RS63061B1

RS63061B1 - Proteini koji vezuju antigen koji aktiviraju receptor leptina

Info

Publication number: RS63061B1
Application number: RS20220294A
Authority: RS
Inventors: Jesper Gromada; Panayiotis Stevis; Judith ALTAREJOS
Original assignee: Regeneron Pharma
Priority date: 2015-10-12
Filing date: 2016-10-11
Publication date: 2022-04-29
Also published as: CO2018003852A2; CA3000215A1; JP2023002713A; US20220112293A1; JP2018535948A; US20200031946A1; JP2024026230A; US10253102B2; CN108368177A; US20250051465A1; HRP20220426T1; KR20250069979A; PT3362477T; WO2017066204A1; US20180282420A1; JP7759417B2; IL258448A; SMT202200125T1; AU2023206125A1; UA124419C2

Description

Opis

OBLAST TEHNIKE

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na antitela i fragmente antitela koji vežu antigen koji se vezuje za humani receptor leptina (LEPR), i na ona antitela za upotrebu u terapeutskim postupcima.

STANJE TEHNIKE

[0002] Leptin je polipeptidni hormon koji se pretežno eksprimira od strane adipoznog tkiva i uključen je u regulaciju metabolizma, energetske ravnoteže i unosa hrane. Aktivnost leptina je posredovana preko interakcije sa, i signalizacijom preko, leptinskog receptora. Receptor leptina, (takođe poznat kao "LEPR," "WSX," "OB receptor," "OB-R," i "CD295") je transmembranski receptor sa jednim prolazom klase I familije citokinskih receptora sa velikim (818 aminokiselina) vanćelijskim domenom. Deficijencija leptina, rezistentnost na leptin, i određene LEPR mutacije u defektnoj signalizaciji/narušenom prenosu signala, su povezani sa gojaznošću, dijabetesom tipa 2, dislipidemijom, lipodistrofijama, hepatičnom steatozom, ne-alkoholnim i alkoholnim bolestima masne jetre, teškom insulinskom rezistencijom, Leprehaunizam/Donohueov-im sindromom, Rabson-Mendenhalov-im sindromom, i srodnim komplikacijama. Terapeutski pristupi kojima se tretira rezistencija na leptin, deficijencija leptina, i hipoleptinemija (npr., lipodistrofija) uglavnom su usmereni na isporuku dodatnog leptina ili analoga leptina pogođenim individuama. Takvi pristupi, međutim, generalno su pokazali ograničenu efikasnost, posebno kod individua koji su rezistentni na leptin, i učestalo su povezani sa neželjenim sporednim efektima. Prema tome, u oblasti tehnike postoji potreba za alternativnim pristupima za lečenje rezistencije na leptin i drugih stanja koja su u vezi sa deficijencijom leptina ili hipoleptinemijom.

[0003] US 6,977,240 prikazuje identifikovanje i karakterizaciju nukleotida koji kodiraju OB receptor. US 6,977,240 takođe prikazuje OB-R nukleotide, ekspresione sisteme ćelije domaćina, OB-R proteine, spojene proteine, polipeptide i peptide, antitela protiv receptora, transgene životinje koje eksprimuju OB-R transgen, ili rekombinantne životinje sa izbačenim genom (eng. knock-out) koje ne eksprimuju OB-R, antagoniste i agoniste receptora, i druga jedinjenja koja moduliraju ekspresiju OB-R gena ili aktivnost OB-R koja se mogu koristiti za dijagnozu, pretraživanje leka, praćenje kliničkog ispitivanja, i/ili za lečenje poremećaja telesne težine.

KRATKO IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA

[0004] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitela i njihove fragmente koji vezuju antigen kao što je definisano u patentnim zahtevima koja se vezuju za receptor humanog leptina (LEPR). Izvođenja i/ili primeri opisa iz nastavka koji nisu pokriveni priloženim zahtevima neće se smatrati delom predmetnog pronalaska. Antitela iz predmetnog pronalaska su antitela agonisti; tj., vezivanje anti-LEPR antitela iz pronalaska za LEPR uzrokuje, inter alia, aktivaciju signalizacije preko receptora za leptin u ćelijama. U određenim izvođenjima, antitela iz predmetnog pronalaska nisu u kompeticiji sa leptinom za vezivanje za LEPR. Antitela iz predmetnog pronalaska su korisna, npr., za mimikriju, zamenu za, ili kao dopuna normalne biološke aktivnosti leptina kod subjekta. Antitela i fragmenti koji vezuju antigen iz predmetnog pronalaska su prema tome korisni u terapeutskom lečenju bolesti i poremećaja koji su povezani sa rezistencijom na leptin i definicijencijom na leptin.

[0005] Antitela iz pronalaska mogu biti pune dužine (na primer, IgG1 ili IgG4 antitelo) ili mogu sadržati samo deo koji vezuje antigen (na primer, Fab, F(ab')2ili scFv fragment), i mogu biti modifikovana tako da utiču na funkcionalnost, npr., da se eliminišu preostale efektorske funkcije (Reddy et al., 2000, J. Immunol.164:1925-1933).

[0006] Primeri anti-LEPR antitela iz predmetnog pronalaska ovde su navedeni u Tablelama 1 i 2. Tabela 1 prikazuje identifikatore aminokiselinskih sekvenci varijabilnih regiona teškog lanca (HCVRs), varijabilnih regiona lakog lanca (LCVRs), regiona koji određuju komplementarnost teškog lanca (HCDR1, HCDR2 i HCDR3), i regiona koji određuju komplementarnost lakog lanca (LCDR1, LCDR2 i LCDR3) primera anti-LEPR antitela. Tabela 2 prikazuje identifikatore nukleinskih kiselina HCVRs, LCVRs, HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 primera anti-LEPR antitela.

[0007] Predmetni prikaz obezbeđuje antitela ili njihove fragmente koji vežu antigen koji se specifično vezuju za LEPR, koji sadrže HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je izabrana iz bilo koje od HCVR aminokiselinskih sekvenci koje su navedene u Tabeli 1, ili njihovu suštinski sličnu sekvencu koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% uz to indentična u sekvenci.

[0008] Predmetni prikaz takođe obezbeđuje antitela ili njihove fragmente koji vežu antigen koji se specifično vezuju za LEPR, koji sadrže LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je izabrana iz bilo koje od LCVR aminokiselinskih sekvenci koje su navedene u Tabeli 1, ili njihova suštinski slična sekvenca koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili 99% indentična u sekvenci.

[0009] Predmetni prikaz takođe obezbeđuje antitela ili njihove fragmente koji vežu antigen koji se specifično vezuju za LEPR, koji sadrže HCVR i LCVR aminokiselinski par sekvenci (HCVR/LCVR) koji sadrži bilo koju od HCVR aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1 koje su uparene sa bilo kojom od LCVR aminokiselinskih sekvenci koje su navedene u Tabeli 1. Prema određenim izvođenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje antitela, ili njihove fragmente koj se vezuju za antigen, koja sadrže HCVR/LCVR aminokiselinski par sekvenci koji se nalazi u bilo kom od primera anti-LEPR antitela navedenih u Tabeli 1. U određenim izvođenjima, HCVR/LCVR aminokiselinski par sekvenci je izabran iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs: 2/10, 18/10, 26/10, 34/10, 42/10, 50/10, 58/10, 74/10 i 82/90.

[0010] Predmetni prikaz takođe obezbeđuje antitela ili njihove fragmente koji vežu antigen koji se specifično vezuju za LEPR, koja sadrže teški lanac CDR1 (HCDR1) koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence izabrane iz bilo koje od HCDR1 aminokiselinskih sekvenci koje su navedene u Tabeli 1 ili u suštini njihove slične sekvence koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci.

[0011] Predmetni prikaz takođe obezbeđuje antitela ili njihove fragmente koji vežu antigen koji se specifično vezuju za LEPR, koja sadrže teški lanac CDR2 (HCDR2) koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence izabrane iz bilo koje od HCDR2 aminokiselinskih sekvenci koje su navedene u Tabeli 1 ili u suštini njihove slične sekvence koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci.

[0012] Predmetni prikaz takođe obezbeđuje antitela ili njihove fragmente koji vežu antigen koji se specifično vezuju za LEPR, koja sadrže teški lanac CDR3 (HCDR3) koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence izabrane iz bilo koje od HCDR3 aminokiselinskih sekvenci koje su navedene u Tabeli 1 ili u suštini njihove slične sekvence koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci.

[0013] Predmetni prikaz takođe obezbeđuje antitela ili njihove fragmente koji vežu antigen koji se specifično vezuju za LEPR, koja sadrže laki lanac CDR1 (LCDR1) koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence izabrane iz bilo koje od LCDR1 aminokiselinskih sekvenci koje su navedene u Tabeli 1 ili u suštini njihove slične sekvence koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci.

[0014] Predmetni prikaz takođe obezbeđuje antitela ili njihove fragmente koji vežu antigen koji se specifično vezuju za LEPR, koja sadrže laki lanac CDR2 (LCDR2) koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence izabrane iz bilo koje od LCDR2 aminokiselinskih sekvenci koje su navedene u Tabeli 1 ili u suštini njihove slične sekvence koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci.

[0015] Predmetni prikaz takođe obezbeđuje antitela ili njihove fragmente koji vežu antigen koji se specifično vezuju za LEPR, koja sadrže laki lanac CDR3 (LCDR3) koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence izabrane iz bilo koje od LCDR3 aminokiselinskih sekvenci koje su navedene u Tabeli 1 ili u suštini njihove slične sekvence koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci.

[0016] Predmetni prikaz takođe obezbeđuje antitela ili njihove fragmente koji vežu antigen koji se specifično vezuju za LEPR, koja sadrže HCDR3 i LCDR3 aminokiselinski par sekvenci (HCDR3/LCDR3) koji se sastoji iz bilo koje od HCDR3 aminokiselinskih sekvenci koje su navedene u Tabeli 1 uparene sa bilo kojom od LCDR3 aminokiselinskih sekvenci koje su navedene u Tabeli 1. Prema određenim aspektima, predmetni prikaz obezbeđuje antitela ili njihove fragmente koj se vezuju za antigen, koji sadrže HCDR3/LCDR3 aminokiselinski par sekvenci koji se nalazi u bilo kom od primera anti-LEPR antitela koja su navedena u Tabeli 1. U određenim aspektima, HCDR3/LCDR3 aminokiselinski par sekvenci je izabran iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs: 8/16, 24/16, 32/16, 40/16, 48/16, 56/16, 64/72, 80/72 i 88/72.

[0017] Predmetni prikaz takođe obezbeđuje antitela ili njihove fragmente koji vežu antigen koji se specifično vezuju za LEPR, koji se sastoje iz niza od šest CDRs (tj., HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, i LCDR3) koji se nalaze u bilo kom od primera anti-LEPR antitela koja su navedena u Tabeli 1. U određenim aspektima, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, i LCDR3 aminokiselinski niz sekvenci koji je izabran iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 12, 14, 16; 20, 22, 24, 12, 14, 16; 28, 30, 32, 12, 14, 16; 36, 38, 40, 12, 14, 16; 44, 46, 48, 12, 14, 16; 52, 54, 56, 12, 14, 16; 60, 62, 64, 68, 70, 72; 76, 78, 80, 68, 70, 72; i 84, 86, 88, 68, 70, 72.

[0018] U povezanom aspektu, predmetni prikaz obezbeđuje antitela, ili njihove fragmente koji se vezuju za antigen koji se specifično vezuju za LEPR, koji se sastoje iz niza od šest CDRs (tj., HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, i LCDR3) koji se nalaze u HCVR/LCVR aminokiselinskom paru sekvenci kao što je definisano bilo kojim od primera anti-LEPR antitela koji su navedeni u Tabeli 1. Na primer, predmetni prikaz uključuje antitela ili njihove fragmente koji vežu antigen koji se specifično vezuju za LEPR, koji sadrže HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, i LCDR3 niz aminokiselinskih sekvenci koji se nalaze unutar HCVR/LCVR aminokiselinskog para sekvenci koji je izabran iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs: 2/10, 18/10, 26/10, 34/10, 42/10, 50/10, 58/66, 74/66 i 82/66. Postupci i tehnike za identifikovanje CDRs unutar HCVR i LCVR aminokiselinskih sekvenci su dobro poznati u oblasti tehnike i mogu se koristiti za identifikovanje CDRs unutar određenih HCVR i/ili LCVR aminokiselinskih sekvenci koje su ovde prikazane. Primeri konvencija koje se mogu koristiti za identifikovanje graničnika CDRs uključuju, pr., Kabat definiciju, Chothia definiciju, i AbM definiciju. U opštem smislu, Kabat definicija je zasnovana na varijabilnosti u sekvenci, Chothia definicija je zasnovana na položaju regiona strukturalne petlje, i AbM definicija je kompromis između Kabat i Chothia pristupa. Videti, npr., Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol.273:927-948 (1997); i Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989). Javne baze podataka su takođe dostupne za identifikovanje CDR sekvenci sa antitelom.

[0019] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje molekule nukleinske kiseline koji kodiraju anti-LEPR antitela ili njihove delove iz pronalaska. Na primer, predmetni prikaz obezbeđuje molekule nukleinske kiseline koji kodiraju bilo koju od HCVR aminokiselinskih sekvenci koje su navedene u Tabeli 1; U određenim aspektima molekul nukleinske kiseline sadrži polinukleotidnu sekvencu koja je izabrana iz bilo koje od HCVR sekvenci nukleinskih sekvenci koje su navedene u Tabeli 2, ili njihove u suštini slične sekvence koje su bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% uz to identične u sekvenci.

[0020] Predmetni prikaz takođe obezbeđuje molekule nukleinske kiseline koji kodiraju bilo koju od LCVR aminokiselinskih sekvenci koje su navedene u Tabeli 1; U određenim aspektima molekul nukleinske kiseline sadrži polinukleotidnu sekvencu koja je izabrana iz bilo koje od LCVR sekvenci nukleinskih kiselina koje su navedene u Tabeli 2, ili u suštini njihove slične sekvence koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% uz to identična u sekvenci.

[0021] Predmetni prikaz takođe obezbeđuje molekule nukleinske kiseline koji kodiraju bilo koju od HCDR1 aminokiselinskih sekvenci koje su navedene u Tabeli 1; U određenim aspektima molekul nukleinske kiseline sadrži polinukleotidnu sekvencu koja je izabrana od bilo koje od HCDR1 sekvenci nukleinskih kiselina koje su navedene u Tabeli 2, ili u suštini njihova slična sekvenca koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% uz to identična u sekvenci.

[0022] Predmetni prikaz takođe obezbeđuje molekule nukleinske kiseline koji kodiraju bilo koju od HCDR2 aminokiselinskih sekvenci koje su navedene u Tabeli 1; U određenim aspektima molekul nukleinske kiseline sadrži polinukleotidnu sekvencu koja je izabrana od bilo koje od HCDR2 sekvenci nukleinskih kiselina koje su navedene u Tabeli 2, ili u suštini njihova slična sekvenca koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% uz to identična u sekvenci.

[0023] Predmetni prikaz takođe obezbeđuje molekule nukleinske kiseline koji kodiraju bilo koje od HCDR3 aminokiselinskih sekvenci koje su navedene u Tabeli 1; U određenim aspektima molekul nukleinske kiseline sadrži polinukleotidnu sekvencu koja je izabrana iz bilo koje od HCDR3 sekvenci nukleinskih kiselina koje su navedene u Tabeli 2, ili u suštini njihova slična sekvenca koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% uz to identična u sekvenci.

[0024] Predmetni prikaz takođe obezbeđuje molekule nukleinske kiseline koji kodiraju bilo koju od LCDR1 aminokiselinskih sekvenci koje su navedene u Tabeli 1; U određenim aspektima molekul nukleinske kiseline sadrži polinukleotidnu sekvencu koja je izabrana iz bilo koje od LCDR1 sekvenci nukleinskih kiselina koje su navedene u Tabeli 2, ili njihovom u suštini sličnom sekvencom koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% uz to identična u sekvenci.

[0025] Predmetni prikaz takođe obezbeđuje molekule nukleinske kiseline koji kodiraju bilo koju od LCDR2 aminokiselinskih sekvenci koje su navedene u Tabeli 1; U određenim aspektima molekul nukleinske kiseline sadrži polinukleotidnu sekvencu koja je izabrana iz bilo koje od LCDR2 sekvenci nukleinskih kiselina koje su navedene u Tabeli 2, ili njihovom u suštini sličnom sekvencom koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% uz to identična u sekvenci.

[0026] Predmetni prikaz takođe obezbeđuje molekule nukleinske kiseline koji kodiraju bilo koju od LCDR3 aminokiselinskih sekvenci koje su navedene u Tabeli 1; U određenim aspektima molekul nukleinske kiseline sadrži polinukleotidnu sekvencu koja je izabrana iz bilo koje od LCDR3 sekvenci nukleinskih kiselina koje su navedene u Tabeli 2, ili njihovom u suštini sličnom sekvencom koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% uz to identična u sekvenci.

[0027] Predmetni prikaz takođe obezbeđuje molekule nukleinske kiseline koji kodiraju HCVR, pri čemu HCVR sadrži niz od tri CDRs (tj., HCDR1, HCDR2, HCDR3), pri čemu HCDR1, HCDR2, HCDR3 aminokiselinski niz je kao što je definisao bilo kojim od primera anti-LEPR antitela koji su navedeni u Tabeli 1.

[0028] Predmetni prikaz takođe obezbeđuje molekule nukleinske kiseline koji kodiraju LCVR, pri čemu LCVR sadrži niz od tri CDRs (tj., LCDR1, LCDR2, LCDR3), pri čemu LCDR1, LCDR2, LCDR3 niz aminokiselinskih sekvenci je kao što je definisano bilo kojim primerom anti-LEPR antitela koja su navedena u Tabeli 1.

[0029] Predmetni prikaz takođe obezbeđuje molekule nukleinske kiseline koji kodiraju i HCVR i LCVR, pri čemu HCVR sadrži aminokiselinsku sekvencu prema bilo kojoj od HCVR sekvenci aminokiselina koje su navedene u Tabeli 1, i pri čemu LCVR sadrži aminokiselinsku sekvencu prema bilo kojoj od LCVR aminokiselinskih sekvenci koje su navedene u Tabeli 1. U određenim slučajevima, molekul nukleinske kiseline sadrži polinukleotidnu sekvencu koja je izabrana iz bilo koje od HCVR sekvenci nukleinskih kiselina koje su navedene u Tabeli 2, ili njihovom u suštini sličnom sekvencom koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% uz to identična u sekvenci, i polinukleotidna sekvenca koja je izabrana iz bilo koje od LCVR sekvenci nukleinskih kiselina koje su navedene u Tabeli 2, ili njihovom u suštini sličnom sekvencom koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% uz to identična u sekvenci. U pronalasku, molekul nukleinske kiseline kodira HCVR i LCVR, pri čemu HCVR i LCVR su oba izvedena iz istog anti-LEPR antitela koje se nalazi u Tabeli 1.

[0030] Predmetni prikaz takođe obezbeđuje rekombinantne ekspresione vektore koji su sposobni za eksprimovanje polipeptida koji se sastoji iz varijabilnog regiona teškog i lakog lanca anti-LEPR antitela. Na primer, predmetni prikaz uključuje rekombinantne ekspresione vektore koji se sastoje iz bilo kog od molekula nukleinskih kiselina koji su pomenuti ovde gore u tekstu, tj., molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju bilo koju od HCVR, LCVR, i/ili CDR sekvenci kao što su napred prikazane u Tabeli 1. Predmetni pronalazak obezbeđuje rekombinantni ekspresioni vektor koji sadrži polinukleotid iz pronalaska. Takođe obezbeđeno od strane predmetnog pronalaska su ćelije domaćina u kojima su takvi vektori uneti. Prikaz obezbeđuje postupke za proizvodnju antitela ili njihovih delova kultivacijom ćelija domaćina pod uslovima koji omogućavaju proizvodnju antitela ili fragmenata antitela, i dobijanje tako proizvedenih antitela i fragmenata antitela.

[0031] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži rekombinantno humano antitelo ili njegov fragment iz pronalaska koji se specifično vezuje za LEPR i farmaceutski prihvatljivi nosač. U povezanom aspektu, pronalazak obuhvata kompoziciju koja je kombinacija anti-LEPR antitela iz pronalaska i drugog terapeutskog sredstva. U jednom izvođenju, drugo terapeutsko sredstvo je bilo koje sredstvo je kao prednost kombinovano sa anti-LEPR antitelom.

[0032] U još drugom aspektu, prikaz obezbeđuje terapeutske postupke za pojačanje ili stimulaciju LEPR signalizacije korišćenjem anti-LEPR antitela ili dela antitela koje vezuje antigen iz pronalaska. Terapeutski postupci prema ovom aspektu obuhvataju davanje terapeutski efikasne količine farmaceutske kompozicije koja se sastoji iz antitela ili fragmenta antitela koje vezuje antigen iz pronalaska subjektu kome je to potrebno. Poremećaj koji se leči je bilo koja bolest ili stanje koje je poboljšano, ublaženo, inhibirano ili sprečeno stimulisanjem ili aktivacijom LEPR signalizacije, ili na drugi način imitiranjem prirodne aktivnosti leptina in vitro ili in vivo. Reference na postupke lečenja u paragrafima koji slede u ovom opisu treba razumeti kao reference na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove iz predmetnog pronalaska za upotrebu u postupku lečenja humanog (ili životinjskog) tela terapijom (ili za uspostavljanje dijagnoze).

KRATAK OPIS NACRTA

[0033]

Slika 1 prikazuje vezivanje dimernog humanog LEPR za humani Leptin u prisustvu rastućih koncentracija ispitivanih anti-LEPR antitela ili kontrolnih molekula, kao što je izmereno sa ELISA (absorbancija na 450nm).

