaciju t(8;11)(p23.2;p15.5); 11q23 mikrodelecija; 17p11.2 delecija; 22q13.3 delecija; Xp22.3 mikrodelecija; 10p14 delecija; 20p mikrodelecija, [del(22)(q11.2q11.23)], 7q11.23 i 7q36 delecija; 1p36 delecija; 2p mikrodelecija; tip neurofibromatoze 1 (17q11.2 mikrodelecija), Yq delecija; 4p16.3 mikrodelecija; 1p36.2 mikrodelecija; 11q14 delecija; 19q13.2 mikrodelecija; Rubinstein-Taybi (16 p13.3 mikrodelecija); 7p21 mikrodelecija; Miller-Dieker sindrom (17p13.3); i 2q37 mikrodelecija. Delimične delecije mogu biti male delecije dela hromozoma, ili mogu biti mikrodelecije hromozoma gde može doći do delecije jednog gena. Postupak pronalaska se može koristiti za pomoć u određivanju ovih i drugih hromozomskih abnormalnosti prenatalno.
[0182] Identifikovano je nekoliko sindroma duplikacije uzrokovanih umnožavanjem dela krakova hromozoma (pogledajte OMIN [Onlajn Mendelsko nasleđe kod čoveka na Internetu na ncbi.nlm.nih.gov/omim]). U jednom otelotvorenju, ovaj postupak se može koristiti za određivanje prisustva ili odsustva duplikacija i/ili umnožavanja segmenata bilo kog od hromozoma 1-22, X i Y. Neograničavajući primeri sindroma duplikacije koji se mogu odrediti prema ovom postupku uključuje duplikacije dela hromozoma 8, 15, 12 i 17, koji su opisani u nastavku.
[0183] Sindrom duplikacije 8p23.1 je redak genetski poremećaj uzrokovan duplikacijom regiona iz humanog hromozoma 8. Ovaj sindrom duplikacije ima procenjenu prevalenciju od 1 od 64.000 rođenih i recipročan je sindromu delecije 8p23.1. Duplikacija 8p23.1 je povezana sa promenljivim fenotipom, uključujući jedno ili više kašnjenja govora, kašnjenja u razvoju, blagog dismorfizma, sa istaknutim čelom i zakrivljenim obrvama i urođenim srčanim oboljenjima (CHD).
[0184] Sindrom umnožavanja hromozoma 15q (Dup15q) je klinički prepoznatljiv sindrom koji je rezultat dupliranja hromozoma 15q11-13.1 Bebe sa Dup15q obično imaju hipotoniju (loš mišićni tonus), usporavanje rasta; mogu se roditi sa rascepom usne i/ili nepca ili malformacijama srca, bubrega ili drugih organa; pokazuju određeni stepen kognitivnog
4
kašnjenja/onesposobljenosti (mentalna retardacija), kašnjenja u govoru i jeziku i poremećaje senzorne obrade.
[0185] Pallister-Killian sindrom je rezultat dodatnog materijala #12 hromozoma. Obično postoji mešavina ćelija (mozaicizam), neke sa dodatnim materijalom #12, a neke normalne (46 hromozoma bez dodatnog materijala #12). Bebe sa ovim sindromom imaju mnogo problema uključujući tešku mentalnu retardaciju, loš tonus mišića, „grube“ crte lica i istaknuto čelo. Oni imaju tendenciju da imaju veoma tanku gornju usnu sa debljom donjom usnom i kratkim nosom. Ostali zdravstveni problemi uključuju napade, loše hranjenje, ukočene zglobove, katarakte u odraslom dobu, gubitak sluha i srčane mane. Osobe sa Pallister-Killian sindromom imaju skraćeni životni vek.
[0186] Pojedinci sa genetskim stanjem označenim kao dup(17)(p11.2p11.2) ili dup 17p nose dodatne genetske informacije (poznate kao duplikacije) na kratkom kraku hromozoma 17. Duplikacija hromozoma 17p11.2 leži u osnovi Potocki-Lupskijevog sindroma (PTLS), koji je novopriznato genetsko stanje sa samo nekoliko desetina slučajeva prijavljenih u medicinskoj literaturi. Pacijenti koji imaju ovo dupliranje često imaju nizak tonus mišića, lošu ishranu i neuspeh da napreduju tokom detinjstva, a takođe imaju odložen razvoj motoričkih i verbalnih prekretnica. Mnogi pojedinci koji imaju PTLS imaju poteškoća sa artikulacijom i obradom jezika. Pored toga, pacijenti mogu imati karakteristike ponašanja slične onima koje se vide kod osoba sa autizmom ili poremećajima iz spektra autizma. Pojedinci sa PTLS-om mogu imati srčane mane i apneju u snu. Poznato je da dupliranje velikog regiona u hromozomu 17p12 koji uključuje gen PMP22 uzrokuje Charcot-Marie Tooth bolest.
[0187] CNV su povezani sa mrtvorođenim bebama. Međutim, zbog inherentnih ograničenja konvencionalne citogenetike, smatra se da je doprinos CNV mrtvorođenosti nedovoljno zastupljen (Harris i dr., PrenatalDiagn 31:932-944 [2011]). Predmetni postupci su korisne u pomaganju u određivanju prisustva parcijalnih aneuploidija, npr. brisanja i umnožavanja segmenata hromozoma, i mogu se koristiti za identifikaciju i određivanje prisustva ili odsustva CNV-a koji su povezani sa mrtvorođenim bebama.
[0188] Ovaj postupak takođe može pomoći u identifikaciji polimorfizama povezanih sa genetskim poremećajima koji su složeni, multifaktorski ili poligeni, što znači da su verovatno povezani sa efektima više gena u kombinaciji sa životnim stilom i faktorima životne sredine.
4
Multifaktorski poremećaji uključuju, na primer, bolesti srca i dijabetes. Iako se složeni poremećaji često grupišu u porodicama, oni nemaju jasan obrazac nasleđivanja. U pedigreu, poligene bolesti imaju tendenciju da se „pokreću u porodicama“, ali nasleđivanje nije jednostavno kao kod Mendelovih bolesti. Jake komponente životne sredine su povezane sa mnogim složenim poremećajima, na primer, krvnim pritiskom. Ovaj postupak se može koristiti za identifikaciju polimorfizama koji su povezani sa poligenskim poremećajima uključujući, ali ne ograničavajući se na astmu, autoimune bolesti kao što su multipla skleroza, kanceri, ciliopatije, rascep nepca, dijabetes, bolesti srca, hipertenzija, inflamatorne bolesti creva, mentalna retardacija, poremećaj raspoloženja, gojaznost, refrakciona greška i neplodnost. U nekim otelotvorenjima, polimorfizmi su SNP. U drugim otelotvorenjima, polimorfizmi su STR. U dodatnim otelotvorenjima, polimorfizmi su kombinacija SNP-ova i STR-ova.
[0189] U jednom otelotvorenju, identifikacija polimorfnih sekvenci povezanih sa poremećajima obuhvata sekvenciranje najmanje dela ćelijskog genoma koji odgovara drugom genomu u mešavini cfDNK. Identifikacija polimorfnih sekvenci koje je doprineo prvi genom vrši se određivanjem sekvence na više polimorfnih mesta u prvom uzorku koji sadrži molekule DNK izvedene u suštini samo iz drugog genoma, određivanjem sekvence na odgovarajućim više polimorfnih mesta u drugom uzorku koji sadrži smešu molekula DNK izvedenih iz prvog i drugog genoma, i upoređivanje polimorfnih sekvenci određenih u oba uzorka, čime se identifikuju višestruki polimorfizmi u prvom genomu uzorka koji sadrži mešavinu dva genoma. Na primer, identifikacija polimorfnih sekvenci koje je doprineo fetalni genom, tj. prvi genom, vrši se određivanjem sekvence na više polimorfnih mesta u uzorku majčinog dlaka, tj. uzorku koji sadrži DNK molekule izvedene u suštini iz samo drugog genoma, određujući sekvencu na odgovarajućih višestrukih polimorfnih mesta u prečišćenom uzorku plazme, tj. drugom uzorku koji sadrži mešavinu cfDNK molekula izvedenih iz fetalnog i majčinog genoma, i upoređivanje polimorfnih sekvenci određenih u oba uzorka da bi se identifikovali višestruki fetalni polimorfizmi. U jednom otelotvorenju, prvi genom je fetalni genom, a drugi genom je genom majke. U drugom otelotvorenju, prvi genom je genom ćelije koja nije pogođena, a drugi genom je genom zahvaćene ćelije. U nekim otelotvorenjima, zahvaćene i nezahvaćene ćelije potiču od istog subjekta. Na primer, zahvaćena ćelija može biti ćelija čiji je genom izmenjen zbog poremećaja.
[0190] U jednom otelotvorenju, obelodanjeni postupci procene genomske frakcije pomažu u
4
otkrivanju raka kod pacijenta. U različitim primerima, rak se otkriva postupkom koji obuhvata: obezbeđivanje uzorka od pacijenta koji se sastoji od mešavine genoma izvedenih iz normalnih, tj. nezahvaćenih, i kanceroznih, tj. zahvaćenih ćelija; i identifikovanje više polimorfizama povezanih sa rakom. U nekim otelotvorenjima, uzorak se bira između krvi, plazme, seruma i urina. U nekim otelotvorenjima, uzorak je uzorak plazme. U drugim otelotvorenjima, uzorak je uzorak urina.
[0191] U jednom otelotvorenju, identifikacija višestrukih polimorfizama povezanih sa rakom obuhvata obogaćivanje DNK u uzorku za polimorfne ciljne sekvence. U drugim otelotvorenjima, obogaćivanje uzorka za polimorfne ciljne sekvence se ne vrši. U nekim otelotvorenjima, identifikacija višestrukih polimorfizama povezanih sa rakom obuhvata kvantifikaciju broja kopija polimorfne sekvence.
[0192] Karcinomi koji se mogu identifikovati i/ili pratiti prema postupku uključuju solidne tumore, kao i hematološke tumore i/ili malignitete. Različiti karcinomi koji se leče uključuju sarkome, karcinome i adenokarcinome koji nisu ograničeni na rak dojke, rak pluća, kolorektalni kancer, rak pankreasa, rak jajnika, rak prostate, karcinom bubrega, hepatom, rak mozga, melanom, multipli mijelom, limfom, Hodžkinova bolest , ne-Hodgkinov limfom, dečiji limfomi i limfomi limfocitnog i kožnog porekla, leukemija, leukemija u detinjstvu, leukemija dlakavih ćelija, akutna limfocitna leukemija, akutna mijelocitna leukemija, mijeloidne neoplazme, neoplazme mastocita, hematološki tumor i limfoidni tumor, uključujući metastatske lezije u drugim tkivima ili organima udaljenim od primarnog mesta tumora.
[0193] Postupci prema predmetnom obelodanjivanju su korisni, na primer, u kontekstu dijagnostikovanja ili određivanja prognoze u bolesnom stanju za koje se zna da je povezano sa određenim haplotipom(vima), da bi se odredili novi haplotipovi i da bi se otkrile asocijacije haplotipova sa odgovorom na farmaceutskih proizvoda. Povezanost višestrukih polimorfnih sekvenci sa višestrukim poremećajima može se odrediti iz identiteta jedne polimorfne sekvence za svaki od višestrukih poremećaja. Alternativno, povezanost višestrukih polimorfnih sekvenci sa višestrukim poremećajima može se odrediti iz identiteta višestrukih polimorfnih sekvenci za svaki od višestrukih poremećaja.
[0194] Konvencionalne tehnike genotipizacije su ograničene na identifikaciju polimorfizama
4
u kratkim genomskim regionima od nekoliko kilobaza, a identifikacija haplotipova se oslanjala na porodične podatke i statističku procenu korišćenjem računskih algoritama.
Sekvenciranje celog genoma omogućava identifikaciju haplotipova direktnim identifikovanjem polimorfizama na genomu. Identifikacija haplotipova prema različitim otelotvorenjima nije ograničena intervencionim rastojanjem između polimorfizama. U nekim otelotvorenjima, postupak obuhvata ceo genom sekvencioniranje ćelijske DNK majke.
Ćelijska DNK majke se može dobiti iz biološkog uzorka bez genomske DNK fetusa. Na primer, majčinska DNK se može dobiti iz sloja žutog sloja majčine krvi. Mogu se odrediti haplotipovi koji sadrže mnoštvo polimorfnih sekvenci koje obuhvataju čitave hromozome. U jednom otelotvorenju, fetalni haplotipovi se upoređuju sa poznatim haplotipovima povezanim sa poremećajem, a na osnovu podudaranja fetalnog haplotipa sa bilo kojim od poznatih haplotipova povezanih sa poremećajem ukazuje na to da fetus ima poremećaj ili da je fetus podložan poremećaj. Fetalni haplotipovi se takođe mogu uporediti sa haplotipovima povezanim sa odgovorom na tretman ili neodgovornošću specifičnog polimorfizma.
Poređenje identifikovanih fetalnih haplotipova sa poznatim bazama podataka haplotipova omogućava dijagnozu i/ili prognozu poremećaja. Bilo koji biološki uzorak koji sadrži mešavinu cfDNK fetusa i majke može se koristiti za određivanje prisustva ili odsustva fetalnog poremećaja. Poželjno, biološki uzorak se bira iz krvi, ili njenih frakcija uključujući plazmu ili urin. U jednom otelotvorenju, biološki uzorak je uzorak krvi. U drugom otelotvorenju, biološki uzorak je uzorak plazme. U dodatnom otelotvorenju, biološki uzorak je uzorak urina.
[0195] U jednom otelotvorenju, obelodanjivanje obezbeđuje postupak za određivanje prisustva ili odsustva višestrukih fetalnih poremećaja, koji obuhvata (a) dobijanje uzorka krvi majke koji sadrži mešavinu fetalne i majčinske DNK bez ćelija, (b) sekvenciranje celog genoma najmanje deo mešavine fetalne i majčine DNK bez ćelija, čime se dobija veći broj oznaka sekvence; (c) određivanje višestrukih fetalnih polimorfizama u oznakama sekvence i (d) određivanje prisustva ili odsustva višestrukih fetalnih poremećaja. Primeri višestrukih fetalnih poremećaja koji se mogu identifikovati prema ovom postupku uključuju monogene i poligene poremećaje opisane ovde. Postupak pronalaska se može koristiti za pomoć u određivanju ovih i drugih fetalnih poremećaja prenatalno.
[0196] U jednom otelotvorenju, pronalazak obezbeđuje postupak za određivanje prisustva ili odsustva višestrukih fetalnih poremećaja koji obuhvata identifikaciju višestrukih fetalnih polimorfizama povezanih sa višestrukim haplotipovima povezanih sa poremećajima. U nekim otelotvorenjima, svaki od haplotipova sadrži najmanje dva, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje pet, najmanje deset ili najmanje petnaest različitih polimorfizama oznaka.
Polimorfizmi oznaka prisutni u haplotipu mogu biti istog tipa polimorfizma, npr. svi tag SNP polimorfizmi, ili mogu biti kombinacija polimorfizama npr. SNP oznaka i brisanja oznaka. U jednom otelotvorenju, polimorfizmi su tag SNP. U drugom otelotvorenju, polimorfizmi su oznake STR. U još jednom otelotvorenju, polimorfizmi su kombinacija SNP oznaka i STR oznaka. Polimorfizmi oznaka mogu biti u kodirajućim i/ili nekodirajućim regionima genoma. Identifikacija polimorfizama se vrši sekvenciranjem celog genoma korišćenjem NGS tehnologija kao što je ovde opisano. Postupak pronalaska se može koristiti za pomoć u određivanju ovih i drugih fetalnih poremećaja prenatalno.
[0197] Obelodanjivanje obezbeđuje postupak za identifikaciju varijacija broja kopija (CNV) kao polimorfizama sekvence od interesa u uzorku za testiranje koji sadrži mešavinu nukleinskih kiselina dobijenih iz dva različita genoma, a za koje je poznato ili se sumnja da se razlikuju u količini jednu ili više sekvenci od interesa. Varijacije broja kopija određene postupkom pronalaska uključuju dobitke ili gubitke celih hromozoma, promene koje uključuju veoma velike hromozomske segmente koji su mikroskopski vidljivi, i obilje submikroskopskih varijacija broja kopija segmenata DNK u rasponu od kilobaza (kb) do megabaza (Mb) u veličini. Postupak pronalaska se može koristiti za pomoć u identifikaciji ovih i drugih CNV prenatalno.
[0198] CNV u ljudskom genomu značajno utiče na ljudsku raznolikost i predispoziciju za bolesti (Redon i dr., Nature 23:444-454 [2006], Shaikhi dr. Genome Res 19:1682-1690
[2009]). Poznato je da CNV doprinose genetskoj bolesti kroz različite mehanizme, što dovodi do neravnoteže doze gena ili poremećaja gena u većini slučajeva. Pored njihove direktne korelacije sa genetskim poremećajima, poznato je da CNV posreduju u fenotipskim promenama koje mogu biti štetne. Nedavno je nekoliko studija izvestilo o povećanom teretu retkih ili novonastalih CNV kod kompleksnih poremećaja kao što su autizam, ADHD i šizofrenija u poređenju sa normalnim kontrolama, naglašavajući potencijalnu patogenost retkih ili jedinstvenih CNV (Sebat i dr., 316:445 - 449 [2007]; Walsh i dr., Science 320:539 -543 [2008]). CNV nastaju iz genomskih preuređivanja, prvenstveno zbog delecije, dupliciranja, umetanja i neuravnoteženih događaja translokacije.
