Deprecated: The each() function is deprecated. This message will be suppressed on further calls in /home/zhenxiangba/zhenxiangba.com/public_html/phproxy-improved-master/index.php on line 456
RS63437B1 - Kombinovana terapija koja uključuje antitela protiv klaudina 18.2 za lečenje kancera - Google Patents
[go: Go Back, main page]

RS63437B1 - Kombinovana terapija koja uključuje antitela protiv klaudina 18.2 za lečenje kancera - Google Patents

Kombinovana terapija koja uključuje antitela protiv klaudina 18.2 za lečenje kancera

Info

Publication number
RS63437B1
RS63437B1 RS20220682A RSP20220682A RS63437B1 RS 63437 B1 RS63437 B1 RS 63437B1 RS 20220682 A RS20220682 A RS 20220682A RS P20220682 A RSP20220682 A RS P20220682A RS 63437 B1 RS63437 B1 RS 63437B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
positions
cells
amino acid
fragment
Prior art date
Application number
RS20220682A
Other languages
English (en)
Inventor
Ugur Sahin
Özlem Türeci
Rita Mitnacht-Kraus
Stefan Denis Jacobs
Magdalena Jadwiga Utsch
Cornelia Adriana Maria Heinz
Christiane Regina Stadler
Original Assignee
Astellas Pharma Inc
Tron Translationale Onkologie An Der Univ Der Johannes Gutenberg Univ Mainz Gemeinnuetzige Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=48651960&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS63437(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Astellas Pharma Inc, Tron Translationale Onkologie An Der Univ Der Johannes Gutenberg Univ Mainz Gemeinnuetzige Gmbh filed Critical Astellas Pharma Inc
Priority claimed from EP20163993.7A external-priority patent/EP3725810B1/en
Publication of RS63437B1 publication Critical patent/RS63437B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/28—Compounds containing heavy metals
    • A61K31/282—Platinum compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4375—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a six-membered ring having nitrogen as a ring heteroatom, e.g. quinolizines, naphthyridines, berberine, vincamine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/555—Heterocyclic compounds containing heavy metals, e.g. hemin, hematin, melarsoprol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/662—Phosphorus acids or esters thereof having P—C bonds, e.g. foscarnet, trichlorfon
    • A61K31/663—Compounds having two or more phosphorus acid groups or esters thereof, e.g. clodronic acid, pamidronic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/675—Phosphorus compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pyridoxal phosphate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/243—Platinum; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2013—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
[0001] Kanceri želuca i jednjaka (gastroezofagealni; GE) nalaze se među malignitetima za čijim lečenjem postoji najveća nezadovoljena medicinska potreba. Kancer želuca je drugi vodeći uzrok smrti od kancera širom sveta. Incidenca kancera jednjaka se poslednjih decenija povećala, uz istovremenu promenu histološkog tipa i lokacije primarnog tumora. Adenokarcinom jednjaka sada ima veću prevalencu od karcinoma skvamoznih ćelija u Sjedinjenim Državama i zapadnoj Evropi, pri čemu je većina tumora locirana u distalnom delu jednjaka. Ukupna stopa preživljavanja u periodu od pet godina za GE kancer je 20-25%, uprkos agresivnosti ustanovljenog standardnog tretmana povezanog sa značajnim sporednim efektima.
[0002] Većina pacijenata ima lokalno uznapredovalu ili metastaziranu bolest i mora da bude podvrgnuta prvoj liniji hemoterapije. Osnova na kojoj se zasnivaju režimi lečenja su derivati platine i fluoropirimidina, uglavnom kombinovani sa trećim jedinjenjem (npr. taksanom ili antraciklinima). Ipak, medijana preživljavanja bez napredovanja bolesti od 5 do 7 meseci i medijana ukupnog preživljavanja od 9 do 11 meseci su najbolje što se može očekivati.
[0003] Nedostatak veće koristi od različitih kombinovanih režima hemoterapije novije generacije za ove kancere podstakao je istraživanje upotrebe ciljanih agenasa. Nedavno, Trastuzumab je odobren za Her2/neu-pozitivne gastroezofagealne kancere. Međutim, kako samo ~20% pacijenata eksprimira ciljnu strukturu i ispunjava uslove za ovaj tretman, i dalje postoje velike medicinske potrebe.
[0004] Molekul čvrste veze Klaudin 18, varijante 2 nastale alternativnim splajsovanjem, (Klaudin 18.2 (CLDN18.2)) je član klaudinske familije proteina čvrste veze. CLDN18.2 je transmembranski protein od 27.8 kDa koji sadrži četiri domena koja prolaze kroz membranu sa dve male ekstracelularne petlje.
[0005] U normalnim tkivima ne postoji ekspresija CLDN18.2 koja može da se detektuje pomoću RT-PCR metode, sa izuzetkom želuca. Imunohistohemija sa antitelima specifičnim za CLDN18.2 otkriva želudac kao jedino pozitivno tkivo.
[0006] CLDN18.2 je visoko selektivni antigen želudačne linije koji se eksprimira isključivo na kratkoživećim diferenciranim ćelijama želudačnog epitela. CLDN18.2 se održava tokom maligne transformacije i stoga je često prikazan na površini humanih ćelija kancera želuca. Dodatno, ovaj pan-tumorski antigen se ektopično aktivira na značajnim nivoima u ezofagealnim, pankreasnim i plućnim adenokarcinomima. Protein CLDN18.2 je takođe lokalizovan u metastazama limfnog čvora adenokarcinoma kancera želuca i u udaljenim metastazama, posebno u jajnicima (takozvani Krukenbergovi tumori).
[0007] Himerno IgG1 antitelo IMAB362 koje je usmereno protiv CLDN18.2 razvila je kompanija Ganymed Pharmaceuticals AG. IMAB362 prepoznaje prvi ekstracelularni domen (ECD1) CLDN18.2 sa visokim afinitetom i specifičnošću. IMAB362 se ne vezuje ni za kog drugog člana klaudinske familije, uključujući blisko srodnu varijantu 1 Klaudina 18 nastalu alternativnim splajsovanjem (CLDN18.1). IMAB362 pokazuje preciznu specifičnost za ćelije tumora i povezuje četiri nezavisna veoma potentna mehanizma dejstva. Nakon vezivanja sa ciljnom strukturom IMAB362 posreduje u ubijanju ćelija putem ADCC, CDC i indukcije apoptoze izazvane unakrsnim vezivanjem ciljne strukture na površini ćelije tumora i direktne inhibicije proliferacije. Stoga, IMAB362 efikasno lizira CLDN18.2-pozitivne ćelije, uključujući humane ćelijske linije kancera želuca in vitro i in vivo. Miševi koji nose CLDN18.2-pozitivne ćelijske linije kancera imaju benefit preživljavanja, i do 40% miševa pokazuje regresiju tumora kada se tretiraju sa IMAB362.
[0008] Toksičnost i PK/TK profil IMAB362 detaljno su ispitivani kod miševa i makaki majmuna uključujući studije pronalaženja doznog opsega, studije toksičnosti sa 28-dnevnim ponavljanjem doze kod makaki majmuna i studije toksičnosti sa 3-mesečnim ponovljenim dozama kod miševa. I kod miševa (najduže trajanje tretmana nedeljna primena u toku 3 meseca, najviši nivoi doze 400 mg/kg) i makaki majmuna (do 5 nedeljnih primena do 100 mg/kg) ponovljene doze IMAB362 i.v. su dobro podnošene. Nisu indukovani znaci sistemske ili lokalne toksičnosti. Specifično, nije uočena toksičnost po želudac u bilo kojoj studiji toksičnosti. IMAB362 ne indukuje imunu aktivaciju i oslobađanje citokina. Nisu zabeleženi štetni efekti na reproduktivne organe mužjaka ili ženki. IMAB362 se ne vezuje za tkiva kojima nedostaje ciljna struktura. Studije biološke raspodele kod miševa ukazuju na to da je razlog izostanka gastrične toksičnosti vrlo verovatno kompartmentalizacija čvrstih veza na lumenskoj strani u zdravom gastričnom epitelu, što izgleda da suštinski onemogućava pristup IMAB362 epitopu. Ova kompartmentalizacija se gubi nakon maligne transformacije čineći epitop izloženim leku IMAB362.
[0009] IMAB362 je u ranoj fazi kliničkog ispitivanja. Faza I kliničke studije je izvedena kod ljudi.
5 doznih kohorti (33 mg/m<2>, 100 mg/m<2>, 300 mg/m<2>, 600 mg/m<2>, 1000 mg/m<2>), od po 3 pacijenta svaka, primile su pojedinačnu intravensku dozu IMAB362 i posmatrane su 28 dana. IMAB362 je veoma dobro tolerisan, bez značajnih bezbednosnih opservacija kod pacijenata. Kod jednog pacijenta svi mereni tumor markeri su se značajno smanjili u okviru od 4 nedelje nakon tretmana. U tekućoj fazi IIa kliničke studije IMAB362 se primenjuje ponovljeno.
[0010] WO2011/090005 opisuje lečenje pacijenata koji pate od kolorektalnog kancera kombinacijom irinotekana i antitela protiv A33. WO2010/009794 opisuje in vitro tretman ćelija ezofago-gastričnog kancera antitelima protiv EGFR u kombinaciji sa epirubicinom, cisplatinom i kapecitabinom. Takashi et al. ((2011) Anticancer Res 31(11): 3691-3696) opisuje dejstvo antitela protiv EGFR u kombinaciji sa 5-FU na humane ćelije kancera debelog creva in vitro.
[0011] Podaci koji su predstavljeni u ovom dokumentu ukazuju na to da bisfosfonati kao što je zolendronska kiselina, naročito kada se primeni zajedno sa rekombinantnim interleukinom-2, povećavaju aktivnost anti-CLDN18.2 antitela kao što je IMAB362. Mehanizam u osnovi ove pojave je aktivacija i ekspanzija populacije visoko citotoksičnih imunih ćelija (γ9δ2 T ćelija).
[0012] Dalje, podnosioci prijave predstavljaju podatke koji pokazuju da hemoterapeutski agensi mogu da stabilizuju ili povećaju ekspresiju CLDN18.2 na površini ćelija kancera, što dovodi do poboljšanja mogućnosti upotrebe anti-CLDN18.2 antitela, poput IMAB362, kao leka usmerenog na CLDN18.2. Uočen je sinergistički efekat anti-CLDN18.2 antitela kao što je IMAB362 sa određenim hemoterapeutskim režimima, naročito hemoterapeutskim režimima koji se upotrebljavaju za lečenje kancera želuca ili lečenje humanih solidnih kancera. Ćelije humanih kancera prethodno tretirane hemoterapijom su osetljivije na antitelom-indukovano ciljnospecifično ubijanje. U modelima mišjeg tumora, kontrola tumora anti-CLDN18.2 antitelom zajedno sa hemoterapijom bolja je od kontrole anti-CLDN18.2 antitelom kao jedinim agensom.
REZIME PRONALASKA
[0013] Predmetni pronalazak je definisan priloženim patentnim zahtevima.
[0014] Pronalazak se zasniva na navodima koji će biti objašnjeni u nastavku:
REZIME
[0015] Predmetni navodi generalno obezbeđuju kombinovanu terapiju za efikasno lečenje i/ili prevenciju bolesti povezanih sa ćelijama koje eksprimiraju CLDN18.2, uključujući bolesti kancera kao što je kancer želuca, kancer jednjaka, kancer pankreasa, kancer pluća kao što je nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), kancer jajnika, kancer debelog creva, kancer jetre, kancer glave-vrata, i kancer žučne kese i njihove metastaze, naročito metastaze kancera želuca kao što su Krukenbergovi tumori, peritonealna metastaza i metastaza limfnog čvora. Naročito poželjne bolesti kancera su adenokarcinomi želuca, jednjaka, pankreasnog kanala, žučnih kanala, pluća i jajnika.
[0016] U jednom aspektu, predmetni navodi obezbeđuju postupak za lečenje ili prevenciju bolesti kancera koji obuhvata primenu kod pacijenta antitela koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 u kombinaciji sa agensom koji stimuliše γδ T ćelije. Agens koji stimuliše γδ T ćelije može da se primeni pre, istovremeno sa, ili nakon primene antitela koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2, ili kao njihova kombinacija.
[0017] U jednom primeru izvođenja, γδ T ćelije su Vγ9Vδ2 T ćelije. U jednom primeru izvođenja, agens koji stimuliše γδ T ćelije je bisfosfonat, kao što je bisfosfonat koji sadrži azot (aminobisfosfonat). U jednom primeru izvođenja, agens koji stimuliše γδ T ćelije je odabran iz grupe koja se sastoji od zoledronske kiseline, klodronske kiseline, ibandronske kiseline, pamidronske kiseline, risedronske kiseline, minodronske kiseline, olpadronske kiseline, alendronske kiseline, inkadronske kiseline i njihovih soli. U jednom primeru izvođenja, agens koji stimuliše γδ T ćelije se primenjuje u kombinaciji sa interleukinom-2.
[0018] U jednom primeru izvođenja, postupak prema navodima dalje obuhvata davanje agensa koji stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2. Ekspresija CLDN18.2 je poželjno na ćelijskoj površini kancerske ćelije.
[0019] Agens koji stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2 može da bude citotoksični i/ili citostatski agens. U jednom primeru izvođenja, agens koji stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2 sadrži agens koji indukuje zaustavljanje ćelijskog ciklusa ili akumulaciju ćelija u jednoj ili više faza ćelijskog ciklusa, poželjno u jednoj ili više faza ćelijskog ciklusa različitoj od G1-faze. Agens koji stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2 može da sadrži agens izabran iz grupe koja se sastoji od antraciklina, jedinjenja platine, nukleozidnih analoga, taksana, analoga kamptotecina, ili njihovih prolekova, i njihovih kombinacija. Agens koji stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2 može da sadrži agens izabran iz grupe koja se sastoji od epirubicina, oksaliplatina, cisplatina, 5-fluorouracila ili njihovih prolekova kao što su kapecitabin, docetaksel, irinotekan, i njihove kombinacije. Agens koji stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2 može sadržati kombinaciju oksaliplatina i 5-fluorouracila ili njihovih prolekova, kombinaciju cisplatina i 5-fluorouracila ili njihovih prolekova, kombinaciju najmanje jednog antraciklina i oksaliplatina, kombinaciju najmanje jednog antraciklina i cisplatina, kombinaciju najmanje jednog antraciklina i 5-fluorouracila ili njihovih prolekova, kombinaciju najmanje jednog taksana i oksaliplatina, kombinaciju najmanje jednog taksana i cisplatina, kombinaciju najmanje jednog taksana i 5-fluorouracila ili njihovih prolekova, ili kombinaciju najmanje jednog analoga kamptotecina i 5-fluorouracila ili njihovih prolekova. Agens koji stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2 može da bude agens koji indukuje imunogenu smrt ćelija. Agens koji indukuje imunogenu smrt ćelija može sadržati agens izabran iz grupe koja se sastoji od antraciklina, oksaliplatina i njihovih kombinacija. Agens koji stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2 može sadržati kombinaciju epirubicina i oksaliplatina. U jednom primeru izvođenja, postupak prema navodima sadrži primenu najmanje jednog antraciklina, najmanje jednog jedinjenja platine i najmanje jednog 5-fluorouracila i njihovih prolekova. Antraciklin može da bude izabran iz grupe koja se sastoji od epirubicina, doksorubicina, daunorubicina, idarubicina i valrubicina. Poželjno, antraciklin je epirubicin. Jedinjenje platine se može izabrati iz grupe koja se sastoji od oksaliplatina i cisplatina. Nukleozidni analog može da bude izabran iz grupe koja se sastoji od 5-fluorouracila i njegovih prolekova. Taksan može da bude izabran iz grupe koja se sastoji od docetaksela i paklitaksela. Analog kamptotecina može se izabrati iz grupe koja se sastoji od irinotekana i topotekana. U jednom primeru izvođenja, postupak prema navodima sadrži primenu (i) epirubicina, oksaliplatina i 5-fluorouracila, (ii) epirubicina, oksaliplatina i kapecitabina, (iii) epirubicina, cisplatina i 5-fluorouracila, (iv) epirubicina, cisplatina i kapecitabina, ili (v) folinske kiseline, oksaliplatina i 5-fluorouracila.
[0020] Postupak prema navodima može dodatno da obuhvata primenu najmanje još jednog dodatnog hemoterapeutskog agensa koji može da bude citotoksični agens.
[0021] Antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 može se vezivati za nativne epitope na CLDN18.2 prisutne na površini živih ćelija. U jednom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 vezuje se za prvu ekstracelularnu petlju molekula CLDN18.2. U jednom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 posreduje u ubijanju ćelija jednim ili većim brojem mehanizama od: lize posredovane citotoksičnošću zavisnom od komplementa (CDC), lize posredovane ćelijskom citotoksičnošću zavisnom od antitela (ADCC), indukcije apoptoze i inhibicije proliferacije. U jednom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 je monoklonsko, himerno ili humanizovano antitelo, ili fragment antitela. U jednom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 je antitelo izabrano iz grupe koja se sastoji od (i) antitela koje je proizvedeno i/ili koje se može dobiti iz klona deponovanog pod pristupnim br. DSM ACC2737, DSM ACC2738, DSM ACC2739, DSM ACC2740, DSM ACC2741, DSM ACC2742, DSM ACC2743, DSM ACC2745, DSM ACC2746, DSM ACC2747, DSM ACC2748, DSM ACC2808, DSM ACC2809, ili DSM ACC2810, (ii) antitela koje je himerizovani ili humanizovani oblik antitela pod (i), (iii) antitela koje ima specifičnost antitela pod (i) i (iv) antitela koje sadrži antigen-vezujući deo ili mesto vezivanja antigena, naročito varijabilni region, antitela pod (i) i poželjno ima specifičnost antitela pod (i). U jednom primeru izvođenja, antitelo je kuplovano sa terapeutskim agensom kao što je toksin, radioizotop, lek ili citotoksični agens.
[0022] U jednom primeru izvođenja, postupak prema navodima sadrži primenu antitela koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 u dozi od sve do 1000 mg/m<2>. U jednom primeru izvođenja, postupak prema navodima sadrži primenu antitela koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 ponovljeno u dozi od 300 do 600 mg/m<2>.
[0023] U jednom primeru izvođenja, kancer je CLDN18.2-pozitivan. U jednom primeru izvođenja, bolest kancera je izabrana iz grupe koja se sastoji od kancera želuca, kancera jednjaka, kancera pankreasa, kancera pluća, kancera jajnika, kancera debelog creva, kancera jetre, kancera glavevrata, kancera žučne kese i njihovih metastaza. Bolest kancer može da bude Krukenbergov tumor, peritonealna metastaza i/ili metastaza limfnog čvora. U jednom primeru izvođenja, kancer je adenokarcinom, naročito uznapredovali adenokarcinom. U jednom primeru izvođenja, kancer je izabran iz grupe koja se sastoji od kancera želuca, kancera jednjaka, posebno donjeg jednjaka, kancera ezo-gastričnog spoja i gastroezofagealnog kancera. Pacijent može da bude HER2/neunegativni pacijent ili pacijent sa HER2/neu-pozitivnim statusom, ali koji ne ispunjava uslove za terapiju trastuzumabom.
[0024] Prema navodima, CLDN18.2 poželjno ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 1.
[0025] U sledećem aspektu, predmetni navodi obezbeđuju medicinski preparat koji sadrži antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 i agens koji stimuliše γδ T ćelije. Medicinski preparat prema predmetnim navodima može dodatno da sadrži agens koji stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2. Antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 i agens koji stimuliše γδ T ćelije, i izborno agens koji stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2, mogu da budu prisutni u medicinskom preparatu u smeši ili međusobno odvojeno. Medicinski preparat može da bude komplet koji sadrži prvu posudu koja uključuje antitelo koje ima sposobnost vezivanja CLDN18.2 i posudu koja uključuje agens koji stimuliše γδ T ćelije, i izborno posudu koja uključuje agens koji stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2. Medicinski preparat može dodatno uključivati štampana uputstva za upotrebu preparata za lečenje kancera, naročito za upotrebu preparata u postupku prema navodima. Različiti primeri izvođenja medicinskog preparata i, naročito, agensa koji stimuliše γδ T ćelije i agensa koji stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2 su kao što je prethodno opisano za postupak prema navodima.
[0026] Predmetni navodi takođe otkrivaju ovde opisane agense, kao što je antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 za upotrebu u ovde opisanim postupcima, npr. za primenu u kombinaciji sa agensom koji stimuliše γδ T ćelije i izborno agensom koji stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2.
[0027] Druge karakteristike i prednosti predmetnih navoda biće očigledne iz sledećeg detaljnog opisa i patentnih zahteva.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0028]
Slika 1. Efekat hemoterapije na ćelije kancera želuca. Kultivisanje KatoIII ćelija tokom 96 časova dovodi do zaustavljanja ćelijskog ciklusa u G0/G1-fazi i nishodne regulacije CLDN18.2. Citostatska jedinjenja koja rezultuju u zaustavljanju ćelijskog ciklusa u različitim fazama ćelijskog ciklusa (S-faza (5-FU) ili G2-faza (epirubicin)) stabilizuju ekspresiju CLDN18.2.
Slika 2. Efekat hemoterapije na ćelije kancera želuca. a/b: Efekat hemoterapije na nivoe transkripta i proteina CLDN18.2 u ćelijama kancera želuca. c: Protočna citometrija ekstracelularnog vezivanja IMAB362 na ćelije kancera želuca tretirane hemoterapeutskim agensima
Slika 3. Efekat hemoterapije na ćelije kancera želuca. Citostatska jedinjenja rezultuju u zaustavljanju ćelijskog ciklusa u različitim fazama ćelijskog ciklusa (S/G2-faza (Irinotekan) ili G2-faza (Docetaksel)).
Slika 4. IMAB362-indukovano ADCC-posredovano ubijanje ćelija kancera želuca nakon prethodnog tretmana hemoterapeutskim agensima
Slika 5. Efekat hemoterapije na ćelije kancera želuca. a: Ćelije tretirane Irinotekanom, Docetakselom ili Cisplatinom pokazuju niži nivo vijabilnih ćelija u poređenju sa ciljnim ćelijama kultivisanim u medijumu. b: CLDN18.2 ekspresija u ćelijama tretiranim Irinotekanom, Docetakselom ili Cisplatinom je povećana u poređenju sa ćelijama kultivisanim u medijumu. c/d: Tretman ćelija Irinotekanom, Docetakselom ili Cisplatinom poboljšava potenciju IMAB362 u indukovanju ADCC.
Slika 6. Efekti hemoterapije na IMAB362-indukovani CDC
Slika 7. Efekti hemoterapije na efektorske ćelije
Slika 8. Ekspanzija PBMC u kulturama sa dodatkom ZA/IL-2
Slika 9. Obogaćivanje Vγ9Vδ2 T ćelija u PBMC kulturama sa dodatkom ZA/IL-2
Slika 10. Obogaćivanje Vγ9Vδ2 T ćelija u medijumu sa dodatkom ZA i rastućom dozom IL-2
Slika 11. Ekspanzija i citotoksična aktivnost Vγ9Vδ2 T ćelija nakon ko-inkubacije sa ZA-pulsiranim monocitima i humanim ćelijama kancera
Slika 12. ZA-zavisno razviće različitih tipova ćelija u PBMC kulturama
Slika 13. Prikaz površinskih markera na Vγ9Vδ2 T-ćelijama nakon tretmana sa ZA/IL-2
Slika 14. ADCC aktivnost Vγ9Vδ2 T ćelija sa IMAB362 prema CLDN18.2-pozitivnim NUGC-4 ćelijama kancera želuca
Slika 15. ADCC IMAB362 pri upotrebi Vγ9Vδ2 T ćelija kao efektorskih ćelija
Slika 16. Efekti ZA na površinsku lokalizaciju CLDN18.2 na ciljnim ćelijama
Slika 17. Efekti hemoterapije i ZA/IL-2 tretmana na efektorske ćelije
Slika 18. Studije bio-raspodele sa konjugovanim antitelima kod miševa
Slika 19. Rani tretman ksenotransplantata tumora HEK293~CLDN18.2
Slika 20. Tretman uznapredovalih ksenotransplantata tumora HEK293~CLDN18.2
Slika 21. Efekat IMAB362 na potkožni tumorski rast ksenotransplantata kancera želuca
Slika 22. Efekti imunoterapije sa IMAB362 na NCI-N87~CLDN18.2 ksenotransplantate karcinoma želuca
Slika 23. Efekti kombinovane terapije sa IMAB362 i EOF režimom na ksenotransplantate NCI-N87~CLDN18.2
Slika 24. Efekti kombinovane terapije sa IMAB362 i EOF režimom na ksenotransplantate NUGC-4~CLDN18.2
Slika 25. Efekat ZA/IL-2 indukovanih Vγ9Vδ2 T ćelija na kontrolu makroskopskih tumora pomoću IMAB362 kod NSG miševa
Slika 26. Efekti kombinovane terapije sa IMAB362 i EOF režimom na CLS-103~cldn18.2 alotransplantate tumora
DETALJAN OPIS
[0029] Iako su predmetni navodi u nastavku detaljno opisani, podrazumeva se da ovi navodi nisu ograničeni na određene metodologije, protokole i reagense koji su ovde opisani, jer oni mogu da variraju. Takođe se podrazumeva da ovde korišćena terminologija služi samo u svrhu opisivanja određenih primera izvođenja, i nije namenjena da ograničava obim predmetnog navoda koji će biti ograničen samo priloženim patentnim zahtevima. Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini korišćeni ovde imaju ista značenja koja uobičajeno podrazumeva stručnjak u ovoj oblasti.
[0030] U nastavku dokumenta, biće opisani elementi predmetnih navoda. Ovi elementi su nabrojani sa specifičnim primerima izvođenja, međutim, podrazumeva se da mogu da budu kombinovani na bilo koji način i u bilo kom broju da bi se stvorili dodatni primeri izvođenja. Različito opisani primeri i poželjni primeri izvođenja ne bi trebalo da se tumače tako da ograničavaju predmetne navode samo na eksplicitno opisane primere izvođenja. Ovaj opis treba razumeti tako da podržava i obuhvata primere izvođenja koji kombinuju eksplicitno opisane primere izvođenja sa bilo kojim brojem otkrivenih i/ili poželjnih elemenata. Štaviše, sve permutacije i kombinacije svih opisanih elemenata u ovoj prijavi treba smatrati otkrivenim u opisu ove prijave, osim ako kontekst ne ukazuje drugačije.
[0031] Poželjno, ovde korišćeni termini su definisani kao što je opisano u "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kölbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995).
[0032] Izvođenje predmetnih navoda koristiće, ukoliko nije naznačeno drugačije, konvencionalne postupke hemije, biohemije, biologije ćelije, imunologije i tehnika rekombinantne DNK koje su opisane u literaturi iz ove oblasti (videti, npr., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).
[0033] Kroz ovu specifikaciju i patentne zahteve koji slede, ukoliko kontekst ne zahteva drugačije, reč "sadrže", i varijacije kao što su "sadrži" i "koji sadrži", podrazumevaju uključivanje navedenog člana, celog broja ili koraka ili grupe članova, celih brojeva ili koraka, ali ne i isključivanje bilo kog drugog člana, celog broja ili koraka ili grupe članova, celih brojeva ili koraka, iako u nekim primerima izvođenja takvi drugi članovi, celi brojevi ili koraci ili grupe članova, celih brojeva ili koraka mogu da budu isključeni, tj. predmet se sastoji u uključivanju navedenog člana, celog broja ili koraka ili grupe članova, celih brojeva ili koraka. Treba shvatiti da navođenje termina u jednini upotrebljeno u kontekstu opisa navoda (naročito u kontekstu patentnih zahteva) obuhvata i jedninu i množinu, ukoliko nije ovde naznačeno drugačije ili jasno kontradiktorno u odnosu na kontekst. Predviđeno je da nabrajanje opsega vrednosti ovde služi samo kao skraćeni postupak za pojedinačno označavanje svake zasebne vrednosti koja se nalazi unutar opsega. Ukoliko ovde nije drugačije naznačeno, svaka pojedinačna vrednost je uključena u specifikaciju kao da je ovde pojedinačno navedena. Svi ovde opisani postupci mogu se izvesti bilo kojim pogodnim redosledom, ukoliko ovde nije drugačije naznačeno ili na drugi način jasno kontradiktorno u odnosu na kontekst. Upotreba bilo kog ili svih primera, ili jezički označenog primera (npr., "kao što je"), koja je ovde data, predviđena je samo da bolje ilustruje navode i ne predstavlja ograničenje obima navoda za koji se inače traži patentna zaštita. Nikakvi jezički termini u specifikaciji ne treba
1
da budu shvaćeni kao da naznačuju element za koji nije tražena zaštita koji je esencijalan za izvođenje navoda.
[0034] Termin "CLDN18" odnosi se na klaudin 18 i uključuje bilo koje varijante, uključujući varijantu 1 klaudina 18 nastalu alternativnim splajsovanjem (klaudin 18.1 (CLDN18.1)) i varijantu 2 klaudina 18 nastalu alternativnim splajsovanjem (klaudin 18.2 (CLDN18.2)).
[0035] Termin "CLDN18.2" poželjno se odnosi na humani CLDN18.2, i, naročito, na protein koji sadrži, poželjno se sastoji od aminokiselinske sekvence prema SEQ ID NO: 1 iz listinga sekvenci ili na varijantu pomenute aminokiselinske sekvence.
[0036] Termin "CLDN18.1" se poželjno odnosi na humani CLDN18.1, i, naročito, na protein koji sadrži, poželjno koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prema SEQ ID NO: 2 iz listinga sekvenci ili na varijantu pomenute aminokiselinske sekvence.
[0037] Termin "varijanta" prema navodima se odnosi, naročito, na mutante, varijante nastale alternativnim splajsovanjem, konformacije, izoforme, alelne varijante, varijante vrsta i homologe vrsta, posebno one koje su prisutne u prirodi. Alelna varijanta se odnosi na izmenu u normalnoj sekvenci gena, čiji je značaj često nejasan. Potpuno sekvenciranje gena često identifikuje brojne alelne varijante za dati gen. Homolog vrste je sekvenca nukleinske kiseline ili aminokiseline poreklom od vrste drugačije od one od koje potiče data sekvenca nukleinske kiseline ili aminokiseline. Termin "varijanta" obuhvataće bilo koje posttranslaciono modifikovane varijante i konformacione varijante.
[0038] Termin "CLDN18.2-pozitivni kancer" označava kancer koji uključuje ćelije kancera koje eksprimiraju CLDN18.2, poželjno na površini pomenutih ćelija kancera.
[0039] "Ćelijska površina" je korišćena u skladu sa njenim normalnim značenjem u tehnici, i stoga uključuje spoljašnjost ćelije koja je dostupna za vezivanje od strane proteina i drugih molekula.
[0040] CLDN18.2 je eksprimiran na površini ćelija ukoliko je lociran na površini pomenutih ćelija i dostupan je za vezivanje sa CLDN18.2-specifičnim antitelima koja su dodata ćelijama.
[0041] Prema navodima, CLDN18.2 nije značajno eksprimiran u ćeliji ukoliko je nivo ekspresije niži od ekspresije u ćelijama želuca ili tkivu želuca. Poželjno, nivo ekspresije je niži od 10%, poželjno niži od 5%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1% ili 0.05% ekspresije u ćelijama želuca ili tkivu želuca, ili čak niži. Poželjno, CLDN18.2 nije značajno eksprimiran u ćeliji ukoliko nivo ekspresije ne prelazi nivo ekspresije u nekanceroznom tkivu različitom od želuca za više od 2 puta, poželjno 1,5 put, i poželjno ne prelazi nivo ekspresije u pomenutom ne-kanceroznom tkivu. Poželjno, CLDN18.2 nije značajno eksprimiran u ćeliji ukoliko je nivo ekspresije ispod granice detekcije i/ili ukoliko je nivo ekspresije suviše nizak da bi omogućio vezivanje sa CLDN18.2-specifičnim antitelima dodatim ćelijama.
[0042] Prema navodima, CLDN18.2 se eksprimira u ćeliji ukoliko nivo ekspresije prelazi nivo ekspresije u nekanceroznom tkivu različitom od želuca, poželjno za više od 2 puta, poželjno 10 puta, 100 puta, 1000 puta, ili 10000 puta. Poželjno, CLDN18.2 se eksprimira u ćeliji ukoliko je nivo ekspresije iznad granice detekcije i/ili ukoliko je nivo ekspresije dovoljno visok da omogući vezivanje sa CLDN18.2-specifičnim antitelima dodatim ćelijama. Poželjno, CLDN18.2 eksprimiran u ćeliji je eksprimiran ili izložen na površini pomenute ćelije.
[0043] Prema navodima, termin "bolest" odnosi se na bilo koje patološko stanje, uključujući kancer, naročito one oblike kancera opisane ovde. Bilo koja referenca ovde na kancer ili naročite oblike kancera takođe uključuje njegove metastaze. U poželjnom primeru izvođenja, bolest koja se tretira prema predmetnom pronalasku uključuje ćelije koje eksprimiraju CLDN18.2.
[0044] "Bolesti povezane sa ćelijama koje eksprimiraju CLDN18.2" ili slični izrazi označavaju prema navodima da je CLDN18.2 eksprimiran u ćelijama bolesnog tkiva ili organa. U jednom primeru izvođenja, ekspresija CLDN18.2 u ćelijama bolesnog tkiva ili organa je povećana u odnosu na stanje u zdravom tkivu ili organu. Povećanje se odnosi na povećanje od najmanje 10%, naročito najmanje 20%, najmanje 50%, najmanje 100%, najmanje 200%, najmanje 500%, najmanje 1000%, najmanje 10000% ili čak više. U jednom primeru izvođenja, ekspresija se javlja samo u obolelom tkivu, dok je ekspresija u zdravom tkivu sprečena. Prema navodima, bolesti povezane sa ćelijama koje eksprimiraju CLDN18.2 uključuju bolesti kancera. Dodatno, prema navodima, bolesti kancera su poželjno one gde ćelije kancera eksprimiraju CLDN18.2.
