RS63320B1

RS63320B1 - Supstituisani pirazolopirimidini kao aktivatori glukocerebrozidaze

Info

Publication number: RS63320B1
Application number: RS20220422A
Authority: RS
Inventors: Juan Jose Marugan; Noel Southall; M Ehud Goldin; Samarjit Patnaik; Ellen Sidransky; Omid Motabar; Wendy Westbrook; Wei Zheng
Original assignee: The U S A As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services
Priority date: 2010-12-08
Filing date: 2011-12-08
Publication date: 2022-07-29
Also published as: EP2649075A1; IL259648A; CA2820362A1; MX385600B; RU2603637C2; ZA201304215B; BR112013014242B1; AU2011338377A1; PL3366688T3; IL226767B; IL259648B; PT3366688T; MX2013006462A; ES2681218T3; ES2912284T3; DK3366688T3; CA2820362C; HRP20220512T1; PL2649075T3; WO2012078855A1

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak je delom ostvaren uz podršku Vlade od strane Nacionalnog instituta za zdravlje. Vlada ima određena prava na ovaj pronalazak.

STANJE TEHNIKE

[0002] Gošeova bolest spada u retke bolesti i pogađa 1 od 40,000 rođenih beba sa naročito vizokom učestalošću kod Aškenazi Jevreja poreklom iz Istočne Evrope (oko 1 od 800 živorođenih). Prouzrokovana je urođenim genetskim mutacijama u GBA (glukozidaza, beta kiselina) genu, koje dovode do snižene aktivnosti glukocerebrozidaze (GCase ili kisele betaglukocerebrozidaza), enzima koji se nalazi u ćelijskim organelama nazvanim lizozimi, koji je odgovoran za razgradnju masnog materijala nazvanog glukocerebrozid (ili glukozil ceramid). Nakupljanje ovog lipida unutar ćelija dovodi do njihovog abnormalnog oticanja što prouzrokuje probleme širom organizma. Bolest je kategorizovana u tri tipa: neuronopatična (tipovi 2, 3) i ne-neuronopatična (tip 1) sa blagim do teškim simptomima koji se mogu pojaviti u bilo koje vreme od detinjstva do punoletstva. Kliničke manifestacije obuhvataju uvećanu slezinu/jetru, anemiju, manjak trombocita, neurodegeneracije, kao i bolest kostiju sa različitim težinama što zavisi od tipa bolesti i vremena dijagnostikovanja. Snižavanje aktivnosti GCase pripisuje se manjku proteina u lizozomu. Nakon proizvodnje u endoplazminom retikulumu (ER), proteini koji se neispravno sklope, degradiraju se u ER i ne transportuju se u lizozom gde mogu da hidrolizuju glukocerebrozid.

[0003] Postojeće opcije lečenja Gaucher-ove bolesti obuhvataju enzimsku nadoknadu (CEREZYME) ili terapiju redukcijom supstrata (ZAVESCA) koja košta između $100,000 do >$200,000 godišnje. Razvoj iminošećera izofagomina (PLICERA) kao molekularnog šaperona, zaustavljena je nakon Faze 2 kliničkih ispitivanja, pokazujući povećanje količine GCase u ćelijama bele loze u krvi ali nedostatak smanjivanja visceralnih simptoma. Tako da postoji potreba za razvojem nove šaperonske terapije za Gaucher-ovu bolest. Ovo izlaganje ispunjava ovu potrebu i obezbeđuje dodatne prednosti, objašnjene u izlaganju u nastavku.

[0004] WO 2009/152083 A1 izlaže jedinjenja pirazolo[2,3-B]pirazina koja deluju kao inhibitori kinaze. Jedinjenja imaju opštu formulu

[0005] U poređenju sa jedinjenjima zahteva, jedinjenja izložena u WO 2009/152083 A1 imaju različitu strukturu jezgra i ne uključuju karboksamid u definisanju L1. Sem toga, ova jedinjenja nisu registrovana da imaju glukocerebrozidaznu aktivnost.

KRATKO IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA

[0006] Ovde su opisani supstituisani pirazolopirimidini i dihidropirazolopirimidini i srodna jedinjenja, postupci za njihovu proizvodnju, kompozicije koje sadrže opisana jedinjenja i, postupci za primenu opisanih jedinjenja. Izloženo je jedinjenje koje ima Formulu (I) i farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja Formule (I)

gde je prsten

prstenski sistem formule

(i)

u kojoj je R5opciono supstituisana vinil grupa i R6i R7imaju definicije date u nastavku, ili

(ii)

gde R5, R6, i R7imaju definicije date u nastavku.

R1je C1-C6alkil, C2-C6alkenil, C2-C6alkinil, (mono- ili biciklični karbocikl)Co-C4alkil ili (mono- ili biciklični heterocikl)C0-C4alkil, od kojih je svaki R1nesupstituisan ili supstituisan sa jednim ili više supstituenata nezavisno odabranih od: halogena, hidroksila, cijano, nitro, amino, -CHO, -COOH, C1-C6alkila, C2-C6alkenila, C2-C6alkinila, C1-C6alkoksi, C2-C6alkanoila, (mono- ili di- C1-C6alkilamino)C0-C4alkila, mono- ili di-C1-C6alkilkarboksamida, C1-C6alkilestra, C1-C6alkiltio, C1-C6alkilsulfonila, C1-C2haloalkila, i C1-C2haloalkoksi, i sa 0 ili 1 supstituentom, odabranim od Y-Z- gde je Z kovalentna veza, C1-C4alkilen, -S-, -O-, -NR-, -C(O)-, -NHC(O)-, ili -C(O)NH-, pri čemu je R vodonik ili C1-C4alkil, i Y je fenil ili piridil, od kojih je svaki nesupstituisan ili supstituisan sa 1 do 3 supstituenta nezavisno odabrana od: halogena, hidroksila, cijano, nitro, amino, C1-C4alkila, C1-C4alkoksi, trifluorometila, difluorometila, i trifluorometoksi; i R2je vodonik, C1-C6alkil, C3-C7cikloalkil, i (fenil)C0-C2alkil.

[0007] Ili, R1i R2su spojeni i formiraju 5- do 7-člani heterocikloalkilni prsten koji ima 0 ili 1 dodatni heteroatom, odabran od N, O, i S, pri čemu je 5- do 7-člani heterocikloalkilni prsten opciono spojen sa fenilom ili piridilom; pri čemu je 5- do 7-člani heterocikloalkilni prsten nesupstituisan ili supstituisan sa jednim ili više supstituenata, nezavisno odabranih od: halogena, hidroksila, C1-C2alkila, i C1-C2alkoksi.

[0008] R3je vodonik ili C1-C2alkil.

[0009] R5je halogen, hidroksil, amino, cijano, C1-C4alkil, vinil, ciklopropil, ciklopropilidenil, C1-C4alkoksi, difluorometil, trifluorometil, ili fenil.

[0010] R6je halogen, hidroksil, C1-C4alkil, ili C1-C4alkoksi.

[0011] R7je halogen, hidroksil, amino, cijano, C1-C4alkil, C1-C4alkoksi, difluorometil, ili trifluorometil, ili

R7je fenil ili 5- do 7-člani heterocikloalkilni prsten koji ima 1 ili 2 heteroatoma odabrana od N, O, i S, od kojih je svaki R7direktno vezan preko kovalentne veze ili je vezan preko C1-C4alkila, C1-C4alkoksi, ili C1-C4alkilamino grupe, i od kojih je svaki R7nesupstituisan ili je supstituisan sa 1 do 3 supstituenta nezavisno odabrana od halogena, hidroksila, C1-C4alkila, C1-C4alkoksi, (mono- i di-C1-C2alkilamino)C0-C4alkila, C1-C2haloalkila, i C1-C2haloalkoksi; ili

R6i R7zajedno formiraju 5- ili 6-člani karbociklični prsten bez dodatnih tačaka nezasićenja, pri čemu je prsten nesupstituisan ili je supstituisan sa 1 do 3 supstituenta nezavisno odabrana od C1-C2alkila i C1-C2alkoksi.

[0012] U izvesnim ostvarenjima, R1nije nesupstituisani fenil, dihidroindenil, benzi[b][1,4]diokolil, benzo[d][1,3]diokol-5-il, cikloheksil, piridil, ili fenil supstituisan sa 1 do 3 supstituenta nezavisno odabrana od hloro, fluoro, C1-C4alkila, C1-C2alkoksi, acetila, i trifluorometila, kada je R6vodonik, R5i R7su oba metil, ili kada je R6vodonik i jedan od R5i R7je metil dok je drugi fenil. Isto tako, R1nije 1-(4-fluorobenzil)-1H-pirazol-4-il kada je R6vodonik i jedan od R5i R7je metil dok je drugi fenil.