Slike 2A-2C ilustruju opseg LEPR signalizacije u HEK293 ćelijama koje eksprimuju ili divlji tip LEPR (kružići), LEPR mutant koji je defektan u signalizaciji (A409E, kvadrati), ili LEPR mutant sa narušenom signalizacijom (P316T, trouglovi). LEPR signalizacija je eksprimirana kao odnos pSTAT3-Y705 / STAT3, mereno denzitomerijom sa Western blotova koji su pripremljeni iz ćelija tretiranih sa rastućim koncentracijama leptina (Slika 2A), H4H16650 (Slika 2B), ili H4H16679 (Slika 2C).

Slika 3 prikazuje prosečan dnevni unos hrane miševa koji su miševi koji su deficijentni za leptin koji su dozirani ili sa izotipom kontrolnog antitela na 3 mg/kg, ili LEPR antitelom koje je izabrano od H4H16650P2, H4H16679P2, H4H17319P2 ili H4H 17321 P2 na 3 mg/kg.

Slika 4 pokazuje prosečnu promenu procenta u telesnoj težini miševa koji su dozirani sa ili izotipom kontrolnog antitela na 3 mg/kg, ili LEPR antitelom koje je izabrano od H4H16650P2, H4H16679P2, H4H17319P2 ili H4H17321 P2 na 3 mg/kg.

Slika 5 pokazuje prosečnu masu masti za životinje u svakoj grupi koja prima tretman antitelom kvantifikovano sa mCT 1 dan pre (stupci nisu osenčeni) i 6 dana posle tretmana antitelom (osenčeni stupci) eksprimirano kao srednja vrednost ± SEM.

Slika 6 pokazuje procenat promene u telesnoj težini miševa koji su hranjeni sa 30 mg/kg antitela izabranog od H4H18482P2, H4H18487P2, H4H18492P2 ili kontrolom izotipa.

Slike 7A-7B. Slika 7A pokazuje masu masti miševa pre doziranja sa anti-LEPR antitelima H4H18482P2, H4H18487P2 ili H4H18492P2. Slika 7B pokazuje masu masti (količinu masnog tkiva) kod miševa koji su tretirani sa 30 mg/kg H4H18482P2, H4H18487P2 ili H4H18492P2.

Slika 8. Slika 8 pokazuje da anti-LEPR antitela koja su ispitana aktiviraju majmunski (Mf) LEPR u IMR-32/STAT3-luc/Mf LEPR ćelijskoj liniji.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0034] Pre nego što je predmetni pronalazak opisan, treba razumeti da pronalazak nije ograničen na posebne postupke i opisane eksperimentalne uslove, s obzirom da se takvi postupci i uslovi mogu razlikovati. Takođe treba razumeti da je ovde korišćena terminologija namenjena samo za svrhu opisivanja određenih izvođenja, i nije namenjena da bude ograničavajuća, s obzirom na to da će obim predmetnog pronalaska biti ograničen samo navedenim patentnim zahtevima.

[0035] Osim ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji su ovde korišćeni imaju isto značenje kao što to razume stručnjak koji je uobičajeno verziran u stanje tehnike kojoj ovaj pronalazak pripada. Kao što je ovde korišćen, termin "oko," kada se koristi u odnosu na određenu brojčanu vrednost koja se navodi, označava da se vrednost može razlikovati od navedene vrednosti za ne više od 1%. Na primer, kao što je ovde korišćen, izraz "oko 100" uključuje 99 i 101 i sve vrednosti koje se nalaze između (npr., 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, itd.).

[0036] Iako se mnogi postupci i materijali koji su slični sa ili su ekvivalentni sa onima koji su ovde opisani mogu se koristiti u praksi ili ispitivanju predmetnog pronalaska, poželjni postupci i materijali se opisuju u nastavku.

Definicije

[0037] Izraz "receptor leptina," "LEPR," i slično, kao što se ovde koristi, odnosi se na humani receptor za leptin, koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence kao što je predstavljena u SEQ ID NO:113 (videti takođe UniProtKB/Swiss-Prot pristupni br. P48357). Alternativna imena za LEPR koja su korišćena u naučnoj literaturi uključuju "OB receptor," "OB-R," i "CD295." LEPR se takođe odnosi na "WSX" (videti, npr., US Patent br.7,524,937). Izraz "LEPR" uključuje i monomerne i multimerne (npr., dimerne) LEPR molekule. Kao što je ovde korišćen, izraz "monomerni humani LEPR" označava LEPR protein ili njegov deo koji ne sadrži ili poseduje bilo koje domene za multimerizaciju i koji u normalnim uslovima postoji kao pojedinačni LEPR molekul bez direktnog fizičkog spajanja sa drugim LEPR molekulom. Primer monomernog LEPR molekula je molekul koji je ovde naznačen sa "hLEPR.mmh" koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:114 (videti, npr., Primer 3, ovde). Kao što je ovde korišćen, izraz "dimer humanog LEPR" označava konstrukt koji se sastoji iz dva LEPR molekula spojena jedan sa drugim preko linkera, kovalentne veze, ne-kovalentne veze, ili preko domena za multimerizaciju kao što je Fc domen antitela. Primer dimera LEPR molekula je molekul koji je ovde naznačen sa "hLEPR.mFc" koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:115 (videti, npr., Primer 3, ovde), ili molekula koji je ovde naznačen sa "hLEPR.hFc" koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:116. Kao što su ovde korišćeni, izrazi kao što su "anti-LEPR antitelo," "antitelo koje specifično vezuje LEPR," "protein koji se specifično vezuje za LEPR," i slično, osim ukoliko nije specifično drugačije naznačeno, odnosi se na molekule koji vežu humani LEPR pune dužine, monomer humani LEPR, dimer humani LEPR, ili druge konstrukte koji sadrže ili se sastoje iz vanćelijskog domena LEPR.

[0038] Sve reference na proteine, polipeptide i proteinske fragmente koje su ovde navedene namenjene su da se odnose na humanu verziju odgovarajućeg proteina, polipeptida ili proteinskog fragmenta osim ukoliko eksplicitno nije definisano da pripradaju ne-humanim vrstama. Prema tome, izraz "LEPR" označava humani LEPR osim ukoliko nije naznačeno da pripada ne-humanim vrstama, npr., "mišji LEPR," "majmunski LEPR," itd.

[0039] Kao što je ovde korišćeno, izraz "LEPR koji je eksprimiran na ćelijskoj površini" označava jedan ili više LEPR protein(a), ili njihov vanćelijski domen, koji je/su eksprimirani na površini ćelije in vitro ili in vivo, tako da je bar deo LEPR proteina izložen ka vanćelijskoj strani ćelijske membrane i pristupačan je delu antitela koji se vezuje za antigen. "LEPR eksprimiran na ćelijskoj površini" može sadržati ili se sastojati iz LEPR proteina eksprimiranog na površini ćelije koja normalno (npr., u nativnom ili divljem tipu stanja) eksprimuje protein LEPR. Alternativno, "LEPR eksprimiran na ćelijskoj površini" može sadržati ili se sastojati iz LEPR proteina eksprimiranog na površini ćelije koja normalno ne eksprimira humani LEPR na svojoj površini već je veštački modifikovana da eksprimira LEPR na svojoj površini.

[0040] Kao što je ovde korišćeno, izrazi kao što su "anti-LEPR antitelo," ili "antitelo koje vezuje humani receptor leptina," uključuje i monovalentna antitela sa jednom specifičnosti, kao i bispecifična antitela koja se sastoje iz prvog kraka (eng. arm) koji veže LEPR i drugog kraka koji veže drugi (ciljni) antigen, pri čemu anti-LEPR krak sadrži bilo koju od HCVR/LCVR ili CDR sekvenci kao što su ovde predstavljene u Tabeli 1.

[0041] Termin "antitelo", kao što se ovde koristi, označava bilo koji molekul koji vezuje antigen ili molekulski kompleks koji se sastoji iz bar jednog regiona za određivanje komplementarnosti (CDR) koji se specifično veže za ili interagije sa određenim antigenom (npr., LEPR). Termin "antitelo" uključuje molekule imunoglobulina koji se sastoje iz četiri polipeptidna lanca, dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca koja su međusobno povezana sa disulfidnim vezama, kao i njihovi multimeri (npr., IgM). Svaki težak lanac sadrži varijabilni region teškog lanca (ovde skraćeno kao HCVR ili VH) i konstantni region teškog lanca. Konstantni region teškog lanca sadrži tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca (ovde skraćeno kao LCVR ili VL) i konstantni region lakog lanca. Konstantni region lakog lanca sadrži jedan domen (CL1). Regioni VHi VLmogu dalje biti podeljeni u regione hipervarijabilnosti, koji se zovu regioni za određivanje komplementarnosti (CDRs), koji su rastuti između regiona koji su konzervisaniji, koji su poznati kao regioni okvira (FR). Svaki VHi VLse sastoji iz tri CDRs i četiri FRs, uređeni od amino-kraja prema karboksi-kraju sledećim redosledom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. U različitim izvođenjima iz pronalaska, FRs anti-LEPR antitela (ili njihovog dela koji veže antigen) može biti identičan sa humanim germinativnim sekvencama, ili može biti prirodno ili veštački modifikovan. Aminokiselinska konsenzusna sekvenca se može definisati na osnovu paralelne analize dva ili više CDRs.

[0042] Termin "antitelo", kao što je ovde korišćen, takođe uključuje fragmente koji vezuju antigen punih molekula antitela. Termini "deo koji veže antigen" antitela, "fragment koji veže antigen" antitela, i slično, kao što je ovde korišćen, uključuje bilo koji prirodni, koji se može dobiti enzimski, sintetički, ili genski modifikovani polipeptid ili glikoprotein koji se specifično veže za antigen da bi se obrazovao kompleks. Fragmenti antitela koji vežu antigen mogu se dobiti, npr., iz punih molekula antitela korišćenjem bilo kojih pogodnih standardnih postupaka kao što je proteolitička digestija ili postupci rekombinantnog genskog modifikovanja koji uključuju manipulaciju i eskpresiju DNK koja kodira varijabilne i opciono konstantne domene antitela. Takva DNK je poznata i/ili već je dostupna od, npr., komercijalnih izvora, biblioteka DNK (uključujući, npr., fagne biblioteke antitela), ili se može sintetisati. DNK se može sekvencirati i hemijski manipulisati ili korišćenjem molekularno bioloških postupaka, na primer, da bi se preuredio jedan ili više varijabilnih i/ili konstantnih domena u pogodnoj konfiguraciji, ili da bi se uveli kodoni, kreirali cisteinski ostaci, modifikovale, dodale ili uklonile aminokiseline, itd.

[0043] Ne-ograničavajući primeri fragmenata koji vežu antigen uključuju: (i) Fab fragmente; (ii) F(ab')2 fragmente; (iii) Fd fragmente; (iv) Fv fragmente; (v) jednolančane Fv (scFv) molekule; (vi) dAb fragmente; i (vii) minimalne jedinice prepoznavanja koje se sastoje iz aminokiselinskih ostataka koji imitiraju hipervarijabilni region antitela (npr., izolovani region za određivanje komplementarnosti (CDR) kao što je CDR3 peptid), ili ograničeni FR3-CDR3-FR4 peptid. Drugi modifikovani molekuli, kao što su antitela specifična za domen, antitela jednog domena, antitela sa deletiranim domenom, himerna antitela, antitela sa ugrađenim CDR, diatela, triatela, tetratela, minitela, nanotela (npr. monovalentna nanotela, bivalentna nanotela, itd.), mali modularni imunofarmaceutici (SMIPs), i „shark“ varijabilni IgNAR domeni, takođe su obuhvaćeni izrazom "fragment koji veže antigen," kao što je ovde korišćen.

[0044] Fragment antitela koji veže antigen obično će sadržati bar jedan varijabilni domen. Varijabilni domen može biti bilo koje veličine ili kompozicije aminokiselina i generalno će sadržati bar jedan CDR koji je susedan sa ili je u okviru sa jednom ili više sekvenci regiona okvira. U fragmentima koji vežu antigen koji imaju VHdomen povezan sa VLdomenom, VHi VLdomeni se mogu nalaziti blizu jedan drugom u bilo kom pogodnom uređenju. Na primer, varijabilni region može biti dimerni i sadržati VH-VH, VH-VLor VL-VLdimere. Alternativno, fragment antitela koji veže antigen može sadržati monomerni VHili VLdomen.

[0045] U određenim aspektima, fragment antitela koji veže antigen može sadržati bar jedan varijabilni domen koji je kovalentno povezan sa bar jednim konstantnim domenom. Ne-ograničavajući, primeri konfiguracija varijabilnih i konstantnih domena koji se mogu pronaći unutar fragmenta antitela koji veže antigen iz predmetnog pronalaska uključuje: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VLCH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; i (xiv) VL-CL. U bilo kojoj konfiguraciji varijabilnih i konstantnih domena, uključujući bilo koju od gore navedenih primera konfiguracija, varijabilni i konstantni domeni mogu biti ili direktno povezani jedan sa drugim ili mogu biti povezani sa punim ili delom zgloba ili regiona linkera. Region zgloba može se sastojati iz bar 2 (npr., 5, 10, 15, 20, 40, 60 ili više) aminokiselina što rezultuje u fleksibilnom ili polu-fleksibilnom vezom između susednog varijabilnih i/ili konstantnih domena u jednom polipeptidnom molekulu. Osim toga, fragment antitela koji veže antigen iz predmetnog prikaza može sadržati homodimer ili hetero-dimer (ili drugi multimer) bilo kojih konfiguracija varijabilnog i konstantnih domena koji su gore navedeni u ne-kovalentnoj vezi jedan sa drugim i/ili sa jednim ili više monomernih VHili VLdomena (npr., disulfidnom vezom(ama)).

[0046] Kao sa punim molekulima antitela, fragmenti koji vežu antigen mogu biti monospecifični ili multispecifični (npr., bispecifični). Multispecifični fragment koji veže antigen antitela obično će sadržati bar dva različita varijabilna domena, pri čemu je svaki varijabilni domen sposoban da se specifično veže za odvojeni antigen ili za različiti epitop na istom antigenu. Bilo koji format multispecifičnog antitela, uključujući ovde prikazane primere formata bispecifičnih antitela, mogu biti prilagođeni za upotrebu u kontekstu fragmenta koji se veže za antigen antitela iz predmetnog pronalaska korišćenjem rutinskih postupaka koji su dostupni u oblasti tehnike.

[0047] U određenim izvođenjima iz pronalaska, anti-LEPR antitela iz pronalaska su humana antitela. Termin "humano antitelo", kao što je ovde korišćen, namenjen je da uključi antitela koja imaju varijabilne i konstantne regione koji su izvedeni iz humanih germinativnih imunoglobulinskih sekvenci. Humana antitela iz prikaza mogu uključiti aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani sa humanim zametnim (germinativnim) imunoglobulinskim sekvencama (npr., mutacije uvedene sa slučajnom ili mutagenezom koja je specifična za mesto in vitro ili somatskom mutacijom in vivo), na primer u CDRs i posebno CDR3. Međutim, termin "humano antitelo", kao što je ovde korišćeno, nije namenjen da uključi antitela u kojima su CDR sekvence izvedene iz germinativnih drugih sisarskih vrsa, kao što je miš, koje su prenete u humane sekvence regiona okvira.

[0048] Antitela iz pronalaska mogu, u nekim izvođenjima, biti rekombinantna humana antitela. Termin "rekombinantno humano antitelo", kao što je ovde korišćen, namenjen je da uključi sva humana antitela koja su dobijena, eksprimirana, nastala ili izolovana sa rekombinantnim sredstvima, kao što su antitela koja su eksprimirana korišćenjem rekombinantnog ekspresionog vektora koji je transfektovan u ćeliju domaćina (opisano dalje u tekstu), antitela izolovana iz rekombinantne, biblioteke kombinatornog humanog antitela (opisano dalje u tekstu), antitela koja su izolovana iz životinje (npr., miša) koji je transgeni za humane imunoglobulinske gene (videti npr., Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res.20:6287-6295) ili antitela koja su dobijena, eksprimirana, razvijena ili izolovana bilo kojim drugim sredstvima koja uključuju spajanje humanih imunoglobulinskih genskih sekvenci sa drugim sekvencama DNK. Takva rekombinantna humana antitela imaju varijabilne i konstantne regione koji su izvedeni iz humanih germinativnih immunoglobulinskih sekvenci. U određenim izvođenjima, međutim, takva rekombinantna humana antitela su izložena in vitro mutagenezi (ili, kada je korišćena životinja transgena za humane Ig sekvence, in vivo somatska mutageneza) i prema tome aminokiselinske sekvence VHi VLregiona rekombinantnih antitela su sekvence koje, dok su izvedene iz i povezane sa humanim germinativnim VHi VLsekvencama, mogu da ne postoje prirodno u in vivo repertoaru humanih germinativnih antitela.

[0049] Predmetni pronalazak obuhvata antitela koja imaju jednu ili više mutacija u zglobu, CH2 ili CH3 regionu koji može biti poželjan, na primer, u proizvodnji, da bi se unapredio prinos željenog oblika antitela.

[0050] Antitela iz pronalaska su izolovana antitela. "Izolovano antitelo," kao što je ovde korišćeno, označava antitelo koje je identifikovano i odvojeno i/ili dobijeno iz bar jedne komponente svog prirodnog okruženja. Na primer, antitelo koje je odvojeno ili uklonjeno iz bar jedne komponente organizma, ili iz tkiva ili ćelije u kojoj antitelo prirodno postoji ili je prirodno proizvedeno, je "izolovano antitelo" za svrhe predmetnog pronalaska. Izolovano antitelo takođe uključuje antitelo in situ u rekombinantnoj ćeliji. Izolovana antitela su antitela koja su bila izložena bar jednom koraku prečišćavanja ili izolacije. Prema određenim izvođenjima, izolovano antitelo može u suštini biti slobodno od drugog ćelijskog materijala i/ili hemikalija.

1

[0051] Predmetni prikaz uključuje ovde prikazane varijante anti-LEPR antitela koja sadrže jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, insercija i/ili delecija u regionu okvira i/ili CDR regionima varijabilnih domena teškog i lakog lanca u poređenju sa odgovarajućim germinativnim (zametnim) sekvencama iz kojih su dobijena antitela. Takve mutacije se mogu lako utvrditi poređenjem ovde prikazanih aminokiselinskih sekvenci sa germinativnim sekvencama koje su dostupne od, na primer, javnih baza podataka sekvenci antitela. Predmetni prikaz uključuje antitela, i njihove fragmente koji vežu antigen, koji su izvedeni iz bilo kojih ovde prikazanih aminokiselinskih sekvenci, pri čemu jedna ili više aminokiselinskih sekvenci unutar jednog ili više regiona okvira i/ili CDR regiona su mutirane u odgovarajući ostat(ke)ak germinativne sekvence iz koje je dobijeno antitelo, ili odgovarajući ostata(ci)k druge humane germinativne sekvence, ili u konzervativnu aminokiselinsku supstituciju odgovarajućih germinativnih ostatak(a) (takve promene u sekvenci su ovde kolektivno naznačene kao "germinativne mutacije"). Osoba koja je uobičajeno verzirana u stanje tehnike, počevši od ovde prikazanih sekvenci varijabilnog regiona teškog i lakog lanca, mogu jednostavno proizvesti brojna antitela i fragmente koji vežu antigen koji sadrže jednu ili više individualnih germinativnih mutacija ili njihove kombinacije. U određenim aspektima, svaki od regiona okvira i/ili CDR ostataka unutar VHi/ili VLdomena su povratno mutirani do ostataka koji se nalaze u originalnoj germinativnoj sekvenci iz koje je antitelo dobijeno. U drugim aspektima, samo određeni ostaci su povratno mutirani do originalne germinativne sekvence, npr., samo mutirani ostaci koji se nalaze unutar prvih 8 aminokiselina FR1 ili unutar poslednjih 8 aminokiselina FR4, ili samo mutirani ostaci koji se nalaze unutar CDR1, CDR2 ili CDR3. U drugim aspektima, jedan ili više regiona okvira i/ili CDR osta(ci)tak su mutirani u odgovarajući ostat(ke)ak različite germinativne sekvence (tj, germinativna sekvenca koja je različita od germinativne sekvence iz koje je antitelo originalno dobijeno). Dalje, antitela iz predmetnog prikaza mogu sadržati bilo koju kombinaciju dve ili više germinativnih mutacija unutar regiona okvira i/ili CDR regiona, npr., pri čemu su određeni posebni ostaci mutirani u odgovarajući ostatak određene germinativne sekvence pri čemu određeni drugi ostaci koji se razlikuju od originalne germinativne sekvence su održavane ili su mutirane u odgovarajući ostatak različite germinativne sekvence. Jednom dobijena, antitela i fragmenti koji vežu antigen koji sadrže jednu ili više germinativnih mutacija mogu se jednostavno ispitati za jedno ili više željenih svojstava kao što su, unapređena specifičnost vezivanja, povećani afinitet vezivanja, unapređena ili pojačana antagonistička ili agonistička biološka svojstva (kao što može biti slučaj), smanjena imunogenost, itd. Antitela i fragmenti koji vežu antigen koji su dobijeni na ovaj opšti način obuhvaćeni su obimom predmetnog pronalaska.

[0052] Predmetni prikaz uključuje anti-LEPR antitela i njihove fragmente koji vežu antigen koji sadrže aminokiselinske sekvence koje su u suštini slične ili suštinski identične jednom ili više varijabilnih domena ili CDR aminokiselinskih sekvenci kao što se može pronaći u bilo kom od primera ovde prikazanih anti-LEPR antitela.