1
[0199] Ostvarenja obezbeđuju postupak za procenu varijacije broja kopija niza od interesa, npr. klinički relevantnu sekvencu, u test uzorku koji sadrži mešavinu nukleinskih kiselina dobijenih iz dva različita genoma, i za koje je poznato ili se sumnja da se razlikuju u količini jedne ili više sekvenci od interesa. Mešavina nukleinskih kiselina je izvedena iz dve ili više vrsta ćelija. U jednom otelotvorenju, smeša nukleinskih kiselina je izvedena iz normalnih i ćelija raka dobijenih od ispitanika koji pati od medicinskog stanja, npr. raka. Postupak pronalaska se može koristiti za pomoć u identifikaciji ovih i drugih CNV prenatalno.
[0200] Veruje se da mnogi čvrsti tumori, kao što je rak dojke, napreduju od inicijacije do metastaza kroz akumulaciju nekoliko genetskih aberacija. [Sato i dr., Cancer Res., 50: 7184-7189 [1990]; Jongsmai dr., J ClinPathol: Mol Path 55:305-309 [2002])]. Takve genetske aberacije, kako se akumuliraju, mogu dati proliferativne prednosti, genetsku nestabilnost i prateću sposobnost brzog razvoja rezistencije na lekove, kao i pojačanu angiogenezu, proteolizu i metastaze. Genetske aberacije mogu uticati ili na recesivne "geni supresora tumora" ili na onkogene koji dominiraju. Veruje se da delecije i rekombinacije koje dovode do gubitka heterozigotnosti (LOH) igraju glavnu ulogu u progresiji tumora otkrivanjem mutiranih tumor supresorskih alela.
[0201] cfDNK je pronađena u cirkulaciji pacijenata sa dijagnozom maligniteta uključujući, ali ne ograničavajući se na rak pluća (Pathaki dr. ClinChem 52:1833-1842 [2006]), rak prostate (Schwartzenbach i dr. Clin Cancer Res 15:1032-8 [2009]), i rak dojke (Schwartzenbach i dr. dostupno na mreži na breast-cancer-research.com/content/11/5/R71 [2009]). Identifikacija genomskih nestabilnosti povezanih sa karcinomima koje se mogu odrediti u cirkulišućoj cfDNK kod pacijenata sa rakom je potencijalno dijagnostičko i prognostičko sredstvo. U jednom otelotvorenju, postupak procenjuje CNV sekvence od interesa u uzorku koji sadrži mešavinu nukleinskih kiselina dobijenih od ispitanika za koji se sumnja ili je poznato da ima rak, npr. karcinom, sarkom, limfom, leukemija, tumori polnih ćelija i blastom. U jednom otelotvorenju, uzorak je uzorak plazme dobijen (procesi) iz periferne krvi i koji sadrži mešavinu cfDNK izvedene iz normalnih i ćelija raka. U drugom otelotvorenju, biološki uzorak koji je potreban da bi se utvrdilo da li je CNV prisutan je izveden iz mešavine ćelija raka i ne kanceroznih iz drugih bioloških tečnosti uključujući, ali ne ograničavajući se na serum, znoj, suze, sputum, urin, sputum, protok uha, limfa, pljuvačka, likvor, pustoši, suspenzija koštane srži, vaginalni tok, transcervikalna lavaža, moždana tečnost, ascites, mleko, sekreti respiratornog, crevnog i genitourinarnog trakta i uzorci leukoforeze, ili u
2
biopsijama tkiva svaka, mrlje.
[0202] Sekvenca od interesa je sekvenca nukleinske kiseline za koju se zna ili se sumnja da igra ulogu u razvoju i/ili napredovanju kancera. Primeri sekvence od interesa uključuju sekvence nukleinskih kiselina koje su amplifikovane ili deletirane u ćelijama raka kao što je opisano u nastavku.
[0203] Dominantno delujući geni povezani sa humanim čvrstim tumorima obično ispoljavaju svoj efekat prekomernom ili izmenjenom ekspresijom. Amplifikacija gena je uobičajeni mehanizam koji dovodi do pojačane regulacije genske ekspresije. Dokazi iz citogenetskih ispitivanja pokazuju da se značajno pojačanje javlja u preko 50% slučajeva raka dojke kod ljudi. Najvažnije, amplifikacija protoonkogenog receptora humanog epidermalnog faktora rasta 2 (HER2) koji se nalazi na hromozomu 17 (17(17q21-q22)), rezultira prekomernom ekspresijom HER2 receptora na površini ćelije što dovodi do prekomerne i neregulisane signalizacije kod kancera dojke i drugih maligniteta (Park i dr., Clinical Breast Cancer 8:392-401 [2008]). Utvrđeno je da su različiti onkogeni pojačani u drugim malignim tumorima kod ljudi. Primeri pojačanja ćelijskih onkogena u humanim tumorima uključuju amplifikacije: cmyc u ćelijskoj liniji promijelocitne leukemije HL60 i u ćelijskim linijama malih ćelija karcinoma pluća, N-mic u primarnim neuroblastomima (stadijum III i IV), ćelijskim linijama neuroblastoma, ćelijskoj liniji retinoblastoma i primarnim tumorima i karcinomu malih ćelija pluća linije i tumori, L-mic u ćelijskim linijama i tumorima karcinoma malih ćelija pluća, cmib u ćelijskim linijama akutne mijeloidne leukemije i karcinoma debelog creva, c-erbb u ćeliji epidermoidnog karcinoma i primarnim gliomima, c-K-ras-2 u primarni karcinom pluća, debelog creva, bešike i rektuma, N-ras u ćelijskoj liniji karcinoma dojke (Varmus H., Ann Rev Genetics 18: 553-612 (1984) [citirano u Watson i dr., Molecular Biology of the Gene (4th ed.; Benjamin/Cummings Publishing Co.1987)].
[0204] Hromozomske delecije koje uključuju tumor supresorske gene mogu igrati važnu ulogu u razvoju i napredovanju solidnih tumora. Gen supresor tumora retinoblastoma (Rb-1), lociran u hromozomu 13q14, je najopsežnije okarakterisan gen supresor tumora. Proizvod gena Rb-1, nuklearni fosfoprotein od 105 kDa, očigledno igra važnu ulogu u regulaciji ćelijskog ciklusa (Howe i dr., ProcNatlAcadSci (USA) 87:5883-5887 [1990]). Izmenjena ili izgubljena ekspresija Rb proteina je uzrokovana inaktivacijom oba alela gena bilo kroz tačkastu mutaciju ili hromozomsku deleciju. Utvrđeno je da su promene gena Rb prisutne ne samo kod retinoblastoma već i kod drugih maligniteta kao što su osteosarkomi, karcinom pluća malih ćelija (Rygaard i dr., Cancer Res 50: 5312-5317 [1990)]) i rak dojke. Ispitivanja polimorfizma dužine restrikcionih fragmenata (RFLP) su pokazale da su takvi tipovi tumora često gubili heterozigotnost na 13q, što sugeriše da je jedan od alela gena Rb-1 izgubljen usled velike hromozomske delecije (Bowcock i dr., Am J Hum Genet, 46: 12 [1990]).
Abnormalnosti hromozoma 1, uključujući duplikacije, delecije i neuravnotežene translokacije koje uključuju hromozom 6 i druge partnerske hromozome, ukazuju na to da regioni hromozoma 1, posebno 1q21-1q32 i 1p11-13, mogu sadržavati onkogene ili gene supresorske tumore koji su relevantni i za hronični patogen. faze mijeloproliferativnih neoplazmi (Caramazza i dr., Eur J Hematol84:191-200 [2010]). Mijeloproliferativne neoplazme su takođe povezane sa brisanjem hromozoma 5. Potpuni gubitak ili intersticijalna brisanja hromozoma 5 su najčešća kariotipska abnormalnost kod mijelodisplastičnih sindroma (MDS). Izolovani pacijenti sa del(5q)/5q- MDS imaju povoljniju prognozu od onih sa dodatnim kariotipskim defektima, koji imaju tendenciju da razviju mijeloproliferativne neoplazme (MPN) i akutnu mijeloidnu leukemiju. Učestalost neuravnoteženih delecija hromozoma 5 dovela je do ideje da 5q sadrži jedan ili više tumor-supresorskih gena koji imaju fundamentalnu ulogu u kontroli rasta hematopoetskih matičnih/progenitornih ćelija (HSC/HPC). Citogenetsko mapiranje regiona koji se obično brišu (CDR) sa centrom na 5q31 i 5q32 identifikovanim genima kandidatima za supresiju tumora, uključujući ribozomalnu podjedinicu RPS14, faktor transkripcije Egr1/Krox20 i protein za remodeliranje citoskeleta, alfa-katenin (Eisenmanni dr., Oncogene 28:3429-3441 [2009]). Citogenetske i alelotipske studije svežih tumora i tumorskih ćelijskih linija su pokazale da je gubitak alela iz nekoliko različitih regiona na hromozomu 3p, uključujući 3p25, 3p21-22, 3p21.3, 3p12-13 i 3p14, najraniji i najčešći genomski abnormalni poremećaji. spektar glavnih epitelnih karcinoma pluća, dojke, bubrega, glave i vrata, jajnika, grlića materice, debelog creva, pankreasa, jednjaka, bešike i drugih organa. Nekoliko gena supresora tumora mapirano je u hromozomski 3p region i smatra se da intersticijska brisanja ili hipermetilacija promotera prethode gubitku 3p ili celog hromozoma 3 u razvoju karcinoma (Angeloni D., Briefings Functional Genomics 6:19-39 [2007]).
[0205] Novorođenčad i deca sa Daunovim sindromom (DS) često imaju kongenitalnu prolaznu leukemiju i imaju povećan rizik od akutne mijeloidne leukemije i akutne limfoblastne leukemije. Hromozom 21, koji sadrži oko 300 gena, može biti uključen u brojne strukturne aberacije, npr., translokacije, delecije i amplifikacije, kod leukemija, limfoma i
4
solidnih tumora. Štaviše, identifikovani su geni koji se nalaze na hromozomu 21 koji igraju važnu ulogu u tumorigenezi. Somatske numeričke kao i strukturne aberacije hromozoma 21 su povezane sa leukemijama, a specifični geni uključujući RUNX1, TMPRSS2 i TFF, koji se nalaze u 21q, igraju ulogu u tumorigenezi (Fonatsch C Gene Chromosomes Cancer 49:497-508 [2010]).
[0206] Obelodanjivanje pruža sredstva za procenu povezanosti između amplifikacije gena i obima evolucije tumora. Korelacija između amplifikacije i/ili delecije i stadijuma ili stepena raka može biti prognostički važna jer takve informacije mogu doprineti definiciji genetski zasnovanog stepena tumora koji bi bolje predvideo budući tok bolesti sa uznapredovalim tumorima koji imaju najgoru prognozu. Pored toga, informacije o ranim događajima amplifikacije i/ili delecije mogu biti korisne u povezivanju tih događaja kao prediktora naknadne progresije bolesti. Amplifikacija i brisanje gena kao što su identifikovani metodom mogu biti povezani sa drugim poznatim parametrima kao što su stepen tumora, histologija, Brd/Urd indeks obeležavanja, hormonski status, zahvaćenost čvorova, veličina tumora, trajanje preživljavanja i druga svojstva tumora dostupna iz epidemioloških i biostatističkih ispitivanja. Na primer, DNK tumora koji se testira metodom može uključivati atipičnu hiperplaziju, duktalni karcinom in situ, stadijum I-III kancera i metastatske limfne čvorove kako bi se omogućila identifikacija povezanosti između amplifikacija i delecija i stadijuma. Stvorena udruženja mogu omogućiti efikasnu terapijsku intervenciju. Na primer, konzistentno amplifikovani regioni mogu sadržati prekomerno eksprimiran gen, čiji proizvod može biti u stanju da bude terapeutski napadnut (na primer, tirozin kinaza receptora faktora rasta, p185<HER2>).
[0207] Postupak se može koristiti za identifikaciju događaja amplifikacije i/ili delecije koji su povezani sa rezistencijom na lek određivanjem varijacije broja kopija nukleinskih kiselina od primarnih karcinoma do onih ćelija koje su metastazirale na druga mesta. Ako je amplifikacija i/ili delecija gena manifestacija kariotipske nestabilnosti koja omogućava brz razvoj rezistencije na lekove, očekivalo bi se više amplifikacije i/ili delecije kod primarnih tumora od hemorezistentnih pacijenata nego kod tumora kod hemosenzitivnih pacijenata. Na primer, ako je amplifikacija specifičnih gena odgovorna za razvoj rezistencije na lekove, očekuje se da će regioni koji okružuju te gene biti konzistentno pojačani u tumorskim ćelijama iz pleuralnih izliva hemorezistentnih pacijenata, ali ne i u primarnim tumorima. Otkriće povezanosti između amplifikacije i/ili delecije gena i razvoja rezistencije na lekove može omogućiti identifikaciju pacijenata koji će ili neće imati koristi od adjuvantne terapije.
[0208] U drugim otelotvorenjima, ovaj postupak se može koristiti za identifikaciju polimorfizama povezanih sa poremećajima ponavljanja trinukleotida, koji su skup genetskih poremećaja uzrokovanih ekspanzijom trinukleotidnog ponavljanja. Ekspanzije trinukleotida su podskup nestabilnih mikrosatelitnih ponavljanja koji se javljaju u svim genomskim sekvencama. Ako je ponavljanje prisutno u zdravom genu, dinamička mutacija može povećati broj ponavljanja i rezultirati defektnim genom. U jednom otelotvorenju, ovaj postupak se može koristiti za identifikaciju trinukleotidnih ponavljanja povezanih sa fragilnim X sindromom. Dugi krak X hromozoma pacijenata koji pate od fragilnog X sindroma može sadržati od 230 do 4000 CGG, u poređenju sa 60 do 230 ponavljanja kod nosilaca i 5 do 54 ponavljanja kod osoba koje nisu pogođene. Hromozomska nestabilnost koja je rezultat ove ekspanzije trinukleotida klinički se manifestuje kao mentalna retardacija, karakteristične crte lica i makroorhidizam kod muškaraca. Druga, srodna bolest ponavljanja DNK tripleta, fragilni X-E sindrom, takođe je identifikovana na X hromozomu, ali je utvrđeno da je rezultat proširenog ponavljanja CCG. Ovaj postupak može da identifikuje ponavljanja trinukleotida povezana sa drugim poremećajima ekspanzije ponavljanja uključujući kategorije I, II i III. Poremećaji kategorije I uključuju Hantingtonovu bolest (HD) i spinocerebelarne ataksije koje su uzrokovane ekspanzijom CAG ponavljanja u delovima specifičnih gena koji kodiraju proteine. Ekspanzije kategorije II imaju tendenciju da budu fenotipski raznovrsnije sa heterogenim ekspanzijama koje su generalno male veličine, ali se takođe nalaze u egzonima gena. Kategorija III uključuje fragilni X sindrom, miotoničnu distrofiju, dve spinocerebelarne ataksije, juvenilnu miokloničnu epilepsiju i Fridrajhovu ataksiju. Ove bolesti karakterišu tipično mnogo veće ekspanzije ponavljanja od prve dve grupe, a ponavljanja se nalaze izvan regiona gena koji kodiraju proteine.
[0209] U drugim otelotvorenjima, ovaj postupak može da identifikuje ponavljanja CAG trinukleotida povezana sa najmanje deset neuroloških poremećaja za koje je poznato da su uzrokovani povećanim brojem CAG ponavljanja, tipično u kodirajućim regionima inače nepovezanih proteina. Tokom sinteze proteina, proširena CAG ponavljanja se prevode u niz neprekinutih ostataka glutamina formirajući ono što je poznato kao poliglutaminski trakt („poliQ“). Takvi poliglutaminski putevi mogu biti podložni povećanom agregaciji. Ove poremećaje karakteriše autozomno dominantan način nasleđivanja (sa izuzetkom spinobulbarne mišićne atrofije koja pokazuje nasleđe vezano za X), početak srednjeg životnog doba, progresivni tok i korelacija broja CAG ponavljanja sa težinom bolesti i starost na početku. Uzročni geni su široko izraženi u svim poznatim poliglutaminskim bolestima.