[0013] Izložena je farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje Formule I, ili njegovu so, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju prema ma kom od patentnih zahteva 1 do 4. Pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju prema ma kom od patentnih zahteva 1 do 4 a za primenu kao lek, kako je zahtevano u patentnom zahtevu 5. Pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju prema ma kom od patentnih zahteva 1 do 4 za primenu u lečenju Gaucher-ove bolesti kod pacijenata ili prevenciju simptoma Gaucher-ove bolesti kod pacijenata koji imaju mutaciju na GBA genu putem primenjivanja efektivne količine farmaceutske kompozicije pacijentu kako je zahtevano u patentnom zahtevu 6. Pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju prema ma kom od patentnih zahteva 1 do 4 za primenu za povećanje količine beta glukocerebrozidaze u beloj lozi krvnih ćelija kod pacijenta koji ima mutaciju na GBA genu putem primenjivanja efektivne količine farmaceutske kompozicije pacijentu kako je zahtevano u patentnom zahtevu 7. Pronalazak se odnosi na jedinjenje ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so kako je zahtevano u patentnom zahtevu 8.

[0014] Izložen je postupak lečenja Gaucher-ove bolesti kod pacijenta ili prevenciju ili smanjivanje težine simptoma Gaucher-ove bolesti kod pacijenta koji ima mutaciju na GBA genu koji obuhvata davanje efektivne količine jedinjenja Formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli pacijentu.

[0015] Izložen je postupak povećanja količine beta glukocerebrozidaze u beloj lozi krvnih ćelija kod pacijenta koji ima mutaciju na GBA genu, koji obuhvata davanje efektivne količine jedinjenja Formule (I) pacijentu.

DETALJAN OPIS

[0016] Ovde su opisani supstituisani pirazolopirimidini i dihidropirazolopirimidini i srodna jedinjenja, koji su korisni kao šaperoni glukocerebrozidaze. Izvesni supstituisani pirazolopirimidini i dihidropirazolopirimidini i srodna jedinjenja koji su izloženi u ovoj prijavi, moćni su i selektivni aktivatori glukocerebrozidaze. Ova jedinjenja su korisna u lečenju Gaucherove bolesti i prevenciji simptoma Gaucher-ove bolesti kod osoba koje imaju mutirani GBA gen.

TERMINOLOGIJA

[0017] Jedinjenja su opisana upotrebom standardne nomenklature. Ukoliko nije drugačije definisano, svi ovde korišćeni tehnički i naučni izrazi imaju ista značenja kako ih uobičajeno tumače stručna lica u ovoj oblasti kojima je i namenjen ovaj pronalazak.

[0018] Izrazi "a" i "an" (neodređeni članovi u engl. jeziku, prim. prev.) ne označavaju ograničenje količine, već pre označavaju prisustvo najmanje jedne od stavki na koje se odnose. Izraz "ili" znači "i/ili". Izrazi "obuhvataju", "imaju", "uključuju", i "sadrže" treba da se protumače kao izrazi otvorenog kraja (tj., značeći "uključujući, ali se time ne ograničavajući"). Navedeni opsezi vrednosti su samo namenjeni da posluže kao skraćeni postupak, odnoseći se pojedinačno na svaku zasebnu vrednost koja je unutar opsega, ukoliko nije ovde drugačije naznačeno, kao što je svaka zasebna vrednost inkorporirana u Opis, kao da je ovde pojedinačno navedena. Završne tačke svih opsega su obuhvaćene unutar opsega i nezavisno se mogu kombinovati. Svi postupci, koji su ovde opisani se mogu izvesti prikladnim redosledom, ukoliko nije ovde drugačije naznačeno, ili jasno kontekstom protivrečeno. Korišćenje bilo kog i svih primara, ili jezika za navođenje primera (npr., "kao"), namenjeno je samo boljoj ilustraciji pronalaska i nije namenjeno ograničavanju okvira pronalaska, sem ukoliko nije drugačije zahtevano. Nikakvi izrazi u Opisu ne bi trebalo da budu shvaćeni da ukazuju na element koji nije u zahtevu što je suštinsko za praktikovanje pronalaska kako je ovde primenjen. Ukoliko nije drugačije definisano, tehnički i naučni izrazi koji su ovde korišćeni imaju ista značenja kao što se uobičajeno razumeju od strane stručnih lica u ovoj oblasti kojima je pronalazak i namenjen.

[0019] Podrazumeva se da sva jedinjenja obuhvataju sve moguće izotope atoma koji se pojavljaju u jedinjenjima. Izotopi uključuju one atome koji imaju isti atomski broj ali različit maseni broj. Kao opšti primer, a bez ograničavanja, izotopi vodonika obuhvataju tricijum i deuterijum i, izotopi ugljenika obuhvataju<11>C,<13>C, i<14>C.

[0020] Izraz "supstituisan" označava da je bilo koji ili više vodonika na označenom atomu ili grupi zamenjeno sa izborom od indikovanih grupa, uz uslov da naznačena atomska normalna valenca nije prevaziđena. Kada je supstituent okso (tj., =O), onda su 2 vodonika na atomu zamenjena. Kada su aromatični delovi supstituisani okso grupom, aromatični prsten je zamenjen odgovarajućim delimično nezasićenim prstenom. Na primer, piridil grupa supstituisana sa okso je piridon. Kombinacije supstituenata i/ili promenljivih su dozvoljene samo ako takve kombinacije dovode do stabilnih jedinjenja ili korisnih sintetskih intermedijera. Stabilno jedinjenje ili stabilna struktura znači da se implementira jedinjenje koje je dovoljno robustno da preživi izolaciju iz reakcione smeše, a zatim i formulisanje u efektivno terapeutsko sredstvo.

[0021] Pogodne grupe koje mogu biti prisutne na "opciono supstituisanom" položaju uključuju, ali se ne ograničavaju na, npr., halogen, cijano, hidroksil, amino, nitro, oko, azido, alkanoil (kao što je C2-C6alkanoil grupa kao acil i slične); karboksamido; alkilkarboksamid; alkil grupe, alkoksi grupe, alkiltio grupe uključujući one koje imaju jednu ili više tioetarskih veza, alkilsulfinil grupe uključujući one koje imaju jednu ili više sulfinil veza, alkilsulfonil grupe uključujući one koje imaju jednu ili više sulfonil veza, mono- i diaminoalkil grupe uključujući one koje imaju jedan ili više N atoma, svi od prethodno pomenutih opcionih alkil supstituenata mogu imati jednu ili više metilen grupa zamenjenih kiseonikom ili sa -NH-, i imati od oko 1 do oko 8, od oko 1 do oko 6, ili od 1 do oko 4 atoma ugljenika, cikloalkil; fenil; fenilalkil sa benzilom koja je fenilalkil grupa, fenilalkoksi sa benziloksi koja je fenilalkoksi grupa.

[0022] Crtica ("-") koja nije između dva slova ili simbola, koristi se da označi tačku vezivanja za supstituent.

[0023] "Alkil" obuhvata i razgranati i ravan lanac zasićenih alifatičnih ugljovodoničnih grupa, koje imaju preciziran broj atoma ugljenika. Izraz C1-C2alkil označava alkil grupu koja ima od 1 do otprilike 2 atoma ugljenika, npr., metil odnosno, etil. Slično, "alkenil" je razgranati ili ravan lanac nezasićene ugljovodonične grupe, koja ima preciziran broj atoma ugljenika i najmanje jednu ugljenik-ugljenik dvostruku vezu i, alkinil je je razgranati ili ravan lanac nezasićene ugljovodonične grupe, koja ima preciziran broj atoma ugljenika i najmanje jednu ugljenik-ugljenik trostruku vezu.

[0024] "Alkilen" je ravnolančani ili razgranat zasićeni bivalentni ugljenični lanac koji ima naznačen broj atoma ugljenika.

[0025] "Alkilestar" je alkil grupa kao što je prethodno definisana, koja je povezana preko estarske veze. Estarska veza može biti u bilo kojoj organizaciji atoma, npr., grupa formule -O(C=O)alkil ili grupa formule -(C=O)Oalkil.

[0026] "Alkilestar" " je alkil grupa kao što je prethodno definisana, koja je povezana preko estarske veze. Estarska veza može biti u bilo kojoj organizaciji atoma, npr., grupa formule -O(C=O)alkil ili grupa formule -(C=O)Oalkil.