[0053] Kao primenjeno na polipeptide, termin "suštinska sličnost" ili "u suštini sličan" znači da dve polipeptidne sekvence, kada se optimalno poravnaju, kao što je korišćenjem programa GAP ili BESTFIT upotrebom podrazumevanih „gap weights“, dele bar 95% identitet u sekvenci, još poželjnije bar 98% ili 99% identitet u sekvenci. Poželjno, položaji ostataka koji nisu identični razlikuju se u konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama. "Konzervativna aminokiselinska supstitucija" je ona u kojoj je aminokiselinski ostatak supstituisan sa drugim aminokiselinskim ostatkom koji ima bočni lanac (R grupu) sa sličnim hemijskim karakteristikama (npr., naelektrisanje ili hidrofobnost). Generalno, konzervativna aminokiselinska supstitucija neće suštinski izmeniti funkcionalna svojstva proteina. U slučajevima gde se dve ili više aminokiselinskih sekvenci razlikuju jedna od druge konzervativnim supstitucijama, procenat identiteta sekvence ili stepen sličnosti mogu se podesiti naviše kako bi se ispravila konzervativna priroda supstitucije. Sredstva za ovo prilagođavanje su dobro poznata stručnjacima iz oblasti tehnike. Videti, npr., Pearson (1994) Methods Mol. Biol.24: 307-331. Primeri grupa aminokiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim svojstvima uključuju (1) alifatične bočne lance: glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; (2) alifatične-hidroksil bočne lance: serin i treonin; (3) bočne lance koje sadrže amid: asparagin i glutamin; (4) aromatične bočne lance: fenilalanin, tirozin, i triptofan; (5) bazne bočne lance: lizin, arginin, i histidin; (6) kisele bočne lance: aspartat i glutamat, i (7) bočne lance koji sadrže sumpor su cistein i metionin. Poželjne grupe konzervativnih aminokiselinskih supstitucija su: valin-leucin-izoleucin, fenilalanintirozin, lizin-arginin, alanin-valin, glutamat-aspartat, i asparagin-glutamin. Alternativno, konzervativna zamena je bilo koja promena koja ima pozitivnu vrednost u PAM250 matrici log-verovatnoće koja je prikazana u Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445. "Umereno konzervativna" zamena je bilo koja promena koja ima nenegativnu vrednost u PAM250 matrici log-verovatnoće.

[0054] Sličnost u sekvenci za polipeptide, koja je takođe naziva i identitet sekvence, obično se meri korišćenjem softvera za analizu sekvence. Softver za analizu proteina odgovara sličnim sekvencama korišćenjem merenja sličnosti dodeljenim različitim supstitucijama, delecijama i drugim modifikacijama, uključujući konzervativne aminokiselinske supstitucije. Na primer, GCG softver sadrži programe kao što su Gap i Bestfit koji se mogu koristiti sa podrazumevanim parametrima da bi se odredila to homologija sekvence ili identitet u sekvenci između blisko povezanih polipeptida, kao što su homologni polipeptidi iz različitih vrsta organizama ili između proteina divljeg tipa i njihovog muteina. Videti, npr., GCG Verzija 6.1. Polipeptidne sekvence takođe mogu biti upoređenje korišćenjem FASTA upotrebom podrazumevanih ili preporučenih parametara, program u GCG Verziji 6.1. FASTA (npr., FASTA2 i FASTA3) obezbeđuje poravnanja i procent identiteta sekvence u regionima najboljeg preklapanja između sekvenci upita i pretrage (Pearson (2000) supra). Drugi poželjni algoritam kada se poredi sekvenca iz pronalaska sa bazom podataka koja sadrži veliki broj sekvenci iz različitih organizama je računarski program BLAST, naročito BLASTP ili TBLASTN, korišćenjem podrazumevanih parametara. Videti, npr., Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol.215:403-410 i Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res.25:3389-402.

Anti-LEPR Antitela koja sadrže varijante Fc

[0055] Prema određenim izvođenjima iz predmetnog pronalaska, obezbeđena su anti-LEPR antitela koja sadrže domen Fc koji obuhvata jednu ili više mutacija koje pojačavaju ili smanjuju vezivanje antitela za FcRn receptor, npr., na kiseloj pH u poređenju sa neutralnom pH. Na primer, predmetni pronalazak uključuje anti-LEPR antitela koja sadrže mutaciju u CH2 ili CH3 regionu Fc domena , pri čemu mutacija(e) povećavaju afinitet Fc domena za FcRn u kiselom okruženju (npr., u endozomu gde je pH opsega od oko 5.5 do oko 6.0). Takve mutacije mogu rezultovati u porastu polu-života antitela u serumu kada se daje životinji. Ne-ograničavajući primeri takvih modifikacija Fc uključuju, npr., modifikaciju u položaju 250 (npr., E ili Q); 250 i 428 (npr., L ili F); 252 (npr., L/Y/F/W ili T), 254 (npr., S ili T), i 256 (npr., S/R/Q/E/D ili T); ili modifikaciju u položaju 428 i/ili 433 (npr., H/L/R/S/P/Q ili K) i/ili 434 (npr., H/F ili Y); ili modifikaciju u položaju 250 i/ili 428; ili modifikaciju u položaju 307 ili 308 (npr., 308F, V308F), i 434. U jednom izvođenju, modifikacija sadrži 428L (npr., M428L) i 434S (npr., N434S) modifikaciju; 428L, 259I (npr., V259I), i 308F (npr., V308F) modifikaciju; 433K (npr., H433K) i 434 (npr., 434Y) modifikaciju; 252, 254, i 256 (npr., 252Y, 254T, i 256E) modifikacija; 250Q i 428L modifikaciju (npr., T250Q i M428L); i 307 i/ili 308 modifikaciju (npr., 308F ili 308P).

[0056] Na primer, predmetni pronalazak uključuje anti-LEPR antitela koje sadrže Fc domen koji sadrži jedan ili više parova ili grupa mutacija izbranih iz grupe koja se sastoji iz: 250Q i 248L (npr., T250Q i M248L); 252Y, 254T i 256E (npr., M252Y, S254T i T256E); 428L i 434S (npr., M428L i N434S); i 433K i 434F (npr., H433K i N434F). Sve moguće kombinacije navedenih mutacija Fc domena, i drugih mutacija u ovde prikazanim varijabilnim domenima antitela, su ovde prikazane.

[0057] Anti-LEPR antitela iz predmetnog pronalaska mogu sadržati modifikvani Fc domen koji ima smanjenu efektorsku funkciju. Kao što je ovde korišćen, "modifikovani Fc domen koji ima smanjenu efektorsku funkciju" označava bilo koji deo Fc imunoglobulina koji je modifikovan, mutiran, prekinut, itd., u odnosu na divlji tip, Fc domen koji se nalazi u prirodi kao što je molekul koji sadrži modifikovani Fc ispoljava smanjenje u težini ili obimu bar jednog efekta koji je izabran iz grupe koja se sastoji iz ćelijskog ubijanja (npr., ADCC i/ili CDC), aktivacija komplementa, fagocitoza i opsonizacija, u odnosu na molekul kompatator koji sadrži divlji-tip, verziju dela Fc koja se nalazi u prirodi. U određenim izvođenjima, "modifikovani Fc domen sa smanjenom efektorskom funkcijom" je Fc domen sa smanjenim ili oslabljenim vezivanjem za Fc receptor (npr., FcyR).

[0058] U određenim izvođenjima predmetnog pronalaska, modifikovani Fc domen je varijanta IgG1 Fc ili varijanta IgG4 Fc koja obuhvata supstituciju u regionu zgloba. Na primer, modifikovani Fc za upotrebu u kontekstu predmetnog pronalaska može sadržati varijantu IgG1 Fc pri čemu bar jedna aminokiselina regiona zgloba IgG1 Fc je zamenjena sa odgovarajućom aminokiselinom iz IgG2 Fc regiona zgloba. Alternativno, modifikovani Fc za upotrebu u kontekstu predmetnog pronalaska može sadržati varijantu IgG4 Fc pri čemu bar jedna aminokiselina IgG4 Fc regiona zgloba je zamenjena sa odgovarajućom aminokiselinom iz IgG2 Fc regiona zgloba. Ne-ograničavajući, primeri modifikovanih Fc regiona koji se mogu koristiti u kontekstu predmetnog pronalaska su predstavljeni u US prijavi patenta br. 2014/0243504.

[0059] Drugi modifikovani Fc domeni i modifikacije Fc koji se mogu koristiti u kontekstu predmetnog pronalaska uključuju bilo koju od modifikacija kao što su predstavljene u US 2014/0171623; US 8,697,396; US 2014/0134162; WO 2014/043361. Postupci za konstruisanje antitela ili drugih spojenih proteina koji vezuju antigen koji se sastoje iz modifikovanog Fc domena kao što je ovde opisano su poznati u oblasti tehnike.

Biološke karakteristike antitela

[0060] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitela i njihove fragmente koji vežu antigen kao što je definisano u zahtevima koji vežu humani LEPR i aktiviraju signalne puteve LEPR. Takva antitela ovde mogu biti naznačena sa "agonisti antitela." U kontekstu predmetnog pronalaska, "aktivacija signalnih puteva LEPR" označava stimulaciju unutarćelijskog efekta koji normalno nastaje iz interakcije leptina sa LEPR u ćelijama koje eksprimuju LEPR. U pronalasku, "aktivacija signalnih puteva LEPR" označava transkripcionu aktivaciju STAT3, koja se može detektovati korišćenjem bilo kog postupka koji se može izmeriti ili identifikovati, direktno ili indirektno, STAT3 aktivnost, npr., korišćenjem obeležene verzije STAT3 koji je eksprimiran u reporterskoj ćelijskoj liniji. Na primer, antitela i njihovi fragmenti koji vežu antigen iz predmetnog pronalaska aktiviraju signalne puteve LEPR u ćelijski zasnovanom reporterskom testu, npr., korišćenjem formata testa koji je zasnovan na ćelijama kao što je ovde definisano u Primeru 7, ili u suštini sličnom testu. Ćelijski zasnovani reporterski testovi kojima se detektuje aktivacija LEPR, kao što je test koji je ovde predstavljen u Primeru 7, mogu proizvesti detektabilni signal koji može biti eksprimiran u terminima vrednosti EC50(tj., koncentracija antitela koja je neophodna da bi se proizvela polovina maksimalne vrednosti signalizacije) i/ili procenat maksimalne signalizacije koja je uočena u prisustvu leptina. U predmetnom pronalasku, anti-LEPR antitela aktiviraju signalne puteve LEPR sa EC50vrednosti manjom od 12.0 nM u ćelijski zasnovanom reporterskom testu, npr.,korišćenjem formata testa kao što je definisan ovde u Primeru 7, ili u suštini sličnim testom. U određenim primerima izvođenja iz predmetnog pronalaska, anti-LEPR antitela takođe aktiviraju signalne puteve LEPR sa maksimalnom vrednosti procenta aktivacije u odnosu na signalizaciju leptina koji je veći od oko 65% u ćelijski zasnovanom reporterskom testu, npr., korišćenjem formata testa kao što je definisano ovde u Primeru 7, ili u suštini sličnim testom.

1

[0061] Predmetni pronalazak takođe uključuje antitela i njihove fragmente koji vežu antigen koji se vežu za monomerni humani LEPR sa visokim afinitetom. Na primer, predmetni pronalazak uključuje anti-LEPR antitela koja vezuju monomerni humani LEPR (npr., hLEPR.mmh, SEQ ID NO:114) sa KDmanjom od oko 150 nM kao što je mereno sa površinskom plazmonskom rezonancom na 25°C ili 37°C, npr., korišćenjem formata testa kao što je ovde definisano u Primeru 3, ili u suštini sličnog testa. Prema određenim izvođenjima, obezbeđena su anti-LEPR antitela koja se vežu za monomerni humani LEPR na 25°C sa Kdmanjom od oko 150 nM, manjom od oko 140 nM, manjom od oko 130 nM, manjom od oko 120 nM, manjom od oko 110 nM, manjom od oko 100 nM, manjom od oko 90 nM, manjom od oko 80 nM, manjom od oko 70 nM, manjom od oko 60 nM, manjom od oko 50 nM, manjom od oko 40 nM, manjom od oko 30 nM, manjom od oko 20 nM, manjom od oko 10 nM, manjom od oko 9 nM, manjom od oko 8 nM, manjom od oko 7 nM, manjom od oko 6 nM, manjom od oko 5 nM, manjom od oko 4 nM, manjom od oko 3 nM, manjom od oko 2 nM, manjom od oko 1 nM, manjom od oko 900 pM, manjom od oko 800 pM, manjom od oko 700 pM, manjom od oko 600 pM, manjom od oko 500 pM, manjom od oko 400 pM, ili manjom od oko 300 pM, kao što je mereno sa površinskom plazmonskom rezonancom, npr., korišćenjem formata testa kao što je ovde definisano u Primeru 3, ili u suštini sličnog testa.

[0062] Predmetni pronalazak takođe uključuje antitela i njihove fragmente koji vežu antigen koji se vežu za monomerni humani LEPR (npr., hLEPR.mmh, SEQ ID NO:114) sa disocijativnim polu-životom (t<1>/2) većim od oko 50 minuta kao što je mereno površinskom plazmonskom rezonancom na 25°C ili 37°C, npr., korišćenjem formata testa kao što je ovde definisan u Primeru 3, ili u suštini sličnim testom. Prema određenim izvođenjima, obezbeđena su anti-LEPR antitela koja vezuju monomerni humani LEPR na 25°C sa (t<1>/2) većim od oko 50 minuta, većim od oko 55 minuta, većim od oko 60 minuta, većim od oko 65 minut, ili duže, kao što je mereno površinskom plazmonskom rezonancom, npr., korišćenjem formata testa kao što je ovde definisano u Primeru 3, ili u suštini sličnog testa.

[0063] Predmetni pronalazak takođe uključuje antitela i njihove fragmente koji vežu antigen koji se vežu za dimerni humani LEPR (npr., hLEPR.mFc, SEQ ID NO:115) sa visokim afinitetom. Na primer, predmetni pronalazak uključuje anti-LEPR antitela koja vežu dimerni humani LEPR sa KDmanjom od oko 1.5 nM kao što je mereno površinskom plazmonskom rezonancom na 25°C ili 37°C, npr., korišćenjem formata testa kao što je ovde definisan u Primeru 3, ili u suštini sličnim testom. Prema određenim izvođenjima, obezbeđena su anti-LEPR antitela koja vezuju dimerni humani LEPR na 25°C sa KDmanjom od oko 150 nM, manjom od oko 130 nM, manjom od oko 110 nM, manjom od oko 80 nM, manjom od oko 70 nM, manjom od oko 60 nM, manjom od oko 50 nM, manjom od oko 40 nM, manjom od oko 30 nM, manjom od oko 20 nM, ili manjom od oko 10 nM, kao što je mereno površinskom plazmonskom rezonancom, npr., korišćenjem formata testa kao što je ovde definisano u Primeru 3, ili u suštini sličnog testa.

[0064] Predmetni pronalazak takođe uključuje antitela i njihove fragmente koji vežu antigen koji se vežu za dimerni humani LEPR (npr., hLEPR.mFc, SEQ ID NO:115) sa disocijativnim polu-životom (t<1>/2) većim od oko 10 minuta kao što je mereno sa površinskom plazmonskom rezonancom na 25°C ili 37°C, npr., korišćenjem formata testa kao što je ovde definisano u Primeru 3, ili u suštini sličnim testom. Prema određenim izvođenjima, obezbeđena su anti-LEPR antitela koja se vežu za dimerni humani LEPR na 25°C sa t<1>/2većim od oko 10, većim od oko 15 minuta, većim od oko 20 minuta, većim od oko 25 minuta, većim od oko 30 minuta, većim od oko 40 minuta, većim od oko 50 minuta, većim od oko 60 minuta, većim od oko 70 minuta, ili duže, kao što je mereno sa površinskom plazmonskom rezonancom, npr., korišćenjem formata testa kao što je ovde definisan u Primeru 3, ili u suštini sličnim testom.

[0065] Predmetni pronalazak takođe uključuje antitela i njihove fragmente koji vežu antigen koji vezuju LEPR u kompleksu sa humanim leptinom ("LEPR u kompleksu sa humanim leptinom" može se takođe predstaviti izrazom "leptin:LEPR"). Na primer predmetni pronalazak uključuje antitela i njihove fragmente koji se vežu za antigen koji su sposobni da se vežu za prethodno obrazovani kompleks koji se sastoji iz hLEPR i humanog leptina. Prema tome, u skladu sa određenim izvođenjima, interakcija između anti-LEPR antitela i LEPR nije inhibirana prisustvom leptina u kompleksu sa LEPR; slično tome, interakcija između leptina i LEPR, u skladu sa ovim aspektom iz pronalaska, nije inhibirana prisustvom anti-LEPR antitela. Primer test formata za određivanje da li antitelo ili njegov fragment koji veže antigen se veže za LEPR u kompleksu sa humanim leptinom ovde je izložen u Primeru 4.

[0066] Slično tome, predmetni pronalazak takođe uključuje antitela i njihove fragmente koji se vežu za antigen koji vezuju LEPR i ne blokiraju interakciju LEPR:leptin. Na primer predmetni pronalazak uključuje antitela i njihove fragmetne koji vežu antigen koji su sposobni da se vežu za LEPR, time proizvodeći kompleks antitelo: LEPR, pri čemu je nastali kompleks antitelo: LEPR sposoban ya interakciju sa leptinom da bi se proizveo kompleks koji se sastoji iz tri člana koji obuhvata antitelo, LEPR i leptin. Primer formata testa za određivanje da li antitelo ili njegov fragment koji veže antigen je sposoban da se veže za LEPR na način koji ne blokira ili ne interferira sa interakcijom između LEPR i leptinom ovde je izložen u Primeru 5.

[0067] Predmetno pronalazak takođe uključuje antitela i njihove fragmente koji vežu antigen koji se vezuju za LEPR eksprimiran na ćelijskoj površini u prisustvu i/ili odsustvu humanog leptina. LEPR koji je eksprimiran na površini ćelije označava LEPR ili njegov deo (npr., vanćelijski deo LEPR) koji je eksprimiran na površini ćelije, ili prirodno ili u modifikovanoj ćelijskoj liniji, tako da antitelo ili njegov fragment koji veže antigen je sposoban da se veže za molekul LEPR. U određenim izvođenjima, LEPR koji je eksprimiran na ćelijskoj površini uključuje rekombinantne komplekse koji obuhvataju vanćelijski domen LEPR koji je spojen sa ćelijom preko tag-a ili sidra (npr., GPI sidro kao što je ovde ilustrovano na Primeru 6). Prema ovom aspektu iz pronalaska, obezbeđena su antitela koja su sposobna da se vežu za LEPR koji je eksprimiran na ćelijskoj površini bez prisustva leptina, i takođe su sposobna da se vežu za LEPR koji je eksprimiran na ćelijskoj površini u prisustvu leptina (tj., pod uslovima u kojima je leptin sposoban da se veže za leptin eksprimiran na ćelijskoj površini). Prema tome, u skladu sa određenim izvođenjima, interakcija između anti-LEPR antitela i LEPR koji je eksprimiran na ćelijskoj površini nije inhibirana prisustvom leptina u kompleksu sa LEPR koji je eksprimiran na ćelijskoj površini. Antitela u skladu sa ovim aspektom iz pronalaska su sposobna da obrazuju kompleks od tri člana na površini ćelije koji se sastoji iz antitela, LEPR eksprimiranog na ćelijskoj površini i leptina. Primer formata testa za određivanje da li antitelo ili njegov fragment koji veže antigen je sposoban da se veže za LEPR koji je eksprimiran na ćelijskoj površini u prisustvu ili odsustvu humanog leptina ovde je izložen u Primeru 6.

[0068] Antitela iz predmetnog pronalaska mogu sadržati jedan ili više od prethodno pomenutih bioloških karakteristika, ili bilo koju njihovu kombinaciju. Nije predviđeno da prethodno navedena lista bioloških karakteristika antitela iz pronalaska bude iscrpna. Druge biološke karakteristike antitela iz predmetnog pronalaska će biti očigledne osobi koja je uobičajeno verzirana u stanje tehnike iz pregleda predmetnog otkrića uključujući ovde navedene radne primere.

Mapiranje epitopa i povezane tehnologije

[0069] Predmetni prikaz takođe uključuje anti-LEPR antitela koja sadrže varijante bilo koje od HCVR, LCVR, i/ili CDR aminokiselinskih sekvenci koje su ovde prikazane koje imaju jednu ili više konzervativnih supstitucija. Na primer, predmetni prikaz uključuje anti-LEPR antitela koja imaju HCVR, LCVR, i/ili CDR aminokiselinske sekvence sa, npr., 10 ili manje, 8 ili manje, 6 ili manje, 4 ili manje, itd. konzervativnih aminokiselinskih supstitucija u odnosu na bilo koju od HCVR, LCVR, i/ili CDR aminokiselinskih sekvenci

1

koje su ovde predstavljene u Tabeli 1. U određenim aspektima, predmetni prikaz obezbeđuje anti-LEPR antitela koja sadrže varijante HCVR, LCVR i/ili CDR aminokiselinskih sekvenci u odnosu na sekvence koje su ovde predstavljene u Tabeli 1 (npr., koje sadrže konzervativne aminokiselinske supstitucije), gde takve varijante antitela pored toga ispoljavaju jednu ili više funkcija i/ili svojstava primera anti-LEPR antitela koja su ovde prikazana.

[0070] Vanćelijski domen humanog LEPR sadrži N-terminalni homologni domen citokinskog receptora (CRH-1), domen sličan imunoglobulinu (Ig), i drugi CRH domen (CRH-2) koji je označen kao domen za vezivanje leptina (LBD). (Carpenter et al. (2012) Structure 20:487-97). Osim toga, LEPR deli najveću homologiju i sličnu veličinu vanćelijskog domena i organizaciju sa faktorom koji stimuliše kolonije granulocita (GCSF) i glikoproteinom 130 (gp13). (Haniu et al. (1998) J Biol Chem 273(44): 28691-699).