[0045] Kako se ovde koristi, "bolest kancera" ili "kancer" uključuje bolest karakterisanu aberantno regulisanim ćelijskim rastom, proliferacijom, diferencijacijom, adhezijom, i/ili migracijom. Pod "ćelijom kancera" podrazumeva se abnormalna ćelija koja raste brzom, nekontrolisanom ćelijskom proliferacijom i nastavlja da raste nakon što prestaje stimulus koji je izazvao novi rast. Poželjno, "bolest kancera" karakteriše se ćelijama koje eksprimiraju CLDN18.2 i ćelija kancera eksprimira CLDN18.2. Ćelija koja eksprimira CLDN18.2 poželjno je ćelija kancera, poželjno kancera koji su ovde opisani.
[0046] "Adenokarcinom" je kancer koji je poreklom iz žlezdanog tkiva. Ovo tkivo je takođe deo veće kategorije tkiva poznatog kao epitelno tkivo. Epitelno tkivo uključuje kožu, žlezde i različito drugo tkivo koje oivičava šupljine i organe tela. Epitel vodi embrionalno poreklo iz ektoderma, endoderma i mezoderma. Da bi bile klasifikovane kao adenokarcinom, ćelije ne moraju obavezno da budu deo žlezde, sve dok imaju sekretorne osobine. Ovaj oblik karcinoma može se javiti kod nekih viših sisara, uključujući ljude. Dobro diferencirani adenokarcinomi teže sličnosti sa žlezdanim tkivom iz koga potiču, dok slabo diferencirani ne moraju. Bojenjem ćelija iz biopsije, patolog će odrediti da li je tumor adenokarcinom ili neki drugi tip kancera. Adenokarcinomi mogu nastati u mnogim tkivima tela usled sveprisutnosti žlezda u telu. Iako svaka žlezda ne mora izlučivati istu supstancu, sve dok postoji egzokrina funkcija ćelije, smatra se žlezdanom i stoga je njen maligni oblik nazvan adenokarcinom. Maligni adenokarcinomi vrše invaziju drugih tkiva i često metastaziraju ukoliko im je dato dovoljno vremena. Adenokarcinom jajnika je najčešći tip karcinoma jajnika. Uključuje serozne i mukozne adenokarcinome, adenokarcinome svetlih ćelija i endometrioidni adenokarcinom.
[0047] Pod "metastazom" se podrazumeva širenje ćelija kancera sa njihovog originalnog mesta u drugi deo tela. Formiranje metastaze je veoma složen proces i zavisi od odvajanja malignih ćelija od primarnog tumora, invazije ekstracelularnog matriksa, penetracije endotelnih bazalnih membrana da bi ćelije ušle u telesne šupljine i sudove, i zatim, nakon transporta krvlju, infiltracije ciljnih organa. Konačno, rast novog tumora na ciljnom mestu zavisi od angiogeneze. Metastaze tumora se često dešavaju čak i nakon uklanjanja primarnog tumora jer tumorske ćelije ili komponente mogu da ostanu i razviju metastazni potencijal. U jednom primeru izvođenja, termin "metastaza" prema navodima odnosi se na "udaljenu metastazu" koja se odnosi na metastazu koja je udaljena od primarnog tumora i regionalnog sistema limfnog čvora. U jednom primeru izvođenja, termin "metastaza" prema navodima se odnosi na metastaze limfnih čvorova. Jedan naročiti oblik metastaze koji može da se leči terapijom prema navodima je metastaza poreklom od kancera želuca kao primarnog mesta. U poželjnim primerima izvođenja takva metastaza kancera želuca su Krukenbergovi tumori, peritonealna metastaza i/ili metastaza limfnog čvora.
[0048] Krukenbergov tumor je neuobičajeni metastazirani tumor jajnika koji čini 1% do 2% svih tumora jajnika. Prognoza Krukenbergovog tumora je još uvek veoma loša i ne postoji ustanovljeni tretman za Krukenbergove tumore. Krukenbergov tumor je metastazni adenokarcinom ćelija tipa pečatnog prstena jajnika. Želudac je u većini slučajeva primarno mesto Krukenbergovog tumora (70%). Karcinomi debelog creva, slepog creva i dojke (uglavnom invazivni lobularni karcinom) su sledeća najčešća primarna mesta. Registrovani su retki slučajevi Krukenbergovog tumora poreklom od karcinoma žučne kese, žučnog kanala, pankreasa, tankog creva, ampule Vateri, grlića materice i mokraćne bešike/urahusa. Interval između dijagnoze primarnog karcinoma i naknadnog otkrivanja uključenosti jajnika je obično 6 meseci ili manje, ali su registrovani i duži periodi. U mnogim slučajevima, primarni tumor je veoma mali i može da ostane neprimećen pri detekciji. Istorija prethodnog karcinoma želuca ili drugog organa može da se dobije u samo 20% do 30% slučajeva.
[0049] Krukenbergov tumor je primer selektivnog širenja kancera, najčešće u pravcu želudacjajnik. Ovaj pravac širenja tumora istorijski je privlačio pažnju mnogih patologa, naročito kada je nađeno da neoplazme želuca selektivno metastaziraju u jajnike bez uključivanja drugih tkiva. Put
1
metastaze želudačnog karcinoma u jajnike bila je misterija dugo vremena, ali je sada očigledno da je retrogradno limfno širenje najverovatnije put metastaze.
[0050] Postoji tendencija da su žene sa Krukenbergovim tumorima neobično mlade za pacijente sa metastaznim karcinomom jer su tipično u petoj deceniji života, sa prosečnom starošću od 45 godina. Ova raspodela u ranom uzrastu može delimično da se poveže sa povećanom učestalošću karcinoma ćelija topa pečatnog prstena želuca kod mladih žena. Uobičajeni simptomi su obično povezani sa jajnicima, od kojih je najčešći abdominalni bol i distenzija (uglavnom zbog obično bilateralnih i često velikih masa jajnika). Preostali pacijenti imaju nespecifične gastrointestinalne simptome ili su asimptomatski. Dodatno, Krukenbergov tumor je navodno povezan sa virilizacijom koja je rezultat proizvodnje hormona u stromi jajnika. Ascites je prisutan u 50% slučajeva i obično otkriva maligne ćelije.
[0051] Krukenbergovi tumori su bilateralni u više od 80% registrovanih slučajeva. Jajnici su obično asimetrično uvećani, sa konturom sa protuberancama. Preseci površina su žuti ili beli; obično su čvrsti, iako su povremeno cistični. Važno je da je kapsularna površina jajnika sa Krukenbergovim tumorima tipično glatka i bez adhezija ili peritonealnih depozita. Od značaja je da drugi metastazni tumori jajnika imaju tendenciju da su povezani sa površinskim implantima. Ovo može objasniti zašto ukupna morfologija Krukenbergovog tumora može varljivo izgledati kao primarni tumor jajnika. Međutim, bilateralizam Krukenbergovog tumora je konzistentan sa njegovom metastaznom prirodom.
[0052] Pacijenti sa Krukenbergovim tumorima imaju ukupnu stopu mortaliteta koja je značajno visoka. Većina pacijenata umre u roku od 2 godine (srednje preživljavanje, 14 meseci). Nekoliko studija pokazuje da je prognoza loša kad je primarni tumor identifikovan nakon otkrivanja metastaziranja u jajnik, i prognoza postaje lošija ukoliko primarni tumor ostaje neotkriven.
[0053] U literaturi nije jasno ustanovljena nikakva optimalna strategija tretmana Krukenbergovih tumora. Nije adekvatno obrađeno ni to da li treba da se izvede hirurška resekcija. Hemoterapija ili radioterapija nema značajan efekat na prognozu za pacijente sa Krukenbergovim tumorima.
[0054] Pod "tretiranjem/lečenjem" podrazumeva se primena jedinjenja ili kompozicije ili kombinacije jedinjenja ili kompozicija kod subjekta da bi se sprečila ili eliminisala bolest, uključujući smanjenje veličine tumora ili broja tumora kod subjekta; zaustavljanje ili usporavanje bolesti kod subjekta; inhibicija ili usporavanje razvoja nove bolesti kod subjekta; smanjenje učestalosti ili težine simptoma i/ili ponovnog pojavljivanja kod subjekta koji trenutno ima ili koji je prethodno imao bolest; i/ili produžavanje, tj. povećanje dužine života subjekta.
[0055] Konkretno, termin "tretman/lečenje bolesti" uključuje lečenje, skraćivanje trajanja, ublažavanje, sprečavanje, usporavanje ili inhibiciju napredovanja ili pogoršanja, ili sprečavanje ili odlaganje pojave bolesti ili njenih simptoma.
[0056] Termin "pacijent" označava prema navodima subjekta za tretman, naročito obolelog subjekta, uključujući ljudska bića, ne-humane primate ili druge životinje, naročito sisare kao što su krave, konji, svinje, ovce, koze, psi mačke ili glodari kao što su miševi i pacovi. U naročito poželjnom primeru izvođenja, pacijent je ljudsko biće.
[0057] γδ T ćelije (gama delta T ćelije) predstavljaju mali subset T ćelija koje poseduju posebni T ćelijski receptor (TCR) na svojoj površini. Većina T ćelija ima TCR sastavljen od dva glikoproteinska lanca nazvana α- i β-TCR lanci. Nasuprot tome, kod γδ T ćelija, TCR je sačinjen od jednog γ-lanca i jednog δ-lanca. Ova grupa T ćelija je obično mnogo manje uobičajena od αβ T ćelija. Humane γδ T ćelije imaju važnu ulogu u odgovorima nadzora nad stresom kao što su infektivne bolesti i autoimunitet. Takođe je sugerisano da transformacijom-indukovane promene u tumorima izazivaju odgovore vezane za nadzor nad stresom posredovane γδ T ćelijama i poboljšavaju antitumorski imunitet. Važno je da nakon vezivanja antigena aktivirane γδ T ćelije na mestima lezija obezbeđuju citokine (npr. INFγ, TNFα) i/ili hemokine koji posreduju u regrutaciji drugih efektorskih ćelija i pokazuju neposredne efektorske funkcije kao što je citotoksičnost (preko puteva receptora smrti i citolitičkih granula) i ADCC.
[0058] Većina γδ T ćelija u perifernoj krvi eksprimira Vγ9Vδ2 T-ćelijski receptor (TCRγδ). Vγ9Vδ2 T ćelije su jedinstvene za ljude i primate i smatra se da imaju ranu i esencijalnu ulogu u registrovanju "opasnosti" od strane invazionih patogena jer se dramatično povećavaju u mnogim akutnim infekcijama i mogu prevazići sve druge limfocite u roku od nekoliko dana, npr. kod tuberkuloze, salmoneloze, erlihioze, bruceloze, tularemije, listerioze, toksoplazmoze i malarije.
[0059] T ćelije γδ odgovaraju na male ne-peptidne fosforilisane antigene (fosfoantigene) kao što su pirofosfati sintetisani u bakterijama i izopentenil pirofosfat (IPP) proizveden u ćelijama sisara posredstvom mevalonatnog puta. Dok proizvodnja IPP u normalnim ćelijama nije dovoljna za aktivaciju γδ T ćelija, deregulacija mevalonatnog puta u tumorskim ćelijama dovodi do akumulacije IPP i aktivacije γδ T ćelija. IPPs se takođe mogu terapeutski povećati aminobisfosfonatima, koji inhibiraju enzim mevalonatnog puta farnezil pirofosfat sintazu (FPPS). Između ostalih, zoledronska kiselina (ZA, zoledronat, Zometa™, Novartis) predstavlja takav aminobifosfonat, koji se već klinički primenjuje kod pacijenata za lečenje osteoporoze i metastazirajućih bolesti kostiju. Nakon tretmana PBMC in vitro, ZA preuzimaju posebno monociti. IPP se akumulira u monocitima i oni se diferenciraju u antigen-prezentujuće ćelije koje stimulišu razvoj γδ T ćelija. U ovom okruženju, poželjno je dodavanje interleukina-2 (IL-2) kao
1
faktora rasta i preživljavanja aktiviranih γδ T ćelija. Konačno, opisano je da određeni alkilovani amini aktiviraju Vγ9Vδ2 T ćelije in vitro, međutim samo u milimolarnim koncentracijama.
[0060] Termin "agens koji stimuliše γδ T ćelije" odnosi se na jedinjenje koje stimuliše razviće γδ T ćelija, naročito Vγ9Vδ2 T ćelija, in vitro i/ili in vivo, naročito indukcijom aktivacije i ekspanzije γδ T ćelija. Poželjno, termin se odnosi na jedinjenja koja in vitro i/ili in vivo povećavaju izopentenil pirofosfat (IPP) proizveden u sisarskim ćelijama, poželjno inhibicijom enzima mevalonatnog puta farnezil pirofosfat sintaze (FPPS).
[0061] Jedna posebna grupa jedinjenja koja stimuliše γδ T ćelije su bisfosfonati, naročito bisfosfonati koji sadrže azot (N-bisfosfonati; aminobisfosfonati).
[0062] Na primer, pogodni bisfosfonati za upotrebu u pronalasku mogu uključivati jedno ili više sledećih jedinjenja uključujući njihove analoge i derivate, farmaceutske soli, hidrate, estre, konjugate i prolekove:
[1-hidroksi-2-(1H-imidazol-1-il)etan-1,1-diil]bis(fosforasta kiselina), zoledronska kiselina, npr. zoledronat;
(dihloro-fosfono-metil)fosforasta kiselina, npr. klodronat
{1-hidroksi-3-[metil(pentil)amino]propan-1,1-diil}bis(fosforasta kiselina), ibandronska kiselina, npr. ibandronat
(3-amino-1-hidroksipropan-1,1-diil)bis (fosforasta kiselina), pamidronska kiselina, npr. pamidronat;
(1-hidroksi-1-fosfono-2-piridin-3-il-etil)fosforasta kiselina, risedronska kiselina, npr. risedronat;
(1-Hidroksi-2-imidazo[1,2-a]piridin-3-il-1-fosfonoetil)fosforasta kiselina, minodronska kiselina;
[3-(dimetilamino)-1-hidroksipropan-1,1-diil]bis(fosforasta kiselina), olpadronska kiselina.
[4-amino-1-hidroksi-1-(hidroksi-oksido-fosforil)-butil]fosforasta kiselina, alendronska kiselina, npr. alendronat;
[(Cikloheptilamino)metilen]bis(fosforasta kiselina), inkadronska kiselina;
(1-hidroksietan-1,1-diil)bis(fosforasta kiselina), etidronska kiselina, npr. etidronat; i {[(4-hlorofenil)tio]metilen}bis(fosforasta kiselina), tiludronska kiselina.
[0063] Zoledronska kiselina (INN) ili zoledronat (prodavan od strane Novartis pod zaštićenim imenima Zometa, Zomera, Aclasta i Reclast) je naročito poželjan bisfosfonat. Zometa je korišćena da se spreče frakture skeleta kod pacijenata sa kancerima kao što je multipli mijelom i kancer
1
prostate, kao i za lečenje osteoporoze. Takođe se može koristiti za lečenje hiperkalcemije maligniteta i može pomoći u lečenju bola kod metastaze kostiju.
[0064] U jednom naročito poželjnom primeru izvođenja, agens koji stimuliše γδ T ćelije prema pronalasku primenjuje se u kombinaciji sa IL-2. Pokazano je da je takva kombinacija naročito efikasna u posredovanju širenja i aktivacije γ9δ2 T ćelija.
[0065] Interleukin-2 (IL-2) je interleukin, tip citokin signalnog molekula u imunom sistemu. To je protein i privlači limfocite i deo je prirodnog odgovora tela na mikrobnu infekciju, i u razlikovanju između stranog (ne-sopstvenog) i sopstvenog. IL-2 posreduje svojim efektima vezivanjem za IL-2 receptore, koje eksprimiraju limfociti.
[0066] IL-2 koji se koristi prema navodima može da bude bilo koji IL-2 koji podržava ili omogućava stimulaciju γδ T ćelija i može da potiče iz bilo koje vrste, poželjno čoveka. IL-2 može da bude izolovan, rekombinantno proizveden ili sintetički IL-2, i može da bude prirodni ili modifikovani IL-2.
[0067] Termin "agens koji stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2" odnosi se na agens ili kombinaciju agenasa čije obezbeđivanje ćelijama rezultuje u povećanim nivoima RNK i/ili proteina CLDN18.2, poželjno u povećanim nivoima proteina CLDN18.2 na ćelijskoj površini, u poređenju sa situacijom gde ćelijama nije obezbeđen agens ili kombinacija agenasa. Poželjno, ćelija je ćelija kancera, naročito ćelija kancera koja eksprimira CLDN18.2, kao što je ćelija ovde opisanih tipova kancera. Termin "agens koji stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2" odnosi se na, naročito, agens ili kombinaciju agenasa čije obezbeđivanje ćelijama rezultuje u povećanoj gustini CLDN18.2 na površini pomenutih ćelija u poređenju sa situacijom gde ćelijama nije obezbeđen agens ili kombinacija agenasa. "Stabilizacija ekspresije CLDN18.2" uključuje, konkretno, situaciju gde agens ili kombinacija agenasa sprečava smanjenje ili redukuje smanjenje ekspresije CLDN18.2, npr. ekspresija CLDN18.2 bi se smanjila bez obezbeđivanja agensa ili kombinacije agenasa, i obezbeđivanje agensa ili kombinacije agenasa sprečava pomenuto smanjenje ili redukuje pomenuto smanjenje ekspresije CLDN18.2. "Povećanje ekspresije CLDN18.2" uključuje, konkretno, situaciju gde agens ili kombinacija agenasa povećava ekspresiju CLDN18.2, npr. ekspresija CLDN18.2 bi se smanjila, ostala suštinski konstantna ili bi se povećala bez obezbeđivanja agensa ili kombinacije agenasa, i obezbeđivanje agensa ili kombinacije agenasa povećava ekspresiju CLDN18.2 u poređenju sa situacijom gde nije obezbeđen agens ili kombinacija agenasa, tako da je rezultujuća ekspresija veća u poređenju sa situacijom kada bi se ekspresija CLDN18.2 smanjila, ostala suštinski konstantna ili se povećala, bez obezbeđivanja agensa ili kombinacije agenasa.
1
[0068] Termin "agens koji stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2" uključuje hemoterapeutske agense ili kombinacije hemoterapeutskih agenasa, kao što su citostatski agensi. Hemoterapeutski agensi mogu da utiču na ćelije na jedan od sledećih načina: (1) oštećivanje DNK ćelija tako da više ne mogu da se reprodukuju, (2) inhibicija sinteze novih DNK lanaca tako da nije moguća replikacija ćelije, (3) zaustavljanje mitotičkih procesa u ćelijama, tako da ćelije ne mogu da se podele na dve ćelije.
[0069] Termin "agens koji stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2" poželjno se odnosi na agens ili kombinaciju agenasa kao što je citostatsko jedinjenje ili kombinacija citostatskih jedinjenja čije obezbeđivanje ćelijama, naročito ćelijama kancera, rezultuje u zaustavljanju ili akumulaciji ćelija u jednoj ili više faza ćelijskog ciklusa, poželjno u jednoj ili više faza ćelijskog ciklusa različitoj od G1- i G0-faze, poželjno različitom od G1-faze, poželjno u jednoj ili više od G2- ili S-faza ćelijskog ciklusa kao što je G1/G2-, S/G2-, G2- ili S-faza ćelijskog ciklusa. Termin "ćelije zaustavljene ili akumulirane u jednoj ili više faza ćelijskog ciklusa" označava da se procenat ćelija koje su u pomenutoj jednoj ili više faza ćelijskog ciklusa povećava. Svaka ćelija prolazi kroz ciklus koji se sastoji od četiri faze da bi se replicirala. Prva faza nazvana G1 je kada se ćelija priprema da replicira svoje hromozome. Drugi stadijum je nazvan S, i u ovoj fazi se odigrava sinteza DNK i DNK se udvaja. Sledeća faza je G2 faza, kada se udvajaju RNK i proteini. Finalni stadijum je M stadijum, koji predstavlja stadijum same ćelijske deobe. U ovom finalnom stadijumu, udvojena DNK i RNK se razdvajaju i odlaze na suprotne krajeve ćelije, i ćelija se zaista deli u dve identične, funkcionalne ćelije. Hemoterapeutski agensi koji oštećuju DNK obično rezultuju u akumulaciji ćelija u G1 i/ili G2 fazi. Hemoterapeutski agensi koji blokiraju rast ćelije preko ometanja sinteze DNK kao što su antimetaboliti obično rezultuju u akumulaciji ćelija u S-fazi. Primeri ovih lekova su 6-merkaptopurin i 5-fluorouracil.
[0070] Termin "agens koji stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2" uključuje antracikline kao što su epirubicin, jedinjenja platine kao što su oksaliplatin i cisplatin, nukleozidne analoge kao što je 5-fluorouracil ili njihove prolekove, taksane kao što je docetaksel, i analoge kamptotecina kao što su irinotekan i topotekan, i kombinacije lekova kao što su kombinacije lekova koje sadrže jedan ili više antraciklina kao epirubicin, oksaliplatin i 5-fluorouracil, kao što je kombinacija lekova koja sadrži oksaliplatin i 5-fluorouracil ili druge kombinacije lekova koje su opisane ovde.
[0071] U jednom poželjnom primeru izvođenja, "agens koji stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2" je "agens koji indukuje imunogenu ćelijsku smrt".
[0072] U specifičnim okolnostima, ćelije kancera mogu ući u put letalnog stresa povezan sa emitovanjem prostorno-vremenski definisane kombinacije signala koje imuni sistem dekodira da bi aktivirao tumor-specifične imunološke odgovore (Zitvogel L. et al. (2010) Cell 140: 798-804).
1
U takvom scenariju ćelije kancera se stimulišu da emituju signale koje detektuju urođeni efektori kao što su dendritske ćelije za stimulaciju srodnog imunog odgovora koji uključuje CD8+ T ćelije i IFN-γ signalizaciju tako da smrt ćelije tumora može izazvati produktivni antikancerski imuni odgovor. Ovi signali uključuju pre-apoptotsko izlaganje šaperona kalretikulina (CRT) endoplazmatičnog retikuluma (ER) na ćelijskoj površini, pre-apoptotsku sekreciju ATP, i postapoptotsko oslobađanje jedarnog proteina HMGB1. Zajedno, ovi procesi čine molekularne determinante imunogene ćelijske smrti (ICD). Antraciklini, oksaliplatin, i γ zračenje su sposobni da indukuju sve signale koji definišu ICD, dok cisplatin, na primer, koji je deficijentan u indukciji CRT translokacije iz ER na površinu umirućih ćelija – procesa koji zahteva stres ER – zahteva dodavanje tapsigargina, induktora ER stresa.
[0073] Termin "agens koji indukuje imunogenu ćelijsku smrt" odnosi se na agens ili kombinaciju agenasa koji su, kada su obezbeđeni ćelijama, naročito ćelijama kancera, sposobni da indukuju ćelije da uđu u put letalnog stresa koji konačno rezultuje u tumor-specifičnim imunološkim odgovorima. Naročito, agens koji indukuje imunogenu ćelijsku smrt kada je obezbeđeno ćelijama indukuje ćelije da emituju prostorno-vremenski definisanu kombinaciju signala, uključujući, naročito, pre-apoptotsko izlaganje šaperona kalretikulina (CRT) endoplazmatičnog retikuluma (ER) na ćelijskoj površini, pre-apoptotsku sekreciju ATP, i post-apoptotsko oslobađanje jedarnog proteina HMGB1.
[0074] Termin "agens koji indukuje imunogenu ćelijsku smrt" uključuje antracikline i oksaliplatin.
[0075] Antraciklini su klasa lekova uobičajeno korišćenih u hemoterapiji kancera koji su takođe antibiotici. Strukturno, svi antraciklini dele zajedničku 7,8,9,10-tetrahidrotetracen-5,12-hinonsku strukturu od četiri prstena i obično zahtevaju glikozilaciju na određenim mestima.
[0076] Antraciklini poželjno imaju jedan ili više sledećih mehanizama dejstva: 1. inhibiciju DNK i RNK sinteze umetanjem između baznih parova DNK/RNK lanca, čime sprečavaju replikaciju brzo rastućih ćelija kancera. 2. inhibiciju enzima topoizomeraze II, čime sprečavaju relaksaciju superzavijene DNK i time blokiraju transkripciju i replikaciju DNK. 3. stvaranje gvožđem posredovanih slobodnih kiseoničnih radikala koji oštećuju DNK i ćelijske membrane.
[0077] Termin "antraciklin" poželjno se odnosi na agens, poželjno agens protiv kancera za indukciju apoptoze, poželjno inhibicijom ponovnog vezivanja DNK u topoizomerazi II.
[0078] Poželjno, termin "antraciklin" se generalno odnosi na klasu jedinjenja koja imaju sledeću strukturu prstena
1
uključujući njegove analoge i derivate, farmaceutske soli, hidrate, estre, konjugate i prolekove.
[0079] Primeri antraciklina i analoga antraciklina uključuju, ali nisu ograničeni na, daunorubicin (daunomcin), doksorubicin (adriamicin), epirubicin, idarubicin, rodomicin, pirarubicin, valrubicin, N-trifluoro-acetil doksorubicin-14-valerat, aklacinomicin, morfolinodoksorubicin (morfolino-DOX), cijanomorfolino-doksorubicin (cijanomorfolino-DOX), 2-pirolinodoksorubicin (2-PDOX), 5-iminodaunomicin, mitoksantron i aklacinomicin A (aklarubicin). Mitoksantron je član klase antracendionskih jedinjenja koji su analozi antraciklina kojima nedostaje šećerni deo antraciklina, ali zadržavaju planarnu strukturu policikličnog aromatičnog prstena koja omogućava interkalaciju u DNK.
[0080] Naročito poželjan kao antraciklin prema navodima je jedinjenje sledeće formule:
gde
R1je izabran iz grupe koja se sastoji od H i OH, R2je izabran iz grupe koja se sastoji od H i OMe, R3je izabran iz grupe koja se sastoji od H i OH, i R4je izabran iz grupe koja se sastoji od H i OH.
[0081] U jednom primeru izvođenja, R1je H, R2je OMe, R3je H, i R4je OH. U sledećem primeru izvođenja, R1je OH, R2je OMe, R3je H, i R4je OH. U sledećem primeru izvođenja, R1je OH, R2je OMe, R3je OH, i R4je H. U sledećem primeru izvođenja, R1je H, R2je H, R3je H, i R4je OH.
[0082] Specifično predviđen kao antraciklin u kontekstu predmetnih navoda je epirubicin. Epirubicin je antraciklinski lek koji ima sledeću formulu:
2
i prodaje se pod zaštićenim imenom Ellence u SAD i Pharmorubicin ili Epirubicin Ebewe na drugim mestima. Naročito, termin "epirubicin" se odnosi na jedinjenje (8R,10S)-10-[(2S,4S,5R,6S)-4-amino-5-hidroksi-6-metil-oksan-2-il]oksi-6,11-dihidroksi-8-(2-hidroksiacetil)-1-metoksi-8-metil-9,10-dihidro-7H-tetracen-5,12-dion. Epirubicin je poželjniji od doksorubicina, najpopularnijeg antraciklina, u nekim hemoterapijskim režimima jer izgleda da izaziva manje sporednih efekata.
[0083] Prema navodima, termin "jedinjenje platine" odnosi se na jedinjenja koja sadrže platinu u svojoj strukturi kao što su kompleksi platine i uključuju jedinjenja kao što su cisplatin, karboplatin i oksaliplatin.
[0084] Termin "cisplatin" ili "cisplatina" odnosi se na jedinjenje cis-diamindihloroplatina(II) (CDDP) sledeće formule:
[0085] Termin "karboplatin" se odnosi na jedinjenje cis-diamin(1,1-ciklobutandikarboksilato)platina(II) sledeće formule:
[0086] Termin "oksaliplatin" se odnosi na jedinjenje koje je jedinjenje platine u kompleksu sa ligandom diaminocikloheksanskim nosačem sledeće formule:
[0087] Naročito, termin "oksaliplatin" se odnosi na jedinjenje [(1R,2R)-cikloheksan-1,2-diamin](etandioato-O,O’)platina(II). Oksaliplatin za injekciju se takođe prodaje pod zaštićenim imenom Eloxatine.
[0088] Termin "nukleozidni analog" se odnosi na strukturni analog nukleozida, kategorije koja uključuje i purinske analoge i pirimidinske analoge. Naročito, termin "nukleozidni analog" se odnosi na fluoropirimidinske derivate koji uključuju fluorouracil i njihove prolekove.
[0089] Termin "fluorouracil" ili "5-fluorouracil" (5-FU ili f5U) (prodavan pod zaštićenim imenima Adrucil, Carac, Efudix, Efudex i Fluoroplex) je jedinjenje koje je pirimidinski analog sledeće formule:
[0090] Naročito, termin se odnosi na jedinjenje 5-fluoro-1H-pirimidin-2,4-dion.
[0091] Termin "kapecitabin" (Xeloda, Roche) odnosi se na hemoterapeutski agens koji je prolek koji se konvertuje u 5-FU u tkivima. Kapecitabin koji se može oralno primeniti ima sledeću formulu:
[0092] Naročito, termin se odnosi na jedinjenje pentil [1-(3,4-dihidroksi-5-metiltetrahidrofuran-2-il)-5-fluoro-2-okso-1 H-pirimidin-4-il]karbamat.
[0093] Taksani su klasa diterpenoidnih jedinjenja koja su prvi put dobijena iz prirodnih izvora kao što su biljke iz roda Taxus, ali su neki veštački sintetisani. Glavni mehanizam dejstva klase lekova taksana je narušavanje funkcije mikrotubula, čime se inhibira proces ćelijske deobe. Taksani uključuju docetaksel (Taxotere) i paklitaksel (Taxol).
[0094] Prema navodima, termin "docetaksel" se odnosi na jedinjenje koje ima sledeću formulu:
[0095] Prema navodima, termin "paklitaksel" se odnosi na jedinjenje koje ima sledeću formulu:
[0096] Prema navodima, termin "analog kamptotecina" odnosi se na derivate jedinjenja kamptotecin (CPT; (S)-4-etil-4-hidroksi-1H-pirano[3’,4’:6,7]indolizino[1,2-b] hinolin-3,14-(4H,12H)-dion). Poželjno, termin "analog kamptotecina" odnosi se na jedinjenja koja sadrže sledeću strukturu:
[0097] Prema navodima, poželjni analozi kamptotecina su inhibitori DNK enzima topoizomeraze I (topo I). Poželjni analozi kamptotecina prema navodima su irinotekan i topotekan.
[0098] Irinotekan je lek koji sprečava odvijanje DNK inhibicijom topoizomeraze I. U hemijskom smislu, to je polusintetički analog prirodnog alkaloida kamptotecina koji ima sledeću formulu:
2
[0099] Konkretno, termin "irinotekan" odnosi se na jedinjenje (S)-4,11-dietil-3,4,12,14-tetrahidro-4-hidroksi-3,14-diokso-1H-pirano[3’,4’:6,7]-indolizino[1,2-b]hinolin-9-il-[1,4’bipiperidin]-1’-karboksilat.
[0100] Topotekan je inhibitor topoizomeraze formule:
[0101] Konkretno, termin "topotekan" se odnosi na jedinjenje (S)-10-[(dimetilamino)metil]-4-etil-4,9-dihidroksi-1H-pirano[3’,4’:6,7]indolizino[1,2-b]hinolin-3,14(4H,12H)-dion monohidrohlorid.
[0102] Prema navodima, agens koji stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2 može da bude hemoterapeutski agens, naročito hemoterapeutski agens ustanovljen u tretmanu kancera i može da bude deo kombinacije lekova kao što je kombinacija lekova ustanovljena za upotrebu u lečenju kancera. Takve kombinacije lekova mogu da budu kombinacije lekova korišćene u hemoterapiji, i mogu da budu kombinacije lekova kao što su one, korišćene u hemoterapeutskom režimu izabranom iz grupe koja se sastoji od EOX hemoterapije, ECF hemoterapije, ECX hemoterapije, EOF hemoterapije, FLO hemoterapije, FOLFOX hemoterapije, FOLFIRI hemoterapije, DCF hemoterapije i FLOT hemoterapije.
[0103] Kombinacija lekova korišćena u EOX hemoterapiji sadrži epirubicin, oksaliplatin i kapecitabin. Kombinacija lekova korišćena u ECF hemoterapiji sadrži epirubicin, cisplatin i 5-fluorouracil. Kombinacija lekova korišćena u ECX hemoterapiji sadrži epirubicin, cisplatin i kapecitabin. Kombinacija lekova korišćena u EOF hemoterapiji sadrži epirubicin, oksaliplatin i 5-fluorouracil.
[0104] Epirubicin se normalno daje u dozi od 50 mg/m2, cisplatin 60 mg/m2, oksaliplatin 130 mg/m2, produžena venska infuzija 5-fluorouracila sa 200 mg/m2/dan i oralni kapecitabin 625 mg/m2 dva puta dnevno, ukupno osam 3-nedeljnih ciklusa.
[0105] Kombinacija lekova korišćena u FLO hemoterapiji sadrži 5-fluorouracil, folinsku kiselinu i oksaliplatin (normalno 5-fluorouracil, 2600 mg/m2, 24-časovna infuzija, folinska kiselina 200 mg/m2 i oksaliplatin 85 mg/m2, svake 2 nedelje).
[0106] FOLFOX je hemoterapijski režim sastavljen od folinske kiseline (leukovorin), 5-fluorouracil i oksaliplatin. Preporučeni dozni raspored koji se daje svake dve nedelje je kao što sledi: Dan 1: Oksaliplatin 85 mg/m<2>IV infuzija i leukovorin 200 mg/m<2>IV infuzija, praćena sa 5-FU 400 mg/m<2>IV bolus, praćeno sa 5-FU 600 mg/m<2>IV infuzija kao 22-časovna kontinuirana infuzija; Dan 2: Leukovorin 200 mg/m<2>IV infuzija tokom 120 minuta, praćeno sa 5-FU 400 mg/m<2>IV bolus dat tokom 2-4 minuta, praćeno sa 5-FU 600 mg/m<2>IV infuzija kao 22-časovna kontinuirana infuzija.
[0107] Kombinacija lekova korišćena u FOLFIRI hemoterapiji sadrži 5-fluorouracil, leukovorin, i irinotekan.
[0108] Kombinacija lekova korišćena u DCF hemoterapiji sadrži docetaksel, cisplatin i 5-fluorouracil.
[0109] Kombinacija lekova korišćena u FLOT hemoterapiji sadrži docetaksel, oksaliplatin, 5-fluorouracil i folinsku kiselinu.
[0110] Termin "folinska kiselina" ili "leukovorin" odnosi se na jedinjenje korisno u sinergističkoj kombinaciji sa hemoterapeutskim agensom 5-fluorouracilom. Folinska kiselina ima sledeću formulu:
[0111] Konkretno, termin se odnosi na jedinjenje (2S)-2-{[4-[(2-amino-5-formil-4-okso-5,6,7,8-tetrahidro-1H-pteridin-6-il)metilamino]benzoil]amino}pentandioična kiselina.
[0112] Za primenu agensa koji stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2, u jednom primeru izvođenja, standardna hemoterapija prema EOX režimu u kombinaciji sa antitelom koje ima sposobnost vezivanja sa CLDN18.2, naročito IMAB362 primenjuje se u najviše 8 ciklusa. Doze i rasporedi mogu da budu kao što sledi:
• 50 mg/m2 Epirubicina biće primenjeno i.v. kao 15-minutna infuzija 1. dana svakog ciklusa tokom EOX faze.
2
• 130 mg/m2 Oksaliplatina biće primenjeno i.v. kao 2-časovna infuzija 1. dana svakog ciklusa tokom EOX faze.
• 625 mg/m2 Kapecitabina se uzima p.o. dva puta dnevno tokom 21 dana, ujutru i uveče počevši od večeri 1. dana svakog ciklusa tokom EOX faze.
• 1000 mg/m2 antitela će biti primenjeno i.v. kao 2-časovna infuzija 1. dana tokom ciklusa 1. Nakon toga biće primenjeno 600 mg/m2 antitela i.v. kao 2-časovna infuzija 1. dana svakog drugog ciklusa nakon što je završena infuzija Oksaliplatina.
