RS63343B1

RS63343B1 - Biciklični inhibitori histonske deacetilaze

Info

Publication number: RS63343B1
Application number: RS20220480A
Authority: RS
Inventors: Nathan Oliver Fuller; John A Lowe Iii
Original assignee: Alkermes Inc
Priority date: 2017-08-07
Filing date: 2018-08-07
Publication date: 2022-07-29
Also published as: MA49839B1; PT3664802T; WO2019032528A1; US20220340558A1; LT3664802T; US11225475B2; DK3664802T3; CN111032040A; CY1125199T1; MA49839A; HUE058799T2; WO2019032528A8; JP2020530019A; US20210147410A1; SMT202200232T1; PL3664802T3; MD3664802T2; EP3664802A1; AU2018313094A1; EA202090424A1

Description

Opis

Stanje tehnike

[0001] Pokazalo se da inhibitori histonske deacetilaze (HDAC) moduliraju transkripciju i izazivaju zastoj u rastu ćelija, diferencijacije i apoptozu. Inhibitori HDAC takođe pojačavaju citotoksične efekte terapeutskih sredstava koja se koriste u lečenju karcinoma, uključujući zračenje i hemoterapijske lekove. Marks, P., Rifkind, R. A., Richon, V. M., Breslow, R., Miller, T., Kelly, W. K. Histone deacetylases and cancer: causes and therapies. Nat Rev Cancer, 1, 194-202, (2001); i Marks, P. A., Richon, V. M., Miller, T., Kelly, W. K. Histone deacetylase inhibitors. Adv Cancer Res, 91, 137-168, (2004). Povrh toga, nedavni dokazi pokazuju da transkripciona disregulacija može doprineti molekularnoj patogenezi određenih neurodegenerativnih poremećaja, kao što su Hantingtonova bolest, spinalna mišićna atrofija, amiotrofična lateralna skleroza, i ishemija. Langley, B., Gensert, J. M., Beal, M. F., Ratan, R. R. Remodeling chromatin and stress resistance in the central nervous system: histone deacetylase inhibitors as novel and broadly effective neuroprotective agents. Curr Drug Targets CNS Neurol Disord, 4, 41-50, (2005). Nedavni pregled sažeo je dokaze da abnormalna aktivnost histonske acetiltransferaze (HAT) i histonske deacetilaze (HDAC) može predstavljati opšti osnovni mehanizam koji doprinosi neurodegeneraciji. Povrh toga, koristeći mišiji model depresije, Nestler je nedavno istakao terapeutski potencijal inhibitora histonske deacetilacije (HDAC5) kod depresije. Tsankova, N. M., Berton, O., Renthal, W., Kumar, A., Neve, R. L., Nestler, E. J. Sustained hippocampal chromatin regulation in a mouse model of depression and antidepressant action. Nat Neurosci, 9, 519-525, (2006).

[0002] Postoji 18 poznatih humanih 18 histonskih deacetilaza, grupisanih u četiri klase na osnovu strukture njihovih dodatnih domena. Klasa I uključuje HDAC1, HDAC2, HDAC3, i HDAC8 i ima homologiju sa RPD3 kvasca. HDAC4, HDAC5, HDAC7, i HDAC9 pripadaju klasi IIa i imaju homologiju sa kvascem. HDAC6 i HDAC10 sadrže dva katalitička mesta i klasifikovani su kao klasa IIb. Klasa III (sirtuini) uključuju SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, i SIRT7. HDAC11 je još jedan nedavno identifikovan član HDAC porodice i ima sačuvane ostatke u svom katalitičkom centru koji dele i deacetilaze klase I i klase II a ponekad se smešta u klasu IV.

[0003] Nasuprot tome, pokazalo se da su HDAC snažni negativni regulatori procesa dugotrajne memorije. Nespecifični inhibitori HDAC poboljšavaju sinaptičku plastičnost, kao i dugotrajnu memoriju (Levenson et al., 2004, J. Biol. Chem.279:40545-40559; Lattal et al., 2007, Behav Neurosci 121:1125-1131; Vecsey et al., 2007, J. Neurosci 27:6128; Bredy, 2008, Learn Mem 15:460-467; Guan et al., 2009, Nature 459:55-60; Malvaez et al., 2010, Biol. Psychiatry 67:36-43; Roozendaal et al., 2010, J. Neurosci.

30:5037-5046). Na primer, inhibicija HDAC može transformisati događaj učenja koji ne dovodi do dugotrajnog pamćenja u događaj učenja koji dovodi do značajnog dugotrajnog pamćenja (Stefanko et al., 2009, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:9447-9452). Osim toga, inhibicija HDAC takođe može stvoriti oblik dugotrajne memorije koja opstaje nakon tačke u kojoj normalno pamćenje zakaže. Pokazalo se da inhibitori HDAC poboljšavaju stanje kognitivnih deficita u genetskim modelima Alchajmerove bolesti (Fischer et al., 2007, Nature 447:178-182; Kilgore et al., 2010, Neuropsychopharmacology 35:870-880).

Ova izvođena sugerišu da modulacija memorije preko inhibicije HDAC ima značajan terapeutski potencijal za mnoge poremećaje pamćenja i kognitivnih funkcija.

[0004] Trenutno, uloga pojedinačnih HDAC-a u dugotrajnoj memoriji je istražena u dve nedvne studije. Kilgore et al.2010, Neuropsychopharmacology 35:870-880 otkrili su da nespecifični inhibitori HDAC, kao što je natrijum butirat, inhibiraju klasu I HDAC-a (HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC8) sa malim uticajem na klasu IIa članova HDAC porodice (HDAC4, HDAC5, HDAC7, HDAC9). Ovo sugeriše da inhibicija klase I HDAC-a može biti kritična za kognitivno poboljšanje primećeno u mnogim studijama. Zaista, povećana ekspresija HDAC2 , ali ne i HDAC1, specifična za prednji mozak i neurone, smanjuje dedritsku gustinu kičme, sinaptičku gustinu, sinaptičku plastičnost i formiranje memorije (Guan et al., 2009, Nature, 459:55-60). Nasuprot tome, HDAC2 nokaut miševi su pokazali povećanu sinaptičku gustinu, povećanu sinaptičku plastičnost i povećanu dendritsku gustinu u neuronima. Ovi miševi sa nedostatkom HDAC2 takođe su pokazali poboljšano učenje i pamćenje prilikom procene sposobnosti učenja paradigmi ponašanja. Ovaj rad pokazuje da je HDAC2 ključni regulator sinaptogeneze i sinaptičke plastičnosti. Pored toga, Guan et al. je pokazao da hronični tretman miševa sa SAHA (inhibitor HDAC 1,2,3,6, 8) reprodukuje efekte viđene kod miševa sa nedostatkom HDAC2 i uklanja kognitivno oštećenje u kod prekomerne ekspresije HDAC2 miševa.

[0005] Inhibicija HDAC2 (selektivno ili u kombinaciji sa inhibicijom drugih HDAC-a klase I) je privlačan terapeutski cilj. Takva inhibicija ima potencijal za poboljšanje spoznaje i olakšavanje procesa učenja kroz povećanje sinaptičke i dendritske gustine u populacijama neuronskih ćelija. Pored toga, inhibicija HDAC2 može takođe da bude terapeutski korisna u lečenju širokog spektra drugih bolesti i poremećaja.

SUŠTINA PRONALASKA

[0006] Opisana su jedinjenja i njihove farmaceutski prihvatljive soli, i farmaceutske kompozicije, koji su korisni u lečenju stanja povezanih sa aktivnošću HDAC (npr., HDAC2). Videti npr., tabelu 1.

[0007] Jedna od prednosti ovde opisanih određenih jedinjenja je da poseduju poboljšane bezbednosne parametre. Na primer, uključivanje dodatnog atoma fluora na donji fenilni prsten određenih jedinjenja obezbedilo je skoro 2 puta povećanje u bezbednosti, pokazujući manje efekata na humane eritroidne i mijeloidne progenitore. Videti npr., tabelu 4, uporedno jedinjenje 1 vs jedinjenje 10; uporedno jedinjenje 2 vs. jedinjenje 3; uporedno jedinjenje 5 vs. jedinjenje 1; i uporedno jedinjenje 6 vs. jedinjenje 2. Sličan rezultat je primećen između strukturnih izomera (uporediti uporedno jedinjenje 4 sa jedinjenjem 8) i zamenu fodonika sa fluorom (uporediti uporedno jedinjenje 3 sa jedinjenjem 6).

[0008] Stanja koja se mogu lečiti opisanim jedinjenjima uključuju, ali nisu ograničena na, neurološke poremećaje, poremećaje ili oštećenja pamćenja ili kognitivnih funkcija, poremećaji gubitka učenja, gljivične bolesti ili infekcije, inflamatorne bolesti, hematološke bolesti, meoplastične bolesti, psihijatrijske oremećaje, i gubitak pamćenja.

DETALJAN OPIS

1. Jedinjenja

[0009] Ovde su obezbeđena jedinjenja koja imaju formulu izabranu od:

ili njihova farmaceutski prihvatljiva so.

[0010] Drugi primeri jedinjenja uključenih u ovaj opis su dati u delu PRIMERI. Uključene su farmaceutski prihvatljive soli i neutralni oblici ovih jedinjenja.

2. Definicije

[0011] Kako se ovde koristi, izrazi "subjekt" i "pacijent" mogu se koristiti naizmenično, i označavaju sisara kome je potrebno lečenje, npr., kućne životinje (npr., psi, mačke, i slično), životinje na farmama (npr., krave, svinje, konji, ovce, koze i slično) i laboratorijske životinje (npr., pacovi, miševi, zamorci i slično). Tipično, subjekt je čovek kome je potrebno lečenje.

[0012] Farmaceutski prihvatljive soli i neutralni oblici ovde opisanih jedinjenja su uključeni. Za upotrebu u lekovima, soli jedinjenja se odnose na netoksične "farmaceutski prihvatljive soli." Farmaceutski prihvatljivi oblici soli uključuju farmaceutski prihvatljive kiselinske/anjonske ili bazne/katjonske soli. Farmaceutski prihvatljive bazne/katjonske soli uključuju, natrijum, kalijum, kalcijum, magnezijum, dietanolamin, n-metil-D-glukamin, L-lizin, L-arginin, amonijum, etanolamin, piperazin i trietanolamin soli. Farmaceutski prihvatljive kiselinske/anjonske soli uključuju, npr., acetat, benzensulfonat, benzoat, bikarbonat, bitartrat, karbonat, citrat, dihidrohlorid, glukonat, glutamat, glikolilarsanilat, heksilrezorcinat, hidrobromid, hidrochlorid, malat, maleat, malonat, mezilat, nitrat, salicilat, stearat, sukcinat, sulfat, tartrat, i tozilat.