Uobičajeni simptom PoliQ bolesti karakteriše progresivna degeneracija nervnih ćelija koja obično pogađa ljude kasnije u životu. Iako ove bolesti dele isti ponovljeni kodon (CAG) i neke simptome, ponavljanja za različite poliglutaminske bolesti se javljaju na različitim hromozomima. Primeri poliQ poremećaja koji se mogu identifikovati ovom metodom uključuju bez ograničenja DRPLA (Dentatorubralno-palidoluizijska atrofija), HD (Hantingtonova bolest), SBMA (Spinobulbarna mišićna atrofija ili Kenedijeva bolest), SCA1 (Spinocerebelarna ataksija tipa 1), SCA2 (spinocerebralni tip 1).2), SCA3 (Spinocerebelarna ataksija Tip 3 ili Machado-Josephova bolest), SCA6 (Spinocerebelarna ataksija Tip 6), SCA7 (Spinocerebelarna ataksija Tip 7), SCA17 (Spinocerebelarna ataksija Tip 17). Primeri nepoliQ poremećaja koji se mogu identifikovati ovom metodom uključuju FRAKSA (fragilni X sindrom), FXTAS (sindrom tremora/ataksije povezan sa fragilnim X-sindromom), FRAKSE (mentalna retardacija fragilnog XE), FRDA (Friedreichova ataksija), DM (Miotonična distrofija), SCA8 (Spinocerebelarna ataksija Tip 8), SCA12 (Spinocerebelarna ataksija Tip 12).
[0210] Pored uloge CNV u raku, CNV su povezani sa sve većim brojem uobičajenih kompleksnih bolesti, uključujući virus humane imunodeficijencije (HIV), autoimune bolesti i spektar neuropsihijatrijskih poremećaja.
[0211] Do sada su brojne studije prijavile povezanost između CNV u genima uključenim u inflamaciju i imuni odgovor i HIV-om, astmom, Kronovom bolešću i drugim autoimunim poremećajima (Fanciulli i dr., Clin Genet 77:201-213 [2010]). Na primer, CNV u CCL3L1 je umešan u osetljivost na HIV/AIDS (CCL3L1, 17q11.2 delecija), reumatoidni artritis (CCL3L1, 17q11.2 delecija) i Kavasakijevu bolest (CCL3L1, 17q11); CNV u HBD-2, prijavljeno je da predisponira Kronovu bolest debelog creva (HDB-2, 8p23.1 delecija) i psorijazu (HDB-2, 8p23.1 delecija); Pokazalo se da CNV u FCGR3B predisponira za glomerulonefritis kod sistemskog ertematoznog lupusa (FCGR3B, 1q23 delecija, 1q23 duplikacija), vaskulatisa povezanog sa anti-neutrofilnim citoplazmatskim antitelom (ANCA) (FCGR3B, 1q23 delecija) i povećava rizik od razvoja reumatoidnog artritisa. Postoje najmanje dve inflamatorne ili autoimune bolesti za koje se pokazalo da su povezane sa CNV na različitim genskim lokusima. Na primer, Kronova bolest je povezana sa malim brojem kopija na HDB-2, ali i sa uobičajenim polimorfizmom delecije uzvodno od IGRM gena koji kodira člana porodice GTPaze p47 povezane sa imunitetom. Pored povezanosti sa brojem kopija FCGR3B, takođe je prijavljeno da je osetljivost na SLE značajno povećana među ispitanicima sa manjim brojem kopija komponente C4 komplementa.
[0212] Veze između genomskih delecija na GSTM1 (GSTM1, 1q23 delecija) i GSTT1 (GSTT1, 22q11.2 delecija) lokusima i povećanog rizika od atopijske astme prijavljene su u brojnim nezavisnim ispitivanjima. U nekim otelotvorenjima, ovaj postupak se može koristiti za određivanje prisustva ili odsustva CNV povezane sa inflamacijom i/ili autoimunim bolestima. Na primer, ovaj postupak se može koristiti za određivanje prisustva CNV-a kod pacijenta za koji se sumnja da pati od HIV-a, astme ili Kronove bolesti. Primeri CNV povezanih sa takvim bolestima uključuju, bez ograničenja, delecije na 17q11.2, 8p23.1, 1q23 i 22q11.2, i duplikacije na 17q11.2 i 1q23. U nekim otelotvorenjima, ovaj postupak se može koristiti za određivanje prisustva CNV u genima uključujući, ali ne ograničavajući se na CCL3L1, HBD-2, FCGR3B, GSTM, GSTT1, C4, i IRGM.
[0213] Povezanost između de novo i nasleđenog CNV i nekoliko uobičajenih neuroloških i psihijatrijskih bolesti prijavljena je kod autizma, šizofrenije i epilepsije, kao i kod nekih slučajeva neurodegenerativnih bolesti kao što su Parkinsonova bolest, amiotrofična lateralna skleroza (ALS) i autozomno dominantna Alchajmerova bolest (Fanciulli i dr., Clin Genet 77:201-213 [2010]). Citogenetske abnormalnosti su primećene kod pacijenata sa autizmom i poremećajima iz spektra autizma (ASD) sa dupliranjem na 15q11-q13. Prema Konzorcijumu projekta za genom autizma, 154 CNV uključujući nekoliko rekurentnih CNV, bilo na hromozomu 15q11-q13 ili na novim genomskim lokacijama uključujući hromozom 2p16, 1q21 i na 17p12 u regionu povezanom sa Smith-Magenisovim sindromom koji se preklapa sa ASD. Ponavljajuće mikrodelecije ili mikroduplikacije na hromozomu 16p11.2 su istakle zapažanje da su de novo CNV otkriveni na lokusima za gene kao što su SHANK3 (delecija 22q13.3), neureksin 1 (NRXN1, 2p16.3 delecija) i neuroglini, XpN2L2.33 brisanje) za koje je poznato da regulišu sinaptičku diferencijaciju i regulišu oslobađanje glutaminergičkog neurotransmitera. Šizofrenija je takođe povezana sa višestrukim de novo CNV. Mikrodelecije i mikroduplikacije povezane sa šizofrenijom sadrže preveliku zastupljenost gena koji pripadaju neurorazvojnim i glutaminergičkim putevima, što sugeriše da višestruki CNV koji utiču na ove gene mogu direktno doprineti patogenezi šizofrenije, npr. ERBB4, 2q34.33 delecija, SLC1A3, 5p13.3 delecija; RAPEGF4, 2q31.1 delecija; CIT, 12.24 delecija; i više gena sa de novo CNV. CNV su takođe bili povezani sa drugim neurološkim poremećajima uključujući epilepsiju (CHRNA7, 15q13.3 delecija), Parkinsonovu bolest (SNCA 4q22 duplikacija) i ALS (SMN1, 5q12.2.-q13.3 delecija); i SMN2 delecija). U nekim otelotvorenjima, ovaj postupak se može koristiti za određivanje prisustva ili odsustva CNV povezane sa bolestima nervnog sistema. Na primer, ovaj postupak se može koristiti za određivanje prisustva CNV kod pacijenta za koga se sumnja da pati od autizma, šizofrenije, epilepsije, neurodegenerativnih bolesti kao što je Parkinsonova bolest, amiotrofična lateralna skleroza (ALS) ili autozomno dominantna Alchajmerova bolest. Ovaj postupak se može koristiti za određivanje CNV gena povezanih sa bolestima nervnog sistema uključujući bez ograničenja bilo koji od poremećaja iz spektra autizma (ASD), šizofreniju i epilepsiju, i CNV gena povezanih sa neurodegenerativnim poremećajima kao što je Parkinsonova bolest.
Primeri CNV povezanih sa takvim bolestima uključuju, bez ograničenja, duplikacije na 15q11-q13, 2p16, 1q21, 17p12, 16p11.2, i 4q22, i delecije na 22q13.3, 2p16.3, Xp22.33, 2q34, 5p13.3, 2q31.1, 12.24, 15q13.3 i 5q12.2. U nekim otelotvorenjima, ovaj postupak se može koristiti za određivanje prisustva CNV u genima uključujući, ali ne ograničavajući se na SHANK3, NLGN4, NRXN1, ERBB4, SLC1A3, RAPGEF4, CIT, CHRNA7, SNCA, SMN1 i SMN2.
[0214] Veza između metaboličkih i kardiovaskularnih osobina, kao što su porodična hiperholesterolemija (FH), ateroskleroza i bolest koronarnih arterija, i CNVs je prijavljena u brojnim studijama (Fanciulli i dr., Clin Genet 77:201-213 [2010]). Na primer, preuređenje germinalne linije, uglavnom delecije, primećeno je na LDLR genu (LDLR, 19p13.2 delecija/duplikacija) kod nekih pacijenata sa FH koji nemaju druge LDLR mutacije. Drugi primer je LPA gen koji kodira apolipoprotein(a) (apo(a)) čija je koncentracija u plazmi povezana sa rizikom od bolesti koronarnih arterija, infarkta miokarda (MI) i moždanog udara. Koncentracije apo(a) koji sadrže lipoprotein Lp(a) u plazmi variraju preko 1000 puta između pojedinaca i 90% ove varijabilnosti je genetski određeno na LPA lokusu, pri čemu su koncentracija u plazmi i veličina izoforme Lp(a) proporcionalne visokoj promenljiv broj sekvenci ponavljanja 'pereca 4' (opseg 5-50). Ovi podaci ukazuju da CNV u najmanje dva gena može biti povezan sa kardiovaskularnim rizikom. Ovaj postupak se može koristiti u velikim ispitivanjima za traženje specifično CNV asocijacija sa kardiovaskularnim poremećajima. U nekim otelotvorenjima, ovaj postupak se može koristiti za određivanje prisustva ili odsustva CNV povezane sa metaboličkom ili kardiovaskularnom bolešću. Na primer, ovaj postupak se može koristiti za određivanje prisustva CNV kod pacijenta za koji se sumnja da pati od porodične hiperholesterolemije. Ovaj postupak se može koristiti za određivanje CNV gena povezanih sa metaboličkim ili kardiovaskularnim oboljenjima, npr. hiperholesterolemija. Primeri CNV povezanih sa takvim bolestima uključuju bez ograničenja 19p13.2 deleciju/duplikaciju LDLR gena i umnožavanje u LPA genu.
SEKVENCIRANJE
[0215] U različitim otelotvorenjima, ovde opisani postupak koristi tehnologiju sekvenciranja sledeće generacije (NGS) u kojoj se klonski amplifikovani DNK šabloni ili pojedinačni DNK molekuli sekvenciraju na masovno paralelan način unutar protočne ćelije (npr. kako je opisano u Volkerding i dr. ClinChem 55:641-658 [2009]; Metzker M Nature Rev 11:31-46 [2010]). Pored informacija o sekvenci visoke propusnosti, NGS pruža digitalne kvantitativne informacije, u tome što je svaka sekvenca prebrojiva „oznaka sekvence“ koja predstavlja pojedinačni klonalni DNK šablon ili jedan molekul DNK. Tehnologije sekvenciranja NGS-a uključuju pirosekvenciju, sekvenciranje po sintezi sa reverzibilnim terminatorima boje, sekvenciranje pomoću ligacije oligonukleotidne sonde i sekvenciranje u realnom vremenu.
[0216] U različitim otelotvorenjima, mogu se analizirati uzorci koji nisu pojačani, ili su samo delimično pojačani (ciljno pojačanje). U nekim slučajevima, postupci određivanja fetalne frakcije mogu se postići bez potrebe za bilo kakvom ciljanom amplifikacijom.
[0217] Amplifikacija celog genoma koja se javlja kao deo procesa sekvenciranja obezbeđuje dovoljno kopija koje se mogu pokriti sve većim brojem ciklusa sekvenciranja kako bi se obezbedila sve bolja pokrivenost.
[0218] U poželjnim otelotvorenjima, uzorak koji sadrži mešavinu molekula DNK izvedenih iz dva različita genoma je nespecifično obogaćen za sekvence celog genoma pre sekvenciranja celog genoma, tj. amplifikacija celog genoma je izvedena pre sekvenciranja.
[0219] Nespecifično obogaćivanje DNK uzorka može se odnositi na amplifikaciju celog genoma fragmenata genomske DNK uzorka koji se može koristiti za povećanje nivoa DNK uzorka pre identifikacije polimorfizama sekvenciranjem. Nespecifično obogaćivanje može biti selektivno obogaćivanje jednog od dva genoma prisutna u uzorku. Na primer, nespecifično obogaćivanje može biti selektivno za fetalni genom u uzorku majke, koji se može dobiti poznatim metodama za povećanje relativnog udela fetalne i majčinske DNK u uzorku.
Alternativno, nespecifično obogaćivanje može biti neselektivna amplifikacija oba genoma prisutna u uzorku. Na primer, nespecifična amplifikacija može biti DNK fetusa i majke u uzorku koji sadrži mešavinu DNK iz genoma fetusa i majke. Postupci za amplifikaciju celog genoma su poznati u tehnici. PCR sa degenerisanim oligonukleotidom (DOP), PCR tehnika proširenja prajmera (PEP) i amplifikacija višestrukog pomeranja (MDA) su primeri postupaka amplifikacije celog genoma. U nekim otelotvorenjima, uzorak koji sadrži mešavinu cfDNK iz različitih genoma nije obogaćen cfDNK genoma prisutnih u smeši. U drugim otelotvorenjima, uzorak koji sadrži mešavinu cfDNK iz različitih genoma je nespecifično obogaćen za bilo koji od genoma prisutnih u uzorku.
[0220] U drugim otelotvorenjima, cfDNK u uzorku je posebno obogaćena. Specifično obogaćivanje se odnosi na obogaćivanje genomskog uzorka za specifične sekvence, npr. polimorfne ciljne sekvence, koje se biraju za amplifikaciju pre sekvenciranja uzorka DNK. Međutim, prednost obelodanjenih otelotvorenja je u tome što nije potrebno ciljano pojačanje. Polimorfni
[0221] Neke od tehnologija sekvenciranja su dostupne komercijalno, kao što je platforma sekvenciranja-hibridizacijom od Affimetrik Inc. (Sunnyvale, CA) i platforme sekvenciranjabi-sinteze iz 454 Life Sciences (Bradford, CT), Illumina/Solexa (Hayward, Kalifornija) i Helicos Biosciences (Kembridž, MA), i platforma za sekvencioniranje po ligaciji iz Applied Biosystems (Foster City, CA), kao što je opisano u nastavku. Pored sekvenciranja pojedinačnih molekula koje se izvodi korišćenjem sekvenciranja po sintezi Helicos Biosciences, druge tehnologije sekvenciranja pojedinačnih molekula su obuhvaćene otkrivenim metodom i uključuju SMRT™ tehnologiju Pacific Biosciences, tehnologiju Ion Torrent™ i sekvenciranje nanopora u razvoju. na primer, Oxford Nanopore Technologies.
[0222] Dok se automatizovani Sangerov postupak smatra tehnologijom 'prve generacije', Sangerovo sekvenciranje, uključujući automatizovano Sangerovo sekvenciranje, takođe može da se koristi obelodanjeni postupak. Dodatni postupci sekvenciranja koje obuhvataju upotrebu razvoja tehnologija snimanja nukleinskih kiselina, npr. mikroskopija atomske sile (AFM) ili transmisiona elektronska mikroskopija (TEM), takođe su obuhvaćeni opisanim postupkom. Primeri tehnologije sekvenciranja su opisani u nastavku.
[0223] U jednom otelotvorenju, tehnologija sekvenciranja DNK koja se koristi u obelodanjenim postupcima je Helicos True Single Molecule Sekuencing (tSMS) (npr. kako je
1
opisano u Harris T.D. i dr., Science 320:106-109 [2008]). U tSMS tehnici, uzorak DNK se cepa na lance od približno 100 do 200 nukleotida, a poliA sekvenca se dodaje na 3' kraj svakog lanca DNK. Svaki lanac je obeležen dodatkom fluorescentno obeleženog adenozin nukleotida. DNK lanci se zatim hibridizuju u protočnu ćeliju, koja sadrži milione mesta za hvatanje oligo-T koja su imobilizovana na površini protočne ćelije. Šabloni mogu biti u gustini od oko 100 miliona šablona/cm<2>. Protočna ćelija se zatim ubacuje u instrument, npr., HeliScope™ sekvencer, a laser osvetljava površinu protočne ćelije, otkrivajući položaj svakog šablona. CCD kamera može mapirati položaj šablona na površini protočne ćelije. Šablonska fluorescentna etiketa se zatim deli i ispira. Reakcija sekvenciranja počinje uvođenjem DNK polimeraze i fluorescentno obeleženog nukleotida. Oligo-T nukleinska kiselina služi kao prajmer. Polimeraza inkorporira obeležene nukleotide u prajmer na način usmeren na šablon. Polimeraza i neugrađeni nukleotidi se uklanjaju. Šabloni koji su usmerili inkorporaciju fluorescentno obeleženog nukleotida prepoznaju se snimanjem površine protočne ćelije. Nakon snimanja, korak deljenja uklanja fluorescentnu oznaku, a proces se ponavlja sa drugim fluorescentno obeleženim nukleotidima dok se ne postigne željena dužina očitavanja. Informacije o sekvenci se prikupljaju sa svakim korakom dodavanja nukleotida. Sekvenciranje celog genoma pomoću tehnologije sekvenciranja jednog molekula isključuje amplifikaciju zasnovanu na PCR-u u pripremi biblioteka sekvenciranja, a direktnost pripreme uzorka omogućava direktno merenje uzorka, a ne merenje kopija tog uzorka.