• Nakon završetka hemoterapije, pacijent će nastaviti sa 600 mg/m2 antitela kao 2-časovne infuzije svake 3 ili 4 nedelje.
[0113] U jednom primeru izvođenja predmetnih navoda, standardna terapija prema EOX režimu u kombinaciji sa ZA/IL-2 i antitelom koje ima sposobnost vezivanja sa CLDN18.2, naročito IMAB362 primenjena je do 8 ciklusa (24 nedelje).
[0114] Termin "antigen" odnosi se na agens kao što je protein ili peptid koji sadrži epitop protiv koga je usmeren imuni odgovor i/ili treba da bude usmeren. U poželjnom primeru izvođenja, antigen je antigen povezan sa tumorom, kao što je CLDN18.2, tj., konstituent ćelija kancera koji može da potiče iz citoplazme, površine ćelije i jedra ćelije, naročito antigeni koji su proizvedeni, poželjno u velikim količinama, intracelularno ili kao antigeni na ćelijama kancera.
[0115] U kontekstu predmetnih navoda, termin "antigen povezan sa tumorom" poželjno se odnosi na proteine koji su pod normalnim uslovima specifično eksprimirani u ograničenom broju tkiva i/ili organa ili u specifičnim razvojnim stadijumima, i eksprimirani su, ili aberantno eksprimirani u jednom ili više tkiva tumora ili kancera. U kontekstu predmetnih navoda, antigen povezan sa tumorom je poželjno povezan sa ćelijskom površinom ćelije kancera i poželjno nije ili je samo retko eksprimiran u normalnim tkivima.
[0116] Termin "epitop" se odnosi na antigenu determinantu u molekulu, tj., na deo u molekulu koji je prepoznat od strane imunog sistema, na primer, koji je prepoznat od strane antitela. Na primer, epitopi su diskretna, trodimenzionalna mesta na antigenu, koja su prepoznata od strane imunog sistema. Epitopi se obično sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupa molekula kao što su aminokiseline ili bočni lanci šećera i obično imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Konformacioni i ne-konformacioni epitopi razlikuju se po tome što je vezivanje za prvo pomenuti, ali ne za poslednje navedeni, izgubljeno u prisustvu denaturišućih rastvarača. Epitop proteina kao što je CLDN18.2 poželjno sadrži kontinuirani ili diskontuirani deo pomenutog proteina i poželjno je dužine između 5 i 100, poželjno između 5 i 50, poželjnije između 8 i 30, najpoželjnije između 10 i 25 aminokiselina, na
2
primer, epitop može da bude poželjno 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ili 25 aminokiselina dužine.
[0117] Termin "antitelo" odnosi se na glikoprotein koji sadrži najmanje dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama, i uključuju bilo koji molekul koji sadrži njegov deo za vezivanje antigena. Termin "antitelo" uključuje monoklonska antitela i fragmente ili derivate antitela, uključujući, bez ograničenja, humana antitela, humanizovana antitela, himerna antitela, jednolančana antitela, npr., scFv i antigen-vezujući fragmenti antitela kao što su Fab i Fab’ fragmenti i takođe uključuje sve rekombinantne oblike antitela, npr., antitela eksprimirana u prokariotima, neglikozilovana antitela, i bilo koje antigen-vezujuće fragmente i derivate antitela kao što su ovde opisani. Svaki teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca (ovde označen skraćenicom VH) i konstantni region teškog lanca. Svaki laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca (ovde označen skraćenicom VL) i konstantni region lakog lanca. VH i VL regioni mogu se dodatno podeliti na regione hipervarijabilnosti, označene kao regioni koji određuju komplementarnost (CDR), naizmenično poređane sa regionima koji su više konzervisani, označenim kao okvirni regioni (FR). Svaki VH i VL je sastavljen od tri CDR i četiri FR regiona, raspoređena od amino-kraja ka karboksi-kraju sledećim redosledom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Varijabilni regioni teških i lakih lanaca sadrže vezujući domen koji interaguje sa antigenom. Konstantni regioni antitela mogu posredovati u vezivanju imunoglobulina za tkiva ili faktore domaćina, uključujući različite ćelije imunog sistema (npr., efektorske ćelije) i prvu komponentu (C1q) klasičnog sistema komplementa.
[0118] Ovde opisana antitela mogu da budu humana antitela. Predviđeno je da termin "humana antitela", kako je ovde korišćen, uključuje antitela koja imaju varijabilne i konstantne regione poreklom iz sekvenci imunoglobulina humane klicine linije. Ovde opisana humana antitela mogu da uključuju aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani sekvencama imunoglobulina humane klicine linije (npr., mutacije introdukovane mutagenezom po principu slučajnosti ili specifičnom za mesto in vitro ili sa somatskom mutacijom in vivo).
[0119] Termin "humanizovano antitelo" odnosi se na molekul koji ima mesto vezivanja antigena koje suštinski potiče od imunoglobulina ne-humanih vrsta, pri čemu je preostala struktura imunoglobulinskog molekula zasnovana na strukturi i/ili sekvenci humanog imunoglobulina. Antigen-vezujuće mesto može da sadrži ili kompletne varijabilne regione fuzionisane sa konstantnim domenima ili samo regione koji određuju komplementarnost (CDR) kalemljene na odgovarajuće okvirne regione u varijabilnim domenima. Antigen-vezujuća mesta mogu da budu divljeg tipa ili modifikovana jednom ili više aminokiselinskih supstitucija, npr. modifikovana da više liče na humane imunoglobuline. Neki oblici humanizovanih antitela imaju očuvane CDR
2
sekvence (na primer humanizovano mišje antitelo koje sadrži svih šest CDR iz mišjeg antitela). Drugi oblici imaju jedan ili više CDR koji su izmenjeni u odnosu na originalno antitelo.
[0120] Termin "himerno antitelo" odnosi se na ona antitela u kojima je jedan deo svake od aminokiselinskih sekvenci teških i lakih lanaca homolog odgovarajućim sekvencama antitela poreklom iz određenih vrsta ili koje pripadaju određenoj klasi, dok je preostali segment lanca homolog odgovarajućim sekvencama u drugoj. Tipično, varijabilni region lakih, kao i teških lanaca imitira varijabilne regione antitela poreklom iz jedne vrste sisara, dok su konstantni delovi homologi sekvencama antitela poreklom iz druge. Jedna jasna prednost takvih himernih oblika je da se varijabilni region može pogodno izvesti iz trenutno poznatih izvora korišćenjem lako dostupnih B-ćelija ili hibridoma iz ne-humanih organizama domaćina u kombinaciji sa konstantnim regionima poreklom iz, na primer, preparata humanih ćelija. Dok varijabilni region ima prednost lakoće pripreme i na specifičnost ne utiče izvor, manje je verovatno da će humani konstantni region izazvati imuni odgovor humanog subjekta kada se antitela ubrizgaju, nego što bi to bio slučaj kod konstantnog regiona iz ne-humanog izvora. Međutim, definicija nije ograničena na ovaj posebni primer.
[0121] Termini "antigen-vezujući deo" antitela (ili jednostavno "vezujući deo") ili "antigenvezujući fragment" antitela (ili jednostavno "vezujući fragment"), ili slični termini odnose se na jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost da specifično vezuju antigen. Pokazano je da se antigen-vezujuća funkcija antitela može izvesti fragmentima antitela pune dužine. Primeri vezujućih fragmenata obuhvaćeni terminom "antigen-vezujući deo" antitela uključuju (i) Fab fragmente, monovalentne fragmente koji se sastoje od VL, VH, CL i CH domena; (ii) F(ab’)2fragmente, bivalentne fragmente koji sadrže dva Fab fragmenta povezena disulfidnim mostom u zglobnom regionu; (iii) Fd fragmente koji se sastoje od VH i CH domena; (iv) Fv fragmente koji se sastoje od VL i VH domena jedne ručice antitela, (v) dAb fragmente (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), koji se sastoje od VH domena; (vi) izolovane regione koji određuju komplementarnost (CDR), i (vii) kombinacije dva ili više izolovanih CDR koji se izborno mogu spojiti sintetičkim linkerom. Dodatno, iako su dva domena Fv fragmenta, VL i VH, kodirani zasebnim genima, mogu se spojiti, korišćenjem rekombinantnih postupaka, sintetičkim linkerom koji omogućava da se naprave kao jedan lanac proteina u kojem su VL i VH regioni upareni da bi formirali monovalentne molekule (poznate kao jednolančani Fv (scFv); videti npr., Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; i Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Predviđeno je da takva jednolančana antitela takođe budu obuhvaćena terminom "antigen-vezujući fragment" antitela. Dodatni primer je vezujući domen imunoglobulinskih fuzionih proteina koji sadrži (i) vezujući domen polipeptida koji je fuzionisan sa polipeptidom zglobnog regiona
2
imunoglobulina, (ii) CH2 konstantni region teškog lanca imunoglobulina fuzionisan sa zglobnim regionom, i (iii) CH3 konstantni region teškog lanca imunoglobulina fuzionisan sa CH2 konstantnim regionom. Vezujući domen polipeptida može da bude varijabilni region teškog lanca ili varijabilni region lakog lanca. Fuzioni proteini sa vezujućim domenom imunoglobulina su dodatno opisani u US 2003/0118592 i US 2003/0133939. Ovi fragmenti antitela su dobijeni korišćenjem konvencionalnih tehnika poznatih stručnjacima, i izvršen je skrining fragmenata za upotrebu na isti način kao kod intaktnih antitela.
[0122] Predviđeno je da termin "bispecifični molekul" uključuje bilo koji agens, npr., protein, peptid, ili proteinski ili peptidni kompleks, koje ima dve različite specifičnosti vezivanja. Na primer, molekul se može vezati za, ili interagovati sa (a) antigenom na površini ćelije, i (b) Fc receptorom na površini efektorske ćelije. Predviđeno je da termin "multispecifični molekul" ili "heterospecifični molekul" uključi bilo koji agens, npr., protein, peptid, ili proteinski ili peptidni kompleks, koje ima više od dve različite specifičnosti vezivanja. Na primer, molekul se može vezati za, ili interagovati sa a) antigenom na površini ćelije, (b) Fc receptorom na površini efektorske ćelije, i (c) najmanje jednom različitom komponentom. Shodno tome, navodi uključuju, ali nisu ograničeni na bispecifične, trispecifične, tetraspecifične i druge multispecifične molekule koji su usmereni na CLDN18.2, i na druge ciljne strukture, kao što su Fc receptori na efektorskim ćelijama. Termin "bispecifična antitela" takođe uključuje diatela. Diatela su bispecifična antitela u kojima su VH i VL domeni eksprimirani na jednom polipeptidnom lancu, ali koriste linker koji je prekratak da bi dozvolio uparivanje između dva domena na istom lancu, čime se prisiljavaju domeni da se sparuju sa komplementarnim domenima drugog lanca čime se stvaraju dva antigen vezujuća mesta (videti npr., Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2: 1121-1123).
[0123] Antitelo može da bude konjugovano sa terapeutskim delom ili agensom, kao što je citotoksin, lek (npr., imunosupresant) ili radioizotop. Citotoksin ili citotoksični agens uključuje bilo koji agens koji je štetan za, i naročito, koji ubija ćelije. Primeri uključuju taksol, citohalazin B, gramicidin D, etidijum bromid, emetin, mitomicin, etoposid, tenoposid, vinkristin, vinblastin, kolhicin, doksorubicin, daunorubicin, dihidroksi antracin dion, mitoksantron, mitramicin, aktinomicin D, 1-dehidrotestosteron, glukokortikoide, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol i puromicin, i njihove analoge ili homologe. Pogodni terapeutski agensi za formiranje konjugata antitela uključuju, ali nisu ograničeni na, antimetabolite (npr., metotreksat, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, citarabin, fludarabin, 5-fluorouracil dekarbazin), alkilirajuće agense (npr., mehloretamin, tioepa hlorambucil, melfalan, karmustin (BSNU) i lomustin (CCNU), ciklofosfamid, busulfan, dibromomanitol, streptozotocin, mitomicin C, i cis-dihlorodiamin platina
2
(II) (DDP) cisplatin), antracikline (npr., daunorubicin (prethodno daunomicin) i doksorubicin), antibiotike (npr., daktinomicin (prethodno aktinomicin), bleomicin, mitramicin, i antramicin (AMC), i antimitotičke agense (npr., vinkristin i vinblastin). U poželjnom primeru izvođenja, terapeutski agens je citotoksični agens ili radiotoksični agens. U sledećem primeru izvođenja, terapeutski agens je imunosupresant. U sledećem primeru izvođenja, terapeutski agens je GM-CSF. U poželjnom primeru izvođenja, terapeutski agens je doksorubicin, cisplatin, bleomicin, sulfat, karmustin, hlorambucil, ciklofosfamid ili ricin A.
[0124] Antitela takođe mogu da budu konjugovana sa radioizotopom, npr., jodom-131, itrijumom-90 ili indijumom-111, da bi se stvorili citotoksični radiofarmaceutici.
[0125] Konjugati antitela prema navodima mogu se koristiti da modifikuju dati biološki odgovor, i deo sa lekom ne treba shvatiti ograničenim na klasične hemijske terapeutske agense. Na primer, deo sa lekom može da bude protein ili polipeptid koji poseduje poželjnu biološku aktivnost. Takvi proteini mogu da uključuju, na primer, enzimski aktivni toksin, ili njegov aktivni fragment, kao što je abrin, ricin A, egzotoksin pseudomonasa, ili toksin difterije; protein kao što je faktor nekroze tumora ili interferon-γ; ili, modifikatore biološkog odgovora kao što su, na primer, limfokini, interleukin-1 ("IL-1"), interleukin-2 ("IL-2"), interleukin-6 ("IL-6"), stimulišući faktor kolonije granulocita makrofaga ("GM-CSF"), stimulišući faktor kolonije granulocita ("G-CSF"), ili drugi faktori rasta.
[0126] Tehnike za konjugovanje takvih terapeutskih delova sa antitelima su dobro poznate, videti, npr., Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", u Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp.243-56 (Alan R. Liss, Inc.
1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", u Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", u Monoclonal Antibodies ’84: Biological And Clinical Applications, Pincheraet al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", u Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp.303-16 (Academic Press 1985), i Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982).
[0127] Kako se ovde koristi, antitelo je "poreklom iz" određene sekvence klicine linije ukoliko je antitelo dobijeno iz sistema imunizacijom životinja ili skriningom biblioteke imunoglobulinskih gena, i gde je izabrano antitelo najmanje 90%, poželjnije najmanje 95%, čak poželjnije najmanje 96%, 97%, 98%, ili 99% identično u aminokiselinskoj sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom kodiranom imunoglobulinskim genom klicine linije. Tipično, antitelo koje potiče iz određene sekvence klicine linije prikazaće razliku koja nije veća od razlike u 10 aminokiselina, poželjnije, ne više od razlike u 5, ili čak još poželjnije, ne više od 4, 3, 2, ili 1 aminokiseline od aminokiselinske sekvence kodirane imunoglobulinskim genom klicine linije.
[0128] Kako se ovde koristi, termin "heteroantitela" odnosi se na dva ili više antitela, njihove derivate, ili antigen vezujuće regione vezane zajedno, od kojih najmanje dva imaju različite specifičnosti. Ove različite specifičnosti uključuju vezujuću specifičnost za Fc receptor na efektorskoj ćeliji, i vezujuću specifičnost za antigen ili epitop na ciljnoj ćeliji, npr., tumorskoj ćeliji.
[0129] Ovde opisana antitela mogu da budu monoklonska antitela. Termin "monoklonsko antitelo" kako se ovde koristi odnosi se na pripremu molekula antitela jedne molekularne kompozicije. Monoklonsko antitelo prikazuje jednu specifičnost vezivanja i afinitet. U jednom primeru izvođenja, monoklonska antitela su proizvedena u hibridomu koji uključuje B ćeliju dobijenu iz ne-humane životinje, npr., miša, fuzionisanu sa imortalizovanom ćelijom.
[0130] Ovde opisana antitela mogu da budu rekombinantna antitela. Termin "rekombinantno antitelo", kako se ovde koristi, uključuje sva antitela koja su pripremljena, eksprimirana, stvorena ili izolovana rekombinantnim načinima, kao što su (a) antitela izolovana iz životinje (npr., miša) koja je transgena ili transhromozomalna u odnosu na imunoglobulinske gene ili hibridom pripremljen od njih, (b) antitela izolovana iz ćelije domaćina transformisane tako da eksprimira antitelo, npr., iz transfektoma, (c) antitela izolovana iz rekombinantne, kombinatorne biblioteke antitela, i (d) antitela pripremljena, eksprimirana, stvorena ili izolovana bilo kojim drugim načinima koji uključuju splajsovanje sekvenci imunoglobulinskih gena sa drugim DNK sekvencama.
[0131] Ovde pisana antitela mogu da potiču iz različitih vrsta, uključujući, ali se ne ograničavajući na miša, pacova, zeca, zamorca i čoveka.
[0132] Ovde pisana antitela uključuju poliklonska i monoklonska antitela i uključuju IgA kao što su IgA1 ili IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgM i IgD antitela. U različitim primerima izvođenja, antitelo je IgG1 antitelo, specifičnije IgG1, kapa ili IgG1, lambda izotip (tj. IgG1, κ, λ), IgG2a antitelo (npr. IgG2a, κ, λ), IgG2b antitelo (npr. IgG2b, κ, λ), IgG3 antitelo (npr. IgG3, κ, λ) ili IgG4 antitelo (npr. IgG4, κ, λ).
[0133] Termin "transfektom", kako se ovde koristi, uključuje rekombinantne eukariotske ćelijedomaćine koje eksprimiraju antitelo, kao što su CHO ćelije, NS/0 ćelije, HEK293 ćelije, HEK293T ćelije, ćelije biljaka, ili gljiva, uključujući ćelije kvasca.
[0134] Kako se ovde koristi, "heterologo antitelo" je definisano u odnosu na transgeni organizam koji proizvodi takvo antitelo. Ovaj termin se odnosi na antitelo koje ima aminokiselinsku sekvencu
1
ili kodirajuću sekvencu nukleinske kiseline koja odgovara onoj u organizmu koji se ne sastoji od transgenog organizma, i generalno potiče iz vrsta različitih od transgenog organizma.
[0135] Kako se ovde koristi, "heterohibridno antitelo" odnosi se na antitelo koje ima lake i teške lance poreklom od različitih organizama. Na primer, antitelo koje ima humani teški lanac povezan sa lakim lancem miša je heterohibridno antitelo.
[0136] Navodi obuhvataju sva antitela i derivate antitela, kao što je ovde opisano, koja su u svrhu navoda obuhvaćena terminom "antitelo". Termin "derivati antitela" označava bilo koji modifikovani oblik antitela, npr., konjugat antitela i drugi agens ili antitelo, ili fragment antitela.
[0137] Antitela koja su ovde opisana su poželjno izolovana. "Izolovano antitelo" kako se ovde koristi, namenjeno je da označava antitelo koje je suštinski bez drugih antitela koja imaju različite antigene specifičnosti (npr., izolovano antitelo koje se specifično vezuje za CLDN18.2 je suštinski bez antitela koja specifično vezuju antigene drugačije od CLDN18.2). Izolovano antitelo koje se specifično vezuje za epitop, izoformu ili varijantu humanog CLDN18.2 može, međutim, da ima unakrsnu reaktivnost sa drugim srodnim antigenima, npr., iz drugih vrsta (npr., homolozi vrste CLDN18.2). Pored toga, izolovano antitelo može da bude suštinski bez drugog ćelijskog materijala i/ili hemikalija. U jednom primeru izvođenja navoda, kombinacija "izolovanih" monoklonskih antitela se odnosi na antitela koja imaju različite specifičnosti i koja su kombinovana u dobro definisanoj kompoziciji ili smeši.
[0138] Termin "vezivanje" prema navodima se poželjno odnosi na specifično vezivanje.
[0139] Prema predmetnim navodima antitelo je sposobno da se vezuje za unapred određeno ciljno mesto ako ima značajan afinitet za navedeno unapred određeno ciljno mesto i vezuje se za navedeno unapred određeno ciljno mesto u standardnim analizama. "Afinitet" ili "vezujući afinitet" se često meri pomoću ravnotežne konstante disocijacije (KD). Poželjno, termin "značajan afinitet" označava vezivanje za unapred određeno ciljno mesto sa konstantom disocijacije (KD) od 10<-5>M ili niže, 10<-6>M ili niže, 10<-7>M ili niže, 10<-8>M ili niže, 10<-9>M ili niže, 10<-10>M ili niže, 10<-11>M ili niže ili 10<-12>M ili niže.
[0140] Antitelo nije (značajno) sposobno za vezivanje za ciljno mesto ako nema značajan afinitet za navedeno ciljno mesto i ne vezuje se značajno, konkretno, ne vezuje se detektabilno, za navedeno ciljno mesto u standardnim analizama. Poželjno, antitelo se ne vezuje detektabilno za navedeno ciljno mesto ako je prisutno u koncentraciji do 2, poželjno 10, poželjnije 20, naročito 50 ili 100 µg/ml ili više. Poželjno, antitelo nema značajan afinitet za ciljno mesto ako se vezuje za navedeno ciljno mesto sa KDkoja je najmanje 10 puta, 100 puta, 10<3>puta, 10<4>puta, 10<5>puta, ili 10<6>puta viša od KDza vezivanje za unapred određeno ciljno mesto za koje je antitelo sposobno da se vezuje. Na primer, ako je KDza vezivanje antitela za ciljno mesto za koje je antitelo sposobno
2
da se vezuje jednaka 10<-7>M, KDza vezivanje za ciljno mesto za koje antitelo nema značajan afinitet bila bi najmanje 10<-6>M, 10<-5>M, 10<-4>M, 10<-3>M, 10<-2>M ili 10<-1>M.
[0141] Antitelo je specifično za unapred određeno ciljno mesto ako je sposobno da se vezuje za navedeno unapred određeno ciljno mesto, dok nije sposobno da se vezuje za druga ciljna mesta, tj. nema značajan afinitet za druga ciljna mesta i ne vezuje se značajno za druga ciljna mesta u standardnim analizama. Prema navodima, antitelo je specifično za CLDN18.2 ako je sposobno da se vezuje za CLDN18.2, ali nije (značajno) sposobno da se vezuje za druga ciljna mesta. Poželjno, antitelo je specifično za CLDN18.2 ako afinitet za vezivanje za takva druga ciljna mesta značajno ne prevazilazi afinitet za ili vezivanje za CLDN18.2-nesrodne proteine kao što su goveđi serum albumin (BSA), kazein, humani serum albumin (HSA), ili ne-klaudinske transmembranske proteine kao što su MHC molekuli ili receptor za transferin ili bilo koji drugi naznačeni polipeptid. Poželjno, antitelo je specifično za unapred određeno ciljno mesto ako se vezuje za navedeno ciljno mesto sa KDkoja je najmanje 10 puta, 100 puta, 10<3>puta, 10<4>puta, 10<5>puta, ili 10<6>puta niža od KDza vezivanje za ciljno mesto za koje nije specifično. Na primer, ako je KDza vezivanje antitela za ciljno mesto za koje je specifično jednaka 10<-7>M, KDza vezivanje za ciljno mesto za koje nije specifično bila bi najmanje 10<-6>M, 10<-5>M, 10<-4>M, 10<-3>M, 10<-2>M, ili 10<-1>M.
[0142] Vezivanje antitela za ciljno mesto može da bude određeno eksperimentalno upotrebom bilo kog pogodnog postupka; videti, na primer, Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions" In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company New York, N Y (1992), i postupcima opisanim ovde. Afiniteti mogu da budu lako određeni upotrebom konvencionalnih tehnika, kao što je pomoću ravnotežne dijalize; upotrebom BIAcore 2000 instrumenta, upotrebom opštih postupaka navedenih od strane proizvođača; pomoću radioimunološke analize upotrebom radioaktivno obeleženog ciljnog antigena; ili pomoću drugog postupka poznatog stručnjaku iz date oblasti tehnike. Podaci o afinitetu mogu da budu analizirani, na primer, pomoću postupka opisanog kod Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. ScL, 51:660 (1949). Izmereni afinitet određene interakcije antitelo-antigen može da varira ako je meren pod različitim uslovima, npr., koncentracija soli, pH. Prema tome, merenja afiniteta i drugih antigen-vezujućih parametara, npr., KD, IC50, poželjno se izvode upotrebom standardizovanih rastvora antitela i antigena, i standardizovanog pufera.
[0143] Kako se ovde koristi, "izotip" označava klasu antitela (npr., IgM ili IgG1) koja je kodirana genima za konstantni region teškog lanca.
[0144] Kako se ovde koristi, "promena izotipa" označava fenomen pomoću koga se klasa, ili izotip, antitela menja iz jedne Ig klase u neku od drugih Ig klasa.
[0145] Termin "prirodan", kako se ovde koristi, primenjen na objekat označava činjenicu da objekat može da bude nađen u prirodi. Na primer, polipeptidna ili polinukleotidna sekvenca koja je prisutna u organizmu (uključujući viruse) koja može da bude izolovana iz izvora u prirodi i koja nije namerno modifikovana od strane čoveka u laboratoriji je prirodna.
[0146] Termin "preuređena" kako se ovde koristi označava konfiguraciju lokusa teškog lanca ili lakog lanca imunoglobulina gde je V segment postavljen neposredno pored D-J ili J segmenta u konformaciji koja kodira esencijalno kompletan VH ili VL domen, respektivno. Preuređeni genski lokus imunoglobulina (antitela) može da bude identifikovan poređenjem sa DNK klicine linije; preuređeni lokus će imati najmanje jedan rekombinovani heptamerni/nonamerni element homologije.
[0147] Termin "nepreuređena" ili "konfiguracija klicine linije" kako se ovde koristi u vezi sa V segmentom označava konfiguraciju u kojoj V segment nije rekombinovan tako da bude neposredno pored D ili J segmenta.
[0148] Prema navodima antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 je antitelo sposobno da se vezuje za epitop prisutan u CLDN18.2, poželjno epitop lociran unutar ekstracelularnih domena CLDN18.2, naročito prvi ekstracelularni domen, poželjno za aminokiselinske položaje 29 do 78 u CLDN18.2. U posebnim primerima izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 je antitelo sposobno da se vezuje za (i) epitop na CLDN18.2 koji nije prisutan na CLDN18.1, poželjno SEQ ID NO: 3, 4 i 5, (ii) epitop lokalizovan na CLDN18.2-petlji 1, poželjno SEQ ID NO: 8, (iii) epitop lokalizovan na CLDN18.2-petlji 2, poželjno SEQ ID NO: 10, (iv) epitop lokalizovan na CLDN18.2-petlji D3, poželjno SEQ ID NO: 11, (v) epitop, koji obuhvata CLDN18.2-petlju 1 i CLDN18.2-petlju D3, ili (vi) neglikozilovani epitop lokalizovan na CLDN18.2-petlji D3, poželjno SEQ ID NO: 9.
[0149] Prema navodima antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 poželjno je antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2, ali ne za CLDN18.1. Poželjno, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 je specifično za CLDN18.2. Poželjno, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 poželjno je antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 eksprimiran na ćelijskoj površini. U naročito poželjnim primerima izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 vezuje se za nativne epitope CLDN18.2 prisutne na površini živih ćelija. Poželjno, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 vezuje se za jedan ili više peptida izabranih iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, 3-11, 44, 46 i 48-50. Poželjno, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 je specifično za gore navedene proteine, peptide ili imunogene fragmente ili njihove derivate. Antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 može da bude dobijeno pomoću postupka koji sadrži korak imunizacije
4
životinje sa proteinom ili peptidom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, 3-11, 44, 46 i 48-50, ili nukleinskom kiselinom ili ćelijom domaćinom koja eksprimira navedeni protein ili peptid. Poželjno, antitelo se vezuje za ćelije kancera, naročito ćelije tipova kancera navedenih u prethodnom tekstu i, poželjno, ne vezuje se značajno za nekancerozne ćelije.
[0150] Poželjno, vezivanje antitela koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 za ćelije koje eksprimiraju CLDN18.2 indukuje ili posreduje u ubijanju ćelija koje eksprimiraju CLDN18.2. Ćelije koje eksprimiraju CLDN18.2 su poželjno ćelije kancera i naročito su izabrane iz grupe koja se sastoji od ćelija tumorogenog kancera želuca, kancera jednjaka, pankreasa, pluća, jajnika, debelog creva, jetre, glave-vrata, i žučne kese. Poželjno, antitelo indukuje ili posreduje u ubijanju ćelija indukcijom jednog ili više mehanizama od lize posredovane citotoksičnošću zavisnom od komplementa (CDC), lize posredovane ćelijskom citotoksičnošću zavisnom od antitela (ADCC), apoptoze i inhibicije proliferacije ćelija koje eksprimiraju CLDN18.2. Poželjno, liza ćelija posredovana pomoću ADCC odigrava se u prisustvu efektorskih ćelija, koje su u određenim primerima izvođenja izabrane iz grupe koja se sastoji od monocita, mononuklearnih ćelija, NK ćelija i PMNs. Inhibicija proliferacije ćelija može da bude merena in vitro određivanjem proliferacije ćelija u analizi upotrebom bromodeoksiuridina (5-bromo-2-deoksiuridin, BrdU). BrdU je sintetički nukleozid koji je analog timidina i može da bude ugrađen u novosintetisanu DNK replicirajućih ćelija (u toku S faze ćelijskog ciklusa), supstitucijom za timidin u toku replikacije DNK. Detekcija ugrađene hemikalije upotrebom, na primer, antitela specifičnih za BrdU označava ćelije koje su aktivno replicirale svoju DNK.
[0151] U poželjnim primerima izvođenja, antitela koja su ovde opisana mogu da budu okarakterisana jednom ili više od sledećih osobina:
a) specifičnost za CLDN18.2;
b) vezujući afinitet za CLDN18.2 od oko 100 nM ili manje, poželjno, oko 5-10 nM ili manje i, poželjnije, oko 1-3 nM ili manje,
c) sposobnost da se indukuje ili posreduje CDC usmerena na CLDN18.2-pozitivne ćelije; d) sposobnost da se indukuje ili posreduje ADCC usmerena na CLDN18.2-pozitivne ćelije; e) sposobnost da se inhibira rast CLDN18.2-pozitivnih ćelija;
f) sposobnost da se indukuje apoptoza CLDN18.2-pozitivnih ćelija.
[0152] U naročito poželjnom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 je proizvedeno pomoću hibridoma deponovanog kod DSMZ (Mascheroder Weg 1b, 31824 Braunschweig, Nemačka; nova adresa: Inhoffenstr. 7B, 31824 Braunschweig, Nemačka) i ima sledeću oznaku i pristupni broj:
a. 182-D1106-055, pristupni br. DSM ACC2737, deponovan 19.10.2005.
b. 182-D1106-056, pristupni br. DSM ACC2738, deponovan 19.10.2005.
c. 182-D1106-057, pristupni br. DSM ACC2739, deponovan 19.10.2005.
d. 182-D1106-058, pristupni br. DSM ACC2740, deponovan 19.10.2005.
e. 182-D1106-059, pristupni br. DSM ACC2741, deponovan 19.10.2005.
f. 182-D1106-062, pristupni br. DSM ACC2742, deponovan 19.10.2005.,
g. 182-D1106-067, pristupni br. DSM ACC2743, deponovan 19.10.2005.
h. 182-D758-035, pristupni br. DSM ACC2745, deponovan 17.11.2005.
i. 182-D758-036, pristupni br. DSM ACC2746, deponovan 17.11.2005.
j. 182-D758-040, pristupni br. DSM ACC2747, deponovan 17.11.2005.
k. 182-D1106-061, pristupni br. DSM ACC2748, deponovan 17.11.2005.
l. 182-D1106-279, pristupni br. DSM ACC2808, deponovan 26.10.2006.
m. 182-D1106-294, pristupni br. DSM ACC2809, deponovan 26.10.2006,
n. 182-D1106-362, pristupni br. DSM ACC2810, deponovan 26.10.2006.
[0153] Poželjna antitela prema navodima su ona proizvedena pomoću, i koja se mogu dobiti od, prethodno opisanih hibridoma; tj. 37G11 u slučaju 182-D1106-055, 37H8 u slučaju 182-D1106-056, 38G5 u slučaju 182-D1106-057, 38H3 u slučaju 182-D1106-058, 39F11 u slučaju 182-D1106-059, 43A11 u slučaju 182-D1106-062, 61C2 u slučaju 182-D1106-067, 26B5 u slučaju 182-D758-035, 26D12 u slučaju 182-D758-036, 28D10 u slučaju 182-D758-040, 42E12 u slučaju 182-D1106-061, 125E1 u slučaju 182-D1106-279, 163E12 u slučaju 182-D1106-294 i 175D10 u slučaju 182-D1106-362; i njihovi himerizovani i humanizovani oblici.
[0154] Poželjna himerizovana antitela i njihove sekvence su prikazane u sledećoj tabeli.
g
g