[0013] Izraz "farmaceutski prihvatljiv nosač" odnosi se na netoksični nosač, ađuvans, ili nosač koji ne uništava farmakološku aktivnost jedinjenja sa kojim je formulisan. Farmaceutski prihvatljivi nosači, ađuvansi ili nosači koji se mogu koristiti u ovde opisanim kompozicijama uključuju, ali nisu ograničeni na, jonske izmenjivače, aluminijum oksid, aluminijum stearat, lecitin, serumske proteine, kao što je humani serumski albumin, puferske supstance kao što su fosfati, glicin, sorbinska kiselina, kalijum sorbat, delimične gliceridne smeše zasićenih biljnih masnih kiselina, vodu, sli ili elektrolite, kao što su protamin sulfat, dinatrijum hidrogen sulfat, kalijum hidrogen fosfat, natrijum hlorid, soli cinkakoloidni silicijum dioksid, magnezijum trisilikat, polivinil pirolidon, supstance na bazi celuloze, polietilen glikol, natrijum karboksimetilcelulozu, poliakrilate, voskove, polietilen-polioksipropilenske blok polimere, polietilen glikol i vunena mast.

[0014] Izrazi "lečenje," "lečiti," i "tretiranje" odnose se na preokret, ublažavanje, smanjenje verovatnoće razvoja, ili inhibiranje napredovanja bolesti ili poremećaja, ili jednog ili više njihovih simptoma, kao što je ovde opisano. U nekim izvođenjima, tretman se može primeniti nakon što se razvije jedan ili više simptoma, tj., terapijsko lečenje. U drugim izvođenjima, tretman se može primeniti u odsustvu simptoma. Na primer, tretman se može primeniti na suspektabilnu osobu pre pojave simptoma (npr., u svetlu istorije simptoma i/ili u svetlu genetskih ili drugih suspektabilnih faktora), tj., profilaktičko lečenje. Lečenje se takođe može nastaviti nakon što su rešeni nastali simptomi, na primer da se spreči ili odloži njihovo ponavljanje.

[0015] Izraz "efikasna količina" ili "terapeutski efikasna količina" uključuje količinu ovde opisanog jedinjenja koja će izazvati biološki ili medicinski odgovor subjekta npr., između 0,01 -100 mg/kg telesne mase/dan opisanog jedinjenja, kao što je npr., 0,1 -100 mg/kg telesne mase/dan.

3. Upotrebe, formulacija i davanje

[0016] U nekim izvođenjima, ovde opisana jedinjenja i kompozicije su korisni u lečenju stanja povezanih sa aktivnošću HDAC. Takva stanja uključuju na primer, ona koja su opisana u nastavku.

[0017] Nedavni izveštaji su detaljno opisali važnost acetilacije histona u funkcijama centralnog nervnog sistema ("CNS’) kao što su diferencijacija neurona, formiranje pamćenja, zavisnost od droga, i depresija (Citrome, Psychopharmacol. Bull.2003, 37, Suppl.2, 74-88; Johannessen, CNS Drug Rev.2003, 9, 199216; Tsankova et al., 2006, Nat. Neurosci. 9,519-525). Prema tome, u jednom aspektu, obezbeđena jedinjenja i kompozicije mogu biti korisni u lečenju neuroloških poremećaja. Primeri neuroloških poremećaja uključuju: (i) hronične neurodegenerativne bolesti kao što su familijarna i sporadična amfitrofična lateralna skleroza (FALS i ALS, respektivno), familijarna i sporadična Parkinsonova bolest, Hantingtonova bolest, familijarna i sporadična Alchajmerova bolest, multipla skleroza, mišićna distrofija, olivopontocerebelarna atrofija, multipla sistemska atrofija, Vilsonova bolest, progresivna supranuklearna paraliza, difuzna bolest Levijevih tela, kortikodentatonigralna degeneracija, progresivna familijarna mioklonična epilepsija, strionigralna degeneracija, torziona distonija, porodični tremor, Daunov sindrom, Žil d la Turetov sindrom, Hallervorden-Spatzova bolest, dijabetička periferna neuropatija, demencija pugilistika, AIDS demencija, demencija povezana sa starošću, oštećenje pamćenja povezano sa starošću, i neurodegenerativne bolesti povezane sa amiloidozom kao što su one izazvane prionskim proteinom (PrP) koji je povezan sa transmisibilnom spongiformnom encefalopatijom (Krojcfeld Jakobova bolest, Gerstmann-Straussler-Scheinkerov sindrom, ovčija svrabež, i kuru), i one izazvane viškom akumulacije cistatina C (nasledna angiopatija cistatina C); i (ii) akutni neurodegenerativni poremećaji kao što su traumatske povrede mozga (npr., hirurška povreda mozga), cerebralni edem, oštećenje perifernih nerava, povreda kičmene moždine, Leighova bolest, Gilen Bareov sindrom, poremećaji skladištenja lizozoma kao što je lipofuscinoza, Alpersova bolest, sindrom nemirnih nogu, vrtoglavica kao rezultat degeneracije CNS; patologije koje nastaju sa hroničnim alkoholom ilidrogom uključujući zlostavljanje, na primer, degeneracija neurona u locus coeruleus i malom mozgu, poremećaji kretanja izazvani lekovima; patologije koje nastaju starenjem uključujući degeneraciju neurona malog mozga i kortikalnih neurona koji dovode do kognitivnih i motoričkih oštećenja; i patologije koje nastaju usled hronične zloupotrebe amfetamina uključujući degeneraciju neurona bazalnih ganglija koji dovode do motoričkih oštećenja; patološke promene koje su posledica fokalne traume kao što je moždani udar, fokalna ishemija, vaskularna insuficijencija, hipoksično-ishemijska encefalopatija, hiperglikemija, hipoglikemija ili direktna trauma; patologije koje nastaju kao negativan sporedni efekat terapijskih lekova i tretmana (npr., degeneracija pojasa i neurona entorhinalnog korteksa kao odgovor na antikonvulzivne doze antagonista NMDA klase glutamatnih receptora) i Wernicke-Korsakoff-ova srodna demencija. Neurološki poremećaji koji utiču na senzorne neurone uključuju Fridrajhovu ataksiju, diabetes, perifernu neuropatiju, i degeneraciju neurona retine. Ostali neurološki poremećaji uključuju povredu nerva ili traume povezane sa povredom kičmene moždine. Neurološki poremećaji limbičkog i kortikalnog sistema uključuju cerebralnu amiloidozu, Pikovu atrofiju, i Retov sindrom. U drugom aspektu, neurološki poremećaji uključuju poremećaje raspoloženja, kao što su afektivni poremećaji i anksioznost; poremećaji društvenog ponašanja, kao što su defekti karaktera i poremećaji ličnosti; poremećaji učenja, pamćenja, i inteligencije, kao što su mentalna retardacija i demencija. Prema tome, u jednom aspektu otkrivena jedinjenja i kompozicije mogu biti korisni u lečenju šizofrenije, delirijuma, poremećaja pažnje (ADD), šizoaktivnog poremećaja, Alchajmerove bolesti, Rubenštajn-Tajbijev sindrom, depresije, manije, poremećaja deficita pažnje, zavisnosti od droga, demencije, agitacije, apatije, anksioznosti, psihoze, poremećaja ličnosti, bipolarnih poremećaja, unipolarnog afektivnog poremećaja, opsesivno kompulsivnih poremećaja, poremećaja u ishrani, posttraumatskih stresnih poremećaja, razdražljivosti, poremećaja ponašanja adolescenata i dezinhibicije.

[0018] Smatra se da je transkripcija ključni korak za procese dugotrajnog pamćenja (Alberini, 2009, Physiol. Rev.89, 121-145). Transkripcija se promoviše specifičnim modifikacijama hromatina, kao što je acetilacija histona, koje moduliraju interakcije histon-DNK (Kouzarides, 2007, Cell, 128:693-705).

Modifikovani enzimi, kao što su histon acetiltransferaze (HATs) i histon deacetilaze (HDACs), regulišu stanje acetilacije na histonskim repovima. Generalno, acetilacija histona promoviše ekspresiju gena, dok deacetilacija histona dovodi do utišavanja gena. Brojne studije su pokazale da snažan HAT, cAMP odgovor element-vezujući protein (CREB)-vezujući protein (CBP), je neophodan za dugotrajne oblike sinaptičke plastičnosti i dugotrajne memorije (za pregled, videti Barrett, 2008, Learn Mem 15:460-467). Prema tome, u jednom aspektu, obezbeđena jedinjenja i kompozicije mogu biti korisni za promovisanje kognitivne funkcije i poboljšanje učenja i formiranje pamćenja.

[0019] Jedinenja i kompozicije koji su ovde opisani mogu se takođe koristiti za lečenje gljivičnih bolesti ili infekcija.

[0020] U drugom aspektu, jedinenja i kompozicije koji su ovde opisani mogu se koristiti za lečenje inflamatornih bolesti kao što su moždani udar, reumatoidni artritis, lupus eritematozus, ulcerozni kolitis i traumatske povrede mozga (Leoni et al., PNAS, 99(5); 2995-3000(2002); Suuronen et al. J. Neurochem.87; 407-416 (2003) i Drug Discovery Today, 10: 197-204 (2005).

[0021] U još jednom aspektu, jedinenja i kompozicije koji su ovde opisani mogu se koristiti za lečenje karcinoma uzrokovanog proliferacijom neoplastičnih ćelija. Takvi karcinomi uključuju npr., čvrste tumore, neoplasme, karcinome, sarkome, leukemije, limfome i slično. U jednom aspektu, karcinomi koji se mogu lečiti sa jedinenjima i kompozicijama koje su ovde opisane uključuju, ali nisu ograničeni na: karcinom srca, karcinom pluća, gastrointestinalni karcinom, karcinom genitourinarnog trakta, karcinom jetrekarcinom nervnog sistema, ginekološki karcinom, hematološki karcinom, karcinom kože, i karcinom nadbubrežne žlezde. U jednom aspektu, jedinenja i kompozicije koji su ovde opisani su korisni u lečenju kardioloških karcinoma odabranih od sarkoma (angiosarkom, fibrosarkom, rabdomiosarkom, liposarkom), myksoma, rabdomioma, fibroma, lipoma i teratoma. U drugom aspektu, jedinenja i kompozicije koji su ovde opisani su korisni u lečenju karcinoma pluća odabranog od karcinoma bronha (skvamozne ćelije, nediferencirane male ćelije, nediferencirane velike ćelije, adenokarcinom), alveolarnog karcinoma (bronhiolaran), bronhijalnog adenoma, sarkoma, limfoma, hondromatskog hamartoma, i mezotelioma. U jednom aspektu, jedinenja i kompozicije koji su ovde opisani su korisni u lečenju gastrointestinalnog karcinoma odabranog od jednjaka (karcinom skvamoznih ćelija, adenokarcinom, lejomiosarkom, limfom), želuca (karcinom, limfom, lejomiosarkom), pankreasa (duktalni adenokarcinom, insulinom, glukagonom, gastrinom, karcinoidni tumori, vipoma), tankog creva (adenokarcinom, limfom, karcinoidni tumori, Kapošijev sarkom, leijomiom, hemangiom, lipom, neurofibrom, fibrom), i debelog creva (adenokarcinom, tubularni adenom, vilozni adenom, hamartom, leijomiom). U jednom aspektu, jedinenja i kompozicije koji su ovde opisani su korisni u lečenju karcinoma genitourinarnog trakta odabranog od bubrega (adenokarcinom, Vilmov tumor [nefroblastom], limfom, leukemija), bešike i mokraćnih kanala (karcinom skvamoznih ćelija, karcinom prelaznih ćelija, adenokarcinom), prostate (adenokarcinom, sarkom), i testisa (seminom, teratom, embrionalni karcinom, teratokarcinom, horiokarcinom, sarkom, karcinom intersticijalnih ćelija, fibrom, fibroadenom, adenomatoidni tumori, lipom). U jednom aspektu, jedinenja i kompozicije koji su ovde opisani su korisni u lečenju karcinoma jetre odabranog od hepatoma (hepatocelularni karcinom), holangiokarcinoma, hepatoblastoma, angiosarkoma, hepatocelularnog adenoma, i hemangioma.