[0071] Termin "epitop" se odnosi na antigensku determinantu koja interaguje sa specifičnim antigenvezujućim mestom u varijabilnom regionu molekula antitela koji je poznat kao paratop. Pojedinačni antigen može imati više od jednog epitopa. Prema tome, različita antitela mogu se vezati za različite oblasti na antigenu i mogu imati različite biološke efekte. Epitopi mogu biti ili konformacioni ili linearni. Konformacioni epitop je proizveden postornim bliskim postavljanjem aminokiselina iz različitih segmenata linearnog polipeptidnog lanca. Linearni epitop je onaj koji je dobijen susednim aminokiselinskim ostacima u polipeptidnom lancu. U određenim okolnostima, epitop može uključiti ostatke saharida, fosforil grupe, ili sulfonil grupe na antigenu.

[0072] Predmetni pronalazak uključuje anti-LEPR antitela koja interaguju sa jednim ili više epitopa koji se nalaze u aminokiselinama M1-D839 humanog LEPR (SEQ ID NO: 113). Kao što je predstavljeno u Primeru 11, 201 peptidi iz humanog LEPR imali su značajno smanjeno usvajanje deuteracije kada su se vezali za antitelo H4H16650P2. Peptidi odgovaraju aminokiselinama 162-169 (aminokiseline LYVLPEVL humanog LEPR, SEQ ID NO: 113) i 170-191 (aminokiseline EDSPLVPQKGSF humanog LEPR, SEQ ID NO: 113) imali su sporije stope deuteracije kada se vezuju za H4H16650P2, ukazujući na to da ovo antitelo veže bar dva humana LEPR epitopa koja imaju sekvence LYVLPEVL ili EDSPLVPQKGSF (aminokiseline 162-169 ili 170-191, redom prema SEQ ID NO: 113).

[0073] Epitop za koji se antitela iz predmetnog pronalaska vežu može se sastojati iz jedne neprekidne sekvence od 3 ili više (npr., 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili više) aminokiselina LEPR proteina. Alternativno, epitop se može sastojati iz mnoštva ne-neprekidnih aminokiselina (ili aminokiselinskih sekvenci) LEPR. U nekim izvođenjima, epitop se nalazi na ili blizu domena koji se veže za leptin LEPR. U drugim izvođenjima, epitop se nalazi na regionu koji je udaljen od domena koji veže leptin LEPR, npr., na položaju na površini LEPR u kome antitelo, kada se veže za takav epitop, ne interferira sa vezivanjem leptina za LEPR.

[0074] Različiti postupci koji su poznati stručnjacima iz oblasti tehnike mogu se koristiti za identifikovanje aminokiselina unutar epitopa koji je prepoznat od strane određenog antitela. Primeri postupaka uključuju, npr., alanin skenirajuću mutacionu analizu, peptidnu blot analizu, i analizu peptidnog cepanja. Dodatno, postupci kao što su isecanje epitopa, ekstrakcija epitopa i hemijska modifikacija antigena se mogu koristiti (Tomer, 2000, Protein Science 9:487-496). Drugi postupak koji se može koristiti za identifikovanje aminokiselina unutar polipeptida sa kojim interaguje antitelo je izmena vodonik/deuterijum koja se detektuje sa masenom spektrometrijom. U opštim terminima, postupak izmene vodonik/deuterijum uključuje obeležavanje proteina od interesa deuterijumom, nakon čega sledi vezivanje antitela za protein koji je obeležen deuterijumom. Sledeće, kompleks protein/antitelo je prenet u vodu da bi se omogućila izmena vodonik-deuterijum na svim ostacima izuzev ostataka koji su zaštićeni sa antitelom (koji ostaju obeleženi deuterijumom). Nakon disocijacije antitela, ciljani protein je izložen proteaznom cepanju i maseno spektrometrijskoj analizi, pri čemu se

1

otkrivaju ostaci koji su obeleženi sa deuterijumom koji odgovaraju specifičnim aminokiselinama sa kojima antitelo interaguje. Videti, npr., Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen i Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A. Analiza rendgenske kristalografije antitela u kompleksu sa njegovim antigenom može se takođe koristiti za identifikovanje aminokiselina unutar polipeptida sa kojim antitelo interaguje.

[0075] Predmetni prikaz dalje uključuje anti-LEPR antitela koja se vežu za isti epitop kao bilo koji od primera ovde opisanih specifičnih antitela (npr. antitela koja sadrže bilo koju od aminokiselinskih sekvenci kao što su ovde predstavljene u Tabeli 1). Slično tome, predmetni prikaz takođe uključuje anti-LEPR antitela koja su u kompeticiji za vezivanje sa LEPR sa bilo kojim od specifičnih ovde opisanih primera antitela (npr. antitela koja sadrže bilo koju od aminokiselinskih sekvenci kao što su predstavljene ovde u Tabeli 1).

[0076] Moguće je odrediti da li se antitelo veže za isti epitop kao, ili je u kompeticiji za vezivanje sa, refrentnim anti-LEPR antitelom korišćenjem rutinskih postupaka koji su poznati u oblasti tehnike i ovde predstavljeni primerom. Na primer, da bi se odredilo da li se antitelo koje se ispituje veže za isti epitop kao referentno anti-LEPR antitelo iz pronalaska, referentnom antitelu je ovde omogućeno da se veže za LEPR. Sledeće, procenjena je sposobnost isptitivanog antitela da se veže za LEPR molekul. Ukoliko je ispitivano antitelo sposobno da veže LEPR zatim zasićenje vezivanja sa referentnim anti-LEPR antitelom, može se zaključiti da se ispitivano antitelo veže za različiti epitop od referentnog anti-LEPR antitela. Sa druge strane, ukoliko ispitivano antitelo nije sposobno da se veže za LEPR molekul nakon zasićenja vezivanja sa referentnim anti-LEPR antitelom, onda se ispitivano antitelo može vezati za isti epitop kao epitop koji je vezan od strane referentnog anti-LEPR antitela iz pronalaska. Dodatno rutinsko izvođenje eksperimenata (npr., mutacija peptida i analiza vezivanja) mogu se zatim izvesti da bi se potvrdilo da li je uočeni nedostatak vezivanja ispitivanog antitela zapravo zbog vezivanja sa istim epitopom kao referentno antitelo ili da li sterno zaklanjanje (ili drugi fenomen) je odgovoran za nedostatak uočenog vezivanja. Eksperimenti ove vrste se mogu sprovesti korišćenjem ELISA, RIA, Biacore, protočne citometrije ili bilo kog drugog kvalitativog ili kvalitativnog testa za vezivanje antitela koji je dostupan u oblasti tehnike. U skladu sa određenim izvođenjima iz predmetnog prikaza, dva antitela se vežu za isti (ili preklapajući) epitop ukoliko, npr., 1-, 5-, 10-, 20- ili 100-puta jedno antitelo u višku inhibira vezivanje drugog za bar 50% ali poželjnije 75%, 90% ili čak 99% kao što je mereno u kompetitivnom testu vezivanja (videti, npr., Junghans et al., Cancer Res. 1990:50:1495-1502). Alternativno, dva antitela se smatraju obaveznim za vezivanje za isti epitop ukoliko suštinski sve aminokiselinske mutacije u antigenu koje smanjuju ili eliminišu vezivanje jednog antitela smanjuju ili eliminišu vezivanje drugog. Dva antitela se smatraju obavezim da imaju "epitope koji se preklapaju" ukoliko samo podset aminokiselinskih mutacija koje smanjuju ili eliminišu vezivanje jednog antitela smanjuje ili eliminiše vezivanje drugog.

[0077] Da bi se odredilo da li je antitelo u kompeticiji za vezivanje (ili unakrsnoj kompeticiji za vezivanje) sa referentnim anti-LEPR antitelom, gore opisana metodologija vezivanja sprovedena je u dve orijentacije: U prvoj orijentaciji, referentom antitelu je omogućeno da se veže za LEPR protein pod uslovima zasićenja nakon procene vezivanja ispitivanog antitela sa LEPR molekulom. U drugoj orijentaciji, ispitivanom antitelu je omogućeno da se veže za LEPR molekul pod uslovima zasićenja nakon čega sledi procena vezivanja referentnog antitela sa LEPR molekulom. Ukoliko je, u obe orijentacije, samo prvo (zasićeno) antitelo sposobno da se veže za LEPR molekul, onda se zaključuje da su antitelo koje se ispituje i referentno antitelo u kompeticiji za vezivanje sa LEPR. Kao što će razumeti osoba koja je uobičajeno verzirana u stanje tehnike, antitelo koje je u kompeticiji za vezivanje sa referentnim antitelom ne mora se nužno vezivati za isti epitop kao referentno antitelo, ali može sterno blokirati vezivanje referentnog antitela vezivanjem za preklapajući ili susedni epitop.

1

Dobijanje humanih antitela

[0078] Anti-LEPR antitela iz predmetnog pronalaska mogu biti puna humana antitela. Postupci za dobijanje monoklonalnih antitela, uključujući puna humana monoklonalna antitela su poznati u oblasti tehnike. Bilo koji takvi postupci se mogu koristiti u kontekstu predmetnog pronalaska da bi se dobila humana antitela koja se specifično vezuju za humani LEPR.

[0079] Korićenjem tehnologije VELOClMMUNE™, na primer, ili bilo kog sličnog poznatog postupka za dobijanje punih humanih monoklonalnih antitela, visoko afinitetna himerna antitela specifična za LEPR su inicijalno izolovana imaju humani varijabilni region i mišji konstantni region. Kao u eksperimentalnom odeljku u tekstu ispod, antitela su karakterisana i odabrana za željene karakteristike, uključujući afinitet, aktivnost blokiranja liganda, selektivnost, epitop, itd. Ukoliko je potrebno, mišji konstantni regioni su zamenjeni sa željenim humanim konstantnim regionom, na primer divljim tipom ili modifikovanim IgG1 ili IgG4, da bi se dobilo puno humano anti-LEPR antitelo. Dok odabrani konstantni region može da se razlikuje u skladu sa specifičnom upotrebom, karakteristike visoko afinitetnog vezivanja antigena i ciljana specifičnost se nalaze u varijabilnom regionu. U određenim slučajevima, puna humana anti-LEPR antitela su direktno izolovana iz antigen-pozitivnih B ćelija.

Bioekvivalenti

[0080] Anti-LEPR antitela i fragmenti antitela iz predmetnog prikaza sadrže proteine koji imaju aminokiselinske sekvence koje se razlikuju od onih koje pripadaju opisanim antitelima ali koja zadržavaju sposobnost da vežu humani LEPR. Takve varijante antitela i fragmenti antitela sadrže jednu ili više adicija, delecija, ili supstitucija aminokiselina kada se uporede sa matičnom sekvencom, ali ispoljavaju biološku aktivnost koja je u suštini jednaka sa onom kod opisanih antitela. Slično tome, anti-LEPR antitelo-kodirajuće sekvence DNK iz predmetnog prikaza sadrže sekvence koje sadrže jednu ili više adicija, delecija, ili supstitucija nukleotida kada se uporede sa prikazanom sekvencom, ali koji kodiraju anti-LEPR antitelo ili fragment antitela koji je u suštini bioekvivalent sa anti-LEPR antitelom ili fragmentom antitela iz pronalaska. Primeri takvih varijanti aminokiselina i DNK sekvenci su razmotreni gore u tekstu.

[0081] Dva proteina koji vežu antigen, ili antitela, smatraju se bioekvivalentima ukoliko su, na primer, farmaceutski ekvivalenti ili farmaceutske alternative čija brzina i stepen apsorpcije ne pokazuje značajnu razliku kada se daju u istoj molarnoj dozi pod sličnim eksperimentalnim uslovima, ili kao pojedinačna doza ili u višestrukim dozama. Neka antitela će biti smatrana ekvivalentima ili farmaceutskim alternativama ukoliko su ekvivalenti u stepenu njihove apsorpcije ali ne u njihovoj brzini apsorpcije i još se mogu smatrati bioekvivalentom zbog toga što takve razlike u brzini apsorpcije su namerne i odražavaju se u obeležavanju, nisu od sušinskog značaja za postizanje efikasnih koncentracija leka u telu, npr., hroničnom upotrebom, i smatraju se medicinski beznačajnim za određeni proučavani proizvod leka.

[0082] U jednom aspektu, dva proteina koja vežu antigen su bioekvivalenti ukoliko ne postoje klinički značajne razlike u njihovoj bezbednosti, čistoći, i potenciji.

[0083] U jednom aspektu, dva proteina koja vežu antigen su bioekvivalenti ukoliko se pacijent može prebaciti jednom ili više puta između referentnog proizvoda i biološkog proizvoda bez očekivanog povećanja u riziku od neželjenih efekata, uključujući klinički značajnu promenu u imunogenosti, ili smanjenu efikasnost, u poređenju sa kontinuiranom terapijom bez takve promene.

1

[0084] U jednom aspektu, dva proteina koja vežu antigen su bioekvivalenti ukoliko oboje deluju preko zajedničkog mehanizma ili mehanizama delovanja za stanje ili stanja upotrebe, u obimu u kome su takvi mehanizmi poznati.

[0085] Bioekvivalencija se može dokazati in vivo i in vitro postupcima. Merenja bioekvivalencije uključuju, npr., (a) in vivo ispitivanje kod humanih bića ili drugih sisara, u kojoj koncentracija antitela ili njegovih metabolita je merena u krvi, plazmi, serumu, ili drugoj biološkoj tečnosti kao funkcija vremena; (b) in vitro ispitivanje je bilo u korelaciji sa i razumno je predvidivo kod humanog bića in vivo u podacima o biodostupnosti; (c) in ispitivanje kod humanih bića ili drugih sisara u kome odgovarajući akutni farmakološki efekat antitela (ili njegove mete) meren je kao funkcija vremena; i (d) u dobro kontrolisanom kliničkom ispitivanju koje uspostavlja bezbednost, efikasnost, ili biodostupnost ili bioekvivalenciju antitela.

[0086] Bioekvivalentne varijante anti-LEPR antitela iz pronalaska mogu se kontruisati sa, na primer, dobijanjem različitih supstitucija ostataka ili sekvenci ili delecijom terminalnih ili unutrašnjih osataka ili sekvenci koji nisu potrebni za biološku aktivnost. Na primer, cisteinski ostaci koji nisu potrebni za biološku aktivnost mogu se ukloniti ili zameniti sa drugim aminokiselinama da bi se sprečilo obrazovanje nepotrebnih ili nepravilnih intramolekulskih disulfidnih mostova nakon renaturacije. U drugim kontekstima, bioekvivalentna antitela mogu uključiti varijante anti-LEPR antitela koja sadrže aminokiselinske promene koje modifikuju karakteristike glikozilacije antitela, npr., mutacije koje eliminišu ili uklanjaju glikozilaciju.

Selektivnost vrsta i unakrsna reaktivnost vrsta

[0087] Predmetni pronalazak, prema određenim izvođenjima, obezbeđuje anti-LEPR antitela koja se vežu za humani LEPR ali ne za LEPR iz drugih. Predmetni pronalazak takođe uključuje anti-LEPR antitela koja se vežu za humani LEPR i za LEPR iz jedne ili više ne-humanih vrsta. Na primer, anti-LEPR antitela iz pronalaska mogu da se vežu za humani LEPR i mogu da se vežu ili ne moraju da se vežu za, kao što slučaj može biti, za jedan ili više od miša, pacova, zamorca, hrčka, gerbila, svinje, mačke, psa, zeca, koze, ovce, krave, konja, kamile, cinomologusa, marmozeta, rezus ili LEPR od šimpanze. Prema određenim primerima izvođenja iz predmetnog pronalaska, anti-LEPR antitela su obezbeđena koja se specifično vežu za humani LEPR i cinomolgus majmuna (npr., Macaca fascicularis) LEPR. Druga anti-LEPR antitela iz pronalaska vežu humani LEPR ali ne vežu, ili se vežu samo slabo, za LEPR cinomolgus majmuna.

Multispecifična antitela

[0088] Antitela iz predmetnog pronalaska mogu biti monospecifična ili multispecifična (npr., bispecifična). Multispecifična antitela mogu biti specifična za različite epitope jednog ciljnog polipeptida ili mogu sadržati domene koji vežu antigen koji su specifični za jedan ili više od jednog ciljnog polipeptida. Videti, npr., Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244. Anti-LEPR antitela iz predmetnog pronalaska mogu biti povezana za ili istovremeno eksprimirana sa drugim funkcionalnim molekulom, npr., drugim peptidom ili proteinom. Na primer, antitelo ili njegov fragment mogu biti funkcionalno povezani (npr., hemijskim spajanjem, genskom fuzijom, nekovalentnim povezivanjem ili drugim načinom) sa jednim ili više drugih molekularnih entiteta, kao što je drugo antitelo ili fragment antitela da bi se proizvelo bi-specifično ili multispecifično antitelo sa drugom specifičnosti vezivanja.

[0089] Predmetni prikaz uključuje bispecifična antitela pri čemu jedan krak imunoglobulina veže humani LEPR, i drugi krak imunoglobulina je specifičan za drugi antigen. LEPR-vezujući krak može

1

sadržati bilo koju od HCVR/LCVR ili CDR aminokiselinskih sekvenci kao što su ovde predstavljene u Tabeli 1.

[0090] Primer formata bispecifičnog antitela koje može da se koristi u kontekstu predmetnog pronalaska uključuje upotrebu prvog imunoglobulinskog (Ig) CH3 domena i drugog Ig CH3 domena, pri čemu prvi i drugi Ig CH3 domeni se razlikuju jedan od drugog za bar jednu aminokiselinu, i gde razlika od bar jedne aminokiseline smanjuje vezivanje bispecifičnog antitela za Protein A u poređenju sa bispecifičnim antitelom koje se ne razlikuje u aminokiselini. U jednom izvođenju, prvi Ig CH3 domen veže Protein A i drugi Ig CH3 domen sadrži mutaciju koja smanjuje ukida vezivanje za Protein A kao što je H95R modifikacija (sa IMGT numerisanjem egzona; H435R sa EU numerisanjem). Drugi CH3 može dalje sadržati Y96F modifikaciju (sa IMGT; Y436F sa EU). Ostale modifikacije se mogu dalje pronaći u drugom CH3 uključuju: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, i V82I (sa IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, i V422I sa EU) u slučaju IgG1 antitela; N44S, K52N, i V82I (IMGT; N384S, K392N, i V422I sa EU) u slučaju IgG2 antitela; i Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, i V82I (sa IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, i V422I sa EU) u slučaju IgG4 antitela. Razmotrene su varijacije u formatu bispecifičnog antitela koje su opisane gore u tekstu.

[0091] Drugi primeri bispecifičnih formata koji se mogu koristiti u kontekstu predmetnog pronalaska uključuju, bez ograničenja, npr., scFv-zasnovano ili diatelo bispecifične formate, IgG-scFv fuzije, dualne variabilnog domena (DVD)-Ig, Quadroma, „knobs-into-holes“, zajednički laki lanac (npr., zajednički laki lanac sa „knobs-into-holes“, itd.), CrossMab, CrossFab, (SEED)body, leucinski zatvarač, Duobody, IgG1/IgG2, Fab sa dualnim dejstvom (DAF)-IgG, i Mab<2>bispecifični formati (videti, npr., Klein et al.2012, mAbs 4:6, 1-11, i ovde navedene reference, za pregled prethodno navedenih formata). Bispecifična antitela takođe mogu biti konstruisana korišćenjem konjugacije peptida/nukleinske kiseline, npr., pro čemu su korišćene ne-prirodne aminokiseline sa ortogonalnom hemijskom reaktivnosti da bi se generisali konjugati antitela-oligonukleotida koji su specifični za mesto koji se zatim samostalno uklapaju u multimerne komplekse sa definisanim sastavom, valencom i geometrijom. (Videti, npr., Kazane et al., J. Am. Chem. Soc. [Epub: Dec.4, 2012]).

Terapeutska formulacija i davanje

[0092] Pronalazak obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže anti-LEPR antitela ili njihove fragmente koji vežu antigen iz predmetnog pronalaska. Farmaceutske kompozicije iz pronalaska su formulisane sa pogodnim nosačima, ekscipijensima, i drugim sredstvima koja obezbeđuju poboljšani transfer, isporuku, podnošljivost, i slično. Brojne odgovarajuće formulacije se mogu naći u formularu koji je poznat svim farmaceutskim hemičarima: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Ove formulacije uključuju, na primer, praškove, paste, masti, želee, voskove, ulja, lipide, nosače koje sadrže lipide (katjonske ili anjonske) (kao što su LIPOFECTIN™, Life Technologies, Carlsbad, CA), DNK konjugate, anhidrovane apsorpcione paste, ulje u vodi i voda u ulju emulzije, emulzije carbowax (polietilen glikoli različitih molekulskih težina), polu-čvrste gelove, i polučvrste smeše koje sadrže carbowax. Videti takođe Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.

[0093] Doza antitela koje se daje pacijentu može se razlikovati u zavisnosti od starosti i veličine pacijenta, ciljne bolesti, stanja, načina davanja, i slično. Poželjna doza je obično izračunata u skladu sa telesnom težinom ili površine tela. U odraslom pacijentu, može bii prednost intravenozno primeniti antitelo iz predmetnog pronalaska normalno u pojedinačnoj dozi od oko 0.01 do oko 20 mg/kg telesne težine, poželjnije oko 0.02 do oko 7, oko 0.03 do oko 5, ili oko 0.05 do oko 3 mg/kg telesne težine. U zavisnosti od ozbiljnosti stanja, učestalost i trajanje tretmana može biti prilagođeno. Efikasne doze i rasporedi za davanje anti-LEPR antitela mogu se odrediti empirijski; na primer, napredovanje pacijenta

2

može se pratiti periodičnim procenama, i doza se prema tome može podesiti. Osim toga, interspecies scaling of dosages can be performed using well-known methods in the art (e.g., Mordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res.8:1351).