[0224] U jednom otelotvorenju, tehnologija sekvenciranja DNK koja se koristi u obelodanjenim postupcima je sekvenciranje 454 (Roche) (npr. kako je opisano u Margulies, M. i dr. Nature 437:376-380 (2005)).454 sekvenciranje uključuje dva koraka. U prvom koraku, DNK se seče na fragmente od približno 300-800 parova baza, a fragmenti imaju tupi krajevi. Oligonukleotidni adapteri se zatim vezuju za krajeve fragmenata. Adapteri služe kao prajmeri za amplifikaciju i sekvenciranje fragmenata. Fragmenti se mogu pričvrstiti za perle za hvatanje DNK, npr., perle obložene streptavidinom pomoću, npr., adaptera B, koji sadrži 5'-biotinsku oznaku. Fragmenti pričvršćeni za perle su PCR amplifikovani unutar kapljica emulzije ulje-voda. Rezultat je više kopija klonalno amplificiranih fragmenata DNK na svakoj perli. U drugom koraku, perle se hvataju u bunare (veličine piko-litara). Pirosekvencija se izvodi na svakom fragmentu DNK paralelno. Dodavanje jednog ili više nukleotida generiše svetlosni signal koji se snima CCD kamerom u instrument za sekvenciranje. Jačina signala je proporcionalna broju ugrađenih nukleotida. Pirosekvencija koristi pirofosfat (PPi) koji se oslobađa nakon dodavanja nukleotida. PPi se pretvara u ATP pomoću ATP sulfurilaze u
2
prisustvu adenozin 5' fosfosulfata. Luciferaza koristi ATP da pretvori luciferin u oksiluciferin, a ova reakcija generiše svetlost koja se prepoznaje i analizira.
[0225] U jednom otelotvorenju, tehnologija sekvenciranja DNK koja se koristi u obelodanjenim postupcima je SOLiD™ tehnologija (Applied Biosystems). U SOLiD™ sekvenciranju po ligaciji, genomska DNK se deli na fragmente, a adapteri su pričvršćeni za 5' i 3' krajeve fragmenata da bi se stvorila biblioteka fragmenata. Alternativno, unutrašnji adapteri mogu biti uvedeni vezivanjem adaptera na 5' i 3' krajeve fragmenata, cirkularizacijom fragmenata, varenjem cirkularizovanog fragmenta da bi se stvorio unutrašnji adapter i pričvršćivanjem adaptera na 5' i 3' krajeve dobijenog fragmente za generisanje biblioteke uparene sa parom. Zatim se klonske populacije zrna pripremaju u mikroreaktorima koji sadrže perle, prajmere, šablone i PCR komponente. Nakon PCR-a, šabloni se denaturišu i perle se obogaćuju da bi se perle odvojile proširenim šablonima. Šabloni na odabranim perlama su podvrgnuti modifikaciji od 3' koja omogućava lepljenje za staklo. Sekvenca se može odrediti sekvencijalnom hibridizacijom i ligacijom delimično nasumičnih oligonukleotida sa centralnom određenom bazom (ili parom baza) koja je identifikovana specifičnim fluoroforom. Nakon što je snimljena boja, vezani oligonukleotid se cepa i uklanja i proces se zatim ponavlja.
[0226] U jednom otelotvorenju, tehnologija sekvenciranja DNK koja se koristi u obelodanjenim postupcima je tehnologija sekvenciranja jednog molekula u realnom vremenu (SMRT™) kompanije Pacific Biosciences. U SMRT sekvenciranju, kontinuirano ugrađivanje nukleotida obeleženih bojom se snima tokom sinteze DNK. Pojedinačni molekuli DNK polimeraze su pričvršćeni za donju površinu pojedinačnih identifikatora talasne dužine nultog moda (ZMW identifikatori) koji dobijaju informacije o sekvenci dok se povezani nukleotidi ugrađuju u rastući prajmer lanac. ZMW je zatvorena struktura koja omogućava posmatranje inkorporacije jednog nukleotida pomoću DNK polimeraze na pozadini fluorescentnih nukleotida koji brzo difunduju u van ZMW (u mikro sekundama). Potrebno je nekoliko milisekundi da se nukleotid ugradi u rastući lanac. Tokom ovog vremena, fluorescentna oznaka se pobuđuje i proizvodi fluorescentni signal, a fluorescentna oznaka se odvaja.
Identifikacija odgovarajuće fluorescencije boje pokazuje koja je baza ugrađena. Proces je ponovljen.
[0227] U jednom otelotvorenju, tehnologija sekvenciranja DNK koja se koristi u obelodanjenim postupcima je sekvenciranje nanopora (npr. kako je opisano u Soni GV and Meller A. ClinChem 53: 1996-2001 [2007]). Tehnike analize DNK sekvenciranja nanopora industrijski razvijaju brojne kompanije, uključujući Oksford Nanopore Technologies (Oksford, Ujedinjeno Kraljevstvo). Sekvenciranje nanopora je tehnologija sekvenciranja sa jednim molekulom pri čemu se jedan molekul DNK sekvencira direktno dok prolazi kroz nanopore. Nanopora je mala rupa, reda veličine 1 nanometar u prečniku. Uranjanje nanopore u provodljivu tečnost i primena potencijala (napona) preko nje rezultira blagom električnom strujom usled provođenja jona kroz nanoporu. Količina struje koja teče je osetljiva na veličinu i oblik nanopora. Kako molekul DNK prolazi kroz nanoporu, svaki nukleotid na molekulu DNK ometa nanopore u različitom stepenu, menjajući jačinu struje kroz nanoporu u različitim stepenima. Dakle, ova promena struje dok molekul DNK prolazi kroz nanopore predstavlja očitavanje DNK sekvence.
[0228] U jednom otelotvorenju, tehnologija sekvenciranja DNK koja se koristi u obelodanjenim postupcima je polje tranzistora sa efektom polja (chemFET) osetljivog na hemikalije (npr., kao što je opisano u patentnoj objavi SAD br.2009/0026082 podnešenoj 17. decembra, 2007). U jednom primeru tehnike, molekuli DNK se mogu staviti u reakcione komore, a molekuli šablona mogu biti hibridizovani u prajmer za sekvenciranje vezan za polimerazu. Inkorporacija jednog ili više trifosfata u novi lanac nukleinske kiseline na 3' kraju prajmera za sekvenciranje može se uočiti promenom struje pomoću chemFET-a. Niz može imati više chemFET senzora. U drugom primeru, pojedinačne nukleinske kiseline mogu biti pričvršćene za kuglice, a nukleinske kiseline se mogu pojačati na kuglici, a pojedinačne kuglice se mogu preneti u pojedinačne reakcione komore na chemFET nizu, pri čemu svaka komora ima chemFET senzor, a nukleinske kiseline se mogu sekvencirati.
[0229] U jednom otelotvorenju, tehnologija sekvenciranja DNK koja se koristi u obelodanjenim postupcima je Halcion Molecular postupak koji koristi transmisionu elektronsku mikroskopiju (TEM). Postupak, nazvana Individual Molecule Placement Rapid Nano Transfer (IMPRNT), obuhvata korišćenje transmisionog elektronskog mikroskopa sa jednom atomskom rezolucijom DNK visoke molekulske mase (150 kb ili više) selektivno označene markerima teških atoma i raspoređivanje ovih molekula na ultra tankim filmovima u ultra gusti (3nm pramen-na-lan) paralelni nizovi sa doslednim razmakom od baze do baze. Elektronski mikroskop se koristi za snimanje molekula na filmovima da bi se odredio položaj markera teških atoma i da bi se izdvojile informacije o baznoj sekvenci iz DNK. Postupak je
4
dalje opisan u PCT patentnoj objavi WO 2009/046445. Postupak omogućava sekvencioniranje kompletnih ljudskih genoma za manje od deset minuta.
[0230] U jednom otelotvorenju, tehnologija sekvenciranja DNK je sekvenciranje jednog molekula jonskog torenta, koje uparuje poluprovodničku tehnologiju sa jednostavnom hemijom sekvenciranja da direktno prevede hemijski kodirane informacije (A, C, G, T) u digitalne informacije (0, 1) na poluprovodnički čip. U prirodi, kada se nukleotid ugradi u lanac DNK pomoću polimeraze, jon vodonika se oslobađa kao nusprodukt. Ion Torrent koristi niz mikro-mašinskih bunara visoke gustine da izvrši ovaj biohemijski proces na masovno paralelan način. Svako udubljenje sadrži drugačiji molekul DNK. Ispod bunara je sloj osetljiv na jone, a ispod njega jonski senzor. Kada se nukleotid, na primer C, doda šablonu DNK, a zatim ugradi u lanac DNK, oslobađa se jon vodonika. Naelektrisanje iz tog jona će promeniti pH rastvora, što se može identifikovati jonskim senzorom Ion Torrent-a. Sekvencer u suštini najmanji pH metar na svetu u čvrstom stanju – poziva bazu, idući direktno od hemijskih informacija do digitalnih informacija. Ion personal Genome Machine (PGM™) sekvencer zatim uzastopno preplavljuje čip jednim nukleotidom za drugim. Ako sledeći nukleotid koji preplavi čip nije podudaran. Nijedna promena napona neće biti zabeležena i nijedna baza neće biti pozvana. Ako postoje dve identične baze na lancu DNK, napon će biti dvostruki, a čip će snimiti dve identične baze. Direktna identifikacija omogućava snimanje inkorporacije nukleotida za nekoliko sekundi.
[0231] U nekim otelotvorenjima, postupci koriste PCR ili srodnu tehniku za amplifikaciju uzoraka nukleotidnih sekvenci pre identifikacije ili mapiranja. Međutim, algoritamske tehnike koje su ovde obelodanjene generalno ne zahtevaju amplifikaciju, posebno ciljano pojačanje polimorfizama koji se koristi za procenu frakcije genoma.
[0232] Određena otelotvorenja koriste digitalni PCR i sekvenciranje hibridizacijom. Lančana reakcija digitalne polimeraze (digitalni PCR ili dPCR) može se koristiti za direktnu identifikaciju i kvantifikaciju nukleinskih kiselina u uzorku. Digitalni PCR se može izvesti u emulziji. Pojedinačne nukleinske kiseline se odvajaju, na primer, u uređaju sa mikrofluidnom komorom, a svaka nukleinska kiselina se pojedinačno amplificira PCR-om. Nukleinske kiseline se mogu razdvojiti tako da u proseku postoji približno 0,5 nukleinskih kiselina/bunariću, ili ne više od jedne nukleinske kiseline/udubljenju. Za razlikovanje fetalnih alela i majčinih alela mogu se koristiti različite sonde. Aleli se mogu nabrojati da bi se odredio broj kopija. U sekvenciranju hibridizacijom, hibridizacija obuhvata dovođenje u kontakt većeg broja polinukleotidnih sekvenci sa više polinukleotidnih sondi, pri čemu svaka od mnoštva polinukleotidnih sondi može biti opciono vezana za supstrat. Supstrat može biti ravna površina koja sadrži niz poznatih nukleotidnih sekvenci. Obrazac hibridizacije na niz može se koristiti za određivanje polinukleotidnih sekvenci prisutnih u uzorku. U drugim otelotvorenjima, svaka sonda je vezana za perlu, na primer, magnetnu perlu ili slično.
Hibridizacija na perle se može identifikovati i koristiti za identifikaciju mnoštva polinukleotidnih sekvenci unutar uzorka.
[0233] U jednom otelotvorenju, postupak koristi masovno paralelno sekvenciranje miliona fragmenata DNK korišćenjem Illumina sekvencioniranja po sintezi i reverzibilne hemije sekvenciranja zasnovane na terminatoru (npr. kako je opisano u Bentley i dr., Nature 6:53-59 [2009]). DNK šablona može biti genomska DNK, npr. cfDNK. U nekim otelotvorenjima, genomska DNK iz izolovanih ćelija se koristi kao šablon, i ona je fragmentisana na dužine od nekoliko stotina parova baza. U drugim otelotvorenjima, cfDNK se koristi kao šablon, a fragmentacija nije potrebna jer cfDNK postoji kao kratki fragmenti. Na primer, fetalna cfDNK cirkuliše u krvotoku kao fragmenti <300 bp, a procenjeno je da cfDNK majke cirkuliše kao fragmenti između oko 0,5 i 1 Kb (Li i dr., ClinChem, 50: 1002-1011 (2004)). Illumina tehnologija sekvenciranja se oslanja na vezivanje fragmentirane genomske DNK za ravnu, optički providnu površinu na kojoj su vezana oligonukleotidna sidra. DNK šablona se popravlja na kraju kako bi se generisali 5'-fosforilisani tupi krajevi, a aktivnost polimeraze Klenov fragmenta se koristi za dodavanje jedne A baze na 3' kraj tupih fosforilisanih DNK fragmenata. Ovaj dodatak priprema fragmente DNK za ligaciju za oligonukleotidiadapteri, koji imaju previs od jedne T baze na svom 3' kraju radi povećanja efikasnosti ligacije.
Adapterski oligonukleotidi su komplementarni sidrima protočnih ćelija. Pod ograničenim uslovima razblaženja, jednolančana DNK šablona modifikovana adapterom se dodaje protočnoj ćeliji i imobiliše hibridizacijom za sidra. Priloženi fragmenti DNK se produžavaju i pojačavaju mostom kako bi se stvorila protočna ćelija ultra-visoke gustine sa stotinama miliona klastera, od kojih svaki sadrži -1.000 kopija istog šablona. U jednom otelotvorenju, nasumično fragmentisana genomska DNK, npr. cfDNK, se amplificira korišćenjem PCR-a pre nego što se podvrgne klaster amplifikaciji. Alternativno, koristi se preparat genomske biblioteke bez amplifikacije, a nasumično fragmentirana genomska DNK, npr. cfDNK se obogaćuje korišćenjem samo klaster amplifikacije (Kozarewa i dr., Nature Methods 6:291-295 [2009]). Šabloni se sekvenciraju korišćenjem robusne tehnologije sekvenciranja po sintezi DNK u četiri boje koja koristi reverzibilne terminatore sa fluorescentnim bojama koje se mogu ukloniti. Identifikacija fluorescencije visoke osetljivosti se postiže korišćenjem laserske ekscitacije i optike totalne unutrašnje refleksije. Kratka sekvenca čita od oko 20-40 bp, npr.36 bp, usklađeni su sa ponovljeno maskiranim referentnim genomom, a genetske razlike se nazivaju korišćenjem specijalno razvijenog softvera za analizu podataka. Nakon završetka prvog čitanja, šabloni se mogu regenerisati na licu mesta da bi se omogućilo drugo čitanje sa suprotnog kraja fragmenata. Prema tome, u skladu sa postupkom se koristi sekvencioniranje fragmenata DNK na jednom kraju ili na paru. Izvodi se delimično sekvenciranje fragmenata DNK prisutnih u uzorku, a oznake sekvence koje sadrže čitanja unapred određene dužine, npr. broje se 36 bp, koje su mapirane na poznati referentni genom.
[0234] Dužina očitane sekvence povezana je sa određenom tehnologijom sekvenciranja. NGS postupci obezbeđuju čitanje sekvenci koje variraju u veličini od desetina do stotina parova baza. U nekim otelotvorenjima ovde opisanog postupka, sekvenca koja se čita je oko 20bp, oko 25bp, oko 30bp, oko 35bp, oko 40bp, oko 45bp, oko 50bp, oko 55bp, oko 60bp, oko 65bp, oko 70bp, oko 75bp, oko 80bp, oko 85bp, oko 90bp, oko 95bp, oko 100bp, oko 110bp, oko 120bp, oko 130, oko 140bp, oko 150bp, oko 200bp, oko 250bp, oko 300bp, oko 350bp, oko 400bp, oko 450bp, ili oko 500bp. Očekuje se da će tehnološki napredak omogućiti jednostrano čitanje veće od 500bp, omogućavajući čitanje veće od oko 1000bp kada se generišu uparene krajnje čitanja. U jednom otelotvorenju, sekvenca koja se očitava je 36bp. Drugi postupci sekvenciranja koje se mogu primeniti obelodanjenim postupcima uključuju postupke sekvenciranja jednog molekula koje mogu sekvencirati molekule nukleinskih kiselina >5000 bp. Ogromna količina izlazne sekvence se prenosi putem cevovoda za analizu koji transformiše primarni izlaz slike iz sekvencera u nizove baze. Paket integrisanih algoritama obavlja osnovne korake primarne transformacije podataka: analiza slike, bodovanje intenziteta, pozivanje baze i poravnanje.