[0155] U poželjnim primerima izvođenja, antitela, naročito himerizovani oblici antitela prema navodima obuhvataju antitela koja sadrže konstantni region teškog lanca (CH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu poreklom od konstantnog regiona humanog teškog lanca kao što je aminokiselinska sekvenca predstavljena sekvencom SEQ ID NO: 13 ili njen fragment. U dodatnim poželjnim primerima izvođenja, antitela, naročito himerizovani oblici antitela prema navodima obuhvataju antitela koja sadrže konstantni region lakog lanca (CL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu poreklom od konstantnog regiona humanog lakog lanca kao što je aminokiselinska sekvenca predstavljena sekvencom SEQ ID NO: 12 ili njen fragment. U naročito poželjnom primeru izvođenja, antitela, naročito himerizovani oblici antitela prema navodima obuhvataju antitela koja sadrže CH koji sadrži aminokiselinsku sekvencu poreklom od humanog CH kao što je aminokiselinska sekvenca predstavljena sekvencom SEQ ID NO: 13 ili njen fragment i koji sadrži CL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu poreklom od humanog CL kao što je aminokiselinska sekvenca predstavljena sekvencom SEQ ID NO: 12 ili njen fragment.
[0156] U jednom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 je himerno mišje/humano IgG1 monoklonsko antitelo koje sadrži kapa mišji varijabilni laki lanac, konstantni region humanog kapa lakog lanca alotip Km(3), mišji varijabilni region teškog lanca, humani IgG1 konstantni region, alotip G1m(3).
[0157] U određenim poželjnim primerima izvođenja, himerizovani oblici antitela obuhvataju antitela koja sadrže teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, i njihovog fragmenta i/ili koja sadrže laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 i njihovog fragmenta.
[0158] U određenim poželjnim primerima izvođenja, himerizovani oblici antitela obuhvataju antitela koja sadrže kombinaciju teških lanaca i lakih lanaca izabranih od sledećih mogućnosti (i) do (ix):
(i) teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 14 ili njen fragment i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 21 ili njen fragment,
(ii) teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 15 ili njen fragment i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 20 ili njen fragment,
(iii) teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 16 ili njen fragment i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 22 ili njen fragment,
(iv) teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 18 ili njen fragment i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 25 ili njen fragment,
(v) teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 17 ili njen fragment i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 24 ili njen fragment,
(vi) teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 19 ili njen fragment i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 23 ili njen fragment,
(vii) teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 19 ili njen fragment i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 26 ili njen fragment,
(viii) teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 19 ili njen fragment i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 27 ili njen fragment, i
(ix) teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 19 ili njen fragment i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 28 ili njen fragment.
[0159] "Fragment" ili "fragment aminokiselinske sekvence", kako se ovde koristi, označava deo sekvence antitela, tj. sekvencu koja predstavlja sekvencu antitela skraćenu na N- i/ili C-kraju, koja kada menja navedenu sekvencu antitela u antitelu zadržava vezivanje navedenog antitela za CLDN18.2 i poželjno funkcije navedenog antitela kao što su ovde opisane, npr. CDC-posredovana liza ili ADCC-posredovana liza. Poželjno, fragment aminokiselinske sekvence sadrži najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% aminokiselinskih ostataka iz navedene aminokiselinske sekvence. Fragment aminokiselinske sekvence izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 i 28 poželjno se odnosi na navedenu sekvencu gde je uklonjeno 17, 18, 19, 20, 21, 22 ili 23 aminokiselina na N-kraju.
[0160] U poželjnom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33, 34, i njenog fragmenta.
[0161] U poželjnom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 sadrži varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, i njenog fragmenta.
[0162] U određenim poželjnim primerima izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 sadrži kombinaciju varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i varijabilnog regiona lakog lanca (VL) izabranu od sledećih mogućnosti (i) do (ix):
(i) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 29 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 36 ili njen fragment,
(ii) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 30 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 35 ili njen fragment,
(iii) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 31 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 37 ili njen fragment,
(iv) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 33 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 40 ili njen fragment,
(v) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 32 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 39 ili njen fragment,
(vi) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 34 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 38 ili njen fragment,
(vii) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 34 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 41 ili njen fragment,
(viii) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 34 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 42 ili njen fragment,
(ix) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 34 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sekvencom SEQ ID NO: 43 ili njen fragment.
[0163] U poželjnom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 sadrži VH koji sadrži skup regiona koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3 izabran od sledećih primera izvođenja (i) do (vi):
(i) CDR1: položaji 45-52 sekvence SEQ ID NO: 14, CDR2: položaji 70-77 sekvence SEQ ID NO: 14, CDR3: položaji 116-125 sekvence SEQ ID NO: 14,
(ii) CDR1: položaji 45-52 sekvence SEQ ID NO: 15, CDR2: položaji 70-77 sekvence SEQ ID NO: 15, CDR3: položaji 116-126 sekvence SEQ ID NO: 15,
(iii) CDR1: položaji 45-52 sekvence SEQ ID NO: 16, CDR2: položaji 70-77 sekvence SEQ ID NO: 16, CDR3: položaji 116-124 sekvence SEQ ID NO: 16,
(iv) CDR1: položaji 45-52 sekvence SEQ ID NO: 17, CDR2: položaji 70-77 sekvence SEQ ID NO: 17, CDR3: položaji 116-126 sekvence SEQ ID NO: 17,
(v) CDR1: položaji 44-51 sekvence SEQ ID NO: 18, CDR2: položaji 69-76 sekvence SEQ ID NO: 18, CDR3: položaji 115-125 sekvence SEQ ID NO: 18 i
(vi) CDR1: položaji 45-53 sekvence SEQ ID NO: 19, CDR2: položaji 71-78 sekvence SEQ ID NO: 19, CDR3: položaji 117-128 sekvence SEQ ID NO: 19.
[0164] U poželjnom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 sadrži VL koji sadrži skup regiona koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3 izabran od sledećih primera izvođenja (i) do (ix):
(i) CDR1: položaji 47-58 sekvence SEQ ID NO: 20, CDR2: položaji 76-78 sekvence SEQ ID NO: 20, CDR3: položaji 115-123 sekvence SEQ ID NO: 20,
(ii) CDR1: položaji 49-53 sekvence SEQ ID NO: 21, CDR2: položaji 71-73 of SEQ ID NO: 21, CDR3: položaji 110-118 sekvence SEQ ID NO: 21,
(iii) CDR1: položaji 47-52 sekvence SEQ ID NO: 22, CDR2: položaji 70-72 sekvence SEQ ID NO: 22, CDR3: položaji 109-117 sekvence SEQ ID NO: 22,
(iv) CDR1: položaji 47-58 sekvence SEQ ID NO: 23, CDR2: položaji 76-78 sekvence SEQ ID NO: 23, CDR3: položaji 115-123 sekvence SEQ ID NO: 23,
(v) CDR1: položaji 47-58 sekvence SEQ ID NO: 24, CDR2: položaji 76-78 sekvence SEQ ID NO: 24, CDR3: položaji 115-123 sekvence SEQ ID NO: 24,
(vi) CDR1: položaji 47-58 sekvence SEQ ID NO: 25, CDR2: položaji 76-78 sekvence SEQ ID NO: 25, CDR3: položaji 115-122 sekvence SEQ ID NO: 25,
(vii) CDR1: položaji 47-58 sekvence SEQ ID NO: 26, CDR2: položaji 76-78 sekvence SEQ ID NO: 26, CDR3: položaji 115-123 sekvence SEQ ID NO: 26,
4
(viii) CDR1: položaji 47-58 sekvence SEQ ID NO: 27, CDR2: položaji 76-78 sekvence SEQ ID NO: 27, CDR3: položaji 115-123 sekvence SEQ ID NO: 27, i
(ix) CDR1: položaji 47-52 sekvence SEQ ID NO: 28, CDR2: položaji 70-72 sekvence SEQ ID NO: 28, CDR3: položaji 109-117 sekvence SEQ ID NO: 28.
[0165] U poželjnom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 sadrži kombinaciju VH i VL od kojih svaki sadrži skup regiona koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3, izabran od sledećih primera izvođenja (i) do (ix):
(i) VH: CDR1: položaji 45-52 sekvence SEQ ID NO: 14, CDR2: položaji 70-77 sekvence SEQ ID NO: 14, CDR3: položaji 116-125 sekvence SEQ ID NO: 14, VL: CDR1: položaji 49-53 sekvence SEQ ID NO: 21, CDR2: položaji 71-73 sekvence SEQ ID NO: 21, CDR3: položaji 110-118 sekvence SEQ ID NO: 21,
(ii) VH: CDR1: položaji 45-52 sekvence SEQ ID NO: 15, CDR2: položaji 70-77 sekvence SEQ ID NO: 15, CDR3: položaji 116-126 sekvence SEQ ID NO: 15, VL: CDR1: položaji 47-58 sekvence SEQ ID NO: 20, CDR2: položaji 76-78 sekvence SEQ ID NO: 20, CDR3: položaji 115-123 sekvence SEQ ID NO: 20,
(iii) VH: CDR1: položaji 45-52 sekvence SEQ ID NO: 16, CDR2: položaji 70-77 sekvence SEQ ID NO: 16, CDR3: položaji 116-124 sekvence SEQ ID NO: 16, VL: CDR1: položaji 47-52 sekvence SEQ ID NO: 22, CDR2: položaji 70-72 sekvence SEQ ID NO: 22, CDR3: položaji 109-117 sekvence SEQ ID NO: 22,
(iv) VH: CDR1: položaji 44-51 sekvence SEQ ID NO: 18, CDR2: položaji 69-76 sekvence SEQ ID NO: 18, CDR3: položaji 115-125 sekvence SEQ ID NO: 18, VL: CDR1: položaji 47-58 sekvence SEQ ID NO: 25, CDR2: položaji 76-78 sekvence SEQ ID NO: 25, CDR3: položaji 115-122 sekvence SEQ ID NO: 25,
(v) VH: CDR1: položaji 45-52 sekvence SEQ ID NO: 17, CDR2: položaji 70-77 sekvence SEQ ID NO: 17, CDR3: položaji 116-126 sekvence SEQ ID NO: 17, VL: CDR1: položaji 47-58 sekvence SEQ ID NO: 24, CDR2: položaji 76-78 sekvence SEQ ID NO: 24, CDR3: položaji 115-123 sekvence SEQ ID NO: 24,
(vi) VH: CDR1: položaji 45-53 sekvence SEQ ID NO: 19, CDR2: položaji 71-78 sekvence SEQ ID NO: 19, CDR3: položaji 117-128 sekvence SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: položaji 47-58 sekvence SEQ ID NO: 23, CDR2: položaji 76-78 sekvence SEQ ID NO: 23, CDR3: položaji 115-123 sekvence SEQ ID NO: 23,
(vii) VH: CDR1: položaji 45-53 sekvence SEQ ID NO: 19, CDR2: položaji 71-78 sekvence SEQ ID NO: 19, CDR3: položaji 117-128 sekvence SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: položaji 4758 sekvence SEQ ID NO: 26, CDR2: položaji 76-78 sekvence SEQ ID NO: 26, CDR3: položaji 115-123 sekvence SEQ ID NO: 26,
(viii) VH: CDR1: položaji 45-53 sekvence SEQ ID NO: 19, CDR2: položaji 71-78 sekvence SEQ ID NO: 19, CDR3: položaji 117-128 sekvence SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: položaji 47-58 sekvence SEQ ID NO: 27, CDR2: položaji 76-78 sekvence SEQ ID NO: 27, CDR3: položaji 115-123 sekvence SEQ ID NO: 27, i
(ix) VH: CDR1: položaji 45-53 sekvence SEQ ID NO: 19, CDR2: položaji 71-78 sekvence SEQ ID NO: 19, CDR3: položaji 117-128 sekvence SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: položaji 47-52 sekvence SEQ ID NO: 28, CDR2: položaji 70-72 sekvence SEQ ID NO: 28, CDR3: položaji 109-117 sekvence SEQ ID NO: 28.
[0166] U dodatnim poželjnim primerima izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 poželjno sadrži jedan ili više regiona koji određuju komplementarnost (CDR), poželjno najmanje CDR3 varijabilni region, varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i/ili varijabilnog regiona lakog lanca (VL) monoklonskog antitela protiv CLDN18.2, poželjno monoklonskog antitela protiv CLDN18.2 koje je ovde opisano, i poželjno sadrži jedan ili više regiona koji određuju komplementarnost (CDR), poželjno najmanje CDR3 varijabilni region, varijabilnih regiona teškog lanca (VH) i/ili varijabilnih regiona lakog lanca (VL) koji su ovde opisani. U jednom primeru izvođenja navedeni jedan ili više regiona koji određuju komplementarnost (CDR) su izabrani iz grupe regiona koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3 koji su ovde opisani. U naročito poželjnom primeru izvođenja, antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 poželjno sadrži regione koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i/ili varijabilnog regiona lakog lanca (VL) monoklonskog antitela protiv CLDN18.2, poželjno monoklonskog antitela protiv CLDN18.2 opisanog ovde, i poželjno sadrži regione koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3 varijabilnih regiona teškog lanca (VH) i/ili varijabilnih regiona lakog lanca (VL) koji su ovde opisani.
[0167] U jednom primeru izvođenja antitelo koje sadrži jedan ili više CDR, grupu CDR ili kombinaciju grupa CDR kao što je ovde opisano, sadrži navedene CDR zajedno sa njihovim umetnutim okvirnim regionima. Poželjno, deo će takođe da obuhvata najmanje oko 50% bilo kog, ili oba, od prvog i četvrtog okvirnog regiona, pri čemu tih 50% predstavlja C-terminalnih 50% prvog okvirnog regiona i N-terminalnih 50% četvrtog okvirnog regiona. Konstrukcija antitela napravljenih pomoću tehnika rekombinantne DNK može da rezultuje u uvođenju ostataka N- ili C-terminalno u odnosu na varijabilne regione kodirane linkerima uvedenim da olakšaju kloniranje ili druge korake manipulacije, uključujući uvođenje linkera da bi se spojili varijabilni regioni prema navodima sa dodatnim proteinskim sekvencama, uključujući teške lance imunoglobulina, druge varijabilne domene (na primer u proizvodnji diatela) ili proteinske obeleživače.
[0168] U jednom primeru izvođenja antitelo koje sadrži jedan ili više CDR, grupu CDR ili kombinaciju grupa CDR, kao što je ovde opisano, sadrži navedene CDR u okvirnom regionu humanog antitela.
[0169] Pozivanje u ovom dokumentu na antitelo koje sadrži, u odnosu na njegov teški lanac, određeni lanac, ili određeni region ili sekvencu, poželjno se odnosi na situaciju u kojoj svi teški lanci navedenog antitela sadrže navedeni određeni lanac, region ili sekvencu. Ovo, na analogni način, važi za laki lanac antitela.
[0170] Termin "nukleinska kiselina", kako se ovde koristi, namenjen je da obuhvata DNK i RNK. Nukleinska kiselina može da bude jednolančana ili dvolančana, ali je poželjno dvolančana DNK.
[0171] Prema navodima, termin "ekspresija" koristi se u najuopštenijem značenju i obuhvata proizvodnju RNK, ili RNK i proteina/peptida. On takođe obuhvata delimičnu ekspresiju nukleinskih kiselina. Pored toga, ekspresija može da bude izvedena prolazno ili stabilno.
[0172] Navodi koji su ovde dati u vezi sa specifičnim aminokiselinskim sekvencama, npr. onim prikazanim u listingu sekvenci, trebalo bi da se tumače tako da se takođe odnose na varijante navedenih specifičnih varijanti koje rezultuju u sekvencama koje su funkcionalno ekvivalente sa navedenim specifičnim sekvencama, npr. aminokiselinskim sekvencama koje ispoljavaju osobine identične ili slične onima kod specifičnih aminokiselinskih sekvenci. Jedna važna osobina je zadržavanje vezivanja antitela za njegovo ciljno mesto ili održavanje efektorskih funkcija antitela. Poželjno, sekvenca koja je varijanta u odnosu na specifičnu sekvencu, kada menja specifičnu sekvencu u antitelu zadržava vezivanje navedenog antitela za CLDN18.2 i poželjno funkcije navedenog antitela kao što je ovde opisano, npr. CDC-posredovanu lizu ili ADCC-posredovanu lizu.
[0173] Stručnjacima iz date oblasti tehnike biće jasno da naročito sekvence CDR, hipervarijabilnih i varijabilnih regiona mogu da budu modifikovane bez gubitka sposobnosti da se vežu za CLDN18.2. Na primer, CDR regioni biće ili identični ili visoko homologi sa regionima ovde naznačenih antitela. "Visoko homologi" označava da od 1 do 5, poželjno od 1 do 4, kao što je 1 do 3, ili 1 ili 2 supstitucije mogu da budu uvedene u CDR regione. Pored toga, hipervarijabilni i varijabilni regioni mogu da budu modifikovani tako da pokazuju značajnu homologiju sa regionima antitela koji su ovde specifično navedeni.
[0174] U svrhu predmetnih navoda, "varijante" aminokiselinske sekvence sadrže aminokiselinske insercione varijante, aminokiselinske adicione varijante, aminokiselinske delecione varijante i/ili aminokiselinske supstitucione varijante. Aminokiselinske delecione varijante koje sadrže deleciju
4
na N-terminalnom i/ili C-terminalnom kraju proteina su takođe označene N-terminalne i/ili C-terminalne skraćene varijante.
[0175] Aminokiselinske insercione varijante sadrže insercije jedne ili dve ili više aminokiselina u određenoj aminokiselinskoj sekvenci. U slučaju varijanti aminokiselinske sekvence koje imaju inserciju, jedan ili više aminokiselinskih ostataka su umetnuti na određeno mesto u aminokiselinskoj sekvenci, iako je takođe moguća slučajna insercija sa odgovarajućim skriningom rezultirajućeg proizvoda.
[0176] Aminokiselinske adicione varijante sadrže amino- i/ili karboksi-terminalne fuzije jedne ili više aminokiselina, kao što je 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 ili više aminokiselina.
[0177] Aminokiselinske delecione varijante su okarakterisane uklanjanjem jedne ili više aminokiselina iz sekvence, kao što je uklanjanje 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 ili više aminokiselina. Delecije mogu da budu u bilo kom položaju proteina.
[0178] Aminokiselinske supstutucione varijante su okarakterisane najmanje jednim ostatkom u sekvenci koji je uklonjen i drugim ostatkom koji je inseriran na njegovo mesto. Prednost se daje modifikacijama koje su na položajima u aminokiselinskoj sekvenci koji nisu konzervativni između homologih proteina ili peptida, i/ili zameni aminokiselina drugim koje imaju slične osobine. Poželjno, aminokiselinske promene u proteinskim varijantama su konzervativne aminokiselinske promene, tj., supstitucije slično naelektrisanih ili nenaelektrisanih aminokiselina. Konzervativna aminokiselinska promena obuhvata supstituciju jedne iz familije aminokiselina koje su srodne po njihovim bočnim lancima. Prirodne aminokiseline su generalno podeljene u četiri familije: kisele (aspartat, glutamat), bazne (lizin, arginin, histidin), nepolarne (alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan), i nenaleketrisane polarne (glicin, asparagin, glutamin, cistein, serin, treonin, tirozin) aminokiseline. Fenilalanin, triptofan i tirozin su nekada klasifikovani zajedno kao aromatične aminokiseline.
[0179] Poželjno, stepen sličnosti, poželjno identičnosti, između date aminokiselinske sekvence i aminokiselinske sekvence koja je varijanta navedene aminokiselinske sekvence biće najmanje oko 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%. Stepen sličnosti ili identičnosti je poželjno dat za aminokiselinski region koji je najmanje oko 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 30%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90% ili oko 100% cele dužine referentne aminokiselinske sekvence. Na primer, ako se referentna aminokiselinska sekvenca sastoji od 200 aminokiselina, stepen sličnosti ili identičnosti je dat poželjno za najmanje oko 20, najmanje oko 40, najmanje oko 60, najmanje oko 80, najmanje oko 100, najmanje oko 120, najmanje oko 140, najmanje oko 160, najmanje oko 180, ili oko 200 aminokiselina, poželjno kontinuiranih aminokiselina. U poželjnim primerima izvođenja, stepen sličnosti ili identičnosti je dat za celu dužinu referentne aminokiselinske sekvence. Poravnanje za određivanje sličnosti sekvenci, poželjno identičnosti sekvenci može se izvesti pomoću alata poznatih u tehnici, poželjno upotrebom najboljeg poravnanja sekvenci, na primer, upotrebom Align, upotrebom standardnih postavki, poželjno EMBOSS::needle, Matrix:Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5.
[0180] "Sličnost sekvenci" označava procenat aminokiselina koje su ili identične ili koje predstavljaju konzervativne aminokiselinske supstitucije. "Identičnost sekvenci" dve aminokiselinske sekvence ukazuje na procenat aminokiselina koje su identične u tim sekvencama.
[0181] Termin "procenat identičnosti" je određen tako da označava procenat aminokiselinskih ostataka koji su identični kod dve sekvence koje se porede, dobijen posle najboljeg poravnanja, ovaj procenat je čisto statistički i razlike između dve sekvence su raspoređene slučajno i duž cele dužine. Poređenja sekvenci dve aminokiselinske sekvence se konvencionalno izvode poređenjem ovih sekvenci posle njihovog optimalnog poravnanja, pri čemu je navedeno poređenje izvedeno pomoću segmenta ili pomoću "prozora poređenja" u cilju identifikacije i poređenja lokalnih regiona sličnosti sekvenci. Optimalno poravnanje sekvenci za poređenje može da se dobije, osim ručno, pomoću algoritma lokalne homologije autora Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math.
2, 482, pomoću algoritma lokalne homologije autora Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol.
48, 443, pomoću postupka traženja sličnosti autora Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444, ili pomoću kompjuterskih programa koji koriste ove algoritme (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N i TFASTA u Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).
[0182] Procenat identičnosti je izračunavan određivanjem broja identičnih položaja kod dve sekvence koje se porede, deljenjem ovog broja sa brojem položaja koji se porede i množenjem dobijenog rezultata sa 100, tako da se dobije procenat identičnosti ove dve sekvence.
[0183] Termin "transgena životinja" označava životinju koja ima genom koji sadrži jedan ili više transgena, poželjno transgena teškog i/ili lakog lanca, ili transhromozoma (bilo integrisanih ili neintegrisanih u prirodnu genomsku DNK životinje) i koja je poželjno sposobna da eksprimira transgene. Na primer, transgeni miš može imati transgen humanog lakog lanca i transgen humanog teškog lanca ili transhromozom humanog teškog lanca, tako da miš proizvodi humana anti-CLDN18.2 antitela kada je imunizovan CLDN18.2 antigenom i/ili ćelijama koje eksprimiraju CLDN18.2. Transgen humanog teškog lanca može da bude integrisan u hromozomalnu DNK miša, kao u slučaju transgenih miševa, npr., HuMAb miševa, kao što su HCo7 ili HCo12 miševi, ili transgen humanog teškog lanca može da bude održavan ekstrahromozomalno, kao u slučaju
4
transhromozomalnih (npr., KM) miševa kao što je opisano u WO 02/43478. Takvi transgeni i transhromozomalni miševi mogu da budu sposobni da proizvode višestruke izotipove humanih monoklonskih antitela za CLDN18.2 (npr., IgG, IgA i/ili IgE) podvrgavanjem V-D-J rekombinaciji i promeni izotipa.
[0184] "Redukovati", "smanjiti" ili "inhibirati", kako se ovde koristi, označava ukupno smanjenje ili sposobnost da se izazove ukupno smanjenje, poželjno od 5% ili više, 10% ili više, 20% ili više, poželjnije od 50% ili više, i najpoželjnije od 75% ili više, nivoa, npr. nivoa ekspresije ili nivoa proliferacije ćelija.
[0185] Termini kao što su "povećanje" ili "pojačanje" poželjno se odnose na povećanje ili pojačanje za oko najmanje 10%, poželjno najmanje 20%, poželjno najmanje 30%, poželjnije najmanje 40%, poželjnije najmanje 50%, čak poželjnije najmanje 80%, i najpoželjnije najmanje 100%, najmanje 200%, najmanje 500%, najmanje 1000%, najmanje 10000% ili čak više.
Mehanizmi delovanja mAb
[0186] Iako su u nastavku data razmatranja u vezi sa mehanizmom koji leži u osnovi terapeutske efikasnosti antitela prema navodima, ne treba ih smatrati ograničavajućim na navode na bilo koji način.
[0187] Antitela koja su ovde opisana poželjno interaguju sa komponentama imunog sistema, poželjno preko ADCC ili CDC. Antitela koja su ovde opisana takođe mogu da budu korišćena da usmere opterećenje lekom (npr., radioizotopi, lekovi ili toksini) da direktno ubije ćelije tumora, ili mogu da budu korišćena sinergistički sa tradicionalnim hemoterapeutskim agensima, napadajući tumore preko komplementarnih mehanizama delovanja koji mogu da obuhvataju antitumorske imune odgovore koji su možda kompromitovani zbog citotoksičnih sporednih efekata hemoterapeutika na T limfocite. Međutim, ovde opisana antitela takođe mogu da ispoljavaju efekat jednostavnim vezivanjem za CLDN18.2 na ćelijskoj površini, na taj način, npr. blokirajući proliferaciju ćelija.
Ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela
[0188] ADCC opisuje sposobnost efektorskih ćelija da ubijaju ćelije kao što je ovde opisano, naročito limfocita, koji poželjno zahtevaju da ciljna ćelija bude označena antitelom.
[0189] ADCC se poželjno javlja kada se antitela vezuju za antigene na ćelijama tumora i Fc domeni antitela zauzimaju Fc receptore (FcR) na površini imunih efektorskih ćelija. Identifikovano je nekoliko familija Fc receptora, i specifične ćelijske populacije karakteristično eksprimiraju definisane Fc receptore. ADCC se može posmatrati kao mehanizam za direktno
4
indukovanje varijabilnog stepena neposredne destrukcije tumora koja dovodi do prikaza antigena i indukcije T-ćelijskih odgovora usmerenih na tumor. Poželjno, in vivo indukcija ADCC će dovesti do T-ćelijskih odgovora usmerenih na tumor i odgovora antitela poreklom od domaćina.
Citotoksičnost zavisna od komplementa
[0190] CDC je drugi postupak za ubijanje ćelija koji može da bude usmeren pomoću antitela. IgM je najefikasniji izotip za aktivaciju komplementa. IgG1 i IgG3 su takođe oba veoma efikasni u usmeravanju CDC preko klasičnog puta aktivacije komplementa. Poželjno, u ovoj kaskadi, formiranje kompleksa antigen-antitelo rezultuje u otkrivanju višestrukih C1q vezujućih mesta u neposrednoj blizini na CH2 domenima molekula antitela koja učestvuju, kao što su molekuli IgG (C1q je jedna od tri subkomponente komplementa C1). Poželjno ova otkrivena C1q vezujuća mesta prevode ovu nisko-afinitetnu C1q-IgG interakciju u interakciju visokog aviditeta, koja pokreće kaskadu događaja koji uključuju seriju drugih proteina komplementa i dovodi do proteolitičkog oslobađanja hemotaktičnih/aktivirajućih agenasa C3a i C5a efektorske ćelije. Poželjno, kaskada komplementa završava formiranjem kompleksa koji napada membranu, koji stvara pore u ćelijskoj membrani koje olakšavaju slobodan prolaz vode i rastvorenih supstanci u, i izvan ćelije.
[0191] Antitela koja su ovde opisana mogu da budu proizvedena različitim tehnikama, uključujući konvencionalnu metodologiju monoklonskog antitela, npr., standardne tehnike hibridizacije somatske ćelije autora Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975). Iako su postupci hibridizacije somatske ćelije poželjni, u principu, mogu se koristiti druge tehnike za proizvodnju monoklonskih antitela, npr., virusna ili onkogena transformacija B-limfocita ili tehnike fagnog prikaza upotrebom biblioteka gena antitela.
[0192] Poželjan životinjski sistem za pripremu hibridoma koji izlučuju monoklonska antitela je mišji sistem. Proizvodnja hibridoma u mišu je veoma dobro ustanovljeni postupak.
[0193] Protokoli i tehnike imunizacije za izolaciju imunizovanih splenocita za fuziju su dobro poznati u stanju tehnike. Fuzioni partneri (npr., ćelije mišjeg mijeloma) i fuzioni postupci su takođe poznati.
[0194] Drugi poželjni životinjski sistemi za pripremu hibridoma koji izlučuju monoklonska antitela su sistem pacova i zeca (npr. opisan u Spieker-Polet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
92:9348 (1995), videti takođe Rossi et al., Am. J. Clin. Pathol.124: 295 (2005)).
[0195] U sledećem poželjnom primeru izvođenja, humana monoklonska antitela mogu da budu generisana upotrebom transgenih ili transhromozomalnih miševa koji nose delove humanog imunog sistema umesto mišjeg sistema. Ovi transgeni i transhromozomalni miševi obuhvataju
4
miševe poznate kao HuMAb miševi i KM miševi, respektivno, i zajednički su označeni ovde kao "transgeni miševi". Proizvodnja humanih antitela u takvim transgenim miševima može da bude izvedena kao što je detaljno opisano za CD20 u WO2004035607.
[0196] Sledeća strategija za generisanje monoklonskih antitela je direktna izolacija gena koji kodiraju antitela iz limfocita koji proizvode antitela definisane specifičnosti npr. videti Babcock et al., 1996; A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single, isolated lymphocytes producing antibodies of defined specificities. Za detalje o inženjeringu rekombinantnog antitela takođe videti Welschof and Kraus, Recombinant antibodes for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8 i Benny K.C. Lo Antibody Engineering ISBN 1-58829-092-1.
[0197] Da bi se generisala antitela, miševi mogu da budu imunizovani peptidima konjugovanim sa nosačem poreklom od sekvence antigena, tj. sekvence protiv koje su usmerena antitela, obogaćenim preparatom rekombinantno eksprimiranog antigena ili njegovih fragmenata i/ili ćelijama koje eksprimiraju antigen, kao što je opisano. Alternativno, miševi mogu da budu imunizovani sa DNK koja kodira antigen ili njegove fragmente. U slučaju da imunizacije koje koriste prečišćeni ili obogaćeni preparat antigena ne rezultiraju u antitelima, miševi takođe mogu da budu imunizovani ćelijama koje eksprimiraju antigen, npr., ćelijskom linijom, za stimulaciju imunih odgovora.
[0198] Imuni odgovor može da bude praćen tokom protokola imunizacije sa uzorcima plazme i seruma koji su dobijeni iz krvi repne vene ili retroorbitalnog vađenja krvi. Miševi sa dovoljnim titrovima imunoglobulina mogu da budu korišćeni za fuzije. Može se izvršiti busterizacija miševa intraperitonealno ili intravenski ćelijama koje eksprimiraju antigen, 3 dana pre žrtvovanja i uklanjanja slezine, kako bi se povećala stopa hibridoma koji izlučuju specifično antitelo.
[0199] Da bi se generisali hibridomi koji proizvode monoklonska antitela, splenociti i ćelije limfnih čvorova iz imunizovanih miševa mogu da budu izolovani i fuzionisani sa odgovarajućom imortalizovanom ćelijskom linijom, kao što je ćelijska linija mijeloma miša. U rezultirajućim hibridomima može zatim da se ispita proizvodnja antigen-specifičnih antitela. Pojedinačni bunarčići mogu zatim da budu ispitivani pomoću ELISA testa za hibridome koji izlučuju antitelo. Pomoću imunofluorescencije i FACS analize upotrebom ćelija koje eksprimiraju antigen, mogu da budu identifikovana antitela sa specifičnošću za antigen. Hibridomi koji izlučuju antitelo mogu da budu ponovo zasejani na ploču, ponovo ispitivani, i ako su još uvek pozitivni na monoklonska antitela mogu da budu subklonirani metodom graničnog razblaženja. Stabilni subklonovi zatim mogu da budu kultivisani in vitro da bi se generisalo antitelo u medijumu za kulturu tkiva za karakterizaciju.
4
[0200] Antitela takođe mogu da budu proizvedena u transfektomu ćelije-domaćina upotrebom, na primer, kombinacije tehnika rekombinantne DNK i postupaka transfekcije gena kao što je dobro poznato u tehnici (Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).