[0027] "Alkilestar" je alkil grupa kao što je prethodno definisana, koja je povezana preko estarske veze. Estarska veza može biti u bilo kojoj organizaciji atoma, npr., grupa formule -O(C=O)alkil ili grupa formule -(C=O)Oalkil.

[0028] "Alkanoil" je alkil grupa kao što je prethodno definisana, koja je povezana preko keto (-(C=O)-) mosta. Alkanoil grupe imaju naznačen broj atoma ugljenika, uz to da je ugljenik keto grupe uključen u broj atoma ugljenika. Na primer a C2alkanoil grupa je acetil grupa koja ima formulu CH3(C=O)-.

[0029] "Alkilsulfonil" je grupa sa formulom alkil-(SO2)-, pri čemu je alkil grupa takva alkil grupa, kako je prethodno definisana, koja ima definisan broj atoma ugljenika. Alkilsulfonil grupa, kao primer je metilsulfonil.

[0030] "Alkiltio" označava alkil grupu kako je prethodno definisana, povezanu preko sumporne veze, tj. grupa formule alkil-S-. Primeri uključuju etiltio i pentiltio.

[0031] "Alkoksi" označava alkil grupu kako je prethodno definisana, sa naznačenim brojem atoma ugljenika, povezanu preko kiseoničnog mosta.

[0032] "Cikloalkil" je zasićena ugljovodonična prstenasta grupa, koja ima prciziran broj atoma ugljenika, obično od 3 do otprilike 7 atoma ugljenika. Primeri cikloalkil grupa obuhvataju ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, ili cikloheksil, baš kao i premošćene ili ušančene zasićene prstenaste grupe, kao što su norboran ili adamantan.

[0033] "Mono- ili biciklični karbocikl" je 3- do 8-člani zasićeni, delimično nezasićeni, ili aromatični prsten koji sadrži samo atome ugljenika u prstenu ili 6 do 11-člani zasićeni, delimično nezasićeni, ili aromatični biciklični karbociklični sistem prstenova koji sadrži samo atome ugljenika u prstenu. Ukoliko nije drugačije naznačeno, karbociklična grupa može biti vezana za svoju privezanu grupu na bilo kom atomu ugljenika ako rezultira u stabilnoj strukturi. Kada je indikovano, ovde opisani karbociklični prstenovi mogu biti supstituisani na ma kom mogućem ugljeniku u prstenu ukoliko je dobijeno jedinjenje stabilno. Karbociklične grupe obuhvataju cikloalkil grupe, kao što su ciklopropil i cikloheksil; cikloalkenil grupe, kao što su cikloheksenil, premošćene cikloalkil grupe; i aril grupe, kao što je fenil.

[0034] "Halo" ili "halogen" označava fluoro, hloro, bromo, ili jodo.

[0035] "Heterocikloalkil" je zasićena ciklična grupa koja ima naznačen broj atoma u prstenu koji sadrži od 1 do otprilike 3 heteroatoma odabrana od N, O, i S, sa ostalim atomima, koji su atomi ugljenika. Primeri heterocikloalkil grupa uključuju tetrahidrofuranil i pirolidinil grupe.

[0036] "Mono- ili biciklični-heterocikl" je 5- do 8-člani zasićeni, delimično nezasićeni, ili aromatični prsten koji sadrži od 1 do otprilike 4 heteroatoma odabrana od N, O, i S, sa ostalim atomima, koji su atomi ugljenika, ili 7- do 11-člani biciklični zasićeni, delimično nezasićeni, ili aromatični heterociklični prstenasti sistem, od kojih svaki sadrži najmanje 1 heteroatom u višestrukom sistemu prstenova odabran od N, O, i S i sadrži do otprilike 4 heteroatoma nezavisno odabrana od N, O, i S u svakom prstenu višestrukog prstenastog sistema. Ukoliko nije drugačije naznačeno, heterociklični prsten može biti vezan za grupu koju supstituiše na bilo kom od heteroatoma ili atoma ugljenika koji dovodi do stabilne strukture. Kada je naznačeno, ovde opisani heterociklični prstenovi mogu biti supstituisani na atomu ugljenika ili azota ukoliko je nastalo jedinjenje stabilno. Atom azota u heterociklu može opciono biti kvaternizovan. Poželjno je da ukupan broj heteroatoma u heterocikličnim grupama nije veći od 4 i da ukupan broj S i O atoma u heterocikličnoj grupi nije veći od 2, poželjnije ne veći od 1. Primeri heterocikličnih grupa uključuju: piridil, indolil, pirimidinil, piridizinil, pirazinil, imidazolil, oksazolil, furanil, tiofenil, tiazolil, triazolil, tetrazolil, izoksazolil, hinolinil, pirolil, pirazolil, benz[b]tiofenil, izohinolinil, quinazolinil, hinoksalinil, tienil, izoindolil, dihidroizoindolil, 5,6,7,8-tetrahidroizohinolin, piridinil, pirimidinil, furanil, tienil, pirolil, pirazolil, pirolidinil, morfolinil, piperazinil, piperidinil, i pirolidinil.

[0037] "Mono- i/ili di-alkilamino" označava sekundarne ili tercijarne alkil amino grupe, pri čemu su alkil grupe kao što su prethodno definisane i imaju naznačen broj atoma ugljenika. Tačka vezivanja alkilamino grupe je na azotu. Alkil grupe se biraju nezavisno. Primeri mono- i dialkilamino grupa uključuju etilamino, dimetilamino, i metil-propil-amino.

[0038] "Mono- ili di-alkilkarboksamid" je grupa koja ima formulu -(C=O)Nalkil1alkil2, gde su alkil1i alkil2grupe nezavisno odabrane alkil grupe kako su ovde definisane, povezane preko karboksamidne veze. Karboksamidna veza može biti bilo koje orjentacije, npr., -NH(C=O)- ili -(C=O)NH-.

[0039] "Haloalkil" označava i razgranale i ravnolančane alkil grupe koje imaju preciziran broj atoma ugljenika, supstituisane sa 1 ili više halogenih atoma, generalno do najvećeg mogućeg broja halogenih atoma. Primeri haloalkila uključuju, ali se ovima ne ograničavaju, trifluorometil, difluorometil, 2-fluoroetil, i penta-fluoroetil.

[0040] "Haloalkoksi" označava haloalkil grupu kako je prethodno definisana, povezanu preko kiseoničnog mosta (kiseonik alkoholnog radikala).

[0041] "Farmaceutske kompozicije" označavaju kompozicije koje sadrže najmanje jedno aktivno sredstvo, kao što je jedinjenje ili so Formule I, i najmanje još jednu drugu supstancu, kao što je nosač. Farmaceutske kompozicije ispunjavaju standarde U.S. FDA GMP (dobra proizvođačka praksa) za humane ili ne-humane lekove.

[0042] "Nosač" označava diluent, podlogu, ili vehikulum sa kojim se aktivno jedinjenje primenjuje. "Farmaceutski prihvatljiv nosač" označava supstancu npr., podlogu, diluent, ili vehikulum, koja se koristi u izradi farmaceutske kompozicije i koja je generalno bezbedna, netoksična i nije niti biološki niti na drugi način nepoželjna, i uključuje nosač koji je prihvatljiv za veterinarsko primenjivanje kao i za humano farmaceutsko korišćenje. "Farmaceutski prihvatljiv nosač" obuhvata oba izraza i jedan i više od jednog takvog nosača.

[0043] "Pacijent" označava čoveka ili ne-čoveka, tj, životinju kojima je potrebno medicinsko lečenje. Medicinsko lečenje može uključiti tretman postojećeg stanja, kao što je bolest ili poremećaj, profilaktički ili preventivni tretman, ili dijagnostički tretman. U nekim ostvarenjima, pacijent je čovek.

[0044] "Obezbeđivanje" označava davanje, primenjivanje, prodaju, distribuciju, transfer (sa ili bez profita), proizvodnju, sjedinjavanje, ili izdavanje.

[0045] "Tretman" ili "lečenje" označava davanje aktivnog jedinjenja pacijentu u količini dovoljnoj za merljivo smanjenje svakog simptoma poremećaja kog posreduje beta-glukocerebrozidaza, npr., prouzrokovanje regresije poremećaja, funkcije jetre, smanjenje anemije, povećanje broja trombocita, ili smanjenje brzine neurodegeneracije ili degeneracije kostiju. U izvesnim ostvarenjima, lečenje Gaucher-ove bolesti može otpočeti pre nego što pacijent ispolji simptome bolesti.

[0046] "Terapeutski efektivna količina" farmaceutske kompozicije označava količinu koja je delotvorna, kada se primeni pacijentu, da obezbedi terapeutsku korist, kao što je ublažavanje simptoma, npr., količinu delotvornu da umanji simptome Gaucher-ove bolesti.