[0022] U nekim izvođenjima, jedinjenja koja su ovde opisana odnose se na lečenje, karcinoma kostiju odabranog od osteogenog sarkoma (osteosarkoa), fibrosarkoma, malignog fibroznog histocitoma, hondrosarkoma, Juingovog sarkoma, malignog limfoma (sarkom retikulumskih ćelija), multiplog mijeloma, hordoma malignog tumora džinovskih ćelija, osteohondroma (osteokartilaginozna egzostoza), benignog hondroma, hondroblastoma, hondromiksofibroma, osteoidnog osteoma i tumora džinovskih ćelija.

[0023] U jednom aspektu, jedinenja i kompozicije koji su ovde opisani su korisni u lečenju kancera nervnog sistema odabranog od lobanje (osteom, hemangiom, granulom, ksantom, osteitis deformans), moždanih omotača (meningiom, meningiosarkom, gliomatoza), mozga (astrocitom, meduloblastom, gliom, ependimom, germinom [pinealom], multiformni glioblastom, oligodendrogliom, švanom, retinoblastom, kongenitalni tumori), i kičmene moždine (neurofibrom, meningiom, gliom, sarkom).

[0024] U jednom aspektu, jedinenja i kompozicije koji su ovde opisani su korisni u lečenju ginekološkog karcinoma odabranog od materice (karcinom endometrijuma), grlića materice (karcinom grlića materice, pre-tumorske cervikalne displazije), jajnika (karcinom jajnika [serozni cistadenokarcinom, mucinozni cistadenokarcinom, neklasifikovani carcinom], tumori granuloza-hekalnih ćelija, tumori Sertoli-Leydig-ovih ćelija, disgerminom, maligni teratom), vulve (karcinom skvamoznih ćelija, intraepitelni karcinom, adenokarcinom, fibrosarkom, melanom), vagine (karcinom bistrih ćelija, karcinom skvamoznih ćelija, botrioid sarkom (embrionalni rabdomiosarkom), i jajovoda (karcinom).

[0025] U jednom aspektu, jedinenja i kompozicije koji su ovde opisani su korisni u lečenju karcinoma kože izabranog od malignog melanoma, karcinoma bazalnih ćelija, karcinoma skvamoznih ćelija, Karpošijevog sarkoma, mladeži displastični nevusi, lipoma, angioma, dermatofibroma, keloida, i psorijaze.

[0026] U jednom aspektu, jedinenja i kompozicije koji su ovde opisani su korisni u lečenju karcinoma nadbubrežne žlezde izabrane od neuroblastoma.

[0027] U jednom aspektu, jedinenja i kompozicije koji su ovde opisani su korisni u lečenju karcinoma koji uključuju, ali nisu ograničeni na: leukemije uključujući akutne leukemije i hronične leukemije kao što je akutna limfocitna leukemija (ALL), akutna mijeloidna leukemija (AML), hronična limfocitna leukemija (CLL), hronična mijeloidna leukemija (CML) i leukemija dlakavih ćelija; llimfomi kao što su kožni limfomi T-ćelija (CTCL), nekožni periferni T-ćelijski limfomi, limfomi povezani sa humanim T-ćelijskim limfotrofnim virusom (HTLV) kao što su leukemija/limfom odraslih T-ćelija (ATLL), Hočkinova bolest i ne-Hočkinov limfom, limfom velikih ćelija, difuzni B-krupnoćelijski limfom (DLBCL); Burkitov limfom; mezoteliom, primarni limfom centralnog nervnog sistema (CNS); multipli mijelom; dečiji čvrsti tumori kao što su tumori mozga, neuroblastom, retinoblastom, Vilmov tumor, tumori kostiju, i sarkomi mekog tkiva, česti čvrsti tumori odraslih kao što su karcinomi glave i vrata (npr., oralni, laringealni i ezofagealni), genitourinarni karcinomi (npr., prostate, bešike, bubrega, materice, jajnika, testisa, rektuma i debelog creva), karcinom pluća, karcinom dojke, karcinom pankreasa, melanom i drugi karcinomi kože, karcinom želuca, tumori mozga, karcinom jetre i karcinom štitaste žlezde.

[0028] U jednom aspektu, ovaj opis obezbeđuje postupak lečenja stanja koji su ovde opisani koji obuhvata davanje subjektu efikasne količine jedinjenja, ili farmaceutski prihvatljive soli koji su ovde opisani, ili njihovih kompozicija.

[0029] Takođe je obezbeđeno jedno ili više jedinjenja, ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli koje su ovde opisane, ili obezbeđenih kompozicija, za lečenje ovde opisanog stanja.

[0030] Takođe je obezbeđena upotreba jednog ili više jedinjenja, , ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli ovde opisanih, za proizvodnju leka za lečenje ovde opisanog stanja.

[0031] Subjekti se takođe mogu odabrati da pate od jednog ili više opisanih stanja pre lečenja sa jednim ili više opisanih jedinjenja, ili farmaceutski prihvatljivih soli ili kompozicija.

[0032] Ovaj opis takođe obezbeđuje farmaceutski prihvatljive kompozicije koje sadrže ovde opisano jedinjenje, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so; i farmaceutski prihvatljiv nosač. Ove kompozicije mogu se koristiti za lečenje jednog ili više prethodno opisanih stanja.

[0033] Kompozicije ovde opisane mogu se davati oralno, parenteralno, pomoću spreja za inhalaciju, lokalno, rektalno, nazalno, bukalno, vaginalno ili preko ugrađenog rezervoara. Izraz "parenteralno" kako se ovde koristi uključuje subkutano, intravensko, intramuskularno, intraartikularno, intrasinovijalno, intrasternalno, intratekalno, intrahepatično, intralezijsko i intrakranijalno injektiranje ili infuzione tehnike. Ovde su uključeni tečni dozni oblici, preparati za injekcije, oblici čvrste disperzije, i dozni oblici za lokalno ili transdermalno davanje jedinjenja.

[0034] Takođe treba shvatiti da će specifična doza i režim lečenja za svakog određenog pacijenta zavisiti od različitih faktora, uključujući starost, telesnu masu, opšte zdravlje, pol, ishranu, vreme davanja, brzinu izlučivanja, kombinaciju lekova, procenu lekara koji leči, i težinu određene bolesti koja se leči. Količina obezbeđenog jedinjenja u kompoziciji će takođe zavisiti od određenog jedinjenja u kompoziciji.

PRIMERI

Opšte informacije

[0035] Tačke su vizuelizovane UV svetlošću (254 i 365 nm). Prečišćavanje pomoću kolone i fleš hromatografije je bilo izvedeno upotrebom silikagela (200-300 meša). Sistemi rastvarača su prikazani kao odnos rastvarača.

[0036]<1>H NMR spektri su snimljeni na Bruker Avance III 400 MHz ili Bruker Fourier 300 MHz.<1>H hemijski pomaci su prikazani u δ vrednostima u ppm sa tetrametlsilanom (TMS, = 0.00 ppm) kao internim standardom. Videti, npr. podatke koji su dati u tabeli 1.

[0037] LCMS spektri su dobijeni na Agilent 1200 serije 6110 ili 6120 masenom spektrometru sa ESI (+) režimom jonizacije. (Kolona: C18 (50 x 4,6 mm, 5 µm) radi u ES (+) ili (-) režimu jonizacije; T = 30 °C; brzina protoka = 1,5 mL/min; detektovana talasna dužina: 220 nm. Videti, npr. podatke koji su dati u Tabeli 1.

Primer 1. Sinteza jedinjenja 1

[0038]

[0039] Sinteza intermedijera 101. U rastvor intermedijera 100 (350 g, 3,00 mol) u DMF (5500 mL) na 0 °C se dodaje NaH (360 g, 9,00 mol), i smeša se meša tokom 30 min na ovoj temperaturi. Dodaje se rastvor propargil bromida (1,43 kg, 12,0 mol) u DMF (1500 mL), i reakciona smeša se zagreva do sobne temperature i meša tokom 4h. Reakciona smeša se zatim gasi sa zasićenim rastvorom amonijum hlorida i ekstrahuje sa EtOAc (2000 mL x 3). Spojeni organski slojevi se isperu sa zasićenim vodenim NaCl (2000 mL x 2), osuši iznad Na2SO4, procedi, i koncentruje u vakuumu. Sirov proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni korišćenjem silikagela da se dobije intermedijer 101 (245 g, 42,5 %) kao žuto ulje.<1>H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ (ppm) 1.48 (s, 9H), 2.22 (t, 2H, J = 4.8 Hz), 4.17 (s, 4H).

[0040] Sinteza intermedijera 102. U rastvor intermedijera 101 (270 g, 1,40 mol) i Cp<∗>RuCl(cod) (13,5 g, 35,6 mmol) u suvom, degaziranom 1,2-dihloretanu (2200 mL) dodaje se rastvor hloroacetonitrila (157 g, 2,10 mol) u suvom, degaziranom 1,2- dihloretanu (500 mL) tokom 15 min pod Ar atmosferom na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša se zatim zagreva do 60 °C i meša tokom 0,5 h, pri čemu je rastvarač uparen a sirovi ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni korišćenjem silikagela da bi se dobio intermedijer 102 (210 g, 56,0 %) kao prljavo bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ (ppm) 1.52 (s, 9H), 4.67 -4.73 (m, 6H), 7.40 (d, 1H, J = 19.2 Hz), 8.50 (d, 1H, J = 15.6 Hz). MS 269.1 [M H]<+>.

1

[0041] Sinteza intermedijera 103. Rastvor intermedijera 102 (210 g, 784 mmol) u MeOH (4000 mL) se tretira sa Pd/C (21,0 g), i reakciona smeša se meša na sobnoj temperaturi pod H2atmosferom tokom 2 h. Reakciona smeša se zatim procedi, i filtrat se koncentruje u vakuumu da se obezbedi intermedijer 103 (120 g, 65,6%) kao prljavo bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ (ppm) 1.53 (s, 9H), 2.98 (s, 3H), 4.86 -4.90 (m, 4H), 7.53 -7.60 (m, 1H), 8.62 -8.67 (m, 1H). MS 235.1 [M H]<+>.