[0094] Poznati su različiti sistemi za isporuku i mogu se koristiti za davanje farmaceutske kompozicije iz pronalaska, npr., inkapsuliranje u lipozomoma, mikročestice, mikrokapsule, rekombinantne ćelije sposobne da eksprimuju mutirane viruse, endocitoza posredovana receptorom (videti, npr., Wu et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Postupci za uvođenje uključuju, ali nisu ograničeni na, intradermalno, intramuskularno, intraperitonealno, intravenozno, subkutano, intranazalno, epiduralno, i oralne načine davanja. Kompozicija se može primeniti bilo kojim pogodnim načinom davanja, na primer infuzijom ili bolus injekcijom, apsorbovanjem kroz epitelne ili mukokutanozne slojeve (npr., oralna mukoza, rektalna i intestinalna mukoza, itd.) i može se primeniti zajedno sa drugim biološki aktivnim sredstvima. Davanje može biti sistemsko ili lokalno.

[0095] Farmaceutska komozicija iz predmetnog pronalaska može se isporučiti subkutanozno ili intravenozno sa standarndnom iglom i špricem. Dodato, u odnosu na subkutanoznu isporuku, sprava za isporuku u obliku olovke već ima primene kod isporučivanja farmaceutske kompozicije iz predmetnog pronalaska. Takva sprava za isporuku u obliku olovke može se koristiti jednokratno ili višekratno. Uređaj za isporuku u obliku olovke za višestruku upotrebu generalno koristi zamenjivi kertridž koji sadrži farmaceutsku kompoziciju. Jednom kada je ukupan sadržaj farmaceutske kompozicije unutar kertridža bio primenjen i ketridž je prazan, prazan ketridž se odmah može odbaciti i zameniti sa novim kertridžom koji sadrži farmaceutsku kompoziciju. Uređaj za isporuku u obliku olovke može se ponovo koristiti. U uređaju za isporuku u obliku olovke za jednokratnu upotrebu, ne postoji kertridž koji se može zameniti. Radije, uređaj za isporuku u obliku olovke za jednokratnu upotrebu se dobija kao prethodno napunjen sa farmaceutskom kompozicijom koja se drži u rezervoaru u samoj spravi. Jednom kada se rezervoar isprazni od farmaceutske kompozicije, čitava sprava se odbacuje.

[0096] Brojni uređaji za isporuku u obliku olovke (eng. pen) i autoinjektora imaju primene u subkutanoznoj isporuci farmaceutske kompozicije iz predmetnog pronalaska. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), DlSETRONlC™ pen (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Switzerland), HUMALOG MIX 75/25™ pen, HUMALOG™ pen, HUMALIN 70/30™ pen (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN™ I, II i III (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), BD™ pen (Bec-ton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™, i OPTICLIK™ (Sanofi-Aventis, Frankfurt, Germany), navedeni samo neki za primer. Primeri uređaja u obliku olovke za isporuku koji imaju primene u subkutanoznoj isporuci farmaceutske kompozicije iz predmetnog pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na SOLOSTAR™ pen (Sanofi-Aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk), i KWIKPEN™ (Eli Lilly), SURECLICK™ Autoinjector (Amgen, Thousand Oaks, CA), PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Germany), EPIPEN (Dey, L.P.), i HUMIRA™ Pen (Abbott Labs, Abbott Park IL), navedeni samo neki.

[0097] U određenim situacijama, farmaceutska kompozicija se može isporučiti u sistemu kontrolisanog oslobađanja. U jednom izvođenju, može se koristiti pumpa (videti Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). U drugom izvođenju, mogu se koristiti polimerni materijali; videti, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida. U još drugom izvođenju, sistem za kontrolisano oslobađanje može se postaviti u blizinu mete kompozicije, stoga je potreban samo deo sistemske doze (videti, npr., Goodson, 1984, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol.2, pp.115-138). Drugi sistemi kontrolisanog oslobađanja se razmatraju u pregledu od strane Langer, 1990, Science 249: 1527-1533.

[0098] Injektabilni preparati mogu uključiti dozne oblike za intravenozne, subkutanozne, intrakutanozne i intramuskularne injekcije, infuzije ukapavanjem, itd. Ovi injektabilni preparati se mogu dobiti pomoću postupaka koji su javno poznati. Na primer, injektabilni preparati se mogu dobiti, npr., rastvaranjem, suspenzijom ili emulgovanjem antitela ili njegovih soli koje su gore opisane u sterilnom vodenom medijumu ili uljanom medijumu koje je uobičajeno korišćeno za injekcije. Kao vodeni medijum za injekcije, nalaze se, na primer, fiziološki rastvor soli, izotonični rastvor koji sadrži glukozu i druga pomoćna sredstva, itd., koja se mogu koristiti u kombinaciji sa sredstvom za rastvaranje kao što je alkohol (npr., etanol), polialkohol (npr., propilen glikol, polietilen glikol), nejonsko površinski aktivno sredstvo [npr., polisorbat 80, HCO-50 (polioksietilen (50 mol) adukt hidrogenizovanog ricinusovog ulja)], itd. Kao uljani medijum, koriste se, npr., susamovo ulje, ulje sojinog zrna, itd., koje se može koristiti u kombinaciji sa sredstvom za rastvaranje kao što je benzil benzoat, benzil alkohol, itd. Injekcija koja je na taj način dobijena je poželjno napunjena u odgovarajućoj ampuli.

[0099] Kao prednost, gore opisane farmaceutske kompozicije za oralnu ili parenteralnu upotrebu pripremljeni su u doznim oblicima u jediničnoj dozi koja je odgovara dozi aktivnog sastojaka. Takvi dozni oblici u jediničnom doznom obliku uključuje, na primer, tablete, pilule, kapsule, injekcije (ampule), supozitorije, itd. Količina prethodno pomenutog antitela koja se nalazi je generalno oko 5 do oko 500 mg po doznom obliku u jediničnom doznom obliku; posebno u obliku injekcije, poželjno je da se prethodno pomenuto antitelo nalazi u oko 5 do oko 100 mg i u oko 10 do oko 250 mg za druge dozne oblike.

Terapeutske upotrebe antitela

[0100] Predmetni prikaz uključuje koji obuhvataju davanje subjektu kome je potrebno terapeutske kompozicije koja sadrži anti-LEPR antitelo (npr., anti-LEPR antitelo koje sadrži bilo koju od HCVR/LCVR ili CDR sekvenci kao što su ovde predstavljene u Tabeli 1). Terapeutska kompozicija može sadržati bilo koje od ovde pomenutih anti-LEPR antitela, ili njihove fragmente koj se vezuju za antigen, i farmaceutski prihvatljiv nosač ili rastvarač.

[0101] Antitela iz pronalaska su korisna, između ostalog, za lečenje, prevenciju i/ili amelioration bilo kojeg od bolesti ili poremećaja koje je povezano sa ili je posredovano sa deficijencijom leptina, rezistencijom na leptin, hipoleptinemijom, ili se na drugi način može lečiti stimulisanjem ili aktivacijom LEPR signalizacije ili imitiranja prirodne aktivnosti leptina in vitro ili in vivo. Na primer, antitela i njihovi fragmenti koji vežu antigen iz predmetnog pronalaska su korisni za lečenje stanja lipodistrofije. Primeri stanja lipodistrofije koja se mogu lečiti sa antitelima i fragmentima koji vežu antigen iz predmetnog pronalaska uključuju, npr., kongenitalnu generalizovanu lipodistrodistrofiju, stečenu generalizovanu lipodistrofiju, familijalnu parcijalnu lipodistrofiju, stečenu parcijalnu lipodistrofiju, centrifugalnu abdominalnu lipodistrofiju, lipoatrophia annularis (gubitka masti u subkutanoznom delu gornjih ekstremiteta), lokalizovane lipodistrofije, i HIV-povezane lipodistrofije.

[0102] Predmetni pronalazak takođe uključuje anti-LEPR antitela i njihove fragmente koji vežu antigen iz pronalaska koji su korisni za uspostavljanje signalizacije leptina prema ćelijama, tkivima i organima koji eksprimiraju jednu ili više LEPR mutacija koje su povezane sa gojazošću. Na primer, određeni LEPR mutanti su identifikovani koji je ispoljavaju, ili imaju smanjenu signalizaciju u prisustvu leptina i povezani su sa gojaznošću i vezanim poremećajima. Kao što se ovde koristi, LEPR mutant koji ne ispoljava signalizaciju u prisustvu leptina je označen sa " LEPR mutant sa defektom u signalizaciji." Primer LEPR mutacije sa defektom u signalizaciji je LEPR-A409E (Farooqi et al., 2007, N Engl J Med 356(3): 237-247). Kao što se ovde koristi, LEPR mutant koji ispoljava smanjenu signalizaciju u prisustvu leptina (u poređenju sa divljim tipom LEPR) ovde je naznačen sa "LEPR mutant sa oštećenom signalizacijom." Primer LEPR mutacije sa oštećenom signalizacijom je LEPR-P316T (Mazen et al., 2011, Mol Genet Metab 102:461-464). Prema tome, predmetni pronalazak uključuje anti-LEPR antitela i njihove fragmente koji vežu antigen iz pronalaska koji su korisni za lečenje, prevenciju i/ili ublažavanje stanja ili poremećaja koji su uzrokovani sa ili su povezani sa jednim ili više LEPR mutanata sa defektom u signalizaciji (npr., A409E) i/ili narušenom signalizacijom (npr., P316T).

[0103] Anti-LEPR antitela i njihovi fragmenti koji vežu antigen iz predmetnog pronalaska su takođe korisni za lečenje ili prevenciju jedne ili više bolesti ili poremećaja koji su izabrani iz grupe koja se sastoji iz gojaznosti, metaboličkog sindroma, želje za hranom koja je indukovana dijetom, funkcionalne hipotalamičke amenoreje, tip 1 dijabetesa, tip 2 dijabetesa, insulinske rezistencije, teške insulinske rezistencije uključujući tešku insulinsku rezistenciju zbog mutacije u receptoru za insulin, teške insulinske rezistencije koja nije izazvana sa mutacijom u insulinskom receptoru, teška insulinska rezistencija koja je izazvana mutacijom u nishodnim signalnim putevima ili je indukovana drugim uzročnicima, ne-alkoholnom i alkoholnim bolestima masne jetre, Alchajmerove bolesti, deficijencije za leptin, rezistencije na leptin, lipodistrofija, Leprehaunism/Donohueovog sindroma, Rabson-Mendenhalovog sindroma.

[0104] U kontekstu postupaka za lečenje koji su ovde opisani, anti-LEPR antitelo se može davati kao monoterapija (tj., jedino terapeutsko sredstvo) ili u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapeutskih sredstava (Primeri koji su ovde na drugom mestu opisani).

Kombinovane terapije i formulacije

[0105] Predmetni pronalazak uključuje kompozicije i terapeutske formulacije koje sadrže bilo koje od anti-LEPR antitela iz pronalaska u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapeutski aktivnih sredstava.

[0106] Anti-LEPR antitela iz predmetnog pronalaska mogu biti ko-formulisana sa i/ili primenjena u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapeutskih aktivnih komponent(a)i, kao što su. npr., farmaceutski proizvodi koji su prepisani za gojaznost, hiperholesterolemiju, hiperlipidemiju, tip 2 dijabetes, tip 1 dijabetes, kontrolu apetita, infertilnost, itd. Primeri takvih dodatnih terapeutski aktivnih komponenata uključuju, npr., rekombinantni humani leptin (npr., metreleptin [MYALEPT]), PCSK9 inhibitori (npr., anti-PCSK9 antitela [alirokumab, evolokumab, bococizumab, lodelcizumab, ralpancizumab, itd.]), statini (atorvastatin, rosuvastatin, cerivastatin, pitavastatin, fluvastatin, simvastatin, lovastatin, pravastatin, itd.), ezetimib, insulin, varijante insulina, insulinske sekretagoge, metformin, sulfoniluree, inhibitora natrijum glukoznog kotransportera 2 (SGLT2) (npr., dapaglifozin, kanaglifozin, empagliflozin, etc.), agonisti/analozi GLP-1 (npr., ekstendin-4, eksenatid, liraglutid, liksisenatid, albiglutid, dulaglutid, itd.), inhibitori glukagona (GCG) (npr., anti-GCG antitela), inhibitori receptora za glukagon (GCGR) (npr., anti-GCGR antitela, antagonisti malih molekula GCGR, GCGR-specifični antisens oligonukleotidi, anti-GCGR aptameri [npr., Spiegelmers], itd.), inhibitori proteina sličnih angiopoetinu (ANGPTL) (npr., anti-ANGPTL3 antitela, anti-ANGPTL4 antitela, anti-ANGPTL8 antitela, itd.), Fentermin, Orlistat, Topiramat, Bupropion, Topiramat/Fentermin, Bupropion/Naltrekson, Bupropion/Zonisamid, Pramlintid/Metrelepin, Lorcaserin, Cetilistat, Tesofenzin, Velneperit, itd.

[0107] Dodatne terapeutski aktivne komponent(e)a, npr., bilo koje od gore navedenih sredstava ili njihovi derivati, mogu se davati neposredno pre, istovremeno sa, ili odmah nakon davanja anti-LEPR antitela iz predmetnog pronalaska; (za svrhe predmetnog prikaza, takvi režimi davanja se smatraju davanjem anti-LEPR antitela "u kombinaciji sa" dodatnom terapeutski aktivnom komponentom). Predmetni pronalazak uključuje farmaceutske kompozicije u kojima je anti-LEPR antitelo iz predmetnog pronalaska zajedno formulisano sa jednom ili više od dodatnih terapeutski aktivnih komponenti kao što su ovde na drugom mestu formulisani.

2

Režimi davanja

[0108] Prema određenim izvođenjima iz predmetnog pronalaska, višestruke doze anti-LEPR antitela (ili farmaceutske kompozicije koja sadrži kombinaciju anti-LEPR antitela i bilo kojeg od dodatnih terapeutskih aktivnih sredstava koja su ovde pomenuta) mogu se davati subjektu tokom definisanog vremenskog perioda. Postupci prema ovom aspektu iz pronalaska obuhvataju uzastopno davanje subjektu višestrukih doza anti-LEPR antitela iz pronalaska subjektu. Kao što se ovde koristit, "uzastopno davanje" označava da svaka doza anti-LEPR antitela je davana subjektu u različitom vremenskom trenutku, npr., u različitim danima koji su razdvojeni sa prethodno određenim intervalom (npr., sati, dani, nedelje ili meseci). Predmetni pronalazak uključuje postupke koji obuhvataju uzastopno davanje pacijentu jedne početne doze anti-LEPR antitela, nakon čega sledi jedna ili više od sekundarnih doza anti-LEPR antitela, i opciono sledi jedna ili više od tercijernih doza anti-LEPR antitela.

[0109] Termini "početna doza," ''sekundarne doze," i "tercijerne doze," odnose se na vremenski redosled davanja anti-LEPR antitela iz pronalaska. Prema tome, "početna doza" je doza koja je davana na početku režima tretmana (takođe nazvana kao "osnovna doza," ''doza opterećenja," ''polazna doza," i slično); "sekundarne doze" su doze koje su davane nakon početne doze; i "tercijerne doze" su doze koje su davane nakon sekundarnih doza. Početna, sekundarna, i tercijerne doze mogu svaka sadržati istu količinu anti-LEPR antitela, ali generalno se mogu razlikovati jedna od druge u terminima učestalosti davanja. U određenim izvođenjima, međutim, količina anti-LEPR antitela koje se nalazi u početnim, sekundarnim i/ili tercijernim dozama se razlikuje jedna od druge (npr., podešena je gore ili dole prema potrebi) tokom trajanja tretmana. U određenim izvođenjima, dva ili više (npr., 2, 3, 4, ili 5) doza su davane na početku režima tretmana kao "doze opterećenja" zatim se daju uzastopne doze koje su davane na manje čestoj osnovi tj. ređe (npr., "doze za održavanje").

Dijagnostičke i analitičke upotrebe antitela

[0110] Anti-LEPR antitela iz predmetnog pronalaska mogu se takođe koristiti za detekciju i/ili merenje LEPR, ili ćelija koje eksprimiraju LEPR u uzorku, npr., za dijagnostičke svrhe. Na primer, anti-LEPR antitelo, ili njegov fragment, mogu se koristiti za dijagnozu stanja ili bolesti koje je karakterisano sa aberantnom ekspresijom (npr., prekomernom ekspresijom, smanjenom ekspresijom, nedostatkom ekspresije, itd.) LEPR. Primeri dijagnostičkih testova za LEPR mogu koristiti, na primer., dovođenje u kontakt uzorka, dobijenog iz pacijenta, sa anti-LEPR antitelom iz pronalaska, pri čemu je anti-LEPR antitelo je obeleženo sa detektabilnim obeleživačem ili reporterskim molekulom. Alternativno, neobeleženo anti-LEPR antitelo može se koristiti u dijagnostičkim primenama u kombinaciji sa sekundarnim antitelom koje je samo po sebi detektabilni obeleživač. Detektabilni obeleživač ili reporterski molekul može biti radioizotop, kao što je<3>H,<14>C,<32>P,<35>S, ili<125>I; fluorescentni ili hemiluminiscentni ostatak kao što je fluorescein izotiocijanat, ili rodamin; ili enzim kao što je alkalna fosfataza, beta-galaktozidaza, peroksidaza rena, ili luciferaza. Specifični primeri testova koji se mogu koristiti da bi se detektovao ili izmerio LEPR u uzorku uključuju enzimski imunosorbentni test (ELISA), radioimunotest (RIA), fluorescencijom aktivirano ćelijsko sortiranje (FACS), i skeniranje pozitron emisionom tomografijom (PET).

[0111] Uzorci koji se mogu koristiti u LEPR dijagnostičkim testovima prema predmetnom pronalasku uključuju bilo koji uzorak tkiva ili tečnosti koji se može dobiti iz pacijenta koji sadrži detektabilne količine proteina LEPR, ili njegove fragmente, pod normalnim ili patološkim uslovima. Generalno, nivoi LEPR u posebnom uzorku dobijenom iz zdravog pacijenta (npr., pacijenta koji nije pogođen sa bolesti ili stanjem koje je povezano sa abnormalnim nivoima LEPR ili aktivnosti) će biti izmereni da bi se inicijalno uspostavila osnova, ili standard, nivoa LEPR. Ovaj osnovni nivo LEPR može se nakon toga uporediti protiv nivoa LEPR izmerenih u uzorcima koji su dobiveni iz individua za koje se sumnja da imaju bolest ili stanje koje je povezano sa LEPR.

PRIMERI

[0112] Primeri koji slede su predstavljeni tako da se obezbedi osobama koje su uobičajeno verzirane u stanje tehnike potpuni prikaz i opis kako napraviti i koristiti postupke i kompozicije iz pronalaska, i nisu namenjeni da ograniče obim onoga što pronalazači smatraju svojim pronalaskom. Uloženi su napori da se osigura tačnost u pogledu korišćenih brojeva (npr., količine, temperatura, itd.) ali neke eksperimentalne greške i odstupanja i odstupanja treba uzeti u obzir. Osim ukoliko nije drugačije naznačeno, delovi su u odnosu na težinu, molekularna težina je prosek molekularne težine, temperatura je u stepenima celzijusa, i pritisak je na ili blizu atmosferskog.

Primer 1. Dobijanje proteina koji vežu antigen koji se specifično vezuju receptor leptina (LEPR) [0113] Anti-LEPR antitela su dobijena imunizovanjem VELOCIMMUNE® miša (tj., genetski modifikovanog miša koji sadrži DNK koja kodira varijabilne regione humanog imunoglobulinskog teškog i kapa lakog lanca) sa imunogenom koji sadrži vanćelijski domen LEPR. Imuni odgovor antitela je praćen sa LEPR-specifičnim imunotestom. Korišćenjem prethodno opisanih tehnika, potpuno humana anti-LEPR antitela su izolovana i prečišćena.

[0114] Određena biološka svojstva primera anti-LEPR antitela koja su dobijena u skladu sa postupcima iz ovog primera opisana su detaljnije u primerima koji su predstavljeni u tekstu ispod.

Primer 2. Sekvence aminokiselina i nukleinskih kiselina varijabilnog regiona teškog i lakog lanca [0115] Tabela 1 prikazuje identifikatore aminokiselinskih sekvenci varijabilnih regiona i CDRs teškog i lakog lanca odabranih anti-LEPR antitela iz pronalaska. Odgovarajući indentifikatori sekvenci nukleinskih kiselina su predstavljeni u Tabeli 2.

Tabela 1: Identifikatori sekvence aminokiselina

(nastavak)

2

Tabela 2: Identifikatori sekvence nukleinske kiseline

[0116] Antitela su ovde obično naznačena prema sledećoj nomenklaturi: Fc prefiks (npr. "H4H," "HIM," "H2M," itd.), kog prati numerički identifikator (npr. "16650," "16679," itd.), zatim sledi "P" ili "N" sufiks. Prema tome, u skladu sa ovom nomenklaturom, antitelo ovde može biti naznačeno sa, npr., "H4H16650P2," "H4H16679P2," itd. Prefiksi Fc na oznakama antitela koje su ovde korišćene (H4H, HIM i H2M) označavaju posebni Fc region izotipa antitela. Na primer, "H4H" antitelo ima Fc humanog IgG4. pri čemu "HIM" antitelo ima Fc mišjeg IgG1, (svi varijabilni regioni su potpuno humani kao što je naznačeno sa prvim 'H' u oznaci antitela). Kao što će razumeti osoba koja je uobičajeno verzirana u stanje tehnike, antitelo koje ima Fc određenog izotipa može se konvertovati u antitelo sa različitim izotipom Fc (npr., antitelo sa mišjim IgG1 Fc može se konvertovati u antitelo sa humanim IgG4, itd.), ali u bilo kom slučaju, varijabilni domeni (uključujući CDRs) – koji su naznačeni sa numeričkim identifikatorima koji su prikazani u Tabelama 1 i 2 – će ostati isti, i očekuje se da će svojstva vezivanja biti identična ili suštinski slična bez obzira na prirodu Fc domena.