MAPIRANJE
[0235] Mogu se koristiti različiti računarski postupci za mapiranje svake identifikovane sekvence u kantu, na primer, identifikacijom svih sekvenci u uzorku koje se mapiraju na određeni gen, hromozom, alel ili drugu strukturu. Postoji veliki broj kompjuterskih algoritama za poravnavanje sekvenci, uključujući bez ograničenja BLAST (Altschul i dr., 1990), BLITZ (MPsrch) (Sturrock& Collins, 1993), FASTA (Person &Lipman, 1988), BOWTIE (Langmead i dr., Genome Biology 10:R25.1-R25.10 [2009]), ili ELAND (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA), U nekim otelotvorenjima, sekvence binoma se nalaze u bazama podataka nukleinskih kiselina poznatim stručnjacima, uključujući bez ograničenja GenBank, dbEST, dbSTS, EMBL (the European Molecular Biology Laboratory), i DDBJ (DNA Databank of Japan). BLAST ili slični alati se mogu koristiti za pretraživanje identifikovanih sekvenci u odnosu na baze podataka sekvenci, a pogoci pretrage se mogu koristiti za sortiranje identifikovanih sekvenci u odgovarajuće korpe.
UREĐAJ
[0236] Analiza podataka sekvenciranja i dijagnoze izvedene iz njih se obično vrše korišćenjem računarskog hardvera koji radi prema definisanim algoritmima i programima. Stoga, određena otelotvorenja koriste procese koji uključuju podatke uskladištene u ili prenete preko jednog ili više računarskih sistema ili drugih sistema za obradu. Otelotvorenja pronalaska se takođe odnose na aparate za izvođenje ovih operacija. Ovaj aparat može biti posebno konstruisan za potrebne svrhe, ili može biti računar opšte namene (ili grupa računara) koji se selektivno aktivira ili rekonfiguriše pomoću računarskog programa i/ili strukture podataka uskladištenih u računaru. U nekim otelotvorenjima, grupa procesora izvodi neke ili sve navedene analitičke operacije zajedno (npr., preko mreže ili računarstva u oblaku) i/ili paralelno. Procesor ili grupa procesora za izvođenje postupaka opisanih ovde može biti različitih tipova uključujući mikrokontrolere i mikroprocesore kao što su programabilni uređaji (npr., CPLD i FPGA) i drugi uređaji kao što su ASIC nizovi kapija, procesori digitalnih signala i/ili opšte namene mikroprocesori.
[0237] Pored toga, određena otelotvorenja se odnose na opipljive i/ili neprolazne računarski čitljive medijume ili računarske programske proizvode koji uključuju programske instrukcije i/ili podatke (uključujući strukture podataka) za izvođenje različitih kompjuterski implementiranih operacija. Primeri računarski čitljivih medija uključuju, ali nisu ograničeni na, poluprovodničke memorijske uređaje, magnetne medijume kao što su disk jedinice, magnetne trake, optičke medije kao što su CD-ovi, magnetno-optički medijumi i hardverske uređaje koji su posebno konfigurisani za skladištenje i rad programske instrukcije, kao što su memorijski uređaji samo za čitanje (ROM) i memorija sa slučajnim pristupom (RAM).
Kompjuterski čitljivi medij može direktno da kontroliše krajnji korisnik ili medij može indirektno da kontroliše krajnji korisnik. Primeri direktno kontrolisanih medijuma uključuju medijume koji se nalaze u objektu korisnika i/ili medije koji se ne dele sa drugim entitetima. Primeri indirektno kontrolisanih medija obuhvataju medijume koji su indirektno dostupni korisniku preko eksterne mreže i/ili preko servisa koji pruža deljene resurse kao što je „oblak“. Primeri programskih instrukcija obuhvataju i mašinski kod, kao što je proizveden od strane kompajlera, i datoteke koje sadrže kod višeg nivoa koji računar može da izvrši pomoću tumača.
[0238] U jednom otelotvorenju, kompjuterski programski proizvod je otkriven za generisanje izlaza koji ukazuje na frakciju nukleinske kiseline izvedene iz definisanog genoma (kao što je genom fetusa) i opciono druge informacije kao što je prisustvo ili odsustvo fetalne aneuploidije u testu uzorak. Kompjuterski proizvod može da sadrži uputstva za izvođenje jednog ili više od iznad opisanih postupaka za određivanje frakcije nukleinskih kiselina iz određenog organizma. Kao što je objašnjeno, računarski proizvod može uključivati neprolazni i/ili opipljiv računarski čitljiv medijum koji ima kompjuterski izvršnu ili kompajliranu logiku (npr., instrukcije) snimljenu na njemu kako bi se omogućilo procesoru da odredi frakciju genoma i, u nekim slučajevima, da li je aneuploidija ili drugo stanje je prisutno ili odsutno u genomu. U jednom primeru, računarski proizvod sadrži računarski čitljiv medijum koji ima kompjuterski izvršnu ili kompajliranu logiku (npr., instrukcije) snimljenu na njemu kako bi se omogućilo procesoru da odredi frakciju fetusa i dijagnostikuje fetalnu aneuploidiju koja se sastoji iz: prijemnog postupka za prijem podataka sekvenciranja od najmanje dela molekula nukleinske kiseline iz biološkog uzorka majke, pri čemu navedeni podaci sekvenciranja obuhvataju sekvence na lokusima jednog ili više polimorfizama; kompjuterski potpomognute logike za analizu sekvenci za određivanje broja alela za jedan ili više polimorfizama i određivanje fetalne frakcije nukleinskih kiselina u biološkom uzorku majke; i izlazne procedure za generisanje izlaza koji pokazuje fetalnu frakciju nukleinskih kiselina u uzorku.
[0239] Informacije o sekvenci iz uzorka koji se razmatra mogu se mapirati u referentne sekvence polimorfizma kao što je opisano. Dalje, informacije o mapiranoj sekvenci mogu se koristiti za generisanje broja alela i/ili određivanje slučajeva zigotnosti za polimorfizme. Takve informacije se mogu koristiti za određivanje frakcije fetusa. U različitim otelotvorenjima, referentne sekvence polimorfizma se čuvaju u bazi podataka kao što je, na primer, relaciona ili objektna baza podataka. Trebalo bi razumeti da nije praktično, ili čak moguće u većini slučajeva, da osoba bez pomoći izvodi bilo koju ili sve ove računske operacije. Na primer, mapiranje jednog očitavanja od 30 bp iz uzorka u bazu podataka referentnih sekvenci polimorfizma će potencijalno trajati nedovoljno dug period bez pomoći računarskog aparata. Naravno, problem se pogoršava jer pouzdani pozivi često zahtevaju mapiranje hiljada (npr., najmanje oko 10.000) ili čak miliona čitanja jednog ili više hromozoma.
[0240] U određenim otelotvorenjima, obelodanjeni postupci koriste uskladištenu listu ili drugu organizovanu kolekciju podataka koji se tiču referentnih polimorfizama za organizam koji proizvodi sekvence nukleinskih kiselina koje treba analizirati. Kao što je iznad objašnjeno, sekvence iz uzorka koji se razmatra mogu se poravnati ili na drugi način mapirati na uskladištene polimorfizme. Pojedinačni polimorfizmi su tipično sekvence dovoljne dužine da se nedvosmisleno mapiraju na sekvence identifikovane iz uzorka nukleinske kiseline. Tipično, polimorfizmi dolaze u grupama, po jedan za svaki alel. U različitim otelotvorenjima, referentni polimorfizmi se čuvaju u bazi podataka koja sadrži karakteristike polimorfizama pored njihovih sekvenci. Ova kolekcija informacija o polimorfizmima može biti uskladištena u relacionoj ili objektnoj bazi podataka, na primer.
[0241] Slika 10 ilustruje tipičan računarski sistem koji, kada je na odgovarajući način konfigurisan ili dizajniran, može poslužiti kao aparat za analizu predmetnog pronalaska. Računarski sistem 200 uključuje bilo koji broj procesora 202 (koji se takođe nazivaju centralne procesorske jedinice ili CPU) koji su povezani sa uređajima za skladištenje uključujući primarnu memoriju 206 (obično memoriju sa slučajnim pristupom, ili RAM), primarnu memoriju 204 (obično čitanje samo memorija ili ROM). CPU 202 može biti različitih tipova uključujući mikrokontrolere i mikroprocesore kao što su programabilni uređaji (npr., CPLD i FPGA) i ne programabilne uređaje kao što su ASIC nizovi kapija ili mikroprocesori opšte namene. Kao što je dobro poznato u tehnici, primarno skladište 204 deluje na prenos podataka i instrukcija u CPU, a primarno skladište 206 se obično koristi za prenos podataka i instrukcija na dvosmerni način. Oba ova primarna uređaja za skladištenje mogu uključivati bilo koji odgovarajući računarski čitljiv medij kao što su oni koji su iznad opisani. Uređaj za masovno skladištenje 208 je takođe dvosmerno povezan sa CPU 202 i obezbeđuje dodatni kapacitet za skladištenje podataka i može uključivati bilo koji od računarski čitljivih medija opisanih iznad. Uređaj za masovno skladištenje 208 se može koristiti za skladištenje programa, podataka i slično i obično je sekundarni medijum za skladištenje kao što je čvrsti disk. Biće cenjeno da informacije koje se čuvaju u uređaju za masovno skladištenje 208 mogu, u odgovarajućim slučajevima, biti ugrađene na standardni način kao deo primarne memorije 206 kao virtuelna memorija. Određeni uređaj za masovno skladištenje, kao što je CD-ROM 214, takođe može prosleđivati podatke u jednom pravcu do CPU-a.
[0242] CPU 202 je takođe povezan sa interfejsom 210 koji se povezuje sa jednim ili više ulazno/izlaznih uređaja kao što su video monitori, miševi, tastature, mikrofoni, ekrani osetljivi na dodir, čitači kartica, tableti, olovke, prepoznavač glasa ili rukopisa, ili drugih dobro poznatih ulaznih uređaja kao što su, naravno, drugi računari. Konačno, CPU 202 opciono može biti spojen sa spoljnim uređajem kao što je baza podataka ili računar ili telekomunikaciona mreža koristeći eksternu vezu kao što je uopšteno prikazano na 212. Sa takvom vezom, smatra se da CPU može da prima informacije iz mreže, ili da može da šalje informacije u mrežu u toku izvođenja koraka postupka opisanih ovde.
[0243] Sekvence ili druge podatke, korisnik može direktno ili indirektno uneti u računar. U jednom otelotvorenju, računarski sistem 200 je direktno povezan sa alatom za sekvenciranje koji čita i/ili analizira sekvence amplifikovanih nukleinskih kiselina. Sekvence ili druge informacije iz takvih alata se obezbeđuju preko interfejsa 212 za analizu od strane sistema 200. Alternativno, sekvence koje obrađuje sistem 200 se obezbeđuju iz izvora skladištenja sekvenci kao što je baza podataka ili drugo spremište. Jednom u aparatu za obradu 200, memorijski uređaj kao što je primarno skladište 206 ili masovno skladište 208 puferuje ili skladišti, barem privremeno, sekvence nukleinskih kiselina. Pored toga, memorijski uređaj može da skladišti brojeve oznaka za različite hromozome ili gene, izračunati broj kopija, itd. Memorija takođe može da skladišti različite rutine i/ili programe za analizu predstavljanja sekvence ili mapiranih podataka. Takvi programi/rutine mogu uključivati programe za izvođenje statističkih analiza itd.
[0244] U jednom primeru, korisnik daje uzorak u aparat za sekvencioniranje. Podaci se prikupljaju i/ili analiziraju pomoću aparata za sekvenciranje koji je povezan sa računarom. Softver na računaru omogućava prikupljanje i/ili analizu podataka. Podaci se mogu čuvati, prikazivati (preko monitora ili drugog sličnog uređaja) i/ili slati na drugu lokaciju. Kao što je naznačeno, računar može biti povezan na internet koji se koristi za prenos podataka na ručni uređaj koji koristi udaljeni korisnik (npr., lekar, naučnik ili analitičar). Podrazumeva se da se podaci mogu čuvati i/ili analizirati pre prenošenja. U nekim otelotvorenjima, neobrađeni podaci se prikupljaju i šalju udaljenom korisniku (ili aparatu) koji će analizirati i/ili čuvati podatke. Prenos se može desiti putem interneta, ali se može desiti i putem satelita ili druge veze. Alternativno, podaci se mogu uskladištiti na računarski čitljivom medijumu (npr., CD ili
1
poluprovodnički memorijski uređaj za skladištenje) i medijum se može poslati krajnjem korisniku (npr., putem pošte). Udaljeni korisnik može biti na istoj ili drugoj geografskoj lokaciji uključujući, ali ne ograničavajući se na zgradu, grad, državu, zemlju ili kontinent.
[0245] U nekim otelotvorenjima, postupci pronalaska dalje obuhvataju prikupljanje podataka u vezi sa mnoštvom polinukleotidnih sekvenci i slanje podataka u računar. Na primer, računar može biti povezan sa laboratorijskom opremom, npr., aparatom za sakupljanje uzoraka, aparatom za amplifikaciju nukleotida, aparatom za sekvenciranje nukleotida ili aparatom za hibridizaciju. Kompjuter tada može da prikuplja primenljive podatke koje je prikupio laboratorijski uređaj. Podaci se mogu čuvati na računaru u bilo kom koraku, na primer, dok se prikupljaju u realnom vremenu, pre slanja, tokom ili u vezi sa slanjem, ili nakon slanja.
Podaci se mogu čuvati na računaru čitljivom medijumu koji se može izdvojiti iz računara. Prikupljeni ili uskladišteni podaci mogu se preneti sa računara na udaljenu lokaciju, na primer, preko lokalne mreže ili mreže šireg područja kao što je internet.
[0246] U jednom otelotvorenju, obelodanjivanje dalje pruža sistem sposoban da izvrši kvantitativnu analizu sekvenciranja nukleotida sa preciznošću od najmanje 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92% , 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili najmanje 99%. Sekvenciranje nukleotida može da obuhvata Sangerovo sekvenciranje, masovno paralelno sekvenciranje, hibridizaciju ili druge tehnike kao što je ovde opisano. Sistem može da sadrži različite komponente, na primer, laboratorijsku opremu i računarske sisteme, i može biti konfigurisan da sprovodi postupke pronalaska.
[0247] U nekim otelotvorenjima, uređaj i/ili uputstva za programiranje mogu dalje da uključuju uputstva za automatsko snimanje informacija koje se odnose na postupak kao što je frakcija fetalne DNK i opciono prisustvo ili odsustvo fetalne hromozomske aneuploidije u medicinskom kartonu pacijenta za čoveka koji obezbeđuje test uzorak majke. Medicinski karton pacijenta može da vodi, na primer, laboratorija, ordinacija lekara, bolnica, organizacija za održavanje zdravlja, osiguravajuća kompanija ili veb stranica lične medicinske dokumentacije. Dalje, na osnovu rezultata analize koju je implementirao procesor, postupak može dalje uključivati propisivanje, iniciranje i/ili promenu tretmana ljudskog ispitanika od koga je uzet testni uzorak majke. Ovo može uključivati izvođenje jednog ili više dodatnih testova ili analiza na dodatnim uzorcima uzetim od ispitanika.
2
Primer
Fetalna frakcija predviđena na osnovu sekvenciranih varijacija: Slučaj 2
[0248] Da bi se pokazalo da se ovaj metod može koristiti za pouzdanu procenu fetalne frakcije u uzorku majke, napravljen je veštački 'majčin' uzorak, a varijacije baze su identifikovane na svim lokusima hromozoma 1 i 7 da bi se predvideo udeo genoma koji doprinosi manjim vrednostima.
[0249] cfDNK koja je izolovana od trudne žene je mešavina cfDNK majke i fetusa, pri čemu nivo fetalne cfDNK odgovara medijani od∼ 10% od ukupne cfDNK (Lo i dr., 2010, "Maternal Plasma DNA seqeucning reveals the genome-wide genetic and mutational profile of the fetus", Prenatal Diagnosis, 2, 1-12). Za kreiranje veštačkog uzorka majke, genomska DNK (gDNK) dobijena od majke i njenog sina (DNK majke i sina NA10924 i NA10925; TheCoriell Institute for Medical Research, Camden, NJ) korišćen je za kreiranje uzorka mešovitih genoma. Po pet mikrograma gDNK svake majke i sina izrezano je na fragmente od oko 200 bp i određena je koncentracija svakog od njih. Veštački uzorak koji sadrži 10% DNK od sina i 90% DNK od majke napravljen je da imitira uzorak krvi majke, za koji se veruje da tipično sadrži 2-40% fetalne cfDNK, u zavisnosti od gestacione starosti [Lun i dr, 2008, "Microfluidics digital PCR reveals a higher than expected fraction of fetal DNA in maternal plasma", Clinical Chemistry, 54, 1664-1672]. Biblioteka sekvenciranja je pripremljena od DNK veštačkog uzorka i podvrgnuta 50 ciklusa sekvenciranja na 4 trake protočne ćelije korišćenjem IlluminaHiSeq 2000. Generisano je približno 800 miliona 49-mer sekvenci.