[0047] Značajna promena je svaka promena koja se može otkriti, a koja je statistički značajna u standardnom parametarskom testu statističke značajnosti, kao što je Studentov T-test, gde je p < 0.05.

HEMIJSKI OPIS

[0048] Jedinjenja formule I mogu imati jedan ili više asimetričnih elemenata, kao što su stereogenski centri, stereogenske ose i slično, npr., asimetrične atome ugljenika, tako da jedinjenja mogu postojati u različitim stereoizomernim formama. Ova jedinjenja mogu biti, na primer, racemati ili optički aktivni oblici. Za jedinjenja sa dva ili više asimetričnih elemenata, ovakva jedinjenja mogu dodatno biti smeše dijastereomera. Za jedinjenja koja imaju asimetrične centre, obuhvaćeni su svi optički izomeri u čistom obliku i u obliku njihovih smeša. U ovim situacijama, pojedinačni enantiomeri, tj., optički aktivni oblici mogu da se dobiju asimetričnom sintezom, sintezom počevši od optički čistih prekursora, ili razdvajanjem racemata. Razdvajanje racemata se, isto tako, može postići, na primer, konvencionalnim postupcima, kao što su kristalizacija u prisustvu sredstva za razdvajanje, ili hromatografijom, korišćenjem, na primer hiralne HPLC kolone. Ovde su razmotreni svi oblici bez obzira na postupke, koji su korišćeni za njihovo dobijanje.

[0049] Svi oblici (na primer solvati, optički izomeri, enantiomerni oblici, polimorfi, slobodna jedinjenja i soli) aktivnog sastojka mogu da se upotrebe bilo sami ili u kombinaciji.

[0050] Izraz "hiralan" se odnosi na molekule, koji imaju svojstvo ne-supernemogućnosti slike u ogledalu partnera.

[0051] "Stereoizomeri" su jedinjenja, koja imaju identičan hemijski sastav, ali se razlikuju u pogledu organizacije atoma ili grupa u prostoru.

[0052] "Dijastereomer" je stereoizomer sa dva ili više centara hiralnosti i čiji molekuli nisu slike u ogledalu jedan drugome. Dijastereomeri imaju različite fizičke osobine, npr., tačke topljenja, tačke ključanja, spektralna svojstva, i reaktivnosti. Smeše dijastereomera se mogu razdvojiti analitičkim procedurama koje primenjuju visoke rezolucije, kao što su elektroforeza, kristalizacija u prisustvu sredstva za razdvajanje, ili hromatografija, koja koristi, na primer hiralnu HPLC kolonu.

[0053] "Enantiomeri" se odnosi na dva stereoizomera jedinjenja, koja su ne-supernemoguće slike u ogledalu jedan drugome. Smeše u odnosu 50:50 enantiomera se označavaju kao racemske smeše ili racemati, koje se mogu javiti tamo gde nema stereoselekcije ili stereospecifičnosti u hemijskoj reakciji ili procesu.

[0054] Stereohemijske definicije i konvencije, koje su ovde korišćene, uopšteno prate: S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; and Eliel, E. and Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., New York. Mnoga organska jedinjenja postoje u optički aktivnim oblicima, tj., mogu da rotiraju ravan ravanski-polarizovane svetlosti. U opisivanju optički aktivnog jedinjenja, prefiksi D i L ili R i S se koriste da označe apsolutnu konfiguraciju molekula oko svog hiralnog centra(centara). Prefiksi d i 1 ili (+) i (-) se koriste da označe smer rotacije ravanski-polarizovane svetlosti koji jedeinjenje ima, sa (-) ili 1 označava se da je jedinjenje levorotirajuće. Jedinjenje koje ima prefiks (+) ili d je desnorotirajuće.

[0055] "Racemska smeša" ili "racemat" je ekvimolarna (ili 50:50) smeša dve enantiomerne vrste, koja nema optičku aktivnost. Racemska smeša se može pojaviti tamo gde nema stereoselekcije ili stereospecifičnosti u hemijskoj reakciji ili procesu.

[0056] "Farmaceutski prihvatljive soli" uključuju derivate izloženih jedinjenja gde je matično jedinjenje modifikovano obrazovanjem njihovih neorganskih i organskih, ne-toksičnih, kiselih ili baznih adicionih soli. Soli ovde izloženih jedinjenja mogu da se sintetišu od matičnog jedinjenja koje sadrži bazne ili kisele delove konvencionalnim hemijskim postupcima. Generalno, takve soli mogu da se izgrade reakcijom slobodnih kiselih oblika ovih jedinjenja sa stehiometrijskom količinom odgovarajuće baze (kao što su Na, Ca, Mg, ili K hidroksid, karbonat, bikarbonat, ili slične), ili reakcijom slobodnih baznih oblika ovih jedinjenja sa stehiometrijskom količinom odgovarajuće kiseline. Ove reakcije se uobičajeno izvode u vodi ili u organskom rastvaraču, ili mešavini ovih. Generalno, praktično su se koristili ne-vodeni medijumi, kao što su etar, etil acetat, etanol, izopropanol, ili acetonitril. Soli ovih jedinjenja dalje obuhvataju solvate jedinjenja i soli jedinjenja.

[0057] Primeri farmaceutski prihvatljivih soli uključuju, ali nisu ovima ograničeni, soli mineralnih ili organskih kiselina sa baznim ostacima kao što su amini; alkalne ili organske soli sa kiselim ostacima kao što je karboksilna kiselina; i slično. Farmaceutski prihvatljive soli uključuju konvencionalne ne-toksične soli i kvaternerne amonijum soli matičnog jedinjenja formirane, na primer, od ne-toksičnih neorganskih ili organskih kiselina. Na primer, konvencionalne ne-toksične kisele soli uključuju one, izvedene od neorganskih kiselina kao što su: hlorovodonična, bromovodonična, sumporna, sulfaminska, fosforna, azotna i slične; i soli izgrađene od organskih kiselina, kao što su: sirćetna, propanska, jantarna, glikolna, stearinska, mlečna, jabučna, vinska, limunska, askorbinska, pamoinska, maleinska, hidroksimaleinska, fenilsirćetna, glutaminska, benzojeva, salicilna, mezilatna, ezilatna, bezilatna, sulfanilna, 2-acetoksibenzojeva, fumarna, toluensulfonska, metansulfonska, etan disulfonska, oksalna, izetjonska, HOOC-(CH2)n-COOH gde je n 0-4, i slične. Liste dodatnih pogodnih soli mogu se pogledati, npr., u: Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., p.1418 (1985).

[0058] Ovde su izloženi mali molekuli koji aktiviraju GCase enzim. Podaci ukazuju na to da ovi mali molekuli mogu da deluju kao šaperoni, koji pomažu pogrešno prostorno organizovanom proteinu da zauzme ispravan položaj i mogu da se prenesu sa endoplazminog retikuluma u lizozom. Većina malih molekula šaperona, opisanih u literaturi su inhibitori GCase i tako mogu potencijalno inhibirati enzimsku aktivnost u lizozomu. Ovdašnje hemijske serije imaju prednosti kao jedinjenja koja ne inhibišu, već pre aktiviraju GCase. Hemijska klasa pirazolo[1, 5-a] pirimidin-3-karboksamida je, isto tako, strukturno udaljena od iminošećera, često opisivanih kao šaperoni u literaturi, i drže obećanje spram selektivnosti prema drugim glikozidazama.

[0059] Osim jedinjenja Formule (I), prethodno prikazanih u delu Kratko izlaganje suštine pronalaska, takođe su izložena i Jedinjenja II i III, koja su subformule Formule I, kao i jedinjenja u kojima promenljive, npr., R1-R7imaju sledeće definicije.

[0060] U Formuli III, izloženo je da je Rsa vodonik, C1-C4alkil, C3-C7cikloalkil, ili 4- do 7-člani ugljenično povezani heterocikloalkil, koji ima 1 ili 2 heteroatoma nezavisno odabrana od N, S, i O.

[0061] U izvesnim ostvarenjima Formule III, izloženo je da je Rsa vodonik ili ciklopropil.

[0062] Ovde su obuhvaćena i jedinjenja i soli za Formulu II u kojoj:

R2je vodonik ili metil.

[0063] Dalje su ovde obuhvaćena i jedinjenja i soli za Formulu II u kojoj:

R5i R7su oba metil; ili

jedan od R5i R7je metil dok je drugi fenil; ili

jedan od R5i R7je metil dok je drugi difluorometil.