[0201] Na primer, u jednom primeru izvođenja, gen(i) od interesa, npr., geni antitela, mogu da budu vezani u ekspresioni vektor kao što je eukariotski ekspresioni plazmid, kakav je korišćen u GS genskom ekspresionom sistemu opisanom u WO 87/04462, WO 89/01036 i EP 338841 ili drugim ekspresionim sistemima dobro poznatim u tehnici. Prečišćeni plazmid sa kloniranim genima za antitelo može da bude uveden u eukariotske ćelije domaćine kao što su CHO ćelije, NS/0 ćelije, HEK293T ćelije ili HEK293 ćelije ili alternativno druge eukariotske ćelije, kao što su ćelije poreklom od biljaka, ćelije gljiva ili ćelije kvasca. Postupak koji se koristi za uvođenje ovih gena može da predstavlja postupke opisane u tehnici kao što su elektroporacija, lipofektin, lipofektamin ili drugi. Posle uvođenja ovih gena antitela u ćelije-domaćine, ćelije koje eksprimiraju antitelo mogu da budu identifikovane i selektovane. Ove ćelije predstavljaju transfektome koji mogu zatim da budu amplifikovani u odnosu na njihov ekspresioni nivo i proizvedeni u većem obimu za proizvodnju antitela. Rekombinantna antitela mogu da budu izolovana i prečišćena iz ovih supernatanata kulture i/ili ćelija.
[0202] Alternativno, klonirani geni antitela mogu da budu eksprimirani u drugim ekspresionim sistemima, uključujući prokariotske ćelije, kao što su mikroorganizmi, npr. E. coli. Pored toga, antitela mogu da budu proizvedena u transgenim ne-humanim životinjama, kao što je u mleku ovaca i zečeva ili jajima kokošaka, ili u transgenim biljkama; videti npr. Verma, R., et al. (1998) J. Immunol. Meth.216: 165-181; Pollock, et al. (1999) J. Immunol. Meth.231: 147-157; i Fischer, R., et al. (1999) Biol. Chem.380: 825-839.
Himerizacija
[0203] Mišja monoklonska antitela mogu da budu korišćena kao terapeutska antitela kod ljudi kada su obeležena toksinima ili radioaktivnim izotopima. Neobeležena mišja antitela su visoko imunogena kod čoveka kada se ponovljeno primenjuju, što dovodi do smanjenja terapeutskog efekta. Glavna imunogenost je posredovana konstantnim regionima teškog lanca. Imunogenost mišjih antitela kod čoveka može da bude smanjena ili potpuno izbegnuta ako su odgovarajuća antitela himerizovana ili humanizovana. Himerna antitela su antitela, čiji su različiti delovi poreklom od različitih životinjskih vrsta, kao što su ona koja imaju varijabilni region poreklom od mišjeg antitela i konstantni region humanog imunoglobulina. Himerizacija antitela je postignuta spajanjem varijabilnih regiona teškog i lakog lanca mišjeg antitela sa konstantnim regionom humanog teškog i lakog lanca (npr. kao što su opisali Kraus et al., u Methods in Molecular Biology
4
series, Recombinant antibodies for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8). U poželjnom primeru izvođenja himerna antitela su generisana spajanjem konstantnog regiona humanog kapa-lakog lanca sa varijabilnim regionom mišjeg lakog lanca. U takođe poželjnom primeru izvođenja himerna antitela mogu da budu generisana spajanjem konstantnog regiona humanog lambda-lakog lanca sa varijabilnim regionom mišjeg lakog lanca. Poželjni konstantni regioni teškog lanca za generisanje himernih antitela su IgG1, IgG3 i IgG4. Drugi poželjni konstantni regioni teškog lanca za generisanje himernih antitela su IgG2, IgA, IgD i IgM.
Humanizacija
[0204] Antitela interaguju sa ciljnim antigenima pretežno preko aminokiselinskih ostataka koji su locirani u šest regiona koji određuju komplementarnost teškog i lakog lanca (CDR). Iz ovog razloga, aminokiselinske sekvence unutar CDR su raznovrsnije između pojedinačnih antitela od sekvenci izvan CDR. Kako su CDR sekvence odgovorne za većinu interakcija antitelo-antigen, moguće je eksprimirati rekombinantna antitela koja imitiraju osobine specifičnih prirodnih antitela konstrukcijom ekspresionih vektora koji obuhvataju CDR sekvence iz specifičnog prirodnog antitela kalemljenog na okvirne sekvence iz drugačijeg antitela sa drugačijim osobinama (videti, npr., Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332: 323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321: 522-525; i Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86: 10029-10033). Takve okvirne sekvence mogu da budu dobijene iz javnih baza podataka DNK koje obuhvataju genske sekvence antitela klicine linije. Ove sekvence klicine linije će se razlikovati od zrelih genskih sekvenci antitela zbog toga što neće obuhvatati potpuno sklopljene varijabilne gene, koji se formiraju pomoću V (D) J spajanja u toku sazrevanja B ćelija. Genske sekvence klicine linije će se takođe razlikovati od sekvenci sekundarnog repertoara antitela visokog afiniteta kod pojedinca ravnomerno duž varijabilnog regiona.
[0205] Sposobnost antitela da vežu antigen može da bude određena upotrebom standardnih analiza vezivanja (npr., ELISA, Western Blot, imunofluorescencija i analiza protočne citometrije).
[0206] Da bi se antitela prečistila, izabrani hibridomi mogu da budu gajeni u dvolitarskim spiner bocama za prečišćavanje monoklonskog antitela. Alternativno, antitela mogu da budu proizvedena u bioreaktorima na bazi dijalize. Supernatanti mogu da budu filtrirani i, ako je neophodno, koncentrovani pre afinitetne hromatografije sa protein G-sefarozom ili protein A-sefarozom. Eluirani IgG može da bude proveren pomoću gel elektroforeze i tečne hromatografije visokog učinka da bi se osigurala čistoća. Puferski rastvor može da bude zamenjen PBS-om, i koncentracija može da bude određena pomoću OD280 upotrebom koeficijenta ekstinkcije od 1.43. Monoklonska antitela mogu da budu podeljena u alikvote i čuvana na -80°C.
[0207] Da bi se odredilo da li se izabrana monoklonska antitela vezuju za jedinstvene epitope, može se koristiti mutageneza usmerena na mesto ili mutageneza usmerena na više mesta.
[0208] Da bi se odredio izotip antitela, mogu da budu izvedeni ELISA testovi izotipa pomoću različitih komercijalnih kompleta (npr. Zymed, Roche Diagnostics). Bunarčići mikrotitarskih ploča mogu da budu obloženi anti-mišjim Ig. Posle blokiranja, ploče reaguju sa monoklonskim antitelima ili prečišćenim kontrolama izotipa, na temperaturi sredine u trajanju od dva časa. Bunarčići zatim mogu da reaguju sa mišjim IgG1, IgG2a, IgG2b ili IgG3, IgA ili mišjim IgM-specifičnom peroksidazom-konjugovanim probama. Posle ispiranja, ploče mogu da budu razvijene sa ABTS supstratom (1 mg/ml) i analizirane na OD 405-650. Alternativno, može da bude korišćen komplet IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit (Roche, kat. br.1493027), kao što je opisao proizvođač.
[0209] Za demonstriranje prisustva antitela u serumima imunizovanih miševa, ili vezivanja monoklonskih antitela za žive ćelije koje eksprimiraju antigen, može da se koristi protočna citometrija. Ćelijske linije koje eksprimiraju antigen prirodno, ili posle transfekcije, i negativne kontrole kojima nedostaje ekspresija antigena (gajene pod standardnim uslovima gajenja) mogu da budu pomešane sa različitim koncentracijama monoklonskih antitela u supernatantima hibridoma ili u PBS koji sadrži 1% FBS, i mogu da budu inkubirane na 4°C u trajanju od 30 min. Posle ispiranja, APC- ili Alexa647-obeleženo anti-IgG antitelo može da se veže za antigen-vezano monoklonsko antitelo pod istim uslovima kao za bojenje primarnim antitelom. Uzorci mogu da budu analizirani protočnom citometrijom pomoću FACS instrumenta upotrebom upravnog rasejanja i bočnog rasejanja svetlosti da bi se izdvojile pojedinačne žive ćelije. Da bi se razlikovala antigen-specifična monoklonska antitela od nespecifičnih vezujućih sredstava u jednom merenju, može da bude korišćen postupak ko-transfekcije. Ćelije prolazno transficirane plazmidima koji kodiraju antigen i fluorescentnim markerom mogu da budu obojene kao što je opisano u prethodnom tekstu. Transficirane ćelije mogu da budu detektovane u različitom fluorescentnom kanalu u odnosu na ćelije obojene antitelom. Kako većina transficiranih ćelija eksprimira oba transgena, antigen-specifična monoklonska antitela se vezuju pretežno za ćelije koje eksprimiraju fluorescentni marker, dok se nespecifična antitela vezuju u sličnom odnosu za netransficirane ćelije. Alternativna analiza koja koristi fluorescentnu mikroskopiju može da bude korišćena uz, ili umesto analize protočne citometrije. Ćelije mogu da budu obojene tačno kao što je opisano u prethodnom tekstu i ispitane fluorescentnom mikroskopijom.
[0210] U cilju demonstriranja prisustva antitela u serumima imunizovanih miševa ili vezivanja monoklonskih antitela za žive ćelije koje eksprimiraju antigen, može se koristiti analiza imunofluorescentne mikroskopije. Na primer, ćelijske linije koje eksprimiraju antigen bilo
1
spontano, ili posle transfekcije, i negativne kontrole kojima nedostaje ekspresija antigena gaje se u pločama sa bunarčićima pod standardnim uslovima rasta u DMEM/F12 medijumu, sa dodatkom 10% fetalnog telećeg seruma (FCS), 2 mM L-glutamina, 100 IU/ml penicilina i 100 µg/ml streptomicina. Ćelije zatim mogu da budu fiksirane metanolom ili paraformaldehidom ili ostavljene netretirane. Ćelije zatim mogu da reaguju sa monoklonskim antitelima protiv antigena u trajanju od 30 min. na 25°C. Posle ispiranja, ćelije mogu da reaguju sa Alexa555-obeleženim anti-mišjim IgG sekundarnim antitelom (Molecular Probes) pod istim uslovima. Ćelije zatim mogu da budu ispitivane pomoću fluorescentne mikroskopije.
[0211] Ćelijski ekstrakti iz ćelija koje eksprimiraju antigen i odgovarajućih negativnih kontrola mogu da budu pripremljeni i podvrgnuti natrijum dodecil sulfatnoj (SDS) poliakrilamid gel elektroforezi. Posle elektroforeze, odvojeni antigeni će biti prebačeni na nitrocelulozne membrane, blokirani i dovedeni u kontakt sa monoklonskim antitelima koja treba da se ispitaju. Vezivanje IgG može da bude detektovano upotrebom anti-mišjeg IgG konjugovanog sa peroksidazom i razvijeno sa ECL supstratom.
[0212] Reaktivnost antitela sa antigenom može da bude dodatno ispitana pomoću imunohistohemije na način koji je dobro poznat stručnjaku iz date oblasti tehnike, npr. upotrebom krioisečaka fiksiranih u paraformaldehidu ili acetonu ili isečaka tkiva ukalupljenih u parafin fiksiranih paraformaldehidom iz uzoraka ne-kanceroznog tkiva ili tkiva kancera dobijenih od pacijenata u toku rutinskih hirurških procedura ili iz miševa koji nose ksenotransplantirane tumore inokulisane ćelijskim linijama koje eksprimiraju antigen spontano ili posle transfekcije. Za imunološko bojenje, antitela reaktivna na antigen mogu da budu inkubirana, a zatim kozja antimišja antitela konjugovana sa peroksidazom rena ili kozja anti-zečja antitela (DAKO) prema uputstvima dobavljača.
[0213] Sposobnost antitela da posreduju u fagocitozi i ubijanju ćelija koje eksprimiraju CLDN18.2 može da se ispita. Ispitivanje aktivnosti monoklonskih antitela in vitro obezbediće početan skrining pre ispitivanja u in vivo modelima.
Ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC):
[0214] Ukratko, polimorfonuklearne ćelije (PMN), NK ćelije, monociti, mononuklearne ćelije ili druge efektorske ćelije, poreklom od zdravih davalaca mogu da budu prečišćene pomoću centrifugiranja na gradijentu gustine Ficoll Hypaque, nakon čega sledi liza primesa eritrocita. Isprane efektorske ćelije mogu da budu suspendovane u RPMI sa dodatkom 10% toplotominaktivisanog fetalnog telećeg seruma ili, alternativno sa 5% toplotom-inaktivisanog humanog seruma i mešane sa<51>Cr-obeleženim ciljnim ćelijama koje eksprimiraju CLDN18.2, u različitim
2
odnosima efektorskih ćelija prema ciljnim ćelijama. Alternativno, ciljne ćelije mogu da budu obeležene ligandom koji pojačava fluorescenciju (BATDA). Visoko fluorescentni helat europijuma sa pojačavajućim ligandom koji se oslobađa iz mrtvih ćelija može da bude meren fluorometrom. Sledeća alternativna tehnika može da koristi transfekciju ciljnih ćelija luciferazom. Dodata lucifer žuta može zatim da bude oksidovana isključivo pomoću vijabilnih ćelija. Prečišćeni anti-CLDN18.2 IgG mogu nakon toga da se dodaju u različitim koncentracijama. Irelevantni humani IgG može da bude korišćen kao negativna kontrola. Analize mogu da budu izvedene za 4 do 20 časova na 37°C u zavisnosti od tipa korišćene efektorske ćelije. U uzorcima može da bude analizirana citoliza merenjem oslobađanja<51>Cr ili prisustva helata EuTDA u supernatantu kulture. Alternativno, luminescencija koja je rezultat oksidacije lucifer žute može da predstavlja meru vijabilnih ćelija.
[0215] Anti-CLDN18.2 monoklonska antitela takođe mogu da budu ispitana u različitim kombinacijama da bi se odredilo da li je citoliza pojačana sa višestrukim monoklonskim antitelima.
Citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC):
[0216] Sposobnost monoklonskih anti-CLDN18.2 antitela da posreduju u CDC može da bude ispitana upotrebom različitih poznatih tehnika. Na primer, serum za komplement može da bude dobijen iz krvi na način poznat stručnjaku iz date oblasti tehnike. Da bi se odredila CDC aktivnost mAb, mogu se koristiti različiti postupci. Na primer, može da se meri oslobađanje<51>Cr ili može da se proceni povećana propustljivost membrane upotrebom analize isključenja propidijum jodida (PI). Ukratko, ciljne ćelije mogu da budu isprane i 5 x 10<5>/ml može da bude inkubirano sa različitim koncentracijama mAb u trajanju od 10-30 min. na sobnoj temperaturi ili na 37°C. Serum ili plazma zatim mogu da se dodaju u krajnjoj koncentraciji od 20% (zapr./zapr.) i ćelije inkubiraju na 37°C u trajanju od 20-30 min. Sve ćelije iz svakog uzorka mogu da budu dodate u PI rastvor u FACS epruveti. Smeša zatim može da bude analizirana neposredno pomoću analize protočne citometrije upotrebom metode FACSArray.
[0217] U alternativnoj analizi, indukcija CDC može da se odredi na adheriranim ćelijama. U jednom primeru izvođenja ove analize, ćelije se zaseju 24 časa pre analize pri gustini od 3 x 10<4>ćelija/bunarčiću u mikrotitarske ploče za kulturu tkiva sa ravnim dnom. Sledećeg dana medijum za rast se ukloni i ćelije se inkubiraju sa antitelima u triplikatu. Kontrolne ćelije se inkubiraju sa medijumom za rast ili medijumom za rast koji sadrži 0.2% saponina za određivanje pozadinske lize i maksimalne lize, redom. Posle inkubacije od 20 min. na sobnoj temperaturi supernatant se uklanja i 20% (zapr./zapr.) humane plazme ili seruma u DMEM (prethodno zagrejanog do 37°C) se dodaje u ćelije i inkubira još 20 min. na 37°C. Sve ćelije iz svakog uzorka se dodaju u rastvor propidijum jodida (10 µg/ml). Zatim, supernatanti se zamenjuju PBS-om koji sadrži 2.5 µg/ml etidijum bromida i emisija fluorescencije posle ekscitacije na 520 nm se meri na 600 nm upotrebom Tecan Safire. Procenat specifične lize se izračunava na sledeći način: % specifične lize = (fluorescencija uzorka – fluorescencija pozadine)/ (fluorescencija maksimalne lize – fluorescencija pozadine) x 100.
Indukcija apoptoze i inhibicija ćelijske proliferacije pomoću monoklonskih antitela:
[0218] Da bi se ispitala njihova sposobnost za započinjanje apoptoze, monoklonska anti-CLDN18.2 antitela mogu, na primer, da budu inkubirana sa CLDN18.2-pozitivnim ćelijama tumora, npr., SNU-16, DAN-G, KATO-III ili CLDN18.2 transficiranim ćelijama tumora na 37°C u trajanju od oko 20 časova. Ćelije mogu da budu sakupljene, isprane u Annexin-V vezujućem puferu (BD biosciences), i inkubirane sa proteinom Annexin V konjugovanim sa FITC ili APC (BD biosciences) u trajanju od 15 min. u mraku. Sve ćelije iz svakog uzorka mogu da budu dodate u PI rastvor (10 µg/ml u PBS) u FACS epruveti i procenjene neposredno pomoću protočne citometrije (kao u prethodnom tekstu). Alternativno, opšta inhibicija ćelijske proliferacije pomoću monoklonskih antitela može da bude detektovana upotrebom komercijalno dostupnih kompleta. DELFIA Cell Proliferation Kit (Perkin-Elmer, kat. br. AD0200) je neizotopska imunološka analiza na bazi merenja ugradnje 5-bromo-2’-deoksiuridina (BrdU) u toku sinteze DNK proliferišućih ćelija u mikropločama. Ugradnja BrdU se detektuje upotrebom monoklonskog antitela obeleženog europijumom. Da bi se omogućila detekcija antitela, ćelije se fiksiraju i DNK se denaturiše upotrebom Fix rastvora. Nevezano antitelo se ispra i dodaje se DELFIA induktor da bi se disocirali joni europijuma sa obeleženog antitela u rastvor, gde oni formiraju visoko fluorescentne helate sa komponentama DELFIA induktora. Izmerena fluorescencija – upotrebom vremenski razložene fluorometrije u detekciji – proporcionalna je sintezi DNK u ćelijama svakog bunarčića.
Pretkliničke studije
[0219] Monoklonska antitela koja se vezuju za CLDN18.2 takođe mogu da budu testirana u in vivo modelu (npr. u imunodeficijentnim miševima koji nose ksenotransplantirane tumore inokulisane ćelijskim linijama koje eksprimiraju CLDN18.2, npr. DAN-G, SNU-16 ili KATO-III, ili posle transfekcije, npr. HEK293) da bi se odredila njihova efikasnost u kontroli rasta ćelija tumora koje eksprimiraju CLDN18.2.
[0220] In vivo studije posle ksenotransplantacije ćelija tumora koje eksprimiraju CLDN18.2 u imunokompromitovane miševe ili druge životinje mogu da budu izvedene upotrebom antitela koja su ovde opisana. Antitela mogu da budu primenjivana kod miševa bez tumora nakon injekcije
4
ćelija tumora kako bi se merili efekti antitela u sprečavanju formiranja tumora ili simptoma povezanih sa tumorom. Antitela mogu da budu primenjivana kod miševa koji nose tumor da bi se odredila terapeutska efikasnost odgovarajućih antitela u smanjenju rasta tumora, metastaze ili simptoma povezanih sa tumorom. Primena antitela može da bude kombinovana sa primenom drugih supstanci, kao citostatskih lekova, inhibitora faktora rasta, blokatora ćelijskog ciklusa, inhibitora angiogeneze ili drugih antitela, za određivanje sinergističke efikasnosti i potencijalne toksičnosti kombinacija. Da bi se analizirali toksični sporedni efekti posredovani antitelima, životinje mogu da budu inokulisane antitelima ili kontrolnim reagensima, i simptomi koji mogu da budu povezani sa terapijom CLDN18.2-antitelom temeljno ispitani. Mogući sporedni efekti in vivo primene CLDN18.2 antitela naročito obuhvataju toksičnost na tkivima koja eksprimiraju CLDN18.2, uključujući želudac. Antitela koja prepoznaju CLDN18.2 kod čoveka i kod drugih vrsta, npr. miševa, su naročito korisna za predviđanje potencijalnih sporednih efekata posredovanih primenom monoklonskih CLDN18.2-antitela kod ljudi.
[0221] Mapiranje epitopa prepoznatih od strane antitela može da bude izvedeno kao što je detaljno opisano u "Epitope Mapping Protocols (Methods in Molecular Biology) autora Glenn E. Morris ISBN-089603-375-9 i u "Epitope Mapping: A Practical Approach" Practical Approach Series, 248 autora Olwyn M. R. Westwood, Frank C. Hay.
[0222] Jedinjenja i agensi koji su ovde opisani mogu da budu primenjivani u obliku bilo koje pogodne farmaceutske kompozicije.
[0223] Farmaceutske kompozicije su obično obezbeđene u jednačenom doznom obliku i mogu da budu pripremljene na način koji je sam po sebi poznat. Farmaceutska kompozicija može npr. da bude u obliku rastvora ili suspenzije.
[0224] Farmaceutska kompozicija može da sadrži soli, puferske supstance, konzervanse, nosače, razblaživače i/ili ekscipijense od kojih su svi poželjno farmaceutski prihvatljivi. Termin "farmaceutski prihvatljiv" označava netoksičnost materijala koji ne interaguje sa delovanjem aktivne komponente farmaceutske kompozicije.
[0225] Soli koje nisu farmaceutski prihvatljive mogu da budu korišćene za pripremu farmaceutski prihvatljivih soli i obuhvaćene su u navodima. Farmaceutski prihvatljive soli ove vrste sadrže na neograničavajući način one pripremljene od sledećih kiselina: hlorovodonične, bromovodonične, sumporne, azotne, fosforne, maleinske, sirćetne, salicilne, limunske, mravlje, malonske i ćilibarne kiseline. Farmaceutski prihvatljive soli takođe mogu da budu pripremljene kao soli alkalnih metala ili soli zemnoalkalnih metala, kao što su soli natrijuma, soli kalijuma ili soli kalcijuma.
[0226] Pogodne puferske supstance za upotrebu u farmaceutskoj kompoziciji obuhvataju sirćetnu kiselinu u soli, limunsku kiselinu u soli, bornu kiselinu u soli i fosfornu kiselinu u soli.
[0227] Pogodni konzervansi za upotrebu u farmaceutskoj kompoziciji obuhvataju benzalkonijum hlorid, hlorobutanol, paraben i timerosal.
[0228] Injektabilna formulacija može da sadrži farmaceutski prihvatljiv ekscipijens kao što je Ringerov laktat.
[0229] Termin "nosač" označava organsku ili neorgansku komponentu, prirodnu ili sintetičku po prirodi, u kojoj je aktivna komponenta kombinovana u cilju olakšavanja, pojačavanja ili omogućavanja primene. Prema navodima, termin "nosač" takođe obuhvata jedan ili više kompatibilnih čvrstih ili tečnih punilaca, razblaživača ili inkapsulirajućih supstanci, koje su pogodne za primenu kod pacijenta.
[0230] Moguće nosačke supstance za parenteralnu primenu su npr. sterilna voda, Ringerov rastvor, Ringerov laktat, sterilni rastvor natrijum hlorida, polialkilen glikoli, hidrogenisani naftaleni i, naročito, biokompatibilni laktidni polimeri, laktid/glikolid kopolimeri ili polioksietilen/polioksipropilen kopolimeri.
[0231] Termin "ekscipijens", kada se ovde koristi, namenjen je da označava sve supstance koje mogu da budu prisutne u farmaceutskoj kompoziciji i koje nisu aktivni sastojci kao što su, npr., nosači, vezujuća sredstva, lubrikanti, sredstva za zgušnjavanje, površinski aktivna sredstva, konzervansi, emulgatori, puferi, sredstva za poboljšanje ukusa ili boje.
[0232] Agensi i kompozicije koji su ovde opisani mogu da budu primenjivani bilo kojim konvencionalnim putem, kao parenteralnom primenom uključujući injekcije ili infuzije. Primena je poželjno parenteralna, npr. intravenska, intraarterijska, subkutana, intradermalna ili intramuskularna.
[0233] Kompozicije pogodne za parenteralnu primenu obično sadrže sterilni vodeni ili nevodeni preparat aktivnog jedinjenja, koji je poželjno izotoničan sa krvlju primaoca. Primeri kompatibilnih nosača i rastvarača su Ringerov rastvor i izotonični rastvor natrijum hlorida. Pored toga, uobičajeno se koriste sterilna, fiksna ulja kao medijum za rastvaranje ili suspendovanje.
[0234] Agensi i kompozicije koji su ovde opisani primenjuju se u efikasnim količinama. "Efikasna količina" označava količinu koja postiže željenu reakciju ili željeni efekat pojedinačno ili zajedno sa dodatnim dozama. U slučaju tretmana određene bolesti ili određenog stanja, željena reakcija se poželjno odnosi na inhibiciju toka bolesti. Ovo obuhvata usporavanje napredovanja bolesti i, naročito, prekid ili reverziju napredovanja bolesti. Željena reakcija u tretmanu bolesti ili stanja takođe može da bude odlaganje početka ili prevencija početka navedene bolesti ili navedenog stanja.
[0235] Efikasna količina agensa ili kompozicije koji su ovde opisani zavisiće od stanja koje se leči, težine bolesti, pojedinačnih parametara pacijenta, uključujući starost, fiziološko stanje, veličinu i težinu, trajanje tretmana, tip prateće terapije (ako je prisutna), specifičan put primene i slične faktore. Prema tome, doze primenjenih agenasa opisane ovde mogu da zavise od različitih takvih parametara. U slučaju da je reakcija kod pacijenta nedovoljna pri početnoj dozi, mogu da se koriste veće doze (ili efikasno veće doze koje se postižu različitim, lokalizovanijim putem primene).
[0236] Agensi i kompozicije koji su ovde opisani mogu da budu primenjivani kod pacijenata, npr., in vivo, za lečenje ili prevenciju različitih poremećaja kao što su oni ovde opisani. Poželjni pacijenti obuhvataju humane pacijente koji imaju poremećaje koji mogu da budu korigovani ili poboljšani primenom agenasa i kompozicija koje su ovde opisane. Ovo obuhvata poremećaje koji uključuju ćelije koje se karakterišu izmenjenim obrascem ekspresije CLDN18.2.
[0237] Na primer, u jednom primeru izvođenja, antitela koja su ovde opisana mogu da budu korišćena za lečenje pacijenta obolelog od kancera, npr., bolesti kancera, kao što je ovde opisano, okarakterisane prisustvom ćelija kancera koje eksprimiraju CLDN18.2.
[0238] Farmaceutske kompozicije i postupci za lečenje opisani prema navodima takođe mogu da budu korišćeni za imunizaciju ili vakcinaciju za prevenciju bolesti koja je ovde opisana.
[0239] Predmetni navodi su dodatno ilustrovani sledećim primerima koje ne treba smatrati ograničavajućim za obim navoda.
PRIMERI
Primer 1: Ekspresija CLDN18.2 u ćelijskim linijama humanog kancera želuca je stabilizovana pomoću in vitro tretmana hemoterapeutskim agensima
[0240] KatoIII ćelije ćelijske linije humanog tumora želuca kultivisane su u medijumu RPMI 1640 (Invitrogen) koji sadrži 20% FCS (Perbio) i 2 mM Glutamax (Invitrogen) na 37°C i 5% CO2, sa ili bez citostatskih jedinjenja. Epirubicin (Pfizer) je ispitivan u koncentraciji od 10 ili 100 ng/ml, 5-FU (Neofluor kompanije NeoCorp AG) je ispitivan u koncentraciji od 10 ili 100 ng/ml, a oksaliplatin (Hospira) je ispitivan u koncentraciji od 50 ili 500 ng/ml. Upotrebljena je i kombinacija sva 3 jedinjenja (EOF; epirubicin 10 ng/ml, oksaliplatin 500 ng/ml, 5-FU 10 ng/ml).
8x10<5>KatoIII ćelija je kultivisano u trajanju od 96 časova bez promene medijuma, ili u trajanju od 72 časa nakon čega je usledilo 24 časa kultivacije u standardnom medijumu da bi se ćelije oslobodile zaustavljanja ćelijskog ciklusa u ploči za kulturu tkiva sa 6 bunarčića na 37°C, 5% CO2. Ćelije su sakupljene sa EDTA/tripsinom, isprane i analizirane.
[0241] Za ekstracelularnu detekciju CLDN18.2 ćelije su bojene monoklonskim anti-CLDN18.2 antitelom IMAB362 (Ganymed) ili kontrolnim antitelom odgovarajućeg izotipa (Ganymed). Kao sekundarni reagens korišćen je kozji-anti-huIgG-APC kompanije Dianova.
[0242] Stadijumi ćelijskog ciklusa su određeni na osnovu merenja sadržaja DNK u ćeliji. Ovo omogućava razlikovanje ćelija u G1-, S- ili G2-fazi ćelijskog ciklusa. U S-fazi odvija se duplikacija DNK, dok u G2-fazi ćelije rastu i pripremaju se za mitozu. Analiza ćelijskog ciklusa je izvedena upotrebom kompleta CycleTEST PLUS DNA Reagent Kit kompanije BD Biosciences praćenjem protokola proizvođača. Protočna citometrija i analiza su izvedene upotrebom BD FACS CantoII (BD Biosciences) i FlowJo (Tree Star) softvera.
[0243] Kolone na Slici 1a i b pokazuju odgovarajući procenat ćelija u G1-, S- ili G2-fazi ćelijskog ciklusa. KatoIII ćelije kultivisane u medijumu pokazuju zaustavljanje ćelijskog ciklusa pretežno u G1-fazi. Ćelije tretirane sa 5-FU su blokirane pretežno u S-fazi. Ćelije KatoIII tretirane sa epirubicinom ili sa EOF pokazuju zaustavljanje ćelijskog ciklusa pretežno u G2-fazi. Oksaliplatinom tretirane KatoIII ćelije pokazuju obogaćenje ćelija pretežno u G1- i G2-fazama. Kao što se može videti na slici 1c, zaustavljanje ćelijskog ciklusa u S-fazi ili G2-fazi rezultira u stabilizaciji ili ushodnoj regulaciji CLDN18.2. Čim se ćelije oslobode iz bilo koje faze ćelijskog ciklusa (Slika 1b) ekspresija CLDN18.2 na ćelijskoj površini KatoIII ćelija postaje ushodno regulisana (Slika 1d).
[0244] NUGC-4 i KATO III ćelije su tretirane sa 5-FU OX (10 ng/ml 5-FU i 500 ng/ml oksaliplatina), EOF (10 ng/ml epirubicina, 500 ng/ml oksaliplatina i 10 ng/ml 5-FU) ili FLO (10 ng/ml 5-FU, 50 ng/ml folinske kiseline i 500 ng/ml oksaliplatina) u trajanju od 96 časova. Iz NUGC-4 i KATO III ćelija prethodno tretiranih hemoterapijom izolovana je RNK i prevedena u cDNK. Nivo transkripcije CLDN18.2 je analiziran metodom kvantitativne PCR u realnom vremenu. Rezultati su prikazani na Slici 2a kao relativna ekspresija u poređenju sa nivoom transkripcije „housekeeping“ gena HPRT. Slika 2b prikazuje Western blot za CLDN18.2 i kontrolu opterećenja aktinom netretiranih i tretiranih NUGC-4 ćelija. Intenzitet luminescentnog signala je prikazan u odnosu na aktin u procentima.
[0245] Prethodni tretman NUGC-4 i KATO III ćelija sa EOF, FLO, kao i 5-FU OX kombinovanim hemoterapijama rezultira u povećanim nivoima RNK i proteina CLDN18.2 kao što je pokazano pomoću kvantitativne PCR u realnom vremenu (Slika 2a) i metode Western blot (Slika 2b).
[0246] Analizirano je vezivanje IMAB362 na NUGC-4 i KATO III ćelijama kancera želuca tretiranim sa EOF (10 ng/ml epirubicina, 500 ng/ml oksaliplatina i 10 ng/ml 5-FU) ili FLO (10 ng/ml 5-FU, 50 ng/ml folinske kiseline i 500 ng/ml oksaliplatina) u trajanju od 96 časova pomoću protočne citometrije. Količina CLDN18.2 proteina na koji IMAB362 na površini ćelijskih linija kancera želuca može ciljno da deluje je povećana, kao što je prikazano na Slici 2c. Ovaj efekat je najizraženiji u ćelijama koje su prethodno tretirane sa EOF ili FLO.
[0247] KatoIII ćelije su prethodno tretirane 4 dana irinotekanom ili docetakselom i u njima je analizirana ekspresija CLDN18.2 i zaustavljanje ćelijskog ciklusa. Tretman ćelija irinotekanom rezultovao je u dozno-zavisnoj inhibiciji ćelijskog rasta i zaustavljanju ćelijskog ciklusa u S/G2-fazi (Slika 3). Tretman ćelija docetakselom rezultovao je u dozno-zavisnoj inhibiciji ćelijskog rasta i zaustavljanju ćelijskog ciklusa u G2-fazi (Slika 3).
Primer 2: Prethodni tretman ćelija humanog kancera želuca hemoterapeuticima rezultuje višom efikasnošću IMAB362-posredovane ADCC
[0248] IMAB362-posredovana ADCC je ispitivana upotrebom NUGC-4 ćelija kancera želuca kao ciljnih ćelija koje su prethodno tretirane sa 10 ng/ml 5-FU i 500 ng/ml oksaliplatina (5-FU OX), 10 ng/ml epirubicina, 500 ng/ml oksaliplatina i 10 ng/ml 5-FU (EOF) ili 10 ng/ml 5-FU, 50 ng/ml folinske kiseline i 500 ng/ml oksaliplatina (FLO) u trajanju od 96 časova (odnos efektora:ciljnog mesta 40:1), ili nisu tretirane. EC50vrednosti su dobijene od 7 zdravih davalaca za netetirane i NUGC-4 ćelije prethodno tretirane sa EOF, FLO ili 5-FU OX.
[0249] Kao što je prikazano na Slici 4a, krive doze/odgovora prethodno tretiranih ćelija pomerene su na gore i ulevo u poređenju sa netretiranim ciljnim ćelijama. Ovo je rezultovalo u većoj maksimalnoj lizi i u smanjenju EC50vrednosti na jednu trećinu u odnosu na netretirane ćelije (Slika 4b).
[0250] Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) uključujući NK ćelije, monocite, mononuklearne ćelije ili druge efektorske ćelije poreklom od zdravih humanih davalaca su prečišćene centrifugiranjem na gradijentu gustine Ficoll Hypaque. Isprane efektorske ćelije su zasejane u X-Vivo medijumu. KatoIII ćelije koje eksprimiraju CLDN18.2 endogeno i poreklom su od želuca korišćene su kao ciljne ćelije u ovoj postavci. Ciljne ćelije stabilno su eksprimirale luciferazu, lucifer žutu, koju oksiduju samo vijabilne ćelije. Prečišćeno anti-CLDN18.2 antitelo IMAB362 je dodato u različitim koncentracijama, a kao antitelo za kontrolu izotipa korišćeno je irelevantno himerno huIgG1 antitelo. U uzorcima je analizirana citoliza merenjem luminescencije nastale oksidacijom lucifer žute koja predstavlja vrednost količine vijabilnih ćelija preostalih posle citotoksičnosti indukovane pomoću IMAB362. KatoIII ćelije koje su prethodno tretirane u trajanju od 3 dana irinotekanom (1000 ng/ml), docetakselom (5 ng/ml) ili cisplatinom (2000 ng/ml) su upoređivane sa netretiranim ciljnim ćelijama kultivisanim u medijumu i kvantitativno je određena ADCC indukovana pomoću IMAB362.