[0042] Sinteza intermedijera 104. Rastvor 4N HCl (600 mL, HCl u EtOAc) se dodaje u kapima na 0 °C rastvoru intermedijera 103 (120 g, 513 mmol) u EtOAc (600 mL). Reakciona smeša se zatim zagreva do sobne temperature i meša tokom 1 h. Rastvarač se uklanja ceđenjem da bi se dobio intermedijer 104 kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (DMSO_d6, 400 MHz): δ (ppm) 2.75 (s, 3H), 4.73 -4.80 (m, 4H), 7.97 (s, 1H), 8.20 (s, 1H). MS 135.1 [M H]<+>.

[0043] Sinteza intermedijera 105. Smeša intermedijera 104 (513 mmol), intermedijera A3 (151 g, 308 mmol) i Na2CO3(272 g, 2,57 mol) u DMSO se meša na sobnoj temperaturi tokom 3 h. Nakon što se reakcija završila prema LCMS, reakciona smeša se sipa u hladnu vodu, ekstrahuje sa EtOAc, i slojevi se odvajaju. Organski sloj se zatim koncentruje u vakuumu, a ostatak se taloži sa EtOAc, a zatim procedi da se obezbedi intermedijer 105 (80,0 g, 38% iz jedinjenja 5) kao žuta čvrsta supstanca.<1>H NMR (DMSO_d6, 400 MHz): δ (ppm) 2.49 (s, 3H), 4.70 -4.96 (m, 4H), 7.29 -7.35 (m, 2H), 7.45 -7.49 (m, 1H), 7.50 -7.51 (m, 1H), 8.08 -8.14 (m, 1H), 8.46 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 10.11 (brs, 1H). MS 412.1 [M H]<+>.

[0044] Sinteza jedinjenja 1. Smeša intermedijera 105 (80,0 g, 195 mmol) i Pd/C (8,00 g) u MeOH (2500 mL) se meša na sobnoj temperaturi tokom 1 h pod H2atmosferom. Nakon 1 h, Pd/C se uklanja ceđenjem kroz celit. Filtrat se koncentruje a ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni sa silikagelom da se obezbedi jedinjenje 1 (52,0 g, 70.3 %) kao siva čvrsta supstanca.<1>H NMR (DMSO_d6, 400 MHz): δ (ppm) 2.48 (s, 3H), 4.77 (s, 4H), 5.28 (s, 2H), 7.16 -7.18 (m, 2H), 7.28 -7.31 (m, 2H), 7.40 -7.42 (m, 1H), 7.92 -7.94 (m, 1H), 8.45 (s, 1H), 8.56 (s, 1H). MS 382.1 [M H]<+>.

[0045] Sinteza intermedijera A2. Smeša intermedijera A1 (300 g, 1,73 mol), 4-fluorofenilboronske kiseline (265 g, 1,91 mmol) i Cs2CO3(1,13 kg, 3,46 mol) u dioksanu/H2O (6000 mL/600 mL) se tretira sa Pd(PPh3)4(72,6 g, 86,3 mmol) pod N2atmosferom. Smeša se meša na 95 °C tokom 2 h a zatim se koncentruje u vakuumu. Ostatak je ostavljen u EtOAc (4000 mL) a dobijeni rastvor je ispran sa rastvorom soli (1000 mL x 3). Spojeni organski slojevi se osuše iznad anhidrovanog Na2SO4, procede, a zatim koncentruju u vakuumu. Sirovi ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni sa silikagelom da bi se obezbedio intermedijer A2 (240 g, sirov) kao žuta čvrsta supstanca.<1>H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ (ppm) 6.90 -6.96 (m, 1H), 6.99 -7.04 (m, 1H), 7.23 -7.26 (m, 1H), 8.02 -8.08 (m, 1H), 8.47 (d, 1H, J = 8.4 Hz). MS 252.0 [M H]<+>.

[0046] Sinteza intermedijera A3. Fenil karbonohloridat (354 g, 2,27 mol) se dodaje u kapima uz mešanje u rastvor intermedijera A2 (240 g, sirov) u piridinu (4800 mL) na sobnoj temperaturi. Nakon što je dodavanje završeno, reakciona smeša se zagreva do 50 °C i meša preko noći. Smeša se zatim koncentruje u vakuumu, i sirovi ostatak se prečisti rekristalizacijom sa MTBE da se obezbedi intermedijer A3 (240 g, 28,2% iz jedinjenja A1) kao žuta čvrsta supstanca.<1>H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ (ppm) 6.97 -7.02 (m, 1H), 7.08 -7.39 (m, 11H), 8.13 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 8.24 -8.30 (m, 1H), 8.67 (d, 1H, J = 8.8 Hz). MS 492.1 [M H]<+>.

Primer 2. Sinteza jedinjenja 2

[0048] Sinteza 107. Smeša 2-hloro-6,7-dihidro-5H-pirolo[3,4-b]piridin hidrohlorida (11 g, 57,9 mmol), TEA (17,5 g, 173,7 mmol) i (Boc)2O (13,9 g, 63,7 mmol) u THF (250 mL) se meša na sobnoj temperaturi tokom 3 h. Reakciona smeša se zatim sipa u DCM (500 mL), ispere sa rastvorom soli (100 mL 33), osuši iznad anhidrovanog Na2SO4a zatim koncentruje u vakuumu. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni sa silikagelom (DCM : EtOAc = 100 : 1 ~ 10 : 1) da bi se dobio 107 (13,5 g, 92%) kao bela čvrsta supstanca. MS 255.2 [M+H]<+>.

[0049] Sinteza 108. Smeša 107 (13,5 g, 53,1 mmol), kalijum acetata (10,4 g, 106,2 mmol), dppf (883 mg, 1,59 mmol) i paladijum acetata (677 mg, 2,66 mmol) u etanolu (20 mL) se meša na 100 °C tokom 16 h pod CO atmosferom na 1,5 MPa. Reakciona smeša se zatim hladi do sobne temperature i procedi kroz celit. Filtrat se koncentruje u vakuumu a ostatak se rastvara u DCM (500 mL), ispere sa rastvorom soli (10 mL x 3), osuši iznad anhidrovanog Na2SO4a zatim koncentruje u vakuumu. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni sa silikagelom (PE : EtOAc = 8: 1-3: 1) da bi se dobio 108 (13,4 g, 86%) kao bela čvrsta supstanca. MS 292.1 [M+H]<+>.

[0050] Sinteza 109. Smeša 108 (13,4 g, 45,9 mmol) i NaBH4(10,4 g, 275,3 mmol) u etanolu (260 mL) se meša na sobnoj temperaturi tokom 16 h. Reakciona smeša se koncentruje u vakuumu a ostatak se rastvara sa DCM (500 mL), ispere sa rastvorom soli (100 mL x 3), osuši iznad anhidrovanog Na2SO4a zatim koncentruje u vakuumu. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni sa silikagelom (DCM : MeOH = 100 : 1 ~ 20 : 1) da bi se dobio 109 (8,6 g, 75%) kao bela čvrsta supstanca. MS 251.4 [M+H]<+>.

[0051] Sinteza 110. U smešu 109 (8,6 g, 34,4 mmol) u DMF (200 mL) na sobnoj temperaturi dodaje se NaH (60% u mineralnom ulju) (4,1 g, 103,2 mmol). Nastala smeša se meša na sobnoj temperaturi tokom 30 min, nakon čega se Mel (14,6 g, 103,2 mmol) dodaje u kapima. Nastala reakciona smeša se meša na sobnoj temperaturi tokom 1 h, a rastvor se zatim razblaži sa vodom (300 mL), i ekstrahuje sa EtOAc (200 mL x 3). Spojeni organski sloj se ispere sa rastvorom soli (100 mL x 3), osuši iznad anhidrovanog Na2SO4a zatim koncentruje u vakuumu. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni sa silikagelom (PE : EtOAc = 8 : 1 ~ 3 : 1) da bi se dobio 110 (8,0 g, 88%) kao prljavo bela čvrsta supstanca. MS 265.3 [M+H]<+>.

[0052] Sinteza 111. U rastvor 110 (7,6 g, 28,8 mmol) u DCM (70 mL) u ledenom kupatilu dodaje se u kapima TFA (38 mL). Nastali rastvor se meša na sobnoj temperaturi tokom 1 h, nakon čega se rastvarač uklanja u vakuumu da bi se dobio 111 kao sirov proizvod. MS 165.2 [M+H]<+>.

[0053] Sinteza 112. Smeša 111 (28,8 mmol, sirov proizvod iz poslednjeg koraka), A3 (11,8 g, 24 mmol) i Na2CO3(25,4 g, 240 mmol) u DMSO (200 mL) se meša na sobnoj temperaturi tokom 16 h. Kada se reakcija završila, što pokazuje LCMS, rastvor se razblaži sa vodom (300 mL), a zatim ekstrahuje sa EtOAc (200 mL x 3). Spojeni organski slojevi se isperu sa rastvorom soli (100 mL x 3), osuši iznad anhidrovanog Na2SO4a zatim koncentruje u vakuumu. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni sa silikagelom (PE: EtOAc = 1 : 1 to EtOAc) da bi se dobio 112 (7,0 g, 66%) kao žuta čvrsta supstanca. MS 442.2 [M+H]<+>.

[0054] Sinteza jedinjenja 2. Smeša 112 (7,0 g, 15,9 mmol) i Pd/C (2,3 g) u DCM/MeOH (140 mL/140 mL) se meša na sobnoj temperaturi tokom 2 h pod H2atmosferom. Pd/C se zatim uklanja ceđenjem kroz celit. Filtrat se koncentruje a ostatak se rekristalizuje sa MTBE da bi se dobilo jedinjenje 2 (4,5 g, 69%) kao svetlo žuta čvrsta supstanca. MS 412.1 [M+H]<+>.

Primer 3. Sinteza jedinjenja 3

[0055]

[0056] Sinteza jedinjenja 3. Jedinjenje 3 se sintetizuje na sličan način kao 1, da se obezbedi 3 (28 mg, 22%) kao prljavo bela čvrsta supstanca. MS 388 [M+H]<+>.

Primer 4. Sinteza jedinjenja 4 ,0

[0057]

1

[0058] Sinteza 114. U rastvor prop-2-in-1-amina (5,0 g, 90,9 mmol) i Et3N (18,4 g, 181,8 mmol) u DCM (100 mL) ohlađenog u ledenom kupatilu dodaje se u kapima (Boc)2O (23,8 g, 109,1 mmol). Nakon što je završeno dodavanje (Boc)2O, nastala smeša se ostavi da se zagreje do sobne temperature, i meša se na sobnoj temperaturi tokom 16 h. Kada je reakcija završena, smeša se razblaži sa DCM (200 mL), a zatim ispere sa rastvorom soli (100 mL x 3). Organski sloj se osuši iznad Na2SO4a zatim koncentruje u vakuumu. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni sa silikagelom (PE : EtOAc = 100 : 1 ~ 10 : 1) da bi se dobio 114 (10 g, 71%) kao bezbojno ulje. MS 178.3 [M 23]<+>, 100.3 [M -56]<+>.