[0064] Ovde su obuhvaćena jedinjenja i soli za Formulu II u kojoj:

R1je (pirimidinil)C0-C4alkil, (C3-C7cikloalkil)C0-C4alkil, (pirazolil)C0-C2alkil, (pirolil)C0-C2alkil, (imidazolil)C0-C2alkil, (tienil)C0-C2alkil, (oksazolil)C0-C2alkil, (tiazolil)C0-C2alkil, pirolidinil, naftil, hinolinil, izohinolinil, tetrahidronaftil, tetrahidrohinolinil, tetrahidroizohinolinil, tetrahidrofuranil, morfolinil, piperidinil ili tiomorfolinil, od kojih je svaki nesupstituisan ili je supstituisan sa jednim ili više supstituenata nezavisno odabranih od: halogena, hidroksila, cijano, nitro, amino, -CHO, -COOH, C1-C6alkila, C1-C6alkoksi, C2-C6alkanoila, mono- ili di-C1-C6alkilamino, mono- ili di-C1-C6alkilkarboksamida, C1-C6alkilestra, C1-C6alkiltio, C1-C6alkilsulfonila, C1-C2haloalkila, i C1-C2haloalkoksi, i sa 0 ili 1 supstituentom odabranim od Y-Z- gde je Z kovalentna veza, C1-C4alkilen, -S-, -O-, -NR-, -C(O)-, -NHC(O)-, ili

-C(O)NH-, gde je R vodonik ili C1-C4alkil, i Y je fenil ili piridil, od kojih je svaki nesupstituisan ili supstituisan sa 1 do 3 supstituenta nezavisno odabrana od: halogena, hidroksila, cijano, nitro, amino, C1-C4alkila, i C1-C4alkoksi.

[0065] Izložena su Jedinjenja i soli Formula I, II, i III u kojima je R1(fenil)C0-C2alkil, supstituisan sa najmanje jednim supstituentom, odabranim od: cijano, trifluorometila, CH3C(O)NH-, ili R1je cikloheksil, supstituisan sa najmanje jednim trifluorometilom, C3-C6alkilom; ili R1je dihidroindenil, hinolinil, ili izohinolinil; od kojih svaki R1može biti supstituisan sa jednim ili više supstituenta nezavisno odabranih od: halogena, hidroksila, cijano, nitro, amino, -CHO, -COOH, C1-C4alkila, C1-C4alkoksi, C2-C4alkanoila, mono- ili di-C1-C4alkilamino, C1-C2haloalkila, i C1-C2haloalkoksi.

[0066] Izložena su jedinjenja i soli Formule I, II, i III u kojima:

R2je vodonik ili metil; a R7je C1-C4alkil, difluorometil, ili fenil. U nekim ostvarenjima je izloženo da je R7difluorometil.

[0067] Izložena su Jedinjenja i soli Formula I, II, i III u kojima:

R2je vodonik ili metil; i R7je metil ili difluorometil; i

R1je (fenil)C0-C2alkil, (piridil)C0-C2alkil, (cikloheksil)C0-C2alkil, pirazolil, furanilnaftil, hinolinil, izohinolinil, tetrahidronaftil, tetrahidrohinolinil, tetrahidroizohinolinil tetrahidrofuranil, morfolinil, piperidinil, piperazinil, tiomorfolinil, dihidroindenil, benzo[b][1,4]dioksinil, ili benzo[d][1,3]diokolil, od kojih je svaki nesupstituisan ili supstituisan sa jednim ili više supstituenata nezavisno odabranih od: halogena, hidroksila, cijano, nitro, amino, -CHO, -COOH, C1-C4alkila, C1-C4alkoksi, C2-C4alkanoila, mono- ili di-C1-C4alkilamino, mono- ili di-C1-C4alkilkarboksamida, C1-C4alkilestra, C1-C2alkilsulfonila, trifluorometila, trifluorometoksi, i difluorometila, i sa 0 ili 1 supstituentom odabranim od Y-Z- gde je Z kovalentna veza, C1-C4alkilen, -S-, -O-, -NR-, -C(O)-, -NHC(O)-, ili -C(O)NH-, gde je R vodonik ili C1-C4alkil, a Y je fenil ili piridil, od kojih je svaki nesupstituisan ili supstituisan sa 1 do 3 supstituenta nezavisno odabranih od: halogena, hidroksila, C1-C2alkila, i C1-C2alkoksi.

[0068] Jedinjenja Formule I imaju sledeće tautomerne formule:

FARMACEUTSKI PREPARATI

[0069] Supstituisani pirazolopirimidini i dihidropirazolopirimidini, koji su ovde izloženi, mogu da se primene kao čista hemikalija, ali se naročito primenjuju u vidu farmaceutske kompozicije, na primer, farmaceutske formulacije koja sadrži supstituisano pirazolopirimidinsko ili dihidropirazolopirimidinsko jedinjenje Formule I ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, zajedno sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim nosačem. Farmaceutska kompozicija može biti formulisana u vidu injektabilne tečnosti, aerosola, kreme, gela, tablete, pilule, kapsule, sirupa, ili transdermalnog flastera.

[0070] Supstituisani pirazolopirimidini i dihidropirazolopirimidini mogu se primeniti oralno, površinski, parenteralno, inhalaciono ili sprejem, sublingvalno, transdermalno, putem bukalne primene, rektalno, kao rastvor za oko, ili drugim putevima, u jediničnim doznim formulacijama koje sadrže konvencionalne farmaceutski prihvatljive nosače. Farmaceutska kompozicija može biti formulisana kao ma koji farmaceutski koristan oblik, npr., kao aerosol, krema, gel, pilula, kapsula, tableta, sirup, transdermalni flaster, ili oftalmički rastvor. Neki dozni oblici, kao što su tablete i kapsule, podeljeni su u jedinične doze prikladne veličine, koje sadrže odgovarajuće količine aktivnih komponenti, npr., efektivnu količinu za ostvarivanje željene namene.

[0071] Nosači obuhvataju podloge i diluente i, moraju imati dovoljno visoku čistoću i dovoljno nisku toksičnost da bi se uvrstili kao pogodni za primenjivanje pacijentu koji se leči. Nosač može biti inertan ili može imati sopstvene farmaceutske benefite. Količina nosača koja se koristi zajedno sa jedinjenjem je dovoljna da obezbedi praktičnu količinu materijala za primenjivanje jedinjenja po jedinici doze.

[0072] Klase nosača obuhvataju, ali nisu ovima ograničene, vezujuća sredstva, puferujuća sredstva, agense za boju, diluente, sredstva za raspadljivost, emulgatore, sredstva za aromu, sredstva za klizanje, lubrikanse, konzervanse, stabilizatore, surfaktante, sredstva za tabletiranje, i vlažeća sredstva. Neki nosači mogu biti ubrojani u više od jedne klase, na primer, biljno ulje može biti korišćeno kao lubrikans u nekim formulacijama i i kao diluent u drugim. Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača obuhvataju šećere, skrobove, celuloze, sprašenu tragakantu, slad, želatin, talk, i biljna ulja. Opciono aktivni i/ili inaktivni agensi mogu biti obuhvaćeni farmaceutskim kompozicijama, uz uslov da takvi agensi suštinski ne interferiraju sa aktivnošću hidrazonskih i diacil hidrazinskih jedinjenja, koja se koriste u farmaceutskim kompozicijama. Opciono aktivan je dodatni aktivan agens koji nije jedinjenje ili so Formule I.

[0073] Farmaceutske kompozicije mogu biti formulisane za oralno primenjivanje. Ove kompozicije sadrže između 0.1 i 99 težinskih % (tež.%) hidrazonskog ili diacil hidrazinskog jedinjenja i obično, bar otprilike 5 tež.% hidrazonskog ili diacil hidrazinskog jedinjenja. Neka ostvarenja sadrže od otprilike 25 tež.% do otprilike 50 tež. % ili od oko 5 tež.% do oko 75 tež.% hidrazonskog ili diacil hidrazinskog jedinjenja.

POSTUPCI LEČENJA

[0074] Jedinjenja Formule I ili njihova so, kao i farmaceutske kompozicije koje sadrže jedinjenja, korisni su za lečenje bolesti lizozomalnog odlaganja, uključujući Gaucher-ovu bolest. Jedinjenja Formule I ili njihova so, kao i farmaceutske kompozicije koje sadrže jedinjenja, takođe su korisne u prevenciji pojavljivanja simptoma bolesti lizozomalnog odlaganja, kao što je Gaucher-ovu bolest, kod pacijenata koji imaju mutaciju GBA gena. Izloženo je da postupak lečenja bolesti lizozomalnog odlaganja kod pacijenta obuhvata davanje pacijentu efektivne količine jedinjenja ili soli Formule I: U ostvarenju, pacijent je sisar, specifično primat, još preciznije čovek. Efektivna količina farmaceutske kompozicije može biti količina koja je dovoljna za inhibiciju progresije bolesti ili poremećaja; ili prouzrokovanje regresije bolesti ili poremećaja.

[0075] Efektivna količina jedinjenja ili kompozicije koja je ovde opisana će takođe obezbediti dovoljnu koncentraciju supstituisanih pirazolopirimidinskih ili dihidropirazolopirimidinskih jedinjenja kada se primeni pacijentu. Dovoljna koncentracija je koncentracija jedinjenja ili soli Formule I u organizmu pacijenta, koja je neophodna da spreči ili da se izbori sa poremećajem. Takva količina može biti eksperimentalno utvrđena, na primer testiranjem koncentracije jedinjenja u krvi, ili teoretski, izračunavanjem bioraspoloživosti.

[0076] Izloženo je da postupci lečenja obuhvataju primenjivanje izvesnih doznih količina supstituisanog pirazolopirimidinskog ili dihidropirazolopirimidinskog jedinjenja ili soli pacijentu. Dozni nivoi svakog jedinjenja od otprilike 0.1 mg do otprilike 140 mg po kilogramu telesne težine na dan, korisni su u lečenju prethodno indikovanih stanja (oko 0.5 mg do oko 7 g po pacijentu na dan). Količina jedinjenja, koja se može kombinovati sa materijalima nosačima, da bi se proizveo pojedinačni dozni oblik će varirati u zavisnosti od pacijenta kog treba lečiti i posebnog načina primenjivanja. Dozni jedinični oblik će generalno sadržavati između od otprilike 1 mg do otprilike 500 mg svakog aktivnog jedinjenja. U izvesnim ostvarenjima, 25 mg do 500 mg, ili 25 mg do 200 mg jedinjenja Formule I se daje pacijentu dnevno. Učestalost doziranja može, isto tako, varirati zavisno od jedinjenja koje se primenjuje, kao i naročite bolesti koja se leči. Međutim, za tretman većine bolesti i poremećaja, može se primeniti dozni režim od 4 puta na dan ili manje, a u izvesnim ostvarenjima se primenjuje dozni režim od 1 ili 2 puta dnevno.

[0077] Međutim, biće jasno da će poseban nivo doze za svakog posebnog pacijenta zavisiti od različitih faktora, uključiv: aktivnost specifičnog korišćenog jedinjenja, starost, telesnu težinu, opšte zdravlje, pol, ishranu, vreme primenjivanja, način primenjivanja, kao i brzinu izlučivanja, kombinaciju lekova kao i težinu bolesti koja podleže terapiji.

[0078] Izložen je postupak lečenja poremećaja lizozomalnog odlaganja kod pacijenata određenih da im je takav tretman neophodan, postupak obuhvata davanje pacijentu efektivne količine jedinjenja Formule I. Jedinjenja i soli Formule I, koji su ovde obezbeđeni, mogu da se primene sami, ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih aktivnih agenasa.

[0079] Ovi izloženi postupci lečenja su takođe korisni za tretman sisara koji nisu ljudi, uključujući veterinarske primene, kao što je lečenje konja i stoke npr. stoka, ovce, krave, koze, svinje i slično, kao i kućnih ljubimaca (životinje za društvo) kao što su psi i mačke.

[0080] Za primene u dijagnostici ili istraživanju, pogodni subjekti će biti veliki broj sisara uključujući glodare (npr. miševi, pacovi, hamsteri), zečevi, primati, kao i svinje, kao što su inbred svinje i slični. Sem toga, za in vitro primenjivanje, kao što je in vitro dijagnostika i primene u istraživanjima, pogodno za korišćenje biće i telesne tečnosti (npr., krv, plazma, serum, ćelijska intersticijalna tečnost, saliva, feces i urine) i uzorci ćelija i tkiva prethodno navedenih subjekata.

PRIMERI

[0081] Sledeći Primeri su dati kao način ilustracije a ni na koji način ne kao ograničenja. Ukoliko nije drugačije precizirano, svi reagensi i rastvarači su standardnog komercijalnog stepena čistoće i koriste se bez prethodnog prečišćavanja. Polazni materijali se mogu nabaviti od komercijalnih snabdevača, kao što su Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), ili se mogu sintetisati korišćenjem procedura poznatih u ovoj oblasti.

PRIMER 1. SINTETIČKA ŠEMA ZA PROIZVODNJU SUPSTITUISANIH PIRAZOLOPIRIMIDINA I DIHIDROPIRAZOLOPIRIMIDINA

[0082] Sintetski redosled (Šema 1), korišćen za stvaranje supstituisanih pirazolopirimidina i dihidropirazolopirimidina, a koji je ovde dat, počinje kondenzovanjem 1,3-diketona 6 sa etil 3-amino-1H-pirazol-4-karboksilatom 7 u sirćetnoj kiselini. Ovakve reakcije su izlagane i ranije. Vidi na primer, WO 2008/134035 i Huppatz, J. L. Aust. J. Chem.1985, 38, 221-230. Početni napori za pojednostavljenje ispitivanja amida SAR koncentrisali su se na upotrebu acetilacetona kao diketona radi eliminacije formiranja regioizomera (R1=R2=CH3). Sa nesimetričnim ketonima se obrazuje smeša regioizomera (8, 9) koji se uobičajeno razdvajaju hromatografijom. Hidroliza estra zatim daje kiselinu, koja se kupluje sa aminima ili anilinima da bi se stvorila jedinjenja (10, 11) za biološku analizu.

PRIMER 2. SINTEZA N-(4-ETINILFENIL)-5,7-DIMETILPIRAZOLO[1,5-A]PIRIMIDIN-3-KARBOKSAMIDA

[0083] Korak 1. Sinteza 5,7-dimetilpirazolo[1,5-a]pirimidin-3-karboksilne kiseline (12)

[0084] Pentan-2,4-dion (1.46 ml, 14.2 mmol), etil 3-amino-1H-pirazol-4-karboksilat (2.00 g, 12.9 mmol) su grejani u zatvorenoj epruveti sa sirćetnom kiselinom (10 ml) na 110°C preko noći. Završetak reakcije se određuje pomoću LCMS (LC-MS: rt (min) = 3.08). Sirćetna kiselina se uklanja duvajućim vazduhom sa balonom koji se greje na 75°C. Sirovi ostatak etil 5,7-dimetilpirazolo[1,5-a]pirimidin-3-karboksilata (pretpostavlja se da je 12.89 mmol) se suspenduje u MeOH (15 ml) i tretira sa 7.2 M natrijum hidroksidom (5.37 ml, 38.7 mmol). Smša se greje na 80°C (na ovoj temperaturi se rastvara čvrsta materija) i zatim meša tokom 3 h. Reakciona smeša se ohladi i neutrališe do pH 6-7. Žitka masa se filtrira preko Büchnerovog levka pod vakuumom, čvrsti ostatak se ispira sa vodom i zatim dietil etrom kako se dobija 5,7-dimetilpirazolo[1,5-a]pirimidin-3-karboksilna kiselina (1.4 g, 7.3 mmol, 57 % prinos).

LC-MS: rt (min) = 2.61.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) d ppm 2.57 (s, 3 H), 2.71 (s, 3 H), 7.10 (s, 1H), 8.50 (s, 1H).

[0085] Korak 2. Sinteza N-(4-etinilfenil)-5,7-dimetilpirazolo[1,5-a]pirimidin-3-karboksamida (13)

[0086] 5,7-Dimetilpirazolo[1,5-a]pirimidin-3-karboksilna kiselina (722 mg, 3.78 mmol), 4-etinilanilin (442 mg, 3.78 mmol), i HATU (1436 mg, 3.78 mmol) se stave u DMF (10 ml) i zatim obrade sa diizopropiletilaminom (1.979 ml, 11.33 mmol). Sadržaj se meša na sobnoj temperaturi preko noći. Proizvod se istaloži iz reakcione smeše. Reakciona smeša se razblaži sa vodom, filtrira preko Büchnerovog levka pod vakuumom. Ostatak se ispira sa vodom (X2), zatim sa CH2Cl2, dietil etrom i, suši se na vazduhu kako se dobija N-(4-etinilfenil)-5,7-dimetilpirazolo[1,5-a]pirimidin-3-karboksamid (500 mg, 1.72 mmol, 46 % prinos).