[0250] ∼ 800 milion čitanja je usklađeno sa Referentnim genomom čoveka sa maskiranim ponavljanjem (hg19 građa) korišćenjem GSNAP algoritma (http://researchpub.gene.com/gmap/), omogućavajući jedno nepodudaranje i bez umetanja i brisanja.
Sekvence koje su mapirane na više lokacija na genomu su zanemarene. Sva ostala mapirana čitanja su računana kao oznake sekvence, a samo lokusi na koje su mapirane oznake sekvence 40 i 100 su uzete u obzir za dalju analizu, tj. razmatrane su samo baze koje imaju pokrivenost od 40 i 100 oznaka.
[0251] Za svaki bazni lokus prebrojan je broj oznaka koje su mapirane na svaku od četiri baze. Lokusi koji imaju više od dve moguće baze su eliminisani, a samo oznake koje su mapirane na monoalelne i bialelne lokuse korišćene su za predviđanje veštačke fetalne frakcije. Ukupan broj oznaka koje su mapirane na svakom osnovnom lokusu predstavljao je pokrivenost (D) na tom lokusu. U ovom simuliranom uzorku majke, očekuje se da će doprinos majčinog glavnog alela (B) odražavati 90% udela oznaka, a doprinos sinovog manjeg alela (A) od 10% udela oznaka.
[0252] Na Slikama 11 A i B prikazani su histogrami broja varijantnih baznih opservacija (frekvencija) na hromozomima 1 i 7, respektivno za manje procente alela (A/D) za hromozome 1 i 7. Procenat minornog alela je procenat ukupnog broja alela na datom lokusu. Na primer, za dati lokus na kome postoji 8 pojavljivanja manjeg alela A i 56 pojavljivanja glavnog alela B, tada je procenat manjeg alela 8%. Podaci pokazuju da se najveći broj pojavljivanja (učestalosti) za minor alel primećuje kada je minor alel prisutan sa 5%, što predstavlja polovinu fetalne frakcije. Shodno tome, podaci su predviđali da uzorak sadrži fetalnu frakciju od 10%, što odgovara onoj korišćenoj za kreiranje veštačkog uzorka majke.
[0253] Slike 12A i B prikazuju distribuciju alelne frekvencije duž hromozoma 1 i 7, respektivno. Obe grafike pokazuju da se maksimalni broj varijantnih alela duž hromozoma javlja na frekvenciji manjeg alela od 5% i frekvenciji glavnog alela od 95%. Neke od preostalih tačaka podataka predstavljaju bialelne lokuse prisutne u genomu majke, dok druge predstavljaju šum metodologije sekvenciranja. Centralni deo svake grafike gde varijantni aleli nisu predstavljeni poklapa se sa centromerima hromozoma, za koje se zna da su regioni hromozoma bogati ponavljanjem, na koje se oznake mapiraju na više od jednog lokusa i stoga su isključene iz analize. U drugim regionima, na primer regionima koji okružuju centromere i regionima koji odgovaraju telomerima, varijantni aleli su previše zastupljeni. Prekomerna zastupljenost ovih regiona može se pripisati metodologiji sekvenciranja u kojoj se neki regioni sekvenciraju na višim nivoima od drugih.
[0254] Stoga, ovaj postupak se može koristiti za predviđanje frakcije fetusa. Postupak je posebno koristan jer ne zahteva identifikaciju ciljanih sekvenci, npr. SNP-ovi i bilo koja varijacija na bilo kojoj poziciji bilo kog hromozoma mogu poslužiti za predviđanje procenta fetalne frakcije.
Druga otelotvorenja
[0255] Iako je iznad uopšteno opisano obelodanjivanje prema specifičnim procesima i aparatima, predmetno obelodanjivanje ima mnogo širi opseg primenljivosti. Konkretno, predmetno obelodanjivanje je opisano u smislu otkrivanja frakcije fetalne DNK u uzorku DNK uzetog od trudne individue, ali nije toliko ograničeno, jer se koncepti i postupci
4
predstavljeni ovde takođe mogu primeniti u drugim kontekstima kao što je npr. otkrivanje relativnih količina tipova DNK u uzorku koji DNK potiče iz dva ili više različitih genoma. Naravno, oni koji su uobičajeni u ovoj oblasti tehnike prepoznaće druge varijacije, modifikacije i alternative.
[0256] Na primer, iako se većina ovde opisanih primera i primena odnosi na procenu fetalne frakcije DNK u uzorku DNK uzetom od osobe koja nosi fetus, obelodanjivanje nije toliko ograničeno. Uopštenije, različita otelotvorenja obelodanjuju postupke za procenu relativnih količina nukleinskih kiselina iz dva različita genoma u uzorku za testiranje koji sadrži mešavinu nukleinskih kiselina iz dva različita genoma, i za koje je poznato ili se sumnja da se razlikuju u količini jednog ili više redosled interesovanja. Mešavina nukleinskih kiselina je izvedena iz dve ili više vrsta ćelija.
[0257] Dalje, iako se većina ovde predstavljenih primera odnosi na uzorke uzete od trudne osobe, otkrivanje nije toliko ograničeno. Na primer, pojedinac koji daje uzorak za testiranje može biti organizam koji sadrži polinukleotidne sekvence, npr., biljka, insekt kao što je muva ili životinja. U nekim otelotvorenjima, ispitanik je sisar, npr., miš, pacov, pas, majmun ili čovek. Kako se navodi, ispitanik može biti trudna individua. Ispitanik može biti pojedinac sa bolešću kao što je rak, ili može biti inficiran stranim telom kao što je mikroorganizam, npr., virus. Uzorak može da sadrži telesnu tečnost ispitanika, npr., krv, plazmu, serum, sputum, pljuvačku, urin, izmet, gnoj, limfu, sluzokožu ili slično. Na primer, uzorak može biti uzorak plazme majke koji sadrži mešavinu DNK bez ćelija majke i fetusa. Generalno, obelodanjeni postupci mogu uključivati sekvencioniranje DNK iz uzorka; mapiranje čitanja sekvence u polimorfizme; klasifikovanje polimorfizama na osnovu zigotnosti; i procena frakcije DNK iz sekundarnog izvora u uzorku.
Dodatak 1 Lista sekvenci baze podataka pretrage alela
[0258]
>rs560681.2|Chr.1|dužina=111|alel=G
>rs4606077.2|Chr.8|dužina=114|alel=T
>rs1821380.2|Chr.15|dužina=139|alel=G
1
2
4

Claims (12)

Patentni zahtevi
1. Postupak za procenu frakcije fetalne DNK u DNK dobijenoj iz telesne tečnosti trudne individue, koji postupak obuhvata:
(a) poravnavanje ili na drugi način mapiranje sekvenci segmenata DNK izvedenih sekvenciranjem DNK u telesnoj tečnosti na jedan ili više naznačenih polimorfizama na referentnoj sekvenci, pri čemu se poravnavanje ili na drugi način mapiranje vrši korišćenjem računarskog aparata programiranog da mapira sekvence nukleinskih kiselina u jedan ili više naznačenih polimorfizama;
(b) određivanje frekvencija alela mapiranih sekvenci DNK segmenta za najmanje jedan od naznačenih polimorfizama;
(c) klasifikovanje najmanje jednog naznačenog polimorfizma na osnovu kombinacije zigotnosti trudne individue i zigotnosti fetusa; i
(d) procenu udela fetalne DNK u DNK dobijenoj od trudne individue koristeći frekvencije alela utvrđene u (b) u vezi sa klasifikacijom zigotnosti iz (c),
pri čemu se (b)-(d) izvode na jednom ili više procesora koji rade prema programskim instrukcijama za određivanje, klasifikaciju i procenu; i
pri čemu klasifikacija u (c) klasifikuje najmanje jedan naznačeni polimorfizam u jednu od sledećih kombinacija: (i) trudna individua je homozigotna i fetus je homozigotni, (ii) trudnica je homozigotna i fetus je heterozigotan, (iii) trudnica je heterozigotna i fetus je homozigotni, i (iv) trudna jedinka je heterozigotna i fetus je heterozigotan.
2. Postupak prema patentnom zahtevu 1:
(a) dalje obuhvata uklanjanje iz razmatranja bilo kog polimorfizma klasifikovanog u kombinaciju (i) ili kombinaciju (iv);
(b) dalje obuhvata filtriranje najmanje jednog naznačenog polimorfizma da bi se uklonio iz razmatranja svaki polimorfizam koji ima manju frekvenciju alela veću od definisanog praga; (c) dalje obuhvata filtriranje najmanje jednog naznačenog polimorfizma da bi se uklonio iz razmatranja svaki polimorfizam koji ima manju frekvenciju alela manju od definisanog praga; (d) pri čemu klasifikacija najmanje jednog naznačenog polimorfizma obuhvata primenu praga na frekvenciju alela utvrđenu u (b);
(e) pri čemu klasifikacija najmanje jednog naznačenog polimorfizma obuhvata primenu podataka o frekvenciji alela iz (b), dobijenih za mnoštvo polimorfizama, na model mešavine, opciono pri čemu model mešavine koristi faktorske momente;
(f) pri čemu je DNK dobijena iz telesne tečnosti trudne individue DNK bez ćelija dobijena iz plazme trudne individue;
(g) pri čemu mapiranje segmenata DNK dobijenih iz krvi pojedinca koji nosi fetus obuhvata kompjutersko mapiranje navedenih segmenata u bazu podataka polimorfizama;
(h) dalje obuhvata izvršavanje programskih instrukcija na jednom ili više procesora za automatsko snimanje frakcije fetalne DNK kako je procenjeno u (d) u medicinskom kartonu pacijenta, uskladištenom na računarski čitljivom medijumu, za trudnu individuu;
(i) dalje obuhvata, na osnovu procene frakcije fetalne DNK, propisivanje, započinjanje i/ili menjanje tretmana ljudskog ispitanika od koga je uzet test uzorak majke; ili
(j) dalje obuhvata, na osnovu procene frakcije fetalne DNK, naručivanje i/ili izvođenje jednog ili više dodatnih testova.
3. Postupak prema patentnom zahtevu 1 koji dalje obuhvata, pre koraka (a), sekvenciranje DNK sekvencerom nukleinske kiseline pod uslovima koji proizvode sekvence segmenata DNK koje sadrže jedan ili više polimorfizama, opciono pri čemu se sekvenciranje sprovodi bez selektivnog umnožavanja bilo kog od jednog ili više označenih polimorfizama.
4. Postupak prema patentnom zahtevu 3, koji dalje obuhvata, pre sekvenciranja DNK, ekstrakciju DNK iz uzorka pod uslovima koji ekstrahuju DNK i genoma majke i genoma fetusa koji je prisutan u telesnoj tečnosti.
5. Postupak prema patentnom zahtevu 4, koji dalje obuhvata, pre ekstrakcije DNK iz uzorka, primanje uzorka telesne tečnosti.
6. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 3-5, koji obuhvata sekvenciranje sintezom.
7. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 3-5, koji obuhvata sekvenciranje hibridizacijom.
8. Postupak prema patentnom zahtevu 7, gde hibridizacija obuhvata dovođenje u kontakt većeg broja polinukleotidnih sekvenci sa više polinukleotidnih sondi, pri čemu je svaka od mnoštva polinukleotidnih sondi vezana za supstrat, pri čemu je supstrat ravna površina koja sadrži niz poznatih nukleotidnih sekvenci.
9. Postupak prema patentnom zahtevu 8, gde se obrazac hibridizacije na niz koristi za određivanje polinukleotidnih sekvenci prisutnih u uzorku.
10. Metoda prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9, pri čemu je referentna sekvenca uskladištena lista ili druga organizovana kolekcija podataka u vezi sa referentnim polimorfizmima za trudnu individuu, opciono pri čemu je referentna sekvenca baza podataka sekvenci, na primer baza podataka sekvenci alela.
11. Aparat za procenu frakcije fetalne DNK u DNK dobijenoj iz telesne tečnosti trudne individue, koji aparat sadrži:
(a) sekvencer konfigurisan da (i) prima DNK ekstrahovanu iz uzorka telesne tečnosti koja sadrži DNK i genoma majke i genoma fetusa, i (ii) sekvencira ekstrahovanu DNK pod uslovima koji proizvode sekvence segmenata DNK koje sadrže jednu ili više naznačenih polimorfizama; i
(b) računarski aparat konfigurisan da daje uputstva jednom ili više procesora
poravnati ili na drugi način mapirati sekvence nukleinske kiseline na jedan ili više naznačenih polimorfizama na referentnoj sekvenci,
određuje frekvencije alela mapiranih sekvenci DNK segmenta za najmanje jedan od naznačenih polimorfizama;
klasifikuje najmanje jednog naznačenog polimorfizma na osnovu kombinacije zigotnosti trudne individue i zigotnosti fetusa;
procentualni udeo fetalne DNK u DNK dobijenoj od trudne individue koristeći frekvencije alela u vezi sa klasifikacijom zigotnosti; i
pri čemu je računarski aparat dalje konfigurisan da uputi jednom ili više procesora da klasifikuju najmanje jedan naznačeni polimorfizam u jednu od sledećih kombinacija: (i) trudna individua je homozigotna i fetus je homozigotni, (ii) trudnica je homozigotna i fetus je heterozigotan, (iii) trudnica je heterozigotna i fetus je homozigotni, i (iv) trudna jedinka je heterozigotna i fetus je heterozigotan.
12. Aparat prema patentnom zahtevu 11:
(a) dalje sadrži alat za ekstrakciju DNK iz uzorka pod uslovima koji ekstrahuju DNK i genoma majke i genoma fetusa;
(b) gde računarski aparat je dalje konfigurisan da naloži jednom ili više procesora da uklone iz razmatranja svaki polimorfizam klasifikovan u kombinaciju (i) ili kombinaciju (iv);
(c) gde računarski aparat je dalje konfigurisan da naloži jednom ili više procesora da uklone iz razmatranja svaki polimorfizam koji ima manju frekvenciju alela veću od definisanog praga; (d) gde računarski aparat je dalje konfigurisan da uputi jednom ili više procesora da filtriraju jedan ili više naznačenih polimorfizama kako bi uklonili iz razmatranja svaki polimorfizam koji ima manju frekvenciju alela manju od definisanog praga;
(e) gde računarski aparat je dalje konfigurisan da naloži jednom ili više procesora da klasifikuju najmanje jedan naznačeni polimorfizam primenom praga na frekvenciju alela; (f) gde računarski aparat je dalje konfigurisan da uputi jednom ili više procesora da klasifikuju najmanje jedan naznačeni polimorfizam primenom podataka o frekvenciji alela dobijenih za mnoštvo polimorfizama, na model mešavine, opciono pri čemu model mešavine koristi faktorske momente;
(g) dalje sadrži aparat za ekstrakciju DNK bez ćelija dobijene iz plazme trudne individue za sekvencioniranje u sekvenceru;
(h) dalje sadrži bazu podataka polimorfizama, pri čemu je računarski aparat dalje konfigurisan da naloži jednom ili više procesora da mapiraju DNK segmente dobijene iz krvi pojedinca koji nosi fetus kompjuterskim mapiranjem navedenih segmenata u bazu podataka polimorfizama; ili
(i) pri čemu je računarski aparat dalje konfigurisan da instrukcije jednom ili više procesora da automatski zabeleže deo fetalne DNK u medicinskom kartonu pacijenta, uskladištenom na računarski čitljivom medijumu, za trudnicu, opciono pri čemu navedeni medicinski karton pacijenta održava laboratorija, ordinacija lekara, bolnica, organizacija za održavanje zdravlja, osiguravajuća kompanija ili internet stranica lične medicinske dokumentacije.
RS20220224A 2011-04-12 2012-04-12 Rešavanje frakcija genoma koristeći brojanje polimorfizma RS63008B1 (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161474362P 2011-04-12 2011-04-12
EP19178858.7A EP3567124B1 (en) 2011-04-12 2012-04-12 Resolving genome fractions using polymorphism counts

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS63008B1 true RS63008B1 (sr) 2022-03-31

Family

ID=46001809

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20181302A RS57837B1 (sr) 2011-04-12 2012-04-12 Razrešavanje genomskih frakcija upotrebom broja kopija polimorfizama
RS20200985A RS60710B1 (sr) 2011-04-12 2012-04-12 Razrešavanje genomskih frakcija upotrebom broja kopija polimorfizama
RS20220224A RS63008B1 (sr) 2011-04-12 2012-04-12 Rešavanje frakcija genoma koristeći brojanje polimorfizma

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20181302A RS57837B1 (sr) 2011-04-12 2012-04-12 Razrešavanje genomskih frakcija upotrebom broja kopija polimorfizama
RS20200985A RS60710B1 (sr) 2011-04-12 2012-04-12 Razrešavanje genomskih frakcija upotrebom broja kopija polimorfizama

Country Status (20)

Country Link
US (4) US9447453B2 (sr)
EP (5) EP3456844B1 (sr)
JP (3) JP5863946B2 (sr)
CN (2) CN106319047B (sr)
AU (1) AU2012242698C1 (sr)
CA (1) CA2832468C (sr)
CY (4) CY1117574T1 (sr)
DK (4) DK3567124T3 (sr)
ES (4) ES2907069T3 (sr)
HR (3) HRP20220296T1 (sr)
HU (3) HUE041411T2 (sr)
IL (1) IL228843A (sr)
LT (3) LT3456844T (sr)
PL (4) PL3078752T3 (sr)
PT (3) PT3567124T (sr)
RS (3) RS57837B1 (sr)
SI (3) SI3456844T1 (sr)
SM (3) SMT202200090T1 (sr)
TR (1) TR201816062T4 (sr)
WO (1) WO2012142334A2 (sr)

Families Citing this family (127)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11111543B2 (en) 2005-07-29 2021-09-07 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US10083273B2 (en) 2005-07-29 2018-09-25 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US9424392B2 (en) 2005-11-26 2016-08-23 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals
US11111544B2 (en) 2005-07-29 2021-09-07 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US10081839B2 (en) 2005-07-29 2018-09-25 Natera, Inc System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
EP2321642B1 (en) 2008-08-04 2017-01-11 Natera, Inc. Methods for allele calling and ploidy calling
WO2011041485A1 (en) 2009-09-30 2011-04-07 Gene Security Network, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
EP2513341B1 (en) 2010-01-19 2017-04-12 Verinata Health, Inc Identification of polymorphic sequences in mixtures of genomic dna by whole genome sequencing
US9260745B2 (en) 2010-01-19 2016-02-16 Verinata Health, Inc. Detecting and classifying copy number variation
EP2370599B1 (en) 2010-01-19 2015-01-21 Verinata Health, Inc Method for determining copy number variations
US20120010085A1 (en) 2010-01-19 2012-01-12 Rava Richard P Methods for determining fraction of fetal nucleic acids in maternal samples
US20120100548A1 (en) 2010-10-26 2012-04-26 Verinata Health, Inc. Method for determining copy number variations
US9323888B2 (en) 2010-01-19 2016-04-26 Verinata Health, Inc. Detecting and classifying copy number variation
WO2011091063A1 (en) 2010-01-19 2011-07-28 Verinata Health, Inc. Partition defined detection methods
US10388403B2 (en) 2010-01-19 2019-08-20 Verinata Health, Inc. Analyzing copy number variation in the detection of cancer
US11332785B2 (en) 2010-05-18 2022-05-17 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US11326208B2 (en) 2010-05-18 2022-05-10 Natera, Inc. Methods for nested PCR amplification of cell-free DNA
US11339429B2 (en) 2010-05-18 2022-05-24 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
WO2011146632A1 (en) 2010-05-18 2011-11-24 Gene Security Network Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US12545960B2 (en) 2010-05-18 2026-02-10 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11332793B2 (en) 2010-05-18 2022-05-17 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US10316362B2 (en) 2010-05-18 2019-06-11 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US12221653B2 (en) 2010-05-18 2025-02-11 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11408031B2 (en) 2010-05-18 2022-08-09 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal paternity testing
US9677118B2 (en) 2014-04-21 2017-06-13 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US12152275B2 (en) 2010-05-18 2024-11-26 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US11939634B2 (en) 2010-05-18 2024-03-26 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11322224B2 (en) 2010-05-18 2022-05-03 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US20190010543A1 (en) 2010-05-18 2019-01-10 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US20140342940A1 (en) 2011-01-25 2014-11-20 Ariosa Diagnostics, Inc. Detection of Target Nucleic Acids using Hybridization
US10533223B2 (en) 2010-08-06 2020-01-14 Ariosa Diagnostics, Inc. Detection of target nucleic acids using hybridization
US11203786B2 (en) 2010-08-06 2021-12-21 Ariosa Diagnostics, Inc. Detection of target nucleic acids using hybridization
US20120034603A1 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Tandem Diagnostics, Inc. Ligation-based detection of genetic variants
US10167508B2 (en) 2010-08-06 2019-01-01 Ariosa Diagnostics, Inc. Detection of genetic abnormalities
US20130040375A1 (en) 2011-08-08 2013-02-14 Tandem Diagnotics, Inc. Assay systems for genetic analysis
US8700338B2 (en) 2011-01-25 2014-04-15 Ariosa Diagnosis, Inc. Risk calculation for evaluation of fetal aneuploidy
US11031095B2 (en) 2010-08-06 2021-06-08 Ariosa Diagnostics, Inc. Assay systems for determination of fetal copy number variation
US20130261003A1 (en) 2010-08-06 2013-10-03 Ariosa Diagnostics, In. Ligation-based detection of genetic variants
CN103608466B (zh) 2010-12-22 2020-09-18 纳特拉公司 非侵入性产前亲子鉴定方法
US11270781B2 (en) 2011-01-25 2022-03-08 Ariosa Diagnostics, Inc. Statistical analysis for non-invasive sex chromosome aneuploidy determination
US9994897B2 (en) 2013-03-08 2018-06-12 Ariosa Diagnostics, Inc. Non-invasive fetal sex determination
US10131947B2 (en) 2011-01-25 2018-11-20 Ariosa Diagnostics, Inc. Noninvasive detection of fetal aneuploidy in egg donor pregnancies
US8756020B2 (en) 2011-01-25 2014-06-17 Ariosa Diagnostics, Inc. Enhanced risk probabilities using biomolecule estimations
RU2671980C2 (ru) 2011-02-09 2018-11-08 Натера, Инк. Способы неинвазивного пренатального установления плоидности
CA2827873C (en) 2011-02-24 2022-08-16 The Chinese University Of Hong Kong Molecular testing of multiple pregnancies
RS57837B1 (sr) 2011-04-12 2018-12-31 Verinata Health Inc Razrešavanje genomskih frakcija upotrebom broja kopija polimorfizama
US9411937B2 (en) 2011-04-15 2016-08-09 Verinata Health, Inc. Detecting and classifying copy number variation
WO2014014498A1 (en) 2012-07-20 2014-01-23 Verinata Health, Inc. Detecting and classifying copy number variation in a fetal genome
US8712697B2 (en) 2011-09-07 2014-04-29 Ariosa Diagnostics, Inc. Determination of copy number variations using binomial probability calculations
EP2768978B1 (en) 2011-10-18 2017-11-22 Multiplicom NV Fetal chromosomal aneuploidy diagnosis
US10289800B2 (en) 2012-05-21 2019-05-14 Ariosa Diagnostics, Inc. Processes for calculating phased fetal genomic sequences
EP2875156A4 (en) 2012-07-19 2016-02-24 Ariosa Diagnostics Inc SEQUENTIAL LIGATION-BASED MULTIPLEX DETECTION OF GENETIC VARIANTS
US20140100126A1 (en) 2012-08-17 2014-04-10 Natera, Inc. Method for Non-Invasive Prenatal Testing Using Parental Mosaicism Data
US10482994B2 (en) 2012-10-04 2019-11-19 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
CN111254500B (zh) 2012-12-10 2024-01-23 分析生物科学有限公司 靶向基因组分析的方法
GB201304810D0 (en) * 2013-03-15 2013-05-01 Isis Innovation Assay
WO2014151117A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Identification and use of circulating nucleic acid tumor markers
KR102665592B1 (ko) 2013-05-24 2024-05-21 시쿼넘, 인코포레이티드 유전적 변이의 비침습 평가를 위한 방법 및 프로세스
WO2015026967A1 (en) * 2013-08-20 2015-02-26 Natera, Inc. Methods of using low fetal fraction detection
US20170132364A1 (en) * 2013-09-03 2017-05-11 Welgene Biotech Co., Ltd. Non-invasive prenatal testing method based on genome-wide normalized score
US9499870B2 (en) 2013-09-27 2016-11-22 Natera, Inc. Cell free DNA diagnostic testing standards
WO2015042649A1 (en) * 2013-09-27 2015-04-02 Murdoch Children's Research Institute A quantitative assay for target dna in a mixed sample comprising target and non-target dna
US10262755B2 (en) 2014-04-21 2019-04-16 Natera, Inc. Detecting cancer mutations and aneuploidy in chromosomal segments
US10577655B2 (en) 2013-09-27 2020-03-03 Natera, Inc. Cell free DNA diagnostic testing standards
RU2543155C1 (ru) * 2014-02-03 2015-02-27 Закрытое акционерное общество "Геноаналитика" Способ неинвазивной диагностики анеуплоидий плода методом секвенирования
WO2015148776A1 (en) * 2014-03-27 2015-10-01 The Scripps Research Institute Systems and methods for genomic annotation and distributed variant interpretation
US12492429B2 (en) * 2014-04-21 2025-12-09 Natera, Inc. Detecting mutations and ploidy in chromosomal segments
CA2945962C (en) 2014-04-21 2023-08-29 Natera, Inc. Detecting mutations and ploidy in chromosomal segments
US20180173846A1 (en) 2014-06-05 2018-06-21 Natera, Inc. Systems and Methods for Detection of Aneuploidy
EP3169803B1 (en) * 2014-07-18 2019-11-20 Illumina, Inc. Non-invasive prenatal diagnosis of fetal genetic condition using cellular dna and cell free dna
US11783911B2 (en) 2014-07-30 2023-10-10 Sequenom, Inc Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US20160053301A1 (en) 2014-08-22 2016-02-25 Clearfork Bioscience, Inc. Methods for quantitative genetic analysis of cell free dna
JP7441584B6 (ja) * 2014-08-22 2024-03-15 レゾリューション バイオサイエンス， インコーポレイテッド 無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の定量的遺伝子解析のための方法
US9857328B2 (en) 2014-12-18 2018-01-02 Agilome, Inc. Chemically-sensitive field effect transistors, systems and methods for manufacturing and using the same
CA2971589C (en) 2014-12-18 2021-09-28 Edico Genome Corporation Chemically-sensitive field effect transistor
US9859394B2 (en) 2014-12-18 2018-01-02 Agilome, Inc. Graphene FET devices, systems, and methods of using the same for sequencing nucleic acids
US10020300B2 (en) 2014-12-18 2018-07-10 Agilome, Inc. Graphene FET devices, systems, and methods of using the same for sequencing nucleic acids
US10006910B2 (en) 2014-12-18 2018-06-26 Agilome, Inc. Chemically-sensitive field effect transistors, systems, and methods for manufacturing and using the same
US9618474B2 (en) 2014-12-18 2017-04-11 Edico Genome, Inc. Graphene FET devices, systems, and methods of using the same for sequencing nucleic acids
US11479812B2 (en) 2015-05-11 2022-10-25 Natera, Inc. Methods and compositions for determining ploidy
AU2016281193B2 (en) * 2015-06-15 2022-06-16 Murdoch Childrens Research Institute Method of measuring chimerism
BE1023274A9 (nl) * 2015-07-17 2017-03-17 Multiplicom Nv Schattingswerkwijze en -systeem voor het schatten van een foetale fractie
CN115035949A (zh) * 2015-09-22 2022-09-09 香港中文大学 通过母亲血浆dna的浅深度测序准确定量胎儿dna分数
BE1022771B1 (nl) * 2015-10-14 2016-08-31 Multiplicom Nv Werkwijze en systeem om te bepalen of een vrouw zwanger is op basis van een bloedstaal
JP6913089B2 (ja) 2015-11-11 2021-08-04 レゾリューション バイオサイエンス， インコーポレイテッド Ｄｎａライブラリーの高効率構築
CA3016077A1 (en) 2016-03-22 2017-09-28 Counsyl, Inc. Combinatorial dna screening
RU2760913C2 (ru) 2016-04-15 2021-12-01 Натера, Инк. Способы выявления рака легкого
WO2017201081A1 (en) 2016-05-16 2017-11-23 Agilome, Inc. Graphene fet devices, systems, and methods of using the same for sequencing nucleic acids
US11319594B2 (en) 2016-08-25 2022-05-03 Resolution Bioscience, Inc. Methods for the detection of genomic copy changes in DNA samples
WO2018064486A1 (en) 2016-09-29 2018-04-05 Counsyl, Inc. Noninvasive prenatal screening using dynamic iterative depth optimization
WO2018067517A1 (en) 2016-10-04 2018-04-12 Natera, Inc. Methods for characterizing copy number variation using proximity-litigation sequencing
GB201618485D0 (en) 2016-11-02 2016-12-14 Ucl Business Plc Method of detecting tumour recurrence
IL266346B2 (en) * 2016-11-18 2024-07-01 Univ Hong Kong Chinese Universal haplotype-based noninvasive prenatal testing for single gene diseases
US10011870B2 (en) 2016-12-07 2018-07-03 Natera, Inc. Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules
GB2559319B (en) 2016-12-23 2019-01-16 Cs Genetics Ltd Reagents and methods for the analysis of linked nucleic acids
CA3207879A1 (en) 2017-01-24 2018-08-02 Sequenom, Inc. Methods and processes for assessment of genetic variations
RU2636618C1 (ru) * 2017-02-14 2017-11-24 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ и тест-система для определения доли плодовой ДНК в плазме крови беременной женщины с помощью методов высокопроизводительного секвенирования
US12006533B2 (en) * 2017-02-17 2024-06-11 Grail, Llc Detecting cross-contamination in sequencing data using regression techniques
WO2018156418A1 (en) 2017-02-21 2018-08-30 Natera, Inc. Compositions, methods, and kits for isolating nucleic acids
JP7370862B2 (ja) * 2017-03-17 2023-10-30 セクエノム， インコーポレイテッド 遺伝子モザイク症のための方法およびプロセス
KR102145417B1 (ko) * 2017-05-24 2020-08-19 지니너스 주식회사 무세포 핵산으로부터 수득된 서열 분석 데이터에 대한 배경 대립인자의 빈도 분포를 생성하는 방법 및 이를 이용하여 무세포 핵산으로부터 변이를 검출하는 방법
CA3067419A1 (en) * 2017-06-20 2018-12-27 Illumina, Inc. Methods and systems for decomposition and quantification of dna mixtures from multiple contributors of known or unknown genotypes
CN110770839B (zh) * 2017-06-20 2024-12-06 伊鲁米那股份有限公司 来自未知基因型贡献者的dna混合物的精确计算分解的方法
WO2019005877A1 (en) 2017-06-27 2019-01-03 Grail, Inc. CROSS CONTAMINATION DETECTION IN SEQUENCING DATA
CN108220451B (zh) * 2017-12-08 2020-10-27 北京科迅生物技术有限公司 胎儿游离核酸浓度的检测方法及试剂盒
US12084720B2 (en) 2017-12-14 2024-09-10 Natera, Inc. Assessing graft suitability for transplantation
US12398389B2 (en) 2018-02-15 2025-08-26 Natera, Inc. Methods for isolating nucleic acids with size selection
US12024738B2 (en) 2018-04-14 2024-07-02 Natera, Inc. Methods for cancer detection and monitoring
GB201810571D0 (en) 2018-06-27 2018-08-15 Cs Genetics Ltd Reagents and methods for the analysis of circulating microparticles
US12234509B2 (en) 2018-07-03 2025-02-25 Natera, Inc. Methods for detection of donor-derived cell-free DNA
ES2738176B2 (es) * 2018-07-20 2021-01-11 Bioarray S L Metodo para el estudio de mutaciones en embriones en procesos de reproduccion in vitro
CA3107467A1 (en) * 2018-09-07 2020-03-12 Sequenom, Inc. Methods, and systems to detect transplant rejection
CN109378037B (zh) * 2018-10-31 2023-04-14 中国石油大学(华东) 基于遗传学规律的等位基因准确推断方法
WO2020172164A1 (en) * 2019-02-19 2020-08-27 Sequenom, Inc. Compositions, methods, and systems to detect hematopoietic stem cell transplantation status
US20200381079A1 (en) * 2019-06-03 2020-12-03 Illumina, Inc. Methods for determining sub-genic copy numbers of a target gene with close homologs using beadarray