[0251] KatoIII ćelije prethodno tretirane 3 dana irinotekanom, docetakselom ili cisplatinom ispoljile su niži nivo vijabilnih ćelija u poređenju sa ciljnim ćelijama kultivisanim u medijumu (Slika 5a), a ekspresija klaudina18.2 u ćelijama prethodno tretiranim irinotekanom, docetakselom ili cisplatinom je povećana u poređenju sa ćelijama kultivisanim u medijumu (Slika 5b).
[0252] Pored toga, prethodni tretman KatoIII ćelija irinotekanom, docetakselom ili cisplatinom povećao je potenciju IMAB362 za indukciju ADCC (Slika 5c, d).
Primer 3: Hemoterapija dovodi do veće efikasnosti IMAB362-indukovane CDC
[0253] Efekti hemoterapeutskih agenasa na IMAB362-indukovanu CDC su analizirani pomoću prethodnog tretiranja KATO III ćelija kancera želuca sa 10 ng/ml 5-FU i 500 ng/ml oksaliplatina (5-FU OX) u trajanju od 48 časova. Reprezentativne krive doza-odgovor za IMAB362-indukovanu CDC upotrebom KATO III ćelija prethodno tretiranih hemoterapeutikom su prikazane na Slici 6. Prethodni tretman ćelija tumora u trajanju od 48 časova povećao je potenciju IMAB362 da indukuje CDC, rezultujući u višoj maksimalnoj ćelijskoj lizi prethodno tretiranih ćelija tumora u poređenju sa netretiranim ćelijama.
Primer 4: Sposobnost imunih efektorskih ćelija da izvrše IMAB362-posredovanu ADCC nije ugrožena tretmanom hemoterapeuticima
[0254] Hemoterapeutski agensi korišćeni u EOF ili FLO režimu su visoko potentni u inhibiciji proliferacije ciljnih ćelija. Da bi se ispitali štetni efekti hemoterapije na efektorske ćelije, PBMC zdravih davalaca su tretirane sa 10 ng/ml epirubicina, 500 ng/ml oksaliplatina i 10 ng/ml 5-FU (EOF) ili 10 ng/ml 5-FU, 50 ng/ml folinske kiseline i 500 ng/ml oksaliplatina (FLO) u trajanju od 72 časa pre primene u ADCC analizama. Slika 7a prikazuje EC50vrednosti 4 zdrava davaoca, a Slika 7b prikazuje reprezentativne krive doze/odgovora IMAB362-indukovane ADCC upotrebom efektorskih ćelija prethodno tretiranih sa EOF ili FLO. IMAB362-indukovana ADCC ćelija karcinoma želuca NUGC-4 nije ugrožena EOF ili FLO hemoterapijama.
Primer 5: Kombinacija ZA/IL-2 tretmana rezultuje u optimizovanoj ekspanziji kultura mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC)
[0255] Efekat ZA/IL-2 na proliferaciju PBMC kultura je procenjen in vitro. PBMC su sakupljene od zdravih humanih davalaca i kulture su tretirane jednom dozom ZA. IL-2 je dodavan svakih 3-4 dana. Specifično, PBMC poreklom od 3 različita zdrava humana davaoca (#1, #2, #3) su kultivisane u RPMI medijumu (1x10<6>ćelija/ml) u trajanju od 14 dana sa 1 µM ZA sa visokom (300 U/ml) ili niskom (25 U/ml) dozom IL-2; videti Sliku 8a. PBMC istih davalaca su kultivisane dodatno u RPMI medijumu 14 dana sa 300 U/ml IL-2 sa ZA, ili bez ZA; videti Sliku 8b. Povećanje broja ćelija je određeno brojanjem živih ćelija na dan 6, 8, 11 i 14.
[0256] U medijumu dopunjenom visokom dozom IL-2 oko 2 - 5 puta više ćelija je ekspandirano, u poređenju sa kulturama dopunjenim niskom dozom IL-2 (Slika 8a). Ekspanzija ćelija u medijumu bez ZA je bila približno 2 puta niža u poređenju sa ćelijama gajenim u medijumu sa ZA (Slika 8b). Ovi podaci pokazuju neophodnost da se primene oba jedinjenja, i ZA i IL-2 u kombinaciji da bi se obezbedila odgovarajuća ekspanzija ćelija.
Primer 6: Rezultati tretmana sa ZA/IL-2 u ekspanziji velikih količina Vγ9Vδ2 T-ćelija u PBMC kulturama
[0257] PBMC su kultivisane 14 dana u RPMI medijumu obogaćenom sa 300 U/ml IL-2 i sa ili bez 1 µM ZA. Procenat Vγ9+Vδ2+ T ćelija unutar populacije CD3+ limfocita (Slika 9a) i procenat CD16+ ćelija unutar CD3+Vγ9+Vδ2+ T-ćelijske populacije (Slika 9b) je određen pomoću multikolorne FACS analize na dan 0 i dan 14. Rezultati su ocenjivani za svakog davaoca na grafikonu rasipanja. Slika 9c prikazuje grafikon rasipanja koji prikazuje povećanje u vremenu (obogaćenje) u broju CD3+ Vγ9+Vδ2+ i CD3+CD16+ Vγ9+Vδ2+ T ćelija unutar populacije limfocita. Količina ćelija zasejanih na dan 0 i količina ćelija zasejanih na dan 14 su uzete u obzir.
[0258] Dodavanje IL-2 u PBMC kulture je potrebno za preživljavanje i rast limfocita. Oni se efikasno šire u kulturama obogaćenim sa 300 U/ml IL-2. FACS analiza upotrebom antitela specifičnih za Vγ9 i Vδ2 otkriva da dodavanje ZA/IL-2 specifično indukuje akumulaciju Vγ9Vδ2 T ćelija (Slika 9a). Posle 14 dana, populacija CD3+ limfocita može da sadrži do 80% Vγ9Vδ2 T ćelija. Deo Vγ9Vδ2 T ćelija eksprimira CD16, dok obogaćenje ovih ćelija unutar populacije CD3+ limfocita iznosi 10-700 puta, zavisno od davaoca (Slike 9b i 9c). Obogaćenje CD16+Vγ9+Vδ2+ T ćelija u kulturama je 10-600 puta više u poređenju sa kulturama gajenim bez ZA (Slika 9c). Zaključujemo da in vitro tretman PBMC sa ZA/IL-2 rezultuje ushodnom regulacijom FcγIII receptora CD16 koji posreduje ADCC u značajnoj proporciji γδ T ćelija.
Primer 7: IL-2 utiče na ekspanziju Vγ9Vδ2 T ćelija na način zavisan od doze
[0259] Dodavanje ZA u kulture je najvažniji faktor za indukciju razvoja Vγ9Vδ2 T ćelija. Dobro je poznato da je IL-2 potreban za rast i preživljavanje T ćelija.
[0260] PBMC su kultivisane 14 dana u RPMI medijumu dopunjenom sa 1 µM ZA i rastućim koncentracijama IL-2. IL-2 je dodat na dan 0 i dan 4. Obogaćenje CD16+Vγ9+Vδ2+ T ćelija unutar populacije CD3+ limfocita je određeno pomoću multikolornog FACS bojenja na dan 0 i dan 14. Da bi se uporedili različiti davaoci, količina CD16+Vγ9+Vδ2+ T ćelija sakupljenih posle kultivacije sa 600 U/ml IL-2 je podešena na 100%; videti Sliku 10, levo. Pored toga, ispitivana je
1
ADCC aktivnost izolovanih kultura gajenih 14 dana u rastućim koncentracijama IL-2; videti Sliku 10, desno.
[0261] Potvrdili smo pomoću analize odgovora na dozu da IL-2 takođe stimuliše rast i preživljavanje podgrupe Vγ9Vδ2 T ćelija. Dodavanjem niskih koncentracija IL-2 u medijum, nađena je korelacija između doze IL-2 i procenta CD16+Vγ9Vδ2 T ćelija unutar populacije CD3+ limfocita (Slika 10, levo). ADCC aktivnost ćelija gajenih u višim koncentracijama IL-2 (150-600 U/ml) je poboljšana u poređenju sa ćelijama gajenim u niskim koncentracijama IL-2 (Slika 10, desno).
Primer 8: ZA indukuje proizvodnju IPP u monocitima i ćelijama kancera pri čemu oba stimulišu ekspanziju Vγ9Vδ2 T ćelija
[0262] Sveže PBMC (eksp. #1) ili Vγ9Vδ2 T ćelijske kulture koje su 14 dana stimulisane sa ZA/IL-2 (eksp. #2-5) su inkubirane bez monocita (odnos efektorske ćelije : monociti 1:0), sa 0.2-strukom (4:1), ili 5-strukom (odnos 1:4) količinom monocita 1 µM ZA. Obogaćivanje Vγ9Vδ2 T ćelija u ko-kulturama posle 14 dana određeno je pomoću multikolornog FACS, dok je ekspanzija kulture razmatrana u izračunavanju. Faktor obogaćenja Vγ9Vδ2 T ćelija kultivisanih sa monocitima u odnosu 1:4 je podešen na 100% za svaki eksperiment. Povećanje monocita u kulturi je rezultiralo u obogaćenju Vγ9Vδ2 T ćelija većem od 10 puta. Ovaj efekat je jasno zavisan od ZA; videti Sliku 11a.
[0263] Pored toga, ćelije humanog kancera želuca (NUGC-4-luciferaza) i ćelije kancera želuca miša (CLS103 - obojene kalceinom) su prethodno tretirane sa ili bez 5 µM ZA u trajanju od 2 dana. Humane Vγ9Vδ2 T ćelije su prečišćene pomoću MACS (dan 14) i ko-kultivisane sa ćelijama kancera u trajanju od 24 časa. Citotoksičnost Vγ9Vδ2 T ćelija prema netretiranim i ZA-tretiranim ciljnim ćelijama je određena merenjem aktivnosti preostale luciferaze ili fluorescencije kalceina; videti Sliku 11b. Ciljne ćelije (NUGC-4 i CLS103) su prethodno tretirane sa ili bez 5 µM ZA u trajanju od 2 dana i zatim su inkubirane 4 časa sa mitomicinom c (50 MI) da bi se zaustavila proliferacija. Humane Vγ9Vδ2 T ćelije u mirovanju starosti 14 dana prečišćene pomoću MACS i<3>H-timidin su dodati u ciljne ćelije i ko-kulture su inkubirane 48 časova na 37°C. Proliferacija je određena merenjem ugradnje<3>H timidina u DNK upotrebom MicroBeta scintilacionog brojača. Proliferacija ciljnih ćelija koje nisu tretirane sa ZA i bez Vγ9Vδ2 T ćelija je podešena na 100%; videti Sliku 11c.
[0264] Kao što je prikazano na Slikama 11b i 11c ćelije humanog kancera izložene ZA aktivirale su Vγ9Vδ2 T ćelije u smislu citotoksičnosti (5-10 puta) i proliferacije (1.4-1.8 puta), dok mišja ćelijska linija kancera CLS103 nije uspela da izazove ove efekte na Vγ9Vδ2 T ćelije.
2
Primer 9: Tretman sa ZA/IL-2 utiče na sastav PBMC kultura
[0265] Rast i diferencijacija specifičnih ćelijskih tipova u PBMC kulturama zavise od prisustva citokina. Ove komponente se ili dodaju u medijum (npr. faktori rasta prisutni u serumu, IL-2) ili ih izlučuju same imune ćelije. Tipovi ćelija koji se razvijaju takođe zavise od početnog sastava PBMC i od genetičkih doprinosa. Kako bi se analiziralo ukupno povećanje efektorskih ćelija (NK ćelije i Vγ9Vδ2 T ćelije), PBMC uzete od 10 različitih davalaca gajene su u prisustvu 300 U/ml IL-2 i sa ili bez 1 µM ZA tokom 14 dana. Količina efektorskih ćelija unutar populacije limfocita je identifikovana pomoću multikolrnog FACS bojenja upotrebom CD3, CD16, CD56, Vγ9 i Vδ2 antitela. CD3-CD56+CD16+ ćelije predstavljaju NK ćelije, a CD3+Vγ9+Vδ2+ predstavljaju Vγ9Vδ2 T ćelije.
[0266] Multikolorna FACS analiza je otkrila da se posle tretmana sa IL-2 razvijaju uglavnom NK ćelije, dok su u kulturama tretiranim sa ZA/IL-2 pretežno ekspandirane Vγ9Vδ2 T ćelije (Slika 12).
Primer 10: Tretman sa ZA/IL-2 stvara Vγ9Vδ2+ efektorske memorijske T ćelije
[0267] Subpopulacije T limfocita mogu da se razgraniče pomoću dva površinska markera, visokomolekulske izoforme uobičajenog limfocitnog antigena CD45RA i receptora hemokina CCR7. CCR7+ intaktne i centralne-memorijske (CM) T ćelije se odlikuju sposobnošću da ponovljeno cirkulišu u limfne čvorove i dođu u kontakt sa antigenom. Nasuprot tome, efektorske memorijske (EM) ćelije i efektorski T limfociti RA+ (TEMRA) nishodno regulišu CCR7 i izgleda da su specijalizovani za migraciju ka perifernim nelimfoidnim tkivima npr. ka inficiranim mestima ili mestima gde se nalazi tumor. EM ćelije mogu da budu dodatno podeljene na osnovu diferencijalne ekspresije CD27 i CD28. Progresivni gubitak površinske ekspresije CD28 i CD27 se odvija istovremeno sa ushodnom regulacijom citolitičkog kapaciteta ćelija. Pored toga, nivo CD57 je u korelaciji sa ekspresijom granzima i perforina i na taj način predstavlja treći marker koji ukazuje na citotoksičnost/ćelijsko sazrevanje.
[0268] PBMC su kultivisane sa ili bez 1 µM ZA i 300 U/ml IL-2 u trajanju od 14 dana. Ekspresija različitih površinskih markera je određena pomoću multikolorne FACS analize na dan 0 (PBMC) i dan 14. Intaktne ćelije su CD45RA+CCR7+, centralne memorijske ćelije (CM) su CD45RA-CCR7+, TEMRA su CD45RA+CCR7-, a efektorske memorijske ćelije (EM) su negativne za oba markera; videti Sliku 13a. Pored toga, citolitička aktivnost Vγ9Vδ2 T ćelija je određena pomoću bojenja za CD27 i CD57 markere; videti Sliku 13b,c. Dodatno, razvoj karakteristika sličnih NK ćelijama značajan za ADCC aktivnost je analiziran bojenjem CD3+ ćelija sa CD16 (vezivanje antitela) i CD56 (adhezija); videti Sliku 13d.
[0269] Multikolorna FACS analiza Vγ9Vδ2 T ćelija otkrila je da je tretman sa ZA/IL-2 jasno stimulisao razvoj Vγ9Vδ2 T ćelija EM tipa koje su CD27- i CD57+ (Slika 13b-c). Pored pojačane citolitičke aktivnosti, povećanje nivoa CD16 i CD56, za koje je poznato da je kod NK ćelija (CD3-CD16+CD56+) uključeno u ADCC, zabeleženo je u CD3+ populaciji (Slika 13d).
[0270] Uzeti zajedno, ovi podaci ukazuju na to da tretman PBMC sa ZA rezultira u razvoju CD16+Vγ9+Vδ2+ efektorskih memorijskih T ćelija, koje su sposobne da migriraju do perifernih nelimfoidnih tkiva, i koje ispoljavaju markere visoke citolitičke aktivnosti. U kombinaciji sa antitelom IMAB362 koje ciljno deluje na tumor, ove ćelije se izuzetno efikasno upotrebljavaju da migriraju, ciljno deluju i ubijaju tumorske ćelije.
Primer 11: Vγ9Vδ2 T ćelije ekspandirane pomoću ZA/IL-2 su potentni efektori za IMAB362-posredovanu CLDN18.2-zavisnu ADCC
[0271] Slično NK ćelijama, Vγ9Vδ2 T ćelije ekspandirane pomoću ZA/IL-2 su pozitivne na CD16 (videti Sliku 9 i 13), FcγRIII receptor preko koga antitelo vezano za ćeliju pokreće ADCC. Da bi se procenilo da li su Vγ9Vδ2 T ćelije sposobne da indukuju snažnu ADCC zajedno sa IMAB362 izvedena je serija eksperimenata.
[0272] PBMC poreklom od 2 različita davaoca (#1 i #2) su kultivisane u medijumu sa 300 U/ml IL-2, i sa ili bez 1 µM ZA. Posle 14 dana, ćelije su sakupljene i, sa rastućim koncentracijama (0.26 ng/ml - 200 µg/ml) IMAB362, dodate NUGC-4 ćelijama koje eksprimiraju CLDN18.2. Specifično ubijanje ćelija je određeno u analizama sa luciferazom; videti Sliku 14a. Slika 14b,c daje prikaz ADCC analiza izvedenih sa ćelijama 27 davalaca gajenim u 300 U/ml IL-2, i sa ili bez ZA. NUGC-4 su služile kao ciljne ćelije. Za svakog davaoca, na grafikonima rasipanja ocenjivane su vrednosti EC50(b) izračunate iz krivih doza-odgovor, kao i maksimalna stopa specifičnog ubijanja ćelija pri dozi od 200 µg/ml IMAB362 (c).
[0273] Upotrebom PBMC kultivisanih 14 dana sa ZA/IL-2 (Slika 14a) zapažena je ADCC aktivnost protiv CLDN18.2-pozitivnih NUGC-4 ćelija koja snažno zavisi od IMAB362. Pri upotrebi PBMC kultura tretiranih sa ZA/IL-2, ADCC zavisi od prisustva Vγ9Vδ2 T ćelija (Slike 12 i 15). Ako su ćelije kultivisane bez ZA, ADCC aktivnost je smanjena kod većine davalaca. U ovim kulturama, rezidualna ADCC aktivnost je zavisna od NK ćelija (Slike 11 i 14). Testiranjem više od 20 davalaca, analize ADCC su otkrile da tretman PBMC sa ZA/IL-2 poboljšava EC50i maksimalne stope specifičnog ubijanja ćelija u poređenju sa PBMC kultivisanim samo sa IL-2.
[0274] Pored toga, PBMC dva različita davaoca (#1 #2) su kultivisane sa 1 µM ZA i 300 U/ml IL-2. Ove efektorske ćelijske kulture su korišćene u analizama ADCC sa CLDN18.2-pozitivnim (NUGC-4, KATO III) i negativnim (SK-BR-3) humanim ciljnim ćelijskim linijama (E:T odnos
4
40:1). Dodavane su rastuće količine (0.26 ng/ml - 200 µg/ml) IMAB362 antitela. ADCC je merena u analizama sa luciferazom; videti Sliku 15a. Isti eksperiment, kao onaj opisan pod (a), izveden je sa NUGC-4 ciljnim ćelijama i efektorskim ćelijama sakupljenim iz kultura tretiranih sa ZA/IL-2 u različitim vremenskim tačkama; videti Sliku 15b. Isti eksperiment, kao onaj opisan pod (a), izveden je upotrebom NUGC-4 kao ciljnih ćelija; videti sliku 15c. Ćelije ekspandirane sa ZA/IL-2 su ili korišćene direktno, ili su Vγ9Vδ2 T ćelije prečišćene iz kultura upotrebom TCRγδ MACS sortiranja (Miltenyi Biotech). Dobijena je čistoća veća od 97.0% Vγ9Vδ2 T ćelija u limfocitima.
[0275] Zabeležena je snažna ADCC aktivnost protiv CLDN18.2-pozitivnih, ali ne i CLDN18.2-negativnih ćelijskih linija humanog tumora (Slika 15a). Pored toga, nije dobijena ADCC aktivnost sa izotipskim kontrolnim antitelima (nije prikazano). U toku ZA/IL-2 tretmana, ADCC litička aktivnost se povećava tokom vremena kod dela davalaca (Slika 15b). Kriva doze/efekta IMAB362 se pomera na gore i ulevo pokazujući poboljšanje vrednosti EC50i maksimalne stope lize u vremenu. U poređenju sa nekondicioniranim PBMC, Vγ9Vδ2 efektorske T ćelije obogaćene pomoću ZA/IL-2 tretmana su sposobne da dostignu višu maksimalnu stopu ubijanja CLDN18.2-pozitivnih ciljnih ćelija i takođe zahtevaju niže koncentracije IMAB362 za istu stopu ubijanja ćelija.
[0276] Kako bi se potvrdilo da su Vγ9Vδ2 T ćelije rezervoar za litičku aktivnost, ove ćelije su izolovane sa > 97% čistoćom pomoću magnetnog ćelijskog sortiranja iz ZA/IL-2-kultivisanih PBMC populacija na dan 14. ADCC aktivnost povezana sa IMAB362 je zadržana i delimično poboljšana zahvaljujući većoj čistoći. Ovi podaci potvrđuju da su Vγ9Vδ2 T ćelije uglavnom odgovorne za ADCC aktivnost zabeleženu sa 14 dana starim PBMC kulturama (Slika 15c).
Primer 12: Tretman ciljnih ćelijskih linija sa ZA/IL-2 ne utiče na površinsku ekspresiju CLDN18.2
[0277] Načini delovanja pokrenuti delovanjem IMAB362 su strogo zavisni od prisustva i količine ekstracelularnog detektabilnog CLDN18.2. Prema tome, uticaj tretmana sa ZA/IL-2 na površinsku gustinu CLDN18.2 analiziran je protočnom citometrijom upotrebom NUGC-4 i KATO III ćelijskih linija koje endogeno eksprimiraju CLDN18.2. Specifično, izvedena je analiza protočne citometrije vezivanja IMAB362 na nepermeabilizovane NUGC-4 ćelije kancera želuca prethodno tretirane sa ZA/IL-2 ili ZA/IL-2+EOF ili ZA/IL-2+5-FU/OX u trajanju od 72 časa.
[0278] Tretman sa ZA/IL-2 in vitro otkriva da nema promene u količini površinske lokalizacije CLDN18.2; videti Sliku 16.
Primer 13: Povećanje IMAB362-posredovane ADCC pomoću ZA/IL-2 tretmana PBMC nije ugroženo prethodnim tretmanom sa EOF
[0279] Hemoterapeutski agensi ugrožavaju ćelijsku proliferaciju. Nasuprot tome, ZA/IL-2 tretman pokreće širenje Vγ9Vδ2 T ćelija. Da bi analizirali uticaje ovih suprotnih interakcija na efektorske ćelije, PBMC 6 zdravih davalaca su kultivisane sa ZA/IL-2 ili ZA/IL-2+EOF u trajanju od 8 dana pre primene u ADCC analizama (E:T odnos 15:1). Određivane su koncentracije IMAB362 koje rezultiraju u 50% ADCC-posredovanoj lizi netretiranih NUGC-4 ciljnih ćelija (EC50).
[0280] Povećanje IMAB362-indukovane ADCC NUGC-4 ćelija kao posledica tretmana PBMC sa ZA/IL-2 nije značajno promenjeno kombinovanim tretmanom PBMC sa EOF (Slika 17).
Primer 14: In vivo ciljno delovanje IMAB362 na CLDN18.2-pozitivne tumore i antitumorski efekti IMAB362 na ksenotransplantate humanih tumorskih ćelija kod golih miševa
[0281] Da bi se ispitalo in vivo ciljno delovanje IMAB362 na ćelije tumora, 80 µg Dyelight<®>680-obeleženog antitela je intravenski dato golim miševima kojima je subkutano ksenotransplantirana ćelijska linija humanog kancera želuca NUGC-4. NUGC-4 ćelije ispoljavaju površinsku ekspresiju CLDN18.2 kao i HER2/neu (ciljno mesto trastuzumaba), ali su negativne za CD20. Kontrolne studije su izvedene injektiranjem grupe miševa kojima je usađen NUGC-4 sa Dyelight 680-obeleženim trastuzumabom (pozitivna kontrolna grupa) ili Dyelight<®>680-obeleženim rituksimabom (negativna kontrola). IMAB362 se akumulira snažno i isključivo u ksenotransplantatima tumora, kao što je pokazano snimanjem živih miševa upotrebom Xenogen<®>fluorescentnog sistema za snimanje 24 časa posle i.v. injekcije antitela (Slika 18). IMAB362 je efikasno zadržan u tumoru pozitivnom na ciljnu strukturu i detektabilan u sličnom intenzitetu čak i posle 120 časova (Slika 18). Trastuzumab se takođe detektuje isključivo u ksenotransplantatima 24 časa posle injekcije. Signal trastuzumaba je brzo ispran u roku od 120 časova posle ubrizgavanja. Signal nije detektovan sa rituksimabom.
[0282] Pored toga, IMAB362 je korišćen za lečenje golih miševa koji nose CLDN18.2-pozitivne ksenotransplantirane tumore. Izvedene su model studije ranog tretmana (sa primenama IMAB362 već 3 dana posle inokulacije tumorskih ćelija). Pored toga, eksperimenti tretmana uznapredovalog tumora su započeti do 9 dana posle inokulacije ćelije tumora, kada su tumori dostigli zapremine od oko 60 - 120 mm<3>.
[0283] Goli miševi su subkutano inokulisani sa 1x10<7>HEK293~CLDN18.2 transfektantima. Tretman 10 miševa po grupi započet je 3 dana posle inokulacije tumora. Miševi su tretirani sa 200 µg IMAB362, infliksimabom kao kontrolom izotipa i PBS-om dva puta nedeljno u trajanju od 6 nedelja naizmenično intravenskim i intraperitonealnim putevima primene. Dok su svi miševi u grupama tretiranim PBS-om ili kontrolom izotipa uginuli u roku od 70 - 80 dana, životinje tretirane sa IMAB362 imale su preživele (Slika 19). Ne samo da je vreme do smrti produženo, već je 4 od 10 miševa preživelo ceo period posmatranja od 210 dana.
[0284] Tretman 9 do 10 miševa po grupi je započet kada su srednje zapremine tumora dostigle 88 mm<3>(62 - 126 mm<3>). Pre tretmana miševi su stratifikovani u test grupe da bi se osigurale slične veličine tumora u svim grupama. Miševi su tretirani sa 200 µg IMAB362, kontrolom izotipa ili PBS-om dva puta nedeljno u trajanju od 6 nedelja naizmenično intravenskim i intraperitonealnim putevima primene. Svi miševi u grupama tretirani PBS-om ili kontrolom izotipa su uginuli u roku od 50-100 dana. Životinje tretirane sa IMAB362 imale su benefit u vidu preživljavanja, sa gotovo dvostrukom medijanom vremena preživljavanja (47 naspram 25 dana). Tri od ovih miševa preživela su ceo period posmatranja (Slika 20). Značajno, antitumorska efikasnost in vivo zavisi od prisustva ciljne strukture na ćelijama tumora. Antitumoski efekti IMAB362 tretmana nisu zabeleženi kod miševa kojima su usađene CLDN18.2-negativne HEK293 tumorske ćelije.
[0285] Model NUGC-4 tumora želuca je korišćen za ispitivanje efikasnosti IMAB362 protiv ćelija kancera sa endogenom ekspresijom CLDN18.2. NUGC-4 ćelije rastu agresivno u golim miševima.
[0286] 1x10<7>NUGC-4 ćelija kancera želuca je injektirano subkutano u levi bok atimusnih golih miševa (n = 9 za IMAB362 grupu; n = 8 za kontrolne grupe). IMAB362 (200 µg po injekciji) i kontrole su primenjivani dva puta nedeljno naizmenično i.v. i i.p., počevši 6 dana posle inokulacije tumora i.v. injekcijom. Veličine tumora su praćene dva puta nedeljno. Podaci predstavljeni na Slici 21a su srednje vrednosti sa SEM. Rast tumora miševa tretiranih sa IMAB362 bio je značajno inhibiran u poređenju sa miševima tretiranim kontrolama (* p<0.05). Slika 21b prikazuje zapremine tumora na dan 21 posle inokulacije tumora. Zapremine tumora miševa tretiranih sa IMAB362 bile su značajno manje od tumora kontrolnih miševa (* p<0.05).
[0287] Kada je 1x10<7>ćelija tumora inokulisano u miševe, medijana vremena preživljavanja netretiranih miševa nije duža od 25 dana. Tretman sa IMAB362, cetuksimabom, trastuzumabom ili izotipskom i puferskom kontrolom je započet kada su zapremine tumora dostigle srednju veličinu od oko 109 mm<3>(63 - 135 mm<3>). Miševi su stratifikovani u zavisnosti od veličine u tretmanske grupe (Slika 21). Pokazano je da IMAB362 značajno smanjuje stopu rasta tumora. Nije zabeležena značajna redukcija rasta tumora u poređenju sa kontrolama sa fiziološkim rastvorom ili antitelom za ovaj model tumora koji agresivno raste. Odlaganje rasta tumora je povezano sa povećanjem medijane vremena preživljavanja koje nije značajno kod miševa tretiranih sa IMAB362 (31 dana naspram 25 dana).
[0288] Antitumorska aktivnost IMAB362 je ispitivana sa dva modela ksenotransplantata humanog karcinoma želuca upotrebom NCI-N87 ili NUGC-4 ćelija sa lentivirusnom transdukcijom CLDN18.2 na koje ciljno deluje IMAB362 (NCI-N87~CLDN18.2 i NUGC-4~CLDN18.2).
[0289] Ksenotransplantati tumora NCI-N87~CLDN18.2 su inokulisani subkutano injekcijom od 1x10<7>NCIN87~CLDN18.2 ćelija u bok 8 golih miševa (ženke, starosti 6 nedelja) po tretmanskoj grupi. Tretman je počeo 5 dana posle inokulacije tumora intravenskom injekcijom 800 µg IMAB362 ili sa 200 µl 0.9% NaCl za kontrolnu grupu sa fiziološkim rastvorom. Intravenska primena je nastavljena nedeljno tokom celog perioda posmatranja. Veličina tumora i zdravstveno stanje životinja su praćeni polu-nedeljno. Slika 22a prikazuje efekte IMAB362 tretmana na rast tumora. Veličina s.c. tumora je merena dva puta nedeljno (srednja vrednost SEM, ***p<0.001). Slika 22b prikazuje Kaplan-Meier grafikone preživljavanja. Miševi su žrtvovani kada je tumor dostigao zapreminu od 1400 mm<3>.
[0290] Na taj način, kontinuirani tretman sa IMAB362 inhibirao je sa visokom značajnošću (p<0.001) tumorski rast ksenotransplantata karcinoma želuca NCI-N87~CLDN18.2 (Slika 22a). Odlaganje u rastu tumora bilo je povezano sa značajno (p<0.05) dužim vremenom preživljavanja miševa tretiranih sa IMAB362 (Slika 22b).
[0291] IMAB362 imunoterapija brzo rastućih ksenotransplantata NUGC-4~CLDN18.2 je rezultovala u značajno (p<0.05) manjim tumorima na dan 14 tretmana. Posle prve dve nedelje IMAB362 tretmana napredovanje tumora NUGC-4~CLDN18.2 je bilo veoma agresivno. Međutim, inhibicija rasta tumora NUGC-4~CLDN18.2 do dana 14 tretmana je rezultirala u značajno (p < 0.05) dužem preživljavanju miševa tretiranih sa IMAB362.
[0292] Ukratko, IMAB362 je bio visoko efikasan u lečenju ksenotransplantata karcinoma želuca pokazujući značajno usporavanje napredovanja tumora i produženo preživljavanje u endogenim CLDN18.2-pozitivnim modelima tumora. U model sistemima veoma agresivnog tumora ovi antitumorski efekti IMAB362 su manje izraženi, ali su ipak značajni, naglašavajući snažan antitumorski kapacitet IMAB362.
Primer 15: Antitumorski efekti IMAB362 kombinovanog sa hemoterapijom u mišjim modelima tumora
[0293] In vitro, IMAB362-posredovana ADCC je efikasnija na ćelijama humanog kancera želuca prethodno tretiranim kombinacijama hemoterapeutskih agenasa uključujući EOF i 5-FU OX. Prema tome, antitumorski uticaj kombinovanja ovih jedinjenja sa IMAB362 je ispitivan in vivo u mišjim modelima tumora.
[0294] Ksenotransplantati tumora NCI-N87~CLDN18.2 su inokulisani ubrizgavanjem 1x10<7>NCI-N87~CLDN18.2 ćelija subkutano u bok od 9 miševa za svaku tretmansku grupu. Miševi koji imaju tumor su tretirani prema EOF režimu sa 1.25 mg/kg epirubicina, 3.25 mg/kg oksaliplatina i 56.25 mg/kg 5-fluorouracila intraperitonealno na dan 4, 11, 18 i 25 posle inokulacije tumora, nakon čega sledi intravenska injekcija od 800 µg IMAB36224 časa posle primene hemoterapije. Tretman sa IMAB362 je nastavljen nedeljno. Veličina tumora i zdravstveno stanje životinja su praćeni polunedeljno. Slika 23a pokazuje efekte kombinovanog tretmana na rast tumora.
[0295] Veličina s.c. tumora je merena dva puta nedeljno (srednja vrednost SEM; * p<0.05). Slika 23b prikazuje Kaplan-Meier grafikone preživljavanja. Miševi su žrtvovani kada je tumor dostigao zapreminu od 1400 mm<3>.
[0296] Goli miševi koji nose tumor NCI-N87~CLDN18.2 tretirani sa IMAB362 ili EOF režimom pokazali su suprimirani rast tumora sa visokom značajnošću u poređenju sa kontrolnim miševima. Dodatni IMAB362 tretman u kombinaciji sa EOF hemoterapijom rezultovao je u značajno (p<0.05) većoj inhibiciji rasta tumora od tretmana samo sa EOF režimom (Slika 23 a). Medijana preživljavanja miševa u kontrolnoj grupi koja je primala fiziološki rastvor bila je 59 dana. Nedeljni IMAB362 tretman miševa značajno je produžio medijanu preživljavanja do 76 dana slično preživljavanju miševa u EOF grupi sa medijanom preživljavanja od 76 dana, takođe. Ali kombinovani tretman sa IMAB362 i EOF povećao je medijanu preživljavanja do 81 dan (Slika 23b).
[0297] Ksenotransplantati tumora su inokulisani ubrizgavanjem 1x10<7>NUGC-4~CLDN18.2 ćelija subkutano u bok 10 golih miševa (ženke, starosti šest nedelja) po tretmanskoj grupi. Miševi su tretirani na dan 3, 10, 17 i 24 hemoterapeutskim agensima. IMAB362 tretman je nastavljen nedeljno. Slika 24a prikazuje krive rasta tumora s.c. ksenotransplantata NUGC-4~CLDN18.2 (srednja vrednost SEM). Slika 24b prikazuje Kaplan-Meier grafikone preživljavanja (Log-rank (Mantel-Cox) Test, **p<0.01).
[0298] Subkutani ksenotransplantati tumora NUGC-4~CLDN18.2 rastu veoma agresivno. Ipak, IMAB362 tretman golih miševa koji nose tumor je značajno inhibirao rast tumora u poređenju sa kontrolnom grupom tretiranom fiziološkim rastvorom. U kombinovanoj terapiji sa EOF, efekti IMAB362 na rast NUGC-4~CLDN18.2 tumora su maskirani inhibicijom rasta kao posledica EOF tretmana, i ne pokazuju povećanu inhibiciju rasta tumora u poređenju sa tretmanom samo sa EOF (slika 24a). Međutim, medijana preživljavanja miševa tretiranih sa IMAB362 i EOF režimom bilo je produžena sa visokom značajnošću (p<0.01), u poređenju sa preživljavanjem miševa tretiranih samo sa EOF (Slika 24b).
Primer 16: Vγ9Vδ2 T ćelije ekspandirane pomoću ZA/IL-2 poboljšavaju IMAB362-posredovanu kontrolu uznapredovalih tumora in vivo
[0299] Da bi se ispitala kombinovana aktivnost IMAB362 i γδ T ćelija stvorenih pomoću ZA/IL-2 u mišjim sistemima, koristili smo NSG miševe. NSG miševima nedostaju zrele T ćelije, B ćelije, ćelije prirodne ubice (NK), višestruki citokinski putevi prenosa signala i oni imaju mnoge defekte u urođenom imunitetu, dok niše u primarnim i sekundarnim imunološkim tkivima dozvoljavaju kolonizaciju humanim imunim ćelijama.
[0300] NSG miševi su inokulisani subkutano sa 1x10<7>CLDN18.2-transficiranih HEK293 ćelija. Istog dana, miševi su primili 8x10<6>humanih PBMC obogaćenih za Vγ9Vδ2 T ćelije, koje su kultivisane 14 dana u medijumu dopunjenom sa ZA. Pored toga, miševima je ubrizgano 50 µg/kg ZA i 5000 U IL-2 (Proleukin). Da bi se humane T ćelije održavale funkcionalnim, IL-2 je primenjivan polu-nedeljno, a ZA nedeljno. Kada su HEK293~CLDN18.2 tumori postali makroskopski vidljivi, započet je polu-nedeljni tretman sa 200 µg IMAB362. Pored 9 miševa tretiranih kao što je opisano, ustanovljene su dve kontrolne grupe miševa. Jedna grupa nije primila humane γδ T ćelije, druga grupa je tretirana sa antitelom kontrolom izotipa umesto IMAB362. Rast CLDN18.2-pozitivnih tumora kod miševa tretiranih sa IMAB362 u prisustvu humanih γδ T ćelija i ZA bio je značajno inhibiran i skoro ukinut, dok su kod miševa tretiranih izotipskim kontrolnim antitelom ili kojima nedostaju humani T-ćelijski efektori, tumori rasli agresivno i miševi su morali da završe ispitivanje prevremeno (Slika 25).
Primer 17: Antitumorski efekti IMAB362 kombinovanog sa hemoterapijom u mišjim modelima tumora
[0301] Antitumorska aktivnost IMAB362 u kombinaciji sa hemoterapijom je ispitivana kod subkutanih alotransplantata karcinoma želuca kod imunokompetentnih outbred NMRI miševa upotrebom CLS-103 ćelija sa lentivirusnom transdukcijom mišjeg cldn18.2 (CLS-103~cldn18.2).
[0302] CLS-103~cldn18.2 alotransplantati tumora su inokulisani ubrizgavanjem 1x10<6>CLS-103~cldn18.2 ćelija subkutano u bok 10 NMRI miševa za svaku tretmansku grupu. Miševi sa tumorom su tretirani sa 1.25 mg/kg epirubicina, 3.25 mg/kg oksaliplatina i 56.25 mg/kg 5-fluorouracila (EOF) intraperitonealno na dan 3, 10, 17 i 24 posle inokulacije tumora, nakon čega je usledila intravenska injekcija 800 µg IMAB36224 časa posle svake primene hemoterapije. IL-2 je primenjivan polu-nedeljno subkutanom injekcijom 3000 IE. Posle završetka hemoterapije, tretman sa IMAB362 i IL-2 je nastavljen tokom celog perioda posmatranja. Veličina tumora i zdravstveno stanje životinja su praćeni polu-nedeljno. Miševi su žrtvovani kada je tumor dostigao zapreminu od 1400 mm<3>ili kada su tumori postali ulcerozni.
[0303] Kao što se može videti na Slici 26, NMRI miševi koji nose tumor CLS-103~cldn18.2 tretirani sa IMAB362 ili samo EOF nisu pokazali značajnu inhibiciju rasta tumora u poređenju sa kontrolnom grupom koja je primala fiziološki rastvor. Nasuprot tome, kombinacija EOF hemoterapije i IMAB362 tretmana rezultovala je u značajno višoj inhibiciji rasta tumora i u produženom preživljavanju miševa koji nose tumor. Ova zapažanja ukazuju na postojanje aditivnih ili čak sinergističkih terapeutskih efekata pomoću kombinacije EOF hemoterapije i IMAB362 imunoterapije. IL-2 tretman nije pokazao efekat na rast tumora.
1
2
4
1
�
�
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
11
11