[0117] "Komparator mAt" kao što je korišćeno u ovde navedenim Primerima odnosi se na Fab9F8 koji je opisan u Fazeli et al. (2006) J Immunol Methods 312:190-200 i Carpenter et al. (2012) Structure 20(3):487-97.

Primer 3: Afiniteti vezivanja i kinetičke konstante humanih monoklonalnih anti-LEPR antitela izvedene iz površinske plazmonske rezonancije

[0118] Konstante ravnoteže disocijacije (KDvrednosti) za LEPR vezivanje sa prečišćenim anti-LEPR monoklonalnim antitelima određene su korišćenjem biosenzora površinske plazmonske rezonance u realnom vremenu upotrebom Biacore 4000 instrumenta. Sva ispitivanja vezivanja su sprovedena u 10mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA, i 0.05% v/v Surfaktant Tween-20, pH 7.4 (HBS-ET) radnim puferom na 25°C i 37°C. Površina Biacore senzora prvo je derivatizovana kuplovanjem amina sa monoklonalnim mišjim anti-humanim Fc antitelom (GE, # BR-1008-39) da bi se uhvatila anti-LEPR

2

monoklonalna antitela. Ispitivanja vezivanja su sprovedena na sledećim LEPR reagensima: humani LEPR vanćelijski domen eksprimiran sa C-terminalnim myc-myc-heksahistidinski tag (hLEPR.mmh; SEQ ID NO: 114), vanćelijski domen LEPR macaca fascicularis eksprimiran sa C- terminalnim myc-mycheksahistidinskim tagom (mfLEPR.mmh; SEQ ID NO: 117), vanćelijskim domenom humanog LEPR koji je eksprimiran sa C-terminalnim mišjim IgG2a Fc tagom (hLEPR.mFc; SEQ ID NO: 115), vanćelijski domen mišjeg LEPR eksprimiran sa C-terminalnim myc-myc-heksahistidinskim tagom (mLEPR.mmh; SEQ ID NO: 118) i vanćelijski domen pacovskog LEPR eksprimiran sa C-terminalnim myc-mycheksahistidinskim tagom (rLEPR.mmh; SEQ ID NO: 119). Različite koncentracije LEPR reagenasa su prvo pripremljene u HBS-ET radnom puferu (100nM - 3.7nM; 3-struko serijsko razblaženje) i injektovani su preko površine sa uhvaćenim anti-humanim Fc anti-LEPR monoklonalnim antitelom, u trajanju od 4 minuta na brzini protoka od 30^L/minuti, gde je disocijacija LEPR reagensa vezanog za monoklonalno antitelo praćena u trajanju od 10 minuta u HBS-ET radnom puferu. Konstante brzine kinetičke asocijacije (ka) i disocijacije (kd) određene su uklapanjem senzograma vezivanja u realnom vremenu u 1:1 modelu vezivanja sa ograničanjem transporta mase korišćenjem Scrubber 2.0c softvera za podešavanje krive. Konstante ravnoteže disocijacije vezivanja (KD) i disocijativni polu-životi (t<1>/2) su izračunati iz brzine kinetičkih konstanti kao:

[0119] Parametri kinetika vezivanja hLEPR.mmh, mfLEPR.MMH ilihLEPR.mFc, vezivanje sa različitim anti-LEPR monoklonalnim antitelima iz pronalaska na 25°C i 37°C prikazani su u Tabelama 3 do 8.

Tabela 3: Parametri kinetike vezivanja hLEPR-MMH vezivanja sa LEPR monoklonskim antitelima na

25°C.

2

(nastavak)

Tabela 4: Parametri kinetika vezivanja hLEPR-MMH sa LEPR monoklonalnim antitelima na 37°C.

2

Tabela 5: Parametri kinetika vezivanja mfLEPR.MMH vezivanje za LEPR monoklonalna antitela na

25°C.

2

Tabela 6: Parametri kinetika vezivanja mfLEPR.MMH vezivanje sa LEPR monoklonalnim antitelima na 37°C.

(nastavak)

Tabela 7: Parametri kinetika vezivanja hLEPR.mFc vezivanje sa LEPR monoklonalnim antitelima

25°C.

1

Tabela 8: Parametri kinetika vezivanja hLEPR.mFc vezivanje sa LEPR monoklonalnim antitelima na

37°C.

2

[0120] Na 25°C, anti-LEPR monoklonalna antitela vežu se za hLEPR-MMH sa KDvrednostima u opsegu od 7.93nM do 148nM, kao što je prikazano u Tabeli 5. Na 37°C, anti-LEPR monoklonalna antitela vežu se za hLEPR-MMH sa KDvrednostima u opsegu of 14.8nM fo 326nM, kao što je prikazano u Tabeli 4.

[0121] Deset od 12 anti-LEPR monoklonalnih antitela iz pronalaska vežu se za mfLEPR.MMH. Na 25°C, anti-LEPR monoklonalna antitela vežu se za mfLEPR.MMH sa KDvrednostima u opsegu od 2.27nM do 139nM, kao što je prikazano u Tabeli 7. Na 37°C, anti-LEPR monoklonalna antitela vežu se za mfLEPR.MMH sa KDvrednostima u opsegu od 5.18nM to 264nM, kao što je prikazano u Tabeli 8.

[0122] Na 25°C, anti-LEPR monoklonalna antitela vežu se za hLEPR-mFc sa KDvrednostima u opsegu od 613pM do 5.7nM, kao što je prikazano u Tabeli 7. Na 37°C, anti-LEPR monoklonalna antitela vežu se za hLEPR-mFc sa KDvrednostima u opsegu od 1.16nM do 12.8nM, kao što je prikazano u Tabeli 8.

[0123] Nijedno od anti-LEPR monoklonalnih antitela iz pronalaska nije se vezalo za mLEPR.MMH ili rLEPR.MMH na 25°C ili na 37°C (podaci nisu prikazani).

Primer 4. Anti-LEPR Antitela iz pronalaska vežu LEPR u prisustvu vezivanja Leptin:LEPR

[0124] Blokiranje anti-LEPR antitela od vezivanja za LEPR sa humanim leptinom je procenjeno korišćenjem biosenzora površinske plazmonske rezonancije u realnom vremenu na Biacore T200 instrumentu. Ukupno ispitivanje je sprovedeno na 10mM HEPES pH 7.4, 150mM NaCl, 3mM EDTA, i 0.05% v/v Surfaktant Tween-20 (HBS-ET radni pufer) na 25°C. Površina BiacoreCM5 senzora je prvo derivatizovana kuplovanjem amina sa humanim Leptinom (R&D Systems, # 398-LP) korišćenjem standardne EDC/NHS površinske hemije. Kompleks humanog LEPR i humanog Leptina, je obrazovan ubrizgavanjem 20nM vanćelijskog domena humanog LEPR eksprimiranog sa C-terminalnim myc-mycheksahistidinskim tag-om (hLEPR-MMH; SEQ ID NO: xx), preko Biacore senzorske površine sa imobilizovanim humanim leptinom u brzini protoka od 10 µL/minuti ili 25µL/minuti tokom 4 minuta, da bi se postigao afinitet vezivanja od približno 200RU. Da bi se procenilo da li je vezivanje antitela za hLEPR-MMH blokirano sa humanim Leptinom, 200nM anti-LEPR monoklonalnih antitela je ubrizgano tokom preko preformiranog hLEPR-MMH:humani Leptin kompleksa, na brzini protoka od 50µL/minuti ili 25µL/minuti tokom 4 - 5 minuta. Sva anti-LEPR antitela iz ovog pronalaska vežu se sa kompleksom hLEPR-MMH i humanim Leptinom ("Leptin:LEPR") sa skoro sličnom jačinom signala i uočenim vezivanjem, izraženo u RUs, su predstavljena u Tabeli 9. Ovaj rezultat ukazuje na to da humani Leptin ne blokira vezivanje hLEPR-MMH sa anti-LEPR antitelima koja se ispituju.

Tabela 9: Vezivanje anti-LEPR monoklonalnih antitela sa pre-kompleksom hLEPR-MMH i humanog

Leptina.

Primer 5. ELISA blokiranja receptora humanog Leptina

[0125] Za ELISA, humani Leptin (hLeptin; R&D Systems, # 398-LP-01M) je obložen u koncentraciji od 5 µg/mL u PBS-u na mikrotitarskoj ploči sa 96-bunarića preko noći na 4°C. Nespecifična mesta vezivanja su uzastopno blokirana sa 0.5% (mas/v) rastvorom BSA u PBS-u. Konstantna količina 10nM dela vanćelijskog domena LEPR proteina koja je eksprimirana sa C-terminalnim humanim Fc tag-om (hLEPR.hFc; SEQ ID NO: 116) je titrirana sa anti-LEPR antitelima, hLeptin proteinom, ili kontrolnim antitelom izotipa u opsegu u 8.5pM do 500nM u serijskom razblaženju. Ovi antitelo-proteinski ili protein-proteinski kompleksi su nakon toga inkubirani u trajanju od 1.5 h na sobnoj temeperaturi (ST). Nakon toga, kompleksi su preneti na mikrotitarske ploče koje su obložene sa hLeptinom i inkubirane su u trajanju od 2 sata na ST, bunarići su isprani, i hLEPR.hFc koji je vezan za ploču je detektovan sa anti-humanim IgG poliklonalnim antitelom konjugovanim sa peroksidazom rena (Jackson ImmunoResearch Inc, #109-035-098). Uzorci su razvijeni sa rastvorom TMB (BD Biosciences, #555214; supstrat A i B pomešani u odnosu 1:1 prema uputstvima proizvođača) da bi se proizvela kolorimetrijska reakcija i nakon toga su neutralizovani sa 1M sumpornom kiselinom pre merenja apsorbance na 450nm na Victor X5 čitaču ploča.

[0126] Analiza podataka je izvedena korišćenjem sigmoidnog modela doza-odgovor u Prism™ softveru (GraphPad). Procent blokade na maksimumu koncentracije ispitanog antitela je izračunat kao indikator sposobnosti antitela da blokiraju vezivanje 10nM hLEPR.hFc sa humanim Leptinom na ploči. U izračunu, signal vezivanja 10nM hLEPR.hFc bez prisustva antitela se pominje kao 100% vezivanje ili 0% blokiranje; i osnovni signal samog pufera bez pristustva hLEPR.hFc je naznačen sa 0% vezivanje ili 100% blokiranje Podaci blokiranja na 500nM koncentraciji antitela je sažeto u Tabeli 10.

[0127] Kao što je prikazano u Tabeli 10, nijedno od anti-LEPR antitela iz pronalaska nije pokazalo >28% blokiranje vezivanja hLEPR.hFc za površinu koja je obložena sa hLeptinom. Međutim, Komparator Antitelo i hLeptin, kao pozitivna kontrola, mogli su da blokiraju 99% hLEPR.hFc vezivanja za površinu koja je obložena sa hLeptinom. Kontrolno antitelo izotipa nije pokazalo merljivo blokiranje na koncentracijama do 500nM.

Tabela 10: ELISA blokiranje hLEPR.hFc vezivanja za hLeptin sa anti-LEPR antitelima

(nastavak)

4

Primer 6. Vezivanje ćelija pomoću FACS analize sa HEK293/Mycx2-hLepR(ecto)-GPI usidrenim ćelijama

[0128] Leptinski receptor, LEPR, je transmembranski receptor sa jednim prolazom klase I familije citokinskih receptora (Tartaglia et al. (1997) J Biol Chem 7:272(10):6093-6). LEPR se može vezati za Leptin, protein koji je predominanto eksprimiran od strane adipoznog tkiva koji je uključen u regulaciju unosa hrane i metabolizma (Friedman et al. (2014) J Endocrinol 223(1):T1-8).

[0129] Da bi se ispitalo vezivanje ćelija od strane anti-LEPR antitela generisane su stabilne linije HEK293 ćelija. Jedna ćelijska linija, ovde poznata kao HEK293/hLEPR-GPI, stabilno eksprimira vanćelijski domen humanog LEPR (aminokiseline 22-839 pristupnog # P48357 (SEQ ID NO:113), Izooblik B) sa N-terminalnim myc-myc tag-om i C-terminalnom peptidnom sekvencom iz humane karboksipeptidaze M koja usmerava dodavanje GPI (Glikozilfosfatidilinozitol) (Deddish et al. (1990) J. Biological Chemistry 265:25:15083-89) tako da protein može biti GPI-usidren u membrani. Druga linija HEK293 ćelija je generisana da bi se stabilno eksprimirao humani LEPR pune dužine (aminokiseline 1-1165 pristupnog # P48357(SEQ ID NO:113), Izooblik B) zajedno sa reporterom luciferaze (Stat3-luciferaza, Stat3-luc, SA Bioscience, #CLS-6028L), i ovde je poznato kao HEK293/Stat3-luc/hLEPR-FL. HEK293 ćelije samo sa reporterom Stat3-luciferaza (HEK293/Stat3-luc) takođe su generisane kao kontrolna ćelijska linija.

[0130] Za FACS analizu, HEK293 matične ćelije i HEK293/hLEPR-GPI ćelije su bile razdvojene i zasejane na ploče sa 96-bunarića sa v-dnom na 5 x 10<5>ćelija/bunariću u PBS-u koji sadrži 2% FBS (FACS pufer). Kako bi se ispitalo da li je sposobnost anti-hLEPR antitela da se vežu za ćelije pogođena prisustvom Leptina, FACS pufer sa ili bez 1 µM humanog Leptina (R&D Systems, # 398-LP) je inkubiran sa ćelijama u trajanju od 30 minuta na 4°C, zatim sledi dodavanje anti-LEPR antitela ili kontrolnih antitela na 10nM u FACS puferu. Ćelije su nakon toga inkubirane u trajanju od 30 minuta na 4°C, zatim su isprane i nakon toga inkubirane sa 16µg/mL Alexa Fluor®-647 konjugovanim sekundarnim antitelom (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., # 109-547-003) u trajanju od 30 minuta na 4°C. Ćelije su nakon toga fiksirane korišćenjem BD CytoFix™ (Becton Dickinson, # 554655), proceđene, i analizirane HyperCyt protočnom citometru (Beckman Coulter). Neobeležena i sekundarna antitela zasebno kao kontrole su takođe ispitivana za sve ćelijske linije. Rezultati su analizirani korišćenjem ForeCyt (IntelliCyt) i FlowJo verzija 10 softvera da bi se odredila geometrijska srednja vrednost fluorescencije za vijabilne ćelije. Geometrijska srednja vrednost fluorescencije za svaki uzorak je zatim normalizovana sa geometrijskom srednjom vrednosti neobojenih ćelija da bi se dobilo relativno vezivanje po uslovu označeno kao "odnosi vezivanja", i ovi odnosi vezivanja su zabeleženi za svako ispitano antitelo.

[0131] Kao što je prikazano u Tabeli 11, 9 anti-LEPR antitela is pronalaska koji su ispitani na 10nM pokazala su vezivanje sa HEK293/hLEPR-GPI ćelijama sa odnosima vezivanja u opsegu od 824 do 3374 puta bez Leptina. Anti-LEPR antitela takođe su vezivala u pristustvu 1µM Leptina sa odnosima vezivanja 398 i 4184 puta. Kao što je prikazano u Tabeli 11, he Komparator Antitelo koje je ispitano na 10nM pokazalo je vezivanje sa HEK293/hLEPR-GPI ćelijama sa odnosom vezivanja od 2349-puta bez Leptina ali je pokazalo značajno manje vezivanje sa ćelijama u prisustvu 1µM Leptina sa odnosom vezivanja 112. Anti-LEPR antitela nisu pokazala bilo koje značajno vezivanje sa HEK293 matičnim ćelijama sa odnosima vezivanja sa i bez 1µM Leptina u opsegu od 1 do 9 puta. Uzorci kontrolnih antitela izotipa i sekundarnih antitela zasebno takođe nisu pokazali značajno vezivanje za bilo koju ćelijsku liniju sa ili bez Leptina, sa odnosima vezivanja u opsegu od 1 do 6 puta.

[0132] Kao što je prikazano u Tabeli 12, četiri antitela i pronalaska su ispitana na 70nM bez Leptina, pokazala su vezivanje sa HEK293/hLEPR-GPI ćelijama sa odnosom vezivanja u rasponu od 707 do 1131 puta i za HEK293/Stat3-luc/hLEPR-FL ćelije sa odnosima vezivanja u opsegu od 42 do 51. Anti-LEPR antitela nisu pokazala bilo koje značajno vezivanje sa HEK293/Stat3-luc ćelijama sa odnosima vezivanja u opsegu od 1 do 8 puta. Uzorci kontrolnih antitela izotipa i sekundarnih antitela zasebno takođe nisu pokazali značajno vezivanje za bilo koju od ispitanih ćelijskih linija, sa odnosima vezivanja u opsegu od 1 do 2 puta.

Tabela 11: Vezivanje 10nM anti-LEPR antitela sa HEK293/hLEPR-GPI i HEK293 matičnim ćelijama /-1µM Humanim Leptinom

Tabela 12: Vezivanje 70nM anti-LEPR antitela sa HEK293/hLEPR-GPI, HEK293/Stat3-hLEPR-FL, i HEK293/Stat3-luc matičnim ćelijama

Primer 7. Anti-LEPR Antitela iz pronalaska aktiviraju LEPR signalizaciju u prisustvu ili odsustvu leptina

[0133] Razvijen je biotest da bi se detektovala transkripciona akivacija STAT3 preko aktivacije LEPR korišćenjem reporterske ćelijske linije koja stabilno eksprimira humani LEPR pune dužine (hLEPR; aminokiseline 1 do 1165 pristupni broj NP_002294.2) zajedno sa reporterom luciferazom (STAT3-Luc; Qiagen, # CLS-6028L) u IMR-32 ćelijskoj liniji, ćelijska linija humanog neuroblastoma. Dobijena stabilna ćelijska linija, naznačena sa IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR, izolovana je i održavana u MEM-Earl medijumu koji je dopunjen sa 10% FBS, NEAA, 1ug/mL Puromicinom, 100ug/mL Higromicinom B i Penicilin/Streptomicin/L-Glutamin (Potpuni medijum).

[0134] Dobijeni biotest je korišćen za merenje efekta anti-LEPR antitela iz pronalaska na LEPR signalizaciju u prisustvu ili odsustvu Leptina. Za biotest, IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR ćelije su zasejane u gustini od 20,000 ćelija/100ul/bunariću za format 96bunarića u potpunom medijumu, i sledećeg dana zamenjene sa odgovarajućom zapreminom Opti-MEM medijuma koji je dopunjen sa 1% BSA i 0.1% FBS (pufer testa) tokom 30 minuta. Da bi se izmerio efekat antitela iz pronalaska u odsustvu leptina, anti-LEPR antitela ili kontrolnog antitela izotipa i humanog Leptina (hLeptin; R&D Systems, #398-LP) su polulog serijski razblaženi do finalnih koncentracija u opsegu od 100nM do 300fM u puferu testa, koji su dodati ćelijama i nakon toga su inkubirani preko noći na 37°C u 5% CO2.

[0135] Da bi se izmerio efekat antitela iz pronalaska u prisustvu Leptina, fiksna koncentracija humanog Leptina na 200pM u puferu testa je dodata ćelijama, nakon čega se odmah dodaju anti-LEPR antitela ili izotip kontrolnog antitela koji su polu-log serijski razblaženi do finalnih koncentracija u opsegu od 100nM do 300fM. Uzorci su nakon toga inkubirani preko noći na 37°C u 5% CO2. OneGlo reagens (Promega, # E6051) je zatim dodat u uzorke i aktivnost luciferaze je izmerena na Envision Multilable čitaču ploča (Perkin Elmer) u luminiscentnom režimu. Dobijene su vrednosti relativne svetlosne jedinice (RLU) i rezultati su analizirani korišćenjem nelinearne regresije sa GraphPad Prism softverom (GraphPad). Maksimum RLU vrednosti koja je dobijena iz doznog odgovora hLeptina je definisana kao 100% aktivacija u IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR testu.

[0136] Kao što je prikazano u Tabeli 13, u Studiji 1, u odsustvu hLeptina, svako od ispitanih anti-LEPR antitela pokazalo je slabu stimulaciju IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR ćelija sa EC50vrednostima u opsegu od 134pM do 11.9nM i maksimalnu aktivaciju u opsegu od 5% do 13% redom od maksimalne aktivacije koja je dobijena iz odgovora na dozu hLeptina. U Studiji 2, u odsustvu hLeptina, 4 ispitana anti-LEPR antitela pokazala su stimulaciju IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR ćelija sa EC50vrednostima u opsegu od 61.9pM do 206.9pM i maksimalnu aktivaciju u opsegu od 65% do 68% u odnosu na maksimalnu aktivaciju koja je dobijena iz odgovora na dozu hLeptina. U Studiji 1, u prisustvu 200pM hLeptina, svako od ispitanih anti-LEPR antitela pokazalo je stimulaciju IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR ćelija sa EC50vrednostima u opsegu od 20.2pM do 523pM i maksimalnu aktivaciju u opsegu od 66% do 107% u odnosu na maksimalnu aktivaciju koja je dobijena iz odgovora na dozu hLeptina. Zbog toga što ov antitela pojačavaju LEPR signalizaciju koja je indukovana leptinom, ova antitela su klasifikovana kao "Potencijatori", kao što je ovde definisano. U Studiji 2, u prisustvu 200pM hLeptina, 4 anti-LEPR antitela koja su ispitana pokazala su stimulaciju IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR ćelija sa EC50vrednostima u opsegu od 51.9pM do 257.3pM sa maksimalnom aktivacijom u opsegu od 76% do 88% od maksimuma aktivacije koji je dobijen iz odgovora na dozu hLeptina. LEPR signalizacija nije bila značajno poboljšana sa ovim antitelima u prisustvu leptina. Kontrolno anitelo izotipa nije pokazalo bilo koju merljivu stimulaciju IMR-32/STAT3- Luc/hLEPR ćelija u bilo kom od ovih testova.

Tabela 13: Aktivacija hLEPR sa anti-LEPR Antitelima

(nastavak)

Primer 8. Anti-LEPR Antitela iz pronalaska aktiviraju signalizaciju u ćelijama koje ekprimiraju mutante LEPR koji su defektni za signalizaciju ili imaju narušenu signalizaciju

[0137] Identifikovani su LEPR mutanti koji ispoljavaju defektnu ili narušenu signalizaciju koja je posredovana sa leptinom i takođe su povezani sa ranim početkom razvoja gojaznosti. Na primer, LEPR-A409E je mutant LEPR proteina koji je defektan za signalizaciju koji ne vrši transdukciju signala leptina na STAT3; A409E mutant je originalno identifikovan kao monogenski uzročnik ranog početka razvoja gojaznosti. (Farooqi et al., 2007, N Engl J Med 356(3): 237-247). LEPR-P316T mutant LEPR proteina sa narušenom signalizacijom za koga je takođe pokazano da je povezan sa ranim početkom razvoja gojaznosti. (Mazen et al., 2011, Mol Genet Metab 102:461-464).

[0138] U ovom primeru, sposobnost anti-LEPR antitela iz pronalaska da stimulišu LEPR signalizaciju u ćelijskim linijama koje eksprimiraju LEPR mutante koji su defektni za signalizaciju ili imaju narušenu signalizaciju je ispitana. Određeno, reporterske ćelijske linije (HEK293) su konstruisane da eksprimiraju ili divlji tip LEPR, LEPR-A409E (defektan za signalizaciju) ili LEPR-P316T (sa narušenom tj. ošećenom signalizacijom). Ćelije su tretirane ili samo sa nosačem, rekombinantnim humanim leptinom, kontrolom IgG, ili agonistom anti-LEPR antitela iz predmetnog pronalaska (H4H16650 ili H4H16679), i određen je opseg LEPR signalizacije (kao što je mereno Western blot detekcijom pSTAT3-Y705 ekspresije u odnou na STAT3 ekspresiju).

[0139] U ovim eksperimentima je pokazano da agonist anti-LEPR antitela iz predmetnog pronalaska (H4H16650 and H4H16679) stimuliše LEPR signalizaciju u ćelijama koje eksprimiraju LEPR-A409E mutant ili LEPR-P316T mutant (kao što je mereno sa ekspresijom STAT3) u režimu koji zavisi od doze (Slika 2, paneli B i C). Suprotno tome, tretman leptinom indukovao je samo blagu signalizaciju u ćelijama koje eksprimiraju LEPR-P316T mutant, i bez signalizacije u ćelijama koje eksprimiraju LEPR-A409E mutant. (Slika 2, panel A). Osim toga, LEPR signalizacija nije uočena u bilo kojoj od ćelijskih linija koje su tretirane sa nosačem ili IgG kontrolnim antitelom (podaci nisu prikazani). Drugi LEPR mutanti koji su defektni za signalizaciju ili imaju oštećeni signalizaciju su ispitani u ovom testu ali nisu aktivirani sa anti-LEPR mutantima (podaci nisu prikazani), što ukazuje da ovaj efekat spasavanja može biti zavisan od mutanta.

[0140] Rezulati iz ovog primera ukazuju na to da agonist anti-LEPR antitela iz predmetnog pronalaska može biti koristan u lečenju bolesti i poremećaj (npr., ranog stadijuma početka gojaznosti) koji su uzrokovani sa ili su povezani sa određenim LEPR mutantima koji su defektni za signalizaciju ili imaju oštećenu signalizaciju (npr., LEPR-P316T ili LEPR-A409E).

Primer 9: Oktetna unakrsna kompeticija između različitih anti-LEPR monoklonalnih antitela.

[0141] Kompeticija vezivanja između panela različitih anti-LEPR monoklonalnih antitela određena je korišćenjem testa interferometrije na bio-sloju, bez obeleživača u realnom vremenu na platformi Oktet HTX biosenzora (Pall ForteBio Corp.). Ceo eksperiment je sproveden na 25°C u puferu koji sadrži 10mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA, i 0.05% v/v Surfaktant Tween-20, 1mg/mL BSA, pH7.4 (HBS-EBT) na ploči koja se trese u brzini od 1000oum. Da bi se ispitalo da li su dva antitela sposobna da budu u kompeticiji jedno sa drugim za vezivanje za njihove odgovarajuće epitope na rekombinantnom humanom LEPR eksprimiranom sa C-terminalnim myc-myc-heksahistidinskim tag-om (hLEPR.mmh; SEQ ID NO: 114), oko 0.25nm ili 0.34nm hLEPR-MMH je prvo uhvaćeno na anti-penta-His antitelom obloženim Octet biosenzorskim vrhovima (Fortebio Inc, # 18-5122) potapanjem biosenzorskih vrhova tokom 5 minuta u bunariće koji sadrže 20µg/mL hLEPR-MMH. Biosenzorski vrhovi sa uhvaćenim antigenom su nakon toga zasićeni sa prvim anti-LEPR monoklonalnim antitelom (koje je ovde naknadno naznačeno sa mAt-1) uranjanjem u bunariće koji sadrže 50µg/mL rastvora mAt-1 tokom 210 sekundi. Biosenzorski vrhovi su zatim naknadno uronjeni u bunariće koji sadrže 50µg/mL rastvora drugog antiLEPR monoklonalnog antitela (ovde naknadno označenog sa mAt-2) tokom 150 sekundi. Biosenzorski vrhovi su isprani u HBS-EBT puferu između svakog koraka eksperimenta. Odgovor vezivanja u realnom vremenu je praćen tokom čitavog trajanja eksperimenta i odgovor vezivanja na kraju svakog koraka je zabeležen. Odgovor vezivanja mAt-2 sa hLEPR-MMH koje je prethodno u kompleksu sa mAt-1 je upoređeno i kompetitivno/ne-kompetitivno ponašanje različitih anti-LEPR monoklonalnih antitela je određeno kao što je prikazano u Tabeli 14 i Tabeli 15.

Tabela 14: Unakrsna-kompeticija između anti-LEPR monoklonalnih antitela

4

Tabela 15: Unakrsna kompeticija između anti-LEPR monoklonalnih antitela

Primer 10: In vivo efikasnost of LEPR agonista antitela H4H16650P2, H4H16679P2, H4H17319P2 i H4H17321P2 u inducibilnom mišjem modelu deficijencije Leptina.

[0142] Efekti četiri specifična agonista anti-LEPR antitela iz pronalaska, H4H16650P2, H4H16679P2, H4H17319P2, i H4H17321P2 na unos hrane, telesnu težinu i masnoću određivani su u inducibilnom modelu deficijencije leptina kod genetski modifikovanih LEPR<Hu/Hu>miševa, koji eksprimiraju receptor leptina koji se sastoji iz humane sekvence LEPR ektodomena umesto mišje sekvence LEPR ektodomena. Model deficijencije leptina je indukovan sa hidrodinamičkom isporukom DNK (HDD) plazmida koji kodira hFc-obeleženi mišji LEPR ektodomen (ovde naznačen sa mLEPR.hFc ili "Leptin trap"; SEQ ID NO: 120). Leptin trap (zamka) kada je eksprimirana se luči i veže se za Leptin u krvotoku. Nakon HDD od 50 µg DNK konstrukta koji kodira Leptin trap, miševi su ispoljili povećano konzumiranje hrane i povećanu masnoću i telesnu težinu.

[0143] Osnovni dnevni unos hrane je meren između 7 i 4 dana pre davanja zamke za Leptin (eng. leptin trap) (dani -7 i -4). U danu 0, trideset pet 13- do 17- nedelja stari mužjaci LEPR<Hu/Hu>miševa su uspešno izloženi HDD sa zamkom Leptina. U danima 6 i 13 posle HDD, retroorbitalna krvarenja su sakupljena i sastav tela uključujući masnoću je kvantifikovan sa mCT. U danu 7 posle HDD, miševi su randomizovani u pet grupa po 7 miševa na osnovu procenta promene telesne težine od dana 0. Svaka grupa primila je subkutanoznom injekcijom ili pojedinačnu dozu kontrolnog antitela izotipa od 3 mg/kg, H4H16650P2 na 3 mg/kg, H4H16679P2 na 3 mg/kg, H4H17319P2 na 3 mg/kg, ili H4H17321 na 3 mg/kg. Kontrola izotipa antitela nije vezala bilo koji poznati mišji protein. Unos hrane i telesna težina su mereni za svaku životinju tokom trajanja studije. Slika 3 daje pregled prosečnog dnevnog unosa hrane za svaku grupu koja prima tretman. Na slici 3, isprekidana linija predstavlja prosek osnovnog unosa hrane pre HDD injekcije. Procenat promene u telesnoj težini od dana 0 je izračunat za svaku životinju u svakoj vremenskoj tački. Slika 4 daje pregled proseka procenta promene u telesnoj težini životinja u svakoj grupi koja prima tretman antitelom. Slika 5 daje pregled proseka mase masnoća za životinje u svakoj grupi koja je primila tretman antitelom kvantifikovano sa mCT 1 dan pre i 6 dana nakon tretmana antitelom. Svi rezultati su eksprimirani kao srednja vrednost ± SEM.

[0144] Kao što je prikazano na Slikama 3 i 4, koje prate HDD sa zamkom Leptina, slična povećanja u unosu hrane i procenat promene u telesnoj težini su uočeni između grupa miševa pre tretmana sa antitelom. Kao što je prikazano na Slici 3, miševi koji su tretirani sa antitelima H4H16650P2 ili H4H16679P2 na 3 mg/kg ispoljili su značajna smanjenja u unosu hrane počev od prvog dana nakon tretmana sa antitelom (dan 8 posle HDD) i u narednim vremenskim tačkama koje su merene u poređenju sa miševima kojima je ubrizgano kontrolno antitelo izotip. Miševi tretirani sa antitelima H4H17319P2 ili H4H17321P2 na 3 mg/kg ispoljavaju značajno smanjenje u unosu hrane u dva dana nakon tretmana sa antitelom (dan 9 posle HDD) i u drugim narednim vremenskim tačkama kao što je mereno u poređenju sa miševima kojima je ubrizgano kontrolno antitelo izotip. Kao što je prikazano na Slici 4, miševi koji su tretirani sa antitelom H4H16650P2 na 3 mg/kg ispoljili su značajno smanjenje u procentu promene telesne mase jedan dan nakon početka tretmana sa antitelom (dan 8 posle HDD) i u drugim narednim vremenskim tačkama m koje su merene u poređenju sa miševima kojima je ubrizgano kontrolno antitelo izotip. Jedan dan nakon tretmana sa antitelom, u danu 8, miševi koji su tretirani sa kontrolom izotipa antitela pokazali su da 21.16 ± 1.27% povećanje u telesnoj težini od dana 0, gde miševi koji su tretirani sa H4H16650P2 su imali 15.57 ± 0.9% povećanje u telesnoj težini od dana 0. Miševi tretirani sa antitelima H4H16679P2, H4H17319P2 ili H4H17321 P2 na 3 mg/kg ispoljili su značajno smanjenje u procentu promene telesne mase dva dana nakon tretmana antitelom (dan 9 posle HDD) i u drugim narednim vremenskim tačkama koje su merene u poređenju sa miševima kojima je ubrizgano kontrolno antitelo izotip. U danu 9, % promena telesne težine od dana 0 bile su 23.18 ± 1.22, 13.17 ± 1.05, 12.95 ± 1.26, 15.98 ± 1.78 i 15.83 ± 2.01 za miševe koji su tretirani sa kontrolom izotipa, H4H16650P2, H4H16679P2, H4H17319P2, ili H4H17321P2, redom. Kao što je prikazano na Slici 5, miševi koji su tretirani sa kontrolnim antitelom izotipa 3 na mg/kg pokazali su značajno povećanje u u masi masnoća 6 dana nakon tretmana sa antitelom (dan 13 posle HDD) u poređenju sa 1 dan pre tretmana sa antitelom (dan 6 posle HDD). Miševi koji su tretirani sa antitelima H4H16650P2, H4H16679P2, H4H17319P2, ili H4H17321P2 na 3 mg/kg nisu dobili adipoznu masu nakon tretmana sa antitelom u poređenju sa pre-tretmanom antitela. Nakon 6 dana tretmana (dan 13 posle HDD), miševi koji su tretirani sa antitelima H4H16650P2, H4H16679P2 ili H4H17319P2 na 3 mg/kg pokazali su značajno smanjenje u masi masti u poređenju sa miševima koji su tretirani sa kontrolnim antitelom izotipa na 3 mg/kg.

Primer 11: Mapiranje epitopa H4H16650P2 vezivanja za receptor humanog leptina (hLEPR.mmh) sa izmenom vodonik deuterijum.

[0145] Eksperimenti su sprovedeni da bi se odredili aminokiselinski ostaci hLEPR.mmh (aminokiseline M1-D839 SEQ ID NO: 114) sa kojima interaguje H4H16650P2. Za ovu svrhu izvedeno je mapiranje epitopa H/D izmenom sa masenom spektrometrijum. Opšti opis postupka izmene H/D je predstavljen u, npr., Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; i Engen and Smith (2001) Anal. Chem.

73:256A-265A.

[0146] Eksperimentalna procedura. HDX-MS eksperimenti su sprovedeni na integrisanoj Waters HDX/MS platformi, koja se sastoji iz Leaptec HDX PAL sistema za obeležavanje deutrijumom, Waters Acquity M-Class (Auxiliary solvent manager) za digestiju i nanošenje uzorka, Waters Acquity M-Class (mBinary solvent manager) za gradijent analitičke kolone, i Synapt G2-Si maseni spektrometar za merenje mase peptičkih peptida.

[0147] Rastvor za obeležavanje je pripremljen u 10 mM PBS puferu u D2O na pD 7.0 (ekvivalent sa pH 6.6). Za obeležavanje deuterijomom, 3.8 µL hLEPR.mmh (8 pmol/µL) ili hLEPR.mmh u premiksu sa antitelom u 2:1 molarnom odnosu je inkubirano sa 56.2 µL D2O rastvora za obeležavanje za različite vremenske tačke (npr., nedeuterisana kontrola = 0 sek, obeležena za 1 min i 20 min). Deuterisanje je zaustavljeno prenošenjem 50 µL uzorka u 50 µL prethodno ohlađeni pufer za hlađenje (0.2 M TCEP, 6 M gvanidin hlorid u 100 mM fosfatnom puferu, pH 2.5) i mešani uzorak je inkubiran na 1.0°C tokom dva minuta. Zaustavljeni uzorak je nakon toga ubrizgan na Waters HDX Manager za pepsin/proteza XIII digestiju na mreži (eng. online). Digestirani peptidi su uhvaćeni na ACQUITY UPLC BEH C181.7-µm, 2.1 x 5 mm VanGuard pre-koloni na 0°C i eluirani su na analitičku kolonu ACQUITY UPLC BEH C181.7-µm, 1.0 x 50 mm tokom 9-minutog razdvajanja na gradijentu 5%-40% B (mobilna faza A: 0.1% mravlja kiselina u vodi, mobilna faza B: 0.1% mravlja kiselina u acetonitrilu). Maseni spektrometar je podešen na konusni napon od 37 V, vreme skeniranja 0.5 s, i opseg mase/naboja od 50-1700 Th.

[0148] Za identifikaciju peptida LEPR, LC-MSE podaci iz nedeuterisanog uzorka su obrađeni i pretraženi u odnosu na bazu podataka uključujući humani LEPR, pepsin, i njihove randomizovane sekvence pomoću Waters ProteinLynx Global Server (PLGS) softvera. Identifikovani peptidi su uvezeni u DynamX softver i filtrirani pomoću dva kriterijuma: 1) minimum proizvoda po aminokiselini: 0.2, i 2) dosije praga replikacije: 3. DynamX softver zatim automatsko određivanje unosa deuterijuma za svaki peptid zasnovano na vremenu zadržavanja i preciznosti visoke mase (<10ppm) kroz višestruke vremenske tačke sa 3 replikata u svakom vremenu.

[0149] Rezultati. Upotrebom pepsin/proteza XIII kolone na mreži spojene sa MS<E>prikupljanjem podataka, ukupno 201 peptida iz humanog LEPR su reproducibilno identifikovani u odsustvu ili prisustvu antitela, predstavljajući 70% pokrivenost sekvence. Pet peptida imalo je značajno smanjeni deuteracije (centroid delta vrednosti > 0.4 daltona sa p-vrednostima < 0.05) kada su vezani za H4H16650P2 kao što je prikazano u Tabeli 16. Zabeležena peptidna masa odgovara srednjoj vrednosti centroid MH+ mase iz tri replikata. Ovi peptidi, koji odgovaraju aminokiselinama 162-169 (aminokiseline LYVLPEVL humanog LEPR; SEQ ID NO: 113), i aminokiselinama 170-181 (aminokiseline EDSPLVPQKGSF humanog LEPR; SEQ ID NO: 113), imale su slabiju brzinu deuteracije kada su vezane za H4H16650P2. Ovi identifikovani ostaci takođe odgovaraju ostacima kiselina 162-169 i 170-181 humanog LEPR kao što je identifikovano sa Uniprot unosom P48357 (SEQ ID NO.113; Humani receptor leptina)

Tabela 16: Peptidi humanog receptora leptina sa značajnom zaštitom nakon vezivanja za antitelo

H4H16650P2

Primer 12: In vivo efikasnost ispitivanja LEPR potencijatorskih antitela kod humanizovanih LEPR miševa.

[0150] Efekti tri specifična potencijatora anti-LEPR antitela iz pronalaska, H4H18482P2, H4H18487P2 i H4H18492P2, na telesnu težinu i masnoću su određeni kod pojedinačno gajenih genetski modifikovanih LEPR<Hu/Hu>miševa, koji eksprimiraju receptor za leptin koji se sastoji iz sekvence humanog LEPR ektodomena umesto sekvence mišjeg LEPR ektodomena (mLEPR.hFc, SEQ ID NO: 120).

[0151] U danima -19 telesna kompozcija uključujući masnoću je kvantifikovana pomoću mCT. U danima 0, četrdeset osam 14 do 16 nedelja stare ženke LEPR<Hu/Hu>miševa su randomizovane u četiri grupe po 12 miševa na osnovu telesne težine. U danima 0 i 11, miševi iz svake grupe su primili subkutanoznom

4

injekcijom jednu dozu kontrole antitela izotipa na 30 mg/kg, H4H18482P2 na 30 mg/kg, H4H18487P2 na 30 mg/kg ili H4H18492P2 na 30 mg/kg. Kontrola antitela izotipa nije vezala bilo koji poznati mišji protein. Telesna težina je izmerena u toku trajanja studije za svaku životinju. Procenat promene u telesnoj težini od dana 0 je izračunat za svaku životinju u svakoj vremenskoj tački. Slika 6 daje pregled prosečne promene procenta u telesnoj težini za životinje u svakoj grupi koja prima tretman. Slika 6 daje pregled proseka mase masti za životinje u svakoj grupi koja je primila tretman antitelom kvantifikovano sa mCT 19 dana pre i 11 dana nakon tretmana antitelom. Svi rezultati su eksprimirani kao srednja vrednost ± SEM.

[0152] Kao što je prikazano na Slici 6, smanjenje u procentu promene u telesnoj težini je uočeno nakon doziranja sa antitelima potencijatorima LEPR, ali ne sa kontrolom antitela izotipa. Kao što je prikazano na Slici 6, miševi koji su tretirani sa H4H18482P2 na 30 mg/kg ispoljili su značajno smanjenje u procentu promene telesne težine počev od dva dana nakon tretmana (dan 2), i drugim vremenskim tačkama u poređenju sa miševima kojma je ubrizgana kontrola izotipa antitela. Miševi koji su tretirani sa H4H18487P2 na 30 mg/kg ispoljili su značajna smanjenja u procentu promene telesne težine počev od dana 2 i u drugim vremenskim tačkama u poređenju sa miševima kojma je ubrizgana kontrola izotipa antitela. Miševi koji su tretirani sa H4H18492P2 na 30 mg/kg ispoljili su značajno smanjenje u procentu promene telesne težine u danima 4, 5 i 17 ali ne u drugim vremenskim tačkama u poređenju sa miševima kojma je ubrizgana kontrola izotipa antitela. Miševi tretirani sa H4H18482P2 na 30 mg/kg ispoljili su značajno smanjenje u procentu promene telesne težine počev od dana 6 i u sledećim danima ali ne u danima 7, 14 i 17, u poređenju sa miševima kojima je ubrizgan H4H18492P2. Miševi tretirani sa H4H18487P2 na 30 mg/kg ispoljili su značajno smanjenje u procentu promene telesne težine počev od dana 3 i u drugim vremenskim tačkama, ali ne u danima 4 i 5, u poređenju sa miševima kojima je ubrizgan H4H18492P2.

[0153] Kao što je prikazano na Slici 7A, nije bilo razlike u masi masti između grupa pre tretmana (dan -19). Kao što je prikazano na Slici 7B, miševi koji su tretirani sa antitelima H4H18482 i H4H18487, ali ne H4H18492, na 30 mg/kg pokazali su statistički značajno smanjenje u masti masti 17 dana nakon tretmana (dan 12) u poređenju sa izotipom kontrole antitela.

[0154] Predmetni pronalazak ne treba ograničiti u obimu sa ovde opisanim specifičnim izvođenjima. Zaista, različite modifikacije iz pronalaska pored onih koje su ovde opisane će biti očigledne stručnjaku iz oblasti tehnike iz prethodno navedenog opisan i pridruženim nacrtima. Takve modifikacije su namenjene da budu obuhvaćene obimom naznačenih zahteva.

Primer 13: Efekat anti-LEPR antitela iz pronalaska na LEPR signalizaciju majmuna

[0155] Da bi se ispitala transkripciona aktivacija receptora za Leptin kod majmuna, razvijena je stabilna ćelijska linija. IMR-32 ćelije (humani Neuroblastom ATCC) generisane su da stabilno eksprimuju vanćelijski domen Macaca fascicularis LEPR (MfLEPR; aminokiseline 22 do 837 pristupni broj XP_005543194.1 sa treoninom na 827 izmenjenim u alanin) spojen sa transmembranskim i citoplazmatskim domenima humanog LEPR (hLEPR; aminokiseline 840 do 1165 sa pristupnim brojem NP_002294.2) zajedno sa reporterom luciferazom (STAT3-Luc; SABiosciences, # CLS-6028L). Dobijena ćelijska linija, koja je ovde naznačena sa IMR-32/STAT3-Luc/MfLEPR je izolovana i održavana je u MEM-Earl medijumu dopunjenom sa 10% FBS, NEAA, 1ug/mL Puromicina, 100ug/mL Higromicina B i Penicilin/Streptomicin/L-Glutamin.

[0156] Biotest je sproveden da bi se izmerio efekat anti-LEPR antitela iz pronalaska na LEPR signalizaciju kod majmuna u odsustvu Leptina. Za biotest, IMR-32/STAT3-Luc/MfLEPR ćelije su zasejane na 10,000 ćelija/bunariću na ploči sa 96-bunarića u 0.1% FBS u Optimem sa penicilin/streptomicin (pufer za test) i inkubirano je preko noći na 37°C u 5% CO2. Sledećeg dana humani leptin (hLeptin), anti-LEPR antitela ili izotip kontrole antitela su serijski razblaženi sa 50nM do 0.8pM u puferu za test (plus uzorak koji sadrži samo pufer bez ispitivanog molekula) i dodato je ćelijama. Nakon 5.5 sati na 37°C u 5% CO2, aktivnost luciferaze je izmerena sa OneGlo™ reagensom (Promega, # E6031) i Victor™ X multilabel čitačem ploča (Perkin Elmer). Rezultati su analizirani korišćenjem nelinearne regresije (logistika 4-parametra) sa Prism™6 softverom (GraphPad) da se dobiju EC50vrednosti. Procenat aktivacije antitela je izračunat kao maksimalni opseg RLU koji se postuže sa antitelom u odnosu na onaj kod maksimalnog opsega RLU koji se postiže sa hLeptin.

[0157] Kao što je prikazano na Slici 17, u odsustvu hLeptina, svako od ispitanih anti-LEPR antitela pokazalo je aktivaciju LEPR signalizacije kod majmuna u IMR-32/STAT3-Luc/mfLEPR ćelijama sa EC50vrednostima od 266pM do 368pM i maksimalna aktivacija u opsegu od 76% do 82% gde je dobijena 100% aktivacija sa hLeptinom. hLeptin aktiviran je sa EC50vrednosti od 333pM. Izotip kontrole antitela nije pokazao bilo koju merljivu stimulaciju IMR- 32/STAT3-Luc/mfLEPR ćelija.

Tabela 17: Aktivacija Macaca fascicularis LEPR sa anti-LEPR antitelima

Primer 14: Vezivanje epitopa za vanćelijski domen humanog LEPR pune dužine korišćenjem Luminex MFI signala

[0158] Da bi se odredio epitop na humanom LEPR za koji se anti-LEPR antitela iz pronalaska vežu, analiza Luminex FLEXMAP (FM3DD, LuminexCorp) zasnovana na protočnoj citometriji je korišćena da bi se karakterisala interakcija anti-LEPR antitela sa rekombinantnim humanim LEPR proteinskim domenima. Za test, približno 3 miliona karboksilovanih Microplex<R>microsfera (Luminex, Cat# LC1000A), je isprano, vorteksovano i izloženo utrazvučnim talasima na 0.1 M NaPO4, pH 6.2 (pufer za aktivaciju) i zatim su centrifugirane da se ukloni supernatant. Mikrosfere su resuspendovane u 120 mL pufera za aktivaciju i karboksilatne grupe (-COOH) su aktivirane dodavanjem 15 µL 50 mg/mL N-hidroksi-sukcinimida (NHS, Thermo Scientific, Cat# 24500) nakon čega sledi dodavanje 15 µL 50 mg/mL 1-etil-3-[3-dimetil-aminopropil]karbodiimida (EDC, ThermoScientific, Cat# 22980) na 25°C. Nakon 10 minuta, pH reakcije je smanjena do 5.0 sa dodavanjem 600 µL 50 mM MES, pH 5 (pufer za spajanje), i mikrosfere su vorteksovane, i centrifugirane da bi se uklonio supernatant. Aktivirane perlice su odmah pomešane sa 500 µL 20 mg/mL monoklonalnih anti-myc antitela sa ili mišjim IgG ili humanim IgG, u puferu za spajanje i inkubirane su dva sata na 25°C. Reakcija spajanja je zaustavljena sa dodavanjem 50 µL 1M Tris-HCI, pH 8.0 i mikrosfere su brzo vorteksovane, centrifugirane, i isprane četiri puta sa 1 µL DPBS, da bi se uklonili nevezani proteini i druge komponente reakcije.

[0159] Privremeno eksprimirani LEPR proteini, uključujući vanćelijski domen humanog LEPR koji je eksprimiran sa C-terminalnim myc-myc heksahistidinskim tag-om (humani LEPR-MMH, SEQ ID NO: 113), humani LEPR CRH1 (D1) eksprimiran sa C-terminalnim myc-myc heksahistidinskim tag-om

4

(humani LEPR CRH1 (D1)-MMH, aminokiseline 1-208 SEQ ID NO: 113 sa myc-myc heksahistidinskim tag-om, aminokiseline 209-236), humani LEPR CRH1 (D1,D2) domen eksprimiran sa C-terminalnim myc-myc heksahistidinskim tag-om (humani LEPR CRH1 (D1,D2)-MMH, aminokiseline 1-318 SEQ ID NO: 113 sa myc-myc heksahistidinskim tag-om, aminokiseline 319-346), humani LEPR CRH1-lg (D1,D2,D3) domen eksprimiran sa C-terminalnim myc-myc heksahistidinskim tag-om (humani LEPR CRH1 (D1,D2,D3)-MMH, aminokiseline 1-278 SEQ ID NO: 113 sa myc-myc heksahistidinskim tag-om, aminokiseline 279-306), humani LEPR CRH1-lg (D2,D3) domen eksprimiran sa C-terminalnim myc-myc heksahistidinskim tag-om (humani LEPR CRH1-lg (D2,D3)-MMH, aminokiseline 1-198 SEQ ID NO: 113 sa myc-myc heksahistidinskim tag-om, aminokiseline 199-226), humani LEPR Ig (D3) domen eksprimiran sa C-terminalnim myc-myc heksahistidinskim tag-om (humani LEPR Ig (D3)-MMH, aminokiseline 1-88 SEQ iD NO: 113 sa myc-myc heksahistidinskim tag-om, aminokiseline 89-116), humani LEPR CRH2 domen eksprimiran sa C-terminalnim myc-myc heksahistidinskim tag-om (humani LEPR CRH2-MMH, aminokiseline 1-207 SEQ ID NO: 113 sa myc-myc-heksahistidinskim tag-om, aminokiseline 208-235), humani LEPR FNIII domen eksprimiran sa C-terminalnim myc-myc heksahistidinskim tag-om (humani LEPR FNIII-MMH, aminokiseline 1-204 SEQ ID NO: 113 sa myc-myc heksahistidinskim tag-om, aminokiseline 205-232), i humani LEPR Ig-CRH2-FNIII domen eksprimiran sa C-terminalnim myc-myc heksahistidinskim tag-om (humani LEPR Ig-CRH2-FNIII-MMH, aminokiseline 1-510 SEQ ID NO: 113 sa myc-myc-heksahistidinskim tag-om, aminokiseline 511-538), su suspendovani u CHO-S-SFM II Medijumu bez seruma (Thermo Fisher, Cat # 31033020) i nakon toga su razbistrene centrifugiranjem. Alikvote mikrosfera sa imobilizovanim anti-myc monoklonalnim antitelima, koja su dobijena kao što je gore opisano, zasebno su dodati u 1 mL svakog od ovih supernatanata proteina. Mikrosfere su nežno pomešane, inkubirane u trajanju od dva sata na 25°C, isprano dva sata sa 1 mL of DBPS, centrifugirane da bi se uklonio supernatant i konačno su resuspendovan u 1 mL DPBS pufera. Četrdeset osam µL anti-myc IgG spojenih mikrosferea iz svake zasebne reakcije sa humanim LEPR pune dužine i sa svakim od proteina sa LEPR domenom su sakupljene i pomešane zajedno u 3.6 mL PBS 20mg/mL BSA+0.05% natrijum azida (pufer za blokiranje).

[0160] Iz ovog mešanog skupa, 75 µL mikrosfera je zasejano po bunariću na fiter ploču sa 96 bunarića (Millipore, Cat. No: MSBVN1250) i pomešano je sa 25 µL individualnih anti-humanih LEPR monoklonalnim antitelima (0.5 ili 5 µg/mL), inkubirano je tokom dva sata na 25°C i zatim je dva puta isprano sa 200 µL DPBS sa 0.05% Tween 20 (pufer za ispiranje). Da bi se detektovale i kvantifikovale količine nivoa vezanog anti-LEPR antitela sa individualnim mikrosferama, ili 100 µL 2.5 mg/mL R-Fikoeritrinom konjugovano kozje F(ab')2 anti-humano kapa (Southern Biotech, Cat# 2063-09) u puferu za blokiranje ili 100 µL 1.25 µg/mL R-Fikoeritrin AffiniPure F(ab')2 Fragment Kozje Anti-Mišje IgG, F(ab')2 Fragment Specifično (Jackson Immunoresearch, Cat. No: 115-116-072) u puferu za blokiranje, je dodato i inkubirano je u trajanju od 30 minuta na 25°C. Nakon 30 minuta, uzorci su isprani dva puta sa 200 µL pufera za ispiranje i resuspendovani su u 150 µL pufera za ispiranje. Medijana intenziteta fluorescencije (MFI) na mikrosferama je izmerena na Luminex Analizatoru

4

in

duž

ne

pu

R P LE

g

o

na

m

hu

m

o

en

m

do

m

ki

js

li

će

van

mini

će

va

h

uitag

yclmiz sa

la

te

ti

an

R P E

Li-ant

e

nj

iva

vez

o

aln

n

ig

Is

F

M

ex

in

m

u

L

18:

a

el

ab

T

[0161] Rezultati Luminex zasnovane analize predstavljeni su tabelarno u Tabeli 18. Intenziteti Luminex MFI signala ukazuju na to da je dvanaest anti-LEPR antitela iz pronalaska vezalo potpuni vanćelijski domen humanog LEPR. Anti- LEPR antitela H4H18417P2, H4H18438P2, i H4H18492P2, vezala su se za epitope u CRH1 D2 domenu humanog LEPR. Anti-LEPR antitela H4H18449P2, H4H16650P i H4H16679P, vezala su se za epitope u CRH1(D1-2) domenu humanog LEPR. Anti-LEPR antitelo Komparator mAT, vezalo se za epitope u CRH2 domenu humanog LEPR. Anti-LEPR antitelo H4H18445P2 vezalo se za epitope u FNIII domenu humanog LEPR. Anti-LEPR antitela H4H18446P2, H4H18482P2 i H4H18487P2, vezali su se za epitope u Ig-CRH2-FNIII domenu humanog LEPR.

4

1

2

4

1

2

4

1

2

4

�

2

�

2

�

1

11

��

�

Claims

Patentni zahtevi

1. Izolovano antitelo ili njegov fragment koji veže antigen koje veže humani receptor leptina (LEPR) i aktivira LEPR signalizaciju sa EC50vrednosti koja je manja od 12.0 nM u ćelijski zasnovanom reporterskom testu koji detektuje transkripcionu aktivaciju STAT3, pri čemu antitelo ili njegov fragment koji veže antigen sadrži:

(i) varijabilni region teškog lanca koji sadrži:

HCDR1 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 4,

HCDR2 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 6, i

HCDR3 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 8; i

varijabilni region lakog lanca koji sadrži:

LCDR1 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 12,

LCDR2 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 14, i

LCDR3 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 16;

(ii) varijabilni region teškog lanca koji sadrži:

HCDR1 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 20,

HCDR2 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 22, i

HCDR3 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 24; i

varijabilni region lakog lanca koji sadrži:

LCDR1 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 12,

LCDR2 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 14, i

LCDR3 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 16;

(iii) varijabilni region teškog lanca koji sadrži:

HCDR1 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 28,

HCDR2 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 30, i

HCDR3 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 32; i

varijabilni region lakog lanca koji sadrži:

LCDR1 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 12,

LCDR2 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 14, i

LCDR3 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 16;

(iv) varijabilni region teškog lanca koji sadrži:

HCDR1 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 36,

HCDR2 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 38, i

HCDR3 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 40; i

varijabilni region lakog lanca koji sadrži:

LCDR1 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 12, LCDR2 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 14, i LCDR3 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 16; (v) varijabilni region teškog lanca koji sadrži:

HCDR1 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 44, HCDR2 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 46, i HCDR3 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 48; i varijabilni region lakog lanca koji sadrži:

LCDR1 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 12, LCDR2 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 14, i LCDR3 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 16; (vi) varijabilni region teškog lanca koji sadrži:

HCDR1 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 52, HCDR2 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 54, i HCDR3 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 56; i varijabilni region lakog lanca koji sadrži:

LCDR1 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 12, LCDR2 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 14, i LCDR3 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 16; (vii) varijabilni region teškog lanca koji sadrži:

HCDR1 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 60, HCDR2 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 62, i HCDR3 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 64; i varijabilni region lakog lanca koji sadrži:

LCDR1 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 12, LCDR2 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 14, i LCDR3 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 16; (viii) varijabilni region teškog lanca koji sadrži:

HCDR1 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 68, HCDR2 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 70, i HCDR3 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 72; i

1 varijabilni region lakog lanca koji sadrži:

LCDR1 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 12, LCDR2 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 14, i LCDR3 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 16; (ix) varijabilni region teškog lanca koji sadrži:

HCDR1 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 76, HCDR2 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 78, i HCDR3 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 80; i varijabilni region lakog lanca koji sadrži:

LCDR1 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 12, LCDR2 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 14, i LCDR3 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 16; (x) varijabilni region teškog lanca koji sadrži:

HCDR1 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 84, HCDR2 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 86, i HCDR3 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 88; i varijabilni region lakog lanca koji sadrži:

LCDR1 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 92, LCDR2 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 94, i LCDR3 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 96; (xi) varijabilni region teškog lanca koji sadrži:

HCDR1 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 100, HCDR2 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 102, i HCDR3 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 104; i varijabilni region lakog lanca koji sadrži:

LCDR1 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 92, LCDR2 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 94, i LCDR3 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 96; ili (xii) varijabilni region teškog lanca koji sadrži:

HCDR1 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 108, HCDR2 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 110, i HCDR3 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 112; i

1 varijabilni region lakog lanca koji sadrži:

LCDR1 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 92,

LCDR2 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 94, i

LCDR3 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 96.

2. Antitelo ili njegov fragment koji veže antigen prema zahtevu 1, koji sadrži:

varijabilni region teškog lanca koji sadrži:

HCDR1 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 36,

HCDR2 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 38, i

HCDR3 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 40; i

varijabilni region lakog lanca koji sadrži:

LCDR1 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 12,

LCDR2 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 14, i

LCDR3 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 16.

3. Antitelo ili njegov fragment koji veže antigen prema zahtevu 1, koji sadrži:

varijabilni region teškog lanca koji sadrži:

HCDR1 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 4,

HCDR2 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 6, i

HCDR3 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 8; i

varijabilni region lakog lanca koji sadrži:

LCDR1 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 12,

LCDR2 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 14, i

LCDR3 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 16;

4. Antitelo ili njegov fragment koji veže antigen prema zahtevu 1, koji sadrži:

varijabilni region teškog lanca koji sadrži:

HCDR1 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 28,

HCDR2 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 30, i

HCDR3 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 32; i

varijabilni region lakog lanca koji sadrži:

LCDR1 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 12,

LCDR2 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 14, i

LCDR3 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 16

1

5. Izolovano antitelo ili njegov fragment koji veže antigen koje veže humani receptor leptina (LEPR) i sadrži:

(i) varijabilni region lakog lanca kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 10; i varijabilni region teškog lanca kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 2;

(ii) varijabilni region lakog lanca kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 10; i varijabilni region teškog lanca kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 18;

(iii) varijabilni region lakog lanca kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 10; i varijabilni region teškog lanca kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 26;

(iv) varijabilni region lakog lanca kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 10; i varijabilni region teškog lanca kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 34;

(v) varijabilni region lakog lanca kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 10; i varijabilni region teškog lanca kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 42;

(vi) varijabilni region lakog lanca kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 10; i varijabilni region teškog lanca kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 50;

(vii) varijabilni region lakog lanca kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 10; i varijabilni region teškog lanca kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 58;

(viii) varijabilni region lakog lanca kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 10; i varijabilni region teškog lanca kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 66;

(ix) varijabilni region lakog lanca kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 10; i varijabilni region teškog lanca kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 74;

(x) varijabilni region lakog lanca kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 90; i varijabilni region teškog lanca kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 82;

(xi) varijabilni region lakog lanca kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 90; i varijabilni region teškog lanca kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 98; ili

(xii) varijabilni region lakog lanca kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 90; i varijabilni region teškog lanca kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 106.

6. Antitelo ili njegov fragment koji veže antigen prema bilo kom od zahteva 1-5, koje je antitelo.

7. Antitelo prema zahtevu 6, koji sadrži varijabilni region teškog lanca kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 26; i varijabilni region lakog lanca kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 10.

8. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo ili njegov fragment koji veže antigen prema bilo kom od zahteva 1 do 7, i farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač.

9. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 8 za upotrebu u postupku lečenja bolesti ili stanja koje je povezano sa ili je uzrokovano sa deficijencijom leptina ili rezistencijom na leptin, koje je izabrano iz grupe koja se sastoji iz lipodistrofije, gojaznosti, metaboličkog sindroma, funkcionalne hipotalamičke amenoreje, dijabetesa tipa 1 , dijabetesa tipa 2, insulinske rezistencije, teške insulinske rezistencije zbog mutacije u insulinskom receptoru, Alchajmerove bolesti, deficijencije leptina, rezistencije na leptin, Leprehaunism/Donohueov-og sindroma, i Rabson-Mendenhalov-og sindroma, postupak obuhvata davanje farmaceutske kompozicije subjektu kome je to potrebno.

10. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 8 za upotrebu u postupku lečenja stanja lipodistrofije kod pacijenta, postupak obuhvata davanje farmaceutske kompozicije subjektu kome je to potrebno, pri čemu je stanje lipodistrofije izabrano iz grupe koja se sastoji iz kongenitalne generalizovane lipodistrofije, stečene generalizovane lipodistrofije, familijalne parcijalne lipodistrofije, stečene parcijalne lipodistrofije centrifugalne abdominalne lipodistrofije, lipoatrophia annularis (gubitka masti u subkutanoznom delu gornjih ekstremiteta), lokalizovane lipodistrofije, i HIV-povezane lipodistrofije.

1

11. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 8 za upotrebu u postupku lečenja bolesti ili stanja koje je povezano sa ili je uzrokovano sa LEPR mutacijom koja je defektna za signalizaciju ili ometa signalizaciju, postupak obuhvata davanje farmaceutske kompozicije subjektu kome je potrebno, pri čemu:

(a) LEPR mutacija koja je defektna za signalizaciju ili ometa signalizaciju je LEPR-A409E ili LEPR-P316T; i

(b) bolest ili stanje koje je povezano sa ili je uzrokovano sa LEPR mutacijom koja je defektna za signalizaciju ili ometa signalizaciju je rani početak gojaznosti.

12. Farmaceutska kompozicija za upotrebu u postupku prema bilo kom od zahteva 9 do 11, postupak dalje sadrži davanje drugog terapeutskog sredstva subjektu, pri čemu je drugo terapeutsko sredstvo izabrano iz grupe koja se sastoji iz rekombinantnog humanog leptina, PCSK9 inhibitora, statina, ezetimiba, insulina, varijante insulina, sekretagoge insulina, metformina, sulfoniluree, inibitora natrijum glukoznog kotransportera 2, agonist/analoga GLP-1, inhibitora glukagona, inhibitora receptora glukagona, inhibitora proteina sličnog angiopoietina, fentermina, orlistata, topiramata, bupropiona, topiramata/fentermina, bupropiona/naltreksona, bupropiona/zonisamida, pramlintida/metrelepina, lorcaserina, cetilistata, tesofensina, i velneperita.

13. Izolovani polinukleotid kodira varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca antitela ili fragmenta koji veže antigen prema bilo kom od zahteva 1-7.

14. Rekombinantni vektor koji sadrži polinukleotid prema zahtevu 13 ili ćelija domaćina koja sadrži vektor.

1