[0059] Sinteza 101. U rastvor 114 (10 g, 64,5 mmol) u DMF (200 mL) dodaje se NaH (60% u mineralnom ulju) (2,84 g, 71 mmol) polako dok se reakciona smeša hladi u ledenom kupatilu. Nastala reakciona smeša se meša na sobnoj temperaturi tokom 1 h, a zatim se 3-bromoprop-1-in (9,2 g, 77,4 mmol) dodaje u gornju smešu i meša na sobnoj temperaturi tokom 2 h. Reakcija se zatim gasi sa vodom (500 mL i ekstrahuje sa t-BuOMe (250 mL x 3). Spojeni organski sloj se ispere sa rastvorom soli (200 mL x 3), osuši iznad anhidrovanog Na2SO4a zatim koncentruje u vakuumu. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni sa silikagelom (PE : EtOAc = 100 : 1 ~ 10 :1) da bi se dobio 101 (12 g, 96%) kao žuto ulje. MS 138.1 [M -56]<+>.

[0060] Sinteza 102. U rastvor 2-hloroacetonitrila (3,13 g, 41,4 mmol) i [Cp<∗>RuCl(cod)] (394 mg, 1,0 mmol) u DCE (40 mL) dodaje se rastvor 101 (4,0 g, 20,7 mmol) u DCE (80 mL) u kapima tokom 30 min pod N2atmosferom. Nastala reakciona smeša se meša na 40 °C tokom 16 h. Rastvarač se zatim uklanja u vakuumu, a sirovi ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni sa silikagelom (PE : EtOAc = 10 : 1 ~ 2 : 1) da bi se dobio 102 (2,1 g, 22%) kao žuto mrka čvrsta supstanca. MS 269.3 [M H]<+>.

[0061] Sinteza 115. Smeša 102 (1,50 g, 5,6 mmol), 3-fluoroazetidin hidrohlorida (932 mg, 8,4 mmol) i K2CO3(2,32 g, 16,8 mmol) u DMF (30 mL) se meša na 50 °C tokom 3 h. Smeša se zatim razblaži sa vodom (60 mL) i ekstrahuje sa EtOAc (30 mL x 4). Spojeni organski slojevi se isperu sa rastvorom soli (30 mL x 3), osuši iznad anhidrovanog Na2SO4a zatim koncentruje u vakuumu. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni sa silikagelom(DCM :MeOH= 100 : 1 ~ 30 :1) da bi se dobio 115 (1,4 g, 81%) kao bela čvrsta supstanca. MS 308.2 [M+H]<+>.

[0062] Sinteza 116. U rastvor 115 (200 mg, 0,65 mmol) u DCM (4 mL) dodaje se TFA (2 mL), i nastala reakciona smeša se meša na sobnoj temperaturi tokom 1 h. Kada LCMS pokaže da je reakcija gotova, rastvarač se uklanja u vakuumu da bi se dobio 116 kao sirov proizvod koji se koristi bez daljeg prečišćavanja u sledećem koraku. MS 208.2 [M+H]<+>.

[0063] Sinteza 117. Smeša A3 (265 mg, 0,54 mmol) i 116 (0,65 mmol, sirov proizvod iz poslednjeg koraka) u DMSO (40 mL) se meša na sobnoj temperaturi tokom 10 min, a zatim se dodaje Na2CO3(458 mg, 4,32 mmol). Nastala reakciona smeša se meša na sobnoj temperaturi tokom 2 h, zatim se razblaži sa vodom (80 mL), i ekstrahuje sa EtOAc (40 mL x 4). Spojeni organski slojevi se isperu sa rastvorom soli (40 mL x 3), osuše iznad anhidrovanog Na2SO4a zatim koncentruju u vakuumu. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni sa silikagelom (DCM : MeOH = 100 : 1 ~ 50 : 1) da bi se dobio 117 (200 mg, 76%) kao žuta čvrsta supstanca. MS 485.2 [M+H]<+>.

[0064] Sinteza jedinjenja 4. Smeša 117 (200 mg, 0,41 mmol) i Pd/C (200 mg) u MeOH (8 mL) se meša na sobnoj temperaturi tokom 1 h pod H2atmosferom. Pd/C se uklanja ceđenjem kroz celit, i filtrat se koncentruje da se obezbedi sirov ostatak, koji je prečišćen sa Prep-TLC (DCM : MeOH = 10 : 1) tri puta da bi se dobilo jedinjenje 4 (26 mg, 14%) kao žuta čvrsta supstanca.

Primer 5. Sinteza jedinjenja 5

[0065]

[0066] Sinteza A2. Smeša 6-hloro-3-nitropiridin-2-amina (4,58 g, 26,4 mmol), 2,4-difluorofenilboronske kiseline (5,00 g, 31,7 mmol) i Cs2CO3(25,73 g, 79,2 mmol) u dioksanu/H2O (100 mL/10 mL) se tretira sa Pd(PPh3)4(1,10 g, 0,95 mmol) pod N2atmosferom. Smeša se meša na 100 °C

1

tokom 2 h a zatim koncentruje u vakuumu. Ostatak se rastvara u EtOAc (200 mL), a rastvor se ispere sa rastvorom soli (100 mL x 3). Organski sloj se osuši iznad anhidrovanog Na2SO4a zatim koncentruje u vakuumu. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni sa silikagelom (PE : EtOAc = 7 : 1 ~ 5 : 1) da bi se dobio A2 (4,0 g, 61%) kao žuta čvrsta supstanca. MS 252.1 [M H]<+>.

[0067] Sinteza A3. Mešani rastvor A2 (4,0 g, 15,94 mmol) u piridinu (60 mL) se tretira sa fenil karbonohloridatom (7,50 g, 47,81 mmol) kap po kap na 0 °C. Nakon što je dodavanje završeno, reakciona smeša se meša na 50 °C tokom 4 h. Smeša se zatim koncentruje u vakuumu, a sirovi ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni sa silikagelom (PE : DCM = 3: 2 ~ 1 : 1) da bi se dobio A3 (7,1 g, 91%) kao žuta čvrsta supstanca. MS 492.1 [M H]<+>.

[0068] Sinteza 118. Rastvor terc-butil 3-oksopirolidin-1-karboksilata (15,0 g, 81,1 mmol) i DMF-DMA (29,0 g, 243,3 mmol) u THF (150 mL) se meša na 70 °C tokom 16 h. Rastvor se koncentruje u vakuumu da bi se dobio 118 kao sirov proizvod koji se koristi direktno u sledećem koraku. MS 241.1 [M H]<+>.

[0069] Sinteza 119. U rastvor 118 (81,1 mmol, sirov proizvod iz poslednjeg koraka) u EtOH (100 mL) dodaje se Et3N (40,4 g, 0,4 mol) i acetimidamid hidrohlorid (30,1 g, 0,32 mol). Nastali rastvor se meša ma 80 °C tokom 24 h. Nakon što se rastvarač uklanja u vakuumu, ostatak se razblaži sa vodom (100 mL) i ekstrahuje sa DCM (50 mL x 3). Spojeni organski slojevi se isperu sa rastvorom soli (50 mL x 3), osuše iznad anhidrovanog Na2SO4a zatim koncentruju u vakuumu. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni sa silikagelom (PE : DCM = 10 : 1 ~ 1 : 2) da bi se dobio 119 (10,5 g, 55%) kao braon čvrsta supstanca. MS 236.2 [M H]<+>.

[0070] Sinteza 120. Rastvor 119 (600 mg, 2,55 mmol) u dioksanu/HCl (4 N, 10 mL) se meša na sobnoj temperaturi tokom 1 h. Rastvor se koncentruje u vakuumu da bi se dobio 120 (340 mg, 77%) kao bela čvrsta supstanca koji se koristi bez daljeg prečišćavanja. MS 136.2 [M H]<+>.

[0071] Sinteza 121. Smeša A3 (231 mg, 0,47 mmol) i 120 (160 mg, 0,94 mmol) u DMSO (5 mL) se meša na sobnoj temperaturi tokom 10 min. Zatim se Na2CO3(399 mg, 3,76 mmol) dodaje u smešu iznad i nastala smeša se meša na sobnoj temperaturi tokom 2 h. Nakon što se reakcija završi, kako je pokazao LCMS, reakciona smeša se razblaži sa vodom (30 mL) i ekstrahuje sa EtOAc (10 mL x 3). Spojeni organski slojevi se isperu sa rastvorom soli (10 mL x 3), osuše iznad anhidrovanog Na2SO4a zatim koncentruju u vakuumu. Sirovi ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni sa silikagelom (DCM : MeOH = 100 : 1 ~ 50 : 1) da se obezbedi 121 (120 mg, 62%) kao žuta čvrsta supstanca. MS 413.2 [M H]<+>.

[0072] Sinteza jedinjenja 5. Smeša 121 (120 mg, 0,29 mmol) i Pd/C (120 mg) u MeOH (5 mL) se meša na sobnoj temperaturi tokom 30 min pod H2atmosferom. Pd/C se zatim uklanja ceđenjem kroz celit, filtrat se koncentruje, a nastali čvrsti ostatak je prečišćen Prep-TLC (DCM : MeOH = 10 : 1) da bi se dobilo jedinjenje 5 (52 mg, 47%) kao bela čvrsta supstanca. MS 383.2 [M H]<+>, 405.0 [M Na]<+>.

Primer 6. Sinteza jedinjenja 6

[0073]

1

[0074] Sinteza A4. Mešani rastvor 6-bromo-3-nitropiridin-2-amina (5,0 g, 23,0 mmol) i Et3N (6,9 g, 69,0 mmol) u THF (60 mL) se tretira sa fenil karbonohloridatom (10,8 g, 69,0 mmol) kap po kap na 0 °C. Nakon što je dodavanje završeno, smeša se meša na sobnoj temperaturi tokom 1 h. Reakciona smeša se zatim procedi i koncentruje u vakuumu. Nastali čvrsti ostatak se rekristalizuje iz petrolej etra da bi se dobio A4 (10,2 g, 97%) kao svetlo žuta čvrsta supstanca. MS 458.0, 460.0 [M+H]<+>.

[0075] Sinteza 122 i 122-A. U rastvor terc-butil 4,6-dihidropirolo[3,4-c]pirazol-5(2H)-karboksilata (15,0 g, 71,8 mmol) u DMF (150 mL) dodaje se NaH (60% u mineralnom ulju) (8,6 g, 215,4 mmol) dok se reakciona smeša hladi u ledenom kupatilu. Kada se dodavanje završi, nastala smeša se ostavi da se zagreje do sobne temperature i meša se na sobnoj temperaturi tokom 30 min. U ovom trenutku, 1-bromo-2-metoksietan (19,8 g, 143,6 mmol)se dodaje u reakcionu smešu, i mešanje se nastavlja na sobnoj temperaturi tokom 2 h. Reakciona smeša se zatim gasi sa vodom (300 mL), i ekstrahuje sa EtOAc (150 mL x 3). Spojeni organski sloj se ispere sa rastvorom soli (100 mL x 3), osuši iznad anhidrovanog Na2SO4a zatim koncentruje u vakuumu. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni sa silikagelom (DCM : MeOH = 100 : 1 ~ 30 : 1) da bi se dobila smeša 122 i 122-A (19,0 g, 99%) kao bezbojno ulje. MS 268.2 [M H]<+>.

[0076] Sinteza 123 i 123-A. U rastvor 122 i 122-A (6,5 g, 24,3 mmol) u DCM (60 mL) ohlađen u ledenom kupatilu dodaje se TFA (30 mL). Reakciona smeša se meša na sobnoj temperaturi tokom 1 h, nakon čega se rastvarač uklanja u vakuumu da bi se dobio 123 i 123-A kao smeša sirovih proizvoda koja se koristi direktno u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. MS 168.1 [M+H]<+>.

[0077] Sinteza 124 i 124-A. U rastvor 123 i 123-A (24,3 mmol, sirov proizvod iz poslednjeg koraka) i A4 (9,3 g, 20,3 mmol) u DMSO (200 mL) dodaje se Na2CO3(21,5 g, 203 mmol), i reakciona smeša se meša na sobnoj temperaturi tokom 4 h. Smeša se zatim razblaži sa vodom (400 mL) i ekstrahuje sa EtOAc (200 mL x 3). Spojeni organski slojevi se isperu sa rastvorom soli (100 mL x 3), osuše iznad anhidrovanog

1

Na2SO4a zatim koncentruju u vakuumu. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni sa silikagelom (DCM : MeOH = 100 : 1 ~ 30 : 1) da bi se dobila smeša 124 i 124-A (4,5 g, 50%) kao žuta čvrsta supstanca. MS 411.0, 413.1 [M+H]<+>.

[0078] Sinteza 125 i 125-A. Smeša 124 i 124-A (500 mg, 1,22 mmol), 5-hlortiofen-2-ilboronska kiselina (237 mg, 1,46 mmol) i K2CO3(169 mg, 1,23 mmol) u dioksanu/H2O (10 mL/2 mL) se tretira sa Pd(PPh3)4(45 mg, 0,06 mmol) pod N2atmosferom. Reakciona smeša se meša na 50 °C tokom 3 h a zatim koncentruje u vakuumu. Ostatak je potopljen u EtOAc (30 mL), a dobijeni rastvor je ispran sa rastvorom soli (10 mL x 3). Organski sloj se zatim osuši iznad anhidrovanog Na2SO4i koncentruje u vakuumu. Sirovi ostatak je prečišćen Prep-TLC (DCM : MeOH = 20: 1) da bi se dobila smeša 125 i 125-A (450 mg, 82%) kao žuta čvrsta supstanca. MS 449.2 [M H]<+>.

[0079] Sinteza jedinjenja 6 i jedinjenja 6A. Smeša 125 i 125-A (450 mg, 1,0 mmol) i Raney Ni (100 mg) u DCM/MeOH (6mL/6 mL) se meša na sobnoj temperaturi tokom 1 h pod H2atmosferom. Raney Ni se zatim uklanja ceđenjem kroz celit, filtrat se koncentruje u vakuumu, a ostatak je prečišćen Prep-TLC (DCM : MeOH = 10 : 1). Smeša strukturnih izomera se zatim odvaja korišćenjem hiralne HPLC (Kolona: Chiralcel OD-3; Rastvarač: MeOH; Brzina protoka: 2 mL/min; RT1843= 3,477 min, RT1843A= 4.142 min) da bi se dobilo jedinjenje 6 (99 mg, 24%) kao bela čvrsta supstanca (MS 419.2 [M+H]+) i jedinjenje 6A (50 mg, 12%) kao bela čvrsta supstanca. MS 419.2 [M+H]<+>.

Primer 7. Sinteza jedinjenja 7

[0080]

[0081] Sinteza 118. Rastvor terc-butil 3-oksopirolidin-1-karboksilata (600 mg, 3,24 mmol) i DMF-DMA (1,2 g, 9,72 mmol) u THF (10 mL) se meša na 70 °C tokom 16 h. Rastvor se koncentruje u vakuumu da bi se dobio 118 kao sirov proizvod koji se koristi direktno u sledećem koraku. MS 241.1 [M H]<+>.

[0082] Sinteza 126. U rastvor 118 (3,24 mmol, sirov proizvod iz poslednjeg koraka) u EtOH (10 mL) dodaje se Et3N (1,6 g, 16,2 mol) i propionimidamid hidrohlorid (1,4 g, 13,0 mmol). Nastali rastvor se meša na 80 °C tokom 20 h, nakon čega se rastvarač uklanja u vakuumu, ostatak se razblaži sa vodom (10 mL), a smeša se zatim ekstrahuje sa DCM (10 mL x 3). Spojeni organski slojevi se isperu sa rastvorom soli (10 mL x 3), osuše iznad anhidrovanog Na2SO4a zatim koncentruju u vakuumu. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni sa silikagelom (PE : DCM = 10 : 1 ~ 1 :2) da bi se dobio 126 (450 mg, 56%) kao braon čvrsta supstanca. MS 250.2 [M H]<+>.

1

[0083] Sinteza 127. Rastvor 126 (300 mg, 1,2 mmol) u DCM (6 mL) se tretira sa TFA (3 mL), i reakciona smeša se meša na sobnoj temperaturi tokom 1 h. Nakon 1 h, reakcija je bila završena, kako ukazuje LCMS, i reakciona smeša se koncentruje u vakuumu da bi se dobio 127 kao sirov proizvod koji se koristi direktno u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. MS 150.2 [M H]<+>.

[0084] Sinteza 128. Smeša A3 (294 mg, 0,6 mmol) i 127 (1,2 mmol, sirov proizvod iz poslednjeg koraka) u DMSO (10 mL) se meša na sobnoj temperaturi tokom 10 min. Zatim se dodaje Na2CO3(636 mg, 6,0 mmol), i nastala smeša se meša na sobnoj temperaturi tokom 2 h. Nakon što je reakcija završena, kako ukazuje LCMS, reakciona smeša se razblaži sa vodom (30 mL) i ekstrahuje sa EtOAc (10 mL x 3). Spojeni organski slojevi se isperu sa rastvorom soli (10 mL x 3), osuše iznad anhidrovanog Na2SO4a zatim koncentruju u vakuumu. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni sa silikagelom (DCM : MeOH = 100 : 1 ~ 50 : 1) da se obezbedi 128 (136 mg, 53%) kao žuta čvrsta supstanca. MS 427.2 [M H]<+>.

[0085] Sinteza jedinjenja 7. Smeša 128 (120 mg, 0,28 mmol) i Raney Ni (120 mg) u MeOH (5 mL) se meša na sobnoj temperaturi tokom 1 h pod H2atmosferom. Raney Ni se zatim uklanja ceđenjem kroz celit, filtrat se koncentruje, a sirovi ostatak je prečišćen Prep-TLC (DCM : MeOH = 10 : 1) da bi se dobilo jedinjenje 7 (80 mg, 72%) kao žuta čvrsta supstanca. MS 397.1 [M H]<+>.

Primer 8. Sinteza jedinjenja 8

[0086]

1

[0087] Sinteza 129 i 129-A. Smeša 124 i 124-A (350 mg, 0,85 mmol), 2-fluorofenilboronske kiseline (143 mg, 1,02 mmol) i K2CO3(352 mg, 2,55 mmol) u dioksanu/H2O (10 mL/2 mL) se tretira sa Pd(PPh3)4(49 mg, 0,04 mmol) pod N2atmosferom. Reakciona smeša se meša na 90 °C tokom 3 h a zatim koncentruje u vakuumu. Sirovi ostatak se potapa u EtOAc (30 mL), a dobijeni rastvor je ispran sa rastvorom soli (10 mL x 3). Organski sloj se osuši iznad anhidrovanog Na2SO4a zatim koncentruje u vakuumu. Ostatak je prečišćen Prep-TLC (PE : EA = 5: 1) da bi se dobila smeša 129 i 129-A (300 mg, 83%) kao žuta čvrsta supstanca. MS 427.2 [M H]<+>.

[0088] Sinteza jedinjenja 8 i jedinjenja 8A. Smeša 129 i 129-A (300 mg, 0,70 mmol) i Pd/C (80 mg) u DCM/MeOH (5mL/5 mL) se meša na sobnoj temperaturi tokom 1 h pod H2atmosferom. Pd/C se zatim uklanja ceđenjem kroz celit, filtrat se koncentruje, a sirovi ostatak je prečišćen Prep-TLC (DCM : MeOH = 10 : 1). Smeša strukturnih izomera se zatim odvaja korišćenjem hiralne HPLC (Kolona: Chiralcel OJ-3; Rastvarač: MeOH; Brzina protoka: 2 mL/min; RT1849= 1.201 min, RT1849A= 2.244 min) da bi se dobio 8 (105 mg, 37%) kao žuta čvrsta supstanca (MS 397.2 [M+H]<+>) i 8A (98 mg, 35%) kao žuta čvrsta supstanca. MS 397.2 [M+H]<+>.

Primer 9. Sinteza jedinjenja 9

2

[0090] Sinteza 130. Smeša 6-hloro-3-nitropiridin-2-amina (0,5 g, 2,9 mmol), 2-fluorofenilboronske kiseline (487 mg, 3,48 mmol) i K2CO3(1,20 g, 8,7 mmol) u dioksanu/H2O (10 mL/1 mL) se tretira sa Pd(PPh3)4(17 mg, 0,01 mmol) pod N2atmosferom. Reakciona smeša se meša na 90 °C tokom 2 h a zatim koncentruje u vakuumu. Sirovi ostatak se potapa u EtOAc (200 mL), a dobijeni rastvor je ispran sa rastvorom soli (100 mL x 3). Organski sloj se zatim osuši iznad anhidrovanog Na2SO4i koncentruje u vakuumu. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni sa silikagelom (PE : EtOAc = 10 : 1 ~ 3 : 1) da bi se dobio 130 (301 mg, 45%) kao žuta čvrsta supstanca. MS 234.2 [M H]<+>.

[0091] Sinteza 131. U mešani rastvor 130 (301 mg, 1,3 mmol) u piridinu (10 mL) dodaje se fenil karbonhloridat (608 mg, 3,9 mmol) u kapima dok se reakciona smeša hladi u ledenom kupatilu. Nastala reakciona smeša se meša na 55 °C tokom 4 h, nakon čega se reakciona smeša koncentruje u vakuumu. Nastali čvrsti ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni sa silikagelom (PE : EtOAc = 8: 1 ~ 3 : 1) da bi se dobio 131 (500 mg, 82%) kao žuta čvrsta supstanca. MS 474.2 [M H]<+>.

[0092] Sinteza 132. Balon MeOH (30 mL) ohlađen u ledenom kupatilu se tretira sa NaH (60% u mineralnom ulju) (940 mg, 23,5 mmol), i reakciona smeša se meša na 0 °C tokom 30 min. Jedinjenje 102 (2,1 g, 7,8 mmol) se zatim dodaje, i reakciona smeša se meša na 35 °C tokom 16 h. U ovom trenutku, reakciona smeša se gasi sa vodom (30 mL), ekstrahuje sa DCM (10 mL x 3), i spojeni organski slojevi se isperu sa rastvorom soli (10 mL x 3), osuše iznad anhidrovanog Na2SO4a zatim koncentruju u vakuumu. Nastali čvrsti ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni sa silikagelom (PE : EtOAc = 100 : 1 ~ 10 : 1) da bi se dobio 132 (1,8 g, 94%) kao čvrsta supstanca bež boje. MS 265.1 [M H]<+>.

[0093] Sinteza 133. U rastvor 132 (220 mg, 0,83 mmol) u DCM (6 mL) dodaje se TFA (2 mL) kap po kap, sa reakciona smeša hlađenjem u ledenom kupatilu. Reakcija se meša na sobnoj temperaturi 1 h, nakon čega se rastvarač uklanja u vakuumu da bi se dobio 133 kao sirov proizvod koji se koristi direktno u sledećem koraku. MS 165.1 [M H]<+>.

[0094] Sinteza 134. Smeša 131 (313 mg, 0,64 mmol) i 133 (0,83 mmol, sirov proizvod iz poslednjeg koraka) u DMSO (10 mL) se tretira sa Na2CO3(678 mg, 6,4 mmol), i reakciona smeša se zatim meša na sobnoj temperaturi tokom 2 h. U ovom trenutku, reakciona smeša se razblaži sa vodom (20 mL) i ekstrahuje sa EtOAc (20 mL x 3). Spojeni organski slojevi se isperu sa rastvorom soli (20 mL x 3), osuše iznad anhidrovanog Na2SO4a zatim koncentruju u vakuumu. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni sa silikagelom (EA to EA: MeOH = 50 : 1) da bi se dobio 134 (200 mg, 74%) kao žuta čvrsta supstanca. MS 424.0 [M+H]<+>.

[0095] Sinteza jedinjenja 9. Smeša 134 (200 mg, 0,47 mmol) i Pd/C (200 mg) u DCM/MeOH (4 mL/4 mL) se meša na sobnoj temperaturi tokom 1 h pod H2atmosferom. Pd/C se zatim uklanja ceđenjem kroz celit, filtrat se koncentruje a nastali čvrsti ostatak je prečišćen Prep-TLC (DCM : MeOH = 10 : 1) da bi se dobilo jedinjenje 9 (105 mg, 57%) kao žuta čvrsta supstanca. MS 394.2 [M+H]<+>.

Primer 10. Sinteza jedinjenja 10

[0096]

[0097] Sinteza 135 i 135-A. U rastvor terc-butil 4,6-dihidropirolo[3,4-c]pirazol-5(2H)-karboksilata (250 mg, 1,2 mmol) u DMF (5 mL) dodaje se NaH (96 mg, 2,4 mmol (60% u mineralnom ulju)), sa reakcionom smešom koja je ohlađena u ledenom kupatilu. Nastala smeša se meša na sobnoj temperaturi tokom 1 h, nakon čega se dodaje jodoetan (374 mg, 2,4 mmol), i nastala reakciona smeša se meša na sobnoj temperaturi tokom 2 h. Reakciona smeša se zatim razblaži sa vodom (10 mL) i ekstrahuje sa EtOAc (10 mL x 3). Spojeni organski slojevi se isperu sa rastvorom soli (10 mL x 3), osuše iznad anhidrovanog Na2SO4a zatim koncentruju u vakuumu da bi se dobio 135 i 135-A kao sirov proizvod. MS 238.2 [M H]<+>.

[0098] Sinteza 136 i 136-A. U rastvor 135 i 135-A (1,2 mmol, sirov proizvod iz poslednjeg koraka) u DCM (6 mL) dodaje se TFA (2 mL) kap po kap dok se reakciona smeša hladi u ledenom kupatilu. Reakciona smeša se meša na sobnoj temperaturi 1 h, nakon čega se rastvarač uklanja u vakuumu da bi se dobio 136 i 136-A kao sirov proizvod koji se koristi u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. MS 138.2 [M H]<+>.

[0099] Sinteza 137. Smeša 136 i 136-A (1,2 mmol, sirov proizvod iz poslednjeg koraka) i A3 (491 mg, 1,0 mmol) u DMSO (10 mL) se meša na sobnoj temperaturi tokom 10 min, zatim se dodaje Na2CO3(848 mg, 8,0 mol), i reakciona smeša se meša na sobnoj temperaturi tokom 2 h. Reakciona smeša se zatim razblaži sa vodom (20 mL) i ekstrahuje sa EtOAc (20 mL x 3). Spojeni organski slojevi se isperu sa rastvorom soli (20 mL x 3), osuše iznad anhidrovanog Na2SO4a zatim koncentruju u vakuumu. Sirovi ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni sa silikagelom (DCM : MeOH = 100 : 1 ~ 50 : 1) da bi se dobio sirov proizvod koji je smeša strukturnih izomera 137 i 137-A. Sirov proizvod se dalje prečišćava pomoću Prep-TLC (DCM : MeOH = 30 : 1) da bi se dobio 137 (150 mg, 36%) kao žuta čvrsta supstanca. MS 415.1 [M H]<+>.

[0100] Sinteza jedinjenja 10. Smeša 137 (150 mg, 0,36 mmol) i Pd/C (150 mg) u MeOH (5 mL) se meša na sobnoj temperaturi tokom 1 h pod H2atmosferom. Pd/C se zatim uklanja ceđenjem kroz celit, filtrat se koncentruje a ostatak se prečišćava pomoću Prep-TLC (DCM : MeOH = 15 : 1) da bi se dobilo jedinjenje 10 (85 mg, 61%) kao žuta čvrsta supstanca. MS 385.1 [M H]<+>.

2

Tabela 1. Spektrometrijski podaci za jedinjenja

2

Enzimski test HDAC2 i HDAC1 (HDAC2 IC50 podaci)

[0101] U nastavku se opisuje protokol testa za merenje deacetilacije peptidnog supstrata sa enzimima HDAC2 ili HDAC1. Enzim, supstrat, i kofaktori se spajaju u bunarčiću mikrotitarske ploče i inkubiraju tokom 3 sata na 25 °C. Na kraju inkubacije, reakcija se zaustavlja dodavanjem pufera koji sadrži SDS. Supstrat i proizvod se odvajaju i kvantifikuju elektroforetski korišćenjem LabChip 3000 sistema na bazi mikrofluida za otkrivanje leka od Caliper Life Sciences. Peptidni supstrat koji se koristi za ovaj test je FAM-TSRHK(AC)KL-CONH2 (FAM je karboksifluorescein). Peptid bi trebalo da bude >98% čistoće po kapilarnoj elektroforezi.

1. U bunarčić od ploče sa 384 bunarčića, doda se 5 µL 2X enzimskog pufera. Korišćenjem Labcyte Echo 550, doda se 100 nl jedinjenja. Enzim i jedinjenje mogu biti prethodno inkubirani u ovom trenutku ako se želi.

2. Dodati 5 µL 2X supstratnog pufera.

3. Inkubirati ploču na 25°C tokom 17 sati.

4. Završiti reakciju dodavanjem 40 µL 1,55X stop pufera.

5. Kreirati zadatak na Caliper LabChip<®>3000 sistemu za otkrivanje leka..

6. Napuniti ploču i započeti elektroforezu koristeći plavi laser (480 nm) za ekscitaciju i zeleni CCD (520 nm) za detekciju (CCD2).

2

Vreme reakcije = 17 sati; Temperatura reakcije = 25 °C.

Reakciona smeša finalnog testa

[0102] 100 mM HEPES, pH 7,50,1% BSA 0,01% Triton X-10025 mM KCl

[0103] 1% DMSO (iz jedinjenja) 1 mM FAM-TSRHK(AC)KL-CONH2 5 nM HDAC enzim (specifična aktivnost može da varira od serije do serije, a koncentracija enzima će možda morati da se prilagodi da bi se ostvarila konverzija -10-20% supstrata u proizvod).

[0104] Supstrat i peptidi prisutni u svakom uzorku su odvojeni elektroforetski pomoću instrumenta za kapilarnu elektroforezu LabChip 3000. Kako su peptidi supstrata i proizvoda odvojeni, poslatraju se dva pika fluorescencije. Parametar koji se mere je promena relativnog intenziteta pikova fluorescencije supstrata i proizvoda, odražavajući aktivnost enzima. Kapilarni elektroforegrami (RDA akvizicioni fajlovi) se analiziraju pomoću HTS Well Analyzer softvera (Caliper Life Sciences). Aktivnost enzima u svakom uzorku se određuje kao odnos proizvoda prema iznosu (PSR): P/(S+P), gde je P visina pika peptida proizvoda, a S je visina pika peptida supstrata. Za svako jedinjenje, enzimska aktivnost se meri pri različitim koncentracijama (12 koncentracija jedinjenja raspoređenih sa 3x razblaženjem intervalima). Uzorci negativne kontrole (0%-inhibicija u odsustvu inhibitora) i uzorci pozitivne kontrole (100%-ihibicije, u prisustvu 20 mM EDTA) se sastavljaju u četiri ponavljanja i koriste za izračunavanje %-vrednosti inhibicije za svako jedinjenje pri svakoj koncentraciji. Procenat inhibicije (Pinh) se određuje korišćenjem sledeće jednačine: Pinh= (PSR0%-PSRinh)/(PSR0%-PSR100%)<∗>100, gde je PSRinhodnos zbira proizvoda u prisustvu inhibitora, PSR0%je prosečan zbir proizvoda u odsustvu inhibitora i PSR100%je prosečan zbir proizvoda kod kontrolnih uzoraka sa 100%-inhibicije.

[0105 IC50 vrednosti inhibitora se određuju prilagođavanjem krive inhibicije (Pinhu odnosu na koncentraciju inhibitora) pomoću 4 parametra sigmoidnog modela doza-odgovor korišćenjem softvera XLfit 4 (IBDS).

[0106] Rezultati ovog testa za određena jedinjenja su prikazani u tabeli 2, ispod. U tabeli, "A" označava Kdvrednost manju od 0,1 µM; "B" Kdvrednost između 0,1 µM i 0,5 µM; "C" Kdvrednost veću od 0,5 µM i manje od ili jednako 5,0 µM; i "D" Kdvrenost veću od 5,0 µM.

Tabela 2

2

Test HDAC2 enzimske inhibicije u SH-SY5Y ćelijskom lizatu

Kultura ćelija i inhibitorski tretmani

[0107] Ćelije SH-SY5Y (Sigma) su kultivisane u Eagle’s modifikovanom osnovnom medijumu sa dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma i pen/strep. Dvadeset četiri sata pre doziranja jedinjenja 20 uL ćelija je postavljeno u bele ploče sa 384 bunarčića sa gustinom od 1500 ćelija/bunarčić. Jedinjenja su serijski razblažena u čistom DMSO a zatim razblažena 1:100 v/v u medijumu bez FBS i mešovito. Medijum se uklanja iz ćelija u ploči a razblažena jedinjenja u serumu bez medijuma (1% v/v konačnog DMbSO) se dodaju i inkubiraju na 37+C tokom pet sati. Zatim se dodaje deset uL HDAC-Glo 2 reagensa sa 0,1% Triton X-100, ploča se pomeša i ostavi da se razvija na sobnoj temperaturi tokom 100 minuta. Ploče su se zatim očitavale pomoću luminometra Spectramax LMax koristeći vreme integracije od 0,4s. Konstruisane su krive odgovora na dozu sa normalizovanim podacima gde je CI-994 na 100 uM definisan kao 100% inhibicije a sam DMSO kao 0% inhibicije.

[0108] Rezultati ovog testa za određena jedinjenja su prikazani u tabeli 3, ispod. U tabeli, "A" označava vrednost IC50između 0,1 µM i 1 µM; "B" označava vrednost IC50između 1,0 µM i 1,5 µM; i "C" označava vrednost IC50veću od 1,5 µM.

Tabela 3

Eritroidni i mijeloidni CFU test

[0109] Klonogeni progenitori humanih eritroida (CFU-E, BFU-E), granulocita-monocita (CFU-GM) i multipotentialnih (CFU-GEMM) linija su procenjeni u polučvrstoj formulaciji medijuma na bazi metilceluloze koja sadrži rhIL-3 (10 ng/mL), rhGM-SCF (10 ng/mL), rhSCF (50 ng/mL) i Epo (3 U/mL).

Ćelije

[0110] Normalne ćelije male gustine humane koštane srži izvedene iz normalne koštane srži (NorCal Biologics, California) i kvalifikovane kod ReachBio, su čuvane u gasovitoj fazi tečnog azota (-152°C) dok nisu tražene za test. Na dan eksperimenta ćelije su brzo odmrznute, sadržaj svake bočice se razblaži sa 10 mL Iscove modifikacijom Dulbekovog medijuma koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma (IMDM 10% FBS) i ispere centrifugiranjem (približno1200 o.u.m. tokom 10 minuta, sobna temperatura). Supernatant se odbaci a ćelijske pelete resuspenduju u poznatoj zapremini IMDM 10% FBS. Broj ćelija

2

(3% glacijalna sirćetna kiselina) i procena vijabilnosti (test isključenja triptan plavog) se radi za uzorak koštane srži.

Jedinjenja

[0111] Na dan eksperimenta, jedinjenja se rastvaraju u DMSO do osnovne koncentracije od 10 mM. Serijska razblaženja se pripremaju iz osnovne koncentracije da bi se postigle koncentracije od 2 i 0,4 mM. Kada se doda u medijum na bazi metilceluloze pri 1:1000 (v/v), dostižu se konačne test koncventracije od 10, 2 i 0.4 µM. Dodatno, 5-FU se procenjuje na 1,0, 0,1 i 0.01 µg/mL.

Suština postupka

[0112] Postavljeni su klonogeni progenitori humanih eritroidnih (CFU-E i BFU-E) i mijeloidnih (CFU-GM) linija u formulacijama medijuma na bazi metilceluloze kako je prethodno opisanom. Sva jedinjenja se dodaju u medijum da bi se dobila konačna željena koncentracija (10, 2 i 0.4 µM).5-Fluorouracil (Sigma Aldrich) se koristi kao pozitivna kontrola za proliferaciju progenitora (inhibicija rasta kolonija) i uvodi se u kulture humane koštane srži pri 1,0, 0,1, i 0,01 µg/mL. Kontrolne kulture rastvarača (koje ne sadrže jedinjenje već samo 0,1% DMSO) kao i standardne kontrole (koje ne sadrže ni jedinjenje ni DMSO) e takođe iniciraju.

[0113] Testovi humanog mijeloidnog i eritroidnog progenitora se iniciraju sa 2,0310<4>ćelija po kulturi. Sledećih 14 dana u kulturi, mijeloidne i eritroidne kolonije se procenjuju mikroskopski i ocenjuju od strane obučenog osoblja. Kolonije su podeljene u sledeće kategorije na osnovu veličine i morfologije: CFU-E, BFU-E, CFU-GM i CFU-GEMM.

Statistička analiza CFC brojeva

[0114] Srednja ± jedna standardna devijacija tri ponovljene kulture izračunava se za progenitore svake kategorije (CFU-E, BFU-E, itd.). Izvedeni su dvostrani t-testovi da bi se procenilo da li postoji razlika u broju kolonija koje su stvorene između kontrole razvijača i tretiranih kultura. Zbog potencijalne subjektivnosti popisivanja kolonija, p vrednost manja od 0,01 se smatra značajnom. Za izračunavanje koncentracije od 50inhibicije rasta kolonija (IC50) za svako jedinjenje, kriva doze odgovora se generiše crtanjem log koncentracije jedinjenja u odnosu na procenat rasta kontrolne kolonije korišćenjem XLfit softvera (IDBS). Koncentracija od 50% inhibicije rasta kolonija (IC50) se izračunava na osnovu uklapanja sigmoidne krive koristeći formulu modela doza- odgovor na jednom mestu: y = A [(B -A)/(1 ((C/x) ^ D))], gde je A = početna vrednost (osnovni odgovor), B = maksimalni odgovor, C = centar (koncentracija leka koja izaziva odgovor na pola puta između A i B) i D= nagib krive u sredini. Dalje, ucrtavanja i dodatne krive odgovora na dozu su generisane korišćenjem GraphPad Prism 7.0.

Morfološka procena kolonija

[0115] Napravljene su fotografije representativne kolonije hematopoetskih progenitora iz različitih linija, ilustrujući kolonije u prisustvu kontrole rastvarača kao i kolonije u prisustvu test jedinjenja.

[0116] Prebrojavanje eritroidne (CFU-E i BFU-E), mijeloidne (CFU-GM) i multi potencijalna (CFU-GEMM) kolonija izvodi stručno obučeno osoblje. Analizirana je raspodela tipova kolonija kao i opšta morfologija kolonija i ćelija. Za statističku analizu upoređen je broj kolonija u kulturama tretiranim jedinjenjem sa kulturama kontrole rastvarača.5-FU se koristi kao pozitivna kontrola toksičnosti u ovim

2

testovima i inhibitorni efekti koji su dobijeni za ovo jedinjenje su bili tačno onakvi kako se očekivalo. Eksperiment je korišćen da se proceni potencijalni efekat testiranog jedinjenja na proliferaciju humanih eritroidnih i mijeloidnih progenitora u medijumu na bazi metilceluloze. Izračunate su vrednosti IC50iz XLfit. Krive odgovora na dozu za eritroidnu i mijeloidnu toksičnost generišu se pomoću XLfit. Konačno, nelinearna regresija prilagođavanja krive i IC50s ± 95% CI, se izračunava pomoću Prism 7.0.-GEMM.

[0117] Rezultati su prikazani u tabeli 4.

Tabela 4

1

2

4

[0118] Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni izrazi koji se ovde koriste imaju uobičajeno značenje poznato prosečnom stručnjaku iz ove oblasti.

Claims

Patentni zahtevi 1. Jedinjenje formule:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
2. Jedinjenje prema zahtevu 1, pri čemu je jedinjenje formule:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
3. Jedinjenje prema zahtevu 1, pri čemu je jedinjenje formule:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
4. Jedinjenje prema zahtevu 1, pri čemu je jedinjenje formule:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
5. Jedinjenje prema zahtevu 1, pri čemu je jedinjenje formule:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
6. Jedinjenje prema zahtevu 1, pri čemu je jedinjenje formule:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
7. Jedinjenje prema zahtevu 1, pri čemu je jedinjenje formule:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
8. Jedinjenje prema zahtevu 1, pri čemu je jedinjenje formule:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
9. Jedinjenje prema zahtevu 1, pri čemu je jedinjenje formule:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
10. Jedinjenje prema zahtevu 1, pri čemu je jedinjenje formule:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
11. Jedinjenje prema zahtevu 1, pri čemu je jedinjenje formule:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
12. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata: jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1 do 11,ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so; i farmaceutski prihvatljiv nosač.
13. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1 do 11, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu u lečenju stanja kod subjekta odabranog od neurološkog poremećaja, poremećaja pamćenja ili kognitivnih funkcija ili oštećenja, poremećaj gubitka učenja, gljivične bolesti ili infekcije, inflamatorne bolesti, hematološke bolesti, psihijatrijskih poremećaja, i neoplastične bolesti.
14. Jedinjenje za upotrebu prema zahtevu 13, pri čemu je stanje: a. poremećaj kognitivnih funkcija ili oštećenje udruženo sa Alchajmerovom bolešću, Hantingtonova bolest, napadom indukovan gubitak pamćenja, šizofrenija, Rubinštajn Tajbi sindrom, Retov sindrom, fragilni X, demencija Levijevih tela, vaskularna demencija, frontotemporalna demencija, ADHD, disleksija, bipolarni poremećaj i socijalni, kognitivni i poremećaji učenja udruženi sa autizmom, traumatična povreda glave, poremećaj nedostatka pažnje, anksiozni poremećaj, uslovljeni odgovor na strah, panični poremećaj, opsesivno kompulsivni poremećaj, posttraumatski stresni poremećaj (PTSD), fobija, socijalni anksiozni poremećaj, oporavak zavisnosti od supstanci, oštećenje pamćenja povezano sa starenjem (AAMI), kognitivni pad povezan sa starenjem (ARCD), ataksija, ili Parkinsonova bolest; ili b. hematološka bolest odabrana od akutne mijelogene leukemije, akutne promijelocitne leukemije, akutne limfoblastne leukemije, hronične mijelogene leukemije, mijelodisplastičnih sindroma, i anemije srpastih ćelija; ili c. neoplastična bolest; ili d. poremećaj gubitka učenja odabran od gubitka straha i posttraumatskog stresnog poremećaja.
15. Jedinjenje za upotrebu prema zahtevu 14, pri čemu je stanje Alchajmerova bolest, Hantingtonova bolest, frontotemporalna demencija, Fridrajhova ataksija, posttraumatski stresni poremećaj (PTSD), Parkinsonova bolest, ili oporavak zavisnosti od supstanci. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5 4