Claims (10)

Patentni zahtevi
1. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije bolesti kancera naznačena time što ćelije kancera eksprimiraju CLDN18.2, pri čemu navedeno antitelo ima sposobnost specifičnog vezivanja za CLDN18.2 na površini ćelije i posreduje u ubijanju ćelija koje eksprimiraju CLDN18.2 od strane ADCC i/ili CDC, pri čemu postupak sadrži prethodni tretman ćelija kancera agensom koji stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2, pri čemu je navedeni agens izabran iz grupe koja se sastoji od (i) 5-fluorouracila, (ii) oksaliplatina i 5-fluorouracila, (iii) epirubicina, oksaliplatina i 5-fluorouracila, (iv) 5-fluorouracila, folinske kiseline i oksaliplatina, (v) irinotekana, (vi) docetaksela, (vii) epirubicina, (viii) oksaliplatina, i (ix) cisplatina, i prolekova navedenih agenasa, pri čemu je kancer izabran iz grupe koja se sastoji od kancera želuca, kancera jednjaka, posebno donjeg jednjaka, kancera ezo-gastričnog spoja i gastroezofagealnog kancera, posebno pri čemu kancer je metastaza kancera želuca, poželjno Krukenberg tumori, peritonealna metastaza i metastaza u limfnim čvorovima.
2. Agens koji stabilizuje ili povećava ekspresiju CLDN18.2 za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije bolesti kancera naznačen time što ćelije kancera eksprimiraju CLDN18.2, pri čemu postupak sadrži prethodni tretman ćelija kancera agensom, pri čemu je agens izabran iz grupe koja se sastoji od (i) 5-fluorouracila, (ii) oksaliplatina i 5-fluorouracila, (iii) epirubicina, oksaliplatina i 5-fluorouracila, (iv) 5-fluorouracila, folinske kiseline i oksaliplatina, (v) irinotekana, (vi) docetaksela, (vii) epirubicina, (viii) oksaliplatina, i (ix) cisplatina, i prolekova navedenih agenasa, i pri čemu postupak dalje obuhvata tretiranje ćelija kancera antitelom koje ima sposobnost specifičnog vezivanja za CLDN18.2 na površini ćelije i posreduje u ubijanju ćelija koje eksprimiraju CLDN18.2 od strane ADCC i/ili CDC, pri čemu je kancer izabran iz grupe koja se sastoji od kancera želuca, kancera jednjaka, posebno donjeg jednjaka, kancera ezo-gastričnog spoja i gastroezofagealnog kancera, posebno pri čemu kancer je metastaza kancera želuca, poželjno Krukenberg tumori, peritonealna metastaza i metastaza u limfnim čvorovima.
3. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 1 ili agens za upotrebu prema zahtevu 2, naznačeni time što postupak dalje sadrži primenu agensa koji stimuliše γδ T ćelije, pri čemu navedeni agens je bisfosfonat ili agens izabran iz grupe koja se sastoji od zoledronske kiseline, klodronske kiseline, ibandronske kiseline, pamidronske kiseline, risedronske kiseline, minodronske kiseline, olpadronske kiseline, alendronske kiseline, inkadronske kiseline i njihovih soli.
4. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 3 ili agens za upotrebu prema zahtevu 3, naznačeni time što γδ T ćelije su Vγ9Vδ2 T ćelije.
5. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom zahtevu 3 ili 4 ili agens za upotrebu prema zahtevu 3 ili 4, naznačeni time što se agens koji stimuliše γδ T ćelije primenjuje u kombinaciji sa interleukinom-2.
6. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 i 3 do 5 ili agens za upotrebu prema bilo kom od zahteva 2 do 5, naznačeni time što antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 je antitelo, ili njegova varijanta sa modifikacijom u CDR, pri čemu to antitelo sadrži kombinaciju VH i VL od kojih svaki sadrži skup regiona koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3 izabranih od sledećih primera izvođenja (i) do (ix):
(i) VH: CDR1: pozicije 45-52 SEQ ID NO: 14, CDR2: pozicije 70-77 SEQ ID NO: 14, CDR3: pozicije 116-125 SEQ ID NO: 14, VL: CDR1: pozicije 49-53 SEQ ID NO: 21, CDR2: pozicije 71-73 SEQ ID NO: 21, CDR3: pozicije 110-118 SEQ ID NO: 21,
(ii) VH: CDR1: pozicije 45-52 SEQ ID NO: 15, CDR2: pozicije 70-77 SEQ ID NO: 15, CDR3: pozicije 116-126 SEQ ID NO: 15, VL: CDR1: pozicije 47-58 SEQ ID NO: 20, CDR2: pozicije 76-78 SEQ ID NO: 20, CDR3: pozicije 115-123 SEQ ID NO: 20,
(iii) VH: CDR1: pozicije 45-52 SEQ ID NO: 16, CDR2: pozicije 70-77 SEQ ID NO: 16, CDR3: pozicije 116-124 SEQ ID NO: 16, VL: CDR1: pozicije 47-52 SEQ ID NO: 22, CDR2: pozicije 70-72 SEQ ID NO: 22, CDR3: pozicije 109-117 SEQ ID NO: 22,
(iv) VH: CDR1: pozicije 44-51 SEQ ID NO: 18, CDR2: pozicije 69-76 SEQ ID NO: 18, CDR3: pozicije 115-125 SEQ ID NO: 18, VL: CDR1: pozicije 47-58 SEQ ID NO: 25, CDR2: pozicije 76-78 SEQ ID NO: 25, CDR3: pozicije 115-122 SEQ ID NO: 25,
(v) VH: CDR1: pozicije 45-52 SEQ ID NO: 17, CDR2: pozicije 70-77 SEQ ID NO: 17, CDR3: pozicije 116-126 SEQ ID NO: 17, VL: CDR1: pozicije 47-58 SEQ ID NO: 24, CDR2: pozicije 76-78 SEQ ID NO: 24, CDR3: pozicije 115-123 SEQ ID NO: 24,
(vi) VH: CDR1: pozicije 45-53 SEQ ID NO: 19, CDR2: pozicije 71-78 SEQ ID NO: 19, CDR3: pozicije 117-128 SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: pozicije 47-58 SEQ ID NO: 23, CDR2: pozicije 76-78 SEQ ID NO: 23, CDR3: pozicije 115-123 SEQ ID NO: 23,
11
(vii) VH: CDR1: pozicije 45-53 SEQ ID NO: 19, CDR2: pozicije 71-78 SEQ ID NO: 19, CDR3: pozicije 117-128 SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: pozicije 47-58 SEQ ID NO: 26, CDR2: pozicije 76-78 SEQ ID NO: 26, CDR3: pozicije 115-123 SEQ ID NO: 26,
(viii) VH: CDR1: pozicije 45-53 SEQ ID NO: 19, CDR2: pozicije 71-78 SEQ ID NO: 19, CDR3: pozicije 117-128 SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: pozicije 47-58 SEQ ID NO: 27, CDR2: pozicije 76-78 SEQ ID NO: 27, CDR3: pozicije 115-123 SEQ ID NO: 27 i
(ix) VH: CDR1: pozicije 45-53 SEQ ID NO: 19, CDR2: pozicije 71-78 SEQ ID NO: 19, CDR3: pozicije 117-128 SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: pozicije 47-52 SEQ ID NO: 28, CDR2: pozicije 70-72 SEQ ID NO: 28, CDR3: pozicije 109-117 SEQ ID NO: 28.
7. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 6 ili agens za upotrebu prema zahtevu 6, naznačeni time što modifikacija sadrži 1-5 supstitucija u CDR regionima.
8. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 i 3 do 6 ili agens za upotrebu prema bilo kom od zahteva 2 do 6, naznačeni time što navedeno antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 i posreduje u ubijanju ćelija koje eksprimiraju CLDN18.2 od strane ADCC i/ili CDC sadrži kombinaciju varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i varijabilnog regiona lakog lanca (VL) izabranih od sledećih mogućnosti (i) do (ix):
(i) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 29 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 36 ili njen fragment,
(ii) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 30 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 35 ili njen fragment,
(iii) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 31 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu aminokiselina predstavljenu sa SEQ ID NO: 37 ili njen fragment, (iv) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 33 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 40 ili njen fragment,
(v) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu SEQ ID NO: 32 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 39 ili njen fragment,
(vi) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu SEQ ID NO: 34 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 38 ili njen fragment,
(vii) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 34 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 41 ili njen fragment,
(viii) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 34 ili njen fragment i VL
11
sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 42 ili njen fragment, i
(ix) VH sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 34 ili njen fragment i VL sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 43 ili njen fragment.
9. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 i 3 do 6 ili agens za upotrebu prema bilo kom od zahteva 2 do 6, naznačeni time što navedeno antitelo koje ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2 i posreduje u ubijanju ćelija koje eksprimiraju CLDN18.2 od strane ADCC i/ili CDC sadrži kombinaciju teških i lakih lanaca izabranih od sledećih mogućnosti (i) do (ix):
(i) težak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 14 ili njen fragment, i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 21 ili njen fragment, (ii) težak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 15 ili njen fragment, i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 20 ili njen fragment,
(iii) težak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 16 ili njen fragment, i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 22 ili njen fragment,
(iv) težak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 18 ili njen fragment, i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 25 ili njen fragment,
(v) težak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 17 ili njen fragment, i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 24 ili njen fragment, (vi) težak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 19 ili njen fragment, i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 23 ili njen fragment,
(vii) težak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 19 ili njen fragment, i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 26 ili njen fragment,
(viii) težak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 19 ili njen fragment, i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 27 ili njen fragment, i
(ix) težak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 19 ili njen fragment, i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu sa SEQ ID NO: 28 ili njen
11
fragment.
10. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 i 3 do 9 ili agens za upotrebu prema bilo kom od zahteva 2 do 9, naznačeni time što kancer je adenokarcinom, posebno uznapredovali adenokarcinom.
11
RS20220682A 2012-05-23 2013-05-21 Kombinovana terapija koja uključuje antitela protiv klaudina 18.2 za lečenje kancera RS63437B1 (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/EP2012/002211 WO2013174404A1 (en) 2012-05-23 2012-05-23 Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
EP20163993.7A EP3725810B1 (en) 2012-05-23 2013-05-21 Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS63437B1 true RS63437B1 (sr) 2022-08-31