US12305235B2 (en) 2019-06-06 2025-05-20 Natera, Inc. Methods for detecting immune cell DNA and monitoring immune system
GB201909325D0 (en) 2019-06-28 2019-08-14 Cs Genetics Ltd Reagents and methods for analysis for microparticles
CN110438220A (zh) * 2019-08-16 2019-11-12 深圳市人民医院 纤毛不动综合症基因面板试剂盒及其应用
US12305242B2 (en) 2020-04-24 2025-05-20 The Johns Hopkins University Methods and related aspects for quantitative polymerase chain reaction to determine fractional abundance
US11946104B2 (en) 2020-07-07 2024-04-02 Billiontoone, Inc. Non-invasive prenatal testing at early stage of pregnancy
EP4266315A4 (en) * 2020-12-16 2024-11-20 Seedna Inc. METHOD FOR CALCULATING THE RELIABILITY VALUE OF A POLYMORPHISM LOCUS SIGNAL
CN113345515B (zh) * 2021-06-17 2024-05-31 苏州贝康医疗器械有限公司 新发平衡易位家系中胚胎遗传性检测方法及装置
CN113667734B (zh) * 2021-07-16 2022-05-24 四川大学华西医院 Shank3片段序列甲基化检测试剂在制备精神分裂症诊断试剂盒中的用途
EP4381099A1 (en) 2021-08-02 2024-06-12 Natera, Inc. Methods for detecting neoplasm in pregnant women
CA3223315A1 (en) 2022-02-16 2023-08-24 Michael Mehan Minimizing fetal fraction bias in maternal polygenic risk score estimation
CN115035950B (zh) * 2022-06-28 2025-08-12 广州燃石医学检验所有限公司 基因型检测方法、样本污染检测方法、装置、设备及介质
JP2025043574A (ja) * 2023-09-19 2025-04-01 株式会社東芝 試料識別方法及びバイオマーカー

Family Cites Families (88)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6270961B1 (en) 1987-04-01 2001-08-07 Hyseq, Inc. Methods and apparatus for DNA sequencing and DNA identification
US5976790A (en) 1992-03-04 1999-11-02 The Regents Of The University Of California Comparative Genomic Hybridization (CGH)
WO1994003638A1 (en) 1992-07-30 1994-02-17 Applied Biosystems, Inc. Method of detecting aneuploidy by amplified short tandem repeats
US5776737A (en) 1994-12-22 1998-07-07 Visible Genetics Inc. Method and composition for internal identification of samples
US6057103A (en) 1995-07-18 2000-05-02 Diversa Corporation Screening for novel bioactivities
AU735272B2 (en) 1996-10-04 2001-07-05 Intronn Llc Sample collection devices and methods using markers and the use of such markers as controls in sample validation, laboratory evaluation and/or accreditation
GB9704444D0 (en) 1997-03-04 1997-04-23 Isis Innovation Non-invasive prenatal diagnosis
JP2002503954A (ja) 1997-04-01 2002-02-05 グラクソ、グループ、リミテッド 核酸増幅法
AR021833A1 (es) 1998-09-30 2002-08-07 Applied Research Systems Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico
US6440706B1 (en) 1999-08-02 2002-08-27 Johns Hopkins University Digital amplification
US20020142324A1 (en) 2000-09-22 2002-10-03 Xun Wang Fungal target genes and methods to identify those genes
US6691042B2 (en) 2001-07-02 2004-02-10 Rosetta Inpharmatics Llc Methods for generating differential profiles by combining data obtained in separate measurements
US7226732B2 (en) 2001-07-16 2007-06-05 Cepheid Methods, apparatus, and computer programs for verifying the integrity of a probe
US6927028B2 (en) * 2001-08-31 2005-08-09 Chinese University Of Hong Kong Non-invasive methods for detecting non-host DNA in a host using epigenetic differences between the host and non-host DNA
US7893248B2 (en) 2002-02-20 2011-02-22 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of Myc and/or Myb gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
IL163600A0 (en) 2002-03-01 2005-12-18 Ravgen Inc Methods for detection of genetic disorders
US6977162B2 (en) * 2002-03-01 2005-12-20 Ravgen, Inc. Rapid analysis of variations in a genome
US20030194704A1 (en) 2002-04-03 2003-10-16 Penn Sharron Gaynor Human genome-derived single exon nucleic acid probes useful for gene expression analysis two
US7727720B2 (en) * 2002-05-08 2010-06-01 Ravgen, Inc. Methods for detection of genetic disorders
EP2359689B1 (en) 2002-09-27 2015-08-26 The General Hospital Corporation Microfluidic device for cell separation and use thereof
US10229244B2 (en) 2002-11-11 2019-03-12 Affymetrix, Inc. Methods for identifying DNA copy number changes using hidden markov model based estimations
US20040224331A1 (en) 2003-01-17 2004-11-11 The Trustees Of Boston University Haplotype analysis
EP1599608A4 (en) 2003-03-05 2007-07-18 Genetic Technologies Ltd Identification of fetal DNA and fetal cell marker in maternal plasma or serum
US20040209299A1 (en) 2003-03-07 2004-10-21 Rubicon Genomics, Inc. In vitro DNA immortalization and whole genome amplification using libraries generated from randomly fragmented DNA
WO2005023091A2 (en) 2003-09-05 2005-03-17 The Trustees Of Boston University Method for non-invasive prenatal diagnosis
US20050221341A1 (en) 2003-10-22 2005-10-06 Shimkets Richard A Sequence-based karyotyping
US20050114205A1 (en) * 2003-11-21 2005-05-26 Kenneth Nelson Multi-media digital cartridge storage and playback units
WO2005072133A2 (en) 2004-01-27 2005-08-11 Zoragen, Inc. Nucleic acid detection
US20100216151A1 (en) 2004-02-27 2010-08-26 Helicos Biosciences Corporation Methods for detecting fetal nucleic acids and diagnosing fetal abnormalities
US20100216153A1 (en) * 2004-02-27 2010-08-26 Helicos Biosciences Corporation Methods for detecting fetal nucleic acids and diagnosing fetal abnormalities
US20060046258A1 (en) 2004-02-27 2006-03-02 Lapidus Stanley N Applications of single molecule sequencing
WO2005116257A2 (en) 2004-05-17 2005-12-08 The Ohio State University Research Foundation Unique short tandem repeats and methods of their use
DE102004036285A1 (de) 2004-07-27 2006-02-16 Advalytix Ag Verfahren zum Bestimmen der Häufigkeit von Sequenzen einer Probe
JP2007327743A (ja) 2004-09-07 2007-12-20 Univ Of Tokyo 遺伝子コピーの解析方法及び装置
TW200624106A (en) 2004-09-07 2006-07-16 Uni Charm Corp Warming article
US20060286566A1 (en) * 2005-02-03 2006-12-21 Helicos Biosciences Corporation Detecting apparent mutations in nucleic acid sequences
US20060178835A1 (en) 2005-02-10 2006-08-10 Applera Corporation Normalization methods for genotyping analysis
US7645576B2 (en) 2005-03-18 2010-01-12 The Chinese University Of Hong Kong Method for the detection of chromosomal aneuploidies
AU2006256374A1 (en) 2005-06-08 2006-12-14 Compugen Ltd. Novel nucleotide and amino acid sequences, and assays and methods of use thereof for diagnosis
US20060286558A1 (en) 2005-06-15 2006-12-21 Natalia Novoradovskaya Normalization of samples for amplification reactions
US8532930B2 (en) 2005-11-26 2013-09-10 Natera, Inc. Method for determining the number of copies of a chromosome in the genome of a target individual using genetic data from genetically related individuals
DE102005057988A1 (de) 2005-08-04 2007-02-08 Bosch Rexroth Ag Axialkolbenmaschine
EP3591068A1 (en) 2006-02-02 2020-01-08 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Non-invasive fetal genetic screening by digital analysis
US20100184043A1 (en) * 2006-02-28 2010-07-22 University Of Louisville Research Foundation Detecting Genetic Abnormalities
EP2351858B1 (en) 2006-02-28 2014-12-31 University of Louisville Research Foundation Detecting fetal chromosomal abnormalities using tandem single nucleotide polymorphisms
US20080064098A1 (en) 2006-06-05 2008-03-13 Cryo-Cell International, Inc. Procurement, isolation and cryopreservation of maternal placental cells
WO2007147079A2 (en) 2006-06-14 2007-12-21 Living Microsystems, Inc. Rare cell analysis using sample splitting and dna tags
US8137912B2 (en) 2006-06-14 2012-03-20 The General Hospital Corporation Methods for the diagnosis of fetal abnormalities
US20080050739A1 (en) 2006-06-14 2008-02-28 Roland Stoughton Diagnosis of fetal abnormalities using polymorphisms including short tandem repeats
EP2589668A1 (en) 2006-06-14 2013-05-08 Verinata Health, Inc Rare cell analysis using sample splitting and DNA tags
EP2029779A4 (en) 2006-06-14 2010-01-20 Living Microsystems Inc HIGHLY PARALLEL SNP GENOTYPING UTILIZATION FOR FETAL DIAGNOSIS
US9328378B2 (en) 2006-07-31 2016-05-03 Illumina Cambridge Limited Method of library preparation avoiding the formation of adaptor dimers
US8262900B2 (en) 2006-12-14 2012-09-11 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays
AU2008213634B2 (en) 2007-02-08 2013-09-05 Sequenom, Inc. Nucleic acid-based tests for RhD typing, gender determination and nucleic acid quantification
US12180549B2 (en) 2007-07-23 2024-12-31 The Chinese University Of Hong Kong Diagnosing fetal chromosomal aneuploidy using genomic sequencing
PL2557520T3 (pl) 2007-07-23 2021-10-11 The Chinese University Of Hong Kong Określanie zaburzenia równowagi sekwencji kwasu nukleinowego
CN101889074A (zh) 2007-10-04 2010-11-17 哈尔西恩莫尔丘勒公司 采用电子显微镜对核酸聚合物测序
EP2271772B1 (en) * 2008-03-11 2014-07-16 Sequenom, Inc. Nucleic acid-based tests for prenatal gender determination
US20090307180A1 (en) 2008-03-19 2009-12-10 Brandon Colby Genetic analysis
WO2009120808A2 (en) 2008-03-26 2009-10-01 Sequenom, Inc. Restriction endonuclease enhanced polymorphic sequence detection
US20090270601A1 (en) 2008-04-21 2009-10-29 Steven Albert Benner Differential detection of single nucleotide polymorphisms
EP2853601B1 (en) 2008-07-18 2016-09-21 TrovaGene, Inc. Methods for PCR-based detection of "ultra short" nucleic acid sequences
CA3069082C (en) 2008-09-20 2022-03-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by sequencing
US20100285537A1 (en) 2009-04-02 2010-11-11 Fluidigm Corporation Selective tagging of short nucleic acid fragments and selective protection of target sequences from degradation
AU2010311535B2 (en) 2009-10-26 2015-05-21 Lifecodexx Ag Means and methods for non-invasive diagnosis of chromosomal aneuploidy
EP3783110B1 (en) * 2009-11-05 2022-11-23 The Chinese University Of Hong Kong Fetal genomic analysis from a maternal biological sample
CN102597272A (zh) 2009-11-12 2012-07-18 艾索特里克斯遗传实验室有限责任公司 基因座的拷贝数分析
US10388403B2 (en) 2010-01-19 2019-08-20 Verinata Health, Inc. Analyzing copy number variation in the detection of cancer
US20120237928A1 (en) 2010-10-26 2012-09-20 Verinata Health, Inc. Method for determining copy number variations
EP2370599B1 (en) 2010-01-19 2015-01-21 Verinata Health, Inc Method for determining copy number variations
WO2011091063A1 (en) 2010-01-19 2011-07-28 Verinata Health, Inc. Partition defined detection methods
US9323888B2 (en) 2010-01-19 2016-04-26 Verinata Health, Inc. Detecting and classifying copy number variation
US20120100548A1 (en) 2010-10-26 2012-04-26 Verinata Health, Inc. Method for determining copy number variations
EP2513341B1 (en) * 2010-01-19 2017-04-12 Verinata Health, Inc Identification of polymorphic sequences in mixtures of genomic dna by whole genome sequencing
US9260745B2 (en) 2010-01-19 2016-02-16 Verinata Health, Inc. Detecting and classifying copy number variation
US20120010085A1 (en) 2010-01-19 2012-01-12 Rava Richard P Methods for determining fraction of fetal nucleic acids in maternal samples
US20110312503A1 (en) 2010-01-23 2011-12-22 Artemis Health, Inc. Methods of fetal abnormality detection
WO2012012037A1 (en) 2010-07-19 2012-01-26 New England Biolabs, Inc. Oligonucleotide adaptors: compositions and methods of use
US20120034603A1 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Tandem Diagnostics, Inc. Ligation-based detection of genetic variants
CN105243295B (zh) 2010-11-30 2018-08-17 香港中文大学 与癌症相关的遗传或分子畸变的检测
CN103620055A (zh) * 2010-12-07 2014-03-05 利兰·斯坦福青年大学托管委员会 在全基因组规模非侵入性确定亲本单倍型的胎儿遗传
WO2012088348A2 (en) 2010-12-23 2012-06-28 Sequenom, Inc. Fetal genetic variation detection
US20120190020A1 (en) 2011-01-25 2012-07-26 Aria Diagnostics, Inc. Detection of genetic abnormalities
RU2671980C2 (ru) * 2011-02-09 2018-11-08 Натера, Инк. Способы неинвазивного пренатального установления плоидности
RS57837B1 (sr) 2011-04-12 2018-12-31 Verinata Health Inc Razrešavanje genomskih frakcija upotrebom broja kopija polimorfizama
GB2484764B (en) 2011-04-14 2012-09-05 Verinata Health Inc Normalizing chromosomes for the determination and verification of common and rare chromosomal aneuploidies
US9411937B2 (en) 2011-04-15 2016-08-09 Verinata Health, Inc. Detecting and classifying copy number variation
AU2011373694A1 (en) 2011-07-26 2013-05-02 Verinata Health, Inc. Method for determining the presence or absence of different aneuploidies in a sample

Also Published As

Publication number Publication date
CY1117574T1 (el) 2017-04-26
WO2012142334A2 (en) 2012-10-18
SI3078752T1 (sl) 2018-12-31
SMT202000403T1 (it) 2020-09-10
PT3456844T (pt) 2020-08-25
EP3567124B1 (en) 2021-12-15
JP2018061514A (ja) 2018-04-19
CA2832468A1 (en) 2012-10-18
JP6760917B2 (ja) 2020-09-23
US20200251180A1 (en) 2020-08-06
AU2012242698B2 (en) 2014-09-04
HRP20181770T1 (hr) 2018-12-28
RS57837B1 (sr) 2018-12-31
PT3567124T (pt) 2022-02-01
PL3456844T3 (pl) 2020-11-16
HRP20220296T1 (hr) 2022-05-13
HRP20201249T1 (hr) 2020-11-13
PL3078752T3 (pl) 2019-02-28
DK3456844T3 (da) 2020-06-29
HK1195103A1 (zh) 2014-10-31
SI3456844T1 (sl) 2020-10-30
PL2697392T3 (pl) 2016-08-31
US9447453B2 (en) 2016-09-20
SI3567124T1 (sl) 2022-05-31
JP6268153B2 (ja) 2018-01-24
JP2014512817A (ja) 2014-05-29
EP2697392B1 (en) 2016-03-02
EP3567124A1 (en) 2019-11-13
ES2692333T3 (es) 2018-12-03
AU2012242698A1 (en) 2013-05-09
CA2832468C (en) 2023-10-31
EP3078752B1 (en) 2018-08-01
LT3456844T (lt) 2020-08-25
SMT201800558T1 (it) 2018-11-09
CN106319047B (zh) 2020-02-18
US20120264121A1 (en) 2012-10-18
US10658070B2 (en) 2020-05-19
CN106319047A (zh) 2017-01-11
SMT202200090T1 (it) 2022-03-21
ES2907069T3 (es) 2022-04-21
DK2697392T3 (en) 2016-03-29
DK3078752T3 (en) 2018-11-12
TR201816062T4 (tr) 2018-11-21
HUE041411T2 (hu) 2019-05-28
JP2016101168A (ja) 2016-06-02
RS60710B1 (sr) 2020-09-30
ES2806728T3 (es) 2021-02-18
CN103797129A (zh) 2014-05-14
EP3456844B1 (en) 2020-06-10
EP3456844A1 (en) 2019-03-20
IL228843A0 (en) 2013-12-31
IL228843A (en) 2016-07-31
CY1125362T1 (el) 2024-02-16
US20170039318A1 (en) 2017-02-09
DK3567124T3 (da) 2022-03-07
JP5863946B2 (ja) 2016-02-17
EP3078752A1 (en) 2016-10-12
CY1123287T1 (el) 2021-12-31
ES2572912T3 (es) 2016-06-03
LT3567124T (lt) 2022-04-11
PT3078752T (pt) 2018-11-22
AU2012242698C1 (en) 2015-06-04
LT3078752T (lt) 2018-11-26
HUE050032T2 (hu) 2020-11-30
EP4039820A1 (en) 2022-08-10
CY1120851T1 (el) 2019-12-11
PL3567124T3 (pl) 2022-04-19
EP2697392A2 (en) 2014-02-19
HUE057424T2 (hu) 2022-05-28
US20260038632A1 (en) 2026-02-05
CN103797129B (zh) 2016-08-17
WO2012142334A3 (en) 2013-04-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20260038632A1 (en) Resolving genome fractions using polymorphism counts
EP3202915A1 (en) Using cell-free dna fragment size to determine copy number variations
HK40072002A (en) Resolving genome fractions using polymorphism counts
HK40016329A (en) Resolving genome fractions using polymorphism counts
HK40016329B (en) Resolving genome fractions using polymorphism counts
HK40006382A (en) Resolving genome fractions using polymorphism counts
HK40006382B (en) Resolving genome fractions using polymorphism counts
EP4721070A1 (en) Methods for discriminating between fetal and maternal events in non-invasive prenatal test samples
HK1195103B (en) Resolving genome fractions using polymorphism counts
HK1233311B (zh) 使用多态计数来解析基因组分数
HK1233311A1 (en) Resolving genome fractions using polymorphism counts