LC-MS: rt (min) = 3.65.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) d ppm 2.71 (s, 3 H), 2.77 (s, 3 H), 4.11 (s, 1 H), 7.21 (s, 1 H), 7.49 (d, J=8.6 Hz, 2 H), 7.77 (d, J=8.6 Hz, 2 H), 8.65 (s, 1 H), 10.31 (s, 1 H).

PRIMER 3. PROTOKOL TESTA ZA AKTIVNOST GLUKOCEREBROZIDAZE

[0087] qHTS test za inhibitore i aktivatore N370S glukocerebrozidaze kao potencijalni šaperonski tretman Gaucher-ove bolesti: Primarna skrin konfirmacija

[0088] Ovo je fluorogeni enzimski test sa 4-metilumbeliferil-beta-D-glukopiranozidom kao supstratom i N370S glukocerebrozidazom iz homogenata humane slezine kao enzimskog preparata. Kada se završi hidroliza ovog fluorogenog supstrata, nastali proizvod, 4-metillumbeliferon, može biti ekscitovan na 365 nm i emitovati na 440 nm što se može detektovati standardnim čitačem fluorescencije na pločama. Podaci su normalizovani prema kontrolama za bazalnu aktivnost (bez enzima) i 100% aktivnost (sa enzimom). AC50 vrednosti su određene iz podataka koncentracija-odgovor modelovanog sa standardnom Hillovom jednačinom.

[0089] Homogenat humane slezine se priprema na sledeći način putem homogenizovanja slezine sa test puferom koji sadrži 50mM limunske kiseline (titrirane sa kalijum fosfatom do pH 5.0), 100 mM kalijum hlorida, 10 mM natrijum hlorida, 1mM magnezijum hlorida, 0.01% Tween-20. Koncentracija proteina u homogenatu humane slezine je aproksimativno 1.35 ug/ ul.

[0090] Test je izveden na pločama sa 1536 pozicija prema sledećem protokolu. (1) 2 ul homogenata slezine (27ug konačno) se doda u svaku poziciju. (2) 23 nL test jedinjenja u DMSO rastvoru se doda u svaku poziciju. Konačna koncentracija jedinjenja u test poziciji je 0.5 nM do 58 uM. (3) 2 ul supstrata (1 mM konačno) se doda u svaku poziciju. (4) Test ploče se inkubiraju na 37°C u toku 40 min. (5) Doda se 2 ul stop rastvora (1M NaOH i 1M glicin smeša, pH 10) u svaku poziciju. (6) Detekciju na test ploči izvršiti na ViewLux čitaču ploča (PerkinElmer) korišćenjem 365 nm ekscitacije sa emisijom na 440nm.

PRIMER 4. ŠAPERONSKA AKTIVNOST N-(4-ETINILFENIL)-5,7-DIMETILPIRAZOLO[1,5-A]PIRIMIDIN-3-KARBOKSAMIDA (NGC00188758-01)

[0091] Aktivnosti šaperona NGC00188758-1(1µM i 5 µM), izofagomina (1 µM), i vehikulumske kontrole su ispitane na fibroblastima poreklom od N370S pacijenata na šaperonsku aktivnost. GCase je vizualizovana crvenim bojenjem (anti GCase R386 antitelo), lizozom sa zelenim (LAMP), a jedro sa plavim (DAPI). Preklapanje svih bojenja je pokazalo svetlo žutu boju (zbog preklapanja crvene i zelene boje), boja indikuje prisustvo GCase u lizozomu. Sve podešenosti lasera su bile konstantne tokom imidžing analiza svih polja. I izofagomin i NGC00188758-1 pokazuju značajan porast aktivnosti GCase u lizozomu u odnosu na vehikulumsku kontrolu.

PRIMER 5. TEST SELEKTIVNOSTI: QHTS TEST ZA INHIBITORE I AKTIVATORE N370S GLUKOCEREBROZIDAZE KAO MOGUĆI ŠAPERONSKI TRETMAN GAUCHER-OVE BOLESTI: SUPROTAN SKRIN ALFA-GLUKOZIDAZE

[0092] Da bi se opisala selektivnost jedinjenja, skrinirani su odabrani pogodci iz primarnog skrina prema prečišćenoj alfa-glukozidazi, povezanoj šećernoj hidrolazi. Alfa-glukozidaza je odgovorna za hidrolizu terminalnih, ne-redukujućih 1,4-povezanih alfa-D-glukoza ostataka uz oslobađanje alfa-D-glukoze. Ovo je fluorogeni enzimski test koji koristi 4-metilumbeliferil-alfa-D-piranozid kao supstrat i humanu alfa-glukozidazu kao enzimski preparat. Kada je hidroliza ovog fluorogenog supstrata završena, dobijeni proizvod, 1.4-metilumbeliferon, može se ekscitovati na 365 nm i emitovati na 440 nm. Emisija se detektuje standardnim čitačem fluorescentnih ploča. Podaci su normalizovani prema kontrolama za bazalnu aktivnost (bez enzima) i 100% aktivnost (sa enzimom). AC50 vrednosti su određene iz podataka koncentracija-odgovor modelovanog sa standardnom Hillovom jednačinom.

[0093] Test je izveden na pločama sa 1536 pozicija prema sledećem protokolu. (1) Dodati 2 ul/poziciji enzima humane alfa-glukozidaze (4 nM konačno) u test puferu (50 mM limunska kiselina (titrirana sa kalijum fosfatom do pH 5.0), 0.005% Tween-20, pH 5.0) u svaku poziciju. (2) Dodati 23 nL jedinjenja u DMSO rastvoru. Konačna titracija jedinjenja je 0.7 nM do 77 uM. (3) Dodati 1 ul supstrata (400 uM konačno). (4) Inkubirati na sobnoj temperaturi u toku 20 min. (5) Dodati 2 ul stop rastvora (1M NaOH i 1M glicin smeša, pH 10) (6) Detekciju na test ploči izvršiti na ViewLux čitaču ploča (PerkinElmer) sa Ex=365 nm i Em=440nm.

PRIMER 6. TEST LIZOZOMALNE TRANSLOKACIJE: AKTIVNOST ŠAPERONA U GAUCHER-OVIM FIBROBLASTIMA POSLE VIŠEDNEVNE INKUBACIJE SA JEDINJENJEM

[0094] Ovim testom se kvantitativno određuje translociran glukocerebrozidazni protein u fibroblastima pacijenta posle produžene inkubacije sa jedinjenjem. Fibroblasti testirani ovim eksperimentom su bili homozigotni za N370S glukocerebrozidaze.

[0095] Primarno, dermalni fibroblasti poreklom iz biopsija kože od dva prethodno opisana N370S/N370S Gaucher pacijenta (Goker-Alpan et al, 2008) kao i kontrolni su zasejani u Lab-Tek 4 slajdove sa komorama (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Posle tretmana sa jedinjenjem, fibroblasti su fiksirani u 3% paraformaldehidu. Ćelije su permeabilizovane sa 0.1% Triton-X u toku 10 min. i blokirane u PBS koji je sadržavao 0.1% saponina, 100 µM glicina, 0.1% BSA i 2% seruma magarca, a zatim je sledila inkubacija sa mišijim monoklonskim anti-LAMP1 ili LAMP-2 (1:100, Developmental Studies Hybridoma bank, University of Iowa, Iowa City, IA) i zečijim poliklonskim anti-GCase R386 antitelom (1:500). Ćelije su isprane i inkubirane sa sekundarnim magarećim anti-mišijim ili anti-zečijim antitelima konjugovanim sa ALEXA-488 odnosno, ALEXA-555 (Invitrogen, Carlsbad, CA), ponovo isprane i, postavljene u VectaShield sa DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA).

[0096] Ćelije su snimane pomoću Zeiss 510 META konfokalnim laser-skenirajućim mikroskopom (Carl Zeiss, Microimaging Inc., Germany) korišćenjem Argon (458, 477, 488, 514 nm) 30 mW lasera, HeNe (543 nm) 1 mW lasera, i laserske diode (405 nm). Slike malog i velikog uvećanja su pravljene korišćenjem Plan-Apochromat 20X/0.75 objektiva odnosno, Plan-Apochromat 100x/1.4 oil DIC objektiva. Slike su pravljene sa isto podešenim laserima i sve slike su kolabirale z-gomile. Slike su ukazale na značajnu translokaciju proteina glukocerebrozidaze u lizozome u fibroblastima tretiranim jedinjenjem u odnosu na netretirane fibroblaste.

PRIMER 8. DODATNA JEDINJENJA

[0097] Sledeća jedinjenja su proizvedena prema procedurama datim u Primerima 1 i 2. Stručna lica u ovoj oblasti će znati da se reagensi i reakcioni uslovi moraju varirati kako bi se dobila pobrojana jedinjenja. Ove varijacije će biti lako uočljive stručnim licima u oblasti organske hemijske sinteze. Jedinjenja ovog pronalaska su ona koja se podudaraju sa okvirom patentnih zahteva. Druga jedinjenja su izložena kao reference.

[0098] Podaci o LCMS retencionim vremenima su dobijena kako sledi:

Postupak 1. kolona: Fenomenex Luna C18 (3 mikrona, 3 x 75 mm). vreme prolaska: 8 min. Gradijent: 4% do 100% acetonitril u vodi preko 7 min. Mobilna faza: acetonitril (0.025 % TFA), voda (0.05 % TFA). Brzina protoka: 1 mL/min. Temperatura: 50oC. UV talasna dužina: 220 nm, 254 nm

2. Postupak 2: detekcija UV214, Gemini kolona, Rastvarač A je voda, Rastvarač B je 90% acetonitril, 10% voda; 0.1% AcOH modifikator. Gradijent početnih uslova je 100% A sa vremenom zadržavanja 0.5 min; vreme gradijenta je 3 min. Gradijent finalne conc. je 100% B. gradijent finalnog zadržavanja je 0.5 min. Vreme prolaska je 5 min. Brzina protoka 1.5 ml/min.

Postupak 3. detekcija UV220, Fenomenex Luna 2.5 mikrona C18 100X2.00 mm kolona, Rastvarač A je voda (0.05% TFA), Rastvarač B je acetonitril (0.025% TFA). Gradijent početnih uslova je 95% A, 5% B sa vremenom zadržavanja 0.1 min; vreme gradijenta je 2.1 min. Gradijent finalne conc. je 100% B, 5% A. gradijent finalnog zadržavanja je 0.5 min. Onda sledi još jedno zadržavanje tokom sledećih 0.3 min sa 98% A, 2% B. Vreme prolaska je 3 min. Brzina protoka 0.30 do 0.5 ml/min.

[0099] LCMS retenciona vremena su iz Postupka 1 osim, ukoliko nije drugačije naznačeno.

Claims

Patentni zahtevi 1. Farmaceutska kompozicija, koja sadrži jedinjenje formule

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, gde R1je (pirimidinil)C0-C4alkil, (C3-C7cikloalkil)C0-C4alkil, (pirazolil)C0-C2alkil, (pirolil)C0-C2alkil, (imidazolil)C0-C2alkil, (tienil)C0-C2alkil, (oksazolil)C0-C2alkil, (tiazolil)C0-C2alkil, pirolidinil, naftil, hinolinil, izohinolinil, tetrahidronaftil, tetrahidrohinolinil, tetrahidroizohinolinil, tetrahidrofuranil, morfolinil, piperidinil, ili tiomorfolinil, od kojih je svaki nesupstituisan ili supstituisan sa jednim ili više supstituenata nezavisno odabranih od: halogena, hidroksila, cijano, nitro, amino, -CHO, -COOH, C1-C6alkila, C1-C6alkoksi, C2-C6alkanoila, mono- ili di-C1-C6alkilamino, mono- ili di-C1-C6alkilkarboksamida, C1-C6alkilestra, C1-C6alkiltio, C1-C6alkilsulfonila, C1-C2haloalkila, i C1-C2haloalkoksi, i sa 0 ili 1 supstituentom, odabranim od Y-Z-, pri čemu je Z kovalentna veza, C1-C4alkilen, -S-, -O-, -NR-, -C(O)-, -NHC(O)-, ili -C(O)NH-, pri čemu je R vodonik ili C1-C4alkil, a Y je fenil ili piridil, od kojih je svaki nesupstituisan ili supstituisan sa 1 do 3 supstituenta nezavisno odabrana od: halogena, hidroksila, cijano, nitro, amino, C1-C4alkila, i C1-C4alkoksi; R2je vodonik ili metil; R3i R6su oba vodonici; i R5i R7su oba metil; ili je jedan od R5i R7metil dok je drugi fenil; ili je jedan od R5i R7metil, a drugi je difluorometil; pod uslovom da: R1nije nesupstituisani cikloheksil kada su i R5i R7oba metil ili je jedan od R5i R7metil, a drugi je fenil; R1nije 1-(4-fluorobenzil)-1H-pirazol-4-il kada je jedan od R5i R7metil, a drugi fenil.
2. Farmaceutska kompozicija zahteva 1, naznačena time, što su i R5i R7oba metil.
3. Farmaceutska kompozicija zahteva 1 ili 2, naznačena time, što je jedinjenje odabrano od: N-(4-terc-butilcikloheksil)-5,7-dimetilpirazolo[1,5-a]pirimidin-3-karboksamida; 5,7-dimetil-N-(hinolin-3-il)pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-karboksamida; 5,7-dimetil-N-(hinolin-2-il)pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-karboksamida; i N-(izohinolin-5-il)-7-metil-5-metilen-4,5-dihidropirazolo[1,5-a]pirimidin-3-karboksamida.
4. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 3, naznačena time, što je kompozicija u obliku oralnog doznog oblika.
5. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 4 za upotrebu kao lek.
6. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 4 za upotrebu u lečenju Gaucherove bolesti kod pacijenata ili za prevenciju simptoma Gaucher-ove bolesti kod pacijenta koji ima mutaciju GBA gena, davanjem efektivne količine farmaceutske kompozicije pacijentu.
7. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 4 za upotrebu u povećanju količine beta glukocerebrozidaze u belim krvnim zrncima pacijenta koji ima mutaciju GBA gena davanjem efektivne količine farmaceutske kompozicije pacijentu.
8. Jedinjenje formule

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, gde R1je (pirimidinil)C0-C4alkil, (pirazolil)C0-C2alkil, (pirolil)C0-C2alkil, (imidazolil)C0-C2alkil, (tienil)C0-C2alkil, (oksazolil)C0-C2alkil, (tiazolil)C0-C2alkil, pirolidinil, naftil, hinolinil, izohinolinil, tetrahidronaftil, tetrahidrohinolinil, tetrahidroizohinolinil, tetrahidrofuranil, morfolinil, piperidinil, ili tiomorfolinil, od kojih je svaki nesupstituisan ili supstituisan sa jednim ili više supstituenata nezavisno odabranih od: halogena, hidroksila, cijano, nitro, amino, -CHO, -COOH, C1-C6alkila, C1-C6alkoksi, C2-C6alkanoila, mono- ili di-C1-C6alkilamino, mono- ili di-C1-C6alkilkarboksamida, C1-C6alkilestra, C1-C6alkiltio, C1-C6alkilsulfonila, C1-C2haloalkila, i C1-C2haloalkoksi, i sa 0 ili 1 supstituentom, odabranim od Y-Z-, pri čemu je Z kovalentna veza, C1-C4alkilen, -S-, -O-, -NR-, -C(O)-, -NHC(O)-, ili -C(O)NH-, pri čemu je R vodonik ili C1-C4alkil, a Y je fenil ili piridil, od kojih je svaki nesupstituisan ili supstituisan sa 1 do 3 supstituenta nezavisno odabranih od: halogena, hidroksila, cijano, nitro, amino, C1-C4alkila, i C1-C4alkoksi; ili (C3-C7cikloalkil)C0-C4alkil supstituisan sa jednim ili više supstituenata nezavisno odabranih od: halogena, hidroksila, cijano, nitro, amino, -CHO, -COOH, C1-C6alkila, C1-C6alkoksi, C2-C6alkanoila, mono- ili di-C1-C6alkilamino, mono- ili di-C1-C6alkilkarboksamida, C1-C6alkilestra, C1-C6alkiltio, C1-C6alkilsulfonila, C1-C2haloalkila, i C1-C2haloalkoksi, i sa 0 ili 1 supstituentom, odabranim od Y-Z-, pri čemu je Z kovalentna veza, C1-C4alkilen, -S-, -O-, -NR-, -C(O)-, -NHC(O)-, ili -C(O)NH-, pri čemu je R vodonik ili C1-C4alkil, a Y je fenil ili piridil, od kojih je svaki nesupstituisan ili supstituisan sa 1 do 3 supstituenta nezavisno odabranih od: halogena, hidroksila, cijano, nitro, amino, C1-C4alkila, i C1-C4alkoksi; R2je vodonik ili metil; R3i R6su oba vodonici; i R5i R7su oba metil; ili jedan od R5i R7su metil, a drugi je fenil; ili je jedan od R5i R7metil, a drugi je difluorometil; pod uslovom da: R1nije 1-(4-fluorobenzil)-1H-pirazol-4-il kada je jedan od R5i R7metil, a drugi fenil. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5