Family

ID=48651960

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20220682A RS63437B1 (sr) 2012-05-23 2013-05-21 Kombinovana terapija koja uključuje antitela protiv klaudina 18.2 za lečenje kancera

Country Status (24)

Country Link
US (5) US9433675B2 (sr)
JP (6) JP6203830B2 (sr)
KR (4) KR102810919B1 (sr)
CN (3) CN107412773B (sr)
AR (1) AR091131A1 (sr)
AU (4) AU2013265637B8 (sr)
BR (1) BR112014028941B8 (sr)
ES (2) ES2784855T3 (sr)
HK (1) HK1208151A1 (sr)
HR (1) HRP20220897T8 (sr)
HU (1) HUE059241T2 (sr)
IL (3) IL318824A (sr)
LT (1) LT3725810T (sr)
MX (5) MX367241B (sr)
NZ (1) NZ701575A (sr)
PL (1) PL3725810T3 (sr)
PT (1) PT3725810T (sr)
RS (1) RS63437B1 (sr)
RU (1) RU2662066C2 (sr)
SG (2) SG11201406963RA (sr)
SI (1) SI3725810T1 (sr)
SM (1) SMT202200325T1 (sr)
UA (1) UA115985C2 (sr)
WO (2) WO2013174404A1 (sr)

Families Citing this family (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10254601A1 (de) * 2002-11-22 2004-06-03 Ganymed Pharmaceuticals Ag Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung
DE102004024617A1 (de) 2004-05-18 2005-12-29 Ganymed Pharmaceuticals Ag Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung
EP1790664A1 (en) 2005-11-24 2007-05-30 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer
US20100183558A1 (en) 2008-10-17 2010-07-22 Zhennan Lai Safe lentiviral vectors for targeted delivery of multiple therapeutic molecules
WO2013167153A1 (en) 2012-05-09 2013-11-14 Ganymed Pharmaceuticals Ag Antibodies useful in cancer diagnosis
EP2852409B1 (en) 2012-05-23 2020-03-25 Astellas Pharma Inc. Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
WO2013174404A1 (en) * 2012-05-23 2013-11-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
JP6499079B2 (ja) 2012-11-13 2019-04-10 バイオエヌテック アーゲーＢｉｏＮＴｅｃｈ ＡＧ クローディンを発現するガン疾患を処置するための剤
WO2014127785A1 (en) * 2013-02-20 2014-08-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
WO2014146672A1 (en) 2013-03-18 2014-09-25 Ganymed Pharmaceuticals Ag Therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
US10501541B2 (en) 2015-01-27 2019-12-10 Lava Therapeutics B.V. Single domain antibodies targeting CD1d
WO2016165765A1 (en) 2015-04-15 2016-10-20 Ganymed Pharmaceuticals Ag Methods and compositions for prediction of therapeutic efficacy of cancer treatments and cancer prognosis
WO2016165762A1 (en) * 2015-04-15 2016-10-20 Ganymed Pharmaceuticals Ag Drug conjugates comprising antibodies against claudin 18.2
GB201507368D0 (en) * 2015-04-30 2015-06-17 Ucl Business Plc Cell
EP3319631A4 (en) 2015-07-08 2019-01-09 American Gene Technologies International Inc. HIV PREMUNICATION AND IMMUNOTHERAPY
ES2965437T3 (es) * 2015-09-03 2024-04-15 Uab Res Found Células T modificadas genéticamente resistentes a fármacos y procedimientos de utilización de las mismas
US10137144B2 (en) 2016-01-15 2018-11-27 American Gene Technologies International Inc. Methods and compositions for the activation of gamma-delta T-cells
CN116064678A (zh) 2016-01-15 2023-05-05 美国基因技术国际有限公司 用于活化γ-δT细胞的方法和组合物
WO2017139065A1 (en) 2016-02-08 2017-08-17 American Gene Technologies International Inc. Hiv vaccination and immunotherapy
WO2017156311A2 (en) * 2016-03-09 2017-09-14 American Gene Technologies International Inc. Combination vectors and methods for treating cancer
EP3468617A4 (en) 2016-06-08 2020-01-22 American Gene Technologies International Inc. SYSTEM FOR THE NON-INTEGRAL VIRAL ISSUE AND PROCEDURE RELATING TO IT
AU2017292582C1 (en) 2016-07-08 2021-11-11 American Gene Technologies International Inc. HIV pre-immunization and immunotherapy
EP3487507A4 (en) 2016-07-21 2020-04-08 American Gene Technologies International, Inc. VIRAL VECTORS FOR THE TREATMENT OF PARKINSON'S DISEASE
US11820999B2 (en) 2017-04-03 2023-11-21 American Gene Technologies International Inc. Compositions and methods for treating phenylketonuria
JP2020524996A (ja) 2017-06-16 2020-08-27 アメリカン ジーン テクノロジーズ インターナショナル インコーポレイテッド ヒトガンマデルタｔ細胞を介する腫瘍細胞傷害性の活性化のための方法および組成物
CN107177549A (zh) * 2017-06-29 2017-09-19 青岛麦迪赛斯医疗技术有限公司 一种简单高效的扩增γδT细胞的方法
JP7381083B2 (ja) * 2017-09-08 2023-11-15 フォスプラティン テラピューティクス インコーポレイテッド 免疫調節剤としてのホスファプラチン化合物およびその治療的使用
SG11202007055QA (en) * 2018-03-08 2020-09-29 Phanes Therapeutics Inc Anti-claudin 18.2 antibodies and uses thereof
EP3765522A4 (en) * 2018-03-14 2022-05-18 Beijing Xuanyi Pharmasciences Co., Ltd. ANTI-CLAUDIN 18.2 ANTIBODIES
US11059887B2 (en) 2018-05-18 2021-07-13 Lanova Medicines Limited Company Anti-claudin 18.2 antibodies and uses thereof
JP7513605B2 (ja) * 2018-07-18 2024-07-09 アスクジーン・ファーマ・インコーポレイテッド 新規な抗体ならびにそれを調製および使用するための方法
KR20210050547A (ko) * 2018-08-27 2021-05-07 난징 산홈 팔마세우티칼 컴퍼니 리미티드 항-클라우딘18.2 항체 및 이의 용도
AU2019344300A1 (en) 2018-09-19 2021-04-22 LAVA Therapeutics N.V. Dual acting CD1D immunoglobulin
JP2022511394A (ja) * 2018-09-30 2022-01-31 カファ セラピューティクス リミテッド Ｃｌｄｎ１８の抗体及び化学療法薬の併用療法
US11352646B2 (en) 2018-11-05 2022-06-07 American Gene Technologies International Inc. Vector system for expressing regulatory RNA
BR112021011014A2 (pt) * 2018-12-07 2021-08-31 Zlip Holding Limited Anticorpos anti-claudina e usos destes
KR20210110339A (ko) * 2018-12-28 2021-09-07 난징 진스크립트 바이오테크 컴퍼니 리미티드 클라우딘18.2 결합 모이어티 및 그 용도
EP3902824A4 (en) * 2018-12-28 2023-01-04 Sparx Therapeutics Inc. FOR CLAUDIN 18.2 SPECIFIC BINDING MOLECULES, COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATMENT OF CANCER AND OTHER DISEASES
CN119350498A (zh) * 2018-12-28 2025-01-24 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 一种抗体及其用途
CN111434692B (zh) * 2019-01-15 2021-12-31 浙江道尔生物科技有限公司 抗cld18a2纳米抗体及其应用
CN109762067B (zh) * 2019-01-17 2020-02-28 北京天广实生物技术股份有限公司 结合人Claudin 18.2的抗体及其用途
WO2020205331A1 (en) * 2019-03-29 2020-10-08 Phanes Therapeutics, Inc. Humanized anti-claudin 18.2 chimeric antigen receptors and uses thereof
EP3971208A4 (en) * 2019-05-16 2022-11-30 Qilu Pharmaceutical Co., Ltd. ANTIBODIES TO CLAUDIN 18A2 AND USE THEREOF
CN117659190A (zh) * 2019-05-16 2024-03-08 启愈生物技术(上海)有限公司 抗cldn抗体及其药物组合物和检测方法
CN114206935B (zh) 2019-05-24 2024-01-12 三优生物医药(上海)有限公司 新型cldn18.2结合分子
CA3136281C (en) * 2019-05-30 2024-06-25 Shandong Boan Biotechnology Co., Ltd. Antibody or chimeric antigen receptor which targets claudin 18.2
WO2021024020A1 (en) * 2019-08-06 2021-02-11 Astellas Pharma Inc. Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 and immune checkpoint inhibitors for treatment of cancer
BR112021008870A2 (pt) 2019-08-12 2021-11-30 Abl Bio Inc Anticorpo, um ou mais polinucleotídeos, composição, uso do anticorpo, e, método para tratar câncer.
US20220332829A1 (en) * 2019-09-16 2022-10-20 Nanjing Sanhome Pharmaceutical Co., Ltd. Anti-b7-h3 antibody and application thereof
CN112574307B (zh) * 2019-09-29 2023-11-28 迈威(上海)生物科技股份有限公司 抗人Claudin18.2抗体及其应用
CN112707965A (zh) * 2019-09-30 2021-04-27 和铂医药(苏州)有限公司 靶向cldn18.2的抗体及其制备方法和应用
US20230030674A1 (en) 2019-12-06 2023-02-02 Sotio Biotech A.S. Humanized cldn18.2 antibodies
CN114761433B (zh) * 2019-12-11 2025-07-29 上海复宏汉霖生物技术股份有限公司 一种抗Claudin18.2单克隆抗体、其制备方法及用途
WO2021129927A1 (en) 2019-12-23 2021-07-01 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Treatment with immune effector cells engineered to express an antigen receptor
WO2021130291A1 (en) 2019-12-23 2021-07-01 SOTIO a.s. Tumor-specific claudin 18.2 antibodies
CN115715202B (zh) * 2020-05-15 2025-11-04 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 抗体药物缀合物及其制备方法和用途
KR20230042035A (ko) 2020-07-08 2023-03-27 라바 테라퓨틱스 엔.브이. Psma와 감마-델타 t 세포 수용체에 결합할 수 있는 항체
CN111705085B (zh) * 2020-08-20 2020-12-25 北京百奥赛图基因生物技术有限公司 构建动物模型的方法及应用
MX2023003041A (es) 2020-09-16 2023-05-09 Amgen Inc Métodos para administrar dosis terapéuticas de moléculas de acoplamiento a células t biespecíficas para el tratamiento de cáncer.
JP2022061640A (ja) * 2020-10-07 2022-04-19 株式会社村田製作所 積層セラミックコンデンサ
WO2022100590A1 (zh) * 2020-11-10 2022-05-19 齐鲁制药有限公司 针对密蛋白18a2的adcc增强型人源化抗体及其应用
WO2022122709A1 (en) 2020-12-07 2022-06-16 Sotio Biotech A.S. Antibody-drug conjugates based on humanized cldn18.2 antibodies
TW202241519A (zh) 2020-12-23 2022-11-01 捷克商舒迪安生物技術公司 腫瘤特異性密連蛋白１８﹒２抗體藥物結合物
AU2022371521A1 (en) * 2021-10-19 2024-05-02 Biosion Inc. Antibodies binding cldn18.2 and uses thereof
JP2024540062A (ja) * 2021-11-05 2024-10-31 チア タイ ティエンチン ファーマシューティカル グループ カンパニー リミテッド 抗ｃｌｄｎ１８．２抗体及びその用途
CN116162168A (zh) 2021-11-25 2023-05-26 信达细胞制药(苏州)有限公司 分子开关调控型嵌合抗原受体细胞和抗体的组合及其应用
WO2023235808A2 (en) * 2022-06-01 2023-12-07 Integral Molecular, Inc. Claudin 18.2 antibodies, methods of making the same, and uses thereof
WO2024137619A1 (en) 2022-12-20 2024-06-27 Bolt Biotherapeutics, Inc. Anti-claudin, bis-benzimid azole sting agonist immunoconjugates, and uses thereof
WO2024173384A1 (en) 2023-02-14 2024-08-22 Bolt Biotherapeutics, Inc. Aza-benzazepine immunoconjugates, and uses thereof
WO2026050214A1 (en) 2024-08-27 2026-03-05 Bolt Biotherapeutics, Inc. Anti-claudin, tlr agonist immunoconjugates and uses thereof

Family Cites Families (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
WO2000078961A1 (en) 1999-06-23 2000-12-28 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
NZ531664A (en) 1998-09-01 2005-07-29 Genentech Inc Pro1317 polypeptides and sequences thereof with homology to the semaphorin B glycoprotein family
EP1144629A3 (en) 1998-09-01 2001-11-28 Genentech, Inc. Further pro polypeptides and sequences thereof
CA2343001A1 (en) 1998-09-16 2000-03-23 Zymogenetics, Inc. Stomach polypeptide zsig28
AU766279B2 (en) 1998-10-06 2003-10-16 Curagen Corporation Novel secreted proteins and polynucleotides encoding them
WO2000058473A2 (en) 1999-03-31 2000-10-05 Curagen Corporation Nucleic acids including open reading frames encoding polypeptides; 'orfx'
CA2380355A1 (en) 1999-09-01 2001-03-08 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US6380362B1 (en) 1999-12-23 2002-04-30 Genesis Research & Development Corporation Ltd. Polynucleotides, polypeptides expressed by the polynucleotides and methods for their use
WO2001055301A2 (en) 2000-01-31 2001-08-02 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
EP1251863A4 (en) 2000-01-31 2005-03-02 Human Genome Sciences Inc 22 HUMAN SECRETED PROTEINS
EP1255778A2 (en) 2000-01-31 2002-11-13 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
WO2001055326A2 (en) 2000-01-31 2001-08-02 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
AU6802801A (en) 2000-03-01 2001-09-24 Genentech Inc Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US6436703B1 (en) 2000-03-31 2002-08-20 Hyseq, Inc. Nucleic acids and polypeptides
AU2001260847A1 (en) 2000-05-24 2001-12-03 Genesis Research And Development Corporation Limited Compositions isolated from skin cells and methods for their use
ES2284678T3 (es) 2000-08-15 2007-11-16 Immunex Corporation Polipeptidos de claudinas.
JP2004520814A (ja) 2000-08-28 2004-07-15 ディアデクサス インコーポレーテッド 肺特異的遺伝子に関する組成物および方法
ATE549347T1 (de) 2000-09-08 2012-03-15 Schering Corp Gene von säugetiere, und damit verbundene reagentien, methoden
CA2430013C (en) 2000-11-30 2011-11-22 Medarex, Inc. Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
BRPI0315295C1 (pt) 2002-10-17 2021-05-25 Genmab As anticorpo monoclonal humano isolado, célula hospedeira procariótica, composição farmacêutica, molécula biespecífica, usos de um anticorpo, métodos in vitro de detectar a presença de antígeno de cd20 ou uma célula que expressa cd20 em uma amostra, kit, e, vetor de expressão
DE10254601A1 (de) 2002-11-22 2004-06-03 Ganymed Pharmaceuticals Ag Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung
WO2004063355A2 (en) 2003-01-10 2004-07-29 Protein Design Labs, Inc. Novel methods of diagnosis of metastatic cancer, compositions and methods of screening for modulators of matastatic cancer
KR20060134216A (ko) * 2004-04-16 2006-12-27 에미스페어 테크놀로지스, 인코포레이티드 활성제 전달을 위한 8-(2-히드록시페녹시)옥틸디에탄올아민및 그의 염
DE102004024617A1 (de) 2004-05-18 2005-12-29 Ganymed Pharmaceuticals Ag Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung
DE102004042822A1 (de) 2004-08-31 2006-03-16 Technische Universität Dresden Verbindungen und Methoden zur Behandlung, Diagnose und Prognose bei Pankreaserkrankungen
WO2007027867A2 (en) 2005-08-31 2007-03-08 Cell Signaling Technology, Inc. Reagents for the detection of protein phosphorylation in carcinoma signaling pathways
EP1930414B1 (en) * 2005-09-08 2012-07-18 Medinet Co., Ltd. Method for activation treatment of antigen-presenting cell
EP2402758B1 (en) 2005-09-19 2014-09-10 Janssen Diagnostics, LLC Methods and uses for identifying the origin of a carcinoma of unknown primary origin
EP1790664A1 (en) 2005-11-24 2007-05-30 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer
JP5399712B2 (ja) * 2005-12-21 2014-01-29 アムゲン リサーチ （ミュンヘン） ゲーエムベーハー 可溶性ｃｅａに対する抵抗性を有する医薬組成物
US20100129929A1 (en) 2006-07-27 2010-05-27 Roberto Polakewicz Tyrosine Phosphorylation Sites
JP5666136B2 (ja) 2007-02-01 2015-02-12 ジャンセン ダイアグノスティックス，エルエルシー 原発不明がんの原発巣を同定するための方法および材料
EP2145902A3 (en) 2007-04-19 2010-09-29 Peter Hornbeck Tyrosine phosphorylation sites and antibodies specific for them
EP1997832A1 (en) * 2007-05-29 2008-12-03 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies against Claudin-18 for treatment of cancer
JPWO2008152822A1 (ja) * 2007-06-15 2010-08-26 株式会社メディネット 医薬
US20090274698A1 (en) 2007-07-06 2009-11-05 Shripad Bhagwat Combination anti-cancer therapy
EP2036987A1 (en) 2007-09-17 2009-03-18 Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Molecular markers for tumor cell content in tissue samples
MX2010008099A (es) 2008-01-28 2010-08-04 Medimmune Ltd Anticuerpos y angiopoyetina-2 estabilizados y sus usos.
EP2304053A1 (en) 2008-06-02 2011-04-06 NSABP Foundation, Inc. Identification and use of prognostic and predictive markers in cancer treatment
EP2316026A1 (en) 2008-07-25 2011-05-04 Merck Patent GmbH Method of determination of receptor binding saturation effected by monoclonal antibodies
WO2010141093A2 (en) * 2009-06-04 2010-12-09 The University Of Maryland, Baltimore Co-signaling methods for treating cancers
WO2011090005A1 (ja) * 2010-01-19 2011-07-28 協和発酵キリン株式会社 大腸癌の治療用医薬および治療方法
US8840902B2 (en) 2010-03-16 2014-09-23 Biontech Ag Tumor vaccination involving a humoral immune response against self-proteins
CN102168067B (zh) * 2011-02-11 2012-08-29 浙江大学 一种调节性t细胞的诱导培养方法
WO2013167153A1 (en) 2012-05-09 2013-11-14 Ganymed Pharmaceuticals Ag Antibodies useful in cancer diagnosis
WO2013174404A1 (en) 2012-05-23 2013-11-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
WO2013174403A1 (en) 2012-05-23 2013-11-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
WO2014127785A1 (en) 2013-02-20 2014-08-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
JP6241403B2 (ja) 2014-10-24 2017-12-06 横浜ゴム株式会社 リン酸変性ポリマー

Also Published As

Publication number Publication date
SMT202200325T1 (it) 2022-09-14
MX2014014215A (es) 2015-06-23
MX367241B (es) 2019-08-09
CN104427999A (zh) 2015-03-18
CN107050460A (zh) 2017-08-18
IL235672A0 (en) 2015-01-29
US20160339101A1 (en) 2016-11-24
JP6490763B2 (ja) 2019-03-27
LT3725810T (lt) 2022-08-25
US10813996B2 (en) 2020-10-27
CN107050460B (zh) 2021-06-22
US9433675B2 (en) 2016-09-06
JP6203830B2 (ja) 2017-09-27
AR091131A1 (es) 2015-01-14
US12059464B2 (en) 2024-08-13
WO2013174509A1 (en) 2013-11-28
RU2014152107A (ru) 2016-07-10
PL3725810T3 (pl) 2022-09-05
AU2013265637A1 (en) 2014-11-20
JP2015518838A (ja) 2015-07-06
IL276434B2 (en) 2025-07-01
KR20150027112A (ko) 2015-03-11
AU2018201856B2 (en) 2020-06-18
JP2021080262A (ja) 2021-05-27
JP2018002724A (ja) 2018-01-11
UA115985C2 (uk) 2018-01-25
KR102188001B1 (ko) 2020-12-07
AU2020203557A1 (en) 2020-06-18
IL276434A (en) 2020-09-30
US20200390887A1 (en) 2020-12-17
KR20230047493A (ko) 2023-04-07
MX2020011796A (es) 2020-12-07
BR112014028941B8 (pt) 2020-03-17
BR112014028941A2 (pt) 2016-10-25
HK1247567A1 (zh) 2018-09-28
JP2025093926A (ja) 2025-06-24
JP7204791B2 (ja) 2023-01-16
IL276434B1 (en) 2025-03-01
HK1208151A1 (en) 2016-02-26
MX2019009441A (es) 2019-12-16
HRP20220897T1 (hr) 2022-10-14
BR112014028941B1 (pt) 2019-11-12
CN104427999B (zh) 2017-01-18
KR20200140387A (ko) 2020-12-15
MX2020011795A (es) 2020-12-07
PT3725810T (pt) 2022-08-01
CN107412773B (zh) 2021-04-06
AU2023200682A1 (en) 2023-04-27
HRP20220897T8 (hr) 2022-11-11
JP6833885B2 (ja) 2021-02-24
IL318824A (en) 2025-04-01
JP2019104747A (ja) 2019-06-27
RU2662066C2 (ru) 2018-07-23
JP2023038230A (ja) 2023-03-16
US20180326059A1 (en) 2018-11-15
HUE059241T2 (hu) 2022-11-28
WO2013174404A1 (en) 2013-11-28
US10022444B2 (en) 2018-07-17
IL235672B (en) 2020-08-31
CN107412773A (zh) 2017-12-01
ES2784855T3 (es) 2020-10-01
KR102810919B1 (ko) 2025-05-26
SG10201609510UA (en) 2016-12-29
RU2018124328A3 (sr) 2021-10-22
US20150157711A1 (en) 2015-06-11
SI3725810T1 (sl) 2022-10-28
CA2874028A1 (en) 2013-11-28
KR102514338B1 (ko) 2023-03-28
ES2924023T3 (es) 2022-10-04
AU2013265637B2 (en) 2017-12-21
AU2013265637B8 (en) 2018-04-26
KR102810919B9 (ko) 2026-03-09
US20240335533A1 (en) 2024-10-10
SG11201406963RA (en) 2014-12-30
MX2020011768A (es) 2020-11-24
KR20250077600A (ko) 2025-05-30
RU2018124328A (ru) 2019-03-12
NZ701575A (en) 2016-10-28
AU2018201856A1 (en) 2018-04-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240335533A1 (en) Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
AU2018201391B2 (en) Combination therapy involving antibodies against Claudin 18.2 for treatment of cancer
EP3254695B1 (en) Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
EP3725810B1 (en) Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
HK40110865A (en) Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
HK40126719A (en) Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
HK40087661A (en) Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
CA2874028C (en) Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
HK40049154B (en) Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
HK40049154A (en) Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
HK40039705A (en) Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
HK40039705B (en) Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
HK1208152B (en) Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer